PT1994410E - Métodos e estojos para detecção precoce de cancro ou de predisposição a este - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"MÉTODOS E ESTOJOS PARA DETECÇÃO PRECOCE DE CANCRO OU DE PREDISPOSIÇÃO A ESTE"

CAMPO E ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a métodos para detecção precoce não invasiva de cancro utilizando CD24 e, mais particularmente, a métodos para diagnóstico de cancro ou de lesões pré-malignas através da determinação do nivel de expressão de CD24 solúvel, derramado e/ou em bolhas numa amostra biológica. 0 cancro colorrectal (CRC) é uma das principais preocupações de saúde no mundo Ocidental uma vez que é a terceira causa de cancro mais comum tanto nos homens como nas mulheres nos Estados Unidos e em Israel. Esta forma de cancro desenvolve-se através de um processo gradual que envolve uma variedade de alterações genéticas e epigenéticas que são adquiridas ao longo de vários anos e eventualmente culminam na transformação de epitélio normal em neoplasma. Embora a doença tenha um longo período de latência, os marcadores actualmente disponíveis para detecção da doença estão limitados a testes invasivos tais como endoscopia do cólon ou gástrica, que detectam frequentemente a doença quando esta já está disseminada.

Mutações em oncogenes e genes supressores tumorais, expressão génica anormal e defeitos genéticos numa variedade de genes estão intimamente envolvidos em carcinogénese de CRC. Com base nos alelotipos de uma série de tumores do cólon, Vogelstein e colegas mostraram que os passos moleculares que ocorrem após a activação da via APC-β-catenina-Tfc envolvem uma acumulação não linear de 2 alterações genéticas específicas que acompanham a transição da mucosa do cólon normal para carcinoma metastático. Estas incluem mutações no oncogene k-Ras, alterações nos padrões de metilação, perda de DCC (gene suprimido em cancro colorrectal, do inglês Deleted in Colorectal Câncer) e SMADs [homólogos da proteína de drosófila Mães Contra Decapentaplégico (MAD), do inglês Mothers Against Decapentaplegic, e da proteína SMA de C. elegans] e mutações em p53.

Os métodos de pesquisa actualmente disponíveis para cancros do tracto gastrointestinal (tracto GI) tais como cancro colorrectal (CRC) incluem teste de sangue fecal oculto (FOBT) . No entanto, embora ensaios clínicos tenham mostrado que a pesquisa de FOBT em série reduz a mortalidade por CRC (Mandei J, et al., 1993,), a sensibilidade de FOBT é limitada (60 %; McMahon PM, et al., 2001). Vários marcadores foram recentemente sugeridos como ferramentas de diagnóstico não invasivas. Estes incluem proteínas (p. ex., calprotectina fecal, lactoferrina, lisozima, albumina, alfa-l-antitripsina, antigénio carcinoembrionário (CEA), factor acelerador de desintegração (DAF), proteína de manutenção minicromossómica (MCM2)) ou ARNm (p. ex., COX-2 fecal) (Kanaoka S., et al., 2004) que podem ser detectados em amostras de fezes, e proteínas tais como nicotinamida-N-metiltransferase (NNMT) (Roessler M, et al., 2005) ou subunidade 3 do complexo activador do proteassoma (PSME3) (Roessler M., et al., 2006), que podem ser detectadas em amostras de soro. No entanto, devido à sua baixa sensibilidade e especificidade, estes marcadores não estão em utilização clínica. CD24, também conhecido com antigénio termo-estável (HSA) em ratinhos, é uma proteína da superfície celular semelhante à 3 mucina ancorada com fosfatidilinositol fortemente glicosilada. Fisiologicamente, a proteína CD24 é expressa principalmente em subpopulações hematopoéticas de linfócitos B, várias células epiteliais, células musculares e neurais. Tem um papel crucial na selecção e maturação celulares durante a hematopoese e é expressa durante o período embrionário, no desenvolvimento de células neurais e pancreáticas. Adicionalmente, CD24 é um potencial ligando para a P-selectina que funciona como molécula de adesão que aumenta a agregação de plaquetas. A função celular de CD24 é ainda desconhecida, mas relatórios recentes reforçaram o seu envolvimento na iniciação da transdução de sinal intracelular. Schabath et al. (Schabath H, et al., 2006) associaram a expressão de CD24 à subregulaçâo no receptor de quimocinas CXCR-4. Adicionalmente, CD24 é sobre-expressa em vários tecidos malignos incluindo linfomas de células B, gliomas, carcinomas pulmonares de células pequenas e de células não pequenas, hepatocelulares, de células renais, nasofaríngeos, da bexiga, uterinos, epiteliais do ovário, da mama, da próstata e pancreáticos (revisto por Kristiansen et al., 2004). Além disso, verificou-se que a sua expressão se correlaciona com uma maior taxa de crescimento, mobilidade e sobrevivência em linhas celulares de carcinoma derivadas de vários órgãos (Baumann P, et al., 2005; Smith SC, et al., 2006) e com um curso de cancro mais agressivo. Assim, Weichert W., et al. (2005), verificaram que a maior expressão de CD24 no citoplasma se correlaciona com um maior estádio tumoral, grau e presença de metástases e concluíram que a sobre-expressão de CD24 no citoplasma (em resultado de maior produção ou perturbações na distribuição na célula) é um marcador para um prognóstico mais fraco. Adicionalmente, o papel de CD24 na agregação de 4 plaquetas pode explicar o envolvimento com metástases de cancro e pior prognóstico (Sammar, M., et al., 1994; Aigner, S., et ai., 1997; Aigner, S., et al., 1998). 0 Ped. Pat. U.S. 20040005596 para Li J., et al., divulga métodos de diagnóstico de cancro através da determinação do nível de CD24 in situ em amostras de tecido suspeitas de serem pré-cancerosas ou cancerosas, necessitando assim novamente de procedimentos invasivos para detecção de cancro.

Existe assim a necessidade amplamente reconhecida de, e seria altamente vantajoso ter, um método de diagnóstico de cancro, especialmente no estádio pré-maligno, desprovido das limitações de cima.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A invenção é descrita pelas reivindicações 1-6.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A FIG. 1 é uma análise da imunoprecipitação (IP) de CD24 das linhas celulares de CRC. Extractos das linhas celulares de CRC HCT116 (que não expressa CD24) ou HT29 (que expressa CD24) foram sujeitos a IP de CD24 seguida de análise Western blot utilizando o anticorpo de CD24, SWA11. Pista 1: Lisado total de células de CRC HCT116 (sem IP); pista 2: lisado total de células de CRC HT29 (sem IP); pistas 3-8 -produtos de eluição de células HCT116 (pistas 3-5) ou células HT29 (pistas 6-8) utilizando contas de Sepharose conjugadas com anti-ratinho (Sigma): na ausência de anticorpo de IP (primeiro ligador) (pistas 3 e 6), ou após IP utilizando o Ac ML5 (pistas 4 e 7) ou o Ac SWA11 (pistas 5 e 8) . 5

Observe-se a eficiente IP utilizando o Ac SWAll para CD24 (pista 8) , demonstrando que SWAll é um anticorpo de IP adequado, produzindo um fundo baixo.

As FIGs. 2a-c são análises de Western blot de CD24 de amostras de fezes obtidas de pacientes de CRC antes e após a remoção cirúrgica do tumor, ou antes e após tratamento de quimioterapia. Extractos proteicos (quantidades iguais) de amostras de fezes de 12 pacientes (designados P-l, P-2, P-3...P-12) diagnosticados com tumores colorrectais (adenomas ou adenocarcinomas (CRC)) foram sujeitos a análise Western blot utilizando o Ac SWAll. As manifestações clinicas dos pacientes antes da remoção cirúrgica são como se segue: paciente 1 (P-l) - pólipo 15 mm; paciente 2 (P-2) - pólipo massivo; paciente 3 (P— 3) -pólipo 20 mm; paciente 4 (P-4) - pólipo 5 mm, displasia de baixo grau; paciente 5 (P-5) - adenocarcinoma; paciente 7 (P— 7) - adenocarcinoma; paciente 8 (P-8) - adenocarcinoma; paciente 9 (P— 9) - pólipo 15 mm; paciente 10 (P-10) pólipo de elevado grau; paciente 11 (P-ll) adenocarcinoma; paciente 12 (P—12) - adenocarcinoma; paciente 6 (P— 6) carcinoma do recto - ambas as suas amostras foram tomadas após remoção tumoral mas antes (pista 13) ou após (pista 14) terapia de radiação. A Figure 2a - pistas 1-9: Pista 1 - células HT29 (controlo positivo); pistas 2-3 - P-l; pistas 4-5 - P-2; pistas 6-7 -P-3; pistas 8-9 - P-4; Figura 2b - pistas 10-18: pista 10 -células HT29; pistas 11-12 - P-5; pistas 13-14 - P-6; pistas 15-16 - P-7; pistas 17-18 - P-8; Figura 2c - pistas 19-27: pista 19 - células HT29; pistas 20-21 - P-9; pistas 22-23 - P-10; pistas 24-25 - P-ll; pistas 26-27 - P-12. Pistas 2, 4, 6, 8, 11, 15, 17, 20, 22, 24 e 26 - as amostras foram tomadas antes da remoção cirúrgica do tumor, pistas 3, 5, 7, 9, 12, 13, 14, 16, 18, 21, 23, 25 e 27 - as 6 amostras foram tomadas após a remoção cirúrgica do tumor. Observe-se a significativa diminuição nos niveis de CD24 após a remoção cirúrgica dos tumores em pelo menos 9 de 11 dos pacientes (p. ex., compare-se a intensidade da banda proteica na pista 3 com a da pista 2), demonstrando que a presença de CD24 nas fezes tem origem, pelo menos em parte, no tumor. Adicionalmente, observe-se que embora em amostras de fezes tomadas antes da remoção cirúrgica dos pólipos ou tumores a espécie da proteína CD24 inclui proteínas de vários tamanhos tais como de cerca de 20 a cerca de 60 kDa (p. ex., pistas 4, 17, 20 e 24), em amostras de fezes tomadas após a remoção cirúrgica dos pólipos ou tumores a espécie da proteína CD24 inclui proteínas de elevado peso molecular tais como de cerca de 37 a cerca de 50 kDa (p. ex., pistas 11, 18, 21). Observe-se também a diminuição significativa nos níveis de CD24 em amostras de fezes obtidas após terapia de radiação (pista 14) em comparação com os obtidos antes da terapia de radiação (pista 13), demonstrando que o nível de CD24 nas fezes tem origem nas células malignas de CRC, assim uma diminuição no nível após tratamento pode indicar eficiência do tratamento (p. ex., eliminação de células de cancro).

A FIG. 3 representa uma análise de imunoprecipitação de CD24 em amostras de soro. Amostras de soro tomadas de pacientes possuindo CRC activo (pista 3) ou CRC não activo (pista 2) foram imunoprecipitadas com um complexo formado através de pré-incubação de contas de Sepharose conjugadas com anti-ratinho (Sigma, Israel) com o anticorpo monoclonal anti-CD24, SWA11. Os complexos imunoprecipitados foram sujeitos a análise Western blot utilizando o anticorpo monoclonal anti-CD24, SWAT11. Pista 1- Células HT29 sobre-expressando CD24; pista 2 - soro de um paciente possuindo CRC não activo; pista 3 - soro de um paciente possuindo CRC 7 activo. Observe-se a banda proteica de -40 kDa na pista 3 e a ausência de tal banda proteica na pista 2, demonstrando a presença de CD24 no soro de sujeitos com CRC activo e o desaparecimento de CD24 em sujeitos com CRC não activo. A FIG. 4 comparativa é uma análise de RFLP do polimorfismo Val57Ala na proteína CD24 (SEQ ID NO:2) (C/T na posição 280 de SEQ ID NO:l). O ADN genómico foi sujeito a amplificação por PCR utilizando os iniciadores directo (SEQ ID NO:3) e reverso (SEQ ID NO: 4) e os produtos de PCR de 520 pb resultantes foram digeridos utilizando a enzima de restrição SstXI ("D" para digerido, pistas 1, 3, e 5) ou permaneceram não digeridos ("N" para não digerido, pistas 2, 4 e 6) e foram sujeitos a electroforese num gel de agarose a 1%. Pistas 1 e 2 - ADN da linha celular de cancro pancreático colo357, que expressa elevados níveis de CD24; pistas 3 e 4 - ADN da linha celular de cancro pancreático Panei, que expressa níveis moderados de CD24; pistas 5 e 6 - ADN da linha celular de cancro do cólon HT29 que expressa níveis elevados de CD24; pista 7 - marcador do peso molecular de 100 pb. Observe-se que enquanto as células Panei que expressam níveis moderados de CD24 exibem o genótipo C/C na posição 280 de SEQ ID NO:l (que corresponde ao polimorfo Ala na posição 57 de SEQ ID NO:2) tal como evidenciado pela presença de apenas o produto de PCR não digerido de 520 pb, as células colo357 ou HT29, que expressam níveis elevados de CD24 exibem os genótipos C/T ou IT na posição 280 de SEQ ID NO:l (correspondendo aos polimorfos Ala/Val ou Val/Val na posição 57), respectivamente, tal como é evidenciado pela presença de ambos os produtos de PCR digeridos e não digeridos na pista 1 (Colo357) e apenas os produtos de PCR digeridos na pista 5 (HT29) . A FIG. 5 representa a purificação de CD24 a partir de soro humano. CD24 em amostras de soro de pacientes com CRC activo foi purificado através de cromatografia de permuta aniónica utilizando uma minicoluna de DEAE-celulose (DE52). Antes do fraccionamento, o soro foi centrifugado a 12000 xg (30 minutos, 4°C) para remover quaisquer restos celulares, e a albumina foi esgotada do soro utilizando o protocolo de DAC (Esgotamento do componente albumina), que foi modificado a partir de um método anteriormente publicado (Colantonio DA, et al., 2005, Proteomics, 5(15): 3831-5). Após o esgotamento de albumina, o soro foi diluído em Tris-HC1 10 mM pH 7,4 e carregado numa minicoluna DE52 pré-equilibrada no mesmo tampão. O escoado (FT) e a lavagem (W) foram colhidos separadamente e a proteína ligada foi eluída com concentrações crescentes de NaCl (0,05-0,3 M) em Tris-HCl pH 7,4. As proteínas eluídas foram analisadas através de SDS-PAGE e Western blotting utilizando o anticorpo monoclonal SWA11. Pista 1 - lisado total de linhas celulares HT29 serve como controlo positivo para o peso molecular de CD24; pista 2 - uma amostra da amostra de soro após a centrifugação mas antes do esgotamento de albumina; pistas 3-8 - diferentes fracções de eluição. Observe-se a presença de uma proteína com um peso molecular aparente de 35-40 kDa nas pistas 6 e 7 que foi eluída em fracções contendo NaCl 0,1-0,2 M e reconhecida pelo anticorpo anti-CD24 .

DESCRIÇÃO DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERIDAS A presente invenção refere-se a métodos de diagnóstico precoce e não invasivo de cancro ou lesões pré-malignas utilizando CD24 em circulação.

Os princípios e a operação dos métodos de diagnóstico de lesões pré-malignas de acordo com a presente invenção podem 9 ser melhor compreendidos com referência aos desenhos e descrições acompanhantes.

Os cancros do tracto gastrointestinal (GI), incluindo o cancro colorrectal (CRC), desenvolvem-se ao longo de vários anos através de um processo gradual no qual são adquiridas alterações genéticas e epigenéticas que eventualmente culminam na transformação de epitélio normal em neoplasma. Por exemplo, a carcinogénese de CRC envolve mutações em oncogenes (p. ex., k-Ras) e genes supressores tumorais (p. ex., p53), alterações nos padrões de metilação e perda de DCC e SMADs. No entanto, apesar do actual conhecimento genético e dos procedimentos de endoscopia actualmente disponíveis (p. ex., colonoscopia), no momento do diagnóstico a maior parte dos cancros relacionados com o tracto GI já se disseminaram e são mais difíceis de tratar.

Os métodos de pesquisa actualmente disponíveis para cancros do tracto gastrointestinal (tracto GI) tal como o cancro colorrectal (CRC), incluem teste de sangue oculto nas fezes (FOBT). No entanto, embora os ensaios clínicos tenham mostrado que a pesquisa de FOBT em série reduz a mortalidade por CRC, a sensibilidade de FOBT é limitada (60%; McMahon PM, 2001 (Supra)). Foram recentemente sugeridos vários marcadores como ferramentas de diagnóstico não invasivas. Estes incluem proteínas (p. ex., calprotectina fecal, lactoferrina, lisozima, albumina, alfa-l-antitripsina, antigénio carcinoembrionário (CEA), factor acelerador de desintegração (DAF), proteína de manutenção minicrossómica (MCM2)) ou ARNm (p. ex., COX-2 fecal) que podem ser detectados em amostras de fezes, e proteínas tais como nicotinamida-N-metiltransferase (NNMT) ou subunidade 3 do complexo activador de proteassoma (PSME3) que podem ser detectadas em amostras de soro. No 10 entanto, devido à sua baixa sensibilidade e especificidade, estes marcadores não estão em utilização clinica. Outros métodos de diagnóstico tais como o exame rectal digital (DRE), PET-CT (tomografia de emissão de positrões) e a colonoscopia virtual exibem especificidade e/ou sensibilidade limitada. Assim, até à data, o diagnóstico de CRC baseia-se em procedimentos invasivos tais como endoscopia do cólon (colonoscopia ou sigmoidoscopia) seguida de remoção cirúrgica de adenomas e coloração histológica. CD24 é uma proteína da superfície celular semelhante à mucina ancorada com fosfatidilinositol fortemente glicosilada que é expressa principalmente em subpopulações hematopoéticas de linfócitos B, várias células epiteliais, células musculares e neurais. É sobre-expressa em vários tecidos malignos incluindo linfomas de células B, gliomas, carcinomas pulmonares de células pequenas e de células não pequenas, hepatocelulares, de células renais, nasofaríngeos, da bexiga, uterinos, epiteliais do ovário, da mama, da próstata e pancreáticos (revisto por Kristiansen et al., 2004). Além disso, verificou-se que a sua expressão se correlaciona com uma maior taxa de crescimento, mobilidade e sobrevivência de linhas celulares de carcinoma derivadas de vários órgãos (Baumann P, et al., 2005; Smith SC, et al., 2006) e com um curso de cancro mais agressivo. Adicionalmente, Weichert W., et al. (2005), verificaram que a maior expressão de CD24 no citoplasma se correlaciona com um maior estádio tumoral, grau e presença de metástases e concluíram que a sobre-expressão de CD24 no citoplasma (em resultado de maior produção ou perturbações na distribuição na célula) é um marcador para um prognóstico mais fraco. Adicionalmente, o papel de CD24 na agregação de plaquetas pode explicar o seu envolvimento com 11 metástases de cancro e pior prognóstico (Sammar, M., et al., 1994; Aigner, S., et al., 1997; Aigner, S., et al., 1998). 0 Ped. Pat. U.S. 20040005596 para Li J., et al., divulga métodos de diagnóstico de cancro através da determinação do nível de CD24 in situ em amostras obtidas a partir de tecidos pré-cancerosos ou cancerosos, necessitando assim novamente de procedimentos invasivos para detecção de cancro.

Weichert et al., (2005) divulga que CD24 é fortemente expressa no citoplasma, onde é armazenada em corpos microvesiculares. Estes corpos microvesiculares podem ser derramados pelas células tumorais como exossomas para a circulação. Ao reduzir a presente invenção à prática, os presentes inventores revelaram que CD24 é sobre-expressa em lesões pré-malignas do tracto gastrointestinal e que a CD24 derramada, em bolhas ou segregada pode ser detectada em amostras biológicas de sujeitos possuindo lesões pré-malignas e malignas.

Tal como é mostrado na secção de Exemplos que se segue, os presentes inventores revelaram que o nível do transcrito de CD24 é sobrerregulada em linhas celulares transformadas com ras mutante (Exemplo 1) e que o seu nível é revertido para normal após tratamento de tais células com Celecoxib, um inibidor específico de COX-2. Adicionalmente, os presentes inventores revelaram que o nível de expressão de CD24 em várias linhas celulares de CRC se correlaciona com o genótipo do SNP Val57Ala em CD24, tal que as células que expressam um elevado nível da proteína CD24 possuem o genótipo CD24v/v (polimorfo Val-57) enquanto as células que expressam pouco a proteína possuem o genótipo CD24a/a 12 (polimorfo Ala-57) (Exemplo 3). Adicionalmente, os presentes inventores revelaram que CD24 é sobre-expressa em lesões pré-malignas do tracto GI que se correlacionam com estádios iniciais de carcinogénese (Tabela 1, Exemplo 2) . Além disso, tal como é melhor ilustrado na secção de Exemplos que se segue, os presentes inventores mostraram que CD24 solúvel, derramada, em bolhas ou segregada pode ser detectada em amostras de soro (Figuras 3 e 5, Exemplo 4), fezes (Figuras 2a-c, Exemplo 4) e urina de pacientes com carcinogénese de CRC ou lesões pré-malignas colorrectais e que o nivel de CD24 nas fezes diminui após a remoção (p.ex., através de cirurgia) das lesões pré-malignas ou malignas (Figuras 2a-c) bem como quando o CRC é não activo (p.ex., após terapia de radiação; Figura 2b e 3, Exemplo 4) . Conjuntamente, estes resultados demonstram que CD24 é um excelente marcador para diagnóstico precoce de cancro, mesmo no estádio pré-maligno e que CD24 solúvel (p.ex., segregada), em bolhas e/ou derramada pode ser detectada em amostras biológicas tais como fezes, soro e urina e ser assim utilizada em diagnóstico de cancro.

Assim, de acordo com um aspecto da presente invenção é proporcionado um método de diagnóstico de cancro e/ou uma lesão pré-maligna. 0 método é efectuado através da determinação da presença e/ou do nivel de CD24 em circulação de um sujeito a necessitar deste, em que a presença e/ou o nível da referida CD24 em circulação acima de um limiar predeterminado é indicativo de cancro e/ou lesão pré-maligna.

Tal como aqui utilizada a frase "lesão pré-maligna" refere-se a uma massa de células e/ou tecido possuindo maior probabilidade de se transformar num tumor maligno. De preferência, na lesão pré-maligna da presente invenção CD24 13 é sobre-expressa em comparação com um tecido ou uma célula não maligna. Exemplos de lesões pré-malignas incluem, mas não se limitam a, pólipos adenomatosos, esófago de Barrett, IPMN (Neoplasia Mucinosa Papilar Intraductal), DCIS (Carcinoma Ductal in situ) na mama, leucoplasia e eritroplasia. Assim, a lesão pré-maligna que é diagnosticada de acordo com o método deste aspecto da presente invenção pode transformar-se num cancro (ou tumor) sólido ou não sólido maligno (p. ex., malignidades hematológicas) associado a CD24. De preferência, a lesão pré-maligna que é diagnosticada pelo método deste aspecto da presente invenção é um pólipo adenomatoso do cólon, um pólipo adenomatoso do recto, um pólipo adenomatoso do intestino delgado e esófago de Barrett.

Exemplos não limitantes de cancros associados a CD24 que podem ser diagnosticados através do método deste aspecto da presente invenção incluem tumores do tracto gastrointestinal (cancro do cólon, cancro do recto, cancro da região anal, cancro colorrectal, cancro do intestino delgado e/ou grosso, cancro esofágico, cancro do estômago, cancro pancreático, cancro gástrico, cancro do intestino delgado, adenocarcinoma surgindo no intestino delgado, tumores carcinóides surgindo no intestino delgado, linfoma surgindo no intestino delgado, tumores mesenquimatosos surgindo no intestino delgado, tumores do estroma gastrointestinal), carcinoma da vesícula biliar, tumores do tracto biliar, cancro da próstata, cancro do rim (renal) (p. ex., tumor de Wilms), cancro do fígado (p. ex., hepatoblastoma, carcinoma hepatocelular), cancro hepatobiliar, cancro da árvore biliar, tumores da vesícula biliar, cancro da bexiga, rabdomiossarcoma embrionário, tumor das células germinativas, tumor trofoblástico, tumor das células germinativas testiculares, teratoma imaturo do 14 ovário, tumor uterino, epitelial do ovário, sacrococcígeo, coriocarcinoma, tumor trofoblástico de local placentário, tumor epitelial de adulto, cancro do ovário, cancro cervical, cancro da vagina, cancro da vulva, cancro do pulmão (p. ex., carcinoma pulmonar de células pequenas e de células não pequenas), carcinoma nasofaríngeo, da mama, de células escamosas (p. ex., na cabeça e pescoço), tumor neurogénico, astrocitoma, ganglioblastoma, neuroblastoma, linfomas (p.ex., doença de Hodgkin, linfoma não Hodgkin, linfoma de células B, Burkitt, células T cutâneas, histiocítico, linfoblástico, células T, do timo, células T cutâneas, linfoma do sistema nervoso central primário), gliomas, carcinoma medular da tiróide, cancro testicular, cancro do cérebro e da cabeça/pescoço, cancro ginecológico, cancro do endométrio, tumores de células germinativas, tumores mesenquimatosos, tumores neurogénicos, cancro da bexiga, cancro do uréter, cancro da pélvis renal, cancro da uretra, cancro do pénis, cancro dos testículos, cancros do corpo uterino, carcinoma do endométrio, sarcoma uterino, carcinoma peritoneal e carcinoma das trompas de Falópio, tumores das células germinativas do ovário, tumores do estroma do cordão sexual, cancro do sistema endócrino, tumores da tiróide, carcinoma medular da tiróide, linfoma da tiróide, tumores da paratiróide, tumores das supra-renais, tumores endócrinos pancreáticos, sarcomas dos tecidos moles e ossos, mesotelioma benigno e maligno, mesotelioma peritoneal maligno, mesotelioma maligno da Túnica Vaginalis do Testículo, mesotelioma maligno do Pericárdio, cancro da pele, melanoma cutâneo, melanoma intraocular, neoplasmas do sistema nervoso central, meduloblastomas, meningiomas, tumores dos nervos periféricos, tumores da região Pineal, adenomas da pituitária, craniofaringiomas, neuromas acústicos, tumores do Glomus Jugular, Cordomas e Condrossarcomas, 15

Hemangioblastornas, Papilomas e Carcinomas do Plexo Coróide, tumores do eixo espinal, leucemia e leucemia crónica.

Tal como aqui se utiliza a frase "diagnóstico" refere-se à classificação de uma patologia (p. ex., um cancro associado a CD24 ou uma lesão pré-maligna) ou um sintoma, determinação da gravidade da patologia, monitorização da progressão da patologia, previsão de um resultado de uma patologia e/ou perspectivas de recuperação.

Tal como aqui se utiliza a frase "sujeito a necessitar deste" refere-se a um sujeito humano que esteja em risco de ter cancro (p. ex., um sujeito geneticamente predisposto, um sujeito com história médica e/ou familiar de cancro, um sujeito que tenha sido exposto a carcinogénios, risco ocupacional, risco ambiental) e/ou um sujeito que exiba sinais clínicos suspeitos de cancro (p. ex., sangue nas fezes ou melena, dor inexplicável, transpiração, febre inexplicável, perda inexplicável de peso até anorexia, mudanças nos hábitos intestinais (obstipação e/ou diarreia), tenesmo (sensação de defecação incompleta, especificamente para cancro rectal), anemia e/ou fraqueza geral). Adicionalmente ou alternativamente, o sujeito a necessitar deste pode ser um sujeito humano saudável sujeito a um exame de bem estar geral de rotina.

Tal como aqui se utiliza o termo "CD24" refere-se a uma sequência de ácido nucleico e/ou sequência de aminoácidos de pelo menos uma porção funcional da proteína da superfície celular semelhante à mucina ancorada com fosfatidilinositol (p. ex., proteína CD24 - SEQ ID N0:2, N°. de Entrada GenBank NP_037362.1; transcrito de CD24 -SEQ ID N0:1, N°. de Entrada GenBank NM_013230.2) codificado por uma sequência genómica no cromossoma 6q21. 16 A frase "CD24 em circulação" refere-se a qualquer molécula de CD24 presente numa amostra biológica do sujeito que não seja CD24 ancorada in situ. A frase "CD24 ancorada in situ" refere-se a uma sequência de aminoácidos ou de ácido nucleico de CD24 ancorada em tecido que esteja ancorada a células intactas no local onde é produzido (in situ) tais como células de lesões pré-malignas (p. ex., adenomas) ou tumores cancerosos tal como aqui descrito acima. Assim, a frase "CD24 em circulação" refere-se a qualquer molécula de CD24 que possa ser sistematicamente detectada. A CD24 em circulação pode estar numa forma solúvel ou não solúvel (ancorada à membrana através de uma porção GPI). Exemplos de tal CD24 em circulação incluem mas não se limitam a CD24 segregada (p. ex., variante de processamento de CD24), CD24 derramada que seja desprovida de componentes membranares (p. ex., através da acção de fosfolipases tais como PIPLC; p. ex., a sequência de aminoácidos 27-80 de SEQ ID NO:2), CD24 em bolhas (i.e., CD24 presente em bolhas celulares que sejam formadas pela ruptura da membrana plasmática a partir do citosqueleto subjacente seguida de inflação da membrana desprendida pelo fluido intracelular) ou CD24 que esteja presente em células derramadas (i.e., células que se desprendem do tecido).

Assim, a CD24 em circulação da presente invenção pode estar presente numa amostra biológica que seja remota ao tecido canceroso ou sem cancro. Por exemplo, a amostra biológica pode ser fezes, soro ou urina enquanto o cancro pode ser um cancro GI tal como CRC. A frase "amostra biológica" tal como aqui se utiliza refere-se a quaisquer amostras biológicas celulares ou não celulares que possam conter uma CD24 em circulação tal como 17 descrito acima. Exemplos incluem mas não se limitam a, uma amostra de sangue (p. ex., soro), uma amostra de saliva, uma amostra de fezes, uma amostra de urina, esfregaço vaginal, uma amostra de medula óssea (especificamente contendo macrófagos), fluido linfático, células epiteliais, várias secreções externas dos tractos respiratório, intestinal e genito-urinário, lágrimas, leite, biopsia de tecido, amostra de fluido cerebrospinal (CSF) , uma amostra de fluido espermático, fluido amniótico e amostra de vilosidades coriónicas (CVS), uma amostra de células neuronais, e também amostras de constituintes de culturas celulares in vivo.

De preferência, a amostra biológica utilizada pelo método deste aspecto da presente invenção é uma amostra de sangue (p. ex., soro), uma amostra de fezes e/ou uma amostra de urina. A amostra biológica pode ser obtida utilizando métodos conhecidos na arte tais como a utilização de uma seringa com uma agulha, um bisturi, aspiração com uma agulha fina (FNA), cateter, endoscopia gastrointestinal (p. ex., endoscopia colorrectal, gastroendoscopia) e semelhantes. De preferência, a amostra biológica da presente invenção pode ser obtida através de amostragem do sangue, colheita de fezes ou colheita de urina. A determinação do nivel e/ou da presença de CD24 solúvel é efectuada ex vivo (numa amostra derivada do sujeito).

Tal como aqui se utiliza, a frase "presença e/ou nivel de uma CD24 em circulação" refere-se ao grau de expressão génica e/ou actividade do produto génico do gene de CD24 numa amostra biológica. Concordantemente, a presença e/ou o 18 nível de CD24 podem ser determinados ao nível dos aminoácidos utilizando métodos de detecção de proteínas.

Assim, a presença e/ou o nível da sequência de aminoácidos de CD24 (proteína CD24) podem ser determinados utilizando um anticorpo específico de CD24 através da formação de um imunocomplexo (i.e., um complexo formado entre o antigénio de CD24 (uma sequência de aminoácidos de CD24) presente na amostra biológica e o anticorpo específico de CD24). 0 imunocomplexo da presente invenção pode ser formado a uma variedade de temperaturas, concentração de sais e valores de pH que podem variar dependendo do método e da amostra biológica utilizados e os peritos na arte são capazes de ajustar as condições adequadas para a formação de cada imunocomplexo. 0 termo "anticorpo" tal como se utiliza nesta invenção inclui moléculas intactas bem como fragmentos funcionais destas, tais como Fab, F(ab')2, Fv ou moléculas de um único domínio tais como VH e VL para um epitopo de um antigénio. Estes fragmentos de anticorpo funcionais são definidos como se segue: (1) Fab, o fragmento que contém um fragmento monovalente de ligação ao antigénio de uma molécula de anticorpo, pode ser produzido através de digestão do anticorpo inteiro com a enzima papaína para produzir uma cadeia leve intacta e uma porção de uma cadeia pesada; (2) Fab', o fragmento de uma molécula de anticorpo que pode ser obtido através de tratamento do anticorpo inteiro com pepsina, seguido de redução, para produzir uma cadeia leve intacta e uma porção da cadeia pesada; são obtidos dois fragmentos Fab' por molécula de anticorpo; (3) (Fab')2, o fragmento do anticorpo que pode ser obtido através de tratamento do anticorpo inteiro com a enzima pepsina sem 19 subsequente redução; F(ab')2 é um dímero de dois fragmentos Fab' mantidos juntos através de duas ligações dissulfureto; (4) Fv, definido como um fragmento geneticamente concebido contendo a região variável da cadeia leve e a região variável da cadeia pesada expressas como duas cadeias; (5) anticorpo de cadeia simples ("SCA"), uma molécula geneticamente concebida contendo a região variável da cadeia leve e a região variável da cadeia pesada, ligadas através de um ligador polipeptidico adequado como uma molécula de cadeia simples geneticamente fundida; e (6) anticorpos de domínio único são compostos de um único domínio VH ou VL que exibe uma afinidade suficiente para o antigénio. Métodos de produção de anticorpos policlonais e monoclonais bem como fragmentos destes são bem conhecidos na arte (ver por exemplo, Harlow e Lane, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988) .

Os fragmentos de anticorpo de acordo com a presente invenção podem ser preparados através de hidrólise proteolítica do anticorpo ou através de expressão em E. coli ou células de mamífero (p. ex. cultura de células de ovário de hamster chinês ou outros sistemas de expressão proteica) de ADN codificando o fragmento. Os fragmentos de anticorpo podem ser obtidos através de digestão com pepsina ou papaína de anticorpos inteiros através de métodos convencionais. Por exemplo, os fragmentos de anticorpo podem ser produzidos através de clivagem enzimática de anticorpos com pepsina para proporcionar um fragmento 5S denominado F(ab')2. Este fragmento pode ser ainda clivado utilizando um agente redutor tiol, e opcionalmente um grupo bloqueador para os grupos sulfidrilo resultantes da clivagem de ligações dissulfureto, para produzir fragmentos 20 monovalentes Fab' 3.5S. Alternativamente, uma clivagem enzimática utilizando pepsina produz dois fragmentos Fab' monovalentes e um fragmento Fc directamente. Estes métodos são descritos, por exemplo, por Goldenberg, Pat. U.S. Nos. 4,036,945 e 4,331,647, e as referências ai contidas. Ver também Porter, R.R. (Biochem. J. 73: 119-126 (1959)). Outros métodos de clivagem de anticorpos, tais como a separação de cadeias pesadas para formar fragmentos de cadeia leve-pesada monovalentes, mais clivagem de fragmentos ou outras técnicas enzimáticas, químicas ou genéticas podem também ser utilizadas, desde que os fragmentos se liguem ao antigénio que é reconhecido pelo anticorpo intacto.

Os fragmentos Fv compreendem uma associação de cadeias VH e VL. Esta associação pode ser não covalente, tal como descrito em Inbar et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 69: 2659-62 (19720)). Alternativamente, as cadeias variáveis podem ser ligadas através de uma ligação dissulfureto intermolecular ou ligadas de forma cruzada através de químicos tais como glutaraldeído. De preferência, os fragmentos Fv compreendem as cadeias VH e VL ligadas através de um ligador peptídico. Estas proteínas de ligação ao antigénio de cadeia simples (scFv) são preparadas através da construção de um gene estrutural compreendendo sequências de ADN codificando os domínios VH e VL ligados através de um oligonucleótido. O gene estrutural é inserido num vector de expressão, que é subsequentemente introduzido numa célula hospedeira tal como E. coli. As células hospedeiras recombinantes sintetizam uma única cadeia polipeptídica com um péptido ligador a unir os dois domínios V. Métodos para a produção de scFvs são descritos, por exemplo, por Whitlow e Filpula, Methods 2: 97-105 (1991); Bird et al., Science 242: 423-426 (1988); Pack et 21 al., Bio/Technology 11: 1271-77 (1993); e Pat. U.S. N°. 4,946,778.

Outra forma de um fragmento de anticorpo é um péptido codificando para uma única região determinante de complementaridade (CDR). Os péptidos CDR ("unidades mínimas de reconhecimento") podem ser obtidos através da construção de genes codificando a CDR de um anticorpo de interesse. Tais genes são preparados, por exemplo, através da utilização da reacção em cadeia da polimerase para sintetizar a região variável de ARN das células produtoras de anticorpo. Ver, por exemplo, Larrick e Fry (Methods, 2: 106-10 (1991)).

Os anticorpos podem também ser produzidos utilizando várias técnicas conhecidas na arte, incluindo bibliotecas de apresentação fágica (Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991)). As técnicas de Cole et al. e Boerner et al. estão também disponíveis para a preparação de anticorpos monoclonais humanos (Cole et al., "Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy", Alan R. Liss, pág. 77 (1985) e Boerner et al., J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991)). Semelhantemente, os anticorpos humanos podem ser feitos através da introdução de loci de imunoglobulinas humanas em animais transgénicos, p. ex., ratinhos nos quais os genes das imunoglobulinas endógenas tenham sido parcialmente ou completamente inactivados. Após confronto, é observada a produção de anticorpos humanos, que se assemelha intimamente à observada em humanos em todos os aspectos, incluindo rearranjo génico, montagem, e repertório de anticorpos. Esta abordagem está descrita, por exemplo, em Pat. U.S. N03. 5, 545, 807; 5, 545, 806; 5,569,825; 5, 625,126; 5,633,425; 5,661,016, e nas seguintes publicações 22 22 cientificas: Marks et al., Bio/Technology 10, : 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368 812-13 (1994); Fishwild et al. , Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996) ; e Lonberg e Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65- -93 (1995).

De acordo com o método deste aspecto da presente invenção, a detecção da formação do imunocomplexo é indicativa de um diagnóstico do cancro ou da lesão pré-maligna. Vários métodos podem ser utilizados para detectar a formação do imunocomplexo de CD24 da presente invenção e os peritos na arte são capazes de determinar qual o método adequado para cada imunocomplexo e/ou o tipo de células utilizado para diagnóstico. 0 anticorpo de CD24 utilizado no imunocomplexo da presente invenção pode ser marcado utilizando métodos conhecidos na arte. Será apreciado que os anticorpos marcados podem ser anticorpos primários (i.e., que se ligam ao antigénio especifico, p. ex., um antigénio especifico de CD24) ou anticorpos secundários (p. ex., anticorpos de cabra anti-coelho marcados, anticorpo de ratinho anti-humano marcado) que se ligam aos anticorpos primários. 0 anticorpo pode ser directamente conjugado com um marcador ou pode ser conjugado com uma enzima. uma

Os anticorpos da presente invenção podem ser marcados com fluorescência (utilizando um corante fluorescente conjugado com um anticorpo), marcados radioactivamente (utilizando anticorpos marcados radioactivamente p. ex., 125I), ou conjugados com uma enzima (p. ex., peroxidase de rábano ou fosfatase alcalina) e utilizados juntamente com um substrato cromogénico para produzir uma reacção 23 colorimétrica. Os substratos cromogénicos utilizados pelos anticorpos conjugados com enzimas da presente invenção incluem, mas não se limitam a, AEC, Fast Red, substrato ELF-97 (2 - (5'-cloro-2-fosforiloxifenil)-6-cloro-4(3H) — quinazolinona), p-nitrofenilfosfato (PNPP), difosfato de fenolftaleína, e ELF 39-fosfato, BCIP/INT, Vector Red (VR), fosfato salmão e magenta (Avivi C., et al., 1994, J. Histochem. Cytochem., 42: 551-4) para a enzima fosfatase alcalina e Nova Red, diaminobenzidina (DAB), substrato Vector(R) SG, substrato quimioluminescente baseado em luminol para a enzima peroxidase. Estes substratos enzimáticos estão comercialmente disponíveis em Sigma (St. Louis, MO, USA), Molecular Probes Inc. (Eugene, OR, USA), Vector Laboratories Inc. (Burlingame, CA, USA), Zymed Laboratories Inc. (San Francisco, CA, USA), Dako Cytomation (Dinamarca). A detecção do imunocomplexo de CD24 numa amostra biológica tal como soro, fezes ou urina que podem conter CD24 em circulação pode ser efectuada utilizando as análises de separação de células activada com fluorescência (FACS), ensaio imunossorvente enzimático (ELISA), Western blot e radio-imunoensaio (RIA), imunoprecipitação (IP) ou através de uma abordagem baseada no peso molecular.

Para Western blot as proteínas são extraídas de uma amostra celular e são sujeitas a electroforese (p. ex., SDS-PAGE) e transferidas para uma membrana (p. ex., nylon ou PVDF). A membrana é então sujeita a interacção com um anticorpo de CD24 que pode ser directamente marcada ou ainda sujeita a um anticorpo secundário marcado. A detecção pode ser através de autorradiografia, reacção colorimétrica ou quimioluminescência. Este método permite a quantificação de uma quantidade de substrato e determinação da sua 24 identidade através de uma posição relativa na membrana que é indicativa de uma distância de migração no gel de acrilamida durante a electroforese.

No caso da concentração do antigénio na amostra biológica ser baixa, a detecção do antigénio (sequência de aminoácidos de CD24) pode ser efectuada através de imunoprecipitação (IP), essencialmente tal como descrito na secção de Exemplos que se segue. Para a análise de imunoprecipitação o anticorpo de CD24 pode interagir directamente com uma amostra (p. ex., lisado celular) incluindo CD24 e o complexo formado pode ser ainda detectado utilizando um anticorpo secundário conjugado a contas (p. ex., se o anticorpo de CD24 for um anticorpo monoclonal de ratinho, o anticorpo secundário pode ser um anticorpo anti-ratinho conjugado com, p. ex., contas de Sepharose). As contas podem então ser precipitadas através de centrifugação, após o que as proteínas precipitadas (p. ex., CD24 e anticorpos anti-CD24) podem ser desprendidas das contas (p. ex., utilizando desnaturação a 95°C) e sujeitas ainda a análise Western blot utilizando os anticorpos específicos de CD24. Alternativamente, o anticorpo anti-CD24 e o anticorpo secundário conjugado com as contas podem ser adicionados à amostra biológica contendo o antigénio (CD24) para deste modo formar um imunocomplexo. Alternativamente, uma vez que CD24 é uma proteína altamente glicosilada, pode também ser precipitada utilizando um substrato capaz de se ligar a polipéptidos glicosilados tais como Concavalina A (GE Healthcare Bio-Sciences, Uppsala, Suécia) que pode também ser conjugada com contas, seguido de análise Western blot com anticorpos anti-CD24. 25 A análise FACS permite a detecção de antigénios presentes em membranas celulares tais como CD24. Resumidamente, anticorpos específicos de CD24 são ligados a fluoróforos e a detecção é efectuada por meio de uma máquina de separação de células que lê o comprimento de onda da luz emitida por cada célula à medida que esta passa através de um feixe de luz. Este método pode empregar dois ou mais anticorpos simultaneamente. A presença e/ou o nível de CD24 podem também ser determinados utilizando ELISA. Resumidamente, uma amostra contendo antigénio de CD24 é fixada numa superfície tal como um poço de uma placa de microtitulação. Um anticorpo específico do antigénio (um anticorpo de CD24) ligado a uma enzima é aplicado e deixado ligar-se ao antigénio. A presença do anticorpo é então detectada e quantificada através de uma reacção colorimétrica empregando a enzima ligada ao anticorpo. Enzimas vulgarmente empregues neste método incluem peroxidase de rábano e fosfatase alcalina. Se bem calibrada e dentro do intervalo linear de resposta, a quantidade de substrato presente na amostra é proporcional à quantidade de cor produzida. Um substrato padrão é geralmente empregue para melhorar a exactidão quantitativa. A presença e/ou o nível de CD24 podem também ser determinados utilizando um radio-imunoensaio (RIA). Numa versão, este método envolve a precipitação do antigénio desejado (CD24) com um anticorpo específico e proteína de ligação ao anticorpo marcada radioactivamente (p. ex., proteína A marcada com I125) imobilizada num transportador precipitável tal como contas de agarose. 0 número de contagens no sedimento precipitado é proporcional à quantidade de antigénio. 26

Numa versão alternativa do RIA, é empregue um antigénio marcado e uma proteína de ligação ao anticorpo não marcada. Uma amostra contendo uma quantidade desconhecida de antigénio é adicionada em quantidades variáveis. A diminuição nas quantidades precipitadas a partir do antigénio marcado é proporcional à quantidade de antigénio na amostra adicionada. A presença e/ou o nível de CD24 podem também ser determinados utilizando uma abordagem baseada no peso molecular. Uma vez que o imunocomplexo exibe um peso molecular mais elevado que os seus componentes, podem também ser empregues métodos capazes de detectar uma tal mudança no peso molecular. Por exemplo, o imunocomplexo pode ser detectado através de um ensaio de retardamento em gel. Resumidamente, um gel de acrilamida não desnaturante é carregado com amostras. Uma mudança no tamanho (peso molecular) do produto proteico em comparação com os seus componentes é indicativo da presença de um imunocomplexo. Uma tal mudança para um peso molecular mais elevado pode ser vista utilizando uma coloração de proteínas não específica tal como coloração de prata ou coloração de azul de Commassie.

Tal como aqui se utiliza a frase "limiar predeterminado" refere-se a um nível de CD24 em circulação conhecido numa amostra. Um tal nível pode ser experimentalmente determinado através da comparação de amostras normais (p. ex., amostras obtidas de sujeitos saudáveis) com amostras derivadas de sujeitos que se saiba terem carcinogénese tal como CRC (ver por exemplo, Tabela 1 e Exemplo 2 da secção de Exemplos que se segue) . Alternativamente, um tal nível pode ser obtido a partir da literatura científica. 27

Assim, a presença e/ou o nível da CD24 na amostra biológica acima de um limiar predeterminado é indicativo do cancro ou da lesão pré-maligna.

Será apreciado que a presença do cancro ou da lesão pré-maligna possa ainda ser validada utilizando ensaios adicionais. Por exemplo, no caso do nível de CD24 detectado nas fezes de um sujeito estar acima de um limiar predeterminado, ensaios adicionais tais como endoscopia do cólon seguidos de avaliações histológicas (incluindo imunocoloração de CD24) podem ser efectuados nos adenomas identificados (no caso de estarem presentes adenomas).

Assim, os ensinamentos da presente invenção proporcionam, pela primeira vez, um método não invasivo altamente fiável (mais de 80% de exactidão) de diagnóstico de lesões pré-malignas ou malignas do tracto gastrointestinal utilizando amostras biológicas tais como soro, urina e fezes.

Será apreciado que os ensinamentos da presente invenção podem ser ainda utilizados para monitorizar a eficácia da terapia de cancro ou da progressão/remissão da doença. Tal como é mostrado na Figura 2b e descrito no Exemplo 4 da secção de Exemplos que se segue, o nível de CD24 nas fezes diminuiu após terapia de radiação num sujeito sofrendo de CRC, provavelmente em resultado de uma redução significativa em células cancerosas no sujeito.

Assim, de acordo com outro aspecto da presente invenção, é proporcionado um método de monitorização da eficácia da terapia de cancro. O método é efectuado através da determinação do nível de uma CD24 em circulação numa amostra biológica do sujeito após terapia de cancro, em que 28 uma diminuição do limiar predeterminado no nivel da CD24 em circulação após a terapia de cancro é indicativa de redução de células cancerosas, monitorizando deste modo a eficácia da terapia de cancro. A terapia de cancro cuja eficácia é monitorizada de acordo com o método deste aspecto da presente invenção pode ser terapia de radiação, quimioterapia (p. ex., CHOP, Cisplatina, carboplatina, oxaliplatina, azatioprina, mercaptopurina, alcaloides vinca, etopósido, tenipósido, paclitaxel, docetaxel, irinotecano, topotecanamsacrina, etopósido, fosfato de etopósido, tenipósido e dactinomicina), terapia de anticorpos (p. ex., trastuzumab (Herceptina) e rituximab (Rituxan)) ou uma combinação de qualquer um dos de cima.

Assim, uma diminuição de um limiar predeterminado no nivel da CD24 em circulação é indicativa da terapia de cancro ser eficiente. Por outro lado, se não houver diminuição, ou no caso de não haver um aumento do limiar predeterminado no nivel de CD24 em circulação após tratamento, então a terapia de cancro não é eficiente na eliminação (p. ex., morte, esgotamento) das células cancerosas do sujeito tratado e podem ser utilizadas terapias (p. ex., regimes de tratamento) adicionais e/ou alternativas.

Será apreciado que o limiar predeterminado pode ser determinado num subconjunto de sujeitos com um resultado de terapia conhecido.

De preferência, a diminuição do limiar predeterminado é de pelo menos 10 vezes, de preferência 15 vezes, de maior preferência 20 vezes, ainda de preferência 50 vezes ou pelo 29 menos 100 vezes (p. ex., pelo menos 1000 vezes) no nível de CD24 em circulação após terapia de cancro.

Tal como mostrado na Tabela 2, na Figura 4 e descrito no Exemplo comparativo 3 da secção de Exemplos que se segue, os indivíduos que possuem o polimorfo Vai na posição 57 da proteína CD24 (SEQ ID NO:2) têm um maior risco de predisposição a desenvolver cancro gastrointestinal. Adicionalmente, tal como é ainda ilustrado no Exemplo comparativo 3 da secção de Exemplos que se segue os indivíduos que possuem o polimorfo Vai na posição 57 da proteína CD24 (SEQ ID NO:2) bem como o polimorfo 1317Q e/ou ο 1307K de APC (SEQ ID NO: 8) têm maior risco de predisposição a desenvolver cancro gastrointestinal. Este resultado sugere a utilização da combinação do polimorfismo Val/Ala na posição 57 da proteína CD24 e o E1317Q e/ou 11307K da proteína APC para determinação da predisposição a cancro gastrointestinal.

Tal como é ainda mostrado no Exemplo comparativo 3 da secção de Exemplos que se segue, os presentes inventores revelaram que os indivíduos possuindo tanto o alelo contendo o nucleótido timidina na posição 280 do polinucleótido exposto por SEQ ID NO:l (que codifica o polimorfo Val-57 de CD24) como o alelo contendo o nucleótido adenosina na posição 3977 do polinucleótido exposto por SEQ ID NO:7 (que codifica o polimorfo Lys (K)-1307 de APC) e/ou o alelo contendo o nucleótido citosina na posição 4006 do polinucleótido exposto por SEQ ID NO:7 (que codifica o polimorfo Gin (QJ-1317 de APC) aumentaram a predisposição a cancro gastrointestinal (os valores de p são 0,024 para Val-57 e Lys (K)-1307 e 0,028 para Val-57 e Gin (Q)-1317). 30

Tal como aqui se utiliza o termo "cerca" refere-se a ± 10%.

EXEMPLOS É agora feita referência aos seguintes exemplos, que juntos com as descrições acima, ilustram a invenção de um modo não limitante.

Geralmente, a nomenclatura aqui utilizada e os procedimentos laboratoriais utilizados na presente invenção incluem técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas e de ADN recombinante. Tais técnicas são minuciosamente explicadas na literatura. Ver, por exemplo, "Molecular

Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R.M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current

Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A

Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); metodologias tal como expostas em Pat. U.S. Nos. 4,666, 828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 e 5,272,057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J.E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J.E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinicai Immunology" (8a Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W.H. Freeman and Co., New York (1980); imunoensaios disponíveis são extensivamente descritos na literatura de patentes e científica, ver, por exemplo, Pat. U.S. Nos. 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 31 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 e 5,281,521; "Oligonucleotide

Synthesis" Gait, M.J., ed. (1984); "Nucleic Acid

Hybridization" Hames, B.D., e Higgins S.J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B.D., e Higgins S.J., Eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R.I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) e "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic

Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And

Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et ai., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996). Outras referências gerais são proporcionadas ao longo deste documento. Crê-se que os procedimentos aqui sejam bem conhecidos na arte e são proporcionados para conveniência do leitor. EXEMPLO 1

A EXPRESSÃO DE CD24 É REGULADA EM LINHAS CELULARES TRANSFORMADAS COM RAS MUTANTE A análise da expressão génica diferencial, utilizando microarrays, proporciona um perfil compreensivo dos níveis relativos de ARNm, proporcionando assim uma nova perspectiva sobre várias vias biológicas envolvidas na patogénese, progressão e resposta à terapia da doença. Esta técnica emerge como uma potencial ferramenta valiosa para classificar histologicamente tumores semelhantes em subtipos molecularmente específicos, que podem prever o resultado clínico em pacientes individuais. A tecnologia de microarrays foi aplicada com sucesso no estudo de muitas malignidades, incluindo CRC (12-16). 32

Para identificar genes envolvidos na progressão de CRC, os presentes inventores transfectaram enterócitos normais com uma variedade de oncogenes e avaliaram o padrão de expressão génica das células transformadas antes e após a exposição a Celecoxib (Pfizer, NY, USA), um inibidor especifico de COX-2, utilizando o array de expressão de rato de Affymetrix, como se segue.

Materiais e Métodos Experimentais

Modelo celular in vitro - Os presentes inventores desenvolveram um modelo in vitro que consistiu numa variedade de linhas celulares intestinais normais e transformadas. Enterócitos normais derivados do ilio de rato (células IEC18), foram transfectados com uma variedade de oncogenes. Entre eles, os enterócitos transformados com rãs mutante (designadas células Rl) possuem um fenótipo muito agressivo. Estas células foram produzidas através de co-transfecção do marcador seleccionável de resistência ao fármaco tk-neo e o plasmideo pMIKcys, que codifica um mini gene humano c-K-ras (15 kb) que contém uma mutação de cisteina no cordão 12. As mutações de rãs são verificadas na maioria dos pacientes de CRC. Este sistema baseado em linhas celulares é muito mais coerente e útil quando se deseja aplicar a nova técnica de microarrays de expressão, porque consiste apenas em células normais e malignas e é desprovido de células inflamatórias, necróticas e do estroma que poderiam obstruir e mascarar o verdadeiro efeito da transformação maligna.

Estudos de expressão génica foram efectuados utilizando o Genechip® de rato de Affymetrix (RG-U34) de acordo com as instruções do fabricante utilizando ARN do modelo celular in vitro. 33

Resultados Experimentais CD24 é sobrerregulada em células intestinais transformadas com mutantes de Rãs e o seu nível de expressão é invertido após tratamento com Celecoxib - Para caracterizar o padrão de expressão génica alterado após transformação maligna em células epiteliais intestinais, o ARN extraído de linhas celulares intestinais transformadas com vários oncogenes foi sujeito a análise utilizando arrays de expressão de rato (Genechip® de rato de Affymetrix (RG-U34)). Especificamente, a expressão génica diferencial foi analisada para comparar células IEC-18 e RI (Sutter, T., Miyake, M., Kahn, SM., Venkatraj, VS., Sobrino, A., Warburton, D., Holt, PR., Weinstein, IB. "Increased expression of cyclin Dl and the Rb tumor suppressor gene in c-K-ras transformed rat enterocytes". Oncogene 2; 12(9): 1903-8, 1996), antes e após curtas e longas durações de exposição a Celecoxib (Pfizer, NY, USA), um inibidor específico de COX-2 e um agente quimio-preventivo provado no cólon. Os ficheiros dos resultados do varrimento foram analisados e foi determinado o valor de expressão de cada gene. Dos aproximadamente 20.000 genes presentes no chip de Affymetrix, 1.081 eram diferencialmente expressos (> 2 vezes) em células tumorais (Sagiv, E., et al., 2006, Gastroenterology, 131: 630-639; e dados não mostrados).

Destes, um grupo de 71 genes mostrou uma reversão para níveis normais de expressão após tratamentos curtos e longos com celecoxib. Um dos genes mostrando reversão para expressão normal é o gene codificando para CD24 (N°. de Entrada GenBank NM_013230; SEQ ID NO:l). EXEMPLO 2

CD24 É SOBRE-EXPRESSA EM EVENTOS INICIAIS DE CARCINOGÉNESE

DE CRC 34

Tal como descrito aqui na secção de Antecedentes acima, Weichert W., et al. (Clin. Câncer Res. 2005, 11: 6574-6581) testaram o padrão de expressão de CD24 em 146 carcinomas colorrectais (CRC) e verificou-se que embora em 68,7% dos tumores a CD24 exibiu uma coloração membranosa, em 84,4% dos tumores a CD24 é expressa no citoplasma. Adicionalmente, em 10% dos casos foi observada uma expressão citoplasmática de CD24 excepcionalmente forte que se correlacionou com um estádio tumoral mais elevado e um prognóstico mais fraco. No entanto, até à data o nivel de expressão de CD24 em tumores pré-malignos do tracto GI nunca foi testado.

Com base no padrão de expressão regulado de CD24 em linhas celulares transformadas com mutantes de rãs (ver Exemplo 1, aqui e acima), e para determinar o envolvimento de CD24 nos eventos iniciais conduzindo a carcinogénese do tracto GI, foram efectuadas análises imuno-histoquímicas num grupo compreensivo de 398 amostras incluindo tecido normal, tumores pré-malignos e tumores malignos de todo o tracto GI, como se segue.

Materiais e Métodos Experimentais

Análise imano-histoquímica - Foram efectuadas análises imuno-histoquímicas com uma técnica de imunoperoxidase de complexo avidina-biotina (Umansky, M., Rattan, J., et al., Oncogene 2001; 20: 7987-7991). Foram montadas secções de tecido de quatro micrómetros em lâminas revestidas com poli-L-lisina. Após desparafinização em Americlear (Baxter, McGaw Pari, IL) e etanol absoluto, as secções foram hidratadas através de uma série graduada de álcool, água destilada, e solução salina tamponada com fosfato (PBS) a pH 7,4. As lâminas foram então imersas em tampão citrato 10 mM (pH 6) e sujeitas a microondas a 750 W durante um total de 10 minutos. Após bloqueio com soro de cabra durante 20 35 minutos, os anticorpos primários, anticorpo monoclonal anti-CD24 (Ab-2, clone 24Co2; Neomarkers, Fremont, CA) , foram aplicados e incubados de um dia para o outro a 4°C numa câmara de elevada humidade. Embora todas as concentrações de anticorpo primário tenham dado boa coloração membranosa, a concentração ideal com um fundo minimo foi de 20 pg/mL. Como controlo negativo, secções em duplicado de amostras de tecido seleccionadas foram imunocoradas na ausência do anticorpo primário. Passos subsequentes utilizaram o estojo Vectastain Elite ABC de coelho (Vector Laboratories, Burlingame, CA) de acordo com as instruções do fabricante. A revelação da cor foi alcançada com 0,375 mg/dL de solução de tetracloridrato de 3,3'-diaminobenzidina (Sigma Chemical, Co, St. Louis, MO) contendo peróxido de hidrogénio a 0,0003%. As lâminas foram contrastadas com hematoxilina e desidratadas, e as lamelas foram aplicadas utilizando meio de montagem Acrytol (Surgipath Medicai Industries, Richmond, IL).

Resultados Experimentais CD24 é sobre-expressa em vários adenomas e carcinomas do cólon, recto e todo o tracto GI - Tal como é mostrado na Tabela 1, aqui e abaixo, a análise imuno-histoquimica validou os resultados dos arrays relacionados com a sobre-expressão deste gene (CD24) em relação ao meio proteico celular, bem como a projecção dos resultados obtidos a partir do modelo de rato em tecidos humanos de CRC. Para este fim, a expressão de CD24 foi determinada em 398 amostras abrangendo todo o tracto GI (benignas e malignas), 66 delas eram amostras de CRC. A coloração positiva da membrana luminal para CD24 foi observada em 49 dos 54 (90,7%) pólipos colo-rectais adenomatosos (tumores pré-malignos) e em 57 dos 66 (86,3%) adenocarcinomas (Tabela 1) . Deve observar-se que a 36 coloração positiva da membrana tinha a mesma extensão nos tumores pré-malignos (adenomas) que nos malignos. Por outro lado, a coloração membranar foi positiva em apenas 9 de 54 (16,6%) amostras de mucosa de aparência normal adjacentes às de CRC. A coloração positiva da membrana não estava relacionada com o género ou a idade do paciente, nem com o tamanho ou o grau de displasia em pólipos adenomatosos (dados não mostrados). Adicionalmente, a coloração positiva da membrana foi observada em 77,9% dos adenomas pré-malignos de todo o tracto GI e em 71,2% dos carcinomas de todo o tracto GI (Tabela 1).

Tabela 1

Análise imuno-histoquímica de CD24 em CRC e outros tumores GI Cólon e Recto Todo o tracto GI Coloração de CD24 Tecido Normal Adenana Carcinoma Tecido Normal Adencma Carcinana Negativa N (%) 45 (83,3) 5 (9,2) 9 (13,6) 122 (83) 21 (22,1) 45 (28,8) Positiva N (%) 9 (16,6) 49 (90,7) 57 (86,3) 25 (17) 74 (77,9) 111 (71,2) Total N (%) 54 (100) 54 (100) 66 (100) 147 (100) 95 (100) 156 (100)

Tabela 1: 398 espécimes normais e tumorais obtidos a partir de mucosa normal adjacente e tumores de todo o tracto GI (esófago, estômago, pâncreas, intestino delgado e grosso) foram corados para CD24 utilizando anticorpos monoclonais anti-CD24 (Ab-2, clone 24C02; Neomarkers, Fremont, CA) e a coloração da membrana foi registada de acordo com um registo de intensidade numa escala de 0, 1, 2 e 3 de intensidade crescente. São mostradas as frequências da coloração positiva da membrana (de um registo de intensidade superior a "1") em tecido normal, adenomas (lesões pré-malignas) e carcinomas de todo o tracto GI (incluindo o cólon e recto) bem como no cólon e recto como um grupo separado. O facto de CD24 ser expressa na mesma extensão em adenomas (o estádio pré-maligno de um carcinoma) bem como em todos os estádios de CRC ou os carcinomas de todo o tracto GI indica que a expressão de CD24 é um evento inicial no processo de múltiplos passos de carcinogénese de CRC. Assim, a expressão de CD24, não só em carcinomas (CRC e 37 todo o tracto Gl), mas já na lesão pré-maligna, p. ex., o pólipo adenomatoso, sugere a utilização de CD24 como marcador inicial de processos carcinogénicos de todo o tracto GI. EXEMPLO COMPARATIVO 3

O POLIMORFISMO NO GENE DE CD24 TEM SIGNIFICADO CLÍNICO

Sabe-se muito pouco acerca de polimorfismo no gene de CD24. Zhou Q., et al. 2003 (Proc. Natl. Acad. Sei. 100: 15041- 15046) descreveram um polimorfismo de um único nucleótido (SNP) no gene humano de CD24 (substituição C->T na posição 280 de N°. de Entrada GenBank NM_013230; SEQ ID NO:l) resultando numa mutação (GCG (Ala) -<· GTG (Vai) na posição 57 da proteina CD24 exposta por SEQ ID NO:2; N°. de Entrada GenBank NP_037362) imediatamente após o putativo local de clivagem da âncora GPI, que está associada a um maior risco e uma progressão mais rápida de Esclerose Múltipla. O gene de APC (proteina - N°. de Entrada GenBank NP_000029.2 (SEQ ID NO: 8), ARNm - N°. de Entrada GenBank NM_000038.3 (SEQ ID NO:7)) codifica uma proteina supressora tumoral, e é amplamente mutado como primeiro evento no processo de carcinogénese do cólon e do recto. Laken et al. (Laken, SJ., Petersen, GM., Gruber, SB., Oddoux,

Vogelstein, B. "Familial colorectal câncer in Ashkenazim due to a hypermutable tract in APC". Nat. Genet. 17: 79-83, 1997) identificaram ο I1307K que resulta numa substituição de Isoleucina (I) por Lisina (K) no codão 1307 da proteina. A alteração não afecta a funcionalidade da proteina mas cria uma sequência de 8 Adeninas nos genes, o que aumenta o risco de erros na actividade da ADN-polimerase e assim uma região de 500 pb em elevado risco de mutabilidade (Laken, SJ, et al., 1997). Estudos anteriores efectuados pelos presentes inventores (H. Strul, et al., 2003) demonstraram 38 que este polimorfismo não contribui para a avaliação do risco para CRC. 0 polimorfismo E1317Q na proteína APC não possui um efeito funcional ou fenotípico conhecido mas causa uma actividade de reparação de erros e está relacionado com maior risco de neoplasia colorrectal.

Materiais e Métodos Experimentais

Genotipagem - ADN genómico foi extraído de linfócitos do sangue periférico. Foram tomados cerca de 200 ng de ADN para reacção de PCR em tempo real (para os SNPs de APC) ou análise de RFLP (para o SNP de CD24), como se segue.

Determinação do polimorfismo Ala/Val na posição 57 da proteína CD24 - O ADN genómico foi amplificado por PCR utilizando os seguintes iniciadores: Directo: 5' TTGTTGCCACTTGGCATTTTTGAGGC (SEQ ID NO:3) e Reverso: 5' - GGATTGGGTTTAGAAGATGGGGAAA (SEQ ID NO:4) à temperatura de ligação de 50°C. O produto de PCR de CD24 resultante é de 520 pb. A mudança C^T na posição 280 de SEQ ID NO: produz um local da enzima de restrição BstXI no nucleótido 327 do produto de PCR, o que permite a diferenciação dos dois alelos de CD24 através de análise do comprimento do fragmento de restrição. Assim, o ADN codificando o polimorfo Val-57 é digerido por BstXI a cerca de 320 e 200 pb e o ADN codificando o polimorfo Ala-57 não é digerido por BstXI e é assim de 520 pb.

Determinação do polimorfismo I1307K no gene de APC - O polimorfismo I1307K é uma substituição de isoleucina (I) (alelo comum) por lisina (K) (alelo raro) na posição 1307 de N°. de Entrada GenBank NP_000029.2; SEQ ID NO:8; o que resulta da substituição T-»A no nucleótido 3977 de 39 N_000038.3; SEQ ID NO:7. Resumidamente, o ADN genómico foi amplificado por PCR utilizando os seguintes iniciadores: Directo 5' - GATTCTGCTAATACCCTGCAAATAGCA-3' (SEQ ID NO:5) e reverso 5' - CCCTGCAGTCTGCTGGATTTGG-3' (SEQ ID NO:6). Para PCR em tempo real é desenhado um iniciador sensor de acordo com o alelo de tipo selvagem e a jusante deste um iniciador âncora. A reacção à luz muda de acordo com a temperatura à gual o sensor se liga ao ADN e encontra a âncora; a temperatura é elevada com o tempo e o tempo de reacção é medido. Para a detecção do nucleótido polimórfico especifico (T/A na posição 3977 de SEQ ID NO:7) o iniciador âncora foi: LC-Red640-TTTGCAGGGTATTAGCAGAATCTGCTTCCTGTG-ph (SEQ ID NO:9) e o iniciador sensor foi: CCAATCTTTTCTTTTTTTTCT-FL (SEQ ID NO:10).

Determinação do polimorfismo E1317Q no gene de APC - 0 polimorfismo E1317Q é uma substituição de Ácido glutâmico (E) (alelo comum) por Glutamina (Q) (alelo raro) na posição 1317 de Número de Entrada GenBank NP_000029.2; SEQ ID NO: 8; o que resulta da substituição G^C no nucleótido 4006 de N_000038.3; SEQ ID NO:7. Resumidamente, o ADN genómico foi amplificado por PCR utilizando os seguintes iniciadores: Iniciadores directo 5'-GATTCTGCTAATACCCTGCAAATAGCA-3' (SEQ ID NO:5) e reverso 5'-CCCTGCAGTCTGCTGGATTTGG-3' (SEQ ID NO: 6) e a detecção do nucleótido polimórfico especifico (G/C na posição 4006 de SQ ID NO:7) foi por PCR em tempo real utilizando o iniciador âncora:

TGCTGTGACACTGCTGGAACTTCGC - FL (SEQ ID NO:11) e iniciador sensor: ph-LC-Red705-CACAGGATCTTGAGCTGACCTAG (SEQ ID NO:12) .

Resultados Experimentais A expressão de CD24 é dependente do genótipo de CD24 na posição 57 (Ala/Val 57) - Utilizando o teste de RFLP de CD24 os presentes inventores verificaram que células HT29, 40 que expressam elevado nível da proteína CD24, exibem o genótipo CD24v/v (Val/Val na posição 57 da proteína CD24) enquanto as células Panei e as células HCT116 que pouco expressam a proteína possuem o genótipo CD24a/a (Ala/Ala na posição 57 da proteína CD24). Estes resultados sugerem que a sobre-expressão da proteína CD24 está associada ao polimorfo Val-57 da proteína CD24. No entanto, a maior parte de CRC possuindo CD24 não terá o genótipo a/a. Para confirmar esta hipótese, os genótipos de CD24 foram analisados a partir de ADN de sangue periférico e foram determinadas as frequências dos três genótipos. A Figura 4 representa um exemplo da análise do genótipo efectuada utilizando o polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição (RFLP) do polimorfismo Ala57Val do gene de CD24 utilizando a enzima de restrição BstXI. O polimorfo Val-57 está associado a maior risco de carcinogénese de CRC - Um conjunto de dados de 1064 indivíduos (sujeitos saudáveis normais e pacientes de CRC) com idade média de 58,68 anos, desv. padrão: 14,78, revelou que 61,75% da população eram Judeus Israelitas Ashkenazi e 25,47% eram Judeus Israelitas Sefarditas (os restantes são grupos mistos ou de outra etnia). Entre a população testada, os Judeus Sefarditas mostraram uma associação significativa para ancoragem do genótipo comum A/A (Ala): OR 1,3 (1,0-1,8) p = 0,04. Deve notar-se que a prevalência de CRC nos Judeus Sefarditas é menor que em Judeus Ashkenazi (Darwish, H., Trejo, IE., et al., 2002. "Fighting colorectal câncer: molecular epidemiology differences among Ashkenazi and Sephardic Jews and Palestinians". Ann Oncol., 13: 1497-501; Rozen, P., Lynch, HT., Figer, A. et al. "Israel Câncer Registry", "Câncer in Israel", Ministry of Health, Jerusalem, 1987. "Familial colon câncer in the Tel- 41

Aviv area and the influence of ethnic origin". Câncer; 60: 2355-2362). Assim, estes resultados sugerem que o polimorfo Ala na posição 57 da proteina CD24, especialmente no seu estado homozigótico, é um genótipo protector contra CRC, e por outro lado, o polimorfo Val-57 da proteina CD24 é um genótipo de risco de CRC.

Tal como é ainda mostrado nas Tabelas 2 e 3, abaixo, a pesquisa de 890 sujeitos dos quais 393 foram diagnosticados com CRC e 498 eram sujeitos saudáveis revelou que o genótipo Val/Val (Tabela 2) e o alelo Vai (Tabela 3) é mais prevalente em sujeitos afectados com CRC que em controlos saudáveis, sugerindo assim a associação do polimorfo Val-57 a CRC.

Tabela 2

Frequências dos genótipos do polimorfismo Ala/Vai 57 de CD24

Genótipos Sujeitos totais W AV AA CRC 392 31 (7,9%) 144 (36,7%) 217 (55,35%) Normal 498 34 (6,8 %) 176 (35,35%) 288 (57,83 %) 42

Tabela 3

Frequências dos alelos do polimorfismo Ala/Val 58 de CD24 Cromossomas Totais Alelo Vai Alelo Ala CRC 784 206 (26,275 %) 578 (73,72%) Normal 996 244 (24,49 %) 752 (75,50%)

Genótipos combinados em genes de CD24 e APC estão altamente associados a maior risco de neoplasia ou cancro colorrectal - Para testar mais a associação de genótipos combinados nos genes de CD24 e APC, 375 sujeitos com genótipo A/V (na posição 57) da proteína CD24 foram testados quanto à presença do polimorfismo E1317Q na proteína APC. 7 dos 375 sujeitos foram positivos para o polimorfismo E1317Q (i.e., exibiram um alelo do polimorfo 1317Q na proteína APC). Seis dos sete sujeitos (85,7%) que eram A/V para CD24 e E1317Q para APC tinham neoplasia colorrectal. Por outro lado, 368 sujeitos eram negativos para o polimorfo 1317Q na proteína APC (i.e., exibiram apenas E1317). 162 dos 368 sujeitos (44%) tinham neoplasia colorrectal o que produz uma razão de probabilidade (OR) de 7,62963 (Qui-quadrado = 4,83, valor de p 0,028). Assim, estes resultados demonstram que entre os indivíduos que possuem uma mutação no gene de iniciação de carcinogénese tal como o E1317Q de APC, a presença de um polimorfo Val-57 da proteína CD24 é indicativa de maior risco de predisposição para cancro colorrectal. 405 sujeitos com o genótipo A/V (na posição 57) da proteína CD24 foram testados quanto à presença do polimorfismo I1307K na proteína APC. 31 dos 405 sujeitos foram positivos (i.e., exibiram pelo menos um alelo do polimorfo 1307K na proteína APC). 21 dos 31 (67,7%) sujeitos que eram A/V para CD24 e I1307K para APC tinham neoplasia colorrectal. Por outro lado, dos 374 sujeitos que foram negativos para o polimorfismo I1307K na proteína APC (i.e., exibiram apenas 43 o polimorfo 11307 na proteína APC) 175 (46%) tinham neoplasia que resulta numa OR de 2,388 (Qui-quadrado 5,03; valor de p = 0,0249). Assim, estes resultados demonstram que entre os indivíduos que possuem uma mutação no gene de iniciação de carcinogénese tal como ο I1307K de APC, a presença de um polimorfo Val-57 na proteína CD24 é indicativa de maior risco de predisposição para cancro colorrectal. EXEMPLO 4

DETECÇÃO DE CD24 NAS FEZES, NO SORO OU NA URINA COMO MARCADOR INICIAL DE MALIGNIDADE DO TRACTO GI

Tal como aqui descrito no Exemplo 2 acima, CD24 foi significativamente sobre-expressa em tumores pré-malignos do tracto GI, tais como pólipos adenomatosos colorrectais e pólipos adenomatosos de todo o tracto GI. Estes resultados sugerem que a expressão de CD24 pode preceder a conversão do adenoma pré-maligno num adenocarcinoma maligno. Dado que CD24 é expressa na superfície celular e conjugada através de uma âncora GPI, os presentes inventores colocaram a hipótese de que CD24 que é derramada ou verificada em resíduos de membrana de bolhas ou morte celular pode ser detectada em várias amostras biológicas derivadas de sujeitos possuindo tumores pré-malignos, e a sua detecção pode servir como marcador inicial de carcinogénese do tracto GI.

Para determinar a presença de CD24 em amostras biológicas obtidas utilizando métodos não invasivos (p.ex., fezes, urina e soro), os presentes inventores montaram condições experimentais para imunoprecipitação de CD24, como se segue.

Materiais e Métodos Experimentais 44

Análise de imunoprecipitação (IP) de amostras de soro (bem como fezes ou urina) - Amostras de soro (500 yL) foram misturadas com volumes iguais (500 pL) de tampão de lise (Tris-HCl 40 mM, pH 7,4, EDTA 4 mM, NP40 a 2%, SDS a 0,2%) ou solução salina tamponada com fosfato (PBS). Contas de Sepharose conjugadas com anti-ratinho (Sigma, N°. Cat. A6531) (20 pL) foram incubadas durante 1 hora com 2-5 pg do anticorpo monoclonal anti-CD24 (SWAll), e aliquotas do complexo contas-anticorpo (20 pL) foram então misturadas com as amostras de soro lisadas e incubadas de um dia para o outro numa sala fria com agitação. Os complexos imunitários de contas resultantes que incluíam a proteína CD24 das amostras de soro foram colhidos (através de breve centrifugação) e lavados 6 vezes com tampão Hepes-solução salina (HEPES 20 mM, NaCl 150 mM, a Triton a 0,1% e Glicerol a 10%), e depois os imunoprecipitados de CD24 foram eluídos através de tampão de amostra proteica 4χ (Tris-HCl 200 mM pH 6,8, glicerol a 40%, SDS a 8%, azul de Bromofenol a 0,2%, DTT 100 mM) a 90-95°C (5 minutos) seguido de breve centrifugação para separar as contas da proteína CD24 e do anticorpo anti-CD24. Os eluatos foram então sujeitos a análise Western blot utilizando o anticorpo anti-CD24, SWAll.

Alternativamente, amostras de soro foram incubadas com tampão de lise ou PBS (tal como aqui descrito acima) e a imunoprecipitação foi efectuada com contas conjugadas com Concavalina A, que se liga a proteínas glicosiladas. Os imunocomplexos nas contas foram então separados da amostra (através de breve centrifugação), seguido de eluição a 90-95°C. Os eluantes (contendo a proteína CD24) foram então sujeitos a SDS-PAGE seguido de análise Western blot com o anticorpo de CD24, SWAll. 45

Análise Western blot - foi efectuada em lisados celulares preparados utilizando o seguinte tampão de lise: Tris-HCl 20 mM, pH 7,4, EDTA 2 mM, NP40 a 1%, SDS a 0,1%, ou na presença de PBS utilizando o anticorpo SW11 de forma semelhante ao western blot efectuado após análise de IP. Resumidamente, a quantidade de proteína nos extractos celulares é determinada (p. ex., utilizando o ensaio Bradford) e são carregados 16 yg de proteína total em cada poço.

Resultados Experimentais

Calibração do ensaio de IP de CD24 - Os anticorpos de CD24 ML5 e SWAll (Jackson, D., Waibel, R., Weber, E., Bell, J., Stahel, RA. "CD24, a signal-transducing molecule expressed on human B cells, is a major surface antigen on small cell lung carcinomas". Câncer Res. 1992; 52: 5264-7) foram empregues para calibrar o ensaio de IP. Extractos das linhas celulares de CRC, HCT116 (que não expressa CD24) ou HT29 (que expressa CD24), foram sujeitos a IP de CD24 (utilizando contas de Sepharose anti-ratinho) seguido de análise Western blot com os anticorpos ML5 ou SWAll. Tal como é mostrado na Figura 1, verificou-se que o anticorpo SWAll é um anticorpo eficiente para análise de IP, produzindo baixo fundo.

Determinação da sensibilidade da análise de IP de CD24 -

Para avaliar a sensibilidade do método, lisados de células HT29, que expressam CD24, foram homogeneizados com concentrações crescentes de soro normal seguido de análise de IP. A proteína CD24 era visível quando 1 mg, 100 yg e 10 yg de lisados foram misturados em 1 mL de soro mas não em 1 yg e menos (os dados não são mostrados). A experiência foi repetida duas vezes, mudando cada vez as vezes de incubação 46 do complexo contas-Ac com as amostras para aumentar a sensibilidade e reduzir os sinais de fundo.

Análise de IP de CD24 em amostras de soro - Para determinar se a sobre-expressão de CD24 em tumores GI (pré-malignos e malignos) está associada à presença de CD24 no soro, amostras de soro de pacientes cujas biopsias tumorais foram anteriormente coradas positivamente através de IHC de CD24 foram sujeitas a análise de IP utilizando anticorpos monoclonais de CD24 ou contas conjugadas com concanavalina A (a concanavalina A liga-se a proteínas glicosiladas). Resumidamente, amostras de soro (0,5 mL) foram incubadas de um dia para o outro com contas precipitadoras que foram preparadas através de pré-incubação de contas de Sepharose conjugadas com anti-ratinho (Sigma, Israel) com o anticorpo monoclonal anti-CD24, SWA11. Em pacientes cujo soro foi tomado na altura em que CRC estava activo, foi observado um sinal de uma proteína de 35-40 kDa, correspondendo à proteína CD24 em pacientes. Por outro lado, em pacientes cujo soro foi tomado quando CRC não estava activo (em remissão), não houve expressão ou houve expressão significativamente reduzida de CD24 (Figura 3 e dados não mostrados). A CD24 foi também purificada a partir da amostra de soro de um paciente com CRC activo através de cromatografia de permuta aniónica utilizando uma minicoluna de DEAE-celulose (DE52) e esgotamento de albumina, seguido de Western blot com o anticorpo monoclonal anti-CD24, SWA11 (Figura 5). Estes resultados demonstram a presença de proteína CD24 em soro de sujeitos com CRC activo e sugerem a sua detecção no soro como marcador para malignidades GI.

Análise Western blot de CD24 em amostras de fezes e urina -

Mais de 90 amostras de fezes e urina de pacientes de CRC e sujeitos saudáveis, assistidos no Integrated Câncer 47

Prevention Center (Sorasky Medicai Center, Tel Aviv,

Israel) foram colhidas e armazenadas a -80°C. Todos os sujeitos assinaram um consentimento informado com a aprovação do hospital IRB e do ministro da saúde, e foram registados os correspondente relatórios endoscópicos. Para analisar a presença de CD24 em amostras de fezes, uma pequena quantidade (0,3-0,5 mL) foi retirada da amostra congelada e homogeneizada em 1 mL de tampão de lise proteica com inibidores de proteases. Os lisados foram colhidos a partir da fase sobrenadante após centrifugação do homogenato (20 minutos, 14,000 rpm). Em 21/26 sujeitos que sofreram exame colonoscópico e foram diagnosticados com tumores benignos ou malignos verificou-se CD24 nas fezes (dados não mostrados).

Deve observar-se que ao utilizar tampão de lise (que remove os componentes membranares) ou PBS (que não deve afectar os componentes membranares) não houve diferença significativa no nível de CD24 detectado através de análises de IP ou Western blot (dados não mostrados) sugerindo assim que a maioria da CD24 detectada no soro não estava ancorada na membrana. O nível de CD24 nas fezes diminuí após a remoção do tumor -

Para confirmar que pelo menos em parte, a proteína detectada na amostra de fezes tem origem no tumor, amostras de fezes foram colhidas de 11 pacientes antes e após remoção cirúrgica/endoscópica do tumor. Diferenças nos níveis de expressão de CD24 foram visíveis entre as amostras emparelhadas (Figuras 2a-c; e dados não mostrados de uma experiência repetida), demonstrando que a presença de CD24 nas fezes tem origem pelo menos em parte nos tumores. 48 O nível de CD24 nas fezes diminuí após terapia de radiação - Para melhor substanciar a relação entre CD24 nas fezes e a presença de células cancerosas (doença CRC activa) o nível de CD24 foi detectado em pacientes de CRC após a remoção cirúrgica do tumor mas antes ou após terapia de radiação. Tal como é mostrado na Figura 2b (pistas 13 e 14), foi observada uma diminuição significativa no nível de CD24 após terapia de radiação em comparação com antes do tratamento. Assim, estes resultados demonstram que o nível de CD24 nas fezes está correlecionado com a presença de células cancerosas e pode ser utilizado para monitorizar a eficácia do tratamento. A presença de espécies da proteína CD24 de baixo peso molecular é indicativa de lesões colorrectais pré-cancerosas ou cancerosas - Tal como observado nas Figuras 2a-c, em amostras de fezes tomadas de pacientes antes da remoção cirúrgica dos tumores ou pólipos existem várias bandas reactivas para CD24 de baixo peso molecular de cerca de 25-37 kDa que estão ausentes nas amostras de fezes tomadas dos mesmos pacientes após a remoção cirúrgica dos pólipos ou tumores. Sem estar ligado a qualquer teoria, estes resultados podem indicar que a CD24 em circulação que está presente em amostras de fezes, urina ou soro de sujeitos possuindo lesões pré-malignas ou malignas compreende apenas uma porção da sequência de aminoácidos de CD24 ou representa uma forma menos glicosilada (e portanto uma espécie proteica de menor peso molecular) de CD24.

Em conjunto, estes resultados demonstram que a detecção de CD24 em circulação em amostras biológicas pode ser utilizada como um marcador de detecção precoce de cancro tal como malignidades GI e/ou para monitorização da eficácia de tratamento do cancro. Adicionalmente, a 49 presença de espécies de baixo peso molecular de CD24 (p.ex., entre 25 a 37 kDa) e/ou niveis elevados de CD24 (de qualquer tamanho no intervalo de 25-60 kDa) acima de um limiar predeterminado é indicativo de tumores pré-malignos ou malignos.

Análise e Discussão

As descobertas do presente estudo mostram que CD24 é expressa na membrana de uma percentagem claramente elevada de células de tumores pré-malignos e malignos do tracto GI, incluindo adenomas do cólon/recto e do resto do tracto alimentar (intestino delgado e tracto GI superior). Como proteina de superfície que é expressa num estádio inicial da progressão tumoral, embora raramente apareça em tecidos normais, os presentes inventores sugerem a CD24 como um novo biomarcador altamente fiável para células de cancro. Adicionalmente, as descobertas de CD24 em amostras biológicas tais como soro, fezes e urina em sujeitos possuindo lesões pré-malignas ou malignas do tracto GI demonstram, pela primeira vez, que a CD24 solúvel, derramada ou em bolhas (CD24 em circulação) pode ser utilizada no diagnóstico de lesões pré-malignas e malignas.

Dado que CD24 é um péptido curto, que se situa no lado externo das células e não possui domínio transmembranar mas apenas uma âncora para GPI, é provável crer-se que uma porção da proteína, que tal como é mostrado in vitro, é produzida excessivamente quando é expressa, é constantemente segregada das células tumorais e alcança a corrente sanguínea ou é clivada por lipases na matriz extracelular. Para além disso, células tumorais necróticas, seus fragmentos ou produtos de bolhas de células tumorais, podem também alcançar a corrente sanguínea e conter neles a proteina CD24 ancorada a GPI. 50

Os presentes inventores verificaram que um dos anticorpos monoclonais anti-CD24, o SWAll, detecta eficientemente CD24 em amostras biológicas utilizando uma análise de IP (juntamente com as contas conjugadas com anti-Ratinho (Sigma)) ou como um anticorpo de immunoblotting (p.ex., os lisados celulares mostrados na Figura 1). Assim, a CD24 que é derramada das células sobre-expressando CD24 (p.ex., as células pré-malignas de adenomas ou as células tumorais de CRC malignas) pode ser detectada através de IP seguida de análise Western blot em amostras de soro. Adicionalmente, a CD24 pode também ser seguida em fases de materiais maiores não dissolvidos (vesículas e fragmentos celulares) que são separados do seu meio através de ultra-centrifugação ou separação em gradiente de sacarose. Dado que CD24 está ancorada à membrana e pode portanto estar presente na corrente sanguínea ao mesmo tempo que está ainda integrada em fragmentos de membrana ou vesículas que são o produto de bolhas celulares, estes grandes corpos são concentrados tal como mencionado devido ao seu elevado peso e, as membranas são dissolvidas através de tampão de lise, e a IP é efectuada tal como descrito. Para além disso, anticorpos para a proteína podem também estar presentes no soro de sujeitos que expressam níveis elevados de CD24. A sua presença pode ser detectável utilizando metodologia ELISA com placas, revestidas com a proteína purificada ou fixadas com células que expressam elevados níveis de CD24. Células HT29 que expressam níveis elevados de CD24 são fixadas numa placa de 96 poços com formaldeído a 5%. O soro é adicionado ao poço durante 2 horas de incubação, após três lavagens um anticorpo anti-Humano-HRP é adicionado aos poços, lavado cinco vezes e a reacção de cor é efectuada através da adição de um substrato à HRP durante cinco minutos (3, 3', 5,5'-Tetrametilbenzidina (TMB), Sigma). A reacção é parada com ácido sulfúrico e a intensidade da cor (que 51 mostra a quantidade de anticorpo anti-CD24 no soro) é medida através de um dispositivo leitor de ELISA a 450 nm. O ADN de CD24 que pode ser derramado das células tumorais para a corrente sanguínea pode ser detectado através da realização de PCR RT de sangue periférico. As mutações e os polimorfismos que são pesquisados podem assim ser detectados, e podem também ser observadas através de reacções de PCR quantitativa, amplificações nos genes de CD24 que ocorrem dentro das células tumorais.

Os métodos para detecção de CD24 no soro de sujeitos, como ferramenta para diagnóstico precoce de cancro, pode ser aplicado a todos os tumores que tenham sido anteriormente relatados como tendo uma tendência para sobre-expressar CD24. Isto inclui todos os seguintes tumores, bem como suas lesões pré-malignas, e outros tumores que sejam descobertos no futuro como sobre-expressando CD24. A maioria dos tipos de linfomas sobre-expressam CD24, foi até agora relatado em: leucemia acuda, linfomas de anel de Waldeyer, leucemia linfoblástica aguda comum, linfoma não Hodgkin, tricoleucemia. Também, tumores sólidos expressam CD24 tais como: sarcoma de células claras, nefroblastoma, carcinoma de células renais, nefroma mesoblástico do adulto, carcinoma pulmonar de células pequenas e de células não pequenas, neuroblastoma, ganalioblastoma, sarcoma, carcinoma de células escamosas, carcinoma gástrico e colorrectal, carcinoma nasofaríngeo, cancro da bexiga, cancro da mama, glioma, cancro do ovário, cancro da próstata, cancro da próstata neuroendócrino, carcinoma de células de Merkel e cancro pancreático entre outros. 52

REFERÊNCIAS (Referências Adicionais são citadas no texto) 1. Aigner, S. , Sthoeger, Z. M., Fogel, M., Weber, E., Zarn, J., Ruppert, M., Zeller, Y., Vestweber, D., Stahel, R., Sammar, M., e Altevogt, P. "CD24, a mucin-type glycoprotein, is a ligand for P-selectin on human tumor cells". Blood, 1997, 89: 3385-3395. 2. Aigner, S., Ramos, C. L., Hafezi-Moghadam, A., Lawrence, Μ. B., Friederichs, J., Altevogt, P., e Ley, K. "CD24 mediates rolling of breast carcinoma cells on P-selectin". FASEB J. 1998, 12: 1241-1251. 3. Baumann, P., Cremers, N., Kroese, F., Orend, G., Chiquet-Ehrismann, R., Uede, T., Yagita, H., Sleeman, JP. "CD24 expression causes the acquisition of multiple cellular properties associated with tumor growth and metastasis". Câncer Res. 2005; 65: 10783-93. 4. Kanaoka, S., Yoshida, K., Miura, N., Sugimura, H., Kajimura, M. "Potential usefulness of detecting cyclooxygenase 2 messenger RNA in feces for colorectal câncer screening". Gastroenterology, 2004; 127(2): 422-7. 5. Kristiansen et al., 2004; J. of Mol. Hist. 35: 255-262. 6. Laken, SJ, Petersen, GM, Gruber, SB, Oddoux, Vogelstein, B. "Familial colorectal câncer in Ashkenazim due to a hypermutable tract in APC". Nat Genet 17: 79-83, 1997. 7. Mandei, J., Bond, J., et al., 1993, "Reducing mortality from colorectal câncer by screening for fecal occult 53 blood". Minnesota Colon Câncer Control Study. N. Engl. J. Med. 1993: 328: 1365-71. 8. McMahon, PM., Bosch, JL., et al., 2001. "Cost- effectiveness of colorectal câncer screening". Radiology, 219 (1) : 44-50. 9. Roessler, M., Rollinger, W., Palme, S., Hagmann, ML., et al., 2005. "Identification of nicotinamide N-methyltransferase as a novel serum tumor marker for colorectal câncer". Clin. Câncer Res. 2005 Set 15; 11(18): 6550-7 . 10. Roessler, M., Rollinger, W., Mantovani-Endl, L., et al. "Identification of PSME3 as a Novel Serum Tumor Marker for Colorectal Câncer by Combining Two-dimensional

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LISTAGEM DAS SEQUÊNCIAS <110> Medicai Research Fund of Tel Aviv Sourasky Medicai Center Arber, Nadir <120> MÉTODOS E ESTOJOS PARA DETECÇÃO PRECOCE DE CANCRO OU PREDISPOSIÇÃO A ESTE <130> 32835 <160> 12 <170> Patentln versão 3.4

<210> 1 <211> 2194 <212> ADN 55 <213> Homo sapiens <2 2 Ο > <221> misc_característica <222> (280) . . (280)

<223> polimorfismo C/T <4 0 0> 1 gggtctcgcc ggctcgccgc gctccccacc ttgcctgcgc ccgcccggag ccagcggttc 60 tccaagcacc cagcatcctg ctagacgcgc cgcgcaccga cggaggggac atgggcagag 120 caatggtggc caggctcggg ctggggctgc tgctgctggc actgctccta cccacgcaga 180 tttattccag tgaaacaaca actggaactt caagtaactc ctcccagagt acttccaact 240 ctgggttggc cccaaatcca actaatgcca ccaccaaggn ggctggtggt gccctgcagt 300 caacagccag tctcttcgtg gtctcactct ctcttctgca tctctactct taagagactc 360 aggccaagaa acgtcttcta aatttcccca tcttctaaac ccaatccaaa tggcgtctgg 420 aagtccaatg tggcaaggaa aaacaggtct tcatcgaatc tactaattcc acacctttta 480 ttgacacaga aaatgttgag aatcccaaat ttgattgatt tgaagaacat gtgagaggtt 540 tgactagatg atggatgcca atattaaatc tgctggagtt tcatgtacaa gatgaaggag 600 aggcaacatc caaaatagtt aagacatgat ttccttgaat gtggcttgag aaatatggac 660 acttaatact accttgaaaa taagaataga aataaaggat gggattgtgg aatggagatt 720 cagttttcat ttggttcatt aattctataa ggccataaaa caggtaatat aaaaagcttc 780 catgattcta tttatatgta catgagaagg aacttccagg tgttactgta attcctcaac 840 gtattgtttc gacagcacta· atttaatgcc gatatactct agatgaagtt ttacattgtt 900 gagctattgc tgttctcttg ggaactgaac tcactttcct cctgaggctt tggatttgac 960 attgcatttg accttttatg tagtaattgs catgtgccag ggcaatgatg aatgagaatc 1020 tacccccaga tccaagcatc ctgagcaact cttgattatc catattgagt caaatggtag 1080 gcatttccta tcacctgttt ccattcaaca àgagcactac attcatttag ctaaacggat 1140 tccaaagagt agaattgcat tgaccacgac taatttcaaa atgcttttta ttattattat 1200 tttttagaca gtctcacttt gtcgcccagg ccggagtgca gtggtgcgat ctcagatcag 1260 tgtaccattt gcctcccggg ctcaagcgat tctcctgcct cagcctccca agtagctggg 1320 attacaggca cctgccacca tgcccggcta atttttgtaa ttttagtaga gacagggttt 1380 caccatgttg cccaggctgg tttcgaactc ctgacctcag gtgatccacc cgcctcggcc 1440 56 tcccaaagtg ctgggattac aggcttgagc ccccgcgccc agccatcaaa atgcttttta 1500 tttctgcata tgttgaatac tttttacaat ttaaaaaaat gatctgtttt gaaggcaaaa 1560 ttgcaaatct tgaaattaag aaggcaaaaa tgtaaaggag tcaaaactat aaatcaagta 1620 tttgggaagt gaagactgga agctaafcttg cattaaattc acaaactttt afcactctttc 1680 tgtatataca ttttttttct ttaaaaaaca actatggatc agaatagcca catttagaac 1740 actttttgtt atcagtcaat atttttagat agttagaacc tggtcctaag cctaaaagtg 1800 ggcttgattc tgcagtaaat cttttacaac tgcctcgaca cacataaacc tttttaaaaa 1860 tagacactcc ccgaagtctt ttgttcgcat ggtcacacac tgatgcttag atgttccagt 1920 aatctaatat ggccacagta gtcttgatga ccaaagtcct ttttttccat ctttagaaaa 1980 ctacatggga acaaacagat cgaacagttt tgaagctact gtgtgtgtga atgaacactc 2040 ttgctttatt ccagaatgct gtacatctat tttggattgt atattgtgtt tgtgtattta 2100 cgctttgatt catagtaact tcttatggaa ttgatttgca ttgaacacaa actgtaaata 2160 aaaagaaatg gctgaaagag caaaaaaaaa aaaa 2194

<210> 2 <211> 80 <212> PRT <213> Homo sapiens <2 2 0 > <221> misc_característica <222> (57) . . (57) <223> polimorfismo Ala/Val <400> 2

Met Gly Arg Ala Met Vai Ala Arg Leu Gly Leu Gly Leu Leu Leu Leu 15 10 15

Ala Leu Leu Leu Pro Thr Gin Ile Tyr Ser Ser Glu Thr Thr Thr Gly 20 25 30

Thr Ser Ser Asn Ser Ser Gin Ser Thr Ser Asn Ser Gly Leu Ala Pro 35 40 45 57

Asn Pro Thr Asn Ala Thr Thr Lys Xaa Ala Gly Gly Ala Leu Gin Ser 50 55 60

Thr Ala Ser Leu Phe Vai Vai Ser Leu Ser Leu Leu His Leu Tyr Ser 65 70 75 80

<210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Oligonucleótido de ADN de cadeia simples < 4 0 0 > 3 ttgttgccac ttggcatttt tgaggc 26

<210> 4 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Oligonucleótido de ADN de cadeia simples < 4 0 0 > 4 ggattgggtt tagaagatgg ggaaa 25

<210> 5 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Oligonucleótido de ADN de cadeia simples 58 <4Ο0> 5 gattctgcta ataccctgca aatagca 27

<210> 6 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <2 2 0 > <223> Oligonucleótido de ADN de cadeia simples <400> 6 ccctgcagtc tgctggattt gg 22

<210> 7 <211> 10719 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> misc caracteristica <222> (3977) .. (3977)

<223> polimorfismo T/A <2 2 0> <221> misc_caracteristica <222> (4006) .. (4006)

<223> polimorfismo G/C <400> 7 tggagacaga atggaggtgc tgccggactc ggaaatgggg tccaagggta gccaaggatg 60 gctgcagett catatgatca gttgttaaag caagttgagg cactgaagat ggagaactca 120 180 aatcttcgac aagagctaga agataattcc aatcatctta caaaactgga aactgaggca 59 tctaatatga aggaagtact taaacaacta caaggaagta ttgaagatga agctatggct 240 tcttctggac agattgattt attagagcgt cttaaagagc ttaacttaga tagcagtaat 300 ttccctggag taaaactgcg gtçaaaaatg tccctccgtt cttàtggaag ccgggaagga 360 tctgtatcaa gccgttctgg agagtgcagt cctgttccta tgggttcatt tccaagaaga 420 gggtttgtaa atggaagcag agaaagtact ggatatttag aagaacttga gaaagagagg 480 tcattgcttc ttgctgatct tgacaaagaa gaaaaggaaa aagactggta ttacgctcaa 540 cttcagaatc tcactaaaag aatagatagt cttcctttaa ctgaaaattt ttccttacaa 600 acagatatga ccagaaggca attggaatat gaagcaaggc aaatcagagt tgcgatggaa 660 gaacaactag gtacctgcca ggatatggaa aaacgagcac agcgaagaat agccagaatt 720 cagcaaatcg aaaaggacat acttcgtata cgacagcttt tacagtccca agcaacagaa 780 gcagagaggt cãtctcagaa caagcatgaa accggctcac atgatgctga 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tgtttctcca 3360 3780 tacaggtcac ggggagccaa tggttcagaa acaaatcgag tgggttctaa tcatggaatt 3420 aatcaaaatg taagccagtc tttgtgtcaa gaagatgact atgaagatga taagcctacc 3480 aattatagtg aacgttactc tgaagaagaa cagcatgaag aagaagagag accaacaaat 3540 tatagcataa aatataatga agagaaacgt catgtggatc agcctattga ttatagttta 3600 aaatatgcca cagatattcc ttcatcacag aaacagtcat tttcattctc aaagagttca 3660 tctggacaaa gcagtaaaac cgaacatatg tcttcaagca gtgagaatac gtccacacct 3720 tcatctaatg ccaagaggca gaatcagctc catccaagtt ctgcacagag tagaagtggt 61 cagcctcaaa aggctgccac ttgcaaagtt tattgtgtag aagatactcc aatatgtttt tcagctgaag atgaaatagg atgtaatcag ctgcaaatag cagaaanaaa agaaaagatt gaagttccag cagtgtcaca gcaccctaga ttatcttcag aatcagccag gcacaaagct tccaaaagtg gtgctcagac acccaaaagt ctcatgttta gcagatgtac ttctgtcagt gcCagctccg ttcagagtga accatgcagt gatcttccag atagccctgg acaaaccatg cctcctcaaa cagctcaaac caagcgagaa aagagagaga gtggacctaa gcaagctgca cttccagatg ctgatacttt attacatttt tgttcatcca gcctgagtgc tctgagcctc ttaagaataa tgcctccagt tcaggaaaat cctaaagaat caaafcgaaaa ccaagagaaa gacctattag atgattcaga tgatgatgat gccatgccaa caaagtcatc acgtaaagca cctccacctg tggcaaggaa accaagtcag aacaggttgc aaccccaaaa gcatgttagt tattgtgttg aagggacacc tataaacttt atcgaatccc ctccaaatga gttagctgct ggtgaatttg aaaaacgaga taccattcct ggaggaaaaa cctcatctgt aaccatacct gatattcttg cagaatgcat taattctgct cgtgtgaaaa agataatgga ccaggtccag aaaaatcagt tagatggtaa gaaaaagaaa aatactgaat ataggacacg tgtaagaaaa gagagagttt tctcagacaa caaagattca gtcttcaatg ataagctccc aaataatgaa tcttctatta accaagaaac aatacagact tcaagatgta gttcattatc atctttgtca acgacacagg aagcagattc. tgctaatacc ggaactaggt cagctnaaga tcctgtgagc accaaatcca gcagactgca gggttctagt gttgaatttt cttcaggagc gaaatctccc ccacctgaac actatgttca ggagacccca tcacttgata gttttgagag tcgttcgatt ggaatggtaa gtggcattat aagccccagt ccaccaagca gaagtaaaac acctccacca gtacctaaaa ataaagcacc tactgctgaa gtaaatgctg cagttcagag ggtccaggtt gccacggaaa gtactccaga tggattttct gatgagccat ttatacagaa agatgtggaa gacaatggga atgaaacaga atcagagcag gaggcagaaa aaactattga LLctgaaaag attgaaatac tagaagaatg tattatttct aaaaagccag cccagactgc ttcaaaatta ctgcctgtgt acaaacttct accatcacaa tttacaccgg gggatgatat gccacgggtg tccacagcta catctctaag tgatctaaca ggagaaggag ttagaggagg ggcacagtca acagaaggca gaagtacaga tgaggctcaa gaattggatg acaataaagc agaggaaggt atgcccaaag ggaaaaghca caagcctttc caagcatctg cgtcttcttc tgcacccaac ccaacttcac cagtaaaacc tataccacaa aatgcagact caaaaaataa tttaaatgct aagaaacaga atttgaaaaa taattccaag gatagagtca gaggaagttt tgcttttgat 3840 3900 3960 4020 4080 4140 4200 4260 4320 4380 4440 4500 4560 4620 4680 4740 4800 4860 4920 4980 5040 5100 5160 5220 5280 5340 5400 5460 5520 5580 62 tcacctcatc attacacgcc tattgaagga actccttact gtttttcacg aaatgattct 5640 ttgagttctc tagattttga tgatgatgat gttgaccttt ccagggaaaa ggctgaatta 5700 agaaaggcaa aagaaaataa ggaatcagag gctaaagtta ccagccacac agaactaacc 5760 tccaaccaac aatcagctaa taagacacaa gctattgcaa agcagccaat aaatcgaggt 5620 cagcctaaac ccatacttca gaaacaatcc acttttcccc agtcatccaa agacatacca 5880 gacagagggg cagcaactga tgaaaagtta cagaattttg ctattgaaaa tactccggtt 5940 tgcttttctc ataattcctc tctgagttct ctcagtgaca ttgaccaaga aaacaacaat 6000 aaagaaaatg aacctatcaa agagactgag ccccctgact cacagggaga accaagtaaa 6060 cctcaagcat caggctatgc tcctaaatca tttcatgttg aagatacccc agtttgtttc 6120 tcaagaaaca gttctctcag ttctcttagt attgactctg aagatgacct gttgcaggaa 6180 tgtataagct ccgcaatgcc aaaaaagaaa aagccttcaa gactcaaggg tgataatgaa · 6240 aaacatagtc ccagaaatat gggtggcata ttaggtgaag atctgacact tgatttgaaa 6300 gatatacaga gaccagattc agaacatggt ctatcccctg attcagaaaa ttttgattgg 6360 aaagctattc aggaaggtgc aaattccata gtaagtagtt tacatcaagc tgctgctgct 6420 gcatgtttat ctagacaagc ttcgtctgat tcagattcca tcctttccct gaaatcagga 6480 atctctctgg gatcaccatt tcatcttaca cctgatcaag aagaaaaacc ctttacaagt 6540 aataaaggcc cacgaattct aaaaccaggg gagaaaagta cattggaaac taaaaagata 6600 gaatctgaaa gtaaaggaat caaaggagga aaaaaagttt ataaaagttt gattactgga 6660 aaagttcgat ctaattcaga aatttcaggc çaaatgaaac agccccttca agcaaacatg 6720 ccttcaatct ctcgaggcag gacaatgatt catattccag gagt.tcgaaa tagctcctca 6780 agtacaagtc ctgtttctaa aaaaggccca ccccttaaga ctccagcctc caaaagccct 6840 agtgaaggtc aaacagccac cacttctcct agaggagcca agccatctgt gaaatcagaa 6900 ttaagccctg ttgccaggca gacatcccaa ataggtgggt caagtaaagc accttctaga 6960 tcaggatcta gagattcgac cccttcaaga cctgcccagc aaccattaag tagacctata 7020 cagtctcctg gccgaaactc aatttcccct ggtagaaatg gaataagtcc tcctaacaaa 7080 ttatctcaac ttccaaggac atcatcccct agtactgctt caactaagtc ctcaggttct 7140 ggaaaaatgt catatacatc tccaggtaga cagatgagcc aacagaacct taccaaacaa 7200 acaggtttat ccaagaatgc cagtagt^tt ccaagaagtg agtctgcctc caaaggacta 7260 aatcagatga ataatggtaa tggagccaat aaaaaggtag aactttctág aatgtcttca 7320 actaaatcaa gtggaagtga atctgataga tcagaaagac ctgtattagt acgccagtca 7380 63 actttcatca aagaagetec aagcccaacc tttgaatctc tttctccatc atctagacca ccagttttaa gtccttccct tcctgatatg ggtggatggc gaaaactccc acctaatctc ccagcaaagc gccatgatat tgcacggtct aataggtcag gaacctggaa acgtgagcac agcacttgga gaagaactgg aagttcatct gaaaaagcaa aaagtgagga tgaaaaacat aaagaaaacc aagtatccgc aaaaggaaca cccacaaata gtacttctca gaccgtttcc actctaattt atcaaatggc acctgctgtt gaggactgtc ccattaacaa tcctagatct· gtgattgaca gtgtttcaga aaaggcaaat gcaaaacaaa atgtgggtaa tggcagtgtt ctgaactcct ttattcaggt ggatgcccct caaaataatc ctgtccctgt atcagagact ttcagttcta gcagctcaag caaacacagt actcctttta attacaaccc aagccctagg ccatctcaga tcccaactcc agtgaataac agcacagaat ccagtggaac ccaáagtcct tctgtttaaa agagaggaag aatgaaacta atagacattt tgtttcaaat gaaactttaa ttcttgttag agggtttttg ttctggaagc gtcttatttt gggaggcact cttgatggtt gtacagtatg ttttacatgt atttaaagta cttgtcttaa aataatgaac actacagata tttctagatt ataaactgac taaacttaca aaatgttttt gtccttgtga gtccatctaa cacagtaata tggttcccga tgaacaagtt tgaaactgat ggttcaattt cagaagtaat atagagatag ctacagtgta ataatttaca ttaagaagaa aattggagga atctgcttca gcttctccca ctaggtccca ggcacaaact tctctatcca cacattcgtc tgttcaggct agtcccacta tagagtataa tgatggaaga cattctgaaa gtccttctag acttccaatc agcaaacatt catcatccct tcctcgagta tcaattcttt ctgcttcatc agaatccagt gtgaactcta tttcaggaac caaacaaagt tggagaaaaa taaaagaaaa tgaattttct tcaggtgcta caaatggtgc tgaatcaaag tctaaaacag aggatgtttg ggtgagaatt ggaagatctc ccacaggtaa tactcccccg ccaaacatta aagattcaaa agataatcag cccatgcgta ccgtgggttt ggaaaatcgc gaccaaaaag gaactgagat aaaaccagga aatgaaagtt ctatagtgga acgtacccca tcacctagtg ggactgttgc tgccagagtg aaaagcagcg cagatagcac ttcagctcgg aacacaaaga agcgagattc caaaactgac aagcgccatt ctgggtctta ccttgtgaca âgaaaattct atgttaatta caactgctat aagactgáaa aattttgtaa ataggtttga catatttgat agtatacttt gtcttcactg aggaaaaaaa tagtaaagcc aagtatgttt gcatcccatc ccaacttcct ttaattattg gaaaatatga tatattgctg ttatcaatca tcagggaaaa attggtattt atgcaaaaaa catcataatt aatcatgtgg cfcgtgaaatt tacccagcct gctttgcttt actgcatgaa gattaacagt tatgtggtca catgatgtgc ctattttgtg ctccaaacaa aacaaaaatc 7440 7500 7560 7620 7680 7740 7800 7860 7920 7980 8040 8100 8160 8220 8280 8340 8400 8460 8520 8580 8640 8700 8760 8820 8880 8940 9000 9060 9120 9180 9240 64 tgtgtaactg taaaacattg aatgaaacta ttttacctga actagatttt atctgaaagt 9300 aggtagaatt tttgctatgc tgtaatttgt tgtatattct ggtatttgag gtgagatggc 9360 tgctctttta ttaatgagac atgaattgtg tctcaacaga aactaaatga acatttcaga 9420 ataaattatt gctgtatgta aactgttact gaaattggta tttgtttgaa gggtcttgtt 9480 tcacatttgt attaataatt gtttaaaatg cctcttttaa aagcttatat aaattttttt 9540 cttcagcttc tatgcattaa gagtaaaatt cctcttactg taataaaaac aattgaagaa 9600 gactgttgcc acttaaccat tccatgcgtt ggcacttatc tattcctgaa atttctttta 9660 tgtgattagc tcatcttgat ttttaatatt tttccactta aacttttttt tcttactcca 9720 ctggagctca gtaaaagtaa àttcatgtaa tagcaatgca agcagcctag cacagactaa 9780 gcattgagca taataggccc acataatttc ctctttctta atattataga attctgtact 9840 tgaaattgat tcttagacat tgcagtctct tcgaggcttt acagtgtaaa ctgtcttgcc 9900 ccttcatctt cttgttgcaa ctgggtctga catgaacact ttttatcacc ctgtatgtta 9960 gggcaagatc tcagcagtga agtataatca gcactttgcc átgctcagaa aattcaaatc 10020 acatggaact ttagaggtag atttaatacg attaagatat tcagaagtat attttagaat 10080 ccctgcctgt taaggaaact ttatttgtgg taggtacagt tctggggtac atgttaagtg 10140 tccccttata cagtggaggg aagtcttcct tcctgaagga aaataaactg acacttatta 10200 actaagataa tttacttaat atatcttccc tgatttgttt taaaagatca gagggtgact 10260 gatgatacat gcatacatat ttgttgaata aatgaaaatt tatttttagt gataagattc 10320 atacactctg tatttgggga gggaaaacct ttttaagcat ggtggggcac tcagatagga 10380 gtgaatacac ctacctggtg ccttgaaaat cacatcaagt agttaattat ctacccctta 10440 cctgtgttta taacttccag gtaatgagaa tgattttttt taaagctaaa atgccagtaa 10500 ataaaagtgc tatgacttga gctaagatat ttgactccaa tgcctgtact gtgtctactg 10560 caccactttg taaacacttc aatttactat ctttgaaatg attgaccttt aaatttttgc 10620 caaatgttat ctgaaattgt ctatgaatac catctacttc tgttgttttc ccaggcttcc 10680 ataaacaatg gagatacatg caaaaaaaaa aaaaaaaaa 10719

<210> 8 <211> 2843 <212> PRT <213> Homo sapiens <2 2 0 > 65 <221> misc_característica <222> (1307)..(1307) <223> polimorfismo Ile/Lys <220> <221> misc_caracteristica <222> (1317). . (1317) <223> polimorfismo Glu/Gln <400> 8

Met Ala Ala Ala Ser Tyr Asp Gin Leu Leu Lys Gin Vai Glu Ala Leu 1 5 10 15 Lys Met Glu Asn Ser Asn Leu Arg Gin Glu Leu Glu Asp Asn Ser Asn 20 25 30 His Leu Thr Lys Leu Glu Thr Glu Ala Ser Asn Met Lys Glu Vai Leu 35 40 45 Lys Gin Leu Gin Gly Ser Ile Glu Asp Glu Ala Met Ala Ser Ser Gly 50 55 60 Gin Ile Asp Leu Leu Glu Arg Leu Lys Glu Leu Asn Leu Asp Ser Ser 65 70 75 80 Asn Phe Pro Gly Vai Lys Leu Arg Ser Lys Met Ser Leu Arg Ser Tyr 85 90 95 Gly Ser Arg Glu Gly Ser Vai Ser Ser Arg Ser Gly Glu Cys Ser Pro 100 105 110 vai Pro Met Gly Ser Phe Pro Arg Arg Gly Phe Vai Asn Gly Ser Arg 115 * 120 125

Glu Ser Thr Gly Tyr Leu Glu Glu Leu Glu Lys Glu Arg Ser Leu Leu 130 135 140 66

Leu Ala Asp Leu Asp Lys Glu Glu Lys Glu Lys Asp Trp Tyr Tyr Ala 145 150 155 160 Gin Leu Gin Asn Leu Thr Lys Arq Ile Asp Ser Leu Pro Leu Thr Glu 165 170 175 Asn Phe Ser Leu Gin Thr Asp Met Thr Arg Arg Gin Leu Glu Tyr Glu 180 185 190 Ala Arg Gin Ile Arg Vai Ala Mèt Glu Glu Gin Leu Gly Thr Cys Gin 195 200 205 Asp Met Glu Lys Arg Ala Gin Arg Arg Ile Ala Arg Ile Gin Gin Ile 210 215 220 Glu Lys Asp Ile Leu Arg Ile Arg Gin Leu Leu Gin Ser Gin Ala Thr 225 230 235 * 240 GlU Ala Glu Arg Ser Ser Gin Asn Lys His Glu Thr Gly Ser His Asp 245 250 255 Ala Glu Arg Gin Asn Glu Gly Gin Gly Vai Gly Glu Ile Asn Met Ala 260 265 270 Thr Ser Gly Asn Gly Gin Gly ser Thr Thr Arg Met Asp His Glu Thr 275 2B0 285 Ala Ser Vai Leu Ser Ser Ser ser Thr His Ser Ala Pro Arg 290 295 300 Thr Ser His Leu Gly Thr Lys Vai Glu Met Vai Tyr Ser Leu Leu Ser 305 310 315 320 Met Leu Gly Thr His Asp Lys Asp Asp Met Ser Arg Thr Leu Leu Ala 325 330 335 Met Ser Ser Ser Gin Asp Ser Cys Ile Ser Met Arg Gin Ser Gly Cys 340 345 350 Leu Pro leu Leu Ile Gin Leu Leu His Gly Asn Asp Lys Asp ser Val 355 360 365 67

Leu Leu Gly Asn Ser Arg Gly Ser 370 375

Lys Glu Ala Arg Ala Arg Ala Ser 380

Ala Ala Leu His Asn Ile lie His 385 390

Ser Gin Pro Asp Asp Lys Arg Gly 395 400

Arg Arg Glu Ile Arg Vai Leu His 405

Leu Leu Glu Gin Ile Arg Ala Tyr 410 415

Cys Glu Thr Cys Trp Glu Trp Gin 420

Glu Ala His Glu Pro Gly Met Asp 425 430

Gin Asp Lys Asn Pro Met Pro Ala 435 440

Pro Val Glu His Gin Ile Cys Pro 445

Ala Vai Cys Vai Leu Met Lys Leu 450 455

Ser Phe Asp Glu Glu His Arg His 460

Ala Met Asn Glu Leu Gly Gly Leu 465 470

Gin Ala Ile Ala Glu Leu Leu Gin 475 480

Vai Asp Cys Glu Met Tyr Gly Leu 485

Thr Asn Asp His Tyr Ser Ile Thr 490 495

Leu Arg Arg Tyr Ala Gly Met Ala 500

Leu Thr Asn Leu Thr Phe Gly Asp 505 510

Vai Ala Asn Lys Ala Thr Leu Cys 515 520

Ser Met Lys Gly Cys Met Arg Ala 525

Leu Val Ala Gin Leu Lys Ser Glu 530 535

Ser Glu Asp Leu Gin Gin Val Ile 540

Ala Ser Val Leu Arg Asn Leu Ser 545 550

Trp Arg Ala Asp Val Asn Ser Lys 555 560

Lys Thr Leu Arg Glu Val Gly Ser 565

Val Lys Ala Leu Met Glu Cys Ala 570 575

Leu Glu Val Lys Lys Glu Ser Thr 580

Leu Lys Ser Val Leu Sex Ala Leu 585 590 68

Trp Asn Leu Ser Ala His Cys Thr Glu Asn Lys Ala Asp Ile Cys Ala 595 600 605 Vai Asp Gly Ala Leu Ala Phe Leu Vai Gly Thr Leu Thr Tyr Arg.Ser 610 615 620 Gin Thr Asn Thr Leu Ala Ile Ile Glu Ser Gly Gly Gly Ile Leu Arg 625 630 635 640 Asn Vai Ser Ser Leu Ile Ala Thr Asn Glu Asp His Arg Gin Ile Leu 645 650 655 Arg Glu Asn Asn Cys Leu Gin Thr Leu Leu Gin His Leu Lys Ser His 660 665 670 Ser Leu Thr Ile Vai Ser Asn Ala Cys Gly Thr Leu Trp Asn Leu Ser 675 680 685 Ala Arg Asn Pro Lys Asp Gin Glu Ala Leu Trp Asp Met Gly Ala Vai 690 695 700 Ser Met Leu Lys Asn Leu Ile His Ser Lys His Lys Met Ile Ala Met 705 710 715 720 Gly Ser Ala Ala Ala Leu Arg Asn Leu Met Ala Asn Arg Pro Ala Lys 725 730 735 Tyr Lys Asp Ala Asn Ile Met Ser Pro Gly Ser Ser Leu Pro Ser Leu . 740 745 750 His Vai Arg Lys Gin Lys Ala Leu Glu Ala Glu Leu Asp Ala Gin His 755 760 765 Leu Ser Glu Thr Phe Asp Asn Ile Asp Asn Leu Ser Pro Lys Ala Ser 770 775 780 His Arg Ser Lys Gin Arg His Lys Gin Ser Leu Tyr Gly Asp Tyr Vai 785 790 795 800 Phe Asp Thr Asn Arg His Asp Asp Asn Arg Ser Asp Asn Phe Asn Thr 805 810 815 69

Gly Asn Met Thr Vai Leu Ser Pro Tyr Leu Asn Thr Thr Vai Leu Pro 820 825 830 Ser Ser Ser Ser Ser Arg Gly Ser Leu Asp Ser Ser Arg Ser Glu Lys 835 840 845 Asp Arg Ser Leu Glu Arg Glu Arg Gly lie Gly Leu Gly Asn Tyr His 850 855 860 Pro Ala Thr Glu Asn Pro Gly Thr Ser Ser Lys Arg Gly Leu Gin Ile 865 870 875 880 Ser Thr Thr Ala Ala Gin Ile Ala Lys vai Met Glu Glu Vai Ser Ala 885 890 895 Ile His Thr Ser Gin Glu Asp Arg Ser Ser Gly Ser Thr Thr Glu Leu 900 905 910 His Cys Vai Thr Asp Glu Arg Asn Ala Leu Arg Arg Ser Ser Ala Ala 915 920 925 His Thr His Ser Asn Thr Tyr Asn Phe Thr Lys Ser Glu Asn Ser Asn 930 935 940 Arg Thr Cys Ser Met Pro Tyr Ala Lys Leu Glu Tyr Lys Arg Ser Ser 945 950 955 960 Asn Asp Ser Leu Asn Ser Vai Ser Ser Ser Asp Gly Tyr Gly Lys Arg 965 970 975 Gly Gin Met Lys Pro Ser Ile Glu Ser Tyr Ser Glu Asp Asp Glu Ser 980 985 990

Lys Phe Cys Ser Tyr Gly Gin Tyr Pro Ala Asp Leu Ala His Lys i; 995 1000 1005

His Ser Ala Asn His Met Asp Asp Asn Asp Gly Glu Leu Asp Thr 1010 1015 1020

Pro Ile Asn Tyr Ser Leu Lys Tyr Ser Asp Glu Gin Leu Asn Ser 1025 1030 1035 70

Gly Arg Gin Ser Pro Ser Gin Asn Glu Arg Trp Ala Arg Pro Lys 1040 1045 1050

His Ile lie Glu Asp Glu Ile Lys Gin Ser Glu Gin Arg Gin Ser 1055 1060 1065

Arg Asn Gin Ser Thr Thr Tyr Pro Vai Tyr Thr Glu Ser Thr Asp 1070 1075 1080

Asp Lys His Leu Lys Phe Gin Pro His Phe Gly Gin Gin Glu Cys 1085 1090 1095

Val Ser Pro Tyr Arg Ser Arg Gly Ala Asn Gly Ser Glu Thr Asn 1100 1105 1110

Arg Val Gly Ser Asn His Gly Ile Asn Gin Asn Val Ser Gin Ser 1115 1120 1125

Leu Cys Gin Glu Asp Asp Tyr Glu Asp Asp Lys Pro Thr Asn Tyr 1130 1135 1140

Ser Glu Arg Tyr Ser Glu Glu Glu Gin His Glu Glu Glu-Glu Arg 1145 1150 1155

Pro Thr Asn Tyr Ser Ile Lys Tyr Asn Glu Glu Lys Arg His Val 1160 1165 1170

Asp Gin Pro Ile Asp Tyr Ser Leu Lys Tyr Ala Thr Asp Ile Pro 1175 1180 1185

Ser Ser Gin Lys Gin Ser Phe Ser Phe Ser Lys Ser Ser Ser Gly 1190 1195 1200

Gin Ser Ser Lys Thr Glu His Met Ser Ser Ser Ser Glu Asn Thr 1205 1210 1215

Ser Thr Pro Ser Ser Asn Ala Lys Arg Gin Asn Gin Leu His Pro 1220 . 1225 1230 71

Ser Ser Ala Gin Ser Arg Ser Gly Gin Pro Gin Lys Ala Ala Thr 1235 1240 1245 Cys Lys Vai Ser Ser Ile Asn Gin Glu Thr Ile Gin Thr Tyr Cys 1250 1255 12 S0 vai Glu Asp Thr Pro Ile Cys Phe Ser Arg Cys Ser Ser Leu Ser 1265 1270 1275 Ser Leu Ser Ser Ala Glu Asp Glu ile Gly cys Asn Gin Thr Thr 1280 12B5 1290 Gin Glu Ala Asp Ser Ala Asn Thr Leu Gin Ile Ala Glu Xaa Lys 1295 1300 1305 Glu Lys Ile Gly Thr Arg Ser Ala Xaa Asp Pro val Ser Glu val 1310 1315 1320- Pro Ala val Ser Gin His Pro Arg Thr Lys Ser Ser Arg Leu Gin 1325 1330 1335 Gly Ser Ser Leu Ser Ser Glu Ser Ala Arg His Lys Ala Val Glu 1340 1345 1350 Phe Ser Ser Gly Ala Lys Ser Pro Ser Lys Ser Gly Ala Gin Thr 1355 1360 1365 Pro Lys Sex Pro Pro ~GTu His Tyr Val Gin Glu Thr Pro Leu Met 1370 1375 1380 Phe Ser Arg Cys Thr Ser val Ser Ser Leu Asp Ser Phe Glu Ser 1385 1390 1395 Axg Ser Ile Ala Ser Ser Val Gin Ser Glu Pro Cys Ser Gly Met 1400 1405 1410 Vai Ser Gly Ile Ile Ser Pro Ser Asp Leu Pro Asp Ser Pro Gly 1415 1420 1425 Gin Thr Met Pro Pro Ser Arg Ser Lys Thr Pro Pro Pro Pro Pro 1430 1435 1440 72

Gin Thr Ala Gin Thr Lys Arg Glu Val Pro Lys Asn Lys Ala Pro 1445 1450 1455 Thr Ala Glu Lys Arg Glu Ser Gly Pro Lys Gin Ala Ala Val Asn 1460 1465 1470 Ala Ala Vai Gin Arg Vai Gin Val Leu Pro Asp Ala Asp Thr Leu 1475 1480 1485 Leu His Phe Ala Thr Glu Ser Thr Pro Asp Gly Phe Ser Cys Ser 1490 1495 1500 Ser Ser Leu Ser Ala Leu Ser Leu Asp Glu Pro Phe Ile Gin Lys 1505 1510 1515 Asp Vai Glu Leu Arg Ile Met Pro Pro Val Gin Glu Asn Asp Asn 1520 1525 1530 Gly Asn Glu Thr Glu Ser Glu Gin Pro Lys Glu Ser Asn Glu Asn 1535 1540 1545 Gin Glu Lys Glu Ale Glu Lys Thr Ile Asp Ser Glu Lys Asp Leu 1550 1555 1560 Leu Asp Asp Ser Asp Asp Asp Asp Ile Glu Ue Leu Glu Glu Cys 1565 1570 1575 Ue Ile Ser Ala Met Pro Thr LVS Ser Ser Ara Lvs Ala Lvs Lvs 1580 1585 1590 Pro Ala Gin Thr Ala Ser Lys Leu Pro Pro Pro Val Ala Arg Lys 1595 1600 « 1605 Pro Ser Gin Leu Pro Val Tyr Lys Leu Leu Pro Ser •Gin Asn Arg 1610 1615 1620 Leu Gin Pro Gin Lys His val Ser Phe Thr Pro Gly Asp Asp Met 1625 1630 1635 Pro Arg Vai Tyr Cys Val Glu Gly Thr Pro Ue Asn Phe Ser Thr 1640 1645 ' 1650 73

Ala Thr Ser Leu Ser Asp Leu Thr Ile Glu Ser Pro Pro Asn Glu 1655 1660 1665 Leu Ala Ala Gly Glu Gly Vai Arg Gly Gly Ala Gin Ser Gly Glu 1670 1675 1680 Phe Glu Lys Arg Asp Thr Ile Pro Thr Glu Gly Arg Ser Thr Asp 1685 1690 1695 Glu Ala Gin Glv Gly Lys Thr Ser Ser Vai Thr Ile Pro Glu Leu 1700 1705 1710 Asp Asp Asn Lys Ala Glu Glu Gly Asp Ile Leu Ala Glu Cys Ile 1715 1/2U 1725 Asn Ser Ala Met Pro Lys Gly Lys Ser His Lys Pro Phe Arg val 1730 1735 1740 Lys Lys Ile Met Asp Gin Vai Gin Gin Ala Ser Ala Ser Ser Ser 1745 1750 1755 Ala Pro Asn Lys Asn Gin Leu Asp Gly Lys Lys Lys Lys Pro Thr 1760 1765 1770 Ser Pro Vai Lys Pro Ile Pro Gin Asn Thr Glu Tyr Arg Thr Arg 1775 1780 1785 Vai Arg Lys Asn Ala Asp Ser Lys Asn Asn Leu Asn Ala Glu Arg 1790 1795 1800 Vai Phe Ser Asp Asn Lys Asp Ser Lys Lys Gin Asn Leu Lys Asn 1805 1810 1815 Asn Ser Lys Vai Phe Asn Asp Lys Leu Pro Asn Asn Gin Asp Arg 1820 1825 1830 Vai Arg Gly Ser Phe Ala Phe Asp Ser Pro His His Tyr Thr Pro 1835 1840 1845 Ile Glu Gly Thr Pro Tyr Cys Phe Ser Arg Asn Asp Ser Leu Ser 1850 1855 1860 74

Ser Leu Asp Phe Asp Asp Asp Asp Vai Asp Leu Ser Arg Glu Lys 1865 1370 1875

Ala Glu Leu Arg Lys Ala Lys Glu Asn Lys Glu Ser Glu Ala Lys 1880 1885 1890

Vai Thr Ser His Thr Glu Leu Thr Ser Asn Gin Gin Ser Ala Asn 1895 1900 1905

Lys Thr Gin Ala Ile Ala Lys Gin Pro Ile Asn Arg Gly Gin Pro 1910 1915 1920

Lys Pro lie Leu Gin Lys Gin Ser Thr Phe Pro Gin Ser Ser Lys _1925_1930_1935_

Asp Ile Pro Asp Arg Gly Ala Ala Thr Asp Glu Lys Leu Gin Asn 1940 1945 1950

Phe Ala Ile Glu Asn Thr Pro Vai Cys Phe Ser His Asn Ser Ser 1955 1960 1965

Leu Ser Ser Leu Ser Asp Ile Asp Gin Glu Asn Asn Asn Lys GÍu 1970 1975 1980

Asn Glu Pro Ile Lys Glu Thr Glu Pro Pro Asp Ser Gin Gly Glu 1985 1990 1995

Pro Ser Lys Pro Gin Ala Ser Gly Tyr Ala Pro Lys Ser Phe His 20QP 2005 ' 2010

Vai Glu Asp Thr Pro Vai Cys Phe Ser Arg.Asn Ser Ser Leu Ser 2015 2020 2025

Ser Leu Ser Ile Asp Ser Glu Asp Asp Leu Leu Gin Glu Cys Ile 203D 2035 2040

Ser Ser Ala Met Pro Lys Lys Lys Lys Pro Ser Arg Leu Lys Gly 2045 2050 2055

Asp Asn Glu Lys His Ser Pro Arg Asn Met Gly Gly Ile Leu Gly 2060 2065 2070 75

Glu Asp Leu Thr-Leu Asp Leu Lys Asp He Gin Arg Pro Asp Ser 2075 2080 2085 Glu Hls Gly Leu Ser Pro Asp Ser Glu Asn Phe Asp Trp Lys Ala 2090 2095 2100 Ile Gin Glu Gly Ala Asn Ser Ile Vai Ser Ser Leu His Gin Ala 2105 2110 2115 Ala Ala Ala Ala Cys Leu Ser Arg Gin Ala Ser Ser Asp Ser Asp 2120 2125 2130 Ser Ile Leu Ser Leu Lys Ser Gly Ile Ser Leu Gly Ser Pro Phe 2135 214ÍL 71 d*=i His Leu Thr Pro Asp Gin Glu Glu Lys Pro Phe Thr Ser Asn Lys '2150 2155 2160 Gly Pro Arg Ile Leu Lys Pro Gly Glu Lys Ser Thr Leu Glu Thr 2165 2170 2175 Lys Lys Ile Glu Ser Glu Ser Lys Gly Ile Lys Gly Gly Lys Lys 2180 2185 2190 Vai Tyr Lys Ser Leu Ile Thr Gly Lys Vai Arg Ser Asn Ser Glu 2195 2200 2205 Ile Ser Gly Gin Met Lys Gin Pro Leu Gin Ala Asn Met Pro Ser 2210 2215 2220 Ile Ser Arg Gly Arg Thr Met Ile His ile Pro Gly Val Arg Asn 2225 2230 2235 Ser Ser Ser Ser Thr Ser Pro vai Ser Lys Lys Gly Pro Pro Leu 2240 2245 2250 Lys Thr Pro Ala Ser Lys Ser Pro ser Glu Gly Gin Thr Ala Thr 2255 2260 2265 Thr Ser Pro Arg Gly Ala Lys Pro Ser Val Lys Ser Glu Leu Ser 2270 2275 2280 76

Pro Vai Ala Arg Gin Thr Ser Gin Ile Gly Gly Ser Ser Lys Ala 2285 2290 2295

Pro Ser Arg Ser Gly Ser Arg Asp Ser Thr Pro Ser Arg Pro Ala 2300 2305 2310

Gin Gin Pro Leu Ser Arg Pro lie Gin Ser Pro Gly Arg Asn Ser 2315 2320 2325

Ile Ser Pro Gly Arg Asn Gly Ile Ser Pro Pro Asn Lys Leu Ser 2330 2335 2340

Gin Leu Pro Arg Thr Ser Ser Pro Ser Thr Ala Ser Thr Lys Ser 2345 2350 2355

Ser Gly Ser Gly Lys Met Ser Tyr Thr Ser Pro Gly Arg Gin Met 2360 2365 2370

Ser Gin Gin Asn Leu Thr Lys Gin Thr Gly Leu Ser Lys Asn Ala 2375 2380 2385

Ser Ser Ile Pro Arg Ser Glu Ser Ala Ser Lys Gly Leu Asn Gin 2390 2395 2400

Met Asn Asn Gly Asn Gly Ala Asn Lys Lys Vai Glu Leu Ser Arg 2405 2410 2415

Met Ser Ser Thr Lys Ser Ser Gly Ser Glu Ser Asp Arg Ser Glu 2420 2425 2430

Arg Pro Vai Leu Vai Arg Gin Ser Thr Phe Ile Lys Glu Ala Pro 2435 2440 2445

Ser Pro Thr Leu Arg Arg Lys Leu Glu Glu Ser Ala Ser Phe Glu 2450 2455 2460

Ser Leu Ser Pro Ser Ser Arg Pro Ala Ser Pro Thr Arg Ser Gin 2465 2470 2475

Ala Gin Thr Pro Vai Leu Ser Pro Ser Leu Pro Asp Met Ser Leu 2480 2485 2490 77

Ser Thr 2495 His Ser Ser Vai Gin 2500 Ala Gly Gly Trp Arg 2505 Lys Leu Pro Pro Asn 2510 Leu Ser Pro Thr Ile 2515 Glu Tyr Asn ASp Gly 2520 Arg Pro Ala Lys Arg 2525 His Asp Ile Ala Arg 2530 Ser His Ser Glu Ser 2535 Pro ser Arg Leu Pro 2540 Ile Asn Arg Ser Gly 2545 Thr Trp Lys Arg Glu 2550 His Ser Lys His Ser 2555 Ser Ser Leu pro Arg 2560 Val Ser Thr Trp Arg 2565 Arg Thr Gly Ser Ser 2570 Ser Ser Ile Leu Ser 2575 Ala Ser Ser Glu Ser 2580 Ser Glu Lys Aid Lys 2585 Ser Glu Asp Glu Lys 2590 His Val Asn Ser Ile 2595 ser Gly Thr Lys Gin 2600 Ser Lys Glu Asn Gin 2605 val Ser Ala Lys Gly 2610 Thr Trp Arg Lys Ile 2615 Lys Glu Asn Glu Phe 2620 Ser Pro Thr Asn Ser 2625 Thr Ser Gin Thr Vai 2630 Ser Ser Gly Ala Thr 2635 Asn Gly Ala Glu Ser 2640 Lys Thr Leu Ile Tyr 2645 Gin Met Ala Pro Ala 2650 Val Ser Lys Thr Glu 2655 Asp Val Trp Vai Àrg 2660 Ile Glu Asp Cys Pro 2665 Ile Asn Asn Pro Arg 2670 Ser Gly Arg Ser Pro 2675 Thr Gly Asn Thr Pro 2680 Pro Val Ile Asp Ser 2685 Val Ser Glu Lys Ala 2690 Asn Pro Asn Ile Lys 2695 Asp Ser Lys Asp Asn 2700 Gin Ala Lys 78 78 Gin Asn Vai Gly Asn Gly Ser Vai.Pro Met Arg Thr Vai Gly Leu 2705 2710 2715 Glu Asn Arg Leu Asn Ser Phe Ile Gin vai Asp Ala Pro Asp Gin 2720 2725 2730 1 9 Lys Gly Thr Glu Ile Lys Pro Gly Gin Asn Asn Pro val Pro Val 2735 2740 2745 Ser Glu Thr Asn Glu Ser Ser Ile Vai Glu Arg Thr Pro Phe Ser 2750 2755 2760 Ser Ser Ser Ser Ser Lys His Ser Ser Pro Ser Gly Thr Val Ala 2765 2770 2775 Ala Arg Vai Thr Pro Phe Asn Tyr Asn Pro Ser Pro Arg Lys Ser 2780 2785 2790 Ser Ala Asp Ser Thr Ser Ala Arg Pro Ser Gin Ile Pro Thr Pro 2795 2800 2805 Vai Asn Asn Asn Thr Lys Lys Arg Asp Ser Lys Thr Asp Ser Thr 2810 2815 2820 Glu Ser Ser Gly Thr Gin Ser Pro Lys Arg His Ser Gly Ser Tyr 2825 2830 2835 Leu Vai Thr Ser Vai 2840

<210> 9 <211> 33 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Oligonucleótido de ADN de cadeia simples <400> 9 33 tttgcagggt attagcagaa tctgcttcct gtg 79

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<210> 12 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Oligonucleótido de ADN de cadeia simples < 4 0 0 > 12 23 cacaggatct tgagctgacc tag 80

Lisboa, 3 de Janeiro de 2011

Claims (6)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Método ex vivo de diagnóstico de cancro ou de uma lesão pré-maligna, compreendendo o método a determinação da presença e/ou do nivel de uma CD24 em circulação que não está ligada a células intactas numa amostra biológica do sujeito a necessitar deste, em que a referida amostra biológica é seleccionada a partir do grupo que consiste numa amostra de soro, uma amostra de sangue, uma amostra de fezes, uma amostra de urina e uma amostra de saliva, em que a referida presença e/ou o referido nivel da referida CD24 em circulação acima de um limiar predeterminado é indicativo do cancro ou da lesão pré-maligna.

2. Método ex vivo de monitorização da eficácia da terapia de cancro, compreendendo a determinação de um nivel de uma CD24 em circulação que não está ligada a células intactas numa amostra biológica de um sujeito após a terapia de cancro, em que a referida amostra biológica é seleccionada a partir do grupo que consiste numa amostra de soro, uma amostra de sangue, uma amostra de fezes, uma amostra de urina e uma amostra de saliva, em que a terapia de cancro é seleccionada a partir do grupo que consiste em terapia de radiação, quimioterapia e terapia de anticorpos, em que uma diminuição de um limiar predeterminado no referido nivel da referida CD24 em circulação após a terapia de cancro é indicativa de uma redução das células cancerosas, monitorizando deste modo a eficácia da terapia de cancro.

3. Método da reivindicação 1 ou 2, em que a referida CD24 em circulação é uma espécie de baixo peso molecular de CD24 entre 25 a 37 kDa. 2

4. Método da reivindicação 1, em que a referida lesão pré-maligna é seleccionada a partir do grupo que consiste num adenoma, um pólipo adenomatoso, um esófago de Barrett, uma neoplasia mucinosa papilar intraductal (IPMN), um carcinoma ductal ín situ (DCIS) numa mama, uma leucoplasia e uma eritroplasia.

5. Método da reivindicação 1 ou 2, em que a referida CD24 em circulação é seleccionada a partir do grupo que consiste em CD24 derramada, CD24 em bolhas e CD24 solúvel.

6. Método da reivindicação 1, em que a lesão pré-maligna ou o cancro está associado a um cancro do tracto gastrointestinal. Lisboa, 3 de Janeiro de 2011 1/3

V' 19 20 21 22 23 24 25 26 27

2/3

Λ *

3/3