JP2001524802A - ２０ｑ１３アンプリコンからの遺伝子及びそれらの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、疾患に関連する第20染色体上の増幅領域由来のcDNA配列に関する。本配列は、さまざまな疾患に関連する染色体異常の同定のためのハイブリダイゼーション法において使用されることができる。本配列は、疾患の治療において使用されることもできる。

Description

【発明の詳細な説明】 20q13アンプリコンからの遺伝子及びそれらの使用 関連出願のクロス−リファレンス 本願は、1995年10月20日に出願された同時係属中の米国特許出願USSN 08／546 ,130に関係する、1997年１月17日に出願されたUSSN 08／785,532、1996年10月16 日に出願されたUSSN 08／731,499及び1996年７月15日に出願されたUSSN 08／680 ,395の一部継続である（これらの全てを目的を限定せずに引用により本明細書中 に取り込む。）。 本発明の背景 本発明は、細胞遺伝学の分野に関する。より特に、本発明は、さまざまな癌に おけるほぼ20q13における増幅の領域内での遺伝子の同定に関する。本明細書中 に開示される遺伝子は、20q13アンプリコンに特異的なプローブとして及びさま ざまな癌の治療のために使用されることができる。 染色体異常は、遺伝子失調、変性疾患、及び癌にしばしば関連する。特に、全 染色体又は染色体セグメントの欠失又はコピーの増幅、及びそのゲノムの特定の 領域の高レベルの増幅が、癌において一般に発生する。例えば、Smith，et al. ，Breast Cancer Res．Treat.，18:Suppl．1:5-14(1991)，van de Vijer & Nuss e，Biochim.Biophys.Acta．1072:33-50(1991)，Sato，et al.，Cancer.Res.，50 :7184-7189(1990)を参照のこと。実際、プロト−オンコジーンと腫瘍抑制遺伝子 をそれぞれ含むDNAの増幅と欠失は、しばしば腫瘍形成に特徴的である。Dutrill aux，et al.，Cancer Genet.Cyt ogenet.，49:203-217(1990)。明らかに、関連する遺伝子の増幅された及び欠失 された領域の同定及びクローニングは、腫瘍形成の研究及び癌診断の開発の両者 にとって決定的である。 増幅され又は欠失された染色体領域の検出は、伝統的には細胞遺伝学により行 われてきた。染色体内へのDNAの複雑なパッキングのために、細胞遺伝学的技術 の分解能は、約10Mb:ほぼ、Giemsa染色された染色体内のバンドの幅、よりも大 きな領域に限定されてきた。多数の転座(translocation)及び他の遺伝子変化を 伴う複雑な核型において、伝統的な細胞遺伝学の分析は、ほとんど有用ではない 。なぜなら、核型の情報を欠いており又は翻訳されることができないからである 。Teyssier，J.R.，Cancer Genet.Cytogenet.，37:103（1989）。さらに、慣用 の細胞遺伝学的バンド分析は時間がかかり、労働集約的であり、そしてしばしば 困難であり又は不可能である。 より最近には、クローン化されたプローブは、サザン・ブロッティングにより 染色体内の所定のDNA配列の量を評価するために使用されてきた。この方法は、 ゲノムが有用な核型情報を消去するようにひどく再編成される場合でさえ、有効 である。しかしながら、サザン・ブロッティングは、DNA配列のコピー数のラフ な推定を与えるだけであり、そして染色体内のその配列の位置決めについての情 報を全く与えない。 比較ゲノム・ハイブリダイゼーション(CGH)は、増幅され／欠失された配列の 存在及び位置決めを同定するための最新のアプローチである。Kallioniemi，et al.，Science，258:818（1992）を参照のこと。CGHは、サザン・ブロッティング と同様に、ゲノム再編成に拘らず増幅及び欠失を現す。さらに、CGHは、サザン ・ブロッティングよりもより定量的なコピー数の推定を提供し、そしてその上 、正常な染色体内の増幅され又は欠失された配列の位置決めの情報をも提供する 。 CGHの使用により、染色体の20q13領域が、癌においてしばしば増幅される領域 として同定されてきた（例えば、Kallioniemi et al.，Genomics，20:125-128(1 994)を参照のこと。）。胸癌細胞系におけるこの領域の初期の分析は、一貫して 増幅される第20染色体上に約２Mbの領域を同定した。 本発明の要約 本発明は、原発性腫瘍内で一貫して増幅される約染色体20q13(より正確には20 q13.2)に位置する２Mbのアンプリコン内に（約600kb）の狭い領域の同定に関す る。さらに、本発明は、この領域にマップされる多数の遺伝子からのcDNA配列を 提供する。これらの配列は、生物学的サンプル、例えば腫瘍細胞から対応の配列 の相対的なコピー数をモニタリングするためのプローブ又はプローブ標的として 有用である。上記アンプリコンに特異的なプローブを調製するために使用される ことができるコーティング（このアプリコンに接触して広がる一連のクローン） も提供される。これらのプローブは、20q13における染色体異常を検出するため に使用されることができる。 従って、１の態様においては、本発明は、ヒト第20染色体上のほぼFLpter 0.8 25位(20q13.2位)における染色体異常（例えば、増幅又は検出）を検出する方法 を提供する。本法は、プローブが標的配列と安定したハイブリダイゼーション複 合体を形成するところの条件下でヒト第20染色体上のほぼFLpter 0.825位におけ る標準ポリヌクレオチド配列にその各々が選択的に結合するところの１以上の標 識された核酸配列から本質的に成る組成物と患者からの染色体サンプルを接触さ せ；そしてそのハイブリダイゼーション複合体を検出 することを含む。上記ハイブリダイゼーション複合体の検出段階は、上記標的配 列のコピー数を測定することを含むことができる。上記プローブは、好ましくは 、本明細書中に開示された核酸から選ばれた１の核酸にストリンジェント条件下 で特異的にハイブリダイズする核酸を含んで成る。さらにより好ましくは、上記 プローブは、配列番号：１〜10及び12に記載の配列から選ばれた１のサブ配列を 含んで成る。このプローブは好ましくは標識付けされ、そしてより好ましくは、 ジゴキシゲニン(digoxigenin)又は（biotin）で標識される。１の態様において は、上記ハイブリダイゼーション複合体は、サンプル中の静止核(interphase nu clei)内に検出される。検出は好ましくは蛍光標識(例えば、FITC、フルオレセイ ン、又はテキサス・レッド(Texas Red))を検出することにより行われる。この方 法は、第20染色体の動原体に選択的に結合する参照プローブと上記サンプルを接 触させることをさらに含むことができる。 本発明は、さまざまな癌において増幅され、かつ、過剰発現される20q13.2領 域内に、２つの新たな遺伝子、ZABC1と1b1をも提供する。ZABC1は推定上のZnフ ィンガー・プロテインである。このZnフィンガー・プロテインは、さまざまな転 写因子内に在り、そして転写因子の増幅又は過剰発現は典型的には細胞のミス− レギュレーション（mis-regulation）をもたらす。従って、ZABC1と1b1は、多く の癌の病因論において重要な役割を演じるようである。 本発明は、新たなヒトのサイクロフィリン核酸（配列番号：13）を提供する。 サイクロフィリン核酸は、シグナル変換を含むさまざまな細胞過程に関係してい るとみなされてきた。 本発明は、20q13アンプリコン内の核酸配列（配列番号：１〜10及び12〜13） によりコードされたタンパク質及びサブ配列、より好ましくは、長さ少なくとも 10アミノ酸、好ましくは少なくとも20ア ミノ酸、そして最も好ましくは少なくとも30アミノ酸のサブ配列をも提供する。 特に好ましいサブ配列は、20q13プロテインに特異的なエピトープ、より好まし くはZABC1と1b1プロテインに特異的なエピトープである。このようなタンパク質 は、非限定的に、配列番号：１〜10及び12〜13の核酸によりコードされたポリペ プチドからの又は配列番号：11のポリペプチドからの少なくとも20のアミノ酸を 含む単離されたポリペプチドを含み、ここで、このポリペプチドは、免疫原とし て提示されるとき、配列番号：１〜10及び12〜13の核酸によりコードされたポリ ペプチドから成る群又は配列番号：11のポリペプチドから選ばれたポリペプチド に特異的に結合する抗体の生産を顕出し、ここで、上記ポリペプチドは、配列番 号：１〜10及び12〜13の核酸によりコードされたポリペプチドから成る群又は配 列番号：11のポリペプチドから選ばれたポリペプチドにより十分に免疫吸着され ている配列番号：11のポリペプチド又は配列番号：１〜10及び12〜13の核酸によ りコードされたポリペプチドから成る群から選ばれたポリペプチドに対して生じ た抗血清に結合しない。好ましい態様においては、本発明のポリペプチドは、配 列番号：１〜13によりコードされたものによりコードされたポリペプチドに対し て生じた抗血清にハイブリダイズし、ここで、その抗血清は、構造的に最も関連 した先に知られたポリペプチドにより免疫吸収されている。例えば、本発明のポ リペプチドは、配列番号：13によりコードされたポリペプチドに対して生じた抗 血清に結合し、ここで上記抗血清は、ラット又はマウスのサイクロフィリン・ポ リペプチドにより免疫吸収されている(Ratのサイクロフィリン核酸は、知られて いる；アクセス番号M19533の下GenBank^TMを参照のこと；マウスのサイクロフィ リン核酸は知られている；アクセス番号50620の下、GenBank^TMを参照のこと。マ ウスとラットのサイクロフィリンcD NAからのcDNAは配列番号：13と約85％同一である。)。 他の態様においては、本法は、20q13アンプリコン内の核酸(ORF)によりコード されたポリペプチド（タンパク質）を検出することを含む。本法は、本明細書中 に関連されるタンパク質アッセイを非限定的に含む多数の周知のタンパク質検出 方法を含むことができる。 本発明は、アンプリコン内の遺伝子からのcDNA配列（配列番号：１〜10及び12 〜13）をも提供する。上記核酸配列は、内因性遺伝子の発現又はその遺伝子産物 の活性を調節するための知られた方法に従って治療的用途において使用されるこ とができる。治療的アプローチの例は、遺伝子発現のアンチセンス阻害、遺伝子 治療、その遺伝子産物に特異的に結合するモノクローナル抗体を含む。これらの 遺伝子はインビトロにおける遺伝子産物の組換え発現のために使用されることも できる。 本発明は、アンプリコン内の遺伝子からのcDNA配列（例えば、配列番号：１〜 10及び12〜13）によりコードされたタンパク質（例えば、配列番号：11）をも提 供する。増幅された核酸が発現されたcDNAを含む場合、そのタンパク質発現産物 の検出及び／又は定量は、その存在又は非存在を同定し又はアンプリコンの又は そのアンプリコンにより作られた異常なタンパク質産物の増幅レベルを定量する ために使用されることができる。 本明細書中に開示されるプローブは、ヒト第20染色体上のほぼFLpter 0.825位 における染色体異常の検出のためのキットにおいて使用されることができる。こ れらのキットは、ヒト第20染色体上のほぼFLpter 0.825位における標的ポリヌク レオチド配列に選択的に結合する標識された核酸プローブを含む区画を含む。こ のプローブは、好ましくは、本明細書中に開示される核酸から選ばれた核酸にス トリンジェント条件下特異的にハイブリダイズする少なくとも１の核酸を含む、 さらにより好ましくは、上記プローブは、本明細書中に開示される核酸から選ば れた１以上の核酸を含む。好ましい態様においては、上記プローブは、ジゴキシ ゲニン又はビオチンで標識される。上記キットは、第20染色体の動原体内の配列 に特異的な参照プローブをさらに含む。 定義 本明細書中に使用するとき“核酸サンプル”は、本発明のプローブへのハイブ リダイゼーションのために好適な形態におけるDNAを含むサンプルをいう。核酸 は、全ゲノムDNA、全mRNA、特定の染色体からのゲノムDNA又はmRNA、又は本明細 書中に開示される特定のアプリコン内の選ばれた配列（例えば、特定のプロモー ター、遺伝子、増幅又は制限断片、cDNA、等）であることができる。この核酸サ ンプルは、特定の細胞又は組織から抽出されることができる。それから核酸サン プルが調製されるところの組織サンプルは、検出されている増幅に関係する疾患 をもつ疑いのある患者から典型的に採取される。ある場合には、上記核酸は、ハ イブリダイゼーションに先立って、標準的な技術、例えばPCRを使用して増幅さ れることができる。上記サンプルは、サザン又はドット・ハイブリダイゼーショ ンその他における使用のための固相表面（例えば、ニトロセルロース）上に固定 化された単離核酸であることができる。上記サンプルは、個々の核酸が実質的に 無傷で残り、そして標準的な技術に従って調製される静止核（inter phase nucl ei）を含むように調製されることもできる。本明細書中に使用するとき“核酸サ ンプル”は、実質的に無傷の濃縮された染色体（例えば、分裂中期の(metaphase )染色体）をもいうことができる。このような濃縮された染色体 は、イン・サイチュー・ハイブリダイゼーション技術におけるハイブリダイゼー ション標的（例えば、FISH）としての使用のために好適である。（抽出された核 酸又は無傷の分裂中期の染色体としてのいずれであっても）用語“核酸サンプル ”の特定の用い方は、その用語が使用される文脈から当業者に容易に明らかにな るであろう。例えば、上記核酸サンプルは、以下に記載するイン・サイチュー・ ハイブリダイゼーション法のために調製された組織又は細胞サンプルであること ができる。 上記サンプルは、個々の染色体が実質的に無傷で残り、そして典型的には、標 準的な技術に従って調製された分裂中期のスプレッド（spreads）又は静止核を 含むように、調製される。 本明細書中に使用するとき“染色体サンプル”とは、以下に記載する標準的な イン・サイチュー・ハイブリダイゼーション法のために調製された組織又は細胞 サンプルをいう。上記サンプルは、個々の染色体が実質的に無傷で残り、そして 典型的には、標準的な技術に従って調製された分裂中期のスプレッド又は静止核 を含むように、調製される。 “核酸”とは、１本鎖又は２本鎖形態のいずれかにおけるデオキシリボヌクレ オチド又はリボヌクレオチドをいい、そして別段限定しない限り、天然ヌクレオ チドと同様なやり方で機能することができる天然ヌクレオチドの知られたアナロ グを包含するであろう。 “単離された”ポリヌクレオチドは、天然にそれに同伴する他の汚染物、例え ば、タンパク質、脂質、及び他のポリヌクレオチド配列から実質的に分離された ポリヌクレオチドである。この用語は、それらの天然環境又はクローン・ライブ ラリーから除去され又は精製されているポリヌクレオチド配列を包含し、そして 組換え又はクローン化されたDNA単離物及び化学的に合成アナログ又は異種系に より生物学的に合成されたアナログを含む。 “サブ配列”とは、より長い核酸配列の一部を含む核酸配列をいう。 本明細書中に使用するとき“プローブ”又は“核酸プローブ”とは、標的への そのハイブリダイゼーションが検出されることができるところの１以上の核酸断 片のコレクション（収集物）として定義される。上記プローブは、上記標的への その結合が検出されることができるように以下に記載するように標識されず又は 標識されることができる。上記プローブは、ゲノムの１以上の特定の（事前に選 択された）部分、例えば、１以上のクローン、単離された染色体全体又は染色体 断片、又はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅産物のコレクションから製造される 。本発明のプローブは、本明細書中に記載するように20q13アンプリコン内に在 る核酸から作られる。上記プローブは、いくつかのやり方で、例えば、反復核酸 のブロッキング又は除去又はユニーク核酸の濃縮によりプロセスされることがで きる。従って、用語“プローブ”は、検出可能な核酸だけではなく、例えば、ブ ロッキング核酸等をもって、標的に適用されるところの形態にある検出可能な核 酸をいうために、本明細書中に使用されることができる。上記ブロッキング核酸 は、別に言及されることもできる。“プローブ”が特別に言及するものは、この 用語が使用されるところの文脈から明らかである。 上記プローブは、固体表面（例えば、ニトロセルロース）上に固定化された単 離核酸であることもできる。いくつかの態様においては、プローブは、例えば、 WO 96／17958中に記載されたような、多数の核酸アレイであることができる。高 密度アレイを作ることができる技術も、上記目的のために使用されることができ る（例えば、Fodor et al．Science 767-773（1991）及び米国特許第5,143,8 54号を参照のこと。）。 “ハイブリダイジング”とは、相補的塩基の対合を介しての２つの１本鎖核酸 の結合をいう。 “実質的に結合する”又は“特異的に結合する”又は“選択的に結合する”又 は“特異的にハイブリダイズする”とは、オリゴヌクレオチドと標的配列の間の 相補的ハイブリダイゼーションをいい、そして標的ポリヌクレオチド配列の所望 の検出を達成するためにそのハイブリダイゼーション媒質のストリンジェンシー を減少させることにより合わせられることができる僅かなミスマッチ（minor mi smatches）を包含する。これらの用語は、その配列が複雑な混合物(例えば、全 細胞)DNA又はRNA中に存在するとき、ストリンジェント条件下で特定の核酸配列 だけへの、分子の結合、２本鎖形成、又はハイブリダイジングをもいう。用語“ ストリンジェント条件”は、その下で、プローブがその標的サブ配列にハイブリ ダイズするであろうが他の配列にはハイブリダイズしないであろうところの条件 をいう。ストリンジェント条件は、配列依存性であり、そして異なる状況におい て相違するであろう。核酸ハイブリダイゼーション実験、例えばCGH，FISH、サ ザン及びノーザン・ハイブリダイゼーションの文脈における“ストリンジョント ・ハイブリダイゼーション”及び“ストリンジェント・ハイブリダイゼーション 洗浄条件”は、配列依存性であり、そして異なる環境パラメーター下で相違する 。核酸のハイブリダイゼーションについての広範囲にわたるガイドは、Tijssen （1993）Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hyb ridazation with Nucleic Acid Probes part I chapter 2“overview of princi ples of hybridization and strategy of nucleic acid probe assays”，Elsev ier，New York中に在る。一般に、高ストリンジョント・ハイブリダイゼーショ ン及び洗浄条件は、所定のイオン強度及びphにおける特異的配列についての熱融 点（Ｔ_m）よりも約５℃低くあるように選ばれる。このＴ_mは、その標的配列の50 ％が完全にマッチしたプローブにハイブリダイズするところの（所定のイオン強 度及びpH下の）温度である。かなりストリンジェントな条件が、特定のプローブ のためのＴ_mに等しくあるように選ばれる。 サザン又はノーザン・ブロットにおけるフィルター上に100を超える相補残基 をもつ相補的核酸のハイブリダイゼーションのためのストリンジェントなハイブ リダイゼーションの条件の例は、そのハイブリダイゼーションが一夜行われる場 合、42℃における１mgのヘパリンを含む50％ホルマリンである。ストリンジェン ト洗浄条件の例は、15分間65℃における.2×SSCである(SSCバッファーの説明に ついてはSambrook前掲を参照のこと。)。しばしば、この高ストリンジェンシー 洗浄は、バックグラウンド・シグナルを除去するために低ストリンジェンシー洗 浄により先行される。例えば約100ヌクレオチド以上の２本鎖についての例示的 な中程度のストリンジェンシー洗浄は、15分間45℃において１×SSCである。例 えば、100を超えるヌクレオチドの２本鎖についての例示的な低ストリンジェン シー洗浄は、15分間40℃における４×SSCである。一般に、特定のハイブリダイ ゼーション・アッセイにおける無関係なプローブについて観察されるものよりも ２×（以上）高いシグナル対ノイズ比は、特異的なハイブリダイゼーションの検 出を示す。 当業者は、本明細書中に記載される特定のプローブの正しい配列がその開示さ れたプローブに“実質的に同一”であるがその標的配列に実質的に結合する能力 を保持しているプローブを作り出すためにある程度修飾されることができるとい うことを認めるであろう。このような修飾は、本明細書中の個々のプローブを参 照することに より特別にカバーされる。ポリヌクレオチド配列の用語“実質的同一性”とは、 ポリヌクレオチドが、標準的なパラメーターを使用する以下に記載する方法を使 用した参照配列に比較して、少なくとも90％の配列同一性、より好ましくは少な くとも95％の配列同一性をもっ配列を含むということを意味する。 ２つの核酸配列は、その２つの配列内のヌクレオチドの配列が、以下に記載す るように最大の一致について整列されるときに同一である場合に、“同一”であ るといわれる。用語“相補的”とは、本明細書中、その相補配列が参照ポリヌク レオチド配列の全部又は一部に同一であることを意味するために使用される。ス トリンジェント条件下互いに相補的なバージョンにハイブリダイズしない核酸は 、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一である場合、未だ実質的に同 一である。これは、例えば、核酸のコピーがその遺伝子コードにより許容される 最大コドンの縮重を使用して創出されるときに、生じる。 ２（以上の）ポリヌクレオチドの間の配列の比較が、配列類似性をもつ局所的 領域を同定し及び比較するために“比較窓”上でその２つの配列の配列を比較す ることにより典型的に行われる。本明細書中に使用するとき、“比較窓”とは、 ２つの配列が最適に整列された後、同一の隣接位置数をもつ参照配列に比較され ることができるところの、少なくとも約20の隣接位置、通常約50〜約200の隣接 、より普通には約100〜約150の隣接位置数をもつセグメントをいう。 比較のための配列の最適な配列は、Smith and Waterman Adv.Appl.Math．2:48 2（1981）の局所的ホモロジー・アルゴリズムにより、Needleman and Wunsch J. Mol.Biol．48:443（1970）のホモロジー整列アルゴリズムにより、Pearson and Lipman Proc.Natl.Acad. Sci.（U.S.A.）85:2444（1988）の類似性方法のためのサーチにより、これらの アルゴリズムのコンピューター支援による実行により、行われることができる。 “配列同一性のパーセンテージ”は、比較窓上で２つの整列された配列を比較 することにより測定され、ここで、その比較窓内のポリヌクレオチド配列の部分 は、その２つの配列の最適整列のために（付加又は欠失を含まない）参照配列に 比較したとき、追加又は欠失（すなわち、ギャップ）を含むことができる。パー センテージは、同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が両配列内で生じているところ の位置の数を測定してマッチした位置の数を測定し、比較窓内の全位置数により 上記マッチした位置数を割り、そしてその結果に100を掛けて同一性のパーセン テージを得ることにより計算される。ヌクレオチド配列が実質的に同一であると いう他の指標は、２つの分子がストリンジェント条件下同一の核酸配列にハイブ リダイズする場合である。特定の核酸配列の“保存的に修飾されたバリエーショ ン”は、同一の又は同一のアミノ酸配列をコードする核酸を、又はその核酸がア ミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一の配列をいう。遺伝子コードの縮 重のために、多数の機能的に同一な核酸がいずれかの所定のポリペプチドをコー ドする。例えば、コドンCGV，CGC，CGA，CGG，AGA、及びAGGは全て、アミノ酸ア ルギニンをコードする。従って、アルギニンがコドンにより特定されている各々 の位置において、そのコドンは、そのコードされたポリペプチドを変更せずに上 記の対応コドンのいずれかに変更されることができる。このような核酸のバリエ ーションは、“保存的に修飾されたバリエーション”の１の種である“サイレン トなバリエーション”である。ポリペプチドをコードする本明細書中の各核酸配 列もそれぞれ可能性のあるサイレント・バリエーションを記載する。当業者は 、（元来、メチオニンのための唯一のコドンであるAUGを除き）核酸内の各コド ンが修飾されて標準的な技術により機能的に同一な分子が作られることができる ということを認めるであろう。従って、ポリペプチドをコードする核酸の各“サ イレントなバリエーション”は、各記載された配列内で暗黙である。さらに、当 業者は、コードされた配列内の単一アミノ酸又は低パーセンテージのアミノ酸（ 典型的には５％未満、より典型的には１％未満）を変更し、付加し又は欠失させ る個々の置換、欠失又は付加が、その変更が化学的に類似のアミノ酸によるアミ ノ酸の置換をもたらす場合、“保存的に修飾されたバリエーション”であるとい うことを認めるであろう。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換の表は 、本分野において周知である。以下の６つの群はそれぞれ、互いにとって保存的 置換であるアミノ酸を含む： １）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）； ２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）； ３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）； ４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）； ５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ） ；及び ６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。 用語“20q13アンプリコン・タンパク質”とは、本明細書中に開示される20q13 アンプリコン内のORFsによりコードされたタンパク質をいうために使用される。 20q13アンプリコン・タンパク質を検出するアッセイは、被験生物学的サンプル 中に存在する内因性（生来）の20q13アンプリコン・タンパク質のレベルを検出 することを意図される。しかしながら、（その生物学的サンプルに外因的な源か らの）外来20q13アンプリコン・タンパク質は、さまざまなアッセイに添加され て、抗−20q13アンプリコン・タンパク質抗体への結合において、ラベルを提供 し、又はその生来の20q13アンプリコン・タンパク質と競合することができる。 当業者は、20q13アンプリコン・タンパク質擬態が上記文脈において外来20q13タ ンパク質に代えて使用されることができるということを認めるであろう。本明細 書中に使用するとき“20q13タンパク質”とは、生来の20q13アンプリコン・タン パク質に特異的に結合する抗体によりそれが特異的に結合されるような１以上の 20q13アンプリコン・タンパク質エピトープを担持する分子をいう。 本明細書中に使用するとき、“抗体”とは、免疫グロブリン遺伝子又は免疫グ ロブリン遺伝子の断片により実質的にコードされた１以上のポリペプチドから成 るタンパク質をいう。認識された免疫グロブリン遺伝子は、カッパ、ラムダ、ア ルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン及びミュー定常領域遺伝子、並びにその無 数の免疫グロブリンの可変領域遺伝子を含む。軽鎖はカッパ又はラムダのいずれ かとして分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、又はイプシ ロンとして分類され、これは次に、それぞれ、免疫グロブリンのクラス、IgG，I gM，IgA，IgD及びIgEを定める。 基本的な免疫グロブリン（抗体）構造単位はテトラマーを含むことが知られて いる。各テトラマーは、各対が１の“軽”（約25kD）と１の“重”（約50〜70kD ）をもつ、２つの同一のポリペプチド鎖対から成る。各鎖のＮ末端は、主に抗原 認識に責任を負う約100〜110以上のアミノ酸の可変領域を定める。用語可変軽鎖 （Ｖ_L）と可変重鎖（Ｖ_H）は、それぞれ、上記の軽鎖と重鎖をいう。 抗体は、無傷の免疫グロブリンとして又は各種ペプチダーゼによる消化により 作られたよく特徴付けられた多数の断片として存在す ることができる。従って、例えば、ペプシンは、そのヒンジ領域内でジスルフィ ド結合の下で抗体を消化してF(ab)’₂を作り出し、Fabのダイマーは、それ自体 、ジスルフィド結合によりＶ_H−Ｃ_H１に結合された軽鎖である。F(ab)’₂は、緩 やかな条件下で還元されてそのヒンジ領域内でジスルフィド結合を切断し、それ によりF(ab)’₂ダイマーをFab’モノマーに変換する。Fab’モノマーは、本質的 に、ヒンジ領域の部分をもつFabである（他の抗体断片のより詳細な説明につい てはFundamental Immunology，W.E.Paul，ed.，Raven Press，N.Y.（1993）を参 照のこと。）。各種抗体断片が無傷の抗体の消化の意味において定義されている けれども、当業者は、上記Fab’断片が化学的にか又は組換えDNA方法論の使用の いずれかにより新規に合成されることができる。従って、用語抗体は、本明細書 中に使用されるとき、抗体全体の修飾により製造されたか又は組換えDNA法を使 用して新規合成された抗体断片をも含む。 句“タンパク質に特異的に結合する”又は“タンパク質と特異的に免疫反応す る”とは、抗体について言うとき、タンパク質及び他の生物製剤の外因的集団の 存在下でのタンパク質の存在について確定的な結合反応をいう。従って、指定さ れたイムノアッセイ条件下、特定の抗体が特定のタンパク質に結合し、そしてサ ンプル中に存在する他のタンパク質に有意な量で結合しない。上記条件下でのタ ンパク質への特異的結合は、特定のタンパク質についてのその特異性について選 択された抗体を必要とすることができる。例えば、抗体は、20q13アンプリコン ・タンパク質に結合するが生物学的サンプル中に存在する他のタンパク質のいず れとも結合しない20q13アンプリコン・タンパク質に対して生じることができる 。さまざまなイムノアッセイ形式が特定のタンパク質と特異的に免疫反応的であ る抗体を選択するために使用されることができる。例えば、固相ELISAイムノア ッセイは、タンパク質と特異的に免疫反応性であるモノクローナル抗体を選択す るために日常的に使用される。特異的免疫反応性を測定するために使用されるこ とができるイムノアッセイ形式及び条件については、Harlow and Lane（1988）A ntibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Publications，New Yor kを参照のこと。 図面の簡単な説明 図１（Ａ）は、20q13増幅のレベルに従う129胸癌患者の疾患フリー生存を示す 。高レベル20q13増幅をもつ腫瘍をもつ患者は、低レベルの増幅をもつか又は全 くもたないものに比較してより短い疾患フリー生存（Mantel-Coxテストによりｐ ＝0.04）をもつ。 図１（Ｂ）は、79の腋節(axillary node)陰性患者の亜群における同一疾患フ リーの生存の相違を示す（Mantel-Coxテストによりｐ＝0.0022）。 図２は、29歳の患者からの原発性胸癌腫及びその転移におけるFISHにより検出 された20q13増幅の比較を示す。20q13の低レベル増幅(20ｐ参照プローブに比較 した20q13)は、上記原発性腫瘍内に在った。乳房切除術後８ケ月目に現れた転移 は、染色体20q13領域の高レベル増幅を示す。染色体20（20ｐ参照プローブ）の 全コピー数は未変化のまま残った。各データ点は、分析された個々の腫瘍細胞内 に遺伝子のコピー数を表す。 図３は、20q13.2アンプリコンの分子細胞遺伝学的マッピング及びその後のク ローニングを図示したものである。遺伝子距離は、センチモルガン（centi Morg ans(cM)）で示される。厚い黒い棒は、胸癌細胞系BT474内の最高レベルの増幅の 領域を表し、そして約１ .5Mbの領域をカバーする。Ｐ１とBACクローンは、短い水平線として表され、そ してYACクローンはより重い水平線として表される。全てのYACとＰ１クローンが 示されてはいない。YACs 957f3，782c9，931h12、及び902は切断されている。配 列タグ部位（STSs）は、細い垂直線として現れ、そして白丸は、所定のYACが所 定のSTSについてテストされ、そしてそれについて陽性であるということを示し ている。全てのSTSsが全てのYACsに対してテストされてはいない。100を超える エクソンがそれからトラップされているところの間隔を黒箱として表す。原発性 腫瘍において最高の増幅レベルの領域にわたる600kbの間隔は、中まで詰った黒 箱（標識配列）により表される。この図の下の部分は、約600kb以内まで最高増 幅の領域をさらに狭める２つの原発性腫瘍における増幅レベルを示す。 図４は、原発性腫瘍において定義されたアンプリコン・コアのより高い分解能 マップを提供する。 図５は、アンプリコン内の15遺伝子のマップ位置を示す。 図６は、Ratサイクロフィリンと配列番号：13の間の配列整列を示す。 図７は、20q13アンプリコンの物理マップである。この図の列Ａは、マップを 作るために使用されたSTSsの位置を示す。列Ｂは、YACsの位置を示す。列ＣはＰ １とBACクローンの位置を示す。列Ｄは、トラップされたエクソン、直接選択さ れたcDNAs，ESTs、及び遺伝子の位置を示す。列Ｅは、そこに注記したようにＰ １又はBACクローンを使用してさまざまな原発性腫瘍及び細胞系のハイブリダイ ゼーション分析の結果を示す。中の詰まった黒丸は高い増幅を示し、陰をつけた 丸は中程度の増幅を示し、そして白丸は、上記クローンのそれぞれにより検出さ れた増幅がなかったことを示している。 詳細な説明 本発明は、20q13における染色体異常の検出のためのプローブとして使用され ることができる多数のcDNA配列を提供する。比較ゲノム・ハイブリダイゼーショ ン(CGH)を使用した研究は、染色体20q13における領域は、胸（〜30％）、卵巣（ 〜15％）、膀胱（〜30％）、頭及び首（〜75％）及び結腸（〜80％）の癌におい てしばしばコピー数において増加される。これは、いくつかの固形腫瘍の進行に 寄与する１以上の遺伝子の存在が20q13に位置するということを示唆する。 遺伝子増幅は、それにより、優先的に作用する癌遺伝子が過剰発現され、腫瘍 が新たな成長特性及び／又は化学療法剤に対する耐性を獲得することを許容する １のメカニズムである。ヒト胸癌進行に関連する座及び原発性胸癌の10〜25％に おいて増幅された座は、17q12におけるerbB-2座(Lupu et al.，Breast Cancer R es．Treat．，27:83(1993)，Salmon et al．Science，235:177-182(1987)，Heis kanen et al．Biotechniques，17:928(1994))、11q13におけるcyclin-D（Mahade van et al.，Science，255:1253-1255(1993)，Gillett et al.，Canc.Res.，54: 1812(1994)）及び8q34におけるMYC（Gaffey et al.，Mod.Pathol.，6:654(1993) ）を含む。 比較ゲノム・ハイブリダイゼーション(CGH)を使用した全ゲノム調査（Pangeno mic surveys）は、最近、胸癌において増加したコピー数の約20の新規の領域を 同定した（Kallioniemi et al.，Genomics，20:125-128(1994)）。これらの座の 中の１、バンド20q13は、原発性腫瘍の18％及び細胞系の40％において増幅され た（Kallioniemi et al.，Genomics，20:125-128(1994)）。より最近、これと同 一の領域が、卵巣の15％、膀胱の80％、そして結腸直腸腫瘍の80％において増幅 されていることが発見された。CGHの分解は、５ 〜10Mbに限定される。従って、FISHは、CGHデータを確認し、そして増幅領域を 正確にマップするために座特異的プローブを使用して行われた。 20q13領域は、分子レベルにおいて胸癌において分析されており、そして一貫 して増幅される約600kbの領域が、本明細書中に記載するように同定された。そ の上、本明細書中に示すように、胸癌におけるこの増幅の重要性は、増幅と減少 された患者の生存と増加された腫瘍増幅（特に、Ｓ期における細胞の増加画分） の間の強い関係により示される。 特に、実施例１において詳細に説明されるように、高レベル20q13増幅は、低 レベル増幅又は増幅なしの場合に比較して、節陰性患者における乏しい疾患フリ ー生存と関係した(ｐ＝0.0022)(図１)。中程度に増幅された腫瘍をもつ患者の生 存は、増幅をもたないものと有意差はなかった。特定の理論に拘束されないが、 この観察のための説明は、低レベル増幅が高レベル増幅に先行するということで あることができるということを示唆する。これに関して、１の患者が、低レベル 増幅をもつ原発性腫瘍の制限の８ケ月後に高レベル20q13.2増幅をもつ局所的転 移に発達したということが重要であることができる（図２）。 20q13増幅は、腫瘍の高い組織学的等級と関係した。この相関は、中程度に増 幅された腫瘍と高く増幅された腫瘍の両者において見られた。Ｓ期における細胞 の画分により計測された、特定のプローブ、RMC20C001(Tanner et al.，Cancer Res.，54:4257-4260(1994))に相補的な領域の高レベル増幅と、細胞増幅との間 の相関（ｐ＝0.0085）があった。この発見は重要である。なぜなら、それは、増 加されたＳ期画分の下に横たわるメカニズムを知ることなく、機能的アッセイに おいて格付けされることができる表現型を同定する 。20q13増幅は、患者の年齢、原発性腫瘍のサイズ、腋節又はステロイド・ホル モン・レセプター状態と相関しなかった。 この研究は、20q13.2アンプリコンを約２Mbの間隔に局所化した。さらに、上 記腫瘍の７％において見られた高レベル増幅は、その腫瘍に対して攻撃的な表現 型を与え、臨床的結果に悪影響を及ぼすということを示唆する。低レベル増幅（ 原発性腫瘍の22％）は、攻撃的腫瘍の病理学特徴（高い組織学的等級、異数性及 び細胞増殖）と関係したが患者の予後と関係しなかった。 さらに、20q13アンプリコン（より正確には20q13.2アンプリコン）は、いくつ かの原発性腫瘍及び胸癌細胞系のゲノムを通して一緒に充填されたヒト第20染色 体上の３つの別個の同時増幅された座の中の１であるということが、本明細書中 に示される。20q13.2アンプリコン内の癌遺伝子マップは知られていない。 20q13 アンプリコン・プローブの同定 最初に、少数の利用可能な分子細胞遺伝学的プローブは、FISHプローブが第20 染色体特異的ライブラリー、LA20NC 01からのコスミドのランダム選択により生 成され、そして次にデジタル画像形成顕微鏡によりそれらを第20染色体にマップ するということを指図した。70Mb染色体にわたる約46のコスミドを単離し、それ について、部分長計測（fractional length measure ments(FLpter)）及びバン ド指定を得た。26のコスミドを、静止期FISH分析による胸癌細胞系BT474におけ るコピー数をアッセイするために使用した。コピー数を、静止核におけるハイブ リダイゼーション・シグナルを計数することにより測定した。この分析は、Stok ke et al.，Genomics，26:134-137（1995）により記載されたコスミドRMC20C001 (FLpter，0.824;20q13.2)がBT474細胞において最高レベルの増幅（〜60コピー／ 細胞）を定めたことを現した（Tanner et al.，Cancer Res.， 54:4257-4260(1994)）。 遺伝子マップされた配列を含むＰ１クローンを、20q13.2から選択し、そして 増幅領域を確認し、そしてさらに定めるためにFISHプローブとして使用した。他 のＰ１クローンを、20q13.2領域（Flpter，0.81〜0.84）に広く局在化された候 補癌遺伝子について選択した。これらは、各候捕遺伝子の３’非翻訳領域内で開 発されたプライマー対を使用して、PCRにより（Saiki et al，Science，230:135 0(1985)）、DuPont P1ライブラリー（Genome Systemsから商業的に入手可能な、 Shepherd，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci．USA，92:2629(1994)）から選択した。 ゲノム特異的Ｐ１クローンを、タンパク質チロシン・ホスファターゼ（PTPN1，F lpter 0.78）、メラノコルチン３レセプター(MC3R，Flpter 0.81)、ホスホエノ ールピルベート・カルボキシ・キナーゼ(PCK1，Flpter 0.85)、Znフィンガー・ プロテイン8(ZNF8，Flpter 0.93)、グアニン・ヌクレオチド結合性タンパク質（ GNAS1，Flpter.873）、src−オンコジーン（SRC，Flpter 0.669）、トポイソメ ラーゼ１（TOP1，Flpter 0.675）、bcl-2関連遺伝子bcl-x(Flpter 0.526)及び転 写因子E2F-1(FLpter 0.541)について得た。各クローンを、デジタル画像形成顕 微鏡によりマップし、そしてFlpter値を指定した。上記遺伝子の中の５つを(SRC ，TOP01，GNAS1，E2F-1及びBC1-x)を上記アンプリコン内の候補オンコジーンと して排除した。なぜなら、それらは、Flpter 0.81〜0.84における臨界的領域の はるか外側にマップされるからである。３つの遺伝子(PTPNR1，PCK-1及びMC3R) は、さらなる調査を保証するために上記臨界的領域に十分に接近して位置する。 24コスミド及び３遺伝子特異的Ｐ１（PTPNRL，PCK-1及びMC3R)プローブを使用 した14胸癌細胞系及び36原発性腫瘍上静止期FISHは、１以上のプローブにより胸 癌細胞系の35％（５／14）及び原発性腫 瘍の８％（３／36）において高レベルの増幅を見い出した。 上記細胞系の４／５及び３／３原発性腫瘍における最高コピー数をもつ領域を 、コスミドRMC20C001により定めた。これは、PTPNR1，PCK1及びMC3Rがそのアン プリコン内のオンコジーンのための候補として排除されることもでき、そしてそ の上、10Mbから1.5〜2.0Mbまでその臨界領域を狭めることもできるということを 示す（Tanner et al.，Cancer Res.，54:4257-4260(1994)を参照のこと。）。 プローブRMC20C001は細胞系の35％及び原発性腫瘍の８％において高レベルの （３〜10倍の）20q13.2増幅を検出したので、それは、（１）拡大された腫瘍集 団内の増幅の蔓延を定め、（２）上記腫瘍における増幅の頻度及びレベルを評価 し、（３）病理学的及び生物学的特徴との20q13.2アンプリコンの関係を評価し 、（４）20q13増幅と臨床的結果との間に関係が存在するかどうかを決定し、そ して（５）転移胸腫瘍における20q13増幅を評価する、ために使用された。 実施例１において詳説するように、RMC20C001との蛍光イン・サイチュー・ハ イブリダイゼーション（FISH）は、132の原発性及び11の再発胸腫瘍における20q 13.2増幅を評価するために使用された。絶対コピー数（細胞当りのハイブリダイ ゼーション・シグナルの平均数）及び増幅レベル(p-arm参照プローブに対するシ グナルの平均数)を測定した。２つのタイプの増幅が見つかった：低レベル増幅 （腫瘍核の全体に分散されたFISHシグナルより1.5〜３倍）及び高レベル増幅（ 密接にクラスター化したFISHシグナルにより＞３倍）。低レベル20q13.2増幅は1 32原発性腫瘍の中の29において発見され（22％）、一方、９ケース(6.8％)は高 レベル増幅を示した。 RMC20C001と４つのフランキングＰ１プローブ(MC3R，PCK，RMC 20C026、及びRMC20C030)が、高増幅腫瘍におけるDNA増幅の程度を試験するため に使用された。RMC20C001だけが全ての腫瘍において一貫して増幅された。この 発見は、共通増幅領域がPCK-1及びMC3Rにより隣接されるがこれらを含まない２M b間隔内にあるということを確認した。 物理マップは、最小共通増幅領域をさらに局在化し、そして推定されたオンコ ジーンを単離するためにアセンブルされた。DuPont P1ライブラリー（Shepherd et al．Proc.Natl.Acad.Sci．USA，91:2629(1994)）を、バンド20q13.2内でマッ プされるであろうSTSsについてスクリーンした。座D20S102，D20S100，D20S120 ，D20S183，D20S480，D20S211を単離し、そしてFISHをそれぞれ20q13.2に局在化 した。静止期FISH分析を次に胸癌細胞系BT474において行って各座における増幅 レベルを評価した。座D20S100-D20S120-D20S183-D20S480-D20S211はBT474細胞系 内で高増幅され、一方、D20S102は低レベル増幅だけが検出された。それ故、５c Mにわたる5STSsは、20q13.2アンプリコン内で位置決めされ、そしてCEPHメガYAC ライブラリーをスクリーンするために使用された。 CEPHメガYACライブラリー・スクリーニング及び公的データベースのコンピュ ーター・サーチは、D20S120-D20S183-D20S480-D20S211が、３つのメガYACクロー ンy820f5，773h10、及び931h6のそれぞれに結合されることを現した（図３）。 その上、コスミドRMC20C001，RMC20C30及びRMC20C028の端から生成されたSTSsに よるCEPHメガYACライブラリーのスクリーニングは、同一の３つのYACクローンの それぞれにRMC20C001を局在化した。上記YACクローンの最小のサイズに基づいて 、D20S120-D20S183-RMC20C001-D20S480-D20S211が1.1Mb未満の間隔内にマップさ れるということが推定された。D20S100は、静止期FISHによりD20S120に、そして STSマッピン グによりYAC901b12に300kb離れて位置決めされた。併合STSデータは、1.5Mbアン プリコンを包含し、そして座RMC20C030-PCK1-RMC20C001-MC3R-RMC20C026を含む おおよそ４Mbにわたる12員のYACコンティグ（contig）を構築することができる 。各YACは、20q13.2への局在化を確認し、そしてキメラ現象(chimerism)につい てチェックするためにFISHによりマップされた。各YACの５つのクローン単離物 を、パルス・フィールド・ゲル電気泳動（PFGE）によりサイズ決定した。上記YA Csのいずれもキメラではない。しかしながら、いくつかは高く不安定性である。 YACコンティグは、フレームワークとして役立ち、それから２Mb Ｐ１コンテ ィグを構築するために20Q13アンプリコンが広がる。Ｐ１クローンは、（１）安 定性、（２）１％未満のキメラ頻度、（３）標準的なミニプレップ手順によるDN A単離、（４）それらが理想的なFISHプローブを作る、（５）両端が直接的に配 列決定されることができる、（６）２方向プライマー結合性部位を担持する遺伝 子操作されたγδトランスポゾンがクローン化されたDNA内のいずれかの位置で 組み込まれることができる（Strathman et al.，Proc.Natl.Acad.Sci．USA，88: 1247(1991)）、（７）Ｐ１クローンがLBNL HGCにおいてヒト及びキイロショウジ ョウバエ（Drosophila）ゲノムの配列決定のための鋳型である（Palazzolo et a l．DOE Human Genome Program，Contractor-Grantee Workshop IV．Santa Fe，N ew Mexico，November 13-171994）、を含むYACクローンを超える多くの利点を提 供した。 約90のＰ１クローンがPCR又はフィルター・ハイブリダイゼーションのいずれ かによりDuPont P1ライブラリーをスクリーニングすることにより単離した。PCR ベースのスクリーニングについては、22を超える新規のSTSsが２つの方法により 創られた。第１の方法に おいては、アンプリコンに局在化されたＰ１クローンの両端が配列決定され、ST Ssが開発され、そしてＰ１ライブラリーが歩行クローンについてスクリーニング された。第２のアプローチにおいて、inter-Alu PCR（Nelson et al.，86:6686- 6690(1989)）を、上記アンプリコンに広がるYACs上で行い、そしてその生成物を クローン化し、そしてSTS創出について配列決定した。フィルター・ベースのハ イブリダイゼーション・スキームにおいて、Ｐ１クローンを、上記アンプリコン に広がるYACs上でinter-Alu PCRを行い、その生成物を放射標識し、そしてＰ１ ライブラリーの格子アレー(gridded a rray)を含むフィルターに対してこれらを ハイブリダイズすることにより、得た。最後に、ギャップを閉じるために、ヒト ゲノム・バクテリア人工染色体(BAC)ライブラリー(Research Genetics，Huntsui lle，Alabama，USAから商業的に入手可能な、Shizuya et al．Proc.Natl.Acad.S ci．USA，89:8794(1992))をPCRによりスクリーンした。100を超えるＰ１とBACク ローンを作るために併合されたこれらの方法を、FISHにより20q13.2に局在化し た。STS含有物のマッピング、フィンガープリンティング、及びフリークロマチ ン・フィッシュ(free-chromatin fish)(Heiskanen et al.，Bio Techniques，17 :928(1994))を、図３及び図４中に示す２Mbコンティグを構築するために使用し た。図７は、最小タイリング・コンティグ（minimum tiling contig）を示す領 域の第２の物理マップである。 BT474 内の20q13.2アンプリコンの詳細マッピング 2Mb Ｐ１コンティグからのクローンを、胸癌細胞系BT474内の20q13.2におけ る増幅レベルをマップするためにFISHと共に使用した。上記コンティグに沿って 規則的な間隔で分散された35のＰ１プローブを使用した。得られたデータは、BT 474内での最高コピー数増加の領域が、D20S100とD20S211の間で、約1.5Mbの間隔 で生じ るということを示した。この間隔におけるP1 FISHプローブは、BT474における静 止核当り平均50シグナルを検出し、一方、ほんの低レベルの増幅又は無増幅がこ の領域の外側のＰ１クローンを用いて検出された。従って、このアンプリコンの 近位及び遠位境界がクローン化された。 原発性腫瘍における20q13.2アンプリコンの詳細マッピング 原発性腫瘍における上記アンプリコンの詳細マッピングは、病理生理学的に重 要である高増幅の最小共通領域(minimum common region of high amplification (MCA))を現した。この方法は、遺伝性の疾患遺伝子をコードする遺伝子間隔を狭 めることに際し、情報量の多い減数分裂についてのスクリーニングに類似してい る。132の原発性腫瘍の分析は、RMC20C001座において増幅される38の原発性腫瘍 を現した。これらの腫瘍の中の９はRMC20C001において高レベ 期FISHによりさらに分析された。増幅の最小共通領域(MCA)は、Ｐ 、最高レベルの増幅がRMC20C001に対応するＰ１クローン＃38により検出された （図３と図７）。 20q13アンプリコンの600kb間隔にわたるＰ１とBACクローンは、表１と表２に 列記され、これはShepherd，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci．USA，92:2629(1994) により記載されたDuPont P1ライブラリーに対するクロス−リファレンスを提供 する。これらのＰ１及びBACプローブは、それぞれ、Genetic Systems，and Rese arch Geneticsから商業的に入手可能である。 20q13 アンプリコンからのcDNA配列 エクソン・トラッピング（例えば、Dayk et al.，Proc.Natl.Acad.Sci．USA， 87:8995-8999(1990)及びChurch et al.，Nature Ge 600kb最小共通領域にわたるＰ１とBACクローン上で行い、そして200を超えるエ クソンを単離した。 エクソンDNA配列の分析は、発現された配列データ・ベース(dbest)内の部分的 cDNA配列に、そしてS．cerevisiaeの染色体ＸIVオープン・リーディング・フレ ームに多くの配列類似性（85％〜96％）を現した。エクソン・トラッピングに供 される各Ｐ１クローンは、少なくとも中程度の密度の遺伝子と矛盾しない多数の エクソンを作り出した。200を超えるエクソンがトラップされており、そして分 析され、そして200クローンがBT474 cDNAライブラリーからの直接選択により単 離した。さらに、以下に記載する最小アンプリコンにわたる0.6Mbゲノム間隔が 配列決定される。エクソン予測及び遺伝子モデリングを、XGRAIL，SORFIND、及 びBLASTプログラムを用いて行う。これらのアプローチにより同定された遺伝子 断片は、RT-PCR、ノーザン及びサザン・ブロットにより分析されている。15のユ ニークな遺伝子をこの方法で同定した（表３と図５を参照のこと。）。 さらに、２つの他の遺伝子ZABC1(配列番号：９と10)と1b1(配列番号：12)が、 さまざまな異なる癌細胞において過剰発現されることも示された。 さまざまなcDNAクローンからの配列情報を以下に提供する。 それらは、以下のようなものである： 3bf4（配列番号：１）−Beeler et al．Mol.Cell.Biol．14:982-988（1994） 中に開示されたＡ６と命名された、チロシン・キナー ゼ遺伝子に対する配列同一性をもつ３kb転写物。しかしながら、これらの文献は 、遺伝子が約20染色体アンプリコン内に位置することは開示していない。 1b11（配列番号：２）−その発現が、アンプリコンのコピー数との高い相関を 示す約3.5kbの転写物。上記配列は、サーチされたデータベース内の配列とのホ モロジーを示さない。 cc49（配列番号：３）−C2H2 Znフィンガー遺伝子に対するホモロジーを示す ６−７kb転写物。 cc43（配列番号：４）−正常な組織中で発現されるが、胸癌細胞系内でのその 発現が検出されていない約４kbの転写物。 41.1（配列番号：５）は、−キイロショウジョウバエにおけるホメオボックス Ｔシャツ(T shirt)遺伝子に対するホモロジーを示す。 GCAP（配列番号：６）は、−サイクリックAMPの生合成に関係するグアニノ・ シクラーゼ活性化タンパク質をコードする。以下に詳細に説明するように、この 遺伝子からの配列を、網膜変性の治療のために使用されることもできる。 1b4(配列番号：７)−セリン・トレオニン・キナーゼ。 20sa7(配列番号：８)−ラット遺伝子、BEM-1のホモログ。 さらに、ヌクレオチド配列全体がZABC-1のために提供される。ZABC-1は、胸癌 において増幅されたZnフィンガーを表す。この遺伝子は、20q13.2アンプリコン のコアにマップし、そして20q13.2増幅をもつ原発性腫瘍及び胸癌細胞系内で過 剰発現される。 ゲノム配列（配列番号：９）はおおよそ２kbのプロモーター領域を含む。配列 番号：10は、そのcDNA配列から得られたオープン・リーディング・フレームを提 供し、そして配列番号：11は、予測されたタンパク質配列を提供する。Znフィン ガー含有遺伝子は、しばし ば、下流遺伝子の発現を調節するように働く転写因子である。いくつかの知られ たオンコジーンは、実際Znフィンガー含有遺伝子である。 本発明は、多くの胸癌細胞系及びいくつかの原発性腫瘍内でも過剰発現される 1b1と命名されたcDNA（配列番号：12）のための完全長cDNA配列をも提供する。 配列番号：13は、知られたラット及びマウスのサイクロフィリンcDNAsに類似 するゲノム・クローンからの配列を提供する。ラット・サイクロフィリン核酸( 例えば、cDNAs)は知られており；アクセス番号M19533の下GenBank^TM参照；マウ ス・サイクロフィリン核酸(例えば、cDNAs)は知られており；アクセス番号50620 の下GenBank^TM参照（図６参照）。従って、配列番号：13は推定ヒト・サイクロ フィリン遺伝子である。この配列は、20q13からの増幅された配列とも関係し、 そして対応の遺伝子のDNA増幅、又はRNA過剰発現を検出するためにプローブ又は プローブ・ハイブリダイゼーション標的として使用されることができる。 20q13 アンプリコン・タンパク質 先に示したように、本発明は、20q13アンプリコン内の核酸配列（例えば、配 列番号：１〜10及び12〜13）によりコードされたタンパク質、及びサブ配列、よ り好ましくは長さ少なくとも10アミノ酸 の、好ましくは少なくとも20アミノ酸の、そして最も好ましくは少なくとも30ア ミノ酸のサブ配列をも提供する。特に好ましいサブ配列は、20q13タンパク質に 特異的なエピトープ、より好ましくはZABC1と1b1タンパク質に特異的なエピトー プである。このようなタンパク質は、非限定的に、配列番号：１〜10及び12〜13 の核酸によりコードされたポリペプチド又は配列番号：11のポリペプチドからの 少なくとも10の隣接アミノ酸を含む単離ポリペプチドを含み、ここで、このポリ ペプチドは、免疫原として提示されるとき、配列番号：１〜10及び12〜13の核酸 によりコードされたポリペプチド及び配列番号：11のポリペプチドから成る群か ら選ばれたポリペプチドに特異的に結合する抗体の生産を顕出し、そしてこのポ リペプチドは、配列番号：１〜10及び12〜13の核酸によりコードされたポリペプ チドから成る群又は配列番号：11のポリペプチドから選ばれたポリペプチドによ り十分に免疫吸収されている、配列番号：１〜10及び12の核酸によりコードされ たポリペプチドから成る群又は配列番号：11のポリペプチドから選ばれたポリペ プチドに対して生じた抗血清に結合しない。 所定の免疫原、例えば、配列番号：11のアミノ酸配列から成る免疫原に対して 生じた抗体に特異的に結合し又はそれと特異的に免疫反応性であるタンパク質は 、イムノアッセイにおいて測定される。このイムノアッセイは、配列番号：11の タンパク質（免疫原性ポリペプチド）に対して生じたポリクローナル抗血清を使 用する。この抗血清は、他の類似の知られたポリペプチドに対して低い交差反応 性をもつように選ばれ、そしてこのような交差反応性のいずれも、イムノアッセ イにおける使用に先立つ免疫吸収により（例えば、関連ポリペプチドによる上記 抗血清の免疫吸収により）除去される。 イムノアッセイにおける使用のための抗血清を作り出すために、 ポリペプチド、例えば、配列番号：11のポリペプチドが本明細書中に記載するよ うに単離される。例えば、組換えタンパク質は、哺乳類又は他の真核細胞系にお いて製造されることができる。マウスの同系株を、標準的なアジュバント、例え ば、Freund'sアジュバント、及び標準マウス免疫感作プロトコールを使用して配 列番号：11のタンパク質で免疫感作させる（Harlow and Lane前掲参照）。ある いは、本明細書中に開示された配列から得られそして担体タンパク質に抱合され た合成ポリペプチドを免疫原として使用する。ポリクローナル血清を集め、そし てイムノアッセイ、例えば、固体支持体上に固定された免疫原を用いた固相イム ノアッセイにおいて免疫原に対して滴定する。10⁴以上の力価をもつポリクロー ナル抗血清を選び、そして競合的結合イムノアッセイ、例えば、Harlow and Lan e、前掲の第570〜573頁に記載されたものを使用して知られたポリペプチドに対 してそれらの交差反応性についてテストする。好ましくは、２以上の知られたポ リペプチドを、免疫原性ポリペプチドと共に上記測定において使用する。 知られたポリペプチドは、組換えタンパク質として製造されることができ、そ して本明細書中に記載するような標準的な分子生物学及びタンパク質化学を使用 して単離されることができる。 上記競合的結合形式におけるイムノアッセイは、交差反応性の測定のために使 用される。例えば、免疫原性ポリペプチドは固体支持体に固定化される。このア ッセイに添付されるタンパク質は、固定化された抗原への抗血清の結合と競合す る。固定化タンパク質への抗血清の結合と競合するタンパク質の能力は、免疫原 性ポリペプチドと比較される。タンパク質についてのパーセント交差反応性は、 標準的な計算を使用して計算される。知られたポリペプチドに対し10％未満の交 差反応性をもつ抗血清を選択し、そしてプールする。 次に交差反応性抗体を、知られたポリペプチドを用いた免疫吸収により、そのプ ールされた抗血清から取り出す。 上記免疫吸収され、そしてプールされた抗血清を、次に、本明細書中に記載す るような競合的結合イムノアッセイにおいて使用して、免疫原性ポリペプチドと “標的”ポリペプチドを比較する。この比較を行うために、２つのポリペプチド をそれぞれ広い範囲の濃度においてアッセイし、そして固定化タンパク質にへの 抗血清の結合を50％阻害するために必要な各ポリペプチドの量を標準的な技術を 使用して測定する。要求される標的ポリペプチドの量が、要求される免疫原性ポ リペプチドの量の２倍未満である場合、その標的ポリペプチドは、免疫原性タン パク質に対して作られた抗体に特異的に結合するといわれる。特異性の最終決定 として、プールされた抗血清を、免疫吸収において使用されたポリペプチドへの 結合が全く検出されなくなるまで、免疫原性ポリペプチドにより十分に免疫吸収 させる。十分に免疫吸収された抗血清を、次に、テスト・ポリペプチドとの反応 性についてテストする。反応性が観察されない場合、そのテスト・ポリペプチド は、免疫原性タンパク質により顕出された抗血清により特異的に結合される。 同様に、反復実験において、プールされた抗血清を、テスト・ポリペプチドに より免疫吸収させる。免疫吸収後に残存する抗血清が免疫原性ポリペプチド（す なわち、抗血清を顕出させるために使用された配列番号：11のポリペプチド）に 結合しない場合、そのテスト・ポリペプチドは免疫原性ペプチドにより顕出され た抗血清により特異的に結合される。 20q13 異常の検出 当業者は、本明細書中に提供されるクローン及び配列情報が、生物学的サンプ ル中、20q13における増幅、又は他の染色体異常を検 出するために使用されることができるということを認めるであろう。一般的には 、この方法は、生物学的サンプル中に存在する核酸又は生物学的サンプルから得 られた核酸と、標的アンプリコンの１以上の核酸配列に特異的に結合するプロー ブとのハイブリダイゼーションを含む。 本明細書中に使用するとき、生物学的サンプルは、染色体異常（例えば、欠失 の増幅）についてスクリーンされることが望まれる生物学的組織又は細胞を含む 液体のサンプルである。好ましい態様においては、生物学的サンプルは、癌性（ 変質）である疑いのある細胞又は組織である。生物学的サンプルを単離する方法 は、当業者に周知であり、そして非限定的に、吸引、組織切開、針生検その他を 含む。しばしば、サンプルは、患者から得られたサンプルである“臨床サンプル ”であろう。用語“サンプル”は、細胞培養物からの（細胞含有）上清又は細胞 自体、組織培養、及び染色体異常を検出することが望ましくあることができると ころの他の培地からの細胞をも含むと理解されるであろう。 ある態様においては、染色体サンプルは、固体支持体、例えばガラス・スライ ド上に、単細胞懸濁液又は組織調製物として細胞を置くことにより調製され、そ して細胞の最良の空間的分解及び最適なハイブリダイゼーション効率を提供する 固定剤を選ぶことにより固定される。他の態様においては、サンプルは、固定表 面上に固定されたプローブのアレイと接触させられる。 プローブの作製 表１に列記されたＰ１プローブ、表２に列記されたBACプローブ、又は本明細 書中に開示されたcDNAsのいずれかは、20q13アンプリコンの検出における使用の ために好適である。プローブを調製する方法は、当業者に周知である（例えば、 Sambrook et al.，Molec ular Cloning:A Laboratory Manual(2nd ed.)，Vols.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory，(1989)又はCurrent Protocols in Molecular Biology，F.Ausubel et al.，ed．Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York（1987）を 参照のこと。）。 本発明の核酸を作製するための戦略が与えられれば、当業者は、機能的に等価 な核酸を含むさまざまなベクター及び核酸クローンを構築することができる。こ れらの目的を達成するためのクローニング方法論、及び核酸の配列を証明するた めの配列決定法は本分野において周知である。適当なクローニング及び配列決定 技術、及び多くのクローニング訓練を通して当業者を指図するために十分である 指示は、Berger and Kimmel，Guide to Molecular Cloning Techniques，Method s in Enzymology volume 152 Academic Press，Inc.，San Diego，CA(Berger);S ambrook et al．(1989)Molecular Cloning-A Laboratory Manual（2nd ed.）Vol .1-3，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Press，NY，(Samb rook);及びCurrent Protocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel et al.，ed s.，Current Protocols，a joint venture between Greene Publishing Associa tes，Inc．and John Wiley & Sons，Inc.，(1994Supplement)(Ausubel)中に在る 。生物学的試薬及び実験装置の製造者からの製品情報も、知られた生物学的方法 において有用な情報を提供する。このような製造者は、SIGMA chemical company (Saint Louis，MO)，R & D systems(Minneapolis，MN)，Pharmacia LKB Biotech nology(Piscataway，NJ)，CLONTECH Laboratories，Inc．(Palo Alto，CA)，Che m Genes Corp.，Aldrich Chemical Company(Milwaukee，WI)，Glen Research，I nc.，GIBCO BRL Life Technologies，Inc．(Gaithersberg，MD)，Fluka Chemica -Biochemika Analytika(Fluka Chemie AG，Buchs，Switzerland)，Invitrogen（ S an Diego，CA）、及びApplied Biosystems(Foster City，CA)、並びに当業者に 知られた多くの他の商業源を含む。 本発明により提供される核酸は、RNA，cDNA、ゲノムDNA、又はさまざまな組合 せのハイブリッドであるかを問わず、生物学的な源から単離され、又はインビト ロにおいて合成される。本発明の核酸及びベクターは、形質転換され又はトラン スフェクトされた全細胞内、形質転換され又はトランスフェクトされた細胞溶解 物内、又は部分的に精製され又は実質的に純粋な形態において、存在する。 配列を増幅して核酸を提供するために、又はその後の分析、配列決定又はサブ クローニングのために好適なインビトロにおける増幅技術は知られている。ポリ メラーゼ連鎖反応(PCR)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、Ｑβ−レプリカーゼ増幅及び 他のRNAポリメラーゼ仲介技術(例えば、NASBA)を含む上記インビトロ増幅法を通 して当業者を指図するために十分な技術の例は、Berger，Sambrook、及びAusube l、並びにMullis et al.，(1987)米国特許第4,683,202号；PCR Protocols A Gui de to Methods and Applications（Innis et al．eds）Academic Press Inc．Sa n Diego，CA(1990)(Innis);Arnheim & Levinson（October 1，1990）C & EN 36- 47;The Journal Of NIH Research（1991）3，81-94;（Kwoh et al．(1989)Proc. Natl.Acad.Sci．USA 86，1173;Guatelli et al．(1990)Proc.Natl.Acad.Sci．US A 97，1874;Lomell et al．(1989)J.Clin.Chem 35，1826;Landegrem et al.，(1 988)Science 241，1077-1080;Van Brunt（1990）Biotechnology 8，291-294;Wu and Wallace，(1989)Gene 4，560;Barringer et al．(1990)Gene 89，117、及び Sooknanan and Malek（1995）Biotechnology 13:563-564中に在る。インビトロ 増幅核酸の改良クローニング方法は、Wallace et al.，米国特許第5,426,039号 中に記載されている。大きな核酸の改良増 幅方法は、Cheng et al．(1994)Nature 369:684-685及びその中の引用文献中に 要約されている。 インビトロ増幅法のための又は遺伝子プローブとしての使用のための核酸（例 えば、オリゴヌクレオチド）は、典型的には、例えば、Needham-Van Devanter e t al．(1984)Nucleic Acids Res.，12:6159-6168中に記載された、自動合成装置 を使用して、Beaucage and Caruthers(1981)，Tetrahedron Letts.，22(20):185 9-1862により記載された固相ホスホルアミジット・トリエステル法に従って化学 合成される。オリゴヌクレオチドの精製は、適宜、典型的には、生来のアクリル アミド・ゲル電気泳動により又はPearson and Regnier（1983）J.Chrom．255:13 7-149中に記載されたようなアニオン交換HPLCにより行われる。合成オリゴヌク レオチドの配列は、Grossman and Moldave（eds.）Academic Press，New York， Methods in Enzymology 65:499-560中のMaxam and Gilbertの化学分解法（1980 ）を使用して証明されることができる。 プローブは、表１及び２中に列記する１以上の構築物を組み合せ、そして標識 付けすることにより最も容易に調製される。使用前に、これらの構築物は、細胞 を容易に貫通し、そして標的核酸にハイブリダイズするより小さな核酸断片を提 供するように断片化される。断片化は、当業者に周知の多数の方法の中のいずれ かによるものであることができる。好ましい方法は、分子を選択的に解裂させ、 又はあるいはMg²⁺の存在下で核酸を短時間に加熱するための制限酵素による処理 を含む。プローブは、好ましくは、約50bp〜約2000bp、より好ましくは約100bp 〜約1000bp、そして最も好ましくは約150bp〜約500bpの範囲の平均断片に、断片 化される。 あるいは、プローブは、本明細書中に開示された20q13アンプリコンからの選 択されたサブ配列を（例えば、PCRを介して）増幅す ることにより製造されることができる。本明細書中に提供される配列は、当業者 をして20q13アンプリコン内に位置する１以上のエクソンからの配列を増幅せし める。 特に好ましいプローブは、RMC20C001に対応する、プローブ38，40、及び79か らの核酸を含む。さらに、cDNAは、例えば、ノーザン・ブロット分析を使用して 、上記対応の遺伝子の高められた発現をもつ細胞を同定するために、特に有用で ある。 当業者は、本明細中に提供される配列情報及ひクローンを使用して、当業者が 日常的な方法（例えば、サザン又はノーザン・ブロット）を使用して他のヒト・ ゲノム・ライブラリーから同一又は類似のプローブを単離することができるとい うことを認めるであろう。 同様に、本発明のポリペプチドは、多種多様の周知方法において合成的に調製 されることができる。例えば、比較的短い鎖をもつポリペプチドは、慣用の技術 に従って溶液中又は固体支持体上で合成されることができる。例えば、Merrifie ld（1963）J.Am.Chem.Soc.85:2149-2154を参照のこと。さまざまな自動合成装置 が商業的に入手可能であり、そして知られたプロトコールに従って使用されるこ とができる。例えば、Stewart and Young（1984）Solid Phase Peptide Synthes is，2d．ed.，Pierce Chemical Co.を参照のこと。本明細書中により詳細に記載 するように、本発明のポリペプチドは、最も好ましくは、例えば、宿主細胞内で ポリペプチドを発現させ、そして発現されたタンパク質を精製することにより、 組換え技術を使用して行われる。 好ましい態様においては、ポリペプチド、又はそのサブ配列を組換えDNA方法 論を使用して合成する。一般に、これは、組換え、合成、又はインビトロ増幅技 術を通して上記タンパク質をコードするDNA配列を創出し、特定のプロモーター の制御下で発現カセット内 にそのDNAを入れ、宿主細胞内でそのタンパク質を発現させ、その発現されたタ ンパク質を単離し、そして必要により、そのタンパク質を再生することを含む。 核酸の標識付け 核酸（プローブ又はサンプル核酸のいずれか）を標識付けする方法は、当業者 に周知である。好ましい標識付けされたラベルは、インサイチュー・ハイブリダ イゼーションにおける使用のために好適なものである。本発明の核酸プローブ又 はサンプルは、ハイブリダイゼーション反応前に、検出されるように標識付けさ れることができる。あるいは、ハイブリダイゼーション産物に結合する検出可能 な標識を使用することができる。このような検出可能な標識は、検出可能な物理 的又は化学的特性をもついずれかの材料を含み、そしてイムノアッセイの分野に おいて十分に開発されてきた。 本明細書中に使用するとき、“標識”は、分光学的、光化学的、生化学的、免 疫化学的、又は化学的手段により検出されることができるいずれかの組成物であ る。本発明において有用な標識は、放射ラベル（例えば、³²Ｐ，¹²⁵Ｉ，¹⁴Ｃ，³ Ｈ、及び³⁵Ｓ）、蛍光染料（例えば、フルオレセイン、ローダミン、テキサス・ レッド、等）、電子高密度試薬（例えば、金）、（ELISAにおいて一般に使用さ れるような）酵素、比色標識（例えば、コロイド状金）、磁気標識（例えば、Dy nabeads^TM）、その他を含む。直接的に検出されないが直接的に検出されること ができる標識の使用を通じて検出される標識の例は、ビオチン及びジオキシゲニ ン並びにハプテン及びタンパク質であって、それについて標識された抗血清又は モノクローナル抗体が利用可能であるものを含む。 使用される特定の標識は、それが、その染色のインサイチュー・ハイブリダイ ゼーションを妨害しない限り、本発明にとって決定的 なものではない。しかしながら、蛍光標識により直接的に標識された染色（例え ば、フルオレセイン−12−dUTP、テキサス・レッド−５−UTP、等）は、染色体 ハイブリダイゼーションのために好ましい。 本明細書中に使用するとき、直接的に標識付けされたプローブとは、それに、 検出可能な標識が付着されたプローブである。直接標識はプローブに既に付着さ れているので、検出可能な標識をプローブに会合させるためにその後の段階は全 く必要ない。これに対して、間接的な標識プローブは、検出可能な標識がその後 に、典型的には、それにプローブが標的核酸とハイブリダイズした後に結合され るところの部分を担持するプローブである。 さらに、上記標識は、できるだけ低いコピー数で検出され、それによりそのア ッセイの感度を最大化し、そしてさらにいずれかのバックグラウンド・シグナル の上で検出可能なものでなければならない。最後に、高く局在化されたシグナル を提供し、それにより染色体に対してその染色を物理的にマッピングするときに 高程度の空間的分解を提供する標識が選ばれなければならない。特に好ましい蛍 光標識は、フルオレセイン−12−dUTP及びテキサス・レッド−５−dUTPを含む。 上記標識は、当業者に知られたさまざまな手段において上記プローブに結合さ れることができる。好ましい態様においては、核酸プローブは、ニック・トラン スレーション又はランダム・プライマー伸長を使用して標識されるであろう(Rig by，et al．J.Mol.Biol.，113:237(1977)又はSambrook，et al.，Molecular Clo ning-A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Har bor，N.Y．(1985))。 当業者は、本発明のプローブが、ゲノムの標的20q13領域に絶対 的に特異的である必要はないということを理解するであろう。むしろ、上記プロ ーブは、“染色コントラスト”を作り出すことを意図される。“コントラスト” は、ゲノムの標的領域のプローブ強度とそのゲノムの他の部分のプローブ強度の 比により定量される。例えば、特定の染色体（例えば、第７染色体）をクローニ ングすることにより作製されるDNAライブラリーは、染色体全体を染色すること ができる染色として使用されることができる。このライブラリーは、その染色体 上にのみ存在する配列と他の染色体と共有される配列の両者を含む。染色体DNA のおおよそ半分が各クラスに分類される。ライブラリー全体のハイブリダイゼー ションが標的染色体上の結合部位の全てを飽和させることができた場合、その標 的染色体は、他の染色体の２倍の輝度（コントラスト比２）であろう。なぜなら 、それは、その染色における特定配列と共有配列の両方からのシグナルを含むで あろうし、一方、他の染色体は上記共有配列によってのみ染色されるであろうか らである。従って、染色内の上記共有配列のハイブリダイゼーションにおける控 えめな減少だけがそのコントラストを実質的に強化するであろう。従って、非標 的配列にのみハイブリダイズする配列、例えば、ライブラリー内の不純物は、上 記配列が有用なレベルの下までその染色コントラストを減少させない程度まで、 その染色において許容されることができる。 20q13 アンプリコンの検出 先に説明したように、20q13アンプリコン内の増幅の検出は、多数の癌の存在 及び／又は予後の指標である。これらは、非限定的に、胸、卵巣、膀胱、頭及び 首、及び結腸を含む。 好ましい態様においては、20q13増幅は、増幅についてスクリーンすることが 望ましいところの標的核酸（例えば、染色体サンプル）への本発明のプローブの ハイブリダイゼーションを通して検出さ れる。好適なハイブリダイゼーション形式は、当業者に周知であり、そして非限 定的に、サザン・ブロットのバリエーション、インサイチュー・ハイブリダイゼ ーション及び定量的増幅法、例えば定量的PCRを含む（例えば、Sambrook、前掲 、Kallioniemi et al.，Proc.Natl Acad Sci USA，89:5321-5325(1992)、及びPC R Protocols，A Guide to Methods and Applications，Innis et al.，Academic Press，Inc．N.Y..，(1990)を参照のこと。）。 インサイチュー・ハイブリダイゼーション 好ましい態様においては、20q13アンプリコンは、インサイチュー・ハイブリ ダイゼーションを使用して同定される。一般に、インサイチュー・ハイブリダイ ゼーションは、以下の主要な工程：（１）分析されるべき組織又は生物学的構造 の固定；（２）標的DNAの接近可能性を増加させ、そして非特異的結合性を減少 させるためのーヒ記生物学的構造の事前ハイブリダイゼーション；（３）上記核 酸混合物の、上記生物学的構造又は組織中の核酸へのハイブリダイゼーション； （４）上記ハイブリダイゼーションにおいて結合しなかった核酸断片を除去する ためのハイブリダイゼーション後洗浄；及び（５）上記ハイブリダイズされた核 酸断片の検出、を含む。上記各工程において使用される試薬及びそれらの使用条 件は、その特定の適用に依存して変化する。 いくつかの適用においては、反復配列のハイブリダイゼーション能力をブロッ クすることが必要である。この場合、ヒト・ゲノムDNAは、上記ハイブリダイゼ ーションをブロックするための剤として使用される。好ましいサイズ範囲は、２ 本鎖の、ニック・トランスレートされた核酸について、約200bp〜約1000bp、よ り好ましくは約400〜約800bpである。 本明細書中に開示される特定の適用のためのハイブリダイゼーシ ョン・プロトコールは、Pinkel et al．Proc.Natl.Acad.Sci．USA,85:9138-9142 （1988）及びEPO公開No.430,402中に記載されている。好適なハイブリダイゼー ション・プロトコールは、Methods o＼in Molecular Biology Vol.33:In Situ H ybridization Protocols，K.H.A．Choo，ed.，Humana Press，Totowa，New Jers ey，(1994)中にも在る。特に好ましい態様においては、Kallioniemi et al.，Pr oc.Natl Acad Sci USA，89：5321-5325(1992)のハイブリダイゼーション・プロ トコールが使用される。 典型的には、それぞれが異なる蛍光染料により標識付けされた２つのプローブ が使用されるところの２色FISHを使用することが望ましい。着目の領域にハイブ リダイズするテスト・プローブは１の染料により標識付けされ、そして異なる領 域にハイブリダイズする対照プローブは第２の染料により標識付けされる。着目 の染色体の安定部分、例えばその動原体領域にハイブリダイズする核酸は、しば しば、対照プローブとして最も有用である。この方法で、サンプル間のハイブリ ダイゼーション効率の差異を説明することができる。 染色体異常を検出するためのFISH法が、ナノグラム量の被験核酸に対して行わ れることができる。パラフィン包埋腫瘍切片を、新鮮又は凍結材料と同様に使用 する。FISHは限定された材料に適用されることができるので、培養されていない 原発性腫瘍から調製された捺印調製物（touch preparations）も使用することが できる。（例えば、Kallioniemi，A．et al.，Cytogenet．Cell Genet．60:190- 193（1992）を参照のこと。）。例えば、腫瘍からの小さな生検組織サンプルを 捺印調製物のために使用することができる（例えば、Kallioniemi，A．et al.， Cytogenet．Cell Genet．60:190-193（1992）を参照のこと。）。体液（例えば 、血液、尿、喀痰その他）中の吸引生検又は細胞から得られた少数の細胞も分析 することがで きる。出生前診断のためには、適当なサンプルは、羊水その他を含むであろう。 他の形式 多くのハイブリダイゼーション形式が本発明において有用である。例えば、サ ザン・ハイブリダイゼーションを使用することができる。サザン・ブロットにお いては、（典型的には、断片化され、そして電気泳動ゲル上で分離された）ゲノ ム又はcDNAは標的領域に特異的なプローブにハイブリダイズされる。 標的領域(例えば、20q13)のためのプローブからのハイブリダイゼーション・ シグナルの強度と、（増幅されていない）対照、例えば動原体DNAに向けられた プローブからのシグナルとの比較は、標的核酸の相対的なコピー数の推定を提供 する。 他の形式は、例えば、WO 96／17958中に記載されているような、核酸サンプル がそれにハイブリダイズされるところのプローブ又は標的のアレイを使用する。 本明細書中に使用するとき、“核酸アレイ”は、プローブ核酸にそれにハイブリ ダイズされるところの固体表面上に固定化された１以上の標的核酸分子を各々が 含む複数の標的要素である。標的要素の標的核酸は、典型的には、20q13アンプ リコン内にそれらの起源をもつ。標的要素の標的核酸は、例えば、本明細書中に 開示される特定の遺伝子又はクローンからの配列を含む。さまざまな寸法の標的 要素が本発明のアレイにおいて使用されることができる。一般的には、より小さ な、標的要素が好ましい。典型的には、標的要素は、直径約１cm未満であろう。 一般には、要素サイズは、１μｍ〜約３mm、好ましくは約５μｍ〜約１mmの間で ある。 上記アレイの標的要素は、異なる密度において上記固体表面上に配置されるこ とができる。標的要素の密度は、多くの要因、例えば 、標識の性質、固体支持体、その他に依存するであろう。当業者は、各標的要素 が異なる長さ及び配列をもつ標的核酸の混合物を含むことができるということを 理解するであろう。従って、例えば、標的要素は、DNAのクローン片の２以上の コピーを含むことができ、そして各コピーは異なる長さをもつ断片に分解される ことができる。本発明の標的配列の長さ及び複雑性は、本発明にとって決定的で はない。当業者は、上記要因を調節して、最適ハイブリダイゼーション及び所定 のハイブリダイゼーションについての最適シグナル生産を提供し、そして異なる 遺伝子又はゲノムの位置の間の要求分解能を提供することができる。典型的には 、標的配列は、約１kb〜約１Mbの間の、ときどき10kb〜約500kbの間の、そして 普通には約50kb〜約150kbの間の複雑さをもつであろう。 20q13 アンプリコンからの遺伝子内の突然変異の検出 本明細書中に開示されるcDNA配列は、対応の内因性遺伝子内の突然変異（例え ば、置換、挿入、及び欠失）を検出するために使用されることもできる。当業者 は、一般的に先に記載された核酸ハイブリダイゼーション技術が上記のたいてい の突然変異を検出するために適合することができるということを理解するであろ う。例えば、標的遺伝子の突然変異形態と野生型形態の間を区別するオリゴヌク レオチド・プローブが標準的なハイブリダイゼーション・アッセイにおいて使用 されることができる。いくつかの態様においては、ハイブリダイゼーション前に 標的配列のコピー数を高めるために（例えば、PCRを使用した）増幅を使用する ことができる。 20q13 アンプリコン・タンパク質を検出するためのアッセイ 先に示したように、本発明は、各種癌に関係する20q13アンプリコン内の遺伝 子のタンパク質産物を同定する。特に、20q13タンパク質が各種癌において過剰 発現されることが示された。20q13タン パク質の存在又は非存在及び／又は発現レベルは、癌の存在、非存在、又は程度 の指標であることができる。 20q13アンプリコン・タンパク質（例えば、ZABC1又はb1）は、当業者に周知の 多くの手段により検出され、そして定量されることができる。これらは、分析生 化学的方法、例えば電気泳動、キャピラリー電気泳動、高性能液体クロマトグラ フィー（HPLC）、薄層クロマトグラフィー(TLC)、超拡散（hyperdiffusion）ク ロマトグラフィー、その他、又はさまざまな免疫学的方法、例えば液体又はゲル 沈降素反応、免疫拡散（単一又は二重）、免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ (RIA)、酵素結合イムノソルベント・アッセイ（ELISAs）、免疫蛍光アッセイ、 ウェスタン・ブロッティング、その他を含むことができる。 １の好ましい態様においては、20q13アンプリコン・タンパク質を電気泳動タ ンパク質分離、例えは１次元又は２次元電気泳動において検出し、一方、最も好 ましい態様においては、20q13アンプリコン・タンパク質をイムノアッセイを使 用して検出する。 本明細書中に使用するとき、イムノアッセイは、アナライト（例えば、ZABC1 又は1b1タンパク質）に特異的に結合する抗体を使用するアッセイである。従っ て、イムノアッセイは、アナライトを単離し、標的とし、そして定量するための 他の物理的又は化学的特性の使用とは反対に、抗−20q13アンプリコン抗体(例え ば、抗−ZABC1又は抗−1b1)への20q13アンプリコン・タンパク質の特異的結合の 検出を特徴とする。 生物学的サンプルの採取及びその後の20q13アンプリコン・タンパク質につい てのテストを、以下、より詳しく討議する。 Ａ）サンプル採取及びプロセッシング 20q13アンプリコン・タンパク質は、好ましくは、哺乳類から、 より好ましくはヒト患者から又はブタ、ネズミ、ネコ、イヌ、又はウシから得ら れた生物学的サンプル中で定量される。本明細書中に使用するとき、生物学的サ ンプルは、20q13増幅に相関されることができる20q13アンプリコン・タンパク質 濃度を含む生物学的組織又は液体のサンプルである。特に好ましい生物学的サン プルは、非限定的に、生物学的液体、例えば、血液又は尿、又は非限定的に組織 生検（例えば、針生検）サンプルを含む組織サンプルを含む。 生物学的サンプルは、適当なバッファー溶液中での希釈により適宜前処理され 、又は必要により濃縮されることができる。生理学的pHにおいて、さまざまなバ ッファー、例えばホスフェート、トリスその他の中の１を使用する、多くの標準 的な水性バッファー溶液のいずれかを使用することができる。 Ｂ）電気泳動アッセイ 先に示したように、生物学的組織中の20q13アンプリコン・タンパク質の存在 又は非存在は、電気泳動方法を使用して測定されることができる。電気泳動技術 を使用するタンパク質の検出手段は当業者に周知である（一般に、R.Scopes（19 82）Protein Purification，Springer-Verlag，N.Y.;Deutscher，(1990)Methods in Enzymology Vol.182:Guide to Protein Purification.，Academic Press，I nc.，N.Y.）。好ましい態様においては、20q13アンプリコン・タンパク質は、１ 次元又は２次元電気泳動を使用して検出される。特に好ましい２次元電気泳動分 離は、１次元について固定化pHグラジエント及び２次元についてポリアクリルア ミド・ゲル中の等電焦束法(IEF)に頼る。このようなアッセイは、上記引用文献 中に及びPatton et al．(1990)Biotechniques 8:518により記載されている。 Ｃ）免疫学的結合アッセイ 好ましい態様においては、20q13アンプリコンは、多くの十分に認められた免 疫学的結合アッセイのいずれかを使用して検出され、そして／又は定量される（ 例えば、米国特許第4,366,241号；第4,376,110号；第4,571,288号；及び第4,837 ,168号を参照のこと。）。一般的イムノアッセイのレビューについては、Method s in Cell Biology Volume 37:Antibodies in Cell Biology，Asai，ed．Academ ic Press，Inc．New York(1993);Basic and Clinical Immunology 7th Edition ，Stites & Terr，eds．(1991)をも参照のこと。 免疫学的結合アッセイ（又はイムノアッセイ）は、典型的には、アナライト（ この場合20q13アンプリコン）に特異的に結合し、そしてしばしば固定化するた めに“捕獲剤”を使用する。この捕獲剤は、アナライトに特異的に結合する部分 である。好ましい態様においては、この捕獲剤は、20q13アンプリコン・タンパ ク質に特異的に結合する抗体である。 抗体(例えば、抗−ZABC1又は抗−1b1)は、当業者に周知の多数の手段の中のい ずれかにより製造されることができる（例えば、Methods in Cell Biology Volu me 37:Antibodies in Cell Biology ，Asai，ed．Academic Press，Inc．New Yo rk(1993);及びBasic and Clinical Immunology 7th Edition，Stites & Terr，e ds．(1991)を参照のこと。）。抗体は、抗体全体又は抗体断片であることができ る。それはポリクローナル又はモノクローナルであることができ、及びそれは、 20q13アンプリコン・プロテイン又はそれから得られたエピトープで生物（例え ば、マウス、ラット、等）をチャレンジすることにより製造されることができる 。あるいは、抗体は、組換えDNA方法を使用して新規に製造されることができる 。抗体は、20q13アンプリコンに対してスクリーンされたファージ表示ラ イブラリーから選ばれることもできる（例えば、Vaughan et al.（1996）Nature Biotechnology，14:309-314及びその中の引用文献を参照のこと。）。 イムノアッセイも、捕獲剤及びアナライトにより形成される結合複合体に特異 的に結合し、そして標識付けするためのラベリング剤をしばしば使用する。この ラベリング剤は、それ自体、抗体／アナライト複合体を含む部分の中の１である ことができる。従って、ラベリング剤は、標識された20q13アンプリコン・タン パク質又は標識された抗−20q13アンプリコン抗体であることができる。あるい は、このラベリング剤は、第３の部分、例えば、抗体／20q13アンプリコン・タ ンパク質複合体に特異的に結合する他の抗体であることができる。好ましい態様 においては、このラベリング剤は、標識を担持する第２のヒト20q13アンプリコ ン・タンパク質抗体である。あるいは、この第２の20q13アンプリコン・タンパ ク質抗体は標識を欠くことができるが、それは、次に、第２抗体がそれから得ら れるところの種の抗体に特異的な第３の抗体により結合されることができる。こ の第２のものは、検出可能な部分、例えばビオチンで修飾されることができ、そ れに第３の標識された分子、例えば酵素−標識ストレプトアビジンが特異的に結 合する。 免疫グロブリン定常領域に特異的に結合することができる他のタンパク質、例 えばプロテインＡ又はプロテインＧも、上記標識剤として使用されることができ る。これらのタンパク質は、連鎖球細菌の細胞壁の正常な構成成分である。それ らは、さまざまな種からの免疫グロブリン定常領域との強い非免疫原性の反応性 を示す。一般には、Kronval，et al.，J．Immunol.，111:1401-1406(1973)、及 びAkerstrom，et al.，J．Immunol.，135:2589-2542(1985)を参照のこと。 アッセイの全体にわたり、インキュベーション及び／又は洗浄工程が、試薬の 各コンビネーション後に要求されることができる。インキュベーション段階は、 約５秒〜数時間、好ましくは約５分〜約24時間、変化することができる。しかし ながら、インキュベーション時間は、アッセイ形式、アナライト、溶液容量、濃 度、その他に依存するであろう。通常、アッセイは、周囲温度において行われる であろう。但し、それらは、一定温度範囲にわたり、例えば、10℃〜40℃で行わ れることができる。 20q13アンプリコン・タンパク質を検出するためのイムノアッセイは、競合又 は非競合的なものであることができる。非競合的イムノアッセイは、捕獲された アナライト（この場合、20q13アンプリコン）の量が直接的に計測されることが できるようなアッセイである。１の好ましい“サンドイッチ”アッセイにおいて は、例えば、捕獲剤（抗−20q13アンプリコン・タンパク質抗体）が、それらが 固定化されているところの固体支持体に直接結合されることができる。これらの 固定化された抗体は、次に、テスト・サンプル中に存在する20q13アンプリコン ・タンパク質を捕獲する。このように固定化された20q13アンプリコンは、次に ラベリング剤、例えば標識を担持する第２ヒト20q13アンプリコン・タンパク質 抗体により結合される。あるいは、第２の20q13アンプリコン・タンパク質抗体 は標識を欠くことができるが、それは、次に、それから第２抗体が得られるとこ ろの種の抗体に特異的な標識された第３抗体により結合されることができる。第 ２のものは検出可能な部分、例えば、ビオチンにより修飾されることができ、そ れに、第３の標識分子、例えば酵素標識ストレプトアビジンが特異的に結合する ことができる。 ２．競合アッセイ形式 競合アッセイにおいては、サンプル中に存在するアナライト(20q13アンプリコ ン・タンパク質)の量は、サンプル中に存在するアナライトにより捕獲剤（例え ば、抗−ZABC1又は抗−1b1抗体）から変位され（又は離れて競合する）添加（外 因性）アナライト(20q13アンプリコン・タンパク質、例えばZABC1又は1b1タンパ ク質）を間接的に計測することにより計測される。１の競合アッセイにおいては 、この場合、20q13アンプリコン・タンパク質の既知量を、サンプルに添加し、 そしてサンプルを次に捕獲剤、この場合、20q13アンプリコン・タンパク質に特 異的に結合する抗体と接触される。この抗体に結合された20q13アンプリコン・ タンパク質の量は、サンプル中に存在する20q13アンプリコン・タンパク質の濃 度に反比例する。 特に好ましい態様においては、抗−20q13タンパク質抗体は固体支持体上に固 定化される。上記抗体に結合される20q13アンプリコン・タンパク質の量は、20q 13アンプリコン・タンパク質／抗体複合体中に存在する20q13アンプリコンの量 を計測するか、あるいは残った複合体非形成20q13アンプリコン・タンパク質の 量を計測することにより、測定されることができる。20q13アンプリコン・タン パク質の量は、標識された20q13アンプリコン・タンパク質を提供することによ り検出されることができる。 ハプテン阻害アッセイは、他の好ましい競合アッセイである。このアッセイに おいては、知られたアナライト、この場合20q13アンプリコン・タンパク質が固 体支持体上に固定化される。既知量の抗−20q13アンプリコン・タンパク質抗体 をサンプルに添加し、そしてサンプルを、次に固定化された20q13アンプリコン ・タンパク質と接触させる。この場合、固定化された20q13アンプリコン・タン パク質に結合された抗−20q13アンプリコン・タンパク質抗体の量 は、サンプル中に存在する20q13アンプリコン・タンパク質の量に反比例する。 再び、固定化された抗体の量が、抗体の固定化画分又は溶液中に残る抗体の画分 のいずれかを検出することにより検出されることができる。検出は、抗体が標識 されている場合、直接的であり、又は先に記載したように抗体に特異的に結合す る標識された部分のその後の添加により間接的であることができる。 ３．他のアッセイ形式 特に好ましい態様においては、ウェスタン・ブロット（イムノブロット）分析 がサンプル中の20q13アンプリコン・タンパク質の存在を検出し、そしてそれを 定量するために使用される。この技術は、一般に、分子量に基づくゲル電気泳動 によりサンプル・タンパク質を分離し、分離されたタンパク質を好適な固体支持 体、（例えば、ニトロセルロース・フィルター、ナイロン・フィルター、又は誘 導体化されたナイロン・フィルター）に移し、そして20q13アンプリコン・タン パク質に特異的に結合する抗体と共にサンプルをインキュベートすることを含む 。抗−20q13アンプリコン・タンパク質抗体は、固体支持体上の20q13アンプリコ ン・タンパク質に特異的に結合する。これらの抗体は、直接的に標識され、ある いは抗−20q13アンプリコン・タンパク質に特異的に結合する標識された抗体（ 例えば、標識されたヒツジ抗−マウス抗体）を使用してその後に検出されること かできる。 他のアッセイ形式は、リポソーム・イムノアッセイ(LIA)を含み、これは、特 定の分子（例えば、抗体）に結合するようにデザインされたリポソームを使用し 、そしてカプセル化された試薬又はマーカーを放出する。次にこの放出された化 学物質が標準的な技術に従って検出される(Monroe et al．(1986)Amer.Clin.Pro d.Rev．5:34-41を参照のこと。)。Ｄ）非特異的結合の減少 当業者は、イムノアッセイにおいて非特異的結合を減少させることがしばしば 望ましいということを理解するであろう。特に、アッセイが固体支持体上に固定 化された抗原又は抗体を含む場合、上記支持体への非特異的結合の量を最小化す ることが望ましい。このような非特異的結合を減少させる手段は、当業者に周知 である。典型的には、これは、タンパク質性組成物による上記支持体のコーティ ングを含む。特に、タンパク質組成物、例えばウシ血清アルブミン（BSA）、脱 脂粉末乳、及びゼラチンが広く使用される。粉末乳が最ら好ましい。 Ｅ）標識 上記アッセイにおいて使用される特定の標識又は検出可能な基は、それがその アッセイにおいて使用される抗体の比特異的結合を有意に妨害しない限り、本発 明の決定的側面ではない。検出可能な基は、検出可能な物理的又は化学的特性を もついずれかの材料であることができる。このような検出可能な標識は、イムノ アッセイの分野において十分に開発されており、そして一般に、このような方法 において有用な標識のほとんどが本発明に適用されることができる。従って、標 識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的又は化学的 手段により検出されることができるいずれかの組成物である。本発明において有 用な標識は、磁気ビーズ（例えば、Dynabeads^TM）、蛍光染料（例えば、フルオ レセイン・イソチオシアネート、テキサス・レッド、ローダミン、その他）、放 射標識（例えば、³Ｈ，¹²⁵Ｉ，³⁵Ｓ，¹⁴Ｃ、又は³²Ｐ）、酵素（例えば、ELISA において一般に使用される西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファ ターゼ、その他）、及び比色標識、例えばコロイド状金又は着色ガラス又はプラ スチック（例えば、ポリ スチレン、ポリプロピレン、ラテックス、等）ビーズを含む。 標識は、当業者に周知の方法に従ってアッセイの所望の成分に直接的又は間接 的に結合されることができる。先に示したように、多種多様の標識が使用される ことができ、標識の選択は、要求感度、化合物との結合容易性、安定性要求、利 用可能な計装、及び処分設備に依存する。 非放射性標識はしばしば間接手段により付着される。一般に、リガンド分子（ 例えば、ビオチン）は上記分子に共有結合される。次にリガンドは、固有に検出 可能であり又はシグナル系に共有結合された抗−リガンド（例えば、ストレプト アビジン）分子、例えば検出可能な酵素、蛍光化合物、又は化学ルミネセンス化 合物に結合する。多くのリガンド及び抗−リガンドを使用することができる。リ ガンドが天然の抗−リガンド、例えばビオチン、チロキシン、及びコルチゾール をもつ場合、それは、標識された、天然の抗−リガンドと共に使用されることが できる。あるいは、いずれかのハプテン又は抗原化合物が抗体と共に使用される ことができる。 分子は、例えば、酵素又は蛍光団(fluorophore)との抱合により、シグナル生 成化合物に直接的に抱合されることもできる。標識としての着目の酵素は、主と して、ヒドロラーゼ、特にホスファターゼ、エラスターゼ及びグリコシダーゼ、 又はオキシドレダクターゼ、特にペルオキシダーゼであろう。蛍光化合物は、フ ルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリ フェロン(umbelliferone)、等を含む。化学ルミネセント化合物は、ルシフェリ ン、及び２，３−ジヒドロフタラジンジオン、例えばルミノールを含む。使用さ れることができるさまざまな標識付け又はシグナル生成系のレビューについては 、米国特許第4,391,904号を参照のこと。 標識の検出手段は当業者に周知である。従って、例えば、標識が放射性標識で ある場合、検出手段は、シンチレーション・カウンター又はオートラジオグラフ ィーにおけるような写真フィルムを含む。標識が蛍光標識である場合、それは、 光の適当な波長により蛍光色素（fluorochrome）を励起し、そして得られた蛍光 を検出することにより検出されることができる。フルオレセインは、写真フィル ムにより、電気的検出装置、例えば電荷結合素子（CCDs）又は光電子増倍装置そ の他により視覚的に検出されることができる。同様に、酵素標識は、酵素のため の適当な基質を提供し、そして得られた反応生成物を検出することにより検出さ れることができる。最後に、単純な比色標識が、その標識に関係する色を単に観 察することにより検出されることができる。従って、さまざまな計量棒アッセイ において、抱合金はしばしばピンクを現し、一方、さまざまな抱合ビーズは、そ のビーズの色を現す。 いくつかのアッセイ形式は、標識された成分の使用を必要としない。例えば、 凝集アッセイは、標的抗体の存在を検出するために使用されることができる。こ の場合、抗原−コート粒子は、標的抗体を含むサンプルにより凝集される。この 形式においては、その成分のいずれも標識付けされる必要はなく、そして標的抗 体の存在は、簡単な視覚的検査により検出される。 Ｇ）基質 上述のように、アッセイに依存して、抗原、標的抗体、又は抗−ヒト抗体を含 むさまざまな成分が、固体表面に結合されることができる。さまざまな固体表面 への生体分子の多くの固体化方法が本分野において知られている。例えば、固体 表面は、膜（例えば、ニトロセルロース）、マイクロタイター皿（例えば、PVC 、ポリプロピレン、又はポリスチレン）、試験管（ガラス又はプラスチック）、 計量棒（例えば、ガラス、PVC、ポリプロピレン、ポリスチレン、ラテックス、 その他）、マイクロセントリフュージ管、又はガラス又はプラスチック・ビーズ であることができる。所望の成分は、非特異的結合を通じて共有結合又は非共有 結合されることができる。 多種多様な有機及び無機ポリマー、天然及び合成の両者が、固体表面のための 材料として使用されることができる。例示的なポリマーは、ポリエチレン、ポリ プロピレン、ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリメタクリレート、 ポリ（エチレン・テレフタレート）、レーヨン、ナイロン、ポリ（ビニル・ブチ レート）、ポリビニリデン・ジフルオリド（PVDF）、シリコーン、ポリホルムア ルデヒド、セルロース、酢酸セルロース、ニトロセルロースその他を含む。使用 されることができる他の材料は、紙、ガラス、セラミック、金属、メタロイド、 半導体材料、セメントその他を含む。さらに、ゲルを形成する物質も含まれ、例 えばタンパク質（例えば、ゼラチン）、リポ多糖、シリケート、アガロース及び ポリアクリルアミドを使用することができる。いくつかの水相を作るポリマー、 例えばデキストラン、ポリエチレン・グリコール又は界面活性剤、例えばリン脂 質、長鎖（12−24炭素原子）アルキル・アンモニウム塩その他も好適である。固 体表面が多孔性である場合、さまざまな多孔サイズがその系の性質に依存して使 用されることができる。 表面の調製においては、複数の異なる材料が、特にラミネートとして、さまざ まな特性を得るために使用されることができる。例えば、タンパク質コーティン グ、例えばゼラチンが、非特異的結合を回避し、共有結合を単純化し、シグナル 検出を強化する等のために使用されることができる。 化合物と表面の間の共有結合が望ましい場合、その表面は、通常、多官能価で あり又は多官能性にされることができるであろう。表 面上に存在し、そして結合のために使用されることができる官能基は、カルボン 酸、アルデヒド、アミノ基、シアノ基、エチレン基、ヒドロキシル基、メルカプ ト基その他を含むことができる。多種多様な化合物をさまざまな表面に結合させ るやり方は、周知であり、そして文献中に十分に説明されている。例えば、Immo bilized Enzymes，Ichiro Chibata，Halsted Press，New York，1978、及びCuat recasas（1970）J.Biol.Chem．2453059を参照のこと。 共有結合に加え、アッセイ成分に非共有結合するさまざまな方法を使用するこ とができる。非共有結合は、典型的には、表面への化合物の非特異的吸収である 。典型的には、その表面は、標識されたアッセイ成分の非特異的結合を防止する ために第２の化合物によりブロックされる。あるいは、表面は、それが１成分に 非特異的に結合するが他に有意に結合しないように、デザインされる。例えば、 レクチン、例えばコンカナバリンＡを担持する表面は、炭水化物含有化合物に結 合するが、グリコシル化を欠く標識タンパク質に結合しないであろう。アッセイ 成分の非共有結合における使用のためのさまざまな固体表面が米国特許第4,447, 576号及び第4,254,082号中に概説されている。 20q13 アンプリコン・プローブを含有するキット 本発明は、20q13における染色体異常の検出のための診断キットをも提供する 。好ましい態様においては、キットは、本明細書中に記載する20q13アンプリコ ンに対する１以上のプローブ及び／又は20q13アンプリコンに対する抗体(例えば 、抗−ZABC1又は抗−1b1)を含む。キットは、さらに、ブロッキング・プローブ 、20q13アンプリコンの検出においてそのキット内容物をどのように使用するか を説明する指示書等を含む。キットは、以下の：プローブの検出を容易にするた めのさまざまな標識又は標識付け剤、バッファー、 分裂中期スプレッド、ウシ血清アルブミン(BSA)及び他のブロッキング剤を含む ハイブリダイゼーションのための試薬、細い針、綿棒、アスピレーターその他を 含むサンプル・デバイス、ポジティブ及びネガティブ・ハイブリダイゼーション ・コントロール等の中の１以上をも含むことができる。 cDNA クローンの発現 当業者は、本明細書中に開示するcDNAクローンにより、又は組換え操作された 細胞、例えばバクテリア、酵母、昆虫（特にバキュロウイルス・ベクターを使用 したもの）、又は哺乳類細胞内でゲノム配列のcDNA部分をサブクローニングする ことによりコードされた所望のポリペプチドを発現させることができる。当業者 は、cDNAsの発現のために利用されることができる多くの発現系においてよく知 っているということが予想される。原核又は真核生物内でのタンパク質の発現の ために知られたさまざまな方法を詳細に説明することを行わない。 簡単に言えば、本発明のポリペプチドをコードする中性又は合成核酸の発現は 、典型的には、DNA又はcDNAを（構成的又は誘導的である）プロモーターに作用 可能な状態で連結し、その後、発現ベクター内に取り込むことにより、達成され るであろう。ベクターは、原核生物又は真核生物内での複製及び組み込みのため に好適であることができる。典型的な発現ベクターは、ポリペプチドをコードす るDNAの発現の調節のために有用な転写及び翻訳ターミネーター、開始配列、及 びプロモーターを含む。クローン化遺伝子の高レベル発現を得るために、少なく とも、転写を指令するための強プロモーター、翻訳開始のためのリボソーム結合 部位、及び転写／翻訳ターミネーターを含む発現プラスミドを構築することが望 ましい。 E．coliにおける上記目的のために好適な調節領域の例は、Yano fsky，C.，1984，J.Bacteriol.，158:1018-1024により記載されたようなE．coli トリプトファン生合成系路のプロモーター及びオペレーター領域、及びHerskowi tz，I．and Hagen，D.，1980，Ann.Rev.Genet.，14:399-445により記載されたよ うなラムダ・ファージの左側プロモーター（Ｐ_L）である。E．coli内に形質転換 されたDNAベクター内に選択マーカーを入れることも有用である。このようなマ ーカーの例は、アンピシリン、テトラサイクリン、又はクロラムフェニコールに 対する耐性を特定する遺伝子を含む。E．coli，Bacillus種（Palva，I et al.， 1983，Gene 22:229-235;Mosbach，K．et al．Nature，302:543-545）を使用した 発現系を利用することができる。E．coli系が好ましい。 原核細胞により製造されるポリペプチドは、必ずしも正しく折り畳まれないか もしれない。E．coliからの精製の間、発現されたポリペプチドは、まず、変性 され、そして次に再生されることができる。これは、攪乱剤、例えば、グアニジ ンHC1中でバクテリアにより製造されたタンパク質を可溶化し、そして還元剤、 例えばベーターメルカプトエタノールで全てのシステイン残基を還元することに より達成されることができる。ポリペプチドは、次に、遅い透析により又はゲル 濾過により、再生される。米国特許第4,511,503号。 さまざまな真核発現系、例えば酵母、昆虫細胞系及び哺乳類細胞が当業者に知 られている。以下に簡単に説明するように、ポリペプチドは、上記真核系におい て発現されることもできる。 酵母内での異種タンパク質の合成は周知であり、そして記載されている。Meth ods in Yeast Genetics，Sherman，F.，et al.，Cold Spring Harbor Laborator y，(1982)は、酵母内でポリペプチドを製造するために利用することができるさ まざまな方法を記載するよく理解された仕事である。YEp6，YEp13，YEp4のよう な多くの酵母 発現プラスミドをベクターとして使用することができる。着目の遺伝子は、さま ざまな酵母ベクター内でプロモーターのいずれかに融合されることができる。上 述のプラスミドは、文献中によく記載されている（Botstein，et al.，1979，Ge ne，8:17-24;Broach，et al.，1979，Gene，8:121-133）。 ポリペプチドの製造のために有用な細胞培養のために例証となるものは、昆虫 又は哺乳類起源の細胞である。哺乳類細胞系は、しばしば、単層の細胞形態にあ るであろう。但し、哺乳類細胞懸濁液も使用されることができる。哺乳類細胞系 の実例となる例は、VERO及びHeLa細胞、チャイニーズ・ハムスター卵巣(CHO)細 胞系、W138，BHK，Cos-7又はMDCK細胞系を含む。 先に示したように、ベクター、例えば、宿主細胞を形質転換するために使用さ れるプラスミドは、好ましくは、抗原遺伝子配列の転写を開始するためのDNA配 列及びその翻訳を制御するための配列を含む。これらの配列は、発現制御配列と いわれる。宿主細胞が昆虫又は哺乳類起源をもつとき、実例となる発現制御配列 は、しばしば、SV-40プロモーター(Science，222:524-527，1983)、CMV I.E.プ ロモーター(Proc.Natl.Acad.Sci．81:659-663，1984)又はメタロチオネイン・プ ロモーター(Nature 296:39-42，1982)から得られる。上記発現制御配列を含むク ローニング・ベクターは、本分野において周知の手段により、制限酵素を使用し て解裂され、そして必要により又は所望によりサイズを調整され、そして所望の DNAによりライゲートされる。 酵母に関しては、高等動物宿主細胞が使用されるとき、知られた哺乳類遺伝子 からのポリアデニレーション又は転写ターミネーター配列がそのベクター内に取 り込まれる必要がある。ターミネーター配列の例は、ウシ成長ホルモン遺伝子か らのポリアデニレーション 配列である。転写物の正しいスプライシングのための配列も含まれることができ る。スプライシング配列の例は、SV40からのVP1イントロンである（Sprague，J ．et al.，1983，J.Virol．45:773-781）。 さらに、宿主細胞内で複製を制御するための遺伝子配列、例えばウシ乳頭腫ウ イルス型ベクター内に在るものが、ベクター内に取り込まれることができる。Sa veria-Campo，M.，1985，“Bovine Papilloma virus DNA a Eukaryotic Cloning Vector”in DNA Cloning Vol.II a Practical Approach Ed．D.M.Glover，IRL Press，Arlington，Virginia pp.213-238。 cDNAs 及びそれらの遺伝子産物の治療的用途及びその他の用途 本発明のcDNA配列及びポリペプチド産物は、cDNAsに対応する内因性遺伝子の 遺伝子産物の活性を調節するために使用されることができる。遺伝子産物の活性 を調節することにより、それらの発現に関係する又は発現を欠く病理学的条件が 処理されることができる。当業者に周知の多くの技術の中のいずれも上記目的の ために使用されることができる。 本発明のcDNAsは、特に、さまざまな癌、例えば、胸、卵巣、膀胱、頭及び首 、及び結腸の癌の治療のために使用される。他の疾患も本発明の配列により治療 されることができる。例えば、上記のように、GCAP（配列番号：６）は、サイク リックAMPの生合成に関係するグアニノ・シクラーゼ活性化タンパク質をコード する。サイクリックAMPの生合成に関係する遺伝子内の突然変異は、遺伝性網膜 変性疾患に関連することが知られている。これらの病気は、網膜構造の進行性の 両側性の変性が網膜機能の損失を導くところの一群の遺伝性の症状である。これ らの病気は、年齢に関係する黄斑変性、老齢者における視力低下の主原因；Lebe r's先天性黒内障、その犠 牲者が生まれつきの盲になることを引き起こすもの；及び色素性網膜炎（“RP” ）、遺伝性盲の最も一般的な形態の中の１つ、を含む。RPは、網膜視細胞（桿体 及び錐体）の損失を特徴とする遺伝性網膜症に与えられた名前であり、ここで、 光フラッシュへの網膜の電気的応答（すなわち、網膜電図、又は“ERGs”）は振 幅において減少される。 異なる網膜変性における網膜視細胞の損失又は細胞死のメカニズムは十分に理 解されていない。多くの異なる遺伝子内の突然変異は、ヒトRPの異なる形態にお ける原発性遺伝病変として同定されている。影響受ける遺伝子は、ロドプシン、 cGMPのアルファ及びベータ・サブユニット、及びペリフェリン−RDSを含む(Dryj a，T.P．et al.，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci．36，1197-1200(1995))。全ての ケースにおいて、特定の原発性遺伝子突然変異に拘らず、失調の顕示は類似して おり、視細胞の変性及び盲目をもたらす。 網膜変性の動物モデルに対する研究は、最近10年間多くの実験室の焦点であっ た。盲目を導く突然変異のいくつかにおいて変更されたメカニズムが明らかにさ れてきた。これは、rdマウスの遺伝性失調を含むであろう。rd遺伝子は、cGMP− ホスホジエステラーゼ(PDE)のベータ・サブユニットをコードする（Bowes，C．e t al.，Nature 347，677-680(1990)）、正常な視覚の働きにおいて基本的に重要 な酵素をコードする。なぜなら、それは、光変換において生じる事件のカスケー ドにおける重要な成分であるからである。 本発明のcDNAsによりコードされたポリペプチドは、ポリクローナル又はモノ クローナルの抗体を生じさせるための免疫原として使用されることができる。抗 体は、診断目的のために上記ポリペプチドを検出するために、上記ポリペプチド を阻害するための治療剤として、又は免疫毒における標的分子として、使用され ることができ る。所望の抗原に対するモノクローナル抗体の製造は当業者に周知であり、そし て本明細書中には詳細にレビューされない。 当業者は、さまざまな免疫グロブリン分子の製造及び操作のための多くの方法 が在るということを認めている。本明細書中に使用するとき、用語“免疫グロブ リン”及び“抗体”とは、免疫グロブリン遺伝子により実質的にコードされた１ 以上のポリペプチドから成るタンパク質をいう。免疫グロブリンは、抗体に加え てさまざまな形態で存在し、例えば、Fv，Fab，F(ab)₂、を含み、そして一本鎖 で存在することができる。モノクローナル抗体を生じさせるために、免疫感作さ れた動物（例えば、マウス）から得られた抗体産生細胞を不死化し、そしてスク リーンし、又はまず所望の抗体の生産についてスクリーンし、そして次に不死化 する。モノクローナル抗体生産の一般的手順の討議については、Harlow and Lan e，Antibodies，A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Publications，N.Y. （1988）を参照のこと。 上記技術により作られた抗体は、本明細書中に開示する核酸からの遺伝子産物 の発現を検出し、そして定量するための免疫診断アッセイにおいて使用されるこ とができる。例えば、本発明のポリペプチドに対する標識されたモノクローナル 抗体は、生物学的サンプル中の発現レベルを検出するために使用されることがで きる。診断的イムノアッセイにおける一般的手順のレビューのためには、Basic and Clinical Immunology 7th Edition D.Stites and A.Terr ed.(1991)を参照 のこと。 本発明のポリヌクレオチドは、当業者に周知の遺伝子治療のために特に有用で ある。本明細書中に使用されるとき遺伝子治療とは、それにより遺伝子発現が細 胞内で変更されることができるところの多数の技術をいう。このような方法は、 例えば、リボザイムをコー ドするDNA又は発現を阻害するためのアンチセンス核酸の導入並びに（例えば、 網膜変性を治療するための野生型GCAP遺伝子を使用した）突然変異遺伝子を置き 替えるための機能的な野生型遺伝子の導入を含む。多くの好適なウイルス・ベク ターが知られている。このようなベクターは、レトロウイルス・ベクター(Mille r，Curr.Top.Microbiol.Immunol．158:1-24(1992);Salmons and Gunzburg，Huma n Gene Therapy 4：129-141(1993);Miller et al.，Methods in Enzymology 217 :581-599，(1994))及びアデノ−関連ベクター（Carter，Curr.Opinion Biotech ．3:533-539(1992):Muzcyzka，Curr.Top.Microbiol.Immunol．158:97-129（1992 ）中に概説されたもの）を含む。上記方法において使用されることができる他の ウイルス・ベクターは、アデノウイルス・ベクター、ヘルペス・ウイルス・ベク ター及びSindbisウイルスベクターを含み、一般には、例えば、Jolly，Cancer G ene Therapy 1:51-64(1994):Latchman，Molec.Biotechnol．2:179-195(1994);及 びJohanning et al.，Nucl.Acids Res．23:1495-1501(1995)中に記載されている 。 リポソームを介して異種プロモーターエンハンサー要素に結合された核酸のデ リバリーも知られており（例えば、Brigham，et al．(1989)Am.J.Med.Sci.，298 :278-281;Nabel，et al．(1990)Science，249:1285-1288;Hazinski，et al．(19 91)Am.J.Resp.Cell Molec.Biol.，4:206-209及びWang and Huang（1987）Proc.N atl.Acad.Sci．(USA)，84:7851-7855を参照のこと。）；これは、リガンド−特 異的、カチオン−ベースの輸送システムと組み合される(Wu and Wu（1988）J.Bi ol.Chem.，263:14621-14624)。裸のDNA発現ベクターも記載されている（Nabel e t al．(1990)、前掲）；Wolff et al．(1990)Science，247:1465-1468)。 本発現の核酸及びコードされたポリペプチドは、内因性遺伝子又 はそれらの遺伝子産物を阻害するために直接的に使用する。例えば、阻害性核酸 は相補的核酸配列に特異的に結合するために使用されることができる。適当な標 的配列への結合により、RNA-RNA，DNA-DNA、又はRNA-DNA ２本鎖が形成される。 これらの核酸は、しばしば“アンチセンス”といわれる。なぜなら、それらは、 通常その遺伝子のセンス又はコーディング鎖に相補的であるからである。但し、 “センス”核酸の使用のためのアプローチも開発されている。用語“阻害性核酸 ”とは本明細書中に使用するとき、“センス”核酸と“アンチセンス”核酸の両 者をいう。阻害性核酸法は、異なるメカニズムにより働く特定の遺伝子の発現を 変更させるための多数の異なるアプローチを包含する。 簡単に言えば、阻害性核酸治療アプローチは、DNA配列を標的とするもの、(プ レmRNA及びmRNAを含む)RNA配列を標的とするもの、タンパク質を標的とするもの （センス鎖アプローチ）、及び標的核酸の解裂又は化学的修飾を引き起こすもの （リボザイム）に分類されることができる。これらの異なるタイプの阻害性核酸 技術は、例えば、Helene，C．and Toulme，J．（1990）Biochim.Biophys.Acta. ，1049:99-125中に記載されている。 c-myc mRNAの領域に相補的な阻害性核酸は、プロトオンコジーン（protoncoge ne）を過剰発現する、ヒト前骨髄球性白血病細胞系、HL60内でのc-mycタンパク 質の発現を阻害することが示されている。Wickstrom E.L.，et al.，(1988)PNAS (USA)，85:1028-1032及びHarel-Bellan，A.，et al.，(1988)Exp.Med.，168:230 9-2318を参照のこと。 本発明のコードされたポリペプチドは、例えば、タンパク質とそのタンパク質 により特異的に認識される第２分子の間の相互作用を阻害することにより内因性 タンパク質を阻害する（ペプチト又は非 ペプチド）分子をデザインするためにも使用されることができる。このような分 子のデザイン方法は当業者に周知である。 例えば、コードされたタンパク質との配列同一性をもち又はその配列の（保存 的又は非保存的）修飾を含むことができるポリペプチドをデザインすることがで きる。例えば、それらのインビボにおける安定性を変えるために、上記修飾を選 ぶことができる。例えば、ペプチド内の１以上のＤ−アミノ酸の含有は、典型的 には、特にそのＤ−アミノ酸残基がそのペプチド配列の１又は両末端で置換され る場合、安定性を高める。 ポリペプチドは、他の分子への結合により修飾されることもできる。例えば、 異なるＮ−又はＣ−末端基がその分子の物理的及び／又は化学的特性を変えるた めに導入されることができる。このような変更は、例えば、接着、安定性、生物 学的利用能、その分子の位置決め又は検出に影響を及ぼすために、使用されるこ とができる。診断目的のためには、多種多様な標識がそれの末端に結合されるこ とができ、これが、直接的又は間接的に、検出可能なシグナルを提供することが できる。従って、ポリペプチドは、生物学的活性を未だ保存しながらさまざまな 最終目的のためにさまざまな方法で修飾されることができる。 実施例 以下の実施例は本発明を非限定的に説明するために提供される。 実施例１ 胸癌における染色体領域20q13の増幅の予後的意味 患者及び腫瘍材料 腫瘍サンプルを、Tampere University又はCity Hospitalsで1987〜1992年の間 に胸癌のために外科手術を受けた152人の女性から得 た。142サンプルは原発性胸癌腫由来であり、そして11は転移腫瘍由来であった 。原発性腫瘍と局所転移の両者からの試料が１の患者から入手できた。インサイ チュー又は粘液性の癌腫であった10の原発性腫瘍を上記材料から除外した。なぜ なら、それらの試料はFISH試験のために不適当であると考えられたからである。 残る132の原発性腫瘍の中で、128が浸潤管であり、４つが小葉癌腫であった。患 者の年齢は29〜92歳の範囲にあった（平均61）。臨床的な追跡は129人の患者に おいて可能であった。中央値の追跡期間は45ケ月であった(1.4〜1.77ケ月の範囲 )。放射線治療は129患者の内77人に与えられた（51人の患者は陽性の、そして26 人は陰性のリンパ節をもっていた）、そして全身的アジュバント治療を36人の患 者に対して行った（33人は内分泌、そして３人は細胞毒性化学療法であった）。 原発性腫瘍のサイズと腋窩節併発が、腫瘍−節転移(TNM)分類に従って測定され た。組織病理学的診断を、世界保健機構（11）に従って評価した。癌腫は、Bloo m and Richardson，Br.J.Cancer，1１：359-377（1957）に従う、癌細胞の管状 配置、異型核、及び有糸分裂の又は濃色核図に基づき格付けされた。 外科的生検試料を、15分以内の除去で、−70℃で凍結させた。クリオスタット 切片（５〜６μｍ）を、術中の組織病理学的診断のために調製し、そして追加の 薄い切片を、免疫組織化学的試験のために切断した。１の隣接200μｍ厚の切片 を、DNAフロー・サイトメトリー及びFISH試験のために切断した。 FISH のための細胞調製 上記生検試料が高い割合の腫瘍細胞を含むという組織学的証明の後に、核を、 DNAフロー・サイトメトリーのための修正Vindelov手術に従って200μｍの冷凍切 片から単離し、Hyytinen et al.，Cytometry 16:93-99（1994）により記載され たようにFISH分析のため にスライド上に固定し、そして滴下した。包皮線維芽細胞を、増幅試験において ネガティブ・コントロールとして使用し、そしてＧ１期の濃縮された静止核を得 るために集密において細胞を収穫することにより調製した。全てのサンプルを、 メタノール一酢酸（３：１）中で固定した。 プローブ 20q13領域にマッピングする５つのプローブを使用した（Stokke，et al.，Gen omics，26:134-137(1995)を参照のこと）。上記プローブは、メラノコルチン− ３−レセプターのためのＰ１−クローン（プローブMC3R、p-armテロメア(Flpter 0.81)からの部分的な長さ）及びホスホエノールピルベート・カルボキシ・キナ ーゼ（PCK，Flpter 0.84）、並びに無名コスミド・クローンRMC20C026（Flpter 0.79）を含む。さらに、RMC20C001(Flpter 0.825)及びRMC20C030（Flpter 0.85 ）を使用した。プローブRMC20C001は、最大増幅の領域を定めることが先に示さ れている(Tanner et al.，Cancer Res，54:4257-4260(1994))。近位p-armにマッ ピングする１のコスミド・プローブ、RMC20C038(FLpter 0.237)を、染色体−特 異的参照プローブとして使用した。テスト・プローブを、ビオチン−14−dATPで 、そして上記参照プローブをジゴキシゲニン−11−dUTPで、ニック・トランスレ ーションを使用して、標識付けした（Kallioniemi et al.，Proc.Natl Acad Sci USA，89:5321-5325(1992)）。 フルオレセイン・インサイチュー・ハイブリダイゼーション ２色FISHを、本質的に（同書に）記載したように、ビオチン−標識付けされた 20q13−特異的プローブ及びジゴキシゲニン−標識付けされた20ｐ参照ブローブ を使用して行った。腫瘍サンプルを、ハイブリダイゼーションに先立って４℃で ５分間、４％パラホルムア ルデヒド／ホスフェート緩衝液化生理食塩水中で事後固定（post fixed）し、70 ％、85％及び100％エタノール中で脱水し、風乾させ、そして80℃で30分間イン キュベートした。スライドを、72〜74℃で３分間70％ホルムアミド／２×標準生 理シトレート溶液中で変性させ、その後、プロティナーゼＫ(0.5μｇ／ml)消化 を行った。ハイブリダイゼーション混合物は、18ngの各標識プローブ及び10μｇ のヒト胎盤DNAを含んでいた。ハイブリダイゼーション後、上記プローブを、ア ビジン−FITC及び抗−ジゴキシゲニン・ローダミンにより免疫化学的に検出した 。スライドは、アンチフェード（antifade）溶液中0.2μＭの４，６−ジアミジ ノ−２−フェニルインドールにより対比染色された。 静止核内のシグナルの蛍光顕微鏡及び格付け ２重バンド−バス・フィルター(double band-bass filters)(Chromatechnolog y，Brattleboro，Vermont，USA)及び63×対物レンズ（NA1.3）を備えたNikon蛍 光顕微鏡を、FITC及びローダミン・シグナルの同時可視化のために使用した。DA PI対比染色に基づく無傷の形態をもつ少なくとも50の非重複核を、テスト及び参 照プローブ・ハイブリダイゼーション・シグナルの数を測定するために格付けし た。腫瘍を浸潤する白血球を分析から除外した。正常な線維芽細胞静止核への対 照ハイブリダイゼーションを、プローブが単一コピーの標的を認識すること及び テスト及び参照プローブのハイブリダイゼーション効率が同様であることを確か めるために、行った。 格付け結果を、細胞当りのハイブリダイゼーション・シグナルの平均数として 、及び平均増幅レベル（＝参照プローブ・シグナルの数に対するシグナルの数平 均）として表した。 DNA フロー・サイトメトリー及びステロイド・レセプター分析 DNAフロー・サイトメトリーを、Kallioniemi，Cytometry 9:16 4-169(1988)により記載されたように冷凍200μｍ切片から行った。分析を、EPIC S Cフロー・サイトメーター(Coulter Electronics Inc.，Hialeah，Florida，US A)及びMulti Cycleプログラム（Phoenix Flow Systems，San Diogo，California ，USA）を使用して行った。（20％を超える細胞における）1.07を超えるDNA−係 数を、DNA異数性のための基準として使用した。DNA異数体ヒストグラムにおいて 、異数体クローンからのみＳ−相を分析した。細胞サイクルの評価は、腫瘍の86 ％(102／126)において成功であった。 エストロゲン（ER）とプロゲステロン（PR）レセプターは、先に記載したよう に（17）クリオスタット切片から免疫組織化学的に検出された。染色結果は、半 定量的に評価され、そして100以上のヒストスコア（histoscore）がERとPRの両 者について陽性であると考えられた（17）。 統計的方法 分割表(contingency table)を、傾向についてのｘ²検定（Chisquare）により 分析した。Ｓ期画分（連続変数）と20q13増幅の間の関係を、クルスカル−ウオ リス（Kruskal-Wallis）テストにより分析した。無疾患生存者の分析を、BMDPIL プログラム及びMantel-Coxテストを使用して行い、そしてコックスの比例危険モ デル(Cox's proportional hazards model(BMDP2Lプログラム))を、多変量回帰分 析において使用した(Dixon BMDP Statistical Software London，Berkeley，Los Angeles:University of California Press，(1981))。 蛍光インサイチュー・ハイブリダイゼーションによる原発性胸癌腫における20 q13の増幅 最小領域プローブRMC20C001を、20q13増幅を評価するためにFISH分析において 使用した。FISHを、個々の腫瘍細胞における合計シ グナル数を分析し、かつ、平均増幅レベル（20ｐ−参照プローブに対するRMC20C 001プローブによる平均コピー数）を測定するために使用した。さらに、腫瘍核 内のシグナル数の分布をも評価した。腫瘍を３つのカテゴリー：増幅なし、低レ ベルの増幅、及び高レベルの増幅、に分類した。増幅なしとして分類された腫瘍 は、p-arm対照に比較して、RMC20C001の1.5倍未満のコピー数を示した。低レベ ル増幅をもつとして分類されたものは、1.5〜３倍の平均増幅レベルをもってい た。３倍を超える平均増幅レベルを示す腫瘍を、高増幅されたものとして分類し た。 高増幅された腫瘍は、しばしば、個々の腫瘍細胞内で40までのシグナルをもつ 広範な腫瘍内異質性を示した。高増幅腫瘍においては、RMC20C001プローブ・シ グナルは、FISHによりクラスターにおいて常に配置され、このことは、例えば、 タンデム・アレイにおいて互いに近接して増幅されたDNA配列の位置を示してい る。低レベル20q13増幅は、132原発性腫瘍の中の29（22％）において発見され、 一方、９ケース(6.8％)は高レベル増幅を示した。従って、20q13において増加さ れたコピー数の合計普及率は29％(38／132)であった。 増幅の最小領域の定義 RMC20C001に隣接する４つのプローブの平均コピー数が、９つの高増幅腫瘍に おいて測定された。テストされたフランキング・プローブは、メラノコルチン− ３−レセプター(MC3R，FLpter 0.81)、ホスホエノールピルベート・カルボキシ キナーゼ(PCK，0.84)、RMC20C026(0.79)及びRMC20C030(0.85)であった。上記ア ンプリコンのサイズ及び位置は、腫瘍間で僅かに変化したが、RMC20C001は、９ つのケースの全てにおいて一貫して高増幅された唯一のプローブであった。20q13 増幅と病理学的及び生物学的特徴との関係 20q13増幅は、腫瘍の高い組織学的等級と有意に関係していた（ｐ＝0.01）。 この相関は、中程度及び高く増幅された腫瘍の両者において見られた（表４）。 20q13の増幅も、DNAフロー・サイトメトリーにより測定されるとき異数性と有意 に関係した（ｐ＝0.01、表４）。Ｓ期画分中の細胞のパーセンテージとして計測 された、平均細胞増殖活性は、増幅なし、低レベル増幅及び高レベル増幅をもつ 腫瘍における増幅のレベルと共に増加した(Kruskal-Wallisテストによりｐ＝0.0 085)(表４)。患者の年齢、原発性腫瘍のサイズ、腋窩節又はステロイド・ホルモ ン−レセプター状態との関係は見つからなかった（表４）。 ^1.Kruskal-Wallisテスト 20q13 増幅と無疾患生存の間の関係 高レベル20q13増幅をもつ患者の無疾患生存は、増幅なし又はほんの低レベル 増幅をもつ患者についてのものよりも有意に短かかった（ｐ−0.04）。中程度に 増幅された腫瘍をもつ患者の無疾患生存 は、増幅をもたない患者のものと有意差はなかった。節陰性患者（ｎ＝９）の中 では、腫瘍サイズER，PR等級（格付け）、多数性及びＳ期画分についての調整後 の多変量Cox’回帰分析においてさえ(ｐ＝0.026)、高レベル20q13増幅は、より 短い無疾患生存についてのより高い有意な予後的因子であった(ｐ＝0.002)。 転移胸腫瘍における20q13増幅 11の転移胸腫瘍の中の２は、１の低レベルと１の高レベル20q13増幅をもって いた。従って、転移腫瘍における増幅した20q13コピー数の合計普及率（27％） は、原発性腫瘍において観察されたものと同様であった。原発性と転移腫瘍試料 の両者が、患者の中の１人から入手できた。この29歳の患者は、全乳房切除後８ ケ月目に胸筋浸潤転移に発展した。この患者は、乳房切除後にアジュバント又は 放射線療法を受けなかった。原発性腫瘍における腫瘍細胞の大部分は、低レベル 増幅を示した。但し、個々の腫瘍細胞（合計の５％未満）は、FISHにより細胞当 り８〜20コピーを含んでいた。これに対し、転移からの腫瘍細胞の全てが高レベ ルの20q13増幅（細胞当り12〜50コピー）を示した。参照プローブの絶対コピー 数は同一のままであり、このことは、高レベル増幅が増加した異数性程度の結果 ではなかったということを示唆するものである。 20q13 増幅の診断的及び予後的価値 本発見は、新たに発見された20q13増幅が特定の胸癌腫の遺伝的進行経路の重 要な成分であることができるということを示唆している。特に、これまでの実験 は：１）腫瘍の７％において検出された高レベル20q13増幅が、節陰性胸癌患者 における減少された無疾患生存と、そして高悪性可能性をもつ間接的な指標、例 えば高等級及びＳ期画分と有意に関係したこと、２）より一般的である低レベル 増幅も、攻撃性腫瘍の臨床病理学的特徴と関係するが予後的には重 要ではなかったこと、３）RMC2OC001の増幅レベルが近くの候補遺伝子及び座の 増幅よりも高く残り、これが新規オンコジーンがRMC20C001の近傍に位置すると いうことを示していること、を確立している。 高レベル20q13増幅は、他の胸癌オンコジーン、例えば、ERBB2（17q12）及びC yclin-D(11q13)のいくつかについて報告された増幅頻度よりもいくぶん低い、20 q13増幅の３倍以上高いコピー数の存在により定義される（Borg et al.，Oncoge ne，6:137-143（1991），Van de Vijver et al．Adv.Canc.Res.，61:25-56(1993 )）。しかしながら、上記の他のオンコジーンをもって先に発見されているもの と同様に(Swab，et al.，Genes Chrom.Canc.，1:181-193(1990)、高レベルの20q 13増幅は、高等級の又は高いＳ−期画分をもつ腫瘍において、及び乏しい予後に おいて、より一般的である。ほんの少しの数の節陰性患者が分析されたけれども 、我々の結果は、20q13増幅が予後指標として独立の役割をもっているかもしれ ないということを示唆する。大きな患者材料における上記問題に向けられた研究 が正当化される。その上、上記の生存相関に基づき、上記座において増幅された 、今日知られていない、推定オンコジーンが、攻撃性表現型を与えることができ る。従って、上記遺伝子のクローニングが重要な目標である。高増幅された腫瘍 と増幅の関係に基づき、当業者は、細胞の成長調節における上記遺伝子の役割を 推定することができるであろう。 腫瘍進行における重要な事件としての低レベル20q13増幅の役割は、ほとんど 明らかではないようである。低レベル増幅は、p-arm対照に対する20q13プローブ の1.5〜３倍高められた平均コピー数として定義された。さらに、これらの腫瘍 は、特徴的に、ひじように高いコピー数をもつ個々の腫瘍細胞を欠き、そして散 乱した、ク ラスター化していないシグナル外観を示した。高レベルと低レベル増幅の間の正 確な区別は、FISHによってのみ信頼性をもって行われることができ、一方、サザ ン及びスロット・ブロット分析は、高レベル増幅だけを検出することができる傾 向にあり、ここでは、平均遺伝子コピー数の実質的な評価が行われる。この区別 は重要である。なぜなら、高増幅腫瘍だけが有害な臨床結果と関係したからであ る。低レベル20q13増幅をもつ腫瘍は、増幅をもたない腫瘍について発見された ものと高レベル増幅をもつものの間にある多くの臨床病理学的特徴をもつようで あった。例えば、平均腫瘍Ｓ−期画分は、非増幅腫瘍において最低であり、そし て高増幅腫瘍において最高であった。１の可能性は、低レベル増幅が高レベル増 幅の発達に先行するということである。これは、例えば、インビトロにおける薬 剤耐性遺伝子の発達においてそうであることが示されている(Stark，Adv.Canc.R es.，61:87-113(1993))。この仮説を支持する証拠は、その者の局所転移が８ケ 月前に手術された原発性腫瘍よりかなり高いレベルの20q13増幅を含んでいたと ころの、我々の患者の中の１人において見られた。 最後に、我々は先の論文は、胸癌細胞系における及び限定された数の原発性胸 腫瘍における、RMC20C001プローブにより定められた1.5Mbの決定的領域及び候補 遺伝子の排除を報告する。本研究の結果は、上記の決定的な増幅領域が実際に上 記プローブにより定義されるということを、原発性腫瘍の大きなセットにおいて 争う余地のない程に示すことにより上記発見を確かなものにする。 従って、本データは、高レベル20q13増幅がより悪性の表現型への特定の胸腫 瘍の進行における重要な段階であることができるといことを示唆するものである 。20q13増幅の臨床的及び予後的意味はすばらしいものであり、20q13における増 幅の最小領域の位置は今 日定められている。 本明細書中に記載する実施例及び態様は、例証の目的のためだけのものであり 、この点におけるさまざまな修正又は変更が当業者に示唆されるであろうし、本 明細書及び添付の請求の範囲の本質及び範囲内に含まれるべきであるということ が理解される。本明細書中に引用される刊行物、特許、及ひ特許出願の全てを、 目的を限定することなく引用により本明細書中に取り込む。 添付配列表の討議 配列番号：１〜10及び12〜13は核酸配列を提供する。各ケースにおいて、その 情報はDNA配列として提示される。当業者は、その配列が対応のRNA(すなわち、 Ｕ残基によるＴ残基の置換による)、そしてさまざまなその保存的に修飾された バリエーションをも説明するということを容易に理解するであろう。相補的配列 は、現存の配列との比較により十分に説明される。すなわち、相補的配列は、DN Aについての標準的な塩基対規則（例えば、Ａ対Ｔ、Ｃ対Ｇ、により得られる。 さらに、核酸配列は、遺伝子コードを使用して所定のDNAを翻訳することにより 対応のアミノ酸配列を提供する。 配列番号：11については、その情報は、ポリペプチド配列として提示される。 当業者は、その配列が、遺伝子コードの使用によりそのアミノ酸配列を対応のヌ クレオチド配列に変換することにより、可能なコドン位置のそれぞれにおいて可 能なコドンのそれぞれを交互に指定することにより、ポリペプチドをコードする 対応のRNA及びDNA配列の全てをも説明するということを容易に理解するであろう 。同様に、提供される各核酸配列は同一のタンパク質をコードする核酸の全てを も本質的に提供する。なぜなら、当業者は選ばれた核酸をタンパク質に単に翻訳 し、そしてその後、遺伝子コードを使用して、そのアミノ酸配列から全ての可能 性のある核酸を逆翻訳す るからである。 上記配列は、例えば先の定義の節において、提供された見本の保存的アミノ酸 置換により適当な残基を置換することによりさまざまな保存的に修飾されたバリ エーションをも提供する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ０８／７８５，５３２ (32)優先日 平成９年１月17日(1997．1．17) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 コリンズ，コリン コンラッド アメリカ合衆国，カリフォルニア 94901, サン ラファエル，マウンテン ビュー アベニュ 333 (72)発明者 ワン，スー―イン アメリカ合衆国，カリフォルニア 94070, サン カルロス，ティモシー ドライブ 251 (72)発明者 ゴッドフレー，トニー アメリカ合衆国，カリフォルニア 94127, サン フランシスコ，テレシタ ブールバ ード 699 (72)発明者 コーベル，デイビッド アメリカ合衆国，カリフォルニア 94618, オークランド，オーバーン アベニュ 6009 (72)発明者 ロメンス，ジョアンナ カナダ国，オンタリオ エム５ジー ２ジ ェイ９，トロント，ベイ ストリート ＃1501 717

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ストリンジェント条件下、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、 配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配 列番号：10、配列番号：12、及び配列番号：13から成る群から選ばれた配列に、 特異的にハイブリダイズするサブ配列をもつポリヌクレオチド配列を含んて成る 単離核酸分子。 １．前記サブ配列がストリンジェント条件下配列番号；２に特異的にハイブリ ダイズする、請求項１に記載の単離核酸。 ２．前記サブ配列が配列番号：２である、請求項２に記載の単離核酸。 ３．前記サブ配列が配列番号：３に特異的にハイブリダイズする、請求項１に 記載の単離核酸。 ４．前記ポリヌクレオチドが配列番号：３である、請求項４に記載の単離核酸 。 ５．前記サブ配列がストリンジェント条件下配列番号：４に特異的にハイブリ ダイズする、請求項１に記載の単離核酸。 ６．前記サブ配列が配列番号：４である、請求項６に記載の単離核酸。 ７．前記サブ配列がストリンジェント条件下配列番号：５に特異的にハイブリ ダイズする、請求項１に記載の単離核酸。 ８．前記サブ配列が配列番号：５である、請求項８に記載の単離核酸。 ９．前記サブ配列がストリンジェント条件下配列番号：６に特異的にハイブリ ダイズする、請求項１に記載の単離核酸。 10．前記サブ配列が配列番号：６である、請求項10に記載の単離 核酸。 11．前記サブ配列がストリンジェント条件下配列番号：７に特異的にハイブリ ダイズする、請求項１に記載の単離核酸。 12．前記サブ配列が配列番号：７である、請求項12に記載の単離核酸。 13．前記サブ配列がストリンジェント条件下配列番号：８に特異的にハイブリ ダイズする、請求項１に記載の単離核酸。 14．前記サブ配列が配列番号：８である、請求項14，16，18，20に記載の単離 核酸。 15．前記サブ配列がストリンジェント条件下配列番号：９に特異的にハイブリ ダイズする、請求項１に記載の単離核酸。 16．前記サブ配列が配列番号：９である、請求項16に記載の単離核酸。 17．前記サブ配列がストリンジェント条件下配列番号：10に特異的にハイブリ ダイズする、請求項１に記載の単離核酸。 18．前記サブ配列が配列番号：10である、請求項18に記載の単離核酸。 19．前記サブ配列がストリンジェント条件下配列番号：12に特異的にハイブリ ダイズする、請求項１に記載の単離核酸。 20．前記サブ配列が配列番号：12である、請求項20に記載の単離核酸。 21．前記サブ配列がストリンジェント条件下配列番号：13に特異的にハイブリ ダイズする、請求項１に記載の単離核酸。 22．前記サブ配列が配列番号：12である、請求項22に記載の単離核酸。 23．前記ポリヌクレオチド配列に作用可能な状態で連結されたプロモーター配 列をさらに含む、請求項１に記載の単離核酸。 24．前記核酸がcDNA分子である、請求項１に記載の単離核酸。 25．サンプル中の新形成細胞についてスクリーニングする方法であって： 配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、 配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：10、配 列番号：11、配列番号：12、及び配列番号：13から成る群から選ばれた配列を含 んで成る標的ポリヌクレオチド配列に選択的にハイブリダイズするプローブと、 ヒト患者からの核酸配列サンプルとを接触させ、ここで、上記プローブは、上記 プローブが上記標的ポリヌクレオチド配列と選択的にハイブリダイズして安定な ハイブリダイゼーション複合体を形成する条件下で、上記サンプルと接触され； そして 上記ハイブリダイゼーション複合体の形成を検出する、 を含む前記方法。 26．前記核酸サンプルが胸癌をもつ患者由来である、請求項26に記載の方法。 27．前記核酸サンプルが分裂中期のスプレッド又は静止核である、請求項26に 記載の方法。 28．前記プローブが配列番号：１に記載のポリヌクレオチド配列を含む、請求 項26に記載の方法。 29．前記プローブが配列番号：２に記載のポリヌクレオチド配列を含む、請求 項26に記載の方法。 30．前記プローブが配列番号：３に記載のポリヌクレオチド配列を含む、請求 項26に記載の方法。 31．前記プローブが配列番号：４に記載のポリヌクレオチド配列を含む、請求 項26に記載の方法。 32．前記プローブが配列番号：５に記載のポリヌクレオチド配列 を含む、請求項26に記載の方法。 33．前記プローブが配列番号：６に記載のポリヌクレオチド配列を含む、請求 項26に記載の方法。 34．前記プローブが配列番号：７に記載のポリヌクレオチド配列を含む、請求 項26に記載の方法。 35．前記プローブが配列番号：８に記載のポリヌクレオチド配列を含む、請求 項26に記載の方法。 36．前記プローブが配列番号：９に記載のポリヌクレオチド配列を含む、請求 項26に記載の方法。 37．前記プローブが配列番号：10に記載のポリヌクレオチド配列を含む、請求 項26に記載の方法。 38．前記プローブが配列番号：12に記載のポリヌクレオチド配列を含む、請求 項26に記載の方法。 39．前記プローブが配列番号：13に記載のポリヌクレオチド配列を含む、請求 項26に記載の方法。 40．前記プローブが、前記標的ポリヌクレオチド配列内の突然変異の存在を同 定するために使用される、請求項26に記載の方法。 41．生物学的サンプル中の新形成細胞を検出するための方法であって： 配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、 配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：10、配 列番号：12、及び配列番号：13から成る群から選ばれた配列を含んで成るポリヌ クレオチド配列によりコードされたポリペプチド抗原に特異的に結合する抗体を 上記サンプルと接触させ；そして 抗原−抗体複合体の形成を検出する、 を含む前記方法。 42．前記サンプルが胸組織由来である、請求項42に記載の方法。 43．癌細胞の病理学的増殖を阻害する方法であって：配列番号：１、配列番号 ：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号； ７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：10、配列番号：12、及び配列番号 ：13から成る群から選ばれた配列にストリンジェント条件下でハイブリダイズす るサブ配列をもつ内因性遺伝子の遺伝子産物の活性を阻害することを含む、前記 方法。 44．20q13アンプリコン内にコードされたタンパク質の過剰発現を検出するこ とを含む、癌の検出方法。 45．前記の20q13アンプリコン内にコードされたタンパク質がZABC1である、請 求項45に記載の方法。 46．前記の20ｑアンプリコン内にコードされたタンパク質が1b1である、請求 項45に記載の方法。