JP4068861B2 - 哺乳動物のテロメラーゼ - Google Patents

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Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒトテロメアDNAの合成に関与するリボヌクレオプロテイン酵素である、ヒトテロメラーゼに関する。本発明は、分子生物学、化学、薬理学、ならびに医学および診断技術の分野に関連する方法および組成物を提供する。
【０００２】
【従来の技術】
真核生物の染色体の末端またはテロメアにおけるDNAは、普通、タンデムに繰り返す単純な配列からなっている。テロメラーゼは、リボヌクレオプロテイン酵素であり、この酵素のRNA成分中に含まれる配列を鋳型として用いて、テロメアDNAの一方の鎖を合成する。Blackburn，1992，Annu. Rev. Biochem. 61:113-129を参照のこと。これは、本明細書に参考として援用される。
【０００３】
ヒトテロメラーゼのRNA成分は、今日まで科学文献には報告されていないが、ヒトテロメラーゼは、配列5’-TTAGGG-3’を有するテロメアリピートユニットを合成することは知られている。Morin，1989，Cell 59:521-529、およびMorin，1991，Nature 353:454-456を参照のこと。これらは、本明細書に参考として援用される。この知見は、ヒトテロメラーゼのRNA成分のヌクレオチド配列の残りの部分の単離および同定を可能にするには十分ではなかった。Saccharomyces cerevisiae、テトラヒメナの特定種、および他の繊毛虫の特定種（例えば、EuplotesおよびGlaucoma）のテロメラーゼ酵素のRNA成分は、配列が決定され、科学文献に報告されている。SingerおよびGottschling，1994年10月21日，Science 266,:404-409; Lingnerら、1994, Genes & Development 8:1984-1988; GreiderおよびBlackburn，1989，Nature 337:331-337; RomeroおよびBlackburn，1991，Cell 67:343-353; ならびにShippen-LentzおよびBlackburn，1990，Science 247:546-552を参照のこと。これらは本明細書に参考として援用される。これらの繊毛虫のテロメラーゼ酵素はヒトのものとは異なるテロメアリピートユニットを合成する。
【０００４】
ヒトテロメラーゼに関するさらなる情報が、大いに必要である。テロメアDNAのリピートユニットは単純な性質と考えられているにもかかわらず、科学者らは、長い間、テロメアが染色体の構造と機能の維持に重要な生物学的な役割を有していることを信じてきた。より最近、科学者らは、テロメアDNAの欠失が細胞の老化と加齢の引き金として作用し得ること、ならびにテロメラーゼの調節が重要な生物学的関連性を有し得ると推測している。Harley，1991，Mutation Research256:271-282を参照のこと。これは本明細書に参考として援用される。
【０００５】
テロメラーゼ活性を検出する方法、ならびにテロメラーゼ活性を調節しあるいは活性に影響を与える化合物を同定する方法もまた、テロメアの長さおよびテロメラーゼ活性の制御による細胞の老化の治療および診断方法ならびに不滅化の方法とともに、記載されている。PCT特許公開第95/13381号,1995年５月18日公開; PCT特許公開第95/13382号,1995年５月18日公開; PCT特許公開第93/23572号，1993年11月25日公開;および米国特許出願番号未決定（発明者はC.Harley，N．Kim，S．Weinrichである），1995年６月７日出願; 08/315,214,1994年９月28日出願; 08/315,216，1994年９月28日出願; 08/288,501,1994年８月10日出願; 08/014,838，1993年２月８日出願; 08/153,051および08/151,477、それぞれ、1993年11月12日出願; 08/060,952，1993年５月13日出願; 08/038,766，1993年３月24日出願;および、07/882,438，1992年５月13日出願を参照のこと。これらは本明細書に参考として援用される。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
テロメラーゼ媒介治療ならびにテロメラーゼのアッセイならびにスクリーニング方法についての重要な改良および新たな機会は、テロメラーゼのRNA成分を含有する核酸および/またはタンパク質成分をコードする核酸が純粋なまたは単離可能な形態で入手可能であり、このような核酸のヌクレオチド配列が知られている場合に、実現され得た。本発明はこれらのおよび他の要求に応え、このような改良および機会を提供する。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、実質的に純粋な形態にある哺乳動物テロメラーゼのＲＮＡ成分であって、プラスミドｐＧＲＮ３３（ＡＴＣＣ ７５９２６）の約２．５ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ挿入片の位置１４５９で始まる配列；ここで位置１がＳａｃＩ制限部位の最初のＧヌクレオチドおよび位置２４２６がＨｉｎｄＩＩＩ制限部位の最後のＴヌクレオチドに対応する；を有するヒトテロメラーゼのＲＮＡ成分と同一であるか、またはそれとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によって特徴付けられる、ＲＮＡ成分を提供する。
【０００８】
ある局面において、このＲＮＡ成分は、ヒトテロメラーゼのＲＮＡ成分である。
【０００９】
本発明はまた、抗テロメラーゼ活性を有するオリゴヌクレオチドであって、このオリゴヌクレオチドはプラスミドｐＧＲＮ３３（ＡＴＣＣ ７５９２６）の約２．５ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ挿入片内に含まれるヒトテロメラーゼＲＮＡ成分遺伝子の連続した配列と同一であるかまたはそれと相補的である少なくとも１１ヌクレオチドを含み、 ここで、このオリゴヌクレオチドは、５’−ＴＴＡＧＧＧ−３’のダイマーまたはその他のポリマーではない、オリゴヌクレオチドを提供する。
【００１０】
ある局面において、このオリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも２５ヌクレオチドである。
【００１１】
本発明はまた、プラスミドｐＧＲＮ３３（ＡＴＣＣ ７５９２６）の約２．５ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ挿入片内に含まれるヒトテロメラーゼＲＮＡ成分遺伝子の連続した配列と同一であるかまたはそれに相補的である少なくとも１１ヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドプローブを提供する。
【００１２】
ある局面において、このオリゴヌクレオチドプローブは、検出可能な標識をさらに含み、さらなる局面において、このオリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも１５ヌクレオチドである。特定の局面において、このオリゴヌクレオチドは、５’−ＴＴＡＧＧＧ−３’のダイマーまたはその他のポリマーではない。
【００１３】
本発明はまた、この哺乳動物テロメラーゼのＲＮＡ成分をコードするヌクレオチド配列を含む、組換え核酸分子が提供する。
【００１４】
ある局面において、この組換え核酸分子は、プロモーターをさらに含み、このプロモーターが、このヌクレオチド配列の転写を駆動するために配置される。
【００１５】
本発明はまた、これらの組換え核酸で形質転換された細胞を提供する。
【００１６】
本発明はまた、組換えテロメラーゼ酵素を生産する方法であって、テロメラーゼのタンパク質成分を発現する真核生物宿主細胞中に、プロモーターおよび哺乳動物テロメラーゼＲＮＡ成分をコードするヌクレオチド配列を含む組換え核酸分子を導入する工程であって、ここで、このプロモーターが、このヌクレオチド配列の転写を駆動するために配置される、工程を包含する、方法を提供する。
【００１７】
ある局面において、この真核生物宿主細胞は、ヒトテロメラーゼのタンパク質成分を発現する。別の局面において、この哺乳動物テロメラーゼＲＮＡ成分は、ヒトテロメラーゼＲＮＡ成分である。
【００１８】
本発明はまた、ヒト細胞中のテロメラーゼ活性を阻害する方法であって、細胞に、プラスミドｐＧＲＮ３３（ＡＴＣＣ ７５９２６）の約２．５ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ挿入片内に含まれるヒトテロメラーゼＲＮＡ成分（ｈＴＲ）遺伝子の連続した配列と同一であるかまたはそれに相補的である少なくとも１１ヌクレオチドのヌクレオチド配列であって、５’−ＴＴＡＧＧＧ−３’のダイマーまたはその他のポリマーではないヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する工程を包含する、方法を提供する。
【００１９】
ある局面において、この細胞は、このポリヌクレオチドの発現を駆動するために配置されるプロモーターを含む組換え核酸を備える。
【００２０】
本発明はまた、サンプルがヒトテロメラーゼＲＮＡ成分を含有するかどうかを決定する方法であって：
ａ）このサンプルを、ヒトテロメラーゼＲＮＡ成分に特異的にハイブリダイズする、オリゴヌクレオチドと接触させる工程、および
ｂ）このオリゴヌクレオチドがこのヒトテロメラーゼＲＮＡ成分と特異的にハイブリダイズしたかどうかを検出する工程であって、それにより、特異的ハイブリダイゼーションを検出する工程が、このサンプルがヒトテロメラーゼＲＮＡ成分を含含有するという決定を提供する、工程
を包含する方法を提供する。
【００２１】
この決定方法のある局面において、このオリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも１５ヌクレオチドである。別の局面において、このオリゴヌクレオチドがプライマーであり、そしてこの検出する工程が、このプライマーを用いたヒトテロメラーゼＲＮＡ成分の逆転写を開始すること、および逆転写を検出することを包含し、それによって、逆転写の検出が、このオリゴヌクレオチドがヒトテロメラーゼのＲＮＡ成分に特異的にハイブリダイズしたことを示す。
【００２２】
この方法のある局面において、この検出工程が、
（ｉ）このサンプルを、ヒトテロメラーゼのＲＮＡ成分に特異的にハイブリダイズする、第２のオリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、ここでこの第１およびこの第２のオリゴヌクレオチドが、１０〜３０ヌクレオチドの増幅プライマーである、工程、
（ｉｉ）このプライマー類を用いてヒトテロメラーゼのＲＮＡ成分からヌクレオチド配列を増幅する、工程、および
（ｉｉｉ）この増幅された配列を検出する工程をさらに包含する。
【００２３】
別の局面において、この検出する工程がインサイチュ検出を含む。更なる局面において、このサンプルは、腫瘍性状態について試験されるヒトサンプルである。
【００２４】
本発明はまた、患者から得られたサンプルを用いてこの患者におけるテロメラーゼ関連疾患を診断する方法であって：
（ａ）このサンプルを、ヒトテロメラーゼＲＮＡ成分と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドと接触させる工程；
（ｂ）このサンプル中のヒトテロメラーゼのＲＮＡ成分の存在または不在を検出する工程；
（ｃ）このサンプル中のヒトテロメラーゼのＲＮＡ成分の存在または不在を、この患者におけるテロメラーゼ関連疾患の存在または不在と相関付ける工程、を包含する、方法を提供する。
【００２５】
ある局面において、このオリゴヌクレオチドが、長さが少なくとも１５ヌクレオチドである。別の局面において、このテロメラーゼ関連疾患が癌である。
【００２６】
ある局面において、この方法は、このサンプル中に存在するヒトテロメラーゼのＲＮＡ成分の量を測定し、診断量を決定する工程、およびこの診断量をコントロールサンプル中のヒトテロメラーゼのＲＮＡ成分の通常範囲と比較する工程をさらに包含する。
【００２７】
別の局面において、このサンプルは、インサイチュ検出のために調製される細胞サンプルである。
【００２８】
本発明はまた、プロモーター活性を有する配列を含む組換え核酸であって、このプロモーーターが、プラスミドｐＧＲＮ３３（ＡＴＣＣ ７５９２６）の約２．５ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ挿入片の位置１４３８〜１４４４の配列を有するヒトテロメラーゼＲＮＡ成分遺伝子；ここで位置１がＳａｃＩ制限部位の最初のＧヌクレオチドおよび位置２４２６がＨｉｎｄＩＩＩ制限部位の最後のＴヌクレオチドに対応する；の５’領域中のＣＡＡＴボックスコンセンサス配列からＡ／Ｔボックスコンセンサス配列に伸びる調節配列またはその相補配列と同一であるか、またはそれにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含有する、核を提供する。
【００２９】
ある局面において、このプロモーターは、このＣＡＡＴボックスコンセンサス配列からＡ／Ｔボックスコンセンサス配列に伸びる調節配列と同一であるか、またはそれに相補的な配列を含む。別の局面において、このプロモーターが、このＣＡＡＴボックスから、ヒトテロメラーゼＲＮＡ成分遺伝子のコード領域の開始部まで伸びる以下の配列と同一であるか、またはそれに相補的である配列を含む：ＣＡＡＴＣＣＧＴＧＣＧＧＴＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＣＣＴＴＴＡＴＡＡＧＣＣＧＡＣＴＣＧＣＣＣＧＧＣＡＧＣＧＣＡＣＣ。
【００３０】
特定の局面において、このプロモーターは、このポリヌクレオチド中に配置され、レポーター遺伝子の転写を駆動する。
【００３１】
【発明の実施の形態】
第１の局面において、本発明は、ヒトテロメラーゼのRNA成分、およびヒトテロメラーゼのRNA成分の遺伝子を実質的に純粋な形態で提供し、ならびに、ヒトテロメラーゼのRNA成分のヌクレオチド配列の全てまたは少なくとも有用な部分を有する核酸を提供する。本発明はまた、他の種からのRNA成分の核酸（霊長類などの哺乳動物のRNA成分を含むがこれに限定されない）を提供し、この核酸はヒトテロメラーゼのRNA成分と実質的な相同性を共有する。本発明の他の有用な核酸は、RNA成分に相補的な配列を有する核酸；RNA成分のヌクレオチド配列と関連するが異なる配列を有し、そのRNA成分と、またはヒトテロメラーゼのRNA成分もしくはタンパク質成分の遺伝子と、有用な方法で相互作用する核酸；および、RNA成分またはRNA成分の遺伝子と有意な配列相同性あるいは相補性を有さないが、所望のおよび有用な方法てRNA成分に作用する核酸、を含む。以下にさらに十分に記載するように、本発明の核酸は、DNA分子およびRNA分子の両方、ならびに、いずれかの修飾されたアナログを含み、そして種々の有用な目的にかなうものである。
【００３２】
本発明の有用な核酸の一つのタイプは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重ヘリックス形成オリゴヌクレオチド、または他のオリゴヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド模倣物（例えば、アンチセンスPNA-ペプチド核酸/ポリアミド核酸）であり、インビボまたはインビトロでヒトテロメラーゼ活性を阻害するために用いられ得る。このようなオリゴヌクレオチドはテロメラーゼ活性を多くのの方法でブロックし得る。これは、テロメラーゼ遺伝子の転写抑制による（例えば、三重ヘリックスの形成による）か、あるいは機能的なリボヌクレオプロテインテロメラーゼが会合することを妨げるか、またはいったんテロメラーゼ酵素複合体が形成されて、RNA成分がテロメアDNA合成の鋳型として作用することを妨げるようにテロメラーゼのRNA成分に結合することによる方法を含む。典型的には、作用の様式に依存して、これらの本発明のオリゴヌクレオチドは、約10〜約25から、200またはそれ以上のヌクレオチドの特定の配列を有しており、この配列は、テロメラーゼのRNA成分中の特定のヌクレオチド配列またはテロメラーゼのRNA成分の遺伝子と同一かまたは相補的かのいずれかである。
【００３３】
一つの実施態様においては、本発明は、テロメラーゼのRNA成分のポリヌクレオチド配列に相補的なアンチセンスポリヌクレオチドを提供し、これは典型的には、天然に存在する哺乳動物のテロメラーゼのRNA成分の遺伝子配列と実質的に同一であるポリヌクレオチド配列に相補的である。このようなアンチセンスポリヌクレオチドは、テロメラーゼのRNA成分種の転写および/または安定性および/または機能を阻害するために用いられ、それによって、細胞(例えば、患者の新生物性細胞)中のそれぞれのテロメラーゼ活性の量を減少させる。このようなアンチセンスポリヌクレオチドは、機能的な（触媒的活性と高い忠実性）テロメラーゼホロ酵素の形成を阻害することにより、テロメラーゼ調節剤として機能し得る。このホロ酵素は、細胞における正確なテロメア複製と修復に必要とされる。
【００３４】
アンチセンスポリヌクレオチドは、他の抗新生物性の治療法、例えばイオン化放射線照射あるいは化学療法（例えば、ブレオマイシン、シスプラチン、ナイトロジェンマスタード、ドキソルビシン(doxyrubicin)、ヌクレオチドアナログなどのDNA-損傷剤を用いて）と組み合わせられ得る。アンチセンスポリヌクレオチドは感受性の細胞（例えば、DNA修復または複製にテロメラーゼ活性を必要とする複製中の細胞）での細胞死を促進し得る。アンチセンスポリヌクレオチドは、本明細書に開示された哺乳動物テロメラーゼRNA配列の相補的配列の少なくとも25の連続するヌクレオチドと実質的に同一である。アンチセンスポリヌクレオチドは、典型的には、ssDNA、ssRNA、メチルホスホネートバックボーンポリヌクレオチド、ホスホロチオレートバックボーンポリヌクレオチド、混合バックボーンポリヌクレオチド、ポリアミド核酸、およびその他の当業者に知られているアンチセンス構造物である。本発明の一つの局面においては、アンチセンスポリヌクレオチドは、投与されて、複製し得るヒト細胞のような細胞中のテロメラーゼのRNA成分の転写および/または活性ならびにテロメラーゼ活性を阻害する。
【００３５】
一つの実施態様において、本発明は、鋳型ミスマッチポリヌクレオチドを提供する。このポリヌクレオチドは哺乳動物のテロメラーゼのRNA成分と実質的に同一の配列を有し、そして、ヒトテロメラーゼリピート配列5’-TTAGGG-3’に関して少なくとも１塩基がミスマッチであるが、他は相補的であるテロメアリピート鋳型配列を有する。鋳型ミスマッチポリヌクレオチドは、典型的には、天然に存在する鋳型配列中に単一のヌクレオチドミスマッチを有し、そして、鋳型配列中で２つのヌクレオチドミスマッチを有し得、この場合、ミスマッチしたヌクレオチドが隣接するか、あるいはミスマッチしたヌクレオチドが１またはそれ以上のマッチする（相補的な）ヌクレオチドによって分離されているかのいずれかである。本発明の鋳型ミスマッチポリヌクレオチドは、一般的にヒトテロメラーゼポリペプチド成分と結合してテロメラーゼ活性を発現し得、それにより、ヒトテロメラーゼリピート配列中の選択された（ミスマッチした）ヌクレオチド部分でのミスの導入を行って、テロメアリピートの複製、修復、および/または付加を結果として生じ、従って、実質的な複製およびテロメアの長さの維持のために、変異したセンステロメラーゼのRNA成分の持続的な存在に依存するテロメアを生じる。
【００３６】
本発明の有用な核酸の別のタイプは、リボザイムであり、これは、ヒトテロメラーゼのRNA成分を特異的に切断し、酵素を不活性化し得る。本発明の有用な核酸のさらに別のタイプは、プローブまたはプライマーであり、これは、ヒトテロメラーゼのRNA成分に特異的に結合し、そして、例えば、サンプル中のテロメラーゼの存在を検出するために用いられ得る。最後に、本発明の有用な核酸は、本発明の核酸を生産するための組換え発現プラスミドを包含する。このようなプラスミドの特に有用な一つのタイプは、ヒト遺伝子治療に用いられるプラスミドである。本発明のヒト遺伝子治療に有用なプラスミドは、種々のタイプを含み、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムをコードするプラスミドのみならず、ヒトテロメラーゼのRNA成分、または、欠失したもしくは変化した（変異した）型のヒト（またはヒトRNA成分に実質的に相同なRNA成分配列を有する他の種）テロメラーゼのRNA成分、またはその遺伝子を発現させるプラスミドも含む。
【００３７】
一つの実施態様において、哺乳動物のテロメラーゼのRNA成分に相補的であり、生理学的条件下で特異的にハイブリダイズするのに十分な部分を有するポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド合成の間または合成後のいずれかに、付加的な化学置換基の共有結合により誘導体化され、それにより、このテロメラーゼのRNA成分に特異的にハイブリダイズし得る誘導体化されたポリヌクレオチドを形成する。この誘導体化されたポリヌクレオチドはこのRNA成分を有する内因性テロメアーゼ酵素に局在し得、そして、この誘導体化されたポリヌクレオチドはテロメラーゼのRNA成分および/またはタンパク質成分の変化あるいは化学修飾を生じ、それによって、テロメラーゼの酵素活性を改変し、典型的には減少させる。
【００３８】
一つの実施態様においては、本発明は、異常なテロメラーゼのRNA成分の量および/または構造と関連する病気の診断に適したポリヌクレオチドを提供する。
【００３９】
哺乳動物のテロメラーゼのRNA成分のヌクレオチド配列と実質的に同一か実質的に相補的である配列を有するポリヌクレオチドプローブは、病気の状態（例えば、新生物あるいはプレ新生物）の診断に用いられ得る。診断は、テロメラーゼのRNA成分の量および/またはテロメラーゼのRNA成分の構造変化（例えば、短縮型、配列の変化、欠失または挿入など）の検出、および/または患者からの外植片の細胞におけるテロメラーゼのRNA成分遺伝子の再配列または増幅の検出、または疾病特徴的な哺乳動物のテロメラーゼのRNA成分の対立遺伝子(allele)（例えば、RFLPあるいは対立遺伝子特異的PCR分析による）の検出により行われる。検出はしばしば、哺乳動物のテロメラーゼのRNA成分に相補的な、標識された（例えば、32P、35S、14C、3H、蛍光、ビオチン化、ジゴキシゲニン化(digoxigeninylated)）アンチセンスポリヌクレオチドを用いてインサイチュハイブリダイゼーションで行われ得る。ノーザンブロッティング、ドットブロッティングまたは溶液ハイブリダイゼーションが用いられ得るが、これらは、例えば、テロメラーゼのRNA成分特異的プライマーを用いるPCR増幅またはLCR増幅により細胞サンプルから単離されたバルクRNAあるいはポリA+RNAに対して用いられ得る。同一細胞タイプの非新生物性細胞と比較したときにテロメラーゼのRNA成分の量的変化（典型的には有意な増加）を有する細胞は、新生物となる前の(pre-neoplastic)細胞または明白な新生物性細胞などのような病気細胞の候補として同定され、そして、転移可能性を有する細胞として同定され得る。同様に、細胞サンプル中のテロメラーゼのRNA成分の遺伝子座あるいは密接に関連した遺伝子座における疾病特徴的な再配列または増幅の検出により、病的状態または病的状態（例えば、ガン、遺伝子病）を発病する疾病素質の存在が同定される。テロメラーゼのRNA成分のポリヌクレオチドプローブはまた、個人の（犯罪容疑者または身元不明の故人の父系調査または確認のような）法医学的同定にもまた使用される。
【００４０】
第２の局面では、本発明は、細胞内でまたは細胞のグループ内でテロメラーゼ活性に関連する症状を処置する方法を提供する。この方法は、細胞を、治療的に有効な量の、その細胞内でテロメラーゼ活性を変化させる薬剤と接触させることによる。このような薬剤は、テロメラーゼのRNA成分をコードする核酸、三重ヘリックスを形成するオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、およびプラスミドならびにその他の遺伝子治療用ベクターである。これらのベクター（例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなど）はヒト遺伝子治療用であり、上記のテロメラーゼのRNA成分、テロメラーゼのRNA成分に対するアンチセンスRNA、またはミスマッチしたテロメラーゼのRNA成分を発現する。関連した局面では、本発明は、これらの治療剤を薬学的に受容可能なキャリアまたは塩とともに含有する薬学的組成物を提供する。これは、リポフェクチン複合体、リポソーム、または治療剤を標的に送達するための免疫リポソーム中への処方を含み得る。本発明はまた、このようなテロメラーゼ媒介治療剤と他の医薬品との組み合わせを提供する。他の薬剤としては、例えば、抗新生物剤および他の細胞傷害性または静細胞性剤；抗真菌剤（例えば、AIDS患者の処置用）；ヌクレオチド、ヌクレオシド、およびこれらのアナログ；および病状（例えば、新形成、過形成(hyperplasia)、HIV感染/AIDSおよび関連する病理学、および異常なテロメア代謝により特徴づけられる他の病気）を処置するために適切な薬学的薬剤がある。この方法は、哺乳動物テロメラーゼ中のテロメラーゼのRNA成分と特異的にハイブリダイズし得る誘導体化されたポリヌクレオチドの使用を包含し得る。誘導体化されたポリヌクレオチドはテロメラーゼ活性を有する哺乳動物細胞に送達され、そして、テロメラーゼのRNA成分に局在化し、テロメラーゼ活性を不活性化または阻害することによりテロメラーゼ活性を阻害する。
【００４１】
本発明はまた、テロメラーゼのRNA成分の形成を阻害または増強してテロメラーゼの機能を調整することにより新形成またはアポトーシスを阻害する治療剤を提供する；このような薬剤は医薬品として用いられ得る。このような医薬品は、ヒトおよび家畜の種々の病気、例えば、新形成、過形成、神経細胞変性病、加齢、AIDS、真菌感染などの処置に用いられる。一つの実施態様においては、薬剤はテロメラーゼのRNA成分またはその相補体の配列を転写し得る遺伝子治療ベクター、またはその代わりに機能的なテロメラーゼホロ酵素の形成を競合阻害し得る酵素的に不活性なテロメラーゼのRNA成分からなる。
【００４２】
第３の局面においては、本発明は、細胞、細胞集団あるいは組織サンプルもしくは前記のいずれかからの抽出物中のヒトテロメラーゼのRNA成分、テロメラーゼあるいはテロメラーゼ活性のレベル、量または存在を決定するための診断方法を提供する。関連する局面において、本発明はこのような方法に有用な試薬（上記のプライマーおよびプローブを含む）を提供し、任意に、キットの形態にその診断方法を実施するためのキットの使用指示書とともにパッケージされる。
【００４３】
本発明は、ヒト患者の病気（例えば、新形成）を診断する方法を提供する。この診断アッセイ（例えば、固定化した細胞を用いる、ヒトテロメラーゼのRNA成分または遺伝子配列を特異的に結合する、標識されたテロメラーゼのRNA成分のプローブによるインサイチュポリヌクレオチドハイブリダイゼーション）は、ヒト患者からの生物学的サンプル中に所定の疾病特徴的な濃度のテロメラーゼのRNA成分が存在するか否かを決定するために使用される；もし、そのアッセイが、テロメラーゼのRNA成分の存在が正常の範囲をはずれている（例えば、所定の疾病特徴的な濃度を超えている）ことを示すときは、その患者は、病気の状態であるか疾病素質があると診断される。
【００４４】
一つの実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは、病気の状態または遺伝子病の診断に用いられる。これらの病状または遺伝子病は、新形成、過形成、プレ成熟細胞または異常な細胞の老化、またはテロメラーゼ機能に関連する他の医学的状態を包含し、そして、より詳細には、病状または病気はテロメラーゼのRNA成分または遺伝子配列の構造的または量的変化を包含し、あるいは、RFLPおよび/または対立遺伝子特異的PCR、または他の適切な検出方法によって検出され得る疾病特徴的なテロメラーゼのRNA成分の対立遺伝子に関連している。典型的には、この方法はヒト患者における病気（例えば、新形成）の診断である。この診断アッセイ（例えば、テロメラーゼのRNA成分の量および/または構造の決定）は、所定の疾病特徴的な濃度または構造のテロメラーゼのRNA成分が、ヒト患者からの生物学的サンプル中に存在するか否かを決定するために使用される；
そのアッセイがテロメラーゼのRNA成分の疾病特徴的な量の存在が正常の範囲をはずれている（例えば、所定の疾病特徴的な濃度を超えている）ことを示すときは、その患者は、病気の状態であるか疾病素質があると診断される。
【００４５】
第４の局面において、本発明は組換えテロメラーゼ調製物およびこのような調製物を生産する方法を提供する。従って、本発明は、組換えヒトテロメラーゼを提供し、この組換えヒトテロメラーゼは、ヒトテロメラーゼのタンパク質成分、ならびに、本発明の組換えRNA成分と関連するヒトテロメラーゼのRNA成分と実質的に相同なRNA成分を有する哺乳動物種由来のテロメラーゼのタンパク質成分を含む。このような本発明の組換えRNA成分分子は、天然に存在するRNA成分分子とは１またはそれ以上の置換、欠失、末端付加および/または挿入の点で異なる分子を含み、ならびに、組換え宿主細胞中で生産される、天然に存在するRNA成分分子と同一のRNA成分分子を含む。このような組換えテロメラーゼ分子を生産する方法は、テロメラーゼのタンパク質成分を発現する真核宿主細胞を、本発明のRNA成分分子をコードする組換え発現ベクターで形質転換する工程、および、このベクターで形質転換された宿主細胞を培養する工程を包含する。この培養は、テロメラーゼのタンパク質成分とテロメラーゼのRNA成分とが発現され、これらの成分が集合して活性なテロメラーゼ分子を形成し、染色体DNAのテロメアに配列（天然のテロメラーゼによって付加される配列と必ずしも同じである必要はない）を付加することができるような条件下で行われる。
【００４６】
第５の局面において、本発明は、ヒトテロメラーゼのRNA成分およびヒトテロメラーゼのRNA成分に実質的に相同なRNA成分を有する哺乳動物種由来のテロメラーゼのタンパク質成分の精製方法を提供する。本発明はまた、このようなタンパク質成分をコードする核酸を単離かつ同定する方法を提供する。関連する局面において、本発明は、精製されたヒトテロメラーゼ、および、ヒトテロメラーゼのRNA成分に実質的に相同なRNA成分を有する哺乳動物種の精製されたテロメラーゼ、ならびに、１またはそれ以上のこのようなテロメラーゼ調製物をコードする精製された核酸を提供する。本発明はまた、活性成分として、テロメラーゼのタンパク質成分、またはテロメラーゼのタンパク質成分をコードする、もしくはタンパク質をコードする核酸と相互作用する核酸を含有する薬学的組成物を提供する。
【００４７】
第６の局面において、本発明は哺乳動物テロメラーゼ活性を調整する（すなわち、阻害、増強または特異性を変化する）薬剤を同定する方法を提供する。このようなテロメラーゼ調節剤は、しばしば、小さな分子であり（例えば、約3000ダルトンよりも小さい）、そして、治療効果のためにインビトロおよびインビボでしばしばテロメラーゼ活性を改変するのに使用され得、そして実験用試薬および/または医薬品として使用される。
【００４８】
一つの実施態様においては、本発明は、薬剤のバンクまたはライブラリーから、哺乳動物のテロメラーゼのRNA成分とテロメラーゼのタンパク質成分との非共有結合を調整することによりテロメラーゼ活性を調整する候補薬剤を同定する方法を提供する。テロメラーゼのRNA成分は、宿主細胞中で組換え鋳型から生産されるか、所望であれば、化学的に合成され得る。典型的には、哺乳動物テロメラーゼのタンパク質成分（これらは例えばテロメラーゼ発現細胞から精製され得、そして天然に存在するテロメラーゼのRNA成分が（例えば、RNAse処理により）取り除かれ得た）は、哺乳動物のテロメラーゼのRNA成分と接触され、それは、添加する薬剤の非存在下でのRNA成分とタンパク質成分との間の非共有結合を許容する適切な水性の条件下（すなわち、コントロールの結合反応）である。薬剤のライブラリーまたはバンクから選択された１またはそれ以上の薬剤の存在下におけるテロメラーゼのRNA成分とタンパク質成分との間の非共有相互作用の強度を、テロメラーゼのRNA成分とテロメラーゼのタンパク質成分を有し、薬剤を含まないコントロールの結合反応における非共有相互作用の強度と比較する；テロメラーゼのRNA成分とタンパク質成分との間の非共有結合の強度が統計的に有意に増大する薬剤が、それによって、テロメラーゼ調節剤の候補として決定される。
【００４９】
非共有結合の相対的な強度は任意の適切な方法によって決定され得、これには、（例えば、競合結合アッセイによる）特異的な結合親和性の決定、適切なテロメアリピート鋳型におけるテロメラーゼ触媒活性の測定、または、哺乳動物のテロメラーゼのRNA成分とタンパク質成分との間の機能的な非共有相互作用の他の適切なアッセイ（例えば、ゲルシフトあるいはEMSA(電気泳動移動度シフトアッセイ)）が含まれる。
【００５０】
テロメラーゼ調節剤の候補を検出するための非共有結合アッセイの一つの実施態様においては、テロメラーゼのRNA成分またはタンパク質成分の一つまたは両方が適切な検出可能な標識で標識されており、そして非共有結合は、薬剤のライブラリーまたはバンクから選択された薬剤の存在または非存在下において別々に測定される。非共有結合の測定は、標識されたテロメラーゼ成分（RNA成分またはタンパク質成分）が、同種の（cognate）テロメラーゼ成分（それぞれ、タンパク質成分またはRNA成分：この同種のテロメラーゼ成分は別々に標識されているかまたは標識されていない）と結合する程度を、例えば、この標識されたテロメラーゼ成分および同種のテロメラーゼ成分を有する複合体を捕獲（例えば、固定化）することにより測定する工程、および、結合していない標識されたテロメラーゼ成分をこの結合複合体から（例えば、洗浄により）分離し、それによって、分離された結合画分を生じさせ、そして、この分離された結合画分中の結合した複合体を検出可能な標識の存在を測定することにより検出する工程、を包含する。テロメラーゼのRNA成分およびタンパク質成分の非共有結合の統計学的に有意な減弱または増強を生じる薬剤は、それによって、テロメラーゼ調節剤の候補であると同定される。非共有結合を減弱させる薬剤は、テロメラーゼインヒビター（またはアンタゴニスト）の候補であるが、テロメラーゼ成分の非共有結合を増強する薬剤はテロメラーゼアゴニストの候補である。
【００５１】
一つの実施態様においては、候補のテロメラーゼ調節剤は、精製されたテロメラーゼのタンパク質成分とテロメラーゼのRNA成分とを有する哺乳動物のテロメラーゼの酵素活性を統計的に有意に増加または減少させる能力によって同定される。
【００５２】
一つの実施態様においては、候補のテロメラーゼ調節剤は、代謝的に活性な哺乳動物細胞中における、哺乳動物のテロメラーゼのRNA成分遺伝子（好ましくはヒトテロメラーゼのRNA成分遺伝子）の転写調節配列に作動可能に連結したリポーターポリヌクレオチド配列（例えば、β-ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、HPRT遺伝子）の転写を統計的に有意に減少または増加させる能力によって同定される。バリエーションとして、哺乳動物細胞中の内因性テロメラーゼのRNA成分遺伝子は、リポーターポリヌクレオチド配列を、内因性遺伝子の染色体座の内因性テロメラーゼのRNA成分遺伝子の転写調節配列（例えば、プロモーター）の上流に作動可能に連結されている相同な標的構築物で標的化される。別のバリエーションにおいては、リポーターポリヌクレオチドを有する外因性ポリヌクレオチドは、哺乳動物のテロメラーゼのRNA成分遺伝子の転写調節領域（例えば、プロモーターおよび上流の転写因子結合部位）に作動可能に連結している。この外因性ポリヌクレオチドは哺乳動物細胞に転移され、その細胞では非相同的に染色体の部位に組み込まれ得、および/または維持されるか、あるいはエピソームのポリヌクレオチドとして複製される。薬剤で処理された細胞において、統計的に有意なリポーターポリヌクレオチドの転写調節を生じる薬剤は、それによって、哺乳動物のテロメラーゼ調節剤の候補であると同定される。
【００５３】
テロメラーゼ調節剤候補を同定するための組成物は、典型的には以下を含む：(1)哺乳動物テロメラーゼのタンパク質成分、これは、テロメラーゼ発現哺乳動物細胞（好ましくは霊長類(例えば、ヒト)）から精製され得、典型的には付随するRNA成分が、もしあれば、RNAse処理またはRNA成分の除去、ならびに、適切な結合条件での同種のテロメラーゼのRNA成分の存在下でテロメラーゼ活性を再構築するタンパク質の能力を維持することに適合可能な他の処理で取り除かれる、(2)哺乳動物のテロメラーゼのRNA成分、好ましくは細胞中の組換えポリヌクレオチドの転写により生産されるヒトRNA成分、および(3)水性の結合条件（例えば、生理学的条件、テロメラーゼアッセイ条件）、および任意に(4)少なくとも一つの複製可能なまたは伸長可能な哺乳動物のテロメラーゼリピート配列を有するリポーターポリヌクレオチド、典型的には、RNA成分のテロメアリピート配列に相補的な鋳型部分の配列に相補的である、および任意に(5)テロメアアッセイ条件下で、リポーターポリヌクレオチドのテロメアリピート配列の複製および/または伸長に適したヌクレオチド；薬剤は典型的にはこのような組成物に添加され、非共有結合および/またはテロメラーゼ活性を、この薬剤がないコントロール組成物と比較して評価する。
【００５４】
第７の局面において、本発明はまた、哺乳動物のテロメラーゼのRNA成分遺伝子のヌル対立遺伝子(null allele)を提供する。これらは、異種ポリヌクレオチドの相同遺伝子を哺乳動物のテロメラーゼのRNA成分遺伝子中に標的化してこのテロメラーゼのRNA成分の遺伝子を機能的に不活性化することにより生産される。本発明はまた、テロメラーゼのRNA成分のヌル対立遺伝子を有する非ヒトノックアウト動物を提供する。バリエーションとして、テロメラーゼのRNA成分のヌル対立遺伝子および内因性テロメラーゼのRNA成分の欠如により生じる実質的に欠如する内因性テロメラーゼ活性に対して同型接合である非ヒトノックアウト動物を提供する。このようなノックアウト動物は、毒物学的スクリーニングのため、テロメラーゼ調節剤を同定または研究する医薬品研究所への販売のための商業的試薬として、ペットとして、および農業用家畜として、数ある用途の中で用いられる。
【００５５】
第８の局面において、本発明は哺乳動物細胞を不死化する方法を提供する。このような細胞は、例えば、バイオリアクター中での望ましい発酵作用を有する細胞、または商業的な研究試薬として有利な特徴を有する望ましい細胞株である。
【００５６】
この方法は、テロメラーゼのタンパク質成分の存在下に機能的なテロメラーゼ酵素を形成し得る機能的なテロメラーゼのRNA成分を発現するポリヌクレオチドを哺乳動物細胞に導入する工程を包含する。
【００５７】
本発明の他の特徴および有利性は、以下の図面、発明の好ましい実施態様、実施例および特許請求の範囲の記載から明らかである。
【００５８】
（定義）
本明細書で使用する用語「テロメラーゼのRNA成分ポリヌクレオチド」は、少なくとも20ヌクレオチドを有するポリヌクレオチドをいう。ポリヌクレオチドは少なくとも20ヌクレオチドのセグメントを有している：これは、天然に存在する哺乳動物のテロメラーゼのRNA成分配列、典型的には霊長類のテロメラーゼのRNA成分、例えば、ヒトまたはサルのテロメラーゼのRNA成分、に対して少なくとも85％同一である。天然に存在するテロメラーゼのRNA成分配列またはその相補物と比較して、配列変異性を有するいくつかのテロメラーゼのRNA成分ポリヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションプローブ、PCRプライマー、LCRアンプリマー、ミスマッチRNA成分などとして適切であり得る。
【００５９】
本明細書で使用する用語「に対応する」は、ポリヌクレオチド配列が参照ポリヌクレオチド配列の全部または一部に対して相同である（すなわち、同一であるが厳密には進化的に関連していない）か、あるいはポリペプチド配列が参照ポリペプチド配列と同一であることを意味する。対照的に、本明細書で使用する用語「に相補的な」は、相補的な配列が参照ポリヌクレオチド配列の全部または一部と相同であることを意味する。実例として、ヌクレオチド配列「TATAC」は参照配列「TATAC」に対応し、参照配列「GTATA」と相補的である。
【００６０】
以下の用語は、２またはそれ以上のポリヌクレオチド間の配列の関係を記載するために用いられる：「参照配列」、「比較窓枠」、「配列の同一性」、「配列同一性の割合(％)」、および「実質的な同一性」。「参照配列」は、配列の比較の基礎として用いられる所定の配列である；参照配列は、例えば、全長のテロメラーゼのRNA成分遺伝子配列のセグメントのように、より大きな配列のサブセットであり得る。一般的に、参照配列は、少なくとも20ヌクレオチド長であり、しばしば少なくとも25ヌクレオチド長であり、そして、たびたび少なくとも50ヌクレオチド長である。２つのポリヌクレオチドは、それぞれが、(1)２つのポリヌクレオチド間で類似する配列（すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部）を有し得、および(2)２つのポリヌクレオチド間で異なる配列をさらに有し得るので、２つ（またはそれ以上）のポリヌクレオチド間の配列の比較は、典型的には、２つのポリヌクレオチドの配列を「比較窓枠」と比較することにより行われ、配列が類似する局所領域を同定し比較する。
【００６１】
本明細書で使用する「比較窓枠」は、少なくとも25の連続するヌクレオチドの位置の概念的なセグメントをいい、ポリヌクレオチド配列は、少なくとも25の連続するヌクレオチドの参照配列と比較され得る。そして、２つの配列の最適な整列のために、比較窓枠中のポリヌクレオチド配列の一部は、参照配列（これは付加または欠失を含まない）と比較して20％またはそれより少ない付加または欠失（すなわち、ギャップ）を有し得る。比較窓枠を整列させるための配列の最適な整列は、SmithおよびWaterman（1981）Adv．Appl．Math. 2:482の局部相同性アルゴリズム、NeedlemanおよびWunsch（1970）J．Mol．Biol. 48: 443の相同性整列アルゴリズム、PearsonおよびLipman(1988)Proc．Natl．Acad. Sci. (U.S.A.) 85:2444の類似性検索方法、これらのアルゴリズムのコンピュータ化した実施（Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WIのGAP，BESTFIT，FASTA，およびTFASTA）または調査によって行われ得、そして、種々の方法で生じた最もよい整列（すなわち比較窓枠に対して最も高い相同性の割合(%)を得る）が選択される。
【００６２】
用語「配列の同一性」は、比較窓枠に対して、２つのポリヌクレオチド配列が同一（すなわち、ヌクレオチド-ヌクレオチドベースで）であることを意味する。用語「配列同一性の割合(%)」は、比較窓枠に対して２つの最適に整列した配列を比較し、同一の核酸塩基（例えば、A、T、C、G、U、またはI）が両方の配列で生じて適合した位置の数を得、適合位置数を算出し、適合した位置の数を比較窓枠の位置の総数（すなわち、窓枠サイズ）で除し、そして、この結果に100を乗じて、配列同一性の割合(%)を得ることにより計算される。本明細書で使用する用語「実質的な同一性」は、ポリヌクレオチド配列の特徴を意味し、ポリヌクレオチドは、少なくとも20ヌクレオチド位置の比較窓枠、しばしば少なくとも30-50ヌクレオチドの窓枠に対して、少なくとも80％の配列同一性、好ましくは少なくとも85％の同一性およびしばしば89から95％の配列同一性、より普通には、少なくとも99％の配列同一性を有する配列を含んでいる。配列同一性の割合(%)は、参照配列とポリヌクレオチド配列（これは比較窓枠に対して、参照配列の合計20％またはそれより少ない欠失または付加を有し得る）とを比較することにより算出される。参照配列は、より大きな配列のサブセットであり得、例えば、本明細書に開示されるような全長のテロメラーゼのRNA成分遺伝子配列のセグメントのようなものである。
【００６３】
本明細書では特異的ハイブリダイゼーションは、プローブポリヌクレオチド（例えば、置換、欠失、および/または付加を含み得る本発明のポリヌクレオチド）と特定の標的ポリヌクレオチド（例えば、テロメラーゼのRNA成分配列またはゲノム遺伝子配列）との間のハイブリッド形成と定義される。このプローブは、優先的に特定の標的とハイブリダイズして、例えば、１またはそれ以上のテロメラーゼのRNA成分遺伝子のRNA種（または特異的に切断またはプロセスされたテロメラーゼのRNA成分種）に対応する一本のバンドが、適切な細胞源（例えば、テロメラーゼのRNA成分を発現する体細胞）から調製したRNAのノーザンブロットで同定され得る。哺乳動物のテロメラーゼのRNA成分の配列またはヒトテロメア配列と特異的にハイブリダイズする本発明のポリヌクレオチドは、本明細書で提供される配列データに基づいて調製され得るが、これは当業者に既知の方法および熱力学的原理および以下の文献の記載に従っている：Maniatisら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第２版,(1989)，Cold Spring Harbor、N.Y.および、BergerおよびKimmel，Methods in Enzymology，Volume152，Guide to Molecular Cloning Techniques (1987)，Academic Press，Inc.,San Diego，CA。これらは本明細書に参考として援用される。
【００６４】
本明細書で使用する用語「適切な結合条件」は、水性条件を意味し、その条件では哺乳動物のテロメラーゼのRNA成分がその同種タンパク質成分と結合し、酵素的に活性なテロメラーゼホロ酵素を形成する。このホロ酵素は、テロメアリピートを含む適切な鋳型からテロメアリピートを触媒的に複製、修復、および/または付加し得る；このようなテロメアリピート鋳型は存在し得るかまたは存在し得ない。しばしば、適切な結合条件は生理学的条件であり得る。本明細書で使用する「生理学的条件」は、温度、pH、イオン強度、粘性などの生化学的パラメーターであって、生存する生物体に適合性であり、および/または典型的には生存する培養哺乳動物細胞の細胞内に存在し、特に、この哺乳動物細胞の核に存在する条件をいう。例えば、典型的な実験室での培養条件下における哺乳動物細胞の生育中の核内または細胞質内条件は、生理学的条件である。インビトロ転写の反応混液のための適切なインビトロ反応条件は一般的に生理学的条件であり、当業者に既知の核抽出物の多様性によって、例示され得る。一般に、インビトロの生理学的条件は、以下を含み得る：50-200mM NaClまたはKCl，pH6.5-8.5，20-45℃および0.001-10mMの２価のカチオン（例えば、Mg++、Ca++）；好ましくは、約150mM NaClまたはKCl，pH7.2-7.6，5mMの２価のカチオンおよびしばしば、0.01-1.0%の非特異的タンパク質（例えばBSA）を含む。非イオン性界面活性剤（Tween、NP-40、Triton X-100）は、しばしば存在し得、通常、約0.001から2%、典型的には0.05-0.2%(V/V)である。特定の水性条件が、通常の方法に従って研究者に選択され得る。一般的な指針として、以下の緩衝化水性条件が適用され得る：10-250mM NaCl，5-50mM Tris HCl，pH5-8，任意に２価のカチオンおよび/または金属キレーターおよび/または非イオン性界面活性剤および/または膜画分および/または消泡剤および/またはシンチラントを含み得る。
【００６５】
本明細書で使用する用語「標識」または「標識された」は、検出され得るマーカーの導入を意味し、例えば、放射能標識されたアミノ酸の導入、あるいはポリペプチドへのビオチン基の付着による導入を意味する。このビオチン基は標識されたアビジン（例えば、蛍光マーカーあるいは光学的または熱量測定方法で検出され得る酵素活性を有するストレプトアビジン）で検出され得る。ポリペプチドおよび糖タンパク質の種々の標識化方法は当業者に公知であり、用いられ得る。
【００６６】
ポリペプチドの標識の例は、以下を含むが、これらに限定されない：放射性同位元素（例えば、3H、14C、35S、125I、131I）、蛍光標識（例えば、FITC、ローダミン、ランタニドホスホール(lanthanide phosphors)）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、ビオチン基、二次リポーターにより認識される所定のポリペプチドのエピトープ（例えば、ロイシンジッパーペア配列、二次抗体の結合部位、転写アクチベーターポリペプチド、金属結合ドメイン、エピトープタッグ）。
【００６７】
いくつかの実施態様においては、標識は立体障害の可能性を減少するために種々の長さのスペーサーアームによって付着されている。
【００６８】
本明細書で使用する用語「統計的に有意な」は、一般的に、コントロールアッセイ読み出し(readout)の少なくとも３回の個別の測定の平均の少なくとも２標準偏差以上または以下の結果（すなわち、アッセイ読み出し）、および/またはStudentのt-検定または他の統計的有意性の当業者に受け入れられている評価法により決定されるように統計的に有意であることを意味する。
【００６９】
本明細書で使用する用語「疾病特徴的な濃度」、「疾病特徴的な量」および「疾病特徴的なハイブリダイゼーションパターン」は、それぞれ、サンプル中のテロメラーゼのRNA成分の濃度、量、あるいは局在化パターンを意味し、病的状態（例えば、新形成、老化、免疫不全、神経細胞変性、炎症など）、または、ガン、肉腫、あるいは白血病のような新生物性疾病を発病する疾病素質が存在することを示す。疾病特徴的な量は、細胞または細胞性サンプル中のテロメラーゼのRNA成分の量であり、予測的および/または遡及的な統計的臨床研究によって確立された正常な臨床値の範囲からはずれている。一般的に、新生物性疾病（例えば、ガン、肉腫、あるいは白血病）を有する個体は、細胞内または組織サンプル内に多量のテロメラーゼのRNA成分を示し、正常な罹患していない個体を特徴づける濃度範囲をはずれている；典型的には、この疾病特徴的な濃度は、少なくとも平均正常値外の約１標準偏差であり、より普通には、平均正常値の少なくとも約２標準偏差またはそれ以上である。しかし、本質的にすべての臨床診断テストはある割合(%)で擬陽性および擬陰性を生じる。診断アッセイの感度と選択性は診断対象と任意の関連する調節要求性とを十分満足しなければならない。一般的に、本発明の診断方法は、資格のある健康の専門家によってなされる病気の鑑別診断における付加的なパラメーターを提供して、個体が病気の候補であると同定するために用いられる。
【００７０】
本明細書で使用する用語「疾病の対立遺伝子」は、認識し得る病気を生じ得る遺伝子の対立遺伝子をいう。疾病の対立遺伝子は、優性または劣性であり得、直接病気を生じ得るか、特定の遺伝的背景あるいはすでに存在する病的状態と組み合わせて存在するときに病気を生じ得る。疾病の対立遺伝子は、遺伝子プールに存在し得るか、または体細胞変異により個体中に新しく生じ得る。
【００７１】
本明細書で使用する用語「抗新生物剤」は、ヒトの新生物の発生または進行を阻害する機能的な特性を有する薬剤をいい、しばしば、転移または転移可能性の阻害を含む。
【００７２】
本明細書で使用する用語「作動可能に連結した」は、機能的な関係でポリヌクレオチドエレメントが連結することを意味する。核酸は、他の核酸配列と機能的関係に置かれたときに「作動可能に連結」している。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、コード配列の転写に影響を与えるときにコード配列に作動可能に連結している。「作動可能に連結した」は、連結されたDNA配列が典型的には連続しており、そして２つのタンパク質コード領域を連結する必要がある時には、連続的であり読み枠に入っている。しかし、エンハンサーは、一般に、プロモーターから数キロベース離れたときに機能し、そしてイントロン配列は長さが変化し得るので、いくつかのポリヌクレオチドエレメントは作動可能に連結し得るが連続ではない。内因性の遺伝子の転写調節配列に対応するポリヌクレオチド配列に作動可能に連結している構造遺伝子（例えば、HSVのtk遺伝子）は、天然に存在する遺伝子で起こるのと同様に、実質的に、一時的にそして細胞型特異的パターンで一般的に発現される。
【００７３】
本明細書で使用する用語「転写ユニット」または「転写複合体」は、以下を含むポリヌクレオチド配列をいう：構造遺伝子（エクソン）、シス作用性結合プロモーターおよび構造遺伝子の効率的転写に必要な他のシス作用性配列、構造遺伝子の適切な組織特異的ならびに発展的な転写に必要な遠位の調節エレメント、および効率的な転写ならびに翻訳に重要な付加的なシス配列（例えば、ポリアデニル化部位、mRNAの安定性制御配列）。
【００７４】
本明細書で使用する用語「転写調節」は、シスに連結した構造遺伝子の転写を増強するか、または転写を阻害するかのいずれか能力をいう；このような増強または阻害は、誘導剤による刺激のような特定の事象の発生に付随し得、および/または特定の細胞の型でのみ明白であり得る。
【００７５】
本明細書で使用する用語「転写調節領域」は、機能的プロモーターと、任意の関連する転写エレメント（例えば、エンハンサー、CCAATボックス、TATAボックス、SP1部位など）を有するDNA配列をいう：これらは転写調節領域に作動可能に連結しているポリヌクレオチド配列の転写に必須である。
【００７６】
本明細書で使用する用語「ヌル(null)対立遺伝子」は、遺伝子座が、実質的に機能的遺伝子産物の効率的発現の指揮を不能にするような少なくとも１つの変異または構造変化を含むことを意味する。「ノックアウト(knockout)細胞」は少なくとも１つの内因性遺伝子のヌル対立遺伝子を有し、典型的にはヌル対立遺伝子に対して同型接合である細胞をいう。従って、例えば、ノックアウト細胞は、ヌル対立遺伝子に対して、テロメラーゼのRNA成分の遺伝子座で同種接合であり得、それによってノックアウト細胞は実質的に機能的なテロメラーゼのRNA成分を発現することができない。
【００７７】
（好ましい実施態様の説明）
本発明は、リボヌクレオタンパク質ヒトテロメラーゼに関連する方法、薬剤、遺伝的に改変した動物および細胞、および薬学的組成物を提供する。
【００７８】
本明細書中、以下で使用される名称、および以下で記述される細胞培養、分子遺伝学、ならびに核酸化学およびハイブリダイゼーションにおける実験室手順は、当該分野において周知で一般的に用いられる手順を包含し得る。標準的な技術が、組換え核酸法、ポリヌクレオチド合成、ならびに微生物培養および形質転換(例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション)について使用される。この技術および手順は、一般的に、当該分野、およびこの書類を通じて提供される種々の一般的な参考文献(一般的には、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第２版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.を参照。これらは、本明細書中で参考として援用される)における従来の方法に従って実施される。
【００７９】
オリゴヌクレオチドは、Applied Bio Systemsのオリゴヌクレオチド合成機で、製造業者によって提供される仕様書に従って合成され得る。
【００８０】
PCR増幅の方法は、当該分野で記載されている(PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification、HA Erlich編、Freeman Press，New York，NY(1992)；PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications、Innis、Gelfland、Snisky、およびWhite編、Academic Press、San Diego、CA(1990)；
Mattilaら(1991)Nucleic Acids Res. 19: 4967；Eckert，K.A.およびKunkel，T.A.(1991)PCR Methods and Applications 1: 17；PCR、McPherson、Quirkes、およびTaylor、IRL Press、Oxford；および米国特許第4,683,202、これらは、本明細書中で参考として援用する)。
【００８１】
（概観）
本発明は、一部、ヒトテロメラーゼのRNA成分およびそのRNA成分の遺伝子のクローニングおよび単離から生じ、関連する(結合した)転写制御エレメントを含む。ヒトテロメラーゼのRNA成分のヌクレオチド配列を以下に示す。簡便のために、この配列を、リボヌクレオチドのための標準的な略号(Ａはリボアデニンであり、Ｇはリボグアニンであり、Ｃはリボシチジンであり、そしてＵはウリジンである)を使用して示す。当業者は、以下に示される配列はまた、cDNAの配列も示し、ここで、リボヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドで置換される(ウリジンはチミジンで置換される)ことを理解する。
【００８２】
【化１】
Figure 0004068861
上記の配列は、5’−3’方向に示され、そして参照のために番号付けされている。
【００８３】
RNA成分のテンプレート配列は、ヌクレオチド50〜60(5’-CUAACCCUAAC-3’)で規定される領域内に位置すると考えられており、これは、テロメア反復ユニットの約３分の１および３分の２から構成されるテロメア配列に相補的である。
【００８４】
この配列は、cDNAクローンおよびRNA成分のゲノムクローンに由来した。RNA成分が、まず、対応する遺伝子から転写される場合、少なくともいくつかの生成されたRNA転写物は、上記の約560ヌクレオチド配列よりずっと長く、そして事実、1000ヌクレオチド以上含み得る。しかし、完全に機能的なテロメラーゼ分子は、上記の約560ヌクレオチド配列からなる転写物から組み立てられ得る。天然のテロメラーゼにおけるRNA成分の3’末端部は、上記配列中のヌクレオチド514〜559で規定される領域内にあると考えられている；１つの分析は、3’末端部がヌクレオチド538のＵ残基であり得ること示す。上記配列のヌクレオチド１〜559未満を含む組換えRNA成分分子もまた、活性テロメラーゼを調製するために使用され得る。
【００８５】
ゲノムクローンは、λベクターFIXII中に挿入されたヒトDNAの遺伝子ライブラリーから同定および単離された。RNA成分遺伝子配列を含むゲノムクローンは、約15kbの挿入物を含み、そしてクローン28-1と名付けられた。この遺伝子は、第３染色体のｑアームの遠位末端部に位置付けられる。λクローン28-1の、約15kbの挿入物の一方の末端部のSauIIIA1制限酵素認識部位〜内部HindIII制限酵素認識部位(これは、成熟RNA成分配列およびRNA成分遺伝子の転写制御エレメントの全てを含む)から得られた配列情報を、標準的なデオキシリボヌクレオチド略号を使用して以下に示し、そして5’−3’方向に示す。
【００８６】
【化２】
Figure 0004068861
【００８７】
【化３】
Figure 0004068861
【００８８】
【化４】
Figure 0004068861
RNA成分配列は塩基1459から始まる。種々の転写制御エレメントがこの配列中に同定されている。A/Tボックス共通配列は、ヌクレオチド1431〜1436に見出され；PSE共通配列はヌクレオチド1406〜1414およびヌクレオチド1508〜1526に見出され；CAATボックス共通配列はヌクレオチド1399〜1406に見出され；SP1共通配列はヌクレオチド1354〜1359に見出され；そしてβ/γ-インターフェロン応答エレメント共通配列は、ヌクレオチド1234〜1245に見出される。HT1080(テロメラーゼ発現)のようなヒト細胞におけるヒトテロメラーゼRNA成分遺伝子のて定常状態転写は、ヌクレオチド1159の上流の配列が、この細胞中に安定にトランスフェクトされるベクターにおいて欠失している場合には、実質的に不変である。
【００８９】
ヒトに対して最も遺伝的にかけ離れた非ヒト霊長類であると考えられているリスザル由来のDNAは、開示したヒトテロメラーゼRNA成分ポリヌクレオチド配列に対応するかまたはこれに相補的な配列からなるPCRプライマーで増幅可能であるテロメラーゼRNA成分遺伝子を含む。他の非ヒト霊長類は、ヒトテロメラーゼRNA成分遺伝子の配列由来のPCRプライマーで、また増幅可能であるテロメラーゼRNA成分遺伝子を有すると考えられている。
【００９０】
（テロメラーゼRNA成分ポリヌクレオチド）
ヒトテロメラーゼについては上記に、そしてリスザルテロメラーゼについては図５に示されるような、哺乳動物テロメラーゼRNA成分およびその遺伝子の配列の開示により、少なくとも15個の連続ヌクレオチド、代表的には、少なくとも20〜25個の連続ヌクレオチドの配列を含む単離ポリヌクレオチドの構築が可能になる。これら連続配列は、哺乳動物テロメラーゼRNA成分配列または哺乳動物RNA成分遺伝子配列と実質的に同一である。さらに、哺乳動物テロメラーゼRNA成分(および遺伝子)配列により、細胞、細胞性サンプル、組織切片、反応容器、ハイブリダイゼーションメンブレンなどにおいて、同種(cognate)のテロメラーゼRNA成分および/または遺伝子のRNAおよびDNA配列を検出するために使用され得る核酸ハイブリダイゼーションプローブおよびPCRプライマーの構築が可能になる。
【００９１】
哺乳動物テロメラーゼRNA成分配列を含むポリヌクレオチドは、転写を促進する配列(発現配列)、RNA安定化配列などを包含し得る。本発明により開示した配列情報ならびに本発明のガイダンスおよび誘導を考慮すると、このようなポリヌクレオチドの構築に関する一般原理は、当該分野において周知であり、そしてManiatisら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第２版(1989)、Cold Spring Harbor、N.Y.にさらに記載されている。例えば、このようなポリヌクレオチドは、プロモーター、および必要に応じて、真核生物発現宿主における使用のためのエンハンサー、ならびに必要に応じて、ベクターの複製に必要な配列を含み得るが、これらに限定されない。代表的な真核生物発現カセットは、転写された場合、哺乳動物テロメラーゼRNA成分転写物を生成するポリヌクレオチドを含む；このようなポリヌクレオチド配列は、下流に(すなわち、必要に応じてエンハンサーに連結された、適切なプロモーター(例えば、HSV tkプロモーターまたはpgk(ホスホグリセリン酸キナーゼ)プロモーター)の転写方向５’から３’に)連結される。
【００９２】
さらに、機能的なテロメラーゼRNA成分の発現を望まない場合、本発明のポリヌクレオチドは、機能的なテロメラーゼRNA成分転写物を転写する必要がない。
【００９３】
本発明のポリヌクレオチドは、テロメラーゼRNA成分RNAまたはDNA配列を検出するためのハイブリダイゼーションプローブおよび/またはPCRプライマー(アンプリマー)ならびに/あるいはLCRオリゴマーとして働き得る。
【００９４】
あるいは、本発明のポリヌクレオチドは、関連する遺伝子、または関連する種(代表的には、哺乳動物種)のテロメラーゼRNA成分遺伝子のRNAまたはDNA配列を検出するためのハイブリダイゼーションプローブまたはプライマーとして働き得る。このようなハイブリダイゼーションおよびPCRアプリケーションのためには、本発明のポリヌクレオチドは、機能的なテロメラーゼRNA成分を転写する必要がない。従って、本発明のポリヌクレオチドは、哺乳動物テロメラーゼRNA成分配列に対する特異的ハイブリダイゼーションまたは特異的増幅が維持されるかぎり、実質的な欠失、付加、ヌクレオチド置換および/または転移を含み得る。
【００９５】
哺乳動物テロメラーゼRNA成分および対応する遺伝子配列のゲノムクローンまたはcDNAクローンは、クローンライブラリー(例えば、Clontech(Palo Alto、CA)から入手可能)から、本明細書中で開示されたヌクレオチド配列に基づいて設計されたハイブリダイゼーションプローブを使用し、そして従来のハイブリダイゼーションスクリーニング法(例えば、Benton WDおよびDavis RW(1977)Science 196: 180；Goodspeedら(1989)Gene 76: 1)を使用して単離され得る。cDNAクローンを所望する場合、体細胞RNAまたは他のテロメラーゼRNA成分発現細胞RNA由来のcDNAを含むクローンライブラリーが好ましい。あるいは、本明細書中で開示した配列の全てまたは一部に対応する合成ポリヌクレオチド配列は、オリゴヌクレオチドの化学合成によって構築され得る。さらに、本明細書中で開示した配列データに基づくプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、ゲノムDNA、RNAプール、またはcDNAクローンライブラリーからDNAフラグメントを増幅するために使用され得る。米国特許第4,683,195号および第4,683,202号は、PCR法を記載する。
【００９６】
このようなポリヌクレオチドは、テロメラーゼRNA成分プローブ、細胞において機能的または非機能的テロメラーゼRNA成分を生成するためのテンプレート、テロメラーゼRNA成分検出アッセイを標準化するための市販の診断試薬、動物に投与するための遺伝子治療ポリヌクレオチドとしての使用を包含する、種々の使用を有する；このようなポリヌクレオチドはまた、とりわけ、食料品(foodstuff)、可燃性エネルギー源、UV吸収日焼け止め薬剤、および粘性増強溶質として使用され得る。
【００９７】
ヒトテロメラーゼのRNA成分およびRNA成分の遺伝子のクローンニングの間に構築された、本明細書中に記載されるプラスミドは、本発明の重要な局面である。
【００９８】
これらのプラスミドは、実質的に純粋な形態のヒトテロメラーゼのRNA成分およびその遺伝子を作成するために使用され得る。これは、本発明のさらに別の重要な局面である。さらに、当業者は、ヒトテロメラーゼのRNA成分のヌクレオチド配列の全てまたはその少なくとも有用な部分を含む、種々の他のプラスミドおよび実質的に純粋な形態の非プラスミド核酸が、本発明によって提供される有用な物質であることを認識する。
【００９９】
本発明の核酸および核酸を含有する調製物に関する一般的な見解として、当業者は、本発明の核酸がDNAおよびRNA分子の両方、ならびに合成の、天然に存在しない核酸アナログ、およびデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドおよび/またはそのいずれかのアナログのヘテロポリマーを包含することを認識する。
【０１００】
本発明の核酸または核酸アナログの特定の組成は、その物質が使用される目的およびその物質が配置される環境に依存する。改変、または合成の天然には存在しないヌクレオチドは、種々の目的に働くよう、または当該分野において周知のように、ヌクレアーゼが存在する環境のような種々の環境で安定な状態を維持するように設計されている。改変、または合成の天然には存在しないヌクレオチドは、天然に存在するリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドと比較して、ヌクレオチドの炭化水素(糖)、リン酸結合、または塩基部分に関して異なり得るか、またはいくつかの場合、非ヌクレオチド塩基さえ含み得る(あるいは、塩基を全く含み得ない)。例えば、Arnoldら、「ヌクレオチドプローブのための非ヌクレオチド連結試薬」と題するPCT特許公開第WO89/02439号(本明細書中に参考として援用)を参照。本発明の核酸は広範囲のヌクレオチドを含み得るというだけで、これら核酸は、広範囲の有用な機能を働かせ得る。
【０１０１】
（同種遺伝子の単離）
上記の記載によって示されるように、ヒトテロメラーゼのRNA成分の配列を含む精製核酸は、有用な診断法および診断薬ならびに治療法および治療薬、ならびに他の重要な利点を提供する。本発明の１つの重要な利点は、本発明の方法および試薬が任意の哺乳動物種から、本発明のヒトRNA成分と実質的に相同なRNA成分を有する、テロメラーゼのRNA成分のおよびRNA成分の遺伝子を単離するために使用し得ることである。句「実質的に相同な」は、ヒトRNA成分のオリゴヌクレオチドまたは核酸配列と別の哺乳動物種のRNA成分配列の核酸配列との特異的ハイブリダイゼーションに必要とされる相同性の程度をいう。このような実質的な相同性を仮定すれば、当業者は、本発明の核酸およびオリゴヌクレオチドのプライマーおよびプローブ使用して、実質的に相同な配列を同定および単離し得る。
【０１０２】
例えば、ゲノムまたはcDNAライブラリーをプローブして相同配列を検出し得る。また、DNA成分配列の領域に対応するプライマーおよびPCR増幅を、低いまたは中程度のストリンジェンシー条件下で使用して、特定の相同な核酸配列を、哺乳動物種由来のRNAまたはDNAの調製物から増幅し得る。これらまたは他の同様な技術を使用することによって、当業者は、ヒト細胞から変異RNA成分核酸を容易に単離しだけでなく、他の哺乳動物細胞、例えば、霊長類由来の細胞、獣医学的な目的の哺乳動物(すなわち、ウシ、ヒツジ、ウマ、イヌ、およびネコ)由来の細胞、および齧歯類(すなわち、ラット、マウス、およびハムスター)由来の細胞から相同なRNA成分核酸を容易に単離し得る。次いで、これらの核酸は、テロメラーゼ活性を調節する薬物のスクリーニングおよび試験に非常に有用なトランスジェニック動物を調製するために使用され得る。例えば、本発明のプラスミドを使用することによって、mus spretus胚幹細胞において、RNA成分遺伝子を「ノックアウト(knock out)」するかまたは天然RNA成分遺伝子を組換え誘導可能遺伝子で置換し、次いで年齢関連疾患または老化関連疾患の研究のためのモデルまたは試験系として有用であるトランスジェニックマウスを作成し得る。下記の実施例９は、そのような方法が、霊長類のRNA成分配列を同定および単離するために如何に使用されているかを説明する。
【０１０３】
ヒトまたはサルテロメラーゼRNA成分および/または同種遺伝子の他の哺乳動物相同体は、適切な非ヒト哺乳動物ゲノムまたはcDNAクローンライブラリー(例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスター、イヌ、ウシ、ヒツジ、オオカミ(lupine)、ブタに由来)、あるいは適切なベクター(例えば、酵母人工染色体、コスミド、またはバクテリオファージλ(例えば、λCharon 35))中の他のゲノムまたはcDNAライブラリーを、ヒトまたはサルテロメラーゼRNA成分あるいは遺伝子ポリヌクレオチド配列のおよそ少なくとも20個の連続するヌクレオチドの配列(またはそれらの相補体)を含むポリヌクレオチドプローブを用いてスクリーニングすることによって同定および単離され得る。代表的には、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、従来のハイブリダイゼーション手順に従って、高いストリンジェンシーで実行される。陽性クローンは、単離および配列決定される。説明のためてあって限定のためではなく、ヒトテロメラーゼRNA成分の559ヌクレオチド配列に対応する完全長のポリヌクレオチドは標識され、そしてλEMBL4またはλGEM11(Promega Corporation、Madison、Wisconsin)中の非ヒトゲノムクローンライブラリーからゲノムクローンを単離するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る；プラークリフト(plaque lift)をスクリーニングするための代表的なハイブリダイゼーション条件(BentonおよびDavis(1978)Science 196:180；Dunnら(1989)J.Biol.Chem. 264:13057)は、50％ホルムアミド、５×SSCまたはSSPE、１〜５×Denhardt溶液、0.1〜１％SDS、100〜200μgの剪断(sheared)異種DNAまたはtRNA、０〜10％硫酸デキストラン、１×105〜１×107cpm/ml変性プローブ(このプローブは、約１×108cpm/μgの比活性を有する)、および42℃〜37℃にて約６〜36時間のインキュベーションであり得る。プレハイブリダイゼーション条件は、プローブを含まないことおよびインキュベーション時間が代表的には減少していることを除いて、本質的に同一である。洗浄条件は、代表的には、１〜３×SSC、0.1〜１％SDS、45〜70℃であり、約５〜30分で洗浄溶液を交換する。非ヒトテロメラーゼRNA成分ポリヌクレオチドを、ヒトテロメラーゼRNA成分ヌクレオチドプローブで単離するために、より低いストリンジェンシー(例えば、約39℃)でハイブリダイズさせ、そして、続いて以下のステップ温度：室温、37℃、39℃、42℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、および70℃で洗浄して、各工程の後に停止し、バックグランドのプローブシグナルをモニター(および、放射活性標識プローブを使用する場合、必要に応じて、オートラジオグラムおよび/またはリン画像化によってシグナルを検出)し、そして経験的に決定される適切なシグナル/ノイズ比が達成される場合、洗浄工程を終結することが好ましい。
【０１０４】
本明細書中に示される、ヒトおよびサルテロメラーゼRNA成分配列のヌクレオチド配列に対応するかまたはこれに相補的な、およそ少なくとも30〜50ヌクレオチド、好ましくは、少なくとも100ヌクレオチドの配列を含むポリヌクレオチドは、開示した遺伝子およびRNA成分配列に対応する生殖細胞系列の遺伝子を同定および単離するためのPCRプライマーおよび/またはハイブリダイゼーションプローブとして働き得る。このような生殖細胞系列の遺伝子は、当該分野における従来の種々の方法(バクテリオファージλ中のゲノムライブラリーまたはコスミドライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニング、または本明細書中で開示した配列に由来するプライマーを使用するゲノム配列のPCR増幅を包含するが、これらに限定されない)によって単離され得る。ヒトゲノムライブラリーは、公に入手可能であるか、またはヒトDNAから新規に構築され得る。
【０１０５】
ヌクレオチド置換、欠失、および付加が本発明のポリヌクレオチド中に組み込まれ得ることは当業者に明らかである。ヌクレオチド配列のバリエーションは、種々の対立遺伝子などの配列多形性から生じ得る。しかし、このようなヌクレオチド置換、欠失、および付加は、本明細書中に示される完全長ヒトまたはサルテロメラーゼRNA成分ポリヌクレオチド配列このポリヌクレオチドのうちの１つに、特異的ハイブリダイゼーションを生じるに十分なストリンジェンシーであるハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドの能力を実質的に破壊するべきでない。
【０１０６】
哺乳動物テロメラーゼRNA成分ポリヌクレオチドは、例えば、ハイブリダイゼーションプローブおよびPCR(またはLCR)プライマーとしての使用に関しては、短いオリゴヌクレオチド(例えば、20〜100塩基長)であり得る。ポリヌクレオチド配列はまた、より長いポリヌクレオチド(例えば、テロメラーゼRNA成分クローンを含むクローニングベクター)の一部分を含み得、そしてポリヌクレオチド結合によって、別のポリヌクレオチド配列と融合され得る。代表的には、テロメラーゼRNA成分ポリヌクレオチドは、天然に存在するテロメラーゼRNA成分または遺伝子配列と実質的に同一な、少なくとも25個の連続ヌクレオチドを含み、より通常には、テロメラーゼRNA成分ポリヌクレオチドは、天然に存在する哺乳動物テロメラーゼRNA成分配列と実質的に同一な、少なくとも50〜100個の連続ヌクレオチドを含む。しかし、テロメラーゼRNA成分標的配列への特異的ハイブリダイゼーションに必要なテロメラーゼRNA成分ポリヌクレオチドの最小の長さは、いくつかの因子、とりわけ、G/C含有量、不適合塩基の位置(存在する場合)、標的ポリヌクレオチドの集団と比較した場合の配列の独自性の程度、およびポリヌクレオチドの化学的性質(例えば、メチルホスホネート骨格、ポリアミド核酸、ホスホロチオレートなど)に依存することが当業者によって認識される。
【０１０７】
所望であれば、実質的に完全長のcDNAコピーを増幅するためのPCRアンプリマーは、実施者の自由に選択され得る。同様に、テロメラーゼRNA成分遺伝子(サルまたはヒト)の一部分を増幅するためのアンプリマーは、選択され得る。
【０１０８】
これらの配列のそれぞれは、テロメラーゼRNA成分を検出するため(例えば、細胞における増加したまたは減少したテロメラーゼRNA成分レベルの存在によって特徴づけられる新生物疾患を診断するため)、または組織型決定(tissue typing)(すなわち、テロメラーゼRNA成分の発現によって特徴づけられる組織を同定する)などを実行するために、ハイブリダイゼーションプローブまたはPCRアンプリマーとして使用され得る。配列はまた、DNAサンプルにおいてゲノムテロメラーゼRNA成分遺伝子配列を検出するため、例えば、法廷のDNA分析(例えば、RFLP分析、PCR産物長さ分布などによる)またはテロメラーゼRNA成分遺伝子の増幅および/または再配置によって特徴づけられる疾患の診断のために使用され得る。
【０１０９】
例えば（しかし限定はしないが）、以下のペアのオリゴヌクレオチドプライマーが、テロメラーゼRNA成分ポリヌクレオチド配列(例えば、cDNA)を増幅するため、またはハイブリダイゼーションプローブ(例えば、ビオチン化または末端標識オリゴヌクレオチドプローブ)として使用され得る：
【０１１０】
【化５】
Figure 0004068861
他の適切なPCRプライマー、LCRプライマー、ハイブリダイゼーションプローブ、およびプライマーなどは、本明細書中で開示されたテロメラーゼRNA成分およびこれから得られ得るテロメラーゼRNA成分を考慮すると配列当業者に明らかである。ヒトテロメラーゼRNA成分ポリヌクレオチドおよびそれらの相補体は、哺乳動物テロメラーゼRNA成分のRNAまたはDNA配列を検出するためのハイブリダイゼーションプローブまたはプライマーとして働き得る。このようなハイブリダイゼーションおよびPCRの適用増幅のためには、ヒトテロメラーゼRNA成分配列の特異的ハイブリダイゼーションまたは特異的増幅が維持される限り、実質的な欠失、付加、ヌクレオチド置換および/または転移を含み得る。しかし、このようなヌクレオチド置換、欠失、および付加は、テロメラーゼRNA成分または遺伝子配列と、特異的なハイブリダイゼーションを生じるに十分なストリンジェンシーであるハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドの能力を実質的に破壊すべきでない。
【０１１１】
例えば(そして、限定ではない)、ヒトテロメラーゼRNA成分ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド48からヌクレオチド209までの配列を含み得る。この配列は、テロメラーゼタンパク質成分の存在下でヒトテロメラーゼホロ酵素を再構築するために十分であると考えられている：
【０１１２】
【化６】
Figure 0004068861
またはDNAとして
【０１１３】
【化７】
Figure 0004068861
また、ヒトテロメラーゼRNA成分ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド１〜559を含み得るかまたはこれからなり得、そして他のヌクレオチドまたはヌクレオチド配列の末端付加を含み得る。ヌクレオチド48〜209からなるテンプレートスクランブルド(template-scrambled)変異体(しかし、ここで、テロメア反復テンプレート配列は変更される)は、野生型配列48〜209からなる切形のRNA成分と、テロメラーゼタンパク質成分への結合およびテロメラーゼホロ酵素の再構築について競合し得る。
【０１１４】
ヒトテロメラーゼRNA成分の構造分析は、二次構造(例えば、ヘアピンループ)を形成する傾向(propensity)を有する領域を示す。例えば、ヒトテロメラーゼRNA成分のおよそヌクレオチド200からヌクレオチド350までの領域は、実質的なヘアピンループ特性を有する。テロメラーゼRNA成分の他の部分もまた、重要な二次構造特性を有する。この顕著な二次構造を考慮すると、コンピュータ解析によって同様な二次構造形態をとる他のヌクレオチド配列は、当業者によって置換され得る。種々のコンピュータプログラムが、実質的に等価な二次構造をとるヌクレオチド配列を決定するために適切であるか、UWGCG配列解析ソフトウェアパッケージプログラムFOLD、SQUIGGLES、CIRCLES、DOMES、NOUNTAINS、およびSTEMLOOPなどが使用され得る。同様に、ペプチド核酸などのような非ヌクレオチド構造模擬体(mimetic)は、分子モデリングプログラムによって、まねることが望ましいヒトテロメラーゼRNA成分領域の特徴的な二次構造の模擬体として、設計され得る。このような構造的模擬体は、治療上または種々の使用(例えば、競合アンタゴニストなど)のために使用され得る。
【０１１５】
（アンチセンス）
本発明の核酸の１つの特に有用なタイプは、インビボまたはインビトロで使用されてヒトテロメラーゼの活性を阻害し得るアンチセンスオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトテロメラーゼのRNA成分に相補的な、約10ヌクレオチドから約25〜200ヌクレオチドまたはそれ以上まで(すなわち、安定な二重鎖を形成するに十分であるが、(所望であれば、インビボに投与するために)送達の様式に依存して、十分に小さい)の特定の配列を含む。このようなオリゴヌクレオチドの作用機序は、機能的リボヌクレオタンパク質テロメラーゼの組立を妨げるため、RNA成分がテロメアDNA合成のテンプレートとして働くことを妨げるため、テロメラーゼRNA成分を不安定化しそしてその半減期を減少させるため、および/またはテロメラーゼRNA成分遺伝子の転写を阻害するためのいずれかのためのRNA成分の結合を包含し得る。
【０１１６】
インビボおよび/またはインビトロでテロメラーゼ活性を阻害するために働く、本発明の例示的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、クローンpGRN7がヒトテロメラーゼのRNA成分のcDNAを含むかどうかを決定するための試験に関連して、上記のオリゴヌクレオチドを包含する。上記のような、３つのこのようなオリゴヌクレオチドを使用して、インビトロにおけるテロメラーゼ活性の阻害を示した。これらオリゴヌクレオチドのそれぞれの配列を以下に示す。
【０１１７】
【化８】
Figure 0004068861
これらのオリゴヌクレオチドはまた、ヒト細胞においてテロメラーゼ活性を阻害するために使用され得る。
【０１１８】
当業者は、本発明が、テロメラーゼ活性を阻害し得る広範囲のアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供することを認識する。本発明の別の有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、Tel-AUである。これは、配列5’-CAGGCCCACCCTCCGCAACC-3’を有し、そして本発明の任意のアンチセンスオリゴヌクレオチドと同様に、ホスホロチオエートヌクレオチド、キラル−メチルホスホネート、天然に存在するヌクレオチド、またはそれらの混合物を使用して合成されて、安定性および所望のTnを与えられ得る。当業者は、広範囲の改変ヌクレオチドアナログ(例えば、O-メチルリボヌクレオチド、ホスホロチオエートヌクレオチド、およびメチルホスホネートヌクレオチド)が、天然に存在するヌクレオチドを使用して生成される核酸より望ましい性質(すなわち、ヌクレアーゼ抵抗性、より強固な結合など)を有する本発明の核酸を生成するために使用され得ることを理解する。オリゴヌクレオチドをヌクレアーゼ抵抗性にする他の技術は、PCT特許公開第94/12633号に記載される技術を含む。
【０１１９】
テロメラーゼ活性の調節に関するさらなる実施態様は、ヒトテロメラーゼRNA成分(hTR)配列の全てまたは一部分に相補的な特定のアンチセンスポリヌクレオチド、例えば、ヒトテロメラーゼRNA成分遺伝子またはその転写RNA(テロメラーゼホロ酵素と結合し得る切形形態を含む)アンチセンスポリヌクレオチドを用いる方法を包含する。このような相補的アンチセンスポリヌクレオチドは、テロメラーゼRNA成分またはその遺伝子に対応する関連標的配列への特異的結合が、ポリヌクレオチドの機能的な性質として維持される限り、ヌクレオチド置換、付加、欠失、または転移を含み得る。相補的アンチセンスポリヌクレオチドは、テロメラーゼRNA成分種に特異的にハイブリダイズし、そしてテロメラーゼRNA成分遺伝子の転写を妨げ得る可溶性アンチセンスRNAまたはDNAオリゴヌクレオチドを含む(Chingら(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 86: 10006；Broderら(1990)Ann.Int.Med. 113: 604；Loreauら(1990)FEBS Letters 274: 53；Holcenbergら、WO91/11535；米国特許出願第07/530,165；WO91/09865；WO91/04753；WO90/13641；およびEP 386563、これらのそれぞれは、本明細書中に参考として援用する)。従って、アンチセンスポリヌクレオチドは、機能的テロメラーゼRNA成分の産生を阻害する。テロメラーゼRNA成分の発現(転写速度および/またはRNA安定性)は、活性化およびテロメラーゼホロ酵素の酵素活性と関連するので、テロメラーゼRNA成分に対応するRNAの転写、および/またはテロメラーゼRNA成分とヒトテロメラーゼのタンパク質成分との相互作用、および／またはテロメラーゼRNA成分とテロメア配列との相互作用を妨げるアンチセンスポリヌクレオチドは、テロメラーゼ活性を阻害し、そして／またはアンチセンスポリヌクレオチドの非存在下でテロメラーゼ活性を発現する細胞の表現型を逆転(例えば、不死化または悪性転換)し得る。治療有効投与量のテロメラーゼRNA成分アンチセンスポリヌクレオチドを含有する組成物は、細胞性病因(例えば、新生物)のためにテロメラーゼ活性を必要とする疾患の処置のため、あるいは所望の場合、配偶子産生または維持を阻害するため(すなわち、避妊剤として)に投与され得る。種々の長さのアンチセンスポリヌクレオチドが生成され得るが、このようなポリヌクレオチドは、代表的には、およそ少なくとも25個の連続するヌクレオチドの配列を含む。この配列は、天然に存在するテロメラーゼRNA成分ポリヌクレオチド配列に実質的に相補的であり、そして代表的には、ヒトテロメラーゼRNA成分配列に完全に相補的である。これは、しばしば、テロメア反復配列に相補的であるテロメラーゼRNA成分の配列に相補的であるか、またはテロメラーゼポリペプチドサブユニットと接触するテロメラーゼRNA成分の部分に相補的である。
【０１２０】
アンチセンスポリヌクレオチドは、トランスフェクタント細胞またはトランスジェニック細胞において、異種発現カセットから生成され得る。異種発現カセットは、遺伝子治療ベクター(例えば、アデノウイルスベクターまたはアデノ関連ウイルスベクター)または他の遺伝子治療ベクターの一部であり得る。異種カセットは、独立して複製し得ず、そして、当業者に公知の種々の適切な任意の方法(例えば、リポフェクション、バイオリスティック(biolistic)、リポソーム、イムノリポソーム、エレクトロポレーションなど)により細胞中に移入されるポリヌクレオチド上にあり得る。あるいは、アンチセンスポリヌクレオチドは、外部環境(インビトロの培養培地、またはインビボ適用については間質性空間および体液(例えば、血液、CSF))に投与される可溶性オリゴヌクレオチドを含み得る。
【０１２１】
外部環境に存在する可溶性アンチセンスポリヌクレオチドは、細胞質に接近し、そして特定のRNA種を阻害することが示されている。いくつかの実施態様では、アンチセンスポリヌクレオチドは、メチルホスホネート部分、C-5プロペニル部分、2’フルオロリボース糖を含むか、またはポリアミド核酸(PNA)である(Egholmら(1992)J.Am.Chem.Soc. 114: 1895；Wittungら(1994)Nature 368: 561；Egholmら(1993)Nature 365: 566；Hanveyら(1992)Science 258: 1481、本明細書中に参考として援用する)。アンチセンスポリヌクレオチドに関する一般的な方法については、Antisense RNA and DNA、(1988)、D.A.Melton編、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、NYを参照。
【０１２２】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドに加え、折り畳まれたRNA成分またはRNA成分の遺伝子のいずれかにおいて、二重鎖核酸と結合して三重らせん含有または三重鎖核酸を形成しテロメラーゼ活性を阻害するオリゴヌクレオチドを構築し得る。本発明のこのようなオリゴクレオチドは、三重らせん形成の塩基対合規則およびRNA成分のヌクレオチド配列を使用して構築される(Chengら(1988)J.Biol.Chem. 263: 15110；FerrinおよびCamerini-Otero(1991)Science 354: 1494；Ramdasら(1989)J.Biol.Chem. 264: 17395；Strobelら(1991)Science 254: 1639；Hsiehら(1990)op.cit. ;Rigasら(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.) 83: 9591、本明細書中で参考として援用する)。このようなオリゴヌクレオチドは、テロメラーゼ遺伝子の転写を妨げること、あるいは、RNA成分が機能的なリボヌクレオタンパク質テロメラーゼを形成することまたはテロメアDNA合成のテンプレートとして働くことのいずれかを妨げる様式で、テロメラーゼのRNA成分の二重鎖領域に結合させることを包含する多くの方法でテロメラーゼ活性をブロックし得る。代表的には、そして作用の態様に依存して、本発明の三重鎖形成オリゴヌクレオチドは、テロメラーゼのRNA成分またはテロメラーゼのRNA成分の遺伝子中の特定の配列に「相補的な」(この文脈において、相補的なは、安定な三重らせんを形成し得ることを意味する)、約10ヌクレオチドから約25〜200ヌクレオチドまたはそれ以上(すなわち、安定な三重らせんを形成するに十分な長さであるが、(所望であれば、インビボに投与するために)送達の態様に依存して、十分短い)の特定の配列を含む。
【０１２３】
本発明のアンチセンスおよび三重らせん形成オリゴヌクレオチドに加えて、ヒトテロメラーゼのRNA成分の少なくとも一部分に連続して同一なセンスオリゴヌクレオチドもまた、テロメラーゼ活性を阻害するために使用され得る。このタイプの本発明のオリゴヌクレオチドは、(１)機能的なテロメラーゼ酵素を生成するに必要とされるRNA成分の完全配列より少ない、または(２)機能的なテロメラーゼ酵素を生成するに必要とされるRNA成分の完全配列、および得られるRNAを非機能的にする１またはそれ以上のヌクレオチドの置換または挿入のいずれかを含むことで特徴づけられる。両方の場合において、テロメラーゼ活性の阻害は、「変異」RNA成分がヒトテロメラーゼのタンパク質成分に結合して不活化テロメラーゼ分子を形成することに起因して観察される。従って、このようなオリゴヌクレオチドの作用機序は、非機能的リボヌクレオタンパク質テロメラーゼの組立、または機能的リボヌクレオタンパク質テロメラーゼの組立の妨害を包含する。例は、ヌクレオチド48〜209からなるテンプレートスクランブルド変異体(しかし、ここで、テロメア反復テンプレート配列は変更されている)であり得る。このようなテンプレートスクランブルド変異体は、テロメラーゼタンパク質成分への結合について競合し得る。このタイプの本発明のセンスオリゴヌクレオチドは、代表的には、ヒトテロメラーゼのRNA成分中のヌクレオチドの特定の配列と同一な、約20、50、100、200、400、500、またはそれ以上のヌクレオチドの特定の配列を含む。
【０１２４】
さらに、アンチセンスポリヌクレオチドは、哺乳動物テロメラーゼのRNA成分とのハイブリダイゼーションに関して、実質的に妨害しない誘導体化置換基を含み得る。化学置換基を付加されて改変されているアンチセンスポリヌクレオチドは、代謝的に活性な真核細胞に導入されて、その細胞においてテロメラーゼのテロメラーゼRNA成分とハイブリダイズし得る。代表的には、このようなアンチセンスポリヌクレオチドは誘導体化され、そしてさらなる化学置換基が、ポリヌクレオチド合成の間または後のいすれかに、それぞれ、付着され、従って局所的なDNA配列および/またはテロメラーゼタンパク質成分に相補的なテロメラーゼRNA成分の配列(ここで、化学的置換基は、変化または化学的改変を生じる)に位置されられる。好ましい付着化学置換基は、ユウロピウム(III)テクサフィリン(texaphyrin)、架橋剤、プソラレン、金属キレート(例えば、鉄触媒切断については鉄/EDTAキレート)、トポイソメラーゼ、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、リガーゼ、ホスホジエステラーゼ、光力学的ポルフィリン、化学療法薬剤(例えば、アドリアマイシン、ドキシルビシン(doxirubicin))、挿入剤、塩基改変剤、免疫グロブリン鎖、およびオリゴヌクレオチドを含む。鉄/EDTAキレートは、ポリヌクレオチド配列の局所的切断を所望する場合、特に好ましい化学置換基である(Hertzbergら(1982)J.Am.Chem.Soc. 104: 313；HertzbergおよびDervan(1984)Biochemistry 23: 3934；Taylorら(1984)Tetrahedron 40: 457；Dervan,PB(1986)Science 232: 464)。好ましい付着化学は、例えば、付加された反応性アミノ基を介する直接結合(CoreyおよびSchultz(1988)Science 238: 1401、本明細書中に参考として援用する)、および他の直接結合化学を包含するが、ストレプトアビジン/ビオチンおよびジゴキシゲニン/抗ジゴキシゲニン抗体結合法もまた、使用され得る。化学置換基を結合するための方法は、米国特許第5,135,720号、第5,093,245号および第5,055,556号(本明細書中に参考として援用する)に提供される。他の結合化学は、実施者の自由に使用され得る。哺乳動物テロメラーゼRNA成分の全てまたは実質的な部分に対応するポリヌクレオチド(すなわち、「センス」ポリヌクレオチド)もまた誘導化され、そしてゲノムのテロメア反復配列と反応させ、そして染色体のテロメア領域に付加生成物(adduct)または他の化学的環境の改変を生じさせるために使用され得る。
【０１２５】
（不適合テンプレート）
従って、本発明の別の有用なオリゴヌクレオチドは、ヒトテロメラーゼのRNA成分の改変または変異配列を含む。Yuら、1990，Nature 344: 126は、TetrahymenaテロメラーゼのRNA成分の変異形態が、Tetrahymena細胞のテロメラーゼ中に取り込まれること、およびこの取り込みがこれらの細胞に対して有害な効果を有す得ることを示す。ヒトテロメラーゼのRNA成分の変異形態の取り込みは、そうでなければ、テロメラーゼ活性を有さない正常ヒト細胞に影響することなくテロメラーゼ活性を有するヒト細胞に対して同様な効果を有し得る。このような変異形態は、配列5’-CTAACCCTA-3’が、5’-CAAACCCAA-3’、5’-CCAACCCCAA-3’、または5’-CTCACCCTCA-3’に変異している形態を包含する。これらの改変RNA成分配列のそれぞれは、染色体DNA中に取り込まれたテロメア反復ユニットを改変し、従って染色体の構造および機能に影響する。このようなオリゴヌクレオチドは、テロメアDNAまたは伸長テロメラーゼ基質の制限酵素消化を介する、改変RNA成分の存在に関する診断方法に有用な制限酵素認識部位を含有するよう設計され得る。
【０１２６】
本発明のこの局面を例示するために、部位特異的変異誘発を、λクローン28-1(下記の実施例７を参照)由来の約2.5kbのHindIII〜SacIフラグメントおよびSV40複製開始点(しかし、プロモーター活性はない)を含むプラスミド(消化されたpGRN33、American Type Culture Collectionから受託番号ATCC75926で入手可能)を使用して実行した。pGRN34(5’-CAAACCCAA-3’を含む)、pGRN36(5’-CCAACCCCAA-3’を含む)、およびpGRN37(5’-CTCACCCTCA-3’を含む)と名付けられた、得られたプラスミドを、真核生物宿主細胞(SV40ラージＴ抗原を発現する293由来細胞株)中に形質転換し、そしてテロメラーゼアッセイをこの形質転換体由来の細胞抽出物を使用して行った。
【０１２７】
このアッセイは、細胞におけるテロメラーゼ活性が、改変配列を含む核酸の形成を生じたことを示し、このことは、ゲノムクローンが機能的なRNA成分遺伝子を含むこと、およびプラスミドが改変されたが機能的なRNA成分遺伝子を含むことを示した。これらの結果は、本発明が、如何にして組換えテロメラーゼ調製物およびこのような調製物を作成する方法を提供するかを例示する。本発明は、本発明の組換えRNA成分と機能的に結合したヒトテロメラーゼのタンパク質成分を含む組換えヒトテロメラーゼを提供する。本発明のこのような組換えRNA成分分子は、天然に存在するRNA成分分子とは、１個またはそれ以上の塩基置換、欠失、または挿入で異なるRNA成分分子、および組換え宿主細胞において作成される、天然に存在するRNA成分分子と同一なRNA成分分子を包含する。このような組換えテロメラーゼ分子を作成するための方法は、テロメラーゼのタンパク質成分を発現する真核生物宿主細胞を、本発明のRNA成分分子をコードする組換え発現ベクターで形質転換する工程、および上記ベクターで形質転換されたこの宿主細胞を、タンパク質成分およびRNA成分が発現されそして組み立てられて、染色体DNAのテロメアに配列(天然のテロメラーゼによって付加される配列と同じ配列である必要はない)を付加し得る活性なテロメラーゼ分子を生成する条件下で培養する工程を包含する。このような組換えDNA発現ベクター(または、プラスミド)の他の有用な実施態様は、欠失、挿入、または遺伝子を非機能的にする他の改変を有するヒトテロメラーゼのRNA成分の遺伝子を含むプラスミドを包含する。このようなプラスミドは、内因性RNA成分遺伝子を「ノックアウト」するためのヒト遺伝子治療に特に有用であるが、処置した細胞を不可逆的に致死的にするためには、高度に効率的な形質転換および組換えシステムが要求される。
【０１２８】
（リボザイム実施態様）
本発明の他のオリゴヌクレオチド(リボザイムと呼ばれる)もまた、テロメラーゼ活性を阻害するために使用され得る。上記のアンチセンスおよび他のオリゴヌクレオチド(これらは、RNA、DNA、またはテロメラーゼタンパク質成分と結合する)とは異なり、リボザイムは、標的RNA(例えば、ヒトテロメラーゼRNA成分)に結合するだけでなく、標的RNAを特異的に切断しそしてこのことよって標的RNAを不活化する可能性がある。このようなリボザイムは、テロメラーゼRNAに相補的な５’-および３’-末端配列を含み得る。切断部位に依存して、リボザイムは、テロメラーゼ酵素を不活化し得る。PCT特許公開第93/23572号、上記を参照。当業者は、ヒトテロメラーゼRNA成分のRNA配列を考慮して、いくつかの有用なリボザイム標的部位が存在し、そしてこれが、例えば、ハンマーヘッド状モチーフリボザイムによる切断を受けやすいことに気づく。このタイプの本発明の例示的なリボザイムは、下記のリボザイムを包含し、それらは、示される配列を有するRNA分子である：
【０１２９】
【化９】
Figure 0004068861
テロメラーゼ活性のリボザイム仲介阻害のために他の最適な標的部位は、Sullivanら、PCT特許公開第94/02595号およびDraperら、PCT特許公開第93/23569号(共に、本明細書中で参考として援用される)によって記載されるように決定され得る。Huら、PCT特許公開第94/03596号(本明細書中で参考として援用される)によって記載されるように、アンチセンスおよびリボザイム機能は、一つのオリゴヌクレオチドにおいて組み合わされ得る。さらに、リボザイムは、本発明の例示的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの記載ととともに上記のように、１またはそれ以上の改変ヌクレオチドまたはヌクレオチド間の改変結合を含み得る。１つの局面では、RNase P(ヒトまたはE.coli)の触媒サブユニットは、テロメア反復配列と塩基対合する哺乳動物テロメラーゼRNA成分の一部分に対応するガイド配列を生成するように改変(Altman S（1995）Biotechnology 13: 327)される；このようなRNase P変異体は、テロメア配列を切断し得る。１つの局面において、RNase P(ヒトまたはE.coli)の触媒サブユニットはテロメラーゼRNA成分の一部分に相補的であるガイド配列を生成するように改変され、その結果、RNase P変異体がテロメラーゼRNA成分を切断し得る。このような操作されたリボザイムは、細胞において発現させられ得るか、または種々の手段(例えば、リポソーム、イムノリポソーム、バイオリスティック、細胞中への直接的取り込みなど)によって移入され得る。他の形態のリボザイム(グループＩイントロンリボザイム(Cech T(1995)Biotechnology 13; 323)；ハンマーヘッドリボザイム(Edgington SM(1992)Biotechnology 10: 256)は、開示したテロメラーゼ「RNA成分配列情報に基づいて操作されて、ヒトテロメラーゼRNA成分および/またはヒトテロメア反復配列の切断を触媒し得る。
【０１３０】
従って、本発明は、テロメラーゼ活性を阻害するための広範囲のオリゴヌクレオチドを提供する。このようなオリゴヌクレオチドは、疾患を処置するために本発明の治療方法のおいて使用され得る。この方法は、患者に、治療有効用量の、本発明のテロメラーゼインヒビターまたはアクチベーターを投与する工程を包含する。テロメラーゼ阻害または活性化を、共に係属中の上記米国特許出願およびPCT特許公開第93/23572号に記載されるアッセイプロトコールを使用して測定し、治療有効用量で送達されるべき薬剤の量を決定し得る。これらの出願に記載されるように、そして上記で議論したように、テロメラーゼ活性の阻害は不死細胞を致死性にするが、一方テロメラーゼ活性の活性化は、細胞の複製寿命を増加させる。テロメラーゼ阻害治療は、不死細胞の未制御の増殖を含むガンに対する効果的な処置であり、そしてテロメラーゼ活性化は、細胞老化を防ぐための効果的な処置である。テロメラーゼ活性を阻害またはブロックする薬剤(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせん形成オリゴヌクレオチド、リボザイム、またはテロメラーゼの変異RNA成分の発現を駆動するプラスミド)の送達は、テロメラーゼ作用を妨げ得、そして最終的に、処置した細胞の細胞老化および細胞死を導く。
【０１３１】
（治療的および予防的局面）
さらに、本発明は、正常細胞が確実に致死性を維持する治療方法を提供する；例えば、RNA成分は、標準的な遺伝子操作手順を使用して改変されて、遺伝子組換えによって(例えば、インビトロ変異誘発によって)、この成分をコードする全てまたは一部の天然遺伝子を欠失し得る。次いで、このような細胞は、不可逆的に致死性になる。この手順は、発現プラスミドを含むように改変された正常細胞が患者に導入される遺伝子治療、およびガン細胞が確実に導入されないよう、あるいはそのような細胞が導入されるとき、その細胞は不可逆的に致死性にされていることが望まれる遺伝子治療において有用である。
【０１３２】
テロメラーゼは腫瘍、生殖細胞系列、および造血系の特定の幹細胞においてのみ活性であるので、他の正常細胞は、テロメラーゼ阻害治療によって影響されない。テロメラーゼインヒビターと生殖細胞系列または幹細胞との接触を避ける工程もまた、採用しうるが、これは本質的でないかもしれない。例えば、生殖細胞系列の細胞は、テロメラーゼ活性を発現するので、テロメラーゼの阻害は、精子形成および精子生存能活性に負の影響を与え、このことは、テロメラーゼインヒビターが、効果的な避妊剤または不妊化剤であり得ることを示唆する。しかし、この避妊効果は、ガンの処置のために本発明のテロメラーゼインヒビターを投与される患者は望まないかもしれない。このような場合、本発明のテロメラーゼインヒビターは、このインヒビターが治療期間の間だけ産生され、その結果、生殖細胞系列の細胞に対するこの負の影響(negative impact)が単に一時的であることを確実にする様式で送達され得る。
【０１３３】
本発明の他の治療方法は、本発明のテロメラーゼRNA核酸を用いてテロメラーゼ活性を刺激し、そして細胞の複製寿命を延長する。これらの方法は、本発明の機能的な組換えテロメラーゼリボヌクレオタンパク質を細胞に送達することによって、その細胞に対して実行され得る。例えば、リボヌクレオタンパク質は、細胞に、リポソームで送達され得、またはヒトテロメラーゼのRNA成分の遺伝子(または、異なる調節エレメントを有する組換え遺伝子)は、真核生物発現プラスミド(テロメラーゼのタンパク質成分の発現をコードする配列を有するかまたは有しない)において使用されて、種々の正常ヒト細胞(そうでなければ、低いレベルの、テロメラーゼのRNA成分の発現またはタンパク質成分のために、検出可能なテロメラーゼ活性を欠く)においてテロメラーゼ活性を活性化し得る。テロメラーゼRNA成分が、テロメラーゼ活性を刺激するに十分でない場合、RNA成分は、テロメラーゼ活性を刺激するために、テロメラーゼのタンパク質成分を発現する遺伝子とともにトランスフェクトされ得る。従って、本発明は、細胞を、治療有効量の、その細胞におけるテロメラーゼ活性を変化させる薬剤と接触させることによって、細胞内または細胞群内のテロメラーゼ活性に関連する状態を処置するための方法を提供する。
【０１３４】
テロメラーゼRNA遺伝子の余分(extra)のコピーを取り込む細胞は、テロメラーゼ活性増大および関連して複製寿命の延長を示し得る。このような治療は、引き続く宿主への導入のために細胞に対してエクスビボて実施され得るか、またはインビボで実施され得る。正常二倍体細胞に外因性テロメラーゼ遺伝子をエクスビボで付加することによって、テロメアの長さを安定化するかまたは増加させることの利点は、以下のことを包含する：テロメアの安定化は、細胞の老化を防ぎそして、潜在的に細胞の無制限の増幅を可能にし得：そして延長された寿命を有する正常二倍体細胞は、薬物試験、ウイルス製造、または他の有用な目的のためにインビトロで培養され得る。さらに、エクスビボで増幅された種々のタイプの幹細胞は、上記のような、特定の疾患のための細胞治療に使用され得る。
【０１３５】
テロメアの安定化はまた、テロメアが、危機（crisis）に近づいた細胞のように臨界的に短くなるのを防ぐことによって、複製中の細胞におけるガンの発現率を抑制し得る。危機の間、大規模なゲノム不安定性が生じる。なぜなら、テロメアキャップ(telomeric cap)の保護的効果を失うからである。「遺伝的デッキ(genetic deck)」は、再びシャッフルされ、そしてほとんど全ての細胞が死ぬ。このプロセスから脱する希な細胞は、代表的には、多くの遺伝子再配置を有する異数体であり、そしてテロメラーゼを発現することによってテロメアにおける安定性の再確立を終わりにする。危機が、テロメアを長く維持することによって予防され得る場合、危機に関連するゲノム不安定性もまた予防され得、個々の細胞が、必要な数の、転移性ガンを生じるに必要な遺伝的変異に遭う機会を制限する。
【０１３６】
テロメラーゼ遺伝子治療(標的細胞のテロメラーゼ活性を増加させることを包含する治療)について標的づけられ得る細胞は、造血幹細胞(AIDSおよび化学治療後)、血管内皮細胞(心臓および脳血管疾患)、皮膚線維芽細胞および基底皮膚ケラチノサイト(創傷治癒および火傷)、軟骨細胞(関節炎)、脳星状細胞および小グリア細胞(アルツハイマー病)、骨細胞(骨粗鬆症)、網膜細胞(眼疾患)、および膵島細胞(Ｉ型糖尿病)を包含するが、これらに限定されない。
【０１３７】
代表的には、本発明の治療方法は、インビボの生理学的条件下でテロメラーゼ活性を阻害または刺激するために機能し、そしてそのような条件下で安定であるオリゴヌクレオチドの投与を包含する。上記のように、改変核酸は、このような安定性を与えることにおいて、および所望の組織、器官、または細胞へのオリゴヌクレオチドの送達を確実にするために有用であり得る。治療目的のオリゴヌクレオチドの送達に有用な方法は、Inouyeら(米国特許第5,272,065号、本明細書中で参考として援用される)に記載される。、 オリゴヌクレオチドは、適切な薬学的処方物における薬物として、直接送達され得るが、また、遺伝子治療および本発明の組換えDNA発現プラスミドを使用してもオリゴヌクレオチドを送達し得る。１つのこのような例示的なプラスミドは、下記の実施例８に記載される。一般に、このようなプラスミドは、プロモーター、および必要に応じて、オリゴヌクレオチドの転写を駆動するために働くエンハンサー(プロモーター配列内に含まれるものとは別に)、ならびに、所望であれば、エピソーム維持または染色体統合および高レベルの転写を提供する他の調節エレメントを含む。アデノウイルスベースのベクターが、しばしば、遺伝子治療のために使用され、そして本発明の試薬および方法と組み合わせての使用に適切である。PCT特許公開第94/12650号；第94/12649号；および第94/12629号を参照。このような目的に有用なプロモーターは、メタロチオネインプロモーター、構成性アデノウイルス主要後期プロモーター、デキサメタゾン誘導性MMTVプロモーター、SV40プロモーター、MRP polIIIプロモーター、構成性MPSVプロモーター、テトラサイクリン誘導性CMVプロモーター(例えば、ヒトCMV即時プロモーター)、および構成性CMVプロモーターを包含する。遺伝子治療に有用なプラスミドは、他の機能エレメント(例えば、選択マーカー)、同定領域、および他の遺伝子を含み得る。組換えDNA発現プラスミドはまた、遺伝子治療以外の手段による送達のための本発明のオリゴヌクレオチドを調製するために使用され得るが、インビトロでの化学合成によって短いオリゴヌクレオチドを作成することはより経済的であり得る。
【０１３８】
関連する局面において、本発明は、治療有効量の、本発明のテロメラーゼインヒビターまたはテロメラーゼアクチベーターを含む薬学的組成物を特徴とする。
【０１３９】
本発明のテロメラーゼインヒビターの薬学的組成物は、ヒトテロメラーゼの変異RNA成分、ヒトテロメラーゼのRNA成分またはこれの遺伝子に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは三重らせん形成オリゴヌクレオチド、あるいはヒトテロメラーゼのRNA成分を切断し得るリボザイム、もしくはこれらまたは薬学的に受容可能なキャリアまたは塩中の他の薬物の組み合わせを含む。本発明の他の薬学的組成物は、テロメラーゼアクチベーター調製物(例えば、精製ヒトテロメラーゼまたはテロメラーゼのタンパク質成分およびテロメラーゼのRNA成分のためのmRNA)を含み、そして老化に関連する疾患を処置するために使用される。ある局面において、変異センス哺乳動物テロメラーゼRNA成分は、細胞集団に投与される；この変異センステロメラーゼRNA成分は、ヒトテロメラーゼ反復配列に関して、少なくとも１つの塩基不適合を含が、しかし、ヒトテロメラーゼポリペプチド成分とともにテロメラーゼ活性を示し、ヒトテロメラーゼ反復における選択されたヌクレオチド位置に取り込みミス(misincorporation)を生じ、このことによって、実質的な複製のために変異センステロメラーゼRNA成分の連続する存在を頼るテロメアを生じ得る。変異センステロメラーゼRNA成分が、十分な期間、細胞集団に投与されて、天然に存在する哺乳動物テロメラーゼRNA成分のテンプレートとして実質的に機能しないテロメア配列が導入され、続いて、変異センステロメラーゼRNA成分の退薬が細胞集団の平均テロメア長の迅速な喪失および増強した老化または細胞死亡率を生じる治療方法が提供される。。
【０１４０】
治療薬剤は、非経口、経鼻、経口、または他の投与様式に適切な処方物において提供され得る。PCT特許公開第93/23572号、上記を参照。
【０１４１】
（診断方法）
本発明は、上記の薬学的処方物および治療方法に加えて、診断方法および試薬を提供する。本発明は、細胞、細胞集団、または組織サンプル中のヒトテロメラーゼのRNA成分、テロメラーゼ、またはテロメラーゼ活性のレベル、量、または存在を測定するための診断方法を提供する。関連の局面において、本発明は、このような方法のための有用な試薬を提供する。試薬は、必要に応じて、キット形態で、この診断方法を実施するためにキットを用いるための指示書とともにパッケージされる。クローンpGRN7がヒトテロメラーゼのRNA成分に対するcDNAを含有することを決定するために実施された試験と関連して上述したように、このRNA成分のレベルは、腫瘍細胞において高レベルである。従って、このRNA成分の検出は、腫瘍細胞にとって有用な診断である。
【０１４２】
さらに、ヒトテロメラーゼのRNA成分（またはヒトテロメラーゼに関する遺伝子の各鎖）に特異的に結合するプローブまたはプライマーは、サンプル中のテロメラーゼ核酸の存在を検出する診断方法において用いられ得る。プライマーおよびプローブは、標的核酸に相補的であり、そして結合するオリゴヌクレオチドである。プライマーおよびプローブは、配列および長さにおいて相違し得るが、主に異なる要素は機能の相違である：プライマーは、DNA合成を開始させるものとして作用する（例えば、PCR増幅において）が、プローブは、典型的には、標的核酸に結合させるためのみに用いられる。プライマーまたはプローブの典型的な長さは、８〜20、そしてそこから30またはそれ以上のヌクレオチドであり得る。
【０１４３】
プライマーまたはプローブはまた標識され得、検出（すなわち、放射性分子または蛍光分子が、典型的に、この目的のために用いられる）または精製／分離（すなわち、ビオチンまたはアビジンが、しばしばこの目的のために用いられる）を容易にする。
【０１４４】
本発明の特に好ましい診断方法は、ガンのおそれがあるとの疑いのある患者から採取した細胞または組織サンプルにおけるテロメラーゼRNA成分配列を検出することを含む。このような方法は、典型的に、標識プローブまたはプライマーを、完全に適合した（相補的な）配列のみが互いに結合（ハイブリダイズ）するような条件下でRNA成分配列に結合することを含む。サンプルにおけるRNAに結合した標識物質の検出は、テロメラーゼ活性の存在およびガン細胞の存在と相関する。いくつかの細胞は、テロメラーゼのRNA成分を発現するが、テロメラーゼのタンパク質成分の発現がないためにテロメラーゼネガティブを維持し得る。このような細胞においてテロメラーゼ活性の存在を検出することが所望される場合、まずタンパク質を単離し、次いでタンパク質画分がテロメラーゼRNA成分を含有するか否かを決定し得る。これによりテロメラーゼ活性の存在の指標となる。本発明の診断方法は、組織バイオプシーおよび組織学的切片において、テロメラーゼ活性の存在を検出することに特に有用であり得、ここでこの方法はインサイチュで実施され、典型的には、それに先だって本発明の特異的PCRプライマーを用いてテロメラーゼRNA成分が増幅される。
【０１４５】
本発明はまた、患者から体外移植した細胞におけるテロメラーゼRNA成分の検出またはテロメラーゼRNA成分遺伝子の再配置または増幅、または疾病特徴的なテロメラーゼRNA成分対立遺伝子の検出（例えば、RFLPまたは対立遺伝子特異的PCR分析による）による、疾患状態（例えば、新生物形成または新生物発生前）の診断のためのテロメラーゼRNA成分ポリヌクレオチドプローブを提供する。典型的には、検出は、標識（例えば、32Ｐ、35Ｓ、14Ｃ、3Ｈ、蛍光、ビオチン化、ジコキシゲニン化）テロメラーゼRNA成分ポリヌクレオチドを用いるインサイチュハイブリダイゼーションによる。しかし、細胞サンプルから単離されたバルクRNAまたはポリＡ+RNAにおけるノーザンブロッティング、ドットブロッティング、または溶液ハイブリダイゼーションもまた用いられ得る。同様に、テロメラーゼRNA成分特異的プライマーを用いるPCR増幅も用いられ得る。同じ細胞型の非新生細胞に比較して変化した量のテロメラーゼRNA成分を含有する細胞が、候補疾患細胞として同定される。同様に、細胞サンプルにおけるテロメラーゼRNA成分遺伝子座または近くに連結した遺伝子座の疾病特徴的な再配置または増幅の検出が、病理状態または病理状態を発現する傾向の存在を同定する（例えば、ガン、遺伝子疾患）。ポリヌクレオチドプローブはまた、個体の法医学的同定（例えば、父親判定試験、または犯罪容疑者または身元不明の死者の同定）のために用いられる。
【０１４６】
ヒト集団内で、テロメラーゼRNA成分の主要一次配列においてわずかな変化が見られ得、これらは、対立遺伝子変異体、制限部位多型、および遺伝子疾患に関連した先天的なテロメラーゼRNA成分疾患対立変異体を含む。
【０１４７】
所望であれば、実質的に全長のテロメラーゼRNA成分コピーを増幅するためのPCRアンプリマーが、実施者の判断で選択され得る。同様に、テロメラーゼRNA成分遺伝子またはRNAの、部分を増幅するアンプリマーが選択され得る。
【０１４８】
（テロメラーゼRNA成分発現）
プライマー、プローブ、またはヒトテロメラーゼのRNA成分由来の配列を含む他の核酸の、長さおよび意図された機能に依存して、本発明の発現プラスミドは有用であり得る。例えば、本発明の全長RNA成分の組換え生産は、本発明の組換えDNA発現プラスミドを用いて実施され得る。本発明の発現プラスミドは、適切なプロモーターの制御下で転写のために配置されたRNA成分のヌクレオチド配列を含む核酸を含む。このようなプラスミドのための宿主細胞は、原核性または真核性のいずれかであり得、そしてプロモーター、ならびに発現プラスミドへの取り込みのために選択される他の調節エレメントおよび選択マーカーは、生産のために用いられる宿主細胞に依存する。
【０１４９】
インタクトな（intact）完全RNA成分遺伝子（すなわち、プロモーター（これは、遺伝子の5’領域における任意の調節配列を含む）およびRNA成分コード領域）は、ヒト細胞においてRNA成分を発現させるために用いられ得る。このヒト細胞には、ウイルス形質転換またはガンにより不死化されたヒト細胞が含まれる。
【０１５０】
RNA成分遺伝子のプロモーターは調節され得るが、この理由および他の理由から、異なるプロモーターの制御下でRNA成分を発現させることを所望し得る。他方で、RNA成分遺伝子のプロモーターは、目的とする他のコード配列を発現させるために、RNA成分コード配列とは独立して用いられ得る。例えば、レポーターコード配列に関するコード配列にRNA成分遺伝子のプロモーターを融合することにより、RNA成分遺伝子の転写調節を研究し得る。このようなコード配列としては、例えば、βガラクトシダーゼ、またはその発現が容易にモニターされ得る別の酵素またはタンパク質に関するコード配列が挙げられる。従って、ヒトテロメラーゼのRNA成分に関する遺伝子のプロモーターおよび他の調節エレメントは、このRNA成分を発現させるためだけでなく、ヒトテロメラーゼのタンパク質成分、アンチセンスまたは他のオリゴヌクレオチド、ならびにヒト細胞における目的とする他の遺伝子産物を発現させるためにも用いられ得る。ヒトテロメラーゼのRNA成分に関するインタクトな遺伝子を含む発現プラスミドが特に、種々の目的のために有用であり得る。この目的には、遺伝子療法が含まれる。当業者は、広範な発現プラスミドが本発明の有用な核酸を生産するために用いられ得ること、および本明細書で用いられる用語「プラスミド」が、宿主細胞に特定の遺伝情報を移送し、かつある期間にわたってその情報を維持させるために用いられ得る、任意のタイプの核酸（ファージ、ウイルス、染色体などに由来するもの）を指すことを認識する。
【０１５１】
（テロメラーゼタンパク質成分の単離）
本発明の試薬はまた、まだ入手可能でないヒトおよび他の哺乳動物テロメラーゼ酵素のタンパク質成分をコードする核酸のクローン化および単離を可能にする。このような核酸へのアクセスは、ヒトテロメラーゼのRNA成分の核酸配列を含む核酸により提供される利点に対し、これを補う利点を提供する。例えば、そして上述されたように、本発明の治療上の利点は、ある場合において、ヒトテロメラーゼのタンパク質成分の精製調製物の使用およびこれをコードする核酸へのアクセスにより増強される。ヒトテロメラーゼのRNA成分をコードする本発明の核酸は、ヒトテロメラーゼのタンパク質成分をコードする核酸を単離するために用いられ得、このような利点に近づくことができる。従って、本発明は、ヒトテロメラーゼのタンパク質成分を単離し精製するための方法、ならびにヒトテロメラーゼのタンパク質成分をコードする核酸を同定し単離するための方法を提供する。関連の局面では、本発明は、精製ヒトテロメラーゼ、ヒトテロメラーゼのタンパク質成分をコードする精製核酸、ヒトテロメラーゼのタンパク質成分のための組換え発現プラスミドを提供する。本発明はまた、活性成分として、ヒトテロメラーゼのタンパク質成分、またはこれらのタンパク質成分をコードするかまたはこれらのタンパク質成分をコードする核酸と相互作用する核酸のいずれかを含む薬学的組成物を提供する。このような核酸の例としては、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重ヘリックス形成オリゴヌクレオチド、リボザイム、または上記のいずれかのための組換えDNA発現プラスミドが挙げられる。
【０１５２】
ヒトテロメラーゼのクローン化RNA成分は、リボ核タンパク質テロメラーゼ酵素のタンパク質成分をコードする核酸を同定しクローン化するために用いられ得る。いくつかの異なる方法が、タンパク質成分の同定およびクローン化を達成するために用いられ得る。例えば、アフィニティーリガンドとして（１）インタクトな酵素のRNA成分に結合する、RNA成分に相補的なヌクレオチド配列；または（２）部分的にまたは完全に変性した酵素のタンパク質成分に結合するRNA成分のいずれかを用いる、酵素または部分変性した酵素のアフィニティー捕捉を用い得る。リガンドは、固体支持体に付着され得、またはその支持体に後で固定化するために化学修飾（例えば、ビオチン化）され得る。ヒトテロメラーゼを含む細胞抽出液を曝露し、次いで洗浄し、支持体に結合したテロメラーゼ酵素の溶出を行うことにより、高度に精製されたテロメラーゼ酵素調製物が提供される。次いで、タンパク質成分は、必要に応じてさらに精製されるか、または直接、タンパク質配列決定により分析され得る。決定されたタンパク質配列は、cDNAをクローン化し、またはテロメラーゼのタンパク質成分をコードする核酸を含むゲノムバンクにおいてクローンを同定するための、プライマーおよびプローブを調製するために用いられ得る。
【０１５３】
設計されたRNA成分を用いるテロメラーゼのアフィニティー捕捉はまた、インビトロで転写されたテロメラーゼRNA、およびテロメラーゼ酵素活性の再構築のための系を用いて実施され得る。AutexierおよびGreider，1994，Genes & Development 8:563-575（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。RNAは、タンパク質のエピトープ標識と同様に、標識(tag)を含むように設計される。
【０１５４】
標識は、それに堅く結合するリガンドが利用可能なRNA配列であり得る。このようなリガンドとしては、例えば、RNA配列特異的抗体、配列特異的核酸結合タンパク質、または特定のRNA配列に堅く結合する有機染料が挙げられる。標識配列および位置に関するテロメラーゼの耐性は、標準的な方法を用いて試験され得る。変化させたRNA成分の合成およびこの方法の再構築工程はまた、インビボにおいても実施され得る。次いで、RNA標識に対する固定化リガンドを用いるアフィニティー捕捉が、酵素を単離するために用いられ得る。
【０１５５】
発現スクリーニングもまた、テロメラーゼ酵素のタンパク質成分を単離するために用いられ得る。この方法において、cDNA発現ライブラリーは、標識テロメラーゼRNAを用いてスクリーニングされ得、そしてテロメラーゼRNAに特異的に結合するタンパク質をコードするcDNAが同定され得る。翻訳阻害を用いる分子遺伝学アプローチもまた、テロメラーゼ酵素のタンパク質成分をコードする核酸を単離するために用いられ得る。この方法において、テロメラーゼRNA配列は、選択マーカーの上流に融合される。適切な系において発現される場合、選択マーカーは機能性である。テロメラーゼRNA結合タンパク質をコードするcDNAが発現される場合、タンパク質は、その認識配列に結合し、それにより選択マーカーの翻訳をブロックし、従ってタンパク質をコードするクローンの同定が可能になる。この方法の他の実施態様では、選択マーカーの翻訳ブロックにより、形質転換細胞の増殖が可能になる。用いられ得る他の系には、PCT公開公報第WO94/10300号に記載の「相互作用トラップ系」；LiおよびHerskowitz、1993年12月17日、Science 262:1870-1874、およびZervosら、1993年１月29日、Cell 72:223-232に記載の「１ハイブリッド」系；およびClontechから市販により入手可能な「２ハイブリッド」系が含まれる。
【０１５６】
特異的結合タンパク質および活性の検出のためのテロメラーゼRNA結合またはテロメラーゼ活性アッセイは、テロメラーゼ酵素の精製、および酵素のタンパク質成分をコードする核酸の同定を容易にするために用いられ得る。例えば、RNA成分配列を含む核酸は、RNA成分内に含まれる配列に特異的に結合するペプチド、タンパク質、または他の化合物（例えば、ヒトテロメラーゼのタンパク質成分）を単離、同定、および精製するためのアフィニティー試薬として用いられ得る。いくつかの異なるフォーマットが、このような結合を検出し、そしてRNA成分に特異的に結合する成分を単離するために利用可能である。これらのフォーマットには、ゲルシフト、フィルター結合、フットプリンティング、ノースウェスタン（タンパク質ブロットのRNAプローブ）、および光架橋が含まれる。これらのアッセイは、結合タンパク質を同定するため、結合タンパク質の精製を追跡するため、RNA結合部位を特徴付けするため、結合タンパク質の分子サイズを決定するため、分取単離のためにタンパク質を標識するため、および（抗体生成のための引き続き行う動物免疫に関して）タンパク質を単離するかまたは組合せ転写／翻訳系においてそのタンパク質をコードする核酸を同定する際に用いられる抗体を得るために、用いられ得る。
【０１５７】
（哺乳動物テロメラーゼタンパク質成分の精製）
哺乳動物テロメラーゼタンパク質成分は、従来の生化学的方法により、テロメラーゼ発現細胞から精製され得る。このテロメラーゼ発現細胞の例としては、HT1080細胞、293細胞、および他の適切な不死化細胞株が挙げられる。例えば、しかもこれに限定されないが、ヒトテロメラーゼは、米国特許出願第08/288,501号（1994年８月10日出願、これは本明細書中に参考として援用される）に開示された方法に実質的に従って、細胞抽出液から精製され得る。哺乳動物テロメラーゼ抽出液からは、RNAse活性または他の適切な手段での処理により、テロメラーゼRNA成分が除去され得る。これによりテロメラーゼRNA成分は解離および／または分解されるが、テロメラーゼタンパク質成分を実質的にインタクトで、かつ（組換えなどにより産生され得る）外因性テロメラーゼRNA成分の付加により再構築可能な状態にとどめる。このようにして精製され、そして必要に応じて内因性テロメラーゼRNA成分が除去されたテロメラーゼタンパク質成分は、本明細書中に記載の薬剤スクリーニングアッセイにおいて、および他の用途のために用いられ得る。
【０１５８】
（遺伝子療法）
外因性遺伝物質の細胞への導入（すなわち、DNA仲介トランスフェクション）は、細胞生物学および分子遺伝学における基礎研究のための必須方法であり、そしてヒト遺伝子療法のための有効な方法の開発のための基礎となる。これまで米国において承認されてきた遺伝子導入の試みの大部分は、レトロウイルスゲノムの一部として治療用ポリヌクレオチド配列を有する複製欠損レトロウイルスベクターに依存する（Millerら，（1990）Mol．Cell．Biol. 10:4239；Kolberg R(1992)J．NIH Res. 4:43；Cornettaら（1991）Hum．Gene Ther. 2:215）。アデノウイルスベクターもまた、ヒト遺伝子療法における使用可能性が記載されている（Rosenfeldら，（1992）Cell 68:143）。
【０１５９】
ヒトにおける使用について承認されている他の遺伝子導入法は、リポソーム中のプラスミドDNAを直接インサイチュで腫瘍細胞に物理的に導入することである。培養細胞において増殖されなければならないウイルスベクターとは異なり、プラスミドDNAは、均質に精製され得、従って病原性混入の可能性が減少される。
【０１６０】
いくつかの状況（例えば、腫瘍細胞）では、外因性DNAが形質導入細胞中に安定に組み込まれることは必要ではない。なぜなら、一過性の発現が、腫瘍細胞を殺傷するために十分であり得るからである。リポソーム仲介DNA導入は、種々の研究者により記載されている（WangおよびHuang（1987）Biochem．Biophys．Res.Commun. 147:980；WangおよびHuang（1989）Biochemistry 28:9508；LitzingerおよびHuang（1992）Biochem．Biophys．Acta 1113:201；GaoおよびHuang(1991)Biochem．Biophys．Res．Commun. 179:280；Felgner WO91/17424；WO91/16024）。
【０１６１】
免疫リポソームもまた、外因性ポリヌクレオチドのキャリアとして記載されている（WangおよびHuang（1987）Proc．Natl．Acad．Sci．(U.S.A.) 84:7851；Trubetskoyら，（1992）Biochem．Biophys．Acta 1131:311）。免疫リポソームは、おそらく特定の細胞型上の表面抗原に結合する特異的抗体を含有することによって、リポソームに比較して改良された細胞型特異性を有することが仮定として予期され得る。Behrら，（1989）Proc．Natl．Acad．Sci．(U.S.A.) 86:6982は、リポソームを形成させるための付加的なリン脂質を必要とせずに、リポポリアミンをそれ自身トランスフェクションを仲介する試薬として用いることを報告している。
【０１６２】
従って、テロメラーゼRNA成分配列またはその相補体と少なくとも25ヌクレオチド、好ましくは50〜100ヌクレオチドまたはそれ以上が実質的に同一であるポリヌクレオチドが、異種プロモーターに作動可能に連結され、ヒト細胞においてテロメラーゼRNΛ成分またはアンチセンステロメラーゼRNA成分ポリヌクレオチドを発現させ得る転写単位を形成する。このような転写単位は、ヒト細胞に送達するためのトランスジーン、アデノウイルスベクター、または他の遺伝子治療様式において、例えば、テロメラーゼ関連疾患（例えば、新生物形成）の治療用に、含まれ得る。テロメラーゼRNA成分センスまたはアンチセンス発現構築物の適切な送達方法は、許容され得る実施行為および法律に規定される要件を考慮して、実施者により選択される。
【０１６３】
（トランスジェニック動物実施態様）
哺乳動物テロメラーゼRNA成分のゲノムクローン、特にマウステロメラーゼRNA成分と実質的に同一であるテロメラーゼRNA成分遺伝子のゲノムクローンは、少なくとも１つの機能破壊テロメラーゼRNA成分対立遺伝子を含有する細胞およびトランスジェニック非ヒト動物を生成するための、相同標的構築物を構築するために用いられ得る。相同標的構築物の構築のための指針は、以下を含む技術文献中に見出し得る：Rahemtullaら、（1991）Nature 353:180；Jasinら、（1990）Genes Devel. 4:157；Kohら、（1992）Science 256:1210；Molinaら、（1992）Nature 357:161；Grusbyら、（1991）Science 253:1417；Bradleyら、（1992）Bio/Technology 10:534（これらは、本明細書中に参考として援用される）。
【０１６４】
相同標的は、いわゆる「ノックアウト」マウスを作出するために用いられ得る。
【０１６５】
このノックアウトマウスは、不活性化されたテロメラーゼRNA成分対立遺伝子に関して異型接合性または同型接合性である。このようなマウスは、免疫系の発達、新生物形成、精子形成の研究のための実験用動物として市販され得、ペットとして用いられ得、動物タンパク質（食糧）および他の用途に関して用いられ得る。
【０１６６】
キメラ標的マウスは、Hoganら、Manipulating the Mouse Embryo: ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory（1988）およびTeratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach，E.J.Robertson編、IRL Press，Washington，D.C.，(1987)（これらは本明細書中に参考として援用される）に従って入手される。胚幹細胞は、公開された手順に従って操作される（Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach，E.J．Robertson編、IRL Press，Washington，D.C.，（1987）；Zjilstraら、（1989）Nature 342:435；およびSchwartzbergら、（1989）Science 246:799、これらはそれぞれ本明細書中に参考として援用される）。
【０１６７】
さらに、テロメラーゼRNA成分cDNAまたはゲノム遺伝子コピーは、高レベルで、かつ／またはテロメラーゼRNA成分遺伝子に天然では近接して存在しない転写制御配列の転写制御下で、テロメラーゼRNA成分を発現させるためのトランスジーンを構築するために用いられ得る。例えば、しかもこれに限定されないが、構成性プロモーター（例えば、HSV-tkまたはpgkプロモーター）または細胞系統特異的転写調節配列（例えば、CD4またはCD8遺伝子プロモーター／エンハンサー）は、テロメラーゼRNA成分ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結され、トランスジーンを形成させ得る（典型的には、neo遺伝子発現カセットのような選択マーカーと組み合わせられる）。このようなトランスジーンは細胞（例えば、ES細胞、造血幹細胞）に導入され得、そしてトランスジェニック細胞およびトランスジェニック非ヒト動物が従来の方法に従って入手され得る。トランスジェニック細胞および／またはトランスジェニック非ヒト動物は、抗新生物剤についてのスクリーニングおよび／または潜在的な発ガン性物質についてのスクリーニングのために用いられ得る。テロメラーゼRNA成分の過剰発現またはテロメラーゼRNA成分の不適切な発現は、新生物発生前または新生物形成の状態を生じ得るからである。
【０１６８】
（薬剤スクリーニングアッセイ）
テロメラーゼRNA成分ポリヌクレオチド、テロメラーゼタンパク質成分調製物、テロメラーゼ反復鋳型、および結合反応物などは、実施例を参照することによって実施される。一般的には、テロメラーゼタンパク質成分は、従来の精製により、テロメラーゼ発現哺乳動物細胞から得られ、そして本明細書中に記載のアッセイにおいて使用される前に、付随するRNA成分が除去される。特定の水性条件が、従来の方法に従って、実施者により選択され得る。一般的指針としては、以下の緩衝水性条件が用いられ得る：10〜250mM NaCl、５〜50mM Tris HCl、pH５〜８であり、必要に応じて二価陽イオンおよび／または金属キレート化剤および／または非イオン性界面活性剤および／または膜画分を添加する。添加、削除、改変（例えば、pH）、および置換（例えば、NaClの代わりにKClを用いること、または緩衝液の置換）が、これらの基本条件に対して行われ得ることは、当業者により理解される。改変は、特定のテロメラーゼホロ酵素形成および／またはテロメラーゼ活性がコントロール反応下で生じる限り、基本結合反応条件に対して行われ得る。コントロール反応（薬剤を含まない）において特異的結合および開裂を生じさせない条件は、結合アッセイにおける使用に適切ではない。
【０１６９】
好ましくは、テロメラーゼRNA成分の固定化テロメラーゼタンパク質成分への結合を決定するために、テロメラーゼRNA成分種は、検出マーカー（典型的には、ビオチニル基、蛍光部分、または放射性標識取り込みヌクレオチド）で標識される。テロメラーゼタンパク質成分のための適切な標識化には、放射性標識アミノ酸（例えば、14Ｃ-標識ロイシン、3Ｈ−標識グリシン、35Ｓ-標識メチオニン）の取り込みによる放射性標識化、125Ｉまたは131Ｉ（例えば、Bolton-Hunter反応およびクロラミンＴ）での翻訳後放射性ヨウ素化による放射性標識化、32Ｐ（例えば、ホスホリラーゼおよび無機放射性標識リン酸）での翻訳後リン酸化による標識化、蛍光標識（例えば、フルオレセインまたはローダミン）の取り込みによる蛍光標識化、または当該分野で知られる他の従来方法による標識化が含まれるが、これらに限定されない。ポリペプチド種の１つが基材への結合により固定化される実施態様では、一般に、他の成分が検出マーカーで標識される。
【０１７０】
標識テロメラーゼRNAまたはタンパク質成分は、固定化テロメラーゼタンパク質またはRNA成分とそれぞれ接触され、そして、固定化されるようになる（すなわち同一起源の(cognate)テロメラーゼ成分に結合し、捕獲される）標識成分の量を変化させる薬剤の能力が決定される。結合反応のインキュベーションの時間および温度は、選択された条件が、薬剤が存在しないコントロール反応において特異的結合を生じさせる限り、変化され得る。好ましい実施態様は、少なくとも約15℃、より好ましくは35〜42℃の反応温度、および少なくとも約15秒のインキュベーションの時間を用いる。しかし、一つの実施態様においては、結合平衡が達成されるために、より長いインキュベーション期間が好ましいとされることもある。結合複合体の結合速度論および熱力学安定性が、時間、温度、塩、pH、および他の反応条件の変化に利用可能な範囲を決定する。しかし、いかなる特定の実施態様においても、所望の結合反応条件は、当該分野の従来の方法を用いて実施者により容易に検量され得る。この従来方法には、スキャッチャード分析、ヒル分析、および他の方法を用いる結合分析が含まれ得る（Protein,Structures and Molecular Principles，（1984）Creighton（編）、W.H.Freeman and Company，New York）。
【０１７１】
標識テロメラーゼタンパク質成分の固定化テロメラーゼRNA成分への特異的結合は、それぞれ非標識競合タンパク質（例えば、アルブミン）および／または非標識RNAを含むことにより決定される。結合反応が完了した後、固定化種に特異的に結合した標識種の量が検出される。例えば、しかもこれに限定されないが、結合のために適切なインキュベーション期間後に、非固定化標識テロメラーゼタンパク質成分を含有する水相が除去され、そして固定化結合テロメラーゼホロ酵素種およびこれに結合した任意の標識テロメラーゼタンパク質成分を含有する基材が適切な緩衝液（必要に応じて非標識ブロッキング剤を含有する）で洗浄され、そしてこの洗浄緩衝液が除去される。洗浄後、固定化標識成分に特異的に結合した状態にある検出可能な標識の量が決定される（例えば、光学的方法、酵素的方法、オートラジオグラフ法、または他の放射化学法による）。
【０１７２】
いくつかの実施態様においては、非特異的結合を阻害する非標識ブロッキング剤の添加が含まれる。このようなブロッキング剤の例は、以下を包含するがこれらに限定されない：ウシ胸腺DNA、サケ精子DNA、酵母RNA、混合配列（ランダムまたは擬ランダム配列）、種々の長さのオリゴヌクレオチド、ウシ血清アルブミン、非イオン性界面活性剤（NP-40、Tween、Triton X-100など）、脱脂粉乳タンパク質、デンハルト試薬、ポリビニルピロリドン、Ficoll、および他のブロッキング剤。実施者は、自身の判断において、結合アッセイにおいて含まれるべき、適切な濃度でのブロッキング剤を選択し得る。
【０１７３】
テロメラーゼRNA成分またはテロメラーゼタンパク質成分が固定化される実施態様において、基材に対する共有結合または非共有結合が用いられ得る。共有結合化学には、当該分野で公知の十分に特徴づけられた方法が含まれるが、これらに限定されない（KadonagaおよびTijan（1986）Proc．Natl．Acad．Sci.(U.S.A.) 83:5889）。一例は、これに限定されないが、臭化シアンを用いて誘導化された基材（例えば、CNBr誘導化Sepharose 4B）への共有結合である。スペーサーを用いて、基材からの潜在的な立体障害を減少させることが所望され得る。タンパク質の基材への非共有結合には、タンパク質の荷電表面への結合および特異的抗体との結合が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７４】
１つの実施態様では、候補治療剤は、テロメラーゼタンパク質成分のテロメラーゼRNA成分への結合をブロックする能力により同定される。
【０１７５】
典型的には、これらの方法において用いられるテロメラーゼRNA成分は、天然に生じる哺乳動物テロメラーゼRNA成分配列（例えば、ヒトRNA成分）を含む。しかし、変異体テロメラーゼRNA成分配列もまた、この変異体テロメラーゼRNA成分がコントロールアッセイ条件（例えば、生理的条件）下でテロメラーゼタンパク質成分に結合する場合に、時折用いられる。
【０１７６】
１つの実施態様では、候補テロメラーゼ調節剤は、代謝的に活性な哺乳動物細胞において、哺乳動物テロメラーゼRNA成分遺伝子（好ましくはヒトテロメラーゼRNA成分遺伝子）の転写調節配列に作動可能に連結されたレポーターポリヌクレオチド配列（例えば、β-ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、HPRT遺伝子）の転写における統計学的に有意な減少または増加を生じる能力により同定される。レポーター遺伝子（例えば、HPRT）は、相同標的構築物またはトランスジーンを生成するように、哺乳動物テロメラーゼRNA成分の二本鎖cDNAの制限部位または平滑末端部位に挿入され得る。この相同標的構築物またはトランスジーンでは、生存哺乳動物細胞において、レポーター遺伝子が、内因性テロメラーゼRNA成分遺伝子プロモーターおよび関連転写制御エレメントの転写制御下に配置される。レポーター遺伝子の用量依存性転写調節を生じる薬剤は、そのことにより、候補テロメラーゼ調節剤として同定される。
【０１７７】
１つの変型では、哺乳動物細胞における内因性テロメラーゼRNA成分遺伝子は、相同標的構築物で標的されて、内因性遺伝子の染色体座において内因性テロメラーゼRNA成分遺伝子の上流転写調節配列（例えば、プロモーター）に作動可能に連結してレポーターポリヌクレオチド配列を配置する。別の変型では、レポーターポリヌクレオチドを含む外因性ポリヌクレオチドは、哺乳動物テロメラーゼRNA成分遺伝子転写調節領域（例えば、プロモーターおよび上流転写因子結合部位）に作動可能に連結される。この外因性ポリヌクレオチドは、哺乳動物細胞に導入され、ここで、染色体位置に非相同に組み込まれ得、かつ／またはエピソームポリヌクレオチドとして維持または複製される。その薬剤で処理された細胞においてレポーターポリヌクレオチドの統計学的に有意な転写調節を生じる薬剤は、そのことにより、候補哺乳動物テロメラーゼ調節剤として同定される。
【０１７８】
テロメラーゼ損傷を修復する細胞の能力を減少させるかまたはテロメラーゼ複製を阻害する（例えば、内因性の天然に生じるテロメラーゼを競合阻害することによる）テロメラーゼ調節剤は、候補抗新生物剤または感作剤である。この感作剤は、細胞（例えば、新生細胞）をテロメラーゼ損傷剤（例えばアルキル化剤および電離放射線）に感作する。
【０１７９】
候補抗新生物剤は、次いで、ヒト抗新生物形成薬として用いるための適応性を推定するために慣用的に用いられるアッセイにおいて、抗新生物形成活性についてさらに試験される。これらのアッセイの例は、以下を包含するが、これらに限定されない：（１）候補薬剤が、足場非依存性形質転換細胞が軟寒天において増殖する能力を阻害する能力、（２）nu/nuマウスに移植された形質転換細胞の腫瘍発生性を低下させる能力、（３）形質転換細胞の形態学的形質転換を逆転させる能力、（４）nu/nuマウスにおいて移植された腫瘍の増殖を低下させる能力、（５）自発性または化学誘導性の発ガンの動物モデルにおいて腫瘍または新生物発生前細胞の形成を阻害する能力、および（６）薬剤が適用される形質転換細胞においてより分化された表現型を誘導する能力。
【０１８０】
薬剤がテロメラーゼタンパク質成分：テロメラーゼRNA成分結合および／またはテロメラーゼの酵素活性を阻害または増加させる能力を検出するためのアッセイは、テロメラーゼアンタゴニストまたはアゴニストを同定するための、薬剤バンク（例えば、化合物ライブラリー、ペプチドライブラリーなど）の簡便な高処理能スクリーニングを提供する。このようなアンタゴニストおよびアゴニストは、テロメラーゼ活性を調整し得、そしてそれによりテロメラーゼ修復反応性および複製能を調整し得る。
【０１８１】
テロメラーゼ活性を特異的に阻害し得る有効用量の薬剤を患者に投与することは、テロメラーゼ活性およびDNA修復および複製を調整することにより有効に処置される病理状態（例えば、ガン、炎症、リンパ増殖性疾患、自己免疫疾患、神経変性疾患など）を処置するための治療方法または予防方法として用いられ得る。
【０１８２】
本開示を読む際に当業者により理解されるように、本発明は、ヒトテロメラーゼに関する有益な試薬、ならびに種々の有用な治療方法および診断方法を提供する。上述の説明は、必然的に、このような方法の限られたサンプルを提供するのみであるが、このことが本発明の範囲を限定するとみなされるべきではない。本発明の他の特徴および利点は、以下の実施例および請求の範囲から明らかである。
【０１８３】
以下の実施例は、本発明の特定の局面を記載して本発明を説明し、そして当業者に、ヒトテロメラーゼのRNA成分を単離し同定するために用いられる方法の説明を提供する。実施例は、本発明を限定するものとしてみなされるべきではない。実施例は、単に本発明の理解および実施において有用な特定の方法を提供するものだからである。
【０１８４】
【実施例】
（概観）
ヒトテロメラーゼのRNA成分のクローン化は、新規な方法を必要とした。この方法は、以下に記載のネガティブ選択およびポジティブ選択サイクルを含む。しかし、まず、逆転写、および’5-RACE PCR増幅と呼ばれるcDNAの末端をクローン化するための方法を用いて、RNA成分をクローン化する試みが行われた。逆転写反応を、ヒトテロメアDNAの一本鎖部分の繰り返し単位に同一であり、従ってヒトテロメラーゼのRNA成分に存在すると考えられる配列に相補的なプライマーを用いて、開始させた。プライマーはまた、その5’末端に、制限酵素認識部位に対応する配列を含有した。しかし、逆転写反応およびPCR増幅により生成したcDNAをゲル電気泳動およびゲル中に存在する核酸のバンドのヌクレオチド配列分析により試験した場合、リボソームRNA配列しか検出されなかった。同様の問題は、この5’-RACEアプローチの変型をネストプライマーを用いて試みた場合にもみられた。
【０１８５】
成功したクローン化の試みは、ヒトテロメラーゼの精製調製物からの、ならびにヒトテロメラーゼ活性を有する細胞株および検出可能なヒトテロメラーゼ活性を有しない細胞株からのcDNAの調製で開始した。このcDNAを調製するために用いた方法を、以下の実施例１に詳細に記載する。２つのネガティブ選択工程、およびポジティブ選択の連続サイクルを、２つのヒト細胞株由来のcDNA調製物とともに用い、望まれない配列の濃度を下げ、そして所望のRNA成分配列の濃度を高めた。
【０１８６】
ネガティブ選択工程は、検出可能なテロメラーゼ活性を有しないヒト細胞株から調製したcDNAからのビオチン化PCR産物の調製を包含する。ビオチン化PCR産物を変性し、次いでテロメラーゼ活性を有するヒト細胞株から調製したcDNAからの大幅に低い濃度の非ビオチン化PCR産物（100ビオチン化産物：１非ビオチン化産物）を含有する溶液中で再びハイブリダイズさせた。テロメラーゼネガティブ細胞株が幾分かの低い量のRNA成分を含有する可能性を考慮して、ハイブリダイゼーション工程を実施し、両方の細胞株で豊富に発現されているRNAのみに対して区別または選択した。最も豊富に発現されたRNAのハイブリダイゼーションを可能にするように選択されたＣ0ｔに対してハイブリダイゼーションを行った後、望まれない物質を、ストレプトアビジン化磁気粒子に結合させることにより除去した。粒子回収後に残存する上清は、ヒトテロメラーゼのRNA成分に対する所望のcDNAを含有した。cDNAのPCR増幅のためのプロセスを、以下の実施例２に記載する。
【０１８７】
この物質をさらに、所望のcDNAについて、ポジティブ選択の連続サイクルにより富化した。ポジティブ選択工程において、ヒトテロメラーゼのRNA成分中の推定鋳型配列に相補的なビオチン化プローブを、テロメラーゼ活性を有するヒト細胞株由来のPCR増幅cDNAの富化（ネガティブ選択による）サンプルからのPCR産物にハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、プローブ／標的複合体をアビジン化磁気ビーズに結合させ、これを次いで回収し、そしてポジティブ選択のさらなるサイクルにおいて、RNA成分配列が富化された核酸の供給源として用いた。ポジティブ選択プロセスを、以下の実施例３および４に、より詳細に記載する。
【０１８８】
ポジティブ選択の３回目のサイクルの後、増幅産物をゲル電気泳動により分離し、そして約200bpの大きさの核酸に対応するゲルの切片を切り出した。次いで核酸をゲル切片から溶出し、PCRにより増幅した。PCR増幅産物を制限酵素NotIで消化し、次いでプラスミドpBluescript IISK+（Stratageneから市販されている）のNotI部位に連結することにより挿入した。得られたプラスミドをE.coli宿主細胞に形質転換し、そして個々のコロニーを単離し、さらなる分析およびDNA配列決定のための核酸の供給源として用いた。次いで、この試験によりポジティブであった多くのコロニーを、DNA配列決定および種々の他の試験により分析した。
【０１８９】
これらの他の試験は、以下を包含した：（１）推定RNA成分に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドがテロメラーゼを含有することが知られるヒト細胞抽出物においてテロメラーゼ活性を阻害するか否かの決定；（２）推定RNA成分クローン配列に特異的なPCRプライマーがテロメラーゼサンプル中に存在する核酸を増幅するために用いられ得るか否か、および観察された産物（もしあれば）がテロメラーゼの精製の間にテロメラーゼ活性を追跡するか否かの決定；および（３）推定RNA成分クローン配列に特異的なPCRプライマーが、テロメラーゼ活性を全く生じないかまたはほんの少量しか生じないことが知られる細胞からの細胞抽出物よりもテロメラーゼ活性が高いことが知られる細胞（すなわち、腫瘍細胞）からの細胞抽出物において、より豊富に存在する核酸を増幅するために用いられ得るか否かの決定。１つのクローン（プラスミドpGRN7と称される）が、これらの試験において、このプラスミドがヒトテロメラーゼのRNA成分に対応するcDNAを含むという決定と一貫する結果を生じた。
【０１９０】
従って、pGRN7の推定RNA成分配列の配列に対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、インビトロでテロメラーゼ活性の阻害を示した。同様に、テロメラーゼを、（１）DEAEクロマトグラフィー；（２）Sephadex S300クロマトグラフィー；および（３）グリセロールグラジエント、SPセファロース、またはフェニルセファロースのいずれかの分離、を含むプロセスにより、細胞抽出物から精製し、そして画分を回収したとき、pGRN7の推定RNA成分配列に特異的なPCRプライマーは、適切な大きさの核酸を増幅し、そして増幅産物の量は、回収された画分で認められたテロメラーゼ活性の量と良く相関した。最後に、正常（テロメラーゼ活性が全く検出されない）およびガン（テロメラーゼ活性が存在する）ならびに精巣（テロメラーゼ活性が存在する）からの細胞抽出物において、細胞は、pGRN7中に含まれる推定RNA成分に対して特異的なプライマーを用いる逆転写およびPCR増幅(RT-PCR)の際に、対応する量のPCR産物を示した。RT-PCRに関するプロトコルを、以下の実施例５および６に記載する。
【０１９１】
上記の結果は、ヒトテロメラーゼのRNA成分がクローン化されたことの説得力のある証拠を提供した。そこで、次いでこのプラスミドpGRN7を用いて、以下の実施例７に記載のように、ヒト細胞株由来のRNA成分についてゲノムクローンを単離した。ゲノムクローンを、Stratageneから購入したλベクターFIXIIに挿入したヒトDNAのゲノムライブラリーにおいて同定し、そしてそこから単離した。RNA成分遺伝子配列を含む所望のクローンは約15kbの挿入断片を含有し、このクローンをクローン28-1と称した。このクローンはAmerican Type Culture Collectionに寄託され、受託番号第75925号として入手可能である。種々の制限フラグメントをこのファージからサブクローン化し、そして配列決定した。この遺伝子はまた、第３染色体のｑ腕の遠位末端に位置付けられた。λクローン28-1の、約15kb挿入断片の一端のSauIIIA1制限酵素認識部位から内部HindIII制限酵素認識部位まで（これは、成熟RNA成分配列の全部ならびにRNA成分遺伝子の転写制御エレメントを含む）で得られた配列情報は、上記に示される。
【０１９２】
（実施例１）
（PCR-増幅性cDNAの調製）
RNAをグアニジンチオシアネート抽出法により293細胞およびIMR-90細胞から得るか、フェノール／クロロホルム抽出法により精製テロメラーゼ画分から得た。
【０１９３】
293細胞由来の全RNAを、2%アガロースゲル上てサイズ分画し、そして500bp未満のサイズのRNAを単離した。
【０１９４】
第１鎖cDNA合成をBethesda Research Laboratories(BRL)から得たSuperscript TMII逆転写酵素を用いて行った。約0.5μg〜1.0μｇのRNAを全容量11μｌで水中の約40ngのランダムプライマー(6マー;pdN6)と混合した。溶液を10分間95℃にて加熱し、次いで、５分間〜10分間氷上で冷却した。変性核酸を遠心分離により回収した。次いで、変性RNAとプライマーとの混合物を、以下に示すものを順に添加することにより再懸濁させた：４μｌの５×第一鎖合成緩衝液；２μｌの0.1Mジチオスレイトール(DTT)；１μｌのRNAsin(Pharmacia)；および１μｌのdNTP(各々2.5mMのストック溶液)。反応混合物を42℃にて１時間インキュベーションし、次いで１μl(200単位)のSuperscriptTMII RTase(BRL)を反応物中に添加し、そして混合した。次いで、この反応物を42℃にて60分間インキュベーションした。得られた反応混合物(新たに合成したcDNAを含有する)を第２鎖合成を行うまで氷上に配置した。
【０１９５】
第２鎖cDNA合成を以下のように行った。第１鎖cDNA合成反応混合物(上記)からの反応混合物(約20μl)を、以下に示す成分とこの順に混合させた：111.1μｌの水；16μｌの10×E．coli DNAリガーゼ緩衝液；３μｌのdNTP(各々2.5mMのストック)；1.5μｌのE．coli DNAリガーゼ(BRL製の15単位)；7.7μｌのE．coli DNAポリメラーゼ(Pharmacia製の40単位)；および0.7μｌのE．coli RNase H(BRL)。
【０１９６】
得られた溶液を緩やかに混合し、そして16℃にて２時間インキュベーションした。この時点で、１μl(10単位)のT4 DNAポリメラーゼを反応チューブに添加し、そしてインキュベーションを同一温度(16℃)にて５分間続けた。反応を停止し、そして核酸をフェノール／クロロホルムを用いて反応物を２度抽出し、エタノールを用いて核酸を沈殿させ、そして反応物混合物を遠心分離して核酸をペレット化することにより回収した。
【０１９７】
遠心分離により回収したcDNAペレットを20μｌのTE緩衝液中に再懸濁させ、そして以下の２つのオリゴヌクレオチド(NH2はアミノ保護基である)からなる「NotAB」と呼称される、２本鎖オリゴヌクレオチドに連結した：
【０１９８】
【化１０】
Figure 0004068861
２本鎖オリゴヌクレオチドを、50μｌのNotAオリゴヌクレオチド(100pmol)を46.25μｌの水中で50μｌのNotBオリゴヌクレオチド(100pmol)と混合し、得られた溶液を95℃にて５分間加熱し、溶液がまだ熱いうちに3.75μｌの20×SSC緩衝液を添加することにより作製した。次いで、混合物を含有するチューブを熱水(約70℃〜75℃の温度にて)を含有するビーカー中に配置した。この温度をゆっくりと15℃未満に下げると、２つのヌクレオチドがハイブリダイズし得て、２本鎖オリゴヌクレオチドNotABを形成し得た。得られた核酸を沈殿および遠心分離により回収した。
【０１９９】
２本鎖NotABオリゴヌクレオチドを約30μｌのTE緩衝液中に再懸濁させ、次いて上記の10μｌのcDNA調製物、約50pmol(OD260により計算)のNotAB；２μｌの10×T4 DNAリガーゼ緩衝液、1.2μｌのT4 DNAリガーゼ；0.2μｌの10mM ATP；および水を全容量20μｌ中に含有する反応混合物を16℃にて一晩インキュベーションすることにより、この反応混合物中のcDNAに連結した。次いで、反応混合物を65℃にて10分間加熱することにより、熱不活性化した。代表的には、約１μ1〜２μｌの得られた混合物を、PCR増幅に用いた。実施例２に記載のように、連結混合物を10サイクル〜15サイクル増幅し得(94℃、45秒間；60℃、45秒間；および72℃、1.5分間)、そしてストックとして貯蔵し得る。
【０２００】
（実施例２）
（cDNAのPCR増幅）
cDNAを、５μｌの10×PCR緩衝液(500mM KCl；100mM Tris、pH=8.3；および20mM MgCl2；5μｌ〜8μｌのdNTP(各2.5mM)；１μｌのTaqポリメラーゼ(Boehringer-Mannheim);0.1μｌの遺伝子32タンパク質(Boehringer-Mannheim)；６μｌのNot B プライマー(20μMストック)；２μｌのcDNA(実施例１に記載のように調製)および水(50μｌとする)からなる増幅反応混合物を調製することにより、通常通り増幅した。次いでこの混合物を50μｌ〜100μｌの鉱油を用いて重層し、PCR増幅を94℃、45秒間；60℃、45秒間；および72℃、1.5分間の10サイクル〜15サイクル行った。増幅後、反応混合物をフェノール／クロロホルムを用いて抽出し、そして増幅核酸をエタノールを用いて沈殿させ、そして遠心分離により回収した。
【０２０１】
次いで沈殿物を100μｌのTE緩衝液中に溶解させ、ストック溶液を調製した。
【０２０２】
（実施例３）
（サブトラクティブハイブリダイゼーションおよびサイクル選択のためのPCR増幅）
サブトラクティブハイブリダイゼーションおよびサイクル選択(cyclic selection)の両方のためのPCR産物を作製するために、実施例２に記載のように調製した約１μｌのストック溶液を、21サイクル〜24サイクルのプライマーアニーリング、伸長、および産物の変性を行ったこと以外は実施例２に記載のように調製した50μｌのPCR反応混合物中で増幅した。増幅後、反応混合物をフェノール/クロロホルムを用いて抽出し、エタノールを用いて沈殿させ、そして遠心分離により回収した。産物収率を少量のアリコートの反応混合物のアガロースゲル電気泳動後、臭化エチジウムを用いて染色することにより見積もった。サブトラクティブハイブリダイゼーションのために、テロメラーゼ陰性細胞(IMR-90)由来のcDNAライブラリーをビオチン化dUTPの存在下で増幅した。テロメラーゼ陰性細胞(IMR-90)由来のcDNAとテロメラーゼ陽性細胞(293)由来のcDNAとの比(約100対１)を用いて、サブトラクティブハイブリダイゼーションを行った。標準条件を65℃にて48時間〜72時間使用した。代表的には、部分精製cDNAおよび陰性に選択された材料由来の核酸産物(２μg)を少なくとも２回のサイクル選択に使用した。
【０２０３】
サイクル選択後（実施例４に記載）、約１μｌ〜２μｌの選択された「プルダウン」産物(20μｌの全容量から)を実施例２に記載のように22サイクルPCR増幅を行い、エタノールを用いて沈殿させ、そして更なるサイクル選択のための調製物中に遠心分離により回収した。
【０２０４】
（実施例４）
（PCR増幅cDNAの陽性選択）
ヒトテロメラーゼのRNA成分をクローン化するために使用するサイクル選択プロセスの陽性選択工程のために、約２μｇのPCR増幅cDNAを25μｌのTE緩衝液中に希釈し、次いで1.25μｌの20×SSCと混合させ、そして得られた溶液を95℃にて３分間加熱した。温度を５分間に60℃まで下げ、そして１μl(0.1μg/μl)のR2またはR4ビオチン化プローブを添加した。これらのプローブの配列を以下に示す。このプローブは、O-メチル-RNAプローブであり、Uは、O-メチルウリジンであり、Aは、O-メチルリボアデニンであり、Gは、O-メチルリボグアニンであり、そしてＩは、イノシンである。
【０２０５】
【化１１】
Figure 0004068861
このR2プローブは、テロメア反復に特異的であり、そしてR4プローブは、RNase P(これは、サイクル選択プロセスの有効性および効率性を追跡するために使用した)に特異的である。公知の配列の分子であるRNase P RNAのサイクル選択を同時に、しかし別々に行うことにより、サイクル選択プロセスが目的分子(この場合、ヒトテロメラーゼのRNA成分)に関して適切に機能していることにより大きな信頼を有し得る。
【０２０６】
R2プローブまたはR4プローブのいずれかを混合物に65℃にて添加した後、30℃で５分間混合物をインキュベーションすることにより、ハイブリダイゼーション反応混合物の温度を30℃まで下げ、次いで14℃にて60分間インキュベーションすることにより反応混合物をさらに14℃の温度まで下げた。最終的に、混合物を４℃にて２時間〜12時間インキュベーションした。
【０２０７】
各サンプル(R2またはR4)についてのハイブリダイゼーション反応混合物全体を400μｌの0.5×SSCに４℃にて添加し、次いで氷冷磁気ビーズチューブ(Promegaから購入し、そして0.5×SSCを用いて使用前に４回予め洗浄した)に添加した。
【０２０８】
得られた混合物を４℃にて30分間インキュベーションして磁気ビーズに確実に完全に結合させた。次いで、各反応チューブを磁気スタンド(Promega)上で室温にて簡単にインキュベーションして、ビーズをプルダウンした。このビーズを冷0.5×SSC(600μl)中に再懸濁させ、そして氷上に(チューブ中で)配置した。サンプルをこの様にして0.5×SSCを用いてさらに３回洗浄した。核酸を100μｌの水中にビーズを再懸濁させ、そして65℃にて２分間インキュベーションし、次いで回収のために磁気スタンド上にビーズを再び配置することによりビーズから溶出した。このプロセスをさらに３回反復した。最後のプロセスにおいて、再懸濁ビーズを65℃にて５分間インキュベーションし、次いで回収のために磁気スタンド上にビーズを配置した。全ての100μｌの上清(各サンプルについて)をプールし、そしてSpeedVacTM遠心分離機中20μｌまで乾燥した。次いで、回収DNAを更なる回の増幅および選択用にPCR増幅した。各増幅後、PCR産物を２回フェノール-クロロホルム抽出し、エタノール沈殿し、そして20μｌのTE緩衝液中に再懸濁させた。
【０２０９】
代表的には、PCR増幅をアガロースゲル電気泳動法により確認した。さらに、種々のコントロールを使用してサイクル選択プロセスをモニターした。１つのコントロールとして、PCR「アーム(arm)」(プライマーハイブリダイゼーション部位として作用する規定された配列のオリゴヌクレオチド)を、ネオマイシン耐性を付与する遺伝子を含有する核酸上に配置した。得られた核酸をPCR増幅cDNAと混合し、そして定量的なPCRにより各選択においてモニターした。他のコントロールとしては、RNase PをRNase P選択およびテロメラーゼRNA成分選択ライブラリーの両方の後に続けた。
【０２１０】
（実施例５）
（RT-PCRプロトコル）
第１鎖cDNAを実施例１に記載の手順と実質的に同一の手順で作製した。基本的には、RNAを各テロメラーゼ画分(0.1μｇ〜１μｇのRNAを含有する)から精製し；代表的には、300μｌの画分から作製されるRNAの約３分の１〜５分の１を使用した。RNAを40ng〜80ngのランダムヘキサマーと10μｌ中で混合し、95℃にて10分間変性(サーマルサイクル機器(thermal-cycling instrument)を用いて)させ、そして氷上で冷却した。変性RNAおよび６マーを、逆転写酵素(RTase、BRLから購入)の製造業者により供給される５×第１鎖合成緩衝液(４μl)、２μｌの0.1M DTT、１μｌの10mM dNTP(各)、１μｌのRNaseインヒビター(Pharmacia)、および水(全容量を９μｌとする)を含有する反応混合物に添加した。合わせた混合物を42℃の水浴に配置した。１分間〜２分間インキュベーションした後、１μｌのSuperscriptTM II RTase(BRL)を混合物に添加した。インキュベーションを42℃にて60分間続けた。反応をチューブを95℃〜98℃にて10分間加熱することにより停止させた。第１鎖cDNAを短い遠心分離により回収し、更なるチューブに分割(aliquoted)し、迅速にドライアイス上で凍結させ、そして-80℃にて貯蔵するか、または即座に使用した。
【０２１１】
（実施例６）
（特異的プライマーセットを用いたcDNAのPCR増幅）
放射性標識化ヌクレオチドを用いた20μｌのPCR反応のために、実施例５の手順に従って調製した１μｌのcDNAを、20pmolのプライマー１、20pmolのプライマー２、2.5μｌの2.5mM dNTP、５μCiのα-32P-dATP、２単位のTaqポリメラーゼ(Boehringer-Mannheim)、0.2μgのT4遺伝子32タンパク質(Boehringer-Mannheim)、２μｌの10×緩衝液(500mM KCl、100mM Tris-HCl-pH8.3、および20mM MgCl2)、ならびに水(全容量を20μｌにする)と混合した。次いで、鉱油を１滴チューブに添加した。
【０２１２】
テロメラーゼRNA成分クローン用のPCR増幅条件は以下の通りである：94℃で45秒間、60℃で45秒間、72℃で1.5分間。サイクル数は、代表的には18サイクル〜25サイクルの範囲であるが、RNA調製に使用される精製物質のタイプに応じて異なった。全ての定量的なRT-PCRに関して、異なるサイクルのいくつかの反応を各サンプルについて行って、いつPCR増幅が飽和し、そして非線形となったかを決定した。
【０２１３】
RNase Pをコントロールとして使用するための、PCR増幅条件は以下の通りであった：94℃で45秒間、50℃で45秒間、および72℃で1.5分間。さらにサイクル数は、サンプルの性質に応じて15サイクル〜22サイクルの範囲であった。RNase P増幅に使用するプライマーの配列を以下に示す：
【０２１４】
【化１２】
Figure 0004068861
これら２つのプライマーを用いて得たPCR産物は、約110bpのサイズである。
【０２１５】
PCR後、産物(５μｌ〜10μｌの反応混合物)を6%ネイティブポリアクリルアミドゲル上にロードし、そして電気泳動を行った。電気泳動後、ゲルを乾燥し、そして分析のためにPhosphorImagerTMカセットまたはオートラジオグラフィー用フィルムに曝露した。
【０２１６】
（実施例７）
（ヒトテロメラーゼのRNA成分に対する遺伝子のクローニング）
ヒトテロメラーゼのRNA成分に対する遺伝子をクローン化するために使用する手順を、概ねManiatisら、Laboratory Molecular Cloning Manual.に記載されるように行った。λファージベクターFIXIIに挿入したヒト肺線維芽細胞株WI-38由来のDNAのゲノムDNAライブラリーをStratageneから購入した。このファージを１プレート当たり約25,000プラークの濃度で３セットの15(150mm)プレート上にプレートした。このプレートをNZYアガーおよびNZYトップアガロースを用いて作製し；ファージ形質転換に使用した細胞は、XLlBlueMRAP2細胞であり；そして形質転換体を37℃にて約16時間一晩増殖させた。次いでプレートを４℃にて約１時間冷却し、次いでプラークをC/Pナイロンサークル(Bio Rad製のフィルターペーパー)上に「リフト」した。このプロセスを反復してリフトしたフィルターの２連のセットを得た。このフィルター(２連)を変性させ、中和し、6×SSC緩衝液中で平衡化し、UV照射に曝露して核酸をフィルターに架橋し、次いでブロッター紙上で乾燥した。
【０２１７】
プレハイブリダイゼーションを50%ホルムアミド緩衝液中、37℃にて１時間行った。フィルターを、クローンpGRN7由来の約218bpの放射能標識NotIフラグメントを用いてプローブした。このフラグメントは、電気泳動による分離後5%ポリアクリルアミドゲルから電気溶出法により単離し、次いで製造業者の手引きに従いBoehringer-Mannheim Biochemicals製のニックトランスレーションキットを用いてα-32P-dCTPでニックトランスレーションした。約25ng(約10μCi標識)のプローブを１フィルター当たり使用し、そしてハイブリダイゼーションを50%ホルムアミドハイブリダイゼーション緩衝液中、37℃にて一晩行った。ハイブリダイゼーション後、このフィルターを室温で６回洗浄し；最初の３回の洗浄を6×SSC(0.1%SDS含有)を用いて行い、そして後の３回の洗浄を6×SSC単独で行った。PhosphorImagerTMカセット中でいくつかの２連フィルターをまず曝露して、ハイブリダイゼーション効率とシグナル強度をチェックした後、フィルターを0.5×SSC中で65℃にて洗浄した。次いでこのフィルターを、２つの増感スクリーンを用いてKodak XAR5フィルム下に配置し、そしてこのフィルムを-70℃にて約100時間曝露した。
【０２１８】
１つの強いシグナルがファージ(後に28-1と命名、これはヒトテロメラーゼのRNA成分に対する遺伝子を含む)を含有するフィルターから発せられた。このフィルター上に観測されたシグナルに相当するプラークを２次プレートを作製するために使用し、その結果、単離されたプラーク(標識pGRN7核酸を用いてプローブすることにより確認)をファージDNAの大規模単離用に培養した。ファージ28-1(アメリカンタイプカルチャーコレクションから受託番号75925号のもと入手可能)は、約15Kbのインサートを含有し、かつpGRN7上のRNA成分配列とハイブリダイズする配列を含む以下のいくつかの制限フラグメントを含有する：4.2kbのEcoRI制限酵素フラグメント；4.2kbのClaI制限酵素フラグメント、および2.5kbのHindIII-SacI制限酵素フラグメント。後者のフラグメントは、上記に示されるRNA成分の約560ヌクレオチド配列全体を含有し、そしてRNA成分に対する完全な遺伝子を含有すると考えられている。pBluescriptベクター中に2.5kbのHindIII-SacI制限酵素フラグメントを含有するプラスミドをプラスミドpGRN33と命名し、そしてこれはアメリカンタイプカルチャーコレクションから受託番号ATCC のもと入手可能である)。ヒト遺伝子が2.5kbのフラグメント上のもの以外の配列を含み得ても、これらの配列は、ファージ28-1から単離され得るか、または2.5kbのフラグメント(あるいは本発明の他のプローブ)を用いてプローブすることにより同定される他のファージクローンから単離され得る。上記の制限酵素フラグメントを別々の制限酵素消化において調製し；この消化産物を0.7%アガロースゲル、または約2.5kbフラグメントのみについては3%ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動により分離し、そして所望のバンドをゲルから切り取り、そしてGeneCleanTM Kit II(Bio101、Inc.製)を用いるか、または0.1×TBE中でSpectropor番号２透析チューブ中に100Vにて２時間（約2.5kbのフラグメントのみについて)電気溶出することによるかのいずれかでサブクローニング用に調製した。
【０２１９】
これらの制限酵素フラグメントをpUC-ベースのプラスミドまたはpBluescriptIIプラスミドから誘導されるSV40の複製開始点をも含有する(しかし、SVプロモーター活性はない)E．coli発現/変異誘発プラスミド中にサブクローン化した。得られたプラスミドを、好ましい実施態様の説明において上記のように種々の目的のためにヒトまたは他の真核生物細胞中に導入するための改変(変異)RNA成分核酸を調製するために使用し得る。
【０２２０】
（実施例８）
（ヒトテロメラーゼのRNA成分に対するアンチセンスプラスミド）
アンチセンス発現プラスミドを、以下のプライマーセットを用いるRNA成分cDNAのPCR増幅により調製した：(1)NotBおよびG1、これは、プラスミド中のcDNAインサートより小さいアンチセンス核酸を産生する；および(2)NotBおよびR3C、これは完全長(プラスミド中のインサートと比較して)のアンチセンス核酸を産生する。NotBのヌクレオチド配列を上記実施例１に示し、G1およびR3Cプライマーのヌクレオチド配列を以下に示す。
【０２２１】
【化１３】
Figure 0004068861
PCR増幅後、増幅フラグメントを約10kbの発現プラスミド中にPmlI部位にてクローン化した。このプラスミドは、選択マーカーとしてのプロマイシン耐性を付与するDHFR遺伝子、およびヒグロマイシンB耐性を付与する遺伝子、SV40の複製開始点；ヒトテロメラーゼのRNA成分に対する遺伝子のアンチセンス鎖の発現のために配置した誘導性ヒトメタロチオネイン遺伝子プロモーター(より高い発現レベルを得るためにより強力なプロモーターを使用し得る)、およびSV40後期ポリA添加部位を含有する。
【０２２２】
得られたプラスミド(NotB/G1産物に対してpGRN42およびNotB/R3C産物に対してpGRN45と命名)をリン酸カルシウム手順(Maniatisら、上記を参照のこと)により線維肉腫細胞株HT1080中にトランスフェクトした。HT1080細胞は、通常不死である。ヒトテロメラーゼのRNA成分に対するアンチセンスRNAの発現により、ヒトテロメラーゼのRNA成分のタンパク質成分との会合が妨害されて、活性テロメラーゼの形成を阻害し、かつ細胞死をさせる。
【０２２３】
（実施例９）
（非ヒト哺乳動物由来のRNA成分核酸の同定および単離）
いかにして本発明の試薬が、他の哺乳動物種由来の実質的に相同な核酸を同定し、そして単離するために使用され得るのか示すために、ヒトRNA成分配列に対して相補的なPCRプライマーを、PCRにおいて相同な配列を増幅するために使用した。本発明のこの局面を示すために使用した例証的なプライマー対は、プライマー＋10(配列5’-CACCGGGTTGCGGAGGGAGG-3’を有する)、およびプライマーR7(配列5’-GGAGGGGCGAACGGGCCAGCA-3’を有する)からなる。ゲノムDNAをチンパンジー、リスザル、アカゲザル、およびヒヒの組織から調製し、そして約0.5mg/ml〜４mg/mlの濃度にてTE緩衝液中に溶解した。
【０２２４】
各組織タイプについて、PCR混合物を調製し、混合物は以下からなった：１μＬのゲノムDNA、48μLのMaster Mix(Master Mixは、Stratagene製の１×TaqExtenderTM緩衝液、200μMの各dNTP、および0.5μMの各プライマーからなる)、ならびに0.5μLTaqポリメラーゼ(5単位/μL、Boehringer Mannheim)：Tthポリメラーゼ(TaqExtenderTMポリメラーゼ、Stratagene製)の1：1混合物。反応チューブをサーマルサイクラー(最初に、反応混合物を94℃にて５分間加熱し、次いで94℃で30秒間、63℃で10秒間、および72℃で45秒間にて27サイクルのインキュベーションを行うようにプログラムした)上にロードした。増幅反応が完結した後、電気泳動のために約10μLの各反応混合物を2%アガロースゲル上にロードした。電気泳動、ゲルの染色、そしてUV照射後、各反応混合物が予測されたサイズ(約200bp)のバンドを含有したことを観測し得た。これらのバンド由来の核酸は、クローン化され得、そして配列決定され得、そしてこれらの各哺乳動物種由来のRNA成分遺伝子の残りはヒトテロメラーゼのRNA成分に対する遺伝子について上記したようにクローン化され得る。実施例14(後述)は、リスザルテロメラーゼRNAゴモネント(gomonent)遺伝子配列決定の具体的な例を記載する。
【０２２５】
（実施例１０）
（変異センスヒトテロメラーゼRNA成分配列）
この実施例は、テンプレート領域におけるテロメラーゼRNA成分配列を変化させることにより、ヒトテロメラーゼにより合成される配列が変化し、染色体のテロメラーゼ反復における変化を導くことを例証する。
【０２２６】
TRC3テンプレート領域の再プログラムが、ヒトテロメラーゼ活性において合成されたテロメア反復中に対応する変化を導くか否かを決定するために、テロメラーゼRNA成分(TRC3)遺伝子配列全体を発現する遺伝子フラグメントをクローン化し、そして変異誘発した。サザンブロット分析は、TRC3がヒトゲノムにおいて単一コピー遺伝子にハイブリダイズしたことを示した。TRC3のゲノムコピーをλファージライブラリーから単離し、そしてそれがTRC3を用いてプローブしたゲノムサザンブロット上に観測したものと同一の制限マップを有することが示された。2.6kb HindIII-Saclフラグメントを単離し、そしてpBluescriptの改変型中にサブクローン化し、ゲノムTRC3プラスミドpGRN33を生じた。RNAの5’および3’末端をプライマー伸長、RACE PCR、およびRT-PCRを用いてマップした。RNA転写物のサイズは約550塩基であり、ノーザンブロット上の移動度と一致した。TRC3についての転写された領域はゲノムクローンの中心であり、1.4kbの上流配列を有した。
【０２２７】
RNAを精製テロメラーゼ調製物から抽出し、次いで以下の実験において使用した。5’RACE：第一鎖cDNAを32P-dATPの存在下、アンチセンスTRC3プライマー(R3B：5’-CAACGAACGGCCA GCAGCTGACATT)を用いて作製した。伸長産物をPAGEにより分離し、そしてオートラジオグラフィーにより同定し、切り出し、そして抽出した。オリゴヌクレオチド(NotA：5’-pATAGCGGCCGCTT GCCTTCA-NH2)をT4 RNAリガーゼを用いてこれらの第一鎖産物に連結し、次いでPCRをネストプライマー、R3c(5’-GTTTGCTCTAGAATGAACGGTGGAAG)およびNotAオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチド(NotB：5’-TGAATTCTTGCGGCCGCTAT)を用いて行った。PCR産物をアガロースゲル上に分離し、そしてバンドを切り出し、そしてプライマーとしてオリゴヌクレオチドG1(5’-AGAAAAACAGCGCGCGGGGAGCAAAGCA)を用いて直接配列決定した。3’末端マッピング：3’RACEを行う試みは成功しなかった。次に、RT-PCRストラテジーを採用し、ここでゲノムDNA配列に相補的な一連のアンチセンスプライマーを用いて、第一鎖cDNA合成をプライムした。この系列におけるプライマーを約150bp間隔とし、転写物の5’末端から始めて、3’末端に進行した。次いで、PCRを第一鎖プライマーおよびその配列が公知のTRC3転写物の内側であるプライマー(F3b：5’-TCTAACCCTAACTGAGAAGGGCGTAG)を用いて行った。逆転写酵素-感受性PCRバンドの予期されたサイズは、＋558〜＋950に対して設計されたいずれのプライマーを用いても見られず、間隔＋100〜＋450(5’末端に対して番号づけた)に対して設計された全てのプライマーを用いて作製されたcDNAを用いる場合に見られた。これは、＋450位と＋558位との間に成熟TRC3転写物の3’末端を位置づけた。続くプライマー設計およびRT-PCRにより、＋545と＋558との間にこの間隔を狭めた。
【０２２８】
TRC3の予期されたテンプレート配列を、ゲノムプラスミドpGRN33のインビトロ変異誘発(Perezら、(1994)J．Biol．Chem. 269：22485に実質的に従って行った)によりCUAACCCUAからCCAACCCCA(MuC)またはCAAACCCAA(MuA)に変えた。機能性テロメラーゼ中に組み込まれた場合、これらの変異RNAは、野生型反復TTAGGGではなく、TTGGGG(MuC)またはTTTGGG(MuC)の合成鋳型となるはずである。
【０２２９】
これらの変異テロメラーゼ活性は野生型活性から容易に区別され得る。なぜならこれらは、もはや活性のためにdATPを必要とせず、そして野生型活性のみが、ddATPによる終結に感受性であるはずだからである。２重変異体(MuC＋17)もまた調製された。ここでは、17bpインサートがMuCテンプレートに加えて＋180bpにて存在した。この変異体は、17bpインサートに対するプローブ、またはサイズにより改変RNAの特異的検出を可能とした。
【０２３０】
2.6kbのゲノム配列でインビボのTRC3の発現には十分であった。細胞を一過性にMuC＋17プラスミドを用いてトランスフェクトし、そしてトランスフェクトされたDNAから発現したRNAを逆転写工程におけるプライマーとして17bpインサート配列を用いるRT PCRにより検出した。RNAをモックトランスフェクト細胞においてではなくMuC＋17トランスフェクト細胞において検出し、このことによりTRC3発現のためには、2.6kbゲノムクローンで十分であることが示された。次いで、安定な形質転換体をpCMVneoと共にHT1080をリン酸カルシウムトランスフェクションすることによりこれらの３つの変異体プラスミドの各々から誘導した。耐性クローンをG418中で選択し、そしてMuC＋17RNAの発現をRT-PCRにより確認した(Irvingら、(1992)Exp．Cell Res. 202：161)。
【０２３１】
変異体テロメラーゼ活性を試験するために、未トランスフェクト細胞から、および組み込まれたMuC★、MuC、またはMuAベクター(図１におけるC★、CまたはA)を有する安定な形質転換体からの抽出物をアッセイした。変異体抽出物は野生型および変異体テロメラーゼ活性の両方を含むことが予期されたので、種々のアッセイ条件をこれらを区別するために採用した。通常の反応条件下(dTPP、32P-dGTPおよびdATP)、変異体構築物系列由来の全ての抽出物は、RNaseに感受性の野生型テロメラーゼ活性を示した(図１、レーン1〜6)。予期されたように、この活性は、ddCTPが反応物に含まれた場合影響されず(図１、レーン7〜9)、そしてddTTPによりなくさられた(図１、レーン10〜12)。対照的に、ddATPがdATPに置き換わった場合、C(レーン14)およびA(レーン15)抽出物は依然、RNase-感受性(レーン17および18)テロメラーゼ活性を示し、一方C★(レーン13)およびコントロール抽出物はテロメラーゼ活性を示さなかった。これらの結果は、テロメラーゼが示すddATP-耐性活性はMuCまたはMuA TRC3 RNAを用いて再プログラムされたことを示す。対照的に、C★における17bpインサートは再構成を阻害し、このことはテロメラーゼ再構成がTRC3配列に非常に特異的であることを示す。
【０２３２】
変異体MuAにより合成された配列が(GGGTTT)nであることを確認するために、本発明者らは、独持のテロメラーゼプライマーに付加されたテロメラーゼ反復を増幅するための既存のPCR方法を改変した(Kimら、（1994）Science 266：2011)。
【０２３３】
合成プライマーを用いて、本発明者らは、配列d(CCCAAACCCAAACCCAA)を有する3’プライマーが(TTTGGG)n反復のみを増幅し、(TTAGGG)n含有反復を増幅しない反応条件を同定した。
【０２３４】
野生型と変異体テロメラーゼとによって付加されたテロメラーゼ反復を区別するために、２工程アッセイを、テロメラーゼ反応に対するヌクレオチドの利用可能性を制限するストラテジーと組み合わせた。MuAおよびMuCが(TTTGGG)nおよび(TTGGGG)nのテロメア反復配列をそれぞれ生じるので、細胞抽出物を始め室温にて10分間dTTPおよびdGTPのみの存在下、TS基質と共にインキュベーションしてテロメア反復を付加させた。次いで、残余のテロメラーゼ活性を５分間抽出物を沸騰させることにより破壊した。次いで、特異的DNA配列を有するテロメラーゼ産物を、記載(Kimら、(1994)前出)したように適切な逆方向プライマーを用い、そして４つ全てのdNTPおよび微量の32P-dCTPの存在下でのPCR増幅により検出した。MuA産物を検出するためには、逆方向プライマーは、(ACCCAA)4であり、そしてPCR条件は94℃、10秒、60℃、30秒および72℃、30秒で20サイクルであった。MuC産物を検出するためには、以下の３つの逆方向プライマーをそれぞれ使用した：(CCCCAA)3、(CCAACC)3および(CCAACC)3。これらは、テロメラーゼ産物に対するアニーリングの予期した位置と一致する、対応する移動度を有するPCR産物を与えた。使用したPCR条件は、アニーリング温度が50℃であったこと以外は上記と同一であった。同一条件下、テロメラーゼ産物は、親細胞または野生型TRC-3遺伝子を用いてトランスフェクトした細胞の抽出物から全く生じなかった。本発明者らのPCR増幅条件の特異性の試験において、(TTTGGG)nおよび(TTGGGG)nを含有する合成オリゴヌクレオチドは、それぞれ(ACCCAA)4または(CCCCAA)3逆方向プライマーを用いて適切な６ntラダーPCR産物を生じ、一方(TTAGGG)nオリゴヌクレオチドは、(ACCCAA)4または(CCCCAA)3逆方向プライマーを用いて全くPCR産物を産生しなかった。
【０２３５】
これらの条件を用いて、MuCまたは野生型細胞由来ではなくMuA由来の抽出物は、改変したテロメラーゼアッセイにおいて産物を生じ、このことは、MuA含有細胞由来のテロメラーゼが、(TTTGGG)n反復を生じたことを示した。同様の方法を用いてMuC変異体を分析したところ、(TTGGGG)n反復が合成されていた。まとめると、上記のデータは、TRC3遺伝子がヒトテロメラーゼのRNA成分をコードすることの強い証拠を構成し、これにより、本発明者らは、TRC3をヒトテロメラーゼRNA(human Telomerase RNA)のためにhTRと再命名した。
【０２３６】
（実施例１１）
（死滅細胞および不死化細胞におけるテロメラーゼRNA成分）
大部分のガン細胞は高レベルのテロメラーゼ活性を発現するが、大部分の正常な体細胞においては、テロメラーゼは検出されない(Kimら、(1994)前出)。テロメラーゼRNA成分レベルが、不死化ガン細胞株において高くなっているか否かを決定するために、テロメラーゼRNA成分およびGAPDH転写物レベルを５つの死滅初代細胞株(これは、検出可能なテロメラーゼ活性を有さない)および高レベルのテロメラーゼ活性を有する５つの不死化ガン細胞株においてRT-PCRを用いて分析した。定常状態のレベルのテロメラーゼRNA成分転写物は、GAPDHのレベルと比較した場合、初代細胞においてより、腫瘍細胞株において３倍〜12倍高かった(図2A)。テロメラーゼRNA成分レベルが高レベルのテロメラーゼを発現する不死化ガン細胞において増加したが、興味深いことに低いが、容易に検出可能なレベルのテロメラーゼRNA成分もまた死滅初代細胞(検出可能なテロメラーゼ活性を有さない)中に存在した(レーン１〜５)。
【０２３７】
テロメラーゼRNA成分レベルをまた、ノーザンブロット分析により種々の正常ヒト組織において検討した。精巣および卵巣は、最も高いレベルのテロメラーゼRNA成分を有していた。これらの組織が高レベルのテロメラーゼ活性を発現するので、このことは予期されていた。しかし、他の多くの組織もまた、テロメラーゼRNA成分を発現した(図2Bおよび2C)。これらは、正常腎臓、前立腺および成人肝臓を包含し、これらの全ては、検出可能なレベルのテロメラーゼ活性を有さなかった。これらの結果は、細胞株のデータ(図2A)を裏付け、そしてテロメラーゼRNAが、多くのヒト組織において存在するが、不活性であり得ることを示唆する。RNA発現における同様の組織特異的な差異がマウス組織において見られた。
【０２３８】
しかし、多くの正常なマウス組織は、テロメラーゼ活性について陽性である。ヒト細胞におけるテロメラーゼ活性の見かけ上上昇した抑制は、培養中にマウス細胞が自然に不死化する(ヒト細胞はそうはならない)理由を説明する助けとなり得る。
【０２３９】
（実施例１２）
（HeLa細胞におけるアンチセンスhTR(ヒトテロメラーゼRNA成分)転写物の発現は細胞危機(crisis)および細胞死を導く）
不死化細胞におけるテロメラーゼの機能を検討するために、アンチセンスhTR発現構築物をHeLa細胞中に導入した。１bp-193bpのヒトテロメラーゼRNA成分cDNAクローン、TRC3、を含有する200bp EcoRI DNAフラグメントをp10-3およびpBBS212のEcoRI部位中に挿入して、それぞれプラスミドp10-3-hTRおよびpBBBhTRを生じた。プラスミドp10-3-hTRは、記載されるように(Gossenら、(1992)Proc．Natl．Acad．Sci(USA)89：5547)、２つの異なる方向の上流の５つのTet-オペレーターに対応してテトラサイクリンで調節されるCMV最少プロモーターの転写制御下で、テロメラーゼRNA成分のアンチセンスを発現する。プラスミドpBBS-hTRは、MPSVプロモーターの制御下、hTRのアンチセンスを発現する(Linら、(1994)Gene 147：287)。平行して、アンチセンスhTRコード配列を有さないコントロール発現ベクターもまた、HeLa細胞中にエレクトロポレートした。アンチセンスまたはコントロールプラスミドを含有するクローンを、３つの別々の実験において選択した。最初、アンチセンスhTRを発現する41の培養物はコントロールベクターを有する細胞と同様に増殖した。しかし、トランスフェクション後23集団倍加レベル〜26集団倍加レベル(PDL)で41中33のアンチセンスを発現する培養物は危機を経験した(表１)。これらの培養物における細胞危機は、20PD〜26PDの細胞増殖における著しい阻害、及びそれに続く１週間にわたる丸まり(rounding up)およびプレートからの細胞の脱離により特徴づけられた。細胞が危機を経験した33中28のケースにおいて、希な(1%未満)復帰変異体コロニーが観察されたが、大部分の細胞はその後３週間以内に死滅した。復帰変異細胞は、アンチセンスhTR構築物の阻害効果を免れる変異体を示したのかもしれない。アンチセンスクローンとは対照的に、ベクターコントロール細胞株は、50倍加にかけて増殖または死滅における変化を全く有さなかった。
【０２４０】
（表１）
（アンチセンスhTRは比較的短い平均TRFおよび細胞危機を導く）
３つの独立した実験を行った。ここで、HeTe7細胞(高レベルのテトラサイクリンリプレッサーVP16キメラタンパク質を発現するHeLa細胞)をプラスミドp10-3-hTR(テトラサイクリン-VP16誘導性CMV最少プロモーターの制御下でアンチセンスhTRを発現する)、またはpBBS-hTR(MPSVプロモーター(54)の制御下でアンチセンスhTRを発現する)のいずれかを用いてエレクトロポレーションによりトランスフェクトした。［これらの実験において、テトラサイクリンによる調節は観測されなかった。p10-3-hTRを用いた実験は、代表的には、テトラサイクリンの非存在下で行った。なぜならテトラサイクリン-VP16-誘導性CMV最少プロモーターの制御下での、ルシフェラーゼまたはアンチセンスhTRを用いたコントロール実験は、テトラサイクリンの存在または非存在がHete7細胞におけるルシフェラーゼまたはアンチセンスhTR発現においてほとんど有効ではないことを実証したからである。実際、HeTe7細胞におけるアンチセンスhTR構築物を用いた初期の実験では、細胞は依然としてテトラサイクリンの存在下で23PDL〜26PDLにて危機を経験した。］。コントロールとして、HeTe7細胞をまた同じ条件下で親ベクターでトランスフェクトした。11〜18の安定なクローンが各トランスフェクション系列から単離された。全ての単離物由来のクローンは20PDLまで同一の形態および増殖プロフィールを示した。この時点で大部分のアンチセンス発現クローンの増殖は著しく遅くなった(p10-3-hTRおよびpBBS-hTR)。PDL23〜26までに、これらの細胞は危機を経験し、これは大きくかつ丸みを帯びた細胞の出現により特長づけられた。しかし、pBBS-hTRトランスフェクトHeTe7細胞から生じるクローンの全てが危機を経験したわけではない。アンチセンスhTRを発現する８つのクローンは、コントロール培養物と同様な増殖を継続した。全てのクローン由来の細胞をPDL23にて回収し、そして平均TRF長を決定した。P値を片側t-検定の方法により計算した。各系列について、危機を経験したクローンの割合を示す。
【０２４１】
【表１】
Figure 0004068861
テロメア長およびテロメラーゼ阻害が、アンチセンス発現クローンにおける細胞危機と相関するか否か決定するために、いくつかの前危機(precrisis)のコントロールおよび実験コロニーにおけるテロメア長およびテロメラーゼ活性を23PDLにおいてアッセイした。コントロールベクターを含有する全てのコロニーは、親細胞株(3.15kb)と同様の平均TRF長(3.22および3.27kb)を有し、一方、危機を経験したアンチセンスベクター構築物を含有するクローンは、2.39kbと2.72kbとの間の平均TRF長、すなわち、親株のものより17%〜26%短かい平均TRF長を有した(図３)。これらのデータは、テロメラーゼ活性の阻害によりアンチセンス含有クローンにおいてテロメア反復が損失されたことと一致している。このことを直接試験するために、テロメラーゼ活性を14のクローンにおいてアッセイした。テロメラーゼ活性は、多くのアンチセンスクローンにおいて一般に低いが検出可能であった。しかし短縮されたテロメアは、このレベルがテロメア長を維持するために十分ではないことを示唆している。なぜなら、平均TRFは3.22kbから2.39kbまで低下したからである(P=0.0008)。危機を経験しなかったアンチセンスベクター(pBBS-hTRb)を含有する８つのクローンにおいて、テロメア長は、有意に変化せず(3.03対3.33、P=0.355)、そしてテロメラーゼ活性はコントロールのものと同様であった。考えあわせると、これらの結果はテロメアが臨界長に達すると、テロメア損失が、危機および細胞死を引き起こすことの証拠となる。
【０２４２】
アンチセンステロメラーゼRNA成分を発現するHeLa細胞における細胞危機の誘導は、テロメラーゼ阻害がヒトガンに対する特異的、かつ効果的な治療法を提供し得ることの更なる支持を提供する。
【０２４３】
（実施例１３）
（インサイチュ増幅および検出）
（テロメラーゼRNAのインサイチュ検出）
（A. 蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH)）
細胞の混合集団または組織におけるテロメラーゼ陽性細胞の同定を、テロメラーゼのRNA成分に標的化した標識プローブのインサイチュハイブリダイゼーションにより行い得る。細胞サンプルの組織を顕微鏡用ガラススライドに固定し、そして十分透過化し、そしてインサイチュハイブリダイゼーションに使用した。ヒトテロメラーゼRNA(hTR)用のインサイチュハイブリダイゼーションの例は、予め70℃〜74℃まで２分〜３分加温した70%の脱イオン化ホルムアミド/2×SSC溶液中にスライドを浸すことにより核酸を変性させる工程をまず包含する。次いで、このスライドを氷冷した70%EtOH、次いで95%EtOH、次いで100%EtOH(各溶液中に４分)に移す。100ng〜200ng(１スライド当たり)の標識htRNAプローブ(ビオチン、ジゴキシゲニン、放射性同位体、蛍光タグを用いて標識した約500bpのDNAプローブ)を乾燥し、10μｌの100%脱イオン化ホルムアミド中に再懸濁させ、75℃にて８分間インキュベーションすることにより変性し、そして即座に氷上で冷却する。10μｌの２×ハイブリダイゼーション緩衝液(４×SSC；４×Denhardt’s溶液；
20%デキストランスルフェート；100mM Tris、pH7.5)を10μｌの再懸濁プローブに添加する。プローブ／ハイブリダイゼーション混合物(20μ1)を固定化サンプルに添加し、カバーグラスで覆い、そしてゴムセメントまたはマニキュアを用いてカバーグラスをシールした。サンプルを37℃にて８時間〜48時間インキュベーションする。ハイブリダイゼーション後、カバーグラスを取り除き、サンプルを37℃にて2×SSC/50%脱イオン化ホルムアミド中で２回洗浄し、次いで37℃にて２×SSC中で２回洗浄する(１洗浄当たり５分間)。次いで、サンプルを顕微鏡で観察する。
【０２４４】
（B.プライムインサイチュ標識(Primed in situ labeling)(PRINS)）
伝統的なインサイチュハイブリダイゼーション検出法に対する他の改変は、プライムインサイチュ標識(PRINS)である。PRINSによるhTRの検出は、逆転写酵素(RT)によるhTRの最初のcDNA合成、及びそれに続くhTR特異的オリゴヌクレオチドプローブおよび標識ヌクレオチドを取り込む鎖伸長を用いるPRINS検出を包含する。hTRのRT反応は、種々の方法により行い得る。RT反応の１つの例は、GeneAmp Thermostable rTth Reverse Transcriptase RNA PCRキット(Perkin Elmer)を用いることによるものである。この方法において、10μｌのRT混合物(10mM Tris-HCl pH8.3；90mM KCl；１mM MnCl2；200μM dNTP；2.5U rTth DNAポリメラーゼ；
0.4μMリターンプライマー(return primer)［例えば、R7G：5’-GGAGGGGCGAACGGGCCAGCAG-3’］)を固定化され、そして透過化されたサンプル上に配置し、カバーグラスでシールし、マニキュアでアンカーし、鉱油で重層し、そして70℃にて30分間インキュベーションする。その後、鉱油をキシレン中で５分間、次いで100%EtOH中で５分間洗浄することによって除去する。カバーグラスを取り外し、DepC水、次いで100%EtOHで手短に洗浄し、そして５分間風乾する。次いで10μｌのPRINS混合物(5%(v/v)グリセロール；10mM Tris-HCl、pH.3；100mM KCl；0.05%(w/v)Tween20；0.75mM EGTA；2.5mM MgCl2；0.4μM正方向プライマー［例えば、U3b：5’-GCCTGGGAGGGGTGGTGGCTATTTTTTG-3’］；200μM dA、dG、dCTP；110μM dTTP；90μM標識dUTP)をサンプル上に配置する。カバーグラスでシールし、マニキュアでアンカーし、鉱油で重層し、そして70℃にて30分間〜３時間インキュベーションする。次いでサンプルを70℃まで加熱した洗浄緩衝液(４×SSC；0.05%Tween20)中で２分間３回洗浄する。次いでシグナルを観測する。
【０２４５】
（C.インサイチュRT-PCR）
hTRのRT-PCR検出は、逆転写酵素反応(ウイルス逆転写酵素、または熱安定性DNAポリメラーゼの内因性RT活性による)による標的RNAのcDNA合成、及びそれに続く標的cDNAのインサイチュPCR増幅を包含する。種々のRT反応は、第11.B節において論じられるRTプロトコルを包含するhTRのcDNA合成において使用され得る。
【０２４６】
さらに、PRINS検出法において使用される同一の緩衝液条件およびプライマーはまたRT-PCR用に使用され得るが、70℃にて30分間〜３時間最終インキュベーションの代わりに、サンプルをサイマルサイクラー中で30サイクル〜40サイクルの94℃/40秒、55℃/90秒(第11.B節を参照のこと)増幅する。PCRの後、サンプルを70℃まで加熱した洗浄緩衝液(４×SSC；0.05%Tween20)中で２分間３回洗浄する。
【０２４７】
次いでシグナルを観測する。
【０２４８】
別の改変は、GeneAmpインサイチュPCRシステム1000およびGeneAmpインサイチュPCRコアキット(Perkin Elmer)を用いることにより最初のRT反応から生じたcDNAを増幅することである。
【０２４９】
固定化され、かつ透過化されたサンプル上の１工程インサイチュRT-PCRを、GeneAmpインサイチュPCRシステム1000(Perkin Elmer)と組み合わせてGeneAmpEZ rTth RNA PCRプロトコルを用いて行い得る。この方法は、40μｌ〜50μｌのEZRNAPCR緩衝液混合物(50mM Bicine；115mM酢酸カリウム；8%(w/v)グリセロール、pH8.2；300μM dA、dG、dCTP；165μM dTTP；135μM標識dUTP；5U〜10UのrTth DNAポリメラーゼ；2.5mM Mn(OAc)2；0.45μM〜１μMのhtRNA-特異的プライマー(例えば、R7およびU3b))を、顕微鏡用スライド上の固定化され、かつ透過化されたサンプル上に配置する工程、および製造業者のプロトコル(GeneAmpインサイチュPCRシステム1000、Perkin Elmer)に従って、シリコーンガスケットおよびクリップを用いてそれをシールする工程を包含する。次いで、このサンプルをGeneAmpインサイチュPCR機器中に配置し、そして94℃にて120秒間加熱し、次いで30サイクル〜40サイクルの94℃/45秒、および60℃/45秒で増幅する。増幅後、サンプルを洗浄し、そして上記で論じたように視覚化する。
【０２５０】
PCR増幅時に蛍光タグを直接取り込むことから生じ得るバックグラウンドシグナルを減少させるために、間接検出(これは、非タグ化dNTPを用いたPCR増幅、及びそれに続く増幅産物に特異的なタグ化ハイブリダイゼーションプローブを利用するインサイチュハイブリダイゼーションを包含する)が使用され得る。この方法において、シグナルを標識化dNTPまたはプライマーなしで上記任意のRT-PCR法により増幅し、そして増幅産物を、インサイチュハイブリダイゼーションにより検出する。
【０２５１】
（D．インサイチュPCRへの産物伸長プライマーの適用）
インサイチュPCRの成功は、細胞外への細胞マトリックス内の増幅産物の漏れを防ぐことに依存する。従って、500bpより小さいPCR産物は、インサイチュPCRにとって望ましくはないことが一般的には真実である。細胞マトリックスからの500bpより小さいPCR産物の漏れを防ぐために、「かさ高い(bulky)」dNTP(例えば、ビオチン、蛍光タグ、ジゴキシゲニン標識dUTP)のPCR産物への取り込みが通常用いられる。インサイチュPCRにおける小さい産物の漏れを防ぐ他の方法は、インサイチュPCRプロトコル中に産物伸長プライマーを組み込むことである。
【０２５２】
この方法は、5’末端にて３〜４の６ｂｐ反復配列(例えば、［5’-TTTCCC-3’］3-4］、及びそれに続く標的物に特異的な配列を含むプライマー(図４、プライマー１)を、適切なリターンプライマー(プライマー２)、および反復配列のみからなる第３のプライマー(プライマー３、例えば［5’-TTTCCC-3’］4)と組み合わせて、インサイチュPCRにおいて特異的な標的を増幅する工程を包含する。プライマー３の存在は、プライマー３の標的PCR産物の3’末端へのぐらついた結合(staggered-binding)に起因してPCR産物を伸長する。PCR産物の伸長は、最初のPCR条件のアニーリング温度を低下させることにより誘導され得る。
【０２５３】
例えば、プライマー１における標的配列のアニーリング温度が60℃であれば、サンプルは、15サイクル〜20サイクルの94℃/45℃および60℃/45℃でまず増幅され、次いで15サイクル〜20サイクルの94℃/45℃および50℃/45℃で増幅される。
【０２５４】
第２のPCR工程におけるアニーリング温度の低下は、プライマー３の反復配列へのぐらついた結合の機会を増やすことにより伸長したPCR産物の生成を助ける。
【０２５５】
得られた伸長PCR産物は、細胞マトリックスからの漏れがより少ない傾向になり、これによりインサイチュPCR分析におけるシグナル保持がより良好となる。
【０２５６】
（実施例１４）
（非ヒト霊長類テロメラーゼRNA成分）
他の哺乳動物のテロメラーゼRNA成分配列がヒトRNA成分の配列に基づくプライマーを用いて得られ得ることを示すために、ヒト配列PCRプライマーを使用して、リスザル（ヒトと比較して最も進化的に分岐した非ヒト霊長類の種の１つと考えられている種）のゲノムDNAからのテロメラーゼRNA成分配列を増幅した。
【０２５７】
記載のように、リスザルゲノムDNAをプライマーF3b(5’-TCTAACCCTAACTGAGAAGGGCGTAG-3’)およびH3＋20(5’-CTCAAGGTCATCGCCAAGGT-3’)を用いて増幅した。単一のDNAバンドを観測し、そして次いでベクターpBluescriptII SK(Stratagene、San Diego、CA)中にクローン化した。得られたクローンを逆方向ユニバーサルプライマー(5’-AACAGCTATGACCATG-3’)、プライマー210-3’(5’-TCACGTCTCCTGCCAATTTGC-3’)、またはプライマーH3＋20を用いるPCR法を用いて部分的に配列決定した。
【０２５８】
このリスザルテロメラーゼRNA成分の得られた部分配列は以下の通りである：
【０２５９】
【化１４】
Figure 0004068861
ヒトテロメラーゼRNA成分遺伝子配列に並べた場合、以下のアラインメントが得られた。ここで、ヒトテロメラーゼRNA成分遺伝子の番号付け慣習を使用している(ハイフンは、配列アラインメントを最適化するために導入したギャップを示す)：
【０２６０】
【化１５】
Figure 0004068861
先の実施例は、本発明の種々の局面、および本発明の特定の核酸がどのように作製されるのかを記載する。実施例は、以下の請求の範囲により包含される本発明の多くの異なる実施態様の完全な記載を提供することを意図しない。
【０２６１】
【発明の効果】
テロメラーゼ媒介治療ならびにテロメラーゼのアッセイならびにスクリーニング方法についての重要な改良および新たな機会は、テロメラーゼのRNA成分を含有する核酸および/またはタンパク質成分をコードする核酸が純粋なまたは単離可能な形態で入手可能であり、このような核酸のヌクレオチド配列が知られている場合に、実現され得た。本発明はこれらのおよび他の要求に応え、このような改良および機会を提供する。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、鋳型-変異TRC3を発現する細胞からのテロメラーゼ活性。変異TRC3を発現する安定な形質転換体からのDEAEセファロース分画抽出物を、テロメラーゼ活性について、種々の反応条件下で、一般的なアッセイを用いてアッセイした。MuC＋17 TRC3（レーン1,4,7,10,13,16 C*で標識されている）、MuC TRC-3（レーン2,5,8,11,14,17 Cで標識されている）、またはMuA TRC3（レーン3,6,9,12,15,18 Aで標識されている）を発現している細胞からの抽出物を、通常の反応条件（レーン1-6）、通常＋0.5mM ddCTP（レーン7-9）、通常−dTTP＋0.5mM ddTTP（レーン10-12）、または、通常−dATP＋0.5mM ddATP（レーン13-18）でアッセイした。レーン1-9のアッセイ反応液は、８μMの総dGTPを含んでいたが、その１μMは、32P-dGTP(800Ci/mmol)であった。変異体テロメラーゼの検出を容易にするために、レーン10-18のアッセイ反応液は、８μMの総dGTPを含んでいたが、その２μMは、32P-dGTP(800Ci/mmol)であった。抽出物をDNaseを含まないRNaseで処理(25μg/ml、10分間、30℃)して、テロメアーゼをアッセイした（レーン1-3、16-18）。これらの両側のレーンは、図に示すヌクレオチド(nt)の図に示すサイズを有するDNAマーカーを含んでいる。
【図２】図２は、テロメラーゼのRNA成分(hTR)およびGAPDHを示す結果である。 RNAの定常状態レベルを、定量的RT-PCRを用いて測定した。コントロールは、すべてのPCR定量が25サイクルまで直線の範囲であったことを示す。５つの正常テロメラーゼ陰性細胞株(1〜5)、および５つの腫瘍テロメラーゼ陽性細胞株(6〜10)について、RT-PCRを分析した：1)初期胎児肺；2)初期胎児手の皮膚；3)成人一次前立腺；4)原発性sinovial繊維芽細胞；5)包皮繊維芽細胞；6)メラノーマLOX；7)白血病U251；8)NCIH23肺ガン；9)結腸腫瘍SW620；10)乳腫瘍MCF7。PCR産物を32Pで標識し、6%PAGEで分離し、Phosphorlmagerを用いて定量した。相対的な転写を任意の単位で表す。
【図３】図３は、テロメラーゼのRNA成分のアンチセンス細胞およびベクターコントロール細胞の平均TRFの長さを示す結果である。 10-3-hTRアンチセンスまたはベクターコントロールを安定に発現するHeTe7細胞をハイグロマイシンおよびピュロマイシン培地で選択し、トランスフェクション後、23PDLで回収した。核DNAを精製し、HinfIおよびRsaIで切断し、そして0.5%アガロースゲルで泳動した。DNAをゲル中で(TTAGGG)3オリゴヌクレオチドでプローブし、テロメアの末端制限フラグメント(TRF)を標識した。ゲルをMolecular DynamicのPhosphorImagerでスキャンし、平均TRFをAllsoppら、(1992)Proc．Natl．Acad．Sci．(USA) 89:10114に記載のように定量した。破線は、アンチセンスおよびコントロール群に対するTRFの平均を示す。
【図４】図４は、インサイチュPCR方法の模式図である。

Claims (21)

  1. 哺乳動物テロメラーゼタンパク質成分と会合して、酵素学的に活性なテロメラーゼホロ酵素を形成し得る、実質的に純粋なリボ核酸であって、
    （ａ）プラスミドｐＧＲＮ３３（ＡＴＣＣ ７５９２６）の約２．５ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ挿入片のコード領域によってコードされる配列
    （ｂ）ストリンジェントな条件下で該（ａ）の配列とハイブリダイズする配列、または
    （ｃ）１または数個のヌクレオチドの置換、付加もしくは欠失によって、（ａ）もしくは（ｂ）から誘導された配列
    を含む、リボ核酸。
  2. 請求項１に記載のリボ核酸であって、前記配列が、
    （ａ）
    Figure 0004068861
     （ｂ）ストリンジェントな条件下で該（ａ）の配列とハイブリダイズする配列、または
    （ｃ）１または数個のヌクレオチドの置換、付加もしくは欠失によって、（ａ）もしくは（ｂ）から誘導された配列
    である、リボ核酸。
  3. ヒトテロメラーゼのＲＮＡ成分である、請求項１または２に記載のリボ核酸。
  4. 請求項１〜３のいずれかに記載のリボ核酸であって、配列
    Figure 0004068861
    を含む、リボ核酸。
  5. 請求項１〜４のいずれかに記載のリボ核酸をコードする、単離された核酸分子。
  6. 請求項１〜４のいずれかに記載のリボ核酸をコードするヌクレオチド配列を含む、組換えプラスミド。
  7. 請求項６に記載のプラスミドで形質転換された宿主細胞。
  8. オリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドの配列は、以下：
    （１） 5 ’ -CTCAGTTAGGGTTAGACAAA-3 ’または、
    （２）上記（１）の少なくとも１０個の連続する核酸からなる（１）のフラグメント、
    からなり、ここで、該オリゴヌクレオチドは、哺乳動物のテロメラーゼ酵素活性を阻害する、オリゴヌクレオチド。
  9. Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ホスホロチオエートヌクレオチドまたはメチルホスホネートヌクレオチドのような改変されたヌクレオチドアナログを含む、請求項８に記載のオリゴヌクレオチド。
  10. インビトロにおいて細胞中のテロメラーゼ活性を阻害する方法であって、該細胞を請求項８または９のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドと接触する工程を包含する、方法。
  11. 請求項１〜４のいずれかに記載のリボ核酸の１７個より大きい連続するヌクレオチドと同一な配列または相補的な配列、あるいはこれら配列の相補物を含む、単離された、組換えの、または合成された、核酸であって、ここで該核酸は、以下、
    ａ）哺乳動物のサンプル中のテロメラーゼＲＮＡまたはテロメラーゼＲＮＡコード配列と特異的にハイブリダイズする、１７個より大きい連続するヌクレオチドのヌクレオチドプローブであって、必要に応じて検出可能な標識を含む、ヌクレオチドプローブ；あるいは、
    ｂ）哺乳動物のサンプル中のテロメラーゼＲＮＡまたはテロメラーゼＲＮＡコード配列の特異的増幅反応を開始し得る、少なくとも１７個の連続するヌクレオチドのヌクレオチドプライマー、
    から選択される、核酸。
  12. 請求項１１に記載の核酸であって、ここで、前記核酸は、請求項１〜４のいずれかに記載のリボ核酸の少なくとも２０個の連続するヌクレオチドと同一な配列または相補的な配列、あるいはこれら配列の相補物を含む、核酸。
  13. 請求項１〜４のいずれかに記載のリボ核酸の１７個より大きい連続するヌクレオチドと同一な配列または相補的な配列あるいはこれら配列の相補物を含むオリゴヌクレオチドの：
    ａ）哺乳動物のサンプル中のテロメラーゼＲＮＡまたはテロメラーゼＲＮＡコード配列に特異的な、１７個より大きい連続するヌクレオチドのヌクレオチドプローブであって、必要に応じて検出可能な標識を含む、ヌクレオチドプローブ；あるいは、
    ｂ）テロメラーゼＲＮＡまたはテロメラーゼＲＮＡコード配列の特異的増幅反応を開始し得る、少なくとも１７個の連続するヌクレオチドのヌクレオチドプライマー、
    としての使用。
  14. 請求項１３に記載の使用であって、ここで該オリゴヌクレオチドは、請求項１〜４のいずれかに記載のリボ核酸の少なくとも２０個の連続するヌクレオチドと同一な配列または相補的な配列あるいはこれら配列の相補物を含む、使用。
  15. 哺乳動物のサンプル中のテロメラーゼＲＮＡ成分のレベル、量、または存在を決定するための方法であって、該方法は、以下の工程：
    ａ）該サンプルを、請求項１１または１２に記載のオリゴヌクレオチドプローブと、該オリゴヌクレオチドが該サンプル中のテロメラーゼＲＮＡと特異的にハイブリダイズする条件下で組み合わせる工程、および、結果として形成される任意のハイブリッドを検出する工程；あるいは
    ｂ）該サンプルを、請求項１１または１２に記載のオリゴヌクレオチドプライマーと組み合わせる工程、増幅反応を行う工程、および結果として形成される任意の増幅産物を検出する工程、
    を包含する、方法。
  16. 請求項１５に記載の方法であって、さらに、前記ハイブリッドまたは増幅産物を定量して、前記サンプル中のテロメラーゼＲＮＡ成分の濃度を決定する工程を包含する、方法。
  17. サンプル中の癌細胞の存在を検出する方法であって、以下の工程、
    請求項１５または１６に従って、該サンプル中のテロメラーゼＲＮＡ成分のレベルを決定する工程、および、
    テロメラーゼＲＮＡ成分の病原性レベルの存在を、癌細胞の存在と相関させる工程、
    を包含する方法。
  18. サンプル中のヒトテロメラーゼＲＮＡ成分のレベル、量、または存在を決定するためのキットであって、該キットは、請求項１１または１２に記載のオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーを含み、そして、該キットは、必要に応じて一組の指示書を含む、キット。
  19. テロメラーゼホロ酵素を単離する方法であって、以下の工程、
    請求項１〜４のいずれかに記載のリボ核酸と相補的なオリゴヌクレオチドの１０個より大きい連続するヌクレオチドを含むアフィニティー因子を使用して、該ホロ酵素タンパク質を捕捉する工程、および
    次に、該アフィニティー因子から、該タンパク質を回収する工程、
    を包含する、方法。
  20. 請求項１９に記載の方法であって、ここで、前記アフィニティー因子は、固相支持体に結合されているか、または、固相支持体へのその後の固定化のために化学的に修飾されている、方法。
  21. 非ヒト哺乳動物種のテロメラーゼＲＮＡ成分を同定するための方法であって、該種の組織からの核酸を、請求項１１に記載のオリゴヌクレオチドプライマーと接触する工程を包含する、方法。
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