JP2000510330A - 癌の診断および予後のための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、腫瘍抑制遺伝子ｐＲｂ２／ｐ１３０の発現のレベルを決定することを含む、診断および予後のための方法を提供する。ｐＲｂ２／ｐ１３０発現の相対レベルは癌の存在、腫瘍等級、および患者予後と関連するため、これらの方法は、癌を検出し、治療の判断を行い、患者の成果を予測し、および罹患していない個体における癌の危険性を予測するために用いることができる可能性がある。本発明はさらに、ｐＲｂ２／ｐ１３０遺伝子中の突然変異および多型性の検出のための方法を提供する。これは、腫瘍形成に関連する遺伝的事象を特徴付けし、突然変異の親起源を追跡し、生殖系突然変異のキャリアーを同定し、および、癌の素因を有する個体を同定するために用いることができる可能性がある。

Description

【発明の詳細な説明】 癌の診断および予後のための方法政府助成金 本明細書に記載されている発明は国立衛生研究所助成金ＲＯ１ ＣＡ６０９９９ −０１Ａ１により支援された。米国政府は本発明にある種の権利を持っている。関連出願の参照 本出願は１９９７年３月３日に出願された米国仮特許出願番号６０／０３９，５ ３２号、１９９６年６月２１日に出願された米国仮特許出願番号６０／０２０， １９６号、１９９６年６月５日に出願された米国仮特許出願番号６０／０１９， ３７２号および１９９６年４月５日に出願された米国仮特許出願番号６０／０１ ４，９４３号からの優先権を請求する。発明分野 本発明は癌の危険性のある個体の同定、および癌の検出および評価のための方 法に関している。背景技術 Ａ．癌抑制のＲｂファミリー ヒトの癌の多くの型は細胞内での増殖制御の平衡異常により起こされると信じ られている。増殖制御における負の調節の減少および／またはそれらの不活性化 は癌性状態を起こすことができる。もしくは、正の調節増殖制御の増加もまた癌 性状態を起こすことができる。 最初の腫瘍抑制遺伝子の同定以来、新規腫瘍抑制遺伝子の同定およびヒトの癌 におけるそれらの関与に癌研究のより多くの努力が焦点を合わせてきた。Ｋｎｕ ｄｓｏｎの”ツーヒット”仮説に従うと（Ｋｎｕｄｓｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ，６８，８２０−８２３（１９７１））、ヒトの癌 の多くの型は未だに同定されていない推定腫瘍抑制遺伝子のヘテロ接合性の喪失 により発現すると考えられている（Ｌａｓｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅ ｖ ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２５，２８１−２９６（１９９１））。 最も研究されている腫瘍抑制遺伝子の一つは網膜芽細胞腫感受性遺伝子（Ｒ ｂ）であり、その遺伝子産物（ｐＲｂ、ｐ１０５またはｐＲｂ／ｐ１０５）は細 胞分割の制御において鍵となる役割を果たしていることが示されている。分裂間 期細胞において、ｐＲｂはＥ２Ｆのような転写因子との相互作用を通して細胞周 期に必要とされる遺伝子の転写を抑制することにより細胞の静止状態の維持に寄 与している（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２，１８９−１ ９０（１９９１）；Ｎｅｖｉｎｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５８，４２４−４２９（ １９９２）；およびＨｉｅｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏ ｐ ．，６，１７７−１８５（１９９２））。この活性の喪失は、機能性ｐＲｂで の置換後のｐＲｂ細胞における形質転換された表現型の復帰により証明されたよ うに、細胞の形質転換を誘導できる（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃ ｅ ２４２：１５６３−１５６５（１９８８）；Ｂｏｏｋｓｔｅｉｎ ｅｔ ａ ｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７：７１２−７１５（１９９０）；およびＳｕｍｅ ｇｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．，１：２４７− ２５０（１９９０））。 細胞周期に入ったら、ｐＲｂは細胞周期依存性キナーゼによりリン酸化される ようであり（Ｌｅｅｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１０：４２７９−４２９ ０（１９９１）；Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１２： ９７１−９８０（１９９２）；Ｈｉｎｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，７０：９ ９３−１００６（１９９２）；およびＭａｔｓｕｓｈｉｍｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎ ａｔｕｒｅ ，３５：２９５−３００））、それはｐＲｂの転写因子からの解離、 ゆえに細胞周期の進行に必要とされる遺伝子の発現を可能にすると考えられてい る。 網膜芽細胞腫タンパク質ファミリーには少なくとも三つの構成物が含まれてい ることが観察されている。二つの他のタンパク質、ｐ１０７および最近クローン 化されたｐＲｂ２／ｐ１３０はｐＲｂ／ｐ１０５、特に”ポケット領域”を作り 上げる二つの不連続ドメインと相同性の領域を共有している。Ｅｗｅｎ ｅｔａ ｌ．，Ｃｅｌｌ ６６：１１５５−１１６４（１９９３）；Ｍａｙｏｌ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：１５６１−２５６６（１９９３）：Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．７：２３６６−２３７７（１９９３）；およ びＨａｎｎｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．７：２３７８−２３９１ （１９９３）。ポケットドメインはいくつかのウイルス形質転換オンコプロテイ ンとの結合に必要とされる（Ｍｏｒａｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄ ｅｖ ．３：６３−７０（１９９３））。 ｐＲｂ２／ｐ１３０ ｃＤＮＡおよび推定アミノ酸配列はＬｉらにより示され ている。ｐ１０７ ｃＤＮＡおよび推定アミノ酸配列はＥｗｅｎらにより示され ている。ＬｉらおよびＥｗｅｎらの全開示は本明細書において援用される。 ｐＲｂ２／ｐ１３０ならびにｐ１０７およびｐＲｂは細胞周期進行の負の制御 因子として作用することが観察されており、細胞をＧ１期で遮断する（Ｇｏｏｄ ｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６７：２９３−３０２（１９９１）；Ｚｈ ｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．７：１１１１−１１２５（１９９３） ；Ｃｌａｕｄｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：５５５６−５ ５６０（１９９４）；およびＺｈｕ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１４：１９ ０４−１９１３（１９９５））。しかしながら、これらのタンパク質は選択され た細胞株において異なった増殖抑制特性を示し、網膜芽細胞腫タンパク質ファミ リーの異なったメンバーはお互いに補足しあうであろうけれども、それらは完全 には機能的に重複していないことを示唆している（Ｃｌａｕｄｉｏ ｅｔ ａｌ ．，上記文献）。 これら三つのタンパク質による細胞周期進行に対して制御を働かせる機構は完 全には理解されていないが、いくつかの転写因子との複合体形成および活性の調 節を含んでいるようである（Ｓａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｄｉ ｆｆｅｒ ．３：１−２９（１９９５））。これらの複合体の内で最も研究されて いるのは転写因子のＥ２Ｆファミリーの複合体である。Ｅ２Ｆの複合体は細胞周 期のＧ０／Ｇ１ Ｓ期の進行に必要とされる遺伝子の発現を制御する、Ｅ２Ｆ様 およびＤＰ様サブユニットからなるヘテロ二量体転写因子である（Ｌａｎ Ｔｈ ａｎｇｕｅ，Ｎ．Ｂ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１９：１０８ −１１４（１９９４））。 三つのタンパク質は細胞周期の異なった期において別個のＥ２Ｆ／ＤＰ１複合 体に結合しおよびその活性を調節している（Ｓａｎｇ ｅｔ ａｌ．，上記文献 ；Ｃｈｅｌｌａｐａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６５：１０５３−１０６１（ １９９１）；Ｓｈｉｒｏｄｋａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６６：１５７−１ ６６（１９９２）；Ｃｏｂｒｉｎｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．７ :２３９２−２４０４（１９９３）；Ｈｉｊｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ ．１５：３０８２−３０８９（１９９５）；およびＶａｉｒ ｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．９：８６９−８８１（１９９５））。 このことは細胞周期の制御におけるこれらの関連タンパク質の別個の役割を示唆 している。 ｐＲｂ２／ｐ１３０の増殖抑制性特性はＧ１期に特異的であることが示されて いる。Ｄ型サイクリン、ならびに転写因子Ｅ２Ｆ−１およびＥ１Ａウイルス性オ ンコプロテインは腫瘍細胞においてｐＲｂ２／ｐ１３０仲介Ｇ１増殖停止を助け ることができる。このことは、他のＲｂファミリータンパク質同様に、ｐＲｂ２ ／ｐ１３０のリン酸化は細胞周期により機械的に制御されていること、およびｐ Ｒｂ２／ｐ１３０は実際に別の鍵となるＧ１−Ｓ期制御因子であることを示唆し ている。Ｃｌａｕｄｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６，２００ ３−２００８（１９９６）。 ｐＲｂとＥ２Ｆのような転写因子との会合は”ポケット領域”として知られて いる領域での相互作用により起こることが示されている（Ｒａｙｃｈａｕｄｈｕ ｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．，５ １２００−１２０７ （１９９１））。最近、ｐ１０７もそのような結合プロフィールを用いることが 示された（Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５５ １７６−１７９（１ ９９２））。ドメインＡおよびＢはスペーサーと一緒に、本明細書に記載したｐ Ｒｂ２／ｐ１３０遺伝子中の”ポケット領域”に対応すると信じられている。さ らに、いくつかのヒトの癌でポケット領域中の突然変異が観察されており、ｐＲ ｂタンパク質の機能欠如は形質転換された表現型の獲得に関係していると考えら れている（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，９ １１４７−１１５３（１ ９９０）；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１０： ３７６１−３７６９（１９９０））。 Ｒｂ、ｐ１０７およびｐＲｂ２／ｐ１３０タンパク質は細胞周期制御に鍵とな る働きを果たしており、そこでは三つのタンパク質すべてがいくつかのサイクリ ン／ｃｄｋ複合体と相互作用している。インビボではｐＲｂとサイクリンＡ／ｃ ｄｋ２またはサイクリンＡ／ｃｄｋ２との安定な相互作用は観察されていないけ れども、ｐＲｂはサイクリンＡ／ｃｄｋ２、サイクリンＥ／ｃｄｋ２およびサイ クリンＤ／ｃｄｋ４のようなサイクリン／ｃｄｋ複合体により制御できる（Ｍａ ｃＬａｃｈｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐ．５ ： １２７−１５６（１９９５））。一方、ｐ１０７およびｐＲｂ２／ｐ１３ ０の両方ともインビボでサイクリンＥ／ｃｄｋ２およびサイクリンＡ／ｃｄｋ２ 複合体と安定に相互作用する（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，上記文献；Ｅｗｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：８５−８７（１９９２）；およびＦａｈａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：８７−９０（１９９２））。これら の複合体は、細胞周期の種々の期におけるｐＲｂ、ｐ１０７およびｐＲｂ２／ｐ １３０の異なったリン酸化型の存在の原因になっているのであろう（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ５８：１１９３−１１９８（１９８９）；Ｄｅ Ｃａ ｐｒｉｏ ｅｌ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８ ９ ：１７９５−１７９８（１９９２）：およびＢｅｉｊｅｒｓｂｅｒｇｅｎ ｅ ｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．９：１３４０−１３５３（１９９３））。ｐ Ｒｂの機能的活性はこれらのリン酸化により促進されるのであるから、この翻訳 後修飾によりｐＲｂ２／ｐ１３０もまた同様の様式で影響されることはありそう なことである。ｐＲｂ２／ｐ１３０は重複しないにしても、ｐＲｂと同様な機能 的特性を示すので、ｐＲｂ同様、ｐＲｂ２／ｐ１３０は腫瘍抑制遺伝子として作 用することが提案されている。ｐＲｂ２／ｐ１３０が染色体１６の長腕上に位置 していることも観察されている。この発見は腫瘍抑制遺伝子としてのｐＲｂ２／ ｐ１３０についての意見を補強している。染色体１６は乳、卵巣、肝細胞および 前立腺癌のようないくつかのヒト新生組織形成（ｎｅｏｐｌａｓｉａｓ）におい てヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）がしばしば報告されている領域である（Ｙｅｕ ｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：３４６５−３４６８（１９９３） ）。染色体１６，および特にｐＲｂ２／ｐ１３０は遺伝性円柱腫症（ＨＲ）とし て知られているまれなヒト皮膚疾患に関係があるとされている。ＨＲは染色 体１６ｑ１２−ｑ１３上の座に位置していると報告されている。ｐＲｂ２／ｐ１ ３０が１６ｑ１２−ｑ１３に位置しているという点から、この疾患の発症に関与 する腫瘍抑制遺伝子の候補として提案されてきた。Ｂｉｇｇｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １１：４４１−４４３（１９９５年１２月） 。 癌の危険性のある個体の同定、および癌の検出および評価についての改良され た方法が必要とされている。 ｐＲｂ２／ｐ１３０遺伝子は腫瘍抑制遺伝子であり、およびそれは種々の癌腫 に関係付けられることが知られている染色体領域に位置しているので、この遣伝 子中の突然変異について個体をスクリーニング方法が必要とされている。この遺 伝子の配列多型を同定することも必要とされている。ｐＲｂ２／ｐ１３０の機能 に影響を及ぼすであろう、エキソンコード配列およびエキソン−イントロン結合 内の両方での突然変異が起こりうると信じられている。腫瘍から抽出されたゲノ ムＤＮＡより取り出された個々のエキソンの直接ＤＮＡ配列分析が、卵巣癌での ｐ５３遺伝子および網膜芽細胞腫でのＲｂ遺伝子の突然変異を同定するために首 尾よく使用された。Ｍｉｌｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒ ｃｈ ５３：２１２８−２１３２（１９９３）；Ｙａｎｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ． ，Ｎ．Ｅ．Ｊ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３２１：１６８９−１６９５（１９８９）。 しかしながら、エキソンの直接配列決定は、非常に時間のかかる方法であるので 望ましい方法ではない。ｐＲｂ２／ｐ１３０遺伝子のゲノム構造の理解は、ｐＲ ｂ２／ｐ１３０遺伝子中の多型および配列突然変異について患者のＤＮＡをスク リーニングすることを当業者に可能にするであろう。配列突然変異の同定はまた ｐＲｂ２／ｐ１３０遺伝子の生殖細胞突然変異保持者の診断も可能にするであろ うし、およびこれらの場合の出生前スクリーニングを可能にする。Ｂ．婦人科癌 婦人科癌には子宮、卵巣、子宮頚、膣、陰門およびファロピー管の癌、ならび に妊娠絨毛性疾患が含まれる。子宮の癌には子宮内膜癌および予宮肉腫が含まれ る。 子宮内膜癌は婦人生殖器官の最も一般的な悪性腫瘍である。この新生物はしば しば初期に診断されるが（ステージＩで７５％）、患者の約２０％がこの疾患で 死亡するであろう（その半数はステージＩで診断されている）（Ｐｅｔｔｅｒｓ ｓｏｎ，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｐｏｒｔ Ｏｎ Ｔｈｅ Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｏｆ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｉｎ Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ ，Ｒａ ｄｉｕｍｈｅｍｍｅｔ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，ｖｏｌ．２２：６５−８２；Ｂｒ ａｌy，Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｏｎｃｏｌ ５８：１４５−７（１９９５））。より 進行性の疾患を持つ患者を同定する能力は、各々の場合に対する適切な処置の立 案において非常に重要である。この目的を心に留めて、組織学的型、分化度、子 宮筋層の深さ、リンパ節転移および子宮外拡散を含むいくつかの病理学的な腫瘍 の特色がこれまで考えられてきた（ＭａｃＭａｈｏｎ，Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｏｎｃ ｏｌ ２：１２２（１９７４）；Ｃｈａｍｂｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｙｎｅｃ ｏｌ Ｏｎｃｏｌ ２７：１８０−８（１９８７））。不幸にして、これらの因 子のどれも患者の十分に正確な階層化を可能にしなかった。そのようなパラメー ターも再現性が疑わしいものであった。 子宮内膜癌の臨床成果を予言するものと一致する簡単な実験室での試験が非常 に必要とされている。必要とされているものとは治療の開始前に、初期の疾患段 階で個々の患者の疾患の進行性を同定できる予後診断法である。 卵巣癌は米国において、婦人科癌死の最も多い原因となっている。ほとんどの 卵巣悪性腫瘍は上皮癌腫であり、少数派の腫瘍は生殖または間質細胞から生じて いる。卵巣癌においては、細胞分化の程度（組織学的段階）が、処置への応答お よび全生存率の両方についての重要で独立した予想因子である。卵巣癌はしばし ば染色体変化を示している。ｐＲｂ／ｐ１３０遺伝子はヒト染色体１６ｑ１２． ２に位置しており、そこはヒト卵巣癌でしばしば変化を受けている一つの領域で ある。卵巣癌を等級付ける改良法が必要とされている。改良された方法は疾患の 診断、処置の選択および予後指標に有用であろう。Ｃ．肺癌 肺癌は西洋諸国においての癌関連死の最も大きな単一原因である。肺癌療法の 適当な方針の選択にあたっては、癌の悪性度の正確な決定が必要とされる。この 決定は典型的には腫瘍の”等級付け（ｇｒａｄｉｎｇ）”によりなされる。腫瘍 の等級付けは典型的には熟練した病理学者により腫瘍切片の特徴および外観が調 査されることにより実施される。肺癌の予後徴候および処置の型を決定する場合 に組織学的基準を使用する際の重大な問題は、同一の標本を読みとる際の観察者 間および観察者内変異の程度である。決定は必然的に主観的である。加えて、原 発および転移部位の両方で腫瘍それ自体内に不均質性が存在する。個々の腫瘍等 級を一致させるには何人かの病理学者の意見を得ることが必要になってきている であろう。 腫瘍試料の現主観的病理学的分析よりも、個々の患者の肺癌の悪性度と一致し て断定的である簡単な実験室での試験が必要とされている。 肺障害出現前の潜在的癌の検出は、疾病の初期段階での治療開始を可能にする であろうし、それにより陽性の治療成果の見込みを最大にする。簡単な遺伝子検 査により、肺癌の危険性があるがまだ病気にはなっていない人を同定するのも望 まれるであろう。そのようなスクリーニング試験は、発癌物質への環境的暴露ま たは癌の家族歴などで肺癌が発生する危険性のある人に対して最も利点があるで あろう。 肺癌診断の別の形を増加させる、および潜在的肺癌を持つ個体を同定するのに 使用できる簡単な実験室での試験が必要とされている。肺癌の素質がある個体を スクリーニングするための検査もまた必要とされている。発明の概要 本発明はヒトｐＲｂ２／ｐ１３０遺伝子およびｐＲｂ２／ｐ１３０タンパク質 、および癌の診断および予後のための並びに癌の素質の予想のための方法におけ る分子マーカーとしてのそれらの使用に関している。本発明の好適な態様による と、癌とは婦人科癌または非小細胞肺癌である。本発明の最も好適な態様による と、癌とは子宮内膜癌、卵巣癌、肺の扁平上皮癌または肺の腺癌である。 患者からの試料中のｐＲｂ２／ｐ１３０遺伝子の発現レベルを決定することを 含む、癌に悩む患者の予後を決定するための方法を提供するのが本発明の目的で ある。試料中のｐＲｂ２／ｐ１３０遺伝子の発現レベルの低下は好ましくない予 後の指標である。 組織試料中のｐＲｂ２／ｐ１３０遺伝子の発現レベルを決定することを含む、 組織の癌性疾患状態を検出または同定するための方法を提供するのも本発明の別 の目的である。評価は都合良くは、試料中のｐＲｂ２／ｐ１３０発現レベルを決 定し、そして試料組織の発現レベルを正常で非癌性組織のｐＲｂ２／ｐ１３０発 現レベルと比較することにより実施される。ｐＲｂ２／ｐ１３０発現レベルの低 下は癌の存在の指標である。この方法は目にみえる障害を示さない個体での癌検 出に使用されるであろう。 個体の組織試料中のｐＲｂ２／ｐ１３０遺伝子の発現レベルを決定し、組織試 料のｐＲｂ２／ｐ１３０発現レベルを正常ｐＲｂ２／ｐ１３０発現レベルと比較 することを含む、病気にはなっていないが癌の危険性を持つ個体をまたは処置後 に癌の再発の危険性を持つ個体を同定する方法を提供するのが本発明のさらに別 の目的である。ｐＲｂ２／ｐ１３０発現のレベルの減少は、疾患または疾患再発 の可能性の指標である。子宮内膜癌の場合、子宮切除術後の再発の危険性を同定 するための、または放射線治療または化学療法のようなさらなる処置の必要性を 評価するための方法が提供される。 本発明の別の目的は、癌患者からの組織試料中のｐＲｂ２／ｐ１３０遺伝子の 発現レベルを決定することを含む、癌の等級付けのための方法を提供することで ある。組織試料中の発現レベルは正常組織中の発現レベルと比較される。正常組 織と比較して、癌組織レベルでの発現レベルの減少量の程度は癌の病理学的等級 の指標である。より大きな減少量はより進行性の疾病状態を示している。 ｐＲｂ２／ｐ１３０遺伝子のイントロンまたは少なくともその１５ヌクレオチ ドセグメントから本質的に成るＤＮＡセグメントを提供するのが本発明の一つの 目的である。 ｐＲｂ２／ｐ１３０イントロン（該イントロンのスプライスシグナルジヌクレ オチドを除いて）のセグメントと実質的に相補的なヌクレオチド配列を持つＤＮ Ａセグメントから本質的に成る少なくとも１５のヌクレオチドの増幅プライマー を提供するのが本発明の別の目的である。 ヒトｐＲｂ２／ｐ１３０遺伝子のエキソン中の多型および突然変異を同定する ための方法を提供するのが本発明のさらに別の目的である。 本発明の一つの態様は以下の工程を含むヒトｐＲｂ２／ｐ１３０遺伝子のエキ ソン中の多型および突然変異を増幅および同定するための方法を含んでいる： （ａ）増幅条件下、該エキソンを含んでいるゲノムＤＮＡの試料を、プロモ ーター領域または該エキソンの上流のイントロンにハイブリダイズす る第一プライマーおよびイントロンまたは３’−非コード領域にハイ ブリダイズする第二プライマーを含むプライマー対で処理し、該処理 は該エキソンを含む増幅産物を産生する； （ｂ）該エキソンのヌクレオチド配列を提供するために該増幅産物のヌクレ オチド配列を決定し；そして （ｃ）工程ｂで得られた該エキソンの配列と相当する野生型エキソンの配列 に対する配列を比較する。 ＰＣＲプライマー対の各々のプライマーは、プロモーター領域からの、スプラ イスシグナルジヌクレオチドを除いたｐＲｂ２／ｐ１３０イントロンからの、ま たは３’−非コード領域からのＤＮＡセグメントを本質的に含む少なくとも１５ のヌクレオチドの増幅プライマーから成っている。 上記の増幅プライマーは３’−非コード領域、配列ＩＤ番号：１１３として与 えられているようなプロモーター領域、または配列ＩＤ番号：４８、配列ＩＤ番 号：４９、配列ＩＤ番号：５０、配列ＩＤ番号：５１、配列ＩＤ番号：５２、配 列ＩＤ番号：５３、配列ＩＤ番号：５４、配列ＩＤ番号：５５、配列ＩＤ番号： ５６、配列ＩＤ番号：５７、配列ＩＤ番号：５８、配列ＩＤ番号：５９、配列Ｉ Ｄ番号：６０、配列ＩＤ番号：６１、配列ＩＤ番号：６２、配列ＩＤ番号：６３ 、配列ＩＤ番号：６４、配列ＩＤ番号：６５、配列ＩＤ番号：６６、配列ＩＤ番 号：６７、および配列ＩＤ番号：６８から成る群より選択されるヌクレオチド配 列を持つイントロンと実質的に相補的なヌクレオチド配列を持っている。 好適な態様において、上記の増幅プライマーは配列ＩＤ番号：６９、配列ＩＤ 番号：７０、配列ＩＤ番号：７１、配列ＩＤ番号：７２、配列ＩＤ番号：７３、 配列ＩＤ番号：７４、配列ＩＤ番号：７５、配列ＩＤ番号：７６、配列ＩＤ番号 ：７７、配列ＩＤ番号：７８、配列ＩＤ番号：７９、配列ＩＤ番号：８０、配列 ＩＤ番号：８１、配列ＩＤ番号：８２、配列ＩＤ番号：８３、配列ＩＤ番号：８ ４、配列ＩＤ番号：８５、配列ＩＤ番号：８６、配列ＩＤ番号：８７、配列ＩＤ 番号：８８、配列ＩＤ番号：８９、配列ＩＤ番号：９０、配列ＩＤ番号：９１、 配列ＩＤ番号：９２、配列ＩＤ番号：９３、配列ＩＤ番号：９４、配列ＩＤ番号 ：９５、配列ＩＤ番号：９６、配列ＩＤ番号：９７、配列ＩＤ番号：９８、配列 ＩＤ番号：９９、配列ＩＤ番号：１００、配列ＩＤ番号：１０１、配列ＩＤ番号 ：１０２、配列ＩＤ番号：１０３、配列ＩＤ番号：１０４、配列ＩＤ番号：１０ ５、配列ＩＤ番号：１０６、配列ＩＤ番号：１０７、配列ＩＤ番号：１０８、配 列ＩＤ番号：１０９、配列ＩＤ番号：１１０、配列ＩＤ番号：１１１、および配 列ＩＤ番号：１１２から成る群より選択されるヌクレオチド配列を持っている。 本発明の別の態様はヒトｐＲｂ２／ｐ１３０遺伝子のエキソン中の多型および 突然変異を同定するための方法を含んでおり、その方法は以下の工程を含む： （ａ）ポリメラーゼ連鎖反応緩衝液中、該エキソンを含んでいるゲノムＤＮ Ａの試料、プロモーター領域または該エキソンの上流のイントロンに ハイブリダイズする第一プライマーおよび３’−非コード領域または 該エキソンの下流のイントロンにハイブリダイズする第二プライマー を含むプライマー対、一つまたはそれ以上のデオキシヌクレオチド 三リン酸の混合物、および該プライマー対を放射性標識できる化合物 、およびＤＮＡポリメラーゼを混合することによりポリメラーゼ連鎖 反応混合物を形成し； （ｂ）該混合物を複数回のポリメラーゼ連鎖反応熱サイクルにかけてｐＲｂ ２／ｐ１３０増幅産物を生成させ； （ｃ）該ｐＲｂ２／ｐ１３０増幅産物を変性させ； （ｄ）該変性ｐＲｂ２／ｐ１３０増幅産物を電気泳動的に分離し； （ｅ）工程ｄの電気泳動的に分離された産物をフィルムに暴露して写真画像 を作成し；そして （ｅ）該ｐＲｂ２／ｐ１３０増幅産物の該写真画像中のバンドの移動度を相 当する野生型エキソンからの電気泳動的に分離された増幅生成物と比 較する。 別の態様において、本発明はヒトｐＲｂ２／ｐ１３０遺伝子のエキソンを含む ヒト染色体試料中の突然変異を同定する方法を含んでおり、その方法は以下の工 程を含んでいる： （ａ）緩衝液中、該エキソンを含んでいる染色体試料、プロモーター領域ま たは該エキソンの上流のイントロンにハイブリダイズする第一プラ イマーおよび３’−非コード領域または該エキソンの下流のイントロ ンにハイブリダイズする第二プライマーを含むプライマー対、一つま たはそれ以上のデオキシヌクレオチド 三リン酸の混合物（標識され ている少なくとも一つのデオキシヌクレオチド 三リン酸を含んでい る）、およびＤＮＡポリメラーゼを混合することにより混合物を形成 させ； （ｂ）該混合物にｐＲｂ２／ｐ１３０増幅産物を産生するために十分な温度 および時間を与え；および （ｃ）該標識に特異的に結合する蛍光色素で該ｐＲｂ２／ｐ１３０増幅産物 を可視化し；そして （ｄ）工程ｃで得られた可視化されたｐＲｂ２／ｐ１３０増幅産物と相当す る野生型エキソンからの可視化増幅産物を比較する。 これらおよびその他の目的は以下の説明から当業者には明らかにされるであろ う。図の説明 図１はｐＲｂ２／ｐ１３０陽性かまたはｐＲｂ２／ｐ１３０陰性腫瘍を持って いると特徴付けられた子宮内膜癌（すべてのステージ）の患者１００人の生存確 率のプロットである。 図２はステージおよびｐＲｂ２／ｐ１３０発現により階層化された同一の患者 １００人における生存確率のプロットである。 図３ＡはヒトｐＲｂ２／ｐ１３０遺伝子の概要図である。エキソンは白抜きの 方形で示され、一方イントロンは斜線を付けた垂直棒で示されている。エキソン １０−１３、１４−１６および１７−２０は各々ドメインＡ、スペーサーおよび ドメインＢを表している。 図３ＢはＰ１およびλファージライブラリーに由来するヒトｐＲｂ２／ｐ１３ ０ゲノムクローンの概略図である。 図４はヒトｐＲｂ２／ｐ１３０遺伝子の５’末端および５’上流領域のヌクレ オチド配列（配列番号：４）であり、転写開始部位（→）およびプライマー伸長 分析に利用されたプライマーに相補的な配列（下線）を示している。＋１位はＡ ＴＧ翻訳開始コドンのＡに割り当てられた（ボールド体および下線）。Ｓｐ１因 子認識モチーフに対応する配列は四角で囲まれている。ＭｙｏＤおよびＫｅｒ１ 転写因子に対応する配列モチーフもまた四角で囲まれている。１位から始まり２ ４０位までのヌクレオチドはｐＲｂ２／ｐ１３０のエキソン１に対応している。 ２４１位で始まる小文字の文字はイントロン１の最初の１０のヌクレオチドを表 している。 図５はヒトｐＲｂ２／ｐ１３０遺伝子の転写開始部位を同定するために行われ たプライマー伸長実験の生成物を示している。細胞質ＲＮＡは図４の−２２位か ら始まる２４のヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチド（配列番号：４）と 一夜ハイブリダイズされた。レーンＭは分子量マーカー（φχ１７４ＤＮＡ／Ｈ ａｅIII，Ｐｒｏｍｅｇａ）を含んでいる。レーン１および２は各々鋳型として のヒーラー細胞およびｔＲＮＡからのｐＲｂ２／ｐ１３０のプライマー伸長生成 物を含んでいる。 図６はＰＲＩＮＳ技術の使用により可視化された抹消血リンパ球核中のｐＲｂ ２／ｐ１３０遺伝子のエキソン２０を含んでいる二つの対立遺伝子を例示してい る。発明の詳細な説明 Ａ．略語および定義 １．略語 ｂｐ 塩基対 ＢＳＡ ウシ血清アルブミン ｄＡＴＰ デオキシアデニン 三リン酸 ｄＣＴＰ デオキシシトシン 三リン酸 ｄＧＴＰ デオキシグアノシン 三リン酸 ＤＩＧ ＤＮＡ ジゴキシゲニン標識ＤＮＡ ＤＩＧ−ｄＵＴＰ ジゴキシゲニンーデオキシウリジン 三リン酸 ＤＮＡ デオキシリボ核酸 ｄＴＴＰ デオキシチミン 三リン酸 ＥＤＴＡ エチレンジアミン四酢酸 ＦＩＴＣ フルオレセイン イソチオシアナート ＰＣＲ ポリメラーゼ連鎖反応 ＰＨＡ フィトヘマグルチニン ＰＲＩＮＳ オリゴヌクレオチド−ＰＲｉｍｅｄ ＩＮ Ｓｉｔｕ 合成 ＲＮＡ リボ核酸 ＳＤＳ ドデシル硫酸ナトリウム ＳＳＣ 標準クエン酸塩溶液 ＳＳＣＰ −本鎖コンフォメーション多型 ＴＢＥ ０．０９Ｍトリス、０．０９Ｍホウ酸および２．５ｍ Ｍ ＥＤＴＡの緩衝液混合物 ２．定義 ”対立遺伝子”とは染色体上の決められた座位を占める遺伝予の一つまたはそ れ以上の別の形を指している。 ”影響を受けた組織”とは視覚的または他の試験により、癌性または前癌性と 称される障害を含むと信じられる組織を意味している。 ”増殖産物”とはその生成物が増幅された鋳型セグメントに相補的である、Ｐ ＣＲ、ＳＳＣＰおよびＰＲＩＮＳのような増幅法により生成された核酸セグメン トを指している。 ”下流”とは発現の方向、すなわち、核酸中の与えられた部位の３’側に配列 が位置していることを示している。 ”子宮内膜癌”または”子宮内膜癌瘍”とは子宮内膜に起こっているポリープ 様増殖を意味している。 ”発現”（ｐＲｂ２／ｐ１３０遺伝子に関して）とは、遺伝子にコードされて いる遺伝子情報を実現して機能性ＲＮＡまたはタンパク質を産生することを意味 している。本用語は最も広い意味で使用され、そうでないと示されない限り、転 写または翻訳の両方を含んでいる。 ”発現レベル”（ｐＲｂ２／ｐ１３０遺伝子に関して）とは、絶対的な発現レ ベルのみでなく、ｐＲｂ２／ｐ１３０発現の標準レベルとの比較により決定され るような相対的発現レベルも意味している。 ”ゲノムＤＮＡ”とは細胞または生物体のゲノムを形成しているＤＮＡ配列の すべてを指している。本明細書に記載されている発明において、それはｐＲｂ２ ／ｐ１３０遺伝子のためのエキソン、イントロンおよび制御要素を含んでいる。 ”等級付け”（腫瘍試料に関して）とは悪性度について認められた程度の分類 化を意味している。腫瘍試料の等級化において、病理学者または他の観察者は組 織の分化の程度を評価する（例えば、等級１、よく分化している、等級２、中程 度に分化している、等級３、よく分化していない）。 ”婦人科癌”とは子宮、卵巣、子宮頚、膣、陰門およびファロピー管に生じる 腫瘍、ならびに妊娠絨毛性疾患を意味している。 ”ハイブリダイゼーション”とは本質的に相補的なヌクレオチド配列（核酸の ポリマー）のワトソン−クリック塩基対生成により二本鎖分子が形成されること を意味している。 ”３’−非コード領域”とは終止コドンの下流の核酸配列を意味している。 ”非小細胞肺癌”（ＮＳＣＬＣ）とは小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）を除いた肺癌の すべての形を意味している。特に、非小細胞肺癌は扁平上皮癌、腺癌、細気管支 −肺胞癌および大細胞癌を含む肺癌の群を意味している。 ”多型”とは対立遺伝子変異を示しているゲノム集団の同時発生を意味してい る。本明細書で使用される場合、本用語は異なった表現型、ならびに集団中にア ミノ酸変異体は存在するが、変異体はタンパク質の機能を破壊しないようなタン パク質を産生する対立遺伝子を包含している。 ”プライマー”とは相補的鋳型鎖と塩基対を形成する、遊離の３’ヒドロキシ ル基を含むオリゴヌクレオチドを指し、それはポリメラーゼによる核酸合成のた めの出発点として作用することができる。プライマーは一本鎖でも二本鎖でもよ いが、二本鎖形であれば、プライマーはその相補鎖から分離されるように最初に 処理される。 ”ｐＲｂ２／ｐ１３０遺伝子”とはｐＲｂ２／ｐ１３０タンパク質をコードし ている遺伝子（そのｃＤＮＡは配列番号：１に示されている）、およびそのすべ ての対立遺伝子変異体および突然変異体を意味している。 ”ｐＲｂ２／ｐ１３０イントロン”とは、本明細書で使用される場合、ｐＲｂ ２／ｐ１３０遺伝子の野生型イントロンセグメント、ならびにその任意の対立遺 伝子変異体を意味している。 ”ｐＲｂ２／ｐ１３０タンパク質”とはそのすべての対立遺伝子変異体および 突然変異体を含むｐＲｂ２／ｐ１３０遺伝子の翻訳生成物を意味している。ｐＲ ｂ２／ｐ１３０アミノ酸配列は配列番号：２に示されている。 ”予後”とはその本来の医学的意味（すなわち、疾患からの回復の見込み）に 従って使用される。 ”スプライス結合”または”エキソン−イントロン結合”とは核遺伝子のエキ ソン−イントロン境界のすぐ隣を囲んでいるヌクレオチド配列を指している。本 明細書で使用される場合、本用語はＲＮＡスプライシングの機構における破損お よび再結合の部位を含んでいる。 ”スプライスシグナル ジヌクレオチド”とはイントロンの最初の二つのヌク レオチド（５’末端）または最後の二つのヌクレオチド（３’末端）を指してい る。高度に保存された遺伝子においては、５’末端ジヌクレオチドはＧＴであり 、３’末端ジヌクレオチドはＡＧである。もしくは、５’末端ジヌクレオチドお よび３’末端ジヌクレオチドは各々”ドナー”および”アクセプター”と称され ている。 ”実質的に相補的なヌクレオチド配列”とは（二つのヌクレオチド配列間で） 配列がハイブリダイゼーション条件下、ハイブリッド二重鎖の形成を可能にする 十分なワトソン−クリック塩基対一致を示すような関係を意味している。しかし ながら、塩基対の一致が正確であることは必要とされない。 ”下流”とは発現の方向、すなわち、核酸中の与えられた部位の３’側に配列 が位置していることを示しており、”上流”とは発現と逆の方向、すなわち、核 酸中の与えられた部位の５’側に配列が位置していることを示している。 本発明は癌の危険性のある個体を同定するための、および癌の検出および評価 のための方法を提供する。これらの方法は二つの基本型から成っている：ｐＲｂ ２／ｐ１３０発現レベルの決定に基づいた方法、およびｐＲｂ２／ｐ１３０のゲ ノム構造の決定に基づいた方法。Ｂ．ｐＲｂ２／ｐ１３０発現レベルの決定に基づいた方法 本発明は婦人科癌および非小細胞肺癌を含む（これらに制限されるわけではな い）癌の診断および予後のための、ｐＲｂ２／ｐ１３０発現レベルに基づいた改 良法を提供する。婦人科癌の中でこれらの方法が応用されるであろう婦人科癌は 卵巣癌および子宮内膜癌である。１．婦人科癌 初期の卵巣癌はしばしば無徴候であるか、または患者には無視されるであろう 温和な徴候のみしか示さない。卵巣癌の大多数は診断の時点で卵巣を越えて、お よびしばしば骨盤を越えて拡がっている。卵巣癌の診断および予後のための改良 法は処置の選択に有用であろうし、患者の結果に良好な効果を持っていなければ ならない。本発明は、卵巣癌組織において、ｐＲｂ２／ｐ１３０発現と腫瘍等級 間に相関があるという発見に基づいている。 子宮内膜癌はしばしば順調な過程をたどる、しかしながら、これらの場合のか なりの部分は挙動が悪く、最終的には本疾患で死亡する。現在使用されている手 術−病理学的パラメーターはこの患者の群の同定を必ずしも可能にするわけでは ない。 子宮内膜癌の病期のためのＦ．Ｉ．Ｇ．Ｏ．基準に従うと、外科的方法は必ず 腹膜洗浄、腹式子宮摘出、両側性卵管卵巣摘出および系統的骨盤および大動脈性 リンパ腺切除を含んでいなければならない。本当にこの手術は子宮体に限られた 腫瘍の患者にはしばしば不必要に”過激で”および潜在的に危険である。子宮内 膜癌の患者が腹部手術の死亡率の危険因子として知られている（Ｄｉｓａｉａｅ ｔ． ａｌ．，”子宮の腺癌”、Ｃｌｉｎｉｃａｌ ＧｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃＯ ｎｃｏｌｏｇｙ ，Ｓｔ．Ｌｏｕｓ：Ｍｏｓｂｙ−Ｙｅａｒ Ｂｏｏｋ，ｐ１５６ −９３（１９９３））心血管疾患、糖尿病、高血圧および重度の肥満をもまたし ばしば引き起こすと考えられるとしたら（Ｗｉｎｇｏ ｅｔ．ａｌ．，ＡｍＪ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ １５２：８０３−８（１９８５））、この観察 はより適切なものになる。一方、肥満または高い手術危険度の患者には、子宮摘 出は膣技術（Ｍａｓｓｉ ｅｔ ａｌ．．Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃ ｏｌ １７４：１３２０−６（１９９６）；Ｐｉｔｋｉｎ，Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙ ｎｅｃｏｌ ４９：５６７−９（１９７７）；Ｐｅｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ １４６：２８５−９０（１９８３）） により容易におよび安全に実施できる。このことを考慮して、本発明によりアッ セイされる相対的ｐＲｂ２／ｐ１３０発現は、治癒の機会を低下させることなく より侵略的でない手術処置の候補の選択に使用できるであろうし、ならびに、高 い危険度の患者（すべての手術的努力を試み、および手術後の処置を与えなけれ ばならない）の同定の助けになっている。 子宮内膜の正常組織は比較的高レベルのｐＲｂ２／ｐ１３０タンパク質を発現 している。本発明は子宮内膜癌患者の組織中のｐＲｂ２／ｐ１３０発現と処置後 の最終的臨床結果との間に高度な統計的逆相関が発見されたことに基づいている 。ｐＲｂ２／ｐ１３０のレベルの減少は有意に悪い生存率と相関している。本明 細書で報告された研究結果は、腫瘍のステージまたは分化の等級に関係なく、そ の腫瘍がｐＲｂ２／ｐ１３０陰性の患者においては子宮内膜癌で死亡する危険性 がほぼ５倍に増加していることを示している。 最も大きな悪性度の組織ではｐＲｂ２／ｐ１３０の発現がわずかであるか、ま たは全く発現していない。従って、試料をｐＲｂ２／ｐ１３０タンパク質に特異 的な抗体と接触させる。子宮内膜癌の場合、試料は典型的には子宮内膜組織を含 んでいるであろうし、および特に子宮内膜癌を含むであろう。試料により結合さ れた抗体の量は正常子宮内膜組織により結合された抗体量と比較して決定される 。正常および試験試料により結合された量の相違は患者の予後の指標である。実 施 例１に記載された子宮内膜癌研究では同時に既知の分子予後指標、すなわち、Ｄ ＮＡインデックス、種々の古典的臨床−病理学的パラメーターおよびｐＲｂ２／ ｐ１３０発現が試験された。ｐＲｂ２／ｐ１３０レベルの低下は有意に悪い生存 率と関連した。ｐＲｂ２／ｐ１３０の発現はそれ故、子宮内膜癌の臨床結果の独 立した予想を表している。Ｆ．Ｉ．Ｇ．Ｏ．ステージおよび腫瘍倍数性のような よく知られた危険因子も、それほど強力ではないが、独立した予後を示すものと して確認された。子宮内膜癌の生存率のそのような特色の既知の負の影響に従っ て（ＤｉＳａｉａ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｌ Ｇｙｎｅｃｏｌ １５１：１００９−１５（１９８５）； Ｓｕｓｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ １７０：５２７−３４（１９９４）；Ｍａ ｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ １７４：１ ３２０−６（１９９６））、ｐＲｂ２／ｐ１３０の陰性は異数性（Ｐ＝０．００ １）および年齢）６５才（Ｐ＝０．００８）と関連しているという点において、 ｐＲｂ２／ｐ１３０発現は腫瘍倍数性および患者年齢に有意に相関していた。し かしながら、腫瘍倍数性は多変異分析による独立した予後変数として抵抗したこ とは注目に値する。ｐＲｂ２／ｐ１３０状態および倍数性による階層化は、生存 率が有意に相違した患者部分群の同定を可能にした（データは示されていない） 。相関に対する傾向はｐＲｂ２／ｐ１３０状態と分化の程度のような別の主たる 予後指標間でも観察され、ｐＲｂ２／ｐ１３０陰性は中程度および未分化の腫瘍 でより頻繁であった（Ｐ＝０．０６）。さらに、分化の程度に関して、ｐＲｂ２ ／ｐ１３０状態による階層化は各々の群内の生存率における有意な相違を明らか にした（データは示されていない）。ｐＲｂ２／ｐ１３０の発現は腫瘍ステージ とは相関しなかった；ｐＲｂ２／ｐ１３０陰性腫瘍は異なった腫瘍ステージに等 しく分布されており、それ故、この特色は初期ステージの始まりからある種の腫 瘍に典型的であることを示している。 従って、ｐＲｂ２／ｐ１３０発現レベルは伝統的な予後技術に置き代わるまた は拡大させる都合のよい分子マーカーとして働くであろう。予後因子としての古 典的な手術的病理学的パラメーターに対するｐＲｂ２／ｐ１３０発現使用の重要 な利点は、治療が開始される前に、最初の診断の時点で決定できることである。 放射線療法または化学療法により前もって処置されていない患者に対し、低レベ ルのｐＲｂ２／ｐ１３０は進行的に挙動する傾向を持つ腫瘍の同定に使用できる 。 個々の患者における疾患進行性の初期での正確な決定は処置進行計画の必要な 部分である。本発明の試験法が悪い予後を同定した場合、放射線療法または化学 療法のような補助的治療が開始されるであろう。このより積極的な処置は患者の 生存の機会を増加させるにちがいない。疾患の初期の段階においても、ｐＲｂ２ ／ｐ１３０発現レベルは患者の癌の悪性の可能性および続いての疾患経過の進行 性を反映するものである。”分子に基づいた”予後診断のこの形式では、組織学 的型、分化度、子宮筋層侵襲の深さ、リンパ節転移の程度、子宮外拡散および子 宮内膜癌予後診断が現在基づいているその他の因子などの主観的評価に基づいて いる伝統的な予後因子よりも一貫して評価できる。２．肺癌 肺癌の場合、肺組織試料を、当業者に周知である慣用的な生検技術によって個 体から取出す。その試料は、概して、針生検によって集められる。例えば、本明 細書中に援用される、Cancer:Principles & Practice of Oncology，V.T.DeVita ,Jr.ら監修，第３版（1989），J.B.Lippincott Co.，フィラデルフィア，ＰＡ， 616-619頁を参照されたい（経竜骨（ｔｒａｎｓｃａｒｉｎａｌ）針生検および 経胸腔経皮微針吸引生検）。ＮＳＣＬＣを含むような肺病巣の識別のために、病 変から試料を採取する。病変は、最初、Ｘ線または当業者に知られている他の慣 用的な肺病巣画像化技術によって見つけられる。潜伏性ＮＳＣＬＣまたはＮＳＣ ＬＣ素因について調べるために、肺のどの部位からも組織試料を採取することが できる。最も顕著に悪性の可能性がある組織は、ｐＲｂ２／ｐ１３０をほとんど または全く発現しない。正常肺組織細胞は、高レベルのｐＲｂ２／ｐ１３０タン パク質を発現する。患者肺腫瘍組織の細胞におけるｐＲｂ２／ｐ１３０発現レベ ルは、同患者の正常肺組織でのレベルとまたは正常の対照群の肺組織でのレベル と比較することができる。 非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）には、偏平上皮細胞癌、腺癌、細気管支肺胞癌お よび大細胞癌が含まれる。極めて有意の統計的逆相関関係が、非小細胞肺癌から の組織でのｐＲｂ２／ｐ１３０の発現と、熟練した病理学者による組織の病理学 的等級付との間に確立されている。 したがって、ｐＲｂ２／ｐ１３０発現レベルは、慣用的な腫瘍等級付に代るま たはそれを増大させる好都合な分子マーカーとして役立つことができる。正確な 腫瘍等級付は、個々の患者の治療過程の設計に不可欠な部分である。等級付は、 問題の腫瘍の悪性の可能性を反映するものであり、したがって、続いて起こる疾 患経過の攻勢を反映するものである。生体の腫瘍等級情報の作成は、腫瘍組織学 に関するより主観的な知見に代る分子の代用としてｐＲｂ２／ｐ１３０に頼るこ とによって一層容易に行われる。「分子に基づく」等級付のこの形式は、熟練し た病理学者による主観的評価に基づいている慣用的な病理学的等級付よりも一貫 して行うことができる。ｐＲｂ２／ｐ１３０発現レベルは、活発な若しくは潜伏 性のＮＳＣＬＣまたはＮＳＣＬＣに対する素因の存在についての好都合な分子マ ーカーとしても役立ちうる。 肺病巣は、正常な無癌対照肺組織におけるｐＲｂ２／ｐ１３０のレベルに比較 された病巣でのｐＲｂ２／ｐ１３０の発現の減少を示すことにより、非小細胞肺 癌（ＮＳＣＬＣ）として識別することができる。同様に、明らかな肺病巣はない が、他の肺癌の症状がある個体、または疾患を免れた個体の肺組織におけるｐＲ ｂ２／ｐ１３０発現レベルは、潜伏性ＮＳＣＬＣまたはＮＳＣＬＣＬの危険をそ れぞれ示している。ＮＳＣＬＣの初期診断は、目に見える肺病巣が出現する前で も、治療の早期開始および延命を可能にするであろう。 本発明の実施により、罹患した肺組織試料におけるｐＲｂ２／ｐ１３０発現レ ベルの正常対照と比較して少なくとも約３分の１の減少は、その病巣がＮＳＣＬ Ｃであることを示す。同様に、肺病巣はないが、喀痰細胞異常、咳または気管支 炎などの他の潜在的肺癌症状を示している患者の肺組織における約３分の１また はそれ以上のｐＲｂ２／ｐ１３０発現減少は、前病巣ＮＳＣＬＣを示すものであ る。肺癌の症状を示していないそれ以外には健康な個体の肺組織における約３分 の１またはそれ以上のｐＲｂ２／ｐ１３０発現減少は、将来のＮＳＣＬＣの危険 を示すものであると考えられる。約半分またはそれ以上のｐＲｂ２／ｐ１３０発 現の減少は、ＮＳＣＬＣ疾患またはＮＳＣＬＣ素因をより一層示すものである。 本発明の一つの側面により、疾患を免れている個体のＮＳＣＬＣにかかる危険 について評価する。その検査法を用いて、環境的発癌物質にさらされた集団、例 えば、アスベスト作業員、鉱夫、織物工員、喫煙者等の中から、またはＮＳＣＬ Ｃの履歴または他の形態の癌を有する家族の中からＮＳＣＬＣを発症する危険の ある個体を識別することができる。３．発現レベルを測定する方法 本発明の実施により、罹患組織の試料は、当業者に周知である慣用的な生検技 術によって癌患者から取出される。その試料は、好ましくは、放射線療法または 化学療法の開始前に患者から得られる。次に、その試料を、ｐＲｂ２／ｐ１３０ 発現レベルの測定用に調製する。 組織試料中のｐＲｂ２／ｐ１３０遺伝子の発現の相対レベルを測定することは 、試料組織中のｐＲｂ２／ｐ１３０ＲＮＡ転写物、特に、ｍＲＮＡ転写物の相対 数 を測定すること、または試料組織中の対応するｐＲｂ２／ｐ１３０タンパク質の 相対レベルを測定することを含む。好ましくは、試料組織中のｐＲｂ２／ｐ１３ ０タンパク質の相対レベルは、ｐＲｂ２／ｐ１３０タンパク質を結合する抗体を 試料組織と接触させる免疫検定によって測定される。試料採取された腫瘍の細胞 中の相対ｐＲｂ２／ｐ１３０発現レベルは、一つまたはそれ以上の標準に関して 好都合に測定される。それら標準は、例えば、一方にはゼロ発現レベル、そして もう一方には、同患者の正常組織中の遺伝子の発現レベル、または正常対照群の 組織中の発現レベルを含むことができる。その標準は、標準細胞系におけるｐＲ ｂ２／ｐ１３０発現レベルを含んでもよい。正常の発現レベルと比較したｐＲｂ ２／ｐ１３０発現の減少の大きさは、治療後の将来の臨床結果を示すものである 。 目的の組織の細胞中の特定の遺伝子のｍＲＮＡ転写物のレベルを測定する方法 は、当業者に周知である。一つのこのような方法により、全細胞ＲＮＡは、達成 した細胞から、核酸抽出緩衝液の存在下での均一化に続く遠心分離によって精製 される。核酸を沈澱させ、そしてＤＮＡをＤＮアーゼでの処理および沈澱によっ て除去する。次に、ＲＮＡ分子を、標準的な技法によるアガロースゲル上のゲル 電気泳動によって分離し、そして例えば、いわゆる「ノーザン」ブロッティング 技術によってニトロセルロースフィルターに転移させる。ＲＮＡを加熱によって フィルター上に固定する。特異的ＲＮＡの検出および定量化は、問題のＲＮＡに 対して相補的な適当に標識されたＤＮＡまたはＲＮＡプローブを用いて行われる 。本明細書中にその開示が援用される、Molecular Cloning:A Laboratory Manua l，J.Sambrookら監修，第２版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989年 ，第７章を参照されたい。 ブロッティング技術の他に、in situハイブリダイゼーション技術にしたがっ てｍＲＮＡ検定試験を行うことができる。後者技術は、ノーザンブロッティング 技術よりも少ししか腫瘍細胞を必要としない。「細胞交雑」としても知られるin situ技術は、顕微鏡カバーガラス上に全細胞を付着させ、そして放射性または それ以外の標識ｃＤＮＡまたはｃＲＮＡプローブを含有する溶液で細胞の核酸含 有量をプローブすることを行う。in situハイブリダイゼーション技術の実施は 、本明細書中にその開示がそのまま援用される米国特許第5,427,916号で更に詳 細に 記載されている。 上のＲＮＡハイブリダイゼーション法のための核酸プローブは、本明細書中に その開示がそのまま援用される、Liら，Genes Dev.7:2366-2377(1993)の公表さ れたｐＲｂ２／ｐ１３０ｃＤＮＡ配列に基づいて設計することができる。そのヌ クレオチド配列は、本明細書中において配列番号：１として再現される。翻訳開 始コドンは、配列番号：１のヌクレオチド７０〜７２を含む。翻訳終結コドンは 、ヌクレオチド３４８７〜３４８９を含む。 ＲＮＡハイブリダイゼーシヨン、ブロットハイブリダイゼーションかまたはin situハイブリダイゼーション法は、ＲＮＡドナー細胞中の標的ＲＮＡ転写物の 存在について定量的結果を与えることができる。標識ＤＮＡおよびＲＮＡプロー ブの調製方法、および標的ヌクレオチド配列に対するそれらのハイブリダイゼー ション条件は、本明細書中に援用される、Molecular Cloning，上記，第１０お よび１１章で記載されている。 核酸プローブは、例えば、³²Ｐ、¹⁴Ｃ若しくは³⁵Ｓなどの放射性核種;重金属 ；または標識抗体、蛍光分子、化学発光（chemolescent）分子、酵素若しくは類 似のものなどの放射性リガンドに特異的な結合対メンバーとして機能することが できるリガンドで標識することができる。 プローブは、Rigbyら，J.Mol.Biol.113:237-251(1977)のニックトランスレー ション法によってかまたはランダムプライム法、Fienbergら，Anal.Biochem.132 :6-13(1983)によって高特異的活性まで標識することができる。後者は、高特異 的活性の³²Ｐ標識プローブを一本鎖ＤＮＡからまたはＲＮＡ鋳型から合成するた めに選ばれた方法である。どちらの方法も当業者に周知であるので、本明細書中 では繰返さない。既存のヌクレオチドを極めて放射性のヌクレオチドと置換える ことにより、ニックトランスレーション法にしたがって、特異的活性を有する³² Ｐ標識ＤＮＡプローブを１０⁸ｃｐｍ／マイクログラムの充分に過剰で製造する ことは可能である。次に、フィルターを写真フィルムに暴露することによって、 ハイブリダイゼーションのオートラジオグラフ検出を行うことができる。フィル ターのデンシトメーター走査は、ｍＲＮＡ転写物の正確な測定を与える。 放射性核種標識付が実施できない場合、ランダムプライマー法を用いて、ｄＴ ＴＰ類似体５−（Ｎ−（Ｎ−ビオチニル−ε−アミノカプロイル）−３−アミノ アリル）デオキシウリジン三リン酸をプローブ分子中に包含させることができる 。このようにビオチニル化されたプローブオリゴヌクレオチドは、着色反応を生 じる蛍光色素または酵素と結合したアビジン、ストレプトアビジンまたは抗ビオ チン抗体などのビオチン結合タンパク質との反応によって検出することができる 。 ｐＲｂ２／ｐ１３０転写物の相対数は、ｍＲＮＡの逆転写に続くポリメラーゼ 連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）での増幅および標準との比較によって測定することも できる。ＲＴ−ＰＣＲの方法およびそれらの変更は、当業者に周知である。 本発明のもう一つの実施態様により、患者組織の細胞中のｐＲｂ２／ｐ１３０ 発現レベルは、該当するｐＲｂ２／ｐ１３０タンパク質の量を検定することによ って測定される。ｐＲｂ２／ｐ１３０タンパク質の発現を測定する種々の方法が 存在し、ウェスタンブロッティングおよび免疫組織化学的染色が含まれる。ウェ スタンブロットは、ＳＤＳゲルを用いてゲル上のタンパク質試料を拡散させ、そ のゲルを硝酸セルロースフィルターでブロッティングし、そして標識抗体でフィ ルターをプローブすることによって行われる。免疫組織化学的染色技術を用いる と、細胞試料は、典型的に、脱水および定着に続いて、結合した遺伝子産物に特 異的な標識抗体との反応によって製造され、この場合、酵素標識、蛍光標識、発 光標識等のような標識は、通常、目視検出される。 本発明の一つの実施態様により、組織試料を患者から得、そして慣用的な組織 固定技法にしたがってそれら試料を包埋した後、例えば、３〜５μｍに切断し、 定着させ、固定し、そして乾燥させる。定着剤は、好都合にはホルマリンを含む ことができる。検体を固定するための包埋剤は、例えば、パラフィンを含むこと ができる。試料はこの状態で貯蔵することができる。脱パラフィン化および再水 和後、ｐＲｂ２／ｐ１３０に特異的な抗体を含む免疫試薬と試料を接触させる。 抗体は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を含むことができる。抗 体は、自然のままの抗体、またはｐＲｂ２／ｐ１３０タンパク質を特異的に結合 できるそのフラグメントを含むことができる。このようなフラグメントには、Ｆ ａｂおよびＦ（ａｂ’）₂フラグメントが含まれるが、これらに制限されるわけ ではない、本明細書中で用いられる「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体 お よびモノクローナル抗体両方を含む。「抗体」という用語は、自然のままの抗体 分子を意味するのみならず、抗原結合能力を保持しているそれらのフラグメント も包含する。 適当なポリクローナル抗血清は、適当な宿主動物をｐＲｂ２／ｐ１３０タンパ ク質で免疫感作し、そして当業者に知られている慣用的な技法にしたがって抗血 清を集め且つ精製することによって製造することができる。モノクローナル抗体 は、Monoclonal Antibodies,Hybridomas:A New Dimension in Biological Analy sis，R.H.Kennetら監修，PlenumPress，ニユーヨークおよびロンドン（1980）な どの後の研究で更に推考される、KohlerおよびMilstein，Nature 254:493-497(1 975)の古典的技法を行うことによって製造することができる。 ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を生じさせる免疫原として用い るための実質的に純粋なｐＲｂ２／ｐ１３０は、好都合には組換えＤＮＡ法によ って調製することができる。一つのこのような方法により、ｐＲｂ２／ｐ１３０ は、細菌で発現されたグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タン パク質のかの質で製造される。このような融合タンパク質は、標準的な発現プロ トコール、例えば、「グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合タンパク質の発 現および精製」，Current Protocols inMolecular Biology(1990)中の補遺１０ ，単元１６．７の後に、商業的に入手可能な発現系を用いて製造することができ る。SmithおよびJohnson，Gene 67:34-40(1988)；FrangioniおよびNeel，Anal.B iochem.210:179-187(1993)も参照されたい。簡単にいうと、ｐＲｂ２／ｐ１３０ をコードするＤＮＡを、正しい読み枠内のｐＧＥＸ２Ｔ中にサブクローン化し、 そして大腸菌（E.coli）細胞中に導入する。形質転換細胞をＬＢ／アンピシリン プレート上で選択するが；それらプレートは３７℃で１２〜１５時間インキュベ ートされる。形質転換細胞をイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド中で増殖 させて、ｐＲｂ２／ｐ１３０−ＧＳＴ融合タンパク質の発現を誘導する。細胞を 液体培養物から遠心分離によって採取する。細菌ペレットを再懸濁させ、そして 細胞ペレットを音波処理して細胞を溶解させる。次に、その溶解産物をグルタチ オン−アガロースビーズと接触させる。ビーズを遠心分離によって集め、そして 融合タンパク質を溶離させる。次に、その融合タンパク質をトロンビン切断緩衝 液で処理することによってＧＳＴ担体を除去する。放出されたｐＲｂ２／ｐ１３ ０タンパク質を回収する。 完全なｐＲｂ２／ｐ１３０分子を用いる免疫感作に代るものとして、適当な宿 主を完全なタンパク質のフラグメント、特に、分子のカルボキシ末端に対応する ペプチドで免疫感作することによって、ｐＲｂ２／ｐ１３０に対する抗体を生じ ることができる。 抗体は、検出可能な標識を直接的にかまたは間接的に有する。検出可能な標識 は、一次抗ｐＲｂ２／ｐ１３０抗体に対して直接的に結合することができる。更 に好都合に、検出可能な標識は、一次抗体を結合する二次抗体、例えば、ヤギ抗 ウサギＩｇＧに対して結合している。標識は、例えば、ラジオイムノアッセイの 場合に放射性核種；免疫蛍光検定の場合に蛍光残基；化学発光検定の場合に化学 発光残基；または酵素結合イムノソルベント検定の場合、色素原基質を切断する 酵素を好都合に含むことができる。 最も好ましくは、検出可能な標識は、過剰のビオチン結合能力を有するアビジ ン−ビオチンペルオキシダーゼ複合体（ＡＢＣ）を含む。二次抗体はビオチニル 化される。分析中の組織切片においてｐＲｂ２／ｐ１３０抗原を位置決定するた めに、その切片を、ｐＲｂ２／ｐ１３０に対する一次抗血清で処理し、洗浄した 後、二次抗血清で処理する。ＡＢＣの引続きの添加は、ＡＢＣがビオチンに対し て非特異的に付着するので、特定の抗原の部位にペルオキシダーゼを局在させる 。ペルオキシダーゼ（したがって抗原）は、切片を、例えば、Ｈ₂Ｏ₂およびジア ミノベンジジン（褐色に染色されている抗原部位を生じる）またはＨ₂Ｏ₂および ４−クロロ−１−ナフトール（青色染色を生じる）と一緒にインキュベートする ことによって検出される。 ＡＢＣ法は、パラフィン包埋切片、凍結切片および塗抹標本に用いることがで きる。内因性（組織または細胞）ペルオキシダーゼは、例えば、メタノール中の Ｈ₂Ｏ₂で急冷することができる。 腫瘍試料中のｐＲｂ２／ｐ１３０発現のレベルは、染色強度を比較することに よって、または染色された細胞数を比較することによって、正常組織試料中での 発現に相対する基準で比較することができる。正常対照に関して染色強度が低い ほど、または対照切片とほぼ同数の細胞を有する組織切片中の染色された細胞計 数が少ないほど、ｐＲｂ２／ｐ１３０遺伝子の発現は少なく、したがって、試料 の予想される悪性の可能性は高い。 次の実施例では、ＡＤＬ１と称される、ｐＲｂ２／ｐ１３０に対して生じたポ リクローナル抗体を用いた。その抗体の特異性は、ウェスタンブロット分析（Pe rtileら，Cell Growth & Diff6;1659-64(1995)；Claudioら，Cancer Res 56:200 3-8(1996)）によって、更には、ｐＲｂ２／ｐ１３０、および他の網膜芽腫関連 タンパク質ｐＲｂ／ｐ１０５およびｐ１０７をコードするｃＤＮＡのin vitroで 翻訳された形を用いる抗体の免疫沈降によって確認された。ＡＤＬ１抗体は、ｐ Ｒｂ２／ｐ１３０タンパク質のin vitroで翻訳された形だけを免疫沈降させるこ とができた（Baldiら，Clin Cancer Res 2:1239-45(1996)。Ｃ．ｐＲｂ２／ｐ１３０のゲノム構造の識別に基づく方法 ヒトｐＲｂ２／ｐ１３０遺伝子のゲノム構造を本明細書中で記載する。ｐＲｂ ２／ｐ１３０ゲノムＤＮＡは、クローン化され且つ配列決定されている。ｐＲｂ ２／ｐ１３０遺伝子は、ヒト新形成についてヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ）を示 すことが以前に報告された部分である染色体１６の長いアームまで地図で表わさ れている。ｐＲｂ２／ｐ１３０の推定上のプロモーターは、識別され、クローン 化され、そして配列決定されている。遺伝子の完全なイントロン−エキソン機構 が解明されている。ヒトｐＲｂ２／ｐ１３０遺伝子は、５０ｋｂを越えるゲノム ＤＮＡにわたって、２２個のエキソンおよび２１個のイントロンを含有する。個 々のエキソンの長さは、６５ｂｐ〜１５１７ｂｐであるが、個々のイントロンの 長さは８２ｂｐ〜９８３７ｂｐである。これらエキソンおよびイントロンの体制 を図３Ａで示す。ｐＲｂ２／ｐ１３０のそれぞれのエキソンおよびイントロンの 位置および寸法、並びにエキソン−イントロン結合部のヌクレオチド配列を下記 の表７で示す（配列番号：６〜４７）。エキソン配列は大文字で示され、イント ロン配列は小文字で示される。superscript番号は、配列番号：１上のエキソン −イントロン境界のヌクレオチド位置に対応する。 エキソンは全て完全に配列決定されたが、エキソンのゲノム配列および以前に 報告されたｃＤＮＡ配列を比較した場合、相違は見られなかった。Li,Y.ら，Gen es 7:2366-2377(1993)。エキソン−イントロン境界は、ゲノムＤＮＡ配列がｃＤ ＮＡの配列から分れる位置として識別された。 全エキソンの内で最大（１５１７ｂｐ長さ）であるエキソン２２を例外として 、見出されたエキソンは比較的小さく、最も短いエキソン４および７は、それぞ れ６５ヌクレオチドだけ含んでいた。エキソン１０〜２０までは、「ポケット領 域」を形成するｐＲｂ２／ｐ１３０タンパク質の部分をコードする。エキソン１ ０〜１３までおよび１７〜２０までは、ドメインＡおよびドメインＢにそれぞれ 翻訳される。エキソン１４，１５および１６は、「スペーサー」として知られる ｐＲｂ２／ｐ１３０タンパク質の部分をコードする。そのスペーサーは、ドメイ ンＡおよびＢ間に位置する。 イントロンは完全に配列決定されている。エキソン１６と１７との間にある最 も短いイントロンであるイントロン１６は、僅か８２ｂｐ長さであるが、最大の イントロンであるイントロン２１は、９８３７ｂｐにわたる。イントロン２１は 、エキソン２１と２２との間に位置する。イントロンの完全な配列は、配列番号 ：４８〜６８として与えられる。ｐＲｂ２／ｐ１３０のイントロン配列は全て、 他のヒト遺伝子に特有であることが判ったＧＴ−ＡＧ則にあてはまる。Breathna ch,R.ら，Annu.Rev.Biochem.50:349-383(1981)。この規則は、イントロンの属の 配列をＧＴ... ...ＡＧとして識別する。この属形を有するイントロンは、ＧＴ −ＡＧ則にあてはまると特徴付けられる。「スプライスシグナルジヌクレオチド 」として知られる２種類のジヌクレオチドＧＴおよびＡＧは、ｐＲｂ２／ｐ１３ ０ｍＲＮＡのプロセッシング中にイントロンからのスプライシングのためのシグ ナルとして作用する。スプライスシグナルジヌクレオチド中の点突然変異は、他 の遺伝子のin vivoおよびin vitroでの異常なスプライシングと関係している。 概して、Genes V，B.Lewin，オックスフォード大学出版部，913-916頁，ニュー ヨーク（1994）およびYandellら，上記，1694頁を参照されたい。したがって、 スプライシング中にＲＮＡ転写物から除外されるスプライスシグナルジヌクレオ チドまたは他の配列に対する何等かの突然変異を識別することは重要である。 本明細書中に記載のｐＲｂ２／ｐ１３０ゲノム構造およびイントロン配列は、 腫瘍形成に関係した突然変異および再編成を減少させるのに用いることができる 。 本明細書中のそのゲノム構造およびイントロン配列は、天然に存在する多形性に ついてヌクレオチドレベルでスクリーニングするのに用いることもできる。特異 的な１種類の多形性についての情報は、目的とされた突然変異がその多形性と同 様のパターンを示す場合、腫瘍中の原因となる因子としてｐＲｂ２／ｐ１３０中 の突然変異を排除するのに用いることができる。ｐＲｂ２／ｐ１３０中の多形性 の情報は、同一の突然変異の遺伝的連鎖を、そして順に、突然変異が生殖系列起 原である場合、時間集中的配列決定を必要とすることなく、親起原および家族履 歴の追跡を確認するのに用いることができる。次に、これら多形性は、ヒト新形 成の診断的アプローチの開発に用いることができる。しかしながら、全部の多形 性がこれら用途において等しく有用であるわけではないということに留意すべき である。エキソン中の突然変異は腫瘍発生をもたらすと考えられるので、これら 突然変異を捜し出すことは好ましい。更に、遺伝子のコード領域は、概して、よ り安定であり且つ経時的にほとんど突然変異しないと考えられるので、エキソン 領域中の多形性は当然、典型的にほとんど共通性がないということになる。ｐＲ ｂ２／ｐ１３０のエキソン領域中の多形性の検出は、ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮ Ａ両方のスクリーニングを可能にすると考えられる。 次の実施例において、ｐＲｂ２／ｐ１３０突然変異および多形性を確認するい くつかのスクリーニング法を示す。１．ｐＲｂ２／ｐ１３０の転写調節 腫瘍サプレッサー遺伝子産物は、細胞成長のみならず細胞分化も調節するＭｙ ｏＤなどの転写因子と直接的に相互作用するということが証明されている。Sang ら，上記、８頁。これら転写因子の配列部分モチーフの突然変異は、腫瘍抑制遺 伝子の機能に影響すると考えられる。したがって、ｐＲｂ２／ｐ１３０遺伝子の ゲノム構造を識別することに加えて、追加の実験を行って、ｐＲｂ２／ｐ１３０ の５’フランキングプロモーター配列を決定した。ｐＲｂ２／ｐ１３０の推定上 のプロモーター配列の一部分は、最初のエキソンの完全な配列および最初のイン トロンの開始部分と一緒に、図４で示される（配列番号：４）。推定上のプロモ ーター領域の完全な配列は、配列番号：１１３で与えられる。 ｐＲｂ２／ｐ１３０プロモーターを特性決定するために、プライマー伸長分析 を行って、転写開始部位の位置を示した。プライム伸長分析のプロトコールは、 次の実施例で与えられる。推定上のＡＴＧコドンから２６〜５０ヌクレオチド上 流のアンチセンス鎖配列（図４を参照されたい）を含有する２４ヌクレオチドセ グメント（配列番号：１１４）を末端標識し、そしてヒーラ細胞からの細胞質Ｒ ＮＡ上の伸長反応のためのプライマーとして用いた。図５で示されるように、７ ８ｂｐの主要な伸長フラグメントは、ヒーラ細胞を鋳型として用いて行われたプ ライマー伸長から検出された（列１）。プライマー伸長分析によって検出された 追加のバンドは、追加の開始部位でありうる。この知見（列１）は、出発コドン の９９ヌクレオチド上流の転写開始部位と一致する。逆に、ｔＲＮＡを鋳型とし て用いた場合（列２）、プライマー伸長生成物は観察されなかった。プロモータ ー配列中で識別された転写開始部位の考えられる位置は、図４において矢印で示 される。プライマー伸長分析を３回繰返し、そしてそれぞれの場合に同様の結果 を生じた。 推定上の転写因子結合部位は、SIGNAL SCANプログラムの使用により、既知の 転写因子結合部位の共通配列に対するそれらの類似性によって識別された。この プログラムの説明は、次の実施例に包含されている。最も認識可能な配列モチー フは、転写因子Sｐｌ（２か所の部位）ＫｅｒｌおよびＭｙｏＤについてである 。図４は、これらモチーフの位置を示す。Ｋｅｒｌは、ケラチノサイト特異的転 写に関与するが、ＭｙｏＤは筋発生に関与する。Leaskら，Genes Dev.4:1985-19 98(1990)；Weintraub,H.，Cell 75:1241-1244(1993)。これら配列モチーフのｐ Ｒｂ２／ｐ１３０のプロモーター領域中の存在は、特定の細胞系の分化を調節す る複雑な経路におけるこの遺伝子の関与の仮説を支持する。２．ｐＲｂ２／ｐ１３０における突然変異の検出 本発明は、ｐＲｂ２／ｐ１３０のゲノムＤＮＡを増幅し且つそこでの多形性お よび突然変異をスクリーニングする方法を提供する。本明細書中で記載の検定法 を用いて、いくつかの癌を診断し且つ特性決定することができるしまたはヘテロ 接合担体状態を識別することができる。ｐＲｂ２／ｐ１３０中の突然変異を増幅 させ且つ検出する方法の例を与えるが、本発明は、示された特定の方法に制限さ れるわけではない。ｐＲｂ２／ｐ１３０のゲノムＤＮＡ配列の使用および／また は本明細書中で記載のプライマーの使用に頼る他の増幅および識別の手段も、本 発明によって包含される。 概して、本明細書中に記載の方法は、スクリーニング用の核酸試料を調製した 後、その試料を１個またはそれ以上の対立遺伝子中の突然変異について検定する ことを行う。核酸試料を細胞から得る。ゲノムＤＮＡの細胞源には、培養細胞系 、または組織（または全器官若しくは生物全体）から得られる単離細胞若しくは 細胞種が含まれる。好ましくは、細胞源は末梢血リンパ球である。血液および組 織試料からのＤＮＡ抽出法は、当業者に知られている。例えば、本明細書中にそ の開示がそのまま援用される、Blinら，Nuc.Acids Res.3:2303-2308(1976)；お よびSambrookら，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第２版，9.16-9.23 頁，Cold Spring Harbor Laboratory Press，コールド・スプリング・ハーバー ，ＮＹ（1989）を参照されたい。スクリーニングされる患者試料が二本鎖ゲノム ＤＮＡの形である場合、最初に、当業者に周知の方法を用いてそれを変性させる 。変性は、鎖を融解させるかまたは、アルカリ溶液およびホルムアミド若しくは 尿素の濃厚溶液などの水素結合を脱安定化させる薬剤に鎖をさらすことによって 行うことができる。 本発明の一つの実施態様において、ゲノムＤＮＡ試料をスクリーニングする前 に、ｐＲｂ２／ｐ１３０ゲノムＤＮＡ試料を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ） の使用により、プライマー対、緩衝液混合物および鎖伸長を促進することができ る酵素を用いて増幅させる。ＰＣＲを行う方法は、当業者に周知である。例えば 、詳細に示されているかのように本明細書中に援用される、Beutlerら，米国特 許第5,234,811号、またはTempleton,N.S.，Diag.Mol.Path.,(1):58-72(1992)を 参照されたい。次に、ＰＣＲから製造された増幅生成物を用いて、一本鎖コンホ メーション多形（ＳＳＣＰ）またはプライマーin situ ＤＮＡ合成（ＰＲＩＮＳ ）として知られる技法を用いて、突然変異についてスクリーニングすることがで きる。当然ながら、突然変異は、患者の遺伝子単離物を配列決定し、そして対応 する野生型ｐＲｂ２／ｐ１３０セグメントのそれと配列を比較する一層面倒な作 業によって識別することもできる。 ＰＣＲは、熱循環、すなわち、下限が３７℃〜５５℃で且つ上限が約９０℃〜 １００℃である温度範囲内でＰＣＲ反応混合物を加熱し且つ冷却する反復サイク ルによって行われる。選択される具体的な温度範囲は、選択される酵素および必 要な特異性または緊縮に依存する。下限温度は、典型的に、高い特異性を必要と しない増幅でのアニーリングに用いられ、そして逆に、高い方の限界温度は、よ り大きい緊縮が必要な場合に用いられる。後者の例は、一つの具体的な標的ＤＮ ＡをゲノムＤＮＡから増幅させることが目的である場合である。より高いアニー リング温度は、所望の配列からではないＤＮＡセグメントをより少なく生じるで あろう。好ましくは、本明細書中で記載の発明のためのアニーリング温度は、５ ０℃〜６５℃である。最も好ましくは、アニーリング温度は５５℃である。 ＰＣＲは、概して、緩衝水溶液、すなわち、ＰＣＲ緩衝液中において、好まし くは７〜９、最も好ましくは約８のｐＨで行われる。典型的に、モル過剰のプラ イマーを、鋳型鎖を含有する緩衝液と混合する。ゲノムＤＮＡについてのこの比 率は、典型的に、１０⁶：１（プライマー：鋳型）である。ＰＣＲ緩衝液は、デ オキシヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ） およびポリメラーゼも含有する。ＰＣＲにおいて用いるのに適したポリメラーゼ には、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフ ラグメント、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、ＴａｑＤＮＡ ポリメラーゼ（Thermus aquaticus ＤＮＡポリメラーゼＩ）、および増幅生成物 の形成を促進する他の熱安定酵素が含まれるが、これらに制限されるわけではな い。 本明細書中で用いられるプライマーは、核酸制限消化物から精製されたまたは 当業者に知られている何等かの適当な方法を用いて合成的に製造された天然に存 在するオリゴヌクレオチドでありうる。本明細書中で用いられるプライマーは、 自動化された方法を用いて合成することができる。 突然変異は、エキソン自体およびスプライス部位の両方で起こりうるので、分 析されるエキソン部分全体を確実に増幅させるプライマーを設計する必要がある 。エキソン全体を増幅させるために、何等かの与えられたエキソンのためのオリ ゴヌクレオチドプライマーは、それが、プロモーター領域、３’非コード領域ま たは増幅されるエキソンに隣接したイントロンに相補的な配列の一部分を含むよ うに設計されるべきであるが、しかしながら、そのプライマー配列は、スプライ ス シグナルジヌクレオチドの配列を含むべきではないということを条件とする。ス プライスシグナルジヌクレオチドを含めた領域全体を増幅させることを確実にす るために、スプライスシグナルジヌクレオチドに相的な配列をプライマーから除 外することは重要である。スプライスシグナルジヌクレオチドに相的な配列を含 むことは、スプライス部位に張付き且つそこで起こりうる可能な突然変異をいず れも隠す増幅生成物を生じると考えられる。しかしながら、エキソンに隣接した イントロンとは、増幅されるエキソンに直接隣接したイントロンに制限されるわ けではないということに留意すべきである。オリゴヌクレオチドプライマーは、 それが、増幅されるエキソンからエキソンまでの上流または下流のイントロンに 相補的な配列の一部分を含むように設計されうる。後者の場合、製造された増幅 生成物は、２個以上のエキソンを含むと考えられる。好ましくは、それぞれ隣接 したイントロンの配列の少なくとも２０〜２５ヌクレオチドがプライマー配列中 に包含される。 本明細書中で用いられるプライマーは、増幅されるｐＲｂ２／ｐ１３０セグメ ントのそれぞれの鎖に対して実質的に相補的であるように選択される。ハイブリ ダイゼーション条件下においてハイブリッド二本鎖の形成を可能にする充分な塩 基対対合が存在すべきである。しかしながら、その塩基対対合は正確である必要 はない。したがって、プライマー配列は、増幅されるｐＲｂ２／ｐ１３０セグメ ントの正確な配列を反映してよいしまたはしていなくてよい。非相補的塩基また は更に長い配列は、プライマー中に散在しうるが、そのプライマー配列は、増幅 されるセグメントとの充分な相補性を保持することによって増幅生成物を形成す るということを条件とする。 プライマーは、重合剤の存在下で増幅生成物の合成をプライムするように充分 に長くなければならない。用いられるプライマーの正確な長さは、温度およびプ ライマー源を含めた多数の因子に依存するが、これらに制限されるわけではない 。好ましくは、プイラマーは、１５〜３０ヌクレオチド、更に好ましくは、１８ 〜２７ヌクレオチド、そして最も好ましくは、２４〜２５ヌクレオチドから成る 。それより短いプライマーは、概して、鋳型との安定なハイブリッド複合体を形 成するのに、更に冷たいアニーリング温度を必要とする。 通常、プライマー対は同じ長さであるが、しかしながら、若干のプライマーの 長さは、同一アニーリング温度でプライマー対を得るように変更された。１５ｂ ｐ未満のプライマーは、概して、非特異的増幅生成物を生じると考えられる。 本発明の一つの実施態様により、ＳＳＣＰを用いて、ｐＲｂ２／ｐ１３０のエ キソンにおける多形性および突然変異を分析する。ＳＳＣＰは、それが簡単、迅 速で且つ能率がよいという点で、直接配列決定にまさる利点を有する。 分析は、Ｏｒｉｔａら、Ｇｅｎｏｍｉｃ，５，８７４−８７９（１９８９）に 記載の方法に従って行い、その開示全体を、ここに参照として援用する。放射活 性標識されたプライマーまたはでオキシヌクレオチドを用い、ＰＣＲ法を用いる ことによって、標的配列を増幅し、同時に標識する。原位置でのハイブリダイゼ ーションも制限酵素の使用も両方とも、ＳＳＣＰには必要ではない。 ＳＳＣＰは、ゲルマトリックス内での分子の電気泳動移動度のシフトにより、 単一塩基置換（ポイントミューテーション）を含む、配列の変化を検出する。２ つの類似した配列の間の一つのヌクレオチドの違いは、他方と比較して一方の折 りたたみ構造を変えるに充分である。このコンフォメーション変化は、相当する 野生型ＤＮＡセグメントのバンドパターンと比較した場合、癌ＤＮＡではバンド シフトが出現することによって検出される。単一の塩基対変化は、最大で約４０ ０ｂｐのＰＣＲ生成物をＳＳＣＰ分析することによって、検出することができる 。この大きさより大きいＰＣＲ生成物は、最初に制限酵素で消化して、より小さ いフラグメントにしなければならない。 本発明のもう一つの実施態様では、ｐＲｂ２／ｐ１３０内の配列の変異を、Ｐ ＲＩＮＳ技術を用いて検出することができる。ＰＲＩＮＳ法は、融通性のある技 術であり、分子および細胞遺伝学的技術の正確さを合わせ持っており、核および 染色体内での遺伝子の天然位置を提供する。Ｃｉｎｔｉら、Ｎｕｃ，Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２１，２４，７９９−５８００（１９９３）を参照のこと。この開 示全体を参照としてここに援用する。ＰＲＩＮＳ技術は、ｉｎ ｓｉｔｕでの標 識されていないオリゴデオキシヌクレオチドの配列特異的アニーリングを基本と している。オリゴデオキシヌクレオチドは、ＴａｑＩポリメラーゼによって触媒 されるｉｎ ｓｉｔｕでの鎖延長のためのプライマーとして作用する。ビオチン またはジゴキシゲニン(Digoxigenin)のような物質で標識された標識ヌクレオチ ドは、鎖延長のための基質として働く。標識されたＤＮＡ鎖は、標識物質に特異 的なフッ化クロム結合抗体に晒すことによって可視化される。好ましくは、標識 はジゴキシゲニンであり、フッ化クロム複合抗体は、抗−ジゴキシゲニン−ＦＩ ＴＣである。これにより、結果としてプライマーそれ自身のヌクレオチド数より はるかに多い数の標識ヌクレオチドが取り込まれる。さらに、ハイブリダイゼー ションの特異性は、標識されたヌクレオチドがプライマー内に置かれる場合に持 ち上がる問題に対して無防備ではない。結合標識は、プライマーをアニールし延 長するそのような場所にのみ見出されるであろう。 ＳＳＣＰ技術も、またＰＲＩＮＳ技術も、多型性の具体的姿または検出された 変異を特徴付けないであろう。バンドシフトが、ＳＳＣＰ分析を用いることによ って検出されるならば、サンプルセグメントをさらに配列決定し、相当する野生 型のｐＲｂ２／ｐ１３０セグメントのそれと配列を比較しなければならない。同 様に、与えられたエキソンセグメントのアレレの一つまたは両方の欠如がＰＲＩ ＮＳ技術によって検出されるならば、セグメントの配列を決定し、相当する野生 型のヌクレオチド配列と比較して、突然変異、即ちポイントミューテーション、 欠失または挿入、の正確な位置および形を決定しなければならない。ＰＲＩＮＳ 技術は、多型性を検出することはできない。 ＳＳＣＰ分析およびＰＲＩＮＳ技術を用いるためのプロトコールは、以下の実 施例に含まれる。 ｐＲｂ２／ｐ１３０遺伝子内の変異を検出するＰＲＩＮＳ方法は、キットの形 で実施される。そのような実施態様では、キャリヤーを細分し、バイアルまたは 試験管のような一つまたはそれより多くの容器に、密閉して入れる。第一の容器 は、ＤＮＡサンプルを乾燥、脱水または変性状態に保つための、一つまたはそれ より多くのサブ容器、セグメントまたはディビジョンを含むことができる。第二 の容器は、ＰＲＩＮＳ反応混合物を含むことができ、その混合物は、ＰＣＲバッ ファー、ＤＩＧ ＤＮＡ標識混合物、ＴａｑＩポリメラーゼのようなポリメラー ゼ、および本発明に従って設計したプライマー（実施例７、表８を参照のこと） を含むことができる。ＤＩＧ ＤＮＡ標識混合物は、標識および未標識のデオキ シヌクレオチドの混合物を含む。好ましくは、標識されたヌクレオチドは、ビオ チンまたはジゴキシゲニンのいずれかで標識されている。より好ましくは、標識 は、ジゴキシゲニンである。第三の容器は、標識に特異的なフッ化クロム結合抗 体を含むことができる。ジゴキシゲニンに特異的なフッ化クロム結合抗体は、抗 −ジゴキシゲニン−ＦＩＴＣである。ビオチンに適当な結合フッ化クロムは、ア ビジン−ＦＩＴＣまたはアビジンテキサスレッド(Texas Red)である。第四の容 器は、染色化合物、好ましくはヨウ化プロピジウム(ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄ ｉｄｅ)（ＰＩ）、を含むことができる。さらに、キットは、適当な洗浄溶液お よび希釈溶液を含むことができる。 実施例 以下の実施例は本発明を具体的に説明する。これらの実施例は、具体的に説明 するためにのみ提供され、本発明の範囲を制限するものではない。実施例１：子宮内膜癌でのｐＲｂ２／ｐ１３０の発現 Ａ．患者および癌 １９９４年１２月から１９８８年９月の間、以前に治療されていない子宮内膜 癌患者１９６人を、イタリア、フローレンス大学産科婦人科(Department of Obs terics and Gynecology,University of Florence,Italy)で調べた。放射線の分 子分析への影響の可能性の懸念を除去するため、予備的放射線照射を受けた患者 は除外した。１７５例では、外科手術が最初の治療であった。癌の最も典型的な 部分を含むパラフィン包埋組織ブロックをこれらの内１０４例から得られた：４ 人の患者は、追跡できず、全体で１００人の患者が残った。患者の年齢は、４６ から８４歳の範囲であり、平均年齢は６４歳であった。組織学的型、分化の程度 、および子宮筋層浸潤の深さを評価するため、組織スライドを再調査した。段階 は、１９８８年国際婦人科産科学会(the International Federation of Gynecol ogy and Obstetrics）（ＦＩＧＯ）の分類（Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｏｎｃｏｌ，３５ ，１２５，１９８８）に従って、外科標本の顕微鏡分析によって、評価した。表 １に研究グループの臨床的病理的特徴を要約した。Ｂ．外科治療 外科治療は、９５例の全子宮切除を含み、５例の子宮切除も含む。両側の卵管 −卵巣摘出も常に関連する。骨盤および傍らの大動脈のリンパ節切除は、外科医 の考えで行われたが、秩序立てられているわけではない。全体で４３人の患者が リンパ節切除を受けた。網(Omentu)は、適当な場合に除去した（４例）。 表１ｐＲｂ２／ｐ１３０発現について試験した１００人の患者の臨床的病理的特徴 Ｃ．癌標本の収集 全体で１００人の患者について、癌標本を、子宮摘出後すぐの病変を示してい ると認められる部位から新しく摘出した。癌サンプルのそれぞれを後に二分割し た：そのうち一方はフローサイトメトリーに、もう一方は組織学的分析に用いた 。Ｄ．補助療法 １００人の患者の内４３人が補助療法を受けた。補助療法を受けた４３人の患 者の内、３７人は放射線療法を、６人は化学療法を受けた。分化の程度はわずか で、子宮内膜浸潤が深く（＞５０％）、子宮体外側の癌（段階１）であることが 、補助治療を受けた人の主な診断基準であった。照射を受けた患者（３７人）は 、骨盤全体に５６Ｇｙを受けた。化学療法（６人の患者）は、より進行した病状 （段階III−IV）で、可能な場合に、行われた。化学療法養生法は、シスプラチ ン（体表面領域ｍ²当たり６０ｍｇ）を、シクロホスファミド（体表面ｍ²当たり ６００ｍｇ）およびエピルビシン（体表面領域ｍ²当たり６０ｍｇ）と組み合わ せて、２１日ごとに６サイクル、行った。Ｅ．結果の追跡調査および評価 治療完了後、最初の２年間は３ヶ月毎に、３年目４年目は４ヶ月毎に、その後 は、６ヶ月毎に、患者を調査した。再発は、骨盤または全身のいずれかで、任意 の癌が再発したと診断書に記載された場合に、再発であると見なした。病気無（ ｄｉｓｅａｓｅ−ｆｒｅｅ）状態の持続期間は、手術の日付から計算された。手 術後病気の治癒しなかった患者または手術日から３ヶ月以内に再発した患者は、 病気が治癒したとは考えられず、それ故、病気の治癒した人々の分析から除外さ れたが、保険統計上の生存期間の計算からは除外しなかった。子宮内膜癌以外の 原因でなくなった患者は、追跡できなかったと考えて、それ故生存期間を死亡日 として検閲した。追跡データは、１００人の患者全体について得られ、その平均 は４８ヶ月（２０から８６ヶ月の範囲）であった。病気治癒（ｄｉｓｅａｓｅ− ｆｒｅｅ）状態の持続期間および保険統計の生存期間を研究の終点とした。Ｆ．ＤＮＡインデックスのフローサイトメトリー分析 フローサイトメトリーを行うために、リン酸塩緩衝溶液中でサンプルをランセ ットおよびはさみで細かく切り刻むことによって、腫瘍細胞懸濁液を得た。細胞 懸濁液を、ポリアクリルアミドの５０μｍメッシュでろ過し、７０％のエタノー ルで固定化し、アッセイするまで、−４℃で保存した。ＤＮＡ分析を行う前に、 エタノールを、遠心分離（１５００回転／分で１０分間）によって除去した；次 いで、ペレットを再懸濁し、リン酸塩緩衝溶液中で２回洗浄した。ＲＮＡを、リ ボヌクレアーゼ（Ｓｅｒｖａ、リン酸塩緩衝溶液中０．１ｍｇ／ｍｌ）で、３７ ℃で３０分間消化することによって除去し、核酸をリン酸塩緩衝溶液中で洗浄し 、そしてＤＮＡを４０ｍｇのヨウ化プロピジウム（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｎｓ ｏｎ）および１ｇのクエン酸ナトリウム／リットル（蒸留水）で染色した。サン プ ルにヒト女性のリンパ球を加えたのち、酵素処理および染色を行い、それらをＤ ＮＡ二倍体の標準として用いた。ＤＮＡ分析は、Ｅｌｉｔｅのフローサイトメー ター（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈｉａｌｅａｈ，Ｆｌａ）を 用い、１５ｍＷアルゴンレーザー、波長４８８ｍｍの条件で行った。データは、 ＤＮＡのヒストグラムとして表された。ＤＮＡ倍数性は、ＤＮＡインデックスに よって定められ、二倍体標準のＤＮＡ含有量に対する癌のＧ₀およびＧ₁細胞（ピ ークチャンネル）のモデルＤＮＡ値の割合と定義した。ヒストグラムは、１０， ０００より多い細胞の測定を基本とし、結果として、一般的に、３から６％の変 異係数で良好な分解能を示した。ＤＮＡインデックスの計算は、コンピューター 補助プログラム Ｍｕｌｔｉｃｙｃｌｅ Ａｕｔｏｆｉｔ、ｖｅｒｓｉｏｎ２． ００（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｆｌｏｗ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ ）でのそれぞれのヒストグラムを処理することによって、行われた。 ＤＮＡインデックス値が１（±０．０４）の全ての例を二倍体と分類し、他を 異数体とした。Ｇ．抗体 ＡＤＬ１と名付けられたウサギのポリクローナル免疫血清は、Ｈａｒｌｏｗお よびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ ｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８８、 第５章（この開示はここに参照として採用される）に記載の方法に従って、ｐＲ ｂ２／ｐ１３０に対して調製された。ウサギは、キーホールリンペットヘモシア ニン(keyhole limpet hemocyanin)（ＫＬＨ）と結合させたペプチドGlu-Asn-His -Ser-Ala--Leu-Leu-Arg-Arg-Leu-Gln-Asp-Val-Ala-Asn-Asp-Arg-Gly-Ser-His-Cy s（配列番号：３）を含む複合体で免疫化された。ペプチドは、ｐＲｂ２／ｐ１ ３０タンパク質のカルボキシ末端に相当する。簡単に言えば、ウサギは、配列番 号：３−ＫＬＨ結合体を皮下注射で二週間に一度、全体で３回の注射を実施する ことによって、免疫化された。１回目の注射（一次免疫）は、１ｍｇの配列番号 ：３−ＫＬＨ結合体／５００μｌ ＰＢＳ、および５００μｌの完全フロイント アジュバントを含んでいた。２回目および３回目の注射（追加免疫）には、５０ ０μｇの結合体/５００μｌ ＰＢＳ、および５００μｌの完全フロイントアジ ュバントが含まれていた。ウサギは、３回目の注射の後に採血した。その後、２ 回目および３回目の注射と同じ組成物を含む追加免疫を、月に一度行った。Ｈ．免疫組織化学的分析 それぞれの腫瘍標本の切片を５μｍに切断し、ガラス上にマウントし、３７℃ で一晩乾燥させた。次いで、全ての切片をキシレン中で脱パラフィン化し、一連 のアルコール勾配で再び水和し、リン酸塩緩衝溶液中で洗浄した。この緩衝液は 、以後の洗浄の全て、さらに抗体の希釈に用いられた。切片を０．５％の過酸化 水素で急冷し、希釈した１０％の正常なヤギ抗−ウサギ血清でブロックした。次 に、１：１０００に希釈したＡＤＬ１免疫血清と共に、スライドを室温で１時間 インキュベートし、次いで、希釈されたヤギ抗−ウサビビオチニル化抗体（Ｖｅ ｃｔｏｒ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，Ｃａｌｉf）と共に、室温で３０分間、イン キュベートした。リン酸塩緩衝溶液で洗浄の後、スライドを、ＡＢＣ法（Ｖｅｃ ｔｏｒ）によって、室温で３０分間、処理した。最終の色原体としてジアミノベ ンジジン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）を用い、核対比染色としてヘマトキ シリンを用いた。それぞれの組織断片の負の対照は、一次抗体を相当する免疫化 前血清を置換することからなる。さらに、相当する免疫化抗原を過剰に含む抗体 のプレインキュベーションは、免疫細胞化学反応をブロックし、それによってｐ Ｒｂ２／ｐ１３０に関するＡＤＬ１抗体の特異性をますます強固にする（データ は示していない）。 全サンプルを、同じ条件下で処理した。また、それぞれの実験に、正常な子宮 組織を、対照として含めた。ｐＲｂ２／ｐ１３０免疫染色の結果は、それぞれの 患者の臨床結果の知識を前もって持ち合わせていない３人の観察者によって、独 立的に解釈した。一致度合いは、観察者間の一致の％として表されたが、９０％ （１００標本の内９０）であった。残りの標本では、一致した２人の研究者の意 見からスコアを得た。結果は、陽性細胞の％として表した。それぞれの癌サンプ ル中、少なくとも２０の抗力化領域(high power field)をランダムに選択し、２ ，０００の細胞が計測された。ｐＲｂ２／ｐ１３０による抗体染色では、そのほ と んどが核であったが、少数の標本は、細胞質染色を示した。この免疫反応性のパ ターンは、固定化および包埋の手順による微小構造の変化に関係するか、または すでに分子レベルで示されているように（Ｃｌａｕｄｉｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒ ｅｓ．，５６，２００３−８、１９９６）、様々な細胞サイクル期の間でのこの 抗原の発現のレベルの違いおよび所在位置の違いを反映しているのであろう。Ｉ．細胞反応性のカットオフポイント ｐＲｂ２／ｐ１３０の発現の予後値を評価するために、患者の病気治癒期間お よび保険統計の生存期間を、ｐＲｂ２／ｐ１３０（＋）％のカットオフポイント を変えて、２グループに分け、後に比較した。４０％またはそれより少ない反応 細胞のカットオフポイントを用いた場合、Ｐ値は、不充分な病気治癒および保険 統計の生存について、有意であった（それぞれ、Ｐ＝０．００３およびＰ＜０． ００１）。（＋）５０％のカットオフポイントでは、有意性のレベルは、それぞ れｐ＝０．０２およびＰ＝０．０１に減少し、（＋）が６０％またはそれより高 い反応性のカットオフポイントでは有意でなくなった。従って、以後の生存分析 は、（＋）が４０％の反応性をカットオフポイントに用いて、行った。最適カッ トオフポイントを同定するための同様の研究法は、ｐ５３発現およびｂｃｌ−２ 発現を利用した免疫組織化学研究に用いられている（Ｓｈｉｍら、Ｊ．Ｎａｔｌ ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，８８，５１９−２９、１９９６；Ｓｉｌｖｅｓｔ ｒｉｎｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１４，１６０４−１０、１９９６） 。Ｊ．統計学的分析 Ｆｉｓｈｅｒの精密試験を用いて、ｐＲｂ２／ｐ１３０発現およびその他の予 後変化の間の関係を評価した（Ｆｉｅｎｂｅｒｇら、Ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｒｏｓｓ−Ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ Ｃａｔｅｇｏｒｉｃａｌ Ｄａｔ ａ，ＭＩＴ Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．；Ｚｅｌｔｅｒｍａ ｎら、”Ｃｏｎｔｉｎｇｅｎｃｙ Ｔａｂｌｅｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｔ ｕｄｉｅｓ”，ＮＥＪＭ Ｂｏｏｋｓ，２９３−３１０、１９９２）。病気治癒 状態維持期間および保険統計の生存期間を、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法（Ｋａ ｐｌａｎら、Ａｍ Ｓｔａｔ Ａｓｓｏｃ．，５３，４５７−８１、１９５８） に従って計算し、ｌｏｇ−ｒａｎｋ試験（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｓｕｒｖｉｖａｌ Ａ ｎａｌｙｓｉｓ，４４−１０２，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１ ９８１）によって評価した。Ｃｏｘの単変数分析(Unibariate Cox Analysis)を 用いて、病気治癒状態維持期間および生存期間のそれぞれの予後変化への影響に ついて評価した。可能な危険因子のいずれが独立した個々の予後情報を与えたか を予測するために、多変数分析（変数の事前選択によるＣｏｘの比例−危険回帰 ）（Ｃｏｘ，Ｊ．Ｒ．Ｓｔａｔ．Ｓｏｃ．，３４，１８７−２２０、１９７２） を行った。データ分析は、ＳＰＳＳ統計パッケージ、リリース５．０．１（ＳＰ ＳＳ Ｉｎｃ．，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）で行った。Ｋ．結果 茶色の染色は、腫瘍細胞内にｐＲｂ２／ｐ１３０が存在することを示す。標本 は、染色の検出不可能、数少ない陽性細胞のみが染色される（約１０％）、細胞 の４０％より多くが染色される、または細胞の大部分が強く染色される、として 特徴付けられる。細胞の４０％より多くが免疫染色される癌は、ｐＲｂ２／ｐ１ ３０（＋）であると考えられる。 正常な子宮サンプル内では、子宮内膜および頸管内上皮細胞内で、ｐＲｂ２／ ｐ１３０に対する強い免疫反応性を検出した。試験した１００例の子宮内膜腺癌 の内、５例は２０％またはそれより少ない細胞でｐＲｂ２／ｐ１３０に対する免 疫反応性を示し、１５例は３０％の細胞で反応性を示し、９例では４０％の細胞 が染色された。これらの２９例の腫瘍（２９％）は、ｐＲｂ２／ｐ１３０陰性と 考えられた。残り７１例の腫瘍では、そのうち１１例が５０％陽性、４９例が６ ０％陽性、そして４例が７０％より多くの細胞が染色されたと評価された。これ ら７１例の腫瘍（７１％）は、ｐＲｂ２／ｐ１３０陽性と考えられた。 ＤＮＡインデックス値は、７３例で二倍体型を示し、２７例で異数体型を示し た。異数体腫瘍のＤＮＡインデックスでは、１例は低二倍体(hypodiploid)であ り、４例は高四倍体(Hypertetraplold)であり、残り２２例は、二倍体から四倍 体の範囲のＤＮＡ含有形態（１＜ＤＮＡ＜２）であった。Ｌ．ｐＲｂ２／ｐ１３０発現と臨床的病理学的特徴との関連 ｐＲｂ２／ｐ１３０の発現は、患者の年齢と逆比例した；６５歳より若い患者 では、ｐＲｂ２／ｐ１３０陰性の腫瘍は５２例中９例（１７．３％）であったが 、これに対して、６５歳もしくはそれより高年齢の患者では４８例中２０例（４ １．６％）（Ｐ＝０．００８）であった。ｐＲｂ２／ｐ１３０の免疫染色は、二 倍体パターンを持つ患者間（７３例中１６例、２１．９％）（Ｐ＝０．００１） より異数体腫瘍の患者間（２７例中１３例、４８．１％）での方が、陰性である ことがより頻繁であった。ｐＲｂ２／ｐ１３０陰性の腫瘍は、分化の程度の低い または中程度の腫瘍の患者の間でより頻繁であったが、この関係は、統計的には 有意ではなかった（Ｐ＝０．０６）。ｐＲｂ２／ｐ１３０の発現レベルは、子宮 頸部に限定された腫瘍患者（段階Ｉ）および子宮頸部の外側に広がった腫瘍を持 つ患者（段階＞１）の間では、有意な差はなかった（Ｐ＝０．４）。ｐＲｂ２／ ｐ１３０陰性の広がりの有意の差は、組織学的型の間でも、また子宮筋層浸潤の 程度の異なる患者間でも、認められなかった。 表２に示したように、ｐＲｂ２／ｐ１３０の発現、癌の倍数体型、ＦＩＧＯの 段階および分化の程度は、Ｕｎｉｖａｒｉａｔｅ Ｃｏｘ分析によって、病気治 癒状態期間および保険統計の生存期間と、有意に相互関連した。年齢、組織学的 型および子宮筋層浸潤の深さを含む、その他の臨床病理の特徴は、結果とは関係 しなかった（データには示していない）。 図１に示すように、ｐＲｂ２／ｐ１３０陰性の腫瘍患者は、病気治癒状態期間 および生存期間の有意の減少（それぞれ、Ｐ＝０．００１およびＰ＜０．０００ １）を示し；５年間の生存の可能性は、そのような腫瘍患者中では５２．０％で あったが、これに対して、ｐＲｂ２／ｐ１３０陽性の癌患者では、９２．５％で あった。 表３に、子宮内膜癌患者の病気から死亡に至る率比率を概算するために、ｐＲ ｂ２／ｐ１３０免疫染色に対する応答、腫瘍の多倍数体型、ＦＩＧＯの段階およ び分化の程度を同時に試験した、Ｃｏｘの比例−危険回帰分析の結果を示した。 ｐＲｂ２／ｐ１３０の免疫染色陰性は、乏しい結果の最も強い独立した予想因子 として生じた。ｐＲｂ２／ｐ１３０陰性の腫瘍患者は、ｐＲｂ２／ｐ１３０陽性 の腫瘍患者より病気による死亡率比率（４．９１）が有意により高かった。子宮 頸部の外側に広がった癌（段階＞１）および異数倍体型もまた、病気から死に至 る可能性がより高いこととも関連するが、これに対して分化の程度は独立した予 後情報を与えなかった。ｐＲｂ２／ｐ１３０の発現およびＦＩＧＯの段階を組み 合わせて用いることによって、より正確な死の危険性の解析が可能になる。 図２は、これらの層別危険グループによるＫａｐｌａｎ Ｍｅｉｅｒの生存評 価を示す。以下に、ｌｏｇ−ｒａｎｋ試験によるグループ間の比較を示す。 段階Ｉ、ｐＲｂ２／ｐ１３０−陽性 対 段階＞１．ｐＲｂ２／ｐ１３０−陽性 ：差は有意でなかった。 段階Ｉ、ｐＲｂ２／ｐ１３０−陽性 対 段階１．ｐＲｂ２／ｐ１３０−陰性： Ｐ＝０．０１。 段階Ｉ、ｐＲｂ２／ｐ１３０−陰性 対 段階＞１．ｐＲｂ２／ｐ１３０−陰性 ：Ｐ＝０．００５。 段階＞Ｉ、ｐＲｂ２／ｐ１３０−陽性 対 段階＞１．ｐＲｂ２／ｐ１３０−陰 性：Ｐ＝０．００３。 段階＞Ｉ、ｐＲｂ２／ｐ１３０−陽性 対 段階１．ｐＲｂ２／ｐ１３０−陰性 ：差は有意でなかった。 実施例２：卵巣癌でのｐＲｂ２／ｐ１３０の発現 Ａ．癌 ６０の（ホルマリン固定しパラフィン包埋した）上皮癌標本を、ペンシルバニ ア病院病理学部門(the Department of Pathology at Pennsylvania Hospital)か ら得た。標本は、グレード１、グレード２およびグレード３の癌を含んでいた。Ｂ．免疫組織化学 自動免疫染色器（Ｖｅｎｔａｎａ ＥＳ，Ｖｅｎｔａｎａ ＭｅｄｉｃａｌＳ ｙｓｔｅｍｓ，Ｔｕｃｓｏｎ．ＡＺ）およびペルオキシダーゼーＤＡＢ免疫検出 キット（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、免疫組 織化学染色を行った。５ミクロンの断片をそれぞれの癌標本から切り出した。断 片をスライド上にマウントし、空気乾燥した。断片をキシレン中で脱パラフィ ン化し、そして水中の一連のアルコール勾配で水和した。ポリクローナル抗−Ｒ Ｂ２一次抗体を、１：５００に希釈して、３７℃で３０分間、適用した。次いで スライドをビオチニル化ヤギ抗−ウサギ抗体と共に３０分間インキュベートした 。次に、スライドを西洋わさびペルオキシダーゼ結合アビジンと共にインキュベ ートした。過酸化水素を酸化基質として用い、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を 色原体として用いた。スライドをヘマトキシリンで対抗染色し、脱水し、そして マウントした。ｐＲｂ２／ｐ１３０免疫染色の強度を評価した。Ｃ．結果 予備試験の結果を表４に示している。これらの結果から、腫瘍のグレードが増 すに従って、検出されるｐＲｂ２／ｐ１３０タンパク質の発現はより少なくなる と考えられる。それ故、ｐＲｂ２／ｐ１３０発現のレベルは、グレード付けに、 さらにヒトの卵巣上皮癌の予備指標として、有用であるだろう。 実施例３：肺癌、シリーズ１でのｐＲｂ２／ｐ１３０の発現 Ａ．ｐＲｂ２／ｐ１３０に対する抗体 ウサギのポリクローナル免疫血清は、ＡＤＬｌと名付けられ、実施例１Ｇに記 載の方法に従って、これらの研究に用いられた。Ｂ．ｐ１０７に対する抗体 ウサギのポリクローナル免疫血清は、細菌で発現させたＧＳＴ−ｐ１０７融合 タンパク質でウサギを免疫化することによって、ｐ１０７（ＡＤＬ２）に対して 、調製された。融合タンパク質の発現は、ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ，Ｇ ｅｎｅ，６７，３１−４０、１９８８ならびにＦｒａｎｇｉｏｎｉおよびＮｅｅ ｌ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１０，１７９−１８７、１９９３に報告さ れた方法に従って、行われた。ウサビの免疫化には、融合タンパク質を用い、皮 下注射を２週間に一度、全体で３回注射を行った。１回目の注射（一次免疫）に は、５００μｌ ＰＢＳ中の５００μｇタンパク質、＋５００μｌの不完全フロ イントアジュバントが含まれた。２回目および３回目の注射（追加免疫）は、１ ００μｇのタンパク質／５００μｌ ＰＢＳ、＋５００μｌの不完全フロイント アジュバントを含んでいた。ウサギは３回目の注射の後、採血した。さらに、二 回目および３回目の注射と同一組成物で、追加免疫を、月に一度行った。Ｃ．ｐＲｂ／ｐ１０５に対する抗体 Ｈｕら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１１，５７９２−５７９９（１９９ １）に記載の方法に従って調製した、抗−ｐＲｂ／ｐ１０５モノクローナル抗体 （ＸＺ７７）を、これらの研究に用いた。Ｄ．組織サンプル 外科手術で一部切除した肺癌患者５１人からの肺組織標本を、一部切除外科手 術の前に化学療法または放射線療法を受けなかった患者から得た。サンプルは、 ３９例の扁平上皮細胞癌および１２例の腺癌からなっていた。組織学的診断およ びグレード付けは、熟練した肺病理学者によって行われた。サンプルを１−２− ３のスケールでグレード付けし、このうち”３”は、最も悪性の病気を表し、” １”は悪性の最も少ない病気を示している。気管、気管支および隣接腺の層状の 円柱上皮を含む正常な肺組織サンプルは、患者の死から１０時間以内に行われた 生検または死体解剖のいずれかから得られた。Ｅ．免疫組織化学 それぞれの肺組織標本からの切片を３−５μｍに切断し、ガラス上にマウント し、３７℃で一晩乾燥させた。その後、切片の全てをキシレンで脱パラフィン化 し、一連のアルコール勾配で再び水和し、リン酸塩緩衝溶液（ＰＢＳ）内で洗浄 した。同一緩衝液を、以後の洗浄の全てに、および抗体の希釈に用いた。 ｐＲｂ２／ｐ１３０およびｐ１０７検出用組織切片を、０．５％の過酸化水素 で結果として急冷し、希釈した１０％の正常ヤギ抗−ウサギ血清（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でブロックした。スライドを、ｐＲｂ２／ｐ１３ ０で高められたウサギポリクローナル免疫血清（ＡＤＬ１）（１：２０００に希 釈）、またはｐ１０７に対するＡＳＤＬ２抗体（１：５００に希釈）と共に、室 温で１時間、インキュベートした。次いで、希釈したヤギ抗−ウサギビオチニル 化抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共に、スライドを、室温 で３０分間、インキュベートした。 ｐＲｂ／ｐ１５０検出用切片を、クエン酸緩衝液（ｐＨ６）中、７００Ｗのマ イクロ波でそれぞれ５分間、二度加熱し、０．５％過酸化水素中で結果として急 冷し、そして希釈された１０％の正常なウマ抗−マウス血清（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＩＮＣ）でブロックした。モノクローナルマウス抗− ヒトｐＲｂ／ｐ１０５抗体ＸＺ７７（１：５００に希釈）を加え、室温で１２０ 分間、インキュベートした。ＰＢＳ中で洗浄の後、スライドを、希釈したウマ抗 −マウスビオチニル化抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ ）と共に、室温で３０分間、インキュベートした。 スライドは、ビオチニル化抗体製造者（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ ｅｓ）の教えに従って、いわゆる”ＡＢＣ”法によって、室温で３０分間、処理 した。ジアミノベンジジンを最終色原体として、またヘマトキシリンを核対抗染 色として、用いた。それぞれの組織切片についての陰性対照は、ＡＤＬ１および ＡＤＬ２に対する一次抗体を免疫化前血清で置換するか、またはＸＺ７７の一次 抗体を省くことからなる。 ３人の病理学者は、ｐＲｂ２／ｐ１３０タンパク質の発現を、陽性染色された 核の％として、スケール０−１−２−３で評価した：０＝検出不可能な発現のレ ベル；１＝低い発現レベル（１−３０％細胞が陽性染色された）；２＝中程度の 発現レベル（３０−６０％の細胞が陽性染色された）；３＝高い発現レベル（６ ０−１００％の細胞が陽性染色された。気管、気管支および隣接する腺の重層扁 平上皮を含む正常な肺組織サンプルは、強く染色され、高い発現レベルを示した 。Ｆ．結果 結果は表５に示す。 統計分析 表５からのデータをＪｏｎｋｈｅｅｒｅ−Ｔｅｒｐｓｔｒａ試験とＳＴＡＴＸ ＡＣＴ統計ソフトウェア（Ｃｙｔｅｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｍ ｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）とを用いて分析して、組織グレードとタンパク質発現レベ ルとの間に関係があるかどうかを調べた。 偏平細胞癌（ｐ＜０．０００１）及び腺癌（ｐ＜０．００４）においては病理 学的グレード評価とｐＲｂ２／ｐ１３０の発現との間には、統計的に有意な逆関 係(invere relationship)が存在した。 偏平細胞癌（ｐ＝０．００４）では、病理学的グレード評価とｐＲｂ／ｐ１０ ５の発現との間に統計的に有意な逆関係が存在したが、腺癌のｐＲｂ／ｐ１０５ の発現とグレード評価との間には、このような関係が存在しなかった。 実施例４ 肺癌、シリーズＩＩにおけるｐＲｂ２／ｐ１３０の発現肺癌標本 Ｖ．Ｍｏｎａｌｄｉ Ｈｏｓｐｉｔａｌと、ＩＩ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏ ｆ Ｎａｐｌｅｓ（イタリー）の胸部外科部門において１９９５年１月から１９ ９６年４月までに手術による切除（肺葉切除術又は肺切除術）を受けた患者から １５８肺癌標本を得た。標本は手術による切除の前に化学療法又は放射線療法を 受けなかった患者からのみ入手した。 腫瘍の組織学的診断と分類はＷＨＯ基準に基づいておこない、術後の病的ＴＮ ＭステージはＡｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｃａ ｎｃｅｒの指針を用いて決定した。 分析した１５８腫瘍標本のルーチンの組織病理学的評価をｐＲｂ２／ｐ１３０ 免疫染色とは別におこなった。３２腫瘍は腺癌であり、１１８腫瘍は偏平細胞癌 であり、４腫瘍はカルシノイドであり、４腫瘍は小細胞肺癌であった。８７腫瘍 （５５．１％）はステージＩとして分類され、４３腫瘍（２７．１％）はステー ジＩＩとして分類され、２８腫瘍（１７．７％）はステージＩＩＩａとして分類 された。腺癌と偏平細胞癌とは表６に示すようにグレードによって分類した。Ｂ．免疫組織化学 各標本の切片を３〜５μｍでカットして、ガラス上に取り付け、３７℃におい て一晩乾燥させた。次に全ての切片をキシレン中で脱パラフィン化し、段階的な アルコールシリーズ(graded alcohol series)で再水和させ、ＰＢＳ中で洗浄し た。その後の全ての洗浄と抗体の希釈のためにはこの緩衝液を用いた。切片をク エン酸緩衝液（ｐＨ６）中で、それぞれ７００Ｗの電子オーブンにおいて５分間 ずつ２回加熱し、次いで、０．５％過酸化水素中で急冷し、希釈１０％標準ヤギ 抗ウサギ血清によってブロックした。次に、スライドを１：５００〜１：１５０ ０の範囲の希釈度においてｐＲｂ２／ｐ１３０に対してレイズさせた(raised)ウ サギポリクローナル免疫血清と共に室温において１時間インキュベートし、次に 、希釈ヤギ抗ウサギビオチニル化抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ ｓ）と共に室温において１時間インキュベートした。ＰＢＳ中で洗浄した後に、 スライドをＡＢＣ法（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によって室温 において３０分間処理した。ジアミノベンジジンを最終色原体(chromogen)とし て、ヘマトキシリンをカウンターステイン(counterstain)として用いた。一次抗 体の代わりに免疫前血清を用いることによって、各組織切片に対する陰性対照を 得た。 全てのサンプルを同じ条件下で処理した。３人の病理学者（Ａ．Ｂａｌｄｉ、 Ｇ．Ｇ．Ｇｉｏｒｄａｎａｏ及びＦ．Ｂａｌｄｉ）がタンパク質の染色パターン を別々に評価して、それを陽性核の％に関して得点をつけた：スコア１、陽性細 胞１０％未満（検出不能レベルまでの低い発現）；スコア２、陽性細胞１０％〜 ５０％（中程度レベルの発現）；スコア３、陽性細胞５０％を越える（高レベル の発現）。観察者の間の一致の％として表された一致レベル(level of concorda nce)は９０％（１４２〜１５８標本）であった。残りの標本では、一致した、２ 人の研究者の意見からスコアを得た。少なくとも２０の高出力場(higher powerf ield)をランダムに選択して、２０００細胞をカウントした。このコード化され たスコアは統計分析を容易にするために好ましい。Ｃ．統計分析 考えられる腫瘍の異なる変数（組織学的種類とグレード評価、転移の兆候、ｐ Ｒｂ２／ｐ１３０発現レベル）の間の関連(association)の有意性を評価するた めにカイ二乗検定法を用いた統計分析をおこなった。＜０．０５のｐ値は統計的 に有意であると考えられた。Ｄ．結果 ｐＲｂ２／ｐ１３０免疫染色は主として核であったが、一部の標本は低バック グラウンド〜無バックグラウンドで細胞質染色を明らかに示した。 腫瘍の免疫組織化学的染色パターンは次のように要約することができる：５０ 標本（３１．６％）は低レベル〜検出不能レベルのｐＲｂ２／ｐ１３０（スコア １）を示し、７３標本（４６．２％）は中程度レベルのｐＲｂ２／ｐ１３０（ス コア２）を示し、３５標本（２２．２％）では高レベルの発現が検出された。こ の研究の少数の小細胞肺癌とカルシノイドはこれらの組織学的群における統計分 析を可能にしなかった。ＳＣＬＣ標本の全ては低レベル〜検出不能レベルのｐＲ ｂ２／ｐ１３０（スコア１）を示したが、このタンパク質の高レベルの発現が全 てのカルシノイドにおいて認められた。 統計分析は、ｐＲｂ２／ｐ１３０発現が腫瘍ステージ又はＴＮＭ状態と相関し ないことを明らかにした（ｐ＝ｎ．ｓ．）。しかし、ｐＲｂ２／ｐ１３０発現レ ベルと組織学的グレード評価との間に陰性の有意な関係が存在した（ｐ＜０．０ ００１）。組織学的グレードとｐＲｂ２／ｐ１３０発現との間の相関関係を表６ に示す。 平均フォローアップ期間があまりに短かったので、患者の無疾患時間と総生残 時間との詳細な分析は不可能であった。しかし、患者における転移の発生に注目 すると、転移とｐＲｂ２／ｐ１３０発現との間の有意な逆関係が認められた（ｐ ＜０．０００１）。 実施例５ ゲノムクローンの単離と特徴付けＡ．ゲノムクローンの単離 全ヒトｐＲｂ２／ｐ１３０遺伝子を単離するために、ヒトＰ１ゲノムライブラ リー（Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を公 開ｃＤＮＡ配列（Ｌｉ等，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．７：２３６６〜２３７７（１９ ９３））から作製された２プライマーを用いてスクリーニングした。ゲノムクロ ーンを単離するために用いたプライマーの配列は、ＧＴＡＴＡＣＣＡＴＴＴＡＧ ＣＡＧＣＴＧＴＣＣＧＣＣ（配列番号：１１６）と、配列ＧＴＧＴＧＣＣＡＴＴ ＴＡＴＧＴＧＡＴＧＧＣＡＡＡＧ（配列番号：１１５）の補体とである。 Ｐ１ゲノムライブラリーのスクリーニング時に同定されたクローンの１つ（ク ローンｎｏ．１４３７、図３Ｂ）は、サザンブロットハイブリダイゼーションに よって、ｐＲｂ２／ｐ１３０遺伝子の一部を含有することが確認された。推定(p utative)プロモーター領域を含有するｐＲｂ２／ｐ１３０遺伝子の他の５’隣接 配列を得るために、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡからのヒト胎 盤ゲノムＤＮＡファージライブラリー（ＥＭＢＬ３ＳＬ６／Ｔ７）をｃＤＮＡプ ローブを用いて、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等の方法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ ｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，１２．３０〜１２． ３８頁，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒ ｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９），この全開 示は本明細書に援用される］に従ってスクリーリングした。［γ−³²Ｐ］で標識 したｃＤＮＡプローブは、公開ｃＤＮＡ配列（Ｌｉ等，上記文献）の開始コドン 後の最初の４３０ｂｐに相当した。得られた２種類の陽性クローンのうち、φＳ ＣＲ３（図３Ｂ）として同定された１つは、ｐＲｂ２／ｐ１３０遺伝子の５’隣 接領域を含有すると確認された。Ｂ．エキソン／イントロン境界の同定 ゲノムＤＮＡにおけるエキソンの位置とエキソン／イントロン境界とを正確に 特徴付けるために、オリゴヌクレオチドプライマーのセットを用いて、ゲノムＤ ＮＡクローンの配列を決定した。これらのプライマーが大体１５０ｂｐ間隔でゲ ノムＤＮＡにアニールされるようにｐＲｂ２／ｐ１３０のｃＤＮＡヌクレオチド 配列に基づいて、プライマーを合成した。ゲノムＤＮＡ配列が公開ｃＤＮＡ配列 と異なるような位置から、エキソン／イントロン境界を同定した。Ｃ．クローンの配列決定 組換えクローンの配列決定を一部は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ Ｍｏｄｅｌ ３７３Ａ ＤＮＡシーケンサーでの配列分析にジデオキシターミネ ーター反応化学を用いる自動化ＤＮＡシーケンシングによって、また一部はＧＩ ＢＣＯ ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）から購入したｄｓＤＮＡＣ ｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ キットを製造者の指示に従っ て用いることによっておこなった。Ｄ．オリゴヌクレオチドプライマーの合成 本発明に用いるオリゴヌクレオチドプライマーの全ては、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂ ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＤＮＡ−ＲＮＡシンセサイザーＭｏｄｅｌ３９４によって 、β−シアノエチルホスホラミジット(β-cyanoethyl phosphoramidite)化学を 用いて合成した。Ｅ．ゲノムクローン特徴付けの結果 ヒトｐＲｂ２／ｐ１３０遺伝子は２２エキソン及び２１イントロンと、ゲノム ＤＮＡの５０ｋｂを越えるスパンとから成る。これらのエキソンとイントロンの 構成(organization)を図３Ａのスケールに大体合わせて示す。ｐＲｂ２／ｐ１３ ０の各エキソンとイントロンとの位置とサイズ、並びにエキソン−イントロン境 界におけるヌクレオチド配列を表４（配列番号：６〜４７）に示す。これらのエ キソンは６５〜１５１７ｂｐ長さのサイズの範囲である。８２〜９８３７ｂｐ長 さのサイズの範囲であるイントロンは完全に配列決定されている。ヌクレオチド 配列を配列番号：４８〜６８として示す。 実施例６ 転写調節要素の特徴付けＡ．細胞培養とＲＮＡ抽出 ヒトＨｅＬａ（頚部類上皮癌）細胞系統をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ ｒｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから得て、１０％ウシ胎児血清（ＰＣＳ）を 加えたＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＨＥＭ）での３７℃、１０％Ｃ Ｏ₂含有雰囲気における培養に維持した。細胞質ＲＮＡをＲＮＡｚｏｌ Ｂ方法 （ＣＩＮＮＡ／ＢＩＯＴＥＣＸ，Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ，ＴＸ）を用いて抽出 した。 Ｂ．プライマー伸長分析 ｐＲｂ２／ｐ１３０プロモーターを特徴付けるために、プライマー伸長分析を おこなって、転写開始部位を確認した。この分析のためのプライマーは、位置２ ２から開始する、ｐＲｂ２／ｐ１３０ゲノムＤＮＡ配列に対して相補的な、オリ ゴヌクレオチド、５’ＡＣＣＴＣＡＧＧＴＧＡＧＧＴＧＡＧＧＧＣＣＣＧＧ３’ （配列番号：１１４）であった（図４、配列番号：４を参照のこと）。このプラ イマーを［γ³²Ｐ］ＡＴＰによって末端標識して、２０μｇのＨｅＬａ細胞質Ｒ ＮＡによって４２℃において一晩ハイブリダイゼーションした。プライマー−ア ニーリングしたＲＮＡを２ｍＭデオキシヌクレオチドの存在下で４２℃において ４５分間、トリ骨髄芽球症ウイルス逆転尊酵素によってｃＤＮＡに転化した。ｃ ＤＮＡ生成物を次に８Ｍ尿素を含有する７％シーケンスゲル(sequencing gel)上 で分析した。得られた伸長生成物の長さから転写開始部位の位置をマッピングし た。Ｃ．シグナル スキャン プログラム 幾つかの転写因子結合モチーフをＳＩＧＮＡＬ ＳＣＡＮ ＶＥＲＳＩＯＮ４ ． ０を用いて同定した。ＳＩＧＮＡＬ ＳＣＡＮはミネソタ大学のＡｄｖａｎｃｅ ｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｓｔ．Ｐａｕ ｌ，ＭＮ）によって開発されたコンピュータープログラムである。このプログラ ムは、分子生物学者がＤＮＡ配列における可能な転写因子結合部位と他の要素と を見いだすのを容易にする。このプログラムの完全な説明はＰｒｅｓｔｒｉｄｇ ｅ，Ｄ．Ｓ．，ＣＡＢＩＯＳ ７：２０３〜２０６（１９９１）に見いだすこと ができ、これの全開示は長々しく説明されているとしても本明細書に援用される 。 ＳＩＧＮＡＬ ＳＣＡＮは公開シグナル配列と未知配列との間の配列相同性を 見いだす。本明細書で定義するかぎり、シグナルとは、周知の意義(known signi ficance)を有する可能性がある任意の短いＤＮＡ配列である。大抵の既知シグナ ルは転写要素を表す。このプログラムは同定された相同性の意義を解明せず、同 定された配列の意義の解釈は使用者に任される。シグナル要素の意義はシグナル の長さによって変化し、短いセグメントに匹敵するもの(matches)はランダム発 生の高い見込みを有する。Ｄ．プライマー伸長分析とＳＩＧＮＡｌ ＳＣＡＮとの結果 図５は、ｐＲｂ２／ｐ１３０の転写開始部位を確認するためにおこなったプラ イマー伸長分析の結果を示す。鋳型としてＨｅＬａ細胞を用いておこなったプラ イマー伸長から７８ｂｐの主要な伸長フラグメントが検出された（レーン１）。 同定された転写開始部位の可能な位置は図４の矢印によって示される。推定転写 因子結合部位は、既知転写因子結合部位の共通配列へのそれらの類似性によって 同定された。Ｓｐ１、Ｋｅｒ１及びＭｙｏＤに相当する配列モチーフも図４に示 される。 実施例７ ＰＣＲによる異型突然変異(heterozygous mutation)の検出Ａ．ゲノムＤＮＡの作製 本発明で用いるゲノムＤＮＡはヒト末梢血液リンパ球から得た。サンプルは， Ｓａｍｂｒｏｏｋ等の方法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，９．１６〜９．２３頁，Ｃｏｌｄ Ｓ ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓ ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）］によって作製した。Ｂ．ＰＣＲプライマーの合成 本明細書で用いるＰＣＲプライマーは実施例５Ｄに述べたように合成した。用 いた特異的プライマー配列とそれらのアニーリング温度は表８に配列番号：６９ 〜１１２として記載する。 Ｃ．ＰＣＲ増幅 サンプルＤＮＡをＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓサーモサイクラー(t hermocycler)において増幅した。２．５単位の組換えＴａｑＤＮＡポリメラーゼ と４０ｎｇのゲノムＤＮＡとを用いて、１００μｌ反応量でＰＣＲを実施した。 Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｐｅｒｋｉｎ −Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）に与えられた勧告に従って、反応混合物を調製した 。この反応混合物は５０ｍＭ／ｌのＫＣｌと、１０ｍＭ／ｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．３）と、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂と、２００μＭの各デオキシヌクレ オチド三リン酸と、１μＭの各プライマーとから成るものであった。３５ＰＣＲ サイクルをおこなった、各サイクルは９０℃における１分間と、アニーリング温 度（５５℃）における１分間の初期変性工程と、７２℃における１分間の伸長工 程と、その後の７２℃における７分間の最終インキュベーション期間とから成る ものであった。本発明によって設計される各プライマーに関する、適当なアニー リング温度を表８に示す。本発明によって設計される他のプライマーに対処する ために、アニーリング温度を微細調整することができる。Ｄ．ＰＣＲの増幅生成物 ＰＣＲによって生成される増幅生成物のサイズを上記表８に示す。ＰＣＲ生成 物の長さは１９６ｂｐ〜４１３ｂｐの範囲であった。Ｅ．ＰＣＲ生成物の配列決定 ｐＲｂ２／ｐ１３０の増幅生成物の配列決定を、上記実施例５Ｃに記載した方 法に従っておこなうことができる。配列決定は、Ｓａｎｇｅｒ等のＰｒｏｃ．Ｎ ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．７４：５４６３〜５４６７（１９７７） 、又はＳａｍｂｒｏｏｋ等のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，１３．４２〜１３．７７，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）によって述べられているチェー ンターミネーション法によって、本明細書に述べるｐＲｂ２／ｐ１３０ゲノム配 列に基づく適当なプライマーを用いておこなうこともできる。 実施例８ ＳＳＣＰ分析による突然変異の検出Ａ．一般的方法 ＳＳＣＰ分析はＯｒｉｔａ等の方法［Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，５：８７４〜８７９ （１９８９）］及びＨｏｇｇ等の方法［Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，７：１４４５〜１４ ５１（１９９２）］によっておこなった、これらの文献の各々は本明細書に援用 される。ＳＳＣＰ分析に関して、個々のエキソンの増幅を幾つかの実験において 実施例７に述べたように、但し、この場合には、標識生成物を得るために１μＣ ｉの［³²Ｐ］ｄＣＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を加えて、おこなった。ＰＣ Ｒ増幅生成物の１０％アリコートを１０〜２０μｌの０．１％ＳＤＳと１０ｍＭ ＥＤＴＡとの混合物によって希釈した。９５％ホルムアミドと、２ｍＭ ＥＤＴ Ａと、０．０５％ブロモフェノールブルーと、０．０５％キシレンシアノール負 荷溶液（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ＯＨ）とに よって１：１希釈した後に、希釈したサンプルを６％非変性ゲル上でランした。 ＤＮＡをＴＢＥ（０．０９Ｍ Ｔｒｉｓ塩基、０．０９Ｍホウ酸及び２．５ｍＭ ＥＤＴＡ）ランニング緩衝液(running buffer)中で一定ワット数において室温で 電気泳動した。ゲルを濾紙上で乾燥させ、Ｘ線フィルムに増感スクリーンなしに １２〜７２時間暴露させた。 変性ＰＣＲ増幅生成物の電気泳動移動パターンにおけるシフトを、対応する野 生型サンプル又は同じ患者からの正常組織サンプルと比較して観察することによ って、多形と突然変異とを検出した。バンドシフトが同定されたならば、セグメ ントを配列決定して、多形又は突然変異の正確な性質を確認した。Ｂ．ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞系統におけるｐＲｂ２／ｐ１３０遺伝子突然変異の検 出 ＤＮＡをＣＣＲＦ−ＣＥＭ系統（ヒトリンパ芽球細胞）から抽出して、増幅し た。増幅のために、４ｎｇのゲノムＤＮＡと、０．２ｍＭの各デオキシヌクレオ チド三リン酸と、２単位のＴａｑポリメラーゼと、０．４μＭの各プライマーと を含有するＰＣＲ反応混合物５０μｌを用いた。変性（９５℃、１分間）、アニ ーリング（５５℃、１分間）及び伸長（７２℃、１分間）の５５サイクルをサー マルサイクラーにおいておこなった。ＳＳＣＰ分析はＭＤＥ突然変異検出キット （ＡＴ Ｂｉｏｃｈｅｍ）を用いておこなった。ＰＣＲ生成物を９５℃において ２分間加熱してから、氷上に数分間直接置いた。サンプルを０．６ＸＴＢＥラン ニング緩衝液中で８ワットの一定電力において室温でＭＤＥゲルに通して８時間 ランした。ゲルを０．６ＸＴＢＥ緩衝液中で製造された１μｇ／ｍｌの臭化エチ ジウム溶液中で室温において１５分間染色してから、ＵＶ−トランスイルミネー ター上に置いて、バンドを可視化した。エキソン２０は対照に比べて異なった移 動を示し、このことは突然変異の存在を示唆した。 ＰＣＲ生成物の配列を、ジデオキシターミネーター反応化学を用いる自動化Ｄ ＮＡ配列決定法によって決定した。２種類の点突然変異が同定された：配列番号 ：１の２９５０位置におけるＡＣＣからＧＣＣへ、スレオニンのアラニン置換を 生じる；配列番号：１の３０２９位置におけるＣＣＴからＣＧＴへ、プロリンの アルギニン置換を生じる。Ｃ．他の細胞系統におけるｐＲｂ２／ｐ１３０遺伝子突然変異の検出 上述したＳＳＣＰとＤＮＡ配列決定法とを用いて、ｐＲｂ２／ｐ１３０遺伝子 における突然変異を次のヒト腫瘍細胞系統において同定した： Ｊｕｒｋａｔ細胞系統（ヒト白血病、Ｔ細胞リンパ芽球）：エキソン２２にお ける点突然変異； Ｋ５６２細胞系統（ヒト慢性骨髄性白血病、赤芽球細胞(erythroblastoid cel l)）：エキソン２２における点突然変異、エキソン２１における欠失； Ｍｏｌｔ−４細胞系統（ヒトＴ細胞白血病、末梢血リンパ芽球）：エキソン２ １における点突然変異、エキソン２２における突然変異（単数又は複数）； Ｄａｕｄｉ細胞系統（ヒト甲状腺リンパ腫、リンパ芽球Ｂ細胞）：エキソン１ ９における点突然変異と挿入、エキソン２１における点突然変異と挿入、エキソ ン２２における突然変異（単数又は複数）； Ｃｅｍ細胞系統（リンパ芽球細胞系統、Ｔリンパ球）：エキソン２０における 突然変異（単数又は複数）、エキソン２２における点突然変異と挿入； Ｓａｏｓ−２細胞系統（ヒト原発性骨原性肉腫）：エキソン２１における点突 然変異と挿入、エキソン２２における点突然変異と挿入； Ｕ２−Ｏｓ細胞系統（ヒト原発性骨原性肉腫）：エキソン１９と２０における 点突然変異、エキソン２２における点突然変異と挿入； ＭＧ６３細胞系統（ヒト骨肉腫）：エキソン１９における点突然変異； Ｈｏｓ細胞系統（ヒト骨原性肉腫、ＴＥ８５）：エキソン１９における点突然 変異、エキソン２２における挿入； Ｕ１７５２細胞系統（ヒト肺腫瘍）：エキソン１９における点突然変異、エキ ソン２１における点突然変異と挿入、エキソン２２における点突然変異と挿入； Ｈ６９細胞系統（ヒト肺腫瘍）：エキソン２１における点突然変異； Ｈ８２細胞系統（ヒト肺腫瘍）：エキソン２１における点突然変異；及び Ｈｏｎｅ細胞系統（ヒト鼻咽頭癌）：エキソン２１における突然変異と挿入、 エキソン２２における突然変異（単数又は複数）。Ｄ．原発性腫瘍におけるｐＲｂ２／ｐ１３０遺伝子突然変異の検出 上述したＳＳＣＰとＤＮＡ配列決定法とを用いて、ｐＲｂ２／ｐ１３０遺伝子 における突然変異を次の原発性ヒト腫瘍において同定した： １３ＮＰＣ原発性腫瘍（ヒト鼻咽頭癌）：エキソン２１における点突然変異、 エキソン２２における点突然変異と挿入；及び ５ＮＰＣ原発性腫瘍（ヒト鼻咽頭癌）：エキソン２２における点突然変異と挿 入。 実施例９ ＰＲＩＮＳ法による突然変異の検出 ＰＲＩＮＳ法を、Ｃｉｎｔｉ等、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１巻，２４ 号，５７９９〜５８００（１９９３）の方法に従って、ゲノムＤＮＡの供給源と してヒト末梢リンパ球を用いておこなった。オリゴヌクレオチドプライマーを、 それらがイントロン隣接エキソン２０の一部を含むように設計した。エキソン２ ０を増幅するために用いたプライマーの配列は上記表８に記載する（配列番号： ８９と９０）。 ＰＨＡ刺激末梢血リンパ球からのヒト固定中期染色体又は間期核をガラススラ イド上に広げて、１０日間風乾した。ＤＮＡをエタノールシリーズ（７０％、９ ０％及び１００％）中で脱水してから、９４℃に５分間加熱することによって変 性させた。２００ｐｍｏｌの各オリゴヌクレオチドと、５μｌの１０ＸＰＣＲ緩 衝液ＩＩ（ＡｍｐｌｉＴａｑ、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）と、２μｌのＤＩＧ ＤＮＡ標識用混合物（１ｍＭ ｄＡＴＰ、１ｍＭ ｄＣＴＰ、１ｍＭ ｄＧＴＰ 、０．６５ｍＭ ｄＴＴＰ、０．３５ｍＭ ＤＩＧ−ｄＵＴＰ、Ｂｏｅｈｒｉｎ ｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）と、２単位のＴａｑ Ｉ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａ ｍｐｌｉＴａｑ、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）とを含有する反応混合物を用いて 、サンプルを５５℃において１０分間、７２℃において３０分間インキュベート した。本発明に従って設計される他のプライマーに適したアニーリング温度を表 ８に示す。次に、サンプルを２ＸＳＳＣ（ｐＨ７．０）中と４ＸＳＳＣ（ｐＨ７ ．０）中で室温において５分間、２回洗浄した。次に、ＤＮＡサンプルを４ＸＳ ＳＣと０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）との溶液（ｐＨ７．０）中に入れ て、抗ジゴキシゲニン−ＦＩＴＣ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ） と共に室温において４５分間インキュベートし、４ＸＳＳＣと０．５％ＢＳＡ（ ｐＨ７．０）（ｐＨ７．０）中で１：１００に希釈した。４ＸＳＳＣと０．０５ ％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００中でサンプルを洗浄した後に、サンプルを１μｇ／ｍ ｌのＰｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）によってカウンター染色した。 スライドをＣｏｎｆｏｃａｌ Ｌａｓｅｒ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｓ ｃｏｐｅ（ＣＬＳＭ Ｓａｒａｓｔｒｏ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃ ｓ）下で調べた。ＦＩＴＣとＰＩシグナルが、独立的に生成されて、同時に検出 された、最終プロジェクション(projection)を、Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｇｒａｐｈｉ ｃ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｐｅｒｓｏｎａｌ ＩＲＩＳ−４Ｄ／２０ワークステー シヨン(workstation)ニよってスーパーインポーズした。 図６は、正常なヒト間期核に対するＰＲＩＮＳ反応の結果を示す。ブライトス ポット(bright spot)はｐＲｂ２／ｐ１３０のエキソン２０を含有するＤＮＡセ グメントに相当する。この個体はｐＲｂ２／ｐ１３０のエキソン２０の存在に関 して同型接合体(homozygous)である。この個体のエキソン２０に突然変異が存在 したならば、これらの部位の一方又は両方が強度を減じたか、又はその全体にお いて目視不能であったと思われる。 この突然変異の正確な性質を決定するために、患者のｐＲｂ２／ｐ１３０ＤＮ Ａセグメントを当業者に公知の方法によって配列決定し、ｐＲｂ２／ｐ１３０Ｄ ＮＡの野生型サンプルと比較することが考えられる。 本明細書に引用した参考文献の全ては本明細書に援用される。本明細書に開示 した方法、手段及びテクニックを実施するために必要な試薬、組成物及び供給品 (supplies)の全てはキットとして提供することができる。このようなキットも本 発明の別の実施態様である。 本発明が上記目的と利益、並びに本発明に固有の目的と利益を果たすために充 分に適合することは、当業者が容易に理解するであろう。本明細書に述べる核酸 、組成物、方法、手段及びテクニックは好ましい実施態様の代表的なものとして 提示され、例示であると意図され、本発明の範囲に対する限定とは意図されない 。 本発明はその要旨又は本質的な特質から逸脱せずに他の特定の形式で具体化され ることができるので、本発明の範囲を定義するものとして、上記明細書ではなく 、添付請求の範囲を参照すべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ６０／０２０，１９６ (32)優先日 平成８年６月21日(1996．6．21) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０３９，５３２ (32)優先日 平成９年３月３日(1997．3．3) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ， ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ， ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，Ｎ Ｚ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ， ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 癌に苦しむ患者の予後を決定する方法であって、患者由来の試料中のｐ Ｒｂ２／ｐ１３０遺伝子の発現レベルを決定する、ここにおいてｐＲｂ２／ｐ１ ３０発現の減少したレベルは好ましくない予後の指標である、ことを含む前記方 法。 ２． ｐＲｂ２／ｐ１３０遺伝子の発現レベルの決定が、当該遺伝子のＲＮＡ 転写物の相対数を決定することを含む、請求項１に記載の方法。 ３． ｐＲｂ２／ｐ１３０遺伝子の発現レベルの決定が、ｐＲｂ２／ｐ１３０ タンパク質の相対レベルを決定することを含む、請求項１に記載の方法。 ４． ｐＲｂ２／ｐ１３０タンパク質のレベルを、試料をｐＲｂ２／ｐ１３０ タンパク質に結合する抗体と接触させることによって決定する、請求項３に記載 の方法。 ５． 放射線療法または化学療法による患者の治療の前に、試料を患者から得 る、請求項１に記載の方法。 ６． 癌が婦人科系の癌である、請求項１に記載の方法。 ７． 癌が子宮内膜癌である、請求項６に記載の方法。 ８． 試料が子宮内膜組織を含む、請求項７に記載の方法。 ９． 子宮内膜組織が腫瘍を含む、請求項８に記載の方法。 １０． 癌が卵巣癌である、請求項６に記載の方法。 １１． 癌が非小細胞肺癌である、請求項１に記載の方法。 １２． 組織における癌性疾患状態を検出する方法であって、当該組織の試料中 のｐＲｂ２／ｐ１３０遺伝子の発現レベルを決定する、ここにおいてｐＲｂ２／ ｐ１３０発現の減少したレベルは癌の存在の指標である、ことを含む前記方法。 １３． ｐＲｂ２／ｐ１３０遺伝子の発現レベルの決定が、当該遺伝子のＲＮＡ 転写物の相対数を決定することを含む、請求項１２に記載の方法。 １４． ｐＲｂ２／ｐ１３０遺伝子の発現レベルの決定が、ｐＲｂ２／ｐ１３０ タンパク質の相対レベルを決定することを含む、請求項１２に記載の方法。 １５． ｐＲｂ２／ｐ１３０タンパク質のレベルを、試料をｐＲｂ２／ｐ１３０ タンパク質に結合する抗体と接触させることによって決定する、請求項１４に記 載の方法。 １６． 癌が婦人科系の癌である、請求項１２に記載の方法。 １７． 癌が子宮内膜癌である、請求項１６に記載の方法。 １８． 癌が卵巣癌である、請求項１６に記載の方法。 １９． 癌が非小細胞肺癌である、請求項１２に記載の方法。 ２０． 癌の危険性のある個体、または治療後に癌の再発の危険性のある個人を 同定する方法であって、 個体から試料化された組織中のｐＲｂ２／ｐ１３０の発現レベルを決定し；そ して 試料組織中のｐＲｂ２／ｐ１３０発現レベルを正常なｐＲｂ２／ｐ１３０発現 レベルと比較する ことを含む前記方法。 ２１． ｐＲｂ２／ｐ１３０遺伝子の発現レベルの決定が、当該遺伝子のＲＮＡ 転写物の相対数を決定することを含む、請求項２０に記載の方法。 ２２． ｐＲｂ２／ｐ１３０遺伝子の発現レベルの決定が、ｐＲｂ２／ｐ１３０ タンパク質の相対レベルを決定することを含む、請求項２０に記載の方法。 ２３． ｐＲｂ２／ｐ１３０タンパク質のレベルを、試料をｐＲｂ２／ｐ１３０ タンパク質に結合する抗体と接触させることによって決定する、請求項２２に記 載の方法。 ２４． 癌が婦人科系の癌である、請求項２０に記載の方法。 ２５． 癌が子宮内膜癌である、請求項２４に記載の方法。 ２６． 癌が卵巣癌である、請求項２４に記載の方法。 ２７． 癌が非小細胞肺癌である、請求項２０に記載の方法。 ２８． 癌を等級付けする方法であって、 癌を病む患者からの組織の試料中のｐＲｂ２／ｐ１３０遺伝子の発現のレベル を決定する、ここにおいて、発現のレベルは癌の等級の指標となることを含む前 記方法。 ２９． ｐＲｂ２／ｐ１３０遺伝子の発現レベルの決定が、試料組織中の当該遺 伝子のＲＮＡ転写物の相対数を決定することを含む、請求項２８に記載の方法。 ３０． ｐＲｂ２／ｐ１３０遺伝子の発現レベルの決定が、試料組織中のｐＲｂ ２／ｐ１３０タンパク質の相対レベルを決定することを含む、請求項２８に記載 の方法。 ３１． 試料組織中の当該タンパク質のレベルを、ｐＲｂ２／ｐ１３０タンパク 質に結合する抗体を前記試料組織と接触させる免疫測定によって決定する、請求 項３０に記載の方法。 ３２． 癌が婦人科系の癌である、請求項２８に記載の方法。 ３３． 癌が子宮内膜癌である、請求項３２に記載の方法。 ３４． 癌が卵巣癌である、請求項３２に記載の方法。 ３５． 癌が非小細胞肺癌である、請求項２８に記載の方法 ３６． 癌が扁平上皮細胞または腺癌である、請求項３５に記載の方法。 ３７． 本質的にｐＲｂ２／ｐ１３０遺伝子のイントロンもしくはプロモーター 領域、またはその少なくとも１５ヌクレオチドセグメントからなるＤＮＡセグメ ント。 ３８． 本質的にｐＲｂ２／ｐ１３０イントロン１、またはその少なくとも１５ ヌクレオチドセグメントからなる、請求項３７に記載のＤＮＡセグメント。 ３９． 本質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６からなる、請求項３８に記載のＤＮ Ａセグメント。 ４０． 本質的にｐＲｂ２／ｐ１３０イントロン２、またはその少なくとも１５ ヌクレオチドセグメントからなる、請求項３７に記載のＤＮＡセグメント。 ４１． 本質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７からなる、請求項４０に記載のＤＮ Ａセグメント。 ４２． 本質的にｐＲｂ２／ｐ１３０イントロン３、またはその少なくとも１５ ヌクレオチドセグメントからなる、請求項３７に記載のＤＮＡセグメント。 ４３． 本質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８からなる、請求項４２に記載のＤＮ Ａセグメント。 ４４． 本質的にｐＲｂ２／ｐ１３０イントロン４、またはその少なくとも１５ ヌクレオチドセグメントからなる、請求項３７に記載のＤＮＡセグメント。 ４５． 本質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９からなる、請求項４４に記載のＤＮ Ａセグメント。 ４６． 本質的にｐＲｂ２／ｐ１３０イントロン５、またはその少なくとも１５ ヌクレオチドセグメントからなる、請求項３７に記載のＤＮＡセグメント。 ４７． 本質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０からなる、請求項４６に記載のＤＮ Ａセグメント。 ４８． 本質的にｐＲｂ２／ｐ１３０イントロン６、またはその少なくとも１５ ヌクレオチドセグメントからなる、請求項３７に記載のＤＮＡセグメント。 ４９． 本質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１からなる、請求項４８に記載のＤＮ Ａセグメント。 ５０． 本質的にｐＲｂ２／ｐ１３０イントロン７、またはその少なくとも１５ ヌクレオチドセグメントからなる、請求項３７に記載のＤＮＡセグメント。 ５１． 本質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２からなる、請求項５０に記載のＤＮ Ａセグメント。 ５２． 本質的にｐＲｂ２／ｐ１３０イントロン８、またはその少なくとも１５ ヌクレオチドセグメントからなる、請求項３７に記載のＤＮＡセグメント。 ５３． 本質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３からなる、請求項５２に記載のＤＮ Ａセグメント。 ５４． 本質的にｐＲｂ２／ｐ１３０イントロン９、またはその少なくとも１５ ヌクレオチドセグメントからなる、請求項３７に記載のＤＮＡセグメント。 ５５． 本質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４からなる、請求項５４に記載のＤＮ Ａセグメント。 ５６． 本質的にｐＲｂ２／ｐ１３０イントロン１０、またはその少なくとも１ ５ヌクレオチドセグメントからなる、請求項３７に記載のＤＮＡセグメント。 ５７． 本質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５からなる、請求項５６に記載のＤＮ Ａセグメント。 ５８． 本質的にｐＲｂ２／ｐ１３０イントロン１１、またはその少なくとも１ ５ヌクレオチドセグメントからなる、請求項３７に記載のＤＮＡセグメント。 ５９． 本質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６からなる、請求項５８に記載のＤＮ Ａセグメント。 ６０． 本質的にｐＲｂ２／ｐ１３０イントロン１２、またはその少なくとも１ ５ヌクレオチドセグメントからなる、請求項３７に記載のＤＮＡセグメント。 ６１． 本質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７からなる、請求項６０に記載のＤＮ Ａセグメント。 ６２． 本質的にｐＲｂ２／ｐ１３０イントロン１３、またはその少なくとも１ ５ヌクレオチドセグメントからなる、請求項３７に記載のＤＮＡセグメント。 ６３． 本質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８からなる、請求項６３に記載のＤＮ Ａセグメント。 ６４． 本質的にｐＲｂ２／ｐ１３０イントロン１４、またはその少なくとも１ ５ヌクレオチドセグメントからなる、請求項３７に記載のＤＮＡセグメント。 ６５． 本質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９からなる、請求項６４に記載のＤＮ Ａセグメント。 ６６． 本質的にｐＲｂ２／ｐ１３０イントロン１５、またはその少なくとも１ ５ヌクレオチドセグメントからなる、請求項３７に記載のＤＮＡセグメント。 ６７． 本質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０からなる、請求項６６に記載のＤＮ Ａセグメント。 ６８． 本質的にｐＲｂ２／ｐ１３０イントロン１６、またはその少なくとも１ ５ヌクレオチドセグメントからなる、請求項３７に記載のＤＮＡセグメント。 ６９． 本質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１からなる、請求項６８に記載のＤＮ Ａセグメント。 ７０． 本質的にｐＲｂ２／ｐ１３０イントロン１７、またはその少なくとも１ ５ヌクレオチドセグメントからなる、請求項３７に記載のＤＮＡセグメント。 ７１． 本質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２からなる、請求項７０に記載のＤＮ Ａセグメント。 ７２． 本質的にｐＲｂ２／ｐ１３０イントロン１８、またはその少なくとも１ ５ヌクレオチドセグメントからなる、請求項３７に記載のＤＮＡセグメント。 ７３． 本質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３からなる、請求項７２に記載のＤＮ Ａセグメント。 ７４． 本質的にｐＲｂ２／ｐ１３０イントロン１９、またはその少なくとも１ ５ヌクレオチドセグメントからなる、請求項３７に記載のＤＮＡセグメント。 ７５． 本質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４からなる、請求項７４に記載のＤＮ Ａセグメント。 ７６． 本質的にｐＲｂ２／ｐ１３０イントロン２０、またはその少なくとも１ ５ヌクレオチドセグメントからなる、請求項３７に記載のＤＮＡセグメント。 ７７． 本質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５からなる、請求項７６に記載のＤＮ Ａセグメント。 ７８． 本質的にｐＲｂ２／ｐ１３０イントロン２１、またはその少なくとも１ ８ヌクレオチドセグメントからなる、請求項３７に記載のＤＮＡセグメント。 ７９． 本質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８からなる、請求項７８に記載のＤＮ Ａセグメント。 ８０． ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１３に示されたプロモーター領域またはそのセ グメントの少なくとも１５ヌクレオチドからなるクレーム１のＤＮＡセグメント 。 ８１． ｐＲｂ２／ｐ１３０イントロンのセグメントであって、当該イントロン 中のスプライシングシグナルジヌクレオチドを除いたものに実質的に相補的なヌ クレオチド配列を有するＤＮＡセグメントから本質的になる、少なくとも１５ヌ クレオチドの増幅プライマー。 ８２． プライマーが約１５ないし約３０ヌクレオチドを含む、請求項８１に記 載の増幅プライマー。 ８３． プライマーが約１８ないし約２７ヌクレオチドを含む、請求項８２に記 載の増幅プライマー。 ８４． 前記プライマーが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１３に示されたプロモータ ー領域、あるいは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９、Ｓ ＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５ ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ Ｏ：５５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７、ＳＥＱ Ｉ Ｄ ＮＯ：５８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０、ＳＥ Ｑ ＩＤ ＮＯ：６１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３ 、 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８からなるグル ープから選択されるヌクレオチド配列を有するイントロンに実質的に相補的なヌ クレオチド配列を有する、請求項８１に記載の増幅プライマー。 ８５． 前記プライマーが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８、Ｓ ＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８ １、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ Ｏ：８４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６、ＳＥＱ Ｉ Ｄ ＮＯ：８７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９、ＳＥ Ｑ ＩＤ ＮＯ：９０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９２ 、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：９５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１００、ＳＥ Ｑ ＩＤ ＮＯ：１０１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０ ８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１２からなるグループから選択さ れるヌクレオチド配列を有する、請求項８１に記載の増幅プライマー。 ８６． ヒトｐＲｂ２／ｐ１３０遺伝子のエキソン中の多型性をまたは突然変異 を同定する方法であって、 （ａ）増幅条件下において、エキソンを含むゲノムＤＮＡの試料をプライマー 対で処理し、ここにおいて、前記プライマー対は、前記エキソン上流のプロモー ター領域もしくはイントロンにハイブリダイズする第１プライマーおよび前記エ キソン下流の３’−非コード領域もしくはイントロンにハイブリダイズする第２ プライマーを含み、前記処理は、前記エキソンを含む増幅産物を産生する； （ｂ）前記増幅産物のヌクレオチド配列を決定して、前記エキソンのヌクレオ チド配列を提供し；そして （ｃ）工程（ｂ）において得られた前記エキソンの配列を、対応する野生型エ キソンの配列と比較する ことを含む、前記方法。 ８７． 前記プライマー対の各プライマーが、３’−非コード領域、ＳＥＱ Ｉ Ｄ ＮＯ：１１３に示されたプロモーター領域、あるいは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：４８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６、 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７およ びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８からなるグループから選択されるヌクレオチド配列 を有するイントロンに実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する、請求項８６ に記載の方法。 ８８． 前記プライマー対の各プライマーが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９、ＳＥ Ｑ ＩＤ ＮＯ：７０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２ 、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：７５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３、 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４、Ｓ ＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９ ７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９９、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ Ｏ： １００、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０ ５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１０、 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１２からなるグルー プから選択されるヌクレオチド配列を有する、請求項８６に記載の方法。 ８９． ヒトｐＲｂ２／ｐ１３０遺伝子のエキソン中の多型性をまたは突然変異 を同定する方法であって、 （ａ）前記エキソンを含むゲノムＤＮＡの試料、前記エキソン上流のプロモー ター領域もしくはイントロンにハイブリダイズする第１プライマーおよび前記エ キソン下流の３’−非コード領域もしくはイントロンにハイブリダイズする第２ プライマーを含むプライマー対、１種類またはそれ以上のデオキシヌクレオチド 三リン酸の混合物、および前記プライマー対を放射性標識することの可能な化合 物、およびＤＮＡポリメラーゼ、をポリメラーゼ連鎖反応溶液中で混合すること によって、ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成し； （ｂ）前記混合物を複数回のポリメラーゼ連鎖反応熱サイクルにかけてｐＲｂ ２／ｐ１３０増幅産物を産生し； （ｃ）前記ｐＲｂ２／ｐ１３０増幅産物を変性し； （ｄ）前記変性ｐＲｂ２／ｐ１３０増幅産物を電気泳動により分離し； （ｅ）工程（ｄ）の電気泳動により分離された産物をフィルムに曝露して、写 真画像を作成し；そして （ｅ）前記ｐＲｂ２／ｐ１３０増幅産物の写真画像中のバンドの移動度を、対 応する野生型エキソンについての電気泳動により分離された増幅産物と比較する 、ことを含む、前記方法。 ９０． 前記プライマー対の各プライマーが、３’−非コード領域、ＳＥＱ Ｉ Ｄ ＮＯ：１１３に示されたプロモーター領域、あるいは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：４８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６、 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７およ びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８からなるグループから選択されるヌクレオチド配列 を有するイントロンに実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する、請求項８９ に記載の方法。 ９１． 前記プライマー対の各プライマーが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９、ＳＥ Ｑ ＩＤ ＮＯ：７０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２ 、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：７５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３、 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４、Ｓ ＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９ ７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９９、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ Ｏ：１００、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０２、ＳＥ Ｑ ＩＤ ＮＯ：１０３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１ ０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１２からなるグ ループから選択されるヌクレオチド配列を有する、請求項８９に記載の方法。 ９２． ヒトｐＲｂ２／ｐ１３０遺伝子のエキソンを含むヒト染色体試料中の突 然変異を同定する方法であって、 （ａ）前記エキソンを含む染色体試料、前記エキソン上流のプロモーター領域 もしくはイントロンにハイブリダイズする第１プライマーおよび前記エキソン下 流の３’−非コード領域もしくはイントロンにハイブリダイズする第２プライマ ーを含むプライマー対、少なくとも１種類の標識されたデオキシヌクレオチド三 リン酸を含む１種類またはそれ以上のデオキシヌクレオチド三リン酸の混合物、 およびＤＮＡポリメラーゼ、を緩衝液中で混合することによって混合物を形成し （ｂ）前記混合物をｐＲｂ２／ｐ１３０増幅産物を産生するために十分な温度 と時間にさらし；そして （ｃ）前記標識に特異的な蛍光色素結合体でｐＲｂ２／ｐ１３０増幅産物を可 視化し；そして （ｄ）工程ａで得られた可視化ｐＲｂ２／ｐ１３０増幅産物を、対応する野生 型エキソンについての可視化増幅産物と比較する ことを含む、前記方法。 ９３． 前記プライマー対の各プライマーが、３’−非コード領域、ＳＥＱ Ｉ Ｄ ＮＯ：１１３に示されたプロモーター領域、あるいは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：４８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６、 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７およ びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８からなるグループから選択されるヌクレオチド配列 を有するイントロンに実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する、請求項９２ に記載の方法。 ９４． 前記プライマー対の各プライマーが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９、ＳＥ Ｑ ＩＤ ＮＯ：７０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２ 、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：７５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３、Ｓ ＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８ ６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ Ｏ：８９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１、ＳＥＱ Ｉ Ｄ ＮＯ：９２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４、ＳＥ Ｑ ＩＤ ＮＯ：９５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７ 、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：１００、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ ０５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７、ＳＥＱ Ｉ Ｄ ＮＯ：１０８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１０ 、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１２からなるグル ープから選択されるヌクレオチド配列を有する、請求項９２に記載の方法。 ９５． 前記染色体試料が、前記エキソンを含む、脱水され変性された染色体試 料である、請求項９２に記載の方法。 ９６． ヒトｐＲｂ２／ｐ１３０遺伝子のエキソン中の突然変異を検出するため のキットであって、 １またはそれ以上の容器を受容するためのキャリヤー； ヒトＤＮＡの試料を乾燥し、脱水し、そして変性するためのスライドガラスを 保持することの可能な、１またはそれ以上のサブ容器を含む第１容器； 緩衝液、標識混合物、請求項４１に記載のプライマー、およびヒトＤＮＡの試 料を増幅することの可能なポリメラーゼからなる反応混合物を含む第２容器手段 ； 前記標識混合物に特異的な蛍光色素結合体を含む第３容器手段；並びに 染色化合物を含む第４容器手段 を含む前記キット。