KR101859652B1

KR101859652B1 - Psmb8을 측정하는 제제를 포함하는 수술전 화학방사선치료 반응성 예측용 조성물 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101859652B1
Application number: KR1020160132302A
Authority: KR
Inventors: 김진천; 김용성; 조동형; 하예진; 노선애; 김선규
Original assignee: 울산대학교 산학협력단; 재단법인 아산사회복지재단
Priority date: 2016-10-12
Filing date: 2016-10-12
Publication date: 2018-06-28
Also published as: KR20180040420A

Abstract

본 발명은 PSMB8을 측정하는 제제를 포함하는 암세포의 방사선치료 저항성 또는 감수성 예측용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 암세포의 방사선치료 저항성 또는 감수성 예측용 키트, PSMB8 유전자 또는 단백질의 수준을 확인하는 단계를 포함하는 암 환자의 방사선치료 저항성 또는 감수성 예측을 위한 정보의 제공방법에 관한 것이다. 본 발명의 암세포의 방사선치료 저항성 또는 감수성 예측용 조성물의 사용에 의해서, 암 환자의 수술적 치료 전 화학방사선치료에 대한 반응성을 예측하여 맞춤화된 방사선 치료를 제공할 수 있고 치료 효과의 증진 및 부작용을 감소시킬 수 있는 효과가 있다.

Description

PSMB8을 측정하는 제제를 포함하는 수술전 화학방사선치료 반응성 예측용 조성물 및 이의 용도{Composition for predicting of preoperative chemoradiotherapy comprising PSMB8 marker and uses thereof}

본 발명은 PSMB8을 측정하는 제제를 포함하는 암세포의 방사선치료 저항성 또는 감수성 예측용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 암세포의 방사선치료 저항성 또는 감수성 예측용 키트, PSMB8 유전자 또는 단백질의 수준을 확인하는 단계를 포함하는 암 환자의 방사선치료 저항성 또는 감수성 예측을 위한 정보의 제공방법에 관한 것이다.

전 세계에 걸쳐 암은 인간의 건강을 위협하는 심각한 문제이다. 현재 암을 치료하거나 진단하기 위하여 많은 방법과 기술들이 개발되고 있으나, 더 안전하고 효과적인 치료 방법을 찾기 위한 기술이 요구되고 있다.

통계적으로 암 환자의 약 30-50%는 치료시기 중 한 시점에 방사선 치료를 받는다. 그러나, 방사선 치료의 유효성은 암의 성질, 환자 및 방사선이 기타 치료와 조합되는 것에 따라 다양하다. 일반적으로 방사선 치료가 널리 시행되고 있는 암으로는 두경부암, 후두암, 자궁경부암, 인두암, 폐암, 뇌암, 유방암, 대장암 등이 있다. 이들 암종이 방사선 치료의 주요 대상이 될지라도 방사선 치료시 반응이 좋지 않은 경우가 빈번하므로 치료 효율을 높이는 전략이 필요하다. 이와 더불어 방사선 치료가 잘 되어 초기반응은 좋을지라도 재발하는 경우가 빈번하여 재발 암에 대한 대책을 세우는 것도 방사선 치료의 효율을 높이는데 중요하다. 암세포에 대한 방사선 치료의 감수성의 차이가 존재하지만 방사선 치료 전에 개인별로 방사선에 대한 감수성을 예측할 수 있는 기술을 개발하면, 개인별로 방사선 처리량을 조절하여 암을 치료함으로써, 개인에게 가장 적합한 방사선 치료를 제공할 수 있다.

조직학적 소견이나 병기가 같은 암 환자의 경우에도 방사선 감수성은 매우 다르며, 이에 영향을 주는 많은 인자들이 있는 것으로 알려져 있다. 종양이 방사선 저항성을 가지게 되는 이유 중 가장 큰 요인으로 종양 세포의 내적인 방사선 감수성이다. 암세포가 방사선에 조사되면 복잡한 분자생물학적 변화에 의해 사망하거나 회복이 되는데 이러한 과정의 신호전달에 관여된 유전자와 단백질의 기능을 조절하는 기전들이 밝혀졌으며 근래에 와서 이러한 모든 것이 방사선 치료의 효과를 증진시킬 수 있는 표적이 될 수 있는 것으로 알려졌다. 지금까지 방사선 저항성에 대한 연구들이 진행되어 이 중 일부는 방사선 저항성을 극복하기 위한 방사선 민감제의 개발에 기초가 되고 있다. 현재까지 밝혀진 방사선 저항성과 관련된 인자들에 대해서 아직까지 부분적으로만 기전이 밝혀져 있으며 방사선 치료 결과의 유용한 예측 인자로 활용되고 방사선 민감도를 증가시킬 수 있는 마커는 미비한 실정이다.

한편, 수술전 화학방사선치료는 직장암을 치료하기 위해 필수적인 것으로 고려되며, 직장암의 전형적인 치료 순서는 수술전 화학방사선치료를 받고 수술(abdominopelvic resection or lower anterior resection) 후 항암치료를 받는 것이다. 직장암의 방사선치료시 수술전 화학방사선요법이 주로 사용되는데, 수술전 방사선요법의 장점으로는 수술시 암세포 파종 감소, 산소 농도 유지로 방사선 민감도 증가, 항문 괄약근의 보존률을 높임, 절제율 향상, 국소 재발률 감소 등이 있다. 또한 수술전 화학방사선요법 시행으로 70%에서 장벽 침윤도와 림프절 전이가 감소한다. 이러한 수술전 화학방사선치료에 대해 직장암 환자의 10-30%만이 반응성이 있으며, 약 15-45%의 직장암 환자가 수술전 화학방사선치료에 대해 저항성이 있다고 알려져 있다. 한편, 방사선치료시 생길 수 있는 부작용으로는 문합 누출(anastomotic leakage), 항문직장의 기능장애, 대장염, 설사, 혈변, 변실금, 배변 습관 변화, 방사선 항문 피부염, 이차암 발생, 골반뼈 골절, 장폐쇄, 장천공, 폐경 등이 있다.

따라서, 수술전 화학방사선치료에 대한 반응성의 정확한 예측은 방사선 감수성이 없는 환자에서 부작용을 줄일 수 있으며 동시에 수술전 화학방사선치료에 대한 이익이 있는 환자를 식별하는 데 필수적이나, 수술전 화학방사선치료에 대한 반응성을 정확하게 예측할 수 있는 마커는 알려진 바가 거의 없는 실정이다.

특히 현재까지 사용되는 마커들은 방사선 처리 후의 환자에서의 발현 변화를 확인하는 경우가 많아 실제로 방사선 처리 전 환자의 감수성을 정확하게 예측하기 어려운 문제점이 있어왔다.

이에, 본 발명자들은 암 환자의 수술전 화학방사선치료에 대한 반응성을 예측할 수 있는 마커를 찾기 위해 예의 노력한 결과, 수술전 화학방사선치료에 대한 반응군과 비반응군에서 발현의 차이를 나타내는 유전자를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 PSMB8(Proteasome Subunit Beta 8) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 암세포의 방사선치료 저항성 또는 감수성 예측용 조성물, 및 상기 조성물을 포함하는 암세포의 방사선치료 저항성 또는 감수성 예측용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 (a) PSMB8(Proteasome Subunit Beta 8) 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머를 사용하여 암 환자의 생물학적 시료로부터 mRNA 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 mRNA 수준의 변화를 대조군 시료의 mRNA 수준과 비교하는 단계;를 포함하는, 암 환자의 방사선치료 저항성 또는 감수성 예측을 위한 정보의 제공방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 (a) PSMB8(Proteasome Subunit Beta 8) 단백질에 특이적인 항체를 암 환자의 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성으로 단백질 수준을 확인하는 단계; 및 (b) 상기 단백질 형성량의 변화를 대조군 시료의 단백질 수준과 비교하는 단계;를 포함하는, 암 환자의 방사선치료 저항성 또는 감수성 예측을 위한 정보의 제공방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 PSMB8(Proteasome Subunit Beta 8) 유전자 또는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 암세포의 방사선치료 저항성 또는 감수성 예측용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 암세포의 방사선치료 저항성 또는 감수성 예측용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 (a) PSMB8(Proteasome Subunit Beta 8) 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머를 사용하여 암 환자의 생물학적 시료로부터 mRNA 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 mRNA 수준의 변화를 대조군 시료의 mRNA 수준과 비교하는 단계;를 포함하는, 암 환자의 방사선치료 저항성 또는 감수성 예측을 위한 정보의 제공방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 (a) PSMB8(Proteasome Subunit Beta 8) 단백질에 특이적인 항체를 암 환자의 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성으로 단백질 수준을 확인하는 단계; 및 (b) 상기 단백질 형성량의 변화를 대조군 시료의 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 암 환자의 방사선치료 저항성 또는 감수성 예측을 위한 정보의 제공방법을 제공한다.

본 발명의 암세포의 방사선치료 저항성 또는 감수성 예측용 조성물의 사용에 의해서, 암 환자의 수술적 치료 전 화학방사선치료에 대한 반응성을 예측하여 맞춤화된 방사선 치료를 제공할 수 있고 치료 효과의 증진 및 부작용을 감소시킬 수 있는 효과가 있다.

도 1은 수술전 화학방사선치료에 대한 바이오마커를 동정하기 위한 실험 설계를 나타낸 도이다.
도 2는 수술전 화학방사선치료를 받은 40명의 직장암 환자 집단에서 8종의 후보군 유전자(B3GALT4 , HSPA1B , KRBOX1 , PPBP , PPP1R18 , PSMB8 , SLC39A7 , TAP2)의 mRNA 발현 수준을 real-time RT-PCR로 확인한 결과를 나타낸 도이다(*:p<0.05).
도 3a는 웨스턴 블롯팅을 통해 PSMB8을 과발현하는 HCT116 및 RKO 세포와 SLC39A7을 과발현하는 HCT116 및 DLD1 세포주의 제조를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3b는 PSMB8을 과발현하는 HCT116 세포주의 생존 곡선 및 6 Gy의 조사 양을 처리한 대표 콜로니들의 생존 결과를 나타낸 도이다.
도 3c는 PSMB8을 과발현하는 RKO 세포주의 생존 곡선 및 6 Gy의 조사 양을 처리한 대표 콜로니들의 생존 결과를 나타낸 도이다.
도 4a는 PSMB8을 과발현하는 HCT116 세포에 6 Gy를 조사하고 3일 후 FACS 분석을 수행하여 세포 사멸을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4b는 PSMB8을 과발현하는 HCT116 세포에서 절단된 PARP 및 활성 카스파아제-3의 수준을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 4c는 PSMB8을 과발현하는 RKO 세포에 6 Gy를 조사하고 3일 후 FACS 분석을 수행하여 세포 사멸을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4d는 PSMB8을 과발현하는 RKO 세포에서 절단된 PARP 및 활성 카스파아제-3의 수준을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 5a는 LoVo 세포에서 siRNA에 의해 PSMB8이 넉다운 되었는지 여부를 웨스턴 블롯팅을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5b는 PSMB8이 하향조절된 LoVo 세포에서 방사선의 감수성을 클론원성 분석법을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5c는 PSMB8이 하향조절된 LoVo 세포에서 방사선의 감수성을 MTT 분석법을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6a는 마우스 이종이식 모델에서 PSMB 과발현이 방사선에 대한 감수성 변화를 야기하는지를 종양 부피 측정을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6b는 마우스 이종이식 모델에서 종양 부피의 억제율을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 6c는 마우스 이종이식 모델을 희생하고 종양을 제거하여 H&E로 염색한 결과를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명은 PSMB8(Proteasome Subunit Beta 8) 유전자 또는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 암세포의 방사선치료 저항성 또는 감수성 예측용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어 “PSMB8(Proteasome Subunit Beta 8)”은 프로테아좀 소단위 중 하나로, JMP; ALDD; LMP7; NKJO; D6S216; PSMB5i; RING10; D6S216E로도 알려져 있다.

본 발명의 조성물은 B3GALT4(UDP-Gal:BetaGlcNAc Beta 1,3-Galactosyltransferase, Polypeptide 4), HSPA1B(Heat Shock 70kDa Protein 1B), KRBOX1(KRAB Box Domain Containing 1), PPBP(Pro-Platelet Basic Protein (Chemokine (C-X-C Motif) Ligand 7), PPP1R18(Protein Phosphatase 1, Regulatory Subunit 18), SLC39A7(Solute Carrier Family 39 (Zinc Transporter), Member 7), 및 TAP2(Transporter 2, ATP-Binding Cassette, Sub-Family B (MDR/TAP))로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자 또는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 방사선치료는 바람직하게 수술전 화학방사선치료(preoperative chemotherapy)일 수 있으며, 이는 국소 진행된 직장암에서의 표준치료로 알려져 있고 수술적 치료 전에 방사선을 처리함으로써 수술시 암세포 파종 감소, 산소 농도 유지로 방사선 민감도 증가, 항문 괄약근의 보존률을 높임, 절제율 향상, 국소 재발률 감소 등의 효과가 있다.

본 발명에서 용어 “저항성"은 방사선 조사에 의해 쉽게 영향을 받지 않으며, 방사선에 노출시 세포 복구 또는 증식에 거의 변화가 없는 상태를 말한다.

본 발명에서 용어 "감수성"은 방사선 조사에 의해 쉽게 영향을 받으며, 방사선에 노출시 세포 복구 또는 증식에 변화를 보이는 상태를 말한다.

본 발명의 방사선 저항성 또는 감수성 예측용 조성물은 정상 암세포 대비 방사선 저항성 암세포에서 차등적 발현수준을 갖는 유전자로 구성되어, 개체나 세포의 방사선 저항성을 판단할 수 있게 한다. 즉, 본 발명의 조성물에서 PSMB8 유전자 또는 단백질의 발현 수준이 대조군보다 높거나 낮은 개체나 암세포는 방사선 감수성 또는 저항성을 갖는 것으로 판단할 수 있다.

본 발명에서 용어 "암세포"는 다세포 생물체의 조직 또는 기관에서 조절되지 않은 성장을 나타내는 임의의 세포를 말한다.

본 발명의 조성물은 암 환자, 특히 직장암 환자의 수술적 치료 전 화학방사선치료에 대한 반응성을 예측하는 것을 특징으로 한다. 수술전 화학방사선치료 감수성이 있는 개체나 암세포에서 PSMB8의 유전자 또는 단백질 발현 수준은 대조군 암세포에서의 PSMB8의 유전자 또는 단백질 발현 수준에 비해서 높으며, 반대로 수술전 화학방사선치료 저항성이 있는 개체나 암세포에서 PSMB8의 유전자 또는 단백질 발현 수준은 대조군 암세포에서의 PSMB8의 유전자 또는 단백질 발현 수준에 비해서 낮다.

방사선치료, 바람직하게는 수술적 치료 전에 화학방사선치료에 대한 반응성을 예측한다면, 예측 결과에 따라 화학방사선치료의 실시 여부, 또는 방사선치료시의 방사선 조사량을 결정할 수 있으므로, 수술전 화학방사선치료의 효과를 향상시킬 수 있다.

본 발명의 조성물에 의해 암세포의 방사선치료 저항성 또는 감수성을 예측할 수 있는 암은 본 발명의 마커 유전자의 발현차이에 의해 구별할 수 있는 암을 제한없이 포함하나, 바람직하게는 직장암이다.

직장암은 유방암, 폐암, 두경부암, 췌담도암, 자궁경부암, 림프종, 전립선암 등과 함께 방사선치료가 빈번하게 수행되는 암이다. 방사선치료는 유방암, 자궁경부암, 전립선암 등 호르몬과 연관된 암의 치료에 사용되는 경우가 많다. 현재 호르몬과 연관된 암에서 방사선치료에 대한 저항성 또는 감수성을 예측할 수 있는 바이오마커에 대하여는 보고된 바가 있으나, 직장암에서 방사선치료에 대한 저항성 또는 감수성을 예측할 수 있는 바이오마커는 보고된 바가 없다. 따라서 본 발명은 직장암에 대한 방사선치료의 저항성 또는 감수성을 예측할 수 있는 마커를 최초로 발견한 것이다.

본 발명에서 용어 “마커(marker) 또는 바이오마커(biomarker)”는 암 세포 또는 암 질환을 가진 개체를 방사선치료 반응성이 있거나 없는 것으로 구분하여 예측할 수 있는 물질로, 정상 암세포에 비하여 사선치료에 반응성을 나타내는 암세포 또는 개체에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산 (예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질 또는 당 (예: 단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자들을 포함한다.

본 발명에서 용어 “유전자의 수준 측정”은 방사선치료에 대한 저항성 또는 감수성을 예측하기 위하여 생물학적 시료에서 마커 유전자들의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 바람직하게는 mRNA의 양을 측정하는 것을 지칭한다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어 “단백질의 수준 측정”은 방사선치료에 대한 저항성 또는 감수성을 예측하기 위하여 생물학적 시료에서 마커 유전자로부터 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정을 지칭하는 것으로, 바람직하게는, 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블롯, 엘라이자(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선면역분석(Radioimmunoassay, RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 유전자들의 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있고, 상기 프라이머는 공지의 데이터 베이스에 공지된 상기 유전자의 서열을 바탕으로 당업자가 다양한 프로그램을 이용하여 제작할 수 있다.

본 발명에서 용어 "프라이머"는, 짧은 자유 3'말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명의 프라이머는, 각 마커 유전자 특이적인 프라이머로 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산이다. 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예: 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이트화제(예: 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등) 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 본 발명의 핵산 서열은 또한 검출 가능한 시그널을 직접적으로 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 표지의 예로는 방사성 동위원소, 형광성 분자, 비오틴 등이 있다.

본 발명에서 상기 유전자의 단백질 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어 “항체”는 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 다클론 항체는 상기한 수술전 화학방사선치료 반응성 예측용 마커 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다. 단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler 및 Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제할 수 있다.

또한 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

본 발명에서의 용어, "그레이(Gy)"는 대표적인 생물학 조직 1kg에서 1J을 방출하는 방사선의 양이다.

본 발명의 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, 마이크로어레이 또는 단백질 칩 키트일 수 있다.

본 발명에서 용어 "키트"는 PSMB8(Proteasome Subunit Beta 8), B3GALT4(UDP-Gal:BetaGlcNAc Beta 1,3-Galactosyltransferase, Polypeptide 4), HSPA1B(Heat Shock 70kDa Protein 1B), KRBOX1(KRAB Box Domain Containing 1), PPBP(Pro-Platelet Basic Protein (Chemokine (C-X-C Motif) Ligand 7), PPP1R18(Protein Phosphatase 1, Regulatory Subunit 18), SLC39A7(Solute Carrier Family 39 (Zinc Transporter), Member 7), 또는 TAP2(Transporter 2, ATP-Binding Cassette, Sub-Family B (MDR/TAP)) 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준을 확인하여 암세포의 방사선치료의 저항성 또는 감수성을 예측할수 있는 도구를 의미한다. 본 발명의 암세포의 방사선치료 저항성 또는 감수성 예측용 키트에는 PSMB8(Proteasome Subunit Beta 8), B3GALT4(UDP-Gal:BetaGlcNAc Beta 1,3-Galactosyltransferase, Polypeptide 4), HSPA1B(Heat Shock 70kDa Protein 1B), KRBOX1(KRAB Box Domain Containing 1), PPBP(Pro-Platelet Basic Protein (Chemokine (C-X-C Motif) Ligand 7), PPP1R18(Protein Phosphatase 1, Regulatory Subunit 18), SLC39A7(Solute Carrier Family 39 (Zinc Transporter), Member 7), 또는 TAP2(Transporter 2, ATP-Binding Cassette, Sub-Family B (MDR/TAP)) 유전자의 발현 수준을 측정하기 위한 프라이머, 프로브 또는 선택적으로 마커를 인지하는 항체뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 1종 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액, 또는 장치가 포함될 수 있다.

본 발명의 방법은 PSMB8 이외에도 B3GALT4(UDP-Gal:BetaGlcNAc Beta 1,3-Galactosyltransferase, Polypeptide 4), HSPA1B(Heat Shock 70kDa Protein 1B), KRBOX1(KRAB Box Domain Containing 1), PPBP(Pro-Platelet Basic Protein (Chemokine (C-X-C Motif) Ligand 7), PPP1R18(Protein Phosphatase 1, Regulatory Subunit 18), SLC39A7(Solute Carrier Family 39 (Zinc Transporter), Member 7), 및 TAP2(Transporter 2, ATP-Binding Cassette, Sub-Family B (MDR/TAP))로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자의 mRNA 수준을 측정 및 비교하는 단계를 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 (a) PSMB8(Proteasome Subunit Beta 8) 단백질에 특이적인 항체를 암 환자의 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성으로 단백질 수준을 확인하는 단계; 및 (b) 상기 단백질 형성량의 변화를 대조군 시료의 단백질 수준과 비교하는 단계;를 포함하는, 암 환자의 방사선치료 저항성 또는 감수성 예측을 위한 정보의 제공방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 PSMB8 이외에도 B3GALT4(UDP-Gal:BetaGlcNAc Beta 1,3-Galactosyltransferase, Polypeptide 4), HSPA1B(Heat Shock 70kDa Protein 1B), KRBOX1(KRAB Box Domain Containing 1), PPBP(Pro-Platelet Basic Protein (Chemokine (C-X-C Motif) Ligand 7), PPP1R18(Protein Phosphatase 1, Regulatory Subunit 18), SLC39A7(Solute Carrier Family 39 (Zinc Transporter), Member 7), 및 TAP2(Transporter 2, ATP-Binding Cassette, Sub-Family B (MDR/TAP))로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자의 단백질 수준을 측정 및 비교하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 방법에서 상기 생물학적 시료는 조직, 전혈, 혈청 또는 혈장일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 방법에서 상기 암은 직장암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 방법에서 대조군 시료는 방사선치료에 대해 감수성이 없는 생물학적 암 세포 시료를 제한 없이 포함한다.

대조군 시료 내 상기 유전자들의 mRNA 또는 단백질의 발현수준보다 암 환자의 생물학적 시료 내 상기 유전자들의 mRNA 또는 단백질의 발현수준이 높으면, 상기 암 환자는 화학방사선치료에 감수성이 있는 것으로 판단할 수 있다.

대조군 시료 내 상기 유전자들의 mRNA 또는 단백질의 발현수준보다 암 환자의 생물학적 시료 내 상기 유전자들의 mRNA 또는 단백질의 발현수준이 낮으면, 상기 암 환자는 화학방사선치료에 저항성이 있는 것으로 판단할 수 있다.

상기와 같이 암 환자의 수술적 치료 전 화학방사선치료에 대한 반응성을 예측하여 맞춤화된 방사선 치료를 제공할 수 있고 예후 예측이 가능하며, 치료 효과의 증진 및 부작용을 감소시킬 수 있는 효과가 있다.

본 발명에서 용어 "예후 예측"이란, 방사선 조사 후, 대조군과 비교하여 반응군인 암세포주에서 발현차이를 보이는 유전자를 통해 방사선치료에 대한 반응성이 있는 암세포 또는 개체를 예측하는 것을 지칭한다.

본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 실험재료 및 방법

1.1 실험의 설계 및 수행

암세포의 수술전 화학방사선치료(chemoradiotherapy, CRT)에 대한 반응성을 예측할 수 있는 바이오마커를 동정하기 위해, 4단계의 실험을 설계하였으며 이를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 1단계는, 수술전 화학방사선치료 및 절제 치료(curative resection)를 받은 22명의 직장암(locally advanced rectal cancer, LARC) 환자에 대해 RNA 시퀀싱을 수행하는 단계이다. 2단계는, 동일한 치료를 받은 40명의 직장암 환자에 대하여 real-time RT-PCR을 통해 상기 22명의 환자에 대해 RNA 시퀀싱을 수행하여 얻어진 후보 유전자의 mRNA 발현을 측정하는 단계이다. 3단계는, 후보 유전자의 처리시 암세포의 사멸 확인을 통해 후보 유전자의 생물학적 유용성(biological utility)을 측정하는 단계이다. 4단계는, 바이오마커로 발견한 유전자의 효과를 마우스 이종이식 모델에서 검증하는 단계이다.

1단계와 2단계의 두 집단에 있는 환자들은 아산 병원에서 치료받았으며, 동의를 받은 후 화학방사선치료 전에 환자들로부터 조직 시료를 모았다. 수술전 화학방사선치료는 선형 가속장치에 의해서 6 또는 15 MV의 빔 에너지(beam energy)로 골반에 3 또는 4 필드 동안 적용함으로써 수행하였다. 수술전 화학방사선치료를 위한 방사선의 양은 46 Gy이고, 이를 전체 골반에 23 부분으로 나누어 적용한 후 1차 종양에 대해 4 Gy를 더하였다. 카페시타빈(capecitabine) 또는 5-플루오로우라실을 방사선치료와 함께 투여했다. 화학방사선치료 6-8주 후에 기초적인 수술을 수행하였다. 시료에서 화학방사선치료에 대한 반응은 Mandard et al., 에 기술된 바에 의해 표준화된 TRG(tumor regression grade)를 사용함으로써 평가하였다. 초기의 상대적인 TRG 데이터 및 추가적인 집단에서의 데이터를 표 1에 나타내었다.

특징	환자의 수		P-값^a
특징	RNA 시퀀싱을 위한 집단 (n=22)	후보 유전자의 효과 검증을 위한 집단(n=40)	P-값^a
남성/여성	14/8	27/13	0.758
나이, 평균 ±SD, y	61 ±12	57 ± 11	0.223
임상병기(Clinical stage)^b, I/II/III/IV	2/0/18/2	0/4/35/1	0.061
수술전 CRT의 s-CEA 농도, 평균 ±SD, ng/mL	6.83 ±16.23	4.58 ±5.58	0.534
수술후 CRT의 s-CEA 농도, 평균 ±SD, ng/mL	3.27 ±7.28	2.23 ±1.59	0.513
TRG(Tumor regression grade)^c,1/2/3/4/5	3/6/9/4/0	12/8/16/4/0	0.45
낮은 수준의 분화 또는 점액	1	1	0.663
AV로부터의 위치, 평균±SD, cm	3.52 ±2.27	2.74 ±1.5	0.106
림프 또는 신경주위(perineural) 침윤	5	7	0.618

Abbreviations: s-CEA = serum carcinoembryonic antigen, AV = anal verge; CRT = chemoradiotherapy

^aComparison of initial screening and validation by Pearson’χ²test or unpaired t-test

^bCancer staging according to the American Joint Committee on Cancer (7th ed., 2010)

^cPathologic tumor regression grades after preoperative chemoradiation therapy as described by Mandard et al.

임상평가를 위해서 TRG에 따라 시료를 다음과 같이 2 군으로 카테고리화 하였다; TRG 1-2: 반응군(responder), TRG 3-5: 비-반응군(non-responder). 상기 프로토콜은 Institutional Review Boeard for Human Genetic and Genomic Research (등록 번호. 2014-0150)에 의해 승인되었으며 연구는 Helsinki 선언의 원칙에 따라 수행되었다.

1.2 RNA 추출 및 RNA 시퀀싱

환자를 대상으로 한 RNA 시퀀싱을 위해 RNA의 추출 및 시퀀싱을 다음과 같이 수행하였다. RNeasy Mini Kit(Quiagen, Hilden, Germany)를 이용해서 제조업자의 프로토콜에 따라 총 RNA를 분리하였다. 아가로스 겔 전기영동 및 EtBr 염색을 통해서 RNA의 질을 확인하였다. TruSeq RNA Sample Preparation kit v2(Illumina, San Diego, CA)를 사용해서 제조업자의 지시에 따라 서열 라이브러리를 제조하였다. 간략하게, 폴리-T 올리고-부착된 마그네틱 비드를 사용해서 총 RNA로부터 mRNA를 정제한 후, 절단하고 cDNA로 전환하였다. 이후 PCR에 의해 cDNA에 adapter를 연결하고 절편(fragment)을 증폭하였다. 시퀀싱은 Hiseq-2000(Illumina)을 사용함으로써 paired-end read(2x100 bp)로 수행하였다.

1.3 RNA 시퀀싱 데이터 및 real time RT- PCR

Homo sapiens의 기준 게놈 서열 데이터를 캘리포니아 대학 Santa Cruz Genome Browser Gateway(assembly ID: hg19)로부터 얻었다. 기준 게놈은 Bowtie2(ver. 2.0)의 Bowtie2-build component 및 SAMtools(ver. 0.1.18)를 사용해서 표시하였다. 조직 시료 내의 기준 게놈을 매핑(mapping)하는 데 Tophat2(ver. 2.0)를 사용하였다. 모든 RNA 시퀀싱 데이터의 매핑 비율을 하기의 표 2에 나타내었다.

시료 표시	시료 명칭	조직 유형	매핑된 리드(read)의 수	매핑되지 않은 리드(read)의 수	매핑 비율(%)
1	520T	종양	40,700,312	3,319,526	92.46%
2	521T	종양	56,621,864	4,840,898	92.12%
3	524T	종양	36,900,295	3,020,105	92.44%
4	527T	종양	45,362,847	3,714,701	92.43%
5	529T	종양	39,334,336	3,595,880	91.62%
6	530T	종양	48,305,319	3,931,069	92.47%
7	532T	종양	39,794,040	3,239,972	92.47%
8	533T	종양	23,246,262	1,992,352	92.11%
9	534T	종양	32,730,125	2,771,885	92.19%
10	535T	종양	48,364,899	3,828,819	92.66%
11	536T	종양	47,328,691	4,237,369	91.78%
12	537T	종양	37,246,722	3,215,480	92.05%
13	538T	종양	42,919,864	3,561,886	92.34%
14	539T	종양	32,056,126	2,667,180	92.32%
15	540T	종양	53,908,975	4,580,349	92.17%
16	541T	종양	41,369,387	3,421,013	92.36%
17	543T	종양	37,640,652	3,276,290	91.99%
18	544T	종양	36,397,414	3,053,264	92.26%
19	546T	종양	59,750,161	4,706,669	92.70%
20	547T	종양	52,374,230	4,336,144	92.35%
21	549T	종양	37,421,755	2,994,741	92.59%
22	551T	종양	27,643,645	2,361,135	92.13%

RNA 시퀀싱에 의해 생성된 데이터 세트는 NCBI GEO(Gene Expression Omnibus)에서 accession number GSE80606으로 확인 가능하다.

제조업자의 지시에 따라 TRIzol®시약(Invitrogen)을 이용해서 총 RNA를 추출하였다. 총 RNA로부터 임의의 프라이머 및 SuperScript II RT(Invitrogen)를 사용해서 cDNA를 증폭하였다. 8개의 선택된 유전자에 대한 프라이머를 하기 표 3에 나타내었다.

유전자	logFC	P 값	프라이머 서열 5'-3'	RefSeq accession
B3GALT4	-6.54	2.E-06	Forward: TCCTACCGCAACCTCACCCTAA Reverse: TCGCAAGACCAGCTCTGATACC	NM_003782
HSPA1B	-8.38	1.E-08	Forward: ACCTTCGACGTGTCCATCCTGA Reverse: TCCTCCACGAAGTGGTTCACCA	NM_005346
KRBOX1	4.40	0.00002	Forward: CCTTTGTAGTGCCACCCACT Reverse: TATCCAGCCTGCTCTCCAGT	NM_001205272
PPBP	-5.22	0.00045	Forward: TGCTCTGGCTTCCTCCACCAAA Reverse: ACACATGCAGCGGAGTTCAGCA	NM_002704
PPP1R18	-6.42	0.00008	Forward: TACCCAACTGCCGAGGAGATCT Reverse: GTATTGGTACGTGGTCTCCAGG	NM_133471
PSMB8	-4.03	0.00007	Forward: CCTTACCTGCTTGGCACCATGT Reverse: TTGGAGGCTGCCGACACTGAAA	NM_148919
SLC39A7	-5.91	0.00028	Forward: GACCACAATGACTGTCCTGCTAC Reverse: GCTGTCAGTAGTTGCAGACGCA	NM_006979
TAP2	-4.07	0.00011	Forward: ATGCCCTTCACAATAGCAGCGG Reverse: CCAAAACTGCGAACGGTCTGCA	NM_000544

Abbreviations: logFC, log2-transformed fold change

제조업자의 지시에 따라 SYBR Green I Master를 사용하여 Roche96(Roche, Mannheim, Germany)로 real-time RT-PCR을 수행하였다. GAPDH를 내적 대조군으로 사용하였고, GAPDH를 증폭하기 위한 프라이머는 다음과 같다; 정방향: 5'-AGG GCT GGT TTT AAC TCT GGT-3', 역방향: 5'-CCC CAC TTG ATT TTG GAG GGA-3'.

1.4 결장 세포주에서의 유전자 과발현 또는 넉다운

결장 세포주(CCD-18co, CCE841, DLD1, HCT116, HCT15, HT29, LS174T, LoVo, RKO, SW480, SW620 및 WiDr)를 ATCC(Manassas, VA)로부터 구입하였다. 구입한 상기 세포주들을 10% (v/v) FBS 및 1% (w/v) 페니실린 및 스트렙토마이신으로 보충된 RPMI1640에서 배양하였다. DDK로 태그된 PSMB8 cDNA를 Origene(Rockville, MD)으로부터 구입하였다.

OptiMEM 내에서 각각의 세포 혼합물에 대해 리포펙타민 2000(Invitrogen)을 사용하여 형질감염을 수행하였다. 10일 동안의 항생제 셀렉션을 통해 안정한 세포를 클로닝하고 최소 2 이상의 상이한 클론을 각각의 세포주로부터 제조하였다. DDK 항체(Origene, Rockville, MD)를 사용한 웨스턴 블롯팅에 의해 PSMB8의 과발현을 확인하였다.

PSMB8 넉다운을 위해서, 인간-특이적 siRNA(센스: 5'-AGUUCCAGCAUGGAGUGAU-3' 및 안티센스: 5'-AUCACUCCAUGGUGGAACU-3')를 바이오니아로부터 합성하였다. 공지된 유전자 서열에 대해 유의적인 상동성을 나타내지 않았던 스크램블(scrambled) siRNA를 음성 대조군으로 사용하였다. 유전자가 넉다운된 세포를 제조하기 위해, 상기 기재된 바와 같이 100 nM OptiMEM 내에서 형질전환하였다.

1.5 클론원성 ( clonogenic ) 분석 및 MTT 분석법

클론원성 분석에 있어, 100, 400, 1000, 및 10000 개의 RKO, HCT116, DLD1 세포를 6-웰 플레이트에 플레이팅하고(3번 반복), 0 Gy, 2 Gy, 4 Gy 및 6 Gy의 방사선에 각각 노출시켰다. 방사선 노출 10일 후, 세포를 크리스탈 바이올렛(0.5%)으로 염색하고 GelCount(Oxford, Abingdon, UK)로 측정하였다. 콜로니 중 최소 지름은 100(νm)이었다. 생존한 콜로니 부분은 다음과 같이 계산하였다:

(콜로니 수)/[(시딩한 세포) ×(플레이팅 효율)]

여기서, 플레이팅 효율은 비-방사선 처리된 대조군 세포 내 콜로니 수/시딩한 세포이다.

세포 생존률은 MTT 분석법에 의해 측정하였다. 간략하게, 세포를 96-웰 플레이트에 시딩하고(5x10³ 세포/웰), 다음날 6 Gy로 방사선처리 하였으며, 방사선을 처리하고 2일 후, 멸균한 MTT 염색약(5 mg/ml; Sigma-Aldrich)을 세포에 10μl/웰로 첨가하였다. 37℃에서 1시간 동안 배양한 후, 배지를 버리고 디메틸 설폭사이드(Sigma-Aldrich)를 150μl/웰로 첨가하였다. 마이크로타이터 플레이트 리더(Sunrise-Basic TECAN, Grodig, Austria)를 사용해서 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

1.6 유세포분석 및 웨스턴 블롯 분석

프로피듐 이오다이드 및 아넥신 V(Annexin V) 더블 염색 분석법을 이용해서 유세포분석으로 세포의 아폽토시스를 측정하였다. 간략히, 트립신으로 세포를 약하게 분리한 후 FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I(BD Biosciences)으로부터 얻은 프로피듐 이오다이드 및 아넥신 V로 세포를 염색했다. FACSCalibur(Becton Dickson, Heidelberg, Germany) 유세포분석 시스템과 CellQuest Sortware를 사용해서 형광 세포를 카운팅했다.

웨스턴 블롯 분석을 위해서, 세포 용해 완충액(Cell Signaling, Beverly, MA)을 사용해서 배양된 세포로부터 단백질을 추출하고, 동량의 단백질을 SDS-PAGE 분석하였다. 이후 전기영동한 단백질을 PVDF 멤브레인(Millipore, Billerica, MA, USA)에 트랜스퍼하였으며, 트랜스퍼 후, 멤브레인을 TBST 내 5% 무지방 드라이 밀크로 차단하였다. 이후 멤브레인을 일차 항체 및 HRP-접합된 이차 항체와 함께 배양하였다. SuperSignal west pico kit(ThermoScientific, Rockford, IL)를 이용해서 특이적 복합체를 검출하였다. 절단된 카스파제-3(caspase-3), PARP 및 MCL1 항체를 Cell Signaling(Beverly, MA)로부터 구입하였다. LC3 항체(Novus, Littleton, CO, USA)의 사용에 의한 경쇄 3 알파 LC3의 전환에 의해서 자가소화 활성(autophagic activity)를 측정하였다. 베타 액틴(Bethyl Laboratories, Montfomery, TX)을 로딩 대조군으로 사용하였다.

1.7 뮤린 이종이식 모델

5주령 수컷 BALB/c-SLc-nu 마우스(5 마우스/군)를 일본 SLC(Shizuika, Japan)로부터 구입하였다. 모든 동물 실험은 Institutional Animal Care and Use Committe of Asan Institute for Life Sciences, Seoul, Korea(IACUC 2016-12-028)에 의해 승인된 프로토콜 하에 수행하였고, 이는 ILAR(the institue of Laboraory Animal Resources) 가이드를 따른다. 1x10⁷ 엘리쿼트의 세포를 100 μl 무혈청 배지에 현탁하고 각 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 주입하였다. 종양 부피가 평균적으로 150-200 mm³에 도달할 때, 마우스 몸의 나머지 부분을 차폐하고 5 부분에 총 10 Gy 양의 방사선을 5일 이상 연속하여 조사하였다. 3주 후, 종양 성장을 digital caliper (Mitutoyo, Kanagawa, Japan)을 이용해서 3-4일 간격으로 측정하였고, 이후 마우스를 희생하고 종양을 조직학적으로 측정하였다.

1.8 통계적 분석

초기 스크리닝 및 검증 데이터의 비교는 Pearson’s χ² 테스트 또는 unpaired t-test를 사용해서 수행하였다. 화학방사선치료 반응군 및 비-반응군 사이의 유전자 발현상 차이의 유의성을 측정하기 위해서 EdgeR 패키지를 사용하였다. 유전자 수 분산은 Cox-Reid 프로파일-조절된 유사 방법에 의해서 측정하였다. 모델 피팅(model fitting) 및 분산 측정 후에, 상이하게 발현된 유전자를 GLM(generalized linear model) 유사 비율 테스트(GLM likelihood ratio test)를 사용하여 선택했다. GLM 유사 비율 테스트는 Cox-Reid 분산 추정과 함께 음 이항 GLM 피팅 원리에 기초한다. 유전자 발현에 있어서의 차이는 통계적으로 p<0.001인 경우에 유의적인 것으로 고려되고, 2 군 사이의 유전자 발현 배수의 차이(fold difference)는 2배 이상인 경우에 유의적인 것으로 고려된다. 통계적 분석은 R language environment (ver. 3.1.3)를 사용하여 수행했다. 대조군과 타겟 DNA로 감염된 클론 사이의 생물학적 결과는 unpaired t-test를 사용해서 비교하였다. 통계적 유의성은 p<0.05인 것으로 정의된다. 모든 계산은 SPSS software ver.21(SPSS Inc., Chicago, IL)을 이용하여 수행하였다.

실시예 2: 실험 결과

2.1 화학 방사선치료에 대한 반응군과 비반응군 사이에서 상이한 발현을 보이는 유전자 스크리닝

직장암에서 화학 방사선치료에 대한 반응성의 바이오마커로 사용할 수 있는 유전자를 동정하기 위해서, 화학방사선치료에 대한 반응군과 비반응군에서 상이한 발현을 보이는 유전자를 스크리닝하였다.

구체적으로, 22명의 직장암 환자로부터 시료를 채취한 후 환자에게 화학방사선치료를 처리한 뒤에 수술적 치료를 진행하였다. 치료가 완료된 후 TRG에 따라 상기 환자를 방사선치료에 대한 반응군과 비반응군으로 나누고 미리 채취된 시료를 환자의 반응성에 따라 분류하였다. 그 후 분리된 반응군과 비반응군 시료에서 RNA 시퀀싱에 기초한 유전자 발현 프로파일을 수행하였다. 화학방사선치료에 대한 반응군과 비반응군에서 GLM 유사 비율 테스트에 의해서 575 종의 유전자의 발현 수준이 통계적으로 유의적인 수준으로 상이함을 발견하였다. 이와 같은 결과는 직장암에서 화학 방사선치료에 대해 반응하는 유전자 세트가 존재함을 의미한다(2배 이상의 차이, p<0.001).

상기 575 종의 유전자들에 대해서 더욱 엄격한 기준, 예컨대 생물학적 반응 및 분자적 기능과의 연관성과에 의한 선별(16배 이상의 차이, p<0.0005)을 추가적으로 수행함으로써 8종의 후보군을 선택하였다. 상기 기준은 Gene Ontology Consortium (http://geneontology.org)에 기초한 것이며, 선별한 8종의 후보군은 다음과 같다.

- UDP-Gal:BetaGlcNAc Beta 1,3-Galactosyltransferase, Polypeptide 4 (B3GALT4)

- Heat Shock 70kDa Protein 1B (HSPA1B)

- KRAB Box Domain Containing 1 (KRBOX1)

- Pro-Platelet Basic Protein (Chemokine (C-X-C Motif) Ligand 7 (PPBP)

- Protein Phosphatase 1, Regulatory Subunit 18 (PPP1R18)

- Proteasome Subunit Beta 8 (PSMB8)

- Solute Carrier Family 39 (Zinc Transporter), Member 7 (SLC39A7)

- Transporter 2, ATP-Binding Cassette, Sub-Family B (MDR/TAP) (TAP2)

2.2 반응군 및 비반응군에서 화학 방사선치료에 대한 유전자 발현의 측정

상기 2.1에서 얻은 8종의 후보군에 대한 스크리닝 결과를 검증하기 위해서, 상기 2.1의 22명의 직장암 환자군과 상이한 집단에 대한 검증을 수행하였다. 구체적으로, 수술전 화학방사선치료를 받은 40 명의 직장암 환자군에서 real-time RT-PCR을 이용해서 상기 8종의 유전자들의 mRNA 발현을 GAPDH로 표준화하여 분석하였다. 분석 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, p 값은 unpaired t-test를 이용하여 계산하였고 다음과 같다: B3GALT4, 0.262; HSPA1B, 0.066; KRBOX1, 0.231; PPBP, 0.0231; PPP1R18, 0.64; PSMB8, 0.001; SLC39A7, 0.012; TAP2, 0.602. 오차 바는 SEM을 나타낸다. 상기 8종의 유전자 중에서, PSMB8 및 SLC39A7의 mRNA 수준 차이가 비반응군에 비해서 반응군에서 유의적으로 큼을 확인하였고, PSMB8 유전자에 대해서 하기와 같이 추가적인 실험을 수행하였다.

2.3 PSMB8 과발현에 따른 방사선-유발된 직장암 세포 사멸 촉진 효과 확인

2.3.1 세포주의 제조

PSMB8 유전자가 방사선-유발된 세포 사멸의 조절에 있어 중요한 역할을 하는지 여부를 확인하기 위해서, PSMB8을 과발현하는 HCT116 및 RKO 세포를 제조하였다.

상기 세포주 각각으로부터 두 개의 클론을 최종적으로 분리하였다. PSMB8의 과발현은 항-DDK 항체를 사용한 웨스턴 블롯팅을 통해 확인하였다. 확인 결과를 도 3a에 나타내었다.

도 3a에 나타낸 바와 같이, PSMB8을 과발현하는 HCT116 및 RKO 세포에서 PSMB8이 과발현되었음을 확인하였다.

2.3.2 PSMB8 을 과발현하는 세포주의 방사선-유발된 직장암 세포 사멸 촉진 효과 확인

상기 2.3.1에서 제조한 HCT116 및 RKO 세포주들에 0, 2, 4 및 6 Gy의 방사선을 조사하고, PSMB8을 과발현하는 HCT116 세포주의 생존 곡선을 도 3b 상부에, PSMB8을 과발현하는 RKO 세포주의 생존 곡선을 도 3c 상부에 나타내었다. 또한 6 Gy의 조사 양을 처리한 대표 콜로니들의 생존 결과를 도 3b 하부(PSMB8을 과발현하는 HCT116 세포주), 도 3c 하부(PSMB8을 과발현하는 RKO 세포주)에 나타내었다.

도 3b 및 도 3c에 나타낸 바와 같이, 0 Gy에서 6 Gy까지 방사선의 양을 점차적으로 증가시킴에 따라 대조군에 비해서 PSMB8이 과발현된 HCT116 및 RKO 세포의 방사선 조사에 대한 감수성이 증가하여 세포 사멸이 촉진되는 것을 확인하였다.

따라서, PSMB8이 방사선 감수성을 증가시킬 수 있는 물질임을 확인하였다.

2.3.3 외인성 PSMB8의 방사선-유도된 아폽토시스에 대한 증가 효과 확인

외인성 PSMB8이 HCT116 및 RKO 세포에서 방사선-유도된 아폽토시스를 증가시키는지 확인하기 위해서, PSMB8이 넉다운된 HCT116 세포 및 RKO 세포 중 아폽토시스가 일어나는 세포를 아넥신 V-FITC 염색 및 FACS 분석을 통해서 확인하였다. 이를 위해 세포에 6 Gy를 조사하고 3일 후 FACS 분석을 수행하였으며, 분석 결과를 도 4a 및 도 4c에 나타내었다.

도 4a 및 도 4c에 나타낸 바와 같이, PSMB8을 과발현시킨 HCT116 세포에 방사선을 처리한 결과, 사멸된 세포는 약 25%(clone 1: 25.6%, clone 2: 24.1%)인 반면, 대조군 세포에서는 11%가 사멸하였음을 확인하였다(p<0.05). 또한, PSMB8을 과발현시킨 RKO 세포에 방사선을 처리한 결과, 사멸된 세포는 약 18%(clone 1: 17.6%, clone 2: 18.2%)인 반면, 대조군 세포에서는 11%가 사멸하였음을 확인하였다.

또한 상기 세포주에서 표준 아폽토시스 마커로 알려진 절단된 PARP 및 활성 카스파아제-3의 수준을 측정한 결과를 도 4b 및 도 4d에 나타내었다.

도 4b 및 도 4d에 나타낸 바와 같이, 방사선으로 처리된 HCT116 및 RKO 세포에서 절단된 PARP 및 활성 카스파아제-3의 수준이 증가하였음을 확인하였다. 상기와 같은 결과는 FACS의 결과와 일치하는 것이다.

따라서 상기 세포주의 방사선 처리에 의한 세포 사멸 증가의 효과는 PSMB8의 과발현으로 인한 것이므로, PSMB8이 직장암 환자에서 수술전 화학방사선치료에 대한 감수성의 마커로 사용할 수 있음을 확인하였다.

실시예 3: PSMB8의 넉다운의 방사선-유도된 세포 사멸 억제 효과 확인

PSMB8 넉다운의 효과를 확인하기 위해서, LoVo 세포에서 siRNA에 의해서 PSMB8의 넉다운을 유도하였다. PSMB8이 넉다운 되었는지 여부를 항-PSMB8 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅에 의해 확인한 결과를 도 5a에 나타내었다.

도 5a에 나타낸 바와 같이, PSMB8이 LoVo 세포에서 넉다운되었음을 확인하였다.

PSMB8이 하향조절된 LoVo 세포에서 방사선의 감수성을 클론원성 분석법 및 MTT 분석법에 의해 측정하였고, 그 결과를 각각 도 5b 및 도 5c에 나타내었다.

도 5b에 나타낸 바와 같이, PSMB8이 넉다운된 세포의 경우, 대조군 세포에 비해서 방사선에 대해 저항성이 있는 표현형을 나타냄을 확인하였다. 또한, 클론원성 분석법으로부터 2 및 4 Gy 용량의 조사에 대한 반응으로 PSMB8이 넉다운된 LoVo 세포가 더 많은 콜로니를 형성하는 것을 확인하였다(p<0.05).

도 5c에 나타낸 바와 같이, PSMB8이 넉다운된 경우 방사선 6 Gy에 대하여 대조군에 비해 증가된 세포 생존률을 나타냄을 확인하였다(p=0.004, 24시간에서 9%; p=0.006, 48시간에서 8%; p=0.00008, 72시간에서 13%).

실시예 4: in vivo 에서 PSMB8의 과발현에 따른 방사선 감수성 증가 효과 확인

상기 실시예들로부터 직장암 세포주에서 PSMB8의 과발현이 방사선 감수성을 향상시킴을 확인하였고, 이를 인 비보에서 추가적으로 확인하기 위해서 마우스 이종이식 모델을 확립하고, 마우스 모델에서 PSMB 과발현이 방사선에 대한 감수성 변화를 야기하는지 확인한 결과를 도 6a에 나타내었다.

도 6a에 나타낸 바와 같이, 마우스 모델에 2 Gy로 5번 방사선을 조사한 결과, HCT116/벡터 군에 비해서 HCT116/PSMB8 이종이식 모델에서 방사선 조사에 의해 종양 부피의 증가가 유의성있게 억제됨을 확인하였으며, 이는 시간 의존적 방식으로 억제됨을 확인하였다. 구체적으로, HCT116/벡터, HCT116/PSMB8, HCT116/벡터 + 10 Gy, 및 HCT116/PSMB8 + 10 Gy 조사 군에서 종양 부피(평균±S.E.)가 각각 1487.60±255.14, 1333.01±127.03, 579.38±33.53, 및 260.10±39.73 mm³ 임을 확인하였다(p=0.0003).

또한, 상기 마우스 모델에서 종양 부피의 억제율을 측정한 결과를 도 6b에 나타내었다.

도 6b에 나타낸 바와 같이, 방사선 조사에 따른 종양 부피의 감소 비율은 HCT116/PSMB8 모델의 경우 81%, HCT116/벡터 모델에서 53%임을 확인하였다. 따라서, PSMB8의 발현에 의해 종양 부피가 감소하였음을 확인하였다(p=0.001).

또한, 상기 마우스 모델을 이용한 실험의 종료시 마우스를 희생하고 종양을 제거하여 H&E로 염색한 결과를 도 6c에 나타내었다.

도 6c에 나타낸 바와 같이, H&E로 염색한 각각의 시료는 수축 종양 클러스터(외막) 및 세포 괴사(내막)를 나타내었다.

따라서, 상기 결과로부터 PSMB8의 발현 증가가 인 비보 및 인 비트로에서 종양의 방사선 감수성을 증가시킴을 확인하였다.

비록 본 발명이 상기에 언급된 바람직한 실시예로서 설명되었으나, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 또한 첨부된 청구 범위는 본 발명의 요지에 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함한다.

Claims

PSMB8(Proteasome Subunit Beta 8) 유전자 또는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 직장암세포 또는 결장암세포의 방사선치료 저항성 또는 감수성 예측용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 B3GALT4(UDP-Gal:BetaGlcNAc Beta 1,3-Galactosyltransferase, Polypeptide 4), HSPA1B(Heat Shock 70kDa Protein 1B), KRBOX1(KRAB Box Domain Containing 1), PPBP(Pro-Platelet Basic Protein (Chemokine (C-X-C Motif) Ligand 7), PPP1R18(Protein Phosphatase 1, Regulatory Subunit 18), SLC39A7(Solute Carrier Family 39 (Zinc Transporter), Member 7), 및 TAP2(Transporter 2, ATP-Binding Cassette, Sub-Family B (MDR/TAP))로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자 또는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 더 포함하는, 직장암세포 또는 결장암세포의 방사선치료 저항성 또는 감수성 예측용 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 방사선치료는 수술전 화학방사선치료(preoperative chemoradiation therapy)인, 직장암세포 또는 결장암세포의 방사선치료 저항성 또는 감수성 예측용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 유전자의 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것인, 직장암세포 또는 결장암세포의 방사선치료 저항성 또는 감수성 예측용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 것인, 직장암세포 또는 결장암세포의 방사선치료 저항성 또는 감수성 예측용 조성물.
제1항, 제2항, 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 직장암세포 또는 결장암세포의 방사선치료 저항성 또는 감수성 예측용 키트.
제7항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, 마이크로어레이, 및 단백질 칩 키트로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 직장암세포 또는 결장암세포의 방사선치료 저항성 또는 감수성 예측용 키트.
(a) PSMB8(Proteasome Subunit Beta 8) 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머를 사용하여 직장암 또는 결장암 환자의 생물학적 시료로부터 mRNA 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 mRNA 수준의 변화를 대조군 시료의 mRNA 수준과 비교하는 단계;를 포함하는, 직장암 또는 결장암 환자의 방사선치료 저항성 또는 감수성 예측을 위한 정보의 제공방법.
제9항에 있어서, B3GALT4(UDP-Gal:BetaGlcNAc Beta 1,3-Galactosyltransferase, Polypeptide 4), HSPA1B(Heat Shock 70kDa Protein 1B), KRBOX1(KRAB Box Domain Containing 1), PPBP(Pro-Platelet Basic Protein (Chemokine (C-X-C Motif) Ligand 7), PPP1R18(Protein Phosphatase 1, Regulatory Subunit 18), SLC39A7(Solute Carrier Family 39 (Zinc Transporter), Member 7), 및 TAP2(Transporter 2, ATP-Binding Cassette, Sub-Family B (MDR/TAP))로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자의 mRNA 수준을 측정 및 비교하는 단계를 더 포함하는, 직장암 또는 결장암 환자의 방사선치료 저항성 또는 감수성 예측을 위한 정보의 제공방법.
제9항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 조직, 전혈, 혈청 또는 혈장인 것을 특징으로 하는, 직장암 또는 결장암 환자의 방사선치료 저항성 또는 감수성 예측을 위한 정보의 제공방법.
삭제
(a) PSMB8(Proteasome Subunit Beta 8) 단백질에 특이적인 항체를 직장암 또는 결장암 환자의 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성으로 단백질 수준을 확인하는 단계; 및
(b) 상기 단백질 형성량의 변화를 대조군 시료의 단백질 수준과 비교하는 단계;를 포함하는, 직장암 또는 결장암 환자의 방사선치료 저항성 또는 감수성 예측을 위한 정보의 제공방법.
제13항에 있어서, B3GALT4(UDP-Gal:BetaGlcNAc Beta 1,3-Galactosyltransferase, Polypeptide 4), HSPA1B(Heat Shock 70kDa Protein 1B), KRBOX1(KRAB Box Domain Containing 1), PPBP(Pro-Platelet Basic Protein (Chemokine (C-X-C Motif) Ligand 7), PPP1R18(Protein Phosphatase 1, Regulatory Subunit 18), SLC39A7(Solute Carrier Family 39 (Zinc Transporter), Member 7), 및 TAP2(Transporter 2, ATP-Binding Cassette, Sub-Family B (MDR/TAP))로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자의 단백질 수준을 측정 및 비교하는 단계를 더 포함하는, 직장암 또는 결장암 환자의 방사선치료 저항성 또는 감수성 예측을 위한 정보의 제공방법.
제13항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 조직, 전혈, 혈청 또는 혈장인 것을 특징으로 하는, 직장암 또는 결장암 환자의 방사선치료 저항성 또는 감수성 예측을 위한 정보의 제공방법.
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