HUT78054A - Emlőseredetű telomeráz RNS-összetevője - Google Patents

Emlőseredetű telomeráz RNS-összetevője Download PDF

Info

Publication number
HUT78054A
HUT78054A HU9700035A HU9700035A HUT78054A HU T78054 A HUT78054 A HU T78054A HU 9700035 A HU9700035 A HU 9700035A HU 9700035 A HU9700035 A HU 9700035A HU T78054 A HUT78054 A HU T78054A
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
telomerase
rna component
sequence
human
cells
Prior art date
Application number
HU9700035A
Other languages
English (en)
Inventor
William H. Andrews
Junli Feng
Walter Funk
Bryant Villeponteau
Original Assignee
Geron Corporation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US08/330,123 external-priority patent/US5583016A/en
Priority claimed from US08/472,802 external-priority patent/US5958680A/en
Priority claimed from US08/482,115 external-priority patent/US5776679A/en
Application filed by Geron Corporation filed Critical Geron Corporation
Publication of HUT78054A publication Critical patent/HUT78054A/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B29—WORKING OF PLASTICS; WORKING OF SUBSTANCES IN A PLASTIC STATE IN GENERAL
    • B29C—SHAPING OR JOINING OF PLASTICS; SHAPING OF MATERIAL IN A PLASTIC STATE, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; AFTER-TREATMENT OF THE SHAPED PRODUCTS, e.g. REPAIRING
    • B29C59/00—Surface shaping of articles, e.g. embossing; Apparatus therefor
    • B29C59/02—Surface shaping of articles, e.g. embossing; Apparatus therefor by mechanical means, e.g. pressing
    • B29C59/04—Surface shaping of articles, e.g. embossing; Apparatus therefor by mechanical means, e.g. pressing using rollers or endless belts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12Y207/07049—RNA-directed DNA polymerase (2.7.7.49), i.e. telomerase or reverse-transcriptase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C12N2310/111—Antisense spanning the whole gene, or a large part of it
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
    • C12N2310/121—Hammerhead
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/13—Decoys
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/15—Nucleic acids forming more than 2 strands, e.g. TFOs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Mechanical Engineering (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Shaping Of Tube Ends By Bending Or Straightening (AREA)
  • Extrusion Moulding Of Plastics Or The Like (AREA)

Description

DANUBIA SZABADALMI ÉS VÉDJEGY IRODA Kft.
Emlőseredetű telomeráz RNS-összetevője
A találmány tárgyát a humán telomeráz, a humán telomerDNS szintézisében szerepet játszó ribonukleoprotein-enzim képezi.
A találmány tárgyát képezik továbbá: emlőstelomeráz RNS-összetevője, az RNS-összetevő szekvenciájával megegyező vagy azzal komplementer oligonukleotidok, az előbbi oligonukleotidokat tartalmazó rekombináns expressziós plazmidok, a rekombináns expressziós plazmidokkal transzformáit gazdasejtek, rekombináns telomeráz enzim előállítására szolgáló eljárások, humán telomeráz-RNS-összetevőt tartalmazó készítmények, mutációt hordozó, emlőstelomerázRNS-összetevő-polinukleotidok azonosítására alkalmazható eljárások, feltételezett telomeráz-módosító hatóanyagok azonosítására szolgáló eljárások, humán sejtekben telomeráz-aktivitás gátlására alkalmazható eljárások, betegben telomeráz-aktivitással kapcsolatos állapotok, ezen belül neopláziás (daganatképződéssel járó) állapotok kimutatására szolgáló eljárások, sejtben vagy sejtmintában emlőstelomeráz-RNS-összetevő jelenlétének kimutatására szolgáló eljárások.
Aktaszámunk: 85078-6510/PÁ *'
A találmány tárgyához tartoznak ezen felül, a molekuláris biológia, kémia, gyógyszerészet valamint orvosi és diagnosztikai technológia területén hasznosítható, tárgy szerinti eljárások és készítmények.
Az eukarioták kromoszómáinak végein, azaz telomerjein található DNS-t, rendszerint tandem ismétlődő egyszerű szekvenciák alkotják. A telomeráz egy ribonukleoproteinenzim, amely a telomer-DNS egyik szálát szintetizálja; ehhez a templátot az enzim RNS-összetevőjében található szekvencia szolgáltatja [lásd: Blackburn, Annu. Rév. Biochem. 61, 113 (1992), amely teljes terjedelmében a kitanítás részét képezi] .
A humán telomeráz-RNS-összetevőjét ismertető közlemény napjainkig nem jelent meg a tudományos szakirodalomban, bár ismert, hogy a humán telomeráz [ 5' -TTAGGG-3' ] -szekvenciával rendelkező telomer ismétlődő egységeket képes szintetizálni. [Lásd: Morin és mtsai.: Cell 59, 521 (1989); és Morin: Natúré 353, 454 (1991); amelyek teljes terjedelmük a kitanítás részét képezik.] Ez az ismeret nem volt elegendő ahhoz, hogy a humán telomeráz-RNS-összetevő nukleotid szekvenciájának további részeit izoláljuk és azonosítsuk. A Saccharmyces cerevisiae, bizonyos Tetrahymena fajok, valamint más csillósok (ciliata), például az Euplotes és Glaucoma telomeráz enzimjének RNS-összetevőjét szekvenálták, és közölték a tudományos szakirodalomban. [Lásd: Singer és Gottschling: Science 266, 404 (1994 okt. 21.); Linger és mtsai.: Genes and Development 8y 1984 (1994); Greider és Blackburn: Natúré 337, 331 (1989);
r μ *
Romero és Blackburn: Cell 67, 343 (1991); valamint ShippenLentz és Blackburn: Science 247, 546 (1990); amelyek teljes terjedelmükben a kitanítás részét képezik.] A fenti ciliaták telomeráz enzimjei a humán enzimtől eltérő telomer ismétlődő egységeket szintetizálnak.
Nagy szükség van a humán telomerázra vonatkozó további információkra. A telomer-DNS ismétlődő egységeinek látszólagos egyszerűsége ellenére, a kutatók számára régóta nyilvánvaló, hogy a telomeráz jelentős biológiai szerepet tölt be a kromoszóma struktúrájának és funkciójának fenntartásában. A közelmúltban kutatók azt a lehetőséget vetették fel, hogy a telomer-DNS elvesztése szerepet játszhat a sejt öregedésének és elhasználódásának kiváltásában, és a telomeráz szabályozásának igen nagy biológiai jelentősége lehet [ lásd: Harley: Mutation Research 256, 271 (1991); amely teljes terjedelmében a kitanítás részét képezi] .
A találmány tárgyát képezik továbbá, a telomerázaktivitás kimutatására szolgáló eljárások, a telomerázaktivitást szabályozó vagy befolyásoló vegyületek azonosítása, valamint a telomerek hosszúságának és a telomeráz aktivitásának meghatározásán és szabályozásán keresztül, a sejtöregedés és a sejtek folyamatos szaporodásúvá (halhatatlanná) válásának diagnózisára és terápiájára vonatkozó eljárások. [Lásd: a 95/13381 sz. (1995 május 18.), 95/13382 sz. (1995 május 18.), valamint 93/23572 sz. (1993 november 25.) PCT közzétételi iratokat; továbbá az 1995 június 7.-én bejelentett (sorozatszám nélküli) amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentést (feltalálók: C.
• · · · • · · · · · • · ···*·· • · · · · _ 4 - .......
Harley, N. Kim, S. Weinrich), a 08/315,214 sz. (bejelentés napja: 1994 szeptember 28.), a 08/ 315,216 sz. (bejelentés napja: 1994 szeptember 28.), a 08/288,501 sz. (bejelentés napja: 1994 augusztus 10.), a 08/014,838 sz. (bejelentés napja: 1993 február 8.), a 08/153,051 sz. és a 08/151,477 sz. (a bejelentés napja mindkét esetben: 1993 november 12.), a 08/060,952 sz. (bejelentés napja: 1993 május 13.), a 08/038,766 sz. (bejelentés napja: 1993 március 24.), valamint 07/882,438 sz. (bejelentés napja: 1992 május 13.) amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentések; amelyek teljes terjedelmükben a kitanítás részét képezik.]
A telomeráz befolyásolásán keresztül végzett terápiás eljárások, telomeráz meghatározásra szolgáló vizsgálati eljárások és szűrővizsgálatok szempontjából lényeges fejlődést jelentene és új lehetőségeket teremtene, ha a telomeráz-RNS-összetevőjét tartalmazó és/vagy a telomeráz protein össztevőjét kódoló nukleinsav tiszta vagy izolálható formában rendelkezésre állna, és az említett nukleinsavak szekvenciája ismert lenne. A találmány szerinti megoldás ezeket és más igényeket elégít ki, valamint az előző ismeretekhez képest előrelépést és új lehetőségeket teremt.
Az alábbiakban összefoglaljuk a találmány szerinti megoldást .
Egyrészt, a találmány tárgyát képezik a humán telomeráz-RNS-összetevője és az RNS-összetevő génje lényegében tiszta formában, továbbá a humán telomeráz-RNSösszetevő nukleinsav-szekvenciájának egészét vagy annak legalább egy alkalmazható részét tartalmazó nukleinsavak. A találmány tárgyát képezik továbbá, a humán telomeráz-RNSösszetevőjével jelentős homológiát mutató, más fajokból származó RNS-összetevő nukleinsavak - anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk- emlősökből, például főemlősökből származó RNS-összetevő nukleinsavak. A találmány tárgyához tartoznak ezen felül, az RNS-összetevő szekvenciaz
RNS-összetevő ájával komplementer nukleinsavak; nukleotid szekvenciájával rokonságot mutató, de attól eltérő nukleinsavak, amelyek a humán telomeráz-RNSösszetevőjével vagy az RNS-összetevő génjével vagy a humán telomeráz protein-összetevőjével alkalmazható módon kölcsönhatásba lépnek; valamint az RNS-összetevővel vagy az RNS-összetevő génjével jelentős szekvencia-homológiát vagy komplementaritást nem mutató, de az RNS-összetevőre kivánt és alkalmazható módon hatást kifejtő nukleinsavak. Amint azt az alábbiakban részletesen ismertetjük, a találmány szerinti nukleinsavak egyaránt lehetnek DNS- és RNSmolekulák, valamint azok módosított analógjai, és azok különböző célokra alkalmazhatók.
A találmány szerinti antiszensz oligonukleotidok, oligonukleotidok, vagy egyéb oligonukleotid-mimetikumok, (például antiszensz PNA, - peptid-nukleinsav / poliamidnukleinsav), amelyek in vivő vagy in vitro, humán telomeráz aktivitásának gátlására felhasználhatók. Az ilyen megoldásban alkalmazhatók hármas hélixet alkotó oligonukleotidok- a humán telomeráz aktivitását több módon gátolhatják, például a telomeráz gén átíródásának megakadályozásával (például hármas hélix kialakításával), vagy a • · · · • · telomeráz-RNS-Összetevőjéhez történő kötődéssel úgy, hogy meggátolják annak funkcionális ribonukleoproteinné történő összeépülését, vagy az RNS-összetevő telomeráz enzimkomplexszé történő összeépülését követően megakadályozza azt, hogy az telomer-DNS-szintézis számára templátként működjék. Tipikusan, és a hatás kifejtésének módjától függően, a találmány szerinti oligonukleotidok egy 10-25 nukleotidtól 200 vagy több nukleotidig terjedő specifikus szekvenciát tartalmaznak, amely a telomeráz-RNS-összetevő vagy a telomeráz-RNS-összetevőt kódoló gén specifikus nukleotid szekvenciájával megegyezik vagy azzal komplementer.
A találmány tárgyához tartoznak ezen felül, a telomeráz-RNS-összetevő polinukleotid-szekvenciáival komplementer antiszensz polinukleotidok, tipikusan a természetben előforduló, emlőstelomeráz-RNS-összetevő gén szekvenciáival lényegében megegyező polinukleotid-szekvenciákkal komplementer polinukleotidok. Az ilyen antiszensz polinukleotidok a telomeráz-RNS-összetevő átiródásának és/vagy stabilitásának és/vagy funkciójának gátlására, ezáltal a sejtekben (például beteg rákos sejtjeiben) a telomeráz-aktivitás mértékének gátlására alkalmazhatók. Az említett antiszensz polinukleotidok kifejthetik hatásukat telomeráz-módosító hatóanyagokként, a sejtekben a helyes telomeráz replikációhoz és repair (DNS-javító, DNSreparáló) működéshez szükséges, funkcionális [ katalitikusán aktív és rendkívül pontos működésű (high fidelity)] telomeráz holoenzim képződésének gátlásán keresztül.
Antiszensz polinukleotidokat kombinálhatunk más antineopláziás (daganatellenes) terápiás módszerekkel, például ionizáló besugárzás vagy kemoterápia (például DNSkárosító hatóanyagok, mint például belomycin, cisplatin, nitrogénmustár, doxyrubicin, nukleotid-analógok és hasonlók) alkalmazásával. Az antiszensz polinukleotidok fogékony sejtekben (például replikálódó sejtekben, amelyekben a DNSrepair folyamatához vagy replikációhoz telomerázaktivitásra van szükség), a sejt pusztulását idézhetik elő. Az antiszensz polinukleotidok szekvenciája lényegében megegyezik a találmány szerinti, emlőstelomeráz-RNS szekvenciájával komplementer szekvencia legalább 25 egymást követő nukleotidjával. Antiszensz polinukleotidok tipikusan a következők lehetnek: ssDNS (egyszálú DNS), ssRNS (egyszálú RNS), metilfoszfonát-vázzal rendelkező polinukleotidok, foszforotiolát-vázzal rendelkező polinukleotidok, vegyes vázzal rendelkező polinukleotidok, poliamid nukleinsavak és a technika állása szerint ismert egyéb antiszensz struktúrák. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, az antiszensz oligonukleotidokat a sejtekben (például replikációra képes humán sejtekben) a telomeráz-RNSösszetevő transzkripciójának és/vagy a telomeráz-RNSösszetevő aktivitásának és a telomeráz enzim aktivitásának gátlása céljából adjuk be.
A találmány tárgyát képezik továbbá, hibás bázispárosodást előidéző templát polinukleotidok (template mismatch polynucleotide), amely polinukleotidok az emlőstelomerázRNS-összetevővel lényegében megegyező szekvenciával rendelkeznek, és amelyek olyan ismétlődő telomer templát szekvenciát tartalmaznak, amely a humán telomeráz ismétlődő szekvenciájához képest (5' -TTAGGG-3' ) legalább egy hibás bázispárosodást előidéző bázist tartalmaz, de egyébként azzal komplementer. A hibás bázispárosodást előidéző templát polinukleotidok a természetben előforduló templát szekvenciához képest tipikusan egyetlen nem kompatibilis nukleotidot tartalmaznak, de tartalmazhatnak a templát szekvenciában két nem kompatibilis nukleotidot; a hibás bázispárosodást előidéző nukleotidok lehetnek egymással szomszédosak, vagy azok elhelyezkedhetnek egy vagy több, helyes bázispárosodást előidéző (komplementer) nukleotiddal elválasztva. A találmány szerinti, hibás bázispárosodást előidéző templát polinukleotidok a humán telomeráz polipeptid összetevőjével együtt általában képesek telomerázaktivitást kifejteni, ezáltal a telomer ismétlődő egységek replikációja, javítása és/vagy hozzáadódása során, a humán telomeráz ismétlődő egységeit alkotó szekvenciák meghatározott nukleotid pozíciójában hibás bázisbeépülést előidézni, ezáltal olyan telomerek keletkezéséhez vezetnek, amelyeknél az alapvető replikáció és a telomerek hosszúságának fenntartása a mutáns, szensz telomeráz-RNS-összetevő folyamatos jelenlétén alapul.
Ezen felül, a találmány tárgyához tartoznak ribozim nukleinsavak, amelyek specifikusan képesek humán telomerázRNS-összetevő hasítására, ezáltal az enzim inaktiválására. A találmány tárgyát képezik továbbá, hibridizációs próbaként vagy láncindító oligonukleotidként alkalmazható nukle• · • · ··· insavak, amelyek specifikusan képesek kötődni a humán telomeráz-RNS-összetevőjéhez, ezáltal például felhasználhatók mintában telomeráz jelenlétének kimutatására. Végül, a találmány szerinti megoldásban alkalmazható nukleinsavak lehetnek a találmány szerinti nukleinsavak előállítására alkalmazható rekombináns expressziós plazmidok. Különösen előnyös ilyen típusú plazmidok a humán génterápiára alkalmazható plazmidok. A találmány szerinti, génterápiára alkalmazható plazmidok különböző típusú plazmidok lehetnek, nem csupán antiszensz oligonukleotidokat vagy ribozimokat kódoló plazmidok, hanem humán telomeráz-RNS-összetevőjének, vagy a humán telomeráz (vagy a humán RNS-összetevőjének szekvenciájával lényegében homológ RNS-összetevővel rendelkező, más fajhoz tartozó telomeráz) RNS-összetevője deletált vagy más módon módosított (mutációt hordozó) változatának expresszióját, vagy az előbbieket kódoló gének expresszióját irányítani képes plazmidok.
A találmány tárgyát képezik emlőstelomeráz-RNSösszetevővel fiziológiás körülmények mellett specifikus hibridizációt lehetővé tevő komplementer részt tartalmazó polinukleotidok, amelyeket úgy módosítottunk, hogy azokhoz a polinukleotid-szintézis folyamán vagy azt követően kovalens kötéssel további kémiai szubsztituenst kapcsoltunk, ezáltal az említett telomeráz-RNS-összetevővel specifikusan hibridizálódni képes polinukleotid származékot nyertünk. A polinukleotid származék elhelyezkedhet az említett RNSösszetevőt tartalmazó endogén telomeráz enzimben, ahol az említett polinukleotid származék a telomeráz-RNS• · összetevőjének és/vagy protein-összetevőjének megváltoztatását vagy kémiai módosítását eredményezi, ezáltal módosítja, tipikusan csökkenti a telomeráz enzimatikus aktivitását .
A találmány tárgyát képezik ezen felül, a telomerázRNS-összetevő normálistól eltérő mennyiségével és/vagy struktúrájával kapcsolatos betegségek diagnózisára alkalmazható polinukleotidok. Emlőstelomeráz-RNS-összetevő nukleotid-szekvenciájával lényegében megegyező vagy azzal lényegében komplementer szekvenciákat tartalmazó polinukleotid-próbák alkalmazhatók, betegből származó sejtekben betegség állapotok (például neopláziák vagy neopláziát megelőző állapotok) diagnózisára, a telomerázRNS-összetevő mennyiségi eltérésének és/vagy a telomerázRNS-összetevő strukturális eltérésének (például csonkítottság, szekvencia variációk, deléciók, vagy inszerciók és hasonlók) kimutatására, és/vagy a telomeráz-RNS-összetevőt kódoló génben előforduló átrendeződés vagy amplifikáció kimutatására, vagy kóros emlőstelomeráz-RNS-összetevő alléi kimutatására (például RFLP-eljárassal vagy allél-specifikus PCR-analízissel). A kimutatást gyakran in situ hibridizációs eljárással végezzük, az emlőstelomeráz-RNS-összetevővel komplementer, jelölt (például 32P-, 35S-, 14C-, 3H-, fluoreszcens-, biotinezett, digoxigenin-jelölt) antiszensz polinukleotidok alkalmazásával, bár alkalmazható Northernblot, dot-blot eljárás, vagy sejtmintából izolált összRNS-en vagy polyA+-RNS-en oldatban végzett hibridizáció, alkalmazható továbbá, telomeráz-specifikus láncindító
* · • · · · · · • · · ·· · oligonukleotidok felhasználásával végzett PCR- (polimerase chain reaction) vagy LCR- (ligásé chain reaction) amplifikáció. Az azonos sejttípushoz (sejttípusokhoz) tartozó, nem-neopláziás sejtekhez képest megváltozott mennyiségű (tipikusan jelentősen megnövekedett mennyiségű) telomeráz-RNS-összetevőt tartalmazó sejtek feltételezett beteg sejtekként, azaz neopláziás állapotot megelőző állapotban levő vagy nyilvánvalóan neopláziás sejtekként, és metasztatikus (áttétképző) képességgel rendelkező sejtekként azonosíthatók. Hasonlóképp, sejtmintában a telomerázRNS-összetevő gén lókusz vagy ahhoz közel elhelyezkedő lókuszok átrendeződésének vagy amplifikációjának kimutatása patológiás állapotra vagy patológiás állapot (például karcinóma, genetikai megbetegedés) kialakulására való hajlamra utal. A telomeráz-RNS-összetevó kimutatására szolgáló polinukleotid próbák alkalmazhatók továbbá, egyének igazságügyi azonosítására, például apasági perekben, vagy bűntett gyanúsítottjának vagy ismeretlen tettesek azonosítására .
Másrészt, a találmány tárgyát képezik sejtben vagy sejtcsoportban telomeráz-aktivitással kapcsolatos állapotok kezelésére szolgáló eljárások, melyek szerint a sejtet (sejteket) olyan hatóanyag terápiásán hatékony mennyiségével érintkeztetjük, amely az adott sejtben megváltoztatja a telomeráz-aktivitást. Ilyen hatóanyagok lehetnek a telomeráz-RNS-összetevőt kódoló nukleinsavak, hármas hélixet képző oligonukleotidok, antiszensz oligonukleotidok, ribozimok, valamint plazmidok és egyéb, telomeráz-RNS12 összetevőt expresszáló, humán génterápiára alkalmazható génterápiás vektorok (például adenovírus-vektorok, adenovírussal kapcsolatos vírusvektorok, stb.), a telomeráz-RNSösszetevőhöz képest antiszensz RNS-ek, vagy hibás bázisbeépülést eredményező telomeráz-RNS-összetevők, amint azokat a fentiekben ismertettük. A találmány tárgyát képezik ezen felül, a fenti terápiás hatóanyagokat, valamint egy gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagot vagy sót tartalmazó gyógyászati készítmények, amelyeket a hatóanyag célzott bejuttatása céljából előállíthatunk lipofektin-komplex, liposzóma, vagy immunoliposzóma formájában. A találmány tárgya vonatkozik a fenti, telomerázon keresztül hatást kifejtő terápiás hatóanyagok más gyógyászati hatóanyagokkal történő kombinációjára: például antineopláziás szerekkel és egyéb citotoxikus vagy citosztatikus szerekkel; gombaellenes hatóanyagokkal (például AIDS-betegek kezelésére); nukleotidokkal, nukleozidokkal és azok analógjaival; valamint betegség állapotok, például neopláziák, hiperpláziák, HIV-fertőzés / AIDS és azzal kapcsolatos kóros állapotok, valamint kóros telomeráz metabolizmussal jellemezhető betegségek kezelésére alkalmas más gyógyászati hatóanyagokkal történő kombinációkra. Az eljárásokban alkalmazhatunk emlőstelomerázban a telomeráz-RNS-összetevővel specifikusan hibridizálódni képes polinukleotid származékokat, amely eljárások szerint, a polinukleotid származékot telomerázaktivitással rendelkező emlős sejtbe juttatjuk, az ott a telomeráz-aktivitást úgy gátolja, hogy a telomeráz-RNS• ·« · összetevővel kapcsolatba kerül, és a telomeráz-aktivitást inaktiválja vagy gátolja.
A találmány tárgyát képezik továbbá, neopláziát vagy apoptózist (sejthalált) gátolni képes terápiás hatóanyagok, amelyek a telomeráz működésének módosítását a telomerázRNS-összetevő képződésének gátlásával vagy elősegítésével érik el; az említett hatóanyagok gyógyászati készítményekként alkalmazhatók. Az ilyen gyógyászati készítmények különböző humán és állatgyógyászati betegségek kezelésére alkalmasak, például neopláziák, hiperpláziák, neurodegeneratív betegségek, öregedési folyamat, AIDS, gombás fertőzés és hasonlók kezelésére. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a készítmény génterápiás vektort tartalmaz, amely képes átírni a telomeráz-RNS-összetevőjének szekvenciáját vagy annak komplementer szekvenciáját, vagy egy olyan, enzimatikusan inaktív telomeráz-RNS-összetevőt, amely kompetitív módon képes funkcionális telomeráz holoenzim képződését gátolni.
Harmadszor, a találmány tárgyát képezik diagnosztikus eljárások sejtben, sejtpopulációban vagy szövetmintában vagy az előbbiek bármelyikének kivonatában humán telomerázRNS-összetevő, telomeráz vagy telomeráz-aktivitás szintjének, mennyiségének vagy jelenlétének meghatározására. A találmány tárgyához tartoznak továbbá, az említett eljárásokban alkalmazható reagensek, (ezen belül a fent említett láncindító oligonukleotidok és hibridizációs próbák), adott esetben reagenskészlet formájában kiszerelve, a diagnosztikus eljárás kivitelezésére vonatkozó utasításokkal együtt.
··»·
A találmány tárgyát képezik humán betegekben betegségek (például neoplázia) diagnózisára alkalmazható eljárások, amelyek szerint, diagnosztikus vizsgálati eljárást alkalmazunk (például humán telomeráz-RNS-összetevőhöz vagy annak génszekvenciájához specifikusan kötődni képes, jelölt RNSösszetevő próba alkalmazásával, fixált sejteken in situ polinukleotid-hibridizációt végzünk) annak megállapítására, hogy a humán betegből származó biológiai mintában a telomeráz-RNS-összetevő az előzetes meghatározás szerint kóros koncentrációban van-e jelen; amennyiben a vizsgálati eljárás szerint a telomeráz-RNS-összetevő szintje a normális tartományon kívül esik (azaz, az előzetes meghatározás szerint kóros koncentráció-tartományban van), a betegnél betegségállapot meglétét vagy arra való hajlamot diagnosztizálunk .
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti polinukleotidokat patológiás állapotok vagy genetikai betegségek, például neoplázia, hiperplázia, korai vagy abnormális sejtöregedés, vagy más, telomeráz funkcióval kapcsolatos, egészséget érintő állapotok diagnózisára alkalmazzuk, még közelebbről, a telomeráz-RNSösszetevő vagy azt kódoló génszekvenciájának struktúráját vagy mennyiségét érintő változások diagnózisára, vagy kóros telomeráz-RNS-összetevőt kódoló allélhez kapcsolódó szekvencia diagnózisára, amely RFLP-eljárással és/vagy allélspecifikus PCR-eljárással vagy egyéb alkalmas kimutatási módszerrel mutatható ki. Tipikusan, az eljárást humán betegekben alkalmazzuk betegség (például neoplázia) diagnózisá'· ···· ra, mely szerint diagnosztikus vizsgálati eljárást alkalmazunk (például a telomeráz-RNS-összetevő mennyiségének és/vagy struktúrájának meghatározását) annak megállapítására, hogy a humán betegből származó biológiai mintában található sejtekben a telomeráz-RNS-összetevő az előzetes meghatározás szerint kóros koncentrációban van-e jelen, vagy kóros struktúrával rendelkezik-e; amennyiben a vizsgálat arra utal, hogy a telomeráz-RNS-összetevő mennyisége a normális tartományon kívül esik, (azaz, az előzetes meghatározás szerinti kóros koncentráció-tartományban van), a betegnél betegségállapot meglétét vagy betegségre való hajlamot diagnosztizálunk.
Negyedszer, a találmány tárgyát képezik rekombináns telomeráz készítmények és ilyen készítmények előállítására szolgáló eljárások. A találmány tárgyát képezi tehát rekombináns humán telomeráz, amely egy, a találmány szerinti rekombináns RNS-összetevővel kapcsolódva, tartalmazza a humán telomeráz protein-összetevőit, vagy olyan emlős fajból származó telomeráz protein-összetevőit, amely humán telomeráz-RNS-összetevójével lényegében homológ RNS-összetevővel rendelkezik. Ilyen, találmány szerinti rekombináns
RNS-összetevő molekulák lehetnek a természetben előforduló
RNS-összetevőtől egy vagy több bázis-szubsztitúció, deléció, terminális addíció és/vagy iszerció vonatkozásában eltérő molekulák, valamint rekombináns gazdasejtekben előállított, a természetben előforduló RNS-összetevő molekulával megegyező szekvenciával rendelkező RNS-összetevő molekulák. Az említett, rekombináns telomeráz-molekulák előál16 lítása céljából, a találmány szerinti RNS-összetevőt kódoló rekombináns expressziós vektorral a telomeráz proteinösszetevőit expresszáló eukarióta gazdasejteket transzformálunk, az említett vektorral transzformált gazdasejteket a telomeráz protein-összetevő és a telomeráz-RNS-összetevő expresszálódása és összeépülése számára megfelelő körülmények mellett tenyésztjük úgy, hogy a kromoszómális DNS telomerjeihez szekvenciák (nem szükségszerűen a natív telomeráz által hozzákapcsolt szekvenciákkal megegyező szekvenciák) hozzákapcsolódását eredményező aktív telomeráz-molekulák képződjenek.
Ötödször, a találmány tárgyát képezik humán telomeráz protein-összetevőinek, valamint olyan, emlős fajból származó telomeráz protein-összetevőinek tisztítására szolgáló eljárások, amelyek a humán telomeráz-RNS-összetevőjével lényegében homológ RNS-összetevővel rendelkeznek. A találmány tárgyához tartoznak ezen felül, az említett proteinösszetevőket kódoló nukleinsavak izolálására és azonosítására szolgáló eljárások. Ezzel kapcsolatban, a találmány tárgyát képezik tisztított humán telomerázok és olyan, emlős fajból származó tisztított telomerázok, amelyek a humán telomeráz-RNS-összetevőjével lényegében homológ RNSösszetevővel rendelkeznek, valamint a fenti telomeráz készítmény egy vagy több összetevőjét kódoló nukleinsavak. A találmány tárgyát képezik továbbá, gyógyászati készítmények, amelyek aktív hatóanyagként a telomeráz proteinösszetevőit tartalmazzák, vagy a telomeráz protein- 17 összetevőit kódoló vagy azzal kölcsönhatásba lépő nukleinsavat tartalmaznak.
Hatodszor, a találmány tárgyához tartoznak az emlőstelomeráz aktivitását módosító (azaz, gátló, fokozó vagy az enzim specifitását megváltoztató) hatóanyagok azonosítására szolgáló eljárások. Ilyen telomeráz-módosító hatóanyagok gyakran kis méretű molekulák (például kisebbek, mint körülbelül 3000 dalton) , és azok gyakran, in vitro és in vivő terápiás hatékonysággal telomeráz-aktivitás módosítására alkalmazhatók, valamint laboratóriumi reagensekként és/vagy gyógyászati készítményekként használhatók.
A találmány tárgyát képezik továbbá, eljárások hatóanyagbankból vagy hatóanyag-könyvtárból olyan hatóanyagok azonosítására, amelyek az emlóstelomeráz-RNSösszetevő és a telomeráz protein-összetevő közti nemkovalens kötésre hatva feltételezhetően módosítják a telomeráz aktivitását. A telomeráz-RNS-összetevője előállítható gazdasejtben rekombináns templát alapján, vagy kívánt esetben, kémiai szintézissel. Tipikusan, emlőstelomeráz protein-összetevőt, - például telomeráz-expresszáló sejtekből tisztított, és a természetben előforduló RNSösszetevőtől (például ribonukleáz kezeléssel) mentessé tett protein-összetevőt - érintkeztetünk emlőstelomeráz-RNSösszetevővel, olyan megfelelő, vizes közegben alkalmazott kötődési körülmények mellett, amelyek lehetővé teszik az RNS- és protein-összetevő közti nem-kovalens kötődés létrejöttét, hozzáadott hatóanyag alkalmazása nélkül, (azaz, egy kontroll kötődési reakcióban). A telomeráz-RNS-összetevő és a protein-összetevő közt, egy vagy több, hatóanyagkönyvtárból vagy hatóanyagbankból választott hatóanyag jelenlétében létrejött nem-kovalens kölcsönhatás mértékét összehasonlítjuk a telomeráz-RNS-összetevőt és proteinösszetevőket tartalmazó, de a hatóanyagot (hatóanyagokat) nem tartalmazó kontroll kötődési reakcióban létrejött nemkovalens kölcsönhatás mértékével; azokat a hatóanyagokat, amelyek a telomeráz-RNS-összetevő és protein-összetevők közti nem-kovalens kötődés mértékének statisztikailag szignifikáns növekedését eredményezik, feltételezetten telomeráz-módosító hatóanyagoknak tekintjük. A nem-kovalens kötődés viszonylagos mértékét bármely alkalmas módszerrel meghatározhatjuk, például a specifikus kötődési affinitás meghatározásával, például kompetitív kötődési vizsgálat alkalmazásával; . megfelelő telomer ismétlődő egységekből álló templáton a telomeráz katalitikus aktivitásának meghatározásával; vagy az emlőstelomeráz RNS- és protein-összetevői közti funkcionális nem-kovalens kölcsönhatás vizsgálatára alkalmas más vizsgálati módszerrel, például gélen, a mobilitás változásának vizsgálatával (gél shift eljárással) vagy EMSA-eljárással (elektroforetikus mobilitás-eltolódási vizsgálattal).
A találmány tárgyához tartozik ezen felül, nem-kovalens kötődési vizsgálati eljárás, feltételezetten telomerázmódosító hatóanyagok kimutatására, mely szerint a telomeráz-RNS-összetevőjét vagy protein-összetevőjét vagy mindkettőt megfelelő kimutatható jelölőanyaggal jelöljük, és a nem-kovalens kötődést egy, hatóanyagbankból vagy « ···· ·· ·· ···· • · * · · · « « · ······ ♦ • · · · · · hatóanyag-könyvtárból kiválasztott hatóanyag jelenlétében vagy anélkül, külön-külön meghatározzuk. A nem-kovalens kötődés meghatározását úgy végezzük, hogy mérjük a jelölt telomeráz összetevőnek (RNS-összetevőnek vagy proteinösszetevőnek) a megfelelő másik telomeráz összetevőhöz (protein-összetevőhöz vagy RNS-összetevőhöz) történő kötődése mértékét; az említett megfelelő másik telomeráz összetevő lehet az előbbitől függetlenül jelölt, vagy lehet jelöletlen; a módszer alapulhat az említett jelölt telomeráz összetevőt és az említett másik telomeráz összetevőt tartalmazó kötődött komplexek befogásán (például immobilizálásán), és a nem kötődött jelölt telomeráz összetevőnek a kötődött komplexektől történő elválasztásán, ezáltal elkülönített kötődött frakció előállításán, és az elkülönített kötődött frakcióban a kimutatható jelölőanyag meghatározásával a kötődött komplexek kimutatásán. Azokat a hatóanyagokat, amelyek a telomeráz-RNS-összetevője és proteinösszetevői közti nem-kovalens kötődést statisztikailag szignifikáns mértékben csökkentik vagy fokozzák, feltételezett telomeráz-módosító hatóanyagoknak tekintjük. A nemkovalens kötődést csökkentő hatóanyagokat feltételezett telomeráz inhibitoroknak (gátló anyagoknak vagy antagonistáknak) tekintjük, míg a telomeráz összetevők közti nem-kovalens kötődést fokozó hatóanyagokat feltételezett telomeráz agonistáknak tekintjük.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a feltételezett telomeráz-módosító hatóanyagokat annak alapján azonosítjuk, hogy azok statisztikailag szignifikáns mértékben képesek tisztított telomeráz protein-összetevőt és telomeráz-RNS-összetevőt tartalmazó, emlőstelomeráz enzimatikus aktivitásának csökkentésére vagy fokozására.
A találmány egy további megvalósítási módja szerint, a feltételezett telomeráz-módosító hatóanyagokat annak alapján azonosítjuk, hogy azok metabolikusan aktív emlős sejtben statisztikailag szignifikáns mértékben képesek egy, emlőstelomeráz-RNS-összetevő gén transzkripciós szabályozó szekvenciáival, - előnyösen humán RNS-összetevő gén szekvenciáival funkcionálisan kapcsolt riporter polinukleotidszekvencia (például β-galaktozidáz gén, luciferáz gén, HPRT-gén) transzkripciójának csökkentésére vagy fokozására. Más eljárás szerint, emlős sejtben egy endogén telomerázRNS-összetevő gént egy homológ rekombinációval célbajuttató konstrukcióval rekombináltatunk úgy, hogy az endogén gén kromoszómáiis lókuszába, az endogén telomeráz-RNS-összetevő géntől 5' -irányban található transzkripciós szabályozó szekvenciához (például promóterhez) funkcionálisan kapcsoltan riporter polinukleotid-szekvenciát építsünk be. További eljárás szerint, emlőstelomeráz-RNS-összetevő gén transzkripciós szabályozó régiójához (például promóterhez és 5' irányú transzkripciós faktor kötőhelyekhez) funkcionálisan kapcsoltan riporter polinukleotidot tartalmazó exogén polinukleotidot kapcsolunk; az exogén polinukleotidot emlős sejtbe juttatjuk, ahol az nem-homológ módon a kromoszómába épülhet és/vagy episzómális polinukleotidként fennmaradhat vagy replikálódhat. A hatóanyaggal kezelt sejtekben a riporter polinukleotid transzkripcióját statisztikailag szig- 21 nifikáns mértékben módosító hatóanyagokat feltételezett, emlóstelomeráz-módosító hatóanyagoknak tekintjük.
Feltételezett telomeráz-módosító hatóanyagok azonosítására alkalmas készítmények és vizsgálati eljárások tipikusan a következőket tartalmazzák: (1) emlőstelomeráz protein-összetevőt, például telomeráz-expresszáló emlős sejtekből, előnyösen főemlős eredetű (például humán) sejtekből tisztított és tipikusan, a hozzá kapcsolódó RNSösszetevőtől olyan kezeléssel - például ribonukleázkezeléssel vagy az RNS-összetevő eltávolítására alkalmas más kezeléssel - mentesített formában, amely kezelést követően, alkalmas kötődési körülmények mellett, a megfelelő RNS-összetevő jelenlétében a protein telomeráz-aktivitást kifejtő képessége helyreáll; (2) sejtekben, rekombináns polinukleotid transzkripciójával előállított emlőstelomeráz-RNS-összetevőt, előnyösen humán RNS-összetevőt; (3) vizes kötődési körülményeket (például fiziológiás körülményeket, telomeráz vizsgálati körülményeket); adott esetben (4) egy riporter polinukleotidot, amely legalább egy, replikálható vagy növelhető emlőstelomeráz ismétlődő szekvenciát, tipikusan, az említett RNS-összetevőnek a telomer ismétlődő egységgel komplementer templát részével komplementer szekvenciát tartalmaz; és adott esetben, (5) telomer vizsgálati körülmények mellett a riporter polinukleotidhoz kapcsolt telomer ismétlődő szekvenciák replikációjára és/vagy extenziójára alkalmas nukleotidokat; az ilyen készítményekhez tipikusan, a nem-kovalens kötődés és/vagy telomeráz-aktivitás meghatározása céljából egy vizsgálandó • · · · · · ···· ·· · ·
- 22 hatóanyagot adunk, és az eredményeket az említett, hatóanyagot nem-tartalmazó kontroll készítménnyel hasonlítjuk össze.
Hetedszer, a találmány tárgyát képezik emlőstelomerázRNS-összetevő-gének null-alléljei (funkcionális enzim expresszálódását nem eredményező allélek), mint például a telomeráz-RNS-összetevő-gének funkcionális inaktiválása céljából egy heterológ polinukleotid homológ rekombinációval, célzottan emlőstelomeráz-RNS-összetevő génekbe történő beépítésével előállított allélek. A találmány tárgyát képezik ezen felül, telomeráz-RNS-összetevő null-allélt tartalmazó nem-humán knockout állatok (inaktivált alléit tartalmazó állatok), valamint telomeráz-RNS-összetevő null-allélekre nézve homozigóta, ezáltal endogén telomeráz-RNS-összetevő hiányában endogén telomerázaktivitással lényegében nem rendelkező nem-humán knockout állatok. Ilyen inaktivált alléit tartalmazó állatok többek között alkalmazhatók a kereskedelemben hozzáférhető reagensekként toxikológiai szűrővizsgálatok céljára, forgalmazhatók gyógyszerészeti kutatólaboratóriumoknak telomerázmódosító hatóanyagok azonosítására vagy vizsgálatára, ezen kívül lehetnek kedvenc állatok, valamint mezőgazdasági haszonállatok.
Nyolcadszor, a találmány tárgyához tartoznak emlős sejtek folyamatos szaporodásává (halhatatlanná) tételére alkalmazható eljárások, például bioreaktorban alkalmazott kívánt fermentációs sejtek vagy kereskedelemben hozzáférhető, kutatási reagensekként előnyös tulajdonsággal rendelkező • · · · kívánt sejtvonalak folyamatos szaporodásává tételére szolgáló eljárások. A fenti eljárások szerint, emlős sejtekbe olyan, funkcionális telomeráz-RNS-összetevőt expresszáló polinukleotidot juttatunk, amely telomeráz proteinösszetevő jelenlétében képes funkcionális telomeráz enzimet képezni.
A találmány további sajátságai és előnyei nyilvánvalóak lesznek az ábrák, a találmány előnyös megvalósítási módjai, a példák és igénypontok alábbiakban következő ismertetése alapján.
A leírásban a következő meghatározásokat alkalmaztuk.
Telomeráz-RNS-összetevő polinukleotidnak a leírásban olyan, legalább 20 nukleotidból álló polinukleotidot nevezünk, amelyben a polinukleotid legalább 20 nukleotidból álló szegmenst tartalmaz, amely: legalább 85 %-ban azonos a természetben előforduló emlőstelomeráz-RNS-összetevő szekvenciájával, tipikusan főemlóstelomeráz-RNS-összetevő szekvenciájával, például humán vagy majom telomeráz-RNSösszetevő szekvenciájával. Egyes, a természetben előforduló telomeráz-RNS-összetevő szekvenciájához vagy annak komplementer szekvenciájához képest szekvencia-variációkat tartalmazó telomeráz-RNS-összetevő polinukleotidok alkalmazhatók lehetnek hibridizációs próbaként, PCR láncindító oligonukleotidokként, LCR amplifikációs oligonukleotidokként (amp1imerekként), nem-komplementer bázist tartalmazó RNS-összetevőkként, és hasonlókként.
Akkor mondjuk, hogy egy szekvencia megfelel egy másik szekvenciának, ha egy polinukleotid-szekvencia homológ, • · · • · ····«· · • « · · · · «··· ·· · ·
- 24 (vagyis azonos, nem csak evolúciósán szorosan kapcsolt) egy referencia polinukleotid-szekvencia egészével vagy annak egy részével, vagy ha egy polipeptid-szekvencia azonos egy referencia polipeptid-szekvenciával. Ezzel szemben, akkor mondjuk, hogy egy szekvencia komplementer egy szekvenciával, ha a komplementer szekvencia homológ egy referencia polinukleotid-szekvencia egészével vagy annak egy részével. Szemléltetésképp, a TATAC nukleotid-szekvencia megfelel a TATAC referencia-szekvenciának, és komplementer a GTATA referencia-szekvenciával.
Két vagy több polinukleotid közti szekvenciaviszony leírására a következő meghatározásokat alkalmaztuk:
referencia-szekvencia, összehasonlítási ablak, szekvencia-azonosság, a szekvencia-azonosság aránya százalékban kifejezve és lényegében vett azonosság. Referenciaszekvenciának egy, a szekvencia összehasonlítás alapját képező meghatározott szekvenciát nevezünk; a referenciaszekvencia lehet egy nagyobb szekvencia része, például a teljes hosszúságú telomeráz-RNS-összetevő gén szekvenciájának egy része. Általánosságban, egy referencia-szekvencia legalább 20 nukleotid hosszúságú, gyakran legalább 25 nukleotid hosszúságú, és gyakran legalább 50 nukleotid hosszúságú. Mivel két polinukleotid tartalmazhat (1) mindkét polinukleotidban előforduló hasonló szekvenciát (azaz, a teljes polinukleotid-szekvencia egy részét képező szekvenciát) , valamint (2) a két polinukleotidban eltérő szekvenciákat, - két (vagy több) polinukleotid szekvenciájának összehasonlítását tipikusan úgy végezzük, hogy a két • · • · · · « · · • · ······ ·
- 25 - ”’· : -**·’ '' polinukleotid szekvenciáját egy összehasonlítási ablak alkalmazásával hasonlítjuk össze, szekvencia hasonlóságot mutató régiók helyének azonosítása és összehasonlítása célj ából.
Összehasonlítási ablaknak a leírásban egy, legalább 25 egymást követő nukleotidból álló feltételezett szegmenst nevezünk, amelyben a polinukleotidok szekvenciáját összehasonlíthatjuk egy legalább 25 egymást követő nukleotidból álló referencia-szekvenciával, és amelyben az összehasonlítási ablak polinukleotid-szekvencájának egy része a két szekvencia optimális egyeztetése mellett, a referenciaszekvenciához képest, (amely nem tartalmaz addíciókat vagy deléciókat) 20 %-ban vagy annál kisebb arányban tartalmazhat addíciókat vagy deléciókat, (azaz hézagokat). A szekvenciák optimális egyeztetését az összehasonlítási ablak felállításánál a következő eljárásokkal végezhetjük: a Smith és Waterman szerinti lokális homológra algoritmussal [ Adv. Appl. Math. 2, 482 (1981)] , a Needleman és Wunsch szerinti homológia-egyeztetési algoritmussal [ J. Mól. Bioi. 48, 443 (1970)], a Pearson és Lipman féle hasonlóságkutatási módszerrel [ Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444 (1988)] , a fenti algoritmusok komputerizált alkalmazásával (GAP,
BESTFIT, FASTA és TFASTA; Wisconsin Genetics Software
Package Release 7,0; Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), vagy az összehasonlítás történhet megtekintés alapján; a különböző eljárások szerint a legjobb egyezést (azaz, az összehasonlítási ablak mentén a • · • · legmagasabb arányú százalékos homológiát eredményező egyeztetést) választjuk.
Szekvencia-azonosság alatt azt értjük, hogy két polinukleotid-szekvencia az összehasonlítási ablak mentén megegyezik, (azaz nukleotidról-nukleotidra azonos) . A szekvenciaegyezés százalékos arányát két, az összehasonlítási ablak mentén optimálisan egyeztetett szekvencia öszszehasonlítása alapján számítjuk ki, meghatározva azon pozíciók számát, amelyekben mindkét szekvenciában azonos nukleinsav bázisok (például A, T, C, G, U vagy I) találhatók; így kapjuk meg az egyező pozíciók számát, az egyező pozíciók számát elosztjuk az összehasonlítási ablakban található pozíciók számának összegével, (azaz az ablak méretével), majd az eredményt megszorozzuk 100-zal, így megkapjuk a szekvencia egyezés százalékos arányát. Akkor mondjuk, hogy két szekvencia lényegében azonos, ha a polinukleotid egy referencia-szekvenciához képest egy, legalább 20 nukleotid pozíciót, gyakran legalább 30-50 nukleotid pozíciót tartalmazó összehasonlítási ablak mentén legalább 80 %-ban azonos szekvenciát tartalmaz, előnyösen legalább 85 %-ban azonos szekvenciát tartalmaz, előnyösebben 8995 %-ban azonos szekvenciát tartalmaz, és még előnyösebben %-ban azonos szekvenciát tartalmaz, ahol a szekvenciaegyezés százalékos arányát a referencia-szekvenciának a polinukleotid-szekvenciával történő összehasonlításával számítjuk ki, amely utóbbi a referencia-szekvenciához képest az összehasonlítási ablak mentén 20 %-ban vagy annál kisebb arányban deléciókat vagy addíciókat tartalmazhat. A • · · ·
- 27 referencia-szekvencia lehet egy nagyobb szekvencia része, például a találmány szerinti, teljes hosszúságú telomerázRNS-összetevő gén szekvenciájának egy része.
Specifikus hibridizáció alatt egy polinukleotid próba (például egy találmány szerinti polinukleotid, amely tartalmazhat szubsztitúciókat, deléciókat és/vagy addíciókat) és egy specifikus, célzott polinukleotid (például telomeráz-RNS-összetevő vagy genomi génszekvencia) közti hibrid képződését értjük, ahol a próba előnyösen a specifikus célzott szekvenciával hibridizálódik, például megfelelő eredetű sejtekből (például telomeráz-RNS-összetevőt expresszáló szomatikus sejtekből) előállított RNS alapján készült Northern-blot készítményen a telomeráz-RNSösszetevő gén egy vagy több RNS-faj táj ának (vagy specifikusan hasított vagy feldolgozott telomeráz-RNSösszetevő fajtának) megfelelő egyetlen hibridizálódó csík azonosítható. Emlőstelomeráz-RNS-összetevővel vagy humán telomer szekvenciákkal specifikusan hibridizálódó, találmány szerinti polinukleotidok az itt feltárt szekvenciaadatok alapján előállíthatok, a technika állása szerint ismert, és az alábbi szakirodalmi helyek által ismertetett eljárások és termodinamikai elvek alkalmazásával [ Maniatis és mtsai.:Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. kiadás, Cold Spring Harbor, New York, (1989); valamint Berger és Kimmel: Methods in Enzymology 152, Guide to Molecular Cloning Techniques, Academic Press, Inc., San Diego, CA, (1987); amelyek teljes terjedelmükben a kitanitás részét képezik] .
·♦ « » ·♦· ··· · • * · · » · Λ _ «♦·♦····
- 28 Megfelelő kötődési körülmények alatt olyan vizes közegben alkalmazott feltételeket értünk, amelyek mellett az emlőstelomeráz-RNS-összetevó a megfelelő proteinösszetevővel összekapcsolódik, és katalitikus replikációra, javító (repair) funkcióra és/vagy telomer ismétlődő egységeket tartalmazó megfelelő templát alapján telomer ismétlődő egységek hozzáadására képes, enzimatikusan aktív telomeráz holoenzimet képez; az ilyen telomer ismétlődő egység templát jelen lehet, vagy az hiányozhat is. A megfelelő kötődési körülmények általában fiziológiás körülmények. Fiziológiás körülmények alatt, élő organizmusokkal kompatibilis hőmérsékletet, pH-t, ionerősséget, viszkozitást és hasonló biokémiai paramétereket, és/vagy tipikusan, élő tenyésztett emlős sejtekben intracellulárisan található körülményeket, különösen az említett emlős sejtek magjában észlelhető körülményeket értünk. Fiziológiás körülmények például a tipikus laboratóriumi feltételek mellett tenyésztett emlős sejtekben található intracelluláris vagy citoplazmáris körülmények. Az in vitro transzkripciós koktélokban alkalmazott in vitro reakciós körülmények általánosságban fiziológiás körülmények; azok a technika állása szerint ismert, különböző mag-extraktumokkal szemléltethetők. Általánosságban, in vitro fiziológiás körülményeknek megfelelnek például a következő paraméterek: 50-200 mmól/l NaCl vagy KC1, pH=6,5-8,5, 30-45 °C, 0,001-10 mmól/l divalens kation (például Mg++, Ca++) ; előnyösen, körülbelül
150 mmól/l NaCl vagy KC1; pH=7,2-7,6; 5 mmól/l divalens kation; és gyakran 0,01-1,0 százalék nem-specifikus proteint • · · • · · · * · ♦ * · * ·»· ··· « • · · · · · «*«« »» · «
- 29 (például BSA-t) is alkalmazunk. Jelen lehet egy nem-ionos detergens is (például Tween, NP-40, Triton-X-100), rendszerint körülbelül 0,001-2 %, tipikusan 0,05-0,2 térfogat-% koncentrációban. Az adott vizes közegben alkalmazott körülményeket szakember választja ki, ismert eljárások alapján.
tri
Általános irányelvként, a következő pufferolt vizes közeg alkalmazható: 10-250 mmól/l NaCl, 5-50 mmól/l Tris-HCl, pH=5-8; adott esetben, a közeghez divalens kationt (kationokat) és/vagy fémkelátorokat és/vagy nem-ionos detergenseket és/vagy membrán-frakciókat és/vagy habzásgátló szereket és/vagy szcintillációs anyagokat adhatunk. Jelölés vagy jelölt kifejezéseken kimutatható jelölőanyag beépülését értjük, például radioaktívan jelölt aminosav beépülését vagy polipeptidhez biotinilezett csoport hozzákapcsolását, mely utóbbi jelölt avidinnel kimutatható (például fluoreszcens jelölőanyagot vagy enzimatikus aktivitást tartalmazó streptavidinnal, amely optikai vagy kalorimetriás eljárásokkal kimutatható). Polipeptidek és glikoproteinek jelölésére a technika állása szerint számos különböző eljárás ismert, és alkalmazható. Polipeptidek anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk - jelölhetők például a következőkkel: radioizotópokkal (például 3H, 14C, 35S, 125I, 131I), fluoreszcens jelölőanyagokkal (például FITC, rodamin, lantanid-foszforok), enzimatikus jelölőanyaggal (például tormaperoxidáz, β-galaktozidáz, luciferáz, alkalikus foszfatáz), biotinil-csoportokkal, vagy egy másodlagos hírvivő (riporter) által felismert, meghatározott polipeptid-epitóppal (például leucin-cipzár• · · ·
- 30 szekvenciapárokkal, másodlagos ellenanyagok számára szolgáló kötőhelyekkel, transzkripciós aktivátor polipeptidekkel, fémkötő doménokkal, epitóp-cimkékkel). A találmány egy további megvalósítási módja szerint, jelölőanyagokat különböző hosszúságú térkitöltő szekvenciák (spacer arms) alkalmazásával kapcsolunk a polipeptidhez, az esetleges szférikus gátlás csökkentése érdekében.
Statisztikailag szignifikánsnak nevezünk egy eredményt (például egy vizsgálati eljárás eredményét), ha az általánosságban, a kontroll vizsgálat legalább három egymástól független meghatározása eredményének átlagához képest a standard eltérés kétszeresén felül vagy az alatt található, és/vagy ha az Student-féle t-teszttel vagy más, statisztikai szignifikancia meghatározására szolgáló, a technika állása szerint elfogadott módszerrel statisztikailag szignifikánsnak bizonyul.
A leírásban kóros koncentráció, kóros mennyiség, és kóros hibridizációs minta alatt a telomeráz-RNS-összetevó olyan koncentrációját, mennyiségét vagy lokalizációs mintáját értjük, amely kóros (neopláziás, elöregedett, immundeficiens, neurodegeneratív, gyulladásos, stb.) állapotra utal, vagy neopláziás betegség, például karcinóma, szarkóma vagy leukémia kialakulására való hajlamra utal. Kóros mennyiségnek a telomeráz-RNS-összetevó sejtben vagy sejtmintában mérhető olyan mennyiségét nevezzük, amely kívül esik a prospektív és/vagy retrospektív statisztikai klinikai vizsgálatok alapján meghatározott normális klinikai értékeken. Általánosságban, egy neopláziás megbetege··· ·«« désben (például karcinómában, szarkómában vagy leukémiában) szenvedő egyén sejtjeiben vagy szövetmintájában a telomeráz-RNS-összetevő mennyisége kívül esik a normális, betegségben nem szenvedő egyének jellemző koncentrációtartományán; tipikusan, a kóros koncentráció az átlagos normális koncentrációhoz képest a standard eltérés legalább körülbelül egyszeresén kívül található, előnyösebben, a standard eltérés legalább körülbelül kétszeresén kívül található, vagy annál nagyobb mértékben eltér. Lényegében azonban, valamennyi klinikai diagnosztikai teszt bizonyos százalékban tévesen pozitív és tévesen negatív eredményt ad. A diagnosztikus eljárás érzékenységének és szelektivitásának elegendőnek kell lennie ahhoz, hogy az a diagnosztikai célkitűzésnek és bármely vonatkozó szabályozó kívánalomnak megfeleljen. Általánosságban, a találmány szerinti diagnosztikus eljárásokat betegség kialakulására való hajlammal rendelkező egyének azonosítására alkalmazzuk, további paramétert szolgáltatva a betegség, illetékes egészségügyi szakember által felállított elkülönítő diagnózisához.
Betegség alléinak egy gén olyan allélját nevezzük, amely felismerhető megbetegedés keletkezéséhez vezet. Egy betegség alléi lehet domináns vagy recesszív, és okozhat betegséget közvetlenül, vagy specifikus genetikai háttér kombinációja vagy előzetesen meglévő kóros állapot jelenlétében. A betegség alléi jelen lehet az eredetileg meglévő génkészletben, vagy keletkezhet egy egyénben de novo, szomatikus mutáció révén.
• · * · · · 99 19 99
9 19 9 ««· 999 9
9 9 19 ·« · «
Antineopláziás hatóanyagnak olyan hatóanyagot nevezünk, amely emberben neopláziás elváltozás kifejlődését vagy súlyosbodását gátolni képes, és gyakran metasztázis (áttét) kialakulását vagy metasztatikus képességet gátló tulajdonsággal is rendelkezik.
Akkor mondjuk, hogy egy polinukleotid funkcionálisan kapcsolt egy másikkal, ha a polinukleotid elemek funkcionális viszonyban állnak. Egy nukleinsav funkcionálisan kapcsolt egy másikkal, amennyiben az egy másik nukleinsavszekvenciával funkcionális viszonyban áll. Például egy promóter vagy enhanszer funkcionálisan kapcsolt egy kódoló szekvenciával, ha az előbbi hat a kódoló szekvencia transzkripciójára. Funkcionálisan kapcsoltak a szekvenciák, ha az összekapcsolt DNS-szekvenciák tipikusan folyamatosak, és amennyiben két protein kódoló régió összekapcsolására van szükség - folyamatosak, és leolvasási fázisba esnek. Mivel azonban az enhanszerek általában a promótertől néhány kilobázis nagyságú szekvenciával elválasztva működnek, és a közbeeső szekvencia különböző hosszúságú lehet, egyes polinukleotid elemek funkcionálisan kapcsoltak lehetnek anélkül, hogy folyamatosak lennének. Egy endogén gén transzkripciós szabályozó szekvenciájának megfelelő polinukleotid-szekvenciával funkcionálisan kapcsolt strukturális gén (például HSV-tk-gén) általánosságban, lényegében ugyanolyan időbeli és sejttípus-specifikus megoszlásban expresszálódik, mint a természetben előforduló gén.
Transzkripciós egységnek vagy transzkripciós komplexnek olyan polinukleotid-szekvenciát nevezünk, amely tartalmaz egy strukturális gént (exont), egy hozzákapcsolt cisz-működésű promótert, valamint egyéb, a strukturális szekvencia hatékony transzkripciójához szükséges ciszműködésű szekvenciákat, a strukturális szekvencia megfelelő szövetspecifikus és a fejlődés során változó transzkripciójához szükséges disztális szabályozó elemeket, és annak hatékony transzkripciója és transzlációja szempontjából lényeges további cisz-működésű elemeket (például poliadenilezési helyet, valamint az mRNS stabilitását szabályozó szekvenciákat) .
Transzkripciós szabályozás alatt, a cisz-kötésben levő strukturális szekvencia transzkripcióját fokozó vagy gátló képességet értjük; az ilyen fokozás vagy gátlás függhet egy meghatározott eseménytől, például egy indukálószerrel történő stimulációtól, és/vagy érvényesülhet csak bizonyos sejttípusokban.
Transzkripciós szabályozó régiónak funkcionális promótert és ahhoz kapcsolódó transzkripciós elemeket (például enhanszert, CCAAT-box-szekvenciát, *'TATA-box szekvenciát, SPl-helyet, stb.) tartalmazó DNS-szekvenciát nevezünk, amely a transzkripciós szabályozó régióhoz funkcionálisan kapcsolt polinukleotid-szekvencia transzkripciója szempontjából nélkülözhetetlen.
Null-alléi alatt azt értjük, hogy egy génlókusz legalább egy mutációt vagy strukturális módosulást tartalmaz úgy, hogy a null-allél lényegében nem képes funkcionális géntermék hatékony expressziójának irányítására. Knockoutsejtnek olyan sejteket nevezünk, amelyek legalább egy
Λ ·«· *·« null-alléllal rendelkeznek, és amelyek tipikusan, homozigóták a null-allélre nézve. Egy knockout-sejt például homozigóta lehet a telomeráz-RNS-összetevő lókuszban található null-allélekre nézve, ezáltal a knockout-sejt lényegében nem képes funkcionális telomeráz-RNS-összetevő expresszálására.
Az alábbiakban röviden ismertetjük a leírásokhoz csatolt ábrákat.
1. ábra: Telomeráz-aktivitás meghatározása a templátban mutációt hordozó TRC3-at expresszáló sejtekben. Mutáns TRC3-at expresszáló stabil transzformánsokból származó, DEAE-Sepharose frakcionált extraktumok telomeráz aktivitását vizsgáltuk ismert vizsgálati eljárások alkalmazásával, különböző reakciós körülmények mellett. MuC+17 (1., 4., 7.,
10., 13., 16. csíkok: jelölt C*) , MuC-TRC-3 (2., 5., 8.,
11., 14., 17 csíkok: jelölt C) vagy MuA-TRC3 (3., 6., 9.,
12., 15., 18. csíkok: jelölt A) TRC3-expresszáló sejtekből származó extraktumokat vizsgáltunk normális reakciós körülmények mellett (1-6. csíkok), normális, de 0,5 mmól/l ddCTP-vel kiegészített közegben (7-9. csíkok), normális, de dTTP-t nem tartalmazó, viszont 0,5 mmól/l ddTTP-t tartalmazó közegben (10-12. csíkok), vagy normális, de dATP-t nem tartalmazó, viszont 0,5 mmól/l ddATP-t tartalmazó közegben (13-18. csíkok). Az 1-9. csíkok esetében alkalmazott vizsgálati reakciók 8 pmól/l össz-dGTP-t tartalmaztak, amelyből pmól/l 32P-dGTP volt (800 Ci/mmól). A mutáns telomeráz kimutatásának megkönnyítésére, a 10-18. csíkok esetében alkalmazott vizsgálati reakciók 8 pmól/l össz-dGTP-t tártál·»·· • · ««· ·«· · • * » · · · ♦ ♦ · · · · · ·
- 35 mázták, amelyből 2 pmól/l 32P-dGTP volt (800 Ci/mmól). Egyes extraktumokat a telomeráz meghatározás előtt dezoxiribonukleáz-mentes ribonukleázzal kezeltünk (25 pg/ml, 10 perc, 30 °C) (1-3., 16-18. csíkok). A széleken látható csíkok a nukleotidok (nt) számával megadott méretű DNSmarkereket tartalmaztak, a jelöltek szerint.
2. ábra: A telomeráz-RNS-összetevő (hTR) és GAPDH-RNS egyensúlyi szintjét határoztuk meg kvantitatív RT-PCReljárással. A kontrollok szerint, 25 ciklusig bezárólag valamennyi kvantitatív PCR-meghatározás lineáris tartományba esett. Az RT-PCR-t öt normális telomeráz-negatív sejtvonal (1-5) és öt tumoros telomeráz-pozitív sejtvonal (6-10) esetében végzetük el: 1) elsődleges fötális tüdő; 2) elsődleges fötális kézbőr; 3) felnőtt elsődleges prosztata; 4) elsődleges szinoviális fibroblasztok; 5) fityma fibroblasztok; 6) LOX-melanoma; 7) U251-leukémia; 8) NCIH23-jelű tüdő karcinóma; 9) SW620-jelű vastagbéltumor; 10) MCF7-jelű emlőtumor. A PCR-termékeket 32P-ral jelöltük, 6 %-os PAGE-n szétválasztottuk, és Phosphorlmager készülékkel mennyiségileg meghatároztuk. A transzkripció viszonylagos mértékét önkényes egységekben fejeztük ki.
3. ábra: A TRF átlagos hosszúsága antiszensz telomerázRNS-összetevőt expresszáló és vektor kontroll sejtekben.
Antiszensz 10-3-hTR-t, valamint vektor kontrollt stabilan expresszáló HeTe7-sejteket hygromycint és puromycint tartalmazó táptalajon szelektáltunk, majd a transzfekciót követően, a 23. megkettőződés (PDL) időpontjában öszegyűjtöttünk. Mag-DNS-t tisztítottunk, azt HinfI- és Rsal··»· «« «* • * * * • *·· ··· « • · · · ·
- 36 enzimekkel hasítottuk, és 0,5 %-os agarózgélen futtattuk. A DNS-t a gélben (TTAGGG) 3-oligonukleotid próbával hibridizáltattuk, a telomer terminális restrikciós fragmensek (TRF) jelölése céljából. A gélt Molecular Dynamic' s Phosphor Imager készülékkel pásztáztuk, és a TRF-ek átlagos méretét a leírtak szerint mennyiségileg meghatároztuk [ Allstop és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10224 (1992)] . A szaggatott vonalak a TRF átlagos méretét jelölik, az antiszensz és kontroll csoportokban.
4. ábra: In situ PCR-eljárás vázlatos ábrázolása.
Az alábbiakban ismertetjük a találmány előnyös megvalósítási módjait.
A találmány tárgyát képezik humán telomeráz ribonukleoproteinnel kapcsolatos eljárások, reagensek, genetikailag módosított állatok és sejtek, valamint gyógyászati készítmények .
Az alábbiakban használt elnevezések és a sejttenyésztésre, molekuláris genetikára, nukleinsav-kémiára, valamint hibridizációra vonatkozó, alább ismertetett laboratóriumi eljárások a technika állása szerint jól ismert, és általánosan alkalmazott eljárások. A rekombináns nukleinsaveljárások, polinukleotid-szintézis, mikrobiális tenyésztés és transzformáció (például elektroporáció, lipofekció) kivitelezésére ismert technikákat alkalmaztunk. A technikákat és eljárásokat általánosságban, a technika állása szerint ismert módszerek és szakirodalmi ajánlások szerint végeztük [lásd például: Sambrook és mtsai.: Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, 2. kiadás, Cold Spring Harbor
2. kiadás
Λ ·♦·· 99 «· ···* • * 9 · * « ··· ··* · • · · · · * ·· · ·
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); amely teljes terjedelmében a kitanítás részét képezi] , melyekre a leírás során folyamatosan hivatkoznunk.
Oligonukleotidokat egy Applied BioSystems oligonukleotid szintetizáló készülékkel szintetizálhatunk, a gyártó utasításai szerint eljárva. PCR-amplifikációra vonatkozó eljárások leírása megtalálható a szakirodalomban [PCR Technology: Principles and Applications fór DNA Amplification, szerk.: HA Erlich, Freeman Press, New
York, NY (1992); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, szerk.: Innis, Gelfland, Snisky és White, Academic Press, San Diego, CA (1990); Mattila és mtsai.:
Nucleic Acids Rés. 19, 4967 (1991); Eckert K. A. és Kunkel T. A.: PCR Methods and Applications 1_, 17 (1991); PCR, szerk.: McPherson, Quirkes és Taylor, IRL Press, Oxford; valamint a 4 683 202 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, amelyek teljes terjedelmükben a kitanítás részét képezik] .
Az alábbiakban ismertetjük a találmány szerinti megoldást .
A találmány tárgyát egyrészt, humán telomeráz-RNSösszetevő és a fenti RNS-összetevőt kódoló gén klónozása és izolálása képezi, a hozzá tartozó transzkripciós szabályozó elemekkel együtt. A humán telomeráz-RNS-összetevőjének nukleotid-szekvenciáját az alábbiakban közöljük. Az egyszerűség kedvéért, a szekvenciát a ribonukleotidok esetében használatos ismert rövidítések alkalmazásával ábrázoltuk (A : riboadenin, G : riboguanin, C : ribocitidin, és
9· «· • · · ··» ···
U: uridin). Szakember számára nyilvánvaló, hogy az alábbiakban bemutatott szekvencia megfelel a cDNS szekvenciájának is, azzal az eltéréssel, hogy abban ribonukleotidok helyett dezoxiribonukleotidok találhatók (az uridin helyett pedig timidin található).
‘ ‘ ‘ ‘ ‘ 50
GGGUUGCGGAGGGAGGGUGGGCCUGGGAGGGGUGGUGGCCAUUUUUUGUC • ‘ ‘ ‘ ‘ 100
UAACCCUAACUGAGAAGGGCGUAGGCGCCGUGCUUUUGCUCCCCGCGCGC ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ 150
UGUUUUUCUCGCUGACUUUCAGCGGGCGGAAAAGCCUCGGCCUGCCGCCU ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ 200
UCCACCGUUCAUUCUAGAGCAAACAAAAAAUGUCAGCUGCUGGCCCGUUC « . ‘ ‘ * 250
GCCCCUCCCGGGACCUGCGGCGGGUCGCUGCCCAGCCCCCGAACCCCGCC « ‘ ‘ ‘ ‘ 300
UGGAGGCCGCGGUCGGCCGGGGCUUCUCCGGAGGCACCCACUGCCACCGC « « ‘ ‘ ‘ 350
GAAGAGUUGGGCUCUGUCAGCCGCGGGUCUCUCGGGGGCGAGGGCGAGGU ‘ ‘ ‘ ‘ 400
UCACCGUUUCAGGCCGCAGGAAGAGGAACGGAGCGAGUCCCGCGCGCGGC ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ 450
GCGAUUCCCUGAGCUAUGGGACGUGCACCCAGGACUCGGCUCACACAUGC ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ 500
AGUUCGCUUUCCUGUUGGUGGGGGGAACGCCGAUCGUGCGCAUCCGUCAC
550
CCCUCGCCGGCAGUGGGGGCUUGUGAÁCCCCCAAACCUGACUGACUGGGC ‘ 559
CAGUGUGCU
A fenti szekvenciát 5' -3' irányban ábrázoltuk, és a hivatkozás kedvéért számozással láttuk el. Az RNS-összetevő templát szekvenciája feltételezetten az 50-60. nukleotidok által meghatározott régióba esik (5' -CUAACCCUAAC-3' ), amely körülbelül egy egész és két harmad telomer ismétlődő egységet tartalmazó telomer szekvenciával komplementer.
Ezt a szekvenciát cDNS-klónokból és az RNS-összetevőnek megfelelő genomi kiónból nyertük. Amikor az RNS-összetevő először átíródik a megfelelő génről, a keletkező RNStranszkriptumok legalább egy része sokkal hosszabb, mint a fent bemutatott, körülbelül 560 nukleotidból álló szekven39 • ···· fc* ···· ·· · · · · · • · ··· ··· · • · · · · « ··· * ·· · 9 cia, és valójában 1000 nukleotidnál több nukleotidot is tartalmazhat. A fenti, körülbelül 560 nukleotidból álló transzkriptumok elegendőek azonban a teljes működőképes telomeráz-molekulák összeépüléséhez. A natív telomerázban az RNS-összetevő 3' -vége a fenti szekvencián belül feltételezetten az 514-559. nukleotidok által meghatározott régióba esik; egy analízis szerint, a 3' -vég az 538. pozícióban található U-nukleotidnak felel meg. Aktív telomeráz előállítására felhasználhatók a fenti szekvencia 1-559.
nukleotidjainál kevesebb nukleotidot tartalmazó rekombináns
RNS-összetevő molekulák is.
FIXII-jelű lambda-vektorba inszertált humán DNSgénkönyvtárból egy genomi kiónt azonosítottunk és izoláltunk. Az RNS-összetevőt kódoló génszekvenciákat magába foglaló genomi klón körülbelül 15 kb inszertet tartalmazott, és azt 28-1-klónnak neveztük. A gént a 3. kromoszóma qkarjának disztális végén lokalizáltuk. A 28-1-jelű lambdaklónban található szekvenciára vonatkozó információkat, a körülbelül 15 kb inszert egyik végén található SauIIIAl restrikciós enzim felismerési helytől egy belső Hindui restrikciós enzim felismerési helyig terjedően, - amely régió tartalmazza a teljes érett RNS-összetevő szekvenciát, valamint az RNS-összetevő gén transzkripciós szabályozó elemeinek szekvenciáit, - az alábbiakban közöljük, az ismert dezoxiribonukleotid rövidítések alkalmazásával, 5' -3' irányban ábrázolva.
GATCAGTTAGAAAGTTACTAGTCCACATATAAAGTGCCAAGTCTTGTACT 5 0
CAAGATTATAAGCAATAGGAATTTAAAAAAAGAAATTATGAAAACTGACA
100 • ·
150
AGATTTAGTGCCTACTTAGATATGAAGGGGAAAGAAGGGTTTGAGATAAT ‘ ‘ ‘ ‘ 200 GTGGGATGCTAAGAGAATGGTGGTAGTGTTGACATATAACTCAAAGCATT / ‘ ‘ ‘ ‘ 250
TAGCATCTACTCTATGTAAGGTACTGTGCTAAGTGCAATAGTGCTAAAAA ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ 300
CAGGAGTCAGATTCTGTCCGTAAAAAACTTTACAACCTGGCAGATGCTAT ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ 350
GAAAGAAAAAGGGGATGGGAGAGAGAGAAGGAGGGAGAGAGATGGAGAGG ‘ ‘ ‘ ‘ * 400
GAGATATTTTACTTTTCTTTCAGATCGAGGACCGACAGCGACAACTCCAC ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ 450
GGAGTTTATCTAACTGAATACGAGTAAAACTTTTAAGATCATCCTGTCAT ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ 500
TTATATGTAAAACTGCACTATACTGGCCATTATAAAAATTCGCGGCCGGG ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ 550
TGCGGTGGCTCATACCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAAGCGGGT ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ 600
GGATCACTTGAGCCCTGGCGTTCGAGACCAGCCTGGGCAACATGGTGAAA ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ 650
CCCCCGTCTCTACTAAAAACACAAAAACTAGCTGGGCGTGGTGGCAGGCG ‘ ‘ ‘ ‘ 700
CCTGTAATCCCAGCTACTCAGGAGGCTGAGACACGAGAATCGCTTGAACC ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ 750
CGGGAGCAGAGGTTGCAGTGAGCCGAGATCACGCCACTAGACTCCATCCA ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ 800
GCCTGGGCGAAAGAGCAAGACTCCGTCTCAAAAAAAAAAATCGTTACAAT ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ 850
TTATGGTGGATTACTCCCCTCTTTTTACCTCATCAAGACACAGCACTACT ‘ .... goo
TTAAAGCAAAGTCAATGATTGAAACGCCTTTCTTTCCTAATAAAAGGGAG ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ * 950
ATTCAGTCCTTAAGATTAATAATGTAGTAGTTACACTTGATTAAAGCCAT ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ 1000 CCTCTGCTCAAGGAGAGGCTGGAGAAGGCATTCTAAGGAGAAGGGGGCAG ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ 1050
GGTAGGAACTCGGACGCATCCCACTGAGCCGAGACAAGATTCTGCTGTAG ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ 1100
TCAGTGCTGCCTGGGAATCTATTTTCACAAAGTTCTCCAAAAAATGTGAT ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ 1150
GATCAAAACTAGGAATTAGTGTTCTGTGTCTTAGGCCCTAAAATCTTCCT ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ 1200
GTGAATTCCATTTTTAAGGTAGTCGAGGTGAACCGCGTCTGGTCTGCAGA ‘ ‘ ‘ ‘ 1250
GGATAGAAAAAAGGCCCTCTGATACCTCAAGTTAGTTTCACCTTTAAAGA ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ 1300
AGGTCGGAAGTAAAGACGCAAAGCCTTTCCCGGACGTGCGGAAGGGCAAC ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ 1350
GTCCTTCCTCATGGCCGGAAATGGAACTTTAATTTCCCGTTCCCCCCAAC ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ 1400
CAGCCCGCCCGAGAGAGTGACTCTCACGAGAGCCGCGAGAGTCAGCTTGG ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ 1450
CCAATCCGTGCGGTCGGCGGCCGCTCCCTTTATAAGCCGACTCGCCCGGC ‘ ‘ ‘ ‘ 1500
AGCGCACCGGGTTGCGGAGGGAGGGTGGGCCTGGGAGGGGTGGTGGCCAT ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ 1550
TTTTTGTCTAACCCTAACTGAGAAGGGCGTAGGCGCCGTGCTTTTGCTCC ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ 1600
CCGCGCGCTGTTTTTCTCGCTGACTTTCAGCGGGCGGAAAAGCCTCGGCC ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ 1650
TGCCGCCTTCCACCGTTCATTCTAGAGCAAACAAAAAATGTCAGCTGCTG '* ‘ ‘ ‘ 1700
GCCCGTTCGCCCCTCCCGGGACCTGCGGCGGGTCGCTGCCCAGCCCCCGA ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ 1750
ACCCCGCCTGGAGGCCGCGGTCGGCCGGGGCTTCTCCGGAGGCACCCACT ‘ ‘ ‘ ‘ 1800 GCCACCGCGAAGAGTTGGGCTCTGTCAGCCGCGGGTCTCTCGGGGGCGAG ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ 1850
GGCGAGGTTCACCGTTTCAGGCCGCAGGAAGAGGAACGGAGCGAGTCCCG ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ 1900
CGCGCGGCGCGATTCCCTGAGCTATGGGACGTGCACCCAGGACTCGGCTC ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ 1950
ACACATGCAGTTCGCTTTCCTGTTGGTGGGGGGAACGCCGATCGTGCGCA ‘ ‘ ‘ ‘ 2000 TCCGTCACCCCTCGCCGGCAGTGGGGGCTTGTGAACCCCCAAACCTGACT ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ 2050
GACTGGGCCAGTGTGCTGCAAATTGGCAGGAGACGTGAAGGCACCTCCAA ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ 2100
AGTCGGCCAAAATGAATGGGCAGTGAGCCGGGGTTGCCTGGAGCCGTTCC ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ 2150
TGCGTGGGTTCTCCCGTCTTCCGCTTTTTGTTGCCTTTTATGGTTGTATT ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ 2200
ACAACTTAGTTCCTGCTCTGCAGATTTTGTTGAGGTTTTTGCTTCTCCCA ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ 2250
AGGTAGATCTCGACCAGTCCCTCAACGGGGTGTGGGGAGAACAGTCATTT ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ 2300 ttttttgagagatcatttaacatttaatgaatatttaattagaagatcta * ‘ ‘ ‘ ‘ 2350
AATGAACATTGGAAATTGTGTTCCTTTAATGGTCATCGGTTTATOCCAGA ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ 2400
GGTTAGAAGTTTCTTTTTTGAAAAATTAGACCTTGGCGATGACCTTGAGC ‘ ‘ ‘ 2425
AGTAGGATATAACCCCCACAAGCTT
Az RNS-összetevő szekvenciája az 1459. bázisnál kezdődik. A szekvencián belül különböző transzkripciós szabályozó elemeket azonosítottunk. Az 1431-1436. nukleotidoknál egy A/T-box konszenzus szekvencia található; az 14061414. szekvenciáknál, valamint az 1508-1526. nukleotidoknál egy PSE konszenzus szekvenciát találtunk; az 1399-1406. nukleotidoknál egy CAAT-box konszenzus szekvenciát találtunk; az 1354-1359. nukleotidoknál egy SPl-box konszenzus szekvenciát mutattunk ki; és az 1234-1245. nukleotidoknál egy β/γ-interferőn válaszelemnek megfelelő konszenzus szekvenciát találtunk. A humán telomeráz-RNS-összetevő gén egyensúlyi transzkripciója humán sejtekben, - például HT1080-jelű (telomerázt expresszáló) sejtekben, - lényegében változatlan, ha az 1159. nukleotidőktől 5' -irányban található szekvenciák a sejtekbe stabilan transzfektált vektorokban deletáltak.
Selyemmajomból·, - az emberhez képest genetikailag leginkább eltérő nem-humán főemlősök közt számon tartott fajból származó DNS a találmány szerinti, humán telomeráz-RNSösszetevő polinukleotid-szekvenciájával megegyező vagy azzal komplementer szekvenciákat tartalmazó PCR láncindító oligonukleotidokkal amplifikálható telomeráz-RNS-összetevő gént tartalmaz. Más, nem-humán főemlősök feltehetően olyan telomeráz-RNS-összetevő géneket tartalmaznak, amelyek szintén amplifikálhatók a humán telomeráz-RNS-összetevő gén szekvenciájából származó PCR láncindító oligonukleotidokkal .
Telomeráz-RNS-összetevő polinukleotidok
Az emlőstelomeráz-RNS-összetevő szekvenciájának és az annak megfelelő génnek, például a találmány szerinti humán telomeráz és a selyemmajom telomeráz (lásd 5. ábra) szekvenciájának ismerete lehetővé teszi olyan izolált polinukleotidok előállítását, amelyek legalább 15, tipikusan 20-25 folyamatosan egymást követő nukleotidból álló, egy emlőstelomeráz-RNS-összetevő szekvenciájával, vagy emlőstelomeráz-RNS-összetevő gén szekvenciájával lényegében megegyező szekvenciát tartalmaznak. Ezen felül, az • ·
- 43 emlőstelomeráz-RNS-összetevő (és az azt kódoló gén) szekvenciájának ismerete lehetővé teszi nukleinsav hibridizációs próbák és PCR láncindító oligonukleotidok előállítását, amelyek sejtben, sejtmintában, szövetmintában, reakciós edényben, hibridizációs membránon és hasonlókban, a megfelelő telomeráz-RNS-összetevő és/vagy gén RNS- vagy DNSszekvenciáinak kimutatására alkalmazhatók.
Emlőstelomeráz-RNS-összetevő szekvenciákat tartalmazó polinukleotidok tartalmazhatnak a transzkripciót elősegítő szekvenciákat (expressziós szekvenciákat), RNS-stabilizáló szekvenciákat és hasonlókat. Az ilyen polinukleotidok előállításánál az itt feltárt szekvencia-információk és a leírásban található irányelvek, valamint útmutatások figyelembe vételével alkalmazható általános elvek a technika állása szerint jól ismertek, és azok megtalálhatók például Maniatis és munkatársai kézikönyvében [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. kiadás, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)] . Ilyen polinukleotidok -anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk - tartalmazhatnak promótert, adott esetben, eukarióta expressziós gazdaszervezetben alkalmazható enhanszert, és adott esetben, tartalmazhatnak a vektor replikációjához szükséges szekvenciákat. Tipikus eukarióta expressziós kazetták olyan polinukleotid-szekvenciákat tartalmaznak, amelyek átíródva, emlőstelomeráz-RNS-összetevő transzkriptumokat eredményeznek; az említett polinukleotidszekvenciák egy megfelelő promótertől, például a HSV-fckpromótertől vagy a pgk- (foszfoglicerát kináz) promótertől • · • ·
- 44 3' -irányban (azaz, 5' -3' transzkripciós orientációban) találhatók, adott esetben, egy enhanszerhez kapcsolódva.
Ezen felül, amennyiben funkcionális telomeráz-RNSösszetevó expressziója nem kívánatos, a találmány szerinti polinukleotidokat úgy tervezzük, hogy azok ne idézzék elő funkcionális telomeráz-RNS-összetevő átíródását. A találmány szerinti polinukleotidok alkalmazhatók hibridizációs próbákként és/vagy PCR láncindító oligonukleotidokként (amplifikációs láncindító oligonukleotidokként) és/vagy LCR láncindító oligomerekként, telomeráz-RNS-összetevőt kódoló RNS- vagy DNS-szekvenciák kimutatására.
Más eljárás szerint, a találmány szerinti polinukleotidok alkalmazhatók hibridizációs próbákként vagy láncindító oligonukleotidokként, az emberrel rokonságban álló fajokban, tipikusan emlős fajokban, rokon RNS- vagy DNS-szekvenciák vagy telomeráz-RNS-összetevőt kódoló gén kimutatására. Az ilyen hibridizáció és PCR-amplifikáció szempontjából, a találmány szerinti polinukleotidokkal szemben nem merül fel az igény, hogy funkcionális telomeráz-RNS-összetevő átíródását eredményezzék. A találmány szerinti polinukleotidok tehát jelentős méretű deléciókat, addíciókat, nukleotid szubsztitúciókat és/vagy transzpozíciókat tartalmazhatnak, feltéve, hogy az emlőstelomeráz-RNS-összetevő szekvenciájával történő specifikus hibridizálódás képessége fennmarad.
Emlőstelomeráz-RNS-összetevőt és megfelelő génszekvenciákat kódoló genomi- vagy cDNS-klónok klón-könyvtárakból izolálhatok (például a Clontech cégtől hozzáférhető gén• · · ·
- 45 könyvtárból, Paolo Alto, CA), a találmány szerinti nukleotid-szekvencia alapján tervezett hibridizációs próbák és ismert hibridizációs vizsgáló módszerek alkalmazásával [ lásd például: Benton WD. és Davis RW: Science 196, 180 (1977); Goodspeed és mtsai.: Gene 76, 1 (1989)] . Amennyiben cDNS-klónt kívánunk izolálni, szomatikus sejtekből nyert RNS-ből vagy más, telomeráz-RNS-összetevőt expresszáló sejtekből nyert RNS-ből származó cDNS-t tartalmazó klónkönyvtárak alkalmazása előnyös. A találmány szerinti szekvencia egészének vagy egy részének megfelelő szintetikus polinukleotid-szekvenciákat előállíthatunk oligonukleotidok kémiai szintézisével. A találmány szerinti szekvenciaadatok alapján tervezett láncindító oligonukleotidok felhasználásával végzett polimeráz láncreakciót (PCRt) alkalmazhatunk továbbá genomi DNS-ről, össz-RNS-ről, vagy cDNS-klónkönyvtárakról DNS-fragmensek amplifikációjára. [A PCR-eljárásokat a 4 683 195 sz. és 4 683 202 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások ismertetik.]
A fenti polinukleotidok különböző célokra alkalmazhatók, például telomeráz-RNS-összetevő kimutatására alkalmas hibridizációs próbákként; sejtekben, funkcionális vagy nemfunkcionális telomeráz-RNS-összetevő előállítására szolgáló templátként; a kereskedelemben hozzáférhető diagnosztikus reagensekként, telomeráz-RNS-összetevő kimutatására szolgáló vizsgálati eljárás standardizálására; állatoknak beadható génterápiás polinukleotidokként; az ilyen polinukleotidok ezen felül felhasználhatók többek között élei46 műszerekként, éghető energiaforrásként, ultraibolya sugárzást elnyelő, napfényelleni védőszerekként, és viszkozitást fokozó adalékanyagként.
A találmány tárgyát képezik a humán telomeráz-RNSösszetevő és az RNS-összetevőt kódoló gén klónozása során előállított plazmidok. Ezek a plazmidok felhasználhatók humán telomeráz-RNS-összetevő vagy az azt kódoló gén lényegében tiszta formában történő előállítására, ami szintén a találmány tárgyát képezi. Szakember számára világos továbbá, hogy a találmány tárgyához tartoznak humán telomerázRNS-összetevő nukleotid-szekvenciájának egészét vagy annak legalább egy alkalmazható részét tartalmazó egyéb plazmidok, valamint nem-plazmid nukleinsavak, lényegében tiszta formában.
A találmány szerinti nukleinsavak és az azokat tartalmazó készítmények vonatkozásában, szakember számára általános elvként nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti nukleinsavak lehetnek mind DNS-, mind RNS-molekulák, valamint azok szintetikus, természetben elő nem forduló analógjai, valamint ribonukleotidok és dezoxiribonukleotidok heteropolimerjei és/vagy azok analógjai. A találmány szerinti nukleinsav vagy nukleinsav analóg pontos összetétele függ az alkalmazás céljától, valamint attól a környezettől (környezetektől), amelyben azt alkalmazni kívánjuk. A technika állása szerint ismert módon, módosított vagy szintetikus, természetben elő nem forduló nukleotidokat tervezhetünk a különböző alkalmazási módoknak megfelelően, és abból a célból, hogy azok a különböző környezetben, például • ·
- 47 nukleázokat tartalmazó környezetben stabilak maradjanak. A módosított vagy szintetikus, természetben elő nem forduló nukleotidok a természetben előforduló ribo- vagy dezoxiribonukleotidoktól eltérhetnek a nukleotidokban található szénhidrát (cukor), a foszfátkötés vagy bázisalkotórész vonatkozásában, vagy egyes esetekben, tartalmazhatnak nemnukleotid bázisokat (vagy egyáltalán nem tartalmaznak bázisokat) . [Lásd például: Arnold és mtsai.: WO 89/02439 sz. nemzetközi közzétételi irat, amelynek címe: Non-nucleotide Linking Reagents fór Nucleotid Probes, amely teljes terjedelmében a kitanítás részét képezi.] Annak megfelelően, hogy a találmány szerinti nukleinsavak különböző nukleotidok változatos sokaságát tartalmazhatják, azok számos különböző funkcióra alkalmazhatók.
Közös eredetű gének izolálása
A fenti leírás szerint, humán telomeráz-RNS-összetevő szekvenciát tartalmazó tisztított nukleinsavak előállítása révén értékes diagnosztikus és terápiás eljárásokhoz, valamint reagensekhez jutunk, és az ilyen nukleinsavak további jelentős előnyöket tartogatnak számunkra. A találmány szerinti megoldás egy jelentős előnye, hogy a találmány szerinti eljárások alkalmazhatók telomeráz-RNS-összetevő és telomeráz-RNS-összetevő gének izolálására bármely olyan emlős fajból, amely a találmány szerinti, humán RNSösszetevővel lényegében homológ RNS-összetevővel rendelkezik. Lényegében homológ kifejezés alatt a homológiának azt a fokát értjük, amely egy, a humán RNS-összetevőből származó oligonukleotid vagy nukleinsav szekvenciájának egy ··· · ···
- 48 másik emlős fajból származó RNS-összetevő nukleotidszekvenciájával történő specifikus hibridizálódásához elegendő. Ilyen lényegében vett homológia fennállása esetén, szakember a találmány szerinti nukleinsavak, láncindító oligonukleotidok és hibridizációs próbák alkalmazásával képes lényegében homológ szekvenciák azonosítására és izolálására .
Például, genomi génkönyvtárat vagy cDNS-génkönyvtárat vizsgálhatunk hibridizációs próbával, homológ szekvenciák kimutatása céljából. Az RNS-összetevő szekvencia egy régiójának megfelelő láncindító oligonukleotidok és PCR amplifikációs eljárás alkalmazásával, a hibridizáció szempontjából kevésbé sztringens vagy mérsékelten sztringens körülmények mellett, emlős fajból származó RNS- vagy DNSkészítményekből specifikus homológ nukleinsav szekvenciát is amplifikálhatunk. A fenti és más hasonló technikák alkalmazásával, szakember nem csak variáns RNS-összetevő nukleinsavak izolálására képes humán sejtekből, hanem homológ RNS-összetevő nukleinsavak izolálására is, más emlős sejtekből, például főemlős sejtekből, állatorvosi szempontból jelentőséggel bíró emlősökből, azaz szarvasmarhából, birkából, lóból, kutyákból és macskákból, valamint rágcsálókból, - azaz patkányokból, egerekből és hörcsögökből. Ezek a nukleinsavak viszont felhasználhatók transzgenikus állatok előállítására, amelyek igen értékesek telomeráz-aktivitást szabályozó gyógyászati hatóanyagok szűrésénél és tesztelésénél. A találmány szerinti plazmidok alkalmazásával például az RNS-összetevő gén kiiktatható vagy a természetes RNS• · · · · ·
- 49 összetevő gén rekombináns, indukálható génnel helyettesíthető egy mus spretus embrionális törzssejtben, ezáltal transzgenikus egér állítható elő, amely modell- vagy tesztrendszerként alkalmazható korral vagy öregedéssel kapcsolatos betegségek vizsgálatára. Az alábbi, 9. példa azt szemlélteti, hogy az ilyen eljárás hogyan alkalmazható főemlősökből RNS-összetevő szekvenciák azonosítására és izolálására.
A humán és majom telomeráz-RNS-összetevő és/vagy az azoknak megfelelő gének egyéb emlős homológjai megfelelő nem-humán emlős genomi génkönyvtár vagy cDNS-klónkönyvtár szűrésével izolálhatok, - például egérből, nyúlból, tengerimalacból, hörcsögből, kutyából, szarvasmarhából, birkából, farkasszerűekből, sertésből származó, vagy más, alkalmas vektorban, például mesterséges élesztő kromoszómákban, kozmidokban vagy λ-bakteriofágban (például X-Charon-35) található genomi vagy cDNS-génkönyvtárakból, a humán vagy majom telomeráz-RNS-összetevő vagy azt kódoló gén polinukleotid-szekvencájának legalább körülbelül 20 folyamatosan egymást követő nukleotidból álló szekvenciáját (vagy azok komplementer szekvenciáját) tartalmazó polinukleotid próbával. Tipikusan, a hibridizációt és mosást ismert hibridizációs eljárások szerint, a hibridizáció szempontjából igen sztringens (a specifikus hibridizációnak kedvező) körülmények mellett végezzük. Pozitív kiónokat izolálunk és szekvenálunk. A szemléltetés kedvéért - de anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk - a humán telomeráz-RNS-összetevő 559 nukleotidból álló szekven50 ciájának megfelelő teljes hosszúságú polinukleotidszekvenciá jelölhető, és hibridizációs próbaként alkalmazható XEMBL4-ben vagy λΘΕΜΙΙ-όβη (Promega Corporation, Madison, Wisconsin) létesített nem-humán genomi klónkönyvtárból genomi kiónok izolálására; a felemelt plakkok szűrésénél alkalmazható tipikus hibridizációs körülmények a következők [ Benton és Davis: Science: 196, 180 (1978); Dunn és mtsai.: J. Bioi. Chem. 264, 13057 (1989)] : 50 % formaldehid, 5x SSC vagy SSPE, l-5x Denhardt-féle oldat, 0,11 % SDS, 100-200 pg darabolt heterológ DNS vagy tRNS, 010 % dextrán-szulfát, körülbelül 1x10 cpm/pg specifikus aktivitással rendelkező 1χ105-1χ10? cpm/ml denaturált próba, és körülbelül 6-36 órán át, 42-37 °C-on végzett inkubáció. Az előhibridizációnál lényegében a fentiekkel megegyező körülményeket alkalmazunk, azzal az eltéréssel, hogy a közeg hibridizációs próbát nem tartalmaz, és az inkubációs idő tipikusan kevesebb. A mosásnál tipikusan az alábbi körülményeket alkalmazzuk: l-3x SSC, 0,1-1 % SDS, 45-70 °C, a mosó oldatot körülbelül 5-30 percenként cserélve. Nem-humán telomeráz-RNS-összetevő polinukleotidok izolálását humán telomeráz-RNS-összetevő polinukleotid próba alkalmazásával, gyakran előnyösen kevésbé sztringens hibridizációs körülmények mellett, például körülbelül 39 °C-on végezzük, majd egymást követően a következő hőmérsékleteken történő mosásokat alkalmazunk: szobahőmérsékleten, 37 °C-on, 39 °C-on, 42 °C-on, 45 °C-on, 50 °C-on, 55 °C-on, 60 °C-on, 65 °C-on és 70 °C-on; valamennyi lépést követően megállva, és meghatározva a próba által adott, háttérnek megfelelő jelet, ····
.. . * . . ...
. · · · · · ·<·· ·· · ·
- 51 (adott esetben -amennyiben radioaktívan jelölt próbát alkalmaztunk -, a jel kimutatása történhet autoradiogram készítésével és/vagy foszfor-leképezéssel), a tapasztalati úton történő meghatározás szerint, a megfelelő jel/háttér arány elérésekor a mosást befejezzük.
A leírásban ismertetett humán vagy majom telomeráz-RNSösszetevő szekvenciájával komplementer, körülbelül legalább 30-50 nukleotidból, előnyösen körülbelül legalább 100 nukleotidból álló szekvenciát tartalmazó polinukleotidok PCR láncindító oligonukleotidokként és/vagy hibridizációs próbákként alkalmazhatók a találmány szerinti gén és RNSösszetevő szekvenciáknak megfelelő csírasejt eredetű gének azonosítására és izolálására. Az ilyen csírasejt eredetű gének különböző, a technika állása szerint ismert eljárásokkal izolálhatok, például - de anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk - λ-bakteriofág- vagy kozmidgénkönyvtárban létesített genomi génkönyvtárak hibridizációs szűrésével, vagy genomi szekvenciák PCR-amplifikációjával, a találmány szerinti szekvenciákból származó láncindító oligonukleotidok alkalmazásával. Humán genomi génkönyvtárak a kereskedelemben hozzáférhetők, és humán
DNS-ból de novo előállíthatok.
Szakember számára világos, hogy a találmány szerinti polinukleotidokban nukleotid-szubsztitúciók, -deléciók és addíciók hozhatók létre. Nukleotid-szekvencia-variáció lehet a különböző allélek szekvencia-polimorfizmusának és hasonlóknak a következménye. Az ilyen nukleotidszubsztitúciók, -deléciók és -addíciók azonban nem csók«· ··· · ·* · ·
- 52 keríthetik jelentősen a polinukleotidoknak azt a képességét, hogy a specifikus hibridizálódás szempontjából elég sztringens hibridizációs körülmények mellett, az itt bemutatott, teljes hosszúságú humán vagy majom eredetű telomeráz-RNS-összetevő polinukleotid-szekvenciák valamelyikével hibridizálódjanak.
Emlőstelomeráz-RNS-összetevő-polinukleotidők lehetnek rövid oligonukleotidok (például 20-100 bázispár hosszúságúak) , mint például a hibridizációs próbaként vagy PCR (vagy LCR) láncindító oligonukleotidokként alkalmazott polinukleotidok. A polinukleotid-szekvenciák ezen felül tartalmazhatják egy nagyobb polinukleotid egy részét, (például egy telomeráz-RNS-összetevő-klónt tartalmazó klónozó vektor), és polinukleotidok összekapcsolásával, más polinukleotid-szekvenciával fuzionáltathatók. Tipikusan, a telomeráz-RNS-összetevő polinukleotidok legalább 25 olyan folyamatosan egymást követő nukleotidot tartalmaznak, amelyek lényegében megegyeznek egy természetben előforduló telomeráz-RNS-összetevő vagy azt kódoló gén szekvenciájával, előnyösebben, a telomeráz-RNS-összetevő polinukleotidok legalább 50-100 olyan egymást követő nukleotidot tartalmaznak, amelyek lényegében megegyeznek egy természetben előforduló, emlőstelomeráz-RNS-összetevő szekvenciájával. Szakember számára azonban világos, hogy a telomeráz-RNS-összetevő polinukleotidnak az a minimális hosszúsága, amely a telomeráz-RNS-összetevő célszekvenciával létrejövő specifikus hibridizálódáshoz szükséges, több faktortól függ, többek között a következő faktoroktól: G/C4 · tartalom; nem-kompatibilis bázisok pozíciója (ha van ilyen); a szekvencia egyediségének foka, összehasonlítva célzott polinukleotidok populációjával, valamint a polinukleotid kémiai természete, (például metilfoszfonát váz, poliamid nukleinsav, foszforotiolát, stb.).
Kívánt esetben és a szakember tetszése szerint, lényegében teljes hosszúságú cDNS-kópiák amplifikációjára alkalmas PCR láncindító oligonukleotidok (amplimerek) választhatók. Hasonlóképp, a telomeráz-RNS-összetevő gén (majom vagy humán eredetű gén) egy részének amplifikációjára alkalmazható amplimerek is választhatók.
Valamennyi fenti szekvencia alkalmazható hibridizációs próbaként vagy PCR láncindító oligonukleotidként (amplimerként), telomeráz-RNS-összetevő jelenlétének kimutatására, például a sejtekben fokozott vagy csökkent menynyiségű telomeráz-RNS-összetevő jelenlétével jellemezhető neopláziás betegségek diagnózisára, vagy szövettipizálásra, (azaz, telomeráz-RNS-összetevő expressziójával jellemezhető szövetek azonosítására), és hasonlókra. A szekvenciák alkalmazhatók ezen felül, DNS-mintában genomi telomeráz-RNSösszetevő génszekvenciák kimutatására, például igazságügyi DNS-analízis céljára (például RFLP-analízisre, PCR-termékek hossz-megoszlásának vizsgálatára, stb.), vagy a telomerázRNS-összetevő gén amplifikációjával és/vagy átrendeződésével jellemezhető betegségek diagnózisára.
Például - de anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk - az alábbi láncindító oligonukleotid pár alkalmazható telomeráz-RNS-összetevő polinukleotid,ί ·« * · e a · - · · • « ,·♦··» » • · · · · · #·«· » · · ·
- 54 szekvenciák (például cDNS) amplifikációjára vagy hibridizációs próbaként (például biotinilezett vagy jelölt végű oligonukleotid próbaként):
5' - AGCACACTGGCCCAGTCAGTCAGGTTTG -3'
5' - GGGTTGCGGAGGGAGGGTGGGCCTGGGA -3' .
Más alkalmas PCR láncindító oligonukleotidok, LCR láncindító oligonukleotidok, hibridizációs próbák, láncindító oligonukleotidok és hasonlók a találmány szerinti, telomeráz-RNS-összetevő szekvenciák, valamint az azok felhasználásával nyerhető szekvenciák ismeretében nyilvánvalók szakember számára. Humán telomeráz-RNS-összetevő polinukleotidok és azok komplementer szekvenciái felhasználhatók hibridizációs próbákként vagy láncindító oligonukleotidokként, emlőstelomeráz-RNS-összetevő RNSvagy DNS-szekvenciáinak kimutatására. A hibridizáció vagy PCR-amplifikáció céljára alkalmazható polinukleotidok jelentős méretű deléciókat, addíciókat, nukleotidszubsztitúciókat és/vagy transzpozíciókat tartalmazhatnak, amennyiben azok továbbra is képesek humán telomeráz-RNSösszetevő szekvenciájával specifikusan hibridizálódni, vagy azt specifikus módon amplifikálni. Az ilyen nukleotidszubsztitúciók, -deléciók - addíciók azonban, nem csökkenthetik jelentős mértékben a polinukleotidoknak azt a képességét, hogy a specifikus hibridizálódás létrejötte szempontjából elég sztringens hibridizációs körülmények mellett telomeráz-RNS-összetevő vagy génszekvenciákkal hibridizálódjanak.
··*«
- 55 Például - de anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk - egy humán telomeráz-RNS-összetevő polinukleotid tartalmazhatja a 48-209. nukleotidokat, amely telomeráz protein-összetevő jelenlétében elegendőnek tűnik a humán telomeráz holoenzim helyreállításához:
5' -UCUAACCCUAACUGAGAAGGGCGUAGGCGCCGUGCUUUUGCUCCCCGCGCGCUGUUUUUCUCGCUGACUUUCAGCGGGCGGAAAAGCCUCGGCCUGCCGCCUUCCACCGUUCAUUCUAGAGCAAACAAAAAAUGUCAGCUGCUGGCCCGUUCGCCCCUCCC-3' vagy az ennek megfelelő DNS:
5' -TCTAACCCTAACTGAGAAGGGCGTAGGCGCCGTGCTTTTGCTCCCCGCGCGCTGTTTTTCTCGCTGACTTTCAGCGGGCGGAAAAGCCTCGGCCTGCCGCCTTCCACCGTTCATTCTAGAGCAAACAAAAAATGTCAGCTGCTGGCCCGTTCGCCCCTCCC-3' .
Egy humán telomeráz-RNS-összetevő polinukleotid az 1559. nukleotidokat is tartalmazhatja, vagy állhat azokból, és tartalmazhat más nukleotidokból vagy nukleotidszekvenciákból felépülő terminális addíciókat. A 48-209. nukleotidokat tartalmazó, kevert templát-bázissorrenddel rendelkező variáns, amelyben a telomer ismétlődő egység templátszekvenciája az eredetihez képest megváltozott, a telomeráz protein-összetevővel való kötődésben képes kompetícióba lépni a 48-209. nukleotidoknak megfelelő vadtípusú szekvenciát tartalmazó csonka RNS-összetevővel, és képes telomeráz holoenzimet képezni.
A humán telomeráz-RNS-összetevő strukturális analízise szerint, az olyan régiókat tartalmaz, amelyek hajlamosak másodlagos struktúrákat képezni, például haj tű hurok szerkezetet felvenni. Például, a humán telomeráz-RNS-összetevő • ·· ·
- 56 körülbelül 200-350. nukleotidjainak megfelelő régiója alapvetően hajtű hurok jelleggel rendelkezik. A telomeráz-RNSösszetevő más részei is szignifikáns másodlagos szerkezettel jellemezhetők. Az említett másodlagos szerkezet figyelembe vételével, szakember az említett szekvenciákat olyan egyéb nukleotid-szekvenciákkal helyettesítheti, amelyek komputeres analízis szerint, várhatóan hasonló másodlagos struktúrát vesznek fel. Az előbbiekkel lényegében egyenértékű másodlagos struktúrák felvételére képes nukleotidszekvenciák meghatározására különböző komputerprogramok alkalmazhatók, többek között a következők: a FOLD, a
SQUIGGLES, a CIRCLES, a DOMES, a NOUNTAINS és STEMLOOP
UWGCG Sequence Analysys Software Package programok és hasonlók. Hasonlóképp, molekuláris modellező programok segítségével nem-nukleinsavakat, például peptid-nukleinsavakat és hasonlókat tartalmazó, az eredetinek megfelelő struktúrát képező molekulák tervezhetők, amelyek a kívánt, humán telomeráz-RNS-összetevő régió (régiók) jellemző másodlagos struktúráját utánozzák. Ilyen, az eredeti struktúrát utánzó molekulák alkalmazhatók terápiás célra, vagy különböző egyéb célokra (például kompetitív antagonistákként, stb.).
Antiszensz megközelítési mód
A találmány tárgyát képezik in vivő vagy in vitro, a humán telomeráz aktivitásának gátlására alkalmazható antiszensz oligonukleotidok. Antiszensz oligonukleotidok a humán telomeráz-RNS-összetevő specifikus nukleotidszekvenciájával komplementer, körülbelül 10-25 nukleotidtól körülbelül 200 vagy több nukleotidig terjedő specifikus
- 57 szekvenciát tartalmaznak, - (azaz, elég hosszú szekvenciát ahhoz, hogy stabil duplexet képezzenek, de elég rövidet ahhoz, hogy a bejuttatás módjától függően, kívánt esetben in vivő alkalmazhatók legyenek). Az ilyen oligonukleotidok kifejthetik hatásukat úgy, hogy az RNS-összetevőhöz kötődve megakadályozzák a funkcionális ribonukleoprotein telomeráz összeépülését; és/vagy megakadályozzák azt, hogy az RNSösszetevő telomer DNS-szintézis számára templátként működjék; és/vagy destabilizálják a telomeráz-RNS-összetevőt és csökkentik annak féléletidejét; és/vagy gátolják a telomeráz-RNS-összetevő gén transzkripcióját.
A telomeráz-aktivitás gátlására in vivő és/vagy in vitro alkalmazható találmány szerinti antiszensz oligonukleotidok például a fent említett tesztoligonukleotidok, amelyeket annak meghatározására használtunk, hogy a pGRN7-klón tartalmazza-e a humán telomerázRNS-összetevőnek megfelelő cDNS-t. A fent említettek szerint, a telomeráz-aktivitás in vitro gátlásának szemléltetésére három ilyen oligonukleotidot alkalmaztunk. Az egyes oligonukleotidok szekvenciáját az alábbiakban közöljük:
T3 5' - CTCAGTTAGGGTTAGACAAA -3'
P3 5' - CGCCCTTCTCAGTTAGGGTTAG -3'
TA3 5' - GGCGCCTACGCCCTTCTCAGTT -3' .
A fenti oligonukleotidok alkalmazhatók továbbá, a telomeráz aktivitásának gátlására, humán sejtekben.
Szakember számára világos, hogy a találmány tárgyát képezi antiszensz oligonukleotidok széles skálája, amelyek képesek telomeráz-aktivitás gátlására. A találmány tárgyát képező további előnyös oligonukleotid a Tel-AUoligonukleotid, amely az 5' - CAGGCCCACCCTCCGCAACC -3' szekvenciával rendelkezik, és amely a találmány szerinti, egyéb antiszensz oligonukleotidokhoz hasonlóan előállítható foszforotioát-nukleotidok, királis metil-foszfonátok, természetben előforduló nukleotidok, vagy azok keverékének alkalmazásával, hogy megfelelő stabilitással és a kívánt Tmértékkel (melting temperature-, azaz olvadáspontértékkel) rendelkező oligonukleotidot kapjunk. Szakember számára nyilvánvaló, hogy nagy számú módosított nukleotid analóg, - például O-metil-ribonukleotidok, foszforotioátnukleotidok, és metil-foszfonát-nukleotidok alkalmazhatók olyan találmány szerinti nukleinsavak előállítására, amelyek sokkal előnyösebb tulajdonsággal, (azaz nukleázrezisztenciával, erősebb kötődési képességgel, stb.) rendelkeznek, mint a természetben előforduló nukleotidok felhasználásával előállítottak. Oligonukleotidok nukleázrezisztenciájának fokozására szolgáló technikákat ismertet például a 94/12633 sz. PCT közzétételi irat.
A találmány tárgyához tartoznak ezen felül, telomeráz aktivitásának módosítására irányuló olyan eljárások, amelyek szerint, a humán telomeráz-RNS-összetevő (hTR) szekvenciájának egészével vagy egy részével komplementer specifikus antiszensz oligonukleotidokat alkalmazunk, például humán telomeráz-RNS-összetevő génhez vagy annak átíródott RNS-szekvenciájához, ezen belül, telomeráz holoenzimmel kapcsolódni képes csonkított formákhoz képest antiszensz polinukleotidokat. Az ilyen komplementer antiszensz polinukleotidok tartalmazhatnak nukleotid-szubsztitúciókat, -addíciókat, -deléciókat vagy -transzpozíciókat, amennyiben a polinukleotid funkcionális jellemzőjeként, annak specifikus kötődési képessége a telomeráz-RNS-összetevő vagy az azt kódoló gén megfelelő célzott szekvenciájához megmarad. Komplementer antiszensz polinukleotidok lehetnek oldható antiszensz RNS- vagy DNS-oligonukleotidok, amelyek telomeráz-RNS-összetevő fajtákkal specifikus módon képesek hibridizálódni, és a telomeráz-RNS-összetevő gén transzkripcióját megakadályozni [ Ching és mtsai.: Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 86, 10006 (1989); Broder és mtsai.: Ann.
Int. Med. 113, 604 (1990); Loreau és mtsai.: FEBS Letters 274, 53 (1990); Holcenberg és mtsai.: WO91/11535 sz. nemzetközi közzétételi irat; 07/530,165 sz. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás; a WO91/09865 sz., a WO91/04753 sz., a WO90/13641 sz. nemzetközi közzétételi iratok; valamint az EP 386563 sz. európai közzétételi irat; amelyek teljes terjedelmükben a kitanítás részét képezik] .Az antiszensz polinukleotidok ezáltal gátolják a funkcionális telomeráz-RNS-összetevő keletkezését. Mivel a telomeráz-RNS-összetevő expressziója (a transzkripció aránya és/vagy az RNS stabilitása) a telomeráz holoenzim enzimatikus aktiválódásával kapcsolatos, a telomeráz-RNSösszetevőnek megfelelő RNS transzkripcióját és/vagy a telomeráz-RNS-összetevő és a humán telomeráz proteinösszetevő kölcsönhatását, és/vagy a telomeráz-RNS-összetevő és a telomer szekvenciák kölcsönhatását gátló antiszensz polinukleotidok gátolhatják a telomeráz aktivitását és/vagy • · ·
- 60 eredményezhetik az antiszensz polinukleotidok hiányában telomeráz-aktivitással rendelkező sejtek, például folyamatos szaporodásúvá vált vagy neopláziás transzformáción átment sejtek fenotípusának megváltozását. Telomeráz-RNSösszetevő antiszensz. polinukleotidok terápiásán hatékony mennyiségét tartalmazó gyógyászati készítmények olyan betegségek kezelésére adhatók be, amelyeknél a sejtek patogenezisében telomeráz-aktivitás játszik szerepet (például neopláziákban), vagy kívánt esetben, adagolhatok ivarsejtek termelődésének vagy fennmaradásának gátlására (azaz, kontraceptívumként). Különböző hosszúságú antiszensz polinukleotidok állíthatók elő, bár az ilyen antiszensz polinukleotidok tipikusan olyan, legalább körülbelül 25 egymást követő nukleotidból álló szekvenciát tartalmaznak, amely lényegében komplementer a természetben előforduló telomeráz-RNS-összetevő polinukleotid-szekvenciájával, és tipikusan tökéletesen komplementer a humán telomeráz-RNSösszetevő szekvenciájával, és általában komplementer a telomeráz-RNS-összetevőnek a telomeráz ismétlődő szekvenciával komplementer szekvenciájával, vagy a telomeráz-RNSösszetevőnek a telomeráz polipeptid alegységgel érintkező részével.
Antiszensz polinukleotidok előállíthatók transzfektált sejtekben vagy transzgenikus sejtekben, heterológ expressziós kazettáról. A heterológ expressziós kazetta lehet egy génterápiás vektor része, például adenovírus vagy adenovírussal kapcsolatos vírusvektor vagy más génterápiás vektor része. A heterológ kazetta lehet olyan polinukleotidon, amely nem képes önálló replikációra, és amelyet különböző, szakember számára jól ismert eljárásokkal (például lipofekcióval, biolisztikumokkal, liposzómákkal, immunliposzómákkal, elektroporációval, stb.) juttathatunk a sejtbe. Más esetben, az antiszensz polinukleotidok tartalmazhatnak oldható oligonukleotidokat, amelyeket a sejteken kívüli térbe adagolunk, például in vitro alkalmazás esetén a sejttenyésztő tápfolyadékba, vagy in vivő alkalmazás esetén intersticiális (szövet közti) terekbe vagy testfolyadékokba (például vérbe vagy CSF-be). A sejt közötti terekben jelen levő antiszensz polinukleotidokról kimutatták, hogy azok képesek a citoplazmába bejutni, és ott meghatározott RNS-fajtákat gátolni. A találmány egy további megvalósítási módja szerint, az antiszensz polinukleotidok tartalmazhatnak metilfoszfonátcsoportokat, C-5-propenil-csoportokat, 2' -fluororibóz cuk-
rókát, vagy azok lehetnek poliamid-nukleinsavak (PNA-k)
[ Egholm és mtsai.: : J. Am. Chem. Soc. 114, 1895 (1992);
Wittung és mtsai. : Natúré 368, 561 (1994); Egholm és
mtsai.: Natúré 365 , 566 (1993); Hanvey és mtsai.: Science
258, 1481 (1992); amelyek teljes terjedelmük a kitanítás részét képezik] . Az antiszensz polinukleotidokra vonatkozó általános eljárásokat lásd a következő szakirodalmi helyen: Antisense RNA and DNA, szerk.: D.A. Méltón, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1988).
A találmány szerinti antiszensz polinukleotidokon felül, a telomeráz-aktivitás gátlására előállíthatunk olyan oligonukleotidokat is, amelyek a hajtogatódott RNS-
- 62 összetevőben vagy az RNS-összetevőt kódoló génben a duplex nukleinsavhoz kötődnek, hármas hélixet tartalmazó vagy hármas hélixből álló nukleinsavat képezve. Az ilyen, találmány szerinti oligonukleotidokat a hármas hélixre vonatkozó bázispár-képzési szabályok, és az RNS-összetevő nukleotidszekvenciájának ismeretében állíthatjuk elő [ Cheng és mtsai.: J. Bioi. Chem. 263, 15110 (1988); Ferrin és
Camerini-Otero: Science 354, 1494 (1991); Ramdas és mtsai.:
J. Bioi. Chem. 264, 17395 (1989); Strobel és mtsai.: Science 254, 1639 (1991); Hsieh és mtsai.: op. cit. (1990); Rigas és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 9591 (1986); amelyek teljes terjedelmükben a kitanítás részét képezik] . Az ilyen oligonukleotidok több módon gátolhatják a telomeráz aktivitását, például a telomeráz gén transzkripciójának a gátlása révén, vagy oly módon kötődve a telomeráz-RNS-összetevő duplex régiójához, hogy vagy megakadályozzák a működőképes ribonukleoprotein telomeráz létrejöttét, vagy meggátolják azt, hogy az telomer-DNS szintézis számára templátként működjék. Tipikusan, és a hatás kifejtésének módjától függően, a találmány szerinti, triplexet képző oligonukleotidok körülbelül 10-től körülbelül 25-200 vagy több nukleotidig terjedő specifikus szekvenciát tartalmaznak, (azaz, elég hosszú szekvenciát ahhoz, hogy stabil hármas hélixet képezzenek, de elég rövidet ahhoz, hogy a bejuttatás módjától függően, kívánt esetben in vivő alkalmazhatók legyenek), amely komplementer, (azaz, stabil hármas hélixet képes létrehozni) a telomeráz-RNS• ·
- 63 összetevőben vagy a telomeráz-RNS-összetevő génben található specifikus szekvenciával.
A találmány szerinti, antiszensz és hármas hélixet képző oligonukieotidokon felül, a humán telomeráz-RNSösszetevő legalább egy részével megegyező szensz oligonukleotidok is alkalmazhatók a telomeráz aktivitásának gátlására. A fenti típusú találmány szerinti oligonukleotidok a következőket tartalmazzák: (1) a funkcionális telomeráz enzim képzéséhez szükséges teljes RNSösszetevő szekvenciánál rövidebb szekvenciát; vagy (2) a funkcionális telomeráz enzim képzéséhez szükséges teljes RNS-összetevő szekvenciát, ebben pedig egy vagy több olyan nukleotid-szubsztitúciót vagy -inszerciót, amelyek az ilyen RNS-t funkcióképtelenné teszik. Mindkét esetben, a telomeráz-aktivitás gátlása figyelhető meg, mivel a mutáns RNS-összetevő kötődik a humán telomeráz proteinösszetevőihez, és inaktív telomeráz molekula keletkezik. Az ilyen oligonukleotidok hatása úgy érvényesül, hogy nemfunkcionális ribonukleoprotein-telomeráz áll össze, vagy a funkcionális ribonukleoprotein telomeráz összeépülése gátolt. A fentiekre példa a 48-209. nukleotidokból álló, kevert templát bázissorrenddel rendelkező (template scrambled) variáns, amelyben a telomer ismétlődő egység szekvenciája megváltozott. Az ilyen kevert templát bázissorrenddel rendelkező variánsok képesek versengeni a telomeráz protein-összetevőhöz történő kötődésért. Az ilyen típusú, találmány szerinti szensz oligonukleotidok tipikusan olyan, körülbelül 20, 50, 100, 200, 400, 500 vagy több nukleotidból· álló specifikus szekvenciát tartalmaznak, amely megegyezik a humán telomeráz-RNS-összetevőben található specifikus nukleotid-szekvenciával.
Antiszensz polinukleotidok tartalmazhatnak továbbá, olyan derivatizált szubsztituenst, amely lényegében nem gátolja az emlőstelomeráz-RNS-összetevővel történő hibridizációt. Kémiai szubsztituensek hozzákapcsolásával módosított antiszensz polinukleotidok metabolikusan aktív eukarióta sejtekbe juttathatók, hogy a sejtekben telomeráz-RNSösszetevővel hibridizálódjanak. Tipikusan, az ilyen antiszensz polinukleotidok derivatizáltak, és a polinukleotid szintézis során vagy azt követően azokhoz további kémiai szubsztituensek kapcsolódnak; ezek tehát az RNS-összetevőhöz képest komplementer szekvencián találhatók, ahol azok a DNS-szekvencia és/vagy telomeráz proteinösszetevő megváltozását vagy kémiai módosítását eredményezik. Előnyös, kapcsolódó kémiai szubsztituensek a következők: európium (III)-texaphyrin, keresztkötéseket létrehozó csoportok, psoralen, fémkelátok (például vas/EDTA-kelát, vas által katalizált hasításhoz), topoizomerázok, endonukleázok, exonukleázok, ligázok, foszfodiészterázok, fotodinamikus porfirinek, kemoterápiás hatóanyagok, (például adriamycin, doxirubicin), interkalálódó hatóanyagok, bázis-módosító hatóanyagok, immunglobulin láncok, és oligonukleotidok. Vas/EDTA-kelátok kémiai szubsztituensként történő alkalmazása különösen előnyös akkor, ha polinukleotid-szekvenciák lokális hasítását kívánjuk elérni [ Hertzberg és mtsai.: J. Am. Chem. Soc. 104, 313 (1982);
• · · · • · • · • · · ·
- 65 Hertzberg és Dervan: Biochemistry 23, 3934 (1984); Taylor és mtsai.: Tetrahedron £0, 457 (1984); Dervan P.B.: Science 232, 464 (1986)] . Szubsztituensek hozzákapcsolására szolgáló előnyös kémiai eljárások a következők: közvetlen kémiai kötés, például egy hozzákapcsolt reaktív aminocsoporton keresztül [ Corey és Schultz: Science 238, 1401 (1988), amely teljes terjedelmében a kitanítás részét képezi], és más közvetlen kötést létrehozó kémiai eljárások; bár streptavidin / biotin és digoxigenin /anti-digoxigenin ellenanyagkötő eljárások is alkalmazhatók. Kémiai szubsztituensek hozzákapcsolására szolgáló eljárásokat ismertetnek például az 5,135,720 sz. az 5,093,245 sz., valamint az 5,055,556 sz. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások, amelyek teljes terjedelmükben a kitanítás részét képezik. Szakember céljától függően egyéb, kötést létrehozó kémiai eljárások is alkalmazhatók. Emlőstelomeráz-RNS-összetevő egészének vagy egy részének megfelelő polinukleotidok, (azaz, szensz polinukleotidok) szintén derivatizálhatók, és a genomban telomer ismétlődő szekvenciákkal reagáltathatók, így a kromoszómák telomer régióiban adduktumok keletkezését vagy a kémiai környezet más módosítását idézik elő.
Nem-komplementer bázisokat is tartalmazó templátok (mismatch templátok)
A találmány tárgyát képezik továbbá, humán telomerázRNS-összetevő megváltoztatott vagy mutációt hordozó szekvenciáit tartalmazó oligonukleotidok. Yu és mtsai. [Natúré
344, 126 (1990)] kimutatták, hogy a retrahymena-telomeráz• ·· · • ·
- 66 RNS-összetevő mutációt hordozó formája Tetrahymena-sejtek telomeráz-enzimébe beépíthető, és a beépítés a sejtekre káros hatást fejt ki. Humán telomeráz-RNS-összetevő mutációt hordozó formájának beépülése hasonló hatást fejthet ki az egyébként telomeráz-aktivitással rendelkező humán sejtekre, míg a telomeráz-aktivitással nem rendelkező normális humán sejtekben ez a hatás nem érvényesül. Ilyen, mutációt hordozó formák például azok az RNS-összetevők, amelyekben az 5' CTAACCCTA-3' szekvencia helyett 5' -CAAACCCAA-3' , 5' CCAACCCCAA-3' vagy 5' -CTCACCCTCA-3' mutáns szekvencia található. Valamennyi fenti módosított szekvencia a kromoszómális DNS-be beépülő telomer ismétlődő egységek megváltozását eredményezi, így befolyásolja a kromoszóma struktúráját és funkcióját. Ilyen oligonukleotidokat tervezhetünk úgy, hogy azok restrikciós enzim felismerési helyeket tartalmazzanak, amelyek elősegítik a megváltozott RNS-összetevő jelenlétének kimutatását, a telomer-DNS vagy egy meghosszabbított telomeráz szubsztrát restrikciós enzimmel történő emésztésén alapuló diagnosztikus eljárás során .
A találmány ezen megvalósítási módjának szemléltetésére, hely-specifikus mutagenezist végeztünk a lambda-28-1klónból származó, körülbelül 2,5 kb HindiII-SacI-fragmenst tartalmazó plazmid felhasználásával (pGRN33, hozzáférhető az American Type Culture Collection, gyűjteményéből, ATCC 75926 nyilvántartási szám alatt) (lásd, az alábbiakban a 7. példát), amely plazmid az SV40 replikációs origóját is tartalmazta (de promóter aktivitás nélkül). Az így kapott, • ·
- 67 pGRN34- (az 5' - CAAACCCAA-3' szekvenciát tartalmazó) , pGR36- (az 5' - CCkACCCCAA-3' szekvenciát tartalmazó) és pGRN37- (az 5' - CTCACCCTCA-3' szekvenciát tartalmazó) plazmidokat eukarióta gazdasejtekbe juttattuk (az SV40 nagy T-antigénjét expresszáló, 293-jelű sejt eredetű sejtvonalba) , és a transzformánsokból nyert extraktumok felhasználásával telomeráz vizsgálati eljárásokat végzetünk.
A vizsgálati eljárások szerint, a telomeráz-aktivitás a sejtekben a megváltozott szekvenciával rendelkező nukleinsavak képződését eredményezte, ami arra utal, hogy a genomi klón funkcionális RNS-összetevő gént tartalmazott, és a plazmidok módosított, de funkcionális RNS-összetevő gént tartalmaztak. A fenti eredmények szerint, a találmány tárgyát képezik rekombináns telomeráz készítmények, valamint ilyen készítmények előállítására szolgáló eljárások. A találmány tárgyához tartozik ezen felül, rekombináns humán telomeráz, amely a humán telomeráz protein-összetevőit tartalmazza a találmány szerinti rekombináns RNS-összetevővel funkcionálisan kapcsoltan. A találmány szerinti rekombináns telomeráz-molekulák eltérhetnek a természetben előforduló
RNS-összetevőtől egy vagy több bázis-szubsztitúció, deléció vagy -inszerció vonatkozásában, vagy lehetnek rekombináns gazdasejtekben előállított, de a természetben előforduló RNS-összetevővel megegyező szekvenciával rendelkező RNS-összetevő molekulák. Az ilyen rekombináns telomeráz-molekulák előállítására szolgáló eljárás szerint, a telomeráz protein-összetevőit expresszáló eukarióta gazdasejteket transzformálunk a találmány szerinti RNS··· · ·· ·· · ·
- 68 összetevőt kódoló rekombináns expressziós vektorral, és az említett vektorral transzformált említett gazdasejteket a protein-összetevők és RNS-összetevő expresszálódását és összeépülését lehetővé tevő körülmények mellett tenyésztjük, úgy, hogy a kromoszómális DNS telomerjeihez szekvenciák, (a natív telomeráz által hozzáadott szekvenciákkal nem szükségszerűen azonos szekvenciák) hozzáadására képes, aktív telomeráz-molekula keletkezzék. Az ilyen rekombináns DNS-expressziós-vektorok (vagy plazmidok) további előnyös alkalmazását olyan plazmidok jelentik, amelyek a humán telomeráz-RNS-összetevőt kódoló gént tartalmazzák, amelyekben azonban a gén deléció, inszerció vagy más módosítás következtében nem funkcióképes. Ilyen plazmidok különösen előnyösen alkalmazhatók humán génterápiára, - az endogén RNS-összetevő gén kiiktatására (a funkcionális gén helyett a mutáns gén beépítésére), ezáltal a kezelt sejtek visszafordíthatatlanul halandókká változtatására (a szabályozatlan szaporodás megszüntetésére), ehhez azonban igen hatékony transzformációs és rekombinációs rendszerre van szükség.
Ribozimok alkalmazása
A találmány egy további megvalósítási módja szerint, a telomeráz-aktivitás gátlására ribozimoknak nevezett oligonukleotidokat alkalmazunk. A fent ismertetett antiszensz és egyéb oligonukleotidoktól eltérően, amelyek RNS-hez, DNShez vagy telomeráz protein-összetevőhöz kötődnek, a ribozimok nem csupán kötődési képességgel rendelkeznek, hanem specifikus módon hasítják, ezáltal inaktiválják a cél69 zott RNS-t, például a humán telomeráz-RNS-összetevőjét. Az ilyen ribozimok tartalmazhatnak a telomeráz-RNS-összetevővel komplementer 5'- és 3' -végi szekvenciákat. A hasítás helyétől függően, a ribozim inaktiválhatja a telomeráz enzimet. [Lásd, a 93/23572 sz. PCT szabadalmi leírást, (lásd fent).] Szakember számára, a humán telomeráz-RNSösszetevő szekvenciájának tanulmányozását követően világos, hogy abban több alkalmas ribozim hasítási hely található, amelyek például egy kalapácsfej-ribozim hatásával szemben érzékenyek. Ilyen, találmány szerinti ribozimok például a következő szekvenciával rendelkező RNS-molekulák:
1: 5' -UAGGGUUACUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACAAAAAAU-3'
2: 5' -UUAGGGUCUGAUGAGÜCCGUGAGGACGAAAGACAAAA-3'
3: 5' -UCUCAGUCUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAAGGGUUA-3'
4: 5' -CCCGAGACUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACCCGCG-3' .
A telomeráz-aktivitás ribozimok közvetítette gátlására alkalmazható további célzott helyek, például az alábbi szakirodalmi helyeken ismertetettek szerint határozhatók meg: Sullivan és mtsai.: 94/02595 sz. PCT közzétételi irat; Draper és mtsai.: 93/23569 sz. PCT közzétételi irat; amelyek teljes terjedelmük a kitanítás részét képezik. Amint azt Hu és munkatársai leírták, (94/03596 sz. PCT közzétételi irat, amely teljes terjedelmében a kitanítás részét képezi) , antiszensz- és ribozim-funkciók egyetlen oligonukleotidon belül is egyesíthetők. Egy ribozim tartalmazhat továbbá, egy vagy több módosított nukleotidot, vagy nukleotidok közti módosított kötést, amint azt a fentiekben, a találmány szerinti antiszensz oligonukleotidokkal • tt ·
- 70 kapcsolatban leírtuk. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, RNáz-P-t (humán vagy E. coli) módosítunk [lásd, Altman S.: Biotechnology 13, 327 (1995)] úgy, hogy olyan vezérlő szekvenciát kapjunk, amely az emlőstelomerázRNS-összetevő, telomer ismétlődő egységet alkotó szekvenciával komplementer részének felel meg; az ilyen RNáz-P variáns képes telomer szekvenciák hasítására. Más eljárás szerint, az RNáz-P (humán vagy E. coli) katalitikus alegységét úgy módosítjuk, hogy olyan vezérlő szekvenciát kapjunk, amely a telomeráz-RNS-összetevő egy részével komplementer, így az RNáz-P variáns telomeráz-RNS-összetevő hasítására képes. Az említett, géntechnikai úton módosított ribozimok expresszálhatók sejtekben, vagy különböző eljárásokkal juttathatók oda (például liposzómákkal, immunoliposzómákkal, biolisztikumokkal, a sejtekbe történő közvetlen felvétellel, stb.) . Ribozimok további formái, például [ I-csoportú intron-ribozimok; Cech T.: Biotechnology 13, 323 (1995)] és kalapácsfej-ribozimok [ Edgington S.M.: Biotechnology 10, 256 (1992)], előállíthatok a találmány szerinti telomerázRNS-összetevő szekvenciája alapján, humán telomeráz-RNSösszetevő és/vagy humán telomer ismétlődő szekvenciák hasításának katalizálása céljából.
A találmány tárgyát képezi tehát telomeráz-aktivitás gátlására alkalmazható oligonukleotidok széles skálája. Az ilyen oligonukleotidok alkalmazhatók a találmány szerinti eljárások során betegségek kezelésére, mely eljárás szerint, betegnek találmány szerinti telomeráz-gátló vagy aktivátor terápiásán hatékony mennyiségét adjuk be. A
* «
- 71 telomeráz gátlást vagy aktiválást mérhetjük, hogy meghatározzuk a hatóanyag azon mennyiségét, amelyet a jelen bejelentéssel együttesen függő (copending) amerikai egyesült államokbeli közzétételi iratban és a 93/23572 sz. PCT közzétételi iratban ismertetett eljárásokkal, terápiásán hatékony dózisban be kell juttatnunk. A fent említett bejelentések és a leírásban fent ismertettek szerint, a telomerázaktivitás gátlása a halhatatlan (folyamatos szaporodású) sejteket halandókká (véges szaporodóképességgel rendelkező sejtekké) változtatja, míg a telomeráz-aktivitás aktiválása növelheti a sejtek replikatív élettartamát. A telomerázgátló terápia tehát hatékony kezelést jelent tumoros betegségekben, melyek keletkezésében halhatatlan sejtek szabályozatlan szaporodása játszik szerepet, a telomeráz aktiválás pedig a sejt-öregedés megelőzésére alkalmazható hatékony kezelés. A telomeráz-aktivitást gátló vagy blokkoló hatóanyagok, például antiszensz oligonukleotidok, hármas hélixet képző oligonukleotidok, ribozimok vagy mutáns telomeráz-RNS-összetevő expresszálódását kódoló plazmidok bejuttatása képes gátolni a telomeráz hatását, és végül, a kezelt sejtek elöregedéséhez és pusztulásához vezet.
Terápiás és profilaktikus megközelítési módok A találmány tárgyát képezik továbbá, olyan terápiás eljárások, amelyek biztosítják, hogy a normális sejtek halandóak maradjanak; például, az RNS-összetevőt ismert géntechnikai eljárásokkal módosíthatjuk úgy, hogy genetikai rekombinációval az összetevőt kódoló természetes gén egészét ·»·· ·» ♦ 9 » · * · ··· ♦ ·· « *
- 72 ) vagy egy részét deletáljuk (például in vitro mutagenezissel). Az ilyen sejtek ezt követően visszafordíthatatlanul halandóak (korlátozott szaporodásúak) lesznek. Ez az eljárás alkalmazható génterápia esetén, amikor expressziós plazmidot tartalmazó normális sejteket juttatunk a betegbe, és biztosak akarunk lenni abban, hogy tumoros sejt nem jut a betegbe, vagy ha ilyen sejt mégis bejutna, akkor az visszafordíthatatlanul halandóvá válik.
Mivel a telomeráz csak tumoros sejtekben, ivarsejtekben és a véképzőrendszer egyes törzssejtjeiben aktív, a telomerázgátló terápia más normális sejteket nem érint. Lépéseket tehetünk annak érdekében, hogy a telomerázgátló és az ivarsejtek vagy törzssejtek érintkezését elkerüljük, bár ez nem feltétlenül szükséges. Mivel például az ivarsejtek telomeráz-aktivitással rendelkeznek, a telomeráz gátlása negatív irányban befolyásolhatja a spermatogenezist és a spermák életképességét, ami azt jelenti, hogy a telomerázgátlók hatásos kontraceptívumok (fogamzásgátlók) vagy sterilizáló hatóanyagok lehetnek. Ez a kontraceptív hatás azonban nem feltétlenül előnyös olyan betegnél, aki a találmány szerinti telomerázgátlót tumor kezelésére kapja. Ilyen esetekben, a találmány szerinti telomerázgátlót oly módon juttathatjuk be, hogy az csak a terápia időtartama során termelődjék, úgy, hogy annak az ivarsejtekre kifejtett negatív hatása átmeneti legyen.
A találmány tárgyát képezik továbbá, terápiás eljárások a telomeráz RNS-nukleinsav alkalmazásával telomerázaktivitás stimulálására, és a sejtek replikatív élettarta- 73 mának fokozására. A fenti eljárás szerint, a sejtekbe találmány szerinti funkcionális rekombináns telomeráz ribonukleinsavat juttatunk. A ribonukleoproteint bejuttathatjuk a sejtekbe például liposzómákban, vagy a humán telomerázRNS-összetevő gént (vagy különböző szabályozó elemeket tartalmazó rekombináns gént) (a telomeráz protein-összetevőit kódoló szekvenciákkal· együtt vagy azok nélkül) eukarióta expressziós plazmidba építve alkalmazhatjuk a telomeráz aktiválására különböző normális humán sejtekben, amelyek a telomeráz-RNS-összetevő vagy a protein-összetevő alacsony szintű expresszálódása következtében egyébként nem rendelkeznek kimutatható telomeráz-aktivitással. Amennyiben a telomeráz-RNS-összetevő nem elegendő a telomeráz-aktivitás stimulálására, az RNS-összetevőt a telomeráz proteinösszetevőit expresszáló génekkel együtt transzfektálhatjuk a sejtekbe a telomeráz-aktivitás stimulálására. A találmány tárgyát képezik tehát, sejtben vagy sejtcsoportban telomeráz-aktivitással kapcsolatos állapotok kezelésére szolgáló eljárások, mely eljárások szerint, a sejtet (sejteket) hatóanyag olyan terápiásán hatékony mennyiségével érintkeztetjük, amely az adott sejtben elegendő a telomeráz-aktivitás megváltoztatásához.
A telomeráz-RNS-gén szám feletti kópiáit tartalmazó sejtek fokozott telomeráz-aktivitással, és ennek következtében, megnövekedett replikatív élettartammal rendelkezhetnek. Ilyen terápiát végezhetünk ex vivő, olyan sejteken, amelyeket azután gazdaszervezetbe juttatunk, vagy végezhetünk in vivő. Normális diploid sejtekhez exogén telomer gé• «··· 4« »> · •· ♦ · 4 4 4 » 4 *·· ··« >
• · · · « 4 ··· » 4« · » >*··
nek ex vivő hozzáadása révén, a telomer stabilizálásának fokozásával vagy hosszúsága növelésével nyert előnyök a következők: a telomer stabilizálása megakadályozhatja a sejtöregedést, és lehetővé teszi a sejtek látszólag korlátlan amplifikációját; a megnövekedett élettartammal rendelkező normális diploid sejtek in vitro tenyészthetők, és azok hatóanyagok tesztelésére, vírustenyésztésre vagy más célra alkalmazhatók. Ezen felül, amint azt a fentiekben említettük, ex vivő amplifikált, különböző típusú törzssejtek sejtterápiában alkalmazhatók egyes betegségek kezelésére.
A telomer stabilizálása ezen felül csökkentheti a replikatív sejtekben a tumoros elfajulás előfordulási gyakoriságát, megakadályozva azt, hogy a sejtekben sejtkrízis közeledtével a telomerek kritikusan röviddé váljanak. A krízis során, a telomer-sapka védő hatásának megszűntével súlyos genomi instabilitás jön létre. A genetikai információkat tartalmazó kártyacsomag megkeveredik, és csaknem valamennyi sejt elpusztul. A folyamatot túlélő néhány sejt tipikusan, számos génátrendeződést tartalmazó aneupioid (a haploid kromoszómaszám többszörösét tartalmazó) sejt; a fenti sejtek telomerjeik stabilitását telomeráz enzim expresszálódása révén nyerik vissza. Ha a krízist a telomerek hosszúságának fenntartásával meg tudjuk akadályozni, a krízissel kapcsolatos genomi instabilitás is megelőzhető, csökkentve annak lehetőségét, hogy egy adott sejtben elegendő számú genetikai mutáció jöjjön létre ahhoz, hogy metasztatikus tumoros elfajulást eredményezzen.
• « · · · • *·· ··· · • · · « · • ·· · · i
Telomeráz-génterápiával (célzott sejtekben a telomerázaktivitás fokozásával) célzottan kezelhető sejtek - anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk - vérképzőrendszeri törzssejtek (AIDS-betegségben és kemoterápiát követően), vaszkuláris endothel (az ereket bélelő hámsejtek) (szív és agyi vaszkuláris betegségekben), bőr fibroblasztok és bazális bőr keratinociták (sebgyógyulás és égés esetén), porcsejtek (ízületi gyulladásokban), agyi asztrociták és mikroglia-sejtek (Alzheimer-féle betegségben), oszteoblasztok (csontritkulásban), retina sejtek (szembetegségekben) és hasnyálmirigy szigetsejtek (I-típusú diabéteszben).
Tipikusan, a találmány szerinti terápiás eljárásokban, in vivő fiziológiás körülmények mellett a telomeráz aktivitását gátló vagy fokozó, és ilyen körülmények mellett stabil oligonukleotidokat adunk be. Amint azt a fentiekben említettük, a stabilitás elérésére, valamint az oligonukleotidoknak a kívánt szövethez, szervhez vagy sejthez történő eljuttatására, módosított oligonukleotidok alkalmazása előnyös. Oligonukleotidok terápiás célból történő bejuttatására szolgáló eljárásokat ismertetnek Inouye és munkatársai (5 272 065 sz. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás; amely teljes terjedelmében a kitanítás részét képezi).
Az oligonukleotidokat bejuttathatjuk megfelelő gyógyászati készítményben közvetlenül gyógyszerként, vagy bejuttathatjuk génterápiás eljárás és a találmány szerinti rekombináns DNS expressziós plazmidok alkalmazásával. Ilyen ···· ·· ·«···· • · · · · plazmidot ismertetünk az alábbiakban, a 8. példában. Általánosságban, ilyen plazmidok tartalmaznak promótert, és adott esetben, egy oligoribonukleotid transzkripciójának irányítására szolgáló enhanszert (a promóter-régióban található szekvenciáktól elkülönítve), valamint további szabályozó elemeket, amelyek kívánt esetben, az episzómaként való fennmaradást, a kromoszómába történő beépülést vagy a magas szintű transzkripciót szolgálják. Génterápiára gyakran alkalmazott vektorok az adenovírus alapú vektorok; azok alkalmazása a találmány szerinti reagensekkel és eljárásokkal összeegyeztethető. [Lásd, a 94/12650, 94/12649 és 94/12629 sz. PCT közzétételi iratokat. Ilyen célra alkalmazható promóterek például a metallothionein promóter, a konstitutív adenovírus fő késői promóter, a dexametozonnal indukálható MMTV-promóter, az SV40-promóter, az MRP-polIII promóter, a konstitutív MPSV-promóter, a tetraciklinnel indukálha'tó CMV-promóter (például a humán közvetlen-korai CMV-promóter), valamint a konstitutív CMV-promóter. Génterápiára alkalmazható plazmidok tartalmazhatnak más funkcionális elemeket is, például szelektálható markereket, azonosítást megkönnyítő régiókat és egyéb géneket. Rekombináns DNS expressziós plazmidok alkalmazhatók továbbá a találmány szerinti oligonukleotidok előállítására, a sejtekbe génterápiás eljárástól eltérő eljárással történő bejuttatás céljára, - bár rövid oligonukleotidok előállítását sokkal gazdaságosabban végezhetjük in vitro kémiai szintézissel.
A találmány tárgyához tartoznak ezen felül, a találmány szerinti telomerázgátló vagy telomeráz-aktivátor terápiásán • · · · ·· · · ···· • · · · · • ······ · • · · · · hatékony mennyiségét tartalmazó gyógyászati készítmények. A találmány szerinti telomerázgátlót tartalmazó gyógyászati készítmények tartalmazhatnak mutáns, humán telomeráz-RNSösszetevőt, humán telomeráz-RNS-összetevőjéhez vagy az azt kódoló génhez kötődő antiszensz oligonukleotidot vagy hármas hélixet képző oligonukleotidot, humán telomeráz-RNSösszetevő hasítására képes ribozimot, vagy az előbbiek kombinációját vagy azoknak egyéb hatóanyagokkal való kombinációját, egy gyógyászatilag elfogadható hordozóanyaggal vagy sóval együtt. A találmány szerinti további gyógyászati készítmények telomeráz-aktivátor készítményt tartalmaznak, például tisztított humán telomerázt vagy a telomeráz protein-összetevőit kódoló mRNS-t, valamint a telomeráz-RNSösszetevő jét ; ezeket a készítményeket sejtöregedéssel kapcsolatos betegségek kezelésre használjuk. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a humán telomeráz ismétlődő szekvenciához képest legalább egy nem-kompatibilis bázist tartalmazó, mutáns, szensz, emlőstelomeráz-RNSösszetevőt adunk egy sejtpopulációhoz, amely azonban humán telomeráz polipeptid-összetevővel együtt képes telomerázaktivitást kifejteni, és a humán telomeráz ismétlődő egységében, az adott nukleotid pozícióban hibás bázis beépülését előidézni, ezáltal olyan telomerek keletkezéséhez vezetve, amelyek alapvető replikációja a mutáns szensz telomerázRNS-összetevő folyamatos jelenlétén alapul. A találmány tárgyát képezi olyan terápiás eljárás, amely szerint egy sejtpopulációhoz a találmány szerinti mutációt hordozó, szensz telomeráz-RNS-összetevőt adunk, elegendő ideig ah• · · · · · hoz, hogy a természetben előforduló emlőstelomeráz-RNSösszetevő keletkezése szempontjából templátként lényegében nem funkcionáló telomer szekvenciák épüljenek be, majd a mutációt hordozó, szensz telomeráz-RNS-összetevőt a rendszerből kivonjuk, ami a sejtpopulációban a telomerek átlagos hosszúságának gyors csökkenéséhez, és gyorsabb sejtöregedéshez vagy fokozott sejtmortalitáshoz vezet.
A gyógyászati készítményt kiszerelhetjük parenterális, orron át történő (nazális), szájon át történő (orális) vagy más adagolási módnak megfelelően. (Lásd a 93/23572 sz. PCT közzétételi iratot).
Diagnosztikus eljárások
A fent ismertetett gyógyászati készítményeken és terápiás eljárásokon felül, a találmány tárgyát képezik diagnosztikus eljárások és reagensek. A találmány tárgyát képezik sejtben, sejtpopulációban vagy szövetmintában humán telomeráz-RNS-összetevő, telomeráz vagy telomeráz-aktivitás meghatározására szolgáló diagnosztikus eljárások. A találmány tárgyához tartoznak ezen felül, a fenti eljárásokban alkalmazható reagensek, adott esetben reagenskészlet formájában kiszerelve, a diagnosztikus eljárás kivitelezését leíró utasításokkal együtt. Amint azt a fentiekben azon tesztekkel kapcsolatban ismertettük, amelyek alkalmazásával meghatároztuk, hogy a pGRN7-klón tartalmazza-e a humán telomeráz-RNS-összetevőt kódoló cDNS-t, az RNS-összetevő szintje tumorsejtekben megnő. Az RNS-összetevő meghatározása tehát hasznos diagnosztikus eszköz tumorsejtek jelenlétének kimutatására. Ezen felül, humán telomeráz-RNS- 79 összetevőhöz (vagy az azt kódoló gén valamelyik szálához) specifikus módon kötődő hibridizációs próbák és láncindító oligonukleotidok alkalmazhatók diagnosztikus eljárásokban, adott mintában telomeráz nukleinsav jelenlétének kimutatására. A láncindító oligonukleotidok és hibridizációs próbák olyan oligonukleotidok, amelyek egy célzott nukleinsavval komplementerek, és ezáltal ahhoz kötődni képesek. Bár a láncindító oligonukleotidok és hibridizációs próbák szekvenciájuk és hosszúságuk vonatkozásában eltérhetnek, az elsődleges különbség köztük az általuk betöltött funkcióban rejlik: a láncindító oligonukleotidok DNS-szintézis megindítására szolgának, például PCR-amplifikációs eljárásban, míg a hibridizációs próbákat tipikusan, csak a célzott nukleinsavhoz történő kötődésre használjuk. Egy láncindító oligonukleotid vagy hibridizációs próba hossza tipikusan 820-tól 30 vagy több nukleotidig terjed. A láncindító oligonukleotid vagy hibridizációs próba jelölhető is a kimutatás megkönnyítésére, (például radioaktív vagy fluoreszcens molekulák alkalmazhatók tipikusan a fenti célra) , vagy a tisztítás / szétválasztás megkönnyítésére, (a fenti célra például biotint vagy avidint alkalmazunk általában) .
Egy, a találmány szerinti különösen előnyös diagnosztikus eljárásban, olyan betegekből származó sejtekben vagy szövetmintákban mutatjuk ki a telomeráz-RNS-összetevőt, akikről feltételezzük, hogy náluk tumoros betegség kialakulásának magas a kockázata. Ilyen eljárások szerint, tipikusan, jelölt próbát vagy láncindító oligonukleotidot kötünk • · · ·
- 80 egy RNS-összetevő szekvenciához, olyan körülmények alkalmazása mellett, amelyeknél csak a hibátlan bázispárosodással rendelkező (komplementer) szekvenciák kötődnek (hibridizálódnak) egymással. A mintában az RNS-hez kötődött jelölt anyag kimutatása arányos a telomeráz-aktivitással és a tumoros sejtek jelenlétével. Egyes sejtek expresszálhatnak RNS-összetevőt vagy telomerázt, de mégis telomeráznegatívak maradhatnak, mivel azokban a telomeráz proteinösszetevői nem expresszálódnak. Ha ilyen sejtekben kívánjuk kimutatni a telomeráz-aktivitást, először proteint izolálhatunk, majd meghatározhatjuk, hogy a protein frakció tartalmazza-e a telomeráz-RNS-összetevőt, amelynek jelenléte telomeráz-aktivitásra utal. A találmány szerinti diagnosztikus eljárások különösen előnyösen alkalmazhatók szövet biopsziákban és szövet-metszetekben telomeráz-aktivitás jelenlétének kimutatására, mely esetekben az eljárást in situ végezzük, tipikusan azt követően, hogy a telomeráz-RNSösszetevőt a találmány szerinti specifikus PCR láncindító oligonukleotidok alkalmazásával amplifikáltuk.
A találmány tárgyát képezik továbbá, olyan telomerázRNS-összetevő polinukleotid-próbák, amelyek betegségek (például neopláziák vagy azt megelőző állapotok) diagnózisára alkalmazhatók, betegből származó sejtekben a telomeráz-RNS-összetevő vagy a telomeráz-RNS-összetevő gén átrendeződésének vagy amplifikációjának kimutatásával, vagy kóros telomeráz-RNS-összetevő alléi kimutatásával (például RFLP-vel vagy allél-specifikus PCR-analízissel) . A kimutatás tipikusan in situ hibridizációval történik, jelölt
32, 35S-, 14C-, 3H-jelölt, fluoreszcens-j elölt,
- 81 (például Ρ-, biotinilezett, digoxigenilezett) telomeráz-RNS-Összetevő polinukleotid alkalmazásával, bár Northern-blot, dot-blot vagy oldatban történő hibridizáció is alkalmazható sejtmintából izolált össz-RNS- vagy poliA+-RNS-mintán, alkalmazható ezen felül PCR-amplifikáció is, telomeráz-RNSösszetevőre specifikus láncindító oligonukleotidok felhasználásával. Az azonos sejttípushoz (típusokhoz) tartozó nemneopláziás sejtekhez képest megváltozott mennyiségű telomeráz-RNS-összetevőt tartalmazó sejteket feltételezetten beteg sejteknek tekintjük. Hasonlóképp, sejtmintában a telomeráz-RNS-összetevő gén lókusz vagy ahhoz szorosan kapcsolódó lókuszok kóros átrendeződésének vagy amplifikációjának kimutatása kóros állapotra utal, vagy kóros állapot (például tumor, genetikai betegség) kialakulására való hajlamra utal. A polinukleotid-próbák alkalmazhatók továbbá, egyének igazságügyi azonosítására, például apasági perekben, vagy bűntett gyanúsítottjának vagy ismeretlen tettesek azonosítására.
A humán populáción belül a telomeráz-RNS-összetevő alapvető elsődleges szekvenciáját tekintve kisebb eltérések fordulhatnak elő, például allélvariációk, restrikciós hely polimorfizmus, valamint -genetikai betegségekkel kapcsolatban - kongenitális, telomeráz-RNS-összetevő betegségallélek jelenléte.
Kívánt esetben, szakember igényei szerint, lényegében teljes hosszúságú telomeráz-RNS-összetevő kópiák amplifikációjára szolgáló láncindító oligonukleotidok (amplime• · ·
- 82 rek) választhatók. Hasonlóképp, a telomeráz-RNS-összetevő gén vagy RNS egyes részeinek amplifikációjára szolgáló amplimerek is tervezhetők.
A telomeráz-RNS-összetevő expresszálása
A láncindító oligonukleotidok, hibridizációs próbák és egyéb, a humán telomeráz-RNS-összetevőből származó szekvenciákat tartalmazó nukleinsavak hosszától és szándékolt funkciójától függően, előnyös lehet a találmány szerinti expressziós plazmidok alkalmazása. Például, a találmány szerinti RNS-összetevő rekombináns úton történő előállítását olyan találmány szerinti rekombináns DNS expressziós plazmid alkalmazásával végezhetjük, amely az RNSösszetevőnek megfelelő nukleotid-szekvenciából álló nukleinsavat tartalmaz, megfelelő promóter transzkripciós szabályozása alatt. Ilyen plazmidok bejuttathatok prokarióta vagy eukaríóta gazdasejtekbe; az expressziós plazmidba történő beépítésre kiválasztott promóter, valamint egyéb szabályozó elemek és szelektálható markerek az előállításra alkalmazott gazdasejttől függnek.
Az intakt RNS-összetevő gén, - azaz, a promóter, beleértve a gén 5' -végén található valamely szabályozó elemet, valamint az RNS-összetevőt kódoló régió, - alkalmazható RNS-összetevő expresszálására humán sejtekben, például olyan humán sejtekben, amelyek vírustranszformáció vagy tumoros elfajulás révén folyamatos szaporodásává váltak. Az RNS-összetevő gén promótere azonban szabályozás alatt állhat; a már említett és más okokból, előnyös lehet az RNSösszetevő más promóter szabályozása alatt történő * · · · · · · • · · ·
• · expresszálása. Másrészt, az RNS-összetevő gén promótere alkalmazható az RNS-összetevő kódoló szekvenciájától függetlenül, más kódoló szekvenciák expresszálására is. Például, az RNS-összetevő gén transzkripciójának szabályozása tanulmányozható oly módon, hogy az RNS-összetevő gén promóterét egy olyan riporter kódoló szekvenciával fuzionáltatjuk, például a béta-galaktozidáz vagy más enzim vagy protein kódoló szekvenciájával, amelynek expresszálódása könnyen követhető. A humán telomeráz-RNS-összetevő gén promótere és más szabályozó elemei tehát nem csak az RNS-összetevő expresszálására használhatók, hanem a humán telomeráz protein-összetevők, antiszensz vagy más oligonukleotidok, valamint más géntermékek humán sejtekben történő expresszálására is. A humán telomeráz-RNS-összetevőnek megfelelő intakt gént tartalmazó expressziós plazmidok különösen előnyösen alkalmazhatók különböző célokra, például génterápiára. Szakember számára világos, hogy expressziós plazmidok széles skálája alkalmazható a találmány szerinti nukleinsavak előállítására, és a plazmid kifejezés bármely típusú nukleinsavra (fágból, vírusból, kromoszómából, stb. származó nukleinsavra) vonatkozik, amely alkalmas specifikus genetikai információnak gazdasejtbe történő juttatására, és ott az adott információnak meghatározott időtartamig való fenntartására.
Telomeráz protein-összetevők izolálása
A találmány szerinti reagensek ugyancsak lehetővé teszik humán, valamint olyan egyéb emlőstelomeráz-enzimek protein-összetevőit kódoló nukleinsavák klónozását és izo• · ·
- 84 lálását, amelyek a korábbiakban nem álltak rendelkezésre. Az ilyen nukleinsavakra vonatkozó információk további előnyt jelentenek a humán telomeráz-RNS-összetevő nukleinsav-szekvenciáját tartalmazó nukleinsav-szekvenciák ismeretéhez képest. Például, és amint azt a fentiekben említettük, a találmány szerinti terápiás előnyök egyes esetekben növelhetők a humán telomeráz protein-összetevőit tartalmazó tisztított készítmények és az azt kódoló nukleinsavak alkalmazásával. A humán telomeráz-RNS-összetevőt kódoló, találmány szerinti nukleinsavak alkalmazhatók a humán telomeráz protein-összetevőit kódoló nukleinsavak izolálására, lehetővé téve az ilyen előnyök kihasználását. A találmány tárgyát képezik tehát eljárások humán telomeráz protein-összetevőinek izolálására és tisztítására, valamint humán telomeráz protein-összetevőit kódoló nukleinsavak azonosítására és izolálására. A találmány tárgyához tartoznak továbbá, a következők: tisztított humán telomeráz, a humán telomeráz protein-összetevőit kódoló tisztított nukleinsavak, valamint humán telomeráz protein-összetevőit kódoló rekombináns expressziós plazmidok. A találmány tárgyát képezik továbbá, gyógyászati készítmények, amelyek aktív hatóanyagként a humán telomeráz protein-összetevőjét vagy az említett protein-összetevőket kódoló nukleinsavat vagy az említett protein-összetevőt kódoló nukleinsavval kölcsönhatásba lépő nukleinsavat tartalmaznak - például antiszensz oligonukleotidok, hármas hélixet képző oligonukleotidok, ribozimok, vagy bármely előzőnek megfelelő rekombináns DNS-expressziós-plazmidok.
A klónozott, humán telomeráz-RNS-összetevő alkalmazható a ribonukleoprotein telomeráz enzim protein-összetevőit kódoló nukleinsavak azonosítására és klónozására. A proteinösszetevők azonosítására és klónozására több különböző eljárás alkalmazható. Például végezhetjük az enzim vagy részlegesen denaturált enzim affinitásos befogását, affinitásos ligandumként, a következők alkalmazásával: (1) az RNSösszetevővel komplementer nukleotid-szekvenciák alkalmazásával, amelyek az intakt enzim RNS-összetevőjéhez kötődnek; vagy (2)az RNS-összetevő alkalmazásával, amely a proteinösszetevőkhöz vagy részlegesen vagy teljesen denaturált enzimhez kötődik. A ligandum szilárd hordozóhoz köthető, vagy a hordozón történő későbbi immobilizáció céljából kémiai úton módosítható (például biotinilezhető). Nagy mértékben tisztított telomeráz-enzim készítményt nyerhetünk oly módon, hogy a ligandumot humán telomerázt tartalmazó sejtextraktummal érintkeztetjük, mossuk, és a hordozóhoz kötődött telomeráz enzimet eluáljuk. Ezt követően, a protein-összetevőket kívánság szerint tovább tisztíthatjuk, vagy protein szekvenálással közvetlenül analizálhatjuk. Az így meghatározott proteinszekvencia felhasználható . a cDNS klónozására alkalmazható láncindító oligonukleotidok és hibridizációs próbák előállítására, vagy a telomeráz protein-összetevőjét kódoló nukleinsavakat tartalmazó genomi génkönyvtárban, adott klón azonosítására.
A telomeráz affinitásos alapon történő befogása történhet géntechnológiai eljárással módosított RNS-összetevő felhasználásával is, in vitro átírt telomeráz-RNS és ·· » · ···· ·· * · · · ♦••••· · • · · · •« · * telomeráz enzimaktivitás helyreállítására alkalmas rendszer alkalmazásával. [Lásd, Autexier és Greider: Genes &
Development 8^ 563 (1994); amely teljes terjedelmében a kitanítás részét képezi.] Az RNS-t, proteinek epitóptoldalékkal történő ellátásához hasonlóan úgy módosítjuk, hogy az egy toldalékot tartalmazzon. A toldalék lehet egy RNS-szekvencia, amellyel szemben nagy affinitással kötődő ligandum áll rendelkezésre, például egy RNS-szekvenciára specifikus ellenanyag, egy szekvencia-specifikus nukleinsavkötő protein vagy egy adott RNS-szekvenciához erősen kötődő szerves festék. A telomeráznak a toldalékkal és annak elhelyezésével szembeni toleranciája ismert eljárásokkal tesztelhető. A módosított RNS-összetevő szintézise és az enzim helyreállítása in vivő is végezhető. Az enzim izolálására ezt követően, az RNS-toldalékkal kölcsönhatásba lépő immobilizált ligandum alkalmazásával történő affinitásos befogás alkalmazható.
A telomeráz-enzim izolálására ugyancsak alkalmazható eljárás az expressziós szűrővizsgálat. A fenti eljárás szerint, cDNS expressziós génkönyvtárakat szűrhetünk jelölt telomeráz RNS-sel, és telomeráz RNS-hez specifikusan kötődő proteineket kódoló cDNS-eket azonosíthatunk. A telomerázenzim protein-összetevőit kódoló nukleinsavak izolálására alkalmazható továbbá, transzláció-gátláson alapuló molekuláris genetikai megközelítési mód. Az említett eljárás szerint, telomeráz RNS-szekvenciákat fuzionáltatunk egy szelektálható markertől 5' -irányban. Megfelelő rendszerben expresszálva, a szelektálható marker funkcionális lesz.
Amennyiben telomeráz RNS-kötő proteint kódoló cDNS expresszálódik, a protein az általa felismert szekvenciához kötődik, ezáltal a szelektálható marker transzlációját gátolja, és a proteint kódoló klón azonosítását lehetővé teszi. A fenti eljárás egy másik változatában, a szelektálható marker gátolt transzlációja teszi lehetővé a transzformáit sejtek szaporodását. További alkalmazható rendszerek a kölcsönhatáson alapuló csapdarendszer, amelyet a
WO 94/10300 sz. nemzetközi közzétételi irat ismertet; az egy-hibrid rendszer, amelyet Li és Herskowitz [ Science: 262, 1870 (1993, dec. 17.)], valamint Zervos és mtsai. írtak le [Cell 262, 1870 (1993, jan. 29.)] ; és a két-hibrid rendszer, amely a kereskedelemben hozzáférhető a Clontech cégtől.
Specifikus kötőproteinek és enzimaktivitás kimutatására szolgáló telomeráz RNS-kötődési vagy telomeráz-aktivitási vizsgálatok alkalmazhatók a telomeráz enzim tisztításának, és az enzim protein-összetevőit kódoló nukleinsavak izolálásának megkönnyítésére. Például, RNS-összetevő szekvenciákat tartalmazó nukleinsavak affinitásos reagensekként alkalmazhatók, az RNS-összetevőben található szekvenciához specifikusan kötődő peptidek, proteinek vagy más vegyületek, például a humán telomeráz protein-összetevőinek izolálására, azonosítására és tisztítására. A kötődés kimutatására és az RNS-összetevőhöz specifikusan kötődő vegyületek izolálására több különböző eljárás áll rendelkezésünkre, például gélen megfigyelhető migráció változás, filterkötődés, lábnyomkészítés (footprinting), Northwestern« · • * · · · · · * · 4· · · H 9 • · 9 9 9 9 ··· · 99 · ♦
- 88 biot (protein-blot hibridizálása RNS-próbával) és fotokeresztkötések képzése. Ezek a vizsgálati módszerek alkalmazhatók kötőproteinek azonosítására, kötőproteinek tisztításának követésére, az RNS-kötő helyek jellemzésére, a kötőproteinek molekulatömegének meghatározására, proteinek preparatív izolálás céljából történő jelölésére, valamint ezt követően, állatok immunizálására, a protein izolálására alkalmazható ellenanyagok előállítása vagy kapcsolt transzkripciós / transzlációs rendszerben a proteint kódoló nukleinsavak azonosítása céljából.
Emlőstelomeráz protein-összetevők tisztítása Emlőstelomeráz protein-összetevők ismert biokémiai eljárásokkal tisztíthatok, telomeráz-expresszáló sejtekből, például HT1080-sejtekből, 293-sejtekből és egyéb alkalmas, folyamatos szaporodású sejtvonalakból. Például - de anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk - sejtextraktumokból humán telomeráz lényegében a 08/288 501 sz. számú amerikai egyesült államokbeli közzétételi iratban leírtak szerint tisztítható, (bejelentés napja: 1994 augusztus 10.), amely teljes terjedelmében a kitanítás részét képezi. Emlőstelomeráz extraktumok megszabadíthatok a telomeráz-RNS-összetevőtől, például RN-áz kezeléssel, vagy a telomeráz-RNS-összetevő disszociálására és/vagy lebontására alkalmas, de a telomeráz protein-összetevőt lényegében intakt állapotban hagyó más módszerrel, melyet követően, a protein exogén telomeráz-RNS-összetevővel, például rekombináns úton előállított RNS-összetevővel vagy hasonlóval újból képes teljes enzimmé összeépülni. Az így tiszti* *··· ·· »« ··»· • · · · « ♦ · • · »·· ··* ·
... : · .· :
- 89 tott, és adott esetben, az endogén RNS-összetevőtől megszabadított telomeráz protein-összetevő a leírásban ismertetett hatóanyag-szűrő vizsgálatokban, és egyéb célokra alkalmazható .
Génterápia
Exogén genetikus anyag sejtekbe történő bejuttatása (például DNS-közvetítette transzfekcióval) a sejtbiológiai és molekuláris genetikai alapkutatás nélkülözhetetlen módszerét, és humán génterápiában alkalmazható hatékony eljárások kifejlesztésének alapját képezi. Az Egyesült Államokban eddig engedélyezett génátviteli vizsgálatok zöme olyan, replikációra képtelen retrovírus vektorok alkalmazásán alapult, amelyek a retrovírus genom részeként, terápiás polinukleotid-szekvenciát tartalmaznak [Miller és mtsai.: Mól. Cell. Bioi. 10, 4239 (1990); Kolberg R. : J. NIH Rés.
£, 43 (1992); Cornetta és mtsai.: Hűm. Gene Ther. 2_, 215 (1991)] . Adenovírus-vektorok humán génterápiában történő alkalmazásának lehetőségét ugyancsak leírták [Rosenfeld és mtsai.: Cell 68, 143 (1992).
Emberben elfogadottan alkalmazható további génterápiás eljárás plazmid-DNS fizikai úton történő bejuttatása liposzómák alkalmazásával, in situ, közvetlenül a tumorsejtekbe. Eltérően a vírusvektoroktól, amelyeket előzőleg tenyésztett sejtekben fel kell szaporítanunk, a plazmid-DNS homogén készítményként tisztítható, ami csökkenti a patogén kontamináció lehetőségét. Egyes esetekben, (például tumorsejtek esetében) nincs szükség arra, hogy az exogén DNS stabilan beépüljön a transzdukált sejt kromoszó·· · · • · · · » · • · ·»« »«» • · · · ··* β ··» «
- 90 májába, mivel az átmeneti expresszálódás elegendő a tumorsejt elpusztításához. Liposzóma-közvetítette DNSátvitelt ismertet több szakember: Wang és Huang: Biochem
Biophys. Rés. Commun. 147, 980 (1987);_Wang és Huang:
Biochemistry 28, 9508 (1989); Litzinger és Huang: Biochem.
Biophys. Acta 1113, 201 (1992); Gao és Huang: Biochem
Biophys. Rés. Commun. 179, 280 (1991); Felgner: WO 91/17424 sz. és WO 91/16024 sz. nemzetközi közzétételi iratok.
Exogén polinukleotidok hordozójaként immunliposzómák alkalmazását is leírták [Wang és Huang: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7851 (1987); Trubetskoy és mtsai.: Biochem.
Biophys. Acta 1131, 311 (1992)] . Az immunliposzómáktól elvárható, hogy a liposzómáknál nagyobb szövetspecifitással rendelkezzenek, mivel specifikus ellenanyagokat tartalmaznak, amelyek feltehetően specifikus sejttípusok felületi antigénjeihez kötődnek. Behr és mtsai.[ Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6982 (1989)] lipopoliamint alkalmaztak egyedüli reagensként a transzfekció közvetítésére, anélkül, hogy a liposzómák képzéséhez foszfolipidek hozzáadására lett volna szükség.
A fentiek szerint, a telomeráz-RNS-összetevő szekvenciájának legalább 25 nukleotidjával, előnyösen 50-100 nukleotidjával vagy többel lényegében azonos polinukleotidot funkcionálisan kapcsolunk egy heterológ promóterhez, úgy, hogy humán sejtben telomeráz-RNSösszetevő vagy antiszensz telomeráz-RNS-összetevő polinukleotid expresszálására képes transzkripciós egységet kapjunk. Az említett transzkripciós egységet tartalmazhatja »··
- 91 egy transzgén, adenovírus vektor, vagy az lehet egyéb génterápiára alkalmas környezetben, amely humán sejtekbe történő bejuttatásra, például telomerázzal kapcsolatos betegségek (például neoplázia) kezelésére alkalmazható. A telomeráz-RNS-összetevőt kódoló szensz és antiszensz expressziós konstrukciók bejuttatására alkalmas eljárásokat szakember választja ki, az elfogadott gyakorlatnak és szabályozási követelményeknek megfelelően.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, transzgenikus állatokat alkalmazunk.
Emlőstelomeráz-RNS-összetevőt kódoló genomi kiónok, különösen egér telomeráz-RNS-összetevővel lényegében megegyező telomeráz-RNS-összetevő gének alkalmazhatók homológ rekombinációs célbajuttató konstrukciók előállítására, amelyek legalább egy, funkcionálisan megszakított telomerázRNS-összetevő alléllal rendelkező sejtek, valamint transzgenikus nem-humán állatok előállítására használhatók. Homológ szekvenciák célzott rekombinációját előidéző konstrukciók előállítására szolgáló eljárások leírása megtalálható a szakirodalomban, lásd többek között: Rahemtulla és mtsai.: Natúré 353, 180 (1991); Jasin és mtsai.: Genes
Devel. 4, 157 (1990); Koh és mtsai.: Science 256, 1210 (1992); Molina és mtsai.: Natúré 357, 161 (1992); Grusby és mtsai.: Science 253, 1417 (1991); Bradley és mtsai.:
Bio/Technology 10, 534 (1992); amelyek teljes terjedelmükben a kitanítás részét képezik.
Homológ szekvenciák célzott rekombinációja segítségével úgy nevezett knock-out egerek (inaktivált telomeráz-RNS92 összetevő alléit tartalmazó egerek) állíthatók elő, amelyek az inaktivált telomeráz-RNS-összetevő allélre nézve lehetnek heterozigóták vagy homozigóták. Ilyen egerek kereskedelmi forgalomba hozhatók kutatásban alkalmazott kísérleti állatokként, azok felhasználhatók az immunrendszer fejlődésének vizsgálatára, neopláziák és a spermatogenezis tanulmányozására, lehetnek kedvenc állatok, hasznosíthatók állati proteinként (tápanyagként), és felhasználhatók egyéb célokra.
Célzott homológ rekombináción átment gént tartalmazó kiméra egereket állíthatunk elő Hogan és mtsai. eljárása szerint [ Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988); valamint Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, szerk.: E.J. Robertson, IRL Press, Washington D.C. (1987), amelyek teljes terjedelmükben a kitanítás részét képezik. Embrionális őssejtek módosítására szolgáló eljárásokat közöltek a következő szakirodalmi helyeken: Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical
Approach, szerk.: E.J. Robertson, IRL Press, Washington
D.C. (1987), Zjilstra és mtsai.: Natúré 342, 435 (1989) ;
valamint Schwartzberg és mtsai.: Science 246, 799 (1989) ;
amelyek teljes terjedelmükben a kitanítás részét képezik.
Telomeráz-RNS-összetevőt kódoló cDNS vagy genomi génkópia alkalmazható transzgének előállítására, telomeráz-RNSösszetevő magas szintű expresszálása céljából és/vagy olyan transzkripciós szabályozó szekvenciák irányítása alatt történő expresszálása céljából, amelyekkel a telomeráz-RNS• · ·· ·· ···· • · · · · • ······ · • · · · összetevő gén a természetben nem kapcsolódik. Például - de anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk - egy konstitutív promóter (például HSV-tk- vagy pgk-promóter) vagy sejtvonal-specifikus transzkripciós szabályozó szekvencia (például CD4- vagy CD8-gén promóter / enhanszer) kapcsolódhat funkcionálisan a telomeráz-RNS-összetevő polinukleotid-szekvenciához, ily módon transzgént képezve, (tipikusan egy szelektálható markerrel, például neo-gén expressziós kazettával kombinálva). Az ilyen transzgéneket sejtekbe juttathatjuk (például ES-sejtekbe, vérképzőrendszeri törzssejtekbe), és ismert eljárások szerint, transzgenikus sejteket, valamint transzgenikus nem-humán állatokat nyerhetünk. Transzgenikus sejtek és/vagy transzgenikus nem-humán állatok alkalmazhatók antineopláziás hatóanyagok szűrésére és/vagy lehetséges karcinogén anyagok szűrésére, mivel a telomeráz-RNSösszetevő nagy mennyiségű expresszálódása vagy a telomerázRNS-összetevő nem megfelelő helyen történő expresszálódása neopláziát megelőző állapot vagy neopláziás állapot eredménye lehet.
Hatóanyag-szűrő vizsgálati eljárások
A telomeráz-RNS-összetevő polinukleotidok, telomeráz protein-összetevő készítmények és telomer ismétlődő egységnek megfelelő terápiátok előállítását, valamint a kötődési reakciókat a példákban leírtak szerint végeztük. Általánosságban, telomeráz protein-összetevőket telomeráz expresszáló emlős sejtekből nyertünk, ismert tisztítási eljárások alkalmazásával, és a találmány szerinti vizsgálati
- 94 eljárásokban történő felhasználásukat megelőzően, a hozzájuk kapcsolódó RNS-összetevőt eltávolítottuk. A vizes közegben alkalmazott adott paramétereket szakember választhatja meg, ismert módszerek szerint. Általános irányelvként, a pufferolt vizes közegben a következő paraméterek alkalmazhatók: 10-250 mmól/1 NaCl, 5-50 mmól/1 Tris-HCl (pH=5-8), előnyösen divalens kation (kationok) és/vagy fémkelátorok és/vagy nem-ionos detergensek és/vagy membránfrakciók hozzáadásával. Szakember számára nyilvánvaló, hogy a fenti alapkörülmények egyéb anyagok hozzáadásával, a felsoroltak elhagyásával, a körülmények módosításával (például pH-módosítással) és helyettesítésekkel (például KC1 helyett NaCl alkalmazásával vagy puffer helyettesítéssel) megváltoztathatók. A kötődési reakciónál alkalmazott alapkörülmények módosíthatók, amennyiben a kontroll reakcióban (reakciókban) specifikus telomeráz holoenzim képződés és/vagy telomeráz-aktivitás észlelhető. A kötődésvizsgálati eljárások esetében, a kontroll reakciókban (hatóanyag hozzáadása nélkül végzett reakciókban) nem alkalmazhatunk olyan körülményeket, amelyek a specifikus kötődést és hasítást gátolják.
A telomeráz-RNS-összetevő immobilizált telomeráz protein-összetevőhöz történő kötődésének meghatározására a telomeráz-RNS-összetevőt előnyösen, egy kimutatható markerrel, tipikusan biotinil-csoporttal, fluoreszcens csoporttal vagy radioaktívan jelölt nukleotid beépítésével jelöljük. Telomeráz protein-összetevő jelölésére - anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk - a következőket • · · · · · · • · ······ · • · · · · · ···· ·· · ·
- 95 alkalmazhatjuk: radioaktív jelölés radioaktívan jelölt aminosav (például 14C-jelölt leucin, 3H-jelölt glicin, 35Sjelölt metionin) beépítésével; radioaktív jelölés transzlá125 131 ciót követő radiojodozással, I vagy I alkalmazásával, (például Bolton-Hunter reakcióval és Chloramin-Teljárással); radioaktív jelölés transzlációt követő Pfoszforilezéssel, (például foszforiláz és radioaktívan jelölt szervetlen foszfát alkalmazásával); fluoreszcens jelölés fluoreszcens jelölőanyag (például fluoreszcein vagy rhodamine) beépítésével; vagy a technika állása szerint ismert egyéb eljárással történő jelölés. Azon esetekben, amelyekben a polipeptid-összetevő egy hordozóhoz kötve immobilizált, a másik komponenst általában egy kimutatható markerrel jelöljük.
A jelölt telomeráz-RNS-összetevőt vagy proteinösszetevőt, immobilizált telomeráz proteinnel vagy RNSösszetevővel érintkeztetjük, és meghatározzuk a hatóanyagnak a jelölt összetevő immobilizálódására, (azaz, annak a megfelelő telomeráz összetevőhöz történő kötődésére) kifejtett hatását. A kötődési reakció inkubációs ideje és az alkalmazott hőmérséklet változhat, amennyiben a választott körülmények a kontroll reakcióban,- tehát hatóanyag jelenléte nélkül végzett reakcióban - lehetővé teszik a specifikus kötődés létrejöttét. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, legalább 15 °C-os hőmérsékletet, előnyösebben 35-42 °C-os hőmérsékletet, és körülbelül legalább 15 másodperces inkubációs időt alkalmazunk, bár hosszabb inkubációs idők alkalmazása előnyösebb, úgy, hogy egyes megvalósítási módok esetén kötődési egyensúly alakuljon ki. A kötődés kinetikája és a kötődött komplexek termodinamikai stabilitása meghatározzák azt a tartományt, amelyen belül az idő, a hőmérséklet, az alkalmazott sók, a pH, és egyéb reakciós körülmények változtathatók. Valamely konkrét megvalósítási mód esetén azonban, szakember számára a kötődési reakcióban előnyösen alkalmazott körülmények a technika állása szerint ismert módszerekkel könnyen meghatározhatók, például a kötődés Scatchard-analízissel vagy Hillanalízissel történő vizsgálatával és egyéb eljárásokkal [Proteins, Structures and Molecular Principles, szerk.: Creighton, W.H. Freeman and Company, New York (1984)] .
Jelölt telomeráz protein-összetevő immobilizált telomeráz-RNS-összetevőhöz történő specifikus kötődését jelöletlen kompetitor protein (például albumin) és/vagy jelöletlen RNS alkalmazásával határozhatjuk meg. Miután a kötődési reakció végbement, az immobilizált összetevőhöz specifikusan kötődött jelölt összetevő (összetevők) mennyiségét meghatározzuk. Például - de anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk - a kötődés létrejöttéhez szükséges megfelelő inkubációs időt követően a nem-immobilizált jelölt telomeráz protein-összetevőt tartalmazó vizes frakciót eltávolítjuk, és az immobilizált, kötődött telomeráz holoenzimet, valamint bármely kötődött jelölt telomeráz protein-összetevőt tartalmazó hordozót megfelelő pufferrel, adott esetben, jelöletlen blokkoló anyagot (anyagokat) tartalmazó pufferrel mossuk, és a mosópuffert (puffereket) eltávolítjuk. A mosást követően meghatározzuk az immobilizált • ·
- 97 jelölt összetevővel specifikus kötődésben maradt kimutatható jelölőanyag mennyiségét (például optikai, enzimatikus, autoradiográfiás vagy más radiokémiái eljárással).
A találmány egy további megvalósítási módja szerint, a reakciót a nem-specifikus kötődést gátló jelöletlen blokkoló anyagok hozzáadásával végezzük. Ilyen blokkoló anyagok anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk - a következők: borjú thymus (csecsemőmirigy) -DNS, lazacspermaDNS, élesztő-RNS, különböző hosszúságú, kevert szekvenciájú (random vagy pszeudorandom szekvenciájú) oligonukleotidok, szarvasmarha szérumalbumin, nem-ionos detergensek (NP-40, Tween, Triton-X-100, stb.), zsírtalan szárított tejproteinek, Denhardt-féle reagens, polivinilpirrolidon, Ficoll és egyéb blokkoló szerek. Szakember szándéka szerint választhat a kötődési reakcióban, megfelelő koncentrációban alkalmazott blokkoló anyagokat.
Olyan megvalósítási módok esetén, amikor a telomerázRNS-összetevő vagy telomeráz protein-összetevő immobilizált, a hordozóhoz történő kötésre kovalens vagy nemkovalens kötést alkalmazhatunk. Kovalens kötést létrehozó kémiai eljárások- anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk - lehetnek a technika állása szerint jól ismert eljárások [ Kadonaga és Tijan: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 5889 (1986)] . például - de anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk - kovalens kötést hozhatunk létre cianogén-bromiddal derivatizált szubsztráthoz (például CNBr-derivatizált Sepharose-4B-hez) történő kapcsolással. Előnyös lehet térkitöltő elem (spacer) alkalmazása a hor• · • · · · · · * • · ······ · • · · · · · ···· ·· · «
- 98 dozó esetleges szférikus gátlásának csökkentése céljából. Proteinnek egy hordozóhoz való nem-kovalens kötése anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk - történhet a proteinnek töltéssel rendelkező felszínhez történő kötésével vagy specifikus ellenanyagokkal történő kötődés létrehozásával.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, feltételezett terápiás hatóanyagokat annak alapján azonosítunk, hogy azok képesek-e blokkolni a telomeráz proteinösszetevőnek telomeráz-RNS-összetevőhöz történő kötődését.
Tipikusan, a fenti eljárásokban alkalmazott telomeráz-RNSösszetevő a természetben előforduló emlőstelomeráz-RNSösszetevő szekvenciát tartalmaz (például humán RNSösszetevó szekvenciát), bár egyes esetekben mutáns telomeráz-RNS-összetevő szekvenciák is alkalmazhatók, amennyiben a mutáns telomeráz-RNS-összetevő kontroll vizsgálati körülmények (például fiziológiás körülmények mellett) kötődik a telomeráz protein-összetevőhöz.
A találmány egy további megvalósítási módja szerint, feltételezetten telomeráz-módosító hatóanyagokat azon képességük alapján azonosítunk, hogy metabolikusan aktív emlős sejtekben statisztikailag szignifikáns módon csökkentik vagy növelik egy emlőstelomeráz-RNS-összetevő gén, előnyösen humán telomeráz-RNS-összetevő gén transzkripciós szabályozó szekvenciáihoz funkcionálisan kapcsolt riporter polinukleotid-szekvencia (például β-galaktozidáz gén, luciferáz gén, HPRT-gén) transzkripcióját. Egy emlőstelomeráz-RNS-összetevőt kódoló, kettős szálú cDNS restrik99 ciós hasítási helyére vagy tompa végűvé alakított végekkel rendelkező helyére riportergént (például HPRT-gént) inszertálhatunk, úgy, hogy célzott homológ rekombinációt létrehozó konstrukciót vagy transzgént nyerjünk, amelyben a riportergén az endogén telomeráz-RNS-összetevő gén promóterének és az azzal kapcsolatos transzkripciós szabályozó elemeknek transzkripciós szabályozása alatt áll. Azokat a hatóanyagokat, amelyek a riportergén transzkripcióját dózisfüggő módon befolyásolják, feltételezetten telomerázaktivitást módosító hatóanyagoknak tekintjük.
Más eljárás szerint, emlős sejtben, endogén telomerázRNS-összetevő gént homológ rekombináció létrehozására képes konstrukcióval érintkeztetünk, hogy az endogén gén kromoszómális lókuszába, az endogén telomeráz-RNS-összetevő gén 5' -irányú transzkripciós szabályozó szekvenciáival (például promóterével) funkcionálisan kapcsolt riporter polinukleotid-szekvenciát iktassunk be. További lehetőség szerint, egy riporter polinukleotidot tartalmazó exogén polinukleotidot emlőstelomeráz-RNS-összetevő gén transzkripciós szabályozó régiójával (például promóterrel és 5' irányú transzkripciós faktor kötőhelyekkel) funkcionálisan kapcsolunk; az exogén polinukleotidot emlős sejtbe juttatjuk, ahol az nem-homológ módon beépülhet a kromoszómába és/vagy fennmaradhat vagy replikálódhat episzómális polinukleotidként. Azokat a hatóanyagokat, amelyek a hatóanyaggal kezelt sejtekben statisztikailag szignifikáns módon befolyásolják a riporter polinukleotid transzkripció• ·
- 100 ját, feltételezett emlőstelomeráz-aktivitást módosító hatóanyagoknak tekintjük.
Azokat a telomeráz-aktivitást módosító hatóanyagokat, amelyek csökkentik a sejtek telomer-károsodást helyreállító képességét, vagy gátolják a telomerek replikációját (például úgy, hogy kompetitív módon gátolják a természetben előforduló endogén telomerázt), feltételezett antineoplasztikus hatóanyagoknak tekintjük, vagy a sejteket (például neopláziás sejteket) telomer-károsító hatóanyagokkal vagy hatásokkal szemben (például alkiláló szerekkel vagy ionizáló sugárzással szemben) érzékenyítő hatóanyagoknak tekintjük.
A feltételezett antineopláziás hatóanyagokat ezt követően antineopláziás aktivitásra nézve teszteljük, humán antineopláziás hatóanyagok alkalmazhatóságának vizsgálatára szolgáló, szokásosan alkalmazott vizsgálati eljárásokban. Ilyen vizsgálati eljárások például - de anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk - a következők: a feltételezett hatóanyag azon képességének tesztelése, hogy (1) letapadástól függetlenül szaporodó transzformált sejtek lágyagarban történő szaporodását gátolják; (2) nu/nuegerekbe transzplantált sejtek tumor-keltő hatását gátolják; (3) transzformált sejtek morfológiai elváltozásait visszafordítják; (4) transzplantált tumorok nu/nu-egerekben történő növekedését gátolják; (5) állati modellekben, spontán vagy kémiailag indukált karcinogenezis esetén tumorok keletkezését vagy preneopláziás sejtek keletkezését gátol- 101 • ···· ·« ·· ···· «· · · · . · • · ·«···« · • · · · · · ···· · · * · ják; és (6) a hatóanyaggal kezelt transzformált sejtekben differenciáltabb fenotípust hoznak létre.
A hatóanyagok, telomeráz protein-összetevőre gátló vagy serkentő hatást kifejtő képességének vizsgálatára szolgáló eljárások - a telomeráz-RNS-összetevő kötődésének és/vagy a telomeráz enzimatikus aktivitásának vizsgálatán keresztül lehetővé teszik hatóanyag-bankok (például vegyület-bankok, peptid-bankok és hasonlók) nagy hatásfokú szűrését, telomeráz-antagonisták vagy -agonisták azonosítása céljából. Az ilyen antagonisták vagy agonisták módosíthatják a telomeráz-aktivitást, ezáltal a telomerek helyreállításának és replikációjának lehetőségét.
A telomeráz-aktivitást specifikusan gátló hatóanyagok terápiásán hatékony dózisának adagolása betegnek, terápiás vagy profilaktikus (megelőző) eljárásként alkalmazható olyan kóros állapotok (például tumorok, gyulladások, limfoproliferatív betegségek, autoimmun betegségek, neurodegeneratív betegségek és hasonlók) kezelésére, amelyek hatékonyan kezelhetők a telomeráz-aktivitás, valamint a DNShelyreállító működés és replikáció befolyásolásával.
A leírás alapján szakember számára világos, hogy a találmány tárgyát képezik humán telomerázzal kapcsolatos értékes reagensek, valamint különböző terápiás és diagnosztikus eljárások. A fenti leírás az ilyen eljárások korlátozott példáit tartalmazza, amelyekkel nem kívánjuk a találmány tárgykörét korlátozni. A találmány szerinti megoldás további sajátságai és előnyei nyilvánvalóak lesznek az alábbi példák és a szabadalmi igénypontok alapján.
*« • ··· · ·· • · · · · 4 · • « «····« · • · Λ · · · *··· ·· · *
- 102 Az alábbi példák a találmány specifikus vonatkozásait ismertetik, a találmány szerinti megoldás szakember számára történő szemléltetése, a humán telomeráz-RNS-összetevő izolálására és azonosítására alkalmazható eljárások leírása céljából. A találmány szerinti megoldást a továbbiakban konkrét megvalósítási példákon keresztül kívánjuk szemléltetni, anélkül azonban, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk, a példákban közelebbről ismertetett módszerek csupán a találmány megértéséhez és alkalmazásához nyújtanak segítséget.
Az alábbi példákban áttekintést adunk a kísérletek menetéről .
A humán telomeráz-RNS-összetevő klónozásához új eljárásra volt szükség, amely negatív szelekciós eljárást és pozitív szelekciós ciklusokat foglalt magába, az alább ismertetettek szerint. Először azonban kísérletet tettünk az
RNS-összetevő klónozására reverz transzkripció, és a cDNS végeinek klónozására szolgáló, úgy nevezett 5' -RACE-PCRamplifikációs eljárás alkalmazásával. A reverz transzkripciós eljárást a humán telomer-DNS egy szálú részében található ismétlődő egység szekvenciájával megegyező szekvenciájú láncindító oligonukleotid alkalmazásával indítottuk meg, amely így komplementer volt a humán telomerázban feltételezetten jelen levő szekvenciával. A láncindító oligonukleotid, annak 5' -végén egy restrikciós enzim felismerési helynek megfelelő szekvenciát is tartalmazott. Amikor azonban a reverz transzkripciós reakcióval és PCRamplifikációval előállított cDNS-t gélelektroforézissel, és *««· • · ··· ·
- 103 a gélben található csíkoknak megfelelő nukleinsavakat nukleotidszekvencia-analízissel vizsgáltuk, csak riboszómális RNS-szekvenciákat tudtunk kimutatni. Hasonló problémákba ütköztünk, amikor a fenti 5' -RACE megközelítési módon változtatni próbáltunk, beágyazott (nested) láncindító oligonukleotidok alkalmazásával.
A klónozásra irányuló erőfeszítések tisztított humán telomeráz készítményekből, valamint humán telomerázaktivitással rendelkező és kimutatható humán telomerázaktivitással nem rendelkező sejtvonalakból származó cDNS előállításával váltak sikeressé. A cDNS előállítására szolgáló eljárást az alábbiakban, az 1. példában részletesen ismertetjük. A cDNS-készítmény két humán sejtvonalból történő előállítása során két negatív szelekciós lépést, majd egymást követő pozitív szelekciós lépéseket alkalmaztunk, a nem kívánt szekvenciák koncentrációjának csökkentése és a kívánt RNS-összetevő szekvenciák koncentrációjának növelése céljából.
A negatív szelekciós lépés szerint, kimutatható telomeráz-aktivitással nem rendelkező humán sejtvonalból nyert cDNS alapján biotinilezett PCR-terméket állítottunk elő. A biotinilezett PCR-terméket denaturáltuk, majd telomeráz-aktivitással rendelkező sejtvonalból nyert cDNS alapján előállított, az előzőnél sokkal alacsonyabb koncentrációban nem-biotinilezett PCR-terméket tartalmazó oldatban (100 biotinilezett termék : 1 nem-biotinilezett termék arány mellett) ismételten hibridizáltattuk. Figyelembe véve azt a lehetőséget, hogy a telomeráz-negatív sejtvonal n
•r ··« *.·» «'* • 1 » *
V «·« ··- 104 kis mennyiségben tartalmazhat RNS-összetevőt, a hibridizációs lépés csak mindkét sejtvonalban nagy mennyiségben expresszálódó RNS-sel szemben történő diszkrimináció vagy szelekció céljára volt alkalmas. A Cot-hez történő hibridizálódást követően, melyet úgy választottunk meg, hogy csak a legnagyobb mennyiségben expresszálódó RNS-ek hibridizálódását tegye lehetővé, a nem kívánt anyagot streptavidinnel fedett mágneses részecskékhez történő kötéssel eltávolítottuk; a részecskék összegyűjtését követően maradt felülúszó tartalmazta a kívánt, humán telomeráz-RNS-összetevőt kódoló cDNS-t. A cDNS PCR-amplifikációjára alkalmazott eljárást az alábbi, 2. példában ismertetjük.
A kapott anyagot, egymást követő pozitív szelekciós lépésekkel a kívánt cDNS-re nézve tovább dúsítottuk. A pozitív szelekciós lépés szerint, a humán telomeráz-RNSösszetevőben található következtetett templát szekvenciával komplementer biotinilezett próbát hibridizáltattunk olyan PCR-termékkel, amely telomeráz-aktivitással rendelkező humán sejtvonalból származó, PCR-amplifikált cDNS dúsított (negatív szelekciós eljárással dúsított) mintáját tartalmazta. A hibridizációt követően, a (hibridizációs próba/célzott DNS)-komplexeket avidinnel fedett mágneses gyöngyökhöz kötöttük, azokat összegyűjtöttük, és további pozitív szelekciós lépésekben RNS-összetevő szekvenciákra nézve dúsított nukleinsav forrásként használtuk. A pozitív szelekciós lépést részletesebben az alábbi 3. és 4. példákban ismertetjük.
- 105 -
A harmadik amplifikációs ciklust követően, az amplifikált terméket gélelektroforézissel szétválasztottuk, és a körülbelül 200 bázispár nagyságnak megfelelő nukleinsavakat tartalmazó géldarabokat eltávolitottuk. A nukleinsavakat ezután a géldarabokból eluáltuk, és PCR-eljárással amplifikáltuk. Ezt követően, a PCR-amplifikációs terméket Notl restrikciós enzimmel emésztettük, majd ligálással a kereskedelemben hozzáférhető NőtI-enzimmel emésztett pBluescriptIISK+ -plazmidba inszertáltuk (Stratagene). A kapott plazmidokat transzformációval E. coli gazdasejtekbe juttattuk, különálló telepeket izoláltunk, és azokat további analízis és DNS-szekvenálás céljára nukleinsav forrásként használtuk. A fenti teszt alapján pozitívnak bizonyult számos kiónt DNS-szekvenálással és egyéb tesztekkel analizáltunk.
Az alábbi teszteket alkalmaztuk: (1) annak meghatározását, hogy a feltételezett RNS-összetevővel komplementer antiszensz oligonukleotidok telomerázt tartalmazó humán sejtextraktumokban gátolják-e a telomeráz-aktivitást; (2) annak meghatározását, hogy a feltételezett RNS-összetevőklónra specifikus PCR láncindító oligonukleotidok alkalmazhatók-e telomeráz mintában található nukleinsav amplifikálására, és a megfigyelt termék - ha van ilyen - telomeráz tisztítása során a telomeráz-aktivitást mutató frakciónak megfelelően jelenik-e meg; (3) annak meghatározását, hogy a feltételezett RNS-összetevő-klón szekvenciájára specifikus PCR láncindító oligonukleotidok alkalmazhatók-e magas telomeráz-aktivitással rendelkező sejtekből (például tumor-
• · · · · ·
- 106 sejtekből) nyert sejtextraktumokban, a telomerázaktivitással nem rendelkező vagy csak alacsony telomerázaktivitással rendelkező sejtekből nyert sejtextraktumoknál nagyobb mennyiségben jelen levő nukleinsav amplifikálására. Egy klón, amelyet pGRN7-plazmidnak neveztünk, a fenti tesztekben kapott eredmények szerint, tartalmazta a humán telomeráz-RNS-összetevőnek megfelelő cDNS-t.
A pGRN7-plazmidban található feltételezett RNSösszetevő szekvenciához képest antiszensz oligonukleotidok tehát in vitro, gátolták a telomeráz-aktivitást. Hasonlóképp, amikor sejtextraktumokból telomerázt tisztítottunk a következő eljárások alkalmazásával: (1) DEAE-kromatográfia; (2) Sephadex-S300-kromatográfia; (3) glicerin-gradiens, SPSepharose vagy fenil-sepharose elválasztás, és a frakciók összegyűjtése - a pGRN7-plazmidban található, feltételezett RNS-összetevő szekvenciára specifikus PCR láncindító oligonukleotidok a várakozásnak megfelelő méretű nukleinsav amplifikálódását eredményezték, és az amplifikált termék mennyisége jól megfelelt a gyűjtött frakciókban megfigyelt telomeráz-aktivitásnak. Végül, normális (kimutatható telomeráz-aktivitással nem rendelkező) és tumoros (telomeráz-aktivitással rendelkező), valamint heréből nyert (telomeráz-aktivitással rendelkező) sejtekből származó sejtextraktumok esetében, a pGRN7-plazmidban található, feltételezett RNS-összetevőre specifikus láncindító oligonukleotidok alkalmazásával végzett reverz transzkripciós reakció és PCR-amplifikáció (RT-PCR) a várakozásnak megfelelő mennyiségű PCR-terméket eredményezett. Az RT-PCR• ·
- 107 eljárás leírását az alábbiakban, az 5. és 6. példákban ismertetjük.
A fenti eredmények meggyőző módon bizonyították, hogy a humán telomeráz-RNS-összetevőjét klónoztuk, ezek után tehát a pGRN7-plazmidot alkalmaztuk humán sejtvonalból származó, RNS-összetevőt kódoló genomi klón izolálására, az alábbi, 7. példában ismertetettek szerint. A genomi kiónt FIXIIjelű lambda-vektorba (Stratagene) inszertált humán genomi DNS-génkönyvtárban azonosítottuk és onnan izoláltuk. Az RNS-összetevő génszekvenciákat tartalmazó kívánt klón egy körülbelül 15 kb inszertet tartalmazott, és azt 28-1klónnak neveztük. Ezt a kiónt az American Type Culture Collection gyűjteményében 75925 nyilvántartási szám alatt helyeztük letétbe. A fenti fágból különböző restrikciós fragmenseket szubklónoztunk, és azokat szekvenáltuk. A gént a 3. kromoszóma q-karjának disztális végén lokalizáltuk. A kb inszert egyik végén található SauIIIAl restrikciós enzim felismerési helytől egy belső HindlII restrikciós enzim felismerési helyig terjedő szekvenciát, amely tartalmazza a 28-1-jelű lambda-klónban található teljes érett RNS-összetevő szekvenciát, valamint az RNS-összetevő gén transzkripciós szabályozó elemeit, a fentiekben ismertettük.
1. példa
Amplifikálható cDNS előállítása PCR-eljárás céljára
RNS-t 293-sejtekből és IMR-90-sejtekből állítottunk elő, guanidin-tiocianát extrakcióval, vagy tisztított
- 108 • · · · · · ···· ·· · · telomeráz frakciókból nyertünk fenol / kloroform extrakcióval. A 293-jelű sejtekből nyert össz-RNS-t 2 %-os agarózgélen, méret alapján frakcionáltuk, és az 500 bázispárnál kisebb méretű RNS-eket izoláltuk.
Első szál cDNS-t szintetizáltunk Superscript™-II reverz transzkriptáz alkalmazásával (Bethesda Research Laboratories, BRL). Körülbelül 0,5-1,0 pg RNS-t elegyítettünk körülbelül 40 ng véletlenszerű láncindító oligonukleotiddal (6 nukleotidból álló láncindító oligonukleotidokkal; pdN6„), vízben, 11 pl össztérfogatban. Az oldatot 10 percig 95 °C-on hevítettük, majd 5-10 percig jégen lehűtöttük. A denaturált nukleinsavat centrifugálással összegyűjtöttük. A denaturált RNS-t és láncindító oligonukleotidot tartalmazó elegyet ezt követően, az alábbi vegyületek következő sorrendben történő hozzáadásával ismét felszuszpendáltuk: 4 pl 5x első szál szintézis-puffér; 2 pl 0,1 mól/1 dithiothreitol (DTT); 1 pl RN-azin (Pharmacia); és 1 pl dNTP (2,5 mmól/1 koncentrációjú törzsoldatokból). A reakcióelegyet 1 percig, 42 °C-on inkubáltuk, majd ahhoz 1 pl (200 egység) Superscript-II-RT-ázt (BRL) adtunk, a reakcióelegyet elkevertük, és 60 percig, 42 °C-on inkubáltuk. Az így kapott, újonnan szintetizált cDNS-t tartalmazó reakcióelegyet a második szál szintéziséig jégre tettük.
A második cDNS-szál szintézisét a következőképp végeztük. Az első cDNS-szál szintézisére szolgáló reakcióelegyből körülbelül 20 pl-t (lásd fent) a következő sorrendben, az alábbi összetevőkkel elegyítettünk: 111,1 pl víz; 16 pl ΙΟχ E. coli DNS ligáz puffer; 3 pl dNTP (2,5 mmól/1 kon• · · · · • ··**·· · • · · · · • · · * ·
- 109 centrációjú törzsoldatokból); 1,5 μΐ E. coli DNS ligáz (15 egység; BRL); 7,7 μΐ E. coli DNS polimeráz (40 egység, Pharmacia); és 0,7 μΐ E. coli RNáz-H (BRL). A kapott oldatot óvatosan elkevertük, és 2 órán át, 16 °C-on inkubáltuk, ekkor a reakciós elegyet tartalmazó csövekhez 1 μΐ (10 egység) T4 DNS polimerázt adtunk, és az inkubálást a fentivel megegyező hőmérsékleten (16 °C-on), 5 percig folytattuk. A reakciót leállítottuk, és a nukleinsavakat összegyűjtöttük, úgy, hogy az elegyet két alkalommal fenol / kloroform eleggyel extraháltuk, etanollal precipitáltuk, és a reakcióelegyet a nukleinsavak ülepítése céljából centrifugáltuk .
A centrifugálással összegyűjtött cDNS-üledéket 20 μΐ TE-pufferben szuszpendáltuk, és NotAB elnevezésű, két szálú oligonukleotiddal ligáltuk, amely az alábbi két oligonukleotidból állt (NH2 egy amino blokkoló csoport):
NotA: 5' -pATAGCGGCCGCAAGAATTCA-NH2;
NotB: 5' -TGAATTCTTGCGGCCGCTAT-3' .
A két szálú oligonukleotidot úgy kaptuk, hogy 50 μΐ NotA-oligonukleotidot (100 pmól), valamint 50 μΐ NotBoligonukleotidot (100 pmól) 46,25 μΐ vízben elegyítettünk, a kapott oldatot 5 percig 95 °C-on hevítettük, és ehhez, amíg az oldat forró volt, 3,75 μΐ 20x SSC-puffert adtunk. Az elegyet tartalmazó csövet forró (körülbelül 70-75 °C-os) vizet tartalmazó főzőpohárba tettük, a hőmérsékletet fokozatosan hagytuk 15 °C alá csökkenni, úgy, hogy a két oligonukleotid hibridizálódjon, és belőlük kettős szálú, • ·
- 110 NotAB-oligonukleotid képződjék. A kapott nukleínsavat precipitációval összegyűjtöttük, és centrifugáltuk.
A kettős szálú NotAB-oligonukleotidot körülbelül 30 pl TE-pufferben szuszpendáltuk, majd 10 pl, fentiek szerint előállított cDNS-készítménvt, körülbelül 50 pmól NotABoligonukleotid (260 nm-en mért fényelnyelés szerint), 2 pl
ΙΟχ T4 DNS ligáz puffer; 1,2 pl T4 DNS ligáz; 0,2 pl 10 mmól/1 ATP; és víz hozzáadásával, összesen 20 pl össztérfogatban, egy éjszakán át, 16 °C-on inkubálva, a cDNS-sel ligáltunk. A reakciót a reakcióelegy 10 percig, 65 °C-on történő hevítésével, hővel inaktiváltuk. A fenti elegyből tipikusan, körülbelül 1-2 pl térfogatú mintát használtunk PCR-amplifikációra; a ligációs elegyet 10-15 ciklus alkalmazásával amplifikáltuk (45 másodperc 94 °C-on; 45 másodperc 60 °C-on; 1,5 perc 72 °C-on), és a 2. példában ismertetettek szerint, törzsoldatként tároltuk.
2. példa
A cDNS PCR-amplifikációja
A cDNS-t rutinszerűen végzett eljárással amplifikáltuk, a következő amplifikációs reakcióelegy elkészítésével: 5 pl lOx PCR-puffer [ 500 mmól/1 KC1; 100 mmól/1 Tris (pH=8,3); és 20 mmól/1 MgCl2] ; 5-8 pl dNTP (2,5 mmól/1 koncentrációjú törzsoldatokból); 1 pl Taq polimeráz (Boehringer Mannheim); 0,1 pl gén-32-protein (Boehringer Mannheim); 6 pl NotB láncindító oligonukleotid (20 pmól/1 törzsoldatból); 2 pl cDNS (az 1. példában leírtak szerint előállítva), és víz, pl össztérfogatig. Ezt az elegyet 50-100 pl ásványi • ·· ·· ···· ♦ · · · * • · *·«··· · ···· ·· · ·
- 111 olajjal felülrétegeztük, és PCR-reakciót végeztünk, 10-15 ciklus és a következő paraméterek alkalmazásával: (45 másodperc 94 °C-on; 45 másodperc 60 °C-on; 1,5 perc 72 °C-on). Az amplifikációt követően, a reakcióelegyet fenol / kloroform eleggyel extraháltuk, az amplifikált nukleinsavat etanollal precipitáltuk, és centrifugálással összegyűjtöttük. A precipitátumot 100 μΐ TE-pufferben szuszpendáltuk, hogy törzsoldatot kapjunk.
3. példa
Szubsztraktív hibridizáció és ciklikus szelekció céljára felhasznált PCR-termék előállítása
A szubsztraktív hibridizáció és ciklikus szelekció céljára felhasznált PCR-termék előállításához körülbelül 1 μΐ, a 2. példában ismertetettek szerint előállított törzsoldatot 50 μΐ, szintén a 2. példában ismertetettek szerint előállított PCR-reakcióelegyben amplifikáltunk, azzal az eltéréssel, hogy a láncindító oligonukleotidok hibridizálódása, az extenzió és a termék denaturációja 21-24 ciklusban történt. Az amplifikációt követően, a reakcióelegyeket fenol / kloroform eleggyel extraháltuk, etanollal precipitáltuk, és centrifugálással összegyűjtöttük. A termék előállításának hatásfokát a reakcióelegy kis mennyiségű mintájának agarózgél-elektroforézisét követően, a gél etidiumbromiddal történő festésével határoztuk meg. A szubsztrakciós hibridizáció céljára, telomeráz-negatív sejtekből (IMR-90) készített cDNS-génkönyvtárat amplifikáltunk biotinilezett dUTP jelenlétében. A szubsztrakciós hibridi·· · • · • · · · · · · • · ······ · • · · · · · ···« ·· · ·
- 112 záció kivitelezésénél a telomeráz-negatív sejtekből (IMR90) nyert cDNS-nek a telomeráz-pozitív sejtekből (293) nyert cDNS-hez viszonyított aránya körülbelül 100:1 volt. Az eljárást standard körülmények mellett végeztük, 65 °Con, 48-72 óráig. Tipikusan, körülbelül 2 pg, részlegesen tisztított cDNS-ből nyert és negatív szelekciós eljárással dúsított nukleinsav termék felhasználásával, legalább két körből álló ciklikus szelekciót végeztünk.
A 4 . példában ismertetettek szerint végzett ciklikus szelekciót követően, körülbelül 1-2 pl (20 pl össztérfogatból)pull-down terméket a 2. példában leírtak szerint, 22 ciklus során PCR-amplifikáltunk, a terméket etanollal precipitáltuk, és a további ciklikus szelekció céljára centrifugálással összegyűjtöttük.
4. példa
A PCR-eljárással amplifikált cDNS pozitív szelekciója
A humán telomeráz-RNS-összetevő klónozására alkalmazott ciklikus szelekciós eljárás pozitív szelekciós lépéséhez, körülbelül 2 pg PCR-amplifikált cDNS-t 25 pl TE-pufferben hígítottunk, majd 1,25 pl 20x SSC-pufferrel elegyítettünk, és a kapott oldatot 3 percig, 95 °C-on hevítettük. A hőmérsékletet 5 percig 60 °C-ra csökkentettük, és az elegyhez 1 pl (0,1 pg/pl) R2- vagy R4-jelű biotinezett próbát adtunk. A fenti próbák szekvenciáját az alábbiakban közöljük. A próbák O-metil-RNS-próbák, tehát U O-metil uridinnak, A O-metil riboadeninnek, G O-metil-riboguaninnak és I inozinnak felel meg.
• ·· · • · · · · · · • · ·♦···· · • · · · · · ···· · · · ·
- 113 R2: 5' -UUAGGGUUAGII-biotin;
R4: 5' -AUUGGGUUAUI I-biotin .
Az R2-próba specifikus a telomer ismétlődő egységre, az R4-próba pedig specifikus az RNáz-P-re; az utóbbit a ciklikus szelekciós eljárás hatékonyságának ellenőrzése céljából alkalmaztuk. Azzal, hogy a ciklikus szelekciós eljárást RNázP-RNS, azaz egy ismert szekvenciával rendelkező molekula szelekciójával párhuzamosan, de attól függetlenül végeztük, nagyobb biztonsággal állíthattuk, hogy a ciklikus szelekciós eljárás megfelelően működik a kérdéses molekula, azaz, a humán telomeráz-RNS-összetevő esetében is.
Akár az R2-, akár az R4-próbát adtuk 65 °C-on az elegyhez, a hibridizációs reakció hőmérsékletét 30 °C-ra csökkentettük, az említett hőmérsékleten 5 percig történő inkubálással, majd a reakcióelegy hőmérsékletét tovább csökkentettük 14 °C-ra, a fenti hőmérsékleten 60 percig történő inkubálással. Végül, az elegyet 2-12 órán át, 4 °Con inkubáltuk.
Mindkét minta esetében (R2 vagy R4) a teljes hibridizációs reakcióelegyet 4 °C-on, 400 μΐ 0,5x SSC-pufferhez adtuk, majd az elegyet jéghideg mágneses gyöngyöket tartalmazó csőhöz adtuk, amelyeket a Promega cégtől szereztünk be, és amelyeket a felhasználás előtt 0,5x SSC-pufferrel négyszer mostunk. A kapott elegyet 30 percig, 4 °C-on inkubáltuk, hogy a mágneses gyöngyökhöz történő kötődés teljesen végbemenjen. Ezt követően, a reakciós elegyeket tartalmazó csöveket rövid ideig mágneses állványon (Promega), szobahőmérsékleten inkubáltuk, a gyöngyök mágne• · · ·
- 114 ses erőtér alapján történő összegyűjtése céljából. A gyöngyöket hideg, 0,5x SSC-pufferben (600 μΐ) szuszpendáltuk, és (a csövet) jégre helyeztük. A mintákat az előzőekben ismertetettek szerint, 0,5x SSC-pufferrel még háromszor mostuk. A gyöngyökről a nukleinsavakat a következőképp eluáltuk: a gyöngyöket 100 μΐ vízben szuszpendáltuk, 2 percig, 65 °C-on inkubáltuk, majd azokat összegyűjtés céljából újból mágneses állványra helyeztük. Ezt az eljárást még háromszor ismételtük; az utolsó alkalommal a szuszpendált gyöngyöket 5 percig, 65 °C-on inkubáltuk, mielőtt azokat összegyűjtés céljából újból mágneses állványra helyeztük. A 100 μΐ térfogatú felülúszókat összegyűjtöttük (mindegyik minta esetében), és SpeedVac™ centrifugában 20 μΐ-re beszárítottuk. Az így nyert DNS-t ezt követően PCR-eljárással amplifikáltuk, egy újabb amplifikációs és szelekciós kör céljára. Valamennyi amplifikációs lépést követően, a PCR-terméket fenol-kloroform eleggyel kétszer extraháltuk, etanollal precipitáltuk, és 20 μΐ TE-pufferben szuszpendáltuk.
Tipikusan, a PCR-amplifikáció eredményét agarózgélelektroforézissel ellenőriztük. Ezen felül, a ciklikus szelekciós eljárás követésére különböző kontrollokat alkalmaztunk. Az egyik kontroll szerint, PCR-karokat (meghatározott szekvenciával rendelkező oligonukleotidokat, amelyek láncindító oligonukleotid hibridizációs helyekként szolgáltak) neomycin-rezisztenciát átvivő gént tartalmazó nukleinsavhoz kapcsoltunk. A kapott nukleinsavat a PCRamplifikált cDNS-sel elegyítettük, és annak mennyiségét • ·* · • · · · · · ···· · · · ·
- 115 mindegyik szelekció alkalmával, kvantitatív PCR-eljárással meghatároztuk. Egy másik kontroll szerint, az RNáz-P menynyiségét követtük az RNáz-P-re szelektált, és a telomeráz-RNS-összetevőre nézve szelektált génkönyvtárakban .
5. példa
RT-PCR-elj árás
Az első cDNS-szálat, lényegében az 1. példában leírt eljárás szerint állítottuk elő. Általánosságban, mindegyik, 01-1 pg RNS-t tartalmazó telomeráz-frakcióból RNS-t tisztítottunk; tipikusan, 300 pl frakcióból nyert RNS körülbelül egy harmadát - egy ötödét használtuk fel. Az RNS-t 10 pl térfogatban, 40-80 ng random hexamerrel elegyítettük, 10 percig, 95 °C-on denaturáltuk (egy termociklusos készülékben) , és jégen lehűtöttük. A denaturált RNS-t és a 6 nukleotidból álló láncindító oligonukleotidokat a következőket tartalmazó reakcióelegyhez adtuk: 4 pl 5x első szál szintézis puffer, [ amelyet a reverz transzkriptáz (RTáz) gyártójától (BRL) szereztünk be] , 2 pl 0,1 mól/1 koncentrációjú DTT, 1 pl 10 mmól/1 koncentrációjú dNTP (az egyes dezoxinukleotid-trifoszfátokból) , 1 pl RNáz-gátló (Pharmacia), és 9 pl össztérfogatig víz. Az elegyet az öszszekeverést követően 42 °C-os vízfürdőbe helyeztük. Egy-két perc inkubálást követően, az elegyhez 1 pl Superscript™IIRTáz (BRL) reagenst adtunk. Az inkubálást 60 percig, 42 °Con folytattuk. A reakciót oly módon állítottuk le, hogy a csövet 10 percig, 95-98 °C-ra melegítettük. Az első cDNS·*·· ·· ·· ···· • · · · · • ······ · • · · · ·
- 116 szálat rövid centrifugálással összegyűjtöttük, új csövekbe osztottuk szét, szárazjégen gyorsan lefagyasztottuk, és 80 °C-on tároltuk, vagy közvetlenül felhasználtuk.
6. példa cDNS_PCR-amplif ikáció j a_specifikus_láncinditó oligonukleotid kombináció alkalmazásával
Húsz (20) μΐ, radioaktívan jelölt nukleotidok alkalmazásával végzett PCR-reakcióhoz 1 μΐ, az 5. példában leírtak szerint előállított cDNS-t elegyítettünk 20 pmól 1. láncindító oligonukleotiddal, 20 pmól 2. láncindító oligonukleotiddal, 2,5 μΐ 2,5 mmól/l dNTP-vel, 5 pCi alf a-32P-dATPvel, 2 egység Taq polimerázzal (Boehringer Mannheim) , 0,2 pg T4-gén32-proteinnel (Boehringer Mannheim), 2 μΐ lOx pufferrel [500 mmól/l KC1, 100 mmól/l Tris-HCl (pH=8,3), 20 mmól/l MgCl2] , és 20 μΐ össztérfogatig vízzel. Végül, a csőhöz egy csepp ásványi olajat adtunk.
A telomeráz-RNS-összetevő-klón PCR-amplifikációjánál a következő körülményeket alkalmaztuk: 45 másodperc 94 °C-on; 45 másodperc 60 °C-on; 1,5 perc 72 °C-on. Az ciklusok száma az RNS-előállításra felhasznált tisztított anyag típusától függően változott, de tipikusan 18-25 ciklust alkalmaztunk. Amint az valamennyi kvantitatív RT-PCR esetében szokásos, az egyes minták esetében több, különböző számú ciklusból álló reakciót futtattunk, annak meghatározására, hogy a PCR-amplifikáció mikor válik telítetté és nem-lineárissá.
A kontrollként használt RNáz-P esetében, a következő
PCR-amplifikációs körülményeket alkalmaztuk: 45 másodperc ···· • · « ·· · • 9 9 9 · 9 9 • « ···«.· · • · · · · ·
9 9 9 9 9 9
- 117 94 °C-on; 45 másodperc 50 °C-on; 1,5 perc 72 °C-on. Az ciklusok száma itt is 15-22 között változott, az alkalmazott minta természetétől függően. Az RNáz-P amplifikációjánál felhasznált láncindító oligonukleotidok a következő szekvenciával rendelkeztek:
P3: 5' - GGAAGGTCTGAGACTAG-3' ;
P4 : 5' - ATCTCCTGCCCAGTCTG-3' .
A fenti két láncindító oligonukleotid alkalmazásával kapott PCR-termékek körülbelül 110 bp méretűek voltak.
A PCR-amplifikációt követően, a terméket (a reakcióelegyből vett 5-10 pl mintát) 6 %-os natív poliakrilamidgélre vittünk fel, és elektroforetizáltuk. Az elektroforézist követően, a gélt szárítottuk, és analízis céljából Phosphorlmager™-kazettára vagy autoradiográfiás filmre exponáltuk .
7. példa
A humán telomeráz-RNS-összetevőt kódoló gén klónozása
A humán telomeráz-RNS-összetevőt kódoló gén klónozását általánosságban, Maniatis és munkatársai kézikönyvében leírtak szerint végeztük (Laboratory Molecular Cloning Manual). A WI-38-jelű, humán tüdő fibroblaszt sejtvonalból nyert DNS-ból előállított genomi DNS-génkönyvtárat FIXIIjelű lambdafág-vektorba inszertáltuk (Stratagene). A fágokat körülbelül 25 000 plakk/lemez koncentrációban, háromszor 15-15 lemezből álló lemezcsoportokra (150 mm) oltottuk. A lemezeket NZY-agarból és NZY fedő agarózból készítettük; a fág-transzformációra XLlBlueMRAP2-sejteket • · · · « · · • · «·♦ »·* · • · · · · · ··· · ·· · ·
- 118 használtunk; a transzformánsokat egy éjszakán át, körülbelül 16 óráig, 37 °C-on tenyésztettük. A lemezeket körülbelül egy órán át 4 °C-on hűtöttük, majd a plakkokat kör alakú C/P-nylon filterekkel (a BioRad cégtől származó filterpapírral) felemeltük. Ezt az eljárást ismételtük, hogy a filterpapírra átvitt (felemelt) plakkokat tartalmazó filterek duplikátumban álljanak rendelkezésünkre. A filtereket (duplikátumokat) denaturáltuk, neutralizáltuk, 6x SSC-pufferben ekvilibráltuk, a nukleinsavaknak a filterhez történő kötése céljából ultraibolya fénysugárzásnak tettük ki, majd szűrőpapíron szárítottuk.
Előzetes hibridizálást végeztünk egy órán át, 37 °C-on, 50 %-os formaldehid-pufferben. A filtereket egy, a pGRN7klónból számazó, körülbelül 218 bp méretű, radioaktívan jelölt Notl-fragmenssel hibridizáltattuk, amelyet elektroforézissel történő szétválasztást követően 5 %-os poliakrilamidgélből elektroelúcióval izoláltunk, majd alfa32P-dCTP, és a Boehringer-Mannheim GmbH cégtől hozzáférhető nick-transzlációs reagenskészlet alkalmazásával, a gyártó utasításai szerint, nick-transzlációval (részleges emésztéssel, és a keletkezett megszakításoknál radioaktívan jelölt nukleotid beépítésével) jelöltünk. Filterenként körülbelül 25 ng (körülbelül 10 pCi) hibridizációs próbát alkalmaztunk, és a hibridizációt egy éjszakán át, 37 °C-on végeztük, 50 % formaldehid tartalmú hibridizációs pufferben. A hibridizációt követően, a filtereket szobahőmérsékleten hatszor mostuk; az első három mosást 0,1% SDS-t tartalmazó 6x SSC-pufferrel, az utolsó három mosást csak 6x » ·· · • · · « * * · • « ··· ·»· · • · · * · · ··« · ·« · ·
- 119 SSC-pufferrel végeztük. Miután a hibridizáció hatékonyságának és a hibridizációs jel erősségének ellenőrzése céljából, először néhány duplikátum filtert PhosphoImagerTO kazettában előhívtunk, a filtereket 65 °C-on, 0,5x SSCpufferrel mostuk. Ezután a filtereket két erősítő ernyő alkalmazásával Kodak-XAR5-filmek alá helyeztük, és körülbelül 100 órán át, -70 °C-on exponáltuk.
A későbbiekben 28-1-elnevezést kapott fágot tartalmazó filter esetében egy erős hibridizációs jel volt megfigyelhető; az ennek megfelelő fág tartalmazta a humán telomerázRNS-összetevőt kódoló gént. A filteren megfigyelhető jelnek megfelelő plakk felhasználásával újabb lemezeket készítettünk, úgy, hogy az izolált plakk, (amelyet jelölt pGRN7nukleinsavval történő hibridizációval ellenőriztünk), a fág-DNS nagy mennyiségben történő izolálása céljából tenyészthető legyen. A 28-1-fág, amely ATCC 75925 nyilvántartási szám alatt hozzáférhető az American Type Culture Collection gyűjteményéből, körülbelül 15 kb inszertet tartalmaz, és több olyan restrikciós fragmenst tartalmaz, amelyek a pGRN7-plazmádban található RNS-összetevő szekvenciákkal hibridizálódó szekvenciával rendelkeznek, ezek a következők: egy 4,2 kb EcoRI restrikciós enzim fragmens; egy 4,2 kb Clal restrikciós enzim fragmens; valamint egy 2,5 kbHindlII-SacI restrikciós enzim fragmens. Az utóbbi fragmens tartalmazza a fent bemutatott, körülbelül 560 nukleotidból álló teljes RNS-összetevő szekvenciát, és feltevésünk szerint tartalmazza az RNS-összetevőt kódoló teljes gént. A pBluescript-vektorba építve a 2,5 kb ···· ·· »·*· * « «9« ··« · • · · · · · ««· · ·« * ·
- 120 HindlII-SacI restrikciós fragmenst tartalmazó plazmidot pGRN33-plazmidnak neveztük, ez a plazmid ATCC . . . nyilvántartási szám alatt hozzáférhető az American Type Culture Collection gyűjteményéből. Amennyiben a humán gén a 2,5 kb fragmensen található szekvenciákon felül további szekvenciákat is tartalmaz, ezek a szekvenciák a 28-1-jelű fágról, vagy a 2,5 kb fragmenssel (vagy más, találmány szerinti hibridizációs próbával) történő hibridizálódás alapján más fág kiónokról izolálhatok. A fenti restrikciós enzim fragmenseket külön-külön végzett restrikciós emésztésekkel állítottuk elő; az emésztések termékét 0,7 %-os agarózgélen történő elektroforézissel szétválasztottuk, a körülbelül 2,5 kb fragmens esetében azonban, csak 0,3 %-os poliakrilamidgélt alkalmaztunk; a kívánt csíkokat a gélből kivágtuk, és GeneClean™ Kit reagenskészlet (BiolOl, Inc) alkalmazásával vagy (csak a körülbelül 2,5 kb fragmens esetében) Spectropor-#2-dialíziscsóbe, 0,lx TBE-pufferbe, 100 V mellett, 2 órán át végzett elektroelúcióval szubklónozásra előkészítettük.
A fenti restrikciós enzim fragmenseket pUC-plazmidból, vagy egy SV40 replikációs origót is tartalmazó, (de SV40 promóter aktivitással nem rendelkező) pBluescriptlIplazmidból származó, E. coliban történő expresszióra / mutagenezisre felhasznált plazmádba szubklónoztuk. A kapott plazmidok felhasználhatók módosított (mutációt hordozó)
RNS-összetevő nukleinsavak előállítására, azoknak humán vagy más eukarióta sejtekbe történő bejuttatása céljából, * ·»· · «· * 9 - - « * » ··· ··’ 9 • · · · · « «·· » ·· «
- 121 különböző, a fentiekben és a találmány előnyös megvalósítási módjainak leírásánál ismertetett célokból.
8. példa
Humán telomeráz-RNS-összetevőhöz képest antiszensz szekvenciákat tartalmazó plazmidok
Antiszensz expressziós plazmidokat állítottunk elő PCRamplif ikációval, a következő láncindító oligonukleotid kombinációk alkalmazásával: (1) NotB és Gl, amely kombináció a plazmidban található cDNS-inszertnél kisebb antiszensz nukleinsavat eredményez; és (2) NotB és R3C, amely kombináció (a plazmidban található inszerthez képest) teljes hosszúságú antiszensz nukleinsavat eredményez. A NotB nukleotidszekvenciáját a fentiekben, az 1. példában közöltük; a Gl és R3C láncindító oligonukleotidok a következő szekvenciával rendelkeztek:
Gl: 5' - GAGAAAAACAGCGCGCGGGGAGCAAAAGCA -3' ;
R3C: 5'- GTTTGCTCTAGAATGAACGGTGGAAG -3' .
A PCR-amplifikációt követően, az amplifikált fragmenseket egy körülbelül 10 kb expressziós plazmid PmlIhelyére klónoztuk; a plazmid szelektálható markerekként puromycin rezisztenciát, DHFR, és hygromycin rezisztenciát létrehozó géneket tartalmazott, továbbá tartalmazta az SV40 replikációs origót; az indukálható, humán metallothioneinpromótert, olyan elhelyezésben, hogy a humán telomeráz-RNSösszetevő génnek megfelelő antiszensz szál expresszálódását lehetővé tegye, (magasabb expressziós szint elérésére al• ·
- 122 kalmazhatunk erősebb promótert is) , valamint az SV40 késői, poli-A hozzáadást irányító helyét.
Az így kapott plazmidokat (a NotB/Gl láncindító oligonukleotid-pár termékét pGRN42-plazmidnak, a NotB/R3C láncindító oligonukleotid-pár termékét pGRN45-plazmádnak neveztük) kálcium-foszfát eljárással (lásd, Maniatis és mtsai.: lásd fent) HT1080-jelű fibroszarkoma sejtvonalba juttattuk. A HT1080-sejtek normális esetben folyamatos szaporodási! sejtek; a humán telomeráz-RNS-Összetevőhöz képest antiszensz RNS expresszálódásának gátolnia kell a humán telomeráz-RNS-összetevő protein-összetevőkkel történő öszszekapcsolódását, ezáltal gátolva az aktív telomeráz képződését, ezáltal, a sejtek korlátozott szaporodású sejtekké történő átalakulását eredményezve.
9. példa
Nem-humán emlősökből származó RNS-összetevő nukleinsavak azonosítása és izolálása
Annak szemléltetésére, hogy a találmány szerinti reagensek hogy alkalmazhatók más emlősökből származó, lényegében homológ nukleinsavak azonosítására és izolálására, a humán RNS-összetevő szekvenciájával komplementer PCR láncindító oligonukleotidokat alkalmaztunk PCR-reakcióban, homológ szekvenciák amplifikációjára. A találmány fenti vonatkozását szemléltetjük a következő láncindító oligonukleotid-párral: +10-jelű láncindító oligonukleotid, amely az 5' - GGAGGGGCGAACGGGCCAGCA -3' szekvenciával rendelkezik, és az R7-jelű láncindító oligonukleotid, amely az 5' • · · ·
- 123 GGAGGGGCGAACGGGCCAGCA -3' szekvenciával rendelkezik. Genomi
DNS-t állítottunk elő csimpánzból, selyemmajomból, rhesus majomból, valamint babuin-szövetből, és a DNS-t körülbelül 0,5-4 mg/ml koncentráció mellett, TE-pufferben oldottuk.
Valamennyi szövettípus esetében PCR-elegyet készítettünk, amely a következőket tartalmazta: 1 μΐ genomi DNS, 48 pl Master Mix (a Master Mix összetétele a következő: lx TaqExtender™-puffér (Stratagene); 200 pmól az egyes dNTP-okbók, és 0-5 pmól az egyes láncindító oligonukleotidokból); valamint 0,5 pl Taq polimeráz (5 egység/pl; (Boehringer Mannheim) és Tth polimeráz (TaqExtender™ polimeráz, Stratagene) 1:1 arányú elegye. A reakcióelegyet tartalmazó csöveket termociklusos készülékbe helyeztük, amelyet úgy programoztunk, hogy a reakcióelegyet először 5 percig 94 °C-ra hevítse, majd 27 cikluson keresztül a következő paraméterek szerint inkubálja: 30 másodperc, 94 °C-on; 10 másodperc, 63 °C-on; és 45 másodperc, 72 °C-on. Miután az amplifikációs reakció végbement, valamennyi reakcióelegyből körülbelül 10 pl mintát 2 %-os agarózgélre vittünk fel, elektroforézis céljából. Az elektroforézist, a gél festését és ultraibolya fénnyel történő besugárzását követően, valamennyi reakcióelegy esetében egy várakozásnak megfelelő méretű (körülbelül 200 bp) csík volt megfigyelhető. A fenti csíkokból származó nukleinsavak klónozhatok és szekvenálhatók, és az említett emlősfajokból származó RNS-összetevő gén további része a humán telomeráz-RNS-összetevő gén esetében fent ismertetettek szerint klónozható. Az alábbi 14. példa- 124 bán szemléltetésképp a selyemmajom telomeráz-RNS-összetevő gén szekvenálását ismertetjük.
10. példa
Mutációt hordozó, szensz, humán telomeráz-RNS-összetevő szekvenciák
Ebben a példában azt szemléltetjük, hogy a telomerázRNS-összetevő szekvenciájának módosítása a templát régión belül, a humán telomeráz által szintetizált szekvencia megváltozását eredményezi, ami az eredetitől eltérő kromoszómális ismétlődő egységek keletkezéséhez vezet.
Annak meghatározására, hogy a TRC3-templát régió újraprogramozása a humán telomeráz-aktivitás jelenlétében szintetizálódott telomer ismétlődő egység megfelelő változásához vezet-e, a teljes telomeráz-RNS-összetevő génszekvenciát (TRC3) expresszáló génfragmenst klónoztuk és mutagenizáltuk. Southern-analízis-blot szerint, a TRC3 a humán genomban egy egyetlen példányban előforduló génnel hibridizálódott. Lamdafág génkönyvtárból a TRC3 genomi kópiáját izoláltuk, és kimutattuk, hogy az ugyanolyan restrikciós térképpel rendelkezik, mint a TRC3-mal hibridizáltatott genomi Southern-blotokon megfigyelhető minta. Egy körülbelül 2,6 kb nagyságú HindlII-SacI -fragmenst izoláltunk és szubklónoztunk a pBluescript-plazmid módosított változatába, így kaptuk a TRC3 genomi megfelelőjét tartalmazó, pGRN33-jelű plazmidot. Az RNS 5' - és 3' - végeit láncindító oligonukleotid extenziós eljárás, valamint RACE-PCR- és RTPCR-eljárások alkalmazásával térképeztük. Az
RNStérképeztük.
- 125 transzkriptum mérete, Northern-bloton megfigyelhető migrációjának megfelelően, körülbelül 550 kb volt. A TRC3 átíródott régiója a genomi kiónhoz képest centrálisán helyezkedett el, 1,4 kb 5' -irányú szekvenciával.
Tisztított telomeráz készítményből RNS-t extraháltunk, és azt a következő kísérletekben használtuk fel:
5' -RACE: Első cDNS-szálat antiszensz TCR3 láncindító oligonukleotidok alkalmazásával állítottunk elő (R3B: 5' CAACGAACGGCCA GCAGCT-GACATT) , 32P-dATP jelenlétében. Az extenziós termékeket PAGE-eljárással szétválasztottuk, autoradiográfiával azonosítottuk, kivágtuk és extraháltuk. A fenti, első szálat képező termékekhez T4 RNS ligáz alkalmazásával egy oligonukleotidot ligáltunk (NotA: 5' - pATAGCG-GCCGCTT GCCT-TCA-NH2), és az R3C-jelű beágyazott (nested) láncindító oligonukleotid (5' - GTTTGCTCTAGAATGAACGGTGGAAG), valamint egy, a NotA-oligonukleotiddal komplementer oligonukleotid (NotB: 5'- TGAATTCTTGCGGCCGCTAT) alkalmazásával PCR-reakciót végeztünk. A PCR-termékeket agarózgélen szétválasztottuk, a csíkokat kivágtuk, és a Gloligonukleotid (5' - AGAAAAACAGCGCGCGGGGAGCAAAGCA) láncindító oligonukleotidként történő felhasználásával közvetlenül szekvenáltuk. A 3' -vég térképezése: A 3' -RACE-eljárás sikertelennek bizonyult. Ezt követően, RT-PCR-stratégiát alkalmaztunk, amely szerint, az első cDNS-szál szintézisét a genomi DNS-szekvenciával komplementer antiszensz láncindító oligonukleotid sorozat segítségével végeztük. Az ebbe a sorozatba tartozó láncindító oligonukleotidokat úgy terveztük, hogy azok a transzkriptum 5' -végétől a 3' -vég irányába ···· ·· ·· ··· • · · · • · · · ·
- 126 haladva, körülbelül 150 bp közönként hibridizálódjanak a genomi DNS-sel. Ezt követően, PCR-reakciót végeztünk az első szál láncindító oligonukleotid és egy olyan láncindító oligonukleotid alkalmazásával (5' - TCTAACCCTAACTGAGAAGGGCGTAG), melynek szekvenciája az ismert TRC3-transzkriptum szekvenciájához képest belül helyezkedett el. A várakozásnak megfelelő méretű, reverz transzkriptáz szenzitív csíkok voltak megfigyelhetők valamennyi olyan láncindító oligonukleotiddal előállított cDNS alkalmazása esetében, amelyeket úgy terveztünk, hogy azok a (+100)-(+450). nukleotidok között hibridizálódjanak (az 5' -véghez viszonyított számozás szerint), de nem volt megfigyelhető ilyen csík azon láncindító oligonukleotidok alkalmazása esetén, amelyeket úgy terveztünk, hogy azok az (+558)-(+950). nukleotidok között hibridizálódjanak. A fentiek szerint, az érett TRC3-transzkriptum 3' -vége a +450. és +558. pozíciók között található. További láncindító oligonukleotidok tervezésével és RT-PCR alkalmazásával ezt a távolságot tovább szűkítettük, a +545. és 558. nukleotidok közti régióra.
A következtetett TRC3 templát szekvenciát a pGRN33jelű, genomi DNS-t tartalmazó plazmid in vitro mutagenezisével CUAACCCUA-szekvenciáról CCAACCCCA- (MuC) vagy CAAACCCAA- (MuA) szekvenciára módosítottuk [ az eljárást lényegében Perez és mtsai. eljárása szerint végeztük:
J. Bioi. Chem. 269, 22485 (1994)] . Funkcionális telomerázba beépülve, ezek a mutációt hordozó RNS-ek, a vad-típusú TTAGGG ismétlődő szekvencia helyett TTGGGG (MuC) vagy
TTTGGG (MuA) szekvenciák szintézise számára szolgáltatnak • ·· ·
- 127 templát szekvenciát. A fenti mutáns telomeráz-aktivitás könnyen megkülönböztethető a vad-típusú aktivitástól, mivel ezek nem igényelnek dATP-t, és csak a vad-típusú aktivitás érzékeny ddATP-vel történő terminációra. Előállítottunk egy kettős mutánst is (MuC+17), amelyben a MuC-templáton felül, a +180. pozíciónál egy 17 bázispárból álló inszertált szekvencia volt jelen. Ez a mutáns lehetővé tette a módosított RNS-nek, a 17 bp inszertre specifikus hibridizációs próba alkalmazásával, vagy méret alapján történő specifikus kimutatását .
A 2,6 kb genomi szekvencia elegendő volt a TRC3 in vivő expresszálódásához. Sejteket tranziens módon a MuC+17 plazmiddal transzfektáltunk, és a transzfektált DNS alapján expresszálódott RNS-t RT-PCR-eljárással, a reverz transzkripciós lépésben láncindító oligonukleotidként a 17 bázispárból álló inszert szekvencia alkalmazásával kimutattuk. Az RNS kimutatható volt a MuC+17 -transzfektált sejtekben, de nem volt kimutatható a kontroll eljárással transzfektált sejtekben, jelezve, hogy a 2,6 kb genomi klón elegendő volt a TRC3 expresszálódásához. A három fenti mutáns plazmidból származó stabil transzformánsokat nyertünk HT1080-sejtek kálcium-foszfát eljárással, pCMVneoplazmiddal együtt végzett transzfekciójával. Rezisztens kiónokat szelektáltunk G418 jelenlétében, és a MuC+17 -RNS expresszióját RT-PCR-eljárással igazoltuk [ Irvin és mtsai.: Exp. Cell. Rés. 202, 161 (1992)] .
Mutáns telomeráz-aktivitás tesztelésére, nemtranszformált sejtekből és a beépült MuC*-, MuC- vagy MuA- 128 vektorokat (az 1. ábrán C* , C vagy A) tartalmazó, három stabil transzformánsból nyert extraktumokat vizsgáltunk. Mivel a mutáns extraktumoknak mind vad-típusú, mind mutáns telomeráz-aktivitást tartalmazniuk kellett, azok elkülönítésére eltérő vizsgálati körülményeket alkalmaztunk. Normális reakciókörülmények mellett (dTTP, 32P-dGTP és dATP), a mutáns konstrukciókból származó valamennyi extraktum vadtípusú telomeráz-aktivitást mutatott, amely érzékeny volt RNáz-ra (1. ábra, 1-6. csíkok) . A várakozásnak megfelelően, ezt az aktivitást ddCTP hozzáadása a reakcióhoz nem befolyásolta (1. ábra, 7-9. csíkok), de ddTTP hozzáadása megszüntette (10-12. csíkok). Ezzel szemben, amikor a dATP-t ddATP-vel helyettesítettük, a C- (14, csík) és A- (15. csík) extraktumok még mindig RNáz-szenzitív telomerázaktivitással rendelkeztek (17. és 18. csíkok), míg a C* (13. csík) és a kontroll extraktumok nem. A fenti eredmények arra utalnak, hogy a MuC- vagy MuA-TRC3-RNS beiktatásával a sejteket ddATP-rezisztens aktivitással jellemezhető telomeráz előállítására programoztuk át. A fentiekkel szemben, a C*-mutánsba a 17 bázispárból álló inszert beépítése gátolta az enzim összeépülését, jelezve, hogy a telomeráz összeépülése nagy mértékben specifikus a TRC3-szekvenciára.
Annak igazolására, hogy a MuA-mutáns által szintetizált szekvencia valóban (GGGTTT)n, egy, egyedi telomeráz láncindító oligonukleotidhoz hozzáadódó telomeráz ismétlődő egységek amplifikációjára eddig alkalmazott eljárást módosítottuk [Kim és mtsai.: Science 2 66, 2011 (1994)] . Szintetikus láncindító oligonukleotidok alkalmazásával olyan reak• ·
- 129 dó-körülményeket határoztunk meg, amelyek mellett- a d(CCCAAACCCAAACCCAA)-szekvenciával rendelkező, 3' -végi láncindító oligonukleotid csak (TTTGGG)n ismétlődő egységeket amplifikál, de (TTAGGG)n tartalmú ismétlődő egységeket nem amplifikál. Abból a célból, hogy a vad-típusú és mutációt hordozó telomeráz által hozzáadott telomer ismétlődő egységeket el tudjuk különíteni, egy két lépésből álló vizsgálati eljárást kombináltunk olyan stratégiával, amely szerint, a telomeráz reakcióhoz szükséges nukleotidokat korlátozott mennyiségben alkalmaztuk. Mivel a MuA és MuC (TTTGGG)n és (TTGGGG)n telomer ismétlődő egységek keletkezését irányítja, sejtextraktumokat először 10 percig, szobahőmérsékleten, csupán dTTP és dGTP jelenlétében a TSszubsztráttal inkubáltuk, hogy a telomer ismétlődő egységek hozzáadását lehetővé tegyük. A maradék telomeráz-aktivitást ezután 5 percig tartó forralással inaktiváltuk. Ezt követően, a specifikus DNS-szekvenciával rendelkező telomeráz termékeket a megfelelő reverz irányú láncindító oligonukleotid, mind a négy dNTP és nyomokban 32P-dCTP jelenlétében végzett PCR-amplifikációval mutattuk ki, a leírtak szerint [Kim és mtsai.: lásd fent, (1994)] . A MuAtermékek kimutatására az (ACCCAA) reverz irányú láncindító oligonukleotidot és a következő PCR-körülményeket alkalmaztuk: 20 cikluson keresztül, 10 másodperc 94 °C-on; 30 másodperc 60 °C-on; és 30 másodperc 72 °C-on. A MuC-termékek kimutatására három reverz irányú láncindító oligonukleotidot, - a (CCCCAA)3 a (CCAACC)3 és a (CCAACC)3 láncindító oligonukleotidokat alkalmaztuk, ami a telomeráz tér···· ·· • ·
- 130 mékekhez történő hibridizálódás feltételezett helyének megfelelően, egymáshoz képest eltolódott mobilitással rendelkező PCR-termékekét eredményezett. A fentivel megegyező PCR-körülményeket alkalmaztuk, azzal az eltéréssel, hogy a hibridizálódási hőmérséklet 50 °C volt. A fentivel megegyező körülmények alkalmazása mellett, az eredeti sejtekből vagy vad-típusú TRC3-génnel transzfektált sejtekből előállított extraktumokból nem sikerült telomeráz terméket előállítani. Az általunk alkalmazott PCR-amplifikációs körülmények specifitásának tesztelése során, a (TTTGGG)n- és (TTGGGG)n- szekvenciákkal rendelkező szintetikus oligonukleotidok az (ACCCAA)4 vagy (CCCCAA)3 reverz irányú láncindító oligonukleotidokkal együtt alkalmazva, a megfelelő 6 nukleotid ismétlődéséből álló, lépcsőzetesen növekvő méretű PCR-termékek keletkezését eredményezték, míg a (TTAGGG)n oligonukleotid az (ACCCAA)4 vagy (CCCCAA)3 reverz irányú láncindító oligonukleotidokkal együtt alkalmazva nem eredményezett semmilyen PCR-terméket.
A fenti körülmények alkalmazásával, a módosított telomeráz vizsgálati eljárás során a MuA-sejtekből nyert extraktumok PCR-termékek keletkezését eredményezték, míg a MuC-sejtekből vagy vad-típusú sejtekből nyert extraktumok esetében nem volt PCR-termék megfigyelhető, ami azt jelenti, hogy a MuA tartalmú sejtekben (TTTGGG)n ismétlődő egységek keletkeztek. Hasonló eljárásokat alkalmaztunk a MuCmutáns analízisére, amelyekben (TTGGGG)n ismétlődő egységek szintetizálódtak. A fenti adatok együttesen meggyőző módon bizonyították, hogy a TRC3-gén humán telomeráz-RNS• · < * · · ♦ *» · ·· * *
- 131 összetevőt kódol, ezért a TRC3-gént, a humán telomeráz RNS rövidítéseként hTR-génnek neveztük el.
11. példa
Korlátozott szaporodású és folyamatos szaporodási! sejtekből származó telomeráz-RNS-összetevők
A legtöbb tumoros sejt magas szintű telomerázaktivitással rendelkezik, míg a legtöbb normális szomatikus sejtben telomeráz nem mutatható ki [Kim és mtsai.: (1994); lásd fent] . Annak meghatározására, hogy a telomeráz-RNSösszetevő szintje folyamatos szaporodású tumoros sejtvonalakban megnövekedett-e, telomeráz-RNS-összetevő és GAPDHtranszkriptumok szintjét analizáltuk RT-PCR-eljárással, öt korlátozott szaporodású elsődleges sejtvonalban, amelyek nem rendelkeztek kimutatható telomeráz-aktivitással, valamint öt folyamatos szaporodású tumoros sejtvonalban, amelyek magas szintű telomeráz-aktivitást mutattak. A telomeráz-RNS-összetevő transzkriptumok egyensúlyi állapotban mérhető szintje a tumoros sejtvonalakban a GAPDHtranszkriptumok szintjéhez képest 3-12-szer magasabb volt, mint az elsődleges sejtekben (2.A ábra). Míg a magas telomeráz-aktivitással rendelkező, folyamatos szaporodású tumoros sejtekben a telomeráz-RNS-összetevő szintje magasabb volt, érdekes, hogy alacsony, de könnyen kimutatható telomeráz-RNS-összetevő szint volt jelen a korlátozott szaporodású, kimutatható telomeráz-aktivitással nem rendelkező elsődleges sejtekben is (1-5 csíkok).
- 132 A telomeráz-RNS-összetevő szintjét Northern-blotanalízissel különböző normális humán szövetekben is megvizsgáltuk. A legmagasabb telomeráz-RNS-összetevő szintet a herében és a petefészekben találtuk, ami megfelelt a várakozásnak, mivel ezek a szövetek magas telomerázaktivitással rendelkeznek. Telomeráz-RNS-összetevő azonban számos más szövetben is kimutatható volt (2.B és 2.C ábrák) . Ezek közé tartozott a normális vese, prosztata és a felnőtt máj, amelyek közül egy sem rendelkezik kimutatható telomeráz-aktivitással. A fenti eredmények megerősítik a sejtvonalakkal kapott adatok helyességét (2.A ábra), és arra utalnak, hogy a telomeráz RNS inaktív formában, számos humán szövetben jelen lehet. Az RNS-expresszió vonatkozásában, egér szövetek esetében is hasonló szövetspecifikus eltéréseket találtunk; számos normális egér szövet azonban, pozitívnak bizonyult telomeráz-aktivitásra nézve. Humán sejtekben a telomeráz-aktivitás nyilvánvalóan fokozott repressziója magyarázatul szolgálhat arra, hogy az egér sejtek tenyészetben miért válnak spontán módon folyamatos szaporodásává, míg a humán sejtek nem.
12. példa
Antiszensz_hTR-_(humán_telomeráz-RNS-összetevő) transzkriptumok expressziója HeLa-sejtekben sejtkrízishez és sejtpusztuláshoz vezet
Abból a célból, hogy a telomeráz funkcióját egy folyamatos szaporodású sejtvonalban vizsgálhassuk, antiszenszhTR-expressziós konstrukciókat HeLa-sejtekbe juttattunk. A • · · ·
- 133 TRC3-jelű, humán telomeráz-RNS-összetevőt kódoló cDNS-klón 1-193. bázispár pozícióinak megfelelő régiót tartalmazó, 200 bp nagyságú EcoRI DNS-fragmenst pl0-3- és pBBS212plazmidok EcoRI-helyére inszertáltuk, így kaptuk a plO-3hTR- és pBBS-hTR-plazmidokat. A plO-3-hTR a telomeráz-RNSösszetevő antiszensz megfelelőjét expresszálja, a tetraciklin-szabályozás alatt álló CMV-minimál-promóter transzkripciós szabályozása alatt, az öt Tet-operátorhoz képest 5' -irányban, két különböző orientációban, a leírtak szerint [Gossen és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5547 (1992)] . A pBBS-hTR-plazmid a hTR antiszensz megfelelőjét az MPSV-promóter szabályozása alatt expresszálja [ Lin és mtsai.: Gene 147, 287 (1994)] . Az előbbiekkel párhuzamosan, az antiszensz-hTR-kódoló szekvenciát nem tartalmazó, kontroll expressziós vektorokat juttattunk elektroprációval HeLa-sejtekbe. Antiszensz vagy kontroll plazmidokat tartalmazó kiónokat három különböző kísérletben szelektáltunk.
Először, az antiszensz hTR-t expresszáló 41 tenyészetet a kontroll vektorokat tartalmazó sejtekkel megegyező körülmények mellett tenyésztettük. A transzfekció után azonban, a populáció 23-26 megkettőződését (population doubling level; PDL-t) követően, 41 antiszensz-expresszáló tenyészetből 33 krízisen ment át (1. táblázat). Ezekben a tenyészetekben a sejtkrízist a populáció 23-26. megkettőződése idején a sejtszaporodás jelentős gátoltsága, majd egy hetes időtartam során a sejtek lekerekedése és a lemezről való leválása jellemezte. Harminchárom (33) olyan esetből, amelyben a sejtek krízisen mentek át, 28 esetben néhány • · · · · ·
- 134 (1 %) revertáns telep volt megfigyelhető három héttel azután, hogy a sejtek többsége elpusztult. A revertáns sejtek olyan variánsokat képviselhettek, amelyek elkerülték az antiszensz hTR-konstrukciók gátló hatását. Az antiszensz kiónokkal szemben, egy vektor kontroll sejtvonal szaporodása vagy mortalitása sem változott 50 megkettőződés során.
1. táblázat
Antiszensz hTR jelenléte rövidebb átlagos hosszúságú
TRF-ek keletkezéséhez és sejtkrízishez vezet
Három, egymástól független kísérletet végeztünk el, amelyek során HeTe7-sejteket (a tetraciklin-represszor / VP16 kiméra proteint nagy mennyiségben expresszáló HeLasejteket) transzfektáltunk elektroporációs eljárással, antiszensz hTR-t a tetraciklin-VPl6 -indukált CMV-minimálpromóter szabályozása alatt expresszáló plO-3-hTRplazmiddal, vagy antiszensz hTR-t az MPSV-promóter szabályozása alatt expresszáló pBBS-hTR-plazmiddal (54). [A fenti kísérletekben tetraciklin-szabályozás nem volt megfigyelhető. A plO-3-hTR-plazmid esetében, a kísérleteket tipikusan tetraciklin mentes közegben végeztük, mivel luciferázzal vagy tetraciklin-VPl6 -indukált CMV-minimálpromóter szabályozása alatt expresszálódó antiszensz-hTRrel végzett kontroll kísérletek szerint, a tetraciklin jelenlétének vagy hiányának nem volt jelentős hatása HeTe7sejtekben a luciferáz vagy az antiszensz-hTR expressziójára. Valójában, a HeTe7-sejtekben antiszenszhTR- konstrukciókkal végzett korábbi kísérletek szerint, a
- 135 sejtek a 23-26. megkettőződés (PDL) során tetraciklin jelenlétében is krízisen mentek át.] Kontrollként, HeTe7sejteket transzferáltunk az inszertet nem tartalmazó szülői vektorral, a fentiekkel megegyező körülmények mellett. Valamennyi transzfekciós sorozatból tizenegy-tizennyolc stabil telepet izoláltunk. A 20 megkettőződésig valamennyi izolátumból származó klón azonos morfológiával és szaporodási profillal rendelkezett, ettől az időponttól kezdve a legtöbb antiszensz-expresszáló (plO-3-hTR és pBBS-hTR) klón szaporodása jelentősen lelassult. A 23-26. megkettőződés között ezek a sejtek sejtkrízisen mentek át, amelyet megnagyobbodott és lekerekedett sejtek megjelenése jellemzett. Nem mindegyik, pBBS-hTR-plazmiddal transzfektált HeTe7sejtből származó klón ment át azonban sejtkrízisen; nyolc, antiszensz-hTR-t expresszáló klón a kontroll tenyészetekhez hasonlóan folyamatosan szaporodott. A 23. megkettőződés időpontjában valamennyi kiónból sejteket gyűjtöttünk, és a TRF-ek átlagos hosszúságát meghatároztuk. A p-értékeket nem párosított t-teszttel számítottuk ki. Valamennyi sorozat esetében, a krízisen átment sejtek arányát jelöltük.
plazmid sejtkrízis átlagos TRF P-érték krízis/ ossz
1 plO-3 nem N.D. 0/7
pl0-3-hTR igen N.D. 18/18
2 plO-3 nem 3, 27+/-0, 10 0,0003 0/12
pl0-3-hTR igen 2,72+/-0,07 11/11
3 pBBS nem 3,22+/-0,11 0,0008 0/13
pBBS-hTRa igen 2,39+/-0,10 4/4
pBBS-hTRb nem 3,03+/-0,20 0,3551 0/8
HeTe7-sejtek nem 3, 15 + /-0, 09 szülői sejtek
• · · ·
- 136 Annak meghatározására, hogy az antiszensz-expresszáló kiónokban a telomerek hosszúsága és a telomeráz-gátlás öszszefüggésben áll-e a sejtkrízis bekövetkezésével, a krízist megelőzően, a 23. megkettőződés időpontjában néhány kontroll és kísérleti kolóniában meghatároztuk a telomerázaktivitást. Valamennyi, kontroll vektort tartalmazó kolónia a szülői sejtvonalhoz (3,15 kb) hasonló átlagos TRFhosszúsággal rendelkezett (3,22-3,27 kb), míg a krízisen átment, antiszensz vektor-konstrukciókat tartalmazó kiónok
2,39-2,72 kb, - azaz, a szülői sejtvonalnál 17-26 %-kal rövidebb átlagos TRF-hosszúsággal rendelkeztek (3. ábra). A fenti adatok összhangban vannak azzal a feltételezéssel, hogy az antiszensz-tartalmú kiónokban, a telomerázaktivitás gátlása telomer ismétlődő egységek elvesztését eredményezi. Hogy a fenti feltételezést közvetlenül tesztelhessük, 14 kiónban meghatároztuk a telomeráz-aktivitást. Számos antiszensz kiónban, általában alacsony, de kimutatható szintű telomeráz-aktivitást mértünk, bár a rövidebb telomer egységek arra utalnak, hogy a telomeráz szintje nem volt elegendő a telomer egységek hosszúságának fenntartásához, hiszen a fenti kiónokban az átlagos TRF-hosszúság 3,22 kb-ról 2,39 kb-ra csökkent (P=0,0008). Abban a nyolc, antiszensz vektort (pBBS-hTRb) tartalmazó kiónban , amely nem ment át krízisen, a telomerek hosszúsága nem változott szignifikáns mértékben (3,03 kb a 3,33 kb-hoz képest; P=0,355), és a telomeráz-aktivitás mértéke is a kontrolihoz hasonló volt. A fentieket összegezve, az eredmények azt bizonyítják, hogy a telomer egységek elvesztése, - miután a • ·
- 137 telomerek hosszúsága kritikus mértékre csökken, - sejtkrízishez és sejtpusztuláshoz vezet.
A sejtkrízis kiváltása az antiszensz telomeráz-RNSösszetevőt expresszáló HeLa-sejtekben további bizonyítékát szolgáltatja annak, hogy a telomeráz gátlása specifikus és hatékony terápiás eszköz lehet kezünkben a humán tumorokkal szembeni küzdelemben.
13. példa
In situ amplifikáció és kimutatás
A telomeráz-RNS in situ kimutatása
A. Fluoreszcens in situ hibridizáció (FISH)
Kevert sejtpopulációban vagy szövetben telomerázpozitív sejtek azonosítását végezhetjük a telomeráz-RNSösszetevőre specifikus jelölt próba in situ hibridizációjával. Szövet- vagy sejtmintát mikroszkóp-tárgylemezre fixáltunk, kellően permeábilissá tettünk, és in situ hibridizációs kísérletben használtunk. Humán telomeráz-RNS-összetevó (hTR) in situ hibridizációját például a következőképp végeztük: a nukleinsavakat először a lemezek 70-74 °C-ra előmelegített, 70 %-os ionmentesített formaldehid / 2xSSC oldatba történő merítésével 2-3 percen át denaturáltuk. A lemezeket ezt követően jéghideg, 70 %-os etanolba, majd 95 %os etanolba, végül 100 %-os etanolba tettük (valamennyi oldatba 4-4 percig). Lemezenként 100-200 ng jelölt htRNSpróbát (körülbelül 500 bp, biotinnel, digoxigeninnel, radioizotóppal vagy fluoreszcens-toldalékkal jelölt DNSpróbát) beszárítottunk; 10 μΐ, 100 %-os ionmentesített fór- 138 maldehidben szuszpendáltunk; 8 percig, 75 °C-on történő inkubálással denaturáltunk, majd jégen azonnal lehűtöttünk. A 10 pl szuszpendált hibridizációs próbához 10 pl hibridizációs puffért [ 4x SSC; 4x Denhardt-féle oldat; 20 % dextrán-szulfát; 100 mmól/1 Tris (pH=7,5)] adtunk. A próbát és hibridizációs puffért tartalmazó elegyet (20 pl) a fixált mintához adtuk, fedőlemezzel fedtük, és a fedőlemezt gumiragasztóval vagy körömlakkal körbeszigeteltük. A mintát 8-48 órán át, 37 °C-on inkubáltuk. A hibridizációt követően a fedőlemezt eltávolitottuk, a mintát 37 °C-on, 2x SSC / 50 % ionmentesített formaldehid elegyével kétszer mostuk, majd 37 °C-on, 2x SSC-pufferrel kétszer mostuk (mosásonként 5-5 percig). A mintát ezután mikroszkóp alatt vizsgáltuk.
B. In situ jelölés láncindító oligonukleotid alkalmazásával (prímed in situ labeling; PRINS)
A hagyományos in situ hibridizáció további variációjaként, láncindító oligonukleotid alkalmazásával végzett in situ hibridizációt (PRINS) végeztünk. A hTR PRINSeljárással történő kimutatása szerint, először a hTR alapján reverz transzkriptázzal (RT) cDNS-t szintetizáltunk, majd hTR-specifikus oligonukleotid próba, valamint jelölt nukleotidok beépülését eredményező láncelongációs lépés alkalmazásával PRINS-kimutatást végeztünk. A hTR alapján történő RT-reakciót különböző eljárásokkal végezhetjük. Például, az RT-rekaciót végezhetjük GeneAmp Thermostable rTth Reverse Transcriptase RNA PCR-reagenskészlet (Perkin Elmer) alkalmazásával. A fenti eljárásban, 10 pl RT-elegyet [ 10 mmól/1 Tris-HCl (pH=8,3); 90 mmól/1 KC1; 1 mmól/1
- 139 MnCl2; 200 pmól/l az egyes dNTP-okból; 2,5 egység rTth DNS polimeráz; 0,4 pmól/1 reverz irányú láncindító oligonukleotid (például R7G: 5' - GGAGGGGCGAACGGGCCAGCAG 3' )] cseppentettünk a fixált és permeábilissá tett mintákra, azokat fedőlemezzel fedtük, a fedőlemezt körömlakkal rögzítettük, ásványi olajjal felülrétegeztük, és 30 percig, 70 °C-on inkubáltuk. Ezt követően, az ásványi olajat eltávolítottuk, oly módon, hogy a mintákat 5 percig xilénben, majd 5 percig 100 %-os etanolban mostuk. A fedőlemezt eltávolítottuk, rövid ideig DepC-vízzel, majd 100 %-os etanollal mostuk, és 5 percig levegőn szárítottuk. Ezután, 10 μΐ PRINS-elegyet [ 5 térfogat-% glicerin; 10 mmól/l Tris-HCl (pH= ,3; 100 mmól/l KC1; 0,05 vegyes-% Tween-20; 0,75 mmól/l EGTA; 2,5 mmól/l MgCl2; 0,4 μιηόΐ/ΐ előre irányuló (forward) láncindító oligonukleotid (például U3b: 5' - GCCTGGGAGGGGTGGTGGCTATTTTTTG -3' ); 200 pmól/l dA-, dG-, dCTP; 110 pmól/l dTTP; 90 pmól/l jelölt dUTP] adtunk a mintákhoz. A mintákat fedőlemezzel fedtük, a fedőlemezt körömlakkal rögzítettük, ásványi olajjal felülrétegeztük, és 70 °C-on, 30 perc -3 óra hosszat inkubáltuk. A mintákat 2 percig, 70 °C-ra előmelegített mosópufferben (4x SSC; 0,05 % Tween-20) háromszor mostuk. Ezt követően, a mintákat pozitív jelre nézve megvizsgáltuk.
C. In situ RT-PCR
A hTR RT-PCR-eljárással történő kimutatása szerint, a célzott RNS alapján reverz transzkriptáz reakcióval (vírus eredetű reverz transzkriptáz alkalmazásával, vagy a hőstabil DNS polimerázok belső RT-aktivitásának kihasználá• ·
- 140 sával) cDNS-t szintetizáltunk, majd a célzott cDNS alkalmazásával in situ PCR-amplifikációt végeztünk. A hTR-nek megfelelő cDNS szintézisére különböző RT-reakciókat végezhetünk, például a 11.B példában ismertetett eljárást. Ezen felül, az RT-PCR kivitelezésénél alkalmazhatók a PRINS kimutatási eljárásnál ismertetettekkel azonos pufferek és láncinditó oligonukleotidok, azzal az eltéréssel, hogy ahelyett, hogy az utolsó inkubálást 30 perc - 3 óra hosszat, 70 °C-on végezzük, a mintát termociklusos készülékben, 3040 ciklus során, az alábbi paraméterek alkalmazásával amplif ikál juk: 94 °C / 40 másodperc; 55 °C / 90 másodperc (lásd, 11.B). A PCR-eljárást követően, a mintát 2 percig, 70 °C-ra előmelegített mosópufferben (4x SSC; 0,05 % Tween20) háromszor mossuk. Végül, a mintákat pozitív jelre nézve megvizsgáljuk.
További lehetőség szerint, a kiindulásul szolgáló RTreakcióban keletkezett cDNS-t GeneAmp in situ PCR-system 1000 és GeneAmp in situ PCR core reagenskészletek (Perkin Elmer) alkalmazásával amplifikáljuk.
Egy lépésből álló RT-PCR-t végezhetünk fixált és permeábilissá tett mintákon, GeneAmp EZ-rTth RNS PCReljárás, valamint GeneAmp in situ PCR system 1000 (Perkin Elmer) kombinációjának alkalmazásával. A fenti eljárás szerint, 40-50 μΐ EZ-RNS-PCR-puffér elegyet [ 50 mmól/1 Bicine; 115 mmól/1 kálium-acetát; 8 vegyes-% glicerin (pH=8,2); 300 pmól/l dA-, dG-, dCTP; 165 pmól/l dTTP; 135 pmól/l jelölt dUTP; 5-10 egység rTth DNS polimeráz; 2,5 mmól/1 Mn(OAc)2; 0,45-1 pmól/l htRNS-specifikus láncindító
- 141 oligonukleotid, például R7 és U3b] mikroszkóp-tárgylemezen fixált és permeábilissá tett mintára cseppentünk; majd a gyártó utasításai szerint (GeneAmp in situ PCR system 1000; Perkin Elmer), azt szilikontömítéssel és kapoccsal szigeteljük. Ezt követően, a mintát GeneAmp ín situ PCRkészülékbe helyezzük, és 120 másodpercen át, 94 °C-on hevítjük, majd 30-40 ciklus során, az alábbi paraméterek alkalmazásával amplifikáljuk: : 94 °C / 45 másodperc; 60 °C / 45 másodperc. Az amplifikációt követően, a mintát mossuk, és a fent ismertettek szerint, a jelet láthatóvá tesszük.
A háttérnek megfelelő jel csökkentése érdekében, amely a PCR-amplifikáció során a fluoreszcens toldalékok közvetlen beépüléséből eredhet, alkalmazhatunk indirekt kimutatást is, amely szerint, jelöletlen (toldalékkal nem rendelkező) dNTP-k alkalmazásával végzünk PCR-amplifikációt, majd az amplifikált termékre specifikus, jelölt hibridizációs próba felhasználásával in situ hibridizációt végzünk. Az előbbi eljárásban, a jelet bármely fent ismertetett RT-PCReljárással amplifikálhatjuk, jelölt dNTP-k és láncindító oligonukleotidok alkalmazása nélkül, majd az amplifikált terméket in situ hibridizációval kimutatjuk.
D. Termék-extenziós (megnövekedett mérettel rendelkező termékek keletkezését eredményező) láncindító oligonukleotid alkalmazása in situ PCR-eljárásban
Az in situ PCR-eljárás sikere attól függ, mennyiben tudjuk megakadályozni a sejtmátrixban keletkezett amplifikált termékeknek a sejtből történő kiszivárgását. Általánosságban igaz, hogy 500 bázispárnál kisebb PCR• ·
- 142 termékek nem alkalmasak in situ PCR végzésére. Az 500 bázispárnál kisebb PCR-termékek sejtmátrixból történő kijutásának megakadályozására, a PCR-termékbe nagy méretű dNTP-k (például biotinnal, fluoreszcens toldalékkal, digoxigeninnel jelölt dUTP) beépítése általánosan alkalmazott eljárás. In situ PCR során, a kis méretű termékek kiszivárgásának megakadályozására további lehetőség az in situ PCR-eljárásban termék-extenziós láncindító oligonukleotidok alkalmazása.
A fenti eljárás szerint, az in situ PCR-során, a specifikus célzott nukleinsav amplifikálására olyan láncindító oligonukleotidot alkalmazunk, amely az 5' -végen 3-4, 6 bázisból felépülő, ismétlődő szekvenciát tartalmaz (például [ 5' - TTTCCC -3' ] 3_4) , és amelyet a célzott szekvenciára specifikus szekvencia követ (lásd, 4. ábra, 1. láncindító oligonukleotid) , a megfelelő, reverz irányú láncindító oligonukleotiddal (2. láncindító oligonukleotid) és egy harmadik láncindító oligonukleotiddal kombinálva, amely utóbbi csak az ismétlődő szekvenciát tartalmazza (3. láncindító oligonukleotid; például [ 5' - TTTCCC -3'] 4) . A 3. láncindító oligonukleotid jelenléte a PCR-termék hosszának megnövekedését eredményezi, mivel a 3. láncindító oligonukleotid a célzott PCR-termék 3' -végéhez lépcsőzetesen eltolódva kötődik. A PCR-termékek elongációja kiváltható úgy, hogy a kiindulási PCR-körülményekhez képest alacsonyabb hibridizációs hőmérsékletet alkalmazunk.
Például, amennyiben az 1. láncindító oligonukleotidnak a célzott szekvenciához történő hibridizációjához 60 °C-os
- 143 hőmérséklet alkalmaztunk, a mintát először 15-20 cikluson keresztül, 94 °C/45 másodperc és 60 °C/45 másodperc paraméterek mellett amplifikáljuk, majd 15-20 cikluson keresztül, 94 °C/45 másodperc és 50 °C/45 másodperc paraméterek mellett amplifikáljuk. A második PCR-lépésben alkalmazott alacsonyabb hibridizációs hőmérséklet kedvez a meghosszabbított PCR-termékek keletkezésének, mivel fokozza a 3. láncindító oligonukleotid ismétlődő szekvenciákhoz történő lépcsőzetes kötődésének esélyét. Az így kapott, megnövekedett méretű PCR-termékek kevésbé hajlamosak a sejtmátrixból való kijutásra, ezáltal az in situ PCR-analízis során keletkező jel jobb megtartottságát eredményezik.
14. példa
Nem-humán főemlősből származó telomeráz-RNS-összetevő
Annak szemléltetésére, hogy a humán telomeráz-RNSösszetevő szekvenciája alapján tervezett láncindító oligonukleotidok alkalmazásával további emlóstelomeráz-RNSösszetevő szekvenciák nyerhetők, a humán RNS-összetevő szekvenciájával rendelkező PCR láncindító oligonukleotidokat alkalmaztunk selyemmajómból származó genomi DNS-ből telomeráz-RNS-összetevőt kódoló szekvenciák amplifikációjára, amely faj az evolúció szempontjából az egyik, embertől leginkább eltérő nem-humán főemlős faj.
Selyemmajomból származó genomi DNS-t amplifikáltunk a leírtak szerint, az F3b-jelű láncindító oligonukleotid (5' TCTAACCCTAACTGAGAAGGGCGTAG -3' ) és a H3 + 30 -jelű láncindító oligonukleotid (5'- CTCAAGGTCATCGCCAAGGT -3') alkalmazásé- 144 val. Egyetlen DNS-csík volt megfigyelhető, ezt a pBluecsriptII-SK- (Stratagene, San Diego, CA) vektorba szubklónoztuk. A kapott kiónokat a reverz irányú univerzális láncindító oligonukleotid (5' - AACAGCTATGACCATG -3' ), a 210-3' -jelű láncindító oligonukleotid (5' - TCACGTCTCCTGCCAATTTGC -3' ) vagy a H3+20-jelű láncindító oligonukleotid alkalmazásával, PCR-eljárással részlegesen szekvenáltuk. A selyemmajom telomeráz-RNS-összetevő részleges szekvenciameghatározása során a következő szekvenciákat kaptuk:
5' - GGCGCGCTTCCCTGAGCTGTGGACGTGCACCAGGACTCGGCTACACATGCAGTTCGCTTTCCTGCTGGTGGGGGGACGCCCGATCGTGGCCATCCGTCACCCCTCGCCGGCAGTGGGGGCTTGTGAATCCCTAAATCTGACTGA -3' , es 5, _ TTTTGAGAGATCATTAAGTATTTAATGAATATTT-AGCTAGAAGATCTAAACGAAAATTCAAGTTGTGTTCCTTTAGTGGTCATCGGTTTATGCCGAAGGTTACAAATTTCTTCTTTGAAAAATTAGACCATTGGCGATGATCCTTGA-3' .
Az előbbi szekvenciát a humán telomeráz-RNS-összetevő gén szekvenciájával egyeztetve, a humán telomeráz-RNSÖsszetevő gén számozásának felhasználásával, a következő komplementer szekvenciákat találtuk (a kötőjelek az optimális egyeztetés érdekében beiktatott hézagokat képviselnek):
1900 humán majom humán majom
CGCGCGGCGCGATTCCCTGAGCTATGGGACGTGCACCCAGGA CTCGGCTC
GGCGCGCTTCCCTGAGCTGT-GGACGTGCACC-AGGA CTCGGCTC
ACACATGCAGTTCGCTTTCCTGTTGGTGGGGGGAACGCCGATCGTGCGCA
ACACATGCAGTTCGCTTTCCTGCTGGT -GGGGGAACGCCGGTCGTGGCCA
1950
2000
- 145 humán: TCCGTCACCCCTCGCCGGCAGTGGGGGCTTGTGAACCCCCAAACCTGACT majom: TCCGTCACCCCTCGCCGGCAGTGGGGGCTTGTGAATCCCTAAAT CTGACT
2050 humán: GACTGGGCCAGTGTGCTGCAAATTGGCAGGAGACGTGAAGGCACCTCCAA majom: GA;
és
2300 humán: TTTTTTGAGAGATCATTTAACATTTAATGAATATTTAATTAGAAGATCTA majom: TTTTGAGAGATCATTAAGTATTTAATGAATATTTAGCTAGAAGATCTA
2350 humán: AATGAACATTGGAAATTGTGTTCCTTTAATGGTCATCGGTTTATGCCAGA majom: AACGAAAATT-CAAGTTGTGTTCCTTTAGTGGTCATCGGTTTATGCCGAA
2400 humán: GGTTAGAAGTTTCTTTTTTGAAAAATTAGACC-TTGGCGATGA-CCTTGAGC majom: GGTTACAAATTTCTTCTTTGAAAAATTAGACCATTGGCGATGAT CCTTGA.
A fenti példák a találmány különböző vonatkozásait, valamint egyes, találmány szerinti nukleinsavak előállítását ismertetik. A példákban nem kívánjuk az igényünkben megfogalmazott számos megoldás részletes leírását adni.

Claims (11)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK ···· «· • ·
    - 146 1. Emlőstelomeráz RNS-összetevője, lényegében tiszta formában.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti emlőstelomeráz-RNSösszetevő, melynek szekvenciája a következő:
    GGGUUGCGGAGGGAGGGUGGGCCUGGGAGGGGUGGUGGCCAUUUUUUGUC UAACCCUAACUGAGAAGGGCGUAGGCGCCGUGCUUUUGCUCCCCGCGCGC UGUUUUUCUCGCUGACUUUCAGCGGGCGGAAAAGCCUCGGCCUGCCGCCU UCCACCGUUCAUUCUAGAGCAAACAAAAAAUGUCAGCUGCUGGCCCGUUC GCCCCUCCCGGGACCUGCGGCGGGUCGCUGCCCAGCCCCCGAACCCCGCC UGGAGGCCGCGGUCGGCCGGGGCUUCUCCGGAGGCACCCACUGCCACCGC GAAGAGUUGGGCUCUGUCAGCCGCGGGUCUCUCGGGGGCGAGGGCGAGGU UCACCGUUUCAGGCCGCAGGAAGAGGAACGGAGCGAGUCCCGCGCGCGGC GCGAUUCCCUGAGCUAUGGGACGUGCACCCAGGACUCGGCUCACACAUGC AGUUCGCUUUCCUGUUGGUGGGGGGAACGCCGAUCGUGCGCAUCCGUCAC CCCUCGCCGGCAGUGGGGGCUUGUGAACCCCCAAACCUGACUGACUGGGC CAGUGUGCU.
  3. 3. Oligonukleotid lényegében tiszta formában, amely a 2. igénypont szerinti RNS-összetevő 10-500. nukleotidjai által alkotott folyamatos szekvenciával azonos, vagy azzal pontosan komplementer szekvenciát tartalmaz.
  4. 4. Az 3. igénypont szerinti oligonukleotid, amely humán telomeráz-RNS-összetevőhöz kötődve, gátolja vagy blokkolja a telomeráz aktivitását.
  5. 5. Rekombináns expressziós plazmid, amely 3. igénypont szerinti oligonukleotidot, továbbá egy promótert tartalmaz olyan elhelyezésben, hogy képes vezérelni az oligonukleotiddal komplementer vagy azzal megegyező szekvenciával rendelkező RNS transzkripcióját.
    ·»*· ··
    - 147
  6. 6. Az 5. igénypont szerinti rekombináns expressziós plazmid, azzal jellemezve, hogy az említett gén a következő nukleotid-szekvenciával rendelkezik:
    5’-GATCAGTTAGAAAGTTACTAGTCCACATATAAAGTGCCAAGTCTTGT ACTCAAGATTATAAGCAATAGGAATTTAAAAAAAGAAATTATGAAAACTG ACAAGATTTAGTGCCTACTTAGATATGAAGGGGAAAGAAGGGTTTGAGAT AATGTGGGATGCTAAGAGAATGGTGGTAGTGTTGACATATAACTCAAAGC ATTTAGCATCTACTCTATGTAAGGTACTGTGCTAAGTGCAATAGTGCTAA AAACAGGAGTCAGATTCTGTCCGTAAAAAACTTTACAACCTGGCAGATGC TATGAAAGAAAAAGGGGATGGGAGAGAGAGAAGGAGGGAGAGAGATGGAG AGGGAGATATTTTACTTTTCTTTCAGATCGAGGACCGACAGCGACAACTC
    CACGGAGTTTATCTAACTGAATACGAGTAAAACTTTTAÁGATCATCCTGT
    CATTTATATGTAAAACTGCACTATACTGGCCATTATAAAAATTCGCGGCC
    GGGTGCGGTGGCTCATACCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAAGCG
    GGTGGATCACTTGAGCCCTGGCGTTCGAGACCAGCCTGGGCAACATGGTG
    AAACCCCCGTCTCTACTAAAAACACAAAAACTAGCTGGGCGTGGTGGCAG
    GCGCCTGTAATCCCAGCTACTCAGGAGGCTGAGACACGAGAATCGCTTGA
    ACCCGGGAGCAGAGGTTGCAGTGAGCCGAGATCACGCCACTAGACTCCAT
    CCAGCCTGGGCGAAAGAGCAAGACTCCGTCTCAAAAAAAAAAATCGTTAC
    AATTTATGGTGGATTACTCCCCTCTTTTTACCTCATCAAGACACAGCACT
    ACTTTAAAGCAAAGTCAATGATTGAAACGCCTTTCTTTCCTAATAAAAGG
    GAGATTCAGTCCTTAAGATTAATAATGTAGTAGTTACACTTGATTAAAGC
    CATCGTCTGCTCAAGGAGAGGCTGGAGAAGGCATTCTAAGGAGAAGGGGG
    CAGGGTAGGAACTCGGACGCATCCCACTGAGCCGAGACAAGATTCTGCTG
    TAGTCAGTGCTGCCTGGGAATCTATTTTCACAAAGTTCTCCAAAAAATGT
    GATGATCAAAACTAGGAATTAGTGTTCTGTGTCTTAGGCCCTAAAATCTT
    CCTGTGAATTCCATTTTTAAGGTAGTCGAGGTGAACCGCGTCTGGTCTGC
    AGAGGATAGAAAAAAGGCCCTCTGATACCTCAAGTTAGTTTCACCTTTAA
    AGAAGGTCGGAAGTAAAGACGCAAAGCCTTTCCCGGACGTGCGGAAGGGC
    AACGTCCTTCCTCATGGCCGGAAATGGAACTTTAATTTCCGGTTCCCCCC
    AACCAGCCCGCCCGAGAGAGTGACTCTCACGAGAGCCGCGAGAGTCAGCT
    TGGCCAATCCGTGCGGTCGGCGGCCGCTCCCTTTATAAGCCGACTCGCCC
    GGCAGCGCACCGGGTTGCGGAGGGAGGGTGGGCCTGGGAGGGGTGGTGGC CATTTTTTGTCTAACCCTAACTGAGAAGGGCGTAGGCGCCGTGCTTTTGC TCCCCGCGCGCTGTTTTTCTCGCTGACTTTCAGCGGGCGGAAAAGCCTCG GCCTGCCGCCTTCCACCGTTCATTCTAGAGCAAACAAAAAATGTCAGCTG CTGGCCCGTTCGCCCCTCCCGGGACCTGCGGCGGGTCGCTGCCCAGCCCC CGAACCCCGCCTCGAGGCCCCGGTCGGCCGGGGCTTCTCCGGAGGCACCC ACTGCCACCGCGAAGAGTTGGGCTCTGTCAGCCGCGGGTCTCTCGGGGGC GAGGGCGAGGTTCACCGTTTCAGGCCGCAGGAAGAGGAACGGAGCGAGTC CCGCGCGCGGCGCGATTCCCTGAGCTATGGGACGTGCACCCAGGACTCGG CTCACACATGCAGTTCGCTTTCCTGTTGGTGGGGGGAACGCCGATCGTGC GCATCCGTCACCCCTCGCCGGCAGTGGGGGCTTGTGAACCCCCAAACCTG ACTGACTGGGCCAGTGTCCTCCAAATTGGCAGGAGACGTGAAGGCACCTC CAAAGTCGGCCAAAATGAATGGGCAGTGAGCCGGGGTTGCCTGGAGCCGT TCCTGCGTGGGTTCTCCCGTCTTCCGCTTTTTGTTGCCTTTTATGGTTGT ATTACAACTTAGTTCCTGCTCTGCAGATTTTGTTGAGGTTTTTGCTTCTC CCAAGGTAGATCTCGACCAGTCCCTCAACGGGGTGTGGGGAGAACAGTCA TTTTTTTTTGAGAGATCATTTAACATTTAATGAATATTTAATTAGAAGAT CTAAATGAACATTGGAAATTGTGTTCCTTTAATGGTCATCGGTTTATGCC AGAGGTTAGAAGTTTCTTTTTTGAAAAATTAGACCTTGGCGATGACCTTG AGCAGTAGGATATAACCCCCACAAGCTT-3’.
    - 148
  7. 7. Eukarióta gazdasejt, amely olyan 4. igénypont szerinti expressziós plazmiddal van transzformálva, amely emlőstelomeráz protein-össztevőivel - telomerekhez nukleotid-szekvenciákból álló ismétlődő egységek hozzáadását eredményező telomeráz-aktivitást kiváltó módon - összekapcsolódni képes RNS-molekulát kódol.
  8. 8. Eljárás rekombináns telomeráz enzim előállítására, azzal jellemezve, hogy telomeráz protein-összetevőit expresszáló eukarióta gazdasejtet transzformálunk egy, a 7. igénypont szerinti RNS-összetevőt kódoló rekombináns expressziós vektorral; a vektorral transzformált gazdasejteket olyan körülmények között tenyésztjük, amelyek lehetővé teszik a protein-összetevők és az RNS-összetevő expresszálódását és összekapcsolódását, és ily módon kromoszómális DNS telomerjeihez szekvenciák hozzáadására képes aktív telomeráz molekula képződését.
  9. 9. Eljárás feltételezett telomeráz-módosító hatóanyagok azonosítására, azzal jellemezve, hogy az alábbi lépéseket magába foglaló, heterodimerizációt vagy telomeráz-aktivitást vizsgáló eljárást hajtunk végre:
    (i) a humán telomeráz-RNS-összetevő szekvenciájával lényegében megegyező szekvenciával rendelkező, és humán telomeráz proteinhez kötődni képes polinukleotidot tartalmazó polinukleotidot, lényegében tisztított humán telomeráz proteint; és egy vizsgálandó hatóanyagot érintkeztetünk;
    (ii) meghatározzuk, hogy a hatóanyag gátolja-e a humán telomeráz-RNS-összetevő és humán telomeráz-protein heterodimerizációját, vagy a telomeráz-aktivitást; és ··*·
    - 149 (iii) a heterodimerizációt vagy a telomeráz-aktivitást gátoló hatóanyagokat feltételezett telomerázaktivitás-gátló telomeráz-modulátor hatóanyagoknak tekintjük.
  10. 10. Eljárás telomeráz-aktivitás gátlására humán sejtekben, azzal jellemezve, hogy a sejtekbe olyan transzkripciós egységet tartalmazó exogén polinukleotidot juttatunk, amely legalább 25 egymást követő nukleotidból álló polinukleotidszekvenciát tartalmaz, amely lényegében megegyezik vagy lényegében komplementer a humán telomeráz-RNS-összetevő szekvenciájával, és az előbbi szekvencia funkcionálisan össze van kapcsolva egy heterológ transzkripciós szabályozó egységgel, amely az említett sejtekben képes vezérelni az ahhoz funkcionálisan kapcsolt polinukleotidok transzkripcióját.
  11. 11. Eljárás egy beteg neopláziás állapotának kimutatására, azzal jellemezve, hogy:
    (i) a betegből sejtmintát izolálunk;
    (ii) a sejtmintában meghatározzuk a humán telomerázRNS-összetevő mennyiségét, és ezt diagnosztikus értéknek tekintjük;
    (iii) a diagnosztikus értéket a humán telomeráz-RNSösszetevő expressziójának, a sejtmintával megegyező típusú, nem-neopláziás sejtekben meghatározott standard értékével összehasonlítjuk; és (iv) a standard értéknél elegendően nagyobb diagnosztikus értéket neopláziás állapot diagnosztikus jelének tekintjük, ami patológiás állapotra utal.
    f
    - 150 U-3Ή1 Eljárás emlőstelomeráz-RNS-összetevő jelenlétének kimutatására sejtekben vagy sejtmintában, azzal jellemezve, hogy telomeráz-RNS-összetevő-polinukleotid vagy telomerázRNS-összetevő láncindító oligonukleotid, vagy telomerázRNS-összetevő-polinukleotid vagy telomeráz-RNS-összetevő láncindító oligonukleotid szekvenciájával komplementer szekvencia alkalmazásával amplifikálást vagy hibridizálást hajtunk végre.
HU9700035A 1994-07-07 1995-07-06 Emlőseredetű telomeráz RNS-összetevője HUT78054A (hu)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US27210294A 1994-07-07 1994-07-07
US08/330,123 US5583016A (en) 1994-07-07 1994-10-27 Mammalian telomerase
US08/472,802 US5958680A (en) 1994-07-07 1995-06-07 Mammalian telomerase
US08/482,115 US5776679A (en) 1994-07-07 1995-06-07 Assays for the DNA component of human telomerase

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HUT78054A true HUT78054A (hu) 1999-07-28

Family

ID=27501040

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9700035A HUT78054A (hu) 1994-07-07 1995-07-06 Emlőseredetű telomeráz RNS-összetevője

Country Status (23)

Country Link
EP (2) EP1293565A3 (hu)
JP (2) JPH10505488A (hu)
KR (1) KR100789741B1 (hu)
CN (1) CN1231491C (hu)
AT (1) ATE308554T1 (hu)
AU (1) AU696702B2 (hu)
BG (1) BG63573B1 (hu)
BR (1) BR9508254A (hu)
CA (1) CA2194393C (hu)
CZ (1) CZ3497A3 (hu)
DE (1) DE69534568T2 (hu)
DK (1) DK0778842T3 (hu)
ES (1) ES2251720T3 (hu)
FI (1) FI970026A (hu)
HK (1) HK1011691A1 (hu)
HU (1) HUT78054A (hu)
IS (1) IS4408A (hu)
NO (1) NO970041L (hu)
NZ (1) NZ289720A (hu)
PL (1) PL181019B1 (hu)
RO (1) RO117328B1 (hu)
UA (1) UA47407C2 (hu)
WO (1) WO1996001835A1 (hu)

Families Citing this family (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7067497B2 (en) 1992-09-29 2006-06-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of telomere length by oligonucleotides having a G-core sequence
US5958680A (en) 1994-07-07 1999-09-28 Geron Corporation Mammalian telomerase
US5972605A (en) * 1994-07-07 1999-10-26 Geron Corporation Assays for regulators of mammalian telomerase expression
US5968506A (en) * 1995-08-04 1999-10-19 Geron Corporation Purified telomerase
US6517834B1 (en) 1995-08-04 2003-02-11 Geron Corporation Purified telomerase
US6545133B1 (en) 1995-08-04 2003-04-08 Geron Corporation Methods for purifying telomerase
US5858777A (en) 1995-09-08 1999-01-12 Geron Corporation Methods and reagents for regulating telomere length and telomerase activity
DE19681033D2 (de) 1995-11-16 1999-03-18 Michael W Dahm Verfahren zur Quantifizierung von Tumorzellen in einer Körperflüssigkeit und dazu geeignete Testkits
AU2593697A (en) * 1996-03-28 1997-10-17 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Transgenic organisms with altered telomerase activity
US6015710A (en) * 1996-04-09 2000-01-18 The University Of Texas System Modulation of mammalian telomerase by peptide nucleic acids
JPH1052300A (ja) * 1996-06-03 1998-02-24 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 細胞内テロメラーゼ活性の測定法
JPH1028600A (ja) * 1996-07-17 1998-02-03 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd テロメラーゼ活性の測定法
US6475789B1 (en) 1996-10-01 2002-11-05 University Technology Corporation Human telomerase catalytic subunit: diagnostic and therapeutic methods
US6808880B2 (en) 1996-10-01 2004-10-26 Geron Corporation Method for detecting polynucleotides encoding telomerase
US6610839B1 (en) 1997-08-14 2003-08-26 Geron Corporation Promoter for telomerase reverse transcriptase
US6261836B1 (en) 1996-10-01 2001-07-17 Geron Corporation Telomerase
US7585622B1 (en) 1996-10-01 2009-09-08 Geron Corporation Increasing the proliferative capacity of cells using telomerase reverse transcriptase
EP1783139B8 (en) * 1996-10-01 2009-09-23 Geron Corporation Human telomerase catalytic subunit
US6093809A (en) 1996-10-01 2000-07-25 University Technology Corporation Telomerase
US7390891B1 (en) * 1996-11-15 2008-06-24 Amgen Inc. Polynucleotides encoding a telomerase component TP2
US5919656A (en) * 1996-11-15 1999-07-06 Amgen Canada Inc. Genes encoding telomerase protein 1
US5846723A (en) * 1996-12-20 1998-12-08 Geron Corporation Methods for detecting the RNA component of telomerase
CA2274586A1 (en) 1996-12-20 1998-07-02 Geron Corporation Methods for detecting and inhibiting the rna component of telomerase
WO1998037181A2 (en) * 1997-02-20 1998-08-27 Whitehead Institute For Biomedical Research Telomerase catalytic subunit gene and encoded protein
EP0981627B1 (en) * 1997-04-04 2003-09-17 Geron Corporation Purified telomerase
US7413864B2 (en) 1997-04-18 2008-08-19 Geron Corporation Treating cancer using a telomerase vaccine
US7622549B2 (en) 1997-04-18 2009-11-24 Geron Corporation Human telomerase reverse transcriptase polypeptides
AU745420B2 (en) * 1997-06-20 2002-03-21 Bayer Aktiengesellschaft Human catalytic telomerase sub-unit and its diagnostic and therapeutic use
EP1571215A3 (en) * 1997-07-01 2007-10-31 Cambia Biosystems LLC Vertebrate telomerase genes and proteins and uses thereof
KR100581990B1 (ko) 1997-07-01 2006-05-23 캄비아 바이오시스템즈 엘엘씨 척추 동물 텔로머라제 유전자 및 단백질과 이의 용도
US7378244B2 (en) 1997-10-01 2008-05-27 Geron Corporation Telomerase promoters sequences for screening telomerase modulators
DE19757300A1 (de) * 1997-12-22 1999-06-24 Roche Diagnostics Gmbh Nachweis von Harnblasenkarzinom in einer Urinprobe
GB9801902D0 (en) * 1998-01-29 1998-03-25 Cancer Res Campaign Tech A gene promoter
DE19804372A1 (de) 1998-02-04 1999-08-05 Michael W Dr Dr Dahm Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Tumorzellen in einer Körperflüssigkeit und dazu geeignete Testkits
US7402307B2 (en) * 1998-03-31 2008-07-22 Geron Corporation Method for identifying and killing cancer cells
US6358739B1 (en) * 1999-04-12 2002-03-19 Modex Therapeutiques, S.A. Transiently immortalized cells
AU5466500A (en) * 1999-06-04 2000-12-28 Jessie L.S. Au Methods and compositions for modulating drug activity through telomere damage
US6995145B1 (en) 1999-06-04 2006-02-07 Au Jessie L-S Methods and compositions for modulating drug activity through telomere damage
JP4267233B2 (ja) 1999-09-10 2009-05-27 ジェロン・コーポレーション オリゴヌクレオチドｎ３’→ｐ５’チオホスホルアミデート：それらの合成および使用
AU1309101A (en) * 1999-11-16 2001-05-30 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Method of searching for substance inhibiting binding between telomerase subunits
PL2548880T3 (pl) * 2003-06-23 2019-07-31 Telomerase Activation Sciences, Inc. Kompozycje powodujące wzrost aktywności telomerazy
ES2662196T3 (es) 2003-09-09 2018-04-05 Geron Corporation Oligonucleótidos modificados para la inhibición de la telomerasa
JP4635196B2 (ja) * 2005-03-04 2011-02-16 国立大学法人広島大学 遺伝子導入細胞、及びそれを用いたテロメラーゼ誘導物質の検出方法
WO2008094640A2 (en) 2007-01-30 2008-08-07 Geron Corporation Compounds having anti-adhesive effects on cancer cells
SG175282A1 (en) 2009-04-21 2011-11-28 Genetic Technologies Ltd Methods for obtaining fetal genetic material
WO2012165653A1 (ja) * 2011-05-30 2012-12-06 国立大学法人豊橋技術科学大学 改良されたオリゴヌクレオチドおよびそのオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物
US20150125438A1 (en) * 2012-07-20 2015-05-07 Sang Jae Kim Anti-Inflammatory Peptides and Composition Comprising the Same
US9200327B2 (en) 2012-11-30 2015-12-01 Geron Corporation Diagnostic markers for treating cell proliferative disorders with telomerase inhibitors
WO2015036434A1 (en) * 2013-09-13 2015-03-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Application of oligo-dt molecules to avoid generation of high molecular pcr products induced by polya-carrier
JOP20200257A1 (ar) 2014-05-01 2017-06-16 Geron Corp تركيبات أوليجو نوكليوتيد وطرق لتحضيرها
KR101628890B1 (ko) * 2015-09-03 2016-06-09 주식회사 학표벽지 엠보싱 벽지 제조 장치

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4312686A (en) * 1980-02-11 1982-01-26 American Biltrite Inc. Printed and embossed floor covering and method and apparatus for its manufacture
JPH02179729A (ja) * 1988-12-30 1990-07-12 Shinetsu Kogyo Kk ゲートル巻きするラッピングフィルムの製造法
US5489508A (en) * 1992-05-13 1996-02-06 University Of Texas System Board Of Regents Therapy and diagnosis of conditions related to telomere length and/or telomerase activity
WO1995013382A1 (en) * 1993-11-12 1995-05-18 Geron Corporation Therapy and diagnosis of conditions related to telomere length and/or telomerase activity
EP0666313A3 (en) * 1994-01-27 1996-03-06 Univ Iowa State Res Found Inc Targeting telomerase in gene therapy for cancer.
US5876979A (en) * 1994-07-07 1999-03-02 Cold Spring Harbor Laboratory RNA component of mouse, rat, Chinese hamster and bovine telomerase
JPH08294966A (ja) * 1995-04-26 1996-11-12 Nippon Shokubai Co Ltd 樹脂成形品の連続成形方法
JPH10119130A (ja) 1996-10-22 1998-05-12 Japan Steel Works Ltd:The 連続発泡体の製造方法及び装置
KR100815605B1 (ko) * 2002-02-18 2008-03-20 바프렉스 주식회사 공압출 다층필름의 제조방법 및 장치

Also Published As

Publication number Publication date
CZ3497A3 (en) 1997-10-15
ES2251720T3 (es) 2006-05-01
KR20050058527A (ko) 2005-06-17
NO970041L (no) 1997-03-06
DK0778842T3 (da) 2006-03-20
BG101103A (en) 1997-10-31
FI970026A (fi) 1997-03-03
KR100789741B1 (ko) 2008-01-02
UA47407C2 (uk) 2002-07-15
NZ289720A (en) 1999-03-29
CN1231491C (zh) 2005-12-14
BR9508254A (pt) 1997-12-23
JPH10505488A (ja) 1998-06-02
EP0778842A4 (en) 1999-08-11
JP4068861B2 (ja) 2008-03-26
EP1293565A3 (en) 2004-05-12
IS4408A (is) 1997-01-03
AU696702B2 (en) 1998-09-17
EP0778842A1 (en) 1997-06-18
JP2002272489A (ja) 2002-09-24
FI970026A0 (fi) 1997-01-03
PL181019B1 (pl) 2001-05-31
PL318169A1 (en) 1997-05-26
DE69534568T2 (de) 2006-07-27
EP1293565A2 (en) 2003-03-19
EP0778842B1 (en) 2005-11-02
CN1158617A (zh) 1997-09-03
WO1996001835A1 (en) 1996-01-25
DE69534568D1 (de) 2005-12-08
NO970041D0 (no) 1997-01-06
CA2194393A1 (en) 1996-01-25
ATE308554T1 (de) 2005-11-15
BG63573B1 (bg) 2002-05-31
RO117328B1 (ro) 2002-01-30
CA2194393C (en) 2002-06-25
HK1011691A1 (en) 1999-07-16
AU2964795A (en) 1996-02-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HUT78054A (hu) Emlőseredetű telomeráz RNS-összetevője
US7732402B2 (en) Mammalian telomerase
US5583016A (en) Mammalian telomerase
US5876979A (en) RNA component of mouse, rat, Chinese hamster and bovine telomerase
US5972605A (en) Assays for regulators of mammalian telomerase expression
US5958769A (en) Compositions and methods for mediating cell cycle progression
US20110088106A1 (en) Compositions and methods for mediating cell cycle progression
US5776679A (en) Assays for the DNA component of human telomerase
US6399298B1 (en) Ku70—related methods
US20020114797A1 (en) Composition and methods for modulating the length of telomeres
AU714540B2 (en) Mammalian telomerase
EP1090146A1 (en) Uses of dna-pk
US6013468A (en) RNA component of telomerase
KR100566766B1 (ko) 포유류텔로머라제

Legal Events

Date Code Title Description
DFC4 Cancellation of temporary protection due to refusal