ES2251720T3

ES2251720T3 - Telomerasa de mamifero.

Info

Publication number: ES2251720T3
Application number: ES95925552T
Authority: ES
Inventors: Bryant Villeponteau; Junli Feng; Walter Funk; William H. Andrews
Original assignee: Geron Corp
Current assignee: Geron Corp
Priority date: 1994-07-07
Filing date: 1995-07-06
Publication date: 2006-05-01
Anticipated expiration: 2015-07-06
Also published as: KR100789741B1; PL318169A1; KR20050058527A; IS4408A; NZ289720A; NO970041D0; AU2964795A; DE69534568D1; CA2194393A1; AU696702B2; UA47407C2; FI970026A; CN1231491C; CZ3497A3; JP2002272489A; EP0778842A1; HK1011691A1; EP1293565A3; DE69534568T2; JP4068861B2

Abstract

ACIDOS NUCLEICOS QUE COMPRENDEN EL COMPONENTE DE ARN DE UNA TELOMERASA DE MAMIFERO SON UTILES COMO REACTIVOS FARMACEUTICOS, TERAPEUTICOS Y DE DIAGNOSTICO.

Description

Telomerasa de mamífero.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención se refiere a la telomerasa humana, una enzima ribonucleoroteínica implicada en la síntesis del ADN de los telómeros humanos. La invención proporciona métodos y composiciones relacionados con los campos de la biología molecular, química, farmacología y tecnología médica y de diagnóstico.

Descripción de la técnica relacionada

El ADN en los extremos o telómeros de los cromosomas de los eucariotas normalmente consta de secuencias sencillas repetidas una detrás de la otra. La telomerasa es una enzima ribonucleoroteínica que sintetiza una cadena del ADN telomérico que utiliza como plantilla una secuencia contenida en el componente ARN de la enzima. Véase Blackburn, 1992, Annu. Rev. Biochem. 61:113-129.

El componente ARN de la telomerasa humana no ha sido descrito en la bibliografía científica hasta la fecha, aunque la telomerasa humana es conocida porque sintetiza unidades teloméricas repetidas con la secuencia 5'-TRTGGG-3'. Véase Morin, 1989, Cell 59:521-529, y Morin, 1991, Nature 353:454-456. Este conocimiento no ha sido suficiente para permitir el aislamiento y la identificación del resto de la secuencia de nucleótidos del componente ARN de la telomerasa humana. El componente ARN de las enzimas de telomerasa de Saccharomyces cerevisiae, determinada especie de Tetrahymena, así como el de otros ciliados, tales como Euplotes y Glaucoma, ha sido secuenciado y descrito en la bibliografía científica. Véase Singer y Gottschling, 21 oct. 1994, Science 226:404-409; Lingner et al., 1994, Genes & Development 8:1984-1988; Greider y Blackburn, 1989, Nature 337:331-337; Romero y Blackburn, 1991, Cell 67:343-353; y Shippen-Lentz y Blackburn, 1990, Science 247:546-552. Las enzimas de telomerasa de estos ciliados sintetizan unidades teloméricas repetidas distintas de éstas en los seres humanos.

Existe una gran necesidad de más información acerca de la telomerasa humana. A pesar de la naturaleza aparentemente sencilla de las unidades repetidas del ADN telomérico, los científicos hace tiempo que conocen que los telómeros desempeñan una función biológica importante en el mantenimiento y función de la estructura del cromosoma. Más recientemente, los científicos han especulado que la pérdida del ADN telomérico puede actuar como un activador de la senectud y del envejecimiento celular y esta regulación de la telomerasa puede tener importantes implicaciones biológicas. Véase Harley, 1991, Mutation Research 256:271-282.

También se han descrito los métodos para detectar la actividad de la telomerasa, así como para identificar los compuestos que regulan o afectan la actividad de la telomerasa, junto con los métodos para la terapia y el diagnóstico de la senectud y de la inmortalización celulares mediante el control de la longitud del telómero y de la actividad de la telomerasa. Véase la publicación de la patente PCT nº 95/13381, publicada el 18 de mayo de 1995; nº 95/13382, publicada el 18 de mayo de 1995 y nº 93/23572, publicada el 25 de noviembre de 1993.

Mejoras significativas y nuevas oportunidades para las terapias mediadas por la telomerasa y análisis y métodos de cribado de la telomerasa podrían realizarse si el ácido nucleico que comprende el componente ARN y/o que codifica los componentes de la proteína de la telomerasa estuvieran disponibles en forma pura o aislable y se conocieran las secuencias de nucleótidos de dichos ácidos nucleicos. La presente invención reúne estas y otras necesidades y proporciona dichas mejoras y oportunidades.

Sumario de la invención

La invención proporciona un ácido ribonucleico sustancialmente puro como el definido en la reivindicación 1. Formas de realización más específicas de este aspecto de la invención se definen en las reivindicaciones 2 a 4.

La invención también proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un ácido ribonucleico de la invención, así como un plásmido recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un ácido ribonucleico de la invención. Otro aspecto de la invención es una célula huésped transformada con el plásmido.

En otro aspecto la invención proporciona un oligonucleótido como el definido en la reivindicación 8 con más formas de realización específicas de los oligonucleótidos como se define en las reivindicaciones 9 a 14. La invención comprende una formulación farmacéutica que comprende los oligonucleótidos, así como la utilización de los oligonucleótidos como producto farmacéutico. En un aspecto los oligonucleótidos se utilizan para tratar la neoplasia.

La invención comprende además un método de inhibir la actividad de la telomerasa en una célula in vitro como se define en la reivindicación 18.

En otro aspecto la invención proporciona un ácido nucleico aislado, recombinante o sintetizado tal como se define en la reivindicación 19 o más específicamente tal como se define en la reivindicación 20.

La invención también proporciona la utilización de un oligonucleótido de la invención como sonda o cebador tal como se define en la reivindicación 21 o más específicamente tal como se define en la reivindicación 22.

En otro aspecto la invención proporciona un método de determinación de la concentración, cantidad o presencia de componente de ARN de telomerasa en una muestra de mamífero tal como se define en la reivindicación 23.

En la reivindicación 24 se definen más características específicas del método.

La invención proporciona asimismo un método de detección del componente ARN de la telomerasa en una muestra del paciente tal como se define en la reivindicación 25.

La invención proporciona además un método de detección de la presencia de células cancerosas en una muestra tal como se define en la reivindicación 26.

En otro aspecto la invención proporciona un kit para determinar la concentración, cantidad o presencia del componente de ARN de telomerasa humana en una muestra tal como se define en la reivindicación 27.

En un aspecto adicional la invención proporciona un método para aislar la holoenzima telomerasa tal como se define en la reivindicación 28 o como se define además en la reivindicación 29.

La invención proporciona asimismo un método de identificación de un componente ARN de telomerasa tal como se define en la reivindicación 30.

En otro aspecto la invención proporciona un ácido nucleico aislado, recombinante o sintetizado tal como se define en la reivindicación 31 o como se define además en la reivindicación 32. Asimismo se incluye un plásmido recombinante tal como se define en la reivindicación 33 o una célula huésped tal como se define en la reivindicación 34.

Asimismo se proporciona un mamífero transgénico no humano tal como se define en la reivindicación 35.

Por consiguiente la presente invención proporciona el componente ARN, así como el gen para el componente ARN, de la telomerasa humana en forma sustancialmente pura, así como los ácidos nucleicos que comprenden toda o por lo menos una parte útil de la secuencia de nucleótidos del componente ARN de la telomerasa humana. La presente invención también proporciona ácidos nucleicos con el componente ARN de otras especies, ácidos nucleicos que comparten homología sustancial con el componente ARN de la telomerasa humana, que incluye pero no se limita a los componentes ARN de mamíferos, tales como los primates. Otros ácidos nucleicos útiles de la invención comprenden los ácidos nucleicos con secuencias complementarias a las del componente ARN; ácidos nucleicos con secuencias relacionadas pero distintas de las secuencias de nucleótidos del componente ARN y que interactúan con el componente ARN o con el gen para el componente ARN o los componentes proteicos de la telomerasa humana en una forma útil; y los ácidos nucleicos que no comparten homología de secuencia significativa o complementariedad con el componente ARN o con el gen para el componente ARN pero actúan sobre el componente ARN de forma deseada y útil. Tal como se describe con más detalle a continuación, los ácidos nucleicos de la invención incluyen tanto moléculas de ADN y ARN como análogos modificados de ambos y sirven para una variedad de fines útiles.

Un tipo de ácido nucleico útil de la invención es un oligonucleótido con cadena complementaria, un oligonucleótido que forma una hélice triple u otro oligonucleótido o mimético de oligonucleótido (p. ej., APN con cadena complementaria - ácido nucleico peptídico/ácido poliamidonucleico) que puede utilizarse in vivo o in vitro para inhibir la actividad de la telomerasa humana. Dichos oligonucleótidos pueden bloquear la actividad de la telomerasa de numerosas maneras, incluyendo por impedimento de la transcripción del gen de telomerasa (por ejemplo, mediante la formación de la triple hélice) o por enlace al componente ARN de la telomerasa de manera que impida el montaje de la telomerasa ribonucleoroteínica operativa o impida al componente ARN, una vez montado en el complejo de la enzima telomerasa, que sirva de plantilla para la síntesis de ADN telomérico. Típicamente, y dependiendo del modo de actuación, estos oligonucleótidos de la invención comprenden una secuencia específica desde aproximadamente 10 a aproximadamente 25 hasta 200 o más nucleótidos que es idéntica o complementaria a una secuencia específica de nucleótidos en el componente ARN de la telomerasa o el gen para el componente ARN de la telomerasa.

En una forma de realización, la invención proporciona polinucleótidos con cadena complementaria complementarios con las secuencias de polinucleótidos del componente ARN de la telomerasa, típicamente complementarios con las secuencias de polinucleótidos que son sustancialmente idénticas a la secuencia del gen para el componente ARN de la telomerasa natural de mamífero. Dichos polinucleótidos con cadena complementaria se emplean para inhibir la transcripción y/o la estabilidad y/o la operatividad de las especies del componente ARN de la telomerasa y por consiguiente efectúan una reducción en la cantidad de la actividad de la telomerasa respectiva en una célula (por ejemplo, una célula neoplásica de un paciente). Dichos polinucleótidos con cadena complementaria pueden funcionar como agentes mediadores de la telomerasa inhibiendo la formación de la holoenzima telomerasa operativa (catalíticamente activa y de alta fidelidad) para la correcta replicación del telómero y la reparación en una célula. Los polinucleótidos con cadena complementaria pueden combinarse con otras modalidades terapéuticas antineoplásicas, tal como la radiación ionizante o la quimioterapia (p. ej., con un agente alterador del ADN tales como la bleomicina, cisplatino, mostaza nitrogenada, doxirrubicina, análogos de nucleótidos y similares). Los polinucleótidos con cadena complementaria pueden estimular la muerte celular en las células sensibles (p. ej., las células replicadoras que requieren la actividad de telomerasa para la reparación o replicación del ADN). Los polinucleótidos con cadena complementaria pueden ser sustancialmente idénticos a por lo menos los 25 nucleótidos contiguos de la secuencia complementaria de una secuencia de ARN de telomerasa de mamífero dada a conocer en la presente memoria. Los polinucleótidos con cadena complementaria son típicamente ADNss, ARNss, polinucleótidos con eje central de fosfonato de metilo, polinucleótidos con eje central de fosforotiolato y polinucleótidos con eje central mixto, ácidos poliamidonucleicos y las estructuras con cadena complementaria similares conocidas en la técnica. En un aspecto de la invención, se administra un polinucleótido con cadena complementaria para inhibir la transcripción y/o la actividad del componente ARN de la telomerasa y la actividad de telomerasa en una célula, tal como en una célula humana replicable.

En una forma de realización, la invención proporciona un polinucleótido incompatible con la plantilla, teniendo dicho polinucleótido una secuencia sustancialmente idéntica a un componente ARN de mamífero de telomerasa y comprendiendo una secuencia telomérica repetida en la plantilla teniendo por lo menos una base incompatible con respecto a la secuencia 5'-TRTGGG-3' repetida de la telomerasa humana, aunque sino complementaria de la misma. Un polinucleótido incompatible de la plantilla comprende típicamente un solo nucleótido incompatible en la secuencia natural de la plantilla y puede comprender dos nucleótidos incompatibles en la secuencia de la plantilla, ya sea como nucleótidos incompatibles adyacentes o en la que los nucleótidos incompatibles se separan mediante uno o más nucleótidos (complementarios) compatibles. Los polinucleótidos incompatibles de la plantilla de la invención generalmente son capaces de presentar actividad de telomerasa juntamente con el componente polipeptídico de la telomerasa humana y por consiguiente producir incorporación incorrecta en las posiciones del nucleótido seleccionadas (incompatibles) en la secuencia humana repetida de telomerasa consecuente con la replicación repetida, reparación y/o adición en el telómero, generando de este modo telómeros que se basan en la presencia continua del componente ARN de la
telomerasa con cadena transcrita mutado para la replicación sustancial y el mantenimiento de la longitud del telómero.

Otro tipo de ácido nucleico útil de la invención es una ribozima capaz de escindir específicamente el componente ARN de la telomerasa humana, haciendo inactiva la enzima. Asimismo otro tipo de ácido nucleico útil de la invención es una sonda o cebador que se une específicamente al componente ARN de la telomerasa humana y de este modo puede utilizarse, p. ej., para detectar la presencia de telomerasa en una muestra. Por último, los ácidos nucleicos útiles de la invención comprenden plásmidos con expresión recombinante para producir los ácidos nucleicos de la invención. Un tipo especialmente útil de dicho plásmido es un plásmido utilizado para la terapia génica humana. Los plásmidos útiles de la invención para la terapia génica humana incluyen una variedad de tipos, que comprenden no solamente aquellos que codifican los oligonucleótidos con cadena complementaria o las ribozimas sino también los que dirigen la expresión del componente ARN de la telomerasa humana o una versión eliminada o si no alterada (mutada) del componente ARN de la telomerasa humana (u otras especies con secuencias sustancialmente homólogas del componente ARN a las del componente ARN humano) o al gen para la misma.

En una forma de realización, un polinucleótido que tiene una parte complementaria con un componente ARN de telomerasa de mamífero suficiente para hibridarse específicamente en condiciones fisiológicas se deriva por enlace covalente de un sustituyente químico adicional, ya sea durante o después de la síntesis del polinucleótido, formando de este modo un polinucleótido derivado capaz de hibridarse específicamente con dicho componente ARN de la telomerasa. El polinucleótido derivado puede localizar la enzima telomerasa endógena que tiene dicho componente ARN en el que dicho polinucleótido derivado produce una alteración o modificación química del componente ARN y/o del componente
proteico de la telomerasa y de este modo modifica, típicamente por reducción, la actividad enzimática de la telomerasa.

Por consiguiente la invención proporciona polinucleótidos que son adecuados para diagnosticar enfermedades relacionadas con la abundancia y/o la estructura del componente ARN de la telomerasa aberrante. Las sondas de polinucleótidos que comprenden secuencias que son sustancialmente idénticas a una secuencia de nucleótidos del componente ARN de la telomerasa de mamífero o sustancialmente complementarias con la misma pueden utilizarse para el diagnóstico de estados patológicos (p. ej., neoplasia o preneoplasia) mediante la detección de la abundancia del componente ARN de la telomerasa y/o de las alteraciones estructurales del componente ARN de telomerasa (p. ej. truncamiento, variaciones, deleciones o inserciones de la secuencia y similares) y/o de transposiciones o ampliaciones del gen para el componente ARN de telomerasa en células explantadas de un paciente o de la detección de un alelo del componente ARN de telomerasa de mamífero patognómico (p. ej., por análisis RFLP o PCR específica del alelo). La detección con frecuencia será por hibridación in situ utilizando un polinucleótido con cadena complementaria marcado (p. ej., ^{32}P, ^{35}S, ^{14}C, ^{3}H, fluorescente, biotinilado o digoxigeninilado) complementario de un componente ARN de telomerasa de mamífero, aunque puede utilizarse transferencia Northern, transferencia de manchas o hibridación de la solución en ARN voluminoso o poli A^{+} ARN aislado de una muestra de células, ya que la ampliación por PCR o LCR puede utilizar cebadores específicos del componente ARN de telomerasa. Las células que contienen una cantidad alterada (típicamente un aumento significativo) de componente ARN de telomerasa en comparación con las células no neoplásicas del mismo tipo o tipos celulares se identifican como células enfermas experimentales, tal como las células preneoplásicas o francamente neoplásicas y pueden identificarse como células con potencial metastásico. Asimismo la detección de transposiciones patognómicas o la amplificación del locus del gen para el componente ARN de telomerasa o los locus estrechamente ligados en una muestra celular identificarán la presencia de un estado patológico o una predisposición a desarrollar un estado patológico (p. ej., cáncer, enfermedad genética). Las sondas de polinucleótido para el componente ARN de telomerasa se utilizan también para la identificación medicolegal de individuos,
tal como para la prueba de paternidad o identificación de criminales sospechosos o de descendientes desconocidos.

La invención permite el tratamiento de una enfermedad asociada con la actividad de la telomerasa en una célula o grupo de células que contiene la(s) célula(s) con una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente que altera la actividad de la telomerasa en esta célula. Dichos agentes comprenden los ácidos nucleicos que codifican el componente ARN de la telomerasa, oligonucleótidos que forman triple hélice, oligonucleótidos con cadena complementaria, ribozimas y plásmidos y otros vectores de la terapia génica (p. ej., vectores adenovíricos, vectores víricos adenoasociados, etc.) para la terapia génica humana mediante la expresión del componente ARN de la telomerasa, ARN con cadena complementaria para el componente ARN de la telomerasa o el componente ARN incompatible de telomerasa, tal como se describió anteriormente. En un aspecto relacionado, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden estos agentes terapéuticos junto con un excipiente o sal farmacéuticamente aceptable, que puede incluir la formulación en un complejo de lipofección, liposoma o inmunoliposoma para la administración dirigida del agente terapéutico. La invención también proporciona combinaciones de dichos agentes terapéuticos mediados por telomerasa con otros productos farmacéuticos, tales como los agentes antineoplásicos y otros agentes citotóxicos o citostáticos; agentes antimicóticos (p. ej., para el tratamiento de pacientes de SIDA); nucleótidos, nucleósidos y análogos de los mismos; y otros agentes farmacéuticos adecuados para el tratamiento de estados patológicos tales como neoplasia, hiperplasia, infección por VIH/SIDA y patologías asociadas, y otras enfermedades caracterizadas por el metabolismo anormal del telómero. El método puede comprender la utilización de un polinucleótido derivado capaz de hibridarse específicamente a un componente ARN de la telomerasa en una telomerasa de mamífero, en la que el polinucleótido derivado se administra a células de mamífero con actividad de telomerasa e inhibe la actividad de la telomerasa localizando el componente ARN de telomerasa e inactivando o inhibiendo la actividad de telomerasa.

La invención proporciona también agentes terapéuticos que inhiben la neoplasia o apoptosis modulando la función de la telomerasa mediante la inhibición o aumento de la formación del componente ARN de la telomerasa; dichos agentes pueden utilizarse como productos farmacéuticos. Dichos productos farmacéuticos se utilizarán para tratar una variedad de enfermedades humanas y veterinarias, tales como: neoplasia, hiperplasia, enfermedades neurodegenerativas, envejecimiento, SIDA, infección micótica y similares. En una forma de realización, el agente consiste en un vector de terapia génica capaz de transcribir una secuencia del componente ARN de la telomerasa o su complemento, o alternativamente un componente ARN de telomerasa enzimáticamente inactivo que puede inhibir competitivamente la formación de la holoenzima operativa de telomerasa.

La invención proporciona métodos de diagnóstico para determinar la concentración, cantidad o presencia del componente ARN de la telomerasa humana, telomerasa o actividad de telomerasa en una célula, población celular o muestra de tejido o un extracto de cualquiera de los anteriores. En un aspecto relacionado, la presente invención proporciona reactivos útiles para dichos métodos (incluyendo los cebadores y sondas indicados anteriormente) opcionalmente envasados en forma de kit junto con las instrucciones para utilizar el kit destinado a poner en práctica el método de diagnóstico.

La presente invención proporciona un método para el diagnóstico de una enfermedad (p. ej., neoplasia) en un paciente humano, en la que se utiliza un análisis de diagnóstico (p. ej., hibridación in situ del polinucleótido de las células fijadas mediante una sonda del componente ARN de telomerasa marcada que se une específicamente al componente ARN de la telomerasa humana o a las secuencias del gen) para determinar si una concentración patognómica predeterminada del componente ARN de telomerasa está presente en una muestra biológica de un paciente humano; si el análisis indica la presencia del componente ARN de telomerasa fuera del intervalo normal (p. ej., más allá de la concentración patognómica predeterminada), se diagnostica que el paciente presenta un estado patológico o predisposición a la enfermedad.

En una forma de realización, los polinucleótidos de la invención se emplean para el diagnóstico de afecciones patológicas o enfermedades genéticas que incluyen la neoplasia, hiperplasia, envejecimiento celular prematuro o anormal u otras enfermedades médicas relacionadas con la función de la telomerasa, y más específicamente afecciones y enfermedades que implican alteraciones en la estructura o abundancia de un componente ARN de telomerasa o la secuencia génica, o que están unidos a un alelo componente ARN de telomerasa patognómico que puede detectarse por RFLP y/o PCR específica del alelo u otro método de detección adecuado. Típicamente, el método es para el diagnóstico de una enfermedad (p. ej., neoplasia) en un paciente humano, en la que se utiliza un análisis de diagnóstico (p. ej., determinación de una cantidad y/o estructura del componente ARN de la telomerasa) para determinar si una concentración patognómica predeterminada del componente ARN de telomerasa está presente en las células en una muestra biológica de un paciente humano; si el análisis indica la presencia de una cantidad patognómica del componente ARN de telomerasa fuera del intervalo normal (p. ej., más allá de la concentración patognómica predeterminada), se diagnostica que el paciente presenta un estado patológico o predisposición a la enfermedad.

La presente invención proporciona preparaciones de telomerasa recombinante y métodos para producir dichas preparaciones. Por lo tanto, la presente invención proporciona una telomerasa humana recombinante que comprende los componentes proteicos de la telomerasa humana así como los componentes proteicos de la telomerasa de una especie de mamífero con un componente ARN sustancialmente homólogo al componente ARN de la telomerasa humana en asociación con un componente ARN de la invención. Dichas moléculas de componente ARN recombinante de la invención incluyen las que se diferencian de las moléculas del componente ARN natural en una o más sustituciones, deleciones, adiciones terminales y/o inserciones de bases, así como moléculas del componente ARN idénticas a unas moléculas de componente ARN natural que se producen en células huésped recombinantes. El método para producir dichas moléculas de telomerasa recombinantes comprende la transformación de una célula huésped eucariótica que expresa los componentes proteicos de telomerasa con un vector de expresión recombinante que codifica una molécula de componente ARN de la invención y el cultivo de dichas células huésped transformadas con dicho vector en condiciones tales que el componente proteico de telomerasa y el componente ARN de telomerasa se expresen y reúnan para formar una molécula de telomerasa activa capaz de añadir secuencias (no necesariamente la misma secuencia añadida por la telomerasa natural) a las telomerasas del ADN cromosómico.

La invención proporciona métodos para purificar los componentes proteicos de la telomerasa humana así como los componentes proteicos de la telomerasa de una especie de mamífero con un componente ARN sustancialmente homólogo al componente ARN de la telomerasa humana. La presente invención también proporciona métodos para aislar e identificar ácidos nucleicos que codifican dichos componentes proteicos. En los aspectos relacionados, la presente invención proporciona telomerasa humana purificada y telomerasa purificada de especies de mamífero con un componente ARN sustancialmente homólogo al componente ARN de la telomerasa humana, así como ácidos nucleicos purificados que codifican uno o más componentes de dichas preparaciones de telomerasa. La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden como ingrediente activo los componentes proteicos de la telomerasa o un ácido nucleico que codifica o interactúa con un ácido nucleico que codifica un componente proteico de la telomerasa.

La invención proporciona métodos para identificar agentes que modulen (es decir, inhiban, aumenten u otra especificidad) la actividad de la telomerasa de mamífero. Dichos agentes de modulación de la telomerasa son con frecuencia moléculas pequeñas (p. ej., de menos de aproximadamente 3.000 Daltons) y pueden utilizarse para modificar la actividad de la telomerasa in vitro e in vivo, frecuentemente por efecto terapéutico y se utilizan como reactivos de laboratorio y/o productos farmacéuticos.

La invención proporciona métodos de identificación, de un banco o biblioteca de agentes, agentes experimentales que modulan la actividad de la telomerasa mediante la modulación del enlace no covalente de un componente ARN de telomerasa de mamífero con un componente proteico de telomerasa. El componente ARN de telomerasa puede producirse a partir de una plantilla recombinante en una célula huésped o, si se desea, sintetizarse químicamente. Típicamente, un componente proteico de telomerasa de mamífero, tal que pueda ser purificado a partir de células que expresan la telomerasa, y que pueda tener un componente ARN eliminado de telomerasa natural (p. ej., por tratamiento con ARNasa), se pone en contacto con un componente ARN de telomerasa de mamífero en condiciones de fijación acuosa adecuada que permitan el enlace no covalente entre el ARN y los componentes en ausencia de un agente añadido (es decir, en una reacción de fijación de referencia). La magnitud de la interacción no covalente entre el componente ARN de telomerasa y el componente proteico en presencia de uno o más agentes seleccionados de una biblioteca o banco de agentes se compara con la magnitud de la interacción no covalente en una reacción de fijación de referencia que comprende los componentes ARN y proteico de la telomerasa y que carece del agente o los agentes; los agentes que producen un aumento estadísticamente significativo de la magnitud del enlace no covalente entre los componentes ARN y proteico de la telomerasa se determina por consiguiente como un agente modulador de telomerasa experimental. La magnitud relativa del enlace no covalente puede determinarse por cualquier método adecuado, incluyendo la determinación de la afinidad de enlace específica, tal como por análisis de fijación competitiva, determinación de la actividad catalítica de la telomerasa o en una plantilla de repetición del telómero adecuada u otro ensayo adecuado de interacción no covalente operativa entre el ARN y los componentes proteicos de la telomerasa de mamífero, tal como un cambio de gen o EMSA (análisis de cambio de movilidad electroforética).

En un análisis de enlace no covalente para detectar los agentes moduladores de telomerasa experimentales, uno o ambos componentes ARN de telomerasa o el componente proteico se marcan con un marcador detectable adecuado y el enlace no covalente se determina independientemente en presencia y ausencia de un agente seleccionado de entre una biblioteca o banco de agentes. La determinación del enlace no covalente comprende la medición del alcance al que un componente de telomerasa marcado (componente ARN o componente proteico) se une a su componente de telomerasa afín (componente proteico o componente ARN, respectivamente) si dicho componente de telomerasa afín se marca por separado o está sin marcar, tal como mediante captura (p. ej., inmovilización) de complejos unidos que comprenden dicho componente de telomerasa marcado y dicho componente de telomerasa afín y la separación (p. ej., mediante lavado) del componente de telomerasa marcado no unido de dichos complejos unidos generando de este modo una fracción unida separada y detectando los complejos unidos en la fracción unida separada por determinación de la presencia del marcador detectable. Los agentes que producen una reducción o mejora estadísticamente significativa del enlace no covalente del ARN de la telomerasa y de los componentes proteicos se identifican de este modo como agentes moduladores de telomerasa experimentales. Los agentes que reducen el enlace no covalente son inhibidores (o antagonistas) de telomerasa experimentales, mientras que los agentes que potencian el enlace no covalente de los componentes de telomerasa son agonistas de telomerasa experimentales.

Los agentes moduladores de telomerasa experimentales pueden identificarse por su capacidad para producir un aumento o disminución estadísticamente significativo de la actividad enzimática de una telomerasa de mamífero que comprende un componente proteico de telomerasa purificado y un componente de ARN de telomerasa.

Los agentes moduladores de telomerasa experimentales pueden identificarse por su capacidad para producir una reducción o aumento estadísticamente significativo de la transcripción de una secuencia indicadora de polinucleótido (p. ej., gen de \beta-galactosidasa, gen de luciferasa, gen de HPRT) operativamente ligada a una secuencia reguladora de la transcripción de un gen para el componente ARN de la telomerasa de mamífero, preferentemente un gen para el componente ARN de la telomerasa humana, en una célula de mamífero metabólicamente activa. En una variación, un gen para el componente ARN de telomerasa endógeno en una célula de mamífero se dirige con un montaje de direccionamiento homólogo para colocar una secuencia indicadora de polinucleótidos en un enlace operable con la secuencia reguladora de la transcripción corriente arriba (p. ej., del activador) del gen para el componente ARN de la telomerasa endógena en el locus cromosómico del gen endógeno. En una variación alternativa, un polinucleótido exógeno que comprende un polinucleótido indicador se une operativamente a una zona reguladora de la transcripción del gen para el componente ARN de telomerasa de mamífero (p. ej., activador y secuencias de enlace del factor de transcripción corriente arriba); el polinucleótido exógeno se transfiere a una célula de mamífero en la que puede integrarse de manera no homóloga en una posición cromosómica y/o se mantiene o replica como polinucleótido episómico. Los agentes que producen una modulación de la transcripción estadísticamente significativa del polinucleótido indicador en las células tratadas con el agente se identifican por este motivo como agentes moduladores de telomerasa de mamífero experimentales.

Las composiciones para la identificación de agentes moduladores de telomerasa experimentales pueden comprenden típicamente: (1) un componente proteico de telomerasa de mamífero tal como el que puede purificarse en las células de mamífero que expresan telomerasa, preferentemente de células de primate (p. ej., humano), y que es despojado típicamente del componente ARN asociado, si existe, mediante tratamiento con ARNasa u otro tratamiento compatible con la eliminación del componente ARN y la retención de la capacidad de la proteína para reconstituir la actividad de la telomerasa en presencia del componente ARN de telomerasa afín en condiciones de enlace adecuadas, (2) un componente ARN de telomerasa de mamífero, preferentemente un componente ARN humano producido por transcripción de un polinucleótido recombinante en una célula, y (3) condiciones de fijación acuosa (p. ej., condiciones fisiológicas, condiciones de análisis de telomerasa) y opcionalmente (4) un polinucleótido indicador que comprende por lo menos una secuencia repetida de telomerasa de mamífero ampliable, típicamente complementaria con la secuencia de la fracción de la plantilla complementaria repetitiva del telómero de dicho componente ARN, y opcionalmente (5) nucleótidos adecuados para la replicación y/o ampliación de dicha(s) secuencia(s) repetida(s) de telómero del polinucleótido indicador en las condiciones de análisis del telómero; se añade típicamente un agente a dicha composición para la evaluación por enlace no covalente y/o actividad de la telomerasa en comparación con una composición de referencia que carece de dicho agente.

Puede producirse alelos nulos de los genes para el componente ARN de telomerasa de mamífero tal como se produce mediante la destrucción dirigida al gen homólogo de un polinucleótido heterólogo en un gen para el componente ARN de telomerasa de mamífero para inactivar operativamente el gen para el componente ARN de telomerasa. La invención por consiguiente proporciona también animales no humanos transgénicos que comprenden un alelo nulo para el componente ARN de telomerasa, y en una variación proporciona animales homozigóticos no humanos transgénicos para alelos nulos del componente ARN de telomerasa y que carecen sustancialmente de actividad de telomerasa endógena resultante de una falta del componente ARN de telomerasa endógena. Dichos animales modificados genéticamente se utilizan como reactivos comerciales para la identificación de la toxicología, para la venta a laboratorios de investigación farmacéutica para identificar o investigar los agentes moduladores de telomerasa, como animales de compañía y como ganado agrícola entre otras utilizaciones.

La invención permite un método para inmortalizar las células de mamífero, tales como las células de fermentación deseables en un biorreactor o una cepa de células deseables que presenta características ventajosas como reactivo de investigación comercial. El método comprende la introducción en una célula de mamífero de un polinucleótido que expresa un componente de ARN de telomerasa operativa que es capaz de formar la enzima telomerasa operativa en presencia del componente proteico de telomerasa.

Otras características y ventajas de la invención se pondrán de manifiesto a partir de la descripción de los dibujos siguiente, de las formas de realización preferidas de la invención, los ejemplos y las reivindicaciones.

Definiciones

La expresión "polinucleótido del componente ARN de telomerasa" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un polinucleótido de por lo menos 20 nucleótidos en el que el polinucleótido comprende un segmento de por lo menos 20 nucleótidos que: son por lo menos 85 por ciento idénticos a una secuencia del componente ARN de telomerasa de mamífero natural, típicamente un componente ARN de telomerasa de primate tal como un componente de ARN de telomerasa humano o de mono. Algunos polinucleótidos del componente ARN de telomerasa con variaciones en la secuencia en comparación con una secuencia del componente ARN de telomerasa natural o su complemento pueden ser adecuados como sondas de hibridación, cebadores para PCR, amplímeros para LCR, componentes de ARN incompatibles y similares.

La expresión "corresponde a" se utiliza en la presente memoria para significar que una secuencia de polinucleótidos es homóloga (es decir, es idéntica, no relacionada estrictamente de manera evolutiva) con toda o una parte de una secuencia de polinucleótidos de referencia, o que una secuencia de polipéptidos es idéntica a una secuencia de polipéptidos de referencia. De manera diferente, la expresión "complementario a" utilizado en la presente memoria significa que la secuencia complementaria es homóloga con toda o una parte de una secuencia de polinucleótido de referencia. Para ilustración, la secuencia de nucleótidos "RTRTC" corresponde con una secuencia de referencia "RTRTC" y es complementaria con una secuencia de referencia "GRTRT".

Las expresiones siguientes se utilizan para describir las relaciones de las secuencias entre dos o más polinucleótidos: "secuencia de referencia", "intervalo de comparación", "identidad de secuencia", "porcentaje de identidad de secuencia" e "identidad sustancial". Una secuencia de referencia es una secuencia definida utilizada como base para una comparación de secuencias; una secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia mayor, por ejemplo, como un segmento de una secuencia del gen para el componente ARN de telomerasa completa. Generalmente, una secuencia de referencia tiene por lo menos 20 nucleótidos de longitud, frecuentemente por lo menos 25 nucleótidos de longitud y con frecuencia por lo menos 50 nucleótidos de longitud. Dado que dos polinucleótidos pueden cada uno (1) comprender una secuencia (es decir, una fracción de la secuencia completa de polinucleótido) que es similar entre los dos polinucleótidos, y (2) puede comprender además una secuencia que es divergente entre los dos polinucleótidos, las comparaciones de secuencia entre dos (o más) polinucleótidos se realizan típicamente comparando las secuencias de los dos polinucleótidos en un "intervalo de comparación" para identificar y comparar las zonas locales de similitud de secuencia.

Un "intervalo de comparación", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un segmento conceptual de por lo menos 25 posiciones de nucleótidos contiguas en el que una secuencia de polinucleótidos puede compararse con una secuencia de referencia de por lo menos 25 nucleótidos contiguos y en el que la parte de la secuencia de polinucleótidos en el intervalo de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, huecos) de 20 por ciento o menos en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) por alineación óptima de las dos secuencias. La alineación óptima de secuencias para alinear un intervalo de comparación puede realizarse mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482, mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443, mediante la investigación por el método de similitud de Pearson y Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85: 2444, mediante aplicaciones informatizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASRT y TFASRT en el Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) o mediante inspección, y se selecciona la mejor alineación (es decir, la resultante en el porcentaje más elevado de homología en el intervalo de comparación) generada por varios métodos.

La expresión "identidad de secuencia" significa que dos secuencias de polinucleótidos son idénticas (es decir, sobre una base nucleótido a nucleótido) en todo el intervalo de comparación. La expresión "porcentaje de identidad de secuencia" se calcula comparando dos secuencias óptimamente alineadas en todo el intervalo de comparación, determinando el número de posiciones en las que aparecen las bases idénticas del ácido nucleico (p. ej., A, T, C, G, U o I) en ambas secuencias para dar el número de posiciones compatibles, dividiendo el número de posiciones compatibles por el número total de posiciones en el intervalo de comparación (es decir, el tamaño del intervalo) y multiplicando el resultado por 100 para dar el porcentaje de identidad de secuencia. Las expresiones "identidad sustancial" tal como se utilizan en la presente memoria indica una característica de una secuencia de polinucleótidos, en la que el polinucleótido comprende una secuencia que tiene por lo menos el 80 por ciento de identidad de secuencia, preferentemente por lo menos el 85 por ciento de identidad y con frecuencia del 89 al 95 por ciento de identidad de secuencia, más frecuentemente por lo menos el 99 por ciento de identidad de secuencia en comparación con la secuencia de referencia en todo el intervalo de comparación de por lo menos 20 posiciones de nucleótidos, frecuentemente en todo un intervalo de por lo menos 30 a 50 nucleótidos, en el que el porcentaje de identidad de secuencia se calcula comparando la secuencia de referencia con la secuencia de polinucleótidos que puede incluir deleciones o adiciones que totalizan el 20 por ciento o menos de la secuencia de referencia en todo el intervalo de comparación. La secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia mayor, por ejemplo, un segmento de la secuencia del gen para el componente ARN de telomerasa completo como se da a conocer en la presente memoria.

Hibridación específica se define en la presente memoria como la formación de híbridos entre un polinucleótido sonda (p. ej., un polinucleótido de la invención que puede incluir sustituciones, deleciones y/o adiciones) y polinucleótido diana específico (p. ej., un componente ARN de telomerasa o una secuencia del gen genómica, en la que en la sonda preferentemente se hibrida a una diana específica de modo que, por ejemplo, una sola banda correspondiente a una o más de las especies de ARN del gen para el componente ARN de telomerasa (o especies para el componente ARN de telomerasa específicamente escindidas o procesadas) pueden identificarse en una transferencia Northern de ARN preparado a partir de una fuente celular adecuada (p. ej., una célula somática que expresa el componente ARN de telomerasa). Los polinucleótidos de la invención que se hibridan específicamente con el componente ARN de telomerasa de mamífero o las secuencias teloméricas humanas pueden prepararse basándose en los datos de la secuencia proporcionados en la presente memoria según los métodos y principios termodinámicos conocidos en la técnica y descritos en Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., (1989), Cold Spring Harbor, N.Y. y Berger y Kimmel, Methods in Enzymology, volumen 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (1987), Academic Press, Inc., San Diego, CA.

Tal como se utiliza en la presente memoria la expresión "condiciones de enlace adecuadas" se refiere a las condiciones acuosas en las que un componente de ARN de telomerasa de mamífero se asocia con su componente proteico afín y forma una holoenzima telomerasa enzimáticamente activa capaz de replicación, reparación y/o adición catalítica de repeticiones teloméricas procedentes de una plantilla adecuada que comprende repeticiones teloméricas; dicha plantilla con repeticiones teloméricas puede estar presente o ausente. Con frecuencia, las condiciones de enlace adecuadas pueden ser las condiciones fisiológicas. "Condiciones fisiológicas" tal como se utiliza en la presente memoria, se refieren a la temperatura, pH, fuerza iónica, viscosidad y parámetros bioquímicos similares que son compatibles con un organismo viable, y/o que típicamente existen intracelularmente en una célula de mamífero cultivada viable, particularmente las condiciones que existen en el núcleo de dicha célula de mamífero. Por ejemplo, las condiciones intranucleares o citoplásmicas en un cultivo de células de mamífero en las condiciones típicas de cultivo en el laboratorio son las condiciones fisiológicas. Las condiciones de reacción in vitro adecuadas para las mezclas de transcripción in vitro son generalmente las condiciones fisiológicas y pueden ser ejemplificadas mediante una variedad de extractos nucleares conocidos en la técnica. En general, las condiciones fisiológicas in vitro pueden comprender NaCl o KCl 50 a 200 mM, pH 6,5-8,5, 20 a 45ºC y catión divalente (p. ej., Mg^{++}, Ca^{++}) 0,001 a 10 mM; NaCl o KCl preferentemente aproximadamente 150 mM, pH 7,2 a 7,6, catión divalente 5 mM y con frecuencia incluyen la proteína no específica del 0,01 al 1,0 por ciento (p. ej. BSA). Un detergente no iónico (Tween, NP-40, Triton X-100) puede estar presente con frecuencia, normalmente a aproximadamente del 0,001 al 2%, típicamente del 0,05 al 0,2% (v/v). El médico de familia puede seleccionar condiciones acuosas particulares según los métodos convencionales. Para directrices generales, pueden ser aplicables las siguientes condiciones acuosas tamponadas: NaCl 10 a 250 mM, Tris HCl 5 a 50 mM, pH 5 a 8, con adición opcional de catión o cationes divalentes y/o quelantes metálicos y/o detergentes no iónicos y/o fracciones de membrana y/o agentes antiespumantes y/o centelleantes.

Tal como se utiliza en la presente memoria, los términos "marcador" o "marcado" se refieren a la incorporación de un marcador detectable, p. ej., por incorporación de un aminoácido radiomarcado o un enlace a un polipéptido de grupos biotinilo que pueden detectarse mediante avidina marcada (p. ej., estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o la actividad enzimática que puede detectarse por métodos ópticos o calorimétricos). En la técnica se conocen y pueden utilizarse varios métodos de marcado de polipéptidos y glucoproteínas. Ejemplos de marcadores para polipéptidos incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: radioisótopos (p. ej., ^{3}H, ^{14}C, ^{125}I, ^{131}I), marcadores fluorescentes (p. ej., FITC, rodamina, fósforos lantánidos), marcadores enzimáticos (p. ej., peroxidasa de rábano picante, \beta-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), grupos biotinilo, epítopos de polipéptidos predeterminados reconocidos por un indicador secundario (p. ej., par de secuencias de cierre de cremallera con leucina, sitios de fijación para anticuerpos secundarios, polipéptido activador de transcripción, dominios de fijación al metal o etiquetas de epítopo). En algunas formas de realización, los marcadores están unidos mediante brazos separadores de varias longitudes para reducir el impedimento estérico potencial.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "estadísticamente significativo" significa un resultado (es decir, una medida del análisis) que generalmente está por lo menos dos desviaciones estándar por encima o por debajo de la media de por lo menos tres determinaciones independientes de una medida del ensayo de referencia y/o que es estadísticamente significativo tal como se determina mediante la prueba de la t de Student u otra medida aceptada de significado estadístico.

Tal como se utilizan en la presente memoria las expresiones "concentración patognómica", "cantidad patognómica" y "modelo de hibridación patognómico" se refiere a una concentración, cantidad o modelo de localización, respectivamente, de un componente ARN de telomerasa en una muestra, que indica la presencia de un estado patológico (p. ej., neoplásico, senescente, inmunodeficiente, neurodegenerativo, inflamatorio, etc.) o una predisposición a desarrollar una enfermedad neoplásica, tal como carcinoma, sarcoma o leucemia. Una cantidad patognómica es una cantidad de componente ARN de telomerasa en una célula o muestra celular que está fuera del intervalo de los valores clínicos normales que se determina mediante estudios clínicos estadísticos prospectivos y/o retrospectivos. Generalmente, un paciente con una enfermedad neoplásica (p. ej., carcinoma, sarcoma o leucemia) presentará una cantidad de componente ARN de telomerasa en una célula o muestra de tejido que está fuera del intervalo de concentraciones que caracterizan los individuos normales, no enfermos; típicamente la concentración patognómica está por lo menos aproximadamente una desviación estándar fuera del valor medio normal, más frecuentemente está por lo menos aproximadamente dos desviaciones estándar o más por encima del valor medio normal. Sin embargo, esencialmente todas las pruebas de diagnóstico clínico producen algún porcentaje de positivos falsos y negativos falsos. La sensibilidad y selectividad del análisis de diagnóstico puede ser suficiente para satisfacer el objetivo del diagnóstico y cualquier requisito regulador aplicable. En general, los métodos de diagnóstico de la invención se utilizan para identificar individuos como candidatos a la enfermedad, proporcionando un parámetro adicional en un diagnóstico diferencial de la enfermedad realizado por un profesional sanitario competente.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "alelo de enfermedad" se refiere a un alelo de un gen que es capaz de producir una enfermedad reconocible. Un alelo de enfermedad puede ser dominante o recesivo y puede producir la enfermedad directamente o cuando se presenta combinado con un fondo genético específico o un estado patológico preexistente. Un alelo de enfermedad puede estar presente en el grupo génico o puede generarse por primera vez en un paciente por mutación somática.

La expresión "agente antineoplásico" se utiliza en la presente memoria para referirse a los agentes que presentan la propiedad operativa de inhibir un desarrollo o evolución de un neoplasma en un ser humano, incluyendo con frecuencia la inhibición de la metástasis o del potencial metastásico.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "operativamente ligado" se refiere a un enlace de elementos de polinucleótido en una relación operativa. El ácido nucleico está "operativamente ligado" cuando se coloca en una relación operativa con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un activador o potenciador está operativamente ligado a la secuencia de codificación si afecta la transcripción de la secuencia de codificación. Operativamente ligado significa que las secuencias de ADN que se ligan están típicamente contiguas y, cuando sea necesario unir dos zonas de codificación de la proteína, contiguas y en un marco de lectura. Sin embargo, ya que los potenciadores generalmente funcionan cuando están separados del activador por varios kilobases y las secuencias intrónicas pueden ser de longitudes variables, algunos elementos del polinucleótido pueden estar operativamente ligados pero no contiguos. Un gen estructural (p. ej., un gen tk de HSV) que está operativamente ligado a una secuencia de polinucleótido correspondiente a una secuencia reguladora de transcripción de un gen endógeno generalmente se expresa sustancialmente en el mismo modelo temporal y específico de un tipo de célula como es el gen natural.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "unidad de transcripción" o "complejo de transcripción" se refiere a una secuencia de polinucleótidos que comprende un gen estructural (exones), un activador ligado de actuación en cis y otras secuencias de actuación en cis necesarias para la transcripción eficaz de las secuencias estructurales, elementos reguladores distales necesarios para la transcripción específica del tejido apropiado y de desarrollo de las secuencias estructurales y las secuencias cis adicionales importantes para la transcripción y traducción eficaces (p. ej., sitio de poliadenilación o secuencias que controlan la estabilidad del ARNm).

La expresión "modulación de la transcripción" se utiliza en la presente memoria para referirse a la capacidad para aumentar la transcripción o inhibir la transcripción de una secuencia estructural unida en cis; dicho aumento o inhibición puede depender de que ocurra un episodio específico, tal como la estimulación con un inductor y/o puede solamente manifestarse en determinados tipos de células.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "zona reguladora de la transcripción" se refiere a una secuencia de ADN que comprende un activador operativo y cualquier elemento de transcripción asociado (p. ej., potenciador, secuencia CCAAT, secuencia RTRT, sitio SP1, etc.) que son esenciales para la transcripción de una secuencia de polinucleótidos que está operativamente ligada a la zona reguladora de transcripción.

La expresión "alelo nulo" tal como se utiliza en la presente memoria significa que un locus del gen comprende por lo menos una mutación o alteración estructural de modo que el alelo nulo es sustancialmente incapaz de dirigir la expresión eficaz de un producto génico operativo. Una "célula transgénica" es una célula que tiene por lo menos un alelo nulo de un gen endógeno, siendo típicamente homozigótica para el alelo nulo. Por esta razón, por ejemplo, una célula transgénica puede ser homozigótica para los alelos nulos en el locus del componente ARN de telomerasa, de modo que la célula transgénica es sustancialmente incapaz de expresar un componente ARN operativo de telomerasa.

Breve descripción de los dibujos

Fig. 1. Se analizó la actividad de telomerasa de las células que expresan extractos fraccionados de TRC3 DEAE sefarosa mutados con plantilla de transformantes estables que expresan TRC3 mutante utilizando análisis convencional en varias condiciones de reacción. Los extractos de las células que expresan MuC+17 TRC3 (bandas 1, 4, 7, 10, 13, 16 marcadas C*), MuC TRC-3 (bandas 2, 5, 8, 11, 14, 17 marcadas C) o MuA TRC3 (bandas 3, 6, 9, 12, 15, 18 marcadas A) se analizaron en condiciones normales de reacción (bandas 1 a 6), normal más ddCTP 0,5 mM (bandas 7 a 9), normal menos dTTP más ddTTP 0,5 mM (bandas 10 a 12) o normal menos dATP más ddATP 0,5 mM (bandas 13 a 18). Las reacciones de análisis en las bandas 1 a 9 contenían dGTP 8 \muM total, 1 \muM del cual era ^{32}P-dGTP (800 Ci/mmol). Para facilitar la detección de la telomerasa mutante, las reacciones de análisis en las bandas 10 a 18 contenían dGTP 8 \muM total, 2 \muM del cual era ^{32}P-dGTP (800 Ci/mmol). Se trataron extractos con ARNasa exentos de ADNasa (25 \mug/ml durante 10 min a 30ºC) antes del análisis de telomerasa (bandas 1 a 3, 16 a 18). Las bandas flanqueantes contienen marcadores de ADN con los tamaños en nucleótidos (nt) indicados.

Fig. 2. Se determinó la concentración en estado estacionario del componente ARN de telomerasa (hTR) y GAPDH ARN utilizando RT-PCR cuantitativa. Las referencias demuestran que todas las cuantificaciones por PCR estaban en el intervalo lineal de hasta 25 ciclos. Se analizaron por RT-PCR cinco líneas celulares negativas de telomerasa normal (1 a 5) y cinco líneas celulares positivas a telomerasa tumoral (6 a 10): 1) pulmón fetal primario; 2) piel de mano fetal primaria; 3) próstata primaria de adulto; 4) fibroblastos sinoviales primarios; 5) fibroblastos de prepucio; 6) LOX de melanoma; 7) U251 de leucemia; 8) NCIH23 de carcinoma pulmonar; 9) SW620 de tumor de colon; y 10) MCF7 de tumor de mama. Se marcaron los productos de PCR con ^{32}P, se resolvieron en PAGE al 6% y se cuantificaron utilizando un PhosphorImager. La transcripción relativa se expresa en unidades arbitrarias.

Fig. 3. Longitud media de TRF en la cadena complementaria del componente ARN de telomerasa y en células de referencia del vector. Las células HeTe7 que expresan de forma estable la cadena complementaria 10-3-hTR o la referencia del vector se seleccionaron en medios con higromicina y puromicina y se recogieron a 23 PDL después de la transfección. Se purificó ADN nuclear, se cortó con HinfI y RsaI y se introdujo en un gel de agarosa al 0,5%. El ADN se sondó en el gel con un oligonucleótido (TRTGGG)_{3} para marcar los fragmentos de restricción terminal teloméricos (TRF). El gel se exploró con un PhosphorImager de Molecular Dynamic y el medio TRF se cuantificó tal como se describe (Allsopp et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89: 10114). Las líneas de trazos indican el TRF medio para los grupos con cadena complementaria y de referencia.

Fig. 4. Representación esquemática del método de PCR in situ.

Descripción de las forma de realización preferidas

La presente invención proporciona métodos, reactivos, animales y células modificadas genéticamente y composiciones farmacéuticas en relación con la telomerasa ribonucleoroteínica humana.

La nomenclatura utilizada en lo sucesivo y los procedimientos de laboratorio en el cultivo celular, genética molecular y química del ácido nucleico y la hibridación descrita a continuación puede conllevar procedimientos bien conocidos y empleados frecuentemente en la técnica. Se utilizan técnicas normalizadas para los métodos con ácido nucleico recombinante, síntesis de polinucleótidos y cultivo microbiano y transformación (p. ej., electroporación o lipofección). Las técnicas y procedimientos se realizan generalmente según los métodos convencionales en la técnica y varias referencias generales (véase, generalmente, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed. (1989)
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. las cuales se proporcionan en todo este documento.

Los oligonucleótidos pueden sintetizarse en un sintetizador de oligonucleótidos de Applied Bio Systems según las especificaciones proporcionadas por el fabricante.

Los métodos para la ampliación de PCR se describen en la técnica (PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification ed. HA Erlich, Freeman Press, Nueva York, NY (1992); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, eds. Innis, Gelfland, Snisky, y White, Academic Press, San Diego, CA (1990); Mattila et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19: 4967; Eckert, K.A. y Kunkel, T.A. (1991) PCR Methods and Applications 1: 17; PCR, eds. McPherson, Quirkes, y Taylor, IRL Press, Oxford; y en la patente U.S. nº 4.683.202.

Compendio

La invención descubre en parte la clonación y aislamiento del componente ARN de la telomerasa humana y el gen para este componente ARN, incluyendo los elementos de control de la transcripción asociados. La secuencia de nucleótidos del componente ARN de la telomerasa humana se presenta a continuación. Por comodidad, la secuencia se presenta utilizando las abreviaturas habituales para los ribonucleótidos (A es riboadenina, G es riboguanina, C es ribocitidina y U uridina). Los expertos en la materia reconocen que la secuencia mostrada a continuación también presenta la secuencia del ADNc, en la que los ribonucleótidos se sustituyen por desoxirribonucleótidos (siendo sustituida la uridina por la timidina).

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La secuencia anterior se presenta en la dirección 5'-3' y está numerada para referencia. La secuencia de la plantilla del componente ARN se cree que está situada en la zona definida por los nucleótidos 50 a 60 (5'-CUAACCCUAAC-3'), que es complementaria con una secuencia telomérica compuesta por aproximadamente uno y dos tercios de unidades teloméricas repetidas.

Esta secuencia se derivó de los clones de ADNc y del clon genómico del componente ARN. Cuando el componente ARN se transcribe en primer lugar en el correspondiente gen, por lo menos algunos de los transcritos de ARN producidos son mucho más largos que la secuencia de \sim560 nucleótidos presentada anteriormente y de hecho puede comprender más de 1.000 nucleótidos. Sin embargo, puede montarse una molécula de telomerasa completamente operativa a partir de transcritos constituidos por la secuencia de \sim560 nucleótidos mostrados anteriormente. Se cree que el terminal 3' del componente ARN en la telomerasa natural se une en la zona definida por los nucleótidos 514 a 559 en la secuencia anterior; un análisis indica que el extremo 3' puede ser el resto U en el nucleótido 538. Las moléculas del componente ARN recombinante que comprenden menos de los nucleótidos 1 a 559 de la secuencia mostrada anteriormente pueden también utilizarse para preparar telomerasa activa.

Se identificó un clon genómico y se aisló a partir de un banco genómico de ADN humano insertado en un vector lambda FIXII. El clon genómico, que comprende las secuencias del gen para el componente ARN, contenía una inserción de \sim15 kb y se denominó clon 28-1. El gen se sitúa en el extremo distal del brazo q del cromosoma 3. La información de la secuencia obtenida a partir de una secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción SauIIIA1 de la inserción de \sim15 kb en una secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción interna HindIII, que comprende toda la secuencia del componente ARN maduro así como los elementos de control de la transcripción del gen para el componente ARN, del clon lambda 28-1 se presenta a continuación utilizando las abreviaturas de desoxirribonucleótidos habituales y se representa en la dirección 5'-3'.

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La secuencia del componente ARN comienza en la base 1459. Se identifican varios elementos de control de la transcripción en la secuencia. Una secuencia de consenso secuencia A/T se encuentra en los nucleótidos 1431 a 1436; las secuencias de consenso PSE se encuentran en los nucleótidos 1406 a 1414 así como en los nucleótidos 1508 a 1526; una secuencia de consenso la secuencia CAAT se encuentra en los nucleótidos 1399 a 1406; una secuencia de consenso SP1 se encuentra en los nucleótidos 1354 a 1359; y una secuencia de consenso de elemento de respuesta del interferón \beta/\gamma se encuentra en los nucleótidos 1234 a 1245. La transcripción en estado estacionario del gen para el componente ARN de telomerasa humana en células humanas tales como HT1080 (que expresan la telomerasa) está sustancialmente inalterada cuando las secuencias corriente arriba del nucleótido 1159 se eliminan en los vectores que están establemente transfectados en las células.

El ADN del mono ardilla, que se cree que está entre los primates no humanos más genéticamente divergentes con respecto a los humanos, comprende un gen para el componente ARN de telomerasa que se puede ampliar con cebadores de PCR constituidos por secuencias que se corresponden con la secuencia de polinucleótidos del componente ARN de telomerasa humana descrita o son complementarias de la misma. Se cree que otros primates no humanos poseen genes del componente ARN de telomerasa que se pueden ampliar también con cebadores de PCR derivados de la secuencia del gen para el componente ARN de telomerasa humana.

Polinucleótidos del componente ARN de telomerasa

El descubrimiento de las secuencias para el componente ARN de telomerasa de mamíferos y su gen, presentado anteriormente para la telomerasa humana, permite la construcción de polinucleótidos aislados que comprenden una secuencia de por lo menos 15 nucleótidos contiguos. Típicamente por lo menos 20 a 25 polinucleótidos contiguos, que son sustancialmente idénticos a una secuencia del componente ARN de telomerasa de mamífero o una secuencia génica del componente ARN de mamífero. Además, las secuencias del componente ARN (y del gen) de telomerasa de mamífero permiten la construcción de las sondas de hibridación de ácido nucleico y cebadores de PCR que pueden utilizarse para detectar secuencias de ARN y ADN del componente ARN y/o del gen de telomerasa afín en una célula, muestra celular, sección de tejido, recipiente de reacción, membrana de hibridación o similares.

Los polinucleótidos que comprenden las secuencias del componente ARN de telomerasa de mamífero pueden incluir secuencias que facilitan la transcripción (secuencias de expresión), secuencias de estabilización del ARN y similares. Los principios generales para la construcción de dichos polinucleótidos a la vista de la información de la secuencia descubierta actualmente y de las directrices y dirección de la invención son bien conocidos en la materia y están descritos con más detalle en Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed. (1989), Cold Spring Harbor, N.Y. A título de ejemplo, pero no de limitación, dichos polinucleótidos pueden incluir un activador y, opcionalmente, un potenciador para su utilización en los anfitriones eucarióticos de expresión, y, opcionalmente, las secuencias necesarias para la replicación de un vector. Un casete de expresión eucariótico típico incluirá una secuencia de polinucleótidos la cual, cuando se transcribe, produce un transcrito del componente ARN de telomerasa de mamífero; dicha secuencia de polinucleótidos está ligada corriente abajo (es decir, en la orientación 5' a 3' de la transcripción de un activador adecuado, tal como el activador tk del HSV o el activador pgk (fosfoglicerato cinasa), opcionalmente ligado a un potenciador.

Además, cuando no se desea la expresión de un componente ARN de telomerasa operativo, los polinucleótidos de la presente invención no necesitan transcribir un transcrito del componente ARN de la telomerasa operativa. Los polinucleótidos de la presente invención pueden servir como sondas de hibridación y/o cebadores de PCR (amplímeros) y/o oligómeros de LCR para la detección de las secuencias de ARN o ADN de componente ARN de telomerasa.

Por otra parte, los polinucleótidos de la presente invención pueden servir como sondas o cebadores de hibridación para detectar las secuencias de ARN o ADN de los genes relacionados, o el gen para el componente ARN de telomerasa en las especies relacionadas, típicamente especies de mamíferos. Para dicha hibridación y las aplicaciones de PCR, los polinucleótidos de la invención no necesitan transcribir un componente ARN de telomerasa operativa. Por esta razón, los polinucleótidos de la invención pueden contener deleciones, adiciones, sustituciones de nucleótidos y/o transposiciones sustanciales, siempre que se conserve la hibridación específica o la ampliación específica en una secuencia del componente ARN de la telomerasa de mamífero.

Los clones genómicos o de ADNc del componente ARN de telomerasa de mamífero y las correspondientes secuencias génicas pueden aislarse del banco de clones (p. ej., disponible en Clontech, Palo Alto, CA) utilizando sondas de hibridación diseñadas sobre la base de las secuencias de nucleótidos dadas a conocer en la presente memoria utilizando métodos de cribado de hibridación convencional (p. ej., Benton WD y Davis RW (1977) Science 196: 180; Goodspeed et al. (1989) Gene 76: 1). Cuando se desea un clon de ADNc, se prefieren los bancos de clones que contienen ADNc derivado de ARN de células somáticas u otro ARN de células que expresen el componente ARN de telomerasa. Por otra parte, las secuencias de polinucleótido sintéticas correspondientes a toda o parte de las secuencias dadas a conocer en la presente memoria pueden construirse por síntesis química de oligonucleótidos. Además, la reacción en cadena de polimerasa (PCR) que utiliza cebadores basados en los datos de la secuencia dada a conocer en la presente memoria puede utilizarse para ampliar fragmentos de ADN de ADN genómico, grupos de ARN o de bancos de clones de ADNc. Las patentes U.S. nº 4.683.195 y nº 4.683.202 describen el método de PCR.

Dichos polinucleótidos presentan una variedad de utilizaciones, incluyendo como sondas del componente ARN de telomerasa, como plantillas para la producción del componente ARN de telomerasa operativo o no en las células, como reactivo de diagnóstico comerciales para la normalización de un análisis de detección del componente ARN de telomerasa, como polinucleótidos de terapia génica para su administración a un animal; dichos polinucleótidos pueden utilizarse también como artículos alimenticios, fuentes de energía combustibles, agentes de protección solar absorbentes de UV y solutos que aumentan la viscosidad entre otras utilizaciones.

Los plásmidos descritos en la presente memoria que se construyeron durante la clonación del componente ARN de la telomerasa humana y el gen para el componente ARN constituyen aspectos importantes de la presente invención. Estos plásmidos pueden utilizarse para producir el componente ARN de la telomerasa humana, así como el gen de la misma, en forma sustancialmente pura, otro aspecto importante además de la presente invención. Además, los expertos en la materia reconocen que una variedad de otros plásmidos, así como de ácidos nucleicos no plásmidos en forma sustancialmente pura, que comprenden toda o por lo menos una parte útil de la secuencia de nucleótidos del componente ARN de la telomerasa humana son materiales útiles proporcionados por la presente invención.

Como punto general con respecto a los ácidos nucleicos y a las preparaciones que contienen los mismos de la invención, los expertos en la materia reconocen que los ácidos nucleicos de la invención comprenden tanto moléculas de ADN como de ARN, así como análogos sintéticos, no naturales de las mismas y heteropolímeros de desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos y/o análogos de ambos. La composición particular de un ácido nucleico o análogo de ácido nucleico de la invención dependerá de la finalidad para la que se utilice el material y del o de los entornos en los que se coloque el material. Se han diseñado nucleótidos no naturales, modificados o sintéticos, que sirven para varias finalidades y permanecen estables en varios entornos, tales como aquellos en los que están las nucleasas, como es bien conocido en la técnica. Los nucleótidos no naturales, modificados o sintéticos, comparados con los ribo- o desoxirribonucleicos naturales, pueden diferenciarse con respecto al carbohidrato (azúcar), enlace fosfato o fragmentos de bases, del nucleótido o pueden contener incluso una base no nucleotídica (o ninguna base) en algunos casos. Véase, p. ej., Arnold et al., publicación de la patente PCT nº WO 89/02439, titulada "Non-nucleotide Linking Reagents for Nucleotide Probes" incorporada en la presente memoria como referencia. Nada más que los ácidos nucleicos de la invención pueden comprender una amplia variedad de nucleótidos, así también pueden los ácidos nucleicos servir para una amplia variedad de funciones útiles.

Aislamiento de genes afines

Como se indica en la descripción anterior, el acceso a los ácidos nucleicos purificados que comprenden la secuencia del componente ARN de telomerasa humana proporciona métodos y reactivos de diagnóstico y terapéuticos valiosos, así como otras utilidades importantes. Una utilidad importante de la presente invención consiste en que los métodos y reactivos de la invención pueden utilizarse para aislar el componente ARN y los genes para el componente ARN de telomerasa de cualquier especie de mamífero que tenga un componente ARN sustancialmente homólogo al componente ARN humano de la presente invención. La frase "sustancialmente homólogo" se refiere al grado de homología requerido para la hibridación específica de un oligonucleótido o secuencia de ácido nucleico del componente ARN humano con la secuencia de ácido nucleico de una secuencia del componente ARN de otra especie de mamífero. Dada dicha homología sustancial, los expertos en la materia pueden utilizar los ácidos nucleicos y cebadores y sondas de oligonucleótidos de la invención para identificar y aislar secuencias sustancialmente homólogas.

Por ejemplo, se puede sondar un banco genómico o de ADNc para detectar secuencias homólogas. Se puede utilizar también cebadores correspondientes a las zonas de la secuencia del componente ARN y ampliación por PCR en condiciones de severidad baja o moderada para ampliar una secuencia específica de ácido nucleico homólogo de preparaciones de ARN o ADN de una especie de mamífero. Utilizando estas y otras técnicas similares, los expertos pueden aislar fácilmente no solo ácidos nucleicos del componente ARN de la variante procedente de células humanas sino también ácidos nucleicos del componente ARN homólogo de otras células de mamífero, tales como las células de primates, de mamíferos de interés veterinario, es decir, vacas, ovejas, caballos, perros y gatos y de roedores, es decir, ratas, ratones y hámsters. A su vez, estos ácidos nucleicos pueden utilizarse para preparar animales transgénicos de gran valor para la identificación y análisis de los productos farmacéuticos que regulan la actividad de telomerasa. Por ejemplo, utilizando un plásmido de la invención, se puede "modificar genéticamente" el gen para el componente ARN o sustituir el gen para el componente ARN natural por un gen inducible recombinante en una célula madre embrionaria de mus spretus y a continuación generar un ratón transgénico que será útil como modelo o sistema de análisis para el estudio de la enfermedad relacionada con la edad o la senectud. El Ejemplo 9, más adelante, ilustra cómo ha sido utilizada dicha metodología para identificar y aislar secuencias del componente ARN de primates.

Otros homólogos de mamífero de los componentes ARN de telomerasa humana y de mono y/o los genes afines pueden identificarse y aislarse mediante el cribado de un banco de clones genómicos o de ADNc de mamífero no humano adecuado, tal como el procedente de un banco genómico o de ADNc de ratón, rata, conejo, cobaya, hámster, canino, bovino, ovino, lupino, porcino en un vector adecuado, tal como cromosomas artificiales de levadura, cósmidos o bacteriófagos \lambda (p. ej., \lambda Charon 35), con una sonda de polinucleótido que comprende una secuencia de aproximadamente por lo menos 20 nucleótidos contiguos (o su complemento) de un componente ARN de telomerasa humana o de mono o una secuencia de polinucleótidos del gen. Típicamente, las condiciones de hibridación y lavado se realizan a alta severidad según procedimientos de hibridación convencionales. Los clones positivos se aíslan y secuencian. A título de ilustración y no de limitación, un polinucleótido completo que corresponde a la secuencia de 559 nucleótidos del componente ARN de telomerasa humano puede ser marcado y utilizado como sonda de hibridación para aislar clones genómicos aislados de un banco de clones genómico no humano en \lambdaEMBL4 o \lambdaGEM11 (Promega Corporation, Madison, Wisconsin); las condiciones de hibridación típicas para la identificación de elevaciones en la placa (Benton y Davis (1978) Science 196: 180; Dunn et al. (1989) J. Biol. Chem. 264: 13057) pueden ser: formamida al 50%, 5 \times SSC o SSPE, 1-5 \times solución de Denhardt, SDS al 0,1-1%, 100 a 200 \mug de ADN o ARNt heterólogos cortados, sulfato de dextrano al 0-10%, 1 \times 10^{5} a 1 \times 10^{7} cpm/ml de sonda desnaturalizada con una actividad específica de aproximadamente 1 \times 10^{8} cpm/\mug e incubación entre 42ºC y 37ºC durante 6 a 36 horas. Las condiciones de prehibridación son esencialmente idénticas excepto que la sonda no está incluida y el tiempo de incubación se reduce típicamente. Las condiciones de lavado son típicamente 1-3 \times SSC, SDS al 0,1-1%, 45 a 70ºC con cambio de solución de lavado a aproximadamente 5 a 30 minutos. Para el aislamiento de polinucleótidos del componente ARN de telomerasa no humana con una sonda de polinucleótido del componente ARN de telomerasa humana, se prefiere con frecuencia hibridar a una severidad menor, tal como aproximadamente a 39ºC y lavar sucesivamente en las etapas de temperatura siguientes: temperatura ambiente, 37ºC, 39ºC, 42ºC, 45ºC, 50ºC, 55ºC, 60ºC, 65ºC y 70ºC, interrumpiendo después de cada etapa y controlando la señal de la sonda de fondo (y detectando opcionalmente la señal por autorradiograma y/o detección por imagen con fósforo, si se utiliza sonda radiomarcada) y terminando las etapas de lavado cuando se consiga una relación señal/ruido adecuada, determinada experimentalmente.

Los polinucleótidos que comprenden secuencias de aproximadamente por lo menos 30 a 50 nucleótidos, preferentemente por lo menos de 100 nucleótidos, correspondientes a las secuencias de nucleótidos o complementarias a las mismas mostradas en la presente memoria para las secuencias del componente ARN de telomerasa humana y de mono pueden servir como cebadores de PCR y/o sondas de hibridación para identificar y aislar los genes de la línea germinal correspondientes al gen dado a conocer y a las secuencias del componente de ARN. Dichas líneas germinales pueden ser aisladas por varios métodos convencionales en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, identificación por hibridación de bancos genómicos en el bacteriófago \lambda o bancos de cósmido o por ampliación por PCR de secuencias genómicas que utilizan cebadores derivados de las secuencias dadas a conocer en la presente memoria. Los bancos genómicos humanos están a disposición pública o pueden ser construidos por primera vez a partir de ADN humano.

Para un experto en la materia es evidente que las sustituciones, deleciones y adiciones de nucleótidos pueden incorporarse en los polinucleótidos de la invención. La variación de la secuencia de nucleótidos puede proceder de los polimorfismos de la secuencia de varios alelos y similares. Sin embargo, dichas sustituciones, deleciones y adiciones de nucleótidos no deberían destruir sustancialmente la capacidad del polinucleótido para hibridarse a secuencias de polinucleótidos del componente ARN de telomerasa humana o de mono completas mostradas en la presente memoria en condiciones de hibridación que sean suficientemente severas para producir la hibridación específica.

Los polinucleótidos del componente ARN de telomerasa de mamífero pueden ser oligonucleótidos cortos (p. ej., de 20 a 100 bases de longitud), tales como para su utilización como sondas de hibridación y cebadores de PCR (o LCR). Las secuencias de polinucleótidos pueden comprender también parte de un polinucleótido más largo (p. ej., un vector de clonación que comprende un clon para el componente ARN de telomerasa) y pueden fusionarse, mediante enlace de polinucleótido, con otra secuencia de polinucleótidos. Típicamente, los polinucleótidos del componente ARN de telomerasa comprenden por lo menos 25 nucleótidos consecutivos que son sustancialmente idénticos a un componente ARN de telomerasa natural o a una secuencia génica, más frecuentemente los polinucleótidos del componente ARN de telomerasa comprenden por lo menos 50 a 100 nucleótidos consecutivos que son sustancialmente idénticos a una secuencia del componente ARN de telomerasa de mamífero natural. Sin embargo, los expertos reconocerán que la longitud mínima de un polinucleótido del componente ARN de telomerasa requerido para la hibridación específica con una secuencia diana del componente ARN de telomerasa dependerá de varios factores: contenido en G/C, colocación de las bases incompatibles (si existen), grado de exclusividad de la secuencia en comparación con la población de polinucleótidos diana y la naturaleza química del polinucleótido (p. ej., eje central de fosfonato de metilo, ácido poliamidanucleico, fosforotiolato, etc.), entre otros.

Si se desea, los amplímeros de PCR para ampliar sustancialmente las copias de ADNc completo pueden seleccionarse a voluntad del médico de familia. Asimismo, pueden seleccionarse amplímeros para ampliar fracciones del gen para el componente ARN de telomerasa (de mono o humano).

Cada una de estas secuencias puede utilizarse como sondas de hibridación o amplímeros de PCR para detectar la presencia del componente ARN de telomerasa, por ejemplo para diagnosticar una enfermedad neoplásica caracterizada por la presencia de una concentración elevada o reducida en las células del componente ARN de telomerasa o para realizar la histotipia (es decir, identificar los tejidos caracterizados por la expresión del componente ARN de telomerasa) y similares. Las secuencias pueden utilizarse también para detectar secuencias del gen para el componente ARN de telomerasa genómico en una muestra de ADN, tal como para el análisis de ADN medicolegal (por ejemplo, por análisis de RFLP, distribución de longitud(es) de producto por PCR, etc.) o para el diagnóstico de enfermedades caracterizadas por la ampliación y/o transposiciones del gen para el componente ARN de telomerasa.

A título de ejemplo y no de limitación, puede utilizarse el siguiente par de cebadores de oligonucleótidos para ampliar las secuencias de polinucleótidos del componente ARN (p. ej., ADNc) o como sondas de hibridación (p. ej., como sondas de oligonucleótido biotiniladas o marcadas en el extremo):

: 5'-AGCACACTGGCCCAGTCAGTCAGGTTTG-3'

y

: 5'-GGGTTGCGGAGGGAGGGTGGGCCTGGGA-3'

Otros cebadores de PCR, cebadores de LCR, sondas de hibridación y cebadores y similares adecuados son evidentes para los expertos en la materia a la vista de las secuencias del componente ARN de telomerasa dadas a conocer en la presente memoria y que pueden obtenerse con éstas. Los polinucleótidos para el componente ARN de telomerasa humanos y sus complementos pueden servir como sondas de hibridación o cebadores para detectar las secuencias de ARN o ADN del componente ARN de telomerasa de mamífero. Para dicha hibridación y aplicaciones de PCR pueden contener deleciones, adiciones, sustituciones de nucleótidos y/o transposiciones sustanciales, siempre que se conserve la hibridación específica o la ampliación específica de una secuencia del componente ARN de telomerasa humana. Sin embargo dichas sustituciones, deleciones y adiciones de nucleótidos no deberían destruir sustancialmente la capacidad del nucleótido para hibridarse a un componente del ARN de telomerasa o a una secuencia génica en condiciones de hibridación que sean suficientemente severas para producir hibridación específica.

A título de ejemplo y no de limitación, un polinucleótido del componente ARN de telomerasa humano puede comprender la secuencia desde el nucleótido 48 al nucleótido 209, que se cree suficiente para la reconstrucción de la holoenzima de telomerasa humana en presencia del componente proteico de telomerasa:

4

o como ADN:

5

También, un polinucleótido del componente ARN de telomerasa humana puede comprender o estar constituido por los nucleótidos 1 a 559, y puede incluir adiciones terminales de otros nucleótidos o secuencias de nucleótido. Una variante mezclada con la plantilla constituida por los nucleótidos 48 a 209, pero en la que la secuencia de la plantilla repetida del telómero está alterada, puede competir con un componente ARN truncado constituido por la secuencia 48 a 209 natural para unirse al componente proteico de telomerasa y reconstruir la holoenzima de telomerasa.

El análisis estructural del componente ARN de telomerasa humana indica las zonas que son propensas a formar estructuras secundarias, tales como bucles en horquilla. Por ejemplo, la zona desde aproximadamente el nucleótido 200 hasta el nucleótido 350 del componente ARN de telomerasa humana presenta un carácter de bucle en horquilla sustancial. Otros fragmentos del componente ARN de telomerasa también presentan un carácter significativo de estructura secundaria. A la vista de esta estructura secundaria indicada, los especialistas expertos pueden sustituir otras secuencias de nucleótidos previstas mediante análisis por ordenador para adoptar formaciones similares de estructura secundaria. Aunque una variedad de programas informáticos son adecuados para determinar las secuencias de nucleótidos que adoptan estructuras secundarias sustancialmente equivalentes, pueden utilizarse los programas FOLD, SQUIGGLES, CIRCLES, DOMES, NOUNRTINS y STEMLOOP y similares del paquete informático de análisis de secuencias UWGCG. Asimismo, pueden diseñarse miméticos estructurales no nucleotídicos, tales como los ácidos peptidonucleicos y similares, mediante programas de modelado molecular como miméticos de la estructura secundaria característica de la zona o zonas para el componente ARN de telomerasa humana deseadas que deben simularse. Dichos miméticos estructurales pueden utilizarse terapéuticamente para varias utilizaciones (p. ej., antagonista competitivo, etc.).

Cadena complementaria

Un tipo especialmente útil de ácido nucleico de la invención es un oligonucleótido de cadena complementaria que puede utilizarse in vivo o in vitro para inhibir la actividad de la telomerasa humana. Los oligonucleótidos con cadena complementaria comprenden una secuencia específica desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 25 a 200 o más (es decir, suficientemente grande para formar una duplicidad estable pero suficientemente pequeña, dependiendo del modo de administración, para administrar in vivo, si se desea) nucleótidos complementarios a una secuencia específica de nucleótidos en el componente ARN de la telomerasa humana. El mecanismo de actuación de dichos oligonucleótidos puede implicar la unión del componente ARN para impedir el montaje de la ribonucleoproteína telomerasa operativa y para impedir que el componente ARN sirva como plantilla para la síntesis del ADN telomérico, para desestabilizar el componente ARN de telomerasa y reducir su vida media y/o para inhibir la transcripción del gen para el componente ARN de telomerasa.

Los oligonucleótidos de cadena complementaria ilustrativos de la invención que sirven para inhibir in vivo y/o in vitro la actividad de la telomerasa comprenden los oligonucleótidos mencionados anteriormente relacionados con las pruebas para determinar si el clon pGRN7 comprendía el ADNc del componente ARN de telomerasa humana. Se utilizaron tres de dichos oligonucleótidos, indicados anteriormente, para demostrar la inhibición de la actividad de telomerasa in vitro. La secuencia de cada uno de estos oligonucleótidos se muestra a continuación.

T3: 5'-CTCAGTRTGGGTRTGACAAA-3'

P3: 5'-CGCCCTTCTCAGTRTGGGTRTG-3'

RT3: 5'-GGCGCCRTCGCCCTTCTCAGTT-3'

Estos oligonucleótidos pueden utilizarse también para inhibir la actividad de telomerasa en las células humanas.

Los expertos en la materia reconocerán que la presente invención proporciona una amplia variedad de oligonucleótidos con cadena complementaria capaces de inhibir la actividad de la telomerasa. Otro oligonucleótido con cadena complementaria útil de la invención es el oligonucleótido Tel-AU, que posee la secuencia 5'-CAGGCCCACCCTCCG
CAACC-3', y que, como alguno de los oligonucleótidos con cadena complementaria de la invención, puede sintetizarse utilizando nucleótidos de fosforotioato, fosfonatos de metilo quirales, nucleótidos naturales o mezclas de los mismos para comunicar estabilidad y el T_{m} deseado. Los expertos en la materia reconocen que puede utilizarse una amplia variedad de análogos de nucleótido modificados, tales como los O-metil ribonucleótidos, los nucleótidos de fosforotioato y los nucleótidos de fosfonato de metilo, para producir los ácidos nucleicos de la invención con más propiedades deseadas (es decir resistentes a la nucleasa, enlace más fuerte, etc.) que las producidas utilizando nucleótidos naturales. Otras técnicas para hacer a los oligonucleótidos resistentes a la nucleasa incluyen las descritas en la publicación de patente PCT nº 94/12633.

Las formas de realización adicionales dirigidas a la modulación de la actividad de telomerasa comprenden métodos que emplean polinucleótidos de cadena complementaria específicos complementarios de todas o parte de las secuencias del componente ARN de telomerasa humano (hTR), tales como los polinucleótidos de cadena complementaria para el gen para el componente ARN de telomerasa humana o su ARN transcrito, incluyendo las formas truncadas que pueden asociarse a la holoenzima telomerasa. Dichos polinucleótidos con cadena complementaria complementarios pueden comprender sustituciones, adiciones, deleciones o transposiciones de nucleótido, siempre que la unión específica a la secuencia diana aplicable que corresponde al componente ARN de telomerasa o su gen se conserve como una propiedad operativa del polinucleótido. Los polinucleótidos con cadena complementaria complementarios comprenden oligonucleótidos con ARN de cadena complementaria o ADN soluble que pueden hibridarse específicamente con especies del componente ARN de telomerasa y evitar la transcripción del gen para el componente ARN de telomerasa (Ching et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 10006; Broder et al. (1990) Ann. Int. Med. 113: 604; Loreau et al. (1990) FEBS Letters 274: 53; Holcenberg et al., documentos WO 91/11535; U.S. nº 5.256.643 (U.S.S.N. 07/530.165); WO 91/09865; WO 91/04753; WO 90/13641 y EP 386563. Los polinucleótidos con cadena complementaria por consiguiente inhiben la producción del componente ARN de telomerasa operativo. Ya que la expresión del componente ARN de telomerasa (velocidad de transcripción y/o estabilidad del ARN) está asociada con la activación y la actividad enzimática de la holoenzima telomerasa, los polinucleótidos de cadena complementaria que impiden la transcripción del ARN correspondiente al componente ARN de telomerasa y/o la interacción del componente ARN de telomerasa con el componente proteico de la telomerasa humana y/o la interacción el componente ARN de telomerasa con las secuencias teloméricas pueden inhibir la actividad de la telomerasa y/o invertir un fenotipo, tal como la inmortalización o transformación neoplásica, de las células que expresan actividad de telomerasa en ausencia de polinucleótidos con cadena complementaria. Las composiciones que contienen una dosis terapéuticamente eficaz de polinucleótidos con cadena complementaria para el componente ARN de telomerasa pueden administrarse para el tratamiento de las enfermedades que requieran la actividad de telomerasa para la patogénesis celular (p. ej., neoplasia) o para inhibir la producción o el mantenimiento de gametos (es decir, como anticonceptivos), si se desea. Pueden producirse polinucleótidos de cadena complementaria de varias longitudes, aunque dichos polinucleótidos de cadena complementaria comprenden típicamente una secuencia de aproximadamente por lo menos 25 nucleótidos consecutivos que son sustancialmente complementarios con la secuencia de polinucleótidos de componente ARN de telomerasa natural y que típicamente son perfectamente complementarios con una secuencia del componente ARN de la telomerasa humana, siendo con frecuencia complementarios con la secuencia del componente ARN de telomerasa que es complementaria con la secuencia repetida del telómero o complementaria con una parte del componente ARN de telomerasa que contacta con la subunidad del polipéptido de la telomerasa.

Los polinucleótidos con cadena complementaria pueden producirse a partir de un casete de expresión heterólogo en una célula transfectante o en una célula transgénica. El casete de expresión heterólogo puede formar parte de un vector para terapia génica, tal como un vector adenovírico o vírico adenoasociado u otro vector para terapia génica. El casete heterólogo puede estar en un polinucleótido que no sea capaz de replicación independiente y que se transfiere a las células por alguno de los varios métodos adecuados conocidos por los expertos en la materia (p. ej., lipofección, biolística, liposomas, inmunoliposomas, electroporación, etc.). Por otra parte, los polinucleótidos con cadena complementaria pueden comprender oligonucleótidos solubles que se administran al medio externo, ya sea en el medio de cultivo in vitro o en los espacios intersticiales y en los fluidos corporales (p. ej., sangre, CSF) por aplicación in vivo. Los polinucleótidos con cadena complementaria solubles presentes en el medio externo se ha demostrado que consiguen acceder al citoplasma e inhiben las especies de ARN específico. En algunas formas de realización los polinucleótidos con cadena complementaria comprenden grupos de fosfonato de metilo, grupos propenilo C-5, azúcares 2' fluororribosa o son ácidos poliamidonucleicos (PNA) (Egholm et al. (1992) J. Am. Chem. Soc. 114: 1895; Wittung et al. (1994) Nature 368: 561; Egholm et al. (1993) Nature 365: 566; Hanvey et al. (1992) Science 258: 1481. Para los métodos generales relacionados con los polinucleótidos con cadena complementaria, véase Antisense RNA and DNA, (1988), D.A. Melton, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).

Además de los oligonucleótidos con cadena complementaria de la invención, se pueden construir oligonucleótidos que se unirán al ácido nucleico doble ya sea en el componente ARN plegado o en el gen para el componente ARN, formando un ácido nucleico triple o que contiene una triple hélice o para inhibir la actividad de la telomerasa. Dichos oligonucleótidos de la invención se construyen utilizando las reglas de emparejamiento de bases de formación de la triple hélice y la secuencia de nucleótidos del componente ARN (Cheng et al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 15110; Ferrin y Camerini-Otero (1991) Science 354: 1494; Ramdas et al. (1989) J. Biol. Chem. 264: 17395; Strobel et al. (1991) Science 254: 1639; Hsieh et al. (1990) op. cit.; Rigas et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 83: 9591. Dichos oligonucleótidos pueden bloquear la actividad de la telomerasa de numerosas maneras, incluyendo por impedimento de la transcripción del gen de telomerasa o por unión a una zona duplicada del componente ARN de telomerasa de manera que impida al componente ARN formar una ribonucleoproteína telomerasa operativa o servir de plantilla para la síntesis del ADN telomérico. Típicamente, y dependiendo del modo de actuación, los oligonucleótidos que forman la triple hélice de la invención comprenden una secuencia específica de aproximadamente 10 a aproximadamente 25 hasta 200 o más (es decir, suficientemente grande para formar una triple hélice estable pero suficientemente pequeña, dependiendo del modo de administración, para administrar in vivo, si se desea) nucleótidos "complementarios" (en este contexto, complementario significa capaz de formar una triple hélice estable) con una secuencia específica en el componente ARN de la telomerasa o el gen para el componente ARN de la telomerasa.

Además de los oligonucleótidos con cadena complementaria y de los formadores de triple hélice de la invención, los oligonucleótidos con cadena transcrita idénticos en la secuencia con al menos una parte del componente ARN de la telomerasa humana pueden utilizarse también para inhibir la actividad de la telomerasa. Los oligonucleótidos de la invención de este tipo se caracterizan porque comprenden (1) menos de la secuencia completa del componente ARN necesaria para formar una enzima telomerasa operativa o (2) la secuencia completa del componente ARN necesaria para formar una enzima operativa así como una sustitución o inserción de uno o más nucleótidos que vuelven no operativo el ARN resultante. En ambos casos, se observa la inhibición de la actividad de la telomerasa debido al componente ARN "mutante" que une los componentes proteicos de la telomerasa humana para formar una molécula de telomerasa inactiva. El mecanismo de actuación de dichos oligonucleótidos implica de este modo el montaje de una ribonucleoproteína telomerasa no operativa o el impedimento del montaje de una ribonucleoproteína telomerasa operativa. Un ejemplo puede ser una variante mezclada con plantilla constituida por los nucleótidos 48 a 209, pero en la que se altera la secuencia de la plantilla con repetición en el telómero. Dichas variantes mezcladas en la plantilla son capaces de competir por la unión al componente proteico de la telomerasa. Los oligonucleótidos con cadena transcrita de la invención de este tipo comprenden típicamente una secuencia específica de aproximadamente 20, 50, 100, 200, 400, 500 o más nucleótidos idénticos a una secuencia específica de nucleótidos en el componente ARN de la telomerasa humana.

Además, los polinucleótidos con cadena complementaria pueden comprender un sustituyente derivado que no interfiere sustancialmente con respecto a la hibridación al componente ARN de una telomerasa de mamífero. Los polinucleótidos con cadena complementaria que han sido modificados con sustituyentes químicos agregados pueden introducirse en una célula eucariótica metabólicamente activa para hibridarse con un componente ARN de la telomerasa en la célula. Típicamente dichos polinucleótidos con cadena complementaria se producen, y los sustituyentes químicos adicionales se unen, ya sea durante o después de la síntesis del polinucleótido, respectivamente, y están localizados por esta razón en una secuencia complementaria en el componente ARN de telomerasa donde producen una alteración o modificación química en una secuencia de ADN local y/o en el componente proteico de telomerasa. Los sustituyentes químicos unidos preferidos comprenden: europio (III) texafirina, agentes reticulantes, psoraleno, quelatos metálicos (p. ej., quelato hierro/EDRT para la escisión catalizada del hierro), topoisomerasas, endonucleasas, exonucleasas, ligasas, fosfodiesterasas, porfirinas fotodinámicas, fármacos quimioterapéuticos (p. ej., adriamicina, doxirrubicina), agentes intercaladores, agentes de modificación de bases, cadenas de inmunoglobulina y oligonucleótidos. Los quelatos hierro/EDRT son sustituyentes químicos particularmente preferidos en los que se desea la escisión local de una secuencia de polinucleótido (Hertzberg et al. (1982) J. Am. Chem. Soc. 104: 313; Hertzberg y Dervan (1984) Biochemistry 23: 3934; Taylor et al. (1984) Tetrahedron 40: 457; Dervan, PB (1986) Science 232: 464). Las químicas de fijación preferidas comprenden: enlace directo, p. ej. mediante un grupo amino reactivo agregado (Corey y Schultz (1988) Science 238: 1401 y otras químicas de enlace directo, aunque pueden utilizarse también métodos de enlace estreptavidina/biotina y digoxigenina/anticuerpo anti-digoxigenina. Los métodos para el enlace de los sustituyentes químicos se proporcionan en las patentes U.S. nº 5.135.720, nº 5.093.245 y nº 5.055.556. A voluntad del médico de familia pueden utilizarse otras químicas de enlace. Los polinucleótidos que corresponden a toda o a una parte sustancial de un componente ARN de telomerasa de mamífero (es decir, polinucleótidos con "cadena transcrita") pueden también producirse y utilizarse para reaccionar con secuencias de repetición teloméricas en el genoma y producir aductos y otra modificación del medio químico en las zonas del telómero de los cromosomas.

Plantillas incompatibles

Por lo tanto, otro oligonucleótido útil de la invención comprende una secuencia alterada y mutada del componente ARN de la telomerasa humana. Yu et al., 1990, Nature 344: 126, demuestra que una forma mutada del componente ARN de la telomerasa de Tetrahymena puede incorporarse en la telomerasa de las células de Tetrahymena y que la incorporación presenta efectos perjudiciales en estas células. La incorporación de las formas mutadas del componente ARN de la telomerasa humana puede presentar efectos similares en las células humanas que de otro modo presentan actividad de telomerasa sin afectar las células humanas normales que no presentan actividad de telomerasa. Dichas formas mutadas comprenden aquellas en la que la secuencia 5'-CRTACCCRT-3' muta a 5'-CAAACCCAA-3', 5'-CCAACCCCAA-3' o 5'-CTCACCCTCA-3'. Cada una de estas secuencias alteradas del componente ARN altera las unidades teloméricas repetidas incorporadas en el ADN cromosómico, afectando de este modo la estructura y función del cromosoma. Dichos oligonucleótidos pueden diseñarse para que contengan secuencias de reconocimiento de la enzima de restricción en métodos de diagnóstico para la presencia del componente ARN alterado mediante la digestión de la enzima de restricción del ADN telomérico o un sustrato de telomerasa ampliado.

Para ilustrar este aspecto de la invención, se realizó la mutagénesis específica del sitio utilizando un plásmido (denominado pGRN33, disponible en la American Type Culture Collection con el nº de registro ATCC 75926) que comprende un fragmento HindIII-SacI de \sim2,5 kb del clon lambda 28-1 (véase el Ejemplo 7, más adelante) así como el origen SV40 de la replicación (pero sin actividad del activador). Los plásmidos resultantes, denominados pGRN34 (que comprenden 5'-CAAACCCAA-3'), pGRN36 (que comprende 5'-CCAACCCCAA-3') y pGRN37 (que comprende 5'-CTCACCCTCA-3') se transformaron en células huésped eucarióticas (una línea celular derivada de 293 que expresa el antígeno T largo SV40) y se realizaron análisis de telomerasa utilizando extractos celulares de transformantes.

Los análisis demostraron que la actividad de la telomerasa en las células producía la formación de ácidos nucleicos que comprenden las secuencias alteradas, indicando que el clon genómico comprendía un gen operativo para el componente ARN y que los plásmidos comprendían un gen para el componente ARN alterado pero operativo. Estos resultados ilustran cómo la presente invención proporciona preparaciones y métodos de telomerasa recombinante para producir dichas preparaciones. La presente invención proporciona una telomerasa humana recombinante que comprende los componentes proteicos de la telomerasa humana en asociación operativa con un componente ARN recombinante de la invención. Dichas moléculas del componente ARN recombinante de la invención comprenden las que se diferencian de las moléculas del componente ARN natural en una o más sustituciones, deleciones o inserciones de bases, así como moléculas del componente ARN idénticas a una molécula del componente ARN natural que se producen en las células huésped recombinantes. El método para producir dichas moléculas recombinantes de telomerasa comprenden transformar una célula huésped eucariótica que expresa los componentes proteicos de la telomerasa con un vector de expresión recombinante que codifica una molécula del componente ARN de la invención y cultivar dichas células huésped transformadas con dicho vector en condiciones tales que los componentes proteicos y el componente ARN se expresen y se reúnan para formar una molécula de telomerasa activa capaz de añadir secuencias (no necesariamente la misma secuencia añadida por la telomerasa natural) a los telómeros del ADN cromosómico. Otras formas de realización útiles de dichos vectores (o plásmidos) de expresión del ADN recombinante incluyen los plásmidos que comprenden el gen para el componente ARN de la telomerasa humana con una deleción, inserción u otra modificación que haga no operativo al gen. Dichos plásmidos son especialmente útiles para la terapia génica humana destinada a "modificar genéticamente" el gen para el componente ARN endógeno, aunque se necesita un sistema de transformación y recombinación muy eficaz, para hacer irreversiblemente mortales las células tratadas.

Formas de realización de ribozima

Pueden utilizarse también otros oligonucleótidos de la invención denominados ribozimas para inhibir la actividad de la telomerasa. A diferencia de los oligonucleótidos con cadena complementaria y de otros descritos anteriormente, que se unen a un ARN, un ADN o a un componente proteico de telomerasa, una ribozima no sólo se une sino que también se escinde específicamente y por esta razón inactiva potencialmente un ARN diana, tal como el componente ARN de la telomerasa humana. Dicha ribozima puede comprender las secuencias terminales 5' y 3' complementarias del ARN de la telomerasa. Dependiendo del sitio de escisión, una ribozima puede volver inactiva la enzima telomerasa. Véase la publicación de la patente PCT nº 93/23572, supra. Los expertos en materia de estudio de la secuencia de ARN del componente ARN de telomerasa humana observarán que varias secuencias diana de ribozima útiles están presentes y son susceptibles de ser escindidas, por ejemplo, por una ribozima con motivo de cabeza de martillo. Las ribozimas ilustrativas de la invención de este tipo incluyen las ribozimas siguientes, que son moléculas de ARN que tienen las secuencias indicadas:

1:: 5'-UAGGGUUACUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACAAAAAAU-3';

2:: 5'-UUAGGGUCUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAAGACAAAA-3';

3:: 5'-UCUCAGUCUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAAGGGUUA-3'; y

4:: 5'-CCCGAGACUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACCCGCG-3'.

Otras secuencias diana óptimas para la inhibición de la actividad de telomerasa mediada por ribozimas pueden determinarse tal como describe Sullivan et al., publicación de la patente PCT nº 94/02595 y Draper et al., publicación de la patente PCT nº 93/23569. Tal como describe Hu et al., publicación de la patente PCT nº 94/03596, las funciones de cadena complementaria y de ribozima pueden combinarse en un solo oligonucleótido. Además, las ribozimas pueden comprender uno o más nucleótidos modificados o enlaces modificados entre nucleótidos, como se describió anteriormente junto con la descripción de los oligonucleótidos con cadena complementaria ilustrativos de la invención. En un aspecto, se modifica una subunidad catalítica de ARNasa P (humano o de E. coli) (véase, Altman S. (1995) Biotechnology 13: 327) para generar una secuencia directriz que corresponde a la fracción del componente ARN de telomerasa de mamífero cuyos pares de bases en la secuencia repetida del telómero; dichas variantes de ARNasa P pueden escindir las secuencias del telómero. En un aspecto, una subunidad catalítica de ARNasa P (humana o de E. coli) se modifican para generar una secuencia directriz que es complementaria con una parte del componente ARN de telomerasa de modo que la variante ARNasa P puede escindir el componente ARN de la telomerasa. Dichas ribozimas modificadas genéticamente pueden expresarse en las células o pueden transferirse por varios medios (por ejemplo, liposomas, inmunoliposomas, biolística, absorción directa en células, etc.). Otras formas de ribozimas (ribozimas del intrón del grupo I (Cech T (1995) Biotechnology 13; 323); ribozimas de cabeza de martillo (Edgington SM (1992) Biotechnology 10: 256) pueden modificarse genéticamente basándose en la información de la secuencia del componente ARN de telomerasa descubierta para catalizar la escisión del componente ARN de la telomerasa humana y/o las secuencias con repetición del telómero humano.

Por lo tanto, la invención proporciona una amplia variedad de oligonucleótidos para inhibir la actividad de la telomerasa. Dichos oligonucleótidos pueden utilizarse en los métodos terapéuticos de la invención para el tratamiento de la enfermedad, cuyos métodos comprenden la administración a un paciente de una dosis terapéuticamente eficaz de un inhibidor de telomerasa o un activador de la invención. Se puede medir la inhibición o activación de la telomerasa para determinar la cantidad de un agente que debería administrarse en una dosis terapéuticamente eficaz utilizando los protocolos de análisis descritos en la publicación de la patente PCT nº 93/23572 indicados anteriormente. Como se indicó en esas aplicaciones y se expuso anteriormente, la inhibición de la actividad de la telomerasa vuelve inmortal una célula mortal, aunque la activación de la actividad de la telomerasa puede aumentar la duración replicadora de una célula. La terapia de inhibición de la telomerasa es un tratamiento eficaz contra los cánceres que implica el crecimiento incontrolado de células inmortales y la activación de la telomerasa es un tratamiento eficaz para prevenir la senectud celular. La administración de agentes que inhiben o bloquean la actividad de la telomerasa, tal como un oligonucleótido de cadena complementaria, un oligonucleótido formador de triple hélice, una ribozima o un plásmido que dirige la expresión de un componente ARN mutante de telomerasa puede impedir la acción de la telomerasa y conducir finalmente a la senectud celular y a la muerte celular de las células tratadas.

Aspectos terapéuticos y profilácticos

Además, la presente invención proporciona métodos terapéuticos que aseguran que las células normales permanecen mortales; por ejemplo, el componente ARN puede modificarse utilizando los procedimientos de ingeniería genética habituales para eliminar toda o una parte de un gen natural que codifica el componente (p. ej., mediante mutagénesis in vitro) por recombinación genética. Dichas células serán entonces irreversiblemente mortales. Este procedimiento es útil en terapia génica, donde las células normales modificadas para contener los plásmidos de la expresión se introducen en un paciente y se quiere asegurar que las células cancerosas no se introduzcan o, si dichas células se introducen, entonces las células se han vuelto irreversiblemente mortales.

Debido a que la telomerasa es activa únicamente en la línea germinal del tumor y determinadas células madre del sistema hematopoyético, otras células normales no son afectadas por la terapia de inhibición de la telomerasa. Las etapas también puede considerarse que impiden el contacto del inhibidor de telomerasa con las células de la lineal germinal o con las células madre, aunque éste puede no ser esencial. Por ejemplo, debido a que las células de la línea germinal expresan la actividad de la telomerasa, la inhibición de la telomerasa puede impactar negativamente la espermatogénesis y la viabilidad del esperma, lo que sugiere que los inhibidores de telomerasa pueden ser anticonceptivos o agentes de esterilización eficaces. Sin embargo, este efecto anticonceptivo puede no ser deseado por un paciente que recibe un inhibidor de telomerasa de la invención para el tratamiento del cáncer. En dichos casos, se puede administrar un inhibidor de telomerasa de la invención de manera que asegure que el inhibidor solamente se producirá durante el periodo de la terapia, de modo que el impacto negativo sobre las células de la línea germinal sea solamente transitorio.

Otros métodos terapéuticos de la invención emplean el ácido nucleico ARN de telomerasa de la invención para estimular la actividad de la telomerasa y prolongar la duración de la célula replicadora. Estos métodos pueden realizarse administrando a una célula una ribonucleoproteína telomerasa recombinante operativa de la invención a la célula. Por ejemplo, la ribonucleoproteína puede administrarse a una célula en un liposoma, o puede utilizarse el gen para el componente ARN de la telomerasa humana (o un gen recombinante con diferentes elementos reguladores) en un plásmido con expresión eucariótica (con o sin secuencias que codifican la expresión de los componentes proteicos de la telomerasa) para activar la actividad de la telomerasa en varias células humanas normales que de otro modo carecen de actividad de telomerasa detectable debido a los bajos niveles de expresión del componente ARN o un componente proteico de telomerasa. Si el componente ARN de telomerasa no es suficiente para estimular la actividad de la telomerasa, entonces el componente ARN puede transferirse junto con los genes que expresan los componentes proteicos de la telomerasa para estimular la actividad de la telomerasa. Por lo tanto, la invención proporciona métodos para tratar una enfermedad asociada con la actividad de la telomerasa en una célula o grupo de células poniendo en contacto la(s) célula(s)
con una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente que altera la actividad de la telomerasa en estas células.

Las células que incorporan más copias del gen para el ARN de telomerasa pueden presentar un aumento de actividad de la telomerasa y una duración replicadora prolongada asociada. Dicha terapia puede realizarse ex vivo en las células para la introducción posterior en un anfitrión o puede realizarse in vivo. Las ventajas de estabilizar o aumentar la longitud del telómero añadiendo genes de telomerasa exógenos ex vivo a células diploides incluyen: estabilización del telómero puede interrumpir la senectud celular y permitir potencialmente la ampliación ilimitada de las células; y las células diploides normales con una duración de la vida ampliada pueden cultivarse in vitro para experimentación del fármaco, preparación del virus u otros fines útiles. Además, las células madre ampliadas ex vivo de varios tipos pueden utilizarse en terapia celular para enfermedades concretas, como se indicó anteriormente.

La estabilización del telómero puede también suprimir la incidencia del cáncer en las células replicadoras impidiendo que los telómeros lleguen a ser críticamente cortos como células próximas a la crisis. Durante la crisis, se genera inestabilidad genómica masiva ya que se pierde el efecto protector del casquete telomérico. La "cubierta genética" se reconstruye y casi todas las células mueren. Las células raras que surgen de este proceso son típicamente aneuploides con muchas transposiciones génicas y acaban restableciendo la estabilidad en sus telómeros expresando la telomerasa. Si la crisis puede impedirse conservando los telómeros largos, entonces la inestabilidad genómica asociada a la crisis también puede evitarse, limitando las probabilidades de que una célula individual sufra el número requerido de mutaciones genéticas necesarias para producir un cáncer metastásico.

Las células que pueden ser dirigidas para la terapia génica de telomerasa (la terapia que implica aumentar la actividad de la telomerasa de una célula diana) incluyen pero no se limitan a las células madre hematopoyéticas (SIDA y quimioterapia posterior), células endoteliales vasculares (cardiopatía y enfermedad vascular cerebral), fibroblastos de la piel y queratinocitos basales de la piel (cicatrización de heridas y quemaduras) condriocitos (artritis), astrocitos del cerebro y células microgliales (enfermedad de Alzheimer), osteoblastos (osteoporosis), células de la retina (enfermedades oculares) y células de los islotes pancreáticas (diabetes tipo I).

Típicamente, los métodos terapéuticos de la invención implican la administración de un oligonucleótido que opera para inhibir o estimular la actividad de la telomerasa en condiciones fisiológicas in vivo y será estable en estas condiciones. Como se indicó anteriormente, los ácidos nucleicos modificados pueden ser útiles para comunicar dicha estabilidad, así como para asegurar la administración del oligonucleótido al tejido, órgano o célula deseado. Los métodos útiles para la administración de oligonucleótidos con fines terapéuticos se describen en Inouye et al., patente U.S. nº 5.272.065.

Aunque los oligonucleótidos pueden administrarse directamente como un fármaco en una formulación farmacéutica adecuada, se pueden administrar también oligonucleótidos utilizando terapia génica y plásmidos con expresión de ADN recombinante de la invención. Dicho plásmido ilustrativo se describe en el Ejemplo 8, más adelante. En general, dichos plásmidos comprenderán un activador y, opcionalmente, un potenciador (separado de cualquiera contenido en las secuencias del activador) que sirve para dirigir la transcripción de un oligorribonucleótido, así como otros elementos reguladores que proporcionan mantenimiento episómico o integración cromosómica y, si se desea, para la transcripción de alto nivel. Los vectores a bases de adenovirus se utilizan con frecuencia en terapia génica y son adecuados para su utilización junto con los reactivos y métodos de la presente invención. Véase la publicación de la patente PCT nº 94/12650; nº 94/12649 y nº 94/12629. Los activadores útiles para dichos fines incluyen el activador de la metalotioneína, el activador tardío principal de adenovirus constitutivo, el activador MMTV inducible con dexametasona, el activador SV40, el activador MRP polIII, el activador MPSV constitutivo, el activador CMV inducible con tetraciclina (tal como el activador CMV precoz inmediato humano) y el activador CMV constitutivo. Un plásmido útil para la terapia génica puede comprender otros elementos operativos, tal como marcadores seleccionables, zonas de identificación y otros genes. Los plásmidos con expresión de ADN recombinante pueden utilizarse también para preparar los oligonucleótidos de la invención para la administración por otros medios aparte de la terapia génica, aunque puede ser más económico acortar los oligonucleótidos mediante síntesis química in vitro.

En los aspectos relacionados, la invención caracteriza composiciones farmacéuticas que incluyen una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de telomerasa o de un activador de telomerasa de la invención. Las composiciones farmacéuticas de los inhibidores de telomerasa de la invención incluyen un componente ARN mutante de la telomerasa humana, un oligonucleótido de cadena complementaria o un oligonucleótido formador de triple hélice que se une al componente ARN o al gen para el mismo de la telomerasa humana o una ribozima capaz de escindir el componente ARN de la telomerasa humana o combinaciones de los mismos u otros productos farmacéuticos en un excipiente o sal farmacéuticamente aceptable. Otras composiciones farmacéuticas de la invención comprenden una preparación de activador de telomerasa, tal como telomerasa humana purificada o ARNm para los componentes proteicos de la telomerasa y el componente ARN de la telomerasa y se utilizan para tratar la enfermedad relacionada con la senectud. En un aspecto, un componente ARN de telomerasa de mamífero con cadena transcrita mutada se administra a una población de células, dicho componente ARN de telomerasa con cadena transcrita mutada comprende por lo menos una base incompatible con respecto a la secuencia repetida de telomerasa humana, pero es capaz de presentar actividad de telomerasa juntamente con el componente polipeptídico de la telomerasa humana, produciendo la incorporación incorrecta en posiciones del nucleótido seleccionado en la repetición de la telomerasa humana, generando por esta razón telómeros que se basan en la presencia continua del componente ARN de telomerasa con cadena transcrita mutado para la replicación sustancial. Se proporciona un método terapéutico en el que un componente de ARN de telomerasa con cadena transcrita mutada se administra a una población de células durante un periodo suficiente para introducir secuencias del telómero que son sustancialmente no operativas como plantillas para el componente ARN de telomerasa de mamífero natural, seguido de retirada del componente ARN de telomerasa con cadena transcrita mutada que produce la pérdida rápida de la longitud media del telómero en la población celular y aumento de senectud o mortalidad celular.

El agente terapéutico puede proporcionarse en una formulación adecuada para administración parenteral, nasal, oral u otro modo de administración. Véase la publicación de la patente PCT nº 93/23572, supra.

Métodos de diagnóstico

La presente invención proporciona métodos de diagnóstico y reactivos además de las formulaciones farmacéuticas de los métodos terapéuticos descritos anteriormente. La invención proporciona métodos de diagnóstico para determinar la concentración, cantidad o presencia del componente ARN de la telomerasa humana, telomerasa o actividad de la telomerasa en una célula, población de células o muestra de tejido. En un aspecto relacionado, la presente invención proporciona reactivos útiles para dichos métodos opcionalmente envasados en forma de kit junto con las instrucciones para utilizar el kit para poner en práctica el método de diagnóstico. Como se indicó anteriormente en relación con las pruebas realizadas para determinar que el clon pGRN7 contenía el ADNc para el componente ARN de la telomerasa humana, las concentraciones del componente ARN son elevadas en células tumorales. Por lo tanto, la detección del componente ARN es un diagnóstico útil para las células tumorales.

Además, las sondas o cebadores que se unen específicamente al componente ARN de la telomerasa humana (o a una de las dos cadenas del gen para el mismo) pueden utilizarse en métodos de diagnóstico para detectar la presencia del ácido nucleico de la telomerasa en una muestra. Los cebadores y sondas son oligonucleótidos que son complementarios, y por eso se unirán, a un ácido nucleico diana. Aunque los cebadores y sondas pueden diferenciarse en la secuencia y longitud, el factor de diferenciación primario es el de la función: los cebadores sirven para iniciar la síntesis de ADN, como en la ampliación del PCR, mientras que las sondas se utilizan típicamente sólo para unirse a un ácido nucleico diana. Las longitudes típicas para un cebador o una sonda pueden oscilar entre 8 y 20 hasta 30 o más nucleótidos. Un cebador o sonda puede también estar marcado para facilitar la detección (es decir, se utilizan típicamente moléculas radioactivas o fluorescentes con esta finalidad) o la purificación/separación (es decir, se utilizan con frecuencia biotina o avidina con esta finalidad).

Un método de diagnóstico especialmente preferido de la invención implica la detección de las secuencias del componente ARN de telomerasa en las células o muestras de tejido extraídas de pacientes que se sospecha que están en riesgo de contraer cáncer. Dichos métodos implicarán típicamente la fijación de una sonda o cebador marcado a una secuencia del componente ARN en condiciones tales que solamente las secuencias perfectamente compatibles (complementarias) se fijan (hibridan) entre sí. La detección del material marcado unido al ARN en la muestra se correlacionará con la presencia de actividad de telomerasa y la presencia de células cancerosas. Algunas células pueden expresar el componente ARN de telomerasa pero permanecen negativas a la telomerasa debido a la falta de expresión de los componentes proteicos de la telomerasa. Si se desea detectar la presencia de actividad de telomerasa en dichas células, entonces se podría aislar en primer lugar la proteína y a continuación determinar si la fracción de proteína contiene el componente ARN de telomerasa, que señalizaría la presencia de actividad de telomerasa. Los métodos de diagnóstico de la invención pueden ser especialmente útiles en la detección de la presencia de actividad de telomerasa en biopsias de tejido y secciones histológicas en las cuales el método se realiza in situ, típicamente después de la ampliación del componente ARN de telomerasa utilizando cebadores de PCR específicos de la invención.

La invención también proporciona sondas de polinucleótidos del componente ARN de telomerasa para el diagnóstico de estados patológicos (p. ej., neoplasia o preneoplasia) mediante detección de un componente ARN de telomerasa o transposiciones o ampliación del gen del componente ARN de telomerasa, en células explantadas de un paciente o la detección de un alelo del componente ARN de telomerasa patognómico (p. ej., por análisis RFLP o PCR específica del alelo). Típicamente, la detección será por hibridación in situ utilizando un polinucleótido del componente ARN de telomerasa marcado (p. ej., ^{32}P, ^{35}S, ^{14}C, ^{3}H, fluorescente, biotinilado, digoxigeninilado), aunque pueden utilizarse la transferencia Northern, la transferencia de manchas o la hibridación de la solución en ARN completo o poli A^{+} ARN aislado de una muestra de células, como puede utilizarse la ampliación por PCR que utiliza cebadores específicos del componente ARN de telomerasa. Las células que contienen una cantidad alterada de componente ARN de telomerasa en comparación con las células no neoplásicas del mismo tipo o tipos de células se identificarán como células enfermas experimentales. Asimismo, la detección de transposiciones patognómicas o la ampliación del locus del gen del componente ARN de telomerasa o los locus unidos íntimamente en una muestra de células identificarán la presencia de un estado patológico o una predisposición a desarrollar un estado patológico (p. ej., cáncer o enfermedad genética). Las sondas de polinucleótido se utilizan también para la identificación medicolegal de personas, tal como para las pruebas de paternidad o la identificación de sospechosos de crímenes o descendientes desconocidos.

En la población humana pueden existir alteraciones menores en la secuencia primaria básica del componente ARN de telomerasa, incluyendo las variantes alélicas, los poliformismos de la secuencia de restricción y los alelos de la enfermedad congénita del componente ARN de telomerasa asociados a la enfermedad genética.

Si se desea, los amplímeros de PCR para ampliar sustancialmente las copias del componente ARN de telomerasa completo pueden seleccionarse a discreción del médico de familia. Asimismo, pueden seleccionarse los amplímeros para ampliar fracciones del gen para el componente ARN de telomerasa o ARN.

Expresión del componente ARN de telomerasa

Dependiendo de la longitud y de la función pretendida del cebador, sonda u otras secuencias que comprendan ácido nucleico del componente ARN de telomerasa humana, pueden ser útiles los plásmidos de expresión de la invención. Por ejemplo, la producción recombinante del componente ARN completo de la invención puede realizarse utilizando un plásmido con expresión de ADN recombinante de la invención que comprenda un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos del componente ARN colocada para la transcripción bajo el control de un activador adecuado. Las células huésped de dichos plásmidos pueden ser procarióticas o eucarióticas, y el promotor, así como los demás elementos reguladores y marcadores seleccionables seleccionados para la incorporación en el plásmido de expresión dependerán de la célula huésped utilizada para la producción.

El gen del componente ARN intacto, es decir, el activador, que incluye cualquier secuencia reguladora en la zona 5' del gen y el componente ARN de la zona de codificación puede utilizarse para expresar el componente ARN en las células humanas, incluyendo las células humanas que han sido inmortalizadas mediante transformación vírica o cáncer. El activador del gen para el componente ARN puede ser regulado, sin embargo, y por esta y otras razones, se puede querer expresar el componente ARN bajo el control de un activador diferente. Por otra parte, el activador del gen para el componente ARN puede utilizarse independientemente de la secuencia de codificación del componente ARN para expresar otras secuencias de codificación de interés. Por ejemplo, se podría estudiar la regulación de la transcripción del gen para el componente ARN fusionando el activador del gen para el componente ARN a una secuencia de codificación para una secuencia de codificación del indicador, tal como la secuencia de codificación para la beta-galactosidasa y otra enzima o proteína cuya expresión pueda controlarse fácilmente. Por lo tanto, el activador y los demás elementos reguladores del gen para el componente ARN de la telomerasa humana pueden utilizarse no solamente para expresar el componente ARN sino también los componentes proteicos de la telomerasa humana, cadena complementaria u otros oligonucleótidos, así como otros productos génicos de interés en las células humanas. Los plásmidos de expresión que comprenden el gen intacto para el componente ARN de la telomerasa humana pueden ser especialmente útiles para una variedad de objetivos, incluyendo la terapia génica. Los expertos en la materia reconocen que puede utilizarse una amplia variedad de plásmidos de expresión para producir ácidos nucleicos útiles de la invención y que el término "plásmido", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a cualquier tipo de ácido nucleico (desde un fago, virus, cromosoma, etc.) que puede utilizarse para llevar la información genética específica en una célula huésped y mantener esta información durante un periodo de
tiempo.

Aislamiento del componente proteínico de telomerasa

Los reactivos de la presente invención también permiten la clonación y el aislamiento de los ácidos nucleicos que codifican los componentes proteicos de las enzimas telomerasa humanas así como de otros mamíferos, que no han estado disponibles anteriormente. El acceso a dichos ácidos nucleicos proporciona utilidades complementarias a las proporcionadas por los ácidos nucleicos que comprenden secuencias de ácido nucleico del componente ARN de la telomerasa humana. Por ejemplo, y como se indicó anteriormente, las utilidades terapéuticas de la presente invención pueden aumentarse, en algunos casos, mediante la utilización de preparaciones purificadas de los componentes proteicos de la telomerasa humana y mediante acceso a los ácidos nucleicos que codifica la misma. Los ácidos nucleicos de la invención que codifican el componente ARN de la telomerasa humana pueden utilizarse para aislar el ácido nucleico que codifica los componentes proteicos de la telomerasa humana, permitiendo el acceso a dichas utilidades. Por lo tanto, la invención proporciona métodos para aislar y purificar los componentes proteicos de la telomerasa humana así como para identificar y aislar ácidos nucleicos que codifican los componentes proteicos de la telomerasa humana. En los aspectos relacionados, la presente invención proporciona telomerasa humana purificada, ácidos nucleicos purificados que codifican los componentes proteicos de la telomerasa humana, plásmidos de expresión recombinante para los componentes proteicos de la telomerasa humana. La invención también proporciona componentes de telomerasa humana. La invención también proporciona composiciones que comprenden como ingrediente activo bien los componentes proteicos de la telomerasa o un ácido nucleico que codifica estos componentes proteicos o interactúa con los ácidos nucleicos que codifican estos componentes proteicos, tal como los oligonucleótidos de cadena complementaria, los oligonucleótidos que forman la triple hélice, ribozimas o plásmidos de expresión de ADN recombinante para cualquiera de los anteriores.

El componente ARN clonado de la telomerasa humana puede utilizarse para identificar y clonar ácidos nucleicos que codifican los componentes proteicos de la enzima ribonucleoproteína telomerasa. Pueden emplearse varios métodos diferentes para conseguir la identificación y clonación de los componentes proteicos. Por ejemplo, se puede utilizar la captura por afinidad de la enzima o enzima parcialmente desnaturalizada utilizando un ligando de afinidad ya sea (1) las secuencias de nucleótido complementarias del componente ARN que se une al componente ARN de la enzima intacta; o (2) el componente ARN que se une a los componentes proteicos o una enzima parcial o totalmente desnaturalizada. El ligando puede fijarse a un soporte sólido o químicamente modificado (p. ej., biotinilado) para la inmovilización posterior sobre el soporte. La exposición de los extractos celulares que contienen telomerasa humana, seguido de lavado y elución de la enzima telomerasa unida al soporte, proporciona una preparación muy purificada de la enzima telomerasa. Los componentes proteicos pueden purificarse entonces opcionalmente o analizarse directamente por secuenciado de proteínas. La secuencia proteica determinada puede utilizarse para preparar cebadores y sondas para la clonación del ADNc o identificar un clon en un banco genómico que comprende ácidos nucleicos que codifican un componente proteico de telomerasa.

La captura por afinidad de la telomerasa utilizando un componente ARN modificado genéticamente puede realizarse también utilizando ARN de telomerasa transcrito in vitro y un sistema para la reconstitución de la actividad enzimática de la telomerasa. Véase Autexier y Greider, 1994, Genes & Development 8:563-575. El ARN se modifica genéticamente para que contenga una etiqueta, similar al etiquetado del epítopo de proteínas. La etiqueta puede ser una secuencia de ARN a la que un ligando que se une fuertemente está disponible, por ejemplo, un anticuerpo específico de la secuencia de ARN, o un colorante orgánico que se une fuertemente a una secuencia de ARN específica. La tolerancia de la telomerasa para la secuencia y posición de la etiqueta puede analizarse utilizando métodos normalizados. La síntesis del componente ARN alterado y la etapa de reconstitución de este método pueden también realizarse in vivo. La captura por afinidad utilizando el ligando inmovilizado para la etiqueta de ARN puede utilizarse entonces para aislar la enzima.

Puede utilizarse además la identificación de la expresión para aislar los componentes proteicos de la enzima telomerasa. En este método, los bancos de expresión de ADNc pueden cribarse con ARN de telomerasa marcado y pueden identificarse las proteínas que codifican los ADNc que se unen específicamente al ARN de la telomerasa. Puede utilizarse también un método genético molecular que utiliza inhibición de la traducción para aislar ácidos nucleicos que codifican los componentes proteicos de la enzima telomerasa. En este método, las secuencias de ARN de telomerasa se fusionarán corriente arriba de un marcador seleccionable. Cuando se expresa en un sistema adecuado, el marcador seleccionable será operativo. Cuando se expresa el ADNc que codifica una proteína de fijación del ARN de telomerasa, la proteína se unirá a su secuencia de reconocimiento bloqueando por consiguiente la traducción del marcador seleccionable, permitiendo de este modo la identificación del clon que codifica la proteína. En otras formas de realización de este método, la traducción bloqueada del marcador seleccionable permitirá que se desarrollen células transformadas. Otros sistemas que pueden emplearse incluyen el "sistema trampa de interacción" descrito en la publicación de patente PCT nº WO 94/10300; el sistema de "un híbrido" descrito en Li y Herskowitz, 17 dic. 1993, Science 262:1870-1874, y Zervos et al., 29 ene. 1993, Cell 72:223-232; y el sistema de "dos híbridos" disponible el mercado en Clontech.

Los ensayos de fijación de ARN de telomerasa o de actividad de telomerasa para la detección de proteínas de fijación específicas y de la actividad pueden utilizarse para facilitar la purificación de la enzima telomerasa y la identificación de los ácidos nucleicos que codifican los componentes proteicos de la enzima. Por ejemplo, los ácidos nucleicos que comprenden secuencias del componente ARN pueden utilizarse como reactivos de afinidad para aislar, identificar y purificar péptidos, proteínas u otros compuestos que se unen específicamente a una secuencia contenida en el componente ARN, tal como los componentes proteicos de la telomerasa humana. Varios formatos diferentes están disponibles, incluyendo desplazamiento en gel, la fijación en el filtro, impresión de huellas, Northwestern (sonda de ARN de la transferencia proteica) y fotorreticulación, para detectar cada enlace y aislar los componentes que se unen específicamente al componente ARN. Estos análisis pueden utilizarse para identificar proteínas de fijación, para seguir la pista de la purificación de las proteínas de fijación, para caracterizar los sitios de fijación del ARN, para determinar el tamaño molecular de las proteínas de fijación, para marcar proteínas destinadas a aislamiento preparativo y para la inmunización posterior de animales destinados a la generación de anticuerpos para obtener anticuerpos para su utilización en el aislamiento de la proteína o en la identificación de un ácido nucleico que codifica la proteína en un sistema de transcripción/traducción acoplado.

Purificación del componente proteico de telomerasa de mamífero

El componente proteico de telomerasa de mamífero puede purificarse por métodos bioquímicos convencionales a partir de las células que expresan la telomerasa, tales como las células HT1080, las células 293 y otras líneas celulares inmortalizadas adecuadas. A título de ejemplo y no de limitación, la telomerasa humana puede purificarse a partir de extractos celulares. Los extractos de telomerasa de mamífero pueden separarse del componente ARN de telomerasa por tratamiento con una actividad de ARNasa u otro medio adecuado para disociar y/o degradar el componente ARN de telomerasa si bien dejando el componente proteico de telomerasa sustancialmente intacto y capaz de reconstitución con adición del componente ARN de telomerasa exógeno, tal como puede producirse de manera recombinante o similar. El componente proteico de telomerasa purificado de este modo y opcionalmente separado del componente ARN endógeno de telomerasa, puede utilizarse en los ensayos de identificación del agente descritos en la presente memoria y para otras utilizaciones.

Terapia génica

La transferencia de material genético exógeno en las células (es decir, transfección mediada por ADN) es un método esencial para la investigación básica en biología celular y genética molecular, así como la base para desarrollar métodos eficaces para terapia génica humana. Hasta ahora, la mayoría de las pruebas de transferencia génica aprobadas en los Estados Unidos se basan en vectores retrovíricos defectuosos de replicación que llevan una secuencia de polinucleótidos terapéuticos como parte del genoma retrovírico (Miller et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10: 4239; Kolberg R. (1992) J. NIH Res. 4: 43; Cornetta et al. (1991) Hum. Gene Ther. 2: 215). Los vectores adenovíricos también han sido descritos para utilización potencial en la terapia génica humana (Rosenfeld et al. (1992) Cell 68: 143).

El otro método de transferencia génica que ha sido aprobado para utilización en personas es la transferencia física del ADN del plásmido en liposomas directamente en las células tumorales in situ. A diferencia de los vectores víricos que tienen que propagarse en las células cultivadas, el ADN del plásmido puede purificarse hasta homogeneidad y de este modo reduce el potencial de contaminación patógena. En algunas situaciones (p. ej., células tumorales) puede no ser necesario que el ADN exógeno se integre de manera estable en la célula transducida, ya que puede bastar la expresión transitoria para describir las células tumorales. La transferencia del ADN mediada por liposomas ha sido descrita por varios investigadores (Wang y Huang (1987) Biochem. Biophys. Res. Commun. 147: 980; Wang y Huang (1989) Biochemistry 28: 9508; Litzinger y Huang (1992) Biochem. Biophys. Acta 1113: 201; Gao y Huang (1991) Biochem. Biophys. Res. Commun. 179: 280; Felgner WO 91/17424; WO 91/16024).

Se han descrito también inmunoliposomas como portadores de polinucleótidos exógenos (Wang y Huang (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 84: 7851; Trubetskoy et al. (1992) Biochem. Biophys. Acta 1131: 311). Los inmunoliposomas supuestamente podría esperarse que presenten especificidad mejorada de tipo celular en comparación con los liposomas en virtud de la inclusión de anticuerpos específicos que supuestamente se unen a los antígenos superficiales en tipos de células específicos. Behr et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86: 6982 describen la utilización de lipopoliamina como agente para mediar la propia transfección, sin necesidad de ningún fosfolípido adicional para formar liposomas.

Por consiguiente, un polinucleótido sustancialmente idéntico a por lo menos 25 nucleótidos, preferentemente 50 a 100 nucleótidos o más, de la secuencia del componente ARN de telomerasa o su complemento, está operativamente ligada a un activador heterólogo para formar una unidad de transcripción capaz de expresar un componente ARN de telomerasa o un polinucleótido del componente ARN de telomerasa de cadena complementaria en una célula humana. Dicha unidad de transcripción puede estar comprendida en un transgén, vector adenovírico u otra modalidad de terapia génica para la administración en las células humanas, tal como para la terapia de una enfermedad relacionada con la telomerasa (p. ej., neoplasia). Los métodos de administración adecuados del montaje de la expresión de la cadena transcrita o complementaria del componente ARN de telomerasa serán seleccionados por los médicos de familia a la vista de prácticas aceptables y de requisitos reguladores.

Formas de realización en animal transgénico

Los clones genómicos del componente ARN de telomerasa de mamífero, particularmente de genes del componente ARN de telomerasa que son sustancialmente idénticos al componente ARN de telomerasa de ratón, pueden utilizarse para construir montajes de direccionamiento homólogo para generar células y animales no humanos transgénicos que presentan al menos un alelo del componente ARN de telomerasa funcionalmente destruido. Las directrices para la construcción de montajes de direccionamiento homólogo pueden hallarse en la técnica, incluyendo: Rahemtulla et al. (1991) Nature 353: 180; Jasin et al. (1990) Genes Devel. 4: 157; Koh et al. (1992) Science 256: 1210; Molina et al. (1992) Nature 357: 161; Grusby et al. (1991) Science 253: 1417; Bradley et al. (1992) Bio/Technology 10: 534. Puede utilizarse direccionamiento homólogo para generar los denominados ratones "transgénicos" que son heterozigóticos u homozigóticos para un alelo del componente ARN de telomerasa inactivado. Dichos ratones pueden comercializarse como animales de investigación para la investigación del desarrollo del sistema inmunitario, neoplasia, espermatogénesis, pueden utilizarse como animales domésticos, pueden utilizarse para proteínas animales (producto alimenticio) y otras utilizaciones.

Los ratones híbridos destinatarios se obtienen según Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) y Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J. Robertson, ed., IRL Press, Washington, D.C., (1987). Las células madre embrionarias se manipulan según procedimientos publicados (Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach; E.J. Robertson, ed., IRL Press, Washington, D.C., (1987); Zjilstra et al. (1989) Nature 342: 435; y Schwartzberg et al. (1989) Science 246: 799.

Además, puede utilizarse un ADNc con el componente ARN de telomerasa o una copia genómica del gen para construir transgenes destinados a expresar el componente ARN de telomerasa a altas concentraciones y/o bajo el control de la transcripción de las secuencias de control de transcripción que no se producen de forma natural adyacentes al gen del componente ARN de telomerasa. A título de ejemplo pero no de limitación, un activador constitutivo (p. ej., un activador tk o pgk de HSV) o una secuencia reguladora de transcripción específica de estirpe celular (p. ej., un activador/potenciador del gen CD4 o CD8) puede estar operativamente ligado a una secuencia de polinucleótidos del componente ARN de telomerasa para formar un transgén (típicamente en combinación con un marcador seleccionable tal como un casete de expresión del gen neo). Dichos transgenes pueden introducirse en las células (p. ej., células ES, células madre hematopoyéticas) y células transgénicas y pueden obtenerse animales transgénicos no humanos según los métodos convencionales. Pueden utilizarse células transgénicas y/o animales transgénicos no humanos como agentes antineoplásicos y/o para identificar carcinógenos potenciales, ya que la sobreexpresión del componente ARN de telomerasa o la expresión inapropiada del componente ARN de telomerasa puede producir un estado preneoplásico o neoplásico.

Análisis de identificación del agente

Los polinucleótidos del componente ARN de telomerasa, las preparaciones del componente proteico de telomerasa, las plantillas con repetición del telómero y las reacciones de fijación y similares se ponen en práctica con relación a los Ejemplos Experimentales. Generalmente, los componentes proteicos de telomerasa se obtienen por purificación convencional de las células de mamífero que expresan telomerasa y se separan del componente ARN asociado antes de su utilización en los análisis descritos en la presente memoria. El médico de familia puede seleccionar condiciones acuosas concretas según los métodos convencionales. Para directrices generales, pueden utilizarse las condiciones acuosas tamponadas siguientes: NaCl 10 a 250 mM, Tris HCl 5 a 50 mM, pH 5 a 8, con adición opcional de catión(es) divalente(s) y/o quelantes metálicos y/o detergentes no iónicos y/o fracciones de membrana. Los expertos en la materia aprecian que las adiciones, deleciones, modificaciones (tal como pH) y sustituciones (tal como la sustitución de KCl por NaCl o la sustitución del tampón) puedan prepararse en estas condiciones básicas. Pueden hacerse modificaciones en las condiciones de reacción de enlace básico siempre que la formación de holoenzima de telomerasa específica y/o la actividad de telomerasa se produzca en la(s) reacción(es) de control. Las condiciones que no permiten la fijación específica y la escisión en las reacciones de control (sin agente incluido) no son adecuadas para su utilización en los ensayos de fijación.

Preferentemente, para determinar la fijación del componente ARN de telomerasa al componente proteico de telomerasa inmovilizado, la especie del componente ARN de telomerasa está marcada con un marcador detectable, normalmente un grupo biotinilo, un grupo fluorescente o un nucleótido incorporado radiomarcado. El marcado adecuado para el componente proteico de telomerasa comprende, pero no se limita a, radiomarcado por incorporación de un aminoácido radiomarcado (por ejemplo, leucina marcada con ^{14}C, glicina marcada con ^{3}H y metionina marcada con ^{35}S), radiomarcado por radioyodado tras la traducción con ^{125}I o ^{131}I (p. ej., reacción de Bolton-Hunter y cloramina T), marcado por fosforilación tras la traducción con marcado fluorescente con ^{32}P (p. ej., fosforilasa y fosfato inorgánico radiomarcado) por incorporación de un marcador fluorescente (p. ej. fluoresceína o rodamina) o marcado por otros métodos convencionales conocidos en la técnica. En las formas de realización en las que una de las especies de polipéptido está inmovilizada por fijación a un sustrato, el otro componente está generalmente marcado con un marcador detectable.

El ARN de telomerasa marcado o el componente proteico se pone en contacto con la proteína telomerasa inmovilizada o con el componente ARN, respectivamente, y la capacidad de un agente para alterar la cantidad de componente marcado que llega a estar inmovilizada (es decir, que se une al componente de telomerasa afín y está capturado). El tiempo y la temperatura de incubación de una reacción de fijación puede ser variado, siempre que las condiciones seleccionadas permitan que se produzca la fijación específica en una reacción de control donde ningún agente está presente. Preferentemente las formas de realización emplean una temperatura de reacción de aproximadamente por lo menos 15 grados centígrados, más preferentemente 35 a 42 grados centígrados y un tiempo de incubación de aproximadamente por lo menos 15 segundos, aunque para este fin son preferibles periodos de incubación más largos de modo que, en algunas formas de realización, se alcance un equilibrio de fijación. La cinética de fijación y la estabilidad termodinámica de los complejos unidos determina la latitud disponible para variar el tiempo, la temperatura, la sal, el pH y otras condiciones de reacción. Sin embargo, para alguna forma de realización concreta, las condiciones de reacción de fijación deseadas pueden ser calibradas fácilmente por el médico de familia utilizando métodos convencionales en la materia, que pueden incluir análisis de fijación que utilizan análisis Scatchard, análisis de Hill y otros métodos (Proteins, Structures and Molecular Principles, (1984) Creighton (ed.), W.H. Freeman and Company, Nueva York).

La fijación específica del componente proteico de telomerasa marcado para el componente ARN de telomerasa inmovilizado, respectivamente, se determina incluyendo la proteína del competidor no marcado (p. ej., albúmina) y/o el ARN no marcado. Una vez terminada la reacción de fijación, se detecta la cantidad de especies marcadas que está o están unidas específicamente a la especie inmovilizada. A título de ejemplo y no de limitación, tras un periodo de incubación adecuado para fijación, se separa la fase acuosa que contiene el componente proteico de telomerasa marcado no inmovilizado y el sustrato que contiene la especie de holoenzima telomerasa ligada inmovilizada y cualquier componente proteico de telomerasa marcado unido a ella se lava con un tampón adecuado, que contiene opcionalmente agente(s) de bloqueo no marcado(s) y se eliminan el o los tampones de lavado. Después del lavado, se determina la cantidad de marcador detectable que queda específicamente ligado al componente inmovilizado marcado (p. ej., por métodos ópticos, enzimáticos, autorradiográficos u otros métodos radioquímicos).

En algunas formas de realización, se incluye la adición de agentes de bloqueo no marcados que inhiben la fijación no específica. Ejemplos de dichos agentes de bloqueo comprenden, pero no se limitan a los siguientes: ADN del timo de ternero, ADN de esperma de salmón, ARN de levadura, oligonucleótidos de secuencia mixta (secuencia aleatoria o pseudoaleatoria) de varias longitudes, albúmina de suero bovino, detergentes no iónicos (NP-40, Tween, Triton X-100, etc.), proteínas de leche en polvo desnatada, reactivo de Denhardt, polivinilpirrolidona, Ficoll y otros agentes de bloqueo. Los médicos de familia pueden seleccionar, a su discreción, agentes de bloqueo en concentraciones adecuadas para ser incluidos en ensayos de fijación.

En las formas de realización en las que está inmovilizado un componente ARN de telomerasa o un componente proteico de telomerasa, puede utilizarse enlace covalente o no covalente a un sustrato. Las químicas de enlace covalente comprenden, pero no se limitan a, métodos bien caracterizados conocidos en la técnica (Kadonaga y Tijan (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 83: 5889). Un ejemplo, no para limitación, es el enlace covalente a un sustrato derivado del bromuro de cianógeno (tal como el derivado de CNBr de Sepharose 4B). Puede ser deseable utilizar un separador para reducir el impedimento estérico potencial del sustrato. La fijación no covalente de proteínas a un sustrato comprende, pero no se limita a, la fijación de la proteína a una superficie cargada y la fijación con anticuerpos específicos.

En una forma de realización, los agentes terapéuticos experimentales se identifican por su capacidad para bloquear la fijación de un componente proteico de telomerasa a un componente ARN de telomerasa.

Normalmente, el componente ARN de telomerasa utilizado en estos métodos comprende una secuencia del componente ARN de telomerasa de mamífero natural (p. ej., un componente ARN humano) aunque a veces se utilizan las secuencias del componente ARN de telomerasa mutante si el componente ARN de telomerasa mutante se une al componente proteico de telomerasa en las condiciones del ensayo de referencia (p. ej., condiciones fisiológicas).

En una forma de realización, los agentes moduladores de telomerasa experimentales se identifican por su capacidad para producir una reducción o aumento estadísticamente significativos en la transcripción de una secuencia indicadora de polinucleótidos (p. ej. gen de \beta-galactosidasa, gen de luciferasa, gen de HPRT) operativamente ligada a una secuencia reguladora de la transcripción de un gen para el componente ARN de telomerasa de mamífero, preferentemente un gen para el componente ARN de telomerasa humano, en una célula de mamífero metabólicamente activa. Puede insertarse un gen indicador (p. ej., HPRT) en una secuencia de restricción o en una secuencia truncada de un ADNc de ds de un componente ARN de telomerasa de mamífero para generar un montaje de direccionamiento homólogo o un transgén en el que, en una célula de mamífero viable, el gen indicador se coloca bajo el control de la transcripción del activador del gen del componente ARN de telomerasa endógeno y los elementos de control de la transcripción relacionados. Los agentes que producen una modulación de la transcripción dependiente de la dosis del gen indicador se identifican de este modo como agentes de modulación de telomerasa experimentales.

En una variación, un gen para el componente ARN de telomerasa endógena en una célula de mamífero se dirige con un montaje de direccionamiento homólogo para colocar una secuencia de polinucleótidos indicadora en enlace operable a la secuencia reguladora de la transcripción corriente arriba (p. ej., activador) del gen para el componente ARN de la telomerasa endógena en el locus cromosómico del gen endógeno. En una variación alternativa, un polinucleótido exógeno que comprende un polinucleótido indicador está operativamente ligado a una zona reguladora de la transcripción del gen para el componente ARN de la telomerasa de mamífero (p. ej., activador y secuencias de fijación del factor de transcripción corriente arriba); el polinucleótido exógeno se transfiere a una célula de mamífero en la que puede integrarse de manera no homogénea en una posición cromosómica y/o se mantiene o replica como polinucleótido episómico. Los agentes que producen una modulación de la transcripción estadísticamente significativa del polinucleótido indicador en las células tratadas con el agente se identifican por esta razón como agentes moduladores de telomerasa de mamífero experimentales.

Los agentes de modulación de la telomerasa que reducen la capacidad de la célula para reparar la alteración del telómero o inhibir la replicación del telómero (p. ej., por telomerasa natural endógena de inhibición competitiva) son agentes antineoplásicos experimentales o agentes sensibilizantes que sensibilizan las células (p. ej., células neoplásicas) a los agentes de alteración del telómero (p. ej., agentes alquilantes y radiación ionizante).

A continuación se analiza además la actividad antineoplásica de los agentes antineoplásicos experimentales en análisis que son utilizados de forma rutinaria para predecir de forma adecuada la utilización como fármacos antineoplásicos humanos. Ejemplos de estos análisis comprenden, pero no se limitan a: (1) capacidad del agente experimental para inhibir la capacidad de las células transformadas independientemente del anclaje para desarrollarse en agar-agar suave, (2) capacidad para reducir la tumorigenicidad de las células transformadas trasplantadas en ratones nu/nu, (3) capacidad para invertir la transcripción morfológica de las células transformadas, (4) capacidad para reducir el crecimiento de los tumores trasplantados en ratones nu/nu, (5) capacidad para inhibir la formación de tumores o las células preneoplásicas en modelos animales de carcinogénesis espontánea o provocada químicamente y (6) capacidad para producir un fenotipo más diferenciado en las células transformadas en las que se aplica el agente.

Los análisis para la detección de la capacidad de los agentes para inhibir o aumentar el componente proteico de telomerasa: componente ARN de telomerasa y/o la actividad enzimática de la telomerasa se proporcionan para facilitar la identificación con alto rendimiento de los bancos de agentes (p. ej., bancos de compuestos, bancos de péptidos y similares) para identificar los antagonistas o agonistas de telomerasa. Dichos antagonistas y agonistas pueden modular la actividad de telomerasa y por ello modular la competencia de reparación del telómero y el potencial replicador.

La administración de una dosis eficaz de un agente capaz de inhibir específicamente la actividad de telomerasa en un paciente puede utilizarse como un método terapéutico o profiláctico para el tratamiento de estados patológicos (p. ej., cáncer, inflamación, enfermedades linfoproliferantes, enfermedad autoinmunitaria, enfermedades neurodegenerativas, y similares) que son tratadas de manera eficaz modulando la actividad de la telomerasa y la reparación y replicación del ADN.

Para los expertos en la materia de la lectura de esta exposición es evidente, que la presente invención proporciona reactivos valiosos en relación con la telomerasa humana, así como una variedad de métodos terapéuticos y de diagnóstico útiles. La descripción anterior de la necesidad proporciona una muestra limitada de dichos métodos, que no debería considerarse limitativa del alcance de la invención. Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de los ejemplos y reivindicaciones siguientes.

Los ejemplos siguientes describen aspectos específicos de la invención para ilustrar la invención y proporcionar una descripción de los métodos utilizados para aislar e identificar el componente ARN de telomerasa humana para los expertos en la materia. Los ejemplos no deberían ser considerados como limitativos de la invención, ya que los ejemplos proporcionan meramente la metodología específica útil en la comprensión y puesta en práctica de la invención.

Ejemplos experimentales Compendio

La clonación del componente ARN de telomerasa humana necesitaba un método nuevo que implica la selección negativa y ciclos de selección positiva, descrito a continuación. Inicialmente, sin embargo, se hizo un intento para clonar el componente ARN utilizando la transcripción inversa y un método para clonar los extremos del ADNc denominado ampliación de PCR 5'-RACE. La reacción de transcripción inversa se inició con un cebador idéntico a la unidad de repetición en la fracción de una sola cadena de un ADN telomérico humano y por lo tanto complementaria con una secuencia que se cree que está presente en el componente ARN de la telomerasa humana. El cebador comprendía también, en su extremo 5', una secuencia correspondiente a una secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción. Sin embargo, cuando se examinó el ADNc producido por reacción de transcripción inversa y ampliación por PCR mediante electroforesis en gel y análisis de la secuencia de nucleótidos de las bandas de ácido nucleico presentes en el gel, solamente se detectaron secuencias de ARN ribosómico. Problemas similares se encontraron cuando se intentaron variaciones de este método 5'-RACE utilizando cebadores anidados.

El esfuerzo de clonación con éxito comenzó con la preparación del ADNc de preparaciones purificadas de telomerasa humana así como de líneas celulares que presentan actividad de telomerasa humana y de líneas celulares que no presentan actividad de telomerasa humana detectable. El método utilizado para preparar el ADNc se describe con detalle en el Ejemplo 1, a continuación. Se utilizaron dos etapas de selección negativa y ciclos sucesivos de selección positiva junto con las preparaciones de ADNc de las dos líneas celulares humanas para disminuir la concentración de las secuencias no deseadas y para aumentar la concentración de las secuencias deseadas del componente ARN.

Las etapas de selección negativas implicaban la preparación del producto de la PCR biotinilado a partir del ADNc preparado a partir de una línea celular humana que no presenta actividad detectable de telomerasa. El producto de PCR biotinilado se desnaturalizó y a continuación se volvió a hibridar en una solución que comprende una concentración mucho menor de producto de PCR no biotinilado (100:1 producto biotinilado:producto no biotinilado) del ADNc preparado a partir de una línea celular humana que no presenta actividad de telomerasa. Dada la posibilidad de que la línea celular negativa de telomerasa pueda contener alguna cantidad baja de componente ARN, se realizó la etapa de hibridación para discriminar o seleccionar contra sólo el ARN expresado abundantemente en ambas líneas celulares. Tras la hibridación a un C_{o}t seleccionado para permitir la hibridación del ARN expresado de manera más abundante, se eliminó el material no deseado mediante la fijación a partículas magnéticas tratadas con estreptavidina; el sobrenadante restante tras la recogida de partículas contenía el ADNc deseado para el componente ARN de telomerasa humana. El procedimiento para la ampliación por PCR del ADNc se describe en el Ejemplo 2 más adelante.

Este material se enriqueció más para el ADNc deseado mediante ciclos sucesivos de selección positiva. En la etapa de selección positiva, una sonda biotinilada complementaria con la secuencia de la plantilla prevista en el componente ARN de telomerasa humana se hibridó con el producto de PCR de una muestra enriquecida (por selección negativa) del ADNc ampliado por PCR procedente de una línea celular humana que presenta actividad de telomerasa. Tras la hibridación, los complejos sonda/diana se fijaron a perlas magnéticas tratadas con avidina, que se recogieron a continuación y se utilizaron como fuente de ácido nucleico enriquecido en secuencias del componente ARN en ciclos adicionales de selección positiva. El procedimiento de selección positiva se describe con más detalle en los Ejemplos 3 y 4, más adelante.

Después del tercer ciclo de selección positiva, los productos de ampliación se separaron por electroforesis en gel y se eliminaron las secciones del gel correspondiente a los ácidos nucleicos de tamaño \sim200 bp. Los ácidos nucleicos se eluyeron a continuación a partir de las secciones en gel y se amplificaron por PCR. Los productos de amplificación por PCR se digirieron con la enzima de restricción NotI y a continuación se insertaron por ligadura en la secuencia NotI del plásmido pBluescriptIISK+, disponible en el mercado en Stratagene. Los plásmidos resultantes se transformaron en células huésped de E. coli y se aislaron las colonias individuales y se utilizaron como fuente de ácido nucleico para análisis adicionales y secuenciado de ADN. A continuación se analizaron numerosos clones positivos mediante esta prueba por secuenciado de ADN y varias otras pruebas.

Estas otras pruebas incluían las siguientes: (1) determinación de si los oligonucleótidos de cadena complementaria complementarios con el supuesto componente ARN inhibirían la actividad de telomerasa en los extractos celulares humanos que se conoce que contienen telomerasa; (2) determinación de si los cebadores de PCR específicos para una supuesta secuencia del clon del componente ARN podrían utilizarse para ampliar un ácido nucleico presente en una muestra de telomerasa y si el producto observado, si existe, seguiría la pista de la actividad de telomerasa durante la purificación de la telomerasa; y (3) determinación de si los cebadores de PCR específicos para una secuencia del clon del componente ARN supuesta podrían utilizarse para ampliar un ácido nucleico presente en mayor cantidad en los extractos celulares de las células en las que se conoce que la actividad de telomerasa es elevada (es decir, células tumorales) que en los extractos celulares de las células conocidos porque no producen o producen únicamente bajas cantidades de actividad de telomerasa. Un clon, denominado plásmido pGRN7, produjo resultados en estas pruebas acordes con la determinación de que el plásmido comprendía ADNc correspondiente al componente ARN de telomerasa humana.

Por lo tanto, los oligonucleótidos de cadena complementaria correspondientes a las secuencias de la secuencia del componente ARN supuesta de pGRN7 presentaban inhibición de la actividad de telomerasa in vitro. Asimismo, cuando se purificó la telomerasa procedente de extractos celulares mediante un procedimiento que implica (1) cromatografía en DEAE; (2) cromatografía en Sephadex S300; y (3) gradiente de glicerol, sepharose SP o separación de fenil sepharose y las fracciones recogidas, cebadores de PCR específicos para la secuencia del componente ARN supuesta de pGRN7 ampliaron un ácido nucleico del tamaño apropiado y la cantidad de producto de ampliación se correlacionó bien con la cantidad de actividad de telomerasa observada en las fracciones recogidas. Por último, los extractos celulares procedentes de células normales (actividad de telomerasa no detectable) y cancerosas (actividad de telomerasa presente), así como de testículos (actividad de telomerasa presente), presentaban cantidades correspondientes de producto de PCR en la transcripción inversa y en la ampliación por PCR (RT-PCR) con cebadores específicos para el componente ARN supuesto comprendido en pGRN7. El protocolo para la RT-PCR se describe en los Ejemplos 5 y 6, más adelante.

Los resultados anteriores proporcionaron pruebas convincentes de que el componente ARN de telomerasa humana se había clonado, así pues el plásmido pGRN7 se utilizó a continuación para aislar un clon genómico para el componente ARN de una línea celular humana, como la descrita en el Ejemplo 7, más adelante. Se identificó el clon genómico y se aisló en un banco genómico de ADN humano insertado en un vector lambda FIXII adquirido en Stratagene. El clon deseado que comprende las secuencias génicas para el componente ARN contenían una inserción de \sim15 kb y se denominó clon 28-1. Este clon se ha depositado en la American Type Culture Collection y está disponible con el nº de registro 75925. Se subclonaron varios fragmentos de restricción procedentes de este fago y se secuenciaron. El gen se ha localizado también en el extremo distal del brazo q del cromosoma 3. La información de la secuencia obtenida a partir de la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción SauIIIA1 y un extremo de la inserción de \sim15 kb a una secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción HindIII interna, que comprende toda la secuencia del componente ARN maduro así como los elementos de control de la transcripción del gen para el componente ARN, del clon lambda 28-1 se presentó anteriormente.

Ejemplo 1 Preparación del ADNc ampliable por PCR

Se obtuvo ARN de las células 293 e IMR-90 mediante extracción con tiocianato de guanidina o de fracciones de telomerasa purificadas mediante extracciones con fenol-cloroformo. El ARN total de las células 293 se fraccionó por tamaño en un gel de agarosa al 2% y se aisló el ARN de tamaño menor de 500 bp.

Se realizó la síntesis de la primera cadena del ADNc con transcriptasa inversa Superscript^{TM} II adquirida en Bethesda Research Laboratories (BRL). Se mezcló aproximadamente 0,5 a 1,0 \mug de ARN con aproximadamente 40 ng de cebador al azar (hexámero; pdN_{6}) en agua en un volumen total de 11 \mul. Se calentó la solución durante 10 min. a 95ºC y a continuación se enfrió en hielo 5 a 10 min. El ácido nucleico desnaturalizado se recogió por centrifugación. El ARN desnaturalizado y la mezcla de cebador se volvieron a poner en suspensión a continuación añadiendo, en el orden mostrado: 4 \mul 5\times de tampón de síntesis de la 1ª cadena; 2 \mul de ditiotreitol 0,1 M (DTT); 1 \mul de ARNsin (Pharmacia); y 1 \mul de dNTP (cada solución madre 2,5 mM). La mezcla de reacción se incubó a 42ºC durante 1 min., y a continuación se añadió 1 \mul (200 unidades) de Superscript^{TM} II RTasa (BRL) y se mezcló en la reacción, la cual se incubó a continuación durante 60 min. a 42ºC. La mezcla de reacción resultante, que contenía el ADNc recién sintetizado se colocó en hielo hasta realizar la síntesis de la segunda cadena.

Se realizó la síntesis de la segunda cadena de ADNc de la forma siguiente. Se mezclaron aproximadamente 20 \mul de la mezcla de reacción de la síntesis de la primera cadena de ADNc (de anteriormente) en el orden mostrado, con los componentes siguientes: 111,1 \mul de agua; 16 \mul de 10\times tampón de ADN ligasa de E. coli; 3 \mul de dNTP (cada solución madre 2,5 mM); 1,5 \mul de ADN ligasa de E. coli (15 unidades de BRL); 7,7 \mul de ADN polimerasa de E. coli (40 unidades de Pharmacia); y 0,7 \mul de ARNasa H (BRL) de E. coli. La solución restante se mezcló poco a poco y se incubó durante 2 horas a 16ºC, en cuyo momento se añadió 1 \mul (10 unidades) de T4 ADN polimerasa al tubo de reacción y se continuó la incubación durante 5 min. a la misma temperatura (16ºC). Se interrumpió la reacción y se recogió el ácido nucleico extrayendo la reacción dos veces con fenol/cloroformo, precipitando el ácido nucleico con etanol y centrifugando la mezcla de reacción para sedimentar el ácido nucleico.

El sedimento de ADNc recogido por centrifugación se volvió a poner en suspensión en 20 \mul de tampón TE y se ligó a un oligonucleótido de doble cadena denominado "NotAB" compuesto por dos oligonucleótidos (NH_{2} es un grupo amino de bloqueo):

NotA:: 5'-pARTGCGGCCGCAAGAATTCA-NH_{2}

NotB:: 5'-TGAATTCTTGCGGCCGCRTT-3'

El oligonucleótido de doble cadena se preparó mezclando 50 \mul de oligonucleótido NotA (100 pmol) con 50 \mul de oligonucleótido NotB (100 pmol) en 46,25 \mul de agua, calentando la solución resultante durante 5 min. a 95ºC y añadiendo 3,75 \mul de 20\times tampón SSC mientras la solución permanecía caliente. El tubo que contenía la mezcla se colocó a continuación en un vaso de precipitados que contenía agua caliente (a una temperatura entre aproximadamente 70 y 75ºC), cuya temperatura se dejó descender lentamente hasta por debajo de 15ºC, de modo que los dos oligonucleótidos pudieran hibridarse para formar el oligonucleótido NotAB de doble cadena. El ácido nucleico resultante se recogió por precipitación y centrifugación.

El oligonucleótido NotAB de doble cadena se volvió a poner en suspensión aproximadamente en 30 \mul de tampón TE y a continuación se ligó al ADNc en una mezcla de reacción que contenía 10 \mul de la preparación de ADNc descrita anteriormente, aproximadamente 50 pmol (calculada por DO_{260}) de NotAB; 2 \mul de 10\times tampón de T4 ADN ligasa; 1,2 \mul de T4 ADN ligasa; 0,2 \mul de ATP 10 mM; y agua en un volumen total de 20 \mul incubando la mezcla de reacción a 16ºC toda la noche. La reacción se inactivó térmicamente a continuación calentando la mezcla de reacción durante 10 min. a 65ºC. Aproximadamente de 1 a 2 \mul de la mezcla resultante se utilizó específicamente para la ampliación por PCR; se puede ampliar la mezcla de ligadura durante 10 a 15 ciclos (94ºC, 45 segundos; 60ºC, 45 segundos; y 72ºC, 1,5 min.) y guardar como solución madre tal como se describe en el Ejemplo 2.

Ejemplo 2 Ampliación de ADNc por PCR

El ADNc se amplió de la forma habitual preparando una mezcla de reacción de ampliación compuesta por 5 \mul de 10\times tampón de PCR (KCl 500 mM; Tris 100 mM, pH=8,3; y MgCl_{2} 20 mM; 5 a 8 \mul de dNTP (2,5 mM cada uno); 1 \mul de Taq polimerasa (Boehringer-Mannheim); 0,1 \mul de proteína del gen 32 (Boehringer-Mannheim); 6 \mul de cebador Not B (solución madre 20 \muM); 2 \mul del ADNc (preparado como se describe en el Ejemplo 1) y agua hasta 50 \mul. Esta mezcla se estratificó a continuación con 50 a 100 \mul de aceite mineral y se realizó la ampliación por PCR durante 10 a 15 ciclos de 94ºC, 45 segundos; 60ºC, 45 segundos; y 72ºC, 1,5 min. Después de la ampliación, la mezcla de reacción se extrajo con fenol/cloroformo y el ácido nucleico ampliado se precipitó con etanol y se recogió por centrifugación. El precipitado se disolvió a continuación en 100 \mul de tampón TE para preparar una solución madre.

Ejemplo 3 Ampliación por PCR para hibridación substractiva y selección cíclica

Para preparar el producto por PCR tanto para la hibridación subtractiva como para la selección cíclica, aproximadamente 1 \mul de una solución madre preparada según se describió en el Ejemplo 2 se amplió en 50 \mul de una mezcla de reacción de PCR preparada como se describió en el Ejemplo 2, excepto que los ciclos 21 a 24 de la hibridación del cebador, extensión y desnaturalización del producto de realizaron. Tras la ampliación, se extrajeron mezclas de reacción con fenol/cloroformo, se precipitaron con etanol y se recogieron por centrifugación. Se estimó el rendimiento del producto tiñendo con bromuro de etidio después de la electroforesis en gel de agarosa de una pequeña alícuota de la mezcla de reacción. Para la hibridación por substracción, se amplió un banco de ADNc de células negativas a telomerasa (IMR-90) en presencia de dUTP biotinilado. Se utilizó una relación aproximadamente de 100 a 1 de ADNc de células negativas a telomerasa (IMR-90) a ADNc de células positivas a telomerasa (293) para realizar la hibridación por substracción. Se utilizaron condiciones estándar a 65ºC durante 48 a 72 horas. Específicamente, aproximadamente 2 \mug de producto ácido nucleico del ADNc parcialmente purificado y material seleccionado negativamente se utilizó durante al menos dos rondas de selección cíclica.

Después de la selección cíclica, descrita en el Ejemplo 4, aproximadamente 1 a 2 \mul de los productos "rebajados" seleccionados (más de un volumen total de 20 \mul) se ampliaron por PCR como se describió en el Ejemplo 2 durante 22 ciclos, se precipitaron con etanol y se recogieron por centrifugación en preparación para la selección cíclica adicional.

Ejemplo 4 Selección positiva del ADNc ampliado por PCR

Para la etapa de selección positiva del procedimiento de selección cíclica utilizado para clonar el componente ARN de la telomerasa humana, se diluyeron aproximadamente 2 \mug del ADNc ampliado por PCR en 25 \mul de tampón TE y a continuación se mezclaron con 1,25 \mul de 20\timesSSC y la solución resultante se calentó a 95ºC durante 3 min. La temperatura se redujo a 60ºC durante 5 min. y se añadió un \mul (0,1 \mug/\mul) de la sonda R2 o R4 biotinilada. Las secuencias de estas sondas se muestran a continuación. Las sondas son sondas de O-meti-ARN, así U es O-metil-uridina, A es O-metil-riboadenina, G es O-metil-riboguanina e I es inosina.

: R2: 5'-UUAGGGUUAGII-biotina

: R4: 5'-AUUGGGUUAUII-biotina

La sonda R2 es específica para la repetición del telómero y la sonda R4 es específica para ARNasa P, que se utilizó para hacer el seguimiento de la eficacia y la eficiencia del proceso de selección cíclica. Realizando una selección cíclica simultáneamente pero por separado de ARN de ARNasa P, molécula de secuencia conocida, se puede tener mayor confianza en que el proceso de selección cíclica está funcionando apropiadamente con respecto a la molécula de interés, en este caso el componente ARN de la telomerasa humana.

Después de añadir una de las sondas R2 o R4 a la mezcla a 65ºC, se redujo la temperatura de la mezcla de reacción de hibridación a 30ºC incubando la mezcla a esta temperatura durante 5 min., y a continuación las mezclas de reacción se redujeron más hasta una temperatura de 14ºC incubando a esta temperatura durante 60 min. Por último, se incubó la mezcla a 4ºC durante 2 a 12 horas.

La mezcla de reacción de hibridación completa para cada muestra (R2 o R4) se añadió a 400 \mul de 0,5\timesSSC a 4ºC y a continuación se añadió a un tubo de perlas magnéticas enfriado con hielo, que se adquirieron en Promega y se prelavó cuatro veces con 0,5\timesSSC antes de su utilización. La mezcla resultante se incubó 30 min. a 4ºC para asegurar la unión completa a las perlas magnéticas. Cada tubo de reacción se incubó a continuación brevemente a temperatura ambiente en la posición magnética (Promega) para hacer caer las perlas. Las perlas se volvieron a poner en suspensión en 0,5\timesSSC frío (600 \mul) y se colocaron (en un tubo) sobre yodo. Se lavaron las muestras tres veces más con 0,5\timesSSC de esta manera. Se eluyó el ácido nucleico de las perlas volviendo a poner en suspensión las perlas en 100 \mul de agua e incubando durante 2 min. a 65ºC antes de volver a colocar las perlas en la posición magnética para su recogida. Este proceso se repitió tres veces más; la última vez las perlas resuspendidas se incubaron durante 5 min. a 65ºC antes de colocar las perlas sobre el soporte magnético para su recogida. Los 100 \mul sobrenadantes (de cada muestra) se agruparon y se secaron por debajo de 20 \mul en una centrifugadora SpeedVac^{TM}. El ADN se amplió por PCR a continuación para otra ronda de ampliación y selección. Después de cada ampliación, los productos por PCR se extrajeron dos veces con fenol-cloroformo, se precipitaron en etanol y se volvieron a poner en suspensión en 20 \mul de tampón TE.

Normalmente, las ampliaciones por PCR se verificaron mediante electroforesis en gel de agarosa. Además, se utilizaron varios controles para controlar el proceso de selección cíclica. Como referencia, se colocaron las "brazos" de PCR (oligonucleótidos de secuencia definida que sirven como sitios de hibridación del cebador) en un ácido nucleico que comprendía un gen que confiere resistencia a la neomicina. El ácido nucleico resultante se mezcló con el ADNc ampliado por PCR y se controló en cada solución por PCR cuantitativa. Como otra referencia, se siguió la ARNasa P tanto en la ARNasa P seleccionada como en los bancos seleccionados del componente ARN de telomerasa.

Ejemplo 5 Protocolo de RT-PCR

Se preparó la primera cadena de ADNc de acuerdo sustancial con el procedimiento descrito en el Ejemplo 1. Básicamente, se purificó el ARN de cada fracción de telomerasa que contiene 0,1 a 1 \mug de ARN; típicamente, aproximadamente se utilizó un tercio a un quinto del ARN preparado a partir de una fracción de 300 \mul. El ARN se mezcló con 40 a 80 ng de hexámero aleatorio en 10 \mul, se desnaturalizó durante 10 min. a 95ºC (utilizando un instrumento de ciclación térmico) y se enfrió en hielo. El ARN desnaturalizado y el hexámero se añadieron a una mezcla de reacción que contenía 4 \mul de 5\times tampón de síntesis de la primera cadena suministrado por el fabricante de la transcriptasa inversa (RTasa adquirido en BRL), 2 \mul de DTT 0,1 M, 1 \mul de dNTP 10 mM (cada uno), 1 \mul de inhibidor de ARNasa (Pharmacia), y agua hasta un volumen total de 9 \mul. La mezcla combinada se colocó en un baño de agua a 42ºC. Después de 1 a 2 min. de incubación, se añadió a la mezcla 1 \mul de Superscript^{TM} II RTasa (BRL). Se continuó la incubación durante 60 min. a 42ºC. Se interrumpió la reacción calentando el tubo durante 10 min. a 95-98ºC. La primera cadena de ADNc se recogió por centrifugación breve, se prepararon alícuotas en tubos nuevos, se congelaron rápidamente en nieve carbónica y se almacenaron a -80ºC o se utilizaron inmediatamente.

Ejemplo 6 Ampliación por PCR de ADNc con un conjunto de cebador específico

Para unos 20 \mul de reacción PCR con nucleótidos marcados radioactivamente, se mezcló 1 \mul del ADNc preparado según el procedimiento del Ejemplo 5 con 20 pmol del cebador 1, 20 pmol del cebador 2, 2,5 \mul de dNTP 2,5 mM, 5 \muCi de alfa-^{32}P-dATP, 2 unidades de Taq polimerasa (Boehringer-Mannheim), 0,2 \mug de proteína de T4 gen 32 (Boehringer-Mannheim), 2 \mul de 10\times tampón (KCl 500 mM, Tris-HCl-pH 8,3 100 mM y MgCl_{2} 20 mM) y agua hasta un volumen total de 20 \mul. A continuación se añadió una gota de aceite mineral al tubo.

Las condiciones de ampliación por PCR para el clon del componente ARN de telomerasa fueron: 94ºC durante 45 s., 60ºC durante 45 s., 72ºC durante 1,5 min. El número de ciclos difirió dependiendo del tipo de materiales purificados utilizados para la preparación ARN pero típicamente oscilan entre 18 y 25 ciclos. Como para todas las RT-PCR cuantitativas, se realizaron varias reacciones con diferentes ciclos para cada muestra para determinar cuándo la ampliación por PCR llegaba a estar saturada y no era lineal.

Para la ARNasa P utilizada como referencia, las condiciones de ampliación por PCR fueron: 94ºC durante 45 s., 50ºC durante 45 s. y 72ºC durante 1,5 min. De nuevo, el número de ciclos osciló entre 15 y 22 ciclos, dependiendo de la naturaleza de las muestras. Las secuencias de los cebadores utilizados para la ampliación de ARNasa P se presentan a continuación:

: P3: 5'-GGAAGGTCTGAGACRTG-3'

: P4: 5'-ATCTCCTGCCCAGTCTG-3'

El producto de PCR obtenido con estos dos cebadores es de aproximadamente 110 bp de tamaño.

Tras la PCR, los productos (5 a 10 \mul de la mezcla de reacción) se cargaron en un gel de poliacrilamida natural al 6% y se realizó la electroforesis. Tras la electroforesis, el gel se secó y se expuso a una casete de PhosphorImager^{TM} o a película autorradiográfica para análisis.

Ejemplo 7 Clonación del gen para el componente ARN de telomerasa humana

Se realizaron los procedimientos utilizados para clonar el gen para el componente ARN de telomerasa humana como describe generalmente Maniatis et al., Laboratory Molecular Cloning Manual. Se adquirió en Stratagene un banco de ADN genómico de ADN de la línea celular WI-38 de fibroblastos de pulmón humano insertada en el vector FIXII lambda de fago. Los fagos se colocaron en placas a una concentración de aproximadamente 25.000 fagos por placa en tres series de 15 (150 mm) placas. Las placas se prepararon con agar-agar con NZY y agarosa con la parte superior de NZY; las células utilizadas para la transformación del fago eran células XL1BlueMRAP2; y los transformantes se cultivaron durante la noche aproximadamente 16 horas a 37ºC. Las placas se enfriaron a continuación a 4ºC durante aproximadamente una hora y a continuación las placas se "montaron" en círculos de nilón C/P (papel de filtro de Bio Rad). Este proceso se repitió para producir una serie por duplicado de los filtros montados. Los filtros (por duplicado) se desnaturalizaron, neutralizaron, equilibraron en 6\times tampón SSC, se expusieron a irradiación UV para reticular el ácido nucleico en el filtro y a continuación se secaron en papel de transferencia.

La prehibridación se realizó durante una hora a 37ºC en tampón de formamida al 50%. Los filtros se sondaron con un fragmento NotI marcado radioactivamente de \sim218 bp del clon pGRN7, que se había aislado por electroelución de un gel de poliacrilamida al 5% después de la separación por electroforesis y a continuación se tradujo el corte con alfa-^{32}P-dCTP utilizando un kit de traducción del corte de Boehringer-Mannheim Biochemicals según las instrucciones del fabricante. Se utilizaron aproximadamente 25 ng (\sim10 \muCi de marcador) de la sonda por filtro y se realizó la hibridación toda la noche a 37ºC en tampón de hibridación de formamida al 50%. Tras la hibridación, se lavaron los filtros a temperatura ambiente seis veces; los primeros tres lavados fueron con 6\times SSC que contenía SDS al 0,1% y los tres lavados últimos fueron con 6\times SSC solo. Tras una exposición inicial de varios filtros por duplicado en un casete PhosphorImager^{TM} para comprobar la eficacia de la hibridación y la intensidad de la señal, se lavaron los filtros a 65ºC en 0,5\times SSC. Se colocaron a continuación los filtros bajo película Kodak XAR5 utilizando dos pantallas intensificadoras y se dejó exponer la película durante aproximadamente 100 horas a -70ºC.

Una señal intensa se desprendía del filtro que contiene un fago, denominada después 28-1, que comprendía el gen para el componente ARN de telomerasa humana. La placa correspondiente a la señal observada en el filtro se utilizó para preparar placas secundarias, de modo que una placa aislada (confirmada por sondeo con ácido nucleico de pGRN7 marcado) podría cultivarse durante el aislamiento en gran escala del ADN del fago. El fago 28-1, disponible en la American Type Culture Collection con el nº de registro 75925, comprende una inserción de \sim15 kb y comprende varios fragmentos de restricción que contienen secuencias que se hibridan con las secuencias del componente ARN en pGRN7: un fragmento de la enzima de restricción de EcoRI de 4,2 kb; un fragmento de la enzima de restricción ClaI de 4,2 kb y un fragmento de la enzima de restricción HindIII-SacI de 2,5 kb. El último fragmento comprende la secuencia completa de \sim560 nucleótidos del componente ARN mostrado anteriormente y se cree que comprende el gen completo para el componente ARN. El plásmido que comprende el fragmento de la enzima de restricción HindIII-SacI de 2,5 kb en el vector pBluescript se denominó plásmido pGRN33 y está disponible en la American Type Culture Collection con el nº de registro ATCC 75926. Para la ampliación el gen humano puede comprender otras secuencias aparte de las del fragmento 2,5 kb, estas secuencias pueden aislarse del fago 28-1 o de otros clones del fago identificados mediante sondeo con el fragmento de 2,5 kb (u otra sonda de la invención). Los fragmentos de la enzima de restricción observados anteriormente se prepararon en digestos de enzima de restricción por separado; los productos de los digestos se separaron por electroforesis en un gel de agarosa al 0,7%, para el fragmento de \sim2,5 kb solamente, un gel de poliacrilamida al 3%, y las bandas deseadas se cortaron en el gel y se prepararon para su clonación utilizando el kit II de GeneClean^{TM} (de Bio101, Inc.) o por electroelución en tubería de diálisis Spectropor nº 2 en 0,1\times TBE a 100 V durante dos horas (para el fragmento de \sim2,5 kb
solamente).

Estos fragmentos de la enzima de restricción se subclonaron en plásmidos de expresión/mutagénesis de E. coli procedentes de plásmidos a base de pUC o de plásmidos pBluescriptII que también comprenden un origen SV40 de replicación (pero no actividad del activador SV40). Los plásmidos resultantes pueden utilizarse para preparar ácidos nucleicos del componente ARN alterado (mutado) para la introducción en células humanas u otras eucarióticas para varios fines, tal como los descritos anteriormente en la Descripción de las formas de realización prefe
ridas.

Ejemplo 8 Plásmidos de cadena complementaria para el componente ARN de telomerasa humana

Se prepararon plásmidos de expresión de cadena complementaria mediante ampliación por PCR del ADNc con componente ARN utilizando los conjuntos de cebador siguientes: (1) NotB y G1, que produce un ácido nucleico de cadena complementaria que es más pequeño que la inserción del ADNc en el plásmido; y (2) NotB y R3C, que produce un ácido nucleico de cadena complementaria completo (en relación con la inserción en el plásmido). La secuencia de nucleótidos de NotB se presenta en el Ejemplo 1, anterior; las secuencias de nucleótidos de los cebadores G1 y R3C se presentan a continuación.

: G1: 5'-GAGAAAAACAGCGCGCGGGGAGCAAAAGCA-3'

: R3C: 5'-GTTTGCTCRTGAATGAACGGTGGAAG-3'

Tras la ampliación por PCR, los fragmentos ampliados se clonaron en un plásmido de expresión de \sim10 kb en una secuencia PmlI; el plásmido comprende DHFR, que comunica resistencia a la puromicina, y genes que comunican resistencia a la higromicina B como marcadores seleccionables, el origen de replicación SV40; el activador del gen con metalotioneína inducible humano colocado para la expresión de la cadena complementaria del gen para el componente ARN de telomerasa humana (se puede también utilizar un activador más fuerte para obtener niveles de expresión más altos) y la secuencia de adición de poli A tardía SV40.

Los plásmidos resultantes (denominados pGRN42 para el producto NotB/G1 y pGRN45 para el producto NotB/R3
C) se transfectaron por el procedimiento del fosfato de calcio (véase Maniatis et al., supra) en la línea celular HT1080 de fibrosarcoma. Las células HT1080 son normalmente inmortales; la expresión del ARN de cadena complementaria para el componente ARN de telomerasa humana debería evitar la asociación del componente ARN de telomerasa humana con los componentes proteicos, bloqueando la formación de la telomerasa activa y volviendo mortales las células.

Ejemplo 9 Identificación y aislamiento de los ácidos nucleicos con componente ARN de mamíferos no humanos

Para ilustrar cómo los reactivos de la invención pueden utilizarse para identificar y aislar sustancialmente ácidos nucleicos homólogos de otras especies de mamífero, se utilizaron cebadores por PCR complementarios con secuencias del componente ARN humano para ampliar secuencias homólogas en una PCR. Un par cebador ilustrativo utilizado para demostrar este aspecto de la invención se compone del cebador +10, que posee la secuencia 5'-CACCGGGTTGCGGAGGGAGG-3' y del cebador R7, que posee la secuencia 5'-GGAGGGGCGAACGGGCCAG
CA-3'. Se preparó ADN genómico de tejido de chimpancé, mono ardilla, mono resus y mandril y se disolvió en tampón TE a una concentración de aproximadamente 0,5 a 4 mg/ml.

Para cada tipo de tejido, se preparó una mezcla de PCR, cuya mezcla comprendía: 1 \mul de ADN genómico, 48 \mul de Master Mix (Master Mix se compone de tampón 1\times TaqExtender^{TM} de Stratagene, 200 \muM de cada dNTP y 0,5 \muM de cada cebador) y 0,5 \mul de una mezcla 1:1 de Taq polimerasa (5 unidades/\mul, Boehringer-Mannheim): Tth polimerasa (TaqExtender^{TM} polimerasa, de Stratagene). Los tubos de reacción se cargaron en un ciclador térmico, que estaba programado para calentar en primer lugar la mezcla de reacción a 94ºC durante 5 minutos y a continuación realizar 27 ciclos de incubaciones a 94ºC durante 30 s., 63ºC durante 10 s., y 72ºC durante 45 s. Una vez terminada la reacción de ampliación, se cargaron aproximadamente 10 \mul de cada mezcla de reacción en un gel de agarosa al 2% para electroforesis. Tras la electroforesis, tinción del gel e irradiación con UV, se pudo observar que cada mezcla de reacción contenía una banda del tamaño (\sim200 bp) previsto. Los ácidos nucleicos de estas bandas pueden clonarse y secuenciarse y los genes para el componente ARN restantes de cada una de estas especies de mamífero pueden clonarse tal como se describió anteriormente para el gen destinado al componente ARN de telomerasa humana. El Ejemplo 14, más adelante, describe un ejemplo específico de secuenciado del gen para el componente ARN de telomerasa del mono ardilla.

Ejemplo 10 Secuencias mutadas del componente ARN de telomerasa humana de cadena transcrita

Este ejemplo demuestra que cambiando la secuencia para el componente ARN de telomerasa en la zona de la plantilla se altera la secuencia sintetizada por la telomerasa humana, conduciendo a cambios en las repeticiones cromosómicas de la telomerasa.

Para determinar si la reprogramación de la zona de la plantilla TRC3 produciría indicaciones para los cambios correspondientes en la repetición del telómero sintetizada en la actividad de telomerasa humana, un fragmento de gen que expresa el componente ARN de telomerasa completo (TRC3) se clonó y mutó la secuencia génica. El análisis de transferencia Southern demostró que TRC3 se hibridó a un gen de una sola copia en el genoma humano. Una copia genómica de TRC3 se aisló de un banco de fago lambda y se demostró que tenía la misma cartografía de restricción que la observada en las transferencias Southern genómicas sondadas con TRC3. Se aisló un fragmento HindIII-SacI de 2,6 kb y se subclonó en una versión modificada de pBluescript, generando el plásmido pGRN33 de TRC3 genómico. Los extremos 5' y 3' del ARN se cartografiaron utilizando la extensión del cebador, RACE PCR y RT-PCR. El tamaño del transcrito de ARN fue \approx550 bases, acorde con su migración en las transferencias Northern. La versión transcrita para TRC3 fue central para el clon genómico con 1,4 kb de la secuencia corriente
arriba.

Se extrajo ARN de preparaciones de telomerasa purificada y a continuación se utilizó en los experimentos siguientes. 5' RACE: se preparó ADNc de la primera cadena utilizando cebadores TRC3 de cadena complementaria (R3B: 5'-CAACGAACGGCCA GCAGCTGACATT) en presencia de ^{32}P-dATP. Se resolvieron los productos de la ampliación por PAGE y se identificaron por autorradiografía, se escindieron y se extrajeron. Se ligó un oligonucleótido (NotA: 5'-pARTGCGGCCGCTT GCCTTCA-NH_{2}) a estos productos de la primera cadena utilizando T4 ARN ligasa y se realizó a continuación la PCR utilizando un cebador anidado, R3c (5'-GTTTGCTCRTGAATGAACGGTGGAAG) y un oligonucleótido (NotB: 5'-TGAATTCTTGCGGCCGCRTT) complementario con el oligonucleótido NotA. Se resolvieron los productos de PCR en un gel de agarosa y las bandas se escindieron y se secuenciaron directamente utilizando el oligonucleótido G1 (5'-AGAAAAACAGCGCGCGGGGAGCAAAGCA) como cebador. Cartografía del extremo 3': Los intentos para realizar la RACE de 3' fracasaron. Posteriormente, se empleó una estrategia de RT-PCR en la cual se utilizaron una serie de cebadores de cadena complementaria complementarios con la secuencia del ADN genómico para la síntesis del ADNc de la primera cadena del cebador. Los cebadores en esta serie estaban espaciados a aproximadamente intervalos de 150 bp a partir del extremo 5' del transcrito, avanzando hacia el extremo 3'. Se realizó a continuación la PCR utilizando el cebador de la primera cadena y el cebador cuya secuencia era interna en el transcrito TRC3 conocido (F3b: 5'-TCRTACCCRTACTGAGAAGGGCGRTG). Se observaron bandas de PCR sensibles a la transcriptasa inversa del tamaño previsto cuando se utiliza ADNc preparado con todos los cebadores diseñados en el intervalo +100 a +450 (numeración correspondiente al extremo 5') pero no con cualquiera de los cebadores diseñados desde +558 a +950. Esto colocó el extremo 3' supuesto del transcrito TRC3 maduro entre la posición +450 y +558. Las rondas siguientes del diseño del cebador y de RT-PCR estrecharon este intervalo entre +545 y
+558.

\newpage

La secuencia de la plantilla prevista de TRC3 se alteró desde CUAACCCUA hasta CCAACCCCA (MuC) o CAAACCCAA (MuA) mediante mutagénesis in vitro (realizada sustancialmente según Perez et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 22485) del plásmido pGRN33 genómico. Si se incorporase en la telomerasa operativa, estos ARN mutantes deberían secuenciar la síntesis de TTGGGG (MuC) o TTTGGG (MuA) en lugar de la TRTGGG de repetición natural. Estas actividades de la telomerasa mutante podrían distinguirse fácilmente de la actividad natural ya que no requerirían más dATP para la actividad y solamente la actividad natural sería sensible a la terminación por ddATP. Se preparó también un mutante doble (MuC+17) en el cual una inserción de 17 bp estaba presente en +180 bp además de la plantilla MuC. Este mutante permitió la detección específica del ARN alterado con una sonda en la inserción de 17 bp o por tamaño.

Los 2,6 kb de la secuencia genómica eran suficientes para la expresión de TRC3 in vivo. Las células se transfectaron temporalmente con el plásmido MuC+17 y el ARN expresado procedente del ADN transfectado se detectó por RT-PCR utilizando la secuencia de inserción de 17 bp como cebador en la etapa de transcripción inversa. Se detectó el ARN en las células transfectadas con MuC+17 pero no en las células pseudotransfectadas, lo que indica que el clon genómico de 2,6 kb era suficiente para la expresión de TRC3. Los transformantes estables se obtuvieron a continuación a partir de cada uno de estos tres plásmidos mutantes mediante transfección con fosfato de calcio de las células HT1080 junto con pCMVneo. Se seleccionaron los clones resistentes en G418 y se comprobó por RT-PCR la expresión del ARN de MuC+17 (Irving et al. (1992) Exp. Cell Res. 202: 161).

Para probar la actividad de la telomerasa mutante, se analizaron los extractos de las células no transfectadas y de tres transformantes estables con los vectores MuC*, MuC o MuA integrados (C*, C o A en la Fig. 1). Dado que era de esperar que los extractos mutantes contuvieran actividades tanto de telomerasa natural como mutante, se emplearon varias condiciones de análisis para distinguir entre ellos. En las condiciones normales de reacción (dTTP, ^{32}P-dGTP y dATP) los tres extractos de la serie del montaje mutante presentaban actividad de telomerasa natural que era sensible a ARNasa (Fig. 1, bandas 1 a 6). Como era de esperar, esta actividad no se afectó cuando se incluyó ddCTP en las reacciones (Fig. 1, bandas 7 a 9) y se suprimió por ddTTP (bandas 10 a 12). En cambio, cuando se sustituyó ddATP por dATP, los extractos C (banda 14) y A (banda 15) todavía presentaban actividad de telomerasa sensible a ARNasa (bandas 17 y 18), mientras que C* (banda 13) y el extracto de referencia no la presentaban. Estos resultados indican que las actividades resistentes a ddATP representan que la telomerasa estaba reprogramada con ARN de TRC3 MuC o MuA. En cambio, la inserción de 17 bp en C* inhibe la reconstrucción, indicando que la reconstrucción de telomerasa es muy específica de la secuencia TRC3.

Para confirmar que la secuencia sintetizada por el MuA mutante era (GGGTTT)_{n}, se modificó la metodología de PCR existente para ampliar las repeticiones de telomerasa añadidas en un cebador de telomerasa exclusivo (Kim et al. (1994) Science 266: 2011). Utilizando cebadores sintéticos, se identificaron las condiciones de reacción en las que un cebador 3' con la secuencia d(CCCAAACCCAAACCCAA) amplificaría solamente las repeticiones (TTTGGG)_{n} y no amplificaría las repeticiones que contienen (TRTGGG)_{n}.

Para distinguir entre las repeticiones teloméricas añadidas por la telomerasa natural frente a la mutada, se combinó un análisis en dos etapas con una estrategia para limitar la disponibilidad de los nucleótidos para la reacción de telomerasa. Dado que MuA y MuC generarían secuencias de repetición teloméricas de (TTTGGG)_{n} y (TTGGGG)_{n'}
respectivamente, los extractos celulares se incubaron en primer lugar con el sustrato TS en presencia solamente de dTTP y dGTP durante 10 min a temperatura ambiente para permitir la adición de repeticiones teloméricas. Se destruyó a continuación la actividad de la telomerasa residual hirviendo los extractos durante 5 min. Se detectaron a continuación los productos de telomerasa con secuencia de ADN específico mediante amplificación por PCR utilizando los cebadores inversos apropiados y en presencia de los 4 dNTP y vestigios de ^{32}P-dCTP como describió (Kim et al. (1994) op. cit). Para detectar los productos de MuA, el cebador inverso fue (ACCCAA)_{4} y las condiciones de PCR fueron 94ºC, 10 s., 60ºC, 30 s. y 72ºC, 30 s. durante 20 ciclos. Para detectar los productos de MuC, se utilizaron tres cebadores inversos: (CCCAA)_{3'}, (CCAACC)_{3} y (CCAACC)_{3'}, respectivamente, que proporcionaron productos de PCR con los correspondientes cambios de movilidad acordes con la posición ampliada de la hibridación con los productos de telomerasa. Las condiciones de PCR utilizadas fueron las mismas que anteriormente, excepto que la temperatura de hibridación fue de 50ºC. En las mismas condiciones, no se generaron productos de telomerasa de extractos de células precursoras o de células transfectadas con el gen TRC3 natural. En las pruebas de especificidad de las condiciones de ampliación por PCR, los oligonucleótidos sintéticos que contienen (TTTGGG)_{n} y (TTGGGG)_{n} generaron los productos apropiados de PCR a escala de 6 nt con el cebador inverso (ACCCAA)_{4} o (CCCCAA)_{3}, mientras que los oligonucleótidos (TRTGGG)_{n} no produjeron ningún producto por PCR con el cebador inverso (ACCCAA)_{4} o (CCCCAA)_{3}.

Utilizando estas condiciones, los extractos procedentes de MuA pero no de MuC o las células naturales generaron productos en el ensayo de telomerasa modificado, lo que indica que la telomerasa procedente de las células que contiene MuA generó repeticiones (TTTGGG)_{n}. Se utilizaron métodos similares para analizar el mutante MuC, que sintetizó las repeticiones (TTGGGG)_{n}. En conjunto, los datos anteriores constituyen una prueba potente de que el gen TRC3 codifica el componente ARN de la telomerasa humana y por lo tanto se ha redenominado TRC3 como hTR por ARN de Telomerasa humana.

Ejemplo 11 Componente ARN de telomerasa en las células mortales e inmortales

La mayoría de las células cancerosas expresan niveles elevados de actividad de telomerasa, mientras que en la mayoría de las células humanas somáticas normales, no se detecta la telomerasa (Kim et al. (1994) op. cit). Para determinar si las concentraciones del componente ARN de telomerasa son elevadas en las líneas celulares cancerosas inmortales, se analizaron las concentraciones del componente ARN de telomerasa y del transcrito GAPDH utilizando RT-PCR en cinco cepas de células primarias mortales, que carecen de actividad de telomerasa detectable y cinco líneas celulares de cáncer inmortales con altos niveles de actividad de telomerasa. Las concentraciones en estado estacionario de los transcritos del componente ARN de telomerasa fueron 3 a 12 veces mayores en las líneas celulares tumorales que en las líneas primarias en comparación con las concentraciones de GAPDH (Fig. 2A). Mientras que las concentraciones del componente ARN de telomerasa aumentaron en las células cancerosas inmortales que expresan altos niveles de telomerasa, es interesante que las concentraciones bajas pero fácilmente detectables del componente ARN de telomerasa estuvieran también presentes en las células primarias mortales sin actividad de telomerasa detectable (bandas 1 a 5).

Las concentraciones del componente ARN de telomerasa se examinaron también en una variedad de tejidos humanos normales por análisis de transferencia Northern. Los testículos y el ovario presentaban la concentración mayor del componente ARN de telomerasa, que era de esperar ya que estos tejidos expresan niveles altos de actividad de telomerasa. Sin embargo, numerosos otros tejidos también expresan el componente ARN de telomerasa (Fig. 2B y 2C). Éstos incluyen el riñón, la próstata y el hígado adulto normales, todos los cuales carecen de niveles detectables de actividad de telomerasa. Estos resultados confirman los datos de las líneas celulares (Fig. 2A) y sugieren que el ARN de telomerasa puede estar presente pero inactivo en numerosos tejidos humanos. Se observan diferencias específicas del tejido similares en la expresión del ARN en los tejidos de ratón; sin embargo, muchos tejidos de ratón normales son positivos para la actividad de la telomerasa. El aumento aparente de represión de la actividad de telomerasa en las células humanas puede ayudar a explicar por qué las células de ratón se inmortalizan espontáneamente en el cultivo mientras que las células humanas no.

Ejemplo 12 La expresión de transcritos de hTR de cadena complementaria (componente ARN de telomerasa humana) en las células HeLa conduce a la crisis celular y a la muerte celular

Para examinar la función de la telomerasa en una célula inmortalizada, se introdujeron montajes de expresión de hTR de cadena complementaria en las células HeLa. Un fragmento de ADN de EcoRI de 200 bp que contiene 1 a 193 bp de un clon de ADNc del componente ARN de telomerasa humana, TRC3, se insertó en la secuencia EcoRI de p10-3 y pBBS212 para generar los plásmidos p10-3-hTR y pBBBhTR, respectivamente. El plásmido p10-3-hTR expresa la cadena complementaria del componente ARN de telomerasa bajo el control de la transcripción del activador mínimo de CMV regulado por tetraciclina correspondiente a los cinco operadores Tet corriente arriba en dos orientaciones diferentes descritas (Gossen et al.. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89: 5547). El plásmido pBBS-hTR expresa la cadena complementaria de hTR bajo el control del activador MPSV (Lin et al. (1994) Gene 147: 287). En paralelo, se realizó la electroporación en células HeLa de los vectores de expresión de referencia que carecen de la secuencia de codificación hTR de cadena complementaria. Los clones que contienen los plásmidos de cadena complementaria o de referencia se seleccionaron en tres experimentos independientes. Inicialmente, los 41 cultivos que expresan hTR de cadena complementaria se cultivaron de manera idéntica a las células con el vector de referencia. Sin embargo, en 23 a 26 niveles que duplican la población (PDL) tras la transfección, 33 de los 41 cultivos que expresan la cadena complementaria experimentaron crisis (Tabla I). La crisis celular en estos cultivos se caracterizó por una inhibición notable en el crecimiento celular de 20 a 26 PD, seguido del redondeo y desprendimiento de las células de la placa durante un periodo de una semana. En 28 de los 33 casos en los que las células experimentaron crisis, se observaron colonias revertientes raras (<1%) a las tres semanas después que la mayoría de las células habían muerto. Las células revertientes pueden representar variantes que escapen al efecto inhibidor del montaje hTR de cadena complementaria. En contraste con los clones de cadena complementaria, ninguna de las líneas celulares de referencia del vector experimentaron ningún cambio en el crecimiento o la mortalidad en 50
duplicaciones.

TABLA I

hTR de cadena complementaria conduce a TRF media más corta y a crisis celular
\begin{minipage}[t]{155mm} Se realizaron tres experimentos independientes en los que las células HeTe7 (células HeLa que expresan concentraciones elevadas de la proteína híbrida VP16 del represor de tetraciclina) se transfectaron por electroporación con el plásmido p10-3-hTR, que expresa a hTR de cadena complementaria bajo el control del activador mínimo CMV producido por tetraciclina-VP16 o con pBBS-hTR, que expresa hTR de cadena complementaria bajo el control del activador MPSV (54). [En estos experimentos no se observó regulación por tetraciclina. Los experimentos con p10-3-hTR se realizaron normalmente en ausencia de tetraciclina, porque los experimentos de referencia con luciferasa o hTR de cadena complementaria bajo el control del activador mínimo CMV producido por tetraciclina-VP16 demostró que la presencia o ausencia de tetraciclina tenía poco efecto sobre la luciferasa o la expresión hTR de cadena complementaria en las células HeTe7. De hecho, en los experimentos iniciales con montajes de hTR de cadena complementaria en células HeTe7, las células experimentaron todavía crisis en 23 a 26 PDL en presencia de tetraciclina]. Como referencia, las células HeTe7 se transfectaron también con el vector precursor en las mismas condiciones. Se aislaron once a dieciocho clones estables de cada serie de transfección. Los clones de todas las cepas presentaron idéntica morfología y perfiles de crecimiento hasta 20 PDL, en cuyo momento el crecimiento de la mayoría de los clones que expresan la cadena complementaria disminuyó notablemente (p10-3-hTR y pBBS-hTR). Mediante PDL 23-26, estas células experimentaron crisis, caracterizada por la aparición de células alargadas y redondeadas. Sin embargo, no todos los clones generados a partir de las células HeTe7 transfectadas con pBBS-hTR experimentaron crisis; ocho clones que expresan hTR de cadena complementaria continuaron el crecimiento similar a los cultivos de referencia. Las células de todos los clones se recogieron en PDL 23 y se determinaron las longitudes medias de TRF. Los valores P se calcularon por el método de la prueba t para datos independientes. Para cada serie, se indica la proporción de clones que experimentó crisis. \end{minipage}
	Plásmido	Crisis celular	TRF medio	Valor P	Crisis/Total
1	p10-3	no	ND		0/7
	p10-3-hTR	sí	ND		18/18
2	p10-3	no	3,27 \pm 0,10		0/12
	p10-3-hTR	sí	2,72 \pm 0,07	0,0003	11/11
	pBBS	no	3,22 \pm 0,11		0/13
3	pBBS-hTRa	sí	2,39 \pm 0,10	0,0008	4/4
	pBBS-hTRb	no	3,03 \pm 0,20	0,3551	0/8
	células HeTe7	no	3,15 \pm 0,09		Células precursoras

Para determinar si la longitud de la telomerasa y la inhibición de la telomerasa se correlacionan con la crisis celular en los clones que expresan la cadena complementaria, se determinó la longitud del telómero y la actividad de la telomerasa en varias colonias en precrisis de referencia y experimentales en 23 PDL. Todas las colonias que contenían vector de referencia tenían longitudes medias de TRF (3,22 y 3,27 kb) similares a la línea celular precursora (3,15 kb), mientras que los clones que contenían los montajes del vector de cadena complementaria que experimentó crisis tenían longitudes medias de TRF entre 2,39 y 2,72 kb o 17 a 26% más cortas que las de la línea precursora (Fig. 3). Estos datos son acordes con las repeticiones del telómero que se pierden en los clones que contienen la cadena complementaria debido a la inhibición de la actividad de la telomerasa. Para probar esto directamente, se determinó la actividad de la telomerasa en 14 de los clones. La actividad de telomerasa fue generalmente baja pero detectable en muchos de los clones con cadena complementaria, aunque los telómeros acortados sugieren que el nivel no era suficiente para mantener la longitud del telómero ya que la TRF media disminuyó desde 3,22 a 2,39 kb (P=0,0008). En los ocho clones que contienen el vector de cadena complementaria (pBBS-hTRb) que no experimentaron crisis, la longitud del telómero no cambió de manera significativa (3,03 frente a 3,33, P=0,355) y la actividad de la telomerasa fue similar a la de las referencias. Considerados en conjunto, estos resultados son una prueba de que la pérdida del telómero conduce a la crisis y a la muerte celular una vez que los telómeros alcanzan una longitud crítica.

La producción de la crisis celular en las células HeLa que expresan el componente ARN de la telomerasa de cadena complementaria proporcionan más soporte que el que inhibición de la telomerasa puede proporcionar a un agente terapéutico específico y eficaz contra el cáncer humano.

Ejemplo 13 Ampliación y detección in situ Detección in situ de ARN de telomerasa A. Hibridación fluorescente in situ (FISH)

La identificación de las células positivas a la telomerasa en una población mixta de células o tejidos puede realizarse mediante hibridación in situ de la sonda marcada dirigida al componente ARN de telomerasa. Un tejido de muestras celulares se fijó en un portaobjetos microscópico de vidrio, se permeabilizó suficientemente y se utilizó para hibridación in situ. Un ejemplo de hibridación in situ para el ARN de telomerasa humana (hTR) consiste en desnaturalizar en primer lugar los ácidos nucleicos sumergiendo los portaobjetos en formamida desionizada al 70%/solución 2\times SSC precalentada entre 70 y 74ºC durante 2 a 3 min. Los portaobjetos se transfieren a continuación a EtOH al 70% enfriado en hielo y a continuación a EtOH al 95% y a continuación a EtOH al 100% (4 min. en cada una de las soluciones). Se secan 100 a 200 ng (por portaobjeto) de la sonda htARN marcada (sonda de ADN de \sim500 bp marcada con biotina, digoxigenina, radioisótopo, etiqueta fluorescente), se vuelve a poner en suspensión en 10 \mul de formamida desionizada al 100%, se desnaturaliza por incubación a 75ºC durante 8 min. e inmediatamente se enfría en hielo. Se añaden 10 \mul de 2\times tampón de hibridación (4\times SSC; 4\times solución de Denhardt; 20% de sulfato de dextrano; Tris 100 mM, pH 7,5) a los 10 \mul de sonda resuspendida. Se añade la sonda/mezcla de hibridación (20 \mul) a la muestra fijada, se cubre con un cubreobjetos y se sella el cubreobjetos con cemento de caucho o esmalte de uñas. Se incuba la muestra a 37ºC durante 8 a 48 h. Tras la hibridación, se elimina el cubreobjetos, se lava la muestra dos veces en 2\times SSC/formamida desionizada al 50% a 37ºC y a continuación se lava dos veces en 2\times SSC a 37ºC (5 min. por lavado). Se observa a continuación la muestra al microscopio.

B. Marcado del cebado in situ (PRINS)

Otra variación al método de detección de hibridación in situ tradicional es el marcado del cebado in situ (PRINS). La detección del hTR por PRINS consiste en la síntesis del ADNc inicial de la hTR mediante la transcriptasa inversa (RT) seguido de la detección por PRINS utilizando la sonda de oligonucleótido específico de hTR y el alargamiento de la cadena incorporando nucleótidos marcados. La reacción a RT del hTR puede realizarse por varios métodos. Un ejemplo de la reacción a RT consiste en utilizar el kit GeneAmp para PCR de ARN de la transcriptasa inversa rTth termoestable (Perkin Elmer). En este método, se colocan 10 \mul de la mezcla a RT (Tris-HCl 10 mM pH 8,3; KCl 90 mM; MnCl_{2} 1 mM; dNTP 200 \muM; 2,5 U de rTth ADN polimerasa; cebador de retorno 0,4 \muM [p. ej., R7G: 5'-GGAGGGGCGAACGGGCCAGCAG-3']) en la muestra fijada y permeabilizada, se seca con el cubreobjetos, se sujeta con esmalte de uñas, se cubre con aceite mineral y se incuba a 70ºC durante 30 min. Después, se elimina el aceite mineral mediante lavado durante 5 min. en xileno y a continuación 5 min. en EtOH al 100%. Se retira el cubreobjetos, se lava brevemente con agua de DepC, a continuación con EtOH al 100% y se seca con aire durante 5 min. A continuación, se coloca en la muestra 10 \mul de mezcla PRINS (glicerol al 5% (v/v); Tris-HCl 10 mM, pH 0,3; KCl 100 mM; Tween 20 al 0,05% (p/v); EGRT 0,75 mM; MgCl_{2} 2,5 mM; cebador de cadena transcrita 0,4 \muM [p. ej., U3b: 5'-GCCTGGGAGGGGTGGTGGCRTTTTTTTG-3']; dA, dG, dCTP 200 \muM; dTTP 110 \muM; dUTP marcado 90 \muM). Se sella con el cubreobjetos, se sujeta con esmalte de uñas, se cubre con aceite mineral y se incuba a 70ºC durante 30 min. a 3 h. La muestra se lava a continuación 3 veces en el tampón de lavado (4\times SSC; Tween 20 al 0,05%) se calienta a 70ºC durante 2 min. Se observa a continuación la señal.

C. PCR a AT in situ

La detección por RT-PCR de hTR consiste en la síntesis del ADNc del ARN diana mediante reacción de transcriptasa inversa (transcriptasa inversa vírica o mediante la actividad intrínseca a RT de las ADN polimerasas termoestables) seguido de ampliación por PCR in situ del ADNc diana. Puede utilizarse varias reacciones a RT en la síntesis del ADNc del hTR incluyendo el protocolo a RT expuesto en el apartado 11.B. Además, puede utilizarse también la misma condición del tampón y los cebadores utilizados en los métodos de detección PRINS para la RT-PCR, pero en lugar de la incubación final a 70ºC durante 30 min. a 3 h., la muestra se amplía en un termociclador durante 30 a 40 ciclos de 94ºC/40 s., 55ºC/90 s. (véase apartado 11B). Tras la PCR, la muestra se lava 3 veces en el tampón de lavado (4\times SSC; Tween 20 al 0,05%) calentado a 70ºC, durante 2 min. Se observa a continuación la
señal.

Otra alternativa consiste en ampliar el ADNc generado a partir de la reacción a RT inicial utilizando el sistema 1000 de PCR in situ de GeneAmp y el kit del núcleo de PCR in situ de GeneAmp (Perkin Elmer).

Puede realizarse una etapa de la RT-PCR in situ en una muestra fijada y permeabilizada utilizando el protocolo de PCR de EZ ARN rTth de GeneAmp en combinación con el sistema 1000 de la PCR in situ de GeneAmp (Perkin Elmer). Este método consiste en colocar 40 a 50 \mul de mezcla del tampón de PCR EZ ARN (Bicina 50 mM; acetato de potasio 115 mM; glicerol al 8% (p/v), pH 8,2; dA, dG, dCTP 300 \muM; dTTP 165 \muM; dUTP marcada 135 \muM; 5 a 10 U de rTth ADN polimerasa; Mn (OAc)_{2} 2,5 mM; cebadores específicos de htARN 0,45 a 1 \muM p. ej. R7 y U3b en una muestra fijada y permeabilizada en un portaobjetos microscópico y sellándola con la junta de silicona y abrazadera seguido del protocolo del fabricante (sistema 100 de PCR in situ de GeneAmp, Pekín Elmer). La muestra se coloca a continuación en la máquina de PCR in situ de GeneAmp y se calienta durante 120 s. a 94ºC y a continuación se amplía durante 30 a 40 ciclos de 94ºC/45 s. y 60ºC/45 s. Después de la ampliación, la muestra se calienta y se observa como se expuso anteriormente.

Para reducir las señales del fondo que puedan surgir de la incorporación directa de las etiquetas fluorescentes durante la ampliación por PCR, puede utilizarse la detección indirecta que consiste en la ampliación por PCR utilizando los dNTP no marcados seguido de hibridación in situ utilizando una sonda de hibridación marcada específica para el producto ampliado. En este método, la señal se amplía por cualquier método de RT-PCR descrito anteriormente sin los dNTP marcados o cebadores y el producto ampliado se detecta por hibridación in situ.

D. Aplicación del cebador de ampliación del producto a la PCR in situ

El éxito de la PCR in situ depende de que se impida la fuga de los productos ampliados dentro de la matriz celular fuera de la célula. Por consiguiente, generalmente es cierto que los productos de PCR menores de 500 bp no son deseables para la PCR in situ. Para impedir la fuga de los productos de la PCR menores de 500 bp de la matriz celular, se utiliza normalmente la incorporación de dNTP "voluminosos" (p. ej., biotina, etiqueta fluorescente, digoxigenina, dUTP marcada) en el producto de la PCR. Otra manera de impedir la fuga de un pequeño producto en la PCR in situ consistiría en incorporar el cebador de la ampliación del producto en el protocolo de la PCR in situ.

El método comprende la utilización de un cebador que contiene 3 a 4 secuencias repetitivas de 6 bp (p. ej. [5'-TTTCCC-3']_{3-4}) en el extremo 5', seguido de una secuencia que es específica para la diana (véase la Fig. 4, cebador 1), en combinación con el cebador de retorno apropiado (cebador 2) y un tercer cebador que consta únicamente de la secuencia repetitiva (cebador 3, p. ej. [5'-TTTCCC-3']_{4}) para ampliar la diana específica en la PCR in situ. La presencia del cebador 3 alargará el producto de la PCR debido a la unión alterna del cebador 3 al extremo 3' del producto de la PCR diana. El alargamiento de los productos de la PCR puede producirse disminuyendo la temperatura de hibridación de la condición inicial de la PCR.

Por ejemplo, si la temperatura de hibridación de la secuencia diana en el cebador 1 es 60ºC, la muestra se ampliará inicialmente durante 15 a 20 ciclos de 94ºC/45ºC y 60ºC/45ºC, a continuación se ampliará durante 15 a 20 ciclos durante 94ºC/45ºC y 50ºC/45ºC. La temperatura de hibridación reducida en la segunda etapa de la PCR favorecerá la generación de productos de PCR alargados aumentando la probabilidad de la unión alterna del cebador 3 a las secuencias repetitivas. Los productos de la PCR alargados resultantes serán menos propensos a la fuga a través de la matriz celular, produciendo de este modo una mejor retención de la señal en el análisis de la PCR in situ.

Ejemplo 14 Componente ARN de la telomerasa de primates no humanos

Para demostrar que pueden obtenerse otras secuencias del componente ARN de telomerasa de mamífero utilizando cebadores basados en la secuencia del componente ARN humano, se utilizaron cebadores de PCR de secuencia humana para ampliar las secuencias del componente ARN de telomerasa del ADN genómico del mono ardilla, una especie que se considera una de las especies de primates no humanos más divergente desde el punto de la evolución en comparación con la humana.

El ADN genómico del mono ardilla se amplió con cebadores F3b (5'-TCRTACCCRTACTGAGAAGGGCGRTG-3') y H3+20 (5'-CTCAAGGTCATCGCCAAGGT-3') tal como se describió. Se observó una sola banda de ADN y se clonó posteriormente en el vector pBluescriptII SK (Stratagene, San Diego, CA). Los clones resultantes se secuenciaron parcialmente utilizando el método de PCR con el cebador universal inverso (5'-AACAGCRTTGACCATG-3'), el cebador 210-3' (5'-TCACGTCTCCTGCCAATTTGC-3') o el cebador H3+20. Las secuencias parciales del componente ARN de telomerasa de mono ardilla obtenidas fueron:

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Al alinearse a la secuencia génica del componente ARN de telomerasa humana, se obtuvo la alineación siguiente, utilizando el acuerdo de numeración del gen del componente ARN de telomerasa humano (los guiones representan los huecos introducidos para optimizar la alineación de la secuencia):

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Los ejemplos anteriores describen varios aspectos de la invención y cómo se prepararon determinados ácidos nucleicos de la invención. Los ejemplos no pretenden proporcionar una descripción exhaustiva de muchas realizaciones diferentes de la invención incluidas en las reivindicaciones siguientes.

Claims

1. Ácido ribonucleico sustancialmente puro capaz de asociarse con un componente proteico de telomerasa de mamífero para formar una holoenzima de telomerasa enzimáticamente activa, comprendiendo el oligorribonucleótido una secuencia codificada por la zona de codificación de la inserción HindIII-SacI de \sim2,5 kb del plásmido GRN33 (ATCC 75926) o por una secuencia que presenta por lo menos 80% o 95% de identidad con por lo menos 50 nucleótidos contiguos de dicha zona de codificación.

2. Ácido ribonucleico según la reivindicación 1, en el que la secuencia es:

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o una secuencia que presenta por lo menos 80% o por lo menos 95% de identidad con por lo menos 50 nucleótidos contiguos de dicha secuencia.

3. Ácido ribonucleico según la reivindicación 1 ó 2, que es un componente ARN de telomerasa humana.

4. Ácido ribonucleico según la reivindicación 1 a 3, que comprende la secuencia:

11

5. Ácido nucleico aislado que codifica un ácido ribonucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. Plásmido recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un ácido ribonucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

7. Célula huésped transformada con un plásmido según la reivindicación 6.

8. Oligonucleótido que comprende más de 10 nucleótidos contiguos complementarios de los nucleótidos contiguos de un ácido ribonucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y que inhibe la actividad enzimática de la telomerasa de mamífero.

9. Oligonucleótido según la reivindicación 8, en el que el oligonucleótido comprende por lo menos 15, opcionalmente por lo menos 20 nucleótidos contiguos complementarios de los nucleótidos contiguos de un ácido ribonucleico según las reivindicaciones 1 a 4.

10. Oligonucleótido según la reivindicación 8, constituido por dichos más de 10 nucleótidos contiguos complementarios de los nucleótidos contiguos de un ácido ribonucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

11. Oligonucleótido según la reivindicación 9, constituido por dichos por lo menos 15, opcionalmente por dichos por lo menos 20, nucleótidos contiguos complementarios de dichos nucleótidos contiguos de un ácido ribonucleico de cualquiera según las reivindicaciones 1 a 4.

12. Oligonucleótido según la reivindicación 8 ó 9, que presenta la secuencia:

: 5'-CTCAGTTAGGGTTAGACAAA-3';

: 5'-CGCCCTTCTCAGTTAGGGTTAG-3';

: 5'-GGCGCCTACGCCCTTCTCAGTT-3':

: o

: 5'-CAGGCCCACCCTCCGCAACC-3'

13. Oligonucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, que es una ribozima que escinde específicamente el componente ARN de la telomerasa.

14. Oligonucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, que comprende análogos de nucleótidos modificados, p. ej., ribonucleótidos de O-metilo, nucleótidos de fosforotioato o nucleótidos de fosfonato de me-
tilo.

15. Formulación farmacéutica que comprende un oligonucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 14.

16. Oligonucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 14, para su utilización como producto farmacéutico.

17. Utilización de un oligonucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 14, para la preparación de un medicamento destinado a tratar la neoplasia.

18. Método de inhibición de la actividad de la telomerasa en una célula in vitro, que comprende poner en contacto la célula con un oligonucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 14.

19. Ácido nucleico aislado, recombinante o sintetizado que comprende una secuencia idéntica o complementaria a más de 10 nucleótidos consecutivos de un ácido ribonucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o el complemento de los mismos, y se selecciona de entre:

a): una sonda nucleotídica que se hibrida específicamente con ARN de telomerasa o su secuencia de codificación en una muestra de un mamífero, preferentemente humano, que comprende opcionalmente un marcador detectable; o

b): un cebador nucleotídico capaz de cebar una reacción de ampliación específica del ARN de telomerasa o su secuencia de codificación en una muestra de un mamífero, preferentemente humano.

20. Ácido nucleico según la reivindicación 19, en el que el ácido nucleico comprende una secuencia idéntica o complementaria de por lo menos 20 nucleótidos consecutivos de un ácido ribonucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o el complemento de los mismos.

21. Utilización de un oligonucleótido que comprende una secuencia idéntica o complementaria de más de 10 nucleótidos consecutivos de un ácido ribonucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o el complemento de los mismos, como:

a): sonda nucleotídica específica para el ARN de telomerasa o su secuencia de codificación en una muestra de un mamífero, preferentemente humano, que comprende opcionalmente un marcador detectable; o

b): cebador nucleotídico capaz de cebar una reacción de ampliación específica del ARN de telomerasa o su secuencia de codificación.

22. Utilización según la reivindicación 21, en la que el oligonucleótido comprende una secuencia idéntica o complementaria a por lo menos 20 nucleótidos consecutivos de un ácido ribonucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o el complemento de los mismos.

23. Método para determinar el nivel, la cantidad o la presencia del componente ARN de telomerasa en una muestra de mamífero, preferentemente humano, que comprende:

a): combinar la muestra con una sonda de oligonucleótidos tal como se ha definido en la reivindicación 19 ó 20, en condiciones en las que el oligonucleótido se hibridará específicamente con el ARN de telomerasa en una muestra y detectando cualquier híbrido que se forme como resultado; o

b): combinar la muestra con un par de cebadores de oligonucleótidos tal como se ha definido en la reivindicación 19 ó 20, realizando una reacción de ampliación y detectando cualquier producto de la ampliación que se forme como resultado.

24. Método según la reivindicación 23, que comprende además cuantificar el híbrido o el producto de ampliación a fin de determinar la concentración del componente ARN de la telomerasa en la muestra.

25. Método para detectar el componente ARN de la telomerasa en una muestra obtenida de un paciente, que comprende la unión de una sonda o cebador oligonucleotídico marcado, tal como se ha definido en la reivindicación 19 ó 20, a una muestra obtenida del paciente y para detectar la presencia del material marcado unido al ARN en la muestra.

26. Método para detectar la presencia de células cancerosas en una muestra, comprendiendo el procedimiento la determinación del nivel del componente ARN de la telomerasa en la muestra según la reivindicación 23 ó 24 y correlacionar presencia de una concentración patognómica del componente ARN de la telomerasa con la presencia de células cancerosas.

27. Kit para determinar el nivel, la cantidad o la presencia del componente ARN de telomerasa humana en una muestra, comprendiendo dicho kit una sonda o cebador oligonucleotídico tal como se define en la reivindicación 19 ó 20 y comprendiendo opcionalmente un conjunto de instrucciones.

28. Método para aislar la holoenzima de telomerasa, que comprende la captura de la proteína holoenzima utilizando un agente de afinidad que comprende más de 10 nucleótidos consecutivos de un oligonucleótido complementario a un ácido ribonucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y a continuación la recuperación de la proteína a partir del agente de afinidad.

29. Método según la reivindicación 28, en el que el agente de afinidad está fijado a un soporte sólido o está modificado químicamente para una inmovilización ulterior sobre un soporte sólido.

30. Método de identificación de un componente ARN de telomerasa de una especie de mamífero no humano que comprende poner en contacto el ácido nucleico procedente del tejido de dicha especie con un cebador oligonucleotídico, tal como se ha definido en la reivindicación 17 ó 18.

31. Ácido nucleico aislado, recombinante o sintetizado que comprende una zona reguladora de transcripción que presenta por lo menos una de las propiedades siguientes:

(a): comprende la secuencia siguiente, o su complemento:

12

13

(b): comprende una secuencia que es idéntica a por lo menos 25 nucleótidos consecutivos de la secuencia en (a);

(c): comprende una secuencia que es idéntica por lo menos 80% o 95% a por lo menos 100 nucleótidos consecutivos de la secuencia en (a) o su complemento;

(d): se hibrida específicamente con la inserción HindIII-SacI de \sim2,5 kb del plásmido pGRN33 (ATCC 75926); o

(e): se hibrida específicamente con una inserción SauIIIA1-HindIII del clon 28-1 lambda (ATCC 75925).

32. Ácido nucleico según la reivindicación 31, en el que la zona reguladora de la transcripción controla la transcripción de una secuencia génica a la que está ligada funcionalmente.

33. Plásmido recombinante que comprende una secuencia nucleotídica según la reivindicación 31.

34. Célula huésped transformada con un plásmido según la reivindicación 33.

35. Mamífero transgénico no humano que tiene por lo menos un alelo del componente ARN de telomerasa de mamífero destruido funcionalmente que ha sido destruido mediante destrucción dirigida homóloga.