WO2014198995A1

WO2014198995A1 - Biomarcadores para el diagnóstico y respuesta al tratamiento en cáncer de páncreas

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Publication number: WO2014198995A1
Application number: PCT/ES2014/070495
Authority: WO
Inventors: Carolina TORRES PERALES; Sonia PERALES ROMERO; Juan Ramón DELGADO PÉREZ; Antonio IRIGOYEN MEDINA; María José ALEJANDRE PÉREZ; José IGLESIAS GÓMEZ; Rogelio PALOMINO MORALES; Octavio CABA PÉREZ; José Carlos PRADOS SALAZAR; Antonia ARÁNEGA JIMÉNEZ; Ana LINARES GIL
Original assignee: Universidad De Granada; Servicio Andaluz De Salud; Universidad De Jaén
Priority date: 2013-06-14
Filing date: 2014-06-13
Publication date: 2014-12-18
Also published as: US20160139129A1; CN105829893A; EP3015864A4; EP3015864A1

Abstract

Biomercadores, método y kit de diagnóstico temprano de cáncer de páncreas, en particular, de adenocarcinoma ductal de páncreas (PDAC) y Biomarcadores, método y kit o dispositivo para predecir o pronosticar la respuesta de un individuo al tratamiento combinado con un análogo de nucleósido (preferiblemente Gemcitabina) y con un receptor del factor de crecimiento (preferiblemente Erlotinib) en pacientes con adenocarcinoma ductal de páncreas.

Description

BIOMARCADORES PARA EL DIAGNÓSTICO Y RESPUESTA AL TRATAMIENTO

EN CÁNCER DE PÁNCREAS

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se encuentra dentro del campo de la Biología Molecular y la Medicina. Específicamente, se refiere a un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico temprano del adenocarcinoma ductal de páncreas. El diagnóstico precoz se realiza mediante el análisis de los biomarcadores FGF- 10, CXCL 11, OSM, GPNMB y SCF. También se refiere a un método de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar la respuesta al tratamiento combinado con un análogo de nucleósido (Gemcitabina) con un receptor del factor de crecimiento (Erlotinib) en pacientes con adenocarcinoma ductal de páncreas. El pronóstico se realiza mediante el análisis de los biomarcadores séricos CD80, EG-VEGF, IL-29, NRG1 -beta1 y PD-ECGF.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Adenocarcinoma ductal de Páncreas El adenocarcinoma ductal de páncreas (PADC), aunque sólo representa el 2,68% de todos los cánceres, posee una de las tasas de mortalidad más altas entre todos los tipos de cáncer. Los nuevos casos de este cáncer alcanzaron los 44.000 individuos el año pasado (2012) y de ellos, 37.400 murieron (el 85%). Hombres y mujeres tienen aproximadamente un riesgo similar de padecerlo (Siegel et al., 2012. C.A. Cáncer J. Clin. 62, 10-29).

Entre los motivos de la escasa respuesta al tratamiento se encuentran el diagnóstico tardío dado que en la mayoría da los casos cuando el cáncer es detectado se ha producido metástasis y los mecanismos intrínsecos de resistencia a la quimioterapia (Hidalgo, 2010. N. Engl. J. Med. 362, 1605-1617; Sakar et al. 2007. Toxicol. Appl. Pharmacol. 224, 326-336). Debido al impacto que el diagnóstico temprano tiene en la supervivencia de los pacientes (Agarwal et al., 2008. Páncreas 36, 15-20), son necesarias mejores herramientas de diagnóstico sencillas para la detección y evaluación de la enfermedad. El suero es la mejor opción para obtener muestras donde estudiar los tumores malignos ya que puede ser tomado por métodos no invasivos. En el caso del cáncer de páncreas es especialmente útil ya queel acceso al órgano diana es muy difícil. Por estas razones, los biomarcadores del cáncer basados en suero constituyen las pruebas de detección más sencillas. Hasta la fecha, el único biomarcador basado en suero para el PDAC usado es el antígeno carbohidrato 19-9 (CA), con sensibilidad entre el 70 y 90% y especificidad entre el 70 y 98%, dependiendo del tamaño del tumor (Chan et al., 2012. J. Proteomics). No obstante, este biomarcador no es detectado si el tamaño del tumor es menor a 2 centímetros y por la falta de expresión en el 10% de los pacientes. Esto también ocurre en otras patologías. Por ello y desde hace poco, la Sociedad Americana de Oncología no recomienda CA 19-9 para las pruebas de detección del PADC (Duffy et al., 2010. Ann. Oncl. 21 , 441 -447). Existe una estrecha relación entre los procesos inflamatorios y la carcinogénesis (Mantovani et al., 2008. Nature 454, 436-444; Germano et al., 2008. Cytokine 43, 374-379). El cáncer pancreático está caracterizado por una densa reacción desmoplásica, la cual representa una barrera importante que previene la liberación efectiva de los agentes quimioterapéuticos en el sitio principal de la enfermedad. Además, el microambiente del complejo tumoral nutre la invasión y metástasis del cáncer pancreático (Shields et al., 2012. Biochem J. 441 , 541 -542; Nesse et al., 201 1 . Gut. 60, 861 -868; Luo et al., 2012. Biochim. Biophys Acta. 1826, 170-178). Las citoquinas liberadas por células cancerosas o por células en el interior del microambiente tumoral son los arquitectos de esta reacción. Teniendo en cuenta lo anterior, consideramos que una modulación en los niveles de citoquinas podría reflejar los procesos que llevan al desarrollo de la enfermedad o a la quimioresistencia. Los arrays basados en anticuerpos representan una herramienta útil para el descubrimiento de biomarcadores del cáncer. Esta metodología destaca por su capacidad de ofrecer percepciones rápidas y correctas para la detección temprana de biomarcadores del cáncer, aportando nuevos enfoques para terapias contra el cáncer (Breman et al., 2010. Nat. Rev. Cáncer 10, 605-617). Por tanto la identificación y validación de biomarcadores individuales o conjuntos de biomarcadores para la rápida detección del PDAC (biomarcadores diagnóstico) ayudaría a incrementar la supervivencia de los pacientes.

Por otro lado, el pronóstico para los pacientes con esta enfermedad es desesperanzador. Menos del 5% de los pacientes llegan a los 5 años de supervivencia tras el diagnóstico debido al escaso efecto de la quimioterapia en el tratamiento de la enfermedad y al estado metastásico del tumor en el momento de diagnóstico. La enfermedad se desarrolla debido a un proceso complejo, poco conocido, que abarca una amalgama de mutaciones y múltiples alteraciones en vías de señalización celular. Todo ello explica la heterogeneidad de esta patología y las diferencias observada en los resultados entre los distintos pacientes. En los últimos años no se han producido mejoras para aumentar la supervivencia de los pacientes de PDAC (Hidalgo, 2010. Pancreatic cáncer. N. Engl. J. Med. 362, 1605-1617; Costello et al., 2012. Nat. Rev. Gastroenterol Hepatol. 9, 435-444.)

Biomarcadores

Un marcador biológico (biomarcador), según NIH Biomarker, es una característica que puede ser objetivamente medida y evaluada como un indicador de procesos biológicos normales, procesos patológicos, o de respuestas farmacológicas después de una intervención terapéutica (Fong et al., 2012. Cáncer J. 18, 530-538.).

En el PDAC son de gran utilidad 3 tipos de biomarcadores: aquellos que ayudan en la detección de la enfermedad (biomarcadores diagnóstico); aquellos que predicen la respuesta a tratamientos (biomarcadores predictivos) y aquellos que pronostican el curso más probable de la enfermedad, incluyendo la supervivencia y el patrón de recurrencia (biomarcadores pronóstico). Los biomarcadores de pronóstico pueden guiar los planes de tratamiento, ayudando a identificar aquellos pacientes que podrían beneficiarse de intervenciones más agresivas, nuevos regímenes de quimioterapia y también ayudar a establecer nuevas expectativas para médicos y pacientes. En los últimos años, se han realizado numerosas investigaciones en biomarcadores para el pronóstico del PDAC usando inmunohistoquímica, Western Blot, PCR, ARNm, proteómica y métodos de metilación del ADN (Jamieson et al., 201 1 . Clin Cáncer Res 17, 3316-333; Garcea et al., 2005. Eur. J. Cáncer 4 , 2213-2236; Luo et al., 2013. Hum. Pathol. 44, 69-76; Mann et al., 2012. PLoS One 7, e51 1 19; Dallol et al., 2012. Cáncer Epidemiol. Biomarkers. Prev. 21 , 2069-2075).

Este estudio se ha centrado en los mediadores inflamatorios que podrían constituir biomarcadores útiles para el pronóstico de pacientes con PDAC incluso antes de ser tratados. Se han encontrado alteraciones en los niveles de citoquinas inflamatorias de pacientes con cáncer, incluso en estadios tempranos de su desarrollo. La respuesta inmune tiene un papel importante durante la carcinogénesis, y los marcadores circulatorios inflamatorios pueden ser biomarcadores útiles para el diagnóstico y pronóstico del cáncer (Schetter et al., 2010. Carcinogenesis 2>^~\ , 37-49; Germano et al., 2008. Cytokine 43, 374-379). Las citoquinas son moléculas de señalización y actúan como mediadores clave de la inflamación o de la respuesta inmune. La hipótesis de partida está basada en el papel esencial del microambiente y de la reacción desmoplástica en el desarrollo y progresión del PDAC de manera que el patrón de expresión de las citoquinas en el interior del tumor y en el microambiente circundante podría constituir potenciales biomarcadores de pronóstico para el PDAC. El objetivo del estudio consistió en investigar el poder de pronóstico de las citoquinas del suero en respuesta al tumor hospedado en pacientes con PDAC. Para identificar la combinación de biomarcadores significativamente más acertada se usó un algoritmo condicional, basado en un análisis probabilístico y ajustado al modelo de regresión de COX. Se derivó una ecuación para la supervivencia específica en esta cohorte.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA ¡NYENCHÓN

Biomarcadores para diagnóstico temprano

Un primer aspecto de la invención se refiere al uso de los genes (y/o proteínas) FGF- 10, CXCL 11, OSM, GPNMB y SCF, para el diagnóstico temprano del cáncer de páncreas. El uso puede ser simultáneo o puede elegirse cualquiera de los genes (y/o proteínas), o cualquiera de sus combinaciones.

En una realización preferida de este aspecto de la invención el cáncer de páncreas es el adenocarcinoma ductal de páncreas (PDAC)

Otro aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles, de ahora en adelante primer método de la invención, para el diagnóstico temprano del cáncer de páncreas, que comprende: a) Obtener una muestra aislada del individuo.

b) cuantificar el producto de expresión de los genes que se seleccionan de la lista que consiste en: FGF- 10, CXCL 1 1, OSM, GPNMB y SCF. Se puede cuantificar el producto de expresión de todos los genes simultáneamente, o puede elegirse cualquiera de los genes (y/o proteínas), o cualquiera de sus combinaciones.

En otra realización preferida, el método de la invención además comprende: c) comparar las cantidades obtenidas en el paso (b) con una cantidad de referencia.

En una realización preferida del método de la invención, los pasos (b) y/o (c) de los métodos descritos anteriormente pueden ser total o parcialmente automatizados.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método de diagnóstico del cáncer de páncreas que comprende los paso (a)-(c) según el primer método de la invención, y además comprende asignar al individuo del paso (a) al grupo de individuos que padecen cáncer de páncreas cuando presentan una cantidad de producto de expresión del los genes FGF- 10, CXCL 1 1, OSM, GPNMB y SCF, superior a la cantidad de referencia.

En una realización preferida del método de la invención, la muestra biológica aislada de un individuo del paso (a) es una muestra de sangre.

En otra realización preferida, la detección de la cantidad de expresión de cualquiera de los genes FGF-10, CXCL1 1 , OSM, GPNMB y SCF se realiza mediante un inmunoensayo.

En otra realización preferida, el inmunoensayo es un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas o ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay).

Otro aspecto de la invención se refiere a un anticuerpo para tratar un individuo que padece cáncer de páncreas (o alternativamente al uso de un anticuerpo en la elaboración de un medicamento para el tratamiento del cáncer de páncreas), identificable por un método de la invención, donde el anticuerpo se selecciona de entre anti-FGF-10, anti-CXCL1 1 , anti-OSM, anti-GPNM y anti-SCF, o cualquiera de sus combinaciones. Preferiblemente se emplea una combinación de todos los anticuerpos anteriores. En otra realización preferida de este aspecto de la invención el cáncer de páncreas es el adenocarcinoma ductal de páncreas (PDAC).

Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un agente modulador de al menos uno de los genes que se seleccionan de entre FGF- 10, CXCL 11, OSM; GPNMB y SCF, para tratar a un individuo que padece cáncer de páncreas (o alternativamente al uso de una composición farmacéutica que comprende un agente modulador de al menos uno de los genes que se seleccionan de entre FGF- 10, CXCL 11, OSM, GPNMB y SCF en la elaboración de un medicamento para el tratamiento del cáncer de páncreas), y más preferiblemente del adenocarcinoma ductal de páncreas (PDAC), identificable por un método de la invención. Otro aspecto de la presente invención se refiere a un kit o dispositivo, de ahora en adelante "primer kit de la invención", que comprende los elementos necesarios para cuantificar la cantidad de producto de expresión de los genes que se seleccionan de entre FGF- 10, CXCL 1 1, OSM, GPNMB y SCF o cualquiera de sus combinaciones.

En una realización preferida, el primer kit de la presente invención comprende los anticuerpos que se seleccionan de la lista que consiste en anticuerpos: anti-FGF- 10, antí- CXCL1 1 , anti-OS , anti- GPNM y anti-SCF, o cualquiera de sus combinaciones. Preferiblemente, el kit de la invención comprende simultáneamente al menos un anticuerpo de cada tipo: anti-FGF-10, anti- CXCL1 1 , anti-OSM, anti- GPNM y anti- SCF.

En otra realización preferida, el primer kit de la invención comprende anticuerpos secundarios o controles positivos y/o negativos. El kit además puede incluir, sin ningún tipo de limitación, tampones, soluciones de extracción de proteínas, agentes para prevenir la contaminación, inhibidores de la degradación de las proteínas, etc.

Otro aspecto de la invención se refiere a un soporte sólido, o chip de proteínas, que comprende al menos uno de los anticuerpos anti-FGF-10, anti- CXCL1 1 , anti-OSM, anti- GPNM y anti-SCF, o cualquiera de sus combinaciones, para llevar a cabo el cualquiera de los métodos de la invención.

Otro aspecto de la invención se refiere a un soporte sólido, o chip de DNA, que comprende oligonucleótidos o microarreglos de canal único diseñados a partir de una secuencia conocida o un ARNm de al menos uno de los genes FGF-10, CXCL 1 1, OSM, GPNM y SCF. Preferiblemente, comprende los oligonucleótidos capaces de detectar el ARNm de todos los genes FGF- 10, CXCL 11, OSM, GPNM y SCF,

Biomarcadores de respuesta al tratamiento

Otro aspecto de la invención se refiere al uso de los genes (y/o proteínas) CD80, EG- VEGF, IL-29, NRG1 -beta1 y PD-ECGF, para predecir o pronosticar la respuesta de un individuo al tratamiento combinado con un análogo de nucleósido más un inhibidor del receptor del factor de crecimiento epidérmico, donde el individuo padece cáncer de páncreas.

En una realización preferida, en el tratamiento el análogo de nucleósido es la Gemcitabina. En otra realización preferida, en el tratamiento el inhibidor del receptor del factor de crecimiento epidérmico es el Erlotinib. En otra realización preferida, el cáncer es el adenocarcinoma ductal de páncreas (PDAC). Otro aspecto de \a invención se refiere a un método de obtención de datos útiles, de ahora en adelante tercer método de la invención, para predecir o pronosticar la respuesta de un individuo al tratamiento del cáncer de páncreas, que comprende: a) Obtener una muestra aislada del individuo.

b) cuantificar el producto de expresión de los genes que se seleccionan de la lista que consisten en: CD80, EG-VEGF, IL-29, NRG1-beta1 y PD- ECGF.

En otra realización preferida, el tercer método de la invención además comprende: c) hallar un valor de índice pronóstico (IP) con los valores de las citoquinas del paso b), aplicando la fómula:

IPPDAC = 4.351 x B7-1/CD80 + 0.003 x EG-VEGF / P 1 +0.081 x IL-29 + 0.020 x NGRl-betal/HRGl-betal + 0.264 x PD-ECGF

Donde, los individuos que presentan un IP>17 presentan un mal pronóstico de la enfermedad. En una realización preferida de este aspecto, los individuos que presentan una IP>17 muestran una supervivencia menor a cinco meses. En otra realización preferida, los individuos con un IP≤17 presentan un mejor pronóstico de la enfermedad En otra realización preferida de este aspecto, los individuos con un IP≤17 presentan una supervivenciamayor de cinco meses.

En una realización preferida del tercer método de la invención, el análogo de nucleósido es la Gemcitabina. En otra realización preferida, el inhibidor del receptor del factor de crecimiento epidérmico es el Erlotinib.

En otra realización preferida, el cáncer es el adenocarcinoma ductal de páncreas (PDAC).

En un otra realización preferida de este aspecto de la invención, la muestra biológica (a) es una muestra de sangre, y más preferiblemente suero. En otra realización preferida, la detección de la cantidad de expresión de cualquiera de los genes CD80, EG-VEGF, IL-29, NRG1-beta1 y PD-ECGF se realiza mediante un inmunoensayo. En otra realización preferida, el inmunoensayo es un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas o ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay).

Otro aspecto de la invención se refiere a un anticuerpo para tratar un individuo que padece cáncer de páncreas, identificable por un método de la invención, donde el anticuerpo se selecciona de entre anti-CD80, antí-EG-VEGF, anti-IL-29, anti-NRG1 - betal y aníi-PD-ECGF, o cualquiera de sus combinaciones.

Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un agente modulador de al menos uno de los genes que se seleccionan de entre CD80, EG-VEGF, IL-29, NRG1 -beta l y PD-ECGF, para tratar a un individuo que padece cáncer de páncreas (o alternativamente al uso de una composición farmacéutica que comprende un agente modulador de al menos uno de los genes que se seleccionan de entre CD80, EG-VEGF, IL-29, NRG1-beta 1 y PD-ECGF en la elaboración de un medicamento para el tratamiento del cáncer de páncreas), identificable por un método de la invención. Otro aspecto de la presente invención se refiere a un kit o dispositivo, de ahora en adelante segundo kit de la invención, que comprende los elementos necesarios para cuantificar la cantidad de producto de expresión de los genes que se seleccionan de entre CD80, EG-VEGF, IL-29, NRG1 -beta l y PD-ECGF o cualquiera de sus combinaciones. Aún más preferiblemente, el segundo kit de la presente invención comprende los anticuerpos que se seleccionan de la lista que consiste en anticuerpos: anti-CD80, anti-EG-VEGF, anti-IL-29, anti-NRG1 -beta1 y aníi-PD-ECGF, o cualquiera de sus combinaciones. Preferiblemente, el segundo kit de la invención comprende simultáneamente al menos un anticuerpo de cada tipo: anti-CD80, aníi-EG-VEGF, anís- IL29, anti-NRG1 -betal y anti- PD-ECGF.

Otro aspecto de la invención se refiere a un soporte sólido, o chip de proteínas, que comprende al menos uno de los anticuerpos anti-CD80, anti-EG-VEGF, anti-IL-29, anti-NRG1 -betal y anti-PD-ECGF, o cualquiera de sus combinaciones o cualquiera de sus combinaciones, para llevar a cabo cualquiera de los métodos de la invención. Otro aspecto de la invención se refiere a un soporte sólido, o chip de DNA, que comprende oligonucleótidos o microarreglos de canal único diseñados a partir de una secuencia conocida o un ARNm de al menos uno de los genes CD80, EG-VEGF, IL- 29, NRG 1 -betal y PD-ECGF Implementación de los métodos de la invención

Otro aspecto de la invención se refiere a un medio de almacenamiento legible por un ordenador o a una señal transmisible que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención.

DESCRIPCIÓN DE LA INVE CIÓN

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención.

Definiciones

Una "muestra biológica aislada" incluye, pero sin limitarnos a, células, tejidos y/o fluidos biológicos de un organismo, obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en la materia.

El término "individuo", tal y como se utiliza en la descripción, se refiere a animales, preferiblemente mamíferos, y más preferiblemente, humanos. El término "individuo" no pretende ser limitativo en ningún aspecto, pudiendo ser éste de cualquier edad, sexo y condición física.

Los niveles de expresión de los genes van a dar un determinado perfil de expresión génica. El término "nivel de expresión", también denominado "cantidad producto génico" o "cantidad de producto de expresión" se refiere al material bioquímico, ya sea ARN o proteína, resultado de la expresión de un gen. Algunas veces se usa una medida de la cantidad de producto génico para inferir qué tan activo es un gen. Se entiende por "perfil de expresión génica" el perfil génico obtenido tras la cuantificación del ARNm y/o de proteína producida por los genes de interés o biomarcadores, es decir, por los genes FGF-10, CXCL 11, OSM, GPNMB, SCF, CD80, EG-VEGF, IL-29, NRG1-beta1 y PD-ECGF, en una muestra biológica aislada. El perfil de expresión de los genes se realiza, preferiblemente, determinando el nivel de ARNm derivado de su transcripción, previa extracción del ARN total presente en la muestra biológica aislada, lo cual puede realizarse mediante protocolos conocidos en el estado de la técnica.

La detección la cantidad de producto de expresión de FGF- 10, CXCL 1 1, OSM, GPNMB, SCF, CD80, EG-VEGF, IL-29, NRG1-beta 1 y PD-ECGF puede realizarse por cualquier medio conocido en el estado de la técnica. Los autores de la presente invención han demostrado que la detección de la cantidad o la concentración de anticuerpos frente a estas citoquinas de manera semi-cuantitativa o cuantitativa permiten diagnosticar de manera temprana a individuos que padecen adenocarcinoma ductal de páncreas. La medida de la cantidad o la concentración de producto de expresión de estos genes, preferiblemente de manera semi-cuantitativa o cuantitativa, puede ser llevada a cabo de manera directa o indirecta. La medida directa se refiere a la medida de la cantidad o la concentración del producto de expresión de los genes, basada en una señal que se obtiene directamente de los transcritos de dichos genes, o de las proteínas, y que está correlacionada directamente con el número de moléculas de RNA o de proteínas producidas por los genes. Dicha señal - a la que también podemos referirnos como señal de intensidad - puede obtenerse, por ejemplo, midiendo un valor de intensidad de una propiedad química o física de dichos productos. La medida indirecta incluye la medida obtenida de un componente secundario o un sistema de medida biológica (por ejemplo la medida de respuestas celulares, ligandos, "etiqueta" o productos de reacción enzimática).

El término "cantidad", tal y como se utiliza en la descripción, se refiere pero no se limita, a la cantidad absoluta o relativa de los productos de expresión de los genes o a la cantidad de los anticuerpos, así como a cualquier otro valor o parámetro relacionado con los mismos o que pueda derivarse de éstos. Dichos valores o parámetros comprenden valores de intensidad de la señal obtenidos a partir de cualquiera de las propiedades físicas o químicas de dichos productos de expresión obtenidos mediante medida directa. Adicionalmente, dichos valores o parámetros incluyen todos aquellos obtenidos mediante medida indirecta, por ejemplo, cualquiera de los sistemas de medida descritos en otra parte del presente documento.

El término "comparación", tal y como se utiliza en la descripción, se refiere pero no se limita, a la comparación de la cantidad de los productos de expresión de los genes o de la muestra biológica a analizar, también llamada muestra biológica problema, con una cantidad de los productos de expresión de los genes de una o varias muestras de referencia deseable. La muestra de referencia puede ser analizada, por ejemplo, simultánea o consecutivamente, junto con la muestra biológica problema.

El término "compuesto marcador", tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a un compuesto capaz de dar lugar a una señal cromogénica, fluorogénica, radiactiva y/o quimioluminiscente que permita la detección y cuantificación de la cantidad de anticuerpos frente a FGF-10, CXCL1 1 , OSM, GPNMB, SCF, CD80, EG- VEGF, IL-29, NRG1-beta 1 y PD-ECGF. El compuesto marcador se selecciona de la lista que comprende radioisótopos, enzimas, fluoróforos o cualquier molécula susceptible de ser conjugada con otra molécula o detectada y/o cuantificada de forma directa. Este compuesto marcador puede unirse al anticuerpo directamente, o a través de otro compuesto. Algunos ejemplos de compuestos marcadores que se unen directamente son, pero sin limitarse, enzimas como la fosfatasa alcalina o la peroxidasa, isótopos radiactivos como ³²P o ³⁵S, fluorocromos como fluoresceína o partículas metálicas, para su detección directa mediante colorimetría, auto-radiografía, fluorimetría, o metalografía respectivamente.

El término "inmunoensayo", tal y como se utiliza en la presente descripción se refiere a cualquier técnica analítica que se basa en la reacción de la conjugación de una anticuerpo con un antígeno. Ejemplos de inmunoensayos conocidos en el estado de la técnica son, por ejemplo, pero sin limitarse: inmunoblot, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), inmunoensayo lineal (LIA), radioinmunoensayo (RIA), inmunofluoresecencia, x-map o chips de proteína.

Los términos "polinucleótido" y "ácido nucleico" se usan aquí de manera intercambiable, refiriéndose a formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud, tanto ribonucleótidos (ARN) como desoxirribonucleótidos (ADN). Los términos "secuencia aminoacídica", "péptido", "oligopéptido", "polipéptido" y "proteína" se usan aquí de manera intercambiable, y se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que pueden ser codificantes o no codificantes, química o bioquímicamente modificados.

Biomarcadores de diagnóstico temprano Los autores de la presente invención han analizado los miembros de la familia de las citoquinas en individuos sanos, en individuos que padecen PDAC sin tratar y en individuos que padecen PDAC que han sido sometidos al tratamiento con Gemcitabina y Erlotinib. Han encontrado una serie de marcadores que les permite el diagnostico temprano de los individuos con PDAC. Así la presente invención proporciona un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico temprano de individuos con PDAC.

Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere al uso de los genes (y/o proteínas) FGF- 10, CXCL 11, OSM, GPNMB y SCF, para el diagnóstico temprano del cáncer de páncreas. El uso puede ser simultáneo o puede elegirse cualquiera de los genes (y/o proteínas), o cualquiera de sus combinaciones.

En otra realización preferida, el primer método de la invención además comprende: c) comparar las cantidades obtenidas en el paso (b) con una cantidad de referencia.

En una realización preferida, los pasos (b) y/o (c) de los métodos descritos anteriormente pueden ser total o parcialmente automatizados, por ejemplo, por medio de un equipo robótico sensor para la detección de la cantidad en el paso (b) o la comparación computarizada en el paso (c). Una realización preferida de este aspecto de la invención se refiere a un método de diagnóstico del cáncer de páncreas que comprende los paso (a)-(c) del primer método de la invención, y además comprende asignar al individuo del paso (a) al grupo de individuos que padecen cáncer de páncreas cuando presentan una cantidad de producto de expresión del los genes FGF-10, CXCL 1 1, OSM, GPNMB y SCF, superior a la cantidad de referencia. Puede presentar una cantidad de producto de expresión de cualquiera de los genes FGF- 10, CXCL 11, OSM, GPNMB y SCF, o de todos ellos simultáneamente, superior a la cantidad de referencia.

En una realización preferida del método de la invención, la muestra biológica aislada de un individuo del paso (a) es una muestra de sangre, y aún más preferiblemente suero La comparación descrita en el apartado (c) del método de la presente invención puede ser realizada manualmente o asistida por ordenador.

Las cantidades de referencia adecuadas pueden ser determinadas por el método de la presente invención a partir de una muestra de referencia que puede ser analizada, por ejemplo, simultánea o consecutivamente, junto con la muestra biológica problema. Así, por ejemplo pero sin limitarnos, la muestra de referencia pueden ser los controles negativos, esto es, las cantidades detectadas por el método de la invención en muestras de individuos que no padecen la enfermedad.

A continuación se describen las características de las citoquinas que son objeto del estudio: El gen FGF-10 ó fibroblast growth factor 10 (KGF-2: keratinocyte growth factor 2) se encuentra en el cromosoma 5 (5p13-p12). Este factor ha sido descrito como un promotor de la morfogénesis en etapas primarias de la organogénesis así como un regulador de la proliferación de células progenitoras epiteliales pancreáticas (Bhushan et a/., 2001 . Development l 28, 5109-51 17). Recientemente, también se ha descrito un vínculo entre la señalización FGF10/FGFR2-Iilb y la migración y la invasión de las células de cáncer pancreático a través de la inducción de metaloproteinasas de matriz de membrana tipo 1 y transformando el factor de crecimiento TGF-βΙ el cual es un importante regulador de la transición epitelial mesenquimal (Nomura et ai, 2008. Br. J. Cáncer 99, 305-313). En el contexto de la presente invención, FGF- 10 se define también por una secuencia de nucleotidos o polinucleotido, que constituye la secuencia codificante de la proteína recogida en la SEQ ID NO: 8, y que comprendería diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 8, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 8, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína FGF-10. Entre dichas moléculas de ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia SEQ ID NO: 1 .

El gen CXCL 11 ó hemokine (C-X-C motif) ligand 1 1 (C-X-C motif chemokine 1 1 ; beta- R1 ; interferon gamma-inducible protein 9; interferon-inducible T-cell alpha chemoattractant; small inducible cytokine B1 1 ; small inducible cytokine subfamily B (Cys-X-Cys), member 1 1 ; small inducible cytokine subfamily B (Cys-X-Cys), member 9B; small-inducible cytokine B1 1 , H174, l-TAC, IP-9, IP9, SCYB1 1 , SCYB9B, b-R1 ) se encuentra en el cromosoma 4 (4q21 .2). CXCL1 1 es una quirnioquina que interactúa específicamente con el receptor CXCR3. Estimula la fosforilación de las vías de las quinasas MAPK conduciendo a la proliferación y prevención de la apoptosis (Miekus et ai, 2010. Folia Histochem. Cyiobioí. 48, 104-1 1 1 ) Además, se ha descrito su papel en varios tipos de íumorigénesis cancerosas (Lo et al., 2010. Am. J. Pathol. 176, 2435- 2446; Furuya et al., 201 1 . Gynecol. Oncol. 122, 648-655). Aunque aquí presentamos, por primera vez, CXCL1 1 como un posible biomarcador en pacientes con PDAC, ha sido recientemente propuesto como un biomarcador sérico para adenocarcinoma de próstata (Klee ef ai, 2012. Clin. Chem. 58, 599-609)

En el contexto de la presente invención, CXCL 11 se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína recogida en la SEQ ID NO: 9, y que comprendería diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 9, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 9, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína CXCL1 1 . Entre dichas moléculas de ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia SEQ ID NO: 2.

El gen OMS ó oncostatin M (C-X-C motif chemokine 1 1 ; beta-R1 ; interferon gamma- inducible protein 9; interferon-inducible T-cell alpha chemoattractant; small inducible cytokine B1 1 ; small inducible cytokine subfamily B (Cys-X-Cys), member 1 1 ; small inducible cytokine subfamily B (Cys-X-Cys), member 9B; small-inducible cytokine B1 1 , H174, l-TAC, IP-9, IP9, SCYB1 1 , SCYB9B, b-R1 ) se encuentra en el cromosoma 4 (4q21 .2). La oncostatina M pertenece a la misma familia que la interleuquina-6 y estimula varias funciones implicadas en reparación de heridas. Aunque inicialmente se describió como un inhibidor del crecimiento de células de leucemia (Zarling et ai., 1986. Proc. Nal Acad. Sci. USA. 83, 9739-43), recientemente se ha comprobado que puede albergar un doble papel, también como promotor en la proliferación, migración celular e invasión (Fosse eí al. 201 1 , BMC Cáncer 1 1 , 125; Li eí ai, 201 1 . Int. J. Mol. Med. 28, 101 -108; Winder et al., 201 1 . J. Paíhoi 225, 448-462; Tifien et al., 2008. Mol. Endocrino!. 22, 2677-2688). Una vez OMS se une a su receptor, promueve la fosforilación recíproca y la activación de la vía de la familia Janus quinasa (JAK)/STAT. Varios objetivos transcripcionales de STAT3 son importantes contribuidores a la biología del PDAC (Corcoran et al., 201 1 . Cáncer Res. 71 , 5020-5029)

En el contexto de la presente invención, OMS se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína recogida en la SEQ ID NO: 10, y que comprendería diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 10, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 10, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína OMS. Entre dichas moléculas de ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia SEQ ID NO: 3.

El gen GPNMB ó glycoprotein (transmembrane) nmb (UNQ1725/PR09925, HGFIN, NMB, glycoprotein NMB; glycoprotein nmb-like protein; osteoactivin; transmembrane glycoprotein HGFIN; transmembrane glycoprotein, NMB NQ1725/PR09925, HGFIN, NMB) se encuentra en el cromosoma 7 (7p15). La glicoproteína GPNMB, también conocida como osteoactivina (QA), DG-HIL o HGFIN es una proteína transmembrana tipo 1 , la cual se describió al principio como bajo a nivel indetectable en células malignas (Weterman et ai., 1995. Int. J. Cáncer 60, 73-81 ) Sin embargo, estudios más recientes han descrito GPNMB/osíeoactivina como un promotor de la metástasis y la invasión (Rose et a!., 2010. PLos One 5, 12093) en algunos cánceres como el melanoma (Tomihari et a!., 2010. Cáncer Res 70, 5778-5787; Tse et ai, 2006. Clin. Cáncer Res. 12, 1373-1382), melanoma uveal (Williams et al., 2010. Melanoma res. 20, 184-190), glioma (Kuan et al., 2006. Clin. Cáncer Res. 12, 1970-1982), carcinoma hepatocelular (Onaga et al., 2003. J. Hepatol. 39, 779-785 y cáncer de mama, en los cuales se ha descrito también como un indicador pronóstico de recurrencia (Rose et al., 2010. Clin. Cáncer Res. 16, 2147-2156). Recientemente se ha descrito una inducción de GPNMB en la médula espinal de pacientes con esclerosis lateral amiotrófica como un inductor de la degeneración de las neuronas motoras (Tanaka et al., 2012. Sci. Rep. 2, 573).

En el contexto de la presente invención, GPNMB se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína recogida en la SEQ ID NO: 1 1 o la SEQ ID NO: 12, y que comprendería diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 1 1 o de la SEQ ID NO: 12, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 1 1 o la SEQ ID NO: 12, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína GPNMB. Entre dichas moléculas de ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia SEQ ID NO: 4 o en la SEQ ID NO: 5.

El gen SCF ó KIT ligand (KITLG, FPH2, KL-1 , Kitl, MGF, SCF, SF, SHEP7, c-Kit ligand; familial progressive hyperpigmentation 2; kit ligand; mast cell growth factor; steel factor; stem cell factor) se encuentra en el cromosoma 12 (12q22). SCF es el principal ligando para el receptor de la tirosina quinasa c-kit (KIT). Sus uniones apoyan la proliferación, diferenciación y supervivencia en las células que expresan KIT, tanto células normales como en células tumorales, incluyendo células de cáncer pancreático (Yasuda eí al., 2006. Mol. Cáncer 5, 46) a través de la activación de las vías (PI3K)/Akt; APK y STAT (Yasuda eí ai, 2007. Dig. Dis. Sci. 52, 2292-2300). Análisis previos han descrito los elevados niveles de factor de célula madre (FC ) en ¡os sueros de cáncer colorrecta! y PDAC (Mroczko et al., 2005. Clin, Ghem, Lab. Med. 43, 146-1 50; Mroczko eí a/., 2004. Clin. Chem. Lab. Med. 42, 256-260; Mroczko eí a/., 2005. iní.J. Colorecíal Dis. 22,33-38). .

En el contexto de la presente invención, SCF se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína recogida en la SEQ ID NO: 13 o en la SEQ ID NO: 14, y que comprendería diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 13 o de la SEQ ID NO: 14, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 13 o con la SEQ ID NO: 14, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína SCF. Entre dichas moléculas de ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia SEQ ID NO: 6 o en la SEQ ID NO. 7.

Como PDAC presenta múltiples alteraciones genéticas y epigenéticas e implica a varias vías de señalización, una combinación de CA 19-9 con diversos biomarcadores podría representar un nuevo enfoque para establecer nuevos biomarcadores diagnóstico. FGF-10, CXCL 11, OSM, GPNMB y SCF se han seleccionado por los autores de ¡a presente invención para un diagnóstico temprano de la enfermedad.

En otra realización preferida, la detección de la cantidad de expresión de cualquiera de los genes FGF-10, CXCL 11, OSM, GPNMB y SCF se realiza mediante un inmunoensayo.

En otra realización preferida, el inmunoensayo es un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas o ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay). El ELISA se basa en la premisa de que un inmunorreactivo (antígeno o anticuerpo) puede ser inmovilizado en un soporte sólido, poniendo luego ese sistema en contacto con una fase fluida que contiene el reactivo complementario que puede unirse a un compuesto marcador. Existen diferentes tipos de ELISA: ELISA directo, ELISA indirecto o ELISA sándwich.

Otro aspecto de la invención se refiere a un anticuerpo para tratar un individuo que padece cáncer de páncreas (o alternativamente al uso de un anticuerpo en la elaboración de un medicamento para el tratamiento del cáncer de páncreas), identificable por un método de la invención, donde el anticuerpo se selecciona de entre anti-FGF-10, anti-CXCL 1 , anti-OSM, anti-GPNM y aníi-SCF, o cualquiera de sus combinaciones. Preferiblemente se emplea una combinación de todos los anticuerpos anteriores.

Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un agente modulador de al menos uno de los genes que se seleccionan de entre FGF- 10, CXCL 11, OSM; GPNMB y SCF, para tratar a un individuo que padece cáncer de páncreas (o alternativamente al uso de una composición farmacéutica que comprende un agente modulador de al menos uno de los genes que se seleccionan de entre FGF- 10, CXCL 11, OSM; GPNMB y SCF en la elaboración de un medicamento para el tratamiento del cáncer de páncreas), identificable por un método de la invención. Preferiblemente, la composición comprende uno o más agentes moduladores de todos los genes FGF-10, CXCL 11, OSM; GPNMB y SCF simultáneamente. Aún más preferiblemente, la composición farmacéutica además comprende otro principio activo. En otra realización más preferida, el agente modulador es un anticuerpo que se selecciona de entre anti-FGF-10, anti- CXCL1 1 , anti-OSM, anti- GPNM y anti-SCF, o cualquiera de sus combinaciones.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un kit o dispositivo, de ahora en adelante primer kit de la invención, que comprende los elementos necesarios para cuantificar la cantidad de producto de expresión de los genes que se seleccionan de entre FGF- 10, CXCL 1 1, OSM, GPNMB y SCF o cualquiera de sus combinaciones.

En una realización preferida, el primer kit de la presente invención comprende los anticuerpos que se seleccionan de la lista que consiste en anticuerpos: anti-FGF-10, anti- CXCL1 1 , anti-OSM, anti- GPNM y anti-SCF, o cualquiera de sus combinaciones. Preferiblemente, el kit de la invención comprende simultáneamente al menos un anticuerpo de cada tipo: anti-FGF-10, anti- CXCL1 1 , anti-OSM, anti- GPNM y anti- SCF.

En otra realización preferida, el primer kit de la invención comprende anticuerpos secundarios o controles positivos y/o negativos. Este kit además puede incluir, sin ningún tipo de limitación, tampones, soluciones de extracción de proteínas, agentes para prevenir la contaminación, inhibidores de la degradación de las proteínas, etc.

Por otro lado este kit puede incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización. Preferiblemente, este kit comprende además las instrucciones para llevar a cabo los métodos de la invención.

Otro aspecto de la invención se refiere a un soporte sólido, o chip de proteínas, que comprende al menos uno de los anticuerpos anti-FGF- 10/, anti- CXCL1 1 , anti-OSM, anti- GPNM y anti-SCF, o cualquiera de sus combinaciones, para llevar a cabo el cualquiera de los métodos de la invención. Otro aspecto de la invención se refiere a un soporte sólido, o chip de DNA, que comprende oligonucleótidos o microarreglos de canal único diseñados a partir de una secuencia conocida o un ARNm de al menos uno de los genes FGF-10, CXCL 1 1, OSM, GPNM y SCF. Preferiblemente, comprende los oligonucleotidos capaces de detectar el ARNm de todos los genes FGF- 10, CXCL 11, OSM, GPNM y SCF.

Así, por ejemplo, las secuencias de oligonucleotidos son construidas en la superficie del chip mediante el elongamiento secuencial de una cadena en crecimiento con un sólo nucleótido utilizando fotolitografía. Así, los oligonucleotidos son anclados por el extremo 3' mediante un método de activación selectiva de nucleotidos, protegidos por un reactivo fotolábil, mediante la incidencia selectiva de luz a través de una fotomáscara. La fotomáscara puede ser física o virtual.

Así, las sondas oligonucleotidos pueden ser de entre 10 y 100 nucleotidos, más preferiblemente, de entre 20 y 70 nucleotidos, y aún más preferiblemente, de entre 24 y 30 nucleotidos. Para la cuantificacion de la expresión génica, preferiblemente se emplean aproximadamente unos 40 oligonucleotidos por gen.

La síntesis in situ sobre un soporte sólido (por ejemplo, vidrio), podría hacerse mediante tecnología chorro de tinta (ink-jet), lo que requiere sondas más largas. Los soportes podrían ser, pero sin limitarse, filtros o membranas de NC o nylon (cargadas), silicio, o portaobjetos de vidrio para microscopios cubiertos con aminosilanos, polilisina, aldehidos o epoxy. La sonda es cada una de las muestras del chip. La diana es la muestra a analizar: ARN mensajero, ARN total, un fragmento de PCR, etc.

Biomarcadores de respuesta al tratamiento Por otro lado, los autores de la presente invención han analizado 507 proteínas de la familia de las citoquinas en el suero de individuos que padecen PDAC y que ha sido tratados con la combinación Gemcitabina + Erlotinib. Han encontrado una serie de marcadores que les permite el pronóstico de los individuos con PDAC. Así la presente invención proporciona un método de obtención de datos útiles que pronostiquen la respuesta al tratamiento de Gemcitabina + Erlotinib de individuos con PDAC, incluso antes de ser sometidos a dicho tratamiento.

Por tanto, otro aspecto de la invención se refiere al uso de los genes CD80, EG-VEGF, IL-29, NRG1-beta 1 y PD-ECGF, para predecir o pronosticar la respuesta de un individuo al tratamiento con un análogo de nucleósido y un inhibidor del receptor del factor de crecimiento epidérmico, donde el individuo padece cáncer de páncreas. En una realización preferida, el análogo de nucleosido es la Gemcitabina. En otra realización preferida, el inhibidor del receptor del factor de crecimiento epidérmico es el Erlotinib.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles, de ahora en adelante tercer método de la invención, para predecir o pronosticar la respuesta al tratamiento del cáncer de páncreas, que comprende: a) Obtener una muestra aislada de suero del individuo. b) cuantificar el producto de expresión de los genes que se seleccionan de la lista que consisten en: CD80, EG-VEGF, IL-29, NRG 1-beta 1 y PD-ECGF.

En otra realización preferida, este método además comprende: c) hallar un valor de índice pronóstico (IP) con los valores de las citoquinas del paso b):

IPPDAC = 4-351 x B7-1/CD80 + 0.003 x EG-VEGF / PK1 +0.081 x IL-29 + 0.020 x NGRl-betal/HRGl-betal + 0.264 x PD-ECGF

Donde, los individuos que presentan un IP>17 presentan un mal pronóstico de la enfermedad, dado que la supervivencia es menor a cinco meses.

En otra realización preferida, los individuos con un IP<17 presentan un mejor pronóstico de la enfermedad, dado que la supervivencia es mayor de cinco meses. En una realización preferida de este método, en el tratamiento el análogo de nucleosido es la Gemcitabina. En otra realización preferida, en el tratamiento el inhibidor del receptor del factor de crecimiento epidérmico es el Erlotinib.

En otra realización preferida, el cáncer es el adenocarcinoma ductal de páncreas (PDAC). En un otra realización preferida de este aspecto de la invención, la muestra biológica (a) es una muestra de sangre. Los pasos (b) y/o (c) descritos pueden ser total o parcialmente automatizados, por ejemplo, por medio de un equipo robótico sensor para la detección de la cantidad en el paso (b) o la comparación computarizada en el paso (c).

Preferiblemente, la muestra biológica aislada de un individuo del paso (a) es una muestra de sangre (suero).

La comparación descrita en el apartado (c) del método de la presente invención puede ser realizada manualmente o asistida por ordenador.

Las cantidades de referencia adecuadas pueden ser determinadas por el método de la presente invención a partir de una muestra de referencia que puede ser analizada, por ejemplo, simultánea o consecutivamente, junto con la muestra biológica problema.

A continuación se describen las características de las citoquinas que son objeto del estudio:

CD80 (también conocida como B7-1 ): el sistema B7 es uno de los más importantes mecanismos de señalización secundaria, y es esencial mantener el delicado balance entre ¡a potencia inmune y la supresión de la autoinmunidad. B7-1 (CD80) y B7-2 (CD86) son ligandos expresados en células presentadoras de antígeno, y ellas son responsables de la señalización co-estimuladora por que regulan el crecimiento, maduración y tolerancia de la célula T (Seliger et ai, 2012. Cáncer immunoi, immunoíher. 61 , 1327-1341 ). Tras la unión a sus receptores se activan las células T y se promueve la supervivencia (Chen et al., 1994. J. Exp. Med. 79, 523-532). Por otro lado, también pueden entregar señales co-inhibidoras en sus receptores inhibitorios y bloquear la respuesta de la célula T. Una co-estimuiación inadecuada podría contribuir al crecimiento progresivo de los tumores. La combinación de B7-1 y de B7-H1 ya ha sido propuesta como un factor pronóstico para PDAC. Aunque el papel de B7-1 parece ser anti-tumora!, existe una nueva visión global donde se cree que la expresión aberrante o desequilibrada de los miembros de la familia B7, podría contribuir al escape del control inmune (Wang et ai, 2012. PLoS One 7, e45491 ; Wang et al., 2010. World J. Surg. 34, 1059-1065).

En el contexto de la presente invención, CD80 se define también por una secuencia de nucleotidos o poiinucieótidos, que constituye la secuencia codificante de la proteina recogida en la SEQ ID NO: 24, y que comprendería diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 24, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia poiinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de ai menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 24, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína CD80. Entre dichas moléculas de ácido nucleico se encuentra la recogida en la secuencia SEQ ID NO: 15.

EG-VEGF {también conocida como PK1 ): esta molécula fue descrita en principio como un ejemplo de un tipo de mitógeno específico que actúa para regular la proliferación y diferenciación del endotelio vascular de manera tejido-específica. Aunque esta profeína no muestra ninguna homología estructural a la familia VEGF, tiene en común distintas funciones reguladoras relacionadas con la proliferación y la migración (LeCouter et al., 2001 . Naíure 412, 877-884). También se ha descrito que EG-VEGF está relacionada con el cáncer de ovario (Balu et ai, 2012. Rom. J. Morphoí, Embryol. 53, 479-483), colorrectal (Nagano et al., 2007 J. Surg. Oncol. 96, 605-610), próstata (Pasquaii et al., 2006. Endocrinology 147 ^', 4245-4251 ), hepatoceluiar (Li eí /., 2006. J. Exp. Clin. Cáncer fíes. 25, 403-409), pancreático (Jiang eí /., 2009. Pancreatology 9, 165-172) y neuroblastoma (Ngan et ai, 2007. Clin. Cáncer Res. 13, 868-875). Así como un factor para la angiogénesis de la placenta (Broui!iet, S., 2012. Trends Endocrino!. Metab. 23, 501 -508).

En el contexto de la presente invención, EG-VEGF se define también por una secuencia de nucleotidos o poiinucleótidos, que constituye la secuencia codificante de la proteína recogida en la SEQ ID NO: 25, y que comprendería diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 25, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia poiinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de ai menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 25, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína EG-VEGF. Entre dichas moléculas de ácido nucleico se encuentra la recogida en la secuencia SEQ ID NO: 16.

IL-29: también se nombra como IFN--A1 y pertenece al tipo III de la familia IFN. Se ha descrito que induce actividades biológicas similares a las de tipo I de la misma familia. Aunque ambas son capaces de inducir la respuesta anti-proliferativa en muchos tipos de células, IFN-λ i parece estar más limitada. La señalización que produce !FN-λ I desencadena la activación de las rutas STAT1 , STAT2, STAT3 y STAT5, que son las 3 principales cascadas de proteínas quinasa activadas por mitógeno (MAPK) y la fosforilación de la proteína kinasa B (Akt) a través de la ruta fosfatidi!inositol-3-kinasa (P13K; Kotenko et ai, 201 1 . Curr. Opin. immuno!. 23, 583-590; Maher et ai, 2008. Cáncer BioL Ther. 7, 1 109- 1 1 15; Donnelly et ai., 2010. J. Inferieron Cytokine Res. 30, 555-564). Sin embargo, la habilidad de !FN-λ i de desencadenar estas rutas alternativas, podrían ser específicas para las células alteradas o células cancerígenas. La conclusión deriva de otros estudios que sugieren que la inducción al crecimiento de células humanas de mieloma múltiple ocurre por la activación de MAPK (Novak et al., 2008. Leukemia 22, 2240-2246). El papel concreto de IL-29 en la respuesta del hospedador y en la vigilancia inmune no ha sido aún definido en el contexto de cáncer en general y en el contexto de PDAC en particular.

En el contexto de la presente invención, IL-29 se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótidos, que constituye la secuencia codificante de la proteína recogida en la SEQ ID NO: 26, y que comprendería diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 26, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia poiinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de ai menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 26, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína IL- 29. Entre dichas moléculas de ácido nucleico se encuentra la recogida en la secuencia SEQ ID NO: 17.

NRG1 -beta1 : ia neuregulina-1 o la hereguiína- 1 es un ligando de una proteína extraceiular destinado a unirse a los miembros de ia familia de receptores ErbB, ErbB3 y ErbB4. Tras la interacción con sus receptores son estimulados varios de eventos biológicos, entre los que incluimos la inducción y progresión de algunos cánceres epiteliales. Las proteínas NRG1/HRG1 juegan un papel esencial en el sistema nervioso, el corazón y las mamas, y están implicados en el desarrollo de algunas enfermedades, incluyendo la esquizofrenia y el cáncer de mama (Falls et al., 2003. Exp. Cell. Res. 284, 14-30; Hayes et al., 2008. J. Mammary Gland. Biol. Neopíasia 13, 205-214). También se ha descrito la regulación del factor angiogénico VEGF por NRG1 /HRG1 (Yen et al., 2000. Oncogene 19, 3460-3469). Probablemente sus efectos proiiferativos se logran a través de ia acción combinada con múltiples vías, incluyendo las vías PI3K, MAPK y p38MAPK (Stove et al., 2004. Clin. Exp. Metástasis 21 , 665- 684) que han sido específicamente descritas en células PDAC. Los pacientes de PDAC con peor tasa de supervivencia presentaron una alta expresión del ARNrn de HRG-β. ErbB3 tiene un papel esencial en la tumorogénesis pancreática ya que promueve la proliferación de células cancerígenas tanto in vivo como in vitro. Recientemente se ha comprobado cómo ios fibroblastos asociados al cáncer desarrollan el ligando NRG1/HRG1 , activando a células PDAC por señalización mediada por ErbB3/AKT y aumentando ia tumorogénesis. Esto podría estar relacionado con el efecto insuficiente de Erlotinib (inhibidor EGFR) cuando es combinado con Gemcitabina en el tratamiento de pacientes con PDAC (Liles eí ai, 201 1 . Br. J. Cáncer 105, 523-533).

En el contexto de ia presente invención, NRG1 /HRG1 se define también por una secuencia de nucleotidos o poiinucleótidos, que constituye ia secuencia codificante de la proteína recogida en la SEQ ID NO: 27, y que comprendería diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 27, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia poiinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de ai menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 27, en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína NRG1 /HRG1 . Entre dichas moléculas de ácido nucleico se encuentra la recogida en la secuencia SEQ ID NO: 18.

PD-ECGF: también conocida como timidina fosforiíasa. Su actividad y expresión en carcinomas de esófago, estómago, pulmón, páncreas y coiorrectai es significativamente mayor que en tejidos adyacentes no-neoplásicos, y puede tener un papel importante en la proliferación de estos tumores sólidos. PD-ECGF se expresa no solo en células turnorales, sino también en células del estrorna asociadas a tumor. En ios análisis de regresión de carcinoma de vejiga, coiorrectai, gástrico, renal y pancreático se ha marcado PD-ECGF como un factor pronóstico para malos resultados.

En el contexto de la presente invención, PD-ECGF se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótidos, que constituye la secuencia codificante de la proteína recogida en la SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 32, y que comprendería diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 32 b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia poiinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de ai menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 32, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína PD-ECGF. Entre dichas moléculas de ácido nucleico se encuentra la recogida en la secuencia SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23.

En otra realización preferida, la detección de la cantidad de expresión de cualquiera de los genes CD80, EG-VEGF, IL-29, NRG1-beta1 y PD-ECGF se realiza mediante un inmunoensayo.

Otro aspecto de la invención se refiere a un anticuerpo para tratar un individuo que padece cáncer de páncreas, identificable por un método de la invención, donde el anticuerpo se selecciona de entre anti-CD80, anti-EG-VEGF, anti- IL-29, anti-NRG1 - betal y anti-PD-ECGF, o cualquiera de sus combinaciones. Preferiblemente se emplea una combinación de todos ios anticuerpos anteriores.

Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un agente modulador de al menos uno de los genes que se seleccionan de entre CD80, EG-VEGF, IL-29, NRG1 -beta l y PD-ECGF, para tratar a un individuo que padece cáncer de páncreas (o alternativamente al uso de una composición farmacéutica que comprende un agente modulador de al menos uno de los genes que se seleccionan de entre CD80, EG-VEGF, IL-29, NRG1 -beta l y PD-ECGF en la elaboración de un medicamento para el tratamiento del cáncer de páncreas), identificable por un método de la invención. Preferiblemente, la composición comprende uno o más agentes moduladores de todos los genes CD80, EG-VEGF, IL- 29, NRG1 -betal y PD-ECGF simultáneamente. Más preferiblemente, el cáncer de páncreas es el adenocarcinoma ductal de páncreas. Aún más preferiblemente, la composición farmacéutica además comprende otro principio activo. En otra realización más preferida, el agente modulador es un anticuerpo que se selecciona de entre anti-CD80, anti-EG-VEGF, anti- IL-29, anti-NRG1 -beta1 y anti-PD-ECGF, o cualquiera de sus combinaciones.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un kit o dispositivo, de ahora en adelante segundo kit de la invención, que comprende los elementos necesarios para cuantificar la cantidad de producto de expresión de los genes que se seleccionan de entre CD80, EG-VEGF, IL-29, NRG1-beta 1 y PD-ECGF o cualquiera de sus combinaciones.

Aún más preferiblemente, el segundo kit de la presente invención comprende los anticuerpos que se seleccionan de la lista que consiste en anticuerpos: anti-CD80, anti-EG-VEGF, anti-IL-29, anti-NRG1 -beta1 y anti-PD-ECGF, o cualquiera de sus combinaciones. Preferiblemente, el segundo kit de la invención comprende simultáneamente al menos un anticuerpo de cada tipo: anti-CD80, aníi-EG-VEGF, anís- IL29, anti-NRG1 -beta1 y anti-PD-ECGF.

En otra realización preferida, el segundo kit de la invención comprende anticuerpos secundarios o controles positivos y/o negativos. Este kit además puede incluir, sin ningún tipo de limitación, tampones, soluciones de extracción de proteínas, agentes para prevenir la contaminación, inhibidores de la degradación de las proteínas, etc.

En una realización preferida, el segundo kit de la invención comprende la asignación de un valor de índice pronóstico y clasificación de individuos, de manera que: si los individuos presentan un IP>17 tienen un mal pronóstico de la enfermedad, mientras que si los individuos presentan un IP<17 tienen un mejor pronóstico de la enfermedad. Preferiblemente, los individuos que presentan un IP≤17 muestran una supervivencia superior a 5 meses. En otra realización preferida, los individuos que presentan un IP>17 muestran una supervivencia inferior a 5 meses.

Otro aspecto de la invención se refiere a un soporte sólido, o chip de proteínas, que comprende al menos uno de los anticuerpos anti-CD80, anti-EG-VEGF, anti-IL-29, anti-NRG1 -beta1 y anti-PD-ECGF, o cualquiera de sus combinaciones o cualquiera de sus combinaciones, para llevar a cabo el cualquiera de los métodos de la invención. Otro aspecto de la invención se refiere a un soporte sólido, o chip de DNA, que comprende oligonucleótidos o microarreglos de canal único diseñados a partir de una secuencia conocida o un ARNm de al menos uno de los genes CD80, EG-VEGF, IL- 29, NRG1-beta 1 y PD-ECGF. Preferiblemente, comprende los oligonucleótidos capaces de detectar el ARNm de todos los genes CD80, EG-VEGF, IL-29, NRG1- beta 1 y PD-ECGF.

Así, por ejemplo, las secuencias de oligonucleótidos son construidas en la superficie del chip mediante el elongamiento secuencial de una cadena en crecimiento con un sólo nucleótido utilizando fotolitografía. Así, los oligonucleótidos son anclados por el extremo 3' mediante un método de activación selectiva de nucleotidos, protegidos por un reactivo fotolábil, mediante la incidencia selectiva de luz a través de una fotomáscara. La fotomáscara puede ser física o virtual.

Así, las sondas oligonucleótidos pueden ser de entre 10 y 100 nucleotidos, más preferiblemente, de entre 20 y 70 nucleotidos, y aún más preferiblemente, de entre 24 y 30 nucleotidos. Para la cuantificacion de la expresión génica, preferiblemente se emplean aproximadamente unos 40 oligonucleótidos por gen.

La síntesis in situ sobre un soporte sólido (por ejemplo, vidrio), podría hacerse mediante tecnología chorro de tinta (ink-jet), lo que requiere sondas más largas. Los soportes podrían ser, pero sin limitarse, filtros o membranas de NC o nylon (cargadas), silicio, o portas de vidrio para microscopios cubiertos con aminosilanos, polilisina, aldehidos o epoxy. La sonda es cada una de las muestras del chip. El target es la muestra a analizar: ARN mensajero, ARN total, un fragmento de PCR, etc.

Implementación de los métodos de la invención

Otro aspecto de la invención se refiere a un medio de almacenamiento legible por un ordenador que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención.

Otro aspecto de la invención se refiere a una señal transmisible que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. (A) muestra la curva de supervivencia Kaplan-Meier específica de enfermedad para toda la población del estudio. La curva de supervivencia Kaplan- Meier es definida como la probabilidad de sobrevivir en un periodo de tiempo definido. Cada periodo de tiempo es el intervalo entre dos eventos terminales no simultáneos. No hubo datos de supervivencia censurados ya que no se perdió información sobre el tiempo de supervivencia de ningún individuo. (B-H) estas gráficas representan las curvas de supervivencia Kaplan-Meier de cada uno de los biomarcadores individuales, etiquetados como marcadores pronóstico significativos: (B), respuesta clínica; (C) edad; (D), BDNF; (E), HVEM/TNFRSF14; (F), IL-24; (G), IL-29; (H), receptor de leptina; (I) LRP-6 y (J), ROB04. Para la dicotomización se usaron los valores de corte más significativos en términos de supervivencia. Los valores p para el test log-rank se muestran para cada variable.

Figura 2. Modelo de regresión de Cox. Curvas de pronóstico observadas (denotadas por puntos con forma de cuadrado, triángulo y diamante) y previstas (denotadas por línea sólida), para pacientes con PDAC de acuerdo con (A): modelo univariante o (B): modelo multivariante de riesgos proporcionales. Con la Regresión de Cox se pretende detectar alguna relación entre el riesgo de que se produzca un determinado suceso estudiado (muerte) y una o varias variables independientes. (B) Se representan las tres curvas correspondientes a los modelos generados con 3,4 y 5 citoquinas. Como se esperaba, las curvas de pronóstico se ajustaron a una distribución logarítmica. El coeficiente de determinación R² es ilustrativo del modelo de bondad de ajuste. Como coeficiente, estos modelos dan predicciones útiles, siendo el modelo multivariante de las 5 citoquinas el más exacto, alcanzando el 92,6%. Por tanto, nuestro modelo de IP se aproxima al 93% de la variación de la supervivencia.

Figura 3. Curvas Kaplan-Meier de supervivencia IP. (A) muestra la gráfica de supervivencia para IP derivada del modelo univariante, abarcando 2 citoquinas. Se eligió 1 ,5 como valor de corte para dividir la cohorte de pacientes de tiempo de supervivencia corto (<5 meses) y de tiempo de supervivencia largo (>5 meses). (B) muestra la gráfica de supervivencia IP derivada del modelo multivariante, abarcando a las 5 citoquinas. Se eligió 17 como valor de corte para dividir la cohorte de pacientes de tiempo de supervivencia corto (<5 meses) o de tiempo de supervivencia largo (>5 meses). Los valores p para los test log-rank se muestran para ambas comparaciones. Figura 4. Análisis de las curvas ROC para cada una de ¡as cinco citoquinas séricas, encontró que estaban diferencialmente expresadas entre los pacientes con PADC. Las curvas ROC resumen ¡a precisión de las citoquinas en la predicción de pacientes con PDAC. El área bajo la curva (ABC) es la sensibilidad media del biomarcador. Un biomarcador con valores no predictivos tendría un ABC de 0,5, mientras que un biomarcador con una habilidad perfecta para predecir la enfermedad, tendría un ABC de 1 . A muestra los valores de ABC, valor de corte, sensibilidad y especificidad para FGF-10; B muestra ios valores de ABC, valor de corte, sensibilidad y especificidad para I-CXCL1 1 ; C muestra los valores de ABC, valor de corte, sensibilidad y especificidad para OSM; D muestra los valores de ABC, valor de corte, sensibilidad y especificidad para la GPNMB; E muestra los valores de ABC, valor de corte, sensibilidad y especificidad para SCF; F muestra ios valores de ABC, valor de corte, sensibilidad y especificidad para las cinco citoquinas combinadas. Los valores de corte (valores de señal de intensidad) seleccionados fueron aquellos tanto con la mayor sensibilidad como especificidad.

EJEMPLOS DE LA INVENCIÓN

Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. Todo el análisis de datos y estadístico se realizó usando el software IBM SPSS statistic 20 o con lenguaje estadístico R. La calidad del análisis se incrementó usando el paquete "ArrayQualityMetrics" en R para eliminar cualquier valor atípico posible.

Biomarcadores de diagnóstico temprano

MATERIALES Y MÉTODOS En el estudio participaron 39 pacientes. Se establecieron 3 grupos diferentes:

1 ) 12 pacientes sanos, como grupo control.

2) 14 pacientes con PDAC que no habían recibido ningún tratamiento (denominado como pre-tratados).

3) 13 pacientes con PDAC bajo 2 semanas de tratamiento con la terapia combinada Gemcitabina + Erlotinib (denominados como post-tratados) Todos los pacientes fueron diagnosticados con PDAC en el Hospital Virgen de las Nieves (Granada, España) entre 2008 y 201 1 . Se registró toda la información de los pacientes, incluyendo género, edad, grado de la enfermedad y síntomas. La edad media de los pacientes fue de 66 años (rango 41 -79 años) con un ratio entre hombres y mujeres de 50:50. La clasificación clínica de los pacientes con adenocarcinoma pancreático fue como sigue: estado III (28%) y estado IV (72%; Tabla 1 ).

Tabla 1. Características clinicopatológicas de la población de estudio

(n=14)

Edad de diagnostico, años (media ± SD) 66 ± 10,5

50%

Género

F: §0%

Etapa de la enfermedad m (28%)

Tipo de quimioterapia

EñotMb

PR (14,29%)

Respuesta clínica SD (21 ,43%)

PD (64,29%)

Tiempo de supervivencia, meses (media ± SD) 12,6 t 12,6

Nivel de CEA [[Jig/I] (media ± SD) 2219 ± 5017

Saludable

0-37

Nivel de CA 19-9 [U/1] (media ± SD) 899 ± 3185

Saludable:

0-3

PR: respuesta parcial; SD: enfermedad estable; PD: enfermedad progresiva; SD: desviación estándar.

Tabla 1. Características clínico-patológicas de la población de estudio {n=14). información recopilada de todos los pacientes PDAC, participantes en el estudio.

Procedencia de las muestras.

Las muestras de sangre fueron recogidas después de obtener la aprobación de comités éticos relevantes y consentimientos firmados por los pacientes. Se recogieron un total de 39 muestras de suero desde 2009 hasta 201 1 , usando los procedimientos estándares del Servicio de Oncología del Hospital Virgen de las Nieves (Granada, España). Las muestras de sangre fueron obtenidas de pacientes diagnosticados con PDAC al inicio del estudio y 2 semanas después del inicio de la terapia (Gemcitabina + Erlotinib) y también de individuos sanos. El suero fue obtenido después de la centrifugación de la sangre a 1500 rpm durante 10 minutos a 4^eC. Las muestras fueron alicuotadas y almacenadas a -80^eC.

Ensayo de anticuerpos de citoquinas

Las proteínas solubles en suero de pacientes con PADC, fueron medidas usando un array de anticuerpos humanos etiquetados con biotina {Human Antibody L-series 507 Array (RayBiotech, Norcross, GA, USA), de acuerdo a las protocolos recomendados. Brevemente, las muestras se biotinilizaron. Los anticuerpos se inmovilizaron en sitios puntuales en portaobjetos de vidrio. La incubación de los arrays con las muestras biológicas consistía en la unión de las citoquinas a sus correspondientes anticuerpos. Las señales se visualizan usando conjugados estreptavidina-HRP y colorimetría. Las intensidades finales se midieron como las intensidades originales menos el fondo. Los datos fueron normalizados al control positivo para cada resultado individual

Análisis estadístico

Como las citoquinas en todos los grupos no presentaron una distribución normal, se utilizó el test de Mann-Whitney para destacar las diferencias entre grupos (p<0.05). Además, se calculó la tasa de cambio {fold change, FC). Los valores de tasa de cambio de citoquinas se comprobaron para indicar sus relativos niveles de expresión.

Ni FC < 1 ,5 ni FC 1 ,5 en ¡a señal de intensidad entre los grupos, fueron considerados relevantes. Se calculó el área bajo la curva (ABC) de la característica operativa del receptor (ROC) de cada marcador para evaluar su significancia diagnóstica representando la tasa de verdaderos positivos (sensibilidad) frente a la tasa de falsos positivos {1 -especificidad). Además, se generó un índice de combinación de marcadores y se trazó la curva ROC también para esta combinación. Los valores de corte se seleccionaron para mejorar tanto la sensibilidad como la especificidad. Adicionalmente, se representaron diagramas de caja que muestran la modulación de la expresión de aquellas citoquinas comunes modificadas significativamente entre post-tratados frente a pre-tratados y entre pre-tratados y control. RESULTADOS

Anáfisis de ios biomarcadores séricos de diagnóstico en pacientes con PDAC y sanos (control),

Con el fin de encontrar marcadores que ayudaran a la detección temprana del PDAC, se realizó un extenso cribado con un array de anticuerpos para 507 citoquinas humanas para identificar aquellas citoquinas expresadas diferencialmente entre los individuos sanos y los que padecían PDAC. Las características clínico patológicas de los pacientes con PDAC están resumidas en la Tabla 1 . Como se muestra en la tabla 2, existen 5 citoquinas sobreexpresadas en pacientes con PDAC no tratados al compararlos con ios voluntarios sanos (p<0,05). Las citoquinas FGF-10, CXCL1 1 , OSM, GPNMB y SCF podrían representar un perfil sérico alterado en pacientes con PDAC.

Tabla 2, Las 5 citoquinas significativamente sobreexpresadas. Las diferencias fueron obtenidas por el test ann-Whitney (p<0,05). Sus niveles de expresión relativa se dan por su correspondiente FC. Cada FC≥1 ,5 o ≤1/1 ,5 en la intensidad de señal entre grupos se consideró relevante.

Aná isis de sensibilidad y especificidad de ios biomarcadores séricos para ei diagnóstico temprano de PDAC. Para determinar si estas 5 citoquinas podrían ser usadas como marcadores para la detección temprana del PDAC, se evaluó el valor diagnóstico (la habilidad de diferenciar entre salud y enfermedad) de cada biomarcador, por si sólo y en combinación. La sensibilidad y especificidad para cada biomarcador se analizaron usando el método del área bajo la curva de las características operativas del receptor (ROC). Las curvas están basadas en los niveles de citoquinas en individuos sanos e individuos antes y después del tratamiento. Se probó cada biomarcador candidato independientemente fue investigado (Figura 4A-E). Todos ios posibies nuevos marcadores mostraron valores AUC entre 0,74 y 0,78 para diferenciar pacientes sanos y pacientes con PDAC. Las áreas bajo ia curva ROC para las citoquinas FGF-10, CXCL1 1 , OSM, GPNMB y SCF fueron 0,744, 0,737, 0,744, 0,776 y 0,772 respectivamente. La osteoactivina destacó por desarrollar la mayor sensibilidad para la predicción del PDAC. Seguidamente, para determinar si estas 5 citoquinas en su conjunto podrían ser usadas como grupo de biomarcadores para ia detección del PDAC, se analizó una combinación de estos 5 marcadores para obtener una curva ROC integrada. El grupo combinado de estas citoquinas mejoró significativamente la habilidad de todos ¡os biomarcadores por separado en aislamiento para distinguir pacientes con cáncer pancreático de ios controles sanos, el valor de ia AUC mejoró hasta 0,841 (Figura 4F).

Para determinar ia sensibilidad y especificidad de cada biornarcador, se establecieron aqueilos puntos de corte que proporcionan los mejores puntos de renuncia entre la mayor sensibilidad y la mayor especificidad (Figura 4). Todos mostraron una especificidad del 75% y una sensibilidad con un rango entre 69-77%. El grupo de ¡as 5 citoquinas mostró el mejor rendimiento para detectar PDAC en muestras séricas, reflejando también una sensibilidad del 77% pero una especificidad del 83%, más alta que por separado.

Biomarcadores de respuesta al tratamiento

La totalidad de los pacientes del estudio fueron diagnosticados con PDAC en el Hospital Virgen de las Nieves (Granada, España) entre 2008 y 201 1 . Se registró toda la información sobre los pacientes: género, edad, grado de la enfermedad y síntomas. La edad media de los pacientes fue de 66 años (rango 41 -79 años) y el ratio masculino-femenino (50:50). La clasificación clínica de los pacientes con adenocarcinoma pancreático era: estado III (28%) y estado IV (72%; Tabla 3). El tiempo global de supervivencia de los pacientes con PDAC fue de 12.6 meses y estaban tratados bajo la terapia combinada de Gemcitabina + Erlotinib. Las muestras de sangre se recogieron una vez obtenida la aprobación de los comités éticos relevantes y el consentimiento por parte de los donantes. Las muestras séricas fueron recogidas entre 2009 y 201 1 , usando procedimientos estándar en el servicio de oncología del Hospital Virgen de las Nieves. Además, las muestras de sangre se obtuvieron de pacientes diagnosticados con PDAC en condiciones iniciales, en pacientes tras 2 semanas del inicio de la terapia (Gemcitabina + Erlotinib) y también de individuos sanos. Se obtuvo el suero después de centrifugación de la sangre a 1500 rpm durante 10 minutos a 4^eC. Las muestras se alicuotaron y se almacenaron a una temperatura de -80^eC.

Características clinicopatológicas de la población de estudio (n= 14)

Edad de diagnostico, años (media ± SD) 66 ± 10.5

M: 50%

Género

F: 50%

III (28%)

Etapa de la enfermedad

IV (72%)

Gemcitabine

Tipo de quimioterapia +

Erlotinib

PR (14.29%)

Respuesta clínica SD (21 .43%)

PD (64.29%)

Tiempo de supervivencia, meses (media ± SD) 12.6 ± 12.6

Nivel de CEA [μς/Ι] (media ± SD) 2219 ± 5017

Saludable:

0-37

Nivel de CA 19-9 [U/1] (media ± SD) 899 1 3185

Saludable:

0-5

PR: respuesta parcial; SD: enfermedad estable; PD: enfermedad progresiva; SD:

desviación estándar. labia 3. Características clínico-patológicas de la población de estudio (n=14). Información recopilada de todos ios pacientes PDAC, participantes en el estudio.

Ensayo de anticuerpos de citoquinas

Se usó un array de anticuerpos humanos de biotina (Human Antibody L-series 507 array (RayBiotech, Norcross, GA, USA)) y de acuerdo a los protocolos recomendados para medir las proteínas solubles en los sueros de pacientes con PDAC. Se biotinizaron todas las muestras. Los anticuerpos se inmovilizaron en lugares específicos del portaobjetos de vidrio. Se incubaron de las membranas del array con las muestras biológicas para dar lugar a la unión de las citoquinas con sus correspondientes anticuerpos. Se visualizaron las señales usando estreptavidina-HRP conjugada y colorimetría. Las intensidades de puntos finales se calcularon como la intensidad original, restando el fondo. Los datos se normalizaron a los controles positivos en la dispositiva individual.

Análisis estadístico

La media de supervivencia después de la administración de Gemcitabina y Erlotinib se calculó en meses desde el comienzo del tratamiento hasta la muerte. Para un análisis de supervivencia global (OS), se utilizó la curva de Kaplan-Meier como un método para estimar la probabilidad de supervivencia en un tiempo dado, usando la proporción de pacientes que había sobrevivido a ese tiempo. El test long fíank se utilizó para determinar las diferencias de supervivencia entre grupos. Las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier para marcadores individuales se obtuvieron después de la dicotomización. Los valores de corte para cada marcador fueron aquellos que desarrollaron la supervivencia más significativa entre los 2 grupos. Para determinar las variables más significantes que contribuían al OS, se realizaron análisis univariantes y multivariantes con el modelo de regresión de Cox de riesgos proporcionales, para determinar asociaciones entre citoquinas del suero y la mortalidad relacionadas con el cáncer. Primero se analizó la asociación entre ¡a mortandad y el nivel de citoquinas, considerando un factor cada vez. Después se aplicó el modelo multivariante de riesgo proporcional de Cox usando un algoritmo condicional paso a paso, basado en la tasa de probabilidad.

El ajuste del modelo global se consideró significativo de acuerdo a la prueba de chi- cuadrado. (p<0,05). Además, se mostró el índice de Wald para determinar el peso de cada variable en el en modelo global, tanto en univariante como en multivariante. Los niveles de 507 citoquinas se introdujeron en los modelos, como parámetros continuos, y ¡os resultados se expresaron como razón de riesgo o tasa de riesgo relativo.

Mediante el análisis de estas variables se obtuvo el índice pronóstico (IP), que considera los coeficientes de regresión derivados del modelo de Cox de todos los factores significativos. Las diferencias fueron consideradas significativas cuando p<0,05. El modelo de regresión de Cox para el estudio de la supervivencia de los pacientes PDAC, quedó definido por la siguiente ecuación:

Ecuación 1 : h(t)

Donde h (t) es la razón de riesgo en el momento t, h₀ (t) es la tasa de riesgo basal y el exponente, el cual no depende del tiempo, es conocido como índice pronóstico (IP). El índice pronóstico para un paciente específico /^' es definido como:

Ecuación 2 ^■■ PL =

Donde ¡¡ define el coeficiente previsto por el modelo de regresión de Cox para un paciente particular / y la citoquina j x¡_j determina el nivel de expresión medido para el paciente y la citoquina j y N representa el número de citoquinas incluidas en el modelo. RESULTADOS

Anáfisis de supervivencia de pacientes con PDAC

Las características clínicas de los pacientes PDAC están resumidas en la tabla 1 . Para el conjunto de la población de estudio, las tasas de OS fueron 46.15% a los 6 meses, 23.08% a los 12 meses y 7.69% a los 24 meses. La duración media del seguimiento para el grupo de estudio fue de 12 meses (rango 1 -40 meses) y durante ese tiempo el 100% de los pacientes con PDAC murieron debido a la enfermedad. Las probabilidades de supervivencia se calcularon fueron usando el método de Kapian- eier. La curva de supervivencia para toda la cohorte de pacientes se muestra en la figura 1 A. Anáfisis univariante entre citoquinas séricas y supervivencia

Primero se utilizó un enfoque univariante en el estudio para identificar factores de diagnóstico medibles que fueran relevantes e independientes y se pudieran asociar a un riesgo alto de muerte por PDAC. Se analizaron ios niveles séricos de citoquinas, y los parámetros clínico-patológicos como, la edad, género, estado y respuesta clínica. Los parámetros clínico-patológicos, edad y respuesta clínica (enfermedad progresiva o no progresiva) tuvieron poco peso en el pronóstico según el análisis univariante (p=0,030 y p=0,013, respectivamente). En cuanto a las citoquinas, el análisis univariante de los niveles de expresión de BDNF (p=0, 034, HR 1 ,005, IC 95% (1 ,000- 1,009)); HVEM/TNFRSF14 (p=0,G39, HR 0,924, IC 95% (0,858-0,996)); IL-24 (p=Q,023 HR 1.041, !C 95% (1,006-1,078)); ÍL-29 ( =0,021, HR 1,012, !C 95% (1,002-1,023)); Leptin R (p=0,018, HR 1,008, !C 95% (1,001-1,015)); LRP-6 (p==Q,022 HR 1.027, ¡C 95% (1,004-1,051)) y R0B04 (p=Q,045 HR 1,002, !C 95% (1,000-1,004)) mostraron una influencia significativa en el pronósfico. Los resultados del análisis univariante de cada citoquina, corno de ios factores pronóstico independientemente y sus beta- coeficientes, razón de riesgo (HR, representa el factor por el cual el riesgo cambia para cada unidad que aumenta de la expresión de citoquinas), IC 95% (límites superior e inferior del intervalo de confianza con un nivel significativo de 0.05) y valores p, se muestran en la tabla 4.

Tabla 4: Factores de pronóstico según el análisis univariante

Supervivencia global

Variable

β HR 95% Cl p-valor

BDNF 0,005 1,005 1,000 1,009 0,034

HVEM/ TNFRSF14 -0,079 0,924 0,858 0,996 0,038

IL-24 0,040 1,041 1,006 1,078 0,023

IL-29 0,012 1,012 1,002 1,023 0,021

Leptin R 0,008 1,008 1,001 1,015 0,018

LRP-6 0,027 1,027 1,004 1,051 0,022

ROB04 0,002 1,002 1,000 1,004 0,045

Edad 0,086 1,089 1,008 1,177 0,030

Respuesta clínica 2,064 8,706 1,057 71,692 0,013

Ajuste del modelo general (p= 0,0023)

Citoquinas

β HR 95% Cl p-valor

11-24 (1) 0,042 1 ,042 1,003 1,023 0,026

11-29 (2) 0,014 1 ,014 1,005 1,081 0,017 β: coeficiente según el modelo de regresión de Cox para un paciente concreto y citoquina; HR: Ratio al azar (representa el factor según los cambios de razón de riesgo para cada unidad de incremento de expresión de citoquinas); 95% Cl: límites superior e inferior del intervalo de confianza con un nivel de significación de 0,05.

labia 4, Factores de pronóstico según en el análisis univariante. Variables asociadas significativamente con la supervivencia de pacientes con PDAC en análisis univariante. Se muestran: Coeficientes-beta (β), razón de riesgo (HR), IC 95% y los valores p para las variables seleccionadas. Coeficientes-beta positivos para una variable explicativa representan un alto riesgo y por tanto el pronóstico es peor. Por el contrario, un coeficiente de regresión negativo implica un mejor pronóstico para pacientes con valores más alto de esta variable. La razón de riesgo es una medida descriptiva usada para comparar ios tiempos de supervivencia de los dos grupos diferentes de pacientes. La razón de riesgo indica el cambio en el riesgo de muerte si la variable aumenta en una unidad (una unidad de expresión para citoquinas, un año para la edad variable y progresión de la enfermedad en respuesta clínica). IC 95% es el intervalo de confianza para la razón de riesgo. Los valores p, en la parte superior de la tabla, reflejan la significancia de cada variable individual que explica la supervivencia. En la parte inferior de la tabla se muestra el modelo, paso a paso, utilizando sólo aquellas citoquinas significativas según el análisis univariante. Los valores p indicados, reflejan la significancia de las citoquinas en el modelo completo.

Con el fin de determinar las diferencias de supervivencia de estos marcadores individualmente en pacientes con PDAC, se generaron curvas de supervivencia de Kaplan-Meier usando los puntos de corte, proporcionando la discriminación más significativa en términos de supervivencia entre grupos. La figura 1 (B-J) representa los puntos de supervivencia de Kaplan-Meier de marcadores individuales, que muestran diferencias significativas en el pronóstico.

Análisis muitivariante entre citoquinas del suero y supervivencia

A pesar de que a menudo las variables estadísticamente significativas del análisis univariante son las incluidas en el análisis muitivariante, algunas variables que no son significativas en el análisis univariante podrían aparecer como significativas en el análisis muitivariante. Asi, además de las variables estadísticamente significativas relacionadas con el pronóstico en el análisis univariante, también se incluyeron aquellas sin impacto. La mejor combinación de las citoquinas seleccionadas según el análisis de riesgo proporcional muitivariante de Cox se muestra en la tabla 5.

Tabla 5: Factores de pronóstico según el análisis muitivariante

Ajuste del

Supervivencia global

Citoquinas modelo general β HR 95% Cl p-valor p-valor

IL-29 0,081 1 ,084 1 ,010 1 ,164 0,026 0,004212 B7-1/CD80 4,351 77,574 1 ,138 5289,453 0,043 0,002494 PD-ECGF 0,264 1 ,302 0,944 1 ,797 0,108 0,001350 EG-VEGF/PK1 0,003 1 ,003 1 ,000 1 ,005 0,049 0,000134 NRG1-beta1 /

0,020 1 ,020 0,994 1 ,047 0,129 0,000286 HRG1-beta1

β: coeficiente según el modelo de regresión de Cox para un paciente concreto y citoquina; HR: Ratio al azar (representa el factor por el cual los cambios de riesgo para cada unidad de incremento de expresión de citoquinas); 95% Cl: límites superior e inferior del intervalo de confianza con un nivel de significación de 0,05.

labia 5. Factores de pronóstico según el análisis mu!tivariante. Las citoquinas significativamente asociadas con ¡a supervivencia de pacientes con PDAC en el análisis muitivariante. Se muestran: coeficientes-beta (β), razón de riesgo (HR). IC 95% y los valores p para las citoquinas seleccionadas. La última columna de valores p, representa la significancia de las citoquinas en el modelo completo.

Ninguno de ¡os parámetros clínico-patológicos demostraron una tendencia significativa hacia la disminución de la supervivencia global (p>0,05) y no fueron considerados en el modelo global. Referente a las citoquinas y según el análisis muitivariante, los niveles de expresión de CD80 (p=0,043, HR 77,574, IC 95% (1 ,138-5289,4)); EG~ VEGF (p=0,049, HR 1 ,003, IC 95% (1 ,000-1 ,005)) e ÍL-29 (p=0,026, HR 1 ,084, ¡C 95% (1 ,010-1 ,164)), mostraron una influencia significativa en el pronóstico. La influencia significativa de IL-29 en la supervivencia se observó en el análisis univariante y se confirmó con el análisis muitivariante. Los coeficientes beta (β), razón de riesgo (HR), ¡C 95% y valores p para las citoquinas seleccionadas se muestran en la tabla 3. Aunque NRG1-beta1 ((p=0,129), HR 1 ,020, IC 95% 0,994-1 ,797)) no mostraron influencia significativa en el pronóstico como factor independiente.

Indices da pronóstico de citoquinas en pacientes con PDAC:

Una combinación adecuada de biomarcadores podría proporcionarnos ¡a información más exacta sobre el pronóstico, por tanto el conjunto más exacto de variables se buscó usando el protocolo de regresión condicional basado en la tasa de probabilidad.

Para ilustrar el efecto interrelacíonado en OS de los 7 marcadores destacados por el análisis univariante, se utilizó el análisis de riesgo proporcional de Cox para seleccionar variables relacionadas conjuntamente con la supervivencia. Como resultado de este análisis, resultó un modelo que contenía sólo !L-24 (p=0,026, HR 1 ,042, IC 95%, (1 ,003-1 ,023)) e IL-29 (p=0,017, HR 1 ,014, IC 95% (1 ,005-1 ,081 )). El ajuste del modelo global demostró ser significativo por el test estadístico del chi- cuadrado (ρ=0.0023). A fin de establecer un índice pronóstico para determinar la supervivencia global de ios pacientes con PDAC, estos coeficientes-beta de las citoquinas fueron introducidos en la siguiente ecuación y se generó el siguiente modelo de índice pronóstico:

^'univariate = 0.042 X IL-24 +0.014 X IL-29 El IP univariante representa el modelo mulíivaríantes derivado de la combinación de los marcadores significativos en el análisis univariante. Con respecto a todas las citoquinas obtenidas por análisis muitivariante, se construyó un segundo modelo de supervivencia estadísticamente significativo (p=0,0003), y se generó el siguiente modelo IP:

^muiüvariate = 4.351 x B7-1/CD80 + 0.003 x EG-VEGF / P 1 +0.081 x IL-29 + 0.020

x NGRl-betal/HRGl-betal + 0.264 x PD-ECGF El IP muitivariante representa el modelo muitivariante derivado de la mejor de todas las posibles combinaciones usando las 507 citoquinas del análisis muitivariante.

Se evaluó mediante análisis de regresión si ios IP podían generar a un modelo de supervivencia exacto para esta cohorte de pacientes. Se utilizó R² como prueba de bondad de ajuste. Se calcularon, clasificaron y relacionaron con OS los resultados de los IP unívariantes e IP muitivariante propuestos. Como se esperaba, ambos modelos de supervivencia mostraron una tendencia logarítmica cuando se representaron frente al tiempo. La figura 2 representa los resultados del IP observados y los ajusfes logarítmicos previstos para estos modelos. Según el modelo muitivariante, el modelo global con 5 citoquinas resultó ser estadísticamente significativo aunque también se evaluaron los análisis de regresión para los modelos que contenían 3 y 4 citoquinas. Los valores de R² obtenidos fueron 0,684, 0,727, 0,908 y 0,926 para el modelo de IP univariante y para los modelos de IP muitivariante con 3, 4 y 5 respectivamente. Todos los modelos arrojan resultados satisfactorios, pero el modelo muitivariante que abarca a CD80, EG-VEGF, IL-29, NRG1-beta1 y PD-ECGF, destacó sobre el resto. El índice de pronóstico para el modelo muitivariante con estas 5 citoquinas, osciló de 0 a 40 en nuestra cohorte. Los pacientes se categorizaron en 2 grupos, de acuerdo a sus índices pronóstico: pronóstico desfavorable (IP>17) y pronóstico favorable (IP<17). Las curvas de supervivencia se compararon después entre estos 2 grupos pronóstico (Figura 3 A). Los grupos propuestos que se muestran para diferenciar el tiempo global de supervivencia son: bajo (<5 meses) y alto (>5 meses). La supervivencia global en estos grupos fue estadísticamente muy significativa (p<0, 00056). El índice pronóstico para modelo univariante fue también representado y su rango fue de 0 a 5. De acuerdo a este ¡P, los pacientes fueron categorizados de nuevo en 2 grupos: pronóstico desfavorable (IP>1 ,5) y pronóstico favorable (1P<1 ,5). Además, las curvas de supervivencia se compararon entre estos 2 grupos pronóstico (Figura 3 B), y se obtuvo una correlación significativa con la supervivencia global, como baja supervivencia (< 5 meses) y alta supervivencia {> 5 meses). La supervivencia global en estos grupos, fue menos pero aún significativa (p < 0,004) comparada con el IP muitivariante. Cláusulas

En resumen, los aspectos la presente invención se describen en las siguientes cláusulas numeradas:

1 . - El uso simultáneo de los genes: CD80, EG-VEGF, IL-29, NRG1-beta 1 y PD-ECGF, para predecir o pronosticar la respuesta de un individuo al tratamiento que comprende un análogo de nucleosido y un inhibidor del receptor del factor de crecimiento epidérmico, donde el individuo padece cáncer de páncreas.

2. - El uso según la cláusula anterior, donde el individuo padece adenocarcinoma ductal de páncreas (PDAC).

3. - El uso, según cualquiera de las cláusulas anteriores, donde el tratamiento comprende el análogo de nucleosido Gemcitabina y el inhibidor del receptor del factor de crecimiento Erlotinib.

4. - Un método de obtención de datos útiles, para predecir o pronosticar la respuesta de un individuo al tratamiento que comprende un análogo de nucleosido y un inhibidor del receptor del factor de crecimiento epidérmico, donde el individuo padece cáncer de páncreas, que comprende: a) obtener una muestra biológica aislada del individuo, b) cuantificar la cantidad de producto de expresión de los genes: CD80, EG- VEGF, IL-29, NRG1-beta1 y PD-ECGF

5. - El método según la cláusula anterior, que además comprende: c) hallar un valor de índice pronóstico (IP) con los valores de las citoquinas del paso b) aplicando la fórmula: IPPDAC = 4.351 x B7-1/CD80 + 0.003 x EG-VEGF / P 1 +0.081 x IL-29 + 0.020 x

NGRl-betal/HRGl-betal + 0.264 x PD-ECGFC)

6. Un método para predecir o pronosticar la respuesta de un individuo al tratamiento que comprende un análogo de nucleosido y un inhibidor del receptor del factor de crecimiento epidérmico, donde el individuo padece cáncer de páncreas, que comprende los pasos (a) - (c) según cualquiera de las cláusulas 4 - 5, y además comprende clasificar a los individuos que presentan un IP>17 en el grupo de individuos con un mal pronóstico de la enfermedad, y preferiblemente una supervivencia inferior a 5 meses. 7.- Un método para predecir o pronosticar la respuesta de un individuo al tratamiento que comprende un análogo de nucleosido y un inhibidor del receptor del factor de crecimiento epidérmico, donde el individuo padece cáncer de páncreas, que comprende los pasos (a) - (c) según cualquiera de las cláusulas 4 - 5, y además comprende clasificar a los individuos que presentan un IP≤17 en el grupo de individuos que presentan un mejor pronóstico de la enfermedad, y más preferiblemente una supervivencia superior a 5 meses.

8. - El método según cualquiera de las cláusulas 4-7, donde el análogo de nucleosido es la Gemcitabina.

9. - El método según cualquiera de las cláusulas 4-8, donde el inhibidor del receptor del factor de crecimiento epidérmico es el Erlotinib.

10. - El método según cualquiera de las cláusulas 4-9, donde el individuo padece adenocarcinoma ductal de páncreas (PDAC).

1 1 . - El método según cualquiera de las cláusulas 4-10, donde la muestra biológica es una muestra de sangre (suero). 12.- El método según cualquiera de las cláusulas 4-1 1 , donde los pasos (b) y/o (c) de los métodos descritos anteriormente pueden ser total o parcialmente automatizados.

13. - El método según cualquiera de las cláusulas 4-12, donde la cuantificación se hace mediante un inmunoensayo.

14. - El método según cualquiera de las cláusulas 4-13, donde el inmunoensayo es un ELISA. 15. - El uso de un anticuerpo en la elaboración de un medicamento para tratar un individuo que padece cáncer de páncreas, identificable por un método según cualquiera de las cláusulas 4-14, donde el anticuerpo se selecciona de entre anti- CD80, anti-EG-VEGF, anti-IL29, anti-NRG1 -beta1 y aníi-PD-ECGF, o cualquiera de sus combinaciones.

16. - Una composición farmacéutica que comprende un agente modulador de al menos uno de los genes que se seleccionan de entre CD80, EG-VEGF, IL-29, NRG1-beta 1 y PD-ECGF, para tratar a un individuo que padece cáncer de páncreas, identificable por el método según cualquiera de las cláusulas 4-14. 17.- Un kit o dispositivo, que comprende los elementos necesarios para cuantificar la cantidad de expresión de los genes que se seleccionan de entre CD80, EG-VEGF, IL- 29, NF¡G1-beta1 y PD-ECGF

18.- El kit o dispositivo, según la cláusula anterior, que comprende los anticuerpos anti- CD80, anti-EG-VEGF, anti-IL29, anti-NRG1 -beta1 y anti-PD-ECGF.

19.- El kit o dispositivo según las cláusulas 17-18, que además comprende la asignación de un valor de índice pronóstico y clasificación de individuos, según las cláusulas 5-6.

20. - Un soporte sólido, o chip de proteínas, que comprende al menos uno de los anticuerpos anti-CD80, anti-EG-VEGF, anti-IL29, anti-NRG1 -beta1 y anti-PD-ECGF, o cualquiera de sus combinaciones, para llevar a cabo un método según cualquiera de las cláusulas 4-14.

21 . - Un soporte sólido, o chip de DNA, que comprende oligonucleótidos o microarreglos de canal único diseñados a partir de una secuencia conocida o un ARNm de al menos uno de los genes CD80, EG-VEGF, IL-29, NRG1-beta1 y PD- ECGF, o cualquiera de sus combinaciones, para llevar a cabo un método según cualquiera de las cláusulas 4-14.

22. - Un medio de almacenamiento legible por un ordenador que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos del método según cualquiera de las cláusulas 4-14. 23.- Una señal transmisible que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos del método según cualquiera de las cláusulas 4-14.

Claims

REIVINDICACIONES

1 . - El uso simultáneo de los genes FGF- 10, CXCL 11, OSM, GPNMB y SCF, para el diagnóstico del cáncer de páncreas.

2. - El uso, según la reivindicación anterior, donde el cáncer de páncreas es el adenocarcinoma ductal de páncreas (PDAC).

3. - Un método de obtención de datos útiles, para el diagnóstico del cáncer de páncreas, que comprende: a) obtener una muestra aislada del individuo. b) cuantificar la cantidad de producto de expresión de los genes FGF- 10, CXCL 1 1, OSM, GPNMB y SCF.

A.- El método según la reivindicación anterior, que además comprende: c) comparar las cantidades obtenidas en el paso (b) con una cantidad de referencia.

5. El método según cualquiera de las reivindicaciones 3-4, donde los pasos (b) y/o (c) pueden ser total o parcialmente automatizados.

6. - Un método de diagnóstico del cáncer de páncreas que comprende los paso (a)-(c) según cualquiera de las reivindicaciones 3-5, y además comprende asignar al individuo del paso (a) al grupo de individuos que padecen cáncer de páncreas cuando presentan una cantidad de producto de expresión del los genes FGF-10, CXCL 1 1, OSM, GPNMB y SCF, superior a la cantidad de referencia.

7. - El método según cualquiera de las reivindicaciones 3-6, donde cáncer de páncreas es el adenocarcinoma ductal de páncreas (PADC).

8. - El método según cualquiera de las reivindicaciones 3-7, donde la muestra biológica es una muestra de sangre, y preferiblemente suero.

9.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 3-8, donde la cuantificación se hace mediante inmunoensayo.

10.- El uso de un anticuerpo en la elaboración de un medicamento para tratar un individuo que padece cáncer de páncreas, identificable por un método según cualquiera de las reivindicaciones 3-9, donde el anticuerpo se selecciona de entre anti- FGF-10, antí- CXCL1 1 , anti-OSM, anti- GPNM y anti-SCF.

1 1 . - Una composición farmacéutica que comprende un agente modulador de al menos uno de los genes que se seleccionan de entre FGF-10, CXCL 11, OSM; GPNMB y SCF, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de un individuo que padece cáncer de páncreas, identificable por un método según cualquiera de las reivindicaciones 3-9.

12. - Un kit o dispositivo, que comprende los elementos necesarios para cuantificar la cantidad de expresión de los genes que se seleccionan de entre FGF-10, CXCL 1 1, OSM, GPNMB y SCF.

13. - El kit o dispositivo, según la reivindicación 12, que comprende los anticuerpos anti-FGF-10, anti- CXCL1 1 , anti-OSM, anti- GPNM y anti-SCF.

14. - Un soporte sólido, o chip de proteínas, que comprende al menos uno de los anticuerpos anti-FGF-10/, anti- CXCL1 1 , anti-OSM, anti- GPNM y anti-SCF, o cualquiera de sus combinaciones, para llevar a cabo un método según cualquiera de las reivindicaciones 3-9.

15. - Un soporte sólido, o chip de DNA, que comprende oligonucleótidos o microarreglos de canal único diseñados a partir de una secuencia conocida o un ARNm de al menos uno de los genes FGF- 10, CXCL 1 1, OSM, GPNM y SCF, o cualquiera de sus combinaciones, para llevar a cabo un método según cualquiera de las reivindicaciones 3-9.