KR20220129816A

KR20220129816A - 미만형 위암의 예후 진단 마커

Info

Publication number: KR20220129816A
Application number: KR1020210034599A
Authority: KR
Inventors: 정재호; 원미선; 김보경; 박경찬
Original assignee: 한국생명공학연구원; 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2021-03-17
Filing date: 2021-03-17
Publication date: 2022-09-26

Abstract

본 발명은 SYT11 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 미만형(diffuse type) 위암의 진단 또는 예후 예측용 조성물과 키트를 제공한다. 또한, 본 발명에서는 미만형 위암의 진단에 필요한 정보나, 미만형 위암의 치료 전략 결정을 위해 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

Description

미만형 위암의 예후 진단 마커{Diagnostic Biomarker For Prognosis of Diffuse Type Gastric Cancer}

본 발명은 미만형 위암(diffuse type gastric cancer)을 진단하거나 미만형 위암의 예후를 예측할 수 있는 진단 또는 예후 예측용 조성물 및 이를 포함하는 키트, 그리고 미만형 위암의 진단에 필요한 정보나 미만형 위암의 치료 전략 결정을 위해 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

위암은 한국인의 발병률이 세계 1위에 이르는 암으로 이에 대한 예방, 치료 및 예후 예측에 대한 필요성이 큰 질환 중 하나이다. 위암은 병리학적, 조직학적 기반의 로렌 분류(Lauren classification)에 따라 분류할 때 장형(intestinal type)과 미만형(diffuse type)으로 나눌 수 있다. 미만형 위암은 위의 점막 아래에서 퍼져나가는 형상으로 증식하며 암세포들이 위벽으로 침윤하는 특징을 가진다. 그런데, 미만형 위암의 경우, 장형 위암에 비해 생존율이 나쁜 특징이 있고, 특히 암에 대한 경각심이나 건강검진의 기회가 상대적으로 부족한 20, 30대의 젊은 층에서 발병률이 높아 발병 초기에 발견되기 어렵다. 그러므로, 미만형 위암은 위암의 발병 사실을 조기에 발견해야 할 필요성이 더 높으며, 치료 전략을 수립하기 위해 위암 중에서도 미만형 위암인 것으로 진단하는 방법에 대한 연구의 필요성이 높아지고 있다.

현재까지 위암을 진단하기 위한 검사 방법으로는, X선 촬영이나 위 내시경을 통한 물리적인 수단을 이용하는 것이 대부분이었으나, 이는 검사를 받는 환자에게 고통이 수반되며 번거로운 과정을 거쳐야 한다는 단점이 있다. 이에 따라, 위암 환자에게서 특이적으로 발현되거나 발현 수준이 증가하는 유전자 마커에 관한 연구가 이루어지고 있으며, 위암 마커의 발현 수준을 측정함으로써 이를 진단에 이용하고자 하는 연구가 계속되어 오고 있으나, 위암 중에서도 조직학적 분류에 따른 미만형 위암 진단과 관련된 유전자 마커에 관한 연구나, 미만형 위암 환자의 예후 예측과 관련된 연구는 미흡한 실정이다.

한편, 본 발명의 연구진은 SYT11(Synaptotagmin 11) 억제제를 유효성분으로 포함하는 위암 치료용 조성물과, SYT11의 발현 측정을 포함하는 줄기형 위암의 진단 방법에 관한 대한민국 공개특허공보 제2020-0044695호를 통해 SYT11 유전자를 '줄기형 위암' 진단 마커로 이용하는 연구를 제시한 바 있으나, 이와는 다른 특징을 갖는 미만형 위암과 SYT11 유전자 발현 수준 사이의 관련성은 보고된 바 없다. 또한, 상기 SYT11 억제제와 같이 SYT11을 표적으로 하는 치료제를 투여함에 있어, 치료제의 효과를 미리 예측하여 특정 환자에게 적합한 치료 전략을 세우기 위한 동반진단(companion diagnostics)에 이용될 수 있는 마커 유전자에 관한 연구도 이루어진 바 없다. 따라서, 미만형 위암을 진단하고 이의 예후를 예측하며, SYT11 표적 치료제의 적용 등 치료 전략을 수립함에 있어 이용될 수 있는 새로운 마커와 이를 통한 미만형 위암의 진단, 미만형 위암의 치료 전략을 결정하는 데 필요한 정보를 제공하는 방법의 개발이 요구된다.

본 발명은 위암 중에서도 미만형(diffuse type) 위암을 진단하거나 미만형 위암 환자의 예후를 예측할 수 있는 조성물 및 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 미만형 위암의 진단에 필요한 정보나, 미만형 위암 환자의 치료 전략 결정을 위해 필요한 정보를 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 SYT11 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 미만형 위암의 진단 또는 예후 예측용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 조성물을 포함하는, 미만형 위암의 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명의 또 다른 측면은 분리된 생물학적 위 조직 시료로부터 SYT11 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계;를 포함하는, 미만형 위암의 진단 또는 미만형 위암의 치료 전략 결정을 위해 필요한 정보를 제공하는 방법으로서, 상기 미만형 위암의 치료 전략 결정을 위해 필요한 정보는, 미만형 위암의 예후 예측; 미만형 위암의 예후 평가; 및 위암 환자에서 SYT11 표적 치료제에 대한 유효성 평가;로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것인, 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, SYT11 유전자의 발현 수준이 장형과 미만형 중 미만형 위암 환자에게서 높은 상관관계를 나타내며, 미만형 위암 환자의 예후와도 관련성이 높은 것을 확인함으로써, 미만형 위암을 진단하거나 예후를 예측하기 위한 마커로 SYT11 유전자를 유용하게 이용할 수 있음을 확인하였다. 또한, SYT11 유전자 이외에 8종의 유전자의 발현 수준이 미만형 위암 환자에게서 SYT11 유전자의 발현 수준과 유사한 패턴으로 나타나 미만형 위암 환자의 예후와도 밀접한 관련성이 있음을 확인하였는바, 상기 8종 유전자는 SYT11 유전자와 함께 미만형 위암의 진단이나 치료 전략을 수립하는 데 있어 유용하게 이용할 수 있다.

다만, 본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.

도 1은 정상인의 위 조직, 장형 위암 조직 및 미만형 위암 조직을 현미경으로 확인한 사진과, 상기 각 조직들을 대상으로 측정된 SYT11 유전자의 발현 수준 데이터를 바탕으로 SYT11 유전자 발현 수준이 낮거나(SYT11-low) 또는 높은(SYT11-high) 군으로 분류한 표이다.
도 2는 424명의 위암 환자의 임상 데이터를 바탕으로, 장형(intestinal type) 또는 미만형(diffuse type) 위암으로 각각 분류하고 이들을 다시 SYT11 유전자의 발현 수준과 줄기형 위암 여부 차이에 따라 분류한 결과이다.
도 3은 424명의 위암 환자의 임상 데이터를 바탕으로, 위암의 종류(장형 또는 미만형 위암)와 SYT11 유전자(도 3의 A, B) 또는 SYT4 유전자(도 3의 C, D)의 발현 수준에 따른 생존 가능성을 분석하여 비교한 그래프이다.
도 4는 미만형 위암 환자에게서 SYT11 유전자의 발현 수준과 8종 유전자(ANGPTL2, CACNB1, CCL19, CD34, JAM3, SLIT2, THBS4 및 VIMENTIN 유전자)의 발현 수준의 패턴을 비교하여 분석한 표와 그래프이다.
도 5는 위암 환자의 임상 데이터를 바탕으로, 위암의 종류(장형 또는 미만형 위암)와 SYT11 유전자 및 8종 유전자(ANGPTL2, CACNB1, CCL19, CD34, JAM3, SLIT2, THBS4 및 VIMENTIN 유전자)의 발현 수준에 따른 생존 가능성을 분석하여 비교한 그래프이다.
도 6은 위암 세포주 SNU484 세포를 대상으로 SYT11 표적 치료제로 기능할 수 있는 siSYT11과 대조군 siScramble(siSC)을 트랜스펙션시킨 후 SYT11 단백질과 ANGPTL2, THBS4, VIMENTIN 및 JAM3 단백질에 대한 웨스턴 블랏팅을 수행한 결과이다.

먼저, 본 발명에서 이용된 용어를 정의한다.

본 발명에서, "예후"는 환자의 질병에 대한 장래의 의학적인 귀추(예를 들어, 전체 생존율, 재발 없는 생존율 등)에 대해 전망하는 것을 의미하며, 질병의 차도(예를 들어, 질병의 회복 등), 질병의 개선되는 정도(예를 들어, 종양의 퇴행 등) 또는 질병의 안정화를 포함하는 양성적 예후를 포함하며, 질병의 재발, 질병의 진행 정도 또는 치명성(예를 들어, 종양의 성장, 전이, 약 저항성 등)을 포함하는 음성적 예후를 포함한다.

본 발명에서, "예측"은 환자의 질병에 대한 장래의 의학적인 귀추를 미리 헤아려서 짐작하는 것을 의미하며, 환자의 질병의 경과(예를 들어, 질병의 차도, 개선되는 정도, 안정화, 재발, 진행 정도, 치명성, 악화 등)에 대한 예측을 포함한다.

본 발명에서, "생물학적 시료"는 미만형 위암 환자 또는 정상인 개체로부터 얻은 조직을 의미하며, 구체적으로는 위 조직일 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

1. 미만형 위암의 진단 또는 예후 예측용 조성물 및 키트

본 발명은 미만형 위암을 진단하거나 미만형 위암의 예후를 예측하기 위한 조성물을 제공한다.

상기 미만형 위암의 진단 또는 예후 예측용 조성물은 SYT11 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함한다.

상기 미만형(diffuse type) 위암은 병리학적, 조직학적 특징 기반의 로렌(Lauren) 분류에 따라 위암을 분류하였을 때 장형(intentional type) 위암과 구분되는 것으로, 암세포의 점착력이 낮아 뚜렷한 형태의 종괴가 형성되지 않은 상태에서 개별 암세포가 위벽을 침윤하는 특성을 나타내는 위암이다. 상기 장형 위암은 암세포가 한 위치에 뭉쳐 덩어리 형태로 자라는 특성을 나타내는 위암이다.

상기 SYT11 유전자(Synaptotagmin 11, ILMN_1717934)는 Synaptotagmin 유전자 패밀리의 일종으로, 칼슘 센서로 알려진 다른 패밀리 멤버 단백질과 유사한 단백질을 암호화한다. 상기 SYT11 유전자로부터 발현된 단백질은 시냅스 전달(synaptic transmission) 과정에서 막 수송의 칼슘 의존적 조절을 조정하는 역할을 할 수 있다. 상기 SYT11 유전자의 염기서열 및 상기 SYT11 유전자로부터 발현된 단백질의 아미노산 서열은 NCBI의 GenBank 등의 공개된 데이터베이스나 문헌에서 얻을 수 있다.

상기 미만형 위암의 진단 또는 예후 예측용 조성물은 ANGPTL2, CACNB1, CCL19, CD34, JAM3, SLIT2, THBS4 및 VIMENTIN으로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 적어도 하나 더 포함할 수 있다.

상기 ANGPTL2 유전자(Angiopoietin-like protein 2, ILMN_1772612), CACNB1 유전자(Calcium Voltage-Gated Channel Auxiliary Subunit Beta 1, ILMN_2271149), CCL19 유전자(C-C Motif Chemokine Ligand 19, ILMN_1769129), CD34 유전자(ILMN_1732799), JAM3 유전자(Junctional adhesion molecule C, ILMN_1769575), SLIT2 유전자(Slit homolog 2 protein, ILMN_1676449), THBS4 유전자(Thrombospondin-4, ILMN_1736078) 및 VIMENTIN 유전자(ILMN_1782538)의 염기서열 및 상기 유전자들로부터 발현된 단백질의 아미노산 서열은 NCBI의 GenBank 등의 공개된 데이터베이스나 문헌에서 얻을 수 있다.

상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자의 mRNA가 존재하는 양 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질이 존재하는 양을 측정하는 제제일 수 있다.

상기 유전자의 mRNA가 존재하는 양을 측정하는 제제는 상기 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하여 인식할 수 있도록 하거나 양을 증폭시킬 수 있는 제제를 의미하며, 상기 mRNA 또는 mRNA를 역전사시켜 만든 cDNA의 염기서열에 특이적으로 결합하는 프라이머(primer) 쌍 또는 프로브(probe)를 포함한다.

상기 프라이머는 자유 3'말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)을 가지는 짧은 길이의 핵산 서열로 상보적인 주형 가닥(template strand)과 염기쌍을 형성함으로써 핵산 중합효소가 주형 가닥을 복제하여 증폭할 때의 시작 지점을 제공하는 역할을 하는 핵산 서열이다. 그리고 상기 프로브는 mRNA 또는 cDNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 서열로 이루어진 수 염기 내지 수백 염기의 길이를 가지는 핵산 절편을 의미한다.

상기 유전자의 mRNA가 존재하는 양은 상기 유전자 서열의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR, RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR) 등의 방법을 수행함으로써 측정할 수 있으며, 상기 유전자의 mRNA 또는 역전사하여 만들어진 cDNA에 특이적 결합을 이룰 수 있는 서열을 가진 프로브를 이용하여 노던 블롯(Northern blot), 마이크로 어레이(Microarray) 등의 방법을 수행함으로써 측정할 수 있으며, 나아가 RNase 보호 분석법(RNase protection assay), 염기서열 분석(sequencing) 등의 방법으로 측정할 수 있으나, 이에 한정하지 않고 통상의 기술자에게 알려진 어떠한 방법을 사용하는데 필요한 제제이든 가능하다.

상기 유전자로부터 발현된 단백질이 존재하는 양을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하여 인식할 수 있도록 하는 제제를 의미하며, 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머(aptamer)를 포함한다.

상기 항체는 면역학적으로 상기 단백질의 에피토프(epitope)와 특이적 결합하여 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 의미하며, 단일클론항체, 다클론항체, 전체 길이의 사슬 구조를 가진 항체, 적어도 항원 결합 기능을 갖는 기능적인 단편의 항체 및 재조합 항체를 모두 포함할 수 있다. 상기 앱타머는 상기 단백질을 표적으로 하여 특이적인 결합을 형성할 수 있는 특징을 가지며 안정적인 3차 입체구조를 이루고 있는 단일가닥 핵산 분자를 의미하며, SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment) 기술 등을 이용하여 상기 단백질에 특이성을 가진 앱타머를 합성할 수 있다.

상기 유전자로부터 발현된 단백질의 양은 상기 항체 또는 앱타머를 이용하여 웨스턴 블롯(Western blot), 단백질 마이크로 어레이(단백질 칩), ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay), 2차원 전기영동법(2-dimentional electrophoresis), 면역화학염색법(Immunohistochemistry, IHC), 면역형광법(immunofluorescence), 공동면역침전법(Co-Immunoprecipitation assay), FACS(Fluorescence activated cell sorter), 방사선면역분석(Radioimmunoassay, RIA), 방사면역확산법(Radioimmunodiffusion), MALDI-TOF 분석(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 등의 방법으로 측정할 수 있으나, 이에 한정하지 않고 통상의 기술자에게 알려진 어떠한 방법을 사용하는데 필요한 제제이든 가능하다.

상기 SYT11 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 조성물은 미만형 위암의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 용도로 이용할 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 장형 위암과는 달리 미만형 위암 환자에게서 SYT11 유전자의 발현 수준이 높게 나타나는 것을 확인하였는 바, 위암 발병 여부를 알 수 없는 환자나 조직학적 분류를 알지 못하는 위암 환자를 대상으로 SYT11 유전자의 발현 수준을 측정함으로써 SYT11 유전자의 발현 수준이 높게 나타날 경우 미만형 위암인 것으로 진단하기 위한 정보를 제공하기 위해 본 발명의 조성물이 이용될 수 있다(도 1 및 도 2).

또한, 상기 SYT11 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하거나, ANGPTL2, CACNB1, CCL19, CD34, JAM3, SLIT2, THBS4 및 VIMENTIN으로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 적어도 하나 더 포함하는 조성물은 미만형 위암 환자의 예후에 대한 예측 용도로 이용할 수 있다. 상기 SYT11 유전자의 발현 수준, 및 ANGPTL2, CACNB1, CCL19, CD34, JAM3, SLIT2, THBS4 및 VIMENTIN으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현 수준을 측정한 결과, 상기 유전자의 발현 수준이 높을 경우 미만형 위암 환자의 예후가 나쁠 것이라는 예측을 가능하게 하게 하여, 치료를 위한 전략과 대책을 수립할 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명의 구체적인 실시예에서는 SYT11 유전자 발현 수준은 위암 환자 중에서도 미만형 환자에게서 더 높게 나타나며, SYT11 유전자의 발현 수준이 높은 미만형 위암 환자의 생존가능성이 SYT11 유전자의 발현량이 낮은 미만형 위암 환자에 비해 더 높게 나타남을 확인하였다(도 3). 또한, 상기 SYT11 유전자의 발현 수준이 높은 미만형 위암 환자에게서 ANGPTL2, CACNB1, CCL19, CD34, JAM3, SLIT2, THBS4 및 VIMENTIN 유전자의 발현 수준도 함께 높은 것으로 측정되었으며(도 4), 상기 유전자들의 발현 수준이 미만형 위암 환자의 생존가능성과도 관련성이 있음을 확인하였다(도 5).

본 발명은 미만형 위암을 진단하거나 미만형 위암의 예후를 예측하기 위한 키트를 제공한다.

상기 키트는 상기 미만형 위암의 진단 또는 예후 예측용 조성물을 포함한다.

상기 키트는 상기 SYT11 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 조성물이나, 상기 SYT11 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제, 및 ANGPTL2, CACNB1, CCL19, CD34, JAM3, SLIT2, THBS4 및 VIMENTIN으로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 적어도 하나 포함하는 조성물을 포함할 수 있다.

상기 키트는 상기 유전자들의 mRNA가 존재하는 양을 측정하는 데 적합한 다른 성분을 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트의 형태이거나 상기 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트의 구성을 더 포함할 수 있으며, 통상의 기술자에게 알려진 mRNA의 양을 측정하기 위해 이용되는 형태의 키트라면 본 발명의 키트에 적용될 수 있다.

구체적으로, 상기 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수적 구성을 포함하는 키트일 수 있다. 예를 들어, 상기 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머 쌍 외에도, 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, Taq-중합효소(Taq-Polymerase) 및 역전사효소(Reverse transcriptase)와 같은 효소, 반응 완충용액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 디옥시뉴클레오티드(dNTP), DNase 및 RNase 억제제, DEPC-물(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 정량 시 대조군으로 이용되는 유전자에 대하여 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.

또한, 상기 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수적 구성을 포함하는 키트일 수 있다. 상기 유전자의 mRNA 또는 역전사된 cDNA에 특이적 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드가 부착되어 있는 유리 기판 및 형광 표지 프로브를 제작하기 위한 시약, 효소, 제제 등을 포함할 수 있다.

상기 키트는 상기 유전자들로부터 발현된 단백질이 존재하는 양을 측정하는데 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 성분을 포함하는 조성물, 용액 또는 장치를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 키트는 ELISA 키트, 단백질 칩 키트 형태이거나 상기 ELISA 키트, 단백질 칩 키트의 구성을 더 포함할 수 있으며, 통상의 기술자에게 알려진 단백질의 양을 측정하기 위해 이용되는 형태의 키트라면 본 발명의 키트에 적용될 수 있다.

구체적으로, 상기 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수적 구성을 포함하는 키트일 수 있다. 예를 들어, 항체의 면역학적 검출을 위한 기질, 적절한 반응 완충용액, 상기 유전자로부터 발현된 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 이용하는 항원-항체 복합체의 형성을 검출할 수 있는 시약을 포함할 수 있으며, 여기에는 발색 반응을 매개하는 효소, 형광물질 등으로 표지된 2차 항체 및 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기 발색 반응을 매개하는 효소의 예로는, 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase), 산성 포스파타제(acid phosphatase), 퍼옥시다제(peroxidase)를 포함할수 있고, 상기 형광물질의 예로는 콜로이드 골드(Coloid gold), 플루오레신카복실산(FCA), 플루오레신 이소티오시아네이트(FITC), RITC(Rhodamine-B-isothiocyanate), 플루오레신 티오우레아(FTH), 7-아세톡시쿠마린-3-일, 플루오레신-5-일, 플루오레신-6-일, 2',7'-디클로로플루오레신-5-일, 2',7'-디클로로플루오레신-6-일, 디하이드로테트라메틸로사민-4-일, 테트라메틸로다민-5-일, 테트라메틸로다민-6-일,4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-인다센-3-에틸 또는 4,4-디플루오로-5,7-디페닐-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸 등을 포함할 수 있다. 또한, 정량 시 대조군으로 이용되는 유전자로부터 발현된 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함할 수 있다. 상기 ELISA는 직접 ELISA(direct ELISA), 간접 ELISA(indirect ELISA) 또는 경쟁적 ELISA(competitive ELISA)일 수 있다.

또한, 상기 키트는 단백질 칩을 수행하기 위해 필요한 필수적 구성을 포함하는 키트일 수 있다. 예를 들어, 상기 유전자로부터 발현된 단백질에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 항체가 기판 위의 정해진 위치에 고밀도로 고정화되어 배열되어 있는 것일 수 있다. 또한, 정량 시 대조군으로 이용되는 유전자로부터 발현된 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함할 수 있다.

2. 미만형 위암의 진단 또는 미만형 위암의 치료 전략 결정을 위해 필요한 정보의 제공 방법

본 발명은 미만형 위암의 진단에 필요한 정보 또는 미만형 위암의 치료 전략 결정을 위해 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

상기 미만형 위암의 진단 또는 미만형 위암의 치료 전략 결정을 위해 필요한 정보를 제공하는 방법은, 분리된 생물학적 위 조직 시료로부터 SYT11 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계;를 포함한다. 미만형 위암의 치료 전략 결정을 위해 필요한 정보는, 미만형 위암의 예후 예측; 미만형 위암의 예후 평가; 및 위암 환자에서 SYT11 표적 치료제에 대한 유효성 평가;로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나이다.

또한, 상기 방법은, 분리된 생물학적 위 조직 시료로부터 ANGPTL2, CACNB1, CCL19, CD34, JAM3, SLIT2, THBS4 및 VIMENTIN으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계;를 더 포함할 수 있다.

상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계는 상기 유전자의 mRNA가 존재하는 양을 측정하거나, 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질이 존재하는 양을 측정하는 것일 수 있다.

상기 유전자의 mRNA가 존재하는 양을 측정하는 것은, 상기 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하여 인식할 수 있도록 하거나 양을 증폭시킬 수 있는 제제를 이용하여 측정하는 것일 수 있다. 구체적인 예로, 상기 mRNA 또는 mRNA를 역전사시켜 만든 cDNA의 염기서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍, 프로브를 이용하여 측정하는 것일 수 있으며, PCR, RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), 노던 블롯(Northern blot), 마이크로 어레이(Microarray), RNase 보호 분석법(RNase protection assay), 염기서열 분석(sequencing) 등의 방법으로 측정할 수 있으나, 이에 한정하지 않고 통상의 기술자에게 알려진 어떠한 방법을 이용하여 측정하는 것이든 가능하다.

상기 유전자로부터 발현된 단백질이 존재하는 양을 측정하는 것은 상기 단백질에 특이적으로 결합하여 인식할 수 있도록 하는 제제를 이용하여 측정하는 것일 수 있다. 구체적인 예로, 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머(aptamer)를 이용하여 측정하는 것일 수 있으며, 웨스턴 블롯(Western blot), 단백질 마이크로 어레이(단백질 칩), ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay), 2차원 전기영동법(2-dimentional electrophoresis), 면역화학염색법(Immunohistochemistry, IHC), 면역형광법(immunofluorescence), 공동면역침전법(Co-Immunoprecipitation assay), FACS(Fluorescence activated cell sorter), 방사선면역분석(Radioimmunoassay, RIA), 방사면역확산법(Radioimmunodiffusion), MALDI-TOF 분석(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 등의 방법으로 측정할 수 있으나, 이에 한정하지 않고 통상의 기술자에게 알려진 어떠한 방법을 이용하여 측정하는 것이든 가능하다.

본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, SYT11 유전자는 미만형 위암 환자에게서 높은 수준으로 발현되어 통계상 유의적인 관계가 있는 것으로 나타났으며, 장형 위암에서는 상기와 같은 결과가 나타나지 않았는바(도 2), 상기 정상 대조군의 SYT11 유전자의 발현 수준에 비해 분석의 대상이 되는 생물학적 위 조직 시료에서 SYT11 유전자의 발현 수준이 높게 나타날 경우, 상기 분석 대상은 미만형 위암으로 판정될 수 있다. 따라서, 상기와 같은 방법을 통해 미만형 위암의 진단을 위해 필요한 정보를 제공할 수 있다.

또한, 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, SYT11 유전자의 발현 수준이 높게 나타나는 미만형 위암 환자의 경우, 발현 수준이 낮은 것으로 분류되는 군의 미만형 위암 환자와 비교할 때 생존가능성이 더 높아, 상기 발현 수준과 미만형 위암의 예후는 통계적으로 유의한 관련성이 있음을 확인하였으며, 이러한 관계는 장형 위암 환자에게서는 유의적으로 나타나지 않았다(도 3). 그리고, SYT11 유전자의 발현 수준과 상기 ANGPTL2, CACNB1, CCL19, CD34, JAM3, SLIT2, THBS4 및 VIMENTIN 중 어느 하나의 발현 수준이 모두 높은 미만형 위암 환자에게서도 생존가능성과 관련성이 있다는 점이 확인되었다(도 5). 따라서, 미만형 위암 환자로부터 분리된 시료에서 상기 유전자들의 발현 수준을 측정하였을 때 발현 수준이 높을 경우 예후가 나쁘지 않을 것으로 예측할 수 있다.

본 발명의 상기 방법은, 상기 생물학적 위 조직 시료로부터 측정된 상기 유전자 발현 수준을, 대조군 시료로부터 측정된 기준값과 비교하는 단계;를 더 포함할 수 있다.

상기 대조군 시료는 미만형 위암을 앓고 있지 않은 집단으로부터 분리된 시료, 미만형 위암 환자 집단으로부터 분리된 시료, 또는 SYT11 표적 치료제를 투여한 미만형 위암 환자 집단일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 미만형 위암의 진단이나 치료 전략 결정을 위해 본 발명의 기술분야에서 통상적으로 비교할 수 있는 집단으로부터 분리된 시료라면 제한없이 이용될 수 있다.

상기 대조군 시료로부터 측정된 기준값은, 상기 대조군 시료를 대상으로 상기 유전자들의 발현 수준을 측정하여 수득된 값/데이터에 대한 기준을 의미하며, 측정하고자 하는 시료에서 발현되는 상기 유전자들의 발현 수준이 과발현 또는 저발현인지 여부를 나누는 기준이 되는 값일 수 있다. 상기 기준값은 절대값; 상대값; 상한 및/또는 하한을 갖는 값; 값의 범위; 평균값; 중간값; 중앙값; 또는 특정 대조군 또는 기준값과 비교된 값;일 수 있다. 상기 기준값은 본 발명의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 방법에 따라 설정될 수 있고, 각종 통계법 및 통계를 처리하기 위한 소프트웨어를 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 미만형 위암의 진단은, 진단의 대상이 되는 개체가 위암에 걸리지 않은 정상인 개체인지 아니면 미만형 위암에 걸린 개체인 것인지 여부를 진단하는 것이거나, 또는 진단의 대상이 되는 개체가 앓고 있는 위암이 미만형 위암인지 아닌지 여부를 진단하는 것일 수 있다. 더 구체적으로, 진단의 대상이 되는 개체가 앓고 있는 위암이 미만형 위암인지 장형 위암인지 여부를 진단하는 것일 수 있다.

상기 미만형 위암의 예후 예측은, 예후가 좋을 것인지 또는 나쁠 것인지 여부를 예측하는 것일 수 있으며, 이는 완치 가능성, 호전 가능성, 재발 가능성, 사망 가능성 등을 예측하는 것일 수 있다. 상기 예후의 예측은 미만형 위암 환자의 생존가능성을 예측하는 것일 수 있으며, 예를 들어 미만형 위암 환자 집단의 생존 기간의 평균값 또는 중간값을 기준으로, 상대적으로 긴 기간 동안 생존할 것인지 또는 상대적으로 짧은 기간 동안 생존할 것인지 여부를 예측하는 것일 수 있다.

상기 미만형 위암의 예후 평가는, 상기 예후 예측과 관련하여 설명한 예후가 미만형 위암 환자에게서 어떻게 나타났는지 평가하는 것으로, 예를 들어, 특정 치료 방법이나 의약품의 투여를 적용한 환자, 또는 적용하지 않은 환자가, 시간이 경과함에 따라 예후가 좋아졌는지 또는 나빠졌는지 여부를 평가하는 것일 수 있다.

본 발명의 상기 방법은, 상기 생물학적 위 조직 시료로부터 측정된 상기 유전자 발현 수준이, 미만형 위암을 앓고 있지 않은 집단으로부터 측정된 상기 유전자 발현 수준의 평균값 또는 중간값보다 높을 경우 미만형 위암인 것으로 판정하는 단계를 더 포함할 수 있다.

또한, 상기 방법은, 상기 생물학적 위 조직 시료로부터 측정된 상기 유전자 발현 수준이, 미만형 위암을 앓고 있지 않은 집단으로부터 측정된 상기 유전자 발현 수준의 평균값 또는 중간값; 또는 미만형 위암 환자 집단으로부터 측정된 상기 유전자 발현 수준의 평균값 또는 중간값;보다 높을 경우 예후가 나쁠 것으로 판정하는 단계;를 더 포함할 수 있다.

상기 위암 환자에서 SYT11 표적 치료제에 대한 유효성 평가는 SYT11 표적 치료제의 투여의 필요성; SYT11 표적 치료제에 대한 약제 저항성의 발현 가능성; SYT11 표적 치료제에 대한 민감성; 및 SYT11 표적 치료제에 의한 치료의 예후 예측;으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 평가하는 것일 수 있다.

상기 SYT11 표적 치료제에 대한 유효성 평가는, SYT11 표적 치료제를 특정한 미만형 위암 환자에게 적용함에 따른 각종 결과의 발생 가능성을 확인하기 위한 진단 테스트 중 하나일 수 있으며, 동반진단(companion diagnostic)으로 지칭될 수 있다.

상기 SYT11 표적 치료제는 예컨대 SYT11 억제제일 수 있으며, SYT11의 발현 또는 활성을 감소시키는 제제를 모두 통칭하는 의미로 사용되며, 구체적으로는 SYT11의 발현 감소에 영향을 주거나 SYT11에 직접적으로 작용하거나 그의 리간드에 간접적으로 작용하는 등의 방식으로, SYT11의 발현양을 전사(transcription), mRNA 수준, 또는 이행 (translation) 수준에서 감소시키거나, SYT11 활성을 방해함으로써, SYT11의 활성을 감소시키는 모든 제제를 포함할 수 있다.

상기 SYT1의 억제제는 SYT11의 발현 또는 SYT11을 표적으로 하여 활성을 억제할 수 있는 화합물, 핵산, 펩타이드, 바이러스 또는 상기 핵산을 포함하는 벡터 등 그 형태에 제한 없이 사용 가능하다. 상기 SYT11 억제제는 이에 제한되지는 않으나, SYT11 유전자의 mRNA를 분해시키는 siRNA 또는 shRNA, SYT11 단백질의 발현을 감소시키는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 있다. 또한, SYT11 단백질에 결합하여 기능을 억제하는 SYT11 억제제로 앱타머(aptamer) 또는 저분자 화합물일 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, 미만형 위암 환자에서 SYT11 유전자의 발현 수준과 상기 ANGPTL2, CACNB1, CCL19, CD34, JAM3, SLIT2, THBS4 및 VIMENTIN으로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자의 발현 수준이 동일한 패턴으로 나타나 통계적으로 유의한 관련성이 있음을 확인하였다. 또한, 상기 SYT11 유전자의 발현 수준과 상기 ANGPTL2, CACNB1, CCL19, CD34, JAM3, SLIT2, THBS4 및 VIMENTIN으로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자의 발현 수준은 미만형 위암 환자의 예후와도 밀접한 관련성이 있어 동일한 패턴을 나타내는 것을 확인하였다. 따라서, SYT11를 표적으로 하는 미만형 위암의 치료제를 투여함에 있어, 상기 ANGPTL2, CACNB1, CCL19, CD34, JAM3, SLIT2, THBS4 및 VIMENTIN으로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자의 발현 수준을 측정함으로써, SYT11 표적 치료제에 대한 약제 저항성의 발현 가능성; SYT11 표적 치료제에 대한 민감성; 및 SYT11 표적 치료제에 의한 치료의 예후 예측;을 평가하는 데 상기 발현 수준의 측정 결과를 이용할 수 있다.

상기 투여의 필요성은 상기 치료제에 대한 치료 효과를 얻을 수 있는 개체 또는 얻을 수 있을 것으로 예상되는 개체에 상기 치료제의 투여 여부를 결정하기 위한 것이다.

상기 방법은, 미만형 환자로부터 분리된 생물학적 위 조직 시료로부터 측정된, 상기 ANGPTL2, CACNB1, CCL19, CD34, JAM3, SLIT2, THBS4 및 VIMENTIN으로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자의 발현 수준이 기준값보다 높은 경우, 상기 시료를 제공한 개체가 다음 중 적어도 하나의 경우에 해당할 가능성이 있는 것으로 판정하는 단계를 더 포함할 수 있다: SYT11 표적 치료제의 투여가 필요함; SYT11 표적 치료제에 대한 약제 저항성의 발현가능성이 낮음; SYT11 표적 치료제에 대한 민감성이 높음; 또는 SYT11 표적 치료제에 의한 치료의 예후가 좋음.

본 발명의 일 구체예에서, 미만형 위암 환자로부터 얻은 생물학적 위 시료를 대상으로 SYT11 유전자가 발현되어 있음을 확인하고, 상기 ANGPTL2, CACNB1, CCL19, CD34, JAM3, SLIT2, THBS4 및 VIMENTIN으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현 수준을 측정한 다음, SYT11 표적 치료제에 대한 처방 여부를 결정할 수 있다. 구체적으로, 상기 환자의 상기 유전자들의 발현 수준이 기준값 이상인 것으로 측정될 경우, 상기 환자는 SYT11 표적 치료제에 대한 민감성이 높거나, SYT11 표적 치료제에 대한 저항성이 낮을 것으로 예상할 수 있어, SYT11 표적 치료제의 처방 여부 결정에 필요한 정보를 제공할 수 있다.

또한, 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 위암 세포주를 대상으로 SYT11을 표적으로 하여 이의 발현을 억제하거나 활성을 억제하는 기능을 하는 SYT11 표적 치료제, 예를 들어 siSYT11을 처리하였을 때 세포 내 SYT11 단백질의 양뿐만 아니라, ANGPL2, THBS4, VIMENTIN 및 JAM3 단백질의 양도 함께 감소하는 것으로 확인되었다(도 6). 따라서, 상기 마커들은 SYT11의 억제에 따라 함께 발현 또는 활성이 억제되어 조절되는 것을 알 수 있으며, SYT11 표적 치료제를 투여함에 있어 상기 마커들을 모니터링함으로써 SYT11 표적 치료제에 대한 민감성, 저항성 등을 확인할 수 있는바 상기 마커들은 SYT11 표적 치료제에 대한 유효성 평가에 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되지 아니한다.

SYT11 유전자의 발현 수준과 미만형 위암의 관련성 확인

위암 조직과 정상인의 위 조직을 대상으로, 이로부터 발현되는 SYT11 유전자의 발현 수준을 측정하여 비교함으로써, SYT11 유전자 발현 수준과 위암 사이의 관련성을 확인하였다.

암 및 정상 조직은 바이오맥스(Biomax US, 미국)에서 구입하였고, 위암 조직 70개, 정상 조직 10개에 대하여 면역조직화학법(Immunohistochemistry)을 수행하여 SYT11 발현 수준을 확인하였다.

구체적으로, 각 조직의 파라핀(paraffin) 제거를 위하여 자일렌(xylene) 용액에 10분간 담근 후 남아있는 자일렌의 제거를 위해 100%, 95%, 80%, 70% 에탄올 용액에 차례로 5분간 담근 후 물로 헹궈냈다. 조직 슬라이드를 3% 과산화수소(H₂O₂) 용액에 10분간 담근 후 15분간 물에 담궈 헹궈냈다. 0.01M 시트르산 나트륨(sodium citrate) 용액을 95 ℃로 끓인 후 상기 조직 슬라이드를 넣고 10분간 둔 다음 상온에서 30분간 식혔다. 이를 다시 물로 10분간 헹군 후 완충용액(Phosphate buffered saline)에 10분간 담가 준비한 시료에 항-SYT11 항체, 비오틴-결합 2차 항체(biotin-conjugated secondary antibody, vector lab사, 미국), 아비딘-비오틴 결합 효소(Abidin+Biotinylated horseradish peroxidase, Vector lab 사, 미국)를 순차적으로 반응시킨 후 DAB 기질(DAB peroxidase substrate, vector lab사, 미국)을 사용하여 SYT11 단백질의 발현 수준을 확인하였다. 그리고 조직의 핵 부분을 구분하기 위해 헤마토자일린(hematoxylin) 용액에 5분간 반응시킨 후 물로 헹궈낸 다음, 조직 슬라이드를 0.1% 염화수소(HCl), 0.1% 암모니아(NH₄OH) 수용액에 차례로 담근 후 물로 헹궈냈다. 70%, 85%, 95%, 100% 에탄올에 순차적으로 5분씩 담근 후 자일렌 용액에 5분간 반응시키고 나서 조직 슬라이드를 건조시켰다.

면역조직화학법을 통해 측정한 SYT11 유전자의 발색 정도에 따라 이의 중간값 또는 평균값을 기준으로 하여 SYT11 유전자의 발현 수준이 낮은 군(SYT11-low)와 발현 수준이 높은 군(SYT11-high)으로 분류하였다. 그 결과, 정상 위 조직의 경우 30%에서만 SYT11 유전자의 발현 수준이 높은 것으로 나타났으나, 위암 환자의 위 조직의 경우 64.3%의 환자에게서 SYT11 유전자의 발현 수준이 높은 것으로 나타났다. 따라서, SYT11 유전자의 발현 수준이 위암의 발생과 상관관계가 있음을 확인할 수 있었다(도 1).

또한, 상기 70개의 위암 조직을, 조직학적으로 분류하여 30개의 장형 위암(diffuse type) 조직과 40개의 미만형 위암(diffuse type) 조직으로 나누어 각각 SYT11 유전자의 발현 수준을 발색 정도로 측정하고, 마찬가지로 SYT11 유전자의 발현 수준이 낮은 군(SYT11-low)와 발현 수준이 높은 군(SYT11-high)으로 분류하였다. 그 결과, 장형 위암 조직의 경우 46.7%에서 SYT11 유전자의 발현 수준이 높은 것으로 나타났으나, 미만형 위암 환자의 위 조직의 경우 77.5%의 환자에게서 SYT11 유전자의 발현 수준이 높은 것으로 나타났다. 따라서, SYT11 유전자의 발현 수준은 미만형 위암과 관련성이 있음을 확인할 수 있었다(도 1).

미만형 위암, 장형 위암에서의 SYT11 유전자 발현 수준 차이 비교

연세대학교 세브란스 병원으로부터 제공받은 장형(intestinal) 위암 환자 239명, 미만형(diffuse) 위암 환자 185명의 마이크로어레이(Microarray) 결과를 분석하였다. 마이크로어레이 결과에서 SYT11 발현 수준에 따른 수신자 조작 특성 곡선(Receiver operating characteristic) 분석 후 이의 중간값 또는 평균값을 기준으로 하여 위암 환자군을 SYT11 발현 수준이 높거나 낮은 그룹으로 분류하였다. 또한, 위암이 줄기형 위암(stem-like)인지 줄기형이 아닌 위암(non-stem-like)인지 여부도 함께 확인하였다.

그 결과, 장형 위암의 경우, 239명 중에서 77명의 환자가 SYT11 유전자 발현 수준이 높은 것으로 나타났고, 그 중 31명의 줄기형 환자 중에서 27명이 SYT11 유전자 발현 수준이 높은 것으로 분석되었다. 반면에, 미만형 위암의 경우, 185명의 환자 중에서 100명의 환자가 SYT11 유전자 발현 수준이 높은 것으로 나타났고, 그 중 80명의 줄기형 환자 중에서 67명이 SYT11 유전자 발현 수준이 높은 것으로 분석되었다(도 2).

상기와 같은 결과를 통해, 종래 연구에서처럼 SYT11 유전자의 발현은 줄기형 위암과 관련성이 있음을 다시 확인할 수 있었던 것에 더하여, SYT11 유전자의 발현은 장형 위암에서는 낮게 나타나고 미만형 위암에서는 높게 나타남을 새롭게 확인함으로써 SYT11 유전자의 발현 수준이 미만형 위암과 관련성이 있어 미만형 위암의 진단 마커로 이용될 수 있음을 확인할 수 있었다.

SYT11 유전자 발현 수준과 미만형 위암 환자의 예후 사이의 관련성 확인

상기 실시예 2에 따른 424명의 위암 환자 임상 데이터를 기반으로, 위암 환자의 생존 가능성(survival probability)과 SYT11 유전자 발현 수준의 관련성을 분석하였다.

구체적으로, 239명의 장형 위암 환자와 185명의 미만형 위암 환자를 분류하고, 이들 환자들의 마이크로어레이 결과를 이용해 SYT11 유전자 및 SYT4 유전자의 발현 수준을 바탕으로 상기 발현 수준이 높은 군과 낮은 군으로 나누었다. 그리고, 각 군의 생존가능성 데이터를 비교하여 유전자 발현 수준과 위암 환자의 예후 사이의 관련성을 확인하였다.

그 결과, 도 3에서 볼 수 있듯이, 장형 위암 환자 239명의 경우 SYT11 유전자의 발현 수준이 높은 군과 낮은 군 사이에 통계적으로 유의한 수준의 생존가능성의 차이가 나타나지 않은 것에 반해(p=0.3363), 미만형 위암 환자 185명의 경우 SYT11 유전자의 발현 수준이 높은 군에서는 생존가능성이 유의적으로 낮게 나타나(p=0.0067) SYT11 유전자의 발현 수준과 미만형 환자의 예후 사이에 밀접한 관련성이 있음을 확인할 수 있었다. 또한, SYT11 유전자와 동일한 패밀리에 속하는 SYT4 유전자 발현 수준과 생존가능성 사이의 관계를 확인한 대조군의 결과로 볼 때, 미만형 환자의 예후와 SYT4 유전자 발현 수준은 유의미한 관련성이 없는 것으로 확인되었고(p=0.1618), 미만형 위암은 SYT11 유전자의 발현 수준과만 관련이 있음을 확인할 수 있었다.

8종의 동반진단 마커의 발굴 및 미만형 위암과의 관련성 확인

상기 실시예들을 통해 미만형 위암 환자에게서 SYT11 유전자의 발현 수준이 높게 나타나며, SYT11 유전자의 발현량이 높은 미만형 환자는 예후가 좋지 않다는 점을 확인하였다. 이에, SYT11 유전자와 같은 경향으로 발현 수준이 조절되는 유전자들을 확인하여, 동반진단 마커로 이용될 수 있는 가능성이 있는 8종의 새로운 마커를 발굴하였다(도 4).

구체적으로, 위암 환자의 마이크로어레이 결과를 기본으로 ANGPTL2, CACNB1, CCL19, CD34, JAM3, SLIT2, THBS4, VIMENTIN 유전자의 발현 수준에 따른 수신자 조작 특성 곡선(Receiver operating characteristic) 분석 후 환자에서 각 유전자의 발현 수준에 따라 그 중간값, 평균값을 기준으로 발현 수준이 높은 군과 낮은 군으로 분류하였다. 그리고 SYT11과 상기 각 유전자의 발현 수준에 따른 환자의 생존율을 카플란-마이어 곡선(Kaplan Meier graph)으로 나타내었다.

도 4에서 확인할 수 있듯이, SYT11 유전자의 발현량이 높은 환자에게서 SYT11 유전자 발현량에 비례해 ANGPTL2, CACNB1, CCL19, CD34, JAM3, SLIT2, THBS4 및 VIMENTIN 8종 유전자의 발현량도 함께 증가하였으며, 통계적으로도 유의한 관계가 있는 것으로 나타났다.

또한, 장형 위암 환자와 미만형 위암 환자를 대상으로 SYT11 유전자 및 ANGPL2 유전자의 발현 수준이 모두 높거나(SYT11(H)-ANGPL2(H)) 낮은 경우(SYT11(L)-ANGPL2(L))의 생존가능성을 확인하고, ANGPL2 유전자 이외에 다른 7종의 유전자 마커의 경우에도 마찬가지의 방법으로 생존가능성과의 관련성을 비교하였다. 그 결과, SYT11 유전자 및 상기 8종 유전자 각각의 발현 수준이 모두 높은 미만형 환자들은 생존가능성이 낮아 예후가 좋지 않은 것으로 나타났으며 통계적으로도 유의한 결과를 나타냈다. 반면, 장형 위암의 경우 모든 8종 마커에서 생존가능성과 발현 수준 사이에 유의적인 관련성이 존재하지는 않는 것으로 확인되었는바, 상기 8종의 유전자 마커는 미만형 위암에서만 SYT11 유전자의 발현 수준과 상관관계가 있음을 알 수 있었다(도 5).

SYT11 표적 치료제 처리에 따른 동반진단 마커의 발현 수준 확인

위암 세포주 SNU484 세포를 대상으로, SYT11 유전자의 mRNA에 결합하여 이의 발현을 억제할 수 있는 SYT11 표적 치료제의 일종인 siSYT11을 트랜스펙션(transfection)시켜 도입시켰다. 대조군으로는 siScramble을 트랜스펙션시켰다. 도입 48시간 후 리파 용액(RIPA buffer)을 이용해 단백질을 추출하고 폴리아크릴아마이드 젤에서 전기영동(SDS-PAGE)으로 분리한 후, 상기 실시예 4를 통해 발굴한 동반진단 마커 유전자들의 각 항체를 이용하여 웨스턴 블랏(Western blotting)을 수행하였다(도 6).

그 결과, SYT11 표적 치료제인 siSYT11을 사용하여 세포 내 SYT11 단백질 양을 감소시킴에 따라 ANGPL2, THBS4, VIMENTIN2 및 JAM3의 양이 감소되었음을 확인하였다. 상기와 같은 결과로 볼 때, ANGPL2, THBS4, VIMENTIN2 및 JAM3 유전자는 SYT11에 의해 조절 받는 SYT11의 하위 유전자로 예상될 수 있으며, SYT11 유전자의 발현 수준과 유의적인 관련성이 있는 상기 실시예 4의 유전자들은, SYT11의 발현을 조절하였을 때, 이에 따라 그 발현 수준이 함께 조절될 것임을 예상할 수 있었다. 따라서, SYT11 발현을 감소시키거나 SYT11 활성을 억제하는 표적 치료제를 사용할 때 ANGPL2, THBS4, VIMENTIN 및 JAM3의 발현 수준을 측정하여 이의 감소 여부를 확인함으로써 SYT11 표적 치료제의 치료 효과나 저항성 등을 모니터링할 수 있으며, 이에 따라 상기 유전자들을 SYT11 표적 치료제의 동반진단 마커로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

상기와 같은 실시예의 결과를 종합하여 볼 때, SYT11 유전자는 미만형 위암 환자에게서 발현 수준이 높은 것으로 나타나 SYT11 유전자를 미만형 위암의 진단을 위한 마커로 이용할 수 있음을 확인할 수 있었다. 또한, 상기 SYT11 유전자의 발현 수준은 미만형 환자의 예후와도 관련성이 있어 SYT11 유전자의 발현 수준이 높을 경우 미만형 환자의 예후가 좋지 않을 것으로 예측할 수 있음을 확인하였다. 이에 더하여, 미만형 위암 환자에서는, SYT11 유전자의 발현 수준과 ANGPTL2, CACNB1, CCL19, CD34, JAM3, SLIT2, THBS4 및 VIMENTIN 8종 유전자의 발현 수준이 유사한 경향을 보이며 관련성이 있는 것으로 나타나, 미만형 위암 환자의 예후와도 관련이 있음을 확인하였다. 따라서, 상기 8종의 유전자 역시 미만형 위암의 예후를 예측하기 위한 마커로 이용될 수 있음을 확인할 수 있었다.

나아가, SYT11이 위암을 치료하기 위한 표적이 될 수 있다는 점이 기존 연구를 통해 밝혀져 있으며, SYT11의 양을 감소시킬 수 있는 siSYT11을 위암 세포주에 처리한 결과 상기 마커 유전자들의 양도 함께 감소되는 것을 실험을 통해 확인할 수 있었다. 따라서, SYT11을 표적으로 하는 미만형 위암의 치료와 관련하여, 상기 8종의 마커는 SYT11 표적 치료가 필요한지 여부, SYT11 표적 치료제 투여에 대한 민감성 예측, 치료제 투여 후의 예후 예측 등의 정보를 얻기 위한 동반진단 마커로 이용될 수 있음을 확인할 수 있었다.

이상에서 본 발명은 기재된 실시예에 대해서만 상세히 설명되었지만 본 발명의 기술사상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 청구범위에 속함은 당연한 것이다

Claims

SYT11 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 미만형 위암의 진단 또는 예후 예측용 조성물.
청구항 1에 있어서,
ANGPTL2, CACNB1, CCL19, CD34, JAM3, SLIT2, THBS4 및 VIMENTIN으로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 적어도 하나 더 포함하는, 미만형 위암의 진단 또는 예후 예측용 조성물.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는, 상기 유전자의 mRNA의 양을 측정하는 제제 및 상기 유전자로부터 발현된 단백질의 양을 측정하는 제제 중 적어도 하나인 것인, 미만형 위암의 진단 또는 예후 예측용 조성물.
청구항 3에 있어서,
상기 유전자의 mRNA의 양을 측정하는 제제는 상기 유전자의 mRNA 또는 cDNA에 특이적으로 결합하는 프라이머(primer) 쌍 또는 프로브(probe)를 포함하는 것인, 미만형 위암의 진단 또는 예후 예측용 조성물.
청구항 3에 있어서,
상기 유전자로부터 발현된 단백질의 양을 측정하는 제제는 상기 유전자로부터 발현된 단백질에 특이적인 항체 또는 앱타머를 포함하는 것인, 미만형 위암의 진단 또는 예후 예측용 조성물.
청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는, 미만형 위암의 진단 또는 예후 예측용 키트.
분리된 생물학적 위 조직 시료로부터 SYT11 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계;를 포함하는, 미만형 위암의 진단 또는 미만형 위암의 치료 전략 결정을 위해 필요한 정보를 제공하는 방법으로서,
상기 미만형 위암의 치료 전략 결정을 위해 필요한 정보는, 미만형 위암의 예후 예측; 미만형 위암의 예후 평가; 및 위암 환자에서 SYT11 표적 치료제에 대한 유효성 평가;로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것인, 방법.
청구항 7에 있어서,
상기 분리된 생물학적 위 조직 시료로부터 ANGPTL2, CACNB1, CCL19, CD34, JAM3, SLIT2, THBS4 및 VIMENTIN으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계;를 더 포함하는 것인, 미만형 위암의 진단 또는 미만형 위암의 치료 전략 결정을 위해 필요한 정보를 제공하는 방법.
청구항 7 또는 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서,
상기 생물학적 위 조직 시료로부터 측정된 상기 유전자 발현 수준을, 대조군 시료로부터 측정된 기준값과 비교하는 단계;를 더 포함하는, 미만형 위암의 진단 또는 미만형 위암의 치료 전략 결정을 위해 필요한 정보를 제공하는 방법.
청구항 9에 있어서,
상기 생물학적 위 조직 시료로부터 측정된 상기 유전자 발현 수준이, 미만형 위암을 앓고 있지 않은 집단으로부터 측정된 상기 유전자 발현 수준의 평균값 또는 중간값보다 높을 경우 미만형 위암인 것으로 판정하는 단계를 더 포함하는, 미만형 위암의 진단 또는 미만형 위암의 치료 전략 결정을 위해 필요한 정보를 제공하는 방법.
청구항 9에 있어서,
상기 생물학적 위 조직 시료로부터 측정된 상기 유전자 발현 수준이, 미만형 위암을 앓고 있지 않은 집단으로부터 측정된 상기 유전자 발현 수준의 평균값 또는 중간값; 또는 미만형 위암 환자 집단으로부터 측정된 상기 유전자 발현 수준의 평균값 또는 중간값;보다 높을 경우 예후가 나쁠 것으로 판정하는 단계;를 더 포함하는, 미만형 위암의 진단 또는 미만형 위암의 치료 전략 결정을 위해 필요한 정보를 제공하는 방법.
청구항 7에 있어서,
상기 위암 환자에서 SYT11 표적 치료제에 대한 유효성 평가는 SYT11 표적 치료제의 투여의 필요성; SYT11 표적 치료제에 대한 약제 저항성의 발현 가능성; SYT11 표적 치료제에 대한 민감성; 및 SYT11 표적 치료제에 의한 치료의 예후 예측;으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 평가하는 것인, 미만형 위암의 진단 또는 미만형 위암의 치료 전략 결정을 위해 필요한 정보를 제공하는 방법.