KR101927577B1 - 간암 바이오 마커로서 ｈ２ａ．ｚ．１의 용도 - Google Patents

간암 바이오 마커로서 ｈ２ａ．ｚ．１의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 H2AFZ의 간암 바이오 마커로서의 용도에 대한 것으로, 보다 구체적으로 H2AFZ의 간암 바이오 마커로서의 용도에 대한 것으로, 보다 구체적으로 H2AFZ 유전자 또는 그 발현 단백질(H2A.Z.1)로 이루어진 간암 진단용 마커, 간암 진단 또는 예후 추정용 조성물, 간암 진단 또는 예후 추정 방법, 간암 진단 또는 예후 추정용 바이오 마커 검출 방법, 간암 치료제의 스크리닝 방법 및 간암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 H2AFZ 유전자는 비-간암 조직 또는 비-간암 세포에 비해 간암 조직 또는 간암 세포에서 발현양이 증가되는 것으로 확인됨에 따라 H2AFZ 유전자를 간암 진단용 마커로 사용할 경우 간암을 조기에 신속하고 정확하게 진단 및 예측할 수 있는 효과가 있으며, 간암의 예방 또는 치료를 위한 치료제 개발의 표적으로 활용할 수 있는 효과가 있다.

Description

간암 바이오 마커로서 Ｈ２Ａ．Ｚ．１의 용도{Use of H2A.Z.1 as a hepatocellular carcinomar biomarker}
본 발명은 H2A.Z.1의 간암 바이오 마커로서의 용도에 대한 것으로, 보다 구체적으로 간암을 조기에 효과적으로 진단 및 예측할 수 있는 신규한 간암 진단 또는 예후 추정용 조성물, 간암 진단 또는 예후 추정 방법, 간암 진단 또는 예후 추정용 바이오 마커 검출 방법, 간암 치료제의 스크리닝 방법 및 간암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
간암(hepatocellular carcinoma; HCC)은 세계적으로 가장 치명적인 암 중 하나이다. 특히 아시아와 사하라 이남 아프리카에서, 해마다 약 오십만명 이상이 간암으로 사망하고 있다. 비록 간암의 위험 요인이 B형 간염 또는 C형 간염 바이러스에 의한 고질적인 감염이라고 할지라도 간암 세포 내의 분자 메커니즘은 아직도 명확히 규명되지 않은 상태이다.
현재 간암 진단을 위해 초음파 검사, CT 검사, MRI 검사 등의 화상 진단 검사, 혈청 검사(AFP, PIVKA-II) 및 생검 재료의 병리 조직 검사가 이용되고 있는데, 혈청 AFP 검사는 환자의 대략 7할 미만에서 높은 값을 나타내지만, 만성 간질환 환자에 있어도 경도의 높은 값을 나타내는 것이 자주 인정되어 그 감별이 중요하다. 한편, 조기 간암에서는 낮은 값을 나타내는 일도 많은데, PIVKA-II(protein induced by vitamin K antagonist II)의 양성율은 5할 미만으로 낮지만, 간암에서의 특이성은 높고 양자의 병용에 의해 진단 정밀도가 상승하는 것으로 알려져 있다. 그렇지만, 위양성 혹은 양자 음성의 증례에 대해 보다 특이적인 종양 마커의 개발이 기대되고 있다.
생검 재료의 병리 조직 검사는 간질환의 확정 진단에 있어 중요한 검사이다. 그러나 병리학적 특징만으로 암, 특히 초기의 간암과 비암부 조직을 식별하는 일도 때때로 곤란하다. 즉, 미소병변은 대재성 결절, 혹은 초기의 고분화형의 간세포암인 경우를 볼 수 있으며, 특히 경피성 침생검에 의해 종양성 조직을 채취했을 경우에는, 채취량이 한정되는 일도 있으므로 보다 확실한 진단 기술이 요구된다. 따라서 이러한 일로부터 조기의 간세포암을 비암부 조직으로부터 식별할 수 있는 암특이적인 항체 또는 마커의 개발이 필요한 실정이다.
한편, 진핵세포내 게놈 DNA는 H2A, H2B, H3, H4 및 H1와 같은 표준 히스톤(canonical histone) 구성 단위를 포함하는 뉴클레오솜과 함께 염색질 속에 팩킹된다. 히스톤들은 H3-H4 헤테로다이머(heterodimer) 및 H2A-H2B 헤테로다이머와 링커 히스톤 H1이 뉴클레오솜을 결속시키면서 구성된다. 뉴클레오솜 조성 및 생화학적 특성의 매우 급격한 변화는 전사, 유전자 슬라이싱, DNA 복제 및 제조합에 대한 조절을 가능하게 한다. H2A.Z는 포유류 세포 내 표준 히스톤 H2A와 약 60%의 동일성을 갖는 히스톤 H2A 변형체 중 하나로서, 염색질(chromatin) 재구성, 유전자 전사 조절, 염색체 분리 및 DNA 복구와 연관된다. H2A.Z 교환은 Snf2-Related CREBBP activator(SRCAP) 및 p400/Tip60 복합체를 포함하는 ATP 의존적 교환 인자에 의하여 촉진되고, 이는 염색체 분리, 세포 주기 진행 및 이질염색질/진정염색질 상태 유지 등과 같은 중요 생물 과정에서 중요한 역할을 수행한다. 히스톤이 많은 생체 기관에서 필수불가결한 것으로 알려져 있으나, 무척추동물에서는 오직 한 개 유전자 카피만이, 척추동물에서는 두 개의 상이한 유전자 카피가 존재한다. 이들은 기능적으로 상이한 두 개의 단백질, H2AFZ에 의해 암호화되는 H2A.Z.1과 H2AFV에 의하여 암호화되는 H2A.Z.2로 구성되고, 최근 이들이 다양한 암과 연관되어 있음이 알려졌다. H2A.Z.1와 H2A.Z.2는 단백질 수준에서 단지 3개의 아미노산만이 다르지만, 상이한 염기서열로 암호화된다. 현재 각 이형체(isoform)의 특이적 기능은 많은 부분이 규명되지 않았지만, H2A.Z.1 넉다운 쥐 연구는 상기 두 유전자는 필수적인 것으로, 나아가 예비 자료에 따르면 이들은 뉴클레오솜의 구조 및 기능적 차이점을 부여하는 것으로 알려졌다(비특허문헌 2) 예를 들어 이종 이식 종양(xenograft tumors),(안드로겐 비연관적 종양) 정소의 거세 저항성 림프선 암종(castration-resistant lymph node carcinoma)에서 H2A.Z.1의 현격한 증가가 관찰되었다(비특허문헌 3)
하지만 H2A.Z 의 두 이형체간의 구조 기능적 차이점들에 대한 많은 연구가 요구되며, 게다가 H2A.Z가 종양 형성에 미치는 영향 측면에서 유방암, 정소암, 방광암에서 과발현되는 것이 보고되기는 하였지만, 이는 H2A.Z.1 단독에 초점을 두거나 아니면 두 이형체 간의 차이를 구별하지 않았다. 따라서, 상기 중요한 두 이형체간의 특이적 차이점에 착안하여 보다 효과적이고 더욱 특이적인 항암 바이오 마커가 요구된다.
1. 중국특허 CN103497253 2. 미국등록특허 US5780432
1. Oncotarget. 2014 Jun; 5(11): 34283443. 2. Dryhurst D, Ishibashi T, Rose KL, Eirin-Lopez JM, McDonald D, Silva-Moreno B, Veldhoen N, Helbing CC, Hendzel MJ, Shabanowitz J, Hunt DF and Ausio J. Characterization of the histone H2A.Z-1 and H2A.Z-2 isoforms in vertebrates. BMC Biol. 2009; 7:86. 3. Dryhurst D, McMullen B, Fazli L, Rennie PS and Ausio J. Histone H2A.Z prepares the prostate specific antigen (PSA) gene for androgen receptor-mediated transcription and is upregulated in a model of prostate cancer progression. Cancer Letters. 2012; 315(1):38-47. 4. Sartor MA, Mahavisno V, Keshamouni VG, Cavalcoli J, Wright Z, Karnovsky A, Kuick R, Jagadish HV, Mirel B, Weymouth T, Athey B and Omenn GS. ConceptGen: a gene set enrichment and gene set relation mapping tool. Bioinformatics. 2010; 26(4):456-463.
본 발명의 목적은 간암(HCC)의 발전 및 진행에 있어서 간암을 조기에 신속하고 정확하게 진단할 수 있는 효과적인 바이오 마커를 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 다른 목적은 간암 특이적 유전자의 수준 또는 그 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는 간암 진단용 조성물을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명의 간암 진단용 조성물을 포함하는 간암 진단용 키트, 간암을 예측 및 진단하는 방법, 간암을 예방 또는 치료할 수 있는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다. 나아가, 본 발명의 다른 목적은 간암 특이적 유전자의 발현을 억제하는 물질을 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상술한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 H2AFZ 유전자 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 H2A.Z.1단백질로 이루어진 간암 진단용 마커를 제공한다.
본 발명의 일태양에 따르면, 상기 간암 진단용 마커의 H2AFZ 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일태양에 따르면, H2AFZ 유전자의 발현 수준을 측정하는 물질을 포함하는 간암 진단 또는 예후 추정용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일태양에 따르면, 상기 간암 진단 또는 예후 추정용 조성물에서 유전자의 발현 수준을 측정하는 물질은 상기 유전자가 전사하는 mRNA, 상기 유전자가 암호화하는 단백질, 또는 양자 모두의 존재 여부, 존재량 및 존재 패턴 중에서 어느 하나 이상을 검출하는 물질인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일태양에 따르면, 상기 간암 진단 또는 예후 추정용 조성물에서 유전자의 발현 수준을 측정하는 물질은 상기 유전자의 뉴클레오타이드 서열, 그에 상보적인 서열, 상기 뉴클레오타이드의 단편 및 그에 상보적인 서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브, 앱타머 및 안티센스 중 어느 하나 이상인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일태양에 따르면, 상기 간암 진단 또는 예후 추정용 조성물에서 유전자의 발현 수준을 측정하는 물질은 상기 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 코딩되는 폴리펩타이드, 그에 상보적인 서열에 코딩되는 폴리펩타이드, 상기 뉴클레오타이드 서열의 단편에 코딩되는 폴리펩타이드 중 어느 하나 이상에 특이적으로 결합하는 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 항체단편, 리간드, PNA(Peptide nucleic acid), 앱타머(aptamer), 아비머(avidity multimer) 및 펩티도모방체(peptidomimetics) 중에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일태양에 따르면, 상기 간암 진단 또는 예후 추정용 조성물에서 유전자의 발현 수준을 측정하는 물질은 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소 연쇄반응, 실시간 중합효소 연쇄반응, Nuclease 보호 분석(RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, DNA 마이크로어레이 이용법, 노던 블랏, 웨스턴 블랏, ELISA(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), 방사선 면역분석법, 면역 확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 질량분석법(Mass spectrometry) 및 단백질 마이크로어레이 이용법 중에서 어느 하나 이상의 방법으로 유전자 발현을 측정하는 검출시약인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일태양에 따르면, 상기 상술한 간암 진단 또는 예후 추정용 조성물을 포함하는 간암 진단 또는 예후 추정용 키트를 제공한다.
본 발명의 일태양에 따르면, 상기 키트는 마이크로 어레이, 유전자 증폭 키트, 면역분석(immunoassay)용 키트, 루미넥스 분석 키트, 단백질 마이크로어레이 키트 및 ELISA 키트 중에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일태양에 따르면, 상기 상술한 간암 진단 또는 예후 추정용 조성물을 대상 생물학적 시료에 처리하는 단계; 상기 대상 생물학적 시료로부터 H2AFZ 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 유전자 발현 수준 측정 결과를 기준치와 대비하는 단계를 포함하는 간암 진단 또는 예후 추정 방법을 제공하다.
본 발명의 일태양에 따르면, 상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨로 이루어진 군중에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일태양에 따르면, 상기 간암 진단 또는 예후 추정 방법에서 유전자의 발현 수준 측정은 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소 연쇄반응, 실시간 중합효소 연쇄반응, Nuclease 보호 분석(RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, DNA 마이크로어레이 이용법, 노던 블랏, 웨스턴 블랏, ELISA(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), 방사선 면역분석법, 면역 확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 질량분석법(Mass spectrometry) 및 단백질 마이크로어레이 이용법 중에서 어느 하나 이상의 방법을 사용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일태양에 따르면, 간암의 진단 또는 예후 추정에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 인간의 생물학적 시료에 있는 H2AFZ 유전자의 발현 수준 측정하는 단계를 통해 간암 진단 또는 예후 추정용 바이오 마커를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일태양에 따르면, 상기 간암 진단 또는 예후 추정용 바이오 마커를 검출하는 방법에서의 유전자의 발현 수준 측정은 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소 연쇄반응, 실시간 중합효소 연쇄반응, Nuclease 보호 분석(RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, DNA 마이크로어레이 이용법, 노던 블랏, 웨스턴 블랏, ELISA(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), 방사선 면역분석법, 면역 확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 질량분석법(Mass spectrometry) 및 단백질 마이크로어레이 이용법 중에서 어느 하나 이상의 방법을 사용하는 것을 특징으로 한다.
시험 대상 화합물에서 H2AFZ 유전자의 발현 촉진 또는 억제 여부를 확인하는 단계를 포함하는 간암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 일태양에 따르면, 상기 간암 치료제의 스크리닝 방법에서 유전자의 발현 촉진 또는 억제 여부 확인은 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소 연쇄반응, 실시간 중합효소 연쇄반응, Nuclease 보호 분석(RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, DNA 마이크로어레이 이용법, 노던 블랏, 웨스턴 블랏, ELISA(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), 방사선 면역분석법, 면역 확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 질량분석법(Mass spectrometry) 및 단백질 마이크로어레이 이용법 중에서 어느 하나 이상의 방법을 사용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일태양에 따르면, H2AFZ 유전자의 염기서열에 상보적인 서열을 가지는 안티센스 또는 siRNA(small interference RNA) 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일태양에 따르면, 상기 간암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에서 사용되는 siRNA 올리고뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 H2AFZ 유전자는 비-간암 조직 또는 비-간암 세포에 비해 간암 조직 또는 간암 세포에서 발현양이 증가되는 것으로 확인됨에 따라 H2AFZ 유전자를 간암 진단용 마커로 사용할 경우 간암을 조기에 신속하고 정확하게 진단 및 예측할 수 있는 효과가 있으며, 간암의 예방 또는 치료를 위한 치료제 개발의 표적으로 활용할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 인간 간암 세포(HCC)에서 H2A.Z.1이 과발현되는 것을 확인한 다양한 실험결과 그림이다.
1a는 Gene Expression Omnibus (GEO) database로부터의 마이크로어레이 분석결과임(GSE14520, GSE16757, GSE22058 and GSE36376). (평균±표준편차, ***P <0.001, versus 비종양).
1b는 인간 간암 세포내 H2AFZ mRNA 발현을 qRT-PCR 수행한 결과임.
1c는 인간 간암 세포내 H2AFZ에 대한 위스턴블롯 결과(T;종양조직, N:비종양조직), 글리세알데하이드-3-인산 탈수소효소(GADPH)를 로딩 대조군(loading contr으로 사용함.
1d는 정상 간세포 1개(MIHA), 간암 세포 9개(HepG2, Hep3B, Huh7, PLC/PRF/5, SK-Hep1, SNU-182, SNU-368, SNU-449, SNU-475)에 대한 qRT-PCR 수행 결과임. 글리세알데하이드-3-인산 탈수소효소(GADPH) 대조군(평균±표준편차, n=3, *P <0.05, **P <0.01, versus MIHA 세포).
1e는 간세포주에서 내재성 단백질 H2A.Z.1의 발현을 웨스턴블랏한 결과임. 글리세알데하이드-3-인산 탈수소효소(GADPH)는 로딩 대조군(loading control)임.
1f는 쥐의 Gene Expression Omnibus (GEO) database로부터의 마이크로어레이 분석결과이다(GSE29813, GSE35289, and GSE57597). (평균±표준편차, ***P <0.001, versus 비종양).
도 2는 간암 환자내 H2AFZ 발현의 임상적 상관성 및 H2AFZ 관련 유전자 분석 결과이다.
2a는 GEO database (GSE16757)로부터 얻은 마이크로어레이 데이터임. 524개 유전자를 선별하여 클러스터 분석을 수행함(P < 0.01, r > 0.4 or r < -0.4). 환자들을 고-H2AFZ 그룹 및 저-H2AFZ 그룹으로 나눔.
2b는 평균 생존자에 대한 Kaplan-Meier 생존 곡선임.
2c는 DAVID(a molecular function mining tool)로 처리한 결과. 막대그래프는 유전자 enrichement score를 나타냄.
2d는 H2AFZ 특이적 분자 징후에 대한 GSEA 분석결과임.
도 3은 H2AFZ 넉다운이 세포 성장 및 분열에 미친 영향을 살펴본 결과이다.
3a는 SNU-449 및 SK-Hep1 세포주들을 음성 대조군 siRNA(N.C. 100nM), H2A.Z.1 특이적 siRNA(siH2A.Z.1, 100nM)로 감염시킴. 72시간 후 측정하고, 세포수를 트립신 블루 세포 계측(평균±표준편차., n=3, **P <0.01).
3b는 H2A.Z.1 넉다운시 산세포 성장 속도가 억제된 것을 확인함. 세포 성장은 96시간동안 측정함. 모든 실험은 3회 수행(평균±표준편차, n=3, **P <0.01, ***P <0.001).
3c는 Bromodeoxyuridine (BrdU) incorporation assays 결과임. (평균±표준편차, n=3, *P <0.05).
3d는 Clonogenic assays 결과임. 상부 패널: 대표적인 이미지, 하부패널: 임의적으로 선택된 3개(평균±표준, n = 3, **P < 0.01, ***P < 0.001).
도 4는 H2A.Z.1의 특이적 파괴는 간암 세포에서의 세포 괴사 및 세포 주기 억류를 초래하는 것을 확인한 결과이다.
4a는 세포 사멸 분석 결과임. 음성 대조군 siRNA (N.C) 또는 H2A.Z.1 siRNA (siH2A.Z.1)를 SNU-449 및 SK-Hep1 세포주에 처리함. 72시간 후, PI(FL3-H) 및 annexin V(FL1-H)를 사용하여 형광 활성 세포 분리 분석(fluorescence-activated cell sorting analysis, FACS)을 수행함. 막대 그래프는 annexin V 양성 세포의 비율을 나타냄. (평균±표준편차., n=3, **P < 0.001).
4b는 세포주기 분석 결과임. 음성 대조군 siRNA 또는 H2A.Z.1 siRNA 감염 후 FACS 분석을 수행함. H2A.Z.1 넉다운시, G1/S 주기에서의 억류가 발생함. %는 세포의 분포를 나타냄(평균±표준편차., n=3, *P < 0.05).
4c는 caspase-3, cleaved caspase-3, PARP, 및 cleaved PARP에 대한 웨스턴블롯 결과임. H2A.Z.1 넉다운시, SNU-449 및 SK-Hep1 세포주에서 세포 사멸을 초래함. GADPH를 로딩 대조군(loading control)으로 사용함.
4d는 웨스턴블롯 결과임. 음성 대조군 siRNA 또는 H2A.Z.1 siRNA 를 SNU-449 및 SK-Hep1 세포주에 처리함. H2A.Z.1, cyclin D1, p21, p27, CDK2 및 phosphorylated-pRb (p-pRb)이 단백질 수준을 항체를 사용해 측정함. GADPH를 로딩 대조군(loading control)으로 사용함.
도 5는 H2A.Z.1 발현 억제가 간암 세포의 전이 잠재성을 억제하는 것을 확인한 결과들이다.
5a는 H2A.Z.1 넉다운시 SNU-449 및 SK-Hep1 세포주의 생체외 세포 이동 및 침입을 억제함을 확인. 이동 및 침입된 세포의 수를 측정하고, 3회 실험을 수행하여 그래프를 나타냄(평균 ± 표준편차, n=3, **P < 0.01, ***P < 0.001). 그림은 대표 이미지임.
5b는 상처 치유 분석(scratch wound healing assay) 결과임. 세포를 긁어 상처를 낸 후 24시간 동안 배양함. 막대 그래프는 회복된 영역의 비율임(평균 ± 표준편차, n=3, ***P < 0.001, *P < 0.05).
5c는 상피간엽이행(Epithelial mesenchymal transition, EMT) 마커에 대한 웨스턴블롯 결과임. H2A.Z.1 넉다운시 EMT 단백질들을 선택적으로 변화시킴. H2A.Z.1, E-cadherin, 피브로넥틴, N-cadherin, 비멘틴(vimentin), snail 및 slug에 대하여 특이적 항체를 사용해 검출함. GADPH를 로딩 대조군(loading control)으로 사용함.
5d는 Gene Expression Omnibus (GEO) 데이터베이스로부터 마이크로 어레이 자료를 분석함. H2AFZ와 FN1사이의 발현 분석을 위해 accession numbers GSE36376의 GEO 자료를 사용함. 왼쪽 패널은 GSE36376 에서의 FN1 mRNA 발현을 나타냄, 오른쪽 패널은 GSE36376 에서 H2AFZ와 FN1사이의 양적 상관관계를 나타냄.(Pearson correlation coefficient r = 0.4273, ***P < 0.0001).
도 5e는 H2AFZ의 특이적 분자징후에 관련된 네트워크를 분석한 결과로서, H2AFZ관련 유전자들은 concept map이란 웹 도구를 이용하여 분석한 것이며 분석결과 나온 4개의 경로는 각각 서로 다른 색으로 표시되어 있다.
상기 상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명은, 본 발명은 H2AFZ의 간암 바이오 마커로서의 용도에 대한 것으로, 보다 구체적으로 H2AFZ 유전자 또는 그 발현 단백질(H2A.Z.1)로 이루어진 간암 진단용 마커, 간암 진단 또는 예후 추정용 조성물, 간암 진단 또는 예후 추정 방법, 간암 진단 또는 예후 추정용 바이오 마커 검출 방법, 간암 치료제의 스크리닝 방법 및 간암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 이하 도면을 참조하여 본 발명을 구체적으로 설명한다.
본 발명자들은 간암을 신속하고 정확하게 진단하고 예후를 추정할 수 있는 신규한 바이오 마커를 발굴하고자 연구할 결과, 본 발명의 바이오 마커들이 간암을 조기 진단할 수 있고, 예후를 판정할 수 있는 마커임을 규명함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명에서 용어 "간암 (liver cancer)"이란 일반적으로 간세포에서 기원하는 암을 의미한다. 간암에는 처음부터 간에서 생기는 원발성 간암과 다른 조직에서 발생한 암이 간에 전이되어 발병하는 전이성 간암이 있다. 원인은 대부분 불분명하나, 간경변이 있는 경우가 많으며, 간경변이 있는 환자와 만성 활동성 B형 간염, 또는 B형 간염 보균자에서 간암이 잘 발생하는 것으로 밝혀지고 있다. 본 발명자들은 본 발명의 마커를 사용하면, 개체로 부터 간암의 발병여부에 대해 민감도 및 신뢰도가 높은 결과를 얻을 수 있음을 확인하였다.
본 명세서에서 용어 진단은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)(예컨대, 전-전이성 또는 전이성 암 상태의 동정, 암의 단계 결정 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다. 간암의 "예후"는 다양한 관점에서 추정될 수 있지만, 대표적으로 재발가능성, 생존가능성, 무병생존가능성의 관점에서 판단된다.
본 발명에서 용어 "(바이오)마커, 진단하기 위한 마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)"란 간암이 발생한 세포 또는 조직을 정상 세포 또는 조직과 구분하여 판정할 수 있는 물질로, 정상 세포에 비하여 간암을 가진 세포에서 증가 양상을 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명의 목적상, 상기 간암 진단 (바이오)마커는 H2AFZ 유전자의 뉴클레오타이드 (그의 단편 포함) 또는 그에 코딩되는 단백질(그의 단편 포함) 로서, 간암 세포에서 발현이 증가하는 유전자이다. 이러한 마커들은 어느 하나의 유전자에 대한 mRNA 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 어느 하나의 단백질을 사용할 수 있으며, 이들 마커들이 둘 이상 포함된 복합 마커일 수도 있다.
본 명세서에서 사용되는 '폴리펩타이드'(또는 단백질)는 해당 아미노산 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은 본 발명의 아미노산 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 사용되는 알로리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 90%의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 의미한다.
예를 들어, 상기 폴리펩타이드(단백질)는 기재된 특정의 아미노산 서열과 약 60% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 99% 이상, 99.1% 이상, 99.2% 이상, 99.3% 이상, 99.4% 이상, 99.5% 이상, 또는 99.9% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가지며 간암 진단 또는 예후 추정의 바이오 마커 기능을 하는 폴리펩타이드를 포함한다. 일반적으로, 동일성 % 는 높을수록 더욱 바람직하다.
또한 상기 동일성을 가지는 폴리펩타이드는 기재된 특정 아미노산 서열의 폴리펩타이드에서 1개 이상 아미노산 잔기가 소실, 치환, 삽입, 및/또는 첨가된 아미노산 서열을 포함하면서 베타-아디페이트 경로와 관련되는 폴리펩타이드를 포함한다. 일반적으로, 소실, 치환, 삽입, 및/또는 첨가의 수는 적을수록 더욱 바람직하다.
본 명세서에 사용되는 '폴리뉴클레오타이드' (또는 뉴클레오타이드, 핵산)는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogues)도 포함한다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 상기 기재된 특정의 아미노산 서열(폴리펩타이드)을 암호화하는 핵산 분자에 제한되지 않고, 상기에서 서술한 것처럼 특정 아미노산 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 아미노산 서열 또는 그에 상응하는 기능을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은 본 발명의 아미노산 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 사용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 90%의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 의미한다.
상기 상응하는 기능을 가진 폴리펩타이드는 예를 들어, 하나 이상의 아미노산이 소실, 치환, 삽입, 및/또는 첨가되는 아미노산 서열의 폴리펩타이드를 포함한다. 그러한 폴리펩타이드는 상기 상술한 것처럼 1 개 이상의 아미노산 잔기가 소실, 치환, 삽입, 및/또는 첨가된 아미노산 서열로 이루어지며 3-하이드록시프로피온산 합성 관련되는 폴리펩타이드를 포함하며, 아미노산 잔기의 소실,치환,삽입, 및/또는 첨가의 수가 적은 것이 바람직하다. 또한, 상기 폴리펩타이드는 상기 상술한 것처럼 기재된 특정의 아미노산 서열과 약 60% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가지며 간암 진단 또는 예후 추정의 바이오 마커 기능을 하는 폴리펩타이드를 포함하며, 동일성이 높을 수록 바람직하다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "상보적" 또는 "상보성"은 퓨린 및 피리미딘 뉴클레오티드가 수소 결합을 통해 결합하여 더블 스트랜드 폴리뉴클레오타이드를 형성하는 능력을 의미하며, 부분적으로 상보적인 경우도 포함한다. 하기 염기쌍이 상보성과 관련된다: 구아닌 및 시토신; 아데닌 및 티민; 및 아데닌 및 우라실. "상보적"은 상기 언급된 관계가 전장의 상기 분자에 걸쳐 2개의 싱글-스트랜드 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 모든 염기쌍에 실질적으로 적용된다. "부분적으로 상보적"은 2개의 싱글-스트랜드 폴리뉴클레오타이드 중 하나의 길이가 짧기 때문에 그 분자들 중 하나의 일부가 싱글 스트랜드로 남아있는 것 관계를 의미한다.
본 발명은 H2AFZ 유전자 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 H2A.Z.1단백질로 이루어진 간암 진단용 마커를 제공한다. 상기 간암 진단용 마커의 H2AFZ 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 가질 수 있다.
본 발명은 H2AFZ 유전자의 발현 수준을 측정하는 물질을 포함하는 간암 진단 또는 예후 추정용 조성물을 제공한다.
상기 간암 진단 또는 예후 추정용 조성물에서 유전자의 발현 수준을 측정하는 물질은 상기 유전자가 전사하는 mRNA, 상기 유전자가 암호화하는 단백질, 또는 양자 모두의 존재 여부, 존재량 및 존재 패턴 중에서 어느 하나 이상을 검출할 수 있다.
본 발명에서 상기 H2AFZ 유전자의 수준은, 바람직하게 H2AFZ 유전자가 발현된 mRNA 수준, 즉, mRNA의 양을 의미하며, 상기 수준을 측정할 수 있는 물질로는 H2AFZ 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있다. 본 발명에서 상기 H2AFZ 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브는 서열번호 1로 나타내는 H2AFZ 유전자 전체 또는 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브일 수 있으며, 상기 프라이머 또는 프로브는 당업계에 알려진 방법을 통해 디자인할 수 있다.
본 발명에서 상기프라이머란 용어는 적합한 온도 및 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있을 수 있다. 또한, 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 H2AFZ 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 또한, 본 발명에 따른 프라이머는 유전자 증폭 반응에 이용될 수 있는 것이 바람직하다.
본 발명에서, 상기프로브라는 용어는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄([0046] linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타켓 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것을 말한다. 본 발명에 따른 프로브는 단일쇄일 수 있으며, 바람직하게는 올리고디옥시리보뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 프로브는 자연 dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 프로브는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 프로브는 골격 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대, 펩타이드 핵산 (PNA) (M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.
따라서, 상기 간암 진단 또는 예후 추정용 조성물에서 유전자의 발현 수준을 측정하는 물질은 상기 유전자의 뉴클레오타이드 서열, 그에 상보적인 서열, 상기 뉴클레오타이드의 단편 및 그에 상보적인 서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브, 앱타머 및 안티센스 중 어느 하나 이상일 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 H2AFZ 유전자에 의하여 발현되는 H2A.Z.1 단백질의 수준은, 바람직하게 H2AFZ 유전자가 발현된 mRNA로부터 번역과정을 거쳐 생성된 H2A.Z.1 폴리펩티드를 의미하며, 상기 H2A.Z.1 폴리펩티드의 서열은 서열번호 3에 나타내었다.
상기 H2A.Z.1 단백질의 수준을 측정할 수 있는 물질로는 H2A.Z.1 단백질에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 다클론 항체, 단일클론 항체 및 재조합 항체 등의 항체를 포함할 수 있다. 따라서, 간암 진단 또는 예후 추정용 조성물에서 유전자의 발현 수준을 측정하는 물질은 상기 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 코딩되는 폴리펩타이드, 그에 상보적인 서열에 코딩되는 폴리펩타이드, 상기 뉴클레오타이드 서열의 단편에 코딩되는 폴리펩타이드 중 어느 하나 이상에 특이적으로 결합하는 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 항체단편, 리간드, PNA(Peptide nucleic acid), 앱타머(aptamer), 아비머(avidity multimer) 및 펩티도모방체(peptidomimetics) 중에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 기술한 바와 같이 간암을 진단할 수 있는 마커 단백질로서 H2A.Z.1 단백질이 규명되었으므로, 상기 단백질을 이용하여 항체를 생성하는 방법은 당해 기술분야의 일반적 기술자가 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 예컨대, 다클론 항체의 경우에는 H2AFZ(H2A.Z.1) 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있으며, 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조가능하다. 단일클론항체의 경우에는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마(hybridoma) 방법(Kohler et al., European Jounral of Immunology, 6, 511-519, 1976)을 이용하여 제조할 수 있거나 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352, 624-628, 1991, Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태 뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
상기 간암 진단 또는 예후 추정용 조성물에서 유전자의 발현 수준을 측정하는 물질은 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소 연쇄반응, 실시간 중합효소 연쇄반응, Nuclease 보호 분석(RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, DNA 마이크로어레이 이용법, 노던 블랏, 웨스턴 블랏, ELISA(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), 방사선 면역분석법, 면역 확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 질량분석법(Mass spectrometry) 및 단백질 마이크로어레이 이용법 중에서 어느 하나 이상의 방법으로 유전자 발현을 측정하는 검출시약일 수 있다.
본 발명은 상기 상술한 간암 진단 또는 예후 추정용 조성물을 포함하는 간암 진단 또는 예후 추정용 키트를 제공한다. 상기 키트는 마이크로 어레이, 유전자 증폭 키트, 면역분석(immunoassay)용 키트, 루미넥스 분석 키트, 단백질 마이크로어레이 키트 및 ELISA 키트 중에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명은 상기 상술한 간암 진단 또는 예후 추정용 조성물을 대상 생물학적 시료에 처리하는 단계; 상기 대상 생물학적 시료로부터 H2AFZ 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 유전자 발현 수준 측정 결과를 기준치와 대비하는 단계를 포함하는 간암 진단 또는 예후 추정 방법을 제공하다. 상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.
상기 H2AFZ 유전자의 발현 수준 측정은 바람직하게는 mRNA의 수준을 측정하는 것이며, mRNA의 수준을 측정하는 방법으로는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소연쇄반응, RNase 보호 분석법, 노던 블럿 및 DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 간암 진단 또는 예후 추정 방법에서 유전자의 발현 수준 측정은 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소 연쇄반응, 실시간 중합효소 연쇄반응, Nuclease 보호 분석(RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, DNA 마이크로어레이 이용법, 노던 블랏, 웨스턴 블랏, ELISA(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), 방사선 면역분석법, 면역 확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 질량분석법(Mass spectrometry) 및 단백질 마이크로어레이 이용법 중에서 어느 하나 이상의 방법을 사용할 수 있다.
상기 H2AFZ 단백질 수준의 측정은 항체를 이용할 수 있는데, 이러한 경우, 생물학적 시료 내의 H2AFZ 마커 단백질과 이에 특이적인 항체는 결합물, 즉, 항원-항체 복합체를 형성하며, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 이에 제한되지는 않으나, 웨스턴 블럿, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있다.
따라서 본 발명은 상기와 같은 검출 방법들을 통하여, 대조군의 H2AFZ mRNA 발현양 또는 단백질의 양과 간암 환자 또는 간암 의심환자에서의 H2AFZ mRNA 발현양 또는 단백질의 양을 확인할 수 있고, 상기 발현양의 정도를 대조군, 즉, 정상인의 샘플과 비교함으로써 간암의 발병여부, 진행단계 또는 예후 등을 예측 및 진단할 수 있다.
일례로, 간암 환자로부터 수득한 조직 및 간암세포를 용해시켜 세포내 단백질들을 포함하는 용해물을 수득한 다음, H2AFZ(H2A.Z.1)에 대한 항체를 이용한 웨스턴 블럿 방법을 수행하여 각 간암시료로부터 H2AFZ의 단백질 양을 측정한 다음, 상기 측정치를 정상의 대조군과 비교 분석하는 과정을 통해 수행한다. 나아가 본 발명자들은 상기와 같은 결과를 통해 간암이 발병할 경우 세포 또는 조직내에서 H2AFZ의 발현이 증가되므로 간암세포에서 H2AFZ의 발현을 억제할 경우 간암을 예방 또는 치료할 수 있을 것으로 예상하였고, H2AFZ의 발현을 억제할 수 있는 물질을 간암 치료제로 사용할 수 있다는 것을 알 수 있었다.
본 발명은 간암의 진단 또는 예후 추정에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 인간의 생물학적 시료에 있는 H2AFZ 유전자의 발현 수준 측정하는 단계를 통해 간암 진단 또는 예후 추정용 바이오 마커를 검출하는 방법을 제공한다.
상기 간암 진단 또는 예후 추정용 바이오 마커를 검출하는 방법에서의 유전자의 발현 수준 측정은 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소 연쇄반응, 실시간 중합효소 연쇄반응, Nuclease 보호 분석(RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, DNA 마이크로어레이 이용법, 노던 블랏, 웨스턴 블랏, ELISA(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), 방사선 면역분석법, 면역 확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 질량분석법(Mass spectrometry) 및 단백질 마이크로어레이 이용법 중에서 어느 하나 이상의 방법을 사용할 수 있다.
본 발명은 시험 대상 화합물에서 H2AFZ 유전자의 발현 촉진 또는 억제 여부를 확인하는 단계를 포함하는 간암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 따르면, 먼저 H2AFZ 유전자 또는 H2A.Z.1 단백질을 포함 또는 발현하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시킬 수 있다. 여기서 상기시료는 H2AFZ 유전자의 발현양, H2A.Z.1 단백질의 양 또는 활성에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시료는 화학물질, 뉴클레오티드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 이후, 시료가 처리된 세포에서 H2AFZ 유전자의 발현양, H2A.Z.1 단백질의 양 또는 활성을 측정할 수 있으며, 측정 결과, H2AFZ 유전자의 발현양, H2A.Z.1 단백질의 양 또는 활성이 감소되는 것이 측정되면 상기시료는 간암을 치료 또는 예방할 수 있는 물질로 판정될 수 있다.
상기에서 H2AFZ 유전자의 발현양, H2A.Z.1 단백질의 양 또는 활성을 측정하는 방법(유전자의 발현 촉진 또는 억제 여부)은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 수행될 수 있는데, 예를 들면, 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소 연쇄반응, 실시간 중합효소 연쇄반응, Nuclease 보호 분석(RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, DNA 마이크로어레이 이용법, 노던 블랏, 웨스턴 블랏, ELISA(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), 방사선 면역분석법, 면역 확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 질량분석법(Mass spectrometry) 및 단백질 마이크로어레이 이용법 중에서 어느 하나 이상의 방법을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 H2AFZ 유전자의 염기서열에 상보적인 서열을 가지는 안티센스 또는 siRNA(small interference RNA) 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 상기 간암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에서 사용되는 siRNA 올리고뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 실제로 H2AFZ 유전자의 발현을 억제하거나 또는 H2A.Z.1 단백질의 발현을 억제할 경우, 간암을 예방 또는 치료할 수 있는지를 확인하는 실험을 수행하였는데, 즉, H2AFZ 유전자에 대한 siRNA를 이용하여 간암세포에서 H2AFZ의 발현을 억제한 결과, 간암 세포의 세포성장이 억제되는 것으로 나타났고, 나아가 간암세포의 세포사멸이 촉진되는 것을 확인할 수 있었다.
한편, 정상세포는 세포가 스스로 성장 및 분화 조절기능과 자기사멸기능 간의 균형을 유지하지만, 암세포는 이 균형이 깨져 세포의 수가 기하급수적으로 빠르게 증가하고 성장한다. 세포의 성장과 분화를 위한 세포주기의 과정은 크게 간기(Interphase)와 분열기(Mitotic phase)로 나뉘며, 간기는 다시 세포들이 세포분열에 필요한 각종 단백질의 합성이 일어나는 G(1)-phase와 DNA 합성이 일어나는 S-phase, 세포분화 과정인 유사분열(Mitosisphase) 단계로 이루어져 있다.
또한, 세포분열에는 이를 조절할 수 있는 조절요소들이 필요한데, 특히 각종 사이클린(Cyclin) 단백질은 사이클린 의존성 키나아제(Cyclin Dependent Kinase, CDK)라고 불리는 인산화 효소와 cyclin/CDK 복합체를 형성하여 세포주기의 단계를 조절하는 역할을 하며, 특히 사이클린 키나제 억제제(cyclin kinase inhibitors, CKIs)인 p21은 G1-phase의 cyclin/CDK 복합체에 붙어서 이 복합체가 활성화되는 것을 막고, 세포주기의 진행을 억제시킴으로써 결국 세포의 성장을 저해시키는 결과를 낳는다.
상기 사이클린 단백질 또한 세포 주기에 있어서 중요한 역할을 하는데, 세포 주기 동안 사이클린의 발현 레벨이 변동하게 되도록 사이클린의 합성 및 분해는 엄격하게 조절되어 있다. 사이클린은 사이클린 의존적 세린/트레오닌 키나제(CDK)에 결합하며, 이러한 결합은 세포내 CDK(예, CDK1 CDK2, CDK4 및/또는 CDK6) 활성에 있어서 필수적인 것이다. 또한, CDK는 다수의 종양유전자 신호전달 경로의 하류에 존재하는 것으로 보고되고 있는데, 사이클린의 상향조절 또는 내인성 억제제의 결실에 의한 CDK 활성의 부조절(disregulation)은 종양 세포의 유사분열 촉진성 신호전달 경로와 종양 세포의 증식 사이에서 중요한 축을 이루는 것으로 알려져 있으며, 세포 주기 키나제(CDK)의 억제제는 세포 증식, 예컨대 포유동물 암 세포 성장의 선택적 억제제로서 유용한 것으로 인식되고 있다.
이에 본 발명자들은 간암 세포에서 H2AFZ가 과발현되고 있다는 사실을 통해 H2AFZ가 암 세포의 세포주기 과정에도 관여하고 있을 것으로 예상하였고, H2AFZ에 의해 영향을 받는 세포주기 조절인자를 조사하였는데, 본 발명의 일실시예에 의한 결과에 의하면, 간암 세포에 H2AFZ siRNA을 처리하여 H2AFZ의 유전자 발현을 억제하였더니 사이클린 D1 및 CDK2의 발현도 함께 억제되는 것으로 나타난 반면, p21, p16, p15 및 사이클린 D3는 아무런 영향을 받지 않는 것으로 나타났다.
상기 결과를 통해 본 발명자들은 H2AFZ가 사이클린 D1 및 CDK2의 조절을 통해 세포 내에서 세포주기 및 성장의 조절에 이상을 초래하여 암을 유발시킨다는 것을 알 수 있었다. 따라서 본 발명자들은 H2AFZ가 사이클린 D1 및 CDK2의 조절을 통해 세포 내에서 세포주기 및 성장의 조절에 이상을 초래하여 암을 유발시킨다는 것을 알 수 있었고, 나아가 세포내에서 H2AFZ의 발현을 억제할 경우, 간암의 발병을 예방하거나 또는 간암을 치료할 수 있다는 사실을 알 수 있었다. 그러므로 본 발명에 따른 간암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에는 H2AFZ의 발현을 억제할 수 있는 물질이라면 모두 포함할 수 있고, 바람직하게는 화학물질, 뉴클레오티드, 안티센스, siRNA 올리고뉴클레오타이드 또는 천연물 추출물을 유효성분으로 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 본 발명의 H2AFZ 유전자의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열을 가지는 안티센스 또는 siRNA(small interference RNA) 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 포함할 수 있으며, 더욱더 바람직하게는 서열번호 2 의 염기서열을 가지는 H2AFZ 유전자에 대한 siRNA 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 "안티센스 올리고뉴클레오타이드란 용어는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 H2AFZ의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 본 발명의 안티센스 서열은 H2AFZ mRNA에 상보적이고 H2AFZ mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하며, H2AFZ mRNA의 번역, 세포질내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다.
또한, 상기 안티센스 핵산은 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격(backbone)의 위치에서 변형될 수 있다(De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5, 3, 343-55, 1995). 핵산 골격은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬, 시클로알킬, 단쇄 헤테로아토믹, 헤테로시클릭당간 결합 등으로 변형될 수 있다. 또한, 안티센스 핵산은 하나 이상의 치환된 당 모이어티(sugar moiety)를 포함할 수 있다. 안티센스 핵산은 변형된 염기를 포함할 수 있다. 변형된 염기에는 하이포크잔틴, 6-메틸아데닌, 5-메틸피리미딘(특히 5-메틸시토신), 5-하이드록시메틸시토신(HMC), 글리코실 HMC, 젠토비오실 HMC, 2-아미노아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6(6-아미노헥실)아데닌, 2,6-디아미노퓨린 등이 있다. 또한, 본 발명의 안티센스 핵산은 상기 안티센스 핵산의 활성 및 세포 흡착성을 향상시키는 하나 이상의 모이어티(moiety) 또는 컨쥬게이트(conjugate)와 화학적으로 결합될 수 있다. 콜레스테롤 모이어티, 콜레스테릴 모이어티, 콜릭산, 티오에테르, 티오콜레스테롤, 지방성 사슬, 인지질, 폴리아민, 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 아다맨탄 아세트산, 팔미틸 모이어티, 옥타데실아민, 헥실아미노-카르보닐-옥시콜에스테롤 모이어티 등의 지용성 모이어티 등이 있고 이에 제한되지는 않는다. 지용성 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오티드와 제조 방법은 본 발명의 기술 분야에서 이미 잘 알려져 있다(미국특허 제5,138,045호, 제5,218,105호 및 제5,459,255호). 상기 변형된 핵산은 뉴클레아제에 대한 안정성을 증가시키고 안티센스 핵산과 표적 mRNA와의 결합 친화력을 증가시킬 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드는 통상의 방법으로 시험관에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 합성되도록 할 수 있다. 시험관에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 일예는 RNA 중합효소 I를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한 가지 예는 인식부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 이런 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 "siRNA용어는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다(국제공개특허번호 00/44895, 01/36646, 99/32619, 01/29058, 99/07409 및 00/44914 참조). siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운(knock-down) 방법으로서 또는 유전자치료 방법으로 제공된다.
본 발명의 siRNA 분자는, 센스 가닥(H2AFZ mRNA 서열에 상응하는 서열)과 안티센스 가닥(H2AFZ mRNA 서열에 상보적인 서열)이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있으며, 또한, 본 발명의 siRNA 분자는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다. 나아가 siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 또한, siRNA 말단 구조는 H2AFZ 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하고, 점착 말단 구조는 3'-말단 돌출 구조와 5'-말단 돌출 구조 모두 가능하다. 또한, 본 발명의 siRNA 분자는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥 사이에 짧은 뉴클레오티드 서열이 삽입된 형태를 가질 수 있으며, 이 경우 뉴클레오타이드 서열의 발현에 의해 형성된 siRNA 분자는 분자내 혼성화에 의하여 헤어핀 구조를 형성하게 되며, 전체적으로는 스템-앤드-루프 구조를 형성하게 된다. 이 스템-앤드-루프 구조는 인 비트로 또는 인 비보에서 프로세싱되어 RNAi를 매개할 수 있는 활성의 siRNA 분자를 생성한다.
siRNA를 제조하는 방법은 시험관에서 siRNA를 직접 합성한 뒤, 형질전환 과정을 거쳐 세포 안으로 도입시키는 방법과 siRNA가 세포 안에서 발현되도록 제조된 siRNA 발현 벡터 또는 PCR-유래의 siRNA 발현 카세트 등을 세포 안으로 형질전환 또는 감염(infection)시키는 방법이 있다.
또한, 유전자 특이적인 siRNA를 포함하는 본 발명의 조성물은 siRNA의 세포내 유입을 촉진시키는 제제를 포함할 수 있다. siRNA의 세포내 유입을 촉진시키는 제제에는 일반적으로 핵산 유입을 촉진하는 제제를 사용할 수 있으며, 이러한 예로는, 리포좀을 이용하거나 콜레스테롤, 콜레이트 및 데옥시콜산을 비롯한 다수의 스테롤류 중 1종의 친유성 담체와 함께 배합할 수 있다. 또한 폴리-L-라이신(poly-L-lysine), 스퍼민(spermine), 폴리실아잔(polysilazane), 폴리에틸레민(PEI: polyethylenimine), 폴리디하이드로이미다졸레늄(polydihydroimidazolenium), 폴리알리라민(polyallylamine), 키토산(chitosan) 등의 양이온성 고분자(cationic polymer)를 이용할 수도 있고, 숙실화된 PLL(succinylated PLL), 숙실화된 PEI(succinylated PEI), 폴리글루타믹산(polyglutamic acid), 폴리아스파틱산(polyaspartic acid), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 폴리메타아크릴산(polymethacylic acid), 덱스트란 설페이트(dextran sulfate), 헤파린(heparin), 히아루릭산(hyaluronic acid) 등의 음이온성 고분자(anionic polymer)를 이용할 수 있다. 또한, 상기 H2A.Z.1 단백질의 발현 및 활성을 감소시키는 물질로서 H2AFZ 단백질(H2A.Z.1)에 특이적인 항체를 사용할 경우, 상기 항체는 기존의 치료제와 직접 또는 링커 등을 통하여 간접적으로 커플링(예를 들어, 공유결합)시킬 수 있다. 항체와 결합될 수 있는 치료제로는 이에 제한되지는 않으나, 131I, 90Y, 105Rh, 47Sc, 67Cu, 212Bi, 211At, 67Ga, 125I, 186Re, 188Re, 177Lu, 153Sm, 123I, 111In 등과 같은 방사성핵종(radionuclide); 메토트렉세이트(methotrexate), 아드리아마이신(adriamycin), 및 인터페론과 같은 림포카인(lympokine) 등의 생물학적 반응 변형체 또는 약물; 리신, 아브린, 디프테리아 등과 같은 독소; 이형기능성 항체(heterofunctional antibodies), 즉 다른 항체와 결합되어서 그 복합체가 암 세포와 효능 세포(예를 들면, T 세포와 같은 K 세포(killer cell) 모두에 결합하는 항체; 및 자연적인, 즉, 비-연관 또는 비-복합된 항체와 결합될 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등과 같은 경구 투여용 담체 및 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르 브산과 같은 항산화제가있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
본 발명에 따른 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 적합한 형태로 제형화 될 수 있다. 즉, 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있으며, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는, 이에 한정되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 환약 및 캡슐 등이 있다.
상기와 같은 방법으로 제형화된 약학적 조성물은 유효량으로 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있는데, 상기 투여란 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 물질의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다.
또한, 상기에서 유효량 이란 환자에게 투여하였을 때, 예방 또는 치료 효과를 나타내는 양을 말한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 환자의 질환 종류 및 중증도, 연령, 성별, 체중, 약물에 대한 민감도, 현재 치료법의 종류, 투여방법, 표적 세포 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며,당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 종래의 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 바람직하게는 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1~10000㎍/체중kg/day, 더욱더 바람직하게는 10~1000㎎/체중kg /day의 유효용량으로 하루에 수회 반복 투여될 수 있다.
이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.
1. 실험 준비
(1) 조직 샘플 준비
간세포암종(Hepatocellular carcinoma, HCC) 조직 16개 및 6쌍과, 그에 대응하는 비종양세포 간조직을 연세대학교(서울, 대한민국) 병리학 교실 및 과학기술부 산하 한국과학재단 (현, 미래창조과학부 산하 한국연구재단) 국가연구소재은행사업의 간암검체은행(Liver cancer speciman bank)로부터 수득하였다. 헬싱키 선언에 따라 모든 대상 검체로부터 서면 동의서를 받았으며, 가톨릭대학교 의과대학(성의 교정)의 임상시험심의위원회(IRB)에 승인을 받았다(IRB 승인 번호: MC12SNMI0184).
(2) 세포 배양
Hep3B, HepG2, Huh7, PLC/PRF/5, SK-Hep1, SNU-182, SNU-368, SNU-449 및 SNU-475 HCC은 한국세포주은행(서울, 대한민국)으로부터 얻었다. 비종양 정상 간세포주(MIHA)는 ATCC(미국, 버지니아주)로부터 구입하였다. 모든 세포주들은 RPMI-1640 또는, 10% 우태아혈청(Sigma, 미주리주) 및 100 units/㎖ 페니실린-스트렙토마이신(Invitrogen, 캘리포니아주)이 함유된 DMEM 배지(Lonza, 메릴랜드주)에서 배양하였다. 모든 세포들을 37℃, 5% 이산화탄소 함유된 가습 배양기에서 배양하였다.
(3) 유전자 발현 자료(Gene expression data)
간세포암종 내 H2AFZ 및 H2AFV 유전자 발현 수준을 분석하기 위하여, 유전자 발현 프로파일링 자료 셋트를 미국 국립생물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI)의 유전자 발현 옴니버스 (Gene Expression Omibud, GEO) 데이터베이스로부터 얻었다(Accession Nos. GSE14520, GSE16757, GSE22058, GSE29813, GSE35289, GSE36376 GSE57597)
(4) 웨스턴블럿 분석(Western blot analysis)
세포를 용해 버퍼(50mM HEPES, 5mM EDTA, 50mM 염화나트륨, 1% Triton X-100, 50mM 플루오린화 나트륨(NaF), 10mM Na2P4O7, 1mM Na3VO4, 5㎍/㎖ 아프로티닌(aprotinin), 5㎍/㎖ 류펩틴(Leupeptin), 1mM PMSF 및 프로테아제 억제제 칵테일)로 용해하였다. 동량의 단백질을 포함하는 용해물을 SDS-PAGE로 분리하고, 폴리바이닐라이덴 다이플루오라이드 막(polyvinylidene difluoride membrane, Bio-Rad, 캘리포니아주)으로 이동하였다. 블롯들을 5% 무지방 우유 용액에서 블로킹하고, 다음의 항체와 함께 배양하였다: anti-H2A.Z.1, anti-p21, anti-PARP, anti-caspase-9, anti-caspase-3, anti-cleaved caspase-3, anti-p27, anti-Cyclin D1, anti-Cyclin A2, anti-CDK2, anti-p-pRb, anti-vimentin, anti-slug (Cell Signaling Technology, 메사추세츠주), anti-GAPDH, anti-Fibronectin (Santa Cruz Biotechnology, 캘리포니아주), anti-E-cadherin, anti-N-cadherin (BD Transduction, 캘리포니아주), 및 anti-Snail(Abcam, 메사추세츠주). ImmobilonTM 웨스턴블롯 감지 시스템(Millipore, 메사추세츠주)를 사용하여 결합된 항체를 감지하였다. LAS-3000 (Fuji Photo Film Co., 일본)를 사용하여 웨스턴블럿의 강도를 측정하였다.
(5) 세포 생존성 분석(Cell viability assay)
세포를 6-웰 접시에 접종하고, 음성 대조군 siRNA 또는 H2A.Z.1 siRNA(5' GAAGAAAGGACAACAGAAGACT 3')를 감염시켰다. 감염 후, 세포를 72시간 동안 배양하고, 트립신으로 수거한 후, 트핍판 블루 용액(Sigma, 미주리주)으로 착색하였다. 착색 후, 헤모사이토미터(Marienfeld Superior, 독일)를 사용하여 계측하였다.
(6) 세포 증식 실험(Cell proliferation assay)
3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium(MTS) 분석을 사용하여 상대적 세포 증식을 측정하였다.세포를 12-웰 접시에 넣고, 음성 대조군 siRNA 및 H2A.Z.1 siRNA를 감염시켰다. 감염 후 세포 증식을 측정하기 위하여, 세포를 1/20로 희석된 500㎕ cellTriter 96　 One Solution Cell Proliferation assay solution (Promega, 위스콘신주)를 사용하여 매 24시간마다 측정하였다. 한 시간 경과후, VICTOR3TM Multilabel plate reader(PerkinElmer Inc, 메사추세츠주)로 490nm 파장에서 세포 흡광도를 측정하였다.
(7) 브로모데옥시우리딘(Bromodeoxyuridine, BrdU) 결합 분석
세포를 40%-50% 컨플루언시가 될 때까지 24-웰 접시에 넣었다. 음성 대조군 siRNA 또는 H2A.Z.1 siRNA로 접종된 세포를 감염시키고, BrdU 세포 증식 분석 키트(Millipore, 메사추세츠주)를 가지고 제조자의 프로토콜에 따라 매 24시간마다 분석을 수행하였다.
(8) 클론원성 분석(Clonogenic assay)
60mm2 세포 배양 접시에서 세포를 H2A.Z.1 siRNA로 감염시켰다. 24시간 동안 감염 후, 2×103, 4×103, 6×103 세포를 6-웰 접시에 재접종하고, 2주 동안 배양하였다. 이후, 세포를 인산완충식염수로 세척하고, 1% 파라포름알데하이드로 30분 동안 실온에서 고정하였다. 고정된 세포를 0.5% 크리스탈 바이올렛으로 1시간 동안 실온에서 착색하였다. 콜론 카운터 프로그램을 사용하여 콜론을 계측하였다(Niyazi M, Niyazi I and Belka C. Counting colonies of clonogenic assays by using densitometric software. Radiat Oncol. 2007; 2:4.)
(9) 세포 주기 분석(Cell cycle assay)
세포 분포를 결정하기 위하여, 세포를 60mm2 접시에 접종한 후, 음성 대조군 siRNA 및 H2A.Z.1 siRNA로 감염시켰다. 72시간 배양한 후, 트립신 처리하여 세포를 수거하였다. 이후, 70% 에탄올을 사용하여 세포를 고정한 후, 인산완충식염수로 세척하고, 1㎎/㎖ RNase, 0.05% Triton X-100 및 50㎍/㎖ 프로피디움 아이오다이드(BD Biosciences, 캘리포니아주)를 포함하는 200㎕ 인산완충식염수로 재현탁하였다. 이후, 현탁된 세포를 37℃ 배양기에서 이산화탄소 없이 1시간 동안 배양한 후, FLOWJO software (Tree Star, 오레곤주)를 설치한 FACSCalibur flow cytometer (BD Biosciences, 캘리포니아주)를 사용하여 분석하였다.
(10) 세포 사멸 분석(Apoptosis assay)
Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit I (BD Biosciences, 캘리포니아주)를 사용하여 세포 사멸 수준을 측정하였다. 72시간 동안 감염 후, 세포를 트립신 처리하고, 인산완충식염수로 세척하고, 1x 바인딩 버퍼(1x106 cells/㎖)로 재현탁하고, 1x105 cell를 포함하는 100㎕를 5㎖ 배양관에 이동시켰다. 이후, 5㎕ Annexin V-FITC 및 5㎕ 프로피디움 아이오다이드(PI) 용액을 첨가하였다. 세포들을 어둠 속에서 15분 동안 실온에서 배양하였다. 배양 후, 400㎕ 1x 바인딩 버퍼를 각 튜브에 넣고, 사멸 조각을 FACSCalibur flow cytometer (BD Biosciences, 캘리포니아주)를 사용하여 감지하고, FLOWJO software (Tree Star, 오레곤주)로 분석하였다.
(11) RNA 분리 및 양적 실시간 역전사 중합 효소 연속 반응(qRT-PCR)
TRIzol reagent (Invitrogen, 캘리포니아주)를 사용해 제조자의 메뉴얼에 따라 동결 조직 및 세포주로부터 총 RNA를 분리시켰다. cDNA를 합성하기 위하여, tetro cDNA synthesis kit(Bioline USA Inc., 메사추세츠주)를 사용하였다. 양적 실시간 역전사 중합 효소 연속 반응(qRT-PCR) 분석을 위하여, SensiFAST™ SYBR　 No-ROX Kit (Bioline USA Inc., 메사추세츠주)를 사용해 반응을 수행하였다. GADPH 수준을 로딩 대조군으로 사용하였다. PCR 반응은 threshold cycle(Ct): PCR 산물의 대수증폭시간을 확인할 수 있게 하는 IQ-5(Bio-Rad)를 사용해 모니터링하였다. 상대적 발현 수준은 대조군 -2( Target Ct - Control Ct )를 사용해 표준화하였다. H2AFZ 증폭에 사용된 프라이머는 다음과 같다.
* 정방향 : 5'- GCAGTTTGAATCGCGGTG-3'
* 역방향 : 5'- GAGTCCTTTCCAGCCTTACC-3'
GADPH 프라이머는 다음과 같다.
* 정방향 : 5'- ACCAGGTGGTCTCCTCTGAC -3'
* 역방향 : 5'- TGCTGTAGCCAAATTCGTTG -3'
(12) 운동성 및 침윤 분석(Motility and invasion assay)
생체외 세포 운동성 및 침윤 분석을 위하여, modified Boyden chamber assay (BD Bioscience, 캘리포니아주)를 사용해 세포 이동을 측정하였다. 침윤 분석을 위하여, 마트리겔(Matrigel, BD Biosciences)을 코팅 버퍼(0.01M 트리스, 0.7% 염화나트륨, pH 8.0)으로 0.3㎎/㎖ 농도로 희석하였다. 이후, 100㎕ 마트리겔로 세포 배양 인서트의 상부를 코팅하였다. 37℃에서 2시간 동안 배양하면 인서트 접종이 준비된다. 인서트를 준비한 후, 트랜스웰 인서트(8-㎛ 포어 사이즈)의 상부 표면에 세포를 놓은 후, 상기 인서트를 24-웰 접시에 놓았다. 하부 웰은 화학주사인자로 5% 우태아혈청를 포함하였다. 상기 접시를 밤새 배양한 후, Diff-Quik staining kit (Sysmex, 일본)를 사용해 고정하였다. 세포 이미지는 Axiovert 200 inverted microscope (Zeiss, 독일)를 사용해 x200 배율로 촬영하였고, 상기 세 개의 무작위 이미지 필드 속에서 세포 수를 계측하였다.
(13) 상처 치유 분석(Wound healing assay)
세포를 감염시킨 후, 60mm2 세포 배양 접시에 담아 24시간 동안 배양하였다. 이후, 세포를 트립신 처리하고, 6-웰 세포 배양 접시에 세포를 1x106개 접종하였다. 밤새 배양한 후, 멸균 마이크로 파이펫 팁을 사용해 세포 단층을 스크랩하였다. 스크랩 0시간 후 초기 틈새 크기(initial gap width) 및 스크래칭 24시간 후 잔여 틈새 크기(residual gap width)를 현미경 사진으로 영상화하였다.
(14) Gene set enrichment analysis(GSEA)
H2A.Z.1 유전자의 기본 메카니즘을 조사하기 위하여, 대규모 코호트 연구(GSE16757)에서 규명된 H2AFZ 상관 유전자 셋트를 사용하여 Gene set enrichment analysis(GSEA)를 수행하였다. 관심 표현형에 의한 유전자 발현 수준과의 상관 관계에 의하여 순위가 정리된 유전자 데이터 셋트에 대하여, 기본 GSEA 분석은 상기 순위 정렬된 데이터 셋트의 상위(양성 상관) 또는 하위(음성 상관)에서 주어진 유전자 셋트의 농축도를 정량화한 점수를 제공하였다. 상기 유전자 셋트의 근접성은 Kolmogorov-Smirnoff (KS) 점수(높은 점수가 더 큰 근접성을 나타낸다)로 측정하였다. 관측된 KS 점수는 유의성을 평가하기 위하여 모든 유전자 셋트에 대하여 1000 치환된 KS 점수 분포와 비교하였다.
(15) 분자 개념도(Molecular concept map)
공개 소스 유전자 셋트 엔리치먼트 테스팅 및 개념도 작성 도구인 ConceptGen를 사용하여 유전자 셋트들 간의 상호연결성을 도식화하는 네트워크 그래프를 작성하였다(http://conceptgen.ncibi.org/core/conceptGen/index.jsp). HCC내 H2AFZ 특이적 유전자 셋트와의 기능적 상관성을 제공하기 위하여, 대규모 HCC 코호트 연구(GSE16757)에서 규명된 H2AFZ 상관 유전자 셋트에 대하여, 14개의 생물 지식 유형으로 구성된 20,000 여개 이상의 분자를 포함하는 ConceptGen Molecular Concept Map(MCM)을 사용해 분자적 상관성을 평가하고, modified Fisher's extract test를 사용해 불균형 오버랩을 조정하였다(Sartor MA, Mahavisno V, Keshamouni VG, Cavalcoli J, Wright Z, Karnovsky A, Kuick R, Jagadish HV, Mirel B, Weymouth T, Athey B and Omenn GS. ConceptGen: a gene set enrichment and gene set relation mapping tool. Bioinformatics. 2010; 26(4):456-463). 477개 H2AFZ 상관 유전자(p<0.01, r>0.4 또는 r<-0.4)와 다른 종양 관련 유전자에 대하여 MCM 분석을 수행하였고, 엔리치먼트 네트워크를 작성하였다.
(16) 통계 처리
모든 실험은 최소 3회 수행하고, 모든 시료들도 3회 분석하였다. 결과값은 평균±표준편차(SD)로 기록하였다. 실험군들간의 통계적 차이는 GraphpadTM 5.0 (GraphPad software Inc.,캘리포니아주)로 unpaired two-tailed Student's t-test를 수행하여 평가하였다. P값 0.05 이하인 경우 통계적 유의성이 있는 것으로 하였다.
2. 실험 결과
(1) HCC 환자에서 H2A .Z.1 유전자가 비이상적으로 과발현되고, 그 과발현이 간암의 나쁜 예후와 연관되어 있다.
간암에서 H2A.Z 발현을 평가하기 위하여, 미국생물학정보센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI)와 유전자 발현 옴니버스(Gene Expression Omnibus, GEO) 데이터베이스에서 입수 가능한 대규모 간암 코호트 연구 (accession numbers GSE14520, GSE16757, GSE22058 및 GSE36376)에서 H2AFZ 및 H2FAV 발현을 요약하였다.
전이성 흑색종과는 달리, 4개의 간암 코호트 연구에서 오직 H2AFZ 유전자만이 유의적으로 과발현한 반면, H2AFV 유전자 발현은 변화하지 않았다(도 1a)
간암 환자에서의 H2AFZ 유전자 과발현을 확인하기 위하여, 16개 무작위 추출된 간암 세포 조직에서의 H2AFZ의 유전자 발현을 인접 비종양 간조직과 짝을 지어 양적 실시간 역전사 중합 효소 연속 반응(qRT-PCR)을 수행하였다. 실험 결과, 16개 간암 세포 조직 중에서 총 10개의 조직에서 H2AFZ 유전자가 과발현되었다(도 1b)
6개 무작위 선택된 간암 세포 조직과 그에 대응하는 비종양 간조직에 대한 면역블롯을 수행한 결과, 상기 결과와 일관되게 H2A.Z.1 단백질의 발현도 증가하는 것을 확인하였다(도 1c)
또한, 비종양 정상 간세포주(MIHA)를 포함한 10개의 상이한 간 세포주에 대하여 양적 실시간 역전사 중합 효소 연속 반응(qRT-PCR)을 수행하여 H2AFZ의 내재성 발현을 연구하였다(도 1d). 인간 간암 세포주(HepG2, Hep3B, Huh7, SK-Hep-1, SNU-368, SNU-449 및 SNU-475)들은 비종양 정상 간세포주(MIHA)에 비하여 상대적으로 높은 H2AFZ 유전자 발현 수준을 나타냈다. 인간 간암 세포주들은 또한 비종양 정상 간세포주(MIHA)에 비하여 상대적으로 높은 H2AFZ 단백질 발현 수준을 나타냈다(도 1e).
동물 실험에서도, NCBI 및 GEO 데이터베이스에서 얻을 수 있는 3개의 상이한 쥐 간암 연구(accession numbers GSE29813, GSE35289, 및 GSE57597)에서 H1AFZ 및 H2AFV 발현을 요약하였다. 상기 인간에서의 결과와 동일하게, 쥐 간암 GEO 데이터 셋트는 오직 H2AFZ만이 쥐 간암에서 유의적으로 과발현되었다(도 1f 참조).
H2A.Z.1의 mRNA 및 단백질 수준이 모두 상승하는 것을 확인하였기 때문에, 100 간암 환자에 대한 대규코 코호트 연구(GSE16757)에서의 H2A.Z.1 발현의 예후 연관성을 평가하였다. H2A.Z.1 발현과 높은 상관성의 발현 성향을 갖는 524 개의 유전자를 클러스터 분석(P<0/001, r>0.4 또는 r<-0.4)을 위해 선택하였고, 이를 Heatmaps로 도시하였다(도 2a). 이후 환자들을 H2A.Z.1 고클러스터 그룹(H2AFZ_high) 및 H2A.Z.1 저클러스터 그룹(H2AFZ_low)으로 분류하였다. 간암 환자군에 대한 Kaplan-Meier 생존 곡선에 따르면, H2A.Z.1 고발현군의 5년 평균 생존율이 H2A.Z.1 저발현군의 생존율보다 유의적으로 낮았다.(P=0.0466, 도 2b) 이러한 결과는 간암군에서 H2A.Z.1 발현이 증가하고, 그의 고발현이 종양 형성 및 간암 환자의 좋지 않은 질병 예후와 연관된다는 것을 의미한다.
H2AFZ 연관 분자적 지표의 생물학적 연관성을 연구하기 위하여, 상기 유전자 클러스터(총 524개 유전자)를 DAVID Web-based bioinformatics platform(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)에 입력하여 H2AFZ 지표의 생물학적 경로를 검색하였다. 그 결과 DAVID 도구의 일부로 생긴Gene Functional Annotation Cluster맵핑은 분자생물학적 데이터 셋트를 발견하는 생물학적 과정을 보여주었다(도 2c 참조). H2AFZ 지표의 주요 신호 경로는 세포 주기, DNA 복구, 핵 루멘, 염색체, 유사분열, 거대분자 집합, 감수분열, 미세소관 프로세스(Microtubule process), ATPase 활성 및 DNA 복제이다(도 2c 및 표 1 참조).
Figure 112016006147054-pat00001
간암 발생에서 H2A.Z.1의 분자적 메카니즘을 보다 이해하기 위하여, H2AFZ 관련 유전자 셋트를 규명하기 위하여 H2AFZ 지표를 사용하여 gene set enrichment analysis (GSEA)를 수행하였다. 상기 GSEA는 간암 세포내 H2AFZ 지표의 세포내 신호 경로를 규명하고, REACTOME_CELL_CYCLE이 H2AFZ 지표내 유의적으로 고농축된 유전자임이 규명되었다(도 2d 및 표 2 참조).
Figure 112016006147054-pat00002
(2) H2A .Z.1 표적적 억제는 간암 세포 내에서 세포 주기 및 EMT 단백질 조절을 통해 암 억제 작용을 이끌어 낸다.
간 종양 발생에서 H2A.Z.1의 분자적 기능을 더욱 이해하기 위하여, RNA 간섭 방법에 의하여 H2A.Z.1 넉다운을 시도하였고, 세포 생존력, MTS 세포 증식, BrdU 결합 및 클론원성 분석을 수행하였다. H2A.Z.1 넉다운시 SNU-449 및 SK-Hep1 간암 세포에서 성장 및 증식 속도가 감소하였다(도 3a 내지 3d 참조).
이러한 성장 억제 효과는 H2A.Z.1을 표적으로 하는 세포 주기 억류(cell cycle arrest), 세포의 노쇠기(cellular senescence), 세포 사멸 등과 같은 세포 성장 조절의 분열에 의하여 일부 설명될 수 있다. 유동 세포 세포 주기 분석에 의하면, H2A.Z.1 넉다운시 SNU-499 및 SK-Hep1 간암 세포주 모두에서 G1기 세포수가 유의적으로 증가하고, 그에 수반하여 S기 및 G2/M기 세포수는 감소한 결과를 보였다(도 4a).
세포 사멸 분석을 위하여, H2A.Z.1 표적 siRNA(siH2A.Z.1)로 감염시킨 후, annexin V-FITC 및 PI로 세포를 염색하였다. H2A.Z.1 넉다운시 SNU-499 및 SK-Hep1 간암 세포주에서 음성 대조군 siRNA(N.C)와 대비하여 사멸 세포 수가 유의적으로 증가하였고, capsage-3 및 PARP 분열이 증가하였다(도 4b 및 4c 참조).
또한, GSEA는 REACTOME_CELL_CYCLE을 H2AFZ 지표내에서 유의적으로 고농축된 유전자로 규명하였기에, 세포 주기 단백질에 대한 웨스턴블롯 분석을 실시하여 H2A.Z.1 표적에 의하여 유발된 성장 억제의 기전을 명확하게 하였다. 웨스턴블롯 분석 결과, H2A.Z.1 넉다운시 SNU-449 및 SK-Hep-1 세포 모두에서 사이클린 D1 및 사이클린 A2의 발현이 억제되고, p21WAF1 / CiPa 및 P27Kipl의 발현은 증가하였다(도 4d). 이러한 결과는 H2A.Z.1 유전자에 대한 특이적인 파괴는 p21WAF1 / CiPa 및 P27Kipl 같은 세포 주기 음성 조절제를 억제하는 동시에 사이클린 D나 CDK2와 같은 특이적 조절제는 증가시켰다는 것을 나타낸다.
일반적으로, 활성화된 사이클린/CDK 복합체는 pRb의 과인산화를 초래하여 그의 종양 억제 능력을 상실케 하고, E2F/DP1 전사 활성을 증가시킨다. 이에 따라, H2A.Z.1 변화에 의한 사이클린 및 CDKs 감소에 따라 E2F/DP1 전사 활성이 변화하는지 평가하였다. 예상한 대로, H2A.Z.1 표적적 파괴시 SNU-449 및 SK-Hep-1 세포 모두에서 pRb의 과소인산화를 초래하였다. 결론적으로, H2A.Z.1에 대한 특이적 조절은 사이클린/CDK의 전사 활성을 통한 Rb 단백질의 인산화 및 간암 형성 억제 인자의 불활성화에 영향을 미친다는 것을 의미한다.
또한, 모든 종양 관련 유전자 발현 지표를 통합하고 분자적 개념도(ConceptGen)을 사용하여 H2A.Z.1 지표를 분석하였다(비특허문헌 4). 이 분석을 통해 H2A.Z.1 관련 유전자 요소들과 연관된 요소들의 관련성을 살펴보고, H2A.Z.1 지표와 세포 주기, 세포 이동, 세포 사멸 및 크로모솜 조절 프로그램을 연관시키는 요소를 규명하였다(도 5e 참조).
이를 통해, H2A.Z.1 지표는 세포 이동 또는 세포 이동 연관 지표와 매우 높게 관련된 것을 알았다.
H2A.Z.1 유전자의 간암 세포에서의 기능을 규명하기 위하여, 생체외 운동성 및 침투 분석 수행하였다. 변형한 Boyden chamber 분석을 통해 H2A.Z.1 넉다운시 NU-449 및 SK-Hep-1 세포 모두에서 유의적으로 화학주성인자(chemoattractant, 5% 우태아혈청)에 의하여 유도된 세포 이동 및 침투적 반응이 감소한 것을 확인하였다(도 5a). 또한, 상처 회복 분석(scratch wound healing assay)를 통해, H2A.Z.1 넉다운시 화학주성인자(chemoattractant, 5% 우태아혈청)에 의하여 유도된 상처 회복 효율이 감소한 것을 확인하였다(도 5b).
H2A.Z.1가 상피간엽이행(epithelial-mesenchymal transition, EMT)에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상피간엽이행 단백질에 대한 웨스턴블롯 분석을 수행하였다. 놀랍게도, SNU-449 및 SK-Hep-1 세포 모두에서 siH2A.Z.1 감염체에서 EMT의 전형적인 특징인 피브로넥틴(fibronectin)은 감소한 반면, 표피 지표인 E-카드헤린(cadherin)은 증가하였다(도 5c).
또한, NCBI GEO 데이터베이스에서 얻은 대규모 간암 코호트 연구(accession number GSE36376)의 유전자 발현 분석에서도, 피브로넥틴 유전자 발현이 간암군에서 유의적으로 높았고, 서로 양의 상관관계를 보이는 것을 확인하였다(도 5d)
이러한 결과들은 H2A.Z.1 유전자의 전이성이 간암 세포내 피브로넥틴, E-카드헤린과 같은 상피간엽이행 단백질에 대한 선택적 조절에 기인한 것이라는 점을 의미한다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항 들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Catholic University <120> Use of H2A.Z.1 as a hepatocellular carcinomar biomarker <130> pn1511-341 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 2269 <212> DNA <213> H2AFZ DNA sequence <400> 1 attggtggga tgagcaatcc gagttcccgg atgagggaac attctgcagt ataaagggag 60 cagggaaggc gggagacagc gcagtttgaa tcgcggtgcg acgaaggagt aggtggtggg 120 atctcaccgt gggtccgatt agccttttct ctgccttgct tgcttgagct tcagcggaat 180 tcgaaatggt aaacttcgca gagacgctcg atgactccgc gggtttttgc cggcgagaga 240 aaaacccgtt acacagaggg atgggggtga agtggcgacg gttgggaacg cgcggagaca 300 ggatttagaa gagtgggggg aggtgttttg tcggctgcta gcggagcagc ctcggatctc 360 gcggcgggcg gcgacggttg ggtggcgcgc gcagcgccgc tgggggccgg cgggcggagg 420 cgcgcggccg tggcgagcgc gcggcggggg gcgaacgggc ggggtcgccc ctgcggcgcg 480 ccgcgggccg gagaccccgg cagggtgcgg ggacgcgctc gcggcgggac gcgccgcggt 540 gggggatggg cgcgccgcct tggtaattct atattctccg ttcctcctcc gctcgcgggc 600 gtgtgcgcgc cgcaggctgg cggtaaggct ggaaaggact ccggaaaggc caagacaaag 660 gcggtttccc gctcgcagag agccggcttg caggtcagta gttgttcgtg cagtctggga 720 gtcatgatgt ttttctttgc atttcctttt ttgttattca tcgctctcga tgggcgtttt 780 gtgtatgcgt gggtgatgcg gtgtcgcgac ttgggctgcc catacgataa atatgggggg 840 gaggaatcac gtgtttcgat gtcgggacgc gttgctgcgc ccgtgcccct tgctttggcg 900 cgcatataat ttccccatct ctagttctca tttttgtgca tttatgtttg tgtatgctta 960 aaatttaagt tcccagtggg ccgtattcat cgacacctaa aatctaggac gaccagtcat 1020 ggacgtgtgg gcgcgactgc cgctgtgtac agcgcagcca tcctggagta cctcaccgca 1080 gaggtaaatg ggtgaacgcc tataatccgg agaaggtttg gggggcgggg aggcggcaag 1140 agggaaggag gaaagtgatg caagaaaact cccaggccct gaacgcggcg agaggcctaa 1200 gagaacgcta gagggagctg gtgttcaaca aggatcctac tgagcttgag ttctctgctc 1260 ttggaattaa aattgcgtgc cccctgtata tcttgccagt cagatagtga ggaacgattc 1320 cagttggtag atctgcgttt gtgagggttt tattctgttc tctgaatctt ggccaaagga 1380 aagttggaag gcaactgaca gattctgcct tttaggtact tgaactggca ggaaatgcat 1440 caaaagactt aaaggtaaag cgtattaccc ctcgtcactt gcaacttgct attcgtggag 1500 atgaagaatt ggattctctc atcaaggcta caattgctgg tggtggtatg ttaacttcta 1560 acattttaaa aaatttcttc agaggaagga attttttgct gcttttaatt agtttttcca 1620 ggagaggaaa tttaagtata ttttcaatga tggaagtatg gttgtatcat gaaatttgat 1680 ttatatgtat aactcaatga atttttactt catacttgag ctgcatgttt ttaaagatac 1740 ctttcaagtt gaacagtata cactttcttg gtttcaaata ctgtgatttt ttaaaaaatc 1800 ttaagtagaa ttaattcctg tcactctcct aggtgtcatt ccacacatcc acaaatctct 1860 gattgggaag aaaggacaac agaagactgt ctaaaggatg cctggattcc ttgttatctc 1920 aggactctaa atactctaac agctgtccag tgttggtgat tccagtggac tgtatctctg 1980 tgaaaaacac aattttgcct ttttgtaatt ctatttgagc aagttggaag tttaattagc 2040 tttccaacca accaaatttc tgcattcgag tcttaaccat atttaagtgt tactgtggct 2100 tcaaagaagc tattgattct gaagtagtgg gttttgattg agttgactgt ttttaaaaaa 2160 ctgtttggat tttaattgtg atgcagaagt tatagtaaca aacatttggt tttgtacaga 2220 cattatttcc actctggtgg ataagttcaa taaaggtcat atcccaaac 2269 <210> 2 <211> 22 <212> RNA <213> H2AFZ siRNA sequence <400> 2 gaagaaagga caacagaaga ct 22 <210> 3 <211> 128 <212> PRT <213> H2A.Z.1 amino acid sequence <400> 3 Met Ala Gly Gly Lys Ala Gly Lys Asp Ser Gly Lys Ala Lys Thr Lys 1 5 10 15 Ala Val Ser Arg Ser Gln Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg 20 25 30 Ile His Arg His Leu Lys Ser Arg Thr Thr Ser His Gly Arg Val Gly 35 40 45 Ala Thr Ala Ala Val Tyr Ser Ala Ala Ile Leu Glu Tyr Leu Thr Ala 50 55 60 Glu Val Leu Glu Leu Ala Gly Asn Ala Ser Lys Asp Leu Lys Val Lys 65 70 75 80 Arg Ile Thr Pro Arg His Leu Gln Leu Ala Ile Arg Gly Asp Glu Glu 85 90 95 Leu Asp Ser Leu Ile Lys Ala Thr Ile Ala Gly Gly Gly Val Ile Pro 100 105 110 His Ile His Lys Ser Leu Ile Gly Lys Lys Gly Gln Gln Lys Thr Val 115 120 125

Claims (19)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 H2AFZ(히스톤 H2A의 변형체) 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트를 포함하는 간암 진단 또는 예후 추정용 조성물.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제3항에 따른 간암 진단 또는 예후 추정용 조성물을 포함하는 간암 진단 또는 예후 추정용 키트.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 키트는 마이크로 어레이 또는 유전자 증폭 키트인 것을 특징으로 하는 간암 진단 또는 예후 추정용 키트.
  10. 제3항에 따른 간암 진단 또는 예후 추정용 조성물을 대상 생물학적 시료에 처리하는 단계;
    상기 대상 생물학적 시료로부터 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 H2AFZ(히스톤 H2A의 변형체) 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계;
    상기 유전자 발현 수준 측정 결과를 기준치와 대비하는 단계; 및
    상기 H2AFZ 유전자의 발현이 증가하는 경우 간암이 발병된 것으로 판정하는 단계를 포함하는 간암 진단 또는 예후 추정에 관한 정보 제공 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨로 이루어진 군중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 간암 진단 또는 예후 추정에 관한 정보 제공 방법.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 유전자의 발현 수준 측정은 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소 연쇄반응, 실시간 중합효소 연쇄반응, Nuclease 보호 분석(RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, DNA 마이크로어레이 이용법 및 노던 블랏 중에서 어느 하나 이상의 방법을 사용하는 것을 특징으로 하는 간암 진단 또는 예후 추정에 관한 정보 제공 방법.
  13. 삭제
  14. 간암의 진단 또는 예후 추정에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 인간의 생물학적 시료에 있는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 H2AFZ(히스톤 H2A의 변형체) 유전자의 발현 수준 측정하는 단계를 통해 간암 진단 또는 예후 추정용 바이오 마커를 검출하는 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 유전자의 발현 수준 측정은 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소 연쇄반응, 실시간 중합효소 연쇄반응, Nuclease 보호 분석(RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, DNA 마이크로어레이 이용법 및 노던 블랏 중에서 어느 하나 이상의 방법을 사용하는 것을 특징으로 하는 간암 진단 또는 예후 추정용 바이오 마커를 검출하는 방법.
  16. 시험 대상 화합물에서 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 H2AFZ(히스톤 H2A의 변형체) 유전자의 발현 촉진 또는 억제 여부를 확인하는 단계를 포함하는 간암 치료제의 스크리닝 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 유전자의 발현 촉진 또는 억제 여부 확인은 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소 연쇄반응, 실시간 중합효소 연쇄반응, Nuclease 보호 분석(RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, DNA 마이크로어레이 이용법 및 노던 블랏 중에서 어느 하나 이상의 방법을 사용하는 것을 특징으로 하는 간암 치료제의 스크리닝 방법.
  18. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 H2AFZ(히스톤 H2A의 변형체) 유전자의 염기서열에 상보적으로 결합하는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 siRNA(small interference RNA) 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  19. 삭제
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