ES2355388T3

ES2355388T3 - Métodos para la detección precoz de cáncer.

Info

Publication number: ES2355388T3
Application number: ES07706065T
Authority: ES
Inventors: Nadir Arber
Original assignee: MEDICAL RES FUND OF TEL AVIV SOURASKY MEDICAL CT; MEDICAL RESEARCH FUND OF TEL AVIV SOURASKY MEDICAL CENTER
Current assignee: MEDICAL RES FUND OF TEL AVIV SOURASKY MEDICAL CT; MEDICAL RESEARCH FUND OF TEL AVIV SOURASKY MEDICAL CENTER
Priority date: 2006-01-31
Filing date: 2007-01-31
Publication date: 2011-03-25
Anticipated expiration: 2027-01-31
Also published as: PL1994410T3; IL193097A; JP2009525041A; WO2007088537A2; IL193097A0; US9394569B2; DE602007010108D1; JP5091163B2; EP1994410B1; PT1994410E; SI1994410T1; EP1994410A2; WO2007088537A3; DK1994410T3; US20100062450A1; ATE486285T1

Abstract

Un método ex vivo de diagnóstico del cáncer o una lesión pre-maligna, el método que comprende la determinación de la presencia y/o el nivel de un CD24 en circulación, que no está unido a las células intactas en una muestra biológica del sujeto que lo necesite, en donde dicha muestra biológica se selecciona del grupo que consiste de una muestra de suero, una muestra de sangre, una muestra de materia fecal, una muestra de orina y una muestra de saliva, en donde dicha presencia y/o dicho nivel del citado CD24 en circulación, por encima de un umbral predeterminado, es indicativo del cáncer o de la lesión pre-maligna.

Description

CAMPO Y ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La presente invención se relaciona con los métodos para la detección precoz, no-invasiva del cáncer utilizando CD24, y más particularmente, con los métodos para diagnosticar cáncer o lesiones pre-malignas mediante la 5 determinación del nivel de expresión de CD24 soluble, descamado y/o vesiculado, en una muestra biológica.

El cáncer colorectal (CRC) es, un principal problema de la salud en el mundo Occidental, ya que es el tercer cáncer más común en tanto los hombres como las mujeres en los Estados Unidos e Israel. Esta forma del cáncer se desarrolla a través de un proceso gradual que involucra una variedad de cambios genéticos y epigenéticos que son adquiridos a lo largo de muchos años y eventualmente culminan en la transformación del epitelio normal en neoplasma. 10 Aunque la enfermedad tiene un largo periodo de latencia, los marcadores disponibles en la actualidad para la detección de la enfermedad se limitan a pruebas invasivas tales como endoscopia gástrica o de colon, que generalmente detectan la enfermedad, mientras que ya se ha diseminado.

Las mutaciones en oncogenes y genes supresores del tumor, expresión del gen anormal y defectos genéticos en una variedad de genes, se involucran íntimamente en la carcinogénesis del CRC. Sobre la base de los alelotipos de 15 una serie de tumores de colon, Vogelstein y sus colegas han mostrado que las etapas moleculares que ocurren después de la activación de la senda APC- β-catenina - Tfc involucran una acumulación no-lineal de cambios genéticos específicos que acompañan la transición de la mucosa colónica normal a carcinoma metastásico. Estos incluyen mutaciones en el oncogén k-Ras, los cambios en patrones de metilación, pérdida de DCC (Suprimido en gen del Cáncer Colorectal) y SMADs [homólogos de la proteína de drosófila Madres en contra de la Decapentaplejia (MAD), y la 20 proteína C. elegans SMA] y mutaciones en p53.

Los métodos de detección disponibles en la actualidad para cánceres del tracto gastrointestinal (tracto GI) tales como cáncer colorectal (CRC), incluyen la prueba de sangre oculta en materia fecal (FOBT). Sin embargo, aunque las pruebas clínicas han mostrado que la detección con FOBT en serie reduce la mortalidad de CRC (Mandel J, et al., 1993,), la sensibilidad de FOBT se limita [60%; McMahon PM, et al., 2001]. Varios marcadores se han sugerido 25 recientemente como herramientas de diagnóstico no-invasivas. Estas proteínas incluyen [por ejemplo, calprotectina fecal, lactoferrina, lisozima, albúmina, alfa-1-antitripsina, antígeno carcinoembrionario (CEA), factor de aceleración del decaimiento (DAF), proteína de mantenimiento minicrosomal (MCM2)] o ARNm (por ejemplo, COX-2 fecal) (Kanaoka S., et al., 2004) que se puede detectar en muestras de materia fecal, y proteínas tales como nicotinamida N-metiltransferasa (NNMT) (Roessler M, et al., 2005) o subunidad 3 del complejo activador del proteasoma (PSME3) 30 (Roessler M., et al., 2006), que se puede detectar en muestras de suero. Sin embargo, debido a su baja sensibilidad y especificidad, estos marcadores no están en uso clínico.

CD24, también conocido como antígeno estable al calor (HSA) en ratones, es una proteína de la superficie celular, similar a la mucina anclada al fosfatidilinositol altamente glicosilada. Fisiológicamente, la proteína CD24, se expresa principalmente sobre subpoblaciones hematopoyéticas de los linfocitos B, varias células epiteliales, células 35 musculares y neurales. Juega un papel crucial en la selección y maduración celular durante la hematopoyésis y se expresa durante el periodo embrionario, en el desarrollo de las células neurales y pancreáticas. Además, CD24 es un ligando potencial para P-selectina que funciona como una molécula de adhesión que aumenta la agregación de las plaquetas.

La función celular de CD24 aún se desconoce, pero recientes reportes han reforzado su participación en la 40 iniciación de transducción de la señal intracelular. Schabath et al. (Schabath H, et al., 2006) han asociado la expresión de CD24 con la regulación hacia abajo, en el receptor de la quimioquina CXCR-4. Además, CD24 se sobre expresa en varios tejidos malignos incluyendo los linfomas de célula-B, carcinoma de gliomas, de pulmón de célula pequeña y no pequeña, hepatocelular, de célula renal, nasofaríngeo, de vejiga, uterino, de ovario epitelial, de mama, de próstata y pancreático (revisado por Kristiansen et al., 2004). Por otra parte, se encontró que su expresión se correlaciona con el 45 aumento de la velocidad de crecimiento, motilidad y supervivencia en líneas de células de carcinoma derivadas de varios órganos (Baumann P, et al., 2005; Smith SC, et al., 2006) y con un curso más agresivo del cáncer. De esta manera, Weichert W., et al. (2005), encontró que el aumento de la expresión de CD24 en el citoplasma, se correlaciona con un tumor de estadio más avanzado, grado y presencia de metástasis y se concluye que la sobre expresión de CD24 en el citoplasma (como resultado de la sobre producción o trastornos en la distribución en la célula) es un marcador de 50 pronóstico pobre. Además, el papel de CD24 en la agregación plaquetaria puede explicar la participación con la metástasis del cáncer y peor pronóstico (Sammar, M., et al., 1994; Aigner, S., et al., 1997; Aigner, S., et al., 1998).

U.S. Pat. Appl. 20040005596 para Li J., et al., revela los métodos de diagnóstico del cáncer, mediante la determinación del nivel de CD24 in situ, en muestras de tejido sospechoso de ser pre-canceroso o canceroso, necesitando así, otra vez procedimientos invasivos para la detección del cáncer. 55

Por lo tanto, existe, una necesidad ampliamente reconocida, y sería altamente ventajoso, tener un método de diagnóstico del cáncer, especialmente en el estadio pre-maligno, desprovisto de las limitaciones anteriores.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La invención se describe mediante las reivindicaciones 1-6.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La FIG. 1 es CD24 - análisis de inmunoprecipitación (IP) de las líneas celulares de CRC. Los extractos de las líneas celulares de CRC HCT116 (que no expresan CD24) o HT29 (que expresa CD24) fueron sometidos a CD24-IP 5 seguido por análisis de Western blot, utilizando el anticuerpo de CD24 SWA11. Carril 1: Lisado total de células de CRC HCT116 (sin IP); carril 2: lisado total de las células de CRC HT29 (sin IP); carriles 3-8 - productos de elución de células HCT116 (carriles 3-5) o células HT29 (carriles 6-8) utilizando perlas de Sefarosa conjugadas anti-ratón (Sigma): en la ausencia del anticuerpo IP (primer fijador) (carriles 3 y 6), o después de IP utilizando el ML5 Ab (carriles 4 y 7) o el SWA11 Ab (carriles 5 y 8). 10

Tener en cuenta la IP eficiente utilizando el SWA11 Ab para CD24 (carril 8), demostrando que SWA11 es un apropiado anticuerpo IP, produciendo un fondo bajo.

Las FIGs. 2a-c son análisis de Western blot de CD24, de muestras de materia fecal obtenidas a partir de pacientes de CRC antes y después de la eliminación quirúrgica del tumor, o antes y después del tratamiento con quimioterapia. Los extractos de proteínas (cantidades iguales) a partir de muestras de materia fecal de 12 pacientes 15 (designadas P-1, P-2, P-3...P-12) diagnosticados con tumores colorectales [adenomas o adenocarcinomas (CRC)] fueron sometidos a análisis de Western blot utilizando el SWA11 Ab. Las manifestaciones clínicas de los pacientes antes de la eliminación quirúrgica son de la siguiente manera: paciente 1 (P-1) – pólipo de 15 mm; paciente 2 (P-2) - pólipo masivo; paciente 3 (P-3)- pólipo de 20 mm; paciente 4 (P-4) - pólipo de 5 mm, displasia de bajo grado; paciente 5 (P-5) - adenocarcinoma; paciente 7 (P-7) -adenocarcinoma; paciente 8 (P-8) - adenocarcinoma; paciente 9 (P-9) - pólipo 20 de 15 mm; paciente 10 (P-10) - pólipo de alto grado; paciente 11 (P-11) - adenocarcinoma; paciente 12 (P-12) - adenocarcinoma; paciente 6 (P-6) carcinoma del recto –sus muestras fueron tomadas tanto después de la eliminación del tumor como antes (carril 13) o después de (carril 14) la terapia de radiación. Figura 2a – carriles 1-9: Carril 1 - células HT29 (control positivo); carriles 2-3 - P-1; carriles 4-5 - P-2; carriles 6-7 - P-3; carriles 8-9 - P-4; Figura 2b - carriles 10-18: carril 10 - células HT29; carriles 11-12 - P-5; carriles 13-14 - P-6; carriles 15-16 - P-7; carriles 17-18 - P-8; 25 Figura 2c - carriles 19-27: carril 19 - células HT29; carriles 20-21 - P-9; carriles 22-23 - P-10; carriles 24-25 - P-11; carriles 26-27 - P-12. Los carriles 2, 4, 6, 8, 11, 15, 17, 20, 22, 24 y 26 – las muestras fueron tomadas antes de la eliminación quirúrgica del tumor, carriles 3, 5, 7, 9, 12, 13, 14, 16, 18, 21, 23, 25 y 27 – las muestras fueron tomadas después de la eliminación quirúrgica del tumor. Tener en cuenta la significante disminución en los niveles de CD24 después de la eliminación quirúrgica de los tumores en al menos 9 de 11 de los pacientes (por ejemplo, comparar la 30 intensidad de la banda de la proteína en el carril 3 con aquella del carril 2), demostrando que la presencia de CD24 en la materia fecal se origina al menos en parte a partir del tumor. Además, tener en cuenta que mientras que en las muestras de materia fecal tomadas antes de la eliminación quirúrgica de los pólipos o tumores de la especie de la proteína CD24 incluyen proteínas de varios tamaños tales como de 20 a aproximadamente 60 kDa (por ejemplo, carriles 4, 17, 20 y 24), en las muestras de materia fecal, tomadas después de la eliminación quirúrgica de los pólipos o tumores de la 35 especie de la proteína CD24 incluyen proteínas de alto peso molecular tales como de 37 a aproximadamente 50 kDa (por ejemplo, los carriles 11, 18, 21). También tener en cuenta la significante disminución en los niveles de CD24 en muestras de materia fecal obtenidas después de la terapia de radiación (carril 14), en comparación con aquella obtenida antes de la terapia de radiación (carril 13), demostrando que el nivel de CD24 en la materia fecal se origina a partir de las células malignas de CRC, por lo tanto una disminución en el nivel después del tratamiento puede indicar la eficiencia 40 del tratamiento (por ejemplo, eliminación de las células cancerosas).

La FIG. 3, muestra un análisis de inmunoprecipitación de CD24 en muestras de suero. Las muestras de suero, se tomaron de pacientes que tienen CRC activo (carril 3) o CRC no-activo (carril 2), fueron inmunoprecipitadas con un complejo formado por la pre-incubación de perlas de Sefarosa conjugadas anti-ratón (Sigma, Israel), con el anticuerpo monoclonal anti-CD24 SWA11. Los complejos inmunoprecipitados fueron sometidos a un análisis de Western blot 45 utilizando el anticuerpo monoclonal anti-CD24 de SWAT11. Carril 1- células HT29 que sobre expresan CD24; carril 2 - suero de un paciente que tiene CRC no-activo; carril 3 - suero de un paciente que tiene CRC activo. Tener en cuenta -la banda de la proteína de 40 kDa en el carril 3 y la ausencia de dicha banda de la proteína en el carril 2, demostrando la presencia de CD24 en el suero de sujetos con CRC activo y la desaparición de CD24 en sujetos con CRC no-activo.

La FIG. 4 comparativa, es un análisis de RFLP del polimorfismo Val57Ala en la proteína CD24 (SEQ ID NO:2) 50 (C/T en la posición 280 de SEQ ID NO:1). El ADN genómico fue sometido a amplificación de PCR utilizando los cebadores hacia adelante (SEQ ID NO:3) y reverso (SEQ ID NO:4) y los productos de PCR de 520 bp resultantes fueron digeridos utilizando la enzima de restricción BstXI ("D" para los digeridos, carriles 1, 3, y 5) o permanecen no-digeridos ("N" para no-digeridos, carriles 2, 4 y 6) y se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa al 1%. Los carriles 1 y 2 - ADN de la línea celular de cáncer pancreático colo357, que expresa altos niveles de CD24; carriles 3 y 4 - ADN de la 55 línea celular del cáncer pancreático Panc1, que expresa niveles moderados de CD24; carriles 5 y 6 - ADN de la línea celular del cáncer de colon HT29 que expresa altos niveles de CD24; carril 7 - marcador de peso molecular de 100 bp. Tener en cuenta que mientras las células Panc1 que expresan niveles moderados de CD24 muestran el genotipo C/C en la posición 280 de SEQ ID NO:1 (que corresponde al polimorfo Ala en la posición 57 de SEQ ID NO:2) como se evidencia por la presencia de solo el producto PCR sin digerir de 520 bp, las células colo357 o HT29, que expresan 60

altos niveles de CD24 muestran los genotipos C/T o los IT en la posición 280 de SEQ ID NO:1 (correspondiente a los polimorfos Ala/Val o Val/Val en la posición 57), respectivamente, como se evidencia por la presencia de ambos productos de PCR digeridos y sin digerir en el carril 1 (Colo357) y solo los productos de PCR digeridos en el carril 5 (HT29).

La FIG. 5 representa la purificación de CD24 a partir de suero humano. CD24 en muestras de suero a partir de 5 pacientes con CRC activo, se purificó por cromatografía de intercambio aniónico utilizando una minicolumna DEAE-celulosa (DE52). Antes del fraccionamiento, el suero se centrifugó a 12,000 x g (30 minutos, 4 °C) con el fin de eliminar cualquiera de los restos remanentes, y la albúmina se agotó a partir del suero utilizando el protocolo DAC (Depleción del componente de la albúmina), que fue modificado a partir de un método publicado previamente [Colantonio DA, et al., 2005, Proteomics, 5(15): 3831-5]. Después de la depleción de la albúmina, el suero se diluyó en Tris-HCl 10 mM pH 7.4 10 y se cargó en una minicolumna DE52 pre-equilibrada en la misma solución reguladora. El flujo-a través de (FT) y el lavado (W) fueron recolectados por separado y la proteína unida fue eluida con el aumento de concentraciones de NaCl (0.05-0.3 M) en Tris-HCl pH 7.4. Las proteínas eluidas fueron analizadas por SDS-PAGE y transferencia de Western, utilizando el anticuerpo monoclonal SWA11. Carril 1 - lisado total de las líneas celulares HT29 sirve como un control positivo para el peso molecular de CD24; carril 2 - una muestra de la muestra de suero después de la centrifugación 15 pero antes de la depleción de la albúmina; carriles 3-8 - son diferentes fracciones de elución. Tener en cuenta la presencia de una proteína con un peso molecular aparente de 35-40 kDa en los carriles 6 y 7 lo que fue eluido en fracciones que contienen NaCl 0.1-0.2 M y reconocido por el anticuerpo anti-CD24.

DESCRIPCIÓN DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS

La presente invención se relaciona con los métodos de diagnóstico precoz y no-invasivo del cáncer o lesiones 20 pre-malignas utilizando el CD24 en circulación.

Los principios y operación de los métodos de diagnóstico de lesiones pre-malignas de acuerdo con la presente invención, se pueden entender mejor con referencia a los dibujos y las descripciones anexas.

Los cánceres del tracto gastrointestinal (GI), incluyendo el cáncer colorectal (CRC), desarrollados durante muchos años a través de un proceso gradual, en el cual los cambios genéticos y epigenéticos se adquieren y 25 eventualmente culminan en la transformación del epitelio normal en neoplasma. Por ejemplo, la carcinogénesis del CRC involucra las mutaciones en oncogenes (por ejemplo, k-Ras) y los genes supresores del tumor (por ejemplo, p53), cambios en los patrones de metilación y pérdida de DCC y SMADs. Sin embargo, a pesar de los actuales conocimientos genéticos y los procedimientos de endoscopias disponibles en la actualidad (por ejemplo, colonoscopia), en el tiempo de diagnóstico la mayoría de los cánceres relacionados con el tracto GI, ya se han diseminado y son más difíciles de tratar. 30

Los métodos de detección disponibles en la actualidad para los cánceres del tracto gastrointestinal (tracto GI) tales como cáncer colorectal (CRC), incluyen la prueba de sangre oculta en materia fecal (FOBT). Sin embargo, aunque las pruebas clínicas han mostrado que la detección con FOBT en serie reduce la mortalidad de CRC, la sensibilidad de FOBT se limita [60%; McMahon PM, 2001 (Supra)]. Recientemente, se han sugerido, varios marcadores como herramientas de diagnóstico no-invasivo. Estas proteínas incluyen [por ejemplo, calprotectina fecal, lactoferrina, 35 lisozima, albúmina, alfa-1-antitripsina, antígeno carcinoembrionario (CEA), factor de aceleración de decaimiento (DAF), proteína de mantenimiento minicrosomal (MCM2)] o ARNm (por ejemplo, COX-2 fecal) que se puede detectar en muestras de materia fecal, y proteínas tales como nicotinamida N-metiltransferasa (NNMT) o subunidad 3 del complejo activador del proteasoma (PSME3) que se puede detectar en muestras de suero. Sin embargo, debido a su baja sensibilidad y especificidad, estos marcadores, no están en uso clínico. Otros métodos de diagnóstico tales como 40 examen rectal digital (DRE), PET-CT (tomografía por emisión de positrón) y colonoscopia virtual, muestran especificidad y/o sensibilidad limitada. Por lo tanto, hasta la fecha, el diagnóstico de CRC se basa en los procedimientos invasivos tales como endoscopia del colon (colonoscopia o sigmoidoscopia) seguido por la eliminación quirúrgica de los adenomas y la tinción histológica.

CD24 es una proteína de la superficie celular similar a la mucina, anclada al fosfatidilinositol altamente 45 glicosilada, que se expresa principalmente en las subpoblaciones hematopoyéticas de linfocitos B, varias células epiteliales, células musculares y neurales. Se sobre expresa en varios tejidos malignos incluyendo linfomas de célula-B, gliomas, carcinomas de pulmón de célula pequeña y no pequeña, hepatocelular, célula renal, nasofaríngeo, vejiga, uterino, ovario epitelial, mama, próstata y pancreático (revisado por Kristiansen et al., 2004). Por otra parte, su expresión se correlaciona con el aumento de la velocidad de crecimiento, motilidad y supervivencia de las líneas de células de 50 carcinoma derivadas de varios órganos (Baumann P, et al., 2005; Smith SC, et al., 2006) y con un curso más agresivo del cáncer. Además, Weichert W., et al. (2005) encontró que el aumento de la expresión de CD24 en el citoplasma se correlaciona con un tumor en estadio más avanzado, grado y presencia de metástasis y se concluye que la sobre-expresión de CD24 en el citoplasma (como resultado de la sobre producción o trastornos en la distribución en la célula) es un marcador de pronóstico pobre. Además, el papel de CD24 en la agregación plaquetaria puede explicar su 55 participación con la metástasis del cáncer y peor pronóstico (Sammar, M., et al., 1994; Aigner, S., et al., 1997; Aigner, S., et al., 1998).

U.S. Pat. Appl. 20040005596 para Li J., et al., revela los métodos de diagnóstico del cáncer, mediante la determinación del nivel de CD24 in situ, en muestras obtenidas a partir de tejidos sospechosos pre-cancerosos o cancerosos, necesitando así, otra vez procedimientos invasivos para la detección del cáncer.

Weichert et al., (2005), revela que CD24 se expresa fuertemente en el citoplasma, donde se almacena en cuerpos microvesiculares. Estos cuerpos microvesiculares, se pueden desprender por las células tumorales como 5 exosomas en la circulación. Mientras que reduce la presente invención a la práctica, los presentes inventores han descubierto que CD24 se sobre-expresa en lesiones pre-malignas del tracto gastrointestinal y que CD24 descamado, vesiculado o secretado se puede detectar en muestras biológicas de sujetos que tienen lesiones pre-malignas y malignas.

Como se muestra en la sección de Ejemplos a continuación, los presentes inventores han descubierto que el 10 nivel de la transcripción CD24 se aumenta en las líneas celulares transformadas mutantes ras (Ejemplo 1) y que su nivel se invierte a normal después del tratamiento de dichas células con Celecoxib, un inhibidor de COX-2 específico. Además, los presentes inventores han descubierto que el nivel de expresión de CD24 en varias líneas celulares de CRC se correlaciona con el genotipo de la Val57Ala SNP en CD24, de manera que las células que expresan alto nivel de la proteína CD24 portan el genotipo CD24v/v (polimorfo Val-57) mientras que, las células que escasamente expresan la 15 proteína portan el genotipo CD24a/a (polimorfo Ala-57) (Ejemplo 3). Además, los presentes inventores han descubierto que CD24 se sobre-expresa en lesiones pre-malignas del tracto GI que se correlaciona con las primeras etapas de carcinogénesis (Tabla 1, Ejemplo 2). Por otra parte, como adicionalmente se ilustra en la sección de Ejemplos a continuación, los presentes inventores han mostrado que CD24 soluble, descamado, vesiculado o secretado se puede detectar en muestras de suero (Figuras 3 y 5, Ejemplo 4), materia fecal (Figuras 2a-c, Ejemplo 4) y orina, de pacientes 20 con carcinogénesis de CRC o lesiones pre-malignas de colon-rectal y que el nivel de CD24 en materia fecal disminuye después de la extracción (por ejemplo, por cirugía) de las lesiones pre-malignas o malignas (Figuras 2a-c) así como cuando el CRC es no-activo (por ejemplo, después de la terapia de radiación; Figura 2b y 3, Ejemplo 4). En conjunto, estos resultados demuestran que CD24 es un excelente marcador para el diagnóstico precoz del cáncer, incluso en el estadio pre-maligno y que CD24 soluble (por ejemplo, secretado), vesiculado y/o CD24 descamado se puede detectar 25 en muestras biológicas tales como materia fecal, suero y orina y de esta manera ser producido en el diagnóstico del cáncer.

Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto de la presente invención se proporciona un método de diagnóstico del cáncer y/o de una lesión pre-maligna. El método se realiza mediante la determinación de la presencia y/o nivel de un CD24 en circulación, de un sujeto que lo necesite, en donde la presencia y/o el nivel del citado CD24 en circulación, por 30 encima de un umbral predeterminado es indicativo del cáncer y/o de la lesión pre-maligna.

Como se utiliza en este documento la expresión "lesión pre-maligna" se refiere a una masa de células y/o tejido que tiene mayor probabilidad de transformarse en un tumor maligno. Preferiblemente, en la lesión pre-maligna de la presente invención CD24 se sobre-expresa en comparación con una célula o tejido no-maligno. Ejemplos de lesiones pre-malignas incluyen, pero no se limitan a, pólipos adenomatosos, esófago de Barrett, IPMN (Neoplasia Mucinosa 35 Papilar Intraductal), DCIS (Carcinoma Ductal in Situ) en la mama, leucoplasia y eritroplasia. Por lo tanto, la lesión pre-maligna que se diagnostica de acuerdo con el método de este aspecto de la presente invención puede transformar en un cáncer asociado con CD24 (o tumor) sólido o no-sólido maligno (por ejemplo, desórdenes hematológicos). Preferiblemente, la lesión pre-maligna que se diagnostica por el método de este aspecto de la presente invención es un pólipo adenomatoso del colon, un pólipo adenomatoso del recto, un pólipo adenomatoso del intestino delgado y esófago 40 de Barrett.

Ejemplos no limitantes de cánceres asociados con CD24, que se pueden diagnosticar por el método de este aspecto de la presente invención incluyen tumores del tracto gastrointestinal (cáncer de colon, cáncer del recto, cáncer de la región anal, cáncer colorectal, cáncer del intestino delgado y/o grueso, cáncer de esófago, cáncer de estómago, cáncer pancreático, cáncer gástrico, cáncer de intestino delgado, adenocarcinoma que se origina en el intestino 45 delgado, tumores carcinoides que se origina en el intestino delgado, linfoma que se origina en el intestino delgado, tumores mesenquimatosos que se origina en el intestino delgado, tumores estromales gastrointestinales), carcinoma de la vesícula biliar, tumores tractobiliares, cáncer de próstata, cáncer de riñón (renal) (por ejemplo, tumor de Wilms), cáncer de hígado (por ejemplo, hepatoblastoma, carcinoma hepatocelular), cáncer hepatobiliar, cáncer del árbol biliar, tumores de la Vesícula biliar, cáncer de vejiga, rabdomiosarcoma embrionario, tumor de célula germinativa, tumor 50 trofoblástico, tumor de células germinal del testículo, teratoma inmaduro de ovario, tumor uterino, epitelial de ovario, sacrococcígeo, coriocarcinoma, tumor trofoblástico del sitio placentario, tumor de adulto epitelial, cáncer de ovario, cáncer cervical, cáncer de la vagina, cáncer de la Vulva, cáncer de pulmón (por ejemplo, carcinoma de pulmón de célula pequeña y no pequeña), nasofaríngeo, cáncer de mama, carcinoma de célula escamosa (por ejemplo, en cabeza y cuello), tumor neurogénico, astrocitoma, ganglioblastoma, neuroblastoma, linfomas (por ejemplo, enfermedad de 55 Hodgkin, linfoma de no-Hodgkin, célula B, Burkitt, célula T cutánea, histiocítico, linfoblástico, célula T, timo, linfoma cutáneo de células T, linfoma del sistema nervioso central primario), gliomas, carcinoma medular tiroideo , cáncer testicular, cáncer de cerebro y cabeza/cuello, cáncer ginecológico, cáncer endometrial, tumores de células germinativas, tumores mesenquimatosos, tumores neurogénicos, cáncer de la vejiga, cáncer del uréter, cáncer de la pelvis renal, cáncer de la uretra, cáncer del pene, cáncer de los testículos, cánceres del cuerpo uterino, carcinoma endometrial, 60 sarcoma uterino, carcinoma peritoneal y carcinoma de Trompa de Falopio, tumores de células germinativas del ovario, tumores estromales del cordón sexual, cáncer del sistema endocrino, tumores de tiroides, carcinoma medular tiroideo,

linfoma de tiroides, tumores de paratiroides, tumores adrenales, tumores endocrinos pancreáticos, sarcomas del tejido blando y óseo, mesotelioma benigno y maligno, mesotelioma peritoneal maligno, mesotelioma maligno de la Túnica Vaginal del Tésticulo, mesotelioma maligno del Pericardio, cáncer de piel, melanoma cutáneo, melanoma intraocular, neoplasias del sistema nervioso central, medulloblastomas, meningiomas, tumores del nervio periférico, tumores de la región Pineal, adenomas pituitarios, craniofaringiomas, neuromas acústicos, tumores Glomus Jugulare, Cordomas y 5 Condrosarcomas, Hemangioblastomas, Papilomas del Plexo Coroideo y Carcinomas, tumores del eje espinal, leucemia, y leucemia crónica.

Como se utiliza en este documento la expresión "diagnóstico" se refiere a la clasificación de una patología (por ejemplo, un cáncer asociado con CD24 o una lesión pre-maligna) o un síntoma, la determinación de una severidad de la patología, seguimiento de la progresión de la patología, pronóstico de un resultado de una patología y/o perspectivas de 10 la recuperación.

Como se utiliza en este documento la expresión "sujeto que lo necesite" se refiere a un sujeto humano que está en riesgo de tener cáncer [por ejemplo, un sujeto predispuesto genéticamente, un sujeto con historia médica y/o familiar de cáncer, un sujeto que ha sido expuesto a carcinógenos, de riesgos ocupacionales, riesgo ambiental] y/o un sujeto que muestra signos clínicos sospechosos del cáncer [por ejemplo, sangre en la materia fecal o melena, dolor 15 inexplicado, sudoración, fiebre inexplicada, pérdida de peso inexplicada hasta la anorexia, cambios en hábitos intestinales (estreñimiento y/o diarrea), tenesmo (percepción de defecación incompleta, para específicamente cáncer rectal), anemia y/o debilidad general]. Adicional o alternativamente, el sujeto que lo necesite puede ser sujeto humano saludable sometido a un chequeo de bienestar rutinario.

Como se utiliza en este documento el término "CD24" se refiere a la secuencia del ácido nucleico y/o la 20 secuencia de aminoácido de al menos una porción funcional de la proteína de la superficie celular similar a la mucina, anclada al fosfatidilinositol (por ejemplo, proteína CD24 - SEQ ID NO:2, No. de Acceso GenBank NP_037362.1; transcripción de CD24 - SEQ ID NO:1, No. de Acceso GenBank NM_013230.2) codificada por una secuencia genómica en el cromosoma 6q21.

La expresión "CD24 en circulación" se refiere a cualquier molécula de CD24 presente en una muestra biológica 25 del sujeto, la cual no es CD24 anclado in situ. La expresión "CD24 anclado in situ" se refiere a una secuencia de aminoácido o del ácido nucleico CD24 anclado del tejido, que se ancla a las células intactas en el sitio donde se produce (in situ), tal como células de lesiones premalignas (por ejemplo, adenomas) o tumores cancerosos según se describe anteriormente. Por lo tanto, la expresión "CD24 en circulación" se refiere a cualquier molécula de CD24 que se puede detectar sistémicamente. El CD24 en circulación puede ser en una forma soluble o insoluble (anclado a la 30 membrana a través de una fracción GPI). Ejemplos de tal CD24 en circulación incluyen pero no se limitan un CD24 secretado (por ejemplo, variante alternativa de corte y empalme de CD24), CD24 descamado que carece de los componentes de la membrana (por ejemplo, por la acción de las fosfolipasas tales como PIPLC; por ejemplo, la secuencia de aminoácidos 27-80 de SEQ ID NO:2), CD24 vesiculado (i.e., CD24 presente en vesículas de células que se forman por la ruptura de la membrana plasmática a partir del citoesqueleto subyacente seguido por la inflación del 35 desprendimiento de la membrana por fluido intracelular) o CD24 que está presente en las células descamadas (i.e., células que se desprenden del tejido).

Por lo tanto, el CD24 en circulación de la presente invención puede estar presente en una muestra biológica que está alejada del tejido canceroso o libre de cáncer. Por ejemplo, la muestra biológica puede ser materia fecal, suero u orina mientras que el cáncer puede ser un cáncer GI tal como CRC. 40

La expresión "muestra biológica" como se utiliza en este documento se refiere a cualquier muestra biológica celular o no-celular que puede contener un CD24 en circulación según se describe anteriormente. Ejemplos incluyen pero no se limitan a, una muestra de sangre (por ejemplo, suero), una muestra de saliva, una muestra de materia fecal, una muestra de orina, frotis de las crías, una muestra de médula ósea (específicamente que contiene macrófagos), fluido linfático, células epiteliales, varias secreciones externas de los tractos respiratorio, intestinal, y genitourinario, 45 lágrimas, leche, una biopsia de tejido, una muestra de fluido cerebroespinal (CSF), una muestra de esperma, fluido amniótico, y muestra de vellosidad coriónica (CVS), una muestra de células neurales, y también muestras de constituyentes del cultivo celular in vivo.

Preferiblemente, la muestra biológica utilizada por el método de este aspecto de la presente invención, es una muestra de sangre (por ejemplo, suero), una muestra de materia fecal y/o una muestra de orina. 50

La muestra biológica se puede obtener utilizando métodos conocidos en el oficio, tales como el uso de una jeringa con una aguja, un escalpelo, aspiración con aguja fina (FNA), catéter, endoscopia gastrointestinal (por ejemplo, endoscopia colorectal, gastro-endoscopia) y similares. Preferiblemente, la muestra biológica de la presente invención se puede obtener mediante el muestreo de sangre, recolección de materia fecal o recolección de orina. La determinación del nivel y/o presencia de CD24 soluble se realiza ex vivo (en una muestra derivada del sujeto). 55

Como se utiliza en este documento, la expresión "presencia y/o nivel de un CD24 en circulación" se refiere al grado de expresión génica y/o actividad del producto génico del gen CD24 en una muestra biológica. En consecuencia,

la presencia y/o nivel de CD24 se puede determinar en el nivel de aminoácido utilizando métodos de detección de proteínas.

Por lo tanto, la presencia y/o nivel de la secuencia de aminoácido de CD24 (CD24 de la proteína) se puede determinar utilizando un anticuerpo específico de CD24, vía la formación de un inmunocomplejo [i.e., un complejo formado entre el antígeno CD24 (una secuencia de aminoácido de CD24) presente en la muestra biológica y el 5 anticuerpo específico de CD24].

El inmunocomplejo de la presente invención se puede formar a una variedad de temperaturas, concentración de sal y valores de pH, que puede variar dependiendo del método y la muestra biológica utilizada y aquellos de habilidad en el oficio son capaces de ajustar las condiciones apropiadas para la formación de cada inmunocomplejo.

El término "anticuerpo" como se utiliza en esta invención, incluye las moléculas intactas así como los 10 fragmentos funcionales de estos, tales como Fab, F(ab’)2, Fv o moléculas de dominio único tales como VII y VL para un epitope de un antígeno. Estos fragmentos de anticuerpo funcionales se definen de la siguiente manera: (1) Fab, el fragmento que contiene un fragmento de enlace de antígeno monovalente de una molécula de anticuerpo, se puede producir por digestión de anticuerpo completo con la enzima papaina para producir una cadena liviana intacta y una porción de una cadena pesada; (2) Fab’, el fragmento de una molécula de anticuerpo que se puede obtener tratando el 15 anticuerpo completo con pepsina, seguido por la reducción, para producir una cadena liviana intacta y una porción de la cadena pesada; dos fragmentos Fab’ se obtienen por molécula de anticuerpo; (3) (Fab’)2, el fragmento del anticuerpo que se puede obtener tratando el anticuerpo completo con la enzima pepsina sin la posterior reducción; F(ab’)2 es un dímero de dos fragmentos Fab’ sujetados juntos por dos enlaces disulfuros; (4) Fv, se define como un fragmento genéticamente modificado que contiene la región variable de la cadena liviana y la región variable de la cadena pesada 20 expresada como dos cadenas; (5) Anticuerpo de cadena única ("SCA"), una molécula genéticamente modificada que contiene la región variable de la cadena liviana y la región variable de la cadena pesada, ligada por un ligador polipéptido apropiado como una molécula de cadena única fusionada genéticamente; y (6) Anticuerpos de dominio único están compuestos de un dominio VH o VL único que muestra suficiente afinidad con el antígeno.

Los métodos de producción de anticuerpos policlonales y monoclonales, así como los fragmentos de estos, son 25 bien conocidos en el oficio (Ver por ejemplo, Harlow and Carril, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988, ).

Los fragmentos de anticuerpos de acuerdo con la presente invención, se pueden preparar mediante hidrólisis proteolítica del anticuerpo o por la expresión en E. coli o células de mamífero (por ejemplo cultivo celular de ovario de hámster Chino u otros sistemas de expresión de proteína) de ADN codificante el fragmento. Los fragmentos de 30 anticuerpos se pueden obtener por digestión con pepsina o papaina de todos los anticuerpos por métodos convencionales. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo se pueden producir por división enzimática de los anticuerpos con pepsina para proporcionar un fragmento 5S denominado F(ab’)2. Este fragmento además se puede dividir utilizando un agente reductor tiol, y opcionalmente un grupo bloqueador para los grupos sulfidrilo que resultan de la división del enlace disulfuro, para producir fragmentos monovalentes 3.5S Fab’. De manera alterna, una división 35 enzimática utilizando pepsina produce dos fragmentos monovalentes Fab’ y un fragmento Fc directamente. Estos métodos se describen, por ejemplo, por Goldenberg, U.S. Pat. Nos. 4,036,945 y 4,331,647, y referencias contenidas en este. Ver también Porter, R. R. [Biochem. J. 73: 119-126 (1959)]. Otros métodos de división de anticuerpos, tales como separación de cadenas pesadas para formar fragmentos monovalentes de cadena pesada-liviana, además también se pueden utilizar la división de fragmentos, u otras técnicas enzimáticas, químicas, o genéticas, con la condición de que 40 los fragmentos unidos con el antígeno sea reconocido por el anticuerpo intacto.

Los fragmentos Fv comprenden una asociación de cadenas VH y VL. Esta asociación puede ser no covalente, como se describe en Inbar et al. [Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 69:2659-62 (19720]. De manera alterna, las cadenas variables se pueden ligar por un enlace disulfuro intermolecular o ligado en cruz por productos químicos tales como glutaraldehido. Preferiblemente, los fragmentos Fv comprenden cadenas VH y VL conectadas por un ligador péptido. 45 Estas proteínas de enlace antígeno de cadena única (scFv) se preparan mediante la construcción de un gen estructural que comprende las secuencias de ADN que codifican los dominios VH y VL conectados por un oligonucleótido. El gen estructural se inserta en un vector de expresión, que posteriormente se introduce en una célula huésped tal como E. coli. Las células huésped recombinantes sintetizan una cadena de polipéptido único con un péptido ligador que une los dos dominios V. Los métodos para producir scFvs se describen, por ejemplo, por Whitlow and Filpula, Methods 2: 97-50 105 (1991); Bird et al., Science 242:423-426 (1988); Pack et al., Bio/Technology 11:1271-77 (1993); y U.S. Pat. No. 4,946,778, .

Otra forma de un fragmento de anticuerpo es un péptido codificante de una región determinante complementaria única (CDR). Los péptidos CDR ("unidades de reconocimiento mínimos") se pueden obtener por la construcción de genes que codifican la CDR de un anticuerpo de interés. Tales genes se preparan, por ejemplo, 55 mediante el uso de la reacción de cadena de la polimerasa para sintetizar la región variable de ARN de células que producen anticuerpos. Ver, por ejemplo, Larrick and Fry [Methods, 2: 106-10 (1991)].

Los anticuerpos también se pueden producir utilizando varias técnicas conocidas en el oficio, incluyendo librerías de phage display [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581

(1991)]. Las técnicas de Cole et al. and Boerner et al. También están disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) and Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)]. De manera similar, los anticuerpos humanos se pueden hacer mediante la introducción de loci de inmunoglobulina humano en animales transgénicos, por ejemplo, ratones en los cuales los genes de inmunoglobulina endógena han sido parcial o completamente inactivos. Después del desafío, la producción de 5 anticuerpos humanos se observa, la cual se asemeja estrechamente a aquella observada en humanos en todos los aspectos, incluyendo el reordenamiento génico, ensamble, y repertorio de anticuerpos. Este enfoque se describe, por ejemplo, en U.S. Pat. Nos. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016, y en las siguientes publicaciones científicas: Marks et al., Bio/Technology 10,: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368 812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature 10 Biotechnology 14: 826 (1996); y Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13, 65-93 (1995).

De acuerdo con el método de este aspecto de la presente invención, la detección de formación de inmunocomplejo es indicativa de un diagnóstico del cáncer o la lesión pre-maligna. Varios métodos se pueden utilizar para detectar la formación del inmunocomplejo de CD24 de la presente invención y aquellos de habilidad en el oficio son capaces de determinar cual método es apropiado para cada inmunocomplejo y/o el tipo de células utilizadas para el 15 diagnóstico.

El anticuerpo de CD24 utilizado en el inmunocomplejo de la presente invención, se puede etiquetar utilizando métodos conocidos en el oficio. Será apreciado que los anticuerpos etiquetados pueden ser tanto anticuerpos primarios (i.e., que se unen al antígeno específico, por ejemplo, un antígeno específico de CD24) como anticuerpos secundarios (por ejemplo, anticuerpos anti conejo de cabra marcados, anticuerpo anti humano de ratón marcado) que se unen a los 20 anticuerpos primarios. El anticuerpo se puede conjugar directamente con un marcador o se puede conjugar con una enzima.

Los anticuerpos de la presente invención pueden ser marcados por fluorescencia (utilizando un tinte fluorescente conjugado con un anticuerpo), radiomarcados (utilizando un radiomarcador por ejemplo, 125I, anticuerpos), o conjugados con una enzima (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante o fosfatasa alcalina) y se utiliza junto con un 25 sustrato cromogénico para producir una reacción colorimétrica. Los sustratos cromogénicos utilizados por los anticuerpos conjugados con la enzima de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, AEC, Fast red, sustrato ELF-97 [2-(5’-cloro-2-fosforiloxifenil)-6-cloro-4(3H)-quinazolinona], p-nitrofenil fosfato (PNPP), fenolftaleina difosfato, y ELF 39-fosfato, BCIP/INT, Vector Red (VR), salmón y fosfato de color magenta (Avivi C., et al., 1994, J Histochem. Cytochem. 1994; 42: 551-4) para la enzima fosfatasa alcalina y Nova Red, diaminobencidina (DAB), sustrato SG 30 Vector(R), sustrato quimioluminiscente basado en el luminol para la enzima peroxidasa. Estos sustratos enzimáticos son comercialmente disponibles de Sigma (St Louis, MO, USA), Molecular Probes Inc. (Eugene, OR, USA), Vector Laboratories Inc. (Burlingame, CA, USA), Zymed Laboratories Inc. (San Francisco, CA, USA), Dako Cytomation (Denmark).

La detección del inmunocomplejo de CD24 en una muestra biológica tal como suero, materia fecal u orina, que 35 puede contener CD24 en circulación, se puede llevar a cabo utilizando clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), ensayo inmunoabsorbente de enzima ligada (ELISA), Western blot y análisis de radio-inmunoensayo (RIA), inmunoprecipitación (IP) o por una tecnología basada en el peso molecular.

Para un Western blot, las proteínas se extrajeron de una muestra de células y se sometieron a electroforesis (por ejemplo, SDSPAGE) y la transferencia a una membrana (por ejemplo, nylon o PVDF). La membrana luego se hace 40 interactuar con un anticuerpo de CD24 que puede ser, marcado directamente o sometido posteriormente a un anticuerpo secundario marcado. La detección puede ser mediante autoradiografía, reacción colorimétrica o quimioluminiscencia. Este método permite tanto la cuantificación de una cantidad de sustrato como la determinación de su identidad por una posición relativa en la membrana que es indicativa de una distancia de migración en el gel acrilamida durante la electroforesis. 45

En el caso de que la concentración del antígeno en la muestra biológica sea baja, la detección del antígeno (secuencia de aminoácido de CD24) se puede llevar a cabo por inmunoprecipitación (IP), esencialmente como se describe en la sección de Ejemplos a continuación. Para el análisis de inmunoprecipitación el anticuerpo de CD24 puede interactuar directamente con una muestra (por ejemplo, lisado celular) incluyendo CD24 y el complejo formado, además se puede detectar utilizando un anticuerpo secundario conjugado con perlas (por ejemplo, si el anticuerpo de 50 CD24 es un anticuerpo monoclonal de ratón, el anticuerpo secundario puede ser un anticuerpo conjugado anti-ratón con por ejemplo, perlas de Sefarosa). Las perlas luego se pueden precipitar por centrifugación, después de lo cual las proteínas precipitadas (por ejemplo, CD24 y anti anticuerpos de CD24) se pueden separar de las perlas (por ejemplo, utilizando desnaturalización a 95°C) y se someten posteriormente a un análisis de Western blot utilizando los anticuerpos específicos de CD24. De manera alterna, el anti-anticuerpo de CD24 y el anticuerpo secundario conjugado 55 con las perlas se puede adicionar a la muestra biológica que contiene el antígeno (CD24) para formar así un inmunocomplejo. De manera alterna, dado que CD24 es una proteína altamente glicosilada, también se puede precipitar utilizando un sustrato capaz de unir polipéptidos glicosilados como la Concavalina A (GE Healthcare Bio-Sciences, Uppsala, Sweden) que también se puede conjugar con perlas, seguido por un análisis de Western blot con anti-anticuerpos de CD24. 60

El análisis FACS permite la detección de antígenos presentes en las membranas celulares tales como CD24. En resumen, los anticuerpos específicos de CD24 se unen a los fluoróforos y la detección se realiza por medio de un equipo de clasificación de células el cual lee la longitud de onda de la luz emitida de cada célula que pasa a través de un rayo de luz. Este método puede emplear dos o más anticuerpos al mismo tiempo.

La presencia y/o nivel de CD24, también se puede determinar utilizando un ELISA. En resumen, una muestra 5 que contiene el antígeno de CD24 se fija a una superficie tal como un pozo de una placa de microtitulación. Un anticuerpo específico del antígeno (un anticuerpo de CD24) acoplado a una enzima se aplica y se deja unir con el antígeno. La presencia del anticuerpo luego se detecta y cuantifica, mediante una reacción colorimétrica que emplea la enzima acoplada al anticuerpo. Las enzimas comúnmente empleadas en este método incluyen peroxidasa de rábano picante y fosfatasa alcalina. Si se calibra bien y dentro del rango lineal de respuesta, la cantidad de sustrato presente en 10 la muestra es proporcional a la cantidad de color producido. Un estándar de sustrato por lo general se emplea para mejorar la exactitud cuantitativa.

La presencia y/o nivel de CD24, también se puede determinar utilizando un radio-inmunoensayo (RIA). En una versión, este método involucra la precipitación del antígeno deseado (CD24) con una proteína de enlace del anticuerpo específico y el anticuerpo radiomarcado (por ejemplo, proteína A marcada con I125) inmovilizada en un portador 15 precipitable tal como perlas de agarosa. El número de cuentas en el pellet precipitado es proporcional a la cantidad de antígeno.

En una versión alternativa del RIA, un antígeno marcado y una proteína de enlace con el anticuerpo sin marcar se emplean. Una muestra que contiene una cantidad de antígeno desconocida se adiciona en cantidades variables. La disminución en cuentas precipitadas a partir del antígeno marcado es proporcional a la cantidad de antígeno en la 20 muestra adicionada.

La presencia y/o nivel de CD24, también se puede determinar utilizando la metodología basada en el peso molecular. Dado que el inmunocomplejo, muestra un mayor peso molecular que sus componentes, los métodos capaces de detectar tal cambio en el peso molecular también se pueden emplear. Por ejemplo, el inmunocomplejo se puede detectar por un ensayo de retardo en gel. En resumen, un gel de acrilamida no-desnaturalizante se carga con las 25 muestras. Un cambio en el tamaño (peso molecular) del producto de la proteína como se compara con sus componentes es indicativo de la presencia de un inmunocomplejo. Dicho cambio con un mayor peso molecular se puede ver utilizando una tinción de la proteína no-específica tales como tinte de plata o tinte de azul de Commassie.

Como se utiliza en este documento la expresión "umbral predeterminado" se refiere a un nivel conocido de CD24 en circulación en una muestra. Tal nivel se puede determinar experimentalmente comparando muestras normales 30 (por ejemplo, muestras obtenidas a partir de sujetos saludables) con muestras derivadas de sujetos conocidas por tener carcinogénesis tales como CRC (ver por ejemplo, Tabla 1 y Ejemplo 2 de la sección de Ejemplos a continuación). De manera alterna, dicho nivel se puede obtener a partir de la literatura científica.

Por lo tanto, la presencia y/o el nivel de CD24 en la anterior muestra biológica un umbral predeterminado es indicativo del cáncer o de la lesión pre-maligna. 35

Será apreciado que la presencia del cáncer o la lesión pre-maligna además se puede validar utilizando ensayos adicionales. Por ejemplo, en el caso de que el nivel de CD24 detectado en la materia fecal de un sujeto sea superior a un umbral predeterminado, ensayos adicionales tales como endoscopia del colon seguida por evaluaciones histológicas (incluyendo inmunotinción de CD24) se puede llevar a cabo en los adenomas identificados (en el caso de que los adenomas estén presentes). 40

Por lo tanto, las enseñanzas de la presente invención proporcionan, por la primera vez, un método de diagnóstico no-invasivo, altamente confiable (sobre el 80% de exactitud) de lesiones pre-malignas o malignas del tracto gastrointestinal utilizando muestras biológicas tales como suero, orina y materia fecal.

Será apreciado que las enseñanzas de la presente invención, además se pueden utilizar para monitorear la eficacia de la terapia contra el cáncer o progresión/remisión de la enfermedad. Como se muestra en la Figura 2b y se 45 describe en el Ejemplo 4 de la sección de Ejemplos a continuación, el nivel de CD24 en la materia fecal disminuyó después de la terapia de radiación en un sujeto que padece de CRC, probablemente como resultado de una reducción significante en células cancerosas en el sujeto.

Por lo tanto, de acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona un método de seguimiento de la eficacia de la terapia contra el cáncer. El método se realiza mediante la determinación de un nivel de un CD24 en 50 circulación en una muestra biológica del sujeto después de la terapia contra el cáncer, en donde una disminución de un umbral predeterminado en el nivel del CD24 en circulación después de la terapia contra el cáncer es indicativo de la reducción de las células cancerosas, por lo tanto el seguimiento de la eficacia de la terapia contra el cáncer.

La terapia contra el cáncer, cuya eficacia se controla de acuerdo con el método de este aspecto de la presente invención puede ser terapia de radiación, quimioterapia (por ejemplo, CHOP, Cisplatino, carboplatina, oxaliplatino, 55 aziatioprina, mercaptopurina, alcaloides de la vinca, etopósido, tenipósido, paclitaxel, docetaxel, irinotecan,

topotecanamsacrine, etopósido, fosfato de tenipósido, tenipósido y dactinomicina), terapia de anticuerpo [por ejemplo, trastuzumab (Herceptina) y rituximab (Rituxan)] o una combinación de cualquier de los anteriores.

Por lo tanto, una disminución a partir de un umbral pre-determinado en el nivel de CD24 en circulación es indicativa de que la terapia contra el cáncer es eficiente. Por otra parte, si no existe disminución, o en el caso de que exista un aumento del umbral pre-determinado en el nivel de CD24 en circulación después del tratamiento, entonces la 5 terapia contra el cáncer no es eficiente en la eliminación (por ejemplo, aniquilando, reduciendo) las células cancerosas del sujeto tratado y se pueden utilizar terapias adicionales y/o alternativas (por ejemplo, regímenes de tratamiento).

Será apreciado que el umbral pre-determinado, se puede determinar en un subgrupo de sujetos con conocidos resultados de terapia.

Preferiblemente, la disminución a partir del umbral pre-determinado es de al menos 10 veces, más 10 preferiblemente, 15 veces, preferiblemente, 20 veces, preferiblemente, 50 veces o al menos 100 veces (por ejemplo, al menos 1000 veces) en el nivel de CD24 en circulación después de la terapia contra el cáncer.

Como se muestra en la Tabla 2, en la Figura 4 y se describe en el Ejemplo comparativo 3 de la sección de Ejemplos a continuación, individuos portadores del polimorfo Val en la posición 57 de la proteína CD24 (SEQ ID NO:2), tienen un mayor riesgo de predisposición a desarrollar cáncer gastrointestinal. Además, como adicionalmente se ilustra 15 en el Ejemplo comparativo 3, de la siguiente sección de Ejemplos, los individuos portadores del polimorfo Val en la posición 57 de la proteína CD24 (SEQ ID NO:2), así como el polimorfo 1317Q y/o el polimorfo 1307K de APC (SEQ ID NO:8), tienen un mayor riesgo de predisposición a desarrollar cáncer gastrointestinal. Estos resultados sugieren el uso de la combinación del polimorfismo Val/Ala en la posición 57 de la proteína CD24 y el E1317Q y/o 11307K de la proteína APC, para la determinación de la predisposición al cáncer gastrointestinal. 20

Como además se muestra en el Ejemplo comparativo 3, de la siguiente sección de Ejemplos, los presentes inventores han descubierto que los individuos portadores de tanto el nucleótido de timidina que contiene el alelo en la posición 280 del polinucleótido establecido por la SEQ ID NO:1 (que codifica el polimorfo Val-57 de CD24) y el nucleótido de adenosina que contiene el alelo en la posición 3977 del polinucleótido establecido por la SEQ ID NO:7 [que codifica el polimorfo Lys (K)-1307 de APC] y/o el nucleótido de citosina que contiene el alelo en la posición 4006 25 del polinucleótido establecido por la SEQ ID NO:7 [que codifica el polimorfo Gln (Q)-1317 de APC), tienen una mayor predisposición al cáncer gastrointestinal [los valores-p son 0.024 para Val-57 y Lys (K)-1307 y 0.028 para Val-57 y Gln (Q)-1317].

Como se utiliza en este documento el término "aproximadamente" se refiere a ± 10%.

EJEMPLOS 30

Ahora se hace referencia a los siguientes ejemplos, que junto con las descripciones anteriores, ilustran la invención de una manera no limitante.

En general, la nomenclatura utilizada en este documento y los procedimientos de laboratorio utilizados en la presente invención incluyen técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas y de ADN recombinante. Tales técnicas se explican a fondo en la literatura. Ver, por ejemplo, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); 35 "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); metodologías según se publican en U.S. Pat. Nos. 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 and 5,272,057; 40 "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980); los inmunoensayos disponibles se describen extensamente en la literatura científica y patentes, ver, por ejemplo, U.S. Pat. Nos. 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 45 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 y 5,281,521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., Eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) and "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", 50 Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996). Otras referencias generales se proporcionan a través de este documento. Se considera que, los procedimientos en este, son bien conocidos en el oficio y se proporcionan para la conveniencia del lector.

EJEMPLO 1 55

LA EXPRESIÓN DE CD24 SE REGULA EN LAS LÍNEAS CELULARES TRANSFORMADAS MUTANTES RAS

El análisis de la expresión génica diferencial, utilizando microarreglos, proporciona un perfil general de los niveles de ARNm relativos, proporcionando, así una nueva comprensión en las diferentes rutas biológicas involucradas en la patogénesis de la enfermedad, progresión, y respuesta a la terapia. Esta técnica surge como una herramienta de potencial valor para la clasificación de tumores histológicamente similares en los subtipos molecularmente específicos, que pueden predecir el resultado clínico en pacientes individuales. La tecnología microarreglo ha sido aplicada 5 exitosamente en el estudio de muchas malignidades, incluyendo CRC (12-16).

Para identificar los genes implicados en la progresión CRC, los presentes inventores han transfectado los enterocitos normales con una variedad de oncogenes y han evaluado el patrón de expresión génica de las células transformadas antes y después de la exposición al Celecoxib (Pfizer, NY, USA), un inhibidor de COX-2 específico, utilizando el arreglo de expresión Affymetrix en rata, de la siguiente manera. 10

Materiales y Métodos experimentales

Modelo de células in vitro - Los presentes inventores han desarrollado un modelo in vitro que consiste de una variedad de líneas celulares intestinales transformadas y normales. Los enterocitos normales derivados de ileon de rata (células 18 IEC), fueron transfectadas con una variedad de oncogenes. Entre ellos, enterocitos transformados mutantes ras (designados células R1) poseen un muy agresivo fenotipo. Estas células fueron producidas por la co-transfección 15 del marcador seleccionable de resistencia al fármaco tk-neo y el plásmido pMIKcys, que codifica un gen c-k-ras humano mini (15 kb) que contiene una mutación de cisteina en el codón 12. Las mutaciones ras se encontraron en la mayoría de los pacientes de CRC. Este sistema basado en la línea celular es mucho más coherente y útil cuando se desea aplicar la nueva técnica de expresión micro-arreglo, ya que consiste solo de células normales y malignas y carece de células inflamatorias, necróticas y estromales que pueden obstruir y enmascarar el efecto verdadero de la transformación 20 maligna.

Estudios de expresión génica fueron llevados a cabo utilizando el Affymetrix rat (RG-U34) Genechip® de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando ARN a partir del modelo de células in vitro.

Resultados experimentales

CD24 se aumenta en células intestinales transformadas con mutantes Ras y su nivel de expresión se 25 invierte después del tratamiento con Celecoxib - Para caracterizar el patrón de expresión génica alterado, después de la transformación maligna en células epiteliales intestinales, el ARN extraído de las líneas celulares intestinales transformadas con varios oncogenes fue sometido a un análisis utilizando los arreglos de expresión en ratas Affymetrix rat (RG-U34) Genechip®]. Específicamente, la expresión génica diferencial fue analizada para comparar células IEC-18 y R1 Sutter T, Miyake M, Kahn SM, Venkatraj VS, Sobrino A, Warburton D, Holt PR, Weinstein IB. El aumento de la 30 expresión de ciclina D1 y el gen supresor del tumor Rb en enterocitos en rata c-Kras transformadas. El oncogén 2;12(9):1903-8, 1996], antes y después de duraciones cortas y largas de exposiciones a Celecoxib (Pfizer, NY, USA), un inhibidor de COX-2 específico y un agente quimio-preventivo probado en el colon. Los archivos de salida de barrido fueron analizados y se determinó el valor de expresión de cada gen. De aproximadamente 20,000 genes presentes en el Affymetrix chip, 1,081 se expresaron diferencialmente (> 2-veces) en células tumorales (Sagiv E., et al., 2006, 35 Gastroenterology, 131: 630-639; y los datos no se muestran). De estos, un grupo de 71 genes mostró una reversión a niveles de expresión normales después de los tratamientos cortos y largos con celecoxib. Uno de los genes que muestran una reversión a la expresión normal es el gen codificante para CD24 (No. de Acceso GenBank NM_013230; SEQ ID NO:1).

EJEMPLO 2 40

CD24 SE SOBREEXPRESA EN EVENTOS INICIALES DE CARCINOGENESIS CRC

Como se describe en la sección de Antecedentes mencionada anteriormente, Weichert W., et al. (Clin. Cancer Res. 2005, 11:6574-6581) probó el patrón de expresión de CD24 en 146 carcinomas colorectales (CRC) y encontró que mientras en el 68.7% de los tumores CD24 mostraron una tinción membranosa, en 84.4% de los tumores CD24 se expresan en el citoplasma. Además, en 10% de los casos una expresión de CD24 citoplásmica excepcionalmente 45 fuerte, se observó que se correlaciona con un tumor de estadio más avanzado y pronóstico más pobre. Sin embargo, hasta la fecha el nivel de expresión de CD24 en tumores pre-malignos del tracto GI nunca se probó.

Con base en el patrón de expresión regulado de CD24 en las líneas celulares transformadas con mutantes ras (ver Ejemplo 1, mencionado anteriormente), y con el fin de determinar la participación de CD24 en los primeros acontecimientos que conducen a carcinogénesis del tracto GI, los análisis inmunohistoquímicos fueron llevados a cabo 50 en un grupo integral de 398 muestras incluyendo tejido normal, tumores premalignos y tumores malignos del tracto GI completo, de la siguiente manera.

Materiales y Métodos experimentales

Análisis inmunohistoquímico – Los análisis inmunohistoquímicos fueron llevados a cabo con una técnica inmunoperoxidasa del complejo avidina-biotina (Umansky M., Rattan J., et al., El oncogén 2001; 20: 7987-7991). Cuatro-55 secciones de tejido micrómetro fueron montadas sobre portaobjetos recubiertos de poli-L-lisina. Después de la

desparafinización en Americlear (Baxter, McGaw Parl, IL) y etanol absoluto, las secciones fueron hidratadas a través de una serie de alcohol clasificado, agua destilada, y solución salina reguladora de fosfato (PBS) a pH 7.4. Los portaobjetos luego se sumergieron en solución reguladora de citrato 10 mM (pH 6) y se colocaron en el microondas a 750 W por un total de 10 minutos. Después del bloqueo con suero de cabra por 20 minutos, los anticuerpos primarios, anti anticuerpo de CD24 monoclonal (Ab-2, clon 24Co2; Neomarkers, Fremont, CA), fueron aplicados e incubados durante la noche a 4 5 °C en una cámara de alta-humedad. Aunque todas las concentraciones del anticuerpo primario dieron buena tinción membranosa, la concentración ideal con antecedentes mínimos fue 20 µg/ml. Como un control negativo, las secciones por duplicado de muestras de tejido seleccionadas fueron inmunoteñidas en la ausencia del anticuerpo primario. Las etapas posteriores utilizaron el kit Vectastain rabbit Elite ABC (Vector Laboratories, Burlingame, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El desarrollo del control se logró con 0.375 mg/dL de solución de 3,3’-diaminobencidina 10 tetrahidrocloruro (Sigman Chemical, Co, St. Louis, MO) que contiene 0.0003% de peróxido de hidrógeno. Los portaobjetos fueron contrateñidos con hematoxilina y deshidratados, y los cubreobjetos fueron aplicados utilizando medio de montaje Acrytol (Surgipath Medical Industries, Richmond, IL).

Resultados experimentales

CD24 se sobre-expresa in varios adenomas y carcinomas del colon, recto y tracto GI completo - Como 15 se muestra en la Tabla 1, mencionada a continuación, el análisis inmunohistoquímico validó los resultados del arreglo, relacionados con la sobre expresión de este gen (CD24) con respecto al ambiente de proteína celular, así como la proyección de los resultados obtenidos del modelo de rata en los tejidos de CRC humanos. Con este fin, la expresión de CD24 se determinó en 398 muestras que abarcan el tracto GI completo (benigno y maligno), 66 de estos fueron muestras de CRC. 20

Tinción de la membrana luminal positiva para CD24 se observó en 49 de los 54 (90.7 %) pólipos adenomatosos colorectales (tumores pre-malignos) y en 57 de los 66 (86.3 %) adenocarcinomas (Tabla 1). Cabe señalar que la tinción de la membrana positiva fue en la misma medida en el pre-maligno (adenomas) como en los tumores malignos. Por otra parte, la tinción de membrana fue positiva en solo 9 de las 54 mucosas de apariencia normal (16.6 %), adyacentes a muestras de CRC. La tinción de membrana positiva no fue relacionada con el género o edad del paciente, ni con el 25 tamaño o grado de displasia en los pólipos adenomatosos (los datos no se muestran). Además, la tinción de la membrana positiva se observó en 77.9% de los adenomas pre-malignos del tracto GI completo y en el 71.2% de los carcinomas del tracto GI completo (Tabla 1).

Tabla 1

Análisis inmunohistoquímicos de CD24 en CRC y otros tumores GI

: Colon y Recto Tracto GI total

Tinción CD24: Tejido Normal Adenoma Carcinoma Tejido Normal Adenoma Carcinoma

Negativo N (%): 45 (83.3) 5 (9.2) 9 (13.6) 122 (83) 21 (22.1) 45 (28.8)

Positivo N (%): 9 (16.6) 49 (90.7) 57 (86.3) 25 (17) 74 (77.9) 111 (71.2)

Total N (%): 54 (100) 54 (100) 66 (100) 147 (100) 95 (100) 156 (100)

Tabla 1: 398 muestras normales y tumorales obtenidas de mucosa adyacente normal y tumores del tracto GI completo (esófago, estómago, páncreas, intestino delgado y grueso) fueron teñidos para CD24 utilizando anticuerpos monoclonales de anti-CD24 (Ab-2, clon 24C02; Neomarkers, Fremont, CA) y la tinción de la membrana fue registrada de acuerdo con una puntuación de intensidad en una escala de 0,1, 2, y 3 de aumento de la intensidad. Se muestran las frecuencias de tinción de la membrana positiva (de una puntuación de intensidad superior de "1") en tejido normal, adenomas (lesiones pre-malignas) y carcinomas del tracto GI completo (incluyendo el colon y el recto) así como en el colon y recto como un grupo separado.

30

El hecho de que CD24 fue expresado en la misma medida en adenomas (el estadio pre-maligno de un carcinoma) así como en todos los estadios de CRC o carcinomas del tracto GI completo indica que la expresión de CD24, es un evento precoz en el proceso de multi-etapa de carcinogénesis de CRC. Por lo tanto, la expresión de CD24, no solo en carcinomas (CRC y el tracto GI completo), pero ya en la lesión pre-maligna, por ejemplo, el pólipo adenomatoso sugiere el uso de CD24 como un proceso carcinogénico de marcador temprano del tracto GI completo. 35

EJEMPLO COMPARATIVO 3

EL POLIMORFISMO EN EL GEN CD24 ES DE IMPORTANCIA CLÍNICA

Muy poco se conoce sobre el polimorfismo en el gen CD24. Zhou Q., et al. 2003 (Proc. Natl. Acad. Sci. 100:15041-15046) han descrito un polimorfismo de nucleótido único (SNP) en el gen CD24 humano (sustitución CT en la posición 280 de No. de Acceso GenBank NM_013230; SEQ ID NO:1) que resulta en una mutación sin sentido GCG (Ala)GTG (Val) en la posición 57 de la proteína CD24 establecida por la SEQ ID NO:2; No. de Acceso GenBank NP_037362) inmediatamente después del sitio de división putativo del ancla de GPI, que se asocia con un mayor riesgo 5 y una progresión más rápida de la Esclerosis Múltiple.

La proteína del gen APC - No. de Acceso GenBank NP_000029.2 (SEQ ID NO:8), ARNm - No. de Acceso GenBank NM_000038.3 (SEQ ID NO:7)] codifica una proteína supresora del tumor, y se muta ampliamente como un primer evento en el proceso de carcinogénesis del colon y del recto. Laken et al (Laken SJ, Petersen GM, Gruber SB, Oddoux, Vogelstein B. Familial colorectal cancer in Ashkenazim due to a hypermutable tract in APC. Nat Genet 17: 79-10 83, 1997) identificaron el I1307K que da lugar a una sustitución de Lisina (K) para Isoleucina (I) en el codón 1307 de la proteína. El cambio no afecta la funcionalidad de la proteína pero crea una secuencia de 8 Adeninas en los genes, que aumentan el riego de errores en la actividad de la polimerasa de ADN y de esta manera una región de 500 bp en alto riesgo de mutabilidad (Laken SJ, et al., 1997). Los estudios previos realizados por los presentes inventores (H. Strul, et al., 2003) demostraron que este polimorfismo no contribuye a la evaluación del riesgo de CRC. 15

El polimorfismo E1317Q en la proteína de APC no tiene un efecto fenotípico o funcional conocido pero causa una actividad reparadora del apareamiento erróneo y se relaciona con el alto riesgo de neoplasia colorectal.

Materiales y Métodos experimentales

Genotipado - El ADN genómico fue extraído a partir de linfocitos de sangre periférica. Aproximadamente 200 ng de ADN fueron tomados para la reacción de PCR a tiempo real (para el APC SNPs) o análisis de RFLP (para el 20 CD24 SNP), de la siguiente manera.

Determinación del polimorfismo Ala/Val en la posición 57 de la proteína CD24 - El ADN genómico fue PCR amplificado utilizando los siguientes cebadores: Hacia adelante: 5’ - TTGTTGCCACTTGGCATTTTTGAGGC (SEQ ID NO:3) y Reverso: 5’ - GGATTGGGTTTAGAAGATGGGGAAA (SEQ ID NO:4) a una temperatura de hibridación de 50 °C. El producto de PCR de CD24 resultante es de 520 bp. El cambio de CT en la posición 280 de SEQ ID NO: 25 produce un sitio de enzima de restricción BstXI en el nucleótido 327 del producto de PCR, lo que permite la diferenciación de los dos alelos de CD24, mediante el análisis de longitud del fragmento de restricción. Por lo tanto, el ADN que codifica el polimorfo Val-57 se digiere mediante BstXI a aproximadamente 320 y 200 bp y el ADN que codifica el polimorfo Ala-57 no se digiere mediante BstXI y por lo tanto es de 520 bp.

Determinación del polimorfismo I1307K en el gen APC - El polimorfismo I1307K es una sustitución de 30 isoleucina (I) (alelo común) con lisina (K) (alelo raro) en la posición 1307 de No. de Acceso GenBank NP_000029.2; SEQ ID NO:8; que resulta de la sustitución TA en el nucleótido 3977 de N_000038.3 ; SEQ ID NO:7. En resumen, el ADN genómico fue PCR amplificado utilizando los siguientes cebadores: cebadores hacia adelante 5’ - GATTCTGCTAATACCCTGCAAATAGCA-3’ (SEQ ID NO:5) y reverso 5’ - CCCTGCAGTCTGCTGGATTTGG-3’ (SEQ ID NO:6). Para el PCR de tiempo real un cebador sensor se diseñó de acuerdo con el alelo de tipo salvaje y secuencia 35 abajo a un cebador anclado. Cambios leves de la reacción de acuerdo con la temperatura en la cual el sensor se une al ADN y encuentra el ancla; la temperatura se eleva con el tiempo y el tiempo de reacción se determina. Para la detección del nucleótido polimórfico específico (T/A en la posición 3977 de SEQ ID NO:7) el cebador anclado fue: LC-Red640-TTTGCAGGGTATTAGCAGAATCTGCTTCCTGTG-ph (SEQ ID NO:9) y el cebador sensor fue: CCAATCTTTTCTTTTTTTTCT-FL (SEQ ID NO: 10). 40

Determinación del polimorfismo E1317Q en el gen APC - El polimorfismo E1317Q es una sustitución del Ácido glutámico (E) (alelo común) con Glutamina (Q) (alelo raro) en la posición 1317 de No. de Acceso GenBank NP_ 000029.2; SEQ ID NO:8; que resulta de la sustitución GC en el nucleótido 4006 de N_000038.3 ; SEQ ID NO:7. En resumen, el ADN genómico fue PCR amplificado utilizando los siguientes cebadores: cebadores hacia adelante 5’ - GATTCTGCTAATACCCTGCAAATAGCA- 3’ (SEQ ID NO:5) y reverso 5’ - CCCTGCAGTCTGCTGGATTTGG-3’ (SEQ 45 ID NO:6) y la detección del nucleótido polimórfico específico (G/C en la posición 4006 de SQ ID NO:7) fue por PCR de tiempo real utilizando el cebador anclado: TGCTGTGACACTGCTGGAACTTCGC - FL (SEQ ID NO:11) y cebador sensor: ph-LC-Red705-CACAGGATCTTGAGCTGACCTAG (SEQ ID NO:12).

Resultados experimentales

Expresión de CD24 es dependiente del genotipo CD24 en la posición 57 (Ala /Val 57) - Utilizando la 50 prueba de CD24 RFLP los presentes inventores han encontrado que las células HT29, que expresan un alto nivel de la proteína CD24, muestran el genotipo CD24v/v (Val/Val en la posición 57 de la proteína CD24) mientras que, las células Panc1 y las células HCT116 que escasamente expresan la proteína portan el genotipo CD24a/a (Ala/Ala en la posición 57 de la proteína CD24). Estos resultados sugieren que la sobre-expresión de la proteína CD24 se asocia con el polimorfo Val-57 de la proteína CD24. Aún la mayoría de CRC que porta CD24 no tendrán el genotipo a/a. Con el fin de 55 confirmar esta hipótesis, los genotipos de CD24 fueron analizados a partir del ADN de sangre periférica y las frecuencias de los tres genotipos fueron determinados.

La Figura 4 representa un ejemplo del análisis de genotipo realizado utilizando el polimorfismo de longitud del fragmento de restricción (RFLP) del polimorfismo Ala57Val del gen CD24 utilizando la enzima de restricción BstXI.

El polimorfo Val-57 se asocia con el mayor riesgo a la carcinogénesis de CRC - Un conjunto de datos de 1064 individuos (sujetos normales saludables y pacientes de CRC) con una edad media de 58.68 años, desviación estándar: 14.78, reveló que 61.75 % de la población fueron Judios Ashkenazi de Israel y 25.47% fueron Judios 5 Sefardíes de Israel (el resto son mezclas u otros grupos étnicos). Entre la población evaluada, los Judíos Sefardíes mostraron una significante asociación para hospedar el genotipo común A/A (Ala): OR 1.3 1.0-1.8] p = 0.04. Cabe señalar, que el predominio de CRC en los Judíos Sefardíes es más pequeño que en los Judios Ashkenazi (Darwish H, Trejo IE, et al., 2002. Fighting colorectal cancer: molecular epidemiology differences among Ashkenazi and Sephardic Jews and Palestinians. Ann Oncol., 13: 1497-501; Rozen P, Lynch HT, Figer A et al. Israel Cancer Registry, Cancer in 10 Israel, Ministry of Health, Jerusalem, 1987. Familial colon cancer in the Tel-Aviv area and the influence of ethnic origin. Cancer; 60:2355-2362). Por lo tanto, estos resultados sugieren que el polimorfo Ala en la posición 57 de la proteína CD24, especialmente en su estado homocigoto, es un genotipo protector contra CRC, y por otra parte, el polimorfo Val-57 de la proteína CD24 es un genotipo de riesgo para CRC.

Como además se muestra en las Tablas 2 y 3, mencionadas a continuación, la detección de 890 sujetos de 15 estos 393 fueron diagnosticados con CRC y 498 fueron sujetos saludables, reveló que el genotipo Val/Val (Tabla 2) y el alelo Val (Tabla 3) tiene más prevalencia en los sujetos afectados con CRC que en los controles saludables, sugiriendo así la asociación del polimorfo Val-57 con CRC.

Tabla 2

Frecuencias del genotipo del polimorfismo Ala/Val 57 de CD24

Genotipos: Sujetos totales VV AV AA

CRC: 392 31 (7.9%) 144 (36.7%) 217 (55.35%)

Normal: 498 34 (6.8 %) 176 (35.35%) 288 (57.83 %)

20

Tabla 3

Frecuencias de alelo del polimorfismo Ala/Val 58 de CD24

: Cromosomas Totales alelo Val alelo Ala

CRC: 784 206 (26.275 %) 578 (73.72%)

Normal: 996 244 (24.49 %) 752 (75.50%)

Genotipos combinados en genes los CD24 y APC, se asocian altamente con un mayor riesgo para la neoplasia colorectal o cáncer - Para además probar la asociación de los genotipos combinados en los genes CD24 y APC, 375 sujetos con genotipo A/V (en la posición 57) de la proteína CD24 fueron probados para la presencia del 25 polimorfismo E1317Q en la proteína APC. 7 de los 375 sujetos fueron positivos para el polimorfismo E1317Q (i.e., mostraron un alelo del polimorfo 1317Q en la proteína APC). Seis de los siete sujetos (85.7 %) que fueron CD24 A/V y APC E1317Q tuvieron neoplasia colorectal. Por otra parte, 368 sujetos fueron negativos para el polimorfo 1317Q en la proteína APC (i.e., mostraron solo E1317). 162 de los 368 sujetos (44 %) tuvieron neoplasia colorectal que produce una razón de probabilidades (OR) de 7.62963 (Chi-cuadrado = 4.83, valor-p 0.028). Por lo tanto, estos resultados 30 demuestran que entre los individuos que portan una mutación en el gen que inicia la carcinogénesis tal como el APC E1317Q, la presencia de un polimorfo Val-57 de la proteína CD24 es indicativo de un mayor riesgo de predisposición para el cáncer colorectal.

405 sujetos con el genotipo A/V (en la posición 57) de la proteína CD24 fueron probados para la presencia del polimorfismo I1307K en la proteína APC. 31 de los 405 sujetos fueron positivos (i.e., mostraron al menos un alelo del 35 polimorfo 1307K en la proteína APC). 21 de los 31 (67.7 %) sujetos que fueron CD24 A/V y APC I1307K tuvieron neoplasia colorectal. Por otra parte, de los 374 sujetos que fueron negativos para el polimorfismo I1307K en la proteína APC (i.e., mostraron solo el polimorfo I1307 en la proteína APC) 175 (46 %) tuvieron neoplasia que da lugar a OR de 2.388 (Chi-cuadrado 5.03; valor-p= 0.0249). Por lo tanto, estos resultados demostraron que entre los individuos que portan una mutación en el gen que inicia la carcinogénesis tal como el APC I1307K, la presencia de un polimorfo Val-57, 40 en la proteína CD24 es indicativo de un mayor riesgo de predisposición para el cáncer colorectal.

EJEMPLO 4

DETECCIÓN DE CD24 EN MATERIA FECAL, SUERO U ORINA COMO UN MARCADOR PRECOZ PARA MALIGNIDAD DE TRACTO GI

Como se describe en el Ejemplo 2, mencionado anteriormente, CD24 se sobre-expresó significantemente en tumores pre-malignos del tracto GI, tales como pólipos adenomatosos colorectales y pólipos adenomatosos del tracto GI 5 completo. Estos resultados sugieren que la expresión de CD24 puede preceder la conversion del adenoma pre-maligno a un adenocarcinoma maligno. Dado que CD24 se expresa en la superficie celular y conjugado vía un ancla de GPI, los presentes inventores han planteado que CD24 que se escama o encuentra en residuos de membrana a partir de células vesiculadas o muertas, se puedan detectar en varias muestras biológicas derivadas de sujetos que tienen tumores pre-malignos, y su detección puede servir como un marcador temprano de carcinogénesis del tracto GI. 10

Con el fin de determinar la presencia de CD24 en muestras biológicas obtenidas utilizando métodos no-invasivos (por ejemplo, materia fecal, orina y suero), los presentes inventores ha establecido las condiciones experimentales para la inmunoprecipitación de CD24, de la siguiente manera.

Materiales y Métodos experimentales

Análisis de inmunoprecipitación (IP) de muestras de suero (así como de materia fecal u orina) - Las 15 muestras de suero (500 µl) fueron mezcladas con volúmenes iguales (500 µl) de solución reguladora de lisis (Tris-HCl 40 mM, pH 7.4, EDTA 4 mM, 2 % de NP40, 0.2 % de SDS) o solución salina reguladora de fosfato (PBS). Las perlas de sefarosa conjugadas anti-ratón (Sigma, Cat. No. A6531) (20 µl) fueron incubadas durante 1 hora con -2-5 µg del anti-anticuerpo monoclonal de CD24 (SWA11), y alícuotas del complejo perlas-anticuerpo (20 µl), luego se mezclaron con las muestras de suero lisadas y se incubaron durante la noche en un cuarto frío, mientras que se agitan por rotación. 20 Los complejos inmuno-perlas resultantes que incluyen la proteína CD24 de las muestras de suero fueron recolectados (mediante centrifugación corta) y se lavaron 6 veces con solución reguladora salina-Hepes (HEPES 20 mM, NaCl 150 mM, Triton al 0.1 % y Glicerol al 10 %), y a continuación los CD24-inmunoprecipitados fueron eluidos por 4 X solución reguladora de muestra de proteína (Tris-HCl 200 mM pH 6.8, glicerol al 40%, SDS al 8%, Azul de bromofenol al 0.2 %, DTT 100 mM) a 90-95 °C (5 minutos) seguido por centrifugación corta para separar las perlas de la proteína CD24 y el 25 anti-anticuerpo de CD24. Los eluidos luego fueron sometidos a un análisis de Western blot utilizando el anti-anticuerpo SWA11 de CD24.

De manera alterna, las muestras de suero se incubaron con solución reguladora de lisis o PBS (según se describe anteriormente) y la inmunoprecipitación se realizó con perlas conjugadas con Concavalina A, que se une a las proteínas glicosiladas. Los complejos inmuno-perlas, luego fueron separados de la muestra (mediante centrifugación 30 corta), seguido por elución a 90-95 °C. Los eluyentes (que contienen la proteína CD24) luego fueron sometidos a SDS-PAGE seguido por un análisis de Western blot con el anticuerpo de CD24 SWA11.

Análisis de Western blot - se realizó sobre lisados celulares preparados utilizando la siguiente solución reguladora de lisis: Tris-HCl 20 mM, pH 7.4, EDTA 2 mM, NP40 al 1 %, SDS al 0.1 %, o en la presencia de PBS utilizando el anticuerpo SW11 de manera similar al Western blot realizado después del análisis IP. En resumen, la 35 cantidad de proteína en los extractos de células se determina (por ejemplo, utilizando el ensayo de Bradford) y 16 µg de proteína total se cargan en cada pozo.

Resultados experimentales

Calibración del ensayo IP de CD24 - Los anticuerpos de CD24 ML5 y SWA11 (Jackson D, Waibel R, Weber E, Bell J, Stahel RA. CD24, una molécula transductora de señal expresada sobre células B humanas, es un antígeno 40 superficial principal sobre el carcinoma de pulmón de célula pequeña. Cancer Res. 1992; 52:5264-7) fueron empleados con el fin de calibrar el ensayo IP. Los extractos de las líneas celulares HCT116 (que no expresa CD24) o HT29 (que expresa CD24) de CRC fueron sometidos a CD24-IP (utilizando las perlas de Sefarosa anti-ratón) seguido por el análisis de Western blot con cualquiera de los anticuerpos ML5 o SWA11. Como se muestra en la Figura 1, se encontró que el anticuerpo SWA11 era un anticuerpo eficiente para el análisis IP, produciendo un fondo bajo. 45

Determinación de la sensibilidad del análisis IP de CD24 - Con el fin de aprender sobre la sensibilidad del método, los lisados de las células HT29, que expresan CD24, fueron homogeneizados con el aumento de concentraciones de sueros normales seguido por un análisis IP. La proteína CD24 fue visible cuando 1 mg, 100 µg y 10 µg de los lisados fueron mezclados en 1 ml de suero, pero no en 1 µg y menos (los datos no se muestran). El experimento fue repetido dos veces, cambiando cada vez los tiempos de incubación del complejo perlas-Ab con la 50 muestras con el fin de aumentar la sensibilidad y reducir las señales de fondo.

Análisis IP de CD24 en muestras de suero - Con el fin de determinar si la sobre-expresión de CD24 en tumores GI (premaligno y maligno) se asocia con la presencia de CD24 en el suero, las muestras de suero de pacientes cuyas biopsias de tumor con anterioridad fueron teñidas positivamente mediante IHC de CD24, fueron sometidas a análisis IP utilizando anticuerpos monoclonales de CD24 o perlas conjugadas con conconavalina A (proteínas 55 glicosiladas unidas a la conconavalina A). En resumen, muestras de suero (0.5 ml) se incubaron durante la noche con perlas precipitadas que fueron preparadas por pre-incubación de perlas de Sefarosa conjugadas anti-ratón (Sigma,

Israel) con el anticuerpo monoclonal anti-CD24 SWA11. En pacientes cuyos sueros fueron tomados en el tiempo cuando CRC fue activo, una señal de una proteína de 35-40 kDa se observó, correspondiente a la proteína CD24 en los pacientes. Por otra parte, en pacientes cuyos sueros fueron tomados cuando CRC no era activo (en remisión), no hubo ninguna expresión o se redujo significantemente la expresión de CD24 (Figura 3 y los datos no se muestran). CD24 también se purificó a partir de una muestra de suero de un paciente con CRC activo por cromatografía de intercambio 5 aniónico utilizando una minicolumna DEAE-celulosa (DE52) y depleción de albúmina, seguido por un análisis de Western blot con el anticuerpo monoclonal anti-CD24 SWA11 (Figura 5). Estos resultados demostraron la presencia de la proteína CD24 en suero de sujetos con CRC activo y sugieren su detección en suero como un marcador para malignidades GI.

Análisis de Western blot de CD24 en muestras de materia fecal y orina – Más de 90 muestras de materia 10 fecal y orina de pacientes de CRC y sujetos saludables, asisten al Centro de Prevención de Cáncer Integrado (Sorasky Medical Center, Tel Aviv, Israel) fueron recolectadas y almacenadas a - 80 °C. Todos los sujetos firmaron el consentimiento informado en la aprobación del hospital IRB y el ministerio de salud, y los reportes endoscópicos correspondientes fueron registrados. Con el fin de analizar la presencia de CD24 en muestras de materia fecal, una pequeña cantidad (0.3-0.5 ml) fue tomada de la muestra congelada y se homogenizaron en 1 ml de solución reguladora 15 de lisis de proteína con inhibidores de proteasas. Los lisados fueron recolectados de la fase sobrenadante después de la centrifugación del homogeneizado (20 minutos, 14,000 rpm). En 21/26 sujetos que se sometieron a examen colonoscópico y se diagnosticaron con tumores benignos o malignos, se encontró CD24 en la materia fecal (los datos no se muestran).

Cabe señalar que utilizando ya sea una solución reguladora de lisis (que elimina los componentes de 20 membranas) o PBS que debería no afectar los componentes de membranas) no hubo diferencia significante en el nivel de CD24 según se detecta por análisis IP o de Western blot (los datos no se muestran) sugiriendo así que la mayoría de CD24 detectado en el suero no estaba unido a la membrana.

El nivel de CD24 en la materia fecal disminuye después de la extracción del tumor - Con el fin de confirmar que al menos en parte, la proteína detectada en la muestra de materia fecal se origina a partir del tumor, las 25 muestras de materia fecal fueron recolectadas de 11 pacientes antes y después de la extracción quirúrgica/endoscópica del tumor. Las diferencias en los niveles de expresión de CD24 fueron visibles entre las muestras pareadas (Figuras 2a-c; y los datos de un experimento repetido no se muestran), demostrando que la presencia de CD24 en la materia fecal se origina al menos en parte, de los tumores.

El nivel de CD24 en la materia fecal disminuye después de la terapia de radiación - Con el fin de 30 demostrar la relación entre CD24 en la materia fecal y la presencia de las células cancerosas (enfermedad de CRC activo) el nivel de CD24 fue detectado en pacientes de CRC después de la eliminación quirúrgica del tumor pero antes o después de la terapia de radiación. Como se muestra en la Figura 2b (carriles 13 y 14), una significante disminución en el nivel de CD24 se observó después de la terapia de radiación en comparación con antes del tratamiento. Por lo tanto, estos resultados demostraron que el nivel de CD24 en la materia fecal se correlaciona con la presencia de las células 35 cancerosas y se puede utilizar para el seguimiento de la eficacia del tratamiento.

La presencia de proteína de bajo peso molecular de especies de CD24 es indicativo de lesiones colon-rectales pre-cancerosas o cancerosas - Como se observa en las Figuras 2a-c, en muestra de materia fecal tomada de pacientes antes la extracción quirúrgica de los tumores o pólipos, hay varias bandas reactivas de CD24 de peso molecular bajo de aproximadamente 25-37 kDa, que están ausentes de muestras de materia fecal tomadas de los 40 mismos pacientes después de la extracción quirúrgica de los pólipos o tumores. Sin estar sujetos a ninguna teoría, estos resultados pueden indicar que el CD24 en circulación que está presente en materia fecal, orina o muestras de suero de sujetos que tienen lesiones pre-malignas o malignas comprende ya sea solo una porción de la secuencia de aminoácido de CD24 o representa una forma menos glicosilada (y por lo tanto una especie de proteína de peso molecular menor) de CD24. 45

En conjunto, estos resultados demostraron que la detección de CD24 en circulación en muestras biológicas se puede utilizar, como una detección precoz del marcador del cáncer tal como malignidades GI y/o para el seguimiento de la eficacia del tratamiento del cáncer. Además, la presencia de la especie de bajo peso molecular de CD24 (por ejemplo, entre 25 a 37 kDa) y/o altos niveles de CD24 (de cualquier tamaño entre el rango de 25-60 kDa), por encima de un umbral pre-determinado es indicativo de tumores pre-malignos o malignos. 50

Análisis y Discusión

Los hallazgos del presente estudio mostraron que CD24, se expresa en la membrana de un porcentaje distintivamente alto de células de tumores malignos y pre-malignos del tracto GI, incluyendo adenomas del colon/recto y del resto del tracto alimentario (tracto GI superior e intestino delgado). Como una proteína superficial que se expresa en un estadio temprano de la progresión del tumor, mientras que rara vez aparece en tejidos normales, los presentes 55 inventores sugieren CD24 como un novedoso biomarcador altamente confiable, para las células cancerosas. Además, los hallazgos de CD24 en muestras biológicas tales como suero, materia fecal y orina, en sujetos que tienen lesiones pre-malignas o malignas del tracto GI demostraron, por primera vez, que CD24 soluble, descamado o vesiculado (CD24 en circulación), se puede utilizar en el diagnóstico de lesiones pre-malignas y malignas.

Dado que CD24 es un péptido corto, que se encuentra en la parte exterior de las células y no tiene dominio transmembrana pero solo un ancla para GPI, es probable considerar que una porción de la proteína, que como se muestra in-vitro, se produce excesivamente cuando se expresa, se secreta constantemente de las células tumorales y alcanza la corriente sanguínea o se divide por las lipasas en la matriz extra-celular. Adicionalmente, las células tumorales necróticas, sus fragmentos o productos vesiculados de células tumorales, pueden alcanzar la corriente 5 sanguínea, así y contienen en ellos GPI anclado a la proteína CD24.

Uno de los anticuerpos monoclonales anti-CD24, el SWA11, se encontró por los presentes inventores que detecta eficientemente CD24 en muestras biológicas utilizando un análisis IP junto con las perlas conjugadas anti-Ratón (Sigma)] o como un anticuerpo de inmunotransferencia (por ejemplo, los lisados celulares mostrados en la Figura 1). Por lo tanto, CD24 que se descama de las células que sobre expresan CD24 (por ejemplo, las células de adenomas pre-10 malignos o las células tumorales de CRC malignas) se puede detectar por IP seguido por un análisis de Western blot en muestras de suero. Además, CD24 también se puede rastrear en fases de materiales grandes no disueltos (fragmentos de células y vesículas), que se separan de su medio mediante separación por ultra-centrifugación o gradiente de sacarosa. Dado que CD24 está anclado a la membrana y por lo tanto puede estar presente en la corriente sanguínea mientras que aún este integrado en fragmentos de membrana o vesículas que son el producto de células vesiculadas, 15 estos grandes cuerpos se concentran como se menciona debido a su alto peso y, las membranas se disolvieron por solución reguladora de lisis, y IP se realiza como se describe. Adicionalmente, los anticuerpos para la proteína también pueden estar presentes en los sueros de sujetos que expresan altos niveles de CD24. Su presencia puede ser detectable utilizando la metodología de ELISA con placas, recubiertas con la proteína purificada o fijada con células que expresan altos niveles de CD24. Las células HT29 que expresan altos niveles de CD24 se fijan a una placa de 96 pozos 20 con formaldehido al 5%. El suero se adiciona al pozo por 2 horas de incubación, después de tres lavados, un anticuerpo HRP anti-Humano se adiciona a los pozos, se lavaron cinco veces, y una reacción de color se realiza adicionando un sustrato al HRP durante cinco minutos 3,3’,5,5’-Tetrametilbencidina (TMB), Sigma]. La reacción se detiene con ácido sulfúrico y la intensidad de color (que representa la cantidad de anti-anticuerpo de CD24 en el suero) se determina por un dispositivo lector de ELISA a 450nm. El ADN de CD24 que se puede descamar de las células tumorales a la 25 corriente sanguínea, se puede detectar mediante la realización de PCR RT a partir de sangre periférica. Las mutaciones y polimorfismos que se buscan por lo tanto se pueden detectar, y también por reacciones de PCR cuantitativa, las amplificaciones en los genes CD24 que se producen dentro de las células tumorales se pueden ver.

Los métodos para detectar CD24 en el suero de sujetos, como una herramienta para el diagnóstico precoz del cáncer, se puede aplicar para todos los tumores que se reportaron previamente que tienen una tendencia a sobre 30 expresar CD24. Esto incluye todos los siguientes tumores, así como sus lesiones pre-malignas, y otros tumores que serán descubiertos en el futuro que sobre expresan CD24. Hasta ahora, la mayoría de clases de linfomas en los que CD24 se sobre expresa son: leucemia aguda, linfomas de anillo de Waldeyer, leucemia linfoblástica aguda común, linfoma de no-Hodgkin, leucemia de célula vellosa. También, los tumores sólidos expresan CD24 tales como: sarcoma de célula clara, nefroblastoma, carcinoma de célula renal, nefroma mesoblástico del adulto, carcinoma de pulmón de 35 célula pequeña y de célula no pequeña, neuroblastoma, ganglioblastoma, sarcoma, carcinoma de célula escamosa, carcinoma gástrico y colorectal, carcinoma nasofaríngeo, cáncer de vejiga, cáncer de mama, glioma, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de próstata neuroendocrino, carcinoma de células de Merkel y cáncer pancreático entre otros.

REFERENCIAS 40

(Referencia Adicionales se citan en el texto)

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11. Sagiv E., et al., 2006, Gastroenterology, 131: 630-639

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18. U.S. Pat. Appl. 20040005596 to Li J., et al.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> Medical Research Fund of Tel Aviv Sourasky Medical Center Arber, Nadir

<120> MÉTODOS Y KITS PARA LA DETECCIÓN TEMPRANA DE CÁNCER O PREDISPOSICIÓN A ESTE 25

<130> 32835

<160> 12

<170> PatentIn versión 3.4

<210> 1

<211> 2194 30

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (280)..(280) 35

<223> polimorfismo C/T

<400> 1

<210> 2

<211> 80

<212> PRT

<213> Homo sapiens 5

<220>

<221> misc_feature

<222> (57)..(57)

<223> polimorfismo Ala / Val

<400> 2 10

<210> 3

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 15

<220>

<223> oligonucleótido de ADN monocatenario

<400> 3

ttgttgccac ttggcatttt tgaggc 26

<210> 4

<211> 25 5

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> oligonucleótido de ADN monocatenario

<400> 4 10

ggattgggtt tagaagatgg ggaaa 25

<210> 5

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 15

<220>

<223> oligonucleótido de ADN monocatenario

<400> 5

gattctgcta ataccctgca aatagca 27

<210> 6 20

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> oligonucleótido de ADN monocatenario 25

<900> 6 -

ccctgcagtc tgctggattt gg 22

<210> 7

<211> 10719

<212> ADN 30

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (3977)..(3977)

<223> polimorfismo T/A 35

<220>

<221> misc_feature

<222> (4006) .. (4006)

<223> polimorfismo G/C

<400> 7

<210> 8

<211> 2843

<212> PRT

<213> Homo sapiens 5

<220>

<221> misc_feature

<222> (1307)..(1307)

<223> polimorfismo Ile / lys

<220> 10

<221> misc_feature

<222> (1317)..(1317)

<223> polimorfismo Glu / Gln

<400> 8

<210> 9

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> oligonucleótido de ADN monocatenario

<400> 9

tttgcagggt attagcagaa tctgcttcct gtg 33

<210> 10

<211> 21 5

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> oligonucleótido de ADN monocatenario

<400> 10 10

ccaatctttt cttttttttc t 21

<210> 11

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 15

<220>

<223> oligonucleótido de ADN monocatenario

<400> 11

tgctgtgaca ctgctggaac ttcgc 25

<210> 12 20

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> oligonucleótido de ADN monocatenario 25

<400> 12

cacaggatct tgagctgacc tag 23

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCION

Esta lista de referencias citada por el aspirante es solamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento de la patente Europea. Aún cuando se ha tenido gran cuidado en recopilar las referencias, los errores u omisiones no se pueden excluir y la EPO desconoce toda responsabilidad a este respecto.

Documentos de patentes citadas en la descripción 5

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método ex vivo de diagnóstico del cáncer o una lesión pre-maligna, el método que comprende la determinación de la presencia y/o el nivel de un CD24 en circulación, que no está unido a las células intactas en una muestra biológica del sujeto que lo necesite, en donde dicha muestra biológica se selecciona del grupo que consiste de una muestra de suero, una muestra de sangre, una muestra de materia fecal, una muestra de orina y una muestra de 5 saliva, en donde dicha presencia y/o dicho nivel del citado CD24 en circulación, por encima de un umbral predeterminado, es indicativo del cáncer o de la lesión pre-maligna.
2. Un método ex vivo del seguimiento de la eficacia de la terapia contra el cáncer, que comprende la determinación de un nivel de un CD24 en circulación, que no está unido a las células intactas en una muestra biológica de un sujeto que sigue la terapia contra el cáncer, en donde dicha muestra biológica se selecciona del grupo que 10 consiste de una muestra de suero, una muestra de sangre, una muestra de materia fecal, una muestra de orina y una muestra de saliva, en donde la terapia contra el cáncer se selecciona del grupo que consiste de terapia de radiación, quimioterapia y terapia de anticuerpos, en donde una disminución de un umbral predeterminado en dicho nivel del citado CD24 en circulación, después de la terapia contra el cáncer, es indicativo de una reducción de las células cancerosas, por lo tanto el seguimiento de la eficacia de la terapia contra el cáncer. 15
3. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde dicho CD24 en circulación, es una especie de bajo peso molecular de CD24 entre 25 a 37 kDa,
4. El método de la reivindicación 1, en donde dicha lesión pre-maligna se selecciona del grupo que consiste de un adenoma, un pólipo adenomatoso, un esófago de Barrett, una neoplasia intraductal papilar mucinus (IPMN), un carcinoma ductal in situ (DCIS) en un seno, una leucoplasia y una eritroplasia. 20
5. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde dicho CD24 en circulación se selecciona del grupo que consiste de CD24 descamado, CD24 vesiculado y CD24 soluble.
6. El método de la reivindicación 1, en donde la lesión pre-maligna o el cáncer se asocia con un cáncer de tracto gastrointestinal.