DE69534568T2 - Säugetier-telomerase - Google Patents

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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft menschliche Telomerase, ein Ribonukleoprotein-Enzym, welches an der Synthese von menschlicher Telomer-DNA beteiligt ist. Die Erfindung sieht Verfahren und Zusammensetzungen in Bezug auf die Gebiete der Molekularbiologie, Chemie, Pharmakologie und medizinische und diagnostische Technologie vor.
  • Beschreibung von verwandten Offenbarungen
  • Die DNA an den Enden oder Telomeren der Chromosomen von Eukaryoten besteht üblicherweise aus tandemartig wiederholten einfachen Sequenzen. Telomerase ist ein Ribonukleoprotein-Enzym, welches einen Strang der telomeren DNA synthetisiert, wobei eine Sequenz, die innerhalb der RNA-Komponente des Enzyms enthalten ist, als Matrize verwendet wird; siehe Blackburn, 1992, Annu. Rev. Biochem. 61: 113-129.
  • Die RNA-Komponente von menschlicher Telomerase ist bislang nicht in der wissenschaftlichen Literatur berichtet worden, obwohl bekannt ist, dass menschliche Telomerase telomere Wiederholungseinheiten bzw. Repeats mit der Sequenz 5'-TTAGGG-3' synthetisiert; siehe Morin, 1989, Cell 59: 521-529, und Morin, 1991, Nature 353: 454-456. Diese Feststellung ist nicht ausreichend gewesen, um die Isolierung und Identifizierung des Restes der Nukleotidsequenz der RNA-Komponente von menschlicher Telomerase zu ermöglichen. Die RNA-Komponente der Telomerase-Enzyme von Saccharomyces cerevisiae, bestimmten Spezies von Tetrahymena, sowie denjenigen von anderen Ciliaten, wie Euplotes und Glaucoma, ist sequenziert und in der wissenschaftlichen Literatur berichtet worden; siehe Singer und Gottschling, 21. Oktober 1994, Science 266: 404-409; Lingner et al., 1994, Genes & Development 8: 1984-1988; Greider und Blackburn, 1989, Nature 337: 331-337; Romero und Blackburn, 1991, Cell 67: 343-353; und Shippen-Lentz und Blackburn, 1990, Science 247: 546-552. Die Telomeraseenzyme dieser Ciliaten synthetisieren telomere Wiederholungseinheiten, welche von denjenigen in Menschen verschieden sind.
  • Es besteht ein großer Bedarf für weitere Informationen über menschliche Telomerase. Trotz der scheinbar einfachen Natur der Wiederholungseinheiten von telomerer DNA haben Wissenschaftler seit langem gewußt, dass Telomere eine wichtige biologische Rolle bei der Aufrechterhaltung von Chromosomenstruktur und -funktion innehaben. Kürzlicher haben Wissenschaftler spekuliert, dass ein Verlust von telomerer DNA als ein Auslöser für zelluläre Seneszenz und Alterung wirken kann, und dass die Regulierung von Telomerase wichtige biologische Implikationen besitzen kann; siehe Harley, 1991, Mutation Research 256: 271-282.
  • Verfahren zur Detektion von Telomeraseaktivität sowie zur Identifizierung von Verbindungen, welche Telomeraseaktivität regulieren oder beeinflussen, zusammen mit Verfahren für die Therapie und Diagnose von zellulärer Seneszenz und Immortalisierung durch Regulieren der Telomerlänge und Telomeraseaktivität sind ebenfalls beschrieben worden; siehe PCT-Patentveröffentlichungen Nr. 95/13381, veröffentlicht am 18. Mai 1995; 95/13382, veröffentlicht am 18. Mai 1995; und 93/23572, veröffentlicht am 25. November 1993.
  • Bedeutende Verbesserungen an und neue Gelegenheiten für Telomerase-vermittelte Therapien und Telomerase-Assays und Screeningverfahren könnten realisiert werden, wenn Nukleinsäure, umfassend die RNA-Komponente und/oder codierend die Proteinkomponenten von Telomerase, in reiner oder isolierbarer Form verfügbar wäre und die Nukleotidsequenzen solcher Nukleinsäuren bekannt wären. Die vorliegende Erfindung erfüllt diese und andere Anforderungen und stellt derartige Verbesserungen und Gelegenheiten zur Verfügung.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die Erfindung sieht eine im wesentlichen reine Ribonukleinsäure, wie definiert in Patentanspruch 1, vor. Genauer gesagt sind Ausführungsformen dieses Aspektes der Erfindung in den Ansprüchen 2 bis 4 definiert.
  • Die Erfindung sieht ebenfalls ein isoliertes Nukleinsäuremolekül vor, das eine Ribonukleinsäure der Erfindung codiert, sowie ein rekombinantes Plasmid, wleches eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die eine Ribonukleinsäure der Erfindung codiert. Ein anderer Aspekt der Erfindung ist eine mit dem Plasmid transformierte Wirtszelle.
  • In einem anderen Aspekt sieht die Erfindung ein Oligonukleotid, wie definiert in Patentanspruch 8, vor, wobei spezifischere Ausführungsformen der Oligonukleotide in den Patentansprüchen 9 bis 14 definiert werden. Die Erfindung schließt eine pharmazeutische Formulierung, umfassend die Oligonukleotide, sowie die Verwendung der Oligonukleotide als ein Pharmazeutikum ein. In einem Aspekt werden die Oligonukleotide verwendet, um Neoplasie zu behandeln.
  • Die Erfindung schließt zusätzlich ein Verfahren zum Inhibieren von Telomeraseaktivität in einer Zelle in vitro ein, wie definiert in Anspruch 18.
  • In einem weiteren Aspekt sieht die Erfindung eine isolierte, rekombinante oder synthetisierte Nukleinsäure, wie definiert in Anspruch 19, oder spezifischer wie definiert in Anspruch 20, vor.
  • Die Erfindung sieht auch die Verwendung eines Oligonukleotids der Erfindung als eine Sonde oder einen Primer, wie definiert in Anspruch 21, oder spezifischer wie beansprucht in Anspruch 22, vor.
  • In einem anderen Aspekt sieht die Erfindung ein Verfahren zum Bestimmen des Spiegels, der Menge oder des Vorliegens von Telomerase-RNA-Komponente in einer Säugetierprobe, wie definiert in Anspruch 23, vor.
  • Spezifischere Merkmale des Verfahrens werden in Anspruch 24 definiert.
  • Die Erfindung sieht ebenfalls ein Verfahren zum Nachweisen einer Telomerase-RNA-Komponente in einer Patientenprobe vor, wie definiert in Anspruch 25.
  • Die Erfindung sieht weiterhin ein Verfahren zum Nachweisen des Vorliegens von Krebszellen in einer Probe vor, wie definiert in Anspruch 26.
  • In einem anderen Aspekt sieht die Erfindung ein Kit zum Bestimmen des Spiegels, der Menge und des Vorliegens einer menschlichen Telomerase-RNA-Komponente in einer Probe vor, wie definiert in Anspruch 27.
  • In einem weiteren Aspekt sieht die Erfindung ein Verfahren zum Isolieren des Telomerase-Holoenzyms, wie definiert in Anspruch 28 oder wie weiterhin definiert in Anspruch 29, vor.
  • Die Erfindung sieht ebenfalls ein Verfahren zum Identifizieren einer Telomerase-RNA-Komponente, wie definiert in Anspruch 30, vor.
  • In einem anderen Aspekt sieht die Erfindung eine isolierte, rekombinante oder synthetisierte Nukleinsäure, wie definiert in Anspruch 31 oder wie ferner definiert in Anspruch 32, vor. Ebenfalls eingeschlossen ist ein rekombinantes Plasmid, wie definiert in Anspruch 33, oder eine Wirtszelle, wie definiert in Anspruch 34.
  • Des Weiteren wird ein transgenes nicht-menschliches Säugetier bereitgestellt, wie definiert in Anspruch 35.
  • Die vorliegende Erfindung stellt somit die RNA-Komponente sowie das Gen für die RNA-Komponente von menschlicher Telomerase in im wesentlichen reiner Form, sowie Nukleinsäuren, umfassend die Gesamtheit oder wenigstens einen nützlichen Abschnitt der Nukleotidsequenz der RNA-Komponente von menschlicher Telomerase, bereit. Die vorliegende Erfindung sieht auch die RNA-Komponente-Nukleinsäuren aus anderen Spezies vor, wobei die Nukleinsäuren eine wesentliche Homologie mit der RNA-Komponente von menschlicher Telomerase gemeinsam haben, einschließlich, ohne darauf eingeschränkt zu sein, die RNA-Komponenten von Säugetieren, wie Primaten. Andere nützliche Nukleinsäuren der Erfindung schließen Nukleinsäuren mit zu der RNA-Komponente komplementären Sequenzen; Nukleinsäuren mit Sequenzen, welche zu Nukleotidsequenzen der RNA-Komponente verwandt aber davon verschieden sind, und welche mit der RNA-Komponente oder dem Gen für die RNA-Komponente oder den Proteinkomponenten von menschlicher Telomerase in einer nützlichen Weise interagieren; und Nukleinsäuren, welche keine signifikante Sequenzhomologie oder Komplementarität mit der RNA-Komponente oder dem Gen für die RNA-Komponente gemeinsam haben, aber in einer gewünschten und nützlichen Weise auf die RNA-Komponente einwirken, ein. Wie nachstehend vollständiger beschrieben, schließen die Nukleinsäuren der Erfindung sowohl DNA- als auch RNA-Moleküle und modifizierte Analoge von beiden ein und dienen einer Vielzahl von nützlichen Zwecken.
  • Ein Typ von nützlicher Nukleinsäure der Erfindung ist ein Antisense- bzw. Antisinn-Oligonukleotid, ein Tripelhelix-bildendes Oligonukleotid oder ein anderes Oligonukleotid oder Oligonukleotid-Mimetikum (z. B. Antisense-PNA – Peptid-Nukleinsäure/Polyamid-Nukleinsäure), welches in vivo oder in vitro verwendet werden kann, um die Aktivität von menschlicher Telomerase zu hemmen. Solche Oligonukleotide können Telomeraseaktivität auf mehreren Wegen blockieren, einschließlich durch Verhindern der Transkription des Telomerasegens (zum Beispiel durch Tripelhelix-Bildung) oder durch Binden an die RNA-Komponente von Telomerase in einer Weise, welche verhindert, dass eine funktionelle Ribonukleoprotein-Telomerase zusammengebaut wird, oder verhindert, dass die RNA- Komponente, sobald sie in den Telomerase-Enzymkomplex eingebaut wurde, als eine Matrize für die Synthese von telomerer DNA dient. Typischerweise, und abhängig von der Wirkungsweise, umfassen diese Oligonukleotide der Erfindung spezifische Sequenz von etwa 10 bis etwa 25 bis 200 oder mehr Nukleotiden, welche zu einer spezifischen Sequenz von Nukleotiden in der RNA-Komponente von Telomerase oder dem Gen für die RNA-Komponente von Telomerase entweder identisch oder komplementär ist.
  • In einer Ausführungsform sieht die Erfindung Antisense-Polynukleotide vor, komplementär zu Telomerase-RNA-Komponente-Polynukleotidsequenzen, typischerweise komplementär zu Polynukleotidsequenzen, welche zu einer natürlich vorkommenden Säugetier-Telomerase-RNA-Komponenten-Gensequenz im wesentlichen identisch sind. Derartige Antisense-Polynukleotide werden verwendet, um Transkription und/oder Stabilität und/oder Funktionalität der Telomerase-RNA-Komponenten-Spezies zu inhibieren und dadurch eine Reduktion in dem Ausmaß der jeweiligen Telomeraseaktivität in einer Zelle (z. B. einer neoplastischen Zelle eines Patienten) zu bewirken. Derartige Antisense-Polynukleotide können als Telomerase-modulierende Mittel fungieren durch Inhibieren der Bildung eines funktionellen (katalytisch aktiven und in hohem Maße originalgetreuen) Telomerase-Holoenzyms, welches für eine korrekte Telomer-Replikation und -Reparatur in einer Zelle erfordert wird. Antisense-Polynukleotide können mit anderen antineoplastischen therapeutischen Modalitäten kombiniert werden, wie ionisierender Strahlung oder Chemotherapie (z. B. mit einem DNA-schädigenden Mittel, wie Bleomycin, Cisplatin, Stickstofflost, Doxyrubicin, Nukleotid-Analogen und dergleichen). Die Antisense-Polynukleotide können den Zelltod in empfindlichen Zellen (z. B. replizierenden Zellen, welche Telomeraseaktivität für die DNA-Reparatur oder -Replikation benötigen) fördern. Die Antisense-Polynukleotide können im wesentlichen identisch zu wenigstens 25 aneinander angrenzenden Nukleotiden der komplementären Sequenz einer hierin offenbarten Säugetier-Telomerase-RNA-Sequenz sein. Bei den Antisense-Polynukleotiden handelt es sich typischerweise um ssDNA, ssRNA, Methylphosphonat-Grundgerüst-Polynukleotide, Phosphorothiolat-Grundgerüst-Polynukleotide, Polynukleotide mit gemischtem Grundgerüst, Polyamid-Nukleinsäuren und gleichartige Antisense-Strukturen, welche im Fachgebiet bekannt sind. In einem Aspekt der Erfindung wird ein Antisense-Polynukleotid verabreicht, um die Transkription und/oder Aktivität der Telomerase-RNA-Komponente und Telomeraseaktivität in einer Zelle, wie in einer replikationsfähigen menschlichen Zelle, zu inhibieren.
  • In einer Ausführungsform sieht die Erfindung ein Matrizen-Fehlpaarungs-Polynukleotid vor, wobei das Polynukleotid eine Sequenz aufweist, welche im wesentlichen identisch zu einer Säuger-RNA-Komponente von Telomerase ist und eine telomere Wiederholungseinheit- Matrizensequenz umfasst, welche wenigstens eine Basenfehlpaarung in Bezug auf die menschliche Telomerase-Wiederholungseinheit-Sequenz 5'-TTAGGG-3' aufweist, aber ansonsten komplementär dazu ist. Ein Matrizenfehlpaarungs-Polynukleotid umfasst typischerweise eine einzelne Nukleotidfehlpaarung in der natürlich vorkommenden Matrizensequenz und kann zwei Nukleotidfehlpaarungen in der Matrizensequenz umfassen, entweder als aneinandergrenzende fehlgepaarte Nukleotide, oder wobei die fehlgepaarten Nukleotide von einem oder mehreren passend-gepaarten (komplementären) Nukleotiden getrennt sind. Matrizenfehlpaarungs-Polynukleotide der Erfindung sind im allgemeinen fähig zum Aufzeigen von Telomeraseaktivität in Verbindung mit der menschlichen Telomerase-Polypeptidkomponente, und dadurch rufen sie einen Fehleinbau an ausgewählten (fehlgepaarten) Nukleotidpositionen in der Sequenz der menschlichen Telomerase-Wiederholungseinheit im Anschluß an Telomer-Wiederholungseinheit-Replikation, -Reparatur und/oder -Addition hervor, wodurch Telomere erzeugt werden, welche auf der fortwährenden Gegenwart der mutierten Sinn-Telomerase-RNA-Komponente für eine substantielle Replikation und Aufrechterhaltung der Telomerlänge beruhen.
  • Ein anderer Typ von nützlicher Nukleinsäure der Erfindung ist ein Ribozym, das fähig ist, die RNA-Komponente von menschlicher Telomerase spezifisch zu spalten, wodurch das Enzym inaktiv gemacht wird. Noch ein anderer Typ von nützlicher Nukleinsäure der Erfindung ist eine Sonde oder ein Primer, welche(r) spezifisch an die RNA-Komponente von menschlicher Telomerase bindet und so verwendet werden kann, z. B., um das Vorliegen von Telomerase in einer Probe nachzuweisen. Schließlich schließen nützliche Nukleinsäuren der Erfindung rekombinante Expressionsplasmide zur Herstellung der Nukleinsäuren der Erfindung ein. Ein speziell nützlicher Typ eines derartigen Plasmides ist ein Plasmid, welches für Gentherapie am Menschen verwendet wird. Nützliche Plasmide der Erfindung für menschliche Gentherapie existieren in einer Vielzahl von Typen, wobei nicht nur diejenigen eingeschlossen sind, welche Antisense-Oligonukleotide oder Ribozyme codieren, sondern auch diejenigen, welche die Expression der RNA-Komponente von menschlicher Telomerase oder einer deletierten oder anderweitig veränderten (mutierten) Version der RNA-Komponente von menschlicher Telomerase (oder einer anderen Spezies mit RNA-Komponenten-Sequenzen, welche im wesentlichen homolog zu der menschlichen RNA-Komponente sind) oder des Gens für selbige lenken.
  • In einer Ausführungsform wird ein Polynukleotid mit einem zu einer Säugetier-Telomerase-RNA-Komponente komplementären Abschnitt, ausreichend, um unter physiologischen Bedingungen spezifisch zu hybridisieren, durch kovalente Anbindung eines zusätzlichen chemischen Substituenten, entweder während oder nach der Polynukleotidsynthese, derivatisiert, wodurch ein derivatisiertes Polynukleotid gebildet wird, welches zum spezifischen Hybridisieren an die Telomerase-RNA-Komponente in der Lage ist. Das derivatisierte Polynukleotid kann auf endogenes Telomeraseenzym lokalisiert werden, welches die RNA-Komponente aufweist, wobei das derivatisierte Polynukleotid eine Veränderung oder chemische Modifikation der RNA-Komponente und/oder Proteinkomponente von Telomerase verursacht und dadurch die enzymatische Aktivität von Telomerase, typischerweise durch Vermindern, modifiziert.
  • Die Erfindung sieht daher Polynukleotide vor, welche geeignet sind, um Krankheiten zu diagnostizieren, die mit einer ungewöhnlichen Häufigkeit und/oder Struktur der Telomerase-RNA-Komponente assoziiert sind. Polynukleotidsonden, umfassend Sequenzen, welche im wesentlichen identisch zu oder im wesentlichen komplementär zu einer Säugetier-Telomerase-RNA-Komponenten-Nukleotidsequenz sind, können für die Diagnose von Krankheitszuständen (z. B. Neoplasie oder Präneoplasie) durch Nachweisen von Telomerase-RNA-Komponenten-Häufigkeit und/oder strukturellen Veränderungen der Telomerase-RNA-Komponente (z. B. Trunkierung, Sequenzvariationen, Deletionen oder Insertionen und dergleichen) und/oder Rearrangements oder Amplifikation des Telomerase-RNA-Komponenten-Gens in Zellen, welche aus einem Patienten explantiert wurden, oder Nachweisen eines pathognomonischen Säugetier-Telomerase-RNA-Komponenten-Allels (z. B. durch RFLP oder Allel-spezifische PCR-Analyse) verwendet werden. Der Nachweis wird oft durch in situ-Hybridisierung unter Verwendung eines markierten (z. B. 32P, 35S, 14C, 3H, fluoreszenten, biotinylierten, digoxigeninylierten) Antisense-Polynukleotids, welches komplementär zu einer Säugetier-Telomerase-RNA-Komponente ist, erfolgen, obwohl Northern-Blotting, Dot-Blotting oder Lösungshybridisierung an Gesamt-RNA oder Poly-A+-RNA, welche aus einer Zellprobe isoliert wurde, angewandt werden können, wie auch PCR- oder LCR-Amplifizierung unter Verwendung von Telomerase-RNA-Komponenten-spezifischen Primern verwendet werden kann. Zellen, welche eine veränderte Menge (typischerweise eine signifikante Erhöhung) der Telomerase-RNA-Komponente im Vergleich zu nicht-neoplastischen Zellen des/der gleichen Zelltyps/en enthalten, werden typischerweise als Kandidaten-Erkrankungszellen identifiziert, wie präneoplastische Zellen oder offenkundig neoplastische Zellen, und können als Zellen identifiziert werden, welche ein metastatisches Potential aufweisen. In ähnlicher Weise wird der Nachweis von pathognomonischen Rearrangements oder einer Amplifikation des Telomerase-RNA-Komponenten-Genlocus oder eng gekoppelter Loci in einer Zellprobe das Vorhandensein eines pathologischen Zustands oder eine Prädisposition zur Entwicklung eines pathologischen Zustands (z. B. Krebs, genetische Krankheit) identifizieren. Die Telomerase-RNA-Komponenten-Polynukleotidsonden werden auch für die forensische Identifizierung von Individuen verwendet, wie für Vaterschaftstests oder die Identifikation von Verdächtigen bei einem Verbrechen oder von unbekannten Verstorbenen.
  • Die Erfindung gestattet die Behandlung eines Zustands, welcher mit der Telomeraseaktivität innerhalb einer Zelle oder Gruppe von Zellen assoziiert ist, durch Kontaktieren der Zelle(n) mit einer therapeutisch wirksamen Menge eines Mittels, welches die Telomeraseaktivität in dieser Zelle verändert. Derartige Mittel schließen die Telomerase-RNA-Komponente codierenden Nukleinsäuren, Tripelhelix-bildende Oligonukleotide, Antisense-Oligonukleotide, Ribozyme und Plasmide und andere Gentherapievektoren (z. B. adenovirale Vektoren, Adeno-assoziierte virale Vektoren etc.) für Gentherapie am Menschen durch Expression von Telomerase-RNA-Komponente, von Antisense-RNA gegen die Telomerase-RNA-Komponente oder von Fehlpaarungs-Telomerase-RNA-Komponente, wie obenstehend beschrieben, ein. In einem verwandten Aspekt sieht die Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen vor, umfassend diese therapeutischen Mittel zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Salz, welche die Formulierung in einem Lipofektions-Komplex, Liposom oder Immunliposom für die zielgerichtete Zuführung des therapeutischen Mittels einschließen können. Die Erfindung sieht auch Kombinationen derartiger Telomerase-vermittelter therapeutischer Mittel mit anderen Pharmazeutika vor, wie antineoplastischen Mitteln und anderen cytotoxischen oder cytostatischen Mitteln; Anti-Pilz-Mitteln (z. B. für die Behandlung von AIDS-Patienten); Nukleotiden, Nukleosiden und Analogen davon; und anderen pharmazeutischen Mitteln, geeignet für die Behandlung von Krankheitszuständen, wie Neoplasie, Hyperplasie, HIV-Infektion/AIDS und assoziierten Pathologien, und anderen Krankheiten, welche durch einen abnormalen Telomer-Metabolismus gekennzeichnet sind. Die Verfahren können die Verwendung eines derivatisierten Polynukleotids umfassen, welches zum spezifischen Hybridisieren an eine Telomerase-RNA-Komponente in einer Säugetier-Telomerase in der Lage ist, wobei das derivatisierte Polynukleotid in Säugetierzellen, welche Telomeraseaktivität aufweisen, zugeführt wird und Telomeraseaktivität durch Lokalisieren zu Telomerase-RNA-Komponente und Inaktivieren oder Inhibieren von Telomeraseaktivität hemmt.
  • Die Erfindung sieht ebenfalls therapeutische Mittel vor, welche Neoplasie oder Apoptose durch Modulieren von Telomerasefunktion durch Inhibieren oder Steigerung der Bildung von Telomerase-RNA-Komponente inhibieren; derartige Mittel können als Pharmazeutika verwendet werden. Solche Pharmazeutika werden verwendet werden, um eine Vielzahl von humanen und tiermedizinischen Krankheiten zu behandeln, wie: Neoplasie, Hyperplasie, neurodegenerative Krankheiten, Alterung, AIDS, Pilzinfektion und dergleichen. In einer Ausführungsform besteht das Mittel aus einem Gentherapievektor, der fähig ist, eine Telomerase-RNA-Komponenten-Sequenz oder ihr Komplement oder alternativ dazu eine enzymatisch inaktive Telomerase-RNA-Komponente zu transkribieren, welche die Bildung von funktionellem Telomerase-Holoenzym kompetitiv inhibieren kann.
  • Die Erfindung stellt diagnostische Verfahren zur Bestimmung des Spiegels, der Menge oder des Vorliegens der RNA-Komponente von menschlicher Telomerase, Telomerase oder Telomeraseaktivität in einer Zelle, Zellpopulation oder Gewebeprobe oder einem Extrakt von irgendeinem der Vorangehenden, zur Verfügung. In einem verwandten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung nützliche Reagenzien für solche Verfahren (einschließlich der obenstehend erwähnten Primer und Sonden) bereit, welche gegebenenfalls in Kit-Form zusammen mit Anweisungen zum Gebrauch des Kits zur Ausübung des diagnostischen Verfahrens verpackt werden.
  • Die vorliegende Erfindung sieht ein Verfahren zum Diagnostizieren einer Krankheit (z. B. Neoplasie) in einem menschlichen Patienten vor, wobei ein diagnostischer Assay (z. B. in situ Polynukleotid-Hybridisierung von fixierten Zellen durch eine markierte Telomerase-RNA-Komponenten-Sonde, welche spezifisch humane Telomerase-RNA-Komponente oder -Gensequenzen bindet) angewandt wird, um zu bestimmen, ob eine vorbestimmte pathognomonische Konzentration an Telomerase-RNA-Komponente in einer biologischen Probe aus einem menschlichen Patienten vorhanden ist; wenn der Assay das Vorliegen von Telomerase-RNA-Komponente außerhalb des normalen Bereichs (z. B. über die vorherbestimmte pathognomonische Konzentration hinausgehend) anzeigt, wird bei dem Patienten die Diagnose erstellt, dass er einen Krankheitszustand oder eine Prädisposition aufweist.
  • In einer Ausführungsform werden Polynukleotide der Erfindung für die Diagnose von pathologischen Zuständen oder genetischen Krankheiten verwendet, welche Neoplasie Hyperplasie, verfrühte oder abnorme Zellseneszenz oder andere mit Telomerasefunktion zusammenhängende medizinische Zustände beteiligen, und genauer gesagt Zuständen und Krankheiten, welche Änderungen in der Struktur oder Häufigkeit einer Telomerase-RNA-Komponente oder -Gensequenz beteiligen, oder welche mit einem pathognomonischen Telomerase-RNA-Komponenten-Allel gekoppelt sind, welches mittels RFLP und/oder Allel-spezifischer PCR oder einem anderen geeigneten Nachweisverfahren detektiert werden kann. Typischerweise ist das Verfahren für die Diagnose einer Krankheit (z. B. Neoplasie) in einem humanen Patienten beschaffen, wobei ein diagnostischer Assay (z. B. Bestimmung der Menge und/oder Struktur von Telomerase-RNA-Komponente) verwendet wird, um zu bestimmen, ob eine vorherbestimmte pathognomonische Konzentration oder Struktur von Telomerase-RNA-Komponente in Zellen in einer biologischen Probe aus einem menschlichen Patienten vorliegt; wenn der Assay das Vorliegen einer pathognomonischen Menge an Telomerase-RNA-Komponente außerhalb des normalen Bereichs (z. B. über die vorbestimmte pathognomonische Konzentration hinausgehend) anzeigt, wird bei dem Patienten die Daignose erstellt, dass er einen Krankheitszustand oder eine Krankheitsprädisposition aufweist.
  • Die vorliegende Erfindung sieht rekombinante Telomerasepräparationen und Verfahren zur Herstellung derartiger Präparationen vor. Somit stellt die vorliegende Erfindung eine rekombinante menschliche Telomerase bereit, welche die Proteinkomponenten von menschlicher Telomerase sowie die Proteinkomponenten von Telomerase aus einer Säugetierart mit einer RNA-Komponente, welche im wesentlichen homolog zu der RNA-Komponente von menschlicher Telomerase ist, in Assoziation mit einer rekombinanten RNA-Komponente der Erfindung umfasst. Derartige rekombinante RNA-Komponenten-Moleküle der Erfindung schließen diejenigen ein, welche sich von natürlich vorkommenden RNA-Komponenten-Molekülen durch eine oder mehrere Basen-Substitutionen, -Deletionen, terminale Additionen und/oder -Insertionen unterscheiden, sowie RNA-Komponenten-Moleküle, welche zu dem natürlich vorkommenden RNA-Komponenten-Molekül identisch sind, die in rekombinanten Wirtszellen hergestellt werden. Das Verfahren zur Herstellung solcher rekombinanten Telomerasemoleküle umfasst das Transformieren einer eukaryotischen Wirtszelle, welche die Proteinkomponenten von Telomerase exprimiert, mit einem rekombinanten Expressionsvektor, welcher ein RNA-Komponenten-Molekül der Erfindung codiert, und das Kultivieren der Wirtszellen, welche mit dem Vektor transformiert wurden, unter solchen Bedingungen, dass die Telomerase-Proteinkomponente und die Telomerase-RNA-Komponente exprimiert und unter Bildung eines aktiven Telomerasemoleküls zusammengebaut werden, das fähig ist, Sequenzen (nicht notwendigerweise dieselbe Sequenz, welche von nativer Telomerase angefügt wird) an Telomere von chromosomaler DNA anzufügen.
  • Die Erfindung sieht Verfahren zum Reinigen der Proteinkomponenten von menschlicher Telomerase sowie der Proteinkomponenten von Telomerase aus einer Säugetierart mit einer RNA-Komponente, welche im wesentlichen homolog zu der RNA-Komponente von menschlicher Telomerase ist, vor. Die vorliegende Erfindung sieht auch Verfahren zum Isolieren und Identifizieren von Nukleinsäuren, welche solche Proteinkomponenten codieren, vor. In verwandten Aspekten sieht die vorliegende Erfindung gereinigte menschliche Telomerase und gereinigte Telomerase aus Säugetierarten mit einer RNA-Komponente, welche im wesentlichen homolog zu der RNA-Komponente von menschlicher Telomerase ist, sowie gereinigte Nukleinsäuren, welche eine oder mehrere Komponenten solcher Telomerasepräparationen codieren, vor. Die vorliegende Erfindung stellt auch pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, welche als einen aktiven Bestandteil die Proteinkomponenten von Telomerase oder eine Nukleinsäure, welche eine Nukleinsäure codiert oder mit selbiger wechselwirkt, die eine Proteinkomponente von Telomerase codiert, umfassen.
  • Die Erfindung sieht Verfahren zum Identifizieren von Mitteln vor, welche Säuger-Telomeraseaktivität modulieren (d. h. inhibieren, steigern oder die Spezifität ändern). Derartige Telomerase-modulierende Mittel sind häufig kleine Moleküle (z. B. weniger als etwa 3000 Dalton) und können verwendet werden, um Telomeraseaktivität in vitro und in vivo zu modifizieren, häufig für einen therapeutischen Effekt, und werden als Laboratoriumsreagenzien und/oder Pharmazeutika verwendet.
  • Die Erfindung sieht Verfahren zum Identifizieren von Kandidatenmitteln, aus einer Bank oder Bibliothek von Miteln, vor, welche Telomeraseaktivität durch Modulieren der nichtkovalenten Bindung einer Säugetier-Telomerase-RNA-Komponente mit einer Telomerase-Proteinkomponente modulieren. Die Telomerase-RNA-Komponente kann von einer rekombinanten Matrize in einer Wirtszelle hergestellt oder chemisch synthetisiert werden, falls gewünscht. Typischerweise wird eine Säugetier-Telomerase-Proteinkomponente, wie sie aus Telomerase-exprimierenden Zellen gereinigt werden kann und bei welcher eine natürlich vorkommende Telomerase-RNA-Komponente entfernt worden sein kann (z. B. durch RNAse-Behandlung), mit einer Säugetier-Telomerase-RNA-Komponente unter geeigneten wäßrigen Bindungsbedingungen in Kontakt gebracht, um eine nicht-kovalente Bindung zwischen den RNA- und Protein-Komponenten in Abwesenheit eines zugesetzten Mittels (d. h. in einer Kontroll-Bindungsreaktion) zu gestatten. Das Ausmaß der nicht-kovalenten Interaktion zwischen der Telomerase-RNA-Komponente und der Proteinkomponente in Gegenwart von einem oder mehreren Mitteln, gewählt aus einer Bibliothek oder Bank von Mitteln, wird mit dem Ausmaß der nicht-kovalenten Interaktion in einer Kontroll-Bindungsreaktion, welche Telomerase-RNA- und Protein-Komponenten umfasst und welcher das/die Mittel fehlten, verglichen; Mittel, welche eine statistisch signifikante Erhöhung im Ausmaß der nichtkovalenten Bindung zwischen den RNA- und Protein-Komponenten von Telomerase hervorrufen, werden dadurch als ein Telomerase-modulierendes Kandidatenmittel bestimmt. Das relative Ausmaß der nicht-kovalenten Bindung kann durch jedwedes geeignete Verfahren bestimmt werden, einschließlich Bestimmung der spezifischen Bindungsaffinität, wie mittels kompetitivem Bindungsassay, Bestimmung der katalytischen Telomeraseaktivität auf einer geeigneten Telomer-Wiederholungseinheit-Matrize, oder einem anderen geeigneten Assay der funktionellen nicht-kovalenten Wechselwirkung zwischen den RNA- und Proteinkomponenten von Säugetier-Telomerase, wie einem Gel-Shift oder EMSA (elektrophoretischer Mobilitäts-Shift-Assay).
  • In einem nicht-kovalenten Bindungs-Assay zum Nachweisen von Telomerase-modulierenden Kandidatenmitteln werden eines oder beide der Telomerase-RNA-Komponente oder -Proteinkomponente mit einer geeigneten nachweisbaren Markierung markiert, und die nicht-kovalente Bindung wird separat in Gegenwart und Abwesenheit eines Mittels bestimmt, welches aus einer Bibliothek oder Bank von Mitteln ausgewählt wurde. Die Bestimmung der nicht-kovalenten Bindung umfasst das Messen des Ausmaßes, zu welchem eine markierte Telomerasekomponente (RNA-Komponente oder Proteinkomponente) an ihre kognate bzw. dazu passende Telomerasekomponente (Proteinkomponente bzw. RNA-Komponente) gebunden wird, ungeachtet dessen, ob die kognate Telomerasekomponente separat markiert oder unmarkiert ist, wie durch Einfangen (z. B. Immobilisieren) von gebundenen Komplexen, umfassend die markierte Telomerasekomponente und besagte kognate Telomerasekomponente, und Trennen (z. B. durch Waschen) von ungebundener markierter Telomerasekomponente von besagten gebundenen Komplexen, wodurch eine abgetrennte gebundene Fraktion erzeugt wird, und Nachweisen der gebundenen Komplexe in der abgetrennten gebundenen Fraktion durch Bestimmen des Vorliegens von nachweisbarer Markierung. Mittel, welche eine statistisch signifikante Verringerung oder Verstärkung von nicht-kovalenter Bindung von Telomerase-RNA- und -Protein-Komponenten erzeugen, werden dadurch als Telomerase-modulierende Kandidatenmittel identifiziert. Mittel, welche die nicht-kovalente Bindung verringern sind Kandidaten-Telomeraseinhibitoren (oder -Antagonisten), wohingegen Mittel, welche die nicht-kovalente Bindung von Telomerasekomponenten verstärken, Kandidaten-Telomeraseagonisten sind.
  • Telomerase-modulierende Kandidatenmittel können durch ihre Fähigkeit identifiziert werden, eine statistisch signifikante Erhöhung oder Verringerung der enzymatischen Aktivität einer Säugetier-Telomerase, umfassend eine gereinigte Telomerase-Proteinkomponente und eine Telomerase-RNA-Komponente, zu erzeugen.
  • Telomerase-modulierende Kandidatenmittel können durch ihre Fähigkeit identifiziert werden, eine statistisch signifikante Verringerung oder Erhöhung der Transkription einer Reporter-Polynukleotidsequenz (z. B. β-Galactosidase-Gen, Luciferase-Gen, HPRT-Gen), welches funktionsfähig an eine transkriptionsregulatorische Sequenz eines Säuger-Telomerase-RNA-Komponenten-Gens, vorzugsweise eines menschlichen Telomerase-RNA-Komponenten-Gens, verknüpft ist, in einer metabolisch aktiven Säugetierzelle hervorzurufen. In einer Variation wird ein endogenes Telomerase-RNA-Komponenten-Gen in einer Säugetierzelle mit einem homologen Targeting-Konstrukt angezielt, um eine Reporter-Polynukleotidsequenz in funktionsfähiger Verknüpfung an die stromaufwärts gelegene transkriptionsregulatorische Sequenz (z. B. Promotor) des endogenen Telomerase-RNA-Komponenten-Gens in dem chromosomalen Ort des endogenen Gens zu plazieren. In einer alternativen Variation wird ein exogenes Polynukleotid, umfassend ein Reporterpolynukleotid, funktionsfähig an einen transkriptionsregulatorischen Bereich eines Säugetier-Telomerase-RNA-Komponenten-Gens (z. B. Promotor und stromaufwärts gelegene Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen) verknüpft; das exogene Polynukleotid wird in eine Säugetierzelle transferiert, worin es nicht-homolog in eine chromosomale Lokalisierung integrieren kann und/oder als ein episomales Polynukleotid aufrechterhalten oder repliziert wird. Mittel, welche eine statistisch signifikante transkriptionelle Modulation des Reporterpolynukleotids in mit dem Mittel behandelten Zellen hervorrufen, werden dadurch als Säugetier-Telomerase-modulierende Kandidatenmittel identifiziert.
  • Zusammensetzungen zur Identifizierung von Telomerase-modulierenden Kandidatenmitteln können typischerweise folgendes umfassen: (1) Eine Säugetier-Telomerase-Proteinkomponente, wie sie aus Telomerase-exprimierenden Säugerzellen, vorzugsweise aus Zellen von Primaten (z. B. dem Menschen) gereinigt werden kann, und welche typischerweise von assoziierter RNA-Komponente, falls vorhanden, abgestriffen worden ist durch Behandlung mit RNAse oder eine andere Behandlung, die kompatibel ist mit der Entfernung von RNA-Komponente und der Beibehaltung des Vermögens des Proteins, Telomeraseaktivität in Gegenwart von kognater Telomerase-RNA-Komponente unter geeigneten Bindungsbedingungen zu rekonstituieren, (2) eine Säugetier-Telomerase-RNA-Komponente, vorzugsweise eine menschliche RNA-Komponente, welche durch Transkription eines rekombinanten Polynukleotids in einer Zelle hergestellt wurde, und (3) wäßrige Bindungsbedingungen (z. B. physiologische Bedingungen, Telomerase-Assaybedingungen), und gegebenenfalls (4) ein Reporter-Polynukleotid, umfassend mindestens eine replizierbare oder verlängerbare Säugetier-Telomerase-Wiederholungseinheit-Sequenz, welche typischerweise komplementär ist zu der Sequenz des zur Telomer-Wiederholungseinheit komplementären Matrizenbereichs der RNA-Komponente, und gegebenenfalls (5) Nukleotide, welche für die Replikation und/oder Verlängerung der Telomer-Wiederholungseinheit-Sequenz(en) des Reporter-Polynukleotids unter Telomer-Assaybedingungen geeignet sind; Ein Mittel wird typischerweise zu einer solchen Zusammensetzung zur Auswertung durch nicht-kovalente Bindung und/oder Telomeraseaktivität, im Vergleich zu einer Kontrollzusammensetzung ohne dieses Mittel, zugegeben.
  • Null-Allele von Säugetier-Telomerase-RNA-Komponenten-Genen, wie erzeugt durch homologes Gen-Targeting eines heterologen Polynukleotids in ein Säugetier-Telomerase-RNA-Komponenten-Gen zur funktionellen Inaktivierung des Telomerase-RNA-Kompo nenten-Gens, können hergestellt werden. Die Erfindung stellt deshalb ebenfalls nicht-menschliche "Knockout"-Tiere zur Verfügung, umfassend ein Telomerase-RNA-Komponenten-Null-Allel, und stellt in einer Variation nicht-menschliche Knockout-Tiere bereit, welche für Telomerase-RNA-Komponenten-Null-Allele homozygot sind und welchen im wesentlichen endogene Telomeraseaktivität fehlt, resultierend aus einem Mangel an endogener Telomerase-RNA-Komponente. Solche Knockout-Tiere werden als kommerzielle Reagenzien für Toxikologie-Screening, zum Verkauf an pharmazeutische Forschungslaboratorien zum Identifizieren oder Erforschen von Telomerase-modulierenden Mitteln, als Haustiere, und, neben anderen Anwendungen, als landwirtschaftlicher Viehbestand verwendet.
  • Die Erfindung gestattet ein Verfahren zum Immortalisieren von Säugetierzellen, wie wünschenswerten Fermentationszellen, in einem Bioreaktor, oder einem wünschenswerten Zellstamm, welcher vorteilhafte Merkmale als ein kommerzielles Forschungsreagenz aufweist. Das Verfahren umfasst das Einführen eines Polynukleotids in eine Säugetierzelle, welches eine funktionelle Telomerase-RNA-Komponente exprimiert, die in der Lage ist, funktionelles Telomeraseenzym in Gegenwart von Telomerase-Proteinkomponente zu bilden.
  • Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der nachfolgenden Beschreibung der Zeichnungen, bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung, den Beispielen und den Patentansprüchen offensichtlich werden.
  • Definitionen
  • Der Ausdruck "Telomerase-RNA-Komponenten-Polynukleotid", wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein Polynukleotid mit wenigstens 20 Nukleotiden, wobei das Polynukleotid ein Segment von wenigstens 20 Nukleotiden umfasst, welche: zu wenigstens 85 Prozent zu einer natürlich vorkommenden Säugetier-Telomerase-RNA-Komponenten-Sequenz, typischerweise einer Primaten-Telomerase-RNA-Komponente, wie einer Mensch- oder Affen-Telomerase-RNA-Komponente, identisch sind. Manche Telomerase-RNA-Komponenten-Polynukleotide mit Sequenzvariationen im Vergleich zu einer natürlich vorkommenden Telomerase-RNA-Komponenten-Sequenz oder ihrem Komplement können als Hybridisierngssonden, PCR-Primer, LCR-Amplimere, Fehlpaarungs-RNA-Komponenten und dergleichen geeignet sein.
  • Der Ausdruck "entspricht zu" wird hierin verwendet, um zu bezeichnen, dass eine Polynukleotidsequenz homolog (d. h. identisch, nicht strikt evolutionär verwandt) zur Gesamtheit oder einem Abschnitt einer Referenz-Polynukleotidsequenz ist, oder dass eine Polypeptidsequenz identisch zu einer Referenz-Polypeptidsequenz ist. Im Unterschied dazu wird der Ausdruck "komplementär zu" hierin verwendet, um zu bezeichnen, dass die komplementäre Sequenz homolog zur Gesamtheit oder einem Abschnitt einer Referenz-Polynukleotidsequenz ist. Zur Veranschaulichung entspricht die Nukleotidsequenz "TATAC" einer Referenzsequenz "TATAC" und ist komplementär zu einer Referenzsequenz "GTATA".
  • Die folgenden Begriffe werden verwendet, um die Sequenzbeziehungen zwischen zwei oder mehreren Polynukleotiden zu beschreiben: "Referenzsequenz", "Vergleichsfenster", "Sequenzidentität", "Prozentsatz an Sequenzidentität" und "wesentliche Identität". Eine "Referenzsequenz" ist als eine Sequenz definiert, welche als Grundlage für einen Sequenzvergleich verwendet wird; eine Referenzsequenz kann eine Teilmenge einer größeren Sequenz sein, wie zum Beispiel ein Segment einer Volllängen-Telomerase-RNA-Komponenten-Gensequenz. Im allgemeinen weist eine Referenzsequenz wenigstens 20 Nukleotide Länge, häufig wenigstens 25 Nukleotide Länge und oftmals wenigstens 50 Nukleotide Länge auf. Da zwei Polynukleotide jeweils (1) eine Sequenz (d. h. einen Abschnitt der vollständigen Polynukleotidsequenz) umfassen können, welche zwischen den zwei Polynukleotiden ähnlich ist, und (2) eine Sequenz umfassen können, welche zwischen den zwei Polynukleotiden abweichend ist, werden Sequenzvergleiche zwischen zwei (oder mehr) Polynukleotiden typischerweise durch Vergleichen von Sequenzen der zwei Polynukleotide über ein "Vergleichsfenster" hinweg durchgeführt, um lokale Bereiche mit Sequenzähnlichkeit zu identifizieren und zu vergleichen.
  • Ein "Vergleichsfenster", wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein konzeptuelles Segment von wenigstens 25 aneinander angrenzenden Nukleotidpositionen, wobei eine Polynukleotidsequenz zu einer Referenzsequenz von wenigstens 25 aneinander angrenzenden Nukleotiden verglichen werden kann, und wobei der Abschnitt der Polynukleotidsequenz in dem Vergleichsfenster Additionen oder Deletionen (d. h. Lücken) von 20 Prozent oder weniger im Vergleich zu der Referenzsequenz (welche keine Additionen oder Deletionen umfasst) für eine optimale Alignierung der zwei Sequenzen umfassen kann. Eine optimale Alignierung von Sequenzen zum Alignieren eines Vergleichsfensters kann mittels des lokalen Homologie-Algorithmus von Smith und Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482, durch den Homologie-Alignment-Algorithmus von Needleman und Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443, durch die Ähnlichkeits-Suchmethode von Pearson und Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85; 2444, durch computergestützte Implementierungen dieser Algorithmen (GAP, BESTFIT, FASTA und TFASTA im Wisconsin Genetics Software-Paket, Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) oder durch Betrachtung durchgeführt werden, und das beste Alignment (d. h. welches zum höchsten Prozentsatz an Homologie über das Vergleichsfenster hinweg führt), das durch die verschiedenen Methoden erzeugt wird, wird gewählt.
  • Der Ausdruck "Sequenzidentität" bedeutet, dass zwei Polynukleotidsequenzen (d. h. auf einer Nukleotid-um-Nukleotid-Basis) über das Vergleichsfenster hinweg identisch sind. Der Ausdruck "Prozentsatz an Sequenzidentität" wird durch Vergleichen von zwei optimal alignierten Sequenzen über das Vergleichsfenster hinweg, Bestimmen der Zahl von Positionen, bei welchen die identische Nukleinsäurebase (z. B. A, T, C, G, U oder I) in beiden Sequenzen auftritt, um die Anzahl von übereinstimmenden Positionen zu ergeben, Dividieren der Anzahl von übereinstimmenden Positionen durch die Gesamtzahl an Positionen im Vergleichsfenster (d. h. die Fenstergröße) und Multiplizieren des Ergebnisses mit 100, um den Prozentsatz an Sequenzidentität zu erhalten, berechnet. Der Ausdruck "wesentliche Identität", wie hierin verwendet, bezeichnet ein Charakteristikum einer Polynukleotidsequenz, wobei das Polynukleotid eine Sequenz umfasst, welche wenigstens 80 Prozent Sequenzidentität, vorzugsweise wenigstens 85 Prozent Identität und häufig 89 bis 95 Prozent Sequenzidentität, noch üblicher wenigstens 99 Prozent Sequenzidentität aufweist, bei Vergleichen zu einer Referenzsequenz über ein Vergleichsfenster von wenigstens 20 Nukleotidpositionen, häufig über ein Fenster von wenigstens 30-50 Nukleotiden, hinweg, wobei der Prozentsatz an Sequenzidentität berechnet wird durch Vergleichen der Referenzsequenz zu der Polynukleotidsequenz, welche Deletionen oder Additionen einschließen kann, welche insgesamt 20 Prozent oder weniger der Referenzsequenz über das Vergleichsfenster hinweg ausmachen. Die Referenzsequenz kann eine Teilmenge einer größeren Sequenz sein, wie zum Beispiel ein Segment der Volllängen-Telomerase-RNA-Komponenten-Gensequenz, wie hierin offenbart.
  • Eine spezifische Hybridisierung wird hierin definiert als die Bildung von Hybriden zwischen einem Sonden-Polynukleotid (z. B. einem Polynukleotid der Erfindung, welches Substitutionen, Deletion und/oder Additionen einschließen kann) und einem spezifischen Zielpolynukleotid (z. B. einer Telomerase-RNA-Komponente oder genomischen Gensequenz), wobei die Sonde präferentiell an das spezifische Ziel hybridisiert, so dass beispielsweise eine einzelne Bande, entsprechend einer oder mehreren der RNA-Spezies des Telomerase-RNA-Komponenten-Gens (oder spezifisch gespaltenen oder prozessierten Telomerase-RNA-Komponenten-Spezies), auf einem Northern-Blot von RNA identifiziert werden kann, welcher aus einer geeigneten Zellquelle angefertigt wurde (z. B. einer somatischen Zelle, welche Telomerase-RNA-Komponente exprimiert). Polynukleotide der Erfindung, welche spezifisch an Säugetier-Telomerase-RNA-Komponente oder menschliche telomere Sequenzen hybridisieren, können auf der Basis der hierin vorgesehenen Sequenzdaten gemäß Verfahren und thermodynamischen Prinzipien, welche im Fachgebiet bekannt sind und in Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe (1989), Cold Spring Harbor, N.Y., und Berger und Kimmel, Methods in Enzymology, Band 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (1987), Academic Press, Inc., San Diego, CA, beschrieben sind, hergestellt werden.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck "geeignete Bindungsbedingungen" auf wässrige Bedingungen, bei welchen eine Säugetier-Telomerase-RNA-Komponente mit ihrer kognaten Proteinkomponente assoziiert und ein enzymatisch aktives Telomerase-Holoenzym bildet, fähig zur katalytischen Replikation, Reparatur und/oder Addition von telomeren Wiederholungseinheiten von einer geeigneten Matrize aus, welche telomere Wiederholungseinheiten umfasst; eine solche Telomer-Wiederholungseinheit-Matrize kann vorhanden oder abwesend sein. Oft können geeignete Bindungsbedingungen physiologische Bedingungen sein. "Physiologische Bedingungen", wie hierin verwendet, bezieht sich auf Temperatur, pH-Wert, Ionenstärke, Viskosität und gleichartige biochemische Parameter, welche mit einem lebensfähigen Organismus kompatibel sind und/oder welche typischerweise intrazellulär in einer lebensfähigen kultivierten Säugerzelle existieren, insbesondere Bedingungen, welche im Zellkern der Säugerzelle herrschen. Zum Beispiel sind die intranukleären oder cytoplasmatischen Bedingungen in einer Säugerzelle, welche unter typischen Laboratoriums-Kulturbedingungen herangezüchtet worden ist, physiologische Bedingungen. Geeignete in vitro-Reaktionsbedingungen für in vitro-Transkriptions-Cocktails sind im allgemeinen physiologische Bedingungen und können durch eine Vielzahl von im Fachgebiet bekannten Zellkernextrakten beispielhaft veranschaulicht werden. Im allgemeinen können physiologische in vitro-Bedingungen 50-200 mM NaCl oder KCl, pH 6,5-8,5, 20-45°C und 0,001-10 mM zweiwertiges Kation (z. B. Mg++, Ca++); vorzugsweise etwa 150 mM NaCl oder KCl, pH 7,2-7,6, 5 mM zweiwertiges Kation, umfassen und schließen oft 0,01-1,0 Prozent nicht-spezifisches Protein (z. B. BSA) ein. Oft kann ein nicht-ionisches Detergens (Tween, NP-40, Triton X-100) vorhanden sein, üblicherweise bei etwa 0,001 bis 2%, typischerweise 0,05-0,2% (v/v). Jeweilige wässrige Bedingungen können durch den Ausübenden gemäß herkömmlicher Verfahren gewählt werden. Als allgemeine Richtlinie können die folgenden gepufferten wässrigen Bedingungen anwendbar sein: 10-250 mM NaCl, 5-50 mM TrisHCl, pH 5-8, mit der wahlfreien Zugabe von zweiwertigen Kation(en) und/oder Metall-Chelatierungsmitteln und/oder nicht-ionischen Detergentien und/oder Membranfraktionen und/oder Antischaummitteln und/oder Szintillationssubstanzen.
  • Wie hierin verwendet, beziehen sich die Begriffe "Markierung" oder "markiert" auf den Einbau eines nachweisbaren Markers, z. B. durch Einbau einer radioaktiv markierten Aminosäure oder Anheftung von Biotinyl-Einheiten an ein Polypeptid, welche durch markiertes Avidin (z. B. Streptavidin, welches einen fluoreszenten Marker oder eine enzymatische Aktivität enthält, welche(r) durch optische oder calorimetische Verfahren detektiert werden kann) nachgewiesen werden können. Verschiedene Verfahren zur Markierung von Polypeptiden und Glykoproteinen sind im Fachgebiet bekannt und können angewandt werden. Beispiele von Markierungen für Polypeptide schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, die Folgenden ein: radioaktive Isotope (z. B. 3H, 14C, 35S, 125I, 131I), fluoreszierende Markierungen (z. B. FITC, Rhodamin, Lanthaniden-Phosphore), enzymatische Markierungen (z. B. Meerrettichperoxidase, β-Galactosidase, Luciferase, alkalische Phospatase), Biotinylgruppen, vorbestimmte Polypeptidepitope, welche von einem sekundären Reporter erkannt werden (z. B. Leucin-Zipper-Paar-Sequenzen, Bindungsstellen für sekundäre Antikörper, transkriptionelles Aktivator-Polypeptid, Metall-Bindungsdomänen, Epitop-Tags). In einigen Ausführungsformen werden Markierungen mittels Abstandhalter-Armen verschiedener Längen angeheftet, um eine potentielle sterische Behinderung zu verringern.
  • Wie hierin verwendet, bedeutet der Ausdruck "statistisch signifikant" ein Ergebnis (d. h. eine Assay-Ablesung), welches im allgemeinen mindestens zwei Standardabweichungen über oder unter dem Mittelwert von mindestens drei getrennten Bestimmungen einer Kontrollassay-Ablesung liegt und/oder welches statistisch signifikant ist, wie durch den t-Test nach Student oder ein anderes im Fachgebiet akzeptiertes Maß der statistischen Signifikanz bestimmt wird.
  • Wie hierin verwendet, beziehen sich die Begriffe "pathognomonische Konzentration", "pathognomonische Menge" und "pathognomonisches Hybridisierungsmuster" auf eine Konzentration, Menge bzw. ein Lokalisierungsmuster einer Telomerase-RNA-Komponente in einer Probe, welche(s) das Vorhandensein eines pathologischen (z. B. neoplastischen, seneszenten, Immundefizienten, neurodegenerativen, entzündlichen, etc.) Zustands oder eine Prädisposition zur Entwicklung einer neoplastischen Krankheit, wie Karzinom, Sarkom oder Leukämie, anzeigt. Eine pathognomonische Menge ist eine Menge von Telomerase-RNA-Komponente in einer Zelle oder zellulären Probe, welche außerhalb des Bereichs von normalen klinischen Werten liegt, der durch prospektive und/oder retrospektive statistische klinische Untersuchungen festgestellt wird. Im Allgemeinen wird ein Individuum mit einer neoplastischen Krankheit (z. B. Karzinom, Sarkom oder Leukämie) eine Menge an Telomerase-RNA-Komponente in einer Zelle oder Gewebeprobe aufzeigen, welche außerhalb des Bereichs an Konzentrationen liegt, welche normale, nicht-erkrankte Individuen kennzeichnen; typischerweise liegt die pathognomonische Konzentration mindestens etwa eine Standardabweichung außerhalb des mittleren normalen Wertes, noch üblicher liegt sie mindestens etwa zwei Standardabweichungen oder mehr über dem mittleren normalen Wert. Allerdings erzeugen im wesentlichen alle klinischen diagnostischen Tests einen gewissen Prozentsatz an falschen positiven und falschen negativen Resultaten. Die Empfindlichkeit und Selektivität des diagnostischen Assays müssen ausreichend sein, um das diagnostische Ziel und jedwede relevanten regulatorischen Anforderungen zu erfüllen. Im allgemeinen werden die diagnostischen Verfahren der Erfindung angewandt, um Individuen als Krankheitskandidaten zu identifizieren, wodurch ein zusätzlicher Parameter in einer differentiellen Krankheitsdiagnose bereitgestellt wird, welche von einem kompetenten Gesundheitsexperten erstellt wird.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "Krankheitsallel" auf ein Allel eines Gens, welches zur Erzeugung einer erkennbaren Krankheit in der Lage ist. Ein Krankheitsallel kann dominant oder rezessiv sein und kann eine Krankheit direkt oder dann, wenn es in Kombination mit einem spezifischen genetischen Hintergrund oder im Voraus existierenden pathologischen Zustand vorliegt, hervorrufen. Ein Krankheitsallel kann im Genpool vorhanden sein oder de novo in einem Individuum durch somatische Mutation erzeugt werden.
  • Der Ausdruck "antineoplastisches Mittel" wird hierin verwendet, um auf Mittel bezug zu nehmen, welche die funktionelle Eigenschaft der Inhibierung einer Entwicklung oder Progression eines Neoplasmas in einem Menschen aufweisen, oftmals einschließlich Inhibition von Metastase oder von metastatischem Potential.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck "funktionsfähig verknüpft" auf eine Verknüpfung von Polynukleotidelementen in einer funktionellen Beziehung. Eine Nukleinsäure ist "funktionsfähig verknüpft", wenn sie in eine funktionelle Beziehung mit einer anderen Nukleinsäuresequenz gebracht wird. Zum Beispiel ist ein Promoter oder Enhancer funktionsfähig an eine codierende Sequenz verknüpft, wenn er die Transkription der codierenden Sequenz beeinflusst. Funktionsfähig verknüpft bedeutet, dass die verknüpften DNA-Sequenzen typischerweise aneinander angrenzend sind, und, falls notwendig um zwei proteincodierende Regionen zu verbinden, aneinander angrenzend und im Leseraster vorliegen. Da jedoch Enhancer im allgemeinen funktionieren, wenn sie von dem Promoter durch einige Kilobasen getrennt sind, und Intron-Sequenzen variable Längen aufweisen können, können manche Polynukleotidelemente funktionsfähig verknüpft aber nicht aneinander angrenzend sein. Ein Strukturgen (z. B. ein HSV-tk-Gen), welches funktionsfähig an eine Polynukleotidsequenz verknüpft ist, die einer transkriptionsregulatorischen Sequenz eines endogenen Gens entspricht, wird im allgemeinen im Wesentlichen in dem gleichen zeitlichen und Zelltyp-spezifischen Muster exprimiert, wie es bei dem natürlich vorkommenden Gen der Fall ist.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck "Transkriptionseinheit" oder "transkriptioneller Komplex" auf eine Polynukleotidsequenz, die ein Strukturgen (Exons), einen cis-wirkenden verknüpften Promoter und andere cis-wirkende Sequenzen, welche für die effiziente Transkription der strukturellen Sequenzen notwendig sind, distale regulatorische Elemente, welche für die passende gewebespezifische und entwicklungsmäßige Transkription der strukturellen Sequenzen notwendig sind, und zusätzliche cis-Sequenzen, welche für die effiziente Transkription und Translation bedeutsam sind (z. B. Polyadenylierungsstelle, mRNA-Stabilität regulierende Sequenzen) umfasst.
  • Der Ausdruck "transkriptionelle Modulation" wird hierin verwendet, um Bezug auf die Fähigkeit zu nehmen, die Transkription einer strukturellen Sequenz, welche in cis verknüpft ist, entweder zu verstärken oder deren Transkription zu inhibieren; eine derartige Verstärkung oder Inhibition kann von dem Auftreten eines spezifischen Ereignisses, wie der Stimulation mit einem Induktor, abhängig sein und/oder kann nur in bestimmten Zelltypen manifestiert werden.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck "transkriptionsregulatorischer Bereich" auf eine DNA-Sequenz, umfassend einen funktionellen Promotor und jedewede assoziierte Transkriptionselemente (z. B. Enhancer, CCAAT-Box, TATA-Box, SP1-Stelle etc.), welche wesentlich für die Transkription einer Polynukleotidsequenz sind, die funktionsfähig an den transkriptionsregulatorischen Bereich verknüpft ist.
  • Der Begriff "Null-Allel", wie hierin verwendet, bedeutet, dass ein Genlocus mindestens eine Mutation oder Strukturveränderung umfasst, so dass das Null-Allel im wesentlichen unfähig ist, die effiziente Expression eines funktionellen Genproduktes zu steuern. Eine "Knockout-Zelle" ist eine Zelle, welche mindestens ein Null-Allel eines enodogenen Gens aufweist, wobei sie typischerweise bezüglich des Null-Allels homozygot ist. Somit kann eine Knockout-Zelle zum Beispiel homozygot hinsichtlich Null-Allelen an dem Telomerase-RNA-Komponenten-Locus sein, so dass eine Knockout-Zelle im wesentlichen nicht in der Lage ist, eine funktionelle Telomerase-RNA-Komponente zu exprimieren.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1. Telomeraseaktivität aus Zellen, welche Matrizen-Mutiertes-TRC3 exprimieren. DEAE-Sepharose-fraktionierte Extrakte aus Mutanten-TRC3 exprimierenden stabilen Transformanten wurden hinsichtlich Telomeraseaktivität unter Anwendung herkömmlicher Assays unter verschiedenen Reaktionsbedingungen getestet. Extrakte aus Zellen, welche MuC+17 TRC3 (Spuren 1, 4, 7, 10, 13, 16, markiert mit C*), MuC TRC-3 (Spuren 2, 5, 8, 11, 14, 17, markiert mit C) oder MuA TRC3 (Spuren 3, 6, 9, 12, 15, 18, markiert mit A) exprimierten, wurden unter normalen (Spuren 1-6), normalen plus 0,5 mM ddCTP (Spuren 7-9), normalen minus dTTP plus 0,5 mM ddTTP (Spuren 10-12), oder normalen minus dATP plus 0,5 mM ddATP (Spuren 13-18) Reaktionsbedingungen geassayt. Die Assay-Reaktionen in den Spuren 1-9 enthielten 8 μM Gesamt-dGTP, wovon 1 μM 32P-dGTP (800 Ci/mmol) war. Um die Detektion von Mutanten-Telomerase zu erleichtern, enthielten die Assay-Reaktionen in den Spuren 10-18 8 μM Gesamt-dGTP, wovon 2 μM 32P-dGTP (800Ci/mmol) waren. Die Extrakte wurden mit DNase-freier RNase (25 μg/ml während 10 Minuten bei 30°C) vor den Telomerase-Assays behandelt (Spuren 1-3, 16-18). Flankierende Spuren enthalten DNA-Marker mit Größen in Nukleotiden (nt), wie angezeigt.
  • 2. Der Grundzustands-Spiegel an Telomerase-RNA-Komponente (hTR) und GAPDH-RNA wurde unter Verwendung einer quantitativen RT-PCR bestimmt. Die Kontrollen zeigen, dass alle PCR-Quantifizierungen im linearen Bereich bis zu 25 Zyklen lagen. RT-PCR wurde hinsichtlich fünf normaler Telomerase-negativer Zelllinien (1-5) und fünf Telomerase-positiven Tumor-Zelllinien (6-10) analysiert: 1) primäre fötale Lunge; 2) primäre fötale Handhaut; 3) adulte primäre Prostata; 4) primäre synoviale Fibroblasten; 5) Vorhaut-Fibroblasten; 6) Melanom LOX; 7) Leukämie U251; 8) NCIH23-Lungenkarzinom; 9) Kolon-Tumor SW620; 10) Brusttumor MCF7. Die PCR Produkte wurden mit 32P markiert, auf einer 6%igen PAGE aufgetrennt und unter Verwendung eines 'PhosphorImagers' quantifiziert. Die relative Transkription ist in willkürlichen Einheiten ausgedrückt.
  • 3. Mittlere TRF-Länge in Telomerase-RNA-Komponenten-Antisense- und Vektor-Kontroll-Zellen. HeTe7-Zellen, welche 10-3-hTR-Antisense oder Vektor-Kontrolle stabil exprimieren, wurden in Hygromycin- und Puromycin-Medien gewählt und bei 23 PDL nach Transfektion geerntet. Zellkern-DNA wurde gereinigt, mit HinfI und RsaI geschnitten und auf einem 0,5%igen Agarosegel laufen gelassen. Die DNA wurde im Gel mit einem (TTAGGG)3-Oligonukleotid sondiert, um die Telomer-Enden-Restriktionsfragmente (TRF) zu markieren. Das Gel wurde mit einem PhosphorImager von Molecular Dynamic's abgetastet, und die mittleren TRF wurden quantifiziert, wie beschrieben (Allsopp et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10114). Die gestrichelten Linien zeigen die durchschnittlichen Mittelwert-TRF für die Antisense- und Kontroll-Gruppen.
  • 4. Schematische Widergabe des in situ-PCR-Verfahrens.
  • Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
  • Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren, Reagenzien, genetisch modifizierte Tiere und Zellen und pharmazeutische Zusammensetzungen, betreffend das Ribonukleoprotein humane Telomerase, bereit.
  • Die hierin nachstehend verwendete Nomenklatur und die Laboratoriums-Vorgehensweisen in Zellkultur, Molekulargenetik und Nukleinsäurechemie und Hybridisierung, welche nachstehend beschrieben werden, können gut bekannte und weithin angewandte Vorgehensweisen im Fachgebiet beinhalten. Standardtechniken werden für rekombinante Nukleinsäureverfahren, Polynukleotid-Synthese und Mikroben-Kultur und -Transformation (z. B. Elektroporation, Lipofection) angewandt. Die Techniken und Verfahrensweisen werden im allgemeinen gemäß den im Fachgebiet herkömmlichen Verfahren und verschiedenen allgemeinen Bezugstellen durchgeführt (siehe im allgemeinen, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), welche überall in diesem Dokument angegeben werden.
  • Oligonukleotide können auf einem Oligonukleotid-Synthesizer von Applied Bio Systems gemäß den vom Hersteller bereitgestellten Spezifikationen synthetisiert werden.
  • Verfahren für die PCR-Amplifikation sind im Fachgebiet beschrieben (PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, Hrsg.: HA Erlich, Freeman Press, New York, NY (1992); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Hrsg.: Innis, Gelfland, Snisky und White, Academic Press, San Diego, CA (1990); Mattila et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19: 4967; Eckert, K.A., und Kunkel, T.A., (1991) PCR Methods and Applications 1: 17; PCR, Hrsg.: McPherson, Quirkes und Taylor, IRL Press, Oxford; und U.S.-Patent 4 683 202.
  • Überblick
  • Die Erfindung erwächst zum Teil aus der Klonierung und Isolierung der RNA-Komponente von menschlicher Telomerase und des Gens für diese RNA-Komponente, einschließlich assoziierter Transkriptionsregulations-Elemente. Die Nukleotidsequenz der RNA-Komponente von menschlicher Telomerase wird nachstehend gezeigt. Zur Bequemlichkeit ist die Sequenz unter Verwendung der Standardabkürzungen für Ribonukleotide gezeigt (A ist Riboadenin, G ist Riboguanin, C ist Ribocytidin und U ist Uridin). Der Fachmann auf dem Gebiet erkennt, dass die nachstehend gezeigte Sequenz auch die Sequenz der cDNA zeigt, in welcher die Ribonukleotide durch Desoxyribonukleotide ersetzt sind (wobei Uridin durch Thymidin ersetzt wird).
  • Figure 00230001
  • Die obenstehende Sequenz ist in der 5'-3'-Richtung gezeigt und ist zur Bezugnahme numeriert. Die Matrizensequenz der RNA-Komponente liegt angenommenermaßen innerhalb der Region, welche von den Nukleotiden 50-60 eingegrenzt wird (5'-CUAACCCUAAC-3'), welche komplementär zu einer telomeren Sequenz ist, die aus etwa ein-zweidrittel telomeren Wiederholungseinheiten aufgebaut ist.
  • Diese Sequenz wurde aus cDNA-Klonen und aus einem genomischen Klon der RNA-Komponente abgeleitet. Wenn die RNA-Komponente zuerst von dem entsprechenden Gen transkribiert wird, sind wenigstens einige der hergestellten RNA-Transkripte viel länger als die oben gezeigte ~560 Nukleotide große Sequenz und können tatsächlich mehr als 1000 Nukleotide umfassen. Allerdings kann ein vollständig funktionelles Telomerase-Molekül aus Transkripten zusammengesetzt werden, welche aus der oben gezeigten ~560 Nukleotide großen Sequenz bestehen. Das 3'-Ende der RNA-Komponente in nativer Telomerase liegt angenommenermaßen innerhalb der Region, welche von den Nukleotiden 514-559 in der obenstehenden Sequenz eingegrenzt wird; eine Analyse zeigt, dass das 3'-Ende der U-Rest an Nukleotid 538 sein kann. Rekombinante RNA-Komponenten-Moleküle, welche weniger als die Nukleotide 1-559 der obenstehend gezeigten Sequenz umfassen, können ebenfalls verwendet werden, um aktive Telomerase herzustellen.
  • Ein genomischer Klon wurde aus einer genomischen Bibliothek von menschlicher DNA, welche in einen Lambda-Vektor FIXII inseriert war, identifiziert und isoliert. Der genomische Klon, welcher die RNA-Komponenten-Gensequenzen umfasste, enthielt ein ~15 kb großes Insert und wurde als Klon 28-1 bezeichnet. Das Gen ist auf dem distalen Ende des q-Armes von Chromosom 3 lokalisiert. Die von einer SauIIIA1-Restriktionsenzym-Erkennungsstelle an einem Ende des ~15 kb großen Inserts bis zu einer internen HindIII-Restriktionsenzym-Erkennungsstelle erhaltene Sequenzinformation, welche die Gesamtheit der reifen RNA-Komponenten-Sequenz sowie die Transkriptionsregulations-Elemente des RNA-Komponenten-Gens umfasst, von Lambda-Klon 28-1 wird untenstehend unter Verwendung der Standard-Desoxyribonukleotid-Abkürzungen gezeigt und in der 5'-3'-Richtung dargestellt.
  • Figure 00250001
  • Figure 00260001
  • Die RNA-Komponenten-Sequenz beginnt an der Base 1459. Eine Vielzahl von Transkriptionsregulations-Elementen werden in der Sequenz identifiziert. Eine A/T-Box-Konsensus-Sequenz wird an den Nukleotiden 1431-1436 gefunden; PSE-Konsensus-Sequenzen werden an den Nukleotiden 1406-1414 sowie an den Nukleotiden 1508-1526 gefunden; eine CAAT-Box-Konsensus-Sequenz wird an den Nukleotiden 1399-1406 gefunden; eine SP1-Konsensus-Sequenz wird an den Nukleotiden 1354-1359 gefunden; und eine β/γ-Interferon-Antwortelement-Konsensus-Sequenz wird an den Nukleotiden 1234-1245 gefunden. Die Grundzustand- bzw. "Steady-state"-Transkription von menschlichem Telo merase-RNA-Komponenten-Gen in menschlichen Zellen, wie HT1080 (Telomeraseexprimierend), ist im Wesentlichen unverändert, wenn Sequenzen stromaufwärts von Nukleotid 1159 in Vektoren deletiert sind, welche stabil in die Zellen transfiziert werden.
  • DNA aus Totenkopfäffchen, welches angenommenermaßen zu den genetisch am stärksten divergenten nicht-menschlichen Primaten in Bezug auf den Menschen zählt, umfasst ein Telomerase-RNA-Komponenten-Gen, welches mit PCR-Primern amplifizierbar ist, bestehend aus Sequenzen, welche der offenbarten menschlichen Telomerase-RNA-Komponenten-Polynukleotidsequenz entsprechen oder dazu komplementär sind. Von anderen nicht-menschlichen Primaten wird angenommen, Telomerase-RNA-Komponenten-Gene zu besitzen, welche ebenfalls mit PCR-Primern amplifizierbar sind, die aus der Sequenz des menschlichen Telomerase-RNA-Komponenten-Gens abgeleitet sind.
  • Telomerase-RNA-Komponenten-Polynukleotide
  • Die Offenbarung der Sequenzen für Säugetier-Telomerase-RNA-Komponente und deren Gen, wie obenstehend für menschliche Telomerase gezeigt, ermöglicht die Konstruktion von isolierten Polynukleotiden, welche eine Sequenz von wenigstens 15 aneinander angrenzenden Nukleotiden, typischerweise wenigstens 20 bis 25 aneinander angrenzenden Polynukleotiden, umfassen, die im Wesentlichen identisch zu einer Säugetier-Telomerase-RNA-Komponenten-Sequenz oder einer Säugetier-RNA-Komponenten-Gen-Sequenz sind. Ferner ermöglichen die Säugetier-Telomerase-RNA-Komponenten (und Gen-)Sequenzen die Konstruktion von Nukleinsäure-Hybridisierungssonden und PCR-Primern, welche zum Nachweis von RNA- und DNA-Sequenzen der kognaten Telomerase-RNA-Komponente und/oder des Gens in einer Zelle, zellulären Probe, einem Gewebeschnitt, Reaktionsgefäß, einer Hybridisierungsmembran oder dergleichen verwendet werden können.
  • Polynukleotide, umfassend Säugetier-Telomerase-RNA-Komponenten-Sequenzen, können Sequenzen, welche Transkription erleichtern (Expressions-Sequenzen), RNA-stabilisierende Sequenzen und dergleichen einschließen. Allgemeine Prinzipien für die Konstruktion solcher Polynukleotide im Hinblick auf die vorliegend offenbarte Sequenzinformation und Richtlinien und Anweisungen der Erfindung sind im Fachgebiet gut bekannt und werden ferner in Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe (1989), Cold Spring Harbor, N.Y., beschrieben. Zum Beispiel, aber nicht zur Einschränkung, können solche Polynukleotide einen Promotor und gegebenenfalls einen Enhancer zur Verwendung in eukaryotischen Expressionswirten und, gegebenenfalls, für die Replikation eines Vektors notwendige Sequenzen einschließen. Eine typische eukaryotische Expressionskassette wird eine Polynukleotidsequenz einschließen, welche, falls sie transkribiert wird, ein Säugetier-Telomerase-RNA-Komponenten-Transkript herstellt; eine solche Polynukleotidsequenz ist stromabwärts (d. h. in der Transkriptionsorientierung 5' nach 3') von einem geeigneten Promotor verknüpft, wie etwa dem HSV-tk-Promotor oder dem PGK(Phosphoglyceratkinase)-Promotor, welcher gegebenenfalls an einen Enhancer verknüpft ist.
  • Wo die Expression einer funktionellen Telomerase-RNA-Komponente nicht gewünscht wird, dürfen darüber hinaus Polynukleotide dieser Erfindung nicht zu einem funktionellen Telomerase-RNA-Komponenten-Transkript transkribiert werden. Die Polynukleotide dieser Erfindung können als Hybridisierungssonden und/oder PCR-Primer (Amplimere) und/oder LCR-Oligomere zum Nachweisen von Telomerase-RNA-Komponenten-RNA- oder -DNA-Sequenzen dienen.
  • Alternativ dazu können Polynukleotide dieser Erfindung als Hybridisierungssonden oder Primer zum Nachweisen von RNA- oder DNA-Sequenzen von verwandten Genen oder eines Telomerase-RNA-Komponenten-Gens in verwandten Spezies, typischerweise Säugetierarten, dienen. Für solche Hybridisierungs- und PCR-Anwendungen müssen die Polynukleotide der Erfindung nicht eine funktionelle Telomerase-RNA-Komponente transkribieren. Somit können Polynukleotide der Erfindung substanzielle Deletionen, Additionen, Nukleotidsubstitutionen und/oder Transpositionen enthalten, solange die spezifische Hybridisierung oder spezifische Amplifizierung zu einer Säugetier-Telomerase-RNA-Komponenten-Sequenz beibehalten wird.
  • Genomische oder cDNA-Klone von Säugetier-Telomerase-RNA-Komponente und entsprechende Gen-Sequenzen können aus Klon-Bibliotheken (z. B. erhältlich von Clontech, Palo Alto, CA) isoliert werden, wobei Hybridisierungssonden verwendet werden, die auf der Grundlage der hierin offenbarten Nukleotidsequenzen entworfen sind, und wobei herkömmliche Hybridisierungs-Screeningverfahren eingesetzt werden (z. B. Benton WD, und Davis, RW (1977) Science 196: 180; Goodspeed et al. (1989) Gene 76: 1). Wo ein cDNA-Klon gewünscht wird, werden Klonbibliotheken, enthaltend cDNA, abgeleitet aus somatischer Zell-RNA oder sonstiger Telomerase-RNA-Komponente exprimierender Zell-RNA bevorzugt. Alternativ dazu können synthetische Polynukleotidsequenzen, entsprechend der Gesamtheit oder einem Teil der hierin offenbarten Sequenzen, durch chemische Synthese von Oligonukleotiden konstruiert werden. Darüber hinaus kann eine Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung von Primern, basierend auf den hierin beschriebenen Sequenzdaten, angewandt werden, um DNA-Fragmente aus genomischer DNA, RNA-Pools oder aus cDNA- Klon-Bibliotheken zu amplifizieren. Die U.S.-Patente 4 683 195 und 4 683 202 beschreiben das PCR-Verfahren.
  • Solche Polynukleotide besitzen eine Vielzahl von Anwendungen, einschließlich als Telomerase-RNA-Komponenten-Sonden, als Matrizen zur Herstellung von funktioneller oder nicht-funktioneller Telomerase-RNA-Komponente in Zellen, als kommerzielle diagnostische Reagenzien zum Standardisieren eines Telomerase-RNA-Komponenten-Nachweis-Assays, als Gentherapie-Polynukleotide für die Verabreichung an ein Tier; solche Polynukleotide können, neben anderen Anwendungen, auch als Nahrungsmittel, verbrennbare Energieträger, UV-absorbierende Sonnenschutzmittel und Viskositäts-steigernde Gelöststoffe verwendet werden.
  • Die hierin beschriebenen Plasmide, welche während der Klonierung der RNA-Komponente von menschlicher Telomerase und des Gens für die RNA-Komponente konstruiert wurden, sind wichtige Aspekte der vorliegenden Erfindung. Diese Plasmide können verwendet werden, um die RNA-Komponente sowie das Gen von/für menschliche(r) Telomerase in im Wesentlichen reiner Form herzustellen, was noch ein weiterer bedeutender Aspekt der vorliegenden Erfindung ist. Darüber hinaus wird der Fachmann auf dem Gebiet erkennen, dass eine Vielzahl von anderen Plasmiden sowie Nicht-Plasmid-Nukleinsäuren in im Wesentlichen reiner Form, welche die Gesamtheit oder wenigstens einen nützlichen Abschnitt der Nukleotidsequenz der RNA-Komponente von menschlicher Telomerase umfassen, nützliche Materialien sind, welche von der vorliegenden Erfindung vorgesehen werden.
  • Als einen allgemeinen Punkt in Bezug auf die Nukleinsäuren der Erfindung und Präparationen, welche selbige enthalten, wird der Fachmann auf dem Gebiet erkennen, dass die Nukleinsäuren der Erfindung sowohl DNA- als auch RNA-Moleküle, sowie synthetische, nicht-natürlich vorkommende Analoge derselbigen und Heteropolymere von Desoxyribonukleotiden, Ribonukleotiden und/oder Analogen von beiden einschließen. Die besondere Zusammensetzung einer Nukleinsäure oder eines Nukleinsäure-Analoges der Erfindung wird von dem Zweck, für welches das Material eingesetzt werden wird, sowie den Umgebung(en), in welche das Material eingebracht wird, abhängen. Modifizierte oder synthetische nicht-natürlich vorkommende Nukleotide sind entworfen worden, um einer Vielzahl von Zwecken zu dienen und in einer Vielzahl von Umgebungen stabil zu bleiben, wie denjenigen, in welchen Nukleasen vorhanden sind, wie es im Fachgebiet gut bekannt ist. Modifizierte oder synthetische nicht natürlich vorkommende Nukleotide, können sich, im Vergleich zu den natürlich vorkommenden Ribo- oder Desoxyribonukleotiden, in Hinsicht auf die Kohlenhydrat(Zucker)-, Phosphatverknüpfungs- oder Basen-Anteile des Nukleotids unterscheiden oder können in manchen Fällen sogar eine Nicht-Nukleotid-Base (oder überhaupt keine Base) enthalten; siehe z. B. Arnold et al., PCT-Patentveröffentlichung Nr. WO 89/02439 mit dem Titel "Non-nucleotide Linking Reagents for Nucleotide Probes", was hierin als Bezugsstelle einbezogen ist. Ebenso wie die Nukleinsäuren der Erfindung eine breite Vielfalt an Nukleotiden umfassen können, so können diese Nukleinsäuren auch einer weiten Vielfalt an nützlichen Funktionen dienen.
  • Isolierung von kognaten Genen
  • Wie von der vorangehenden Beschreibung angegeben, sieht der Zugang zu gereinigten Nukleinsäuren, welche die Sequenz der RNA-Komponente von menschlicher Telomerase umfassen, wertvolle diagnostische und therapeutische Verfahren und Reagenzien sowie andere bedeutende Vorteile vor. Ein bedeutender Nutzen der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass die Verfahren und Reagenzien der Erfindung verwendet werden können, um die RNA-Komponente und Gene für die RNA-Komponente von Telomerase aus jedweder Säugetierart zu isolieren, welche eine RNA-Komponente aufweist, die im Wesentlichen homolog zu der menschlichen RNA-Komponente der vorliegenden Erfindung ist. Der Ausdruck "im Wesentlichen homolog" bezieht sich auf denjenigen Grad an Homologie, der für eine spezifische Hybridisierung eines Oligonukleotides oder einer Nukleinsäuresequenz der menschlichen RNA-Komponente an eine Nukleinsäuresequenz einer RNA-Komponenten-Sequenz einer anderen Säugetierart erforderlich ist. Ist eine derartige substanzielle Homologie gegeben, kann der Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet die Nukleinsäuren und Oligonukleotid-Primer und -Sonden der Erfindung verwenden, um im Wesentlichen homologe Sequenzen zu identifizieren und zu isolieren.
  • Zum Beispiel kann man eine genomische oder cDNA-Bibliothek sondieren, um homologe Sequenzen nachzuweisen. Man kann auch Primer, entsprechend zu Regionen der RNA-Komponenten-Sequenz, und PCR-Amplifikation unter niedrigen oder mäßigen Stringenzbedingungen verwenden, um eine spezifische homologe Nukleinsäuresequenz aus Präparationen von RNA oder DNA aus einer Säugetierspezies zu amplifizieren. Durch Verwenden dieser und anderer ähnlicher Techniken kann der Durchschnittsfachmann ohne Weiteres nicht nur abweichende RNA-Komponenten-Nukleinsäuren aus menschlichen Zellen sondern auch homologe RNA-Komponenten-Nukleinsäuren aus anderen Säugetierzellen, wie Zellen aus Primaten, aus Säugetieren von tiermedizinischem Interesse, d. h. Rinder, Schafe, Pferde, Hunde und Katzen, und aus Nagetieren, d. h. Ratten, Mäusen und Hamstern, isolieren. Diese Nukleinsäuren können ihrerseits verwendet werden, um transgene Tiere von großem Wert für das Screening und Testen von Pharmazeutika, welche Telomeraseaktivität regulieren, herzustellen. Durch Verwendung eines Plasmids der Erfindung kann man zum Beispiel das RNA-Komponenten-Gen "aus-knocken" oder das natürliche RNA-Komponenten-Gen mit einem rekombinanten induzierbaren Gen in einer Mus spretus-Embryostammzelle austauschen und dann eine transgene Maus erzeugen, welche als ein Modell oder Testsystem für die Untersuchung von Alters- oder Seneszenz-verwandter Krankheit nützlich sein wird. Das nachstehende Beispiel 9 veranschaulicht, wie eine derartige Methodik angewandt worden ist, um RNA-Komponenten-Sequenzen von Primaten zu identifizieren und zu isolieren.
  • Andere Säugetier-Homologe der Menschen- und Affen-Telomerase-RNA-Komponenten und/oder die kognaten Gene können identifiziert und isoliert werden durch Screening einer geeigneten nicht-menschlichen Säugetier-Genom- oder cDNA-Klon-Bibliothek, wie abgeleitet aus einer Maus-, Ratten-, Kaninchen-, Meerschweinchen-, Hamster-, Hund-, Rind-, Schaf-, Wolf-, Schwein- oder anderen genomischen oder cDNA-Bibliothek, in einem geeigneten Vektor, wie künstlichen Hefechromosomen, Cosmiden oder Bakteriophage λ (z. B. λ Charon 35), mit einer Polynukleotidsonde, welche eine Sequenz von etwa wenigstens 20 aneinander angrenzenden Nukleotiden (oder deren Komplement) einer Mensch- oder Affen-Telomerase-RNA-Komponenten- oder -Gen-Polynukleotidsequenz umfasst. Typischerweise werden Hybridisierungs- und Waschbedingungen bei hoher Stringenz gemäß herkömmlichen Hybridisierungs-Verfahrensweisen durchgeführt. Positive Klone werden isoliert und sequenziert. Zur Veranschaulichung und nicht zur Einschränkung kann ein Vollängen-Polynukleotid, entsprechend der 559-Nukleotid-Sequenz der menschlichen Telomerase-RNA-Komponente, markiert und als eine Hybridisierungssonde verwendet werden, um genomische Klone aus einer genomischen nicht-menschlichen Klon-Bibliothek in λEMBL4 oder λGEM11 (Promega Corporation, Madison, Wiconsin) zu isolieren; typische Hybridisierungsbedingungen für das Screening von Plaque-Abdrücken (Benton und Davis (1978) Science 196: 180; Dunn et al. (1989) J. Biol. Chem. 264: 13057) können die Folgenden sein: 50% Formamid, 5 × SSC oder SSPE, 1-5 × Denhardt-Lösung, 0,1-1% SDS, 100-200 μg gescherte heterologe DNA oder tRNA, 0-10% Dextransulfat, 1 × 105 bis 1 × 107 cpm/ml denaturierte Sonde mit einer spezifischen Aktivität von etwa 1 × 108 cpm/μg, und eine Inkubation bei 42°C-37°C während etwa 6-36 Stunden. Die Vorhybridisierungsbedingungen sind im Wesentlichen identisch, außer dass Sonde nicht eingeschlossen wird und die Inkubationszeit typischerweise verringert wird. Die Waschbedingungen bestehen typischerweise in 1-3 × SSC, 0,1-1 % SDS, 45-70°C mit einem Wechsel der Waschlösung nach etwa 5-30 Minuten. Zum Isolieren von nicht-menschlichen Telomerase-RNA-Komponenten-Polynukleotiden mit einer menschlichen Telomerase-RNA-Komponenten-Polynukleotidsonde wird es häufig bevorzugt, bei einer niedrigeren Stringenz zu hybridisieren, wie ungefähr 39°C, und aufeinanderfolgend bei den folgenden Temperaturstufen zu waschen: Raumtemperatur, 37°C, 39°C, 42°C, 45°C, 50°C, 55°C, 60°C, 65°C und 70°C, nach jeder Stufe anzuhalten und das Hintergrund-Sondensignal zu überwachen (und Signal gegebenenfalls mittels Autoradiogramm- und/oder Phosphor-Bildgebung nachzuweisen, wenn radioaktiv markierte Sonde verwendet wird) und die Waschschritte zu beenden, wenn ein geeignetes Signal/Rauschen-Verhältnis erreicht ist, wie empirisch ermittelt wird.
  • Polynukleotide, umfassend Sequenzen von ungefähr wenigstens 30-50 Nukleotiden, vorzugsweise wenigstens 100 Nukleotiden, entsprechend oder komplementär zu den hierin gezeigten Nukleotidsequenzen für die Mensch- und Affen-Telomerase-RNA-Komponenten-Sequenzen, können als PCR-Primer und/oder Hybridisierungssonden zur Identifizierung und zum Isolierung von Keimbahn-Genen dienen, welche den offenbarten Gen- und RNA-Komponenten-Sequenzen entsprechen. Derartige Keimbahn-Gene können durch verschiedene, im Fachgebiet herkömmliche Verfahren isoliert werden, einschließlich, ohne darauf eingeschränkt zu sein, Hybridisierungs-Screening von genomischen Bibliotheken in Bakteriophagen-λ- oder Cosmid-Bibliotheken, oder durch PCR-Amplifikation von genomischen Sequenzen unter Verwendung von Primern, welche von den hierin offenbarten Sequenzen abgeleitet sind. Menschliche genomische Bibliotheken sind öffentlich verfügbar oder können de novo aus menschlicher DNA konstruiert werden.
  • Dem Fachmann auf dem Gebiet ist es offensichtlich, dass Nukleotid-Substitutionen, -Deletionen und -Additionen in die Polynukleotide der Erfindung eingebunden werden können. Nukleotidsequenzvariation kann aus Sequenzpolymorphismen von verschiedenen Allelen und dergleichen resultieren. Allerdings sollten derartige Nukleotidsubstitutionen, -Deletionen und -Additionen nicht wesentlich die Fähigkeit des Polynukleotids zerstören, an eine der hierin gezeigten Mensch- oder Affen-Volllängen-Telomerase-RNA-Komponenten-Polynukleotidsequenzen unter Hybridisierungsbedingungen, welche ausreichend stringent sind, um zu spezifischer Hybridisierung zu führen, zu hybridisieren.
  • Säugetier-Telomerase-RNA-Komponenten-Polynukleotide können kurze Oligonukleotide (z. B. 20 – 100 Basen lang), wie zur Verwendung als Hybridisierungssonden und PCR(oder LCR)-Primer sein. Die Polynukleotidsequenzen können auch einen Teil eines größeren Polynukleotids (z. B. ein Klonierungsvektor, umfassend einen Telomerase-RNA-Komponenten-Klon) ausmachen und können, durch Polynukleotidverknüpfung, mit einer anderen Polynukleotidsequenz fusioniert sein. Typischerweise umfassen Telomerase-RNA-Komponenten-Polynukleotide wenigstens 25 aufeinander folgende Nukleotide, welche im Wesentlichen identisch zu einer natürlich vorkommenden Telomerase-RNA-Komponente- oder -Gen-Sequenz sind, noch üblicher umfassen Telomerase-RNA-Komponente-Polynukleotide wenigstens 50 bis 100 aufeinander folgende Nukleotide, welche im Wesentlichen identisch zu einer natürlich vorkommenden Sequenz von Säugetier-Telomerase-RNA-Komponenten sind. Es wird jedoch vom Fachmann auf dem Gebiet erkannt werden, dass die Minimumlänge eines Telomerase-RNA-Komponenten-Polynukleotids, die für eine spezifische Hybridisierung an eine Telomerase-RNA-Komponenten-Zielsequenz erforderlich ist, von mehreren Faktoren abhängen wird: unter anderem G/C-Gehalt, Positionierung von fehlgepaarten Basen (falls vorhanden), Grad der Einzigartigkeit der Sequenz im Vergleich zu der Population von Ziel-Polynukleotiden, und chemische Natur des Polynukleotids (z. B. Methylphosphonat-Grundgerüst, Polyamid-Nukleinsäure, Phosphorothiolat etc.).
  • Falls gewünscht, können PCR-Amplimere zur Amplifizierung von im Wesentlichen Volllänge aufweisenden cDNA-Kopien nach der Beurteilung des Ausführenden gewählt werden. In ähnlicher Weise können Amplimere zum Amplifizieren von Abschnitten des Telomerase-RNA-Komponenten-Gens (aus Affe oder Mensch) gewählt werden.
  • Jede dieser Sequenzen kann für Hybridisierungssonden oder PCR-Amplimere verwendet werden, um das Vorhandensein von Telomerase-RNA-Komponente nachzuweisen, zum Beispiel, um eine neoplastische Krankheit zu diagnostizieren, welche durch das Vorliegen eines erhöhten oder verringerten Telomerase-RNA-Komponenten-Spiegels in Zellen charakterisiert ist, oder eine Gewebe-Typisierung (d. h. Identifizierung von durch die Expression von Telomerase-RNA-Komponente gekennzeichneten Geweben) und dergleichen durchzuführen. Die Sequenzen können auch zum Nachweisen von genomischen Telomerase-RNA-Komponenten-Gensequenzen in einer DNA-Probe, wie für eine forensische DNA-Analyse (z. B. durch RFLP-Analyse, PCR-Produktlänge(n)-Verteilung etc.) oder für die Diagnose von Krankheiten, welche durch Amplifikation und/oder Rearrangements des Telomerase-RNA-Komponenten-Gens charakterisiert sind, verwendet werden.
  • Zum Beispiel, und nicht als Einschränkung, kann das folgende Paar von Oligonukleotid-Primern zur Amplifizierung von Telomerase-RNA-Komponenten-Polynukleotidsequenzen (z. B. cDNA) oder als Hybridisierungssonden (z. B. als biotinylierte oder endmarkierte Oligonukleotidsonden) eingesetzt werden:
    Figure 00330001
  • Andere geeignete PCR-Primer, LCR-Primer, Hybridisierungssonden und Primer und dergleichen werden dem Fachmann auf dem Gebiet im Hinblick auf die hierin offenbarten Telomerase-RNA-Komponenten-Sequenzen sowie jenen, welche damit erhalten werden können, offensichtlich sein. Menschliche Telomerase-RNA-Komponente-Polynukleotide und ihre Komplemente können als Hybridisierungssonden oder Primer zum Nachweisen von RNA- oder DNA-Sequenzen von Säugetier-Telomerase-RNA-Komponente dienen. Für eine solche Hybridisierung und PCR-Anwendungen können sie wesentliche Deletionen, Additionen, Nukleotidsubstitutionen und/oder Transpositionen enthalten, solange eine spezifische Hybridisierung oder spezifische Amplifizierung einer menschlichen Telomerase-RNA-Komponenten-Sequenz beibehalten wird. Allerdings sollten derartige Nukleotidsubstitutionen, -deletionen und -additionen die Fähigkeit des Polynukleotids nicht wesentlich zerstören, an eine Telomerase-RNA-Komponenten- oder -Gen-Sequenz unter Hybridisierungsbedingungen zu hybridisieren, welche ausreichend stringent sind, um zu spezifischer Hybridisierung zu führen.
  • Zum Beispiel und nicht als Einschränkung kann ein menschliches Telomerase-RNA-Komponente-Polynukleotid die Sequenz von Nukleotid 48 bis Nukleotid 209 umfassen, welche angenommenermaßen ausreichend für die Rekonstituierung von menschlichem Telomerase-Holoenzym in Gegenwart von Telomerase-Proteinkomponente ist:
    Figure 00340001
  • Des Weiteren kann ein menschliches Telomerase-RNA-Komponenten-Polynukleotid die Nukleotide 1-559 umfassen oder daraus bestehen, und kann terminale Additionen von anderen Nukleotiden oder Nukleotidsequenzen einschließen. Eine "Matrizen-zerschlagene" bzw. "template-scrambled" Variante, bestehend aus den Nukleotiden 48-209, worin jedoch die Telomerwiederholungseinheit-Matrizensequenz verändert ist, ist in der Lage, mit einer trunkierten RNA-Komponente, bestehend aus der Wildtypsequenz 48-209, um die Bindung an Telomerase-Proteinkomponente und die Rekonstituierung des Telomerase-Holoenzyms zu konkurrieren.
  • Die Strukturanalyse der menschlichen Telomerase-RNA-Komponente zeigt Regionen an, welche eine Propensität zur Ausbildung von Sekundärstrukturen, wie Haarnadel-Schleifen, aufweisen. Beispielsweise besitzt die Region, welche ungefähr von Nukleotid 200 bis Nukleotid 350 der menschlichen Telomerase-RNA-Komponente reicht, einen substanziellen Haarnadel-Schleifen-Charakter. Andere Abschnitte der Telomerase-RNA-Komponente besitzen ebenfalls einen signifikanten Sekundärstruktur-Charakter. In Hinsicht auf diese beobachtete Sekundärstruktur können andere Nukleotidsequenzen, von welchen durch Computeranalyse vorhergesagt wird, ähnliche Sekundärstruktur-Formationen anzunehmen, vom Fachmann substituiert werden. Obwohl eine Vielzahl an Computerprogrammen zur Bestimmung von Nukleotidsequenzen, welche im Wesentlichen äquivalente Sekundärstrukturen annehmen, geeignet ist, können aus dem UWGCG-Sequenzanalyse-Softwarepaket die Programme FOLD, SQUIGGLES, CIRCLES, DOMES, NOUNTAINS und STEMLOOP und dergleichen eingesetzt werden. In ähnlicher Weise können Nicht-Nukleotid-Strukturmimetika, wie Peptid-Nukleinsäuren und dergleichen, durch molekulare Modelling-Programme als Mimetika der charakteristischen Sekundärstruktur der Region(en) von menschlicher Telomerase-RNA-Komponente, von welchen gewünscht wird, nachgeahmt zu werden, entworfen werden. Derartige Struktur-Mimetika können therapeutisch oder für verschiedene Anwendungen (z. B. kompetitiver Antagonist etc.) verwendet werden.
  • Antisense
  • Ein speziell nützlicher Typ von Nukleinsäure der Erfindung ist ein Antisense-Oligonukleotid, welches in vivo oder in vitro verwendet werden kann, um die Aktivität von menschlicher Telomerase zu hemmen. Antisense-Oligonukleotide umfassen eine spezifische Sequenz von etwa 10 bis etwa 25 bis 200 oder mehr (d. h. groß genug zur Bildung eines stabilen Duplex, aber klein genug, abhängig von der Zuführungsart, für eine Verabreichung in vivo, falls gewünscht) Nukleotiden, welche komplementär zu einer spezifischen Sequenz von Nukleotiden in der RNA-Komponente von menschlicher Telomerase sind. Der Wirkungsmechanismus derartiger Oligonukleotide kann eine Bindung der RNA-Komponente beinhalten, entweder, um den Zusammenbau der funktionellen Ribonukleoprotein-Telomerase zu verhindern, die RNA-Komponente daran zu hindern, als eine Matrize für die Synthese von telomerer DNA zu dienen, die Telomerase-RNA-Komponente zu destabilisieren und ihre Halbwertszeit zu verringern und/oder um die Transkription des Telomerase-RNA-Komponenten-Gens zu inhibieren.
  • Veranschaulichende Antisense-Oligonukleotide der Erfindung, welche zum Hemmen von Telomeraseaktivität in vivo und/oder in vitro dienen, schließen die obenstehend im Zusammenhang mit den Tests zur Bestimmung, ob Klon pGRN7 die cDNA für die RNA-Komponente von menschlicher Telomerase umfasste, erwähnten Oligonukleotide ein. Drei solche Oligonukleotide, wie obenstehend erwähnt, wurden verwendet, um eine Inhibition von Telomeraseaktivität in vitro zu demonstrieren. Die Sequenz von jedem dieser Oligonukleotide wird nachstehend gezeigt.
  • Figure 00360001
  • Diese Oligonukleotide können auch verwendet werden, um Telomeraseaktivität in menschlichen Zellen zu inhibieren.
  • Der Fachmann auf dem Gebiet wird erkennen, dass die vorliegende Erfindung eine große Vielzahl an Antisense-Oligonukleotiden vorsieht, welche fähig zum Hemmen von Telomeraseaktivität sind. Ein anderes nützliches Antisense-Oligonukleotid der Erfindung ist das Oligonukleotid Tel-AU, welches die Sequenz 5'-CAGGCCCACCCTCCGCAACC-3' aufweist, und welches, wie jedes der Antisense-Oligonukleotide der Erfindung, unter Verwendung von Phosphorothioat-Nukleotiden, chiralen Methyl-Phosphonaten, natürlich vorkommenden Nukleotiden oder Mischungen derselben synthetisiert werden kann, um Stabilität und die gewünschte Tm zu vermitteln. Der Fachmann auf dem Gebiet erkennt, dass eine große Vielfalt an modifizierten Nukleotidanalogen, wie O-Methylribonukleotide, Phorphorothioat-Nukleotide und Methylphosphonat-Nukleotide, verwendet werden kann, um Nukleinsäuren der Erfindung mit stärker gewünschten Eigenschaften (d. h. Nuklease-resistent, fester bindend etc.) als bei denjenigen, welche unter Verwendung von natürlich vorkommenden Nukleotiden hergestellt werden, herzustellen. Andere Techniken, um Oligonukleotide Nuklease-resistent zu machen, schließen diejenigen ein, welche in der PCT-Patentveröffentlichung NR. 94/12633 beschrieben sind.
  • Zusätzliche Ausführungsformen, welche auf die Modulation von Telomeraseaktivität gerichtet sind, schließen Verfahren ein, welche spezifische Antisense-Polynukleotide anwenden, die komplementär zur Gesamtheit oder einem Teil der Sequenzen von humaner Telomerase-RNA-Komponente (hTR) sind, wie Antisense-Polynukleotide gegen das menschliche Telomerase-RNA-Komponenten-Gen oder dessen transkribierte RNA, einschließlich trunkierter Formen, welche mit Telomerase-Holoenzym assoziiert sein können. Derartige komplementäre Antisense-Polynukleotide können Nukleotidsubstitutionen, -Additionen, -Deletionen oder Transpositionen einschließen, so lange die spezifische Bindung an die relevante Zielsequenz, welche der Telomerase-RNA-Komponente oder ihrem Gen entspricht, als eine funktionelle Eigenschaft des Polynukleotids beibehalten wird. Komplementäre Antisense-Polynukleotide schließen lösliche Antisense-RNA- oder -DNA-Oligonukleotide ein, welche spezifisch an Telomerase-RNA-Komponenten-Spezies hybridisieren und die Transkription des Telomerase-RNA-Komponenten-Gens verhindern können (Ching et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 10006; Broder et al. (1990) Ann. Int. Med. 113: 604; Loreau et al. (1990) FEBS Letters 274: 53; Holcenberg et al., WO91/11535; US 5 256 643 ; (U.S.-Seriennummer 07/530 165; WO91/09865; WO91/04753; WO90/13641; und EP 386563 ). Die Antisense-Polynukleotide inhibieren deshalb die Herstellung von funktioneller Telomerase-RNA-Komponente. Da die Expression von Telomerase-RNA-Komponente (Transkriptionsrate und/oder RNA-Stabilität) mit der Aktivierung und der enzymatischen Aktivität von Telomerase-Holoenzym assoziiert ist, können Antisense-Polynukleotide, welche die Transkription von der Telomerase-RNA-Komponente entsprechender RNA und/oder die Wechselwirkung von Telomerase-RNA-Komponente mit der Proteinkomponente von menschlicher Telomerase und/oder die Wechselwirkung von Telomerase-RNA-Komponente mit telomeren Sequenzen verhindern, Telomeraseaktivität hemmen und/oder einen Phänotyp, wie Immortalisierung oder neoplastische Transformation, von Zellen, welche Telomeraseaktivität in Abwesenheit von Antisense-Polynukleotiden exprimieren, rückgängig machen. Zusammensetzungen, welche eine therapeutisch wirksame Dosis an Telomerase-RNA-Komponenten-Antisense-Polynukleotiden enthalten, können zur Behandlung von Krankheiten, welche eine Telomeraseaktivität für die zelluläre Pathogenese erfordern (z. B. Neoplasie), oder zur Hemmung von Gameten-Produktion oder -Aufrechterhaltung (d. h. als ein Empfängnisverhütungsmittel) verabreicht werden, falls gewünscht. Antisense-Polynukleotide von verschiedenen Längen können hergestellt werden, obwohl derartige Antisense-Polynukleotide typischerweise eine Sequenz von etwa wenigstens 25 aufeinander folgendem Nukleotiden umfassen, welche im Wesentlichen komplementär zu einer natürlich vorkommenden Telomerase-RNA-Komponente-Polynukleotidsequenz sind und welche typischerweise perfekt komplementär zu einer menschlichen Telomerase-RNA-Komponente-Sequenz sind, wobei sie oft zu der Sequenz von Telomerase-RNA-Komponente komplementär sind, welche komplementär zu der Telomer-Wiederholungseinheit-Sequenz ist, oder zu einem Abschnitt der Telomerase-RNA-Komponente komplementär sind, welcher die Telomerase-Polypeptid-Untereinheit kontaktiert.
  • Antisense-Polynukleotide können von einer heterologen Expressionskassette in einer Transfektanten-Zelle oder transgenen Zelle hergestellt werden. Die heterologe Expressionskassette kann ein Teil eines Gentherapievektors, wie eines adenoviralen oder Adenoassoziierten viralen Vektors, oder eines sonstigen Gentherapievektors sein. Die heterologe Kassette kann auf einem Polynukleotid vorliegen, welches nicht zur unabhängigen Replikation in der Lage ist und welches durch irgendeines einer Vielzahl von dem Fachmann auf dem Gebiet bekannten geeigneten Verfahren in Zellen überführt wird (z. B. Lipofektion, Biolistik, Liposomen, Immunliposomen, Elektroporation etc.). Alternativ dazu können die Antiserse-Polynukleotide lösliche Oligonukleotide umfassen, welche an das äußere Milieu verabreicht werden, entweder im Kulturmedium in vitro oder in interstitiellen Räumen und Körperflüssigkeiten (z. B. Blut, CSF) für eine Anwendung in vivo. Lösliche Antisense-Polynukleotide, welche im äußeren Milieu vorhanden sind, erlangen gezeigtermaßen Zugang zum Zytoplasma und inhibieren spezifische RNA-Spezies. In einigen Ausführungsformen umfassen die Antisense-Polynukleotide Methylphosphonat-Einheiten, C-5-Propenyl-Einheiten, 2'-Fluorribose-Zucker oder sind Polyamidnukleinsäuren (PNAs) (Egholm et al. (1992) J. Am. Chem. Soc. 114: 1895; Wittung et al. (1994) Nature 368: 561; Egholm et al. (1993) Nature 365: 566; Hanvey et al. (1992) Science 258: 1481). Für allgemeine Verfahren in Bezug auf Antisense-Polynukleotide siehe Antisense RNA and DNA, (1988), Hrsg.: D.A. Melton, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
  • Zusätzlich zu den Antisense-Oligonukleotiden der Erfindung kann man Oligonukleotide konstruieren, welche an Duplex-Nukleinsäure entweder in der gefalteten RNA-Komponente oder in dem Gen für die RNA-Komponente binden werden, wobei eine Tripelhelix-haltige oder Triplex-Nukleinsäure gebildet wird, um Telomeraseaktivität zu hemmen. Solche Oligonukleotide der Erfindung werden unter Verwendung der Basenpaarungs-Regeln für Tripelhelix-Bildung und der Nukleotidsequenz der RNA-Komponente konstruiert (Cheng et al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 15110; Ferrin und Camerini-Otero (1991) Science 354: 1494; Ramdas et al. (1989) J. Biol. Chem. 264: 17395; Strobel et al. (1991) Science 254: 1639; Hsieh et al. (1990) op.cit.; Rigas et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 83: 9591). Derartige Oligonukleotide können Telomeraseaktivität in einer Anzahl von Weisen blockieren, einschließlich durch Verhinderung der Transkription des Telomerase-Gens oder durch Bindung an eine Duplexregion der RNA-Komponente von Telomerase in einer Weise, welche die RNA-Komponente daran hindert, entweder eine funktionelle Ribonukleoprotein-Telomerase zu bilden oder als eine Matrize für die Synthese von telomerer DNA zu dienen. Typischerweise und abhängig von der Wirkungsart umfassen die Triplex-bildenden Oligonukleotide der Erfindung eine spezifische Sequenz von etwa 10 bis etwa 25 bis 200 oder mehr (d. h. groß genug, um eine stabile Tripelhelix zu bilden, aber klein genug, abhängig vom Zuführungsweg, um nach Bedarf eine Verabreichung in vivo vorzunehmen) Nukleotide, welche "komplementär" (in diesem Kontext bedeutet komplementär die Fähigkeit, eine stabile Tripelhelix zu bilden) zu einer spezifischen Sequenz in der RNA-Komponente von Telomerase oder dem Gen für die RNA-Komponente von Telomerase sind.
  • Zusätzlich zu den Antisense- und Tripelhelix-bildenden Oligonukleotiden der Erfindung können auch Sinn- bzw. Sense-Oligonukleotide, deren Sequenz zu wenigstens einem Abschnitt der RNA-Komponente von menschlicher Telomerase identisch ist, verwendet werden, um Telomeraseaktivität zu hemmen. Oligonukleotide der Erfindung dieses Typs sind dadurch gekennzeichnet, dass sie entweder (1) weniger als die vollständige Sequenz der RNA-Komponente, welche zur Bildung eines funktionellen Telomerase-Enzyms benötigt wird, oder (2) die vollständige Sequenz der RNA-Komponente, welche zur Bildung eines funktionellen Telomerase-Enzyms benötigt wird, sowie eine Substitution oder Insertion von einem oder mehreren Nukleotiden, welche die resultierende RNA nicht-funktionell machen, umfassen. In beiden Fällen wird eine Inhibition der Telomeraseaktivität aufgrund der Bindung der "mutanten" RNA-Komponente an die Proteinkomponenten von menschlicher Telomerase unter Bildung eines inaktiven Telomerasemoleküls beobachtet. Die Wirkungsmechanismen solcher Oligonukleotide beinhalten somit das Zusammenbauen einer nicht-funktionellen Ribonukleoprotein-Telomerase oder die Verhinderung des Zusammenbauens einer funktionellen Ribonukleoprotein-Telomerase. Ein Beispiel kann eine Matrizen-'Scrambled'-Variante sein, welche aus den Nukleotiden 48-209 besteht, worin aber die Telomer-Wiederholungseinheit-Matrizensequenz verändert ist. Derartige Matrizen-'Scrambled'-Varianten sind in der Lage, um die Bindung an Telomerase-Proteinkomponente zu kompetieren. Sense-Oligonukleotide der Erfindung dieses Typs umfassen typischerweise eine spezifische Sequenz von etwa 20, 50, 100, 200, 400, 500 oder mehr Nukleotiden, welche identisch zu einer spezifischen Sequenz von Nukleotiden in der RNA-Komponente von menschlicher Telomerase sind.
  • Darüber hinaus können Antisense-Polynukleotide einen derivatisierten Substituenten umfassen, welcher in Bezug auf die Hybridisierung an die RNA-Komponente einer Säugetier-Telomerase im Wesentlichen nicht störend ist. Antisense-Polynukleotide, welche mit angehefteten chemischen Substituenten modifiziert worden sind, können in eine metabolisch aktive eukaryotische Zelle eingeführt werden, um mit einer Telomerase-RNA-Komponente von Telomerase in der Zelle zu hybridisieren. Typischerweise sind derartige Antisense-Polynukleotide derivatisiert, und zusätzliche chemische Substituenten werden jeweilig entweder während oder nach der Polynukleotidsynthese angeheftet und werden so auf eine komplementäre Sequenz in der Telomerase-RNA-Komponente lokalisiert, wo sie eine Änderung oder chemische Modifikation an einer lokalen DNA-Sequenz und/oder an der Telomerase-Proteinkomponente hervorrufen. Bevorzugte angeheftete chemische Substituenten schließen folgende ein: Europium(III)-texaphyrin, vernetzende Mittel, Psoralen, Metallchelate (z. B. Eisen/EDTA-Chelat für Eisen-katalysierte Spaltung), Topoisomerasen, Endonukleasen, Exonukleasen, Ligasen, Phosphodiesterasen, photodynamische Porphyrine, chemotherapeutische Arzneistoffe (z. B. Adriamycin, Doxirubicin), interkalierende Mittel, Basenmodifikationsmittel, Immunglobulinketten und Oligonukleotide. Eisen/EDTA-Chelate sind besonders bevorzugte chemische Substituenten, falls eine örtliche Spaltung einer Polynukleotidsequenz gewünscht wird (Hertzberg et. al. (1982) J. Am. Chem. Soc. 104: 313; Hertzberg und Dervan (1984) Biochemistry 23: 3934; Taylor et al. (1984) Tetrahedron 40: 457; Dervan, PB (1986) Science 232: 464). Bevorzugte Anheftungschemie-Arten schließen direkte Bindung, z. B. durch eine anhängige reaktive Aminogruppe (Corey und Schultz (1988) Science 238: 1401), und sonstige direkte Verknüpfungs-Chemie ein, obwohl auch Streptavidin/Biotin- und Digoxigenin/Anti-Digoxigenin-Antikörper-Verknüpfungsverfahren verwendet werden können. Verfahren zur Verknüpfung von chemischen Substituenten sind in den U.S.-Patenten 5 135 720, 5 093 245 und 5 055 556 angegeben. Eine sonstige Verknüpfungschemie kann nach der Beurteilung des Ausführenden zum Einsatz kommen. Polynukleotide, welche der Gesamtheit oder einem wesentlichen Abschnitt einer Säugetier-Telomerase-RNA-Komponente entsprechen (d. h. "Sense"-Polynukleotide), können ebenfalls derivatisiert und verwendet werden, um mit telomeren Wiederholungseinheit-Sequenzen im Genom zu reagieren und Addukte oder eine sonstige Modifikation der chemischen Umgebung an Telomerregionen der Chromosomen zu erzeugen.
  • Fehlpaarungs-Matrizen
  • Somit umfasst ein anderes nützliches Oligonukleotid der Erfindung eine veränderte oder mutierte Sequenz der RNA-Komponente von menschlicher Telomerase. Yu et al., 1990, Nature 344: 126, zeigt, dass eine mutierte Form der RNA-Komponente von Tetrahymena-Telomerase in die Telomerase von Tetrahymena-Zellen eingebaut werden kann, und dass der Einbau nachteilige Auswirkungen auf diese Zellen besitzt. Der Einbau von mutierten Formen der RNA-Komponente von menschlicher Telomerase kann ähnliche Auswirkungen auf menschliche Zellen besitzen, welche ansonsten eine Telomeraseaktivität aufweisen, ohne normale menschliche Zellen zu beeinflussen, welche keine Telomeraseaktivität aufweisen. Solche mutierten Formen schließen diejenigen ein, in welchen die Sequenz 5'-CTAACCCTA-3' zu 5'-CAAACCCAA-3', 5'-CCAACCCCAA-3' oder 5'-CTCACCCTCA-3' mutiert ist. Jede dieser veränderten RNA-Komponenten-Sequenzen verändert die telomeren Wiederholungseinheiten, welche in die chromosomale DNA eingebaut werden wodurch Chromosomenstruktur und -funktion beeinflusst werden. Solche Oligonukleotide können entworfen werden, um Restriktionsenzym-Erkennungsstellen zu enthalten, welche in diagnostischen Verfahren hinsichtlich des Vorhandenseins der veränderten RNA-Komponente durch Restriktionsenzym-Verdau von telomerer DNA oder eines verlängerten Telomerase-Substrats nützlich sind.
  • Um diesen Aspekt der Erfindung zu veranschaulichen, wurde eine ortsspezifische Mutagenese durchgeführt, wobei ein Plasmid verwendet wurde (bezeichnet als pGRN33, erhältlich von der American Type Culture Collection unter der Zugangs-Nr. ATCC 75926), welches das ~2,5 kb große HindIII-SacI-Fragment aus dem Lambda-Klon 28-1 (siehe Beispiel 7 unten) sowie den SV40-Replikationsursprung (aber keine Promotor-Aktivität) umfasst. Die resultierenden Plasmide, bezeichnet als pGRN34 (umfassend 5'-CAAACCCAA-3'), pGRN36 (umfassend 5'-CCAACCCCAA-3') und pGRN37 (umfassend 5'-CTCACCCTCA-3'), wurden in eukaryotische Wirtszellen (eine 293-abgeleitete Zelllinie, welche das SV40-"large"-T-Antigen exprimiert) transformiert, und Telomerase-Assays wurden unter Verwendung von Zellextrakten aus den Transformanten durchgeführt.
  • Die Assays zeigten, dass die Telomeraseaktivität in den Zellen zur Bildung von Nukleinsäuren führte, welche veränderte Sequenzen umfassten, was anzeigt, dass der genomische Klon ein funktionelles RNA-Komponenten-Gen umfasste, und dass die Plasmide ein verändertes aber funktionelles RNA-Komponenten-Gen umfassten. Diese Ergebnisse veranschaulichen, wie die vorliegende Erfindung rekombinante Telomerase-Präparationen und Verfahren zur Herstellung solcher Präparationen vorsieht. Die vorliegende Erfindung sieht eine rekombinante menschliche Telomerase vor, welche die Proteinkomponenten von menschlicher Telomerase in funktioneller Assoziation mit einer rekombinanten RNA-Komponente der Erfindung umfasst. Derartige rekombinante RNA-Komponenten-Moleküle der Erfindung schließen diejenigen ein, welche sich von natürlich vorkommenden RNA-Komponenten-Molekülen um eine oder mehrere Basensubstitutionen, -deletionen oder -insertionen unterscheiden, sowie RNA-Komponenten-Moleküle, welche identisch zu natürlich vorkommendem RNA-Komponenten-Molekül sind, welche in rekombinanten Wirtszellen hergestellt werden. Das Verfahren zur Herstellung derartiger rekombinanter Telomerase-Moleküle umfasst das Transformieren einer eukaryotischen Wirtszelle, welche die Proteinkomponenten von Telomerase exprimiert, mit einem rekombinanten Expressionsvektor, der ein RNA-Komponenten-Molekül der Erfindung codiert, und das Kultivieren der mit dem Vektor transformierten Wirtszellen unter solchen Bedingungen, dass die Proteinkomponenten und die RNA-Komponente exprimiert und unter Bildung eines aktiven Telomerase-Moleküls zusammengebaut werden, welches dazu in der Lage ist, Sequenzen (nicht notwendigerweise dieselbe Sequenz, welche von nativer Telomerase angefügt wird) an Telomere von chromosomaler DNA anzufügen. Andere nützliche Ausführungsformen solcher rekombinanten DNA-Expressionsvektoren (oder Plasmide) schließen Plasmide ein, welche das Gen für die RNA-Komponente von menschlicher Telomerase mit einer Deletion, Insertion oder einer anderen Modifikation umfassen, die das Gen nicht-funktionell macht. Solche Plasmide sind besonders nützlich für Gentherapie am Menschen, um das endogene RNA-Komponenten-Gen "auszuknocken", obwohl ein in hohem Maße effizientes Transformations- und Rekombinationssystem erforderlich ist, um die behandelten Zellen irreversibel sterblich zu machen.
  • Ribozym-Ausführungsformen
  • Andere Oligonukleotide der Erfindung, welche Ribozyme genannt werden, können ebenfalls verwendet werden, um Telomeraseaktivität zu hemmen. Anders als die oben beschriebenen Antisense- und sonstige Oligonukleotide, welche an eine RNA, eine DNA oder eine Telomerase-Proteinkomponente binden, bindet ein Ribozym nicht nur an eine Ziel-RNA, wie die RNA-Komponente von menschlicher Telomerase, sondern spaltet diese auch spezifisch und inaktiviert sie dadurch potenziell. Ein solches Ribozym kann 5'- und 3'-terminale Sequenzen umfassen, welche komplementär zu der Telomerase-RNA sind. Abhängig von der Stelle der Spaltung kann ein Ribozym das Telomeraseenzym inaktiv machen; siehe PCT-Patentveröffentlichung Nr. 93/23572, siehe oben. Der Fachmann wird beim Betrachten der RNA-Sequenz der menschlichen Telomerase-RNA-Komponente bemerken, dass mehrere nützliche Ribozym-Zielstellen vorhanden und gegenüber einer Spaltung zum Beispiel durch ein Hammerkopf-Motiv-Ribozym anfällig sind. Veranschaulichende Ribozyme der Erfindung dieses Typs schließen die nachstehenden Ribozyme ein, bei welchem es sich um RNA-Moleküle mit den angegebenen Sequenzen handelt:
    Figure 00420001
  • Andere Optimum-Zielstellen für Ribozym-vermittelte Inhibition von Telomeraseaktivität können bestimmt werden, wie beschrieben von Sullivan et al., PCT-Patentveröffentlichung Nr. 94/02595, und Draper et al., PCT-Patentveröffentlichung Nr. 93/23569. Wie beschrieben von Hu et al., PCT-Patentveröffentlichung Nr. 94/03596, können Antisense- und Ribozym-Funktionen in einem einzigen Oligonukleotid kombiniert werden. Darüber hinaus können Ribozyme ein oder mehrere modifizierte Nukleotide oder modifizierte Bindungen zwischen Nukleotiden umfassen, wie oben im Zusammenhang mit der Beschreibung von veranschaulichenden Antisense-Oligonukleotiden der Erfindung beschrieben wurde. In einem Aspekt wird eine katalytische Untereinheit von RNase P (menschlich oder aus E. coli) modifiziert (siehe, Altman, S. (1995) Biotechnology 13: 327), um eine 'Guide'-Sequenz zu erzeugen, welche dem Abschnitt von Säugetier-Telomerase-RNA-Komponente entspricht, welcher an die Telomer-Wiederholungseinheit-Sequenz basenpaart; solche RNase-P-Varianten können Telomersequenzen spalten. In einem Aspekt wird eine katalytische Untereinheit von RNase P (menschlich oder von E. coli) modifiziert, um eine 'Guide'-Sequenz zu erzeugen, welche komplementär zu einem Abschnitt von Telomerase-RNA-Komponente ist, so dass die RNase- P-Variante Telomerase-RNA-Komponente spalten kann. Solche manipulierten Ribozyme können in Zellen exprimiert oder können durch eine Vielzahl von Methoden (z. B. Liposomen, Immunoliposomen, Biolistik, direkte Aufnahme in Zellen etc.) transferiert werden. Andere Formen von Ribozymen (Gruppe I-Intron-Ribozyme (Cech, T. (1995) Biotechnology 13; 323); Hammerkopf-Ribozyme (Edgington, S. M. (1992) Biotechnology 10; 256)) können auf der Grundlage der offenbarten Telomerase-RNA-Komponenten-Sequenzinformation manipuliert werden, um die Spaltung von menschlicher Telomerase-RNA-Komponente und/oder menschlichen Telomer-Wiederholungseinheit-Sequenzen zu katalysieren.
  • Somit sieht die Erfindung eine breite Vielfalt an Oligonukleotiden vor, um Telomeraseaktivität zu hemmen. Solche Oligonukleotide können in den therapeutischen Verfahren der Erfindung zur Behandlung einer Krankheit verwendet werden, wobei die Verfahren das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Dosis eines Telomerase-Inhibitors oder -Aktivators der Erfindung an einen Patienten umfassen. Man kann die Telomerase-Inhibierung oder -Aktivierung messen, um die Menge eines Mittels zu bestimmen, welche in einer therapeutisch wirksamen Dosis zugeführt werden sollte, wobei die Assay-Protokolle angewandt werden, welche in der obenstehend erwähnten PCT-Patentveröffentlichung Nr. 93/23572 beschrieben wurden. Wie in diesen Patentanmeldungen bemerkt und obenstehend erörtert wurde, macht die Inhibition von Telomeraseaktivität eine immortale Zelle sterblich, wohingegen die Aktivierung von Telomeraseaktivität die relative Lebensdauer einer Zelle erhöhen kann. Telomerase-Inhibitions-Therapie ist eine wirkungsvolle Behandlung gegen Krebsarten, welche das unregulierte Wachstum von unsterblichen Zellen beteiligen, und Telomerase-Aktivierung ist eine wirksame Behandlung zur Verhinderung von Zellseneszenz. Die Zuführung von Mitteln, welche Telomeraseaktivität hemmen oder blockieren, wie ein Antisense-Oligonukleotid, ein Tripelhelix-bildendes Oligonukleotid, ein Ribozym oder ein Plasmid, welches die Expression einer Mutanten-RNA-Komponente von Telomerase lenkt, kann Telomerase-Wirkung verhindern und führt letztendlich zu Zellseneszenz und Zelltod von behandelten Zellen.
  • Therapeutische und prophylaktische Aspekte
  • Zusätzlich dazu sieht die vorliegende Erfindung therapeutische Verfahren vor, welche gewährleisten, dass normale Zellen sterblich bleiben; zum Beispiel kann die RNA-Komponente unter Anwendung von standardmäßigen gentechnischen Vorgehensweisen modifiziert werden, um die Gesamtheit oder einen Abschnitt eines natürlichen Gens, welches die Komponente codiert, (z. B. durch in vitro-Mutagenese) durch genetische Rekombination zu deletieren. Solche Zellen werden dann irreversibel sterblich sein. Diese Vorgehensweise ist nützlich in der Gentherapie, wobei normale Zellen, welche modifiziert sind, um Expressionsplasmide zu enthalten, in einen Patienten eingebracht werden, und gewünscht wird, dass es gewährleistet ist, dass krebsartige Zellen nicht eingebracht werden oder, wenn solche Zellen eingebracht werden, dann diese Zellen irreversibel sterblich gemacht worden sind.
  • Weil Telomerase nur in Tumor-, Keimbahn- und bestimmten Stammzellen des hämatopoetischen Systems aktiv ist, werden andere normale Zellen nicht von einer Telomerase-Inhibitions-Therapie beeinflusst. Es können auch Schritte unternommen werden, um den Kontakt des Telomerase-Inhibitors mit Keimbahn- oder Stammzellen zu vermeiden, obwohl dies nicht wesentlich sein muss. Zum Beispiel kann, weil Keimbahnzellen Telomeraseaktivität exprimieren, eine Inhibition von Telomerase die Spermatogenese und Spermienlebensfähigkeit negativ beeinflussen, was nahe legt, dass Telomerase-Inhibitoren wirksame Empfängnisverhütungsmittel oder Sterilisierungsmittel sein können. Dieser empfängnisverhütende Effekt kann jedoch von einem Patienten nicht erwünscht sein, welcher einen Telomerase-Inhibitor der Erfindung zur Behandlung von Krebs erhält. In solchen Fällen kann man einen Telomerase-Inhibitor der Erfindung auf eine Weise zuführen, welche gewährleistet, dass der Inhibitor nur während der Dauer der Therapie erzeugt werden wird, so dass die negative Auswirkung auf Keimbahnzellen lediglich vorübergehend ist.
  • Andere therapeutische Verfahren der Erfindung verwenden die Telomerase-RNA-Nukleinsäure der Erfindung, um Telomeraseaktivität zu stimulieren und die replikative Zelllebensdauer zu verlängern. Diese Verfahren können durch Zuführen eines funktionellen rekombinanten Telomerase-Ribonukleoproteins der Erfindung an eine Zelle ausgeführt werden. Zum Beispiel kann das Ribonukleoprotein in einem Liposom an eine Zelle zugeführt werden, oder das Gen für die RNA-Komponente von menschlicher Telomerase (oder ein rekombinantes Gen mit unterschiedlichen regulatorischen Elementen) kann in einem eukaryotischen Expressionsplasmid (mit oder ohne Sequenzen, codierend für die Expression der Proteinkomponenten von Telomerase) verwendet werden, um Telomeraseaktivität in verschiedenen normalen menschlichen Zellen zu aktivieren, denen ansonsten eine nachweisbare Telomeraseaktivität aufgrund niedriger Spiegel der Expression der RNA-Komponente oder einer Proteinkomponente von Telomerase fehlt. Wenn die Telomerase-RNA-Komponente nicht ausreichend ist, um Telomeraseaktivität zu stimulieren, dann kann die RNA-Komponente gemeinsam mit Genen, welche die Proteinkomponenten von Telomerase exprimieren, transfiziert werden, um Telomeraseaktivität zu stimulieren. Daher stellt die Erfindung Verfahren zur Behandlung eines mit der Telomeraseaktivität innerhalb einer Zelle oder Gruppe von Zellen assoziierten Zustands durch Kontaktieren der Zelle(n) mit einer therapeutisch wirksamen Menge eines Mittels, welches Telomeraseaktivität in dieser Zelle verändert, zur Verfügung.
  • Zellen, welche Extra-Kopien des Telomerase-RNA-Gens beinhalten, können einen Zuwachs der Telomeraseaktivität und eine assoziierte verlängerte replikative Lebensdauer aufzeigen. Eine solche Therapie kann ex vivo an Zellen für die anschließende Einbringung in einen Wirt durchgeführt werden, oder kann in vivo durchgeführt werden. Die Vorteile des Stabilisierens oder Erhöhens der Telomerlänge durch Hinzufügen exogener Telomerase-Gene ex vivo zu normalen diploiden Zellen schließen die folgenden ein: eine Telomer-Stabilisierung kann zelluläre Seneszenz arretieren und eine potenziell unbeschränkte Vermehrung der Zellen erlauben; und normale diploide Zellen mit einer verlängerten Lebensdauer können in vitro für Tests von Arzneistoffen, Virusherstellung oder andere nützliche Zwecke in Kultur gehalten werden. Weiterhin können ex vivo amplifizierte Stammzellen verschiedener Typen in der Zelltherapie für besondere Krankheiten, wie oben erwähnt, eingesetzt werden.
  • Telomer-Stabilisierung kann auch das Krebs-Auftreten in replizierenden Zellen unterdrücken, indem verhindert wird, dass Telomere in kritischer Weise kurz werden, wenn sich Zellen einer Krisis nähern. Während einer Krisis wird eine massive genomische Instabilität erzeugt, wenn der schützende Effekt der telomeren Kappe verloren geht. Die "genetischen Karten" werden neu gemischt, und fast alle Zellen sterben. Die wenigen Zellen, welche aus diesem Prozess hervortreten, sind typischerweise aneuploid mit vielen Gen-Rearrangements und gelangen letztendlich dahin, die Stabilität in ihren Telomeren durch Expression von Telomerase wieder einzurichten. Wenn eine Krisis durch Lang-Halten der Telomere verhindert werden kann, dann kann die mit der Krisis assoziierte genomische Instabilität ebenfalls verhindert werden, was die Chancen beschränkt, dass eine individuelle Zelle die erforderliche Anzahl an genetischen Mutationen erleiden wird, welche benötigt werden, um einen metastatischen Krebs auszulösen bzw. auszusäen.
  • Zellen, welche für eine Telomerase-Gentherapie (Therapie, welche die Erhöhung der Telomeraseaktivität einer Zielzelle beinhaltet) angezielt werden können, schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, hämapoetische Stammzellen (AIDS und Nach-Chemotherapie), vaskuläre Endothelzellen (Herz- und Gehirn-Gefäß-Krankheit), Hautfibroblasten und basale Haut-Keratinozyten (Wundheilung und Verbrennungen), Chondrozyten (Arthritis), Gehirn-Astrozyten und Mikroglialzellen (Alzheimer-Krankheit), Osteoblasten (Osteoporose), Retinazellen (Augenkrankheiten) und Pankreas-Inselzellen (Diabetes vom Typ I) ein.
  • Typischerweise beinhalten die therapeutischen Verfahren der Erfindung die Verabreichung eines Oligonukleotids, welches wirkt, um Telomeraseaktivität unter physiologischen in vivo-Bedingungen zu hemmen oder zu stimulieren, und unter diesen Bedingungen stabil sein wird. Wie oben erwähnt, können modifizierte Nukleinsäuren zur Verleihung einer derartigen Stabilität sowie zur Gewährleistung der Zuführung des Oligonukleotids an das/die gewünschte Gewebe, Organ oder Zelle nützlich sein. Verfahren, welche für die Zuführung von Oligonukleotiden zu therapeutischen Zwecken nützlich sind, werden in Inouye et al., U.S.-Patent 5 272 065, beschrieben.
  • Obgleich Oligonukleotide direkt als ein Arzneimittel in einer geeigneten pharmazeutischen Formulierung zugeführt werden können, kann man Oligonukleotide auch unter Anwendung von Gentherapie und rekombinanten DNA-Expressionsplasmiden der Erfindung zuführen. Ein derartiges veranschaulichendes Plasmid wird im nachstehenden Beispiel 8 beschrieben. Im Allgemeinen werden solche Plasmide einen Promotor und wahlfrei einen Enhancer (separat von jedweden solchen, welche innerhalb der Promotorsequenzen enthalten sind), welche dazu dienen, die Transkription eines Oligoribonukleotids zu lenken, sowie andere regulatorische Elemente, welche für die episomale Beibehaltung oder die chromosomale Integration und für eine Transkription bei hohem Spiegel sorgen, nach Bedarf umfassen. Adenovirus-basierende Vektoren werden häufig für die Gentherapie verwendet und sind geeignet zur Verwendung in Verbindung mit den Reagenzien und Verfahren der vorliegenden Erfindung; siehe PCT-Patentveröffentlichungen Nr. 94/12650; 94/12649 und 94/12629. Nützliche Promotoren für derartige Zwecke schließen den Metallothionein-Promotor, den konstitutiven Adenovirus-"Major late"-Promotor, den Dexamethason-induzierbaren MMTV-Promotor, den SV40-Promotor, den MRP polIII-Promotor, den konstitutiven MPSV-Promotor, den Tetracyclin-induzierbaren CMV-Promotor (wie den menschlichen "Immediate-early"-CMV-Promotor) und den konstitutiven CMV-Promotor ein. Ein für Gentherapie nützliches Plasmid kann andere funktionelle Elemente, wie selektierbare Marker, Identifikationsregionen und andere Gene umfassen. Rekombinante DNA-Expressionsplasmide können auch verwendet werden, um die Oligonukleotide der Erfindung für eine Zuführung durch andere Methoden als durch Gentherapie herzustellen, obwohl es wirtschaftlicher sein kann, kurze Oligonukleotide durch chemische Synthese in vitro herzustellen.
  • In verwandten Aspekten beinhaltet die Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen, welche eine therapeutisch wirksame Menge eines Telomerase-Inhibitors oder Telomerase-Aktivators der Erfindung einschließen. Pharmazeutische Zusammensetzungen von Telomerase-Inhibitoren der Erfindung schließen eine Mutanten-RNA-Komponente von menschlicher Telomerase, ein Antisense-Oligonukleotid oder Tripelhelix-bildendes Oligonukleotid, welches die RNA-Komponente oder das Gen für selbige von menschlicher Telomerase bindet, oder ein Ribozym, das in der Lage ist, die RNA-Komponente von menschlicher Telomerase zu spalten, oder Kombinationen von selbigen oder anderen Pharmazeutika in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Salz ein. Andere pharmazeutische Zusammensetzungen der Erfindung umfassen eine Telomerase-Aktivator-Präparation, wie gereinigte menschliche Telomerase oder mRNA für die Proteinkomponenten von Telomerase und die RNA-Komponente von Telomerase, und werden verwendet, um mit Seneszenz zusammenhängende Krankheit(en) zu behandeln. In einem Aspekt wird eine mutierte Sense-Säugetier-Telomerase-RNA-Komponente an eine Zellpopulation verabreicht; die mutierte Sense-Telomerase-RNA-Komponente umfasst mindestens eine Basenfehlpaarung bezüglich der menschlichen Telomerase-Wiederholungseinheit-Sequenz, aber ist in der Lage, Telomeraseaktivität in Verbindung mit menschlicher Telomerase-Polypeptidkomponente aufzuzeigen, und zwar unter Erzeugung eines Fehleinbaus an ausgewählten Nukleotidpositionen in der menschlichen Telomerase-Wiederholungseinheit, wodurch Telomere erzeugt werden, welche auf der fortgesetzten Gegenwart der mutierten Sense-Telomerase-RNA-Komponente für eine substanzielle Replikation beruhen. Ein therapeutisches Verfahren wird vorgesehen, worin eine mutierte Sense-Telomerase-RNA-Komponente an eine Zellpopulation während einer ausreichenden Dauer verabreicht wird, um Telomersequenzen einzuführen, welche als Matrizen für natürlich vorkommende Säugetier-Telomerase-RNA-Komponente im Wesentlichen nicht-funktionell sind, gefolgt von einem Abziehen der mutierten Sense-Telomerase-RNA-Komponente, was zu einem raschen Verlust der durchschnittlichen Telomerlänge in der Zellpopulation und zu einer verstärkten Seneszenz oder Zellsterblichkeit führt.
  • Das therapeutische Mittel kann in einer Formulierung vorgesehen werden, welche für den parenteralen, nasalen, oralen oder einen anderen Verabreichungsmodus geeignet ist; siehe PCT-Patentveröffentlichung Nr. 93/23572, siehe oben.
  • Diagnostische Verfahren
  • Die vorliegende Erfindung sieht diagnostische Verfahren und Reagenzien zusätzlich zu den oben stehend beschriebenen pharmazeutischen Formulierungen und therapeutischen Verfahren vor. Die Erfindung sieht diagnostische Verfahren zur Bestimmung des Spiegels, der Menge oder des Vorliegens der RNA-Komponente von menschlicher Telomerase, Telomerase oder Telomeraseaktivität in einer Zelle, Zellpopulation oder Gewebeprobe vor. In einem verwandten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung nützliche Reagenzien für solche Verfahren, gegebenenfalls verpackt in Kit-Form zusammen mit Instruktionen zur Verwendung des Kits beim Ausüben des diagnostischen Verfahrens, bereit. Wie oben stehend im Zusammenhang mit den Tests, durchgeführt zum Bestimmen, dass Klon pGRN7 die cDNA für die RNA-Komponente von menschlicher Telomerase enthält, bemerkt wurde, sind die Spiegel der RNA-Komponente in Tumorzellen erhöht. Somit ist ein Nachweis der RNA-Komponente ein nützliches Diagnostikum für Tumorzellen.
  • Darüber hinaus können Sonden oder Primer, welche spezifisch an die RNA-Komponente von menschlicher Telomerase (oder einen der beiden Stränge des Gens für diese) binden, in diagnostischen Verfahren verwendet werden, um das Vorliegen von Telomerase-Nukleinsäure in einer Probe nachzuweisen. Primer und Sonden sind Oligonukleotide, welche komplementär zu einer Zielnukleinsäure sind, und somit daran binden werden. Obwohl Primer und Sonden hinsichtlich Sequenz und Länge abweichen können, ist der hauptsächliche Unterscheidungsfaktor ein solcher bezüglich der Funktion: Primer dienen dazu, DNA-Synthese zu initiieren, wie in einer PCR-Amplifizierung, wohingegen Sonden typischerweise nur verwendet werden, um an eine Zielnukleinsäure zu binden. Typische Längen für einen Primer oder eine Sonde können im Bereich von 8 bis 20 bis 30 oder mehr Nukleotiden liegen. Ein Primer oder eine Sonde können auch markiert sein, um die Detektion (d. h. radioaktive oder fluoreszierende Moleküle werden typischerweise für diesen Zweck eingesetzt) oder die Reinigung/Trennung (d. h. Biotin oder Avidin wird häufig für diesen Zweck eingesetzt) zu erleichtern.
  • Ein speziell bevorzugtes diagnostisches Verfahren der Erfindung beinhaltet den Nachweis von Telomerase-RNA-Komponenten-Sequenzen in Zell- oder Gewebeproben, welche aus Patienten entnommen wurden, die im Verdacht stehen, ein Risiko für Krebs aufzuweisen. Solche Verfahren werden typischerweise das Binden einer/eines markierten Sonde oder Primers an eine RNA-Komponenten-Sequenz unter Bedingungen beinhalten, so dass nur perfekt passende (komplementäre) Sequenzen aneinander binden (hybridisieren). Der Nachweis von markiertem Material, das an RNA in der Probe gebunden hat, wird mit dem Vorliegen von Telomeraseaktivität und dem Vorliegen von Krebszellen korrelieren. Manche Zellen können die RNA-Komponente von Telomerase exprimieren, aber aufgrund des Fehlens der Expression der Proteinkomponenten von Telomerase Telomerase-negativ bleiben. Wenn man wünschen würde, das Vorliegen von Telomeraseaktivität in solchen Zellen nachzuweisen, dann könnte man zuerst Protein isolieren und dann bestimmen, ob die Proteinfraktion die Telomerase-RNA-Komponente enthält, was das Vorliegen von Telomeraseaktivität signalisieren würde. Die diagnostischen Verfahren der Erfindung können speziell nützlich beim Nachweisen des Vorliegens von Telomeraseaktivität in Gewebebiopsien und histologischen Schnitten sein, wobei das Verfahren in situ durchgeführt wird, typischerweise nach Amplifikation von Telomerase-RNA-Komponente unter Verwendung spezifischer PCR-Primer der Erfindung.
  • Die Erfindung sieht ebenfalls Telomerase-RNA-Komponenten-Polynukleotidsonden für die Diagnose von Krankheitszuständen (z. B. Neoplasie oder Präneoplasie) durch Nachweisen einer Telomerase-RNA-Komponente oder von Rearrangements oder einer Amplifikation des Telomerase-RNA-Komponenten-Gens in Zellen, welche aus einem Patienten explantiert wurden, oder durch Nachweis eines pathognomonischen Telomerase-RNA-Komponenten-Allels (z. B. durch RFLP oder allelspezifische PCR-Analyse), vor. Typischerweise wird der Nachweis durch in situ-Hybridisierung und Verwendung eines markierten (z. B. 32P, 35S, 14C, 3H, fluoreszierenden, biotinylierten, digoxigeninylierten) Telomerase-RNA-Komponenten-Polynukleotides erfolgen, obwohl Northern-Blotting, Dot-Blotting oder Lösungs-Hybridisierung an Gesamt-RNA oder Poly-A+-RNA, welche aus einer Zellprobe isoliert wurde, angewandt werden können, ebenso wie PCR-Amplifizierung unter Verwendung von für Telomerase-RNA-Komponente spezifischen Primern. Zellen, welche eine veränderte Menge an Telomerase-RNA-Komponente im Vergleich zu nicht-neoplastischen Zellen derselben Zelltyp(en) enthalten, werden als Kandidaten-Erkrankungszellen identifiziert werden. In ähnlicher Weise wird der Nachweis von pathognomonischen Rearrangements oder von Amplifikation des Telomerase-RNA-Komponenten-Genlocus oder eng gekoppelter Loci in einer Zellprobe das Vorliegen eines pathologischen Zustands oder einer Prädisposition zur Entwicklung eines pathologischen Zustands (z. B. Krebs, genetische Krankheit) identifizieren. Die Polynukleotid-Sonden werden auch für die forensische Identifikation von Individuen, wie für Vaterschaftstests oder die Identifizierung von Verbrechensverdächtigen oder unbekannten Verstorbenen, verwendet.
  • Innerhalb der menschlichen Population können geringfügige Abweichungen in der grundlegenden Primärsequenz der Telomerase-RNA-Komponente vorkommen, einschließlich allelischer Varianten, Restriktionsstellen-Polymorphismen und kongenitaler Telomerase-RNA-Komponenten-Krankheits-Allelen, welche mit einer genetischen Krankheit assoziiert sind.
  • Falls gewünscht, können PCR-Amplimere zur Amplifizierung von im Wesentlichen Volllängen-Telomerase-RNA-Komponenten-Kopien gemäß der Beurteilung des Ausführenden gewählt werden. In ähnlicher Weise können Amplimere zum Amplifizieren von Abschnitten des Telomerase-RNA-Komponenten-Gens oder von RNA ausgewählt werden.
  • Expression der Telomerase-RNA-Komponente
  • Abhängig von der Länge und beabsichtigten Funktion des Primers, der Sonde oder sonstigen Nukleinsäure, umfassend Sequenz aus der RNA-Komponente von menschlicher Telomerase, können Expressionsplasmide der Erfindung nützlich sein. Beispielsweise kann die rekombinante Produktion der Volllängen-RNA-Komponente der Erfindung unter Verwendung eines rekombinanten DNA-Expressionsplasmids der Erfindung ausgeführt werden, welches eine Nukleinsäure umfasst, umfassend die Nukleotidsequenz der RNA-Komponente, welche zur Transkription unter die Kontrolle eines geeigneten Promotors positioniert wurde. Wirtszellen für derartige Plasmide können entweder prokaryotisch oder eukaryotisch sein, und der Promotor wie auch die anderen regulatorischen Elemente und selektierbaren Marker, welche für den Einbau in das Expressionsplasmid gewählt wurden, werden von der zur Herstellung verwendeten Wirtszelle abhängen.
  • Das intakte RNA-Komponenten-Gen, d. h. der Promotor, der jedwede regulatorischen Sequenzen in der 5'-Region des Gens einschließt, und die RNA-Komponente codierende Region, kann verwendet werden, um die RNA-Komponente in menschlichen Zellen zu exprimieren, einschließlich menschlichen Zellen, welche durch virale Transformation oder Krebs immortalisiert worden sind. Der Promotor des RNA-Komponenten-Gens kann jedoch reguliert werden, und aus diesen oder anderen Gründen kann man wünschen, die RNA-Komponente unter der Steuerung eines anderen Promotors zu exprimieren. Andererseits kann der Promotor des RNA-Komponenten-Gens unabhängig von der RNA-Komponentecodierenden Sequenz verwendet werden, um andere codierende Sequenzen von Interesse zu exprimieren. Zum Beispiel könnte man die transkriptionelle Regulierung des RNA-Komponenten-Gens durch Fusionieren des Promotors des RNA-Komponenten-Gens an eine codierende Sequenz für eine Reporter-Codierungssequenz, wie die codierende Sequenz für Beta-Galactosidase oder ein anderes Enzym oder Protein, dessen Expression leicht verfolgt werden kann, untersuchen. Somit können der Promotor und andere regulatorische Elemente des Gens für die RNA-Komponente von menschlicher Telomerase verwendet werden, um nicht nur die RNA-Komponente sondern auch Proteinkomponenten von menschlicher Telomerase, Antisense- oder sonstige Oligonukleotide sowie andere Genprodukte von Interesse in menschlichen Zellen zu exprimieren. Expressionsplasmide, welche das intakte Gen für die RNA-Komponente von menschlicher Telomerase umfassen, können speziell nützlich für eine Vielzahl von Zwecken einschließlich Gentherapie sein. Der Fachmann auf dem Gebiet wird erkennen, dass eine große Vielzahl von Expressionsplasmiden verwendet werden kann, um nützliche Nukleinsäuren der Erfindung herzustellen, und dass der Begriff "Plasmid", wie hierin verwendet, sich auf jedweden Typ von Nukleinsäure (aus einem Phagen, Virus, Chromosom etc.) bezieht, welcher verwendet werden kann, um spezifische genetische Information in eine Wirtszelle zu einzutragen und diese Information während einer gewissen Zeitdauer aufrechtzuerhalten.
  • Isolierung von Telomerase-Proteinkomponente
  • Die Reagenzien der vorliegenden Erfindung gestatten ebenfalls die Klonierung und Isolierung von Nukleinsäuren, codierend die Proteinkomponenten von menschlichen sowie anderen Säugetier-Telomerase-Enzymen, welche früher nicht verfügbar gewesen sind. Der Zugang zu solchen Nukleinsäuren liefert ergänzende Vorteile zu denjenigen, welche von den Nukleinsäuren bereitgestellt werden, die Nukleinsäuresequenzen der RNA-Komponente von menschlicher Telomerase umfassen. Zum Beispiel, und wie oben stehend angegeben, können die therapeutischen Vorteile der vorliegenden Erfindung in manchen Fällen verstärkt werden durch Verwenden der gereinigten Präparationen der Proteinkomponenten von menschlicher Telomerase und durch Zugang zu Nukleinsäuren, welche selbige codieren. Die Nukleinsäuren der Erfindung, welche die RNA-Komponente von menschlicher Telomerase codieren, können verwendet werden, um die Nukleinsäure, welche die Proteinkomponenten von menschlicher Telomerase codiert, zu isolieren, wodurch der Zugang zu derartigen Vorteilen gestattet wird. Somit sieht die Erfindung Verfahren zum Isolieren und Reinigen der Proteinkomponenten von menschlicher Telomerase sowie zum Identifizieren und Isolieren von Nukleinsäuren, welche die Proteinkomponenten von menschlicher Telomerase codieren, vor. In verwandten Aspekten sieht die vorliegende Erfindung gereinigte menschliche Telomerase, gereinigte Nukleinsäuren, welche die Proteinkomponenten von menschlicher Telomerase codieren, und rekombinante Expressionsplasmide für die Proteinkomponenten von menschlicher Telomerase vor. Die Erfindung sieht des Weiteren pharmazeutische Zusammensetzungen vor, welche als einen aktiven Bestandteil entweder die Proteinkomponenten von menschlicher Telomerase oder eine Nukleinsäure, welche entweder diese Proteinkomponenten codiert oder mit Nukleinsäuren wechselwirkt, welche diese Proteinkomponenten codieren, wie Antisense-Oligonukleotide, Tripelhelix-bildende Oligonukleotide, Ribozyme oder rekombinante DNA-Expressionsplasmide für ein beliebiges der Vorgenannten, umfassen.
  • Die klonierte RNA-Komponente von menschlicher Telomerase kann verwendet werden, um Nukleinsäuren zu identifizieren und zu klonieren, welche die Proteinkomponenten des Ribonukleoproteins Telomerase-Enzym codieren. Mehrere unterschiedliche Verfahren können angewandt werden, um eine Identifikation und Klonierung der Proteinkomponenten zu erreichen. Zum Beispiel kann man Affinitäts-Einfangen des Enzyms oder partiell denaturierten Enzyms anwenden, wobei als ein Affinitätsligand entweder (1) zur RNA- Komponente komplementäre Nukleotidsequenzen zum Binden an die RNA-Komponente des intakten Enzyms; oder (2) die RNA-Komponente zum Binden der Proteinkomponenten eines teilweise oder vollständig denaturierten Enzyms verwendet werden. Der Ligand kann an einen festen Träger befestigt oder chemisch für eine anschließende Immobilisierung auf dem Träger modifiziert (z. B. biotinyliert) werden. Die Exposition von Zellextrakten, welche menschliche Telomerase enthalten, gefolgt von Waschen und Elution des an den Träger gebundenen Telomerase-Enzyms, sieht eine in hohem Maße gereinigte Präparation des Telomerase-Enzyms vor. Die Proteinkomponenten können dann gegebenenfalls weiter gereinigt oder direkt durch Proteinsequenzierung analysiert werden. Die bestimmte Proteinsequenz kann verwendet werden, um Primer und Sonden zur Klonierung der cDNA oder Identifizierung eines Klons in einer genomischen Bank, umfassend Nukleinsäuren, welche eine Proteinkomponente von Telomerase codieren, herzustellen.
  • Das Affinitäts-Einfangen von Telomerase unter Verwendung einer gentechnisch manipulierten RNA-Komponente kann auch unter Verwendung von in vitro transkribierter Telomerase-RNA und eines Systems für die Rekonstitution von Telomerase-Enzymaktivität durchgeführt werden; siehe Autexier und Greider, 1994, Genes & Develoment 8: 563-575.
  • Die RNA wird manipuliert um ein 'Tag' bzw. eine Markierung zu enthalten, ähnlich zum Epitop-Tagging von Proteinen. Das Tag kann eine RNA-Sequenz sein, für welche ein fest bindender Ligand verfügbar ist, z. B. ein RNA-Sequenz-spezifischer Antikörper, ein sequenzspezifisches Nukleinsäure-Bindungsprotein oder ein organischer Farbstoff, welcher fest an eine spezifische RNA-Sequenz bindet. Die Toleranz von Telomerase für die Tag-Sequenz und -Position kann unter Anwendung von Standardverfahren getestet werden. Die Synthese der veränderten RNA-Komponente und der Rekonstitutionsschritt dieses Verfahrens können ebenfalls in vivo ausgeführt werden. Das Affinitäts-Einfangen unter Verwendung des immobilisierten Liganden für das RNA-Tag kann dann angewandt werden, um das Enzym zu isolieren.
  • Auch Expressions-Screening kann angewandt werden, um die Proteinkomponenten des Telomerase-Enzyms zu isolieren. In diesem Verfahren können cDNA-Expressionsbibliotheken mit markierter Telomerase-RNA gescreent werden, und cDNAs, welche Proteine codieren, die spezifisch an Telomerase-RNA binden, können identifiziert werden. Eine molekulargenetische Vorgehensweise unter Anwendung von translationaler Inhibition kann ebenfalls angewandt werden, um Nukleinsäuren zu isolieren, welche die Proteinkomponenten des Telomerase-Enzyms codieren. In diesem Verfahren werden Telomerase-RNA-Sequenzen stromaufwärts von einem selektierbaren Marker fusioniert. Bei Expression in einem geeigneten System wird der selektierbare Marker funktionell sein. Wenn ein Telomerase- RNA-Bindungsprotein codierende cDNA exprimiert wird, wird das Protein an seine Erkennungssequenz binden, wodurch die Translation des selektierbaren Markers blockiert wird, wodurch die Identifizierung des Klons, welcher das Protein codiert, ermöglicht wird. In anderen Ausführungsformen dieses Verfahrens wird die blockierte Translation des selektierbaren Markers transformierten Zellen gestatten, zu wachsen. Andere Systeme, welche angewandt werden können, schließen das "Interaktions-Fallen-System", welches in der PCT-Patentveröffentlichung Nr. WO 94/10300 beschrieben wird; das "Ein-Hybrid"-System, das in Li und Herskowitz, 17. Dezember 1993, Science 262: 1870-1874, und Zervos et al., 29. Januar 1993, Cell 72: 223-232, beschrieben wird; und das "Zwei-Hybrid"-System, welches kommerziell von Clontech erhältlich ist, ein.
  • Telomerase-RNA-Bindungs- oder Telomeraseaktivitäts-Assays zum Nachweisen von spezifischen Bindungsproteinen und Aktivität können eingesetzt werden, um die Reinigung des Telomerase-Enzyms und die Identifizierung von Nukleinsäuren, welche die Proteinkomponenten des Enzyms codieren, zu erleichtern. Zum Beispiel können Nukleinsäuren, umfassend RNA-Komponenten-Sequenzen, als Affinitätsreagenzien verwendet werden, um Peptide, Proteine und andere Verbindungen zu isolieren, zu identifizieren und zu reinigen, welche spezifisch an eine Sequenz binden, die innerhalb der RNA-Komponente enthalten ist, wie die Proteinkomponenten von menschlicher Telomerase. Mehrere unterschiedliche Formate sind verfügbar, einschließlich "Gel-Shift", Filterbindung, "Footprinting", Northwestern (RNA-Sonden von Protein-Blot) und Photo-Quervernetzung, um eine solche Bindung nachzuweisen und die Komponenten zu isolieren, welche spezifisch an die RNA-Komponente binden. Diese Assays können eingesetzt werden, um Bindungsproteine zu identifizieren, die Reinigung von Bindungsproteinen zu verfolgen, die RNA-Bindungsstellen zu charakterisieren, die molekulare Größe von Bindungsproteinen zu bestimmen, Proteine für eine präparative Isolierung zu markieren, sowie für eine anschließende Immunisierung von Tieren zur Antikörperherstellung, um Antikörper zur Verwendung bei der Isolierung des Proteins oder Identifizierung einer das Protein codierenden Nukleinsäure in einem gekoppelten Transkriptions/Translation-System zu erhalten.
  • Reinigung von Säugetier-Telomerase-Proteinkomponente
  • Säugetier-Telomerase-Proteinkomponente kann durch herkömmliche biochemische Verfahren aus Telomerase exprimierenden Zellen gereinigt werden, wie HT1080-Zellen, 293-Zellen und anderen geeigneten immortalisierten Zelllinien. Zum Beispiel und nicht zur Einschränkung kann menschliche Telomerase aus Zellextrakten gereinigt werden.
  • Säugetier-Telomerase-Extrakte können durch Behandlung mit einer RNAse-Aktivität oder andere geeignete Methoden zum Dissoziieren und/oder Abbauen der Telomerase-RNA-Komponente von der Telomerase-RNA-Komponente abgelöst bzw. abgestriffen werden, während Telomerase-Proteinkomponente im Wesentlichen unversehrt und fähig zur Rekonstitution bei Zugeben von exogener Telomerase-RNA-Komponente, wie sie rekombinant oder gleichermaßen hergestellt werden kann, verbleibt. Die so gereinigte und gegebenenfalls von endogener Telomerase-RNA-Komponente abgestriffene Telomerase-Proteinkomponente kann in den hierin beschriebenen Mittel-Screeningassays und für andere Verwendungen eingesetzt werden.
  • Gentherapie
  • Das Transferieren von exogenem genetischem Material in Zellen (d. h. DNA-vermittelte Transfektion) ist ein essentielles Verfahren für die Grundlagenforschung in der Zellbiologie und Molekulargenetik als auch die Basis für die Entwicklung effektiver Verfahren für die Gentherapie am Menschen. Bislang beruht die Mehrheit der zugelassenen Gentransfer-Versuche in den Vereinigten Staaten auf Replikations-defekten retroviralen Vektoren, welche eine therapeutische Polynukleotidsequenz als Teil des retroviralen Genoms beinhalten (Miller et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10: 4329; Kolberg, R. (1992) J. NIH Res. 4: 43; Cornetta et al., (1991) Hum. Gene Ther. 2: 215). Adenovirale Vektoren sind ebenfalls für eine potenzielle Verwendung in der Gentherapie beim Menschen beschrieben worden (Rosenfeld et al. (1992) Cell 68: 143).
  • Das andere Gentransferverfahren, welches zur Verwendung in Menschen zugelassen worden ist, ist der physikalische Transfer von Plasmid-DNA in Liposomen direkt in Tumorzellen in situ. Anders als virale Vektoren, welche in kultivierten Zellen vermehrt werden müssen, kann Plasmid-DNA bis zur Homogenität gereinigt werden und verringert somit das Potenzial für eine pathogene Kontamination. In manchen Situationen (z. B. Tumorzellen) muss es für die exogene DNA nicht notwendig sein, stabil in die transduzierte Zelle zu integrieren, da eine transiente Expression ausreichen kann, um die Tumorzellen zu töten. Liposomen-vermittelter DNA-Transfer ist von verschiedenen Forschern beschrieben worden (Wang und Huang (1987) Biochem. Biophys. Res. Commun. 147: 980; Wang und Huang (1989) Biochemistry 28: 9508; Litzinger und Huang (1992) Biochem. Biophys. Acta 1113: 201; Gao und Huang (1991) Biochem. Biophys. Res. Commun. 179: 280; Felgner WO 91/17424; WO 91/16024).
  • Auch Immunliposomen sind als Träger für exogene Polynukleotide beschrieben worden (Wang und Huang (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 84: 7851; Trubetskoy et al. (1992) Biochem. Biophys. Acta 1131: 311). Von Immunliposomen könnte man hypothetisch erwarten, eine verbesserte Zelltypspezifität im Vergleich zu Liposomen dank dem Einschluss spezifischer Antikörper aufzuweisen, welche vermutlich an Oberflächen-Antigene auf spezifischen Zelltypen binden. Behr et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86: 6982, berichten über die Verwendung von Lipopolyamin als ein Reagenz zur Vermittlung von Transfektion selbst, ohne die Notwendigkeit irgendeines zusätzlichen Phospholipids zur Bildung von Liposomen.
  • Folglich wird ein Polynukleotid, das im Wesentlichen zu wenigstens 25 Nukleotiden, vorzugsweise 50 bis 100 Nukleotiden oder mehr, der Telomerase-RNA-Komponenten-Sequenz oder ihrem Komplement identisch ist, funktionsfähig an einen heterologen Promotor verknüpft, um eine Transkriptionseinheit zu bilden, die zum Exprimieren einer Telomerase-RNA-Komponente oder eines Antisense-Telomerase-RNA-Komponenten-Polynukleotides in einer menschlichen Zelle fähig ist. Eine solche Transkriptionseinheit kann in einem Transgen, adenoviralen Vektor oder einer anderen Gentherapiemodalität für eine Zuführung in menschliche Zellen, wie für die Therapie einer mit Telomerase zusammenhängenden Krankheit (z. B. Neoplasie), enthalten sein. Geeignete Zuführungsverfahren für das Telomerase-RNA-Komponenten-Sense- oder Antisense-Expressions-Konstrukt werden von ausührenden Fachleuten in Hinsicht auf annehmbare Praktiken und Regulationsanforderungen gewählt werden.
  • Ausführungsformen transgener Tiere
  • Genomische Klone von Säugetier-Telomerase-RNA-Komponente, insbesondere von Telomerase-RNA-Komponenten-Genen, welche im Wesentlichen identisch zu Maus-Telomerase-RNA-Komponente sind, können verwendet werden, um homologe Targeting-Konstrukte zur Erzeugung von Zellen und transgenen nicht-menschlichen Tieren zu konstruieren, welche wenigstens ein funktionell unterbrochenes Telomerase-RNA-Komponenten-Allel aufweisen. Eine Richtlinie für die Konstruktion von homologen Targeting-Konstrukten kann im Fachgebiet gefunden werden, einschließlich: Rahemtulla et al. (1991) Nature 353: 180; Jasin et al. (1990) Genes Devel. 4: 157; Koh et al. (1992) Science 256: 1210; Molina et al. (1992) Nature 357: 161; Grusby et al. (1991) Science 253: 1417; Bradley et al. (1992) Bio/Technology 10: 534. Homologes Targeting kann verwendet werden, um so genannte "knockout"-Mäuse zu erzeugen, welche heterozygot oder homozygot hinsichtlich eines inaktivierten Telomerase-RNA-Komponenten-Allels sind. Solche Mäuse können als Forschungstiere für die Untersuchung der Immunsystem-Entwicklung, Neoplasie, Spermatogenese kommerziell vertrieben werden, können als Haustiere verwendet werden, können als tierisches Protein (Nahrungsmittel) und für andere Anwendungen verwendet werden.
  • Chimäre Targeting-behandelte bzw. 'Targeted'-Mäuse werden gemäß Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) und Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, Hrsg.: E. J. Robertson, IRL Press, Washington, D.C., (1987) abgeleitet. Embryonale Stammzellen werden gemäß veröffentlichten Verfahrensweisen (Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Pracitcal Approach; Hrsg.: E.J. Robertson, IRL Press, Washington, D. C., (1987); Zjilstra et al. (1989) Nature 342: 435; und Schwartzberg et al. (1989) Science 246: 799) manipuliert.
  • Darüber hinaus kann eine Telomerase-RNA-Komponenten-cDNA- oder genomische Gen-Kopie verwendet werden, um Transgene für die Expression von Telomerase-RNA-Komponente bei hohen Spiegeln und/oder unter der transkriptionellen Kontrolle von Transkriptions-Steuerungssequenzen, welche nicht natürlicherweise angrenzend zu dem Telomerase-RNA-Komponenten-Gen vorkommen, zu konstruieren. Zum Beispiel, aber ohne Einschränkung, kann ein konstitutiver Promotor (z. B. ein HSV-tk- oder pgk-Promotor-) oder eine Zellabstammungslinien-spezifische transkriptionsregulatorische Sequenz (z. B. ein CD4- oder CD8-Gen-Promotor/Enhancer) funktionsfähig an eine Telomerase-RNA-Komponenten-Polynukleotidsequenz verknüpft werden, um ein Transgen zu bilden (typischerweise in Kombination mit einem selektierbaren Marker, wie einer Neo-Genexpressionskassette). Derartige Transgene können in Zellen (z. B. ES-Zellen, hämatopoietische Stammzellen) eingebracht werden und transgene Zellen und transgene nicht-menschliche Tiere können gemäß herkömmlichen Verfahren erhalten werden. Transgene Zellen und/oder transgene nicht-menschliche Tiere können verwendet werden, um nach antineoplastischen Mitteln zu screenen und/oder nach potenziellen Karzinogenen zu screenen, da eine Überexpression von Telomerase-RNA-Komponente oder eine unangemessene Expression von Telomerase-RNA-Komponente zu einem präneoplastischen oder neoplastischen Zustand führen kann.
  • Assays zum Screening von Mitteln
  • Telomerase-RNA-Komponenten-Polynukleotide, Telomerase-Proteinkomponenten-Präparationen, Telomer-Wiederholungseinheit-Matrizen und Bindungsreaktionen und dergleichen werden unter Bezugnahme auf die experimentellen Beispiele ausgeführt. Im Allgemeinen werden Telomerase-Proteinkomponenten durch herkömmliche Reinigung aus telomerase-exprimierenden Säugetierzellen erhalten und werden von assoziierter RNA-Komponente vor ihrer Verwendung in den hierin beschriebenen Assays abgestriffen. Besondere wässrige Bedingungen können vom Ausübenden gemäß herkömmlicher Verfahren gewählt werden. Als allgemeine Richtlinie können die folgenden gepufferten wässrigen Lösungen verwendet werden: 10-250 mM NaCl, 5-50 mM Tris-HCl, pH 5-8, mit wahlfreier Zugabe von zweiwertigen Kation(en) und/oder Metallchalotoren und/oder nichtionischen Detergenzien und/oder Membranfraktionen. Der Fachmann auf dem Gebiet wird es richtig einschätzen, dass Additionen, Deletionen, Modifikationen (wie pH) und Substitutionen (wie KCl, das NaCl ersetzt, oder Puffer-Substitution) an diesen grundlegenden Bedingungen vorgenommen werden können. Modifikationen können an den grundlegenden Bindungsreaktionsbedingungen vorgenommen werden, so lange eine spezifische Telomerase-Holoenzym-Bildung und/oder Telomeraseaktivität in den Kontrollreaktion(en) auftritt. Bedingungen, welche keine spezifische Bindung und Spaltung in Kontrollreaktionen erlauben (kein Mittel eingeschlossen) sind nicht geeignet zur Verwendung in Bindungsassays.
  • Zur Bestimmung der Bindung von Telomerase-RNA-Komponente an immobilisierte Telomerase-Proteinkomponente wird vorzugsweise die Telomerase-RNA-Komponentenspezies mit einem nachweisbaren Marker, typischerweise einer Biotinylgruppe, einer fluoreszierenden Einheit oder einem radioaktiv markierten eingebauten Nukleotid, markiert. Eine geeignete Markierung für Telomerase-Proteinkomponente schließt, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, radioaktive Markierung durch Einbau einer radioaktiv markierten Aminosäure (z. B. 14C-markiertes Leucin, 3H-markiertes Glycin, 35S-markiertes Methionin), radioaktive Markierung durch post-translationale Radioiodierung mit 125I oder 131I (z. B. Bolton-Hunter-Reaktion und Chloramin T), Markierung durch post-translationale Phosphorylierung mit 32P (z. B. Phosphorylase und anorganisches radioaktiv markiertes Phosphat), Fluoreszenzmarkierung durch Einbau einer fluoreszierenden Markierung (z. B. Fluorescein oder Rhodamin) oder eine Markierung durch andere im Fachgebiet bekannte herkömmliche Verfahren ein. In Ausführungsformen, worin eine der Polypeptidspezies durch Verknüpfung an ein Substrat immoilisiert ist, wird die andere Komponente im Allgemeinen mit einem nachweisbaren Marker markiert.
  • Markierte Telomerase-RNA- oder Protein-Komponente wird mit immobilisierter Telomerase-Protein- bzw. RNA-Komponente in Kontakt gebracht, und das Vermögen eines Mittels, die Menge an markierter Komponente, welche immobilisiert wird (d. h. welche die kognate Telomerasekomponente bindet und eingefangen wird), zu verändern wird bestimmt. Die Zeit und Temperatur der Inkubation einer Bindungsreaktion können variiert werden, solange die gewählten Bedingungen das Stattfinden von spezifischer Bindung in einer Kontrollreaktion gestatten, in der kein Mittel vorhanden ist. Bevorzugte Ausführungsformen verwenden eine Reaktionstemperatur von etwa mindestens 15°C, weiter bevorzugt 35 bis 42°C, und eine Inkubationszeit von ungefähr wenigstens 15 Sekunden, obwohl längere Inkubationsdauern zu bevorzugen sind, so dass, in manchen Ausführungsformen, ein Bindungsgleichgewicht erreicht wird. Die Bindungskinetik und die thermodynamische Stabilität von gebundenen Komplexen bestimmen den Spielraum, der für das Variieren der Zeit-, Temperatur-, Salz-, pH- und anderen Reaktionsbedingungen verfügbar ist. Für eine beliebige besondere Ausführungsform jedoch können die gewünschten Bindungsreaktionsbedingungen vom Ausübenden ohne Weiteres eingestellt werden, wobei herkömmliche Verfahren des Fachgebiets angewandt werden, welche eine Bindungsanalyse unter Verwendung von Scatchard-Analyse, Hill-Analyse und andere Verfahren einschließen können (Proteins, Structures and Molecular Principles, (1984) Creighton (Hrsg.), W. H. Freeman and Company, New York).
  • Die spezifische Bindung von markierter Telomerase-Proteinkomponente an immobilisierte Telomerase-RNA-Komponente wird jeweilig durch Einschließen von unmarkiertem Kompetitorprotein (z. B. Albumin) und/oder unmarkierter RNA bestimmt. Nachdem eine Bindungsreaktion abgeschlossen ist, wird die Menge an markierter Spezies, welche an die immobilisierte Spezies spezifisch gebunden ist/sind, detektiert. Zum Beispiel, und nicht zur Einschränkung, wird, nach einer geeigneten Inkubationsdauer für die Bindung, die wässrige Phase, enthaltend nicht-immobilisierte markierte Telomerase-Proteinkomponente, entfernt, und das Substrat, enthaltend die immobilisierte gebundene Telomerase-Holoenzym-Spezies und jedwede markierte Telomerase-Proteinkomponente, welche daran gebunden hat, wird mit einem geeigneten Puffer gewaschen, welcher gegebenenfalls (ein) unmarkierte(s) Blocking-Mittel enthält, und der/die Waschpuffer wird/werden entfernt. Nach dem Waschen wird die Menge an nachweisbarer Markierung, welche an die immobilisierte markierte Komponente spezifisch gebunden hat, bestimmt (z. B. durch optische, enzymatische, autoradiographische oder andere radiochemische Verfahren).
  • In manchen Ausführungsformen wird die Zugabe von unmarkierten Blocking-Mitteln, welche nicht-spezifische Bindung inhibieren, eingeschlossen. Beispiele für solche Blockingmittel schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, die Folgenden ein: Kalbsthymus-DNA, Lachssperma-DNA, Hefe-RNA, verschieden lange Oligonukleotide von gemischter Sequenz (statistische oder pseudo-statistische Sequenz), Rinderserumalbumin, nicht-ionische Detergenzien (NP-40, Tween, Triton X-100, etc.), fettfreie Trockenmilch-Proteine, Denhardt's Reagenz, Polyvinylpyrrolidon, Ficoll und andere Blockingmittel. Der ausführende Fachmann kann, nach seiner Beurteilung, Blockingmittel bei geeigneten Konzentrationen auswählen, welche in die Bindungsassays eingeschlossen werden sollen.
  • In Ausführungsformen, worin eine Telomerase-RNA-Komponente oder Telomerase-Protein-Komponente immobilisiert wird, kann die kovalente oder nicht-kovalente Verknüpfung an ein Substrat verwendet werden. Eine kovalente Verknüpfungs-Chemie schließt, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, gut charakterisierte, im Fachgebiet bekannte Verfahren ein (Kadonaga und Tijan (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 83: 5889). Ein Beispiel, nicht zur Einschränkung, ist die kovalente Bindung an ein Substrat, welches mit Cyanogenbromid derivatisiert wurde (wie CNBr-derivatisierte Sepharose 4B). Es kann wünschenswert sein, einen Abstandhalter zu verwenden, um eine potenzielle sterische Behinderung von dem Substrat aus zu verringern. Nicht-kovalentes Binden von Proteinen an ein Substrat schließt, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, das Binden des Proteins an eine geladene Oberfläche und eine Bindung mit spezifischen Antikörpern ein.
  • In einer Ausführungsform werden therapeutische Kandidatenmittel durch ihre Fähigkeit identifiziert, die Bindung einer Telomerase-Proteinkomponente an eine Telomerase-RNA-Komponente zu blockieren.
  • Typischerweise umfasst eine in diesen Verfahren verwendete Telomerase-RNA-Komponente eine natürlich vorkommende Sequenz von Säugetier-Telomerase-RNA-Komponente (z. B. eine menschliche RNA-Komponente), obwohl manchmal mutante Telomerase-RNA-Komponenten-Sequenzen verwendet werden, wenn die Mutanten-Telomerase-RNA-Komponente unter Kontroll-Assay-Bedingungen (z. B. physiologischen Bedingungen) an die Telomerase-Proteinkomponente bindet.
  • In einer Ausführungsform werden Telomerase-modulierende Kandidatenmittel identifiziert durch ihr Vermögen, eine statistisch signifikante Verringerung oder Erhöhung der Transkription einer Reporter-Polynukleotidsequenz (z. B. β-Galactosidase-Gen, Luciferase-Gen, HPRT-Gen), welche funktionsfähig an eine transkriptionsregulatorische Sequenz eines Säugetier-Telomerase-RNA-Komponenten-Gens, vorzugsweise eines menschlichen Telomerase-RNA-Komponenten-Gens, verknüpft ist, in einer metabolisch aktiven Säugetier-Zelle hervorzurufen. Ein Reporter-Gen (z. B. HPRT) kann in eine Restriktionsstelle oder eine glattendige Stelle einer ds-cDNA einer Säugetier-Telomerase-RNA-Komponente inseriert werden, solange ein homologes Targeting-Konstrukt oder Transgen erzeugt wird, worin, in einer lebensfähigen Säugetierzelle, das Reporter-Gen unter die transkriptionelle Kontrolle des endogenen Telomerase-RNA-Komponenten-Gen-Promotors und verwandter Transkriptions-Regulations-Elemente gebracht wird. Mittel, welche eine dosisabhängige transkriptionelle Modulation des Reporter-Gens hervorrufen, werden dadurch als Telomerase-modulierende Kandidatenmittel identifiziert.
  • In einer Variation wird ein endogenes Telomerase-RNA-Komponenten-Gen in einer Säugetierzelle mit einem homologen Targeting-Konstrukt angezielt, um eine Reporter-Polynukleotid-Sequenz in eine funktionsfähige Verknüpfung an die stromaufwärts gelegene transkriptionsregulatorische Sequenz (z. B. Promotor) des endogenen Telomerase-RNA-Komponenten-Gens an dem chromosomalen Locus des endogenen Gens zu bringen. In einer alternativen Variation wird ein exogenes Polynukleotid, welches ein Reporter-Polynukleotid umfasst, funktionsfähig an eine transkriptionsregulatorische Region eines Säugetier-Telomerase-RNA-Komponenten-Gens (z. B. Promotor und stromaufwärts gelegene Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen) verknüpft; das exogene Polynukleotid wird in eine Säugetierzelle transferiert, worin es nicht-homolog in eine chromosomale Lokalisierung integrieren kann und/oder aufrechterhalten wird oder als episomales Polynukleotid repliziert wird. Mittel, welche eine statistisch signifikante transkriptionelle Modulation des Reporter-Polynukleotids in mit dem Mittel behandelten Zellen hervorrufen, werden dadurch als Säugetier-Telomerasemodulierende Kandidatenmittel identifiziert.
  • Telomerase-modulierende Mittel, welche die Fähigkeit der Zelle verringern, Telomer-Beschädigung zu reparieren, oder die Telomer-Replikation (z. B. durch kompetitives Inhibieren von endogener natürlich vorkommender Telomerase) inhibieren, sind antineoplastische Kandidatenmittel oder sensitivierende Mittel, welche Zellen (z. B. neoplastische Zellen) gegenüber Telomer-schädigenden Mitteln (z. B. alkylierenden Mitteln und ionisierender Strahlung) empfindlich machen.
  • Antineoplastische Kandidaten-Mittel werden dann ferner hinsichtlich antineoplastischer Aktivität in Assays getestet, welche routinemäßig angewandt werden, um die Eignung zur Verwendung als antineoplastische Arzneistoffe beim Menschen vorherzusagen. Beispiele dieser Assays schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, folgende ein: (1) Fähigkeit des Kandidatenmittels, das Vermögen von Verankerungs-unabhängigen transformierten Zellen, in Weichagar zu wachsen, zu inhibieren, (2) Fähigkeit, Tumorigenität von transformierten Zellen zu verringern, welche in nu/nu-Mäuse transplantiert wurden, (3) Fähigkeit, die morphologische Transformation von transformierten Zellen rückgängig zu machen, (4) Fähigkeit, das Wachstum von transplantierten Tumoren in nu/nu-Mäusen zu reduzieren, (5) Fähigkeit zum Inhibieren der Bildung von Tumoren oder präneoplastischen Zellen in Tiermodellen der spontanen oder chemisch induzierten Karzinogenese, und (6) Fähigkeit, einen stärker differenzierten Phänotyp in transformierten Zellen zu induzieren, auf welche das Mittel angewandt wird.
  • Assays zum Nachweisen der Fähigkeit von Mitteln, die Telomerase-Protein-Komponente: Telomerase-RNA-Komponente-Bindung und/oder die enzymatische Aktivität von Telomerase zu inhibieren oder zu steigern, ermöglichen ein einfaches Hochdurchsatz-Screening von Banken von Mitteln (z. B. Verbindungs-Bibliotheken, Peptid-Bibliotheken und dergleichen), um Telomerase-Antagonisten oder -Agonisten zu identifizieren. Solche Antagonisten und Agonisten können Telomeraseaktivität modulieren und dadurch Telomer-Reparatur-Kompetenz und replikatives Potenzial modulieren.
  • Die Verabreichung einer wirksamen Dosis eines Mittels, welches fähig zur spezifischen Inhibierung von Telomeraseaktivität ist, an einen Patienten, kann als ein therapeutisches oder prophylaktisches Verfahren zur Behandlung von pathologischen Zuständen verwendet werden (z. B. Krebs, Entzündung, lymphoproliferative Krankheiten, Autoimmunkrankheit, neurodegenerative Krankheiten und dergleichen), welche effektiv durch Modulieren von Telomeraseaktivität und DNA-Reparatur und -Replikation behandelt werden.
  • Wie dem Fachmann auf dem Gebiet bei Lektüre dieser Offenbarung offensichtlich sein wird, stellt die vorliegende Erfindung wertvolle Reagenzien in Bezug auf menschliche Telomerase sowie eine Vielzahl von nützlichen therapeutischen und diagnostischen Verfahren bereit. Die obenstehende Beschreibung sieht notwendigerweise eine beschränkte Auswahl derartiger Verfahren vor, was nicht als einschränkend für den Umfang der Erfindung ausgelegt werden sollte. Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus den folgenden Beispielen und Patentansprüchen offensichtlich werden.
  • Die folgenden Beispiele beschreiben spezifische Aspekte der Erfindung zur Veranschaulichung der Erfindung und liefern für den Fachmann auf dem Gebiet eine Beschreibung der Verfahren, welche angewandt wurden, um die RNA-Komponente von menschlicher Telomerase zu isolieren und zu identifizieren. Die Beispiele sollten nicht als die Erfindung einschränkend ausgelegt werden, da die Beispiele lediglich eine spezifische Methodik angeben, die nützlich zum Verständnis und Ausführen der Erfindung ist.
  • EXPERIMENTELLE BEISPIELE
  • Überblick
  • Die Klonierung der RNA-Komponente von menschlicher Telomerase erforderte ein neues Verfahren, beinhaltend negative Selektion und Zyklen von positiver Selektion, welche nachstehend beschrieben werden. Anfänglich wurde jedoch ein Versuch unternommen, die RNA-Komponente unter Anwendung von reverser Transkription und eines Verfahrens für die Klonierung der Enden von cDNA, welches '5-RACE-PCR-Amplifikation genannt wird, zu klonieren. Die reverse Transkriptionsreaktion wurde mit einem Primer initiiert, welcher zu der Wiederholungseinheit in dem einzelsträngigen Abschnitt von menschlicher telomerer DNA identisch und somit komplementär zu einer Sequenz ist, von welcher angenommen wird, dass sie in der RNA-Komponente von menschlicher Telomerase vorhanden ist. Der Primer umfasste an seinem 5'-Ende auch eine Sequenz, welche einer Restriktionsenzym-Erkennungsstelle entspricht. Als jedoch die durch die reverse Transkriptionsreaktion und PCR-Amplifizierung hergestellte cDNA durch Gelelektrophorese und Nukleotidsequenzanalyse der Banden von in dem Gel vorhandener Nukleinsäure untersucht wurde, wurden lediglich ribosomale RNA-Sequenzen nachgewiesen. Ähnliche Probleme traten auf, als Variationen dieses 5'-RACE-Vorgehens unter Verwendung von verschachtelten Primern versucht wurden.
  • Der erfolgreiche Klonierungs-Ansatz begann mit der Präparation von cDNA aus gereinigten Präparationen von menschlicher Telomerase sowie aus Zelllinien, welche menschliche Telomeraseaktivität aufweisen, und aus Zelllinien, welche keine nachweisbare menschliche Telomeraseaktivität aufweisen. Das zur Herstellung der cDNA angewandte Verfahren ist ausführlich im untenstehenden Beispiel 1 beschrieben. Zwei Negativselektions-Schritte und aufeinander folgende Zyklen von Positivselektion wurden im Zusammenhang mit den cDNA-Präparationen aus den zwei menschlichen Zelllinien angewandt, um die Konzentration an nicht-erwünschten Sequenzen zu senken und die Konzentration der gewünschten RNA-Komponenten-Sequenzen zu erhöhen.
  • Die Negativselektions-Schritte beinhalteten die Präparation von biotinyliertem PCR-Produkt aus cDNA, welche aus einer menschlichen Zelllinie hergestellt wurde, die keine nachweisbare Telomeraseaktivität aufweist. Das biotinylierte PCR-Produkt wurde denaturiert und dann in einer Lösung rehybridisiert, umfassend eine viel niedrigere Konzentration an nicht-biotinyliertem PCR-Produkt (10 biotinyliertes Produkt : 1 nicht-biotinyliertes Produkt) aus cDNA, welche aus einer menschlichen Zelllinie hergestellt wurde, die keine Telomeraseaktivität aufweist. Angesichts der Möglichkeit, dass die Telomerase-negative Zelllinie eine gewisse geringe Menge der RNA-Komponente enthalten könnte, wurde der Hybridisierungsschritt durchgeführt, um eine Unterschiedung oder Selektion nur gegenüber RNA vorzunehmen, welche reichlich in beiden Zelllinien exprimiert wurde. Nach Hybridisierung zu einem C0t, welches gewählt wurde, um eine Hybridisierung der am reichlichsten exprimierten RNA zu gestatten, wurde das unerwünschte Material durch Bindung an streptavidinylierte magnetische Teilchen entfernt; der Überstand, welcher nach dem Teilchen-Absammeln verblieb, enthielt die gewünschte cDNA für die RNA-Komponente von menschlicher Telomerase. Das Verfahren für die PCR-Amplifizierung von cDNA wird im untenstehenden Beispiel 2 beschrieben.
  • Dieses Material wurde ferner hinsichtlich der gewünschten cDNA durch aufeinander folgende Zyklen einer Positivselektion angereichert. In dem Positivselektion-Schritt wurde eine biotinylierte Sonde, komplementär zu der vorhergesagten Matrizensequenz in der RNA-Komponente von menschlicher Telomerase, an PCR-Produkt aus einer (durch Negativ-Selektion) angereicherten Probe der PCR-amplifizierten cDNA aus einer menschlichen Zelllinie, welche Telomeraseaktivität besitzt, hybridisiert. Nach der Hybridisierung wurden die Sonde/Ziel-Komplexe an avidinylierte magnetische Kügelchen gebunden, welche dann abgesammelt und als Quelle von Nukleinsäure, welche hinsichtlich RNA-Komponenten-Sequenzen angereichert war, in weiteren Zyklen der Positivselektion verwendet wurde. Das Verfahren der Positivselektion wird in größerer Ausführlichkeit in den Beispielen 3 und 4 nachstehend beschrieben.
  • Nach dem dritten Zyklus der Positivselektion wurden die Amplifizierungsprodukte durch Gelelektrophorese getrennt, und Schnittstücke des Gels, entsprechend Nukleinsäuren von ~200 bp Größe, wurden entnommen. Die Nukleinsäuren wurden dann aus den Gel-Schnittstücken eluiert und mittels PCR amplifiziert. Die PCR-Amplifizierungsprodukte wurden mit dem Restriktionsenzym NotI verdaut und dann durch Ligation in die NotI-Stelle des Plasmids pBluescriptIISK+, welches von Stratagene kommerziell erhältlich ist, inseriert. Die resultierenden Plasmide wurden in E. coli-Wirtszellen transformiert, und individuelle Kolonien wurden isoliert und als eine Quelle von Nukleinsäure zur weiteren Analyse und DNA-Sequenzierung verwendet. Eine Anzahl von Klonen, welche in diesem Tests positiv waren, wurde dann mittels DNA-Sequenzierung und einer Vielzahl anderer Tests analysiert.
  • Diese anderen Tests schlossen die folgenden ein: (1) Bestimmen, ob Antisense-Oligonukleotide, welche zu der vermeintlichen RNA-Komponente komplementär sind, die Telomeraseaktivität in menschlichen Zellextrakten, welche bekannterweise Telomerase enthalten, hemmen werden; (2) Bestimmen, ob PCR-Primer, welche spezifisch für eine vermeintliche RNA-Komponenten-Klon-Sequenz sind, verwendet werden konnten, um eine Nukleinsäure zu amplifizieren, welche in einer Telomerase-Probe vorhanden ist, und ob das beobachtete Produkt, falls vorhanden, Telomeraseaktivität während einer Aufreinigung von Telomerase verfolgen wird; und (3) Bestimmen, ob für eine vermeintliche RNA-Komponenten-Klon-Sequenz spezifische PCR-Primer verwendet werden konnten, um eine Nukleinsäure zu amplifizieren, welche in größerer Häufigkeit in Zellextrakten aus Zellen, in denen Telomeraseaktivität bekanntermaßen hoch ist (d. h. Tumorzellen), vorliegt als in Zellextrakten aus Zellen, welche bekanntermaßen keine oder nur geringe Mengen an Telomeraseaktivität hervorbringen. Ein Klon, bezeichnet als Plasmid pGRN7, erzeugte Ergebnisse in diesen Tests, welche konsistent mit der Feststellung sind, dass das Plasmid cDNA umfasste, welche der RNA-Komponente von menschlicher Telomerase entspricht.
  • Daher zeigten Antisense-Oligonukleotide, entsprechend zu Sequenzen der vermeintlichen RNA-Komponenten-Sequenz von pGRN7, eine Inhibition von Telomeraseaktivität in vitro auf. Als Telomerase aus Zellextrakten mittels eines Verfahrens, beinhaltend (1) DEAE-Chromatographie; (2) Sephadex-S300-Chromatographie; und (3) entweder Glycerol-Gradient, SP-Sepharose- oder Phenyl-Sepharose-Auftrennung, aufgereinigt wurde und Fraktionen aufgefangen wurden, amplifizierten für die vermeintliche RNA-Komponenten-Sequenz von pGRN7 spezifische PCR-Primer gleichfalls eine Nukleinsäure der passenden Größe, und die Menge an Amplifikationsprodukt korrelierte gut mit der Menge an Telomeraseaktivität, welche in den aufgefangenen Fraktionen beobachtet wurde. Schließlich zeigten Zellextrakte aus normalen (keine nachweisbare Telomeraseaktivität) und Krebs- (Telomeraseaktivität vorhanden) sowie Hoden-Zellen (Telomeraseaktivität vorhanden) entsprechende Mengen an PCR-Produkt nach reverser Transkription und PCR-Amplifizierung (RT-PCR) mit Primern, welche für die vermeintliche RNA-Komponente, die in pGRN7 enthalten ist, spezifisch waren. Das Protokoll für die RT-PCR wird in den Beispielen 5 und 6 nachstehend beschrieben.
  • Die obenstehenden Ergebnisse lieferten überzeugende Beweise, dass die RNA-Komponente von menschlicher Telomerase kloniert worden war, so dass das Plasmid pGRN7 dann verwendet wurde, um einen genomischen Klon für die RNA-Komponente aus einer menschlichen Zelllinie zu isolieren, wie beschrieben im nachstehenden Beispiel 7. Der genomische Klon wurde in einer genomischen Bibliothek von menschlicher DNA, welche in einen von Stratagene erworbenen Lambda-Vektor FIXII inseriert worden war, identifiziert und daraus isoliert. Der gewünschte Klon, umfassend die RNA-Komponenten-Gen-Sequenzen, enthielt ein ~15 kb großes Insert und wurde als Klon 28-1 bezeichnet. Dieser Klon ist bei der American Type Culture Collection hinterlegt worden und ist unter der Zugangs-Nr. 75925 erhältlich. Verschiedene Restriktionsfragmente wurde aus diesem Phagen subkloniert und sequenziert. Das Gen ist des Weiteren auf das distale Ende des q-Arms von Chromosom 3 lokalisiert worden. Die von einer SauIIIAl-Restriktionsenzym-Erkennungsstelle an einem Ende des ~15kb-Inserts bis zu einer internen HindIII-Restriktionsenzym-Erkennungsstelle erhaltene Sequenzinformation, welche die Gesamtheit der reifen RNA-Komponenten-Sequenz sowie Transkriptions-Regulationselemente des RNA-Komponenten-Gens umfasst, von dem Lambda-Klon 28-1 ist oben gezeigt.
  • Beispiel 1
  • Herstellung von PCR-amplifizierbarer cDNA
  • RNA wurde aus 293- und IMR-90-Zellen durch Guanidin-Thiocyanat-Extraktion oder aus gereinigten Telomerase-Fraktionen durch Phenol/Chloroform-Extraktionen erhalten. Die Gesamt-RNA aus 293-Zellen wurde auf einem 2%igem Agarosegel der Größe nach fraktioniert, und die RNA mit einer Größe von weniger als 500 bp wurde isoliert.
  • Eine Erststrang-cDNA-Synthese wurde mit SuperscriptTMII-Reverse-Transkriptase durchgeführt, welche von Bethesda Research Laboratories (BRL) erhalten wurde. Etwa 0,5 bis 1,0 μg RNA wurde mit etwa 40 ng statistischem Primer (6mer, pdN6) in Wasser bei einem Gesamtvolumen von 11 μl vermischt. Die Lösung wurde 10 Minuten lang bei 95°C erwärmt und dann auf Eis 5-10 Minuten lang abgekühlt. Die denaturierte Nukleinsäure wurde durch Zentrifugation abgesammelt. Das denaturierte RNA- und Primer-Gemisch wurde dann durch Zugeben, in der gezeigten Reihenfolge, von: 4 μl 5×-Erststrang-Synthesepuffer; 2 μl 0,1 M Dithiothreitol (DTT); 1 μl RNAsin (Pharmacia); und 1 μl dNTP (2,5 mM jeder Stammlösung), resuspendiert. Die Reaktionsmischung wurde bei 42°C 1 Minute lang inkubiert, und dann wurde 1 μl (200 Units) SuperscriptTMII-RTase (BRL) in die Reaktion zugesetzt und vermischt, welche dann 60 Minuten lang bei 42°C inkubiert wurde. Die resultierende Reaktionsmischung, enthaltend die neu synthetisierte cDNA, wurde auf Eis gestellt, bis die Zweitstrang-Synthese durchgeführt wurde.
  • Die Zweitstrang-cDNA-Synthese wurde wie folgend durchgeführt. Etwa 20 μl der Reaktionsmischung aus der Erststrang-cDNA-Synthese-Reaktionsmischung (von oben) wurden, in der gezeigten Reihenfolge, mit den folgenden Komponenten vermischt: 111,1 μl Wasser; 16 μl 10 × E. coli-DNA-Ligase-Puffer; 3 μl dNTP (2,5 mM jeder Stammlösung); 1,5 μl E. coli-DNA-Ligase (15 Units von BRL); 7,7 μl E. coli-DNA-Polymerase (40 Units, von Pharmacia); und 0,7 μl E. coli-RNase H (BRL). Die resultierende Lösung wurde vorsichtig vermischt und 2 Stunden lang bei 16°C inkubiert, zu welcher Zeit 1 μl (10 Units) T4-DNA-Polymerase in das Reaktionsröhrchen zugesetzt wurde, und die Inkubation wurde 5 Minuten lang bei der gleichen Temperatur (16°C) fortgesetzt. Die Reaktion wurde angehalten, und die Nukleinsäure wurde durch zweimaliges Extrahieren der Reaktion mit Phenol/Chloroform, Fällen der Nukleinsäure mit Ethanol und Zentrifugieren der Reaktionsmischung zur Pelletierung der Nukleinsäure abgesammelt.
  • Das durch Zentrifugation abgesammelte cDNA-Pellet wurde in 20 μl TE-Puffer resuspendiert und an ein doppelsträngiges, als "NotAB" bezeichnetes Oligonukleotid ligiert, aufgebaut aus zwei Oligonukleotiden (NH2 ist eine Amino-Blocking-Gruppe):
    Figure 00660001
  • Das doppelsträngige Oligonukleotid wurde durch Mischen von 50 μl NotA-Oligonukleotid (100 pmol) mit 50 μl NotB-Oligonukleotid (100 pmol) in 46,25 μl Wasser, Erwärmen der resultierenden Lösung während 5 Minuten bei 95°C und Zugeben von 3,75 μl 20 × SSC-Puffer, während die Lösung noch heiß war, hergestellt. Das Röhrchen, welches die Mischung enthielt, wurde dann in ein Becherglas gebracht, enthaltend heißes Wasser (bei einer Temperatur von etwa 70 bis 75°C), dessen Temperatur langsam auf unter 15°C sinken gelassen wurde, so dass die zwei Oligonukleotide unter Bildung des doppelsträngigen Oligonukleotides NotAB hybridisieren konnten. Die resultierende Nukleinsäure wurde durch Präzipitation und Zentrifugation aufgefangen.
  • Das doppelsträngige NotAB-Oligonukleotid wurde in etwa 30 μl TE-Puffer resuspendiert und dann an die cDNA in einer Reaktionsmischung, enthaltend 10 μl der obenstehend beschriebenen cDNA-Präparation, etwa 50 pmol (berechnet durch OD260) NotAB; 2 μl 10 × T4-DNA-Ligase-Puffer; 1,2 μl T4-DNA-Ligase; 0,2 μl 10 mM ATP; und Wasser in einem Gesamtvolumen von 20 μl, durch Inkubieren der Reaktionsmischung bei 16°C über Nacht ligiert. Die Reaktion wurde dann durch Erwärmen der Reaktionsmischung während 10 Minuten bei 65°C hitzeinaktiviert. Etwa 1 bis 2 μl der resultierenden Mischung wurden typischerweise für eine PCR-Amplifizierung verwendet; man kann die Ligationsmischung während 10 bis 15 Zyklen (94°C, 45 Sekunden; 60°C, 45 Sekunden; und 72°C, 1,5 Minuten) amplifizieren und als Stammlösung aufbewahren, wie beschrieben in Beispiel 2.
  • Beispiel 2
  • PCR-Amplifizierung von cDNA
  • Die cDNA wurde routinemäßig durch Herstellen einer Amplifikations-Reaktionsmischung amplifiziert, welche aus 5 μl 10 × PCR-Puffer (500 mM KCl; 100 mM Tris, pH = 8,3; und 20 mM MgCl2; 5-8 μl dNTP (jeweils 2,5 mM); 1 μl Taq-Polymerase (Boehringer-Mannheim); 0,1 μl Gen-32-Protein (Boehringer-Mannheim); 6 μl NotB-Primer (20 μM Stammlösung); 2 μl der cDNA (hergestellt wie beschrieben in Beispiel 1) und Wasser zu 50 μl bestand. Diese Mischung wurde dann mit 50 bis 100 μl Mineralöl überschichtet, und eine PCR- Amplifizierung wurde während 10 bis 15 Zyklen von 94°C, 45 Sekunden; 60°C, 45 Sekunden; und 72°C 1,5 Minuten durchgeführt. Nach der Amplifikation wurde die Reaktionsmischung mit Phenol/Chloroform extrahiert, und die amplifizierte Nukleinsäure wurde mit Ethanol präzipitiert und durch Zentrifugation abgesammelt. Das Präzipitat wurde dann in 100 μl TE-Puffer gelöst, um eine Stammlösung herzustellen.
  • Beispiel 3
  • PCR-Amplifizierung zur subtraktiven Hybridisierung und zyklischen Selektion
  • Um PCR-Produkt sowohl für subtraktive Hybridisierung als auch zyklische Selektion herzustellen, wurde etwa 1 μl einer Stammlösung, hergestellt wie beschrieben in Beispiel 2, in 50 μl PCR-Reaktionsmischung, hergestellt wie beschrieben in Beispiel 2, amplifiziert, außer dass 21-24 Zyklen von Primer-Annealing, Verlängerung und Denaturierung des Produkts ausgeführt wurden. Nach der Amplifizierung wurden Reaktionsmischungen mit Phenol/Chloroform extrahiert, mit Ethanol präzipitiert und durch Zentrifugation abgesammelt. Die Produktausbeute wurde durch Färbung mit Ethidiumbromid nach Agarose-Gelelektrophorese eines kleinen Aliquots der Reaktionsmischung abgeschätzt. Für die Subtraktionshybridisierung wurde eine cDNA-Bibliothek aus Telomerase-negativen Zellen (IMR-90) in Gegenwart von biotinyliertem dUTP amplifiziert. Ein Verhältnis von ungefähr 100 zu 1 von cDNA aus Telomerase-negativen Zellen (IMR-90) zu cDNA aus Telomerase-positiven Zellen (293) wurde angewandt, um die Subtraktionshybridisierung durchzuführen. Standardbedingungen wurden bei 65°C während 48-72 Stunden angewandt. Typischerweise wurden etwa 2 μg des Nukleinsäureprodukts aus partiell gereinigter cDNA und negativ-selektiertem Material für mindestens zwei Runden der zyklischen Selektion eingesetzt.
  • Nach der zyklischen Selektion, die in Beispiel 4 beschrieben wird, wurden etwa 1 bis 2 μl der selektierten "pull-down"-Produkte (heraus aus einem Gesamtvolumen von 20 μl) mittels PCR, wie beschrieben in Beispiel 2, während 22 Zyklen amplifiziert, mit Ethanol gefällt und durch Zentrifugation abgesammelt, und zwar in Vorbereitung für eine weitere zyklische Selektion.
  • Beispiel 4
  • Positiv-Selektion von PCR-amplifizierter cDNA
  • Für den Positivselektions-Schritt des zyklischen Selektionsverfahrens, welches zur Klonierung der RNA-Komponente von menschlicher Telomerase angewandt wurde, wurden etwa 2 μg der PCR-amplifizierten cDNA in 25 μl TE-Puffer verdünnt und dann mit 1,25 μl 20 × SSC gemischt, und die resultierende Lösung wurde 3 Minuten lang auf 95°C erwärmt.
  • Die Temperatur wurde 5 Minuten lang bis 60°C erniedrigt, und ein μl (0,1 μg/μl) der biotinylierten R2- oder R4-Sonde wurde zugesetzt. Die Sequenzen dieser Sonden sind nachstehend gezeigt. Die Sonden sind O-Methyl-RNA-Sonden, und so steht U für O-Methyl-Uridin, A ist O-Methyl-Riboadenin, G ist O-Methyl-Riboguanin, und I ist Inosin.
  • Figure 00680001
  • Die R2-Sonde ist spezifisch für die Telomer-Wiederholungseinheit, und die R4-Sonde ist spezifisch für RNase P, welche verwendet wurde, um die Effektivität und Effizienz des zyklischen Selektionsverfahrens zu verfolgen. Durch Ausführen einer zyklischen Selektion gleichzeitig, aber separat, für RNase-P-RNA, ein Molekül von bekannter Sequenz, kann man ein größeres Vertrauen haben, dass das zyklische Selektionsverfahren in Hinsicht auf das Molekül von Interesse, in diesem Falle die RNA-Komponente von menschlicher Telomerase, richtig funktioniert.
  • Nachdem entweder die R2- oder R4-Sonde zu der Mischung bei 65°C zugesetzt wurde, wurde die Temperatur der Hybridisierungs-Reaktionsmischung auf 30°C durch Inkubieren der Mischung bei dieser Temperatur während 5 Minuten gesenkt, und dann wurden die Reaktionsmischungen ferner auf eine Temperatur von 14°C durch Inkubieren bei dieser Temperatur während 60 Minuten abgesenkt. Schließlich wurde die Mischung 2-12 Stunden lang bei 4 °C inkubiert.
  • Die gesamte Hybridisierungs-Reaktionsmischung für jede Probe (R2 oder R4) wurde zu 400 μl 0,5 × SSC bei 4°C zugesetzt und dann in ein Röhrchen mit eiskalten magnetischen Kügelchen zugegeben, welche von Promega bezogen und viermal mit 0,5 × SSC vor der Verwendung vorgewaschen worden waren. Die resultierende Mischung wurde 30 Minuten lang bei 4°C inkubiert, um eine vollständige Bindung an die magnetischen Kügelchen zu gewährleisten. Jedes Reaktionsröhrchen wurde dann kurz bei Raumtemperatur auf dem magnetischen Gestell (Promega) inkubiert, um die Kügelchen hinabzuziehen. Die Kügelchen wurden in kaltem 0,5 × SSC (600 μl) resuspendiert und (in einem Röhrchen) auf Eis gestellt. Die Proben wurden drei weitere Male mit 0,5 × SSC auf diese Weise gewaschen. Nukleinsäure wurde von den Kügelchen eluiert, indem die Kügelchen in 100 μl Wasser resuspendiert und 2 Minuten lang bei 65°C inkubiert wurden, bevor die Kügelchen zum Absammeln zurück auf das magnetische Gestell gebracht wurden. Dieses Vorgehen wurde drei weitere Male wiederholt; beim letzten Mal wurden die resuspendierten Kügelchen 5 Minuten lang bei 65°C inkubiert, bevor die Kügelchen zum Absammeln auf das magnetische Gestell gebracht wurden. Alle der 100-μl-Überstände (für jede Probe) wurden vereinigt und in einer SpeedVacTM-Zentrifuge auf 20 μl eingetrocknet. Die aufgereinigte DNA wurde dann während einer weiteren Runde aus Amplifizierung und Selektion PCR-amplifiziert. Nach jeder Amplifikation wurden die PCR-Produkte zweimal mit Phenol/Chloroform extrahiert, mit Ethanol gefällt und in 20 μl TE-Puffer resuspendiert.
  • Typischerweise wurden die PCR-Amplifikationen mittels Agarose-Gelelektrophorese überprüft. Darüber hinaus wurde eine Vielzahl von Kontrollen verwendet, um das zyklische Selektionsverfahren zu verfolgen. Als eine Kontrolle wurden PCR-"Arme" (Oligonukleotide von definierter Sequenz, welche als Primer-Hybridisierungsstellen dienen) auf eine Nukleinsäure gebracht, welche ein Neomycinresistenz-vermittelndes Gen umfasste. Die resultierende Nukleinsäure wurde mit der PCR-amplifizierten cDNA gemischt und bei jeder Selektion durch quantitative PCR überwacht. Als eine andere Kontrolle wurde RNase P sowohl in den hinsichtlich RNase P selektierten als auch den hinsichtlich der Telomerase-RNA-Komponente selektierten Bibliotheken verfolgt.
  • Beispiel 5
  • RT-PCR-Protokoll
  • Die Erststrang-cDNA wurde in wesentlicher Übereinstimmung mit dem in Beispiel 1 beschriebenem Vorgehen hergestellt. Grundsätzlich wurde RNA aus jeder Telomerase-Fraktion, enthaltend 0,1 bis 1 μg RNA, gereinigt; typischerweise wurde ein Drittel bis ein Fünftel der RNA, welche aus einer 300-μl-Fraktion hergestellt wurde, eingesetzt. Die RNA wurde mit 40 bis 80 ng statistischem Hexamer in 10 μl vermischt, 10 Minuten lang bei 95°C (unter Verwendung eines Thermozykler-Instruments) denaturiert und auf Eis gekühlt. Die denaturierte RNA und das 6-mer wurden zu der Reaktionsmischung, enthaltend 4 μl an 5 × Erststrang-Synthesepuffer, welcher vom Hersteller der reversen Transkriptase geliefert wurde (RTase, bezogen von BRL), 2 μl 0,1 M DTT, 1 μl 10 mM dNTP (jeweils), 1 μl RNase-Inhibitor (Pharmacia) und Wasser zu einem Gesamtvolumen von 9 μl, zugesetzt. Die vereinigte Mischung wurde in ein Wasserbad von 42°C eingebracht. Nach 1-2 Minuten Inkubation wurde 1 μl SuperscriptTMII-RTase (BRL) zu der Mischung zugesetzt. Die Inkubation wurde 60 Minuten lang bei 42°C fortgesetzt. Die Reaktion wurde durch Erwärmen des Röhrchens während 10 Minuten bei 95-98°C gestoppt. Die Erststrang-cDNA wurde durch kurze Zentrifugation abgesammelt, in neue Röhrchen aliquotiert, rasch auf Trockeneis eingefroren und bei –80°C aufbewahrt oder unverzüglich verwendet.
  • Beispiel 6
  • PCR-Amplifizierung von cDNA mit einem spezifischem Primersatz
  • Für ein 20 μl große PCR-Reaktion mit radioaktiv markierten Nukleotiden wurde 1 μl der gemäß des Vorgehens von Beispiel 5 hergestellten cDNA mit 20 pmol Primer 1, 20 pmol Primer 2, 2,5 μl 2,5 mM dNTP, 5 μCi alpha-32P-dATP, 2 Units Taq-Polymerase (Boehringer-Mannheim), 0,2 μg T4-Gen32-Protein (Boehringer-Mannheim), 2 μl 10×-Puffer (500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl-pH8,3 und 20 mM MgCl2), und Wasser zu einem Gesamtvolumen von 20 μl vermischt. Ein Tropfen Mineralöl wurde dann in das Röhrchen zugegeben.
  • Die PCR-Amplifikationsbedingungen für den Telomerase-RNA-Komponenten-Klon waren: 94°C während 45 Sekunden, 60°C während 45 Sekunden, 72°C während 1,5 Minuten. Die Anzahl von Zyklen unterschied sich in Abhängigkeit vom Typ der gereinigten Materialien, welche für die RNA-Präparation verwendet wurden, lag aber typischerweise im Bereich von 18 bis 25 Zyklen. Wie bei allen quantitativen RT-PCR, wurden mehrere Reaktionen mit unterschiedlichen Zyklen für jede Probe durchgeführt, um zu bestimmen, wann die PCR-Amplifizierung gesättigt und nicht-linear wurde.
  • Für die als Kontrolle verwendete RNase P waren die PCR-Amplifikationsbedingungen die folgenden: 94°C während 45 Sekunden, 50°C während 45 Sekunden und 72°C während 1,5 Minuten. Wiederum lag die Zahl an Zyklen im Bereich von 15 bis 22 Zyklen, abhängig von der Natur der Proben. Die Sequenzen der für die RNase-P-Amplifizierung verwendeten Primer sind nachstehend gezeigt:
    Figure 00700001
  • Das mit diesen zwei Primern erhaltene PCR-Produkt weist eine Größe von etwa 110 bp auf.
  • Nach der PCR wurden die Produkte (5 bis 10 μl der Reaktionsmischung) auf ein 6%iges natives Polyacrylamidgel geladen und elektrophoretisch behandelt. Nach der Elektrophorese wurde das Gel getrocknet und zur Analyse an eine PhosphorImagerTM-Kassette oder an Autoradiographie-Film exponiert.
  • Beispiel 7
  • Klonierung des Gens für die RNA-Komponente von menschlicher Telomerase
  • Die zum Klonieren des Gens für die RNA-Komponente von menschlicher Telomerase angewandten Vorgehensweisen wurden durchgeführt, wie allgemein beschrieben in Maniatis et al., Laboratory Molecular Cloning Manual. Eine genomische DNA-Bibliothek von DNA aus der menschlichen Lungen-Fibroblasten-Zelllinie WI-38, inseriert in den Phagen Lambda-Vektor FIXII, wurde von Stratagene erworben. Die Phagen wurden bei einer Konzentration von etwa 25000 Plaques je Platte auf drei Sätze von 15 Platten (150 mm) ausplatiert. Die Platten wurden mit NZY-Agar und NZY-Top-Agarose hergestellt; die für die Phagen-Transformation verwendeten Zellen waren XL1BlueMRAP2-Zellen; und die Transformanten wurden über Nacht etwa 16 Stunden lang bei 37°C wachsen gelassen. Die Platten wurden dann bei 4 °C während etwa einer Stunde gekühlt, und dann wurden die Plaques auf C/P-Nylon-Kreise (Filterpapier von Bio Rad) "abgestempelt". Dieses Vorgehen wurde wiederholt, um einen Duplikat-Satz von abgestempelten Filtern herzustellen. Die Filter (in zweifacher Ausfertigung) wurden denaturiert, neutralisiert, in 6 × SSC-Puffer äquilibriert, an UV-Strahlung exponiert, um die Nukleinsäure an den Filter zu vernetzen, und dann auf Blotter-Papier getrocknet.
  • Eine Prähybridisierung wurde eine Stunde lang bei 37°C in 50%-Formamid-Puffer durchgeführt. Die Filter wurden mit einem ~218 bp großen, radioaktiv markierten NotI-Fragment aus Klon-pGRN7 sondiert, welches mittels Elektroelution aus einem 5%igem Polyacrylamidgel nach Trennung durch Elektrophorese isoliert und dann mit Alpha-32P-dCTP unter Verwendung eines Nick-Translations-Kits von Boehringer-Mannheim Biochemicals gemäß den Anweisungen des Herstellers nick-translatiert worden war. Etwa 25 ng (~10 μCi Markierung) der Sonde wurden pro Filter verwendet, und die Hybridisierung wurde über Nacht bei 37°C in 50%igem Formamid-Hybridisierungspuffer durchgeführt. Nach der Hybridisierung wurden die Filter bei Raumtemperatur sechsmal gewaschen; die ersten drei Waschungen erfolgten mit 6 × SSC, enthaltend 0,1 % SDS, und die letzten drei Waschungen erfolgten mit 6 × SSC allein. Nach einer anfänglichen Exposition von mehreren Duplikat-Filtern in einer PhorsphorImagerTM-Kassette zur Überprüfung der Hybridisierungseffizienz und Signalstärke wurden die Filter bei 65°C in 0,5 × SSC gewaschen. Die Filter wurden dann unter Verwendung von zwei Verstärkerfolien unter Kodak XARS-Film gelegt, und man ließ sie den Film etwa 100 Stunden lang bei –70°C belichteten.
  • Ein starkes Signal ging von dem Filter aus, welcher einen Phagen enthielt, der später als 28-1 bezeichnet wurde, welcher das Gen für die RNA-Komponente von menschlicher Telomerase umfasst. Der Plaque, entsprechend dem auf dem Filter beobachteten Signal, wurde zur Herstellung von sekundären Platten verwendet, so dass ein isolierter Plaque (bestätigt durch Sondieren mit markierter pGRN7-Nukleinsäure) zur Isolierung der Phagen-DNA im Großmaßstab kultiviert werden konnte. Der Phage 28-1 erhältlich von der American Type Culture Collection unter der Zugangs-Nr. 75925, umfasst ein ~15 kb großes Insert und umfasst mehrere Restriktionsfragmente, welche Sequenzen enthalten, die mit RNA-Komponenten-Sequenzen auf pGRN7 hybridisieren: ein 4,2 kb großes EcoRI-Restriktionsenzym-Fragment; ein 4,2 kb großes ClaI-Restriktionsenzym-Fragment und ein 2,5 kb großes HindIII-SacI-Restriktionsenzym-Fragment. Das letztgenannte Fragment umfasst die gesamte ~560 Nukleotide große Sequenz der RNA-Komponente, welche obenstehend gezeigt wird, und umfasst angenommenermaßen das vollständige Gen für die RNA-Komponente. Das Plasmid, welches das 2,5 kb große HindIII-SacI-Restriktionsenzym-Fragment in dem pBluescript-Vektor umfasst, wurde als Plasmid pGRN33 bezeichnet und ist von der American Type Culture Collection unter der Zugangs-Nr. ATCC 75926 erhältlich. In dem Ausmaß, zu welchem das menschliche Gen andere Sequenzen als diejenigen auf dem 2,5-kb-Fragment umfassen kann, können diese Sequenzen aus dem Phagen 28-1 oder aus anderen Phagen-Klonen isoliert werden, welche durch Sondieren mit dem 2,5-kb-Fragment (oder einer anderen Sonde der Erfindung) identifiziert werden. Die obenstehend angegebenen Restriktionsenzym-Fragmente wurden in getrennten Restriktionsenzym-Verdaus hergestellt; die Produkte der Verdaus wurden durch Elektrophorese auf einem 0,7%igen Agarosegel oder, nur für das ~2,5-kb-Fragment, einem 3%igem Polyacrylamidgel getrennt; und die gewünschten Banden wurden aus dem Gel geschnitten und für die Subklonierung entweder unter Verwendung des GeneCleanTM-Kit II (von Bio101, Inc.) oder durch Elektroelution in Spectropor #2-Dialyse-Schlauch in 0,1 × TBE bei 100 V während zwei Stunden (nur für das ~2,5-kb-Fragment) präpariert.
  • Diese Restriktionsenzym-Fragmente wurden in E. coli-Expressions/Mutagenese-Plasmide subkloniert, welche aus pUC-basierenden Plasmiden oder aus pBluesriptII-Plasmiden abgeleitet wurden, die auch einen SV40-Replikationsursprung (aber keine SV40-Promotor-Aktivität) umfassen. Die resultierenden Plasmide können verwendet werden, um veränderte (mutierte) RNA-Komponenten-Nukleinsäuren für die Einbringung in menschliche oder andere eukaryotische Zellen für eine Vielzahl von Zwecken herzustellen, wie obenstehend in der Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen beschrieben wurde.
  • Beispiel 8
  • Antisense-Plasmide für die RNA-Komponente von menschlicher Telomerase
  • Antisense-Expressionsplasmide wurden durch PCR-Amplifizierung von RNA-Komponenten-cDNA unter Verwendung der folgenden Primersätze hergestellt: (1) NotB und G1, welcher eine Antisense-Nukleinsäure herstellt, die kleiner als das cDNA-Insert in dem Plasmid ist; und (2) NotB und R3C, welcher eine (im Verhältnis zum Insert im Plasmid) Volllängen-Antisense-Nukleinsäure herstellt. Die Nukleotidsequenz von NotB ist in Beispiel 1 obenstehend gezeigt; die Nukleotidsequenzen der Primer G1 und R3C werden nachstehend gezeigt.
  • Figure 00730001
  • Nach der PCR-Amplifizierung wurden die amplifizierten Fragmente in ein ~10 kb großes Expressionsplasmid an einer PmlI-Stelle kloniert; das Plasmid umfasst Puromycinresistenzvermittelnde, DHFR- und Hygromycin-B-Resistenz-vermittelnde Gene als selektierbare Marker, den SV40-Replikationsursprung; den induzierbaren menschlichen Metallothionein-Gen-Promotor, welcher für eine Expression des Antisinn-Strangs des Gens für die RNA-Komponente von menschlicher Telomerase positioniert ist (man könnte auch einen stärkeren Promotor verwenden, um höhere Expressionsspiegel zu erhalten), und die SV40-"late"-Poly-A-Anfügungsstelle.
  • Die resultierenden Plasmide (bezeichnet als pGRN42 für das NotB/G1-Produkt, und pGRN45 für das NotB/R3C-Produkt) wurden mittels des Calciumphosphat-Vorgehens (siehe Maniatis et al., siehe oben) in die Fibrosarkom-Zelllinie HT1080 transfiziert. HT1080-Zellen sind normalerweise unsterblich; die Expression der Antisense-RNA für die RNA-Komponente von menschlicher Telomerase sollte die RNA-Komponente von menschlicher Telomerase von der Assoziierung mit den Proteinkomponenten abhalten, wodurch die Bildung aktiver Telomerase blockiert wird und die Zellen sterblich gemacht werden.
  • Beispiel 9
  • Identifizierung und Isolierung von RNA-Komponenten-Nukleinsäuren aus nicht-menschlichen Säugetieren
  • Um zu veranschaulichen, wie die Reagenzien der Erfindung angewandt werden können, um im Wesentlichen homologe Nukleinsäuren aus anderen Säugetierarten zu identifizieren und zu isolieren, wurden zu menschlichen RNA-Komponenten-Sequenzen komplementäre PCR- Primer verwendet, um homologe Sequenzen in einer PCR zu amplifizieren. Ein veranschaulichendes Primerpaar, verwendet zur Demonstration dieses Aspekts der Erfindung, besteht aus dem Primer +10, welcher die Sequenz 5'-CACCGGGTTGCGGAGGGAGG-3' aufweist, und dem Primer R7, welcher die Sequenz 5'-GGAGGGGCGAACGGGCCAGCA-3' aufweist. Genomische DNA wurde aus Schimpansen-, Totenkopfäffchen-, Rhesusaffen- und Pavian-Gewebe hergestellt und in TE-Puffer bei einer Konzentration von etwa 0,5-4 mg/ml gelöst.
  • Für jeden Gewebetyp wurde eine PCR-Mischung hergestellt, wobei die Mischung folgendes umfasste: 1 μl genomische DNA, 48 μl Master-Mix (Master-Mix ist zusammengesetzt aus 1 × TagExtenderTM-Puffer von Stratagene, 200 μM jedes dNTP und 0,5 μM jedes Primers) und 0,5 μl einer 1:1-Mischung von Taq-Polymerase (5 Units/μl, Boehringer-Mannheim) Tth-Polymerase (TagExtenderTM-Polymerase von Stratagene). Die Reaktionsröhrchen wurden in einen Thermozykler eingebracht, der programmiert war, um die Reaktionsmischung zuerst 5 Minuten lang bei 94°C zu erwärmen und dann 27 Zyklen an Inkubationen bei 94°C während 30 Sekunden, 63°C während 10 Sekunden und 72°C während 45 Sekunden zu vollführen. Nachdem die Amplifikationsreaktion vollständig war, wurden etwa 10 μl jeder Reaktionsmischung auf ein 2%iges Agarosegel für eine Elektrophorese geladen. Nach der Elektrophorese, Färbung des Gels und UV-Bestrahlung konnte man beobachten, dass jede Reaktionsmischung eine Bande der vorhergesagten (~200 bp) Größe enthielt. Nukleinsäuren aus diesen Banden können kloniert und sequenziert werden, und der Rest der RNA-Komponenten-Gene aus jeder dieser Säugetier-Spezies kann kloniert werden, wie oben stehend beschrieben für das Gen für die RNA-Komponente von menschlicher Telomerase. Das untenstehende Beispiel 14 beschreibt ein spezifisches Beispiel für Totenkopfäffchen-Telomerase-RNA-Komponenten-Gen-Sequenzierung.
  • Beispiel 10
  • Mutierte Sense-Human-Telomerase-RNA-Komponenten-Sequenzen
  • Dieses Beispiel demonstriert, dass die Änderung der Telomerase-RNA-Komponenten-Sequenz an der Matrizen-Region die von menschlicher Telomerase synthetisierte Sequenz verändert, was zu Änderungen in den chromosomalen Telomerase-Wiederholungseinheiten führt.
  • Um zu bestimmen, ob eine Re-Programmierung der TRC3-Matrizen-Region zu entsprechenden Veränderungen in der Telomer-Wiederholungseinheit, welche bei menschlicher Telomeraseaktivität synthetisiert wird, führen würde, wurde ein Genfragment, welches die gesamte Telomerase-RNA-Komponente(TRC3)-Gensequenz exprimiert, kloniert und mutagenisiert. Eine Southern-Blot-Analyse zeigte, dass TRC3 an ein Einzelkopie-Gen im menschlichen Genom hybridisierte. Eine genomische Kopie von TRC3 wurde aus einer Lambda-Phagen-Bibliothek isoliert, und von ihr wurde gezeigt, dieselbe Restriktionskarte aufzuweisen, wie diejenige, welche auf genomischen Southern-Blots, welche mit TRC3 sondiert worden waren, beobachtet wurde. Ein 2,6 kb großes HindIII-SacI-Fragment wurde isoliert und in eine modifizierte Version von pBluescript subkloniert, wodurch das genomische TRC3-Plasmid pGRN33 erzeugt wurde. Die 5'- und 3'-Enden der RNA wurden unter Verwendung von Primer-Verlängerung, RACE-PCR und RT-PCR kartiert. Die Größe des RNA-Transkripts belief sich auf ≈ 550 Basen, was konsistent mit seiner Migration auf Northern-Blots war. Die transkribierte Region für TRC3 lag zentral im genomischen Klon mit 1,4 kb an stromaufwärts gelegener Sequenz.
  • RNA wurde aus gereinigten Telomerase-Präparationen extrahiert und wurde dann in den folgenden Experimenten verwendet. 5'-RACE: Erststrang-cDNA wurde unter Verwendung von Antisense-TRC3-Primern (R3B: 5'-CAACGAACGGCCA GCAGCTGACATT) in Gegenwart von 32P-dATP hergestellt. Verlängerungsprodukte wurden mittels PAGE aufgelöst und wurden mittels Autoradiographie identifiziert, herausgeschnitten und extrahiert. Ein Oligonukleotid (NotA: 5'-pATAGCGGCCGCTT GCCTTCA-NH2) wurde an diese Erststrang-Produkte unter Verwendung von T4-RNA-Ligase ligiert, und dann wurde eine PCR unter Verwendung eines verschachtelten Primers, R3C (5'-GTTTGCTCTAGAATGAACGGTGGAAG) und eines Oligonukleotids (NotB: 5'-TGAATTCTTGCGGCCGCTAT), das zu dem NotA-Oligonukleotid komplementär ist, durchgeführt. Die PCR-Produkte wurden auf einem Agarosegel aufgetrennt, und die Banden wurden herausgeschnitten und direkt sequenziert, wobei das Oligonukleotid G1 (5'-AGAAAAACAGCGCGCGGGGAGCAAAGCA) als ein Primer verwendet wurde. 3'-Enden-Kartierung: Versuche zur Durchführung einer 3'-RACE waren erfolglos. Anschließend wurde eine RT-PCR-Strategie angewandt, in welcher eine Reihe von Antisense-Primern, welche komplementär zu der genomischen DNA-Sequenz waren, verwendet wurden, um eine Erststrang-cDNA-Synthese zu primen. Die Primer in dieser Reihe lagen ungefähr in 150 bp-Intervallen auseinander, beginnend vom 5'-Ende des Transkripts und fortschreitend in Richtung auf das 3'-Ende. Danach wurde eine PCR unter Verwendung des Erststrang-Primers und eines Primers, dessen Sequenz intern bezüglich des bekannten TRC3-Transkripts liegt (F3b: 5'-TCTAACCCTAACTGAGAAGGGCGTAG), durchgeführt. Gegenüber reverse Transkriptase empfindliche PCR-Banden der vorhergesagten Größe waren ersichtlich, als cDNA verwendet wurde, hergestellt mit allen Primern, die gegen das Intervall +100 bis +450 (Nummerierung relativ zum 5'-Ende) entworfen waren, aber nicht mit irgendeinem der Primer, die gegen +558 bis +950 entworfen waren. Dies plazierte das vermeintliche 3'-Ende des reifen TRC3-Transkripts zwischen die Position +450 und +558. Anschließende Runden von Primer-Entwerfen und RT-PCR verschmälerten dieses Intervall auf zwischen +545 und +558.
  • Die vorhergesagte Matrizen-Sequenz von TRC3 wurde von CUAACCCUA zu CCAACCCCA (MuC) oder CAAACCCAA (MuA) mittels in vitro-Mutagenese (durchgeführt im wesentlichen gemäß Perez et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 22485) des genomischen Plasmids pGRN33 verändert. Bei Einbau in funktionelle Telomerase sollten diese Mutanten-RNAs als Matrize die Synthese von TTGGGG (MuC) oder TTTGGG (MuA) anstelle der Wildtyp-Wiederholungseinheit TTAGGG bedingen. Diese mutanten Telomerase-Aktivitäten konnten einfach von Wildtyp-Aktivität unterschieden werden, da sie nicht länger dATP für die Aktivität erfordern würden, und nur die Wildtyp-Aktivität empfindlich gegenüber Termination durch ddATP sein sollte. Eine Doppelmutante (MuC+17) wurde ebenfalls hergestellt, in welcher eine 17 bp große Insertion bei +180 bp zusätzlich zu der MuC-Matrize vorhanden war. Diese Mutante gestattete den spezifischen Nachweis der veränderten RNA mit einer Sonde gegen die 17 bp-Insertion oder durch die Größe.
  • Die 2,6 kb der genomischen Sequenz waren ausreichend für eine Expression von TRC3 in vivo. Zellen wurden mit dem MuC+17-Plasmid transient transfiziert, und RNA, welche von der transfizierten DNA exprimiert wurde, wurde mittels RT-PCR unter Verwendung der 17-bp-Insert-Sequenz als dem Primer in dem Reverse-Transkriptions-Schritt detektiert. Die RNA wurde in MuC+17-transfizierten Zellen aber nicht in scheintransfizierten Zellen detektiert, was anzeigt, dass der 2,6 kb große genomische Klon für eine TRC3-Expression ausreichend war. Dann wurden stabile Transformanten von jedem dieser drei Mutanten-Plasmide durch Calciumphosphat-Transfektion von HT1080-Zellen gemeinsam mit pCMVneo abgeleitet. Resistente Klone wurden in G418 selektiert, und die Expression der MuC+17-RNA wurde mittels RT-PCR bestätigt (Irving et al. (1992) Exp. Cell Res. 202: 161).
  • Um hinsichtlich Mutanten-Telomeraseaktivität zu testen, wurden die Extrakte aus nicht-transfizierten Zellen und aus drei stabilen Transformanten mit integrierten MuC*-, MuC- oder MuA-Vektoren (C*, C oder A in 1) geassayt. Da erwartet wurde, dass die Mutanten-Extrakte sowohl Wildtyp- als auch Mutanten-Telomeraseaktivitäten enthalten, wurden verschiedene Assay-Bedingungen angewandt, um zwischen ihnen zu unterscheiden. Unter normalen Reaktionsbedingungen (dTTP, 32P-dGTP und dATP) zeigten alle drei Extrakte aus der Mutanten-Konstrukt-Serie eine Wildtyp-Telomeraseaktivität, welche empfindlich gegenüber RNase war (1, Spuren 1-6). Wie erwartet, blieb diese Aktivität unbeeinflusst, als ddCTP in die Reaktionen eingeschlossen wurde (1, Spuren 7-9), und wurde durch ddTTP eliminiert (Spuren 10-12). Wenn, im Gegensatz dazu, ddATP für dATP substituiert wurde, zeigten die Extrakte C (Spur 14) und A (Spur 15) noch RNase-empfindliche (Spuren 17 und 18) Telomeraseaktivität, wohingegen C* (Spur 13) und Kontrollextrakt diese nicht zeigten. Diese Ergebnisse zeigen, dass die ddATP-resistenten Aktivitäten Telomerase repräsentieren, welche mit MuC- oder MuA-TRC3-RNA umprogrammiert worden war. Im Gegensatz dazu inhibiert die 17-bp-Insertion in C* eine Rekonstitution, was anzeigt, dass die Telomerase-Rekonstitution sehr spezifisch für die TRC3-Sequenz ist.
  • Um zu bestätigen, dass die von der Mutante MuA synthetisierte Sequenz (GGGTTT)n war, modifizierten wir die existierende PCR-Methodik zur Amplifizierung von Telomerase-Wiederholungseinheiten, die auf einen einzigen Telomerase-Primer angefügt werden (Kim et al. (1994) Science 266: 2011). Unter Verwendung synthetischer Primer identifizierten wir Reaktionsbedingungen, bei welchen ein 3'-Primer mit der Sequenz d(CCCAAACCCAAACCCAA) lediglich (TTTGGG)n-Wiederholungseinheiten amplifizieren wird und (TTAGGG)n-enthaltende Wiederholungseinheiten nicht amplifizieren wird.
  • Um zwischen telomeren Wiederholungseinheiten zu unterscheiden, welche von Wildtyp- oder mutierter Telomerase angefügt worden waren, wurde ein Zweistufen-Assay mit einer Strategie zur Beschränkung der Verfügbarkeit von Nukleotiden für die Telomerase-Reaktion kombiniert. Da MuA und MuC telomere Wiederholungseinheit-Sequenzen von (TTTGGG)n bzw. (TTGGGG)n erzeugen werden, wurden Zellextrakte zuerst mit dem TS-Substrat in Gegenwart von lediglich dTTP und dGTP 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, um die Addition von telomeren Wiederholungseinheiten zu gestatten. Restliche Telomeraseaktivität wurde dann durch 5 Minuten langes Kochen der Extrakte zerstört. Telomerase-Produkte mit einer spezifischen DNA-Sequenz wurden dann mittels PCR-Amplifikation unter Verwendung der passenden Rückwärtsprimer und in Gegenwart aller 4 dNTP's und von Spurenmengen an 32P-dCTP wie beschrieben (Kim et al. (1994) op.cit.) detektiert. Um die MuA-Produkte zu detektieren, war der Rückwärtsprimer (ACCCAA)4, und die PCR-Bedingungen waren 94°C, 10 Sekunden, 60°C, 30 Sekunden und 72°C, 30 Sekunden während 20 Zyklen. Um die MuC-Produkte zu detektieren, wurden drei Rückwärtsprimer verwendet: (CCCCAA)3, (CCAACC)3 bzw. (CCAACC)3, welche PCR-Produkte mit den entsprechenden Mobilitäts-Shifts bzw. -Verschiebungen ergaben, konsistent mit der erwarteten Position des Annealings an die Telomerase-Produkte. Die verwendeten PCR-Bedingungen waren die gleichen wie oben, außer dass die Annealing- bzw. Anlagerungstemperatur 50°C betrug. Unter denselben Bedingungen wurden keine Telomerase-Produkte aus Extrakten von Parental-Zellen oder Zellen, welche mit dem Wildtyp-TRC-3-Gen transfiziert waren, erzeugt. In Tests der Spezifität unserer PCR-Amplifikationsbedingungen erzeugten synthetische Oligonukleotide, enthaltend (TTTGGG)n und (TTGGGG)n, die ungefähren 6-nt-Leiter-PCR-Produkte mit (ACCCAA)4 bzw. (CCCCAA)3-Rückwärtsprimer, wohingegen (TTAGGG)n-Oligonukleotide keinerlei PCR-Produkte mit dem (ACCCAA)4- oder (CCCCAA)3-Rückwärtsprimer erzeugten.
  • Unter Anwendung dieser Bedingungen erzeugten Extrakte aus MuA- aber nicht aus MuC- oder Wiltyp-Zellen Produkte in dem modifizierten Telomerase-Assay, was anzeigt, dass Telomerase aus MuA-enthaltenden Zellen (TTTGGG)n-Wiederholungseinheiten erzeugte. Ähnliche Verfahren wurden angewandt, um die MuC-Mutante zu analysieren, welche (TTGGGG)n-Wiederholungseinheiten synthetisierte. Zusammengenommen liefern die obenstehenden Daten einen starken Beweis, dass das TRC3-Gen die RNA-Komponente von menschlicher Telomerase codiert, und daher haben wir TRC3 in hTR, für humane Telomerase-RNA, umbenannt.
  • Beispiel 11
  • Telomerase-RNA-Komponente in sterblichen und unsterblichen Zellen
  • Die meisten Krebszellen exprimieren hohe Spiegel an Telomeraseaktivität, wohingegen in den meisten normalen somatischen menschlichen Zellen Telomerase nicht nachgewiesen wird (Kim et al., (1994) op.cit). Um zu bestimmen, ob Telomerase-RNA-Komponenten-Spiegel in unsterblichen Krebszelllinien erhöht sind, wurden Telomerase-RNA-Komponenten- und GAPDH-Transkriptspiegel unter Verwendung von RT-PCR in fünf sterblichen Primärzellstämmen, welchen detektierbare Telomeraseaktivität fehlte, und in fünf unsterblichen Krebszelllinien mit hohen Spiegeln an Telomeraseaktivität analysiert. Die Grundzustands-Spiegel von Telomerase-RNA-Komponenten-Transkripten waren 3- bis 12-fach höher in den Tumorzelllinien als in primären Zellen, wenn mit den Spiegeln von GAPDH verglichen wurde (2A). Während Telomerase-RNA-Komponenten-Spiegel in den unsterblichen Krebszellen, welche hohe Spiegel an Telomerase exprimierten, erhöht waren, ist es interessant, dass niedrige aber ohne Weiteres nachweisbare Spiegel an Telomerase-RNA-Komponente auch in sterblichen primären Zellen ohne nachweisbare Telomeraseaktivität vorhanden waren (Spuren 1-5).
  • Die Telomerase-RNA-Komponenten-Spiegel wurden auch in einer Vielzahl von normalen menschlichen Geweben mittels Northern-Blot-Analyse untersucht. Hoden und Eierstock wiesen die höchsten Spiegel an Telomerase-RNA-Komponente auf, was erwartet worden war, da diese Gewebe hohe Spiegel an Telomeraseaktivität exprimieren. Allerdings exprimierte auch eine Reihe anderer Gewebe Telomerase-RNA-Komponente (2B und 2C). Diese schließen normale Niere, Prostata und adulte Leber ein, welchen allen nachweisbare Spiegel an Telomeraseaktivität fehlen. Diese Ergebnisse bestätigen die Daten aus Zelllinien (2A) und legen nahe, dass Telomerase-RNA in einer Anzahl von menschlichen Geweben vorhanden aber inaktiv sein kann. Ähnliche gewebespezifische Unterschiede in der RNA-Expression werden in Maus-Geweben beobachtet; allerdings sind viele normale Maus-Gewebe positiv hinsichtlich Telomeraseaktivität. Die offensichtliche erhöhte Repression von Telomeraseaktivität in menschlichen Zellen kann bei der Erklärung helfen, warum Maus-Zellen in Kultur spontan unsterblich werden, wohingegen dies bei menschlichen Zellen nicht der Fall ist.
  • Beispiel 12
  • Expression von Antisense-hTR (humane-Telomerase-RNA-Komponente)-Transkripten in HeLa-Zellen führt zu Zell-Krisis und Zelltod
  • Um die Funktion von Telomerase in einer immortalisierten Zelle zu untersuchen, wurden Antisense-hTR-Expressionskonstrukte in HeLa-Zellen eingebracht. Ein 200 bp großes EcoRI-DNA-Fragment, enthaltend 1 bis 193 bp eines humanen Telomerase-RNA-Komponenten-cDNA-Klons, TRC3, wurde in die EcoRI-Stelle von p10-3 bzw. pBBS212 inseriert, um die Plasmide p10-3-hTR und pBBBhTR zu erzeugen. Das Plasmid p10-3hTR exprimiert den Antisinn von Telomerase-RNA-Komponente unter der transkriptionellen Steuerung des Tetracyclin-regulierten CMV-Minimal-Promotors relativ zu den fünf Tet-Operatoren stromaufwärts in zwei unterschiedlichen Orientierungen, wie beschrieben (Gossen et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89: 5547). Das Plasmid pBBS-hTR exprimiert den Antisinn von hTR unter der Steuerung des MPSV-Promotors (Lin et al. (1994) Gene 147: 287). Parallel dazu wurden auch Kontrollexpressionsvektoren, ohne die Antisense-hTR codierende Sequenz, in HeLa-Zellen per Elektroporation eingeführt. Klone, welche Antisense- oder Kontrollplasmide enthielten, wurden in drei getrennten Experimenten selektiert. Anfänglich wuchsen die 41 Kulturen, welche Antisense-hTR exprimierten, identisch zu Zellen mit dem Kontrollvektor. Allerdings erlitten, bei 23 bis 26 Populations-Verdopplungs-Stufen (PDL) nach der Transfektion, 33 von 41 Antisense-exprimierenden Kulturen eine Krisis (Tabelle I). Die Zellkrisis in diesen Kulturen war von einer merklichen Hemmung des Zellwachstums von 20 bis 26 PD gekennzeichnet, gefolgt von der Abrundung und Ablösung von Zellen von der Platte über eine Dauer von einer Woche. In 28 von 33 Fällen, in denen die Zellen eine Krisis durchliefen, wurden seltene (< 1 %) Revertanten-Kolonien innerhalb von drei Wochen beobachtet, nachdem die meisten der Zellen gestorben waren. Die Revertanten-Zellen können Varianten repräsentieren, welche dem inhibierenden Effekt des Antisense-hTR-Konstrukts entfliehen. Im Gegensatz zu den Antisense-Klonen wies keine der Vektor- Kontrollzelllinien irgendeine Änderung hinsichtlich Wachstum oder Sterblichkeit über 50 Verdopplungen hinweg auf.
  • Tabelle I
  • Antisense-hTR führt zu kürzeren mittleren TRF und Zell-Krisis
  • Drei unabhängige Experimente wurden ausgeführt, in welchen HeTe7-Zellen (HeLa-Zellen, welche hohe Spiegel des chimären Tetracyclinrepressor-VP16-Proteins exprimieren) durch Elektroporation transfiziert wurden mit entweder dem Plasmid p10-3-hTR, welches Antisense-hTR unter der Kontrolle des Tetracyclin-VP16-induzierten CMV-Minimalpromotors exprimiert, oder pBBS-hTR, welches Antisense-hTR unter der Kontrolle des MPSV-Promotors exprimiert (54). [In diesen Experimenten wurde keine Regulation durch Tetracyclin beobachtet. Die Experimente mit p10-3-hTR wurden typischerweise in Abwesenheit von Tetracyclin durchgeführt, weil Kontrollexperimente mit Luciferase oder Antisense-hTR unter der Kontrolle des Tetracyclin-VPl6-induzierten CMV-Minimalpromotors demonstrierten, dass die Gegenwart oder Abwesenheit von Tetracyclin einen geringen Effekt auf Luciferase- oder Antisense-hTR-Expression in HeTe7-Zellen hatte. In der Tat durchliefen, in frühen Experimenten mit Antisense-hTR-Konstrukten in HeTe7-Zellen, die Zellen immer noch eine Krisis bei 23 bis 26 PDL in Gegenwart von Tetracyclin.] Als eine Kontrolle wurden auch HeTe7-Zellen mit dem Stammform-Vektor unter den gleichen Bedingungen transfiziert. 11 bis 18 stabile Klone wurden aus jeder Transfektions-Serie isoliert. Klone aus allen Isolaten zeigten identische Morphologie und Wachstumsprofile bis 20 PDL, zu welchem Zeitpunkt sich das Wachstum der meisten der Antisense-exprimierenden Klone merklich verlangsamte (p10-3hTR und pBBS-hTR). Bei PDL 23-26 durchliefen diese Zellen eine Krisis, gekennzeichnet durch das Auftreten von vergrößerten und abgerundeten Zellen. Allerdings durchliefen nicht alle der aus den pBBS-hTR-transfizierten HeTe7-Zellen generierten Klone eine Krisis; acht Klone, welche Antisense-hTR exprimierten, zeigten ein fortgesetztes Wachstum ähnlich zu den Kontrollkulturen. Zellen aus allen Klonen wurden bei PDL 23 geerntet, und die Mittelwert-TRF-Längen wurden bestimmt. Die P-Werte wurden durch das Verfahren des ungepaarten t-Tests berechnet. Für jede Serie ist der Anteil an Klonen, welche eine Krisis durchliefen, angegeben.
  • Figure 00800001
  • Um zu bestimmen, ob Telomerlänge und Telomerase-Inhibition mit einer Zellkrisis in den Antisense-exprimierenden Klonen korrelierten, wurden die Telomerlänge und die Telomeraseaktivität in mehreren Vor-Krisis-Kontroll- und -Experimental-Kolonien bei 23 PDL getestet. Alle Kolonien, welche Kontrollvektor enthielten, hatten mittlere TRF-Längen (3,22 und 3,27 kb), ähnlich zu der Eltern-Zelllinie (3,15 kb), wohingegen die Antisense-Vektor-Konstrukte enthaltende Klone, welche eine Krisis durchliefen, mittlere TRF-Längen zwischen 2,39 und 2,72 kb oder 17 bis 26 % kürzer als diejenigen der Eltern-Linie aufwiesen (3). Diese Daten sind damit konsistent, dass die Telomer-Wiederholungseinheiten in den Antisense-enthaltenden Klonen aufgrund der Inhibition von Telomeraseaktivität verloren gehen. Um dies direkt zu testen, wurde Telomeraseaktivität in 14 der Klone geassayt. Die Telomeraseaktivität war im Allgemeinen niedrig, aber in vielen der Antisense-Klone nachweisbar, obwohl die verkürzten Telomere nahelegen, dass der Spiegel nicht ausreichend war, um die Telomerlänge aufrechtzuerhalten, da der Mittelwert der TRF von 3,22 auf 2,39 kb fiel (P = 0,0008). In den acht den Antisense-Vektor (pBBS-hTRb) enthaltenden Klonen, welche keine Krisis durchliefen, war die Telomerlänge nicht signifikant verändert (3,03 gegen 3,33, P = 0,355), und die Telomeraseaktivität war ähnlich zu derjenigen von Kontrollen. Zusammengenommen, sind diese Ergebnisse ein Beweis, dass Telomerverlust zu Krisis und Zelltod führt, sobald Telomere eine kritische Länge erreichen.
  • Die Induktion von Zellkrisis in HeLa-Zellen, welche Antisense-Telomerase-RNA-Komponente exprimieren, spricht weiter unterstützend dafür, dass Telomerase-Inhibition ein spezifisches und effektives Therapeutikum gegen Krebs beim Menschen bereitstellen kann.
  • Beispiel 13
  • In Situ-Amplifizierung und -Nachweis
  • In Situ-Nachweis von Telomerase-RNA
  • A. Fluoreszente in situ-Hybridisierung (FISH)
  • Die Identifizierung von Telomerase-positiven Zellen in einer gemischten Population von Zellen oder Geweben kann durch in situ-Hybridisierung von markierter Sonde, welche auf die RNA-Komponente von Telomerase gerichtet ist, durchgeführt werden. Ein Gewebe von Zellproben, welches auf einen mikroskopischen Glasobjektträger fixiert und ausreichend permeabilisiert worden ist, wird für die in situ-Hybridisierung verwendet. Ein Beispiel von in situ-Hybridisierung für humane Telomerase-RNA (hTR) besteht zuerst aus dem Denaturieren der Nukleinsäuren durch Eintauchen der Objektträger in 70% entionisiertes Formamid/2 × SSC-Lösung, welche auf 70-74°C vorgewärmt wurde, während 2-3 Minuten. Die Objektträger werden dann in eiskalten 70%igen EtOH und dann in 95%igen EtOH und dann in 100%igen EtOH überführt (4 Minuten in jeder Lösung). 100-200 ng (je Objektträger) der markierten htRNA-Sonde (~500 bp große DNA-Sonde, markiert mit Biotin, Digoxigenin, Radioisotop, fluoreszierendem Tag) werden getrocknet, in 10 μl 100% entionisiertem Formamid resuspendiert, durch Inkubation bei 75°C während 8 Minuten denaturiert und unverzüglich auf Eis gekühlt. Es werden 10 μl 2 × Hybridisierungspuffer (4 × SSC; 4 × Denhardt-Lösung, 20 % Dextransulfat, 100 mM Tris, pH 7,5) zu den 10 μl der resuspendierten Sonde zugegeben. Die Sonde/Hybridisierungs-Mischung (20 μl) wird zu der fixierten Probe zugesetzt, mit einem Deckgläschen überlagert, und das Deckgläschen wird mit Gummiklebstoff oder Nagellack abgedichtet. Die Probe wird 8-48 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Nach der Hybridisierung wird das Deckgläschen entfernt, die Probe wird zweimal in 2 × SSC/50 % entionisiertem Formamid bei 37°C gewaschen und danach zweimal in 2 × SSC bei 37°C (5 Minuten je Waschung) gewaschen. Die Probe wird dann unter einem Mikroskop betrachtet.
  • B. Geprimte in situ-Markierung (Primed in situ Labeling, PRINS)
  • Eine andere Variation an dem herkömmlichen in situ-Hybridisierungs-Nachweisverfahren ist das "Primed in situ labeling" (PRINS). Der Nachweis der hTR durch PRINS besteht aus der anfänglichen cDNA-Synthese der hTR durch reverse Transkriptase (RT), gefolgt von PRINS-Detektion unter Verwendung von hTR-spezifischer Oligonukleotidsonde und Kettenverlängerung unter Einbau von markierten Nukleotiden. Die RT-Reaktion der hTR kann durch eine Vielzahl von Verfahren ausgeführt werden. Ein Beispiel der RT-Reaktion besteht in der Verwendung des GeneAmp-"Thermostable-rTth-Reverse-Transcriptase"-RNA-PCR-Kits (Perkin Elmer). In diesem Verfahren werden 10 μl RT-Mix (10 mM Tris-HCl pH 8,3; 90 mM KCl; 1 mM MnCl2; 200 μM dNTPs; 2,5 U rTth-DNA-Polymerase; 0,4 μM Return- bzw. Rückwärts-Primer [z. B. R7G: 5'-GGAGGGGCGAACGGGCCAGCAG-3']) auf die fixierte und permeabilisierte Probe gebracht, mit einem Deckgläschen versiegelt, mit Nagellack verankert, mit Mineralöl überschichtet und 30 Minuten lang bei 70°C inkubiert. Danach wird das Mineralöl durch 5 Minuten langes Waschen in Xylen und danach 5 Minuten in 100 % EtOH entfernt. Das Deckgläschen wird abgenommen, es wird kurz mit DepC-Wasser, dann mit 100 % EtOH, gewaschen, und es folgt eine Lufttrocknung während 5 Minuten. Dann werden 10 μl PRINS-Mischung (5 % (v/v) Glycerol; 10 mM Tris-HCl, pH ,3; 100 mM KCl; 0,05 % (w/v) Tween 20; 0,75 mM EGTA; 2,5 mM MgCl2; 0,4 μM Vorwärts-Primer [z. B. U3b: 5'-GCCTGGGAGGGGTGGTGGCTATTTTTTG-3']; 200 μm dA-, dG-, dCTP; 110 μM dTTP, 90 μM markiertes dUTP) auf die Probe gebracht. Es wird mit einem Deckgläschen abgedeckt, mit Nagellack verankert, mit Mineralöl überschichtet und 30 Minuten bis 3 Stunden lang bei 70°C inkubiert. Die Probe wird dann dreimal in Waschpuffer (4 × SSC; 0,05 % Tween 20) gewaschen, und 2 Minuten lang auf 70 °C erwärmt. Dann wird das Signal beobachtet.
  • C. In situ-RT-PCR
  • Die RT-PCR-Detektion von hTR besteht aus der cDNA-Synthese der Ziel-RNA durch reverse Transkriptase-Reaktion (virale reverse Transkriptase oder durch die intrinsische RT-Aktivität von thermostabilen DNA-Polymerasen), gefolgt von in situ-PCR-Amplifizierung der Ziel-cDNA. Verschiedene RT-Reaktionen können in der cDNA-Synthese des hTR verwendet werden, einschließlich des RT-Protokolls, welches in Abschnitt 11.B erörtert wird. Darüber hinaus können die gleiche(n) Pufferbedingung(en) und die in den PRINS-Nachweisverfahren verwendeten Primer ebenfalls für RT-PCR verwendet werden, aber anstelle einer End-Inkubation bei 70°C während 30 Minuten bis 3 Stunden wird die Probe in einem Thermozykler während 30-40 Zyklen von 94°C/40 Sekunden, 55°C/90 Sekunden amplifiziert (siehe Abschnitt 11B). Im Anschluss an die PCR wird die Probe dreimal in dem Waschpuffer (4 × SSC; 0,05 % Tween 20) gewaschen und 2 Minuten lang auf 70°C erwärmt. Dann wird das Signal beobachtet.
  • Eine andere Alternative besteht darin, die cDNA, welche aus der anfänglichen RT-Reaktion erzeugt wurde, durch Anwendung des "GeneAmp in situ-PCR-Systems 1000" und des "GeneAmp-in situ-PCR-Core-Kits" (Perkin Elmer) zu amplifizieren.
  • Eine Ein-Schritt-in situ-RT-PCR auf einer fixierten und permeabilisierten Probe kann unter Anwendung des "GeneAmp EZ rTth"-RNA-PCR-Protokolls in Kombination mit dem "GeneAmp-in situ-PCR-System 1000" (Perkin Elmer) durchgeführt werden. Dieses Verfahren besteht aus dem Aufbringen von 40-50 μl EZ-RNA-PCR-Puffer-Mix (50 mM Bicine; 115 mM Kaliumacetat; 8 % (w/v) Glycerol, pH 8,2; 300 μM dA-, dG-, dCTP; 165 μM dTTP; 135 μM markiertes dUTP; 5-10 U rTth-DNA-Polymerase; 2,5 mM Mn(OAc)2; 0,45-1 μM htRNA-spezifische Primer, z. B. R7 und U3b, auf eine fixierte und permeabilisierte Probe auf einem mikroskopischen Objektträger und Versiegeln desselben mit der Silikon-Dichtungsscheibe und -Klammer unter Befolgung des Protokolls des Herstellers (GeneAmp-in situ-PCR-System 1000, Perkin Elmer). Die Probe wird dann in die GeneAmp-in situ-PCR-Maschine eingebracht und 120 Sekunden lang bei 94°C erwärmt und danach während 30-40 Zyklen von 94°C/45 Sekunden und 60°C/45 Sekunden amplifiziert. Nach der Amplifikation wird die Probe gewaschen und sichtbar gemacht, wie oben stehend erörtert.
  • Um die Hintergrundsignale zu reduzieren, welche aus einem direkten Einbau von fluoreszierenden 'Tags' während der PCR-Amplifizierung entstehen können, kann eine indirekte Detektion angewandt werden, welche aus der PCR-Amplifikation unter Verwendung von nicht-getaggten dNTPs, gefolgt von in situ-Hybridisierung unter Verwendung einer getaggten Hybridisierungssonde, die spezifisch für das amplifizierte Produkt ist, besteht. In diesem Verfahren wird das Signal durch ein beliebiges obenstehend beschriebenes RT-PCR-Verfahren ohne markierte dNTPs oder Primer amplifiziert, und das amplifizierte Produkt wird mittels in situ-Hybridisierung nachgewiesen.
  • D. Anwendung von Produkt-Verlängerungsprimer auf in situ-PCR
  • Der Erfolg von in situ-PCR hängt von der Verhinderung des Auslaufens der amplifizierten Produkte innerhalb der zellulären Matrix aus der Zelle heraus ab. Deshalb gilt im Allgemeinen, dass kleinere PCR-Produkte als 500 bp nicht für eine in situ-PCR wünschenswert sind. Um das Auslaufen der PCR-Produkte, welche kleiner als 500 bp sind, aus der zellulären Matrix zu verhindern, wird üblicherweise der Einbau von "sperrigen" dNTPs (z. B. mit Biotin, einem fluoreszenten Tag, Digoxigenin markiertes dUTP) in das PCR-Produkt angewandt. Ein anderer Weg, um das Auslaufen eines kleinen Produkts bei in situ-PCR zu verhindern, wäre die Einbindung von Produkt-Verlängerungsprimer in das in situ-PCR-Protokoll.
  • Das Verfahren umfasst die Verwendung eines Primers, der drei bis vier 6-bp-Wiederholungssequenzen (z. B. [5'-TTTCCC-3']3-4) am 5'-Ende enthält, gefolgt von einer Sequenz, welche spezifisch für das Ziel ist (siehe 4, Primer 1), in Kombination mit passendem Rückwärts-Primer (Primer 2) und einem dritten Primer, welcher lediglich aus der wiederholten Sequenz besteht (Primer 3, z. B. (5'-TTTCCC-3']4), um das spezifische Ziel in einer in situ-PCR zu amplifizieren. Das Vorliegen des Primers 3 wird das PCR-Produkt aufgrund der gestaffelten Bindung des Primers 3 an das 3'-Ende des Ziel-PCR-Produkts verlängern. Die Verlängerung der PCR-Produkte kann durch Senken der Annealing-Temperatur der anfänglichen PCR-Bedingung induziert werden.
  • Wenn zum Beispiel die Annealing-Temperatur der Zielsequenz in dem Primer 1 60°C beträgt, wird die Probe anfänglich während 15-20 Zyklen von 94°C/45°C und 60°C/45°C amplifiziert werden, und danach wird sie während 15-20 Zyklen von 94°C/45°C und 50°C/45°C amplifiziert werden. Eine gesenkte Annealing-Temperatur in dem zweiten PCR-Schritt wird die Erzeugung der verlängerten PCR-Produkte durch Erhöhen der Wahrscheinlichkeit einer Staffel-Bindung von Primer 3 an die repetitiven Sequenzen begünstigen. Die resultierenden verlängerten PCR-Produkte werden weniger anfällig für ein Auslaufen durch die zelluläre Matrix sein, was somit zu einer besseren Signal-Zurückhaltung bei in situ-PCR-Analyse führt.
  • Beispiel 14
  • Nicht-menschliche Primaten-Telomerase-RNA-Komponente
  • Um zu demonstrieren, dass andere Säugetier-Telomerase-RNA-Komponenten-Sequenzen unter Verwendung von Primern, basierend auf der Sequenz der menschlichen RNA-Komponente, erhalten werden können, wurden menschliche Sequenz-PCR-Primer verwendet, um Telomerase-RNA-Komponenten-Sequenzen aus genomischer DNA des Totenkopfäffchens zu amplifizieren, einer Spezies, welche angenommenemaßen eine der Arten von nicht-menschlichen Primaten ist, welche im Vergleich zum Menschen die am stärksten evolutionär abweichende Spezies ist.
  • Genomische Totenkopfäffchen-DNA wurde mit dem Primern F3b (5'-TCTAACCCTAACTGAGAAGGGCGTAG-3') und H3+20 (5'-CTCAAGGTCATCGCCAAGGT-3') wie beschrieben amplifiziert. Eine einzelne DNA-Bande wurde beobachtet und wurde anschließend in den Vektor pBluesriptII SK (Stratagene, San Diego, CA) kloniert. Die resultierenden Klone wurden unter Anwendung des PCR-Verfahrens mit dem Rückwärts-Universal-Primer (5'-AACAGCTATGACCATG-3'), dem Primer –210-3' (5'-TCACGTCTCCTGCCAATTTGC-3') oder dem Primer H3+20 partiell sequenziert. Die erhaltenen partiellen Totenkopfäffchen-Telomerase-RNA-Komponenten-Sequenzen waren die Folgenden:
    Figure 00850001
  • Bei der Alignierung zu der Gensequenz von menschlicher Telomerase-RNA-Komponente wurde die folgende Alignierung bzw. Parallel-Übereinanderstellung erhalten, wobei die Numerierungs-Konvention des menschlichen Telomerase-RNA-Komponenten-Gens benutzt wurde (Trennstriche repräsentieren Lücken, welche eingeführt wurden, um die Sequenz-Alignierung zu optimieren):
    Figure 00860001
  • Die vorangehenden Beispiele beschreiben verschiedene Aspekte der Erfindung und den Weg, wie bestimmte Nukleinsäuren der Erfindung hergestellt wurden. Mit den Beispielen wird nicht beabsichtigt, eine erschöpfende Beschreibung der vielen verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung zu geben, welche von den folgenden Patentansprüchen abgedeckt werden.

Claims (35)

  1. Eine im Wesentlichen reine Ribonukleinsäure, welche in der Lage ist, mit einer Säugetier-Telomerase-Proteinkomponente zu assoziieren, um ein enzymatisch aktives Telomerase-Holoenzym zu bilden, wobei das Oligoribonukleotid eine Sequenz umfasst, welche durch den Codierungsbereich des HindIII-SacI-Inserts mit ~2,5 kb des Plasmids GRN33 (ATCC 75926) oder durch eine Sequenz, die wenigstens 80% oder 95% Identität mit wenigstens 50 aneinander angrenzenden Nukleotiden dieses Codierungsbereichs aufweist, codiert wird.
  2. Eine Ribonukleinsäure wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei die Sequenz die folgende:
    Figure 00870001
    oder eine Sequenz ist, die wenigstens 80% oder wenigstens 95% Identität mit wenigstens 50 aneinander angrenzenden Nukleotiden dieser Sequenz aufweist.
  3. Eine Ribonukleinsäure wie in Anspruch 1 oder Anspruch 2 beansprucht, welche eine menschliche Telomerase-RNA-Komponente ist.
  4. Eine Ribonukleinsäure wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3 beansprucht, welche die folgende Sequenz umfasst:
    Figure 00870002
  5. Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, welches eine Ribonukleinsäure nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4 codiert.
  6. Ein rekombinantes Plasmid, welches eine Nukleotidsequenz umfasst, die eine Ribonukleinsäure nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4 codiert.
  7. Eine Wirtszelle, welche mit einem Plasmid nach Anspruch 6 transformiert ist.
  8. Ein Oligonukleotid, welches mehr als 10 aneinander angrenzende Nukleotide umfasst, die zu aneinander angrenzenden Nukleotiden einer Ribonukleinsäure nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4 komplementär sind, und welches die Aktivität eines Säugetier-Telomerase-Enzyms hemmt.
  9. Ein Oligonukleotid wie in Anspruch 8 beansprucht, wobei das Oligonukleotid wenigstens 15, gegebenenfalls wenigstens 20 aneinander angrenzende Nukleotide umfasst, die zu aneinander angrenzenden Nukleotiden einer Ribonukleinsäure der Ansprüche 1 bis 4 komplementär sind.
  10. Ein Oligonukleotid wie in Anspruch 8 beansprucht, bestehend aus den mehr als 10 aneinander angrenzenden Nukleotiden, welche zu aneinander angrenzenden Nukleotiden einer Ribonukleinsäure nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4 komplementär sind.
  11. Ein Oligonukleotid wie in Anspruch 9 beansprucht, bestehend aus den wenigstens 15, gegebenenfalls den wenigstens 20 aneinander angrenzenden Nukleotiden, welche zu aneinander angrenzenden Nukleotiden einer Ribonukleinsäure nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4 komplementär sind.
  12. Ein Oligonukleotid wie in Anspruch 8 oder Anspruch 9 beansprucht mit der Sequenz:
    Figure 00880001
  13. Ein Oligonukleotid wie in irgendeinem der Ansprüche 8 bis 11 beansprucht, welches ein Ribozym ist, das spezifisch die RNA-Komponente der Telomerase spaltet.
  14. Ein Oligonukleotid wie in irgendeinem der Ansprüche 8 bis 12 beansprucht, welches modifizierte Nukleotidanaloge, z.B. O-Methyl-Ribonukleotide, Phosphorothioat-Nukleotide oder Methylphosphonat-Nukleotide, umfasst.
  15. Eine pharmazeutische Formulierung, welche ein Oligonukleotid nach irgendeinem der Ansprüche 7 bis 14 umfasst.
  16. Ein Oligonukleotid wie in irgendeinem der Ansprüche 8 bis 14 beansprucht zur Verwendung als ein Pharmazeutikum.
  17. Verwendung eines Oligonukleotids wie in irgendeinem der Ansprüche 8 bis 14 beansprucht zur Herstellung eines Medikaments, um Neoplasie zu behandeln.
  18. Ein Verfahren zum Hemmen der Telomeraseaktivität in einer Zelle in vitro, umfassend das Inkontaktbringen der Zelle mit einem Oligonukleotid nach irgendeinem der Ansprüche 8 bis 14.
  19. Eine isolierte, rekombinante oder synthetisierte Nukleinsäure, umfassend eine Sequenz, die mit mehr als 10 aufeinander folgenden Nukleotiden einer Ribonukleinsäure nach irgendeinem der Ansprüche 1-4 identisch oder zu diesen komplementär ist, oder das Komplementäre davon und welche ausgewählt ist aus: a) einer Nukleotidsonde, die spezifisch mit Telomerase-RNA oder ihrer codierenden Sequenz in einer Säugetierprobe, vorzugsweise einer aus Menschen, hybridisiert, wobei diese gegebenenfalls eine nachweisbare Markierung umfasst; oder b) einem Nukleotidprimer, der in der Lage ist, eine Amplifizierungsreaktion zu primen, die für Telomerase-RNA oder ihre codierende Sequenz in einer Säugetierprobe, vorzugsweise einer aus Menschen, spezifisch ist.
  20. Eine Nukleinsäure wie in Anspruch 19 beansprucht, wobei die Nukleinsäure eine Sequenz umfasst, die mit wenigstens 20 aufeinander folgenden Nukleotiden einer Ribonukleinsäure nach irgendeinem der Ansprüche 1-4 identisch oder zu diesen komplementär ist, oder das Komplementäre davon.
  21. Die Verwendung eines Oligonukleotids, umfassend eine Sequenz, die mit mehr als 10 aufeinander folgenden Nukleotiden einer Ribonukleinsäure nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4 identisch oder zu diesen komplementär ist, oder eines Komplementären davon als: a) eine Nukleotidsonde, die spezifisch ist für Telomerase-RNA oder ihre codierende Sequenz in einer Säugetierprobe, vorzugsweise einer aus Menschen, wobei diese gegebenenfalls eine nachweisbare Markierung umfasst; oder b) einen Nukleotidprimer, der in der Lage ist, eine Amplifizierungsreaktion zu primen, die für Telomerase-RNA oder ihre codierende Sequenz spezifisch ist.
  22. Eine Verwendung wie in Anspruch 21 beansprucht, wobei das Oligonukleotid eine Sequenz umfasst, die mit wenigstens 20 aufeinander folgenden Nukleotiden einer Ribonukleinsäure nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4 identisch oder zu diesen komplementär ist, oder das Komplementäre davon.
  23. Ein Verfahren zur Bestimmung des Spiegels, der Menge oder des Vorliegens einer Telomerase-RNA-Komponente in einer Säugetierprobe, vorzugsweise einer aus Menschen, umfassend entweder: a) das Kombinieren der Probe mit einer Oligonukleotidsonde wie in Anspruch 19 oder Anspruch 20 definiert unter Bedingungen, wo das Oligonukleotid spezifisch mit Telomerase-RNA in der Probe hybridisiert, und das Nachweisen irgendeines Hybrids, das sich als ein Ergebnis bildet; oder b) das Kombinieren der Probe mit einem Paar von Oligonukleotidprimern wie in Anspruch 19 oder Anspruch 20 definiert, das Durchführen einer Amplifizierungsreaktion und das Nachweisen irgendeines Amplifizierungsprodukts, das sich als ein Ergebnis bildet.
  24. Ein Verfahren wie in Anspruch 23 beansprucht, welches weiterhin das Quantifizieren des Hybrids oder Amplifizierungsprodukts umfasst, um so die Konzentration der Telomerase-RNA-Komponente in der Probe zu bestimmen.
  25. Ein Verfahren zum Nachweisen einer Telomerase-RNA-Komponente in einer Probe, die aus einem Patienten erhalten wird, umfassend das Binden einer markierten Oligonukleotidsonde oder eines Primers wie in Anspruch 19 oder Anspruch 20 definiert an eine Probe, die aus dem Patienten erhalten wird, und das Nachweisen des Vorliegens von markiertem Material, das an die RNA in der Probe gebunden ist.
  26. Ein Verfahren zum Nachweisen des Vorliegens von Krebszellen in einer Probe, wobei das Verfahren das Bestimmen des Spiegels der Telomerase-RNA-Komponente in der Probe gemäß Anspruch 23 oder Anspruch 24 und das Korrelieren des Vorliegens eines pathognomen Spiegels der Telomerase-RNA-Komponente mit dem Vorliegen von Krebszellen umfasst.
  27. Ein Kit zum Bestimmen des Spiegels, der Menge oder des Vorliegens einer menschlichen Telomerase-RNA-Komponente in einer Probe, wobei der Kit eine Oligonukleotidsonde oder einen Primer wie in Anspruch 19 oder Anspruch 20 definiert umfasst und welcher gegebenenfalls einen Satz Instruktionen umfasst.
  28. Ein Verfahren zum Isolieren des Telomerase-Holoenzyms, umfassend das Einfangen des Holoenzymproteins unter Verwendung eines Affinitätsmittels, das mehr als 10 aufeinander folgende Nukleotide eines Oligonukleotids umfasst, welche zu einer Ribonukleinsäure nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4 komplementär sind, und dann das Gewinnen des Proteins aus dem Affinitätsmittel.
  29. Ein Verfahren wie in Anspruch 28 beansprucht, wobei das Affinitätsmittel an einem festen Träger befestigt ist oder zur anschließenden Immobilisierung an einem festen Träger chemisch modifiziert ist.
  30. Ein Verfahren zum Identifizieren einer Telomerase-RNA-Komponente von einer nicht-menschlichen Säugetierspezies, umfassend das Inkontaktbringen von Nukleinsäure aus Gewebe von dieser Spezies mit einem Oligonukleotidprimer, wie er in Anspruch 17 oder Anspruch 18 definiert ist.
  31. Eine isolierte, rekombinante oder synthetisierte Nukleinsäure, umfassend einen transkriptionsregulatorischen Bereich mit wenigstens einer der folgenden Eigenschaften: (a) er umfasst die folgende Sequenz oder deren Komplementäres:
    Figure 00920001
    (b) er umfasst eine Sequenz, die mit wenigstens 25 aufeinander folgenden Nukleotiden der Sequenz in (a) identisch ist; (c) er umfasst eine Sequenz, die zu wenigstens 80% oder 95% mit wenigstens 100 aufeinander folgenden Nukleotiden der Sequenz in (a) identisch ist, oder deren Komplementäres; (d) er hybridisiert spezifisch mit dem HindIII-SacI-Insert von ~2,5 kb des Plasmids pGRN33 (ATCC 75926); oder (e) er hybridisiert spezifisch mit einem SauIIIA1-HindIII-Insert des Lambda-Klons 28-1 (ATCC 75925).
  32. Eine Nukleinsäure wie in Anspruch 31 beansprucht, wobei der transkriptionsregulatorische Bereich die Transkription einer Gensequenz, mit welcher dieser funktionsfähig verknüpft ist, steuert.
  33. Ein rekombinantes Plasmid, welches eine Nukleotidsequenz wie in Anspruch 31 beansprucht umfasst.
  34. Eine Wirtszelle, welche mit einem Plasmid wie in Anspruch 33 beansprucht transformiert ist.
  35. Ein transgenes nichtmenschliches Säugetier mit wenigstens einem funktional unterbrochenen Allel einer Säugetier-Telomerase-RNA-Komponente, welches durch homologes Targetting unterbrochen wurde.
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