ES2623128T3 - Composiciones ANTI-CXCR1 y métodos - Google Patents

Abstract

Antagonista de CXCR 1 para su uso en un método para el tratamiento de un sujeto que tiene un tumor, en el que el método comprende además la administración de un agente quimioterápico.

Description

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Composiciones ANTI-CXCR1 y metodos

Declaration respecto a investigacion o desarrollo subvencionado federalmente

Esta invencion se realizo con apoyo estatal con los numeros de subvencion CA66233, CA101860 y 5 P 30 CA46592 olorgados por los NIH, El gobierno tiene ciertos derechos en la invencion.

Campo de la invencion

La presente invencion proporciona metodos de tratamiento del cancer administrando un inhibidor de la ruta de IL8- CXCR1 (por ejemplo, un anticuerpo antLCXCRI o repertaxina) en combination con un agente quimioterapico adicional de manera que se destruyan las celulas cancerosas tumorigenicas y no tumorigenicas en un sujeto. La presente invencion tambien trata de composiciones y metodos para detectar la presencia de y aislar celulas madre de tumores solidos en un paciente (por ejemplo, basandose en la presencia de CXCR1 o FBX021).

Antecedentes

El cancer sigue siendo la segunda causa de mortalidad en este pais, dando como resultado mas de 500.000 muertes al ano. A pesar de los avances en la detection y el tratamiento, la mortalidad por cancer sigue siendo alta. A pesar del notable progreso en la comprension de la base molecular del cancer, este conocimiento todavia no se ha traducido en estrategias terapeuticas eficaces.

En particular, el cancer de mama es el cancer mas comun en mujeres americanas, desarrollando aproximadamente una de cada nueve mujeres cancer de mama en el transcurso de su vida. Desafortunadamente, el cancer de mama metastasico es todavia una enfermedad incurable. La mayoria de las mujeres con cbncer de mama metastasico sucumben a la enfermedad.

Los modos tradicionales de terapia (radioterapia, quimioterapia y terapia hormonal), aunque son utiles, se han visto limitados por la aparicion de celulas cancerosas resistentes al tratamiento. Claramente, se necesitan nuevos enfoques para identificar dianas para tratar el cancer de mama metastasico y el cancer de manera en general.

Ginestier et al. (99a Reunion Anual de la AACR, abril de 2008, resumen n.° 5004) estudian el papel del eje IL8/CXCR1 en la regulation de la funcion de las celulas madre de cancer de mama.

El documento WO 2005/103711 se refiere a secuencias de acido nucleico y secuencias de aminoacidos de un CXCR1 humano y su regulacion para el tratamiento de trastornos cardiovasculares, enfermedades gastrointestinales y hepaticas, enfermedades metabolicas, enfermedades inflamatorias, trastornos hematologicos, enfermedades respiratorias, trastornos neurologicos, trastornos urologicos, trastornos de cancer y trastornos de la reproduction en mamiferos.

El documento US 2007/208074 da a conocer un metodo de reduction del crecimiento o invasividad de una celula tumoral, y agentes que reduce e! nivel o actividad de IL-8 o receptor de IL-8.

El documento WO 2008/036419 se refiere a composiciones y metodos para tratar, caracterizar y diagnosticar cancer, y al marcador de cancer de celulas madre ALDH1.

Sumario de la invencibn

La presente invencion proporciona metodos de tratamiento del cbncer administrando un inhibidor de la ruta de IL8- CXCR1 (por ejemplo, un anticuerpo anti-CXCR1 o repertaxina) en combinacion con un agente quimioterapico adicional de manera que se destruyan las celulas cancerosas tumorigenicas y no tumorigenicas en un sujeto, La presente invencion tambien trata de composiciones y metodos para diagnosticar la presencia de celulas madre de tumores solidos en un paciente (por ejemplo, basandose en la presencia de CXCR1 o FBX021).

En algunas realizaciones, la presente invencion proporciona metodos de tratamiento del cancer que comprenden: administrar un antagonista de la ruta de IL8-CXCR1 y un agente quimioterapico adicional a un sujeto. En determinadas realizaciones, la presente invencion proporciona metodos de reduccibn o eliminacion de celulas madre de cancer y celulas cancerosas no tumorigenicas en un sujeto que comprenden: administrar repertaxina o derivado de la misma a un sujeto en condiciones tales que se destruyen al menos una parte de las celulas madre de cancer y al menos una parte de las celulas cancerosas no tumorigenicas. En otras realizaciones, la presente invencion proporciona metodos de reduccion o eliminacion de celulas madre de cancer y celulas cancerosas no tumorigenicas en un sujeto que comprenden: administrar un antagonista de la ruta de IL8-CXCR1 y un agente quimioterapico adicional a un sujeto en condiciones tales que se destruyen al menos una parte de las celulas madre de cancer y al menos una parte de las celulas cancerosas no tumorigenicas. Se proporcionan composiciones o kits que comprenden un antagonista de la ruta de IL8-CXCR1 y un agente quimioterapico adicional.

En determinadas realizaciones, el antagonista de la ruta de IL8-CXCR1 comprende un agente que bloquea

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especificamente la union de IL8 a CXCR1. En algunas realizaciones, el agente se une a (es especifico para) CXCR1, pero no se une a CXCR2, En otras realizaciones, el agente se une a CXCR1, En realizaciones particulars, el agente comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti-CXCR1. En realizaciones adicionales, el agente comprende repertaxina o un derivado de la misma. En realizaciones adicionales, el agente quimioterapico adicional comprende un compuesto antimitotico. En determinadas realizaciones, el compuesto antimitotico se selecciona del grupo que consiste en: docetaxel, doxorubicina, paclitaxel, fluorouracilo, vincristina, vinblastina, nocodazol, colchicina, podofilotoxina, esteganacina y combretastatina. En otras realizaciones, el compuesto antimitotico es un alcaloide de Catharanthus (por ejemplo, vincristina y vinblastina); o un carbamato de bencimidazol tal como nocodazol; o colchicina o compuestos relacionados tales como podofilotoxina, esteganacina o combretastatina; o un taxano tal como paclitaxel y docetaxel. En determinadas realizaciones, el agente quimioterapico adicional comprende docetaxel.

En realizaciones particulars, el sujeto tiene un tipo de cancer que, cuando se trata con un agente quimioterapico, tiene niveles aumentados de produccion de IL-8 (por ejemplo, que provoca un aumento del numero o la motilidad de celulas madre de cancer). En algunas realizaciones, el sujeto tiene un tipo de cancer seleccionado del grupo que consiste en: cancer de prostata, cancer de ovarios, cancer de mama, melanoma, cancer de pulmon de celulas no pequehas, cancer de pulmdn de celulas pequehas y adenocarcinoma esofagico.

La presente solicitud describe ademas metodos de detection de celulas madre de tumors sdlidos que comprenden; a) proporcionar: i) una muestra tomada de un tumor de un sujeto, y ii) un anticuerpo, o fragmento de anticuerpo (u otra molecula de union), especifico para la proteina CXCR1 o proteina FBX021 (u otra proteina de la tabla 1); y b) poner en contacto la muestra de tejido con el anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, en condiciones tales que se detecten la presencia o ausencia de celulas madre de tumors solidos CXCR1+ o FBX021+.

El anticuerpo, o fragmento de anticuerpo puede conjugarse con una molecula de serial. La molecula de serial puede comprender una molecula fluorescente. La molecula de serial puede comprender una enzima que puede catalizar un color que produce reaction en presencia de un sustrato colorimetrico. El metodo puede comprender ademas poner en contacto la muestra con un anticuerpo secundario, o fragmento de anticuerpo secundario, especifico para el anticuerpo o fragmento de anticuerpo. El anticuerpo secundario, o fragmento de anticuerpo secundario, puede comprender una molecula de serial. En particular, no se someten a ensayo otras proteinas o acidos nucleicos para determinar la presencia o ausencia de las celulas madre de tumores solidos CXCR1 o FBX021+. El tumor puede seleccionarse del grupo que consiste en: un tumor de cancer de prostata, un tumor de cancer de ovarios, un tumor de cancer de mama, un melanoma, un tumor de cancer de pulmon de celulas no pequehas, un tumor de cancer de pulmon de celulas pequehas y un tumor de adenocarcinoma esofdgico.

La presente solicitud describe ademas metodos de enriquecimiento de una poblacion de celulas madre de tumores solidos que comprenden: a) disociar un tumor solido para generar celulas disociadas; b) poner en contacto las celulas disociadas con un reactivo que se une a CXCR1 o FBX021 (u otra proteina de la tabla 1); y c) seleccionar celulas que se unen al reactivo en condiciones tales que se genera una poblacion enriquecida en celulas madre de tumores solidos.

En determinados casos, no se emplean reactivos adicionales con el fin de generar la poblacion enriquecida en celulas madre de tumores sblidos. El tumor puede seleccionarse del grupo que consiste en: un tumor de cancer de prostata, un tumor de cancer de ovarios, un tumor de cancer de mama, un melanoma, un tumor de cancer de pulmon de celulas no pequehas, un tumor de cancer de pulmon de celulas pequehas y un tumor de adenocarcinoma esofagico. El reactivo puede ser un anticuerpo o fragmento de anticuerpo (por ejemplo, fragmento Fab). El reactivo puede conjugarse con un fluorocromo o particulas magneticas. Algunas veces, la seleccion de celulas se realiza mediante citometria de flujo, clasificacion de celulas activadas por fluorescencia, cribado, separation en columna de afinidad o seleccion magnetica.

La presente solicitud describe ademas una poblacion enriquecida de celulas madre de tumores solidos aisladas por los metodos descritos en el presente documento.

Se describen en el presente documento poblaciones aisladas de celulas madre de cancer que son: a) tumorigenicas; y b) CXCR1+ o FBX021+. En determinados casos, las celulas madre de cancer son celulas madre de cancer seleccionadas del grupo que consiste en: celulas madre de cancer de prostata, celulas madre de cancer de ovarios, celulas madre de cancer de mama, celulas madre de cancer de piel, celulas madre de cancer de pulmon de celulas no pequehas, celulas madre de cancer de pulmon de celulas pequehas y celulas madre de adenocarcinoma esofagico En otros casos, la poblacion comprende al menos el 60% de celulas madre de cancer y menos del 40% de celulas tumorales no tumorigenicas. Las celulas madre de cancer pueden estar enriquecidas al menos dos veces en comparacion con celulas tumorales no tumorigenicas no fraccionadas (por ejemplo, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces,10 veces, ... 100 veces,... 1000 veces).

En algunos casos, la presente solicitud describe metodos para obtener a partir de un tumor una composition celular que comprende celulas madre de cancer y celulas tumorales no tumorigenicas, en los que al menos el 60% son celulas madre tumorigenicas y el 40% o menos son celulas tumorales no tumorigenicas, comprendiendo el metodo: a) obtener una mezcla disociada de celulas tumorales a partir de un tumor; b) separar la mezcla de celulas

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tumorales en una primera fraccion que comprende al menos el 60% de celulas madre de cancer y el 40% o menos de celulas tumorales no tumorigenicas y una segunda fraccion de celulas tumorales empobrecida en celulas madre de cancer en la que la separacion se realiza poniendo en contacto la mezcla con un reactivo contra CXCR1 o FBX021; y c) demostrar que la primera fraccion es tumorigenica mediante: i) inyeccidn en serie en un primer animal huesped y la segunda fraccion no es tumorigenica mediante inyeccidn en serie en un segundo animal huesped. En determinadas realizaciones, la separacion se realiza mediante citometria de flujo, clasificacion de celulas activadas por fluorescencia (FACS), cribado, cromatografia de afinidad o selection magnetica. En algunas realizaciones, la separacion se realiza mediante analisis de clasificacion de celulas activadas por fluorescencia (FACS).

Particularmente, los metodos para seleccionar un tratamiento para un paciente que tiene un tumor sdlido pueden comprender: (a) obtener una muestra del paciente; (b) identificar la presencia de celulas madre de tumores solidos CXCR1+ o FBX021+ en la muestra; y (c) seleccionar un tratamiento para el paciente que selecciona como diana celulas madre de tumores solidos CXCR1+ o FBX021+ (por ejemplo, seleccionar el uso de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti-CXCR1). Las celulas madre de tumores solidos CXCR1+ o FBX021+ pueden ser celulas madre de cancer seleccionadas del grupo que consiste en: celulas madre de cancer de prostata, celulas madre de cancer de ovarios, celulas madre de cancer de mama, celulas madre de cancer de piel, celulas madre de cancer de pulmon de celulas no pequenas, celulas madre de cancer de pulmon de celulas pequenas y celulas madre de adenocarcinoma esofagico.

La presente solicitud describe tambien metodos para examinar un compuesto, que comprenden: a) exponer una muestra que comprende una celula madre de cancer CXCR1+ o FBX021+ a un compuesto antineoplasico candidato, en el que el compuesto antineoplasico candidato comprende un antagonista de CXCR1 o FBX021 o un antagonists de la ruta de serialization de IL8-CXCR1; y b) detectar un cambio en la celula en respuesta al compuesto.

La muestra puede comprender una mamosfera no adherente. El antagonista de CXCR1 o FBX021, o antagonista de la ruta de senalizacion de IL8-CXCR1 puede comprender un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. El antagonista de CXCR1 puede ser un derivado de repartaxina. La detection puede comprender la detection de la muerte celular de la celula mamaria tumorigenica. Los metodos pueden comprender ademas la identification de que el agente antineoplasico candidato puede destruir celulas tumorigenicas asi como celulas cancerosas no tumorigenicas.

En algunos casos, la presente solicitud describe metodos para determinar la capacidad de un compuesto de prueba para inhibir la tumorigenesis de celulas madre de tumores solidos que comprenden: a) obtener celulas madre de tumores solidos enriquecidas, en los que las celulas madre de tumores solidos: i) estan enriquecidas al menos dos veces en comparacion con celulas tumorales no fraccionadas; y ii) expresan CXCR1 o FBX021; b) exponer un primer conjunto, pero no un segundo conjunto, de las celulas madre de tumores sdlidos a un compuesto de prueba; c) inyectar el primer conjunto de las celulas madre de tumores solidos en un primer animal huesped e inyectar el segundo conjunto de celulas madre de tumores solidos en un segundo animal huesped; y d) comparar un tumor, si esta presente, en el primer animal con un tumor formado en el segundo animal con el fin de determinar si el compuesto de prueba inhibe la formation tumoral. En particular, el compuesto de prueba es un inhibidor de CXCR1 o FBX021, o un inhibidor de ia ruta del inhibidor de IL8-CXCR1.

La presente solicitud describe ademas metodos para determinar la capacidad de un compuesto de prueba para inhibir la tumorigenesis de celulas madre de tumores solidos que comprenden: a) obtener una muestra que comprende al menos el 60% de celulas madre de tumores solidos, en los que las celulas madre de tumores solidos expresan CXCR1 o FBX021; b) inyectar las celulas madre de tumores solidos en animales huesped primera y segundo; c) tratar el primer animal huesped con un compuesto de prueba, y no tratar el segundo animal huesped con el compuesto de prueba; y d) comparar un tumor, si esta presente, en el primer animal con un tumor formado en el segundo animal con el fin de determinar si el compuesto de prueba inhibe la formacion tumoral. El compuesto de prueba puede ser un inhibidor de CXCR1 o FBX021 o un inhibidor de la ruta de IL8-CXCR1.

Description de las figuras

La figura 1 muestra que las poblaciones de celulas positivas para ALDEFLUOR de lineas celulares de cancer de mama (MDA-MB-453, SUM159) tienen prapiedades de celulas madre de cancer. A-B, G-H. An&lisis de citometria de flujo representative de actividad enzimatica de ALDH en celulas MDA-MB-453 (A-B) y SUM159 (G-H). El ensayo ALDEFLUOR se realizo tal como se describe en e! ejemplo 1 mas adelante. (C, I) La poblacion positiva para ALDEFLUOR pudo generar tumores en ratones NOD/SCID que recapitularon la heterogeneidad fenotipica del tumor inicial. (F, L) Se representaron graficamente curvas de crecimiento tumoral para diferentes numeros de celulas inyectadas (para MDA-MB-453: 50.000 celulas, 5.000 celulas y 500 celulas y para SUM159: 100.000 celulas, 10.000 celulas y 1.000 celulas) y para cada poblacion (positiva para ALDEFLUOR, negativa para ALDEFLUOR, no separada). La cinetica de crecimiento tumoral se correlacionaba con la latencia y el tamafio de la formacion tumoral y el numero de celulas positivas para ALDEFLUOR (F, L). (D, J) Tincion de H&E de sitio de inyeccion de celulas positivas para ALDEFLUOR, que revela la presencia de celulas tumorales (D: sitio de inyeccion de celulas positivas para ALDEFLUOR MDA-MB-453, y J: sitio de inyeccion de celulas positivas para ALDEFLUOR SUM59). (E, K) el sitio de inyeccion de celulas negativas para ALDEFLUOR contenia solo Matrigel residual, celulas apoptoticas y tejido de raton (E: sitio de inyeccidn de celulas negativas para ALDEFLUOR MDA-MB-453, y K: sitio de inyeccion de

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celulas negativas para ALDEFLUOR SUM59). Los datos representan la media ± DE.

La figura 2 muestra la clasificacidn de las poblaciones positivas para ALDEFLUOR y negativas para ALDEFLUOR aisladas de lineas celulares de mama basandose en la "firma de celulas madre de cancer". Figura 2A. Agrupamiento jerarquico de 16 muestras basandose en una firma de expresion de 413 genes. Cada fila de la matriz de datos representa un gen y cada columna representa una muestra. Observese la separation entre las muestras positivas (nombres subrayados) y negativas (nombres sin subrayar) para ALDEFLUOR con los 413 genes para 15 de cada 16 muestras. Se hace referenda a algunos genes incluidos en la firma mediante su abreviatura HUGO tal como se usa en ‘Entrez Gene’ (los genes regulados por disminucidn en las poblaciones positivas para ALDEFLUOR se marcan en verde y los genes regulados por incremento en las poblaciones positivas para ALDEFLUOR se marcan en rojo). Figura 2B-C. Para confirmar los resultados de expresion genica, en un conjunto de cinco lineas celulares de cancer de mama clasificadas para el fenotipo de ALDEFLUOR, se midio la expresion de cinco genes discriminadores sobreexpresados en poblaciones positivas para ALDEFLUOR (CXCR1/IL8RA, FBX021, NFYA, NOTCH2 y RAD51L1) mediante RT-PCR cuantitativa. Los niveles de expresion de RT-PCR cuantitativa de CXCR1 y FBX021 se presentan en esta figura. Los niveles de expresion genica medidos mediante RT-PCR cuantitativa confirman los resultados obtenidos usando microalineamientos de ADN con un aumento dei nivel de ARNm de CXCR1 y FBX021 en la poblacion positiva para ALDEFLUOR en comparacion con la poblacibn negativa para ALDEFLUOR (p<0,05).

La figura 3 muestra el papel del eje IL8/CXCR1 en la regulation de celulas madre de cancer de mama. A. Estan contenidas celulas que expresan CXCR1 en la poblacion positiva para ALDEFLUOR. Se aislaron la poblacion positiva y negativa para ALDEFLUOR de cuatro lineas celulares de mama diferentes (HCC1954, SUM159, MDA- MB-453, BrCa-MZ-01) mediante FACS, se fijaron y se analizaron para determinar la expresion de proteina CXCR1 mediante inmunotincion y analisis FACS. Las celulas positivas para ALDEFLUOR estaban altamente enriquecidas en celulas positivas para CXCR1 en comparacion con la poblacion negativa para ALDEFLUOR. B. Efecto del tratamiento con IL8 sobre la formation de tumoresferas de tres lineas celulares diferentes (HCC1954, SUM159, MDA-MB-453). El tratamiento con 1L8 aumento la formacion de tumoresferas primarias y secundarias de manera dependiente de la dosis. C. Efecto del tratamiento con IL8 sobre la poblacion positiva para ALDEFLUOR de cuatro lineas celulares diferentes cultivadas en condiciones adherentes. IL8 aumento la poblacion positiva para ALDEFLUOR de manera dependiente de la dosis en cada una de las cuatro lineas celulares analizadas (*p<0,05/** p<0,01, diferencias estadisticamente significativas con respecto al grupo de control).

La figura 4 muestra que celulas positivas para ALDEFLUOR presentan potencial metastasico aumentado. A. El eje IL8/CXCR1 esta implicado en la invasion de celulas madre de cancer. Se evaluo el papel del eje IL8/CXCR1 en la invasion mediante un ensayo de invasion de Matrigel usando suero o IL8 como atrayente para tres lineas celulares diferentes (HCC1954, MDA-MB-453, SUM159). Las celulas positivas para ALDEFLUOR eran de 6 a 20 veces mas invasivas que las celulas negativas para ALDEFLUOR (p<0,01). Cuando se usaba IL8 (100 ng/ml) como atrayente, se observo un aumento significativo de celulas positivas para ALDEFLUOR que estaban invadiendo a traves de Matrigel en comparacion con suero como atrayente (p<0,05). En cambio IL8 no tuvo ningun efecto sobre la capacidad invasiva de la poblacion negativa para ALDEFLUOR. B-M. La poblacion positiva para ALDEFLUOR presento potencial metastasico aumentado. B-D. Cuantificacion del flujo de fotones normalizado medido a intervalos semanales tras la inoculation de 100.000 celulas infectadas con luciferasa de cada grupo (positivas para ALDEFLUOR, negativas para ALDEFLUOR, no separadas). E-J Detection de metastasis utilizando el software de obtencion de de imagenes de bioluminiscencia (E, G, I: ratones boca abajo; F, H, J: ratones boca arriba). Los ratones en los que se inocularon celulas positivas para ALDEFLUOR desarrollaron varias metastasis localizadas en diferentes sitios (hueso, musculo, pulmon, tejido blando) y presentaron una emision de flujo de fotones mayor que los ratones en los que se inocularon celulas no separadas, que desarrollaron no mas de una metastasis por raton. En cambio, los ratones en los que se inocularon celulas negativas para ALDEFLUOR desarrollaron solo una metastasis pequefia ocasional, que se limitd a los ganglios linfaticos. K-M. Confirmation histologica, mediante tincion de H&E, de la metastasis en hueso (K), tejido blando (L) y musculo (M) que resulta de la inyeccion de celulas positivas para ALDEFLUOR.

La figura 5 muestra el efecto de inhibicidn de CXCR1 sobre la viabilidad de celulas tumorales (figura 5A) asi como sobre la viabilidad celulas madre de cancer (figura 5B).

La figura 6 muestra que el tratamiento con repertaxina induce un efecto inespecifico mediado por la serialization de FAS/ligando FAS, y muestra especificamente que la inhibicidn del crecimiento celular inducida por el tratamiento con repertaxina se rescataba parcialmente mediante la adicion de un antagonista de FAS y que las celulas tratadas con un agonista de FAS presentaron una inhibicidn de crecimiento celular similar que las celulas tratadas con repertaxina.

La figura 7 muestra la activacion de la activacion de FAK, AKT y FOXOA3 sin tratamiento con repertaxina (7A) y en presencia de repertaxina (7B).

La figura 8 muestra el efecto de repertaxina, docetaxel, o la combinacion de los mismos sobre una linea celular de cancer de mama (8A, SUM159) y tres xenoinjertos de cancer de mama humano generados a partir de diferentes pacientes (8B, MC1; 8C, UM2; y 8D, UM3).

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La figura 9 muestra el efecto de repertaxina, docetaxel, o el tratamiento de combinacion sobre la poblacion de celulas madre de cancer tal como se evaluo mediante el ensayo ALDEFLUOR sobre diversas llneas celulares incluyendo SUM159 (9A), MC1 (9B), UM2 (9C), UM3 (9D).

La figura 10 muestra el efecto de repertaxina, docetaxel o la combinacion sobre diluciones en serie de tumores primarios (10A. SUM159, 10B. MC1, 10C. UM2, 10D. UM3) que se implantaron en la almohadilta adiposa mamaria de ratones NOD-SCID secundarios.

La figura 11 muestra que el tratamiento con repertaxina reduce el potencial metastasico de linea celular SUM159. La figura 11A muestra una cuantificacion del flujo de fotones normalizado medido a intervalos semanales tras la inoculacion con celulas SUM159 administradas intracardiacas. Se monitorizo la formacion de metastasis usando obtencion de imagenes de bioluminiscencia (11B: Ratones tratados con solution salina; 11C: Ratones tratados con repertaxina).

La figura 12 muestra representaciones del solapamiento entre la subpoblacion positiva para ALDEFLUOR y la subpoblacion positiva para CXCR1 (parte superior) o subpoblacion positiva para CXCR2 (parte inferior) de celulas SUM159. B-C. Se cultivaron celulas SUM159 en condiciones adherentes y se trataron con repertaxina (100 nM) o dos anticuerpos bloqueantes especificos para CXCR1 (10 pg/ml) o CXCR2 (10 pg/ml). Tras tres dias, se analizo el efecto sobre la poblacion de celulas madre de cancer usando el ensayo ALDEFLUOR (B). Se accedio a la viabilidad celular tras cinco dias de tratamiento usando el ensayo MTT (C). Se observo una reduccion significativa de la poblacion positiva para ALDEFLUOR y la viabilidad celular tras el tratamiento con repertaxina o anticuerpo anti- CXCR1. En cambio no se observo ningun efecto significativo con anticuerpo anti-CXCR2. D. Tras 4 dias de tratamiento, se evaluo el numero de celulas apoptoticas utilizando un ensayo TUNEL. Se detectaron el 36% de celulas apoptoticas (tenidas de verde) en celulas tratadas con repertaxina en comparacion con los controles donde estaban presentes celulas viables en su mayoria (tenidas de azui). E-F. Para determinar si la muerte celular estaba mediada por medio de un efecto inespecifico. Se clasificaron por flujo poblaciones positivas para CXCR1 y negativas para CXCR1 y se trato cada poblacion con diversas concentraciones de repertaxina (D). Se detecto una disminucion en la viabilidad celular en poblaciones positivas para CXCR1 y no clasificadas mientras que no se observo ningun efecto en la poblacion negativa para CXCR1 (E). Se utilize medio acondicionado dializado (dCM) a partir de celulas positivas para CXCR1 tratadas durante tres dias con repertaxina para tratar poblaciones positivas para CXCR1, negativas para CXCR1 clasificadas o no clasificadas. Se utilizaron diluciones en serie de medio acondicionado dializado (control, dCM 1/4, dCM 1/2, dCM 3/4, dCM). Tras dos dias de tratamiento, se evaluo la viabilidad celular utilizando el ensayo MTT. Se observo una disminucion masiva en la viabilidad celular en poblaciones tanto negativas para CXCR1 como no separadas mientras que no se observo ningun efecto en la poblacion positiva en CXCR1 (F).

La figura 13 muestra la tumorigenicidad de las poblaciones de celulas positivas para ALDEFLUOR/positivas para CXCR1 y positivas para ALDEFLUOR/negativas para CXCR1 a partir de la linea celular SUM159. A. Se representaron graficamente curvas de crecimiento tumoral para diferentes numeros de celulas inyectadas (50,000 cblulas, 5.000 celulas, 1.000 celulas y 500 celulas) y para cada poblacion (positiva para ALDEFLUOR/positiva para CXCR1, positiva para ALDEFLUOR/negativa para CXCR1). Ambas poblaciones celulares generaron tumores. La cinetica de crecimiento tumoral se correlacionaba con la latencia y el tamafio de la formacion tumoral y el numero de celulas inyectadas. B-C. Tumores generados por la poblacion positiva para ALDEFLUOR/positiva para CXCR1 reconstituyeron la heterogeneidad fenotipica del tumor inicial tras pases en serie mientras que la poblacion positiva para ALDEFLUOR/negativa para CXCR1 dio lugar a tumores que contenian solo celulas positivas para ALDEFLUOR/negativas para CXCR1. Se trasplantaron ambas poblaciones celulares durante tres pases.

La figura 14 muestra el efecto del bloqueo de CXCR1 sobre la formacion de tumoresferas. Se cultivaron celulas SUM159 y HCC1954 en condiciones adherentes y se trataron durante tres dias con repertaxina (100 nM), un anticuerpo bloqueante de anti-CXCR1 (10 pg/ml) o un anticuerpo bloqueante de anti-CXCR2 (10 pg/ml). Tras tres dias de tratamiento, se desprendieron las celulas y se cultivaron en suspension. Se evaluaron el numero de tumoresferas formadas tras 5 dias de cultivo. Se observaron resultados similares para ambas lineas celulares con una disminucion significativa en la formacion de tumoresferas primarias y secundarias en las condiciones de repertaxina y tratadas con anti-CXCR1 en comparacion con los controles. En cambio, el anticuerpo bloqueante anti- CXCR2 no tuvo ningun efecto sobre la formacion de tumoresferas.

La figura 15 muestra el efecto del tratamiento con repertaxina sobre la viabilidad celular de las lineas celulares SUM159, HCC1954 y MDA-MB-453. Se cultivaron tres lineas celulares diferentes (SUM159, HCC1954, MDA-MB- 453) en condiciones adherentes y se trataron con repertaxina (100 nM). Se evaluo las viabilidad celular tras uno, tres y cinco dias de tratamiento usando el ensayo MTT, Se observo una disminucibn en la viabilidad celular tras 3 dias de tratamiento para la linea celular SUM159 y HCC1954. Sin embargo, la repertaxina no tuvo ningun efecto sobre la viabilidad de celulas MDA-MB 453.

La figura 16 muestra el efecto del bloqueo de CXCR1 sobre la poblacion positiva para ALDEFLUOR in vitro. A-B. Se cultivaron celulas FICC1954 (A) y MDA-MB-453 (B) en condiciones adherentes y se trataron con repertaxina (100 nM) o dos anticuerpos bloqueantes especificos para CXCR1 (10 pg/ml) o CXCR2 (10 pg/ml), Tras tres dias, se analizo el efecto sobre la poblacion de celulas madre de cancer usando el ensayo ALDEFLUOR. Para HCC1954, se observo una reduccion significativa de la poblacion positiva para ALDEFLUOR y viabilidad celular tras el tratamiento

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con repertaxina o anticuerpo anti-CXCR1. En cambio no se observo ningun efecto significativo con anticuerpo anti- CXCR2 (A). Para MDA-MB-453, no se observo ningun efecto sobre la poblacion positiva para ALDEFLUOR (B).

La figura 17 muestra que el tratamiento con repertaxina induce un efecto inespecifico mediado por senalizacion de FAS/ligando FAS. A. Para determinar si el efecto de destruction inespecifico inducido por el tratamiento con repertaxina estaba mediado por ligando FAS, se midio el nivel de ligando FAS soluble en el medio utilizando un ensayo ELISA. Tras 4 dias de tratamiento, se detecto un aumento mayor de cuatro veces de ligando FAS soluble en el medio de celulas tratadas con repertaxina en comparacion con los controles no tratados. B. Se midio el nivel de ARNm de ligando FAS mediante RT-PCR y se confirmo el aumento de production de ligando FAS tras el tratamiento con repertaxina. Se observaron resultados similares tras 4 dias de tratamiento con un agonista de FAS que activa la senalizacion de FAS, con un aumento de cinco veces del ARNm de ligando FAS en comparacion con el control. C. Se cultivaron celulas SUM 159 en condiciones adherentes y se trataron con repertaxina sola o en combinacion con un anticuerpo anti-ligando FAS. Se rescato parcialmente la inhibicion del crecimiento celular inducida por el tratamiento con repertaxina mediante la adicion de anticuerpo anti-ligando FAS. Las celulas tratadas con un agonista de FAS presentaron una inhibicion de crecimiento celular similar a las celulas tratadas con repertaxina sola, D-E. Se analizo el efecto del tratamiento con repertaxina sola o en combinacion con un anticuerpo anti-ligando FAS y el tratamiento de un agonista de FAS sobre la poblacion positiva para CXCR1 y positiva para ALDEFLUOR. No se rescato la disminucion masiva en la poblacion positiva para CXCR1 y positiva para ALDEFLUOR inducida por tratamiento con repertaxina mediante el anticuerpo anti-ligando FAS y el tratamiento con agonista de FAS produjo un aumento de diez veces y de tres veces en el porcentaje de la poblacion positiva para CXCR1 y positiva para ALDEFLUOR, respectivamente.

La figura 18 muestra el efecto de agonista de FAS sobre celulas positivas para CXCR1 y negativas para CXCR1. Se clasificaron por flujo poblaciones positivas para CXCR1 y negativas para CXCR1 y se trato cada poblacion con diversas concentraciones de agonista de FAS. Se detecto una disminucion en la viabilidad celular en poblaciones negativas para CXCR1 y no clasificadas mientras que no se observo ningun efecto en la poblacion positiva para CXCR1.

La figura 19 muestra el analisis de la expresion de proteina CXCR1 en la poblacion madre/progenitora de mama normal y el efecto del tratamiento con IL-8 sobre la formacion de mamosferas. A. Se aislo la poblacion positiva y negativa para ALDEFLUOR de celulas epiteliales de mama normales aisladas de mamoplastias de reduccion mediante FACS, se fijaron y se analizaron para determinar la expresion de proteina de CXCR1 mediante inmunotincion y analisis FACS. Las celulas positivas para ALDEFLUOR estaban altamente enriquecidas en celulas positivas para CXCR1 en comparacion con la poblacion negativa para ALDEFLUOR. B-C. Efecto del tratamiento con IL8 sobre la formacion de mamosferas. El tratamiento con IL8 aumento la formacion de mamosferas primarias (B) y segundarias (C) de manera dependiente de la dosis.

La figura 20 muestra el efecto del tratamiento con repertaxina sobre las celulas epiteliales mamarias normales. A. Se cultivaron celulas epiteliales mamarias normales aisladas de mamoplastias de reduccion en condicion adherente y se trataron con repertaxina (100 nM o 500 nM) o agonista de FAS (500 ng/ml). Tras cinco dias de tratamiento se evaluo la viabilidad celular usando ensayo MTT. El tratamiento con repertaxina o el agonista de FAS no tuvo ningun efecto sobre la viabilidad de celulas epiteliales mamarias normales cultivadas en condiciones adherentes, incluso cuando se utilizaron altas concentraciones de repertaxina (500 nM). B. Se evaluo el nivel de ligando FAS soluble mediante ensayo Elisa en el medio de celulas epiteliales mamarias normales tratadas con repertaxina. Tras 4 dias de tratamiento se detecto un aumento de ligando FAS soluble en el medio de celulas tratadas. C. Analisis de la expresion de FAS/CD95 en las celulas epiteliales mamarias normales mediante analisis FACS. No se detecto expresion de FAS/CD95 en las celulas epiteliales mamarias normales cultivadas en condicion adherente. D. Efecto del tratamiento con repertaxina sobre la formacion de mamosferas. Se cultivaron celulas epiteliales mamarias normales en condicion adherente y se trataron durante cuatro, ocho, once y quince dias con repertaxina (100 nM). Tras el tratamiento con repertaxina se desprendieron las celulas y se cultivaron en suspension. Se observo una disminucion significativa de celulas iniciadoras de mamosferas en la condicion tratada con repertaxina.

La figura 21 muestra el efecto del tratamiento con repertaxina sobre la activacion de FAK, AKT y FOX03a. Para evaluar el efecto del tratamiento con repertaxina sobre la senalizacion posterior de CXCR1, se utilizaron dos constructos virales diferentes, uno que desactiva la expresion de PTEN por medio de un PTEN-ARNip y el otro que conduce a sobreexpresion de FAK (Ad-FAK). A. se cultivaron celulas SUM159 control, SUM159 PTEN-ARNip y SUM159 Ad-FAK en condiciones adherentes durante dos dias en ausencia o presencia de repertaxina 100 nM y se accedio a la activacion de la ruta de FAK/AKT mediante analisis de tipo Western. El tratamiento con repertaxina condujo a una disminucion en la fosforilacion FAK Tyr397 y AKT Ser473 mientras que la deletion de PTEN y la sobreexpresion de FAK bloquearon el efecto del tratamiento con repertaxina sobre la actividad de FAK y AKT. B. Utilizando tincion por inmunofluorescencia sobre celulas positivas para CXCR1, se confirmo que el tratamiento con repertaxina da como resultado una desaparicion de la expresion fosfo-FAK (tincion de membrana en rojo) y fosfo- AKT (tincion citoplasmatica en rojo). La tincion por inmunofluorescencia con un anticuerpo anti-FOX03A revelo una ubicacion citoplasmatica de FOX03a (en rojo) en las celulas no tratadas mientras que el tratamiento con repertaxina indujo una relocalizacion de FOX03A a! nucleo. En cambio, celulas con delecion de PTEN o sobreexpresion de FAK presentan un alto nivel de expresion fosfo-FAK, fosfo-AKT y FOX03A citoplasmatico en celulas tanto tratadas con repertaxina como no tratadas. En todas las muestras, se contratineron los nucleos con DAPI (en azul). C-D. Se

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evaluo el efecto de repertaxina sobre la viabilidad celular de SUM 159 PTEN-ARNip y SUM 159 Ad-FAK y sobre la poblacion de celulas madre de cancer utiiizando los ensayos MTT y ALDEFLUOR, respectivamente. Tras 3 dlas de tratamiento, las celulas con delecion de PTEN o sobreexpresion de FAK desarrollaron resistencia a repertaxina (C). El tratamiento con repertaxina no altero la proporcion de celulas con desactivacion de PTEN SUM159 positivas para ALDEFLUOR. (D).

La figura 22 muestra el efecto del tratamiento con repertaxina sobre la activacion de FAK/AKT en las iineas celulares HCC1954 y MDA-MB-453. Para evaluar el efecto de! tratamiento con repertaxina sobre la serialization posterior de CXCR1 se utilizo un constructo lentiviral que desactiva la expresion de PTEN por medio de un PTEN-ARNip A. Se cultivaron celulas HCC1954 de control y PTEN-ARNip HCC1954 en condiciones adherentes durante dos dias en ausencia o presencia de repertaxina 100 nM y se accedio a la activacibn de la ruta de FAK/AKT mediante analisis de tipo Western. E! tratamiento con repertaxina condujo a una disminucion de la fosforilacion de FAK Tyr397 y AKT Ser473 mientras que la delecion de PTEN bloqueo el efecto del tratamiento con repertaxina sobre la actividad de FAK y AKT. B. El tratamiento con repertaxina no tuvo ningim efecto sobre la viabilidad celular de la linea celular MDA-MB-453 que alberga la mutation de PTEN. Utiiizando un analisis de tipo Western se confirmo que la ruta de FAK/AKT no se perturbaba por el tratamiento con repertaxina,

La figura 23 muestra el efecto de la repertaxina sobre la viabilidad celular de HCC1954 PTEN-ARNip, evaluada utiiizando el ensayo MTT. Tras 3 dias de tratamiento, las celulas con delecion de PTEN desarrollaron resistencia a repertaxina.

La figura 24 muestra la expresion del ligando FAS y ARNm de IL-8 tras el tratamiento con docetaxei o repertaxina medida mediante RT-PCR cuantitativa. A-B. Se trataron celulas SUM159 cultivadas en condition adherente con repertaxina (100 nM), agonista de FAS (500 ng/ml) o docetaxei (10 nM). Tras tres dias de tratamiento se recogieron las celulas y se extrajo el ARN. E! docetaxei indujo tanto ligando FAS (A) como ARNm de IL-8 (B) en celulas SUM159. Se detecto un aumento de 4 veces del nivel de ARNm de IL-8 tras el tratamiento con agonista de FAS o docetaxei (B).

La figura 25 muestra la evaluation de la activacion de PTEN/FAK/AKT en los tres xenoinjertos de cancer de mama diferentes. El analisis de tipo Western revelo que ambos xenoinjertos presentaban una expresion de PTEN y una activacion de la ruta de FAK/AKT tal como se muestra mediante la fosforilacion de FAK Tyr397 y AKT Ser473.

La figura 26 muestra el efecto del tratamiento con repertaxina sobre la poblacion de celulas madre de cancer de mama in vivo. A-C. Para evaluar el efecto del tratamiento con repertaxina sobre el crecimiento tumoral y la poblacion de celulas madre de cancer in vivo se utilizaron una linea celular de cancer de mama (SUM 159) y tres xenoinjertos de cancer de mama humano generados a partir de pacientes diferentes (MC1, UM2, UM3). A. Para cada muestra, se inyectaron 50.000 celulas en la almohadilla adiposa mamaria humanizada de ratones NOD/SCID y se monitorizo el tamano tumoral. Cuando los tumores eran de aproximadamente 4 mm, se initio la inyeccion s.c. de repertaxina (15mg/kg) dos veces/dia durante 28 dias o la inyeccion i.p. una vez/semana de docetaxei (10 mg/kg) o la combination (repertaxina/docetaxel). El grafico muestra el tamano tumoral antes y durante el transcurso de cada tratamiento indicado (flecha, comienzo del tratamiento). Se observaron resultados similares para cada muestra con una reduccion estadisticamente significativa del tamano tumoral en grupos tratados con docetaxei solo o combinacion de repertaxina/docetaxel en comparacion con el control, mientras que no se observo ninguna diferencia entre el crecimiento de los tumores de control y los tumores tratados con repertaxina sola. BC. Evaluacion de repertaxina, docetaxei, o el tratamiento combinado sobre la poblacion de celulas madre de cancer tal como se evaluo mediante el ensayo ALDEFLUOR (B) y mediante reimplantation en ratones secundarios (C). Los xenoinjertos de tumor tratados con docetaxei mostraron un porcentaje aumentado o similar de celulas positivas para ALDEFLUOR en comparacion con el control, mientras que el tratamiento con repertaxina sola o en combinacion con docetaxei produjo una disminucion estadisticamente significativa de celulas positivas para ALDEFLUOR con una disminucion del 65% al 85% de celulas madre de cancer en comparacion con el control (p<0,01) (B). Se implantaron diluciones en serie de celulas obtenidas de tumores primarios, ratones no tratados (control) y tratados en la almohadilla adiposa mamaria de ratones NOD/SCID secundarios que no recibieron tratamiento adicional. Los tumores primarios de control y tratados con docetaxei formaron tumores secundarios en todas las diluciones mientras que solo un numero superior de celulas obtenidas de tumores primarios tratados con repertaxina o en combinacion con docetaxei pudieron formar tumores. Ademas, el crecimiento tumoral se retraso significativamente y los tumores resultantes eran significativamente mas pequenos en tamano que los tumores de control o tratados con docetaxei (C). D. Se recogieron los xenotrasplantes de cada grupo y se realizo tincion por inmunohistoquimica para detectar la expresion de fosfo-FAK, fosfo-AKT, FOX03A y ALDH1. Se detecto la expresion de fosfo-FAK de membrana y la expresion de fosfo-AKT citoplasmatica (flecha) en los tumores de control y tratados con docetaxei mientras que no se detecto expresion en los tumores tratados con repertaxina sola o en combinacion con docetaxei. Se detecto expresion de F0X03A nuclear (en marron) en las celulas tratadas con docetaxei o repertaxina sola o en combinacion. Se detecto una disminucion de la expresion de ALDH1 (flecha) en tumores tratados con repertaxina sola o en combinacion en comparacion con tumores de control y tratados con docetaxei.

La figura 27 muestra el efecto del tratamiento con repertaxina sobre la poblacion de celulas madre de cancer de mama in vivo. A-C. Para evaluar el efecto del tratamiento con repertaxina sobre el crecimiento tumoral y la poblacion de celulas madre de cancer in vivo, una linea celular de cancer de mama (SUM 159, A) y tres xenoinjertos de cbncer

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de mama humano generados a partir de pacientes diferentes, Para cada muestra, se inyectaron 50.000 celulas en la almohadilla adiposa mamaria humanizada de ratones NOD/SCID y se monitorizo el tamano tumoral. Cuando los tumores eran de aproximadamente 4 mm, se inicio la inyeccion s.c. de repertaxina (15 mg/kg) dos veces/dia durante 28 dias o inyeccion i.p. una vez/semana de docetaxel (10 mg/kg) o la combinacion (repertaxina/docetaxel). El grafico muestra el tamano tumoral antes y durante el transcurso de cada tratamiento indicado (flecha, comienzo del tratamiento). Se observaron resultados similares para cada muestra con una reduccion estadisticamente significativa del tamano tumoral en grupos tratados con docetaxel solo o combinacion de repertaxina/docetaxel en comparacion con el control, mientras que no se observo diferencia entre el crecimiento de los tumores de control y los tumores tratados con repertaxina sola. La evaluacion de repertaxina, docetaxel, o el tratamiento combinado sobre la poblacion de celulas madre de cancer se evaluo mediante el ensayo ALDEFLUOR y mediante reimplantation en ratones secundarios. Los xenoinjertos de tumor tratados con docetaxel mostraron un porcentaje aumentado o similar de celulas positivas para ALDEFLUOR en comparacion con el control, mientras que el tratamiento con repertaxina sola o en combinacion con docetaxel produjo una disminucion estadisticamente significativa en celulas positivas para ALDEFLUOR con una disminucion del 65% al 85% en celulas madre de cancer en comparacion con el control (p<0,01). Se implantaron diluciones en serie de celulas obtenidas de tumores primarios, ratones no tratados (control) y tratados en la almohadilla adiposa mamaria de ratones NOD/SCID secundarios que no recibieron tratamiento adicional, Los tumores primarios de control y tratados con docetaxel formaron tumores secundarios en todas las diluciones mientras que solo numeros superiores de celulas obtenidas de tumores primarios tratados con repertaxina o en combinacion con docetaxel pudieron formar tumores. El crecimiento tumoral se retraso significativamente y los tumores resultantes eran significativamente mas pequefios en tamano que los tumores de control o tratados con docetaxel.

La figura 28 muestra el efecto del tratamiento con repertaxina sobre la poblacion de celulas madre de cancer de mama tal como se evaluo mediante el fenotipo CD44+/CD24-. A-B. La evaluacion de repertaxina, docetaxel, o el tratamiento combinado sobre la poblacion de celulas madre de cancer se evaluo mediante la presencia de celulas CD44+/CD24-. En los tumores residuales tratados con docetaxel solo, se observo de manera sistematica un porcentaje o bien sin cambios o bien aumentado de celulas CD44+/CD24- mientras que el tratamiento con repertaxina sola o en combinacion con docetaxel dio como resultado una reduccion de la poblacion de celulas CD44+/CD24-. A. Se presenta un analisis de diagrama de flujo para el xenoinjerto UM3. B, Se observaron resultados similares para MC1, UM2 y UM3. Casi todas las celulas SUM 159 son CD44+/CD24- en todas las condiciones de tratamiento.

La figura 29 muestra que el tratamiento con repertaxina reduce el desarrollo de metastasis sistemica. Para evaluar el efecto del tratamiento con repertaxina sobre la formation de metastasis en lineas celulares de cancer de mama HCC1954 (A), SUM159 (B), MDA-MB-453 (C) se infectaron con un lentivirus que expresaba luciferasa y se inocularon 250.000 celulas infectadas con luciferasa en ratones NOD/SCID por medio de inyeccion intracardiaca. Se trataron los ratones 12 horas tras la inyeccion intracardiaca o bien con inyeccidn s.c. de solution salina o bien con inyeccion s.c. de repertaxina (15 mg/kg), dos veces al dia durante 28 dias. Se monitorizo la formacion de metastasis usando obtencion de imagenes de bioluminiscencia. La cuantificacion del flujo de fotones normalizado medido a intervalos semanales tras la inoculation revelo una disminucion estadisticamente significativa de la formacion de metastasis en repertaxina en comparacion con los controles de solucion salina para ratones en los que se inocularon celulas HCC1954 o SUM159 (A-B). En cambio, el tratamiento con repertaxina no tuvo ningiin efecto sobre la formacidn de metastasis para los ratones en los que se inyectaron celulas MDA-MB-453. (C). Confirmacion histologica, mediante tincion de H&E, de metastasis en hueso y tejido blando resultante de ratones no tratados por repertaxina (D).

La figura 30 muestra la senalizacion de IL-8/CXCR1 en celulas madre de cancer tratadas con quimioterapia sola o en combinacion con repertaxina. A. Representation de la posible senalizacion celular de IL-8/CXCR1 en celulas madre de cancer. La activacion de CXCR1 tras la union a IL-8 induce fosforilacion de la cinasa de adhesion focal (FAK). La FAK activa fosforila AKT y activa la ruta de WNT, que regula la autorrenovacion de celulas madre y FOX03A que regula la supervivencia celular. La activacion de FAK protege a las celulas madre de cancer de un efecto inespecifico mediado por FAS/iigando FAS inhibiendo FADD, un efector posterior de la senalizacion de FAS. En presencia de quimioterapia, solo las celulas tumorales a granel son sensibles al tratamiento y liberan un alto nivel de proteinas de ligando FAS e IL-8 durante el proceso apoptotico. Las celulas madre de cancer de mama se estimulan por medio de un efecto inespecifico mediado por IL-8 y son resistentes al efecto de destruccion inespecifico mediado por medio de ligando FAS. B. El tratamiento con repertaxina bloquea la senalizacion de IL- 8/CXCR1 e inhibe la autorrenovacion y supervivencia de celulas madre de cancer de mama. Cuando se combina el tratamiento con repertaxina con quimioterapia las celulas madre de cancer se sensibilizan al efecto de destruccion inespecifico mediado por ligando FAS.

Definiciones

Para facilitar la comprension de la presente invention, se definen a continuation varios terminos y frases.

Tal como se usa en el presente documento, los terminos “agente anticancerigeno”, “agente anticancerigeno conventional”, o “farmaco terapeutico contra el cancer” se refieren a cualquier agente terapeutico (por ejemplo, compuestos quimioterapicos y/o compuestos terapeuticos moleculares), radioterapias o intervenciones quirurgicas,

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usados en el tratamiento del cancer (porejemplo, en mamiferos).

Tal como se usa en el presente documento, los terminos "farmaco" y “agente quimioterapico” se refieren a moleculas farmacologicamente activas que se usan para diagnosticar, tratar o prevenir enfermedades o estados patologicos en un sistema fisioldgico (por ejemplo, un sujeto, u organos, tejidos y celulas in vivo, in vitro o ex vivo). Los farmacos actuan alterando la fisiologia de una celula, tejido, organismo vivo, o sistema in vitro al que se le ha administrado el farmaco. Se pretende que los terminos “farmaco’’ y "agente quimioterapico” abarquen compuestos antihiperproliferativos y antineoplasicos asi como otros compuestos biologicamente terapeuticos.

Una “cantidad eficaz” es una cantidad suficiente para lograr resultados deseados o beneficiosos. Puede administrarse una cantidad eficaz en una o mas administraciones.

Tal como se usa en el presente documento, el termino “administracion” se refiere al acto de proporcionar un farmaco, profarmaco, anticuerpo, u otro agente, o tratamiento terapeutico a un sistema fisiologico (por ejemplo, un sujeto u organos, tejidos y celulas in vivo, in vitro o ex vivo). Vias de administracion a modo de ejemplo al cuerpo humano pueden ser a traves de los ojos (oftalmica), boca (oral), piel (transdermica), nariz (nasal), pulmones (por inhalation), mucosa bucal (bucal), oido, mediante inyeccion (por ejemplo, por via intravenosa, por via subcutanea, por via intratumoral, por via intraperitoneal, etc.) y similares.

"Coadministracion” se refiere a la administracion de mas de un agente quimico o tratamiento terapeutico (por ejemplo, radioterapia) a un sistema fisiologico (por ejemplo, un sujeto u organos, tejidos y celulas in vivo, in vitro o ex vivo). La “coadministracion” de los agentes quimicos respectivos (por ejemplo antagonista de la ruta de serialization de IL8-CXCR1 y agente quimioterapico adicional) puede ser concurrente, o en cualquier orden temporal o combination fisica.

Tal como se usa en el presente documento, el termino “regresion” se refiere al retorno de un organo, tejido, celula o sujeto enfermo a un estado no patologico o menos patologico en comparacion con el organo, tejido, celula o sujeto a modo de ejemplo no patogeno basal. Por ejemplo, la regresion de un tumor incluye una reduction de la masa tumoral asi como la desaparicion completa de un tumor o tumores.

Tal como se usa en el presente documento el termino, “in vitro" se refiere a un entorno artificial y a procedimientos o reacciones que tienen lugar dentro de un entorno artificial. Entornos in vitro pueden consistir en, pero no se limitan a, tubos de ensayo y cultivos celulares. El termino “in vivo” se refiere a! entorno natural (por ejemplo, un animal o una celula) y a procedimientos o reacciones que tienen lugar dentro de un entorno natural.

Tal como se usa en el presente documento, el termino “cultivo celular” se refiere a cualquier cultivo de celulas in vitro. Se incluyen dentro de este termino lineas celulares continuas (por ejemplo, con un fenotipo inmortal), cultivos celulares primarios, lineas celulares finitas (por ejemplo, celulas no transformadas), y cualquier otra poblacion celular mantenida in vitro, incluyendo ovocitos y embriones.

Tal como se usa en el presente documento, el termino “sujeto” o “paciente” se refiere a organismos que van a tratarse mediante los metodos de la presente invencion. Tales organismos incluyen, pero no se limitan a, seres humanos y animates domesticos (perros, gatos, caballos, cerdos, ganado, ovejas, cabras y similares). En el contexto de la invencion, el termino “sujeto” o “paciente” se refiere en general a un individuo que recibira o que ha recibido tratamiento.

El termino “diagnosticado”, tal como se usa en el presente documento, se refiere al reconocimiento de una enfermedad mediante sus signos y sintomas o analisis genetico, analisis patologico, analisis histologico y similares.

Tal como se usa en el presente documento, el termino “antisentido” se usa en referenda a secuencias de acido nucleico (por ejemplo, ARN, ADN de fosforotioato) que son complementarias a una secuencia de ARN especifica (por ejemplo, ARNm). Se incluyen dentro de esta definition moleculas de ARN antisentido naturales o sinteticas, incluyendo moleculas que regulan la expresion genica, tal como los ARN de interferencia pequehos o microARN. Un tipo de secuencia antisentido que puede emplearse por la presente invencion es el tipo que es especifico para ARNm de CXCR1.

El termino “compuesto de prueba” o “compuesto candidate” se refiere a cualquier entidad quimica, producto farmaceutico, farmaco, y similares, que puede usarse para tratar o prevenir una enfermedad, dolencia, afeccion o trastorno de la funcion corporal, o alteration de otro modo del estado fisiologico o celular de una muestra. Los compuestos de prueba comprenden compuestos terapeuticos tanto conocidos como potenciales. Un compuesto de prueba puede determinarse que va a ser terapeutico usando los metodos de examen de la presente invencion. Un “compuesto terapeutico conocido” se refiere a un compuesto terapeutico que ha mostrado (por ejemplo, a traves de ensayos en animates o experiencia anterior con administracion a seres humanos) que es eficaz en tal tratamiento o prevention. En realizaciones preferidas, “compuestos de prueba” son agentes anticancerigenos. En realizaciones particularmente preferidas, “compuestos de prueba” son agentes anticancerigenos que inducen apoptosis en celulas.

Tal como se usa en el presente documento, el termino “proteina de union a antigeno’’ se refiere a proteinas que se

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unen a un antigeno especifico. Las “proteinas de union a antigeno” incluyen, pero no se limitan a, inmunoglobulinas, incluyendo anticuerpos policlonales, monoclonales, quimericos, de cadena sencilla, y humanizados, fragmentos Fab, fragmentos F(ab’)2, y bibliotecas de expresion de Fab. Se usan diversos procedimientos conocidos en la tecnica para la produccion de anticuerpos policlonales. Para la produccion de anticuerpos, pueden inmunizarse diversos animales huesped por inyeccion con el peptido correspondiente al epitopo deseado incluyendo, pero sin limitarse a, conejos, ratones, ratas, ovejas, cabras, etc. En una realizacion preferida, el peptido se conjuga con un portador inmugenico (por ejemplo, toxoide difterico, albumina de suero bovina (BSA) o hemocianina de lapa californiana (KLH)). Se usan diversos adyuvantes para aumentar la respuesta inmunologica, dependiendo de la especie huesped, incluyendo, pero sin limitarse a, adyuvante de Freund (complete e incompleto), geles minerales tales como hidroxido de aluminio, sustancias activas de superficie tales como lisolecitina, polioles Pluronic, polianiones, peptidos, emulsiones oleosas, hemocianinas de lapa californiana, dinitrofenol, y adyuvantes humanos potencialmente utiles tales como BCG (Bacilo Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum.

Para la preparacion de anticuerpos monoclonales, puede usarse cualquier tecnica que proporcione la produccion de moleculas de anticuerpo mediante lineas celulares continuas en cultivo (vease por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Estas incluyen, pero no se limitan a, la tecnica de hibridoma desarroliada originalmente por Kohler y Milstein (Kohler y Milstein, Nature, 256:495-497 (1975)), asi como la tecnica de trioma, la tecnica de hibridoma de celulas B humanas (vease por ejemplo, Kozbor et al., Immunol. Today, 4:72 (1983)), y la tecnica de hibridoma de VEB para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pags. 77-96 (1985)).

Segun la invencion, pueden adaptarse tecnicas descritas para la produccion de anticuerpos de cadena sencilla (documento U.S. 4.946.778) para producir anticuerpos espectficos de cadena sencilla segun se desee. Una realizacion adicional de la invencion utiliza las tecnicas conocidas en la tecnica para la construccion de bibliotecas de expresion de Fab (Huse et al., Science, 246:1275-1281 (1989)) para permitir una identification rapida y sencilla de fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada.

Pueden generarse fragmentos de anticuerpo que contienen el idiotipo (region de union a antigeno) de la molecula de anticuerpo mediante tecnicas conocidas. Por ejemplo, tales fragmentos incluyen, pero no se limitan a: el fragmento F(ab’)2 que puede producirse mediante digestion con pepsina de una molecula de anticuerpo; los fragmentos Fab’ que pueden generarse reduciendo los puentes disulfuro de un fragmento F(ab’)2, y los fragmentos Fab que pueden generarse tratando una molecula de anticuerpo con papaina y un agente reductor.

Pueden aislarse genes que codifican para proteinas de union a antigeno mediante metodos conocidos en la tecnica. En la produccion de anticuerpos, puede realizarse examen para detectar el anticuerpo deseado mediante tecnicas conocidas en la tecnica (por ejemplo, radioinmunoensayo, ELISA (ensayo de inmunoabsocion ligado a enzimas), inmunoensayos de tipo “sandwich”, ensayos inmunorradiometricos, reacciones de precipitacion de difusion en gel, ensayos de inmunodifusion, inmunoensayos in situ (usando marcadores de oro coloidal, enzimaticos o radioisotopicos, por ejemplo), inmunotransferencias de tipo Western, reacciones de precipitacion, ensayos de aglutinacion (por ejemplo, ensayos de aglutinacion en gel, ensayos de hemaglutinacion, etc.), ensayos de fijacion al complemento, ensayos de inmunofluorescencia, ensayos de proteina A y ensayos de inmunoelectroforesis, etc.) etc.

Tal como se usa en el presente documento, el termino “modular" se refiere a la actividad de un compuesto que afecta (por ejemplo, promueve o retarda) a un aspecto de la funcion celular incluyendo, pero sin limitarse a, crecimiento celular, proliferation, invasion, angiogenesis, apoptosis y similares.

Descripcion detallada de la invencion

La presente invencion proporciona metodos de tratamiento del cancer administrando un inhibidor de la ruta de IL8- CXCR1 (por ejemplo, un anticuerpo anti-CXCR1 o repertaxina) en combination con un agente quimioterapico adicional de manera que se destruyan las celulas cancerosas tumorigenicas y no tumorigenicas en un sujeto. La presente invencion tambien trata de composiciones y metodos para diagnosticar la presencia de celulas madre de tumores solidos en un paciente (por ejemplo, basandose en la presencia de CXCR1 o FBX021).

I. Inhibition de celulas cancerosas tumorigenicas. ALDH, CXCR1 v CXCR1

La evolucibn de una celula normal a una completamente transformada requiere la desregulacion de multiples procesos celulares (1, 2). Segun los modelos clasicos de carcinogenesis, estos acontecimientos pueden producirse en cualquier celula. En cambio, la “hipotesis de celulas madre de cancer” sostiene que las dianas preferentes de transformation oncogenica son celulas progenitoras tempranas o madre de tejido que tienen potencial de autorrenovacion adquirido (3-6). Estas "celulas que inician tumores" o “celulas madre de cancer” (CSC), a su vez, se caracterizan por su capacidad para experimentar autorrenovacion, un proceso que dirige la tumorigenesis y la diferenciacion que contribuye a la heterogeneidad celular tumoral. Se han generado evidencias recientes que apoyan la hipotesis de celulas madre de cancer utilizando xenoinjertos de tumores humanos primarios. Estos estudios han sugerido que los tumores se componen de una jerarquia celular dirigida por el componente de celulas madre de cancer. Ademas, datos recientes sugieren que lineas celulares inmortalizadas derivadas de tejidos tanto

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murinos como humanos tambien pueden contener una poblacion celular que presenta propiedades de celulas tnadre. La mayoria de estos estudios se han basado en propiedades in vitro incluyendo formation de esferas clonogenicas, potenciales y potencial de diferenciacion en multiples linajes (7-10). Estudios mas limitados utilizando trasplante funcional de lineas celulares inmortalizadas en xenoinjertos tambien han sugerido la existencia de una jerarquia de este tipo. Estos estudios han utilizado en general la exclusion de colorante Hoechst para identificar la denominada “poblacion secundaria" (SP) (7, 9, 11). Ademas, tambien se han utilizado marcadores de superficie celuiar deftnidos usando xenoinjertos de tumor primarios tales como CD44 y CD133 para identificar poblaciones similares en lineas celulares establecidas (7, 8).

Tai como se describe en los ejemplos a continuation, se estudid la expresion del marcador de celulas madre aldehido deshidrogenasa (ALDH) en una serie de 33 lineas celulares derivadas de canceres de mama humanos y celulas de mama no transformadas. ALDH es un enzima detoxificante responsable de la oxidation de aldehidos intracelulares y se cree que desempeha un papel en la diferenciacion de celulas madre a traves del metabolismo de retinal a acido retinoico (12, 13). La actividad de ALDH tal como se evaluo mediante el ensayo ALDEFLUOR fluorescente se ha utilizado satisfactoriamente para aislar celulas madre de cancer en mieloma multiple y leucemia mieloide aguda (LMA) asi como de tumores cerebrales (14-16). Se demostrb recientemente que la actividad de ALDH puede utilizarse para aislar una subpoblacion de celulas que presentan propiedades de celulas madre de tejidos de mama humanos normales y carcinomas de mama (17). La poblacion positiva para ALDEFLUOR aislada del tejido de mamoplastia de reduction puede reconstituir estructuras alveolares ductales en almohadiilas adiposas mamarias de ratones NOD/SCID humanizados. Ademas, las celulas positivas para ALDEFLUOR aisladas de carcinomas mamarios humanos tienen propiedades de celulas madre tal como se demuestra por su capacidad para reconstituir tumores en pases en serie en ratones NOD/SCID asi como para generar la heterogeneidad fenotipica de los tumores iniciales (17). En los ejemplos mas adelante, se demuestra que la mayoria de lineas celulares de cancer de mama contienen una poblacion positiva para ALDEFLUOR con un perfil molecular distinto que presenta propiedades de celulas madre de cancer.

Tal como se describe en los ejemplos mas adelante, el trabajo realizado durante el desarrollo de las realizaciones de la presente invention identified CXCR1 (que es un receptor para la quimiocina inflamatoria IL8) como marcador de cdlulas madre de cancer. Solo las celulas dentro de la poblacion positiva para ALDEFLUOR expresaron CXCR1. Ademas, se demostro que este receptor desempeha un papel funcional porque IL8 recombinante puede aumentar la proportion de celulas madre en lineas celulares tal como se determino mediante los ensayos de formation de esferas y Aldefluor. Aunque se ha notificado que IL8 esta asociada con canceres de mama agresivos y es superior en el suero de mujeres con enfermedad metastasica, se cree que la presente invention es la primera que muestra un vinculo funcional entre IL8 y su receptor CXCR1 en celulas madre.

Tal como se describe ademas en los ejemplos mas adelante, se demostro que pueden seleccionarse como diana selectivamente celulas madre de cancer bloqueando el receptor CXCR1 en estas celulas, En un enfoque descrito en los ejemplos, se trataron lineas celulares de cancer de mama con anticuerpos monoclonales frente a CXCR1, pero no frente al otro receptor CXCR2 de IL8. Tal tratamiento selecciono como diana selectivamente celulas madre de cancer tal como se demostro por poblaciones positivas para Aldefluor reducidas, De manera notable, se encontro que aunque CXCR1 solo se expresa en un porcentaje muy pequeho de celulas (por ejemplo, menor del 1%), el bloqueo del receptor CXCR1 indujo muerte celular en la mayoria de las otras celulas cancerosas a pesar del hecho de que carezcan del receptor CXCR1. Se ha dilucidado la ruta molecular que media en los efectos de IL sobre celulas madre de cancer y explica este denominado “efecto inespecifico" de destruction de otras celulas. IL8 estimula la autorrenovacion de celulas madre uniendose a CXCR1, que a su vez activa la ruta de Fak de cinasa de adhesion focal. Esto da como resultado la activation de Akt que dirige la autorrenovacion de celulas madre. Cuando se bloquea esta ruta en las cblulas madre de cancer, la disminucibn de la serialization de Akt produce el secuestro citoplasmatico de los factores de transcription de Foxo dando como resultado una slntesis aumentada de ligando Fas. El ligando Fas se secreta a partir de celulas madre de cancer e induce muerte celular en celulas circundantes que contienen el receptor de Fas.

Aunque la presente invention no se limita a ningun mecanismo particular, y la comprension del mecanismo no es necesaria para poner en practica la presente invention, se cree que CXCR1 media en la autorrenovacion de celulas madre de cancer a traves de una ruta que implica Fak y Akt y que el bloqueo de esta ruta induce muerte celular en celulas madre de cancer asi como celulas tumorales circundantes, Como tal, en determinadas realizaciones, la presente invention proporciona composiciones y metodos para alterar la ruta de IL8-CXCR1 (por ejemplo, con anticuerpos anti-CXCR1, anticuerpos anti-FAK, u otros agentes) con el fin de tratar el cancer.

Puesto que IL8 es una quimiocina implicada en la inflamacion tisular, ha existido un interes previo en el desarrollo de inhibidores de la serialization de IL8. Se ha desarrollado un inhibidor de molecula pequeha, repartaxina, como agente antiinflamatorio para reducir potencialmente las complicaciones de infarto de miocardio y accidente cerebrovascular. Se ha introducido repartaxina en ensayos clinicos de fase I y fase II y ha mostrado poca toxicidad. Tal como se muestra en los ejemplos a continuation, la repartaxina (como anticuerpos anti-CXCR1) puede seleccionar como diana celulas madre de cancer asi como inducir apoptosis mediada por fas de ligando FAS mediante el efecto inespecifico en celulas circundantes. De manera importante, en xenoinjertos tumorales, la repartaxina potencia el efecto de la quimioterapia. Ademas, a diferencia de la quimioterapia, que destruye preferentemente las celulas diferenciadas en tumores dejando las celulas madre tumorales, la repartaxina puede

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seleccionar como diana celulas madre tumorales. Tal como se muestra en los ejemplos, esto se demostro por una disminucion de la poblacidn de Aldefiuor en tumores tratados con repartaxina y por la disminucion en la capacidad de estas celulas tumorales tratadas para formar tumores secundarios en ratones. Tambien se sometieron a prueba los efectos de la repartaxina sobre la capacidad para bloquear la metastasis. Se marcaron celulas tumorales con luciferasa y se inyectaron por via intracardiaca en un modelo de metastasis experimental. Al dia siguiente se introdujeron las celulas tumorales, a un grupo de animates se les aplico repartaxina sola y al otro no se le aplico tratamiento. La repartaxina redujo significativamente el desarrollo de metastasis.

La presente invencion identified el receptor CXCR1 de IL8 como una diana en el tratamiento de celulas madre de cancer. La repartaxina inhibidora de molecula pequena inhibe tanto CXCR1 como CXCR2. Los ejemplos demostraron que CXCR1 es el receptor mas importante en celulas madre de cancer. Ademas, los ejemplos indican que el fracaso de la quimioterapia citotoxica para tratar eficazmente canceres establecidos puede deberse no solo a la incapacidad de esta terapia para seleccionar como diana celulas madre de cancer, sino tambien al aumento documentado de secrecion de IL8 tras el tratamiento con quimioterapia citotoxica del tumor. Los presentes ejemplos indican que el uso de inhibidores de CXCR1 tiene efectos beneficiosos al poder seleccionar como diana especificamente celulas madre de cancer asi como bloquear la estimulacion por IL8 de estas celulas inducida por quimioterapia citotoxica.

La seleccion como diana de la ruta de IL8-CXCR1 no se limita al cancer de mama, sino que puede emplearse en cualquier tipo de cancer. Preferiblemente, el tipo de cancer tratado es uno en donde existan evidencias de produccion de IL8 aumentada (por ejemplo, conjuntamente con quimioterapia). Se ha mostrado que los agentes de quimioterapia regulan directamente la transcripcion de IL8 en celulas cancerosas. Paclitaxel aumenta la transcripcion y secrecion de IL8 en tineas celulares de cancer de ovarios, mama y pulmon (Uslu et al., 2005, Int. J. Gynecol. Cancer, 15:240-245; y Collins et al., 2000, Can. Imm. Immuno., 49:78-84). Ademas, la administracion de adriamicina y 5-fluoro-2’-desoxiuridina a celulas de cancer de mama (DeLarco et al., 2001, Can. Res, 61:2857-2861), la adicion de 5-FU a celulas de cancer oral (Tamatani et al., 2004, Int., J. Can., 108:912:921), la adicion de doxorubicina a celulas de cancer de pulmon de celulas pequenas (Shibakura et al., 2003, Int. J. Can., 103:380-386) y la administracion de dacarbazina a celulas de melanoma (Lev et al., 2003, Mol., Can. Ther., 2:753-763) dan todas como resultado expresion de CXCL8 aumentada. Como tal, en determinadas realizaciones, la presente invencion proporciona agentes para seleccionar como diana IL-CXCR1, en combinacion con agentes de quimioterapia (por ejemplo, tales como los mencionados en las referencias anteriores) para tratar a un sujeto con un tipo de cancer incluyendo, pero sin limitarse a, cancer de prostata, cancer de ovarios, cancer de mama, melanoma, cancer de pulmon de celulas no pequenas, Cctncer de pulmon de celulas pequenas y adenocarcinoma esofagico.

La presente invencion no se limita al tipo de cancer tratado y en su lugar incluye, pero no se limita a, fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogenico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, limfangiosarcoma, limfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, cancer pancreatico, cancer de mama, cancer de ovarios, cancer de prostata, carcinoma de celulas escamosas, carcinoma de celulas basales, adenocarcinoma, carcinoma de glanduias sudoriparas, carcinoma de glanduias sebaceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogenico, carcinoma de celulas renales, hepatoma, carcinoma de conducto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilms, cancer de cuello uterino, tumor testicular, carcinoma de pulmon, carcinoma de pulmon de celulas pequenas, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acustico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma y retinoblastoma.

II. Deteccion de marcadores de cancer de celulas madre de tumores solidos

En algunos casos, la presente solicited describe metodos para la deteccion de la expresion de marcadores de cancer de celulas madre (por ejemplo, CXCR1, FBX021, NFYA, NOTCH2, RAD51L1, TBP, y otras proteinas de la tabla 1). La expresion puede medirse directamente (por ejemplo, al nivel de ARN o proteina). La expresion puede detectarse en muestras de tejido (por ejemplo, tejido de biopsia). La expresion puede detectarse en fluidos corporates (por ejemplo, incluyendo pero sin limitarse a, plasma, suero, sangre completa, mucosidad y orina).

La presente solicitud describe ademas paneles y kits para la deteccion de marcadores. La presencia de un marcador de cancer de celulas madre puede usarse para proporcionar un pronostico a un sujeto. La informacion proporcionada tambien se usa para dirigir el ciclo de tratamiento. Por ejemplo, si se encuentra que un sujeto tiene un marcador indicativo de una celula madre de tumor (por ejemplo, CXCR1, FBX021, NFYA, NOTCH2, RAD51L1, TBP, y otras proteinas de la tabla 1), pueden comenzarse terapias adicionales (por ejemplo, radioterapias) en un punto anterior cuando es mas probable que sean eficaces (por ejemplo, antes de la metastasis). Ademas, si se encuentra que un sujeto tiene un tumor que no es sensible a una terapia determinada, pueden evitarse el gasto y la molestia de tales terapias.

La presente solicitud describe un panel para el analisis de una pluralidad de marcadores (por ejemplo, la combinacion de CXCR1 o FBX021 y al menos uno de CD44, CD24 y ESA). El panel permite el analisis simultaneo de marcadores multiples que se correlacionan con carcinogenesis y/o metastasis, Dependiendo del sujeto, los paneles pueden analizarse solos o en combinacion con el fin de proporcionar el mejor diagnostico y pronostico

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posible. Los marcadores para su inclusion en un panel se seleccionan mediante examen para determinar su valor predictivo usando cualquier metodo adecuado, incluyendo pero sin limitarse a, los descritos en los ejemplos ilustrativos mas adelante.

1. Detection de ARN

Pueden detectarse marcadores de cancer de celulas madre de tumores solidos midiendo la expresion de ARNm correspondiente en una muestra de tejido. La expresion de ARNm puede medirse mediante cualquier metodo adecuado, incluyendo pero sin limitarse a, los descritos a continuacion. El numero de registro para el acido nucleico de CXCR1 humano es NM_000634 (incorporado en el presente documento por referenda) y el numero de registro para FBX021 humano es NM_033624. Estas secuencias pueden usarse para disehar cebadores y sondas (asi como secuencias de ARNip).

En algunos casos, el ARN se detecta mediante analisis de transferencia de tipo Northern. El analisis de transferencia de tipo Northern implica la separacion de ARN y la hibridizacion de una sonda marcada complementaria.

En todavla casos adicionales, el ARN (o ADNc correspondiente) se detecta mediante hibridacion con una sonda de oligonucleotido). Estan disponibles una variedad de ensayos de hibridacidn que usan una variedad de tecnologias para la hibridacion y deteccion. Por ejemplo, en algunos casos, se utiliza el ensayo de TaqMan (PE Biosystems, Foster City, CA; veanse por ejemplo las patentes estadounidenses n.os 5.962.233 y 5.538.848, cada una de las cuales se incorpora en el presente documento por referenda). El ensayo se realiza durante una reaccion PCR. El ensayo de TaqMan aprovecha la actividad exonucleasa 5’-3’ de la ADN polimerasa AMPLITAQ GOLD. Se incluye una sonda que consiste en un oligonucleotido con un colorante indicador en 5’ (por ejemplo, un colorante fluorescente) y un colorante de extincion en 3’ en la reaccion PCR. Durante la PCR, si la sonda se une a su diana, la actividad nucleolitica 5’-3’ de la polimerasa AMPLITAQ GOLD escinde la sonda entre el colorante indicador y el de extincion. La separacion del colorante indicador del colorante de extincion da como resultado un aumento de la fluorescencia. La serial se acumula con cada ciclo de PCR y puede monitorizarse con un fluorimetro.

En aim otros casos, se usa PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR) para detectar la expresion de ARN. En RT- PCR, el ARN se convierte enzimaticamente en ADN complementario o “ADNc" usando una enzima transcriptasa inversa. Despues se usa el ADNc como molde para una reaccion PCR. Los productos de PCR pueden detectarse mediante cualquier metodo adecuado, incluyendo pero sin limitarse a, electroforesis en gel y tincion con una tincion especifica de ADN o hibridacion con una sonda marcada. En algunos casos, se utiliza PCR con transcriptasa inversa cuantitativa con mezclas normalizadas de moldes competitivos, metodo descrito en las patentes estadounidenses 5.639.606, 5.643.765 y 5.876.978.

2. Detection de protelna

La expresion genica de marcadores de cancer de celulas madre puede detectarse midiendo la expresion de la proteina o el polipeptido correspondiente (por ejemplo, CXCR1, FBX021, NFYA, NOTCH2, RAD51L1, TBP, y otras proteinas de la tabla 1). La expresion de proteina puede detectarse mediante cualquier metodo adecuado. En algunos casos, las proteinas se detectan mediante inmunohistoquimica. En otros casos, las proteinas se detectan mediante su union a un anticuerpo generado contra la proteina. E! numero de registro para la proteina CXCR1 humana es NP_000625 y el numero de registro para FBX021 humano es NP_296373. La generacion de anticuerpos se describe a continuacion.

La union a anticuerpo se detecta mediante tecnicas conocidas en la tecnica (por ejemplo, radioinmunoensayo, ELISA (ensayo de inmunoabsocidn ligado a enzimas), inmunoensayos de tipo “sandwich”, ensayos inmunorradiometricos, reacciones de precipitacion de difusion en gel, ensayos de inmunodifusion, inmunoensayos in situ (usando marcadores de oro coloidal, enzimaticos o radioisotopicos, por ejemplo), inmunotransferencias de tipo Western, reacciones de precipitacion, ensayos de aglutinacion (por ejemplo, ensayos de aglutinacion en gel, ensayos de hemaglutinacion, etc.), ensayos de fijacion al complemento, ensayos de inmunofluorescencia, ensayos de proteina A y ensayos de inmunoelectroforesis, etc.

La union a anticuerpo puede detectarse detectando un marcador sobre el anticuerpo primario. El anticuerpo primario puede detectarse detectando la union a un anticuerpo secundario o reactivo al anticuerpo primario. El anticuerpo secundario puede estar marcado. Se conocen muchos metodos en la tecnica para detectar la union en un inmunoensayo y estan dentro del alcance de la presente solicitud,

En algunos ejemplos, se utiliza un ensayo de deteccion automatizado. Los metodos para la automatization de los inmunoensayos incluyen los descritos en las patente estadounidenses 5.885.530, 4.981.785, 6.159.750 y 5.358.691. El analisis y la presentation de resultados tambien pueden automatizarse. Por ejemplo, puede utilizarse un software que genera un pronostico basandose en la presencia o ausencia de una serie de proteinas correspondientes a marcadores de cancer.

En otros aspectos, el inmunoensayo se describe en las patentes estadounidenses 5.599.677 y 5.672.480.

3. Tecnologia de microalineamientos de ADNc

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Los microalineamientos de ADNc se componen de multiples (habitualmente miles) de diferentes ADNc colocados {habitualmente usando un dispositivo de colocacion robotico) sobre ubicaciones conocidas sobre un soporte solido, tal como un portaobjetos para microscopio de vidrio. Los ADNc se obtienen normalmente mediante amplificacion por PCR de Insertos de biblioteca de pl&smidos usando cebadores complementarios a la parte de la estructura principal del vector del plasmido o al propio gen para genes donde se conoce la secuencia. Los productos de PCR adecuados para la production de microalineamientos tienen normalmente entre 0,5 y 2,5 kB de longitud. Pueden elegirse ADNc de longitud completa, etiquetas de secuencia expresada (EST), o ADNc elegidos aleatoriamente de cualquier biblioteca de interes. EST son ADNc parcialmente secuenciados tal como se describe, por ejemplo, en Hillier, et al., 1996, 6:807-828. Aunque algunos EST corresponden a genes conocidos, frecuentemente esta disponible muy poca o ninguna informacion con respecto a cualquier EST particular excepto para una pequena cantidad de secuencia en 3’ y/o 5’ y, posiblemente, el tejido de origen del ARNm del que se derivo el EST. Tal como apreciara un experto habitual en la tecnica, en general los ADNc contienen informacion de secuencia suficiente para identificar de manera unica un gen dentro del genoma humano. Ademas, en general los ADNc tienen una longitud suficiente para hibridarse, de manera selectiva, especifica o unica, con el ADNc obtenido del ARNm derivado de un unico gen en las condiciones de hibridacion del experimento.

En un experimento de microalineamiento tipico, se hibrida un microalineamiento con poblaciones de ARN, ADN o ADNc marcadas de manera diferencial derivadas de dos muestras diferentes. Los mas comunmente el ARN (o bien ARN total o bien ARN poli A+) se aisla de celulas o tejidos de interes y se transcribe de manera inversa para dar ADNc. El marcaje se realiza habitualmente durante la transcription inversa incorporando un nucleotido marcado en la mezcla de reaction. Aunque pueden usarse diversos marcadores, lo mas comunmente se conjuga el nucleotido con los colorantes fluorescentes Cy3 o Cy5. Por ejemplo, pueden usarse Cy5-dUTP y Cy3-dUTP. El ADNc derivado de una muestra (que representa, por ejemplo, un tipo de celula, tipo de tejido o condition de crecimiento particular) se marca con un fluoroforo mientras que el ADNc derivado de una segunda muestra (que representa, por ejemplo, un tipo de celula, tipo de tejido, o condicion de crecimiento diferente) se marca con el segundo fluoroforo. Cantidades similares de material marcado de las dos muestras se hibridan conjuntamente con el microalineamiento. En el caso de un experimento de microalineamiento en el que se marcan las muestras con Cy5 (que presenta fluorescencia roja) y Cy3 (que presenta fluorescencia verde), los datos primarios (obtenidos mediante barrido del microalineamiento usando un detector que puede detectar cuantitativamente la intensidad de fluorescencia) son razones de intensidad de fluorescencia (rojo/verde, R/G). Estas razones representan las concentraciones relativas de moleculas de ADNc que se hibridan con los ADNc representados en el microalineamiento y por tanto reflejan los niveles relativos de expresion del ARNm correspondiente a cada ADNc/gen representado en el microalineamiento.

Cada experimento de microalineamiento puede proporcionar decenas de miles de puntos de datos, cada uno de los cuales representa la expresion relativa de un gen particular en las dos muestras. La organization y el analisis apropiados de los datos es de suma importancia, y se han desarrollado diversos programas informaticos que incorporan herramientas estadisticas convencionales para facilitar el analisis de datos. Una base para organizar los datos de expresion genica es agrupar genes con patrones de expresion similar entre si en agrupaciones. Se describe un metodo para realizar el analisis de agrupamiento jerarquico y la presentation de datos derivados de experimentos de microalineamiento en Eisen et al., 1998, PNAS 95:14863-14868. Tal como se describe en el mismo, el agrupamiento puede combinarse con una representation grafica de los datos primarios en la que cada punto de datos se representa con un color que representa cuantitativa y cualitativamente ese punto de datos. Convirtiendo los datos de una tabla grande de numeros en un formato visual, este procedimiento facilita un analisis intuitivo de los datos. Pueden encontrarse informacion y detalles adicionales con respecto a las herramientas matematicas y/o el propio enfoque de agrupamiento, por ejemplo, en Sokal & Sneath, Principles of numerical taxonomy, xvi, 359, W. H. Freeman, San Francisco, 1963; Hartigan, Clustering algorithms, xiii, 351, Wiley, Nueva York, 1975; Pauli et al., 1989, J. Natl. Cancer Inst. 81:1088-92; Weinstein etal. 1992, Science 258:447-51; van Osdol et al., 1994, J. Natl. Cancer Inst. 86:1853-9; y Weinstein et al., 1997, Science, 275:343-9.

Se encuentran detalles adicionales de los metodos experimentales usados en la presente invention en el ejemplo mas adelante. Se encuentra informacion adicional que describe los metodos para fabricar y usar microalineamientos en la patente estadounidense n.° 5.807.522. Instrucciones para construir hardware microalineamiento (por ejemplo, alineadores y escaneres) usando partes comercialmente disponibles. Se encuentran comentarios adicionales de la tecnologia de microalineamiento y protocolos para preparar muestras y realizar experimentos de microalineamientos en, por ejemplo, DNA arrays for analysis of gene expression, Methods Enzymol, 303:179-205, 1999; Fluorescence- based expression monitoring using microarrays, Methods Enzymol, 306: 3-18, 1999; y M. Schena (ed ), DNA Microarrays: A Practical Approach, Oxford University Press, Oxford, R.U., 1999.

4. Analisis de datos

Puede usarse un programa de analisis basado en ordenador para traducir los datos sin procesar generados por el ensayo de detection (por ejemplo, la presencia, ausencia, o cantidad de un marcador o marcadores dados) en datos de valor predictivo para un medico. El medico puede acceder a los datos predictivos usando cualquier medio adecuado. Por tanto, la presente solicitud proporciona el beneficio adicional de que el medico, que probablemente no este entrenado en genetica o biologia molecular, no necesita entender los datos sin procesar. Los datos se presentan directamente al medico en su forma mas util. El medico puede entonces utilizar inmediatamente la informacibn con el fin de optimizar el cuidado del sujeto,

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La presente solicited contempla cuaiquier metodo que pueda recibir, procesar y transmits la informacion a y de los laboratories que realizan los ensayos, fuentes de informacion, personal medico y sujetos, Por ejemplo, puede obtenerse una muestra (por ejemplo, una biopsia o una muestra de suero u orina) de un sujeto y presentarse a un servicio de obtencion del perfil (por ejemplo, laboratorio clinico en una instalacion medica, empresa de obtencion de perfiles genomicos, etc ), localizado en cuaiquier parte del mundo (por ejemplo, en un pais diferente del pais en que reside el sujeto o donde se usa la informacion finalmente) para generar datos sin procesar. Cuando la muestra comprende un tejido u otra muestra biologica, el sujeto puede visitar un centro medico para que se obtenga la muestra y enviarla al centro de obtencidn de perfiles, o los sujetos pueden recoger la muestra ellos mismos y enviarla directamente al centro de obtencidn de perfiles. Cuando la muestra comprende informacion biologica determinada previamente, el sujeto puede enviar la informacion directamente al servicio de obtencion de perfiles (por ejemplo, puede escanearse una tarjeta de informacion que contiene la informacion mediante un ordenador y los datos transmitirse a un ordenador del centro de obtencion de perfiles usando un sistema de comunicacidn electronica). Una vez recibido por el servicio de obtencion de perfiles, se procesa la muestra y se produce un perfil (por ejemplo, datos de expresion), especifico para la informacion de diagnostico o pronostico deseada para el sujeto.

Los datos de perfil se preparan entonces en un formato adecuado para su interpretation por el medico encargado. Por ejemplo, en vez de proporcionar datos de expresion sin procesar (por ejemplo examinar varios marcadores), el formato preparado puede representar una evaluation de riesgo o diagnostico para el sujeto, junto con recomendaciones para las opciones de tratamiento particulares. Los datos pueden presentarse al medico mediante cuaiquier metodo adecuado. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el servicio de obtencion de perfiles genera un informe que el medico puede imprimir (por ejemplo, en el punto de asistencia) o presentarse al medico en un monitor de ordenador.

En algunos casos, la informacion se analiza en primer lugar en el punto de asistencia o en una instalacion regional. Los datos sin procesar se envian entonces a una instalacion de procesamiento central para su analisis adicional y/o para convertir los datos sin procesar en informacion util para un medico o paciente. La instalacion de procesamiento central proporciona la ventaja de privacidad (todos los datos se almacenan en una instalacion central con protocolos de seguridad uniformes), velocidad, y uniformidad del analisis de datos La instalacion de procesamiento central puede controlar entonces el destino de los datos tras el tratamiento del sujeto. Por ejemplo, usando un sistema de comunicacion electronica, la instalacion central puede proporcionar datos al medico, ei sujeto o investigadores.

En algunos casos, el sujeto puede acceder directamente a los datos usando el sistema de comunicacion electronica. El sujeto puede elegir intervention u orientation adicional basandose en los resultados. En algunas realizaciones, los datos se usan para su uso en investigation. Por ejemplo, los datos pueden usarse para optimizar ademas la inclusion o elimination de marcadores como indicadores utiles de un estado o estadio particular de la enfermedad.

5. Kits

En aim otros aspectos, la presente solicitud describe kits para la detection y caracterizacion de cancer (por ejemplo para detectar uno o mas de los marcadores, o para modular la actividad de un peptido expresado por uno o mas de los marcadores). Los kits pueden contener anticuerpos especlficos para un marcador de cancer, ademas de reactivos de detection y tampones. Los kits pueden contener reactivos especificos para la detection de ARNm o ADNc (por ejemplo, cebadores o sondas de oligonucleotido). Los kits pueden contener todos los componentes necesarios y/o suficientes para realizar un ensayo de detection, incluyendo todos los controles, directrices para realizar ensayos, y cuaiquier software necesario para el analisis y la presentation de los resultados.

Puede usarse un kit para someter a prueba para detectar la presencia de los polinucleotidos o proteinas. El kit puede comprender, por ejemplo, un anticuerpo para la detection de un polipeptido o una sonda para la detection de un polinucleotido, Ademas, el kit puede comprender una muestra de referencia o control; instrucciones para procesar muestras, realizar la prueba e interpretar los resultados; y tampones y otros reactivos necesarios para realizar la prueba. En otros casos el kit comprende pares de cebadores para detectar expresion de uno o mas de los genes de la firma de gen de celulas madre de tumores solidos. En otros casos el kit comprende un alineamiento de ADNc u oligonucleotido para detectar la expresidn de uno o mds de los genes de la firma de gen de celulas madre de tumores solidos.

6. Obtencidn de imagenes in vivo

Pueden usarse tecnicas de obtencion de imagenes in vivo para visualizar la expresion de marcadores de cancer en un animal (por ejemplo, un ser humano o mamifero no humano). Por ejemplo, puede marcarse ARNm de marcador de cancer (por ejemplo, ARNm de CXCR1 o FBX021) o proteina (por ejemplo, proteina CXCR1 o FBX021) usando un anticuerpo marcado especifico para el marcador de cancer, Puede detectarse un anticuerpo marcado y unido especificamente en un individuo usando un metodo de obtencion de imagenes in vivo, incluyendo, pero sin limitarse a, obtencion de imagenes de radionuclidos, tomografia por emision de positrones, tomografia axial computarizada, metodo de obtencion de imagenes de rayos X o resonancia magnetica, detection de fluorescencia y detection de quimioluminiscencia. A continuation se describen metodos para generar anticuerpos frente a los marcadores de cancer.

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Los metodos de obtencion de imageries in vivo son utiles para diagnosticar canceres que expresan los marcadores de cancer de celulas madre de tumores solidos. La obtencion de imagenes in vivo se usa para visualizar la presencia de un marcador indicativo del cancer. Tales tecnicas permiten diagnosticar sin el uso de una biopsia desagradable. Los metodos de obtencion de imagenes in vivo tambien son utiles para proporcionar pronosticos a pacientes con cancer. Por ejemplo, puede detectarse la presencia de un marcador indicativo de celulas madre de cancer. Los metodos de obtencion de imagenes in vivo de la presente invencion pueden usarse ademas para detectar canceres metastasicos en otras partes del cuerpo.

En algunos casos, los reactivos (por ejemplo, anticuerpos) especificos para CXCR1 o FBX021 se marcan fluorescentemente. Los anticuerpos marcados se introducen en un sujeto (por ejemplo, por via oral o por via parenteral), Los anticuerpos marcados fluorescentemente se detectan usando cualquier metodo adecuado (por ejemplo, usando el aparato descrito en la patente estadounidense 6.198.107).

En otros casos, los anticuerpos se marcan radioactivamente. El uso de anticuerpos para diagnostico in vivo se conoce bien en la tecnica. Sumerdon et al., (Nucl. Med. Biol 17:247-254 [1990] han descrito un quelante de anticuerpo optimizado para la obtencion de imagenes radioinmunoescintograficas de tumores usando indio-111 como marcador. Griffin et al., (J Clin One 9:631-640 [1991]) han descrito el uso de este agente en la deteccion de tumores en pacientes que se sospecha que tienen cancer pancreatico. El uso de agentes similares con iones paramagneticos como marcadores para obtencion de imagenes por resonancia magnetica se conoce en la tecnica (Lauffer, Magnetic Resonance in Medicine 22:339-342 [1991]). El marcador usado dependera de la modalidad de la obtencion de imagenes elegida. Pueden usarse marcadores radioactivos tales como indio-111, tecnecio-99m o yodo-131 para barridos pianos o tomografia computarizada por emision monofotonica (SPECT). Tambien pueden usarse marcadores que emiten positrones tales como fluor-19 para tomografia por emision de positrones (PET). Para MRI, pueden usarse iones paramagneticos tales como gadolinio (III) o manganeso (II).

Estan disponibles metales radioactivos con semividas que oscilan entre 1 hora y 3,5 dias para su conjugacion con anticuerpos, tales como escandio-47 (3,5 dias) galio-67 (2,8 dias), galio-68 (68 minutos), tecnecio-99m (6 horas), e indio-111 (3,2 dias), de los que son preferibles galio-67, tecnecio-99m e indio-111 para la obtencion de imagenes de camara gamma, galio-68 es preferible para tomografia por emision de positrones.

Un metodo util de marcaje de anticuerpos con tales radiometales es por medio de un agente quelante bifuncional, tal como acido dietilentriaminapentaacetico (DTPA), tal como se describe, por ejemplo, por Khaw et al. (Science 209:295 [1980]) para In-111 y Tc-99m, y por Scheinberg et al. (Science 215:1511 [1982]). Tambien pueden usarse otros agentes quelantes, pero el 1-(p-carboximetoxibencil)EDTA y el anhidrido carboxicarbonico de DTPA son ventajosos porque su uso permite la conjugacion sin afectar a la inmunoreactividad del anticuerpo sustancialmente.

Otro metodo para acoplar DPTA a proteinas es mediante el uso del anhidrido ciclico de DTPA, tal como se describe por Hnatowich et al. (Int. J. Appl. Radiat. Isot. 33:327 [1982]) para el marcaje de alumina con In-111, pero que puede adaptarse para el marcaje de anticuerpos. Un metodo adecuado de marcaje de anticuerpos con Tc-99m que no usa quelacion con DPTA es el metodo de pretincion de Crockford et al., (patente estadounidense n.° 4.323.546).

Un metodo de marcaje de inmunoglobulinas con Tc-99m es el descrito por Wong et al. (Int. J. Appl. Radiat Isot., 29:251 [1978]) para proteina plasmatica, y se aplico recientemente de manera satisfactoria por Wong et al. (J. Nucl. Med., 23:229 [1981]) para marcar anticuerpos,

En el caso de los radiometales conjugados con el anticuerpo especlfico, asimismo es deseable introducir una porcion tan alta del radiomarcador como sea posible dentro de la molecula de anticuerpo sin destruir su inmunoespecificidad. Puede conseguirse una mejora adicional realizando un radiomarcaje en presencia del marcador de cancer de la celula madre especlfico de la presente invencion, para garantizar que se proteger£ el sitio de union a antigeno en el anticuerpo.

Puede utilizarse obtencion de imagenes biofotonicas in vivo (Xenogen, Almeda, CA) para la obtencion de imagenes in vivo. Esta obtencion de imagenes in vivo en tiempo real utiliza luciferasa. El gen de luciferasa se incorpora en celulas, microorganismos y animales (por ejemplo, como una proteina de fusion con un marcador de cancer de la presente invencion). Cuando se activa, conduce a una reaccion que emite luz. Se usa una camara CCD y software para capturar la imagen y analizarla.

III. Anticuerpos v fraamentos de anticuerpos

La presente solicitud describe anticuerpos aislados y fragmentos de anticuerpos contra CXCR1, FBX021, NFYA, NOTCH2, RAD51L1, TBP, y otras proteinas de la tabla 1. El anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, puede ser cualquier anticuerpo monoclonal o policlonal que reconoce especificamente estas proteinas. En la tabla 1 se describen anticuerpos monoclonales, o fragmentos de los mismos, que se unen especificamente a CXCR1, FBX021, NFYA, NOTCH2, RAD51L1, TBP, y otras proteinas. Los anticuerpos monoclonales, o fragmentos de los mismos, pueden ser anticuerpos quimericos o humanizados que se unen especificamente a estas proteinas. Los anticuerpos monoclonales, o fragmentos de los mismos, pueden ser anticuerpos humanos que se unen especificamente a estas proteinas.

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Los anticuerpos contra CXCR1, FBX021, NFYA, NOTCH2, RAD51L1, TBP, y otras proteinas de la tabla 1 encuentran uso en los metodos experimentales, de diagnostic*) y terapeuticos descritos en el presente documento. Los anticuerpos pueden usarse para detectar la expresion de una proteina de marcador de celulas madre de cancer en muestras biologicas tales como, por ejemplo, una biopsia de tejido de pacientes, efusion pleural o muestra de sangre. Pueden cortarse biopsias de tejido y detectarse la proteina usando, por ejemplo, inmunofluorescencia o inmunohistoquimica. Alternativamente, se aislan celulas individuales de una muestra, y se detecta la expresion de proteina sobre celulas fijadas o vivas mediante analisis FACS. Ademas, los anticuerpos pueden usarse sobre matrices de proteinas para detectar la expresion de un marcador de celulas madre de cancer, por ejemplo, sobre celulas tumorales, en lisados celulares o en otras muestras de proteina. Los anticuerpos pueden usarse para inhibir el crecimiento de celulas tumorales poniendo en contacto los anticuerpos con celulas tumorales o bien en ensayos basados en celulas in vitro o bien en modelos animates in vivo. Los anticuerpos pueden usarse para tratar cancer en un paciente humano administrando una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo contra un marcador de celulas madre de cancer (por ejemplo, de la tabla 1). El anticuerpo o fragmento de anticuerpo frente a CXCR1 se usa en el contexto de la invention.

Pueden prepararse anticuerpos policlonales mediante cualquier metodo conocido. Pueden generarse anticuerpos policlonales inmunizando un animal (por ejemplo un conejo, una rata, un raton, un asno, etc.) mediante inyecciones subcutaneas o intraperitoneal multiples del antigeno relevante (un fragmento de peptido purificado, proteina recombinante de longitud completa, proteina de fusion, etc ), conjugarse opcionalmente con hemocianina de lapa californiana (KLH), albumina serica, etc. diluirse en solution salina esteril y combinarse con un adyuvante (por ejemplo adyuvante completo o incomplete de Freund) para formar una emulsion estable. El anticuerpo policlonal se recupera de la sangre, liquido ascitico y similares, de un animal asi inmunizado. Se coagula la sangre recogida, y se decanta el suero, se clarifica mediante centrifugation, y se somete a ensayo para determinar el titulo de anticuerpo. Los anticuerpos policlonales pueden purificarse del suero o liquido ascitico segun metodos convencionales en la tecnica incluyendo cromatografia de afinidad, cromatografia de intercambio ionico, electroforesis en gel, dialisis, etc.

Pueden prepararse anticuerpos monoclonales usando metodos de hibridoma, tales como los descritos por Kohler y Milstein (1975) Nature 256:495. Usando el metodo de hibridoma, se inmuniza un raton, hamster u otro animal huesped apropiado, tal como se describio anteriormente para provocar la production por linfocitos de anticuerpos que se uniran especificamente a un antigeno inmunizante. Alternativamente, pueden inmunizarse linfocitos in vitro. Tras la inmunizacion, los linfocitos se aislan y se fusionan con una linea celular de mieloma adecuada usando, por ejemplo, polietilenglicol, para formar celulas de hibridoma que entonces pueden separarse por selection de los linfocitos y cdlulas de mieloma no fusionados. Los hibridomas que producen anticuerpos monoclonales dirigidos especificamente contra un antigeno elegido tal como se determina mediante inmunoprecipitacion, inmunotransferencia o mediante un ensayo de union in vitro tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo de inmunoabsorcion ligado a enzimas (ELISA) pueden propagarse entonces o bien en cultivo in vitro usando metodos convencionales (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986) o in vivo como tumores asciticos en un animal. Los anticuerpos monoclonales pueden purificarse entonces del medio de cultivo o liquido ascitico tal como se describio para los anticuerpos policlonales anteriormente.

Alternativamente tambien pueden prepararse anticuerpos monoclonales usando metodos de ADN recombinante tal como se describe en la patente estadounidense 4.816.567. Se aislan los polinucleotidos que codifican para un anticuerpo monoclonal, tal como de celulas de hibridoma o celulas B maduras, tal como mediante RT-PCR usando cebadores de oligonucleotido que amplifican especificamente los genes que codifican para las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo, y se determina su secuencia usando procedimientos convencionales. Los polinucleotidos aislados que codifican para las cadenas pesada y ligera se clonan entonces en vectores de expresion adecuados, que cuando se transfectan en celulas huesped tales como celulas de E. coli, celulas COS de simio, celulas de ovario de hamster chino (CHO) o celulas de mieloma que por lo demas no producen proteina de inmunoglobulina, se generan anticuerpos monoclonales por las celulas huesped. Ademas, pueden aislarse anticuerpos monoclonales recombinantes o fragmentos de los mismos de las especies deseadas de bibliotecas de presentation en fago tal como se describe (McCafferty et at., 1990, Nature, 348:552-554; Clackson ef a/., 1991, Nature, 352:624-628; y Marks etal., 1991, J. Mol. Bio!., 222:581-597).

El/los polinucledtido(s) que codifica(n) para un anticuerpo monoclonal puede(n) modificarse ademas de varias maneras diferentes usando tecnologia de ADN recombinante para generar anticuerpos alternativos. Los dominios constantes de las cadenas pesada y ligera de, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal de raton pueden sustituirse 1) por las regiones de, por ejemplo, un anticuerpo humano para generar un anticuerpo quimerico o 2) por un polipeptido distinto de inmunoglobulina para generar un anticuerpo de fusidn. Las regiones constantes pueden truncarse o eliminarse para generar el fragmento de anticuerpo deseado de un anticuerpo monoclonal. Ademas, puede usarse mutagenesis dirigida al sitio o de alta densidad de la region variable para optimizar la especificidad, afinidad, etc. de un anticuerpo monoclonal.

El anticuerpo monoclonal contra un marcador de celulas madre de cancer puede ser un anticuerpo humanizado. Los anticuerpos humanizados son anticuerpos que contienen secuencias minimas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) dentro de las regiones variables. Tates anticuerpos se usan terapeuticamente para reducir la antigenicidad y respuestas de HAMA (anticuerpo humano anti-ratdn) cuando se administran a un sujeto humano. En la practica, los anticuerpos humanizados son normalmente anticuerpos humanos con secuencias no humanas

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minimas a ausentes. Un anticuerpo humano es un anticuerpo producido por un ser humano o un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoacidos correspondiente a un anticuerpo producido por un ser humano.

Pueden producirse anticuerpos humanizados usando diversas tecnicas conocidas en la tecnica. Un anticuerpo puede humanizarse sustituyendo la CDR de un anticuerpo humano por la de un anticuerpo no humano (por ejemplo raton, rata, conejo, hamster, etc.) que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas (Jones et al., 1986, Nature. 321:522-525; Riechmann et al., 1988. Nature, 332:323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:15341536). El anticuerpo humanizado puede modificarse ademas mediante la sustitucion de un residuo adicional o bien en la region de entramado de Fv y/o dentro de los residuos no humanos reemplazados para refinar y optimizar la especificidad, afinidad y/o capacidad del anticuerpo.

Pueden prepararse directamente anticuerpos humanos usando diversas tecnicas conocidas en la tecnica. Pueden generarse linfocitos B humanos inmortalizados in vitro o aislarse de un individuo inmunizado que produce un anticuerpo dirigido contra un antigeno diana (veanse, por ejemplo, Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boemer et al., 1991, J. Immunol., 147 (1):86-95; y la patente estadounidense 5.750.373). Ademas, el anticuerpo humano puede seleccionarse de una biblioteca de fagos, en donde esa biblioteca expresa anticuerpos humanos (Vaughan et al., 1996, Nature Biotechnology, 14:309-314; Sheets et at., 1998, PNAS, 95:6157-6162; Hoogenboom y Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581). Tambien pueden prepararse anticuerpos humanizados en ratones transgenicos que contienen locus de inmunoglobulina humana que pueden producir tras la inmunizacidn el repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de produccion de inmunoglobulinas endogenas. Este enfoque se describe en las patentes estadounidenses 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; y 5.661.016.

Esta invencion tambien abarca anticuerpos biespecificos que reconocen especificamente marcadores de celulas madre de cancer. Anticuerpos biespecificos son anticuerpos que pueden reconocer y unirse especificamente a al menos dos epitopos diferentes.

Los anticuerpos biespecificos pueden ser anticuerpos intactos o fragmentos de anticuerpos. En la tecnica son comunes tecnicas para preparar anticuerpos biespecificos (Millstein et al., 1983, Nature 305:537-539; Brennan et al., 1985, Science 229:81; Suresh et al, 1986, Methods in Enzymol. 121:120; Traunecker et al., 1991, EMBO J. 10:36553659; Shalaby et al., 1992, J. Exp. Med. 175:217-225; Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553; Gruber et al., 1994, J. Immunol. 152:5368; y la patente estadounidense 5.731.168).

En determinadas realizaciones de la invencion, puede ser deseable usar un fragmento de anticuerpo, en vez de un anticuerpo intacto, para aumentar la penetracion en el tumor, por ejemplo. Se conocen diversas tecnicas para la produccion de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente, estos fragmentos se derivan por medio de digestion proteolitica de anticuerpos intactos (por ejemplo Morimoto et al.. 1993, Journal of Biochemical and Biophysical Methdos 24:107-117 y Brennan et al., 1985, Science, 229:81). Sin embargo, estos fragmentos normalmente se producen directamente por celulas huesped recombinantes tal como se describio anteriormente. Por tanto los fragmentos de anticuerpos Fab, Fv y scFv pueden expresarse todos en y secretarse a partir de E. coli u otras celulas huesped, permitiendo asi la produccion de grandes cantidades de estos fragmentos. Altemativamente, tales fragmentos de anticuerpos pueden aislarse de las bibliotecas de fagos con anticuerpos comentadas anteriormente. El fragmento de anticuerpo tambien puede ser anticuerpos lineales tal como se describe en la patente estadounidense 5.641.870, por ejemplo, y puede ser monoespecifico o biespecifico. Otras tecnicas para la produccion de fragmentos de anticuerpos resultaran evidentes para el experto en la tecnica.

Puede ser deseable ademas, especialmente en el caso de fragmentos de anticuerpos, modificar un anticuerpo con el fin de aumentar su semivida en suero. Esto puede lograrse, por ejemplo, mediante la incorporation de un epitopo de union a receptor salvaje en el fragmento de anticuerpo mediante mutation de la region apropiada en el fragmento de anticuerpo o incorporando el epitopo en una etiqueta de peptido que entonces se fusiona con el fragmento de anticuerpo o bien en el extremo o bien en el medio (por ejemplo, mediante sintesis de ADN o peptidos).

La presente invencion abarca ademas variantes y equivalentes que son sustancialmente homologos a los anticuerpos quimericos, humanizados y humanos, o fragmentos de anticuerpos de los mismos, expuestos en el presente documento. Estos pueden contener, por ejemplo, mutaciones por sustitucion conservativa, es decir la sustitucion de uno o mas aminoacidos por aminoacidos similares. Por ejemplo, sustitucion conservativa se refiere a la sustitucion de un aminoacido por otro dentro de la misma clase general tal como, por ejemplo, un aminoacido acido por otro aminoacido acido, un aminoacido basico por otro aminoacido basico o un aminoacido neutro por otro aminoacido neutro, Lo que se pretende mediante una sustitucion de aminoacido conservativa se conoce bien en la tecnica.

La invencion tambien se refiere a inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo conjugado con un agente citotoxico. Los agentes citotoxicos incluyen agentes quimioterapicos, agentes inhibidores del crecimiento, toxinas (por ejemplo, una toxina enzimaticamente activa de origen bacteriano, fungico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma), isotopos radiactivos (es decir, un radioconjugado), etc. Los agentes quimioterapicos utiles en la generation de tales inmunoconjugados incluyen, por ejemplo, metotrexato, adriamicina, doxorubicina, melfalan, mitomicina C, clorambucilo, daunorubicina u otros agentes intercalates. Las toxinas enzimaticamente activas y fragmentos de las

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mismas que pueden usarse incluyen cadena A de difteria, fragmentos activos que no se unen de toxina difterica, cadena A de exotoxina, cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, proteinas de Aleurites fordii, proteinas diantina, proteinas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos. Estan disponibles una variedad de radioniiclidos para la production de anticuerpos radioconjugados incluyendo 212Bi, 1311, 131 In, 90Y y 186Re. Se preparan conjugados del anticuerpo y agente citotoxico usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteinas bifuncionales tales como propionato de N- succinimidil-3-(2-piridilditiol) (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoesteres (tales como adipimidato de dimetilo HCL), esteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehidos (tales como glutaraldehido), compuestos de bis-azido (tales como bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como 2,6-diisocianato de toliieno) y compuestos de fluor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Tambien pueden usarse conjugados de un anticuerpo y una o mas toxinas de molecula pequena, tales como una caliqueamicina, maitansinoides, un tricoteno, y CC1065, y los derivados de estas toxinas que tienen actividad de toxina.

En algunas realizaciones el anticuerpo usado en el contexto de la invencion contiene regiones Fc humanas que se modifican para potenciar la funcion efectora, por ejemplo, citotoxicidad mediada por celulas dependiente de antigenos (ADCC) y/o citotoxicidad mediada por complemento (CDC). Esto puede lograrse introduciendo una o mas sustituciones de aminoacido en una region Fc del anticuerpo. Por ejemplo, puede(n) introducirse residuo(s) de cisteina en la region Fc para permitir la formation de enlaces disulfuro intercatenarios en esta region para mejorar la destruction celular mediada por complemento y la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) (Caron et a!., 1992, J. Exp Med. 176:1191-1195; Shopes, 1992, Immunol. 148:2918-2922). Tambien pueden prepararse anticuerpos homodimericos con actividad antitumoral potenciada usando agentes de reticulation heterobifuncionales tal como se describe en Wolff et a!., 1993, Cancer Research 53:2560-2565, Alternativamente, puede modificarse por ingenieria genetica un anticuerpo que tiene regiones Fc dobles (Stevenson et al., 1989, Anti-Cancer Drug Design 3:219-230).

IV. Examen de farmacos

La presente solicitud describe ensayos de examen de farmacos (por ejemplo, para examinar para detectar farmacos anticancerigenos). Los metodos de examen utilizan marcadores de cancer de celulas madre (por ejemplo, CXCR1, FBX021, NFYA, NOTCFI2, RAD51L1, TBP, y otras proteinas de la tabla 1) identificados usando los metodos de la presente solicitud. Por ejemplo, la presente solicitud describe metodos de examen para detectar compuestos que alteran (por ejemplo, aumentan o disminuyen) la expresion de, o actividad de, CXCR1 o FBX021. Compuestos candidatos pueden ser agentes antisentido o agentes de ARNip (por ejemplo, oligonucleotidos) dirigidos contra marcadores de cancer. Los compuestos candidatos pueden ser anticuerpos que se unen especificamente a un marcador de cancer de celulas madre de la presente invencidn. Pueden examinarse bibliotecas de compuestos de moleculas pequenas usando los metodos descritos en el presente documento.

En un metodo de examen, se evaluan compuestos candidatos para determinar su capacidad para alterar la expresion de marcadores de cancer de celulas madre poniendo en contacto un compuesto con una celula que expresa un marcador de cancer de celulas madre y luego sometiendo a ensayo para determinar el efecto de los compuestos candidatos sobre la expresion. El efecto de los compuestos candidatos sobre la expresion de un gen de marcador de cancer puede someterse a ensayo detectando el nivel de ARNm de marcador de cancer expresado por la celula. La expresion de ARNm puede detectarse mediante cualquier metodo adecuado. El efecto de compuestos candidatos sobre la expresion de genes de marcadores de cancer puede someterse a ensayo midiendo el nivel de polipeptido codificado por los marcadores de cancer, El nivel de polipeptido expresado puede medirse usando cualquier metodo adecuado, incluyendo pero sin limitarse a, los dados a conocer en el presente documento. En algunos ejemplos, se detectan otros cambios en la biologia celular (por ejemplo, apoptosis).

Especificamente, la presente solicitud describe metodos de examen para identificar moduladores, es decir, compuestos o agentes candidatos o de prueba (por ejemplo, proteinas, pdptidos, peptidomimeticos, peptoides, moleculas pequenas u otros farmacos) que se unen a, o alteran la serialization o funcion asociada con los marcadores de cancer de la presente invencion, tienen un efecto inhibidor (o estimulador) sobre, por ejemplo, la expresion de marcadores de cancer de celulas madre o la actividad de marcadores de cancer, o tienen un efecto estimulador o inhibidor sobre, por ejemplo, la expresion o actividad de un sustrato de marcador de cancer. Los compuestos asi identificados pueden usarse para modular la actividad de productos genicos diana (por ejemplo, genes de marcadores de cancer de celulas madre, tales como CXCR1 o FBX021) o bien directamente o bien indirectamente en un protocolo terapeutico, para elaborar la funcion biologica del producto genico diana, o para identificar compuestos que alteran las interacciones genicas diana normales. Compuestos que inhiben la actividad o expresion de marcadores de cancer son utiles en el tratamiento de trastornos proliferativos, por ejemplo, cancer, particularmente cancer metastasico o la elimination o el control de celulas madre de tumores para impedir o reducir el riesgo de cancer.

La solicitud describe ensayos para examinar compuestos candidatos o de prueba que son sustratos de un polipeptido o una proteina de marcadores de cancer o una parte biologicamente activa de los mismos. La solicitud describe tambidn ensayos para examinar compuestos candidatos o de prueba que se unen a modulan la actividad

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Los compuestos de prueba pueden obtenerse usando cualquiera de los numerosos enfoques en metodos de bibliotecas combinatorias conocidos en la tecnica, incluyendo bibliotecas biologicas; bibliotecas de peptoides (bibliotecas de moleculas que tienen las funcionalidades de peptidos, pero con una estructura principal novedosa, no peptidica, que son resistentes a la degradacion enzimatica pero que no obstante siguen siendo bioactivos; vease, por ejemplo, Zuckennann et at., J. Med Chem. 37: 2678-85 [1994]); bibliotecas en fase de disoiucion o en fase solida direccionables espacialmente; metodos de bibliotecas sinteticas que requieren deconvolucion; el metodo de biblioteca de “una perla un compuesto"; y metodos de bibliotecas sinteticas usando seleccion por cromatografia de afinidad. Se prefieren los enfoques de biblioteca biologica y biblioteca de peptoides para su uso con bibliotecas peptidicas, mientras que los otros cuatro enfoques pueden aplicarse a bibliotecas de compuestos de molecula pequena, de peptidos o de oligomeros no peptidicos (Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12:145).

Pueden encontrarse ejemplos de metodos para la sintesis de bibliotecas moleculares en la tecnica, por ejemplo en: DeWitt et at., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6909 [1993]; Erb et at., Proc. Nad. Acad. Sci. USA 91:11422 [1994]; Zuckermann et at., J. Med. Chem. 37:2678 [1994]; Cho et at.. Science 261:1303 [1993]; Carrell et at., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33,2059 [1994]; Carell et at., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061 [1994]; y Gallop et at., J. Med. Chem. 37:1233 [1994],

Las bibliotecas de compuestos pueden presentarse en disoiucion (por ejemplo, Houghten, Biotechniques 13:412-421 [1992]), o sobre perias (Lam, Nature 354:82-84 [1991), chips (Fodor, Nature 364:555-556 [1993]), bacterias o esporas (patente estadounidense n.° 5.223.409), plasmidos (Cull et at., Proc. Nad. Acad. Sci. USA 89:18651869 [1992]) o sobre fagos (Scott y Smith, Science 249:386-390 [1990]; Devlin Science 249:404-406 [1990]; Cwirla et at., Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382 [1990]; Felici, J Mol. Biol. 222:301 [1991]).

En un aspecto, un ensayo es un ensayo basado en celulas en el que una celula que expresa una proteina de marcador de cancer de celulas madre o una parte biologicamente activa de la misma se pone en contacto con un compuesto de prueba, y se determina la capacidad del compuesto de prueba para modular la actividad del marcador de cancer. La determinacion de la capacidad del compuesto de prueba para modular la actividad del marcador de cancer de celulas madre puede lograse monitorizando, por ejemplo, los cambios en la actividad enzimatica. La celula, por ejemplo, puede ser de origen de mamifero.

La capacidad del compuesto de prueba para modular la union del marcador de cancer a un compuesto, por ejemplo, un sustrato de marcador de cancer de celulas madre, tambien puede evaluarse. Esto puede lograrse, por ejemplo, acoplando el compuesto, por ejemplo, el sustrato, con un radioisotopo o marcador enzimatico de manera que pueda determinarse la union del compuesto, por ejemplo, el sustrato, a un marcador de cancer detectando el compuesto marcado, por ejemplo, sustrato, en un complejo.

Alternativamente, el marcador de cancer de celulas madre se acopla con un radioisotopo o marcador enzimatico para monitorizar la capacidad de un compuesto de prueba para modular la union del marcador de cancer a un sustrato de marcador de cancer en un complejo. Por ejemplo, los compuestos (por ejemplo, sustratos) pueden marcarse con 1251, 35S 14C o 3H, o bien directamente o bien indirectamente, y el radioisotopo detectarse mediante recuento directo de la radioemision o mediante recuento de centelleo. Alternativamente, los compuestos pueden marcarse enzimaticamente con, por ejemplo, peroxidasa del rabano, fosfatasa alcalina o luciferasa, y el marcador enzimatico detectarse mediante determinacion de la conversion de un sustrato apropiado en producto,

Puede evaluarse la capacidad de un compuesto (por ejemplo, un sustrato de marcador de cancer de celulas madre) para interaccionar con un marcador de cancer de celulas madre con o sin el marcaje de cualquiera de los elementos de interaccion. Por ejemplo, puede usarse un microfisiometro para detectar la interaccion de un compuesto con un marcador de cancer sin el marcaje de o bien el compuesto o bien el marcador de cancer (McConnell et at. Science 257:1906-1912 [1992]). Tal como se usa en el presente documento, un “microfisiometro” (por ejemplo, Cytosensor) es un instrumento analitico que mide la velocidad a la que una celula acidifica su entorno usando un sensor potenciometrico direccionable por luz (LAPS). Pueden usarse los cambios en esta velocidad de acidificacion como indicador de la interaccion entre un compuesto y marcadores de cancer.

En aun otro aspecto, se proporciona un ensayo libre de celulas en el que una proteina de marcador de cancer o una parte biologicamente activa de la misma se pone en contacto con un compuesto de prueba y se evalua la capacidad del compuesto de prueba para unirse a la proteina de marcador de cancer de celulas madre o una parte biologicamente activa de la misma. Las partes biologicamente activas de las proteinas de marcadores de cancer que van a usarse en los ensayos de la presente invencion incluyen fragmentos que participan en interacciones con sustratos u otras proteinas, por ejemplo, fragmentos con altas puntuaciones de probabilidad de superficie.

Los ensayos libres de celulas implican preparar una mezcla de reaccion de la proteina del gen diana y el compuesto de prueba en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir que los dos componentes interaccionen y se unan, formando asi un complejo que puede retirarse y/o detectarse,

La interaccion entre dos moleculas tambien puede detectarse, por ejemplo, usando transferencia de energia de fluorescencia (FRET) (veanse, por ejemplo, Lakowicz et at., patente estadounidense n.° 5.631.169; Stavrianopoulos

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et al, patente estadounidense n.° 4.968.103). Se selecciona un marcador de fluoroforo de manera que la energia fluorescente emitida por una primera molecula donadora la absorba un marcador fluorescente sobre una segunda segundo molecula, “aceptora”, que a su vez puede fluorescer debido a la energia absorbida.

Alternativamente, la molecula de proteina “donadora” puede simplemente utilizar la energia fluorescente natural de residuos de triptofano. Se eligen marcadores que emiten diferentes longitudes de onda de luz, de manera que el marcador de molecula “aceptora” pueda diferenciarse de la “donadora". Puesto que la eficacia de transferencia de energia entre los marcadores esta relacionada con la distancia que separa las moleculas, puede evaluarse la relation espacial entre las moleculas. En una situation en la que se produce union entre las moleculas, la emision fluorescente del marcador de molecula “aceptora" en el ensayo debe ser maxima. Un acontecimiento de union de FRET puede medirse convenientemente a traves de medlos de deteccibn fluorometricos convencionales bien conocidos en la tecnica (por ejemplo, usando un fluorlmetro).

En otro aspecto, la determination de la capacidad de la proteina de marcador de cancer de celulas madre para unirse a una molecula diana puede lograrse usando analisis de interaccion biomolecular (BIA) en tiempo real (vease, por ejemplo, Sjolander y Urbaniczky, Anal. Chem. 63:2338-2345 y Szabo et al. Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705 [1995]). La “resonancia de plasmon superficial" o “BIA” detecta interacciones bioespecificas en tiempo real, sin marcaje de ninguno de los elementos de interaccion (por ejemplo, BIAcore). Cambios en la masa en la superfrcie de union (indicatives de un acontecimiento de union) dan como resultado alteraciones del indice de refraction de la luz cerca de la superficie (el fenomeno optico de resonancia de plasmon superficial (SPR)), dando como resultado una serial detectable que puede usarse como una indication de reacciones en tiempo real entre moleculas biologicas.

El producto del gen diana o la sustancia de prueba puede anclarse sobre una fase solida. Los complejos de producto del gen diana/compuesto de prueba anclados sobre la fase solida pueden detectarse al final de la reaction. El producto del gen diana puede anclarse sobre una superficie solida, y el compuesto de prueba, (que no esta anclado), puede marcarse, o bien directamente o bien indirectamente, con marcadores detectables comentados en el presente documento,

Puede ser deseable inmovilizar marcadores de cancer de celulas madre, un anticuerpo anti-marcador de cancer o su molecula diana para facilitar la separation de formas complejadas de no complejadas de una o ambas de las proteinas, asi como para adaptar la automatization del ensayo. La union de un compuesto de prueba a una proteina de marcador de cancer de celulas madre, o la interaccion de una proteina de marcador de cancer con una molecula diana en presencia y ausencia de un compuesto candidato, puede lograrse en cualquier recipiente adecuado para contener los reactantes. Los ejemplos de tales recipientes incluyen placas de microtitulacion, tubos de ensayo y tubos de microcentrlfuga. En una realizacion, puede proporcionarse una proteina de fusion que anade un dominio que permite que una o ambas de las proteinas se unan a una matriz. Por ejemplo, puede absorberse glutation-S- transferasa-proteinas de fusion de marcador de cancer o glutation-S-transferasa/proteinas de fusion diana sobre perlas de glutation-Sepharose (Sigma Chemical, St. Louis, MO) o placas de microtitulacion derivatizadas con glutation, que entonces se combinan con el compuesto de prueba o el compuesto de prueba y o bien la proteina diana no absorbida o bien la proteina de marcador de cancer, y se incuba la mezcla en condlciones que conducen a la formation de complejos (por ejemplo, en condiciones fisioiogicas para sal y pH). Tras la incubation, las perlas o los pocillos de las placas de microtitulacion se lavan para eliminar cualquier componente no unido, se inmoviliza la matriz en el caso de las perlas, se determina el complejo o bien directamente o bien indirectamente, por ejemplo, tal como se describio anteriormente.

Alternativamente, los complejos pueden disociarse de la matriz, y determinarse el nivel de union o actividad de marcadores de cancer usando tecnicas convencionales. Otras tecnicas para inmovilizar o bien proteinas de marcadores de cancer o bien una molecula diana sobre matrices incluyen usar conjugation de biotina y estreptavidina. Pueden prepararse moleculas diana o proteina de marcador de cancer biotinilados a partir de biotina- NHS (N-hidroxi-succinimida) usando tecnicas conocidas en la tecnica (por ejemplo, kit de biotinilacion, Pierce Chemicals, Rockford, IL), e inmovilizarse en los pocillos de placas de 96 pocillos recubiertas con estreptavidina (Pierce Chemical).

Con el fin de realizar el ensayo, se anade el componente no inmovilizado a la superficie recubierta que contiene el componente anclado. Tras completarse la reaccion, se retiran los componentes sin reaccionar (por ejemplo, lavando) en condiciones tales que cualquier complejo formado permanecera inmovilizado sobre la superficie solida. La detection de complejos anclados sobre la superficie solida puede lograrse de varios modos. Cuando el componente no inmovilizado anteriormente se marca prevlamente, la detection de marcador inmovilizado sobre la superficie indica que se formaron complejos. Cuando el componente no inmovilizado anteriormente no se marca previamente, puede usare un marcador indirecto para detectar complejos anclados sobre la superficie; por ejemplo, usando un anticuerpo especifico marcado para el componente inmovilizado (el anticuerpo, a su vez, puede marcarse directamente o marcarse indirectamente con, por ejemplo, un anticuerpo anti-IgG marcado).

Este ensayo se realiza utilizando anticuerpos reactivos con proteina de marcador de cancer de celulas madre o moleculas diana pero que no interfieren con la union de la proteina de marcador de cancer de celulas madre a su molecula diana. Tales anticuerpos pueden derivatizarse en los pocillos de la placa, y atraparse la proteina de marcadores de cancer o diana no unidas en los pocillos mediante conjugation con anticuerpos. Los metodos para

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detectar tales complejos, ademas de los descritos anteriormente para los complejos inmovilizados con GST, incluyen inmunodeteccion de complejos usando anticuerpos reactivos con la proteina de marcador de cancer o molecula diana, asi como ensayos ligados a enzimas que se basan en la detection de una actividad enzimatica asociada con la proteina de marcador de cancer o molecula diana.

Alternativamente, pueden realizarse ensayos libres de celulas en una fase liquida. En un ensayo de este tipo, los productos de reaction se separan de los componentes sin reaccionar mediante cualquiera de varias tecnicas convencionales, incluyendo, pero sin iimitarse a; centrifugation diferencial (vease, por ejemplo, Rivas y Minton, Trends Biochem Sci 18:284-7 [1993]); cromatografia (cromatografia de filtration en gel, cromatografia de intercambio ionico); electroforesis (vease, por ejemplo, Ausubel et a/., eds. Current Protocols in Molecular Biology 1999, J. Wiley: Nueva York.); e inmunoprecipitacion (vease, por ejemplo, Ausubel et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology 1999, J. Wiley: Nueva York). Tales resinas y tecnicas cromatograficas las conoce un experto en la tecnica (vease por ejemplo, Heegaard J. Mol. Recognit 11:141-8 [1998]; Hageand Tweed J. Chromatogr. Biomed. Sci. Appl 699:499-525 [1997]). Ademas, tambien puede utilizarse convenientemente transferencia de energia de fluorescencia, tal como se describe en el presente documento, para detectar la union sin purification adicional del complejo de la disolucion.

El ensayo puede incluir poner en contacto la proteina de marcador de cancer de celulas madre o una parte biologicamente activa de la misma con un compuesto conocido que se une al marcador de cancer para formar una mezcla de ensayo, poner en contacto la mezcla de ensayo con un compuesto de prueba y determinar la capacidad del compuesto de prueba para interaccionar con una proteina de marcador de cancer, en el que determinar la capacidad del compuesto de prueba para interaccionar con una proteina de marcador de cancer incluye determinar la capacidad del compuesto de prueba para unirse preferentemente a marcadores de cancer o una parte biologicamente activa de los mismos, o para modular la actividad de una molecula diana, en comparacion con el compuesto conocido.

Hasta el punto de que los marcadores de cancer de celulas madre puedan, in vivo, interaccionar con una o mas macromoleculas celulares o extracelulares, tales como proteinas, son utiles inhibidores de una interaccion de este tipo. Puede usarse un ensayo homogeneo para identificar inhibidores.

Por ejemplo, se prepara un complejo preformado de producto del gen diana y el producto de pareja de union celular o extracelular de manera que o bien los productos del gen diana o bien sus parejas de union se marcan, pero la senal generada por el marcador se extingue debido a la formation de complejos (v6ase, por ejemplo, la patente estadounldense n.° 4.109.496 que utiliza este enfoque para inmunoensayos). La adicion de una sustancia de prueba que compite con y desplaza a una de las especies del complejo preformado dara como resultado la generation de una serial por encima del fondo. De este modo, pueden identificarse sustancias de prueba que alteran la interaccion producto del gen diana-pareja de union. Alternativamente, puede usarse proteina de marcadores de cancer como "proteina cebo” en un ensayo de dos hibridos o de tres hibridos (veanse, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 5.283.317; Zervos et al., Cell 72:223-232 [1993]; Madura et al., J. Biol. Chem. 268,12046-12054 [1993]; Bartel et al., Biotechniques 14:920-924 [1993]; Iwabuchi et al.. Oncogene 8:1693-1696 [1993]; y Brent documento WO 94/10300), para identificar otras proteinas, que se unen a o interaccionan con marcadores de cancer (“proteinas de union a marcadores de cancer” o “bp de marcadores de cancer”) y estan implicadas en la actividad de marcadores de cancer. Tales bp de marcadores de cancer pueden ser activadores o inhibidores de senates por las proteinas de marcadores de cancer o dianas como, por ejemplo, elementos posteriores de una ruta de serialization mediada por marcadores de cancer.

Tambien pueden identificarse moduladores de la expresion de marcadores de cancer. Por ejemplo, se pone en contacto una celula o mezcla libre de celulas con un compuesto candidato y se evalua la expresion de proteina o ARNm de marcador de cancer en relation con el nivel de expresion de proteina o ARNm de marcador de cancer de celulas madre en ausencia del compuesto candidato. Cuando la expresion de proteina o ARNm de marcador de cancer es mayor en presencia del compuesto candidato que en su ausencia, se identifica al compuesto candidato como estimulador de la expresion de proteina o ARNm de marcador de cancer. Alternativamente, cuando la expresion de proteina o ARNm de marcador de cancer es menor (es decir, estadisticamente significativa menor) en presencia del compuesto candidato que en su ausencia, se identifica al compuesto candidato como inhibidor de la expresion de proteina o ARNm de marcador de cancer. El nivel de expresion de proteina o ARNm de marcadores de cancer puede determinarse mediante metodos descritos en el presente documento para detectar proteina o ARNm de marcadores de cancer.

Esta solicitud se refiere ademas a agentes novedosos identificados mediante los ensayos de examen descritos anteriormente (vease, por ejemplo, la description a continuation de terapias para el cancer). Por consiguiente, esta dentro del alcance de esta solicitud usar ademas un agente identificado tal como se describe en el presente documento (por ejemplo, un agente de modulation de marcadores de cancer, una molecula de acido nucleico de cancer antisentido, una molecula de ARNip, un anticuerpo especifico para marcador de cancer o una pareja de union de marcador de cancer) en un modelo animal apropiado (tal como los descritos en el presente documento) para determinar la eficacia, toxicidad, efectos secundarios o mecanismo de action, de tratamiento con un agente de este tipo. Ademas, pueden usarse agentes novedosos identificados mediante los ensayos de examen descritos anteriormente, por ejemplo, para tratamientos descritos en el presente documento (por ejemplo para tratar a un

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La presente solicitud emplea mamosferas no adherentes para diversos procedimientos de examen, incluyendo metodos para examinar antagonistas de la ruta de senalizacion de CXCR1 o FBX021. Las mamosferas no adherentes son un sistema de cultivo in vitro que permite la propagation de celulas progenitoras y madre epiteliales mamaria humanas primarias en un estado indiferenciado, basandose en su capacidad para proliferar en suspension como estructuras esfericas. Se han descrito anteriormente mamosferas no adherentes en Dontu et al Genes Dev. 15 de mayo de 2003; 17(10):1253-70, y Dontu et al., Breast Cancer Res. 2004; 6(6):R605-15. Estas referencias son especificamente para ensenar la construction y el uso de mamosferas no adherentes. Tal como se describe en Dontu et al., se ha caracterizado que las mamosferas estan compuestas por celulas progenitoras y madre que pueden experimentar autorrenovacion y diferenciacion en multiples linajes. Dontu et al. describen tambien que las mamosferas contienen celulas que pueden generar clonamente estructuras ductales-alveolares funcionales complejas en sistemas de cultivo tridimensionales reconstituidos en Matrigel.

Pueden empiearse los siguientes metodos de examen a modo de ejemplo. Para estudios in vitro, podrian tratarse celulas con o bien constructos adenovirales que expresan ARNip candidato de CXCR1 o FBX021 o control (m.o.i. de 10 a 100) durante 3 dias o un candidato de molecula pequeha (por ejemplo, derivado de PHA665752) (0,10,5 uM) durante 3 dias y comparar la capacidad de celulas CXCR1+ o FBX021+ para fonmar esferas tumorales en comparacion con celulas no tratadas frente a tratadas. Para estudios in vivo, podrian infectarse celulas de cancer de mama humano con un lentivirus que expresa luciferasa para monitorizar el crecimiento tumoral. Las celulas cancerosas que expresan luciferasa podrian inyectarse en tejido de mama y podrian establecerse tumores de aproximadamente 0,5-0,7 cm de tamano, con 5 animates por grupo. Entonces podrian tratarse los animates con tumores establecidos con o bien inhibidor de CXCR1 o FBX021 candidato (diariamente por via i.v. 30 mg/kg/dia durante 7 dias), o control de vehiculo. Podrian realizarse estudios en paralelo usando infection con adenovirus que expresan ARNip de CXCR1 o FBX021 candidato o de control (m.o.i. 100 6 500 durante 7 dias). Podrian obtenerse imagenes de los animates en el dia 7, 14, 21 y 28 para evaluar el tamano tumoral y luego sacrificarse. Podria evaluarse ademas el tamano tumoral en la autopsia y una parte del tumor tenirse para evaluar la histologia del tumor. El tumor restante podria recogerse y clasificarse para evaluar el porcentaje de celulas positivas para CXCR1 o FBX021 y negativas para CXCR1 o FBX021. Para verificar que la administration de inhibidor de CXCR1 o FBX021 candidato y la infection con ARNip de CXCR1 o FBX021 candidato esta inhibiendo la funcion de senalizacion de CXCR1 o FBX021, podria examinarse la fosforilacion de mediadores posteriores tales como Gab-1 y ERK (vease, Chistensen eta!., Cancer Res., 2003; 63:7345-7355).

V. Terapias para el cancer

En algunas realizaciones, la presente invention proportions terapias para el cancer. Las terapias pueden seleccionar como diana marcadores de cancer (por ejemplo, incluyendo pero sin limitarse a, CXCR1 o FBX021 y proteinas en la ruta de senalizacion de CXCR1 o FBX021). Puede usarse cualquier terapia para celulas madre de cancer terapia conocida o desarrollada posteriormente. Por ejemplo, se describen agentes terapeuticos para celulas madre de cancer en las patentes estadounidenses 6.984.522 y 7.115,360 y las solicitudes W003/050502, WO05/074633 y W005/005601.

Terapia con anticuerpos

Se usan anticuerpos antagonistas de CXCR1 en el contexto de la presente invention. Puede utilizarse cualquier anticuerpo adecuado (por ejemplo, monoclonal, policlonal o sintetico) en los metodos dados a conocer en el presente documento. En algunas realizaciones, los anticuerpos usados para la terapia para el cancer son anticuerpos humanizados. Se conocen bien en la tecnica metodos para humanizar anticuerpos (veanse por ejemplo las patentes estadounidenses 6.180.370, 5.585.089, 6.054.297 y 5.565.332).

En algunas realizaciones, los anticuerpos terapeuticos comprenden un anticuerpo generado contra un marcador de cancer de celulas madre de la presente invention, en el que el anticuerpo esta conjugado con un agente citotoxico. En tales realizaciones, se genera un agente terapeutico especiftco de tumor que no selecciona como diana celulas normales, reduciendo por tanto muchos de los efectos secundarios perjudiciales de la quimioterapia traditional. Para determinadas aplicaciones, se preve que los agentes terapeuticos sean agentes farmacologicos que serviran como agentes utiles para la union a anticuerpos, particularmente agentes citotoxicos o por lo demas anticelulares que tienen la capacidad para destruir o suprimir el crecimiento o la division celular de celulas endoteliales. La presente invention contempla el uso de cualquier agente farmacologico que pueda conjugarse con un anticuerpo, y administrarse en forma activa. Los agentes anticelulares a modo de ejemplo incluyen agentes quimioterapicos, radioisotopos y citotoxinas. Los anticuerpos terapeuticos de la presente invention pueden incluir una variedad de restos citotoxicos, incluyendo pero sin limitarse a, isotopos radiactivos (por ejemplo, yodo-131, yodo-123, tecnecio- 99m, indio-111, renio-188, renio-186, gaiio-67, cobre-67, itrio-90, yodo-125 o astatina-211), hormonas tales como un esteroide, antimetabolitos tales como citosinas (por ejemplo, arabinosido, fluorouracilo, metotrexato o aminopterina; una antraciclina; mitomicina C), alcaloides de la vinca (por ejemplo, demecolcina; etoposido; mitramicina), y agente aiquilante mitocondrial tal como clorambucilo o melfalan, Otras realizaciones pueden incluir agentes tales como un coagulante, una citocina, un factor de crecimiento, una endotoxina bacteriana o el resto de lipido A de endotoxina bacteriana. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los agentes terapeuticos incluiran una toxina derivada de plantas,

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hongos o bacterias, tal como una toxina de cadena A, una proteina de inactivation de ribosomas, a-sarcina, aspergilina, restrictocina, una ribonucleasa, toxina difterica o exotoxina de Pseudomonas, por mencionar tan solo unos cuantos ejemplos. En algunas realizaciones, se utiliza cadena A de ricina desglicosilada.

En cualquier caso, se propone que agentes tales como estos, si se desea, puedan conjugarse satisfactoriamente con un anticuerpo, de una manera que permitira su direccionamiento, internalization, liberacion o presentation a componentes sanguineos en el sitio de las celulas tumorales seleccionadas como diana segun se requiera usando tecnologia de conjugation conocida (vease, porejemplo, Ghose et al., Methods Enzymol., 93:280 [1983]).

Por ejemplo, en algunas realizaciones la presente invencion proporciona inmunotoxinas dirigidas a un marcador de cancer de celulas madre de la presente invencion. Las inmunotoxinas son conjugados de un agente de direccionamiento especifico, normalmente un anticuerpo o fragmento dirigido a tumor, con un agente citotoxico, tal como un resto de toxina. El agente de direccionamiento dirige la toxina a, y de ese modo destruye selectivamente, celulas que portan el antigeno seleccionado como diana. En algunas realizaciones, los anticuerpos terapeuticos emplean agentes de reticulation que proporcionan una alta estabilidad in vivo (Thorpe et al., Cancer Res., 48:6396 [1988]).

En otras realizaciones, particularmente las que implican el tratamiento de tumores solidos, se disenan anticuerpos que tienen un efecto citotbxico o por lo demas anticelular contra la vasculatura tumoral, suprimiendo el crecimiento o la division celular de las celulas endoteliales vasculares. Se pretende que este ataque conduzca a un colapso de la vasculatura localizada en un tumor, privando a las celulas tumorales, particularmente las celulas tumorales distales de la vasculatura, de oxlgeno y nutrientes, conduciendo en ultima instancia a muerte celular y necrosis tumoral.

En algunas realizaciones, se formulae agentes terapeuticos basados en anticuerpos como composiciones farmaceuticas tal como se describe a continuation. En algunas realizaciones, la administracion de una composicion de anticuerpos de la presente invencion da como resultado una disminucion medible en e! cancer (por ejemplo, disminucion o elimination del tumor).

VI. Composiciones terapeuticas v administracion

Una composicion farmaceutica que contiene un regulador de la oncogenesis segun la presente invencion puede administrarse mediante cualquier metodo eficaz. Por ejemplo, un antagonista de la ruta de serialization de IL8- CXCR1, u otro agente terapeutico que actua como antagonista de proteinas en la ruta de respuesta/transduccion de senales de IL8-CXCR1 puede administrarse mediante cualquier metodo eficaz. En determinadas realizaciones de la presente invencion, el agente terapeutico comprende repertaxina o un derivado de la misma.

En determinadas realizaciones, una disolucion fisioiogicamente apropiada que contiene una concentracion eficaz de un antagonista de la ruta de sefializacion de IL8-CXCR1 puede administrarse por via topica, por via intraocular, por via parenteral, por via oral, por via intranasal, por via intravenosa, por via intramuscular, por via subcutanea o mediante cualquier otro medio eficaz, En particular, el agente antagonista de la ruta de sefializacion de IL8-CXCR1 puede inyectarse directamente en un cancer o tumor diana (por ejemplo, en tejido de mama) mediante una aguja en cantidades eficaces para tratar las celulas tumorales del tejido diana. Alternativamente, un cancer o tumor presente en una cavidad corporal tal como en el ojo, el tracto gastrointestinal, el tracto genitourinario (por ejemplo, la vejiga urinaria), el sistema pulmonar y bronquial y similares puede recibir una composicion fisioiogicamente apropiada (por ejemplo, una disolucion tal como una solution salina o tampon fosfato, una suspension o una emulsion, que es esteril) que contiene una concentracion eficaz de un antagonista de la ruta de sefializacion de IL8-CXCR1 por medio de inyeccion directa con una aguja o por medio de un cateter u otro tubo de administracion colocado dentro del organo hueco aquejado de cancer o tumor. Puede usarse cualquier dispositivo de obtencion de imagenes eficaz tal como un sistema de visualization de fibra optica, sonograma o rayos X para ubicar el tejido diana y guiar la aguja o tubo de cateter. En otra alternativa, puede administrarse de manera sistemica una disolucion fisioiogicamente apropiada que contiene una concentracion eficaz de un antagonista de la ruta de sefializacion de IL8-CXCR1 a la circulation sanguinea para tratar un cancer o tumor que no puede alcanzarse directamente o aislarse anatomicamente.

Tales manipulaciones tienen en comun el objetivo de colocar el antagonista de la ruta de sefializacion de IL8-CXCR1 en contacto suficiente con el tumor diana para permitir que el antagonista entre en contacto, transduzca o transfecte las celulas tumorales (dependiendo de la naturaleza del agente). En una realization, pueden tratarse tumores solidos presentes en los revestimientos epiteliales de organos huecos infundiendo la suspension dentro de un organo hueco lleno de fluido, o pulverizando o nebulizando dentro de un organo hueco lleno de aire. Por tanto, las celulas tumorales (tales como celulas madre de tumores solidos) pueden estar presente en o entre el tejido epitelial en el revestimiento del arbol bronquial pulmonar, el revestimiento del tracto gastrointestinal, el revestimiento del tracto reproductor femenino, el tracto genitourinario, la vejiga, la vesicula biliar y cualquier otro tejido de organos accesible al contacto con el antagonista de la ruta de sefializacion de IL8-CXCR1. En otra realizacion, el tumor solido puede ubicarse en o sobre el revestimiento del sistema nervioso central, tal como, por ejemplo, la medula espinal, las raices espinales o el cerebro, de modo que el antagonista de la ruta de sehalizacion de IL8-CXCR1 infundido en e! liquido cefalorraquideo entra en contacto y transduce las celulas del tumor solido en ese espacio. Un experto en la tecnica de oncologia puede apreciar que el antagonista puede administrarse al tumor solido mediante

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inyeccion directa dentro del tumor de modo que el antagonista entre en contacto y afecta a las celulas tumorales dentro del tumor.

Las celulas tumorigenicas identificadas tambien pueden usarse para generar anticuerpos anti-ceiulas cancerosas. El metodo puede implicar obtener una poblacion enriquecida de celulas tumorigenicas o celulas tumorigenicas aisiadas; tratar la poblacion para impedir la replicacion celular (por ejemplo, mediante irradiacion); y administrar la celula tratada a un sujeto humano o animal en una cantidad eficaz para inducir una respuesta inmunitaria frente a celulas madre de tumores solidos. Para directrices en cuanto a una dosis eficaz de celulas que van a inyectarse o administrarse por via oral; veanse las patentes estadounidenses n.os 6.218.166, 6.207.147 y 6.156.305. El metodo puede implicar obtener una poblacion enriquecida de celulas madre de tumores solidos o celulas madre de tumores solidos aisiadas; mezclar las celulas madre de tumores en un cultivo in vitro con celulas efectoras inmunitarias (segun metodos inmunologicos conocidos en la tecnica) de un sujeto humano o animal huesped en el que va a generarse el anticuerpo; retirar las celulas efectoras inmunitarias del cultivo; y trasplantar las celulas efectoras inmunitarias dentro de un animal huesped en una dosis que es eficaz para estimular una respuesta inmunitaria en el animal.

Segun la presente invencion, los agentes terapeuticos anti-tumorigenicos (por ejemplo antagonistas de la ruta de serialization de IL8-CXCR1) de la presente invencion se administran conjuntamente con otras terapias anti- neoplasicas. Una amplia gama de agentes terapeuticoes encuentran uso con la presente invencion. Cualquier agente terapeutico que pueda administrarse conjuntamente con los agentes de la presente invencion, o asociarse con los agentes de la presente invencion es adecuado para su uso en los metodos de la presente invencion.

Se contemplan diversas clases de agentes antineoplasicos (por ejemplo, anticancerigenos) para su uso en determinadas realizaciones de la presente invencion. Los agentes anticancerigenos adecuados para su uso con la presente invencion incluyen, pero no se limitan a, agentes que inducen apoptosis, agentes que inhiben la funcion de adenosina desaminasa, inhiben la biosintesis de pirimidinas, inhiben la biosintesis de anillos de purina, inhiben interconversiones de nucleotidos, inhiben la ribonucleotido reductasa, inhiben la sintesis de monofosfato de timidina (TMP), inhiben la reduction de dihidrofolato, inhiben la sintesis de ADN, forman aductos con el ADN, danan el ADN, inhiben la reparation del ADN, se intercalan con el ADN, desaminan asparaginas, inhiben la sintesis de ARN, inhiben la sintesis o estabilidad de proteinas, inhiben la sintesis o funcion de microtubulos, y similares.

En algunas realizaciones, los agentes anticancerigenos a modo de ejemplo adecuados para su uso en las composiciones y los metodos de la presente invencion incluyen, pero no se limitan a: 1) alcaloides, incluyendo inhibidores de microtubulos (por ejemplo, vincristina, vinblastina y vindesina, etc.), estabilizadores de microtubulos (por ejemplo, paclitaxel (TAXOL) y docetaxel, etc.) e inhibidores de la funcion de la cromatina, incluyendo inhibidores de topoisomerasa, tales como epipodofilotoxinas (por ejempio, etoposido (VP-16) y teniposido (VM-26), etc.), y agentes que seleccionan como diana la topoisomerasa I (por ejemplo, camptotecina e isirinotecan (CPT-11), etc.); 2) agentes de union a ADN covalentes (agentes alquilantes), incluyendo mostazas de nitrogeno (por ejemplo, mecloretamina, clorambucilo, ciclofosfamida, ifosfamida y busulfano (MILERAN), etc.), nitrosoureas (por ejemplo, carmustina, lomustina y semustina, etc.), y otros agentes alquilantes (por ejemplo, dacarbazina, hidroximetilmelamina, tiotepa y mitomicina, etc.); 3) agentes de union a ADN no covalentes (antibioticos antitumorales), incluyendo inhibidores de acido nucleico (por ejemplo, dactinomicina (actinomicina D), etc.), antraciclinas (por ejemplo, daunorubicina (daunomicina y cerubidina), doxorubicina (adriamicina) e idarubicina (idamicina), etc.), antracenodionas (por ejemplo, analogos de antraciclina, tales como mitoxantrona, etc.), bleomicinas (BLENOXANE), etc., y plicamicina (mitramicina), etc.; 4) antimetabolitos, incluyendo antifolatos (por ejemplo, metotrexato, FOLEX y MEXATE, etc ), antimetabolitos de purina (por ejemplo, 6-mercaptopurina (6-MP, PURINETOL), 6-tioguanina (6-TG), azatioprina, aciclovir, ganciclovir, clorodeoxiadenosina, 2-clorodeoxiadenosina (CdA) y 2-desoxicoformicina (pentostatina), etc.), antagonistas de pirimidina (por ejemplo, fluoropirimidinas (por ejemplo, 5-fluorouracilo (ADRUCIL), 5-fluorodeoxiuridina (FdUrd) (floxuridina)) etc.) y arabinosidos de citosina (por ejemplo, CYTOSAR (ara-C) y fludarabina, etc.); 5) enzimas, incluyendo L-asparaginasa e hidroxiurea, etc.; 6) hormonas, incluyendo glucocorticoides, antiestrogenos (por ejemplo, tamoxifeno, etc.), antiandrogenos no esteroideos (por ejemplo, fiutamida, etc.) y inhibidores de aromatasa (por ejemplo, anastrozol (ARIMIDEX), etc.); 7) compuestos de platino (por ejemplo, cisplatino y carboplatino, etc ); 8) anticuerpos monoclonales conjugados con farmacos anticancerigenos, toxinas y/o radionuclidos, etc.; 9) modificadores de la respuesta biologica (por ejemplo, interferones (por ejemplo, IFN-a, etc.) e interleucinas (por ejemplo, IL-2, etc.), etc.); 10) inmunoterapia adoptiva; 11) factores de crecimiento hematopoyeticos; 12) agentes que inducen diferenciacion de celulas tumorales (por ejemplo, acido todo-trans-retinoico, etc.); 13) tecnicas de terapia genica; 14) tecnicas de terapia antisentido; 15) vacunas contra tumores; 16) terapias dirigida contra metastasis tumorales (por ejemplo, batimastat, etc.); 17) inhibidores de la angiogenesis; 18) inhibidores de proteosomas (por ejemplo, VELCADE); 19) inhibidores de acetilacion y/o metilacion (por ejemplo, inhibidores de HDAC); 20) moduladores de NF kappa B; 21) inhibidores de la regulation del ciclo celular (por ejemplo, inhibidores de CDK); 22) moduladores de la funcion de la proteina p53; y 23) radiation.

Cualquier agente oncolitico que se use rutinariamente en un contexto de terapia para el cancer encuentra uso en las composiciones y los metodos de la presente invencion. Por ejemplo, la Food and Drug Administration de los EE.UU. mantiene un formulario de agentes oncoliticos aprobados para su uso en los Estados Unidos. Las agencias homologas internacionales a la F.D.A. de los EE.UU. mantienen formularios similares. La tabla 3 proporciona una lista de agentes antineoplasicos a modo de ejemplo aprobados para su uso en los EE.UU. Los expertos en la tecnica

apreciaran que las “etiquetas de producto” requeridas en todos los agentes quimioterapicos aprobados en los EE.UU. describen indicaciones aprobadas, informacion de dosificacion, datos de toxicidad, y similares, para los agentes a modo de ejemplo.

TABLA3

Aldesleucina (des-alanil-1, serina-125 interleucina humana-2)

Proleukin Chiron Corp., Emeryville, CA

Alemtuzumab (IgGlK anticuerpo anti-CD52)

Campath Millennium and ILEX Partners, LP, Cambridge, MA

Alitretinoina (acido 9-cis-retinoico)

Panretin Ligand Pharmaceuticals, Inc., San Diego CA

Alopurinol (sal de monosodio de 1,5-dihidro-4H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4- ona)

Zyloprim GlaxoSmithKline, Research Triangle Park, NC

Altretamina (N,N,N,.N’,N”,N’,-hexametii-1,3,5-triazin-2,4,6-triamina)

Hexalen US Bioscience, West Conshohocken, PA

Amifostina (etanotiol, 2-[(3-aminopropil)amino]-, dihidrogenofosfato (ester))

Ethyol US Bioscience

Anastrozol (1,3-bencenodiacetonitrilo, a,a,a’,a’-tetrametil-5-(1 H-1,2,4-triazol- 1-ilmetilo))

Arimidex AstraZeneca Pharmaceuticals, LP, Wilmington, DE

Trioxido de arsenico

Trisenox Cell Therapeutic, Inc., Seattle, WA

Asparaginasa (L-asparaqina amidohidrolasa, tipo EC-2)

Elspar Merck & Co., Inc., Whitehouse Station, NJ

BCG viva (preparation liofilizada de una cepa atenuada de Mycobacterium bovis (Bacilo Calmette-Gukin [BCG], subcepa Montreal)

TICE BCG Organon Teknika, Corp., Durham, NC

Capsulas de bexaroteno (acido 4-[1-(5,6,7,8-tetrahidro-3,5,5,8,8-pentametil-2- naftalenil)etenil]benzoico)

Targretin Ligand Pharmaceuticals

Gel de bexaroteno

Targretin Ligand Pharmaceuticals

Bleomicina (antibioticos glicopeptidicos citotoxicos producidos por Streptomyces verticillus', bleomicina A2 y bleomicina B2)

Blenoxane Bristol-Myers Squibb Co., NY, NY

Capecitabina (5'-desoxi-5-fluoro-N-[(pentuloxi)carbonil]-citidina)

Xeloda Roche

Carboplatino (platino, diammina [1,1-ciclobutanodicarboxilato(2-)-0,0'J-,(SP-4- 2))

Paraplatin Bristol-Myers Squibb

Carmustina (1,3-bis(2-cloroetil)-1-nitrosourea)

BCNU, BiCNU Bristol-Myers Squibb

Carmustina con implante de Polifeprosan 20

Gliadel Wafer Guilford Pharmaceuticals, lnc„ Baltimore, MD

Celecoxib (como 4-[5-(4-metilfenil)-3-(trifluorometil)-1H-pirazol-1- iljbencenosulfonamida)

Celebrex Searle Pharmaceuticals, Inglaterra

Clorambucilo (acido 4-[bis(2-cloretil)amino]bencenobutanoico)

Leukeran GlaxoSmithKline

Cisplatino (PtCI2H6N2)

Platinol Bristol-Myers Squibb

Cladribina (2-cloro-2'-desoxi-b-D-adenosina)

Leustatin, 2-CdA R.W. Johnson Pharmaceutical Research Institute, Raritan, NJ

Ciclofosfamida (2-6xido de 2-[bis(2-cloroetil)amino]tetrahidro-2H-13,2- oxazafosforina monohidratado)

Cytoxan, Neosar Bristol-Myers Squibb

Citarabina (1-b-D-Arabinofuranosilcytosina, C9H13N3O5)

Cytosar-U Pharmacia & Upjohn Company

Citarabina liposomal

DepoCyt Skye Pharmaceuticals, Inc., San Diego, CA

Dacarbazina (5-(3,3-dimetii-1 -triazeno)-imidazol-4-carboxamida (DTIC))

DTIC-Dome Bayer AG, Leverkusen, Alemania

Dactinomicina, actinomicina D (actinomicina producida por Streptomyces parvullus, C62H86N12O16)

Cosmegen Merck

Darbepoetina alfa (peptido recombinante)

Aranesp Amgen, Inc., Thousand Oaks, CA

Daunorubicina liposomal (clorhidrato de (8S-ris)-8-acetil-10-[(3-amino-2,3,6-tridesoxi-a-L- lixo-hexopiranosil)oxi]-7,8,9,10-tetrahidro-6,8,11-trihidroxi-1- metoxi-5,12-naftacenodiona)

DanuoXome Nexstar Pharmaceuticals, Inc., Boulder, CO

Daunorubicina HCI, daunomicina (clorhidrato de (1S,3S)-3-amino-2,3,6-tridesoxi-(alfa)-L-//xo- hexopiranosido de 3-acetil-1,2,3,4,6,11-hexahidro-3,5,12- trihidroxi-10-metoxi-6,11-dioxo-1-naftacenilo)

Cerubidine Wyeth Ayerst, Madison, NJ

Denileucina diflitox (peptido recombinante)

Ontak Seragen, Inc., Hopkinton, MA

Dexrazoxana ((S)-4,4'-(1-metil-1,2-etanodiil)bis-2,6-piperazindiona)

Zinecard Pharmacia & Upjohn Company

Docetaxel ((2R,3S)-N-carboxi-3-fenilisoserina, ester N-terc-butilico, 13-ester con 4-acetato 2-benzoato de 5b-20-epoxi-12a,4,7b,10b,13a- hexahidroxitax-11-en-9-ona, trihidratado)

Taxotere Aventis Pharmaceuticals, Inc., Bridgewater, NJ

Doxorubicina HCI (clorhidrato de 8S,10S)-10-[(3-amino-2,3,6-tridesoxi-a-L-!ixo- hexopiranosil)oxi]-8-glicoli!-7,8t9,10-tetrahidro-6,8,11 -trihidroxi-1- metoxi-5,12-naftacenodiona)

Adriamycin, Rubex Pharmacia & Upjohn Company

Doxorubicina

Adriamycin PFS inyeccion intravenosa Pharmacia & Upjohn Company

Doxorubicina liposomal

Doxil Sequus Pharmaceuticals, Inc., Menlo park, CA

Propionato de dromostanolona (propionato de 17b-hidroxi-2a-metil-5a-endrostan-3-ona)

Dromostanolone Eli Lilly & Company, Indianapolis, IN

Propionato de dromostanolona

Inyeccion de Mesterone Syntex, Corp., Palo Alto, CA

Disolucion B de Elliott

Disolucidn B de Elliott Orphan Medical, Inc

Epirubicina (clorhidrato de (8S-cis)-10-[(3-amino-2,3,6-tridesoxi-a-L-arabino- hexopiranosil)oxi]-7,8,9,10-tetrahidro-6,8,11-trihidroxi-8- (hidroxiacetil)-l -metoxi-5,12-naftacenodiona)

Ellence Pharmacia & Upjohn Company

Epoetina alfa (peptido recombinante)

Epogen Amgen, Inc

Estramustina (estra-1,3,5(10)-trieno-3,17-diol(17(beta))-, 3-[bis(2- cloroetil)carbamato] 17-(dihidrogenfosfato), sal de disodio, monohidratado, 0 estradiol 3-[bis(2-cloroetil)carbamato] 17- (dihidroqenofosfato), sal de disodio, monohidratado)

Emcyt Pharmacia & Upjohn Company

Fosfato de etoposido (9-[4,6-0-(R)-etiliden-(beta)-D-glucopiranosido de 4- desmetilepipodofilotoxina], 4’-(dihidrogenofosfato))

Etopophos Bristol-Myers Squibb

Etoposido, VP-16 (9-[4,6-0-(R)-etiliden-(beta)-D-glucopiranosido de 4’- desmetilepipodofilotoxinal)

Vepesid Bristol-Myers Squibb

Exemestano (6-metilenandrosta-1,4-dieno-3,17-diona)

Aromasin Pharmacia & Upjohn Company

Filgrastim (r-metHuG-CSF)

Neupogen Amgen, Inc

Floxuridina (intraarterial) (2’-desoxi-5-fluorouridina)

FUDR Roche

Fludarabina (analogo de nucleotido fluorado del agente antiviral vidarabina, 9-

Fludara Berlex Laboratories, Inc., Cedar Knolls, NJ

b-D-arabinofuranosiladenina (ara-A))

Fluorouracilo, 5-FU (5-fluoro-2,4(1H,3H)-pirimidindiona)

Adrucil ICN Pharmaceuticals, Inc., Humacao, Puerto Rico

Fulvestrant ^-alfa-jQ-^AS.S.S-pentafiuoropentisulfiniOnoniljestra-I.S.S-OO)- trieno-3,17-beta-diol)

Faslodex IPR Pharmaceuticals, Guayama, Puerto Rico

Gemcitabina (monociorhidrato de 2’-desoxi-2',2'-difluorocitidina (isomero b))

Gemzar Eli Lilly

Gemtuzumab ozogamicina (anti-CD33 hP67.6)

Mylotarg Wyeth Ayerst

Acetato de goserelina (sal de acetato de [D-Ser(But)6,Azgly10]LHRH; acetato de pyro- Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2 fCsgHwNlsO^ *(C2H402)x

Zoladex Implant AstraZeneca Pharmaceuticals

Hidroxiurea

Hydrea Bristol-Myers Squibb

tbritumomab tiuxetano (inmunoconjugado que results de un enlace covalente de tiourea entre el anticuerpo monoclonal ibritumomab y el ligador-quelante tiuxetano [N-[2-bis(carboximetil)amino]-3-(p-isotiocianatofenil)- propilHN-r2-bis(carboximetil)aminol-2-(metil)-etillglicina)

Zevalin Biogen IDEC, Inc., Cambridge MA

Idarubicina (5,12-naftacenodiona, 9-acetil-7-[(3-amino-2,3(6-tridesoxi-(alfa)-L- lixo-hexopiranosil)oxi]-7,8,9,10-tetrahidro-6,9,11- trihidroxiclorhidrato, (7S-cis))

Idamycin Pharmacia & Upjohn Company

Ifosfamida (2-oxido de 3-(2-cloroetii)-2-[(2-cloroetil)amino]tetrahidro-2H- 1,3,2-oxazafosforina)

IFEX Bristol-Myers Squibb

Mesilato de imatinib (metanosulfonato de 4-[(4-metil-1-piperatinil)metil]-N-[4-metil-3- [[4-(3-piridinil)-2-pirimidinillaminol-fenillbenzamida)

Gleevec Novartis AG, Basel, Suiza

Interferon alfa-2a (peptido recombinante)

Roferon-A Hoffmann-La Roche, Inc., Nutley, NJ

Interferon alfa-2b (peptido recombinante)

Intron A (Betaseron liofilizado) Schering AG, Berlin, Alemania

Irinotecan HCl (clorhidrato de (4S)-4,11-dietil-4-hidroxi-9-[(4- piperidinopiperidino)carboniloxi]-1H-pirano[3’,4’:6,7]indolizino[1,2- blquinolin-3,14(4H,12H)diona trihidratado)

Camptosar Pharmacia & Upjohn Company

Letrozol (4,4'-(1 H-1,2,4-triazol-1-ilmetilen)dibenzonitrilo)

Femara Novartis

Leucovorina (acido L-glutamico, N[4[[(2amino-5-formil-1,4,5t6,7,8 hexahidro4oxo6-pteridinil)metillamino]benzoil], sal de calcio (1:1))

Wellcovorin, Leucovorin Immunex, Corp., Seattle, WA

Levamisol HCl (clorhidrato de (-)-{S)-2,3,5,6-tetrahidro-6-fenilimidazo[2,1-b]tiazol C11H12N2S HCl)

Ergamisol Janssen Research Foundation, Titusville, NJ

Lomustina (1 -(2-cloro-etil)-3-ciclohexil-1 -nitrosourea)

CeeNU Bristol-Myers Squibb

Mecloretamina, mostaza de nitrogeno (clorhidrato de 2-cloro-N-(2-cloroetil)-N-metiletanamina)

Mustargen Merck

Acetato de megestrol 17a(acetiloxi)-6-metilpregna-4,6-dieno-3,20-diona

Megace Bristol-Myers Squibb

Melfalan, L-PAM (4-fbis(2-cloroetil)aminol-L-fenilalanina)

Alkeran GlaxoSmithKline

Mercaptopurina, 6-MP (1,7-dihidro-6H-purina-6-tiona monohidratada)

Purinethol GlaxoSmithKline

Mesna (2-mercaptoetanosulfonato de sodio)

Mesnex Asta Medica

Metotrexato (acido N-[4-[[(2,4-diamino-6-pteridinil)metil]metilamino]benzoi!]-L- glutamico)

Methotrexate Lederle Laboratories

Metoxsalen

Uvadex Therakos, Inc., Way

(9-metoxi-7H-furo[3,2-g][1]-benzopiran-7-ona)

Exton, Pa

Mitomicina C

Mutamycin Bristol-Myers Squibb

Mitomicina C

Mitozytrex SuperGen, Inc., Dublin, CA

Mitotano (1,1'diclorO'2-(o-clorofenil)-2-(p-c!orofenil)etano)

Lysodren Bristol-Myers Squibb

Mitoxantrona (clorhidrato de 1,4-dihidroxi-5,8-bis[[2-[(2- hidroxietil)aminoletil]aminol-9,10-antracenodiona)

Novantrone Immunex Corporation

Fenpropionato de nandrolona

Durabolin-50 Organon, Inc., West Orange, NJ

Nofetumomab

Verluma Boehringer Ingelheim Pharma KG, Alemania

Oprelvekina <11-11)

Neumega Genetics Institute, Inc., Alexandria, VA

Oxaliplatino (cis-[(1R,2R)-1,2-ciclohexanodiamina-N,N’][oxalato(2-)- 0,0’lplatino)

Eloxatin Sanofi Synthelabo, Inc., NY, NY

Paclitaxel (5p,20-epoxi-1,2a,4,7(3,10p,13a-hexahidroxitax-11-en-9-ona 4,10- diacetato 2-benzoato 13-ester con (2R,3S)-N-benzoil-3- fenilisoserina)

TAXOL Bristol-Myers Squibb

Pamidronato (acido fosfonico (3-amino-1-hidroxipropiliden)bis-, sal de disodio, pentahidratado, (APD))

Aredia Novartis

Pegademasa {{monometoxipoloetilenglicolsuccinimidilo)11-17- adenosina desaminasa)

Adagen (pegademasa bovina) Enzon Pharmaceuticals, Inc., Bridgewater, NJ

Pegaspargasa (monometoxipolietilenglicolsuccinimidi! L- asparaginasa)

Oncaspar Enzon

Pegfilgrastim (conjugado covalente de metionil-G-CSF humana recombinante (filgrastim) y monometoxipolietilenglicol)

Neulasta Amgen, Inc

Pentostatina

Nipent Parke-Davis Pharmaceutical Co., Rockville, MD

Pipobromano

Vercyte Abbott Laboratories, Abbott Park, IL.

Plicamicina, mitramicina (antibiotico producido por Streptomyces plicatus)

Mithracin Pfizer, Inc., NY, NY

Porfimero sodico

Photofrin QLT Phototherapeutics, Inc., Vancouver, Canada

Procarbazina (monoclorhidrato de N-isopropil-m-(2-metilhidrazino)-p-toluamida)

Matulane Sigma Tau Pharmaceuticals, Inc., Gaithersburg, MD

Guinacrina (6-cloro-9-(1-metil-4-dietil-amina)butilamino-2-metoxiacridina)

Atabrine Abbott Labs

Rasburicasa (peptido recombinante)

Elitek Sanofi-Synthelabo, Inc.,

Rituximab (anticuerpo anti-CD20 recombinante)

Rituxan Genentech, Inc., South San Francisco, CA

Sargramostim (peptido recombinante)

Prokine Immunex Corp

Estreptozocina (estreptozocin-2-desoxi-2-[[(metilnitrosoamino)carbonil]amino]-a(y b)-D-qlucopiranosa y 220 mg de acido citrico anhidro)

Zanosar Pharmacia & Upjohn Company

Talco (Mq3Si40io (OH);)

Sclerosol Bryan, Corp., Woburn, MA

Tamoxifeno ((Z)2-hidroxi-1,2,3-propanotricarboxilato de 2-[4-(1,2-difenil-1- butenil)fenosil-N,N-dimetiletanamina (1:1))

Nolvadex AstraZeneca Pharmaceuticals

Temozolomida (3,4-dihidro-3-metil-4-oxoimidazo[5,1-d]-as-tetrazin-8-

Temodar Schering

carboxamida)

Teniposido, VM-26 (9-[4,6-0-(R)-2-teniliden-(beta)-D-glucopiranosido de 4- desmetilepipodofilotoxina])

Vumon Bristol-Myers Squibb

Testolactona (acido 13-hidroxi-3-oxo-13,17-secoandrosta-1,4-dien-17-oico [dgr]-lactona)

Teslac Bristol-Myers Squibb

Tioguanina, 6-TG (2-amino-1,7-dihidro-6H-purina-6-tiona)

Thioguanine GlaxoSmithKline

Tiotepa (aziridina, sulfuro de 1l1’,1”-fosfinotioilidintris-, o tris(1- aziridiniljfosfina)

Thioplex Immunex Corporation

Topotecan HCI (monociorhidrato de (S)-10-[(dimetilamino)metil]-4-eti!-4,9- dihidroxi-1H-pirano[3’,4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-3,14- (4H,12H)-diona)

Hycamtin GlaxoSmithKline

Toremifeno (citrato de 2-(p-[(Z)-4-cloro-1,2-difenil-1-butenil]-fenoxi)-N,N- dimetiletilamina (1:1))

Fareston Roberts Pharmaceutical Corp., Eatontown, NJ

Tositumomab, 1131 Tositumomab (anticuerpo anti-CD20 de lgG2a lambda monoclonal inmunoterapeutico murino recombinante (I 131 es un anticuerpo inmunoterapeutico))

Bexxar Corixa Corp., Seattle, WA

Trastuzumab (anticuerpo anti-HER2 de IgGi kappa monoclonal recombinante)

Herceptin Genentech, Inc

Tretinoina, ATRA (acido todo-trans-retinoico)

Vesanoid Roche

Mostaza de uracilo

Capsulas de mostaza de uracilo Roberts Labs

Valrubicina, N-trifluoroacetiladriamicina-14-valerato (pentanoato de (2S-cis)-2-[1,2,3,4,6,11-hexahidro-2,5,12- trihidroxi-7metoxi-6,11-dioxo-[[42,3,6-tridesoxi-3-[(tiifluoroacetil)- amino-a-L-lixo-hexopiranosilloxil]-2-naftacenill-2-oxoetilo)

Valstar Anthra —> Medeva

Vinblastina, leurocristina (C46H56N4O10-H2SO4)

Velban Eli Lilly

Vincristina (C46H56N4O l o’ H2SO4)

Oncovin Eli Lilly

Vinorelbina (S'.A'-dideshidro-A'-desoxi-C’-norvincaleucoblastina [R-(R*,R*)- 2,3-dihidroxibutanodioato (1:2)(sal)])

Navelbine GlaxoSmithKline

Zoledronato, acido zoledronico (acido (1-hidroxi-2-imidazol-1-il-fosfonoetil)fosf6nico monohidratado)

Zorn eta Novartis

Tambien pueden usarse agentes terapeuticos antimicrobianos como agentes terapeuticos en la presente divulgacion. Puede usarse cualquier agente que pueda destruir, inhibir o atenuar de otra forma la funcion de organismos microbianos, asi como cualquier agente que se contempla que tiene tales actividades. Los agentes antimicrobianos incluyen, pero no se limitan a, antibioticos naturales y sinteticos, anticuerpos, proteinas inhibidoras 5 (por ejemplo, defensinas), acidos nucleicos antisentido, agentes disruptores de la membrana y similares, usados solos o en combinacion. De hecho, puede usarse cualquier tipo de antibiotico incluyendo, pero sin limitarse a, agentes antibacterianos, agentes antivirales, agentes antifungicos, y similares.

Los compuestos (y cualquier otro agente quimioterapico) asociados con agentes de direccionamiento pueden seleccionar como diana especificamente tipos de celulas particulares (por ejemplo, celulas tumorales). De manera 10 general, el compuesto terapeutico que esta asociado con un agente de direccionamiento seiecciona como diana celulas neoplasicas a traves de la interaction del agente de direccionamiento con un resto de la superficie celular que se introduce en la celula a traves de endocitosis mediada por receptor.

Cualquier resto que se sepa que esta ubicado en la superficie de celulas diana (por ejemplo, celulas tumorales) encuentra uso con la presente invencion. Por ejemplo, un anticuerpo dirigido contra un resto de este tipo dirige las 15 composiciones a superficies celulares que contienen el resto. Alternativamente, el resto de direccionamiento puede ser un ligando dirigido a un receptor presente sobre la superficie celular o viceversa. De manera similar, tambien pueden usarse vitaminas para dirigir los agentes terapeuticos de la presente invencion a una celula particular.

Tal como se usa en e! presente documento, el termino “moleculas de direccionamiento” se refiere a restos quimicos,

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y partes de los mismos utiles para dirigir compuestos terapeuticos a celulas, tejidos y organos de interes. Se contemplan diversos tipos de moleculas de direccionamiento para su uso con la presente invencion incluyendo, pero sin limitarse a, peptidos serial, anticuerpos, acidos nucleicos, toxinas y similares. Los restos de direccionamiento pueden promover adicionalmente la union de los compuestos quimicos asociados (por ejemplo, moleculas pequenas) o la entrada de los compuestos dentro de las celulas, los tejidos y los drganos seleccionados como diana. Preferiblemente, se seleccionan restos de direccionamiento segun su especificidad, afinidad y eficacia en la administracion selectiva de compuestos unidos a sitios seleccionados como diana dentro de un sujeto, tejido, o una celula, incluyendo organulos y ubicaciones subcelulares especificas.

Diversos problemas de eficacia afectan a la administracion de todos los farmacos y de farmacos altamente citotoxicos (por ejemplo, fbrmacos anticancerigenos) en particular. Un problema de particular importancia es garantizar que los agentes administrados afecten solo a las celulas (por ejemplo, celulas cancerosas), los tejidos o los organos seleccionados como diana. La administracion no especifica o no deliberada de agentes altamente citotoxicos a celulas no seleccionadas como diana puede provocar problemas de toxicidad graves.

Se han hecho numerosos intentos para idear esquemas de direccionamiento de farmacos para abordar los problemas asociados con la administracion no especifica de farmacos (vease por ejemplo, K.N. Syrigos y A.A. Epenetos Anticancer Res., 19:606-614 (1999); Y.J. Park et a/., J. Controlled Release, 78:67-79 (2002); RV.J. Chari, Adv. Drug Deliv. Rev., 31:89-104 (1998); y D. Putnam y J. Kopecek, Adv. Polymer Sci., 122:55-123 (1995)). Se han usado restos de direccionamiento de conjugacion tales como anticuerpos y peptidos de ligando (por ejemplo, RDG para celulas del endotelio) frente a moleculas de farmaco para aliviar algunos problemas de toxicidad colaterales asociados con farmacos particulares.

Los compuestos y agentes anticancerigenos pueden administrarse en cualquier portador farmaceutico esteril, biocompatible, incluyendo, pero sin limitarse a, solucion salina, solucion salina tamponada, dextrosa y agua. Las composiciones farmaceuticas pueden contener un agente (por ejemplo, un anticuerpo). Segun la invencion, las composiciones farmaceuticas pueden contener una mezcla de al menos dos agentes (por ejemplo, un anticuerpo y uno o mas agentes anticancerigenos convencionales). Ademas, las composiciones farmaceuticas de la presente invencion contienen al menos dos agentes que se administran a un paciente en una o mbs de las siguientes condiciones: a diferentes periodicidades, a diferentes duraciones, a diferentes concentraciones, por diferentes vias de administracion, etc. En algunas realizaciones, el antagonista de la ruta de serialization de IL8-CXCR1 se administra antes del segundo agente anticancerigeno, por ejemplo, 0,5,1, 2, 3, 4, 5, 10,12 6 18 horas, 1, 2, 3, 4, 5 6 6 dias, 1,2, 3 6 4 semanas antes de la administracion del agente anticancerigeno. En algunas realizaciones, ei antagonista de la ruta de sehalizacion de IL8-CXCR1 se administra despues del segundo agente anticancerigeno, por ejemplo, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 12 6 18 horas, 1, 2, 3, 4, 5 6 6 dias, 1, 2, 3 6 4 semanas despues de la administracion del agente anticancerigeno. En algunas realizaciones, el antagonista de la ruta de sehalizacion de IL8-CXCR1 y el segundo agente anticancerigeno se administran simultaneamente pero en diferentes programas, por ejemplo, el compuesto antagonista de la ruta de sehalizacion de IL8-CXCR1 se administra diariamente mientras que el segundo agente anticancerigeno se administra una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas o una vez cada cuatro semanas. En otras realizaciones, antagonista de la ruta de serializacibn de IL8- CXCR1 se administra una vez a la semana mientras que el segundo agente anticancerigeno se administra diariamente, una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas o una vez cada cuatro semanas.

Dependiendo del estado que esta tratandose, se formulan realizaciones preferidas de las presentes composiciones farmaceuticas y se administran de manera sistemica o local. Pueden encontrarse tecnicas para la formulation y administracion en la ultima edition de “Remington's Pharmaceutical Sciences" (Mack Publishing Co, Easton Pa,). Las vias adecuadas pueden incluir, por ejemplo, administracion oral o transmucosa asi como administracion parenteral (por ejemplo, administracion intramuscular, subcutanea, intramedular, intratecal, intraventricular, intravenosa, intraperitoneal o intranasal).

La presente invencion contempla la administracion de compuestos terapbuticos y, en algunas realizaciones, uno o mas agentes anticancerigenos convencionales, segun tecnicas de preparation y metodos de administracion farmaceuticos aceptables. Por ejemplo, pueden administrarse compuestos terapeuticos y agentes anticancerigenos adecuados a un sujeto por via intravenosa en un portador farmaceuticamente aceptable tal como solucion salina fisiologica. Se contemplan metodos convencionales para la administracion intracelular de agentes farmaceuticos (por ejemplo, administracion por medio de liposomas). Tales metodos los conocen bien los expertos habituales en la tecnica.

En algunas realizaciones, las formulaciones de la presente invencion son utiles para administracion parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutanea, intramuscular, intramedular y intraperitoneal). La coadministracion terapeutica de algunos agentes anticancerigenos contemplados (por ejemplo, polipeptidos terapeuticos) puede lograrse usando tecnicas y reactivos de terapia genica.

En algunas realizaciones de la presente invencion, se administran compuestos terapeuticos a un sujeto en combination con uno o mas agentes anticancerigenos convencionales (por ejemplo, secuencias de nucleotidos, farmacos, hormonas, etc.) o en composiciones farmaceuticas en donde los componentes se mezclan opcionalmente

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con excipiente(s) u otros portadores farmaceuticamente aceptables. En realizaciones preferidas de la presente invencion, los portadores farmaceuticamente aceptables son biologicamente inertes. En realizaciones preferidas, las composiciones farmaceuticas de la presente invencion se formulan usando portadores farmaceuticamente aceptables bien conocidos en la tecnica en dosificaciones adecuadas para administracion oral. Tales portadores permiten que las composiciones farmaceuticas se formulen como comprimidos, pildoras, capsulas, comprimidos recubiertos de azucar, liquidos, geles, jarabes, suspensiones espesas, disoluciones, suspensiones y similares, para la ingestion oral o nasal respectiva por un sujeto.

Pueden obtenerse preparaciones farmaceuticas para uso oral combinando los compuestos activos con excipientes solidos, opcionalmente triturando la mezcla resultante y procesando la mezcla para dar granulos, tras anadir agentes auxiliares adecuados, si se desea, para obtener comprimidos o nucleos de comprimidos recubiertos de azucar. Excipientes adecuados son cargas de hidratos de carbono o proteinas tales como azucares, incluyendo lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; almidon de malz, trigo, arroz, patata, etc.; celulosa tal como metilcelulosa, hidroxipropilmetil-celulosa o carboximetilcelulosa de sodio; gomas incluyendo arabiga y tragacanto; y proteinas tales como gelatina y colageno. Si se desea, pueden anadirse agentes disgregantes o solubilizantes, tales como la polivinilpirrolidona reticulada, agar, acido alginico o una sal del mismo tal como alginato de sodio.

En realizaciones preferidas. el medico, u otros expertos en las tecnicas farmacologicas, adaptan los regimenes de dosificacion y administracion, basandose en consideraciones farmacologicas y terapeuticas bien conocidas incluyendo, pero sin limitarse a, el nivel deseado de efecto terapeutico, y el nivel practico de efecto terapeutico obtenible. De manera general, es aconsejable seguir principios farmacologicos bien conocidos para administrar agentes quimioterapicos (por ejemplo, generalmente es aconsejable no cambiar las dosificaciones en mas del 50% de una vez y no mas que cada 3-4 semividas del agente). Para composiciones que tienen relativamente pocas o ningunas consideraciones de toxicidad relacionadas con la dosis, y cuando se desea una eficacia meixima (por ejemplo, destruccion de ceiulas cancerosas), no son raras dosis en exceso de la dosis requerida promedio. Este enfoque para la dosificacion se denomina comunmente estrategia de “dosis maxima”. En determinadas realizaciones, el antagonista de la ruta de senalizacion de IL8-CXCR1 se administra a un sujeto a una dosis de 140 mg al dia (por ejemplo durante 4-6 semanas). En determinadas realizaciones, al sujeto se le administra una dosis de carga de entre 15-70 mg del antagonista de la ruta de senalizacion de IL8-CXCR1. En determinadas realizaciones, al sujeto se le administra una dosis de carga de aproximadamente 35-45 mg del antagonista de la ruta de senalizacion de IL8-CXCR1 (por ejemplo por via subcutanea), y luego diariamente dosis de aproximadamente 10 mg (por ejemplo por via subcutanea) durante aproximadamente 4-6 semanas.

Consideraciones de dosificacion adicionales se refieren al calculo de los niveles objetivo apropiados para el agente que esta administrandose, la acumulacion del agente y la toxicidad potencial, la estimulacion de resistencia, la falta de eficacia y la descripcion del intervalo del indice terapeutico del agente.

En determinadas realizaciones, la presente invencion contempla el uso de metodos de rutina de titulacion de la administracion del agente. Una estrategia comim para la administracion es fijar un nivel objetivo razonable para el agente en el sujeto. En algunas realizaciones preferidas, los niveles de agente se miden en el plasma del sujeto. Entonces se disenan frecuencias y niveles de dosis apropiados para lograr el nivel objetivo en estado estacionario deseado para el agente. Se monitorizan los niveles reales, o promedio, del agente en el sujeto (por ejemplo, cada hora, diariamente, semanalmente, etc.) de manera que las frecuencias o los niveles de dosificacion puedan ajustarse para mantener los niveles objetivo. Por supuesto, la farmacocinetica y farmacodinamica (por ejemplo, biodisponibilidad, aclaramiento o bioacumulacion, biodistribucion, interacciones farmacologicas, etc.) del agente o agentes particulares que estan administrandose pueden tener potencialmente un impacto sobre lo que se consideran niveles objetivo razonables y por tanto un impacto sobre las frecuencias o niveles de dosificacion.

Los metodos de dosificacion del nivel objetivo se basan normalmente en el establecimiento de un objetivo terapeutico razonable definido en cuanto a intervalo deseable (o intervalo terapeutico) para el agente en el sujeto. En general, el limite inferior del intervalo terapeutico es aproximadamente igual a la concentracion del agente que proporciona aproximadamente el 50% del efecto terapeutico posible maximo. El limite superior del intervalo terapeutico lo establece habitualmente la toxicidad del agente y no su eficacia. La presente invencion contempla que el limite superior del intervalo terapeutico para un agente particular sera la concentracion a la que menos del 5 o el 10% de los sujetos presentan efectos secundarios toxicos. En algunas realizaciones, el limite superior del intervalo terapeutico es aproximadamente dos veces, o menos, el limite inferior. Los expertos en la tecnica comprenderan que estas consideration de dosificacion son altamente variables y en cierto grado individuales (por ejemplo, basadas en predisposiciones geneticas, consideraciones inmunologicas, tolerancias, resistencias y similares). Por tanto, en algunas realizaciones, los niveles de dosificacion objetivo eficaces para un agente en un sujeto particular pueden ser el 1, ... 5,... 10, .. . 15, ... 20, ... 50, ... 75, ... 100,... 200,... X%, mayores que el optimo en otro sujeto. A la inversa, algunos sujetos pueden padecer efectos secundarios significativos y problemas de salud relacionados con toxicidad

a frecuencias o niveles de dosificacion mucho menores (el 1, ... 5, ... 10... 15,... 20,... 50, ... 75,.. 100,... 200,... X%)

que los que normalmente producen niveles terapeuticos optimos en algunos o una mayoria de sujetos. En ausencia de mas information especifica, los niveles de administracion objetivo se fijan a menudo en la mitad del intervalo terapeutico.

En realizaciones preferidas, el medico diseria racionalmente un regimen de dosificacion individualizado basandose

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en principios y ecuaciones farmacologicos conocidos. En general, el medico disena un regimen de dosificacion individualizado basandose en el conocimiento de diversas propiedades farmacologicas y farmacocineticas del agente, incluyendo, pero sin limitarse a, F (biodisponibilidad fraccional de la dosis), Cp (concentracion en el plasma), CL (aclaramiento/tasa de aclaramiento), Vss (volumen de distribution de farmaco en estado estacionario) Css (concentracion en estado estacionario) y t1/2 (semivida del farmaco), asi como information sobre la distribucion y tasa de absorcion del agente. Se remite a los expertos en la tecnica a cualquiera de varios textos farmacologicos bien conocidos (por ejemplo, Goodman y Gilman’s, Pharmaceutical Basis of Therapeutics, 10a ed., Hardman et al., eds,, 2001) para una explication adicional de estas variables y para ecuaciones completas que ilustran el calculo de regimenes de dosificacion individualizados. Los expertos en la tecnica tambien podran anticipar posibles fluctuaciones en estas variables en sujetos individuates. Por ejemplo, la desviacion estandar en los valores observados para F, CL y Vss es normalmente de aproximadamente el 20%, el 50% y el 30%, respectivamente. El efecto practico de parametros que varian posiblemente de manera amplia en sujetos individuates es que el 95% del tiempo la Css lograda en un sujeto es de entre el 35 y el 270% del nivel objetivo. Para farmacos con bajos indices terapeuticos, este es un intervalo indeseablemente amplio. Sin embargo, los expertos en la tecnica apreciaran que una vez medida la Cp del agente (concentracion en el plasma), es posible estimar los valores de F, CL y Vss directamente. Esto permite al medico ajustar eficazmente de manera fina un regimen de dosificacion del sujeto particular.

En todavia otras realizaciones, la presente invention contempla que se usen tecnicas de monitorizacion de farmacos terapeuticos continuas para ajustar adicionalmente los regimenes y metodos de dosificacion de un individuo. Por ejemplo, en una realization, se usan los datos de Css para refinar adicionalmente las estimaciones de CL/F y para ajustar posteriormente la dosificacion de mantenimiento del individuo para lograr niveles objetivos del agente deseados usando principios y ecuaciones farmacologicos conocidos. La monitorizacion de farmacos terapeuticos puede realizarse en practicamente cualquier momento durante el programs de dosificacion. En realizaciones preferidas, la monitorizacion se lleva a cabo en multiples puntos de tiempo durante la dosificacion y especialmente cuando se administran dosis intermitentes. Por ejemplo, la monitorizacibn de farmacos puede realizarse de manera concomitante, en el plazo de fracciones de un segundo, segundos, minutos, horas, dias, semanas, meses, etc., de la administration del agente independientemente de la metodologia de dosificacion empleada (por ejemplo, dosificacion intermitente, dosis de carga, dosificacion de mantenimiento, dosificacion al azar, o cualquier otro metodo de dosificacion). Sin embargo, ios expertos en la tecnica apreciaran que cuando se toman muestras rapidamente tras la administracion del agente los cambios en la dinamica y los efectos del agente pueden no ser facilmente observables porque los cambios en la concentracion en plasma del agente pueden retrasarse (por ejemplo, debido a una velocidad de distribucion lenta u otros factores farmacodinamicos). Por consiguiente, las muestras del sujeto obtenidas poco despues de la administracion del agente pueden tener un valor disminuido o iimitado.

El objetivo primario de la recogida de muestras biologicas del sujeto durante el nivel objetivo en estado estacionario predicho de la administracion es modificar el regimen de dosificacion del individuo basandose en el calculo posterior de estimaciones revisadas de la razon CL/F del agente. Sin embargo, los expertos en la tecnica apreciaran que concentraciones de farmaco tras la absorcion tempranas no reflejan normalmente aclaramiento del agente. Las concentraciones de farmaco tras la absorcion tempranas estan dictadas principalmente por la tasa de absorcion del agente, el volumen central, mas que el estado estacionario, de distribucion del agente, y la velocidad de distribucion. Cada una de estas caracteristicas farmacocinetica tiene un valor Iimitado cuando se calculan regimenes de dosificacibn de mantenimiento a largo plazo.

Por consiguiente, en algunas realizaciones, cuando el objetivo es la dosificacion de mantenimiento a largo plazo terapeutica, se obtienen muestras biologicas del sujeto, celulas o tejidos de interes mucho despues de que se haya administrado la dosis previa, e incluso mas preferiblemente poco antes de que se administre la siguiente dosis planeada.

En todavia otras realizaciones, cuando el agente terapeutico casi se ha aclarado completamente del sujeto en el intervalo entre dosis, entonces la presente invencion contempla la recogida de muestras biologicas del sujeto en diversos puntos de tiempo tras la administracion previa, y lo mas preferiblemente poco despues de que se administre la dosis.

VII. Reoertaxina v otros inhibidores de CXCR1 de molecula peaueha

Segun la presente invencion pueden emplearse inhibidores de CXCR1 de molecula pequefia. Un agente a modo de ejemplo es repartaxina. En determinadas realizaciones, la dosis in vivo de repartaxina es de entre 3 y 60 mg por kilogramo (por ejemplo, 3 ... 30 ... 50 ... 60 mg/kg). En realizaciones particulars, la dosis de repartaxina es de aproximadamente 30 mg por kilogramo. La formula quimica de la repartaxina se muestra a continuacion:

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En otras realizaciones, se emplean derivados de la repertaxina. Otros antagonistas de CXCR1 de molecula pequena incluyen SB265610 (Glaxo SmithKIine Beecham; Benson et al., 2000, 151:196-197), asi como SCH 527123 (2- hidroxi-N,N-dimetil-3-(2-[[(R)-1-(5-metilfuran-2-il)propil]amino]-3,4-dioxociclobut-1-enilamino}benzamida (SCH

527123), un antagonista del receptor CXCR2/CXCR1 disponible por via oral (Schering Plough)). Pueden identificarse otros inhibidores de molecula pequena mediante los metodos de examen descritos anteriormente.

Ejemplos

El siguiente ejemplo se proporcrona con el fin de demostrar e ilustrar adicionalmente determinadas realizaciones preferidas y aspectos de la presente invention y no debe interpretarse como limitativo del alcance del mismo.

EJEMPLO 1

CXCR1 identifica celulas madre de cancer

Este ejemplo describe la identification de CXCR1, asi como otras proteinas (por ejemplo, FBX021), como marcadores de celulas madre de cancer.

Cultivo celular. Se obtuvieron lineas celulares de mama (BCL) de la ATCC (“
http://www,” seguido por “Igcpromochem-atcc.com/common/catalog/cellBiology/cellBiologyIndex.cfm”) o de colecciones desarrolladas en los laboratories de los doctores S. Ethier (ahora disponible en “
http://www.” seguido por “asterand.com/asterand/BIOREPOSITORY/hbreastcancercelllines.aspx, SUM44, SUM52, SUM149, SUM159,

SUM185, SUM190, SUM225, SUM229”), V.J. Mobus (BrCa-MZ-01) y V. Catros (S68). Todas las BCL sometidas a prueba se derivaban de carcinomas excepto MCF10A, que se deriva de enfermedad fibroquistica, y la 184A1 derivada de HMEC, que se derivo de tejido mamario normal. Se hicieron crecer las lineas celulares usando las condiciones de cultivo recomendadas. Se realizaron todos los experimentos con celulas subconfluentes en la fase de crecimiento exponencial.

Ensayo ALDEFLUOR y separation de la poblacion positiva para ALDH mediante FACS. Se evaluo la actividad de ALDH en 33 BCL que representan los subtipos moleculares principales de cancer de mama humano. Se uso el kit ALDEFLUOR (StemCell technologies, Durham, NC, EE.UU.) para aislar la poblacion con alta actividad enzimatica de ALDH (17). Se suspendieron celulas obtenidas de lineas celulares subconfluentes tras tripsinizacion o de xenoinjertos recien disociados en tampon de ensayo ALDEFLUOR que contenia sustrato de ALDH (BAAA, 1 pmol/l por 1x106 celulas) y se incubaron durante 40 minutos a 37°C. En cada experimento se tino una muestra de celulas en condiciones identicas con 50 mmol/l de dietilaminobenzaldehido (DEAB), un inhibidor de ALDH especifico, como control negativo. Se realizo clasificacion por citometria de flujo usando un instrumento FACStarPLUS (Becton Dickinson). Se excito la fluorescencia de ALDEFLUOR a 488 nm y se detecto usando un filtro paso banda 530/30 de isotiocianato de fluoresceina (FITC) convencional. Para tumores xenotrasplantados, se uso incubation con un anticuerpo anti-H2Kd (BD biosciences, 1/200, 20 min sobre hielo) se seguido por un anticuerpo secundario marcado con ficoeritrina (Jackson labs, 1/250, 20 min sobre hielo) para eliminar celulas de origen de raton. Se establecieron las compuertas de clasificacibn usando celulas tenidas con PI para viabilidad, celulas tenidas con ALDEFLUOR tratadas con DEAB y las tenidas con anticuerpo secundario solo. Antes de la obtencion de perfil de ARN o inyeccion en ratones NOD/SCID, se comprobo la pureza de las poblaciones clasificadas usando doble clasificacion de 10.000 celulas positivas y negativas para ALDEFLUOR en las lineas celulares BrCa-MZ-01 y SUM159. Para ambas lineas celulares, las poblaciones positivas para ALDEFLUOR clasificadas contenian mas del 98% de celulas positivas para ALDEFLUOR y no se detectaron celulas positivas para ALDEFLUOR en la poblacion negativa para ALDEFLUOR,

Tumorigenicidad en ratones NOD/SCID. Se evaluo la tumorigenicidad de celulas SUM 159, MDA-MB-453 y BrCa- MZ-01 positivas, negativas para ALDELFUOR y sin separar en ratones NOD/SCID. Se retiraron las almohadillas grasas del epitelio a las 3 semanas de edad antes de la pubertad y se humanizaron inyectando fibroblastos humanos (irradiados:no irradiados 1:1, 50.000 celulas/100 pi de Matrigel/almohadilla grasa) tal como se describe (17). Se sacrificaron los animates cuando los tumores tenian 1,2 cm en el diametro mas grande, en cumplimiento con las regulaciones para el uso de animates vertebrados en investigation. Se fijo una parte de cada almohadilla grasa en formalina y se incrusto en parafina para el analisis htstologico. Se evaluo otra parte mediante el ensayo ALDEFLUOR, seguido por clasificacion y trasplante en serie.

Cultivo independiente de anclaje. Se sembraron en placa celulas positivas, negativas para ALDEFLUOR y sin separar de 184A1, SUM149 y SUM159 como celulas individuates en placas de union ultra baja (Corning, Acton, MA) a baja densidad (5000 celulas viables/ml). Se hicieron crecer las celulas en medio basal de epitelio mamario libre de suero (Cambrex Bio Science, Walquerville, MD) durante 3-7 dias, tal como se describe (18). Se cuantifico la capacidad de las celulas para formar esferas tras el tratamiento con diferentes dosis de IL8 (GenWay Biotech, San Diego, CA) ariadidas al medio.

Extraction de ARN. Se extrajo el ARN total de celulas positivas y negativas para ALDEFLUOR usando el kit All Prep Maxi de ADN/ARN, segun las instrucciones del fabricante (Qiagen, Sample and Assay technologies, Paises Bajos). Se usaron ocho BCL para el analisis transcriptional: 184A1, BrCa-MZ-01, HCC1954, MDA-MB-231, MDA-MB-453, SK-BR-7, SUM149 y SUM159. Se controlo la integridad del ARN mediante electroforesis en gel de formaldehido- agarosa y microanalisis (Agilent Bioanalyzer, Palo Alto, CA).

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Obtencion del perfil de expresion genica con microalineamientos de ADN. Los analisis de la expresion genica usaron microalineamientos de oligonucleotidos humanos Affymetrix U133 Plus 2.0 que contenian mas de 47.000 transcritos y variantes que incluian 38.500 genes humanos bien caracterizados, La preparation de ARNc, las hibridaciones, los lavados y la detection se realizaron tal como recomendo el proveedor (“
http://www,” seguido por “affymetrix.com/index.affx”). Se analizaron los dates de expresion mediante el metodo de RMA (Robust Multichip Average) en R usando los paquetes Bioconductor y asociados (19), tal como se describe (20, 21). RMA realizo ajuste del fondo, normalization de cuantiles y resumen de 11 oligonucleotidos por gen.

Antes del analisis, un proceso de filtration elimino del conjunto de datos genes con expresion baja y escasamente medida tal como se define por un valor de expresidn inferior a 100 unidades en las 16 muestras, reteniendo 25.285 genes/EST. Se aplico un segundo filtro, basado en la intensidad de desviacion estandar (DE), para analisis no supervisados para excluir genes que mostraban baja variation de expresion a lo largo de los analisis. Se calculo la DE en datos transformados por log2, en los que los valores mas bajos se redujeron en primer lugar hasta un valor minimo de 100 unidades, es decir la intensidad de fondo, reteniendo 13.550 genes/EST con DE superior a 0,5. Se realizd un analisis no supervisado en 16 celulas positivas, negativas para ALDEFLUOR en 13.550 genes. Antes de la agrupacion jerarquica, se transformaron por log2 los datos filtrados y se sometieron al programs Cluster (22) usando la medians de los datos centrada en los genes, correlation de Pearson como metrics de similitud y agrupamiento de union de centroides. Se presentaron los datos usando el programs TreeView (22). Para identificar y clasificar los genes que discriminan poblaciones positivas y negativas para ALDEFLUOR, se aplico una prueba de la U de Mann y Whitney a los 25.285 genes/EST y se usd la tasa de falsos descubrimientos (FDR, (23) para corregir las multiples hipotesis de prueba. Se ilustrd el poder de clasificacion de la firma de discrimination clasificando muestras mediante agrupamiento jerarquico. Se aplico una LOOCV para estimar la exactitud de prediction de las firmas moleculares identificadas y la validez del analisis supervisado; se excluyo cada muestra una a una y se clasifico con el analisis discriminante lineal (LDA, (24) usando el modelo definido en las muestras no excluidas.

RT-PCR en tiempo real. Tras clasificarse poblaciones positivas para ALDEFLUOR y negativas para ALDEFLUOR de diferentes lineas celulares, se aislo el ARN total usando el kit RNeasy Mini (QIAGEN) y se utilizo para ensayos de RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR) en tiempo real en un sistema de deteccion de secuencias ABI PRISM® 7900HT con un modulo de bloque de 384 pocillos y accesorios de automatization (Applied Biosystems). Se seleccionaron cebadores y sondas para el sistema Taqman a partir del sitio web de Applied Biosystems. Las secuencias de los pares de cebadores de PCR y las sondas fluorogenicas usados para CXCR1, FBX021, NFYA, NOTCH2, RAD51L1 y TBP estan disponibles en el sitio web de Applied Biosystems (ID de ensayo de CXCR1: Hs_00174146_mi; ID de ensayo de FBX021: Hs_00372141_mi, ID de ensayo de NFYA: Fls_00953589_mi, ID de ensayo de NOTCFI2: Hs_01050719_mi, ID de ensayo de RAD51L1: Hs00172522_mi, ID de ensayo de TBP: Hs_00427620_mi). Se calculo el nivel de expresion relativa de ARNm de CXCR1, FBX021, NFYA, NOTCH2, RAD51L1 con respecto al gen TBP patron interno para normalizar las variaciones en la calidad del ARN y la cantidad de ADNc de entrada, tal como se describio previamente (25).

Ensayo de invasion. Se realizaron los ensayos por triplicado en camaras Transwell con insertos de filtro de policarbonato de poro de 8 um para placas de 12 pocillos (Corning, NY). Se recubrieron los filtros con 30 ul de extracto de membrana basal 1:6 enfriado con hielo (Matrigel, BD-Bioscience) en DMEM/F12 incubado 1 hora a 37°C. Se anadieron las celulas a la camara superior en 200 ul de medio iibre de suero. Para el ensayo de invasion, se sembraron 5000 celulas en los filtros recubiertos con Matrigel y se llend la camara inferior con 600 ul de medio complementado con suero humano al 10% (Cambrex) o con 600 ul de medio Iibre de suero complementado con IL8 (100 ng/ml). Tras 48 horas incubation, se contaron las celulas en el lado inferior del filtro usando microscopia optica. Se normalizo la invasion relativa a las lineas celulares correspondientes no separadas en condition con suero.

Infeccidn porlentivirus. Para la transduction del gen de luciferasa, se incubaron durante la noche celulas confluentes al 70% de HCC1954, MDA-MB-453 y SUM159 con una mezcla precipitada 1:3 de sobrenadantes lentivirales Lenti- LUC-VSVG (Vector Core, Ann Arbor, Ml) en medio de cultivo. E! dia siguiente se recogieron las celulas mediante tripsina/EDTA y se subcultivaron a una razon de 1:6. Tras 1 semana de incubation, se clasificaron las ediulas segun el fenotipo de ALDEFLUOR y se verified la expresidn de luciferasa en cada poblacion clasificada (positiva para ALDEFLUOR y negativa para ALDEFLUOR) ariadiendo 2 ml de D-luciferina al 0,0003% (Promega, Madison, Wl) en el medio de cultivo y contando el flujo de fotones mediante un sistema de camara de dispositivo (Xenogen, Alameda, CA).

Inoculacion intracardiaca. Se anestesiaron ratones de NOD/SCID de seis semanas de edad con una mezcla de isofluorano al 2%/aire y se les inyecto en el ventriculo izquierdo del corazon 100.000 celulas en 100 pi de PBS de Dulbecco esteril que carecia de Ca2+ y Mg2+. Para cada una de las tres lineas celulares (HCC1954, MDA-MB-453, SUM159) y para cada poblacion (positiva para ALDEFLUOR, negativa para ALDEFLUOR y sin clasificar), se realizaron inyecciones en tres animates.

Deteccion de bioluminiscencia. Se evaluo la bioluminiscencia initial antes de la inoculacion y cada semana despues de las inoculaciones. Se anestesiaron los ratones con una mezcla de isofluorano al 2%/aire y se les administro una dosis i.p. de D-luciferina 150 mg/kg (Promega, Madison, Wl) en PBS. Entonces volvieron a anestesiarse los animates 6 minutos tras la administration de D-luciferina. Para el recuento del flujo de fotones, se usd un sistema de camara de dispositivo de carga acoplada (Xenogen, Alameda, CA) con un sistema de administration de isofluorano

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de mascarilla nasal y plataforma calentada para mantener la temperatura corporal. Se analizaron los resultados tras de 2 a 12 minutos de exposition usando e! software Living Image proporcionado con el sistema de obtencion de imagenes Xenogen. Se cuantifico la intensidad de la serial como la suma de todos los recuentos de flujo de fotones detectados dentro de una region uniforme de interes colocada manualmente durante el procesamiento posterior de los datos. El flujo de fotones normalizado representa la razon del flujo de fotones detectado cada semana tras las inoculaciones y el flujo de fotones detectado antes de la inoculation.

Analisis estadistico. Los resultados se representan como la media ±DE para al menos tres experimentos individuales repetidos para cada grupo. Los analisis estadisticos usaron el software SPSS (version 10.0.5). Se calcularon las correlaciones entre grupos de muestra y parametros moleculares con la prueba exacta de Fisher o el ANOVA de una via para muestras independientes. Un valor de p *0,05 se considero significativo.

La mayorla de las tineas celulares de mama contienen una poblacidn positiva para ALDEFLUOR. Se uso el ensayo de ALDEFLUOR (17) para aislar CSC a partir de 33 BCL que representan los diversos subtipos moleculares y caracteristicas de cancer de mama (20). Se encontro que 23 de las 33 lineas celulares contenian una poblacion de celulas positivas para ALDEFLUOR que oscilaban entre el 0,2 y casi el 100%. Las 16 BCL basales/mesenquimatosas contenian una poblacidn positiva para ALDEFLUOR mientras que 7 de las 12 BCL luminales no contenian ninguna celula positiva para ALDEFLUOR (p=0,0006, prueba exacta de Fischer).

Las celulas positivas para ALDEFLUOR tienen capacidad de formacion de tumoresferas. Se ha notificado previamente que las celulas madre y progenitoras epiteliales mamarias pueden sobrevivir y proliferar en condiciones independientes de anclaje y formar colonias esfericas flotantes que se denominan mamosferas (18). Los datos de tumores de mama, asi como lineas celulares, han demostrado que las celulas de tipo madre de cancer o celulas que inician el cancer tambien pueden aislarse y propagarse como “tumoresferas" en ensayos similares (26). Todas las celulas que inician las mamosferas en la glandula mamaria humana normal estan contenidas dentro de la poblacidn positiva para ALDEFLUOR (17). Para caracterizar la poblacidn positiva para ALDEFLUOR a partir de BCL, se comparo la capacidad de poblaciones positivas y negativas para ALDEFLUOR de 184A1, SUM149 y SUM159 para formar tumoresferas. En cada linea celular, la poblacidn positiva para ALDEFLUOR mostro capacidad de formacion de tumoresferas aumentada en comparacion con celulas negativas para ALDEFLUOR.

Celulas BCL positivas para ALDEFLUOR tienen propiedades de celulas madre de cancer in vivo. Para determinar la organizacion jerarquica de BCL, se analizaron las propiedades de celulas madre de las poblaciones positivas y negativas para ALDEFLUOR de las lineas celulares MDA-MB-453, SUM159 y BrCa-MZ-01. Las poblaciones positivas para ALDEFLUOR de estas tres BCL constituian entre el 3,54+1,73% y el 5,49+3,36% de las poblaciones celulares totales (figura 1A-B, G-H; figura 2A-B). Tal como se muestra en la figura 1F, L el tamano y la latencia de la formacion tumoral se correlacionaba con el numero de celulas positivas para ALDEFLUOR inyectadas. De manera notable, 500 celulas positivas para ALDEFLUOR de MDA-MB-453 y 1.000 celulas positivas para ALDEFLUOR de SUM159 podian formar tumores. La capacidad de generacion de tumores se mantuvo a traves de pases en serie demostrando la capacidad de autorrenovacion de estas celulas. En cambio, las celulas negativas para ALDEFLUOR no pudieron generar tumores, aunque se produjo un crecimiento limitado cuando se inyectaron 50.000 celulas MDA- MB-453 negativas para ALDEFLUOR. La tincion H&E de las secciones de almohadilla grasa confirmo que los tumores formados por celulas positivas para ALDEFLUOR contenian celulas malignas mientras que solo se observaron tejido de raton y celulas apoptoticas, Matrigel residuales en los sitios de inyecciones de celulas negativas para ALDELFUOR (figura 1E, K). De manera consecuente con la poblacion positiva para ALDEFLUOR que tenia caracteristicas de celulas madre de cancer, los tumores generados por esta poblacidn recapitularon la heterogeneidad fenotipica del tumor inicial, con una razon similar de celulas positivas y negativas para ALDEFLUOR (figura 1C, I). Esto indica que las celulas positivas para ALDEFLUOR podian autorrenovarse, generando celulas positivas para ALDEFLUOR y podian diferenciarse, generando celulas negativas para ALDEFLUOR.

Cuando se separaron celulas BrCa-MZ-01 en componentes positivos y negativos para ALDEFLUOR, ambos podian generar tumores. Los tumores generados por la poblacidn positiva para ALDEFLUOR consistian de celulas tanto positivas como negativas para ALDEFLUOR que recapitulaban la heterogeneidad fenotipica del tumor inicial. En cambio, los tumores generados por celulas negativas para ALDEFLUOR dieron lugar a tumores de crecimiento lento que contenian solo celulas negativas para ALDEFLUOR. En contraste con la capacidad de celulas positivas para ALDEFLUOR de trasplantarse en serie, los pases en serie de tumores negativos para ALDEFLUOR produjeron crecimiento tumoral decreciente sin crecimiento tras tres pases. Esto sugiere que el componente positivo para ALDEFLUOR de las celulas BrCa-MZ-01 contiene celulas con propiedades de celulas madre, mientras que las celulas negativas para ALDEFLUOR contienen celulas progenitoras que pueden experimentar crecimiento limitado pero no autorrenovacion.

Obtencion del perfil de expresion genica de poblaciones de celulas positivas y negativas para ALDELFUOR. Para determinar si celulas positivas para ALDEFLUOR aisladas de diferentes BCL expresaban un conjunto comun de genes de “celulas madre de cancer”, se analizaron las poblaciones de celulas positivas y negativas para ALDEFLUOR aisladas de ocho BCL (184A1, BrCa-MZ-01, HCC1954, MDA-MB-231, MDA-MB-453, SK-BR-7, SUM49 y SUM159) usando microalineamientos de oligonucleotidos del genoma completo de Affymetrix. El agrupamiento jerarquico no supervisado, aplicado a las 16 muestras y los 13.550 genes/EST filtrados, no separaron poblaciones positivas y negativas para ALDEFLUOR. En su lugar, las poblaciones positivas y negativas para

ALDEFLUOR se agruparon con la linea celular original. Esto sugiere que las diferencias en los transcritos de ARNm entre lineas celuiares clonales reemplazan a las diferencias entre celulas positivas para ALDEFLUOR y negativas para ALDEFLUOR. Esto sugiere ademas que solo un niimero limitado de genes se expresan de manera diferencial entre supuestas celulas madre de cancer y su progenie.

5 Para determinar qu6 genes discriminaban poblaciones positivas y negativas para ALDEFLUOR, se aplico la prueba de la U de Mann y Whitney a todos los genes menos aquellos con baja expresion y escasamente medida, es decir 25.285 conjuntos de sondas. Esta prueba identified y clasifico tras la correccion de FDR, 413 genes/EST que discriminaban las poblaciones de celulas positivas y negativas para ALDEFLUOR. Los 28 genes sobreexpresados correspondientes a genes unicos se muestran en la tabla 1, y los genes rods frecuentemente subexpresados se 10 muestran en la tabla 2.

TABLA 1 - Genes regulados por incremento

Categoria

Simbolo Descripcion Citobanda ID de conjunto de sondas Funcion

Genes anteriormente descritos que tienen un papel en la biologia de celulas madre

TPRXL De tipo homeobox de repetition de tetrapeptido chr3p25.1 239061_at Desarrollo embrionario temprano

NOTCH2 Homologo 2 de Notch {Drosophila) chr1p13-p11 202443_x_at Programa de autorrenovacion

RBM15 Proteina 15 de motivo de union a ARN chr1p13 1555760 a a t Determination del destino de celulas hematopoyeticas

ST3GAL3 ST3 beta-galactosido alfa-2,3- sialiltransferasa 3 chr1p34.1 1555181_a_a t Mantenimiento de los antigenos embrionarios SSEA-3 y -4

NFYA Factor de transcription nuclear Y, alfa chr6p21.3 204107_at Programa de autorrenovacion

PCNX Homologo de pecanex (Drosophila) chr14q24.2 213173_at Determination del destino de celulas neurales de embrion de desarrollo temprano

Serializacion

FBX021* Proteina F-box 21 chr12q24.22 212231 at Ubiquitinacion

WWOX Oxidorreductasa que contiene dominio WW chr16q23.3- q24.1 210695_s_at Degradation transcription de proteinas y corte y empalme de ARN

CAMK2B Proteina cinasa dependiente de calcio/calmodulina (CaM cinasa) I! beta chr22q12 34846_at Serialization de calcio

PNPLA2 Proteina 2 que contiene dominio fosfolipasa de tipo patatina Chr11p15.5 39854_r_at Hidrolisis de trigliceridos

CLIC5 Canal intracelular de cloruro 5 chr6p12.1-21.1 213317_at Transporte de ion cloruro

UGCGL1 Proteina 2 de tipo UDP-glucosa ceram ida glucosiltransferasa chr2q14.3 222569_at Glicosilacion de proteinas

FBXL18 Proteina 18 de repeticiones ricas en ieucina y F-box chr7p22.2 220896_at Ubiquitinacion

ADRBK1 Cinasa 1 receptora adrenergica, beta chr11 q13 38447_at Fosforilacion de receptores acoplados a proteinas G

SLC38A2 Familia 38 de portadores de solutos, miembro 2 chr12q 1559924_at Transportador de aminoacidos neutros

Proteina de membrana

IL8RA* (CXCR1) Receptor de interleucina 8, aifa chr2q35 207094_at Respuesta inflamatoria

TAS2R14 Receptor de gusto, tipo 2, miembro 14 chr12p13 241997_at Perception del gusto amargo

CDS300LB Miembro b de la familia de de tipo molecula CD300 chr17q25.1 1554173_at Respuesta inmunitaria

GIPC3 Miembro 3 de la familia que contiene dominio GIPC PDZ chr19p13.3 236730_at

Reparation del ADN

RAD51L1 Proteina 1 de tipo RAD51 (S. cerevisiae) chr14q23-q24.2 1570166_a_a t Reparacidn de recombination homologa

Remodelacion de cromatina

ARID1B Dominio 1B interactive rico en AT (de tipo SWI1) chr6q25.1 225181_at Remodelacion de cromatina (complejo SWI/SNF)

Citoesqueieto

EPPK1 Epiplaquina 1 chr8q24.3 208156_x_at Mantenimiento de los filamentos intermedios de queratina

Matriz extracelular

COL11A2 Colageno, tipo XI, alfa 2 Chr6p21,3 216993_s_at Morfogenesis esqueletica

KLK3 Calicreina 3, (antigeno especifico de prostata) chr19q 13.41 231629_x_at Proteasa

Interferencia de ARN

EIF2C2 Factor de initiation de la traduction eucariota 2C, 2 chr8q24 213310_at Silenciamiento genico mediado por ARN de interferencia corto

Desconocida

ZFP41 Homologo de proteina de dedos de zinc 41 (raton) chr8q24.3 227898_s_at

Desconocida

FAM49B Familia con similitud de secuencia 49, miembro B chr8q24.21 243182_at Desconocida

PSORS1C2 Candidato 2 a susceptibilidad a psoriasis 1 chr6p21.3 220635_at Desconocida

TABLA 2 - Genes regulados por disminucion

Categoria

Simbolo Description Citobanda ID de conjunto de sondas Funcion

Sintesis de

MRPL42* Proteina ribosomica chr12q22 217919_s_at Sintesis de proteinas

proteinas

mitocondrial L42 dentro de la mitocondria

MRPL54* proteina ribosomica mitocondrial L54 chr19p13,3 225797_at Sintesis de proteinas dentro de la mitocondria

MRPL47* proteina ribosomica mitocondrial L47 chr3q26.33 223480_s_at Sintesis de proteinas dentro de la mitocondria

MRPS23* proteina ribosomica mitocondrial S23 chr17q22- q23 223156_at Sintesis de proteinas dentro de la mitocondria

EIF3S9’ Factor de iniciacion de la traduccion eucariota 3, subunidad 9 eta, 116 kDa chr7p22.2 236274jat Iniciacion de la sintesis de proteinas (complejo multiproteico EIF3)

Senalizacion

ALG5* Fiomologo 5 de glicosilacion con unidn a asparagina chr13q13.3 218203_at Glucosilacion de proteinas

DNAJC19* Fiomologo de DnaJ (Flsp40), subfamilia C, miembro 19 chr3q26.33 225359_at Importacion de proteina mitocondrial

HBLD2* Proteina 2 que contiene dominio de tipo FiESB chr9q21.33 221425_s„at Biogenesis de agrupacion de hierro- azufre

GART* Fosforribosilglicinamida formiltransferasa, fosforribosilglicinamida sintetasa, fosforribosilaminoimi- dazol sintetasa chr21q22.1 230097_at Biosintesis de purina de novo

NUP37* nucleoporina de 37 kDa chr12q23.2 218622_at Transporte de proteinas intracelulares a traves de la membrana nuclear

RNF7* Proteina de dedos en anillo 7 chr3q22- q24 224439_x_at Subunidad de SKP1- culina/proteina de caja CDC53-F ubiquitina liqasas

DC2* Proteina DC2 chr4q25 223001_at Glicosilacion de proteinas

USP15* Peptidasa 15 especifica de ubiquitina chr12q14 210681_s_at Degradacion de proteinas

COMMD6* Proteina 6 que contiene dominio COMM — 225312_at Inhibicion de la senalizacion de NF- KappaB

UBL5* Proteina 5 de tipo ubitiquina chr19p13.3 218011_at Ubiquitinacion

Apoptosis

MRPL41* Proteina ribosomica mitocondrial L41 chr9p34.3 225425_s_at Estabilizacion de proteina p53, detencion del ciclo celular (dependiente de p21 (WAF1/CIP1) y P27 (Kip1)) _

PCCD10* Muerte celular programada 10 chr3q26.1 210907_s_at Iniciacibn de la apoptosis

PDCD5* Muerte celular programada 5 chr19q12- 227751_at Iniciacion de la apoptosis

Programs de diferencia- cion

NACA* Polipeptido alfa de complejo asociado a polipeptido naciente chr12q23- q24.1 222018_at Diferenciacion de eritroides

Ciclo celular

FAM82B* Familia con similitud de secuencia 82, miembro B chr8q21.3 218549_s_ai Regulacion de la din^mica de microtubulos

Corte y empalme del ARN

CCNL1* Ciclina L1 chr3q25.32 1555411_a_at Procesamiento de pre-ARNm

PRPF39* Homologo de factor 39 de procesamiento de pre-ARNm PRP39 (S. cerevisiae) chr14q21.3 220553_s_at Procesamiento de pre-ARNm

LSM3* Homologo de LSM3, asociado a ARN nuclear pequefio U6 (S. cerevisiae) chr3p25.1 202209_at Procesamiento de pre-ARNm

SFRS7* Factor de corte y empalme, rico en arginina/serina 7, 35 kDa Chr2p22.1 213649_at Regulacion del corte y empalme del ARN

PRPF4B* Homologo B de factor 4 de procesamiento de pre-ARNm PRP4 (levadura) chr6p25.2 202127„at Procesamiento de pre-ARNm

Fosforilacion oxidativa

ATP5S* ATP sintasa, transporte de H+, complejo FO mitocondrial, subunidad s (factor B) chr14q22.1 206992_s_at Subunidad de ATP sintasa mitocondrial

NDUFA2* NADH deshidrogenasa (ubiquinona) 1 alfa subcomplejo 2 chr5q31 209224_s_at Componentes de la enzima de multiples subunidades de complejo I

ATP5J2* ATP sintasa, transporte de H+, complejo FO mitocondrial, subunidad F2 chr7q22.1 202961_s_at Subunidad de ATP sintasa mitocondrial

IMMP1L* Proteina de tipo peptidasa de membrana mitocondrial interna IMP 1 chr11p13 230556_at Proteolisis

Desconocida

ASTE1* Homologo de asteroid 1 (Drosophila) chr3q22.1 221135_s_at

Desconocida

MGC61571* Proteina hipotetica MGC61571 chr3p24.1 228283_at Desconocida

WDR53* Dominio de repetition WD 53 chr3q29 227814_at Desconocida

DKFZP686A 10121* Proteina hipotetica chr7q21.13 234311_s_at Desconocida

CHCHD8* Proteina 8 que contiene dominio enrollado- helicoidal-helice- enrollado-helicoidal- helice chr11q13.4 220647_s_at Desconocida

FLJ32745* Proteina hipotetica FLJ32745 Chr2q13 235644_at Desconocida

CHURC1* Proteina 1 que contiene dominio Churchill chr14q23.3 233268_s_at Desconocida

XTP3TPA* Proteina A transactivada por XTP3 chr16p11.2 218069_at Desconocida

FLJ37953* Proteina hipotetica FLJ37953 chr2q33.1 235181_at Desconocida

SNORD50A* ARN nuclear pequeno, C/D caja 50A chr6q14.3 244669_at Desconocida

LOC644053* Proteina hipotetica LOC644053 chr1q41 235466_s_at Desconocida

TMEM141* Proteina transmembrana 141 chr9q34.3 225568_at Desconocida

C8orf59* Marco abierto 59 del cromosoma chr8q21.2 226165_at Desconocida

El poder de ciasificacion de esta firma de discriminacidn se ilustro clasificando 16 muestras positivas y negativas para con los 413 genes/EST expresados de manera diferencial. El agrupamiento jer&rquico clasifico 15 de las 16 muestras (figura 2A).

Varios genes que se sabe que desempenan un papel en la biologia de celulas madre estaban regulados por 5 incremento en las poblaciones positivas para ALDEFLUOR (tabla 1), inctuyendo NFYA, NOTCH2, PCNX, RBM15, ST3GAL3 y TPRXL. Otros genes codifican para proteinas que tienen un papel no caracterizado o supuesto en la funcion de celulas madre, tales como ARID1B, RAD51L1, y el receptor de quimiocina CXCR1/IL8RA (27). Los genes subexpresados en la poblacion positiva para ALDEFLUOR estan implicados en diferenciacion celular, apoptosis, corte y empalme del ARN y metabolismo mitocondrial.

10 Para aumentar la rigurosidad del analisis, se elevo el umbral del analisis de Mann y Whitney hasta el riesgo de 0,5 y se obtuvo una lista de 49 genes/EST que discriminaban poblaciones positivas y negativas para ALDELFLUOR (genes con asterisco en las tabias 1-2). Con esta lista, todas las celulas positivas para ALDEFLUOR, excepto de SK- BR-7, se agrupaban juntas. Entre estos 49 genes/EST, 45 correspondtan a los genes unicos identificados; solo 3 de estos 45 se sobreexpresaban en el grupo positivo para ALDEFLUOR mientras que 42 se subexpresaban. Los genes 15 sobreexpresados caracterizados codifican para una proteina F-box FBX021 y CXCR1/IL8RA. Los genes subexpresados incluyen los que codifican para proteinas mitocondriales (MRPL41, MRPL42, MRPL47, MRPL54, MRPS23, IMMP1L), y factores de diferenciacion (NACA) y corte y empalme de pre-ARNm (LSM3, factor de procesamiento de pre-ARNm PRPF39 y PRPF4B). Una validation cruzada dejando uno fuera (LOOCV) al 0,5% de riesgo estimd la exactitud de la prediction de la firma molecular identificadora y el 88% de las muestras se predijeron 20 en la clase correcta con esta “firma de celulas madre de cancer” confirmando el analisis supervisado.

La evaluation mediante RT-PCR cuantitativa confirmo un aumento significative de CXCR1 y FBX021 en celulas positivas para ALDEFLUOR. Se realizo un analisis de RT-PCR cuantitativo de cinco genes discriminadores sobreexpresados en poblaciones positivas para ALDEFLUOR (CXCR1/IL8RA, FBX021, NFYA, NOTCH2 y

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RAD51L1). Tres lineas celulares usadas en el analisis de obtencibn del perfil (BrCa-MZ-01, MDA-MB-453, SUM159) y dos lineas celulares luminales adicionales (MCF7, S68) se clasificaron mediante ensayo de ALDEFLUOR y se procesaron por separado poblaciones positivas y negativas para ALDEFLUOR para el analisis de RT-PCR cuantitativa. El nivel de expresion de RT-PCR cuantitativa de CXCR1 y FBX021 se presenta en la figura 2B y C. Los niveles de expresion genica medidos mediante RT-PCR cuantitativa confirmaron los resultados obtenidos usando microalineamientos de ADN con un aumento del nivel de ARNm de CXCR1 y FBX021 en la poblacion positiva para ALDEFLUOR en comparacion con la poblacion negativa para ALDEFLUOR (p<0,05).

IL8 promueve la autorrenovacidn de celulas madre de cancer. Los estudios de obtencion del perfil sugirieron que el receptor de IL8 CXCR1/IL8RA se expresaba de manera sistematica en la poblacion de celulas positivas para ALDEFLUOR. Para confirmar esta asociacion, se midib la expresion de proteina de CXCR1/IL8RA mediante citometrla de flujo en poblaciones positivas y negativas para ALDEFLUOR. Se aislaron las poblaciones positivas y negativas para ALDEFLUOR de cuatro lineas celulares diferentes mediante FACS, se fijaron y se tifieron con un anticuerpo monoclonal frente a marcado con ficoeritrina. Tal como se muestra en la figura 3A, las celulas positivas para ALDEFLUOR estaban altamente enriquecidas en cblulas positivas para CXCR1 en comparacion con las poblaciones negativas para ALDEFLUOR.

Para determinar si la senalizacion de IL8 es importante en la funcion de celulas madre, se trataron cuatro BCL con IL8 recombinante humana para determinar su efecto sobre la poblacibn de celulas madre de cancer tal como se determina mediante la formacibn de tumoresferas y mediante la actividad enzimatica de ALDH. Tal como se muestra en la figura 3B, la adicion de IL8 aumento la formacibn de tumoresferas primarias y secundarias de una manera dependiente de la dosis. Ademas, IL8 aumentb la poblacibn positiva para ALDEFLUOR de una manera dependiente de la dosis en cada una de las cuatro BCL analizadas (figura 3C). Esto ilustra el poder de la “firma de CSC" para identificar rutas que pueden desempenar un papel en la funcion de celulas madre.

El eje IL8/CXCR1 esta implicado en la invasion de celulas madre de cancer. Se ha notificado que el eje IL8/CXCR1 desempena un papel en la invasion de celulas madre de cancer (28, 29).Se utilizo un ensayo de invasion de Matrigel, usando suero como atrayente, para examinar la capacidad de poblaciones de celulas positivas y negativas para ALDEFLUOR de tres lineas celulares diferentes (HCC1954, MDA-MB-453, SUM159) para invadir. Tal como se muestra en la figura 4A, celulas positivas para ALDEFLUOR demostraron una invasibn de 6 a 20 veces superior a traves de Matrigel que la poblacibn negativa para ALDEFLUOR (p<0,01). Cuando se uso como quimioatrayente IL8 (100 ng/ml) aumentb la invasibn de las celulas positivas para ALDEFLUOR (p<0,05) (figura 4A). En contraposicion a sus efectos sobre celulas positivas para ALDEFLUOR, IL8 no tenia ningim efecto sobre la capacidad invasiva de celulas negativas para ALDELFLUOR. Estos resultados indican que las celulas madre de cancer presentaban un comportamiento invasivo y ademas que IL8 facilita este proceso.

Celulas positivas para ALDEFLUOR tienen potencial metastasico aumentado. Se ha propuesto que CSC desempenan un papel crucial en la metastasis del cancer (30, 31). Los experimentos anteriores demostraron que celulas positivas para ALDEFLUOR tienen una capacidad invasiva aumentada en comparacion con celulas negativas para ALDEFLUOR. Para determinar la relacion entre positividad para ALDEFLUOR y capacidad metastasica, se infectaron HCC1954, MDA-MB-453 y SUM 159 con un sistema indicador de lentivirus con luciferasa. Se clasificaron las celulas infectadas con luciferasa usando el ensayo de ALDEFLUOR y se introdujeron en ratones NOD/SCID mediante inyeccion intracardiaca. Se inyecto una suspension de 100.000 celulas de cada poblacibn y se evaluo la metastasis mediante obtencion de imagenes de bioluminiscencia. Ratones inoculados con celulas positivas para ALDEFLUOR desarrollaron metastasis en diferentes sitios y presentaban una emision de flujo de protones superior que ratones inoculados con celulas no separadas, que desarrollaron no mas de una metastasis por raton, o ratones inoculados con celulas negativas para ALDEFLUOR, que desarrollaron solo metastasis ocasionales limitadas a ganglios linfaticos (figura 4B-J). Secciones histologicas confirmaron ia presencia de metastasis en estos sitios (figura 4K-M). Por tanto, la capacidad metastasica de BCL esta mediada predominantemente por CSC contenidas en la poblacibn positiva para ALDEFLUOR.

La hipotesis de que los tumores estan organizados en una jerarquia celular dirigida por CSC tiene implicaciones fundamentales para la biologia del cancer asi como implicaciones clinicas para la deteccion temprana, la prevention y el tratamiento del cancer. Las evidencias de CSC se han basado en gran medida en modelos de xenoinjerto de pase primario y temprano (32-34). Sin embargo, el exito de establecimiento de xenoinjerto de tumor de mama ha sido particularmente bajo para determinados subtipos moleculares. En contraposicion a tumores primarios, estan disponibles lineas celulares en cantidades ilimitadas y proporcionan solo poblaciones carcinomatosas para analisis molecular sin estroma y tejido normal. En cancer de mama, se han producido un gran numero de lineas celulares inmortalizadas que representan los diferentes subtipos moleculares en canceres de mama humanos primarios (2, 20). Sin embargo, sigue estando la cuestion fundamental en cuanto a lo rigurosamente que estas iineas celulares pueden recapitular la biologia de cancer de mama humano.

Evidencias in vivo para celulas madre en lineas celulares. Estudios recientes han sugerido que aunque las lineas celulares pueden derivarse clonalmente, contienen una jerarquia celular que representa diferentes fases de diferenciacion celular. Varios estudios han utilizado marcadores tales como CD44+/CD24- para identificar CSC dentro de lineas celulares de cancer de mama. Sin embargo, su utilidad es limitada por la observacion de que frecuentemente un gran porcentaje de celulas dentro de una iinea celular expresan estos supuestos marcadores de

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celulas madre. Por ejemplo, mas del 90% de celulas en lineas celulares de cancer de mama basales presentan el fenotipo CD44+/CD24-. De hecho, el fenotipo CD44+/CD24- no aislo la poblacidn tumorigenica de estas lineas celulares (Ginestier et al. Cell Stem Cell 1:555-567). Un enfoque alternative ha sido usar la SP de lineas celulares. Sin embargo, estudios funcionales utilizando tincion de Hoechst estan limitados por la toxicidad de este agente (35). Tambien hay evidencias de que la actividad de celulas madre funcionales no esta contenida dentro de la SP (36). Se evaluo la actividad de ALDH mediante el ensayo ALDEFLUOR que aisla celulas con propiedades de celulas madre de diversos canceres (14, 37). En este ejemplo se demostro que 23 de 33 BCL (predominantemente lineas celulares basales) contenian una poblacion positiva para ALDEFLUOR. La falta de una poblacibn positiva para ALDEFLUOR en algunas BCL luminales puede indicar que estas BCL luminales se derivan de celulas progenitoras negativas para ALDEFLUOR.

Este ejemplo utilizo ensayos in vivo en ratones NOD/SCiD para demostrar las propiedades de c6lulas madre de las poblaciones positivas para ALDEFLUOR. Se demostro la autorrenovacion mediante pase en serie en ratones NOD/SCID y se demostro la diferenciacidn mediante la capacidad de celulas positivas para ALDEFLUOR pero no negativas para ALDEFLUOR para regenerar la heterogeneidad celulardel tumor inicial.

Una firma de celulas madre de cancer de mama. Utilizando ocho lineas celulares de mama, este ejemplo identified 413 genes cuya expresion discrimina celulas positivas y negativas para ALDEFLUOR, Esta firma contenia varios genes conocidos por desempenar un papel en la biologia de cdlula madre. Los genes sobreexpresados en la poblacion positiva para ALDEFLUOR incluyen homologo 2 de Notch (NOTCH2), que regula la autorrenovacion y diferenciacidn de celulas madre mamarias (18, 38), NFYA, que regula la autorrenovacion y diferenciacidn de celulas madre. (39,40), homologo de pecanex PCNX, RBM15/OTT, que desempeha un papel pleiotropico en celulas madre hematopoyeticas (41) y afecta a la diferenciacidn mieloide por medio de serialization de NOTCH (42), factor de tipo homeobox TPRXL implicado en desarrollo embrionario, ST3GAL3, que codifica para una sintasa de antigeno embrionario 4 especifico de estadio, asociada con desarrollo fetal y carcinogenesis renai y gastrica (43). Notablemente, la proteina de antigeno 4 embrionario especifico de estadio (SSEA-4) se expresa en poblaciones de celulas madre tales como celulas madre CXCR4+/CD133+/CD34+/lin- en celulas madre mamarias quiescentes y de sangre de cordon umbilical humano (44).

Genes subexpresados en la poblacion positiva para ALDEFLUOR estan implicados en diferenciacidn celular, apoptosis y oxidacion mitocondrial. Incluyen genes que codifican para NACA subunidad alfa de complejo asociado a polipdptido naciente, las proteinas de muerte programada PDCD5 y PDCD10, la proteina ribosomica mitocondrial L41 (MRPL41), que induce apoptosis de una manera dependiente e independiente de P53 por medio de BCL2 y caspasas, y proteinas implicadas en procesos mitocondriaies tales como fosforilacidn oxidativa (NDUFA2, ATP5J2, IMMP1L) y sintesis de proteinas en ia mitocondria (MRPL42, MRPL47, MRPL54, MRPS23). La regulacion por disminucidn de genes apoptoticos en CSC puede desempenar un papel en la resistencia de estas celulas a la radiation y quimioterapia (45,46). ALDH1A1 no se identified como gen expresado de manera diferencial en la firma positiva para ALDEFLUOR. Sin embargo, el examen del perfil de expresion genica de BCL individuales revelo que aunque algunas mostraban expresion diferencial de ALDH1A1 en la poblacion positiva para ALDEFLUOR, otras mostraban expresion diferencial de ALDH 1 A3, una isoforma de ALDH diferente en esta poblacion. Esto sugiere que la expresion de diferentes isoformas de ALDH podria contribuir al fenotipo positivo para ALDEFLUOR.

De quimiocinas a “estemocinas”. La expresion de CXCR1, un receptor para IL8, esta aumentada en una variedad de canceres (47-50). Aunque la expresibn de IL8 esta asociada con cancer de mama negativo para ER (51), no se ha notificado anteriormente que esta quimiocina desempene un papel en la funcion de celulas madre. Su implication en la regulacion del crecimiento y la metastasis esta bien establecida en cancer de prostata androgeno-independiente (52). Ademas, el nivel de expresion de IL8 esta asociado con tumorigenicidad y metastasis a traves de la produccion de VEGF produccion y angiogenesis (53, 54). Se validaron los datos de expresion genica de tres modos. En primer lugar, el analisis mediante RT-PCR cuantitativa confirmo un aumento significativo de ARNm de CXCR1 en la poblacion positiva para ALDEFLUOR a partir de lineas celulares tanto incluidas como no incluidas en el analisis de obtencion del perfil. En segundo lugar, se demostro usando citometria de flujo que las celulas que contenian CXCR1 se encontraban exclusivamente dentro de la poblacion positiva para ALDEFLUOR. En tercer lugar. IL8 recombinante aumento la formation de mamosferas y el porcentaje de celulas positivas para ALDEFLUOR en BCL. El eje IL8/CXCR1 parece por tanto regular la proliferation o autorrenovacion de celulas madre mamarias. Puesto que las ediulas endoteliales y estromales secretan IL8 esta quimiocina parece desempenar un papel en la mediacion en interacciones entre celulas madre tumorales y el microentorno tumoral,

Estudios recientes han sugerido un papel de interleucinas/quimiocinas en la regulacion de CSC (55, 56). Esto incluye un papel de IL6 en CSC de mama e IL4 en la mediacion en la quimiorresistencia de CSC de colon (56-59). Estos factores pueden estar implicados en la asociacion entre infiamacion y cancer. Esto tambien incluye un papel de CCL5 (RANTES), una quimiocina secretada por celulas madre mesenquimatosas, que actua como factor paracrino y potencia la motilidad, invasion y metastasis de celulas de cancer de mama (55).

Las ralces de la metastasis. Las CSC pueden ser responsables de mediar en la metastasis tumoral. Se sugirio por primera vez un vinculo entre CSC y metastasis con la identification de genes de celulas madre en una firma de 11 genes generada usando el perfil comparative de tumores primarios y metastasicos en un modelo de raton transgenico de cancer de prostata y pacientes con cancer (60). Esta firma tambien fue un factor de prediccion

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poderoso de recidiva de la enfermedad, muerte tras la terapia y metastasis distante en una variedad de tipos de cancer. Este ejemplo ha demostrado que celulas positivas para ALDEFLUOR son mas metastasicas que celulas negativas para ALDEFLUOR y que IL8, que previamente se notified que desempena un papel en la metastasis tumoral, promueve la invasion y quimiotaxis de celulas madre de cancer que expresan preferentemente el receptor de IL8 CXCR1. La capacidad para aislar celulas madre de cancer metastasicas a partir de lineas celulares debe facilitar estudios de los mecanismos moleculares mediante los cuales las celulas madre de cancer median en la metastasis tumoral.

EJEMPLO 2

Inhibicion de CXCR1 v terapia de combinacion

Este ejemplo describe diversos metodos empleados para someter a prueba el efecto de la inhibicion de CXCR1 sobre celulas tumorales, as! como la combinacidn de inhibicion de CXCR1 en combinacion con un agente antimitotico (docetaxel).

Efecto de la inhibicion de CXCR1 sobre el crecimiento celular y sobre la poblacion positiva para ALDEFLUOR de la linea celular SUM159.

Se cultivo la linea celular SUM 159 en condicion adherente y se trataron las celulas usando el inhibidor de CXCR1/CXCR2 repertaxina o dos anticuerpos bloqueantes especificos para CXCR1 o CXCR2. Tras 4 dias de tratamiento, se analizo el efecto sobre el crecimiento celular usando el ensayo MTT (figura 5A) y sobre la poblacion de celulas madre de cancer usando el ensayo ALDEFLUOR (figura 5B). Se observo una inhibicion del crecimiento celular de mas del 95% en las celulas tratadas con repertaxina o el anticuerpo bloqueante de CXCR1, mientras que no se observo efecto para las celulas tratadas con el anticuerpo bloqueante de CXCR2 (figura 5A). De manera interesante se observo un efecto similar sobre la poblacion positiva para ALDEFLUOR con una disminucion del 80% y el 50% de la poblacion positiva para ALDEFLUOR en las celulas tratadas con repertaxina y anticuerpo bloqueante de CXCR1 respectivamente (figura 5B).

El tratamiento con repertaxina induce un efecto inespecifico mediadoporta sehalizacion de FAS/ligando FAS

Se cultivaron celulas de la linea celular SUM 159 en condiciones adherentes y entonces se trataron con repertaxina sola o en combinacion con un antagonista de FAS. De manera interesante, la inhibicion del crecimiento celular inducida por el tratamiento con repertaxina se rescato parcialmente mediante la adicion de un antagonista de FAS (anti/ligando Fas de BD pharmingen (n.° de cat. 556371)). Ademas, las celulas tratadas con un agonista de FAS presentaban una inhibicion del crecimiento celular similar a las celulas tratadas con repertaxina. Estos resultados sugieren que el tratamiento con repertaxina induce un efecto inespecifico mediado por la sehalizacion de FAS/ligando FAS.

Efecto del tratamiento con repertaxina sobre la activacion de FAK, AKT y FOXOA3.

Con el fin de evaluar el efecto del tratamiento con repertaxina sobre la sehalizacion posterior de CXCR1, se cultivaron celulas SUM159, durante 2 dias, en condicion adherente en ausencia o en presencia de 100 nM de repertaxina y se tiheron mediante inmunofluorescencia con anticuerpos contra p-FAK, p-AKT y FOXOA3. En las celulas no tratadas (figura 7A), se detecto que el 30% de las celulas que expresan p-FAK y el 10% de las celulas que expresan p-AKT presentaban inactivacion, mientras que las celulas tratadas con repertaxina presentaban una inactivacion completa de p-FAK y p-AKT (figura 7B). Las celulas SUM159 no tratadas presentaban el 80% de celulas positivas en el citoplasma para FOXOA3. De manera interesante, las celulas SUM 159 tratadas con repertaxina presentaban el 80% de celulas positivas en el nucleo para FOXOA3. El cambio en la ubicacion celular en FOXOA3 del citoplasma al nucleo indica una activacion de la proteina FOXOA3.

Curvas de crecimiento tumoral tras el tratamiento con repertaxina, docetaxel o la combinacion

Se evaluo el efecto de repertaxina, docetaxel, o la combinacion de los mismos usando unas lineas celulares de cancer de mama (8A, SUM 159) y tres xenoinjertos de cancer de mama humano generados de diferentes pacientes (8B, MC1; 8C, UM2; y 8D, UM3). Para cada muestra, se inyectaron 50.000 celulas en la almohadilla grasa mamaria de ratones NOD-SCID que se monitorizaron para determinar el tamaho tumoral. Se iniciaron las inyecciones cuando el tamaho tumoral era de aproximadamente 4 mm. Se inyecto repertaxina (15 mg/kg) dos veces a! dia durante 28 dias o una vez a la semana, se inyecto docetaxal por via i.p. (10 mg/kg) o se empleo la combinacion (repertaxina/docetaxel). La figura 8 muestra los tamanos tumorales antes y durante el transcurso de cada tratamiento indicado (flecha, comienzo del tratamiento). Se observan resultados similares para cada muestra (SUM159, MC1, UM2, UM3) con una reduccion estadisticamente significativa del tamaho tumoral cuando se trata con docetaxel solo o la combinacion repertaxina/docetaxel en comparacion con el control (p<0,Q1) mientras que no se observan diferencias significativas entre el crecimiento de los tumores de control y los tumores tratados con reperataxina.

Efecto de repertaxina, docetaxel o el tratamiento de combinacion sobre la poblacion de celulas madre de cancer tal como se evalCia mediante el ensayo ALDEFLUOR

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Se evaluo la actividad de ALDH mediante el ensayo ALDEFLUOR para analizar el tamafio de las poblaciones de celulas madre de cancer en cada tumor (9A, SUM159, 9B, MC1, 9C, UM2, 9D, UM3) tratadas con repertaxina, docetaxel o la combinacion. Se observan resultados similares para cada muestra. Los xenoinjertos tumorales tratados con docetaxel mostraron un porcentaje aumentado o similar de celulas positivas para ALDEFLUOR en comparacion con el control, mientras que el tratamiento con repertaxina solo o en combinacidn con docetaxel produjo una disminucion estadisticamente significativa en celulas positivas para ALDEFLUOR con del 65% al 85% menos de celulas madre de cancer en comparacion con el control (p<0,01).

Efecto de repertaxina, docetaxel o el tratamiento de combinacion sobre la poblacion de celulas madre de cancer tal como se evalua mediante implantacion en ratones secundarios.

Se implantaron diluciones en serie de celulas obtenidas de tumores primarios (10A, SUM159, 10B, MC1, 10C, UM2, 10D, UM3) no tratados (control) y tratados con repertaxina, docetaxel o la combinacion en la almohadilla grasa mamaria de ratones NOD-SCID secundarios, Tumores primarios de control y tratados con docetaxel formaron tumores secundarios a todas las diluciones mientras que solo concentraciones superiores de tumores primarios tratados con reperatxina o en combinacion con docetaxel pudieron formar tumores secundarios retrasados que tenian significativamente un tamano mas pequeno que los tumores de control o tratados con docetaxel (p<0,01). Ademas, 1000 y 100 celulas tratadas primarias con la combinacion no pudieron formar tumores secundarios para 3 de 4 muestras (SUM159, UM2, UM3).

El tratamiento con repertaxina reduce elpotencial metastasico de la linea celular SUM1S9

Se infecto una linea celular SUM159 con un lentivirus que expresa luciferasa y se inocularon 250.000 celulas infectadas con luciferasa en el corazon de ratones NOD/SCID. Se organizaron los ratones en dos grupos. Se trataron los dos grupos de ratones 12 boras tras la inyeccion intracardiaca o bien con inyeccion s.c. de solucion salina o bien con inyeccion s.c. de repertaxina (15 mg/kg), dos veces al dta durante 28 dias. Se monitorizo la formacion de metastasis usando obtencion de imagenes de bioluminiscencia (11B: Ratones tratados con solucion salina; 11C: Ratones tratados con repertaxina). La cuantificacion del flujo de protones normalizado medido a intervalos semanales tras la inoculation reveld un aumento estadisticamente significativo de la formacion de metastasis en el grupo de ratones tratados con solucion salina en comparacion con el grupo de ratones tratados con repertaxina (11 A).

EJEMPLO 3

Tratamiento de celulas madre de cancer mediante bloqueo de CXCR1

Este ejemplo demuestra el efecto de la inhibition de CXCR1 sobre celulas tumorales, a traves de tanto ensayos in vitro como modelos de raton.

Disociacion de tejido mamario. Se trituraron con bisturis 100-200 g de tejido de mama normal a partir de mamoplastias de reduction, se disocio enzimaticamente y se cultivaron celulas individuates en suspension para generar mamosferas o sobre un sustrato de colageno en condicion adherente para inducir diferenciacion celular (Dontu et al. Genes Dev. 17:1253-1270).

Cultivo celular. Se hicieron crecer lineas celulares de cancer de mama usando condiciones de cultivo recomendadas (Charafe-Jauffret et al. Cancer Res. 69:1302-1313). Se trataron lineas celulares de c&ncer de mama en condicion adherente con repertaxina (Sigma-Aldrich), anticuerpo monoclonal de raton anti-CXCR1 humano (cion 42705, R&D systems), anticuerpo monoclonal de raton anti-CXCR2 humano (cion 48311, R&D systems), anticuerpo monoclonal de raton anti-CD95 humano (cion DX2, BD Pharmingen) utilizado como agonista de la senalizacion de FAS, anticuerpo monoclonal de raton anti-ligando FAS humano (cion NOK-1, BD pharmingen) utilizado como antagonists de la senalizacion de FAS, o con docetaxel (Taxotere, Sanofi-Aventis).

Viabilidad celular. Para ensayos MTT, se sembraron en placa las celulas en condicion adherente en placas de 96 pocillos a 5.000 celulas por pocillo. Tras un dia, se inicio e! tratamiento con repertaxina. Se estimo el efecto del tratamiento con repertaxina sobre la viabilidad celular a diferentes puntos de tiempo mediante adicion de 20 pi de disolucion de MTT (5 mg/ml en PBS) en cada pocillo. Entonces se incubaron las celulas durante 1 hora a 37°C seguido por adicion de 50 pi de DMSO a cada pocillo. Se midio la absorbancia a 560 nm en un lector de placas de fluorescencia (Spectrafluor, Tecan). Para ensayos TUNEL, se sembraron en placa las celulas en condiciones adherentes en placas de 6 pocillos a 50.000 celulas por pocillo. Tras un dia, se inicio el tratamiento con repertaxina. Se estimo el numero de celulas apoptoticas tras cuatro dias de tratamiento. Se fijaron las celulas en formaldehido al 3,7% y se tineron utilizando el kit TACS TdT (R&D systems). Se contratiheron los nucleos con DAPI/antidesvanecimiento (Invitrogen). Se examinaron las secciones con un microscopio fluorescente (Leica, Bannockborn, IL, EE.UU.) con celulas apoptoticas detectadas en verde.

Ensayo ALDEFLUOR. Se usd el kit ALDEFLUOR (StemCell technologies) para aislar la poblacion con alta actividad enzimatica de ALDH usando un instrumento FACStarPLUS (Becton Dickinson) tal como se describio anteriormente (Ginestier et al. Cell Stem Cell 1:555-567). Con el fin de eliminar celulas de origen de raton de los tumores xenotrasplantados, se tino la poblacion celular con un anticuerpo anti-H2Kd (BD biosciences, 1/200, 20 min sobre

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hielo) seguido por tincion con un anticuerpo secundario marcado con ficoeritrina (PE) (Jackson labs, 1/250, 20 min sobre hielo).

Ensayo de ELISA. Para medir el nivel de ligando FAS soluble secretado en el medio de cultivo de celulas tratadas o no con repertaxina, se utilizo ELISA de ligando sFAS humano (Bender Med systems). Se leyo la absorbancia en un espectrofotometro usando 450 nm como longitud de onda primaria.

Inmunotransferencia de tipo Western. Se lisaron las celulas en un tampon laemmli y se cargaron sobre geles de SDS-poliacrilamida. Se incubaron las inmunotransferencias con los respectivos anticuerpos primarios diluidos en TBST (que contenia Tween20 al 0,1% y BSA al 2%) o bien durante la noche a 4°C, o 2 horas a temperatura ambiente. Se lavaron las inmunotransferencias y se incubaron con anticuerpos secundarios apropiados (GE Healthcare, RU) y se detectaron usando el sustrato quimioluminiscente SuperSignal West Pico (Pierce).

Inmunotincidn. Para la tincion inmunofluorescente, se fijaron celulas positivas para CXCR1 clasificadas con metanol al 95% a -20°C durante 10 minutos. Se rehidrataron las celulas en PBS y se incubaron con los respectivos anticuerpos a temperatura ambiente durante 1 hora. Los anticuerpos primarios usados fueron P-FAK (1:50, Cell Signaling Technology), P-AKT (1:300, Cell Signaling Technology) y FOX03a (1:250, Cell Signaling Technology). Entonces se lavaron los portaobjetos y se incubaron 30 minutos con anticuerpos secundarios conjugados con PE (Jackson labs). Se contratineron los nucleos con DAPI/antidesvanecimiento (Invitrogen) y se cubrieron con un cubreobjetos. Se examinaron las secciones con un microscopio fluorescente (Leica, Bannockborn, IL, EE.UU.). Se realizo la inmunohistoquimica para la deteccion de la expresion de ALDH1 (1:100, BD biosciences), P-FAK, P-AKT, FOX03a en una seccion de parafina (Ginestier et al. Am. J Pathol. 161:1223-1233, incorporado en el presente documento por referencia en su totalidad). Se realizo la tincion utilizando el kit Histostainplus (Zymed laboratories). Se uso diaminobencidina (DAB) o 3-amino-9-etilcarbazol (AEC) como crombgeno y se contratineron secciones con hematoxilina.

Modelo animal. Se evaluo la tumorigenicidad de celulas SUM 159 positivas para ALDELFUOR/positivas para CXCR1 y positivas para ALDEFLUOR/negativas para CXCR1 en ratones NOD/SCID (Ginestier et al. Cell Stem Cell 1:555-567). Se utilizaron la linea celular SUM159 y tres xenoinjertos de cancer de mama humano primario generados a partir de tres pacientes diferentes (MC1, UM2, UM3) para determinar la eficacia del tratamiento con repertaxina sobre el crecimiento tumoral (Ginestier et al. Cell Stem Cell 1:555-567). Se trasplantaron celulas de estos tumores de manera ortotopica en la almohadilla grasa retirada humanizada de ratones NOD/SCID, sin cultivo in vitro. Se prepararon las almohadillas grasas tal como se describio anteriormente (Ginestier et al. Cell Stem Cell 1:555-567). Se inyectaron 50.000 celulas de cada xenotrasplante en la almohadilla grasa humanizada de ratones NOD/SCID y se monitorizo el crecimiento tumoral. Cuando el tamano tumoral era de aproximadamente 4 mm, se inicio el tratamiento con repertaxina sola (s.c„ 15 mg/kg, dos veces al dia, durante 28 dias), docetaxel solo (i.p., 10 mg/kg, una vez a la semana, durante 4 semanas), en combination (repertaxina/docetaxel), o un grupo de control al que se le inyecto solution salina (i.p., una vez a la semana y s.c, dos veces al dia, durante 28 dias). Se sacrificaron los animales cuando los tumores tenian aproximadamente 1,5 cm en el diametro mas grande, para evitar la necrosis tumoral y en cumplimiento con las regulaciones para el uso de animales vertebrados en investigation. Una parte de cada almohadilla grasa en la que se realizo inyeccibn se fijo en formalina y se incrusto en parafina para el analisis histologico. El resto de las celulas tumorales se reimplantaron en ratones NOD/SCID secundarios. Se utilizaron diluciones en serie de celulas para la reimplantation con inyeccibn de 10.000, 1.000 y 100 celulas para cada tumor tratado.

Cultivo independiente de anclaje. Se disociaron BCL tratadas, en condiciones adherentes, con repertaxina (100 nM), anticuerpo anti-CXCR1 (10 pg/ml) o anti-CXCR2 (10 pg/ml) y se sembraron en placa como celulas individuates en placas de union ultra baja (Corning, Acton, MA) a baja densidad (5.000 celulas viables/ml). Se hicieron crecer las celulas tal como se describio anteriormente (Charafe-Jauffret et al. Cancer Res. 69:1302-1313). Se sembraron en placa cultivos posteriores tras la disociacion de tumoresferas primarias en placas de union ultra baja a una densidad de 5.000 ceiulas viables/ml. Se cuantifico la capacidad de las celulas para formar tumoresferas tras el primer (tumoresferas primarias) y el segundo (tumoresferas secundarias) pase.

Extraccion de ARN y qRT-PCR. Tras tratarse celulas SUM 159, se aislo el ARN total usando el kit RNeasy Mini (QIAGEN) y se utilizo para ensayos de RT-PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) en un sistema de deteccion de secuencias ABI PRISM® 7900HT. Se seleccionaron cebadores y sondas para el sistema Taqman del sitio web de Applied Biosystems (www punto appliedbiosystems punto com) (ID de ensayo de ligando FAS: Hs_00899442_mi; ID de ensayo de IL8: Hs_00174103_min, ID de ensayo de TBP: Hs._00427620_mi). Se calculo el nivel de expresion relativa de ARNm de ligando FAS e IL8 con respecto al gen TBP patron interno para normalizar variaciones en la calidad del ARN y la cantidad de ADNc de entrada, tal como se describio anteriormente (Ginestier et al. Clin. Cancer Res. 12:4533-4544).

Analisis de citometria de flujo. Se realizo la tincion de CD44/CD24/Lin (Ginestier et al. Cell Stem Cell 1:555-567) Se realizo la tincion de CD95/FAS utilizando un anticuerpo anti-CD95 marcado con APC (1:20, BD biosciences). Para la tincion de CXCR1 y CXCR2, a los anticuerpo primarios anti-CXCR1 (1:100, cion 42705, R&D systems) y anti-CXCR2 (1:100, cion 48311, R&D systems) les siguio una tincion con un anticuerpo secundario anti-raton marcado con PE (dilucion 1:250, Jackson Labs). Se tiheron celulas nuevas con PI 1 gg/ml (Sigma) durante 5 min para determinar la

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Infeccidn con virus. Se produjeron dos constructos lentivirales diferentes para la expresion del gen de luciferasa (Lenti-LUC-VSVG) (Charafe-Jauffret ef al. Cancer Res. 69:1302-1313) y para la inhibicion de la expresion de PTEN (Lenti-PTEN-SiRNA-DsRed) (Korkaya et al. PLoS Biolog. 7:e1000121), respectivamente. Se prepararon todos los constructos lentivirales por la University of Michigan Vector. Tambien se utilizo un constructo adenoviral para la sobreexpresion de FAK (Ad-FAK-GFP) (Luo ef al. Cancer Res. 69:466-474). Se realizo la infeccidn de celulas con diferentes vectores tal como se describio anteriormente (Charafe-Jauffret ef al. Cancer Res. 69:1302-1313). Se verified la eficiencia de infeccidn midiendo el porcentaje de celulas que expresan DsRed o GFP.

Inoculacion intracardiaca. Se anestesiaron ratones NOD/SCID de seis semanas de edad con una mezcla de isofluorano al 2%/aire y se les inyecto en el ventriculo izquierdo del corazon 250.000 celulas en 100 pi de PBS de Dulbecco esteril que carecia de Ca2+ y Mg2+. Para cada una de las tres lineas celulares (HCC1954, MDA-MB-453 y SUM 159) y para cada tratamiento (solucion salina o repertaxina) se realizaron inyecciones en seis animales. Doce horas tras las inyecciones intracardiacas, se comenzaron las inyecciones de repertaxina dos veces al dia en los ratones o solucion salina para los controles.

Deteccion de bioluminiscencia. Se evaluo la bioluminiscencia initial antes de la inoculacion y cada semana despues de las inoculaciones. Los procedimientos de deteccion de bioluminiscencia se realizaron tal como se describio anteriormente (Charafe-Jauffret ef al. Cancer Res. 69:1302-1313). El flujo de fotones normalizado representa la razon del flujo de fotones detectado cada semana tras las inoculaciones y el flujo de fotones detectado antes de la inoculacion.

La expresion de CXCR1 subdivide las poblaciones de celulas madre de cancer. La identification de rutas de serialization celular que regulan celulas madre de cancer (CSC) proporciona posibles dianas terapeuticas en una poblacion celular. Se ha identificado una firma de CSC de mama basandose en la obtencion del perfil de expresion genica que contenia varios genes potencialmente implicados en rutas reguladoras de CSC de mama (Charafe- Jauffret et al. Cancer Res. 69:1302-1313). Entre los genes sobreexpresados en la poblacion de CSC de mana, CXCR1, un receptor que se une a la quimiocina proinflamatoria IL-8/CXCL8, parece ser un candidato prometedor puesto que IL-8 recombinante estimulo la autorrenovacion de CSC de mama (Charafe-Jauffret ef al. Cancer Res. 69:1302-1313). Utilizando citometria de flujo, se midio la expresion de proteina CXCR1 en la poblacion de CSC de mama mediante el ensayo ALDELFUOR en las lineas celulares de cancer de mama humano HCC1954, MDA-MB- 453 y SUM159. Las celulas con propiedades de celulas madre funcionales en xenoinjertos de raton NOD/SCID estaban contenidas dentro de la poblacidn de celulas positivas para ALDEFLUOR (Charafe-Jauffret ef al. Cancer Res. 69:1302-1313). La poblacion positiva para CXCR1, que representa menos del 2% de la poblacion total, estaba casi exclusivamente contenida dentro de la poblacion positiva para ALDEFLUOR (vease la figura 12A y la tabla 4).

TABLA4

_______________________________ALDEFLUOR (%) CXCR1(%) Solapamiento CXCR1/ALDEFLUOR (%)

Lineas celulares de cancer de mama

HCC1954

3,42 1,72 0,94

MDA-MB-453

4,22 0,8 0,5

SUM159

5,24 0,52 0,48

Xenoinjertos de cancer de mama humano

MC1

12,3 1,81 1,32

UM2

8,4 1,23 0,88

UM3

9,7 0,84 0,76

Tambi6n se evaluo la expresion de CXCR2, CXCR2 es un receptor que puede unirse tambien a IL-8/CXL8 aunque con afinidad reducida en comparacion con CXCR1. En contraposicion a celulas positivas para CXCR1, las celulas positivas para CXCR2 se distribuian por igual entre las poblaciones positivas para ALDEFLUOR y negativas para ALDEFLUOR (vease la figura 12A). Para determinar la organization jerarquica de la poblacion de celulas madre de cancer segun la expresion de CXCR1, se clasificaron poblaciones de celulas positivas para ALDEFLUOR/positivas para CXCR1 y positiva para ALDEFLUOR/negativas para CXCR1 y se inyectaron en ratones NOD/SCID (vease la figura 13). Ambas poblaciones de celulas generaron tumores. La cinetica del crecimiento tumoral se correlacionaba con la latencia y el tamano de la formacion tumoral y el numero de celulas inyectadas. Los tumores generados por la poblacion positiva para ALDEFLUOR/positiva para CXCR1 reconstituyeron la heterogeneidad fenotipica del tumor inicial tras pases en serie mientras que la poblacion positiva para ALDEFLUOR/negativa para CXCR1 dio lugar a tumores que contenian solo celulas positivas para ALDEFLUOR/negativas para CXCR1. Estos resultados sugieren que la jerarquia celular de CSC se organiza segun la expresion de CXCR1, sin embargo ambas poblaciones de celulas presentaban capacidad tumorigenica similar.

El bloqueo de CXCR1 disminuye la poblacion de celulas madre de cancer de mama in vitro. Se trataron tres lineas celulares diferentes con repertaxina (100 nM), un inhibidor de CXCR1/2, para evaluar el efecto del bloqueo de

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CXCR1 sobre la poblacion de CSC de mama (Bertini et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S A 101:11791-11796). Para SUM159, tras tres dias de tratamiento se observo una reduccion de cinco veces en la proportion de celulas positivas para ALDEFLUOR (vease la figura 12B). Se observo un efecto similar tras el tratamiento de celulas SUM 159 con un anticuerpo bloqueante anti-CXCR1, En cambio, no se observo ningun efecto tras el tratamiento con un anticuerpo bloqueante anti-CXCR2, lo que sugiere que los efectos de la repertaxina sobre la poblacidn positiva para ALDEFLUOR estaban mediados por CXCR1.

Los datos de tumores de mama, asi como lineas celulares, demuestran que pueden aislarse celulas de tipo madre de cancer o celulas que inician el cancer y propagarse como “tumoresferas" en cultivo en suspension (Ponti et al. Cancer Res. 65:5506-5511). Tras tres dias de tratamiento con repertaxina o con el anticuerpo bloqueante anti- CXCR1, cuando se desprendieron las celulas y se cultivaron en suspension, se observo una disminucion de 8 veces en la formation de tumoresferas primarias y secundarias en comparacion con los controles. En cambio, el anticuerpo bloqueante anti-CXCR2 no tuvo ningun efecto sobre la formacion de tumoresferas {vease la figura 14).

Sorprendentemente, tras cinco dias de tratamiento con repertaxina se observo una disminucion masiva en la viabilidad de toda la poblacion celular tal como se evalua mediante el ensayo MTT, permaneciendo solo el 3% de las celulas viables (vease la figura 12C). Se observaron resuitados similares con el anticuerpo bloqueante anti-CXCR1 pero no el anticuerpo bloqueante anti-CXCR2, indicando por tanto que este efecto era dependiente del bloqueo de CXCR1. Este efecto de la repertaxina se retraso con perdida de viabilidad celular comenzando tres dias tras el tratamiento (vease la figura 15A). El tratamiento con repertaxina indujo un efecto similar sobre la linea celular de cancer de mama HCC1954 mientras que no se observo ningun efecto sobre celulas MDA-MB-453 que albergan una mutacion PTEN (Hollestelle et al. Cancer Res. 5:195-201) (veanse las figuras 14, 15B-C y 16).

Utilizando un ensayo TUNEL, se tineron celulas SUM159 tras 4 dias de tratamiento con repertaxina y se observo una disminucion masiva en la viabilidad celular, debido a una induccion de apoptosis detectandose un 36% de celulas apoptoticas tras el tratamiento con repertaxina (vease la figura 12D). Los resuitados sugieren que el bloqueo de CXCR1 da como resultado una disminucion de la poblacion de CSC de mama seguido por induccion de apoptosis masiva en la poblacion tumoral a granel restante.

El bloqueo de CXCR1 induce muerte celular en celulas negativas para CXCR1 por medio de un efecto inespecifico. La observation de que repertaxina o anticuerpo bloqueante anti-CXCR1 inducian muerte celular masiva a pesar del hecho de que la poblacion positiva para CXCR1 representaba menos del 2% de la poblacion celular total sugirio que el bloqueo de CXCR1 en celulas positivas para CXCR1 indujo muerte celular negativa para CXCR1 por medio de un efecto inespecifico. Se trataron las poblaciones positiva para CXCR1 y negativa para CXCR1 clasificadas con repertaxina (vease la figura 12E), La repertaxina disminuyo la viabilidad celular en la poblacion positiva para CXCR1 en el plazo de tres dias mientras que no se observo ningun efecto en la poblacidn negativa para CXCR1. La repertaxina indujo muerte celular masiva en celulas no separadas. El efecto de la repertaxina sobre la viabilidad celular de las poblaciones no separada y positiva para CXCR1 era dependiente de la dosis (vease la figura 12E). Los resuitados concuerdan con el tratamiento con repertaxina que selecciona como diana la poblacion positiva para CXCR1 que a su vez induce muerte celular negativa para CXCR1 por medio de un efecto inespecifico.

Para determinar si este efecto estaba mediado por un factor soluble inducido por repertaxina, se recogio medio condicionado de la poblacion positiva para CXCR1 tras tres dias de tratamiento con repertaxina y se dializo este medio utilizando una membrana con exclusion de 3.5 KDa con el fin de eliminar la repertaxina del medio al tiempo que se retenian moleculas mayores de 3,5 KDa. El medio condicionado dializado indujo una disminucion masiva en la viabilidad celular en las poblaciones tanto negativa para CXCR1 como no separada pero no en la poblacion positiva para CXCR1 (vease la figura 12F), Estos resuitados demuestran que el bloqueo de CXCR1 en la poblacion positiva para CXCR1 induce muerte celular en la poblacion negativa para CXCR1 por medio de un factor no dializable soluble, Aunque la poblacion positiva para CXCR1 es sensible a repertaxina, es resistente al factor de muerte dializable.

El efecto inespecifico inducido por el bloqueo de CXCR1 esta mediado por la senalizacion de ligando FASIFAS. La interaction de ligando FAS/FAS se activa en diferentes estados fisiologicos tales como involution de glandulas mamarias o en condiciones de lesion tisular incluyendo la inducida por quimioterapia (Chhipa et al. J Cell Biochem. 101:68-79, Song ef al. J Clin. Invest 106:1209-1220). El nivel de ligando FAS soluble en el medio de celulas SUM159 tratadas con repertaxina usando un ensayo ELISA para evaluar el papel de la interaccion de ligando FAS/FAS en la mediation del efecto inespecifico apoptotico inducido por el bloqueo de CXCR1. Se observo un aumento de mas de cinco veces de ligando FAS soluble en el medio de celulas tratadas durante cuatro dias con repertaxina en comparacion con celulas no tratadas (vease la figura 17A). La regulation transcripcional de ligando FAS mediante tratamiento con repertaxina midiendo el nivel de ARNm de ligando FAS se confirmo mediante RT-PCR (vease la figura 17B). Se observo un aumento de 4 veces del nivel de ARNm de ligando FAS en las celulas tratadas con repertaxina en comparacion con las celulas no tratadas. Se observaron resuitados similares tras el tratamiento con un agonista de FAS que activa la senalizacion de FAS, indicando que el ligando FAS es una diana de la senalizacion de FAS que genera un bucle de retroalimentacion positiva. El 100% de las celulas SUM159 expresaban proteina FAS tal como se determine mediante citometria de flujo. El tratamiento de las celulas SUM159 con el agonista de FAS reprodujo el efecto de destruction observado con el tratamiento con repertaxina con una reduccion masiva en la viabilidad celular (vease la figura 17C). El efecto del tratamiento con repertaxina sobre la viabilidad celular se

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revirtib parcialmente mediante un anticuerpo bloqueante anti-ligando FAS, permaneciendo el 44% de las celulas viables tras el tratamiento con repertaxina y anticuerpo anti-ligando FAS en comparacion con solo el 3% con repertaxina sola (vease la figura 17C). Los resuitados sugieren que la muerte celular masiva inducida por la repertaxina se debe a un efecto inespecifico mediado por la ruta de ligando FAS/FAS.

El tratamiento de celulas SUM159 con el agonista de FAS dio como resultado un aumento de diez veces y tres veces en el porcentaje de celulas positivas para CXCR1 y positivas para ALDEFLUOR, respectivamente (veanse las figuras 17D/E y 18). Los efectos de la repertaxina sobre ambas poblaciones no se rescataron mediante anticuerpo anti-ligando FAS (vease la figura 17D/E), lo que sugiere que la poblacion positiva para ALDEFLUOR que contiene la poblacion positiva para CXCR1, aunque es directamente sensible al bloqueo de CXCR1 que a su vez induce la production de ligando FAS por estas celulas, es resistente a la senalizacibn proapoptotica de ligando FAS/FAS. En cambio, la poblacion celular a granel negativa para ALDEFLUOR no expresa CXCR1 pero es sensible a la muerte celular mediada por ligando FAS.

La serialization de ligando FAS/FAS desempena un papel importante durante la involution de glandulas mamarias (Song et al. J Clin. Invest 106:1209-1220). Se examino el efecto del bloqueo de CXCR1 sobre celulas epiteliales mamarias normales humanas obtenidas de mamoplastias de reduction. Tal como se observa en lineas celulares de cancer de mama, las celulas mamarias normales positivas para CXCR1 estaban casi exclusivamente contenidas dentro de la poblacion positiva para ALDEFLUOR (vease la figura 19A). Para determinar si la serialization de IL-8 es importante en la funcion progenitor/madre de mama normal, se trataron cblulas epiteliales mamarias normales cultivadas en suspension con IL-8 recombinante humana y se determino su efecto sobre la poblacion de CSC tal como se mide mediante la formation de mamosferas (Dontu et al. Genes Dev. 17:1253-1270). La adicion de IL-8 aumento la formation de mamosferas primarias y secundarias de una manera dependiente de la dosis (vbase la figura 19B), lo que sugiere que el eje IL-8/CXCR1 puede estar implicado en la regulation de la proliferation o autorrenovacion de celulas progenitoras/madre mamarias normales. El tratamiento con repertaxina o el agonista de FAS no tuvo efecto sobre la viabilidad de celulas epiteliales mamarias normales cultivadas en condiciones adherentes, incluso cuando se utilizaron altas concentraciones de repertaxina (500 nM) (vease la figura 16A). Sin embargo, tal como se observa para lineas celulares de cancer de mama, se detecto un aumento de ligando FAS soluble en el medio de celulas epiteliales mamarias normales tratadas con repertaxina (vease la figura 20B). Esta observation puede explicarse por la ausencia de expresion de FAS en las celulas epiteliales normales cultivadas en estas condiciones (vease la figura 20C). Esto concuerda con estudios que demuestran que la expresion de FAS en la glandula mamaria se produce solo durante el proceso de involucion tras la lactancia (Song et al. J Clin. Invest 106:1209-1220). En contraposition a su falta de efecto sobre la poblacion de celulas epiteliales mamarias normales a granel, la repertaxina disminuyo significativamente la formation de mamosferas por estas celulas (vbase la figura 20C).

Estos resuitados sugieren que el eje IL-8/CXCR1 desempena un papel importante en la regulation y la supervivencia de poblaciones de celulas progenitoras/madre epiteliales mamarias normales y malignas. La capacidad para afectar a poblaciones celulares a granel por medio de un efecto inespecifico mediado por ligando FAS puede relacionarse con el nivel de expresion de FAS en estas celulas.

Los efectos de bloqueo de CXCR1 sobe celulas madre de cancer estan mediados por la ruta de FAKIAKTIFOX03A. CXCR1 actua a traves de una ruta de transduction de senales que implica la fosforilacion de la cinasa de adhesion focal (FAK) dando como resultado activation de AKT (Waugh et al. Clin. Cancer Res, 14:6735-6741), Para evaluar el impacto del bloqueo de CXCR1 sobre la activation de FAK y AKT se midio el nivel de proteinas fosforiladas FAK y AKT mediante inmunotransferencia de tipo Western para las tres lineas celulares diferentes, Para SUM159 y HCC1954, se detecto una disminucibn en la fosforilacion de FAK Tyr3'1 y AKT Ser473 en cblutas tratadas con repertaxina en comparacion con celulas no tratadas lo que sugiere que los efectos de la repertaxina pueden estar mediados por la ruta de FAK/AKT (veanse las figuras 21A y 22). La observation de que MDA-MB453 es resistente al tratamiento con repertaxina puede explicarse por la presencia de una mutation de PTEN (919G>A) que activa la ruta de PI3K/AKT (Hollestelle et al. Mol. Cancer Res. 5:195-201, incorporado en el presente documento por referencia en su totalidad). No se detecto modification en la fosforilacion de FAK Tyr39' y AKT Ser473 tras el tratamiento con repertaxina en la linea celular MDAMB453 (vease la figura 22). Para confirmar un papel funcional de la ruta de FAK/AKT en la mediation de los efectos del bloqueo de CXCR1, se usaron dos constructos virales, uno que desactiva la expresion de PTEN por medio de un ARNhp de PTEN y el otro que conduce a sobreexpresion de FAK. PTEN, a traves de su lipido fosfatasa, antagoniza la serialization de PI3-K/AKT (Vivanco et al. Nat. Rev. Cancer 2:489-501). La desactivacion de PTEN dio como resultado activation de AKT tal como se demostro por un aumento de la fosforilacion de AKT Ser473 (veanse las figuras 21A y 22). La desactivacion de PTEN bloqueo el efecto del tratamiento con repertaxina sobre la actividad de FAK y AKT. La sobreexpresion de FAK tambien bloqueb los efectos de la repertaxina e indujo una activacion de FAK y AKT, medida por un aumento de la expresion de fosforilacion de FAK Tyr397 y AKT Ser4'3. Estos resuitados indican que los efectos del bloqueo de CXCR1 estan mediados por la serialization de FAK/AKT.

La utilization de tincion de inmunofluorescencia sobre celulas positivas para CXCR1 confirmo que el tratamiento con repertaxina da como resultado una disminucibn drastica de la expresion de fosfo-FAK y fosfo-AKT en comparacion con celulas no tratadas (vease la figura 21B). AKT regula la actividad del factor de trancripcion forkhead FOX03A por medio de un acontecimiento de fosforilacion dando como resultado secuestro de FOXG3A citoplasmatico (Brunet

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et al. Mol, Cell Biol. 21:952-965). En contraposicion, la forma no fosforilada de FOX03A transita al niicleo donde actua como factor de transcripcion que regula la sintesis de ligando FAS (Jonsson et al. Nat. Med. 11.666-671). La repertaxina induce muerte celular por medio de un efecto inespecifico mediado por ligando FAS; los efectos de la repertaxina sobre esta ruta de transduccidn de senates se examinaron mediante tincion de inmunofluorescencia. FOX03A estaba presente en una localizacion citoplasmatica en celulas no tratadas pero se transporto al niicleo tras el tratamiento con repertaxina (vease la figura 21B). Esto indica que el bloqueo de CXCR1 induce actividad de FOX03A a traves de la inhibicion de la ruta de FAK/AKT. Las celulas con delecion de PTEN o sobreexpresion de FAK presentan un alto nivel de expresion de fosfo-FAK y fosfo-Akt, detectada mediante inmunofluorescencia, en celulas tanto tratadas como no tratadas con repertaxina. El tratamiento con repertaxina no indujo activacion de FOX03A en celulas con delecion de PTEN o sobreexpresion de FAK, tal como se muestra por la ubicacion citoplasmatica de FOX03A (vease la figura 21B).

Como consecuencia de la activacion constitutiva de la ruta de FAK/AKT, las celulas con delecion de PTEN o sobreexpresion de FAK presentaban resistencia al tratamiento con repertaxina. Las celulas con delecion de PTEN o sobreexpresion de FAK no presentaban ninguna disminucidn en la viabilidad celular con el tratamiento con repertaxina. Se ba propuesto que la senalizacion de AKT desempena un papel critico en la biologia de CSC (veanse las figuras 21B y 22) (Dubrovska et al Proc. Natl. Acad Sci. USA 106:268-273, Korkaya et al. PLoS Biolog 7:e1000121, Yilmaz et al. Nature 441:475-482). La activacion de la ruta de FAK/AKT bloqueo los efectos de la repertaxina sobre las poblaciones de CSC, tal como se muestra por el mantenimiento de las poblaciones positivas para ALDELFUOR tras el tratamiento con el inhibidor (vease la figura 21B). Todos los resultados indican que el bloqueo de CXCR1 afecta directamente a la ruta de FAK/AKT/FOX03A. El tratamiento con repertaxina inhibe la senalizacion de AKT que es crucial para la actividad de CSC y posteriormente induce un efecto inespecifico sobre las celulas tumorales a granel mediado por el ligando FAS generado por CSC.

El tratamiento con repertaxina reduce la poblacidn de celulas madre de cancer de mama in vivo. Evidencias recientes sugieren que CSC de mama son relativamente resistentes a la quimioterapia y radiacion y pueden contribuir al recrecimiento tumoral tras la terapia (Phillips et al. J Natl. Cancer Inst. 98:1777-1785, Yu et al. Cell 131:1109-1123, Li et al. J Natl. Cancer Inst. 100:672-679). El concepto de CSC sugiere que mejoras significativas en el desenlace clinico requeriran una seleccion como diana eficaz de la poblacidn de CSC (Reya et al. Nature 414:105-111). Varios factores se sintetizan y secretan durante el proceso apoptotico cuando las celulas tumorales a granel se seleccionan como diana por la quimioterapia. Entre estos factores, el iigando FAS amplifica los efectos de la quimioterapia mediando en un efecto de destruction inespecifico (Chhipa et al. J Cell Biochem. 101:68-79, incorporado en el presente documento por referenda en su totalidad). La quimioterapia tambien puede inducir produccion de IL-8 en celulas tesionadas, El agente quimioterapico comunmente utilizado, docetaxel, indujo ARNm de tanto IL-8 como ligando FAS en celulas SUM159 (vease la figura 10a/B). Tambien se detecto un aumento de 4 veces en el nivel de ARNm de IL-8 tras el tratamiento con agonista de FAS (vease la figura 10B). Se ha mostrado que IL-8 puede regular la poblacidn de CSC. Esto indica que la adicion de repertaxina a quimioterapia citotoxica puede bloquear este efecto y seleccionar como diana la poblacidn de celulas madre de cancer.

Se usaron la linea celular SUM159 y tres xenoinjertos de cancer de mama humano primario generados a partir de tres pacientes diferentes (MC1, UM2, UM3) para explorar la eficacia del tratamiento con repertaxina sobre el crecimiento tumoral. Se trasplantaron de manera ortotopica celulas de estos tumores en la almohadilla grasa retirada humanizada de ratones NOD/SCID, sin cultivo in vitro. Para cada uno de estos xenotrasplantes, la poblacidn de CSC estaba exclusivamente contenida dentro de la poblacidn positiva para ALDEFLUOR (Ginestier et al. Cell Stem Cell 1:555-567, Charafe-Jauffret et al. Cancer Res. 69:1302-1313). En cada uno de los tumores, la poblacidn positiva para CXCR1 estaba casi exclusivamente contenida dentro de esta poblacidn positiva para ALDEFLUOR (vease la tabla 5) y la ruta de PTEN/FAK/AKT esta activada (vease la figura 25).

Tabla 5

ALDEFLUOR (%)

CXCR1 Solapamiento CXCR1/ALDEFLUOR {%)

Lineas celulares de cancer de mama HOC 1954

3,42 1,72 0,94

MDA-MB-453

4,22 0,8 0,5

SUM159

5,24 0,52 0,48

Xenoinjertos de cancer de mama humano MC1

12,3 1,81 1,32

UM2

8,4 1,23 0,88

UM3

9,7 0,84 0,76

Se inyectaron 50.000 celulas de cada xenotrasplante en la almohadilla grasa humanizada de ratones NOD/SCID y se monitorizo el crecimiento tumoral. Cuando el tamano tumoral era de aproximadamente 4 mm, se inicio el tratamiento con repertaxina sola (15 mg/kg, dos veces al dia, durante 28 dias), docetaxel solo (10 mg/kg, una vez a la semana, durante 4 semanas), o una combinacion de ambos farmacos. El crecimiento tumoral se compard con controles en los que se inyecto solucion salina. Para cada xenotrasplante, se observo una inhibicion significativa del

crecimiento tumoral inducido por el tratamiento con docetaxel o la combinacion repertaxina/docetaxel (veanse las figuras 26A y 27). El tratamiento con repertaxina sola tuvo un impacto moderado sobre el crecimiento tumoral. Tras cuatro semanas de tratamiento, se sacrificaron los animates y se analizaron los tumores residuales utilizando el ensayo ALDEFLUOR. Los tumores residuales tratados con docetaxel solo contenian o bien un porcentaje no 5 cambiado o bien aumentado de celuias positivas para ALDELFUOR en comparacion con controles no tratados (veanse las figuras 26B y 27). En cambio, el tratamiento con repertaxina sola o en combinacion con docetaxel redujo la poblacion positiva para ALDEFLUOR en mas del 75% (veanse las figuras 26B y 27). Se confirmaron los resultados mediante inmunohistoquimica de la expresion de ALDH1 en los diferentes xenotrasplantes. Se detecto una disminucidn en celuias positivas para ALDH1 en tumores tratados con repertaxina en comparacion con tumores 10 no tratados, mientras que el porcentaje de celuias positivas para ALDH1 no cambio o aumento en tumores tratados con docetaxel solo (veanse las figuras 26D).

Se evaluo la presencia de celuias CD44+/CD24- en estos tumores. Se ha mostrado anteriormente que se expresan marcadores en celuias madre de cancer de mama (Al Hajj et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S A 100:3983-3988). Se midio el solapamiento entre el fenotipo CD44+/CD24- y la expresion de CXCR1. Estaban presentes celuias positivas 15 para CXCR1 en la poblacion de celuias CD44+/CD24- y la poblacion de celuias que expresan CD24 o negativas para CD44 (vease la tabla 6).

Tabla 6

Xenoinjertos de cancer de mama humano

CD24"/CD44+ (%) CXCR1 (%) Solapamiento CD247CD44+/CXCR1+ (%)

MC1

6,8 1,8 0,5

UM2

3,7 1,2 0,3

UM3

4,8 0,8 0,2

En tumores residuales tratados con docetaxel solo, se observo un porcentaje o bien no cambiado o bien aumentado de celuias CD44+/CD24, mientras que el tratamiento con repertaxina sola o en combinacion con docetaxel dio como 20 resultado una reduccion de la poblacion de celuias CD44*/CD24 (vease la flgura 28).

Un ensayo in vivo funcional que consistia en la reimplantation de celuias de tumores tratados en ratones NOD/SCID secundarios proporciono una prueba directa que evaluaba la capacidad de autorrenovacion e initiation de tumores de las CSC que permanecian tras el tratamiento. Celuias tumorales derivadas de animates de control o tratados con docetaxel mostraron un recrecimiento tumoral similar a todas las diluciones en ratones NOD/SCID secundarios. En 25 cambio, el tratamiento con repertaxina con o sin docetaxel, redujo el crecimiento tumoral en receptores secundarios (vease la figura 26C). Cuando se inyectaron numeros iguales de celuias, las de animates tratados con repertaxina mostraron una reduccion de 2-5 veces en el crecimiento tumoral en comparacion con celuias de los animates de control o tratados con docetaxel (vease la figura 26C). Para cada modelo de xenotrasplante, 1000 6 100 celuias tumorales obtenidas de animates tratados con una combinacion de repertaxina y docetaxel no pudieron format 30 ningun tumor secundario en ratones NOD/SCID (veanse las figuras 26C, 27 y la tabla 7). Estos estudios demostraron que el tratamiento con repertaxina selecciona como diana especificamente y reduce la poblacion de CSC.

Tabla 7

Tumores/inyecciones Nurnero de celuias inyectadas

10.000 5.000 2.500 1.000 500 250 100

Control

6/6 2/2 — 8/8 — — 6/8

Repertaxina

4/4 2/2 2/2 4/8 1/3 0/2 0/8

Docetaxel

2/2 4/4 2/2 6/6 3/4 2/3 8/9

Repertaxina/docetaxel

2/2 3/4 2/2 1/6 1/4 0/4 0/8

El tratamiento con repertaxina inhibe la senalizacion de FAKIAKT y activa FOX03A in vivo, Se examino la expresion 35 de fosfo-FAK y fosfo-AKT mediante inmunohistoquimica en cada uno de los xenotrasplantes tras el tratamiento. Se detecto expresion de fosfo-FAK membranosa en el 50% de las celuias de los tumores de control y tratados con docetaxel mientras que la expresion de fosfo-FAK se suprimio en los tumores tratados con repertaxina sola o en combinacion con docetaxel (vease la figura 26D). Se observaron resultados similares para la expresion de fosfo- AKT, expresando el 70% de las celuias fosfo-AKT en los tumores tratados, el 20% de celuias positivas para fosfo- 40 AKT en tumores tratados con docetaxel y una inhibition completa de la expresion de fosfo-AKT en los tumores tratados con repertaxina sola o en combinacion con docetaxel (vease la figura 26D). Se detecto FOX03A nuclear en las celuias de los tumores tratados con docetaxel solo, repertaxina sola y la combinacion repertaxina/docetaxel. Estos datos in vivo concuerdan con los datos in vitro y confirman que el tratamiento con repertaxina inhibe la senalizacion de FAK/AKT y activa FOX03A.

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El tratamiento con repertaxina reduce el desarrollo de metastasis sistemica. Para determinar si la repertaxina reduce la metastasis sistemica, se infectaron ias lineas celulares de cancer de mama HCC1954, MDA-MB-453 y SUM 159 con un sistema indicador de lentivirus con luciferasa y se introdujeron las celulas en ratones NOD/SCID mediante inyeccion intracardiaca. Se inyecto una suspension de 250 000 celulas para cada linea celular y se monitorizo la formacion de metastasis una vez a la semana mediante obtencion de imagenes de bioluminiscencia, Doce horas tras la inyeccion intracardiaca, se trataron los ratones dos veces al dia mediante inyeccion con repertaxina o solucion salina para los controles. El tratamiento con repertaxina en ratones en los que se inyectaron celulas HCC1954 y SUM 159 redujo significativamente la formacion de metastasis con una emision de flujo de fotones inferior en los ratones tratados en comparacion con los no tratados (vease la figura 29AB). Secciones histologicas confirmaron la presencia de metastasis en varios sitios en animales no tratados (vease la figura 29D). El tratamiento con repertaxina no tuvo ningtin efecto sobre la formacion de metastasis en ratones en los que se inyectaron celulas MDA-MB-453 (vease la figura 29C). La emision de flujo de fotones y el numero de animales que desarrollaron metastasis eran similares en el grupo tanto tratado con repertaxina como no tratado. Este resultado concuerda con los datos que describieron MDA-MB-453 como una linea celular resistente a la repertaxina debido a la presencia de una mutation PTEN. Estos resultados indican que el bloqueo de CXCR1 con agentes tales como repertaxina pueden poder reducir la metastasis que esta mediada por la poblacion de CSC (Charafe-Jauffret et al. Cancer Res. 69:1302-1313).

Los experimentos realizados durante el desarrollo de realizaciones de la presente invencion indican que subcomponentes celulares con propiedades de celulas madre dirigen el crecimiento tumoral y la metastasis Visvader et al. Nat. Rev. Cancer 8:755-768. En virtud de su resistencia relativa a modalidades terapeuticas actuates, estas celulas pueden contribuir a la resistencia al tratamiento y la recidiva (Reya et al. Nature 414:105-111). La presente invencion proporciona un enfoque basado en el bloqueo del receptor de citocinas CXCR1, que se expresa en celulas madre de cancer de mama, para seleccionar como diana eficazmente la poblacion de celulas madre de cancer y mejorar el desenlace terapeutico. Los experimentos realizados durante el desarrollo de realizaciones de la presente invencion en varios sistemas han demostrado que las redes de citocinas desempefian un papel importante en la tumorigenesis. Hay evidencias de que varias de estas citocinas pueden regular el comportamiento de celulas madre. IL-4 puede regular la autorrenovacion de celulas madre de cancer pancreatico e IL-6 regular celulas madre de cancer en colon y cancer de mama (Todaro et al. Cell Stem Cell 1:389-402, Sansone et al. J Clin. Invest 117:39884002). El papel de IL-8 en la mediation en la invasion tumoral y metastasis se ha demostrado anteriormente (Waugh & Wilson. Cancer Res. 14:6735-6741, Inoue et al. Clin. Cancer Res. 6:2104-2119). Ademas, IL-8 aumenta la autorrenovacion de celulas madre neurales durante la cicatrizacion de heridas en el cerebro (Beech et al. J Neuroimmunol. 184:198-208). Se describio que celulas madre de cancer de pulmon expresaban el receptor de quimiocinas CXCR1 (Levina et al. PLoS. ONE. 3:e3077). Los experimentos realizados durante el desarrollo de las realizaciones de la presente invencion demostraron que la poblacion positiva para CXCR1 esta casi exclusivamente contenida dentro de la poblacion positiva para ALDEFLUOR en lineas celulares de cancer de mama y xenoinjertos primarios asi como en celulas mamarias normaies. El receptor de quimiocinas se sobreexpresa en poblaciones de celuias de cancer de mama positivas para ALDEFLUOR (Charafe-Jauffret et al. Cancer Res. 69:1302-1313). En canceres de mama, se produce IL-8 en el microentorno tumoral por varios tipos de celulas incluyendo celulas inflamatorias, celulas endoteliales vasculares, fibroblastos asociados a tumor y celulas madre mesenquimatosas (Waugh et al. Clin. Cancer Res. 14:6735-6741). Las redes de citocinas median en la interaction entre estos tipos de celulas, por tanto las celulas madre de cancer pueden seleccionarse como diana a traves del bloqueo del receptor de IL-8 CXCR1.

Utilizando ensayos in vitro, se demostro que el bloqueo de CXCR1 pero no de CXCR2 (un receptor de IL-8 alternative) reducia la poblacidn de celulas madre de cancer de mama, A esto le siguio induccidn de apoptosis en toda la poblacion celular restante, que carece de expresion de CXCR1. Ademas de anticuerpos bloqueantes de CXCR1, los experimentos realizados durante el desarrollo de las realizaciones demostraron que la repertaxina, un inhibidor de CXCR1/2, inducia efectos similares seleccionando como diana la poblacion positiva para CXCR1. En contraposition a sus efectos directos sobre la poblacion de celulas madre de cancer que expresan CXCR1, la repertaxina no tuvo ningun efecto directo sobre la poblacion de celulas tumorales a granel que carecen de expresion de CXCR1. Esto indica que el bloqueo de CXCR1 en celulas positivas para CXCR1 indujo muerte celular en celulas negativas para CXCR1 por medio de un efecto inespecifico. Los experimentos descritos en el presente documento demuestran que la ruta de ligando FAS/FAS es el mediador de este efecto de destruccion inespecifico. Este fenomeno explica la eficacia del tratamiento con repertaxina en la induction de apoptosis masiva en toda la poblacion celular a pesar del hecho de que la poblacion positiva para CXCR1 representa menos del 1% de la poblacion celular. El papel del ligando FAS se demostro por el bloqueo eficaz de la destruccion inespecifica por anticuerpo anti-ligando FAS.

Los experimentos realizados durante el desarrollo de las realizaciones de la presente invencion indican que pueden producirse interacdones de citocinas similares en tumores expuestos a quimioterapia citotoxica. La quimioterapia puede inducir directamente apoptosis celular en celulas tumorales no diferenciadas asi como inducir la produccion de ligando FAS por estas celulas moribundas que a su vez induce apoptosis en las celulas tumorales circundantes por medio de un efecto inespecifico mediado por FAS. Simultaneamente con la produccion de ligando FAS, estas celulas lesionadas tambien secretan niveles aumentados de IL-8 en un proceso que se asemeja a la involucion mamaria o cicatrizacion de heridas. Tal como es el caso en la glandula mamaria en involucion, esta IL-8 puede

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estimular a celulas madre de cancer de mama asi como protegerlas de la apoptosis. Esto puede contribuir al aumento relativo en celulas madre de cancer observado tras la quimioterapia en modelos preclinicos (4) y ensayos clinicos con neoadyuvante (5). Los efectos de la quimioterapia sobre las rutas de autorrenovacion y apoptosis en tumores se muestran en la figura 30.

Para determinar si el bloqueo de CXCR1 podria seleccionar como diana celulas madre de cancer de mama in vivo, se compararon los efectos del agente citotoxico docetaxel con repertaxina sobre el compartimento de celulas madre de cancer y sobre el crecimiento tumoral en ratones NOD/SCID. Docetaxel es uno de los agentes quimioterapicos mas eficaces usados actualmente para tratar a mujeres con cancer de mama. Se evaluaron las poblaciones de celulas madre de cancer mediante el ensayo ALDEFLUOR y mediante trasplante en serie en ratones NOD/SCID. Utilizando estos ensayos se determinb que el tratamiento con quimioterapia solo dio como resultado ausencia de cambio o un aumento relativo en las poblaciones de celulas madre de cancer. En cambio, el tratamiento con repertaxina sola o con quimioterapia redujo significativamente la poblacion de celulas madre de cancer. A pesar de la reduccion significativa en las poblaciones que inician el tumor, el uso de repertaxina sola no dio como resultado una contraccion significativa del tumor. La combinacion de repertaxina mas quimioterapia dio como resultado una reduccion significativa en el tamano tumoral asi como en la poblacion de celulas madre de cancer. Combinando estos agentes para seleccionar como diana tanto celulas madre de cancer como poblaciones de celulas tumorales a granel se maximiza la eficacia de estos tratamientos.

Para dilucidar el mecanismo de accion de la repertaxina, se analizaron las rutas posteriores a partir de CXCR1. Se confirmo la interaccion entre CXCR1, FAK y AKT. El bloqueo de CXCR1 actua especificamente a traves de activacion de FAK y AKT. Los experimentos realizados durante el desarrollo de las realizaciones de la presente invencion indican que la activacion de AKT regula la autorrenovacion de celulas madre de mama normales y malignas a traves de fosforilacion de GSK3fi dando como resultado la activacion de la ruta de WNT (Korkaya et al. PLoS Biolog. 7:e1000121). Estos resultados indican por que celulas con desactivacion de PTEN son resistentes a repertaxina. Una funcion adicional de AKT es la regulacion de la supervivencia celular a travbs de fosforilacion del factor de transcription forkhead FOX03A. La fosforilacion por AKT de FOX03A da como resultado su secuestro citoplasmatico. En cambio, se demostro que el bloqueo de CXCR1 conduce a una activacion de AKT disminuida dando como resultado la translocation de FOX03A en el nucleo en donde induce a varios genes incluyendo ligando FAS (Jonsson et al. Nat. Med. 11:666-671). El ligando FAS inducido por medio del bloqueo de CXCR1 a su vez es responsable de los efectos de destruction inespecificos observados (vease la figura 30).

Ademas de su papel en la serialization de CXCR1, FAK media en las interacciones de celulas con componentes de la matriz extracelular a traves de receptores de integrina (Waugh et al. Clin. Cancer Res. 14:6735-6741). La senalizacion de FAK desempena un papel en la regulacion de la autorrenovacion de cblulas madre mamarias de raton normales y malignas en modelos transgenicos (Luo et al. Cancer Res, 69:466-474). La activacion de FAK tambien promueve la supervivencia celular bioqueando la apoptosis medida por RIP y FADD (Kurenova et al. Mol. Cell Biol. 24:4361-4371, Xu et al. J Biol. Chem. 275:30597-30604). Esto proporciona una explicacion para la resistencia de la poblacion de celulas madre de cancer a la apoptosis inducida por FAS/ligando FAS.

Se ha demostrado que las celulas madre de cancer de mama desempehan un papel importante en la invasion metastasis tumorales (Croker et al. J Cell Mol. Med. 2008, Charafe-Jauffret et al. Cancer Res. 69:1302-1313). Se muestra en el presente documento que IL-8 y CXCR1 tambien desempehan papeles importantes en estos procesos. Se analizaron los efectos del bloqueo de CXCR1 utilizando repertaxina sobre la formation de metastasis experimentales. Se demostro que el bloqueo de CXCR1 reduce el desarrollo de metastasis cuando se administra posteriormente a la inyeccibn intracardiaca de celulas de cancer de mama.

Estudios clinicos que utilizan repertaxina han demostrado una falta de toxicidad. Las estrategias dirigidas a interferir con bucles reguladores de citocinas tales como IL-8 y CXCR1 representan metodos para seleccionar como diana celulas madre de cancer de mama.

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Claims (6)

1. REIVINDICACIONES
2. 2.

   5
3. 3.
4. 4.

   10 5.
5. 6.

   15 7.

   20 8. 9.

   Antagonista de CXCR1 para su uso en un metodo para el tratamiento de un sujeto que tiene un tumor, en el que el metodo comprende ademas la administracion de un agente quimioterapico.

   Antagonista de CXCR1 para su uso segiin la reivindicacion 1, en el que dicho antagonista de CXCR1 es repertaxina o un derivado de repertaxina.

   Antagonista de CXCR1 para su uso segiin la reivindicacion 1, en el que dicho antagonista de CXCR1 comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo.

   Antagonista de CXCR1 para su uso segiin la reivindicacion 1, en el que dicho agente quimioterapico es un agente antimitotico.

   Antagonista de CXCR1 para su uso segiin la reivindicacion 4, en el que dicho agente antimitotico se selecciona del grupo que consiste en: docetaxel, doxorubicina, paclitaxel, fluorouracilo, vincristina, vinblastina, nocodazol, colchicina, podofilotoxina, esteganacina y combretastatina,

   Antagonista de CXCR1 para su uso segiin la reivindicacion 5, en el que dicho agente antimitotico es paclitaxel.

   Antagonista de CXCR1 para su uso segiin la reivindicacion 1, en el que dicho tumor comprende celulas madre de cancer seleccionadas del grupo que consiste en: celulas madre de cancer de prostata, celulas madre de cancer de ovarios, celulas madre de cancer de mama, celulas madre de cancer de pie!, celulas madre de cancer de pulmon de celulas no pequehas, celulas madre de cancer de pulmon de celulas pequenas y celulas madre de adenocarcinoma esofagico,

   Antagonista de CXCR1 para su uso segiin la reivindicacion 1, en el que dicho antagonista de CXCR1 es repertaxina y en el que dicho agente quimioterapico es paclitaxel.

   Antagonista de CXCR1 para su uso segiin la reivindicacion 8, en el que dicho tumor es un tumor de cancer de mama.

   25
6. 10.

   Antagonista de CXCR1 para su uso segiin la reivindicacion 9, en el que dicho tumor de cancer de mama comprende cdlulas madre de cancer de mama.