JP5750710B2 - 癌マーカー、それを用いた癌の評価方法および評価試薬 - Google Patents

Description

本発明は、癌マーカー、それを用いた癌の可能性の評価方法および評価試薬に関する。さらに、本発明は、前記評価方法において癌マーカーを補正するための補正マーカー、補正方法ならびに補正試薬に関する。

臨床医療の分野において、疾患の有無、進行度、治療後の効果等を容易に判断することが求められている。そこで、間接的な判断手法として、各疾患の発症や進行に対して特異的に発現量が変化するマーカーの検出が提案されており、実際に実用化が試みられている。

疾患の中でも悪性腫瘍、いわゆる癌については、特に、早期発見、適切な治療方針の選択・変更が重要である。このため、前述のようなマーカー検出による間接的な判断を実現するため、種々の癌マーカー（腫瘍マーカー）が報告されている。前記癌マーカーの具体例としては、例えば、ＰＳＡ（前立腺特異抗原：Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ）、ＣＥＡ（癌胎児性抗原：Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ）、ＣＡ１９−９（Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ １９−９）、ＣＡ７２−４（Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ ７２−４）等がある。また、非特許文献１および２には、ｈａｓ−ｍｉｒ−１５、ｈａｓ−ｍｉｒ−１６、ｍｉＲ−１４３およびｍｉＲ−１４５等のｍｉＲＮＡの発現が、リンパ性白血病や大腸癌等でダウンレギュレーションされるとの記載もある（非特許文献１、２）。

Ｃａｌｉｎ ＧＡ， Ｄｕｍｉｔｒｕ ＣＤ， Ｓｈｉｍｉｚｕ Ｍ ｅｔ ａｌ．， Ｆｒｅｑｕｅｎｔ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏ−ＲＮＡ ｇｅｎｅｓ ｍｉＲ１５ ａｎｄ ｍｉＲ１６ ａｔ １３ｑ１４ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， ２００２， ｖｏｌ．９９， ｐ．１５５２４−９ Ｍｉｃｈａｅｌ ＭＺ， ＳＭ ＯＣ， ｖａｎ Ｈｏｌｓｔ Ｐｅｌｌｅｋａａｎ ＮＧ， Ｙｏｕｎｇ ＧＰ， Ｊａｍｅｓ ＲＪ， Ｒｅｄｕｃｅｄ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ｉｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｎｅｏｐｌａｓｉａ， Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ２００３年， １巻， ｐ．８８２−９１

しかしながら、臨床医療の分野においては、優れた信頼性で、癌の発症やその進行状態を判断できる癌マーカーが必要であるため、さらに、新たな癌マーカーの提供が望まれている。そこで、本発明の目的は、癌を評価するための新規な癌マーカー、それを用いた評価方法、および、それに用いる評価試薬を提供することにある。また、本発明の目的は、さらに、癌マーカーの発現レベルを補正するための新たな補正マーカー、それを用いた発現レベルの補正方法、および、それに用いる補正試薬を提供することにある。

本発明の癌マーカーは、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２およびｈｓａ−ｍｉＲ−４９４の少なくとも一方のｍｉＲＮＡを含むことを特徴とする、乳癌を除く癌のマーカーである。

本発明の評価方法は、生体試料における癌マーカーの発現レベルを検出する癌マーカー検出工程を含み、前記癌マーカーが、本発明の癌マーカーであることを特徴とする、乳癌を除く癌の可能性を評価する評価方法である。

本発明の評価試薬は、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２およびｈｓａ−ｍｉＲ−４９４の少なくとも一方のｍｉＲＮＡを検出するｍｉＲＮＡ検出試薬を含み、本発明の評価方法に使用することを特徴とする、乳癌を除く癌の可能性を評価するための評価試薬である。

本発明の補正マーカーは、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８を含み、本発明の評価方法において、生体試料における本発明の癌マーカーの発現レベルを補正するためマーカーであることを特徴とする。

本発明の補正方法は、本発明の評価方法において、生体試料における本発明の癌マーカーの発現レベルを補正するために、
生体試料における本発明の癌マーカーの発現レベルを測定する工程と、
前記生体試料における前記補正マーカーの発現量を測定する工程と、
前記癌マーカーの発現量と前記補正マーカーの発現量との比を、前記生体試料における前記癌マーカーの補正した発現レベルとする補正工程とを含むことを特徴とする。

本発明の補正試薬は、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８を検出するｍｉＲＮＡ検出試薬を含み、本発明の評価方法において、生体試料における本発明の癌マーカーの発現レベルを補正するために使用することを特徴とする。

本発明者らは、鋭意研究の結果、癌の発生に伴って、生体試料中でのｈｓａ−ｍｉＲ−９２およびｈｓａ−ｍｉＲ−４９４の発現レベルが減少することを見出し、本発明に到った。本発明の癌マーカーによれば、生体試料中の発現レベルを検出することによって、例えば、癌の発生の有無や癌の進行を判断することが可能となる。また、本発明の癌マーカーによれば、例えば、癌化について、陰性・陽性の差が有意であることから、一般的な触診等では検出が困難である初期段階の癌についても、容易に検出が可能となる。また、本発明の補正マーカーによれば、前記癌マーカーによる検出の精度をより一層向上できる。

図１は、本発明の実施例２において、正常者由来サンプルにおける各種ｍｉＲＮＡの発現プロファイルを示すグラフであり、同図（ａ）は、各サンプルについて、サンプルに含まれる各種ｍｉＲＮＡのシグナル強度値を示すグラフであり、同図（ｂ）は、各ｍｉＲＮＡについて、正常者７名の各サンプルにおけるシグナル値順位を前記シグナル値平均順位で割った値の対数値（log₁₀[individual rank_Normal/Average rank_Normal]）を示すグラフである。 図２は、本発明の実施例２において、ＡＭＬ患者由来のサンプル間におけるｍｉＲＮＡのシグナル値平均順位と正常者由来のサンプル間におけるｍｉＲＮＡのシグナル値平均順位との比（Average rank_AML/Average rank_Nomal）を示すグラフである。 図３は、本発明の実施例３において、正常者由来サンプルおよび急性白血病患者由来サンプルにおける癌マーカーｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａと補正マーカーｈｓａ−ｍｉＲ−６３８との蛍光強度比（ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ／ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８）を示すグラフである。

＜癌マーカー＞
本発明の癌マーカーは、前述のように、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２およびｈｓａ−ｍｉＲ−４９４の少なくとも一方のｍｉＲＮＡを含むことを特徴とする、乳癌を除く癌のマーカーである。

前述のように、本発明者らにより、これらのｍｉＲＮＡの発現レベルが、種々の組織における細胞の癌化に伴って、特異的に変動することが明らかとなった。具体的には、癌化に伴って、例えば、血漿または血清において、その発現レベルが低下することが明らかとなった。このことから、例えば、癌の発症前と比較して癌の発症後の発現レベル、前臨床期前と比較して前臨床期の発現レベル、臨床期前と比較して臨床期の発現レベル、初期段階前と比較して初期段階の発現レベル、初期段階と比較して初期段階以後の発現レベル等が、有意に低下すると解される。したがって、これらのｍｉＲＮＡの発現レベルの検出によって、例えば、癌が発症する可能性、癌化しているか否か、前臨床期（初期段階）もしくは臨床期等の癌の進行度（進行期または病期）、または、予後の評価等を行うことが可能となる。

本発明において、各用語は、以下のことを意味する。「癌」は、一般的に、悪性腫瘍を意味する。「癌化」は、一般的に、癌の発症を意味し、「悪性転換」の意味も含む。「発症」とは、例えば、疾患特異的臨床症状、検査データ等に基づく総合的判断によって、特定疾患と診断された時点をもって、発症とよぶ。「前臨床期」とは、一般的に、疾患特異的な臨床症状が表れる前の発症前状態であって、既に微量の悪性腫瘍細胞が存在している早期の状態を指す。また、子宮頚癌においては、一般的に、ＣＩＮ１、ＣＩＮ２、ＣＩＮ３等の前癌病変、大腸癌においては、腺腫の状態を示す。「臨床期」とは、一般的に、画像所見によって明らかになる癌、既存の腫瘍マーカーで確認できるものを示す。「初期段階」とは、一般的に、早期がんの状態を示す。「予後」とは、例えば、疾患の術後の経過を意味する。本発明の癌マーカーは、例えば、予後を予測し、見通しを立て、適切な治療方法を選択するための判断材料となりうることから、「予後因子」ということもできる。「癌の進行期」は、例えば、癌化組織の種類等によって適宜判断できるが、一般に、０期とＩ期を初期癌、II期を早期癌、III〜IV期を進行癌と分類できる。

本発明の癌マーカーの対象となる癌は、特に制限されないが、例えば、大腸癌、胆嚢癌、胃癌、肺癌、白血病、膵癌、前立腺癌、膀胱癌、腎癌、子宮体癌、子宮頚癌、肝細胞癌、胆道癌、脳腫瘍、喉頭癌、舌癌、直腸癌、骨肉腫等があげられる。

本発明において、ｍｉＲＮＡとは、例えば、一本鎖（一量体）でもよいし、二本鎖（二量体）であってもよい。また、本発明において、ｍｉＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒ等のリボヌクレアーゼにより切断された成熟型ｍｉＲＮＡが好ましい。

本発明において、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２としては、例えば、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａがあげられ、これは、前述のように成熟型ｍｉＲＮＡが好ましい。

前記成熟型ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａの配列は、例えば、アクセッションＮｏ．ＭＩＭＡＴ０００００９２に登録されている。この配列を、下記配列番号１に示す。
ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ（配列番号１）
５’−ｕａｕｕｇｃａｃｕｕｇｕｃｃｃｇｇｃｃｕｇｕ−３’

ｈｓａ−ｍｉＲ−４９４としては、例えば、前述のように成熟型ｍｉＲＮＡがあげられる。前記成熟型ｍｉＲＮＡの配列は、アクセッションＭｏ．ＭＩＭＡＴ０００２８１６に登録されている。前記成熟型ｈｓａ−ｍｉＲ−４９４の配列を、配列番号２に示す。
ｈｓａ−ｍｉＲ−４９４（配列番号２）
５’−ｕｇａａａｃａｕａｃａｃｇｇｇａａａｃｃｕｃ−３’

下記文献に開示されるように、各ｍｉＲＮＡは、例えば、５’末端と３’末端に、それぞれ数個のｖａｒｉａｔｉｏｎが存在する。したがって、本発明における各ｍｉＲＮＡは、さらに、前述の成熟型配列に対して、数個ずつ塩基が異なるｖａｒｉａｎｔも含む。
Ｗｕ Ｈ．ｅｔａｌ．，２００７，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ２（１０）：ｅ１０２０ ｍｉＲＮＡ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｎａｉｖｅ，ｅｆｆｅｃｔｏｒ ａｎｄ ｍｅｍｏｒｙ ＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌｓ．
Ｐａｂｌｏ Ｌａｎｄｇｒａｆ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｃｅｌｌ，ｖ１２９，１４０１−１４１４ Ａ Ｍａｍｍａｌｉａｎ ｍｉｃｒｏＲＮＡ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｔｌａｓ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｓｍａｌｌ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．
Ｎｅｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ，ｖ２１，５７８−５８９ Ｄｙｎａｍｉｃ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｓｔａｇｅ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．
Ｒｕｂｙ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｃｅｌｌ，ｖ１２７，１１９３−１２０７ Ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅｖｅａｌｓ ２１Ｕ−ＲＮＡｓ ａｎｄ ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ａｎｄ ｅｎｄｏｇｅｎｅｏｕｓ ｓｉＲＮＡｓ ｉｎ Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ．
Ｏｂｅｒｎｏｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ ２００６ １２：１１６１−１１６７ Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．
Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ，ｖ１２，７３５−７３９ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ｆｒｏｍ ｍｏｕｓｅ．

本発明におけるｍｉＲＮＡは、例えば、前記各配列番号に記載の塩基配列と相同性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド、または、それらに相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む。前記「相同性」とは、比較する配列同士を適切にアライメントしたときの同一性の程度であり、前記配列間のアミノ酸の正確な一致の出現率（％）を意味し、ポリヌクレオチドの塩基配列が「相同性を有する」とは、前記ポリヌクレオチドが、本発明におけるｍｉＲＮＡとしての機能を維持できるほど十分に類似していることをいう。なお、前記アライメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ等の任意のアルゴリズムの利用により行うことができる。前記塩基配列が、例えば、点変異、欠失または付加による相違を有しても、これらが前記ｍｉＲＮＡの機能に影響を与えないならば、両者は相同といえる。相違する塩基数としては、例えば、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜５個、１〜３個、１〜２個又は１個である。また、二つのポリヌクレオチドを比較して、例えば、塩基配列が８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは約９９％の同一性を示す場合、これらは相同であるといえる。また、例えば、二つのポリヌクレオチドのうち一方が、他方のポリヌクレオチドの相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする場合には、両者は相同といえる。前記ストリンジェントな条件としては、特に限定されないが、例えば、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト、０．０１％変性サケ精子核酸を含む溶液中、「Ｔｍ−２５℃」の温度で一晩保温する条件等があげられる。

本発明の癌マーカーは、例えば、生体試料中に存在するｍｉＲＮＡである。本発明における前記生体試料は、生体（例えば、被験者）から採取した液体画分であり、例えば、血液、唾液、尿、これらの希釈液等があげられる。中でも、癌化に伴う前記各種ｍｉＲＮＡの発現レベルの変化が特に顕著であることから、血液試料であることが好ましい。前記血液試料としては、特に制限されないが、例えば、血液の液体画分を含む試料であり、いわゆる血漿を含む試料または血清を含む試料等があげられる。前記試料の具体例としては、例えば、全血、全血の液体画分、血漿画分、血清画分、これらを含む試料、これらの希釈試料等があげられる。

＜評価方法＞
本発明の評価方法は、前述のように、生体試料における癌マーカーの発現レベルを検出する癌マーカー検出工程を含み、前記癌マーカーが、本発明の癌マーカーであることを特徴とする、乳癌を除く癌の可能性を評価する評価方法である。

本発明においては、癌マーカーとして本発明の癌マーカーを検出することが特徴であって、例えば、各ｍｉＲＮＡの発現レベルの検出方法に関しては、何ら制限されない。なお、本発明の癌マーカーは、前述の通りである。本発明において、検出する癌マーカーは、例えば、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２およびｈｓａ−ｍｉＲ−４９４のいずれか一方でもよいし、両方であってもよい。検出する癌マーカーがｈｓａ−ｍｉＲ−９２の場合、例えば、成熟型が好ましい。また、検出する癌マーカーがｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａの場合、成熟型ｍｉＲＮＡが好ましい。

本発明において、評価対象となる癌は、特に制限されないが、前述のように、例えば、大腸癌、胆嚢癌、胃癌、肺癌、白血病、膵癌、前立腺癌、膀胱癌、腎癌、子宮体癌、子宮頚癌、肝細胞癌、胆道癌、脳腫瘍、喉頭癌、舌癌、直腸癌、骨肉腫等があげられる。

本発明において、前記生体試料としては、特に制限されないが、例えば、前述のように、血液、唾液、尿等があげられる。中でも、癌化に伴う前記各種ｍｉＲＮＡの発現レベルの変化が特に顕著であることから、前述のような血液試料が好ましく、より好ましくは、血漿を含む試料、血清を含む試料等である。このような血液試料であれば、例えば、血液を採取するのみで検査が可能であり、被検者の苦痛や負担も極めて軽減できることからも、特に好ましい。

本発明の評価方法は、さらに、癌の可能性を決定する工程を含んでもよい。すなわち、前記癌マーカー検出工程で検出した前記生体試料における前記癌マーカーの発現レベルから、下記（１）、（２）および（３）からなる群から選択された少なくとも一つの方法により、癌の可能性を決定する工程を含んでもよい。
（１）被検者の生体試料における前記癌マーカーの発現レベルを、正常者の生体試料における前記癌マーカーの発現レベルと比較し、前記正常者の発現レベルよりも低い場合に、前記被検者は、前記癌の可能性が高いと決定する。
（２）被検者の生体試料における前記癌マーカーの発現レベルを、正常者の生体試料における前記癌マーカーの発現レベルと比較し、前記正常者の発現レベルよりも相対的に低い程、前記被検者は、前記癌の進行が相対的に進んでいると決定する。
（３）被検者の生体試料における前記癌マーカーの発現レベルを、進行期別の各癌患者の生体試料における前記癌マーカーの発現レベルと比較し、前記被検者は、同程度の発現レベルを示す患者と同じ進行期であると決定する。

本発明において、癌の可能性とは、例えば、癌が発症する可能性、癌化しているか否か、前臨床期もしくは臨床期等の癌の進行度、または、予後等の意味を含む。本発明において、「正常者」とは、例えば、評価対象の癌を発症している、または、前記癌を発症している可能性があると判断されていない者を意味する。

前記（１）および（２）における正常者の癌マーカーの発現レベルは、例えば、予め、正常者から採取した生体試料を用いて、決定することができる。また、前記（３）における各癌患者の癌マーカーの発現レベルも、例えば、予め、進行期ごとに患者を分類し、各進行期の患者から採取した生体試料を用いて、決定することもできる。前記（１）〜（３）における正常者および患者の生体試料は、例えば、前記被検体の生体試料と同じ種類の生体試料であることが好ましく、例えば、血液試料が好ましく、特に、血漿を含む試料、血清を含む試料が好ましい。また、前記正常者および患者の生体試料は、例えば、前記被検体の生体試料と同様の方法や条件で調製した試料であることが好ましい。

本発明において、前記癌マーカーの発現レベルとは、例えば、前記生体試料における前記癌マーカーの発現量があげられる。前記発現量は、例えば、実際のｍｉＲＮＡの量でもよいし、実際のｍｉＲＮＡの量と相関関係にある値であってもよい。後者としては、例えば、前記ｍｉＲＮＡの検出の際に得られるシグナル値等があげられる。このシグナル値は、例えば、ｍｉＲＮＡの検出方法や、シグナル値の検出機器の種類に応じて適宜決定できる。前記検出方法が、例えば、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（リアルタイム 逆転写−ポリメラーゼチェーンリアクション）法等のＰＣＲ法の場合、例えば、ｃｏｐｉｅｓ／μＬ等で表わすこともできる。

前記癌マーカーの発現レベルは、例えば、補正マーカーの発現レベルによって補正することが好ましい。前記補正マーカーとしては、特に制限されないが、例えば、生体試料における発現レベルが恒常的な物質があげられ、中でも、癌化の有無にかかわらず、生体試料における発現レベルが恒常的な物質が好ましい。このような補正マーカーを内部標準として、癌マーカーの検出のために採取した生体試料における発現レベルを検出すれば、例えば、異なる被検者間の癌マーカーの発現レベルや、同じ被検者の経時的な発現レベルを、より一層優れた信頼性で比較できる。このような理由から、本発明の評価方法は、さらに、前記被験者から採取した前記生体試料における補正マーカーの発現レベルを検出する補正マーカー検出工程を含んでもよい。

前述の癌マーカーの補正した発現レベルは、例えば、生体試料における癌マーカーの発現量と、補正マーカーの発現量との比で表わすことができる。具体的には、例えば、「癌マーカーの発現量／補正マーカーの発現量」、または、「補正マーカーの発現量／癌マーカーの発現量」として表すことができる。本発明の癌マーカーは、癌化によって発現が低下することから、前者のように「癌マーカーの発現量／補正マーカーの発現量」で表わした場合、例えば、値が相対的に小さいほど、癌の可能性が高いと判断できる。一方、後者のように「補正マーカーの発現量／癌マーカーの発現量」で表した場合、例えば、値が大きい程、癌の可能性が高いと判断できる。

前記補正マーカーとしては、特に制限されず、公知のマーカーが使用できるが、本発明においては、特に、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８を補正マーカーとすることが好ましい。このｍｉＲＮＡを含む補正マーカーは、後述する本発明の補正マーカーであり、例えば、癌化にかかわらず、生体試料内で恒常的に発現する。このように本発明の補正マーカーは、癌化に関わらず、恒常的に発現することから、生体試料における内部標準となる。

本発明の補正マーカー、すなわち、前記ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８は、例えば、Ｄｉｃｅｒ等のリボヌクレアーゼにより切断された成熟型ｍｉＲＮＡが好ましい。

ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８としては、例えば、前述のように成熟型ｍｉＲＮＡがあげられる。成熟型ｍｉＲＮＡの配列は、アクセッションＭｏ．ＭＩＭＡＴ０００３３０８８に登録されている。前記成熟型ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８の配列を、配列番号３に示す。
ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８（配列番号３）
５’−ａｇｇｇａｕｃｇｃｇｇｇｃｇｇｇｕｇｇｃｇｇｃｃｕ−３’

本発明において、前記被検者とは、特に制限されないが、例えば、ヒト、犬、猫等を含む哺乳類、霊長類、齧歯類等があげられる。

以下に、本発明の評価方法について、生体試料として血漿または血清を使用する例をあげて説明する。なお、本発明は、これには制限されない。

まず、被検者の血漿または血清から全ＲＮＡを抽出する。前記血漿または血清は、公知の方法で回収でき、例えば、被検者から全血を採取し、遠心により血球画分を除去することによって調製できる。また、前記血漿または血清からの全ＲＮＡの抽出方法は、特に制限されず、公知の方法が採用できる。前記抽出方法としては、例えば、グアニジン−塩化セシウム超遠心法、ＡＧＰＣ（Ａｃｉｄ Ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ−Ｐｈｅｎｏｌ−Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）法等があげられる。

つぎに、抽出した全ＲＮＡにおける本発明の癌マーカー、すなわち、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２およびｈｓａ−ｍｉＲ−４９４の少なくとも一方を検出する。本発明の癌マーカーの検出方法としては、何ら制限されず、前述のようにｍｉＲＮＡの発現を検出できる方法であればよい。前記検出方法の具体例としては、例えば、ノーザンブロット分析、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ検出法、マイクロアレイ解析法等があげられる。なお、本発明においては、癌マーカーである検出対象のｍｉＲＮＡが、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２およびｈｓａ−ｍｉＲ−４９４の少なくとも一方であることが特徴であり、それらを検出するための方法は、何ら制限されず、且つ、技術常識から当業者であれば実施可能である。

ノーザンブロット分析は、例えば、以下のようにプローブを用いて行うことができる。前記プローブとしては、特に制限されず、前述のｍｉＲＮＡを検出可能なプローブが使用でき、例えば、前記ｍｉＲＮＡのいずれかにハイブリダイズ可能なプローブがあげられる。前記プローブは、例えば、市販品を使用してもよいし、自家調製してもよい。プローブの配列は、例えば、前述したｍｉＲＮＡの塩基配列ならびに技術常識に基づいて、適宜設計可能である。具体例としては、検出目的のｍｉＲＮＡに相補的な配列からなるプローブがあげられる。プローブの配列は、例えば、検出目的のｍｉＲＮＡに対して、約７０％以上相補的であることが好ましく、より好ましくは９０％以上であり、特に１００％相補的であることが好ましい。前記プローブの構成単位としては、特に制限されず、例えば、公知の構成単位が採用でき、具体例として、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド等のヌクレオチド、ＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）等の構成単位があげられる。前記ＬＮＡとしては、例えば、２',４'−Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ等のＢＮＡ（Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）等があげられる。前記ヌクレオチドにおける塩基としては、特に制限されず、例えば、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル等の天然塩基でもよいし、非天然塩基（人工塩基）であってもよい。前記プローブの長さは、特に制限されないが、例えば、１０〜１００ｍｅｒであり、好ましくは、１０〜４０ｍｅｒであり、より好ましくは、１０〜２５ｍｅｒであり、好ましくは、１５〜２０ｍｅｒである。

具体例としては、まず、抽出した全ＲＮＡを、電気泳動によって鎖長に応じて分画し、これを電気泳動のゲルからメンブレンに転写する。前記メンブレンとしては、例えば、ニトロセルロースメンブレンやナイロンメンブレン等があげられる。続いて、分画したＲＮＡが転写された前記メンブレンを、^３２Ｐ等の放射性物質等の標識で標識化した前述のプローブと、所定のバッファー中でインキュベートする。そして、前記プローブの標識を検出することによって、前記プローブとハイブリダイズしたｍｉＲＮＡを検出できる。このように、放射性物質で標識したプローブを使用する場合は、例えば、オートラジオグラフィーにより、バンド密度に基づいて、前記プローブとハイブリダイズしたｍｉＲＮＡを定量できる。ノーザンブロット分析の条件は、特に制限されないが、例えば、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションおよび洗浄は、ストリンジェントな条件で行うことが好ましい。ストリンジェントな条件とは、例えば、^３２Ｐで標識化したＤＮＡをプローブとする場合、ハイブリダイゼーションバッファー中で温度３７℃である。前記ハイブリダイゼーションバッファーは、例えば、０．２５ｍｏｌ／Ｌ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、７％ＳＤＳおよび０．５％ピロリン酸ナトリウムを含むバッファーがあげられる。また、洗浄ステップにおいては、２×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳを含む洗浄バッファー中で温度３７℃、さらに、０．１×ＳＳＣを含む洗浄バッファー中で室温である。なお、これには制限されず、検出方法に応じて、それぞれの標準的な条件が採用できる。

リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ検出法は、例えば、以下のように、蛍光試薬を用いて行うことができる。まず、例えば、抽出した全ＲＮＡの５’末端および３’末端にリンカーをライゲーションした後、これを鋳型として、ｃＤＮＡの増幅を行う。さらに、得られたｃＤＮＡを鋳型として、検出目的のｍｉＲＮＡを増幅可能なプライマーを用いて、ＰＣＲを行う。前記プライマーとしては、何ら制限されず、例えば、前述のｍｉＲＮＡまたは前記ｍｉＲＮＡの周辺領域にハイブリダイズ可能なプライマーがあげられる。前記プライマーは、例えば、前述したｍｉＲＮＡの塩基配列ならびに技術常識に基づいて、適宜設計可能である。具体例としては、検出目的のｍｉＲＮＡまたは前記ｍｉＲＮＡの周辺領域に相補的な配列からなるプローブがあげられる。前記プライマーの配列は、例えば、検出目的のｍｉＲＮＡまたは前記ｍｉＲＮＡの周辺領域に対して、例えば、約７０％以上相補的であることが好ましく、好ましくは８０％以上であり、より好ましくは９０％以上であり、さらに好ましくは９５％以上であり、特に１００％相補的であることが好ましい。前記プライマーの構成単位としては、特に制限されず、例えば、前述のプローブと同様である。前記プライマーの長さは、特に制限されず、一般的な長さがあげられる。

前記ＰＣＲの際、例えば、ＰＣＲ反応液に蛍光試薬を共存させることが好ましい。前記蛍光試薬としては、例えば、二本鎖核酸に特異的に結合する蛍光色素、二本鎖核酸にインターカレートする蛍光色素等があげられる。このような蛍光試薬の場合、核酸増幅により二本鎖核酸を形成すると、前記二本鎖核酸に前記蛍光色素が結合またはインターカレートする。そこで、前記二本鎖核酸に結合またはインターカレートした前記蛍光色素の蛍光強度を測定することにより、検出目的のｍｉＲＮＡを定量できる。前記蛍光色素としては、例えば、ＳＹＢＲ（商標）Ｇｒｅｅｎ等があげられる。このようなリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ検出法は、例えば、公知の方法で行うことができる。また、例えば、ＳＹＢＲ（商標）Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲマスターミックス（商品名、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）等の市販の試薬や、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７９００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（商品名、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）等の市販の検出機器を用いて、それらのマニュアルに従って実施することができる。また、前述のプライマーが、前記蛍光試薬を兼ねてもよい。このようなプライマーとしては、例えば、蛍光色素で標識された標識化プライマーであって、蛍光二本鎖核酸を未形成の場合には蛍光色素の発光が消光され、二本鎖核酸を形成すると消光が解除され蛍光を発するプライマーがあげられる。このような標識化プライマーは、例えば、技術常識に基づいて設計可能である。

このような検出方法によって発現量を測定する際には、例えば、後述するように、補正マーカー等の内部標準を測定し、検出目的のｍｉＲＮＡについて、前記内部標準で補正した発現量を算出しておくことが好ましい。

他方、正常者から採取した血漿または血清についても、同様にして、本発明の癌マーカーを検出しておく。この際、被検者の癌マーカーと正常者の癌マーカーとは、同じ種類の癌マーカーであることが好ましい。正常者における本発明の癌マーカーの発現レベルは、例えば、予め、決定しておくことが好ましく、評価の度に正常者の発現レベルを決定する必要はない。すなわち、予め検出しておいた正常者における本発明の癌マーカーの発現レベルを、正常者の標準値として設定しておくことが好ましい。なお、前記正常者の発現レベルは、例えば、１名の正常者の値であってもよいし、複数人の正常者の発現レベルから統計学的手法により算出した値であってもよい。

そして、前記被検者の発現レベルと前記正常者の発現レベルとから、例えば、下記（１）または（２）の方法により、前記被検者の癌の可能性を評価することができる。

（１）の方法では、例えば、前記被検者の前記癌マーカーの発現レベルを、正常者の前記生体試料における前記癌マーカーの発現レベルと比較し、前記正常者の発現レベルよりも有意に低い場合に、前記癌の可能性が高いと決定する。本発明の癌マーカーは、前述のように、例えば、血液において、癌化に伴って発現レベルが低下する。したがって、正常者の発現レベルと同等またはそれよりも高い場合には、前記被検者について、癌化の可能性は低いと判断できる。一方、前記被検者の発現レベルが、前記正常者の発現レベルよりも低ければ、前記被検者について、癌化の可能性が高いと判断できる。

（２）の方法では、例えば、前記被検者の前記癌マーカーの発現レベルを、正常者の前記生体試料における前記癌マーカーの発現レベルと比較し、前記正常者の発現レベルよりも相対的に低い程、前記癌の進行が相対的に進んでいると決定する。本発明の癌マーカーは、前述のように、例えば、血液において、癌化の進行に伴って発現レベルが低下する。したがって、前記被検者の発現レベルが、前記正常者の発現レベルより低く、且つ、両者の差が相対的に小さい程、癌の進行状況が軽く、前記両者の差が相対的に大きい程、癌の進行状況が重いと判断できる。

前記（１）および（２）の方法では、例えば、被検者の発現レベルが、正常者の発現レベルと比較して、例えば、５０％以上低下している場合に、癌の可能性が高いと判断でき、さらに、８５％以上、９０％以上、９５％以上と低下するにしたがって、より進行していると判断できる。なお、後述するように、補正マーカーにより発現レベルを補正した場合も、同様である。

また、正常者の癌マーカーの検出に代えて、または、加えて、進行期別の各癌患者から採取した血清または血漿についても、同様に本発明の癌マーカーを検出してもよい。この際、被検体の癌マーカーと、癌患者の癌マーカーとは、同じ癌マーカーであることが好ましい。患者における本発明の癌マーカーの発現レベルは、予め、決定しておくことが好ましく、また、評価の度に、患者の発現レベルを決定する必要はない。すなわち、予め検出しておいた各癌患者における本発明の癌マーカーの発現レベルを、各進行期の標準値として設定しておくことが好ましい。なお、前記癌患者の発現レベルは、例えば、１名の癌患者の値であってもよいし、複数人の癌患者の発現レベルから統計学的手法により算出した値であってもよい。

そして、前記被検者の発現レベルと各癌患者の発現レベルとから、例えば、下記（３）の方法により、前記被検者の癌の可能性を評価することができる。

（３）の方法では、例えば、前記被検者の前記癌マーカーの発現レベルを、進行期別の各癌患者の前記生体試料における前記癌マーカーの発現レベルと比較し、同程度の発現レベルを示す患者と同じ進行期であると決定する。本発明の癌マーカーは、前述のように、血液において、癌化の進行に伴って発現レベルが低下する。したがって、進行期別の各癌患者について発現レベルを決定することで、これとの対比により、前記被検者の癌化の可能性だけでなく、その癌の進行期を評価することが可能である。

前記（１）〜（３）に示すように、前記被検者と正常者または癌患者との発現レベルを比較する際、その有意差は、例えば、Ｔ−ｔｅｓｔ（Ｔ検定）、Ｆ検定、カイ二乗検定等の統計学的手法により判断することができる。

また、本発明の評価方法の信頼性を向上するために、前述のように、本発明の癌マーカーの発現レベルを補正して、評価を行ってもよい。

補正した発現レベルとは、前述のように、例えば、生体試料における癌マーカーの発現量と、補正マーカーの発現量との比で表わすことができ、具体例として、「癌マーカーの発現量／補正マーカーの発現量」で表わすことができる。そして、前記（１）または（２）の方法においては、例えば、前記被検者について算出した比と、前記正常者について算出した比とを比較すればよい。さらに、両者の比較を容易にするために、例えば、前記正常者について算出した比を「１」として、これに対する、前記被検者について算出した比の相対値を求めることが好ましい。これによって、前記被検者の算出値が「１」よりも小さいか大きいかによって、より容易な判断が可能となる。また、前記（３）の方法においても、例えば、前記被検者について算出した比と、前記進行期別の癌患者について算出した比とを比較すればよい。

このような評価方法によれば、例えば、判断が困難であった癌の前臨床期の被検者についても、高い信頼性で、癌の可能性が高いと判断することができる。また、例えば、癌の進行期についても、高い信頼性で判断することができる。このため、癌の予防や治療において、例えば、投薬や手術等の方針を決定するための重要な情報を、高い信頼性で得ることができる。

＜評価試薬＞
本発明の評価試薬は、前述のように、本発明の評価方法に使用するための評価試薬であって、本発明の癌マーカーの検出試薬、すなわち、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２およびｈｓａ−ｍｉＲ−４９４の少なくとも一方のｍｉＲＮＡを検出するためのｍｉＲＮＡ検出試薬を含むことを特徴とする。このような評価試薬によれば、本発明の評価方法を簡便に実施できる。

本発明は、前述のように、癌のマーカーとして、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２およびｈｓａ−ｍｉＲ−４９４の少なくとも一方を検出することが特徴であって、これらのｍｉＲＮＡの検出方法は何ら制限されない。したがって、本発明の評価試薬に含まれる前記ｍｉＲＮＡ検出試薬は、これらのｍｉＲＮＡのいずれかを検出できればよく、例えば、その試薬の種類や組成等は、何ら制限されない。また、当業者であれば、技術常識に基づいて、これらのｍｉＲＮＡの検出試薬を設定できる。

本発明の評価試薬は、例えば、各種検出方法に応じて、さらに、各種酵素、緩衝液、洗浄液、溶解液、分散液、希釈液等を含んでもよい。また、本発明の評価試薬の形態は、特に制限されず、例えば、液体状態のウェット系であってもよいし、乾燥状態のドライ系であってもよい。

前記ｍｉＲＮＡ検出試薬としては、特に制限されないが、例えば、前述のようなノーザンブロット分析やリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ検出法に使用する試薬があげられる。ノーザンブロット分析に使用するｍｉＲＮＡ検出試薬の具体例としては、例えば、前述のような、これらのｍｉＲＮＡのうちいずれかにハイブリダイズ可能な標識化プローブがあげられる。また、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ検出法の試薬の具体例としては、前述のような、全ＲＮＡからｃＤＮＡを増幅するためのプライマー、これらのｍｉＲＮＡのうちいずれかを増幅するためのプライマー、二本鎖核酸に特異的に結合またはインターカレートする蛍光試薬、核酸増幅に使用できる各種試薬等があげられる。前記各種試薬としては、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ等の酵素、ヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）等があげられる。

＜評価キット＞
本発明の評価キットは、前述のように、本発明の評価方法に使用するための評価キットであって、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２およびｈｓａ−ｍｉＲ−４９４の少なくとも一方のｍｉＲＮＡを検出するｍｉＲＮＡ検出試薬（例えば、本発明の評価試薬）を含むことを特徴とする。このような評価キットによれば、本発明の評価方法を簡便に行うことができる。なお、本発明の評価キットにおいて、本発明の評価試薬は、例えば、前述の通りである。

本発明の評価キットは、さらに、補正マーカーを検出する補正マーカー検出試薬を含むことが好ましい。前記補正マーカーの検出試薬は、特に制限されず、前述のような補正マーカーの種類、補正マーカーの検出方法等に応じて、適宜決定できる。前述のように、本発明の評価方法における前記補正マーカーは、本発明の補正マーカーが好ましいことから、前記補正マーカー検出試薬としては、例えば、本発明の補正マーカーを検出する試薬、つまり、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８を検出するｍｉＲＮＡ検出試薬であることが好ましい。このｍｉＲＮＡ検出試薬は、特に制限されないが、本発明の癌マーカー検出試薬と同様に、例えば、ノーザンブロット分析やリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ検出法に使用する試薬があげられる。

本発明の評価キットの形態は、特に制限されず、液体状態のウェット系でもよいし、乾燥状態のドライ系であってもよい。本発明の評価キットにおける各種試薬は、例えば、それぞれ別個であり使用時に併用してもよいし、使用時前から混合されてもよい。

本発明の評価キットは、例えば、前述の本発明の評価試薬や、その他の各種試薬を配置した検査用具であってもよい。前記検査用具の形態としては、特に制限されないが、例えば、マイクロリアクター等のリアクター、マイクロチップ等のチップ、マイクロタイタープレート等のプレート、マイクロアレイ等のアレイ等があげられる。このような検査用具であれば、例えば、リアルタイムＰＣＲ装置等の既存の各種検出機器で、必要なシグナルを検出することによって、本発明の評価方法を容易に実行できる。さらに、例えば、コンピュータ処理によって、検出したシグナルの数値化、前述のような補正マーカーの発現レベルによる測定シグナル値の補正、被検者ごとのデータファイルの作成、データファイルの所定のディレクトリへの保存、被検者、正常者および患者の測定結果の統計解析等を行うシステムを伴ってもよい。このようなデータ処理のシステムは、当業者であれば、技術常識に基づいて、既存の技術、方式、手順から設計できる。

本発明の評価キットは、例えば、さらに、本発明の評価方法を実行するために使用できる各種機器等を含んでもよい。また、本発明の評価キットは、さらに、例えば、使用説明書を含むことが好ましい。

＜補正マーカー＞
本発明の補正マーカーは、前述のように、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８を含み、本発明の評価方法において、生体試料における本発明の癌マーカーの発現レベルを補正するためマーカーであることを特徴とする。

本発明者らは、生体試料において、内部標準となる新たな補正マーカーを得るべく鋭意研究を行った。その結果、前述のような、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８が、生体試料中、特に血液試料中で、恒常的に発現することを見出し、本発明に到った。なお、補正マーカーとなるｍｉＲＮＡは、これまで報告されておらず、本発明者らにより見出されたこれらのｍｉＲＮＡが、初めての報告となる。このような補正マーカーによれば、例えば、検出目的の本発明の癌マーカーについて、被検者間の比較や、同じ被検者の経時的な比較を、より優れた信頼性で行うことができる。なお、本発明の補正マーカーにおけるｍｉＲＮＡは、前述の通りである。

本発明の補正マーカーは、生体試料中に存在するｍｉＲＮＡであり、前記生体試料は、特に制限されない。前記生体試料としては、特に制限されないが、例えば、前述のように、血液、唾液、尿等があげられる。中でも、癌であるか否かにかかわらず発現が恒常的に保たれていることから、前述のような血液試料が好ましい。前記血液試料の中でも、例えば、血漿を含む試料、血清を含む試料、または、血漿および血清を含む試料等がより好ましい。

本発明の補正マーカーは、生体試料中における検出対象マーカーの発現レベルの補正に使用でき、具体的には、本発明の癌マーカーの発現レベルの補正に使用することが好ましい。本発明の補正マーカーは、例えば、癌か否かにかかわらず恒常的に存在することから、前記検出対象マーカーの種類は、本発明の癌マーカーには制限されず、例えば、その他に、癌の発症で発現レベルが変化する癌マーカーであってもよい。なお、検出対象マーカーは、例えば、疾患によって生体試料中の発現レベルが変動するマーカーであってもよい。

＜補正マーカーによる補正方法＞
本発明の補正方法は、前述のように、本発明の評価方法において、生体試料における本発明の癌マーカーの発現レベルを補正するために、
生体試料における前記本発明の癌マーカーの発現レベルを測定する工程と、
前記生体試料における前記補正マーカーの発現量を測定する工程と、
前記癌マーカーの発現量と前記補正マーカーの発現量との比を、前記生体試料における前記癌マーカーの補正した発現レベルとする補正工程とを含むことを特徴とする。

本発明の補正方法によれば、前記補正マーカーが生体試料中に恒常的に存在することから、生体試料中における本発明の癌マーカーの発現レベルを補正することで、例えば、被検体間の比較や、同じ検体間の経時的な発現レベルの比較等を、より優れた信頼性で行うことが可能となる。

なお、前述のように、本発明の補正マーカーを用いた補正方法は、例えば、本発明の癌マーカーには制限されず、生体試料における他の検出目的のマーカーに対しても使用可能である。前記補正マーカーは、例えば、癌か否かにかかわらず恒常的に存在することから、前記検出対象マーカーとしては、癌の発症で発現レベルが変化する癌マーカーが好ましい。具体例としては、前記本発明の癌マーカーの他に、例えば、ｍｉＲ−１６−１−１５ａ、ｍｉＲ−１４５、ｌｅｔ−７ family、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１７−９２ cluster、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ１０−ｂ、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８１ｂ、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ１３３ｂ、ｍｉＲ−３１、ｍｉＲ−１３５ｂ、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−１８、ｍｉＲ−２２４、ｍｉＲ−１９９ａ、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−２００ａ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１６−１、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−３７２、ｍｉＲ−３７３、ｍｉＲ−１４６ｂ、ｍｉＲ−１９７、ｍｉＲ−３４６等があげられる。

本発明においては、本発明の補正マーカーによって、本発明の癌マーカーの発現量を補正する点が特徴である。このため、本発明の癌マーカーおよび本発明の補正マーカーの発現量の測定方法は、何ら制限されない。本発明の補正マーカーに関しては、例えば、前述のように、本発明の癌マーカーと同様、各ｍｉＲＮＡを検出できる手法であればよい。

＜補正試薬＞
本発明の補正試薬は、前述のように、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８を検出するｍｉＲＮＡ試薬を含み、本発明の評価方法において、生体試料における本発明の癌マーカーの発現レベルを補正するために使用することを特徴とする。このような補正試薬によれば、本発明の補正方法を簡便に実施できる。

本発明は、前述のように、補正マーカーとして、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８を検出することが特徴であって、このｍｉＲＮＡの検出方法は、何ら制限されない。したがって、本発明の補正試薬に含まれるｍｉＲＮＡ検出試薬は、前述のように、このｍｉＲＮＡのいずれかを検出できればよく、例えば、その試薬の種類や組成等は、何ら制限されない。また、当業者であれば、技術常識に基づいて、このｍｉＲＮＡを検出するｍｉＲＮＡ検出試薬を適宜設定できる。

本発明の補正試薬は、例えば、前記ｍｉＲＮＡに対する各種検出方法に応じて、各種酵素、緩衝液、洗浄液、溶解液、分散液、希釈液等を含んでもよい。また、本発明の補正試薬の形態は、特に制限されず、例えば、液体状態のウェット系であってもよいし、乾燥状態のドライ系であってもよい。

前記ｍｉＲＮＡ検出試薬としては、特に制限されないが、例えば、前述のような、ノーザンブロット分析やリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ検出法に使用する試薬があげられる。ノーザンブロット分析に使用するｍｉＲＮＡ検出試薬の具体例としては、例えば、前述のような、これらのｍｉＲＮＡのうちいずれかにハイブリダイズ可能な標識化プローブがあげられる。また、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ検出法の試薬の具体例としては、前述のような、全ＲＮＡからｃＤＮＡを増幅するためのプライマー、これらのｍｉＲＮＡのうちいずれかを増幅するためのプライマー、二本鎖核酸に特異的に結合またはインターカレートする蛍光試薬、核酸増幅に使用できる各種試薬等があげられる。前記各種試薬としては、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ等の酵素、ヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）等があげられる。

つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記の実施例により制限されない。

［実施例１］
下記表に示す正常者および癌患者より採血し、血清および血漿を含む画分（以下、サンプルという）を分離した。得られた前記サンプルから、商品名Ｉｓｏｇｅｎ−ＬＳ（ニッポンジーン社）を用いて全ＲＮＡを抽出し、全ＲＮＡ濃度を１００ｎｇ／μＬとなるように調製した。そして、全ＲＮＡを、仔牛小腸由来アルカリホスファターゼ（商品名Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｃａｌｆ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）（ＣＩＡＰ）、タカラバイオ社）を用いて脱リン酸化反応を行った後、リガーゼ（商品名Ｔ４ ＲＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（Ｃｌｏｎｅｄ）、アンビオン社）を用いて、シアニン色素でラベル化した。なお、これらの操作は、キット（商品名ｍｉＲＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、カタログＮｏ．５１９０−０４０８、アジレント・テクノロジー社）を用いて、添付のプロトコールに従って行った。さらに、マイクロアレイスライド（商品名Ｈｕｍａｎ ｍｉＲＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｋｉｔ ８×１５Ｋ Ｖ２、カタログＮｏ．Ｇ４４７０Ｂ、アジレント・テクノロジー社）を用いて、シアニンラベル化全ＲＮＡのハイブリダイゼーションを行い、シグナルを、スキャナー（商品名ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｃａｎｎｅｒ、アジレント・テクノロジー社）を用いてスキャニングした。シグナルの検出には、前記スキャナーに付属のソフトウェア「Ｆｅａｔｕｒｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ９．５．３ ＳｏｆｔｗａｒｅおよびＡｇｉｌｅｎｔ Ｓｃａｎ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖｅｒ．７．０）」を用いた。

このようにして、各被検者の前記サンプルにおける、癌マーカーｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａならびにｈｓａ−ｍｉＲ−４９４、および、補正マーカーｈｓａ−ｍｉＲ−６３８の発現レベルを示すシグナル値を得た。さらに、各被検者について、下記（Ａ）および（Ｂ）を算出した。
（Ａ）下記式に示す、癌マーカー発現レベルと補正マーカー発現レベルの比
ｈａｓ−ｍｉＲ−９２ａ/ｈａｓ−ｍｉＲ−６３８（以下、「92a/638」）
ｈａｓ−ｍｉＲ−４９４/ｈａｓ−ｍｉＲ−６３８（以下、「494/638」）
（Ｂ）下記式に示す、各被検者の前記比「９２ａ/６３８」および「４９４/６３８」を、それぞれ、さらに正常者（ＢＳ６３）の比「９２ａ/６３８」および「４９４/６３８」で割った相対値
［被検者９２ａ/６３８］/［正常者９２ａ/６３８］
（以下、「92a/638/BS63」）
［被験者４９４/６３８］/［正常者４９４/６３８］
（以下、［494/638/BS63］）

これらの結果を下記表１および表２に、それぞれ示す。表１は、癌マーカーがｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ、補正マーカーがｈｓａ−ｍｉＲ−６３８である結果を示し、表２は、癌マーカーがｈｓａ−ｍｉＲ−４９４、補正マーカーがｈｓａ−ｍｉＲ−６３８である結果を示す。

前記表１に示すように、癌マーカーとしてｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａを検出し、補正マーカーｈｓａ−ｍｉＲ−６３８で補正した結果、正常者の発現レベル９２ａ／６３８／ＢＳ６３「１．０」と比較して、癌患者の発現レベル９２ａ／６３８／ＢＳ６３は、０．０２２〜０．６６５と極めて顕著に低下していることがわかった。また、表２に示すように、癌マーカーとしてｈｓａ−ｍｉＲ−４９４を検出し、補正マーカーｈｓａ−ｍｉＲ−６３８で補正した結果、正常者の発現レベル４９４／６３８／ＢＳ６３「１．０」と比較して、癌患者の発現レベル４９４／６３８／ＢＳ６３は、０．０３〜０．０８６と極めて顕著に低下していることがわかった。以上の結果から、本発明の癌マーカーの検出によって、高い信頼性で癌化の有無を判断できることがわかった。

［実施例２］
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者（ｎ＝２）および正常者（ｎ＝７）より採血し、１５，６８０ｍ／ｓ^２、１５分間の遠心により血清および血漿を含む画分（以下、「サンプル」という）を回収した。これらのサンプルを使用した以外は、実施例１と同様にして、マイクロアレイ解析により、各サンプル中のｍｉＲＮＡの発現解析を行った。そして、正常者由来の各サンプルについて、発現した各種ｍｉＲＮＡのシグナル値順位（Individual rank_Normal）の決定、正常者由来のサンプル間における、各種ｍｉＲＮＡのシグナル値平均順位（Average rank_Normal）の決定を行った。また、サンプル間における各ｍｉＲＮＡの発現の変動を確認するため、正常者由来の各サンプルにおける各種ｍｉＲＮＡのシグナル値を、前記正常者由来のサンプル間における各種ｍｉＲＮＡのシグナル値平均順位で割り、その対数（log₁₀(individual rank_Normal/Average rank_Normal]）を求めた（底は１０）。

これらの結果を用いて、まず、正常者由来の７検体のサンプルについて、各種ｍｉＲＮＡの発現プロファイルを比較した。この結果を図１（ａ）および（ｂ）に示す。同図（ａ）は、前記７検体の各サンプルについて、サンプルに含まれる各種ｍｉＲＮＡのシグナル強度値を示す図である。同図において、横軸の１〜７は、各検体を示し、縦軸は、シグナル強度を示す。なお、同図においては、「ｈｓａ−ｍｉＲ」を「ｍｉＲ」で示す（以下、同様）。同図（ｂ）は、各ｍｉＲＮＡについて、各正常者７名の順位を平均順位で割った値の対数値（log₁₀(individual rank_Normal/Average rank_Normal]）を示す。同図（ｂ）において、横軸は、各ｍｉＲＮＡを示し、縦軸は、前記対数値を示す。

その結果、図１（ａ）に示すように、正常者由来の７検体のサンプルのいずれにおいても、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８およびｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａの発現が確認され、さらに、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８が最も高い発現を示すことがわかった。また、図１（ｂ）に示すように、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８について、前述のシグナル値順位に関する対数値は、０であった。この対数値は、例えば、正常者の各サンプルにおいて、ｍｉＲＮＡの発現プロファイルが異なる挙動を示す程、０を中心として、絶対値が大きく変動する。しかしながら、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８については、「０」であったことから、いずれの正常者のサンプルにおいても、同様の発現プロファイルを示すことがわかった。以上の結果から、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８は、サンプルにおけるｍｉＲＮＡの定量において、補正マーカーとなることが確認された。

つぎに、ＡＭＬ患者由来のサンプルについて、サンプル間における、各種ｍｉＲＮＡのシグナル値平均順位（Average rank_AML）の決定を行った。そして、２名のＡＭＬ患者由来のサンプル間における各種ｍｉＲＮＡのシグナル値平均順位（Average rank_AML）を、７名の正常者由来のサンプル間における各種ｍｉＲＮＡのシグナル値平均順位（Average rank_Normal）で割り、ＡＭＬ患者由来のサンプルにおける各種ｍｉＲＮＡの発現プロファイルを比較した。この結果を図２に示す。図２は、前記ＡＭＬ患者由来のサンプル間におけるｍｉＲＮＡのシグナル値平均順位と、正常者由来のサンプル間におけるｍｉＲＮＡのシグナル値平均順位との比（Average rank_AML/Average rank_Normal）を示すグラフであり、値が大きいほど、患者と正常者とで発現プロファイルが異なることを意味する。同図において、縦軸は、Average rank_AML/Average rank_Normalを示し、横軸は、各ｍｉＲＮＡを示す。

同図に示すように、ＡＭＬ患者におけるｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａのシグナル値平均順位は、正常者におけるシグナル値平均順位の約２０倍であり、ＡＭＬ患者においてｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａの発現が顕著に減少していることが示された。この結果から、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａは、ＡＭＬについての癌マーカーとなることが確認できた。

［実施例３］
男性３９名、女性３８名の合計７７名の被検者より、前記実施例２と同様にして血漿および血清を含む画分（以下、サンプルという）を回収した。前記被検者のうち、正常者は１６名、急性白血病患者は６１名であり、前記急性白血病患者のＦＡＢ分類は、以下の通りである。
ＡＭＬ Ｍ０ ２ （３．２％）
ＡＭＬ Ｍ１ １１（１８．０％）
ＡＭＬ Ｍ２ １９（３１．１％）
ＡＭＬ Ｍ３ １０（１６．３％）
ＡＭＬ Ｍ４ ３ （４．９％）
ＡＭＬ Ｍ４Ｅ １ （１．６％）
ＡＭＬ Ｍ５ １ （１．６％）
ＡＭＬ Ｍ５ｂ １ （１．６％）
ＡＭＬ Ｍ６ １ （１．６％）
ＡＭＬ Ｍ７ ２ （３．２％）
ＡＭＬ（多血球系異形成を伴うもの） ３ （４．９％）
ＡＬＬ Ｌ２ ２ （３．２％）
ＡＬＬ ｐｈ＋ １ （１．６％）
ＡＬＬ ｐｒｅＢ ４ （６．５％）

前記各サンプルについて、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａおよびｈｓａ−ｍｉＲ−６３８の発現レベルを、市販のＴａｑＭａｎ（商標）ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ａｓｓａｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いた定量的ＲＴ−ＰＣＲにより解析した。なお、特に示さない限り、使用した市販試薬の使用説明書にしたがって解析を行った。

まず、前記全ＲＮＡは、前記各被検者由来のサンプルから、前記実施例２と同様にして単離した。２０ｎｇの前記全ＲＮＡを鋳型として、商品名ＴａｑＭａｎ（商標）ＭｉｃｒｏＲＮＡ ＲＴ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、逆転写反応を行った。具体的には、全ＲＮＡ２０ｎｇ（インプットＲＮＡ）を添加した下記組成の逆転写反応液１５μＬを、１６℃で３０分、４２℃で３０分および８５℃で５分インキュベートして逆転写反応を行った。なお、下記反応液において、下記ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ用プライマーおよびｈｓａ−ｍｉＲ−６３８用プライマーは、それぞれ、ｍｉＲＮＡ特異的ステムループプライマー（Ｌｏｏｐｅｄ ＲＴ ｐｒｉｍｅｒ）である。具体的に、下記ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ用プライマーは、ＴａｑＭａｎ（商標）ＭｉｃｒｏＲＮＡ ＡｓｓａｙのＡｓｓａｙＮａｍｅ ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ 品番４３７３０１３（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用し、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８用プライマーは、ＴａｑＭａｎ（商標）ＭｉｃｒｏＲＮＡ ＡｓｓａｙのＡｓｓａｙＮａｍｅ ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８ 品番４３８０９８６（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用した。

続いて、前記逆転写反応の転写産物を鋳型とし、Ｍｘ３００５Ｐ（商標）ＱＰＣＲシステム（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を用いて、定量的リアルタイムＰＣＲを行った。前記逆転写産物としては、前述の逆転写反応後の反応液とヌクレアーゼフリーの水とを１：２（体積比）で混合希釈した転写産物希釈液１μＬを使用した。具体的には、前記希釈液１μＬを添加した下記組成のＰＣＲ反応液２０μＬを、９５℃で２分処理した後、９５℃１５秒および６０℃１分を１サイクルとして、５０サイクルインキュベートした。下記ＰＣＲ反応液において、下記ｂｕｆｆｅｒは、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ検出用の前記ＴａｑＭａｎ（商標）ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ａｓｓａｙ（ＡｓｓａｙＮａｍｅ ｈｓａ−ｍｉＲ−９２：品番４３７３０１３：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）におけるプライマーセットおよびＴａｑＭａｎ（商標）Ｐｒｏｂｅ、または、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８検出用の前記ＴａｑＭａｎ（商標）ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ａｓｓａｙ（ＡｓｓａｙＮａｍｅ ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８：品番４３８０９８６：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）におけるプライマーセットおよびＴａｑＭａｎ（商標）Ｐｒｏｂｅを、それぞれ含む。なお、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ検出用の前記プローブおよびｈｓａ−ｍｉＲ−６３８検出用の前記プローブは、それぞれ、５’がＦＡＭ、３’がＴＡＭＲＡで標識化されている。

定量的ＲＴ−ＰＣＲのデータは、ＭｘＰｒｏ−Ｍｘ３００５Ｐ（商標）ｖｅｒｓｉｏｎ ３．００（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）で解析し、ベースライン適合およびＣｔ決定のスレッシュホールドのための自動Ｃｔセッティングも行った。そして、各被検体由来のサンプルについて、癌マーカーｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａを示す蛍光強度と補正マーカーｈｓａ−ｍｉＲ−６３８を示す蛍光強度の比（ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ／ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８）を求め、さらに、マンホイットニーＵ検定を行って、正常者由来サンプルと急性白血病患者由来サンプルとの間における前記比の統計的有意性を確認した。

これらの結果を図３に示す。図３は、正常者由来サンプルと急性白血病患者由来サンプルについての前記蛍光強度比（ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ／ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８）を示すグラフである。同図に示すように、正常者由来のサンプルについては、前記蛍光強度比が、中央値０．４６７２、２５％０．００５１、７５％０．０１３８、最高値２．３３８８、最低値０．０１８９、平均値０．７４５８７であった。一方、急性白血病患者由来のサンプルについては、前記蛍光強度比が、中央値０．０１２９、２５％０．００５８、７５％０．０２７４、最高値０．１０８５、最低値０．０００４、平均値０．０２０５８５であった。この結果から、前記患者のサンプルにおいて、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａの発現が著しく減少していることがわかった。また、正常者と急性白血病患者との間の差の統計的有意性を示すＰ値は、２．０×１０^−８であり、十分に有意性を示すことがわかった。以上の結果から、血清または血漿におけるｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａは、急性白血病に関する非常に感度の高いマーカーであることが示された。

［実施例４］
２名の膵臓癌患者について、手術前および手術後に、前記実施例３と同様にして、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａおよびｈｓａ−ｍｉＲ−６３８を測定し、蛍光強度比（ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ／ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８）を算出した。その結果、手術前の蛍光強度比を１とした場合、手術後の蛍光度比の相対値は、２名の患者それぞれ、２．６７および１．４０であった。この結果から、膵臓癌を発症している際には、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａの発現量が低下し、治療後には、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａの発現量が増加することがわかる。つまり、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａの発現量によって、膵臓癌を発症しているか否かを判断することができるといえる。

同様に、４名の肝臓癌患者についても、手術前および手術後に、前記実施例３と同様にして、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａおよびｈｓａ−ｍｉＲ−６３８を測定し、蛍光強度比（ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ／ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８）を算出した。その結果、手術前の蛍光強度比を１とした場合、手術後の蛍光度比の相対値は、４名の患者それぞれ、６．１３、１２．６、１５６．５２、および１２．１２であった。この結果から、肝臓癌を発症している際には、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａの発現量が低下し、治療後には、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａの発現量が増加することがわかる。つまり、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａの発現量によって、肝臓癌を発症しているか否かを判断することができるといえる。なお、他の癌についても同様の結果が得られた。

本発明によれば、生体試料中の本発明の癌マーカーの発現レベルを検出することによって、例えば、癌の発生の有無や進行を高い信頼性で判断することが可能となる。また、本発明の癌マーカーによれば、例えば、癌化について陰性と陽性の差が顕著であることから、一般的な触診等では検出が困難である初期段階の癌についても、検出が可能である。

Claims (10)

1. 生体試料における癌マーカーの発現レベルを検出する癌マーカー検出工程と、
   前記生体試料における補正マーカーの発現レベルを検出する補正マーカー検出工程と、
   前記生体試料における、前記生体試料における癌マーカーの発現量と前記生体試料における補正マーカーの発現量との比（癌マーカーの発現量／補正マーカーの発現量）で表される前記癌マーカーの補正した発現レベルから、下記（１）、（２）および（３）からなる群から選択された少なくとも一つの方法により、癌の可能性を決定する工程とを含み、
   前記生体試料が、血漿または血清であり、
   前記癌マーカーが、血漿中または血清中のｈｓａ−ｍｉＲ−９２およびｈｓａ−ｍｉＲ−４９４の少なくとも一方のｍｉＲＮＡであり、
   前記補正マーカーが、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８であることを特徴とする、乳癌を除く癌の可能性を評価する評価方法（ただし、医師の判断工程を含む方法は除く）。
   （１）被検者の生体試料における前記癌マーカーの補正した発現レベルを、正常者の生体試料における前記癌マーカーの補正した発現レベルと比較し、前記正常者の補正した発現レベルよりも低い場合に、前記被検者は、前記癌の可能性が高いと決定する。
   （２）被検者の生体試料における前記癌マーカーの補正した発現レベルを、正常者の生体試料における前記癌マーカーの補正した発現レベルと比較し、前記正常者の補正した発現レベルよりも相対的に低い程、前記被検者は、前記癌の進行が相対的に進んでいると決定する。
   （３）被検者の生体試料における前記癌マーカーの補正した発現レベルを、進行期別の各癌患者の生体試料における前記癌マーカーの補正した発現レベルと比較し、前記被検者は、同程度の補正した発現レベルを示す患者と同じ進行期であると決定する。
2. 前記ｈｓａ−ｍｉＲ−９２が、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａである、請求項１記載の評価方法。
3. 前記ｍｉＲＮＡが、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａおよびｈｓａ−ｍｉＲ−４９４の少なくとも一方である、請求項１記載の評価方法。
4. 前記癌が、大腸癌、胆嚢癌、胃癌、肺癌、白血病、膵癌、前立腺癌、膀胱癌、腎癌、子宮体癌、子宮頚癌、肝細胞癌、胆道癌、脳腫瘍、喉頭癌、舌癌、直腸癌および骨肉腫からなる群から選択された少なくとも一つの癌である、請求項１から３のいずれか一項に記載の評価方法。
5. 癌マーカーであるｈｓａ−ｍｉＲ−９２およびｈｓａ−ｍｉＲ−４９４の少なくとも一方のｍｉＲＮＡを検出するｍｉＲＮＡ検出試薬と、補正マーカーであるｈｓａ−ｍｉＲ−６３８を検出する補正マーカー検出試薬とを含み、請求項１から４のいずれか一項に記載の評価方法に使用することを特徴とする、乳癌を除く癌の可能性を評価するための評価試薬。
6. 前記ｈｓａ−ｍｉＲ−９２が、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａである、請求項５記載の評価試薬。
7. 前記ｍｉＲＮＡが、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａおよびｈｓａ−ｍｉＲ−４９４の少なくとも一方である、請求項５記載の評価試薬。
8. 請求項５から７のいずれか一項に記載の評価試薬を含み、
   請求項１から４のいずれか一項に記載の評価方法に使用することを特徴とする、乳癌を除く癌の可能性を評価するための評価キット。
9. 請求項１から４のいずれか一項に記載の評価方法において、血漿中または血清中の癌マーカーであるｈｓａ−ｍｉＲ−９２およびｈｓａ−ｍｉＲ−４９４の少なくとも一方の発現レベルを補正するためのマーカーであり、血漿中または血清中のｈｓａ−ｍｉＲ−６３８であることを特徴とする、補正マーカー。
10. 請求項１から４のいずれか一項に記載の評価方法において、癌マーカーであるｈｓａ−ｍｉＲ−９２およびｈｓａ−ｍｉＲ−４９４の少なくとも一方のｍｉＲＮＡの発現レベルを補正するために、
    生体試料における前記癌マーカーの発現レベルを測定する工程と、
    前記生体試料における補正マーカーの発現量を測定する工程と、
    前記癌マーカーの発現量と前記補正マーカーの発現量との比（癌マーカーの発現量／補正マーカーの発現量）を、前記生体試料における前記癌マーカーの補正した発現レベルとする補正工程とを含み、
    前記生体試料が、血漿または血清であり、
    前記補正マーカーが、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８であることを特徴とする、生体試料における癌マーカーの発現レベルの補正方法。

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