KR102416614B1 - 방사선 저항성 지표 단백질 및 이의 검출방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 암 세포의 방사선 저항성 수준을 나타낼 수 있는 유전자 패널의 발현 수준 측정을 통해 암의 방사선 치료 예후를 예측하기 위한 정보제공방법, 진단용 조성물, 진단용 키트, 및 암의 방사선 치료 예후를 예측하기 위한 정보제공방법에 따른 예후 예측 정보를 기초로 하는 방사선 치료 병용 암 치료 방법에 관한 것이다.

Description

방사선 저항성 지표 단백질 및 이의 검출방법{RADIO-RESISTANCE BIOMARKER AND DETECTING METHOD THEREOF}
본 발명은 암 세포의 방사선 저항성 수준을 나타낼 수 있는 유전자 패널의 발현 수준 측정을 통한 암의 방사선 치료 예후를 예측하기 위한 정보제공방법, 진단용 조성물, 진단용 키트, 및 암의 방사선 치료 예후를 예측하기 위한 정보제공방법에 따른 예후 예측 정보를 기초로 하는 암의 방사선 치료 방법에 관한 것이다.
암 치료 방법에는 외과적 수술, 화학적 약물치료, 방사선 치료 등이 있으며, 최근 들어 방사선 치료의 중요성이 더욱 커지고 있다. 외과적 수술이 어려운 경우, 방사선 치료만으로도 종양을 효율적으로 완치한 사례들이 보고되고 있고, 방사선을 이용한 종양 치료 방법도 해를 거듭하면서 발전하고 있어, 방사선 치료는 환자에게 특별한 고통이나 거부감 없이 체내의 종양을 효율적으로 치료할 수 있는 방법으로 자리 잡고 있다. 통계적으로 암 환자의 약 30-50%는 치료시기 중 한 시점에 방사선 치료를 받는다. 방사선 치료를 받는 암 환자의 수가 매년 증가하고 있는 추세이므로 암 치료에 있어 방사선 치료의 중요성 또한 증가하고 있다.
방사선 치료는 단독으로 또는 화학요법제와 조합하여 다양한 형태의 암을 치료하기 위해 통상적으로 이용된다. 그러나, 방사선 치료의 유효성은 암의 성질, 환자 및 방사선이 기타 치료와 조합되는 것에 따라 다양하다. 일반적으로 방사선 치료가 널리 시행되고 있는 암으로는 자궁암, 인두암, 폐암, 뇌암, 유방암 등이 있다. 이들 암종이 방사선 치료의 주요 대상이 될지라도 방사선 치료시 반응이 좋지 않은 경우가 빈번하므로 치료 효율을 높이는 전략이 필요하다. 이와 더불어 방사선 치료가 잘 되어 초기반응은 좋을지라도 재발하는 경우가 빈번하여 재발 암에 대한 대책을 세우는 것도 방사선 치료의 효율을 높이는데 중요하다.
더욱이, 암세포의 방사선 내성 획득, 고선량 방사선 치료 시 정상 조직의 손상 등이 방사선 치료의 효율을 저하시키는 문제점으로 지적되고 있어, 방사선 치료의 효율을 증진시키기 위한 연구가 필요한 실정이다. 현재 방사선 치료는 외과적 수술이나 화학적 약물요법과 함께 효과적인 암 치료법으로서, 환자의 암 조직 부분에 방사선을 처리하여 암세포를 사멸시킬 목적으로 사용되고 있다.
암세포에 대한 방사선 치료의 감수성의 차이가 존재하지만 방사선 치료 전에 개인별로 방사선에 대한 감수성을 예측할 수 있는 기술을 개발하면, 개인별로 방사선 처리량을 조절하여 암을 치료함으로써, 개인에게 가장 적합한 방사선 치료를 제공할 수 있을 것이다.
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 신규의 방사선 저항성 지표 단백질들을 발굴하였다. 이에 따라, 암 치료시 암의 방사선 저항성 유전자 패널의 발현수준을 측정하여 방사선 치료에 대한 저항성 여부 또는 방사선 치료 예후를 예측할 수 있을 수 있도록 본 발명을 완성하였다.
대한민국 특허공개공보 제2012-0077567호 대한민국 특허등록공보 제1228148호
본 발명의 하나의 목적은 CLK4, ZNF354B, GPX3 및 ZNF80 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 둘 이상의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 암의 방사선 저항성 또는 민감성 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 하나의 목적은 CLK4, ZNF354B, GPX3 및 ZNF80 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 둘 이상의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 암의 방사선 저항성 또는 민감성 진단용 조성물을 포함하는 암의 방사선 저항성 또는 민감성 진단용 키트를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 하나의 목적은
(a) CLK4, ZNF354B, GPX3 및 ZNF80 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 둘 이상의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 단계;
(b) 상기 측정된 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 정상 대조군의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준과 비교하는 단계;를 포함하는 암환자의 방사선 저항성 또는 민감성 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 하나의 목적은
(a) 상기 암환자의 방사선 저항성 또는 민감성 진단을 위한 정보 제공 방법에 따른 예측 정보로 방사선 저항성 또는 민감성을 가진 대상체를 분류하는 단계;
(b) 상기 방사선 민감성 가진 대상체에게 방사선을 처리하는 단계;를 포함하는 방사선 처리에 따른 암 치료 방법을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
본 명세서에서 사용되는 모든 용어(기술 및 과학적 용어를 포함)는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공통적으로 이해될 수 있는 의미로 사용될 수 있을 것이다. 또 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 용어들은 명백하게 특별히 정의되어 있지 않은 한 이상적으로 또는 과도하게 해석되지 않는다.
이하, 본 발명에 따른 암의 방사선 저항성 또는 민감성 진단용 조성물, 키트 및 이를 이용한 정보 제공방법과 암 치료 방법에 대하여 상세히 설명한다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는, CLK4, ZNF354B, GPX3 및 ZNF80 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 둘 이상의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 암의 방사선 저항성 또는 민감성 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
CLK4 (CDC Like Kinase 4, NCBI gene ID: 57396)은 세린- 및 아르기닌-풍부 단백질을 인산화시키고 alternative splicing을 조절하는데 관여하는 것으로 알려져 있다. 또한 abscission checkpoint에 관여하여 세포 분열시 염색체의 손상을 막는다고 보고되어 있다. (PMID: 27126587)
ZNF354B (Zinc Finger protein 354B, NCBI gene ID: 117608)은 염기서열 특이적인 DNA 결합 단백질로, 인간세포에서의 기능은 현재까지 잘 알려져 있지 않으나, 생쥐에서 종양 억제 유전자의 프로모터에 결합하여 발현을 억제한다고 알려져 있다. (PMID: 24105743)
GPX3 (Glutathione peroxidase 3, NCBI gene ID: 2878)은 glutathione peroxidase family에 속하며, 과산화수소와 같은 활성산소의 해독 및 제거 기능을 가진다.
ZNF80 (Zinc Finger protein 80, NCBI gene ID: 7634)는 DNA 결합 단백질로 유전자의 전사에 관여할 것으로 여겨지나, 현재까지 기능이 거의 알려지지 않았다.
본 발명에 따른 진단용 조성물은, CLK4, ZNF354B, GPX3 및 ZNF80 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 둘 이상의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제, 셋 이상의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제, CLK4, ZNF354B, GPX3 및 ZNF80 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함한다.
본 발명에 있어서, “방사선 치료”는 방사선을 조사하여 암 세포의 DNA 손상을 통해 세포분열을 억제함으로써 세포사멸을 유도하는 기전을 통해 암을 치료하는 것을 의미한다. 방사선 치료는 고형암의 근치적(curative), 보조적(adjuvant), 고식적(palliative) 목적으로 단독으로 또는 수술적 치료와 함께, 항암화학요법이나 방사선 민감제(radiation sensitizer)와의 병합요법으로 많은 암 환자에게 시행되고 있다.
본 발명에 있어서, "방사선 저항성(radio-resistance)"은 방사선 조사에 의해 쉽게 영향을 받지 않으며, 방사선에 노출시 세포 복구 또는 증식에 거의 변화가 없는 상태를 말한다.
본 발명에 있어서, "방사선 민감성(radio-sensitive)"은 방사선 조사에 의해 쉽게 영향을 받으며, 방사선에 노출시 세포 복구 또는 증식에 변화를 보이는 상태를 말한다.
본 발명의 방사선 저항성 또는 민감성 진단용 조성물은 정상 암세포 대비 방사선 저항성 암세포에서 차등적 발현수준을 갖는 유전자로 구성되어, 개체나 세포의 방사선 저항성을 판단할 수 있게 한다. 즉, 본 발명의 방사선 저항성 진단용 조성물의 발현 수준이 대조군 보다 높거나 낮은 개체나 암세포는 방사선 저항성 또는 민감성을 갖는 것으로 판단할 수 있다.
구체적으로, CLK4, ZNF354B, GPX3 및 ZNF80 유전자는 방사선 저항성 암종에서 하향 조절되는 유전자일 수 있다. 이에 따라, CLK4, ZNF354B, GPX3 및 ZNF80 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 둘 이상의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준이 정상 대조군과 대비하여 낮게 나타나는 경우 방사선 저항성이 존재하는 것으로 판단될 수 있고, 높게 나타나는 경우 방사선 저항성이 낮거나 방사선 민감성이 존재하는 것으로 판단될 수 있다. 예를 들어, 상기 선택된 2종, 3종 또는 4종의 유전자가 모두 낮게 발현하는 경우 방사선 저항성이 높은 것으로 판단될 수 있고, 상기 2종, 3종 또는 4종의 유전자가 모두 높게 발현하는 경우 방사선 저항성이 낮은 것으로 판단될 수 있다.
위와 같은 하향 조절 패널을 이용하여, 방사선 치료 대상 암의 방사선 저항성 또는 민감성 여부 및 그 수준을 판단하면, 이를 반영하여 방사선 치료의 방사선 조사량을 정할 수 있기 때문에, 방사선 치료의 효율 및 치료 결과를 증진시킬 수 있다.
본 발명에서 용어, "마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)"란, 암세포 또는 암 질환을 가진 개체를 방사선 저항성 세포 또는 개체, 방사선 민감성 세포 또는 개체와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 암세포에 비하여 방사선 저항성을 가진 암세포 또는 개체에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산 (예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질 또는 당 (예: 단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자들을 포함한다.
본 발명의 용어 “암”은 종양, 신생물과 상호 호환적으로 사용되며, 생장, 증식 또는 생존이 대조군으로 활용되는 정상 세포의 생장, 증식 또는 생존 보다 우수한 세포 또는 세포 집단, 예를 들어, 세포 증식성 또는 분화성 장애를 의미한다. 전형적으로, 상기 생장은 통제를 벗어난다. 구체적으로 상기 암은 유방암, 폐암, 대장암, 전립선암, 비소세포성 폐암, 결장암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부 암, 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 결장암, 나팔관암, 자궁내막암, 자궁경부암, 질암, 음문암, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS; central nervous system) 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종 등일 수 있으며, 더욱 구체적으로 폐암 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 암은 악성 암뿐만 아니라 전-악성 암도 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예 따르면, 상기 암은 폐암이다.
본 발명에서 “시료”는 방사선 치료(방사선 조사)를 받거나, 방사선 치료 여부의 결정이 필요한 대상체로부터 유래한 시료를 말할 수 있다. 예를 들어, 바이오 마커로서 상기 CLK4, ZNF354B, GPX3 및/또는 ZNF80의 발현을 특정할 수 있는 시료를 말하며, 환자의 조직 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함할 수 있으나, 여기에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, “발현수준”은 발현 시그니처(expression signature), 발현 프로파일(expression profile)과 상호 호환적으로 사용될 수 있으며, 방사선 저항성 유전자 패널 둘 이상의 발현 수준을 포함할 수 있다. 상기 발현수준은 발현 증가 또는 발현 감소를 포함할 수 있다. 또한, 상기 발현수준은 방사선 치료 전 및/또는 후에 개체로부터 분리된 암 세포로부터 측정한 것일 수 있다.
생물학적 시료 중의 유전자 발현 수준은 mRNA 또는 단백질의 양을 확인함으로써 확인할 수 있다.
본 발명에서 있어서, “mRNA 발현수준 측정”이란, 방사선 저항성 및 민감성을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 상기 마커 유전자들의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정한다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 “단백질 발현수준 측정”이란, 방사선 저항성 또는 민감성을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 상기 마커 유전자로부터 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 바람직하게는, 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블롯, 엘라이자(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선면역분석(Radioimmunoassay, RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 유전자 mRNA의 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머를 공지의 데이터 베이스에 공지된 상기 유전자의 서열을 바탕으로 당업자가 다양한 프로그램을 이용하여 제작할 수 있다.
본 발명에서의 용어 "프라이머"란, 짧은 자유 3'말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명의 프라이머는, 각 마커 유전자 특이적인 프라이머로 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산이다. 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예: 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이트화제(예: 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등) 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 본 발명의 핵산 서열은 또한 검출 가능한 시그널을 직접적으로 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 표지의 예로는 방사성 동위원소, 형광성 분자, 비오틴 등이 있다.
또한 상기 유전자의 단백질 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, “항체”란, 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 상기한 바와 같이 방사선 저항성 및 민감성 마커 단백질이 규명되었으므로, 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 다클론 항체는 상기한 방사선 저항성 또는 민감성 마커 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다. 단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler 및 Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제할 수 있다.
또한 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
본 발명의 구체적인 실시양태에 따르면, 폐암에서 정상 대조군 시료에 비해 방사선 저항성 유전자 패널 CLK4, ZNF354B, GPX3 및/또는 ZNF80의 발현이 감소하였으며, 2 종의 방사선 저항성 폐암 세포주의 전사체(trsnscriptome) 분석에서 CLK4, ZNF354B, GPX3 및/또는 ZNF80의 발현 감소의 결과를 확인하였다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 방사선 저항성 또는 민감성 진단용 조성물을 포함하는 암의 방사선 저항성 또는 민감성 진단용 키트를 제공한다. 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, 마이크로어레이 또는 단백질 칩 키트인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 진단용 키트는 상기 방사선 저항성 또는 민감성 진단용 조성물을 사용하여 당업계에서 사용되는 통상의 방법에 따라 제조할 수 있다. 또한, 상기 방사선 저항성 또는 민감성 유전자의 발현변화 측정은 본 발명에 따른 방사선 저항성 또는 방사선 민감성 진단용 마커를 포함하는 키트를 사용하 여 수행할 수 있다.
본 발명에서의 용어, "키트"란, CLK4, ZNF354B, GPX3 및 ZNF80 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 둘 이상의 mRNA 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준을 확인하여 암의 방사선 저항성 또는 민감성 여부를 진단할 수 있는 도구를 의미한다. 본 발명의 암의 방사선 저항성 여부 진단용 키트에는 방사선저항성 진단마커로서 CLK4, ZNF354B, GPX3 및 ZNF80 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 둘 이상의 유전자 발현수준을 측정하기 위한 프라이머, 프로브 또는 선택적으로 마커를 인지하는 항체뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 1종 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액, 또는 장치가 포함될 수 있다.
또한, 상기 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 설명서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다.
또한, 설명서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 (a) CLK4, ZNF354B, GPX3 및 ZNF80 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 둘 이상의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 단계;
(b) 상기 측정된 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 정상 대조군의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준과 비교하는 단계;를 포함하는 암환자의 방사선 저항성 또는 민감성 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
상기 (a) 단계에서의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 것은 앞서 조성물 및 키트에서 살핀 내용이 적용될 수 있다.
암환자의 방사선 저항성 또는 민감성 진단을 위한 정보 제공 방법은 (b) 상기 측정된 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 정상 대조군의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준과 비교하는 단계;를 포함한다.
상기 비교에 따라, 측정된 mRNA 또는 단백질의 수준이 정상대조군과 대비하여 낮은 경우 방사선 저항성이 높은 것으로 판단한다.
구체적으로, CLK4, ZNF354B, GPX3 및 ZNF80 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 둘 이상, 셋 이상 또는 이들 모두의 발현 수준이 정상 수준보다 낮은 경우, 해당 암환자는 방사선 저항성이 높은 것으로 판단될 수 있다.
이에 따라, 상기 암환자의 방사선 저항성 또는 민감성 진단을 위한 정보 제공 방법은 (c) 측정된 mRNA 또는 단백질의 수준이 정상대조군과 대비하여 낮은 경우 암환자가 방사선 치료에 저항성을 나타내는 것으로 판단하는 단계;를 더 포함할 수 있다.
이를 기초로 하여 또한 예후 예측 정보를 제공할 수 있으며, "예후 예측"이란, 방사선 조사 후, 정상 대조군과 비교하여 방사선 저항성 암세포주에서 발현차이를 보이는 유전자를 통해 방사선 저항성 또는 민감성 암세포를 예측하는 것이다.
또한, 상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 (a) 상기 암환자의 방사선 저항성 또는 민감성 진단을 위한 정보 제공 방법에 따른 예측 정보로 방사선 저항성 또는 민감성을 가진 대상체를 분류하는 단계;
(b) 상기 방사선 민감성 가진 대상체에게 방사선을 처리하는 단계;를 포함하는 방사선 처리에 따른 암 치료 방법을 제공하는 것이다.
여기서 방사선 민감성을 가진 대상체는 앞서 CLK4, ZNF354B, GPX3 및 ZNF80 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 둘 이상, 셋 이상 또는 이들 모두의 발현 수준이 정상 대조군 수준보다 동등하거나 높은 경우를 의미할 수 있다.
본 발명의 일시양태에 따르면, 발현이 감소한 방사선 저항성 유전자 패널의 유전자 각각은 폐암 환자에서 발현감소시 고위험군으로 생존율 저하와 밀접한 상관관계가 있는 것으로 분석되어, 폐암 환자에서 방사선 저항성 바이오 마커로 활용될 수 있음을 확인하였다. 또한, 발현이 감소한 방사선 저항성 유전자 패널 유전자 CLK4, ZNF354B, GPX3 및 ZNF80 의 발현 감소는 폐암 환자의 생존율 저하와 밀접한 상관관계가 있는 것으로 분석되어, 이 유전자 발현 패널 분석이 폐암 환자에서 방사선 저항성 바이오 마커로 활용될 수 있음을 확인하였다. 또한, 이 유전자 패널들의 발현은 폐암 뿐만 아니라 암 전체를 대상으로 한 분석에서도 마찬가지로 암 환자의 생존율과 밀접한 상관관계가 있는 것으로 분석되었다.
이에 따라, 상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 CLK4, ZNF354B, GPX3 및 ZNF80 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 둘 이상의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 암 예후 예측용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 CLK4, ZNF354B, GPX3 및 ZNF80 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 둘 이상의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 암 예후 예측용 키트를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 (a) CLK4, ZNF354B, GPX3 및 ZNF80 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 둘 이상의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 단계;
(b) 상기 측정된 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 정상 대조군의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준과 비교하는 단계;를 포함하는 암의 예후를 예측하는데 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서 상기 “암 예후 예측용 조성물”, “암 예후 예측용 키트” 및 “암의 예후를 예측하는데 필요한 정보를 제공하는 방법”에 적용되는 내용은 앞서 살핀 “암의 방사선 저항성 또는 민감성 진단용 조성물”, ”방사선 저항성 또는 민감성 진단용 키트”, “암환자의 방사선 저항성 또는 민감성 진단을 위한 정보 제공 방법”의 내용이 모순되지 않는 한도 내에서 동일하게 적용되거나 목적에 맞게 변형되어 적용될 수 있다.
예를 들어, 측정된 CLK4, ZNF354B, GPX3 및 ZNF80로부터 선택되는 적어도 두 개 이상, 세 개 이상 또는 모두가 정상대조군과 대비하여 낮게 발현되는 경우 암의 예후가 나쁜 것으로 판단될 수 있으며, 정상대조군과 대비하여 높은 경우 암의 예후가 좋거나 양호한 것으로 판단될 수 있다.
예를 들어, 상기 암 예후 예측용 조성물은 CLK4 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 것일 수 있다. 또한, CLK4 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제; 및 ZNF354B, ZNF80 또는 이들 모두의 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 암 예후 예측용 조성물일 수 있다.
바람직하게, CLK4 및 ZNF80 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 암 예후 예측용 조성물일 수 있다.
암 예후 예측용 키트; 암의 예후를 예측하는데 필요한 정보를 제공하는 방법에서 상기 암 예후 예측용 조성물에 관한 내용이 적절히 변형되어 적용될 수 있다.
예를 들어, 상기 암 예후 예측용 조성물은 폐암에 대한 암 예후 예측용 조성물일 수 있다. 구체적으로, 폐암 예후 예측용 조성물은 GPX3 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 것일 수 있다. 또한, GPX3 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제; 및 ZNF354B, ZNF80 또는 이들 모두의 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 폐암 예후 예측용 조성물일 수 있다. 바람직하게, GPX3, ZNF354B 및 ZNF80 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 폐암 예후 예측용 조성물일 수 있다.
암 예후 예측용 키트로써 폐암 예후 예측용 키트, 암의 예후를 예측하는데 필요한 정보를 제공하는 방법으로써 폐암의 예후를 예측하는데 필요한 정보를 제공하는 방법에서, 상기 폐암 예후 예측용 조성물에 관한 내용이 적절히 변형되어 적용될 수 있다.
이러한 "예후"는 암과 같은 질환의, 예를 들어 재발, 전이성 확산, 및 약물 내성을 비롯한 암-기인성 사망 또는 진행의 가능성 등의 병의 경과 및 완치 여부를 의미한다.
"양호한 예후"는 암 환자, 특히 폐암 환자의 질병이 완치될 가능성을 의미하고, "양호하지 않은 예후"는 투병 중인 암 또는 종양의 재생(relapse) 또는 재발(recurrence), 전이 또는 사망할 가능성이 있음을 의미한다. 양호한 결과를 갖는 것으로 분류된 암 환자는 투병 중인 암 또는 종양이 없는 상태이다.
본 발명에서 용어, "예측"이란 환자가 화학요법 또는 방사선 치료 등의 치료법에 대해 선호적으로 또는 비선호적으로 반응하여 환자가 치료, 예를 들어 특정 치료제, 및/또는 원발성 종양의 수술로 제거, 및/또는 암의 재발없이 특정 시기 동안 화학요법으로 치료된 후의 생존 여부 및/또는 가능성과 관련된다. 본 발명의 예측방법은 임의의 특정 환자에 대한 가장 적절한 치료방식을 선택하여 적용함으로써 임상적으로 사용될 수 있다. 본 발명의 예측방법은 환자가, 예를 들어 소정의 치료제 또는 조합물, 외과적 개입, 화학요법 등의 투여를 비롯한 소정의 치료 처방과 같은 치료법에 선호적으로 반응하는지를 확인하거나, 치료 처방 후 환자의 장기 생존 또는 전신 또는 국소 재발이 가능한지를 예측할 수 있다. 또한 이를 통하여 불필요한 보조 항암요법을 최소화하거나 전신 또는 국소 재발이 예측되는 환자에게는 더욱 효과적인 보조 항암요법을 사용할 수 있도록 계획할 수 있다.
본 발명에서 용어, "예후 예측용 조성물"은 암에 대한 치료 후 예후가 양호한 환자와 양호하지 않은 환자를 구별하여 재발 가능성을 예측할 수 있는 물질로, 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백 등과 같은 유기 생체 분자 등을 예후 예측용 마커로서 포함한다.
본 발명은 방사선 치료에 대한 저항성 여부 또는 방사선 치료 예후를 우수한 효과로 예측할 수 있다. 특히, 방사선 저항성 유전자 패널의 활성을 확인하면서 방사선 치료와 병용 시 더욱 효과적으로 암을 치료할 수 있다.
또한, 암, 특히 폐암을 대상으로 하여 임상 예후 정보를 제공함으로써 높은 정확도 및 민감도를 통해 암을 체계적으로 관리할 수 있다.
도 1은 폐암 세포주에서 방사선 저항성 세포주를 제작한 방법과 세포의 모양을 확인한 결과이다.
도 2는 제작한 폐암 방사선 저항성 세포주의 방사선 민감도를 확인한 결과이다.
도 3은 제작한 폐암 방사선 저항성 세포주의 전사체 분석실험을 통해 방사선 저항성 관련 유전자를 분석한 결과이다.
도 4는 제작한 폐암 방사선 저항성 세포주 2종에서 공통적으로 유의미하게 발현이 변화한 방사선 관련 유전자를 분석한 내용이다.
도 5는 분석한 방사선 저항성 관련 유전자 중 폐암 환자의 생존율과 연관된 유전자를 선별한 결과이다.
도 6은 분석한 방사선 저항성 관련 유전자 중 폐암 환자의 생존율과 연관된 유전자의 목록이다.
도 7은 방사선 저항성 세포에서 폐암 환자의 생존율과 연관된 방사선 저항성 관련 유전자의 발현을 검증한 결과이다.
도 8은 인체 폐암 환자군에서 방사선 저항성 유전자 각각의 발현과 생존율의 상관관계를 확인한 결과이다.
도 9는 인체 전체 암 환자군에서 방사선 저항성 유전자 조합의 발현과 생존율의 상관관계를 확인한 결과이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1. 방사선 저항성 폐암 세포주 제작 및 방사선 민감도 측정
방사선 저항성 폐암 세포주를 제작하기 위해, 인간 폐암 세포주 H1975, H2126 세포를 대상으로 회 당 2 Gy씩 조사하여 총 60 Gy를 조사하였다. 방사선 조사가 완료된 세포는 방사선 민감도를 측정하기 위해, 방사선을 선량별로 조사한 후, 10-14 일 동안 배양하여 집락 형성능(clonogenic assay)를 통해 평가하였다. 방사선 저항성이 확인된 세포주는 마이코플라즈마 검사 후 세포주로 확립하였다.
전체 과정의 모식도를 도 1의 A에 나타내었다. 또한, 방사선 저항성 폐암세포주의 제조 과정에서의 세포 형상 변화의 결과를 도 1의 B에 나타내었다.
상기 2 종의 인간 폐암 세포주 및 2 종의 인간 폐암 방사선 저항성 세포주를 각각 10% 우태아혈청(FBS) 및 1% 페니실린-스프렙토마이신(10,000 U/ml)이 첨가된 RPMI-1640 배지에서 5% CO2 및 37℃의 조건에서 유지 배양하였다.
각 세포주를 60 mm 디쉬에 적당한 세포수로 분주하고 24시간이 경과한 다음, 방사선을 선량별로 조사하고 5% CO2 및 37℃의 조건에서 10-14일간 배양하였다. 그 후, 형성된 세포 집락(콜로니)을 인산완충용액(Phosphate Buffered Saline;PBS)로 세척하고 1% 메틸린블루가 포함된 100% 메탄올 혼합액으로 염색하였다. 염색된 세포 집락(세포수 50개 이상의 세포집락)은 실온 건조한 후 각 디쉬 마다 육안으로 계수하고 그 사진을 확보하여 그 결과를 도 2에 나타냈다.
도 2의 A는 H1975 세포, B는 H2126 세포를 나타낸다.
도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 저항성 세포주(RR)의 경우, 방사선 조사에도 불구하고 세포 사멸이 잘 이루어지지 않고 집락 형성능이 높음을 나타내었다.
실시예 2. 폐암 방사선 저항성 관련 유전자 발굴
폐암 방사선 저항성 관련 유전자를 발굴하기 위하여, 방사선 저항성 세포주 2종과 그 모세포주에서 RNA를 추출하여 RNA-Sequencing을 통해 전사체 분석을 2회 반복 수행하였다. 전사체 분석 수행 전 Agilent 사의 2100 bioanalyzer system을 이용하여 추출한 전체 RNA의 품질을 검사하였다. 유전자 library 구성은 Clontech 사의 SMARTer Stranded RNA-Seq Kit으로 제작하였고 Illumina HiSeq 2500을 통해 분석되었다. 유전자 발현 데이터는 Quantile normalization 법으로 보정하였다. 발현이 변화된 유의미한 유전자의 발굴을 위해, P-value가 0.05 이하인 Raw Count가 4 이상인 값 중 1.5배 변화한 유전자를 25,737개의 유전자 데이터로부터 선별하였다.
그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3의 A는 방사선 저항성 인간 폐암 세포주 H1975에서 1.5배 이상 증가 또는 감소된 유전자의 수와 방사선 저항성 인간 폐암 세포주 H2126에서 1.5배 이상 증가 또는 감소된 유전자의 수를 나타낸다. 여기서 확인할 수 있는 바와 같이, H1975 세포주에서는 총 2168개의 발현이 증가된 유전자와 총 1545개의 발현이 감소된 유전자가 확인되었다. H2126 세포주의 경우 총 324개의 발현이 증가된 유전자와 392개의 발현이 감소된 유전자가 확인되었다.
두 세포주에서 공통적으로 발현이 감소한 유전자를 분석하여 도 3B에 나타내었으며, 총 42종의 유전자(1.5배 이상 감소)가 확인되었다.
이와 같이, 두 세포주 모두에서 발현 수준이 감소된 유전자의 리스트를 도 4에 목록으로 나타내었다. 구체적으로, 발현이 감소한 유전자 목록을 H1975 세포를 기준으로 발현이 낮은 순으로 나타냈다.
실시예 3. 폐암 환자에서 생존율에 영향을 미치는 유전자 중 방사선 저항성 관련 유전자 발굴
폐암 환자에서 생존율에 영향을 미치는 유전자 목록을 조사하기 위해, 공개된 유전체 데이터베이스 자료인 TCGA (The Cancer Genome Atlas) 데이터를 활용하여 분석하였다. TCGA 데이터 분석은 LinkedOmics 소프트웨어를 활용하였다. 유의미한 폐암 환자의 생존율 관련 유전자를 확보하기 위해, TCGA LUAD(Lung Adenocarcinoma) 데이터에서 생존율을 분석하고 P-value가 0.05 이하인 유전자를 확인하였고 도 5A에 나타냈다. 도 5A는 LinkedOmics 소프트웨어를 활용하여 TCGA LUAD 샘플에서 생존율에 영향을 미치는 유의미한 유전자를 발굴한 결과이다. 총 4637개의 유전자가 확인되었고, 그 중 발현이 높을수록 생존율이 낮은 유전자는 1843개, 발현이 낮을수록 생존율이 낮은 유전자는 2794개로 나타났다.
또한, 도 5의 B에 나타낸 바와 같이, 방사선 저항성 세포에서 낮게 발현되고, 발현이 낮을수록 환자의 생존율이 낮을 것으로 기대되는 유전자를 분석하여 벤 다이어그램으로 나타내었으며, 총 4종의 유전자를 분리하였다. 여기서, 도 5 b는 발현이 낮을수록 방사선 저항성을 가지면서 폐암 환자의 생존율이 낮은 유전자로 총 4개로 나타났다.
이 유전자들의 목록을 방사선 저항성 유전자 패널로 선정하고 그 목록을 도 6에 나타냈다. LogHR 값은 환자의 생존율을 계산한 HR(Hazard Ratio)를 자연로그를 취한 값으로, 유전자 발현이 높은 그룹에서 이 값이 높을수록 환자의 생존율이 나쁨을 의미한다. 따라서 양의 값은 유전자의 발현이 높은 경우 생존율이 나쁘고, 음의 값은 유전자의 발현이 낮은 경우 생존율이 나쁨을 나타낸다. 또한 방사선 저항성 세포에서 각 유전자들의 발현도 자연로그를 취한 값으로 나타냈다.
도 6은 도 5B의 유전자 목록을 나타낸 것으로 LogHR 값이 높은 순으로 나타냈다.
실시예 4. 방사선 저항성 유전자 패널의 발현 확인
방사선 저항성 세포에서 변화된 방사선 저항성 유전자 패널의 발현수준을 확인하기 위하여, 방사선 저항성 세포주 2종과 그 모세포주에서 RNA를 추출하여 qPCR 분석을 실시하였다. 해당 세포주를 PBS로 세척 후, TRIzol 시약을 사용하여 RNA를 분리하였다. 분리 방법은 해당 시약회사의 프로토콜을 준수하였다. NanoDrop으로 추출한 RNA를 정량 후, 1 ug의 RNA를 역전사하여 각 유전자의 프라이머(표 1)를 사용하여 LightCycler 96 기기를 이용하여 발현을 확인하였다. 이때, 유전자 발현 분석의 내부 대조군으로 GAPDH 유전자를 사용하여 각 유전자의 발현 비율을 도 7에 나타냈다.
[표 1]
Figure 112020058151073-pat00001
도 7A는 H1975 세포와 방사선저항성 H1975 세포주에서, 도 7B는 H2126세포와 방사선 저항성 H2126세포주에서의 유전자 발현 증감을 확인한 것으로, CLK4, ZNF354B, GPX3, ZNF80은 2종의 폐암 모세포주 대비 방사선 저항성 세포주에서 모두 감소되었다.
상기 결과를 통해, 방사선 저항성 유전자 패널의 발현은 전사체 분석의 결과와 동일하게 나타나는 것이 확인되었다.
실시예 5. 폐암 환자에서 방사선 저항성 유전자 패널의 발현에 따른 생존곡선 분석
상기 도출된 방사선 저항성 유전자들의 발현에 따른 폐암 환자의 생존율과의 상관관계를 확인하기 위해, LinkedOmics 소프트웨어로 공개된 유전체 데이터베이스 자료인 TCGA LUAD 데이터를 활용하여, 각각의 유전자 발현에 따른 폐암 환자의 생존율을 카플란-메이어(Kaplan-Meier) 생존곡선을 통해 분석하고 시각화하여 도 8A에 나타냈다. CLK4의 증가에 따른 폐암환자 생존율 위험도는 0.764로 CLK4의 감소가 폐암 환자의 생존율 감소에 유의적 인자임을 나타냈다. 또한 GEPIA2 소프트웨어로 TCGA LUAD 데이터를 활용하여, 방사선 저항성 유전자들의 조합에 따른 폐암 환자의 생존율을 카플란-메이어 생존곡선을 통해 분석하고 시각화 하여 도 8B에서는 2개 유전자 조합과 폐암환자 생존율, 도 8C에서는 3개 유전자 조합과 폐암환자 생존율, 도 8D에서는 4개 유전자 조합과 폐암환자 생존율을 나타냈다. 한편 감소되는 유전자 패널군에서의 폐암 생존율과의 상관관계 분석결과를 보면, ZNF80 + GPX3 + ZNF354B의 조합에서 위험도가 0.68로 가장 유의적이었으며, CLK4 + XNF80, GPX3 + ZNF354B, GPX3 + ZNF80가 각각 0.70, 0.71, 0.72로 나타났다. 4가지 감소되는 유전자 패널 조합(CLK4 + XNF80 + GPX3 + ZNF354B) 과 폐암환자 생존율 위험도도 0.73으로 확인되었다.
실시예 6. 전체 암 환자에서 방사선 저항성 유전자 패널의 발현에 따른 생존곡선 분석
상기 방사선 저항성 유전자 패널이 폐암환자에 국한해서 뿐만 아니라 전체 암 환자의 생존율에 미치는 영향을 분석하고자 GEPIA2 소프트웨어로 전체 TCGA 데이터를 활용하여, 방사선 저항성 유전자들의 조합에 따른 암 환자의 생존율을 카플란-메이어 생존곡선을 통해 분석하고 시각화 하여 도 9에 나타냈다. 감소되는 유전자 패널군에서의 전체 암환자 생존율과의 상관관계 분석결과를 보면, CLK4 + XNF80의 조합에서 위험도가 0.7로 가장 유의적이었으며, ZNF354B + ZNF80 + CLK4의 3개 조합 위험도가 0.78로, 4가지 감소되는 유전자 패널 조합(CLK4 + XNF80 + GPX3 + ZNF354B) 과 암 환자 생존율 위험도는 0.85로 확인되었다.
상기 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명에서는, CLK4, ZNF354B, GPX3, 및/또는 ZNF80의 경우 방사선 치료에 대한 저항성 여부 또는 방사선 치료 예후를 예측할 수 있다. 특히, 방사선 저항성 유전자 패널의 활성을 확인하면서 방사선 치료와 병용 시 더욱 효과적으로 암을 치료할 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> KOREA INSTITUTE OF RADIOLOGICAL & MEDICAL SCIENCES <120> RADIO-RESISTANCE BIOMARKER AND DETECTING METHOD THEREOF <130> 112P <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZNF80 Forward Primer <400> 1 gttttacagg agcaggtctc ca 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZNF80 Reverse Primer <400> 2 gttaaacacg ctcccacatt cc 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GPX3 Forward Primer <400> 3 tggtcattct gggctttccc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GPX3 Reverse Primer <400> 4 ccagaagagg cggtcagatg 20 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZNF354B Forward Primer <400> 5 cgagacagtt cactgttgca ga 22 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZNF354B Reverse Primer <400> 6 cacctcagca cccagacttt 20 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CLK4 Forward Primer <400> 7 gctatcgtgg aagtcacaag cg 22 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CLK4 Reverse Primer <400> 8 ctcgctcatt caaggacctt gc 22 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH Forward Primer <400> 9 gtctcctctg acttcaacag cg 22 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH Reverse Primer <400> 10 accaccctgt tgctgtagcc aa 22

Claims (19)

  1. CLK4, ZNF354B, GPX3 및 ZNF80 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 둘 이상의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 폐암의 방사선 저항성 또는 민감성 진단용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제는 GPX3 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 폐암의 방사선 저항성 또는 민감성 진단용 조성물.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 유전자 mRNA의 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머를 포함하는 것인 폐암의 방사선 저항성 또는 민감성 진단용 조성물.
  6. 제1항, 제2항 및 제5항 중 어느 한 항에 따른 폐암의 방사선 저항성 또는 민감성 진단용 조성물을 포함하는 폐암의 방사선 저항성 또는 민감성 진단용 키트.
  7. 제6항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, 마이크로어레이 및 단백질 칩으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 키트인 폐암의 방사선 저항성 또는 민감성 진단용 키트.
  8. (a) CLK4, ZNF354B, GPX3 및 ZNF80 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 둘 이상의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 단계;
    (b) 상기 측정된 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 정상 대조군의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준과 비교하는 단계;를 포함하는 폐암 환자의 방사선 저항성 또는 민감성 진단을 위한 정보 제공 방법.
  9. 제8항에 있어서, (a) GPX3 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 단계;를 포함하는, 폐암 환자의 방사선 저항성 또는 민감성 진단을 위한 정보 제공 방법.
  10. 삭제
  11. 삭제
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