KR20110093893A - 항-ｃｘｃｒ１ 조성물 및 방법 - Google Patents

항-ｃｘｃｒ１ 조성물 및 방법 Download PDF

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막스 에스. 위차
크리스토프 기네스티어
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더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 미시간
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Abstract

본 발명은 IL8-CXCR1 경로 억제제 (예를 들어, 항-CXCR1 항체 또는 레퍼탁신)를 단독으로 투여하거나 또는 추가의 화학요법제와 함께 투여하여, 대상체의 비종양유발성 암세포 및 종양유발성 암세포를 사멸시키는 암 치료 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 환자에 있어서 고형 종양 줄기 세포가 존재하는지를 탐지하고 (예를 들어, CXCR1 또는 FBXO21의 존재에 기초함) 이를 분리하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.

Description

항-ＣＸＣＲ１ 조성물 및 방법{ANTI-CXCR1 COMPOSITIONS AND METHODS}
관련 출원의 인용
본 발명은 2008년 11월 11일에 출원된 미국 가출원 번호 제61/113,458호에 대한 우선권을 주장하며, 이 출원은 그 내용 전체가 본원에 참조로 포함된다.
연방 정부 지원에 의해 이루어진 연구 또는 개발에 대한 언급
본 발명은 NIH가 부여한 승인 번호 CA66233, CA101860 및 5 P 30 CA46592를 근거로 하여 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 이 발명에 대해 일정 권리를 가진다.
기술분야
본 발명은 IL8-CXCR1 경로 억제제 (예를 들어, 항-CXCR1 항체 또는 레퍼탁신)를 단독으로 투여하거나 또는 추가의 화학요법제와 함께 투여하여, 대상체의 비종양유발성 암세포 및 종양유발성 암세포를 사멸시키는 암 치료 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 환자에 있어서 고형 종양 줄기 세포가 존재하는지를 탐지하고 (예를 들어, CXCR1 또는 FBXO21의 존재에 기초함) 이를 분리하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
암은 우리 나라에서 사망 원인 중 그 두 번째로, 해마다 암으로 50만 명 이상이 사망하고 있다. 암의 조기 발견과 치료가 진전되었음에도 불구하고, 암으로 인한 사망자 수는 높은 수치를 유지하고 있다. 암의 분자적 기반에 대한 이해가 괄목할 정도로 진전되었으나, 이러한 지식들은 아직 유용한 치료 전략으로 발전되지는 못했다.
특히, 유방암은 미국 여성들에게서는 가장 흔한 암으로, 대략 9명의 여성 중의 한 명은 살면서 유방암에 걸리는 것으로 나타났다. 유감스럽게도, 전이성 유방암은 아직도 불치병이다. 전이성 유방암에 걸린 대부분의 여성들이 이 질병에 굴복하고 있다.
통상적인 치료 방법(방사선 요법, 화학요법 및 호르몬 요법)이 유용하지만, 이러한 치료에 내성을 갖는 암세포의 출현으로 그 용도가 제한되고 있다. 전이성 유방암 및 암 전반을 치료하기 위해, 표적을 동정하는 새로운 접근 방법이 필요하다는 점은 명백한 사실이다.
발명의 개요
본 발명은 IL8-CXCR1 경로 억제제 (예를 들어, 항-CXCR1 항체 또는 레퍼탁신)를 단독으로 투여하거나 또는 추가의 화학요법제와 함께 투여하여, 대상체의 비종양유발성 암세포 및 종양유발성 암세포를 사멸시키는 암 치료 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 환자에 있어서 고형 종양 줄기 세포의 존재를 진단하고 (예를 들어, CXCR1 또는 FBXO21의 존재에 기초함) 이를 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 대상체에 IL8-CXCR1 경로 길항제 및 추가의 화학요법제를 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 적어도 일부의 암 줄기 세포 및 적어도 일부의 비종양유발성 암세포를 사멸시키도록 하는 조건 하에, 대상체에 레퍼탁신 또는 이의 유도체를 투여하는 단계를 포함하여, 대상체의 암 줄기 세포 및 비종양유발성 암세포를 감소 또는 제거하는 방법을 제공한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 적어도 일부의 암 줄기 세포 및 적어도 일부의 비종양유발성 암세포를 사멸시키도록 하는 조건 하에, 대상체에 IL8-CXCR1 경로 길항제 및 추가의 화학요법제를 투여하는 단계를 포함하여, 대상체의 암 줄기 세포 및 비종양유발성 암세포를 감소 또는 제거하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 IL8-CXCR1 경로 길항제 및 추가의 화학요법제를 포함하는 조성물 또는 키트를 제공한다.
특정 구현예에서, IL8-CXCR1 경로 길항제는 CXCR1에 대한 IL8의 결합을 특이적으로 차단하는 제제를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제제는 CXCR1에 결합하지만(특이적이나), CXCR2에는 결합하지 않는다. 다른 구현예에서, 상기 제제는 CXCR1에 결합한다. 특정 구현예에서, 상기 제제는 항-CXCR1 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 추가의 구현예에서, 상기 제제는 레퍼탁신 또는 이의 유도체를 포함한다. 추가의 구현예에서, 추가의 화학요법제는 항-유사분열 화합물을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 항-유사분열 화합물은 도세탁셀, 독소루비신, 파클리탁셀, 플루오로우라실, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 노코다졸, 콜히친, 포도필로톡신, 스테가나신 및 콤브레타스타틴으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 구현예에서, 상기 항-유사분열 화합물은 칸타란투스 알카노이드 (예를 들어, 빈크리스틴 및 빈블라스틴); 또는 벤즈이미다졸 카바메이트 예컨대 노코다졸; 또는 콜히친 또는 관련 화합물 예컨대 포도필로톡신, 스테가나신 또는 콤브레타스타틴; 또는 탁산 예컨대 파클리탁셀 및 도세탁셀이다. 특정 구현예에서, 추가의 화학요법제는 도세탁셀을 포함한다.
특정 구현예에서, 대상체는, 화학요법제를 이용하여 치료하는 경우에, IL-8 생성 수준이 증가 (예를 들어, 운동성이 있는 암 줄기 세포 수 증가를 유도함)되는 암 유형을 가진다. 일부 구현예에서, 대상체는 전립선암, 난소암, 유방암, 흑색종, 비소세포성 폐암, 소세포성 폐암 및 식도선암으로 이루어진 군으로부터 선택된 암 유형을 가진다.
다른 구현예에서, 본 발명은 a) i) 대상체의 종양에서 취한 샘플 및 ii) CXCR1 단백질 또는 FBXO21 단백질 (또는 표 1의 다른 단백질)에 특이적인 항체, 또는 항체 단편 (또는 다른 결합 분자)을 제공하는 단계; 및 b) CXCR1+ 또는 FBXO21+ 고형 종양 줄기 세포의 존재 또는 부재를 검출할 수 있는 조건 하에, 상기 조직 샘플을 상기 항체, 또는 항체 단편과 접촉시키는 단계를 포함하는, 고형 종양 줄기 세포를 검출하는 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 항체, 또는 항체 단편은 신호 분자에 접합된다. 추가의 구현예에서, 상기 신호 분자는 형광 분자를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 신호 분자는 비색계 기질의 존재 하에 발색 반응을 촉진시킬 수 있는 효소를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 상기 샘플을 상기 항체 또는 항체 단편에 특이적인 2차 항체, 또는 2차 항체 단편과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 2차 항체, 또는 2차 항체 단편은 신호 분자를 포함한다. 특정 구현예에서, CXCR1+ 또는 FBXO21+ 고형 종양 줄기 세포의 존재 또는 부재를 탐지하기 위해 다른 단백질이나 핵산은 분석하지 않는다. 추가의 구현예에서, 상기 종양은 전립선암 종양, 난소암 종양, 유방암 종양, 흑색종, 비소세포 폐암 종양, 소세포 폐암 종양 및 식도선암 종양으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 a) 고형 종양을 해리시켜 해리된 세포를 생성하는 단계; b) 상기 해리된 세포를 CXCR1 또는 FBXO21 (또는 표 1의 다른 단백질)과 결합하는 시약과 접촉시키는 단계; 및 c) 고형 종양 줄기 세포가 풍부한 개체군이 생성되도록 하는 조건 하에, 상기 시약과 결합하는 세포를 선택하는 단계를 포함하는, 고형 종양의 줄기 세포의 개체군을 증대시키는 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 고형 종양 줄기 세포가 풍부한 개체군을 생성시키기 위하여 어떤 추가의 시약도 사용하지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 종양은 전립선암 종양, 난소암 종양, 유방암 종양, 흑색종, 비소세포 폐암 종양, 소세포 폐암 종양 및 식도선암 종양으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가의 구현예에서, 상기 시약은 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, Fab 단편)이다. 추가의 구현예에서, 상기 시약은 형광색소 또는 자성을 띤 미립자에 접합된다. 다른 구현예에서, 상기 세포를 선별하는 단계는 유동 세포 분석법, 형광 활성 세포 분류법, 패닝(panning)법, 친화성 컬럼 분리법, 또는 자성 선별법에 의해 수행된다.
특정 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 방법에 의해 분리된 고형 종양 줄기 세포가 풍부한 개체군을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 a) 종양유발성이며; b) CXCR1+ 또는 FBXO21+인 암 줄기 세포의 분리된 개체군을 제공한다. 특정 구현예에서, 상기 암 줄기 세포는 전립선암 줄기 세포, 난소암 줄기 세포, 유방암 줄기 세포, 피부암 줄기 세포, 비소세포성 폐암 줄기 세포, 소세포성 폐암 줄기 세포 및 식도선암 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 암 줄기 세포이다. 다른 구현예에서, 상기 개체군은 60% 이상의 암 줄기 세포 및 40% 이하의 비종양유발성 종양 세포를 포함한다. 추가의 구현예에서, 상기 암 줄기 세포는 분획화 되지 않은 비종양유발성 종양 세포에 비해 2배 이상 (예를 들어, 2배, 3배, 4배, 5배, ..., 10배, ... 100배, ... 1000배) 풍부하다.
일부 구현예에서, 본 발명은 종양으로부터 암 줄기 세포 및 비종양유발성 종양 세포를 포함하는 세포성 조성물을 수득하는 방법을 제공하며 (여기에서, 60% 이상은 종양유발성 줄기 세포이고 40% 이하는 비종양유발성 종양 세포임), 상기 방법은 a) 종양으로부터 해리된 종양 세포 혼합물을 수득하는 단계; b) 상기 종양 세포의 혼합물을, 60% 이상의 암 줄기 세포 및 40% 이하의 비종양유발성 종양 세포를 포함하는 제1 분획물과, 암 줄기 세포가 고갈된 종양 세포의 제2 분획물로 분리하는 단계 (여기에서, 상기 분리는 혼합물을 CXCR1 또는 FBXO21에 대한 시약과 접촉시켜 이루어짐); 및 c) 상기 제1 분획물을 제1 숙주 동물에 연속 주사하여 이것이 종양유발성임을 입증하고, 상기 제2 분획물을 제2 숙주 동물에 연속 주사하여 이것이 비종양유발성임을 입증하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 분리는 유동 세포 분석법, 형광 활성 세포 분류법 (FACS), 패닝법, 친화성 크로마토그래피 또는 자성 선별법에 의해 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 분리는 형광 활성 세포 분류 (FACS) 분석법에 의해 수행된다.
특정 구현예에서, 본 발명은 (a) 환자로부터 샘플을 수득하는 단계; (b) 상기 샘플 중에 CXCR1+ 또는 FBXO21+ 고형 종양 줄기 세포의 존재를 확인하는 단계; 및 (c) CXCR1+ 또는 FBXO21+ 고형 종양 줄기 세포를 표적으로 하는 환자 치료법을 선택하는 단계 (예를 들어, 항-CXCR1 항체 또는 항체 단편을 사용하는 방법을 선택함)를 포함하는, 고형 종양을 가진 환자를 위한 치료법을 선택하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, CXCR1+ 또는 FBXO21+ 고형 종양 줄기 세포는 전립선암 줄기 세포, 난소암 줄기 세포, 유방암 줄기 세포, 피부암 줄기 세포, 비소세포성 폐암 줄기 세포, 소세포성 폐암 줄기 세포 및 식도선암 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 암 줄기 세포이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 a) CXCR1+ 또는 FBXO21+ 암 줄기 세포를 포함하는 샘플을 후보 항종양성 화합물에 노출시키는 단계 (여기에서, 상기 후보 항종양성 화합물은 CXCR1 또는 FBXO21 길항제 또는 IL8-CXCR1 신호 전달 경로 길항제를 포함함); 및 b) 상기 화합물에 반응하는 세포 내의 변화를 측정하는 단계를 포함하는 화합물 스크리닝 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 상기 샘플은 비부착성 맘모스피어(mammosphere)를 포함한다. 추가의 구현예에서, CXCR1 또는 FBXO21 길항제, 또는 IL8-CXCR1 신호 전달 경로 길항제는 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, CXCR1 길항제는 레퍼탁신의 유도체이다. 다른 구현예에서, 상기 측정은 종양유발성 유방 세포의 세포 사멸이 있는지를 검출하는 단계를 포함한다. 추가의 구현예에서, 상기 방법은 종양유발성 세포뿐만 아니라 비종양유발성 암세포를 사멸시킬 수 있는 후보 항종양성 제제를 동정하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 a) 풍부한 고형 종양 줄기 세포를 수득하는 단계 (여기에서, 상기 고형 종양 줄기 세포는 i) 분획화 되지 않은 종양 세포에 비해 2배 이상 풍부하고; ii) CXCR1 또는 FBXO21을 발현함); b) 고형 종양 줄기 세포의 제2 세트가 아닌 제1 세트를 시험 화합물에 노출시키는 단계; c) 고형 종양 줄기 세포의 제1 세트를 제1 숙주 동물에 주사하고, 고형 종양 줄기 세포의 제2 세트를 제2 숙주 동물에 주사하는 단계; 및 d) 상기 시험 화합물이 종양 형성을 억제하는지를 확인하기 위해, 제1 숙주 동물에 종양이 존재하는 경우 이를 제2 숙주 동물에서 형성된 종양과 비교하는 단계를 포함하는, 고형 종양 줄기 세포의 종양 형성을 억제하는 시험 화합물의 역량을 측정하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 상기 시험 화합물은 CXCR1 또는 FBXO21 억제제, 또는 IL8-CXCR1 경로 억제제이다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 a) 60% 이상의 고형 종양 줄기 세포를 포함하는 샘플을 수득하는 단계 (여기에서, 상기 고형 종양 줄기 세포는 CXCR1 또는 FBXO21을 발현함); b) 상기 고형 종양 줄기 세포를 제1 숙주 동물 및 제2 숙주 동물에 주사하는 단계; c) 상기 시험 화합물로 제1 숙주 동물을 처리하고, 제2 숙주 동물은 상기 시험 화합물로 처리하지 않는 단계; 및 d) 상기 시험 화합물이 종양 형성을 억제하는지를 확인하기 위해, 제1 숙주 동물에 종양이 존재하는 경우 이를 제2 숙주 동물에서 형성된 종양과 비교하는 단계를 포함하는, 고형 종양 줄기 세포의 종양 형성을 억제하는 시험 화합물의 역량을 측정하는 방법을 제공한다. 다른 구현예에서, 상기 시험 화합물은 CXCR1 또는 FBXO21 억제제, 또는 IL8-CXCR1 경로 억제제이다.
정의
본 발명의 이해를 돕기 위해서, 여러 용어 및 문구들을 하기에 정의하였다:
본 발명에서 사용된 "항암제", "종래의 항암제" 또는 "암 치료 약물"라는 용어는 암의 치료 (예를 들어, 포유동물에서)에 사용되는 임의의 치료제 (예를 들어, 화학요법 화합물 및/또는 분자치료 화합물), 방사선 요법 또는 외과 수술을 지칭한다.
본 발명에서 사용된 "약물" 및 "화학요법제"라는 용어는 생리학적 시스템 (예를 들어, 대상체, 또는 생체 내, 시험관 내 또는 생체 외 세포, 조직 및 기관)에서 질병 또는 병리학적 상태를 진단, 치료 또는 예방하는데 사용되는 약물학적 활성 분자를 일컫는다. 약물은 그 약물이 투여된 살아있는 유기체, 조직, 세포 또는 시험관 내 시스템의 생리 작용에 변화를 가함으로써 작용하게 된다. "약물" 및 "화학요법제"라는 용어는 항-과증식성 화합물 및 항종양성 화합물뿐만 아니라 다른 생물학적 치료 화합물을 지정한다.
"유효량"은 유익한 결과 또는 원하는 결과를 가져오기에 충분한 양이다. 유효량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다.
본 발명에서 사용된 "투여"라는 용어는 생리학적 시스템 (예를 들어, 대상체 또는 생체 내, 시험관 내, 또는 생체 외 세포, 조직 및 기관)에 약물, 전구약물, 항체 또는 다른 제제, 또는 치료적 처치를 제공하는 행위를 일컫는다. 인간의 신체에 투여할 수 있는 예시적인 경로는 눈(안구), 입(경구), 피부(경피), 코(비강), 폐(흡입제), 구강 점막(구강), 귀, 주사를 통한 경로 (예를 들어, 정맥내 주사, 피하 주사, 종양내 주사, 복강 내 주사 등) 등을 들 수 있다.
"동시 투여"는 생리학적 시스템 (예를 들어, 대상체 또는 생체 내, 시험관 내, 또는 생체 외 세포, 조직 및 기관)에 대하여 하나 이상의 화학 제제 또는 치료적 처치 (예를 들어, 방사선 치료)를 투여하는 것을 지칭한다. 각각의 화학 제제 (예를 들어 IL8-CXCR1 신호 전달 경로 길항제 및 추가의 화학요법제)의 "동시 투여"는 동시에 이루어질 수 있거나, 또는 임의의 일시적 순서 또는 물리적 조합으로 이루어질 수 있다.
본 발명에서 사용된 "퇴행(regression)"이라는 용어는 질병에 걸린 대상체, 세포, 조직 또는 기관이 원래의 비병원성인 정상 대상체, 세포, 조직 또는 기관에 비하여 비병리학적 상태 또는 병리 특성이 덜한 상태로 복귀함을 지칭한다. 예를 들어, 종양의 퇴행은 종양의 감소뿐 아니라 종양 또는 종양들의 완전한 소멸을 포함한다.
본 발명에서 사용된 "시험관 내"라는 용어는 인위적인 환경 및 인위적인 환경 내에서 일어나는 진행 과정 혹은 반응을 일컫는다. 시험관 내 환경은, 이에 제한되지는 않지만, 시험관 및 세포 배양물로 이루어질 수 있다. "생체 내"라는 용어는 자연적인 환경(예를 들어, 동물 또는 세포) 및 자연적인 환경 내에서 일어나는 진행 과정 또는 반응을 지칭한다.
본 발명에서 사용된 "세포 배양물"이라는 용어는 세포의 임의의 시험관 내 배양물을 일컫는다. 이 용어에는 증식성 세포주 (예를 들어, 불멸성 표현형을 가진 세포주), 1차 세포 배양물, 유한성 세포주 (예를 들어, 형질전환되지 않은 세포) 및 난모 세포와 배아를 비롯한 시험관 내에서 유지되는 임의의 다른 세포군을 지칭한다.
본 발명에서 사용된 "대상체" 또는 "환자"라는 용어는 본 발명의 방법에 의해 치료될 유기체를 일컫는다. 이러한 유기체로서는, 이에 제한되지는 않지만, 인간 및 수의과 동물 (개, 고양이, 말, 돼지, 소, 양, 염소 등)을 포함한다. 본 발명에 있어서 "대상체" 또는 "환자"라는 용어는 일반적으로 치료를 받을 개체 또는 치료를 받은 개체를 가리킨다.
본 발명에서 사용된 "진단"이라는 용어는 그 징후 및 증상, 또는 유전자 분석, 병리학적 분석, 조직학적 분석 등에 의해 질병을 인지한다는 것을 지칭한다.
본 발명에서 사용된 "안티센스"라는 용어는 특정 RNA 서열 (예를 들어, mRNA)에 상보적인 핵산 서열 (예를 들어, RNA, 포스포로티오에이트 DNA)과 관련하여 사용된다. 상기 정의에는 유전자 발현을 조절하는 분자들을 비롯한 천연 또는 합성 안티센스 RNA 분자, 예컨대 소간섭 RNA 또는 마이크로 RNA가 포함된다. 본 발명에 사용될 수 있는 안티센스 서열의 한 유형은 CXCR1 mRNA에 특이적인 유형을 들 수 있다.
"시험 화합물" 또는 "후보 화합물"이라는 용어는 질병, 질환, 고통, 혹은 신체 기능의 장애를 치료하거나 또는 예방하거나, 그렇지 않으면 샘플의 생리학적 상태 혹은 세포 상태를 변형시키는데 사용될 수 있는 임의의 화학 물질, 제약, 약물 등을 일컫는다. 시험 화합물은 공지된 치료 화합물과 잠재적인 치료 화합물을 모두 포함한다. 시험 화합물은 본 발명의 스크리닝 방법을 이용하여 치료용인 것으로 결정될 수 있다. "공지된 치료 화합물"이란 (예를 들어, 동물 시험 또는 인간에 대한 사전 경험 실시를 통해) 이러한 치료 또는 예방에 있어서 유용한 것으로 밝혀진 치료 화합물을 지칭한다. 바람직한 구현예에서, "시험 화합물"은 항암제이다. 특히 바람직한 구현예에서, "시험 화합물"은 세포 내에서 세포 사멸(apoptosis)을 유도하는 항암제이다.
본 발명에서 사용된 "항원 결합 단백질"이라는 용어는 특정 항원에 결합하는 단백질을 지칭한다. "항원 결합 단백질"은, 이에 제한되지는 않지만, 면역글로불린, 예컨대 다클론성 항체, 단클론성 항체, 키메라 항체, 단쇄 항체와, 인간화 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편 및 Fab 발현 라이브러리를 포함한다. 다클론성 항체를 제조하기 위해 해당 업계에 공지된 여러 가지 절차들이 이용된다. 항체의 제조에 있어서, 다양한 숙주 동물, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 래빗, 마우스, 랫트, 양, 염소 등에게 원하는 에피토프에 상응하는 펩타이드를 주사함으로써 면역력을 갖게 할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 펩타이드는 면역성 담체 [예를 들어, 디프테리아 톡소이드, 소 혈청 알부민 (BSA), 또는 키홀 림펫 헤모사이아닌 (keyhole limpet hemocyanin, KLH)]에 접합된다. 숙주 종에 따라 면역학적 반응을 증대시키기 위하여 다양한 보조제(adjuvant), 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 프로인트 보조제 (완전 및 불완전 프로인트 아주반트), 미네랄 겔, 예컨대 수산화 알루미늄, 계면 활성 물질, 예컨대 리소레시틴, 플루로닉 폴리올, 다가음이온, 펩타이드, 유유제, 키홀 림펫 헤모사이아닌, 디니트로페놀 및 잠재적으로 유용한 인간 보조제, 예컨대 BCG (바실 칼메뜨-게랭, Bacille Calmette-Guerin) 및 코리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum)이 사용된다.
단클론성 항체의 제조에 있어서는, 배양물 내에서 증식성 세포주로 항체 분자를 생성할 수 있는 임의의 기법이라면 어느 것이든 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY] 참조). 이러한 기법으로서는, 이에 제한되지는 않지만, 쾰러(Kohler)와 밀스타인(Milstein)에 의해 처음 개발된 하이브리도마 기법 (문헌 [Kohler and Milstein, Nature, 256:495-497 (1975)] 참조)뿐 아니라, 트리오마(trioma) 기법, 인간 B 세포 하이브리도마 기법 (예를 들어, 문헌 [Kozbor 등, Immunol. Today, 4:72 (1983)] 참조) 및 인간 단클론성 항체를 제조하기 위한 EBV-하이브리도마 기법 (문헌 [Cole 등, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp . 77-96 (1985)])을 포함한다.
본 발명에 따르면, 단쇄 항체의 제조를 위해 알려진 기법 (미국특허 제4,946,778호; 본원에 참조로 포함됨)도 필요에 따라 특정 단쇄 항체를 제조하는데 적용될 수 있다. 본 발명의 추가의 구현예에서는, Fab 발현 라이브러리의 구축에 대해 당업계에 공지된 기법들 (문헌 [Huse 등, Science, 246:1275-1281 (1989)])을 이용하여, 원하는 특이성을 보유하는 단클론성 Fab 단편을 신속하고 용이하게 동정할 수 있다.
항체 분자의 유전형 (항원 결합 부위)을 포함하는 항체 단편은 공지된 기법으로 생성될 수 있다. 예를 들어, 이러한 단편들로서는, 이에 제한되지는 않지만: 항체 분자의 펩신 소화에 의해 제조될 수 있는 F(ab')2 단편; F(ab')2 단편의 이황화 결합을 감소시켜 생성될 수 있는 Fab' 단편; 및 항체 분자를 파파인과 환원제로 처리하여 생성될 수 있는 Fab 단편을 포함한다.
항원 결합 단백질을 코딩하는 유전자는 당업계에 공지된 방법으로 분리될 수 있다. 항체의 제조에 있어서, 원하는 항체의 스크리닝은 당업계에 공지된 기법 등 [예를 들어, 방사선면역측정법, ELISA (효소결합 면역흡착 분석법), "샌드위치" 면역분석법, 면역방사계 측정법, 겔 확산 침강소 반응, 면역확산 분석법, 생체 내 (in situ) 면역분석법 (예컨대, 콜로이드성 금, 효소 또는 방사성 동위원소 표지를 이용함), 웨스턴 블롯, 침전 반응, 응집반응 분석법 (예를 들어, 겔 응집반응 분석법, 적혈구응집반응 분석법 등), 보체 결합반응 분석법, 면역형광 분석법, 단백질 A 분석법 및 면역전기영동 분석법 등]에 의해 수행될 수 있다.
본 발명에 사용된 "변화(조절)"이라는 용어는 세포 기능의 양상, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 세포 성장, 증식, 침입, 혈관형성, 세포사멸 등을 포함하는 것에 영향 (촉진시키거나 지연시키는 것)을 줄 수 있는 화합물의 활성을 일컫는 것이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 IL8-CXCR1 경로 억제제 (예를 들어, 항-CXCR1 항체 또는 레퍼탁신)를 단독으로 투여하거나 또는 추가의 화학요법제와 함께 투여하여, 대상체의 비종양유발성 암세포 및 종양유발성 암세포를 사멸시키는 암 치료 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 환자에 있어서 고형 종양 줄기 세포의 존재를 진단하고 (예를 들어, CXCR1 또는 FBXO21의 존재에 기초함) 이를 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
I. 종양유발성 암세포, ALDH, CXCR1 및 CXCR1 억제
하나의 정상 세포를 완전히 형질전환된 세포로 변형시키기 위해서는 여러 가지 세포 내 기작에 변화를 주는 것이 요구된다(1, 2). 종래의 암 유발 모델에 따르면, 이러한 이벤트들은 어느 세포에서도 일어날 수 있다. 이와는 대조적으로, "암 줄기 세포 가설"은 암 유발을 위한 형질전환에 있어서 자생 능력을 획득한 조직 줄기 세포 혹은 간세포(progenitor cell)를 우선시 되는 표적으로 삼고 있다 (3-6). 이러한 "종양 개시 세포" 혹은 "암 줄기 세포(CSC)"는 결과적으로 종양 형성과 종양 세포 이질성의 원인이 되는 분화를 유도하는 자생 과정을 거칠 수 있는 능력을 특징으로 한다. 최근, 인간의 1차 종양의 이종 이식을 이용하여 이러한 암 줄기 세포 가설을 뒷받침하는 증거를 만들어 냈다. 이러한 연구들은 종양이 세포 줄기 세포 성분에 의해 주도된 세포의 계층구조로 이루어져 있음을 시사하고 있다. 또한, 최근의 데이터들은 쥐과 조직과 인간의 조직 양자 모두에서 유래한 불멸화(immortalized) 세포주도 줄기 세포 특성을 나타내는 세포군을 포함할 수 있다는 점을 시사하고 있다. 대부분의 이러한 연구들은 클론형성 잠재력, 구 형성 및 다중 계통 분화 가능성을 포함하는 시험관 내 특성들을 기반으로 하였다 (7-10). 이종 이식에서 불멸화 세포주의 기능적 이식을 이용하는 더욱 세밀한 연구에서도 이러한 계층의 존재를 시사하고 있다. 이러한 연구들은 소위 "부 개체군(side popualtion)(SP)"을 확인하기 위해 일반적으로 회흐스트 색소 배제법 (Hoechst dye exclusion)을 이용하였다 (7, 9, 11). 또한, 1차 종양 이종 이식을 이용하는 것으로 확인된 세포 표면 마커, 예컨대 CD44 및 CD133도 기존 세포주에서 유사한 개체군을 확인하기 위해 이용되어 왔다 (7, 8).
하기 실시예에 기술된 것처럼, 인간 유방암 세포와 형질 전환되지 않은 유방 세포에서 유래한 33개 일련의 세포주 중에서 줄기 세포 마커인 알데히드 디하이드로지나제 (ALDH)의 발현을 연구하였다. ALDH는 세포 내 알데히드의 산화를 담당하는 해독성 효소로서, 레티날을 레티노산으로 전환하는 물질대사를 통해 줄기 세포 분화에 있어 그 역할을 하는 것으로 생각된다 (12, 13). 형광 ALDEFLUOR 분석법에 의해 평가된 ALDH 활성은, 다발성 골수종 및 급성 골수성 백혈병 (AML)뿐 아니라 뇌종양으로부터 암 줄기 세포를 분리하는데 성공적으로 이용되어 왔다 (14-16). 최근에는 ALDH 활성이 정상적인 인간의 유방 조직 및 유방 암종의 줄기 세포 특성을 나타내는 세포의 하위 개체군을 분리하는데 이용될 수 있다는 사실이 입증되었다 (17). 유방 축소 성형 조직으로부터 분리된 ALDEFLUOR-양성 개체군은 인간화된 NOD/SCID 마우스 유방의 지방체에서 폐포관 (ductal alveolar) 구조를 재구성할 수 있다. 게다가, 인간의 유선암으로부터 분리된 ALDELFUOR-양성 세포는 NOD/SCID 마우스 중에서 연속 계대 배양시 종양을 다시 만들어낼 수 있는 능력뿐 아니라, 초기 종양의 표현형 이질성을 나타낼 수 있는 능력으로 입증된 줄기 세포 특성들을 보유한다 (17). 하기 실시예에서는, 대부분의 유방암 세포주가 암 줄기 세포 특성을 나타내는 뚜렷한 분자 프로파일을 갖는 ALDEFLUOR-양성 개체군을 포함하고 있다는 점을 입증하였다.
하기 실시예에 기술된 바와 같이, 본 발명의 구현예들을 개발하는 동안에 수행된 작업으로, 암 줄기 세포 마커로서 CXCR1 (염증성 케모카인 IL8에 대한 수용체임)을 동정하였다. ALDEFLUOR-양성 개체군 중의 세포들만이 CXCR1을 발현하였다. 또한, 이 수용체는, 재조합 IL8이 ALDEFLUOR 분석법 및 구 형성 분석법으로 측정시 세포주 중에서 줄기 세포 비율을 증대시킬 수 있다는 점에서 기능적 역할을 하는 것으로 입증되었다. IL8이 공격적인 유방암과 관련이 있으며, 전이성 질병이 있는 여성의 혈청에서 더 높게 나타난다고 보고된 바는 있으나, 줄기 세포 내에서 IL8과 그 수용체인 CXCR1의 기능적 관계를 보여준 것은 본 발명이 처음이라고 생각된다.
하기 실시예에서 추가로 기술된 바와 같이, 이들 세포에서 CXCR1 수용체를 차단하여 선택적으로 암 줄기 세포를 표적으로 삼을 수 있음이 입증되었다. 실시예에 기술된 한 접근법에서는, 유방암 세포주를 다른 IL8 수용체인 CXCR2가 아닌 CXCR1에 대한 단클론성 항체를 이용하여 처리하였다. 이러한 처리는 ALDEFLUOR-양성 개체군이 감소된 것으로 입증된 바와 같이, 선택적으로 암 줄기 세포를 표적으로 삼았던 것이다. 확실히, CXCR1은 매우 적은 퍼센트 (예를 들어, 1% 미만)의 세포에서만 발현된다는 점과, 대다수의 다른 암세포에서는 이들이 CXCR1 수용체가 부족함에도 불구하고 CXCR1 수용체의 차단이 세포 사멸을 유발하였다는 점이 밝혀졌다. 암 줄기 세포에 대한 IL의 영향을 매개하며 다른 세포들을 사멸시키는 소위 "방관자 효과"를 설명해 주는 분자 경로가 밝혀진 바 있다. IL-8은 CXCR1에 결합함으로써 줄기 세포의 자기 재생 능력을 촉진시켜, 결과적으로 국소 부착 키나아제(Fak) 경로를 활성화한다. 이는 줄기 세포의 자기 재생을 주도하는 Akt의 활성화를 유도하게 된다. 이 경로가 암 줄기 세포에서 차단되는 경우, Akt 신호 전달의 감소로 인하여 Fas 리간드의 합성 증가를 유도하는 Foxo 전사 인자는 세포 내에서 격리된다. Fas 리간드는 암 줄기 세포에서 분비되어 Fas 수용체를 포함하고 있는 주변 세포의 세포 사멸을 유도하게 된다.
본 발명이 임의의 특정 기작으로 한정되지 않으며, 기작에 대한 이해가 본 발명을 실시하는데 꼭 필요한 것은 아니지만, CXCR1은 Fak와 Akt를 수반하는 경로를 통하여 암 줄기 세포의 자기 재생 과정을 매개하고, 이러한 경로를 차단하면 암 줄기 세포뿐 아니라 주변 종양 세포에 있어서 세포 사멸을 유도할 수 있다고 생각한다. 이러한 예로서, 특정 구현예에서, 본 발명은 암을 치료하기 위해 IL8-CXCR1 경로를 방해하는 조성물 및 방법을 제공한다 (예를 들어, 항-CXCR1 항체, 항-FAK 항체, 또는 다른 제제들을 이용함).
IL-8은 조직 염증에 관계하는 케모카인이기 때문에, 이전에 IL-8 신호 전달 억제제를 개발하는데 있어서 관심의 대상이었다. 소분자 억제제인 레퍼탁신이 심근 경색과 뇌졸중의 합병증을 잠재적으로 감소시키기 위한 항염증제로서 개발되었다. 레퍼탁신은 제1상과 제2상 임상 시험에 도입되었는데, 독성이 거의 없는 것으로 나타났다. 하기 실시예에서 알 수 있는 바와 같이, (항-CXCR1 항체와 같은) 레퍼탁신은 암 줄기 세포를 표적으로 삼을 수 있을 뿐만 아니라, 주위 세포의 방관자 효과에 의해 Fas 리간드 매개의 세포 사멸을 유도할 수 있다. 중요한 점은, 종양 이종 이식에서 레퍼탁신은 화학요법의 효과를 증대시킨다는 것이다. 또한, 종양의 줄기 세포를 제쳐두고 종양에서 분화된 세포를 우선적으로 파괴하는 화학요법과는 달리, 레퍼탁신은 종양 줄기 세포를 표적으로 삼을 수 있다. 실시예에 나타난 바와 같이, 이러한 사실은 레퍼탁신으로 처리된 종양에 있어서 ALDEFLUOR 개체군이 감소했다는 것과 이렇게 처리된 종양 세포가 마우스에 있어서 2차 종양을 형성하는 능력이 감소되었다는 것으로 입증되었다. 암세포 전이를 차단하는 능력에 대한 레퍼탁신의 영향도 시험하였다. 종양 세포를 루시퍼라아제로 표지하고 이를 전이 실험 모델의 심장 내로 주사하였다. 종양 세포를 주사 후 1일째 되는 날, 한 그룹의 동물은 레퍼탁신으로 단독 처리하고, 다른 그룹은 아무 처리도 하지 않았다. 레퍼탁신은 전이의 발생을 현저히 감소시켰다.
본 발명은 암 줄기 세포 치료에 있어 그 표적으로 IL8 수용체 CXCR1을 동정하였다. 소분자 억제제인 레퍼탁신은 CXCR1와 CXCR2 모두를 억제한다. 실시예에서는 CXCR1이 암 줄기 세포에서 가장 중요한 수용체임을 입증하였다. 또한, 실시예는, 세포독성의 화학요법이 체내에 확립된 암을 확실하게 치료하는데 실패한 것은, 그 치료가 암 줄기 세포를 표적으로 삼을 수 없었기 때문이었다는 점뿐 아니라, 거기에 더하여 종양의 세포독성 화학요법 치료시 IL8 분비가 증가한다는 것이 입증되었기 때문이라는 것을 보여준다. 본 발명의 실시예는, CXCR1 억제제의 사용이 암 줄기 세포를 특이적으로 표적 삼을 수 있을 뿐만 아니라, 세포독성 화학요법에 의해 유발된 이러한 세포들의 IL8 촉진을 차단할 수 있다는 점에서 유익한 효과가 있다는 점을 보여주고 있다.
IL8-CXCR1 경로를 표적으로 삼는 것은 유방암에만 한정되는 것이 아니라, 모든 유형의 암에 사용될 수 있다. 바람직하게는, 치료될 암 유형은 IL8 생성이 증가된 흔적 (예를 들어, 화학요법과 병용하여)이 있는 유형의 암이다. 화학요법제는 암세포의 IL8 전사를 직접 조절하는 것으로 밝혀졌다. 파클리탁셀은 난소, 유방 및 폐의 암세포주에 있어서 IL8 전사와 분비를 증가시킨다 (문헌 [Uslu et al., 2005, Int. J. Gynecol. Cancer, 15:240-245] 및 [Collins et al., 2000, Can. Imm. Immuno., 49:78-84], 이들은 모두 본원에 참조로 포함됨). 또한, 유방암 세포에 아드리아마이신과 5-플루오로-2'-데옥시우리딘을 첨가하는 것 (문헌 [DeLarco et al., 2001, Can. Res. 61:2857-2861], 본원에 참조로 포함됨), 구강 암세포에 5-FU를 첨가하는 것 (문헌 [Tamatani et al., 2004, Int., J. Can., 108:912-921], 본원에 참조로 포함됨), 소세포성 폐암 세포에 독소루비신을 첨가하는 것 (문헌 [Shibakura et al., 2003, Int. J. Can., 103:380-386], 본원에 참조로 포함됨) 및 흑색종 세포에 다카바진을 첨가하는 것 (문헌 [Lev et al., 2003, Mol., Can. Ther., 2:753-763], 본원에 참조로 포함됨) 모두가 CXCL8 발현을 증가시키는 결과를 가져왔다. 이러한 예로서, 특정 구현예에서, 본 발명은 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 전립선암, 난소암, 유방암, 흑색종, 비소세포성 폐암, 소세포성 폐암 및 식도선암과 같은 유형의 암에 걸린 대상을 치료하기 위해, 화학요법제(예를 들어, 상기 참조 문헌들에서 언급한 것 등)와 병용하는 IL8-CXCR1 표적 제제를 제공한다.
본 발명은 치료될 암 유형에 제한받지는 않으나, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골원성 육종, 척색종, 혈관육종, 내피육종, 림프관육종, 림프관내피육종, 활막종, 중피종, 유잉종양(Ewing's tumor), 평활근육종, 횡문근육종, 결장암, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평세포암, 기저 세포암, 선암, 땀샘암, 피지샘암, 유두암, 유두 선암, 낭포선암, 수양암, 기관지원성암, 신세포암, 간세포암, 담관암, 융모암종, 정상피종, 태생성 암종, 빌름스종양(Wilms' tumor), 자궁경부암, 고환종양, 폐암, 소세포폐암, 방광암, 상피암, 신경교종, 성상세포종, 수모 세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 희돌기교종, 수막종, 흑색종, 신경아세포종 및 망막아종을 포함한다.
II. 고형 종양 줄기 세포 암 마커의 검출
일부 구현예에서, 본 발명은 줄기 세포 암 마커 (예를 들어, CXCR1, FBXO21, NFYA, NOTCH2, RAD51L1, TBP 및 표 1의 다른 단백질)의 발현을 검출하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 발현은 직접적으로 (예를 들어, RNA 또는 단백질 수준에서) 측정된다. 일부 구현예에서, 발현은 조직 샘플 (예를 들어, 생체 검사 조직) 중에서 검출된다. 다른 구현예에서, 발현은 체액 (예를 들어, 이에 제한되지는 않지만, 혈장, 혈청, 전혈, 점액 및 소변을 포함함) 중에서 검출된다.
또한, 본 발명은 마커 검출을 위한 패널 및 키트를 제공한다. 일부 구현예에서, 줄기 세포 암 마커의 존재는 대상체에 대한 예후를 제공하는데 사용된다. 이 제공된 정보는 치료 과정을 조율하는데에도 사용된다. 예를 들어, 대상체가 고형 종양 줄기 세포를 나타내는 마커 (예를 들어, CXCR1, FBXO21, NFYA, NOTCH2, RAD51L1, TBP 및 표 1의 다른 단백질)를 보유하는 것으로 밝혀진 경우, 추가의 요법 (예를 들어, 방사선 치료)을 보다 효과적일 수 있는 더 이른 시점 (예를 들어, 전이가 되기 전)에 시작할 수 있다. 또한, 대상체가 특정 요법에 반응하지 않는 종양을 보유하는 것으로 밝혀진 경우에는, 이러한 치료로 인한 비용과 불편함은 피할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 다수의 마커 (예를 들어, CXCR1 또는 FBXO21과, CD44, CD24 및 ESA 중에서 하나 이상의 마커와 조합함) 분석을 위한 패널을 제공한다. 이 패널은 발암성 및/또는 전이성과 연관이 있는 다수의 마커를 동시에 분석할 수 있게 해준다. 대상체에 따라서, 패널들은 가능한 최선의 진단과 예후를 제공하기 위해 단독으로 또는 조합하여 분석될 수 있다. 패널 상에 포함될 마커는 임의의 적절한 방법, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 하기에서 실례를 든 실시예에 기술된 방법을 사용하여 그 예측치에 대해 스크리닝함으로써 선택된다.
1. RNA의 검출
일부 구현예에서, 고형 종양 줄기 세포 암 마커의 검출은 조직 샘플 내에 상응하는 mRNA의 발현을 측정함으로써 이루어진다. mRNA 발현은 임의의 적절한 방법, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 하기에 개시된 방법으로 측정될 수 있다. 인간 CXCR1 핵산에 대한 등록번호는 NM_000634 (본원에 참조로 포함됨)이고, 인간 FBXO21에 대한 등록번호는 NM_033624 (본원에 참조로 포함됨)이다. 이들 서열은 프라이머와 프로브 (뿐만 아니라 siRNA 서열도)를 디자인하는데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, RNA는 노던 블롯 분석법에 의해 검출된다. 노던 블롯 분석법은 RNA의 분리 단계 및 상보적으로 표지된 프로브의 하이브리드화 단계를 수반한다.
추가의 구현예에서, RNA (또는 상응하는 cDNA)는 올리고뉴클레오타이드 프로브에 대한 하이브리드화에 의해 검출된다. 다양한 하이브리드화 및 검출 기법들을 사용하는 여러가지 하이브리드화 분석법들이 이용가능하다. 예를 들어, 일부 구현예에서, TaqMan 분석법 [미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 PE 바이오시스템즈(Biosystems); 예를 들어, 미국특허 제5,962,233호 및 제5,538,848호를 참고하며, 이들 각각은 본원에 참조로 포함됨]이 이용된다. 본 분석법은 PCR 반응 동안에 수행된다. TaqMan 분석법은 AMPLITAQ GOLD DNA 폴리머라아제의 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성을 이용한다. 5'-리포터 염료 (예를 들어, 형광 염료)와 3'-켄쳐(quencher) 염료를 가진 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프로브가 PCR 반응에 포함된다. PCR을 하는 동안, 프로브가 그 표적에 결합된 경우, AMPLITAQ GOLD 폴리머라아제의 5'-3' 핵간 용해(nucleolytic) 활성은 리포터 염료와 켄쳐 염료 사이의 프로브를 절단하게 된다. 켄쳐 염료로부터 리포터 염료가 분리되면서 결과적으로 형광도가 증가하게 된다. 그 신호는 PCR의 각 주기에서 축적되기 때문에, 형광 강도 측정기로 모니터링할 수 있다.
다른 구현예에서, 역전사효소 PCR (RT-PCR)은 RNA의 발현을 검출하는데 사용된다. RT-PCR에서, RNA는 역전사효소를 이용하여 상보적인 DNA 또는 "cDNA"로 효소적 변환이 이루어진다. cDNA는 이후에 PCR 반응의 주형으로 사용된다. PCR 생성물은 임의의 적절한 방법, 예컨대 이에 제한되지는 않으나, 겔 전기영동법 및 DNA 특이적 염색법 또는 표지된 프로브에 대한 하이브리드화법으로 검출될 수 있다. 일부 구현예에서, 미국특허 제5,639,606호, 제5,643,765호 및 제5,876,978호 (이들 문헌 각각은 본원에 참조로 포함됨)에 기술되어 있는 경쟁적 주형들의 표준 혼합물을 사용하는 정량적 역전사효소 PCR 방법이 이용된다.
2. 단백질의 검출
다른 구현예에서, 줄기 세포 암 마커의 유전자 발현은 상응하는 단백질 또는 폴리펩타이드 (예를 들어, CXCR1, FBXO21, NFYA, NOTCH2, RAD51L1, TBP 및 표 1의 다른 단백질)의 발현을 측정함으로써 검출된다. 단백질 발현은 임의의 적절한 방법으로 검출될 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질은 면역 조직 화학법에 의해 검출된다. 다른 구현예에서, 단백질은 그 단백질에 대하여 생성된 항체에 대한 결합으로 검출된다. 인간 CXCR1 단백질의 등록번호는 NP_000625 (본원에 참조로 포함됨)이며, 인간 FBXO21의 등록번호는 NP_296373 (본원에 참조로 포함됨)이다. 항체의 생성에 대해서는 하기에 기술되어 있다.
항체 결합은 당업계에 공지된 기법들 [예를 들어, 방사선면역측정법, ELISA (효소결합 면역흡착 분석법), "샌드위치" 면역분석법, 면역방사계 측정법, 겔 확산 침강소 반응, 면역확산 분석법, 생체 내 (in situ) 면역분석법 (예컨대, 콜로이드성 금, 효소 또는 방사성 동위원소 표지를 이용함), 웨스턴 블롯, 침전 반응, 응집반응 분석법 (예를 들어, 겔 응집반응 분석법, 적혈구응집반응 분석법 등), 보체 결합반응 분석법, 면역형광 분석법, 단백질 A 분석법 및 면역전기영동 분석법 등]에 의해 검출된다.
한 구현예에서, 항체 결합은 1차 항체 상의 표지를 탐지함으로써 검출된다. 다른 구현예에서, 상기 1차 항체는 그 1차 항체에 대한 2차 항체 또는 시약의 결합을 탐지함으로써 검출된다. 추가의 구현예에서, 상기 2차 항체는 표지된다. 면역분석법에서 결합을 검출하는 방법은 여러 가지가 당업계에 공지되어 있으며, 이것도 본 발명의 범위 내에 포함된다.
일부 구현예에서, 자동화 검출 분석법이 이용된다. 면역분석의 자동화 방법에는 미국특허 제5,885,530호, 제4,981,785호, 제6,159,750호 및 제5,358,691호 (이들 각각은 본원에 참조로 포함됨)에 기술된 것들을 포함한다. 일부 구현예에서, 결과의 분석과 제공도 자동화된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 암 마커에 대응하는 일련의 단백질들의 존재 또는 부재에 기초하여 예후를 제공해 주는 소프트웨어가 이용된다.
다른 구현예에서, 미국특허 제5,599,677호 및 제5,672,480호 (이들 각각은 본원에 참조로 포함됨)에 기술된 면역분석법이 이용된다.
3. cDNA 마이크로어레이 기법
cDNA 마이크로어레이는 고형 지지체, 예컨대 유리 현미경 슬라이드에 알려진위치 상에 스폿팅 (보통 로봇 스폿팅 장치를 이용함)된 서로 다른 다수의 (보통 수 천개의) cDNA들로 이루어져 있다. cDNA는 보통 플라스미드의 벡터 백본 일부에 상보적인 프라이머, 또는 서열이 공지된 유전자의 그 유전자 자체에 상보적인 프라이머를 이용해 플라스미드 라이브러리 삽입물을 PCR 증폭하여 수득된다. 마이크로어레이 생성에 적합한 PCR 생성물은 보통 그 길이가 0.5 kB 내지 2.5 kB이다. 전장 cDNA, 발현된 서열 태그 (EST), 또는 관심 대상인 임의의 라이브러리로부터 무작위로 선택된 cDNA가 선택될 수 있다. EST는 예를 들어, 문헌 [Hillier, et al., 1996, 6:807-828]에 기술된 바와 같이 부분적으로 시퀀싱된 cDNA이다. 어떤 EST들은 공지된 유전자와 상응하지만, 임의의 특정 EST와 관련해서는, 소량의 3' 및/또는 5' 서열, 그리고 EST가 유래한 것으로 보이는 mRNA의 본래 조직을 제외하고는, 그 정보가 거의 없는 경우가 많거나 혹은 정보가 아예 없다. 당업계의 숙련자에게는 명백하듯이, 일반적으로 cDNA는 인간 유전체 내의 유전자를 유일무이하게 동정하기에 충분한 서열 정보를 포함하고 있다. 게다가, 일반적으로 cDNA는 실험의 하이브리드화 조건 하에 단일 유전자 유래의 mRNA로부터 수득된 cDNA에 선택적으로, 특이적으로 또는 유일무이하게 하이브리드화 하기에 충분한 길이이다.
전형적인 마이크로어레이 실험에서, 마이크로어레이는 서로 다른 두 샘플에서 유래한 것으로서 다르게 표지된 RNA, DNA, 또는 cDNA 개체군으로 하이브리드화된다. 가장 흔한 RNA (전체 RNA 또는 폴리 A+ RNA)는 해당 세포 또는 조직으로부터 분리되고, 역전사되어 cDNA를 만들게 된다. 표지는 통상 역전사가 이루어지는 동안에 반응 혼합물 중에 표지된 뉴클레오타이드를 도입함으로써 수행된다. 다양한 표지들이 사용될 수 있으나, 뉴클레오타이드가 형광 염료 Cy3 또는 Cy5와 접합되는 경우가 가장 흔하다. 예를 들어, Cy5-dUTP 및 Cy3-dUTP가 사용될 수 있다. 제1 샘플 (예를 들어, 특정 세포 유형, 조직 유형 또는 성장 조건을 나타내는 샘플)에서 유래한 cDNA가 제1 형광단으로 표지되는 반면, 제2 샘플 (예를 들어, 특정 세포 유형, 조직 유형 또는 성장 조건을 나타내는 샘플)에서 유래한 cDNA는 제2 형광단으로 표지된다. 두 샘플에 표지된 물질은 유사한 양으로 마이크로어레이에 동시에 하이브리드화된다. 샘플이 Cy5 (적색 형광색을 냄) 및 Cy3 (녹색 형광색을 냄)로 표지된 마이크로어레이 실험의 경우에는, 1차 데이터 (형광 강도를 정량적으로 검출할 수 있는 검출기를 사용해 마이크로어레이를 스캐닝하여 수득됨)는 형광 강도 비율 (적색/녹색, R/G)이다. 이러한 비율은 마이크로어레이 상에 나타난 cDNA에 하이브리드화된 cDNA 분자의 상대적인 농도를 나타내기 때문에, 마이크로어레이 상에 나타난 각 cDNA/유전자에 상응하는 mRNA의 상대적인 발현 수준을 반영하고 있다.
각 마이크로어레이 실험은 두 샘플에 있어서 특정 유전자의 상대적인 발현을 나타내는 수만의 데이터 지점을 제공할 수 있다. 데이터의 적절한 체계와 분석은 매우 중요하기 때문에, 데이터 분석을 쉽게 하기 위해 표준 통계 수단을 도입한 다양한 컴퓨터 프로그램이 개발되었다. 유전자 발현 데이터의 체계화를 위한 하나의 기준으로 유사한 발현 패턴을 갖는 유전자를 그룹화하여 함께 클러스터로 묶는 방법이 있다. 마이크로어레이 실험 데이터의 계층 클러스터 분석과 그 제시를 수행하는 방법은 문헌 [Eisen 등, 1998, PNAS 95:14863-14868]에 기술되어 있다. 여기에 기술된 대로, 클러스터링은 각 데이터 지점이 정량 및 정성적으로 나타내는 색상으로 표현되는 1차 데이터의 그래픽 표시법과 조합할 수 있다. 이러한 방법은 다량의 표 숫자 데이터를 시각적인 형태로 전환시킴으로써 데이터를 직관적으로 분석할 수 있게 도와 준다. 수학적인 도구 및/또는 클러스터링 방법 자체와 관련된 추가의 정보와 그 상세한 내용에 대해서는, 예를 들어, 문헌 [Sokal & Sneath, Principles of numerical taxonomy, xvi, 359, W.H. Freeman, San Francisco, 1963]; [Hartigan, Clustering algorithms, xiii, 351, Wiley, New York, 1975]; [Paull et al., 1989, J. Natl. Cancer Inst. 81:1088-92]; [Weinstein et al. 1992, Science 258:447-51]; [van Osdol et al., 1994, J. Natl. Cancer Inst. 86:1853-9]; 및 [Weinstein et al., 1997, Science, 275:343-9]에서 찾을 수 있다.
본 발명에서 사용된 실험적 방법에 대한 추가의 상세한 내용은 하기 실시예에 나타나 있다. 마이크로어레이의 제조 방법과 그 사용법에 대한 추가적인 정보는 미국특허 제5,807,522호 (이는 본원에 참조로 포함됨)에서 찾아볼 수 있다. 시판되는 부품들을 이용한 마이크로어레이 하드웨어 (예를 들어, 어레이기 및 스캐너)의 구축에 대한 설명도 참조할 수 있다. 샘플 준비 및 마이크로어레이 실험을 수행하기 위한 마이크로어레이 기법과 프로토콜에 관한 추가적인 논의는, 예를 들어, 문헌 [DNA arrays for analysis of gene expression, Methods Enzymol, 303: 179-205, 1999]; [Fluorescence-based expression monitoring using microrarrays, Methods Enzymol, 306: 3-18, 1999]; 및 [M. Schena (ed.), DNA Microrarrays: A Practical Approach, Oxford University Press, Oxford, UK, 1999]에서 찾을 수 있다.
4. 데이터 분석
일부 구현예에서, 검출 분석법에 의해 생성된 미가공 데이터 (예를 들어, 주어진 마커(들)의 존재, 부재 또는 그 양)를 임상의가 예측할 수 있는 수치 데이터로 변환시키기 위해 컴퓨터를 이용한 분석 프로그램이 사용된다. 임상의는 임의의 적절한 방법을 이용해 이러한 예측가능한 데이터에 접근할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 발명은 임상의가 유전학 또는 분자생물학에 대해 정규 교육을 받지 않았더라도 미가공 데이터를 반드시 이해할 필요가 없다는 추가의 장점을 제공한다. 데이터는 가장 유용한 형태로 임상의에게 직접 제공된다. 이후, 임상의는 대상체의 치료를 최적화하기 위하여 해당 정보를 직접적으로 이용할 수 있다.
본 발명은 분석을 수행하고 정보를 제공하는 실험실, 의료팀 및 대상체와 해당 정보를 서로 간에 수취, 처리 및 전송할 수 있는 임의의 방법도 고려하고 있다. 예를 들어, 본 발명의 일부 구현예에서, 샘플 (예를 들어, 조직 검사 샘플 또는 혈청 또는 소변 샘플)을 대상체로부터 얻어서, 이를 세계 어느 국가건 간에 임의 장소 (예를 들어, 대상체가 거주하고 있거나 정보가 결과적으로 사용되는 국가와는 다른 국가)에 위치한 프로파일링 서비스 (예를 들어, 의료 시설의 임상 실험실, 유전체 프로파일링 사업체 등)에 송부하여 미가공 데이터를 만든다. 샘플이 조직 또는 다른 생물학적 샘플을 포함하는 경우에는, 대상체는 의료 센터를 방문해 샘플을 얻어서 이를 프로파일링 센터로 보낼 수 있고, 또는 대상체는 샘플을 직접 수집하여 이를 직접 프로파일링 센터로 보낼 수도 있다. 샘플이 기존에 밝혀진 생물학적 정보를 포함하는 경우, 그 정보는 대상체가 직접 프로파일링 서비스로 보낼 수 있다 (예를 들어, 정보를 포함하는 인포메이션 카드를 컴퓨터로 스캐닝하여 그 데이터를 전자 통신 시스템을 이용하여 프로파일링 센터의 컴퓨터로 전송함). 일단 프로파일링 서비스가 그 샘플을 받으면, 여기에서는 샘플을 정보 처리하여 대상체에 바람직한 진단 또는 예후 정보를 위한 구체적인 프로파일 (예를 들어, 발현 데이터)을 생성한다.
이후, 이러한 프로파일 데이터는 치료 임상의가 해석하기에 적절한 형태로 가공된다. 예를 들어, 미가공된 발현 데이터 (예를 들어, 다수의 마커들을 검사한 데이터)를 제공하기보다는, 상기 가공된 형태로 특정 치료 옵션에 대한 권고 사항과 함께 대상체에 대한 진단 또는 위험성 평가를 제시할 수 있다. 이 데이터는 임의의 적절한 방법으로 임상의에게 제시될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 프로파일링 서비스는 임상의를 위해 (예를 들어, 치료 장소에서) 인쇄될 수 있거나, 컴퓨터 모니터 상에서 임상의에게 나타낼 수 있는 보고서를 생성하게 된다.
일부 구현예에서, 정보는 우선 치료 장소 또는 지역 시설에서 분석된다. 이후, 미가공 데이터는 추가의 분석 및/또는 임상의 혹은 환자에게 유용한 정보로 전환하기 위해 중앙 정보 처리 시설로 보내진다. 이러한 중앙 정보 처리 시설은 데이터 분석의 사생활 보호 (모든 데이터들은 획일적인 보안 프로토콜에 의해 중앙 시설에 저장됨), 속도 및 통일성 측면에서 장점을 제공한다. 이후, 중앙 정보 처리 시설은 대상체의 치료 후 데이터의 향방을 조절할 수 있다. 예를 들어, 전자 통신 시스템을 이용하여, 중앙 시설은 이 데이터를 임상의, 대상체 또는 연구원들에게 제공할 수 있다.
일부 구현예에서, 대상체는 전자 통신 시스템을 이용하여 데이터에 직접 접근할 수 있다. 대상체는 그 결과에 기초하여 추가의 중재 또는 상담을 선택할 수 있다. 일부 구현예에서, 데이터는 연구 용도로 사용된다. 예를 들어, 데이터는 특정 질환 또는 질병의 단계에 대한 유용한 지시자로서 마커를 포함시킬 것인가 혹은 제거할 것인가에 대한 결정을 추가로 최적화하는데 사용될 수 있다.
5. 키트
다른 구현예에서, 본 발명은 암을 검출하고 그 특성을 평가하기 위한 (예를 들어, 하나 이상의 마커를 검출하기 위한, 또는 하나 이상의 마커에 의해 발현되는 펩타이드의 활성을 조절하기 위한) 키트를 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 키트는 검출 시약 및 완충액 이외에도 암 마커에 특이적인 항체를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 키트는 mRNA 또는 cDNA 검출에 특이적인 시약 (예를 들어, 올리고뉴클레오타이드 프로브 또는 프라이머)을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 키트는 검출 분석법을 수행하는데 필요한 모든 요소들 및/또는 검출 분석법을 수행하기에 충분한 모든 요소들, 예컨대 분석법을 수행하기 위한 모든 제어 장치, 지침들 및 결과의 분석과 제공을 위해 필요할 수 있는 소프트웨어를 포함한다.
본 발명의 또 다른 구현예는 폴리뉴클레오타이드 또는 단백질의 존재에 대해 시험하기 위한 키트를 포함한다. 상기 키트는, 예를 들어, 폴리펩타이드 검출을 위한 항체 또는 폴리뉴클레오타이드 검출을 위한 프로브를 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트는 기준 샘플 또는 대조군 샘플; 샘플을 처리하고, 시험을 수행하며 결과를 해석하기 위한 지침; 그리고 시험을 수행하는데 필요한 완충액 및 기타 시약들을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 키트는 고형 종양 줄기 세포 유전자 지문의 하나 이상의 유전자 발현을 검출하기 위한 한 쌍의 프라이머를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 키트는 고형 종양 줄기 세포 유전자 지문의 하나 이상의 유전자 발현을 검출하기 위한 cDNA 또는 올리고뉴클레오타이드 어레이를 포함한다.
6. 생체 내 영상 기법
일부 구현예에서, 동물 (예를 들어, 인간 또는 인간이 아닌 포유동물)에 있어서 암 마커의 발현을 시각화하는데 생체 내 영상 기법이 사용된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 암 마커 mRNA (예를 들어, CXCR1 또는 FBXO21 mRNA) 또는 단백질 (예를 들어, CXCR1 또는 FBXO21 단백질)은 암 마커에 특이적인 표지 항체를 이용하여 표지된다. 특이적으로 결합하여 표지된 항체는, 생체 내 영상 기법, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 방사성 핵종 영상법, 양전자 방출 단층촬영법, 컴퓨터 단층촬영법, X-선 또는 자기 공명 영상법 및 형광 검출법 및 화학발광 검출법을 이용하여 개체 내에서 검출할 수 있다. 본 발명의 암 마커에 대한 항체를 만드는 방법은 하기에 기술되어 있다.
본 발명의 생체 내 영상 기법은 본 발명의 고형 종양 줄기 세포 암 마커를 발현하는 암의 진단에 유용하다. 생체 내 영상 기법은 암을 나타내는 마커의 존재를 시각화하는데 이용된다. 이러한 기법은 바람직하지 않은 조직 검사를 하지 않고도 진단을 수행할 수 있다. 또한, 본 발명의 생체 내 영상 기법은 암 환자에게 예후를 제공하는데에도 유용하다. 예를 들어, 암 줄기 세포를 나타내는 마커의 존재를 검출할 수 있다. 본 발명의 생체 내 영상 기법은 추가로 신체의 다른 부분에 전이성 암을 검출하는데에도 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, CXCR1 또는 FBXO21에 특이적인 시약 (예를 들어, 항체)은 형광 표지된다. 상기 표지된 항체는 대상체에 주입 (예를 들어, 경구 또는 비경구 주입)된다. 형광 표지된 항체는 임의의 적절한 방법 [예를 들어, 미국특허 제6,198,107호(본원에 참조로 포함됨)에 기술된 장치를 사용함]을 사용하여 검출된다.
다른 구현예에서, 항체는 방사성 물질로 표지된다. 생체 내 진단을 위한 항체의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다. 수머돈 등 (Sumerdon et al.) (Nucl. Med. Biol 17:247-254 [1990])은 표지로서 인듐-111을 이용하여 종양의 방사성 면역 신티그래피 영상을 위한 최적화된 항체-킬레이터에 대해 기술하였다. 그리핀 등 (Griffin et al.) (J Clin Onc 9:631-640 [1991])은 췌장암에 걸린 것으로 추정되는 환자의 종양을 검출하는데 있어서 이러한 제제의 사용에 대해 기술하였다. 자기 공명 영상법에 있어서, 표지로 상자성 이온을 갖는 유사 제제를 사용하는 것은 당업계에 공지되어 있다 (문헌 [Lauffer, Magnetic Resonance in Medicine 22:339-342 (1991)]). 사용된 표지는 선택한 영상법 양상에 따라 다를 것이다. 평면 스캔 또는 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영 (SPECT)에는 방사성 표지, 예컨대 인듐-111, 테크네튬-99m, 또는 요오드-131이 사용될 수 있다. 양전자 방출 표지, 예컨대 불소-19도 양전자 방출 단층촬영 (PET)에 사용될 수 있다. MRI에 있어서는, 상자성 이온, 예컨대 가돌리늄 (III) 또는 망간 (II)이 사용될 수 있다.
1시간 내지 3.5일 범위의 반감기를 갖는 방사성 금속, 예컨대 스칸듐-47 (3.5일) 갈륨-67 (2.8일), 갈륨-68 (68분), 테크네튬-99m (6시간) 및 인듐-111 (3.2일)이 항체와의 접합을 위해 이용되는데, 이들 중에서 갈륨-67, 테크네튬-99m 및 인듐-111은 감마선 카메라 영상법에 있어서 바람직하며, 갈륨-68은 양전자 방출 단층촬영에 바람직하다.
이러한 방사성 금속으로 항체를 표지하는 유용한 방법은, 예를 들어, In-111과 Tc-99m에 있어서는, 쿼 등(Khaw et al.) (Science 209:295 [1980]) 및 샤인버그 등(Scheinberg et al.) (Science 215:1511 [1982])에 의해 기술된 바와 같이 이작용성 킬레이트제, 예컨대 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA)을 이용한다. 다른 킬레이트제도 사용될 수는 있지만, 1-(p-카르복시메톡시벤질)EDTA와 DTPA의 카르복시카르본산 무수물을 사용하는 것이 유리한데, 이는 이들의 사용이 항체의 면역반응성에 실질적으로 영향을 주지 않으면서 접합을 허용하기 때문이다.
단백질에 DPTA를 커플링하는 또 다른 방법은 In-111을 이용한 알부민의 표지에 대하여 흐나토위치 등(Hnatowich et al.) (Int. J. Appl. Radiat. Isot. 33:327 [1982])이 기술한 바와 같은 DTPA의 고리 무수물을 사용하는 것인데, 이는 항체를 표지하는데에도 적용될 수 있다. DPTA를 사용한 킬레이트화를 이용하지 않고 Tc-99m를 사용한 적절한 항체 표지 방법으로는 크락포드 등(Crockford et al.) (미국특허 제4,323,546호, 본원에 참조로 포함됨)의 도석법 (pretinning)이 있다.
Tc-99m을 사용하여 면역글로불린을 표지하는 방법은 혈장 단백질에 대하여 왕 등(Wong et al.) (Int. J. Appl. Radiat. Isot., 29:251 [1978])이 기술한 것을 들 수 있고, 이는 최근 항체를 표지하는 데 있어서도 왕 등(Wong et al.) (J. Nucl. Med., 23:229 [1981])에 의해 성공적으로 적용되었다.
특정 항체에 접합된 방사성 금속의 경우, 마찬가지로 항체의 면역특이성을 손상시키지 않으면서 가능한 높은 비율의 방사성 표지를 항체 분자 내에 도입하는 것이 바람직하다. 본 발명의 특정 줄기 세포 암 마커의 존재 하에 방사성 표지를 수행하면, 항체의 항원 결합 부위가 보호되는 추가적인 개선점도 달성할 수 있다.
추가의 구현예에서, 생체 내 바이오포토닉(biophotonic) 영상 기법 [미국 캘리포니아주 알메다 소재의 제노겐(Xenogen)사 제조]이 생체 내 영상 촬영을 위해 이용된다. 이러한 실시간 생체 내 영상 촬영 방법은 루시퍼라아제를 이용한다. 루시퍼라아제 유전자는 세포, 미생물 및 동물에 포함된다 (예를 들어, 본 발명의 암 마커와의 융합 단백질로서 포함됨). 이것이 활성화되면 발광 반응을 유도한다. 그 이미지를 포착하여 분석하는데 CCD 카메라 및 소프트웨어가 사용된다.
III. 항체와 항체 단편
본 발명은 CXCR1, FBXO21, NFYA, NOTCH2, RAD51L1, TBP 및 표 1의 다른 단백질에 대해 분리된 항체와 항체 단편을 제공한다. 항체, 또는 항체 단편은 이러한 단백질들을 특이적으로 인식하는 임의의 단클론성 또는 다클론성 항체일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명은 CXCR1, FBXO21, NFYA, NOTCH2, RAD51L1, TBP 및 표 1의 다른 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체, 또는 이의 단편을 제공한다. 일부 구현예에서, 단클론성 항체, 또는 이의 단편은 이러한 단백질들에 특이적으로 결합하는 키메라 또는 인간화 항체이다. 다른 구현예에서, 단클론성 항체, 또는 이의 단편은 이러한 단백질들에 특이적으로 결합하는 인간의 항체이다.
CXCR1, FBXO21, NFYA, NOTCH2, RAD51L1, TBP 및 표 1의 다른 단백질에 대한 항체는 본원에 기술된 실험, 진단 및 치료 방법들에 있어서 사용된다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항체는 생물학적 샘플, 예를 들어 환자의 생체 조직, 흉수(pleural effusion) 또는 혈액 샘플 내에 암 줄기 세포 마커 단백질의 발현을 검출하는데 사용된다. 생체 조직은 분할하여 예를 들어, 면역 형광 검사 또는 면역 조직 화학 검사를 이용해 단백질을 검출한다. 다르게는, 샘플로부터 개개의 세포들을 분리시키고, FACS 분석에 의해 고정 세포 또는 살아있는 세포에 대한 단백질 발현을 검출한다. 추가로, 항체는 예를 들어, 종양 세포, 세포 용해물, 또는 다른 단백질 샘플에서 암 줄기 세포 마커의 발현을 검출하기 위하여 단백질 어레이 상에서 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 시험관 내 세포를 기반으로 한 분석법 또는 생체 내 동물 모델에 있어서, 항체를 종양 세포와 접촉시켜 종양 세포의 성장을 억제하는데 사용된다. 다른 구현예에서, 항체는 암 줄기 세포 마커 (예를 들어, 표 1에 나타난 것)에 대한 항체를 치료 유효량으로 투여함으로써 인간 환자의 암을 치료하는데 이용된다.
다클론성 항체는 임의의 공지된 방법으로 제조될 수 있다. 다클론성 항체는 관련 항원 (정제된 펩타이드 단편, 전장 재조합 단백질, 융합 단백질 등) [선택적으로, 안정한 에멀젼을 형성하기 위해, 멸균 식염수 중에 희석하고 보조제 (예를 들어, 완전 및 불완전 프로인트 보조제)와 혼합한 키홀 림펫 헤모사이아닌 (KLH), 혈청 알부민 등과 접합될 수 있음]을 수 차례 피하 주사 또는 복강 내 주사하여 동물 (예를 들어, 래빗, 랫트, 마우스, 당나귀 등)에게 면역력을 갖게 함으로써 만들 수 있다. 이후, 이렇게 면역력을 갖게 된 동물의 혈액, 복수 등으로부터 다클론성 항체를 회수한다. 수집된 혈액은 응고되면 혈청을 다른 곳으로 옮겨 원심분리로 정제한 후 항체 역가에 대해 분석한다. 다클론성 항체는 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 등을 비롯한 당업계의 표준 방법에 따라 혈청 또는 복수로부터 정제될 수 있다.
단클론성 항체는 예컨대 문헌 [Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495]에 기술된 바와 같은 하이브리도마 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 하이브리도마 방법을 이용하여 마우스, 햄스터 또는 기타 적절한 숙주 동물을 상기 기술된 것처럼 면역 반응시켜서, 면역 항원에 특이적으로 결합할 항체의 림프구 생성을 유도케 한다. 다르게는, 림프구는 시험관 내에서 면역력을 갖게 할 수도 있다. 면역 반응 유도 후, 림프구를 분리시키고, 이를 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜을 이용해 적절한 골수종 세포주와 융합시켜, 융합되지 않은 림프구와 골수종 세포와 분리해 선별될 수 있는 하이브리도마 세포를 형성한다. 면역 침전법, 면역 블롯팅법, 또는 시험관 내 결합 분석법, 예컨대 방사선면역측정법 (RIA) 또는 효소 결합 면역흡착 분석법 (ELISA)으로 측정시, 선택된 항원에 대해 특이적인 단클론성 항체를 생성하는 하이브리도마는, 표준 방법 (문헌 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986])을 이용한 시험관 내 배양 또는 동물의 복수 종양과 같이 생체 내에서 증식될 수 있다. 차후, 단클론성 항체는 상기 다클론성 항체에 대해 기술된 것과 같은 배양 배지 또는 복수액으로부터 정제될 수 있다.
이와는 달리, 단클론성 항체는 미국특허 제4,816,567호에 기술된 바와 같은 재조합 DNA 방법을 이용하여 제조될 수도 있다. 단클론성 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 예컨대 성숙한 B-세포 또는 하이브리도마 세포로부터, 예컨대 항체의 중쇄와 경쇄를 코딩하는 유전자를 특이적으로 증폭시키는 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 이용한 RT-PCR에 의해 분리되며, 이들의 서열은 통상적인 절차를 이용하여 결정된다. 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 상기 분리된 폴리뉴클레오타이드는 이후 적절한 발현 벡터로 클로닝되고, 이것이 면역글로불린 단백질을 생성하지 않는 대장균 세포, 원숭이 COS 세포, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 골수종 세포를 감염시켰을 경우, 단클론성 항체가 이 숙주 세포에 의해 생성된다. 또한, 원하는 종의 재조합 단클론성 항체 또는 이의 단편은 문헌에 기술된 바와 같이 파지 디스플레이 라이브러리로부터 분리될 수 있다 (문헌 [McCafferty et al., 1990, Nature, 348:552-554]; [Clackson et al., 1991, Nature, 352:624-628]; 및 [Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581-597]).
단클론성 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(들)은 재조합 DNA 기술을 이용해 여러 가지 다른 방식으로 추가 변형되어 대안적 항체를 생성할 수 있다. 한 구현예에서, 예를 들어, 마우스 단클론성 항체의 경쇄 및 중쇄의 불변 도메인은, 1) 예컨대, 인간 항체의 경쇄 및 중쇄 불변 도메인 영역으로 대체되어 키메라 항체를 생성할 수 있거나, 또는 2) 비-면역글로불린 폴리펩타이드로 대체되어 융합 항체를 생성할 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 불변 영역은 절단 또는 제거되어 단클론성 항체의 소정의 항체 단편이 생성된다. 또한, 단클론성 항체의 특이성, 친화도 등을 최적화하기 위해, 가변 영역의 특정 부위 돌연변이 유발법 또는 고밀도 돌연변이 유발법이 사용될 수도 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 암 줄기 세포 마커에 대한 단클론성 항체는 인간화 항체이다. 인간화 항체는 가변 영역 내에 비인간 (예를 들어, 쥐과) 항체의 최소한의 서열을 포함하는 항체이다. 이러한 항체는 인간 대상체에 투여했을 경우 항원성과 HAMA (인간 항-마우스 항체) 반응을 감소시키기 위해 치료적으로 이용된다. 실제로, 인간화 항체는 비인간의 서열이 최소한으로 들어가거나 아예 없는 인간 항체이다. 인간 항체는 인간에 의해 생성된 항체, 또는 인간에 의해 생성된 항체에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 항체이다.
인간화 항체는 당업계에 공지된 여러 가지 기법을 사용하여 제조될 수 있다. 항체는 인간 항체의 CDR을 원하는 특이성, 친화도 및 역량을 갖는 비인간 항체 (예를 들어 마우스, 랫트, 래빗, 햄스터 등)의 것으로 대체함으로써 인간화될 수 있다 (문헌 [Jones et al., 1986, Nature, 321:522-525]; [Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323-327]; [Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536]). 이러한 인간화 항체는 항체 특이성, 친화도 및/또는 역량을 개선하고 최적화하기 위해 Fv 골격 영역 내 및/또는 대체된 비인간 잔기 내 추가의 잔기로 치환하여 추가 변형될 수 있다.
인간 항체는 당업계에 공지된 다양한 기법들을 사용하여 직접 제조될 수 있다. 시험관 내에서 면역 반응이 유도되거나 또는 표적 항원에 대한 항체를 생성하도록 면역화된 개체로부터 분리된 불멸화 인간 B 림프구가 제조될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.77 (1985)]; [Boemer et al., 1991, J. Immunol., 147 (1):86-95]; 및 미국특허 제5,750,373호 참조). 또한, 인간 항체는 인간 항체를 발현하는 파지 라이브러리로부터 선택될 수 있다 (문헌 [Vaughan et al., 1996, Nature Biotechnology, 14:309-314]; [Sheets et al., 1998, PNAS, 95:6157-6162]; [Hoogenboom and Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381]; [Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581]). 인간화 항체는 내생 면역글로불린을 생성하지 않고도 인간 항체의 전체 레파토리를 생성하는 면역력을 낼 수 있는 인간 면역글로불린 자리를 포함하는 형질전환 마우스 중에서도 만들어질 수 있다. 이러한 접근 방법은 미국특허 제5,545,807호; 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 및 제5,661,016호에 기술되어 있다.
또한, 본 발명은 암 줄기 세포 마커를 특이적으로 인식하는 이중특이적 항체도 망라한다. 이중특이적 항체란 2개 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하여 이에 결합할 수 있는 항체를 말한다.
이중특이적 항체는 온전한 항체이거나 또는 항체 단편일 수 있다. 이중특이적 항체를 제조하는 기법은 당업계에서 흔한 기술이다 (문헌 [Millstein et al., 1983, Nature 305:537-539]; [Brennan et al., 1985, Science 229:81]; [Suresh et al., 1986, Methods in Enzymol. 121:120]; [Traunecker et al., 1991, EMBO J. 10:3655-3659]; [Shalaby et al., 1992, J. Exp. Med. 175:217-225]; [Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553]; [Gruber et al., 1994, J. Immunol. 152:5368]; 및 미국특허 제5,731,168호).
본 발명의 특정 구현예에서, 예컨대 종양 투과성을 증대시키기 위해, 온전한 항체보다는 항체 단편을 이용하는 편이 바람직하다. 항체 단편을 제조하는 다양한 기법들이 공지되어 있다. 통상적으로, 이러한 단편들은 온전한 항체의 단백질 가수 분해성 소화를 통해 얻어진다 (예를 들어, 문헌 [Morimoto et al., 1993, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117] 및 [Brennan et al., 1985, Science, 229:81]). 그러나, 현재 이러한 단편들은 통상 상기 기술된 것과 같이 재조합 숙주 세포에 의해 직접 제조된다. 따라서, Fab, Fv 및 scFv 항체 단편들은 모두 대장균 또는 다른 숙주 세포에서 발현되어 여기서부터 분비되기 때문에, 이러한 단편들을 다량으로 생산할 수가 있는 것이다. 다르게는, 이러한 항체 단편들은 상기 거론한 항체 파지 라이브러리로부터 분리될 수 있다. 또한, 이러한 항체 단편은 예를 들어, 미국특허 제5,641,870호에 기술된 바와 같은 선형 항체일 수 있으며, 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다. 항체 단편을 제조하는 기타의 기법들에 대해서는 당업계의 숙련자라면 알 수 있을 것이다.
특히 항체 단편의 경우에 있어서는, 그 혈청 반감기를 증가시키기 위해 항체를 변형시키는 것도 또한 바람직할 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어, 항체 단편 내의 적절한 영역에 돌연변이를 유발시켜서 항체 단편 내로 구조(salvage) 수용체 결합 에피토프를 도입하거나, 또는 차후 항체 단편의 양 말단 또는 중간에 융합 (DNA 또는 펩타이드 합성에 의해)되는 펩타이드 태그 내로 에피토프를 도입함으로써 달성될 수 있다.
또한, 본 발명은 추가로 여기에 기재된 키메라, 인간화 및 인간 항체, 또는 이의 항체 단편과 실질적으로 동일한 변이체 및 등가물을 포함한다. 이들은 예를 들어, 보존적 치환 돌연변이, 즉 유사한 아미노산으로 하나 이상의 아미노산을 치환한 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 보존적 치환이라 함은 하나의 아미노산을 동일한 부류 내의 다른 아미노산으로 치환하는 것, 예컨대 하나의 산성 아미노산을 다른 산성 아미노산으로, 하나의 염기성 아미노산을 다른 염기성 아미노산으로, 또는 하나의 중성 아미노산을 다른 중성 아미노산으로 치환하는 것을 가리킨다. 보존적 아미노산 치환의 목적은 당업계에 잘 알려져 있다.
또한, 본 발명은 세포독성 제제에 접합된 항체를 포함하는 면역접합체에 대한 것이다. 세포독성 제제로는 화학요법제, 성장억제제, 독소 (예를 들어, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 또는 이의 단편), 방사성 동위원소 (즉, 방사성 접합체) 등을 포함한다. 이러한 면역접합체의 생성에 유용한 화학요법제로는, 예를 들어, 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 독소루비신, 멜팔란, 마이토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 기타 끼어들기 약물(intercalating agent)을 포함한다.s 사용가능한 효소 활성 독소 및 이의 단편으로는 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 사슬, 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모덱신 A 사슬, 알파-사신, 유동 (Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 미국자리공 (Phytolacca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 여주 (momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 비누풀 (saponaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 마이토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함한다. 다양한 방사성 핵종, 예컨대 212Bi, 131I, 131In, 90Y 및 186Re가 방사성접합 항체를 제조하는데 이용된다. 항체와 세포독성 제제와의 접합은, 다양한 이작용성 단백질 커플링제, 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트 (SPDP), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이작용성 유도체 (예컨대 디메틸 아디피미데이트 HCL), 활성 에스테르 (예컨대 디숙신이미딜 수버레이트), 알데하이드 (예컨대 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물 (예컨대 비스(p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대 토일렌 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성형 불소 화합물 (예컨대 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 이용하여 수행된다. 또한, 항체 및 하나 이상의 소분자 독소, 예컨대 칼리키마이신, 메이탄시노이드, 트리코텐 및 CC1065, 그리고 독소 활성을 보유하는 이러한 독소들의 유도체와의 접합체도 이용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 효과기 기능, 예를 들어, 항원 의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC) 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 강화하기 위해 변형된 인간 Fc 영역을 포함한다. 이는 항체의 Fc 영역 내에 하나 이상의 아미노산 치환을 도입함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기(들)을 Fc 영역 내로 도입해 이 영역의 사슬 간 이황화 결합의 형성을 유도하여, 보체 매개 세포 사멸 특성과 항체 의존성 세포독성 (ADCC)을 향상시킬 수 있다 (문헌 [Caron et al., 1992, J. Exp Med. 176:1191-1195]; [Shopes, 1992, Immunol. 148:2918-2922]). 또한, 강화된 항종양 활성을 보유하는 동종이량성 항체도 문헌 [Wolff et al., 1993, Cancer Research 53:2560-2565]에 기술된 것과 같이 이형이중기능 (heterobifunctional) 가교제를 이용하여 제조될 수 있다. 다르게는, 항체는 두 부분으로 된 Fc 영역을 갖도록 조작될 수 있다 (문헌 [Stevenson et al., 1989, Anti-Cancer Drug Design 3:219-230]).
IV. 약물 스크리닝
일부 구현예에서, 본 발명은 (예를 들어, 항암제를 스크리닝하기 위한) 약물 스크리닝 분석법을 제공한다. 본 발명의 스크리닝 방법은 본 발명의 방법을 사용해 동정된 줄기 세포 암 마커 (예를 들어, CXCR1, FBXO21, NFYA, NOTCH2, RAD51L1, TBP 및 표 1의 다른 단백질)를 이용한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 발명은 CXCR1 또는 FBXO21의 발현 또는 활성을 변화 (예를 들어, 증가 또는 감소)시키는 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 후보 화합물은 암 마커에 대한 안티센스 제제 또는 siRNA 제제 (예를 들어, 올리고뉴클레오타이드)이다. 다른 구현예에서, 후모 화합물은 본 발명의 줄기 세포 암 마커에 특이적으로 결합하는 항체이다. 특정 구현예에서, 소분자 화합물의 라이브러리는 본원에 기술된 방법을 사용하여 스크리닝된다.
한 스크리닝 방법에서, 후보 화합물들을 줄기 세포 암 마커를 발현하는 세포와 접촉시킨 후 그 발현에 대한 후보 화합물의 영향을 분석함으로써, 줄기 세포 암 마커 발현에 변화를 줄 수 있는 이들의 역량에 대해 평가한다. 일부 구현예에서, 암 마커 유전자의 발현에 대한 후보 화합물의 영향은 세포에 의해 발현되는 암 마커 mRNA의 수준을 검출함으로써 분석된다. mRNA 발현은 임의의 적절한 방법에 의해 검출될 수 있다. 다른 구현예에서, 암 마커 유전자의 발현에 대한 후보 화합물의 영향은 암 마커에 의해 코딩된 폴리펩타이드의 수준을 측정함으로써 분석된다. 발현된 폴리펩타이드의 수준은 임의의 적절한 방법, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 본원에 개시된 방법들을 사용하여 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 생물학상 다른 변화들 (예를 들어, 세포 사멸)도 검출된다.
특히, 본 발명은 조절자, 즉 본 발명의 암 마커에 결합하거나 이러한 암 마커와 관련된 신호 전달 또는 기능을 변화시켜, 예컨대 줄기 세포 암 마커 발현 또는 암 마커 활성에 억제 (또는 자극) 효과를 나타내거나, 혹은 예컨대 암 마커 기질의 발현 또는 활성에 자극 또는 억제 효과를 나타내는 후보 화합물 또는 시험 화합물 또는 제제 (예를 들어, 단백질, 펩타이드, 펩타이드 모방체, 펩토이드, 소분자 또는 기타 약물)을 동정하기 위한 스크리닝 방법을 제공한다. 이렇게 동정된 화합물은 표적 유전자 생성물 (예를 들어, 줄기 세포 암 마커 유전자, 예컨대 CXCR1 또는 FBXO21)의 활성을 치료 프로토콜에서 직접 또는 간접적으로 조절하여 표적 유전자 생성물의 생물학적 기능을 치밀하게 검토하거나, 정상적인 표적 유전자의 상호작용을 방해하는 화합물을 동정하는데 사용될 수 있다. 암 마커의 활성 또는 발현을 억제하는 화합물은 증식성 장애, 예를 들어, 암, 특히 전이성 암의 치료 또는 암의 위험을 예방하거나 감소시키기 위해 종양 줄기 세포를 제거하거나 제어하는데 유용하다.
한 구현예에서, 본 발명은 암 마커 단백질 또는 폴리펩타이드 또는 이의 생물학적 활성 부분의 기질인 후보 화합물 또는 시험 화합물을 스크리닝하기 위한 분석법을 제공한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 암 마커 단백질 또는 폴리펩타이드 또는 이의 생물학적 활성 부분에 결합하거나 또는 이들의 활성을 조절하는 후보 화합물 또는 시험 화합물을 스크리닝하기 위한 분석법을 제공한다.
상기 본 발명의 화합물은 당업계에 공지된 조합 라이브러리 방법들 중에 임의의 다양한 접근 방법, 예컨대 생물학적 라이브러리; 펩토이드 라이브러리 (펩타이드의 기능을 보유하나 신규하고 비펩타이드성 백본을 가진 분자의 라이브러리로서, 효소 분해에 저항성이면서도 생활성인 상태로 존재함, 예를 들어, 문헌 [Zuckennann et al., J. Med. Chem. 37: 2678-85 (1994)] 참조); 공간적으로 어드레서블한 패러렐 고상 또는 액상 라이브러리(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries); 디컨볼루션(deconvolution)이 요구되는 합성 라이브러리 방법; "1-비드 1-화합물" 라이브러리 방법; 그리고 친화성 크로마토그래피 선별을 이용하는 합성 라이브러리 방법을 이용하여 수득할 수 있다. 상기 생물학적 라이브러리 및 펩토이드 라이브러리 접근 방법은 펩타이드 라이브러리를 사용하는데 있어서 바람직한 반면, 다른 4가지 접근 방법은 화합물의 펩타이드, 비펩타이드성 올리고머 또는 소분자 라이브러리에 적용가능하다 (Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12:145).
분자 라이브러리의 합성 방법의 예로서는, 예를 들어 문헌 [DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6909 (1993)]; [Erb et al., Proc. Nad. Acad. Sci. USA 91:11422 (1994)]; [Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37:2678 (1994)]; [Cho et al., Science 261:1303 (1993)]; [Carrell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059 (1994)]; [Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061 (1994)]; 및 [Gallop et al., J. Med. Chem. 37:1233 (1994)] 등에 개시되어 있다.
화합물의 라이브러리는 용액 중에 (예를 들어, Houghten, Biotechniques 13:412-421 [1992]), 또는 비드 (Lam, Nature 354:82-84 [1991]), 칩 (Fodor, Nature 364:555-556 [1993]), 박테리아 또는 포자 (미국특허 제5,223,409호; 본원에 참조로 포함됨), 플라스미드 (Cull et al., Proc. Nad. Acad. Sci. USA 89:1865-1869 [1992]) 또는 파지 (Scott and Smith, Science 249:386-390 [1990]; Devlin Science 249:404-406 [1990]; Cwirla et al., Proc. NatI. Acad. Sci. 87:6378-6382 [1990]; Felici, J. Mol. Biol. 222:301 [1991]) 상에 제공될 수 있다.
한 구현예에서, 분석법은 줄기 세포 암 마커 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분을 발현하는 세포를 시험 화합물과 접촉시켜, 암 마커의 활성을 조절하는 상기 시험 화합물의 역량을 측정하는 세포 기반의 분석법이다. 줄기 세포 암 마커 활성을 조절하는 상기 시험 화합물의 역량 측정은, 예컨대 효소 활성의 변화를 모니터링함으로써 이루어질 수 있다. 세포는, 예를 들어, 포유동물에서 유래할 수 있다.
화합물, 예를 들어 줄기 세포 암 마커 기질에 대한 암 마커 결합을 조절하는 상기 시험 화합물의 역량도 평가될 수 있다. 이는 암 마커에 대한 화합물 (예. 기질)의 결합이 복합체 내에서 표지된 화합물 (예. 기질)을 검출하여 측정될 수 있도록, 예컨대, 화합물 (예. 기질)을 방사성 동위원소 또는 효소 표지와 커플링시킴으로써 달성될 수 있다.
다르게는, 상기 줄기 세포 암 마커를 방사성 동위원소 또는 효소 표지와 커플링시켜, 복합체 내에서 암 마커 기질에 대한 암 마커의 결합을 조절하는 시험 화합물의 역량을 모니터링할 수 있다. 예를 들어, 화합물 (예를 들어, 기질)은 125I, 35S, 14C 또는 3H를 사용하여 직접 또는 간접적으로 표지할 수 있으며, 이러한 방사성 동위원소는 방사선 방출의 직접 계수법 또는 섬광 계수법을 이용하여 검출한다. 다르게는, 화합물은 예컨대 겨자무과산화효소, 알칼리 포스파타아제 또는 루시퍼라아제를 이용하여 효소적으로 표지할 수 있으며, 이러한 효소적 표지는 적절한 기질이 생성물로 변화했는지를 측정하여 검출한다.
임의의 반응물에 표지를 하여, 또는 표지를 하지 않고서, 줄기 세포 암 마커와 상호작용하는 화합물 (예를 들어, 줄기 세포 암 마커 기질)의 역량을 평가할 수 있다. 예를 들어, 마이크로피지오미터(microphysiometer)는 화합물 또는 암 마커에 표지를 하지 않고도 화합물이 암 마커와 서로 작용하는지를 검출하는데 사용될 수 있다 (McConnell et al. Science 257:1906-1912 [1992]). 본원에서 사용된 "마이크로피지오미터" (예를 들어, 사이토센서(Cytosensor))는 광지시형 전위차계 센서 (LAPS)를 사용하여 세포가 그 주변을 산화시키는 속도를 측정하는 분석 장비이다. 이러한 산화 속도의 변화는 화합물과 암 마커 간의 상호작용의 지시자로서 사용될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 암 마커 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분을 시험 화합물과 접촉시켜, 줄기 세포 암 마커 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분에 결합하는 상기 시험 화합물의 역량을 평가하는 무세포 분석법이 제공된다. 본 발명의 분석법에서 사용될 암 마커 단백질의 생물학적 활성 부분은 기질 또는 다른 단백질과의 상호작용에 참여하는 단편, 예를 들어 높은 표면 확률 스코어(surface probability score)을 갖는 단편을 포함한다.
무세포 분석법은 표적 유전자 단백질과 시험 화합물의 두 성분이 상호작용하여 결합할 수 있는 조건 하에, 그리고 결합하도록 충분한 시간 동안 이들의 반응 혼합물을 제조하는 단계, 이에 따라 제거 및/또는 검출될 수 있는 복합체를 형성하는 단계를 수반한다.
상기 두 분자 간의 상호작용은, 예를 들어, 형광 에너지 전이 (FRET) [예를 들어, 라코윅츠 등 (Lakowicz et al.)의 미국특허 제5,631,169호; 스타브리아노폴로스 등 (Stavrianopoulos et al.)의 미국특허 제4,968,103호; 이들 각 특허는 본원에 참조로 포함됨]를 이용하여 검출될 수도 있다. 형광단 표지는, 제1 공여체(donor) 분자에서 방출된 형광 에너지가 제2의 '수용체(acceptor)' 분자 상의 형광 표지에 의해 흡수되어, 결과적으로 이 흡수된 에너지로 인해 형광을 낼 수 있도록 선택된다.
다르게는, 상기 '공여체' 분자는 단순히 트립토판 잔기의 자연 형광 에너지를 이용할 수 있다. 표지는 '수용체' 분자 표지가 '공여체' 분자 표지와 구별될 수 있도록 다른 빛 파장을 방출하는 것을 선택한다. 표지 간에 에너지 전이의 효율이 분자 간에 서로 떨어진 거리와 관계가 있기 때문에, 분자 간의 공간적 관계를 평가할 수 있다. 분자 간에 결합이 발생하는 경우에는, 분석법에 있어서 '수용체' 분자표지의 형광 방출은 최대가 되어야 한다. FRET 결합 이벤트는 당업계에 잘 알려진 표준 형광 검출 수단 (예를 들어, 형광 강도 측정기)을 이용하여 쉽게 측정할 수 있다.
다른 구현예에서, 표적 분자에 결합하는 줄기 세포 암 마커 단백질의 역량의 측정은 실시간 생체분자 반응 분석법 (BIA) (예를 들어, 문헌 [Sjolander and Urbaniczky, Anal. Chem. 63:2338-2345 (1991)] 및 [Szabo et al. Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705 (1995)])을 이용하여 이루어질 수 있다. "표면 플라스몬 공명" 또는 "BIA"는 임의의 반응물에 표지를 하지 않고서도 실시간으로 생체특이적 상호작용을 검출할 수 있다 (예를 들어, BIAcore). 결합 표면에서 질량의 변화 (결합 이벤트가 존재함을 나타냄)는 생체 분자 간 실시간 반응의 징후로 사용할 수 있는 검출가능한 신호를 유도하는, 표면 부근에서 빛의 굴절률 변화 (표면 플라스몬 공명 (SPR)의 광학적 현상)를 초래하게 된다.
한 구현예에서, 표적 유전자 생성물 또는 시험 물질은 고체상에 박혀있다. 이러한 고체상에 박힌 표적 유전자 생성물/시험 화합물 복합체는 반응의 마지막에 검출될 수 있다. 상기 표적 유전자 생성물은 고체 표면상에 박혀 존재할 수 있으며, (여기에 존재하지 않는) 상기 시험 화합물은 본원에 거론된 검출가능한 표지를 이용하여 직접 또는 간접적으로 표지될 수 있다.
하나의 단백질 또는 두 단백질의 비복합체화 형태로부터 복합체화된 형태의 분리를 촉진하기 위해서뿐만 아니라, 분석법의 자동화에 맞추기 위해서라도 줄기 세포 암 마커, 항-암 마커 항체 또는 이의 표적 분자를 고정화하는 것이 바람직할 수 있다. 후보 화합물의 존재 및 부재 하에, 줄기 세포 암 마커 단백질에 대한 시험 화합물의 결합, 또는 암 마커 단백질과 표적 분자와의 상호작용은 반응물들을 포함하기에 적절한 임의의 용기 내에서 수행될 수 있다. 이러한 용기의 예로서는, 미세적정판, 시험관 및 미세원심분리관을 포함한다. 한 구현예에서, 하나의 단백질 또는 두 단백질이 매트릭스에 결합하게 해주는 도메인을 첨가하는 융합 단백질이 제공될 수 있다. 예를 들어, 글루타티온-S-트랜스퍼라아제-암 마커 융합 단백질 또는 글루타티온-S-트랜스퍼라아제/표적 융합 단백질은, 글루타티온 세파로스(Sepharose) 비드 [미국 미주리주 세인트루이스 소재의 시그마 케미칼(Sigma Chemical)사 제조] 또는 글루타티온-유도체화된 미세적정판 상에 흡착시킨 후, 이를 상기 시험 화합물 그리고 흡착되지 않은 단백질 또는 암 마커 단백질과 혼합하여, 이 혼합물을 복합체를 형성하기에 좋은 조건 (예를 들어, 염과 pH의 생리학적 조건에서) 하에 배양시킬 수 있다. 배양 후, 상기 비드 또는 미세적정판 웰들을 세척하여 결합되지 않은 임의의 성분들을 제거하고, 비드의 경우에는 매트릭스를 고정시켜, 예컨대 상기 기술된 바와 같이 복합체를 직접 또는 간접적으로 측정한다.
이와는 달리, 복합체들은 매트릭스로부터 해리될 수 있으며, 암 마커 결합 또는 활성 수준은 표준 기법들을 이용하여 측정할 수 있다. 매트릭스 상에 암 마커 단백질 또는 표적 분자를 고정시키는 기법은 비오틴과 스트렙타비딘의 접합을 이용하는 방법을 포함한다. 비오틴이 결합된 암 마커 단백질 또는 표적 분자는 당업계에 공지된 기법 [예를 들어, 비오틴화 키트(biotinylation kit), 미국 일리노이주 락포드 소재의 피어스 케미칼스(Pierce Chemicals)사 제조]들을 사용하여 비오틴-NHS (N-히드록시-숙신이미드)로부터 제조하여, 스트렙타비딘이 코팅된 96 웰 플레이트 (피어스 케미칼스)의 웰 내에서 고정시킬 수 있다.
상기 분석법을 수행하기 위해, 고정되지 않은 성분은 상기 박힌 성분을 포함하는 코팅된 표면에 첨가한다. 반응이 완료된 후, 반응하지 않은 성분들은, 이미 형성된 복합체들이 고체 표면에 고정된 상태로 잔류할 수 있는 조건 하에 제거 (예를 들어, 세척)한다. 고체 표면상에 박힌 복합체의 검출은 여러 가지 방법으로 수행될 수 있다. 사전에 고정하지 않은 성분을 미리 표지한 곳에서, 표면에 고정된 표지의 검출은 복합체가 형성되었다는 것을 의미한다. 사전에 고정하지 않은 성분을 미리 표지하지 않은 곳에서는, 간접 표지를 이용하여 표면상에 박힌 복합체를 검출할 수 있다: 예를 들어, 고정되지 않은 성분에 특이적인 표지 항체를 이용한다 (결과적으로 항체는 직접적으로 표지하거나, 또는 예를 들어, 표지된 항 -IgG 항체를 이용해 간접적으로 표지될 수 있다).
이러한 분석법은, 줄기 세포 암 마커 단백질 또는 표적 분자와는 반응하지만 줄기 세포 암 마커 단백질이 그 표적 분자에 결합하는 것을 방해하지 않는 항체를 이용하여 수행된다. 이러한 항체는, 플레이트의 웰로 유도체화될 수 있어, 항체 접합으로 인하여 웰 내에서는 결합하지 않은 표적 또는 암 마커 단백질이 포집되어 있게 된다. 이러한 복합체들을 검출하는 방법으로는, GST-고정화 복합체에 대해 기술된 방법 이외에, 암 마커 단백질 또는 표적 분자와 반응하는 항체를 이용하는 복합체의 면역검출법뿐만 아니라, 암 마커 단백질 또는 표적 분자와 관련된 효소 활성 검출에 의존하는 효소 결합 분석법을 포함한다.
이와는 달리, 무세포 분석법이 액체 상으로 수행될 수 있다. 이러한 분석법에서는, 여러 가지 표준 기법들, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 분별 원심분리법 (예를 들어, 문헌 [Rivas and Minton, Trends Biochem Sci 18:284-7 (1993)] 참조); 크로마토그래피법 (겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피); 전기영동법 (예를 들어, 문헌 [Ausubel et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology 1999, J. Wiley: New York] 참조); 및 면역침전법 (예를 들어, 문헌 [Ausubel et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology 1999, J. Wiley: New York] 참조)을 이용하여 반응하지 않은 성분들로부터 반응 생성물을 분리한다. 이러한 수지 및 크로마토그래피 기법은 당업계 종사자에게 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Heegaard J. Mol. Recognit 11:141-8 (1998)]; [Hageand Tweed J. Chromatogr. Biomed. Sci. App1 699:499-525 (1997)] 참조). 또한, 본원에 기술된 바와 같이, 형광 에너지 전이법을 적절히 사용하여 용액으로부터 복합체를 추가로 정제하지 않고도 결합을 검출할 수 있다.
상기 분석법은 줄기 세포 암 마커 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분을 공지된 화합물 (암 마커와 결합하여 분석 대상 혼합물을 형성함)과 접촉시키는 단계, 상기 분석 대상 혼합물을 시험 화합물과 접촉시키는 단계, 및 암 마커 단백질과 상호작용하는 상기 시험 화합물의 역량을 측정하는 단계 (여기에서, 암 마커 단백질과 상호작용하는 상기 시험 화합물의 역량을 측정하는 단계는, 공지된 화합물과 비교한, 암 마커 또는 이의 생물학적 활성 부분에 우선적으로 결합하는 상기 시험 화합물의 역량, 또는 표적 분자의 활성을 조절하는 상기 시험 화합물의 역량을 측정하는 것을 포함함)를 포함한다.
줄기 세포 암 마커가 생체 내에서 하나 이상의 세포성 또는 세포 외 거대분자, 예컨대 단백질과 상호작용할 수 있는 경우라면, 이러한 상호작용의 억제제가 유용하다. 동종성 분석법은 억제제를 동정하는데 사용될 수 있다.
예를 들어, 표적 유전자 생성물과, 상호작용을 하는 세포성 또는 세포 외 결합 파트너 생성물 간에 기형성된 복합체는, 표적 유전자 생성물 또는 이들의 결합 파트너를 표지하도록 제조되지만, 표지에 의해 생성된 신호는 복합체가 형성되면 중지된다 (예를 들어, 면역분석법에 있어 이러한 접근법을 이용하는 미국특허 제4,109,496호 참고하며, 이 문헌은 본원에 참조로 포함됨). 기형성된 복합체 중의 하나와 경쟁하여 이를 대체하는 시험 물질을 첨가하면 백그라운드 이상의 신호를 발생시킬 것이다. 이러한 방식으로, 표적 유전자 생성물-결합 파트너의 상호작용을 방해하는 시험 물질이 동정될 수 있다. 다르게는, 암 마커 단백질은 2-하이브리드 분석법 또는 3-하이브리드 분석법 (예를 들어, 미국특허 제5,283,317호; 문헌 [Zervos et al., Cell 72:223-232 (1993)]; [Madura et al., J. Biol. Chem. 268:12046-12054 (1993)]; [Bartel et al., Biotechniques 14:920-924 (1993)]; [Iwabuchi et al., Oncogene 8:1693-1696 (1993)]; 및 브렌트(Brent)의 국제특허공보 W0 94/10300; 이들 문헌은 각각 본원에 참조로 포함됨)에서 "미끼 단백질(bait protein)"로서 사용하여, 암 마커에 결합하거나 상호작용하고 암 마커 활성에 관여하는 다른 단백질 ("암 마커-결합 단백질" 또는 "암 마커-bp")을 동정할 수 있다. 이러한 암 마커-bp는 예를 들어, 암 마커 매개의 신호 전달 경로의 다운스트림 성분들과 같이 암 마커 단백질 또는 표적에 의한 신호의 활성제 또는 억제제일 수 있다.
또한, 암 마커 발현의 조절자도 동정될 수 있다. 예를 들어, 세포 혼합물 또는 무세포 혼합물을 후보 화합물과 접촉시키고, 후보 화합물의 부재 하에서 줄기 세포 암 마커 mRNA 또는 단백질의 발현 수준에 대해 암 마커 mRNA 또는 단백질의 발현을 평가한다. 암 마커 mRNA 또는 단백질의 발현이 후보 화합물의 부재할 때보다 존재 하에서 더 많이 되면, 그 후보 화합물을 암 마커 mRNA 또는 단백질 발현의 자극제로서 동정한다. 다르게는, 암 마커 mRNA 또는 단백질의 발현이 후보 화합물이 부재할 때보다 존재 하에서 더 적게 (즉, 통계적으로 유의한 정도로 더 적게)되면, 그 후보 화합물을 암 마커 mRNA 또는 단백질 발현의 억제제로서 동정한다. 암 마커 mRNA 또는 단백질 발현의 수준은 암 마커 mRNA 또는 단백질 검출에 대하여 본원에 기술된 방법에 의해 측정될 수 있다.
또한, 본 발명은 추가로 상기 기술한 스크리닝 분석법에 의해 동정한 신규한 제제에 관한 것이다 (예를 들어, 하기의 암 요법 설명 참조). 따라서, 추가로 본원에 기술된 바와 같이 동정된 제제 (예를 들어, 암 마커 조절제, 안티센스 암 마커 핵산 분자, siRNA 분자, 암 마커 특이적 항체, 또는 암 마커-결합 파트너)를 적절한 동물 모델 (예컨대, 본원에 기술된 동물)에서 사용하여, 이러한 제제를 이용한 치료의 효능, 독성, 부작용 또는 작용 기작을 결정하는 것도 본 발명의 범위 내에 속하는 것이다. 또한, 상기 기술된 스크리닝 분석법에 의해 동정된 신규한 제제는, 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 치료 (예컨대, 암에 걸린 인간 환자를 치료함)를 위해 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 CXCR1 또는 FBXO21 신호 전달 경로 길항제를 스크리닝하는 방법을 비롯한 다양한 스크리닝 방법을 위해 비부착성 맘모스피어를 사용한다. 비부착성 맘모스피어는, 구형 구조로서 현탁액 내에서 증식할 수 있는 능력을 기반으로 하여, 1차 인간 유선 상피 줄기 및 간세포의 증식을 미분화된 상태로 가능케 하는 시험관 내 배양 시스템이다. 비부착성 맘모스피어는 이미 문헌[Dontu et al., Genes Dev. 2003 May 15;17(10):1253-70] 및 [Dontu et al., Breast Cancer Res. 2004;6(6):R605-15] (상기 문헌 모두 본원에 참조로 포함됨)에 기술된 바 있다. 이러한 참조 문헌들은 그 내용 전체, 특히 비부착성 맘모스피어의 구축과 용도에 대한 교시가 참조로 포함된다. 문헌 [Dontu et al.]에 기술된 바와 같이, 유방암 줄기 세포는 자기 재생 및 여러 번의 계대 분화가 가능한 줄기 세포 및 간세포로 이루어진 것을 특징으로 하고 있다. 또한, 돈투 등 (Dontu et al.)은 맘모스피어가 매트리겔 중에 재구축된 3-D 배양 시스템에서 복합적인 기능의 폐포관 구조를 클론에 의해 생성할 수 있는 세포를 포함하고 있다는 사실을 기술하고 있다.
특정 구현예에서, 하기의 예시적인 스크리닝 방법들이 사용된다. 시험관 내 연구에서는, 세포를 아데노바이러스 매개의 구축물을 발현하는 대조군 또는 CXCR1 또는 FBXO21 후보 물질 siRNA (m.o.i. 10 내지 100)로 3일간 처리하거나, 혹은 소분자 후보 물질 (예를 들어, PHA665752 유도체) (0.1-0.5 μM)로 3일간 처리한 후, 미처리한 세포와 처리된 세포에 있어서 종양 구를 형성하는 CXCR1+ 또는 FBXO21+ 세포의 역량을 비교할 수 있다. 생체 내 연구에서는, 인간의 유방암 세포를 루시퍼라아제를 발현하는 렌티바이러스로 감염시켜 종양 증식을 모니터링할 수 있다. 루시퍼라아제를 발현하는 암세포를 유방 조직에 주입하여 한 그룹당 5마리의 동물에서 약 0.5-0.7 cm 크기의 종양을 만들어낼 수 있다. 이후, 종양이 자리잡은 동물들은 이후 후보 물질인 CXCR1 또는 FBXO21 억제제 (매일 정맥내로 7일간 30mg/kg/일 투여), 또는 비히클 대조군으로 처리할 수 있다. 아데노바이러스를 발현하는 대조군 또는 후보 물질인 CXCR1 또는 FBXO21 siRNA (m.o.i. 100 또는 500으로 7일간 투여)를 이용한 병행 연구를 수행할 수 있다. 7일, 14일, 21일 및 28일째에 동물들의 사진을 찍어 종양 크기를 평가할 수 있고, 이후 동물들을 폐사시켰다. 종양 크기에 대해서는 부검을 하여 종양의 일부를 염색하여 추가로 종양 조직학 평가를 수행할 수 있다. 잔류 종양을 수거하여 CXCR1 또는 FBXO21 양성과 CXCR1 또는 FBXO21 음성 세포의 백분율을 가늠하기 위해 분류할 수 있다. 후보 물질인 CXCR1 또는 FBXO21 억제제와 후보 물질인 CXCR1 또는 FBXO21 siRNA의 투여로 인한 아데노바이러스 감염이 CXCR1 또는 FBXO21 신호 전달 기능을 억제한다는 것을 검증하기 위해, Gab-1과 ERK와 같은 다운스트림 매개자의 인산화를 검사할 수 있다 (문헌 [Chistensen et al., Cancer Res., 2003; 63:7345-7355], 본원에 참조로 포함됨).
V. 암 요법
일부 구현예에서, 본 발명은 암에 대한 요법을 제공한다. 일부 구현예에서, 요법은 암 마커 (예를 들어, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, CXCR1 또는 FBXO21, 그리고 CXCR1 또는 FBXO21 신호 전달 경로 중의 단백질)를 표적으로 한다. 일부 구현예에서, 공지된 임의의 암 줄기 세포 요법 또는 이후에 개발된 암 줄기 세포 요법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 암 줄기 세포 치료제는 미국특허 제6,984,522호와 제7,115,360호, 그리고 국제출원공보 WO03/050502, WO05/074633 및 WO05/005601 (이들 내용 전체가 본원에 참조로 포함됨)에 기술되어 있다.
항체 요법
일부 구현예에서, 본 발명은 본원의 줄기 세포 암 마커를 발현하는 종양을 표적으로 삼는 항체를 제공한다. 임의의 적절한 항체 (예를 들어, 단클론성, 다클론성, 또는 합성 항체)를 본원에 개시된 치료 방법에 이용할 수 있다. 일부 구현예에서, 암 요법에 사용되는 항체는 인간화 항체이다. 항체를 인간화하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다 (예를 들어, 미국특허 제6,180,370호, 제5,585,089호, 제6,054,297호 및 제5,565,332호; 이들은 각각 본원에 참조로 포함됨).
일부 구현예에서, 치료 항체는 본 발명의 줄기 세포 암 마커에 대하여 생성된 항체를 포함하는데, 여기서 상기 항체는 세포독성 제제에 접합된다. 이러한 구현예에서, 종양 특이적 치료제는 정상적인 세포를 표적으로 하지 않도록 제조되기 때문에, 통상적인 화학요법에서 해로웠던 많은 부작용을 줄일 수 있다. 특정 용도에 있어서, 치료제는 항체에 부착하는데 있어 유용한 제제로서 작용하는 약리학적 제제, 특히 상피 세포를 사멸시키는 능력 혹은 상피 세포의 증식 또는 세포 분열을 억제하는 능력을 가진 세포 독성 제제 또는 항종양 제제일 수 있다. 본 발명은 항체에 접합하여 활성 형태로 전달될 수 있는 임의의 약리학적 제제의 사용도 고려한다. 예시적인 항종양 제제로는, 화학요법제, 방사성 동위원소 및 세포독소를 포함한다. 본 발명의 치료 항체는 다양한 세포독성 부분, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 방사성 동위원소 (예를 들어, 요오드-131, 요오드-123, 테크네튬-99m, 인듐-111, 레늄-188, 레늄-186, 갈륨-67, 구리-67, 이트륨-90, 요오드-125 또는 아스타틴-211), 호르몬 예컨대 스테로이드, 대사 길항 물질 예컨대 사이토신 (예를 들어, 아라비노사이드, 플루오로우라실, 메토트렉세이트 또는 아미노프테린; 안트라사이클린; 마이토마이신 C), 빈카 알칼로이드 (예를 들어, 디메콜신; 에토포시드; 미트라마이신) 및 항종양 알킬화제 예컨대 클로람부실 또는 멜팔란을 포함할 수 있다. 다른 구현예로는 응혈제, 사이토카인, 성장 인자, 박테리아 내독소 또는 박테리아 내독소의 지질 A 부분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 치료제는 몇 개의 예만 언급하자면, 식물, 진균 또는 박테리아 유래의 독소, 예컨대 A 사슬 독소, 리보솜 불활성화 단백질, α-사신, 누룩곰팡이, 레스트릭토신, 리보뉴클레아제, 디프테리아 독소 또는 슈도모나스 외독소일 수 있다. 일부 구현예에서, 탈글리코실화 리신 A 사슬이 이용된다.
어떤 이벤트에서라도, 이와 같은 제제는, 필요하다면, 공지된 접합 기술 (예를 들어, 문헌 [Ghose et al., Methods Enzymol., 93:280 (1983)] 참조)을 사용하여, 그 필요에 따라서 표적으로 삼은 종양 세포 부위의 혈액 성분에 대한 표적화, 세포내 함입, 방출 또는 제시를 가능하게 할 수 있는 방식으로 항체에 성공적으로 접합시킬 수 있는 것으로서 제시되었다.
예를 들어, 일부 구현예에서, 본 발명은 본원의 줄기 세포 암 마커를 표적으로 삼은 면역독소를 제공한다. 면역독소는 특이적 표적제, 통상 종양을 표적으로 하는 항체 또는 단편을 세포독성 제제, 예컨대 독소 부분과 접합시킨 접합체이다. 이러한 표적제는 표적으로 삼은 항원을 수반하는 세포에 독소를 내보내어 선택적으로 그 세포만을 선택적으로 사멸시키게 된다. 일부 구현예에서, 치료 항체는 높은 생체 내 안정성을 제공하는 가교제를 사용한다 (Thorpe et al., Cancer Res., 48:6396 [1988]).
다른 구현예에서, 항체 특히 고형 종양의 치료와 관련된 항체는, 상피 세포의 혈관에서의 증식 또는 세포 분열을 억제함으로써, 종양 혈관계에 대해 세포독성 효과를 가지거나 아니면 항종양 효과를 가지도록 고안된다. 이러한 공격은 종양의 국소적 혈관 붕괴를 초래하여, 종양세포 특히 혈관계에서 종양 세포의 말단 부분에서 산소와 영양분을 빼앗아 궁극적으로는 세포 사멸과 종양 괴사를 유도하려는 목적이 있다.
일부 구현예에서, 항체를 기반으로 한 치료제는 하기 기술된 바와 같이 약학 조성물로서 제형화된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체 조성물을 투여하면 측정이 가능할 정도로 암이 감소 (예를 들어, 종양의 감소 또는 제거) 된다.
VI. 치료 조성물 및 투여
본 발명에 따른 종양 형성 조절자를 포함하는 약학 조성물은 임의의 효과적인 방법으로 투여될 수 있다. 예를 들어, IL8-CXCR1 신호 전달 경로 길항제, 또는 IL8-CXCR1 신호 전달/반응 경로에서 단백질 길항제로서 작용하는 기타 치료제가 임의의 효과적인 방법으로 투여될 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에서, 치료제는 레퍼탁신 또는 이의 유도체를 포함한다.
특정 구현예에서, 유효 농도의 IL8-CXCR1 신호 전달 경로 길항제를 포함하는 생리학적으로 적합한 용액은 국소적으로, 안구 내로, 비경구적으로, 구강으로, 비강 내로, 정맥 내로, 근육 내로, 피하로 투여될 수 있거나, 혹은 임의의 다른 효율적인 방법으로 투여될 수 있다. 특히, IL8-CXCR1 신호 전달 경로 길항제는 표적 조직의 종양 세포를 치료하기에 효과적인 양으로 주사 바늘로 표적 암 또는 종양 내로 (예를 들어, 유방 조직 내로) 직접 주입될 수 있다. 다르게는, 체강, 예컨대 안구, 위장관, 비뇨생식관 (예를 들어, 방광), 폐와 기관지 계통 내에 존재하는 암 또는 종양은, 주사 바늘을 사용한 직접 주입을 통해, 또는 카테터 혹은 암 또는 종양에 걸린 유강 장기 내부에 위치시킨 기타 전달 튜브를 통하여, 유효 농도의 IL8-CXCR1 신호 전달 경로 길항제를 포함하는 생리학적으로 적합한 조성물 (예를 들어, 용액 예컨대 식염수 또는 인산염 완충액, 현탁액, 또는 에멀젼; 이들은 멸균된 것)을 수여받을 수 있다. 임의의 효과적인 영상 장치, 예컨대 X-선, 초음파를 이용한 검사도, 또는 광섬유 시각화 시스템을 사용하여 표적 조직의 정확한 위치를 찾아 주사 바늘 또는 카테터 튜브를 인도할 수 있다. 또 다른 대안으로는, 유효 농도의 IL8-CXCR1 신호 전달 경로 길항제를 포함하는 생리학적으로 적합한 용액을 혈류로 전신 투여함으로써, 직접 도달할 수 없거나 해부학적으로 분리될 수 없는 암 또는 종양을 치료할 수 있다.
이러한 작업들은 공통적으로 IL8-CXCR1 신호 전달 경로 길항제를 표적 종양과 충분히 접촉되도록 위치시켜서, 이 길항제가 종양 세포와 접촉하고, 종양 세포를 변형 또는 감염 (제제의 특성에 따라 다름)시키도록 하는데 목적이 있다. 한 구현예에서, 유강 장기의 상피 내막에 존재하는 고형 종양은, 현탁액을 체액으로 채워진 유강 장기 내로 주입하거나, 또는 공기로 채워진 유강 장기 내로 스프레이 또는 분무함으로써 치료될 수 있다. 따라서, 종양 세포 (예컨대 고형 종양 줄기 세포)는 폐 기관지 내막, 위장관 내막, 여성 생식기 내막, 비뇨생식관, 방광, 쓸개 및 IL8-CXCR1 신호 전달 경로 길항제와 접촉가능한 다른 장기 조직 내막의 상피 조직 내에 또는 이들 사이에 존재할 수 있다. 다른 구현예에서, 고형 종양은 중추 신경계 예컨대, 척수, 척수근 또는 뇌의 내막 내 또는 이들 상에 존재할 수 있어서, 뇌척수액에 주입한 IL8-CXCR1 신호 전달 경로 길항제는 이들 공간 내에서 고형 종양 세포와 접촉하여 이들을 변형시킬 수 있다. 종양학계의 숙련자라면, 길항제가 종양 내 직접 주입에 의해 고형 종양으로 투여되어, 종양 내부의 종양 세포와 접촉해 영향을 줄 수 있다는 점을 알 수 있을 것이다.
본 발명에 의해 확인된 종양유발성 세포는 항-암세포 항체를 배양하는데 사용될 수도 있다. 한 구현예에서, 상기 방법은 종양유발성 세포 또는 분리된 종양유발성 세포의 풍부한 개체군을 수득하는 단계; 상기 개체군을 처리 (예를 들어, 방사선으로 처리)하여 세포 복제를 방지하는 단계; 및 상기 처리된 세포를 고형 종양 줄기 세포에 대한 면역 반응을 유도하기에 효과적인 양으로 인간 또는 동물 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 주사 또는 경구 투여될 세포의 유효 투여량에 관한 지침에 대해서는, 미국특허 제6,218,166호, 제6,207,147호 및 제6,156,305호 (본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. 다른 구현예에서, 상기 방법은 고형 종양 줄기 세포 또는 분리된 고형 종양 줄기 세포의 풍부한 개체군을 수득하는 단계; 시험관 내 배양물 중의 종양 줄기 세포를, 항체가 배양될 인간 피험자 또는 숙주 동물의 면역 효과기 세포와 혼합 (당업계에 공지된 면역학적 방법에 따름)하는 단계; 상기 배양물의 면역 효과기 세포들을 제거하는 단계; 및 상기 면역 효과기 세포를 동물에게 면역 반응을 촉발하기에 효과적인 용량으로 숙주 동물 내로 이식하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에서, 본 발명의 항-종양유발성 치료제 (예를 들어 IL8-CXCR1 신호 전달 경로 길항제)는 다른 항종양성 치료제와 함께 투여된다. 광범위한 치료제를 본 발명에서 사용할 수 있다. 본 발명의 제제와 함께 투여될 수 있거나, 또는 본 발명의 제제와 관련이 있는 임의의 치료제가 본 발명의 방법에서 사용하기에 적절하다.
본 발명의 특정 구현예에서, 다양한 부류의 항종양 (예를 들어, 항암) 제제들을 사용하는 것이 고려된다. 본 발명에서 사용하기에 적절한 항암제로서는, 이에 제한되지는 않지만, 세포 사멸을 유도하는 제제, 아데노신 디아미나아제 기능을 억제하는 제제, 피리미딘 생합성을 억제하는 제제, 퓨린 고리 생합성을 억제하는 제제, 뉴클레오타이드 상호변환을 억제하는 제제, 리보뉴클레오타이드 리덕타아제를 억제하는 제제, 티미딘 모노포스페이트 (TMP) 합성을 억제하는 제제, 디하이드로엽산 환원을 억제하는 제제, DNA 합성을 억제하는 제제, DNA와 부가물을 형성하는 제제, DNA에 손상을 주는 제제, DNA 복구를 억제하는 제제, DNA에 삽입되는 제제, 아스파라긴을 탈아미노화하는 제제, RNA 합성을 억제하는 제제, 단백질 합성 또는 안정성을 저해하는 제제, 미세소관 합성 또는 기능을 억제하는 제제 등을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물과 방법에 사용하기에 적절한 예시적인 항암제로는, 이에 제한되지는 않지만: 1) 알칼로이드, 예컨대 미세소관 억제제 (예를 들어, 빈크리스틴, 빈블라스틴 및 빈데신 등), 미세소관 안정화제 (예를 들어, 파클리탁셀 (TAXOL) 및 도세탁셀 등), 크로마틴 기능 억제제, 예컨대 토포아이소머라아제 억제제, 예컨대 에피포도필로톡신 (예를 들어, 에토포시드 (VP-16) 및 테니포시드 (VM-26) 등) 및 토포아이소머라아제 I을 표적으로 하는 제제 (예를 들어, 캄토테신 및 이리노테칸 (CPT-11) 등); 2) 공유성 DNA 결합제 (알킬화제), 예컨대 질소 머스타드 (예를 들어, 메클로레타민, 클로람부실, 시클로포스파미드, 이포스파미드 및 부설판 (MYLERAN) 등), 니트로소우레아 (예를 들어, 카무스틴, 로무스틴 및 세무스틴 등) 및 기타 알킬화제 (예를 들어, 다카바진, 히드록시메틸멜라민, 티오테파 및 마이토마이신 등); 3) 비공유성 DNA 결합제 (항종양 항생제), 예컨대 핵산 억제제 (예를 들어, 닥티노마이신 (악티노마이신 D) 등), 안트라사이클린 (예를 들어, 다우노루비신 (다우노마이신 및 세루비딘), 독소루비신 (아드리아마이신) 및 이다루비신 (이다마이신) 등), 안트라센디온 (예를 들어, 안트라사이클린 유사체, 예컨대 마이톡산트론 등), 블레오마이신 (BLENOXANE 등) 및 플리카마이신 (미트라마이신) 등; 4) 대사 길항 물질, 예컨대 엽산길항제 (예를 들어, 메토트렉세이트, FOLEX 및 MEXATE 등), 퓨린 대사 길항 물질 (예를 들어, 6-머캅토퓨린 (6-MP, PURINETHOL), 6-티오구아닌 (6-TG), 아자티오프린, 아시클로비르, 간시클로비르, 클로로디옥시아데노신, 2-클로로디옥시아데노신 (CdA) 및 2'-디옥시코포르마이신 (펜토스타틴) 등), 피리미딘 길항제 (예를 들어, 플루오로피리미딘 (예컨대, 5-플루로우라실 (ADRUCIL), 5-플루오로디옥시우리딘 (FdUrd) (플록스우리딘) 등) 및 사이토신 아라비노사이드 (예를 들어, CYTOSAR (ara-C) 및 플루다라빈 등); 5) 효소, 예컨대 L-아스파라기나아제 및 히드록시우레아 등; 6) 호르몬, 예컨대 글루코코르티코이드, 항에스트로겐 (예를 들어, 타목시펜 등), 비스테로이드성항안드로겐 (예를 들어, 플루타미드 등) 및 아로마타아제 억제제 (예를 들어, 아나스트로졸 (ARIMIDEX) 등); 7) 백금 화합물 (예를 들어, 시스플라틴 및 카르보플라틴 등); 8) 항암 약물, 독소 및/또는 방사성 핵종 등과 접합된 단클론성 항체; 9) 생체 반응 조절인자 (예를 들어, 인터페론 (예를 들어, IFN-α 등) 및 인터루킨 (예를 들어, IL-2 등) 등); 10) 입양 면역요법제; 11) 조혈 성장 인자; 12) 종양 세포 분화를 유도하는 제제 (예를 들어, 올-트랜스 레티노산(all-trans-retinoic acid) 등); 13) 유전자 치료 기법; 14) 안티센스 치료 기법; 15) 종양 백신; 16) 종양 전이를 막는 요법 (예를 들어, 바티매스타트 등); 17) 혈관형성 억제제; 18) 프로테오솜 억제제 (예를 들어, VELCADE); 19) 아세틸화 및/또는 메틸화 억제제 (예를 들어, HDAC 억제제); 20) NF κ B의 조절 인자; 21) 세포 주기 조절 억제제 (예를 들어, CDK 억제제); 22) p53 단백질 기능의 조절 인자; 및 23) 방사선을 포함한다.
암 요법과 관련하여 통상적으로 사용되는 종양 붕괴 제제라면 어떤 것이라도 본 발명의 조성물과 방법에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국식품의약품안정청은 미합중국에서의 사용이 승인된 종양 붕괴 제제에 대한 처방집을 보유하고 있다. U.S.F.D.A.에 대한 국제 의결 기구도 유사한 처방집을 보유하고 있다. 표 3은 미합중국에서 사용이 승인된 항종양 제제의 예시 목록을 제공한다. 당업계 종사자라면 미합중국이 승인한 모든 화학요법제에 대해 요구되는 "제품 라벨"이 그 예시한 제제에 대한 승인된 징후, 투여량 정보, 독성 데이터 등을 기술하고 있음을 알고 있을 것이다.
[표 3]
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항균치료제가 또한 본 발명에서 치료제로서 사용될 수 있다. 미생물체의 기능을 사멸, 억제, 또는 달리 약화시킬 수 있는 항균제라면 어느 것이라도 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 그러한 활성을 가질 것으로 생각되는 항균제도 사용될 수 있다. 항균제로는 비제한적으로, 천연 및 합성 항생제, 항체, 억제 단백질 (예, 디펜신), 항감작 핵산, 막 파괴제 등이 단독으로 또는 함께 사용될 수 있다. 사실, 비제한적으로, 항균제, 항바이러스제, 항진균제 등을 포함하여 어떠한 타입의 항생제라도 사용될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 특정 세포 타입 (예, 종양 세포)를 특이적으로 표적화할 수 있는 표적화제와 관련되어 있는 본 발명의 화합물 (및 기타 화학요법제)를 제공한다. 일반적으로, 표적화제와 관련되어 있는 치료 화합물은 표적화제와 수용체 매개된 내포작용 (endocytosis)을 통하여 세포중으로 흡수된 세포 표면 부위와의 상호반응을 통하여 신생 세포를 표적화한다.
표적 세포 (예, 종양 세포)의 표면상에 국지화되는 것으로 공지된 부위라면 어느 것이라도 본 발명에 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기와 같은 부위에 대해 지시된 항체는 상기 부위를 함유하는 세포 표면에 본 발명의 조성물을 표적화시킨다. 달리, 표적화 부위는 세포 표면 상에 존재하는 수용체에 대해 지시된 리간드일 수 있거나 역으로도 가능하다. 유사하게, 비타민도 본 발명의 치료제를 특정 세포로 표적화하는데 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "표적화 분자"는 치료 화합물을 당해 세포, 조직, 기관으로 표적화시키는데 유용한 화학 부위, 및 이의 부분이다. 비제한적으로, 시그날 펩타이드, 항체, 핵산, 독소 등을 포함하여, 여러가지 타입의 표적화 분자가 본 발명에 대해 사용될 수 있는 것으로 고려된다. 표적화 부위는 또한 관련있는 화학적 화합물 (예, 작은 분자)의 결합 또는 상기 화합물이 표적화된 세포, 조직, 및 기관으로 들어가는 것으로 촉진할 수 있다. 바람직하게는, 표적화 부위는 부착된 화합물을 특이적 세포 분포 및 소기관을 포함하여, 대상체, 조직, 또는 세포내의 표적화된 부위로 선택적으로 운반하는데 있어서 이들의 특이성, 친화성, 및 효율에 따라 선택된다.
여러 가지 효율성 문제가 모든 약물 및 특히 고도의 세포독성 약물 (예, 항암 약물)의 투여에 영향을 준다. 특히 중요한 문제는 투여한 약제가 오직 표적화된 세포 (예, 암 세포), 조직 또는 기관에만 영향을 주는 것을 확실히 해야한다는 것이다. 세포독성이 높은 약제를 비표적화된 세포로 비특이적 또는 의도하지 않게 운반하게 되면 심각한 독성 문제를 일으킬 수 있다.
비특이적 약물 운반과 관련한 문제점에 맞추어 약물-표적화 계획을 창안하고자 하는 수많은 시도가 있었다 (참조: K.N. Syrigos and A.A. Epenetos Anticancer Res., 19:606-164 (1999); Y.J. Park et al., J. Controlled Release, 78:67-79(2002); R.V.J. Chari, Adv. Drug Deliv. Rev., 31:89-104 (1998); 및 D. Putnam and J. Kopecek Adv. Polymer Sci., 122:55-123 (1995)). 항체 및 리간드 펩타이드 (예, 내피세포의 경우 RDG)와 같은 표적화 부위를 약물 분자에 접합시키는 것은 특정 약물과 관련한 이차적인 독성 문제를 경감시키기 위하여 사용된 바 있다.
화합물 및 항암제는 비제한적으로, 염수, 완충된 염수, 덱스트로오즈, 및 물을 포함하여, 멸균된, 생체화합성 약제학적 담체와 함께 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 1종의 약제 (예, 항체)를 함유할 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 적어도 2종의 약제의 혼합물 (예, 항체와 통상의 항암제 중 1종 이상)을 함유할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 다음 조건 중 하나 이상의 조건하에서 환자에게 투여할 약제를 적어도 2종 이상을 함유한다: 상이한 주기성, 상기한 지속기간, 상이한 농도, 상이한 투여 경로 등. 일부 구현예에서, IL8-CXCR1 신호 경로 길항제를 제2의 항암제 투여 전에, 예를 들어, 항암제 투여하기 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 12, 또는 18시간 전, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6일 전, 1, 2, 3, 또는 4주 전에 투여할 수 있다. 일부 구현예에서, IL8-CXCR1 신호 경로 길항제를 제2 항암제 투여 후, 예를 들어, 항암제 투여 한지 투여하기 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 12, 또는 18시간 후, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6일 후, 1, 2, 3, 또는 4주 후에 투여할 수 있다. 일부 구현예에서, IL8-CXCR1 신호 경로 길항제 및 제2 항암제를 동시에, 그러나 다른 스케쥴상으로 투여하는데, 예를 들면, IL8-CXCR1 신호 경로 길항제 화합물은 매일 투여하는 한편, 제2 항암제는 1주에 한번, 2주마다 한번, 3주마다 한번, 또는 4주마다 한번 투여한다. 다른 구현예에서, IL8-CXCR1 신호 경로 길항제를 1주에 한번 투여하는 한편, 제2 항암제를 매일, 1주에 한번, 2주마다 한번, 3주마다 한번, 또는 4주마다 한번 투여한다.
치료할 상태에 따라서, 바람직한 양태의 본 발명 약제학적 조성물을 제형화하여 전신적으로 또는 국소적으로 투여한다. 제형화 및 투여 기술은 하기 문헌의 최신판으로부터 알 수 있다: "Remington's Pharmaceutical Sciences" (Mack Publishing Co, Easton Pa.). 적합한 경로는 예를 들면, 경구 또는 점막을 통한 투여, 뿐만 아니라 비경구적 운반 (예를 들면, 근육내, 피하, 골내, 척추강내, 심실내, 정맥내, 복강내, 또는 비강내 투여)을 포함할 수 있다.
본 발명은 투여하는 치료 화합물 및, 일부 구현예에서, 1종 이상의 통상의 항암제를 허용되는 약제학적 운반법 및 제조 기술에 따라서 투여하는 것을 고려한다. 예를 들면, 치료 화합물과 적합한 항암제를 대상체에게 정맥내로 생리학적 염수와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 투여할 수 있다. 약제의 정맥내 운반에 대한 표준 방법이 고려된다 (예, 리포좀을 통한 운반). 그러한 방법은 당업자에게 숙지되어 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 제형은 비경구 투여 (예, 정맥내, 피하, 근육내, 골내, 및 복강내)에 적합하다. 일부 고려된 항암제 (예, 치료용 폴리펩티드)의 치료용 동시-투여가 또한 유전자 요법 시약 및 기술을 사용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 구현예에서, 치료 화합물을 대상체에게 단독으로, 또는 통상의 항암제 (예, 뉴클레오티드 서열, 약물, 호르몬 등) 1종 이상과 함께 또는 성분이 부형제(들) 또는 기타 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합된 약제학적 조성물로 투여한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 약제학적으로 허용되는 담체는 생물학적으로 불활성이다. 바람직한 구현예에서, 당해 분야에 숙지되어 있는 약제학적으로 허용되는 담체를 사용하여 경구 투여에 적합한 투여량으로 본 발명의 약제학적 조성물을 제형화한다. 상기와 같은 담체는 약제학적 조성물이 환자에 의한 경구 또는 비강 섭취을 위하여, 정제, 환제, 캡슐제, 드래기제, 액체, 겔, 시럽, 슬러리, 액제, 현탁제 등으로 제형화되도록 한다.
경구적 사용을 위한 약제학적 제제는 활성 화합물을 고체 부형제와 합하고, 임의로 생성된 혼합물을 분쇄한 다음, 필요에 따라, 적합한 보조제를 가한 후, 혼합물을 과립으로 가공하여 정제 또는 드래기 핵정을 수득한다. 적합한 부형제는 락토오스, 슈크로오스, 만니톨, 또는 소르비톨을 포함한 슈가; 옥수수, 밀, 쌀, 감자 등으로부터의 전분; 메틸 셀룰로오스, 히드록시프로필메틸-셀룰로오스, 또는 나트륨 카복시메틸셀룰로오스와 같은 셀룰로오스; 아라비아 및 트라가칸트를 포함한 검; 및 젤라틴 및 콜라겐과 같은 단백질과 같은, 탄수화물 또는 단백질 충전재이다. 경우에 따라, 가교-결합된 폴리비닐 피롤리돈, 아가, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트와 같은 이의 염과 같은, 분해 또는 가용화제를 가할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 투여량 및 투여 계획은 비제한적으로, 치료 효과의 목적하는 수준, 및 수득할 수 있는 치료 효과의 실용 수준을 포함하여, 숙지되어 있는 약리학적 및 치료적 고려사항을 기준으로 하여, 임상의 또는 약리학 분야에서의 숙련가에 의해 맞추어진다. 일반적으로, 화학치료제 투여에 있어 숙지된 약리학적 원칙에 따르는 것이 좋다 (예를 들어, 일반적으로 투여량을 시간에 있어서 50% 이상 및 3 내지 4 에이전트 반감기마다 그 이하로 변경시키지 않는 것이 좋다). 투여량-관련 독성에 대해 상대적으로 거의 또는 전혀 고려하지 않는 조성물, 및 최대 효과 (예, 암세포의 파괴)를 목적으로 하는 경우, 평균적으로 요구되는 투여량 보다 과량인 투여량이 비정상적인 것이 아니다. 이런 투여량 방식을 통상적으로 "최대 투여량" 전략이라 칭한다. 특정 구현예에서, IL8-CXCR1 신호 경로 길항제를 일일 1 내지 40 ㎎의 투여량으로 (예, 4 내지 6주간) 환자에 투여한다. 특정 구현예에서, 대상체에게 IL8-CXCR1 신호 경로 길항제를 15 내지 70 ㎎의 부하량을 투여한다. 특정 구현예에서, 대상체에게 IL8-CXCR1 신호 경로 길항제를 약 35 내지 45 ㎎의 부하용량을 투여한 다음 (예, 피하로), 약 4 내지 6주간 약 10 ㎎의 일일 투여량을 투여한다.
추가적인 투여시 고려사항은 투여할 약제에 대한 적당한 표적 수준, 약제의 축적량 및 잠재적 독성을 계산하는 것, 내성의 자극, 효과 결여, 및 약제의 치료 지수 범위를 기술하는 것과 관련되어 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 약제의 투여를 적정하는 통상의 방법을 사용하는 것을 고려한다. 통상의 투여 전략 중 하나는 대상체에 있어서 약제에 대한 타당한 표적 수준을 정하는 것이다. 일부 바람직한 구현예에서, 대상체의 혈장 중 약제의 수준을 측정한다. 이어서 적합한 투여량 수준과 빈도를 디자인하여 그 약제에 대한 목적하는 정상상태의 표적 수준을 성취한다. 대상체에 있어서 약제의 실제적인, 또는 평균 수준을 모니터 (예, 시간, 일일, 주간 등)하고, 투여량 수준 또는 빈도를 조절하여 표적 수준을 유지할 수 있다. 물론, 투여할 특정 약제 또는 약제들의 약물동태학 및 약동학 (예, 생물학적 이용가능성, 클리어런스 또는 생체축적, 생체내 분포, 약물 상호작용 등)은 타당한 표적 수준에서의 고려 사항에 잠재적으로 영향을 주며 따라서 투여량 수준 또는 빈도에 영향을 줄 수 있다.
표적-수준 투여량 방법은 전형적으로 대상체에서 약제에 대한 바람직한 범위 (또는 치료 범위)에 있어서 정의된 타당한 치료 목적의 확립에 따른다. 일반적으로, 치료제의 하한치는 최대 가능한 치료 효과의 약 50%를 제공하는 약제의 농도와 거의 대등하다. 치료 범위의 상한치는 통상적으로 약제의 독성에 의해 확립되는 것이며 약제의 효과에 의해 확립되는 것은 아니다. 본 발명은 특정 약제에 대한 치료 범위의 상한치는 독성 부작용을 나타내는 환자가 5 또는 10% 미만인 농도로 고려한다. 일부 구현예에서, 치료제의 상한치가 하한치의 약 2배 이하이다. 당업자는 투여량을 고려하는 것은 매우 가변적이며 어느 정도 개인적이라는 것을 이해할 것이다 (예, 유전적 성향, 면역학적 고려사항, 내성, 저항성 등). 따라서, 일부 양태에 있어서, 특정 환자에서 약제에 대해 효과적인 표적 투여량 수준은 1,...5,...10,...15,...20,...50,...75,...100,...200,...X%, 다른 환자에서의 최적량 이상일 수 있다. 역으로, 일부 환자는 다른 또는 대다수의 환자에서 전형적으로 최적의 치료 수준을 생성하는 투여 수준 또는 빈도 보다 더 낮은 투여량 수준 또는 빈도에서 (1,...5,...10,...15,...20,...50,...75,...100,...200,...X%)에서 확실한 부작용 및 독성 관련 건강 문제로 고생할 수 있다. 더욱 상세한 정보의 부재하에서, 표적 투여 수준은 종종 치료 범위의 중간으로 정한다.
바람직한 구현예에서, 임상의는 공지되어 있는 약리학적 원칙 및 방정식을 기본으로 하여 개인에 맞는 투여 계획을 디자인한다. 일반적으로, 임상의는 비제한적으로 F (투여량의 생가용도 분수), Cp (혈장 내 농도), CL (클리어런스/클리어런스 비율), Vss (안정한 상태에서의 약물 분배 용적), Css (안정한 상태에서의 농도), 및 t1/2 (약물 반감기)를 포함한, 여러 가지 약리학적 및 약력학적 특성, 뿐만 아니라 약물의 흡수 및 분배율에 대한 정보 지식을 기본으로 하여 개인에 맞는 투여 계획을 디자인한다. 당업자는 이들 변수의 추가적인 설명 및 개인에 맞는 투여량 계획의 계산을 설명하는 완벽한 방정식에 대한 수많은 공지의 약리학적 텍스트에 맡기고 있다 (예, Goodman and Gilman's Pharmaceutical Basis of Therapeutics, 10th ed., Hardman et al., eds., 2001). 당업자는 또한 개인에 있어서 이들 변수에서의 잠재적 변동을 예측할 수 있다. 예를 들어, F, CL, 및 Vss에 대해 관찰된 수치에서의 표준 편차는 전형적으로 각각, 약 20%, 50%, 및 30%이다. 개인에 있어서 잠재적으로 크게 변화되는 매개변수의 실제적인 효과는 환자에서 성취되는 Css 시간의 95%가 표적 수준의 35 내지 270%이다. 치료 지수가 낮은 약물의 경우, 이는 바람직하지 못하게 넓은 범위인 것이다. 그러나, 당업자는 일단 약제의 Cp (혈장 내 농도)를 측정한 다음, F, CL, 및 Vss의 수치를 직접 평가할 수 있다고 생각한다. 이는 임상의가 특정 환자의 투여 계획을 효과적으로 미세 조정할 수 있도록 한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 개인의 투여 방법과 계획을 더 조절하기 위하여 사용되는 계속적인 치료 약물 모니터 기술을 고려한다. 예를 들어, 하나의 구현예에서, CL/F의 평가를 더 개선하고 이어서 공지의 약리학적 원리 및 방정식을 사용하여 목적하는 약제 표적 수준을 성취하기 위하여 개인의 유지량을 조절하기위하여 Css 데이타를 사용한다. 치료 약물 모니터링은 투여 스케쥴 중 실제적으로 아무 때나 수행할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 모니터링은 투여 도중 및 특히 간헐적 투여량 투여시 여러 시점에서 수행한다. 예를 들어, 약물 모니터링은 1초 단위, 초 단위, 분 단위, 시간 단위, 일 단위, 주 단위, 월 단위 등의 범주 내에서, 사용되는 투여 방법 (예, 간헐적 투여, 부하량, 유지량, 무작위량, 또는 기타 투여 방법)에 상관없이, 약제 투여에 수반하여 수행할 수 있다. 그러나, 당업자는 약제 투여 후 신속하게 샘플링을 할 경우 약제의 혈장 농도의 변화가 지연될 수 있기 때문에 (예, 느린 분배 속도 또는 약력학적 인자로 인하여) 약제 효과 및 동력학에서의 변화를 용이하게 관측할 수 없다는 것을 인식하고 있다. 따라서, 약제 투여후 짧은 시간내에 수득한 대상체 샘플은 수치를 제한하거나 감소시킬 수 있다.
예측된 안정한-상태의 표적 수준의 투여 중 대상체로부터의 생물학적 샘플을 수거하는 1차적인 목표는 후속되는 약제의 CL/F 비의 보정된 산정치를 계산하는 것을 기본으로 하여 개인의 투여 계획을 수정하는 것이다. 그러나, 당업자는 조기 흡수후 약물 농도가 전형적으로 약제 클리어런스(clearance)를 반영하지 않는다는 것을 인식할 것이다. 조기 흡수후 약물 농도는 원칙적으로 약제의 흡수 속도, 안정한 상태 라기보다는 중심 상태, 약제 분배 용량, 및 분배 속도에 의해 표시된다. 각각의 이들 약동학적 특징은 치료제의 장기간의 유지량 처방 계획을 계산시 제한된 수치를 갖는다.
따라서, 일부 구현예에서, 목표가 장기간의 유지량 치료인 경우, 선행 투여량을 투여후, 및 더욱 바람직하게는 다음 계획된 투여량 투여 직전에 당해 대상체, 세포, 또는 조직으로부터 생물학적 샘플을 수득한다.
또 다른 구현예에서, 치료제가 투여량과 투여량 사이 기간에 환자에 의해 거의 완전히 소거된 경우, 본 발명은 먼저 투여한 후, 가장 바람직하게는 투여 후 짧은 시간 경과 후 다양한 시점에서 환자로부터 생물학적 샘플을 수집하는 것을 고려한다.
VII. 레퍼탁신 및 기타 소분자 CXCR1 억제제
특정 구현예에서, 본 발명의 방법, 키트, 및 조성물은 CXCR1의 소분자 억제제를 사용한다. 약제의 일 예로 레퍼탁신이 있다. 특정 구현예에서, 레퍼탁신의 생체내 투여량은 3 내지 60 ㎎/㎏ (예, 3...30...50...60 ㎎/㎏)이다. 특정 구현예에서, 레퍼탁신의 투여량이 약 30 ㎎/㎏이다. 레퍼탁신의 화학식은 하기와 같다.
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다른 구현예에서, 레퍼탁신의 유도체를 사용한다. 그외 소분자 CXCR1 길항체로는 SB265610 (Glaxo SmithKline Beecham; Benson et al., 2000, 151:196-197), 뿐만 아니라 SCH 527123 (2-하이드록시-N,N-디메틸-3-{2-[[(R)-1-(5-메틸푸란-2-일)프로필]아미노]-3,4-디옥소사이클로부트-1-에닐아미노}벤즈아미드 (SCH 527123), 경구적 생체이용가능한 CXCR2/CXCR1 수용체 길항제 (Schering Plough))가 있다. 상기한 스크리닝법으로 다른 소분자 억제제를 동정할 수 있다.
도 1은 유방암 세포주 (MDA-MB-453, SUM159)의 ALDEFLUOR-양성 세포군이 암 줄기 세포 특성을 보유하고 있음을 나타내고 있다. A-B, G-H. MDA-MB-453 (A-B) 및 SUM159 세포 (G-H)에 있어서 ALDH 효소 활성의 예시적인 유동 세포 분석법. ALDEFLUOR 분석은 하기 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행하였다. (C, I) ALDEFLUOR-양성 세포 개체군은 NOD/SCID 마우스에서 초기 종양의 표현 이질성을 되풀이한 종양을 발생시킬 수 있었다. (F, L) 서로 다른 세포수 (MDA-MB-453에 대해서는: 50,000개의 세포, 5,000개의 세포 및 500개의 세포, 그리고 SUM159에 대해서는: 100,000개의 세포, 10,000개의 세포 및 1,000개의 세포)를 주입한 것과 각 개체군 (ALDEFLUOR-양성, ALDEFLUOR-음성, 비분리된 개체군)에 대해 종양 성장 곡선을 플롯팅하였다. 종양 성장의 역학은 종양 형성의 잠복기와 크기 및 ALDEFLUOR-양성 세포의 수와 상관 관계가 있었다 (F, L). (D, J) 종양 세포가 존재함을 알려주는 ALDEFLUOR-양성 세포 주입 부위의 H&E 염색 (D: MDA-MB-453 ALDEFLUOR-양성 세포의 주입 부위, J: SUM159 ALDEFLUOR-양성 세포의 주입 부위). (E, K) ALDEFLUOR-음성 세포의 주입 부위는 잔류 매트리겔(Matrigel), 사멸된 세포 및 마우스 조직만을 포함하였다 (E: MDA-MB-453 ALDEFLUOR-음성 세포의 주입 부위, K: SUM159 ALDEFLUOR-음성 세포의 주입 부위). 데이터는 평균 ± SD로 나타냈다.
도 2는 "암 줄기 세포 지문"에 기초하여, 유방 세포주로부터 분리된 ALDEFLUOR-양성 및 ALDEFLUOR-음성 개체군을 분류한 것을 나타낸 것이다. 도 2A. 413개의 유전자 발현 지문을 기초로 한 16개 샘플의 계층 클러스터링. 데이터 행렬에서 각 행은 유전자를 나타내고, 각 열은 샘플을 나타낸다. ALDEFLUOR-양성 샘플 (밑줄친 이름)과 음성 샘플 (밑줄치지 않은 이름)과의 분리는 413개 유전자의 16개의 샘플 중 15개의 샘플에서 나타났다. 지문에 포함된 일부 유전자들은 'Entrez Gene'에서 사용된 것과 같은 HUGO 약어로 표시를 하였다 (ALDEFLUOR-양성 개체군 내에서 하향 조절되는 유전자는 녹색으로 표지를 하고, ALDEFLUOR-양성 개체군 내에서 상향 조절되는 유전자는 적색으로 표지함). 도 2B-C. 유전자 발현 결과를 확인하기 위해, ALDEFLUOR 표현형에 대해 분류된 5개의 유방암 세포주 한 세트 중에서, ALDEFLUOR-양성 개체군 중에 과발현된 5개의 식별 유전자 (CXCR1/IL8RA, FBXO21, NFYA, NOTCH2 및 RAD51L1)의 발현을 정량적 RT-PCR로 측정하였다. 본 도면에는 CXCR1과 FBXO21의 정량적 RT-PCR 발현 수준을 나타냈다. 정량적 RT-PCR로 측정한 유전자 발현 수준에 있어서는, DNA 마이크로어레이를 사용하여 얻은 결과로 볼 때, ALDEFLUOR-음성 개체군에 비해 ALDEFLUOR-양성 개체군에서 CXCR1 및 FBXO21 mRNA 수준이 증가했음을 확인하였다 (p<0.05).
도 3은 유방암 줄기 세포를 조절하는데 있어서 IL8/CXCR1 축의 역할을 나타낸 것이다. A. CXCR1을 발현하는 세포는 ALDEFLUOR-양성 개체군에 포함되어 있다. 4개의 서로 다른 유방암 세포주 (HCC1954, SUM159, MDA-MB-453, BrCa-MZ-01)의 ALDEFLUOR-양성 및 -음성 개체군을 FACS에 의해 분리하고 이를 고정시켜, 면역염색법 및 FACS 분석법을 이용하여 CXCR1 단백질의 발현에 대해 분석하였다. ALDEFLUOR-양성 세포들은 ALDEFLUOR-음성 개체군에 비해 CXCR1-양성 세포가 매우 풍부하였다. B. 3개의 서로 다른 세포주 (HCC1954, SUM159, MDA-MB-453)의 종양구 (tumorsphere) 형성에 대한 IL8 처리의 효과. IL8 처리는 투여량 의존 방식으로 1차 및 2차 종양구 형성을 증가시켰다. C. 부착성 조건 하에 배양된 4개의 서로 다른 세포주의 ALDEFLUOR-양성 개체군에 대한 IL8 처리의 효과. IL8은 분석된 4개의 각 세포주에 있어서 투여량 의존 방식으로 ALDEFLUOR-양성 개체군을 증가시켰다 (* p<0.05/ ** p<0.01, 대조군에 비해 통계적으로 유의한 차이).
도 4는 ALDEFLUOR-양성 세포가 증가된 전이 가능성을 나타내고 있음을 보인 것이다. A. IL8/CXCR1 축은 암 줄기 세포 침입과 관련이 있다. 침입에 있어서 IL8/CXCR1 축의 역할은 3개의 서로 다른 세포주 (HCC1954, MDA-MB-453, SUM159)에 대한 유인 물질로서 혈청 또는 IL8을 사용한 매트리겔 침입 분석에 의해 평가하였다. ALDEFLUOR-양성 세포는 ALDEFLUOR-음성 세포에 비해 6배 내지 20배로 침입성이 강했다 (p<0.01). 유인 물질로 IL8 (100 ng/㎖)을 사용했을 때, 유인 물질로 혈청을 사용했을 때보다 매트리겔을 통한 ALDEFLUOR-양성 세포의 침입이 현저히 증가하였음을 관찰할 수 있었다 (p<0.05). 이와는 반대로, IL8은 ALDEFLUOR-음성 개체군의 침입 역량에 대해서는 아무런 영향을 주지 않았다. B-M. ALDEFLUOR-양성 개체군은 증가된 전이 가능성을 나타냈다. B-D. 각 그룹 (ALDEFLUOR-양성, ALDEFLUOR-음성, 비분리된 그룹)의 세포들을 100,000개의 루시퍼라아제로 감염시킨 후, 일주일 간격으로 측정한 정규화 광자 플럭스(normalized photon flux)의 정량. E-J. 생체 발광 영상 소프트웨어를 이용한 전이의 검출 (E, G, I: 마우스가 얼굴을 아래로 향한 상태; F, H, J: 마우스가 얼굴을 위로 향한 상태). ALDEFLUOR-양성 세포로 접종한 마우스는, 마우스 한 마리당 한 개 이하의 전이가 발생했던 비분리된 세포를 이용해 접종했던 마우스에 비해, 서로 다른 부위 (뼈, 근육, 폐, 연조직)에 국소적으로 여러 곳에 전이가 생겼으며, 더 높은 광자 플럭스 방출을 나타냈다. 이와는 반대로, ALDEFLUOR-음성 세포로 접종한 마우스는 림프절에 국한된 작은 전이만이 가끔 발생하였다. K-M. ALDEFLUOR-양성 세포의 주입으로 유발된 뼈 (K), 연조직 (L) 및 근육 (M) 전이의 H&E 염색에 의한 조직학적 확인.
도 5는 종양 세포 생존력 (도 5A)과 암 줄기 세포 생존력 (도 5B)에 대한 CXCR1 억제의 효과를 나타낸 것이다.
도 6은 레퍼탁신 처리가 FAS/FAS 리간드 신호 전달에 의해 매개되는 방관자 효과(bystander effect)를 유발한다는 것을 보여주며, 특히 레퍼탁신 처리로 인해 유발된 세포 성장 억제는 FAS 길항제의 첨가로 인해 부분적으로 구제되었으며, FAS 작용제로 처리된 세포들도 레퍼탁신으로 처리된 세포와 유사한 세포 성장 억제를 나타냈다는 것을 보여준다.
도 7은 레퍼탁신 처리를 하지 않았을 때 FAK, AKT 및 FOXOA3의 활성화 (7A)와 레퍼탁신의 존재 하에 FAK, AKT 및 FOXOA3의 활성화 (7B)를 나타낸 것이다.
도 8은 하나의 유방암 세포주 (8A, SUM159) 및 서로 다른 환자들에서 생성된 3개의 인간 유방암 이종 이식물 (8B, MC1; 8C, UM2; 및 8D, UM3)에 대한 레퍼탁신, 도세탁셀, 또는 이들의 조합의 효과를 나타낸 것이다.
도 9는 SUM159 (9A), MC1 (9B), UM2 (9C), UM3 (9D)을 비롯한 다양한 세포주에 대해 ALDEFLUOR 분석법으로 평가된, 암 줄기 세포 개체군에 대한 레퍼탁신, 도세탁셀, 또는 이들의 조합 처리의 효과를 나타낸 것이다.
도 10은 2차 NOD-SCID 마우스 유방의 지방체(mammary fat pad)에 이식된 1차 종양 (10A. SUM159, 10B. MC1, 10C. UM2, 10D. UM3)의 연속 희석물에 대한 레퍼탁신, 도세탁셀, 또는 이들의 조합의 효과를 나타낸 것이다.
도 11은 레퍼탁신 처리로 SUM159 세포주의 전이 가능성이 감소됨을 나타낸 것이다. 도 11A는 SUM 159 세포를 심장 내 투여로 접종한 후, 일주일 간격으로 측정한 정규화 광자 플럭스의 정량을 나타낸 것이다. 전이의 형성은 생체 발광 영상을 이용하여 모니터링하였다 (11B: 식염수 용액으로 처리한 마우스; 11C: 레퍼탁신으로 처리한 마우스).
도 12는 SUM159 세포의 ALDEFLUOR-양성 하위 개체군과 CXCR1-양성 하위 개체군 (위) 또는 CXCR2-양성 하위 개체군 (아래) 간에 중복되는 부분을 나타낸 것이다. B-C. SUM159 세포를 부착성 조건에서 배양하여 레퍼탁신 (100nM)으로 처리하거나, 또는 CXCR1 (10㎍/㎖) 혹은 CXCR2 (10㎍/㎖)에 대한 두 특이적 차단 항체로 처리하였다. 3일 후, ALDEFLUOR 분석법을 이용하여 암 줄기 세포 개체군에 대한 효과를 분석하였고 (B), MTT 분석법을 이용해 처리 5일 후에 세포 생존력을 평가하였다 (C). 레퍼탁신 또는 항-CXCR1 항체로 처리한 후에 ALDEFLUOR-양성 개체군과 세포 생존력의 현저한 감소가 관찰되었다. 이와는 반대로, 항-CXCR2 항체를 사용했을 때는 현저한 영향이 관찰되지 않았다. D. 처리 4일 후, TUNEL 분석법을 이용해 사멸 세포수를 평가하였다. 대부분 생존 세포 (청색으로 염색됨)가 존재하는 대조군과 비교하여 레퍼탁신으로 처리된 세포들에서는 36%의 사멸 세포 (녹색으로 염색됨)가 검출되었다. E-F. 세포 사멸이 방관자 효과를 통해 매개되는지의 여부 측정. CXCR1-양성 및 CXCR1-음성 개체군을 흐름 분류(flow sort)시켜, 각 개체군을 다양한 농도의 레퍼탁신으로 처리하였다 (D). CXCR1-양성 개체군과 비분류된 개체군에서 세포 생존력의 감소가 관찰되었던 반면에, CXCR1-음성 개체군에서는 아무런 영향도 관찰되지 않았다 (E). 레퍼탁신으로 3일간 처리된 CXCR1-양성 세포의 투석 적응용 배지 (dCM)를 사용하여, 분류된 CXCR1-양성, CXCR1-음성, 또는 비분류된 개체군을 처리하였다. 투석 적응용 배지의 연속 희석을 이용하였다 (대조군, dCM 1/4, dCM 1/2, dCM 3/4, dCM). 처리 2일 후, MTT 분석법을 이용하여 세포 생존력을 평가하였다. CXCR1-음성 개체군과 비분류된 개체군 모두에서 세포 생존력의 현저한 감소가 관찰되었던 반면, CXCR1-양성 개체군에서는 아무런 영향도 관찰되지 않았다 (F).
도 13은 SUM159 세포주의 ALDEFLUOR-양성/CXCR1-양성 세포군 및 ALDEFLUOR-양성/CXCR1-음성 세포군의 종양유발성을 나타낸 것이다. A. 서로 다른 세포수 (50,000개의 세포, 5,000개의 세포, 1,000개의 세포 및 500개의 세포)를 주입한 것과 각 개체군 (ALDEFLUOR-양성/CXCR1-양성, ALDEFLUOR-양성/CXCR1-음성)에 대해 종양 성장 곡선을 플롯팅하였다. 두 세포군 모두에서 종양이 발생하였다. 종양 성장의 역학은 종양 형성의 잠복기와 크기 및 주입된 세포의 수와 상관 관계가 있었다. B-C. ALDEFLUOR-양성/CXCR1-양성 개체군에 의해 생성된 종양은 연속 계대 배양시 초기 종양의 표현 이질성을 재구축하였던 반면, ALDEFLUOR-양성/CXCR1-음성 개체군은 ALDEFLUOR-양성/CXCR1-음성 세포만을 함유하는 종양을 생성하였다. 본 발명자들은 3개의 계대 배양에 대해 두 세포군 모두를 이식하였다.
도 14는 종양구 형성에 대한 CXCR1 차단의 효과를 나타낸 것이다. SUM159 및 HCC1954 세포를 부착성 조건에서 배양하여 레퍼탁신 (100nM), 항-CXCR1 차단 항체 (10㎍/㎖), 또는 항-CXCR2 차단 항체 (10㎍/㎖)로 3일간 처리하였다. 처리 3일 후, 세포들을 떼어내어 현탁액 중에서 배양하였다. 배양 5일 후에 형성된 종양구의 수를 평가하였다. 양 세포주에 있어서, 레퍼탁신 및 항-CXCR1 처리 조건에서 1차 및 2차 종양구 형성이 대조군에 비하여 현저히 감소하는 유사한 결과가 관찰되었다. 이와는 반대로, 항-CXCR2 차단 항체는 종양구 형성에 아무런 영향을 주지 못했다.
도 15는 SUM159, HCC1954 및 MDA-MB-453 세포주의 세포 생존력에 대한 레퍼탁신 처리의 효과를 나타낸 것이다. 3개의 서로 다른 세포주 (SUM159, HCC1954, MDA-MB-453)를 부착성 조건에서 배양하여 레퍼탁신 (100nM)으로 처리하였다. MTT 분석법을 이용해 처리 1일 후, 3일 후 및 5일 후에 세포 생존력을 평가하였다. SUM159 및 HCC1954 세포주에 있어서 처리 3일 후에 세포 생존력의 감소가 관찰되었다. 그러나, 레퍼탁신은 MDA-MB-453 세포의 생존력에는 영향을 주지 못했다.
도 16은 시험관 내 ALDEFLUOR-양성 개체군에 대한 CXCR1 차단의 효과를 나타낸 것이다. A-B. HCC1954 (A) 및 MDA-MB-453 (B) 세포를 부착성 조건에서 배양하여 레퍼탁신 (100nM)으로 처리하거나, 또는 CXCR1 (10㎍/㎖) 혹은 CXCR2 (10㎍/㎖)에 대한 두 특이적 차단 항체로 처리하였다. 3일 후, ALDEFLUOR 분석법을 이용해 암 줄기 세포 개체군에 대한 효과를 분석하였다. HCC1954에 있어서는, 레퍼탁신 또는 항-CXCR1 항체로 처리한 후, ALDEFLUOR-양성 개체군과 세포 생존력의 현저한 감소가 관찰되었다. 이와는 반대로, 항-CXCR2 항체를 사용했을 때는 현저한 영향이 관찰되지 않았다 (A). MDA-MB-453에 있어서는, ALDEFLUOR-양성 개체군에 대한 아무런 영향도 관찰되지 않았다 (B).
도 17은 레퍼탁신 처리가 FAS/FAS-리간드 신호 전달에 의해 매개되는 방관자 효과를 유도함을 나타낸 것이다. A. 레퍼탁신 처리에 의해 유발된 방관자 사멸 효과가 FAS-리간드에 의해 매개되는지의 여부를 알아보기 위해, ELISA 분석법을 이용하여 배지 내에 가용성 FAS-리간드의 수준을 측정하였다. 처리 4일 후, 레퍼탁신으로 처리한 세포의 배지에서는 가용성 FAS-리간드가 비처리된 대조군에 비해 4배 이상 증가되었음이 관찰되었다. B. FAS-리간드 mRNA의 수준을 RT-PCR로 측정하여 레퍼탁신 처리 후 FAS-리간드 생성이 증가되었음을 확인하였다. 대조군에 비해, FAS 신호 전달을 활성화하는 FAS 작용제 처리 4일 후에 FAS-리간드 mRNA가 5배 증가하는 유사한 결과가 관찰되었다. C. SUM159 세포를 부착성 조건에서 배양하고 레퍼탁신 단독으로 또는 항-FAS-리간드를 함께 병용하여 처리하였다. 레퍼탁신 처리로 인해 유발된 세포 성장 억제는 항-FAS-리간드의 첨가로 인해 부분적으로 구제되었다. FAS 작용제로 처리된 세포들도 레퍼탁신 단독으로 처리된 세포와 유사한 세포 성장 억제를 나타냈다. D-E. CXCR1-양성 개체군 및 ALDEFLUOR-양성 개체군에 대하여, 레퍼탁신 단독 처리 또는 항-FAS-리간드와 함께 병용한 처리 효과 및 FAS 작용제의 처리 효과를 분석하였다. 레퍼탁신 처리로 유발된 CXCR1-양성 개체군 및 ALDEFLUOR-양성 개체군의 현저한 감소는 항-FAS-리간드에 의해 구제되지 않았으며, FAS 작용제를 이용하여 처리하였더니 CXCR1-양성 개체군과 ALDEFLUOR-양성 개체군의 백분율이 각각 10배와 3배로 증가하였다.
도 18은 CXCR1-양성 세포 및 CXCR1-음성 세포에 대한 FAS 작용제의 효과를 나타낸 것이다. CXCR1-양성 개체군 및 CXCR1-음성 개체군을 흐름 분류시켜 각 개체군을 다양한 농도의 FAS 작용제로 처리하였다. CXCR1-음성 개체군과 비분류된 개체군에서 세포 생존력의 감소가 관찰되었던 반면, CXCR1-양성 개체군에서는 아무런 영향도 관찰되지 않았다.
도 19는 정상적인 유방 줄기 세포/간세포 개체군에서의 CXCR1 단백질 발현 분석 및 유방암 줄기 세포 형성에 대한 IL-8 처리의 효과에 대해 나타낸 것이다. A. 유방 축소 성형 조직으로부터 분리된 정상적인 유방 상피 세포의 ALDEFLUOR-양성 및 -음성 개체군을 FACS로 분리시키고 이를 고정하여 면역염색법 및 FACS 분석법을 이용해 CXCR1 단백질의 발현에 대해 분석하였다. ALDEFLUOR-양성 세포군은 ALDEFLUOR-음성 개체군에 비해 CXCR1-양성 세포가 매우 풍부하였다. B-C. 유방암 줄기 세포 형성에 대한 IL8 처리의 효과. IL8 처리는 투여량 의존 방식으로 1차 (B) 및 2차 (C) 유방암 줄기 세포 형성을 증가시켰다.
도 20은 정상적인 유선 상피 세포에 대한 레퍼탁신 처리의 효과를 나타낸 것이다. A. 유방 축소 성형 조직으로부터 분리된 정상적인 유선 상피 세포를 부착성 조건에서 배양하여, 레퍼탁신 (100nM 또는 500nM) 또는 FAS 작용제 (500ng/㎖)로 처리하였다. 처리 5일 후, MTT 분석법을 이용하여 세포 생존력을 평가하였다. 레퍼탁신 또는 FAS 작용제의 처리는, 아주 높은 농도의 레퍼탁신 (500nM)을 이용했을 때조차도, 부착성 조건에서 배양된 정상적인 유선 상피 세포의 생존력에 아무런 영향을 주지 못하였다. B. 레퍼탁신으로 처리한 정상적인 유선 상피 세포의 배지 중에서 ELISA 분석법을 이용하여 가용성 FAS-리간드의 수준을 평가하였다. 처리 4일 후, 처리된 세포의 배지 중에서 가용성 FAS-리간드가 증가했음이 검출되었다. C. FACS 분석법에 의한 정상적인 유선 상피 세포에서의 FAS/CD95 발현 분석. 부착성 조건에서 배양된 정상적인 유선 상피 세포에서는 FAS/CD95 발현이 검출되지 않았다. D. 유방암 줄기 세포 형성에 대한 레퍼탁신 처리의 효과. 정상적인 유선 상피 세포를 부착성 조건에서 배양하여, 레퍼탁신 (100nM)으로 4일, 8일, 11일 및 15일간 처리하였다. 레퍼탁신 처리 후, 세포를 떼어내어 현탁액에서 배양하였다. 레퍼탁신 처리 조건에서 유방암 줄기 세포의 개시 세포가 현저히 감소되었음이 관찰되었다.
도 21은 FAK, AKT 및 FOXO3a 활성화에 대한 레퍼탁신 처리의 효과를 나타낸 것이다. CXCR1 다운스트림 신호 전달 과정에 대한 레퍼탁신 처리 효과를 평가하기 위해, 두 개의 서로 다른 바이러스 구축물, 하나는 PTEN-siRNA을 통해 PTEN 발현을 저지하는 것, 그리고 다른 하나는 FAK 과발현을 유도하는 것 (Ad-FAK)을 이용하였다. A. SUM159 대조군, SUM159 PTEN-siRNA 및 SUM159 Ad-FAK 세포들을 100nM 레퍼탁신의 부재 또는 존재 하에 부착성 조건에서 2일간 배양하고, FAK/AKT 경로의 활성화를 웨스턴 블롯팅으로 평가하였다. 레퍼탁신 처리는 FAK Tyr397 및 AKT Ser473 인산화의 감소를 초래한 반면에, PTEN 고갈 및 FAK 과발현은 FAK 및 AKT 활성에 대한 레퍼탁신 처리의 효과를 차단하였다. B. CXCR1-양성 세포에 대한 면역형광 염색을 이용하여, 본 발명자들은 레퍼탁신 처리로 포스포-FAK (막이 적색으로 염색됨) 및 포스포-AKT 발현 (세포질이 적색으로 염색됨)이 사라졌음을 확인하였다. 항-FOXO3A를 이용한 면역형광 염색으로 비처리된 세포에 있어서 FOXO3a의 세포질상 위치 (적색)를 알 수 있었던 반면, 레퍼탁신 처리는 FOXO3A의 핵에 대한 재배치를 유도하였다. 이와는 반대로, PTEN 고갈 또는 FAK 과발현이 있는 세포는 레퍼탁신 처리된 세포와 미처리된 세포 모두에서 높은 수준의 포스포-FAK, 포스포-AKT 및 세포질 FOXO3A 발현을 나타내었다. 모든 샘플에서, 핵은 DAPI로 대비 염색하였다 (청색). C-D. SUM159 PTEN-siRNA 및 SUM159 Ad-FAK 세포 생존력에 대한 레퍼탁신의 효과와 암 줄기 세포 개체군에 대한 레퍼탁신의 효과를 각각 MTT 분석법과 ALDEFLUOR 분석법을 이용하여 평가하였다. 처리 3일 후, PTEN 고갈 또는 FAK 과발현이 있는 세포는 레퍼탁신에 대한 저항성을 나타냈다 (C). 레퍼탁신 처리로는 ALDEFLUOR-양성 SUM159 PTEN 저지(knockdown) 세포의 비율을 변화시키지 못했다 (D).
도 22는 HCC1954 및 MDA-MB-453 세포주에서 FAK/AKT 활성화에 대한 레퍼탁신 처리의 효과를 나타낸 것이다. CXCR1 다운스트림 신호 전달 과정에 대한 레퍼탁신 처리의 효과를 평가하기 위해, 본 발명자들은 PTEN-siRNA을 통해 PTEN 발현을 저지하는 렌티바이러스 구축물을 이용하였다. A. HCC1954 대조군 및 HCC1954 PTEN-siRNA 세포들을 100nM 레퍼탁신의 부재 또는 존재 하에 부착성 조건에서 2일간 배양하고, FAK/AKT 경로의 활성화를 웨스턴 블롯팅으로 평가하였다. 레퍼탁신 처리는 FAK Tyr397 및 AKT Ser473 인산화의 감소를 초래한 반면에, PTEN 고갈은 FAK 및 AKT 활성에 대한 레퍼탁신 처리 효과를 차단하였다. B. 레퍼탁신 처리는 PTEN 돌연변이의 보금자리가 되는 MDA-MB-453 세포주의 세포 생존력에 아무런 영향을 주지 못했다. 본 발명자들은 웨스턴 블롯 분석법을 사용하여 FAK/AKT 경로가 레퍼탁신 처리에 의하여 방해받지 않음을 확인하였다.
도 23은 MTT 분석법을 이용하여 평가한, HCC1954 PTEN-siRNA 세포 생존력에 대한 레퍼탁신의 효과를 나타낸 것이다. 처리 3일 후, PTEN 고갈이 있는 세포들은 레퍼탁신에 대해 저항성을 나타냈다.
도 24는 도세탁셀 또는 레퍼탁신 처리 후, 정량적 RT-PCR에 의해 측정한 FAS-리간드 및 IL-8 mRNA의 발현을 나타낸 것이다. A-B. 부착성 조건에서 배양된 SUM159 세포를 레퍼탁신 (100nM), FAS 작용제 (500ng/㎖) 또는 도세탁셀 (10nM)로 처리하였다. 처리 3일 후, 세포들을 수집하여 RNA를 추출하였다. 도세탁셀은 SUM159 세포에서 FAS-리간드 mRNA (A) 및 IL-8 mRNA (B)를 유도하였다. FAS 작용제 또는 도세탁셀 처리 후 IL-8 mRNA 수준이 4배 증가한 것으로 관찰되었다 (B).
도 25는 3개의 서로 다른 유방암 이종 이식물에서 PTEN/FAK/AKT 활성화에 대해 평가한 것을 나타낸 것이다. 웨스턴 블롯 분석법을 통해, 두 이종 이식물이 PTEN을 발현하며, FAK Tyr397 및 AKT Ser473 인산화에서 보여진 것과 같은 FAK/AKT 경로를 활성화하고 있음을 알 수 있었다.
도 26은 생체 내 유방암 줄기 세포 개체군에 대한 레퍼탁신 처리의 효과를 나타낸 것이다. A-C. 생체 내에서 종양 성장 및 암 줄기 세포 개체군에 대한 레퍼탁신 처리의 효과를 평가하기 위해, 유방암 세포주 (SUM159) 및 서로 다른 환자들 (MC1, UM2, UM3)에서 생성된 3개의 인간 유방암 이종 이식물을 이용하였다. A. 각 샘플에 대해, 50,000개의 세포를 인간화된 NOD/SCID 마우스 유방의 지방체에 주입하고, 종양 크기를 모니터링하였다. 종양 크기가 약 4 mm가 되었을 때, 레퍼탁신 (15mg/Kg)의 피하 주사 (28일간 2회/일) 또는 도세탁셀 (10mg/Kg)의 복강내 주사 (1회/주) 또는 이들의 조합 주사 (레퍼탁신/도세탁셀)를 개시하였다. 그래프는 각 지정된 처리 과정 전과 처리 과정 동안의 종양 크기를 나타낸다 (화살표, 처리 시작점). 각 샘플에 대해, 도세탁셀 단독 또는 레퍼탁신/도세탁셀 조합으로 처리된 그룹에서는 대조군에 비해 종양 크기가 통계적으로 유의한 감소를 나타내는 유사한 결과가 관찰되었던 반면에, 대조군 종양과 레퍼탁신 단독으로 처리한 종양의 성장 간에는 아무런 차이점을 관찰할 수 없었다. B-C. ALDEFLUOR 분석법 (B) 및 2차 마우스로의 재이식 (C)에 의해 평가된 암 줄기 세포 개체군에 대한 레퍼탁신, 도세탁셀, 또는 이들의 조합 처리의 평가. 도세탁셀로 처리된 종양 이종 이식물은 대조군과 비교하여 유사하거나 증가된 백분율의 ALDEFLUOR-양성 세포를 나타내었던 반면, 레퍼탁신 단독 처리 또는 도세탁셀과 함께 병용하여 처리한 경우에는 대조군에 비해 ALDEFLUOR-양성 세포가 암 줄기 세포 내에 65% 내지 85%로 통계적으로 유의하게 감소하였다 (p<0.01) (B). 1차 종양, 비처리된 마우스 (대조군) 및 처리된 마우스에서 얻은 세포의 연속 희석물을 그 어떤 추가의 처치도 받지 않은 2차 NOD/SCID 마우스 유방의 지방체 내로 이식하였다. 대조군 및 도세탁셀로 처리된 1차 종양은 모든 희석물에 있어서 2차 종양을 형성하였던 반면에, 레퍼탁신 또는 도세탁셀과 병용하여 처리한 1차 종양으로부터 얻어진 보다 많은 수의 세포들만이 종양을 형성할 수 있었다. 또한, 종양 성장은 현저히 느려서, 결과적으로 생성된 종양도 대조군 또는 도세탁셀로 처리한 종양보다 그 크기가 현저히 작았다 (C). D. 각 그룹의 이종 이식물을 수거하여, 포스포-FAK, 포스포-AKT, FOXO3A 및 ALDH1의 발현을 검출하기 위해 면역조직화학 염색을 실시하였다. 막형성 포스포-FAK의 발현 및 세포질 형성 포스포-AKT의 발현 (화살표)은 대조군 및 도세탁셀로 처리된 종양에서 검출되었던 반면에, 레퍼탁신 단독 또는 도세탁셀과 함께 병용하여 처리된 종양에서는 발현이 검출되지 않았다. 핵형성 FOXO3A의 발현 (갈색)은 도세탁셀 또는 레퍼탁신 단독 또는 이들을 조합하여 처리한 세포에서 검출되었다. ALDH1 발현의 감소 (화살표)는 대조군과 도세탁셀로 처리된 종양보다는 레퍼탁신 단독 또는 이들의 조합으로 처리된 종양에서 검출되었다.
도 27은 생체 내에서 유방암 줄기 세포에 대한 레퍼탁신 처리의 효과를 나타낸 것이다. A-C. 생체 내에서 종양 성장 및 암 줄기 세포 개체군에 대한 레퍼탁신 처리의 효과를 평가하기 위해, 유방암 세포주 (SUM159, A) 및 서로 다른 환자들에서 생성된 3개의 인간 유방암 이종 이식물을 이용하였다. 각 샘플에 대해, 50,000개의 세포를 인간화된 NOD/SCID 마우스 유방의 지방체에 주입하고, 종양 크기를 모니터링하였다. 종양 크기가 약 4 mm가 되었을 때, 레퍼탁신 (15mg/Kg)의 피하 주사 (28일간 2회/일) 또는 도세탁셀 (10mg/Kg)의 복강내 주사 (1회/주) 또는 이들의 조합 주사 (레퍼탁신/도세탁셀)를 개시하였다. 그래프는 각 지정된 처리 과정 전과 처리 과정 동안의 종양 크기를 나타낸다 (화살표, 처리 시작점). 각 샘플에 대해, 도세탁셀 단독 또는 레퍼탁신/도세탁셀 조합으로 처리된 그룹에서는 대조군에 비해 종양 크기가 통계적으로 유의한 감소를 나타내는 유사한 결과가 관찰되었던 반면에, 대조군 종양과 레퍼탁신 단독으로 처리한 종양의 성장 간에는 아무런 차이점을 관찰할 수 없었다. 암 줄기 세포 개체군에 대한 레퍼탁신, 도세탁셀, 또는 이들의 조합 처리의 평가를 ALDEFLUOR 분석법 및 2차 마우스로의 재이식에 의해 수행하였다. 도세탁셀로 처리된 종양 이종 이식물은 대조군과 비교하여 유사하거나 증가된 백분율의 ALDEFLUOR-양성 세포를 나타내었던 반면, 레퍼탁신 단독 처리 또는 도세탁셀과 함께 병용하여 처리한 경우에는 대조군에 비해 ALDEFLUOR-양성 세포가 암 줄기 세포 내에 65% 내지 85%로 통계적으로 유의하게 감소하였다 (p<0.01). 1차 종양, 비처리된 마우스 (대조군) 및 처리된 마우스에서 얻은 세포의 연속 희석물을 그 어떤 추가의 처치도 받지 않은 2차 NOD/SCID 마우스 유방의 지방체 내로 이식하였다. 대조군 및 도세탁셀로 처리된 1차 종양은 모든 희석물에 있어서 2차 종양을 형성하였던 반면에, 레퍼탁신 또는 도세탁셀과 병용하여 처리한 1차 종양에서 수득한 것으로서 보다 많은 수의 세포들만이 종양을 형성할 수 있었다. 종양 성장은 현저히 느려서, 결과적으로 생성된 종양도 대조군 또는 도세탁셀로 처리한 종양보다 그 크기가 현저히 작았다.
도 28은 CD44+/CD24- 표현형으로 평가된 유방암 줄기 세포 개체군에 대한 레퍼탁신 처리의 효과를 나타낸 것이다. A-B. 암 줄기 세포 개체군에 대한 레퍼탁신, 도세탁셀, 또는 이들의 조합 처리를 CD44+/CD24- 세포의 존재로 평가하였다. 도세탁셀 단독으로 처리한 잔류 종양에서, 본 발명자들은 CD44+/CD24- 세포의 백분율이 일관되게 변하지 않거나 증가되었음을 관찰할 수 있었던 반면에, 레퍼탁신 단독 처리 또는 도세탁셀과 함께 병용하여 처리했을 때에는 CD44+/CD24- 세포 개체군이 결과적으로 감소하였다. A. UM3 이종 이식에 대한 흐름 차트 분석이 제시되어 있다. B. MC1, UM2 및 UM3에 대해서는 유사한 결과가 관찰되었다. 모든 처리 조건 하에서 거의 대부분의 SUM159 세포들이 CD44+/CD24-이다.
도 29는 레퍼탁신 처리로 전신성 전이가 전개되는 것을 감소시켰음을 나타낸 것이다. 전이 형성 과정에 대한 레퍼탁신 처리의 효과를 평가하기 위해, HCC1954 (A), SUM159 (B), MDA-MB-453 (C) 유방암 세포주를 루시퍼라아제를 발현하는 렌티바이러스로 감염시키고, 심장 내 주입을 통해 250,000개의 루시퍼라아제 감염된 세포들을 NOD/SCID 마우스 내로 접종하였다. 심장 내 주입 12시간 후에, 식염수 용액의 피하 주사 또는 레퍼탁신 (15mg/kg)의 피하 주사를 이용하여 마우스를 28일 동안 하루에 2회 처리하였다. 생체 발광 영상을 사용해 전이 형성 과정을 모니터링하였다. 접종 후 일주일 간격으로 측정한 정규화된 광자 플럭스를 정량하였더니, HCC1954 또는 SUM159 세포로 접종한 마우스에 있어서 식염수 대조군에 비해 레퍼탁신에서 전이 형성이 통계적으로 유의하게 감소하였음을 알 수 있었다 (A-B). 이와는 반대로, 레퍼탁신 처리로는 MDA-MB-453 세포를 주사한 마우스에 있어서 전이 형성에 아무런 영향을 주지 못했다 (C). 레퍼탁신으로 처리되지 않은 마우스에서 생성된 뼈와 연조직에서의 H&E 염색에 의한 전이의 조직학적 확인 (D).
도 30은 화학요법 단독 또는 레퍼탁신과 함께 병용하여 처리한 암 줄기 세포의 IL-8/CXCR1 신호 전달 과정을 나타낸 것이다. A. 암 줄기 세포에서 유효한 IL-8/CXCR1 세포 신호 전달 과정 그림. IL-8 결합 후 CXCR1 활성화는 국소 부착 키나아제 (FAK)의 인산화를 유도한다. 활성화된 FAK는 AKT를 인산화시키고, 줄기 세포의 자기 재생을 조절하는 WNT 경로 및 세포 생존을 조절하는 FOXO3A를 활성화시킨다. FAK의 활성화는 FAS 신호 전달의 다운스트림 효과기인 FADD를 억제함으로써 암 줄기 세포를 FAS-리간드/FAS 매개된 방관자 효과로부터 보호한다. 화학요법을 실시하는 경우에는, 벌크 종양 세포만이 그 치료에 민감하여, 세포가 사멸하는 과정 동안 높은 수준의 IL-8 및 FAS-리간드 단백질을 방출하게 된다. 유방암 줄기 세포는 IL-8로 매개된 방관자 효과를 통해 자극되며, FAS-리간드를 통해 매개되는 방관자 사멸 효과에는 저항성을 가지고 있다. B. 레퍼탁신 처리는 IL-8/CXCR1 신호 전달 과정을 차단하며, 유방암 줄기 세포 자기 재생과 생존을 억제한다. 레퍼탁신 처리를 화학요법과 병행하는 경우, 상기 암 줄기 세포는 FAS-리간드에 의해 매개되는 방관자 사멸 효과에 민감하게 된다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 특정 바람직한 양태 및 양상을 증명하고 추가로 설명하기 위하여 제공되며 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예 1
CXCR1는 암 줄기세포를 동정한다
본 실시예는 암 줄기세포 마커로서 CXCR1, 뿐만 아니라 다른 단백질 (예, FBXO21)의 동정을 기술한다.
세포 배양.
유방 세포주 (BCL)를 ATCC ("http://www." 이어서, "Igcpromochem-atcc.com/commom/catalog/cellBiology/cellBiologyIndex.cfm") 또는 Drs.S.Ethier (현재는 ""http://www." 이어서, "asterand.com/asterand/BIOREPOSITORY/hbreastcancercelllines.aspx, SUM44, SUM52, SUM149, SUM159, SUM185, SUM190, SUM225, SUM229"), V.J.Mobus (BrCa-MZ-01), 및 V.Catros (S68)의 래보러토리로 개발된 콜렉션으로부터 수득한다. 시험된 BCLs는 모두 암종으로부터 유래된 것인데, 섬유낭성 질환으로부터 유래된 MCF10A, 및 정상의 유선조직으로부터 유래된 HMEC-유래 184A1은 제외된다. 상기 세포주를 권장되는 배양 조건을 사용하여 성장시킨다. 모든 실험은 지수 성장기의 서브컨플루언트(subconfluent) 세포로 수행한다.
ALDEFLUOR 검정 및 FACS에 의한 ALDH-양성 개체군의 분리
주요 분자 서브타입의 인간 유방암을 나타내는 33개의 BCLs에서 ALDH 활성을 평가한다. ALDEFLUOR 키트 (StemCell technologies, Durham, NC, USA)를 사용하여 ALDH 효소 활성을 갖는 개체군을 분리시킨다 (17). 트립신처리 후 서브컨플루언트 세포주 또는 방금 분리된 이종이식체로부터 수득한 세포를 ALDH 기질을 함유하는 ALDEFLUOR 검정용 완충액에 현탁시키고 (BAAA, 1 μmol/l 1x106개 세포 당) 40분간 37 ℃에서 배양시킨다. 각 실험에서 세포 샘플을 음성 대조물로서, 50 밀리몰/L의 디에틸아미노벤즈알데히드 (DEAB), 특이적 ALDH 억제제와 동일한 조건하에서 염색한다. FACStarPLUS (Becton Dickinson)을 사용하여 유세포분석기 분류를 수행한다. ALDEFLUOR 형광을 488 ㎚에서 여기시키고 표준 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC) 530/30 밴드 통과 필터를 사용하여 검출한다. 이종이식된 종양의 경우, 항-H2Kd 항체 (BD biosciences, 1/200, 빙상에서 20분), 이어서 피코에리트린으로 표지시킨 2차 항체 (Jackson labs, 1/250, 빙상에서 20분)와 함께 배양시켜 마우스 기원의 세포를 제거하는데 사용한다. 분류 게이트는 생존력의 경우 PI 염색한 세포, DEAB로 처리된 ALDEFLUOR-염색한 세포, 및 2차 항체만으로 염색한 것들을 사용하여 확립한다. RNA 프로파일링 또는 NOD/SCID 마우스 주사 전에, 분류된 개체군의 순도를 BrCa-MZ-01 및 SUM159 세포주 중 10,000개의 ALDEFLUOR-양성 및 음성 세포의 이중 분류법을 사용하여 체크한다. 두 세포주의 경우, 분류된 ALDEFLUOR-양성 개체군은 ALDEFLUOR-양성 세포를 98% 이상 함유하며 ALDEFLUOR-음성 개체군에서는 ALDEFLUOR-양성 세포가 전혀 검출되지 않았다.
NOD/SCID 마우스에서의 종양형성능 (tumorigenicity)
ALDEFLUOR-양성, -음성 및 미분리 SUM159, MDA-MB-453 및 BrCa-MZ-01 세포의 종양형성능을 NOD/SCID 마우스에서 평가한다. 사춘기전 3주령에 지방 패드에서 상피조직을 떼어내고 (17)에 기재된 바와 같이 인간 섬유아세포를 주사하여 (1:1 조사된:비-조사된, 50,000개의 세포/100 ㎕ Matrigel/지방 패드) 인간화시킨다. 종양의 최대 직경이 1.2 ㎝가 되었을 때, 연구에서 척추동물 사용에 대한 규제에 따라, 동물을 안락사시킨다. 각각의 지방 패드 부분을 포르말린에 고정시키고 조직학적 분석을 위하여 파라핀에 박아넣는다. 다른 부분은 ALDEFLUOR 검정법으로 평가한 다음, 분류하고 이어서 이식한다.
부착 비의존성 배양
184A1, SUM149 및 SUM159로부터의 ALDEFLUOR-양성, -음성 및 미분리 세포를 초-저부착 플레이트 (Corning, Acton, MA)에 낮은 밀도로 (5000개 바이알 세포/㎖) 단일 세포로 플레이팅한다. 세포를 혈청-유리 포유동물 상피조직 기본 배지 (Cambrex Bio Science, Walkerville, MD)에서 (18)에 기재된 바와 같이 3 내지 7일간 성장시킨다. 세포의 구를 형성하는 능력은 상이한 투여량의 IL8 (GenWay Biotech, San Diego, CA)로 처리한 후 정량화한다.
RNA 추출
DNA/RNA All Prep Maxi Kit를 사용하여, 제조업자 (Qiagen, Sample and Assay technologies, The Netherlands)의 지침에 따라서 냉동된 ALDEFLUOR-양성 및 -음성 세포로부터 전체 RNA를 추출한다. 전사 분석을 위하여 8개의 BCLs를 사용한다: 184A1, BrCa-MZ-01, HCC1954, MDA-MB-231, MDA-MB-453, SK-BR-7, SUM149, 및 SUM159. 포름알데히드 아가로스 겔 전기영동법 및 마이크로-분석 (Agilent Bioanalyzer, Palo Alto, CA) 변성시켜 RNA 인테그리티 (integrity)를 조절한다.
DNA 마이크로어레이를 사용한 유전자 발현 프로파일링
38,500개의 잘-특성화된 인간 유전자를 포함하여 47,000개를 초과하는 전사물과 변이체를 함유하는 Affymetrix U133 Plus 2.0 인간 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이를 사용하여 유전자 발현을 분석한다. cRNA 제조, 하이브리드화, 세척 및 검출은 공급업자 ("http://www." 이어서 "affymetrix.com/index.affx")에 의해 권장되는 바와 같이 수행한다. 발현 데이타는 RMA (Robust Multichip Average) 방법으로 (20,21)에 기재된 바와 같이, R 사용하는 Bioconductor 및 관련 패키지(19)에서 분석한다. RMA는 배경 조정, 사분위수 정규화 및 유전자당 11개의 올리고뉴클레오티드의 요약을 수행한다.
분석 전에, 필터링 공정은 25,285개의 유전자/ESTs를 보유하는, 16개의 샘플 모두에서 100 단위보다 더 낮은 발현 수치로 정의되는 바와 같이 낮게 측정되는 발현 및 거의 측정되지않는 발현에 대해서는 데이타세트 유전자로부터 제거한다. 표준편차 (SD)의 강도를 기본으로 한, 제2의 필터를 무감독 분석에 적용하여 분석을 통하여 낮은 발현 변화를 나타내는 유전자는 배제시킨다. SD는 log2-변형된 데이타에 대해 계산하는데, 여기서 최저값은 0.5 보다 더 큰 SD로 13,550개의 유전자/ESTs를 보유하는, 100 단위의 최소값, 즉, 배경 강도에 먼저 도달하는 값이다. 무감독 분석은 13,550개의 유전자에 대해서 16개의 ALDEFLUOR-양성, -음성 세포상에서 수행한다. 계층적 클러스터화 전에, 필터링한 데이타를 log2-변형시키고 유전자에 집중된 데이타 중위값, 유사성 계량으로 Pearson 상관관계 및 중심 결합 클러스터화를 사용하는 Cluster 프로그램(22)에 맡긴다. 결과는 TreeView 프로그램(22)을 사용하여 표시한다. ALDEFLUOR-양성 및 -음성 개체군을 구별하는 유전자를 동정하고 순위를 매기기 위하여, Mann과 Whitney U 테스트를 25,285개의 유전자/ESTs에 적용시키고 오류 발견율 (FDR, (23))을 사용하여 다중 시험 가설을 정정한다. 구별자 시그니쳐의 분류 파워는 계층적 클러스터화에 의해 샘플을 분류함으로써 설명된다. LOOCV를 적용시켜 동정된 분자 시그니쳐의 예측 정확도와 감독 분석의 유효성을 평가한다; 각 샘플을 하나씩 빼서 선형 구별 분석법 (linear discriminant analysis; LDA, (24))으로 비-배제 샘플에 대해 규정된 모델을 사용하여 분류한다.
실시간 RT-PCR
상이한 세포주로부터 ALDEFLUOR-양성 및 ALDEFLUOR-음성 개체군을 분류한 후, RNeasy Mini Kit (QIAGEN)을 사용하여 전체 RNA를 분리시켜 384개-웰 블럭 모듈과 자동화 액세서리가 장착되어 있는 ABI PRISM®7900HT 서열 검출 시스템 (Applied Biosystems)에서 실시간 정량적 RT-PCR (qRT-PCR) 검정에 이용한다. Taqman 시스템용 프라이머 및 프로브는 Applied Biosystems 웹사이트로부터 선택한다. CXCR1, FBXO21, NFYA, NOTCH2, RAD51L1 및 TBP에 대해 사용되는 PCR 프라이머 쌍의 서열 및 형광유도성 프로브는 Applied Biosystems 웹사이트상에서 입수할 수 있다 (CXCR1 검정 ID: Hs_00174146_mi; FBXO21 검정 ID: Hs_00372141_mi; NFYA 검정 ID: Hs_00953589_mi, NOTCH2 검정 ID: Hs_01050719_mi, RAD51L1 검정 ID: Hs00172522_mi, TBP 검정 ID: Hs_00427620_mi). CXCR1, FBXO21, NFYA, NOTCH2, RAD51L1의 상대적인 발현 mRNA 수준을 내부 표준 TBP 유전자에 대해 계산하여 (25)에 기재된 바와 같이, RNA의 품질과 인풋 cDNA의 양에서의 변분에 대해 정상화한다.
침입 검정
12개-웰 플레이트용 8 ㎛ 기공 폴리카보네이트 필터 삽입물이 장착되어 있는 트랜스웰 챔버 (Corning, NY)에서 3중으로 검정을 수행한다. 필터는 37 ℃에서 1시간 동안 배양시킨 DMEM/F12 중 빙냉시킨 1:6 기저막 추출물 (Matrigel, BD-Bioscience) 30 ㎕로 코팅시킨다. 혈청-유리 배지 200 ㎕중 상부 챔버에 세포를 가한다. 침입 검정을 위하여, 5000개의 세포를 Matrigel-코팅된 필터상에 씨딩하고 하부 챔버에 10% 인간 혈청 (Cambrex)이 보충된 배지 600 ㎕ 또는 IL8 (100 ng/㎖)이 보충된 배지 600 ㎕를 충전한다. 48시간 배양시킨 후, 필터의 하부면상의 세포를 광학현미경을 사용하여 계수한다. 상대적인 침입은 혈청 조건하에서 미분리된 대응하는 세포주에 대해 정상화시킨다.
렌티바이러스 감염
루시퍼라제 유전자 형질도입을 위하여, HCC1954, MDA-MB-453, 및 SUM159로부터 70% 융합성 세포를 배양 배지중 렌티바이러스 상등액 Lenti-LUC-VSVG (Vector Core, Ann Arbor, MI)의 1:3 침전 혼합물과 함께 밤새 배양시킨다. 다음날 트립신/EDTA로 세포를 배양하고 1:6의 비율로 서브배양시킨다. 접종한 지 1주 후, ALDEFLUOR 표현형에 따라 세포를 분류하고 상기 배양배지에 D-루시페린 0.0003% (Promega, Madison, WI) 2 ㎖를 가하고 장비 카메라 시스템 (Xenogen, Alameda, CA)으로 광자속 계수하여 분류된 각 개체군에서 루시퍼라제 발현을 확인한다.
심장내 접종
6주령의 NOD/SCID 마우스를 2% 이소플루오란/공기 혼합물로 마취시키고 심장의 좌심실에 Ca2+ 및 Mg2+가 결여되어 있는 멸균 듈베코의 PBS 100 ㎕중 100,000개의 세포를 주사한다. 3종의 세포주 (HCC1954, MDA-MB-453, SUM159) 각각 및 각 개체군 (ALDEFLUOR-양성, ALDEFLUOR-음성 및 비분류된 세포)에 대해, 3마리의 동물에 주사한다.
생물발광 검출
접종 전 및 접종 후 각 주에 기준치 생물발광을 평가한다. 마우스를 2% 이소플루오란/공기 혼합물로 마취시키고 PBS 중 D-루시페린 (Promega, Madison, WI) 150 ㎎/㎏의 단일 복강내 투여량을 투여한다. 이어서 D-루시페린 투여한 지 6분 후 동물을 다시 마취시킨다. 광자속 계수의 경우, 전하-커플링된 장비 카메라 시스템 (Xenogen, Alameda, CA)을 노즈-콘 이소플루오란 운반 시스템과 함께 함께 사용하고 체온을 유지하기 위하여 스테이지를 가열한다. Xenogen 영상화 시스템이 제공되는 Living Image 소프트웨어를 사용하여 노출 2 내지 12분 후 결과를 분석한다. 시그날 강도는 데이타 포스트프로세싱 중 수동식으로 배치된 당해 균일 영역내에서 검출된 모든 광자속 계수의 합으로 정량화한다. 정상화된 광자속은 접종 후에 매주 검출된 광자속과 접 종전에 검출된 광자속의 비율을 의미한다.
통계학적 분석
각 그룹에 대해 적어도 3회 반복된 각 실험에 대한 평균±SD로 결과를 표시한다. 통계학적 분석은 SPSS 소프트웨어 (version 10.0.5)를 사용한다. 샘플 그룹과 분자 매개변수 간의 상관관계는 Fisher's exact test 또는 독립 샘플의 경우 원-웨이 ANOVA를 사용하여 계산한다. p-값 *0.05는 유효한 것으로 인정한다.
대다수의 유방 세포주는 ALDEFLUOR-양성 개체군을 함유한다.
ALDEFLUOR 검정법 (17)을 사용하여 다양한 분자 서브타입과 유방암 (20)의 특징을 나타내는 33개의 BCLs로부터 CSC를 분리시킨다. 33개의 세포중 중 23개가 0.2%에서 거의 100% 범위로 ALDEFLUOR-양성 세포 개체군을 함유하는 것으로 밝혀졌다. 모두 16개의 기저/간엽조직 BCLs가 ALDEFLUOR-양성 개체군을 함유하는 반면, 12개의 루미날 BCLs 중 7개가 검출가능한 ALDEFLUOR-양성 세포를 하나도 함유하지 않았다 (p=0.0006, Fischer's exact test).
ALDEFLUOR-양성 세포는 종양구 형성 능력을 갖는다.
유방의 상피 줄기 세포 및 전구 세포가 부착 비의존성 조건에서 생존하고 증식하여 맘모스피어로 명칭된 부유하는 구형 콜로니 (18)를 형성할 수 있다고 이전에 보고된 바 있다. 유방 종양, 뿐만 아니라 세포주로부터의 데이타는 암 줄기-유사 세포 또는 암-개시 세포가 또한 분리되어 유사한 검정에서 "종양구 (tumorspheres)"로 번식될 수 있는 것으로 증명되었다. 정상적인 인간의 유선에서 모든 맘모스피어-개시 세포는 ALDEFLUOR-양성 개체군 (17) 내에 포함된다. BCLs로부터 ALDEFLUOR-양성 개체군을 특성화하기 위하여, 184A1, SUM149 및 SUM159로부터 ALDEFLUOR-양성 및 -음성 개체군의 종양구 형성능력을 비교하였다. 각 세포주에서, ALDEFLUOR-양성 개체군은 ALDEFLUOR-음성 세포와 비교하여 증가된 종양구 형성 능력을 나타냈다.
ALDEFLUOR-양성 BCL 세포는 생체내에서 암 줄기 세포 특성을 갖는다.
BCL의 계층적 구조화를 결정하기 위하여, MDA-MB-453, SUM159, 및 BrCa-MZ-01 세포주의 ALDEFLUOR-양성 및 -음성 개체군의 줄기 세포 특성을 분석하였다. 이들 3종의 BCLs의 ALDEFLUOR-양성 개체군은 전체 세포 개체군의 3.54±1.73%와 5.49±3.36% 사이를 차지하였다 (도 1a 및 1b, 도 1g 및 1h; 도 2a 및 2b). 도 1f 및 1l에 나타낸 바와 같이, 종양의 크기와 종양 형성 잠복기는 주사된 ALDEFLUOR-양성 세포의 수와 상관있다. 현격하게도, MDA-AM-453으로부터 500개의 ALDEFLUOR-양성 세포와 SUM159로부터 1,000개의 ALDEFLUOR-양성 세포가 종양을 형성할 수 있었다. 종양-발생 능력은 이들 세포의 자가재생 능력 (self-renewal capacity)을 증명하는 일련의 계대를 통하여 유지된다. 대조적으로, 50,000개의 ALDEFLUOR-음성 MDA-MB-35 세포를 주사할 때 제한된 성장이 생성된다 하더라도, ALDEFLUOR-음성 세포는 종양을 발생시키지 못했다. 지방 패드 분획의 H&E 염색으로 ALDEFLUOR-양성 세포에 의해 형성된 종양은 악성 세포를 포함하는 반면, 나머지 Matrigel, 세포사멸 세포 및 마우스 조직만이 ALDEFLUOR-음성 세포 주사 부위에서 발견됨을 확인하였다 (도 1e 및 1k). 암 줄기세포 특징을 갖는 ALDEFLUOR-양성 개체군과 일치하여, 상기 개체군에 의해 발생된 종양은 유사한 비율의 ALDEFLUOR-양성 및 -음성 세포 비율로, 초기 종양의 표현형 이종성을 재현하였다 (도 1c 및 1i). 이는 ALDEFLUOR-양성 세포가 발생하는 ALDEFLUOR-양성 세포를 자가재생시킬 수 있으며, 발생하는 ALDEFLUOR-음성 세포를 분화시킬 수 있음을 나타낸다.
BrCa-MZ-01 세포가 ALDEFLUOR-양성 및 -음성 성분으로 분리될 때, 둘 다 종양을 발생시킬 수 있다. ALDEFLUOR-양성 개체군에 의해 발생된 종양은 초기 종양의 표현형 이종성을 재현하는 ALDEFLUOR-양성 및 -음성 세포로 이루어져있다. 대조적으로, ALDEFLUOR-음성 세포에 의해 발생된 종양은 ALDEFLUOR-음성 세포만을 함유하는 종양을 천천히 성장시켰다. 연속적으로 이식될 ALDEFLUOR-양성 세포의 능력과는 대조적으로, ALDEFLUOR-음성 종양의 연속계대는 종양 성장을 감소시키고 3회 계대후 성장이 없었다. 이는 ALDEFLUOR-음성 성분의 BrCa-MZ-01 세포는 줄기세포 특성이 있는 세포를 함유하는 반면, ALDEFLUOR-음성 세포는 제한적으로 성장시키지만 자가재생시킬 수 없는 전구 세포를 함유함을 나타내는 것이다.
ALDEFLUOR-양성 및 -음성 세포 개체군의 유전자 발현 프로파일링
상이한 BCLs로부터 분리된 ALDEFLUOR-양성 세포가 통상의 "암 줄기세포"유전자를 발현시키는지 결정하기 위하여, 8종의 BLCs (184A1, BrCa-MZ-01, HCC1954, MDA-MB-231, MDA-MB-453, SK-BR-7, SUM49, 및 SUM159)로부터 분리된 ALDEFLUOR-양성 및 -음성 세포 개체군을 Affymetrix whole-genome 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이를 사용하여 분석한다. 16개의 샘플 및 13,550개의 필터링된 유전자/ESTs에 인가된, 무감독 계층 클러스터화는 ALDEFLUOR-양성 및 -음성 개체군을 분리시키지 못했다. 대신, ALDEFLUOR-양성 및 -음성 개체군은 모세포주로 클러스터화되었다. 이는 클로날 세포주간 mRNA 전사물에서의 차이가 ALDEFLUOR-양성 및 ALDEFLUOR-음성 세포간의 차이를 대신함을 나타내는 것이다. 이는 또한 오직 제한된 수의 유전자만이 추정되는 암 줄기세포와 이들의 자손간에 차별적으로 발현됨을 제시하는 것이다.
ALDEFLUOR-양성 및 -음성 개체군을 구별하는 유전자를 결정하기 위하여, Mann 및 Whitney U 테스트를 모든 유전자, 그러나 발현 수준이 낮고 형편없는 것들, 즉, 25,285개의 프로브 세트에 적용시켰다. 이 테스트는 FDR 수정 후, ALDEFLUOR-양성 및 -음성 개체군을 구별하는, 413개의 유전자/ESTs를 확인하여 순위를 정하였다. 독특한 유전자에 대응하는 28개의 과발현된 유전자를 표 1에 나타내었으며, 가장 자주 발현이 저하된 유전자를 표 2에 나타내었다.
[표 1]
Figure pct00010
Figure pct00011

[표 2]
Figure pct00012
Figure pct00013
상기 식별 시그니쳐의 분류 파워는 413개의 차별적으로 발현된 유전자/ESTs에 대해 16개의 ALDEFLUOR-양성 및 -음성 샘플을 분류함으로써 설명되었다. 계층적 클러스터화로 16개의 샘플 중 15개가 랭크되었다 (도 2a).
줄기세포 생물학에서 역할을 하는 것으로 알려진 수많은 유전자가 NFYA, NOTCH2, PCNX, RBM15, ST3GAL3, 및 TPRXL을 포함하여, ALDEFLUOR-양성 개체군에서 상향 조절되었다 (표 1). 다른 유전자는 ARID1B, RAD51L1과 같이, 줄기세포 기능에서 추정적이거나 비특성화된 역할을 갖는 단백질, 및 케모킨 수용체 CXCR1/1L8RA (27)를 암호화한다. ALDEFLUOR-양성 개체군에서 발현이 저하된 유전자는 세포 분화, 세포사멸, RNA 스플라이싱, 및 미토콘드리아 대사에 연루되어 있다.
분석의 설득력을 증가시키기 위하여, Mann 및 Whitney 분석의 역치를 0.5 위험도로 상승시켰고 ALDEFLUOR-양성 및 -음성 개체군을 구별하는 49개의 유전자/ESTs의 목록을 얻었다 (표 1-2에서 별표로 표시된 유전자). 이 목록으로, SK-BR-7을 제외하고, ALDEFLUOR-양성 세포는 모두 함께 클러스터화되었다. 이들 49개의 유전자/ESTs중에서,45개는 확인된 독특한 유전자에 대응하였으며; 이들 45개중 3개만이 ALDEFLUOR-양성 그룹에서 과발현된 반면, 42개는 발현이 저하되었다. 특성화된 과발현된 유전자는 F-box 단백질 FBXO21 및 CXCR1/IL8RA에 대해 암호화한다. 발현저하된 유전자로는 미토콘드리아 단백질 (MRPL41, MRPL42, MRPL47, MRPL54, MRPS23, IMMP1L), 및 분화 (NACA) 및 pre-mRNA 스플라이싱 인자 (LSM3, pre-mRNA 프로세싱 인자 PRPF39 및 PRPF4B)에 대해 암호화하는 것들이 있다. 위험도 0.5%에서 LOOCV (leave-one-out cross-validation)은 확인자 분자 시그니쳐의 예측 정확도를 평가했으며 샘플의 88%가 우측 클래스에서 예측되었는데 이는 "암 줄기세포 시그니쳐"가 감독 분석을 확인하는 것이다.
정량적 RT-PCR 평가로 ALDEFLUOR-양성 세포에서의 CXCR1 및 FBXO21의 시그니쳐 증가를 확인하였다. ALDEFLUOR-양성 개체군에서 과발현되는 5개의 식별 유전자 (CXCR1/IL8RA, FBXO21, NFYA, NOTCH2 및 RAD51L1)의 정량적 RT-PCR 분석을 수행하였다. 프로파일링 분석에 사용되는 3종의 세포주 (BrCa-MZ-01, MDA-MB-453, SUM159) 및 2종의 추가의 루미날 세포주 (MCF7, S68)을 ALDEFLUOR-검정법으로 분류하고 정량적 RT-PCR 분석을 위하여 ALDEFLUOR-양성 및 -음성 개체군을 별도로 가공하였다. CXCR1 및 FBXO21의 정량적 RT-PCR 발현 수준을 도 2b 및 2c에 제시하였다. 정량적 RT-PCR에 의해 측정된 유전자 발현 수준은 ALDEFLUOR-음성 개체군과 비교하여 ALDEFLUOR-양성 개체군에서 CXCR1 및 FBXO21 mRNA 수준의 증가로 DNA 마이크로어레이를 사용하여 수득한 결과를 확인해 주었다 (p<0.05).
IL8은 암 줄기세포 자가-재생을 촉진한다.
프로파일링 연구로 IL8 수용체 CXCR1/IL8RA가 ALDEFLUOR-양성 세포 개체군에서 지속적으로 발현되는 것으로 나타났다. 이런 연관성을 확인하기 위하여, CXCR1/IL8RA의 단백질 발현을 ALDEFLUOR-양성 및 -음성 개체군에서 유세포분석기로 측정하였다. 4개의 상이한 세포주로부터 ALDEFLUOR-양성 및 -음성 개체군을 FACS로 분리하여, 고정시키고, 피코에리트린으로 표지시킨 CXCR1 모노클로날 항체로 염색한다. 도 3a에 나타낸 바와 같이, ALDEFLUOR-양성 세포가 ALDEFLUOR-음성 개체군과 비교하여 CXCR1-양성 세포에서 고농도이다.
IL8 신호가 줄기세포 기능에서 중요한지 결정하기 위하여, 4개의 BCLs를 인간 재조합 IL8로 처리하여 종양구 형성 및 ALDH 효소 활성에 의해 측정된 바와같은 암 줄기세포 개체군에 대한 이의 효과를 측정한다. 도 3b에 나타낸 바와 같이, IL8을 첨가하면 1차 및 2차 종양구의 형성이 투여량-의존성 방식으로 증가되었다. 또한, IL8은 분석된 4개의 BCLs 각 각에서 투여량-의존성 방식으로 ALDEFLUOR-양성 개체군을 증가시켰다 (도 3c). 이는 줄기세포 기능에 있어서 역할할 수 있는 경로를 확인하는 "CSC 시그니쳐"의 파워를 설명한다.
IL8/CXCR1 축은 암 줄기세포 침입에 연루되어 있다.
IL8/CXCR1 축은 암 줄기세포 침입에서 역할을 하는 것으로 보고된 바 있다 (28,29). 유인물질로서 혈청을 사용하여, Matrigel 침입 검정법을 이용하여 3종의 상이한 세포주 (HCC1954, MDA-MB-453, SUM159)로부터 ALDEFLUOR-양성 및 -음성 세포 개체군의 침입 능력을 조사한다. 도 4a에 나타낸 바와 같이, ALDEFLUOR-양성 세포는 ALDEFLUOR-음성 개체군보다 Matrigel을 통한 침입이 6- 내지 20-배 더 높은 것으로 증명되었다 (p<0.01). 화학-유인물질로서 사용되는 경우 IL8 (100 ng/㎖)은 ALDEFLUOR-양성 세포의 침입을 증가시켰다 (p<0.05)(도 4a). ALDEFLUOR-양성 세포에 대한 이의 효과와는 대조적으로, IL8이 ALDEFLUOR-음성 세포의 침입 능력에 대해서는 전혀 효과가 없었다. 이들 결과는 암 줄기세포가 침입 행위를 나타내고 또한 IL8은 이런 과정을 용이하게 한다는 것을 나타낸다.
ALDEFLUOR-양성 세포는 전이 가능성을 증가시켰다.
CSCs가 암 전이에 있어서 결정적인 역할을 한다고 제안된 바 있다 (30,31). 상기 실험으로 ALDEFLUOR-양성 세포는 ALDEFLUOR-음성 세포와 비교하여 침입 능력을 증가시킨다는 것이 증명되었다. ALDEFLUOR-양성과 전이능력간의 관계를 결정하기 위하여, HCC1954, MDA-MB-453, 및 SUM159를 루시퍼라제 렌티바이러스 수용체 시스템으로 감염시킨다. ALDEFLUOR 검정법을 사용하여 루시퍼라제-감염된 세포를 분류하고 심장내 주사에 의해 NOD/SCID 마우스에 도입시킨다. 각 개체군으로부터 100,000개의 세포의 현탁액을 주사하고 생체발광 영상화에 의해 전이를 평가한다. ALDEFLUOR-양성 세포를 접종한 마우스는 상이한 부위에서 전이를 발달시켰으며 마우스 당 1개 미만의 전이를 발달시키는, 비분리된 세포로 접종한 마우스, 또는 단지 가끔 림프절로 제한된 전이를 발달시키는, ALDEFLUOR-음성 세포로 접종한 마우스보다 더 높은 광자속 방출을 나타냈다 (도 4b 내지 4j). 조직학적 부분은 이들 부위에서의 전이의 존재를 확인해주었다 (도 4k 내지 4m). 따라서, BCLs의 전이 능력은 ALDEFLUOR-양성 개체군에 포함된 CSCs에 의해 주로 매개된다.
종양이 CSCs에 의해 주도되는 세포 체계로 구조화된다는 가설은 암 생물학에 대한 기본적인 결과 뿐만 아니라 암의 조기 검출, 예방 및 치료에 대한 임상적 결과를 갖는다. CSCs에 대한 증거는 원발성 및 조기 계대 이종이식편 모델에 크게 의존하였다 (32-34). 그러나, 유방암 이종이식편을 확립하는데 있어서의 성공은 특정 분자 서브타입에 대해 특히 낮았다. 원발성 종양과는 대조적으로, 세포주는 비제한된 양으로 입수가능하며 정상적인 조직과 간충직 없이 분자 분석용 암성 개체군만을 제공한다. 유방암에서, 많은 수의 불멸화 세포가 생성되는데, 이는 원발성 인간의 유방암에서 발견되는 상이한 분자 서브타입을 나타낸다 (2, 20). 그러나, 이들 세포주가 어떻게 인간 유방암의 생물학을 가깝게 재현할 수 있는가와 같은 기본적인 의문이 남아있다.
세포주에서 줄기세포에 대한 생체내 증거
최근의 연구는 세포주가 클론으로 유도될 수 있지만, 이들이 다른 상태의 세포 분화를 나타내는 세포 계층을 함유한다고 제안한 바 있다. 몇몇 연구에서 유방암 세포주내의 CSC를 동정하기위하여 CD44+/CD24-와 같은 마커를 이용하였다. 그러나, 빈번하게도 세포주내의 대부분의 세포가 이들 추정적인 줄기세포 마커를 발현시키는 것으로 관찰되어 이들 이용이 제한된다. 예를 들어, 기저 유방암 세포주내 세포의 90% 이상이 CD44+/CD24- 표현형을 나타낸다. 사실, CD44+/CD24- 표현형은 이들 세포주의 발암성 개체군을 분리하지 않았다 (Ginestier et al. Cell Stem Cell 1:555-567, 본 명세서에서 전문 참고로 인용). 세포주로부터의 SP를 사용하는 다른 방안이 있었다. 그러나, Hoechst 염색법을 이용하는 기능적 연구는 이들 제제(35)의 독성으로 제한된다. 또한 기능성 줄기세포 활성이 SP(36)내에 포함되어 있지 않다는 증거가 있다. ALDEFLUOR 검정법에 의해 평가된 ALDH 활성은 여러 가지 암으로부터 줄기세포 특성을 갖는 세포를 분리한다 (14,37). 이 실시예에서, 33개의 BCLs (주로 기저 세포주)중에서 23개가 ALDEFLUOR-양성 개체군을 함유하는 것으로 증명되었다. 일부 루미날 BCLs에서 ALDEFLUOR-양성 개체군이 결여되어 있는 것은 이들 루미날 BCLs가 ALDEFLUOR-음성 전구 세포로부터 유래되는 것을 나타낼 수 있다.
이 실시예는 NOD/SCID 마우스에서의 생체내 검정법을 이용하여 ALDEFLUOR-양성 개체군의 줄기세포 특성을 증명하였다. 자가재생 (self-renewal)은 NOD/SCID 마우스에서의 연속계대에 의해 증명되었으며 분화는 ALDEFLUOR-음성이 아닌 ALDEFLUOR-양성 세포의, 초기 종양의 세포 이종성을 재생시키는 능력에 의해 증명되었다.
유방암 줄기세포 시그니쳐
8개의 유방암 세포주를 이용하여, 본 실시예에서 413개의 유전자를 동정하였는데, 이들의 발현은 ALDEFLUOR-양성 및 -음성 세포를 구분한다. 이 시그니쳐는 줄기세포 생물학에서 역할을 하는 것으로 알려진 수많은 유전자를 포함하였다. ALDEFLUOR-양성 개체군에서 과발현된 유전자는 유방 줄기세포의 자가재생 및 분화를 조절하는, Notch 동족체2 (NOTCH2)(18,38), 줄기세포의 자가재생 및 분화를 조절하는 것으로 알려진 NFYA (39,40), 조혈모세포에서 다면발현성 역할을 하며 (41) NOTCH 신호를 통하여 골수 분화에 영향을 주는 (42), 파카넥스 (pecanex) 동족체 PCNX,RBM15/OTT, 배아 발달에 관련된 homeobox-유사 인자 TPRXL, 태아 발달 및 신장 및 위 암발생과 연관된, 단계-특이적 배아 항원-4-신타제에 대해 암호화하는 ST3GAL3 (43)을 포함한다. 현저하게도, 단계-특이적 배아 항원-4-단백질 (SSEA-4)는 인간 제대혈 및 잠복기 유방 줄기세포에서 CXCR4+/CD133+/CD34+/lin-줄기세포와 같은 줄기세포 개체군을 발현시킨다 (44).
ALDEFLUOR-양성 개체군에서 발현이 저하된 유전자는 세포 분화, 세포 사멸, 및 미토콘드리아 산화에 연루되어 있다. 이들은 발생기 폴리펩티드-관련 복합체 알파 서브유니트 NACA, 프로그램된 사멸 단백질 PDCD5 및 PDCD10, BCL2 및 카스파제를 경유하여 P53-의존적 및 독립적 방식을 통하여 세포사멸을 유도하는, 미토콘드리아 리보좀 단백질 L41 (MRPL41), 및 산화적 포스포릴화 (NDUFA2, ATP5J2, IMMP1L) 및 미토콘드리아에서 단백질 합성 (MRPL42, MRPL47, MRPL54, MRPS23)과 같은 미토콘드리아 공정과 관련된 단백질에 대해 암호화하는 유전자를 포함한다. CSCs에서 세포사멸성 유전자의 하향조절은 방사선치료 및 화학요법 (45,46)에 대한 이들 세포의 내성에 있어서 역할을 할 수 있다. ALDH1A1이 ALDEFLUOR-양성 시그니쳐에서 차별적으로-발현된 유전자로 확인되지 않았다. 그러나, 각각의 BCLs의 유전자 발현 프로필의 조사로 비록 일부가 ALDEFLUOR-양성 개체군에서 ALDH1A1의 차별적인-발현을 나타냈지만, 다른 것들은 이 환자군에서 상이한 ALDH isoform인, ALDH1A3의 차별적인-발현을 나타낸 것으로 밝혀졌다. 이는 상이한 ALDH 이소폼(isoform)의 발현이 ALDEFLUOR-양성 표현형에 기인할 수 있음을 나타내는 것이다.
케모킨에서 "스테모킨"까지
IL8에 대한 수용체인 CXCR1의 발현은 다양한 암에서 증가된다 (47-50). 비록 IL8 발현이 ER-음성 유방암 (51)과 관련있지만, 상기 케모틴은 줄기세포 기능에서 역할을 하는 것으로 먼저 보고된 바 없다. 성장 및 전이의 조절에 있어서 이의 관계는 안드로겐-독립성 전립선암(52)에서 잘 확립되어 있다. 또한, IL8의 발현 수준은 VEGF 생산 및 신생혈관형성 (53,54)을 통해 종양형성능 및 전이와 관련되어 있다. 유전자 발현 데이타는 3가지 방법으로 입증되었다. 첫째, 정량적 RT-PCT 분석법으로 프로파일링 분석에 포함되는 것과 포함되지 않는 것 둘다의 세포주로부터 ALDEFLUOR-양성 개체군에서 CXCR1 mRNA의 확실한 증가를 확인하였다. 둘째, 유세포분석기를 사용하여 CXCR1-함유 세포가 ALDEFLUOR-양성 개체군내에서만 발견됨을 증명하였다. 셋째, 재조합 IL8이 맘모스피어 형성 및 BCLs중 ALDEFLUOR-양성 세포의 퍼센트를 증가시켰다. 따라서 IL8/CXCR1 측은 유방 줄기세포 증식 또는 자가재생을 조절하는 것 같다. 내피 및 간세포가 IL8을 분비하기 때문에 이 케모킨은 종양 줄기세포와 종양 미세환경간의 상호반응을 매개하는데 있어서 역할을 하는 것 같다.
최근의 연구는 CSCs의 조절에 있어서 인터류킨/케모킨 (55,56)에 대한 역할을 제시한 바 있다. 이는 유방 CSCs에서 IL6 및 결장 CSCs의 화학내성을 중재하는데 있어서의 IL4 (56-59)에 대한 역할을 포함한다. 이들 인자는 종양과 암 사이의 연관관계에 연루되어 있을 수 있다. 이는 또한 중간엽 줄기세포에 의해 분비되며, 파라크린 인자로 작용하고 유방암 세포 운동성, 침입 및 전이를 향상시키는, CCL5 (RANTES)에 대한 역할을 포함한다 (55).
전이의 뿌리
CSCs는 종양 전이를 중재하는데 관여할 수 있다. CSC와 전이 간의 연결은 먼저 형질전환 마우스의 전립선암 모델 및 암 환자에서 전이성 및 원발성 종양의 비교 프로파일을 사용하여 발생시킨 11-유전자 시그니쳐에서의 줄기세포 유전자의 동정으로 제시되었다 (60). 상기 시그니쳐는 또한 질병 재발, 치료후 사망 및 여러 가지 암 타입에서의 원위부 전이의 강력한 예측변수이다. 이 실시예는 ALDEFLUOR-양성 세포가 ALDEFLUOR-음성 세포 보다 더욱 전이성이며 이미 종양 전이에 있어서 역할을 하는 것으로 보고된, IL8은 IL8 수용체 CXCR1을 우선적으로 발현시키는 암 줄기세포의 침입 및 주화성을 촉진함을 증명하였다. 세포주로부터 전이성 암 줄기세포를 분리시키는 능력은 암 줄기세포가 종양 전이를 매개하도록 하는 분자 메카니즘의 연구를 용이하도록 하여야 한다.
실시예 2
CXCR1 억제 및 병용요법
본 실시예는 종양 세포에 대한 CXCR1 억제 효과를 시험하는데 사용되는 여러가지 방법, 뿐만 아니라 CXCR1 억제를 세포분열저지제 (도세탁셀; docetaxel)과 함께 병용하는 것을 기술한다.
SUM159 세포주의 세포 성장 및 ALDEFLUOR-양성 개체군에 대한 CXCR1 억제 효과
SUM159 세포주를 부착 조건하에서 배양하여 세포를 CXCR1/CXCR2 억제제 레퍼탁신 또는 CXCR1 또는 CXCR2에 대한 2종의 특이적 차단 항체를 사용하여 처리한다. 처리 4일 후, 세포 성장에 대한 효과를 MTT 검정법을 사용하여 분석하고 (도 5a) 암 줄기세포 환자화에 대한 효과는 ALDEFLUOR 검정법을 사용하여 분석한다 (도 5b). 레퍼탁신 또는 CXCR1 차단 항체로 처리한 세포에서는 세포 성장의 95% 이상이 억제되는 것으로 관찰되는 반면, CXCR2 차단 항체로 처리한 세포에 대해서는 효과가 관찰되지 않았다 (도 5a). 흥미롭게도, 각각 레퍼탁신 및 CXCR1 차단 항체로 처리한 세포군에서 ALDEFLUOR-양성 개체군의 80% 및 50%가 감소된 ALDEFLUOR-양성 개체군에서 유사한 효과가 관찰되었다 (도 5b).
레퍼탁신 처리는 FAS/FAS 리간드 신호에 의해 매개된 방관자효과를 유발한다.
SUM159 세포주 세포를 부착 조건하에서 배양한 다음 레퍼탁신 단독으로 또는 FAS 길항제와 함께 처리한다. 흥미롭게도, 레퍼탁신 처리에 의해 유발된 세포 성장 억제가 FAS 길항제 (BD pharmingen으로부터의 항/Fas-리간드 (cat#556371))의 첨가로 부분적으로 복구되었다. 또한, FAS 효능제로 처리한 세포는 레퍼탁신으로 처리된 세포에서 보다 유사한 세포 성장 억제를 나타냈다. 이들 결과는 레퍼탁신 처리가 FAS/FAS 리간드 신호에 의해 매개되는 방관자효과를 유발함을 나타내는 것이다.
FAK, AKT 및 FOXOA3 활성화에 대한 레퍼탁신 처리 효과
CXCR1 다운스트림 신호에 대한 레퍼탁신 처리 효과를 평가하기 위하여, SUM159 세포를 100 nM의 레퍼탁신 부재 또는 존재하에 부착 조건하에서 2일간 배양시키고 p-FAK, p-AKT, 및 FOXOA3에 대한 항체로 면역형광 염색한다. 비-처리 세포에서는 (도 7a), p-FAK를 발현하는 세포의 30% 및 p-AKT를 발현하는 세포의 10%가 불활성화를 나타내는 반면, 레퍼탁신으로 처리된 세포는 p-FAK 및 p-AKT의 완전 불활성화를 나타내는 것으로 검출되었다 (도 7b). 비-처리 SUM159 세포는 FOXOA3에 대한 세포질에서 세포의 80%가 양성인 것으로 나타났다. 흥미롭게도, 레퍼탁신으로 처리된 SUM159 세포는 FOXOA3에 대한 핵에서 세포의 80%가 양성인 것으로 나타났다. 세포질에서 핵까지 FOXOA3 세포 위치에서의 변화는 FOXOA3 단백질의 활성화를 나타낸다.
레퍼탁신, 도세탁셀 또는 병용 처리에 따른 종양 성장 곡선
레퍼탁신, 도세탁셀 또는 이들의 병용 효과는 1개의 유방암 세포주 (8A, SUN159) 및 상이한 환자로부터 발생된 3개의 인간 유방암 이종이식편 (8B, MC1; 8C, UM2; 및 8D, UM3)을 사용하여 평가한다. 각 샘플에 대해, 50,000개의 세포를 종양 크기에 대해 모니터하는 NOD-SCID 마우스의 유방 지방 패드에 주사한다. 종양 크기가 약 4 ㎜일 때 주사를 시작한다. 레퍼탁신은 28일간 일일 2회 주사하거나 (15 ㎎/㎏) 1주에 1회 주사하고, 도세탁셀은 복강내 주사하거나 (10 ㎎/㎏), 함께 (레퍼탁신/도세탁셀) 사용한다. 도 8은 각가의 표시된 처리 전 및 도중의 종양 크기를 나타낸다 (화살표, 처리 시작). 도세탁셀 단독으로 또는 레퍼탁신/도세탁셀 병용 처리되었을 때 대조군과 비교하여 종양 크기가 통계학적으로 유효한 (p<0.01) 감소를 나타낸 각 샘플에 대해 (SUM159, MC1, UM2, UM3) 유사한 결과가 관찰된 반면, 대조군 종양 및 레퍼탁신으로 처리된 종양의 성장 간에는 유효한 차이가 관찰되지 않았다.
ALDEFLUOR 검정에 의해 평가된 바와 같은 암 줄기세포 개체군에 대한 레퍼탁신, 도세탁셀 또는 병용 처리 효과
ALDH 활성은 레퍼탁신, 도세탁셀 또는 병용 처리된 각 종양 (9a, SUM159, 9b, MC1, 9c, UM2, 9d, UM3)에서 암 줄기세포 개체군 크기를 분석하기 위한 ALDEFLUOR 검정법으로 평가하였다. 각 샘플에 대해 유사한 결과가 관찰된다. 도세탁셀 처리된 종양 이종이식편은 대조군과 비교하여 유사한 또는 증가된 퍼센트의 ALDEFLUOR-양성 세포를 나타낸 반면, 레퍼탁신 단독 처리 또는 도세탁셀과의 병용 처리된 경우에는 대조군과 비교하여 암 줄기세포가 65% 내지 85% 미만으로 ALDEFLUOR-양성 세포에서 통계학적으로 유효한 감소를 나타냈다 (p<0.01).
제2의 마우스에서 이식에 의해 평가된 바와 같은 암 줄기세포 개체군에 대한 레퍼탁신, 도세탁셀 또는 병용 처리 효과
비처리 (대조군) 및 레퍼탁신, 도세탁셀 또는 병용 처리된 원발성 종양으로부터 수득한 세포의 일련의 희석액 (10a, SUN159, 10b, MC1, 10c, UM2, 10d, UM3)을 제2의 NOD-SCID 마우스의 유방 지방 패드에 이식한다. 대조군과 도세탁셀 처리된 원발성 종양은 모든 희석액에서 제2의 종양을 형성한 반면, 레퍼탁신 또는 도세탁셀과의 병용 처리된 원발성 종양은 더 높은 농도에서만 대조군 또는 도세탁셀 처리된 종양에서보다 현격하게 더 작은 제2의 종양을 지연되게 형성할 수 있었다 (p<0.01). 또한, 병용 처리된 1차 세포 중 1000개 및 100개가 4종의 샘플중 3종에 대해 (SUM159, UM2, UM3) 제2의 종양을 형성하는데 실패했다.
레퍼탁신 처리는 SUM159 세포주의 전이성을 감소시킨다.
SUM159 세포주를 루시퍼라제를 발현하는 렌티바이러스로 감염시키고 NOD/SCID 마우스의 심장에 250,000개의 루시퍼라제 감염된 세포를 접종한다. 마우스를 두 그룹으로 나눈다. 두 그룹의 마우스를 28일간 일일 2회, 염수 용액 피하 주사액 또는 레퍼탁신의 피하주사액 (15 ㎎/㎏)으로 심장내 주사한 지 12시간 후 처리한다. 전이 형성은 생체발광 영상법으로 모니터한다 (11b: 염수 용액으로 처리된 마우스; 11c: 레퍼탁신으로 처리된 마우스). 접종 후 주 단위로 측정되어 정상화되는 양자속의 정량화로 레퍼탁신으로 처리된 마우스 그룹과 비교하여 염수 용액으로 처리된 마우스 그룹에서 전이 형성에 있어서 통계학적으로 유효한 증가가 있는 것으로 밝혀졌다 (11a).
실시예 3
CXCR1 블록케이드에 의한 암 줄기세포의 처리
본 실시예는 시험관내 및 마우스 모델 둘 다를 통한, 종양 세포에 대한 CXCR1 억제 효과를 증명한다.
유방 조직의 분리
유방축소수술로부터의 정상적인 유방 조직 100 내지 200 g을 수술용 메스로 다진 다음, 효소적으로 분리하고, 단일 세포를 현탁액으로 배양하여 맘모스피어를 발생시키거나 부착 상태의 콜라겐 기층상에서 세포 분화를 유발시킨다 (Dontu et al. Genes Dev. 17:1253-1270., 본 명세서에서 참고로 전문 인용됨).
세포 배양
유방암 세포주를 권장되는 배양 조건을 사용하여 성장시킨다 (Charafe-Jauffret et al. Cancer Res. 69:1302-1313., 본 명세서에서 참고로 전문 인용됨). 유방암 세포주를 부착 상태로 레퍼탁신 (Sigma-Aldrich), 항-인간 CXCR1 마우스 모노클로날 항체 (Clone 42705, R&D systems), 항-인간 CXCR2 마우스 모노클로날 항체 (Clone 48311, R&D systems), FAS 신호 효능제로 이용되는 항-인간 CD95 마우스 모노클로날 항체 (Clone DX2, BD Pharmingen), FAS 신호 길항제로 이용되는 항-인간 FAS-리간드 마우스 모노클로날 항체 (Clone NOK-1, BD Pharmingen), 또는 도세탁셀 (Taxotere, Sanofi-Aventis)과 함께 처리한다.
세포 생존력
MTT 검정법의 경우, 세포를 부착 상태로 96개-웰 플레이트에 웰 당 5,000개의 세포로 플레이팅한다. 1일 후, 레퍼탁신 처리를 시작한다. 세포 생존력에 대한 레퍼탁신 처리 효과는 각 웰에 20 ㎕의 MTT 용액 (PBS중 5 ㎎/㎖)을 첨가하여 상이한 시점에서 평가한다. 이어서 세포를 37 ℃에서 1시간 동안 배양시킨 다음 각 웰에 50 ㎕의 DMSO를 가한다. 형광판 판독기 (Spectrafluor, Tecan)에서 560 ㎚에서의 흡광도를 측정한다. TUNEL 검정법의 경우, 세포를 부착 상태로 96개-웰 플레이트에 웰 당 50,000개의 세포로 플레이팅한다. 1일 후, 레퍼탁신 처리를 시작한다. 처리 4일 후 사멸 세포의 수를 평가한다. 세포를 3.7% 포름알데히드에 고정시키고 TACS TdT 키트 (R&D systems)를 이용하여 염색한다. 핵을 DAPI/안티페이트 (Invitrogen)으로 계수염색한다. 형광 현미경 (Leica, Bannockborn, IL, USA)으로 섹션을 조사하면 사멸 세포는 녹색으로 검출된다.
ALDEFLUOR 검정법
ALDEFLUOR 키트 (StemCell technologies)를 사용하여 ALDH 효소 활성이 높은 개체군을 분리하는데, 전술한 바와 같이 (Ginestier et al. Cell Stem Cell 1:555-567., 본 명세서에서 전문 참고로 인용됨) FACStarPLUS (Becton Dickinson)을 사용한다. 마우스 기원의 세포를 이종이식된 종양으로부터 제거하기 위하여, 세포 개체군을 항-H2Kd 항체 (BD biosciences, 1/200, 빙상에서 20분)로 염색한 다음 피코에리트린 (PE)으로 표지시킨 2차 항체로 염색한다 (Jackson labs, 1/250, 빙상에서 20분).
ELISA 검정법
레퍼탁신으로 처리 또는 비처리된 세포의 배양 배지에서 분비된 가용성 FAS-리간드 수준을 측정하기 위하여, 인간 sFAS Ligand Elisa (Bender Medsystems)를 이용한다. 1차 파장으로서 450 ㎚를 사용하여 분광 광도계상에서 흡광도를 읽는다.
웨스턴 블롯팅 (western blotting)
세포를 laemmli 완충액에 용해시키고 SDS-폴리아크릴아미드 겔상에 부하한다. 블롯을 TBST (0.1% Tween20 및 2% BSA 함유)에 희석한 각각의 1차 항체와 4 ℃에서 밤새 또는 실온에서 2시간 동안 배양시킨다. 블롯을 세척하고 적절한 2차 항체 (GE Healthcare, UK)와 함께 배양하여 SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce)를 사용하여 검출한다.
면역염색법
면역형광성 염색을 위하여, 분류된 CXCR1-양성 세포를 95% 메탄올로 -20 ℃에서 10분간 고정시킨다. 세포를 PBS에 재수화시키고 각각의 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 배양한다. 사용되는 1차 항체는 P-FAK (1:50, Cell Signaling Technology), P-AKT (1:300, Cell Signaling Technology), 및 FOXO3a (1:250, Cell Signaling Technology)이다. 이어서 슬라이드를 세척하고 PE 접합된 2차 항체 (Jackson labs.)와 함께 30분간 배양시킨다. 핵을 DAPI/안티페이트 (Invitrogen)으로 계수염색하고 커버를 닫는다. 형광 현미경 (Leica, Bannockborn, IL, USA)으로 섹션을 조사한다. ALDH1 (1:100, BD biosciences), P-FAK, P-AKT, FOXO3a 발현의 검출을 위한 면역조직화학은 파라핀 섹션 (Ginestier et al. Am. J Pathol.161:1223-1233, 본 명세서에서 전문 참고로 인용됨)상에서 수행한다. Histostainplus 키트 (Zymed laboratories)를 이용하여 염색을 수행한다. 디아미노벤즈이딘 (DAB) 또는 3-아미노-9-에틸카바졸 (AEC)을 색소원으로 사용하고 섹션은 헤마톡실린으로 카운터염색한다.
동물 모델
ADLEFLUOR-양성/CXCR1-양성 및 ADLEFLUOR-양성/CXCR1-음성 SUM159 세포의 종양형성능은 NOD/SCID 마우스 (Ginestier et al. Cell Stem Cell 1:555-567., 본 명세서에서 전문 참고로 인용)에서 평가한다. SUM159 세포주와 상이한 3명의 환자로부터 발생시킨 3개의 원발성 인간 유방암 이종이식편 (MC1, UM2, UM3)을 사용하여 종양 성장에 대한 레퍼탁신 처리의 효과를 측정한다 (Ginestier et al. Cell Stem Cell 1:555-567., 본 명세서에서 전문 참고로 인용). 이들 종양으로부터 세포를 시험관내 배양시키지 않고, NOD/SCID 마우스의 인간화되고 정화된 지방-패드에 동소적으로 이식한다. 지방 패드는 상술한 바와 같이 제조한다 (Ginestier et al. Cell Stem Cell 1:555-567., 본 명세서에서 전문 참고로 인용). 각각의 이종이식물로부터 50,000개의 세포를 상기 NOD/SCID 마우스의 인간화된 지방 패드에 주사하고 종양 성장을 모니터한다. 종양 크기가 대략 4 ㎜가 되었을 때, 레퍼탁신 단독 (피하, 15 ㎎/㎏, 일일 2회, 28일간), 도세탁셀 단독 (복강내, 10 ㎎/㎏, 주 1회, 4주간), 병용 (레퍼탁신/도세탁셀) 처리, 또는 염수(복강내, 주1회 및 피하 일일 2회, 28일간)를 주사한 대조군을 개시한다. 종양의 최대 직경이 대략 1.5 ㎝일 때, 종양 괴사를 피하고 연구시 척추동물 사용에 대한 규제조건에 따라 동물을 마취시킨다. 주사한 각 지방 패드 섹션을 포르말린에 고정시키고 조직학적 분석을 위하여 파라핀에 박아넣는다. 나머지 종양 세포는 제2의 NOD/SCID 마우스에 다시 이식한다. 세포의 일련의 희석액을 이용하여 각각의 처리된 종양에 대해 10,000개, 1,000개, 및 100개의 세포를 주사하여 다시 이식한다.
부착 비의존성 배양
부착 조건으로, 레퍼탁신 (100 nM), 항-CXCR1 항체 (10 ㎍/㎖), 또는 항-CXCR2 (10 ㎍/㎖)로 처리한 BCLs를 분리하여 단일 세포로서 초저 부착 플레이트 (Corning, Acton, MA)에 낮은 밀도로 (5,000개의 생존성 세포/㎖) 플레이팅한다. 세포를 상술한 바와 같이 성장시킨다 (Charafe-Jauffret et al. Cancer Res. 69:1302-1313, 본 명세서에서 전문 참고로 인용). 제1 종양구를 분리시킨 다음 배양물을 초저 부착 플레이트에 5,000개의 생존성 세포/㎖의 밀도로 플레이팅한다. 종양구를 형성할 수 있는 세포의 능력은 1차 (제1 종양구) 및 2차 (제2 종양구) 계대 후 정량한다.
RNA 추출 및 qRT-PCR
SUM159 세포를 처리한 후, RNeasy Mini Kit (QIAGEN)을 사용하여 전체 RNA를 분리하고 실시간 정량적 RT-PCR (qRT-PCR) 검정을 위하여 ABI PRISM®7900HT 서열 검출 시스템에 이용한다. Taqman 시스템용 프라이머와 프로브는 Applied Biosystems 웹사이트로부터 선택한다 (www.appliedbiosystems.com)(FAS-Ligand 검정 ID: Hs_00899442_mi; IL8 검정 ID: Hs_00174103_mi, TBP 검정 ID: Hs_00427620_ mi). FAS-리간드와 IL8의 상대적인 발현 mRNA 수준을 상술한 바와 같이, 내부 표준 TBP 유전자에 대해 평가하여 RNA 품질과 투입된 cDNA의 양에서의 변동에 대해 정상화시킨다 (Ginestier et al. Clin. Cancer Res. 12:4533-4544, 본 명세서에서 전문 참고로 인용).
유세포분석기 분석
CD44/CD24/Lin 염색을 수행한다 (Ginestier et al. Cell Stem Cell 1:555-567., 본 명세서에서 전문 참고로 인용됨). CD95/FAS 염색은 항-CD95 표지된 APC (1:20, BD biosciences)를 이용하여 수행한다. CXCR1 및 CXCR2 염색의 경우, 1차 항체 항-CXCR1 (1:100, Clone 42705, R&D systems) 및 항-CXCR2 (1:100, clone 48311, R&D systems)로 염색한 다음, 이어서 PE로 표지시킨 2차 항체 항-마우스 (희석액 1:250, Jackson Labs.)로 염색한다. 신선한 세포를 PI (Sigma) 1 ㎍/㎖로 5분간 생존력을 위하여 염색한다.
바이러스 감염
2개의 상이한 렌티바이러스 작제물을 각각 루시퍼라제 유전자의 발현 (Lenti-LUC-VSVG) (Charafe-Jauffret et al. Cancer Res.69:1302-1313., 본 명세서에서 전문 참고로 인용됨) 및 억제 PTEN 발현 (Lenti-PTEN-SiRNA-DsRed)(Korkaya et al. PLoS Biolog. 7:e1000121., 본 명세서에서 전문 참고로 인용됨)을 위하여 제조한다. 모든 렌티바이러스 작제물은 미시건 대한 벡터 (the University of Michigan Vector)로 제조한다. FAK의 과발현을 위한 아데노바이러스 작제물 (Ad-FAK-GFP)을 또한 이용한다 (Luo et al. Cancer Res.69:466-474., 본 명세서에서 전문 참고로 인용됨). 다른 벡터에 의한 세포 감염은 상술한 바와 같이 수행한다 (Charafe-Jauffret et al. Cancer Res.69:1302-1313., 본 명세서에서 전문 참고로 인용됨). 감염 효율은 DsRed 또는 GFP 발현 세포의 퍼센트를 측정함으로써 확인된다.
심장내 접종
6주령의 NOD/SCID 마우스를 2% 이소플루오란/공기 혼합물로 마취시키고 심장의 좌심실에 Ca2+ 및 Mg2+가 결여되어 있는 멸균 Dulbecco's PBS 100 ㎕ 중 250,000개의 세포로 주사한다. 3개의 세포주 (HCC1954, MDA-MB-453, 및 SUM159) 및 각각의 처리 (염수 또는 레퍼탁신)에 대해 6마리의 동물을 주사한다. 심장내 주사한 지 12시간 경과 후, 마우스에게 일일 2회 레퍼탁신 또는 대조용 염수를 주사하기 시작한다.
생물발광 검출
접종 전 기준 생물발광을 평가하고 1주 후 접종한다. 생물발광 검출 공정은 상술한 바와 같이 수행한다 (Charafe-Jauffret et al. Cancer Res.69:1302-1313., 본 명세서에서 전문 참고로 인용됨). 정상화된 광자속은 접종 후 각 주 검출된 광자속과 접종 전 검출된 광자속의 비를 나타낸다.
CXCR1 발현은 암 줄기세포 개체군을 다시 세분한다.
암 줄기세포 (CSC)를 조절하는 신호 경로를 확인함으로써 세포 개체군에서 잠재적인 치료 표적을 제공한다. 유방 CSC 조절 경로에 잠재적으로 연루되어 있는 수개의 유전자를 함유하는 유전자 발현 프로파일링을 기본으로 하는 유방 CSC 시그니쳐가 동정되었다 (Charafe-Jauffret et al. Cancer Res.69:1302-1313., 본 명세서에서 전문 참고로 인용됨). 유방 CSC 개체군에서 과발현된 유전자 중에서, 염증전 케모킨 IL-8/CXCL8에 결합하는 수용체인 CXCR1은 재조합 IL-8이 유방 CSC의 자가재생을 자극하기 때문에 유망한 후보물질인 것으로 나타났다 (Charafe-Jauffret et al. Cancer Res.69:1302-1313., 본 명세서에서 전문 참고로 인용됨). 유세포분석기를 사용하여, CXCR1 단백질 발현을 인간 유방암 세포주 HCC1954, MDA-MB-453, 및 SUM159에서의 ALDELFUOR 검정에 의해 평가되는 바와 같이 유방 CSC 개체군에서 측정한다. NOD/SCID 마우스 이종이식편중 기능성 줄기세포 특성을 갖는 세포는 ALDELFUOR-양성 개체군내에 포함된다 (Charafe-Jauffret et al. Cancer Res.69:1302-1313., 본 명세서에서 전문 참고로 인용됨). 전체 개체군의 2% 미만인 것으로 나타나는, CXCR1-양성 개체군은 거의 ALDELFUOR-양성 개체군내에만 포함된다 (도 12a 및 표 4 참조)
[표 4]
Figure pct00014
CXCR2 발현을 또한 평가한다. CXCR2는 CXCR1과 비교하여 감소된 친화성을 갖지만 IL-8/CXL8에 결합할 수 있는 수용체이다. CXCR1-양성 세포와는 대조적으로, CXCR2-양성 세포는 ALDELFUOR-양성 및 ALDELFUOR-음성 개체군에 대등하게 분포된다 (도 12a 참조). CXCR1 발현에 따라서 암 줄기세포 개체군의 계층적 구조화를 결정하기 위하여, ALDELFUOR-양성/CXCR1-양성 및 ALDELFUOR-양성/CXCR1-음성 세포 개체군을 분류하여 NOD/SCID 마우스에 주사한다 (도 13 참조). 두 세포 개체군 모두 종양을 발생시킨다. 종양 크기 동역학은 종양 형성 잠복기와 크기 및 주사된 세포의 수와 상관있다. ALDELFUOR-양성/CXCR1-양성 개체군에 의해 발생된 종양은 연속 계대 시 초기 종양의 표현형 이종성을 재구성하는 반면, ALDELFUOR-양성/CXCR1-음성 개체군은 ALDELFUOR-양성/CXCR1-음성 세포만을 함유하는 종양을 발생시킨다. 이들 결과는 CSC 세포의 계층화가 CXCR1 발현에 따라 구조화되지만, 두 세포 개체군 모두 유사한 종양형성 능력을 나타낸다는 것을 시사한다.
CXCR1 블록케이드는 시험관내 유방암 줄기세포 개체군을 감소시킨다.
3개의 상이한 세포주를 레퍼탁신 (100 nM), CXCR1/2 억제제로 처리하여 유방 CSC 개체군에 대한 CXCR1 블록케이드의 효과를 평가한다 (Bertini et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:11791-11796., 본 명세서에서 전문 참고로 인용됨). SUM159의 경우, 처리한 지 3일 후, ALDELFUOR-양성 세포 비율이 5배 감소된 것으로 나타났다 (도 12b 참조). SUM159 세포를 항-CXCR1 차단 항체로 처리 후 유사한 효과가 관찰되었다. 대조적으로, 세포를 항-CXCR2 차단 항체로 처리 후에는 효과가 전혀 관찰되지 않았는데, 이는 ALDELFUOR-양성 개체군에 대한 레퍼탁신의 효과가 CXCR1에 의해 매개됨을 나타내는 것이다.
유방암, 뿐만 아니라 세포주로부터의 데이타는 암 줄기-유사 세포 또는 암-개시 세포가 또한 현탁배양에서 "종양구"로 분리되어 번식될 수 있음을 증명한다 (Ponti et al. Cancer Res. 65:5506-5511., 본 명세서에서 전문 참고로 인용됨). 레퍼탁신 또는 항-CXCR1 차단 항체로 처리한 지 3일 후, 세포를 현탁액에서 떼어내어 배양할 때, 대조군과 비교하여 제1 및 제2 종양구 형성에 있어서 8배 감소가 관찰되었다. 반대로, 항-CXCR2 차단 항체는 종양구 형성에 대한 효과를 갖지 않는다 (도 14 참조).
놀랍게도, 레퍼탁신으로 처리한 지 5일 후 MTT 검정법으로 평가한 바 전체 세포 개체군의 생존성이 크게 감소된 것으로 관찰되었는데, 세포의 3% 만이 생존하여 남았다 (도 12c 참조). 항-CXCR1 차단 항체로 처리한 경우에도 유사한 결과가 관찰되었지만 항-CXCR2 차단 항체에서는 그런 결과가 없었으므로, 이 효과는 CXCR1 블록케이드에 대해 의존적임을 나타내는 것이다. 레퍼탁신의 상기 효과는 처리 후 3일부터 세포 생존성이 소실되어 지연되었다 (도 15a 참조). 레퍼탁신 처리로 HCC1954 유방암 세포주에 대해서 유사한 효과가 유발되는 반면, PTEN 돌연변이를 갖는 MDA-MB-453 세포에서는 효과가 관찰되지 않았다 (Hollestelle et al. Cancer Res. 5:195-201, 본 명세서에서 전문 참고로 인용됨).
TUNEL 검정법을 이용하여, 레퍼탁신 처리 4일 후 SUM159 세포를 염색하고 세포사멸로 인하여 세포 생존성이 크게 감소되는데, 사멸 세포 36%가 레퍼탁신 처리 후 관찰되었다 (도 12d 참조). 결과는 CXCR1 블록케이드가 유방 CSC 개체군을 감소시킨 다음 남아 있는 벌크 종양 개체군에서 대량의 세포사멸을 유발함을 나타낸다.
CXCR1 블록케이드는 방관자 효과를 통하여 CXCR1-음성 세포에서 세포 사멸을 유발한다.
CXCR1-양성 개체군이 전체 세포 개체군의 2% 미만이라는 사실에도 불구하고 레퍼탁신 또는 항-CXCR1 차단 항체가 대량의 세포 사멸을 유발한다는 관찰 결과는 CXCR1-양성 세포에서 CXCR1 블록케이드가 방관자 효과를 통하여 CXCR1-음성 세포 사멸을 유발함을 제시하는 것이다. 분류된 CXCR1-양성 및 CXCR1-음성 개체군을 레퍼탁신으로 처리한다 (도 12e 참조). 레퍼탁신은 3일 이내에 CXCR1-양성 개체군에서 세포 생존성을 감소시키는 반면, CXCR1-음성 개체군에서는 효과가 관찰되지 않았다. 레퍼탁신은 비분리 세포에서 대량의 세포 사멸을 유발하였다. 비분리 및 CXCR1-양성 개체군의 세포 생존성에 대한 레퍼탁신의 효과는 투여량-의존성이었다 (도 12e 참조). 이 결과는 CXCR1-양성 개체군을 표적으로 하는 레퍼탁신 처리가 마찬가지로 방관자 효과를 통하여 CXCR1-음성 세포 사멸을 유발하는 것과 일치한다.
상기 효과가 레퍼탁신에 의해 유발된 가용성 인자에 의해 매개되는지를 결정하기 위하여, 조건화된 배지를 레퍼탁신 처리 3일 후 CXCR1-양성 개체군으로부터 수집하고 3.5 KDa 배출시키는 막을 이용하여 상기 배지를 투석하여 3.5 KDa 보다 큰 분자는 남기면서 배지로부터 레퍼탁신을 제거한다. 상기 투석되고 조건화된 배지는 CXCR1-음성 및 비분리 개체군 둘 다에서 세포 생존성을 감소시키지만 CXCR1-양성 개체군에서는 그러하지 않다 (도 12f 참조). 이들 결과는 CXCR1-양성 개체군에서 CXCR1 블록케이드는 가용성 비-투석가능한 인자를 통하여 CXCR1-음성 개체군에서 세포 사멸을 유발하는 것을 증명한다. CXCR1-양성 개체군이 레퍼탁신에 대해 민감하다 하더라도 투석가능한 사멸 인자에 대한 내성이다.
CXCR1 블록케이드에 의해 유발된 방관자 효과는 FAS-리간드 /FAS 신호에 의해 매개된다.
FAS-리간드/FAS 상호반응은 유선 퇴축과 같은 상이한 생리학적 상태 또는 화학요법에 의해 유발되는 것을 포함한 조직 손상 상태에서 활성화된다 (Chhipa et al. J Cell Biochem. 101:68-79., Song et al. J Clin. Invest 106:1209-1220, 본 명세서에서 전문 참고로 인용됨). 레퍼탁신으로 처리된 SUM159의 세포의 배지 중 가용성 FAS-리간드의 수준은 ELISA 검정법을 사용하여 CXCR1 블록케이드에 의해 유발된 세포사멸성 방관자효과를 매개하는데 있어서 FAS-리간드/FAS 상호반응의 역할을 평가한다. 레퍼탁신으로 4일간 처리한 세포의 매질 중 가용성 FAS-리간드는 비-처리 세포와 비교하여 5배 이상 증가된 것으로 관찰되었다 (도 17a 참조). FAS-리간드 mRNA 수준을 측정함으로써 레피레탁신 처리에 의한 FAS-리간드의 전사적 조절을 RT-PCR로 확인하였다 (도 17b 참조). 레퍼탁신 처리된 세포에서 FAS-리간드 mRNA 수준은 비-처리 세포와 비교하여 4배 증가된 것으로 관찰되었다. FAS 신호를 활성화시키는 FAS 효능제로 처리한 후에도 유사한 결과가 관찰되었는데, 이는 FAS-리간드가 양성-피드-백 루프를 발생하는 FAS 신호의 표적임을 나타내는 것이다. 유세포분석기로 측정한 바 SUM159 세포 100%가 FAS 단백질을 발현시켰다. FAS 효능제로 SUM159 세포를 처리하면 레퍼탁신 처리로 관찰된 사멸 효과가 재현되며 세포 생존성을 대량으로 감소시켰다 (도 17c 참조). 세포 생존성에 대한 레퍼탁신 처리 효과는 항-FAS-리간드 차단 항체에 의해 부분적으로 역전되는데, 레퍼탁신 및 항-FAS-리간드 차단 항체로 처리한 후 세포의 44%가 살아있는 상태로 남아있었으나, 레퍼탁신 만으로 처리한 경우에는 3%만이 생존하였다 (도 17c 참조). 결과는 레퍼탁신에 의해 유발된 대량의 세포 사멸은 FAS-리간드/FAS 경로에 의해 매개되는 방관자효과에 기인함을 나타내는 것이다.
SUM159 세포를 FAS 효능제로 처리하면 CXCR1-양성 및 ALDEFLUOR-양성 세포의 퍼센트를 각각, 10배 및 3배 증가시킨다(도 17d, 17e 및 도 18). 두 개체군에 대한 레퍼탁신의 효과는 항-FAS-리간드에 의해 회복되지 않았는데 (도 17d 및 17e 참조), 이는 CXCR1 블록케이드에 직접적으로 감응성이며, 따라서 이들 세포에 의해 FAS-리간드 생산을 유발하는 CXCR1-양성 개체군을 함유하는 ALDEFLUOR-양성 개체군이 FAS-리간드/FAS 프로-세포사멸성 신호에 대해 내성이 있음을 제시하는 것이다. 대조적으로, ALDEFLUOR-음성 벌크 세포 개체군은 CXCR1을 발현시키지 않지만 FAS-리간드 매개된 세포 사멸에 대해 감응성이다.
FAS-리간드/FAS 신호는 유선 퇴축중에 중요한 역할을 한다 (Song et al. J Clin. Invest 106:1209-1220, 본 명세서에서 전문 참고로 인용됨). 유방축소수술로부터 수득한 사람의 정상적인 유방 상피 세포에 대한 CXCR1 블록케이드의 효과를 조사하였다. 유방암 세포주에서 관찰된 바와 같이, CXCR1-양성 정상 유방 세포는 거의 ALDEFLUOR-양성 개체군 내에만 포함된다 (도 19a 참조). IL-8 신호가 정상적인 유방 줄기/전구 기능에 있어서 중요한지 결정하기 위하여, 현탁액으로 배양한 정상적인 유방 상피 세포를 인간 재조합 IL-8로 처리하고 맘모스피어의 형성에 의해 측정되는 바와 같이 CSC 개체군에 대한 이의 효과를 측정한다 (Dontu et al. Genes Dev. 17:1253-1270, 본 명세서에서 전문 참고로 인용됨). IL-8을 첨가하면 투여량-의존성 방식으로 제1 및 제2 맘모스피어의 형성이 증가되는데 (도 19b 참조), 이는 IL-8/CXCR1 축이 정상적인 유방 줄기/전구 세포 증식 또는 자가재생의 조절에 연루될 수 있음을 제시하는 것이다. 레퍼탁신 또는 FAS 효능제로 처리할 경우, 고농도의 레퍼탁신 (500 nM)을 이용하는 경우라도, 부착 조건으로 배양된 정상적인 유방 상피 세포의 생존성에 대해 전혀 효과가 나타나지 않았다 (도 16a 참조). 그러나, 유방암 세포주의 경우에 관찰된 바와 같이, 레퍼탁신으로 처리된 정상적인 유방 상피 세포의 배지에서 가용성 FAS-리간드가 증가되는 것으로 검출되었다 (도 20b 참조). 이런 관찰은 이들 조건하에서 배양된 정상적인 상피 세포에서의 FAS 발현이 없는 것으로 설명될 수 있다 (도 20c 참조). 이는 유선에서 FAS 발현은 퇴축 과정에 이은 수유기중에만 일어나는 것을 증명하는 연구와 일치한다 (Song et al. J Clin. Invest 106:1209-1220, 본 명세서에서 전문 참고로 인용됨). 벌크 개체군의 정상적인 유방 상피 세포에 대한 이의 효과가 없는 것과는 대조적으로, 레퍼탁신은 이들 세포에 의한 맘모스피어 형성을 현저히 감소시켰다 (도 20c 참조).
이들 결과는 IL-8/CXCR1 축이 정상 및 악성 유방 상피 줄기/전구 세포 개체군의 조절 및 생존에 있어서 중요한 역할을 함을 제시한다. FAS-리간드 매개된 방관자효과를 통하여 벌크 세포 개체군에 영향을 주는 능력은 이들 세포에서의 FAS 발현 수준과 관계될 수 있다.
암 줄기세포에 대한 CXCR1 블록케이드 효과는 FAK/AKT/FOXO3A에 의해 매개된다.
CXCR1은 병소 접착 키나제 (FAK)를 포스포릴화하여 AKT를 활성화시키는 것을 수반하는 시그날 형질도입 경로를 통하여 작용한다 (Waugh et al. Clin. Cancer Res. 14:6735-6741, 본 명세서에서 전문 참고로 인용됨). FAK 및 AKT 활성화에 대한 CXCR1 블록케이드의 강도를 평가하기 위하여 포스포릴화된 단백질을 3종의 상이한 세포주에 대한 웨스턴 블롯으로 측정하였다. SUM159 및 HCC1954의 경우, 비처리 세포와 비교하여 레퍼탁신으로 처리한 세포에서 FAK Tyr397 및 AKT Ser473 포스포릴화가 감소되는 것으로 검출되었으며, 이는 레퍼탁신 효과가 FAK/AKT 경로에 의해 매개될 수 있음을 제시하는 것이다 (도 21a 및 22 참조). MDA-MB453이 레퍼탁신 처리에 대해 내성인 것으로 관측된 것은 PI3K/AKT 경로를 활성화시키는 PTEN 돌연변이 (919G>A)의 존재로 설명될 수 있다 (Hollestelle et al. Mol. Cancer Res. 5:195-201., 본 명세서에서 전문 참고로 인용됨). MDAMB453 세포주에서 레퍼탁신 처리 후 FAK Tyr397 및 AKT Ser473 포스포릴화 개질은 검출되지 않았다 (도 22 참조). CXCR1 블록케이드의 효과를 매개하는데 있어서 FAK/AKT 경로의 기능적 역할을 확인하기 위하여, 2종의 바이러스 작제물을 사용하는데, 하나는 PTEN shRNA를 경유한 PTEN 발현을 녹다운시키고 다른 하나는 FAK를 과발현시킨다. PTEN은 이의 지질 포스파타제를 통하여 PI3-K/AKT 신호를 길항시킨다 (Vivanco et al. Nat. Rev. Cancer 2:489-501., 본 명세서에서 전문 참고로 인용됨). PTEN이 녹다운되면 AKT Ser473 포스포릴화의 증가로 증명되는 바와 같이 AKT가 활성화된다 (도 21a 및 22 참조). PTEN 녹다운으로 FAK 및 AKT 활성에 대한 레퍼탁신 처리 효과를 차단한다. FAK 과발현 또한 레퍼탁신의 효과를 차단하며 FAK Tyr397 및 AKT Ser473 포스포릴화의 증가된 발현으로 측정된, FAK 및 AKT의 활성화를 유발한다. 이들 결과는 CXCR1 블록케이드 효과가 FAK/AKT 신호에 의해 매개됨을 나타낸다.
CXCR1-양성 세포에 대한 면역형광 염색법을 이용하여 레퍼탁신 처리로 비처리 세포와 비교하여 포스포-FAK 및 포스포-AKT 발현을 급격하게 감소시키는 것을 확인하였다 (도 21b 참조). AKT는 포스포릴화를 통하여 포크헤드 (forkhead) 전사 인자 FOXO3A의 활성을 조절하여 세포질 FOXO3A를 감금시킨다 (Brunet et al. Mol. Cell Biol. 21:952-965., 본 명세서에서 전문 참고로 인용됨). 대조적으로, 비-포스포릴화된 형태의 FOXO3A가 핵으로 이동하여, 여기서 FAS-리간드의 합성을 조절하는 전사 인자로서 작용한다 (Jonsson et al. Nat. Med. 11:666-671, 본 명세서에서 전문 참고로 인용됨). 레퍼탁신은 FAS-리간드 매개된 방관자효과를 통하여 세포 사멸을 유발하며; 상기 시그날 형질도입 경로에 대한 레퍼탁신 효과는 면역형광 염색법으로 조사되었다. FOXO3A는 비처리 세포 중 세포질 지역에 존재하지만 레퍼탁신 처리시 핵으로 왕복하게 된다 (도 21b 참조). 이는 CXCR1 블록케이드가 FAK/AKT 경로의 억제를 통하여 FOXO3A 활성을 유발함을 나타낸다. PTEN이 결실되거나 FAK 과발현인 세포는 레퍼탁신-처리된 세포 및 비처리 세포 둘다에서, 면역형광으로 검출된, 높은 수준의 포스포-FAK 및 포스포-AKT 발현을 나타낸다. 레퍼탁신 처리는 세포질 위치의 FOXO3A에 의해 나타난 바와 같이, PTEN이 결실되거나 FAK 과발현인 세포에서 FOXO3A 활성화를 유발하지 않았다 (도 21b 참조).
FAK/AKT 경로의 구조적 활성화의 결과로, PTEN이 결실되거나 FAK 과발현인 세포는 레퍼탁신 처리에 대한 내성을 나타냈다. PTEN이 결실되거나 FAK 과발현인 세포는 레퍼탁신 처리시 세포 생존력에 있어 어떠한 감소도 나타나지 않았다. AKT 신호가 CSC의 생물학에 있어서 중요한 역할을 한다는 것은 제안된 바 있다 (도 21b 및 22 참조) (Dubrovska et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106:268-273, Korkaya et al. PLoS Biolog. 7:e1000121., Yilmaz et al. Nature 441:475-482, 본 명세서에서 전문 참고로 인용됨). FAK/AKT 경로의 활성화는 억제제로 처리 후 ALDELFUOR-양성 개체군의 유지에 의해 나타난 바와 같이, CSC 개체군에 대한 레퍼탁신 효과를 차단한다 (도 21b 참조). 모든 결과는 CXCR1 블록케이드가 FAK/AKT/FOXO3A 경로에 직접 영향을 준다는 것을 나타낸다. 레퍼탁신 처리는 AKT 신호를 억제하는데 이는 CSC 활성에 있어서 중요하며 따라서 CSC-발생된 FAS-리간드에 의해 매개된 벌크 종양 세포에 대한 방관자효과를 유발한다.
레퍼탁신 처리로 생체내 유방암 줄기세포 개체군을 감소시킨다.
최근의 증거는 유방 CSC가 화학요법 및 방사능치료에 상대적으로 내성이 있으며 치료 이후 종양 재성장에 기여할 수 있는 것을 제시한다 (Phillips et al. J Natl. Cancer Inst. 98:1777-1785., Yu et al. Cell 131:1109-1123., Li et al. J Natl. Cancer Inst. 100:672-679, 본 명세서에서 전문 참고로 인용됨). CSC 컨셉은 임상적 성과에 있어서 확실한 개선에는 CSC 개체군의 효과적인 표적화가 필요함을 제시한다 (Reya et al. Nature 414:105-111., 본 명세서에서 전문 참고로 인용됨). 벌크 종양 세포가 화학요법에 의해 표적화되었을 때 세포사멸 과정 중에 여러 개의 인자가 합성되어 분비된다. 이들 인자 중에서, FAS-리간드는 방관자 사멸 효과를 매개함으로써 화학요법 효과를 증폭시킨다 (Chhipa et al. J Cell Biochem. 101:68-79, 본 명세서에서 전문 참고로 인용됨). 화학요법은 또한 손상된 세포에서 IL-8 생산을 유도할 수 있다. 통상적으로 이용되는 화학요법제인, 도세탁셀은 SUM159 세포에서 IL-8 및 FAS-리간드 mRNA를 둘 다 유발한다 (도 10a 및 10b 참조). 또한, FAS 효능제 처리 후 IL-8 mRNA 수준을 4배 증가시키는 것으로 검출되었다 (도 10b 참조). IL-8이 CSC 개체군을 조절할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 이는 세포독성 화학요법에 레퍼탁신을 첨가하여 상기 효과를 차단하고 암 줄기세포 개체군을 표적화할 수 있음을 나타낸다.
SUM159 세포주 및 3명의 상이한 환자로부터 발생된 3종의 원발성 인간 유방암 이종이식편 (MC1, UM2, UM3)을 사용하여 종양 성장에 있어서 레퍼탁신의 효과를 탐구하였다. 이들 종양으로부터의 세포를 시험관내 배양시키지 않고, NOD/SCID 마우스의 인간화되고 정화된 지방-패드로 동소 이식하였다. 이들 이종이식물 각각에 대해, CSC 개체군은 ALDEFLUOR-양성 개체군에만 포함되었다 (Ginestier et al. Cell Stem Cell 1:555-567, Charafe-Jauffret et al. Cancer Res. 69:1302-1313, 본 명세서에서 전문 참고로 인용됨). 각각의 종양에서, CXCR1-양성 개체군은 거의 상기 ALDEFLUOR-양성 개체군에만 있으며 (표 5 참조) PTEN/FAK/AKT 경로가 활성화된다 (도 25 참조).
[표 5]
Figure pct00015
각각의 이종이식물로부터 50,000개의 세포를 NOD/SCID 마우스의 인간화되고 정화된 지방-패드에 주사하고 종양 성장을 모니터한다. 종양 크기가 대략 4 ㎜가 되었을 때, 레퍼탁신 만 (15 ㎎/㎏, 일일 2회, 28일간), 도세탁셀 만 (10 ㎎/㎏, 1주 1회, 4주간), 또는 두 약물의 병용 투여로 처리를 개시한다. 종양 성장을 염수 주사한 대조군과 비교한다. 각각의 이종이식물의 경우, 도세탁셀 처리 또는 레퍼탁신/도세탁셀의 병용 투여로 유발된 종양 성장의 현저한 억제가 관찰되었다 (도 26a 및 27 참조). 레퍼탁신 처리만은 종양 성장에 온건한 충격을 주었다. 처리 4주 후, 동물을 희생시키고 ALDEFLUOR 검정법을 이용하여 나머지 종양을 분석하였다. 도세탁셀 만으로 처리한 나머지 종양은 비처리 대조군과 비교하여 불변 또는 증가된 퍼센트의 ALDEFLUOR-양성 세포를 함유하였다 (도 26b 및 27 참조). 대조적으로, 레퍼탁신 만 또는 도세탁셀과의 병용 처리로 ALDEFLUOR-양성 개체군을 75% 초과하여 감소시켰다 (도 26b 및 27 참조). 상기 결과는 상이한 이종이식물에서 ALDEFLUOR 발현의 면역조직화학으로 확인되었다. ALDH1-양성 세포에서의 감소는 비처리 종양과 비교하여 레퍼탁신-처리된 종양에서 검출되는 반면, ALDH1-양성 세포의 퍼센트는 변화되지 않거나 도세탁셀만으로 처리된 종양에서 증가되었다 (도 26d 참조).
이들 종양에서 CD44+/CD24- 세포의 존재를 평가하였다. 마커는 유방암 줄기세포에서 발현되는 것으로 이미 밝혀졌다 (Al Hajj et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 100:3983-3988, 본 명세서에서 전문 참고로 인용됨). CD44+/CD24- 표현형과 CXCR1 발현 간 중첩 (overlap)을 측정하였다. CXCR1-양성 세포는 CD44+/CD24- 세포 개체군 및 CD24 또는 CD44-음성를 발현하는 세포 개체군에 존재하였다 (표 6 참조).
[표 6]
Figure pct00016
도세탁셀만으로 처리된 나머지 종양에서, CD44+/CD24- 세포의 퍼센트가 변화되지 않거나 증가되는 것으로 관찰되는 반면, 레퍼탁신 처리만 또는 도세탁셀과의 병용 처리시에는 CD44+/CD24- 세포 개체군이 감소되었다 (도 28 참조).
처리된 종양으로부터의 세포를 제2의 NOD/SCID 마우스내로 다시 이식시키는 것으로 이루어진 기능적 생체내 검정법은 처리 후 남아있는 CSC의 종양-개시 및 자가재생 능력을 평가하는 직접적인 시험법을 제공한다. 대조군 또는 도세탁셀-처리된 동물로부터 유래된 종양 세포는 모든 희석비의, 제2의 NOD/SCID 마우스에서 유사한 종양 재성장을 나타냈다. 대조적으로, 도세탁셀과 함께 또는 없이 레퍼탁신으로 처리하면 제2의 수용체에서 종양 성장이 감소되었다 (도 26c 참조). 동등한 수의 세포를 주사할 경우, 레퍼탁신-처리된 동물로부터의 것들은 대조군 또는 도세탁셀-처리된 동물과 비교하여 종양 성장이 2 내지 5배 감소되는 것으로 나타났다 (도 26c 참조). 각각의 이종이식물 모델의 경우, 레퍼탁신과 도세탁셀의 병용 처리된 동물로부터 수득한 1000 또는 100개의 종양 세포는 NOD/SCID 마우스에서 제2의 종양을 형성하지 못했다 (도 26c, 27 및 표 7 참조). 이들 연구는 레퍼탁신 처리가 CSC 개체군을 특이적으로 표적화하여 감소시킴을 증명하는 것이다.
[표 7]
Figure pct00017
레퍼탁신 처리는 FAK/AKT 신호를 억제하고 FOXO3A를 생체내에서 활성화시킨다.
처리 후 각각의 이종이식물에서 면역조직화학으로 포스포-FAK 및 포스포-AKT의 발현을 조사하였다. 막의 포스포-FAK 발현은 대조군 및 도세탁셀-처리된 종양으로부터의 세포 50%에서 검출되는 반면, 포스포-FAK 발현이 레퍼탁신 만으로 또는 도세탁셀과 함께 처리된 종양에서는 폐지되었다 (도 26d 참조). 포스포-AKT 발현에 대해서도 유사한 결과가 관찰되었는데, 비처리된 종양에서 포스포-AKT를 발현하는 세포 70%, 도세탁셀-처리된 종양에서 포스포-AKT-양성 세포 20% 및 레퍼탁신 단독 또는 도세탁셀과의 병용 처리된 종양에서 포스포-AKT 발현은 완전히 억제되었다 (도 26d 참조). 도세탁셀 단독, 레퍼탁신 단독, 및 레퍼탁신/도세탁셀 병용 처리된 종양으로부터의 세포에서는 핵의 FOXO3A가 검출되었다. 이들 생체내 데이타는 시험관내 데이타와 일치하며 레퍼탁신 처리가 FAK/AKT 신호를 억제하고 FOXO3A를 활성화시킴을 확인하여준다.
레퍼탁신 처리는 전신적 전이의 발달을 감소시킨다.
레퍼탁신이 전신적 전이를 감소시키는지 결정하기 위하여, HCC1954, MDA-MB-453, 및 SUM159 유방암 세포주를 루시퍼라제 렌티바이러스 리포터 시스템으로 감염시키고 상기 세포를 심장내 주사에 의해 NOD/SCID 마우스로 도입시켰다. 각 세포주 당 250,000개의 세포의 현탁액을 주사하고 전이 형성을 생체발광 영상화에 의해 주당 1회 모니터하였다. 심장내 주사한 지 12시간 후, 마우스를 레퍼탁신 주사 또는 대조용으로 염수로 일일 2회 처리한다. HCC1954 및 SUM159 세포가 주사된 마우스에서 레퍼탁신으로 처리하면 비처리된 마우스와 비교하여 처리된 경우 더 낮은 광자속 방출로 전이 형성을 현격하게 감소시켰다 (도 29a 및 29b 참조). 조직학적 섹션으로 비처리된 동물의 여러 부위에서 전이의 존재를 확인하였다 (도 29d 참조). 레퍼탁신 처리는 MDA-MB-453 세포를 주사한 마우스에서의 전이 형성에 어떤 영향도 주지 않았다 (도 29c 참조). 광자속 방출량과 전이가 발달된 동물의 수는 레퍼탁신-처리된 그룹 및 비처리 그룹에서 둘 다 유사하였다. 이 결과는 PTEN 돌연변이의 존재로 인하여 레퍼탁신에 대해 내성인 세포주로서 MDA-MB-453을 기재한 데이타와 일치한다. 이들 결과는 레퍼탁신과 같은 치료제와 함께 CXCR1 블록케이드는 CSC 개체군에 의해 매개되는 전이를 감소시킬 수 있음을 나타낸다 (Charafe-Jauffret et al. Cancer Res. 69:1302-1313., 본 명세서에서 전문 참고로 인용).
본 발명의 양태의 개발중 수행된 실험은 줄기세포 특성을 갖는 세포의 서브성분이 종양 성장과 전이를 유도함을 나타낸다 (Visvader et al. Nat. Rev. Cancer 8:755-768, 본 명세서에서 전문 참고로 인용됨). 진행중인 치료 양상에 대한 이들의 상대적 내성에 의해, 이들 세포는 치료 내성 및 재발에 기여할 수 있다 (Reya et al. Nature 414:105-111., 본 명세서에서 전문 참고로 인용됨). 본 발명은 유방암 줄기세포에서 발현되는, CXCR1 사이토킨 수용체에 대한 차단을 기본으로 하는, 암 줄기세포 개체군을 효과적으로 표적화하고 치료 성과를 개선하는 방법을 제공한다. 수많은 시스템에서 본 발명의 양태를 개발하는 중 수행된 실험으로 사이토킨 네트워크가 종양형성에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 증명되었다. 수개의 이들 사이토킨이 줄기세포 행위를 조절할 수 있다는 증거가 있다. IL-4는 췌장암 줄기세포의 자가재생을 조절할 수 있으며 IL-6은 결장 및 유방암에서 암 줄기세포를 조절할 수 있다 (Todaro et al. Cell Stem Cell 1:389-402., Sansone et al. J Clin. Invest 117:3988-4002, 본 명세서에서 전문 참고로 인용됨). 종양 침입 및 전이를 매개하는데 있어서 IL-8의 역할은 이미 증명되어 있다 (Waugh & Wilson. Cancer Res. 14:6735-6741., Inoue et al. Clin. Cancer Res. 6:2104-2119., 본 명세서에서 전문 참고로 인용됨). 또한, IL-8은 뇌에서 부상부위 치유중 신경 줄기세포 자가재생을 증가시킨다 (Beech et al. J Neuroimmunol. 184:198-208., 본 명세서에서 전문 참고로 인용됨). 폐암 줄기세포는 케모킨 수용체 CXCR1을 발현시키는 것으로 기재되었다 (Levina et al. PLoS, ONE. 3:e3077., 본 명세서에서 전문 참고로 인용됨). 본 발명 양태의 개발중에 수행된 실험으로 CXCR1-양성 개체군은 거의 유방암 세포주 및 제1의 이종이식편 뿐만 아니라 정상적인 유방 세포 중 ALDEFLUOR-양성 개체군 내에만 포함되는 것이 증명되었다. 케모킨 수용체는 ALDEFLUOR-양성 유방암 세포 개체군에서 과발현된다 (Charafe-Jauffret et al. Cancer Res. 69:1302-1313, 본 명세서에서 전문 참고로 인용됨). 유방암에서, IL-8은 염증성 세포, 혈관 내피 세포, 종양-관련된 섬유아세포 및 간충직 줄기세포를 포함한 다수의 세포 타입에 의해 종양 미세환경에서 생성된다 (Waugh et al. Clin. Cancer Res. 14:6735-6741., 본 명세서에서 전문 참고로 인용됨). 사이토킨 네트워크는 이들 세포 타입간의 상호반응을 매개하여, 암 줄기세포가 IL-8 수용체 CXCR1의 블록케이드를 통하여 표적화될 수 있다.
시험관내 검정법을 이용하여, CXCR2 (별개의 IL-8 수용체)가 아닌 CXCR1 블록케이드가 유방암 줄기세포 개체군을 감소시키는 것으로 증명되었다. 이어서 CXCR1 발현이 없는, 남아있는 전체 세포 개체군에서 세포사멸을 유발하였다. CXCR1 차단 항체 외에, 양태의 개발 중 수행된 실험으로 레퍼탁신, CXCR1/2 억제제가 CXCR1-양성 개체군을 표적화함으로써 유사한 효과를 유발함이 증명되었다. CXCR1-발현 암 줄기세포 개체군에 대한 직접적인 효과와는 대조적으로, 레퍼탁신은 CXCR1 발현이 결여된 벌크 종양 세포 개체군에 대한 직접적인 효과를 갖지 않는다. 이는 CXCR1-양성 세포에서의 CXCR1 블록케이드는 방관자효과를 통하여 CXCR1-음성 세포에서 세포 사멸을 유발시키지 않음을 나타낸다. 여기에 기재된 실험은 FAS-리간드/FAS 경로가 상기 방관자 사멸 효과의 매개체임을 증명한다. 상기 현상은 CXCR1-양성 개체군이 세포 개체군의 1% 미만이라는 사실에도 불구하고 전체 세포 개체군에서 대량적인 세포사멸을 유발하는데 있어서 레퍼탁신 처리 효과를 설명한다. FAS-리간드의 역할은 항-FAS-리간드 항체에 의한 방관자 사멸의 효과적인 차단에 의해 증명되었다.
본 발명 양태의 개발 중에 수행된 실험은 유사한 사이토킨 상호반응이 세포독성 화학요법에 노출된 종양에서 일어날 수 있음을 나타낸다. 화학요법은 분화된 종양 세포에서의 세포의 세포사멸을 직접 유발할 수 있을 뿐만 아니라 이들 죽어가는 세포에 의한 FAS-리간드 생산을 유발하고 이어서 FAS 매개된 방관자 효과를 통하여 종양 세포 주변에서 세포사멸을 유발한다. FAS-리간드의 생산과 동시에, 이들 손상된 세포는 또한 유방 퇴축을 모방하는 과정 또는 상처 부위의 회복중에 증가된 수준의 IL-8을 분비한다. 유선이 퇴축되는 경우와 같이, 상기 IL-8은 유방암 줄기세포를 자극할 수 있을 뿐만 아니라 세포사멸로부터 이들을 보호한다. 이는 임상전 모델 (4) 및 네오-애주번트 (neo-adjumant) 임상 시험 (5)에서 화학요법 후 관찰되는 암 줄기세포에서의 상대적 증가에 기여할 수 있다. 종양에서 세포사멸 및 자가재생 경로에 대한 화학요법의 효과를 도 30에 나타냈다.
CXCR1 블록케이드가 유방암 줄기세포를 생체내에서 표적화할 수 있는지 결정하기 위하여, 세포독성제인 도세탁셀의 효과를 NOD/SCID 마우스에서 암 줄기세포 구획 및 종양 성장에 대해서 레퍼탁신과 비교하였다. 도세탁셀은 유방암 여성을 치료하는데 있어서 현재 사용되는 가장 효과적인 화학요법제 중 하나이다. 암 줄기세포 개체군을 NOD/SCID 마우스에서 ALDEFLUOR 검정법 및 일련의 이식으로 평가하였다. 이들 검정법을 이용하여 단독 화학요법 처리로 암 줄기세포 개체군에서 변화가 없었거나 상대적으로 증가한 것으로 결정되었다. 대조적으로, 레퍼탁신 만의 처리 또는 화학요법과의 병용 처리는 암 줄기세포 개체군을 현저하게 감소시켰다. 종양-개시 개체군에서의 현저한 감소에도 불구하고, 레퍼탁신 만을 사용하면 종양이 현저하게 줄어들지 않았다. 레퍼탁신과 화학요법을 병용할 때 종양 크기 뿐만 아니라 암 줄기세포 개체군이 현저하게 감소되었다. 암 줄기세포와 종양 세포 개체군의 부피 모두 표적으로 이들 약제를 병용할 때 이들 처리의 효과가 극대화된다.
레퍼탁신의 작용 메카니즘을 설명하기 위하여, CXCR1으로부터의 다운스트림 경로를 분석하였다. CXCR1, FAK 및 AKT간의 상호반응을 확인하였다. CXCR1 블록케이드는 FAK 및 AKT 활성화를 통하여 특이적으로 작용한다. 본 발명 양태의 개발중에 수행된 실험은 AKT 활성화가 GSK3β의 포스포릴화를 통하여 정상 및 악성 유방 줄기세포 자가재생을 조절하여 WNT 경로를 활성화시킨다 (Korkaya et al. PLoS Biolog. 7:e1000121, 본 명세서에서 전문 참고로 인용됨). 이들 결과는 PTEN 녹다운을 갖는 세포가 레퍼탁신에 왜 내성을 나타내는지 나타낸다. AKT의 추가 기능은 포크헤드 전사 인자 FOXO3A의 포스포릴화를 통하여 세포 생존을 조절하는 것이다. FOXO3A의 AKT 포스포릴화는 세포질을 감금시킨다. 대조적으로, CXCR1 블록케이드가 AKT 활성화를 감소시켜 핵에서 FOXO3A를 전좌시키고 이로써 FAS-리간드를 포함하여 유전자의 수를 감소시킨다는 것이 증명되었다 (Jonsson et al. Nat.Med. 11:666-671., 본 명세서에서 전문 참고로 인용됨). FAS-리간드는 CXCR1 블록케이드를 통하여 유발시키며 따라서 관찰된 방관자 사멸 효과에 대해 책임이 있다 (도 30 참조).
CXCR1 신호에서의 역할 외에, FAK는 인테그린 수용체를 통하여 세포와 세포외 매트릭스 성분의 상호반응을 매개한다 (Waugh et al. Clin. Cancer Res. 14:6735-6741, 본 명세서에서 전문 참고로 인용됨). FAK 신호는 유전자이식 모델에 있어 정상 및 악성 마우스 유방 줄기세포의 자가재생을 조절하는데 있어서 역할을 한다 (Luo et al. Cancer Res. 69:466-474, 본 명세서에서 전문 참고로 인용됨). FAK 활성화는 또한 FADD 및 RIP-매개된 세포사멸을 차단함으로써 세포 생존력을 증진시킨다 (Kurenova et al. Mol. Cell Biol. 24:4361-4371., Xu et al. J Biol. Chem. 275:30597-30604, 본 명세서에서 전문 참고로 인용됨). 이는 암 줄기세포 개체군의 FAS/FAS-리간드 유발된 세포사멸에 대한 내성에 대한 설명을 제공한다.
유방암 줄기세포가 종양 침입 및 전이에 있어서 중요한 역할을 한다는 것은 증명되었다 (Croker et al. J Cell Mol. Med. 2008, Charafe-Jauffret et al. Cancer Res. 69:1302-1313, 본 명세서에서 전문 참고로 인용됨). 본 발명에서는 IL-8 및 CXCR1이 또한 이들 과정에서 중요한 역할을 한다는 것을 제시한다. CXCR1 블록케이드 효과는 실험실 전이 형성에 레퍼탁신을 이용하여 분석한다. CXCR1 블록케이드로 후속되는 유방암 세포의 심장내 주사제 투여시 전이 발달을 감소시킴이 증명되었다.
레퍼탁신을 이용하는 임상 연구로 독성의 결여가 증명되었다. IL-8 및 CXCR1과 같은 사이토킨 조절 루프로 방해하는데 목표를 두고 있는 전략은 유방암 줄기세포를 표적화하는 방법을 나타낸다.
참조문헌
하기 참조문헌은, 본 명세서에 충분히 나타나 있는 바와 같이. 온전히 그대로 참고로 본 명세서에 통합된다.
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상기 명세서에서 언급된 모든 공보 및 특허는 본 발명에서 참고로 인용된다. 본 발명의 기재된 방법 및 시스템의 다양한 개량 및 변화는 본 발명의 범주 및 정신으로부터 벗어남이 없이 당업자에게 자명할 것이다. 본 발명이 특정의 바람직한 양태와 관련하여 기재되었으나, 청구되는 발명은 그러한 특정 양태로 부당하게 제한되어서는 아니 되는 것으로 이해되어야 한다. 사실, 관련 분야의 숙련가에 자명한 본 발명을 수행하기 위한 기재된 방식의 다양한 개량은 본 발명의 범주내의 것이다.

Claims (16)

  1. 대상체의 종양으로부터 획득한 조직 샘플로부터의 CXCR1+ 또는 FBXO21+ 고형 종양 줄기세포를 검출함을 포함하는, 고형 종양 줄기세포의 검출 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 검출이 상기 조직 샘플을 항체 또는 항체 단편과 접촉시킴을 포함하는 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 항체, 또는 항체 단편이 레퍼탁신 (Repertaxin)을 포함하는 방법.
  4. 제 2항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 시그날 분자를 포함하는 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 시그날 분자가 비색 기질의 존재하에서 색상 생산 반응을 촉매할 수 있는 형광 분자 또는 효소를 포함하는 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 CXCR1 또는 FBOX21+ 고형 종양 줄기세포의 존재 또는 부재를 결정하기 위하여 다른 단백질 또는 핵산도 분석하지 않는 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 종양이 전립선암 종양, 난소암 종양, 유방암 종양, 흑색종, 비소세포 폐암 종양, 소세포 폐암 종양, 및 식도선암 종양으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
  8. a) 발암성이고;
    b) CXCR1+ 또는 FBXO21+ 인
    암 줄기세포의 분리된 개체군.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 암 줄기세포가 전립선암 줄기세포, 난소암 줄기세포, 유방암 줄기세포, 피부암 줄기세포, 비소세포 폐암 줄기세포, 소세포 폐암 줄기세포, 및 식도 선암 줄기세포로 이루어진 그룹으로 선택된 암 줄기세포인, 암 줄기세포의 분리된 개체군.
  10. 제 8항에 있어서, 상기 개체군이 적어도 60%가 암 줄기세포이고 40% 미만이 비-발암성 종양 세포인 암 줄기세포의 분리된 개체군.
  11. 제 8항에 있어서, 상기 암 줄기세포가 비분획화된 비-발암성 종양 세포와 비교하여 적어도 2배 풍부한, 암 줄기세포의 분리된 개체군.
  12. 제 8항에 있어서, 상기 암 줄기세포가 비분획화된 비-발암성 종양 세포와 비교하여 적어도 4배 풍부한, 암 줄기세포의 분리된 개체군.
  13. 종양을 갖고 있는 환자에게 화합물을 투여함을 특징으로 하며, 상기 화합물이 CXCR1 또는 FBXO21 길항제 또는 IL8-CXCR1 신호 경로 길항제인, 종양을 갖고 있는 환자를 치료하는 방법.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 화합물이 레퍼탁신 또는 레퍼탁신 유도체인 방법.
  15. 제 13항에 있어서, 상기 CXCR1 또는 FBOX21 길항제, 또는 IL8-CXCR1 신호 경로 길항제가 항체 또는 항체 단편을 포함하는 것인 방법.
  16. 제 13항에 있어서, 상기 종양이 전립선암 줄기세포, 난소암 줄기세포, 유방암 줄기세포, 피부암 줄기세포, 비소세포 폐암 줄기세포, 소세포 폐암 줄기세포, 및 식도 선암 줄기세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 암 줄기세포를 포함하는 것인 방법.
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