JP2000512126A - 体液中の腫瘍細胞を数量化するための方法およびかかる方法に適合した試験キット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 体液中の腫瘍細胞を数量化するための方法が開示されるが、この方法は、検討するべき試料に対して先ず最初にテロメラーゼのＲＮＡ成分がが特異的に増幅されるような反応を行うことおよび次いで増幅された核酸の量を定量的に測定することから成る。またこの方法に適した試験キットも開示される。

Description

【発明の詳細な説明】体液中の腫瘍細胞を数量化するための方法およびかかる方法に適合した試験キッ ト 本発明は、体液中の腫瘍細胞を数量化するための方法において、検討するべき試 料に対して先ず最初にテロメラーゼのＲＮＡ成分が特異的に増幅されるような反 応を行い、次いで増幅された核酸の量を定量的に測定する前記方法およびかかる 方法のために適合した試験キットに関する。 実質的に全ての固形の悪性腫瘍は、転移巣を形成する潜在的能力を有する。かか る転移プロセスは、通常は血液またはリンパを介してミクロ転移巣としての悪性 細胞が遠隔した器官にまで広がり、次いで自律した二次腫瘍が発生・生成するこ とを含んでなる。転移の程度が、腫瘍症の予後判断を決定する。 腫瘍予防またはアフタケアの必要要件とは、一次腫瘍、再発または転移を早期に 、而も転移巣が臨床上明白とならないうちに診断することである。このような目 的は、現行の利用可能な機器による手法では十分に対処することは出来ない；特 に、循環する腫瘍細胞と器官内における転移巣の初期形成との間において診断上 灰色の領域が存在するのである。例えば腫瘍アフタケアを受けている患者の末梢 血液中における循環悪性細胞について早期診断できれば、恐らく治療上有効であ ろう免疫修飾治療または多剤化学療法を早期に、即ち器官転移が明白とならない うちに適用することが可能となるであろう。治療の前後において末梢血液中の転 移巣を数量化することは、このような症例において重要な管理法の一つとなるも のである。 ＢＧ ２２６０８１１は、例えばある特定の体組織の健常細胞−なお、当該健常 細胞がかかる特定の体組織に特異的な遺伝子産物を少なくとも一種形成している −に関連性を有する悪性細胞を検出するための診断方法を提案している。この検 出方法においては、例えば血液−通常は健康な人には認められない当該細胞を含 む−を患者から採取し、当該特異的遺伝子産物のｍＲＮＡを増幅して、検出する のである。例示してあるのは、末梢血液中のメラノーマ細胞を検出するためのチ ロシナーゼである。しかしながら、この方法の欠点は、方法自体が組織特異的遺 伝子産物に関連するものであり、メラノーマ細胞の数量化を行うことは出来ず、 更には間違って陽性の試験結果を生じることである。 Ｋｉｍらは、腫瘍組織中におけるテロメラーゼ活性を測定することが可能である 検定方法の結果について記載している［Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９４）、Ｓ ｃｉｅｎｃｅ ２６６：２０１１］。かかるテロメラーゼ活性は、ガン細胞培養 物については１００個のうちの９８個においてまた悪性腫瘍細胞については１０ １個のうち９０個において１０４個の健常細胞当りほぼ１個の不死化細胞なる感 度で検出されているが、これは、生殖組織において検出されているのであって、 ２２個の体細胞培養物においては検出されていないのである。 テロメラーゼは、逆転写酵素活性を有する最近新たに報告されたリボ核蛋白［Ｓ ｈｉｐｐｅｎ−Ｌｅｎｔｚ ｅｔ ａｌ．（１９９０），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４ ７：５４６〕であり、この蛋白質は、染色体の端部において新しいテロメア（末 端小粒）ＤＮＡが合成される経路である独立したＤＮＡ合成のための鋳型として 一つの完全なＲＮＡ配列を利用するのである［Ｇｒｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（ １９８９）、Ｎａｔｕｒｅ ３３７：３３１］。テロメアは、長さが５−１５キ ロ塩基対（ｋｂ）／細胞ゲノムである縦列配列内において（ＴＴＡＧＧＧ）ｎが 高度に保存されて成り、核膜上において染色体を安定化させる機能を有し、コー ドゲノムＤＮＡが制御されずに組み換えや分解を受けないよう保護するのである ［Ｍｅｈｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９９４）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５４：２３ ６］。染色体端部短縮とテロメラーゼによるテロメア配列のデノーボ合成との間 の動的平衡が、下等な真核生物においては仮定されているが、一方では健常なト 体細胞は、テロメラーゼ活性が低いかまたは検知不可能である。更には、活発に 分裂する細胞の培養物は何れも検知可能なテロメラーゼ活性を示さないため、テ ロメラーゼは、その他のＤＮＡ酵素とは違って成長制御されることがないのであ る。生殖細胞と殆ど全ての腫瘍細胞系［Ｏｈｙａｓｈｉｋｉ ｅｔ ａｌ．（１ ９９４）．Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅｔ Ｃｙｔｏｇｅｎｔ ７８：６４；Ｒｏｇ ａｌｌａ ｅｔ ａｌ．（１９９４）．Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅｔ Ｃｙｔｏｇ ｅｎｔ ７７：１９；Ｓｃｈｗａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．（１９９５）．Ｃａｎｃ ｅｒ ７５：１０９４］および腫瘍組織（肺、［Ｈｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ．（ １９９５）．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １０：９３７；Ｓｈｉｒｏｔａｎｉ ｅ ｔ ａｌ．（１９９４）．Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ １１：２９］，腎臓［Ｍｅ ｈｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９９４）．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ５４：２３６］、卵 巣［Ｃｈａｄｅｎｅａｕ ｅｔ ａｌ．（１９９５）．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５５：２５３３］および血液［Ｃｏｕｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９５）．Ｂ ｌｏｏｄ ８５：２３１５］）に限って、測定可能なテロメラーゼ活性を示しま たそのテロメアの長さは無限の細胞分裂の過程を通じて一定に保持されるのであ る。従って、このことに関連してテロメアの長さが安定化することによってテロ メラーゼが活性化することは、体細胞の不死化を方向ずけるうえで決定的に重要 な段階であるものと見なしてよい。 Ｆｅｎｇらは、第３染色体の遠位部（ｑ）においてコードされているヒトテロメ ラーゼ（ｈＴＲ）の全ＲＮＡ配列をクローンすることが出来た。この著者らは、 競争的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、健常な体細胞と比較して腫瘍 組織および生殖組織においてテロメラーゼ発現が有意に増大することを証明する ことが出来たのである［Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９５）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：１２３６］。このｈＴＲのアンチセンス構築物は、トランスフェクトし たＨｅＬａ細胞において細胞死（アポトーシス）を引き起こした。このようなデ ータから、体細胞においてはテロメラーゼが厳格に抑制されることおよび悪性増 殖が不死細胞の存在とテロメラーゼの活性化に依存している事実とが証明される のである。 本発明の目的は従って、体液中において腫瘍細胞を定量的に測定することを可能 ならしめる方法を開発することであった。 本発明は従って、体液中の腫瘍細胞を数量化するための方法において、先ず最初 に検討するべき試料に対してテロメラーゼのＲＮＡ成分が特異的に増幅されるよ うな反応を行い、次いで増幅された核酸の量を定量的に測定する前記方法および かかる方法のために適合した試験キットに関する。体液とは、本発明の目的のた めには例えば血液、尿もしくは糞便、身体空腔部からの潯出液または濾出液、特 に末梢血液を意味する。 末梢血液は、例えば動脈、静脈または指先を穿孔することによって被験者から採 取し、次いで例えば尿素または好ましくはイソチオシアン酸グアニジウム塩を含 んで成るＲＮＡ溶解緩衝液に移し、存在するあらゆるリボヌクレアーゼを変性せ しめまた当該細胞から核酸を遊離放出させるのである［例えば、Ｃｈｏｍｃｚｙ ｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２、１５ ６を参照のこと］。かかる核酸は、例えばあらゆる核酸が結合可能であるシリカ 粒子を用いてＲＮＡ溶解緩衝液の塩濃度の高い媒体から単離することができる［ Ｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２ ９、４９５］。次にこの粒子を適当な緩衝液で数回洗浄し、結合している核酸を 溶出する。適当な緩衝液に溶かしたリボヌクレアーゼを含まないデオキシリボヌ クレアーゼを用いて試料中に存在するゲノムＤＮＡを全て加水分解し、誤った増 幅信号に起因した間違った陽性の試験結果または過剰なバックグラウンドノイズ が一切生じないようにすることが、その後において有利となる。その理由は、そ の後に行うテロメラーゼのＲＮＡ成分の増幅においてもＤＮＡが存在する可能性 があるからである。通常はこれに引き続いて、例えばフェノール抽出および／ま たは加熱変性によるデオキシリボヌクレアーゼの不活性化・失活を行う。また試 料をデオキシリボヌクレアーゼにより処理する前にまたは好ましくはその後で、 例えばイオン交換クロマトグラフィーなど好ましくはシリカゲルを用いたクロマ トグラフィー法によって試料中に存在するＲＮＡを更に精製することが可能であ りかつまた有利である。 次いで干渉する可能性があるゲノムＤＮＡが当該試料になお存在しているか否か を調べるために、以下において説明するテロメラーゼ特異的オリゴヌクレオチド による増幅反応を実施することが出来るのであるが、この場合試料中に存在する ＲＮＡは、予め逆転写反応によってｃＤＮＡには転写されることはない。当該試 料がテロメラーゼ特異的ＤＮＡを含まない場合にのみ、増幅は一切生起すること がなく、その結果増幅されたＤＮＡは全く測定することが出来なくなる。 これに引き続いて試料中に存在するＲＮＡのｃＤＮＡへの転写が行われるのであ るが、通常は例えばＡＭＶ逆転写酵素を用いた逆転写反応を介して行われる。こ の方法は、汎く知られており、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｙ、１９８９に記載されている。かかる逆転写の一つの好ましい実施態様にお いては、ＷＯ ９０／０７６４１において記載されている熱安定性のよいＲＮＡ 依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用することも可能である。かかる逆転写酵素に対 して適したオリゴヌクレオチドプライマーは、例えば有利には以下に記載するオ リゴヌクレオチドまたは特定の長さのランダムプライマーである。 次の増幅は、例えばＤＮＡポリメラーゼを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ ）によって（例えばアメリカ特許第４、６８３、１９５号；４、６８３、２０２ 号；４、９６５、１８８号を参照のこと）または好ましくはＲＮＡポリメラーゼ を用いて例えば定温核酸配列による増幅（ＮＡＳＢＡ）によって実施することが できる。増幅するべき核酸から由来する特異的オリゴヌクレオチドプライマーは 、いずれの場合においても増幅に必要である。本発明においては、かかるオリゴ ヌクレオチドプライマーを合成するテロメラーゼのＲＮＡ成分のうちの如何なる 区分をも使用することが可能である。かかるオリゴヌクレオチドプライマーは長 さが、好ましくはほぼ２０ないし３０個、更に好ましくはほぼ２０ないし２５個 のヌクレオチドである。かかる増幅産生物は長さが通常は、ほぼ１００ないしほ ぼ２０００個の塩基、好ましくはほぼ２００ないしほぼ１５００個の塩基、特に ほぼ３００ないしほぼ３５０個の塩基である。下記するオリゴヌクレオチドプラ イマーは、図１に示す配列から誘導されたものであり、かかる新規の方法に特に 好ましい： ５’ＧＡＣＴＣＧＧＣＴＣ ＡＣＡＣＡＴＧＣＡＧ ＴＴＣＧＣ ３’（ＴＭ １）、および／または ５’ ＣＴＧＧＴＣＧＡＧＡ ＴＣＴＡＣＣＴＴＧＧ ＧＡＧＡＡＧＣ ３’ （ＴＭ２）、 なお上式において、ＴＭ１および／またはＴＭ２は、適切であれば更にＲＮＡポ リメラーゼのためのプロモーター配列を包含していてもよい。このオリゴヌクレ オチドプライマーＴＭ１は、５’プライマーに相当し、またＴＭ２は３’プライ マーに相当する。この増幅産生物は長さが、３２７塩基対（ｂｐ）である。この ようなプライマーは、例えばトリエステル法［Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ ．、（１９８１）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１０３、３１８５−３１９ １］を用いて合成的手法にて調製してもよい。使用することができるＤＮＡポリ メラーゼとしては、例えばＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラー ゼ、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼＩまたはＥ．ｃｏｌｉのＫｌｅｎｏｗフラグメン トなどの非熱安定性のＤＮＡポリメラーゼまたは例えばＴａｑポリメラーゼなど の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる（アメリカ特許第４、８８９、８１ ８号を参照のこと）。 ＰＣＲの一般的原理は、ＤＮＡの熱変性を行うことおよび数回繰り返す反応サイ クルにおいてＤＮＡポリメラーゼを用い単一鎖の方向を逆にして適当なオリゴヌ クレオチドプライマーの存在下で二重鎖の復元・回復を行うことから成る。次い で下記するいくつかの方法のうちの一つの方法によって数量化することが出来る だけの十分なＤＮＡを形成させるまでこのサイクルを繰り返すのである。通常は 、ほぼ２０ないしほぼ４０回のサイクル、好ましくはほぼ３０ないしほぼ３５回 のサイクルで十分である。 ＮＡＳＢＡ方法（３ＳＲシステムとも称される）においては、ＲＮＡポリメラー ゼ、好ましくはＴ７ＲＮＡポリメラーゼのプライマーを含んで成る少なくとも一 種のオリゴヌクレオチドプリマー、好ましくはＴＭ２を使用するのである［例え ば、Ｇｕａｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７、１８７４−１８７８またはＫｉｅｖｉｔｓ ｅｔａ ｌ．（１９９１）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、３５、２７３−２８６を 参照のこと］。先ず第一に、すでに上記にて詳述したように、上記したオリゴヌ クレオチドプライマーの一種と逆転写酵素の一種、好ましくはＡＭＶ逆転写酵素 とを用いて当該ＲＮＡをｃＤＮＡに転写するのである。この反応生成物は、ＲＮ Ａ：ＤＮＡ二重鎖であり、そのＲＮＡ成分を次いでリボヌクレアーゼ、好ましく はリボヌクレアーゼＨによって分解し、ＤＮＡ単一鎖を生成させるのである。上 記したオリゴヌクレオチドプライマーの一種を用いて、このＤＮＡ単一鎖をＤＮ Ａポリメラーゼを用いてＤＮＡ二重鎖にまで構築する。ＡＭＶ逆転写酵素は、単 にＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するばかりりでなくまたＤＮＡ依存 性ＤＮＡポリメラーゼ活性をも有するので、やはり適当でかつ好ましいＤＮＡポ リメラーゼである。この反応生成物は、例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼのた めのプロモーターを含んで成るＤＮＡ二重鎖である。このＲＮＡポリメラーゼに よって、再び”アンチセンス”ＲＮＡ鎖を合成するのであって、前記サイクルを 再度開始する。通常は、ほぼ２０ないしほぼ４０回のサイクル、好ましくはほぼ ３０ないし３５回のサイクルが、引き続いて数量化を行うに充分なだけの増幅産 生物を生成させるのには十分である。 この増幅産生物は、例えば臭化エチジウムで染色し、次いで例えばアガロースま たはポリアクリルアミドゲル中において検出しかつ数量化することによって数量 化することができる。しかしながら、この増幅産生物を既に増幅過程において標 識化することは、感度を一層高くするので、有利である。適当な標識物質の例と しては、放射性標識物質、ビオチン標識物質、蛍光標識物質または電気化学的発 光（ＥＣＬ）標識物質が挙げられる。これらの標識物質は、原則としてＤＮＡま たはＲＮＡポリメラーゼによる増幅を行うための出発物質としてのヌクレオチド が担持するのである。このような放射性標識化された増幅産生物（例えば、ＰＣ ＲまたはＮＡＳＢＡ生成物）は、その放射能を測定することによって検出するこ とが出来るし、またビオチン標識化した増幅産生物は、アビジンまたはストレプ トアビジンを担持する染料を介して検出することが出来るし、また蛍光物質標識 化した増幅産生物は、蛍光量計によって検出することが出来るし、また電気化学 発光物質で標識化した増幅産生物は、ＥＣＬ検出装置で検出することが出来る。 しかしながら、最も好ましい検出方法は、当該増幅産生物に相補的である、予め 標識化しておいたオリゴヌクレオチドを用いて行うインビトロハイブリダイゼー ションである。このオリゴヌクレオチドは、通常は上記した標識物質を担持して おり、またＮＡＳＢＡ増幅方法に関連していえば、かかるハイブリダイゼーショ ンプローブは、電気化学発光標識物質、好ましくはトリス［２、２−ビピリジン ］ルテニウム［ＩＩ］錯体標識物質を担持している［例えば、ｖａｎ Ｇｅｍｅ ｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、４９、１５ ７−１６８を参照すること］。 このような増幅産生物を正確かつ高感度で数量化することは有利には、一つまた はそれ以上の既知の核酸（標準核酸）の既定量を同時に数量化することによって 行うことが出来る［例えば、ｖａｎ Ｇｅｍｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）、 Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、４３、１７７−１８８を参照すること］。こ の場合、同時に数量化する標準核酸の一種または複数種を異なるものの正確に既 知である量だけ、例えば系列希釈法の形で既知量の検討対象とする試料に添加し 、この試料の増幅産生物と一種またはそれ以上の同時に数量化する標準核酸とを 別個の独立した混合物として定量的に測定するのである。かくして測定した結果 を比較することによって、試料中に含まれ、測定するべきテロメラーゼのＲＮＡ 成分の量が求められる。 検討するべき試料と同一のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて同時に増幅す る標準核酸の一種または複数種を増幅することが有利であり、得られる増幅産生 物も実質的に長さが同一である。この同時に増幅する核酸の配列が、オリゴヌク レオチドプライマーの結合部位−これらは任意であるものの既知である配列を有 する−相互間にあるほぼ２０の核酸を除いて、測定するべき試料の増幅産生物の それと同一であるとすることが特に好ましい。この場合、試料中に含まれる測定 するべき増幅産生物を、例えば適切に相補的である標識化オリゴヌクレオチドを 用いてＳａｍｂｒｏｏｋら（上記を参照）によって詳細に記載されているハイブ リダイゼーションによって同時増幅産生物とから相互に独立して数量化すること が可能である。いくつかの、好ましくは三種の異なる同時増幅核酸を異なる濃度 で試料に添加すると、そうでない場合と比較して実施するべき個別の増幅反応の 回数を減少させることが可能となるので特に有利である［ｖａｎ Ｇｅｍｅｎｅ ｔ ａｌ．（１９９４）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、４９、１５７−１ ６８を参照すること］。また、このような同時増幅核酸を上記したＲＮＡ溶解緩 衝液に添加することは、これによって試料の後処理において起こり得る核酸減失 の影響を排除することが可能となるため、特に好ましい。 本発明における適当でかつ有利な同時増幅標準核酸は、増幅するべき試料のＤＮ ＡまたはｃＤＮＡを含んで成りかつ例えばほぼ１０ないしほぼ３０個、好ましく はほぼ２０個のヌクレオチドの配列についてそれぞれの場合に任意交換を行って ある構築物から、例えばＳｐ６またはＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビト ロ転写によって調製されるＲＮＡの単一鎖配列である。 このような構築物は、増幅するべき利用のＤＮＡまたはｃＤＮＡを既にクローン してある”多重クローニング部位”の間においてＳｐ６またはＴ７ＲＮＡポリメ ラーゼのための結合部位を有する転写ベクターから構成される。かくしてクロー ンされた配列は、制限エンドヌクレアーゼ、好ましくは二種の異なる制限エンド ヌクレアーゼを用いた選択的加水分解によって開放することが出来るのであって 、既定の長さのフラグメントを切り出して、例えばＴ４リガーゼを用いて同じ長 さのフラグメントで置換することが出来る。このクローンしたフラグメントは、 例えばほぼ１０ないし３０個、好ましくはほぼ２０この核酸であるような長さの 配列の置換物を含んで成っていてもよく、好ましくはオリゴヌクレオチドプライ マー結合部位の間に位置するものである。この手法は、他の核酸配列を同一部位 に挿入するために繰り返すことが出来る。適当な切断部位が、例えばベクターも 切断されるために見出せない場合は、人工的な切断部位を創出することが必要で ある。このことは、例えばその実質がＨｉｇｕｃｈｉら［Ｈｉｇｕｃｈｉ、Ｒ． （１９８８）．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１６：７３５１−７３６７ ；Ｈｉｇｕｃｈｉ、Ｒ．（１９９０）．Ｍ．Ｉｎｎｉｓ Ａ．ｅｔ ａｌ．ｅｄ ｓ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｂｅｒｋｌｅｙ、Ｂｏｓｔｏｎ、 Ｌｏｎｄｏｎ、Ｓｙｄｎｅｙ、Ｔｏｋｙｏ、Ｔｏｒｏｎｔｏ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．１７７−１８３］によってまた本発明の実験の部において 記載されている組み換えＰＣＲによって行うことがで出来る。本発明の目的のた めに好ましく使用されるのは、下記である構築物のインビトロ転写されたＲＮＡ 単一鎖配列である：即ち、 ａ）ヒトテロメラーゼのＲＮＡ成分の全ｃＤＮＡを含んで成り、また ｂ）その内部にほぼ２０個のヌクレオチドの配列の任意交換体が既に導入されて いる。 この構築物は、以下の構築物から誘導される：即ち、 図５ａおよび図５ｂに図示してあるｐＧＥＭ−ｈＴＲと 図６ａおよび図６ｂに図示してあるｐＧＥＭ−ｈＴＲ（ｋａ）。 それぞれ長さが９７５塩基対でありかつ下記する配列を有する標準ＲＮＡ核酸を 調製することは、これらの構築物をＳｐ６ＲＮＡポリメラーゼでインビトロ転写 することによって可能である： 図７に図示してある（ｈＴＲＫａ） 図８に図示してある（ｈＴＲＫｂ） 図９に図示してある（ｈＴＲＫｃ） 標準核酸が野生型ＲＮＡとは異なる任意配列は、この実施例においては図５ａに おいて図示してある位置５９１−６１０に位置するが、その長さは２０塩基対で ある。 標準核酸は相互に異なりまたこの実施例では２０塩基対の長さの任意で既知の配 列だけ野生型配列とは異なるので、かかる標準核酸と野生型配列の増幅産生物は 、四種の別々の混合物において標識化オリゴヌクレオチドを相補的に結合するこ とによって検出することが出来る。テロメラーゼ（ｗｔ）のＲＮＡ成分の増幅さ れたｃＤＮＡと本発明に従った標準核酸（ｈＴＲＫａ）、（ｈＴＲＫｂ）および （ｈＴＲＫｃ）の特異的な検出を行うために特に適しているオリゴヌクレオチド は、図７−９において図示してある配列から誘導せしめた下記する配列である： ５’ＣＧＡＣＴＴＴＧＧＡ ＧＧＴＧＣＣＴＴＣＡ ３’ Ｏ（ｗｔ） ５’ＡＡＧＴＣＧＧＡＴＣ ＣＡＣＴＴＡＧＧＴＣ ３’ Ｏ（Ｋａ） ５’ＣＧＣＴＣＧＡＴＴＴ ＧＧＣＧＡＣＧＧＧＡ ３’ Ｏ（Ｋｂ） ５’ＧＡＧＡＧＴＡＴＡＧ ＣＧＡＴＴＧＧＡＣＧ ３’ Ｏ（Ｋｃ） これらに相当する逆相補配列を、増幅した”アンチセンス”ＲＮＡを検出するた めに使用する。 この後に、野生型および標準核酸のそれぞれの増幅された量を測定する。野生型 配列の当初未知の量は、当初量が既知である場合について得られた標準核酸の異 なる増幅量と比較することによって計算することが出来る（例えば、ｈＴＲＫａ ：１０²分子、ｈＴＲＫｂ：１０⁴分子かつｈＴＲＫｃ：１０⁶分子）。次いで、 このことから採取した体液について転移巣の数を決定することが可能である。こ の方法および検討するべき試料についての正の内部参照標準として、通常常に体 液中に存在する一種の核酸を増幅し、これを検出することも可能である。適当な 核酸の例としては、常に体液の細胞中に存在するβ−グロブリンまたはグリセル アルデヒド−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）（例えば、ＧＢ ２２６０ ８１１を参照のこと）をコードするｍＲＮＡが挙げられる。ヒトβ−グロブリ ンｍＲＮＡについて適当なオリゴヌクレオチドプライマーは、例えば下記する配 列を有するプライマーである：即ち、 ５’ＡＣＣＣＡＧＡＧＧＴ ＴＣＴＴＴＧＡＧＴＣ ３’および ５’ＴＣＴＧＡＴＡＧＧＣ ＡＧＣＣＴＧＣＡＣＴ ３’であるが、ここにおい て、かかるオリゴヌクレオチドプライマーは、適切な場合は更にＲＮＡポリメラ ーゼのプロモーター配列を含んで成っていてもよい。 非腫瘍細胞にも含まれている可能性があるテロメラーゼ活性によって惹起される 間違った正の試験結果、即ち所謂バックグラウンドノイズを防止するかまたは低 減させるために、新たな検討を行う前に採取しておいた体液を精製することが有 利である。このような意図は特に、検討するべき試料中の幹細胞および／または 活性化された免疫細胞を除去すること、即ち腫瘍細胞を濃縮することである。原 則としてこれらの個々の細胞は表面マ一カーを有しているため、このような細胞 の免疫吸収による除去または濃縮が、特に有利である。適当な方法の例としては 、磁気（ＭＡＣＳ）または蛍光活性化（ＦＡＣＳ）細胞選別法［例えば、Ｇｏｅ ｔｔｌｉｎｇｅｒ ＆ Ｒａｄｂｒｕｃｈ（１９９３）ｍｔａ、８、５３０−５ ３６、Ｎｏ．５を参照のこと］が挙げられる。即ち、例えば造血幹細胞を、その ＣＤ３４表面マーカーを介してＭＡＣＳによって血液試料から除去することが出 来る［Ｋａｔｏ ＆ Ｒａｄｂｒｕｃｈ（１９９３）Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、１４ 、３８４−３９２］。Ｂ細胞は、例えばそのＣＤ１０、ＣＤ１９および／または ＣＤ２０表面マーカーを介して除去することが出来るし、またＴ細胞は、ＣＤ４ ５ＲＡおよび／またはＣＤ７を介して除去することができる。腫瘍細胞は、その 特異的腫瘍マーカー、例えばＣＥＡを介して濃縮することができる。ＭＡＣＳま たはＦＡＣＳ以外に、該当する関連細胞の除去または濃縮に特に適しているのは 、特に市販の磁気ビーズ（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ４５０、Ｄｙｎａｌ Ｃｏｒｐ．）に結合している特異的表面マーカーの抗体である。上記した方法 を単独でまたは組合せて静脈血から得たテロメラーゼのＲＮＡ成分量を動脈血か ら得たテロメラーゼのＲＮＡ成分量に比較することも、また特に有利である。そ の理由は、腫瘍細胞数測定のためには動脈血試料での細胞の１００％と較べて、 静脈血試料での僅かにほぼ２０％の細胞のみを検出することが可能であ るからである［Ｋｏｏｐ、Ｓ．ｅｔ ａｌ.（１９９５）ＣａｎｃｅｒＲｅｓ． ５５、２５２０−２５２３］。指の先端部から採血した血液を静脈血または動脈 血と比較することも、適している。 試料中のテロメラーゼのＲＮＡ性分量を定量することによって、腫瘍細胞、特に 悪性腫瘍の転移巣、具体的にはその微小転移巣が体液中に存在するか否かとまた その量を決定することが可能となる。このことは、特に悪性腫瘍からの転移巣を 早期に臨床診断するためにまた腫瘍治療を監視するために極めて有用である。本 発明によって検出することができる腫瘍細胞は、悪性腫瘍からの転移巣、好まし くは微小転移巣に由来する腫瘍細胞であり、特に転移性の腫瘍および／または新 生物に由来する細胞であって、例えばＴ細胞リンパ芽細胞腫、Ｔ細胞白血病細胞 、慢性骨髄性白血病、急性リンパ球性白血病細胞、慢性リンパ球性白血病細胞、 奇形腫、黒色腫、肺癌、大腸癌、乳癌、肝細胞癌、腎臓腫瘍、副腎腫瘍、前立腺 癌、神経芽腫、脳腫瘍、小細胞肺癌、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫および／またはリ ンパ腫から誘導される前記細胞である。 本発明は更には、下記する配列を有するオリゴヌクレオチドに係る：即ち、 ５’ＧＡＣＴＣＧＧＣＴＣ ＡＣＡＣＡＴＧＣＡＧ ＴＴＣＧＣ ３’（ＴＭ１ ）、 ５’ＣＴＧＧＴＣＧＡＧＡ ＴＣＴＡＣＣＴＴＧＧ ＧＡＧＡＡＧＣ ３’（Ｔ Ｍ２）、 ５’ＡＴＡＡＧＡＡＴＧＣ ＧＧＣＣＧＣＧＧＧＴ ＴＧＣＧＧＡＧＧＧＴ Ｇ ＧＧＣＣＴＧＧＧＡ ＧＧＧ ３’（ＴＭＫ１）、 ５’ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧ ＴＧＧＧＧＧＴＴＡＴ ＡＴＣＣＴＡ ３’（ＴＭ Ｋ２）、 ５’ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡ ＣＴＴＡＧＧＴＣＡＴ ＣＧＡＴＣＴＧＣＣＡ Ａ ＴＴＴＧＣＡＧＣＡ ＣＡＣＴ ３’（ＴＭＫ３）、および／または ５’ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧ ＡＣＴＴＧＧＴＡＣＣ ＡＴＧＡＡＴＧＧＧ Ｃ ＡＧＴＧＡＧＣＣＧＧ ３’（ＴＭＫ４）であるが、ここにおいてＴＭ１お よび／またはＴＭ２は、適切ならば更にはＲＮＡポリメラーゼに対するプロモー ター配列を含んで成る； また下記する配列を有するオリゴヌクレオチドに係る： ５’ＣＣＡＴＣＧＡＴＴＣ ＣＣＧＴＣＧＣＣＡＡ ＡＴＣＧＡＧＣＧＧＧ Ｔ ＡＣＣＣＣ ３’（Ｋｂ） ３’ ＧＧＴＡＧＣＴＡＡＧ ＧＧＣＡＧＣＧＧＴＴ ＴＡＧＣＴＣＧＣＣＣＡ ＴＧＧＧＧ ５’、又は ５’ＣＣＡＴＣＧＡＴＣＧ ＴＣＣＡＡＴＣＧＣＴ ＡＴＡＣＴＣＴＣＧＧ Ｔ ＡＣＣＣＣ ３’（Ｋｃ） ３’ＧＧＴＡＧＣＴＡＧＣ ＡＧＧＴＴＡＧＣＧＡ ＴＡＴＧＡＧＡＧＣＣ Ａ ＴＧＧＧＧ ５’； また図５ａおよび図５ｂに図示する核酸構築物ｐＧＥＭ−ｈＴＲまたは図６ａお よび図６ｂに図示する核酸構築物ｐＧＥＭ−ｈＴＲ（Ｋａ）に係る； また下記配列を同時増幅するための標準ＲＮＡ核酸に係る： 図７に図示する（ｈＴＲＫａ） 図８に図示する（ｈＴＲＫｂ） 図９に図示する（ｈＴＲＫｃ）およびこれらのｃＤＮＡ、 及び野生型核酸の増幅ｃＤＮＡおよび下記する配列を有する標準核酸ｈＴＲＫａ 、ｈＴＲＫｂおよびｈＴＲＫｃの増幅ｃＤＮＡを検出するためのオリゴヌクレオ チドに係る： ５’ＣＧＡＣＴＴＴＧＧＡ ＧＧＴＧＣＣＴＴＣＡ ３’ Ｏ（ｗｔ） ５’ＡＡＧＴＣＧＧＡＴＣ ＣＡＣＴＴＡＧＧＴＣ ３’ Ｏ（Ｋａ） ５’ＣＧＣＴＣＧＡＴＴＴ ＧＧＣＧＡＣＧＧＧＡ ３’ Ｏ（Ｋｂ） ５’ＧＡＧＡＧＴＡＴＡＧ ＣＧＡＴＴＧＧＡＣＧ ３’ Ｏ（Ｋｃ） ならびに増幅した”アンチセンス”ＲＮＡを検出するためのオリゴヌクレオチド の相当する逆相補的配列に係る。 本発明は更には、例えば血液、尿または糞便、体腔からの滲出物または濾出物、 特に血液などの体液中の腫瘍細胞を数量化するためのキットであって、 （ａ）同時増幅するための単一または複数の核酸、および （ｂ）テロメラーゼをコードする核酸と（ａ）において特定した単一または複数 の核酸を特異的に増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマー対−なおここに おいて、（ａ）において記載した同時増幅するための標準ＲＮＡ核酸が下記する 配列を有するものである： 図７において図示した（ｈＴＲＫａ） 図８において図示した（ｈＴＲＫｂ） 図９において図示した（ｈＴＲＫｃ）− および／または好ましくは下記する配列を有する当該オリゴヌクレオチドプライ マー対： ５’ＧＡＣＴＧＧＣＴＣ ＡＣＡＣＡＴＧＣＡＧ ＴＴＣＧＣ ３’（ＴＭ１） および／または ５’ＣＴＧＧＴＣＧＡＧＡ ＴＣＴＡＣＣＴＴＧＧ ＧＡＧＡＡＧＣ ３’（Ｔ Ｍ２）−なおここにおいて、ＴＭ１および／またはＴＭ２は、適節な場合は更に はＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配列を含んで成る−とから構成され て成る前記キットに係る。 この新規なキットはまた、上記にて詳述したものに加えて野生型配列の増幅ｃＤ ＮＡを特異的に検出するためのハイブリダイゼーションプローブとしての一種の 標識化オリゴヌクレオチドおよび／または標準核酸の単一または複数の増幅ｃＤ ＮＡを特異的に検出するためのハイブリダイゼーションプローブとしての幾つか の標識化オリゴヌクレオチドを含んで成る。更には、ＰＣＲ増幅のための新規の キットは、更に追加して上記にて詳述した酵素、適切な場合は標識化したヌクレ オチドおよび／または適当な緩衝液−例えば逆転写酵素、好ましくはＡＭＶ逆転 写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、好ましくはＴａｑポリメラーゼおよび／またはデ オキシリボヌクレアーゼーおよび／または上記にて詳述した幹細胞および／また は活性化された免疫細胞を除去するためおよび／または腫瘍細胞を濃縮するため に適した手段を含んで成っていてもよい。 ＮＡＳＢＡのための別の新規なキットもまた、上記にて詳述した標準核酸以外に 、野生型配列の増幅された”アンチセンス”ＲＮＡを特異的に検出するためのハ イブリダイゼーションプローブとしての一種の標識化オリゴヌクレオチドおよび ／または標準核酸の一種または複数の増幅された”アンチセンス”ＲＮＡを特異 的に検出するためのハイブリダイゼーションプローブとしての幾つかの標識化オ リゴヌクレオチドを含んで成っていてもよい。このキットは更には、上記にて詳 述した酵素、適切な場合は標識化したヌクレオチドおよび／または適当な緩衝液 −例えば逆転写酵素、ＲＮＡポリメラーゼ、好ましくはＴ７ＲＮＡポリメラーゼ 、リボヌクレアーゼＨおよび／またはデオキシリボヌクレアーゼ−および適切な 場合は上記にて詳述した幹細胞および／または活性化された免疫細胞を除去する ためおよび／または腫瘍細胞を濃縮するために適した手段を含んで成っていても よい。 下記する実施例および図は、本発明を詳細に説明記載することを意図したもので あって、本発明をこれらに限定するものではない。図面の説明 図１は、ヒトテロメラーゼのＲＮＡ成分と下記の設計したオリゴヌクレオチドプ ライマーの位置を示す：即ち、３２７塩基対（ｂｐ）の増幅産生物を有する５’ プライマーＴＭ１（位置４２８−４５２）と３’プライマーＴＭ２（位置７２８ −７５４）または９８１ｂｐの増幅産生物を有する５’プライマーＴＭＫ１（［ １６ｂｐ］＋１−２７）と３’プライマーＴＭＫ２（位置９４０−９６２＋［３ ｂｐ］）。制限エンドヌクレアーゼＮｏｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによる加水分 解によって、９６２ｂｐのフラグメントｈＴＲが得られる。 図２は、いくつかの腫瘍細胞系のｃＤＮＡにおけるＰＣＲ増幅の一例を示す。バ ンド１：ＭＴ４、Ｔ−細胞リンパ芽球腫細胞系、バンド２：Ｃ８１６６、Ｔ−細 胞白血病細胞系、バンド３：Ｋ５６２、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞系、バ ンド４：Ｍｏｌｔ４、急性リンパ球白血病（ＡＬＬ）細胞系およびバンド５：奇 形癌細胞系；Ｍ：１００ｂｐマーカー。ｈＴＲ：ＴＭ１およびＴＭ２プライマー によるＲＴ−ＰＣＲ；ｈＴＲ／φＲＴ：逆転写（ＲＴ）反応を用いないコントロ ールＰＣＲ、ＧＡＰＤＨ：グリセルアルデヒド−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡ ＰＤＨ）にプライマーを用いたコントロールＰＣＲ。 図３は、腫瘍組織と健康な参照組織から得たｃＤＮＡでのＴＭ１およびＴＭ２プ ライマーによるＰＣＲ増幅を示す。Ｍ：１００ｂｐマーカー；バンド１：腎臓癌 、バンド２：健康な腎臓組織；バンド３：甲状腺癌、バンド４：健康な甲状腺組 織、バンド５：乳癌、バンド６：健康な乳房組織：バンド７：結腸癌、バンド８ ：健康な大腸組織；バンド９：Ｈ₂Ｏコントロール反応。図４は、健常な被験者 および白血病患者から得たｃＤＮＡでのＴＭ１およびＴＭ２プライマーによるＰ ＣＲ増幅を示す。 Ｍ：１００ｂｐマーカー；バンド１−３：健康な血液提供者；バンド４−８：急 性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者；バンド９：：Ｈ２Ｏコントロール反応。 図５ａおよび図５ｂは、ヒトテロメラーゼＲＮＡ成分のｃＤＮＡ（塩基１−９５ ６：位置１２−９７５）を含んで成る、転写ベクターｐＧＥＭ−１３Ｚｆ（＋） および図１に示したｈＴＲ（ＮｏｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ）による構築物ｐＧＥＭ −ｈＴＲ（４１１８ｂｐ）を示す。このオリゴヌクレオチドプライマーＴＭＫ１ によるＮｏｔＩ付加（位置：１２−１７）の位置は、破線で示す。 図６ａおよび図６ｂは、ＣｉａＩ−ＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩカセット（位置：５８ ５−６１６）による構築物ｐＧＥＭ−ｈＴＲ（Ｋａ）（４１１８ｂｐ）および６ ０６ｂｐの増幅産生物を有する設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（５’ プライマーＴＭＫ１：位置［１６ｂｐ］＋１−２７、３’プライマーＴＭＫ３： 位置５６５−６０５＋［２４ｂｐ］）、３８７ｂｐの増幅産生物を有する設計さ れたオリゴヌクレオチドプライマー（５’プライマーＴＭＫ４：位置６０１−６ ３６＋［２０ｂｐ］、３’プライマーＴＭＫ２：位置９４０−９６２＋［３ｂｐ ］）の位置を示す。制限エンドヌクレアーゼＮｏｔＩとＢａｍＨＩまたはＢａｍ ＨＩとＨｉｎｄＩＩＩを用いた加水分解によって、それぞれ５８８または３７５ ｂｐの産物が得られる。ｐＧＥＭ−１３Ｚｆ（＋）内におけるこれらフラグメン トの連結反応によって９６３ｂｐの産物が得られる。 図７は、ＨｉｎｄＩＩＩによって線状化されている構築物ｐＧＥＭ−ｈＴＲＫａ においてＳｐ６ ＲＮＡポリメラーゼによるインビトロ転写を行った後での標準 ＲＮＡ ｈ ＴＲＫａおよび２０ｂｐの任意配列の位置（位置５９１−６１０） を示す。 図８は、ＨｉｎｄＩＩＩによって線状化されている構築物ｐＧＥＭ−ｈＴＲＫｂ においてＳｐ６ＲＮＡポリメラーゼによるインビトロ転写を行った後で得られた 標準ＲＮＡ ｈＴＲＫｂおよび２０ｂｐの任意配列の位置（位置５９１−６１０ ）を示す。 図９は、ＨｉｎｄＩＩＩによって線状化されている構築物ｐＧＥＭ−ｈＴＲＫｃ においてＳｐ６ ＲＮＡポリメラーゼによるインビトロ転写を行った後得られた 標準ＲＮＡ ｈＴＲＫｃおよび２０ｂｐの任意配列の位置（位置５９１−６１０ ）を示す。実施例 別段の注記がない限り、以下の実施例は、例えば上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔａ ｌ．（１９８９）によって記載された標準方法によってまたは使用したキットや 酵素の製造メーカーの指示に従って実施したものである。 １． 末梢血液、組織および細胞の培養と単離 例えばＭＴ４（Ｔ−細胞リンパ芽球腫）、Ｃ８１６６（Ｔ−細胞白血病）、Ｋ５ ６２（慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ））、Ｍｏｌｔ４（急性リンパ球白血病（ＡＬ Ｌ））や奇形癌などの腫瘍細胞系を、ＡＴＣＣ（アメリカ型組織培養保存所）に よって推奨されているように培養した。白血病患者（急性骨髄性白血病）と健康 な比較対照被験者から供血された静脈血は、前腕静脈に穿孔することによってＤ よび健康な参照組織を単離した後直ちに液体窒素中にてショック冷蔵し、−７０ ℃にて保存した。 ２． 細胞ＲＮＡの単離 全細胞ＲＮＡを標準方法［Ｃｈｏｍｃｚｙｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ａ ｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １６２、１５６；Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９８９）．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒ ｋ、「ＵＳＡ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ］によって単離した。末梢血液を採取後直ちにＲＮＡ溶解緩衝液（４ Ｍイソチアシアン酸グアニジウム塩；０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５； １％メルカプトエタノール）に移した。組織と細胞をＵｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ Ｔ２５分散装置（Ｌａｂｏｒｒｅａｋｔｏｒ−Ｓｙｓｔｅｍｅ、ＩＫＡ）を使用 してＲＮＡ溶解緩衝液にて均質化した。この混合物を、更に処理するかまたは− ７０℃にて保存した。 ３． 逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ） Ａ−ＰＣＲキット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いて実施した。末梢血液、 細胞系および組織から単離した全ＲＮＡのアリコットをそれぞれの場合について 予め１０μｌの混合液（５０ｍＭＫＣｌ中に１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８ ．３および２．５ｍＭＭｇＣｌ₂を含む）中に２０Ｕのデオキシリボヌクレアー ゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を加えたものを用いて３７℃に て６０分間加水分解し、ついでこのデオキシリボヌクレアーゼを９５℃にて３０ 分間不活化した。タンパク質とＤＮＡフラグメントからこのＲＮＡを完全に精製 するために、デオキイシリボヌクレアーゼの加水分解物をそれぞれの場合におい 光学的に測定した。 下記する二つのオリゴヌクレオチドプライマー：即ち、 ＴＭ１ ５’ＧＡＣＴＣＧＧＣＴＣ ＡＣＡＣＡＴＧＣＡＧ ＴＴＣＧＣ ３’ ＴＭ２ ５’ＣＴＧＧＴＣＧＡＧＡ ＴＣＴＡＣＣＴＴＧＧ ＧＡＧＡＡＧＣ３ ’ をＦｅｎｇ ｅｔ ａｌ．によって発表されたようにヒトテロメラーゼのＲＮＡ 成分の配列に従って設計し（Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９５）、Ｓｃｉｅｎ ｃｅ ２６９： １２３６−４１）（Ｆｉｇ．１）かつＡｐｐ１ｉｅｄ Ｓｙｓ ｔｅｍｓ ３８０Ａ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒを使用して合成した。ＴＭ１およ びＴＭ２プライマーの特異性は、ＢＬＡＳＴＮ １．４．９ＭＰを用いてＧｅｎ Ｂａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪおよびＰＤＢデータバンクにおける核酸配列につ いて相同性に係るコンピュータ支援分析によって検討した｛Ａｌｔｓｃｈｕｌ、 Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．（１９９０）．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３− ４１０］。 増幅量の均質・統一性のために、それぞれの実験においては同一量のＲＮＡをＲ Ｔ反応に対して使用したのである。ＲＮＡ調製物のゲノムＤＮＡによる汚染を排 除するために、デオキシリボヌクレアーゼによって加水分解したＲＮＡ含有試料 はそれぞれ、先ず第一に下記するＰＣＲに供し、増幅について確認を行った。増 幅産生物が一切検出されないＲＮＡ含有試料をその後のｃＤＮＡ合成とＰＣＲの 工程に使用した。ＧＡＰＤＨのオリゴヌクレオチドプライマーを内部標準コント ロールとして使用した。 ＰＣＲは、下記するプログラムに従って５μｌのｃＤＮＡについてまたは単離し たプラスミドＤＮＡの１：５０希釈物について行った：（９５℃：２分間、予備 加熱）；（９４℃：３０秒間、６０℃：３０秒間、７２℃：３０秒間、３５サイ クル）；（７２℃：７分間、最終延長）。これらの増幅産生物を１．５％ＴＡＥ アガロースゲルによるゲル電気泳動法によって分別し、臭化エチジウムで染色し 、次いでＵＶ光照射下で写真撮影することによって記録した（図２−４を参照の こと）。 ４． 標準ＲＮＡ核酸，ｈＴＲＫａ、ｈＴＲＫｂおよびｈＴＲＫｃの調製 例えばＳｐ６ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ４リガーゼや制限エンドヌクレアーゼなど 使用した酵素は、特にＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｂｉｏｌａｂ ｓやＰｒｏｍｅｇａから購入したのであるが、製造メーカーによって推奨されて いる態様にて使用した。クローニングに用いるＰＣＲ増幅産生物は、１．５％Ｔ ＡＥアガロースでのゲル電気泳動法によって分別し、溶出させた（Ｑｉａｇｅｎ ）。制限酵素加水分解物は、フェノール／クロロホルム抽出で精製し、次いで食 塩とエタノール中にてまたはＤＮＡ精製法で沈殿させた（Ｑｉａｇｅｎ）。Ｔ４ リガーゼを用いてクローニング・転写ベクターｐＧＥＭ−１３Ｚｆ（＋）内の相 当する切断部位に当該フラグメントを連結することによって、当該構築物をクロ ーンした。このベクターを使用することによって、選択したＳｐ６またはＴ７Ｒ ＮＡポリメラーゼを用いてクローンしたフラグメントのインビトロ転写を行うこ とが出来るのである。受容能力を有する細菌（ＸＬ−ｌＢｌｕｅ、Ｓｔｒａｔａ ｇｅｎｅ）を電気穿孔法（ＢｉｏＲａｄ）によって形質転換した。プラスミドＤ ＮＡは、プラスミド精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。陽性のクロ ーンは、ベクター特異的または配列特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用 してＰＣＲでバリデーションした。これらの構築物について、配列バリデーショ ンを半自動的配列分析によって実施した。 構築物ｐＧＥＭ−ｈＴＲ（図５ａおよび図５ｂ）は、三つの構築物ｐＧＥＭ−ｈ ＴＲ（Ｋａ）（図６ａおよび６ｂ）、ｐＧＥＭ−ｈＴＲ（Ｋｂ）およびｐＧＥＭ −ｈＴＲ（Ｋｃ）のための始原構築物として創製した。ｐＧＥＭ−ｈＴＲ（Ｋａ ）は、位置５８５−６１６における配列の任意交換だけがｐＧＥＭ−ｈＴＲとは 異なる。二つの構築物ｐＧＥＭ−ｈＴＲＫｂおよびｐＧＥＭ−ｈＴＲＫｃは、位 置５８７−６１５における配列の任意交換だけがｐＧＥＭ−ｈＴＲとは異なる。 これらの構築物は、三つの標準ＲＮＡであるｈＴＲＫａ（図７）、ｈＴＲＫｂ（ 図８）およびｈＴＲＫｃ（図９）をＳｐ６ ＲＮＡポリメラーゼによってインビ トロ転写するために使用した。ｐＧＥＭ−ｈＴＲなる構築物を生成させるために 、ヒトテロメラーゼｈＴＲ（図１）のＲＮＡ成分のｃＤＮＡをｐＧＥＭ−１３Ｚ ｆ（＋）のＮｏｔＩとＨｉｎｄＩＩＩ切断部位にクローンしたが、これは、上記 した条件下において腫瘍細胞または細胞系から先に単離したＲＮＡにおいて、配 列ｈＴＲ（図１）から誘導せしめた下記するオリゴヌクレオチドプライマーを用 いてＲＴ−ＰＣＲを実行することによって行った： ５’ＡＴＡＡＧＡＡＴＧＣ ＧＧＣＣＧＣＧＧＧＴ ＴＧＣＧＧＡＧＧＧＴ Ｇ ＧＧＣＣＴＧＧＧＡ ＧＧＧ ３’ （ＴＭＫ１） ５’ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧ ＴＧＧＧＧＧＴＴＡＴ ＡＴＣＣＴＡ ３’（ＴＭ Ｋ２） このオリゴヌクレオチドプライマーＴＭＫ１（位置１−２７、図１）は、１６ｂ ｐの付加５’伸長部とＮｏｔＩ切断部位を包含し、またオリゴヌクレオチドプラ イマーＴＭＫ２（位置９４０−９６２、図１）は、３ｂｐの伸長部とＨｉｎｄＩ ＩＩ切断部位を包含する。これらのＴＭＫ１とＴＭＫ２のプライマー対が、９７ ９ｂｐのフラグメントを増幅させるのである。ＮｏｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩに よる制限加水分化にを行った後で、９６３ｂｐフラグメントｈＴＲ（ＮｏｔＩ− ＨｉｎｄＩＩＩ）（位置１−９５７、図５）をｐＧＥＭ−１３Ｚｆ（＋）の相当 する切断部位（位置１２および３８）にクローンし、４１１８ｂｐ構築物ＰＧＥ Ｍ−ｈＴＲを創製した。ｐＧＥＭ−ｈＴＲ（Ｋａ）は、構築物ｐＧＥＭ−ｈＴＲ 内の３２ｂｐ配列（位置５８５−６１６）を３２ｂｐのＣｌａＩ−ＢａｍＨＩ− ＫｐｎＩカセットで置換することによって構築した：即ち、 ５’ＡＴＣＧＡＴＧＡＣＣ ＴＡＡＧＴＧＧＡＴＣ ＣＧＡＣＴＴＧＧＴＡ Ｃ Ｃ ３’ ３’ＴＡＧＣＴＡＣＴＧＧ ＡＴＴＣＡＣＣＴＡＧ ＧＣＴＧＡＡＣＣＡＴ Ｇ Ｇ ５’ このような置換は、組み換えＰＣＲによって実施したが、Ｈｉｇｕｃｈｉら［Ｈ ｉｇｕｃｈｉ、Ｒ．（１９８８）．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ １６： ７３５１−７３６７；Ｈｉｇｕｃｈｉ、Ｒ．（１９９０）．Ｍ．Ｉｎｎｉｓ Ａ ．ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇ、ＮｅｗＹｏｒｋ、Ｂｅｒｋｌｅｙ、 Ｂｏｓｔｏｎ、Ｌｏｎｄｏｎ、Ｓｙｄｎｅｙ、Ｔｏｋｙｏ、Ｔｏｒｏｎｔｏ、Ａ ｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．１７７−１８３］によって記載された方 法の変法である。第一工程において、二つの独立したＰＣＲをｐＧＥＭ−ｈＴＲ において実施した： 即ち、第一回目のＰＣＲは、配列ｈＴＲ（図１）から誘導した下記するオリゴヌ クレオチドプライマーにより行われた： ５’ ＡＴＡＡＧＡＡＴＧＣ ＧＧＣＣＧＣＧＧＧＴ ＴＧＣＧＧＡＧＧＧＴＧ ＧＧＣＣＴＧＧＧＡ ＧＧＧ ３’（ＴＭＫ１） ５’ ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡ ＣＴＴＡＧＧＴＣＡＴ ＣＧＡＴＣＴＧＣＣＡＡ ＴＴＴＧＣＡＧＣＡ ＣＡＣＴ ３’（ＴＭＫ３） このオリゴヌクレオチドプライマーＴＭＫ３（位置５６５−６０５、図６）は、 ＢａｍＨＩとＣｌａＩ切断部位を有する２４ｂｐの付加５’伸長部を包含し、Ｃ ｌａＩ−ＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩカセットの２１ｂｐをコードするものである。こ の第一回目のＰＣＲから得られる増幅産生物は、６０６ｂｐの５’フラグメント を与えるのであるが、ＮｏｔＩとＢａｍＨＩによって消化した場合、５８８ｂｐ の５’フラグメントが得られた。 第二回目のＰＣＲは、配列ｈＴＲ（図１）から誘導した下記するオリゴヌクレオ チドプライマーにより行われた： ５’ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧ ＡＣＴＴＧＧＴＡＣＣ ＡＴＧＡＡＴＧＧＧＣ Ａ ＧＴＧＡＧＣＣＧＧ ３’（ＴＭＫ４） ５’ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧ ＴＧＧＧＧＧＴＴＡＴ ＡＴＣＣＴＡ ３’（ＴＭ Ｋ２） このオリゴヌクレオチドプライマーＴＭＫ４（位置５９９−６１８、図６）は、 ＢａｍＨＩとＣｌａＩ切断部位を有する２０ｂｐの付加５’伸長部を包含し、Ｃ ｌａＩ−ＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩカセットの１７ｂｐをコードするものである。こ の第二回目のＰＣＲから得られる増幅産生物は、３８７ｂｐの３’フラグメント を与えるのであるが、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩによって加水分解した場合、 ３７５ｂｐの３’フラグメントが得られた。Ｔ４リガーゼを使用して、これらの ５’と３’フラグメントのＢａｍＨＩ切断部位を一緒に連結し、かくして９６３ ｂｐのＮｏｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントが得られたが、このフラグメント をｐＧＥＭ−１３Ｚｆ（＋）の相当する切断部位（位置１２および３８）にクロ ーンして、４１１８ｂｐの構築物ｐＧＥＭ−ｈＴＲ（Ｋａ）を創製した（図６） 。ｐＧＥＭ-ｈＴＲ（Ｋｂ）およびｐＧＥＭ-ｈＴＲ（Ｋｃ）は、構築物ｐＧＥＭ −ｈＴＲ（Ｋａ）の２９ｂｐ配列（位置５８７−６１５）を２９ｂｐの任意配列 で置換することによって構築した。構築物ｐＧＥＭ−ｈＴＲ（Ｋａ）と下記する オリゴヌクレオチドＫｂおよびＫｃにおいてＣｌａＩとＫｐｎＩによって選択的 制限消化を行い、次いで二回の別々のＴ４リガーゼ反応において、これらオリゴ ヌクレオチドＫｂおよびＫｃのＣｌａＩ−ＫｐｎＩフラグメントをｐＧＥＭ−ｈ ＴＲ（Ｋａ）の相当する切断部位にクローンして、４１１８ｂｐの構築物である ｐＧＥＭ−ｈＴＲ（Ｋｂ）およびｐＧＥＭ−ｈＴＲ（Ｋｃ）とを創製した： ＣｌａＩ ＫｐｎＩ 5'CCATCGATTC CCGTCGCCAA ATCGAGCGGG TACCCC3' Ｋｂ 3'GGTAGCTAAG GGCAGCGGTT TAGCTCGCCC ATGGGG5' ＣｌａＩ ＫｐｎＩ 5'CCATCGATCG TCCAATCGCT ATACTCTCGG TACCCC3' Ｋｃ 3'GGTAGCTAGC AGGTTAGCGA TATGAGAGCC ATGGGG5' ＲＮＡは、Ｓｐ６ ＲＮＡポリメラーゼを用いてｐＧＥＭ−ｈＴＲ（Ｋａ）（ ｈＴＲＫａ、図７）、ｐＧＥＭ−ｈＴＲ（Ｋｂ）（ｈＴＲＫｂ、図８）およびｐ ＧＥＭ−ｈＴＲ（Ｋｃ）（ｈＴＲＫｃ）図９）から９７５ｂｐなる長さにおいて インビトロで製造した。このＲＮＡの更なる処理、例えばデオキシリボヌクレア ーゼ消化、精製や補正などは、標準方法で行った。 ５． 結果 幾つかの腫瘍細胞系についての検討を行った結果、ヒトテロメラーゼのＲＮＡ成 分は、全ての腫瘍細胞系において異なる量で検出可能であり、同一量がＧＡＰＤ Ｈコントロール反応において増幅されることが判明した（図２）。何れの場合に おいてもゲノムＤＮＡによる汚染は、逆転写酵素を添加することなくコントロー ル反応によって排除することが可能であった。 腫瘍組織および健康組織について比較検討を行った結果、ヒトテロメラーゼのＲ ＮＡ成分は、腫瘍組織においては明白に検出可能であったが、健康参照組織にお いてはそうでないことが明らかとなった（図３）。増幅産生物の強度の変動は、 これらの腫瘍組織から得られたＲＮＡの個別の品質によって説明することができ る。 静脈血についての検討の結果、種々に異なるレベルのテロメラーゼ活性が、健康 な被験者および白血病患者からの採取した血液において検出可能であったが、対 照被験者においては、癌患者と比較してテロメラーゼ活性は明白に低いことが判 明した（図４）。 構築物であるｐＧＥＭ−ｈＴＲ（Ｋａ）、ｐＧＥＭ−ｈＴＲ（Ｋｂ）およびｐＧ ＥＭ−ｈＴＲ（Ｋｃ）についてＳｐ６ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロ転 写を行ったところ、いずれの場合においても長さが９７５塩基であるＲＮＡ転写 産物ｈＴＲＫａ、ｈＴＲＫｂおよびｈＴＲＫｃが必要であることが判った。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 以下から構成されて成る体液中の腫瘍細胞を数量化するための方法： （ａ）検討するべき試料に対してテロメラーゼのＲＮＡ成分が特異的に増幅され るような反応を行うこと、および （ｂ）増幅された核酸の量を定量的に測定すること。 ２． 試料に含有されるＲＮＡがｃＤＮＡに転写されるような反応を、検討する べき試料に対する増幅反応に先立って実施する、請求項１において記載された方 法。 ３． デオキシリボヌクレアーゼ反応をＲＮＡのｃＤＮＡへの転写を行う前に検 討するべき試料に対して実施する、請求項１または２において記載された方法。 ４． 検討するべき試料を好ましくは特にシリカゲルのイオン交換クロマトグラ フィーによって精製する、請求項１ないし３の内の何れか一項において記載され た方法。 ５． テロメラーゼをコードする核酸を定量的に測定するために、少なくとも一 種、好ましくは三種の標準核酸を同時に増幅し、次いで検討するべき試料に相異 なる濃度で添加する、請求項１ないし４の内の何れか一項において記載された方 法。 ６． 同時に増幅する核酸が、図７、図８および／または図９に図示する配列を 有する、請求項５において記載された方法。 ７． 増幅産生物が、直接的にまたは標識物質を介して、好ましくは放射性標識 物質、ビオチン標識物質、蛍光標識物質または電気化学的発光標識物質を介する かの何れかで数量化される、請求項１ないし６の内の何れか一項において記載さ れた方法。 ８． 増幅産生物が、標識化されたオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーシ ョンを介して検出されるに際して、該標識物質が、好ましくは放射性標識物質、 ビオチン標識物質、蛍光標識物質または電気化学的発光標識物質である、請求項 １ないし６の内の何れか一項において記載された方法。 ９． 測定するべきテロメラーゼをコードする核酸を数量化するために、同時増 幅された単一または複数の核酸の量をテロメラーゼをコードする核酸の量と比較 する、請求項５ないし８の内の何れか一項において記載された方法。１ ０． 検討するべき試料が末梢血液であり、また正の対照として検討するべき試 料に対して末梢血液中に存在する核酸の一種、好ましくはβ−グロブリンまたは グリセルアルデヒド−リン酸デヒドロゲナーゼをコードするｍＲＮＡが特異的に 増幅されかつ検出されるような反応を実施する、請求項１ないし９の内の何れか 一項において記載された方法。 １１． 負の対照として、検討するべき試料に対する増幅反応を行う前に逆転写 反応を一切行わなずおよび／または水を体液の代わりに使用する、請求項１また は請求項３ないし１０の内の何れか一項において記載された方法。 １２． 下記するオリゴヌクレオチドプライマーが増幅のために使用される、請 求項１ないし１１の内の何れか一項において記載された方法： ５’ ＧＡＣＴＣＧＧＣＴＣ ＡＣＡＣＡＴＧＣＡＧ ＴＴＣＧＣ ３’ （ＴＭＩ）、および／または ５’ ＣＴＧＧＴＣＧＡＧＡ ＴＣＴＡＣＣＴＴＧＧ ＧＡＧＡＡＧＣ ３’ （ＴＭ２）、 なお上式において、ＴＭ１および／またはＴＭ２は、適切な場合はＲＮＡポリメ ラーゼのプロモーター配列を包含して成るものである。 １３． ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼを増幅のために使用する 、請求項１ないし１２の内の何れか一項において記載された方法。 １４． ＤＮＡポリメラーゼによる増幅の場合においてはポリメラーゼ連鎖反応 （ＰＣＲ）を実施し、またＲＮＡポリメラーゼによる増幅の場合においては等温 の、核酸配列をベースとした増幅（ＮＡＳＢＡ）を実施する、請求項１ないし１ ３の内の何れか一項において記載された方法。 １５． 検討するべき試料が、血液でありかつ検討するべき血液試料から、幹細 胞および／または活性化された免疫細胞が、好ましくは免疫吸収法によって除去 される、請求項１ないし１４の内の何れか一項において記載された方法。 １６． 検討するべき試料が、血液でありかつ検討するべき血液試料から、腫瘍 細胞を好ましくは免疫吸収法によって濃縮する、請求項１ないし１５の内の何れ か一項において記載された方法。 １７． 検討するべき試料が、血液でありかつ前記方法において、一方では静脈 血を検討しまた他方では動脈血を検討し、次いで得られた結果を相互に比較する 、請求項１ないし１６の内の何れか一項において記載された方法。 １８． 検討するべき試料が、血液でありかつ前記方法において、一方では指先 端部から採取した血液試料を検査しまた他方では静脈血または動脈血を検査し、 次いで得られた結果を相互に比較する、請求項１ないし１７の内の何れか一項に おいて記載された方法。 １９． 腫瘍細胞が、悪性腫瘍の転移巣、好ましくは微小転移巣から誘導される 、請求項１ないし１８の内の何れか一項において記載された方法。 ２０． 腫瘍細胞が、Ｔ細胞リンパ芽細胞腫、Ｔ細胞白血病細胞、慢性骨髄性白 血病細胞、急性リンパ球性白血病細胞、慢性リンパ球性白血病細胞、奇形腫、黒 色腫、肺癌、大腸癌、乳癌、肝細胞癌、腎臓腫瘍、副腎腫瘍、前立腺癌、神経芽 腫、脳腫瘍、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫および／またはリンパ腫から誘導される転 移性の腫瘍および／または新生物の細胞からなる群から選択される、請求項１な いし１９の内の何れか一項において記載された方法。 ２１． 下記する配列を有するオリゴヌクレオチド：即ち、 ５’ ＧＡＣＴＣＧＧＣＴＣ ＡＣＡＣＡＴＧＣＡＧ ＴＴＣＧＣ ３’ （ＴＭ１）； ５’ ＣＴＧＧＴＣＧＡＧＡ ＴＣＴＡＣＣＴＴＧＧ ＧＡＧＡＡＧＣ ３’ （ＴＭ２）； ５’ ＡＴＡＡＧＡＡＴＧＣ ＧＧＣＣＧＣＧＧＧＴ ＴＧＣＧＧＡＧＧＧＴ ＧＧＧＣＣＴＧＧＧＡ ＧＧＧ ３’（ＴＭＫ１）； ５’ ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧ ＴＧＧＧＧＧＴＴＡＴ ＡＴＣＣＴＡ ３’ （ＴＭＫ２）； ５’ ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡ ＣＴＴＡＧＧＴＣＡＴ ＣＧＡＴＣＴＧＣＣＡＡ ＴＴＴＧＣＡＧＣＡ ＣＡＣＴ ３’（ＴＭＫ３）；および／または ５’ ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧ ＡＣＴＴＧＧＴＡＣＣ ＡＴＧＡＡＴＧＧＧＣＡ ＧＴＧＡＧＣＣＧＧ ３’（ＴＭＫ４）。 ２２． 下記する配列を有するオリゴヌクレオチド：即ち、 5' CCATCGATTC CCGTCGCCAA ATCGAGCGGG TACCCC 3' （Ｋｂ） 3' GGTAGCTAAG GGCAGCGGTT TAGCTCGCCC ATGGGG 5'、および／または 5' CCATCGATCG TCCAATCGCT ATACTCTCGG TACCCC 3' （Ｋｃ） 3' GGTAGCTAGC AGGTTAGCGA TATGAGAGCC ATGGGG 5' ２３． 図７、図８または図９に図示する配列と共に同時増幅するための標準Ｒ ＮＡ核酸または相当するそのｃＤＮＡ。 ２４． 図５ａおよび図５ｂに図示する核酸構築物ｐＧＥＭ−ｈＴＲ。 ２５． 図６ａおよび図６ｂに図示する核酸構築物ｐＧＥＭ−ｈＴＲ（Ｋａ）。 ２６． 下記を包含して成る体液中の腫瘍細胞を数量化するためのキット： （ａ）同時増幅するための単一の核酸または複数の核酸、および （ｂ）テロメラーゼをコードする核酸と（ａ）において特定した単一の核酸また は複数の核酸を特異的に増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマー対。 ２７． （ａ）において特定した単一の標準核酸たは複数の標準核酸が、図７、 図８または図９において図示する配列を有する、請求項２６において記載された キット。 ２８． （ｂ）において特定したオリゴヌクレオチドプライマー対が下記する配 列を有するものである、請求項２６または２７において記載されたキット： ５’ＧＡＣＴＧＧＣＴＣ ＡＣＡＣＡＴＧＣＡＧ ＴＴＣＧＣ ３’（ＴＭ１） および ５’ＣＴＧＧＴＣＧＡＧＡ ＴＣＴＡＣＣＴＴＧＧ ＧＡＧＡＡＧＣ ３’ （ＴＭ２）−なおここにおいて、ＴＭ１および／またはＴＭ２は、適切な場合は ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を含んで成るものである。 ２９． 更に測定するべき試料の増幅された核酸を検出するための標識化オリゴ ヌクレオチドおよび／または同時増幅された単一の標準核酸または複数の標準核 酸を検出するための一つたはそれ以上の標識化オリゴヌクレオチド、特に下記す る配列およびこれらの相当する逆相補的配列を有するオリゴヌクレオチドを含ん で成る、請求項２６ないし２８の内の何れか一項において記載されたキット： ５’ＣＧＡＣＴＴＴＧＧＡ ＧＧＴＧＣＣＴＴＣＡ ３’ Ｏ（ｗｔ） ５’ＡＡＧＴＣＧＧＡＴＣ ＣＡＣＴＴＡＧＧＴＣ ３’ Ｏ（Ｋａ） ５’ＣＧＣＴＣＧＡＴＴＴ ＧＧＣＧＡＣＧＧＧＡ ３’ Ｏ（Ｋｂ） ５’ＧＡＧＡＧＴＡＴＡＧ ＣＧＡＴＴＧＧＡＣＧ ３’ Ｏ（Ｋｃ） ３０． 更に逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、好ましくはＴａｑポリメラーゼ 、デオキシリボヌクレアーゼ−および／または適切な場合は、幹細胞および／ま たは活性化された免疫細胞を除去するためおよび／または腫瘍細胞を濃縮するた めに適した手段を含んで成る、請求項２６ないし２９の内の何れか一項において 記載されたキット。 ３１． 更に逆転写酵素、ＲＮＡポリメラーゼ、好ましくはＴ７ＲＮＡポリメラ ーゼ、リボヌクレアーゼＨ、デオキシリボヌクレアーゼ−および／または適当な 緩衝液および適切な場合は、幹細胞および／または活性化された免疫細胞を除去 するためおよび／または腫瘍細胞を濃縮するために適した手段を含んで成る、請 求項２６ないし２９の内の何れか一項において記載されたキット。