KR100566766B1 - 포유류텔로머라제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 약제, 치료제 및 진단 시약으로서 유용한 포유류의 텔로머라제의 RNA 성분을 함유하는 핵산에 관한 것이다.

Description

포유류 텔로머라제{MAMMALIAN TELOMERASE}
본 발명은 인체의 말단소립 DNA 합성에 관련된 리보핵단백질 효소인 인체 텔로머라제에 관한 것이다. 본 발명은 분자 생물학, 화학, 약리학, 의학 및 진단기법 분야에 관한 방법 및 조성물을 제공한다.
진핵세포 염색체의 말단소립 또는 말단부에 있는 DNA는 대개 간단한 일렬의 반복 서열로 이루어진다. 텔로머라제는 이 효소의 RNA 성분내에 함유된 서열을 주형으로서 사용하여 말단소립 DNA의 한 가닥을 합성하는 리보핵단백질 효소이다. 이에 관해서는 본 발명에 참고 인용한 문헌(블랙번, 1992, Annu. Rev. Biochem. 61:113-129)를 참조할 수 있다.
인체 텔로머라제는 서열 5'-TTAGGG-3'를 가진 말단소립 반복 단위를 합성하는 것으로 공지되어 있지만, 인체 텔로머라제의 RNA 성분은 현재까지의 과학 문헌에 보고된 바가 없다. 이에 관해서는 본 발명에 참고 인용한 문헌(모린, 1989, Cell 59:521-529, 및 모린, 1991, Nature 353:454-456)을 참조할 수 있다. 이러한 정보는 인체 텔로머라제의 RNA 성분이 지닌 뉴클레오티드 서열의 나머지를 분리 및 확인하기에는 불충분한 것이었다. 테트라히메나(Tetrahymena)의 특정한 종인 사카로마이세스 세레비시에의 텔로머라제 효소의 RNA 성분, 및 다른 섬모충, 예를 들면 유플로테스(Euplotes) 및 글라우코마(Glaucoma)의 텔로머라제 효소의 RNA 성분은 서열이 분석되어 과학 문헌에 보고되었다. 이에 관해서는 각각 본 발명에 참고 인용한 문헌(싱거 및 고츠슈링, 1994. 10. 21. Science 266 : 404-409 ; 링그너 등, 1994, Genes ＆ Development 8:1984-1988; 그라이더 및 블랙번, 1989, Nature 337:331-337; 로메로 및 블랙번, 1991, Cell 67:343-353; 및 쉬펜-렌쯔 및 블랙번, 1990, Science 247:546-552)를 참조할 수 있다. 이와 같은 섬모충의 텔로머라제 효소는 인체의 말단소립과는 구별되는 말단소립 반복 단위를 합성한다.
따라서, 인체 텔로머라제에 관해서는 더욱 많은 정보가 필요로 되었다. 말단소립 DNA의 반복단위는 겉보기로는 간단한 특성을 나타낼 것 갖지만, 과학자들이라면 염색체 구조 및 기능을 유지시키는데 있어서 이 말단소립이 중요한 생물학적 역할을 한다는 것을 익히 알고 있을 것이다. 최근에, 과학자들은 말단소립 DNA의 손실이 세포 노쇠 및 노화의 자극인자로서 작용할 수 있으며, 텔로머라제의 조절이 중요한 생물학적 관계를 가질 수 있음을 고찰한 바 있다. 이에 관해서는 본 발명에 참고인용한 문헌(할리, 1991, Mutation Research 256:271-282)를 참조할 수 있다.
텔로머라제 활성을 검출하는 방법, 및 텔로머라제 활성을 조절하거나 그 활성에 영향을 미치는 화합물을 식별하는 방법이 말단소립 길이 및 텔로머라제 활성을 조절함으로써 세포의 노쇠와 무한증식을 진단 및 치료하는 방법과 함께 개시된 바 있다. 이에 관해서는 PCT 특허 공개 공보로서, 1995 년 5 월 18 일자 공개된 95/13381호; 1995 년 5 월 18 일자 공개된 95/13382호; 및 1993 년 11 월 25 일자 공개된 93/23572호; 및 미국 특허 출원으로서, 1995 년 6 월 7 일자 출원된 미국 특허원(출원번호 미지정, 발명자: C. 할리, N. 킴, S. 웨인리치); 1994 년 9 월 28 일자 출원된 08/315,214호; 1994 년 9 월 28 일자 출원된 08/315,216호; 1994 년 8 월 10 일자 출원된 08/288,501호; 1993 년 2 월 8 일자 출원된 08/014,838호; 각각 1993 년 11 월 12 일자 출원된 08/153,051호 및 08/151,477호; 1993 년 5 월 13 일자 출원된 08/060,952호; 1993 년 3 월 24 일자 출원된 08/038,766호; 및 1992 년 5 월 13 일자 출원된 07/882,438호를 참조할 수 있으며, 이들은 모두 본 발명에 참고 인용하였다.
그러나, 텔로머라제의 RNA 성분을 포함하고 및/또는 텔로머라제의 단백질 성분을 암호하는 핵산을 순수한 형태 또는 분리가능한 형태로 입수할 수 있고 그 핵산의 뉴클레오티드 서열을 안다면, 텔로머라제 매개 요법 및 텔로머라제 분석과 선별 방법에 대한 상당한 진보 및 새로운 기회를 실현할 수 있을 것이다. 본 발명은 이러한 요건 및 다른 요건에 부합하여 상당한 진보와 새로운 기회를 제공한다.
발명의 개요
본 발명의 제1 양태에서, 본 발명은 실질적으로 순수한 형태의 인체 텔로머라제의 RNA 성분 뿐만 아니라 그 RNA 성분의 유전자, 및 인체 텔로머라제의 RNA 성분의 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 적어도 유용한 부분을 포함하는 핵산을 제공한다. 또한 본 발명은 다른 종으로부터 RNA 성분 핵산을 제공하며, 그 핵산은 인체 텔로머라제의 RNA 성분, 예를 들면 영장류와 같은 포유류의 RNA 성분(이 예에 제한되는 것은 아님)과 상당한 상동성을 공유한다. 기타 유용한 본 발명의 핵산으로서는 RNA 성분과 상보되는 서열을 가진 핵산; RNA 성분의 뉴클레오티드 서열과 관계가 있지만 그 서열과는 구분되며 인체 텔로머라제의 RNA 성분 또는 RNA 성분에 대한 유전자 또는 단백질 성분과 유용한 방식으로 상호작용하는 서열을 가진 핵산; 및 RNA 성분 또는 RNA 성분에 대한 유전자와 유의적인 서열 상동성이나 상보성을 공유하지 않지만 소정의 유용한 방식으로 RNA 성분에 대해 작용하는 핵산을 들 수 있다. 이하에 상세히 설명하는 바와 같이, 본 발명의 핵산은 DNA와 RNA 분자 및 이들의 변형된 유사체를 모두 포함하며 각종의 유용한 목적으로 사용된다.
본 발명의 유용한 핵산의 한 유형은 생체내에서 또는 시험관내에서 인체 텔로머라제의 활성을 억제하는데 사용될 수 있는 앤티센스 올리고뉴클레오티드, 3중 나선형 올리고뉴클레오티드, 또는 기타 다른 올리고뉴클레오티드나 올리고뉴클레오티드 유사물질(예를 들면 앤티센스 PNA-펩티드 핵산/폴리아미드 핵산)이다. 이와 같은 올리고뉴클레오티드는 여러 가지 방식으로, 예를 들면 텔로머라제 유전자의 전사를 방해함으로써(예를 들면 3중 나선 형성에 의해), 또는 기능성 리보핵단백질 텔로머라제가 조합하는 것을 방해하거나 또는 일단 텔로머라제 효소 복합체로 조합된 RNA 성분이 말단소립 DNA 합성에 대한 주형으로서 작용하는 것을 방해하는 방식으로 텔로머라제의 RNA 성분에 결합함으로써 텔로머라제 활성을 차단할 수 있다. 통상적으로, 작용 방식에 따라, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 텔로머라제의 RNA 성분 또는 텔로머라제의 RNA 성분에 대한 유전자내의 특정한 뉴클레오티드의 서열과 동일하거나 그에 상보되는 약 10개 내지 약 25-200개 또는 그 이상의 뉴클레오티드로 된 특정 서열을 포함한다.
한 실시양태로서, 본 발명은 텔로머라제 RNA 성분 폴리뉴클레오티드 서열과 상보성인, 일반적으로 천연 발생의 포유류 텔로머라제 RNA 성분 유전자 서열과 거의 동일한 폴리뉴클레오티드 서열과 상보성인 앤티센스 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 이와 같은 앤티센스 폴리뉴클레오티드는 텔로머라제 RNA 성분 종의 전사 및/또는 안정성 및/또는 기능을 억제하는데 사용됨으로써 세포(예를 들면 환자의 종양 세포)내의 각 텔로머라제 활성의 양을 감소시키는 작용을 수행한다. 이와 같은 앤티센스 폴리뉴클레오티드는 세포 내에서의 정확한 말단소립 복제 및 수복에 필요한 기능성(촉매 활성 및 높은 정확성) 텔로머라제 완전효소(holoenzyme)의 형성을 억제함으로써 텔로머라제 조절제로서 작용할 수 있다. 앤티센스 폴리뉴클레오티드는 다른 항종양 치료 방식, 예를 들면 이온화 방사선 또는 화학요법(예: 블레오마이신, 시스플라틴, 질소 머스터드, 독시루비신, 뉴클레오티드 유사체 등의 DNA 손상제를 사용함)과 병용할 수 있다. 앤티센스 폴리뉴클레오티드는 감수성 세포(예를 들면 DNA 수복 또는 복제를 위해 텔로머라제 활성을 필요로 하는 복제 세포)의 세포 사멸을 촉진시킬 수 있다. 앤티센스 폴리뉴클레오티드는 본 명세서에 개시한 포유류 텔로머라제 RNA 서열의 상보성 서열인 25개 이상의 인접 뉴클레오티드와 실질적으로 동일하다. 이 앤티센스 폴리뉴클레오티드는 통상 ssDNA, ssRNA, 메틸포스포네이트 골격 폴리뉴클레오티드, 포스포로티올레이트 골격 폴리뉴클레오티드, 복합 골격 폴리뉴클레오티드, 폴리아미드 핵산, 및 당분야에 공지된 기타 유사한 앤티센스 구조물이다. 본 발명의 한 양태에서, 앤티센스 폴리뉴클레오티드는 복제가능한 인체 세포와 같은 세포에서 텔로머라제 RNA 성분의 전사 및/또는 활성 및 텔로머라제 활성을 억제하기 위해 투여한다.
한 실시양태로서, 본 발명은 주형 부정합 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 상기 폴리뉴클레오티드는 텔로머라제의 포유류 RNA 성분과 실질적으로 동일한 서열을 가지며, 인체 텔로머라제 반복 서열 5'-TTAGGG-3' 에 대하여 하나 이상의 염기 부정합을 보유하지만 다른 것들은 상기 반복 서열에 상보성인 말단소립 반복 주형 서열을 포함한다. 주형 부정합 폴리뉴클레오티드는 대개 천연 발생의 주형 서열내에 하나의 뉴클레오티드 부정합을 포함하거나, 인접된 부정합 뉴클레오티드로서, 또는 부정합 뉴클레오티드내에 하나 이상의 정합(상보성) 뉴클레오티드가 개재되어 있는 형태로서 주형 서열내에 2개의 뉴클레오티드 부정합을 포함할 수도 있다. 본 발명의 주형 부정합 폴리뉴클레오티드는 통상 인체 텔로머라제 폴리펩티드 성분과 함께 텔로머라제 활성을 나타낼 수 있으므로, 말단소립 반복 복제, 수복 및/또는 부가된 후 인체 텔로머라제 반복 서열내의 소정(부정합) 뉴클레오티드 위치에 부정혼입이 일어날 수 있고, 따라서 실질적인 말단소립 길이의 복제 및 유지시 변이된 센스 텔로머라제 RNA 성분이 지속적으로 존재하는 말단소립을 발생시킨다.
본 발명의 다른 유용한 핵산의 유형은 인체 텔로머라제의 RNA 성분을 특이적으로 절단하여 그 효소를 불활성화시킬 수 있는 리보자임이다. 본 발명의 핵산의 또 다른 유용한 유형은 인체 텔로머라제의 RNA 성분에 특이적으로 결합하여, 예를 들면 샘플내의 텔로머라제 존재를 검출하는데 사용될 수 있는 프로브 또는 프라이머이다. 마지막으로, 본 발명의 유용한 핵산으로서는 본 발명의 핵산을 생성하는 재조합 형질발현 플라스미드를 들 수 있다. 이와 같은 플라스미드의 특히 유용한 유형은 인체 유전자 치료에 사용되는 플라스미드이다. 인체 유전자 치료에 사용되는 본 발명의 유용한 플라스미드는 다양한 유형에 포함되며, 그 예로서는 앤티센스 올리고뉴클레오티드 또는 리보자임을 암호하는 것들 뿐만 아니라 인체 텔로머라제의 RNA 성분 또는 인체(또는 인체 RNA 성분과 상당한 상동성을 갖는 RNA 성분 서열을 가진 다른 종) 텔로머라제 RNA 성분의 결실 또는 변형(변이)된 변형체 또는 그 유전자의 형질발현을 유도하는 것들을 들 수 있다.
한 실시양태로서, 생리학적인 조건하에서 특이적으로 하이브리드하기에 충분한 포유류 텔로머라제 RNA 성분에 대하여 상보성인 부분를 갖는 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드 합성 도중에 또는 이후에 부가되는 화학적 치환체를 공유 결합시켜 유도체화됨으로써, 상기 텔로머라제 RNA 성분과 특이적으로 하이브리드될 수 있는 유도체화된 폴리뉴클레오티드를 형성한다. 이 유도체화된 폴리뉴클레오티드는 상기 RNA 성분을 가진 내인성 텔로머라제 효소에 위치할 수 있으며, 여기에서 상기 유도체화된 폴리뉴클레오티드는 텔로머라제의 RNA 성분 및/또는 단백질 성분의 변화 또는 화학적 변형을 일으킴으로써, 텔로머라제의 효소 활성을 조절하고, 대개는 활성을 감소시킨다.
다른 실시 양태로서, 본 발명은 이상 텔로머라제 RNA 성분 과다 및/또는 구조와 관련된 질병을 진단하기에 적합한 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 포유류 텔로머라제 RNA 성분의 뉴클레오티드 서열과 실질적으로 상보성이거나 거의 동일한 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 프로브는, 텔로머라제 RNA 성분 과다 및/또는 텔로머라제 RNA 성분 구조 변화(예: 절두, 서열 변화, 결실 또는 삽입 등), 및/또는 환자로부터 외식된 세포내의 텔로머라제 RNA 성분 유전자의 재배열 또는 증폭의 검출에 의해, 또는 질병 특유의 포유류 텔로머라제 RNA 성분 대립유전자의 검출에 의해(예를 들면 RFLP 또는 대립유전자 특이적 PCR 분석에 의해) 질병 상태(예: 종양(neoplasia) 또는 종양발현전(preneoplasia) 상태)를 진단하는데 사용될 수 있다. 검출은 텔로머라제 RNA 성분 특이적인 프라이머를 사용하는 PCR 또는 LCR 증폭 방법과 마찬가지로 세포 샘플로부터 분리된 대량 RNA 또는 폴리 A+ RNA 에 대한 노던 블로팅, 점 블로팅 또는 용액 하이브리드화 방법을 사용할 수도 있지만, 대개 포유류 텔로머라제 RNA 성분에 대해 상보적인 표지화된 (예:32P, 35S, 14C, 3H, 형광, 비오틴화, 디곡시제닌화) 앤티센스 폴리뉴클레오티드를 사용하여 동일계상의 하이브리드화 기법으로 실시한다. 동일한 세포 종류(들)의 비 종양성 세포에 비해 변화된 양(대개는 상당히 증가한 양)의 텔로머라제 RNA 성분을 함유하는 세포는 종양발현전 상태의 세포 또는 진실한 종양 세포와 같이 질병 세포의 후보로서 식별되며, 전이 잠재성을 가진 세포로서 식별될 수 있다. 유사하게, 세포 샘플내에서 텔로머라제 RNA 성분 유전자 좌 또는 인접 연결된 좌들의 질병 특유의 재배열 또는 증폭을 검출함으로써 병리학적 질환 또는 병리학적 질환(예: 암, 유전병)을 진행시키는 소인의 존재를 식별할 수 있을 것이다. 또한 텔로머라제 RNA 성분 폴리뉴클레오티드 프로브는 개인의 법적 식별, 예를 들면 범죄 용의자 또는 신원이 미확인된 고인의 식별이나 부계 테스트에도 사용할 수 있다.
제2 양태로서, 본 발명은 세포(들)을 그 세포내에 존재하는 텔로머라제 활성을 변화시키는 치료학적 유효량의 제제와 접촉시킴으로써, 세포 또는 세포군내의 텔로머라제 활성과 관련된 증상을 치료하는 방법을 제공한다. 이와 같은 제제로서는, 텔로머라제 RNA 성분 암호화 핵산, 3 중 나선 형성 올리고뉴클레오티드, 앤티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임 및 전술한 바와 같은 텔로머라제 RNA 성분, 텔로머라제 RNA 성분에 대한 앤티센스 RNA 또는 부정합 텔로머라제 RNA 성분의 형질발현에 의한 인체 유전자 요법에 사용되는 플라스미드 및 기타 다른 유전자 치료용 벡터를 들 수 있다(예, 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터 등). 이와 관련하여, 본 발명은 상기 치료제와 함께 약학적으로 허용되는 담체 또는 염을 포함하는 약학 조성물을 제공하며, 이 조성물은 치료제의 표적 전달을 위해 리포펙션 복합체, 리포좀 또는 면역리포좀 중에 제제를 포함시킬 수 있다. 또한 본 발명은 상기 텔로머라제 매개된 치료제와 다른 의약, 예를 들면 항종양제 및 기타 세포독성제 또는 세포성장억지제; 항진균제(예: AIDS 환자 치료용); 뉴클레오티드, 뉴클레오시드 및 이들의 유사체; 및 종양, 과형성, HIV 감염/AIDS 및 관련 병리학, 및 비정상적인 말단소립 대사를 특징으로 하는 기타 다른 질병과 같은 증상의 치료에 적합한 기타 약제와의 배합물을 제공한다. 본 발명의 방법은 포유류 텔로머라제 내의 텔로머라제 RNA 성분에 특이적으로 하이브리드할 수 있는 유도체화된 폴리뉴클레오티드의 사용을 포함하며, 이때 유도체화된 폴리뉴클레오티드는 텔로머라제 활성을 가진 포유류 세포내로 전달되어 텔로머라제 RNA 성분에 편재화하여 텔로머라제 활성을 불활성화 또는 억제시킴으로써 텔로머라제 활성을 억제한다.
또한, 본 발명은 텔로머라제 RNA 성분의 형성을 억제하거나 증가시켜 텔로머라제의 기능을 조절함으로써 종양 또는 세포소멸을 억제하는 치료제를 제공하며; 이 치료제는 의약으로서 사용될 수 있다. 이와 같은 의약은 많은 인체 및 수의학적 질병을 치료하는 데 사용될 수 있는데, 그러한 질병의 예로는 종양, 과형성, 신경변성 질병, 노화, AIDS, 진균 감염 등을 들 수 있다. 한 실시양태로서, 상기 치료제는 기능성 텔로머라제 완전효소의 형성을 경쟁적으로 억제할 수 있는 효소적으로 불활성인 텔로머라제 RNA 성분이나, 또는 텔로머라제 RNA 성분 서열 또는 그 보체를 전사시킬 수 있는 유전자 치료용 벡터로 이루어진다.
제3 양태로서, 본 발명은 한 세포, 세포군 또는 조직 샘플, 또는 이들중 어느 하나의 추출물중에 존재하는 인체 텔로머라제의 RNA 성분, 텔로머라제 또는 텔로머라제 활성의 정도, 양 또는 존재를 측정하는 진단 방법을 제공한다. 이와 관련하여, 본 발명은 상기 방법에 유용한 시약(상기한 바와 같은 프라이머 및 프로브 포함)을 제공하며, 경우에 따라 상기 시약은 진단 방법을 실시하는데 있어서 킷트를 사용하는 지침서와 함께 킷트 형태로 포장되기도 한다.
본 발명은 인체 환자의 질병(예:종양)을 진단하는 방법을 제공하며, 이 방법에서는 진단 분석법(예: 인체 텔로머라제 RNA 성분 또는 유전자 서열에 특이적으로 결합하는 표지화된 텔로머라제 RNA 성분 프로브를 이용한 고정된 세포의 동일계상 폴리뉴클레오티드 하이브리드화)을 사용하여 인체 환자로부터 얻은 생물학적 샘플에 텔로머라제 RNA 성분이 소정의 질병 특유의 농도로 존재하는지의 여부를 결정하며; 만일 상기 분석법이 정상의 범위 밖의(예를 들면 소정의 질병 특유의 농도 범위 이상의) 텔로머라제 RNA 성분의 존재를 시사한다면, 그 환자는 질병의 증상 또는 소인을 가진 것으로 진단된다.
한 실시양태로서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 병리학적 증상 또는 유전병자 질환의 진단에 이용되는데, 그 증상이나 질환의 예로는 종양, 과형성, 조기 또는 비정상적인 세포 노쇠와 관련된 또는 텔로머라제 기능과 관련된 기타 다른 의학적 질환, 더욱 구체적으로는 텔로머라제 RNA 성분 또는 유전자 서열의 구조적 또는 양적 변화를 포함하고, 또는 RELP 및/또는 대립유전자 특이적인 PCR, 또는 기타 적당한 검출 방법에 의해 검출될 수 있는 질병 특유의 텔로머라제 RNA 성분 대립 유전자와 관련이 있다. 통상, 상기 방법은 인체 환자의 질병(예: 종양) 진단을 위한 것으로서, 진단 분석법(예: 텔로머라제 RNA 성분의 양 및/또는 구조 결정)을 사용하여 인체 환자로부터 얻은 생물학적 샘플중의 세포에 소정의 질병 특유의 농도 또는 구조의 텔로머라제 RNA 성분이 존재하는지의 여부를 결정하며; 만일 그 분석법이 정상 범위 밖의(예를 들면 소정의 질병 특유의 농도범위 이외의) 질병 특유의 양의 텔로머라제 RNA 성분의 존재를 시사한다면, 그 환자는 질병 증상 또는 질병 소인을 가진 것으로 진단된다.
제4 양태로서, 본 발명은 재조합 텔로머라제 제제 및 그 제제를 제조하는 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 인체 텔로머라제의 단백질 성분, 뿐만 아니라 본 발명의 재조합 RNA 성분과 관련있는 인체 텔로머라제의 RNA 성분과 실질적으로 상동성을 갖는 RNA 성분을 지닌 포유류종 유래의 텔로머라제의 단백질 성분을 포함하는 재조합 인체 텔로머라제를 제공한다. 이와 같은 본 발명의 재조합 RNA 성분 분자는 천연 발생된 RNA 성분 분자와 하나 이상의 염기 치환, 결실, 말단 부가 및/또는 삽입에 의해 구별되는 RNA 성분 분자, 및 재조합 숙주 세포에서 생성되는 천연 발생적인 RNA 성분 분자와 동일한 RNA 성분 분자를 포함한다. 이와 같은 재조합 텔로머라제 분자를 제조하는 방법은 텔로머라제의 단백질 성분을 형질발현하는 진핵 숙주 세포를 본 발명의 RNA 성분 분자를 암호하는 재조합 형질발현 벡터에 의해 형질전환시키는 단계 및 상기 벡터에 의해 형질전환된 숙주 세포를 텔로머라제 단백질 성분 및 텔로머라제 RNA 성분이 형질발현되고 조합되어 염색체 DNA 의 말단소립에 서열(천연의 텔로머라제에 의해 첨가된 것과 동일한 서열일 필요는 없음)을 첨가할 수 있는 활성의 텔로머라제 분자를 형성할 수 있는 조건하에서 배양하는 단계를 포함한다.
제5 양태로서, 본 발명은 인체 텔로머라제의 단백질 성분, 및 인체 텔로머라제의 RNA 성분과 실질적으로 상동성을 갖는 RNA 성분을 가진 포유류 종으로부터 유래한 텔로머라제의 단백질 성분을 정제하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 상기한 바와 같은 단백질 성분을 암호하는 핵산을 분리 및 식별하는 방법을 제공한다. 이러한 맥락에서 본 발명은 정제된 인체 텔로머라제 및 인체 텔로머라제의 RNA 성분과 실질적으로 상동성인 RNA 성분을 가진 포유류 종의 정제된 텔로머라제, 뿐만 아니라 상기 텔로머라제 제제 하나 이상의 성분을 암호하는 정제된 핵산을 제공한다. 또한, 본 발명은 텔로머라제의 단백질 성분 또는 텔로머라제의 단백질 성분을 암호하는 핵산과 상호작용하거나 그 핵산을 암호하는 핵산을 활성 성분으로서 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
제6 양태로서, 본 발명은 포유류 텔로머라제 활성을 조절하는(즉, 억제, 증가 또는 특이성의 변화) 제제를 식별하기 위한 방법을 제공한다. 이와 같은 텔로머라제 조절제는 작은 분자인 경우가 많으며(예를 들면, 약 3000 달톤 이하), 이 제제는 대개 치료용으로서 생체외 또는 생체내에서 텔로머라제 활성을 조절하는데 사용될 수 있으며, 또한 실험용 시약 및/또는 의약으로서 사용된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 포유류 텔로머라제 RNA 성분과 텔로머라제 단백질 성분의 비공유 결합을 조절함으로써 텔로머라제 활성을 조절하는 후보 제제를 제제의 뱅크 또는 라이브러리에서 식별하기 위한 방법을 제공한다. 텔로머라제 RNA 성분은 필요에 따라 화학적으로 합성되거나 또는 숙주 세포에서 재조합 주형으로부터 제조할 수 있다. 통상적으로, 자연 발생의 텔로머라제 RNA 성분(예, RNAse 처리에 의해)이 제거된 것일 수 있고, 예컨대 텔로머라제 발현 세포로부터 정제될 수 있는 포유류 텔로머라제 단백질 성분은 적당한 수성 결합 조건하에서 포유류 텔로머라제 RNA 성분과 접촉시키면 부가 제제의 부재하에서(즉, 대조용 결합 반응에서) RNA와 단백질 성분간의 비공유 결합을 형성한다. 그 다음, 제제의 라이브러리 또는 뱅크에서 선택된 1종 이상의 제제의 존재하에서 텔로머라제 RNA 성분과 단백질 성분간의 비공유 상호작용의 크기를, 텔로머라제 RNA와 단백질 성분을 포함하되, 제제(들)가 결여된 대조용 결합 반응에 있어서의 비공유 상호작용의 크기와 비교하고; 텔로머라제 RNA와 단백질 성분간의 비공유 결합의 크기를 통계적으로 현저히 증가시키는 제제를 후보 텔로머라제 조절제로서 결정한다. 비공유 결합의 상대적 크기는 경쟁 결합 분석법과 같은 특이적인 결합 친화도의 측정, 적당한 말단소립 반복 주형에 대한 텔로머라제 촉매 활성의 측정, 또는 포유류 텔로머라제의 RNA와 단백질 성분간의 작용성 비공유 상호작용의 기타 적당한 분석법, 예컨대 겔 전이 또는 EMSA(전기영동성 전이 분석)에 의해 측정할 수 있다.
후보 텔로머라제 조절제를 검출하기 위한 비공유 결합 분석의 한 구체예로서, 텔로머라제 RNA 성분 또는 단백질 성분중 하나 또는 둘 모두를 적당한 검출성 라벨로 표지한 뒤, 제제의 라이브러리 또는 뱅크에서 선택된 제제의 존재 및 부재하에서 각각 비공유 결합을 측정한다. 비공유 결합의 측정은 표지화된 텔로머라제 성분(RNA 성분 또는 단백질 성분)이 별도로 표지되었거나 표지되어 있지 않음에 관계없는 그의 동족(cognate) 텔로머라제 성분(각각 단백질 성분 또는 RNA 성분)에 결합된 정도를 측정하는 것을 포함하는데, 그 방법은 예컨대, 상기 표지화된 텔로머라제 성분과 상기 동족 텔로머라제 성분을 포함하는 결합 복합체를 포획하고(예, 고정시킴), 이 결합된 복합체로부터 결합되지 않은 표지된 텔로머라제 성분을 분리(예, 세정함)하여 분리된 결합 분획을 만들고, 검출성 라벨의 존재를 측정함으로써 분리된 결합 분획중의 결합 복합체를 검측하는 것을 포함한다. 텔로머라제 RNA 및 단백질 성분의 비공유 결합을 통계적으로 현저히 감소 또는 증가시키는 제제를 후보 텔로머라제 조절제로서 감별한다. 비공유 결합을 감소시키는 제제는 후보 텔로머라제 억제제(또는 길항제)인 반면, 텔로머라제 성분의 비공유 결합을 증가시키는 제제는 후보 텔로머라제 작동제이다.
한 실시양태로서, 후보 텔로머라제 조절제는 정제된 텔로머라제 단백질 성분 및 텔로머라제 RNA 성분을 포함하는 포유류 텔로머라제의 효소 활성을 통계적으로 현저히 증가 또는 감소시키는 정도에 따라 감별한다.
한 실시양태로서, 후보 텔로머라제 조절제는 대사적으로 활성인 포유류 세포 중에서 포유류 텔로머라제 RNA 성분 유전자, 바람직하게는 인체 텔로머라제 RNA 성분 유전자의 전사 조절 서열에 작동가능하게 결합된 리포터 폴리뉴클레오티드 서열(예, β-갈락토시다제 유전자, 루시퍼라제 유전자, HPRT 유전자)의 전사를 통계학적으로 현저히 감소 또는 증가시키는 정도에 따라 감별한다. 한 변형예에 있어서, 포유류 세포중의 내인성 텔로머라제 RNA 성분 유전자는 상동성의 표적화 작제물로 표적화하여, 내인성 유전자의 염색체좌에 있는 내인성 텔로머라제 RNA 성분 유전자의 상류 전사 조절 서열(예, 프로모터)에 리포터 폴리뉴클레오티드 서열을 작동가능한 결합으로 배치한다. 또다른 변형예에서는, 리포터 폴리뉴클레오티드를 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 포유류 텔로머라제 RNA 성분 유전자 전사 조절 영역(예, 프로모터 및 상류 전사 인자 결합 부위)에 작동가능하게 결합시키고; 이 외인성 폴리뉴클레오티드를 포유류 세포로 전이시키면 염색체 위치에 비상동적으로 통합될 수 있고, 및/또는 에피솜성 폴리뉴클레오티드로서 복제되거나 유지된다. 제제로 처리된 세포중에서 리포터 폴리뉴클레오티드의 통계학적으로 현저한 전사 조절을 야기하는 제제는 후보 포유류 텔로머라제 조절제로서 간주한다.
후보 텔로머라제 조절제를 감별하는 조성물로는 통상 하기 (1) 내지 (5)의 성분을 포함한다: (1) 예컨대, 텔로머라제 발현 포유류 세포, 바람직하게는 영장류(예, 인간) 세포에서 정제될 수 있고, RNase 처리나 또는 RNA 성분은 제거하면서 적당한 결합 조건에서 동족 텔로머라제 RNA 성분의 존재하에 텔로머라제 활성을 복원시킬 수 있는 단백질 특성을 유지시킬 수 있는 다른 처리 방법으로 존재할 수도 있는 관련 RNA 성분을 통상 제거한 포유류 텔로머라제 단백질 성분, (2) 포유류 텔로머라제 RNA 성분, 바람직하게는 세포중에서 재조합 폴리뉴클레오티드의 전사에 의해 생성되는 인체 RNA 성분, 및 (3) 수성 결합 조건(예, 생리적 조건, 텔로머라제 분석 조건), 및 임의로 (4) 통상적으로 상기 RNA 성분의 말단소립 반복 상보성 주형부 서열에 대하여 상보성인 하나 이상의 복제가능하거나 또는 신장가능한 포유류 텔로머라제 반복 서열을 포함하는 리포터 폴리뉴클레오티드, 및 임의로 (5) 말단소립 분석 조건하에서 리포터 폴리뉴클레오티드의 상기 말단소립 반복 서열(들)의 복제 및/또는 신장에 적당한 뉴클레오티드. 이와 같은 조성물에 통상적으로 제제를 첨가하여, 이 제제를 첨가하지 않은 대조용 조성물과 비공유 결합 및/또는 텔로머라제 활성을 비교 분석한다.
제7 양태로서, 본 발명은 포유류 텔로머라제 RNA 성분 유전자의 무효(null) 대립 유전자를 제공한다. 이 유전자는, 예컨대 이종 폴리뉴클레오티드의 상동 유전자를 포유류 텔로머라제 RNA 성분 유전자중에 표적화함으로써 이 텔로머라제 RNA 성분 유전자를 기능적으로 불활성화시킴으로써 제조한다. 또한, 본 발명은 텔로머라제 RNA 성분 무효 대립유전자를 포함하는 인간을 제외한 녹아웃(knockout) 동물을 제공하며, 한 변형예로서, 텔로머라제 RNA 무효 대립유전자에 대해 동형 접합성이고, 내인성 텔로머라제 RNA 성분이 결여됨으로써 실질적으로 내인성 텔로머라제 활성도 결여된 인간을 제외한 녹아웃 동물을 제공한다. 이 녹아웃 동물은 기타 많은 용도들중에서도 텔로머라제 조절제를 감별 또는 조사하는 약학 연구 실험실에 판매되는 독물 선별용의 시판 피시험자로서, 애완동물로서, 그리고 농업용 가축으로서 사용된다.
본 발명의 제8 양태로서, 포유류 세포, 예컨대 바람직한 발효세포를 생물 반응기중에서 무한증식시키거나 또는 상업적인 연구 시약으로서 유리한 특징을 지닌 바람직한 세포균주를 무한증식시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 텔로머라제 단백질 성분의 존재하에서 작용성 텔로머라제 효소를 형성시킬 수 있는 작용성 텔로머라제 RNA 성분을 발현하는 폴리뉴클레오티드를 포유류 세포에 도입시키는 것을 포함한다.
본 발명의 기타 특징 및 장점은 이하의 상세한 설명 및 도면, 바람직한 실시태양, 실시예, 및 특허청구의 범위에 의해 자명해질 것이다.
용어 정의
본원에서 사용된 용어 "텔로머라제 RNA 성분 폴리뉴클레오티드"란 20개 이상의 뉴클레오티드로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 의미하며, 여기에서, 폴리뉴클레오티드는 자연 발생적인 포유류 텔로머라제 RNA 성분 서열, 통상적으로 영장류의 텔로머라제 RNA 성분, 예컨대 인간 또는 원숭이 텔로머라제 RNA 성분과 85％ 이상 동일한 20개 이상의 뉴클레오티드 단편을 포함한다. 자연 발생적인 텔로머라제 RNA 성분 서열 또는 이의 보체와 비교해 볼 때 서열 변형을 가진 일부 텔로머라제 RNA 성분 폴리뉴클레오티드는 하이브리드화 프로브, PCR 프라이머, LCR 증폭인자, 부정합 RNA 성분등으로서 적합할 수 있다.
본원에서 사용된 "상응하는"이란 용어는 폴리뉴클레오티드 서열이 대조용 폴리뉴클레오티드 서열의 일부 또는 전부와 상동성(즉, 동일하나, 엄격히 진화적 관련성은 없음)이거나, 또는 폴리펩티드 서열이 대조용 폴리펩티드 서열과 동일함을 의미한다. 이와는 대조적으로 본원에 사용된 "상보적"이란 용어는 상보적인 서열이 대조용 폴리뉴클레오티드 서열의 일부 또는 전부와 상동성임을 의미한다. 일례로, 뉴클레오티드 서열 "TATAC"는 대조용 서열 "TATAC"에 상응하고, 대조용 서열 "GTATA"에 상보적이다.
하기 용어들은 2개 이상의 폴리뉴클레오티드간의 서열 관계를 나태내는데 사용하였다: "대조용 서열", "비교 윈도우", "서열 동일성", "서열 동일성의 퍼센트", 및 "실질적 동일성". "대조용 서열"은 서열 비교시 기본으로서 사용된 서열을 의미하고; 대조용 서열은 보다 큰 서열의 서브세트, 예를 들면 전길이의 텔로머라제 RNA 성분 유전자 서열의 단편일 수 있다. 일반적으로, 대조 서열은 길이가 약 20개 이상의 뉴클레오티드이고, 흔히 길이가 25개 이상의 뉴클레오티드이고, 종종 길이가 50개 이상의 뉴클레오티드이다. 두개의 폴리뉴클레오티드는 각각 (1) 두개의 폴리뉴클레오티드간에 유사성이 있는 서열(즉, 완전한 폴리뉴클레오티드 서열의 일부)을 포함하고, (2) 두개의 폴리뉴클레오티드간에 상이한 서열을 추가로 포함할 수 있으므로, 두개(또는 그 이상)의 폴리뉴클레오티드간의 서열 비교는 통상 "비교 윈도우"에 대하여 두개의 폴리뉴클레오티드의 서열을 비교하여 서열 유사성이 있는 국소 영역을 식별하고 비교함으로써 수행된다.
본원에서 사용된 "비교 윈도우"란 25개 이상의 인접 뉴클레오티드 위치들의 개념상의 단편을 의미하는 것으로, 여기서, 폴리뉴클레오티드 서열은 25개 이상의 인접한 뉴클레오티드로 이루어진 대조용 서열과 비교될 수 있으며, 비교 윈도우중의 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 상기 두개의 서열을 적절히 배열시키기 위해 대조서열(이때 부가 또는 결실부는 포함하지 않음)에 비해 20％ 이하의 부가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 비교 윈도우를 배열하기 위한 서열들의 최적 배열은 스미스 및 워터맨의 문헌[(1981) Adv. Appl. Math. 2: 482]에 기재된 국소 상동성 알고리즘, 니들맨 및 운치의 문헌[(1970) J. Mol. Biol. 48: 443]에 기재된 상동성 배열 알고리즘, 피어슨 및 립프만의 문헌[(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85: 2444]에 기재된 유사성법에 대한 조사, 이들 알고리즘의 컴퓨터 작업(위스콘신 제네틱스 소프트웨어 팩키지 릴리이즈 7.0에서의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA, 제제틱스 컴퓨터 그룹, 미국 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575), 또는 조사에 의해 수행될 수 있고, 각종 방법에 의해 생성된 최고의 배열(즉, 비교 윈도우에 대하여 상동성의 최고 퍼센트를 산출하는 배열)을 선택하였다.
"서열 동일성"은 두개의 폴리뉴클레오티드 서열이 비교 윈도우상에서 동일함(즉, 뉴클레오티드-대-뉴클레오티드를 기본으로 할때)을 의미한다. "서열 동일성의 퍼센트"는 두개의 최적 배열된 서열을 비교 윈도우상에서 비교하고, 동일한 핵산 염기(예, A, T, C, G, U, 또는 I)가 양 서열에서 나타나는 위치의 수를 측정하여 정합되는 위치의 수를 얻고, 정합된 위치의 수를 비교 윈도우의 총 위치수(즉, 윈도우 크기)로 나눈뒤, 그 결과치에 100을 곱하여 서열 동일성의 퍼센트로서 수득하였다. 본원에 사용된 용어 "실질적 동일성"이란 폴리뉴클레오티드가 20개 이상의 뉴클레오티드 수를 지닌 비교 윈도우상에서, 빈번하게는 최소한 30개 내지 50개의 뉴클레오티드를 지닌 윈도우상에서 대조 서열과 비교했을때 80％ 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 85％ 이상의 동일성 및 종종 89 내지 95％의 서열 동일성, 보다 일반적으로는 99％ 이상의 서열 동일성을 지닌 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열의 특징을 표시한다. 이때, 서열 동일성의 퍼센트는 비교 윈도우상에서 대조 서열의 총 20％ 이하가 결실 또는 첨가될 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열과 대조 서열을 비교함으로써 계산한다. 대조 서열은 보다 큰 서열의 서브세트, 예를 들면 본 명세서에 개시된 바와 같은 전 길이 텔로머라제 RNA 성분 유전자 서열의 단편일 수 있다.
특이적인 하이브리드화는 프로브 폴리뉴클레오티드(예, 치환, 결실, 및/또는 첨가를 포함할 수 있는 본 발명의 폴리뉴클레오티드)와 특이적인 표적 폴리뉴클레오티드(예, 텔로머라제 RNA 성분 또는 게놈 유전자 서열)간의 하이브리드의 형성을 나타내고, 여기에서 상기 프로브는 특이적인 표적에 우선적으로 하이브리드하여, 예를 들면, 텔로머라제 RNA 성분 유전자의 하나 이상의 RNA 종(또는 특이적으로 절단 또는 처리된 텔로머라제 RNA 성분 종)에 상응하는 단일 밴드가 적당한 세포 공급원(예, 텔로머라제 RNA 성분을 발현하는 체세포)에서 제조된 RNA의 노던 블롯으로 식별될 수 있다. 포유류 텔로머라제 RNA 성분 또는 인체 말단소립 서열에 특이적으로 하이브리드하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 당 분야에 공지된 열역학적 원리 및 방법과 본원에서 참고로 인용한 매니아티스외 다수의 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2판 ,(1989), 콜드 스프링 하버, 뉴욕] 및 베거 및 킴멜의 문헌[Methods in Enzymology, 152권, Guide to Molecular Cloning Techniques(1987), 아카데믹 프레스, 인코오포레이티드, 샌디에고, 캘리포니아]에 기술된 방법들에 따라 본원에 제공된 서열 데이터를 기초로 하여 제조할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "적당한 결합 조건"은 포유류 텔로머라제 RNA성분이 이의 동족 단백질 성분과 결합하여, 말단소립의 반복 단위를 포함하는 적당한 주형으로부터 말단소립 반복 단위를 촉매적 복제, 수복 및/또는 부가할 수 있는 효소적으로 활성인 텔로머라제 완전효소를 형성하는 수성 조건을 의미한다. 종종, 적당한 결합 조건은 생리적 조건일 수 있다. 본원에 사용된 "생리적 조건"이란 온도, pH, 이온 강도, 점도, 및 생존 개체에 적합하고, 및/또는 통상적으로 생존 배양된 포유류 세포중의 새포내에 존재하는 유사한 생화학적 변수들을 의미하며, 특히 상기 포유류 세포의 핵중에 존재하는 조건이다. 예를 들면, 통상의 실험실 배양 조건하에서 성장된 포유류 세포중의 핵내 또는 세포질 조건은 생리적 조건이다. 생체외 전사 칵테일용으로 적합한 생체외 반응 조건은 일반적으로 생리적 조건이고, 당분야에 공지된 각종 핵 추출물에 의해 예시될 수 있다. 일반적으로, 생체외 생리적 조건은 50-200 mM NaCl 또는 KCl, pH 6.5-8.5, 20-45℃ 및 0.001-10mM 이가 양이온(예, Mg++, Ca++)을 포함할 수 있고, 바람직하게는 약 150 mM NaCl 또는 KCl, pH 7.2-7.6, 5mM 이가 양이온을 포함하고, 종종 0.01-1.0％의 비특이적인 단백질(예, BSA)을 포함할 수 있다. 비이온계 계면활성제(Tween, NP-40, Triton X-100)는 종종 일반적으로 약 0.001 내지 2％, 전형적으로는 0.05-0.2％(v/v)로 존재할 수 있다. 특정 수성 조건은 통상의 방법에 따라 당업자에 의해 선택될 수 있다. 일반적으로, 하기의 완충 수성 조건을 사용할 수 있다: 10-250mM NaCl, 5-50 mM 트리스 HCl, pH 5-8, 임의적으로, 이가 양이온(들) 및/또는 금속 킬레이터 및/또는 비이온 계면활성제 및/또는 막 분획 및/또는 소포제 및/또는 섬광제를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "표지" 또는 "표지된"은 방사성 표지된 아미노산의 병입 또는 표식된 아비딘(예, 광학법 또는 측열법에 의해 측정될 수 있는 형광 마커 또는 효소 활성을 포함하는 스트렙타비딘)에 의해 검출될 수 있는 비오틴부를 폴리펩티드에 결합시키는 것과 같이 검출가능한 마커를 병입시키는 것을 일컫는다. 폴리펩티드 및 당단백질을 표지화하는 다양한 방법은 당 분야에 공지되어 있으며, 이들을 사용할 수 있다. 폴리펩티드에 대한 표지의 예로는 방사성 동위 원소(예, 3H, 14C, 35S, 125I, 131I), 형광 표지(예, FITC, 로다민, 란탄족 인), 효소 표지(예, 양고추냉이 퍼옥시다제, β-갈락토시다제, 루시퍼라제, 알카리성 포스파타제), 비오틴기, 2차 리포터에 의해 인식되는 소정의 폴리펩티드 에피토프(예, 로이신 지퍼 쌍 서열, 2차 항체에 대한 결합 부위, 전사 활성인자 폴리펩티드, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그)가 있으며, 이것에 제한되는 것은 아니다. 몇몇의 구체예에 있어서, 표지는 잠재적 입체 장애를 감소시키도록 다양한 길이의 스페이서 아암을 통해 결합된다.
본 명세서에서 사용된 "통계학적으로 현저한"이란 용어는 비교 분석 판독된 3개 이상의 별도의 측정치 평균값 보다 표준 편차가 2 이상 또는 이하이고, 및/또는 스투덴트 t-검정 또는 기타 통상의 통계학적 유의성 측정법으로 측정시 통계학적으로 유의한 결과(즉, 분석 판독)를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "질병 특유의 농도", "질병 특유의 양", "질병 특유의 하이브리드화 패턴"은 샘플내의 텔로머라제 RNA 성분의 농도, 양 또는 편재화 패턴을 일컬으며, 이는 병리학적 (예, 종양, 노쇠, 면역 결핍, 신경변성, 염증 등) 증상이나 또는 암, 육종 또는 백혈병과 같은 종양 질환을 발생시키는 소인의 존재를 나타낸다. 질병 특유의 양은 예기되고, 및/또는 발표된 통계학적 임상 연구에 의해 설정된 정상적인 임상적 수치 범위 이외에 속하는 세포 또는 세포 샘플내의 텔로머라제 RNA 성분의 함량이다. 일반적으로 종양 질환(예, 암, 육종, 또는 백혈병)에 걸린 개체는 질환을 갖지 않은 정상적인 개체에게 특징적인 농도 범위 이외에 속하는 세포 또는 조직 샘플내의 텔로머라제 RNA 성분의 양을 나타낼 것이며; 특히, 질병 특유의 농도는 평균 정상 수치 밖으로 약 1 이상의 표준 편차를 갖는 값이며, 대개 평균 정상 수치보다 약 2 이상의 표준 편차를 갖는 값이다. 그러나, 기본적으로 모든 임상적 진단 테스트는 허위 양성 또는 허위 음성의 결과를 몇 퍼센트는 산출한다. 진단 분석의 감도 및 선택성은 진단적 목적 및 모든 상관된 조절 조건들을 만족시키기에 충분해야만 한다. 일반적으로, 본 발명의 진단 방법은 환자를 질환의 후보자로서 감별하는데 사용되어, 유능한 보건 전문의에 의해 처치되는 질환의 감별 진단에 부가의 변수로서 제공된다.
본 명세서에서 사용된 용어 "질병 대립 유전자"는 인식 가능한 질병을 형성할 수 있는 유전자의 대립 유전자를 일컫는다. 질병 대립 유전자는 우성 또는 열성일 수 있으며, 직접 질병을 발생시키거나 또는 특정의 유전 이력 또는 이미 존재하는 병리적 증상이 함께 존재할 경우 질병을 발생시킬 수 있다. 질병 대립 유전자는 유전자 푸울에 존재할 수 있거나 또는 신체 돌연변이에 의해 환자내에서 새로이 생성될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "항종양제"는 인체내의 종양의 발생 또는 진행을 억제하는 기능적 특성을 갖는 제제를 일컬으며, 이는 흔히 전이 또는 전이 가능성을 억제한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "작동가능하게 결합된"은 폴리뉴클레오티드 인자들이 기능적 관계로 결합한 것을 일컫는다. 핵산은 다른 핵산 서열과 기능적인 관계를 갖고 위치 되었을때 "작동가능하게 결합"된 것이다. 예를 들면, 프로모터 또는 인헨서는 암호 서열의 전사에 영향을 미칠 경우, 암호 서열에 작동가능하게 결합된 것이다. 작동가능하게 결합된 것은 결합된 DNA 서열이 대개 인접성이며, 2개의 단백질 암호 영역을 결합시키는데 필수적인 경우에는 인접되어 리딩 프레임내에 존재하는 것임을 나타낸다. 그러나, 인헨서는 보통 수 킬로베이스만큼 프로모터로부터 분리되어 있을 경우 기능하게 되고, 인트론 서열은 다양한 길이를 가질 수 있으므로, 몇몇의 폴리뉴클레오티드 인자들은 작동가능하게 결합되어 있지만, 인접성이 아닐 수도 있다. 내인성 유전자의 전사 조절 서열에 해당하는 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 결합된 구조 유전자(예, HSV tk 유전자)는 일반적으로 자연 발생적 유전자와 거의 동일한 일시적이며 세포 종류 특이적인 패턴으로 형질발현된다.
본 명세서에서 사용된 용어 "전사 유니트" 또는 "전사 복합체"는 구조 유전자(엑손), 시스 작용성의 결합된 프로모터 및 구조 서열의 효율적인 전사에 필수적인 기타 다른 시스 작용성 서열, 구조 서열의 적절한 조직 특이성 및 발생성 전사에 필수적인 말단 조절 인자, 및 충분한 전사 및 해독에 중요한 부가의 시스 서열(예, 폴리아데닐화 부위, mRNA 안정성 조절 서열)을 일컫는다.
본 명세서에서 사용된 용어 "전사 조절"은 시스형으로 결합된 구조 서열의 전사를 증가시키거나 억제시키는 능력을 일컬으며; 이러한 증가 또는 억제는 특이한 경우, 예를 들면 유도제를 사용하여 자극한 경우 우발적일 수 있으며, 및/또는 특정 세포 종류에만 명백하게 나타날 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "전사 조절 영역"은 기능적 프로모터 및 임의 결합된 전사 인자(예, 인헨서, CCAAT 박스, TATA 박스, SP1 부위 등)를 포함하는 DNA 서열을 일컬으며, 상기 전사 인자는 전사 조절 영역에 작동가능하게 결합된 폴리뉴클레오티드 서열의 전사에 필수적이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "무효(null) 대립 유전자"는 유전자 좌가 하나이상의 돌연변이 또는 구조적 변화를 포함하여 그 무효 대립 유전자가 기능성 유전자 생성물의 효과적인 형질 발현을 실질적으로 유도할 수 없는 것을 일컫는다. "녹아웃(knockout) 세포"는 내인성 유전자의 하나 이상의 무효 대립 유전자를 갖는 세포이며, 일반적으로, 무효 대립 유전자가 동형 접합성이다. 따라서, 예를 들면, 녹아웃 세포는 텔로머라제 RNA 성분 좌에 있는 무효 대립 유전자가 동형 접합성이어서, 녹아웃 세포는 거의 기능적인 텔로머라제 RNA 성분을 거의 형질발현시킬 수 없다.
도 1. 돌연변이 TRC3 형질발현 안정성 형질전환체로부터 추출한 주형 돌연변이 TRC3 DEAE 세파로스 분획 추출물을 형질발현시키는 세포로부터의 텔로머라제 활성을 다양한 반응 조건하에 통상의 분석법을 사용하여 텔로머라제 활성에 대해 분석했다. MuC+17 TRC3(레인 1, 4, 7, 10, 13, 16 표지된 C * ), MuC TRC-3(레인 2, 5, 8, 11, 14, 17 표지된 C), 또는 MuA TRC 3(레인 3, 6, 9, 12, 15, 18 표지된 A)을 통상의 반응 조건(레인 1-6), 통상의 조건 플러스 0.5mM ddCTP(레인 7-9), 통상의 조건 마이너스 dTTP 플러스 0.5mM ddTTP(레인 10-12) 또는 통상의 조건 마이너스 dATP 플러스 0.5mM ddATP(레인 13-18)하에 분석했다. 레인 1-9의 분석 반응물은 8μM 의 전체 dGTP와 이 중 1μM 의 32P-dGTP(800 Ci/mmol)를 포함했다. 돌연변이 텔로머라제 검출을 용이하게 하기 위해, 레인 10-18의 분석 반응물은 8μM 의 전체 dGTP와 이 중 2μM 의 32P-dGTP(800 Ci/mmol)를 포함했다. 추출물을 DNase 부재 RNase (25㎍/㎖, 10분, 30℃)로 처리한 후, 텔로머라제 분석(레인 1-3, 16-18)을 실시했다. 측면에 위치한 레인은 표시된 바와 같이 뉴클레오티드(nt)의 크기를 갖는 DNA 마커를 포함한다.
도 2. 텔로머라제 RNA 성분(hTR) 및 GAPDH RNA 의 정지 상태 수준은 정량적 RT-PCR을 사용하여 측정했다. 대조예는 모든 PCR 정량 분석이 25 사이클 이하의 선형 범위내인 것으로 나타났다. RT-PCR은 5개의 정상 텔로머라제 음성 세포주인(1-5) 및 5개의 종양 텔로머라제 양성 세포주(6-10) : 1) 1차 태내 폐; 2) 1차 태내 손 피부; 3) 성인의 1차 전립선; 4) 1차 활액 섬유아세포; 5) 포피 섬유아세포; 6) 흑색종 LOX; 7) 백혈병 U251; 8) NCIH23 폐 종양; 9) 결장 종양 SW620; 10) 유방 종양 MCF7 에 대해 분석했다. PCR 생성물을 32P 로 표지하고, 6％ PAGE로 분할한 뒤, 포스퍼이메이저를 사용하여 정량했다. 상대적인 전사는 무작위 유니트로 형질발현되었다.
도 3. 텔로머라제 RNA 성분 앤티센스 및 벡터 조절 세포의 평균 TRF 길이. 10-3-hTR 앤티센스 또는 벡터 조절을 안정하게 형질발현시키는 HeTe7 세포를 하이그로마이신 및 푸로미아신 배지내에서 선별하고, 23PDL 후 형질감염에서 수거했다. 핵 DNA를 정제시키고, HinfI 및 RsaI 로 절단하고, 0.5％ 아가로스 겔에서 전개하였다. DNA를 겔내에서 (TTAGGG)3 올리고뉴클레오티드로 탐침시켜 말단소립 말단 제한 단편(TRF)을 표지화시켰다. 몰레큘라 다이나믹 포스퍼이메이저를 사용하여 상기 겔을 스캐닝하고, 참고 문헌[알소프 일동, (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89 : 10114]에 기재된 바와 같이 평균 TRF를 정량하였다. 점선은 앤티센스 및 대조군에 대한 평균 TRF를 나타낸다.
도 4. 동일계 PCR 법의 개요도.
바람직한 구체예의 설명
본 발명은 라이보핵단백 인체 텔로머라제와 관련된 방법, 제제, 유전적으로 변형된 동물 및 세포, 및 약학적 조성물을 제공한다.
하기에서 사용된 명명법 및 세포 배양에서의 실험 절차, 분자 유전학 및 핵산 화학 및 하기 기재된 하이브리드화는 당분야에 공지되어 있으며, 통상적으로 사용되는 절차이다. 표준 기술을 재조합 핵산 방법, 폴리뉴클레오티드 합성 및 미생물 배양 및 형질 전환(예, 전기침투법, 리포펙션법)에 사용한다. 상기 기술 및 절차는 일반적으로 당분야 및 본 명세서에서 참고로 인용된 참고 문헌[샘브룩 일동, Molecular cloning : A Laboratory Manual, 2판, (1989) 콜드 스프링 하버 래보러토리 프레스, 미국, 뉴욕, 콜드 스프링 하버 소재]에 공지된 통상의 방법에 따라 실시된다.
제조업자에 의해 공급된 명세서에 따라 어플라이드 바이오 시스템즈 올리고뉴클레오티드 합성기로 올리고뉴클레오티드를 합성할 수 있다.
PCR 증폭 방법은 본 명세서에서 참고로 인용된 참고 문헌[PCR Technology : Principles and Applications for DNA Amplification, HA 얼리히 편저, 프리맨 프레스, 미국, 뉴욕주, 뉴욕 소재 (1992); PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications, 이니스, 겔플랜드, 스니스키 및 화이트 편저, 아카데믹 프레스, 미국, 캘리포니아, 샌 디에고 소재(1990); 마틸라 일동, (1991) Nucleic Acids Res. 19 : 4967; 에커트, K.A. 및 컨켈, T.A. (1991) PCR Methods and applications 1 : 17; PCR, 맥퍼슨, 커크 및 테일러, IRL 프레스, 옥스퍼드; 미국 특허 제4,683,202호]에 기재되어 있다.
개요
본 발명의 일부는 전사 조절 요소와 관련된 것을 비롯하여 인체의 텔로머라제의 RNA 성분 및 RNA 성분에 대한 유전자를 클로닝시키고, 분리하는 것에 관한 것이다. 인체 텔로머라제의 RNA 성분의 뉴클레오티드 서열은 하기 제시한다. 편의상, 리보뉴클레오티드(A는 리보아데닌이며, G는 리보구아닌이며, C는 리보시티딘이며, U는 우리딘임)에 대한 표준 약어를 사용하여 제시한다. 당업자는 하기 제시된 서열이 cDNA 의 서열을 나타내는 것이라는 것을 알 수 있는데, 여기에서 리보뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드로 치환되어 있다(우리딘은 티미딘으로 치환된다).
[서열 1]
Figure pct00001
Figure pct00002
상기 서열은 5'-3' 방향으로 제시되어 있으며, 참고로 번호가 매겨져 있다. RNA 성분의 주형 서열은 뉴클레오티드 50-60(5'-CUAACCCUAAC-3')에 표기된 영역내에 위치하며, 이는 약 1⅔의 말단소립 반복 단위로 구성된 말단소립 서열에 상보성을 갖는 것으로 생각된다.
상기 서열은 cDNA 클론에서 유도되며, RNA 성분의 게놈 클론에서 유도된다. RNA 성분이 우선 상응하는 유전자로부터 전사되고, 적어도 RNA 전사물 일부는 상기 제시된 ～560 뉴클레오티드 서열보다 훨씬 길며, 사실상 1000개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 그러나, 완전 기능성 텔로머라제 분자는 상기 제시된 ～560 뉴클레오티드 서열로 구성된 전사물로부터 조합될 수 있다. 천연 텔로머라제내의 RNA 성분의 3'-말단은 상기 서열내의 뉴클레오티드 514-559 에 의해 형성된 영역내에 존재하는 것으로 알려졌으며; 분석에 의해 3'-말단이 뉴클레오티드 538에서 U 잔기가 될 수 있는 것으로 나타났다. 또한, 상기 제시된 서열의 뉴클레오티드 1-559 보다 적은 뉴클레오티드를 포함하는 재조합 RNA 성분 분자를 사용하여 활성 텔로머라제를 제조할 수 있다.
게놈 클론을 식별하고, 이를 람다 벡터 FIXII 에 삽입된 인체 DNA 의 게놈 라이브러리에서 분리했다. RNA 성분 유전자 서열을 포함하는 게놈 클론은 ～15kb 삽입물을 포함하며, 클론 28-1로 표시했다. 이 유전자는 염색체 3 의 q 아암의 원심 말단에 편재화되어 있다. 상기 서열 정보는 내부 HindIII 제한 효소 인식 부위로의 ～15kb 삽입물의 한 말단에서의 SauIIIA1 제한 효소 인식 부위에서 수득했으며, 이는 성숙한 RNA 성분 서열 모두 뿐 아니라, RNA 성분 유전자의 전사 조절 요소를 포함하며, 이의 람다 클론 28-1은 표준 데옥시리보뉴클레오티드 약어를 사용하여 하기에 제시하였으며, 5'-3' 방향으로 나타내었다.
[서열 2]
Figure pct00003
Figure pct00004
RNA 성분서열은 염기 1459에서 시작한다. 각종 전사 조절 인자가 이 서열에서 확인된다. A/T 박스 콘센서스 서열은 뉴클레오티드 1431-1436에서 발견되고, PSE 콘센서스 서열은 뉴클레오티드 1406-1414와 뉴클레오티드 1508-1526에서 발견되며, CAAT 박스 콘센서스 서열은 뉴클레오티드 1399-1406에서 발견되고, SPI 콘센서스 서열은 뉴클레오티드 1354-1359에서 발견되며, β/r-인터페론 반응 인자 콘센서스 서열은 뉴클레오티드 1234-1245에서 발견된다. HT1080(텔로머라제 발현)과 같은 인체세포의 인체 텔로머라제 RNA 성분 유전자의 정상 상태 전사는 뉴클레오티드 1159의 상방 서열이 세포내로 안정하게 형질감염되는 벡터에서 결실되는 경우에 실질적으로 변화하지 않는다.
사람에 비해 유전학적으로 가장 구별되는 비인체 영장류에 속하는 것으로 생각되는 다람쥐 원숭이의 DNA는 개시된 인체 텔로머라제 RNA 성분 폴리뉴클레오티드 서열에 대응하거나 상보성인 서열로 구성되는 PCR 프라이머로 증폭시킬 수 있는 텔로머라제 RNA 성분 유전자를 포함한다. 다른 비인체 영장류들은 인체 텔로머라제 RNA 성분 유전자의 서열로부터 유도된 PCR 프라이머로 증폭시킬 수 있는 텔로머라제 RNA 성분 유전자를 포함하는 것으로 추정된다.
텔로머라제 RNA 성분 폴리뉴클레오티드
인체 텔로머라제에 대해서는 전술한 바와 같고 다람쥐 원숭이 텔로머라제에 대해서는 제5 도에 도시한 바와 같이, 포유류 텔로머라제 RNA 성분 및 그 유전자의 서열이 개시됨으로써 포유류 텔로머라제 RNA 성분 서열 또는 포유류 RNA 성분 유전자 서열과 실질적으로 동일한 15개 이상의 인접 뉴클레오티드의 서열, 일반적으로 20개 내지 25개 이상의 인접 폴리뉴클레오티드의 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 작제할 수 있게 되었다. 또한, 포유류 텔로머라제 RNA 성분(및 유전자)서열로 인해 세포, 세포 샘플, 조직단편, 반응용기, 하이브리드화 막등에서 동족 텔로머라제 RNA 성분 및/또는 유전자의 RNA 및 DNA 서열을 검출하는데 사용할 수 있는 핵산 하이브리드화 프로브 및 PCR 프라이머를 작제할 수 있게 되었다.
포유류 텔로머라제 RNA 성분 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 전사를 용이하게 하는 서열(형질발현 서열), RNA 안정화 서열 등을 포함할 수 있다. 본원 명세서에 개시된 서열정보 및 발명의 교시측면에서 그러한 폴리뉴클레오티드 작제의 일반적인 원칙은 당해기술분야에 공지되어 있으며 매니아티스 등의 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed.(1989), Cold Spring Harbor, N.Y.]에 상세히 개시되어 있다. 예컨대, 상기 폴리뉴클레오티드는 프로모터와, 진핵세포성 형질발현 숙주에 유용한 임의의 인헨서와, 벡터의 복제에 필요한 임의의 서열을 포함할 수 있으며, 이들에 한정되는 것은 아니다. 일반적인 진핵세포성 형질발현 카세트는 전사될 때 포유류 텔로머라제 RNA 성분 전사체를 산출할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으며, 이러한 폴리뉴클레오티드 서열은 예컨대, HSV tk 프로모터 또는 pgk(포스포글리세레이트 키나제) 프로모터와 같은 적합한 프로모터의 하류(전사배향 5' 내지 3'에서)에 결합되며, 이는 인헨서에 결합될 수 있다.
또한, 작용성 텔로머라제 RNA 성분의 형질발현이 바람직하지 않은 경우, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 작용성 텔로머라제 RNA 성분 전사체를 전사할 필요가 없다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 텔로머라제 RNA 성분 RNA 또는 DNA 서열을 검출하기 위한 하이브리드화 프로브 및/또는 PCR 프라이머(증폭인자) 및/또는 LCR 올리고머로서 작용할 수 있다.
대안적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 관련 유전자의 RNA 또는 DNA 서열, 또는 관련 종, 일반적으로 포유류종의 텔로머라제 RNA 성분 유전자를 검출하기 위한 하이브리드화 프로브 또는 프라이머로서 작용할 수 있다. 이러한 하이브리드화 및 PCR에 사용하는 경우, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 작용성 텔로머라제 RNA 성분을 전사할 필요는 없다. 그래서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 포유류 텔로머라제 RNA 성분 서열에 대해 특이적인 하이브리드화 또는 특이적인 증폭을 유지하는 한, 실질적인 결실, 첨가, 뉴클레오티드 치환 및/또는 전위를 포함할 수 있다.
포유류 텔로머라제 RNA 성분의 게놈 또는 cDNA 클론 및 대응하는 유전자 서열은 본 명세서에 개시된 뉴클레오티드 서열을 기초로 하여 작제된 하이브리드화 프로브를 사용하고 문헌[예를 들면, Benton WD 및 Davis RW(1977) Science 196: 180; Goodspeed등(1989) Gene 76: 1]에 개시된 통상의 하이브리드화 선별법을 사용하여 클론 라이브러리(예를 들면, Clontech(Palo Alto,CA 소재)로부터 입수할 수 있는 것)로부터 분리해 낼 수 있다. cDNA 클론이 필요한 경우, 체세포 RNA 또는 다른 텔로머라제 RNA 성분 발현성 세포 RNA로부터 유래된 cDNA를 함유하는 클론 라이브러리가 바람직하다. 대안적으로, 본 명세서에 개시된 서열 전부 또는 일부에 대응하는 합성 폴리뉴클레오티드 서열은 올리고뉴클레오티드의 화학적 합성에 의해 작제할 수 있다. 또한, 본 명세서에 개시된 서열 데이타에 기초한 프라이머를 사용하는 폴리머라제 연쇄반응(PCR)을 사용하여 게놈 DNA, RNA풀, 또는 cDNA 클론 라이브러리로부터 DNA 단편을 증폭시킬 수 있다. PCR법은 미국 특허 제4,683,195호 및 제4,683,202호에 개시되어 있다.
상기한 폴리뉴클레오티드는 텔로머라제 RNA 성분 프로브로서, 세포내에서 작용성 또는 비작용성 텔로머라제 RNA 성분을 생산하는 주형으로서, 텔로머라제 RNA 성분 검출분석을 표준화하기 위한 상업용 진단시약으로서, 동물에 투여하기 위한 유전자 요법용 폴리뉴클레오티드로서와 같은 각종 용도를 가지며, 이러한 폴리뉴클레오티드는 다른 용도중에서도 식품첨가물, 연소성 에너지원, UV 흡수 일광차단제, 및 점도 향상 용질로서도 사용할 수 있다.
인체 텔로머라제의 RNA 성분 및 RNA 성분의 유전자를 클로닝하는 도중에 작제된 본 명세서에 개시된 플라스미드는 본 발명에 의한 중요한 양태를 구성하는 것이다. 이러한 플라스미드는 본 발명에 의한 또 다른 중요한 발명인, 실질적으로 순수한 형태의 인체 텔로머라제의 RNA 성분, 뿐만 아니라 그것의 유전자를 생산하는데 사용할 수 있다. 또한 당업자들은, 인체 텔로머라제 RNA 성분의 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 적어도 그중 유용한 부분을 포함하는 다른 플라스미드, 뿐만 아니라 실질적으로 순수한 형태의 비플라스미드 핵산이 본 발명에 의해 제공되는 유용한 물질임을 인식할 것이다.
핵산과 본 발명의 핵산을 함유하는 제제에 관한 일반적인 사항들로부터, 당업자라면, 본 발명의 핵산이 DNA 및 RNA 분자, 뿐만 아니라 이들의 합성적, 비천연 발생적 유사체, 및 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드 및/또는 이들의 유사체의 헤테로중합체를 포함하는 것임을 인식할 것이다. 본 발명의 핵산 또는 핵산 유사체의 구체적인 조성은 그 물질을 사용하려는 목적과 그 물질이 놓일 환경에 따라 좌우될 것이다. 변형 또는 합성된 비천연 발생성 뉴클레오티드는 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 여러 가지 목적에 사용되고, 그리고 뉴클레아제가 존재하는 것과 같은 여러 가지 환경에서도 안정성을 유지하도록 작제된 것이다. 변형 또는 합성된 비천연 발생성 뉴클레오티드는 천연 발생성 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드에 비해 뉴클레오티드의 탄수화물(당), 포스페이트 결합, 또는 염기부면에서 다를 수 있거나, 경우에 따라서는 비뉴클레오티드 염기를 함유하거나 염기를 전혀 함유하지 않을 수 있다. 예를 들면, 문헌[Arnold 등에 의한 "뉴클레오티드 프로브용 비뉴클레오티드 결합제"라는 명칭의 PCT 출원 공개 WO89/02439]을 참조할 수 있으며, 그 내용은 본 명세서에 참고인용한다. 본 발명의 핵산은 광범위한 뉴클레오티드를 함유할 수 있기 때문에 그러한 핵산들은 광범위의 다양한 기능들을 수행할 수 있다.
동족 유전자의 분리
상기에서 기술한 바에 의해 나타나는 것처럼, 인체 텔로머라제의 RNA 성분의 서열을 포함하는 핵산을 정제함으로써 여러 중요한 이점 뿐만아니라 유용한 진단 방법과 치료 방법 및 시약을 제공하게 된다. 본 발명의 한 가지 중요한 이점은 본 발명의 방법과 시약이, 본 발명의 인체 RNA 성분에 실질적으로 상동성인 RNA 성분을 지닌 임의의 포유류 종 유래의 텔로머라제의 RNA 성분 유전자와 RNA 성분을 분리하는데 이용될 수 있다는 것이다. "실질적으로 상동성"이라는 어구는 인간 RNA 성분의 올리고뉴클레오티드 또는 핵산 서열이 다른 포유류 종의 RNA 성분 서열의 핵산 서열에 특이적으로 하이브리드화하는데 요구되는 상동성 정도를 말한다. 그러한 실질적인 상동성이 있으면, 당업자는 실질적으로 상동성인 서열을 식별하고 분리하는데 본 발명의 핵산과 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 프로브를 이용할 수 있다.
예를 들어, 상동성 서열을 검출하기 위해 게놈 라이브러리 또는 cDNA 라이브러리를 탐침할 수 있다. 또한, 포유류 종의 RNA 또는 DNA 샘플로부터 특이적인 상동성 핵산 서열을 증폭시키기 위해 RNA 성분 서열의 영역에 상응하는 프라이머와, 낮은 또는 중간의 스트린젠시 조건하에서의 PCR 증폭을 이용할 수 있다. 이들 및 다른 유사한 기법들을 이용하여, 당업자는 인체 세포 유래의 다양한 RNA 성분의 핵산 뿐만 아니라 다른 포유류 세포, 예를 들어 영장류, 수의학적 관심의 대상인 포유류, 즉, 소, 양, 말, 개, 고양이, 그리고 설치류, 예를 들어 쥐, 생쥐, 햄스터의 세포 유래의 상동성 RNA 성분 핵산을 쉽게 분리할 수 있다. 한편, 이들 핵산은 텔로머라제 활성을 조절하는 의약의 선별과 시험에 매우 유용한 돌연변이 동물을 만드는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 플라스미드를 이용해, RNA 성분 유전자를 "녹아웃"시키거나, 천연 RNA 성분 유전자를 머스 스프레투스(mus spretus) 배아 간상세포에서 존재하는 재조합 유도성 유전자로 치환한 뒤 연령- 또는 노쇠-관련 질병의 연구를 위한 모델 또는 시험 시스템으로서 유용할 돌연변이 마우스를 제조할 수 있다. 아래 실시예 9는 그러한 방법론이 영장류의 RNA 성분 서열을 식별하고 분리하는데 어떻게 이용되었는가를 보여준다.
인간과 원숭이 텔로머라제 RNA 성분 및/또는 동족 유전자의 다른 포유류 동족체는, 생쥐, 쥐, 토끼, 기니아 피그, 햄스터, 개과, 소과, 양, 이리과, 돼지로부터 유래된 것과 같은 적절한 인간 이외의 포유류 게놈 라이브러리 또는 cDNA 클론 라이브러리, 또는 효모의 합성 염색체, 코스미드, 또는 박테리오파아지 λ(예를 들어, λCharon 35)같은 적절한 벡터에 들어있는 다른 게놈 또는 cDNA 라이브러리를, 인간 또는 원숭이 텔로머라제 RNA 성분 또는 유전자 폴리뉴클레오티드 서열의 약 20개 이상의 인접한 뉴클레오티드 서열(또는 그들의 보체)을 포함하는 폴리뉴클레오티드 프로브로 선별하여 식별하고 분리할 수 있다. 일반적으로, 하이브리드화 및 세척 조건은 통상적인 하이브리드화 과정에 따라 높은 스트린젠시에서 행해진다. 양성 클론을 분리하고 서열을 확인한다. 한정을 위해서가 아니라 예로써, 인간 텔로머라제 RNA 성분의 559 뉴클레오티드 서열에 상응하는 전길이 폴리뉴클레오티드를 표지하여 λEMBL4 또는 λGEM11(Promega사, Madison, Wisconsin)중에서 만든 비인간의 게놈 클론 라이브러리로부터 게놈 클론을 분리하기 위한 하이브리드화 프로브로서 이용할 수 있다. 플라크 융기물을 선별하는 일반적인 하이브리드화 조건(Benton and Davis (1978) Science 196:180; Dunn 등. (1989) J.Biol. Chem. 264: 13057)은 다음과 같을 수 있다: 50％ 포름아미드, 5XSSC 또는 SSPE, 1-5 X 덴하르트 용액, 0.1-1％ SDS, 100-200 ㎍의 전단된 이종의 DNA 또는 tRNA, 0-10％ 의 덱스트란 설페이트, 약 1X108 cpm/㎍의 비활성을 가지는 변성된 프로브 1X105 내지 1X107 cpm/ml, 그리고 약 6-36시간동안 42℃-37℃에서 항온 배양한다. 예비하이브리드화 조건은 프로브가 포함되지 않고 항온 배양시간이 일반적으로 감소된다는 점을 제외하고는 실질적으로 같다. 세척 조건은 통상적으로 1-3X SSC, 0.1-1％ SDS, 45-70℃이고 약 5-30분째 세척 용액을 교환한다. 인체 텔로머라제 RNA 성분 폴리뉴클레오티드 프루브로 비인간 텔로머라제 RNA 성분 폴리뉴클레오티드를 분리하기 위해, 대략 39℃같은 낮은 스트린젠시에서 하이브리드하고 하기의 단계별 온도에서 순차적으로 세척하는 것이 바람직하다: 상온, 37℃, 39℃, 42℃, 45℃, 50℃, 55℃, 60℃, 65℃, 및 70℃, 각 단계 후 멈추고 백그라운드 프로브 시그널을 모니터하고(그리고 만일 방사성 표지된 프로브가 사용되는 경우에는 자동 방사성사진 및/또는 인 영상기법으로 시그널을 선택적으로 검출함), 실험적으로 결정된 바에 따라, 적절한 시그널/노이즈 비가 수득될 때 세척 단계를 마친다.
인간과 원숭이 텔로머라제 RNA 성분 서열에 대해 본 명세서에 제시된 뉴클레오티드 서열에 상응하거나 또는 그 서열에 상보적인, 대략 30-50개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게는 100개 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 개시된 유전자와 RNA 성분 서열에 상응하는 배선 유전자를 식별하고 분리하기 위한 PCR 프라이머 및/또는 하이브리드화 프로브로 이용할 수 있다. 그러한 배선 유전자는 당업계에서 일반적인 다양한 방법에 의해 분리될 수 있는데, 예컨대, 박테리오파아지 λ로 만든 게놈 라이브러리 또는 코스미드 라이브러리를 하이브리드화 선별 방법 또는 본문에 개시된 서열로부터 얻어진 프라이머를 사용하는 게놈 서열의 PCR 증폭 방법도 포함된다(이에 한정되는 것은 아님). 인체 게놈 라이브러리는 공공연히 입수용이하거나 인체 DNA로부터 새로이 작제할 수도 있다.
뉴클레오티드 치환, 결실 및 첨가를 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 병입할 수 있다는 것은 당업자에게 명백한 것이다. 뉴클레오티드 서열 변이는 다양한 대립 유전자의 서열 다형성등으로부터 나타날 수 있다. 그러나, 그러한 뉴클레오티드 치환, 결실, 및 첨가는, 폴리뉴클레오티드가 특이적인 하이브리드화만이 일어나기에 충분히 엄중한 하이브리드화 조건하에서 본원에 제시된 전길이 인체 또는 원숭이 텔로머라제 RNA 성분 폴리뉴클레오티드 서열중의 하나에 하이브리드하는 작용을 실질적으로 방해해서는 안된다.
포유류 텔로머라제 RNA 성분 폴리뉴클레오티드는 하이브리드화 프로브와 PCR(또는 LCR) 프라이머로 사용되는 것과 같은 짧은 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 20-100 염기 길이)일 수 있다. 폴리뉴클레오티드 서열은 또한 더 큰 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 텔로머라제 RNA 성분 클론을 포함하는 클로닝 벡터)의 일부를 구성할 수 있으며, 폴리뉴클레오티드 결합에 의해 다른 폴리뉴클레오티드 서열에 연결될 수 있다. 일반적으로, 텔로머라제 RNA 성분 폴리뉴클레오티드는 자연발생의 텔로머라제 RNA 성분 또는 유전자 서열과 실질적으로 동일한 25개 이상의 연속된 뉴클레오티드를 포함하며, 더 일반적으로는 텔로머라제 RNA 성분 폴리뉴클레오티드는 자연발생의 포유류 텔로머라제 RNA 성분 서열과 실질적으로 동일한 50 내지 100개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함한다. 그러나, 텔로머라제 RNA 성분 표적 서열에 특이적인 하이브리드화를 실시하는데 요구되는 텔로머라제 RNA 성분 폴리뉴클레오티드의 최소 길이는 몇 가지 인자에 따라 달라질 것이라는 것은 당업자에게 자명한 것이다: 그 중에서도 특히, G/C 함량, 부정합 염기의 위치(만일 존재한다면), 표적 폴리뉴클레오티드 군과 비교했을때 그 서열의 고유도, 및 폴리뉴클레오티드의 화학적 특성(예를 들어, 메틸포스포네이트 백본, 폴리아미드 핵산, 포스포로티올레이트 등)이 있다.
필요하다면, 거의 총길이의 cDNA 복사체를 증폭시키기 위한 PCR 증폭 인자는 실무자의 재량으로 선택할 수 있다. 유사하게, 텔로머라제 RNA 성분 유전자(원숭이 또는 인간)의 일부를 증폭시키기 위한 증폭인자도 선택할 수 있다.
이들 서열의 각각은 텔로머라제 RNA 성분의 존재를 검출하기 위한 하이브리드화 프로브 또는 PCR 증폭인자로 이용될 수 있으며, 예로써 세포중의 증가되거나 감소된 텔로머라제 RNA 성분 농도의 존재를 특징으로 하는 종양 질환을 진단하거나, 또는 조직 형별 결정(예를 들면, 텔로머라제 RNA 성분의 발현을 특징으로 하는 조직 식별)용 등으로서 사용될 수 있다. 그 서열은 또한 법의학적 DNA 분석(예를 들어 RFLP 분석, PCR 생성물 길이 분포 등) 또는 텔로머라제 RNA 성분 유전자의 증폭 및/또는 재배열을 특징으로 하는 질병의 진단 등과 같이, DNA 샘플 내의 게놈성 텔로머라제 RNA 성분 유전자 서열을 감별하는데 이용될 수 있다.
한정을 위해서가 아니라 예로써, 하기의 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍은 텔로머라제 RNA 성분 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, cDNA)을 증폭시키기 위해 또는 하이브리드화 프로브(예를 들어, 비오틴화된 또는 말단-표지된 올리고뉴클레오티드 프로브)로서 이용될 수 있다:
5'-AGCACACTGGCCCAGTCAGTCAGGTTTG-3' 및
5'-GGGTTGCGGAGGGAGGGTGGGCCTGGGA-3'.
다른 적절한 PCR 프라이머, LCR 프라이머, 하이브리드화 프로브 및 프라이머등은 본원에서 밝혀지고 얻어질 수 있는 텔로머라제 RNA 성분 서열로부터 당업자라면 명백히 인지할 수 있는 것이다. 인간 텔로머라제 RNA 성분 폴리뉴클레오티드와 그들의 보체는 포유류 텔로머라제 RNA 성분의 RNA 또는 DNA 서열을 감별하기 위한 하이브리드화 프로브 또는 프라이머로 작용할 수 있다. 그러한 하이브리드화 및 PCR 수행에 사용되는 경우에는 상당한 결실, 첨가, 뉴클레오티드 치환 및/또는 전위를 포함할 수 있는데, 단 인체 텔로머라제 RNA 성분 서열의 특이적인 하이브리드화 또는 특이적 증폭은 유지되어야만 한다. 그런데, 그러한 뉴클레오티드 치환, 결실, 및 첨가는, 그 폴리뉴클레오티드가 특이적인 하이브리드화를 산출하기에 충분히 엄중한 하이브리드화 조건하에서 텔로머라제 RNA 성분 또는 유전자 서열에 하이브리드하는 작용을 실질적으로 손상시키지 않아야 한다.
제한을 위해서가 아닌 예로써, 인체 텔로머라제 RNA 성분 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드 48 내지 뉴클레오티드 209의 서열을 포함할 수 있는데, 이 서열은 텔로머라제 단백질 성분의 존재하에서 인체 텔로머라제 완전효소를 재구성하기에 충분한 것으로 생각된다:
[서열 3]
Figure pct00005
또는 DNA인 경우:
[서열 4]
Figure pct00006
또한, 인체 텔로머라제 RNA 성분 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드 1-559를 포함하거나 그들로 이루어질 수 있으며, 다른 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 서열의 말단 첨가를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 48-209로 이루어지나 말단소립 반복 주형 서열이 변화된 주형-혼합 변이체는, 텔로머라제 단백질 성분에 결합하여 텔로머라제 완전효소를 재구성하기 위해, 야생형 서열 48-209로 이루어진 절단된 RNA 성분과 경쟁할 수 있다.
인체 텔로머라제 RNA 성분을 구조적으로 분석한 결과 헤어핀 루프와 같은 이차 구조를 형성하는 경향을 가지는 영역을 나타내었다. 예를 들어, 인체 텔로머라제 RNA 성분의 대략 뉴클레오티드 200 내지 뉴클레오티드 350까지의 영역은 상당한 헤어핀 루프 특성을 가진다. 텔로머라제 RNA 성분의 다른 부분 역시 중요한 이차 구조의 특성을 가졌다. 이와 같이 주지된 이차 구조면에서, 당업자는 컴퓨터 분석에 의해 유사한 이차 구조를 형성하는 것으로 예측되는 다른 뉴클레오티드 서열로 치환시킬 수 있다. 다양한 컴퓨터 프로그램이 실질적으로 동등한 이차 구조를 가지는 뉴클레오티드 서열을 결정하는데 적합한데도 불구하고, UWGCG 서열 분석 소프트웨어 팩키지 프로그램 FOLD, SQUIGGLES, CIRCLES, DOMES, NOUNTAINS, 그리고 STEMLOOP 등이 사용될 수 있다. 유사하게, 펩티드 핵산같은 비뉴클레오티드 구조 모사체등은 모사되어져야할 인체 텔로머라제 RNA 성분 영역(들)의 특징적인 이차 구조의 모사체로서 분자 모델링 프로그램에 의해 작제될 수 있다. 그러한 구조적인 모사체는 치료용으로서 또는 다양한 용도로 이용될 수 있다(예를 들어, 경쟁적 길항제 등).
앤 티 센 스
본 발명의 한 가지 특히 유용한 형태의 핵산은 인체 텔로머라제의 활성을 억제하기위해 생체내에서 또는 시험관내에서 이용될 수 있는 앤티센스 올리고뉴클레오티드이다. 앤티센스 올리고뉴클레오티드는 인체 텔로머라제의 RNA성분의 뉴클레오티드의 특정 서열에 상보적인, 약 10개 내지 약 25 - 200개 또는 그 이상(즉, 안정된 이중 나선을 형성할 만큼 충분히 크지만 필요한 경우 전달 양상에 따라, 생체내에 투여할 수 있을 만큼 충분히 작은)의 뉴클레오티드의 특정 서열을 포함한다. 그러한 올리고뉴클레오티드의 작용기작은, 기능성 리보핵단백질 텔로머라제의 조합을 방지하거나, RNA 성분이 말단소립 DNA 합성의 주형으로 작용하지 못하도록 하거나, 텔로머라제 RNA 성분을 불안정화시켜 그 반감기를 감소시키거나, 및/또는 텔로머라제 RNA 성분 유전자의 전사를 억제하기 위해, RNA 성분의 결합에 관련될 수 있다.
생체내에서 그리고/또는 시험관내에서 텔로머라제 활성을 억제하는 작용을 하는 본 발명의 예시적인 앤티센스 올리고뉴클레오티드는 클론 pGRN7이 인체 텔로머라제의 RNA 성분에 대한 cDNA를 포함하는가를 결정하기위한 시험과 연계되어 상기에서 언급된 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 상기에서 제시한 바와 같은 세개의 올리고뉴클레오티드를 시험관 내에서의 텔로머라제 활성의 억제를 설명하기 위해 이용하였다. 이들 올리고뉴클레오티드 각각의 서열은 다음과 같다:
T3 5'-CTCAGTTAGGGTTAGACAAA-3'
P3 5'-CGCCCTTCTCAGTTAGGGTTAG-3'
TA3 5'-GGCGCCTACGCCCTTCTCAGTT-3'
이들 올리고뉴클레오티드는 또한 인체 세포에서 텔로머라제 활성을 억제하는데 이용할 수 있다.
당업자는 본 발명이 텔로머라제 활성을 억제할 수 있는 다양한 앤티센스 올리고뉴클레오티드를 제공함을 인식할 것이다. 본 발명의 또 다른 유용한 앤티센스 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 Tel-AU 이며, 이것은 5'-CAGGCCCACCCTCCGCAACC-3'의 서열을 가지며, 본 발명의 임의의 앤티센스 올리고뉴클레오티드처럼, 안정성과 원하는 Tm을 부여하도록 포스포로티오에이트 뉴클레오티드, 키랄-메틸 포스포네이트, 자연 발생성 뉴클레오티드, 또는 이들의 혼합물을 이용해서 합성할 수 있다. 당업자는 O-메틸 리보뉴클레오티드, 포스포로티오에이트 뉴클레오티드, 및 메틸 포스포네이트 뉴클레오티드같은 다양한 변형된 뉴클레오티드 유사체가, 자연 발생의 뉴클레오티드를 이용해 생성된 핵산보다 더 바람직한 특성(즉, 뉴클레아제-내성, 더욱 친밀한 결합 등)을 가지는 본 발명의 핵산을 생성하기 위해 이용될 수 있음을 인식한다. 올리고뉴클레오티드에 뉴클레아제 내성을 부여하기 위한 다른 기법은 PCT 특허 공개 번호 94/12633호에 기술된 것을 포함한다.
텔로머라제 활성의 조절에 관한 부가적인 양태는, 인체 텔로머라제 RNA 성분 유전자 또는 그 유전자의 전사된 RNA에 대한 앤티센스 폴리뉴클레오티드 같은, 인체 텔로머라제 RNA 성분(hTR)서열의 전부 또는 일부에 상보적인 특이적 앤티센스 폴리뉴클레오티드를 이용하는 방법을 포함하며, 이 앤티센스 폴리뉴클레오티드에는 텔로머라제 완전효소와 결합될 수 있는 절두 형태도 포함한다. 이러한 상보적인 앤티센스 폴리뉴클레오티드는 텔로머라제 RNA 성분 또는 그 유전자에 상응하는 관련 표적 서열에 대한 특이적 결합이 폴리뉴클레오티드의 기능적 특성으로서 보유되는 한, 뉴클레오티드 치환, 첨가, 결실, 또는 전위를 포함할 수 있다. 상보적인 앤티센스 폴리뉴클레오티드는 텔로머라제 RNA 성분 종에 특이적으로 하이브리드하여 텔로머라제 RNA 성분 유전자의 전사를 방지할 수 있는, 가용성 앤티센스 RNA 또는 DNA 올리고뉴클레오티드를 포함한다(Ching 등. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 10006; Broder 등. (1990) Ann. Int. Med. 113: 604; Loreau 등. (1990) FEBS Letters 274: 53; Holcenberg 등., WO91/11535; U.S.S.N. 07/530,165; WO91/09865; WO91/04753; WO90/13641; 그리고 EP 386563, 이들 각각은 본 명세서에서 참고 문헌으로 인용된다). 따라서 앤티센스 폴리뉴클레오티드는 기능성 텔로머라제 RNA 성분의 생성을 억제한다. 텔로머라제 RNA 성분의 발현(전사비 및/또는 RNA 안정성)은 텔로머라제 완전효소의 활성화 및 효소 활성과 관련이 있기 때문에, 텔로머라제 RNA 성분에 상응하는 RNA의 전사, 및/또는 텔로머라제 RNA 성분과 인체 텔로머라제의 단백질 성분과의 상호작용, 및/또는 텔로머라제 RNA 성분과 말단소립 서열의 상호작용을 저해하는 앤티센스 폴리뉴클레오티드는 앤티센스 폴리뉴클레오티드 부재하에서 텔로머라제 활성을 발현하는 세포의 텔로머라제 활성을 억제하고, 및/또는 무한증식성 또는 종양의 형질 전환과 같이 표현형을 바꿀 수 있다. 텔로머라제 RNA 성분 앤티센스 폴리뉴클레오티드의 치료학적 유효량을 함유하는 조성물은 세포 발병에 텔로머라제 활성을 요구하는 질병(예를 들어, 종양)을 치료하거나 또는 필요한 경우, 생식체 생성 또는 유지를 막기 위해(예를 들어, 피임제로서) 투여될 수 있다. 그러한 앤티센스 폴리뉴클레오티드는, 종종 일반적으로 말단소립 반복 서열에 상보적인 텔로머라제 RNA 성분의 서열에 상보적이거나 또는 텔로머라제 폴리펩티드 서브유니트와 접촉하는 텔로머라제 RNA 성분의 일부에 상보적인, 자연 발생의 텔로머라제 RNA 성분 폴리뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적이면서, 통상 인체 텔로머라제 RNA 성분 서열에 완전히 상보적인, 약 25개 이상의 연속하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 데도 불구하고, 다양한 길이의 앤티센스 폴리뉴클레오티드가 생성될 수 있다.
앤티센스 폴리뉴클레오티드는 형질감염된 세포 또는 돌연변이 세포에서 이종의 발현 카세트로부터 생성될 수 있다. 이종의 발현 카세트는 아데노 바이러스 벡터 또는 아데노-계열 바이러스 벡터같은 유전자 치료용 벡터 또는 다른 유전자 치료용 벡터의 일부일 수 있다. 이종의 카세트는 독립적인 복제를 할 수 없고 당업자에게 공지된 다양한 적절한 방법(예를 들어, 리포펙션, 바이오리스틱스, 리포좀, 면역리포좀, 전기침투 등)의 하나에 의해 세포내로 전달되는 폴리뉴클레오티드상에 존재할 수 있다. 한편, 앤티센스 폴리뉴클레오티드는 생체외 배양배지중에서 또는 생체내 투여용으로서 간질의 공간과 체액(예를 들어, 혈액, CSF)중에서 외부 환경에 투여되는 가용성 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 외부 환경에 존재하는 가용성 앤티센스 폴리뉴클레오티드는 세포질에 접근하여 특정 RNA 종을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 일부 양태에 있어서, 앤티센스 폴리뉴클레오티드는 메틸포스포네이트 부, C-5 프로페닐 부, 2'-플루오로라이보스 당을 포함하거나, 또는 폴리아미드 핵산(PNAs)이다(Egholm 등. (1992) J. Am. Chem. Soc. 114: 1895; Wittung 등. (1994) Nature 368: 561; Egholm 등. (1993) Nature 365: 566; Hanvey 등. (1992) Science 258: 1481, 본 명세서에서 참고문헌으로 인용됨). 앤티센스 폴리뉴클레오티드와 관련된 일반적인 방법에 대해서는 문헌(Antisense RNA and DNA, (1988), D.A. Melton, Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)을 참고하기 바란다.
본 발명의 앤티센스 올리고뉴클레오티드외에도, 접혀진 RNA 성분 또는 그 RNA 성분에 대한 유전자로서 이중 나선의 핵산에 결합하여 텔로머라제 활성을 저해하는 삼중 나선-함유 또는 삼중 나선 핵산을 형성하는 올리고뉴클레오티드를 만들 수 있다. 본 발명의 그러한 올리고뉴클레오티드는 삼중 나선 형성의 염기-쌍 형성 규칙과 RNA 성분의 뉴클레오티드 서열을 이용해 만들어진다(Cheng 등. (1988) J. Biol. Chem. 263: 15110; Ferrin과 Camerini-Otero (1991) Science 354: 1494; Ramdas 등. (1989) J. Biol. Chem. 264: 17395; Strobel 등. (1991) Science 254: 1639; Hsieh 등. (1990) 전기 문헌 참조; Rigas 등. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 83: 9591, 본 명세서에서 참고문헌으로 인용됨). 그러한 올리고뉴클레오티드는 텔로머라제 유전자의 전사를 막거나, 텔로머라제의 RNA 성분이 기능성 리보핵단백질 텔로머라제를 형성하거나 말단소립 DNA 합성의 주형으로서 작용하는 것을 방해하는 형태로 텔로머라제 RNA 성분의 이중 나선 부분에 결합하는 것을 포함하여, 다양한 방법으로 텔로머라제 활성을 막을 수 있다. 일반적으로, 그리고 작용 양상에 따라서, 본 발명의 삼중 나선 형성 올리고뉴클레오티드는 텔로머라제의 RNA 성분 또는 텔로머라제의 RNA 성분에 대한 유전자의 특이적 서열에 "상보적인"(본문단에서, 상보적이라는 어구는 안정한 삼중 나선을 형성할 수 있음을 의미함) 약 10개 내지 약 25 - 200개 또는 그 이상까지의(예를 들어, 안정한 삼중 나선을 형성할 만큼 충분히 크지만, 필요한 경우 전달 양상에 따라, 생체내로 투입하기에 충분히 작은) 뉴클레오티드의 특정 서열을 포함한다.
본 발명의 앤티센스 및 3중 나선-형성 올리고뉴클레오티드에 부가하여, 인체 텔로머라제의 RNA 성분의 일부 이상의 서열에 동일한 센스 올리고뉴클레오티드도 또한 텔로머라제 활성을 저해하기 위해 사용할 수 있다. 본 발명의 이러한 유형의 올리고뉴클레오티드는 (1) 기능성 텔로머라제 효소를 형성하는데 필요한 RNA 성분의 전 서열보다 적은 서열 또는 (2) 생성되는 RNA가 비기능성이 되도록 하는 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입 또는 치환 뿐 아니라 기능성 텔로머라제 효소를 형성하는데 필요한 RNA 성분의 완전한 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다. 양 경우에 텔로머라제 활성의 억제는, 인체 텔로머라제의 단백질 성분에 결합하여 불활성 텔로머라제 분자를 형성하는 "돌연변이" RNA 성분 때문인 것으로 관찰된다. 그러므로 이러한 올리고뉴클레오티드의 작용 메카니즘은 비기능성 리보핵단백질 텔로머라제의 조합 또는 기능성 리보핵단백질 텔로머라제의 조합 억제를 포함한다. 하나의 예로서 뉴클레오티드 48-209로 이루어졌으나 말단소립 반복 주형 서열은 변화된 주형-혼합 변이체일 수 있다. 상기 주형-혼합 변이체는 텔로머라제 단백질 성분에 결합하기 위해 경쟁할 수 있다. 이러한 유형의 본 발명의 센스 올리고뉴클레오티드는, 인체 텔로머라제의 RNA 성분내 뉴클레오티드의 특정 서열과 동일한 약 20개, 50개, 100개, 200개, 400개, 500개 또는 그 이상의 뉴클레오티드로 이루어진 특정한 서열을 포함하는 것이 통상적이다.
부가적으로, 앤티센스 폴리뉴클레오티드는 포유류 텔로머라제의 RNA 성분에 대한 하이브리드와 관련하여 실질적으로 방해하지 않는 유도체화된 치환체를 포함할 수 있다. 부가의 화학치환체로 변형된 앤티센스 폴리뉴클레오티드는 대사적으로 활성인 진핵 세포에 도입되어 세포내 텔로머라제의 텔로머라제 RNA 성분과 하이브리드할 수 있다. 통상적으로 이러한 앤티센스 폴리뉴클레오티드는 유도체화된 뒤, 폴리뉴클레오티드 합성동안에 또는 그 후에 각각 부가적인 화학치환체가 부착되어 텔로머라제 RNA 성분내 상보적 서열에 편재화되고 국소 DNA 서열 및/또는 텔로머라제 단백질 성분에 화학적 변형 또는 변화를 야기한다. 부착된 화학적 치환체로는 유로피움 (III) 텍사피린, 가교제, 소랄렌(psoralen), 금속 킬레이트(예, 철 촉매화 절단에 이용되는 철/EDTA 킬레이트), 토포아이소머라아제, 엔도뉴클레아제, 엑소뉴클레아제, 리가아제, 포스포디에스테라아제, 광동력 포피린, 화학요법제(예, 아드리아마이신, 독시루비신), 삽입제(intercalating agent), 염기(base)-변형제, 면역글로블린 쇄, 및 올리고뉴클레오티드가 바람직하다. 폴리뉴클레오티드 서열의 국소 절단이 필요한 경우, 철/EDTA 킬레이트가 특히 바람직한 화학 치환체이다(허츠버르그 외 다수, (1982) J. Am. Chem. Soc. 104: 313 ; 허츠버르그 및 더반 (1984) Biochemistry 23: 3934; 테일러 외 다수, (1984) Tetrahedron 40: 457; 더반, 피.비. (1986) Science 232: 464 참고). 스트렙트아비딘/비오틴 및 디곡시제닌/항-디곡시제닌 항체 결합방법이 사용될 수도 있으나, 바람직한 부착 화학은 예를 들면 측쇄 반응성 아미노기를 통한 직접 결합(본원에 참고로 인용된 코리 및 슐츠 (1988) Science 238: 1401 참고) 및 다른 직접 결합 화학을 포함한다. 화학 치환체를 결합시키는 방법은 미국 특허 제5,135,720호, 제5,093,245호 및 제5,055,556호(본원에 참고로 인용된 문헌들임)에 개시되어 있다. 다른 결합 화학도 실무자의 재량으로 사용될 수 있다. 포유류 텔로머라제 RNA 성분의 모든 부분 또는 거의 모든 부분에 상응하는 폴리뉴클레오티드(즉, "센스" 폴리뉴클레오티드)도 또 유도체화하여, 게놈내 말단소립 반복서열과 반응하여 염색체의 말단소립 영역에서 화학적 환경의 다른 변형 또는 부가물을 생성하는데 사용할 수 있다.
부정합 주형
따라서, 본 발명의 다른 유용한 올리고뉴클레오티드는 인체 텔로머라제의 RNA 성분이 변화되거나 또는 돌연변이된 서열을 포함한다. 유(Yu) 외 다수의 문헌(1990, Nature 344: 126)은 테트라히메나 텔로머라제 RNA 성분의 돌연변이 형태가 테트라히메나 세포의 텔로머라제내로 도입될 수 있다는 것 및 이러한 도입이 상기 세포에 유해한 영향을 미친다는 것을 개시하고 있다. 인체 텔로머라제 RNA 성분의 돌연변이 형태의 도입이, 텔로머라제 활성을 갖지 않는 정상인의 세포에는 영향을 미치지 않고, 텔로머라제 활성을 가지는 인체세포에 대해서만 유사한 영향을 미칠 수 있다. 이러한 돌연변이 형태로는 서열 5'-CTAACCCTA-3'가 5'-CAAACCCAA-3', 5'-CCAACCCCAA-3' 또는 5'-CTCACCCTCA-3' 로 돌연변이된 것을 포함한다. 이들 변화된 RNA 성분 서열 각각은 염색체 DNA에 도입된 말단소립 반복 단위를 변화시켜, 염색체 구조 및 기능에 영향을 미친다. 상기 올리고뉴클레오티드는 말단소립 DNA의 제한효소 분해 또는 신장된 텔로머라제 기질을 통해 변화된 RNA 성분의 존재에 대한 진단 방법에 유용한 제한효소 인식 부위를 함유하도록 설계될 수 있다.
본 발명의 이러한 양태를 설명하기 위해, 복제의 SV40 오리진(프로모터 활성은 없음)뿐 아니라 람다 클론 28-1(하기 실시예 7 참조)로부터의 ～2.5 kb HindIII-SacI 단편을 포함하는 플라스미드(미국 모식균배양수집소에서 수탁번호 ATCC 제75926호로 입수용이한 pGRN33)를 사용하여 부위 특이적 변이를 실시하였다. 생성되는 플라스미드 pGRN34(5'-CAAACCCAA-3' 포함), pGRN36(5'-CCAACCCCAA-3' 포함) 및 pGRN37(5'-CTCACCCTCA-3' 포함)를 사용하여 진핵 숙주 세포(SV40 거대 T 항원을 발현하는 293 유래의 세포주)를 형질전환하였고, 그 형질전환체로부터의 세포 추출물을 사용하여 텔로머라제 분석을 실시했다.
분석 결과 세포내 텔로머라제 활성이 변화된 서열을 포함하는 핵산을 형성시킨다는 것을 나타냈으며, 이는 게놈성 클론이 기능성 RNA 성분 유전자를 포함하고 플라스미드가 변화되었으나 기능성인 RNA 성분 유전자를 포함한다는 것을 암시한다. 이 결과는 본 발명이 재조합 텔로머라제 제제 및 이 제제의 제조방법을 제공하는 방법을 설명해준다. 본 발명은, 본 발명의 재조합 RNA 성분과 기능적으로 관련된 인체 텔로머라제의 단백질 성분을 포함하는 재조합 인체 텔로머라제를 제공한다. 본 발명의 이러한 재조합 RNA 성분 분자는, 재조합 숙주 세포내에서 생산되는 천연 발생의 RNA 성분 분자와 동일한 RNA 성분 분자 뿐 아니라 하나 이상의 염기가 치환, 결실 또는 삽입되어 천연적으로 발생하는 RNA 성분 분자와는 다른 것을 포함한다. 상기 재조합 텔로머라제 분자를 제조하는 방법은 텔로머라제의 단백질 성분을 발현하는 진핵 숙주 세포를, 본 발명의 RNA 성분 분자를 암호하는 재조합 발현 벡터로 형질전환시키고, 그 단백질 성분 및 RNA 성분이 발현되고 조합되어 염색체 DNA의 말단소립에 서열(천연 텔로머라제에 의해 첨가되는 서열과 동일할 필요는 없음)을 첨가할 수 있는 활성 텔로머라제 분자를 형성하는 환경하에서 상기 벡터로 형질전환된 숙주세포를 배양하는 것으로 구성된다. 상기 재조합 DNA 발현 벡터(또는 플라스미드)의 다른 유용한 양태는, 결실, 삽입 또는 유전자를 비기능성으로 만드는 다른 변형이 있는 인체 텔로머라제의 RNA 성분에 대한 유전자를 포함하는 플라스미드를 포함한다. 매우 효율적인 형질전환 및 재조합 시스템이 필요하긴 하지만, 상기 플라스미드는 특히 내인성 RNA 성분 유전자를 "녹아웃" 시키는 인체 유전자 치료법에 유용하며 처리된 세포를 비가역적으로 치사시킨다.
리보자임 양태
리보자임이라고 불리는 본 발명의 다른 올리고뉴클레오티드는 텔로머라제 활성을 억제하기 위해 사용될 수 있다. RNA, DNA 또는 텔로머라제 단백질 성분에 결합하는 상기 앤티센스 및 다른 올리고뉴클레오티드와 달리, 리보자임은 표적 RNA에 결합할 뿐 아니라 특이적으로 졀단시켜 표적 RNA(예, 인체 텔로머라제의 RNA 성분)를 상당히 불활성화시킨다. 상기 리보자임은 텔로머라제 RNA에 상보적인 5'- 및 3'-말단 서열을 함유할 수 있다. 절단 부위에 따라 리보자임은 텔로머라제 효소를 불활성화시킬 수 있다. 상기 PCT 특허공개 번호 제93/23572호 참고. 인체 텔로머라제 RNA 성분의 RNA 서열을 고려하여 당업자는 여러개의 유용한 리보자임 표적 부위가 존재하며, 예를 들면 햄머헤드 모티프 리보자임에 의해 절단되기 쉽다는 것을 알 것이다. 본 발명의 이러한 예시적인 리보자임은, 하기에 제시된 서열을 지니는 RNA 분자인 리보자임을 포함한다.
1: 5'-UAGGGUUACUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACAAAAAAU-3'
2: 5'-UUAGGGUCUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAAGACAAAA-3'
3: 5'-UCUCAGUCUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAAGGGUUA-3' , 및
4: 5'-CCCGAGACUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACCCGCG-3'
텔로머라제 활성의 리보자임-매개된 억제에 대한 다른 최적 표적부위는 본원에 참고인용된 설리반 외 다수의 문헌(PCT 특허공개 번호 제94/02595호) 및 드레이퍼 외 다수의 문헌(PCT 특허공개 번호 제93/23569호)에 의해 기재된 바와 같이 결정될 수 있을 것이다. 본원에 참고로서 삽입된 휴 외 다수의 문헌(PCT 특허공개 번호 제94/03596호)에 기재된 바와 같이 앤티센스 및 리보자임 기능은 단일 올리고뉴클레오티드내에서 결합될 수 있다. 더구나 리보자임은 본 발명의 예시적인 앤티센스 올리고뉴클레오티드의 설명과 관련하여 상기한 바와 같이 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드, 또는 뉴클레오티드 사이의 변형된 결합을 포함한다. 일 양태로, RNase P(인체 또는 대장균 유래)의 촉매적 서브유니트는 변형되어(알트만 에스(1995) Biotechnology 13: 327), 말단소립 반복 서열에 대해 염기쌍을 이루는 포유류 텔로머라제 RNA 성분의 부분에 상응하는 가이드 서열을 생성한다. 상기 RNase P 변형체는 말단소립 서열을 절단할 수 있다. 일 양태로, RNase P(인체 또는 대장균 유래)의 촉매적 서브유니트는 변형되어 텔로머라제 RNA 성분의 부분에 상보적인 가이드 서열을 생성하여, RNase P 변형체가 텔로머라제 RNA 성분을 절단할 수 있다. 상기 조작된 리보자임은 세포내에서 발현되거나 다양한 방법(예, 리포좀, 면역리포좀, 바이오리스틱(biolistics), 세포내로의 직접적인 흡수 등)으로 전이될 수 있다. 리보자임의 다른 형태, 즉 제1군 인트론 리보자임(세치 티 (1995) Biotechnology 13: 323); 햄머헤드 리보자임(에딩턴 에스엠 (1992) Biotechnology 10: 256)이 인체 텔로머라제 RNA 성분 및/또는 사람 말단소립 반복 서열의 절단을 촉매하기 위해 개시된 텔로머라제 RNA 성분 서열 정보를 기준으로 조작될 수 있다.
그러므로 본 발명은 텔로머라제 활성을 억제하는 다양한 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 이 올리고뉴클레오티드는 질병을 치료하는 본 발명의 치료법에 사용될 수 있는데, 이 방법은 환자에게 치료학적 유효량의 본 발명의 텔로머라제 억제제 또는 활성제를 투여하는 것을 포함한다. 텔로머라제 억제 또는 활성화를 측정하여 상기 계류중인 미국 특허 출원 및 PCT 특허 공개 제93/23572호에 기재된 분석 프로토콜을 사용하여 치료학적 유효량으로 전달되어야 하는 약제의 양을 결정할 수 있다. 상기 출원들에서 언급되고 상기에서 논의한 바와 같이, 텔로머라제 활성의 억제는 무한증식성 세포를 죽게 만드는 반면, 텔로머라제 활성의 활성화는 세포의 복제적 수명을 증가시킬 수 있다. 텔로머라제 억제 치료는 무한증식성 세포의 제어되지 않는 성장을 비롯한 암에 대한 효율적인 치료이고, 텔로머라제 활성 치료는 세포 노쇠를 억제하는 효율적인 치료이다. 텔로머라제 활성을 억제하거나 차단하는 약제(예, 앤티센스 올리고뉴클레오티드, 삼중 나선 형성 올리고뉴클레오티드, 리보자임, 또는 텔로머라제의 돌연변이 RNA 성분의 발현을 구동시키는 플라스미드)의 전달은 텔로머라제 활성을 억제할 수 있고 궁극적으로 세포를 노쇠시키고 처리된 세포를 괴사시킨다.
치료 및 예방양태
게다가 본 발명은 정상세포가 사멸성을 유지하도록 하는 치료방법을 제공한다. 예를 들면, RNA 성분을 표준 유전공학 공정을 사용하여 변형시켜 유전자 재조합에 의해 상기 성분을 암호하는 천연 유전자의 전체 또는 일부를 결실(예, 시험관내 돌연변이유발에 의함)시킬 수 있다. 그후 상기 세포는 비가역적으로 사멸성이 될 것이다. 이 공정은 발현 플라스미드를 함유하도록 변형된 정상세포가 환자에 도입되는 경우의 유전자 치료에 유용하며, 암세포가 도입되지 않도록하거나 상기 세포가 도입된 경우 세포를 비가역적 사멸성으로 만드는 유전자 치료에 유용하다.
텔로머라제가 종양, 배선(germline) 및 조혈계의 특정한 간상세포(stem cell)에서만 활성을 가지므로, 다른 정상세포는 텔로머라제 억제 치료법에 의해 영향을 받지 않는다. 필수적인 것은 아니나, 텔로머라제 억제제가 배선 또는 간상세포에 접촉하는 것을 피하기 위한 단계를 취할 수 있다. 예를 들면 배선 세포는 텔로머라제 활성을 발현하기 때문에 텔로머라제 억제는 정자생성 및 정자 생존성에 유해한 영향을 미칠 수 있고 이는 텔로머라제 억제제가 피임제 또는 불임제로서 유효할 수 있다는 것을 암시한다. 그러나, 암치료를 위해 본 발명의 텔로머라제 억제제를 투여받는 환자에게는 피임 효과가 바람직하지 않을 수 있다. 이러한 경우에 사람은 치료기간동안만 억제제가 생산되어 배선세포에 대한 음성 효과가 일시적이 되도록 하는 방식으로 본 발명의 텔로머라제 억제제를 투여할 수 있다.
본 발명의 다른 치료방법은, 텔로머라제 활성을 자극하고 복제 세포수명을 연장시키기 위해 본 발명의 텔로머라제 RNA 핵산을 사용한다. 이 방법은 세포에 본 발명의 작용성 재조합 텔로머라제 리보핵단백질을 전달하여 수행할 수 있다. 예를 들면, 리보핵단백질은 리포좀 형태로 세포에 전달될 수 있거나, 인체 텔로머라제 RNA 성분에 대한 유전자(또는 상이한 조절 요소를 지닌 재조합 유전자)는 진핵 발현 플라스미드로 사용되어(텔로머라제 단백질 성분의 발현을 암호하는 서열의 존재 또는 부재하), 텔로머라제 단백질 성분 또는 RNA 성분의 낮은 발현정도 때문에 검출가능한 텔로머라제 활성이 부족한 다양한 정상 인체 세포내에서 텔로머라제 활성을 활성화시킬 수 있다. 텔로머라제 RNA 성분이 텔로머라제 활성을 자극하기에 충분하지 않다면, RNA성분은 텔로머라제의 단백질 성분을 발현시키는 유전자와 함께 형질감염되어 텔로머라제 활성을 자극할 수 있다. 그러므로, 본 발명은 세포를 세포내의 텔로머라제 활성을 변화시키는 치료학적 유효량의 약제와 접촉시켜 세포 또는 세포군내에서 텔로머라제 활성과 관련된 증상을 치료하는 방법을 제공한다.
텔로머라제 RNA 유전자의 여분의 복사체를 혼입한 세포는 텔로머라제 활성의 증가 및 관련된 복제 수명의 연장을 나타낼 수 있다. 이러한 치료가 차후의 숙주로의 도입을 위한 세포상에서 생체외에서 수행될 수 있거나 생체내에서 수행될 수 있다. 생체외에서 외인성 텔로머라제 유전자를 정상 이배체(diploid) 세포에 첨가함으로써 말단소립 길이를 증가시키거나 안정화시키는 것의 장점은 다음과 같다: 말단소립 안정화는 세포 노쇠를 저지할 수 있어 세포의 비제한적인 증폭을 허용하며; 수명이 연장된 정상 이배체 세포는 약물 시험, 바이러스제조, 또는 다른 유용한 목적으로 시험관내에서 배양될 수 있다. 더구나 생체외 증폭된 다양한 유형의 간상 세포는 상기한 바와 같이, 특정한 질병에 대한 세포 치료법에 사용될 수 있다.
말단소립을 안정화시키면 말단소립이 발병 상태의 세포처럼 매우 짧아지는 것을 방지하여 복제 세포내 암 발생을 억제할 수 있다. 발병 상태중에, 말단소립 캡의 보호 효과가 상실됨에 따라 다량의 게놈 불안정성이 야기된다. 이 "유전자 갑판"이 재셔플링되면 대부분의 세포가 죽는다. 이 과정으로부터 나타나는 진귀한 세포는 통상적으로 많은 유전자가 재배열된 이수체(aneuploid)이고, 텔로머라제를 발현함으로써 그 말단소립내 안정성의 회복을 종결한다. 말단소립을 길게 유지하여 발병상태를 방지할 수 있다면, 발병상태와 관련된 게놈 불안정성도 방지될 수 있어, 개별적인 세포가 전이암을 생성하기 위한 소정의 수의 유전자 돌연변이를 겪는 비율을 감소시킨다.
텔로머라제 유전자 치료(표적 세포의 텔로머라제 활성을 증가시키는 요법 포함)에서 표적화될 수 있는 세포는 조혈 간상 세포(AIDS 및 후-화학요법), 혈관내 내피세포(심장 및 대뇌 혈관 질병), 피부 섬유아세포 및 기저 피부 각질세포(상처 치유 및 화상), 연골세포(관절염), 두뇌 성상세포 및 소교 세포(알츠하이머병), 골아세포(골다공증), 망막 세포(눈 질병), 및 췌장도 세포(제I 유형 당뇨병)를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
통상적으로, 본 발명의 치료방법은 생체내 생리학적 조건하에서 텔로머라제 활성을 억제하거나 자극하도록 기능하며 상기 조건하에서 안정할 올리고뉴클레오티드의 투여를 포함한다. 상기한 바와 같이, 변형된 핵산은 올리고뉴클레오티드가 소정의 조직, 기관 또는 세포로 투여되는 것을 확신시키기 위해서 뿐 아니라 이러한 안정성을 부여하는데 유용할 수 있다. 치료적 목적으로 사용되는 올리고뉴클레오티드의 투여에 유용한 방법은 본원에 참고로 삽입된 이노우에 외 다수의 문헌(미국특허 제5,272,065호)에 기재되어 있다.
올리고뉴클레오티드를 적합한 약학적 제제내의 약으로서 직접 투여할 수도 있고, 본 발명의 유전자 요법 및 재조합 DNA 발현 플라스미드를 사용하여 올리고뉴클레오티드를 투여할 수도 있다. 이러한 예시적인 플라스미드의 하나가 하기 실시예 8에 기재되어 있다. 일반적으로 이러한 플라스미드는 에피솜 유지 또는 염색체 통합을 제공하고 필요한 경우 높은 정도의 전사를 제공하는 다른 조절 인자뿐 아니라 프로모터, 및 선택적으로는 올리고리보뉴클레오티드의 전사를 구동시키는 인헨서(enhancer, 프로모터 서열내에 함유된 것과 별도임)를 포함한다. 아데노바이러스계의 벡터가 유전자 요법에 종종 사용되는데, 이것은 본 발명의 시약 및 방법과 함께 사용하기에 적합하다. PCT 특허 공보 제94/12650호, 제94/12649호 및 제94/12629호 참고. 이러한 목적에 유용한 프로모터는 메탈로티오네인 프로모터, 구성적인 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 덱사메타손-유도성 MMTV 프로모터, SV40 프로모터, MRP polIII 프로모터, 구성형 MPSV 프로모터, 테트라사이클린-유도성 CMV 프로모터(예, 사람 즉시 초기 CMV 프로모터) 및 구성형 CMV 프로모터를 포함한다. 유전자 요법에 유용한 플라스미드는 선택성 마커, 동정 영역, 및 다른 유전자와 같은 다른 기능적 인자를 포함할 수 있다. 시험관내 화학 합성에 의해 올리고뉴클레오티드를 짧게 만드는 것이 더 경제적일 수 있으나, 유전자 요법에 의한 방법 외의 다른 방법에 의해 투여되는 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 제조하기 위해 재조합 DNA 발현 플라스미드를 사용할 수도 있다.
관련된 양태로, 본 발명은 치료학적 유효량의 본 발명의 텔로머라제 억제제 또는 텔로머라제 활성제를 포함하는 약학 조성물을 특징으로 한다. 본 발명의 텔로머라제 억제제의 약학 조성물은 인체 텔로머라제의 돌연변이성 RNA 성분, 인체 텔로머라제의 RNA 성분 또는 RNA에 대한 유전자에 결합하는 삼중나선-형성 올리고뉴클레오티드 또는 앤티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 인체 텔로머라제 RNA 성분을 절단시킬 수 있는 리보자임, 또는 약학적 허용가능한 담체 또는 염내의 동일하거나 상이한 약제의 혼합물을 포함한다. 본 발명의 다른 약학적 조성물은 정제된 인체 텔로머라제 또는 텔로머라제의 단백질 성분에 대한 mRNA 및 텔로머라제의 RNA 성분과 같은 텔로머라제 활성화 제제를 포함하며, 노쇠-관련된 질병을 치료하기 위해 사용된다. 일 양태로, 돌연변이된 센스 포유류 텔로머라제 RNA 성분은 세포 집단에 투여한다. 상기 돌연변이된 센스 텔로머라제 RNA 성분은 인체 텔로머라제 반복 서열과 관련한 염기 부정합을 하나 이상 포함하나, 인체 텔로머라제 폴리펩티드 성분과 관련하여 텔로머라제 활성을 나타내고 인체 텔로머라제 반복서열내 소정의 뉴클레오티드 위치에서 잘못 혼입될 수 있어, 실질적인 복제를 위해 돌연변이된 센스 텔로머라제 RNA 성분의 연속존재에 따라 좌우되는 말단소립을 생성할 수 있다. 천연 발생의 포유류 텔로머라제 RNA 성분에 대한 주형으로서 실질적으로 기능하지 않는 말단소립 서열을 도입하기에 충분한 기간동안 돌연변이된 센스 텔로머라제 RNA 성분을 세포 집단에 투여한 후, 세포 집단내에서 평균 말단소립 길이의 빠른 손실을 야기하고 노쇠 또는 세포 괴사를 증진시키는 돌연변이된 센스 텔로머라제 RNA 성분을 제거하는 치료방법이 제공된다.
치료제는 비경구, 비강, 구강 또는 다른 투여형태에 적합한 제제로 제공될 수 있다. 상기 PCT 특허 공보 제93/23572호 참고.
진단 방법
본 발명은 전술한 약학 제제 및 치료 방법 외에도 진단 방법 및 진단 시약을 제공한다. 본 발명은 세포, 세포 군집단 또는 조직 샘플내에서 인체 텔로머라제의 RNA 성분, 텔로머라제 또는 텔로머라제 활성의 정도, 양 또는 존재를 측정하는 진단 방법을 제공한다. 관련 양태로 본 발명은 그러한 방법에 유용한 시약을 제공하는 데, 이 시약은 그 진단 방법을 실시하기 위한 킷트의 사용법에 관한 지시서와 함께 킷트형태로 패키징될 수도 있다. 클론 pGRN7이 인체 텔로머라제의 RNA 성분에 대한 cDNA를 함유하였는 지를 측정하기 위한 시험과 관련하여 전술한 바와 같이, RNA 성분의 정도는 종양 세포에서 증가된다. 따라서, RNA 성분의 검출은 종양 세포의 유용한 진단특성이다.
또한, 인체 텔로머라제의 RNA 성분(또는 인체 텔로머라제 유전자의 두 가닥중 하나)에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 프라이머를 진단 방법에 사용하여 샘플내 텔로머라제 핵산의 존재를 검출할 수 있다. 프라이머 및 프로브는 표적 핵산 서열과 상보적이어서 그 서열에 결합할 올리고뉴클레오티드이다. 프라이머 및 프로브는 서열 및 길이가 상이할 수 있지만, 주요한 구별 요소는 기능 요소이다: 프라이머는 PCR 증폭반응에서와 같이 DNA 합성을 개시하는 작용을 하는 반면에, 프로브는 통상 표적 핵산에 결합시키는 데에만 사용된다. 프라이머 또는 프로브의 통상의 길이는 8 내지 20개 또는 30개 이상의 뉴클레오티드의 범위를 가질 수 있다. 프라이머 또는 프로브는 검출(즉, 이 목적으로는 통상 방사성 또는 형광성 분자를 사용함) 또는 정제/분리(즉, 이 목적으로는 종종 비오틴 또는 아비딘을 사용함)를 용이하게 하기 위해 표지를 할 수도 있다.
본 발명의 특히 바람직한 진단 방법은 암으로 의심되는 환자에게서 취한 세포 또는 조직 샘플에서 텔로머라제 RNA 성분의 서열을 검출하는 것을 포함한다. 그러한 방법은 통상 표지된 프라이머 또는 프로브를 완전한 정합(상보적인) 서열만이 서로에게 결합(하이브리드화)하는 조건하에 RNA 성분 서열에 결합시키는 것을 포함한다. 샘플내 RNA에 결합된 표지된 재료의 검출은 텔로머라제 활성의 존재 및 암 세포의 존재와 상관관계가 있을 것이다. 일부 세포는 텔로머라제의 RNA 성분을 발현시키지만, 텔로머라제의 단백질 성분의 발현 부족으로 인해 텔로머라제-음성으로 존재할 수 있다. 상기 세포들에서 텔로머라제 활성의 존재를 검출하고자 하는 경우에는, 먼저 단백질을 분리한 후, 단백질 분획이 텔로머라제 RNA 성분을 함유하여 텔로머라제 활성의 존재를 신호하는 지를 측정할 수 있다. 본 발명의 진단 방법은 동일계에서, 통상은 본 발명의 특이적 PCR 프라이머를 사용하여 텔로머라제 RNA 성분의 증폭반응후에 실시하는 조직 생검 및 조직학적 절단에서 텔로머라제 활성의 존재를 검출하는 데에 특히 유용할 수 있다.
본 발명은 또한 환자에게서 외식한 세포에서의 텔로머라제 RNA 성분, 텔로머라제 RNA 성분 유전자의 재배열 또는 증폭반응 검출 또는 질병특유의 텔로머라제 RNA 성분 대립유전자의 검출(예; RFLP 또는 대립유전자-특이적 PCR 분석에 의해)에 의해 질병 상태(예; 종양 또는 종양발현전 상태)의 진단용으로 텔로머라제 RNA 성분 폴리뉴클레오티드 프로브를 제공한다. 통상, 텔로머라제 RNA 성분-특이적 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시킬 수 있는 것과 같이 세포 샘플에서 분리한 대량의 RNA 또는 폴리 A+ RNA 상에서 노던 블로팅, 점 블로팅 또는 용액 하이브리드화를 사용할 수 있지만, 검출은 표지된(예; 32P, 35S, 14C, 3H, 형광성, 비오틴화성, 디곡시제닌화성) 텔로머라제 RNA 성분 폴리뉴클레오티드를 사용하여 동일계 하이브리드화에 의해 실시한다. 동일한 세포형(들)의 비종양 세포와 비교하여 텔로머라제 RNA 성분의 변화된 양을 함유하는 세포는 발병 세포의 후보로 식별될 것이다. 이와 유사하게, 세포 샘플에서 텔로머라제 RNA 성분 유전자좌 또는 그와 연관도가 매우 높은 유전자좌의 질병특유의 재배열 또는 증폭반응은 병리학적 상태 또는 그러한 상태(예; 암, 유전병)로 발전하는 소질의 존재를 식별할 것이다. 폴리뉴클레오티드 프로브는 친자 확인, 또는 범죄 용의자 또는 신원미상 사망자의 확인과 같은 개인의 법정 확인에도 사용된다.
인체 집단내에서, 대립인자 변형체, 제한 부위 다형태성, 및 유전병과 관련된 선천적 텔로머라제 RNA 성분 질병 대립인자를 포함하여 텔로머라제 RNA 성분의 기본적 1차 서열에는 최소의 변형이 존재할 수 있다.
필요에 따라, 거의 전길이의 텔로머라제 RNA 성분의 사본을 증폭시키기 위한 PCR 증폭자(amplimer)는 의사의 판단에 따라 선택될 수 있다. 이와 유사하게, 텔로머라제 RNA 성분 유전자 또는 RNA의 일부를 증폭시키는 증폭인자가 선택될 수도 있다.
텔로머라제 RNA 성분의 발현
전술한 프라이머, 프로브 또는 인체 텔로머라제의 RNA 성분에서 유래한 서열을 포함하는 기타 핵산의 길이 및 그 의도된 기능에 따라, 본 발명의 발현 플라스미드를 이용할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 전길이의 RNA 성분의 재조합적 제조는 본 발명의 재조합 DNA 발현 플라스미드를 사용하여 수행할 수 있는 데, 이때 플라스미드는 적당한 프로모터의 조절하에 전사되도록 배치된 RNA 성분의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함한다. 그러한 플라스미드에 대한 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 세포중 어느 하나일 수 있고, 발현 플라스미드내로의 혼입에 선택되는 기타 조절 요소 및 선별 마커 뿐만 아니라, 프로모터는 제조에 사용된 숙주 세포에 의해 좌우될 것이다.
천연 RNA 성분 유전자, 즉 그 5'-영역에 임의의 조절 서열을 포함하는 프로모터, 및 RNA 성분 암호 영역을 사용하여 비루스 형질전환 또는 암에 의해 무한증식성 인체 세포를 포함한 인체 세포에서 RNA 성분을 발현시킬 수 있다. 그러나, RNA 성분 유전자의 프로모터는 조절할 수 있으며, 그러한 이유 및 다른 이유로, 상이한 프로모터의 조절하에 RNA 성분을 발현시키고자 할 경우가 있다. 한편, RNA 성분 유전자의 프로모터를 RNA 성분 암호 서열과 무관하게 사용하여 당해의 다른 암호 서열을 발현시킬 수 있다. 예를 들면, RNA 성분 유전자의 프로모터를, 쉽게 모니터할 수 있는 베타-갈락토시다제 또는 또다른 효소나 단백질에 대한 암호 서열과 같은 리포터 암호 서열용 암호 서열에 융합시킴으로써, RNA 성분 유전자의 전사의 조절을 연구할 수 있다. 따라서, 인체 텔로머라제의 RNA 성분에 대한 유전자의 프로모터 및 기타 조절 요소를 사용하여 RNA 성분을 발현시킬 뿐만 아니라, 인체 텔로머라제의 단백질 성분, 앤티센스 또는 기타 올리고뉴클레오티드, 그리고 인체 세포내 관심의 기타 유전자 생성물을 발현시킬 수 있다. 인체 텔로머라제의 RNA 성분에 대한 천연 유전자를 포함하는 발현 플라스미드는 유전자 치료를 포함하여 다양한 목적에 특히 유용할 수 있다. 당해분야의 숙련자라면 다양한 발현 플라스미드를 사용하여 본 발명의 유용한 핵산을 제조할 수 있으며, 본원에 사용된 "플라스미드"란 용어가 숙주 세포내로 특이적 유전 정보를 운반하고 일정 기간 동안 그 정보를 유지하는 데 사용될 수 있는 핵산의 유형중의 하나(파지, 비루스, 염색체등에서 유래함)를 지칭함을 잘 알 것이다.
텔로머라제 단백질 성분의 분리
본 발명의 시약에 의해 종래에는 이용된 적이 없었던 인체 및 기타 포유류 텔로머라제 효소의 단백질 성분을 암호하는 핵산을 클로닝 및 분리하는 것도 가능해진다. 그러한 핵산에 대한 연구는 인체 텔로머라제의 RNA 성분의 핵산 서열을 포함하는 핵산에 의해 제공되는 것과 상호 보완적인 이점을 제공한다. 예를 들면, 전술한 바와 같이, 본 발명의 치료적 이점은 어떤 경우에는 인체 텔로머라제의 단백질 성분의 정제물을 사용함으로써, 그리고 그 성분을 암호하는 핵산에 대한 연구에 의해 증가될 수 있다. 인체 텔로머라제의 RNA 성분을 암호하는 본 발명의 핵산을 사용하여 인체 텔로머라제의 단백질 성분을 암호하는 핵산을 분리하여 상기 이점에 접근할 수 있다. 따라서, 본 발명은 인체 텔로머라제의 단백질 성분을 분리 및 정제하는 방법, 그리고 인체 텔로머라제의 단백질 성분을 암호하는 핵산을 동정하고 분리하는 방법을 제공한다. 관련 양태로 본 발명은 또한 정제된 인체 텔로머라제, 인체 텔로머라제의 단백질 성분을 암호하는 정제된 핵산, 인체 텔로머라제의 단백질 성분에 대한 재조합 발현 플라스미드를 제공한다. 본 발명은 또한 활성성분으로서 인체 텔로머라제의 단백질 성분, 또는 그 단백질 성분을 암호화하거나 그 단백질 성분을 암호하는 핵산과 상호작용하는 핵산을 함유하는 약학 조성물을 제공하는 데, 상기 단백질 성분을 암호하는 핵산의 예로는 앤티센스 올리고뉴클레오티드, 삼중나선-형성 올리고뉴클레오티드, 리보자임, 또는 이들중 어느 하나에 대한 재조합 DNA 발현 플라스미드가 있다.
인체 텔로머라제의 클로닝된 RNA 성분을 사용하여 리보핵단백질 텔로머라제 효소의 단백질 성분을 암호하는 핵산을 동정하고 클로닝할 수 있다. 몇가지 상이한 방법을 이용하여 단백질 성분의 동정 및 클로닝을 달성할 수 있다. 예를 들면, 친화성 리간드로서 (1) RNA 성분과 상보적이어서 천연 효소의 RNA 성분에 결합하는 뉴클레오티드 서열; 또는 (2) 부분적으로 또는 완전히 변성된 효소의 단백질 성분과 결합하는 RNA 성분을 사용하여 효소 또는 부분적으로 변성된 효소의 친화성 포획법을 사용할 수 있다. 리간드는 고체 지지체에 부가시키거나 계속해서 지지체에 고정시키기 위해 화학적으로 변형(비오틴화)시킬 수 있다. 인체 텔로머라제를 함유하는 세포 추출물을 노출시키고, 지지체에 결합된 텔로머라제 효소를 세정 및 용출시키면 텔로머라제 효소의 고도로 정제된 제제가 수득된다. 그 후, 선택적으로 단백질 성분은 추가로 정제하거나 직접 단백질 서열분석으로 분석할 수도 있다. 결정된 단백질 서열을 사용하여 텔로머라제의 단백질 성분을 암호하는 핵산을 포함하는 유전자 은행내에서 클론을 동정하거나 cDNA를 클로닝하기 위한 프라이머 및 프로브를 제조할 수 있다.
유전자 조작된 RNA 성분을 이용하는 텔로머라제의 친화성 포획법은 시험관내 전사된 텔로머라제 RNA 및 텔로머라제 효소 활성의 재구성 시스템을 사용하여 수행할 수도 있다. 본원에 참고로 인용한 문헌[Autexier and Greider, 1994, Genes ＆ Development 8:563-575] 참조. RNA는 단백질의 에피토프 태그화와 유사하게 표지(tag)를 함유하도록 조작한다. 표지는 견고하게 결합하는 리간드가 이용되는 RNA 서열일 수 있는 데, 그 리간드의 예를 들면, RNA 서열 특이 항체, 서열 특이 핵산 결합 단백질, 또는 특이 RNA 서열에 견고하게 결합하는 유기 염료가 있다. 표지 서열 및 위치에 대한 텔로머라제의 허용성은 표준 방법을 사용하여 시험할 수 있다. 상기 방법의 변형된 RNA 성분의 합성 및 재구성 단계는 생체내에서도 수행할 수 있다. RNA 표지에 대한 고정화된 리간드를 사용한 친화성 포획법을 사용하여 상기 효소를 분리할 수 있다.
발현 검색법(expression screening)을 사용하여 텔로머라제 효소의 단백질 성분을 분리할 수 있다. 이 방법에서, cDNA 발현 라이브러리는 표지된 텔로머라제 RNA를 사용하여 검색할 수 있고, 텔로머라제 RNA에 특이적으로 결합하는 단백질을 암호하는 cDNA를 동정할 수 있다. 해독 억제법을 사용한 분자유전학적 방법을 사용하여 텔로머라제 효소의 단백질 성분을 암호하는 핵산을 분리할 수도 있다. 이 방법에서, 텔로머라제 RNA 서열은 선별 마커의 상류에 융합될 것이다. 선별 마커는 적합한 시스템에서 발현될 때 기능할 것이다. 텔로머라제 RNA 결합 단백질을 암호하는 cDNA가 발현될 때는, 이 단백질은 그 인지 서열에 결합하여 선별 마커의 해독을 차단하고, 따라서 그 단백질을 암호하는 클론을 동정할 수 있게 된다. 본 발명의 다른 양태에서, 선별 마커의 차단된 해독은 형질전환된 세포를 증식하게 할 것이다. 이용될 수 있는 기타 시스템으로는 PCT 특허 공개 제WO 94/10300호에 개시된 "상호작용 트랩 시스템(interaction trap system)"; 문헌[Li and Herskowitz, 1993. 12. 17, Science 262:1870-1874] 및 [Zervos등, 1993. 1. 29, Cell 72:223-232]에 개시된 "원-하이브리드(one-hybrid)" 시스템; 및 클론텍에서 시판되는 "투(two)-하이브리드" 시스템을 들 수 있다.
특이 결합 단백질 및 활성의 검출을 위한 텔로머라제 RNA 결합 또는 텔로머라제 활성 분석법을 사용하여 텔로머라제 효소를 용이하게 정제하고, 이 효소의 단백질 성분을 암호하는 핵산을 용이하게 동정할 수 있다. 예를 들면, RNA 성분 서열을 포함하는 핵산을 친화성 시약으로 사용하여 그 RNA 성분내에 함유된 서열에 특이적으로 결합하는 펩티드, 단백질 또는 기타 화합물, 예를 들면, 인체 텔로머라제의 단백질 성분을 분리, 동정 및 정제할 수 있다. 겔 전이, 필터 결합, 풋프린팅(footprinting), (단백질 블롯의) 노스웨스턴(RNA 프로브) 및 광가교법과 같은 몇가지 상이한 형식을 이용하여 그러한 결합을 검출하고, 그 RNA 성분에 특이적으로 결합하는 성분을 분리한다. 이들 분석법을 사용하여 결합 단백질을 동정하고, 결합 단백질의 정제를 추적하고, RNA 결합 부위를 특성분석하고, 결합 단백질의 분자 크기를 측정하고, 정제 분리용 단백질을 표지하며, 이어서 항체 생성에 대해 동물의 면역화를 위해 전사/해독 결합 시스템에서 단백질을 분리하거나 단백질을 암호하는 핵산을 동정하는 데 사용하기 위한 항체를 수득할 수 있다.
포유류의 텔로머라제 단백질 성분의 정제
HT1080 세포, 293 세포 및 기타 적합한 무한증식성 세포주와 같은 텔로머라제-발현 세포로부터 통상의 생화학적 방법에 의해 포유류의 텔로머라제 단백질 성분을 정제할 수 있다. 비제한적인 예를 들면, 인체 텔로머라제는 본원에 참고로 인용한 1994년 8월 10일에 출원된 미국 특허 출원 제08/288,501호에 개시된 방법과 거의 동일하게 세포 추출물로부터 정제할 수 있다. 포유류의 텔로머라제 추출물은 텔로머라제 단백질 성분을 거의 원상대로, 그리고 재조합법 등에 의해 제조할 수 있는 바와 같이 외인성 텔로머라제 RNA 성분의 첨가로 재구성할 수 있도록 유지하면서, RNAse 활성 또는 기타 적합한 수단으로 처리하여 텔로머라제 RNA 성분을 해리 및/또는 분해함으로써, 텔로머라제 RNA 성분을 제거할 수 있다. 이렇게 정제되고, 임의적으로 내인성 텔로머라제 RNA 성분이 제거된 텔로머라제 단백질 성분을 본원에 개시하는 작용제 검색 분석법에, 그리고 기타 용도로 사용할 수 있다.
유전자 치료
외인성 유전물질을 세포내로 전이시키는 방법(즉, DNA 매개 형질감염)은 세포 생물학 및 분자유전학의 기초 연구의 필수 방법이고, 또한 인체 유전자 치료에 효과적인 방법의 개발의 기초가 되는 필수 방법이다. 지금까지 미국에서 인증된 유전자 전이 실험의 대부분은 레트로비루스 게놈의 일부로서 치료용 폴리뉴클레오티드 서열을 보유하는 복제능 결손형 레트로비루스 벡터에 의존하고 있다(참조문헌; Miller등, (1990) Mol. Cell. Biol. 10:4239; Kolberg R (1992) J. NIH Res. 4: 43; Cornetta등, (1991) Hum. Gene Ther. 2: 215). 아데노비루스 벡터는 또한 인체 유전자 치료에 사용할 수 있는 것으로 개시되어 있다(참조문헌; Rosenfeld등, (1992) Cell 68: 143).
인체에 사용할 수 있는 것으로 인증된 기타 유전자 전이 방법은 리포좀내 플라스미드 DNA를 동일계내에서 종양 세포로 직접 물리적으로 전달하는 방법이다. 배양된 세포에서 전파되어야 하는 비루스 벡터와 달리, 플라스미드 DNA는 균질하게 정제하여 병원체 오염 가능성을 감소시킬 수 있다. 일부 상황(예; 종양 세포)에서는 일시적 발현이 종양 세포를 충분히 사멸시킬 수 있기 때문에, 외인성 DNA를 형질도입된 세포 속으로 안정하게 통합시킬 필요는 없을 수도 있다. 리포좀 매개 DNA 전이법은 많은 연구자들에 의해 개시되었다(참조문헌; Wang and Huang (1987) Biochem. Biophys. Res. Commun. 147: 980; Wang and Huang (1987) Biochemistry 28: 9508; Litzinger and Huang (1992) Biochem. Biophys. Acta. 1113: 201; Gao and Huang (1991) Biochem. Biophys. Res. Commun. 179: 280; Felgner WO91/17424;WO91/16024).
면역리포좀은 또한 외인성 폴리뉴클레오티드의 담체로서 개시되어 있다(참조문헌; Wang and Huang (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 84: 7851; Trubetskoy등 (1992) Biochem. Biophys. Acta. 1131: 311). 면역리포좀은 이론적으로 특정 세포 종류의 표면 항원에 결합하는 것으로 생각되는 특정 항체를 포함함으로써, 리포좀과 비교하여 볼때 향상된 세포 유형 특이성이 있는 것으로 예상될 수 있다. 문헌[Behr등 (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86: 6982]에는 임의의 부가 인지질이 리포좀 형성에 필요함이 없이 형질감염 자체를 매개하는 시약으로서 리포폴리아민의 사용이 개시되어 있다.
따라서, 텔로머라제 RNA 성분 서열 또는 그 보체 서열의 25개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게는 50 내지 100개 또는 그 이상의 뉴클레오티드와 거의 동일한 폴리뉴클레오티드는 이종성 프로모터에 작용적으로 연결되어 인체 세포에서 텔로머라제 RNA 성분 또는 앤티센스 텔로머라제 RNA 성분 폴리뉴클레오티드를 발현시킬 수 있는 전사 단위를 형성한다. 그러한 전사 단위는 돌연변이유전자(transgene), 아데노비루스 벡터, 또는 텔로머라제 관련 질병(예; 종양)의 치료용과 같이 인체 세포로의 전달용의 기타 유전자 치료 형태에 포함될 수 있다. 텔로머라제 RNA 성분 센스 또는 앤티센스 발현 구조물의 적합한 전달 방법은 허용되는 관행 및 조절 요건을 고려하여 의사들에 의해 선택될 것이다.
돌연변이 동물의 실시 양태
포유류의 텔로머라제 RNA 성분, 특히 마우스 텔로머라제 RNA 성분과 거의 동일한 텔로머라제 RNA 성분 유전자의 게놈 클론을 사용하여 기능적으로 차단된 하나 이상의 텔로머라제 RNA 성분 대립인자를 가진 돌연변이 비인간 동물 및 세포를 생성시키는 상동성 표적 구조물을 작제할 수 있다. 상동성 표적 구조물의 작제에 관한 지침은 본원에 참고로 인용한 다음과 같은 당해분야의 문헌에서 찾을 수 있다: [Rahemtulla등 (1991) Nature 353: 180; Jasin등 (1990) Genes Devel. 4: 157; Koh등 (1992) Science 256: 1210; Molina등 (1992) Nature 357: 161; Grusby등 (1991) Science 253: 1417; Bradley등 (1992) Bio/Technology 10: 534]. 상동성 표적작용을 이용하여 소위 "녹아웃(knockout) 마우스를 생성시킬 수 있는 데, 이들 마우스는 불활성화된 텔로머라제 RNA 성분 대립유전자에 대해 이형접합성 또는 동형접합성이다. 이러한 마우스는 면역계 개발, 종양형성, 정자형성 연구의 실험 동물로서 시판되며, 애완동물로 사용되기도 하고, 동물 단백질(음식) 및 기타 용도로 사용될 수 있다.
키메라형의 표적화된 마우스는 본원에 참고로 인용한 문헌[Hogan등, Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory (1988) and Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J. Robertson 편집, IRL Press, 워싱턴 디.씨.(1987)]에 따라 유도된다. 배의 간세포(stem cells)는 공지된 방법(본원에 참고로 인용한 문헌[Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J. Robertson 편집, IRL Press, 워싱턴 디.씨.(1987); Zjilstra등 (1989) Nature 342: 435; 및 Schwartzberg등 (1989) Science 246: 799] 참조)에 따라 조작된다.
또한, 텔로머라제 RNA 성분 cDNA 또는 게놈 유전자 사본을 사용하여 텔로머라제 RNA 성분을 고 레벨로 그리고/또는 텔로머라제 RNA 성분 유전자 인접부에 천연적으로는 존재하지 않는 전사 조절 서열의 전사 조절하에 발현시키는 돌연변이유전자를 작제할 수 있다. 비제한적인 예를 들면, 구성형 프로모터(예; HSV-tk 또는 pgk 프로모터) 또는 세포 계통 특이적 전사 조절 서열(예; CD4 또는 CD8 유전자 프로모터/인헨서)을 텔로머라제 RNA 성분 폴리뉴클레오티드 서열에 작동적으로 결합하여 돌연변이유전자(통상 neo 유전자 발현 카세트와 같은 선별 마커와 함께)를 형성할 수 있다. 이러한 돌연변이유전자를 세포(예; ES 세포, 조혈 간세포) 중으로 도입할 수 있으며, 통상의 방법에 따라 돌연변이 세포 및 돌연변이 비인간 동물을 수득할 수 있다. 텔로머라제 RNA 성분의 과다발현 또는 텔로머라제 RNA 성분의 부적합한 발현은 종양발현전 상태 또는 종양 상태를 초래할 것이기 때문에, 돌연변이 세포 및/또는 돌연변이 비인간 동물을 사용하여 종양억제제를 검색하고/하거나 추정 발암물질을 검색할 수 있다.
작용제 검색 분석
텔로머라제 RNA 성분 폴리뉴클레오티드, 텔로머라제 단백질 성분 제제, 말단소립 반복 주형, 및 결합 반응등은 실험예와 관련하여 실험하였다. 일반적으로, 텔로머라제 단백질 성분은 텔로머라제-발현 포유류 세포로부터 통상의 정제방법으로 수득하고, 본 분석에 사용하기 전에 관련 RNA 성분을 제거한다. 구체적인 수성 조건은 통상의 방법에 따라 의사가 선택할 수 있다. 일반적인 지침으로, 다음과 같은 완충 수성 조건을 사용할 수 있다: 10-250 mM NaCl, 5-50 mM Tris HCl, pH 5-8, 경우에 따라 2가 양이온(들) 및/또는 금속 킬레이터 및/또는 비이온성 세제 및/또는 막 분획을 첨가함. 당해분야의 숙련자에게는 상기 기본 조건에 첨가, 결실, 변형(예; pH) 및 치환(예; NaCl을 대체하는 KCl 또는 완충액 치환)이 실시될 수 있음이 자명할 것이다. 특정 텔로머라제 완전효소 형성 및/또는 텔로머라제 활성이 대조 반응(들)에서 일어나는 한, 기본 결합 반응 조건에 변형을 실시할 수 있다. 대조 반응(작용제를 포함하지 않음)에서 특정 결합 및 절단을 허용하지 않는 조건은 결합 분석에 사용하기에는 적합하지 않다.
바람직하게는, 텔로머라제 RNA 성분이 고정화된 텔로머라제 단백질 성분에 결합하는 지를 측정하기 위해, 텔로머라제 RNA 성분종을 검출용 마커, 통상은 비오틴기, 형광성부 또는 방사성표지를 혼입한 뉴클레오티드로 표지한다. 텔로머라제 단백질 성분을 표지하는 적합한 방법은 방사성표지된 아미노산(예; 14C-표지된 로이신, 3H-표지된 글라이신, 35S-표지된 메티오닌)의 혼입에 의한 방사성표지법, 125I 또는 131I로 해독후 방사성 요오드화시키는 방사성표지법(예; 볼턴-헌터 반응 및 클로르아민 T), 32P로 해독후 인산화시키는 표지법(예; 포스포릴라제 및 무기 방사성표지된 포스페이트), 형광성 표지(예; 플루오레세인 또는 로다민)의 혼입에 의한 형광성 표지법, 또는 당해분야에서 공지된 기타 통상의 방법에 의한 표지법이 있으며, 이들에 국한되는 것은 아니다. 폴리펩티드종의 하나를 기재에 연결하여 고정하는 양태에서는, 기타 성분은 일반적으로 검출용 마커로 표지한다.
표지된 텔로머라제 RNA 또는 단백질 성분은 각각 고정화된 텔로머라제 단백질 또는 RNA 성분과 접촉시키고, 작용제가, 고정화되는(즉, 동족 텔로머라제 성분에 결합되고 포획되는) 표지된 성분의 양을 변화시키는 능력을 측정한다. 결합반응의 항온처리 시간 및 온도는, 선택된 조건들이 작용제가 존재하지 않는 대조 반응에서 특이 결합을 일으키지 않는 한 달라질 수 있다. 바람직한 양태는 약 15℃ 이상, 보다 바람직하게는 35 내지 42℃의 반응 온도 및 약 15초 이상의 항온처리 시간을 이용하지만, 일부 양태에서는 결합의 평형이 이루어지도록 보다 더 긴 항온처리 기간이 바람직하다. 결합된 복합체의 결합 역학 및 열역학적 안정성은 시간, 온도, 염, pH 및 기타 반응 조건을 변화시킬 수 있는 범위를 결정한다. 그러나, 임의의 특정 실시 양태에서 목적하는 결합 반응 조건은 당해분야의 통상의 방법을 사용하여 의사에 의해 쉽게 정해질 수 있는 데, 그 예로는, 스캐챠드(Scatchard) 분석, 힐(Hill) 분석 및 기타 방법(Proteins, Structures and Molecular Principles, (1984) Creighton(편집), W.H. Freeman and Company, 뉴욕)을 사용한 결합 분석을 들 수 있다.
고정화된 텔로머라제 RNA 성분에 대한 표지된 텔로머라제 단백질 성분의 특이적 결합은 비표지된 경쟁 단백질(예; 알부민) 및/또는 비표지된 RNA를 포함시킴으로써 측정한다. 결합 반응을 완료한 후, 고정된 종에 특이적으로 결합되는 표지된 종의 양을 검출한다. 비제한적인 예를 들면, 결합에 적합한 항온처리 기간후에, 비고정된 표지된 텔로머라제 단백질 성분을 함유하는 수성상을 제거하고, 비고정 결합된 텔로머라제 완전효소종과 그에 결합된 임의의 표지된 텔로머라제 단백질 성분을 함유하는 기질을 적합한 완충액, 경우에 따라 비표지된 차단제(들)을 함유하는 완충액으로 세정하고, 세정 완충액(들)을 제거한다. 세정후, 고정된 표지 성분에 특이적으로 결합된 채로 잔존하는 검출가능한 표지의 양을 측정한다(예; 광학적, 효소적, 자동방사선사진법 또는 기타 방사선화학적 방법으로).
일부 실시 양태에서는, 비특이적 결합을 억제하는 비표지된 차단제를 첨가한다. 그러한 차단제의 예로는 송아지 흉선 DNA, 연어 정자 DNA, 효모 RNA, 다양한 길이의 혼합 서열(불규칙 또는 가불규칙 서열) 올리고뉴클레오티드, 소의 혈청 알부민, 비이온성 세제(NP-40, 트윈, 트리톤 X-100등), 비지방 건성우유 단백질, 덴하르트 시약, 폴리비닐피롤리돈, 피콜 및 기타 차단제가 있으며, 이들에 국한되는 것은 아니다. 의사들은 그들의 판단으로 차단제를 결합 분석에 포함시킬 적합한 농도로 선택할 수 있다.
텔로머라제 RNA 성분 또는 텔로머라제 단백질 성분을 고정화한 실시 양태에서는, 기질에 결합시키는 방법으로서 공유적 또는 비공유적 결합법을 사용할 수 있다. 공유적 결합법의 예로는 당해 분야에서 널리 특성규명된 방법으로 문헌[Kadonaga and Tijan (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 83: 5889]에 기재된 방법이 있으며, 이에 국한되지는 않는다. 비제한적인 일례로, 시아노겐 브로마이드로 유도체화 기질(예; CNBr-유도체화 세파로스 4B)에 공유적으로 결합시키는 방법이 있다. 스페이서를 사용하여 기재로부터의 잠재적 입체 간섭을 감소시키는 것이 바람직할 수 있다. 기질에 대한 단백질의 비공유 결합의 예로는 단백질을 하전된 표면에 결합시키는 방법 및 특이 항체와 결합시키는 방법이 있으며, 이들에 국한되는 것은 아니다.
일실시 양태로, 치료제의 후보는 그들이, 텔로머라제 단백질 성분이 텔로머라제 RNA 성분에 결합하는 것을 차단하는 능력으로 확인한다.
돌연변이 텔로머라제 RNA 성분이 대조 분석 조건(예: 생리적 조건)하에서 텔로머라제 단백질 성분에 결합한다면, 돌연변이 텔로머라제 RNA 성분 서열을 사용하기도 하지만, 통상, 상기 방법들에 사용되는 텔로머라제 RNA 성분은 천연 포유류 텔로머라제 RNA 성분 서열(예; 인체 RNA 성분)을 포함한다.
일실시 양태로, 텔로머라제 조절제의 후보는 대사 활성이 있는 포유류 세포에서 포유류의 텔로머라제 RNA 성분 유전자, 바람직하게는 인체 텔로머라제 RNA 성분 유전자의 전사 조절 서열에 작동적으로 결합된 리포터 폴리뉴클레오티드 서열(예; β-갈락토시다제 유전자, 루시퍼라제 유전자, HPRT 유전자)의 전사에 있어 통계상 상당한 감소 또는 증가능으로 확인한다. 리포터 유전자(예; HPRT)를 포유류의 텔로머라제 RNA 성분의 ds cDNA의 제한 부위 또는 평활 말단부에 삽입하여 상동성 표적 구조물 또는 돌연변이유전자를 생성시킬 수 있는 데, 여기서, 포유류의 생세포에서는 리포터 유전자를 내인성 텔로머라제 RNA 성분 유전자 프로모터 및 관련 전사 조절 인자의 전사 조절하에 위치시킨다. 따라서 리포터 유전자의 용량 의존적 전사 조절을 산출하는 작용제는 텔로머라제 조절제 후보로서 간주된다.
변형예에서, 포유류 세포내 내인성 텔로머라제 RNA 성분 유전자는 상동성 표적 구조물로 표적화되어 내인성 유전자의 염색체좌에서 내인성 텔로머라제 RNA 성분 유전자의 상류의 전사 조절 서열(예; 프로모터)에 작동적 결합상태로 리포터 폴리뉴클레오티드 서열을 위치시킨다. 또 다른 변형예에서는, 리포터 폴리뉴클레오티드를 포함하는 내인성 폴리뉴클레오티드를 포유류 텔로머라제 RNA 성분 유전자 전사 조절 영역(예; 프로모터 및 상류의 전사인자 결합 부위)에 작동적으로 결합시키고; 외인성 폴리뉴클레오티드는 포유류 세포로 전이시켜, 염색체 위치로 비상동적으로 통합될 수 있고/있거나, 에피좀 폴리뉴클레오티드로서 유지 또는 복제된다. 따라서, 작용제로 처리한 세포에서 리포터 폴리뉴클레오티드의 전사 조절을 충분히 산출하는 작용제는 포유류 텔로머라제 조절제 후보로 확인된다.
세포가 말단소립 손상을 수선하거나 말단소립 복제를 억제(예; 내생 천연 말단소립을 경쟁적으로 억제함으로써)하는 텔로머라제-조절제는 세포(예; 종양 세포)를 말단소립 손상제(예; 알킬화제 및 이온화 방사선)에 감작시키는 종양억제제 또는 감작제 후보이다.
종양억제제 후보는 인체 종양억제 약제로서의 적합성을 예측하는 데에 통상 사용되는 분석에서 종양억제 활성에 대해 추가로 시험한다. 이러한 분석법의 예로는 (1)억제제 후보가, 형질전환된 세포가 연질 아가에서 고착과 무관하게 증식하는 능력을 억제하는 능력, (2) nu/nu 마우스에게 이식된 형질전환된 세포의 종양원성을 감소시키는 능력, (3) 형질전환된 세포의 형태적 변형을 회복하는 능력, (4) 이식된 종양의 nu/nu 마우스에서의 증식 감소 능력, (5) 자발적 또는 화학적-유도 발암성을 가지는 동물 모델에서 종양 또는 종양발현전 세포의 형성을 억제하는 능력, 및 (6) 작용제를 투여한 형질전환된 세포에서 더욱 많이 분화된 표현형을 유도하는 능력을 들 수 있으며, 이들에 국한되는 것은 아니다.
작용제가 텔로머라제의 텔로머라제 단백질 성분:텔로머라제 RNA 성분 결합 활성 및/또는 효소 활성을 억제 또는 증가시키는 능력을 검출하는 분석으로 작용제 은행(예; 화합물 라이브러리, 펩티드 라이브러리등)의 검색은 용이하고 고도의 처리량으로 텔로머라제 길항물질 또는 작동물질을 확인할 수 있게 한다. 그러한 길항물질 및 작동물질은 텔로머라제 활성을 조절하여 말단소립 수복능 및 복제능을 조절할 수 있다.
텔로머라제 활성을 특이적으로 억제할 수 있는 작용제의 유효량을 환자에게 투여하는 방법은 텔로머라제 활성 및 DNA 수복 및 복제를 조절함으로써 효과적으로 치료되는 병리학적 상태(예; 암, 염증, 임파구증식성 질병, 자동면역 질병, 신경퇴행성 질병등)의 예방 또는 치료 방법으로 사용할 수 있다.
본 명세서의 개시사항으로부터 당해분야의 숙련자에게는 본 발명이 인체 텔로머라제와 관련된 유용한 시약, 및 다양하고 유용한 치료 및 진단 방법을 제공함이 명백히 이해될 것이다. 필수적인 상기 설명은 상기 방법들의 한정된 샘플을 제공하는 데, 이들이 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니된다. 본 발명의 기타 특징 및 장점은 하기 실시예 및 특허 청구의 범위로부터 명백해질 것이다.
하기 실시예들은 본 발명의 구체적인 양태를 설명하여 본 발명을 예시하는 것이며, 당해분야의 숙련자에게 인체 텔로머라제의 RNA 성분을 분리하고 확인하는 데에 사용되는 방법들을 설명한다. 실시예들은 단지 본 발명의 이해 및 실시에 유용한 구체적인 방법론을 제시할 뿐이기 때문에 실시예들이 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니된다.
실험예
개론
인체 텔로머라제의 RNA 성분의 클로닝에는 후술하는 음성 선별법 및 다수 사이클의 양성 선별법을 포함하는 신규의 방법이 필요하였다. 그러나, 초기에는 5'-RACE PCR 증폭으로 불리는 cDNA의 말단을 클로닝하는 방법 및 역전사법을 사용하여 RNA 성분을 클로닝하려는 시도가 있었다. 역전사 반응을 인체 말단소립 DNA의 단일가닥 부분의 반복 단위와 동일하고, 따라서 인체 텔로머라제의 RNA 성분에 존재하는 것으로 생각되는 서열과 상보적인 프라이머를 사용하여 개시하였다. 프라이머는 또한 그 5'-단부에 제한효소 인지 부위에 상응하는 서열을 포함하였다. 그러나, 역전사 반응 및 PCR 증폭에 의해 생성된 cDNA는 겔 전기영동 및 겔에 존재하는 핵산 밴드의 뉴클레오티드 서열 분석에 의해 검사했을 때, 리보좀 RNA 서열만이 검출되었다. 네스트형(nested) 프라이머를 사용하여 상기 5'-RACE 방법을 변형시켰을 때 유사한 문제가 발생하였다.
클로닝의 성공은 인체 텔로머라제의 정제물, 인체 텔로머라제 활성을 가지는 세포주 및 검출가능한 인체 텔로머라제 활성을 가지지 않는 세포주로부터 유래한 cDNA 제제를 사용하여 개시되었다. cDNA의 제조에 사용된 방법은 하기 실시예 1에서 상세히 설명한다. 두개의 음성 선별 단계 및 연속 사이클의 양성 선별 단계를 두개의 인체 세포주에서 유래한 cDNA제제와 함께 사용하여 불필요한 서열의 농도를 낮추고, 목적 RNA 성분 서열의 농도를 증가시켰다.
음성 선별 단계는 검출가능한 텔로머라제 활성을 가지지 않는 인체 세포주로부터 제조한 cDNA로부터 비오틴화된 PCR 생성물을 제조하는 것을 포함한다. 비오틴화된 PCR 생성물을 변성시키고, 텔로머라제 활성을 가지는 인체 세포주로부터 제조된 cDNA에서 유래한 매우 낮은 농도의 비오틴화되지 않은 PCR 생성물(비오틴화된 생성물 100 : 비오틴화되지 않은 생성물 1)을 함유하는 용액에서 재하이브리드화시켰다. 텔로머라제 음성 세포주가 일부 소량의 RNA 성분을 함유할 수 있는 가능성이 있기 때문에, 하이브리드화 단계를 수행하여 양 세포주에서 풍부하게 발현된 RNA에 대해서만 식별 또는 선별하였다. 가장 풍부하게 발현된 RNA를 하이브리드화하도록 선별된 C0t에 하이브리드화한 후, 불필요한 물질은 스트렙트아비디닐화된 자기 입자에 결합시켜 제거하였는 데, 입자 수집후에 잔존하는 상청액은 인체 텔로머라제의 RNA 성분에 대한 목적 cDNA를 함유하였다. cDNA의 PCR 증폭 과정은 하기 실시예 2에서 설명한다.
이 물질을 연속 사이클의 양성 선별 단계에 의해 목적 cDNA에 대해 추가로 농축시켰다. 양성 선별 단계에서, 인체 텔로머라제의 RNA 성분중에 예측된 주형 서열과 상보적인 비오틴화된 프로브는 텔로머라제 활성을 가지는 인체 세포주에서 유래한 PCR 증폭된 cDNA의 농축된(음성 선별에 의해) 샘플에서 제조된 PCR 생성물에 하이브리드화하였다. 하이브리드화한 후, 프로브/표적 복합체는 아비딘화된 자기 비드에 결합되었는 데, 그것을 수집하여 양성 선별의 추가 사이클에서 RNA 성분 서열이 풍부한 핵산 공급원으로서 사용하였다. 양성 선별 과정은 하기 실시예 3 및 4에서 더욱 상세히 설명한다.
양성 선별의 세 번째 사이클 이후에, 증폭 생성물은 겔 전기영동에 의해 분리하고, 핵산 ～200 bp 크기에 해당하는 겔의 단면을 분리하였다. 그 겔 단면으로부터 핵산을 용출시켜 PCR로 증폭시켰다. PCR 증폭 생성물은 제한효소 NotⅠ으로 처리한 후, 스트래터진에서 시판되는 플라스미드 p블루스크립트IISK+의 NotⅠ 부위에 결찰시켜 삽입하였다. 생성된 플라스미드로 대장균 숙주 세포를 형질전환시키고, 각각의 콜로니를 분리하고 추가 분석 및 DNA 서열분석용 핵산 공급원으로 사용하였다. 이 시험에 의해 양성인 다수의 클론은 DNA 서열분석 및 다양한 기타 시험으로 분석하였다.
상기 기타 시험으로는 (1) 추정 RNA 성분에 상보적인 앤티센스 올리고뉴클레오티드가 텔로머라제를 함유하는 것으로 공지된 인체 세포 추출물내 텔로머라제 활성을 억제하는 지 여부의 측정; (2) 추정 RNA 성분 클론 서열에 대해 특이적인 PCR 프라이머를 사용하여 텔로머라제 샘플에 존재하는 핵산을 증폭시킬 수 있는 지, 및 관찰된 생성물이 존재하는 경우 그것이 텔로머라제의 정제중에 텔로머라제 활성을 추적하는 지 여부의 측정; 및 (3) 추정 RNA 성분 클론 서열에 특이적인 PCR 프라이머를 사용하여, 텔로머라제 활성이 그 활성을 전혀 생성시키지 않거나 단지 소량만을 생성시키는 것으로 공지된 세포에서 유래한 세포 추출물에서보다 높은 것으로 공지된 세포(즉, 종양 세포)에서 유래한 세포 추출물에 보다 다량으로 존재하는 핵산을 증폭시킬 수 있는 지 여부의 측정을 들 수 있다. 플라스미드 pGRN7로 명명된 하나의 클론이 상기 시험에서 그 플라스미드가 인체 텔로머라제의 RNA 성분에 해당하는 cDNA를 포함하는 지 여부의 측정과 일치하는 결과를 산출하였다.
따라서, pGRN7의 추정 RNA 성분 서열의 서열들에 상응하는 앤티센스 올리고뉴클레오티드는 시험관내에서 텔로머라제 활성의 억제효과를 나타냈다. 마찬가지로, (1) DEAE 크로마토그래피; (2) 세파덱스 S300 크로마토그래피; 및 (3) 글리세롤 구배, SP 세파로즈 또는 페닐 세파로즈 분리를 포함하는 방법으로 세포 추출물로부터 텔로머라제를 정제하고 분획들을 수집했을 때, pGRN7의 추정 RNA 성분 서열에 특이적인 PCR 프라이머는 적당한 크기의 핵산을 증폭시켰으며, 증폭 생성물의 양은 수집된 분획에서 관찰된 텔로머라제 활성의 양과 매우 상관관계가 있었다. 최종적으로, 정상 세포(텔로머라제 활성 검출 불능) 및 암 세포(텔로머라제 활성 존재), 또한 고환 세포(텔로머라제 활성 존재)에서 유래한 세포 추출물은 pGRN7에 포함된 추정 RNA 성분에 대해 특이적인 프라이머를 사용한 역전사 및 PCR 증폭(RT-PCR)시에 상응하는 PCR 생성물을 나타냈다. RT-PCR에 대한 프로토콜은 하기 실시예 5 및 6에서 설명한다.
상기 결과는 인체 텔로머라제의 RNA 성분이 클로닝되었다는 확실한 증거를 제시하는 것이며, 따라서 플라스미드 pGRN7을 사용하여 하기 실시예 7에서 설명하는 바와 같이 인체 세포주에서 유래한 RNA 성분에 대해 게놈 클론을 분리하였다. 게놈 클론은 스트래터진에서 입수한 람다 벡터 FIXII에 삽입된 인체 DNA의 게놈 라이브러리에서 동정하고 그로부터 분리하였다. RNA 성분 유전자 서열을 포함하는 목적 클론은 ∼15 kb의 삽입체를 함유하였고, 클론 28-1로 명명되었다. 이 클론은 미국 모식균 배양 수집소(American Type Culture Collection)에 기탁되었고, 승인번호 제75925로 입수가능하다. 이 파지로부터 다양한 제한 단편을 서브클로닝하고 서열분석하였다. 그 유전자는 염색체 3의 q 아암의 원말단에 위치하는 것으로 확인되었다. ∼15 kb의 삽입체의 한쪽 단부의 SauIIIA1 제한효소 인지 부위로부터 내부 HindIII 제한효소 인지 부위까지 수득한 서열 정보는 람다 클론 28-1의 RNA 성분 유전자의 전사 조절 인자 뿐만 아니라 성숙한 RNA 성분 서열 전체를 포함하는 것으로서, 상기에 제시하였다.
실시예 1
PCR-증폭가능한 cDNA의 제조
구아니딘-티오시아네이트 추출에 의해 293 및 IMR-90 세포로부터 또는 페놀/클로로포름 추출에 의해 정제된 텔로머라제 분획으로부터 RNA를 수득하였다. 293 세포로부터의 전체 RNA를 2％ 아가로즈 겔상에서 크기 분별화하고, 크기가 500 bp 미만인 RNA를 분리하였다.
Bethesda Research Laboratories(BRL)로부터 입수한 SuperscriptTM II 역전사효소를 사용하여 제1 가닥 cDNA 합성을 수행하였다. 약 0.5 내지 1.0 ㎍ RNA를 총 11 ㎕의 수중에서 약 40 ng의 랜덤 프라이머(6량체; pdN6)와 혼합하였다. 용액을 95℃에서 10분 동안 가열한후, 5-10분 동안 빙상에서 냉각시켰다. 변성된 핵산을 원심분리에 의해 수거하였다. 이후, 변성된 RNA와 프라이머 혼합물에 4 ㎕ 5x 제1 가닥 합성 완충액; 2 ㎕ 0.1M 디티오트레이톨(DTT); 1 ㎕ RNAsin(Pharmacia); 및 1 ㎕ dNTP(2.5 mM 각 원액)를 순서대로 첨가하여 재현탁시켰다. 반응 혼합물을 42℃에서 1분 동안 항온처리한 후, 1 ㎕(200 유니트)의 SuperscriptTM II RTase(BRL)를 첨가하여 용액으로 혼합한후, 42℃에서 60분 동안 항온처리하였다. 새로 합성된 cDNA를 포함하는 반응 혼합물을 제2 가닥의 합성시까지 빙상에서 유지시켰다.
제2 가닥 cDNA 합성은 다음과 같이 수행하였다. 제1 가닥 cDNA 합성 반응 혼합물(전술한 바와 같음)로부터 얻은 약 20 ㎕의 반응 혼합물을, 111.1 ㎕의 물; 16 ㎕의 10x 대장균 DNA 리가제 완충액; 3 ㎕의 dNTP(2.5 mM 각 원액); 1.5 ㎕의 대장균 DNA 리가제(BRL 제품, 15 유니트); 7.7 ㎕의 대장균 DNA 폴리머라제(파마시아로부터 구입함; 40 유니트); 및 0.7 ㎕의 대장균 RNase H(BRL)와 순서대로 혼합하였다. 수득되는 용액을 조심스럽게 혼합하고 16℃에서 2시간 동안 항온처리하는데, 이때 1 ㎕(10 유니트)의 T4 DNA 폴리머라제를 반응 튜브에 첨가하고 동일 온도(16℃)에서 5분 동안 계속 항온처리하였다. 반응을 중단하고, 반응물을 페놀/클로로포름으로 2회 추출한후, 핵산을 에탄올로 침전시키고 반응 혼합물을 원심분리하여 핵산을 펠릿화시킴으로써 핵산을 수거하였다.
원심분리에 의해 수거한 cDNA 펠릿을 20 ㎕의 TE 완충액중에서 재현탁하고, 다음 두 올리고뉴클레오티드(NH2가 아미노 차단기임)로 구성된 "NotAB"로 불리는 이본쇄 올리고뉴클레오티드에 결찰시켰다:
NotA : 5'-pATAGCGGCCGCAAGAATTCA-NH2
NotB : 5'-TGAATTCTTGCGGCCGCTAT-3'
46.25 ㎕의 물중에서 50 ㎕의 NotA 올리고뉴클레오티드(100 pmol)를 50 ㎕의 NotB 올리고뉴클레오티드(100 pmol)와 혼합하고 수득된 용액을 95℃에서 5분 동안 가열한후, 용액을 고온으로 유지하면서 3.75 ㎕의 20x SSC 완충액을 첨가함으로써 이본쇄 올리고뉴클레오티드를 제조하였다. 이 혼합물을 포함하는 튜브를 고온수(약 70 내지 75℃의 온도)를 함유하는 비이커내에 위치시킨후, 그 온도를 15℃ 이하로 서서히 강하시켜 두 올리고뉴클레오티드가 하이브리드화하여 이본쇄의 올리고뉴클레오티드 NotAB를 형성하도록 하였다. 수득된 핵산을 침전과 원심분리에 의해 수거하였다.
이본쇄의 NotAB 올리고뉴클레오티드를 약 30 ㎕의 TE 완충액중에 재현탁시킨후, 10 ㎕의 전술한 cDNA 제제, 약 50 pmol(OD260으로 계산)의 NotAB; 2 ㎕의 10x T4 DNA 리가제 완충액; 1.2 ㎕의 T4 DNA 리가제; 0.2 ㎕의 10 mM ATP; 총 20 ㎕의 물을 포함하는 반응 혼합물을 16℃에서 밤새 항온처리함으로써 cDNA에 결찰시켰다. 이후, 반응 혼합물을 65℃에서 10분 동안 가열함으로써 반응물을 열불활성화시켰다. 약 1 내지 2 ㎕의 수득 혼합물을 통상 PCR 증폭에 사용하였으며; 하기 실시예 2에 기술된 바와 같이 10 내지 15 사이클(94℃, 45초; 60℃, 45초; 및 72℃, 1.5분)로 결찰 혼합물을 증폭시켜 원액으로 보관하였다.
실시예 2
cDNA의 PCR 증폭
5 ㎕의 10x PCR 완충액(500 mM KCl; 100 mM 트리스, pH=8.3; 및 20 mM MgCl2; 5-8 ㎕의 dNTP(각각 2.5 mM); 1 ㎕의 Taq 중합효소(뵈링거 만하임); 0.1 ㎕의 유전자 32 단백질(뵈링거 만하임); 6 ㎕의 Not B 프라이머(20 μM 원액); 2 ㎕의 cDNA(실시예 1에 기술된 바와 같이 제조) 및 50 ㎕로 만드는데 필요한 양의 물로 이루어진 증폭 반응 혼합물을 제조함으로써 통상적인 방법으로 cDNA를 증폭시켰다. 이 혼합물에 50 내지 100 ㎕의 광유를 적층시키고 94℃, 45초; 60℃, 45초; 및 72℃, 1.5분의 사이클을 10 내지 15회 수행하여 PCR 증폭시켰다. 증폭후, 반응 혼합물을 페놀/클로로포름으로 추출하고, 증폭된 핵산을 에탄올로 침전시키며, 원심분리에 의해 수거하였다. 이후 100 ㎕의 TE 완충액중에 침전물을 용해시켜 원액을 제조하였다.
실시예 3
공제(subtractive) 하이브리드화 및 순환 선별을 위한 PCR 증폭
공제 하이브리드화 및 순환 선별을 위한 PCR 생성물을 제조하기 위하여, 실시예 2에 기술된 바와 같이 제조한 약 1 ㎕의 원액을, 프라이머 어닐링, 신장 및 생성물 변성의 사이클을 21 내지 24회 수행한다는 점을 제외하고는 실시예 2에 기술된 바와 같이 제조한 50 ㎕의 PCR 반응 혼합물에서 증폭시켰다. 증폭후, 반응 혼합물을 페놀/클로로포름으로 추출하고, 에탄올로 침전시킨 뒤, 원심분리에 의해 수거하였다. 반응 혼합물을 소량 취해 아가로즈 겔 전기영동시킨후, 에티디움 브로마이드로 염색시켜 생성물 수율을 산정하였다. 공제 하이브리드화를 위해, 텔로머라제 음성 세포(IMR-90)로부터의 cDNA 라이브러리를 비오틴화된 dUTP의 존재하에서 증폭시켰다. 텔로머라제 음성 세포(IMR-90) 유래의 cDNA 대 텔로머라제 양성 세포(293) 유래의 cDNA를 대략 100 대 1의 비율로 이용하여 공제 하이브리드화를 수행하였다. 표준 조건을 65℃에서 48-72시간 동안 이용하였다. 통상, 부분 정제된 cDNA 및 음성 선별된 물질로부터 수득한 약 2 ㎍의 핵산 생성물을 순환 선별에 2회 이상 사용하였다.
실시예 4에 기술된 순환 선별후, 선별된 "풀-다운(pull-down) 생성물"(총 용적 20 ㎕)중 각 1 내지 2 ㎕를 실시예 2에 기술된 바와 같이 22 사이클 동안 PCR 증폭시키고, 에탄올로 침전시키며, 이후 순환 선별을 위한 제조물로 원심분리에 의해 수거하였다.
실시예 4
PCR 증폭된 cDNA의 양성 선별
인체 텔로머라제의 RNA 성분을 클로닝시키는데 사용된 순환 선별 과정의 양성 선별 단계에 있어, 약 2 ㎍의 PCR 증폭된 cDNA를 25 ㎕의 TE 완충액에 희석한 후, 1.25 ㎕의 20x SSC와 혼합하고, 수득된 용액을 95℃로 3분 동안 가열하였다. 온도를 5분 동안 60℃로 강하시키고, 1 ㎕(0.1 ㎍/㎕)의 R2 또는 R4 비오틴화된 프로브를 첨가하였다. 이들 프로브의 서열은 하기와 같다. 프로브는 O-메틸-RNA 프로브이며, 이때 U는 O-메틸-우리딘, A는 O-메틸-리보아데닌, G는 O-메틸-리보구아닌이며, I는 이노신이다.
R2 : 5'-UUAGGGUUAGII-비오틴
R4 : 5'-AUUGGGUUAUII-비오틴
R2 프로브는 말단소립 반복부에 특이적이며, R4 프로브는 RNase P에 특이적으로, 이들을 순환 선별 과정의 효과 및 효율을 추적하는데 사용하였다. 순환 선별을 동시에 수행하면서 기지의 서열 분자인 RNase P RNA에 대해서는 별도로 수행하면, 순환 선별 과정이 관심의 분자, 이 경우 인체 텔로머라제의 RNA 성분에 대해 적절히 작용하고 있다는 확신을 높일 수 있다.
65℃의 혼합물에 R2 또는 R4 프로브를 첨가한 후, 혼합물을 이 온도에서 5분 동안 항온처리함으로써 하이브리드화 반응 온도를 30℃로 강하시킨후, 그 온도에서 60분 동안 항온처리함으로써 반응 혼합물을 14℃의 온도로 더 강하시켰다. 최종적으로, 혼합물을 4℃에서 2-12시간 항온처리하였다.
각 샘플(R2 또는 R4)에 대한 총 하이브리드화 반응 혼합물을 4℃의 400 ㎕ 0.5x SSC에 부은후, 프로메가로부터 구입하여 사용전에 0.5x SSC로 4회 미리 세척한 빙냉 자기 비드 튜브에 첨가하였다. 수득된 혼합물을 4℃에서 30분 동안 항온처리하여 자기 비드에 완전히 결합하게 만들었다. 이후, 각 반응 튜브를 실온하에 자기 스탠드(프로메가) 상에서 단시간 항온처리하여 비드를 풀 다운하였다. 비드를 저온 0.5x SSC(600 ㎕)중에 재현탁시키고, 얼음상에 (튜브에 넣어) 위치시켰다. 이러한 방식으로 샘플을 0.5x SSC로 3회 더 세척하였다. 비드를 100 ㎕의 물중에서 재현탁시키고, 수거용 자기 스탠드상에 비드를 재위치시키기 전에 65℃에서 2분 동안 항온처리하여 비드로부터 핵산을 용출시켰다. 이 과정을 3회 더 반복하는데; 마지막에는 비드를 수거용 자기 스탠드상에 재위치시키기전에 65℃에서 5분 동안 재현탁된 비드를 항온처리하였다. 모든 100 ㎕ 상층액(각 샘플용)을 모아서 SpeedVacTM 원심분리기에서 20 ㎕로 건조시켰다. 이후, 회수된 DNA를 다른 증폭 및 선별 과정을 위해 PCR 증폭시켰다. 각 증폭후, PCR 생성물을 페놀-클로로포름으로 2회 추출하고, 에탄올 침전시킨 다음, 20 ㎕의 TE 완충액중에 재현탁시켰다.
통상, PCR 증폭은 아가로즈 겔 전기영동에 의해 입증하였다. 이외에도, 각종 대조군을 사용하여 순환 선별 과정을 모니터하였다. 하나의 대조군으로서, PCR "아암"(프라이머 하이브리드화 부위로 제공되는 특정 서열의 올리고뉴클레오티드)을 네오마이신 내성 부여 유전자를 포함하는 핵산상에 위치시켰다. 수득되는 핵산을 PCR 증폭된 cDNA와 혼합하고 정량 PCR에 의해 각 선별시 모니터하였다. 다른 대조군으로서, RNase P 선별된 라이브러리 및 텔로머라제 RNA 성분 선별된 라이브러리 양자 모두에 대해 RNase P를 이용하였다.
실시예 5
RT-PCR 프로토콜
대부분 실시에 1에 기술된 절차에 따라 제1 가닥 cDNA를 제조하였다. 기본적으로, 0.1 내지 1 ㎍의 RNA를 포함하는 각 텔로머라제 분획으로부터 RNA를 정제하고; 통상 300 ㎕의 분획으로부터 제조한 RNA의 약 1/3 내지 1/5를 사용하였다. RNA를 10 ㎕중 40 내지 80 ng의 랜덤 6량체와 혼합하고, 95℃(열-사이클링 기구 이용)에서 10분 동안 변성시키며, 빙상에서 냉각시켰다. 변성된 RNA 및 6 량체를 역전사효소의 제조업체(RTase, BRL에서 입수)에 의해 제공된 4 ㎕의 5x 제1 가닥 합성 완충액, 2 ㎕의 0.1 M DTT, 1 ㎕의 10 mM dNTP(각각), 1 ㎕의 RNase 억제제(파마시아) 및 총 용적을 9 ㎕로 만드는 양의 물을 함유하는 반응 혼합물에 첨가하였다. 배합된 혼합물을 42℃ 수조에 위치시켰다. 1-2분 항온처리후, 1 ㎕의 SuperscriptTM II RTase(BRL)를 혼합물에 첨가하였다. 42℃에서 60분 동안 항온처리를 계속하였다. 튜브를 95-98℃에서 10분 동안 가열하여 반응을 중지시켰다. 단시간 원심분리하여 제1 가닥의 cDNA를 수거하고, 새로운 튜브에 분취하여 드라이 아이스상에서 급속 동결시키며, -80℃에서 보관하거나 즉시 사용하였다.
실시예 6
특이적 프라이머 세트를 사용한 cDNA의 PCR 증폭
방사능 표지된 뉴클레오티드를 사용한 20 ㎕ PCR 반응을 위해, 실시예 5의 절차에 따라 제조한 1 ㎕의 cDNA를 20 pmol의 프라이머 1, 20 pmol의 프라이머 2, 2.5 ㎕의 2.5 mM dNTP, 5 μCi의 알파-32P-dATP, 2 유니트의 Taq 폴리머라제(뵈링거 만하임), 0.2 ㎍의 T4 유전자 32 단백질(뵈링거 만하임), 2 ㎕의 10x 완충액(500 mM KCl, 100 mM 트리스-HCl-pH 8.3 및 20 mM MgCl2) 및 총 용적을 20 ㎕로 만드는 양의 물과 혼합하였다. 이후 1 방울의 광유를 튜브에 첨가하였다.
텔로머라제 RNA 성분 클론에 대한 PCR 증폭 조건은 94℃에서 45초, 60℃에서 45초, 72℃에서 1.5분이었다. 사이클의 횟수는 RNA 제조물에 사용된 정제된 물질의 종류에 따라 달랐으나, 통상 18 내지 25회 범위였다. 모든 정량적 RT-PCR에 대해, 사이클을 달리한 여러 반응액을 각 샘플마다 진행시켜 PCR 증폭이 포화되어 비직선상이 되는 시점을 결정하였다.
대조군으로 사용한 RNase P에 대해, PCR 증폭 조건은 94℃에서 45초, 50℃에서 45초, 72℃에서 1.5분이었다. 또한, 사이클의 횟수는 샘플의 성질에 따라 15 내지 22회 범위였다. RNase P 증폭에 대해 사용된 프라이머의 서열은 다음과 같다:
P3 : 5'-GGAAGGTCTGAGACTAG-3'
P4 : 5'-ATCTCCTGCCCAGTCTG-3'
상기 두개의 프라이머를 이용하여 수득한 PCR 생성물의 크기는 약 110 bp 였다.
PCR후, 생성물(5 내지 10 ㎕의 반응 혼합물)을 6％ 천연 폴리아크릴아미드 겔상에 로딩하고 전기영동하였다. 전기영동후, 겔을 건조시키고, PhosphorImagerTM 카세트 또는 분석용 자동방사선 필름에 노출시켰다.
실시예 7
인체 텔로머라제의 RNA 성분에 대한 유전자의 클로닝
일반적으로 문헌 [참조: Maniatis 등., Laboratory Moecular Cloning Manual]에 기술된 바와 같이, 인체 텔로머라제의 RNA 성분에 대한 유전자 클로닝에 사용된 절차를 수행하였다. 파지 람다 벡터 FIXII내에 삽입된 인체 폐 섬유아세포 세포주 WI-38로부터 얻은 DNA의 게놈 DNA 라이브러리를 스트라타젠으로부터 입수하였다. 파지를 평판당 약 25,000 플라크의 농도로 3 세트의 15(150 mm) 평판에 도말하였다. 이 평판은 NZY 아가 및 NZY 탑 아가로즈로 만들었으며, 파지 형질전환에 사용된 세포는 XL1BlueMRAP2 세포였고, 형질전환체는 37℃에서 약 16시간 동안 밤새 성장시켰다. 이후, 평판을 4℃에서 약 1시간 동안 냉각시킨 후, 플라크를 C/P 나일론 써클(바이오 라드에서 시판되는 여과지)상으로 리프트하였다. 이 과정을 반복하여 리프트된 여과지의 2 반복 세트를 제조하였다. 필터(2 반복)를 변성시키고, 중화시킨 뒤, 6x SSC 완충액중에서 평형시키고, UV 광선에 노출시켜 핵산을 여과지에 가교시킨후, 블로터 종이상에서 건조시켰다.
50％ 포름아미드 완충액중에서 37℃하에 1시간 동안 예비하이브리드화를 수행하였다. 여과지를 전기영동에 의해 분리후 5％ 폴리아크릴아미드 겔로부터 전기용출시켜 단리해낸후, 뵈링거 만하임 바이오케미칼스로부터 얻은 닉해독 킷트를 제조업체의 지시에 따라 사용하여 알파-32P-dCTP로 닉해독한 -218 bp, 방사능 표지된 NotI 단편으로 탐침하였다. 여과지당 약 25 ng(～10 μCi 표지)의 프로브를 사용하여 50％ 포름아미드 하이브리드화 완충액중에서 37℃로 밤새 하이브리드화를 수행하였다. 하이브리드화후, 여과지를 실온에서 6회 세척하였다. 처음 3회는 0.1％ SDS를 함유하는 6×SSC로 세척하고 다음 3회는 6×SSC로 세척하였다. PhosphorImagerTM 카세트에서 7개의 2 반복 여과지를 처음 노출시켜 하이브리드화 효율과 시그널 강도를 검색한후, 여과지를 0.5X SSC중에서 65℃로 세척하였다. 여과지를 2개의 증감 스크린을 사용하여 코닥 XAR5 필름하에 위치시킨후, -70℃에서 약 100시간 동안 필름을 노출시켰다.
인체 텔로머라제의 RNA 성분에 대한 유전자를 포함하는 파지(이후, 28-1로 칭함)를 포함하는 여과지로부터 하나의 강력한 시그널이 발산되었다. 여과지상에서 관찰된 시그널에 대응하는 플라크를 사용해서 제2 평판을 제조하여 파지 DNA의 대규모 분리를 위해 분리된 플라크(표지된 pGRN7 핵산으로 탐침함으로써 확인)를 배양하였다. 미국 모식균 배양 수집소에서 분양받을 수 있는 기탁 번호 제75925호인 파지 28-1은 ～15 kb 삽입체를 포함하며, pGRN7상에서 RNA 성분 서열과 하이브리드화하는 서열을 포함하는 여러 제한 단편, 4.2 kb EcoRⅠ 제한효소 단편, 및 4.2 kb Cla I 제한효소 단편 및 2.5 kb HindIII-SacⅠ 제한효소 단편을 포함한다. 후자의 단편은 전술한 RNA 성분의 총 ～560 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 이는 RNA 성분에 대한 전체 유전자를 포함하는 것으로 보인다. pBluescript 벡터내에 2.5 kb HindIII-SacI 제한 효소 단편을 포함하는 플라스미드는 플라스미드 pGRN33으로 지칭되며 이는 미국 모식균 배양 수집소에 제75926호로 기탁되어 있어, 분양 받을 수 있다. 인체 유전자는 2.5 kb 단편상의 것 이외의 서열들을 포함할 수 있는 한, 이 서열들은 파지 28-1 또는 2.5 kb 단편(또는 본 발명의 다른 프로브)으로 탐침함으로써 규명된 기타의 파지 클론으로부터 분리할 수 있다. 전술한 제한효소 단편은 별도의 제한효소 분해물에서 제조하였고, 분해물로 이루어진 생성물은 0.7％ 아가로즈 겔 또는 ～2.5 kb 단편의 경우 3％ 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기영동함으로써 분리한 후, 목적 밴드를 겔로부터 절단해내고 GeneCleanTM 킷트 II(바이오101, 인코오포레이티드로부터 입수)를 이용하거나, 0.1x TBE중에서 Spectropor ＃2 투석 튜빙으로 100 V에서 2시간 동안 전기용출(～2.5 kb 단편의 경우)함으로써 서브클로닝용으로 제조하였다.
이들 제한효소 단편을 SV40 복제 기점을 포함(하지만, SV40 프로모터 활성은 없음)하기도 하는 pUC계 플라스미드 또는 pBluescriptII 플라스미드로부터 유래된 대장균 형질발현/돌연변이유발 플라스미드내로 서브클로닝하였다. 수득된 플라스미드를 이용하여, 상기 바람직한 구체예에 기술된 바와 같이 각종 목적을 위해 인체 또는 기타 진핵세포내로 도입하기 위한 변형된(돌연변이된) RNA 성분 핵산을 제조할 수 있다.
실시예 8
인체 텔로머라제의 RNA 성분에 대한 앤티센스 플라스미드
다음 프라이머 세트를 이용하여 RNA 성분 cDNA를 PCR 증폭시킴으로써 앤티센스 형질발현 플라스미드를 제조하였다: (1) 플라스미드내 cDNA 삽입체보다 작은 앤티센스 핵산을 제조하는 NotB 및 G1; 및 (2) 전길이(full-length)(플라스미드내 삽입체 대비) 앤티센스 핵산을 생성하는 NotB 및 R3C. NotB의 뉴클레오티드 서열은 상기 실시예 1에 제시되어 있으며; G1 및 R3C 프라이머의 뉴클레오티드 서열은 하기에 제시되어 있다.
G1 : 5'-GAGAAAAACAGCGCGCGGGGAGCAAAAGCA-3'
R3C : 5'-GTTTGCTCTAGAATGAACGGTGGAAG-3'
PCR 증폭후, 증폭된 단편을 PmlI 부위에서 ～10 kb 형질발현 플라스미드내로 클로닝하였으며; 플라스미드는 선별용 마커로 푸로마이신 내성 부여, DHFR 및 하이그로마이신 B 내성 부여 유전자, SV40 복제 기점; 인체 텔로머라제의 RNA 성분에 대한 유전자의 앤티센스 가닥의 형질발현을 위해 배치한 유도성 인체 메탈로티오네인 유전자 프로모터(또한 높은 형질발현 수준을 얻기 위해 더욱 강력한 프로모터를 사용할 수 있음) 및 SV40 후기 폴리 A 부가 부위를 포함한다.
수득된 플라스미드(NotB/G1 생성물의 경우 pGRN42 및 NotB/R3C 생성물의 경우 pGRN45로 지칭)로 인산 칼슘 절차(Maniatis 등., 상기 문헌 참조)에 의해 섬유육종 세포주 HT1080을 형질감염시켰다. HT1080 세포는 정상적으로는 무한증식성이며; 인체 텔로머라제의 RNA 성분에 대한 앤티센스 RNA의 형질발현은 인체 텔로머라제의 RNA 성분이 단백질 성분과 결합하지 않도록 하여, 활성 텔로머라제의 형성을 차단하고 세포를 무한증식하게 한다.
실시예 9
인간을 제외한 포유류 유래의 RNA 성분 핵산의 규명 및 분리
본 발명의 시약이 다른 포유류 종 유래의 거의 상동성 핵산을 규명하고 분리하는데 사용할 수 있음을 입증하기 위해, 인체 RNA 성분 서열에 상보적인 PCR 프라이머를 사용하여 PCR로 상동성 서열을 증폭시켰다. 본 발명의 상기한 양태를 입증하기 위해 사용된 예시적인 프라이머 쌍은 서열 5'-CACCGGGTTGCGGAGGGAGG-3'을 갖는 프라이머 +10 및 서열 5'-GGAGGGGCGAACGGGCCAGCA-3'을 갖는 프라이머 R7로 구성되어 있다. 게놈 DNA를 침팬지, 다람쥐 원숭이, 리서스 원숭이 및 비비 조직으로부터 제조하여 약 0.5 내지 4 ㎎/㎖의 농도로 TE 완충액중에 용해시켰다.
각 조직 형태에 대해, 1 ㎕의 게놈 DNA, 48 ㎕의 마스터 믹스(이 마스터 믹스는 스트라타젠에서 시판하는 1x TaqExtenderTM 완충액, 200 μM의 각 dNTP 및 0.5 μM의 각 프라이머로 구성됨), 및 0.5 ㎕의 Taq 폴리머라제(5 유니트/㎕, 뵈링거 만하임):Tth 폴리머라제(TaqExtenderTM 폴리머라제, 스트라타젠에서 시판)의 1:1 혼합물로 구성된 PCR 혼합물을 제조하였다. 반응 튜브를 일차로 94℃에서 5분간 반응 혼합물을 가열한후, 94℃에서 30초, 63℃에서 10초, 및 72℃에서 45초 항온처리하는 사이클을 27회 수행하도록 프로그램된 열 순환기에 로딩하였다. 증폭 반응을 완결한후, 약 10 ㎕의 각 반응 혼합물을 전기영동을 위해 2％ 아가로즈 겔상에 로딩하였다. 전기영동, 겔 염색 및 UV 조사후에, 각 반응 혼합물이 예상된(～200 bp) 크기의 밴드를 포함하고 있음을 관측할 수 있었다. 이들 밴드로부터의 핵산을 클로닝하고 서열결정할 수 있으며, 이들 각 포유류종으로부터의 RNA 성분 유전자의 나머지도 인체 텔로머라제의 RNA 성분에 대한 유전자에 대해 전술한 바와 같이 클로닝할 수 있다. 하기 실시예 14에는 다람쥐 원숭이 RNA 고모넨트 유전자 서열결정의 구체적인 실례가 기술되어 있다.
실시예 10
돌연변이된 센스 인체 텔로머라제 RNA 성분 서열
본 실시예는 주형 영역에서의 텔로머라제 RNA 성분 서열의 변화가 인체 텔로머라제에 의해 합성된 서열을 변화시켜 염색체 텔로머라제 반복부에 변화를 야기시킨다는 것을 설명하기 위한 것이다.
TRC3 주형 영역을 재 프로그래밍하는 것이 인체 텔로머라제 활성으로 합성된 말단소립 반복부에서 대응하는 변화를 야기시키는지의 여부를 측정하기 위해, 전체 텔로머라제 RNA 성분(TRC3) 유전자 서열을 형질발현하는 유전자 단편을 클로닝하여 돌연변이원으로 만들었다. 서던 블롯 분석 결과, TRC3은 인체 게놈내 단일 사본 유전자에 하이브리드화하는 것으로 나타났다. TRC3의 게놈 사본을 람다 파지 라이브러리로부터 분리하였고, TRC3으로 탐침한 게놈 서던 블롯상에서 관찰된 것과 동일한 제한 지도를 갖는 것으로 밝혀졌다. 2.6 kb HindIII-Sac1 단편을 분리하여 pBluescript의 변형체내로 서브클로닝하여 게놈 TRC3 플라스미드 pGRN33을 생성하였다. 프라이머 연장, RACE PCR 및 RT-PCR을 통해 RNA의 5' 및 3' 단부를 지도화하였다. RNA 전사체의 크기는 노던 블롯상에서 그 이동에 따르면 약 550 염기였다. TRC3에 대한 전사 영역은 1.4 kb의 상류 서열을 보유한 게놈 클론의 중앙에 위치하였다.
정제된 텔로머라제 제조물로부터 RNA를 추출한후, 이를 다음 실험에서 사용하였다. 5' RACE: 32P-dATP의 존재하에서 앤티센스 TRC3 프라이머를 이용하여 제1 가닥의 cDNA를 작제하였다(R3B: 5'-CAACGAACGGCCAGCAGCTGACATT). PAGE에 의해 연장 생성물을 분석하고 자동방사성사진에 의해 규명한후, 절제하여 추출하였다. 올리고뉴클레오티드(NotA: 5'-pATAGCGGCCGCTT GCCTTCA-NH2)를 T4 RNA 리가제를 이용하여 상기 제1 가닥 생성물에 결찰시킨후, 네스트형 프라이머, R3c(5'-GTTTGCTCTAGAATGAACGGTGGAAG) 및 NotA 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드(NotB: 5'-TGAATTCTTGCGGCCGCTAT)를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 생성물을 아가로즈 겔상에서 분리하고, 밴드를 절제하여 올리고뉴클레오티드 G1(5'-AGAAAAACAGCGCGCGGGGAGCAAAGCA)을 프라이머로 사용하여 직접 서열결정하였다. 3' 단부 지도화: 3' RACE를 수행하려는 시도는 성공하지 못했다. 계속해서, 게놈 DNA 서열에 상보적인 일련의 앤티센스 프라이머를 사용하여 제1 가닥 cDNA 합성을 프라이밍하는데 RT-PCR 기술을 이용하였다. 이러한 일련의 프라이머들은 전사체의 5' 단부에서 시작하여 3' 단부로 진행하는 대략 150 bp 간격을 두고 떨어져 있었다. 이후, 제1 가닥 프라이머와 기지의 TRC3 전사체(F3b: 5'-TCTAACCCTAACTGAGAAGGGCGTAG) 내부에 있는 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. +558 내지 +950으로 고안된 프라이머가 아닌 간격 +100 내지 +450(5' 단부 기준)으로 고안된 모든 프라이머를 사용하여 만들어진 cDNA를 사용한 경우, 예상 크기의 역전사효소 감수성 PCR 밴드가 나타났다. 이는 위치 +450 내지 +558의 성숙된 TRC3 전사체의 추정 3' 단부에 위치하였다. 프라이머 고안과 RT-PCR의 후속 과정에서는 이 간격이 +545 내지 +558로 좁혀졌다.
TRC3의 예상 주형 서열을 게놈 플라스미드 pGRN33의 시험관내 돌연변이 유발에 의해 CUAACCCUA에서 CCAACCCCA(MuC) 또는 CAAACCCAA(MuA)로 변화되었다(실질적으로, 문헌(참조: Perez 등, J.Biol. Chem. 269: 22485(1994))에 따라 수행함). 작용성 텔로머라제내로 혼입되면, 이들 돌연변이체 RNA는 야생형 반복부 TTAGGG 보다는 TTGGGG(MuC) 또는 TTTGGG(MuA)의 합성의 주형이 되어야 한다. 이들 돌연변이체 텔로머라제 활성은, 활성에 더 이상의 dATP를 필요치 않으며, 야생형 활성이 ddATP에 의한 종결에 민감하기 때문에, 야생형 활성과는 쉽게 구분할 수 있었다. 또한 MuC 주형외에도 +180 bp에 17 bp 삽입이 존재하는 이중 돌연변이체(MuC+17)를 제조하였다. 이 돌연변이체는 17 bp 삽입에 대한 프로브를 사용하거나 또는 크기에 의해 변형된 RNA를 특이적으로 검출할 수 있었다.
생체 내에서의 TRC3의 형질발현에는 2.6 kb의 게놈 서열이 충분하였다. 세포를 MuC+17 플라스미드로 일시 형질감염시키고, 역전사 단계에서 프라이머로서 17 bp 삽입 서열을 이용하여 RT PCR에 의해 형질감염된 DNA로부터 형질발현된 RNA를 검출하였다. RNA는 MuC+17-형질감염된 세포에서는 검출되었으나, 모의 형질감염 세포에서는 검출되지 않았는데, 이는 2.6 kb 게놈 클론으로도 TRC3 형질발현에 충분함을 나타낸다. 이후, pCMVneo와 함께 HT1080 세포의 인산 칼슘 형질감염에 의해 이들 세 돌연변이체 각각으로부터 안정한 형질전환체를 유도하였다. G418에서 내성 클론을 선별하여 RT-PCR에 의해 MuC+17 RNA의 형질발현을 입증하였다(Irving 등,Exp. Cell Res. 202: 161(1992)).
돌연변이체 텔로머라제 활성을 시험하기 위해, 통합된 MuC*, MuC 또는 MuA 벡터(도 1의 C*, C 또는 A)를 사용하여 미형질감염된 세포와 3개의 안정한 형질전환체로부터 추출물을 분석하였다. 이 돌연변이체 추출물은 야생형 및 돌연변이 텔로머라제 활성을 둘다 포함하고 있는 것으로 추정되기 때문에, 각종 분석 조건을 이용하여 이들을 구분하였다. 정상적인 반응 조건하에서(dTTP, 32P-dGTP 및 dATP), 돌연변이 구조물로부터 3가지 추출물은 모두 RNase에 감수성인 야생형 텔로머라제 활성을 나타냈다(도 1, 레인 1-6). 예상과 같이, 이 활성은 ddCTP를 반응에 포함시키킨 경우 영향을 받지 않았고(도 1, 레인 7-9), ddTTP(레인 10-12)에 의해 상실되었다(레인 10-12). 대조적으로, dATP를 ddATP로 대체하였을 때, C(레인 14) 및 A(레인 15) 추출물은 RNase-감수성(레인 17 및 18) 텔로머라제 활성을 나타냈으나, C*(레인 13) 및 대조 추출물은 나타내지 않았다. 이러한 결과는 ddATP-내성 활성이 MuC 또는 MuA TRC3 RNA으로 텔로머라제가 재프로그램되었음을 나타냄을 시사한다. 대조적으로, C*내 17 bp 삽입은 재구성을 억제하는데, 이는 텔로머라제 재구성이 TRC3 서열에 매우 특이적임을 나타낸다.
돌연변이체 MuA에 의해 합성된 서열이 (GGGTTT)n임을 확인하기 위해, 본 발명자들은 기존의 PCR 방법을 변형시켜 텔로머라제 반복부를 유일한 텔로머라제 프라이머상에 부가하여 증폭시켰다(Kim 등., Science 266: 2011(1994)). 합성 프라이머를 사용하여, 본 발명자들은 서열 d(CCCAAACCCAAACCCAA)를 사용한 3' 프라이머가 (TTTGGG)n 반복부만을 증폭시키고 반복부를 포함하는 (TTAGGG)n는 증폭시키지 않는 반응 조건을 확인하였다.
야생형 대 돌연변이된 텔로머라제에 의해 부가된 말단소립 반복부를 구분하기 위해, 2-단계 분석으로 텔로머라제 반응에 뉴클레오티드 이용가능성을 제한하는 기술을 병용하였다. MuA 및 MuC는 각각 (TTTGGG)n 및 (TTGGGG)n의 말단소립 반복 서열을 생성하기 때문에, 일단 실온에서 10분 동안 dTTP 및 dGTP만의 존재하에서 세포 추출물을 TS 기술과 함께 항온처리하여 말단소립 반복부가 첨가되도록 하였다. 이후 5분 동안 추출물을 비등시켜서 나머지 텔로머라제 활성을 파괴하였다. 적절한 역 프라이머를 사용하고 모든 4 dNTP 및 전술한 미량의 32P-dCTP의 존재하에서 PCR 증폭에 의해 특이적인 DNA 서열을 가진 텔로머라제 생성물을 검출하였다(참조: Kim 등. 상기한 1994년 문헌). MuA 생성물을 검출하는데 사용된 역 프라이머는 (ACCCAA)4 였고, PCR 조건으로는 94℃, 10초, 60℃, 30초 및 72℃, 30초의 사이클을 20회 실시하였다. MuC 생성물을 검출하기 위해, 각각 3개의 역프라이머 (CCCCAA)3, (CCAACC)3 및 (CCAACC)3을 사용하여, 텔로머라제 생성물의 예상 어닐링 위치에 해당하는 위치로 이동하는 PCR 생성물을 수득하였다. 사용된 PCR 조건은 어닐링 온도를 50℃로 한다는 점만 제외하고는 상기한 바와 동일하였다. 동일한 조건하에서, 야생형 TRC-3 유전자로 형질감염된 세포 또는 모세포의 추출물로부터는 텔로머라제 생성물이 생성되지 않았다. PCR 증폭 조건의 특이성 시험에서, (TTTGGG)n 및 (TTGGGG)n을 포함하는 합성 올리고뉴클레오티드는 각각 (ACCCAA)4 또는 (CCCCAA)3 역 프라이머를 사용하여 대략 6개 뉴클레오티드의 래더 PCR 생성물을 생성시키는 반면에, (TTAGGG)n 올리고뉴클레오티드는 (ACCCAA)4 또는 (CCCCAA)3 역 프라이머를 사용하여 어떠한 PCR 생성물도 생성하지 않았다.
이들 조건을 사용하면, MuC 또는 야생형 세포가 아닌 MuA로부터의 추출물이 변형된 텔로머라제 분석에서 생성물을 생성하였는데, 이는 MuA 함유 세포로부터의 텔로머라제가 (TTTGGG)n 반복부를 생성함을 나타낸다. 유사한 방법을 이용하여 MuC 돌연변이체를 분석하여, (TTGGGG)n 반복부를 합성하였다. 아울러, 상기 데이터는 TRC3 유전자가 인체 텔로머라제의 RNA 성분을 암호함을 나타내는 강력한 증거를 나타내는데, 이를 본 발명자들은 인체 텔로머라제 RNA(human Telomerase RNA)에 대한 hTR로 TRC3을 재명명하였다.
실시예 11
유한증식성 세포 및 무한증식성 세포내의 텔로머라제 RNA 성분
대부분의 암세포는 높은 수준의 텔로머라제 활성을 발현하지만, 대부분의 정상적인 인체 체세포 내에서 텔로머라제는 검출되지 않는다[참조: Kim 등, 이미 기술한 1994년 문헌]. 무한증식성 암세포주 내에서 텔로머라제 RNA 성분 정도의 증가 여부를 결정하기 위해서, 텔로머라제 활성이 결핍된 5개의 유한증식성 초대 세포주 및 5개의 텔로머라제 활성이 큰 무한증식성 세포주 내에서 RT-PCR을 이용하여 텔로머라제 RNA 성분 및 GAPDH 전사체 수준을 분석하였다. 텔로머라제 RNA 성분 전사체의 정상 상태의 정도는 GAPDH의 정도와 비교하는 경우, 초대 세포 내에서 보다 종양 세포 내에서 3 내지 12 배 높게 나타났다(참조: 도 2A). 텔로머라제 RNA 성분 정도는 텔로머라제를 높은 정도로 발현하는 무한증식성 암 세포 내에서 증가하였는데, 낮은 수준이지만 용이하게 검출할 수 있는 텔로머라제 RNA 성분이 검출가능한 텔로머라제 활성이 없는 유한증식성 초대 세포 내에도 존재한다는 것은 흥미로운 일이다(1-5 레인).
또한, 노던 블롯 분석법을 이용하여 각종의 정상적인 인체 조직 내에서 텔로머라제 RNA 성분 수준을 조사하였다. 고환 및 난소는 텔로머라제 RNA 성분 수준이 가장 높았는데, 이들 조직은 텔로머라제 활성을 높은 수준으로 발현하는 조직이었기 때문에 예상한 바였다. 그러나, 다수의 기타 조직들도 텔로머라제 RNA 성분을 발현하였다(참조: 도 2B 및 2C). 이들 조직으로는 정상적인 신장, 전립선 및 성인 간 조직을 들 수 있으며, 이들 모두는 검출 가능한 수준의 텔로머라제 활성이 결핍되어 있다. 이들 결과로부터 세포주로부터 획득한 자료(참조: 도 2A)를 확인하였으며, 이는 텔로머라제 RNA 가 인체 조직 내에 존재할 수 있으나, 불활성임을 제안하고 있다. RNA 발현의 유사한 조직-특이성 차이는 생쥐 조직에서도 나타나지만; 대다수의 정상적인 생쥐 조직은 텔로머라제 활성에 대해 양성이다. 인체 세포 내에서 명백한 텔로머라제 활성의 증가된 억제는 배양물 내에서 생쥐 세포는 자연적으로 무한증식화하지만, 인체 세포는 그리하지 않는 이유를 설명하는데 도움을 줄 수 있다.
실시예 12
세포 발병상태 및 세포 사멸을 유도하는 헤라(HeLa) 세포 내에서 앤티센스 hTR(인체 텔로머라제 RNA 성분) 전사체의 발현
무한증식화된 세포 내에서 텔로머라제의 기능을 조사하기 위해, 앤티센스 hTR 발현 구조물을 헤라 세포 내에 투입하였다. 1 내지 193 bp의 인체 텔로머라제 RNA 성분 cDNA 클론인 TRC3을 함유하는 200 bp의 EcoRI 단편을 p10-3 및 pBBS212 의 EcoRI 위치 내로 삽입하여 각각 플라스미드 p10-3-hTR 및 pBBBhTR을 생성하였다. 플라스미드 p10-3-hTR은 상기한 바와 같이 두개의 상이한 배향으로 상류의 5개의 Tet-작동 유전자에 대해 테트라사이클린-조절된 CMV 최소 프로모터의 전사 제어하에 텔로머라제 RNA 성분의 앤티센스를 발현한다[참조: Gossen 등, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89: 5547 (1992)]. 플라스미드 pBBS-hTR은 MPSV 프로모터의 제어하에 hTR의 앤티센스를 발현한다[참조: Lin 등, Gene 147: 287 (1994)]. 동시에, 앤티센스 hTR 암호화 서열이 결핍된 대조용 발현 벡터도 헤라 세포 내에 전기 침투시켰다. 앤티센스 또는 대조용 플라스미드를 함유하는 클론은 세 가지 별개의 실험에서 선별하였다. 최초에, 앤티센스 hTR을 발현하는 41개의 배양물은 대조용 벡터를 보유하는 세포로 동일하게 성장하였다. 그러나, 전사후 23 내지 26의 군집 배가 수준(PDL)에서, 배양물을 발현하는 41개의 앤티센스중 33개는 발병상태를 겪는다(표 1). 이들 배양물 내에서 세포 발병상태는 20에서 26 PD로의 세포 성장의 현저한 억제, 이후 일주일의 기간에 걸쳐 세포의 원형화(rounding up) 및 판형으로부터의 분리를 특징으로 한다. 세포가 발병상태를 겪는 33개의 경우중 28개의 경우에서 대부분의 세포가 사멸한후 3주 내에 복귀돌연변이성 콜로니는 거의(＜1％) 관찰되지 않았다. 복귀돌연변이 세포는 앤티센스 hTR 구성물의 억제 효과를 회피하는 변이주를 나타낸다. 앤티센스 콜로니와는 대조적으로 50회 이상의 배가 단계에 걸친 성장 또는 유한증식성에 임의의 변화가 생긴 대조용 벡터를 함유한 세포주는 없었다.
[표 1]
더 짧은 평균 TRF 및 세포 발병상태를 초래하는 앤티센스 hTR
Figure pct00007
HeTe7 세포(테트라사이클린 억제제-VP16 키메라성 단백질을 높은 정도로 발현하는 헤라 세포)를 테트라사이클린-VP16 유도된 CMV 최소 프로모터의 제어 하에서 앤티센스 hTR을 발현하는 플라스미드 p10-3-hTR 또는 MPSV 프로모터(54)의 제어 하에서 앤티센스 hTR을 발현하는 pBBS-hTR을 이용하는 전기 침투법으로 형질감염시키는 3개의 개별적인 실험을 수행하였다. [이들 실험에서, 테트라사이클린에 의한 조절은 관찰되지 않았다. p10-3-hTR을 이용하는 실험은 전형적으로 테트라사이클린 부재 하에서 수행하였는데, 그 이유는 테트라사이클린-VP16-유도된 CMV 최소 프로모터의 제어 하에서 루시퍼라아제 또는 앤티센스 hTR을 이용하여 수행한 대조용 실험에서 테트라사이클린의 존재 또는 부재가 HeTe7 세포내 루시퍼라아제 또는 앤티센스 hTR 발현에 미치는 영향이 적다는 것이 밝혀졌기 때문이다. 실제로, HeTe7 세포 내에서 앤티센스 hTR 구성물을 이용하는 초기 실험에서 세포는 테트라사이클린 존재하의 23 내지 26 PDL에서 여전히 발병상태를 겪었다.]. 대조용으로서, HeTe7 세포는 동일한 조건하에서 모 벡터를 이용하여 형질감염시켰다. 11 내지 18개의 안정한 클론은 각각의 형질감염 시리즈로부터 분리하였다. 모든 분리된 클론들은 20 PDL 까지 동일한 형태와 성장 프로필은 보였으며, 대부분의 앤티센스-발현 클론의 성장은 현저히 저하되었다(p10-3-hTR 및 pBBS-hTR). PDL 23-26,에서 이들 세포는 발병상태를 겪었으며, 이는 확장되고, 원형화된 세포의 출현을 특징으로 한다. 그러나, pBBS-hTR 형질감염된 HeTe7 세포로부터 생성된 모든 클론이 발병상태를 겪는 것은 아니며; 앤티센스 hTR을 발현하는 8개의 클론은 대조용 배양물과 유사하게 계속 성장하였다. 모든 클론으로부터 얻어진 세포는 PDL 23에서 수확하였으며, 평균 TRF 길이를 측정하였다. P 값은 비결합 t-테스트법으로 계산하였다. 각각의 시리즈에 대해, 발병상태를 겪는 클론의 비율을 나타냈다.
말단소립 길이 및 텔로머라제 억제가 앤티센스 발현 클론 내에서 세포 발병상태와 어떤 상관관계가 있는지를 결정하기 위해서, 몇몇 전발병 상태 대조용 및 실험용 콜로니 내에서 말단소립 길이 및 텔로머라제 활성을 23 PDL에서 분석하였다. 대조용 벡터를 함유하는 모든 콜로니의 평균 TRF 길이(3.22 및 3.27 kb)는 모 세포주(3.15 kb)와 유사한 반면, 발병상태를 겪은 앤티센스 벡터 구성물을 함유하는 클론의 평균 TRF 길이는 2.39 내지 2.72 kb 또는 모 세포주의 평균 TRF 길이 보다 17 내지 26％ 더 짧았다(참조: 도 3). 이들 자료는 텔로머라제 활성의 억제에 기인한 앤티센스 함유 클론 내에서 상실된 말단소립 반복부와 일치하였다. 이를 직접적으로 검증하기 위해, 텔로머라제 활성을 상기 클론중 14개의 클론에서 분석하였다. 짧아진 말단소립은 평균 TRF 가 3.22에서 2.39 kb(P=0.0008)로 감소되었기 때문에, 상기 정도가 말단소립 길이를 유지하기에 충분치 못함을 제안하고 있음에도 불구하고, 텔로머라제 활성은 일반적으로 낮았으나, 다수의 앤티센스 클론에서 검출할 수 있었다. 앤티센스 벡터(pBBS-hTRb)를 함유하는 발병상태를 겪지 않는 8개의 클론에서, 말단소립 길이는 현저히 변하지 않았으며(3.03 대 3.33, P=0.355), 텔로머라제 활성은 대조용의 텔로머라제 활성과 유사하였다. 말단소립이 임계 길이에 이른 경우, 상기 결과들은 함께 말단소립 손실이 세포 발병상태 및 세포 사멸을 유도한다는 증거가 되고 있다.
또한, 앤티센스 텔로머라제 RNA 성분을 발현하는 헤라 세포 내에서 세포 발병상태의 유도는 텔로머라제 억제가 인체 암에 대한 특이적이고, 유효한 치료를 제공할 수 있음을 지지하는 사실이다.
실시예 13
동일계내(in situ) 증폭 및 검출
텔로머라제 RNA의 동일계내 검출
A. 동일계내 형광 하이브리드화(FISH)
세포와 조직의 혼합된 집단 내에서 텔로머라제 활성 세포의 동정은 텔로머라제의 RNA 성분에 표적화된 표지된 프로브의 동일계내 하이브리드화에 의해 수행하였다. 조직 세포 샘플은 현미경용 유리 슬라이드 상에 고정하였으며, 충분히 투과가능하게 하였으며, 동일계내 하이브리드화에 사용하였다. 인체 텔로머라제 RNA (hTR)에 대한 동일계내 하이브리드화의 한 예는 70 내지 74℃로 예비가온한 70％ 탈이온화된 포름아미드/2X SSC 용액에 2 내지 3분 동안 상기 슬라이드를 침지함으로써 핵산을 일차 변성시키는 단계로 구성되어 있다. 그후, 상기 슬라이드를 빙-냉 70％ 에탄올로 이전하고, 95％ 에탄올로 이전한 후, 100％ 에탄올로 이전하였다(각각의 용액 내에서 4분 동안 체류시켰다). 표지된 htRNA 프로브(비오틴, 디곡시게닌, 방사성 동위원소, 형광 표지로 표지한 ∼500 bp DNA 프로브) 100 내지 200 ng(슬라이드 1개당)을 건조시키고, 100％ 탈이온화된 포름아미드 10 ㎕ 내에 재현탁시키고, 75℃에서 8분 동안 항온처리하여 변성시킨 직후 얼음상에서 냉각하였다. 2X 하이브리드화 완충액(4X SSC; 4X 덴하르트 용액; 20％ 덱스트란 설페이트; 100 mM 트리스(pH 7.5)) 10 ㎕를 재현탁된 프로브 10 ㎕에 첨가하였다. 고정된 샘플에 프로브/하이브리드화 혼합액(20 ㎕)을 첨가하여 커버슬립을 피복하고, 고무 시멘트 또는 네일 폴리쉬(nail polish)로 커버슬립을 밀봉하였다. 상기 샘플을 37℃에서 8-48 시간 동안 배양하였다. 하이브리드화후, 커버슬립을 제거하고, 샘플을 2X SSC/50％ 탈이온화된 포름아미드로 37℃에서 2회 세척하고, 37℃에서 2X SSC로 2회 세척하였다(1회 세척시간은 5분이었다). 그후, 상기 샘플을 현미경으로 관찰하였다.
B. 프라임된 동일계내 표지화(PRINS)
전형적인 동일계내 하이브리드화의 다른 변법은 프라임된 동일계내 표지화(PRINS)이다. PRINS에 의한 hTR의 검출은 역전사효소(RT)에 의한 hTR의 초기 cDNA 를 합성하는 단계와 그후 hTR-특이성 올리고뉴클레오티드 프로브 및 표지된 뉴클레오티드를 혼입하는 쇄 신장 단계로 이루어진다. hTR의 RT 반응은 여러 가지 방법으로 수행할 수 있다. RT 반응의 한 예는 GeneAmp 열안정성 rTth 역전사효소 RNA PCR 킷트(퍼킨 엘머)를 이용하는 방법이다. 상기 방법에서, RT 혼합액(10 mM 트리스-HCl, pH 8.3; 90 mM KCl; 1 mM MnCl2; 200 μM dNTPs; 2.5 U rTth DNA 폴리머라제; 0.4 μM 복귀 프라이머[예를 들어, R7G: 5'-GGAGGGGCGAACGGGCCAGCAG-3']) 10 ㎕를 고정되고, 투과가능한 샘플 상에 위치시키고, 커버슬립으로 밀봉하고, 네일 폴리쉬로 고정시키고, 미네랄로 피복하고, 70℃에서 30분 동안 배양하였다. 그후, 크실렌으로 5분 동안 세척하고, 100％ 에탄올에서 5분 동안 세척함으로써 미네랄 오일을 제거하였다. 커버슬립을 제거하고, DepC 물로 대충 세척한후, 100％ 에탄올로 세척하고, 5분 동안 건조하였다. 그후, PRINS 혼합물(5％(부피/부피) 글리세롤; 10 mM 트리스-HCl, pH 0.3; 100 mM KCl; 0.05％(중량/부피) 트윈 20; 0.75 mM EGTA; 2.5 mM MgCl2; 0.4 μM 전향 프라이머[예를 들어, U3b: 5'-GCCTGGGAGGGGTGGTGGCTATTTTTTG-3']; 200 μM dA, dG, dCTP; 110 μM dTTP; 90 μM 표지된 dUTP) 10 ㎕를 상기 샘플 위에 위치시켰다. 커버슬립을 이용하여 밀봉하고, 네일 폴리쉬로 고정하고, 광유로 피복하고, 70℃에서 30분 내지 3시간 동안 배양하였다. 그후, 상기 샘플을 세척용 완충액(4X SSC; 0.05％ 트윈 20)으로 3회 세척하고, 2분 동안 70℃로 가열하였다. 그후, 시그널을 관찰하였다.
C. 동일계내 RT-PCR
hTR의 RT-PCR 검출은 역전사효소 반응(비루스 역전사효소, 또는 열안정성 DNA 폴리머라제의 고유 RT 활성에 의함)을 이용하는 표적 RNA 의 cDNA 합성 단계 및 그후 상기 표적 cDNA의 동일계내 PCR 증폭 단계로 이루어진다. 여러 가지 RT 반응을 hTR의 cDNA 합성에 사용할 수 있으며, 그 예로는 섹션 11.B에서 논급한 RT 프로토콜을 들 수 있다. 또한, PRINS 검출법에 사용된 것과 동일한 완충액 및 프라이머를 RT-PCR에 사용할 수 있으나, 최종 배양 조건은 70℃에서 30분 내지 3 시간 동안 배양하는 대신에, 상기 샘플은 94℃/40초, 55℃/90초로 30 내지 40 사이클 동안 열싸이클러 내에서 증폭시켰다(참조: 섹션 11B). PCR 이후, 상기 샘플을 세척용 완충액(4X SSC; 0.05％ 트윈 20)으로 3회 세척하고, 2분 동안 70℃로 가열하였다. 그후, 시그널을 관찰하였다.
초기 RT 반응으로부터 생성된 cDNA를 증폭시키기 위한 다른 방법은 GeneAmp 동일계내 PCR 시스템 1000 및 GeneAmp 동일계내 PCR 코어킷트(퍼킨엘머)를 이용하여 수행하는 방법이다.
고정되고, 투과가능하게한 샘플 상에서 동일계내 RT-PCR의 1 단계는 GeneAmp EZ rTth RNA PCR 프로토콜과 GeneAmp 동일계내 PCR 시스템 1000(퍼킨 엘머)을 병용하여 수행할 수 있다. 상기 방법은 EZ RNA PCR 완충액 혼합물(50 mM 비신; 115 mM 아세트산 칼륨; 8％(중량/부피) 글리세롤, pH 8.2; 300 μM dA, dG, dCTP; 165 μM dTTP; 135 μM 표지된 dUTP; 5-1O U의 rTth DNA 폴리머라제; 2.5 mM Mn(OAc)2; 0.45-1 μM의 htRNA-특이성 프라이머, 예를 들어 R7 및 U3b) 40 내지 50 ㎕를 현미경 슬라이드 상의 고정되고, 투과가능하게한 샘플위에 위치시키는 단계, 이를 제조자의 지시에 따라 실리콘 개스킷 및 클립으로 밀봉하는 단계로 이루어진다(GeneAmp 동일계내 PCR 시스템 1000, 퍼킨 엘머). 그후, 상기 샘플을 GeneAmp 동일계내 PCR 장치 내에 위치시키고, 94℃에서 120초 동안 가열하였다. 이후, 94℃/45초 및 60℃/45초에서 30 내지 40 사이클로 증폭하였다. 증폭후, 상기 샘플을 세척하고, 상기한 바와 같이 시각화하였다.
PCR 증폭중 형광 표지의 직접 혼입으로부터 초래할 수 있는 바탕 시그널을 감소시키기 위해, 비표지된 dNTPs를 이용하는 PCR 증폭, 이후 증폭된 생성물에 대해 특이성인 표지된 하이브리드화 프로브를 이용하는 동일계내 하이브리드화로 이루어지는 간접 검출을 이용할 수도 있다. 상기 방법에서, 시그널은 표지된 dNTPs 또는 프라이머 부재 하에서 상기 RT-PCR 법중 임의의 방법으로 증폭되며, 증폭된 생성물은 동일계내 하이브리드화에 의해 검출된다.
D. 동일계내 PCR 에 생성물 연장 프라이머의 적용
동일계내 PCR 의 성공 여부는 세포에서 세포성 매트릭스 내부로의 증폭된 생성물의 유출 방지 여부에 달려있다. 따라서, 일반적으로 받아들여지는 사실은 500 bp 보다 더 작은 생성물은 동일계내 PCR에 적합하지 않다는 것이다. 세포성 매트릭스로부터 500 bp 보다 더 작은 PCR 생성물의 유출을 방지하기 위해서는 PCR 생성물 내로 "용적이 큰(bulky)" dNTPs(예를 들어, 비오틴, 형광 표지, 디곡시게닌 표지된 dUTP)를 혼입하는 방법이 일반적으로 이용된다. 동일계내 PCR 에서 작은 생성물의 유출을 방지하는 다른 방법은 동일계내 PCR 프로토콜 내로 생성물 연장 프라이머를 혼입하는 것이다.
상기 방법은 5' 말단에 3-4개의 반복 서열(예를 들어, [5'-TTTCCC-3']3-4)을 포함하고, 이어서 표적(참조: 도 4, 프라이머 1)에 특이성인 서열을 포함하는 프라이머 및 적합한 복귀 프라이머(프라이머 2) 및 반복 서열(프라이머 3, 예를 들어, [5'-TTTCCC-3']4 만을 포함하는 제3 프라이머를 병용함으로써 동일계내 PCR에서 특이성 표적을 증폭하는 단계를 포함한다. 프라이머 3의 존재는 PCR 생성물을 신장시키는데, 이는 표적 PCR 생성물의 3'-말단에 프라이머 3의 엇갈린 결합에 기인한다. PCR 생성물의 신장은 초기 PCR 조건의 어닐링 온도를 감소시킴으로써 유도할 수 있다.
예를 들어, 프라이머 1 내의 표적 서열의 어닐링 온도가 60℃인 경우, 초기에 샘플은 94℃/45℃ 및 60℃/45℃에서 15 내지 20 사이클, 그후 94℃/45℃ 및 50℃/45℃에서 15 내지 20 사이클로 증폭될 것이다. 제2 PCR 단계에서 어닐링 온도의 감소는 반복 서열에 대한 프라이머 3의 엇갈린 결합의 기회를 증가시킴으로써 신장된 PCR 생성물의 생성을 용이하게 할 것이다. 이어서 생성된 신장된 PCR 생성물은 세포성 매트릭스를 통해 유출되는 경향이 덜 할 것이며, 따라서 동일계내 PCR 분석에서 더 양호한 시그널을 유지할 것이다.
실시예 14
인간을 제외한 영장류의 텔로머라제 RNA 성분
인간 RNA 성분의 서열에 기초한 프라이머를 이용하여 기타 포유류 텔로머라제 RNA 성분 서열의 획득 가능성을 입증하기 위해, 인간 서열 PCR 프라이머를 이용하여 인간과 비교하는 경우 진화학상 가장 다른 비인간 영장류의 하나로 생각되는 다람쥐 원숭이의 게놈 DNA로부터 텔로머라제 RNA 성분 서열을 증폭시켰다.
다람쥐 원숭이 게놈 DNA는 상기한 바와 같은 프라이머 F3b(5'-TCTAACCCTAACTGAGAAGGGCGTAG-3') 및 H3+20(5'-CTCAAGGTCATCGCCAAGGT-3')를 이용하여 증폭하였다. 단일 DNA 밴드가 관찰되었으며, 이어서 벡터 pBluescript II SK(스트라타젠, 캘리포니아, 샌디에고)내로 클론하였다. 이어서 생성된 클론은 보편적인 역 프라이머(5'-AACAGCTATGACCATG-3'), 프라이머-210-3'(5'-TCACGTCTCCTGCCAATTTGC-3') 또는 프라이머 H3+20을 이용하는 PCR 법으로 부분적으로 서열결정하였다. 다람쥐 원숭이 텔로머라제 RNA 성분의 부분 서열은 하기하는 바와 같다:
[서열 3]
Figure pct00008
및
Figure pct00009
인체 텔로머라제 RNA 성분 유전자의 번호부여에 관한 협약을 이용하여 인체 텔로머라제 RNA 성분 유전자 서열에 정열시키는 경우, 하기하는 바와 같은 배열이 획득되었다(하이픈은 서열배열을 최적화하기 위해 사용하였다).
[서열 4]
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
및
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
전술한 실시예는 본 발명의 여러 가지 양태 및 본 발명의 핵산이 어떻게 제조되는지를 기술한 것이다. 상기 실시예는 단지 예시적인 것이며, 첨부하는 특허청구의 범위에 의해 포함되는 본 발명의 여러 가지 상이한 양태를 제한하려는 의도는 없다.

Claims (15)

  1. 포유류 텔로머라제 단백질 성분과 회합하여 효소 활성있는 텔로머라제 완전효소(holoenzyme)를 형성할 수 있는 실질상 순수한 텔로머라제 RNA 성분으로서,
    상기 RNA 성분은:
    a) 하기 서열 또는 이의 상보성 서열로 구성된 뉴클레오티드 서열:
    Figure pct00017
    b) 상기 a)에 기재된 서열과 적어도 80％ 또는 95％ 동일한 서열 또는 이의 상보성 서열로 구성된 뉴클레오티드 서열; 또는
    c) 플라스미드 pGRN33(ATCC 75926)의 2.5kb HindⅢ-SacI 삽입물에 특이적으로 하이브리드되는 뉴클레오티드 서열에 의해 특징 지워지는 것인 텔로머라제 RNA 성분.
  2. 제1항에 있어서, 상기 RNA 성분이 인간 텔로머라제 RNA 성분인 것인 텔로머라제 RNA 성분.
  3. 제1항 또는 제2항에 따른 텔로머라제 RNA 성분을 암호화하는, 분리된, 재조합된 또는 합성된 핵산 분자.
  4. 인간 텔로머라제 RNA성분(hTR)에 특이적으로 하이브리드되는 올리고뉴클레오티드 서열을 함유하는 뉴클레오티드 프로브로서, 상기 올리고뉴클레오티드 서열은 하기 서열의 25 내지 200개의 연속된 핵산 또는 이의 상보성 서열로 구성되는 것인 뉴클레오티드 프로브:
    Figure pct00018
  5. 인간 텔로머라제 RNA 성분(hTR)을 특이적으로 증폭시키는 한 쌍의 뉴클레오티드 프라이머로서, 상기 프라이머 중 하나 또는 둘은 하기 서열의 10 내지 200개의 연속된 핵산 또는 이의 상보성 서열로 구성되는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 한 쌍의 뉴클레오티드 프라이머:
    Figure pct00019
  6. 텔로머라제 효소 활성을 저해하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열을 함유하는 암 치료용 조성물로서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열은 하기 서열에 상보적인 10 내지 200개의 뉴클레오티드로 구성되는 것인 조성물:
    Figure pct00020
  7. 텔로머라제 효소 활성을 저해하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열을 함유하는 암 치료용 조성물로서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열은 하기 서열에서 선택된 서열의 10 내지 22개의 뉴클레오티드로 구성되는 것인 조성물:
    Figure pct00021
  8. 텔로머라제 효소 활성을 저해하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열을 함유하는 암 치료용 조성물로서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열은 세포 내부에서 인간 텔로머라제 RNA 성분의 주형에 특이적으로 하이브리드되고, 상기 주형은 하기 서열로 구성되는 것인 조성물:
    Figure pct00022
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 따른 조성물과 세포를 시험관 내에서 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포 발병상태(cell crisis)를 초래하거나 또는 세포 성장을 저해하는 방법.
  10. 제6항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 서열이 단일 가닥 DNA(ssDNA), 단일 가닥 RNA(ssRNA)이거나, 또는 O-메틸 리보뉴클레오티드, 포스포로티오에이트 뉴클레오티드 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드와 같은 합성 뉴클레오티드에서 제조되는 것인 조성물.
  11. a) 하기 서열의 25 내지 100개의 연속된 뉴클레오티드 또는 이의 상보성 서열로 구성된 프로모터 서열:
    Figure pct00023
    b) 상기 a)에 기재된 서열과 80％ 또는 95％ 동일한 100개의 연속된 뉴클레오티드 또는 이의 상보성 서열로 구성된 프로모터 서열: 또는
    c) 플라스미드 pGRN33(ATCC 75926)의 2.5kb HindⅢ-SacI 삽입물에 특이적으로 하이브리드되는 프로모터 서열
    을 함유하는 재조합 폴리뉴클레오티드.
  12. 제11항에 있어서, 상기 프로모터 서열은 암호화 서열의 발현을 초래하도록 이종 암호화 서열에 융합되는 것인 재조합 폴리뉴클레오티드.
  13. 환자에게서 채취한 샘플 내의 인간 텔로머라제 RNA 성분을 검출하는 방법으로서, 프로브가 샘플 내의 임의의 인간 텔로머라제 RNA 성분과 특이적으로 하이브리드되는 조건 하에서 샘플을 제4항에 따른 핵산 프로브와 접촉시키는 단계, 및 그 결과로서 형성되는 임의의 하이브리드를 검출하는 단계를 포함하는 방법.
  14. 환자에게서 채취한 샘플 내의 인간 텔로머라제 RNA 성분을 검출하는 방법으로서, 샘플을 제5항에 따른 한 쌍의 증폭 프라이머와 접촉시키는 단계, 존재하는 임의의 인간 텔로머라제 RNA 서열이 증폭되도록 증폭 반응을 수행하는 단계, 및 그 증폭 생성물을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
  15. 인간 텔로머라제 RNA 성분의 존재 여부를 검출하는 킷트로서, 제4항에 따른 핵산 프로브 또는 제5항에 따른 한 쌍의 프라이머를 함유하는 킷트.
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