KR100530483B1 - 인간의 텔로머라제 촉매성 서브유닛 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인간의 텔로머라제 촉매성 단백질 서브유닛인 인간의 텔로머라제 역전사효소(hTRT)와 관련된 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드와 폴리펩티드는 인간 질병을 확인, 예후 및 치료하는 용도, 세포와 유기체의 증식능을 변화시키는 용도 및 암과 같은 질병을 치료하는데 유용한 화합물과 치료제를 식별하고 선별하는 용도로 유용하다.

Description

인간의 텔로머라제 촉매성 서브유닛{HUMAN TELOMERASE CATALYTIC SUBUNIT}
본 발명은 텔로머라제의 촉매성 서브유닛을 암호하는 신규 핵산 및 이와 관련된 폴리펩티드에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 인간 텔로머라제의 촉매성 서브유닛에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 의약, 분자생물학, 화학, 약리학 및 의약적 진단법과 예후법에 연관된 방법 및 조성물에 관한 것이다.
이하, 본 발명의 분야에 관해 설명하겠다.
진핵세포의 염색체 중 말단의 완전 복제에는 특정 세포 성분이 필요하다고 예전부터 알려져 있다[Watson, 1972, Nature New Biol., 239:197; Olovnikov, 1973, J.Theor.Biol., 41:181]. 종래의 DNA 폴리머라제를 이용하여 선형 DNA 가닥을 복제하는 경우에는 RNA 프라이머가 필요하며, 단지 5'에서 3' 쪽으로만 복제를 진행시킬 수 있다. 따라서, 진핵 세포의 염색체 DNA 가닥 중 5' 극말단에 결합된 RNA를 제거하면 갭이 생겨, 각 복제 횟수 마다 딸(daughter) 가닥은 점차 단축된다. 이와 같은 염색체 말단에 물리적으로 위치된 단백질-DNA 구조인 말단소립의 단축은 시험관내 및 생체내 정상인 체세포의 세포 노쇠 또는 노화 현상을 설명하는 것으로 생각되고 있다[예컨대, Goldstein, 1990, Science 249:1129; Martin et al., 1979, Lab.Invest.23:86; Goldstein et al., 1969, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 64:155; 및 Schneider and Mitsui, 1976, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,73:3584 참조].
이와 같이, 말단소립의 길이와 완전성은 세포가 노쇠 단계(즉, 증식능 상실)로 진행되는데 관여한다. 따라서, 세포가 말단소립의 길이를 유지(또는 증가)하는 능력을 얻을 수 있다면 세포의 노쇠를 방지할 수 있고, 즉 세포를 무한증식시킬 수 있게 된다.
말단소립과 말단소립 DNA의 구조는 많은 시스템을 통해 연구되어 있다[예컨대, Harley and Villeponteau, 1995, Curr.Opin.Genet.Dev. 5:249 참조]. 대부분의 유기체 중에 존재하는 말단소립 DNA는 매우 단순한 서열의 직렬 배열을 포함하고, 인간과 다른 척추 동물에 존재하는 말단소립 DNA는 서열 TTAGGG의 직렬 반복체를 수백개 내지 수천개 포함한다. 세포 중에 존재하는 말단소립의 길이를 측정하고 조절하는 방법은 PCT 공개 번호 WO 93/23572 및 WO 96/41016에 기재되어 있다.
말단소립의 유지는 텔로머라제라고 부르는 말단소립 특이적인 DNA 폴리머라제의 기능에 의해 이루어진다. 텔로머라제는 말단소립 반복체의 DNA 합성시 주형으로서 자신의 RNA부 중 일부를 이용하는 리보뉴클레오단백질(RNP)이다[Morin, 1997, Eur.J.Cancer 33:750; Yu et al., 1990, Nature 344:126; Singer and Gottschling, 1994, Science 266:404; Autexier and Greider, 1994, Genes Develop., 8:563; Gilley et al., 1995, Genes Develop., 9:2214; McEachern and Blackburn, 1995, Nature 367:403; Blackburn, 1992, Ann.Rev.Biochem.,61:113; Greider, 1996, Ann. Rev. Biochem., 65:337]. 인간의 텔로머라제와 기타 다른 텔로머라제의 RNA 성분은 이미 클로닝되어 특성규명되었다[PCT 공개 번호 WO 96/01835 및 Feng et al., 1995, Science 269:1236]. 하지만, 텔로머라제의 단백질 성분을 특성 규명하기는 어려웠다. 그 이유는 부분적으로 텔로머라제 RNP가 발현되는 세포에서 그 농도가 극히 소량으로 존재하기 때문이다. 예컨대, 텔로머라제 활성이 높은 수준인 것으로 알려진 인간 세포조차도 세포당 효소 분자가 단지 약 1백개 수준인 것으로 추정되고 있다.
세포의 증식능(즉, 세포가 무한 분열하는 성질)에 대한 말단소립과 텔로머라제의 관계와 일관되는 현상으로, 텔로머라제의 활성은 무한증식 세포주와 이상 분열성 종양 조직 군에서는 검출되지만, 종양에 인접한 정상 체세포 배양물이나 정상 조직에서는 검출되지 않는다(즉, 완전 존재하지 않거나 분석 범위 이하임)[미국 특허 제5,629,154호; 제5,489,508호; 제5,648,215호 및 제5,639,613호 참조, 문헌(Morin, 1989, Cell 59:521; Shay and Bacchetti 1997, Eur.J.Cancer 33:787; Kim et al., 1994, Science 266:2011; Counter et al., 1992, EMBO J. 11:1921; Counter et al., 1994, Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.91, 2900; Counter et al., 1994, J.Virol.68:3410) 참조]. 더욱이, 종양 중의 텔로머라제 활성의 정도와 그 결과 나타날 가능성이 있는 환자의 임상적 증상 간의 상호 관계에 대해서도 보고되어 있다[예컨대, 미국 특허 제5,639,613호, 상기 문헌 참조; Langford et al., 1997, Hum.Pathol. 28:416]. 또한, 텔로머라제 활성은 인간 배아 세포, 증식성 간(stem) 세포 또는 선조 세포, 및 활성화된 림프구에서 검출된 바 있다. 하지만, 체성 간 세포 또는 선조 세포와 활성화된 림프구에서 나타나는 텔로머라제 활성은 일반적으로 극소량이거나 단지 일시 발현된다[Chiu et al., 1996, Stem Cells 14:239; Bodnar et al., 1996, Exp.Cell Res.228:58; Taylor et al., 1996, J.Invest.Dermatology 106:759].
인간의 텔로머라제는 암과 같이 세포 증식 및 노쇠와 관련된 인간의 질환을 진단 및 치료하는데 사용할 수 있는 이상적인 표적이다. 인간의 암과 기타 텔로머라제 관련 질환을 진단하고 치료하는 방법은 미국 특허 제5,489,508호, 제5,639,613호 및 제5,645,986호에 기재되어 있다. 종양의 진행을 텔로머라제의 모니터로 예측하는 방법은 미국 특허 제5,639,613호에 개시되어 있다. 따라서, 인간의 텔로머라제 중 촉매성 단백질 서브유닛에 대한 발견과 그 특성 규명을 통해 다른 유용한 텔로머라제를 분석하고, 질병을 진단 및 치료하는 방법을 제공할 수 있을 것이다. 또한, 촉매성 단백질 서브유닛 중 주요 서열을 클로닝하여 서열 분석하면 세포 증식능과 노쇠에 관련된 인간의 암과 기타 다른 질병을 보다 효과적으로 치료할 수 있는 치료법을 제공할 수 있을 것이다.
본 발명은 제1 양태로서, 텔로머라제 역 전사효소 단백질을 분리하거나, 실질적으로 정제하거나 또는 재조합한 단백질 제조물, 이의 변형체 또는 이의 단편을 제공한다. 이것의 구체적인 1가지 예로서, 상기 단백질은 아미노산 서열 Trp-R1 -X7 -R1 -R1 -R2 -X-Phe-Phe-Tyr-X-Thr-Glu-X8-9 -R3 -R3 -Arg-R4 -X2 -Trp로 표시되는 소정의 모티프를 가진 것을 특징으로 하며, 이 서열 중, X는 임의의 아미노산이며, 아랫첨자는 연속 잔기 수를 나타내고, R1 은 로이신 또는 이소로이신이고, R2 는 글루타민 또는 아르기닌이며, R3 은 페닐알라닌 또는 티로신이고, R4 는 리신 또는 히스티딘이다. 또 다른 1가지 구체예로서, 이 단백질은 인간의 TRT 서열을 갖는 것이다. 다른 구체예로서, 본 발명은 상기 단백질들의 준서열과 실질적인 서열 동일성을 공유하는 펩티드 및 폴리펩티드를 제공한다.
이와 관련된 구체예로서, 본 발명은 텔로머라제 역전사효소 단백질을 암호하는, 분리되거나 실질적으로 정제되거나 또는 재조합된 핵산을 제공한다. 1가지 구체예로서, 이 핵산은 아미노산 서열 Trp-R1 -X7 -R1 -R1 -R2 -X-Phe-Phe-Tyr-X-Thr-Glu-X8-9 -R3 -R3 -Arg-R4 -X2 -Trp을 포함하는 단백질을 암호하는 것이다. 다른 구체예는, 상기 핵산이 인간의 TRT 단백질을 암호하는 서열을 갖는 것이다. 또 다른 구체예로서, 본 발명은 상기 핵산의 준서열과 실질적인 서열 동일성이나 상보성을 공유하는 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
제2 양태로서, 본 발명은 인간의 텔로머라제 역전사효소(hTRT) 단백질에 관한 것이다. 즉, 이것의 구체예로서 본 발명은 분리되거나 실질적으로 정제되거나 또는 재조합된 hTRT 단백질의 제조물, 이의 변형체 또는 이의 단편을 제공한다. 다른 구체예는 이 단백질이 도 17(서열 번호 2)에 기재된 hTRT 단백질과 최소 약 75또는 최소 약 80의 서열 동일성을 보유하는 아미노산 서열을 가진 것이거나, 이의 변형체이거나 또는 이의 단편인 것을 특징으로 한다. 이와 관련된 구체예로서 hTRT 단백질은 서열 번호 2에 기재된 서열을 갖고 있음을 특징으로 한다. 다른 구체예로 서, 이 단백질은 1가지 이상의 텔로머라제 활성, 예컨대 촉매 활성을 나타낸다. 1가지 구체예로서 hTRT 단백질의 단편은 최소 6개의 아미노산 잔기를 갖고 있는 것을 특징으로 한다. 다른 구체예로서, hTRT 단백질의 단편은 천연 hTRT 폴리펩티드의 근접 아미노산 잔기 중 최소 8개, 최소 약 10개, 최소 약 12개, 최소 약 15개 또는 최소 약 20개의 잔기를 갖는 것을 특징으로 한다. 또 다른 구체예로서, hTRT 단백질 단편은 최소 약 50개 또는 최소 약 100개의 아미노산 잔기를 보유하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 hTRT 단백질과 RNA를 포함하는 조성물을 제공한다. 이 RNA는 텔로머라제 RNA, 예컨대 인간의 텔로머라제 RNA일 수 있다. 1가지 구체예로서, 텔로머라제 활성을 가진 리보뉴클레오단백질 복합체 유래의 hTRT 단백질과 인간의 텔로머라제 RNA(hTR)를 제공한다.
제3 양태로서, 본 발명은 hTRT 단백질을 포함하는 분리된 인간 텔로머라제, 예컨대 hTRT 단백질과 hTR을 포함하는 실질적으로 순수한 인간 텔로머라제를 제공한다. 이것의 1가지 구체예로서, 상기 텔로머라제는 최소 약 95정제된 것이다. 상기 텔로머라제는 세포, 예컨대 텔로머라제 활성을 발현하는 세포 또는 재조합 숙주 세포에서 분리할 수 있다.
제4 양태로서, 본 발명은 hTRT 단백질을 암호하는 핵산 서열을 포함하고 있는 분리되거나, 합성되거나, 실질적으로 정제되거나 또는 재조합된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 이것의 1가지 구체예로서, 상기 폴리뉴클레오티드는 도 17(서열 번호 2)에 기재된 아미노산 서열이나 이 아미노산 서열 중에 1개 이상의 보존적 아미 노산(또는 코돈) 치환이나 1개 이상의 활성 변이성 아미노산(또는 코돈) 치환을 포함하는 서열을 가진 hTRT 단백질을 암호하는 뉴클레오티드 서열을 보유한다. 이와 관련된 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 도 16에 기재된 서열(서열 번호 1)을 가진 폴리뉴클레오티드와 엄중 조건 하에서 하이브리드하는 것이다. 또 다른 관련 구체예로서, 디폴트 변수를 이용한 BLAST 알고리듬으로 도 16에 기재된 뉴클레오티드 서열(서열 번호 1)과 비교한 경우 최소 총 확률이 약 0.5 보다 적은 상기 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 제공한다.
다른 양태로, 본 발명은 hTRT 단백질을 암호하는 서열에 작동 가능하게 결합된 프로모터 서열을 보유한 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 이 프로모터는 천연 발생의 hTRT 프로모터 이외의 다른 프로모터일 수 있다. 이것의 관련 양태로, 본 발명은 hTRT 프로모터를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
제5 양태로서, 본 발명은 길이가 10개 이상이고, 천연 hTRT 유전자 또는 hTRT mRNA 중의 인접 서열과 동일하거나 정확하게 상보적인 인접 서열로 최소 10개의 뉴클레오티드를 포함하는 것이 특징인, 분리되거나, 합성되거나, 실질적으로 정제되거나 또는 재조합된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 이것의 일부 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 RNA 또는 DNA이거나, 1개 이상의 비천연적인 합성 뉴클레오티드를 포함하는 것이다. 1가지 구체예로서 상기 폴리뉴클레오티드는 천연 hTRT 유전자 또는 hTRT mRNA에 존재하는 최소 10개의 인접 뉴클레오티드인 인접 서열과 동일하거나 정확하게 상보적인 것을 제공한다. 예컨대, 상기 폴리뉴클레오티드는 안티센스 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 다른 구체예로서, 안티센스 폴리뉴클레오티 드는 최소 약 20개의 뉴클레오티드를 포함한다.
제6 양태로서, 본 발명은 재조합 hTRT 단백질과 텔로머라제 RNA 성분이 회합하여 텔로머라제 기질에 뉴클레오티드를 첨가하는 것을 촉매할 수 있는 텔로머라제 효소를 형성하는 조건하에서 상기 재조합 단백질과 상기 텔로머라제 RNA 성분을 접촉시켜 재조합 텔로머라제를 제조하는 방법을 제공한다. 1가지 구체예로서, hTRT 단백질은 도 17에 기재된 서열(서열 번호 2)을 갖는 것이다. 상기 hTRT 단백질은 시험관내 발현계에서 생성한 후 텔로머라제 RNA와 혼합될 수 있고, 또는 다른 구체예로서 시험관내 발현계에서 텔로머라제 RNA를 동시발현시킬 수도 있다. 또 다른 구체예에서, 텔로머라제 RNA는 hTR이다. 또 다른 구체예로서, 접촉 반응은 세포, 예컨대 인간 세포 중에서 실시할 수 있다. 1가지 구체예에서, 세포는 hTRT와 RNA를 접촉시키거나 또는 형질감염 등을 통해 hTRT 폴리뉴클레오티드를 도입시키기 전에는 텔로머라제 활성을 나타내지 않는다. 다른 구체예로서, 상기 텔로머라제 RNA는 상기 세포에 의해 천연적으로 발현되는 것을 특징으로 한다.
제7 양태로서, 본 발명은 프로모터에 작동가능하게 결합된 hTRT 단백질 암호 서열을 가진 폴리뉴클레오티드와 같은 본 발명의 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 인간, 마우스 또는 효소 세포와 같은 세포를 제공한다. 구체예로서, 세포는 척추동물 세포, 예컨대 인간과 같은 포유 동물 유래의 세포이며, 이 세포와 동일하지만 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않는 세포에 비해 증식능이 증가된 세포이거나 또는 세포와 동일하지만 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않는 세포에 비해 텔로머라제 활성 정도가 증가된 세포를 제공한다. 다른 구체예로서, 세포가 무한증식성인 것을 제공한다.
이와 관련된 구체예로서, 본 발명은 인간의 텔로머라제 역전사효소의 폴리펩티드를 암호하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유기체 및 세포, 예컨대 효모, 식물, 박테리아와 같은 인간을 제외한 돌연변이 유기체 또는 마우스와 같은 인간을 제외한 동물을 제공한다. 또한, 본 발명은 hTRT 유전자가 천연의 hTRT 유전자 생성물을 발현하지 않도록 hTRT 유전자가 결실(녹아웃) 또는 변이된 돌연변이 동물 및 세포를 제공한다. 따라서, 또 다른 구체예로서 인간을 제외한 돌연변이 동물은 변이된 텔로머라제 유전자를 보유하고, 텔로머라제 활성이 결손된 동물이며, 야생형 TRT에 비하여 감소된 텔로머라제 활성도를 나타내는 TRT를 암호하는 돌연변이 유전자로 인하여 TRT 결손을 나타내는 동물이고, 미스센스 돌연변이, 논센스 돌연변이, 삽입 또는 결실을 비롯한 1가지 이상의 돌연변이를 가진 변이된 TRT 유전자를 보유하는 동물이다.
또한, 본 발명은 hTRT 단백질에 특이적으로 결합하는 분리되거나 재조합된 항체 또는 이의 단편을 제공한다. 1가지 구체예로서, 이 항체는 최소 약 108 M-1 의 친화도로 결합하는 것이다. 이 항체는 모노클로널 조성물이거나 폴리클로널 항혈청과 같은 폴리클로널 조성물일 수 있다. 이와 관련된 구체예로서, 본 발명은 항체를 분비할 수 있는 세포, 예컨대 하이브리도마를 제공한다.
또한, 본 발명은 화합물이나 치료제가 텔로머라제 역전사효소 활성이나 hTRT 발현의 조절인자인지를 측정하는 방법을 제공한다. 이 방법은 상기 화합물이나 치료제의 투여 후 hTRT 단백질이나 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포, 동물 또는 조 성물에서 나타내는 활성이나 발현의 변화를 검측하거나 모니터하는 단계를 포함한다. 1가지 구체예로서, 이 방법은 TRT 조성물을 제공하는 단계, 이 TRT와 시험 화합물을 접촉시키는 단계 및 상기 TRT의 활성을 측정하는 단계를 포함하며, 이 시험 화합물의 존재 하에 TRT의 활성 변화가 시험 화합물이 TRT 활성을 조절한다는 지시 인자인 것을 특징으로 한다. 다른 구체예로서, 상기 조성물은 hTRT 폴리펩티드를 암호하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포, 유기체, 돌연변이 유기체 또는 발현계와 같은 시험관내 계이다. 따라서, 이 방법에 있어 hTRT는 시험관내 발현의 생성물일 수 있다. 여러 구체예에서 텔로머라제 활성이나 발현은 hTRT 유전자 생성물의 농도 변화를 검측하는 방법, 텔로머라제의 기질 중으로 뉴클레오티드 라벨이 병입되었는지를 모니터하는 방법, 연장된 텔로머라제 기질에 프로브가 하이브리드하는지를 모니터하는 방법, 신장된 텔로머라제 기질의 증폭을 모니터하는 방법, 시험 화합물에 노출된 세포의 말단소립 길이를 모니터하는 방법, 염색체에 결합하는 텔로머라제 성질이 상실되었는지를 모니터하는 방법 또는 말단소립 구조의 누적이나 상실을 측정하는 방법을 통해 검측할 수 있다.
제8 양태로서, 본 발명은 유전자 생성물에 특이적으로 결합하는 프로브와 생물 시료를 접촉시켜 프로브와 유전자 생성물의 복합체가 형성되도록 하는 단계 및 생물 시료 중의 hTRT 유전자 생성물의 존재와 상관관련이 있는 상기 복합체를 검출하는 단계를 통해 생물 시료에 존재하는 hTRT 유전자 생성물을 검측하는 방법을 제공한다. 이 유전자 생성물은 RNA, DNA 또는 폴리펩티드일 수 있다. 검측에 사용할 수 있는 프로브의 예로는 핵산 및 항체를 포함하며, 이것에 국한되는 것은 아니다.
1가지 구체예로서, 이 유전자 생성물은 유전자를 증폭한 뒤 증폭 생성물을 검측하므로써 감지되는 핵산이며, 이 복합체 또는 증폭 생성물의 존재는 생물 시료 중의 hTRT 유전자 생성물의 존재와 상호관련 있다.
다른 구체예로서, 상기 생물 시료는 인간 환자와 같은 환자에게서 얻어진 것이다. 또 다른 구체예로서, 생물 시료는 시험관내 세포 배양물, 예컨대 인간 세포 배양물에서 유래되는 1종 이상의 세포를 포함한다.
또한, 본 발명은 인간 세포를 포함하는 생물 시료를 얻는 단계 및 hTRT 유전자 생성물을 고농도로 함유하는 세포가 시료내 존재하는지를 검측하는 단계를 포함하고, hTRT 유전자 생성물을 고농도로 보유하는 세포의 존재가 그 생물 시료 중의 무한증식성 또는 텔로머라제 양성 세포의 존재와 상관관련 있음을 특징으로 하는, 생물 시료 중의 1종 이상의 무한증식성 또는 텔로머라제 양성의 인간 세포의 존재를 검출하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 환자의 세포 또는 조직 시료를 얻는 단계, 이 세포 또는 조직에 존재하는 hTRT 유전자 생성물의 양을 측정하는 단계 및 이 세포 또는 조직 중에 존재하는 hTRT 유전자 생성물의 양과 동일한 종류의 건강한 세포 또는 조직 중에 존재하는 양을 비교하는 단계를 포함하며, 환자와 건강한 세포 또는 조직 유래의 시료 중에 나타나는 hTRT 유전자 생성물의 상이한 양을 통해 텔로머라제 관련 질환을 진단하는 것이 특징인 환자의 텔로머라제 관련 질환을 확인하는 방법을 제공한다. 1가지 구체예로서, 텔로머라제 관련 질환은 암이고, 이 시료에서는 보다 많은 양의 hTRT 유전자 생성물이 검출된다.
또한, 본 발명은 환자 유래의 생물 시료를 얻는 단계 및 환자 시료에 존재하는 hTRT 유전자 생성물을 검측하는 단계를 포함하고, 이 시료에서 검측되는 hTRT 유전자 생성물의 존재가 암의 확인과 상관관련 있음이 특징인, 환자의 암을 확인하는 방법을 제공한다.
더욱이, 본 발명은 환자 시료를 얻는 단계, 환자 시료 중에 존재하는 hTRT 유전자 생성물의 양을 측정하는 단계 및 hTRT 유전자 생성물의 양과 정상값이나 대조값과 비교하는 단계를 포함하고, 환자 중에서 나타나는 hTRT 유전자 생성물의 양이 정상값 또는 대조값보다 많은 경우 암으로 확인되는 것이 특징인 환자의 암을 확인하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 1종 이상의 세포를 포함하는 환자의 시료를 얻는 단계, 이 시료에 존재하는 세포 중의 hTRT 유전자 생성물의 양을 측정하는 단계 및 이 세포 중에 존재하는 hTRT 유전자 생성물의 양과 그 세포의 정상 값을 비교하는 단계를 포함하고, hTRT 유전자 생성물의 양이 정상 값보다 큰 경우 암으로 확인되는 것이 특징인 환자의 암을 확인하는 방법을 제공한다. 1가지 구체예로서, 시료는 1종 이상의 악성 세포를 포함하는 것으로 추정되는 것이다.
또한, 본 발명은 환자로부터 얻은 암 세포 중에 존재하는 hTRT 유전자 생성물의 양을 측정하는 단계, 암의 예후와 일치하는 hTRT의 예후적 값과 암 세포 중의 hTRT 양을 비교하는 단계를 포함하고, 이 때 시료 중에 존재하는 hTRT의 양이 예후적 값인 경우 특정 예후를 제공할 수 있는 것이 특징인 암 환자의 예후로 측정하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 환자로부터 얻은 1종 이상의 암 세포 중에 존재하는 hTRT 유전자 생성물의 양을 1차 측정하는 단계, 이 환자에게 항암 치료제를 투여한 후 환자로부터 얻은 1종 이상의 암 세포 중에 존재하는 hTRT 유전자 생성물의 양을 2차 측정하는 단계, 및 이 1차 측정값과 2차 측정값을 비교하는 단계를 포함하고, 2차 측정시 나타나는 hTRT 유전자 생성물 농도의 감소가 환자 중의 암 세포 증식능을 감소시키는 항암 치료제의 성질과 상관관련 있는 것임을 특징으로 하는, 환자 중에 존재하는 암세포의 증식능을 감소시키기 위한 항암 치료능을 모니터하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 hTRT 유전자 또는 유전자 생성물을 검측하는 키트를 제공한다. 1가지 구체예로서, 이 키트는 hTRT 핵산이나 이의 준서열, hTRT 폴리펩티드 또는 이의 준서열 및 항hTRT 항체 중에서 선택되는 분자를 함유하는 용기를 포함한다.
또한, 본 발명은 인간의 질병을 치료하는 방법을 제공한다. 1가지 구체예로서, 본 발명은 척추동물 세포, 예컨대 포유동물 세포에 hTRT 폴리펩티드를 암호하는 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 도입하여, 상기 세포의 증식능을 증가시키는 방법을 제공한다. 1가지 구체예로서, hTRT 폴리펩티드는 도 17에 도시된 것과 같은 서열을 보유한다. 다른 구체예로서, 서열은 프로모터에 작동가능하게 결합되어 있다. 또 다른 구체예로서, hTRT는 텔로머라제 촉매 활성을 보유한다. 또 다른 구체예로서, 세포는 인간 세포, 예컨대 인간 환자 중의 세포이다. 또 다른 구체예로서, 세포는 시험관내에서 배양된 것이다. 이와 관련된 구체예로서 세포는 인 간 환자에게 도입한 것이다.
또한, 본 발명은 환자의 1종 이상의 세포 중으로 재조합 hTRT 폴리뉴클레오티드를 도입시켜 인간 질병을 치료하는 방법을 제공한다. 1가지 구체예는, 유전자 치료용 벡터를 사용하는 것을 특징으로 한다. 이와 관련된 구체예로서, 이 방법은 hTR을 암호하는 서열, 예컨대 프로모터에 작동가능하게 결합된 hTR 폴리뉴클레오티드를 세포 중으로 도입시키는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명은 척추 동물 세포 중으로 hTRT 폴리펩티드를 유효량 도입시켜 상기 세포의 증식능을 증가시키는 방법을 제공한다. 1가지 구체예로서, 이 hTRT 폴리펩티드는 텔로머라제 촉매 활성을 보유한다. 또한, 본 발명은 증가된 증식능을 나타내는 세포 및 세포 후대를 제공한다.
본 발명은 세포 중으로 hTRT 폴리펩티드 또는 hTRT 폴리뉴클레오티드인 텔로머라제 활성의 억제제를 치료적 유효량으로 도입시키는 것을 포함하여, 세포 중의증가된 텔로머라제 활성능과 연관된 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 1가지 구체예로서 억제제는 예컨대 도 16, 도 17 또는 도 20에 기재된 서열 중 최소한 준서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드인 것이다. 또 다른 구체예로서, 이 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 TRT 활성, 예컨대 텔로머라제 RNA에 대한 내인성 TRT의 결합을 억제하는 것이다.
또한, 본 발명은 hTRT 폴리펩티드와 보조제를 포함하는 백신을 제공한다. 또한, 본 발명은 hTRT 폴리펩티드, hTRT 폴리펩티드를 암호하는 폴리뉴클레오티드 및 hTRT 핵산이나 이의 준서열 중에서 선택되는 분자와 약학적 허용성 담체를 포함하 는 약리학적 조성물을 제공한다.
도 1은 인간, S.폼베[S.pombe ](tez1), S.세레비지에[S.cerevisiae ](EST2) 및 유프로테스 에디큘라투스[Euplotes aediculatus ](p123)로부터 얻은 TRT 모티프 중의 고도 보존성 잔기를 도시한 것이다. 동일한 아미노산은 별표(*)[약간 상승된 위치]로 표시하고, 유사한 아미노산 잔기는 점(
Figure 111999002929091-pct00001
)으로 표시하였다. 이 도면에서 모티프 "0"은 모티프 T라 부르기도 하고 모티프 "3"은 모티프 A라 부르기도 한다.
도 2는 텔로머라제 단백질과 기타 다른 역전사효소의 텔로머라제 특이적 서열 모티프 및 RT 특이적 서열 모티프의 위치를 도시한 것이다. 텔로머라제 특이적 모티프 T와 보존적 RT 모티프 1, 2 및 A 내지 E의 위치는 박스로 표시하였다. HIV-1 RT가 표지된 열린 직사각형은 도 3에 도시된 이 단백질의 일부를 표시한 것이다.
도 3은 HIV-1 역전사효소의 p66 서브유닛이 나타내는 결정 구조를 도시한 것이다(브룩헤븐 코드 1HNV). 이 도면은 모든 모티프들이 보일 수 있게 오른손 뒤에서 본 것이다.
도 4는 텔로머라제 RT[Sp＿Trt1p, S.폼베 TRT("tezlp"라고도 표시함); hTRT,인간 TRT; Ea＿p123, 유프로테스 p123; Sc＿Est2p, S.세레비지에 Est2p] 및 기타 다른 RT류(Sc＿al, S. 세레비지에 미토콘드리아 유래의 시토크롬 산화효소 제II군 인트론 1 암호성 단백질, Dm_TART, 드로소필라 멜라노가스터 TART 비LTR 레트로트란스포손성 인자 유래의 역전사효소); HIV-1, 인간의 면역결핍 바이러스 역전사효소의 복수 서열을 정렬한 것이다. TRT con과 RT con은 텔로머라제 RT와 비텔로머라 제 RT의 일치 서열을 나타낸 것이다. 아미노산은 h(소수성), p(극성), c(하전성)로 표시하였다. 삼각형은 다른 RT와는 다르지만 텔로머라제 단백질 중에서는 보존성인 잔기를 표시한 것이다. 모티프 E 아래의 실선은 프라이머 그립 영역을 강조하여 표시한 것이다.
도 5는 실시예 2에 기재된 바와 같은 텔로머라제 양성의 무한증식성 세포주와 텔로머라제 음성의 유한증식성 세포주가 나타내는 hTRT RNA의 발현도를 도시한 것이다.
도 6은 RNA 의존적 RNA 폴리머라제를 기원으로 하는 텔로머라제와 역인자들의 가능한 진화계통수를 도시한 것이다.
도 7은 람다 클론 Gφ5의 제한 지도를 도시한 것이다.
도 8은 STS 마커 D5S678(hTRT 유전자 부근에 위치함)의 위치를 표시한 염색체 5p의 지도를 도시한 것이다.
도 9는 hTRT 프로모터-리포터 플라스미드의 작제에 관해 도시한 것이다.
도 10A 및 도 10B는 2면에 걸쳐 촉매적 활성인 인간 텔로머라제를 생성하기 위한 hTRT와 hTR의 시험관내 동시발현 결과를 도시한 것이다.
도 11은 4가지 TRT 단백질 유래의 서열을 정렬하여 목적하는 모티프를 확인한 결과를 도시한 것이다. TRT con은 TRT 일치 서열을 도시한 것이다. RT con은 기타 다른 역전사효소의 일치 잔기를 도시한 것이다. 상부에 나타낸 일치 잔기는 TRT 단백질의 절대 보존 서열을 나타낸 것이다.
도 12는 서열 번호 7에 상응하는 서열로 보이는, hTRT 인트론 중의 토포이소 머라제 II 절단 부위와 NFkB 결합 부위의 모티프를 도시한 것이다.
도 13A 및 도 13B는 유프로테스 123 kDa 텔로머라제 단백질 서브유닛을 암호하는 DNA의 서열(유프로테스 TRT)을 2면에 걸쳐 도시한 것이다.
도 14는 유프로테스 123 kDa 텔로머라제 단백질 서브유닛의 아미노산 서열(유프로테스 TRT 단백질)을 도시한 것이다.
도 15A 내지 도 15F는 S.폼베 텔로머라제 촉매 서브유닛의 DNA 서열과 아미노산 서열(S.폼베 TRT)을 6면에 걸쳐 도시한 것이다.
도 16은 서열 번호 1에 상응하는 것으로 나타난 hTRT cDNA 서열을 도시한 것이다.
도 17은 도 16에 도시된 cDNA에 의해 암호화된 hTRT 단백질을 도시한 것이다. 이 단백질 서열은 서열 번호 2에 상응한다.
도 18은 서열 번호 3에 상응하는 것으로 나타난 클론 712562의 서열을 도시한 것이다.
도 19는 서열 번호 10에 상응하는 것으로 나타난 클론 712562에 의해 암호된 259 잔기의 단백질을 도시한 것이다.
도 20A 내지 도 20E는 서열 번호 5에 상응하는 서열인 것으로 나타난 Δ182 변형 폴리펩티드를 암호하는 오픈 리딩 프레임을 가진 핵산 서열을 5면에 걸쳐 도시한 것이다. 이 도면은 서열 번호 5에 상응하는 아미노산 서열인 것으로 나타난 상기 Δ182 변형 폴리펩티드의 아미노산 서열을 도시한 것이다.
도 21A 내지 도 21E는 서열 번호 6에 상응하는 서열인 것으로 나타난 hTRT 게놈 클론의 서열을 5면에 걸쳐 도시한 것이다. 여기에는 토포이소머라제 II 절단 부위, NFκB 결합 부위, Alu 서열 및 기타 다른 서열 인자를 특징으로 하는 서열을 비롯하여 일치 모티프와 인자를 도시하였다.
도 22는 실시예 1에 기재된 바와 같은 효모 중에 존재하는 TRT 유전자의 돌연변이 효과를 도시한 것이다.
도 23은 서열 번호 8에 상응하는 EST AA281296의 서열을 도시한 것이다.
도 24는 서열 번호 9에 상응하는 서열인 것으로 나타난 클론 712562에서 결실된 182개 염기쌍의 서열을 도시한 것이다.
도 25는 hTRT 단백질(pGRN133)을 암호하는 발현 벡터 또는 실시예 13에 기재된 대조용 플라스미드(pBBS212)로 형질감염된 BJ 세포 유래의 텔로머라제 활성의 분석 결과를 도시한 것이다.
도 26은 결합 단계와 치환 용출 단계를 도시한 텔로머라제의 친화도 정제법의 개략도이다.
도 27은 실시예 1에 기재된 바와 같은 정제 프로토콜 동안 얻은 텔로머라제 제조물의 노던 블롯 사진이다. 레인 1은 1.5 fmol의 텔로머라제 RNA, 레인 2는 4.6 fmol의 텔로머라제 RNA, 레인 3은 14 fmol의 텔로머라제 RNA, 레인 4는 41 fmol의 텔로머라제 RNA, 레인 5는 핵 추출물(42 fmol 텔로머라제), 레인 6은 Affi-Gel-헤파린 정제된 텔로머라제(47 fmol 텔로머라제), 레인 7은 친화도 정제된 텔로머라제(68 fmol) 및 레인 8은 글리세롤 구배 정제된 텔로머라제(35 fmol)를 포함한다.
도 28은 정제 프로토콜을 통해 얻어지는 텔로머라제 활성을 도시한 것이다.
도 29는 유프로테스 에디큘라투스 유래의 약 123 kDa 폴리펩티드와 약 43 kDa 이중선의 존재를 나타내는 SDS-PAGE 겔 사진이다.
도 30은 유프로테스 에디큘라투스 텔로머라제의 침강 계수를 나타내는 그래프이다.
도 31은 유프로테스 텔로머라제의 기질 이용성을 나타내는 36포름아미드를 첨가한 폴리아크릴아미드/우레아 겔 사진이다.
도 32는 텔로머라제 RNA 주형 및 텔로머라제 RNA를 가진 헤어핀 프라이머를 추정적으로 정렬한 것이다.
도 33은 도 31에 도시된 겔 중 레인 25 내지 30을 보다 밝은 노출률에서 촬영한 사진이다.
도 34는 유프로테스 유래의 43 kDa 텔로머라제 단백질 서브유닛을 암호하는 유전자의 DNA 서열을 도시한 것이다.
도 35A 내지 도 35D는 유프로테스 유래의 43 kDa 텔로머라제 단백질 서브유닛에 존재하는 총 3개의 오픈 리딩 프레임의 아미노산 서열 뿐만 아니라 DNA 서열을 4면에 걸쳐 도시한 것이다.
도 36A 및 도 36B는 유프로테스의 123 kDa 텔로머라제 단백질 서브유닛(상부 서열)과 T.서모필라의 80 kDa 폴리펩티드 서브유닛(하부 서열) 간에 서열을 비교한 것이다.
도 37은 E.에디큘라투스의 123 kDa 텔로머라제 단백질 서브유닛(상부 서열) 과 T.서모필라의 95 kDa 텔로머라제 폴리펩티드(하부 서열) 간의 서열을 비교한 것이다.
도 38은 E.에디큘라투스의 43 kDa 텔로머라제 단백질 서브유닛의 "La 도메인" 일부(상부 서열)와 T.서모필라의 95 kDa 폴리펩티드 서브유닛 일부(하부 서열)를 최대 정합 정렬시킨 것이다.
도 39는 E.아에큘라투스의 43 kDa 텔로머라제 단백질 서브유닛의 "La 도메인" 일부(상부 서열)와 T.서모필라의 80 kDa 폴리펩티드 서브유닛 일부(하부 서열)를 최대 정합 정렬시킨 것이다.
도 40은 E.에디큘라투스의 123 kDa 텔로머라제 단백질 서브유닛의 폴리머라제 도메인과 S.세레비지에 미토콘드리아[a1 S.c.(group II)], Dong(LINE) 및 효모 ESTp(L8543.12) 유래의 시토크롬 산화효소 제II군 인트론 1 암호 단백질을 비롯한 다양한 역전사효소의 폴리머라제 도메인을 정렬하고 모티프를 도시한 것이다.
도 41은 각종 La 단백질과 43 kDa 텔로머라제 단백질 서브유닛의 도메인을 정렬한 것이다.
도 42는 T.서모필라 80 kDa 단백질 서브유닛을 암호하는 뉴클레오티드 서열을 도시한 것이다.
도 43은 T.서모필라 80 kDa 단백질 서브유닛의 아미노산 서열을 도시한 것이다.
도 44는 T.서모필라 95 kDa 단백질 서브유닛을 암호하는 뉴클레오티드 서열을 도시한 것이다.
도 45는 T.서모필라 95 kDa 단백질 서브유닛의 아미노산 서열을 도시한 것이다.
도 46은 L8543.12("Est2p")의 아미노산 서열을 도시한 것이다.
도 47은 유프로테스 p123 서열과 옥시트리차(Oxytricha ) PCR 생성물에 의해 암호된 아미노산 서열을 정렬한 것이다.
도 48은 Est2의 DNA 서열을 도시한 것이다.
도 49는 인간 텔로머라제 펩티드 모티프를 암호하는 cDNA 클론의 부분 아미노산 서열을 도시한 것이다.
도 50은 인간의 텔로머라제 펩티드 모티프를 암호하는 cDNA 클론의 일부 DNA 서열을 도시한 것이다.
도 51은 S.폼베 trt라고도 불리는 tez1의 아미노산 서열을 도시한 것이다.
도 52A 및 도 52B는 tez1의 DNA 서열을 2면에 걸쳐 도시한 것이다. 인트론 영역과 기타 다른 비암호 영역은 소문자로 도시하고 엑손(즉, 암호 영역)은 대문자로 도시하였다.
도 53은 일치 서열과 함께 EST2p, 유프로테스 서열 및 테트라히메나(Tetrahymena ) 서열을 정렬한 것이다.
도 54는 항hTRT 항체 생산에 유용한 펩티드 서열을 도시한 것이다.
도 55A 및 도 55B는 tez1+ 서열분석 실험의 개요도이다.
도 56은 E.에디큘라투스 p123 서열의 S.폼베 상동체를 확인하기 위해 PCR에 사용된 2가지 축퇴 프라이머를 도시한 것이다.
도 57은 E.에디큘라투스 p123 서열의 S.폼베 상동체를 확인하기 위해 축퇴 프라이머를 사용한 PCR로 얻은 4가지 주 밴드를 도시한 것이다.
도 58A 및 도 58B는 E.에디큘라투스 p123, S.세레비지에 및 옥시트리차 텔로머라제 단백질 서열과 M2 PCR 생성물을 정렬한 것이다.
도 59는 E.에디큘라투스 p123의 S.폼베 상동체를 동정하기 위한 3'RT PCR 방법을 도시한 개략도이다.
도 60은 S.폼베 텔로머라제 단백질 서열을 선별하는데 사용된 라이브러리의 특성을 도시하고, S.폼베 텔로머라제 단백질 서열에 대한 라이브러리 선별 결과를도시한 것이다.
도 61은 S.폼베 텔로머라제 서열을 포함하고 HindIII 분해된 양성 게놈 클론으로 얻어진 양성 결과를 도시한 것이다.
도 62는 전길이 S.폼베 TRT 클론을 얻는데 사용된 5' RT PCR 전략을 도시한 개략도이다.
도 63은 S.폼베(S.p.), S.세레비지에(S.c.) 및 E.에디큘라투스(E.a.)의 텔로머라제 촉매성 서브유닛으로부터 유래되는 RT 도메인을 정렬한 것이다.
도 64A 및 도 64J는 유프로테스("Ea＿p123"), S.세레비지에("Sc＿Est2p") 및 S.폼베("Sp＿Tezlp") 유래의 서열을 10면에 걸쳐 정렬한 것이다. 패널 A에서 검은 부분은 두 서열 간에 공유된 잔기를 나타낸다. 패널 B에서 검은 부분은 3 서열에서 모두 공유되는 잔기를 나타낸다.
도 65는 S.폼베 중에 존재하는 텔로머라제 유전자를 이용한 분리 방법이다.
도 66은 tez1의 분리를 나타내는 실험 결과를 도시한 것이다.
도 67은 tez1 분리에 의해 S.폼베에 나타나는 말단소립의 점진적 단축화를 도시한 것이다.
도 68A 내지 도 68C는 클론 712562의 EcoRI-NotI 삽입체가 암호하는 약 63 kDa 텔로머라제 단백질을 암호하는 ORF의 DNA 및 아미노산 서열을 3면에 걸쳐 도시한 것이다.
도 69는 각종 공급원에서 유래된 역전사효소의 모티프를 정렬한 것이다.
도 70은 플라스미드 pGRN121의 제한 지도와 기능 지도를 도시한 것이다.
도 71A 및 도 71B는 hTRT cDNA 서열의 예비 핵산 서열분석 결과를 2면에 걸쳐 도시한 것이다.
도 72A 내지 도 72I는 hTRT의 예비 핵산 서열과 3가지 리딩 프레임의 추론된 ORF 서열을 9면에 걸쳐 도시한 것이다.
도 73은 플라스미드 pGRN121의 제한 지도 및 기능 지도를 도시한 것이다.
도 74A 내지 도 74F는 hTRT의 정제된 핵산 서열과 추론된 ORF 서열을 6면에 걸쳐 도시한 것이다.
도 75는 람다 클론 25-1.1의 제한 지도를 도시한 것이다.
상세한 설명
1. 개요
텔로머라제는 RNA 성분 및 촉매성 단백질 성분을 포함하는 리보뉴클레오단백질 복합체(RNP)이다. 본 발명은 이하 "TRT"(텔로머라제 역전사 효소)로 부르는 텔 로머라제의 촉매성 단백질 성분의 클로닝 및 특성 분석에 관한 것이다. TRT는 말단소립 DNA 반복 서열의 합성을 유도하기 위해 텔로머라제 RNA 성분(이하, "TR"이라 부름)을 사용하여 RNA 의존성 DNA 폴리머라제(역전사 효소)로서 작용하기 때문에 부쳐진 명칭이다. 더욱이, TRT는 기타 역전사 효소와 진화론적으로 근연 관계가 있다.
1 가지 양태로서, 본 발명은 이하 "h TRT"로 부르는 인간의 텔로머라제의 촉매성 단백질 성분을 클로닝하고 특성 규명하는 것에 관한 것이다. 인간의 TRT는 전술한 바와 같이 인간(및 기타 포유류 세포)에서의 텔로머라제 활성이 세포 증식능, 세포 무한 증식성 및 신생물 표현형의 발현과 상관관계가 있기 때문에 비상한 관심과 가치를 지닌다. 예를 들면, 인간 TRT 유전자 생성물의 텔로머라제 활성 및 정도(이하, 실시예 2에서 증명됨)는 유한증식성 세포(예컨대, 대부분의 인간 체세포)와 비교하여 무한증식성 인간 세포(예컨대, 악성 종양 세포 및 무한증식성 세포주)에서 높다.
본 발명은 이하에 상세히 설명되는 바와 같이 인간 질환과 질환 증상을 확인, 예후 및 치료하는데 중요한 방법 및 조성물을 제공한다. 또한, 세포를 무한 증식화하고(생체내 및 생체외에서), 바람직한 특성을 보유한 돌연변이 동물을 생성하고, 이하에 상세히 설명되는 기타 용도들에 유용한 방법과 시약을 제공한다. 본 발명은 섬모충류, 진균, 척추동물(예, 포유류) 및 기타 유기체 유래의 TRT 유전자 및 단백질을 제조, 클로닝 또는 재클로닝하는데 유용한 방법과 시약을 제공한다.
TRT는 섬모충류인 유프로테스 에디큘라투스로부터 텔로머라제를 정제한 후 먼저 특성을 분석하였다. RNA 친화도 크로마토그래피 및 기타 방법을 사용한 이. 에디큘라투스 텔로머라제의 충분한 정제로부터 단백질 "p123"을 얻었다. 놀랍게도, p123은 텔로머라제 완전효소(holoenzyme)의 단백질 서브유닛(즉, 테트라히메나 써모필라의 p80 및 p95 단백질)을 구성하는 것으로 종래 생각되어 온 단백질과는 무관하다. p123 DNA 및 단백질 서열(젠뱅크 수탁 번호 U95964; 도 13A 및 도 13B 및 도 14)의 분석에 의해 역전사 효소(RT) 모티프는 텔로머라제의 촉매성 서브유닛으로서의 p123의 역할과 일치하는 것으로 나타났다(예컨대, 도 1, 4 및 11 참조). 더욱이, p123은 S. 세레비지에(효모) 단백질인 Est2p와 친연 관계가 있는데, 이 단백질은 S. 세레비지에(젠뱅크 수탁번호 S5396)의 말단소립의 유지에 큰 역할을 하는 것으로 알려져 있지만, 텔로머라제 촉매성 서브유닛 단백질을 암호화하는 것으로 인식된 적은 본 발명 이전에는 없다(예컨대, 문헌[Lendvay 등, 1996, Genetics , 144:1399] 참조).
1 가지 양태로서, 본 발명은 본 명세서에 개시한 TRT 폴리뉴클레오티드로부터 생성되거나 유래한 핵산 프로브 및 프라이머(예컨대, TRT 유전자 및 cDNA의 클로닝용); 모티프 또는 모티프 서열이나 기타 TRT 에피토프를 특이적으로 인식하는 항체(예컨대, TRT 유전자의 발현 클로닝 및 TRT 단백질의 정제용)를 사용하여 컴퓨터 데이타베이스를 검색하거나 또는 기타 수단으로 신규의 TRT를 동정하고 클로닝하는 시약 및 방법을 제공한다. 예를 들면, 실시예 1에서 설명하는 바와 같이, S. 폼베 DNA의 PCR(폴리머라제 연쇄 반응) 증폭은 유프로테스 p123RT 모티프 B' 및 C로부터 디자인된 축퇴성 서열 프라이머를 사용하여 실시하였다. 생성된 4개의 주요 생성물 중에서, 하나는 유프로테스 p123 및 S. 세레비지에 Est2p와 상동성인 펩티드 서열을 암호화하였다. 이러한 PCR 생성물을 프로브로 사용하여 S. 폼베 cDNA와 게놈 라이브러리의 검색 및 역전사 반응과 PCR(RT-PCR)에 의한 S. 폼베 RNA의 증폭 반응으로 S. 폼베 TRT 상동체의 완전 서열을 얻었다. S. 폼베 유전자 "trt1"; 젠뱅크 수탁번호 AF015783; 도 15A 내지 도 15F)의 완전 서열을 통해 p123과 Est2p의 상동성이 역전사 효소 모티프에서 특히 높다는 것을 알 수 있었다. S.폼베 trt1은 tez1이라고 부르기도 한다.
또한, 텔로머라제 RT 모티프에서 유래한 축퇴성 프라이머를 이용한 증폭 반응을 사용하여 각 실시예 1에서 설명하는 바와 같이 옥시트리차 트리팔락스(Oxytricha trifallax ) 및 테트라히메나 써모필라에서 TRT 유전자 서열을 얻었다.
본 발명의 유프로테스 p123, S. 폼베 trt1 및 S. 세레비지에 Est2p 핵산 서열은 프로그램 블라스트(BLAST)(Altschul 등, 1990, J. Mol. Biol. 215:403)를 사용하여 인간에게서 발현되는 서열 표지(EST)를 컴퓨터에 입력해 놓은 데이타베이스를 검색하였다. Est2p 서열을 사용한 상기 데이타베이스의 검색 결과 정합성 서열은 찾지 못한 반면, p123 및 trt1 서열을 사용한 검색에서는 실시예 1에서 설명하는 바와 같이 상동성 단백질을 암호화하는 것으로 추정되는 인간의 EST(젠뱅크 수탁번호 AA281296)(서열 번호 8)를 동정하였다. EST를 포함하는 cDNA 클론(이하, "클론 712562"라 지칭함; 서열 번호 3참조)의 완전한 서열을 분석한 결과, 7개의 RT 모티프가 존재하는 것으로 나타났다. 그러나, 이 클론은 7개 모티프 전부를 보유한 인접하는 인간의 TRT를 암호화하지는 않았는데, 그 이유는 모티프 B', C, D 및 E가 더 큰 NH2 -말단 모티프보다는 상이한 오프 리딩 프레임(ORF)에 포함되어 있기 때문이다. 또한, 모티프 A와 B' 사이의 거리는 이미 특성 분석된 3개의 TRT의 거리보다 상당히 더 짧았다.
기능적 hTRT를 암호화하는 cDNA 클론 pGRN121(도 16 참조, 서열 번호 1)은 실시예 1에서 설명하는 바와 같이 인간의 293 세포주로부터 유래한 cDNA 라이브러리로부터 분리하였다. 클론 712562를 pGRN121과 비교한 결과, 클론 712562가 모티프 A와 B' 사이에 182개의 염기쌍 결실(도 24 참조, 서열 번호 9)을 가지는 것으로 나타났다. pGRN121에 존재하는 추가의 182개 염기쌍은 단일의 개방 리딩 프레임에 TRT 모티프를 모두 위치시키고, 기타 공지된 TRT와 일치하는 간격으로 모티프 A와 모티프 B' 영역 사이의 간격을 증가시킨다. 이하 실시예(예, 실시예 7)에 기재하는 바와 같이, 서열 번호 1은 서열 번호 2의 서열을 가진 촉매적으로 활성이 있는 텔로머라제 단백질을 암호화한다. 서열 번호 2의 폴리펩티드는 1132개 잔기 및 약 127 킬로달톤(kD)의 계산된 분자량을 가진다.
이하 기재되고 실시예 9를 통해 설명되는 바와 같이 클론 712562의 182개 염기쌍 결실 특성을 보유하는 TRT cDNA는 텔로머라제 양성 세포(예컨대, 정소 및 293 세포)로부터 RNA를 역전사 반응시킨 이후에 검출된다. 상기 182개 염기쌍 서열이 결실된 hTRT RNA는 "Δ182 변형체"로 일반적으로 지칭되며, 1개, 2개 또는 여러 개의 종류가 있다. pGRN121 cDNA에서 발견되는 182개 염기쌍 서열이 결실된 hTRT 변형체는 완전 활성의 텔로머라제 촉매 효소를 암호화하는 것 같지는 않지만, 이들 변형체는 텔로머라제 조절 작용(이하 상세히 설명됨) 및/또는 부분적인 텔로머라제 활성, 예컨대 말단소립 결합 또는 hTR 결합 활성(이하 설명됨)을 가질 수 있다.
따라서, 본 발명은 제1 양태로 비제한적으로 도 16(서열 번호 1)에 기재된 서열을 가진 폴리뉴클레오티드를 포함하는 천연의 인간 TRT 유전자 또는 mRNA의 서열을 가진 분리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 이와 관련된 양태로서, 본 발명은 hTRT 단백질, 이의 단편, 변형체 또는 유도체를 암호하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 또 다른 관련 양태로서, 본 발명은 hTRT 유전자 또는 mRNA에 결합하는 센스 핵산 및 안티센스 핵산을 제공한다. 또한, 본 발명은 합성하거나 천연원에서 정제한 hTRT 단백질 뿐만 아니라 hTRT 단백질이나 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 및 기타 다른 성분을 제공한다. 또한, 본 발명은 전술한 조성물을 이용하여, 예컨대 인간 질병의 진단 분석법 및 예후 분석법을 제공하는 방법, 치료제 개발 방법과 치료 방법, 텔로머라제 관련 단백질의 동정 방법 및 텔로머라제 활성을 활성화하거나 억제할 수 있는 제제를 선별하는 방법을 비롯한 다양한 신규 방법을 제공한다. 본 발명의 다양한 기타 다른 양태 및 구체예에 대해서는 이하에 설명한다.
본 발명의 제2 양태는 길이가 최소 약 10개의 뉴클레오티드 내지 약 10 kb 이상이고, hTRT 유전자 서열이나 hTRT mRNA의 분석이나 선별 또는 재조합 숙주 세포의 제조에 있어 천연 발생의 hTRT 유전자 또는 hTRT mRNA에 존재하는 인접 서열과 동일하거나 정확하게 상보적인 최소 10개의 뉴클레오티드의 인접 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 제3 양태는 척추 동물 세포의 증식능을 증가시키면 치료되는 질환 치료용 약제 제조에 있어 hTRT의 발현을 증가시키는 제제의 용도로서, 선택적으로 상기 약제는 노쇠 효과 억제용이다.
본 발명의 제4 양태는 인간 세포에서 나타나는 텔로머라제 활성의 증가량과 연관된 질환을 치료하기 위한 약제 제조에 있어 텔로머라제 활성의 억제제의 용도이다.
약제로서 사용되는 본 발명의 제5 양태는 본 발명의 단백질, 이의 변형체 및 단편과 이를 암호하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편이다.
또한, 본 발명의 제6 양태는 약제 제조, 예컨대 노화 또는 암 효과 억제용 약제 제조에 사용되는 본 명세서에 기재된 바와 같은 단백질, 이의 변형체 또는 단편이나 폴리뉴클레오티드 또는 단편의 용도이다.
본 발명의 제7 양태는
(a) 도 16에 기재된 서열을 가진 DNA;
(b) 상기 DNA에 하이브리드하고 hTRT 단백질이나 변형체를 암호하거나 이러한 변형체의 암호 서열에 하이브리드하는 10개 이상의 뉴클레오티드 서열을 가진 폴리뉴클레오티드; 및
(c) 상기 (a) 및 (b)에 기재된 DNA 서열에 대하여 유전자 코드에 따라 축퇴성이고 hTRT 폴리펩티드 또는 변형체를 암호하는 DNA 서열 중에서 선택되는 폴리뉴클레오티드이다.
본 발명의 구체적인 특정예로서, hTRT 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 8에 기재된 389개 뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드 및/또는 도 18에 기재된 서열(서열 번호 3)을 가진 삽입체를 포함하는 플라스미드인 클론 712562를 제외한 다른 것이다.
이하, 주제별로 본 발명을 상세히 설명하겠다. 제II 파트는 TRT 단백질의 특징적인 아미노산 모티프 및 이 모티프를 가진 단백질을 암호하는 TRT 유전자에 관해 설명한 것이다. 제III 파트 내지 제VI 파트는 특히 인간 TRT 관련 조성물에 특별히 촛점을 둔 본 발명의 핵산, 단백질, 항체 및 정제 조성물에 관한 것이다. 제VII 파트는 특히 인간 질병을 치료하는데 유용한 본 발명의 방법 및 조성물에 관한 것이다. 제VIII 파트는 무한증식성 인간 세포주의 제조 및 동정에 관한 것이다. 제IX 파트는 특히 인간 질병을 진단하는데 사용되는 본 발명의 핵산, 폴리뉴클레오티드 및 기타 다른 조성물의 용도에 관한 것이다. 제X 파트는 특히 텔로머라제 활성이나 발현을 조절(예컨대, 억제 또는 촉진)하는 제제 및 치료제를 선별하고 동정하는데 유용한 본 발명의 방법 및 조성물에 관한 것이다. 제XI 파트는 특히 돌연변이 동물(예컨대, 텔로머라제 녹아웃 동물 및 세포)에 관한 것이다. 제XII 파트는 제I 파트 내지 제XI 파트에 사용된 용어를 설명한 것이다. 제XIII 파트는 본 발명의 특정 구체예에 관한 실시예를 설명한 것이다. 이와 같이 주제별 및 소제별로 본 발명을 설명한 것은 본 발명을 제한하기 위한 것이 아니라 명료하게 설명하기 위한 것이다.
II. TRT 유전자 및 단백질
본 발명은 텔로머라제 촉매성 서브유닛 단백질(즉, 텔로머라제 역전사효소)의 서열을 가진 분리 및/또는 재조합된 유전자 및 단백질을 제공하며, 이외에도 분 리 또는 재조합 형태인 상기 유전자 및 단백질의 천연 형태를 포함하며, 이것에만 국한되는 것은 아니다. 일반적으로, TRT는 본 명세서에 개시된 바와 같은 역전사효소(RT) 및 텔로머라제 특이적(T) 아미노산 모티프를 보유하는 크기가 큰 염기성 단백질이다. 이 모티프들은 다양한 유기체 중에서 보존적이기 때문에 다양한 유기체의 TRT 유전자는 본 발명의 방법을 사용하여 얻거나 또는 예컨대 1종 이상의 모티프 서열에 특이적인 본 발명의 프라이머, 핵산 프로브 및 항체를 사용하여 동정할 수 있다.
TRT에서 발견되지만 기타 역전사 효소에서 발견되는 것과 유사한 7개의 RT 모티프는 TRT 종에 특이한 구체적인 증표를 가진다. 예를 들면, 도 4에 도시한 바와 같이, TRT RT 모티프내에는 다른 RT들 중에서 고도로 보존되는 잔기들에 다수의 아미노산 치환부(화살표로 표시함)가 있다. 예를 들면, 모티프 C에는 활성 부위 금속 이온과 배위 결합하는 두 개의 아스파르트산 잔기(DD)(문헌[Kohlstaedt 등, 1992, Science 256:1783; Jacobo-Monila 등, 1993, Proc. Natl. Acad Sci. 미국 90:6320; Patel 등, 1995, Biochemistry 34:5351] 참조)가 텔로머라제 RT 경우에는 구조 hxDD(F/Y)에서 나타나는데 비해 기타 RT의 경우에는 (F/Y)xDDh에서 나타난다(여기서, h는 소수성 아미노산이고, "x"는 임의의 아미노산이다; 문헌[Xiong 등, 1990, EMBO J. 9:3353; Eickbush, in The Evolutionary Biology of Viruses (S. Morse 편집, Raven Press, 뉴욕, p.121, 1994)] 참조). 텔로머라제 아군의 또 다른 체계적인 변화 특성은 모티프 E에서 나타나는데, 여기서 WxGxSx는 일치 서열이거나 또는 텔로머라제 단백질 사이에서 보존되는 반면에, hLGxxh는 기타 RT의 특성이다 Xiong 등의 상기 문헌(1990); Eickbush의 상기 문헌(1994) 참조). 이 모티프 E는 "프라이머 그립"이라 불리며, 이 영역에서의 돌연변이는 RNA 프라이밍에는 영향을 미치나 DNA 프라이밍에는 영향을 미치지 않는 것으로 보고되었다(Powell 등, 1997, J. Biol. Chem. 272:13262). 텔로머라제는 DNA 프라이머(예컨대, 염색체의 3' 말단)를 필요로 하기 때문에, 프라이머 그립 영역이 다른 RT와 상이할 것으로 예상된다. 또한, 모티프 A와 B' 사이의 거리는 기타 RT에서 일반적인 것보다 TRT에서 더 긴데, 이것은 오른손과 유사한 구조 중 "손가락" 영역에 삽입부가 있음을 나타낸다 (도 3 참조; Kohlstaedt 등의 상기 문헌; Jacobo-Molina 등의 상기 문헌; 및 Patel 등의 상기 문헌 참조).
더욱이, 전술한 바와 같이, T 모티프는 TRT 단백질의 또 다른 지표이다. 예컨대, 도 54에 도시한 T 모티프는 다음 식으로 표시할 수 있는 서열을 포함한다:
Trp-R1 -X7 -R1 -R1 -R2 -X-Phe-Phe-Tyr-X-Thr-Glu-X 8-9 -R3 -R3 -Arg-R4 -X2 -Trp
상기 식에서, X는 임의의 아미노산이고, 아래 첨자는 연속 잔기의 수를 의미하며, R1 은 로이신 또는 이소로이신이고, R2 는 글루타민 또는 아르기닌이며, R3 은 페닐알라닌 또는 티로신이고, R4 는 리신 또는 히스티딘이다.
또한 T 모티프는 다음 식으로 표시할 수 있다:
Trp-R1 -X4 -h-h-X-h-h-R2 -p-Phe-Phe-Tyr-X-Thr-Glu-X-p-X3 -p-X 2-3 -R3 -R3 -Arg-R4 -X2 -Trp
상기 식에서, X는 임의의 아미노산이고, 아래 첨자는 연속 잔기의 수를 의미 하며, R1 은 로이신 또는 이소로이신이고, R2 는 글루타민 또는 아르기닌이며, R3 은 페닐알라닌 또는 티로신이고, R4 는 리신 또는 히스티딘이며, h는 Ala, Leu, Ile, Val, Pro, Phe, Trp 및 Met으로부터 선택되는 소수성 아미노산이고, p는 Gly, Ser, Thr, Tyr, Cys, Asn 및 Gln으로부터 선택되는 극성 아미노산이다.
일 양태로, 본 발명은 도 11에 도시한 하나 이상의 모티프를 포함하는 분리된 천연 TRT 단백질 및 재조합 TRT 단백질을 제공하며, 여기서 상기 모티프의 예는 다음과 같다:
모티프 T W-X12 -FFY-X-TE-X10-11 -R-X3 -W-X7 -I
모티프 T' E-X2 -V-X
모티프 1 X3 -R-X2 -PK-X3
모티프 2 X-R-X-I-X
모티프 A X4 -F-X3 -D-X4 -YD-X2
모티프 B' Y-X4 -G-X2 -QG-X3 -S-X8
모티프 C X6 -DD-X-L-X3
TRT 단백질이 하나 이상의 TRT 모티프를 포함하는 경우, 그 순서(NH2 →COOH)는 도 11에 도시된 바와 같다.
다른 양태로서, 본 발명은 다음과 같은 수퍼모티프를 포함하는 분리된 천연 TRT 단백질을 제공한다.
(NH2 )-X300-600 -W-X12 -FFY-X-TE-X10-11 -R-X3 -W-X 7 -I-X5-20 -E-X2 -V-X-X5-20 -X3 -R-X2 -PK-X4-10 -R-X-I-X-X60-80 -X4 -F-X3 -D-X4 -YD-X2 -X80-130 -Y-X4 -G-X2 -QG-X3 -S-X8 -X5-35 -X6 -DD-X-L-X3 -X10-20 -X12 -K
당업자라면 분명히 이해할 수 있듯이, 본 명세서에 기재된 시약으로 사용되는 TRT 서열을 포함하는 시약과 본 명세서에 제시된 방법과 지침(예컨대, 이하 제시된 구체적인 방법)을 사용하면 당업자는 TRT 유전자 및 단백질을 재조합 형태로 제조, 분리 및 생성할 수 있을 것이다. 예컨대, 프라이머(예, 축퇴성 증폭 프라이머)는 TRT의 특징인 RT 모티프와 T 모티프를 암호하는 유전자 서열에 하이브리드하는 것을 사용한다. 예컨대, T 모티프나 기타 다른 TRT 모티프(이하 상세히 설명됨) 또는 모티프나 일치 서열의 조합체의 FFYXTE 영역을 암호하는 서열에 하이브리드하는 1종 이상의 프라이머 또는 축퇴성 프라이머는 표적 유기체의 코돈 유형에 근거하여 제조하고, 이것을 사용하여 표적 유기체에서 제조된 게놈 DNA 또는 cDNA 중의 TRT 유전자 서열을 증폭시킬 수 있다. 축퇴성 프라이머의 용법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, PCR의 어닐링 단계에서 염기 부정합이 허용되는 적당한 증폭(예컨대 PCR) 조건 하에 표적 유기체의 코돈 선호도와 유형을 고려하여 표적 모티프의 아미노산을 충분히 암호할 수 있는 핵산 서열 군에 하이브리드하는 프라이머 군도 동시에 사용해야 한다. 보통, 2가지 프라이머 군을 사용하는 것이 일반적이지만, 단일 프라이머(또는 이 경우에는 단일 축퇴성 프라이머 군) 증폭계도 잘 알려져 있고 이를 사용하여 TRT 유전자를 생성할 수 있다.
표 1은 신규 TRT 핵산, 구체적으로 척추 동물(예컨대 인간과 기타 다른 포유동물) 유래의 핵산을 증폭시키는데 사용할 수 있는 본 발명의 프라이머 예를 제공한 것이다. "N"은 모두 4가지 뉴클레오티드의 등몰 혼합물이고, 괄호안의 뉴클레오티드는 특정 뉴클레오티드의 등몰 혼합물이다.
TRT 핵산 증폭용 축퇴성 프라이머의 예
모티프 방향 5'-서열-3'
aFFY VTE 순방향 TT(CT)TT(CT)TA(CT)GTNACNGA
bFFY VTE 역방향 TCNGTNAC(GA)TA(GA)AA(GA)AA
cRF IPK P 순방향 (CA)GNTT(CT)AT(ACT)CCNAA(AG)CC
dRF IPK P 역방향 GG(TC)TTNGG(TGA)AT(GA)AANC
e AYD TI 순방향 GCNTA(CT)GA(CT)ACNAT
f AYD TI 역방향 TANGT(GA)TC(GA)TANGC
gG IPOG 순방향 GGNAT(ACT)CCNCA(AG)GG
hG IPOG S 역방향 (GC)(AT)NCC(TC)TGNGG(TGA)ATNCC
i LVDDF L 순방향 (CT)TNGTNGA(CT)GA(CT)TT(CT)(CT)T
jDD FL LVT 역방향 GTNACNA(GA)NA(GA)(GA)AA(GA)TC(GA)TC
바람직한 프라이머 조합(y=예, n=아니오)
순방향 역방향 b d f h i
a- b- e- g- i- n y y y y n n y y y n n n y y n n n n y n n n n n
1가지 구체예로서, 증폭된 TRT 핵산은 콜로니 하이브리드화용 하이브리드화 프로브로서 표적 유기체로부터 제조한 라이브러리(예, cDNA 라이브러리)에 대해 사용하면 전체 TRT 단백질 암호 서열을 가진 핵산이나 이것의 실질적인 부분을 동정하고 분리 또는 클로닝할 수 있다. 이와 같은 시약 및 방법을 본 명세서에 기재된 방법에 따라 사용하여 다음에 상세히 설명되는 옥시트리차 트리팔락스(Oxytricha trifallax ) 및 테트라히메나 서모필라(Tetrahymena thermophila )의 TRT 유전자 서열을 얻었다. 그 다음 종래 특성규명되지 않은 TRT 유전자를 클로닝한 후 그 서열을 통상의 방법으로 분석하고, 이로부터 암호화된 폴리펩티드를 합성한 뒤, 텔로머라제 촉매 활성과 같은 TRT 활성을 분석하는 것은 당업자에게는 통상적인 것이다(본 명세서에 기재된 방법 및/또는 당해 기술 분야에 공지된 텔로머라제 분석법 이용).
또한, TRT 유전자는 본 발명의 다양한 클로닝 방법을 사용하여 클로닝할 수 있는데, 그 이유는 이와 같은 다양한 방법에 TRT 모티프 서열과 이 서열을 포함하는 본 발명의 핵산을 사용할 수 있기 때문이다. 예컨대, 실시예 1에 기재된 바와 같이 공지의 TRT 서열을 기본으로 한 프로브를 사용하여 표적 유기체 유래의 DNA 또는 기타 다른 핵산 라이브러리에 대한 하이브리드화를 실시할 수 있다. 전술한 바와 같은 축퇴성 PCR 프라이머 또는 이들의 증폭 생성물은 표지화된 뒤 하이브리드화 프로브로서 사용할 수 있다. 다른 구체예로서, 발현 클로닝 방법도 사용할 수 있다. 예컨대, FFYXTE 모티프와 같은 TRT 모티프 또는 기타 다른 TRT 에피토프에 전개되어 있는 펩티드에 특이적으로 결합하는 1종 이상의 항체를 사용하면 TRT 단백질과 이를 암호하는 mRNA를 포함하는 리보솜 복합체를 분리할 수 있다. 이와 같은 본 발명의 항체를 생성하기 위한 펩티드 면역원은 일반적으로 길이가 6개 내지 30개의 아미노산, 보다 일반적으로 길이가 약 10개 내지 20개의 아미노산인 것이 보통이다. 이 항체는 목적 유기체 유래의 cDNA 발현 라이브러리를 탐침하여 TRT 서 열을 암호하는 클론을 동정하는 경우에도 사용할 수 있다. 다른 구체예로서, 공지의 TRT에 보존적인 서열을 포함하는 DNA에 대하여 DNA 데이터베이스를 컴퓨터 조사하면 TRT 서열을 포함하는 클론을 동정할 수 있다.
1 양태로서, 본 발명은 천연 TRT 단백질의 아미노산 서열을 보유하는 분리되거나 또는 재조합된 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 보통, 천연 TRT는 분자량이 약 80,000 달톤(D) 내지 약 150,000 D 사이이고, 가장 일반적으로 약 95,000 D 내지 약 130,000 D 사이이다. 일반적으로, 천연 TRT는 pH7에서 순 양전하를 띤다(pI는 보통 9 보다 큰 것으로 측정됨)이다. 1가지 구체예로서, 이 폴리펩티드는 본 명세서에 기재된 바와 같은 텔로머라제 활성을 나타내는 것을 특징으로 한다. 이와 관련된 구체예로서, 상기 폴리펩티드는 TRT 특이적 영역(T 모티프) 서열을 보유하고 텔로머라제 활성을 나타내는 것을 특징으로 한다. 또한, 본 발명은 상기 폴리펩티드의 단편을 제공한다. 본 발명은 TRT 단백질을 암호하는 천연 유전자 서열을 보유하는 분리되거나 재조합된 폴리뉴클레오티드를 제공하기도 한다. 본 발명은 포유동물(예컨대 쥐 또는 인간)과 같은 척추 동물과 무척추 동물(예, 효모) 유래의 TRT 서열을 분리하는데 유용한 시약을 제공한다. 이와 같이 분리된 폴리뉴클레오티드는 다른 천연 발생이거나 재조합되거나 또는 합성된 벡터 핵산 서열에 결합될 수 있다. 보통, 분리된 핵산은 길이가 약 300 kb 이하, 일반적으로 약 50 kb 미만, 보다 일반적으로 약 20 kb 미만, 보다 더 일반적으로 약 10 kb 미만이며, 때로는 약 5 kb 미만이나 2 kb 미만일 수도 있다. 일부 구체예에서 분리된 TRT 폴리뉴클레오티드는 길이가 약 1 kb 미만이나 0.1 kb 미만의 유전자 단편이나 프라이 머 또는 프로브와 같이 매우 작은 경우도 있다.
III. 핵산
A) 개요
본 발명은 유프로테스, 테트라히메나, S.폼베 또는 인간 유래의 재조합 TRT 유전자와 같이 텔로머라제 촉매성 서브유닛 단백질(TRT)을 암호하는 폴리뉴클레오티드 서열을 보유하는 분리된 핵산 및 재조합된 핵산을 제공한다. 폴리뉴클레오티드의 예는 도 13A 및 도 13B(유프로테스), 도 15A 내지 도 15F(S.폼베) 및 도 16(인간, GenBank 수탁 번호 AF015950)에 도시된다. 본 발명은 프로브, 프라이머, TRT 단백질 암호성 폴리뉴클레오티드 등을 비롯하여 TRT 유전자 서열을 보유하는 센스 폴리뉴클레오티드 및 안티센스 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
B) 인간의 TRT
본 발명은 인간 유래의 텔로머라제 촉매성 서브유닛(즉, hTRT)의 서열을 보유하는 핵산을 제공한다.
제1 양태로서, 본 발명은 인간의 TRT 유전자 또는 RNA의 서열이나 준서열을 보유하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 1가지 구체예로서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 도 16에 도시한 서열 번호 1의 서열이나 이의 준서열을 보유한다. 다른 구체예로서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 3(도 18), 서열 번호 4(도 20) 또는 이의 준서열을 가진 서열을 포함한다. 또한, 본 발명은 본 명세서에 개시된 hTRT 핵산 서열, 예컨대 서열 번호 1(도 16), 서열 번호 4(도 20), 서열 번호 6(도 21A 내지 도 21E) 및 서열 번호 7에 기재된 서열을 비롯한 핵산 서열과 실질적인 서열 동 일성을 가진 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 따라서, 본 발명은 인간 TRT 유전자에 대한 천연 발생의 대립유전자 및 본 명세서에 개시된 hTRT 핵산 서열에 대해 1개 이상의 뉴클레오티드가 결실, 삽입 또는 치환된 변이 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다. 다음에 상세히 설명되는 바와 같이, 변이 핵산은 이하에 기재된 재조합법이나 합성 방법 또는 기타 다른 수단을 통해 제조할 수 있다.
또한, 본 발명은 인간의 TRT 유전자에 인접한 영역의 서열을 보유하는 분리형 및 재조합형 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 이와 같은 폴리뉴클레오티드에는 hTRT mRNA의 비해독 영역에 존재하는 게놈 서열에서 유래된 것을 포함한다. 게놈 서열의 예는 도 21A 내지 도 21E(서열 번호 6)에 도시하였다. 실시예 4에 기재된 바와 같이 서열 번호 6은 인간의 게놈 라이브러리에서 분리된 클론 λGΦ5를 서열 분석하여 얻은 것이다. λGΦ5는 hTRT 암호 서열의 5'쪽 서열 중 약 13,000개 염기를 포함하는 15 kbp(킬로염기쌍)의 삽입체를 포함한다. 이 클론은 hTRT 프로모터 서열과 기타 다른 hTRT 유전자 조절 서열(예, 인헨서)을 포함한다.
또한, 본 발명은 인간의 TRT 유전자의 인트론 영역에서 유래된 서열을 보유하는 분리형 및 재조합형 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 인트론 서열의 예는 도 21A 내지 도 21E(서열 번호 7, 실시예 3 참조)에 도시하였다. 일부 구체예에서 hTRT 인트론은 진핵 세포에서 나타나는 hTRT 단백질의 발현율을 증가시키기 위해 "미니유전자" 중에 포함되기도 한다.
이와 관련된 양태로서, 본 발명은 수사, 변이 및 변형된 hTRT 폴리펩티드를 비롯하여 hTRT 단백질이나 단백질의 단편을 암호하는 폴리뉴클레오티드를 제공한 다. 1가지 구체예로서, 암호화된 hTRT 단백질이나 이의 단편은 도 17(서열 번호 2)에 기재된 아미노산 서열이나, 서열 번호 2의 보존적 치환을 가진 아미노산 서열을 보유한다. 1가지 구체예로서, 암호화된 hTRT 단백질이나 단편은 이 단백질의 활성(예컨대, 텔로머라제 촉매 활성)을 변화시키는 치환을 보유한다.
hTRT 단백질을 암호하는 핵산은 유전자 암호의 축퇴 결과로, 천연 발생의 hTRT 유전자의 서열을 보유할 필요는 없으며, 복수의 폴리뉴클레오티드가 서열 번호 2의 아미노산 서열을 보유하는 hTRT 폴리펩티드를 암호할 수 있다. 본 발명은 공지된 3개의 유전자 코드에 따라 제조할 수 있는 가능한 코돈의 선택에 기초한 조합체들을 선택하여 제조할 수 있는 다양한 각각의 뉴클레오티드 서열을 제공하며, 이와 같은 변형체들은 본 명세서에 구체적으로 개시하였다. 따라서, 몇몇 경우에는 천연 서열의 뉴클레오티드 서열과 하이브리드할 수 있는(적당하게 선택된 엄중 조건 하에) hTRT 폴리펩티드 암호 뉴클레오티드 서열이 바람직하지만, 다른 경우에는 실질적으로 다른 코돈 유형을 이용하고 그 결과 천연 발생의 서열을 가진 핵산에는 하이브리드하지 않는 hTRT를 암호하는 뉴클레오티드 서열을 만드는 것이 유리할 수도 있다.
또 다른 구체예로서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 hTRT 핵산의 준서열을 포함하는 hTRT 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드를 제공한다(예컨대, 서열 번호 1 및 6). 본 발명의 핵산은 보통 예시된 hTRT 폴리뉴클레오티드 중 최소 약 10개, 보다 일반적으로 최소 약 12개 또는 약 15개 연속 염기를 포함하는 것이 일반적이다. 종종, 본 발명의 핵산은 예컨대 폴리펩티드 또는 전길이 hTRT 단백질을 발현시키고자 하는 경우 길이가 최소 약 25개, 약 50개, 약 100개, 약 200 또는 최소 약 500개 내지 3000개 염기와 같은 긴 서열을 포함할 수도 있다.
다른 구체예로서, 본 발명은 pGRN121에서 발견되는 182개 뉴클레오티드 서열을 포함하지 않는(클론 712562에도 존재하지 않은), 서열 번호 3 또는 서열 번호 4와 같은 천연 발생 또는 비천연 발생의 hTRT 폴리뉴클레오티드와 동일하거나 상보적인 서열을 보유하는 "Δ182hTRT" 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 이 폴리뉴클레오티드는 pGRN121에 의해 암호되는 것과 같이 "전길이" hTRT 폴리펩티드(서열 번호 2)에서 발견되는 것과 다른 TRT 모티프의 조합이나 배열을 포함하는 폴리펩티드를 암호하기 때문에 본 발명의 일부로서 바람직한 것이다. 하기 상세히 설명되는 바와 같이 상기 폴리펩티드는 천연에서 생물학적 역할(예, 세포에서 텔로머라제 발현의 조절)을 할 수 있고(또는) 치료제(예컨대, 야생형 단백질의 기능을 억제하는 우성 음성형 생성물)로서의 용도를 나타내거나, 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 기타 다른 역할과 용도를 나타낼 것으로 예상된다.
예컨대, pGRN121에 의해 암호된 폴리펩티드와는 달리 클론 712562는 분자량 계산치가 약 30 kD인 259개 잔기의 단백질을 암호한다(이하, "712562 hTRT"라 부름). 이 712562 hTRT 폴리펩티드[서열 번호 10(도 19)]는 모티프 T, 1, 2 및 A를 포함하지만 모티프 B', C, D 및 E는 포함하지 않는다(도 4 참조). 이와 유사하게, 치료 활성 및 기타 다른 활성을 보유하는 변이 hTRT 폴리펩티드는 클론 712562에 누락된 182개 염기쌍이 결실된 것을 제외하고는 pGRN121 cDNA와 유사한 핵산, 예컨대 도 20에 도시된 서열(서열 번호 4)을 가진 핵산으로 부터 발현될 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 통상의 합성 방법이나 재조합 방법을 사용하여 합성할 수 있는 상기 핵산(이하, "pro90 hTRT")은 서열 번호 1에 기재된 서열에 의해 암호화된 hTRT 단백질과 동일한 아미노 말단 서열을 공유하지만 카르복시 말단 영역이 다른 807 잔기의 단백질(계산된 분자량 약 90 kD)을 암호한다(pro90hTRT의 처음 763 잔기는 공통이고, 마지막 44 잔기는 "전길이" hTRT와 다름). pro90hTRT 폴리펩티드는 모티프 T, 1, 2 및 A를 포함하지만 모티프 B, C, D, E는 포함하지 않으며, 따라서 모든 텔로머라제 활성은 아니지만 약간의 텔로머라제 활성을 보유할 수 있다.
C) 인간 TRT 핵산의 제조
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 비제한적으로 hTRT 또는 이의 단편을 암호하는 폴리펩티드 발현용, 천연 발생의 hTRT 유전자 또는 RNA를 하이브리드화 및/또는 증폭하기 위한 센스 또는 안티센스 프로브 또는 프라이머로서의 용도(예컨대, 진단용 또는 예후용) 및 치료제 용도(예컨대, 안티센스 조성물, 3본쇄 조성물 또는 리보자임 조성물에 함유)를 비롯한 다양한 용도를 보유한다. 본 명세서를 통해 명백히 알 수 있는 바와 같이 상기 용도들은 세포계 생성물의 성장, 증식 및 제조 뿐만 아니라 노화, 암 및 생식과 관련된 인간의 질병을 진단 및 치료하는데 상당한 영향을 미칠 것이다. 이하에 기재된 바와 같이 본 발명의 hTRT 핵산은 당해 기술 분야에 공지된 기법을 사용하여 제조할 수 있다(예컨대, 클로닝, 합성 또는 증폭).
1) 클로닝, 증폭 및 재조합체 생성
1가지 구체예로서, hTRT 유전자 또는 cDNA는 hTRT mRNA, cDNA 또는 게놈 DNA 에 특이적으로 하이브리드하는 핵산 프로브를 사용하여 클로닝한다. 이 목적에 적합한 1가지 프로브는 도 16에 도시된 서열(서열 번호 1) 전체 또는 일부를 가진 폴리뉴클레오티드, 예컨대 상기 서열의 준서열을 포함하는 프로브이다. 일반적으로 표적 hTRT 게놈 DNA 또는 cDNA는 벡터(예컨대, 플라스미드, 파지, 바이러스, 효모 합성 염색체 등)에 결찰시킨 뒤, 게놈이나 cDNA 라이브러리(예컨대 인간의 태반 cDNA 라이브러리)로부터 분리할 수 있다. 일단 hTRT 핵산을 확인한 후에는 당해 기술 분야에 공지된 표준 방법에 따라 분리할 수 있다. hTRT 유전자에 대한 인간 cDNA 라이브러리를 선별하는 일예는 실시예 1에 기재되어 있으며, 이와 유사하게 인간의 게놈 라이브러리를 선별하는 일예는 실시예 3과 4에 예시되어 있다. 클로닝 방법은 공지되어 있으며, 예컨대 문헌[Sambrook et al.(1989) MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2ND ED., VOLS.1-3, COLD SPRING HARBOR LABORATORY(이하 "샘브룩"으로 부름); Berger and Kimmel(1987) METHODS IN ENZYMOLOGY, VOL.152: GUIDE TO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES, San Diego: Academic Press, Inc.; Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York(1997); Cashion et al., 미국 특허 제5,017,478호; 및 Carr, 유럽 특허 제0,246,864호]을 참조하라.
또한, 본 발명은 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)과 같은 증폭 방법으로 분리된 hTRT 게놈 또는 cDNA 핵산을 제공한다. 1가지 구체예로, hTRT 단백질의 암호 서열은 프라이머 5'-GTGAAGGCACTGTTCAGCG-3'("TCP1.1") 및 5'-CGCGTGGGTGAGGTGAGGTG-3("TCP1.15")을 사용하여 RNA 또는 cDNA 시료[예컨대, 이본쇄 태반 cDNA(미국 캘리 포니아주 팔로 알토에 소재하는 클론테크 제품)]로부터 증폭시킨다. 일부 구체예에서는 특이성을 증가시키기 위한 목적으로 예컨대 "네스트형 PCR"용으로 제3의 프라이머 또는 제2의 프라이머 쌍을 사용할 수 있다. 제2의 프라이머 쌍의 일예는 5'-CTGTGCTGGGCCTGGACGATA-3'("billTCP6") 및 5'-AGCTTGTTCTCCATGTCGCCGTAG-3'("TCP1.14")이다. 이외에도, hTRT 핵산을 증폭시키는데 유용한 기타 다른 많은 프라이머와 프라이머 조합을 사용할 수 있음은 당업자라면 충분히 이해할 것이다.
더욱이, 본 발명은 임의의 특정 영역(예컨대, 암호 영역, 프로모터 영역 및/또는 인트론)을 증폭시키는 프라이머 또는 hTRT 게놈 DNA, cDNA 또는 RNA의 준서열을 증폭시키는 프라이머를 제공한다. 예컨대, 서열 번호 1의 위치 274/275에 있는 hTRT 인트론(실시예 3 참조)은 프라이머 TCP1.57과 TCP1.52(프라이머 제1쌍)를 사용하거나 프라이머 TCP1.49와 TCP1.50(프라이머 제2쌍)을 사용하여 증폭시킬 수 있다(예컨대, 게놈 클론 검출용)[프라이머 명칭은 하기 표 2에 기재된 프라이머를 참조하라]. 이 프라이머 쌍은 각각 사용하거나 또는 프라이머 제1쌍을 먼저 사용하는 네스트형 PCR로 사용할 수 있다. 또 다른 일예는 hTRT mRNA의 5' 말단이나 hTRT 유전자의 5' 말단을 암호하는 엑손을 특이적으로 증폭시켜 검출하는 프라이머이다(예컨대 cDNA 클론의 크기 또는 완전성 측정용 프라이머). 이와 같이 hTRT의 5' 말단을 증폭시키는데에는 다음과 같은 프라이머 쌍이 유용하다. 즉, 프라이머 K320과 K321(프라이머 제3쌍); 프라이머 K320과 TCP1.61(프라이머 제4쌍); 프라이머 K320과 K322(프라이머 제5쌍)이다. 이 프라이머 군은 제5쌍, 그 다음 제4쌍이나 제3쌍의 순으로 또는 제4쌍이나 제5쌍 후 제3쌍의 순으로 네스트형 PCR에 사용할 수 있 다. 또 다른 예시적인 예로는 mRNA 중 대략 중간의 3번째 영역을 포함하는 보존적 hTRT TRT 모티프 영역을 증폭하거나 특이적으로 검측하기 위해 선택한 프라이머를 포함한다(예컨대, 인간을 제외한 유기체로부터 TRT 클론을 동정하기 위한 하이브리드화 프로브용). hTRT 핵산의 TRT 모티프 영역을 증폭하는데에는 다음과 같은 프라이머 쌍, 즉 프라이머 K304과 TCP1.8(프라이머 제6쌍) 또는 프라이머 LT1과 TCP1.15(프라이머 제7쌍)가 유용하다. 이 프라이머 군들은 제6쌍, 그 다음 제7쌍의 순으로 네스트형 PCR 실험에 사용할 수 있다.
적합한 PCR 증폭 조건은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있는데, 예컨대 Taq 폴리머라제(미국 코네티컷주 노르워크에 소재하는 퍼킨 엘머 제품) 1 유니트, 각 dNTP(dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 100 μM, 1x PCR 완충액(50 mM KCl, 10 mM Tris, pH 8.3, 실온, 1.5 mM MgCl2 , 0.01젤라틴) 및 0.5 μM 프라이머를 포함하고, 증폭 반응은 94 ℃에서 45 초, 55 ℃에서 45초 및 72 ℃에서 90초로 구성되는 사이클을 약 30회 진행시키며, 이와 같은 조건에만 국한되는 것은 아니다. 당업자라면 기타 다른 열안정성 DNA 폴리머라제, 반응 조건 및 순환 파라미터들도 역시 적합한 증폭을 제공할 수 있다는 것을 알고 있을 것이다. hTRT 핵산을 얻는데 사용할 수 있는 기타 적합한 시험관내 증폭 방법은 이하 본 명세서에 기재된 것을 포함하며, 이것에만 국한되는 것은 아니다. hTRT 핵산은 일단 증폭되면 통상적인 분자생물학 기법을 사용하여 다양한 벡터 중 임의의 벡터에 클로닝하거나 본 발명의 방법에 따라 검출되거나 이용될 수 있다.
전술한 바와 같이 얻은 클로닝되거나 증폭된 hTRT 핵산은 화학적 합성법이나 이.콜리[예, 전술한 문헌(Ausubel et al.) 참조] 같은 박테리아계 또는 포유류 같은 진핵생물 발현계의 형질전환을 통한 복제와 같은 방법으로 제조하거나 전파시킬 수 있다. 이와 유사하게, hTRT RNA는 본 발명의 시험관내 방법이나, 예컨대 T7, T3 또는 SP6과 같은 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 프로모터를 함유하는 시판용 벡터를 이용한 이.콜리와 같은 박테리아계 또는 RNA 폴리머라제 프로모터를 포함하는 프라이머를 이용한 PCR 증폭으로 생성된 DNA의 전사를 통해 발현될 수 있다.
또한, 본 발명은 변이 또는 수사된 hTRT 핵산을 제공한다. 이와 같이 얻어진 클로닝되거나 증폭된 hTRT 핵산은 당해 기술 분야에 공지된 방법(예컨대 부위 지시성 돌연변이유발법, 링커 스캐닝 돌연변이유발법)을 통해 수사(예컨대, 절두, 유도체화, 변이)되거나 또는 다음에 기재되는 바와 같이 새로 간단히 합성할 수 있음을 당업자라면 충분히 알고 있을 것이다. 이와 같이 변이 또는 수사된 hTRT 핵산은 다양한 용도에 사용할 수 있는데, 그 예로는 hTRT 유전자 또는 유전자 생성물의 클로닝이거나 조작을 용이하게 하는 용도 또는 변형 hTRT 유전자 생성물을 발현하는데 사용되는 용도를 포함하며, 이것에만 국한되는 것은 아니다. 예컨대, 1가지 구체예로서 hTRT 유전자 서열은 이하에 상세히 토의되는 바와 같이, 예컨대 hTRT의 보존적 모티프를 변이시켜 변이된 성질이나 활성을 가진 hTRT 폴리펩티드를 암호하도록 변이시킨다. 다른 일예로서, hTRT 핵산 중 단백질 암호 영역을 돌연변이시켜 글리코실화 패턴 변이, 코돈 선호성 변화, 접목 변형체 생성, 프로테아제 감응성 부위의 제거, 항원성 도메인의 형성, 특이 활성의 변화 등을 도입할 수도 있다. 다른 구체예에서, 암호된 아미노산 서열은 변이시키지 않고 hTRT를 암호하는 뉴클레오티 드 서열과 이것의 유도체를 변화시켜, 예컨대 천연 서열에서 생성되는 전사체에 비하여 증가된 해독 효율이나 증가 또는 감소된 반감기와 같은 보다 바람직한 성질을 갖는 RNA 전사체를 얻을 수 있다. 또 다른 구체예에서는 숙주가 이용하는 특정 코돈의 빈도수에 따라 변이된 코돈을 선택하여 특정 원핵이나 진핵 발현 숙주에서 발생되는 그 펩티드의 발현율을 증가시킬 수도 있다. 본 발명의 변이 hTRT 폴리뉴클레오티드를 제조하는데 사용할 수 있는 유용한 시험관내 재조합 기법과 생체내 재조합 기법은 문헌[Sambrook et al. 및 Ausubel et al., 전술한 문헌 설명 참조]에 개시되어 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명은 hTRT 유전자의 인접(5' 또는 3') 서열과 인트론 서열을 보유하는 핵산을 제공한다. 이 핵산은 특히 hTRT 조절에 관여하고 hTRT 및 기타 다른 재조합 단백질이나 RNA 유전자 생성물의 발현에 유용한 프로모터 및 기타 다른 조절 인자를 포함하기 때문에 바람직하다. 서열 번호 6 및 7에 기재된 핵산 서열외에도, 또 다른 hTRT 인트론과 인접 서열 역시 통상의 분자생물학 기법에 따라 용이하게 얻을 수 있다는 것은 자명한 것이다. 예컨대, 전술한 바 있고 실시예 4에 기재되는 바와 같은 람다 클론 G
Figure 111999002929091-pct00004
5(ATCC 수탁 번호 209024)로부터 또 다른 hTRT 게놈 서열을 얻을 수 있다. 이외에도 다른 hTRT 게놈 클론 및 서열은 서열 번호 1에 기재된 서열이나 이의 준서열을 보유하는 hTRT 핵산 프로브를 사용하여 인간의 게놈 라이브러리를 선별하면 얻을 수 있다. 또 다른 클론과 서열(예컨대, 멀리 떨어진 상류 서열)은 적당한 라이브러리를 탐침하도록 λG
Figure 111999002929091-pct00005
5로부터 유래되는 서브클론이나 표지된 서열을 사용하면 얻을 수 있다. hTRT 인접 서열을 추가 특성 규명하기 위한 기타 유용한 방법으로는 문헌[Gobinda et al., 1993, PCR Meth.Applic. 2:318; Triglia et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16:8186; Lagerstrom et al., 1991, PCR Methods Applic. 1:111; 및 Parker et al., 1991, Nucleic Acids Res. 19:3055]에 기재된 일반적인 방법을 포함한다.
인트론 서열은 예컨대 hTRT cDNA 서열과 hTRT 게놈 서열을 비교(예컨대 실시예 3 참조)하거나, S1 분석(전술한 Ausubel et al., 문헌의 제4장 참조)이나 또는 당해 기술 분야에 공지된 다양한 방법과 같은 통상의 방법으로 확인할 수 있다. 인트론 서열은 프리mRNA(즉, 비접목형 또는 불완전한 접목형 mRNA 전구체)에 존재할 수 있는데, 이 서열은 세포성 RNA를 역전사한 후 증폭하거나 또는 클로닝할 수도 있다.
필요한 경우, 클로닝되거나 증폭되거나 또는 합성된 hTRT 핵산이나 기타 다른 TRT 핵산 서열은 당해 기술 분야에 공지된 DNA 서열 분석 방법을 사용하여 측정하거나 입증할 수 있다(예컨대, 전술한(Ausubel et al., 문헌 참조). 유용한 서열 분석 방법에는 DNA 폴리머라제 I의 클리나우 단편, 시쿼나제(미국 오하이오주 클리브랜드에 소재하는 US Biochemical Corp 제품), Taq DNA 폴리머라제(미국 코네티컷주 노르워크에 소재하는 퍼킨 엘머 제품), 열안정성 T7 폴리머라제(미국 일리노이주 시카고에 소재하는 아머샴 제품), 또는 기브코 BRL(미국 매릴랜드주 게터스버그에 소재)에서 시판하는 ELONGASE 증폭 시스템과 같은 재조합 폴리머라제와 프루프리딩 엑소뉴클레아제의 조합물과 같은 효소를 이용한다. 올리고뉴클레오티드(예컨대 화학 합성법으로 새로 만든 올리고뉴클레오티드) 서열을 서열분석하거나 입증하 고자 하는 경우에는 맥삼 및 길버트 방법이 바람직하다(Maxam and Gilbert, 1980, Meth.Enz. 65:499; 전술한 Ausubel et al., 문헌, 제7장 참조).
hTRT 또는 기타 다른 TRT mRNA의 5' 비해독 서열은 mRNA를 역전사한 다음, 생성되는 cDNA를 클로닝하고 서열분석하는 방법과 같은 표준 방법을 사용하여 "전길이" hTRT 또는 cDNA를 클로닝하여 직접 서열 결정할 수 있다. 크기별로 선별되어 보다 긴 cDNA를 포함하는 전 길이 cDNA는 선별이나 증폭에 있어 바람직한 올리고(dT)-프라이밍된 라이브러리가 좋다. 또한, 무작위로 프라이밍된 라이브러리 역시 적합한데, 종종 유전자의 5' 영역을 포함하는 클론이 다량 포함되기도 한다. 또한, 5' RNA 서열을 얻기 위하여 기타 다른 공지의 방법, 예컨대 문헌(Frohman et al., 1988, Proc.Nat.Acad.Sci USA 85:8998)에 기재된 바와 같은 RACE 프로토콜을 사용할 수도 있다. 필요한 경우, hTRT 또는 기타 다른 TRT mRNA의 전사 개시 부위는 본 명세서에 기재된 핵산(예컨대, 서열 번호 1에 기재된 서열을 보유하는 핵산)을 사용하여 통상의 방법에 따라 서열 분석할 수 있다. 1가지 방법은 서열 번호 1에 기재된 서열의 5' 영역 서열을 보유하는 표지된 DNA를 사용하는 S1 뉴클레아제 분석법(Ausubel et al., 상기 문헌 설명 참조)이다.
2) 핵산의 화학 합성법
본 발명은 직접 화학 합성법으로 제조되는 hTRT 폴리뉴클레오티드(RNA, DNA 또는 수사됨)를 제공한다. 화학 합성법은 일반적으로 올리고뉴클레오티드 또는 비표준 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드와 폴리뉴클레오티드(예컨대, 프로브, 프라이머 및 안티센스 올리고뉴클레오티드)를 생성하는데 바람직하다. 핵산 의 직접 화학 합성법은 당해 기술 분야에 공지된 방법으로 실시할 수 있는데, 예컨대 문헌[Narang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:90]에 기재된 포스포트리에스테르 방법; 문헌[Brown et al., Tetra. Lett., 22:1859(1981)]에 기재된 포스포디에스테르 방법; 문헌[Beaucage et al., Meth.Enzymol. 68:109(1979)에 기재된 디에틸포스포아미다이트 방법; 및 미국 특허 제4,458,066호에 기재된 고상 지지체 방법을 포함한다. 화학 합성법은 주로 1본쇄 올리고뉴클레오티드를 생성하고, 이것은 상보 서열과의 하이브리드화 또는 DNA 폴리머라제와 주형으로 1본쇄를 사용한 올리고뉴클레오티드 프라이머에 의한 중합을 통해 2본쇄 DNA로 전환될 수 있다. 이와 같은 DNA의 화학 합성법은 종종 약 100개 또는 150개 염기의 서열에만 제한되는 바, 보다 긴 서열을 얻기 위해서는 짧은 서열의 결찰이나 보다 정교한 합성 방법을 사용해야 한다는 것은 당업자라면 충분히 알고 있을 것이다.
본 발명의 hTRT(또는 hTR이나 기타) 폴리뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드는 목적하는 성질(예컨대, 뉴클레아제 내성의 증가, 보다 결속된 결합, 안정성 또는 바람직한 TM )을 갖도록 비표준 염기(예컨대, 아데닌, 시티딘, 구아닌, 티민 및 우리딘 이외의 다른 염기)나 비표준 백본 구조를 사용하여 제조할 수 있다는 것은 자명한 것이다. 올리고뉴클레오티드에 뉴클레아제 내성을 부여하는 기법은 PCT 공개 번호 WO 94/12633에 기재된 것을 포함한다. 수사된 각종 유용한 올리고뉴클레오티드로는 예컨대 펩티드-핵산(PNA) 백본을 보유하는 올리고뉴클레오티드(Nielsen et al., 1991, Science 254:1497) 또는 2'-O-메틸 리보뉴클레오티드, 포스포로티오에이트 뉴클레오티드, 메틸 포스포네이트 뉴클레오티드, 포스포트리에스테르 뉴클 레오티드, 포스포로티오에이트 뉴클레오티드, 포스포아미데이트를 병입시킨 올리고뉴클레오티드 등을 제조할 수 있다. 기타 다른 유용한 올리고뉴클레오티드는 2' 위치에 다음 중 1가지를 포함하는 알킬 및 할로겐 치환된 당 부를 포함할 수 있다: OH, SH, SCH3 , F, OCN, OCH3 OCH3 , OCH3 O(CH2 )n CH3 , O(CH2 )n NH2 또는 O(CH2 )n CH 3 (여기에서 n은 1 내지 약 10임); C1 내지 C10 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알카릴 또는 아르알킬; Cl; Br; CN; CF3 ; OCF3 ; O-알킬, S-알킬 또는 N-알킬; O-알케닐, S-알케닐 또는 N-알케닐; SOCH3 ; SO2 CH3 ; ONO2 ; NO2 ; N 3 ; NH2 ; 헤테로시클로알킬; 헤테로시클로알카닐; 아미노알킬아미노; 폴리알킬아미노; 치환된 실릴; RNA 절단기; 콜레스테릴 기; 폴레이트기; 리포터 기; 삽입제; 올리고뉴클레오티드의 약력학적 성질을 개선시키기 위한 기; 또는 올리고뉴클레오티드 및 이와 유사한 성질을 가진 치환체의 약동학적 성질을 개선시키기 위한 기. 올리고뉴클레오티드의 흡수를 용이하게 하기 위하여, 임의의 뉴클레오시드의 2' 위치 또는 3' 말단이나 5' 말단 뉴클레오시드의 3' 위치 또는 5' 위치에 각각 폴레이트, 콜레스테롤 또는 기타 다른 기, 예컨대 지질 유사체를 직접 또는 링커를 통해 접합시킬 수 있다. 이와 같은 접합체는 1종 이상 사용할 수도 있다. 또한, 올리고뉴클레오티드는 펜토푸라노실 기 대신에 시클로부틸과 같은 당 모의체를 보유할 수 있다. 또 다른 구체예에서는 이노신과 같은 1종 이상의 수사된 염기 형태나 "보편 염기"를 포함하거나, 또는 퀘오신 및 우이부토신과 같은 비표준 염기 뿐만 아니라 내인성 엔도뉴클레아제에 의해 쉽게 인식되지 않는 아데닌, 시티딘, 구아닌, 티민 및 우리딘의 아세틸 수사 형태, 메틸 수사 형태, 티오 수사 형태 및 기타 유사한 변형 형태가 병입될 수 있다. 또한, 본 발명은 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 메틸포스포네이트, 포스포아미데이트, 알킬 포스포트리에스테르, 설파메이트, 3'-티오아세탈, 메틸렌(메틸이미노), 3'-N-카르바메이트, 모르폴리노 카르바메이트, 키랄 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬이나 시클로알킬의 당 사이 결합을 보유하는 뉴클레오티드, 단쇄 헤테로원자 또는 헤테로고리 당 사이("백본") 결합, 또는 CH2 -NH-O-CH2 , CH2 -N(CH3 )-OCH2 , CH2 -O-N(CH3 )-CH2 , CH2 -N(CH 3 )-N(CH3 )-CH2 및 O-N(CH3 )-CH2 -CH2 백본(포스포디에스테르가 O-P-O-CH2 인 경우) 또는 이들의 혼합 형태와 같은 백본 유사체를 보유하는 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 또한, 모르폴리노 백본 구조를 보유하는 올리고뉴클레오티드도 유용하다(미국 특허 제5,034,506호 참조).
이에 대한 유용한 참조 문헌은 다음과 같다. 문헌[Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, edited by F.Eckstein, IRL Press at Oxford University Press(1991); Antisense Strategies, Annals of the New York Academy of Sciences, Volume 600, Eds. Baserga and Denhardt(NYAS 1992); Milligan et al., 9 July 1993, J.Med.Chem. 36(14); 1923-1937; Antisense Research and Applications(1993, CRC Press), 이 문헌 전체 참조, 특히 제15장 참조, Sanghvi, 표제 "Heterocyclic base modifications in nucleic acids and their applications in antisense oligonucleotides" Antisense Therapeutics, ed. Sudhir Agrawal(Humana Press, Totowa, New Jersey, 1996)]을 참조하라.
D) 핵산 표지화
hTRT 또는 기타 다른 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 핵산 프로브로서 사용하고자 하는 경우에 본 발명의 핵산은 표지화하는 것이 유용하다. 표지(하기 참조)는 당해 기술 분야에 공지된 다양한 방법 중 임의의 방법으로 병입시킬 수 있다. 1가지 구체예로서, 증폭되지 않는 핵산(예컨대, mRNA, 폴리A mRNA, cDNA)을 표지한다. 표지된 핵산을 제조하는 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있고, 예컨대 닉 해독, 무작위 프라이머 표지화, 말단 표지화(예컨대, 키나제 사용) 및 화학적 접합(예컨대, 포토비오티닐화) 또는 합성법을 포함한다. 다른 구체예로서, 표지는 동일한 핵산을 제조하는 증폭 단계 동안 동시적으로 병입시킨다. 따라서, 예컨대 표지된 프라이머 또는 표지된 뉴클레오티드를 이용한 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 또는 기타 다른 핵산 증폭 방법은 표지된 증폭 생성물을 제공할 것이다. 또 다른 구체예로서, 표지된 뉴클레오티드(예컨대, 플루오레세인 표지된 UTP 및/또는 CTP)를 이용한 전사 증폭 방법은 전사된 핵산에 표지를 병입시킨다. 또한, 증폭 생성물은 증폭 완료 후 표지될 수도 있다.
E) 올리고뉴클레오티드의 예
전술한 바 있고 이하에도 상세히 설명되는 바와 같이, 올리고뉴클레오티드는 프라이머, 프로브, 치료용 또는 기타 다른 용도의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 3본쇄 올리고뉴클레오티드 및 본 명세서를 통해 명백히 알 수 있는 바와 같은 기타 다른 다양한 용도에 사용된다. 표 2는 본 발명을 실시하는데 사용할 수 있는 구체적인 올리고뉴클레오티드의 예를 제공한다. 이와 같이 각종 유용한 올리고뉴클레오 티드는 당업자라면 본 명세서에 제공된 안내에 따라 합성할 수 있다.
표 2에서, "seq"는 프라이머가 사용되었거나 또는 서열 분석에 유용함을 의미하고, "PCR"은 프라이머가 사용되었거나 PCR에 유용함을 의미하며, "AS"는 프라이머가 사용되었거나 텔로머라제 활성의 안티센스 억제에 유용함을 의미하고, "CL"은 프라이머가 사용되었거나 hTRT 유전자 또는 RNA의 클로닝 영역에 유용함을 의미하며, "mut"는 프라이머가 사용되었거나 또는 hTRT 유전자 또는 유전자 생성물의 돌연변이체를 작제하는데 유용함을 의미한다. "UC"는 대문자, "lc"는 소문자를 의미한다. 부정합 및 삽입 영역(서열 번호 1과 비교)한 경우는 밑줄로 표시하였다. 결실부는 "-"로 표시하였다. 표 2에 기재된 임의의 특정 올리고뉴클레오티드는 그 용도를 어떤 1가지 용도 또는 임의의 용도 군으로 한정하는 것이 아니라는 것은 자명한 것이다.
[표 2]
Figure 112002031940913-pct00029
Figure 111999002929091-pct00030
Figure 111999002929091-pct00032
Figure 111999002929091-pct00033
IV. TRT 단백질 및 펩티드
A) 개론
본 발명은 구체적으로 텔로머라제 활성의 생성, 세포 중의 텔로머라제 활성 억제, 항hTRT 면역 반응의 유도, 치료 시약으로, 진단 분석시 표준물이나 대조군, hTRT 또는 텔로머라제의 활성을 활성화하거나 억제할 수 있는 화합물 선별시의 표적, 및 당업자에게 자명하거나 그외에 본 명세서에 상세히 기재된 바와 같은 다양한 많은 용도에 유용한 각종 hTRT 단백질을 제공한다. 본 발명의 hTRT는 다음에 예시적인 목적으로 보다 상세히 설명되는 천연 hTRT 및 텔로머라제의 기능적 활성 중 1가지, 몇가지, 또는 전체 활성을 나타내는 기능적 활성 단백질(예컨대 텔로머라제 음성 세포에 대하여 텔로머라제 활성을 부여하는데 유용함)과 이의 변형체, 불활성 변형체(예컨대, 세포 중의 텔로머라제 활성을 억제하는데 유용함), hTRT 폴리펩티드 및 텔로머라제 RNP(예컨대, 단백질을 포함하는 리보뉴클레오단백질 복합체)를 포함한다.
1가지 구체예로서, 본 발명의 hTRT 단백질은 도 17(서열 번호 2)에 기재된 서열이나 이의 단편을 보유하는 폴리펩티드이다. 다른 구체예로서, hTRT 폴리펩티드는 아미노산 잔기의 내부 결실, 삽입 또는 보존적 치환으로 서열 번호 2에 기재된 서열과 다른 서열이다. 이와 관련된 구체예로서, 본 발명은 서열 번호 2에 기재된 서열과 실질적인 유사성을 보유한 hTRT 폴리펩티드를 제공한다. 또한, 본 발명은 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열에 대하여, 예컨대 절두, 돌연변이, 유도체화 또는 기타 다른 서열과 융합(예컨대, 융합 단백질 형성)을 통해 수사된 hTRT 폴리펩티드를 제공한다. 또한, 본 발명은 주형 RNA(예컨대, hTR)와 복합체를 형성한 본 발명의 hTRT 단백질을 포함하는 텔로머라제 RNP를 제공한다. 기타 다른 구체예로서, 1종 이상의 텔로머라제 결합형 단백질은 hTRT 단백질 및/또는 hTR과 결합되는 것이 특징이다.
또한, 본 발명은 서열 번호 5(도 20), 서열 번호 10(도 19)에 기재된 서열이나 이 서열과 실질적으로 유사한 서열을 보유한 단백질 및 이의 단편, 변형체 또는 유도체와 같은 기타 천연 발생의 hTRT 종이나 비천연 발생의 변형체를 제공한다.
본 발명은 기타 hTRT 종과 변형체를 제공하기도 한다. hTRT 변형체의 일예는 클론 712562(서열 번호 3[도 18])에 의해 암호화된 mRNA의 리보솜 구조이동이나 또는 서열 번호 4(도 20)에 도시된 pro90 변형 hTRT의 리보솜 구조이동으로부터 얻어질 수 있으며, 그 결과 모든 TRT 모티프를 포함하는 hTRT 폴리펩티드가 합성된다[일반적인 예로서, 예컨대 문헌(Tsuchihashi et al., 1990, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2516; Craigengen et al., 1987, Cell 50:1; Weiss, 1990, Cell 62:117) 참조]. 리보솜의 구조이동 돌연변이는 특정 mRNA 서열이나 2차 구조가 리보솜을 "정지"시킨 후 서열의 전후로 1개의 뉴클레오티드를 건너 뛰는 경우 발생할 수 있다. 따라서, 712562 mRNA에서의 리보솜 구조이동 약 523개 아미노산 잔기의 폴리펩티드를 합성한다. 또한, pro90 서열에서의 리보솜 구조이동은 약 1071개 잔기를 보유한 단백질을 생성한다. 이와 같이 리보솜 구조이동으로 얻어지는 단백질 역시 본 발명을 통해 제공된 합성 기법이나 재조합 기법으로 발현될 수 있다는 것은 자명한 것이다.
인간의 TRT 단백질, 펩티드 및 기능적 등가 단백질은 다음에 상세히 기재되는 바와 같은 정제, 화학 합성법 또는 재조합 생성법으로 얻을 수 있다.
B) TRT 단백질 활성
본 발명의 TRT 폴리펩티드(이의 단편, 변형체, 대립유전자 생성물 및 융합 단백질 포함)는 천연 hTRT가 나타내는 1종 이상의 또는 모든 기능 활성을 나타낼 수 있다. 특별한 경우를 제외하고는 본 명세서에 기재된 바와 같은 hTRT 또는 기타 다른 TRT 폴리펩티드는 회합된 RNA(예컨대 hTR)가 없는 hTRT 단백질이나 hTRT 회합된 RNA(예컨대 hTR) 복합체가 활성을 나타낸다면 특정 활성을 보유한 것으로 간주한다. hTRT의 hTR 결합 활성은 hTRT 단백질과 관련된 활성의 일예이다. 본 발명의 핵산(예컨대, hTR)과 hTRT 폴리펩티드의 복합체를 생성하는 방법은 다음에 상세히 설명하겠다.
hTRT 단백질이 천연의 hTRT 보다 여러 가지 활성을 나타내도록 변형시키는 방법(예컨대, hTRT 폴리펩티드를 암호하는 폴리뉴클레오티드의 돌연변이 또는 수사 방법이나 천연 폴리뉴클레오티드 서열과 다른 서열을 보유하는 폴리뉴클레오티드의 화학적 합성법을 비롯한 화학적 방법이나 재조합 방법)은 hTRT 또는 텔로머라제 활성의 특정 조절인자 선별용이나 치료적 용도에 유용하다. 또한, 각종 hTRT 활성을 측정하는 분석법은 텔로머라제 활성을 변화시키기 위해 hTRT 또는 텔로머라제와 상호작용하는 제제(예컨대, 활성 조절제)의 동정에 특히 유용하다.
다음에 상세히 설명되는 바와 같이 천연 hTRT의 활성으로는 텔로머라제 촉매 활성(진행성 또는 비진행성 활성); 텔로머라제 가공성; 종래 역전사효소 활성; 뉴클레오티드분해성 활성; 프라이머 또는 기질(말단소립이나 합성 텔로머라제 기질이나 프라이머) 결합 활성; dNTP 결합 활성; RNA(즉, hTR) 결합 활성 및 단백질 결합 활성(예컨대 텔로머라제 관련 단백질, 말단소립 결합 단백질 또는 단백질-말단소립 DNA 복합체에 대한 결합)을 포함한다. 또한, 본 발명은 어떤 특정 hTRT 활성 없이 hTRT 또는 기타 다른 TRT 단백질(예컨대, 일반적으로 짧은 특정 면역원성 펩티드, 억제성 펩티드)과 관련된 일부 유용한 활성을 보유한 hTRT 조성물을 제공하기도 한다.
1) 텔로머라제 촉매 활성
본 명세서에 사용된 바와 같은 본 발명의 폴리펩티드는 주형 핵산(예컨대, hTR)에 의해 암호화된 서열(예컨대, TTAGGG)을 그 부분 서열이나 1 반복체 서열 또는 1 이상의 반복체 서열로 첨가하여 텔로머라제 기질로서 작용하는 DNA 프라이머를 신장시킬 수 있다면 "텔로머라제 촉매 활성"을 보유하는 것이다. 이 활성은 가 공성이거나 비가공성일 수 있다. 가공성 활성은 텔로머라제 RNP가 프라이머 또는 텔로머라제에 다중 반복체를 첨가한 후 DNA가 효소 복합체를 해리시키는 경우에 나타난다. 비가공성 활성은 텔로머라제가 프라이머에 부분 서열이나 또는 단지 1 반복체를 첨가하고 그 후 해리되는 경우에 나타난다. 하지만, 생체내 비진행성 반응은 결합, 신장 및 해리의 과정을 연속 순환시켜 다중 반복체를 첨가한다. 이와 같은 반응은 시험관내에서도 일어날 수 있지만, 표준 분석 조건에서는 텔로머라제 양보다 프라이머 양이 훨씬 많은 몰량이기 때문에 표준 분석법에서는 관찰되지 않는 것이 일반적이다.
비가공성 활성을 보유하는 hTRT 폴리펩티드의 특성 규명을 위해 비가공성 반응에 유리한 조건, 예컨대 고온(즉, 35 내지 40 ℃, 일반적으로 37 ℃), dGTP 저농도(1 μM 또는 그 이하), 프라이머 고농도(5 μM 또는 그 이상) 및 dATP/TTP 고농도(2 mM 또는 그 이상)[온도와 dGTP 농도는 일반적으로 가장 큰 영향을 미침] 조건하에 종래 텔로머라제 반응을 실시한다. 가공성 활성을 보유하는 hTRT 폴리펩티드의 특성 규명을 위해서는 진행성 반응에 유리한 조건(예컨대, 27 내지 34 ℃, 일반적으로 30 ℃), dGTP 고농도(10 μM 또는 그 이상), 프라이머 저농도(1 μM 또는 그 이하) 및/또는 dATP와 TTP 저농도(0.3 mM 내지 1 mM)[온도와 dGTP 농도가 일반적으로 가장 중요함] 조건하에 종래 텔로머라제 반응을 실시한다. 그 외에, TRAP 분석법(가공성 또는 중간 가공성 활성) 또는 점 블롯 분석법과 겔 블롯 분석법(가공성 활성)을 사용할 수도 있다. 본 발명의 hTRT 폴리펩티드는 가공성 활성이 아닌 비가공성 활성을 보유할 수 있거나(예컨대, hTRT 폴리펩티드의 변화가 전좌하는 성 질을 감소시키거나 제거함), 단독 가공성이거나 또는 두가지 활성을 모두 보유할 수 있다.
a) 비가공성 활성
비가공성 텔로머라제 촉매 활성은 DNA 프라이머의 3' 말단이 RNA 주형에 어닐링한 위치에서 부터 주형 서열의 5' 말단까지 DNA 프라이머를 신장시킬 수 있고, 통상 첫 G 잔기를 첨가하면 종결된다(예컨대 주형이 hTR인 경우). 하기 표에 기재된 바와 같이 첨가된 뉴클레오티드의 정확한 수는 TTAGGG 반복 서열 중 프라이머의 3' 말단 뉴클레오티드의 위치에 따라 달라진다.
비가공성 활성
i) ---------TTAGGGttag (DNA) 3'----AUCCCAAUC--------5' (RNA)
ii) ---------TTAGggttag (DNA) 3'-----AUCCCAAUC--------5' (RNA)
DNA에서 UC = 프라이머, lc = 첨가된 뉴클레오티드
따라서, --TTAGGG 프라이머(i)에는 4개의 뉴클레오티드가 첨가되고 --TTGA 프라이머(ii)에는 6개의 뉴클레오티드가 첨가된다. 가공성 반응에서 텔로머라제에 의해 첨가되는 제1 반복체는 이 단계에서는 동일하지만, 가공성 반응인 경우 텔로머라제는 3' 말단이 해리된 후 다른 반복체의 첨가를 자극하기에 충분한 위치에서 주형의 3' 영역에 재결합되는 전좌 단계를 수행한다(Morin, 1997, Eur.J.Cancer 33:750 참조).
완전 비진행성 반응은 단일 합성 프라이머를 사용하는 종래 분석법에서 단지 1개의 밴드를 생성한다. 이와 같은 결과는 말단 전이효소 활성과 같은 다른 효소에 의해서도 나타나기 때문에 일부 용도에서는 생성물이 텔로머라제 촉매 활성의 결과 물임을 입증하는 것이 필요할 것이다. 텔로머라제(hTRT 포함)에 의해 생성된 밴드는 다른 여러가지 특성을 통해 구별할 수 있다. 프라이머 말단에 첨가되는 뉴클레오티드 수는 프라이머 3' 말단의 위치에 따라 일정해야 한다. 따라서, --TTAGGG 프라이머에는 4개의 뉴클레오티드를 첨가해야 하고, --TTAG 프라이머에는 6개의 뉴클레오티드를 첨가해야 한다(상기 참조). 실제로 총 길이는 동일하지만 5' 말단점과 3' 말단점이 상이한 2개 이상의 서열이 과돌연변이된 프라이머도 사용할 수 있다. 일예로서, 프라이머 5'-TTAGGGTTAGGGTTAGGG 및 5'-GTTAGGGTTAGGGTTAGG의 비가공성 신장은 절대 길이가 뉴클레오티드 1개 차이인 생성물을 생성할 것이다(5'-TTAGGGTTAGGGTTAGGG에 4개가 첨가된 총 22 nt 길이 및 5'-GTTAGGGTTAGGGTTAGG에 5개가 첨가된 총 23 nt 길이). 또한, 반응에 필요한 뉴클레오티드는 프라이머 말단의 위치에 따라 일정해야 한다. 즉, --TTAGGG 프라이머 생성물은 dCTP를 제외한 dGTP, TTP 및 dATP를 필요로 하며, --AGGGTT 프라이머 생성물은 TTP 또는 dCTP를 제외한 dGTP와 dATP를 필요로 한다. 이 활성은 hTR을 분해하여 주형을 제거하는 조건하에서 RNAase 또는 마이크로코커스 뉴클레아제 예비처리에 민감하다[문헌(Morin, 1989, Cell 59:521) 참조].
b) 가공성 활성
사실상, 가공성 활성은 종래 분석법, TRAP 분석법 또는 겔블롯 분석법에서 관찰되는 6개 뉴클레오티드의 밴드를 통해 쉽게 관찰된다. 점블롯 분석법도 사용할 수 있으나, 이 방법으로는 밴드를 관찰할 수 없다. 종래 분석법은 본 명세서에 참고 인용되는 문헌[Morin, 1989, Cell 59:521]에 기재되어 있다. TRAP 분석법은 미 국 특허 제5,629,154호, PCT 공개 WO 97/15687, PCT 공개 WO95/13381, Krupp et al. Nucleic Acids Res., 1997, 25:919, 및 Wright et al., 1995, Nuc.Acids Res. 23:3794(각각 본 명세서에 참고 인용됨)에 기재되어 있다. 점 블롯 분석법은 활성을 검측하는데 사용된 (CCCUAA)n 프로브를 안정하게 하이브리드화하는데 필요한 반복체를 3개 이상 첨가하지 않는 비가공성 활성을 화합물이나 hTRT 변형체로 시험하여 동일한 가공성이 생성되는지, 즉 프로브가 추정상의 텔로머라제 기질을 검측한 후, 화합물이나 변이체가 비가공성 활성을 가공성 활성으로 변화시킬 수 있는지를 측정하는 방식으로 사용할 수 있다. 가공성 텔로머라제 촉매 활성을 검측하는 기타 분석법으로, 예컨대 문헌(Tatematsu et al., 1996, Oncogene 13:2265)에 기재된 바와 같은 스트레치 PCR 분석법을 사용할 수도 있다. 겔블롯 분석법은 종래 분석법과 점블롯 분석법을 조합한 방법으로 사용할 수도 있다. 이의 변형예로서, 종래 분석법은 방사능표지된 뉴클레오티드를 첨가함이 없이 dGTP의 고농도(예컨대, 0.1 내지 2 mM) 존재하에 실시한다. 종래 분석법을 실시한 후, 합성된 DNA는 변성 PAGE로 분리한 후 막(예컨대, 니트로셀룰로스)으로 전이시킨다. 그 후, 말단소립 DNA(텔로머라제 생성물 - 연장된 텔로머라제 프라이머 또는 기질)는 표지된 말단소립 DNA 프로브(예컨대, 상기 점블롯 분석법에 사용된 바와 같은 CCCTAA 서열을 포함하는 프로브)를 사용한 하이브리드화와 같은 방법으로 검출할 수 있다. 이 기법의 장점은 종래 분석법보다 감응성이 크고, 합성된 단편의 크기와 반응의 가공성에 대한 정보를 제공한다는 점이다.
c) 활성 측정
hTRT 폴리펩티드의 텔로머라제 활성은 시험관내 또는 생체내에서 발현된 후, 미정제 상태, 부분 정제된 상태 또는 실질적으로 정제된 상태의 hTRT 폴리펩티드(예, hTR과 회합된 상태)를 사용하여 측정할 수 있다. 예컨대, 세포(예, 본 발명의 재조합 hTRT 폴리펩티드를 발현하는 세포) 중의 텔로머라제 활성은 말단소립의 길이가 증가 또는 감소되는지를 검측하여 분석할 수 있다. 텔로머라제 촉매 활성에 대한 일반적인 분석법은 hTR과 복합체를 형성한 hTRT를 사용하여 실시한다. 또한, 이외에 다른 텔로머라제 주형 RNA를 치환 사용하거나 또는 텔로머라제 프라이머 결합성과 같은 기타 활성을 측정하는 분석법을 실시할 수도 있다. 말단소립의 길이를 측정하는 분석법은 당해 기술 분야에 공지되어 있는데, 예컨대 말단소립 DNA에 대한 프로브의 하이브리드화(증폭 단계를 포함할 수 있음) 및 TRF 분석법, 즉 제한 효소로 분해 후 말단소립 DNA 제한 단편(TRF)을 분석하는 분석법을 포함한다[PCT 공개 번호 WO 93/23572 및 WO 96/41016; Counter et al., 1992, EMBO J.11:1921; Allsopp et al., 1992, Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 89:10114; Sanno, 1996, Am J Clin Pathol 106:16 및 Sanno, 1997, Neuroendocrinology 65:299 참조].
hTRT 폴리펩티드의 텔로머라제 촉매 활성은 전술한 분석법과 기타 텔로머라제 촉매 활성 분석법을 사용하여 다양한 방법으로 측정할 수 있다. 1가지 방법에 따르면, hTRT 단백질은 hTR이 발현되는 텔로머라제 음성의 인간 세포(즉, 일반적으로는 세포 중에서 또는 재조합 발현을 통해 생성)에서 발현되고(예컨대, 이하에 상세히 설명됨), 그 다음 상기 세포 또는 세포 용해물에서 텔로머라제 활성의 존재 또는 부재가 측정된다. 적합한 텔로머라제 음성 세포의 예는 IMR 90(ATCC, #CCL-186) 또는 BJ 세포(인간의 포피 섬유아세포주, 예컨대 Feng et al., 1995, Science 269:1236 참조)이다. 기타 다른 예로는 레티날 착색된 상피 세포(RPE), 인간 배꼽 정맥 내피 세포(HUVEC; ATCC #CRL-1730), 인간 대동맥 내피 세포(HAEC; Clonetics Corp, #CC-2535) 및 인간 유방 상피 세포(HME; Hammond et al.,1984, Proc.Nat'l.Acad.Sci. USA 81:5435; Stampfer, 1985, J.Tissue Culture Methods 9:107)를 포함한다. 또 다른 구체예로서, hTRT 폴리펩티드를 텔로머라제 양성 세포에서 발현시키고(예컨대, hTRT 발현 벡터로 형질감염시킴), 형질감염되지 않은 대조 세포에 비하여 상기 세포의 텔로머라제 활성이 증가되었는지를 관찰하여 상기 폴리펩티드가 텔로머라제 촉매 활성을 보유하는지를 검측한다. 일반적으로, hTRT를 발현하는 적합한 형질발현 벡터로 형질감염된 세포에서 나타나는 텔로머라제 촉매 활성은 유의적으로 증가하는데, 예컨대 형질감염되지 않은 세포(대조군)에 비하여 약 2배 이상, 약 5배 이상 또는 약 10배 내지 100배 이상, 또는 심지어 1000배 이상 증가할 것이다.
또다른 구체예로서, hTRT 단백질은 정제를 용이하게 하는 라벨이나 "에피토프 태그"를 보유한 융합 단백질(다음에 상세히 설명됨)로서 세포(예컨대, hTR이 발현되는 텔로머라제 음성 세포)에서 발현시킨다. 1가지 구체예로서, RNP는 태그를 특이적으로 인식하는 항체를 사용하여 세포로부터 회수한다. 바람직한 태그는 짧거나 소형인 것이 일반적이며, hTRT 폴리펩티드로부터 태그를 제거할 수 있는 절단 부위 또는 기타 성질을 포함할 수 있다. 적합한 태그의 예로는 XpressTM 에피토프(미국 캘리포니아주 산디에고에 소재하는 Invitrogen,Inc.) 및 항체 또는 핵산에 의 해 또는 실시예 6에 기재된 것과 같은 기타 등가의 방법으로 특이적으로 결합시킬 수 있는 기타 부를 포함한다. 그 외에 태그로는 예컨대 업스트림 서열에 메티오닌(신규) 개시 코돈이 삽입되어 있을 수 있는 서열 번호 2에 기재된 단백질의 해독을 개시하는 ATG 코돈의 상류에, 예컨대 서열 번호 1에 삽입된 서열에 의해 암호된 것을 포함한다.
hTRT 변형체를 세포에서 발현시키고(예컨대, 융합 단백질로서), 이어서 분리하는 경우(예컨대, 리보뉴클레오단백질 복합체로서), 분리된 복합체에는 기타 다른 세포 단백질(즉, 텔로머라제 회합성 단백질)이 회합되어 있는 경우도 있다. 이와 같은 경우에는 때로 hTRT, hTR 및 회합된 단백질을 포함하는 복합체의 텔로머라제 활성을 분석하는 것이 바람직하다.
2) 기타 다른 텔로머라제 또는 TRT 단백질 활성
본 발명의 hTRT 폴리펩티드에는 텔로머라제 촉매 활성은 없지만 텔로머라제의 활성 중 1가지 이상의 활성을 보유하는 변형체도 포함된다. 이와 같은 기타 활성과 이 활성을 측정하기 위한 본 발명의 방법에 대해서는 다음에 상세히 설명하겠으나, 이것에만 국한되는 것은 아니다.
a) 종래 역전사효소 활성
텔로머라제 종래 역전사효소 활성은 예컨대, 문헌[전술한 Morin, 1997, 문헌 과 Spence et al., 1995, Science 267:988 참조]에 기재되어 있다. hTRT는 역전사효소의 촉매 활성에 필요한 보존적 아미노산 모티프를 포함하기 때문에 hTRT는 특정 외인성(예컨대, 비hTR) RNA를 전사할 수 있는 성질을 보유한다. 종래 RT 분석법 은 어닐링형 DNA 프라이머를 신장시켜 RNA 주형을 전사하는 효소의 성질을 측정한다. 역전사효소 활성은 당해 기술 분야에 공지된 많은 방법으로 측정할 수 있는데, 예컨대 표지된 핵산 프라이머(예컨대, RNA 또는 DNA)의 크기 증가를 모니터하거나 또는 표지된 dNTP를 병입시켜 측정할 수 있다(예컨대, 전술한 Ausubel et al., 문헌 참조).
hTRT는 hTR과 특이적으로 결합하기 때문에 hTR 및/또는 말단소립 DNA 프라이머에 관한 특성을 보유하도록 종래 RT 분석법에 사용된 DNA 프라이머/RNA 주형을 변형시킬 수 있다는 것은 자명한 것이다. 예컨대, RNA는 서열(CCCTAA)n (여기에서, n은 1 이상 또는 3 이상, 또는 10 이상임)을 보유할 수 있다. 1가지 구체예로서, (CCCTAA)n 영역은 RNA의 5' 말단(텔로머라제 RNA 중 주형 영역의 5' 위치와 유사)이나 그 부근이다. 이와 유사하게, DNA 프라이머는 TTAGGG 말단소립 서열의 일부, 예컨대 Xn TTAG, Xn AGGG, Xn (TTAGGG)q TTAG(여기에서, X는 비말단소립 서열이고, n은 8 내지 20 또는 6 내지 30이고, q는 1 내지 4임) 등을 포함하는 3' 말단을 보유할 수 있다. 다른 구체예로서, DNA 프라이머는 RNA 주형에 비상보적인 5' 말단을 보유하고 있어, 프라이머가 RNA에 어닐링되었을 때 프라이머의 5' 말단은 비결합 상태로 유지된다. 이외에도, 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 표준 역전사 분석법에 대한 변형 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있다.
b) 뉴클레오티드분해 활성
텔로머라제 뉴클레오티드분해 활성에 대해서는, 예컨대 문헌(Morin, 1997, 상기 문헌 설명 참조; Collins and Grieder, 1993, Genes and Development 7:1364)에 개시되어 있다. 텔로머라제는 뉴클레오티드분해 활성을 보유하지만(Joyce and Steitz, 1987, Trends Biochem.Sci.12:288), 이 텔로머라제의 활성은 일정 특성을 갖고 있다. 텔로머라제는 DNA의 3' 말단이 DNA 주형 서열의 5' 경계에 위치하면 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에서 보통 단지 1개의 뉴클레오티드만을 우선적으로 제거하고, 인간과 테트라히메나의 경우 이 뉴클레오티드는 말단소립 반복체(인간의 경우 TTAGG)중 첫 G이다. 텔로머라제는 우선적으로 G 잔기를 제거하지만 다른 뉴클레오티드에 대해서도 뉴클레오티드분해 활성을 나타낸다. 이 활성은 모니터할 수 있다. 그 방법으로 본 명세서에는 2가지 방법을 예시한다. 첫번째 방법은 전체 주형 서열에 결합하는 프라이머(즉, 주형 경계에서 종결됨; 인간의 경우 5'-TAGGGATTAG)를 이용한 종래 텔로머라제 반응을 포함한다. 뉴클레오티드분해 활성은 분석법에 방사능표지된 dGTP를 제공하여 마지막 dG 잔기의 치환 여부를 모니터하여 관찰한다. 이와 같은 치환은 겔 전기영동과 자동방사능사진을 통해 출발 프라이머 크기의 밴드가 나타나는지 관찰하여 모니터한다.
바람직한 방법은 텔로머라제에 의해 신장될 수 없는 "차단된" 3' 말단을 보유한 DNA 프라이머를 이용하는 것이다. 3' 차단된 프라이머는 표준 텔로머라제 분석법에 사용할 수는 있지만 텔로머라제의 뉴클레오티드분해 활성에 의해 3' 뉴클레오티드가 제거되지 않는 한 신장되지 않을 것이다. 이 방법의 장점은 텔로머라제 활성이 여러 표준 방법 중 어떤 방법으로도 모니터할 수 있으며, 시그널이 강하고 정량하기가 쉽다는 점이다. 프라이머의 3' 말단을 차단하는 것은 여러가지 방법으 로 실시할 수 있다. 1가지 방법은 표준 올리고뉴클레오티드 합성 기법을 이용하여 프라이머의 3' 말단에 3'-데옥시-dNTP 잔기를 첨가하는 것이다. 이 말단은 텔로머라제에 필요한 3' OH가 아닌 2' OH를 보유한다. 기타 다른 3' 말단의 차단 방법은, 예컨대 3' 디데옥시 말단, 3'-아민 말단 등을 이용하는 것이다. hTRT 뉴클레오티드분해 분석법에 사용할 수 있는 프라이머의 예는 5'-TTAGGGTTAGGGTTA(G3'H )이며, 여기에서 마지막 잔기는 3'-데옥시-구아노신 잔기(Glen Research, 미국 버지니아주 스테링 소재)를 의미한다. 본 명세서에 개시된 내용을 근거로 한 적합한 프라이머에 대한 다양한 변형예는 당해 기술 분야에 공지되어 있다.
c) 프라이머(말단소립) 결합 활성
텔로머라제 프라이머(말단소립) 결합 활성에 대해서는, 예컨대 문헌(전술한 Morin, 1997, 문헌 참조; Collins et al., 1995, Cell 81:677;Harrington et al., 1995, J. Biol.Chem.270:8893)에 기재되어 있다. 텔로머라제는 말단소립의 DNA 프라이머에 결합하는 2 부위를 보유하는 것으로 추정된다. 프라이머 결합과 관련된 RT 모티프는 hTRT 및/또는 hTRT/hTR이 DNA 프라이머 결합 활성을 보유한다는 것을 시사한다. 프라이머 결합 활성을 분석하는 방법에는 여러가지가 있다. 이와 같은 방법들 대부분에 공통적인 단계는 적당한 결합 조건 하에서 표지된 DNA 프라이머를 hTRT 또는 hTRT/hTR이나 기타 TRT/TR 조합체와 항온처리하는 것이다. 또한, 대부분의 방법들은 비결합된 DNA를 단백질 결합된 DNA와 분리하는 수단을 이용하며, 이와 같은 방법들은 다음과 같다.
i) 겔 전이 분석법(전기영동/이동성 전이 분석법이라고도 부름)은 비변성 겔 을 이용한 전기영동으로 단백질 결합된 DNA 프라이머와 비결합된 DNA 프라이머를 분리하는 것이다(Ausubel et al., 전술한 문헌 설명 참조).
ii) 매트릭스 결합 분석법으로는 기본 기법에 여러가지 변형을 포함하는 것으로, 표지된 프라이머와 항온처리하기 전이나 항온처리한 후 매트릭스(예컨대, 니트로셀룰로스)에 hTRT 또는 hTRT/hTR 복합체를 결합시키는 단계를 포함한다. hTRT가 매트릭스에 결합하면 결합된 프라이머로부터 비결합된 프라이머를 기계적으로 분리할 수 있다. 남아있는 비결합된 DNA는 정량하기 전에 막을 세척하여 제거한다. 이와 같은 매트릭스, 고체 지지체 및 막에 단백질을 결합시키는 방법에는 여러가지 방법이 있다는 것은 당업자에게는 자명한 사실이고, 그 예로는 화학적, 광화학적, UV 가교, 항체/에피토프 및 비공유(소수성, 정전기성 등) 상호작용을 포함한다.
DNA 프라이머는 텔로머라제에 대해 친화성이 있는 모든 DNA일 수 있으며, 그 예로는 (TTAGGG)n 과 같은 말단소립 DNA 프라이머(여기에서 n은 1 내지 10일 수 있으며, 일반적으로 3 내지 5이다)를 들 수 있다. 이것의 3' 말단과 5' 말단은 반복 서열 중 어떤 위치에든지 위치할 수 있다. 또한, 이 프라이머는 표지화 또는 검출을 용이하게 할 수 있는 비말단소립 DNA의 5' 또는 3' 신장부를 보유할 수 있다. 또한, 이 프라이머는 예컨대 검출이나 분리가 용이하도록 유도체화될 수 있다.
d) dNTP 결합 활성
텔로머라제 dNTP 결합 활성에 대해서는 예컨대 문헌[전술한 Morin, 1997, 문헌과 전술한 Spence et al., 문헌 참조]에 개시되어 있다. 텔로머라제는 DNA를 합성하는데에 dNTP를 필요로 한다. hTRT 단백질은 뉴클레오티드 결합 활성을 보유하 고 있고, 기타 뉴클레오티드 결합 단백질과 유사한 방식으로 dNTP 결합을 분석할 수 있다(Kantrowitz et al., 1980, Trends Biochem.Sci. 5:124). 일반적으로, 표지된 dNTP 또는 dNTP 유사체의 결합은 비텔로머라제 RT 단백질을 이용한 당해 기술 분야에 공지된 방법대로 모니터할 수 있다.
e) RNA(즉, hTR) 결합 활성
텔로머라제 RNA(즉, hTR) 결합 활성에 대해서는 예컨대 문헌[전술한 Morin, 1997, 문헌 참조; Harrington et al, 1997, Science 275:973; Collins et al., 1995, Cell 81:677]에 개시되어 있다. 본 발명에 따른 TRT 단백질의 RNA 결합 활성은 표지된 RNA 프로브를 사용하여 전술한 DNA 프라이머 결합 분석법과 유사한 방식으로 분석할 수 있다. 결합된 RNA와 비결합된 RNA를 분리하고 RNA를 검출하는 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있고, 상기 DNA 프라이머 결합 분석법에 기재된 것과 유사한 방식으로 본 발명의 활성 분석에 적용할 수 있다. 이 RNA는 전길이 hTR, hTR의 단편 또는 텔로머라제나 hTRT에 대해 친화성을 보유하는 것으로 증명된 기타 RNA일 수 있다. 미국 특허 제5,583,016호 및 PCT 공개 번호 96/40868호를 참조하라.
3) 표적인 텔로머라제 모티프
본 발명은 전술한 바와 같이 완전한 활성 모두(전술함)를 보유하는 재조합 hTRT 외에도 천연 발생의 텔로머라제 또는 hTRT나 기타 다른 TRT 단백질의 텔로머라제 활성 중 일부 활성을 보유하는 hTRT 폴리펩티드를 제공한다. 본 명세서에 개시된 TRT의 텔로머라제 특이적 모티프와 RT를 고려해 볼 때 전술한 모티프 서열에 서 발견되는 바와 같은 보존적 아미노산 잔기의 변형 또는 변이는 치료용, 약물 선별용 및 특성규명용 등의 용도에 유용한 활성 상실(loss-of) 돌연변이를 만들 것이다. 예컨대, 실시예 1에 기재된 바와 같이 S.폼베 중에 존재하는 내인성 TRT 유전자의 RT 도메인 중 모티프 B 내지 D를 결실시킨 결과 말단소립이 점진적으로 단축되어 말단소립 반복체에 대한 말단소립 프로브의 하이브리드화를 거의 관찰할 수 없게 되고, 그 결과 텔로머라제 촉매 활성이 상실된 반수체 세포가 얻어졌다. 이와 유사하게, 모티프 E의 WxGxS 부위를 변형시키면 텔로머라제 DNA 프라이머 결합이나 기능에 영향을 미치게 된다. 또한, 모티프 A, B' 및 C 중에 존재하는 아미노산을 변형시키면 텔로머라제의 촉매 활성에 영향이 미치게 된다. hTRT 중 DD 모티프의 변이는 텔로머라제 활성을 유의적으로 감소 또는 상실시킬 수 있다(실시예 16 참조).
C) hTRT 및 기타 TRT 폴리펩티드의 합성
본 발명은 본 명세서에 개시된 hTRT 및 기타 TRT 폴리펩티드를 제조하는 다양한 방법을 제공한다. 다음 문항에서는 융합 단백질을 비롯한 hTRT 단백질의 화학적 합성법과 재조합 발현에 대하여 상세히 설명하겠다.
1) 화학적 합성법
본 발명은 당해 기술 분야에 공지된 일반적인 화학적 방법으로 전체 또는 일부가 합성된 hTRT 폴리펩티드를 제공한다(예컨대, Caruthers et al., 1980, Nucleic Acid Res.Symp.Ser., 215-223; and Horn et al., 1980, Nucleic Acids Res.Symp.Ser., 225-232). 예컨대, 펩티드 합성은 자동 합성법(예컨대, 제조자의 지시에 따라 Perkin Elmer ABI 431A Peptide Synthesizer 사용)을 비롯한 다양한 고상 기법(Roberge, et al., 1995. Science 269-202)으로 실시할 수 있다. 전길이 단백질이 필요한 경우, 단쇄 폴리펩티드는 1 분자의 아미노 말단과 다른 1 분자의 카르복시 말단을 축합시켜 형성되는 펩티드 결합을 통해 융합시킬 수 있다.
이와 같이 새로 합성된 펩티드는 정제용 고성능 액체 크로마토그래피[예컨대, Creighton, PROTEINS, STRUCTURES AND MOLECULAR PRINCIPLES, WH Freeman and Co, New York NY(1983)]로 실질적으로 정제할 수 있다. 합성 펩티드(또는 본 발명의 기타 다른 펩티드 또는 폴리펩티드)의 조성은 아미노산 분석이나 서열 분석(예, 에드만 분해법; Creighton, 상기 문헌 설명 참조)으로 확인할 수 있다. 중요한 것은, hTRT의 아미노산 서열이나 이의 일부 서열을 직접적 합성법 동안 변형시킬 수 있고(또는) 다른 단백질이나 기타 다른 성분 또는 이것의 일부분, 또는 임의의 용도를 위한 서열과 화학적 방법으로 결합하여 본 발명의 폴리펩티드 변형체를 얻을 수 있다는 점이다.
2) hTRT의 재조합 발현 및 기타 다른 TRT 단백질
본 발명은 시험관내(무세포), 생체외 또는 생체내(세포 또는 유기체계) 재조합 발현계를 이용하여 hTRT 폴리펩티드 및 핵산을 발현하는데 유용한 방법, 시약, 벡터 및 세포를 제공한다. 1가지 구체예로서, hTRT 단백질이나 이의 단편의 발현은 암호 서열을 적당한 발현 벡터(즉, 이용된 발현계에 필요한 삽입된 암호 서열의 전사 및 해독에 필수적인 인자를 포함하는 벡터)로 삽입하는 것을 포함한다. 따라서, 1가지 양태로서 본 발명은 본 발명의 hTRT cDNA 또는 유전자 중 최소 25개 뉴클레 오티드, 많은 용도에서 바람직하게는 50개 내지 100개 뉴클레오티드 또는 그 이상이 hTRT 유전자 암호 서열과 서열에 있어 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 이것은 프로모터에 작동가능하게 결합되어 hTRT 폴리펩티드를 발현할 수 있는 전사 유니트를 형성한다. 본 발명에 의해 제공된 hTRT 서열과 적당한 전사 또는 해독 조절 서열을 포함하는 발현 벡터를 작제하는 방법으로는 당해 기술 분야에 공지된 방법을 사용할 수 있다(예, Sambrook et al. 전술한 문헌 설명 참조, Ausubel et al., 전술한 문헌 설명 참조, 본 명세서 참조).
본 발명에 의해 제공된 hTRT 폴리펩티드로는 hTRT 폴리펩티드 또는 hTRT 단백질의 단편을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 이 융합 단백질은 일반적으로 재조합 방법으로 제조하지만, 화학적 합성법으로도 제조할 수 있다. 융합 단백질은 hTRT 폴리펩티드 작제물의 발현율을 향상시키거나 또는 다른 바람직한 성질, 예컨대 라벨(예, 효소적 리포터 기), 결합기 또는 항체 에피토프를 포함하는 hTRT 폴리펩티드를 생성하는데 유용할 수 있다. 일예로서, hTRT 및 개선된 녹색 형광성 단백질(EGFP) 서열을 포함하는 융합 단백질을 다음 실시예 15에 기재한다. 실시예 15와 기타 본 명세서에 논의되고 있는 사용예 및 적용예는 특정 융합 단백질에만 제한한 것이 아니라 각 융합 단백질의 용도에 대하여 예시한 것이다.
또한, 본 발명의 융합 단백질계는 hTRT 단백질이나 펩티드를 효과적으로 생성 및 분리하는데에도 사용할 수 있다. 예컨대, 일부 구체예로서 융합 단백질의 비hTRT 서열 중 일부는 고정화된 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 짧은 펩티드를 포함하여 융합 단백질을 비결합 성분(예컨대, 세포 용해물 중의 비관련 단백질)과 분리시킬 수 있다. 이와 같은 분자의 일예는 특정 항체에 결합되는 펩티드 서열이다. 다른 예는 니켈이나 구리 이온(즉, 금속 킬레이트 친화성 크로마토그래피)을 포함하는 수지에 결합할 수 있는 폴리히스티딘 트랙, 예컨대 (His)6 또는 히스티딘-트립토판 서열을 포함하는 펩티드이다. 기타 다른 예로는 고정화된 면역글로불린으로 정제할 수 있는 단백질 A 도메인이나 단편 및 FLAGS 신장/친화성 정제계(Immunex Corp, 미국 워싱톤주 시애틀에 소재)에 이용되는 도메인을 포함한다. 일부 구체예로서, 융합 단백질은 절단 부위를 포함하여, 비hTRT 펩티드 또는 단백질 서열로부터 hTRT 또는 기타 TRT 폴리펩티드 서열을 용이하게 분리할 수 있다. 이 경우, 절단은 화학적 절단(예, 시아노겐 브로마이드, 2-(2-니트로페닐설페닐)-3-메틸-3'-브로모인돌렌, 히드록실아민 또는 저pH)이거나 효소적 절단(예, 제Xa인자, 엔테로키나제)일 수 있다. 부분적으로 융합과 절단계는 발현되는 hTRT 폴리펩티드 일부분(즉, 서열)에 따라 선택할 수 있다. 융합 단백질은 일반적으로 문헌[Ausubel et al., 전술한 문헌 설명 참조, 제16장; Kroll et al., 1993, DNA Cell.Biol. 12:441 및 Invitrogen 1997 Catalog(미국 캘리포니아주 산디에고에 소재하는 Invitrogen Inc. 제품)]에 개시되어 있다. 기타 예로서 에피토프 태그 또는 태그와 절단 부위를 보유하는 본 발명의 융합 단백질은 다음 실시예 6에 상세히 설명되어 있다.
이 문항에서 논의되는 발현계는 hTRT 폴리펩티드의 발현에 촛점을 두고 있지만, 이와 동일 세포나 유사 세포, 벡터 및 방법을 사용하여 hTRT 폴리펩티드의 생성을 절대 필수 요건으로 하지 않는 센스 및 안티센스 폴리뉴클레오티드를 비롯한 본 발명의 hTRT 폴리뉴클레오티드를 발현시킬 수 있다는 것은 자명한 것이다. 일반적으로 폴리펩티드의 발현에는 적합한 개시 코돈(예컨대, 메티오닌), 오픈 리딩 프레임 및 해독 조절 시그널(예, 리보솜 결합 부위, 종결 코돈)을 필요로 하며, 이들은 단백질의 생성에 핵산 서열을 해독할 필요가 없는 경우에는 결실될 수도 있다.
hTRT 폴리펩티드와 폴리뉴클레오티드는 발현을 통해 본 발명에서 제공되는 여러 가지 관련 잇점을 제공할 수 있다. 예시적인 1가지 잇점은 hTRT 폴리펩티드를 발현 세포 중에서 후속적으로 분리할 수 있다는 것이다(예컨대, 텔로머라제 활성을 조절하는 화합물을 감별하기 위한 선별 용도 또는 백신 용도에 사용하기 위해 다량의 hTRT을 생산하기 위한 경우). 다른 1가지 잇점은 세포 중에서 hTRT를 발현시켜 세포의 표현형을 변화시킬 수 있다는 점이다(유전자 치료용에 사용하는 경우). 정제용 hTRT를 발현시키고자 하는 경우에는 비포유류 세포를 이용할 수 있는 반면, 세포가 나타내는 표현형을 변화시키기 위한 목적(예컨대 유전자 치료용으로 사용되는 경우 증식능을 변화시키기 위한 목적)인 경우에는 hTRT를 분리 및 정제하고 hTRT를 발현시키기 위해 진핵세포, 특히 포유류 세포(예컨대, 인간 세포)를 사용할 수 있다. 비제한적인 일예로서, 1가지 이상의 텔로머라제 활성(예컨대, 텔로머라제 촉매 활성)을 보유하는 hTRT 폴리펩티드를 숙주 세포에서 발현시켜 세포의 증식능을 증가시킬 수 있고(예컨대, 무한증식성 세포로 변화시킴), 이와 반대로 일반적으로 hTRT 안티센스 폴리뉴클레오티드 또는 억제성 폴리펩티드를 발현시키면 세포(예컨대, 텔로머라제 양성인 악성 종양 세포)의 증식능을 감소시킬 수 있다. 이외에도 구체적인 다양한 용도들에 대해서는 다음에 개시되며, 예컨대 치료용으로 본 발명 의 시약과 방법의 용도에 관하여 다음에 논의된다.
본 발명의 유용한 발현계(세포, 조절 인자, 벡터 및 발현)의 예로는 당해 기술 분야에 공지된 일반적인 방법에 따라 hTRT 폴리뉴클레오티드를 사용하는 망상적혈구 용해물 및 밀배아계와 같은 다양한 무세포계를 포함한다(예컨대, Ausubel et al., 전술한 문헌 제10장 참조). 다른 구체예로서, 본 발명은 원핵 세포 또는 진핵 세포에서 hTRT를 발현하기 위한 시약 및 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 박테리아, 진균, 식물, 곤충 및 당해 기술 분야에 공지된 인간 세포 발현계, 예컨대 분리된 세포, 세포주, 세포 배양물, 조직 및 전 기관을 포함하는 동물에서 발현될 수 있는 hTRT 폴리뉴클레오티드, 단백질, 단백질 준서열 또는 융합 단백질을 암호하는 핵산을 제공한다. 당업자에게는 자명한 것으로, 숙주 세포 또는 무세포 발현계로 도입된 hTRT 폴리뉴클레오티드는 보통 각 숙주 또는 무세포계에 적당한 발현 대조 서열에 작동가능하게 결합되어 있는 것이 일반적이다.
유용한 박테리아 발현계로는 이.콜리, 바실러스(예컨대 바실러스 서브틸리스), 기타 다른 엔테로박테리아시에(예컨대, 살모넬라, 세라티아 및 다양한 슈도모나스 종) 또는 기타 다른 박테리아 숙주[예컨대, 스트렙토코커스 크레모리스(Streptococcus cremoris ), 스트렙토코커스 락티스(Streptococcus lactis ), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus ), 류코노스톡 시트로보럼(Leuconostoc citrovorum ), 류코노스톡 메센테로이즈(Leuconostoc mesenteroides) , 락토바실러스 아시도필레스(Lactobacillus acidophilus) , 락토바실러스 락티스(Lactobacillus lactis) , 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve ) 및 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum )을 포함한다. 원핵 세포에 유용한 hTRT 발현 작제물로는 재조합 박테리오파지, 플라스미드 또는 코스미드 DNA 발현 벡터 등을 포함하며, 보통 프로모터 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 프로모터의 예로는 유도성 프로모터, 예컨대 lac 프로모터, Bluescript7 파지미드[미국 캘리포니아주 라졸라에 소재하는 스트라타진 제품) 또는 pSport1[Gibco BRL]의 하이브리드 lacZ 프로모터; 파지 람다 프로모터 시스템; 트립토판(trp) 프로모터 시스템 및 ptrp-lac 하이브리드 등을 포함한다. 박테리아 발현 작제물은 선택적으로 리보솜 결합 부위와 전사 종결 시그널 조절 서열을 포함한다. 발현에 유용한 특정 벡터의 예로는 pTrcHis2(미국 캘리포니아주 산디에고에 소재하는 인비트로겐 제품), pThioHis A, B & C 및 당해 기술 분야에 공지되어 있거나 개발될 수 있는 기타 종류를 포함한다(예컨대, Ausubel 참조). 박테리아의 유용한 벡터로는 hTRT-융합 단백질의 생성이 용이한 것을 포함한다. 박테리아 세포 중에서 융합 단백질을 고농도로 발현시키기에 유용한 벡터로는 전술한 바와 같은 Bluescript7(스트라타진 제품)과 같은 다중작용성 이.콜리 클로닝 및 발현 벡터를 포함하며, 이 벡터에는 hTRT 단백질, hTRT 융합 단백질 또는 hTRT 단편을 암호하는 서열이 아미노 말단의 Met과 이어서 β-갈락토시다제의 7개 잔기 서열과 프레임에 맞게 결찰되어 하이브리드 단백질을 형성할 수 있다(예컨대, pIN 벡터; Van Heeke and Schuster, 1989, J.Biol.Chem., 264:5503). 또한, 글루타치온 S-트란스퍼라제(GST)와의 융합 단백질로서 hTRT 단백질과 같은 이종 폴리펩티드를 발현시키고자 하는 경우에는 pGEX 벡터(예컨대, pGEX-2TK; 파마시아 바이오테크 제품)와 같은 벡터를 사용할 수 있다. 이와 같은 융합 단백질은 용해된 세포를 글루타치온-아가로스 비드에 흡착시킨 뒤 유리 글루타치온의 존재 하에 용출시켜 정제할 수 있다. 이와 같은 계에서 제조된 단백질은 엔테로키나제, 트롬빈 또는 제Xa 프로테아제 절단 부위를 포함하여, 목적하는 클로닝된 폴리펩티드를 GST 부로부터 마음대로 해리시킬 수 있고, 따라서 정제나 기타 다른 용도에 유용하다. 다른 예는 hTRT와 이.콜리 말토스 결합 단백질(MBP) 또는 이.콜리 티오레독신을 포함하는 융합 단백질이다. 박테리아 세포에 유용한 hTRT 발현 작제물의 예는 다음 실시예 6에 기재하였다.
본 발명은 진균계, 예컨대 딕티오스텔리움(Dictyostelium ), 바람직하게는 효모, 예컨대 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae ), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris ), 토룰롭시스 홀밀(Torulopsis holmil ), 사카로마이세스 프라질리스(Saccharomyces fragilis ), 사카로마이세스 락티스(Saccharomyces lactis ), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha ) 및 칸디다 슈도트로피칼리스(Candida pseudotropicalis)에서 발현되는 hTRT 폴리펩티드를 제공한다. 효모에서 hTRT를 발현시키는 경우, 적합한 벡터로는 플라스미드와 효모 인공 염색체(YAC) 벡터를 비롯한 다양한 벡터가 입수용이하다. 이 벡터들은 필요한 경우 발현 조절 서열, 예컨대 구성형 또는 유도형 프로모터(예컨대, 알파 인자, 알코올 산화효소, PGH 및 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 기타 해당작용 효소) 및 복제 오리진, 종결 서열 등을 포함하는 것이 일반적이다. 피키아에 사용할 수 있는 적합한 벡터로는 pPICZ, His6/pPICZB, pPICZ알파, pPIC3.5K, pPIC9K, pA0815, pGAP2A, B 및 C, pGAP2알파 A, B 및 C(미국 캘리포니아주 산디에고에 소재하는 인비트로겐 제품) 및 당해 기술 분야에 공지되거나 제조가능한 다양한 벡터를 포함한다. 1가지 구체예로서, 효모 피키아 파스토리스에서 His6 -hTRT 융합 단백질을 발현시키는 경우에는 벡터 His6/pPICZB(미국 캘리포니아주 산디에고에 소재하는 인비트로겐 제품)를 사용한다. 사카로마이세스에 유용한 벡터의 예는 pYES2(미국 캘리포니아주 산디에고에 소재하는 인비트로겐 제품)이다. 효모에 유용한 hTRT 발현 작제물의 예는 다음 실시예 6에 제시하였다.
또한, 본 발명의 hTRT 폴리펩티드는 식물이나 식물 바이러스 발현 벡터(예컨대, 꽃양배추 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV)로 형질감염되거나 박테리아 발현 벡터(예, Ti 플라스미드 또는 pBR322 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포계에서 발현될 수 있다. 식물 바이러스 발현 벡터를 사용하는 경우, hTRT 암호 서열은 다양한 프로모터를 사용하여 발현 유도할 수 있다. 예컨대, CaMV의 35S 및 19S 프로모터와 같은 바이러스 프로모터는 단독으로 사용하거나 또는 TMV 유래의 오메가 리더 서열과 조합하여 사용할 수 있다(Takamatsu et al., 1987, EMBO J., 6:307-311). 이 외에도, 예컨대 RUBISCO의 소 서브유닛 유전자 유래의 프로모터(Coruzzi et al., 1984, EMBO J., 3:1671-1680; Broglie et al., 1984, Science 224:838-843) 또는 열충격 프로모터(Winter and Sinibaldi, 1991, Results Probl.Cell Differ., 17:85) 또는 저장 단백질 유전자 프로모터와 같은 식물 프로모터를 사용할 수 있다. 이와 같은 작제물은 직접 DNA 형질전환법이나 병원균 매개의 형질감염법에 의해 식물 세포로 도입될 수 있다[이 기법에 관해서는 문헌(Hobbs or Murry, 1992, in McGRAW HILL YEARBOOK OF SCIENCE AND TECHNOLOGY McGRAW HILL NEW YORK NY, pp.191-196(1992); 또는 Weissbach and Weissbach, 1988, METHODS FOR PLANT MOLECULAR BIOLOGY, ACADEMIC PRESS, NEW YORK NY, pp.421-463)을 참조하라].
본 발명을 통해 제공되는 hTRT 단백질을 발현하는 다른 발현계로는 곤충계가 있다. 바람직한 계는 바큘로바이러스 폴리헤드린 프로모터를 이용한다. 이와 같은 발현계중 1가지는, 벡터로서 오토그라파 칼리포니카(Autographa californica ) 핵 다면성바이러스증 바이러스(AcNPV)를 사용하여 스포돕프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda ) 세포 또는 트리코플루시아(Trichoplusia ) 유생에서 이종 유전자를 발현시킨다. 이 바이러스의 비필수 영역, 예컨대 폴리헤드린 유전자 중으로 목적 유전자를 암호하는 서열을 클로닝하고 폴리헤드린 프로모터의 조절 하에 배치한다. 예컨대, hTRT 단백질을 암호하는 상기 서열이 성공적으로 삽입되면 폴리헤드린 유전자가 불활성화되고 외피 단백질이 결손된 재조합 바이러스가 얻어진다. 이와 같은 재조합 바이러스를 이용하여 S.프루기페르다 세포 또는 트리코플루시아 유생을 감염시키면 hTRT 서열이 발현된다[일반적 방법에 대하여 문헌(Smith et al., J.Virol., 46:584(1983); Engelhard et al., Proc.Natl.Acad.Sci. 91:3224-3227(1994))을 참조하라]. 바큘로바이러스 발현에 유용한 벡터로는 pBlueBacHis2A, B & C, pBlueBac4.5, pMelBacB 및 기타 당해 기술 분야에 공지되거나 개발가능한 다양한 벡터를 포함한다. 곤충 세포에서 유용한 hTRT 발현 작제물의 예는 다음 실시예 6에 제시하였다.
또한, 본 발명은 포유류 및 포유류 세포 중의 발현 계를 제공한다. 전술한 바와 같이 hTRT 폴리뉴클레오티드는 유의적인 양의 hTRT 폴리펩티드를 생성(예컨대, 정제)하거나 표적 세포의 표현형을 변화(예, 유전자 치료용, 세포 무한증식화 등)시키기 위한 목적으로 포유류 세포(예컨대, 인간 세포) 중에서 발현시킬 수 있다. 표현형을 변화시키고자 하는 경우, 발현되는 hTRT 폴리뉴클레오티드는 텔로머라제 촉매 활성을 보유하는 폴리펩티드를 암호하거나 암호하지 않을 수도 있다. 즉, 발현은 센스 또는 안티센스 폴리뉴클레오티드, 억제성 또는 자극성 폴리펩티드, 텔로머라제 활성이 없거나 1가지 또는 그 이상의 텔로머라제 활성을 보유하는 폴리펩티드 및 본 명세서에 개시되거나 이 개시 내용을 통해 당업자라면 용이 유추가능한 기타 다른 복합체 및 변형체로 얻어질 수 있다.
본 발명의 핵산을 발현하기에 적합한 포유류 숙주 조직 배양 세포로는 정상 유한증식성 또는 정상이나 비정상의 무한증식성 동물 또는 인간 세포를 포함하며, 그 예로는 SV40으로 형질전환된 원숭이 신장 CV1 주(COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주(293; Graham et al., J.Gen.Virol. 36:59(1977)); 어린 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10); CHO(ATCC CCL 61 및 CRL 9618); 마우스 세르톨리씨 세포[TM4, Mather, Biol.Reprod. 23:243-251(1980)]; 원숭이 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL 1587); 인간 경부 암종 세포(HeLa, ATCC CTL2); 개 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포(W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포(Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양(MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포(Mather, et al., Annals N.Y.Acad.Sci. 383:44-46(1982); MDCK 세포(ATCC CCL 34 및 CRL 6253); HEK 293 세포(ATCC CRL 1573); 및 WI-38 세포(ATCC CCL 75; ATCC 미국 모식균 배양 수집소, 미국 매릴랜드주 록빌 소재)를 포함한다. 포유류 조직 세포 배양물을 사용하여 폴리펩티드를 발현하는 방법은 문헌[Winnacker, FROM GENES TO CLONES(VCH Publishers, 미국 뉴욕주 뉴욕에 소재, 1987)]에 개괄적으로 기재되어 있다.
포유류 숙주 세포의 경우에는 바이러스계 발현계와 비바이러스계 발현계를 사용한다. 비바이러스 벡터 및 발현계로는 일반적으로 단백질이나 RNA를 발현할 수 있는 발현 카세트와 인간의 인공 염색체를 보유한 플라스미드와 에피솜 벡터를 포함한다(예컨대, Harrington et al., 1997, Nat Genet 15:345). 예컨대, hTRT 폴리뉴클레오티드와 폴리펩티드를 포유류(예컨대, 인간) 세포에서 발현하기에 유용한 비바이러스 벡터로는 pcDNA3.1/His, pEBVHis A, B & C(미국 캘리포니아주 산디에고에 소재하는 인비트로겐 제품), MPSV 벡터, 본 명세서에 참고 인용되는 인비트로겐의 1997년 카탈로그(미국 캘리포니아주 산디에고에 소재하는 인비트로겐 인코포레이티드)에 기재된 기타 벡터 및 다른 단백질에 사용되는 당해 기술 분야에 공지된 다양한 벡터를 포함한다. 포유류 세포에 유용한 hTRT 발현 작제물의 예는 다음의 실시예 6에 제시하였다.
유용한 바이러스 벡터로는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노관련 바이러스, 헤르페스 바이러스, SV40계 벡터, 파필로마 바이러스, HBP 엡스타인 바아 바이러스, 백시니아 바이러스 벡터 및 셈리키 포레스트 바이러스(SFV)를 기본으로 한 벡터를 포함한다. SFV 및 백시니아 벡터에 대해서는 전술한 문헌(Ausubel et al., 제16장)에 개괄적으로 기재되어 있다. 이 벡터는 종종 변형된 바이러스 게놈과 이를 둘러싼 외피 구조의 2 성분으로 구성되며(일반적으로 Smith, 1995, Annu.Rev.Microbiol. 49:807), 때로 바이러스 벡터는 바이러스 단백질 이외의 다른 단백질로 피복된 형태 또는 나출 형태로 도입된다. 하지만, 벡터 중의 바이러스 핵산은, 예컨대 유전자 치료용으로 디자인한 경우 다양한 방법으로 변형시킬 수 있다. 이와 같은 변형의 목적은 이용되는 포장 세포 또는 헬퍼 세포 중에서 벡터 형태로 계속 증식시키고, 바이러스 게놈 중에 외인성 DNA 서열을 삽입할 공간을 제공하며, 목적 유전자를 암호하고 적절하게 발현시킬 수 있는 신규 서열을 병입하면서 표적 세포 중에서 바이러스가 성장하지 못하도록 하기 위한 것이다. 따라서, 벡터 핵산은 일반적으로 2가지 성분, 즉 헬퍼 세포주에서 복제 및 포장에 사용되는 필수 시스 작용성 바이러스 서열과 외인성 유전자의 전사 유니트를 포함한다. 기타 바이러스 기능은 특정 포장 세포주 또는 헬퍼 세포주에서 트란스로 발현된다. 아데노바이러스 벡터(예컨대, 인간 유전자 치료용)에 대해서는 예컨대 문헌(Rosenfeld et al., 1992, Cell 68: 143; PCT 공개 번호 WO 94/12650; WO94/12649 및 94/12629호)에 기재되어 있다. 발현 벡터로서 아데노바이러스를 사용하는 경우에 hTRT를 암호하는 서열은 후기 프로모터 및 3부분 리더 서열을 포함하는 아데노바이러스 전사/해독 복합체에 결찰시킬 수 있다. 바이러스 게놈의 비필수 E1 또는 E3 영역에 삽입한 경우에는 감염된 숙주 세포에서 발현할 수 있는 생 바이러스를 얻을 수 있다(Logan and Shenk, 1984, Proc.Natl.Acad.Sci., 81:3655). 레트로바이러스 게 놈의 일부로서 치료용 폴리뉴클레오티드 서열을 수용하는 복제 결손성 레트로바이러스 벡터에 대해서는 예컨대 문헌[Miller et al., 1990, Mol.Cell.Biol. 10:4239; Kolberg, 1992, J.NIH Res. 4:43 및 Cornetta et al., 1991, Hum.Gene Ther. 2:215]에 개시되어 있다.
포유류 세포계에는 포유류 유전자 유래의 프로모터 또는 포유류 바이러스 유래의 프로모터가 종종 적당하다. 이 프로모터는 구성형, 세포형 특이적, 단계 특이적 및/또는 조절가능하거나 제어가능한(예컨대, 글루코코르티코이드와 같은 호르몬에 의해) 것이 적합하다. 유용한 프로모터로는 메탈로티오네인 프로모터, 구성형 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 덱사메타손 유도성 MMTV 프로모터, SV40 프로모터, MRP polIII 프로모터, 구성형 MPSV 프로모터, 테트라사이클린 유도성 CMV 프로모터(예컨대, 인간 즉시 초기형 CMV 프로모터), 구성형 CMV 프로모터 및 당해 기술 분야에 공지된 프로모터-인헨서 복합체를 포함하며, 이것에만 국한되는 것은 아니다.
또한, hTRT 폴리뉴클레오티드의 효과적인 발현 및/또는 hTRT 단백질을 암호하는 서열의 해독에 필요하거나 바람직한 기타 조절 인자를 사용할 수도 있다. 해독에 필요에 인자로는 통상 ATG 개시 코돈 및 인접 리보솜 결합 부위 또는 기타 서열을 포함한다. hTRT 단백질을 암호하는 서열의 경우, 발현 벡터에 이것의 개시 코돈과 업스트림 프로모터 서열이 삽입된다면 다른 해독 서열이나 기타 대조 시그널은 전혀 필요하지 않다. 하지만, 단지 암호 서열이나 또는 이것의 일부만이 삽입된 경우에는 외인성 전사 및/또는 해독 대조 시그널(예컨대, 프로모터, 리보솜 결 합 부위 및 ATG 개시 코돈)이 종종 필요하다. 또한, 개시 코돈은 일반적으로 정확한 리딩 프레임으로 배치되어야 목적 단백질을 확실하게 해독할 수 있다. 외인성 전사 인자 및 개시 코돈은 다양한 기원에서 얻을 수 있는데, 천연 및 합성된 것일 수 있다. 또한, 발현율은 사용되는 세포계에 적당한 인헨서를 병입시키면 향상시킬 수 있다[Scharf et al., 1994, Results Probl.Cell Differ. 20:125; 및 Bittner et al. 1987, Meth.Enzymol., 153:516]. 예컨대, SV40 인헨서 또는 CMV 인헨서를 사용하여 포유류 숙주 세포에서의 발현율을 증가시킬 수 있다.
또한, hTRT 유전자 생성물은 인간 세포, 예컨대 텔로머라제 음성 세포주와 같은 세포 중에서 hTRT 프로모터 또는 인헨서를 활성화시키면 발현될 수 있다(발현 증가). 활성화는 다양한 방법, 예컨대 외인성 프로모터 활성화 인자를 투여하거나 hTRT 유전자의 발현을 억제하는 세포 성분을 저해하면 실시가능하다. 역으로 생각해보면, 다음에 기재되는 바와 같이 프로모터 기능을 억제하면 hTRT 유전자 발현을 감소시킬 수 있다.
본 발명은 엑디손(Ecdysone) 유도성 발현계(인비트로겐) 및 클론테크 제품인 Tet-On 및 Tet-Off 테트라사이클린 조절계와 같은 반응계를 사용하는 hTRT 폴리펩티드의 유도성 및 억제성 발현을 제공한다. 엑디손 유도성 발현계는 스테로이드 호르몬 엑디손의 유사체인 뮤리스테론 A를 이용하여 헤테로이량체 핵 리포터를 통해 재조합 단백질의 발현을 활성화시킨다(No et al., 1996, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:3346). 본 발명의 1가지 구체예로서, 최소 열 충격 프로모터와 다중 클로닝 부위의 상류에 5개의 변형된 엑디손 반응 인자(E/GRE)의 상류를 포함하는 pIND 벡터( 클론테크)에 hTRT를 클로닝한다. 이 작제물을 이용하여 그 다음 엑디손 수용체를 안정하게 발현하는 세포주를 형질감염시킨다. 형질감염 후, 세포를 뮤리스테론 A로 처리하여 pIND로부터 세포내 발현을 유도한다. 본 발명의 다른 구체예로서, hTRT 폴리펩티드는 Tet-on 및 Tet-off 발현계(클론테크)를 사용하여 발현시키면 고농도 유전자 발현을 조절형으로 제공할 수 있다(Gossen et al., 1992, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 89:5547; Gossen et al., 1995, Science 268:1766).
본 발명의 hTRT 벡터는 다양한 방법에 의해 세포, 조직, 기관, 환자 또는 동물 중으로 도입할 수 있다. 본 발명의 핵산 발현 벡터(일반적으로 dsDNA)는 염화칼슘 형질전환법(박테리아계의 경우), 전기침투, 인산칼슘 처리, 리포솜 매개의 형질전환법, 주사 및 미량주사, 사출법, 바이로솜, 면역리포좀, 다가양이온:핵산 접합체, 나출 DNA, 인조 비리온, 헤르페스 바이러스 구조 단백질 VP22에 대한 융합(Elliot and O'Hare, Cell 88:223), 제제 향상성 DNA 흡수와 생체외 형질도입과 같은 공지 방법을 통해 소정의 숙주 세포로 전이시킬 수 있다. 유용한 리포좀 매개 DNA 전이 방법은 미국 특허 제5,049,386호, 미국 특허 제4,946,787호 및 미국 제4,897,355호; PCT 공개 WO 91/17424, WO/91/16024; Wany and Huang, 1987, Biochem. Biophys. Res. Commun. 147-980; Wang and Huang, 1989 Biochemistry 28: 9508; Litzinger and Huang, 1992, Biochem. Biophys. Acta 1113:201; Gao and Huang, 1991, Biochem.Biophys.Res.Commun. 179:280에 개시되어 있다. 면역리포좀에 대해서는 외인성 폴리뉴클레오티드의 운반체로서 개시된 바 있고(Wang and Huang, 1987, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 84:7851; Trubetskoy et al., 1992, Biochem. Biophys. Acta. 1131:311), 특정 세포 유형 상에 존재하는 표면 항원에 결합할 것으로 추정되는 특정 항체를 병입한 리포좀에 비하여 개선된 세포 유형 특이성을 보유할 수 있다. 문헌[Behr et al., 1989, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 86:6982]에서는 리포좀을 형성하기 위하여 인지질을 추가로 필요로 하지 않으면서 형질감염 자체를 매개하는 시약으로 리포폴리아민을 사용하는 예를 보고하고 있다. 적합한 전달 방법은 허용되는 실험과 조절 조건(예컨대, 재조합 단백질을 발현하기 위한 세포주 제조용이거나 유전자 치료용의 경우)을 고려하여 당업자라면 적절하게 선택할 수 있을 것이다. 이와 같은 전달 방법은 유전자 치료 목적으로 핵산을 세포로 전이하고자 하는 경우, 조직 배양 세포로 전이하고자 하는 경우 등에 사용할 수 있다는 것은 자명한 것이다.
재조합 단백질을 장기간 고수율로 생성하고자 하는 경우에는 발현을 안정화시키는 것이 필요하다. 예컨대, hTRT를 안정하게 발현하는 세포주는 바이러스 복제 오리진이나 내인성 발현 인자 및 선택성 마커 유전자를 포함하는 본 발명의 발현 벡터를 사용하여 제조할 수 있다. 벡터를 도입한 후, 세포는 그 다음 영양 배지에서 1 내지 2일간 증식시키고, 그 뒤 선택 배지로 전이시킨다. 선택성 마커의 목적은 선택 용이하도록 내성을 부여하고 선택 배지에서 도입된 서열을 성공적으로 발현하는 세포를 성장시키기 위한 것이다. 이와 같이 내성적이고 안정하게 형질감염된 세포는 세포 유형에 적당한 조직 배양 기법을 사용하여 증식시킬 수 있다. 또한, 당해 기술 분야에 공지된 방법에 따라 DHFR 유전자로 형질감염된 세포에 메틸트렉세이트를 투여하는 것과 같은 증폭 단계를 포함할 수도 있다.
또한, 숙주 세포주는 삽입 서열의 발현을 조절하는 성질이나 발현된 단백질을 바람직한 형식으로 가공하는 성질에 따라 선택할 수 있다. 이와 같은 폴리펩티드의 변형으로는 아세틸화, 카르복실화, 인산화, 지질화 및 아실화를 포함하며, 이것에만 국한되는 것은 아니다. 또한, 해독후 가공은 정확한 삽입, 폴딩 및/또는 기능에 중요할 수 있다. 여러 숙주 세포는 해독후 활성 면에서 각 세포마다 특이적인 세포 기구류와 특징적인 기작을 보유할 수 있으며, 따라서 도입된 이종 단백질을 정확하게 수사시키고 가공할 수 있도록 특정 세포를 선택한다.
본 발명은 hTRT 또는 기타 TRT 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 발현하는 돌연변이 동물(즉, 인간이나 기타 TRT 유전자 서열이 돌연변이성인 포유류)을 제공한다. 1가지 구체예로서, hTRT는 돌연변이 소, 염소 또는 토끼와 같은 돌연변이 포유류의 젖으로 분비된다. 이와 같은 동물을 제조하는 방법은 예컨대 문헌[Heyneker et al., PCT WO 91/08216]에 개시되어 있다.
전술한 발현계를 사용하여 제조한 것을 비롯한 본 발명의 hTRT 단백질 및 복합체는 본 발명을 통해 제공되는 구체적 방법(예컨대, 다음에 기재되는 방법)에 따라 당해 기술 분야에 공지된 각종 일반적 방법을 사용하여 정제할 수 있다. 이 hTRT 단백질은 화학적 합성, 생물학적 발현 또는 정제 후 천연 발생의 텔로머라제의 천연 형태와는 다른 형태를 보유할 수 있다는 것은 당업자에게는 자명한 것이다. 때로는 폴리펩티드를 변성(예컨대, 디설파이드 또는 기타 결합의 환원)시키고 그 뒤 폴리펩티드를 바람직한 형태로 재폴딩하는 것이 바람직하거나 필요할 수도 있다. 또한, 생산적인 재폴딩은 hTR(또는 hTR 단편)의 존재를 필요로 할 수도 있 다. 단백질을 환원 및 변성시키는 방법 및 재폴딩을 유도하는 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있다(예컨대, Debinski et al., 1993, J.Biol.Chem., 268:14065; Kreitman and Pastan, 1993, Bioconjug. Chem., 4:581; 및 Buchner et al., 1992, Anal. Biochem., 205:263; 및 Mc Caman BioCaman et al., 1985, J.Biotech. 2:177). 또한, PCT 공개 번호 WO96/40868호를 참조하라.
D) 인간 TRT와 인간 텔로머라제 RNA 복합체, 텔로머라제 회합 단백질 및 동시발현과 기타 다른 수단으로 생성되는 기타 생물분자
본 발명의 hTRT 폴리펩티드는 기타 생물분자, 예컨대 RNA(예, hTR), 단백질(예, 텔로머라제 결합 단백질), DNA(예, 말단소립 DNA, [T2 AG3 ]N ) 및 뉴클레오티드, 예컨대 (데옥시)리보뉴클레오티드 트리포스페이트와 생체내 및 시험관내에서 회합할 수 있다. 이와 같은 회합은 hTRT의 존재 또는 기능을 분석하고, hTRT 또는 텔로머라제 회합 분자를 동정하거나 정제하고, 본 발명의 방법에 따라 hTRT 또는 텔로머라제 구조 또는 기능을 분석하는데 이용할 수 있다.
1가지 구체예로서, 본 발명은 핵산, 보통 RNA와 복합체를 이루어(예컨대, 회합하거나 결합함), 예컨대 텔로머라제 홀로효소를 생성하는 hTRT를 제공한다. 다른 1가지 구체예로서, 결합된 RNA는 텔로머라제 매개의 DNA 합성에 사용할 수 있는 주형으로 작용할 수 있다. hTRT 폴리펩티드와 복합체를 이룰 수 있는 RNA의 예로는 천연 발생의 숙주 세포 텔로머라제 RNA, 인간 텔로머라제 RNA(예컨대, hTR; 미국 특허 제5,583,016호), hTR 준서열이나 도메인, 합성 RNA 또는 기타 RNA를 포함한다. RNA-hTRT 단백질 복합체(RNP)는 일반적으로 1종 이상의 텔로머라제 활성, 예컨 대 텔로머라제 촉매 활성을 나타낸다. 이 hTRT-hTR RNP(또는 기타 hTRT-RNA 복합체)는 다음에 상세히 설명되는 바와 같은 다양한 방법, 예컨대 시험관내 재구성 방법, 시험관내(즉, 무세포 계에서) hTRT와 hTR(또는 기타 다른 RNA)의 동시 발현법, 생체내 재구성법 또는 생체외 재구성법을 포함한다.
따라서, 본 발명은 1가지 구체예로서 별도로 정제된 성분("시험관내 재구성법", 재구성에 관해서는 미국 특허 제5,583,016호 참조; Autexier et al., EMBO J. 15:5928)을 혼합하여 시험관내에서 형성시킨 hTRT-hTR 복합체(또는 기타 hTRT-RNA 복합체)를 제공한다.
대안적인 구체예로서, 본 발명은 hTRT 폴리펩티드와 RNA(예, hTR)를 무세포 전사 해독계(예, 밀 배아 또는 토끼 망상적혈구 용해물)에서 시험관내 동시발현시키면 생성되는 텔로머라제 RNP를 제공한다. 실시예 7에 도시된 바와 같이, 재조합 hTRT 폴리펩티드와 hTR을 시험관내 동시발현시키면 텔로머라제 촉매 활성이 얻어진다(TRAP 분석법으로 측정).
또한, 본 발명은 hTR이 천연적으로 발현되거나 hTR(또는 hTRT 단백질과 복합체를 형성할 수 있는 다른 RNA)이 재조합 방법으로 도입되거나 발현되는 세포, 예컨대 포유류 세포에서 hTRT 폴리펩티드를 발현시키므로써 얻어지는 텔로머라제 RNP를 제공한다. 따라서, 1가지 구체예로서, hTRT는 hTR이 존재하는 텔로머라제 음성 인간 세포(예컨대, BJ 또는 IMP90 세포)에서 발현시키면, 그 2 분자는 RNP로 조립된다. 다른 1가지 구체예로서, hTRT는 hTR이 재조합적으로 발현되는 인간이나 비인간 세포에서 발현시킨다. 세포 중에서 hTR을 발현하는 방법에 대해서는 미국 특허 제5,583,016호에 기재되어 있다. 또한, 텔로머라제의 RNA 성분을 암호하는 cDNA를 함유하는 클론은 pGRN33으로 기탁되어 있다(ATCC 75926). 또한, 인간 텔로머라제의 RNA 성분을 암호하는 게놈 서열은 람다 클론 28-1에 ∼15kb SauIIIA1 내지 HindIII 삽입체로 기탁되어 있다(ATCC 75925). 진핵 세포에서 발현시키는 경우 hTRT 서열은 전사 개시 서열(RNA 폴리머라제 결합 부위)과 전사 종지 서열에 작동가능하게 결합시키는 것이 일반적이다(예컨대, PCT 공개 번호 WO 96/01835호; Feng et al., 1995, Science 269:1236).
또한, 본 발명은 소위 "텔로머라제 회합 단백질"과 동시발현되고(또는) 회합되는 실질적으로 정제된 hTRT 폴리펩티드 또는 재조합 생성된 hTRT 폴리펩티드를 제공한다. 따라서, 본 발명은 다른 단백질(예컨대, 텔로머라제 회합 단백질)과 동시발현되거나 복합체를 형성하는 hTRT를 제공한다. 텔로머라제 회합 단백질은 인간의 텔로머라제와 동시정제되고(또는) 예컨대 말단소립 DNA와 텔로머라제의 회합에 관여하여 텔로머라제의 기능이나 활성을 조절하는 역할을 하는 단백질이다. 텔로머라제 회합성 단백질의 예로는 다음과 같은 단백질 및/또는 이들의 인간 상동체를 포함하며, 이것에만 국한되는 것은 아니다: 뉴클레오린(Srivastava et al., 1989, FEBS Letts. 250:99); EF2H(신장 제2 인자 상동체; Nomura et al., 1994, DNA Res.(일본) 1:27, GENBANK 수탁번호 #D21163); TP1/TLP1(Harrington et al., 1997, Science 275:973; Nakayama, 1997, Cell 88:875); 테트라히메나 p95의 인간 상동체 또는 p95 자체(Collins et al., 1995, Cell 81:677); TPC2(말단소립 길이 조절 단백질; ATCC 수탁 번호 97708); TPC3(말단소립 길이 조절 단백질; ATCC 수탁 번호 97707; DNA 결합 단백질 B(dbpB; Horwitz et al., 1994, J.Biol.Chem. 269:14130; 및 말단소립 반복 결합 인자(TRF1 & 2; Chang et al., 1995, Science 270:1663; Chong et al., 1997, Hum Mol Genet 6:69); EST1, 3 및 4(Lendvay et al., 1996, Genetics 144:1399, Nugent et al., 1996, Science 274-249, Lundblad et al., 1989Cell 57:633) 및 말단 캡핑 인자(Cardenas et al., 1993, Genes Dev. 7:883).
텔로머라제 회합 단백질은 hTRT 단백질이나 hTRT-hTR RNP와 동시정제되거나 또는 결합을 통해 감별할 수 있다. 이외에도, 친화도 정제로 측정되는 바와 같은 hTRT 융합 단백질, 예컨대 GST-hTRT 융합 단백질 등에 대한 결합을 토대로 감별할 수도 있다(Ausubel et al., 제20장 참조). hTRT 회합 단백질을 감별하는데 사용할 수 있는 단백질-단백질 상호작용을 평가할 수 있는 특히 유용한 기법은 치엔 등(Chie et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 88:9578, 1991; 및 Ausubel et al. 전술한 문헌 설명 참조, 제20장)이 제시한 2-하이브리드 선별 방법이다. 이 선별법은 전사 활성인자인 효모 Gal4 전사 단백질의 재구성을 통해 단백질-단백질 상호작용을 생체내에서 감별한다(Fields and Song, 1989, Nature 340:245). 이 방법은 DNA 결합과 전사 활성화에 역할을 하는 분리가능한 도메인으로 구성된 효모 Gal4 단백질의 성질을 이용한 것이다. 먼저, 2개의 하이브리드 단백질을 암호하는 폴리뉴클레오티드, 통상 발현 벡터를 작제한다. 1개의 폴리뉴클레오티드는 hTRT 상호작용에 대해 시험되는 단백질(예컨대, 뉴클레오린 또는 EF2H)의 폴리펩티드 서열에 융합된 효모 Gal4 DNA 결합 도메인을 포함한다. 이외에, 효모 Gal4 DNA 결합 도메인은 인간 세포 유래의 cDNA에 융합하여 텔로머라제 회합 단백질을 선별할 수 있는 Gal4 DNA 결합 도메인에 융합된 인간 단백질의 라이브러리를 생성할 수도 있다. 다른 1개의 폴리뉴클레오티드는 hTRT 폴리펩티드 서열에 융합된 Gal4 활성화 도메인을 포함한다. 이 작제물을 효모 숙주 세포에 도입한다. 발현시 hTRT와 시험 단백질 간의 분자간 결합은 Gal4 활성화 도메인과 Gal4 DNA-결합 도메인을 재구성할 수 있다. 그 결과 Gal4 결합 부위에 작동가능하게 결합된 리포터 유전자(예, lacZ, HIS3)는 전사 활성화하게 된다. 리포터를 선별하거나 분석하면 hTRT 상호작용 단백질이나 텔로머라제 회합 단백질을 포함하는 세포의 유전자 콜로니를 감별할 수 있다. 당업자라면 2-하이브리드 선별법을 변형시킨 다양한 변법, 예컨대 LexA계가 있다는 것을 잘 알고 있을 것이다(Bartel et al., 1993, in Cellular Interactions in Development: A Practical Approach Ed. Hartley, D.A.(Oxford Univ. Press) pp. 153-79).
텔로머라제 관련 단백질을 감별하는 다른 유용한 방법은 3-하이브리드계 방법이다(예컨대, Zhang et al., 1996, Anal. Biochem. 242:68; Licitra et al., 1996, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 93:12817). 이 반응계에서 텔로머라제 RNA 성분과 TRT 또는 hTRT 단백질 및 시험 단백질을 함께 이용할 수 있다. 상호작용 단백질 구체적으로(헤테로이량체화하거나 고차 헤테로다량체를 형성하는 단백질)을 감별하는데 유용한 또 다른 방법은 이.콜리/BCCP 상호작용 선별계이다(Germino et al.(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:933; Guarente(1993) Proc. Natl. Acad. Sci.(U.S.A.) 90:1639).
또한, 본 발명은 말단소립 결합 단백질(텔로머라제 회합 단백질이거나 또는 다른 단백질)과 hTRT(hTR, 기타 RNA 또는 1종 이상의 텔로머라제 회합 단백질과 복합체를 형성하거나 형성하지 않음)의 복합체를 제공한다. 말단소립 결합 단백질의 예로는 TRF1 및 TRF2(전술한 문헌 참조); rnpA1, rnpA2, RAP1(Buchman et al., 1988, Mol.Cell.Biol. 8:210, Buchman et al., 1988, Mol.Cell.Biol. 8:5086), SIR3 및 SIR4(Aparicio et al., 1991, Cell 66:1279), TEL1(Greenwell et al., 1995, Cell 82:823; Morrow et al., 1995, Cell 82:831); ATM(Savitsky et al., 1995, Science 268:1749), 말단 캡핑 인자(Cardenas et al., 1993, Genes Dev. 7:883) 및 상응하는 인간 상동체를 포함한다. 전술한 복합체는 hTRT와 hTR의 복합체 또는 텔로머라제 회합 단백질에 대해 전술한 바와 같이, 예컨대 시험관내 또는생체내에서 혼합하거나 동시발현하여 생성할 수 있다.
V. 항체 및 기타 결합제
본 발명은 hTRT와 특이적으로 면역반응성인 항체, 예컨대 폴리클로널 항체 및 모노클로널 항체, 항체 단편, 1본쇄 항체 및 파지 외피 또는 세포 표면 단백질에 융합된 항체나 항체 단편을 비롯한 인간 및 키메라 항체 및 당해 기술 분야에 공지되고 본 명세서에 개시된 기타 다른 항체를 포함한다. 본 발명의 항체는 도 17(서열 번호 2)에 도시된 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 보유하는 폴리펩티드 또는 이 단백질의 면역원성 단편이나 이들에 의해 한정되는 단백질 상의 에피토프를 특이적으로 인식하고 결합할 수 있다. 본 발명의 항체는 hTRT에 대해 최소 약 107 , 108 , 109 또는 1010 M-1 의 특이적 결합 친화도를 나타내며, 폴리클로널이거나 모노클로널 또는 재조합성 또는 기타 다른 방법으로 생성된 항체 일 수 있다. 또한, 본 발명은 hTRT 형태성 에피토프(예컨대, hTRT 단백질이나 텔로머라제 RNP의 표면에 존재하는 에피토프)를 인식하는 항hTRT 항체를 제공한다. 이와 유사한 형태적 에피토프는 필요한 경우에 HIV-1의 p66 서브유닛과 같은 관련있는 역전사효소의 형태와 비교하여 컴퓨터를 보조로 이용한 hTRT 단백질 서열의 분석이나 또는 실험을 통해 감별할 수 있다(예컨대, 도 3 참조). 형태적 에피토프를 인식하는 항hTRT 항체는 특히 인간 텔로머라제의 검출과 정제 및 인간 질병의 진단과 치료에 유용하다.
항hTRT 항체를 제조하기 위하여, 염소, 양, 소, 기니아 피그, 토끼, 래트 또는 마우스와 같은 숙주에 hTRT 단백질이나 면역원성 성질을 보유하는 이 단백질의 임의의 부, 단편 또는 올리고펩티드를 주입하여 면역화시킨다. 항체를 유도하는 hTRT 폴리펩티드를 선별하는데 있어서, 이 폴리펩티드는 생물학적 활성을 보유할 필요는 없지만, 상기 단백질 단편이나 올리고펩티드는 면역원성, 바람직하게는 항원성이어야 한다. 면역원성은 폴리펩티드와 보조제를 동물(예, 토끼)에게 주사하고, 주사된 폴리펩티드에 대하여 지향성인 항체 발생을 분석하여 측정할 수 있다(예컨대, Harlow and Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, COLD SPRING HARBOR LABORATORY, NEW YORK(1988), 본 명세서에 참고 인용됨, 특히 제5장 참조). 특정 항체를 유도하는데 사용된 펩티드는 일반적으로 최소 5개의 아미노산, 바람직하게는 최소 8개의 아미노산, 보다 바람직하게는 최소 10개의 아미노산으로 구성된 아미노산 서열을 보유한다. 이 펩티드들은 일반적으로 서열 번호 2에 기재된 단백질의 아미노산 서열 전체 또는 근접 일부분과 유사하거나 실질적으로 서열 동일성을 보유한다. hTRT 단백질 아미노산의 짧은 스트레치는 다른 단백질, 예컨대 키홀 림펫 헤모시아닌 및 키메라 분자에 대해 생성되는 항hTRT 항체와 융합될 수 있다. 또한, 사용된 숙주 종에 따라 다양한 보조제를 사용하여 면역학적 반응을 증가시킬 수 있다.
항원은 동물에게 적당한 방법을 통해 측정되는 형식으로 면역계에 제공한다. 이와 같은 변수 및 기타 변수는 면역학자들이라면 일반적으로 알고 있는 것이다. 통상, 주사는 발바닥, 근육내, 피내, 외림프절이나 복강내로 투여한다. 숙주에 의해 생성되는 면역글로불린은 친화도 정제를 비롯한 통상의 방법으로 침전, 분리 및 정제할 수 있다.
면역원성 hTRT 펩티드의 예는 실시예 8에 기재되어 있다. 또한, 실시예 8은 항hTRT 폴리클로널 항체의 생산과 용도에 관한 것이다.
A) 모노클로널 항체
hTRT 단백질과 펩티드에 대한 모노클로널 항체는 세포주를 연속 배양하여 항체 분자를 생성할 수 있는 임의의 방법을 사용하여 본 발명에 따라 제조할 수 있다. 그 예로는 최초로 문헌[Koehler and Milstein, Nature 256:495(1975)]에 개시된 하이브리도마 기법, 인간 B 세포 하이브리도마 기법(Kosbor et al., 1983, Immunol. Today 4:72; Cote et al., 1983, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 80:2026) 및 EBV 하이브리도마 기법(Cole et al., MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R Liss Inc, New York NY, pp 77-96, 1985)을 포함하며, 이것에만 국한되는 것은 아니다.
1가지 구체예로서, 적당한 동물을 선택한 후 다음과 같은 적당한 면역 방법을 실시한다. 쥐, 토끼류, 말 등의 비인간 모노클로널 항체 생산은 공지되어 있는데, 예컨대 hTRT 또는 이의 단편을 함유하는 제제로 동물을 면역화하면 얻을 수 있다. 1가지 방법으로, 소정의 시간이 경과한 후 동물의 비장을 절제하고 각 비장 세포를 통상 무한증식성 골수종 세포와 적당한 선별 조건하에 융합시킨다. 그 다음, 세포를 클론마다 분리하고 각 클론(예컨대, 하이브리도마)의 상청액을 가지고 항원의 목적 영역에 특이적인 적당한 항체를 생성하는지 시험한다. 항체를 생산하는 기법은 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 예컨대, 본 명세서에 참고 인용된 문헌[Goding et al., MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE(2D ED.) Acad.Press, N.Y. 및 Harlow and Lane, 전술한 문헌 설명 참조]을 참조하라. 기타 다른 적합한 기법으로는 항원성 폴리펩티드에 림프구를 시험관내 노출시키거나, 대안적으로 파지 또는 이와 유사한 벡터 중의 항체 라이브러리를 선별하는 단계를 포함한다(다음에 상세히 기재됨).
B) 인간 항체
다른 구체예로서, 본 발명은 hTRT 폴리펩티드에 대한 인간 항체를 제공한다. 또한, 공지 항원에 대한 인간의 모노클로널 항체는 인간의 면역계 성분을 보유하는 돌연변이 동물을 사용하거나(예컨대, 미국 특허 제5,569,825호 및 제5,545,806호 참조, 본 발명에 참조 인용됨) 또는 인간의 말초 혈액 세포를 사용하여(Casali et al., 1986, Science 234:476) 제조할 수 있다. 일부 인간 항체는 경쟁적 결합 실험으로 선택하거나 또는 특정 마우스 항체와 동등한 에피토프 특이성을 갖는 것을 선 택한다.
대안적 구체예로서, hTRT 폴리펩티드에 대한 인간 항체는 본 발명에 참조 인용된 문헌[Huse et al., 1989, Science 246:1275]에 개략된 일반 프로토콜에 따라 인간의 B 세포 유래의 DNA 라이브러리를 선별하여 제조할 수 있다. 그 다음, hTRT 폴리펩티드에 대해 결합하는 항체를 선택한다. 이와 같은 항체(또는 항체 단편)를 암호하는 서열을 클로닝한 뒤 증폭시킨다. 상기 Huse에 의해 개시된 방법은 종종 파지 표시 기법과 함께 사용되기도 한다.
C) 인체화된 항체 또는 키메라 항체
본 발명은 표적에 대한 친화성은 감소시키지 않으나 잠재적 항원성을 경감시키기 위하여, 키메라화되거나 인체류이거나 또는 인체화된 항hTRT 항체를 제공한다. 이와 같은 키메라 항체, 인체류 항체 및 인체화된 항체의 제법은 당해 기술 분야에 개시되어 있다(예컨대, 미국 특허 제5,585,098호 및 제5,530,101호; Queen, et al., 1989, Proc.Nat'l Acad.Sci. USA 86:10029; 및 Verhoeyan et al., 1988, Science 239:1534; 본 발명에 참조 인용됨). 인체화된 면역글로불린은 주로 인간 면역글로불린 유래의 가변성 프레임워크 영역(수용체 면역글로불린이라 부름)과 주로 비인간(예, 마우스) 면역글로불린 유래의 상보성 결정 영역(공여체 면역글로불린이라 부름)을 보유한다. 또한, 불변 영역은 존재하는 경우 주로 인간 면역글로불린으로 부터 유래된 것이다.
인간 환자 투여용과 같은 일부 용도에 있어서 본 발명의 인체화된(뿐만 아니라 인간) 항hTRT 항체는 쥐나 다른 종들로부터 유래되는 항체에 비하여 몇가지 장 점을 제공한다. 즉, (1) 인간의 면역계는 인체화된 항체의 프레임워크 또는 불변 영역을 이종으로 인식하지 않으며, 따라서 주사된 이 항체에 대한 항체 응답 반응은 완전 이종성인 마우스 항체나 부분 이종성인 키메라 항체에 비하여 감소한다. (2) 인체화된 항체의 작동인자 부는 인체 유래이기 때문에 인체 면역계의 다른 부분과 양호하게 상호작용 할 수 있다. (3) 주사된 인체화된 항체는 천연 발생의 인간 항체와 실질적으로 동등한 반감기를 보유하기 때문에 다른 종 유래의 항체에 비하여 사용되는 투여량이나 투여 빈도가 적다. 이와 같은 점에 절대적인 결과로서, 항hTRT 항체는, 즉 텔로머라제 양성 세포를 표적으로 하는 질병 치료용으로 사용가능하다.
D) 파지 표시법(phage display)
본 발명은 파지 표시 방법에 의해 생성되는 항hTRT 항체(또는 결합 조성물)를 제공한다[예컨대, Dower et al., WO91/17271 및 McCafferty et al., WO 92/01047; 및 Vaughan et al., 1996, Nature Biotechnology, 14:309; 각각 본 발명에 참조 인용됨). 이 방법에서, 파지 라이브러리는 외측 표면에 대해 상이한 항체를 나타내는 군으로 만든다. 항체는 보통 Fv 또는 Fab 단편으로 나타난다. 목적하는 특이성을 보유하는 파지 표시 항체는 hTRT 폴리펩티드에 대한 친화성 집중도로 선택한다.
파지 표시 방법의 변형법으로 선택된 쥐 항체의 결합 특이성을 보유한 인체화된 항체를 제조할 수 있다. 이 방법에서는 선택된 쥐 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 출발 물질로 사용한다. 예컨대, 경쇄 가변 영역을 출발 물질로 선택한 경우에 파지 라이브러리는 동일한 경쇄 가변 영역(즉, 쥐의 출발 물질)과 상이한 중쇄 가변 영역을 나타내는 군으로 작제한다. 중쇄 가변 영역은 재배열한 인간 중쇄 가변 영역의 라이브러리로부터 얻는다. hTRT 폴리펩티드에 대하여 강한 특이적 결합성(예컨대, 108 이상, 바람직하게는 109 M-1 이상)을 나타내는 파지를 선택한다. 이 파지 유래의 인간 중쇄 가변 영역을 출발 물질로 사용하여 파지 라이브러리를 더 작제한다. 이 라이브러리에서, 각 파지는 동일한 중쇄 가변 영역(즉, 1차 표시 라이브러리에서 감별된 영역)과 상이한 경쇄 가변 영역을 나타낸다. 경쇄 가변 영역은 재배열한 인간 가변 경쇄 영역의 라이브러리로부터 얻는다. 다시 특이적인 강한 결합을 나타내는 파지를 선택한다. 이 파지는 완전한 인간 항hTRT 항체의 가변 영역을 나타낸다. 이 항체는 보통 쥐의 출발 물질과 동일하거나 유사한 에피토프 특이성을 보유하는 것이 일반적이다.
E) 하이브리드 항체
또한, 본 발명은 hTRT 폴리펩티드에 대한 항체의 특이성을 보유하지만 제2 부에 특이적 결합이 가능한 하이브리드 항체를 제공한다. 이와 같은 하이브리드 항체에 있어 1개의 중쇄 및 경쇄쌍은 보통 항hTRT 항체에서 유래된 것이고 다른 1개의 쌍은 다른 에피토프 또는 단백질에 대하여 지향성인 항체에서 유래된 것이다. 따라서, 이 항체는 다중 작용성, 즉 최소한 1개의 에피토프가 항복합체 항체 결합성 에피토프인 경우 최소한 2개의 상이한 에피토프에 동시에 결합하는 성질을 보유한다. 이와 같은 하이브리드는 재조합 기법을 통해 각 항체 성분을 생성하는 하이브리도마를 융합하면 얻을 수 있다. 이 하이브리드는 텔로머라제 양성 세포에 화합 물(예컨대, 약물)을 운반하는 경우 사용할 수 있다(즉, 암 세포에 세포독성제를 투여하는 경우).
또한, 본 발명의 면역글로불린은 다른 유전자(예, 효소) 유래의 기능성 영역에 융합하여 유용한 성질을 보유한 융합 단백질(예, 면역독소)을 생산할 수 있다.
F) 항유전인자형 항체
또한, 본 발명은 전술한 절차에 의해 분리될 수 있는 유용한 항유전인자형 항체를 제공한다. 항유전인자형 항체는 예컨대 1차 항체(즉, 항hTRT 항체 또는 이것의 hTRT 결합 단편)로 동물을 면역화하여 제조할 수 있다. 항hTRT 항체에 대한 항유전인자형 항체로는 그 1차 항체에 대한 결합이 hTRT 폴리펩티드 또는 이것의 단편에 의해 억제되는 것을 선택한다. 항유전인자형 항체와 hTRT 폴리펩티드 또는 이것의 단편은 둘다 1차 면역글로불린에 결합하기 때문에 항유전인자형 면역글로불린은 에피토프의 "내부 이미지"를 나타낼 수 있고, 따라서 분석법에 hTRT 폴리펩티드 대신 사용할 수 있거나 예컨대 환자 중에 존재하는 항hTRT 항체와 결합(즉, 불활성화)시키는데 사용할 수 있다. 또한, 항유전인자형 항체는 텔로머라제 관련 단백질과 상호작용할 수 있다. 이와 같은 항체의 투여는 hTRT 회합 단백질에 결합하는데 있어 hTRT를 중화하거나 hTRT와 경쟁하여 텔로머라제 기능에 영향을 미칠 수 있다.
G) 기타
본 발명의 항체는 모든 이소타입, 예컨대 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE를 포함할 수 있고, 특히 IgG, IgA 및 IgM이 바람직하다. 인체화된 항체는 1 이상의 종류 또는 이소타입에서 유래되는 서열을 포함할 수 있다.
다른 구체예로서, 본 발명은 전술한 천연 항체의 단편을 제공한다. 일반적으로, 이 단편은 hTRT 폴리펩티드에 대한 특이적 결합성으로 부터 얻어진 천연 항체와 경쟁하고, 최소 107 , 108 , 109 M-1 또는 1010 M-1 의 친화도로 결합한다. 항체 단편은 별도로 중쇄, 경쇄, Fab, Fab'F(ab')2 , Fabc 및 Fv를 포함한다. 단편은 천연 면역글로불린을 효소적 또는 화학적 분리하여 얻을 수 있다. 예컨대, F(ab')2 단편은 예컨대 문헌(Harlow and Lane, 전술한 문헌 설명 참조)에 기재된 바와 같은 표준 방법을 사용하여 IgG 분자를 pH 3.0 내지 3.5의 펩신으로 단백 분해하여 얻을 수 있다. Fab 단편은 F(ab')2 단편을 제한 환원하거나 또는 전 항체를 환원제 존재하에 파파인으로 분해하여 얻을 수 있다(일반적으로 Paul, W., ed FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY 2ND Raven Press, N.Y., 1989, 제7장, 본 발명에 참조 인용됨). 또한, 단편은 재조합 DNA 기법으로 제조할 수도 있다. 선택된 단편을 암호하는 핵산의 단편은 전길이 암호 서열을 제한 효소로 분해하거나 새로 합성하여 제조할 수도 있다. 단편은 종종 파지-외피 융합 단백질 형태로 발현되기도 한다.
전술한 면역글로불린의 대부분은 결합 특이성이나 작동인자 기능의 상실 없이 또는 허용되지 않을 정도의 결합 친화성 감소(즉, 약 107 M-1 이하) 없이 가변 영역 및 불변 영역에 비결정적 아미노산 치환, 첨가 또는 결실을 보유할 수 있다. 보통, 이와 같은 변화를 보유하는 면역글로불린은 최초의 대조 면역글로불린과 실 질적인 서열 동일성을 나타낸다. 돌연변이된 면역글로불린은 최초의 대조 면역글로불린에 비하여 증가된 친화성과 동일한 특이성을 보유하는 것으로 선택할 수 있다. 이와 같은 면역글로불린을 선택할 수 있는 유용한 기법으로 파지 표시 기법이 있다. 예컨대 Dower et al., WO 91/17271 McCafferty et al., WO92/01047 및 Huse, WO 92/06204 참조.
본 발명의 항체는 변형을 보유하거나 보유하지 않을 수도 있다. 또한, 이 항체에 표지된 결합체인 경우 본 발명의 항체는 특히 진단용으로 유용하다. 공유 또는 비공유적으로 검출용 표지를 결합시켜 표지화하는 것이 일반적이다.
본 발명의 항hTRT 항체는 공지의 방법을 사용하여 정제할 수 있다. 본 발명에 개시된 완전 항체, 이들의 이량체, 각각의 경쇄 및 중쇄 또는 기타 면역글로불린 형태는 당해 기술 분야의 표준 절차, 예컨대 황산암모늄 침전, 친화성 컬럼, 컬럼 크로마토그래피, 겔 전기영동 등의 방법에 따라 본 발명의 시약과 방법을 사용하여 정제할 수 있다[일반적으로, Scopes, PROTEIN PURIFICATION: PRINCIPLES AND PRACTICE 3RD EDITION(Springer-Verlag, N.Y.1994) 참조]. 이 항체는 실질적으로 정제된 면역글로불린, 순도가 최소한 약 90 내지 95또는 심지어 98내지 99, 또는 그 이상의 균질도가 바람직하다.
VI. 인간 텔로머라제의 정제
본 발명은 전례없는 순도로 분리된 인간 텔로머라제를 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 재조합체 기원 또는 비재조합체 기원의 정제된 hTRT; 선택적으로 1종 이상의 텔로머라제 관련 단백질을 포함하는 재조합체, 비재조합체 또는 복합적 기원의 정제된 hTRT-hTR 복합체(즉, RNP); 정제된 천연 발생의 인간 텔로머라제 등을 제공한다. 또한, 본 발명은 전술한 분자와 변형체, 융합 단백질, 천연 단백질 등을 포함하는 복합체를 부분적으로 정제하거나 실질적으로 정제하거나 또는 고도로 정제할 수 있는 방법 및 시약을 제공한다.
천연 발생의 텔로머라제는 임의의 텔로머라제 양성 세포로 부터 정제할 수 있으며, 재조합 hTRT 및 hTRT 복합체는 그중에서도 전술한 시험관내, 생체내, 생체외, 또는 식물이나 동물 발현계, 또는 당업계에 공지된 기타의 것/시스템을 사용하여 발현 및 정제될 수 있다.
일양태에서, hTRT, 텔로머라제 및 본 발명의 기타 조성물은 면역친화 단계를 단독으로, 또는 기타 정제 단계와 병행하여 정제한다. 통상, 본 발명에서 제시한 바와 같이 고정되거나 고정될 수 있는 항-hTRT 항체를, 항-hTRT 항체가 hTRT 항원에 결합하는 조건하에 목적하는 hTRT 또는 hTRT-함유 복합체를 포함하는 세포 용해물등의 시료와 접촉시킨다. 결합되지 않은 시료 성분을 당업계에 공지된 방법으로 제거한 후, 필요에 따라 항체로부터 거의 순수한 형태로 hTRT 조성물을 용출시킬 수 있다. 일양태에서, 당업계에 공지된 면역친화도 크로마토그래피법[참고: Harlow and Lane, 상기 문헌 참조; Ausubel, 상기 문헌 참조; Hermansan 등, 1992, IMMOBILIZED AFFINITY LIGAND TECHNIQUES(Academic Press, San Diego)]을 본 발명에 이용한다. 또 다른 예시적 일양태에서, 고정된 단백질 A를 사용하여 항hTRT-면역글로블린-hTRT 복합체의 면역침전법을 수행한다. 본 발명의 방법 및 시약에 따라 사용하기에 적절한 각종 변형 및 대안적인 면역친화도 정제 프로토콜은 당업자에게 공지되어 있다.
또 다른 일양태에서, 재조합 hTRT 단백질은 이 단백질의 높은 발현량으로 인하여 통상적인 단백질 정제법, 예컨대 황산암모늄 침전, 친화도 컬럼 크로마토그래피 (예, 면역친화도), 크기별 배제 크로마토그래피, 음이온 및 양이온 교환 크로마토그래피, 겔 전기영동 등[참고, 일반적으로, R.Scopes, PROTEIN PURIFICATION, Springer-Verlag, N.Y(1982) and Deutscher, METHODS IN ENZYMOLOGY VOL. 182: GUIDE TO PROTEIN PURIFICATION, Academic Press, Inc. N.Y. (1990)]을 면역 친화도 방법 대신에 또는 면역 친화도 방법과 함께 사용하여 정제할 수 있다. 양이온 교환법은 hTRT의 염기성 pI 때문에 특히 유용할 수 있다. 예를 들어, 고정화 인산염을 양이온 교환 작용기(예, P-11 포스포셀룰로스, 와트만 카탈로그 #4071 또는 셀룰로스 포스페이트, 시그마 카탈로그 #3145)로 사용할 수 있다. 고정화 포스페이트는 hTRT 정제에 유리한 2가지 장점을 나타낸다. 하나는 포스페이트가 양이온 교환 수지라는 점이고, 다른 하나는 핵산의 포스페이트 골격과 물리적 특성이 유사하다는 점이다. 고정화 포스페이트는 hTRT가 hTR과 말단소립 DNA에 결합하기 때문에 친화도 크로마토그래피에 이용할 수 있다. 기타 비특이적 및 특이적 핵산 친화도 크로마토그래피법도 정제에 유용하다[예, Alberts et al., 1971, Methods Enzymol . 21:198; Arnt-Jovin et al., 1975, Eur.J.Biochem. 54:411; 파마시아 카탈로그 #27-5575-02). 이와 같은 hTRT의 결합 작용은 정제를 위한 특정 핵산(예, 텔로머라제 프라이머 또는 hTR) 친화도 크로마토그래피의 용도에도 이용할 수 있으며[Chodosh et al., 1986, Mol. Cell. Biol . 6:4723; Wu et al., 1987, Science 238:1247; Kadonaga, 1991, Methods Enzymol. 208:10]; 뉴클레오티드와 물리적 유사성을 보여주는 고정화 Cibricon Blue Dye는 뉴클레오티드(예, DNA 합성에 기질로서)에 대한 hTRT 결합성으로 인하여 hTRT 정제에 이용할 수 있는 또 다른 유용한 수지(파마시아 카탈로그 #17-0948-01 또는 시그마 카탈로그 #C 1285)이다.
일양태로서, hTRT 단백질은 기타 텔로머라제 성분이 동시발현되지 않는 시험관내 또는 생체내 발현계로부터 직접 분리한다. 분리된 hTRT 단백질은, 예컨대 텔로머라제 RNP(예, 온화한 변성제 또는 기타 변성제에 노출시켜)를 붕괴시키고 RNP 성분을 분리(예, 크로마토그래피 또는 면역친화도 크로마토그래피 등의 통상적인 방법)하여 정제된 인간의 텔로머라제 또는 hTRT 복합체로부터 용이하게 얻을 수 있다는 것은 자명한 것이다.
텔로머라제 정제는 hTRT의 농도 측정(예, ELISA에 의해), hTR의 농도 측정 또는 당업계에 공지된 기타 방법에 의한 텔로머라제 활성 분석(예, TRAP 분석, 종래 분석법 또는 프라이머 결합 분석)을 이용하여 모니터할 수 있다.
일양태에서, 정제된 인간의 텔로머라제, hTRT 단백질 및 본 발명에서 제공되는 hTRT 복합체는 고도로 정제되어 있다(즉, 약 90이상의 동질성, 종종 약 95이상의 동질성). 동질성은 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동과 같은 표준법 및 당업계에 공지된 기타 수단을 사용하여 측정할 수 있다[참고; Ausubel et al., 상기 문헌 참조]. 고도로 정제된 인간의 텔로머라제, hTRT 단백질 또는 hTRT 복합체가 때때로 바람직하기는 하지만, 실질적으로 정제된(예, 약 75이상의 동질성) 또는 부분적으로 정제된(예, 약 20이상의 동질성) 인간의 텔로머라제, hTRT 단백질 또 는 hTRT 복합체도 여러 용도로 유용하며, 본 발명에 속한다는 것을 인지해야 한다. 예를 들어, 부분적으로 정제된 텔로머라제는 텔로머라제 조절 활성 및 기타 용도에 대해 시험 화합물을 검색하는데 유용하다[참고; 하기 및 상기 문헌과 미국 특허 제5,645,986호 참조].
VII. 텔로머라제 관련 질병의 치료
A) 개요
본 발명은 인간의 질병 및 질병 증상을 치료하는데 유용한 hTRT 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 및 항체를 제공한다. 본 발명의 재조합 hTRT 유전자 생성물과 합성 hTRT 유전자 생성물(단백질 및 mRNA)을 사용하여 세포에서의 텔로머라제 활성을 형성하거나 증가시킬 뿐 아니라 원하지 않는 세포에서의 텔로머라제 활성을 억제할 수 있다. 따라서, 세포에서의 텔로머라제 활성(예, 텔로머라제 촉매 활성, 정확성, 가공성, 말단소립 결합성 등) 억제, 활성화 또는 변경을 이용하여 세포의 증식 능력을 변화시킬 수 있다. 예를 들어, 무한 증식 세포, 예컨대 악성 종양 세포에서 텔로머라제 활성을 감소시키면 세포를 유한증식성으로 만들 수 있다. 역으로, 유한 증식 세포(예, 대부분의 인간 체세포)에서의 텔로머라제 활성을 증가시키면 세포의 증식 능력을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 피부 섬유아세포에서 hTRT 단백질의 발현은 말단소립 길이를 증가시켜 섬유아세포 증식 능력의 증가를 초래하며; 이러한 발현은 상처 봉합의 연령 의존성 지연을 늦추거나 또는 역전시킬 수 있다[참고; West, 1994, Arch. Derm. 130:87).
따라서, 본 발명의 목적중 하나는 세포에서 인간의 텔로머라제 활성의 존재, 부재 또는 활성량에 의해 특징지워지고, 본원에 개시된 방법 및 조성물을 사용한 치료에 감수성이 있는 질병 및 증상을 치료하는데 유용한 시약 및 방법을 제공하는 것이다. 이들 질병으로는 암, 세포 증식의 기타 질병(특히, 노화에 따른 질병), 면역학적 질환, 불임(또는 생식) 등이 있으며, 하기에 더 충분하게 설명되어 있다.
B) 암 치료
본 발명은 종양 세포에서 텔로머라제 활성을 감소시키고 암을 치료하는 방법과 조성물을 제공한다. 조성물은 안티센스 올리고뉴클레오티드, 펩티드, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 활성 변형 단백질을 암호하는 유전자 치료 벡터 및 항hTRT 항체를 포함한다. 텔로머라제 활성을 발현하는 암세포(예, 악성 종양 세포)(텔로머라제 양성 세포)는 내인성 텔로머라제 활성을 감소 또는 억제시켜 유한 증식화할 수 있다. 더욱이, 텔로머라제 농도는 전이 가능성과 같은 질병 특성과 상관관계가 있기 때문에(예, 미국 특허 5,639,613; 5,648,215; 5,489,508; Pandita et al., 1996, Proc. Am. Ass. Cancer Res. 37:559), 텔로머라제 활성의 임의의 감소는 암의 공격적 특성을 더 다루기 쉬운 질병 상태로 변화시킬 수 있다(통상적인 개입 효능 증가).
본 발명은 고형 종양 및 백혈병을 비롯한 광범위한 유형의 암을 치료하는데 유용하다. 치료하고자 하는 암의 유형으로는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 흉부, 전립선, 결장의 선암; 모든 형태의 폐 기관지원성 암종; 골수양; 흑색종; 간종양; 신경모세포종; 유두종; 아푸도마; 분리종; 새종; 악성 유암 증후군; 유암 심장 질환; 암종(예, 워커(Walker), 기저 세포, 호염기성인상, 브라운 피어스(Brown- Pearce) 관 세포, 에르릴히(Ehrlich) 종양, 동일계, 크렙스 2, 메르켈 세포, 점소양 세포, 비소형 폐 세포, 귀리양 세포, 유두, 경선암, 세기관지, 기관지원성, 인상 세포 및 전이 세포), 조직구 질병; 백혈병(예, B-세포 백혈병, 복합 세포 백혈병, 눌(null) 세포 백혈병, T-세포 백혈병, T-세포 만성 백혈병, HTLV-II 관련 백혈병, 림프종 급성 백혈병, 림프종 만성 백혈병, 비만 세포 백혈병 및 흑색종 백혈병); 악성 조직구증; 호지킨 질병; 면역증식성 소형; 비호지킨 림프종; 형질구종; 세망내피증; 흑색종; 연골아세포종; 섬유종; 섬유육종; 거대 세포 종양; 조직구종, 지방종; 지방육종; 중피종; 점액종; 점액육종; 골종; 골육종; 에윙 육종; 활막종; 선섬유종; 선림프종; 암육종; 연골종; 두개인두종; 미분화배세포종; 과오종; 간엽종; 종신종; 근육종; 법랑질아세포종; 시멘트질종; 치아종; 기형종; 흉선종; 영양막 종양; 선암; 선종; 담관종; 콜레스테린종; 원주종; 낭종암; 낭선종; 과립막 세포 종양; 남녀아세포종; 간종양; 한선종; 도세포 종양; 라이디히 세포 종양; 유두종; 세르툴리 세포 종양; 난포막 세포 종양; 평활근육종; 근아세포종; 근종; 근육종; 횡문근종; 횡문근육종; 뇌실상의세포종; 신경절신경종; 신경교종; 수아세포종; 수막종; 신경섬유초종; 신경모세포종; 신경상피종; 신경섬유종; 신경종; 부신경절종; 부신경절종 비크롬친화성; 혈관각화종; 호산소증가증을 동반하는 혈관림프양 과형성; 혈관종 경화성; 다발성 혈관종; 사구맥관종; 혈관내피종; 혈관종; 혈관주위세포종; 혈관육종, 림프관종; 림프관근종; 림프관육종; 송관체종; 암육종; 연골암; 낭육종 엽상; 섬유육종; 혈관육종; 평활근육종; 백혈육종; 지방육종; 림프관육종; 근육종; 점액육종; 난소 암종; 횡문근육종; 육종(예, 에윙 육종, 카포시 육종 및 비만세포 육종); 신생물(예, 뼈, 가슴, 소화계, 결장직장, 간, 췌장, 뇌하수체, 정소, 안와, 머리와 목, 중추신경계, 귀, 골반, 호흡로 및 요생식기); 신경섬유종증 및 경부 형성장애증)이 있다. 본 발명은, 예컨대 hTRT, 텔로머라제 효소 또는 텔로머라제 활성의 조절 이상에 의해(예, 비정상적인 과발현) 세포가 무한증식화되거나 과증식화되는 기타의 증상을 치료하는데 유용한 조성물과 방법을 제공한다.
본 발명은 항hTRT 백신, 텔로머라제 활성화를 예방하는 유전자 치료 벡터 및 텔로머라제 양성 세포의 특이적 치사를 초래하는 유전자 치료 벡터를 포함하여, 암을 예방하는 조성물과 방법을 제공한다. 관련 양태에서, 하기의 유전자 대체 치료법은 암의 유전자적 선호를 "치료"하는데 사용할 수 있다.
C) 기타 증상의 치료
본 발명은 텔로머라제 또는 hTRT 유전자 생성물의 발현 저하 또는 발현 증가를 특징으로 하는 질병 및 질병 증상(암외의 증상)의 치료에 유용한 조성물과 방법을 제공한다. 예로는 세포 증식 질병, 세포 노뇌에 의한 질병(특히 노화 질병), 면역학적 질병, 불임, 면역 장애 질병 등이 있다.
노화의 일부 질병은 말단소립 길이의 감소 (더 젊은 세포에 비하여)로 인한 세포 노뇌 관련 변화를 특징으로 하며, 그 결과 세포 중의 텔로머라제 활성이 소실 (또는 휠씬 낮은 농도)되게 된다. 말단소립 길이의 감소와 복제 성능의 감소는 후술하는 바와 같은 질병에 원인이 된다. 텔로머라제 활성과 말단소립 길이의 증가는, 예컨대 세포 중 hTRT 유전자 생성물(단백질 및 mRNA)의 농도를 증가시키면 얻을 수 있다. hTRT 발현이 치료 효과를 줄 수 있는 세포 노쇠와 관련된 증상의 일부 예로는 알츠하이머병, 파키슨병, 헌팅톤병 및 뇌일혈; 피부 위축, 탄성조직 분해 및 피부 주름, 피지선 과형성, 노인성 검은 사마귀, 두발의 노화와 두발 손실, 만성 피부 궤양 및 상처 치유의 노화 관련 장애와 같은 표피의 노화 관련 질병; 변성 연골 질병; 골다공증; 노화 관련 면역계 장애(예, B 및 T 림프구, 단핵구, 호중구, 호산구, 호염구, NK 세포 및 각각의 선조 세포 포함); 아테롬성 경화증, 석회화, 혈전증 및 동맥류를 비롯한 혈관계의 노화 관련 질병; 당뇨병, 근육 위축증, 호흡계 질병, 간 및 GI로의 질병, 대사 질병, 내분비 질병(예, 뇌하수체 및 부신선 질환), 생식 질병 및 노화관련 황반 변성이 있다. 세포내 hTRT 유전자 생성물의 농도를 증가시켜 말단소립의 길이를 증가시키면, 이들 질병 및 증상은 더 우수한 복제능을 세포에 부여하거나 복원시켜 치료할 수 있다. 이 방법은 생체외에서 배양된 세포 또는 생체내 세포에서 수행할 수 있다. 일양태로서, 세포를 먼저 텔로머라제를 활성화시키고, 말단소립의 길이를 연장하는 처리를 한 후, hTRT 유전자 및 텔로머라제 활성을 불활성화시키는 처리를 한다. 바람직한 일양태로서, 텔로머라제 활성은 분화 전 또는 분화하는 동안에 배아 또는 간(幹)세포중에 제공된 본 발명의 벡터를 통해 형성시킨다.
본 발명은 또한 불임을 치료하는데 유용한 방법 및 조성물을 제공하는 것이다. 인간의 배선 세포(예, 정조 세포, 선조 세포 또는 자손 세포)는 높은 텔로머라제 활성을 특징으로 하고 무한 증식할 수 있다. 비정상적이거나 또는 감소된 농도의 hTRT 유전자 생성물은, 예컨대 부적절하거나 비정상적인 정자의 생성으로 생식 질환 또는 불임을 유발한다. 따라서, "텔로머라제에 의한" 불임은 본 발명의 조성 물 및 방법을 이용하여 텔로머라제 농도를 증가시키면 치료할 수 있다. 유사하게, 텔로머라제 억제는 정모세포발생, 난자형성 및 정자와 난(卵) 생육력에 부정적인 영향을 줄 수 있기 때문에, 본 발명의 텔로머라제 억제 조성물을 배선 세포중 hTRT 유전자 생성물 농도를 감소시키는데 사용하며 피임 효과를 얻을 수 있다.
또한, 본 발명은 텔로머라제 활성을 감소시켜 활성화된 림프구 및 조혈 간세포 등의 텔로머라제 양성 세포의 증식능을 감소시키는데 유용한 방법 및 조성물을 제공한다. 따라서, 본 발명은 면역억제를 실시하는 방법을 제공한다. 역으로, 본 발명의 방법과 시약은 치료 개입전에 텔로머라제를 저농도로 발현하거나 텔로머라제를 전혀 발현하지 않는 간세포와 같은 세포에서의 증식능과 텔로머라제 활성을 증가시키는데 유용하다.
D) 개입의 방식
앞의 설명으로 분명해진 바와 같이, 세포의 텔로머라제 활성 또는 텔로머라제의 농도를 조절하는 것은 세포의 증식능에 큰 영향을 미치며, 따라서 질병을 치료하는데 매우 유용성이 있다. 또한, 이러한 조절은 자명한 것으로 텔로머라제 활성을 감소시키거나 증가시킬 수 있다. 본 발명의 텔로머라제 조절 분자들은 다수의 메카니즘을 통해 작용할 수 있다. 이들 중 일부는 전문가가 치료제를 선택하는데 도움을 주기 위해 본 단원과 하기에 설명하였다. 그러나, 본 출원인은 본 명세서에 개시된 신규 치료용 화합물, 조성물 및 방법에 대한 임의의 특정 메카니즘에 한정시키려는 것은 아니다.
텔로머라제 활성은 몇가지 메카니즘과 이들 메카니즘의 조합을 통해 감소시 킬 수 있다. 하나의 메카니즘은 텔로머라제 활성을 감소시키는 hTRT 유전자 발현을 감소시키는 것이다. 이 유전자 발현 감소는 hTRT 유전자의 mRNA로의 전사, 프로세싱(예, 접목), 핵 이송 또는 mRNA의 안정성, mRNA 해독에 의한 hTRT 단백질 생성 또는 hTRT 단백질의 안정성과 기능 농도에서 이루어질 수 있다. 또 다른 메카니즘은 본 명세서에 개시된 조성물에 의해 제공되거나, 본 명세서에 개시된 방법을 사용하여 확인될 수 있는 억제성 핵산, 폴리펩티드 또는 기타 제제(모의물, 소분자, 약물 및 프로드럭)를 이용하여 1종 이상의 텔로머라제 활성(예, 역전사효소 촉매 활성 또는 hTR 결합 활성)을 방해할 수 있다. 기타의 메카니즘으로는 hTR 및/또는 텔로머라제 관련 단백질의 분리와, 텔로머라제 RNP 성분의 서브유닛으로부터 유래한 이의 어셈블리의 간섭을 포함한다. 관련 메카니즘에서, hTRT 프로모터 서열은 독소를 암호하는 유전자에 작동가능하게 결합되어 세포에 도입되며, hTRT 전사 활성인자가 세포내에서 발현되거나 활성화되는 경우 독소는 발현되어 특정 세포를 죽인다.
세포의 증식 능력을 감소시키는 관련 방법은 정확도가 낮은 hTRT 변형체(즉, 예컨대 1이상의 높은 오차율 가진 변형체)를 도입하여 이상 말단소립 반복체를 합성하는 것이다. 이들 이상 반복체는 말단소립 단백질 결합에 영향을 주어 염색체 재배열 및 변이를 유도하고/또는 세포 사멸을 유도한다.
유사하게, 텔로머라제 활성은 임의의 몇가지 메카니즘 또는 메카니즘의 조합을 통해 증가시킬 수 있다. 이들은 세포중 hTRT의 양을 증가시키는 것을 포함한다. 일반적으로 세포내로 hTRT 폴리펩티드 암호 폴리뉴클레오티드(예, 프로모터에 작동 가능하게 결합된 hTRT DNA 서열 또는 안정한 hTRT mRNA를 포함하는 재조합 생성된 폴리펩티드)를 도입시켜 hTRT의 양을 증가시킬 수 있다. 대안적으로, 촉매적으로 활성인 hTRT 폴리펩티드는, 예컨대 미량주입법 또는 당업계에 공지된 기타 방법을 이용하여 세포나 조직내로 도입될 수 있다. 기타 메카니즘에서, 내인성 hTRT 유전자로부터의 발현 또는 hTRT 유전자 생성물의 세포중에서의 안정성이 증가될 수 있다. 내인성 텔로머라제 억제제와 텔로머라제 RNP의 상호작용, 또는 내인성 hTRT 전사 억제제와 hTRT 유전자의 상호작용을 저해하고; hTRT 전사 활성인자의 발현 및 활성을 증가시키며; 본원을 검토한 후 당업자라면 알 수 있는 기타의 수단을 이용하면 세포에서의 텔로머라제 활성을 증가시킬 수 있다.
E) 개입제
1) TRT 단백질과 펩티드
제1양태로서, 본 발명은 표적 세포에 직접 도입 (예, 주입, 리포좀 매개 융합, 히드로겔을 종양[예, 흑색종] 표면에 적용, 헤르페스 바이러스 구조 단백질 VP22에 융합 또는 부착 및 기타 본원에 개시되고 당업계에 공지된 방법에 의해)되어 텔로머라제 활성을 증가시키거나 감소시키는 텔로머라제 조절 폴리펩티드(즉, 단백질, 폴리펩티드 및 펩티드)를 제공한다. 제2 양태로, 본 발명의 텔로머라제 조절 단백질과 펩티드는 원하는 단백질 또는 펩티드를 암호하는 핵산(예, DNA 발현 벡터 또는 mRNA)을 세포내로 도입하여 세포에서 발현시킨다. 벡터와 어떤 프로모터(후술)를 선택하는냐에 따라 발현은 구성형 또는 유도형일 수 있다. hTRT를 암호하는 전령 RNA 제제는 일시적인 발현(예, 일시적인 텔로머라제의 활성화)이 바람직한 경우에만 특히 유용하다. 핵산을 세포내로 도입하고 발현하는 방법은 당업계에 공지되어 있다(본 명세서, 예컨대 올리고뉴클레오티드, 유전자 치료법에 관한 섹션 참고).
본 발명의 목적 중 하나는 세포에서 텔로머라제 활성을 증가시키는 텔로머라제 조절 폴리펩티드를 제공하는 것이다. 일양태로서, 폴리펩티드는 인간의 말단소립 DNA의 합성(hTR과 같은 RNA 주형과 함께)을 유도할 수 있는 촉매적으로 활성인 hTRT 폴리펩티드이다. 이 활성은 전술한 바와 같이, 예를 들어 TRAP 분석과 같은 텔로머라제 활성 분석을 사용하여 측정할 수 있다. 일양태로서, 폴리펩티드는 서열 번호 2에 기재된 1132개 잔기의 서열 또는 이와 거의 동일한 서열을 가지는 전장 hTRT 단백질이다. 또 다른 양태로서, 폴리펩티드는 융합 폴리펩티드, 파생된 폴리펩티드, 절두 폴리펩티드, 보존성 치환 폴리펩티드, 활성 변형 폴리펩티드 등의 서열 번호 2에 기재된 hTRT 단백질의 변형체이다. 융합 또는 파생 단백질은, 폴리펩티드가 세포막을 통과하는 능력을 증가시키거나 또는 폴리펩티드가 특정 세포 유형(예, 간 세포나 종양 세포)에 우선적으로 또는 세포 구획물(예, 핵 구획물)에 우선적으로 전달되도록 하는 표적 성분을 포함할 수 있다. 표적 성분의 예로는 지질 꼬리, 안테나포디아 펩티드와 같은 아미노산 서열 또는 핵 정위 시그널(NLS; 예, 제노푸스(XenoIpus), 뉴클레오플라스민(nucleoplasmin), Robbins 등, 1991, Cell 64:615)이 있다. 자연 발생적 hTRT 단백질(예, 서열 번호 2의 서열 또는 이 서열과 실질적으로 동일한 서열을 가지는 단백질)은 세포 핵에서 작용한다. 따라서, 잔기 193 내지 196(PRRR) 및 잔기 235 내지 240(PKRPRR)와 같은 서열 번호 2의 1종 이상의 준서열은 핵정위 시그널로서 작용하는 것 같다. 이와 같은 소영역을 다수의 NLS가 염기성 아미노산(K 또는 R)으로 구성되거나 또는 3개의 염기성 아미노산(K 또는 R) 및 H 또는 P로 구성된 4개의 잔기 패턴; P로 시작한 후 4개의 잔기중 3개의 K 또는 R 잔기를 포함하는 염기성 분절이 3개의 잔기내에 있는 패턴을 포함한다는 관찰에 근거하면 NLS로 추정된다(참고, 예를 들어 Nakai 등, 1992, Genomics 14:897). 이들 서열 및/또는 다른 정위 서열 중 하나 또는 둘 모두를 결실시키면 hTRT 대사 회전 속도를 증가시키고/또는 핵으로의 hTRT 이송을 저해할 것으로 기대되며, 핵 기질에 텔로머라제가 접근하는 것을 저해하고 증식능을 감소시키는 데 유용하다. 더욱이, NLS가 결핍되어 있는 변형체 hTRT 폴리펩티드는, 생성 효소가 핵으로 유입될 수 없기 때문에 말단소립 길이를 유지시킬 수 없는 RNP로 조합체를 형성한다.
본 발명의 hTRT 폴리펩티드는, 특히 세포중 텔로머라제 활성을 증가시키기 위해 사용되는 경우, 표적 세포에서 hTR 등의 텔로머라제 RNA와 결합되어 있다. 일양태로서, 도입된 hTRT 폴리펩티드는 내인성 hTR과 결합되어 촉매적으로 활성인 RNP(예, 서열 번호 2의 서열을 가지는 전장 폴리펩티드 및 hTR을 포함하는 RNP)를 형성한다. 이렇게 형성된 RNP는 다른 단백질, 예컨대 텔로머라제 회합 단백질과 회합될 수 있다. 다른 양태로서, 텔로머라제 RNP(hTRT 단백질, hTR 및 임의적인 기타 성분)는 표적 세포에 복합체로서 도입된다.
관련 양태로서, hTRT 발현 벡터는 텔로머라제 RNA(예, hTR) 발현 벡터는 동시에 또는 순차적으로 도입되거나 또는 미리 도입되어 있는 세포(또는 세포의 자 손)내로 도입시킨다. 이 양태에서, hTRT 단백질 및 텔로머라제 RNA는 세포에서 동시발현되고 텔로머라제 RNP를 형성하도록 조합된다. 바람직한 텔로머라제 RNA는 hTR이다. 세포중 hTR의 발현에 유용한 발현 벡터는 상기 문헌[참고 미국 특허 5,583,016]에 설명되어 있다. 또 다른 양태로서, hTRT 폴리펩티드 및 hTR RNA(또는 등가물)은 시험관내에서 결합하여 복합체를 형성한 뒤, 예컨대 리포좀 매개 전달에 의해 표적 세포내로 도입된다.
본 발명의 또 다른 목적은 세포내에서 텔로머라제 활성을 감소시키는데 유용한 hTRT 폴리펩티드를 제공한다. 전술한 바와 같이, 이들 "억제" 폴리펩티드는 세포내에 직접 도입시키거나 또는 재조합 핵산을 발현시켜 도입시킬 수 있다. 통상, 비표준 아미노산(즉, 유전자 코드에 의해 암호되는 20개 아미노산 또는 이의 정상적인 유도체 이외의 아미노산)을 포함하는 폴리펩티드 또는 펩티드 모조체는 직접 도입시킨다.
일양태로서, 텔로머라제 활성 억제는 정확한 말단소립 신장에 필요한 성분을 격리시키면 얻어질 수 있다. 이러한 성분의 예로는 hTRT 및 hTR이 있다. 따라서, hTR과 결합하나 텔로머라제 촉매 활성을 보유하지 않는 폴리펩티드를 투여하면 세포에서 내인성 텔로머라제 활성을 감소시킬 수 있다. 관련 양태에서, hTRT 폴리펩티드는 hTR 이외의 세포 성분, 예컨대 1종 이상의 텔로머라제 회합 단백질에 회합하여, 세포내에서 텔로머라제 활성을 저해할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명의 hTRT 폴리펩티드는 내인성 발현 hTRT 단백질과 텔로머라제 작용에 필요한 기타의 세포 성분, 예컨대 hTR, 말단소립 DNA, 텔로머라 제 회합 단백질, 말단소립 회합 단백질, 말단소립, 세포 사이클 제어 단백질, DNA 수복 효소, 히스톤 또는 비히스톤 염색체 단백질 등의 상호작용을 저해한다.
내인성 발현 hTRT 단백질과 기타 세포 성분의 상호작용에 영향을 주는 본 발명의 분자(예, 폴리펩티드)를 선별하는데 있어서, 본 명세서에 개시된 바와 같이 hTRT 단백질의 보존성 모티프를 1개 이상 포함하는 분자가 선호된다. 이들 영역의 진화적 보전은 이들 모티프가 기여하는 인간의 텔로머라제의 적당한 작용에 있어 이들 영역의 중요한 기능을 나타내며, 이 모티프는 일반적으로 본 발명의 변형 hTRT 단백질을 만들 수 있는 hTRT 단백질 기능을 변화시키는데 유용한 부위이다. 따라서, 보존 모티프내에 변이가 있는 변형 hTRT 폴리펩티드는 본 발명의 일부 용도로 특히 유용하다.
또 다른 일양태로서, 내인성 hTRT 유전자의 발현은 hTRT 유전자의 전사, hTRT 프리 mRNA의 프로세싱, hTRT mRNA의 해독 또는 텔로머라제 RNP의 어셈블리와 이송을 억제하기 위해서 피드백 루프를 통해 작용하는 다량(예, 전형적으로 내인성 농도의 약 2배 이상, 종종 약 10 배 내지 100 배 이상)의 hTRT 폴리펩티드를 세포내로 도입시켜 억제시킨다.
2) 올리고뉴클레오티드
a) 안티센스 작제물
본 발명은 시험관내 또는 생체내에서 hTRT 유전자 생성물의 발현을 감소시키는 데 사용될 수 있는 방법과 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 시약을 제공한다. 본 발명의 안티센스 시약을 표적 세포에 투여하면 텔로머라제 활 성이 감소되고, 높은 텔로머라제 활성이 특징인 질병(예, 암)을 치료하는데 특히 유용하다. 그 치료 기작은 임의의 특정 메카니즘에 국한하려는 것은 아니지만, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 센스 hTRT mRNA에 결합하여 해독을 저해한다고 생각된다. 대안적으로, 안티센스 분자는 hTRT mRNA를 뉴클레아제 분해에 대한 감수성을 부여하거나, 전사를 저해하거나, RNA 전구체("프리 mRNA")의 프로세싱, 정위 등을 저해하거나, hTRT 유전자로부터의 mRNA 전사를 억제하거나 또는 일부 다른 메카니즘을 통해 작용할 수 있다. 그러나, hTRT 발현을 감소시키는 안티센스 분자의 메카니즘은 그다지 중요하지 않다.
본 발명의 안티센스 폴리뉴클레오티드는 hTRT 유전자로부터 전사된 mRNA 또는 hTRT 암호 mRNA의 서열에 특이적으로 하이브리드화되는 최소한 7∼10 내지 통상 20개 이상의 뉴클레오티드로 된 안티센스 서열을 포함한다. 더욱 종종, 본 발명의 안티센스 폴리뉴클레오티드는 길이가 약 10 내지 50개인 뉴클레오티드 또는 길이가 약 14 개 내지 35 개인 뉴클레오티드이다. 기타 양태들에서, 안티센스 폴리뉴클레오티드는 약 100 뉴클레오티드 미만 또는 약 200 뉴클레오티드 미만의 폴리뉴클레오티드이다. 일반적으로, 안티센스 폴리뉴클레오티드는 안정한 2본쇄를 형성하기에 충분히 길지만 필요한 경우 전달 방식에 따라 생체내 투여하기에 충분할 정도로 짧아야 한다. 표적 서열에 특이적으로 하이브리드화하는데 필요한 폴리뉴클레오티드의 최소 길이는 여러 인자 중 몇가지 인자, 예컨대 G/C 함량, 부정합 염기(존재하는 경우)의 위치 결정, 표적 폴리뉴클레오티드 군과 비교시 서열의 고유성 정도 및 폴리뉴클레오티드의 화학 특성(예, 메틸포스포네이트 골격, 펩티드 핵산, 포스포로 티오에이트)에 좌우된다.
일반적으로 특이적 하이브리드화를 확인하기 위한 경우, 안티센스 서열은 표적 hTRT mRNA 서열에 실질적으로 상보성인 것이다. 특정 양태에서, 안티센스 서열은 표적 서열에 정확하게 상보적이다. 그러나, 안티센스 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드 치환, 첨가, 결실, 전이(transition), 전위 또는 수사를 포함하거나, 또는 hTRT RNA나 이의 유전자에 상응하는 관련 표적 서열에 대한 특이 결합이 폴리뉴클레오티드의 작용 특성으로 보유되는 한 기타 핵산 서열 또는 비핵산 부분도 포함할 수 있다.
일양태로서, 안티센스 서열은 상대적으로 접근 가능한 hTRT mRNA 서열(예, 상대적으로 2차 구조가 결핍)에 상보적이다. 이는 예컨대 MFOLD 프로그램(미국 위스콘신주 매디슨에 소재하는 제네틱스 컴퓨터 그룹)을 사용하고 당업계에 공지된 대로 시험관내 또는 생체내에서 시험하여 추정되는 RNA 2차 구조를 분석하면 서열 결정될 수 있다. 안티센스 hTRT 작용의 안티센스 억제에 대해 세포에서 검사될 수 있는 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 1의 서열 중 하기 위치에 하이브리드화할 수 있는 것(즉, 실질적으로 상보적인 것)이다: 40∼60; 260∼280; 500∼520; 770∼790; 885∼905; 1000∼1020; 1300∼1320; 1520∼1540; 2110∼2130; 2295∼2315; 2450∼2470; 2670∼2690; 3080∼3110; 3140∼3160; 및 3690∼3710. 효과적인 안티센스 조성물을 확인하는 다른 유용한 방법은 올리고뉴클레오티드를 조합하여 분석하는 것이다(참고; Milner et al., 1997, Nature Biotechnology 15:537).
본 발명은 안티센스 서열(즉, 항 hTRT 센스 서열)외의 서열을 가지는 안티센스 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다. 이 경우, 안티센스 서열은 더 긴 폴리뉴클레오티드 서열내에 포함되어 있다. 또 다른 양태에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 안티센스 서열이거나 또는 이 서열을 대부분으로 포함한다.
안티센스 핵산(DNA, RNA, 수사물, 유사물 등)은 본 명세서에 개시된 화학 합성법 및 재조합 방법 등과 같이 핵산을 제조하는 임의의 적절한 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 일양태로서, 예컨대 본 발명의 안티센스 RNA 분자는 새로운 화학 합성법 또는 클로닝에 의해 제조할 수 있다. 예를 들어, hTRT mRNA에 하이브리드화되는 안티센스 RNA는 프로모터에 역방향으로 작동가능하게 결합된 hTRT DNA 서열(예, 서열 번호 1 또는 이의 단편)을 벡터(예, 플라스미드)에 삽입(결찰)하여 제조할 수 있다. 프로모터 및 바람직하게는 종결 시그널과 폴리아데닐화 시그널이 적절하게 위치하는 것을 전제로 하여, 비암호 가닥에 해당하는 삽입 서열의 가닥은 전사되고 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드로서 작용한다.
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 포유동물 및 인간을 비롯하여 무세포 추출물, 세포 및 동물에서 텔로머라제 활성을 억제하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 다음 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오티드 A) 내지 D)는 텔로머라제 활성을 억제하는데 사용될 수 있다.
A) 5'-GGCATCGCGGGGGTGGCCGGG
B) 5'-CAGCGGGGAGCGCGCGGCATC
C) 5'-CAGCACCTCGCGGTAGTGGCT
D) 5'-GGACACCTGGCGGAAGGAGGG
10 μM 농도의 각 올리고뉴클레오티드에서, 올리고뉴클레오티드 A 및 B의 혼합물; A, B, C 및 D의 혼합물; 및 A, C 및 D의 혼합물은 7일 동안 매일 1회 처리한 경우 293 세포에서 텔로머라제 활성을 억제하였다. 안티센스 hTR 분자(5'-GCTCTAGAATGAAGGGTG-3')는 올리고뉴클레오티드 A, B 및 C; 올리고뉴클레오티드 A, B 및 D; 및 A 및 C와 함께 사용한 경우에도 억제 작용을 나타내었다. 이러한 실험에 유용한 대조 올리고뉴클레오티드로는 S1) 내지 S3)이 있다.
S1) 5'-GCGACGACTGACATTGGCCGG
S2) 5'-GGCTCGAAGTAGCACCGGTGC
S3) 5'-GTGGGAACAGGCCGATGTCCC
특정 용도를 위한 본 발명의 최적 안티센스 올리고뉴클레오티드를 결정하기 위해서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드 세트를 이용하여 스캔을 실시할 있다. 일례로서, hTRT mRNA에 걸쳐있고 15개의 뉴클레오티드가 다음 올리고뉴클레오티드 세트에 공유되는 30량체 올리고뉴클레오티드의 세트이다(즉, ON1은 위치 1 내지 30에 해당하는 TCCCACGTGCGCAGCAGGACGCAGCGCTGC이고, ON2는 위치 16 내지 45에 해당하는 GCCGGGGCCAGGGCTTCCCACGTGCGCAGC이며, ON3은 위치 31-60에 해당하고 GGCATCGCGGGGGTGGCCGGGGCCAGGGCT이며, 이런 방식으로 mRNA 말단까지 계속됨). 이러한 세트의 각 구성원을 가지고 본원에 개시된 바와 같은 억제 활성에 대해 검사할 수 있다. 그 후 해당 조건하에 억제 활성을 나타내는 올리고뉴클레오티드의 해당 영역을 확인하고, 해당 영역에 상응하는 본 발명의 기타 올리고뉴클레오티드(즉, 8 량체, 10량체, 15량체 등)를 시험하여 바람직한 용도의 활성을 가진 올리고뉴클레오티드를 확인할 수 있다.
안티센스 폴리뉴클레오티드에 관련된 일반적인 방법은 문헌[ANTISENSE RNA AND DNA(1988), D.A.Melton, Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.]을 참조한다. 또한, 문헌[Dagle et al., 1991, Nucleic Acids Research , 19:1805] 참조. 안티센스 처치법에 대한 검토는 문헌[Uhlmann et al., Chem. Reviews, 90:543-584(1990)] 참조.
b) 3본쇄 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드
본 발명은 2본쇄 hTRT 핵산(예컨대 hTRT RNA의 중첩 영역 또는 hTRT 유전자에서)에 결합하는 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드(예, DNA, RNA, PNA 등)를 제공하여 3중 나선 함유 핵산 또는 "3본쇄(triplex)" 핵산을 형성한다. 3중 나선 형성 결과, 예컨대 hTRT 유전자의 전사를 저해하여 세포내에서의 텔로머라제 활성을 감소시키거나 제거하여 hTRT 발현을 억제한다. 임의의 특정 메카니즘으로 한정하려는 것은 아니지만, 3중 나선 쌍은 폴리머라제, 전사 인자 또는 조절 분자가 결합을 위해 충분하게 개방되는 2본쇄의 성질을 저해하는 것으로 생각된다.
본 발명의 삼중 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드는 3중 나선 형성의 염기쌍 규칙[참고: 문헌 Cheng et al., 1988, J.Biol.Chem. 263:15110; Ferrin and Camerini-Otero, 1991, Science 354; 1494; Ramdas et al., 1989, J.Biol.Chem. 264:17395; Strobel et al., 1991, Science 254: 1639; 및 Rigas et al., 1986, Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 83: 9591; 각각의 문헌은 참고로 인용함]과 hTRT mRNA 및/또는 유전자 서열을 이용하여 작제한다. 통상, 본 발명의 3본쇄 형성 올리고뉴클레오티드는 hTRT RNA 또는 유전자 중 특정 서열에 "상보적인" 약 10개 내지 약 25개 이상의 뉴클레오티드 또는 그 이상의 길이를 가지는 뉴클레오티드에서 얻은 특정 서열을 포함한다(즉, 안정한 삼중 나선을 형성하기에 충분히 크지만, 필요한 경우 전달 방식에 따라 생체내 투여하기에 충분히 작은 길이를 가짐). 본원에서, "상보적인"은 안정한 삼중 나선을 형성할 수 있는 것을 의미한다. 일양태로서, 올리고뉴클레오티드는 hTRT 유전자의 조절 영역(예, hTRT 5' 인접 서열, 프로모터 및 인헨서) 또는 전사 개시 부위(예, 전사 개시 부위로부터 약 -10 내지 +10)에 특이적으로 결합되도록 고안된다. 삼중 DNA를 이용한 최근의 치료법 진보를 고찰하기 위해서, 문헌[Gee et al., in Huber and Carr, 1994, MOLECULAR AND IMMUNOLOGIC APPROCHES, Futura Publishing Co., Mt Kisco NY and Rininsland et al., 1977, Proc. Natl.Acad.Sci. USA 94:5854]을 참고하며, 이 문헌은 참고로 인용한 것이다.
c) 리보자임
본 발명은 텔로머라제 활성 억제에 유용한 리보자임을 제공한다. 본 발명의 리보자임은 hTRT mRNA에 결합하고 특이적으로 분해시키며 불활성화시킨다. 유용한 리보자임은 hTRT mRNA에 상보적인 5'-말단 서열과 3'-말단 서열을 포함할 수 있으며, 본원에 개시된 hTRT mRNA 서열을 기초로 당업자라면 유전공학적으로 조작할 수 있다(참고 PCT 공보 WO93/23572, 상기 문헌 참조). 본 발명의 리보자임은 I군 인트론 리보자임(Cech, 1995, Biotechnology 13:323)의 특성 및 기타 해머 모양의 헤드를 가진 리보자임(Edgington, 1992, Biotechnology 10:256)의 특성을 가진 것들을 포함한다.
본 발명의 리보자임은 GUA, GUU 및 GUC 등의 절단 부위를 가지는 것들을 포함한다. 본 발명에 따른 텔로머라제 활성의 리보자임 매개 억제를 위한 다른 최적 절단 부위는 PCT 공보 WO94/02595 및 WO93/23569에 개시되어 있으며, 본원에서 참고로 인용하였다. 절단 부위를 포함하는 표적 hTRT 유전자의 영역에 상응하는 길이가 15개 내지 20개의 리보뉴클레오티드인 짧은 RNA 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드를 더욱 바람직하게 할 수 있는 2차 구조 특성에 대해 평가할 수 있다. 또한, 절단 부위의 적합성은 리보뉴클레아제 보호 분석을 사용하여 상보성 올리고뉴클레오티드와의 하이브리드화에 대한 접근 가능성을 시험하거나, 당업계에 공지된 표준 과정으로 시험관내 리보자임 활성을 시험하여 평가한다.
Hu 등의 특허[PCT 공보 WO 94/03596, 참고로 인용]에 설명된 바와 같이, 안티센스 및 리보자임 기능은 단일 올리고뉴클레오티드에 조합시킬 수 있다. 더욱이, 리보자임은 본 발명의 예시적 안티센스 올리고뉴클레오티드의 설명과 함께 전술되어 있는 바와 같이, 뉴클레오티드 사이에 변형 결합이나 또는 1종 이상의 수사된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
일양태로서, 본 발명의 리보자임은 시험관내에서 제조한 뒤 세포나 환자 중으로 도입한다. 또 다른 일양태로서, 유전자 치료법은 생체외 또는 생체내 표적 세포에서 리보자임을 발현하는데 사용한다.
d) 올리고뉴클레오티드의 투여
통상, 본 발명의 치료법은 생체내 생리학적 조건하에 텔로머라제 활성을 억 제하거나 자극하는 기능을 하는 올리고뉴클레오티드의 투여를 포함하며, 이 방법은 충분한 시간 동안 치료 효과를 제공하는 조건하에서 비교적 안정하다. 전술한 바와 같이, 변형 핵산은 안정성을 부여하는 경우 뿐 아니라 목적하는 조직, 기관 또는 세포에 올리고뉴클레오티드의 전달을 표적화하는 경우에도 유용할 수 있다.
올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드는 적절한 약학적 제제내에 약물로서 직접 전달하거나, 또는 리포좀, 면역리포좀, 사출법, 세포내로 직접 흡수 및 본원에 개시된 기타 방법으로 세포내로 핵산을 도입시키는 수단에 의해 간접적으로 전달한다. 질병을 치료하기 위해서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 치료학적 유효량으로 환자에게 투여한다. 치료학적 유효량은, 예컨대 TRAP 분석 또는 기타 적절한 텔로머라제 생물학적 기능 분석을 이용하여 측정한 경우 표적 세포에서 텔로머라제 활성을 조절하거나 질병의 증상을 경감시키는데 충분한 양이다. 치료 목적을 위해 올리고뉴클레오티드의 전달에 유용한 방법은, 본원에 참고로 인용한 미국 특허 5,272,065호에 설명되어 있다. 하기에 기타 약학적으로 활성인 화합물의 투여에 관해 상세하게 설명되어 있다. 또 다른 양태에서, 올리고뉴클레오뉴클레오티드 및 폴리올리고뉴클레오티드는 본 발명의 유전자 치료법 및 재조합 DNA 발현 플라스미드를 사용하여 전달될 수 있다.
3) 유전자 치료법
유전자 치료법은 폴리뉴클레오티드를 전달하고자 하는 (통상) 포유류 세포(들)에 의학적으로 유용한 표현형 효과를 제공하는 외래 폴리뉴클레오티드를 도입하는 것이다. 본 발명의 목적 중 하나는 텔로머라제 관련 증상을 치료하는 유전자 치 료 방법 및 조성물을 제공하는 것이다. 예시적 양태로서, 유전자 치료는 hTRT 유전자 생성물(예컨대 텔로머라제 활성을 증가시키는 서열 번호 2의 서열을 가지는 hTRT 폴리펩티드와 거의 유사한 hTRT 단백질 또는 활성을 감소시키는 억제성 hTRT 폴리펩티드 등의 생성물)을 발현하거나, hTRT 유전자 또는 mRNA 서열을 보유하는 핵산(예컨대 텔로머라제 활성을 감소시키기 위한 안티센스 RNA 등의 핵산)을 발현하거나, hTRT 유전자 생성물(텔로머라제 활성을 감소시키기 위한 hTRT mRNA 지향성 리보자임)의 발현에 영향을 줄 수 있는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 발현하거나 또는 내인성 hTRT 서열을 대체 또는 파괴하는(예, 각각 유전자 대체법 및 "유전자 무력화") 벡터를 세포내로 도입시키는 것을 포함한다. 여러 양태들은 본원에 개시된 내용을 고찰하면 당업자에게는 명백해질 것이다. 일양태로서, hTR 암호 벡터가 도입될 수도 있다. 다른 양태로서, 텔로머라제 회합 단백질을 암호하는 벡터를 hTR 용 벡터와 함께 또는 벡터 없이 도입할 수도 있다.
hTRT 유전자 치료법에 유용한 벡터는 바이러스성 또는 비바이러스성일 수 있으며 본 발명의 hTRT 발현계와 관련하여 상기 문헌에 개시되어 있는 것들을 포함한다. 유전자 치료 벡터는 본원에 개시된 바와 같은 프로모터 및 기타 조절 서열이나 프로세싱 서열을 포함할 수 있다는 것은 당업자에게는 자명한 일이다. 일반적으로 벡터는 올리고뉴클렝도티드의 전사를 추진하는 작용을 하는 프로모터와 임의적으로 인헨서(프로모터내에 포함된 임의의 것으로 부터 분리) 뿐 아니라 필요한 경우 높은 농도의 전사와 에피좀 유지 또는 염색체 삽입을 위해 제공되는 기타 조절 성분을 포함한다. 유전자 치료에 유용한 플라스미드는 선택 마커, 동정 영역 및 기 타 서열 등의 기타의 작용 성분을 포함할 수 있다. 부가 서열은 세포내외에서 안정성을 부여하고, 특정 기관, 조직 또는 세포 개체군으로 hTRT 뉴클레오티드 서열(센스나 안티센스)의 전달을 표적화하고, 세포내로의 유입을 매개하고, 세포의 핵내로의 유입을 매개하고/또는 핵 DNA 중으로의 통합을 매개하는데 중요한 역할을 한다. 예를 들어, 압타머(aptamer) 유사 DNA 구조, 또는 기타 단백질 결합 성분 부위를 사용하여 수용체에 결합하는 혈청 단백질 또는 세포 표면 수용체에 대한 벡터의 결합을 매개하므로써 세포내로의 DNA 전달 효율을 증가시킨다. 기타 DNA 부위 및 구조는 핵막내의 수용체 또는 핵내로 유입되는 기타 단백질에 직접 또는 간접 결합되어 벡터의 핵 흡수를 용이하게 한다. 기타 DNA 서열은 삽입 효율에 직접 또는 간접적으로 영향을 줄 수 있다.
적절한 유전자 치료 벡터는 복제 기원이 있는 것이거나 없는 것일 수 있다. 예를 들어 환자에게 투여하기 전 벡터 전파를 위해 벡터내에 복제 기원을 병입하는 것이 유리하다. 그러나, 복제 기원은 종종 숙주의 mRNA 또는 DNA에 결합하거나 숙주 염색체 DNA내로 통합되도록 고안되는 경우 투여하기 전에 제거될 수 있다. 일부 상황(예, 종양 세포)에서, 일시적인 발현은 종양 세포를 죽이기에 충분하기 때문에 형질도입된 세포내로 외래 DNA를 안정하게 통합시키는 것이 반드시 필요한 것은 아니다.
전술한 바와 같이, 본 발명은 유전자 대체 치료용(즉, 재조합 유전자와 내인성 hTRT 유전자의 동종 재조합에 의한 대체) 방법 및 시약을 제공하는 것이다. 동종 재조합을 통한 통합을 위해 특이적으로 고안된 벡터를 사용할 수도 있다. 동종 재조합을 최적화하는 중요한 인자는 염색체 서열에 대한 상동성 길이 및 서열 동일성 정도를 포함한다. 동종 재조합을 매개하는 특정 서열도 중요한데, 이는 삽입이 전사적으로 활성인 DNA에서 더 용이하게 발생하기 때문이다. 동종 표적 작제물을 작제하는 방법 및 재료는 문헌[Mansour et al., 1988, Nature 336: 348; Bradley et al., 1992, Bio/Technology 10:534]에 개시되어 있다. 미국 특허 제5,627,059호; 제 5,487,992호; 제5,631,153호; 및 제5,464,764호 참고. 일양태에서, 유전자 대체 치료는 조절하고자 하는 hTRT 유전자의 발현을 제어하는 조절 서열의 일부 또는 전부를 대체하거나 변형시키는 것을 포함한다. 예를 들어 hTRT 프로모터 서열(예, 서열 번호 6에서 발견되는 프로모터 서열)은 파괴되거나(전사 제어 부위를 폐지하거나 hTRT 발현을 감소시키기 위해) 또는 외래 프로모터가 치환 (예컨대 hTRT 발현을 증가시키기 위해)될 수 있다.
본 발명은 hTRT "유전자 무력화"(즉, 재조합 생성된 벡터를 이용한 내인성 hTRT 유전자의 동종 재조합에 의한 결실이나 파괴)을 위한 방법 및 시약을 제공한다. 유전자 무력화에서, 표적 서열은 조절 서열(예, hTRT 프로모터), 또는 RNA나 단백질 암호 서열일 수 있다. 내인성 유전자의 발현을 변화시키기 위한 동종 재조합의 사용에 대해서는 미국 특허 제5,272,071호(및 상기 인용한 미국 특허), WO 91/09955, WO 93/09222, WO 96/29411, WO95/31560 및 WO 91/12650에 상세히 설명되어 있다. Moynahan 등, 1996, Hum.Mol.Genet. 5:875 참고.
또한, 본 발명은 세포에 독성이 있는 단백질 발현을 조절하는 hTRT 유전자 프로모터를 이용하여 텔로머라제 양성 세포를 특이적으로 죽이거나, 텔로머라제 음 성 세포가 텔로머라제 양성 상태로 형질전환되는 것을 방지하는 방법을 제공한다. 실시예 14에 제시된 바와 같이, hTRT 프로모터 서열은 프로모터의 활성화가 리포터 유전자에 의해 암호되는 단백질의 발현을 초래할 수 있도록 리포터 유전자에 작동가능하게 결합될 수 있다. 리포터 단백질 대신 암호 단백질이 세포에 독성이 있는 경우, 프로모터의 활성화로 세포는 이환상태 또는 치사상태가 된다. 본 발명의 일양태에서, 독성이 있는 단백질을 암호하는 유전자에 작동가능하게 결합된 hTRT 프로모터를 포함하는 벡터는 세포, 예컨대 인간 세포(예, 환자의 세포)내로 도입되어 hTRT 프로모터 활성 인자가 발현되는 암과 같은 세포의 세포 사멸을 초래한다. 관련 양태에서, 암호 단백질은 그 자체가 세포에 독성은 아니지만 세포를 비독성 약물에 민감하게 만드는 활성을 암호한다. 예를 들어, 종양은 hTRT-프로모터-헤르페스 티미딘 키나아제(TK) 유전자 융합 작제물을 종양 세포내로 도입하고 강시클로비르 또는 등가물을 투여하여 처리할 수 있다(참고, Moolton and Wells, 1990, J.Nat'l Canc.Inst. 82:297). 당업자가 본 발명을 변형 및 적용할 수 있는 여러 기타 적절한 독성 또는 잠재적으로 독성인 단백질과 시스템(hTRT 외의 프로모터 서열을 이용)은 당업계에 잘 알려져 있다.
유전자 치료 벡터는 생체내, 시험관내 또는 생체외 세포나 조직내로 도입될 수 있다. 생체외 치료의 경우, 벡터는 환자로부터 취한 세포, 예컨대 간세포내로 도입되어 동일한 환자에게 다시 자가 이식하여 클론적으로 증식될 수 있다(참고, 미국 특허 제5,399,493호 및 제5,437,994호, 본원에 참고로 인용됨). 표적 세포의 텔로머라제 활성을 증가시키는 데 목적이 있는 hTRT 유전자 치료에 표적이 될 수 있는 세포로는 상기 문헌에 제시된 바와 같은 배아 간 세포 또는 생식 세포, 특히 영장류 또는 인간 세포와 조혈 간 세포(AIDS 및 화학요법 처치 후), 혈관 내피 세포(심장 및 뇌 혈관 질병), 피부 섬유아세포 및 기저 피부 각질 세포(상처 치유 및 화상), 연골 세포(관절), 뇌 성상 세포 및 미소신경교 세포(알츠하이머병), 골아세포(골다공증), 망막 세포(안과 질환), 및 췌장도 세포(I형 당뇨병) 및 하기 표 3에 제시된 임의의 세포 뿐 아니라 분할되는 것으로 알려진 임의의 기타 세포가 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
본 발명의 일양태에서, TRT, 예컨대 hTRT 암호 서열에 작동가능하게 결합된 유도성 프로모터(또는 변형체)는 생체내 또는 시험관내 세포의 증식 능력을 조절하는 데 사용된다. 특정 양태에서, 예컨대 유도성 프로모터의 조절하에 hTRT 발현 벡터로 형질감염시킨 인슐린 생성 췌장 세포는 환자내로 도입한다. 프로모터 활성화제(예, 테트라사이클린)를 환자에게 투여하여 면 세포가 가능한 정도보다 다수 복제되어 세포의 증식 능력을 조절할 수 있다. 세포 증식은 처치의가 원하는 대로 종결, 지속 또는 재개시할 수 있다.
4) 백신 및 항체
hTRT 서열을 가진 면역원성 펩티드 또는 폴리펩티드는 환자의 항hTRT 면역 응답을 유도하는 데 사용할 수 있다(즉, 백신으로서 작용함). 면역원성 hTRT 펩티드 및 폴리펩티드의 예는 하기 실시예 6 및 8에 설명되어 있다. 또한, 면역 응답은 대상 폴리펩티드를 암호하는 플라스미드 벡터의 전달(즉, "외피가 없는 DNA(naked-DNA)" 투여)에 의해 증가될 수 있다. 해당 핵산은 주사, 리포좀 또는 기타 투여 수 단으로 전달될 수 있다. 일양태로서, 검체에서 텔로머라제 발현 세포에 대한 클래스 I MHC 제한 세포독성 림프구 응답을 유도하는 면역화 방식을 선택한다. 일단 면역화되면, 개체 또는 동물은 고 농도의 텔로머라제를 발현하는 세포(예, 악성 세포)에 대해 면역 응답의 증가를 유도한다.
항hTRT 항체, 예컨대 쥐, 인간 또는 인체화된 모노클로널 항체를 환자에게 투여하여(예, 수동 면역) 텔로머라제 발현 세포에 대한 면역 응답에 영향을 줄 수 있다.
F) 약학 조성물
본 발명의 관련 목적 중 하나는 hTRT 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 및 항체, 작용 물질, 길항 물질, 또는 억제제를 포함하는 약학 조성물을 단독, 또는 1종 이상의 기타 제제, 예컨대 안정화제 화합물, 희석제, 담체 또는 기타 활성 성분이나 제제와 함께 제공한다.
본 발명의 치료제는 이에 국한되는 것은 아니지만 염수, 완충 염수, 덱스트로스 및 물을 비롯하여 임의의 무균, 생체적합성 약학적 담체중에서 투여될 수 있다. 임의의 이들 분자는 적절한 부형제, 보조제 및/또는 약학적 허용 담체와 혼합된 약학 조성물 단독으로, 또는 기타 제제, 약물이나 호르몬과 함께 투여될 수 있다. 본 발명의 일양태에서, 약학적 허용 담체는 약학적으로 불활성이다.
약학 조성물은 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 비경구 전달 방법으로는, 국소, 동맥내(예, 종양에 직접 전달), 근육내, 피하, 수질내, 초내, 심실내, 정맥내, 복강내 또는 비강내 투여가 있다. 활성 성분외에, 이들 약학 조성물은 약학적 으로 사용될 수 있는 제제내로 활성 화합물의 처리를 용이하게 하는 기타 화합물과 부형제를 포함하는 적절한 약학 허용 담체를 포함할 수 있다. 제형화 및 투여 기술에 관한 더 상세한 설명은 문헌["REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES", 미국 펜실베니아주 이스톤에 소재하는 Maack Publishing Co]의 최종판에 기재되어 있다.
경구 투여용 약학 조성물은 경구 투여에 적합한 용량으로 당업계에 공지된 약학적 허용 담체를 사용하여 제형할 수 있다. 이러한 담체는 조성물을 환자가 섭취하기 적절한 정제, 환약, 당제, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형화할 수 있다. PCT 공보 WO 93/23572 참고.
경구용 약학적 제제는 고체 부형제와 활성 성분을 혼합하여 얻을 수 있으며, 임의적으로 생성 혼합물을 분쇄하고, 과립 혼합물을 처리한 후 필요에 따라 적절한 추가의 혼합물을 첨가하여 정제 또는 당제 코어를 얻을 수 있다. 적절한 부형제는 탄수화물 또는 단백질 충전물이 있으며, 비제한적인 예로는 락토스, 슈크로즈, 만니톨 또는 소르비톨 등의 당; 옥수수, 밀, 쌀, 감자 또는 기타 식물에서 얻은 전분; 메틸 셀룰로스, 히드록시프로필메틸 셀룰로스 또는 나트륨 카르복시메틸셀룰로스 등의 셀룰로스; 아라비아검 및 트라가칸트검 등의 검; 뿐 아니라 젤라틴과 콜라겐 등의 단백질이 있다. 필요에 따라, 붕해제 또는 가용화제를 첨가할 수 있으며, 그 예로는 가교된 폴리비닐 피롤리돈, 아가, 알긴산 또는 알긴산 나트륨과 같은 이의 염이 있다.
당제 코어는 아라비아검, 탈크, 폴리비닐피롤리돈, 카르보폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 이산화티탄을 포함할 수도 있는 진한 당용액, 래커 용액 및 적절한 유기 용매 또는 용매 혼합물과 같은 적절한 피복물을 사용하여 제공된다. 염료 또는 안료는 활성 화합물의 양을 특성화하거나(예, 투여량) 생성물 확인을 위해 정제나 당제 피복물에 첨가할 수 있다.
경구적으로 사용될 수 있는 약학 제제는 젤라틴으로 제조한 푸시-핏(push-fit) 캡슐 뿐 아니라 글리세롤 또는 소르비톨 등의 피복물과 젤라틴으로 제조한 연질의 밀봉 캡슐을 포함한다. 푸쉬 핏 캡슐은 락토스 또는 전분과 같은 충전제 또는 결합제, 탈크 또는 마그네슘 스테아레이트 등의 윤활제, 및 임의적으로 안정화제와 혼합된 활성 성분을 포함할 수 있다. 연질 캡슐에서, 활성 성분은 적절한 용액, 예컨대 지방 오일, 액체 파라핀, 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜을 안정화제와 함께 또는 안정화제 없이 용해시키거나 현탁시킬 수 있다.
비경구 투여용 약학적 제제는 활성 성분의 수용액을 포함한다. 주입의 경우, 본 발명의 약학 조성물은 수용액, 바람직하게는 행크스액, 링거액과 같은 생리적으로 적합한 완충액이나 생리적 완충 염수에서 제형화될 수 있다. 수성 주입 현탁액은 나트륨 카르복실메틸 셀룰로스, 소르비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 포함할 수 있다. 또한, 활성 화합물의 현탁액은 적절한 오일성 주입 현탁액으로 제조될 수 있다. 적절한 친유성 용매 또는 부형제는 참기름과 같은 지방 오일, 또는 에틸 올레이트나 트리글리세라이드와 같은 합성 지방산 에스테르, 또는 리포좀을 포함한다. 임의적으로, 현탁액은 고도로 농축된 용액을 제조하기 위한 화합물의 용해도를 증가시키는 적절한 안정화제 또는 제제를 포함할 수 있다.
국소 또는 비측 투여의 경우, 특정 막을 침투하는 데 적절한 침투제가 제제에 사용된다. 일부 침투제가 당업계에 공지되어 있다.
본 발명의 약학 조성물은 당업계에 공지된 것과 유사한 방법(예컨대 종래의 혼합, 용해, 과립화, 당제 제조, 연화, 유화, 캡슐화, 포집화 또는 동결건조 처리)으로 제조할 수 있다.
약학 조성물은 염의 형태로 제공될 수 있으며, 다음의 것에 한정되는 것은 아니지만 염산, 황산, 아세트산, 젖산, 주석산, 말산, 숙신산 등을 비롯하여 여러 산을 이용하여 제조할 수 있다. 상응하는 유리 염기 형태인 수성 용매 또는 기타 양성자 용매내에서 더 잘 용해되는 경향이 있다. 기타의 경우, 바람직한 제제는 pH4.5 내지 5.5의 범위에서 1 mM∼50 mM 히스티딘, 0.1∼0.2슈크로즈, 2∼7만니톨로 만든 동결 건조 분말이며, 이는 사용전에 완충액과 혼합한다.
허용 담체내에서 제형화된 본 발명의 화합물을 포함하는 약학 조성물을 제조한 후에, 적절한 용기에 넣고 소정 질환 치료용으로 라벨 표시한다. 인간의 텔로머라제 단백질과 핵산 투여용인 경우, 이 라벨에는 투여량, 투여 빈도 및 투여 방법을 표시해 둔다.
본 발명에 사용하기에 적절한 약학 조성물은 활성 성분이 의도하는 목적을 달성하기 위한 유효량으로 함유된 조성물을 포함한다. "치료학적 유효량" 또는 "약리학적 유효량"은 의도하는 약리학적 결과를 얻는 데 효과적인 제제의 양을 의미한다. 따라서, 치료학적 유효량은 치료하고자 하는 질병의 증상을 경감시키는 데 충분한 양이다. 주어진 용도에 대한 유효량(예, 치료학적 유효량)인지를 확인하는 데 유용한 분석은 표적 세포에서 텔로머라제 활성에 대한 영향을 측정하는 것이다. 실제 투여량은 치료하고자 하는 개체에 따라 좌우되며, 유의해야할 부작용 없이 원하는 효과를 얻을 수 있는 최적량이 바람직하다. 치료학적 유효량은 당업자들에게는 잘 알려져 있다.
임의의 화합물의 경우, 치료학적 유효 투여량은 초기에 세포내 배양 분석이나 임의의 적절한 동물 모델에서 평가될 수 있다. 동물 모델은 투여 경로와 원하는 농도 범위를 얻는 데 사용된다. 이 정보를 이용하여 인간에게 투여하기 위한 유용한 투여량과 경로를 결정할 수 있다.
치료학적 유효량은 증후나 증상을 경감시키는 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 항체, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 작용물질 또는 길항 물질의 양을 의미한다. 화합물의 치료 효과 및 독성은 세포 배양물 또는 실험 동물중 표준 약학 절차(예, ED50 , 개체군의 50에 치료학적으로 효과가 있는 투여량; LD50 , 개체군의 50에게 치명적인 투여량)로 측정될 수 있다. 치료학적 효과와 독성 효과 사이의 투여 비율이 치료 지수이며, 비율 ED50 /LD50 로 표시될 수 있다. 치료 지수가 큰 약학 조성물이 바람직하다. 세포 배양물 분석과 동물 연구에서 얻은 자료는 인간용의 투여량 범위로 제형화하는 데 사용된다. 이와 같은 화합물의 투여량은 독성을 거의 나타내지 않는 ED50 을 포함한 일정 순환 농도 범위인 것이 좋다. 투여량은 사용된 투여 형태, 환자의 감수성, 투여 경로에 따라 다양하다.
정확한 투여량은 치료하고자 하는 환자를 고려하여 각각의 의사가 선택한다. 투여량 및 투여 경로는 원하는 효과를 유지하거나 활성 성분을 충분한 농도로 제공하도록 조정한다. 고려할 수 있는 추가의 인자로는 질병 상태의 경중(예, 종양 크기 및 위치; 환자의 연령, 체중 및 성; 식이 요법, 투여 시간과 빈도, 약물 조합, 반응 감수성 및 치료에 대한 내성/반응)을 포함한다. 지속적으로 작용하는 약학 조성물은 약학 제제의 반감기와 제거율에 따라 매 3 내지 4일 마다, 매주, 2주에 1회씩 투여될 수 있다. 특정 투여량 및 전달 방법에 대한 지침은 다음 문헌에 제시되어 있다. 본원에서 참고로 인용한 미국 특허 제4,657,760호, 제5,206,344호 및 제5,225,212호 참조. 당업자는 단백질 또는 이의 억제제 보다 뉴클레오티드로 상이한 제제를 일반적으로 사용한다. 유사하게 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 전달은 특정 세포, 조건, 위치 등에 특이적일 수 있다.
VIII. 무한증식 세포, 세포주 및 동물의 증식 능력 및 생산 증가
전술한 바와 같이, 대부분의 척추 동물 세포는 배양시 유한 분열(예, 50 내지 100회로 분열)한 후 노쇠한다. 그러나, 특정 변형 세포는 배양시 무한 분열할 수 있으며(예, HeLa 세포, 293 세포), 따라서 연구 및 산업용으로 유용하다. 일반적으로 이들 무한 증식 세포주는 자발적으로 발생하는 종양으로부터 유도되거나, 방사선 또는 종양 유도 바이러스나 화학물에 노출되어 형질전환된 것이다. 불행히도, 이용할 수 있는 세포주, 특히 분화 세포 기능을 나타내는 인간 세포주는 한정되어 있다. 더구나, 현재 이용할 수 있는 무한 증식 세포주는 염색체 이상(예, 이수배수체, 유전자 재배열, 돌연변이)에 의해 특징지워지는 것들이다. 또한, 다수의 장기간 정착세포주는 상대적으로 미분화된다(예, 유일하게 특정 조직이나 기관을 특성화하는 종류의 고도로 특이화된 생성물을 생성하지 않는다). 따라서, 무한 증식 세포, 특히 인간의 세포를 생성하는 신규 방법이 필요하다. 무한 증식 세포의 한가지 용도는 천연 단백질과 재조합 단백질(예, 에리트로포이에틴, 인간 성장 호르몬, 인슐린 등) 또는 항체를 생성하는 것이며, 안정하고 유전자적으로 정상인 세포주가 바람직하다. 일부 재조합 단백질을 생성하기 위해서, 특정 세포 유형이 바람직할 수 있다(예, 인간의 인슐린을 생성하기 위한 췌장 세포). 무한 증식 세포나 심지어 증식 능력이 증가된(변형되지 않은 세포에 비하여) 유한 증식 세포의 또 다른 용도는 유전자 치료를 위해 환자내로 도입하거나, 또는 질병이 있거나 손상된 세포 또는 조직을 대체하는 것이다. 예를 들어, 본 발명의 재조합 hTRT 유전자 또는 폴리펩티드를 포함하거나 발현하는 자가 면역 세포는 공격적 암 치료, 예컨대 전신 방사선 조사 후에 환자의 세포를 대체하는 데 사용될 수 있다. 무한 증식 세포의 또 다른 용도는 치료용 "인공" 조직이나 기관(예, 피부)을 생체외에서 생성하는 것이다. 이러한 세포의 다른 용도는 텔로머라제 억제 약물과 같은 약물을 검색 또는 확인하거나, 백신이나 생물학적 시약의 생성에 사용하는 것이다. 본 발명의 세포의 추가 용도는 당업자에게는 자명할 것이다.
본 발명의 무한 증식 세포 및 세포주, 뿐 아니라 단지 복제 능력만 증가된 것들도 세포내의 텔로머라제 활성을 증가시켜 만든다. 텔로머라제 활성을 증가시키기 위해 본원에 개시된 임의의 방법이 사용될 수 있다. 따라서, 일양태로서 세포는 세포중 hTRT 폴리펩티드의 양을 증가시키면 무한증식화된다. 일양태로서, hTRT 농도는 세포내로 hTRT 발현 벡터를 도입하여(때때로 안정한 형질감염법이 바람직함) 증가시킨다. 전술한 바와 같이, hTRT 암호 서열은 일반적으로 프로모터에 작동가능하게 결합되어 있으며, 세포내에서 유도형 또는 구성형으로 활성화된다.
일양태로서, 서열 번호 2의 폴리펩티드를 암호하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는, 프로모터(예, 구조적으로 발현된 프로모터, 예컨대 서열 번호 6의 서열)에 작동가능하게 결합되어 있는 서열로서 세포내로 도입된다. 일양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 1의 서열을 포함한다. 폴리아데닐화 시그널 및 종결 시그널을 포함하는 것이 바람직하다. 다른 양태로서, 인헨서 및 상기 문헌에 설명된 기타의 것 등의 부가적 성분이 포함되어 있다. 대안적인 양태로서, 폴리뉴클레펩티드는 프로모터 서열을 포함하지 않으며, 이러한 서열은 도입된 폴리뉴클레오티드의 통합(예, 재조합, 예컨대 동종 재조합) 후에 표적 세포의 내인성 게놈에 의해 제공된다. 폴리뉴클레오티드는 본원에 개시된 방법, 예컨대 리포펙션(lipofection), 전기사출법, 바이로좀, 리포좀, 면역리포좀, 다가양이온:핵산 접합체, 나출 DNA를 비롯한 임의의 방법으로 표적세포내로 도입될 수 있다.
본 발명의 방법을 이용하면, 임의의 척추동물 세포는 배양시 증식 능력이 증가되거나 또는 심지어 무한 증식되거나 무한하게 유지된다. 일양태로서, 세포는 포유류 세포이며, 여러가지 적용을 위해 인간의 세포가 바람직하다. 무한 증식될 수 있는 인간 세포의 예로는 표 3에 제시된 것들이 있다.
후술되어 있는 본 발명의 "진단" 분석은 본 발명의 무한 증식 세포를 확인하고 특성화하는 데 사용될 수 있다는 것을 염두에 두어야 한다.
hTRT 발현이 증가될 수 있는 인간의 세포
각질 상피 세포 표피의 각질세포(분화성 표피 세포) 표피의 기저 세포(간세포) 손톱 및 발톱의 각질세포 조상의 기저 세포(간세포) 모간 세포 수질, 피질, 소피; 모근 초세포, 소피, 헉슬리 층, 외부의 헨레 층; 모발 매트릭스 세포(간세포) 습성 층상 간벽 상피 세포 혀, 구강, 식도, 항문간, 단부 요도, 질의 층상화된 인상 상피 세포의 표면 상피 세포 이들 상피의 기저 세포(간세포) 외부 각막 상피 세포 비뇨 상피 세포(방광 및 뇨관의 내막에 있음) 외분비 작용을 위해 분화된 상피 세포 타액선 세포 점액 세포(다당류가 농축된 분비물) 장액(당단백질 효소가 농축된 분비물) 혀의 본 에브너선 세포(미뢰 세척을 위해 분비) 유선 세포, 모유 분비 누선 세포, 눈물 분비 귀의 이구선 세포, 왁스 분비 에크린 한선 세포, 당단백질 분비(암(暗)세포) 에크린 한선 세포, 소분자 분비(명세포) 아포크린 한선 세포(향이 있는 분비물, 성호르몬에 민감함) 눈꺼풀에 있는 몰선 세포(분화된 한선) 피지선 세포, 지질이 농축된 피지 분비 코의 보우만선 세포(후각 상피 세포를 세척하기 위한 분비물) 십이지장에 있는 브루너선 세포, 점액 및 효소의 알카리 용액 분비 정액 매개 세포, 프럭토스를 비롯하여 정액 성분 분비(이동하는 정자의 연료) 전립선 세포, 정액의 기타 성분 분비 요도구선 세포, 점액 분비 바르톨린선 세포, 질 윤활제 분비 리트레선 세포, 점액 분비 자궁의 자궁내막 세포, 주로 탄수화물 분비 호흡관 및 소화관의 분리 잔모양 세포, 점액 분비 위 내막의 점액 세포 위선의 효소분비 세포, 펩시노겐 세포 위선의 산분비 세포, 소화 효소 및 중탄산염 분비
소장의 파네드 세포, 리소자임 분비 폐의 II형 폐포세포, 계면활성제 분비 폐의 클라라 세포 호르몬 분비를 위해 분화된 세포 전방 뇌하수체 세포, 성장 호르몬, 난포 자극 호르몬, 황체 형성 호르몬, 프로락틴, 부신피질 자극 호르몬, 갑상선 자극 호르몬 분비 중간 뇌하수체 세포, 멜라닌 세포 자극 호르몬 분비 후방 뇌하수체 세포, 옥시토신, 바소프레신 분비 위장 세포 세로토닌, 엔돌핀, 성장억제 호르몬, 가스트린, 세크레틴, 콜레시스토키닌, 인슐린 및 글루카곤 분비 갑상선 세포, 갑상선 호르몬, 칼시토닌 세포 분비 부갑상선 세포, 부갑상선 호르몬 호산성세포 분비 부신선 세포, 에피네프린, 노르에피네프린 및 스테로이드 호르몬; 염류코르티코이드 당코르티코이드 분비 성선 세포, 테스토스테론(정소의 라이디히 세포) 에스트로겐(난소 여포의 내난포막 세포) 프로게스테론(파괴된 난소 여포의 황체) 분비 신장의 방사구체 기관 세포 방사구체 세포(레닌 분비) 밀집반 세포 극주위 세포 메산쥼 세포 위장, 외분비선 및 요생식기로내의 상피 흡수 세포 장의 쇄모 변연 세포(미소 융모) 외분비선의 층화된 관 세포 담낭 방광 상피 세포 신장의 기부 세관의 쇄모 변연 세포 외분비선의 층화된 관 세포 담낭 상피 세포 수출관의 비섬모 세포 부고환 주세포 부고환 기저 세포
대사 및 저장을 위해 분화된 세포 간세포(간의 세포) 지방 세포 백색 지방 세포 갈색 지방 세포 간의 지방 세포 주로 간벽 기능을 가지며, 폐, 위장, 외분비선, 요생식기로의 내막에 있는 상피 세포 I형 폐포 세포(폐의 내막에 있는 공기 간극) 췌장 관 세포(선포중심 세포) 한선, 타액선, 유선의 비층화 관세포 신장 사구체의 벽세포 신장 사구체의 족세포 헨레 루프의 얇은 분절 세포(신장에 존재) 집합관 세포(신장에 존재) 정액 매개체, 전립선의 관 세포 폐쇄된내부 체강의 내막에 있는 상피 세포 혈관 및 림프관의 혈관 내피 세포 천공 연속 비성 활액 세포(관절 공동 내악, 대개 히알우론산 분비) 장막 세포(복막, 흉막 및 심장 주위의 공동의 내막) 귀의 외림프 공간 내막에 있는 인상 세포 귀의 내림프 공간 내막에 있는 세포 인상 세포 내림프낭의 원주 세포 소융모 존재 소융모 부재 "암" 어두운(암) 세포 전정막 세포(맥락막총 세포와 유사) 선조 혈관 기저 세포 선조 혈관 변연 세포 클라디우스 세포 보에쳐 세포 맥락막총 세포(뇌척수액 분비) 유막 지주막의 인상 세포 안구 모양체 상피 세포 착색된 세포 착색되지 않은 세포 각막 "내피" 세포 추진 작용을 가지는 섬모가 있는 세포 호흡로 난관 및 자궁 내막(여성) 고환망 및 수출소관(남성) 중추신경계(뇌 공동 내막에 있는 상의 세포)
세포외 매트릭스의 분비를 위해 분화된 세포 상피 세포: 에나멜 아세포(치아의 에나멜 분비) 귀의 전정 기관의 평면 반월형 세포(프로테오글리칸 분비) 코르티 기관의 치간 세포(코르티 기관의 모세포를 덮는 덮개"막" 분비 비상피 세포(결합 조직) 섬유아세포(다양함-소성 결합 조직, 각막, 건, 골수의 망상 조직 등) 모세혈관의 주위 세포 척추간 디스크의 핵 펄포서스(pulposus) 세포 시멘트아세포/시멘트세포(치근의 뼈와 유사한 시멘트질 분비) 조상아세포/조상세포(치아의 상아ㅓ질 분비) 연골 세포 초자질의 연골, 섬유성연골, 탄성연골 골아세포/골세포 골조상세포(골아세포의 간세포) 눈 초자체의 초자세포 귀의 외림프 공간의 성상 세포 수축 세포 골격근 세포 적색근(느림) 백색근(빠름) 중간 근육 스핀들-핵 백 근육 스핀들- 핵 사슬 위성 세포(간세포) 심장 근육 세포 보통 결절 프르키니에 섬유 평활근 근상피 세포 홍채 외분비선 혈액 및 면역계 세포 적혈구 거핵구 대식세포 단핵구 결합 조직 대식 세포(다양) 랑게르한스 세포(표피) 파골 세포(뼈에 존재) 수상돌기 세포(림프양 조직에 존재) 소신경교 세포(중추신경계에 존재) 호중구 호산구 호염구 비만 세포
T 림프구 헬퍼 T 세포 억제 T 세포 킬러 T 세포 B 림프구 IgM IgG IgA IgE 킬러 세포 혈액 및 면역계를 위한 간세포(다양) 감각 변환기 광수용체 간상체 추상체 청색 민감 녹색 민감 적색 민감 청각 코르티 기관의 내부 모세포 코르티 기관의 외부 모세포 가속 및 중력 귀의 전정 기관 I형 모세포 귀의 전정 기관 II형 모세포 미각 미뢰 세포 II형 모세포 후각 후각 뉴런 후각 상피 세포의 기저 세포(후각 뉴런의 간세포) 혈액 Ph 경동맥 체세포 I형 II형 촉각 표피의 메르켈 세포 촉각을 위해 분화된 1차 감각 뉴런 온도 온도를 위해 분화된 1차 감각 뉴런 냉 감각 온 감각 통증 근육골격계에서 통증의 형태와 힘에 대해 분화된 1차 감각 뉴런 고유 수용 1차 감각 뉴런 자율 뉴런
아드레날린 작용성 펩티드 형성 콜린 작용성감각 기관 및 말초 뉴런의 지지 세포 코르티 기관의 지지 세포 내부 주 세포 외부 주 세포 내부 지절골 세포 외부 지절골 세포 변연 세포 헨센 세포 전정 기관의 지지 세포 미뢰 지지 세포(I형 미뢰 세포) 후각 상피의 지지세포 쉬반 세포 수반 세포(말초신경체를 피복하고 있음) 장신경교 세포 중추신경계의 뉴런 및 신경교 세포 뉴런 신경교 세포 성상 세포 희돌기 세포 수정체 세포 전방 수정체 상피 세포 수정체 섬유(결정질 함유 세포) 착색 세포 멜라노 세포, 망막 착색된 상피 세포 생식 세포 난원 세포/난모 세포 정모 세포 정원 세포(정모 세포의 간세포) 영양 세포 난소 난포 세포 세르톨리 세포(정소) 흉선 상피 세포 간세포 배아 간세포 배아 생식세포 성인 간세포 태아 간세포
IX. 진단 분석
A) 개요
1) TRT 분석
본 발명은 TRT, 바람직하게는 hTRT, 및 텔로머라제에 대한 각종 분석법을 제공한다. 이들 분석법은 특히 민감성, 저렴한 비용, 편리성, 여러 질병, 예컨대 암의 진단 및 예후 추정을 위해 널리 적용할 수 있는 분석의 기초를 제공한다. 전술한 바와 같이, hTRT 유전자 생성물(단백질 및 mRNA)는 일반적으로 대부분의 정상적인 유한 증식 세포(즉, 텔로머라제 음성 세포 및 대부분의 텔로머라제 양성인 정상 성인 체세포)에 비하여 무한 증식 인간 세포에서 증가된다. 따라서, 본 발명의 목적은 무한 증식 세포(예, 악성 종양 세포) 또는 유한 증식 세포(예, 대부분의 정상적인 성인의 체세포)로서, 또는 텔로머라제 양성이나 음성 세포로 특성화되는 인간이나 기타 포유류 또는 진핵세포에서 유래하거나 또는 이 세포를 함유하는 시료로부터 hTRT 유전자 생성물의 존재, 부재 또는 양을 측정하거나 검출하는 데 유용한 분석법을 제공하는 것이다.
hTRT 유전자 생성물(즉, 단백질이나 RNA)의 존재 또는 부재로 특징지워지는 임의의 증상은 본원에 개시된 방법 및 재료를 사용하여 진단될 수 있다. 이들은 암, 세포증식의 가속화에 따른 질병, 면역원성 질환, 생식, 불임 등과 관련되어 있으며, 하기에 상세하게 설명되어 있다. 더구나, 텔로머라제 활성이 암 세포에서 증가되는 정도가 종양의 특성, 예컨대 전이 가능성과 상관 관계가 있기 때문에, hTRT, mRNA 또는 단백질 농도는 종양의 진행 가능성을 추정하고 예측하는 데 사용될 수 있다.
제1 양태로, 본 발명의 진단 및 예후 추정 방법은 인간의 TRT 유전자 생성물 이 생물학적 시료(예, 환자에게서 얻은 시료)에 존재하는지 여부를 측정하는 단계를 제공하는 것이다. 제2 양태는 생물학적 시료(예, 환자에게 얻은 시료)에서 다량의 hTRT 유전자 생성물을 측정하고 대조 시료(예, 정상 세포나 조직)의 것과 비교하는 것이다. 제3 양태는 hTRT 유전자 생성물의 세포 또는 세포내 위치를 세포나 조직 시료에서 측정하는 것이다. 제4 양태는 비정상적인 hTRT 유전자 발현(비정상적인 양, 조절 또는 생성물)의 유전 성향의 서열 특성을 가지는 핵산을 확인하기 위해 숙주(예, 환자) 세포를 분석하는 것이며, 이는 유전자 검색 또는 유전자 카운셀링에 유용하다. 제5 양태는 본 발명의 분석법을 사용하여 항hTRT 항체(예, 환자의 혈청중)의 존재를 검출하는 것이다. 후술된 방법들은 본원에 개시된 서열 및 관련물을 사용하여 수행될 수 있는 유용한 분석법이다. 그러나, 이들 분석법의 각종 변형 및 기타 용도가 개시 내용의 관점에서 당업자들에게 자명할 것이다.
하기 분석법이 진단 및 예후 추정 방법을 위주로 제시되었지만, hTRT 유전자, 유전자 생성물 또는 변형체가 검출, 정량화 또는 특성화되는 경우에도 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 하기 "진단" 방법은 hTRT 또는 인간 텔로머라제의 생성 및 정제 과정에서 hTRT 또는 텔로머라제 분석에 유용하거나, 인간 세포에서 유래한 세포주를 특성화하는 데(예, 무한 증식 세포주를 확인하는 데) 유용하거나, 또는 세포, 비인간 동물, 식물, 진균류, 박테리아 또는 인간의 TRT 유전자 또는 유전자 생성물(또는 이의 단편)을 포함하는 기타 유기체의 특성화에 유용하다.
본원에서 사용한 "확인"이란 용어는 질병(예, 암), 증상(예, 불임, 활성화된) 또는 상태(예, 생식)의 존재 또는 특성을 규명하는 일반적인 의미를 가지며, " 예후 추정"은 질병이나 증상의 가능한 진행 및/또는 결과를 예측하는 것이다. 이들 2가지 용어가 임상적 상황에서는 다소 다른 방식으로 사용되지만, "확인법"과 관련하여 하기에 개시된 임의의 분석 또는 분석 형태는 텔로머라제 활성 농도가 더 높을 수록 암 환자의 예후가 더 좋지 않다는 것은 잘 알려져 있고, 세포내의 텔로머라제 활성과 밀접하게 관련된 농도로 발현되는 hTRT에 특이적인 검출 방법을 제공하기 때문에, 예후 추정에도 적절하다.
2) 암의 진단 및 예후
상기한 정상 또는 표준 범위의 hTRT 유전자, mRNA 또는 단백질 농도의 측정은 텔로머라제 양성 세포, 예컨대 특정 종양 세포와 같은 무한 증식 세포의 존재의 지표이다. 특정 배아 세포 및 태아 세포 뿐 아니라 특정 성인 간세포가 텔로머라제를 발현하기 때문에, 또한 본 발명은 임산부 혈액으로부터 취한 텔로머라제 양성 태아 세포를 검출 또는 분리하여 생식과 같은 기타 증상을 결정하는 방법을 제공한다. 이들 값은 세포가 암으로 분류되지 않거나 종래의 방법으로는 검출되거나 분류되지 않는 경우에 조차도 확인하거나, 또는 확인을 보조하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 확신을 가지고 암 또는 텔로머라제와 관련된 기타 증상을 검출하거나 입증할 수 있으며, 최소한 일부 경우에는 초기 단계에 검출할 수 있다. 본 발명의 분석법은 hTRT 유전자 및 유전자 생성물을 위한 정량 분석을 제공하므로써 상이한 부류와 정도의 인간의 종양 또는 기타 세포 증식성 질병간에 차이를 형성하게 하고, 따라서 적절한 치료 섭생 선택 및 정확한 확인을 용이하게 한다. 더구나, 텔로머라제 활성의 농도는 양성 종양과 악성 종양을 구별하고(예, 미국 특 허 제5,489,508호; Hiyama et al., 1997, Proc. Am Ass. Cancer Res. 38:637), 침입의 내재성을 예측하며(예, 미국 특허 제5,639,613호; Yashima et al., 1997, Proc.Am Ass. Cancer Res. 38:326), 전이 가능성(예, 미국 특허 제5,648,215호; Pandita et al., 1996, Proc.Am Ass. Cancer Res. 37:559)과 상호 관련이 있기 때문에, 이들 분석법은 각종 인간 암의 예방, 검출 및 치료에 유용하다.
암(또는 텔로머라제 양의 증가가 특징인 기타 질병이나 증상)의 예후를 추정하기 위해, hTRT 유전자 생성물(mRNA 또는 단백질)의 예후 추정 값 또는 특정 종양 유형, 부류 또는 등급의 활성은 하기에 개시된 바와 같이 결정된다. 환자의 hTRT 단백질 또는 mRNA 농도 또는 텔로머라제 활성을 결정하고(예컨대 본원에 개시된 분석법 이용), 예후 추정 농도와 비교할 수 있다.
사용된 분석법에 따라, 일부 경우 시료중 hTRT 유전자 생성물의 농도는 분석시 검출될 때마다 상승된 것으로 간주하기도 한다. 텔로머라제 양성 세포에서는 hTRT mRNA 및 단백질의 양이 적고 정상 세포나 텔로머라제 음성 세포에서는 이들 유전자 생성물이 희귀하거나 존재하지 않기 때문에, 정상 세포에 존재하는 경우 hTRT 유전자 생성물을 검출하는 데에는 민감한 분석이 필요하다. 민감성이 적은 분석법이 선택되는 경우, hTRT 유전자 생성물은 건강한 조직에서 검출되지 않으나 텔로머라제 양성 암 또는 기타 텔로머라제 양성 세포에서 검출될 수 있다. 통상 상승된 시료에서 유래한 hTRT 유전자 생성물의 양은 텔로머라제 양성 정상 세포의 백분율이 매우 낮은 경우, 성인의 건강한 조직에서 얻은 텔로머라제 음성 대조 세포(들)의 농도보다 약 5배 이상, 종종 약 10배 이상, 더욱 빈번하게는 50배 이상, 매 우 빈번하게는 약 100배 이상 내지 1000 배 더 높다.
본 발명의 진단 및 예후 추정 방법은 임의의 기원의 세포 또는 조직 유형과 함께 사용될 수 있으며, 임의의 기원의 무한 증식 세포나 신생 세포, 종양 조직, 또는 암을 검출하는 데 사용될 수 잇다. 검출될 수 있는 암의 유형은 이에 국한되는 것은 아니지만 hTRT의 치료 용도에서 설명한 상기의 것들을 포함한다.
본 발명의 분석은 항암 섭생법으로 치료되는 환자에 대한 치료 개입 효과를 모니터링하는 데 사용된다. 모니터링될 수 있는 항암 섭생법은 현재 승인된 치료(화학치료, 방사선 치료 및 수술)을 포함하며 앞으로 승인받을 치료법, 예컨대 본원에 개시된 텔로머라제 억제 또는 활성화 치료를 포함한다(참고: PCT 공보 96/01835 및 96/40868 및 미국 특허 제5,583,016호; 이들 문헌은 본원에 참고로 인용됨).
또 다른 관점에서, 하기 분석법은 암 또는 텔로머라제 활성의 비정상적인 조절과 관련된 증상(불임, 조기 노화)의 지표인 hTRT 유전자 서열의 특정 변형체(변이 및 유전가능한 hTRT 대립 유전자)를 검출하는 데 유용하다.
3) 암 이외의 증상 진단
암의 진단 이외에, 본 발명의 분석법은 여러 용도를 가진다. 본 발명은 세포중 hTRT 유전자 생성물 또는 텔로머라제 발현 저하 또는 발현 증가가 특징인 증상이나 질병을 위한 시약 및 방법/진단법을 제공한다. 성인의 경우, 낮은 텔로머라제 활성 농도는 정상적인 인간의 체세포, 예컨대 간세포, 활성화된 림프구 및 생식 세포의 제한된 보체에서 발견되는 것이 보통이며, 기타 체세포에는 없다. 따라서, hTRT 또는 텔로머라제 활성이 정상적으로 존재하지 않거나 불활성인 세포중 그 활 성의 검출, 또는 hTRT가 정상적으로 낮은 농도로 존재하는 세포중 비정상적인 농도(즉, 정상보다 높거나 낮음)의 검출은 텔로머라제 관련 질병이나 증상의 확인법 또는 특이 세포 유형의 분리 및 동정(즉 간세포 분리)에 사용되는 진단법일 수 있다. 이러한 질병 및 증상의 예로는 다음과 같은 것들이 있다: 세포 증식 질병, 면역원성 질환, 불임, 면역세포 기능 질병, 생식, 태아 비정상, 조기 노화 등. 더구나, 본 발명의 분석법은 환자 또는 세포계 분석이나 동물 분석에서 치료 개입(이에 한정되는 것은 아니지만 텔로머라제 활성을 조절하는 약물을 포함)의 효과를 모니터링하는 데 유용하다.
다른 관점에서, 본 발명은 불임을 진단하는 데 유용하다. 인간 생식 세포(예, 정원세포, 이의 선조 또는 자손 세포)는 무한하게 증식할 수 있으며, 높은 텔로머라제 활성을 가지는 것이 특징이다. 비정상적인 농도의 생성물 또는 감소된 농도의 hTRT 유전자 생성물은 정자의 부적절하거나 비정상적인 생성을 초래하여, 불임 또는 생식 장애를 일으킨다. 따라서, 본 발명은 "텔로머라제계" 생식 장애의 진단 및 치료를 위한 분석법(방법 및 시약)을 제공한다. 유사하게, 정자 생성을 표적하거나 간접적인 영향을 주는(또한 hTRT 농도나 텔로머라제 활성을 감소시킴) 피임(예, 남성 피임)의 효과를 모니터하는데 사용될 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 간세포, 태아 세포, 배아 세포, 활성화된 림프구 및 조혈간세포에서의 텔로머라제 및 hTRT 농도와 기능 분석을 위한 분석법을 제공한다. 예를 들어 hTRT 유전자 생성물 검출을 위한 분석법을 사용하여 면역 기능을 일반적으로 모니터하고(예, 활성화된 림프구의 편재와 선조 간세포의 농도를 모 니터링함), 활성화된 림프구 또는 간세포(상승된 hTRT 농도를 가짐)를 동정, 선택 또는 분리하며, 이들 조직을 표적하는 치료 개입(예, 면역 억제제 또는 간세포군을 확장시키고자 하는 치료적 시도) 효과를 모니터링한다.
또한 본 발명은 항텔로머라제 및 항TRT 면역글로불린(인간의 혈청에서 발견됨)의 동정에 유용한 분석법을 제공한다. 본원에 개시된 재료 및 분석법은 이러한 자가면역 항체가 발견되는 환자를 확인하는 데 사용될 수 있으며, 면역글로불린과 관련된 증상을 진단 및 치료할 수 있다.
4) 배양물에서 세포의 모니터링
본원에 개시된 분석법은 생체외 또는 시험관내 세포에서 hTRT 유전자 생성물의 발현과 hTRT 유전자의 특성화를 모니터링하는 데 유용하다. 상승된 hTRT 농도는 무한 증식 세포의 특징이기 때문에, 본 발명의 분석법은, 예컨대 무한 증식 세포를 검색 또는 동정하는데 사용되거나 hTRT 발현 또는 기능을 억제하여 무한 증식 세포를 유한 증식화할 수 있는 제제를 확인하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 분석법은 세포내에서 hTRT의 발현 증가에 의해, 예컨대 재조합 hTRT의 발현 또는 내인성으로 암호된 hTRT의 발현 증가(예, 프로모터 활성화에 의한 증가)에 의해 무한 증식된 세포를 동정하는 데 유용하다.
유사하게, 이들 분석법은 돌연변이 동물이나 세포(예, hTRT 유전자를 포함하는 효모 또는 인간 세포)에서 hTRT 발현을 모니터링하는 데 사용될 수 있다. 특히, 본 발명의 hTRT를 발현하는 인간 및 비인간 세포에서 hTRT 농도의 특정 치료 효과(예, 공지 또는 추정 텔로머라제 길항 물질의 적용)는 유용한 약물이나 약물 후보( 예, 텔로머라제 활성 조절 약물)를 동정하는 데 사용될 수 있다.
B) 정상, 진단 및 예후 추정 값
hTRT 유전자 생성물의 존재 또는 양에 대한 분석을 수행하고 결과는 분석 형식, 분석할 시료의 특성 및 얻고자 하는 정보에 따라 각종 방법으로 해석될 수 있다. 예를 들어, 정상 상태에서 hTRT 유전자 생성물의 농도는 매우 낮아서 대부분의 인간 체세포에서는 특정 분석법으로 검출될 수 없다. 더구나, 일반적으로 이들 조직의 세포에서는 텔로머라제 활성이 전혀 없어, 활성을 입증하기가 매우 용이하다. 역으로, hTRT 단백질 및/또는 hTRT mRNA 또는 텔로머라제는 다른 텔로머라제 양성 조직, 예컨대 악성 종양에 충분하게 존재하여, 동일한 분석으로 검출될 수 있다. 저 농도의 텔로머라제 활성이 정상적으로 검출될 수 있는 체세포 유형(예, 간세포 및 특정 활성화된 조혈계 세포)에서조차, hTRT mRNA 및 텔로머라제 활성 농도는 무한 증식 세포중의 농도에 비해 매우 작다(예, 약 1이하로 추정); 따라서, 무한 증식 세포 및 유한 증식 세포는 본 발명의 방법으로 쉽게 구별될 수 있다. "감수성이 적은" 분석법을 사용하는 경우, 생물학적 시료중 hTRT 유전자 생성물의 단순 검출은 추가의 분석이 필요하지 않은 진단용이다. 더구나, 후술한 분석법은 대단히 민감하지만, 필요에 따라 덜 민감하게 할 수도 있다(예, 완충액, 세척 조건, 증폭 회수, 시약 및/또는 시그널 증폭제를 잘 선택하므로써 가능함). 따라서, 실제로 임의의 분석은 특정 농도, 예컨대 건강한 조직이나 기타 대조 조직에서의 농도보다 높은 농도로 존재하는 생물학적 시료에서만 hTRT 유전자 생성물을 검출할 수 있도록 고안될 수 있다. 이 경우, 임의의 검출가능한 hTRT mRNA 농도 또는 단백질은 출 생후 인간 체세포 조직에서 얻은 세포(조혈 세포 및 기타 간세포 이외의 세포)에서 증가되는 것으로 생각된다.
그러나, 일부 경우 유전자 생성물 발현 농도에 대한 정상 또는 기준 값(또는 범위)을 설정하는 것이 바람직하며, 특히 정상 체세포에 존재할 수 있는 매우 낮은 농도의 hTRT 유전자 생성물을 검출할 수 있는 매우 민감한 분석이 사용되는 것이 바람직하다. 발현의 정상 농도 또는 정상 발현 생성물은 당업자에게 공지된 표준 방법 및 본 발명의 방법과 시약을 사용하여 임의의 특정 개체군, 아개체군 또는 유기체 군에 대해 측정될 수 있다. 일반적으로 기준(정상) 농도의 hTRT 단백질 및/또는 mRNA는 정상(건강한) 검체, 예컨대 인간 검체에서 얻은 생물학적 시료(예, 체액, 세포 또는 조직) 중에서 hTRT 단백질 및/또는 mRNA의 양을 정량하여 결정된다. 특정 시료 및 용도에 대해, 기준 세포 당, 또는 종양 세포당 hTRT 유전자 생성물의 양을 정량하는 것이 바람직할 수 있다. 시료의 세포충실성을 측정하기 위해, 취한 시료의 세포 유형에서 공지된 농도로 발현되는 기타 유전자 생성물 또는 구성형으로 발현되는 유전자 생성물의 농도를 측정할 수 있다. 대안적으로, 정상적인 hTRT 단백질 또는 hTRT mRNA의 값은 건강한 것으로 알려진 세포나 조직에서 hTRT 단백질/RNA의 양을 정량하여 결정될 수 있으며, 이들 세포나 조직은 질병이 있는(또는 질병이 있을 것으로 예상되는) 세포를 취한 동일한 환자로부터 얻거나 건강한 개체로부터 얻는다. 대안적으로 기준 농도는 일부 경우 배양물중 무한증식되지 않는 인간 체세포에 존재하는 농도로 정한다. 정상(기준) 값은 상이한 세포 유형 사이에서(예컨대 hTRT mRNA 농도는 신장에서보다 정소에서 더 높다), 또는 환자의 연 령, 성 또는 물리적 상태에 따라서 다소 다를 수 있다. 따라서, 예컨대 분석이 암과 관련된 hTRT 농도에서의 변화를 측정하는데 사용되는 경우, hTRT 유전자 생성물 발현의 정상 범위를 결정하는 데 사용되는 세포는 연구 특성에 따라 동일한 연령 또는 상이한 연령의 사람에서 얻은 세포일 수 있다. 분자 유전학에 사용된 표준 통계 방법을 이용하여 발현의 기준 농도를 결정하고, 이러한 기준 농도로부터 중요한 편차를 확인할 수 있다.
본 발명의 진단 및 예후 추정 방법을 수행시, 전술한 바와 같이 "진단" 및 "예후 추정 값"은 유용하다. 본원의 "진단 값"은 hTRT 유전자 생성물의 정상 범위(또는 "기준")와 비교시 질병의 존재를 나타내는 시료에서 검출된 hTRT 유전자 생성물에서 측정된 값이다. 이 질병은 텔로머라제 활성(예, 암), 텔로머라제 활성 부재(예, 불임) 또는 일부 중간값에 의해 특징지워진다. "예후 추정 값"은 질병(예, 암)의 특정 진단 및 예후와 일치하는 소정의 세포 유형(예, 악성 종양 세포)에서 검출되는 hTRT 유전자 생성물의 양을 의미한다. 시료에서 검출되는 hTRT 유전자 생성물의 양(0을 포함하여)을 세포에 대한 예후 추정 값과 비교하여 상대적인 비교값이 질병(예, 암)의 진행 결과일 가능성 또는 질병의 존재를 나타내도록 한다. 일양태에서, 예를 들어, 종양 예후를 평가하기 위해서, 상이한 종양 부류 또는 등급과 hTRT 농도의 통계적으로 중요한 상호관계를 얻기 위해 자료를 모은다. 소정 범위의 hTRT 농도는 공지된 임상적 결과를 가진 개체로부터 얻은 동일한 조직이나 세포 시료에 대해 설정한다. 충분한 수의 측정치를 만들어 통계적 유의값(또는 값의 범위)을 생성하여 비교한다. 소정의 세포나 조직 시료에 대한 소정 범위의 hTRT 농 도 또는 활성은 유리한(또는 불리함이 적은) 예후(예, 암의 경우 "저 농도")와 관련이 있는 hTRT 유전자 생성물의 농도에 대한 값 또는 범위를 결정하는 데 이용될 수 있다. 암의 경우 불리한 (또는 더욱 불리한) 예후와 관련된 "고 농도"에 해당하는 범위는 유사하게 측정될 수 있다. 생물학적 시료(예, 환자 시료)에서 얻은 hTRT 유전자 생성물의 농도를 결정하고, 저 농도 범위 및 고 농도 범위와 비교하고, 임상적인 결과를 예측하는 데 사용할 수 있다.
앞서 암을 예로 들어 설명하였지만, 진단 및 예후 추정 값은 기타 질병(예, 세포 증식 질병) 및 증상에 대해 측정될 수 있으며, 암 이외의 질병이나 증상의 경우 "고" 농도가 원하는 결과와 상호관련이 있고 "저" 농도가 불리한 결과와 상호 관련이 있다는 것은 자명한 것이다. 예를 들어, 일부 질병은 간세포, 활성화된 림프구 또는 배선 세포중의 텔로머라제 활성 결핍(예, 저 농도)을 특징으로 할 수 있다. 이 경우, 유사한 연령 및/또는 유형의 세포(예컨대 특정 환자의 다른 조직에서 얻은 세포 또는 다른 환자에게서 얻은 세포)에 비하여 "고" 농도인 hTRT 유전자 생성물은 바람직한 결과와 상호관련이 있을 수 있다.
분석법은 상대 값이 본 발명의 방법이 사용되는 여러 용도를 충족시키기 때문에, 꼭 필요하지 않다면 반드시 hTRT의 절대값을 측정할 필요가 없다는 것을 알 것이다. 정량이 바람직한 경우, 본 발명은 유전자 생성물을 정량하는 임의의 공지된 방법을 사용할 수 있도록 시약을 제공한다.
본 발명의 분석법은 동물 연구, 임상 시험 또는 개별 환자의 치료 모니터링에서 특정 치료 처리 섭생법의 효과를 평가하는데 사용될 수 있다. 이들 경우, 치 료를 개시하기 전에 환자에 대한 기준을 설정하고, 치료 결과로서 hTRT 농도가 원하는 종말점(예, 암을 분석하는 경우 hTRT 발현이 감소됨)으로 이동하는 지 여부를 일반적으로 보통 기준으로 평가하기 위한 치료 과정을 통해 1회 이상 분석을 반복하는 것이 바람직하다.
당업자는 hTRT 유전자 생성물의 양 또는 농도 이외에 변형체 또는 비정상 발현 패턴(예, RNA 접목 변형체의 비정상적 양) 또는 변형체 또는 비정상 발현 생성물(예, 변이된 전사체, 절두된 폴리펩티드 또는 비센스 폴리펩티드)는 정상적인 발현 농도 및 정상적인 발현 생성물과 비교하여 확인할 수 있다. 이들 경우, "정상" 또는 "기준값" 측정은 건강한 유기체 및/또는 조직(즉, hTRT 발현 조절 이상 또는 신생물 증식이 없는 유기체 및/또는 조직)을 확인하는 단계와, 변형 hTRT 유전자 생성물(예, 접목 변형체)의 발현 농도를 측정하거나, 또는 hTRT 유전자, mRNA 또는 역전사된 cDNA의 서열 결정 또는 검출을 통해 전형적인(정상) 서열 변화를 얻거나 검출하는 단계를 포함한다. 분자 유전학에 사용된 표준 통계학적 방법을 적용하면 기준 농도로부터의 유의적인 편차를 측정할 수 있다.
C) TRT 유전자 생성물의 검출 및 정량화
본원에서 강조한 바와 같이, hTRT 유전자 생성물은 일반적으로 극도로 낮은 농도로 대부분의 정상적인 체세포에서 발견된다. 예를 들어, hTRT 단백질 암호 mRNA는 연구된 모든 텔로머라제 음성 세포 유형에서 대단히 희소하거나 존재하지 않는다. 무한 증식 세포, 예컨대 293 세포에서, hTRT mRNA는 세포당 약 100 카피수로 존재할 수 있지만, 정상 체세포에서는 세포당 1 또는 0 카피수 정도로 낮게 존 재한다. 따라서, hTRT 유전자 생성물에 대한 고도의 민감한 분석법이 바람직한 경우, 분석 형식에 시그널 또는 표적 증폭 기법을 도입하는 것이 때로는 유리하다는 것은 자명하다. 예컨대 Plenat et al., 1997, Ann. Pathol. 17:17(플루오레시닐 -티라미드 시그널 증폭법); Zehbe et al., 1997, J.Pathol. 150:1553(촉매화된 리포터 침착법); 기타 본원에 수록된 참고 문헌(예, bDNA 시그널 증폭, PCR 및 기타 표적 증폭법); 및 기타 당업계에 공지된 기법 참고.
전술한 바와 같이, hTRT 유전자 생성물의 검출(생성물이 대조군, 예컨대 텔로머라제 음성 세포에서 검출되지 않는 분석 조건하에서)은 진단에 중요하기 때문에, 본원에 개시된 분석법에서 hTRT mRNA 또는 단백질을 정량하는 것은 종종 불필요하다. 또 다른 예로서, 시험물(예, 종양) 및 대조군(예, 건강한 세포)에서 발견된 생성물 농도를 직접 비교하는 경우, 정량은 불필요할 수 있다.
그러나, 필요에 따라 본원에 개시된 분석법에서 측정된 hTRT 유전자 생성물은 측정 방법과 편의성에 따라 각종 방법으로 정량할 수 있다. 따라서, 정상, 진단, 예후 추정, 고저의 hTRT 단백질/mRNA는 생물학적 시료량 당 중량의 표준 단위(예, 1 그램 조직 당 피코그램, 1012 세포당 피코그램)로서, 생물학적 시료량 당 분자의 수(예, 전사체/세포, mol/세포)로서, 세포 또는 기타 단위량 당 활성 단위로서, 또는 유사한 방법으로 표시할 수 있다. hTRT 유전자 생성물의 양은 다른 분자의 양과 관련되어 발현될 수 있다. 그 예로는 시료중 hTRT 전사체의 수/시료중 28S rRNA 전사체의 수; hTRT 단백질 ng/총 단백질 ng 등이 있다.
2개(또는 그 이상)의 상이한 시료에서 hTRT 유전자 생성물을 측정하는 경우, 2가지 시료에 대한 공통적인 비교 기준을 가지는 것이 때로는 유리하다. 예를 들어, 정상 조직 시료 및 암 조직 시료를 비교하는 경우, 동일한 양의 조직(중량, 부피, 세포수 등)을 비교할 수 있다. 대안적으로 동량의 마커 분자(예, 28S rRNA, hTR, 텔로머라제 활성, 말단소립 길이, 액틴)가 사용될 수 있다. 예를 들어 28S rRNA 10 피코그램을 함유하는 건강한 조직 시료의 hTRT 단백질 양은 동일한 양의 28S rRNA를 함유하는 질병이 있는 조직 시료와 비교할 수 있다.
실제로 본원에 개시된 임의의 분석법은 정량적으로 고안될 수 있다는 것을 당업자들은 인지할 수 있을 것이다. 통상, hTRT 유전자 생성물(예, 본 발명의 방법 및 조성물을 이용하여 생산된 생성물)의 공지된 양 또는 공급원을 사용하여 분석할 수 있다.
특정 양태에서, 분석 방식은 시료의 각 세포내(또는 대표적인 시료 채취)에서 hTRT 대립 유전자 또는 유전자 생성물의 존재, 부재 또는 농도를 검출하는 것을 선택한다. 이러한 방식의 예로는 조직학(예, 시그널 강화 또는 표적 강화 증폭 단계를 수행하는 면역조직화학) 또는 플루오레스세인 활성화된 세포 분석이나 세포 분류(FACS)에 의해 시그널을 검출하는 것이 있다. 이들 방식은 고도로 이종인 세포 개체군(예, 1개 또는 몇가지 세포 유형이 증가된 hTRT 농도를 가지는 다중 세포 유형 또는 상이한 농도로 텔로머라제를 발현하는 유사 세포의 개체군 포함)의 취급시 특히 유리하다.
D) 시료 수거
hTRT 유전자 또는 유전자 생성물(즉, mRNA 또는 폴리펩티드)는 생물학적 시 료에서 바람직하게 정량 및/또는 검출된다. 이러한 시료는 이에 국한되는 것은 아니지만 세포(전체 세포, 세포 분획물, 세포 추출물 및 배양된 세포나 세포주 포함), 조직(혈액, 혈액 세포(예, 백색 세포) 및 미세 바늘 생검 시료와 같은 조직 시료(예, 전립선, 유방, 갑상선 등)를 포함), 체액(예, 요, 가래, 양수, 혈액, 복막액, 능막액, 정액) 또는 이로부터 수거된 세포(예, 요에서 얻은 방광 세포, 혈액에서 얻은 림프구), 배지(배양된 세포 또는 세포주에서 얻은 배지) 및 세척액(예, 방광 및 폐의)을 포함한다. 생물학적 시료는 조직학적 목적으로 취한 냉동 절편과 같은 조직의 절편을 포함할 수도 있다. 암의 진단 및 예후를 위해, 시료는 암 또는 예비암 또는 암으로 추정되는 조직이나 종양으로부터 얻는다. 때로 나중 분석(예, 약물 치료의 효과를 모니터링하는 경우)을 위해 생물학적 시료를 냉동시키는 것이 바람직하다.
일부 경우, 세포 또는 조직은 분석 전에 분류될 수 있다. 예를 들어, 환자의 조직 생검에서 세포 분별기(예, 형광 활성화된 세포 분별기)를 사용하여 공지된 방법으로 표면 항원(예, 종양 특이적 항원)의 발현과 같은 특성에 따라 세포를 분류한다.
시료는 통상 인간 환자 또는 세포주에서 취한 것이지만, 이 분석법은 다른 동물에서 얻은 시료 중 hTRT 상동 유전자 또는 유전자 생성물을 검출하는 데 사용될 수 있다. 대안적으로, hTRT 유전자 및 유전자 생성물은 인간의 TRT 단백질 또는 핵산 서열을 발현하는 돌연변이 동물 또는 유기체에서 분석될 수 있다.
시료는 필요에 따라 적절한 완충액에서 희석하거나 농축시켜 필요한 만큼 예 비처리할 수 있다. 각종 완충액중 하나, 예컨대 인산염, 트리스 완충액 등을 사용한 다수의 표준 수성 완충액을 생리학적 pH에서 사용할 수 있다.
환자에게서 얻은 "생물학적 시료"는 "생물학 시료" 또는 "환자 시료"라고 한다. "환자 시료"의 분석은 환자로부터 세포나 조직을 반드시 제거할 필요는 없다. 예를 들어, 적절하게 표지된 hTRT 결합제(예, 항체 또는 핵산)가 환자내로 주입되어 표준 영상화 기법(예, CAT, NMR 등)을 사용하여 가시화(표적에 결합하는 경우)된다.
E) 핵산 분석
일양태로서, 본 발명은 hTRT mRNA(접목 또는 서열 변형체 또는 대체 대립유전자 포함)의 발현을 검출 및/또는 정량하는 방법을 제공한다. 대안적인 양태로서, 본 발명은 정상적인 또는 비정상적인 hTRT 유전자(또는 그의 단편)을 분석 및 검출하는 방법을 제공한다. 이러한 정량 또는 정성 분석의 형태는 시그널 증폭과 함께 또는 시그널 증폭 없이 수행되는 증폭계 분석, 하이브리드화계 분석 및 증폭-하이브리드화 분석을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 하이브리드화와 증폭의 구별은 단지 편의를 위한 것임을 당업자라면 이해할 것이다. 하기 실시예에 예시된 바와 같이, 여러 분석 형태는 하이브리드화 및 증폭 요소를 모두 포함하여, 일부 경우에 분류하는 것은 다소 선택적이다.
1) 핵산의 제조
일부 양태에서, 핵산 분석은 시험하고자 하는 세포, 조직, 기관 또는 세포주로부터 분리된 핵산 시료를 이용하여 수행한다. 핵산(예, 게놈 DNA, RNA 또는 cDNA)은 당업자에게 공지된 임의의 여러 방법으로 시료로부터 "분리"될 수 있다. 본원에서 사용한 "분리"는 혼합물 중 임의의 기타 물질로부터 검출될 수 있는 종류 또는 표적을 분리하는 것을 의미하나, 상당한 정도로 표적을 정제할 필요는 없다. 당업자는, hTRT 유전자의 카피수 변경이 검출되는 경우, 게놈 DNA가 검출하고자 하는 표적이다. 역으로, 유전자(들)의 발현 농도를 검출하고자 하는 경우, RNA는 핵산계 분석에서 검출하고자 하는 표적이다. 바람직한 양태에서, 핵산 시료는 생물학적 시료중 총 mRNA(즉, 폴리(A)+ RNA)이다. 핵산 분리 방법은 당업자들에게 알려져 있으며 예를 들어 참고로 인용한 Tijssen의 문헌[Tijssen, P. ed. of LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY: HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES, PART I, THEORY AND NUCLEIC ACID PREPARATION, Elsevier, N.Y. (1993), 제3장]에 설명되어 있다. 일양태에서, 총 핵산은 산 구아니디늄-페놀-클로로포름 추출 방법으로 주어진 시료로부터 분리하고 폴리(A)+ mRNA는 올리고-dT 컬럼 크로마토그래피 또는 (dT)n 자석 비이드를 사용하여 분리한다(참고, Sambrook et al., and Ausubel et al., 상기 문헌 참조).
대안적인 양태에서, 증폭, 하이브리드화 또는 기타 분석을 수행하기 전에 생물학적 시료로부터 유래한 핵산(예, 총 RNA 또는 폴리 A+ RNA)를 분리할 필요는 없다. 이들 양태들은 hTRT mRNA를 측정하고자 하는 경우 유리한 데, 그 이유는 분리 및 취급 과정에서 hTRT mRNA의 손실 가능성이 감소되기 때문이다. 예를 들어, 전술 한 PCR 및 RT-PCR같은 다수의 증폭 기법은 침투된 세포(조직학적 표본 및 FACS 분석), 전체 용해 세포 또는 특정 세포 추출물과 같은 미정제 세포 분획을 사용하여 수행할 수 있다. 필요한 경우 표적 핵산(예, mRNA)의 통합을 보존하는 단계를 취한다(예, RNAse 억제제의 첨가). 증폭 및 하이브리드화 분석은 동일계, 예컨대 생검 시료 또는 세포 단층(예, 혈액 세포 또는 분해된 조직 배양 세포)에서 얻은 얇은 조직 절편에서 수행될 수 있다. 증폭은 손상되지 않은 전체 세포 또는 고정 세포에서도 수행될 수 있다. 예를 들어, PCR, RT-PCR 또는 LCR 증폭 방법이 당업계에 공지된 바와 같이 동일계에서 수행될 수 있으며, 예컨대 고정된, 침투된 또는 미량주입된 세포상에 폴리머라제 또는 리가아제, 프라이머 또는 프라이머(들) 및 (데옥시)리보뉴클레오시드 트리포스페이트(폴리머라제가 사용되는 경우), 및 역전사효소 및 프라이머(RNA를 전사시키고 cDNA를 검출하고자 하는 경우)를 이용하여 표적 hTRT RNA 또는 DNA를 증폭시킬 수 있다. 이어서, 해당 hTRT RNA(예, 텔로머라제 양성 세포) 또는 hTRT DNA 서열을 함유하는 세포를 검출할 수 있다. 이 방법은 종종 형광표지된 dNTP, 프라이머 또는 기타 성분이 현미경, FACS 분석 등과 함께 사용되는 경우 유용하다.
2) 증폭계 분석
일양태에서, 본 발명의 분석법은 hTRT 유전자 또는 유전자 생성물을 검출하기 위한 증폭계 분석법이다. 증폭계 분석법에서, 전체 또는 일부 hTRT 유전자 또는 전사체(예, mRNA 또는 cDNA; 이하 "표적"으로 칭함)를 증폭시킨 후 증폭 생성물을 직접 또는 간접적으로 검출한다. 주형으로서 작용하는 기초 유전자 또는 유전자 생 성물이 없는 경우, (예컨대 예상 크기의) 증폭 생성물이 생성되지 않거나 또는 증폭이 비특이적이고 통상 단일 증폭 생성물이 없다. 대조적으로, 기초 유전자 생성물 또는 유전자 생성물이 존재하는 경우 표적 서열이 증폭되며, 이는 기초 유전자 또는 mRNA의 양 및/또는 존재를 나타내는 것이다. 표적 증폭계 분석법은 당업계에 공지되어 있다.
본 발명은 hTRT 유전자 또는 유전자 생성물을 검출하기 위한 각종 프라이머 및 프로브를 제공한다. 이 프라이머 및 프로브는 표적 핵산에 하이브리드화하는 hTRT 유전자 또는 유전자 생성물에 충분히 상보적이다. 프라이머의 길이는 통상 6개 이상의 염기, 일반적으로 약 10개 내지 약 100개 염기, 전형적으로 약 12개 내지 약 50개 염기, 종종 약 14개 내지 약 25 염기이다. 본 발명의 내용을 검토한 당업자는 일상적인 방법을 이용하여 모든 또는 임의 부분의 hTRT 유전자 또는 유전자 생성물을 증폭시키고, 변형 유전자 생성물, hTRT 대립 유전자 등을 구별하기 위한 프라이머를 선택할 수 있다. 표 2에는 hTRT 또는 특이적 hTRT 유전자 생성물 또는 영역을 PCR 증폭시키는 데 유용한 프라이머의 예가 제시되어 있다. 알려진 바와 같이, 단일 올리고머(예, 미국 특허 제5,545,522호), 올리고머의 네스트형 세트(nested set) 또는 올리고머의 축퇴된 푸울은 증폭에 사용할 수 있으며, 예를 들어 후술하는 바와 같은 테트라하이메나(Tetrahymena ) TRT cDNA의 증폭에 의해 입증된다.
본 발명은 폴리머라제 연쇄 반응을 비롯하여 hTRT 유전자 또는 유전자 생성물(모든 변형체, 예컨대 역전사 효소-PCR; 선라이즈 증폭계(미국 매릴랜드주 게티 스버그에 소재하는 온코 인코포레이티드); 및 당업계에 알려진 기타의 것)을 검출 및 증폭시키는 각종 방법을 제공한다. 예시적 양태에서, PCR 증폭은 핵산 시료(예, hTRT RNA의 역전사 효소를 통해 얻은 cDNA), 100 μM의 각 dNTP(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP; 미국 뉴저지주에 소재하는 파마시아 LKB 바이오테크놀러지), hTRT 특이적 PCR 프라이머(들), 1 유니트/Taq 폴리머라제(코네티컷 노워크에 소재하는 퍼킨 엘머), 1×PCR 완충액(50 mM KCl, 10 mM 트리스, 실온에서 pH 8.3, 1.5 mM MgCl2 , 0.01젤라틴)을 함유하는 50 ㎕ 용액에서 94 ℃에서 45초, 55℃에서 45초 및 72℃에서 90초의 약 30 사이클의 증폭 조작을 수행한다. 그러나, 임의의 특정 반응에 대한 PCR 증폭을 최적화하기 위해 각종 변형이 만들어질 수 있다는 것은 자명한 것이다.
기타 적절한 표적 증폭 방법으로는 리가아제 연쇄 반응(LCR; Wu and Wallace, 1989, Genomics 4:560; Landegren et al., 1988, Science , 241:1077, Barany, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci . USA 88:189 and Barringer et al., 1990, Gene , 89:117); 표준 대체 증폭(SDA; Walker et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci . USA 89:392-396); 전사 증폭(Kwoh et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci . USA 86:1173); 자가 유지 서열 복제(3SR; Fahy et al., 1992 PCR Methods Appl . 1:25, Guatelli et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci . USA 89:1874); 핵산 서열계 증폭(NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario; 예컨대 Compton, 1991, Nature 350:91); 전사계 증폭계(TAS); 및 자가 유지 서열 복제계(SSR)를 포함한다. 전술한 각각의 문헌은 참고로 인용하였다. 유용한 PCR 변형은 디곡시게닌-dUTP가 PCR 생성 물에 삽입되는 PCR ELISA(예, 보에링거 만하임 카탈로그 1 636 111)이다. PCR 반응 혼합물은 변성되고 PCR 생성물의 내부 서열에 어닐링되도록 고안된 바이오틴 표지된 올리고뉴클레오티드와 하이브리드화된다. 하이브리드화 생성물은 스트렙타비딘이 피복된 평판에 고정되고 항디곡시게닌 항체를 이용하여 검출된다. 당업자가 시험관내 증폭 방법을 수행하기에 충분한 기법의 예는 문헌[PCR TECHNOLOGY: PRINCIPLES AND APPLICATIONS FOR DNA AMPLIFICATION, H, Erlich, Ed. Freeman Press, New York, NY(1992); PCR PROTOCOLS; A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, eds, Innis, Gelfland, Snisky, and White, Academic Press, San Diego, CA(1990); Mattila et al., 1991, Nucleic Acids Res. 19:4967; Eckert and Kunkel, (1991) PCR METHODS AND APPLICATIONS 1: 17; PCR, eds. McPherson, Quirkes, and Taylor, IRL Press, Oxford; 미국 특허 4,683,195, 4,683,202, 및 4,965,188; Barringer et al., 1990, Gene , 89:117; Lomell et al., 1989, J. Clin. Chem. , 35:1826, 각각의 문헌은 참고로 인용함]에 나타나있다.
증폭된 생성물은, 예컨대 겔 전기영동; 비이드, 막, 슬라이드 또는 칩 등의 고체 지지체에 고정된 표적 핵산에 대한 하이브리드화; 서열 분석; 면역학적으로, 예컨대 PCR-ELISA, 형광, 인광체, 방사능 시그널의 검출; 또는 기타 공지된 각종 방법으로 직접 분석할 수 있다. 예를 들어, 검출 방법의 예시적 일례로는 억제제로서 작용하는 벤조산 유도체 및 플로오레세인에 결합된 U자형 루프로 증대시킨 PCR 프라이머를 이용하여, 프라이머가 풀려 표적에 결합하고 복제가 일어나는 경우에만 발광시키는 것이다.
hTRT mRNA는 극히 드문 전사체로서 발현되고, 텔로머라제 양성 세포에서도 극히 낮은 농도로 존재하기 때문에, 종종 증폭 단계에서 얻은 시그널을 최적화 또는 증가시키는 것이 바람직하다. 이를 수행하는 방법중 하나는 증폭 사이클 수를 증가시키는 것이다. 예를 들어 20∼25 사이클이 표준 반응 조건하에서 폴리머라제 연쇄 반응을 사용한 대부분의 mRNA 증폭에 적절하지만, 다수의 시료중 hTRT mRNA의 검출을 위해서는 증폭 효율과 검출 형식에 따라 30∼35 사이클의 증폭이 필요할 수 있다. 증폭 사이클 수를 비롯하여 증폭 조건을 잘 선택하면 시험 시료에서 표적의 양이 역치인 경우에만 증폭 생성물을 형성하도록 분석법을 고안할 수 있다(즉, 고농도의 hTRT mRNA을 가지는 시료만이 "양성" 결과를 나타내도록 함)는 것을 인지해야 한다. 또한, 이 방법은 표적 서열의 증폭에 의해 생성된 시그널을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 증폭 서열을 검출하는 능력을 증가시키는 방법은 시그널 증폭계, 예컨대 분지 DNA 시그널 증폭(예, 미국 특허 제5,124,246호; Urdea, 1994, Bio/Tech . 12:926); 티라미드 시그널 증폭(TSA)계(듀퐁); 촉매적 시그널 증폭(CSA; 다코); Q 베타 리플리카제계(Tyagi et al., 1996, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 93:5359) 등을 포함한다.
당업자라면 어떤 증폭 방법을 사용하는지 여부와 관련없이 정량분석이 필요한 경우 알려진 각종 정량법을 사용할 수 있다는 것을 알 것이다. 예를 들어, 필요한 경우, 2개 이상의 폴리뉴클레오티드를 단일 시료에서 동시 증폭시킬 수 있다. 이 방법은 시료중 hTRT mRNA의 양을 정량하는 편리한 방법으로 사용되는 데, 그 이유는 역전사 및 증폭 반응이 표적 및 대조 폴리뉴클레오티드에 대해 동일한 반응으 로 수행되기 때문이다. 대조 폴리뉴클레오티드(일반적으로 공지된 농도 또는 카피수로 존재)의 동시 증폭은 시료중 hTRT의 양과 비교하여 시료중 세포수를 일정하게 하는데 사용될 수 있다. 동시 증폭 반응을 위한 적절한 대조 폴리뉴클레오티드는 DNA, 하우스키핑 유전자로부터 발현된 RNA, 구성형으로 발현된 유전자 및 반응 혼합물에 첨가되는 시험관내 합성된 RNA 또는 DNA를 포함한다. 내인성 대조 폴리뉴클레오티드는 시료에 이미 존재하는 것들이지만, 외래 대조 폴리뉴클레오티드는 시료에 첨가되는 것으로서, "스파이크" 반응을 형성한다. 대조 RNA의 일례는 β-액틴 RNA, GAPDH RNA, snRNA, hTR 및 내인성 발현 28S rRNA를 포함한다(참고, Khan et al.1992, Neurosci. Lett . 147:114). 외래 대조 폴리뉴클레오티드로는 합성 AW106 cRNA를 포함하며, 이는 T7 폴리머라제에 의해 pAW106 으로부터 센스 가닥으로서 합성될 수 있다. 정량에 유용한 동시 증폭 방법에서, 통상 대조 폴리뉴클레오티드 및 표적 폴리뉴클레오티드는 모두 선형 범위에서 증폭되어야 함을 알 것이다. 정량 PCR에 대한 상세한 프로토콜은 문헌[PCR PROTOCOLS, A GUIDE TO METHODS AND APPLICATION, Innis et al., Academic Press, Inc. N.Y., (1990) and Ausubel et al., 상기 문헌 참조(유니트 15) and Diaco, R.(1995) Practical Considerations for the Design of Quantitative PCR Assays , in PCR STRATEGIES, p84-108, Innis et al., eds, Academic Press, 뉴욕]에 설명되어 있다.
내인성 또는 외래 표준물의 서열에 따라, 상이한 프라이머 세트를 동시 증폭 반응에 사용할 수 있다. 경쟁적 증폭이라고 불리우는 한 방법에서, 정량 PCR은 표적 핵산의 증폭에 사용되는 동일한 프라이머를 사용하여 대조 서열의 공지량을 동 시에 동시 증폭시키는 단계를 포함한다(2개의 프라이머 한쌍). 비경쟁적 증폭으로 알려진 대안적인 양태에서, 대조 서열 및 표적 서열(예, hTRT cDNA)은 상이한 프라이머(즉, 2개의 프라이머 2쌍)를 사용하여 증폭된다. 반경쟁적 증폭이라고 알려진 또 다른 대안적 양태에서는 3개의 프라이머가 사용되며, 이중 하나는 hTRT 특이적이고, 다른 하나는 대조 서열에 특이적이며, 나머지 하나는 표적 서열과 대조 서열에 모두 어닐링할 수 있는 것이다. 반경쟁적 증폭은 본원에서 참고로 인용한 미국 특허 제5,629,154호에 개시되어 있다.
3) 하이브리드화계 분석법
a) 개론
핵산 하이브리드화 기법을 사용한 특이적 DNA 및 RNA 측정에 대한 각종 방법이 당업계에 알려져 있다(Sambrook 등의 상기 문헌 참조). 하이브리드화계 분석법은 프로브 핵산이 표적 핵산에 하이브리드화되는 분석을 의미한다. 일반적으로 본 발명의 핵산 하이브리드화 프로브는 hTRT 유전자 또는 RNA 서열의 인접 서열과 전체적으로 동일하거나 또는 거의 동일하다. 핵산 프로브의 길이는 약 10개 이상의 염기, 종종 약 20개 이상의 염기, 때때로 약 200개 이상의 염기인 것이 바람직하다. 핵산 하이브리드화에 사용하기 위한 핵산 프로브 서열을 선택하는 방법은 상기 Sambrook 등의 문헌에 개시되어 있다. 일부 형태에서는, 1종 이상의 표적 및 프로브가 고정된다. 고정된 핵산은 DNA, RNA 또는 기타 올리고뉴클레오티드나 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 자연 발생적 또는 비자연 발생적 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체 또는 골격을 포함할 수 있다. 이 분석법은 서던 블롯, 노던 블롯, 도트 블롯 및 슬롯 블롯, 고밀도 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 배열(예, GeneChipsTM Affymetrix), 딥 스틱, 핀, 칩 또는 비이드를 비롯한 임의의 몇가지 형태일 수 있다. 이들 기법 모두는 당업계에 알려져 있으며, 시판되는 여러 진단 키트의 기초가 된다. 하이브리드화 기법은 일반적으로 문헌[Hames et al., ed., NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION, A PRACTICAL APPROACH IRL Press, (1985); Gall and Pardue Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A., 63:378-383(1969); and Jone et al., Nature, 223:582-587(1969)]
각종 핵산 하이브리드화 형태가 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 일반적인 형태중 하나는 직접 하이브리드화하는 것이며, 이 방법에서 표적 핵산은 표지된 상보성 프로브에 하이브리드화한다. 통상, 표지된 핵산이 하이브리드화에 사용되며, 라벨이 검출할 수 있는 시그널을 제공한다. hTRT mRNA의 존재, 부재 또는 양을 평가하는 방법은 실시예 2에 예시된 바와 같이 시료에서 얻은 RNA의 노던 전이와 표지된 hTRT 특이 핵산 프로브의 하이브리드화를 수행하는 것이다. 전술한 바와 같이, hTRT mRNA는 존재하는 경우 대부분의 세포에서 매우 적은 양으로 존재한다. 따라서, 노던 하이브리드화가 사용되는 경우, 증폭 단계(또는 대안적으로 다량의 출발 RNA)를 이용하는 것이 바람직하다. 시료중 hTRT 단백질 암호 DNA의 존재, 부재 또는 양을 평가하는 유용한 방법은 시료로부터의 DNA의 서던 전이 및 표지된 hTRT 특이적 핵산 프로브의 하이브리드화를 포함한다.
기타 일반적인 하이브리드화 형태는 샌드위치 분석법 및 경쟁 또는 대체 분석법을 포함한다. 샌드위치 분석법은 핵산 서열의 검출 또는 분리를 위해 상업적으 로 이용되는 하이브리드화 분석법이다. 이 분석법은 고체 지지체에 공유적으로 고정된 "포집(capture)" 핵산과 용액중의 표지된 "시그널" 핵산을 이용한다. 생물학적 또는 임상적 시료는 표적 핵산을 제공한다. "포집" 핵산 및 "시그널" 핵산 프로브는 "샌드위치" 하이브리드화 복합체를 형성하도록 표적 핵산과 하이브리드화한다. 시그널 핵산은 포집 핵산과 하이브리드화할 수 없는 것이 효과적이다.
b) 칩계 분석법 및 슬라이드계 분석법
본 발명은 hTRT 핵산이 하이브리드화할 수 있는 고정된 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 배열을 사용하여(즉, 고정된 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 전체 또는 대부분이 아니라 일부에 하이브리드화함) hTRT 유전자 생성물을 위한 프로브계 하이브리드화 분석법을 제공한다. 고밀도 올리고뉴클레오티드 분석법 또는 폴리뉴클레오티드 분석법은 표적 핵산(예, hTRT 유전자, mRNA 또는 cDNA)의 특성(예, 서열) 및 존재를 효과적으로 검출할 수 있는 수단을 제공한다. 동일계 합성을 위한 사진 평판술(미국 특허 제5,578,832호; 제556,752호 및 제5,510,270호; Fodor et al., 1991, Science 251:767; Pease et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5022; and Lockhart et al., 1996, Nature Biotech 14:1675) 또는 규정 올리고뉴클레오티드의 침착 및 빠른 합성을 위한 기타 방법(Blanchard et al., 1996, Biosensors & Bioelectronics 11:687)을 이용하여 표면상의 일정 위치에서 일정 서열에 상보적인 수천개의 올리고뉴클레오티드를 함유하는 배열을 생성하기 위한 기법이 알려져 있다. 이들 방법이 사용되는 경우, 공지 서열의 올리고뉴클레오티드(예, 20량체)는 유도체화된 유리 슬라이드와 같은 표 면에서 직접 합성한다. 일반적으로 생성된 배열은 과잉상태이며 검출하고자 하는 hTRT 폴리뉴클레오티드에 특이적인 칩상에 몇개의 올리고뉴클레오티드 프로브를 가진다.
올리고뉴클레오티드 프로브의 조합은 각종 hTRT 대립 유전자가 특정 시료에서 발현되는지를 동정하거나, 또는 대안적으로 접목된 mRNA를 검출하도록 고안될 수 있다.
예시적 양태로서, 시험 세포에서 얻은 총 RNA의 역전사로 제조한 cDNA를 증폭한다(예, PCR을 이용하여). 통상적으로 증폭 생성물은, 예컨대 형광 표지된 dNTP를 삽입하여 표지한다. 이어서, 표지된 cDNA는 hTRT 유전자의 각종 서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하는 칩에 하이브리드화한다. 종래의 수단을 이용하여 하이브리드화 위치를 결정하고(예, Shalon et al., 1996, Genome Research 6:639 or Schena et al., 1996, Genome Res. 6:639), 하이드리드화 패턴으로부터 서열을 추정한다.
일양태에서, 2개의 cDNA 시료는 각각이 상이한 형광 그룹으로 표지되어 있고 동일한 칩에 하이브리드화한다. 각 표지된 시료가 hTRT 유전자에 상보적인 부위에 하이브리드화한 비율을 분석한다. 두 시료가 모두 hTRT mRNA의 동일한 양을 포함하는 경우, 2 형광제의 비율은 1:1이다(형광제의 몰 감도 차이를 설명할 수 있도록 형광제로부터 나오는 시그널을 조정할 필요가 있음을 알 수 있을 것이다). 대조적으로, 제1 시료가 건강한(또는 대조군) 조직에서 유래한 것이고 제2 시료가 암 조직에서 유래한 것일 때, 제2 시료에 사용된 형광제가 우세할 것이다.
c) 동일계 하이브리드화
hTRT 단백질을 암호하는 유전자 발현을 검출하는 별법으로는 동일계 하이브리드화가 있다. 동일계 하이브리드화 분석법은 잘 알려져 있으며, 일반적으로 문헌[Angerer et al., METHODS ENZYMOL., 152: 649-660 (1987) and Ausubel et al., 상기 문헌 참조]에 기재되어 있다. 동일계 하이브리드화 분석에서, 세포 또는 조직 표본을 고체 지지체, 통상 침투된 상태로 유리 슬라이드상에 고정시킨다. 그 후 세포를 중간 온도에서 하이브리드화 용액과 접촉시켜 hTRT에 완전히 또는 거의 상보적인 표지된 핵산 프로브(예, 35 S-표지 리보프로브, 형광 표지된 프로브)를 어닐링시킨다. 유리 프로브는 세척 및/또는 뉴클레아제 분해에 의해 제거되고, 결합된 프로브는 당업계에 공지된 바와 같이 적절한 영상 기술 또는 자동방사선 사진으로 슬라이드 상에서 직접 가시화된다.
4) 변형체의 특이적 검출
전술한 내용과 실시예(예, 실시예 9)에 예시된 바와 같이, 증폭 프라이머 또는 프로브는 특이적 결실, 절두 및 삽입이 있는 증폭 생성물을 제공하도록 선택될 수 있으며, 이로부터 hTRT mRNA내의 특이적 변형 또는 비정상을 검출 용이하게 한다.
검출될 수 있는 hTRT 변형 유전자 생성물의 한 예는 전술한 내용과 실시예 9에 개시되어 있는 생성물(서열 번호 4)과 같은 hTRT RNA이다. Δ182 변형체의 생물학적 기능은 존재한다고 해도 알려져 있지 않다: 그러나, 변형체에 의해 암호될 것으로 추정되는 절두된 hTRT 단백질은, 예컨대 텔로머라제 성분을 적정하는 비작용 성 텔로머라제 RNP를 어셈블리에 의한 텔로머라제 활성의 조절과 관련이 있을 수 있다. 대안적으로, 텔로머라제 활성의 음성 조절은 전장 mRNA의 제거를 유도하는 방식으로 hTRT 프리 mRNA(발생기의 mRNA) 프로세싱을 유도하고, hTRT mRNA 농도를 감소시키고 Δ182 hTRT RNA 농도를 증가시켜 수행할 수 있다. 이들 및 기타의 이유에서, Δ182 변형체를 검출하는 능력은 유용하다. 또한, 2개 종의 hTRT RNA가 존재하는 시료(전장 hTRT 단백질을 암호하는 Δ182hTRT RNA 및 hTRT RNA등이 존재)에서 상대적 및/또는 절대적 농도를 비교하는 것이 때로는 바람직하다.
본 발명은 Δ182 변형체를 검출하는 각종 방법을 제공한다. 예를 들어, 182 염기쌍 결실부에 걸쳐있는 프라이머 쌍을 이용한 증폭은 결실된 hTRT RNA 및 비결실된 hTRT RNA에 해당하는 상이한 크기의 생성물을 형성하며, 2개가 모두 존재하는 경우 크기를 근거로 구별할 수 있다(예, 겔 전기영동에 의해). 182 bp 결실부에 걸쳐있는 영역을 증폭하는 데 유용한 프라이머 쌍의 예로는 TCP1.14 및 TCP1.15(프라이머 세트 1) 또는 TCP1.25 및 bTCP6(프라이머 세트 2)가 있다(표 2 참조). 이들 프라이머쌍은 프라이머 세트 1이 처음 사용된 네스트형 PCR 실험에 사용될 수 있다. 본 발명의 hTRT 핵산 프로브를 사용한 하이브리드화 방법(예, 노던 하이브리드화) 또는 RNAse 보호 분석법은 hTRT RNA 변형체를 검출하고 이를 구별하는 데 사용될 수 있음은 당업자에게 자명할 것이다.
또 다른 적절한 방법은 3개의 프라이머를 사용한 PCR 증폭(또는 유사한 방법)을 수반하는 것이다. 앞서 상세히 설명한 반경쟁적 정량 PCR법과 유사하게, 프라이머는 hTRT RNA 종류 각각에 특이적이며(표 4에 예시된 바와 같이) 하나의 프라 이머는 2종에 상보적이다(예, TCP1.25(2270-2288)). 서열 번호 1에 특이적인 프라이머의 예는 182 뉴클레오티드 서열(즉 서열 번호 1의 뉴클레오티드 2345 내지 2526)내에서 어닐링하는 것으로, 예컨대 TCP1.73(2465-2445)이 있다. 예를 들어 서열 번호 4에 특이적인 프라이머(Δ182 변형체)는 서열 번호 4의 뉴클레오티드 2358 내지 2339(즉, 서열 번호 1에서 182 뉴클레오티드의 삽입에 해당하는 부위)에서 어닐링하는 것이다. Δ182 hTRT mRNA 종의 절대적 또는 전장 hTRT 단백질을 암호하는 종과 비교한 상대적 농도는 분석하여 세포 상태(예, 무한 증식 능력)와의 상호관련성을 규명할 수 있다. 다수의 기타 프라이머 또는 증폭 또는 검출 방법은 본 발명에 개시된 내용을 근거로 선택될 수 있음을 알 수 있다.
예시적 프라이머
Δ182 종(예, 서열 번호 4) 특이적 프라이머: 5'-GGCACTGGACGTAGGACGTG-3' hTRT(서열 번호 1) 특이적 프라이머(TCP1.73): 5'-CACTGCTGGCCTCATTCAGGG-3 공통(정방향) 프라이머 (TPC1.25): 5'-TACTGCGTGCGTCGGTATG-3'
검출될 수 있는 기타 변형 hTRT 유전자 또는 유전자 생성물은 조기 종결 코돈, 결실, 치환 또는 삽입에 의해 특징지워지는 것들을 포함한다. 결실은 유전자, mRNA 전사체 또는 cDNA의 크기 감소로 검출할 수 있다. 유사하게, 삽입은 유전자, mRNA 전사체, 또는 cDNA의 크기 증가로 검출할 수 있다. 삽입 및 결실은 조기 종결 코돈을 유도하는 리딩 프레임의 이동이나 또는 더 긴 오픈 리딩 프레임을 유발할 수 있다. 변경은 변형 hTRT 폴리펩티드의 크기 변화를 관찰하거나(예, 웨스턴 블롯 에 의해) 또는 적절한 하이브리드화 또는 특이적 증폭으로 검출할 수 있다. 대안적으로, 돌연변이는 표준 방법에 따라 유전자 또는 유전자 생성물의 서열 분석으로 결정될 수 있다. 또한, 전술한 바와 같이 증폭 분석 및 하이브리드화 프로브는 특정 비정상체에 특이적으로 표적되도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 핵산 프로브 또는 증폭 프라이머는 결실, 치환 또는 삽입을 포함하는 영역에 각각 특이적으로 하이브리드화하거나 영역을 증폭하도록 선택될 수 있다. hTRT 유전자가 변이를 보유하는 경우, 프로브는 (1) 하이브리드화 또는 증폭 반응을 못하여 증폭 생성물 또는 하이브리드화 시그널의 크기 변화를 유발하거나 특이 증폭을 제공할 수 없거나; (2) 프로브 또는 증폭 반응이 전체 결실 또는 결실의 한쪽 말단(결실 접합부)을 포함하거나; 또는 (3) 유사하게, 프로브 및 증폭 프라이머가 점 돌연변이 또는 삽입을 특이적으로 표적하도록 선택될 수 있다.
5) 변이 hTRT 대립 유전자의 검출
hTRT 유전자 변이는 질병 억제를 담당하거나 또는 질병 개시에 관여할 수 있다. hTRT의 게놈 DNA의 변경은 유전자 전사에 영향을 주고, hTRT 단백질내 아미노산 잔기를 변화시키고, 생성하고자 하는 절두 hTRT 폴리펩티드를 유발하고, 프리 mRNA 프로세싱 경로(hTRT mRNA 농도를 변경할 수 있는 경로)를 변경하고, 또한 기타 결과를 유발할 수 있다.
비 hTRT 위치에서 게놈 DNA의 변경은 hTRT, hTR 및 텔로머라제 회합 단백질 발현 및 프로세싱과 RNP 어셈블리 및 이송의 조절을 담당하는 효소 또는 세포 프로세스를 변경시켜 hTRT 또는 텔로머라제 발현에 영향을 줄 수 있다. hTRT 발현, 프 로세싱 또는 RNP 어셈블리에 영향을 줄 수 있는 변경은 암 증식, 노화 질병, DNA 손상 질병 등에 중요하다.
hTRT mRNA 또는 그 유전자 및 유전자 조절 인자의 변이 검출은 여러 방식으로 본원에 개시된 방법에 따라 수행될 수 있다. 일례로서 다음과 같은 방법이 사용될 수 있다: 프라이머 검색이라고 불리우는 기술이 사용될 수 있다; PCR 프라이머는 이의 3' 말단이 변이 가능한 시료 DNA(또는 RNA)에서 뉴클레오티드에 어닐링되도록 고안된다. DNA(또는 RNA)가 프라이머에 의해 증폭되는 경우, 3' 말단은 유전자내 뉴클레오티드와 정합된다. DNA가 증폭되지 않은 경우, 한 말단 또는 양 말단은 유전자의 뉴클레오티드와 정합되지 않았고, 이는 변이가 존재함을 의미한다. 리가아제 연쇄 반응(LCR, 전술)을 사용한 점 돌연변이 분석에서와 유사한 프라이머 고안물을 이용할 수 있다. 제한 단편 길이 다형성, RFLP(Pourzand C., Cerutti, P. (1993) Mutat. Res 288:113-121)은 본 발명에 적용될 수 있는 또 다른 기법이다. 각종 제한 효소로 분해된 인간의 게놈 DNA의 서던 블롯은 hTRT 특이적 프로브로 조사한다. 시료와 대조 시료의 단편 수 또는 크기 차이는 실험 시료의 변경, 일반적으로 삽입이나 결실을 나타내는 것이다. 1본쇄 형태 다형성, SSCP(Orrita, M. et al. (1989) PNAS USA 86:2766-70)는 본 방법에 적용되는 또 다른 기법이다. SSCP는 변성된 야생형 및 변이 1본쇄 DNA(일반적으로 PCR에 의해 생성됨)의 이동 차이에 근거한 것이다. 1본쇄 DNA는 서열 특이적 3차 구조를 가진다. 단일 염기 변화와 같은 작은 차이도 비변성화 겔에서 이동성 전이를 초래할 수 있다. SSCP는 단순하기 때문에 가장 널리 사용되는 변이 검색법 중 하나이다. 변성 구배 겔 전기영동, DGGE(Myers, R.M., Maniatis, T.and Lerman, L., (1987) Methods in Enzymology, 155:501-527)는 본 발명에 적용될 수 있는 기법중 하나이다. DGGE는 2본쇄 DNA의 용해 현상을 기초로 한 것이다. 전문화된 변성 전기 영동 장치는 실험 DNA 및 대조 DNA의 용융 프로필을 관찰하는 데 이용된다. 변이가 있는 DNA는 겔 시스템에서 대조군과 비교하여 다른 이동성을 가질 것이다. 논의된 실시예는 공통적으로 사용된 방법론을 예시한다: 당업자에게 공지되어 있고 본원에 교시된 내용에 따라 적용할 수 있는 다수의 기법이 있다.
F. 핵형 분석
본 발명은 인간 환자, 인간 세포주 또는 비인간 세포의 염색체에 존재하는 유래한 hTRT 유전자 서열의 검출 또는 정위 및/또는 hTRT 서열 프로브를 사용하여 핵형 또는 기타 염색체 분석을 위한 방법 및 시약을 추가로 제공한다. 일양태에서, hTRT 유전자의 증폭(즉, 카피수 변화), 결실(즉, 부분적 결실), 삽입, 치환 또는 염색체 위치 변화(예, 전위)는 병리적 증상(예, 암)으로 발전될 소인 또는 병리적 증상의 존재와 상호관련이 있을 수 있다.
정상적인 인간 세포에서, hTRT 유전자는 염색체 5p의 말단소립에 가깝게 지도작성된다는 것을(실시예 5 참고, 후술) 본 발명으로 결정하였다. 가장 가가운 STS 마커는 D5S678이다(도 8 참고). hTRT 유전자에 밀접하게 결합된 마커를 확인하는데 위치를 이용한다. 마커는 YAC, STS, 코스미드, BAC, 람다 파지, P1 파지, 또는 hTRT 게놈 서열 또는 대조 인자를 함유하는 기타 클론을 확인하는 데 사용된다. 마커 또는 유전자 위치를 사용하여 암 또는 질병 유형의 발생과 관련된 정상적인 hTRT 유전자 위치, 조직화 또는 서열에서의 변경에 대한 인간 조직 시료를 검색할 수 있다. 이 정보는 관련 질병 또는 암에 대한 진단 또는 예후 추정 방법에 사용할 수 있다. 더구나, hTRT 유전자에 대한 임의의 변경 특성은 세포가 무한 증식하는 특성에 대한 정보일 수 있다. 예를 들어, 전위는 부적절한 방식으로 hTRT 전사를 유도하는 프로모터로 hTRT 프로모터를 대체하는 경우 hTRT 발현 활성화가 발생한다는 것을 제시한다. 이러한 유형의 발명의 방법 및 시약은 hTRT 프로모터 활성화를 억제하는 데 사용될 수 있다. 정상 체세포내 hTRT 유전자 발현 특성, 예컨대 그 위치가 비발현 헤테로크로마틴의 일부인지를 결정하는 데 위치선정이 유용할 수 있다. 헤테로크로마틴과 유크로마틴을 구별하기 위한 뉴클레아제 과민 분석은 예컨대 Wu 등의 문헌[1979, Cell 16:797]; Groudine 및 Weintraub의 문헌[1982, Cell 30:131]; Gross 및 Garrad의 문헌[1988, Ann.Rev.Biochem. 57:159]에 개시되어 있다.
일양태로서, hTRT 유전자에 대한 변화는 당업계에 공지된 각종 임의의 방법을 사용하여 핵형 분석으로 확인한다. 유용한 기술은 동일계 하이브리드화(ISH)이다. 통상적으로, 동일계 하이브리드화 기술이 핵형 분석에 사용되는 경우, 검출가능한 프로브 또는 검출가능하게 표지된 프로브를 hTRT 유전자 서열의 위치를 선정할 수 있도록 염색체 시료와 동일계에서 하이브리드화시킨다. 일반적으로 ISH는 1 이상의 다음 단계를 포함한다: (1) 분석하고자 하는 조직, 세포 또는 기타 생물학적 구조물의 고정화 단계; (2) 표적 DNA의 접근도를 증가시키고(예컨대, 얼마나 알칼리로 변성) 비특이적 결합을 감소시키는(예컨대 인간의 게놈 DNA를 사용하여 반 복 서열의 하이브리드화 능력을 차단하여 감소시킴) 생물학적 구조의 예비 하이브리드화 처리 단계; (3) 생물학적 구조 또는 조직중의 핵산과 1종 이상의 핵산 프로브(예, 통상적인 핵산, pNA 또는 기타 핵산 유사체를 함유하는 프로브)를 하이브리드화하는 단계; (4) 하이브리드화에서 결합되지 않은 핵산 단편을 제거하기 위한 하이브리드화후 세척 단계; (5) 하이브리드화된 핵산 단편을 검출하는 단계. 각각의 단계에서 사용된 시약 및 이를 사용하기 위한 조건은 특정 용도에 따라 다양하다. 이들 단계는 당업계에 공지된 각종 방법으로 변형될 수 있음을 알 것이다.
ISH의 일양태에서, hTRT 프로브는 형광 표지(형광 동일계 하이브리드화: "FISH")로 표지된다. 전형적으로, 이중 색상 형광 동일계 하이브리드화를 이용하는 것이 바람직하며, 이 방법에서는 2개의 프로브가 이용되고, 각각은 다른 형광 염료로 표지하였다. 목적하는 hTRT 서열에 하이브리드하는 시험 프로브는 제1 염료로 표지하고 다른 영역에 하이브리드하는 대조 프로브는 제2 염료로 표지하였다. 목적한 염색체의 안정한 부분(예, 중심절 영역)에 하이브리드화하는 핵산은 대조 프로브로서 사용될 수 있다. 이 방식에서, 시료간의 하이브리드화 효과 차이를 설명할 수 있다.
염색체 비정상을 검출하는 ISH 방법(예, FISH)은 대상 핵산의 ng 양을 가지고 수행될 수 있다. 신선한 또는 동결된 재료, 조직 또는 절편을 사용할 수 있는 것과 같이 파라핀 매립된 정상 조직이나 종양 절편을 사용할 수 있다. FISH는 한정된 재료에만 적용되는데, 예컨대, 배양하지 않은 1차 종양으로부터 제조된 이상 제조물을 사용할 수 있다(참고, Kallioniemi et al., 1992, Cytogenet. Cell Genet. 60:190). 예를 들어, 종양에서 얻은 작은 생검 조직 시료를 이상 제조물로 사용할 수 있다(예, Kallioniemi et al., 상기 문헌 참조). 체액(예, 혈액, 요, 담 등) 중 세포 또는 흡인 생검으로 얻은 소수의 세포를 분석할 수 있다. 산전 진단을 위한 적절한 시료로는 양막, 모체 혈액 등을 포함한다. 본원에 개시된 방법 및 시약에 적용할 수 있는 유용한 하이브리드화 프로토콜은 문헌에 개시되어 있다[Pinkel et al., 1988, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 85:9138; EPO Pub. 제430,402호; Choo, ed., METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY VOL. 33: IN SITU HYBRIDIZATION PROTOCOLS, Humana Press, Totowa, 뉴저지주(1994); and Kallioniemi et al., 상기 문헌 참조].
핵형 분석에 유용한 기타 기술은, 생물학적 시료에 존재하는 염색체상의 hTRT 서열의 증폭, 결실, 삽입, 치환 또는 기타 재배열을 확인하는 데 사용될 수 있는 본 발명의 hTRT 프로브 및 프라이머를 사용하는, 예컨대 정량적 서던 블롯팅, 정량적 PCR 또는 비교 게놈 하이브리드화 등의 기술이 있다(Kallioniemi et al., 1992, Science, 258-818).
G. TRT 폴리펩티드 분석
1) 개론
본 발명은 hTRT 폴리펩티드의 정량 및 검출을 위한 방법 및 시약을 제공한다. 이들 방법으로는 전기 영동, 질량 분광 분석기, 겔 이동, 모세관 전기영동, 크로마토그래피법, 예컨대 크기 배제 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 박막크로마토그래피(TLC), 고확산 크로마토그래피 등과 같은 분석용 생화학 방법, 또는 유체나 겔 침강소 반응, 면역확산(단일 또는 이중), 면역전기영동, 방사능면역분석(RIA), 효소 결합된 면역흡착 분석(ELISA), 면역형광 분석, 웨스턴 블롯팅, 질량 분광 분석기 및 하기에 개시된 기타의 것과 같은 각종 면역학적 방법이 있으며, 본원을 검토하면 당업자에게는 자명할 것이다.
2) 전기영동 분석
일양태에서, hTRT 폴리펩티드는 전기영동 단백질 분리에서 검출된다. 하나의 관점에서, 2차 전기 영동 시스템이 사용된다. 전기영동 기법을 사용하여 단백질을 검출하는 방법이 당업계에 공지되어 있다(참고: R.Scopes(1982) PROTEIN PURIFICATION, Springer-Verlag, N.Y. ; Deutscher, (1990) METHODS IN ENZYMOLOGY VOL. 182; GUIDE TO PROTEIN PURIFICATION, Academic Press, Inc., N.Y.).
관련 양태에서, 이동성 전이 분석(예컨대 Ausubel et al., 상기 문헌 참고)을 사용한다. 예를 들어, 표지된 hTR은 hTRT와 관련이 있으며 비변성 폴리아크릴아미드 겔 등에서 전기 영동시 변경된 이동성으로 이동한다. 따라서, 예컨대 (임의적으로 표지된) hTR 프로브 또는 (임의적으로 표지된) 텔로머라제 프라이머를 hTRT 함유 시료와 혼합하거나 또는 hTRT와 동시 발현되는(예, 무세포 발현계에서) 경우, 시료중 hTRT 단백질(또는 hTRT 암호하는 폴리뉴클레오티드)의 존재는 검출가능한 hTR 이동성 변화를 초래한다.
3) 면역 분석
a) 개론
본 발명은 1종 이상의 항체 시약을 사용하여 hTRT 폴리펩티드를 검출하는 방법을 제공할 수도 있다(즉, 면역분석법). 본원에 개시된 바와 같이, hTRT 폴리펩티 드 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체(광범위하게는 본원에 제시한 것들, 구체적으로 단편, 키메라 및 기타 결합제를 포함)를 이용하는 분석이다. 본 발명의 항체는 전술한 바와 같이 당업계에 공지된 각종 수단으로 제조될 수 있다.
본 발명의 실시에 적절한 다수의 기존 면역학적 결합 분석 형태가 알려져 있다(참고, 미국 특허 4,366,241; 4,376,110; 4,517,288; 및 4,837,168). 예컨대, METHODS IN CELL BIOLOGY VOLUME 37: ANTIBODIES IN CELL BIOLOGY, Asai, ed. Academic Press, Inc. 뉴욕(1993); BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY 7th Edition, Stites & Terr, eds. (1991); Harlow and Lane, 상기 문헌[예, 14장], 및 Ausubel et al., 상기 문헌, [예, 11장] 참고. 각 문헌은 전체를 참고로 인용하였다. 통상적으로, 면역학적 결합 분석(또는 면역분석법)은 종종 분석물을 고정하고 특이적으로 결합시키기 위한 "포집제"를 이용한다. 일양태에서, 포집제는 hTRT 폴리펩티드 또는 준서열에 특이적으로 결합하는 성분, 예컨대 항hTRT 항체이다. 대안적인 양태에서, 포집제는 hTRT 회합 분자가 hTRT에 결합되어 있는(hTRT 회합 분자가 고정되어 있는 경우 hTRT 단백질이 유사하게 고정되어 있도록) 조건하에서 hTRT 회합 단백질 또는 RNA에 결합할 수 있다. hTRT 회합 분자가 포집된 분석에서는 일반적으로 회합된 hTRT 단백질이 존재하며, 따라서 예컨대 항 hTRT 항체 등을 사용하여 검출될 수 있다. 단백질 복합체를 검출하는 면역분석법이 당업계에 공지되어 있다(참고, Harlow and Lane, 상기 문헌 참조, p 583).
일반적으로 분석할 hTRT 유전자 생성물은 검출가능한 표지를 사용하여 직접 또는 간접적으로 검출된다. 분석에 사용되는 특정 표지 또는 검출가능한 군은, 분 석에 사용되는 항체(들)의 특이적 결합을 유의적으로 저해하지 않는 한 중요하지 않다. 표지는 포집제(예, 항hTRT 항체)에 공유적으로 결합되거나, 또는 예컨대 hTRT 폴리펩티드(포집제에 의해 인식되는 것 외에 상이한 에피토프), 포집제(예, 항-(제1항체)면역글로블린); 항hTRT 항체; 항TRT 항체에 결합하는 항체; 또는 항체/텔로머라제 복합체(예, 텔로머라제 회합 단백질과 같은 회합된 분자에 대한 결합을 통해)에 특이적으로 결합할 수 있는 제3 성분, 예컨대 또 다른 항체에 부착될 수 있다. 분석에 사용되는 항체와 결합할 수 있는 기타 단백질, 예컨대 단백질 A 또는 단백질 G는 표지될 수도 있다. 일부 양태에서, 1종 이상의 표지된 분자(즉, 다른 것과 구별될 수 있는 것)를 사용하는 것이 유용하다. 또한, 포집제(예, 항hTRT 항체)에 의해 결합된(예, 고정화된) 표적이 복합체(즉, hTRT와 hTRT 회합 단백질, hTR, 또는 기타 TRT 회합 분자의 복합체)인 경우, hTRT 단백질과 회합된 RNA 또는 단백질을 인식하는 표지된 항체가 사용될 수 있다. 복합체가 단백질 핵산 복합체(예, TRT-hTR)인 경우, 리포터 분자는 복합체의 RNA 성분을 인식하는 기타 분자(예, 효소) 또는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
일부 면역분석 형태는 표지된 성분의 사용을 필요로 하지 않는다. 예를 들어, 응집 분석을 이용하여 표적 항체의 존재를 검출할 수 있다. 이 경우, 항원 피복된 입자는 표적 항체를 포함하는 시료에 의해 응집된다. 이 형태에서, 성분은 표지될 필요가 없으며, 표적 항체의 존재는 간단한 육안 검사로 검출할 수 있다.
b) 비경쟁적 분석 형태
본 발명은 hTRT 폴리펩티드를 검출하기 위한 경쟁적 및 비경쟁적 면역분석용 시약 및 방법을 제공한다. 비경쟁적 면역분석은 포집된 분석물(이 경우는 hTRT)의 양이 직접 측정되는 분석법이다. 이러한 분석법은 hTRT 단백질상에 2개의 비간섭 에피토프에 반응성이 있는 모노클로널 항체를 이용한 2개 부위를 가지는 모노클로널계 면역 분석법이다. 예컨대 기본 정보에 대해 Maddox et al., 1983, J.Exp.Med., 158:1211 참고. 바람직한 "샌드위치" 분석법에서, 포집제(예, 항TRT 항체)는 고정화된 고체 기질에 직접 결합된다. 이와 같이 고정된 항체는 그 후 시험 시료에 존재하는 모든 hTRT 단백질을 포획한다. 이어서, 이들 고정된 항체를 표지한다. 즉, 라벨 표지 보유 제2 항hTRT 항체에 결합하여 표지한다. 대안적으로, 제2 항hTRT 항체는 라벨이 결핍되어 있을 수 있으나, 제2항체가 유도된 종의 항체에 특이적인 표지된 제3 항체에 결합될 수 있다. 또한, 제2항체는 검출가능한 성분, 예컨대 바이오틴으로 수사시킬 수 있으며, 제3 표지된 분자는 효소 표지된 스트렙타비딘과 같이 특이적으로 결합될 수 있다.
c) 경쟁적 분석 형태
경쟁적 분석에서, 시료에 존재하는 hTRT 단백질의 양은 시료에 존재하는 hTRT 단백질에 의해 포집제(예, 항TRT 항체)로부터 대체된(또는 경쟁 제거된) hTRT (외래) 첨가량을 측정하여 간접적으로 측정한다. 경쟁 분석에서, 공지량의 표지된 hTRT 단백질을 시료에 첨가한 후 포집제(예, hTRT 단백질에 특이적으로 결합하는 항체)와 접촉시킨다. 항체에 결합된 외래(표지된) hTRT 단백질의 양은 시료에 존재하는 hTRT 단백질 농도에 반비례한다. 일양태에서, 항체는 고체 기질에 고정된다. 항체에 결합된 hTRT 단백질의 양은 TRT/항체 복합체에 존재하는 hTRT 단백질의 양 을 측정하거나, 또는 대안적으로 복합체를 형성하지 않고 남아있는 TRT 단백질의 양을 측정하여 결정할 수 있다. hTRT 단백질의 양은 표지된 hTRT 분자를 제공하여 검출할 수 있다.
합텐 억제 분석은 경쟁 분석의 또 다른 예이다. 이 분석에서, hTRT 단백질은 고체 기질상에 고정된다. 공지량의 항TRT항체를 시료에 첨가한 후, 시료를 고정된 hTRT 단백질과 접촉시킨다. 이 경우, 고정된 hTRT 단백질에 결합된 항TRT 항체의 양은 시료에 존재하는 hTRT 단백질의 양과 반비례한다. 고정된 항체의 양은 용액에 남아있는 항체의 분획물 또는 항체의 고정된 분획물을 검출하여 감지할 수 있다. 이 관점에서, 검출은 항체가 표지된 경우는 직접 방식이고, 표지가 전술한 항체에 특이적으로 결합하는 분자에 결합하는 경우는 간접 방식이다.
d) 기타 분석 형태
본 발명은 면역블롯(웨스턴 블롯) 형태를 사용하여 시료중 hTRT의 존재를 정량 및 검출하는 방법과 시약을 제공한다. 여기서, 시료내의 hTRT 폴리펩티드는 겔 전기 영동(예, 분자량을 기초로)에 의해 다른 시료 성분으로부터 분리하고, 분리된 단백질은 적절한 지지체(예, 니트로셀룰로스 필터, 나일론 필터, 유도된 나일론 필터 등)로 이동시키며, 지지체는 본 발명의 항TRT 항체와 함께 항온처리한다. 항TRT 항체는 고체 지지체상의 hTRT 또는 기타 TRT에 특이적으로 결합한다. 이들 항체는 직접 표지되거나, 또는 대안적으로 표지된 항체(예, 표지된 양 항마우스 항체) 또는 항TRT 항체에 특이적으로 결합하는 기타 표지 시약을 사용하여 검출할 수 있다.
기타 분석 형태는 리포좀 면역분석법(LIA)를 포함하며, 특이 분자(예, 항체) 에 결합하고 포집된 시약 또는 마커를 해리하도록 고안된 리포좀을 사용한다. 이어서, 방출된 화학물을 표준 기법으로 검출할 수 있다(참고, Monroe et al., 1986, Amer.Clin.Prod.Rev. 5:34).
전술한 바와 같이, FACS(및 동일한 기구 또는 방법)를 사용한 분석 형태는 이종 시료(예, 정상 세포 및 악성 세포를 함유하는 생검 시료)에서 hTRT 유전자 생성물을 측정하는 경우 유리하다.
e) 기질, 고체 지지체, 막, 필터
전술한 바와 같이, 분석법에 따라, 항원, 표적 항체 또는 항hTRT 항체를 비롯한 각종 성분을 고체 표면 또는 지지체(즉, 기질, 막 또는 필터지)에 결합시킬 수 있다. 각종 고체 표면에 생체분자를 고정시키는 여러 방법이 알려져 있다. 예를 들어, 고체 표면은 막(예, 니트로셀룰로스), 미량역가 접시(예, PVC, 폴리프로필렌 또는 폴리스티렌), 시험관(유리 또는 플라스틱), 딥스틱(예, 유리, PVC, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 라텍스 등), 미량원심분리관 또는 유리나 플라스틱 비드일 수 있다. 원하는 성분은 비특이적 결합을 통해 비공유적으로 부착되거나 공유적으로 결합될 수 있다.
각종 천연 유기 중합체와 무기 중합체, 합성 유기 중합체와 무기 중합체는 고체 표면 재료로서 사용될 수 있다. 예시적 중합체로는 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리(4-메틸부텐), 폴리스티렌, 폴리메타크릴레이트, 폴리(에틸렌 테레프탈레이트), 레이온, 나일론, 폴리(비닐 부티레이트), 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF), 실리콘, 폴리포름알데히드, 셀룰로스, 셀룰로스 아세테이 틀, 니트로셀룰로스 등이 있다. 사용할 수 있는 기타 재료로는 종이, 유리, 세라믹, 금속, 준금속, 반도체, 시멘트 등이 있다. 또한 겔을 형성하는 물질, 예컨대 단백질(예, 젤라틴), 리포다당류, 실리케이트, 아가로스 및 폴리아크릴아미드가 사용될 수 있다. 몇개의 수성상을 형성하는 중합체, 예컨대 덱스트란, 폴리알킬렌 글리콜 또는 계면활성제, 예컨대 인지질, 장쇄(12∼24개의 탄소 원자) 알킬 암모늄염 등이 또한 적절하다. 고체 표면이 다공성인 경우, 시스템의 특성에 따라 각종 소공 크기가 사용될 수 있다.
표면 제조시, 다수의 상이한 재료를 특히 적층체로서 사용하여 다양한 특성을 얻을 수 있다. 예를 들어, 단백질 피복물, 예컨대 젤라틴을 사용하여 비특이적 결합을 피하고, 공유 접합을 단순화하고, 시그널 검출을 증가시킨다.
화합물과 표면 사이의 공유 결합이 필요한 경우, 표면은 일반적으로 다작용성이거나 또는 다작용화될 수 있는 것이다. 표면에 존재하여 연결을 위해 사용될 수 있는 작용기로는 카르복실산, 알데히드, 아미노기, 시아노기, 에틸렌기, 히드록실기, 머캅토기 등이 있다. 각종 표면에 대한 다양한 화합물의 연결 방식이 알려져 있고 문헌에 충분하게 예시되어 있다. 예를 들어 Immobilized Enzymes, Ichiro Chibata, Halsted Press, New York, 1978, and Cuatrecasas(1970) J.Biol.Chem. 245 3059) 참고.
공유 결합 외에, 분석 성분을 비공유적으로 결합시키는 각종 방법을 사용할 수 있다. 통상 비공유 결합은 화합물이 표면에 비특이적으로 흡착되는 방식이다.
면역분석시 비특이적 결합을 감소시키는 것이 종종 바람직하다는 것을 당업 자라면 알 것이다. 특히, 고체 기질상에 고정된 항원 또는 항체를 포함하는 분석의 경우, 기질에 비특이적으로 결합하는 양을 최소화하는 것이 바람직하다. 비특이적 결합을 감소시키는 수단이 당업자들에게는 잘 알려져 있다. 전형적으로, 이 수단은 단백질계 조성물로 기질을 코팅시키는 것을 포함한다. 특히, 소 혈청 알부민(BSA), 비지방 분말화된 우유 및 젤라틴과 같은 단백질 조성물이 널리 사용되며, 분말화된 우유가 때로는 바람직하다. 대안적으로, 표면은 한 성분과 비특이적으로 결합하지만 다른 성분과 유의적으로 결합하지 않도록 고안된다. 예를 들어, 콘카나발린 A와 같은 렉틴 보유 표면은 탄수화물 함유 화합물에 결합하지만 글리코실화가 결핍된 표지된 단백질에는 결합하지 않는다. 분석 성분의 비공유 부착에 사용하기 위한 각종 고체 표면은 미국 특허 제4,447,576호 및 제4,254,082호에 설명되어 있다.
H) 항TRT 항체에 대한 분석
본 발명은 hTRT 특이적 면역글로불린을 검출하는 분석법과 시약도 제공한다. 일양태로서, 고정화된 hTRT(예, 미량분석판 웰에 결합된 재조합 hTRT)는 항hTRT 항체가 존재하는 경우 고정화된 hTRT에 결합하는 조건하에 환자에게서 얻은 혈청과 함께 항온처리한다. 비특이적으로 결합된 면역글로블린을 제거한 후에, 결합된 혈청 항체가 존재하는 경우 검출가능하게 표지된 항(인간 Ig) 항체를 첨가하여 검출할 수 있다(대안적인 양태 및 변형이 당업자에게 공지되어 있다; Harlow, 상기 문헌 참조, 제14장). 이들 분석법은 동물이나 인간의 혈청 또는 염수와 같은 담체를 비롯한 임의의 공급원에서 항hTRT 항체를 검출하는 데 유용하다. 일양태에서, 환자의 hTRT 단백질에 대한 면역 응답, 특히 자가면역(예, 항텔로머라제)응답을 검출 및 모니터링하는 데 사용된다. 항hTRT 항체는 자가면역 질병 또는 기타 증상이 있는 환자로부터 얻은 혈청 또는 기타 조직 또는 유체에 존재할 수 있다.
I) 분석 조합
본원에 개시된 진단 및 예후 분석은 각종 분석을 조합하여 수행될 수 있으며, 기타 진단 또는 예후 시험과 함께 수행될 수 있다. 예를 들어, 본 방법이 환자의 암세포의 존재를 검출하는 데 사용되는 경우, hTRT 존재는 질병의 단계, 특정 종양이 먼 위치로 전이되거나 이웃 조직을 침입할 가능성 여부 및 암의 재발 가능성 여부를 결정하는 데 사용될 수 있다. 추가의 정보를 제공할 수 있는 시험은 생검 시료의 현미경 분석, 종양원성과 관련된 항원(예, 세포 표면 마커)의 검출(예, 조직세포화학, FACS 등을 사용하여), 영상화 방법(예, 표지된 항종양 항체를 환자에게 투여시), 텔로머라제 활성 분석, 텔로머라제 길이 분석, hTR 분석 등을 포함한다. 이러한 조합 시험은 질병의 진행에 관한 유용한 정보를 제공할 수 있다.
분석 조합이 유용한 정보를 제공할 수 있음을 알 것이다. 예를 들어, 전술한 바와 같이, hTRT mRNA 분석은 hTR(인간 텔로머라제 RNA)에 대한 분석 또는 텔로머라제 활성(즉, TRAP)분석과 조합하여 텔로머라제 어셈블리 및 작용에 대한 정보를 제공할 수 있다.
J) 키트
본 발명은 텔로머라제 관련 증상이 있는 환자의 검색, 모니터링, 진단 및 예후 추정을 위해 유용한 키트, 또는 세포 또는 세포주에서 hTRT의 발현 농도를 결정하는데 유용한 키트도 제공한다. 키트는 hTRT 유전자 생성물(RNA 또는 단백질)의 존재 또는 부재를 결정하거나 hTRT 유전자 발현을 정량하기 위한 1종 이상의 시약을 포함한다. 바람직한 시약은 hTRT 유전자, RNA, cDNA, 또는 이의 일부에 특이적으로 결합하는 핵산 프라이머 및 프로브와 함께 단백질, 펩티드, 항체 및 대조 프라이머, 대조 프로브, 대조 올리고뉴클레오티드, 대조 단백질, 대조 펩티드 및 대조 항체를 포함한다. 효소(예, 역전사 효소, DNA 폴리머라제, 리가아제), 완충액, 시약(라벨, dNTP)을 비롯한 기타 재료를 첨가할 수 있다.
키트는 hTRT 폴리펩티드 또는 이의 준서열에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이 항체와 함께 본원에 개시된 임의의 기타 성분을 포함할 수 있다. 항체는 모노클로널 또는 폴리클로널 항체일 수 있다. 항체는 라벨과 같은 다른 성분에 접합되고/또는 고체 지지체(기질)에 고정될 수 있다. 키트(들)는 hTRT 폴리펩티드/항체 복합체의 검출 또는 하이브리드화된 핵산 프로브 검출을 위한 제2 항체 뿐 아니라 대조 시약 또는 기타 시약으로서 사용하기 위한 1종 이상의 hTRT 펩티드 또는 단백질을 포함할 수 있다.
항체 또는 하이브리드화 프로브는 시험관, 미량역가 판, 딥스틱 등과 같은 고체 지지체상에 고정되거나 유리 상태일 수 있다. 또한 키트는 TRT의 검출을 위한 분석에서 항체 또는 하이브리드화 프로브의 용도를 알려주는 지시 재료를 포함할 수도 있다. 이 키트는 라벨 검출이나 양성 및 음성 대조군의 표지화에 적당한 시약과, 세척 용액, 희석 완충액 등을 포함할 수 있다.
일양태에서, 키트는 hTRT mRNA를 증폭시키기 위한 프라이머 쌍을 포함한다. 이러한 키트는 hTRT 증폭된 DNA에 대한 프로브 및/또는 폴리머라제, 완충액, dNTP 등을 포함할 수 있다. 또한, 키트는 프로브, 임의적으로 표지된 프로브를 포함한다. 또, 키트는 항체를 포함한다.
X. 텔로머라제 활성 조절 인자의 확인
A. 개론
본 발명은 텔로머라제 또는 텔로머라제 성분(예, hTRT 단백질)의 활성 또는 발현을 조절하는 처리 및 화합물을 제공한다. 본 발명은 또한 텔로머라제 활성 또는 발현을 조절하는 처리 및 화합물을 확인하는 검색 방법(고처리율 검색) 및 분석법을 제공한다. 텔로머라제 활성 및 발현의 조절인자(이하 "조절 인자"라고 칭함)는 텔로머라제 작용 물질(텔로머라제 활성 및/또는 발현을 증가시키는 물질) 및 텔로머라제 길항 물질(텔로머라제 활성 및/또는 발현을 감소시키는 물질)를 포함한다.
본 발명의 조절인자는 광범위한 용도를 가진다. 예를 들어, 텔로머라제 조절인자는 인간 질병 치료에 효과적인 치료제이다. 세포중 텔로머라제 활성(텔로머라제 의존성 복제 능력 또는 "부분적" 텔로머라제 활성을 포함)을 증가시키는 조성물에 이용가능한 작용물질 활성 및 전사나 해독 활성인자를 검색한다. 작용 조성물은 유용한 단백질을 발현할 수 있는 세포를 비롯하여 정상적인 비형질전환 세포를 무한 증식시키는 방법을 위해 제공된다. 작용 물질은 세포 노쇠를 조절하는 방법을 위해서도 제공될 수 있다. 역으로, 말단소립 의존성 복제 능력을 감소시켜 암 세포와 같은 무한 증식 세포를 유한 증식화하는 조성물에 이용가능한 길항물질을 검색한다. 텔로머라제 활성을 감소시켜 암세포와 같은 비조절되는 세포 증식을 나타내 는 세포의 비제한적 세포 분열을 예방하는 조성물에 이용가능한 길항 물질 활성을 검색한다. 조절인자를 사용하여 치료할 수 있는 질병 및 증상의 예는 본원, 예컨대 상기 섹션 VII 및 IX에 설명되어 있다. 일반적으로, 본 발명의 조절 인자는 세포나 유기체에서 텔로머라제 활성을 증가 또는 감소시키고자 하는 경우 사용될 수 있다. 따라서, 질병 치료에 사용되는 것외에, hTRT 발현 농도를 증가시키는 조절인자는 상기 섹션 VIII에 일반적으로 설명된 특성과 당업자에게는 자명한 각종 용도를 가지는 배양된 인간 세포를 생성하는데 사용될 수 있다.
화합물 또는 치료제를 투여하여 텔로머라제 성분을 암호하는 유전자(예, hTRT mRNA 암호 유전자)의 전사 속도 또는 농도를 변화시키거나, 텔로머라제 성분 암호하는 RNA의 전사후 프로세싱(예, 이동, 접목, 폴리아데닐화 또는 기타 변형) 또는 안정성에 영향을 주거나, 암호된 단백질(예, hTRT)의 해독, 안정성, 전사후 프로세싱 또는 변형에 영향을 주거나, 또는 작용성(예, 촉매적으로 활성) 텔로머라제 RNP의 농도를 변화시키는 경우, 그 화합물 또는 치료제는 텔로머라제 또는 텔로머라제 성분의 "발현"을 조절한다. 화합물 또는 치료제를 투여하여 상기 섹션 IV(B)에 설명된 임의의 활성(예, 진행성 또는 비진행성 텔로머라제 촉매적 활성; 텔로머라제 가공성; 종래의 역전사 효소 활성; 뉴클레오티드 분해 활성; 핵분해 활성; 프라이머 또는 기질 결합 활성; dNTP 결합 활성; RNA 결합 활성; 텔로머라제 RNP 어셈블리; 및 단백질 결합 활성)과 같은 텔로머라제 활성을 변화시키는 경우, 화합물 또는 처리제는 텔로머라제 "활성"에 영향을 준다. "활성"의 변화와 "발현"의 변화의 차이에 대한 명확한 해석이 필요하지 않으며, 제한하기 위해서가 아니라 설명을 용이하게 하기 위해 이들 용어를 사용한 것임을 알 것이다. 본 발명의 조절 인자는, 예컨대 표적 세포를 비특이적으로 악화시키는 텔로머라제 성분의 발현을 감소시키기 보다는 텔로머라제 활성 또는 발현에 특이적으로 영향을 준다(일반적으로 액틴과 같은 하우스키핑 단백질의 발현을 변화시키지 않고).
B. 텔로머라제 조절인자의 확인 방법.
본 발명은 텔로머라제 또는 텔로머라제 성분의 발현에 영향을 주거나, 텔로머라제의 DNA 복제 능력을 변형시키거나 말단소립 DNA를 합성하는 텔로머라제 효소 및 TRT 단백질의 능력("완전 활성")을 변형시킬 수 있는 화합물 또는 조성물을 선별하는 방법 및 시약을 제공한다. 또한, 본 발명은 임의의 또는 전체 hTRT의 "부분 활성"의 조절인자에 대한 검색법을 제공한다. 따라서, 본 발명은, 예컨대 정상적으로 발현되지 않는 세포에서 텔로머라제 또는 hTRT 단백질이 발현되도록 하거나, 또는 텔로머라제 양성 세포내에서 텔로머라제 활성을 증가시켜 텔로머라제 활성을 증가시키는 제제에 대해 검색할 수 있는 분석법을 제공한다.
텔로머라제 또는 텔로머라제 서브유닛 단백질 또는 이의 촉매적 단편이나 면역원성 단편 또는 이의 올리고펩티드가 각종 약물 검색 기법에서 치료 화합물을 검색하는데 사용될 수 있다. 이 시험에서 사용된 단편은 용액중에 유리 상태이거나, 고체 지지체에 고정되거나, 세포 표면에 두거나, 또는 세포내에 위치할 수 있다. 텔로머라제 또는 서브유닛 단백질과 시험할 제제 사이의 결합 복합체 형성도 측정할 수 있다.
각종 양태에서, 본 발명은 효소의 활성 부위에 결합; 텔로머라제 또는 hTRT 단백질에 대한 RNA 성분, 텔로머라제 회합 단백질, 뉴클레오티드 또는 말단소립 DNA의 회합을 억제; 효소 복합체의 해리를 촉진; 텔로머라제 RNA 성분(예, hTR)의 전사를 저해; 또는 본원에 개시된 임의의 "부분 활성"을 억제하는 길항 물질에 대한 검색 방법을 포함한다. 본 발명은 hTRT와 핵산 및/또는 텔로머라제 회합 조성물의 회합, 예컨대 hTRT와 hTR의 회합, p80 또는 p95의 인간 상동 또는 기타 회합된 단백질과 hTRT의 회합, 말단소립 또는 뉴클레오티드와 hTRT의 회합을 억제하는 조성물을 검색; hTR 또는 hTRT에 대해 유도되는 항체와 같은 효소 복합체의 회합(즉, 어셈블리)을 촉진하거나 해리를 촉진하는 조성물 검색; 효소 가공성에 영향을 주는 제제 검색; 및 hTR에 상보적인 핵산과 같이 텔로머라제에 결합하는 핵산 및 기타 조성물 검색 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 hTRT 유전자의 전사 및/또는 hTRT 유전자 생성물의 해독을 증가 또는 감소시키는 조성물의 검색에 관한 것이다. 나아가, 본 발명의 일양태에서 동물, 예컨대 변이된 동물에서 텔로머라제 활성 또는 항텔로머라제 활성을 재구성하여 동물의 텔로머라제 조절 인자를 검색하는 방법을 제공한다. 본 발명은 "무력화" 모델을 포함하는 생체내 분석계를 제공하며, 이 계에서 내인성 텔로머라제, 텔로머라제 RNA 성분 및/또는 텔로머라제 결합 단백질의 하나 또는 수개 유니트가 결실되거나 또는 억제된다. 내인성 텔로머라제의 전체 또는 일부 활성은 남아있거나 존재하지 않을 수도 있다. 일양태에서, 외래 텔로머라제의 부분 또는 전체 활성은 재구성된다.
본 발명의 일양태에서, 각종 텔로머라제 부분 활성 분석법은 텔로머라제 활성 조절 인자의 각종 상이한 부류를 확인하기 위해 제공된다. 본 발명의 "부분 활 성" 분석법은 "전체 활성" 텔로머라제 분석에서 검출되지 않는 텔로머라제 활성 조절 인자의 부류를 확인하는데 사용될 수 있다. 부분적인 활성 분석은 TRT 및 텔로머라제의 비가공성 활성을 포함한다. 텔로머라제 가공 특성은 Morin의 문헌[(1989) Cell 59:521-529) Prowse(1993) "Identification of nonprocessive telomerase activity from mouse cells"Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1493-1497 에 설명되어 있다. 본 발명의 또 다른 부분 활성 분석법은 텔로머라제의 "역전사효소 유사" 활성을 이용한다. 이들 분석법에서는 hTRT 단백질의 역전사효소 활성을 분석한다. Lingner(1977) "Reverse transcriptase motifs in the catalytic subunit of telomerase" Science 276:561-567 참고. 또 다른 본 발명의 부분 활성 분석법은 프라이머의 3' 가닥으로부터 1개 이상의 뉴클레오티드, 특히 구아노신을 효소 제거하는 것을 포함하여 hTRT 및 텔로머라제의 "뉴클레오티드 분해 활성"을 이용한다. 뉴클레오티드 분해 활성은 Collins의 문헌[Collins (1993) "Tetrahymena telomerase catalyzes nucleolytic cleavage and nonprocessive elongation" Genes Dev 7:1364-1376]에 제시된 바와 같이 테트라하이메나 (Tetrahymena ) 텔로머라제에서 관찰된다. 본 발명의 또 다른 부분 활성 분석법은 효소 가공적 DNA 중합 활성의 일부로서 뉴클레오티드에 결합하는 hTRT 및 텔로머라제 능력을 분석하는 것을 포함한다. 또 다른 본 발명의 부분 활성 분석법은 말단소립 합성에 주형으로서 사용되는 RNA 성분, 즉 인간 세포에 대한 hTR에 결합하는 hTRT 또는 텔로머라제 활성을 분석하는 것을 포함한다. 본 발명의 추가적인 부분 활성 분석법은 생체내 염색체에 결합하거나, 재구성된 계에서 또는 시험관내에서 올리고뉴클레오티드 프라이머와 결 합하거나 또는 염색체 구조물과 회합하는 단백질(이러한 단백질의 예는 Harrington (1995) J.Biol.Chem. 270:8893-8901 참조)에 결합하는 hTRT 또는 텔로머라제 능력을 분석하는 것을 포함한다. hTRT에 결합하는 염색체 구조물로는, 예컨대 말단소립 반복 DNA, 말단소립 단백질, 히스톤, 핵 매트릭스 단백질, 세포 분열/세포 사이클 조절 단백질 등이 있다.
일양태에서, 조절 인자 동정 분석법은 1종 이상의 세포(즉, "시험 세포")와 시험 화합물을 접촉시키는 단계, 상기 시험 화합물이 세포내에서 텔로머라제(또는 텔로머라제 성분)의 발현이나 활성에 영향을 주는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일반적으로 결정 단계는 시험 화합물과 접촉되지 않은 유사 세포(들)(즉, 대조 세포)에 대하여 시험 세포에서의 활성과 발현을 비교하는 단계를 포함한다. 대안적으로, 세포 추출물은 완전한 세포 대신에 사용될 수 있다. 관련 양태에서, 시험 화합물은 다세포 유기체(예, 식물이나 동물)에 투여된다. 텔로머라제 또는 텔로머라제 성분은 세포 또는 다세포 유기체에 대해 전체적으로 내인성(즉, 자연 발생적인 내인성 유전자에 의해 암호됨)이거나, 1종 이상의 재조합 발현된 텔로머라제 성분(예, hTRT, hTR, 텔로머라제 회합 단백질)을 포함하는 재조합 세포 또는 돌연변이 유기체이거나, 또는 내인성 성분이나 재조합 성분을 모두 가질 수 있다. 따라서, 일양태에서 텔로머라제 활성 조절인자를 유한 증식 세포에 투여한다. 다른 양태에서, 텔로머라제 활성 조절인자는 무한 증식 세포에 투여된다. 예를 들어, 텔로머라제 매개 DNA 복제의 길항 물질은, 텔로머라제 활성의 유의적인 양을 나타내는 것으로 알려진 세포, 예컨대 암세포에 추정상의 억제 조성물을 투여하는 단계와, 텔로머라제 활성, 말단소립 길이 또는 증식 능력 감소(이것들은 모두 길항물질 활성을 가진 화합물의 지표임)가 관찰되는지 여부를 결정하는 단계를 통해 확인될 수 있다.
다른 양태에서, 조질인자는 TRT(예, hTRT) 및 주형 RNA(예, hTR)를 포함하는 리보뉴클레오단백질 복합체(RNP)의 텔로머라제 활성의 변화를 모니터링하여 확인하며, RNP는 시험관내에서 재구성된다(예, 하기 실시예 7에 개시됨).
또 다른 양태에서, 조절인자는 세포, 동물, 시험관내 발현계 또는 기타 발현계에서 TRT 유전자 생성물(예, RNA 또는 단백질)의 발현에 변화를 모니터링하여 확인한다.
다른 양태에서, 조절인자는 실시예 15에 개시된 바와 같이 리포터 유전자 발현을 변화시켜 확인하며, 유전자 발현은 프로모터 또는 인헨서와 같은 자연 발생적 TRT 조절 성분에 의해 전체적으로 또는 부분적으로 조절된다. 관련 양태에서, 텔로머라제 성분(예, hTRT), RNA, 또는 유전자 조절 서열(예, TRT 유전자 프로모터)에 결합하는 시험 화합물의 능력이 분석된다.
다른 양태에서, 조절인자는 hTRT 프리 mRNA 프로세싱의 변화, 예컨대 교대로 결찰된 생성물, 교대적 폴리아데닐화, RNA 절단 등을 관찰하여 확인한다. 관련 양태에서, 조절인자의 활성은 변형 hTRT 폴리펩티드의 생성을 모니터링하여 관찰할 수 있으며, 이중 일부는 주요 음성 텔로머라제 조절 활성을 보유한다.
단백질의 활성 및 발현에 영향을 주는 화합물을 확인하기 위한 분석 형태는 생물공학 및 약학 산업 분야에 잘 알려져 있으며, 다수의 추가 분석 및 전술한 예 시적 분석의 변형법이 당업자에게는 자명할 것이다.
텔로머라제 활성 또는 발현의 변화는 임의의 적절한 방법으로 측정될 수 있다. 텔로머라제 성분(예, hTRT 단백질) 또는 전구체(예, hTRT mRNA)의 발현 농도 변화는 당업계에 공지된 방법(이중 일부는 예컨대 센셕 IV에 전술되어 있음)을 사용하고, 하이브리드화(예, 본 발명의 TRT 프로브 및 프라이머 사용), 면역분석법(예, 본 발명의 항TRT 항체 사용), RNAse 보호 분석, 증폭 분석 또는 본원에 개시되거나 당업계에 공지된 임의의 적절한 검출 방법으로 TRT 유전자 생성물(예, 단백질 및 RNA)의 농도를 모니터링하여 분석할 수 있다. 시료중 핵산을 정량하는 것(예, RNA, 예컨대 hTR 또는 hTRT mRNA의 농도 평가)도 시스 전사 조절인자 또는 트랜스 전사 조절인자를 평가하는 데 유용하다.
유사하게, 텔로머라제 활성 변화는 전술한(예, 상기 섹션 IV(B)) 방법 또는 텔로머라제 기능에 관한 기타 분석법을 이용하여 측정할 수 있다. 텔로머라제 활성 정량은 필요한 경우 본원에 개시된 방법을 비롯한 임의의 방법으로 수행할 수 있다. 말단소립 구조 상실을 유발하거나 가속화할 수 있는 텔로머라제 길항물질은, 생체내, 생체외, 또는 시험관내 텔로머라제 활성에 대한 길항 물질의 효과; 말단소립 길이(태그된 하이브리드화 프로브나 기타 수단을 사용하여 염색을 통해 측정되거나 또는 검출됨)에 대한 길항물질의 효과; 또는 단순히 텔로머라제 양성암 세포의 세포 분열 억제(말단소립의 상당한 단축은 "위기" 또는 M2 노쇠라고 불리우는 현상을 유도하며(Shay, (1991) Biochem. Biophys. Acta 1072-:1-7), 암세포는 텔로머라제 활성화에 의해 저해되지만, 텔로머라제의 부재하에서는 염색체 결실과 재배 열을 통한 암세포의 노쇠 또는 사멸을 유도할 수 있음)를 모니터링하고 측정하여 확인할 수 있다. 생체내 인간의 텔로머라제 활성의 재구성은 임의 기원의 세포나 동물에서 텔로머라제 조절인자를 검색하는 방법을 제공한다. 길항물질은 말단소립의 길이 변화 측정을 비롯하여, 본 발명의 활성 분석에서 확인될 수 있다. 세포에서 텔로머라제 활성을 측정하는 분석법의 기타 예로는 말단소립 구조의 축적이나 상실에 대한 분석, TRAP 분석 또는 정량적 폴리머라제 연쇄 반응 분석이 있다.
일양태에서, 본 발명의 분석법은 시험 화합물이 결핍된 평행반응에서 도입된 표지의 상대적인 양과 비교하여 기질내로 도입된 표지된 뉴클레오티드의 양을 측정하여 시험 화합물이 텔로머라제 억제제인지를 결정하므로써 시험 화합물이 hTRT의 활성을 통계학적 유의 수준으로 감소시키는 방법을 포함한다.
본 발명의 방법은 과학 및 특허 문헌에 제시되고 당업계에 공지된 프로토콜에 따라 조정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 텔로머라제 또는 TRT 단백질이 텔로머라제 활성 조절 인자로서 작용하는 조성물을 확인하는데 사용되는 경우, 다수의 잠재적으로 유용한 분자를 단일 시험으로 검색할 수 있다. 조절인자는 텔로머라제 활성에 대한 억제(길항물질) 효과 또는 상승(작용물질) 효과를 가질 수 있다. 예를 들어, 1,000개 억제제 패널을 검색하는 경우, 1,000개 억제제를 모두 1개의 미량역가 웰내에 두어 동시에 시험할 수 있다. 이러한 억제제가 발견되면, 1,000 푸울을 100개씩 10개의 푸울로 나누고, 개별 억제제가 확인될 때까지 이 과정을 반복한다.
약물 검색에서, 다수의 성분을 텔로머라제 조절인자로서 작용하는 능력에 대 해 검사하며, 고처리율 검색 기술로 과정이 상당히 가속화되었다. 본원에 개시된 전체 또는 일부 텔로머라제 활성 분석은 고처리율 기술에 사용되도록 조정할 수 있다. 당업자들은 상기 용도를 달성하기 위한 각종 방법이 있음을 알 것이다.
텔로머라제 또는 텔로머라제 단백질 서브유닛에 대한 적절한 결합 친화성을 가지는 화합물의 고처리율 검색에 적용할 수 있는 약물 검색의 또 다른 기술은 Geysen의 "Determination of Amino Acid Sequence Antigenicity"(Geysen, WO 출원 84/03564, 1984년 9월 13일에 공고됨, 본원에서 참고로 인용함)에 상세히 설명되어 있다. 요약하면, 다수의 상이한 작은 펩티드 시험 화합물을 플라스틱 핀이나 일부 기타 표면과 같은 고체 기재상에서 합성한다. 펩티드 시험 화합물은 텔로머라제 단편 또는 텔로머라제 단백질 서브유닛과 반응시킨 후 세척한다. 이어서, 결합된 텔로머라제 또는 텔로머라제 단백질 서브유닛을 당업계에 공지된 방법으로 검출한다. 실질적으로 정제된 텔로머라제 또는 텔로머라제 단백질 서브유닛은 전술한 약물 검색 기술에 사용하기 위해 평판상에 직접 피복한다. 대안적으로, 비중화성 항체를 사용하여 펩티드를 포집하고 고체 지지체상에 고정할 수 있다.
또한, 본 발명은 텔로머라제 또는 서브유닛 단백질(들)에 결합할 수 있는 중화 항체가 텔로머라제 또는 서브유닛 단백질 결합에 대해 시험 화합물과 특이적으로 경쟁하는 경쟁적 약물 검색법의 용도에 관한 것이다. 항체는 텔로머라제 또는 서브유닛 단백질과 1종 이상의 항원성 결정인자를 공유하는 임의의 펩티드의 존재를 검출하는 데 사용될 수 있다.
텔로머라제 활성의 조절인자를 확인하기 위한 추가의 방법은, 본원에서 참고 로 인용한 미국 특허 제5,645,986호에 개시되어 있다. 본 발명은 hTRT 폴리뉴클레오티드, 프로브 및 프라이머, 고도로 정제된 hTR, hTRT 및 텔로머라제 뿐 아니라 항텔로머라제 및 항hTRT 항체와 같은 시약(이들 모두는 대조, 표준, 결합 또는 하이브리드화 제제 등으로서 분석에 사용될 수 있음)을 제공하여 이미 공지된 방법을 부분적으로 개선시킬 수 있음을 알 것이다.
본 발명의 재조합 생성된 텔로머라제 및 TRT(예, hTRT)는 조절인자 확인 분석에 유용하다. 검색 분석은 기존 활성의 증대에 의해 또는 완전하거나 부분적인 텔로머라제 활성 재구성에 의해 유도되는 텔로머라제 또는 hTRT를 이용할 수 있다. 본 발명에 의해 제공되는 분석 또는 검색법을 사용하여 텔로머라제가 말단소립 DNA를 합성하는 능력을 시험하거나 또는 hTRT 및 TRT의 "부분 활성"의 어느 하나 또는 전부를 전술한 바와 같이 시험할 수 있다. 분석법은 그 RNA 성분 또는 관련 단백질의 존재 여부에 상관 없이 텔로머라제를 발현시키도록 조작된 세포의 생체외 변형법을 포함하며, 이들 세포를 동물내로 재이식하여 생체내 시험에 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 생체내 분석법 및 거기에 유용한 돌연변이 동물을 제공한다. 이들 생체내 분석계는 내인성 텔로머라제 효소 복합체의 하나 또는 여러 개의 유니트가 고갈되거나 또는 저해된 "무력화" 세포 뿐만 아니라, 외래 또는 내인성 텔로머라제 활성이 재구성되거나 또는 활성화되는 세포를 이용할 수 있다.
텔로머라제 효소 또는 TRT 단백질의 임의의 또는 전체 기능을 변형 또는 결실시키기 위한 부위 특이적 방식(부위 특이적 돌연변이)으로 변형된 텔로머라제 및 TRT 단백질이 치료 유전자를 발견하기 위한 본 발명의 검색에 사용될 수도 있다. 예를 들어, TRT는 기질 DNA에 결합하는 능력, RNA 성분에 결합하는 능력(hTR로서), 말단소립 DNA의 첨가를 촉진하는 능력, 데옥시뉴클레오티드 기질에 결합하는 능력, 뉴클레오티드 분해 활성을 가지는 능력, 텔로머라제 회합 단백질이나 염색체 구조에 결합하는 능력 등을 상실하도록 유전자를 조작할 수 있다. 생성된 "돌연변이 단백질" 또는 "뮤틴스(muteens)"는 TRT 단백질 또는 텔로머라제의 하나, 수개 또는 전체 기능이나 활성을 특이적으로 조절하는 화합물을 확인하는 데 사용될 수 있다.
C. 예시적 텔로머라제 조절인자
1) 개론
전술한 시험 화합물은 광범위한 화합물, 즉 자연발생적 화합물과 합성 화합물, 유기화합물과 무기 화합물일 수 있으며, 중합체(예, 올리고펩티드, 폴리펩티드, 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드), 소분자, 항체(광범위하게는 본원에서 정의한 항체), 당, 지방산, 뉴클레오티드와 뉴클레오티드 유사체, 자연 발생 구조물의 유사체(예, 펩티드 모조물, 핵산 유사체 등) 및 다수의 기타 화합물을 포함한다.
본 발명은 작용의 특정 메카니즘에 구애받지 않고 모든 유형의 조절인자를 제공한다. 예시적 목적으로, 조절인자의 예로는 다음과 같은 화합물 또는 처리제를 포함한다.
(i) hTRT 폴리펩티드(예, 효소의 활성 부위) 또는 기타 텔로머라제 성분에 결합하여 텔로머라제 활성에 영향을 줄 수 있는 화합물 또는 처리제;
(ii) 텔로머라제 회합 단백질(예, 상기 섹션 IV(D)에 개시된 것들 포함)과 함께 또는 이로부터 텔로머라제 성분(예, hTRT 또는 hTRT-hTR RNP)의 회합을 억제 또는 촉진하거나, 해리를 억제 또는 촉진하는 화합물 또는 처리제;
(iii) 텔로머라제 RNA(예, hTR)와 함께 또는 이로부터 텔로머라제 폴리펩티드(예, hTRT)의 회합을 억제 또는 촉진하거나, 해리를 억제 또는 촉진하는 화합물 또는 처리제;
(iv) 염색체(예, 말단소립) 또는 염색체 DNA(예, 말단소립 DNA)와 함께 또는 이로부터 텔로머라제 폴리펩티드(예, hTRT)의 회합을 억제 또는 촉진하거나, 해리를 억제 또는 촉진하는 화합물 또는 처리제;
(v) 유전자 또는 유전자 생성물에 결합시켜(예컨대 hTRT 유전자 또는 또 다른 텔로머라제 성분의 전사에 영향을 주는 인자(예, 전사 조절 단백질)와 상호작용에 의해) TRT 유전자의 전사 속도 또는 전사율, 해독, 유전자 생성물의 이동 또는 안정성 등의 변화를 비롯하여 텔로머라제 성분 유전자 생성물(예, hTRT 유전자 생성물)의 발현을 증가시키거나 또는 감소시키는 화합물 또는 처리제.
2) 펩티드 조절인자
텔로머라제 활성의 가능한 조절인자는 펩티드(예, 억제성(길항물질) 및 활성화(작용물질) 펩티드 조절인자)를 포함한다. 예를 들어, 무작위적으로 생성된 서열을 가지는 올리고펩티드를 검색하여 텔로머라제 활성의 펩티드 조절인자(작용물질 또는 억제제)를 발견할 수 있다. 이러한 펩티드는 약물로서 직접 사용하거나, 또는 텔로머라제 활성을 억제할 수 있는 작용기의 방향 또는 위치를 결정하여 소분자 억제제를 고안 및 시험하거나 약리학적 유용성을 증가시키도록 골격을 화학 변형하는 데 사용될 수 있다. 펩티드는 구조적 모조물일 수 있으며, 텔로머라제 효소 및 hTRT 단백질의 특징적 2차 구조 및/또는 3차 구조를 기초로 모조물을 고안하는 분자 모델링 프로그램을 이용할 수 있다. 이러한 구조적 모조물은 텔로머라제 활성의 조절인자(길항물질 및 작용물질)로서 생체내에서 치료학적으로 이용될 수 있다. 구조적 모조물은 항텔로머라제 또는 항TRT 단백질 항체를 유발하는 면역원으로서 사용될 수 있다.
3) 텔로머라제 활성의 조절인자로서의 억제성 천연 화합물
또한, 다수의 이용가능한 활성 변형 화합물은 공급원 물질로서 천연 생성물로부터 얻은 추출물에서 검색할 수 있다. 추출물의 공급원은 진균류, 방선균, 조류(藻類), 곤충류, 원생동물, 식물 및 박테리아의 다수의 종으로부터 얻을 수 있다. 억제 활성을 나타내는 추출물을 분석하여 활성 분자를 분리할 수 있다. Turner(1996) J.Ethnopharmacol 51(1-3):39-43; Suh(1995) Anticancer Res. 15:233-239.
4) 억제성 올리고뉴클레오티드
본 발명에 의해 제공되는 특히 바람직한 한 가지 세트의 억제제는 기능성 TRT 단백질의 생산을 방해 또는 억제하는 경우에 hTRT 단백질을 암호화하는 mRNA에 결합하거나 또는 hTRT 유전자에 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명의 기타 올리고뉴클레오티드는 hTR과 같은 텔로머라제의 RNA 성분과 상호작용하거나 또는 텔로머라제 또는 hTRT가 그 DNA 표적에 결합하거나 또는 하나의 텔로머라제 성분이 다른 성분 또는 기재에 결합하는 것을 방지할 수 있다. 그러한 올 리고뉴클레오티드는 또한 텔로머라제 효소 또는 hTRT 단백질, 또는 이 단백질과 RNA 모두에 결합할 수 있고, 전술한 바와 같이 부분적 활성(예컨대, 처리 활성, 그 역전사 효소 활성, 그 뉴클레오티드 분해 활성 등)을 억제한다. 회합은 앱타머(aptamer)에서처럼 일반적인 결합에 의해 또는 또 다른 핵산에의 서열 특이적 하이브리드화를 통해 이루어질 수 있다.
텔로머라제 활성은 hTRT mRNA에 결합할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드로 hTRT mRNA를 표적화시켜 억제할 수 있다.
또 다른 유용한 부류의 억제제로는 hTRT mRNA 또는 hTR의 불활성화 또는 절단을 일으키는 올리고뉴클레오티드가 있다. 즉, 올리고뉴클레오티드는 화학적으로 변형되거나 또는 리보자임과 같은 절단을 일으키는 효소 활성을 가진 EDTA-연결된 올리고뉴클레오티드, 프소라렌과 같은 공유 결합된 올리고뉴클레오티드 또는 가교 시약이 결합된 올리고뉴클레오티드이다. 전술한 바와 같이, 목적하는 활성을 가진 것들에 대한 다수의 상이한 상기 올리고뉴클레오티드 집합체를 검색할 수 있다.
또 다른 유용한 부류의 억제제로는 폴리펩티드에 결합하는 올리고뉴클레오티드가 있다. 특이적 폴리펩티드 표적에 결합하는 2본쇄 또는 1본쇄 DNA 또는 1본쇄 RNA 분자는 "앱타머(aptamer)"로 불린다. 특이적 올리고뉴클레오티드-폴리펩티드 회합은 정전기적 상호작용에 의해 매개될 수 있다. 예컨대, 앱타머는 트롬빈상의 음이온 결합 엑소부위에 특이적으로 결합하는데, 이 때 트롬빈은 다가 음이온성 헤파린에 생리적으로 결합한다(Bock(1992) Nature 355:564-566). hTRT 단백질은 hTR 및 그 DNA 기질에 결합하고, 본 발명은 정제된 형태의 hTRT 및 기타 TRT 단백질을 다량으로 제공하기 때문에, 당업자는 본 발명의 방법을 사용하여 TRT-결합 앱타머를 용이하게 검출할 수 있다.
텔로머라제, hTRT, hTR 또는 이의 일부와 결합하는 올리고뉴클레오티드(예, RNA 올리고뉴클레오티드)는 SELEX의 기술을 사용하여 생성할 수 있다(Tuerk, 1997, Methods Mol Biol 67. 2190). 이 방법에서, 랜덤 서열 핵산의 매우 큰 푸울(106-109)을 표적 결합에 대한 높은 친화도와 낮은 친화도를 가지는 분자 사이에 많은 차이를 유발하는 조건을 사용하여 표적(예, hTRT)에 결합시킨다. 결합 분자는 비결합된 분자로부터 분리되고, 결합된 분자는 말단에 포함된 특이적 핵산 서열과 적절한 증폭시약으로 증폭된다. 이 과정은 상대적으로 작은 수의 분자가 표적에 대해 높은 결합 친화성을 보유할 때까지 수 회 반복한다. 이어서, 이 분자를 본원에 개시된 텔로머라제 활성 조절에 대해 검사할 수 있다.
텔로머라제가 매개하는 DNA 복제의 길항물질은 또한 리보자임을 통해서처럼 상보적 서열 인식 또는 절단을 통해 hTR(Norton(1996) Nature Biotechnology 14:615-619)의 저해에 기초할 수도 있다.
본 발명의 억제성 올리고뉴클레오티드는 당업계에 공지된 각종 기술을 사용하여 세포내로 전달될 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 특정 변형 없이 세포질내로 전달될 수 있다. 대안적으로, 즉 올리고뉴클레오티드에 직접적으로 또는 리포좀에 결합된 리간드를 사용하여 세포막과 융합하거나 또는 세포내흡입되며, 세포의 수용체와 결합하여 엔도사이토시스를 초래한다. 대안적으로, 숙주 세포의 손상 없이 세포내로 올리고뉴클레오티드의 이동을 증가시키도록 투과될 수 있다. DNA 결합 단백질, 예컨대 세포내로 올리고뉴클레오티드를 이동시키는 것으로 알려진 HBGF-1를 이용할 수 있다.
5) 억제성 리보자임
리보자임은 표적 RNA를 절단시키는 리보자임의 효소 부분에 아주 근접하여 있는 리보자임의 표적 RNA 결합 부위를 통해 표적 RNA에 결합하여 작용한다. 따라서, 리보자임은 일반적으로 상보적인 염기쌍을 통해 표적 RNA를 인식하고 결합하며, 일단 정확한 부위에 결합되면 효소적으로 표적 RNA를 절단하고 불활성화시키는 작용을 한다. 이러한 방식의 표적 RNA 절단은 절단이 암호 서열에서 발생하는 경우 암호된 단백질의 합성을 유도할 수 있는 능력을 손상시킨다. 리보자임은 RNA 표적에 결합되어 절단한 후, 통상 RNA로부터 방출되어 새로운 표적에 반복적으로 결합 하고 절단한다.
6) 조절인자로서 사용하기 위한 텔로머라제 회합 단백질의 동정
본 발명의 일양태에서, 텔로머라제는 텔로머라제 회합 단백질, 즉 텔로머라제 활성을 조절하거나 또는 보완하는 텔로머라제 부속 단백질을 동정하는 데 사용될 수 있다. 전술한 바와 같이, 이들 단백질 또는 이의 단편은 텔로머라제 효소 복합체의 해리를 유발하거나 결합을 방지하는 기능, 텔로머라제 복합체의 어셈블리를 방지하는 기능, hTRT가 핵산 보체 또는 DNA 주형에 결합하는 것을 방지하는 기능, hTRT가 뉴클레오티드에 결합하는 것을 방지하는 기능, 텔로머라제 효소나 hTRT 단백질의 부분 활성의 하나, 일부 또는 전체를 차단, 증대 또는 억제하는 기능을 조절할 수 있다.
당업자는 이들 텔로머라제 회합 단백질의 일부(예, 도메인)가 텔로머라제와 접촉하는 것을 확인하기 위해 본 발명의 방법을 이용할 수 있다. 본 발명의 일양태에서, 이들 텔로머라제 회합 단백질 또는 이의 단편은 텔로머라제 활성의 조절인자로서 사용된다.
7) 주요 음성 돌연변이로서의 텔로머라제 회합 단백질
본 발명의 일양태에서, 텔로머라제 회합 단백질은 텔로머라제 활성의 조절인자로서 사용된다. 텔로머라제 회합 단백질은 히스톤, 핵 매트릭스 단백질, 세포 분열 및 세포 사이클 조절 단백질 등의 염색체 구조물을 포함한다. 본 발명에 사용하기 위한 조절인자로서 사용될 수 있는 기타 텔로머라제 회합 단백질은 p80 및 p 95 단백질 및 이의 인간 유사체, 예컨대 TP1 및 TRF-1를 포함한다(Chong, 1995, Science 270:1663-1667). 또한, 이들 텔로머라제 회합 단백질의 단편은 본 발명의 방법에 따라 당업자가 확인할 수 있으며 텔로머라제 활성의 조절인자로서 사용될 수 있다.
8) 주요 음성 돌연변이
8개의 고도로 보존된 모티프가 전술한 바와 같이 상이한 비인간종의 TRT 사이에서 확인되었다(Lingner (1997) Science 276:561-567). 도 4는 에스.폼베 Trt1p, 유프로테스 p123 및 에스. 세레비지에 Est2p와 비교한 인간 TRT 아미노산 서열(pGRN121에서 얻음) 및 RT 모티프의 개략도를 제시한다. 본 발명은 모두 8개의 모티프 각각에서 보존된 아미노산 잔기가 단독으로 또는 1종 이상의 추가의 코돈과 함께 각각 기타 코돈으로 변화된 재조합 및 합성 핵산을 제공한다. 각종 생성 암호 서열은 비작용성 hTRT를 발현한다. 예를 들어 실시예 16 참고. 따라서, 본 발명은 예컨대 텔로머라제 부분적 활성을 가지나 전체 활성은 가지지 않는 광범위하게 "돌연변이된" 텔로머라제 효소 및 TRT 단백질을 제공한다. 예를 들어, 텔로머라제는 말단소립 구조를 결합시킬 수 있으나, 텔로머라제 회합 RNA(예, hTR)는 결합시키지 않는다. 충분히 높은 농도로 발현되는 경우, 텔로머라제 돌연변이는 필수적인 텔로머라제 성분(예, hTR)이 없으며 따라서 야생형 텔로머라제 활성의 억제제로서 작용한다. 이 방법에서 돌연변이된 텔로머라제의 작용은 길항작용 또는 소위 "주요-음성" 돌연변이라고 부른다.
9) 항체
일반적으로, 본 발명의 항체는 텔로머라제 효소 및 hTRT 단백질의 일부 또는 전체 활성을 확인, 정제 또는 억제하는 데 사용될 수 있다. 항체는 각종 방법, 예컨대 텔로머라제 복합체나 뉴클레오티드가 DNA 기질에 결합하는 것을 방지, 텔로머라제 성분이 활성 복합체를 형성하는 것을 방지, 기능적(텔로머라제 복합체) 4차 구조를 유지 또는 효소의 활성 부위나 활성에 대한 알로스테릭 효과를 가지는 기타 부위(텔로머라제의 상이한 부분적 활성은 본 명세서에 상세히 설명되어 있다) 중 어느 하나에 결합하여 텔로머라제 활성의 길항물질로서 작용할 수 있다.
D) 조절인자 합성
본 발명의 텔로머라제 조절인자는 조합 방법 및 합리적인 약물 고안 기술을 비롯하여 약학 분야에 공지된 방법을 사용하여 제조된다.
1) 조합 화학 방법론
합성 분자의 거대 라이브러리를 만들어 동시에 검색하는 것은 조합 화학 분야에 널리 공지된 기술을 사용하여 수행할 수 있다. 예컨대 Breemen(1997) Anal Chem 69:2159-2164; Lam(1997) Anticancer Drug Des 12:145-167(1997) 참고.
전술한 바와 같이 조합 화학 방법론은 본 발명의 TRT 단백질과 같은 임의의 표적에 대한 적절한 결합 친화도와 특이성을 가지는 특이적 올리고뉴클레오티드(또는 화합물)에 대해 신속하게 검색할 수 있는 방대한 수의 올리고뉴클레오티드(또는 화합물)를 형성하는 데 사용될 수 있다(일반적으로 기본적인 정보는 Gold(1995) J. of Biol.Chem. 270:13581-13584).
2) 합리적인 약물 고안법
합리적인 약물 고안법은 표적 분자의 구조적 분석, 합성 화학물 및 진보된 컴퓨터 도구를 포함하는 통합된 방법론 세트를 포함한다. 조절인자, 예컨대 텔로머라제 효소 및 hTRT 단백질과 같은 단백질 표적의 길항물질/억제제를 고안하는 데 사용되는 경우, 합리적인 약물 고안의 목적은 분자의 3차원적 모양 및 화학을 이해하는 것이다. 합리적인 약물 고안에 있어 X-선 결정사진 자료 또는 NMR 자료가 도움이 되며, 본 발명에 의해 제공되는 시약을 사용하고 방법에 따라 hTRT 단백질 및 텔로머라제 활성에 대해 결정할 수 있다. 정전기, 소수성 및 용매 접근도를 고려하여 계산하면 도움이 된다. 예컨대 Coldren(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:6635-6640 참조.
E) 키트
또한 본 발명은 시험 화합물이 TRT 활성의 조절인자인지를 결정하는 것을 보 조하는 데 사용될 수 있는 키트를 제공한다. 키트는 통상 1종 이상의 다음 성분, 즉 거의 정제된 TRT 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드(프로브 및 프라이머 포함); 세포 또는 무세포 발현계내로 도입되는 경우 TRT(예, hTRT)를 발현하는 플라스미드; 세포 또는 세포주; TRT 활성중의 변화를 검출하기 위한 조성물; 및 TRT 활성에 변화를 검출하고 측정하기 위한 수단을 제공하는 지시 재료(시험 화합물의 존재하에 텔로머라제 활성의 변화는 시험 화합물이 텔로머라제 활성을 조절하는 지시자임을 나타냄)와, 하나 이상의 용기를 포함한다. 키트는 정량적 폴리머라제 연쇄 반응 분석에 대한 TRAP 분석 시약(들)과 같은 수단을 포함하여 TRT 활성의 변화를 측정할 수 있다. 또한 키트는 TRT 활성에 변화를 검출 및 측정하는 수단을 제공하는 지시 재료를 포함할 수 있으며, 이는 시험 화합물의 존재하에 텔로머라제 활성 변화가 시험 화합물이 텔로머라제 활성을 조절하는 지시자임을 나타내는 것이다.
XI. 돌연변이 유기체(텔로머라제 무력화 세포 및 동물 모델)
본 발명은 또한 외래 TRT 유전자 서열을 포함하는 돌연변이된 비인간 다세포 유기체(예, 식물이나 인간외의 동물) 또는 단세포 유기체(예, 효모)를 제공하며, 상기 외래 유전자는 암호 서열 또는 조절(예, 프로모터) 서열일 수 있다. 일양태로서, 유기체는 인간의 TRT 단백질의 서열을 가지는 외래 TRT 폴리펩티드를 발현한다. 관련 양태에서, 유기체는 텔로머라제 RNA 성분(예, hTR)을 발현할 수도 있다.
또한 본 발명은 1종 이상의 텔로머라제 성분(예, TRT 또는 TR) 또는 텔로머라제 결합 단백질을 암호하는 하나 이상의 유전자가 변이되거나 결실되어(즉, 암호 또는 조절 영역에서) 천연 텔로머라제가 발현되지 않거나 또는 야생형 세포나 유기 체와 비교했을 때 상이한 활성 또는 감소된 농도에서 발현되는 단세포 및 다세포 유기체(또는 이로부터 얻은 세포)를 제공한다. 이와 같은 세포 및 유기체는 종종 "유전자 무력화" 세포 또는 유기체라고 부른다.
또한, 본 발명은 외래 텔로머라제 유전자(예, 쥐 TRT)가 존재하거나 또는 임의적으로 변이되거나 결실되고, 외래 텔로머라제 유전자 또는 변형체(예, 인간 TRT)가 도입되거나 발현되는 세포 또는 유기체를 제공한다. 이러한 유형의 세포와 유기체는 예컨대 hTRT 활성 또는 발현의 조절인자 동정; 텔로머라제 성분 유전자에서 돌연변이 효과 결정 및 텔로머라제 활성의 발육 타이밍 및 조직 위치 결정과 같은 기타 용도(예, 텔로머라제 조절인자 투여시 평가, 임의의 가능한 부작용 평가)를 위해 모델 시스템으로서 유용하다.
다세포 유기체의 예로는 식물, 곤충 및 인간이외의 동물, 예컨대 마우스, 래트, 토끼, 원숭이, 유인류, 돼지 및 기타 비인간 포유류가 있다. 단세포 유기체의 예는 효모이다.
특정 유전자(예, 내인성 TRT 유전자)를 변경 및 파괴시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. Baudin et al., 1993, Nucl.Acids Res. 21:3329; Wach et al., 1994, Yeast 10:1793; Rothstein, 1991, Methods Enzymol . 194:281; Anderson, 1995, Methods Cell Biol . 48:31; Pettitt et al., 1996, Development 122:4149-4157; Ramirez-Solis et al., 1993, Methods Enzymol . 225:855; 및 Thomas et al., 1987, Cell 51: 503 참고. 각 문헌은 본원에서 참고로 인용하였다.
본 발명의 "무력화" 세포 및 동물은 내인성 텔로머라제 효소 복합체의 하나 또는 수개 유니트가 결실되거나 억제된 세포 및 동물을 포함한다. 텔로머라제 활성의 재구성은 세포나 동물이 노쇠되지 않게 하거나, 암세포의 경우 말단소립을 유지하는 무능력에 의해 세포를 사멸시킨다. 내인성 유전자 발현을 변경하는 방법이 당업계에 알려져 있다. 통상, 이러한 방법은 조절하고자 하는 특정 유전자의 발현을 조절하는 조절 서열의 전체 또는 일부를 변경하거나 대체하는 것을 포함한다. 조절 서열, 예컨대 천연 프로모터가 변경될 수 있다. 유전자의 표적화된 변이에 대한 종래의 방법은 해당 유전자를 포함하는 게놈 DNA 단편을 벡터내에 놓은 후 티미딘 키나아제를 함유하는 벡터내에 선택성 네오마이신 내성 카세트 주위의 표적된 유전자와 관련이 있는 2개의 게놈 팔을 클로닝한다. 이어서, 이 "무력화" 작제물을 적절한 숙주 세포, 즉 마우스 배아 간(ES)세포내로 형질감염시키고, 양성 선별(G418, 예컨대 네오마이신 내성을 선별하기 위해)과 음성 선별(예컨대 FIAU를 사용하여 티미딘 키나아제 결핍 세포를 배제함)을 차례로 수행하여 무력화 벡터와 동종 재조합을 진행하는 세포를 선별할 수 있다. 이 접근법은 대상 유전자를 불활성화시킨다. 미국 특허 5,464,764; 5,631,153; 5,487,992; 및 5,627,059 참고.
내인성 유전자의 "무력화" 발현은 동종 재조합을 사용하여 해당 유전자의 조절 서열(예, 프로모터)내로 이종 핵산을 도입하여 수행할 수 있다. 기능 효소 또는 생성물의 발현을 방지하기 위해서, 프로모터를 파괴하거나 리딩 프레임을 변경하는 단순한 돌연변이가 적절할 수 있다. 발현 조절을 향상시키기 위해서, 천연 프로모터는 더 높은 전사율을 유도하는 이종 프로모터를 사용하여 구성할 수 있다. 또한, "유전자 트랩 삽입"은 숙주 유전자를 파괴하는 데 사용될 수 있으며, 마우스 ES 세 포는 예컨대 문헌[Holzschu (1997) Transgenic Res 6:97-106]에 개시된 바와 같이 무력화 돌연변이 동물을 생성하는 데 사용할 수 있다.
대상 구조 유전자를 포함하는 핵산 서열을 사용하여 동종 재조합에 의한 내인성 유전자의 발현을 변경시킬 수 있다. 업스트림 서열은 이종 재조합 작제물을 표적하는 데 이용된다. 서열 번호 1과 같은 TRT 구조 유전자 서열 정보를 이용하여, 당업자들은 일상적인 실험으로 동종 재조합 작제물을 형성할 수 있다. 내인성 유전자 발현을 변경하는 동종 재조합은 미국 특허 5,272,071 및 WO 91/09955, WO 93/09222, WO 96/29411, WO 95/31560, 및 WO 91/12650에 설명되어 있다. 마이코박테리아에서의 동종 재조합은 문헌[Azad(1996) Proc.Natl.Acad.Sci . USA 93:4787; Baulard(1996) J.Bacteriol. 178:3091; 및 Pelicic (1996) Mol.Microbiol . 20:919]에 설명되어 있다. 동물에서의 동종 재조합은 Moynahan의 문헌[(1996) Hum.Mol. Genet. 5:875]에, 식물에서의 동종 재조합은 Offringa 문헌[(1990) EMBO J. 9:3077]에 개시되어 있다.
XII. 용어 해설
하기의 용어 설명은 본 발명을 실시하는 데 있어 당업자에게 추가적인 안내를 제공하기 위한 것이다: 보조제, 대립유전자(및 대립유전자 서열), 아미노산(소수성, 극성, 하전된 것 포함), 보존적 치환, 조절 인자(및 조절 서열), 유도체화된, 검출가능한 표지, 상승된 농도, 에피토프, 바람직한 예후 및 바람직하지 않은 예후, 융합 단백질, 유전자 생성물, hTR, 무한 증식, 면역원 및 면역원성, 분리된, 조절인자, 모티프, 핵산(및 폴리뉴클레오티드), 올리고뉴클레오티드(및 올리고머), 작동가능하게 결합된, 폴리펩티드, 프로브(핵산 프로브 및 항체 프로브 포함), 재조합체, 선별 시스템, 서열, 특이적 결합, 엄중 하이브리드화 조건(및 엄중도), 실질적인 동일성(및 실질적인 유사성), 실질적으로 순수한(및 실질적으로 정제된), 텔로머라제 음성 세포와 텔로머라제 양성 세포, 텔로머라제 촉매적 활성, 텔로머라제 관련 및 시험 화합물.
"보조제"란 이와 혼합되는 항원에 대한 면역 응답을 증가시키는 임의의 물질을 의미한다. 본 발명에 유용한 보조제로는 수산화 알루미늄과 같은 프로인트 무기 겔과, 리소레시틴, 플루론 폴리올, 다가음이온, 펩티드, 오일 에멀션, 키홀 림펫 헤모시아닌 및 디니트로페놀과 같은 표면 활성 물질을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. BCG(Bacillus Calmette-Guerin) 및 코리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum )은 유용한 보조제이다.
"대립유전자" 또는 "대립유전자 서열"은 핵산 서열(즉, hTRT 단백질 암호 핵산)의 대체 형태를 의미한다. 대립 유전자는 돌연변이(즉, 핵산 서열의 변화)로부터 생기며, 일반적으로 구조 및/또는 기능이 변경될 수 있거나 또는 없을 수 있는 변경 및/또는 상이하게 조절된 mRNA 또는 폴리펩티드를 생성한다. 대립유전자를 발생시키는 일반 돌연변이 변화는 암호된 아미노산에 영향을 주거나 또는 주지 않을 수도 있는 자연적인 뉴클레오티드의 결실, 첨가 또는 치환에 의한 것이다. 각각 이들 유형의 변화는 주어진 유전자, 염색체 또는 세포 핵산내에서 단독으로 또는 기타의 것과 함께 1회 이상 발생할 수 있다. 임의의 주어진 유전자는 대립유전자가 없거나, 1개 또는 다수의 대립유전자 형태를 가질 수 있다. "대립유전자"는 유전자 로부터 전사된 mRNA나 유전자, 또는 둘다를 의미한다.
"아미노산"은 표준 1문자 코드를 사용하여 명기한다: 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 아르기닌(R), 리신(K), 이소로이신(I), 로이신(L), 메티오닌(M), 발린(V), 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W), 프롤린(P), 글리신(G), 히스티딘(H), 시스테인(C). 합성 및 비자연발생적 아미노산 유사체(및/또는 펩티드 결합)을 포함한다.
"소수성 아미노산"은 A, L, I, V, P, F, W 및 M을 의미한다. "극성 아미노산"은 G, S, T, Y, C, N 및 Q를 의미한다. "하전된 아미노산"은 D, E, H, K 및 R을 의미한다.
"보존적 치환"은 단백질의 활성을 거의 변화시키지 않는 단백질의 아미노산 조성의 변화를 의미한다. 따라서, 특정 아미노산 서열의 "보존적 수사 변이체"는 단백질 활성에 중요하지 않은 아미노산들의 아미노산 치환, 또는 유사한 특성(예, 산성, 염기성, 양으로 하전된, 음으로 하전된, 극성 또는 비극성 등)을 가진 다른 아미노산에 의한 아미노산 치환을 포함하며, 여기서의 치환은 심지어 중요한 아미노산 치환이 활성을 거의 변화시키지 않는 것을 포함한다. 작용적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환표는 당업계에 잘 알려져 있다. 다음의 6개 군은 각각 서로에 대해 보존적인 치환인 아미노산을 포함한다: 1) 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T); 2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E); 3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q); 4) 아르기닌(R), 리신(K); 5) 이소로이신(I), 로이신(L), 메티오닌(M), 발린(V); 및 6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W)(문헌[Creighton (1984) Proteins , W.H. Freeman and Company] 참조). 당업자는 상기 명시한 치환은 유일하게 가능한 보존적 치환인 것은 아님을 이해할 것이다. 예를 들면, 일부 목적의 경우, 모든 하전된 아미노산은 이들이 양전하이건 또는 음전하이건 간에 서로에 대한 보존적 치환으로 간주할 수 있다. 또한, 암호화된 서열에서 아미노산의 작은 비율 또는 단일의 아미노산을 변경, 첨가 또는 삭제하는 개개의 치환, 결실 또는 첨가 역시 "보존적으로 변형된 변이"로 간주될 수도 있다. 재조합 단백질에서 "보존성 치환"은 또한 천연 또는 야생형 유전자가 사용되는 코돈과는 상이한 하나 이상의 코돈을 이용하여 만든다. 여기서, 보존성 치환은 아미노산에 대한 코돈을 동일한 아미노산에 대한 상이한 코돈으로 치환하는 것을 포함한다.
"대조 성분" 또는 "조절 서열"은 인헨서, 프로모터, 전사 종결인자, 복제기원, 염색체 통합 서열, 5' 및 3' 비해독 영역을 포함하며, 단백질 또는 기타 생체분자는 상호작용하여 전사 및 해독한다. 진핵 세포의 경우, 대조 서열이 프로모터 및 바람직하게는 인헨서, 예컨대 면역글로불린 유전자, SV40, 시토메갈로바이러스 및 폴리아데닐화 서열에서 유래된 것들을 포함하며, 접목 공여자 및 수용체 서열을 포함할 수도 있다. 사용한 벡터계 및 숙주에 따라, 구성형 프로모터 및 유도형 프로모터를 비롯하여 임의 수의 적절한 전사 및 해독 인자를 사용할 수 있다.
"유도체화된" 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 또는 핵산은 유도체화된 치환을 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 일부 양태에서, 치환은 상보적인 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화하는 것을 거의 저해하 지 않는다. 추가된 화학 치환체로 변형시킨 유도체화된 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드(예, 이미 합성된 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 변형시켜, 또는 합성과정에서 변형된 염기 또는 골격 유사체를 도입하여 유도됨)는 국부 DNA, RNA 또는 단백질에 대해 변경 또는 화학적 변형을 형성한 경우 hTRT DNA, RNA 또는 단백질과 하이브리드화하여 대사적으로 활성인 진핵 세포내로 도입될 수 있다. 대안적으로, 유도체화된 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드는 hTRT 폴리펩티드, 텔로머라제 회합 단백질 또는 hTRT DNA 또는 hTRT 유전자 생성물과 상호작용하거나 hTRT DNA, RNA 또는 단백질의 발현이나 기능을 변경 또는 조절하는 기타 인자와 상호작용하고 이를 변경할 수 있다. 예시적인 결합된 화학 치환체로는 유로피움(III) 텍사피린, 가교제, 프솔라렌, 금속 킬레이트제(예, 철 촉매된 절단에 대한 철/EDTA 킬레이트), 토포이소머라제, 엔도뉴클레아제, 엑소뉴클레아제, 리가아제, 포스포디에스터라제, 광역학적 포피린, 화학치료 약물(예, 아드리아마이신, 독시루비신), 삽입제, 염기변형제, 면역글로불린 쇄 및 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 철/EDTA 킬레이트는 폴리뉴클레오티드 서열의 국부 절단이 바람직한 경우 사용되는 화학적 치환제이다(Hertzberg et al., 1982, J.Am.Chem.Soc. 104:313; Hertzberg and Dervan, 1984, Biochemistry 23:3934; Taylor et al., 1984, Tetrahedron 40:457; Dervan, 1986, Science 232:464). 예시적인 결합 화학물은 직접 결합, 예컨대 첨가된 반응성 아미노기(Corey and Schultz(1988) Science 238:1401, 참고로 인용함)를 통한 결합 및 기타 직접적인 결합 화학물을 포함하지만, 스트렙타비딘/바이오틴 및 디곡시게닌/항-디곡시게닌 항체 결합 방법을 사용할 수 있다. 결합 화학 치환을 위한 방법은 미국 특허 5,135,720, 5,093,245 및 5,055,556에 제시되어 있으며, 본원에서는 참고로 인용하였다. 기타 결합 화학도 당업자의 판단에 따라 사용할 수 있다.
"검출가능한 라벨"은 당업계에서 사용되는 일반적인 의미로서, 원자(예, 방사핵종), 분자(예, 플루오레세인) 또는 복합체를 의미하며, 분자의 존재를 알리거나 검출(예, 물리적 또는 화학적 특성에 의해)하는 데 사용돨 수 있으며, 공유적으로 결합되거나 또는 그 외의 방법으로 결합된 다른 분자를 결합시킬 수 있다. 또한 "라벨"은 검출가능한 원자, 분자 또는 복합체를 형성하는 기질상에서 작용하는 공유적으로 결합된 분자 또는 그 외의 방법으로 회합된 분자(예, 효소와 같은 생체 분자)를 의미한다. 본 발명에 사용하기 적절한 검출가능한 표지는 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 전기적, 광학적 또는 화학적 수단에 의해서 검출 가능한 조성물을 의미한다. 본 발명에 유용한 라벨은 표지된 스트렙타비딘 접합체를 염색하기 위한 비오틴, 자석 비이드(예, DynabeadsTM ), 형광염료(예, 플루오레세인, 텍사스 레드, 로다민, 녹색 형광 단백질, 보강된 녹색 형광 단백질, 리싸민, 피코에리트린, Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, FluorX[아머샴], SyBR 그린 I & II 몰리큘라 프로브스] 등), 방사능표지(예, 3 H, 125 I, 35 S, 14 C 또는 32 P), 효소(예, 하이드롤라제, 특히 포스파타제, 예컨대 알카리 포스파타제, 에스테라제 및 글리코시다제, 또는 옥시도리덕타제, 특히 양고추냉이 퍼옥시다제와 같은 퍼옥시다제 및 ELISA에 통상 사용되는 기타의 것), 기질, 보조인자, 억제제, 화학발광 기, 발색제 및 비색 표지, 예컨대 콜로이드성 금 또는 착색된 유리나 플라스틱(예, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 라텍스 등) 비이드를 포함한다. 라벨의 용도를 제시하는 특허는 미국 특허 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,227,437; 4,275,149; 및 4,366,241을 포함한다. 라벨을 검출하는 수단은 당업계에 공지되어 있다. 따라서, 예컨대, 방사능 라벨과 화학발광 라벨은 사진 필름 또는 신틸레이션 계수기를 사용하여 검출할 수 있으며, 형광 마커는 방출된 빛을 감지하는 광검출기를 사용하여 검출할 수 있다(예, 형광 활성화된 세포 분류기에서). 통상 효소 라벨은 기질과 효소를 제공하고 기질상에서 효소의 작용에 의해 생성되는 반응 생성물을 감지하므로써 검출되며, 비색 라벨은 착색된 라벨을 단순히 가시화하여 검출된다. 따라서, 라벨은 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 전기적, 광학적 또는 화학적 수단으로 검출가능한 임의의 조성물이다. 라벨은 당업계에 공지된 방법으로 분석중 원하는 성분에 직접 또는 간접적으로 커플링시킬 수 있다. 비방사능 라벨을 종종 수단에 간접적으로 부착시킨다. 일반적으로, 리간드 분자(예, 비오틴)는 분자에 공유적으로 결합한다. 그 후 리간드는 검출가능한 효소, 형광 화합물 또는 화학발광 화합물과 같이 시그널 형성계에 공유적으로 결합되거나 또는 처음부터 검출가능하게 결합된 항리간드(예, 스트렙타비딘) 분자에 결합한다. 다수의 리간드 및 항리간드를 사용할 수 있다. 리간드는 천연 항리간드, 예컨대 비오틴, 티록신 및 코르티졸을 가지는 경우, 표지된 자연발생적 항리간드와 함께 사용할 수 있다. 대안적으로, 임의의 합텐 화합물 또는 항원 화합물을 항체와 함께 사용할 수도 있다. 라벨 검출 수단은 당업자들에게 공지되어 있다. 따라서, 예컨대 라벨이 방사능 라벨인 경우, 검출 수단은 신틸레이션 계수기, 자가 방사능사진과 같은 광사진 필름, 또는 저장 포스포 영상화를 포함한다. 라벨이 형광 라벨인 경우, 적절한 광 파장을 가진 플루오로크롬을 들뜬 상태로 하고 생성된 형광을 감지하여 검출될 수 있다. 형광은 광사진 필름에 의해 전하 커플된 장치(CCD) 또는 광전자증배기 등과 같은 전기적 검출기를 사용하여 가시적으로 검출할 수 있다. 유사하게, 효소 라벨은 효소에 대한 적절한 기질을 제공하고 형성된 반응 생성물을 감지하여 검출할 수 있다. 또한, 단순 비색 라벨은 라벨과 관련된 색상을 관찰하여 검출할 수 있다. 형광단 쌍이 분석에 사용되는 경우, 쉽게 구별할 수 있도록 구별된 방출 패턴(파장)을 가지는 것이 종종 바람직하다.
"상승된 농도"는 기준 표준물에서의 농도보다 높거나 상승되어 있는 세포에서의 hTRT 유전자 생성물(또는 특정 물질이나 활성)의 양을 의미하며, 예컨대 진단의 경우 그 농도는 증상이 없는 개체(들)의 정상, 텔로머라제 음성 세포 중의 농도이며, 예후 추정의 경우 농도는 예컨대 종양의 각종 등급과 부류의 종양 세포 중의 농도이다.
"에피토프"는 항체가 인식하는 항원상의 부위를 의미한다. 에피토프는 통상 전체 단백질의 작은 부분인 아미노산 분절이다. 에피토프는 입체적일 수 있다(즉, 불연속적). 즉, 단백질 중첩에 의해 병치된 1차 서열의 비인접 부분이 암호하는 아미노산으로부터 형성될 수 있다.
"바람직한 예후" 및 "바람직하지 않은 예후"가 당업계에 알려져 있다. 암에서, "바람직한 예후"는 바람직하지 않은 예후를 가지는 환자와 비교하여 바람직한 예후를 가지는 환자의 경우 생존 시간이 더 길고 종양이 퇴화될 가능성이 있음을 의미하는 반면, "바람직하지 않은 예후"는 종양이 더 공격적이 될 것 같은, 즉 더 빨리 증식하고/또는 전이되어 환자에게 좋지 않은 결과와 더욱 급속한 질병 진행 경과를 생성하는 것을 의미한다.
"융합 단백질"은 단일 아미노산 서열에서 함께 정상적으로 융합되지 않는 2개의 구별된 이종 폴리펩티드로 만들어진 복합 단백질, 즉 단일 인접 아미노산 서열을 의미한다. 따라서, 융합 단백질은 2개의 유사하거나 동일한 폴리펩티드 서열 또는 2개의 전체적으로 구별되는 아미노산 서열을 포함하는 단일 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 단 이들 서열은 자연에서 발견되는 단일 아미노산 서열에서 동일한 구조로 함께 정상적으로는 함께 발견되지 않는다. 융합 단백질은 일반적으로 재조합 핵산 방법을 사용하여, 즉 재조합 유전자 융합 생성물(융합은 본 발명의 폴리펩티드를 암호하는 분절과 이종 단백질을 암호하는 분절을 포함함)의 전사 또는 해독의 결과로서 제조하거나, 또는 당업계에 공지된 화학적 합성 방법으로 제조할 수 있다. 융합 단백질의 비hTRT 영역은 hTRT 폴리펩티드의 아미노 말단 또는 카르복실 말단 또는 둘 모두에 융합되거나, 또는 비hTRT 영역은 단백질 서열의 내부로 삽입되거나(아미노산 대체 또는 부분 삽입에 의해) 또는 전술한 것들을 조합하여 융합시킬 수 있다.
"유전자 생성물"은 유전자로부터 전사된 RNA 분자, 또는 유전자가 암호하는 단백질 또는 RNA로부터 해독된 단백질을 의미한다.
"hTR"(인간 텔로머라제 RNA)는 인간의 텔로머라제의 RNA 성분과 임의의 자연 발생적인 대립유전자 및 변형체 또는 재조합 변형체를 의미한다. hTRT는 미국 특허 제5,583,016에 개시되어 있으며, 전체를 참고로 인용하였다.
"무한 증식"은 텔로머라제 분야에서의 일반적인 의미를 가지며, 비제한적 복제 가능성을 가진 세포를 의미한다. 무한 증식은 변형되지 않은 대응세포에 비하여 증식 능력이 증가된 세포를 말한다. 무한 증식 인간 세포의 예는 악성 종양 세포, 배선 세포, 및 시험관내에서 배양된 특정 형질전환된 인간 세포주(예, 바이러스 종양 유전자 등에 의해 형질전환된 후 무한 증식되는 세포)가 있다. 대조적으로, 대부분의 정상 인간 체세포는 유한증식, 즉 한정된 수의 세포 분열후 노쇠되고 제한된 복제 능력을 가지는 세포이다.
"면역원" 및 "면역원성"은 당업계에서 사용하는 일반적인 의미, 즉 면역원은 단백질 또는 기타 항원과 같이 동물 또는 사람에게 주입하여 적응성 면역 응답을 유도할 수 있는 분자를 의미한다.
"분리된"은, 예컨대 RNP(예, 1종 이상의 단백질 및 1종 이상의 RNA)와 같은 분자 또는 조성물의 경우, 생체내에서 회합하거나 자연발생적인 상태로 존재하는 단백질, 기타 RNA 또는 기타 오염 성분 등의 1종 이상의 기타 성분으로부터 분자나 조성물을 분리하는 것을 의미한다. 따라서, RNP가 세포 추출물에서와 같이 예컨대 세포막과 자연발생적으로 결합하는 임의의 기타 성분으로부터 분리되는 경우, RNP는 분리된 것으로 간주한다.
"조절인자"는 텔로머라제 역전사 효소(TRT)의 "전체" 또는 임의의 "부분 활성", 또는 둘 모두를 임의의 방식으로 변화시킬 수 있는 합성이나 천연 화합물 또 는 조성물을 의미한다. 조절인자는 작용물질 또는 길항물질일 수 있다. 조절인자는, 예컨대 이에 국한되는 것은 아니지만 소분자, 펩티드, 단백질, 당, 핵산, 지방산 등을 비롯하여 임의의 유기 화합물 및 무기 화합물일 수 있다.
"모티프"는 소정의 부류 또는 유형의 모든 단백질에 공통이거나 보존되는 단백질의 구조 또는 특성을 나타내는 인접 아미노산의 서열(또는 인접 아미노산 서열을 암호하는 핵산 서열)을 의미한다. 모티프 또는 공통 서열은 보존 잔기 및 비보존 잔기를 모두 포함할 수 있다. 모티프 서열내의 보존 잔기는 보존 잔기 또는 부류(즉, 소수성, 극성, 비극성, 또는 기타 부류)의 잔기는 통상 모티프에 의해 규정되는 단백질 부류 중 각 단백질(또는 유전자 또는 mRNA)에서 지정 위치에 존재한다. 모티프는 단백질의 부류에 따라 다르다. 따라서, 예컨대 역전사 효소는 1종 이상의 모티프에 의해 규정될 수 있는 단백질의 부류를 형성하며, 이 부류는 텔로머라제 효소를 포함한다. 그러나, 텔로머라제 활성은 그 부류의 모티프 특성을 가지는 효소 부류로서 정의될 수 있다. 당업자라면 모티프에서 보존 잔기로서의 잔기를 확인하는 것은 모티프에 의해 규정되는 부류의 모든 구성원이 지정 위치에 지정 잔기를 가지는 것을 의미하지 않으며, 이 부류중 하나 이상이 보존 위치에 상이한 잔기를 가질 수 있음을 인지할 것이다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "핵산" 및 "뉴클레오티드"는 서로 번갈아 사용한 것으로, "폴리뉴클레오티드"라는 용어는 올리고뉴클레오티드(즉, 짧은 폴리뉴클레오티드)를 제외하고자 사용된 것이 아니며, 합성 및/또는 비천연 발생의핵산(즉, 핵산 유사체 또는 변형된 백본 잔기 또는 결합 포함)을 의미할 수도 있 다.
본 명세서에 사용된 "올리고뉴클레오티드" 또는 "올리고머"는 프라이머, 프로브, 또는 앰플리머로서 사용될 수 있는 길이가 약 7개 뉴클레오티드 이상인 핵산 서열 및 약 100개 정도의 큰 뉴클레오티드를 의미한다. 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 길이가 약 10개 내지 약 50개 뉴클레오티드 사이이고, 보다 일반적으로 약 14개 내지 약 35개 뉴클레오티드이며, 보다 더 일반적으로 약 15개 내지 약 25개 뉴클레오티드이며, 또한 올리고뉴클레오티드 또는 올리고머란 용어는 합성 및/또는 비천연 발생의 핵산(즉, 핵산 유사체 또는 변형된 백본 잔기 또는 결합 포함)을 의미할 수도 있다.
본 명세서에 사용된 "작동가능하게 결합된"이란 용어는 2종 이상의 핵산(예, DNA) 분절 간의 기능적 관계를 의미하는 것이다. 예컨대, 프로모터 또는 인헨서는 적당한 숙주 세포 또는 기타 발현계에서 서열의 전사를 자극한다면 암호 서열에 작동가능하게 결합된 것이다. 일반적으로, 작동가능하게 결합된 서열은 인접한 것이고, 시그널 서열인 경우에는 인접하고 리딩 페이스에 존재해야 한다. 하지만, 인헨서는 전사를 증강시키는 것이기 때문에 암호 서열에 근접하게 위치할 필요는 없다.
본 명세서에 사용된 "폴리펩티드"란 용어는 본 명세서에서 "단백질"이란 용어와 번갈아 사용한 것으로, 합성, 천연 발생 및 비천연 발생의 유사체(아미노산 및 결합)를 포함하는, 아미드 결합을 통해 결합된 아미노산 잔기로 구성된 중합체를 의미한다. 펩티드는 폴리펩티드의 일 예이다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "프로브"란 용어는 다른 분자에 특이적으로 결합하는 분자를 의미한다. 프로브의 일예는 실질적으로 상보적인 핵산에 특이적으로 결합(즉, 어닐링 또는 하이브리드화)하는 "핵산 프로브"이다. 프로브의 다른 예는 대응하는 항원이나 에피토프에 특이적으로 결합하는 "항체 프로브"이다.
본 명세서에 사용된 "재조합체"란 용어는 시험관내에서 합성되거나 조작된 폴리뉴클레오티드(예컨대, "재조합 폴리뉴클레오티드"), 세포 또는 기타 생물계에서 유전자 생성물을 생성하기 위하여 재조합 폴리뉴클레오티드를 사용하는 방법 또는 재조합 폴리뉴클레오티드에 의해 암호된 폴리펩티드("재조합 단백질")을 의미한다.
본 명세서에 사용된 안정하게 형질전환된 세포주에서 "선택계"란 용어는 목적하는 재조합 핵산을 포함하는 세포를 동정 및/또는 선택하는 방법을 의미한다. 형질전환된 세포를 감별하는데 사용할 수 있는 발현계에는 다양한 종류가 공지되어 있고, 본 발명에도 적합하게 사용할 수 있다. 예컨대, 플라스미드 또는 기타 벡터에 의해 형질전환된 세포는 플라스미드에 포함된 유전자, 예컨대 공지의 amp, gpt, neo 및 hyg 유전자 또는 tk 세포나 aprt 세포에 각각 이용될 수 있는 헤르페스 단순 바이러스 티미딘 키나제 유전자[Wigler et al., Cell 11:223-32(1977)] 및 아데닌 포스포리보실트란스퍼라제 유전자[Lowy et al., Cell 22:817(1980)]과 기타 유전자에 의해 부여되는 항생제 내성으로 선택할 수 있다. 또한, 항대사물질, 항생제 또는 살충제 내성도 선택 성질로서 사용할 수 있으며, 그 예로는 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하고 유전자 증폭에 유용한 dhfr[Wigler et al., Proc.Natl.Acad.Sci., 77:3567(1980)]; 아미노배당체 네오마이신과 G-418에 대한 내성을 부여하는 npt[Colbere-Garapin et al., J.Mol.Biol., 150:1(1981)] 및 클로설푸론과 포스피노트리신 아세틸트란스퍼라제에 대하여 각각 내성을 부여하는 als 또는 pat[Murry, in McGraw Hill Yearbook of Science and Technology, McGraw Hill, New York NY, pp 191-196(1992)]가 있다. 또 다른 선택용 유전자로, 예컨대 세포가 트립토판 대신에 인돌을 이용할 수 있게 만드는 히그로마이신 내성 부여 유전자, trpB 또는 세포가 히스티딘 대신에 히스티놀을 이용할 수 있게 만드는 hisD가 개시되어 있다[Hartman and Mulligan, Proc.Natl.Acad.Sci., 85:8047(1988)]. 최근, 육안관찰가능한 마커로서, 안토시아닌, 베타-글루쿠로니다제와 이것의 기질인 GUS 및 루시퍼라제와 이것의 기질인 루시페린이 대중적으로 사용되고 있으며, 이들은 형질전환체를 감별하는데 뿐만 아니라 특정 벡터계에 의한 일시적 또는 장기적 단백질 발현의 양을 정량하는데에도 사용할 수 있다[Rhodes et al., Meth.Mol.Biol., 55:121(1995)].
본 명세서에 사용된 유전자(다른 표시가 없는 경우), 핵산, 단백질 또는 펩티드의 "서열"이란 2본쇄 DNA 분자의 어느 1가닥 또는 두 가닥에 존재하는 뉴클레오티드, 예컨대 암호 가닥과 이것의 보체의 서열, 또는 1본쇄 핵산 분자의 서열의 순서 또는 펩티드나 단백질에 존재하는 아미노산의 순서를 의미하는 것이다.
본 명세서에 사용된 "특이적 결합"이란 1 분자, 일반적으로 항체 또는 폴리뉴클레오티드가 다양한 다른 분자들의 존재하에서도 다른 특정 분자와 접촉 및 회합하는 성질을 의미한다. 예컨대, 1본쇄 폴리뉴클레오티드는 상보적 서열인 1본쇄 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합할 수 있고, 항체는 이에 대응하는 항원에 특 이적으로 결합(또는 "특이적으로 면역반응")할 수 있다.
본 명세서에 사용된 "엄중 하이브리드화 조건" 또는 "엄중도"는 표적 서열과 이 표적에 대해 정확하거나 또는 거의 정확한 상보성을 보유한 프로브의 융점(Tm )보다 약 5 ℃ 내지 약 20 ℃ 또는 25 ℃ 이하 범위의 조건을 의미한다. 본 명세서에 사용된 융점은 2본쇄 핵산 분자가 1가닥으로 해리되기 시작하는 온도이다. 핵산의 Tm 을 계산하는 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있다[예컨대, 본 명세서에 참고 인용되는 문헌(Berger and Kimmel(1987) METHODS IN ENZYMOLOGY, VOL.152: GUIDE TO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES, San Diego: Academic Press, Inc. and Sambrook et al.(1989) MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2ND ED., VOLS 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory(이하, "샘브룩"이라 표시)) 참조]. 표준 문헌에 기재된 바와 같이, Tm 값의 간단한 추정값은 식 Tm = 81.5 + 0.41(G + C)으로 계산할 수 있으며, 여기에서 핵산은 1M NaCl 수용액에 제공된다[예컨대, Anderson and Young, Quantitative Filter Hybridization in NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION(1985)]. 다른 문헌에는 구조적 특성 뿐만 아니라 서열의 특성도 Tm 의 계산값에 고려하는 보다 복잡한 계산값도 개시되어 있다. 하이브리드의 융점(및 엄중 하이브리드화 조건)은 프로브의 길이 및 특성(DNA, RNA, 염기 조성)과 표적의 특성(DNA, RNA, 염기 조성, 용액 상태 또는 고정화된 상태 등) 및 염과 기타 다른 성분들의 농도(예, 포름아미드, 덱스트란 설페이트, 폴리에틸렌글리콜의 존재 또는 부재)와 같은 다양한 요인에 따라 영향받는다. 이와 같은 요인들의 효과는 공지되어 있고 당해 기술 분야의 표준 문헌, 예컨대 샘브룩(상기 참조) 및 Ausubel et al.(상기 참조)에 논의되어 있다. 일반적으로, 엄중 하이브리드화 조건은 염 농도가 약 1.0 M 미만의 나트륨 이온, 통상 pH 7.0 내지 8.3에서 약 0.01 내지 1.0M 나트륨 이온 및 단쇄 프로브(예, 10개 내지 50개 뉴클레오티드)에 대해서는 약 30 ℃ 이상, 장쇄 프로브(예컨대, 50개 뉴클레오티드 이상)에 대해서는 약 60 ℃ 이상의 온도이다. 주지된 바와 같이, 엄중한 조건은 포름아미드와 같은 탈안정화제 첨가하에 조성할 수 있으며, 이 경우에는 저온을 사용할 수도 있다.
본 명세서에 사용된 서열 중의 "실질적 동일성", "실질적 서열 동일성" 또는 "실질적 유사성"은 2개의 폴리뉴클레오티드 간 서열 유사성의 척도를 의미한다. 실질적인 서열 동일성은 엄중한 조건 하의 하이브리드화, 직접 비교 등의 방법으로 측정할 수 있다. 예컨대, 2개의 폴리뉴클레오티드는 엄중한 하이브리드화 조건 하에 서로 특이적으로 하이브리드할 수 있다면 실질적인 서열 동일성을 보유한 것으로 감별할 수 있다. 기타 서열 동일성의 정도(예컨대, "실질적 정도" 미만)는 다른 엄중도 조건하에서 하이브리드하는 것을 특징으로 한다. 또는, 실질적인 서열 동일성은 두 뉴클레오티드(또는 폴리펩티드) 서열 간의 동일성로 표시할 수 있다. 이 두 서열은 동일성이 약 60이상, 바람직하게는 약 70이상, 또는 약 80이상, 또는 약 90이상 또는 약 95또는 98내지 100이면 실질적으로 동일한 것으로 간주한다. 서열(뉴클레오티드 또는 아미노산) 동일성는 일반적으로 두 서열 간의 최적 정렬을 결정하고 두 서열을 비교하여 계산한다. 예컨대, 단백질 발현에 사용되는 외인성 전사체는 대조 서열(예컨대, 대응하는 내인성 서열)과 비교하여 특정 동일성 또는 유사성를 보유하는 것으로 표시할 수 있다. 서열의 최적 정렬은 국소 상동성 알고리듬[Smith and Waterman(1981) Adv.Appl.Math. 2:482], 상동성 정렬 알고리듬[Needleman and Wunsch(1970) J.Mol.Biol.48:443], 유사성 조사 방법[Pearson and Lipman(1988) Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 85:2444], 이와 같은 알고리듬의 컴퓨터화된 실행(GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA in the Wisconsin Genetics Softwart Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), 또는 검사에 의해 실시할 수 있다. 각종 방법에 따라 얻어지는 최상의 정렬을 선택한다(즉, 최고 동일성을 생성함). 일반적으로, 상기 알고리듬들은 "비교 창"(보통 약 18개 이상의 뉴클레오티드)에서 두 서열을 비교하여 서열 유사성의 국소 영역을 동정하고 비교하므로, 약간의 첨가 또는 결실(즉, 갭)은 허용된다. 첨가 및 결실부는 일반적으로 첨가 또는 결실을 포함하지 않는 대조 서열에 대하여 서열 길이의 20이하인 것이다. 때로, 특정 길이 또는 영역에 대하여 참고적으로 2 서열간의 서열 동일성을 기재하는 것이 바람직한 경우도 있다(예컨대, 500 염기쌍 이상의 길이에 대해서는 95이상의 동일성을 보유한 것으로 기재할 수 있음). 보통, 길이는 최소 약 50, 100, 200, 300, 400 또는 500 염기쌍, 아미노산 또는 기타 잔기일 수 있다. 서열 동일성는 비교 영역에 있어 최적으로 정렬된 2개의 서열을 비교하고, 두 서열 중의 동일 핵산 염기(예, A, T, C, G 또는 U)에 의해 나타나는 정합된 위치의 수를 측정하고, 비교용의 대조 서열이나 영역에 존재하는 염기의 총 수에 대한 정합 위치의 수(또는 )를 측정하여 계산한다. 서열 유사성을 측정하는데 적합한 다른 알고리듬은 BLAST 알고리듬[Altschul(1990), J.Mol.Biol.215:403- 410 및 Shpaer(1996) Genomics 38:179-191]이다. BLAST 분석을 실행하는 소프트웨어는 National Center for Biotechnology Information(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 공시하고 있다. 이 알고리듬은 먼저 데이터베이스 서열 중에 존재하는 동일 길이의 워드(word)와 정렬시켰을 때 약간의 양성값을 나타내는 한계값 T와 일치하거나 충족시키는 문제 서열 중의 길이 W인 짧은 워드를 감별하여 수치가 높은 서열 쌍(HSP)을 감별하는 단계를 포함한다. T는 이웃 워드의 수치 한계값이라 부른다(Altshul et al., 상기 문헌 설명 참조). 이와 같은 초기 이웃 워드의 적중은 이를 포함하는 긴 HSP를 탐색하는 조사를 개시할 수 있는 발단으로 작용한다. 이 워드 적중을 각 서열을 따라 양 방향으로 연장시켜 누적 정렬 값을 최대한 증가시킨다. 각 방향으로 워드 적중의 연장은 누적 정렬 값이 최대 값에서 X 양만큼 떨어지거나, 누적 값이 1종 이상의 음성 값의 잔기 정렬의 축적으로 인해 0 또는 그 이하가 되거나, 또는 서열의 말단에 도달하면 중지한다. BLAST 알고리듬의 매개변수 W, T 및 X는 정렬의 감응도 및 속도를 결정한다. BLAST 프로그램은 디폴트로서 워드길이(W) 11, BLOSUM62 스코링 매트릭스(Henikoff(1992) Proc.Natl.Acad.Sci USA 89:10915-10919) 정렬 값(B) 50, 기대값(E) 10, M=5, N=4 및 양가닥 비교군을 사용한다. BLAST란 용어는 두 서열 간의 유사성을 통계적으로 분석하는 BLAST 알고리듬을 의미한다[예컨대, Karlin(1993) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787 참조]. BLAST 알고리듬이 제공하는 유사성의 1 가지 척도는 최소 총 확률(P(N))로서, 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 간이 우연히 정합할 수 있는 확률의 표시를 제공한다. 예컨대, TRT 핵산에 대하여 시험 핵산을 비교한 경우 최소 총 확률이 약 0.5, 0.2, 0.1, 0.01 또는 0.001 미만이면 그 핵산은 TRT 핵산과 유사하다고 간주할 수 있다. 대안적으로, 2개의 핵산 서열이 유사하다는 다른 표시는 제1 핵산이 암호하는 폴리펩티드가 제2 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드와 면역학적으로 교차 반응한다는 점이다.
본 명세서에 사용된 폴리펩티드와 관련하여 기재된 "실질적인 동일성", "실질적인 서열 동일성", 또는 "실질적인 유사성"이란 용어는 폴리펩티드가 대조 서열과 최소 70서열 동일성, 또는 80또는 85또는 최대 100의 서열 동일성을 포함하거나, 가장 바람직하게는 약 10개 내지 20개 아미노산 잔기의 비교창에서 90동일성을 보유하는 두 폴리펩티드간의 유사성 정도를 의미한다. 아미노산 서열 유사성 또는 서열 동일성은 잔기 정합도를 최적화하고, 필요한 경우 갭을 도입시켜 측정한다. 문헌[Needleham et al.(1970) J.Mol.Biol. 48:443-453; 및 Sankoff et al., 1983, Time Warps, String Edits, and Macromolecules, The Theory and Practice of Sequence Comparison, Chapter One, Addison-Wesley, Reading, MA; 및 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰에 소재하는 IntelliGenetics와 미국 위스콘신주 매디슨에 소재하는 University of Wisconsin Genetics Computer Group의 소프트웨어 패키지]을 참조하라. 당업자에게는 자명한 바와 같이, "실질적인 동일성", "실질적인 유사성" 및 "실질적인 서열 동일성"이란 용어는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드에 대해 번갈아 사용할 수 있다.
본 명세서에 사용된 "실질적으로 순수한" 또는 "실질적으로 정제된"이란 용어는 항체(예, 항hTRT 항체)와 같은 특정 시약을 포함하는 조성물인 경우, 특정 시 약이 조성물(예컨대, 용매 또는 완충액은 포함하지 않음)의 최소 약 75또는 최소 약 90, 또는 최소 약 95또는 최소 약 99이상인 것을 의미한다. 따라서, 예컨대 hTRT 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 본 발명의 바람직한 면역글로불린 제조물은 실질적으로 정제된 것이다.
본 명세서에 사용된 "텔로머라제 음성" 세포란 텔로머라제가 발현되지 않는 세포, 즉 텔로머라제 촉매 활성을 측정하기 위한 종래 분석법이나 TRAP 분석법을 사용하여 텔로머라제 촉매 활성을 검출할 수 없는 세포를 의미한다. 본 명세서에 사용된 "텔로머라제 양성" 세포는 텔로머라제가 발현(즉, 텔로머라제 활성이 검출될 수 있는)되는 세포이다.
본 명세서에 사용된 "텔로머라제 관련" 질환 또는 증상은 개체의 세포 중에 존재하는 비정상적으로 고농도인 텔로머라제 활성과 관련이 있거나, 대부분의 체세포에서 나타나는 임의의 텔로머라제 활성 또는 정상 세포 기능을 손상시키는 저농도의 텔로머라제 활성과 관련이 있는 검체의 질환이나 증상이다. 텔로머라제 관련 질환의 예로는, 예컨대 암(악성 세포 중의 높은 텔로머라제 활성) 및 불임(생식세포 중의 낮은 텔로머라제 활성)을 포함한다.
본 명세서에 사용된 "시험 화합물"이나 "제제"는 임의의 합성 또는 천연 화합물이나 조성물을 의미한다. 이 용어에는 예컨대 소분자, 펩티드, 단백질, 당, 핵산, 지방산 등을 비롯한 모든 유기 및 무기 화합물을 포함한다.
다음 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것으로 본 발명을 제한하는 것이 아 니다.
이하 문항에서 사용된 약어는 다음과 같다.
eq(당량); M(몰); μM(마이크로몰); N(노르말); mol(몰); mmol(밀리몰); μmol(마이크로몰); nmol(나노몰); g(그램); ㎎(밀리그램); ㎍(마이크로그램); ng(나노그램); l 또는 L(리터); ㎖(밀리리터); ㎕(마이크로리터); ㎝(센티미터); ㎜(밀리미터); ㎛(마이크로미터); nm(나노미터); ℃(섭씨 온도); RPN(리보뉴클레오단백질); mreN(2'-O-메틸리보뉴클레오티드); dNTP(데옥시리보뉴클레오티드); dH2 O(증류수); DDT(디티오트레이톨); PMSF(페닐메틸설포닐 플루오라이드); TE(10 mM Tris HCl, 1 mM EDTA, 약 pH 7.2); KGlu(글루탐산 칼륨); SSC(구연산 나트륨염 완충액); SDS(소듐 도데실 설페이트); PAGE(폴리아크릴아미드 겔 전기영동); 노벡스(Novex, 미국 캘리포니아주 산디에고에 소재); 바이오래드(Bio-Rad Laboratories, 미국 캘리포니아주 헤르큘레스에 소재); 파마시아(Pharmacia Biotech, 미국 뉴저지주 피츠카타웨이 소재); 뵈링거-맨하임(Boehringer-Mannheim Corp., 미국 캘리포니아주 콩코드 소재); 아머샴(Amersham, 미국 일리노이주 시카고 소재); 스트라타진(Stratagene Cloning Systems, 미국 캘리포니아주 라졸라 소재); NEB(New England Biolabs, 미국 매사츄세츠주 베버리 소재); 피어스(Pierce Chemical Co., 미국 일리노이주 록포드 소재); 베크만(Beckman Instruments, Fullerton, CA); 랩 인더스트리스(Lab Industries, Inc. 미국 캘리포니아주 버클리 소재); 에펜도르프(Eppendorf Scientific, 미국 위스콘신주 매디슨 소재) 및 몰리큘라 다이나믹스(Molecular Dynamics, 미국 캘리포니아주 서니베일 소재).
실시예 1
텔로머라제 단백질 및 클론의 분리
다음 실시예는 각종 유기체로부터 텔로머라제 단백질과 클론, 예컨대 유프로테스 p.123, hTRT, TRT 및 S.폼베 TRT 텔로머라제 cDNA 클론을 분리하는 방법에 대해 상세히 설명한 것이다.
A. 배경
i) 개요
이하, 본 실시예를 통해 상세히 설명할 TRT 유전자의 정제와 클로닝에 대해 개괄적으로 살펴보겠다. 섬모충, 효모 및 포유류 중에 존재하는 텔로머라제 RNA 서브유닛은 특성이 규명된 바 있으나, 이 효소의 단백질 서브유닛은 지금까지 확인된 바 없다. 섬모를 가진 원생동물인 유프로테스 에디큘라투스(Euplotes aediculatus )로부터 텔로머라제를 정제한 결과, p123 및 p43이라는 2가지 단백질을 생성하였다(이하 상세히 설명됨; Lingner(1996) Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 93:10712). 유프로테스 에디큘라투스는 약 8 x 107 말단소립과 텔로머라제 약 3 x 105 분자를 포함하는 거대핵을 보유한 하모성 섬모충이다. 정제 후, 활성 텔로머라제 복합체는 66 kD의 RNA 서브유닛과 약 123 kD와 43 kD의 2개 단백질에 상응하는 약 230 kD의 분자량을 나타낸다[Lingner(1996), 전술한 문헌 설명 참조]. 큰 p123 단백질은 광가교 실험을 통해 말단소립 DNA 기질의 특이적인 결합에 관계하는 것으로 나타났다[Lingner(1996), 전술한 문헌 설명 참조].
상기 p123 단백질과 p43 단백질을 서열분석하고, 이 단백질들을 암호하는 cDNA 클론을 분리하였다. 이 유프로테스 서열은 테트라히메나 텔로머라제 관련 단백질 p80 및 p95와는 관련이 없는 것으로 관찰되었다. 유프로테스 p123의 서열을 분석한 결과 역전사효소(RT) 모티프를 발견하였다. 또한, 유프로테스 p123 서열은 다른 서열과 비교 분석한 결과 Est2 단백질이라고 하는 효모의 상동체인 것으로 밝혀졌다[Lingner(1997) Science 276:561]. 효모 Est2는 생체내 말단소립 유지에 필수적인 인자인 것으로 밝혀져 있으나[Lendvay(1996) Genetics 144:1399], 텔로머라제 촉매성 단백질로 밝혀진 적은 없다. 부위 특이적 돌연변이유발을 통해, 효모 Est2의 RT 모티프는 생체내 및 시험관내 말단소립 DNA 합성에 필수적인 것으로 입증되었다[Lingner(1997), 전술한 문헌 설명 참조].
ii) S.폼베 텔로머라제의 감별 및 특성규명
이하에 상세히 기재되는 바와 같이 유프로테스 p123RT 모티프로부터 고안한 축퇴성 서열 프라이머를 사용하여 S.폼베 DNA를 PCR 증폭하였다. 생성되는 4가지 주요 PCR 생성물 중에서 120 염기쌍의 밴드가 p123 및 Est2와 상동성인 펩티드 서열을 암호하였다. 이 PCR 생성물을 콜로니 하이브리드화에서 프로브로 사용하고 S.폼베 게놈 라이브러리 유래의 2개의 중첩 클론과 S.폼베 cDNA 라이브러리 유래의 3개의 클론을 동정하였다. 이것을 서열 분석한 결과, 3개의 S.폼베 cDNA 클론 중 어떤 클론도 전길이가 아니었고, 따라서 RT-PCR을 사용하여 단백질 N 말단을 암호하는 서열을 얻었다.
이 클론들을 완전하게 서열 분석한 결과 추정상의 S.폼베 텔로머라제 RT 유전자, trt1을 얻었다. 이 trt1을 완전한 뉴클레오티드 서열은 수탁 번호 AF015783 으로 GenBank에 기탁하였다(도 15A 내지 도 15F 참조).
S. 폼베 trt1(촉매성 서브유닛으로서)을 시험하기 위하여 2개의 결실 작제물을 제조하였다. 서열 분석을 통해 trt1은 추정상의 분자량이 116 kD인 염기성 단백질을 암호한다는 것을 관찰하였다. 특히, 밑줄친 모티프 1,2,A,B,C,D 및 E로 표시된 7개의 역전사효소 모티프는 p123과 Est2와 상동성이 매우 높은 것으로 나타났다(도 63 참조). 또한, T-모티프라고 표시한 다른 텔로머라제 특이적 모티프도 관찰되었다. 암호 서열 사이에는 크기가 36 염기쌍 내지 71 염기쌍 범위인 15개 인트론이 존재하였다.
촉매성 서브유닛으로서 S.폼베 trt1을 시험하기 위하여 2개의 결실 작제물을 제조하였다. 이중 1개는 RT 도메인 중 모티프 B 내지 D만을 제거하였다. 다른 1개는 오픈 리딩 프레임의 99를 제거하였다.
이 2가지 돌연변이체의 S.폼베 포자를 증식시킨 반수체 세포는 말단소립의 반복체에 대한 하이브리드화가 거의 검출되지 않는 지점까지 점진적인 말단소립 단축화를 나타냈다. trt1+ /trt1- 이배체는 포자형성하였고, 그 결과 생성된 4분자를 분할하고 아미노산이 보충된 효모 추출 배지에서 발아시켰다[YES 평판, Alfa(1993) Experiments with Fissin Yeast, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY]. 각 포자에서 생긴 콜로니를 32 ℃에서 3일 동안 성장시키고, 새로운 YES 평판에 3일 마다 연속 스트리킹하였다. 각 스트리킹 마다 콜로니는 32 ℃의 YES 액체 배지 6 ㎖에 넣고 정지상까지 증식시켰다. 그 다음 게놈 DNA를 제조하였다. ApaI으로 분해한 후, DNA를 2.3아가로스 겔에서 전기영동하고 에티디움 브로마이드로 염색하여 각 레인마다 동일한 장입량을 주입하였는지 확인하고, 그 후 나일론 막에 전이한 뒤 말단소립 DNA 프로브와 하이브리드하였다.
아가 상에서 증식 개시가 지연되거나 증식하지 못하고(일반적으로 발아 후 4번째 스트리킹시) 콜로니가 점차 울퉁불퉁한 모서리로 변하고(도 22C에 도시한 바와 같은 콜로니 형태), 세장형 세포의 비율이 점차 증가하면(도 22D에 도시), 노쇠화로 판단한다. 그 다음 세포를 염화암모늄 대신 글루탐산을 첨가한 최소 배지[Alfa(1993) 전술한 문헌 설명 참조]에서 32 ℃하에 2일 동안 평판배양한 후 사진촬영하였다.
각각 집적 배양한 세포를 분할 현미경으로 분리했을 때 그 대부분은 더이상 분열하지 않는 것으로 관찰되었다. 이와 동일한 텔로머라제 음성(trt1- ) 세포 집단은 항상 계속 분열하는 정상 크기의 세포를 포함하나, 종종 비분열성의 후대를 생성하기도 한다. 텔로머라제 음성 개체군은 각종 말단소립 복제 유전자를 결실시킨 발아성 효모 균주에 대하여 기록된 바 있는 말단소립 유지의 재조합 방식을 이용할 수 있다[Lendvay(1996) 전술한 문헌 설명 참조, Lundblad(1993) Cell 73:347].
iii) 인간 텔로머라제의 동정 및 특성 규명
인간 텔로머라제 역전사효소(hTRT) cDNA에서 유래되는 EST(발현성 서열 태그)는 유프로테스 123 kDa 펩티드와 핵산 서열 뿐만 아니라 시조사카로마이세스(Schizosaccharomyces ) 단백질 및 상응하는 cDNA(tez1) 서열을 사용하여 dbEST(발현성 서열 태그)의 BLAST 조사로 감별하였다. Genbank AA28196으로 표시되는 EST는 389개의 뉴클레오티드 길이로, 클론 712562의 위치 1679 내지 2076에 상응하며, I.M.A.G.E.Consortium(Human Genome Center, DOE, Lawrence Livermore National Laboratory, Livermore, CA)에서 얻었다. 이 클론은 편도 세포를 유동 분류하여 얻은 발아성 B 세포의 cDNA 라이브러리에서 얻었다. 이 hTRT cDNA 클론은 완전하게 서열 분석한 결과 모두 8개의 텔로머라제 RT(TRT) 모티프를 포함하는 것으로 관찰되었다. 하지만, 이 hTRT 클론은 RT 모티프 B', C, D 및 E가 더 큰 N-말단 RT 모티프와 상이한 오픈 리딩 프레임에 포함되어 있기 때문에 TRT의 인접부를 암호하지 않았다. 또한, RT 모티프 A와 B 사이의 거리는 종래 공지된(비인간) 3가지 TRT 보다 실질적으로 더 짧았다.
전길이의 cDNA 클론을 분리하기 위하여 텔로머라제 활성을 고농도로 발현하는 인간 293 세포주(전술함) 유래의 cDNA 라이브러리를 선별하였다. 그 다음 293 세포주 유래의 람다 cDNA 라이브러리를 각각 약 200,000 플라크를 포함하는 25개의 푸울로 분할하였다. 각 푸울을 프라이머 쌍 5'-CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA-3' 및 5'-GGATGAAGCGGAGTCTGGA-3'를 사용하여 PCR로 선별하였다. 양성 1차 푸울 1개를 6개로 나눈 서브푸울을 상기와 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 PCR로 더 선별하였다. 1차 서브푸울과 2차 서브푸울의 선별을 위해, hTRT를 94℃에서 45초; 60℃에서 45초; 72℃에서 90초간의 사이클을 총 31회 실시하여 증폭시킨다. 대조군으로, 하우스키핑 효소 GAPDH의 RNA는 프라이머 쌍 5'-CTCAGACACCATGGGGAAGGTGA-3' 및 5'-ATGATCTTGAGGCTGTTGTCATA-3'을 사용하여 94 ℃에서 45초, 55℃에서 45초 및 72℃에서 90초간의 사이클을 총 16회 실시하므로써 증폭시켰다.
그 다음 클론 #712562의 5' 영역에서 유래되는 프로브를 사용한 플라크 하이 브리드화로 2차 선별 후 얻은 hTRT 양성 서브푸울을 1개 선별하였다. 1개의 파지가 양성으로 확인되었다(람다 파지 25-1.1, ATCC 209024, 1997.5.12에 기탁됨). 이것은 약 4 킬로베이스의 삽입체를 포함하고 있었고, 이것을 EcoRI 단편으로 절단하여 pBluescript II SK+ 벡터(미국 캘리포니아주 산디에고에 소재하는 스트라타진 제품)의 EcoRI 부위에 서브클로닝하였다. 이 cDNA 클론을 함유하는 플라스미드는 pGRN121로 표시하였다. cDNA 삽입체는 총 약 4 kbp을 포함한다. 인간 hTRT cDNA의 완전한 뉴클레오티드 서열(pGRN121)은 Genbank(수탁 번호 AF015950)에 기탁하였고, 이 플라스미드는 ATCC에 기탁하였다(ATCC 209016, 1997년 5월 6일자로 기탁됨).
B. 유프로테스 에디큘라투스의 성장
본 실시예에서는, 이. 에디큘라투스의 배양물을 콜로라도 대학교 MCDB의 프레스코트 데이비드 박사로부터 입수하였다. 프레스코트 박사는 본래 이 배양물을 연못의 물로부터 분리하였지만, 이 생물은 또한 ATCC(ATCC #30859)로부터 이용할 수 있다. 음식물 공급원으로 클로로고늄(Chlorogonium )을 포함하는 15 리터들이 유리 용기에서 비멸균 조건하에 문헌[Swanton(1980) Chromosoma 77:203]에 기재된 대로 배양물을 증식시켰다. 밀도가 약 104 세포/㎖에 도달했을 때 배양물로부터 유기체를 수집하였다.
C. 핵 추출물의 제조
본 실시예에서, 이. 에디큘라투스의 핵 추출물은 후술하는 바와 같이 당해 분야에 개시되어 있는 사항[Linger (1994) Genes Develop. 8:1984]을 약간 변형시켜 제조하였다. 간략히 언급하면, 파트 B에 기재된 바와 같이 성장시킨 세포를 15 ㎛의 니텍스 필터를 사용하여 농축시키고, 얼음상에서 냉각시켰다. 세포 펠렛을 최종 부피 110 ㎖의 TMS/PMSF/스퍼미딘 포스페이트 완충액에 재현탁시켰다. 원액 TMS/PMSF/스퍼미딘 포스페이트 완충액은 스퍼미딘 포스페이트(USB) 0.075 g 및 PMSF(에탄올에 제조된 100 mM 원액으로부터 얻음) 0.75 ㎖를 TMS 150 ㎖에 첨가하여 제조하였다. TMS는 10 mM 트리스-아세테이트, 10 mM MgCl2 , 슈크로스 85.5752 g/리터 및 CaCl2 0.33297 g/리터를 포함하였고, pH는 7.5였다.
TMS/PMSF/스퍼미딘 포스페이트 완충액에서 재현탁시킨 후, 10NP-40 8.8 ㎖ 및 슈크로스 94.1 g을 첨가하고, 그 혼합물을 오버헤드 모터에 부착된 스테인레스강 교반봉을 가진 규소화된 유리 비이커에 넣었다. 세포들이 완전히 용해되도록(대략 20분) 그 혼합물을 교반하였다. 베크만 JS-13 스윙아웃 로터를 사용하여 이 혼합물을 4℃에서 7500 rpm(8950 x g)로 10분 동안 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 핵 펠렛을 TMS/PMSF/스퍼미딘 포스페이트 완충액에 재현탁시키고, 베크만 JS-13 스윙아웃 로터를 사용하여 4℃에서 7500 rpm(8950 x g)로 5분 동안 다시 원심분리하였다.
상청액을 제거하고, 핵 펠렛을 50 mM 트리스-아세테이트, 10 mM MgCl2 , 10글리세롤, 0.1NP-40, 0.4 M KGlu, 0.5 mM PMSF로 이루어진 완충액(pH 7.5)에서 수집된 세포 10 g당 완충액 0.5 ㎖의 부피로 재현탁시켰다. 그 다음, 재현탁된 핵을 약 50 스트로크를 가진 유리 균질화기에서 분쇄시킨 다음, 에펜도르프 원심분리기에서 4℃에서 14,000 rpm으로 25분 동안 원심분리하였다. 핵 추출물을 함유하는 상청액을 수집하고, 액체 질소에서 동결시키고 사용시까지 -80℃에서 보관하였다.
D. 텔로머라제의 정제
본 실시예에서는, 파트 C에서 설명한 대로 제조한 핵 추출물을 사용하여 이. 에디큘라투스 텔로머라제를 정제하였다. 이 정제 프로토콜에서, 텔로머라제를 먼저 Affi-Gel-헤파린 칼럼상에서 크로마토그래피하여 농축시킨 다음, 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용하여 친화도 정제에 의해 광범위하게 정제하였다. 텔로머라제 RNA의 주형 영역은 텔로머라제 RNP 입자에서 하이브리드되기 쉽기 때문에, 안티센스 올리고뉴클레오티드(즉, "친화도 올리고뉴클레오티드")는 텔로머라제에 대한 친화도 유인판으로서의 상기 주형 영역에 상보적인 것으로 합성되었다. 비오틴 잔기를 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 포함시켜 그 잔기를 아비딘 칼럼에 고정화시켰다.
올리고뉴클레오티드에 텔로머라제를 결합시키고 광범위하게 세척한 다음, 치환 올리고뉴클레오티드를 사용하여 텔로머라제를 용출시켰다. 친화도 올리고뉴클레오티드는 텔로머라제 RNA5'에 상보적이지 않은 DNA 염기를 텔로머라제 특이 서열에 포함하였다. 치환 올리고뉴클레오티드는 그 전길이에 대해 친화도 올리고뉴클레오티드와 상보적이기 때문에, 친화도 올리고뉴클레오티드에 결합된 텔로머라제보다 더 많은 열역학적으로 안정한 이중체를 형성할 수 있었다. 따라서, 치환 올리고뉴클레오티드를 첨가한 결과 칼럼으로부터 텔로머라제가 용출되었다.
45 리터의 배양물로부터 제조된 핵 추출물은 핵 추출물 총 34 ㎖을 수집할 때까지 동결시켰다. 이것은 배양물 630 리터(즉, 대략 4 x 109 세포)에 해당하였다. 핵 추출물은 완충액으로 410 ㎖까지 희석하여 pH 7.5에서 최종 농도 20 mM 트리스-아세테이트, 1 mM MgCl2 , 0.1 mM EDTA, 33 mM KGlu, 10(v/v) 글리세롤, 1 mM 디티오트레이톨(DTT) 및 0.5 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF)를 제공하였다.
희석된 핵 추출물을 동일한 완충액에서 평형을 이루고 KGlu 33 mM 내지 450 mM 구배 2 리터로 용출시키는, 베드 부피 230 ㎖ 및 직경 5 ㎝인 Affi-Gel-헤파린 겔 칼럼(바이오-래드)에 첨가하였다. 그 칼럼은 유속 1 칼럼 부피/시간으로 4℃에서 작동시켰다. 50 ㎖의 분획을 각각 모으고 파트 E에 기술한 바와 같이 텔로머라제 활성에 대해 분석하였다. 텔로머라제는 약 170 mM KGlu에서 칼럼으로부터 용출되었다. 텔로머라제를 함유하는 분획(약 440 ㎖)을 모으고, 20 mM 트리스-아세테이트, 10 mM MgCl2 , 1 mM EDTA, 300 mM KGlu, 10글리세롤, 1 mM DTT 및 1노니뎃(Nonidet) P-40이 되게 조정하였다. 이 완충액을 "WB"라 명명하였다.
이 제제에, 푸울 1 ㎖당 두 경쟁인자 DNA 올리고뉴클레오티드 (5'-TAGACCTGT TAGTGTACATTTGAATTGAAGC-3' 및 (5'-TAGACCTGTTAGGTTGGATTTGTGGCATCA-3' 각각 1.5 nmol, 효모 RNA 50 ㎍(시그마) 및 비오틴-표지된 텔로머라제 특이 올리고뉴클레오티드(5'-비오틴-TAGACCTGTTA-(mreG)2 -(rmeU)4 -(rmeG)4 -(rmeU)4 -remG-3' 0.3 nmol을 첨가하였다. 텔로머라제 특이 올리고뉴클레오티드의 2-O-메틸리보뉴클레오티드는 텔로머라제 RNA 주형 영역에 상보적이었고, 데옥시리보뉴클레오티드는 상보적이 아니었다. 경쟁인자 비특이적 DNA 올리고뉴클레오티드를 포함하면, 친화도 올리고뉴클레오티드에 결합하거나 또는 혼합물로부터 텔로머라제를 제거할 혼합물내 핵산 결합 단백질 및 기타 성분의 효과가 최소화함에 따라 정제 효율을 증가시켰다.
그 다음, 이 재료를 울트라링크 고정화된 뉴트라비딘 플러스(피어스) 칼럼 재료에 푸울 1 ㎖당 현탁액 60 ㎕의 부피로 첨가하였다. 칼럼 재료는 0.01노니셋 P-40, BSA 0.5 ㎎, fl소자임 0.5 ㎎/㎖, 글리코겐 0.05 ㎎/㎖ 및 효모 RNA 0.1 ㎎/㎖를 함유하는 WB 제제로 각각의 차단(blocking)마다 15분 동안 2회 사전 차단하였다. 차단은 칼럼 재료를 완전히 차단시키는 회전 바퀴를 사용하여 4℃에서 수행하였다. 첫 번째 차단 단계후에, 그리고 두 번째 차단 단계전에 칼럼 재료를 200 x g에서 2분 동안 원심분리하여 매트릭스를 펠렛화하였다.
푸울-칼럼 혼합물을 결합시키기 위한 회전 바퀴(약 10 rpm; 랩인더스트리즈) 상에서 30℃에서 8분 동안 항온처리한 다음, 4℃에서 추가 2 시간 동안 항온처리하였다. 그 다음, 푸울-칼럼 혼합물을 200 xg에서 2분 동안 원심분리하고, 결합되지 않은 재료를 함유하는 상청액을 제거하였다. 그 다음, 푸울-칼럼 혼합물을 세척하였다. 이 세척 공정은 푸울-칼럼 혼합물을 4℃에서 WB로 헹구는 단계, 그 혼합물을 4℃에서 WB로 15분 동안 세척하는 단계, WB로 헹구는 단계, 30℃에서 0.6 M KGlu를 함유하고 노니뎃 P-40을 함유하지 않는 WB로 5분 동안 세척하는 단계, 25℃에서 WB로 5분 동안 세척하는 단계, 및 마지막으로 WB로 다시 헹구는 단계를 포함하였다. 최종 세척후에 잔존하는 부피는 작게 유지하여 완충액 대 칼럼 재료의 비를 대략 1:1로 얻었다.
텔로머라제는 칼럼 재료 1 ㎖당 치환 데옥시올리고뉴클레오티드 (5'-CA4 C4 A4 C2 TA2 CAG2 TCTA-3') 1 nmol을 첨가하고, 25℃에서 30분 동안 항온처리함으로써 칼럼 재료로부터 용출시켰다. 이 재료는 미세 원심분리기(에펜도르프)에서 14,000 rpm으로 2분 동안 원심분리하고 용출물을 수집하였다. 매번 새로운 치환 올리고뉴클레오티드를 사용하여 용출 절차를 2회 더 반복하였다. 전술한 바와 같이, 치환 올리고뉴클레오티드는 친화도 올리고뉴클레오티드와 상보적이기 때문에, 그것은 친화도 올리고뉴클레오티드와의 복합체로서 텔로머라제보다 더 열역학적으로 안정한 복합체를 형성하였다. 따라서, 친화도에 의해 결합된 P-40에 치환 올리고뉴클레오티드를 첨가한 결과 천연 조건하에서 텔로머라제가 효율적으로 용출되었다. 텔로머라제는 단백질 겔상에서의 분석으로 판단할 때, 이 단계에서 약 50의 순도를 가진 것으로 나타났다. 텔로머라제의 친화도 정제 및 치환 올리고뉴클레오티드를 사용한 용출 결과는 도 26(각각 패널 A 및 B)에 도시한다. 도 26에는, 친화도 올리고뉴클레오티드의 2'-O-메틸 당이 굵은 선으로 나타나 있다. 도 26에서 흑색 및 흐린 난형의 모양은 본 발명의 단백질 서브유닛을 그림으로 나타내고자 한 것이다.
AffI-Gel-헤파린 칼럼 크로마토그래피 후에 얻어진 추출물 및 재료의 단백질 농도는 표준으로 BSA를 사용하여 브래드포드의 방법(Bradford (1976) Anal. Biochem. 72:248)을 사용하여 측정하였다. 텔로머라제 제제의 분획만이 글리세롤 구배상에서 추가로 정제되었다.
텔로머라제의 침강계수는 파트 I에서 설명하는 바와 같이 글리세롤 구배 원심분리에 의해 측정하였다.
표 5는 본 실시예의 방법에 따라 정제된 텔로머라제에 대한 정제표이다. 텔로머라제는 전체 세포 추출물과 비교하여 회수율 80로 핵 추출물에서 12배로 농축 되었고; 텔로머라제의 85는 추출시 핵으로부터 용해되었다.
텔로머라제의 정제
분획 단백질(㎎) 텔로머라제(RNP pmol) 텔로머라제/단백질/RNP pmol/㎎ 회수율() 정제 배수
핵 추출물 2020 1720 0.9 100 1
헤파린 125 1040 8.3 60 10
친화도 0.3** 680 2270 40 2670
글리세롤 구배 NA* NA* NA* 25 NA*
* NA = 입수 불가 ** 이 값은 순도를 50(단백질 겔을 기준)로 가정하여 텔로머라제의 측정된 양(680 pmol)으로부터 계산하였다.
E. 텔로머라제 활성
텔로머라제의 정제에 있어서의 각 단계에서, 제제는 본 실시예에서 설명하는 바와 같이, 3개의 별도의 분석법(이중 한 가지는 활성 분석법임)으로 분석하였다. 일반적으로, 텔로머라제 분석은 핵 추출물 0.003 내지 0.3 ㎕, 50 mM 트리스-Cl(pH 7.5), 50 mM KGlu, 10 mM MgCl2 , 1 mM DTT, 125 μM dTTP, 125 μM dGTP 및 5'-32 P-표지된 올리고뉴클레오티드 기질 약 0.2 pmole(즉, 약 400,000 cpm)을 함유하는 40 ㎕에서 수행하였다. 올리고뉴클레오티드 프라이머는 반응 혼합물에 첨가하기 전에 열 변성시켰다. 반응물은 얼음상에 모으고, 25℃에서 30분 동안 항온처리하였다. 10 mM 트리스-Cl(pH 7.5) 200 ㎕, 15 mM EDTA, 0.6SDS 및 프로테이나제 K 0.05 ㎎/㎖를 첨가하여 반응을 정지시키고, 45℃에서 30분 이상 동안 항온처리하였다. 에탄올 침전후에, 당해 분야에 알려진 바와 같이(에컨대, Sambrook 등의 문헌(1989) 참조), 변성 8PAGE 겔상에서 생성물을 분석하였다.
F. 로머라제 활성의 정량 분석
본 실시예에서는, 정제 절차를 통해 텔로머라제 활성을 정량 분석하는 방법을 설명한다. 정량 분석은 dGTP 및 [감마-32 P]dTTP의 존재하에 올리고뉴클레오티드 프라이머의 신장을 분석함으로써 수행하였다. 간략히 언급하면, 1 μM 5'-(G4 T4 )2 -3' 올리고뉴클레오티드를 문헌[Lingner 등, Genes Develp., 8:1984(1994)]에 기재된 바와 같이 [γ-32 P]dTTP(10 mCi/㎖, 400 Ci/mmol; 1 Ci=37 GBq) 2 ㎕ 및 125 μM dGTP의 존재하에 반응 혼합물 20 ㎕에서 연장시키고, 당해 분야에 공지된 바와 같이, 8PAGE 서열 분석 겔상에 적재하였다.
본 연구의 결과는 도 28에 나타낸다. 레인 1에는, 존재하는 텔로머라제가 없으며(즉, 음성 대조군); 레인 2, 5, 8 및 11은 0.14 fmol의 텔로머라제를 함유하였고; 레인 3, 6, 9 및 12는 0.42 fmol의 텔로머라제를 함유하였으며; 레인 4, 7, 10 및 13은 1.3 fmol의 텔로머라제를 함유하였다. 제조자의 지시에 따라 포스포르이미져(몰리라 다이나믹스)를 사용하여 활성을 정량 분석하였다. 이들 조건하에, 1 fmol의 친화도 정제된 텔로머라제는 21 fmol의 dTTP를 30분내에 혼입한 것으로 측정되었다.
도 28나타낸 바와 같이, 텔로머라제의 비활성은 정제 과정을 통해 상당히 변화하였다. 친화도 정제된 텔로머라제는 완전히 활성이 있었다. 그러나, 고농도에서, 저해 활성을 검출하고 미정제 추출물의 활성은 선형이 아닌 것으로 측정되었다. 따라서, 도 28도시한 분석법에서, 미정제 추출물은 700 내지 7000배 희석하였 다. 정제시에, 이러한 저해 활성을 제거하고, 높은 효소 농도에서조차 정제된 텔로머라제 제제에서는 저해성 효과가 검출되지 않았다.
G. 전기영동 및 노던 블롯
파트 E에 나타낸 바와 같이, 텔로머라제의 정제에서의 각 단계에서, 제제는 3개의 별도의 분석에 의해 분석하였다. 본 실시예는 분획내에 존재하는 텔로머라제 RNA을 정량 분석하고, 텔로머라제 리보뉴클레오단백질 입자의 완전성을 분석하는 데 사용된 겔 전기영동 및 블로팅 절차를 설명한다.
i) 변성 겔 및 노던 블롯
본 실시예에서, 기지 농도의 합성 T7-전사된 텔로머라제 RNA를 표준으로 사용하였다. 본 조사를 통틀어, RNA 성분을 텔로머라제의 척도로서 사용하였다.
이. 에디큘라투스 텔로머라제 RNA의 파지 T7 RNA 폴리머라제 전사를 위한 구성체는 PCR을 사용하여 생성시켰다. 텔로머라제 RNA 유전자는 유전자의 어느 하나이 말단에 어닐링되는 프라이머를 사용하여 증폭시켰다. 5' 말단에서 어닐링된 프라이머는 또한 전사된 RNA의 절단시에 천연의 5' 말단, T7-프로모터 서열, 및 서브클로닝을 위한 Eco RI 부위를 생성시키기 위해 해머머리형 리보자임을 암호화하였다. 상기 5' 프라이머의 서열은 다음과 같았다:
5'-GCGGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAAGAAACTCTGATGAGGCCGAAAGGCCGAAACTCCACG AAAGTGGAGTAAGTTTCTCGATAATTGATCTGTAG-3'.
3' 프라이머는 천연의 3' 말단에 전사 종결을 위한 Ear I 부위 및 클로닝을 위한 Bam HI 부위를 포함하였다. 이 3' 프라이머의 서열은 다음과 같았다:
5'-CGGGGATCCTCTTCAAAAGATGAGAGGACAGCAAAC-3'.
PCR 증폭 생성물은 Eco RI 및 Bam HI로 절단하고, pUC19(NEB)의 각각의 부위내로 서브클로닝하여 "pEaT7"을 얻었다. 이 삽입체의 정확도는 DNA 서열 분석에 의해 확인하였다. T7 전사는 Ear I-선형화된 플라스미드를 사용하여 문헌[Zaug et al., Biochemistry (1994) 33:14935]에 기재된 바와 같이 실시하였다. RNA를 겔 정제하고, 농도를 측정하였다(A260 1= 40 ㎍/㎖). 이 RNA를 표준으로 사용하여 다양한 텔로머라제 제제에 존재하는 텔로머라제 RNA를 측정하였다.
하이브리드화 신호는 텔로머라제 RNA의 양에 비례하고, 유도된 RNA 농도는 천연 겔 전기영동에 의해 얻은 것과 유사하나, 그보다 약간 더 높았다. 기지의 T7 RNA 전사체 농도의 일련의 희석물과 전체 세포 RNA의 전체 텔로머라제 RNA의 양을 비교한 결과, 각각의 이. 에디큘라투스 세포는 약 300,000 텔로머라제 분자를 함유한 것으로 나타났다.
텔로머라제의 가시화는 문헌[Linger(1994) Genes Develop. 8:1984]에 기재된 방법을 사용하여 그 RNA 성분에 대한 노던 블롯 하이브리드화에 의해 수행하였다. 간략히 언급하면, 당해 분야에 알려진 바와 같이(예컨대, Sambrook 등의 문헌(1989) 참조), RNA(0.5 ㎍/레인 이하)를 8PAGE상에서 분리하고, 하이본드-N 막(아머샴)상에 전기 블로팅하였다. 블롯을 4x SSC 10 ㎖, 10x 덴하르트 용액, 0.1SDS 및 변성된 청어 정자 DNA 50 ㎍/㎖에서 하루밤 동안 하이브리드시켰다. 3 시간 동안 사전 하이브리드화한 후, 하이브리드화 용액 2 x 106 cpm 프로브/㎖를 첨 가하였다. 무작위 표지된 프로브는 전체 텔로머라제 RNA 유전자를 이루는 PCR-생성물이었다. 블롯은 2x SSC, 0.1SDS에서 몇 가지 완충액을 변화시키면서 세척한 다음, 45℃의 0.1x SSC 및 0.1SDS에서 1 시간 동안 세척하였다.
ii) 천연 겔 및 노던 블롯
본 실험에서는, 정제된 텔로머라제 제제를 당해 분야에 알려져 있고 문헌[Lamond(1994)의 상기 문헌 참조]에 기재된 바와 같이 3.5폴리아크릴아미드 및 0.33아가로스의 천연(즉, 비변성성) 겔상에서 전개시켰다. 텔로머라제는 크실렌 시아놀 염료와 거의 함께 이동하였다.
천연 겔의 결과는 텔로머라제가 정제 프로토콜을 통틀어서 RNP로 유지되었음을 나타냈다. 도 27은 비변성 겔상의 상이한 분획에서의 텔로머라제 뿐만 아니라, 시험관내 전사된 텔로머라제의 이동성을 나타내는 노던 블롯의 사진이다. 도 27에서, 레인 1은 1.5 fmol 텔로머라제 RNA를 함유하였고, 레인 2는 4.6 fmol 텔로머라제 RNA를 함유하였으며, 레인 3은 14 fmol 텔로머라제 RNA를 함유하였고, 레인 4는 41 fmol 텔로머라제 RNA를 함유하였으며, 레인 5는 핵 추출물(42 fmol 텔로머라제)을 함유하였고, 레인 6은 Affi-Gel-헤파린-정제된 텔로머라제(47 fmol 텔로머라제)를 함유하였으며, 레인 7은 친화도-정제된 텔로머라제(68 fmol)를 함유하였고, 레인 8은 글리세롤 구배 정제된 텔로머라제(35 fmol)를 함유하였다.
도 27에 도시한 바와 같이, 핵 추출물에서, 텔로머라제는 조립되지 않은 텔로머라제 RNA보다 더 느리게 이동한 RNP 입자로 조립되었다. 이 방법에 의해서는 1미만의 유리 RNA가 검출되었다. 그러나, 보다 느리게 이동하는 텔로머라제 RNP 복합체 역시 때때로 추출물에서 검출되었다. Affi-Gel-헤파린 칼럼상에서의 정제시에, 텔로머라제 RNP 입자는 이동성이 변화하지 않았다(도 27, 레인 6). 그러나, 친화도 정제시에 RNA 입자의 이동성은 약간 증가하였는데(도 27, 레인 7), 이것은 아마도 단백질 서브유닛 또는 단편이 상실되었음을 나타내는 것이다. 글리세롤 구배상에서, 친화도 정제된 텔로머라제는 크기가 변화하지 않았으나, 약 2의 유리 텔로머라제 RNA를 검출할 수 있었는데(도 27, 레인 8), 이것은 RNP 입자 조립체의 소량의 분해가 일어났음을 시사하는 것이다.
H. 텔로머라제 단백질 조성물
본 실시예에서는, 정제된 텔로머라제 단백질 조성물의 분석 방법을 설명한다. 파트 D에 기재한 바와 같이 얻어지는 글리세롤 구배 분획은 4 내지 20의 폴리아크릴아미드 겔(노벡스)상에서 분리하였다. 전기영동후, 겔을 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색하였다. 도 29는 겔의 사진을 나타낸다. 레인 1 및 2는 도 29에 나타낸 겔의 좌측에 나타낸 바와 같이 분자 질량 마커(파마시아)를 포함하였다. 레인 3-5는 겔의 상부에 나타낸 바와 같은 글리세롤 구배 분획 푸울을 포함하였다(즉, 레인 3은 분획 9 내지 14를, 레인 29는 분획 15 내지 22를, 레인 5는 분획 23 내지 32를 포함하였음). 레인 4는 1 pmol의 텔로머라제 RNA를 가진 푸울을 포함하였다. 레인 6 내지 9에서는 BSA 표준은 도 4의 겔의 상부에 나타낸 농도에서 전개시켰다(즉, 레인 6은 0.5 pmol BSA를 포함하였고, 레인 7은 1.5 pmol BSA를 포함하였으며, 레인 8은 4.5 BSA를 포함하였고, 레인 9는 15 pmol BSA를 포함하였음).
도 29에 도시한 바와 같이, 분자 질량 120 및 43 kDa의 폴리펩티드가 텔로머 라제와 함께 정제되었다. 43 kDa의 폴리펩티드가 이중체로서 관찰되었다. 레인 3의 약 43 kDa의 폴리펩티드는 레인 4의 이중체와는 상이하게 이동한 것을 알 수 있다. 120 kDa 및 43 kDa 이중체는 각각 BSA 표준과 비교하여 대략 1 pmol의 농도로 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색하였다. 이 분획은 텔로머라제 RNA(모두 RNP 입자로 조립되었음, 도 29, 레인 8 참조) 1 pmol을 함유하였기 때문에, 텔로머라제와 화학량론적으로 부합하는 두 개의 폴리펩티드 서브유닛인 것으로 보인다. 그러나, 43 kDa 부근의 두 개의 단백질은 별개의 효소 서브유닛일 가능성도 있다.
글리세롤 구배상에서의 분별증류에 적용시키기 않은 친화도 정제된 텔로머라제는 외관상 분자 질량이 각각 35 및 37 kDa인 추가의 폴리펩티드를 포함하였다. 이 마지막 분획은 순도가 50이상인 것으로 산정되었다. 그러나, 친화도 정제된 물질에 존재하는 35 kDa 및 37 kDa 폴리펩티드는 글리세롤 구배 원심분리에 의해 재현 가능하게 분리되지 않았다. 이들 폴리펩티드는 모든 활성을 함유하는 제제에서 볼 수 없기 때문에 오염물일 수 있다.
I. 침강계수
텔로머라제에 대한 침강계수는 글리세롤 구배 원심분리에 의해 측정하였다. 본 실시예에서, 핵 추출물 및 친화도 정제된 텔로머라제는 1 mM MgCl2 , 0.1 mM EDTA, 300 mM KGlu 및 1 mM DTT와 함께 20 mM 트리스-아세테이트를 함유하는(pH 7.5) 15 내지 40글리세롤 구배상에서 분별 증류하였다. 글리세롤 구배는 5 ㎖(13 x 51 ㎜)의 튜브에 붓고, 4℃에서 55,000 rpm의 SW55Ti 로터(베크만)를 사용하여 14 시간 동안 원심분리하였다.
마커 단백질은 대등한 구배로 전개시켰으며, 그 침강계수는 알코올 디히드로게나제(ADH)의 경우 7.6 S, 카탈라제의 경우 113 S, 아포페리틴의 경우 17.3 S 및 티로글로불린의 경우 19.3 S였다. 텔로머라제 피크는 구배 분획의 천연 겔 전기영동 및 그에 이어 그 RNA 성분에의 블롯 하이브리드화에 의해 확인하였다.
도 30은 텔로머라제에 대한 침강계수를 나타내는 그래프이다. 도 5에 도시한 바와 같이, 친화도 정제된 텔로머라제는 11.5 S에서 카탈라제와 동시에 침강된 반면에, 핵 추출물의 텔로머라제는 약간 더 빨리 침강하여 12.5 S 부근에서 피크에 이르렀다. 그러므로, 천연 겔에서 효소의 이동성과 일치되게, 정제된 텔로머라제는 단백질 분해 단편 또는 약하게 연합된 서브유닛을 상실하는 것으로 보인다.
텔로머라제에 대해 계산된 분자 질량은 그것이 하나의 120 kDa 단백질 서브유닛, 하나의 43 kDa 서브유닛 및 하나의 66 kDa 서브유닛으로 구성되는 것으로 가정하면 결국 총 229 kDa가 된다. 이것은 카탈라제의 분자 질량 232 kDa와 거의 일치하는 것이다. 그러나, 침강계수는 분자 질량의 함수일 뿐만 아니라, 분자의 부분적 비부피 및 마찰계수(둘다 유프로테스 텔로머라제 RNP에 대해서는 알려지지 않았음)의 함수이다.
J. 기질 이용
본 실시예에서, 유프로테스 텔로머라제의 기질 요건을 조사하였다. DNA 말단 복제에 대한 한 가지 간단한 모델은 반보존적 DNA 복제후에, 텔로머라제가 2본쇄의 평활 말단 DNA 분자를 연장시키는 것으로 예측한다. 이 모델의 변형예에서는, 1본쇄의 3'말단이 복제후 헬리카제 또는 뉴클레아제에 의해 생성된다. 이 3'말단은 결 합 및 연장을 위해 텔로머라제에 의해 사용된다.
텔로머라제가 평활 말단 분자를 신장시킬 수 있는 지를 측정하기 위해, 3'말단에 위치하는 말단소립 반복 서열을 가진 모델 헤어핀 구조가 합성되었다. 이들 프라이머 기질을 겔 정제하고 폴리뉴클레오티드 키나제로 5'말단 표지하고, 0.4 μM에서 80℃까지 5분 동안 가열한 다음, 가열 블록에서 실온으로 서서히 냉각시켜 헤어핀 구조를 재생시키고 나선을 형성하였다. 비변성 겔상에서의 기질 이동성은 이량체 형성에 비해 매우 효율적인 헤어핀 구조 형성이 존재함을 나타냈다.
분석은 10 mM MgCl2 , 50 mM KGlu 및 1 mM DTT와 함께 20 mM 트리스-아세테이트를 함유한 반응 혼합물(pH 7.5) 10 ㎕에 표지되지 않은 125 μM dGTP, 125 μM dTTP 및 0.02 μM 5'-말단 표지된 프라이머(5'-32 P-표지된 올리고뉴클레오티드 기질)를 사용하여 실시하였다. 이들 혼합물은 25℃에서 30분 동안 항온 처리하였다. 포름아미드 적재 완충액(즉, TBE, 포름아미드, 브롬티몰 블루 및 시아놀, Sambrook의 상기 문헌(1989) 참조)을 첨가하여 반응을 정지시켰다.
프라이머는 텔로머라제 없이("-"), 5.9 fmol의 친화도 정제된 텔로머라제 ("+")와 함께, 또는 17.6 fmol의 친화도 정제된 텔로머라제("+++")와 함께 항온처리하였다. 본 분석에 사용된 친화도 정제된 텔로머라제는 100 kDa의 분자 질량 한계를 가진 막을 사용하여 투석하여 치환 올리고뉴클레오티드를 제거하였다. 36포름아미드를 함유하는 8PAGE/우레아 겔상에서 반응 생성물을 분리하여 헤어핀 구조를 변성시켰다. 본 연구에 사용된 프라이머 서열 뿐만 아니라 그 레인 할당은 표 6에 나타낸다.
프라이머 서열
레인 프라이머 서열(5'→3')
1-3 C4 (A4 C4 )3 CACA(G4 T4 )3 G4
4-6 C2 (A4 C4 )3 CACA(G4 T4 )3 G4
7-9 (A4 C4 )3 CACA(G4 T4 )3 G4
10-12 A2 C4 (A4 C4 )2 CACA(G4 T4 )3 G4
13-15 C4 (A4 C4 )2 CACA(G4 T4 )3
16-18 (A4 C4 )3 CACA(G4 T4 )3
19-21 A2 C4 (A4 C4 )2 CACA(G4 T4 )3
22-24 C4 (A4 C4 )2 CACA(G4 T4 )3
25-27 C2 (A4 C4 )2 CACA(G4 T4 )3
28-30 (A4 C4 )2 CACA(G4 T4 )3
겔 결과는 도 31에 도시되어 있다. 레인 1-15는 4개의 G 잔기로 종결되는 말단소립 반복 서열을 가진 기질을 포함하였다. 레인 16-30은 4개의 T 잔기로 끝나는 말단소립 반복 서열을 가진 기질을 포함하였다. 텔로머라제 RNA 주형에 대한 추정적인 배열은 도 32에 나타냈다. 프라이머 세트는 도 32(즉, 각각 패널 A 및 패널 B)에 나타낸 주형에서 두 개의 매우 상이한 위치에서 어닐링되는 것으로 추정되었다. 이것은 그 결합 및/또는 신장률에 영향을 끼쳤다.
도 33은 도 31의 레인 25-30의 보다 가벼운 노출을 나타낸 것이다. 도 33의 보다 가벼운 노출은 첨가되는 뉴클레오티드 및 신장된 생성물에서의 정지의 위치를 가시화하기 위해 실시하였다. 각 세트의 세 번째 레인에 대해 신장된 기질의 비율을 도 31의 아래에 나타낸 바와 같이, 포스포르이미져 상에서 정량 분석하였다.
이들 헤어핀 구조에 대한 기질 효율은 상이한 길이의 여분 서열을 가진 2본 쇄 말단소립 유사 기질과 비교하였다. 4개의 G 잔기(도 31의 레인 1 내지 15 참조)로 종결되는 모델 기질은 평활 말단일 때는(레인 1-3 참조) 신장되지 않았다. 그러나, 두 개 염기의 여분의 길이로 약간의 연장이 관찰되었고; 신장은 여분 서열이 4개 이상의 염기 길이일 때 효율적으로 되었다. 텔로머라제는 매우 효율적인 신장에 필요한 6-염기 여분 서열과 함께 4개의 T 잔기로 종결된 2본쇄 기질과 유사한 방식으로 작용하였다. 도 31에서는, 텔로머라제와 무관한 레인 10-15의 프라이머 아래의 희미한 밴드는 프라이머 제제에서 보다 짧은 올리고뉴클레오티드를 나타낸다.
도 33의 레인 25-30의 보다 가벼운 노출은 주형의 추정 5' 경계와 관계 있는 가장 어두운 밴드와 함께 신장된 생성물의 사다리형을 나타낸다(문헌[Lingner 등, Genes Develop., 8:1984(1994)]에 기재된 바와 같이). 주형내 다른 위치에 상응하는 생성물이 풍부하다는 것은 정지 및/또는 해리가 정제된 텔로머라제와 전좌 부위이외의 부위에서 일어난다는 것을 시사한다.
도 31에 도시한 바와 같이, 2본쇄의 평활 말단 올리고뉴클레오티드는 텔로머라제의 기질이 아니었다. 이들 분자가 텔로머라제에 결합할 것인지를 측정하기 위해 경쟁 실험을 실시하였다. 이 실험에서는, 서열 (G4 T4 )2 (서열번호 61)를 가진 2 nM의 5'-말단 표지된 기질 또는 6개 염기의 여분 서열을 가진 헤어핀 기질을 0.125 nM 텔로머라제를 사용하여 연장시켰다(도 31, 레인 25-27). 동일한 비표지된 올리고뉴클레오티드 기질은 연장용의 표지된 기질과 효율적으로 경쟁하지만, 2본쇄의 평활 말단 헤어핀 구조 올리고뉴클레오티드를 경쟁인자로서 사용할 때는 100배 과량의 헤어핀 구조의 존재하에서도 활성의 감소가 관찰되지 않았다.
이러한 결과는 2본쇄의 평활성 말단 올리고뉴클레오티드가 본 실시예에서 시험한 농도 및 조건에서 텔로머라제에 결합할 수 없음을 나타냈다. 대신에, 1본쇄의 3' 말단이 결합에 필요하다. 이 3' 말단이 텔로머라제 RNA 주형과 염기쌍을 형성하는 데 필요한 것 같다.
K. 123 kDa 폴리펩티드의 클로닝 및 서열 분석
본 실시예에서는, 텔로머라제의 유프로테스 123 kDa 폴리펩티드의 클로닝을 설명한다. 본 연구에서는, 상기 파트 D에서 얻은 정제된 폴리펩티드로부터 얻은 펩티드 서열에 일치하도록 조작된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여, 텔로머라제 유전자의 내부 단편을 PCR로 증폭시켰다. 폴리펩티드 서열은 당해 분야에 알려져 있고 문헌[Calvio(1995) RNA 1:724-733]에 기재된 nanoES 직렬식 질량 분광 분석 방법을 사용하여 측정하였다. 본 실시예에서 사용된 올리고뉴클레오티드 프라이머는 다음과 같은 서열을 가졌는데, 괄호 안에는 축퇴성인 위치를 나타냈다:
5'-TCT(G/A)AA(G/A)TA(G/A)TG(T/G/A)GT(G/A/T/C)A(T/G/A)(G/A)TT(G/A)TTCAT-3' 및 5-GCGGATCCATGAA(T/C)CC(A/T)GA(G/A)AA(T/C)CC(A/T)AA(T/C)GT-3'.
50 ㎕의 반응물은 0.2 mM dNTP, 이. 에디큘라투스 염색체 DNA 0.15 ㎍, Taq (베링거-만하임) 0.5 ㎕, 각 프라이머 0.8 ㎍ 및 1X 반응 완충액(베링거-만하임)을 함유하였다. 95℃에서 5분, 그 다음에 94℃에서 1분, 52℃에서 1분 및 72℃에서 2분으로 이루어진 30 주기의 조건을 사용하여 반응물을 열교환기(퍼킨-엘머)에서 항온처리하였다. 반응은 72℃에서 10분 항온처리에 의해 완료되었다.
게놈 DNA 라이브러리는 평활 말단 DNA를 pCR-스크립트 플라스미드 벡터(스트 라타진)의 Sma I 부위내로 클로닝하여 염색체 이. 에디큘라투스 DNA로부터 제조하였다. 이 라이브러리는 방사성 표지된 겔 정제된 PCR 생성물을 사용하여 콜로니 하이브리드화에 의해 검색하였다. 양성 클론의 플라스미드 DNA는 자동 서열분석기(ABI)를 사용하여 디데옥시 방법(Sanger 등, Proc. Natl. Acad. Sci., 74:5463[1977])으로 또는 수작업으로 제조하고 서열 분석하였다. 상기 폴리펩티드를 암호화하는 유전자의 DNA 서열은 도 13A 및 도 13B에 도시한다. DNA 서열로부터 추론된 상기 서열에서의 개시 코돈은 뉴클레오티드 위치 101에 위치하고, 개방형 리딩 프레임은 위치 3193에서 종결된다. 유프로테스의 유전자 암호는 "UGA" 코돈이 시스테인 잔기를 암호화한다는 점에서 다른 생물과 상이하다. DNA 서열로부터 추론된 폴리펩티드의 아미노산 서열은 도 14에 도시되어 있고, 희귀 아미노산은 해독중에 삽입되지 않으며, 해독후 변형이 일어나지 않는 것으로 가정한다.
L, 43 kDa 폴리펩티드의 클로닝 및 서열 분석
본 실시예에서는, 유프로테스 텔로머라제의 43 kDa 폴리펩티드(즉, 43 kDa 단백질 서브유닛)의 클로닝 방법을 설명한다. 본 연구에서는, 상응하는 텔로머라제 유전자의 내부 단편은 상기 파트 D에서 얻은 정제된 폴리펩티드로부터 얻은 펩티드 서열에 일치하도록 조작된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여, PCR로 증폭시켰다. 폴리펩티드 서열은 당해 분야에 알려져 있고 Calvio의 상기 문헌에 기재된 nanoES 직렬식 질량 분광 분석 방법을 사용하여 측정하였다. 본 실시예에서 사용된 올리고뉴클레오티드 프라이머는 다음과 같은 서열을 가졌다:
5'-NNNGTNAC(C/T/A)GG(C/T/A)AT(C/T/A)AA(C/T)AA-3' 및
5-(T/G/A)GC(T/G/A)GT(C/T)TC(T/C)TG(G/A)TC(G/A)TT(G/A)TA-3'.
상기 서열에서, "N"은 4개의 뉴클레오티드(즉, A, T, G 또는 C)중 임의의 것을 존재를 나타낸다.
상기 파트 K에서 기술한 대로 PCR을 실시하였다. 게놈 DNA 라이브러리는 상기 파트 K에서 기술한 바와 같이 제조하고 서열 분석하였다. 이 폴리펩티드를 암호화하는 유전자의 DNA는 도 35A 내지 도 35D에 나타낸다. 3개의 잠재적인 리딩 프레임은 도 35A 내지 도 35D에 나타낸 바와 같이 상기 서열에 대해 나타낸다. 명료하게 하기 위해, 아미노산 서열은 모든 3개의 리딩 프레임에서 뉴클레오티드 서열 아래에 나타낸다. 이들 리딩 프레임은 각각 "a", "b" 및 "c"로 명명하였다. 가능한 개시 코돈은 리딩 프레임 "c"의 뉴클레오티드 위치 84에서 암호화된다. 이들 암호 영역은 리딩 프레임 "b"의 위치 1501에서 종결될 수 있다. 초기의 종결 코돈은 도 35A 내지 도 35D에서 별표로 나타낸 것으로서, 뉴클레오티드 위치 337 내지 350 사이의 3개 모두의 리딩 프레임에서 나타난다.
"La-도메인"은 굵은 활자체로 나타낸다. 더 하류에서 단백질 서열은 3개 리딩 프레임의 어느 것도 종결 코돈에 의해 차단되지 않기 때문에 상이한 리딩 프레임에 의해 암호되는 것으로 보인다. 또한, 정제된 단백질의 펩티드 서열은 3개의 리딩 프레임 모두에서 암호화된다. 그러므로, 이 유전자는 간섭 서열을 포함하거나 아니면 RNA가 편집되는 것으로 보인다. 기타 가능성으로는 리조좀에 의한 틀변경 또는 서열 착오가 있다. 그러나, La-단백질 서열에 대한 상동성은 상당한 흥미거리로 남아 있다. 마찬가지로, 유프로테스에서는 "UGA" 코돈은 시스테인 잔기를 암호 화한다.
M. 아미노산 및 핵산의 비교
본 실시예에서는, 다양한 보고된 서열과 유프로테스 123 kDa 및 43 kDa 텔로머라제 서브유닛 폴리펩티드 서열을 비교하였다.
i) 123 kDa 이. 에디큘라투스 텔로머라제 서브유닛과의 비교
123 kDa 유프로테스 에디큘라투스 폴리펩티드의 아미노산 서열은 테트라히메나 서모필라(젠뱅크 승인번호 #25641)의 80 kDa 텔로머라제 단백질 서브유닛의 서열과 비교하여 그 유사성을 조사하였다. 상기 단백질을 암호화하는 젠뱅크에서 입수한 뉴클레오티드 서열은 도 42에 나타낸다. 젠뱅크에서 얻은 상기 단백질의 아미노산 서열은 도 43에 나타낸다. 123 kDa 이. 에디큘라투스와 80 kDa 티. 써모필라 사이의 서열 비교는 도 36A 및 도 36B에 도시한다. 도 36A 및 도 36B에서, 이. 에디큘라투스 서열은 상부의 서열이고, 티. 써모필라 서열은 하부의 서열이다. 도 36A 및 도 36B 내지 39에서는 동일성이 수직의 막대로 나타나 있고, 반면에 서열들 사이의 단일 점들은 다소 유사한 아미노산을, 그리고 서열들 사이의 2중 점들은 보다 유사한 아미노산을 나타낸다.
123 kDa 유프로테스 에디큘라투스 폴리펩티드의 아미노산 서열은 또한 테트라히메나 써모필라(젠뱅크 승인번호 #U25642)의 95 kDa 텔로머라제 단백질 서브유닛의 서열과 비교하여 그 유사도를 조사하였다. 상기 단백질을 암호화하는 젠뱅크에서 얻은 뉴클레오티드 서열은 도 44에 나타낸다. 젠뱅크에서 얻은 상기 단백질의 아미노산 서열은 도 45에 나타낸다. 이 서열 비교는 도 37에 도시한다. 도 37에서, 이. 에디큘라투스 서열은 상부의 서열이고, 티. 써모필라 서열은 하부의 서열이다. 관찰된 동일성은 약 20로 측정된 반면에, 유사도는 약 43인데, 이 값은 임의의 무작위 단백질 서열의 경우 관찰되는 것과 유사한 것이다.
123 kDa 이. 에디큘라투스 폴리펩티드의 아미노산 서열은 역전사 효소의 특징인 5개의 모티프를 포함한다는 점이 중요하다. 123 kDa 폴리펩티드는 또한 다양한 역전사 효소(서열번호 14-17 및 19-22)의 폴리머라제 도메인과 비교하였다. 도 40은 추정 효소 상동체(L8543.12 또는 EST2p)와 함께 123 kDa 폴리펩티드를 배열한 것이다. 젠뱅크에서 입수한 L8543.12의 아미노산 서열은 도 46에 나타낸다.
4개의 모티프(A, B, C 및 D)가 이 비교에 포함되었다. 도 40는, 고도로 보존된 잔기가 흑색 배경상에 흰색 문자로 나타나 있다. 다른 서열에서 보존되어 있는 이. 에디큘라투스의 잔기는 굵은 활자체로 나타나 있고; "h"는 소수성 아미노산의 존재를 나타낸다. 모티프의 아미노산 잔기 사이에 위치한 숫자는 서열에서의 갭의 길이를 나타낸다. 예를 들면, 모티프 A와 B 사이에 나타낸 "100"은 모티프들 사이의 서열의 100개 아미노산 갭을 반영한다.
전술한 바와 같이, 젠뱅크 탐색에 의해, 이. 에디큘라투스 123 kDa 텔로머라제 서브유닛에 대한 약간의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 암호화하거나 또는 포함하는 효모 단백질(젠뱅크 승인번호 #U20618) 및 유전자 L8543.12(Est2)를 동정하였다. 두 단백질이 그 C-말단 영역에서 역전사 효소 모티프를 포함하고; 두 단백질은 역전사 효소 모티프의 외부 영역에서 유사도를 공유하며; 단백질은 유사하게 염기성이고(이. 에디큘라투스의 경우 pI=10.1이고, 효모의 경우 pI=10.0임); 두 단 백질은 크다(이. 에디큘라투스의 경우 123 kDa이고, 효모의 경우 103 kDa임)는 관찰에 근거하여, 이들 서열은 그 각각의 텔로머라제의 촉매 중심을 포함한다. 이. 에디큘라투스와 효모와 같이 계통 발생학적으로 구별되는 두 생물에서의 상동성의 상기 관찰에 근거하여 인간 텔로머라제는 동일한 특성을 가진(즉, 역전사 효소 모티프가 염기성이고 크기가 큰[>100 kDa] 단백질을 포함하는 것으로 생각되었다.
ii) 43 kDa 이. 에디큘라투스 텔로머라제 서브유닛과의 비교
43 kDa 유프로테스 에디큘라투스 폴리펩티드의 "La-도메인"의 아미노산 서열은 테트라히메나 서모필라(상기 참조)의 95 kDa 텔로머라제 단백질 서브유닛의 서열과 비교하여 그 유사성을 조사하였다. 이 서열 비교는 도 38에 도시하였고, 티. 써모필라 서열은 하부의 서열이다. 관찰된 동일성은 약 23로 측정된 반면에, 본 유사도는 약 46인데, 이 값은 임의의 무작위 단백질 서열의 경우 관찰되는 것과 유사한 것이다.
43 kDa 유프로테스 에디큘라투스 폴리펩티드의 "La-도메인"의 아미노산 서열은 또한 테트라히메나 써모필라(상기 참조)의 80 kDa 텔로머라제 단백질 서브유닛의 서열과 비교하여 그 유사도를 조사하였다. 이 서열 비교는 도 39에 도시한다. 도 39에서, 이. 에디큘라투스 서열은 상부의 서열이고, 티. 써모필라 서열은 하부의 서열이다. 관찰된 동일성은 약 26로 측정된 반면에, 유사도는 약 49인데, 이 값은 임의의 무작위 단백질 서열의 경우 관찰되는 것과 유사한 것이다.
43 kDa 이. 에디큘라투스 폴리펩티드의 도메인의 아미노산 서열(서열번호 23)은 다양한 기타 생물에서 유래한 La 단백질(서열번호 24-27)과 비교하였다. 이 들 비교는 도 41에 나타냈다. 도 41에서, 고도로 보존된 잔기는 흑색 배경상에 흰색 문자로 나타냈다. 다른 서열에 보존되어 있는 이. 에디큘라투스 서열의 잔기는 굵은 활자체로 나타냈다.
N. 다른 유기체에서의 텔로머라제 단백질 서브유닛의 동정
본 실시예에서는, 전술한 실시예들에서 동정된 서열을 사용하여 이. 에디큘라투스와 친연 관계가 매우 먼 섬모충류인 옥시트리차 트리팔락스의 텔로머라제 단백질 서브유닛을 동정하였다. 역전사 효소 도메인 모티프를 포함한 이. 에디큘라투스 123 kDa 폴리펩티드의 보존된 영역에 근거하여 프라이머를 선택하였다. 옥시트리차에서 얻은 총 DNA를 사용하여 적당한 프라이머를 합성하고 PCR 반응에 사용하였다. 옥시트리차 DNA는 당해 분야에 공지된 방법에 따라 준비하였다. PCR 생성물은 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 클로닝하고 서열 분석하였다.
프라이머로서 사용된 올리고뉴클레오티드 서열은 다음과 같았다:
5'-(T/C)A(A/G)AC(T/A/C)AA(G/A)GG(T/A/C)AT(T/C)CC(C/T/A)(C/T)A(G/A)GG-3' 및 5'-(G/A/T)GT(G/A/T)ATNA(G/A)NA(G/A)(G/A)TA(G/A)TC(G/A)TC-3'.
축퇴성인 위치는 괄호안에 나타내고, 대안적인 염기는 괄호내에 나타낸다. "N"은 4개 뉴클레오티드중의 하나를 나타낸다.
PCR 반응에서, 50 ㎕ 반응물은 0.2 mM dNTP, 옥시트리차 트리팔락스 염색체 DNA 0.3 ㎍, Taq 폴리머라제(베링거-만하임) 1 ㎕, 각 프라이머 2 마이크로몰 및 1x 반응 완충액(베링거-만하임)을 함유하였다. 95℃에서 5분; 94℃에서 1분, 53℃에서 1분 및 72℃에서 1분으로 이루어진 30 주기; 및 이어서 72℃에서 10분의 조건 하에 반응물을 열교환기(퍼킨-엘머)에서 항온처리하였다. PCR 생성물은 겔 정제하고 디데옥시 방법으로 서열 분석하였다(예컨대, 문헌[Sanger(1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-5467] 참조).
PCR 생성물의 추론된 아미노산 서열을 결정하고 이. 에디큘라투스 서열과 비교하였다. 도 47은 이들 서열을 상부열에 나타낸 오. 트리팔락스 서열 및 하부열에 나타낸 이. 에디큘라투스 서열과 함께 배열한 것이다. 도 47으로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 실시예에서 동정된 오. 트리팔락스 폴리펩티드 서열과 이. 에디큘라투스 폴리펩티드 서열 사이에는 상당한 상동성이 있다. 따라서, 본 발명에서 동정된 서열은 다른 진핵 생물에서의 상동성 텔로머라제 단백질 서브유닛의 동정에 유용한 것임이 명백하다. 실제로, 본 발명의 개발에 의해 전술한 바와 같이 다수의 다양한 종에서 상동성 텔로머라제 서열을 동정하였다.
O. 테트라히메나 텔로머라제 서열의 동정
본 실시예에서는, 유프로테스 서열 및 EST2p와 상동성을 공유하는 테트라히메나 클론이 생산되었다.
본 실험은 테트라히메나, 유프로테스 및 EST2p 서열 사이의 상동성 영역을 동정하기 위한 보존된 모티프에 대해 유도된 축퇴성 올리고뉴클레오티드 프라이머와 함께 PCR을 이용하였다. 본 실시예에 사용된 PCR 방법은 복합 혼합물로부터 특이적으로 희귀한 DNA 서열을 증폭시키도록 조작된 신규의 방법이다. 이 방법은 PCR 클로닝 방법에서 통상 나타나는 두 말단에서 동일한 PCR 프라이머를 사용한 DNA 생성물(즉, 단일 프라이머 생성물)의 증폭의 문제를 피한 방법이다. 이들 단일의 프 라이머 생성물은 원치 않는 배경 농도를 산출하고, 종종 목적하는 두 프라이머 생물의 증폭 및 검출을 모호하게 할 수 있다. 본 실험에 사용된 방법은 두 프라이머 생성물을 우선적으로 선별한다. 구체적으로, 하나의 프라이머는 비오티닐화되고 다른 하나는 그렇지 않다. PCR 증폭 반응의 수차례의 실시후에, 생성물는 스트렙트아비딘 자기 비드를 사용하여 정제하고 프라이머 생성물은 열 변성을 사용하여 특이적으로 용출시킨다. 이 방법은 본 실시예에서 설명한 실험 이외의 경우에도 사용할 수 있다. 실제로, 이 방법은 희귀한 DNA 서열을 특이적으로 증폭시키고자 하는 용도로, 예컨대, 5' 및 3과 같은 클로닝 방법; RACE; 및 PCR에서 축퇴성 프라이머를 사용하는 임의의 방법에 사용할 수 있다.
당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 분리된 테트라히메나 주형 거대핵 DNA와, FFYXTE 영역에 상응하는 "K231"로 명명된 서열 5' 비오틴-GCCTATTT(TC)TT(TC)TA(TC)(GATC)(GATC)(GATC)AC(GATC)GA-3'을 가진 24량체 순방향 프라이머 및 DDFL(FIL)I 영역에 상응하는 "K220"으로 명명된 서열 5'-CCAGATAT(GATC)A(TGA)(GATC)A(AG)(AG)AA(AG)TC(AG)TC-3'을 가진 23량체 역방향 프라이머를 사용하여 제1의 PCR 반응을 수행하였다. 이 PCR 반응물은 DNA(50 ng) 2.5 ㎕, 각 프라이머(20 μM) 4 ㎕, 10x PCR 완충액 3 ㎕, 10 x dNTP 3 ㎕, Mg 2 ㎕, Taq 0.3 ㎕ 및 dH2 O 11.2 ㎕를 함유하였다. 이 혼합물은 94℃에서 45초, 37℃에서 45초, 37℃에서 45초 및 72℃에서 1분의 8 주기 동안 순환시켰다.
상기 PCR 반응물은 200 ㎕ 스트렙트아비딘 자기 비드에 결합시키고, TE 200 ㎕로 세척하고, dH2 O 20 ㎕에 재현탁시킨 다음, 100℃에서 2분 동안 비등시켜 열 변성시켰다. 비드를 당기고, 용출물을 제거하였다. 다음, 감마-32 P dATP 0.3 ㎕를 포함한 것을 제외하고는 상기 조건을 사용하여, 이 용출물 2.5 ㎕를 재증폭시켰으며, PCR은 33 주기 동안 수행하였다. 이 반응은 5변성 폴리아크릴아미드 겔에서 수행하고, 적당한 영역을 겔로부터 절단하였다. 이들 생성물을 상기 조건하에서 42℃ 어닐링 온도를 사용한 것을 제외하고는 전술한 조건하에 추가 34 주기 동안 재증폭시켰다.
두 번째 PCR 반응은 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 분리된 테트라히메나 거대핵 DNA 주형과, R(LI)(LI)PKK 영역에 상응하는 "K228"로 명명된 서열 5'-ACAATG(CA)G(GATC)(TCA)T(GATC)(TCA)T(GATC)CC(GATC)AA(AG)AA-3'을 가진 23량체 순방향 프라이머 및 CYDSIPR 영역에 상응하는 "K224"로 명명된 서열 5'-ACGAATC(GT)(GATC)GG(TAG)AT(GATC)(GC) (TA)(AG)TC (AG)TA(AG)CA3'을 가진 역방향 프라이머를 사용하여 수행하였다. 이 PCR 반응물은 DNA(50 ng) 2.5 ㎕, 각 프라이머(20 μM) 4 ㎕, 10x PCR 완충액 3 ㎕, 10 x dNTP 3 ㎕, Mg 2 ㎕, 감마-32 P dATP 0.3 ㎕, Taq 0.3 ㎕ 및 dH2 O 10.9 ㎕를 함유하였다. 이 반응은 5변성 폴리아크릴아미드 겔에서 수행하고, 적당한 영역을 겔로부터 절단하였다. 이들 생성물을 상기 조건하에서 42℃ 어닐링 온도를 사용한 것을 제외하고는 전술한 조건하에 추가 34 주기 동안 재증폭시켰다.
반응 수행 1로부터 생성된 반응 생성물 10 ㎕를 TE 200 ㎕에서 스트렙트아비 딘 코팅된 자기 비드에 결합시켰다. 비드를 TE 200 ㎕로 세척한 다음, dH2 O 20 ㎕에 재현탁시키고, 열 변성시키며, 용출물을 제거하였다. 다음, 상기 조건을 사용하여 이 용출물 2.5 ㎕를 33 주기 동안 재증폭시켰다. 반응 수행 2에서 얻은 반응 생성물을 비드에 첨가하고 0.5x SSC 30 ㎕로 희석시켰다. 이 혼합물을 94℃로부터 50℃까지 가열하였다. 용출물을 제거하고 비드를 55℃에서 0.5x SSC에서 3회 세척하였다. 그 다음, 비드를 dH2 O 20 ㎕에 재현탁시키고, 열 변성시키며, 용출물을 제거하여 "반응 수행 1 용출물"이라 명명하고 보관하였다.
테트라히메나 밴드를 분리하기 위해, 반응 수행 1 용출물을 순방향 프라이머 K228 및 역방향 프라이머 K227을 사용하여 재증폭시켰는데, 여기서, 상기 역방향 프라이머는 DIKSCYD 영역에 상응하는 서열 5'-CAATTCTC(AG)TA(AG)CA(GATC)(CG)(TA) (CT)TT(AGT)AT(GA)TC-3'을 가진 것이다. PCR 반응은 상기한 바와 같이 수행하였다. 반응 생성물은 5폴리아크릴아미드 겔상에서 전개시키고; 약 295 뉴클레오티드에 상응하는 밴드를 겔로부터 절단하고 서열 분석하였다.
168-3으로 명명한 클론을 서열 분석하였다. 그 DNA 서열(프라이머 서열 포함)은 다음 서열로 확인되었다:
Figure 111999002929091-pct00034
상기 유전자의 추가 서열은 168-3(서열 5'-GAGTGACATAATATACGTGA-3'을 가진 "K297")에서 유래한 서열과 일치하도록 조작된 특이 프라이머 및 K231(FFYXTE) 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 얻었다. 168-3과 함께 이 반응으로부터 얻은 단편의 서열은 다음과 같다(프라이머 서열은 없음):
Figure 111999002929091-pct00035
상기 DNA 단편에 상응하는 아미노산 서열은 다음 서열로 확인되었다:
Figure 111999002929091-pct00036
상기 아미노산 서열은 기타 텔로머라제 유전자(EST2p 및 유프로테스)와 함께 배열하였다. 그 배열은 도 53에 나타냈다. 일치 서열 역시 도 53에 나타냈다.
P. 시키조사카로마이세스 폼베 텔로머라제 서열의 동정
본 실시예에서는 에스. 폼베의 tez1 서열은 이. 에디큘라투스 p123 및 에스. 세레비제 Est2p의 상동체로서 동정되었다.
도 55A 및 도 55B는 상기 실험을 전체적으로 요약한 것이다. 도 55A 및 도 55B에서, 상부(패널 A)는 두 개의 중첩하는 게놈 클론과 서열 분석된 5825 bp의 부분의 관계를 나타낸다. "tez1 + "로 명명된 영역은 단백질 암호 영역이며, 인접 서열 역시 나타나 있고, 5825 bp 영역 아래의 상자는 후술하는 바와 같이 tez1 분리 구성체의 제조에 사용된 약 2 kb의 Hind III 단편이다.
도 55A 및 도 55B의 하부(패널 B)는 DNA의 상기 동일 영역을 "부각시킨" 개략도이다. "본래의 PCR"로 명명된 서열은 기재한 대로 유프로테스 서열 모티프 4(B') 및 모티프 5(C)를 기준으로 명명된 축퇴성 올리고뉴클레오티드 프라이머쌍과 함께 생성된 본래의 축퇴성 PCR 단편이다.
i) 축퇴성 프라이머를 사용한 PCR
축퇴성 프라이머를 사용한 PCR을 사용하여 에스. 폼베에서 이. 에디큘라투스 p123의 상동체를 발견하였다. 도 56dms 이 반응에 사용된 축퇴성 프라이머("폴리 4" 및 "폴리 1"로 명명함)의 서열을 나타낸다. PCR 반응은 전술한 실시예들에서 설명한 것과 동일한 완충액을 사용하여, 94℃에서 램프(ramp) 시간 5분으로 수행하고, 이어서 94℃에서 30초, 50℃에서 45초 및 72℃에서 30초로 이루어진 30 주기, 그 후 72℃에서 7분 동안 수행하고, 이어서 4℃에서 보관하였다. 변화된 조건(즉, 에스. 폼베 DNA의 다양한 농도 및 MgCl2 농도)을 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. PCR 생성물은 아가로스 겔상에서 전개하고 전술한 바와 같이 에씨듐 브로마이드로 염색하였다. 여러 가지 PCR 반응 수행으로 3개 밴드("T", "M" 및 "B")를 생성시켰다. 이들 밴드는 전술한 것과 동일한 조건을 사용하여 재증폭시키고 겔상에서 전개하였다. 재증폭 반응후 4개의 밴드("T", "M1", "M2" 및 "B")가 관찰되었고, 도 57에 나타냈다. 이들 4개의 밴드는 전술한 것과 동일한 조건을 사용하여 재증폭시켰다. 도 57의 레인의 위로부터 세 번째의 밴드는 텔로머라제 단백질에 대한 정확한 서열을 포함하는 것으로 확인되었다. M2로 명명한 PCR 생성물은 도 58A 및 도 58B에 나타낸 바와 같이 다른 텔로머라제 단백질과 합리적인 일치성을 나타내는 것으로 확인되었다. 나타낸 배열 외에도, 도 58A 및 도 58B은 또한 tez1 의 실제 서열을 나타낸다. 도 58A 및 도 58B에서, 별표는 모두 4개의 서열(옥시트리차 "Ot"; 이. 에디큘라투스 "Ea_p123"; 에스. 세레비제 "Sc_p103"; 및 M2)과 공통되는 잔기를 나타내는 반면에, 원(즉, 점)은 유사한 아미노산 잔기를 나타낸다.
ii) 3' RT PCR
추가의 서열 정보를 얻기 위해, 도 58A 및 도 58B에서 동정된 후보 텔로머라제상에서 3' 및 5' RT PCR을 수행하였다. 도 59는 사용된 3'RT PCR 방법의 개략도이다. 먼저, 올리고뉴클레오티드 프라이머 "QT "(5'-CCA GTG AGC AGA GTG ACG AGG ACT CGA GCT CAA GCT TTT TTT TTT TTT TT-3')를 사용하여 mRNA로부터 제조한 다음, "QO "(5'-CCA GTG AGC AGA GTG ACG-3') 및 본래의 축퇴된 PCR 반응에 기초하여 조작된 프라이머(즉, 서열 5'-G TGT CAT TTC TAT ATG GAA GAT TTG ATT GAT G-3'와의 PCR용 주형으로 상기 cDNA를 사용하였다. "QI "(5'-GAG GAC TCG AGC TCA AGC-3') 및 본래의 축퇴성 PCR 반응으로부터 유래한 서열을 가진 또 다른 PCR 프라이머, 즉 "M2-T2"(5'-AC CTA TCG TTT ACG AAA AAG AAA GGA TCA GTG-3')과의 두 번째 PCR 반응(즉, 네스트형 PCR)을 수행하였다. 이 PCR에 사용된 완충액은 전술한 바와 동일하고, 94℃에서 5분의 램프로 시작하여 94℃에서 30초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 3분으로 이루어진 30 주기, 그 후 72℃에서 7분 동안 증폭을 수행하였다. 반응 생 성물은 사용시까지 4℃에서 보관하였다.
iii) 게놈 라이브러리 및 cDNA 라이브러리의 검색
상기 추가의 서열 정보를 얻은 후에, 몇 가지 게놈 및 cDNA 라이브러리를 검색하여 상기 텔로머라제 후보 유전자를 포함하는 임의의 라이브러리를 동정하였다. 사용된 방법 뿐만 아니라, 라이브러리 및 결과는 도 60에 도시한다. 도 60에서, 패널 A는 상기 실험에서 시험한 라이브러리를 나열한 것이고; 패널 B는 사용된 영역을 나타내며; 패널 C 및 D는 상기 라이브러리로부터 얻은 도트 블롯 하이브리드화 결과를 나타낸다. 그 다음, 양성 라이브러리는 콜로니 하이브리드화에 의해 검색하여 tez1 유전자의 게놈 및 cDNA 라이브러리를 얻었다. 상기 실험에서, Hin dIII 게놈 라이브러리로부터 얻은 약 3 x 104 콜로니를 검색하고 6개의 양성 클론을 동정하였다(약 0.01). DNA는 두 개의 독립 클론(A5 및 B2)으로부터 제조하였다. 도 61은 Hin dIII-처리된 A5 및 B2 양성 게놈 클론을 사용하여 얻은 결과를 나타낸다.
또한, cDNA REP 라이브러리를 사용하였다. 약 3 x 105 콜로니를 검색하고, 5개의 양성 클론을 동정하였다(0.002). 3개의 독립 클론(2-3, 4-1 및 5-20)으로부터 DNA를 제조하였다. 추후의 실험에서, 2-3 및 5-20은 동일한 삽입체를 포함하는 것으로 측정되었다.
iv) 5' RT PCR
이 지점까지 생성된 유전자의 cDNA는 완전하지 않기 때문에, 전길이의 클론을 얻기 위해 5' RT-PCR을 수행하였다. 그 방법은 도 62에 개략적으로 도시되어 있 다. 이 실험에서, cDNA는 이미 동정된 tez1 의 공지된 영역으로부터 조작된 DNA 올리고뉴클레오티드 프라이머 "M2-B"(5'-CAC TGA TCC TTT CTT TTT CGT AAA CGA TAG GT-3') 및 "M2-B2"(5'-C ATC AAT CAA ATC TTC CAT ATA GAA ATG ACA-3')를 사용하여 cDNA를 제조하였다. 포스포릴화된 5' 말단("P")(P-GGG CCG TGT TGG CCT AGT TCT CTG CTC-3')를 가진 올리고뉴클레오티드 링커 PCR Adapt SfiI을 이 cDNA의 3' 말단에 결찰시키고, 이 구성체를 네스트형 PCR용 주형으로서 사용하였다. 제1회의 PCR에서, PCR Adapt SF1 및 M2-B를 프라이머로서 사용한 반면에; 제2회에서는 PCR Adapt SfiII(5'-GAG GAG GAG AAG AGC AGA GAA CTA GGC CAA CAC GCC CC-3') 및 M2-B2을 프라이머로서 사용하였다. 네스트형 PCR을 사용하여 반응의 특이성을 증가시켰다.
v) 서열 정렬
tez1 의 서열이 일단 동정되면, 그것을 전술한 서열들과 비교하였다. 도 63은 에스. 폼베("S.p. Tez1p"), 에스. 세레비제("S.c. Est2p") 및 이. 에디큘라투스 p123("E.a. p123")의 텔로머라제 촉매성 서브유닛의 RT 도메인의 배열을 나타낸 것이다. 도 63에서, "h"는 소수성 잔기를 나타내는 반면에, "p"는 소형 극성 잔기를 나타내며, "c"는 전하를 띤 잔기를 나타낸다. 전술한 아미노산 잔기는 문헌[Xiong (1990) EMBO J. 9:3353-3362]에 기재된 일치 RT 모티프를 나타낸다. 별표는 모두 3개의 단백질에 대해 보존되는 잔기를 나타낸다. "모티프 O"는 본원에서 도 63에서 상기 텔로머라제 서브유닛에 특이적인 모티프로서 동정되고, 일반적으로 역전사 효소에서는 발견되지 않는다. 그러므로, 텔로머라제 촉매성 서브유닛으로서 다른 아 미노산 서열을 동정하는데 있어서 중요하다.
도 64A 및 도 64J는 유프로테스("Ea_p123"), 에스. 세레비제("Sc_Est2p") 및 에스. 폼베("Sp_Tez1p")에서 유래한 전체 서열의 배열을 도시한 것이다. 패널 A에서, 흐리게 표시된 영역은 두 서열들 사이에 공유된 잔기를 나타낸다. 패널 B에서, 흐리게 표시된 영역은 3개 서열 모두 사이에 공유된 잔기를 나타낸다.
vi) tez1의 유전자 분리
본 실시예에서, tez1 의 분리(disruption) 효과를 조사하였다. 텔로머라제는 말단소립 유지에 관여하기 때문에, tez1 이 실제로 텔로머라제 성분이라면, tez1 의 분리는 점진적인 말단소립 단축을 일으킬 것으로 가정되었다.
이들 실험에서, 상동 재조합을 사용하여 에스. 폼베에서 특이적으로 tez1 유전자를 분리시켰다. 이러한 방법은 도 65에 개략적으로 예시하였다. 도 65에 나타낸 바와 같이, 야생형 tez1 은 ura4 또는 LEU2 마커를 포함하는 단편으로 대체하였다.
tez1 유전자의 분리는 PCR로 확인하였으며(도 66), 서던 블롯을 실시하여 말단소립 길이를 검사하였다. 도 67은 이 실험에 대한 서던 블롯 결과를 나타낸다. ApaI 제한 효소 부위는 에스. 폼베에서 말단소립 서열에 바로 인접하여 존재하기 때문에, 에스. 폼베 게놈 DNA 제제의 ApaI 처리로 말단소립 길이를 분석할 수 있다. 따라서, 에스. 폼베에서 유래한 DNA는 ApaI 로 처리하고, 처리 생성물을 아가로스 겔상에서 전개하고, 분리된 에스. 폼베의 말단소립이 단축되었는 지를 측정하기 위해 말단소립 서열 특이적 프로브로 처리하였다. 그 결과는 도 67에 나타냈다. 이 들 결과로부터, tez1 유전자의 분리는 말단소립의 단축을 일으킨 것임이 명백하였다.
Q. 인간 텔로머라제 역전사 효소 단백질 및 cDNA의 클로닝 및 특성 분석
본 실시예에서는, 인간 텔로머라제 역전사 효소에 대한 핵산 및 아미노산 서열 정보를 측정하였다. 부분적인 상동성 서열은 BLAST 탐색에서 먼저 동정되었는데, 상기 데이타베이스는 유프로테스 123 kDa 펩티드 및 핵산 서열 뿐만 아니라, 시조사카로마이세스 단백질 및 상응하는 cDNA(tez1) 서열을 사용하여 수행하였다. "hTCP1.1"로도 지칭되는 인간 서열은 부분적인 cDNA 클론(클론 712562)이다.
이 클론에서 유래한 서열은 전술한 실시예에서 기술한 바와 같이 측정한 서열과 함께 정렬하였다.
도 1은 유프로테스("p123"), 스키조사카로마이세스("tez1"), Est2p(즉, Est2 핵산 서열이 암호화하는 에스. 세레비제 단백질로, "L8543.12"로도 지칭됨) 및 이 비교 탐색에서 동정되는 인간의 상동체의 서열 정렬을 나타낸다. 도 51은 tez1의 아미노산 서열을 나타낸 반면에, 도 52A 및 도 52B는 tez1 의 DNA 서열을 나타낸다. 도 52A 및 도 52B에서, 인트론 및 기타 비암호 영역은 소문자로 나타낸 반면에, 엑손(즉, 암호 서열)은 대문자로 나타낸다.
이 도면들에 나타낸 바와 같이, 이들 단백질 사이에서는 고도로 보존된 영역이 있다. 예를 들면, 도 1에 나타낸 바와 같이, "모티프 0", "모티프 1", "모티프 2" 및 "모티프 3"에는 동일성 영역이 있다. 동일한 아미노산은 별표(*)로 나타내고, 유사한 아미노산 잔기는 점(.)으로 나타낸다. 이것은 텔로머라제 모티프내에는 효모에서 섬모충류 내지는 인간까지 다양한 진핵 세포 사이에서 보존되는 영역이 있음을 나타낸다. 다른 유기체의 TRT 유전자는 서열의 그러한 보존된 영역을 포함하는 것으로 생각된다. 도 49는 인간 텔로머라제 모티프의 부분적 아미노산 서열을 나타내는 반면에, 도 50은 상응하는 DNA 서열을 나타낸다.
생거 디데옥시 서열 분석법 및 기타 방법은 당해 분야에 알려진 바와 같이 사용하여 클론 712562의 완전한 서열 정보를 수득하였다. 서열 분석에 사용된 프라이머의 일부는 표 7에 나타낸다. 이들 프라이머는 플라스미드 백본 서열 또는 클론내 인간 cDNA 삽입체에 대한 서열 상보성에 근거하여 클론에 하이브리드되도록 조작하였다.
프라이머
프라이머 서열
TCP1.1 GTGAAGGCACTGTTCAGCG
TCP1.2 GTGGATGATTTCTTGTTGG
TCP1.3 ATGCTCCTGCGTTTGGTGG
TCP1.4 CTGGACACTCAGCCCTTGG
TCP1.5 GGCAGGTGTGCTGGACACT
TCP1.6 TTTGATGATGCTGGCGATG
TCP1.7 GGGGCTCGTCTTCTACAGG
TCP1.8 CAGCAGGAGGATCTTGTAG
TCP1.9 TGACCCCAGGAGTGGCACG
TCP1.10 TCAAGCTGACTCGACACCG
TCP1.11 CGGCGTGACAGGGCTGC
TCP1.12 GCTGAAGGCTGAGTGTCC
TCP1.13 TAGTCCATGTTCACAATCG
이들 실험으로부터, 클론 712562의 EcoRI-NotI 삽입체는 인간 텔로머라제 단백질에 대한 부분적 개방형 리딩 프레임만을 포함하지만, 그것은 그 단백질의 활성 단편을 암호화할 수 있는 것으로 측정되었다. 이 클론의 개방형 리딩 프레임은 약 63 kD의 단백질을 암호화한다. 동정된 최장의 개방형 리딩 프레임 서열은 도 68A 내지 도 68C에 나타낸다. ORF는 도 68A 내지 도 68C에 나타낸 "met"와 함께 ATG 코돈에서 개시된다. 서열의 3' 말단의 폴리 A 미부 역시 나타나 있다.
도 69는 (인간 텔로머라제 중심 단백질 1, "Hs TCP1"), 이. 에디큘라투스 p123("Ep p123"), 에스 폼베 tez1("Sp Tez1"), 에스. 세레비제 EST2("Sc Est2") 및 일치 서열에서 유래한 텔로머라제 역전사 효소 단백질 예비 서열 분석에 근거한 임시적인 배열을 나타낸다. 이 도면에는, 다양한 모티프가 나타나 있다.
전길이의 클론을 얻기 위해, cDNA 라이브러리 및 5'-RACE를 프로브 처리하는 방법을 사용하여 종래 클로닝되지 않은 영역의 일부분을 암호화하는 클론을 얻었다. 이들 실험에서, RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends; 예컨대, 문헌[M.A. Frohman, "RACE: Rapid Amplification of cDNA Ends", in Innis 등(편집), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (1990), pp. 28-38; Frohman 등, Proc. Natl. Acad. Sci., 85:8998-9002(1988)] 참조)를 사용하여 서열 분석용 재료를 생성시켰다. 그러한 4개 클론이 생성되었고, 이들을 사용하여 추가의 5' 서열 정보(pFWRP5, 6, 19 및 20)를 제공하였다.
또한, 인간 cDNA 라이브러리(람다내로 삽입된)를 상기 클론의 EcoRI-NotI 단편으로 프로브 처리하였다. "람다 25-1.1"(ATCC 수탁번호 #209024)로 명명된 하나의 람다 클론이 상보성 서열을 포함하는 것으로서 동정되었다. 도 75는 이 람다 클론의 제한 지도를 나타낸다. 이 클론에서 얻은 인간의 cDNA 삽입체는 시판되는 파지미드 p블루스크립트IISK+(스트라타진)의 EcoRI 부위내로 EcoRI 제한 단편으로서 서브클로닝하여 플라스미드 "pGRN121"(ATCC 수탁번호 #209016으로 ATCC에 기탁되었음)을 생성시켰다. 예비적인 결과는 플라스미드 pGRN121이 인간의 텔로머라제 단백질을 암호화하는 전체 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함한다는 것을 나타냈다.
플라스미드 pGRN121의 cDNA 삽입체는 당해 분야에 공지된 기술을 사용하여 서열 분석하였다. 도 70은 이러한 예비 연구에 기초하여 동정된 플라스미드 pGRN121의 제한 부위 및 기능 지도를 제공한다. 이러한 예비 서열 분석 결과는 도 71A 및 도 71B에 나타냈다. 이러한 분석으로부터, 도 70에 도시한 바와 같이, 암호 영역에 대한 추정 개시 부위는 EcoRI 부위(위치 707에 위치함)로부터 약 50개 뉴클레오티드에서 동정되었고, 뉴클레오티드 #3571(도 72A 내지 도 72I 참조)에서의 추정 정지 부위 외에도, 텔로머라제 특이 모티프 "FFYVTE", "PKP", "AYD", "QG" 및 "DD"의 위치가 동정되었다. 도 51은 서열내 개방형 리딩 프레임("a", "b" 및 "c")에 대한 DNA 및 상응하는 아미노산 서열을 나타낸다. 그러나, 초기의 서열 분석 작업의 예비적인 성질로 인해, 다양한 모티프에 대한 리딩 프레임은 정렬에 존재하지 않는 것으로 확인되었다.
pGRN121상에서 수행된 추가의 분석은 플라스미드가 712562 클론에 존재하지 않는 암호 서열의 5'-말단으로부터 상당한 부분을 포함한다는 것을 나타냈다. 또한, pGRN121은 약 182개 뉴클레오티드의 삽입체를 포함하는 변형체 암호 서열을 포함하는 것으로 확인되었다. 이 삽입체는 전술한 바와 같이 이 클론으로부터 부재인 것으로 확인되었다. 이. 에디큘라투스 서열의 경우와 같이, 그러한 변형체는 텔로머라제 분석과 같이 기능 분석법으로 시험하여 샘플내 기능적 텔로머라제 또는 부 분적 TRT 활성의 존재를 검출할 수 있다.
추가의 서열 분석으로 분자량이 약 127,000 달톤이고 도 74A 내지 도 74F에 나타낸 바와 같은 1132개 아미노산으로 이루어진 단백질을 암호화하는 인접 개방형 리딩 프레임을 제공하는 pGRN121의 cDNA 서열을 분리하였다. 이 분석에 기초를 둔 pGRN121의 제한 지도는 도 73에 도시하였다. hTRT cDNA의 추가 서열 분석 결과도 도 16(서열 번호 1)에 도시하였다.
실시예 2
hTRT 농도와 세포 무한증식화의 상관관계
hTRT mRNA의 상대적 농도는 유한증식성인 6종의 텔로머라제 음성 세포 균주와 무한증식성인 6종의 텔로머라제 양성 세포주를 사용하여 측정하였다(도 5). 정지 상태에서 hTRT mRNA의 농도는, 활성 텔로머라제를 보유한 것으로 이미 밝혀진 바 있는 무한증식성 세포에서 유의적으로 증가하였다. 일부 텔로머라제 음성 세포 균주에서도 낮은 hTRT mRNA 농도가 검출되었다.
다음과 같은 세포에서 얻은 RNA를 가지고 hTRT, hTR, TP1[테트라히메나 p90과 관련된 텔로머라제 회합 단백질(Harrington et al., 1997, Science 275:973; Nakayama et al., 1997, Cell 88:875)] 및 GAPDH(RNA 주형을 동량으로 규정하기 위한 용도)에 대한 RT-PCR을 실시하였다. (1) 인간 태아 폐 섬유아세포 GFL, (2) 인간 태아 피부 섬유아세포 GFS, (3) 성인 전립선 간질 섬유아세포 31 YO, (4) 인간 태아 무릎 활액 섬유아세포 HSF, (5) 신생아 포피 섬유아세포 BJ, (6) 인간 태아 폐 섬유아세포 IMR90 및 무한증식성 세포주, (7) 흑색종 LOX IMVI, (8) 백혈병 U251, (9) NCI H23 폐 암종, (10) 결장 선암종 SW620, (11) 유방 종양 MCF7, (12) 293 아데노바이러스 E1 형질전환된 인간 배아 신장 세포주.
hTRT 핵산은 올리고뉴클레오티드 프라이머 LT5와 LT6(표 2)을 사용하여 cDNA로부터 총 31회 사이클(94 ℃ 45s, 60 ℃ 45s, 72 ℃ 90s)을 통해 증폭시켰다. GAPDH는 프라이머 K136(5'-CTCAGACACCATGGGGAAGGTGA) 및 K137(5'-ATGATCTTGAGGCTGTTGTCATA)을 사용하여 총 16회 사이클(94 ℃ 45s, 55 ℃ 45s, 72 ℃ 90s)을 통해 증폭시켰다. hTR은 프라이머 F3b(5'-TCTAACCCTAACTGAGAAGGGCGTAG) 및 R3c(5'-GTTTGCTCTAGAATGAACGGTGGAAG)를 사용하여 총 22회 사이클(94 ℃ 45s, 55 ℃, 72 ℃ 90s)을 통해 증폭시켰다. TP1 mRNA는 프라이머 TP1.1 및 TP1.2를 사용하여 28 사이클(hTRT의 경우와 동일함) 동안 증폭시켰다. 반응 생성물을 8폴리아크릴아미드 겔로 분리하고 SYBR 그린(몰리큘라 프로브스 제품)으로 염색한 뒤, Storm 860(몰리큘라 다이나믹스 제품)으로 스캐닝하여 가시화하였다. 도 5에 도시한 바와 같은 결과를 통해 알수 있듯이, hTRT mRNA 농도는 시험된 세포 중의 텔로머라제 활성 농도와 직접적인 상관관계가 있다.
실시예 3
hTRT 인트론 서열의 특성
먼저, 상기 실시예에 기재된 바와 같이 인간 게놈 DNA를 PCR 증폭하여 추정되는 인트론을 식별하고, 이어서 게놈 클론 λGΦ5를 서열분석하여 확인하였다(실시예 4 참조). PCR 증폭은 순방향 프라이머 TCP1.57과 함께 역방향 프라이머 TCP 1.46, TCP1.48, TCP1.50, TCP1.52, TCP1.54, TCP1.56, 및 TCP1.58을 각각 쌍으로 사용하여 실시하였다(표 2 참조). TCP1.57/TCP1.46, TCP1.57/TCP1.48, TCP1.57/TCP1.50, TCP1.57/TCP1.52, TCP1.57/TCP1.54, TCP1.57/TCP1.56 증폭에 의한 게놈 DNA의 생성물은 pGRN121 증폭 생성물 보다 약 100 염기쌍 더 길었다. TCP1.57/TCP1.58 증폭을 통해서는 게놈 DNA나 pGRN121 DNA에서 동일한 결과가 나타났다. 이와 같은 결과는 게놈 DNA가 TCP1.58과 TCP1.50의 부위 사이에 삽입부를 포함한다는 것을 시사한다. TCP1.57/TCP1.50 및 TCP1.57/TCP1.52의 PCR 생성물은 서브클로닝하지 않고 프라이머 TCP1.39, TCP1.57 및 TCP1.49를 사용하여 직접 서열분석하였다.
이하에 기재된 바와 같은 104 염기 인트론 서열(서열 번호 7)은 hTRT mRNA(진한 글자) 중의 도 16에 도시한 서열의 염기 274와 265에 대응하는 접합부에 삽입된다.
CCCCCCGCCGCCCCCTCCTTCCGCCAG /GTGGGCCTCCCCGGGGTCGGCGTCCGGCTGGGGTTGAGGGCGGCCGGGGGGAACCAGCGACATGCGGAGAGCAGCGCAGGCGACTCAGGGCGCTTCCCCCGCAG/GTGTCCTGCCTGAAGGAGCTGGTGGCCCGAGTGCTGCAG
여기에서, "/"는 접목 접합부를 나타내며, 상기 서열은 인간 인트론에 일반적인 일치 5' 접목 부위 서열과 3' 접목 부위 서열에 우수한 정합성을 나타낸다.
이 인트론은 토포이소머라제 II 절단 부위와 NKκB 결합 부위의 특징을 나타내는 모티프를 포함한다(도 21A 내지 도 21E 참조). 이 모티프는 바람직한 것인데, 부분적인 그 이유는 토포이소머라제 II의 발현이 대부분의 종양에서 상승 조절되기 때문이다. 이것은 DNA를 절단하고 재권선하여 DNA를 이완시키는 작용을 하고, 그 결과 특정 유전자의 발현을 증가시킨다. 토포이소머라제 II의 억제제는 항암제로서 사용할 수 있다고 밝혀져있다. NKκB 경우, 이 전사 인자는 분화 말기 중 텔로머라제 조절, 예컨대 발육 동안 텔로러마제의 조기 억제에 큰 역할을 하며, 따라서 세포 중 텔로머라제 활성을 조절하는 치료 개입의 또 다른 표적이다.
실시예 4
람다 파지 GΦ5의 클로닝 및 hTRT 게놈 서열의 특성
A. 람다 GΦ5
인간 게놈 DNA 라이브러리를 PCR과 하이브리드화로 선별하여 hTRT RNA 암호 서열을 포함하는 게놈 클론을 동정하였다. 이 라이브러리는 W138 폐 섬유아세포 세포 유래의 DNA를 사용하여 만든 인간 섬유아세포 게놈 라이브러리이다(스트라타진 카탈로그 #946204). 이 라이브러리에서 부분 Sau3AI 단편을 삽입체 크기가 9 내지 22 kb인 것으로 람다 FIX(등록상표명)II 벡터(스트라타진)의 XhoI 부위에 결찰시켰다.
이 게놈 라이브러리를 각가 150,000 파지인 푸울로 분할하고, 각 푸울을 네스트형 PCR로 선별하였다(외부 프라이머 쌍 TCP1.52와 TCP1.57; 내부 쌍 TCP1.49와 TCP1.50, 표 1 참조). 이 프라이머쌍들은 hTRT의 게놈 DNA 중 추정상의 인트론에 위치하여(실시예 3 참조), PCR 생성물은 hTRT cDNA 클론의 개입에 의해 유래되는 것이 아니라 게놈원에서 유래되는 것이 확실하다. 양성 푸울을 더 분할하여 푸울당 2000 파지가 되게 만들었다. 이 푸울을 저농도로 평판배양하고 도 16에 도시된 염기쌍 1552-2108을 포함하는 DNA 단편(각각 제한 부위 SphI 및 EcoRV)과 하이브리드 화시켜 선별하였다.
2개의 양성 클론을 분리하였고, 전술한 바와 같이 네스트형 PCR로 재선별한 결과 이 두 클론은 PCR에서 양성이었다. 이 클론 중 1개(λGΦ5)를 NotI으로 절단한 결과, 약 20 kb의 삽입 크기를 나타내었다. 이어서, 지도작성(다음 설명 참조)한 결과 삽입 크기가 15 kb이고 파지 GΦ5는 cDNA 서열의 개시 부위로부터 약 13 kb의 DNA 상류를 포함하고 있었다.
파지 GΦ5는 제한효소 분해와 DNA 서열분석으로 지도작성하였다. 얻어진 지도는 도 7에 도시하였다. 먼저, 파지 DNA를 NcoI으로 분해하고 단편을 pBBS167에 클로닝하였다. 얻어지는 서브클론을 PCR로 선별하여 hTRT cDNA의 5' 영역에 대응하는 서열을 포함하는 클론을 동정하였다. 9kb의 NcoI 단편(hTRT 유전자 서열과 4 내지 5kb의 람다 벡터 서열 포함)을 포함하는 서브클론(pGRN140)을 부분 서열분석하여 삽입체의 배향을 측정하였다. pGRN140은 SalI으로 분해하여 람다 벡터 서열을 제거하고, 그 결과 pGRN144를 얻었다. 그 다음 pGRN144를 서열분석하였다. 서열 분석 결과는 도 21A 내지 도 21E에 도시하였다. hTRT mRNA의 5' 말단은 도 21A 내지 도 21E의 염기 2441에 해당한다. 도 7에 도시된 바와 같이, 2개의 Alu 서열 인자가 hTRT DNA 5' 말단의 1700 염기쌍 상류에 위치해 있는데, 이것은 hTRT의 프로모터 영역에 상류 한계를 제공하는 것으로 추정된다. 또한, 이 서열은 전술한 실시예 3에 기재된 인트론에 대해 3' 쪽인 도 21A 내지 도 21E에 기재된 서열 중 염기 4173에 인트론이 위치하는 것을 보여준다.
B. 다른 게놈 서열
전술한 게놈 클론 외에도, 2개의 P1 박테리오파지 클론과 1개의 인간 BAC 클론을 본 발명의 일 양태로 제시한다. P1 삽입체는 보통 75 내지 100 kb이고, BAC 삽입체는 보통 100 Kb 이상이다.
P1 클론(DMPC-HFF#1-477(F6)-GS #15371 및 DMPC-HEF#1-1103(H6)-GS#15372)은 hTRT의 3' 말단을 증폭시키는 프라이머 TCP1.12와 UTR2를 사용하여 인간 포피 섬유아세포 유래의 인간 P1 라이브러리(Shepherd et al., 1994, PNAS USA 91:2629)를 PCR 선별하여 얻었다. 이 클론은 hTRT의 5' 말단을 증폭하는 프라이머에 대해서는 음성(증폭하지 못함)이었다.
RT 모티프 영역을 포함하는 pGRN121(도 16; 염기 1552 내지 2695)의 Sph1/Xmn1 단편을 사용하여 BAC 인간 게놈 라이브러리를 하이브리드화 선별하므로써 인간 BAC 클론(326E20)을 얻었다. 이 클론은 hTRT 유전자의 5' 말단을 포함하는 것으로 추정된다. 이 실시예의 hTRT 게놈 클론은 hTRT 유전자 전체를 포함하는 것으로 추정된다.
실시예 5
염색체 중 hTRT 유전자의 위치
hTRT 유전자는 총 인간 게놈의 83개 RH 클론(스탠포드 휴먼 게놈 센터에서 작제함)의 중간 해상능의 스탠포드(Stanford) G3 패널을 사용하여 방사선 하이브리드 지도작성(Boehnke et al., 1991, Am J Hum Genet 49:1174; Walter et al., 1994, Nature Genet 7:22)하므로써 염색체 5p에 위치하는 것을 규명하였다. 인간의 림프아세포양 세포주(공여체; rM)를 x선 10,000 래드에 노출시킨 후, 방사선조사받 지 않은 햄스터 수용체 세포(A3)와 융합시켰다. 독립적인 체세포 하이브리드 클론 83개를 분리하였고, 각 클론은 방사선조사된 공여체 세포와 수용체 햄스터 세포 간에 융합되었음을 나타낸다. G3 DNA의 패널을 사용하여 목적 영역의 마커를 배열하고 이 마커들 간의 간격을 조정하였다.
RH 지도화에 사용된 프라이머로는 TCP1.12와 UTR2를 사용하고, 증폭은 뵈링거 맨하임 Taq 완충액과 퍼킨 엘머 Taq를 사용하여 94 ℃ 45s, 55 ℃ 45s, 72℃ 45s의 사이클을 45회 실시하였다. 83개의 푸울을 각각 증폭시켰으며, 그 결과 14개(17)는 hTRT(346 bp 밴드) 양성으로 나타났다. 이 증폭 결과를 스탠포드 RH 제공자에게 제출하였고, 그 후 지도 위치 5p와 가장 근접한 마커 STS D5S678을 제공하였다.
제네톤(Genethon) 게놈 지도의 웹 사이트를 조사한 결과, 지도 위치는 STS 마커 D5S678을 포함하는 YAC인 것으로 확인되었다: CEPH YAC 780_C_3 크기: 390,660 kb. 또한, 이 YAC는 염색체 17개 마커를 포함하였다. 이 결과는 hTRT 유전자가 말단소립 단부인 염색체 5 위에 위치한다는 것을 시사한다. 또한, 많은 종양들은 증가된 5p의 복제수를 나타낸다. Cri-du-chat 증상 역시 이 영역 중에 결실부가 있는 것으로 지도작성되었다.
실시예 6
hTRT 단백질 및 폴리뉴클레오티드의 발현용 벡터의 조작 및 구성
박테리아에서의 hTRT의 발현
본 실시예는 전길이의 생물학적 활성 hTRT를 다량으로 생산하는 hTRT-발현성 박테리아 및 진핵세포 발현 벡터의 조작에 대해 상세히 설명한다. 이러한 방법으로 생물학적으로 활성인 hTRT 단백질을 생성시키는 방법은 몇 가지 예로서, 텔로머라제 재구성 분석법에, 텔로머라제 활성 조절인자의 분석에, hTRT의 새로이 분리된 종의 활성 분석에, hTRT와 특이적으로 연합되는 화합물의 동정 및 분리에, 부위 특이적으로 돌연변이된 hTRT 변형체 단백질의 활성 분석에 그리고 면역원으로서 유용하다.
pThioHis A/hTRT 박테리아 발현 벡터
전길이의 hTRT를 다량으로 생산하기 위해, 박테리아 발현 벡터인 pThioHis A(캘리포니아 샌 디에고 소재의 인비트로겐사)를 발현계로 선택하였다. hTRT-암호 삽입체는 플라스미드 pGRN121에서 hTRT 삽입체의 뉴클레오티드 707 내지 4776을 포함한다. 이 뉴클레오티드 서열은 hTRT 단백질에 대한 완전한 암호 서열을 포함한다.
본 발명의 이 발현 벡터는 박테리아에서 유도성 발현을 위해 조작된 것이다. 이 벡터는 이.콜리에서 절단 가능한 HIS 표지된 티오레독신 부분 및 전길이의 hTRT 단백질로 이루어진 고농도의 융합 단백질을 발현시키도록 유도할 수 있다. 발현계의 사용은 실질적으로 제조자의 지시에 따라 이루어졌다. 본 발명의 생성 벡터가 암호화하는 융합 단백질의 아미노산 서열은 아래에 나타내는데, 별표(*)는 엔테로키나제 절단 부위를 나타낸다:
Figure 111999002929091-pct00037
Figure 111999002929091-pct00038
pGRN121의 hTRT 뉴클레오티드 3272 내지 4177을 가진 pGEX-2TK
본 발명의 이러한 구성체를 사용하여 예컨대, hTRT 단백질에 대한 폴리클로널 항체 및 모노클로널 항체를 형성할 목적으로 융합 단백질을 제조한다. hTRT의 단편은 기타 목적, 예컨대, 주요 음성 돌연변이체로서의 텔로머라제 활성의 조절에, 또는 다른 단백질 또는 핵산과 텔로머라제 성분의 회합을 방지하는 데에도 사용할 수 있다.
hTRT 단백질 단편을 다량으로 생산하기 위해서는, 이.콜리 발현 벡터 pGEX-2TK(뉴저지주 피스캐터웨이 소재의 파마시아 바이오테크)를 선별하고, 본질적으로 제조자의 지시에 따라 사용하여 본 발명의 발현 벡터를 제조하였다. 생성되는 구성체는 플라스미드 pGRN121에서 hTRT 삽입체의 뉴클레오티드 3272 내지 4177에서 유래한 삽입체를 포함한다. 이 벡터는 글루타치온-S-트랜스퍼라제 서열(아래 서열에서 밑줄친 부분), 트롬빈 절단 서열(2중으로 밑줄침), 심근 단백질 키나제에 대한 인지 서열(이탤릭체), 클로닝에 의해 도입된 잔기([GSVTK]) 및 hTRT 단백질 단편(굵은 활자체)으로 구성된 융합 단백질의 고농도의 이.콜리에서의 발현을 유도한다:
Figure 111999002929091-pct00039
이 융합 단백질을 발현시킬 때, 그것은 불용성 응집체를 형성하였다. 이것을 봉입체에서 유래한 단백질의 정제라는 제목의 단락에서 설명한 바와 같이 일반적으로 처리하였다. 구체적으로, 유도된 세포는 PBS(20 mM 인산나트륨, pH7.4, 150 mM NaCl)에서 현탁시키고 초음파 처리에 의해 붕괴시켰다. NP-40을 0.1까지 첨가하고, 그 혼합물을 부드럽게 혼합하면서 4℃에서 30분 동안 항온처리하였다. 불용성 물질을 4℃에서 30분 동안 25,000 g로 원심 분리하여 수거하였다. 불용성 물질을 PBS중의 4M 우레아에서 1회 세척하고, 원심분리하여 수집한 다음, PBS에서 다시 세 척하였다. 수집된 펠렛은 75이상의 융합 단백질을 함유하는 것으로 평가되었다. 이 물질을 고속 진공에서 건조시킨 다음, 항체의 생성을 위해 마우스 및 토끼에게 주사하기 위한 보조제에 현탁시켰다. 글루타치온-S-트랜스퍼라제 부로부터 재조합 단백질의 분리는 제조자의 지시에 따라 트롬빈을 사용하여 부위 특이적 단백 분해 작용으로 실시하였다.
HIS-8 태그를 가진 pGRN121의 hTRT 뉴클레오티드 2426 내지 3274를 보유한 pGEX-2TK
hTRT의 단편을 다량으로 생산하기 위해서는, 또 다른 이.콜리 발현 벡터 pGEX-2TK 구성체를 제조하였다. 이 구성체는 플라스미드 pGRN121에서 hTRT 삽입체의 뉴클레오티드 2426 내지 3274에서 유래한 삽입체 및 8개의 연속 히스티딘 잔기(HIS-8 태그)를 암호화하는 서열을 포함한다. HIS-8 TAG를 삽입하기 위해, pGRN121의 hTRT 뉴클레오티드 2426 내지 3274를 가진 pGEX-2TK 벡터를 BamH1으로 선형화하였다. 이것은 GST-트롬빈-심근 단백질 키나제와 hTRT 암호 서열 사이의 연접부에서 플라스미드를 개방하였다. BamHI 적합성 말단을 가진 2본쇄의 올리고뉴클레오티드를 선형화된 플라스미드에 결찰시켜 hTRT 서열의 상류에 8개의 히스티딘 잔기의 틀내 도입을 초래하였다.
상기 벡터는 글루타치온-S-트랜스퍼라제 서열(아래 서열에서 밑줄친 부분), 트롬빈 절단 서열(2중으로 밑줄침), 심근 단백질 키나제에 대한 인지 서열(이탤릭체), 클로닝에 의해 도입된 3개 잔기 세트 및 5개 잔기의 세트 ([GSV] 및 [GSVTK]), 8개의 연속 히스티딘(2중 밑줄) 및 hTRT 단백질 단편(굵은 활자체)으로 구성된 융합 단백질의 고농도의 이.콜리에서의 발현을 유도한다:
Figure 111999002929091-pct00040
본 발명의 각각의 pGEX-2TK 벡터를 사용하여 hTRT 단백질에 대한 폴리클로널 항체 및 모노클로널 항체를 형성할 목적으로 융합 단백질을 생산할 수 있다. 또한, 이 융합 단백질을 사용하여 융합 단백질내에 포함된 TRT 펩티드에 대해 형성된 항체를 친화도 정제할 수 있다. 글루타치온 S-트랜스퍼라제 부분으로부터 재조합 단백질의분리는 제조자의 지시에 따라 트롬빈을 사용하는 부위 특이적 단백질 분해에 의해 수행할 수 있다.
HIS-8 표지가 없는 pGRN121의 hTRT 뉴클레오티드 2426 내지 3274를 가진 pGEX-2TK
hTRT 단편을 다량으로 생산하기 위해, 또 다른 이.콜리 발현 벡터 pGEX-2TK 구성체를 제조하였다.
이 구성체는 플라스미드 pGRN121에서 hTRT 삽입체의 뉴클레오티드 2426 내지 3274에서 유래한 삽입체를 포함하나, 전술한 구성체의 HIS-8 표지는 없다. 이 벡터는 글루타치온-S-트랜스퍼라제 서열(아래 서열에서 밑줄친 부분), 트롬빈 절단 서열(2중으로 밑줄침), 심근 단백질 키나제에 대한 인지 서열(이탤릭체), 클로닝에 의해 도입된 잔기([GSVTK]) 및 hTRT 단백질 단편(굵은 활자체)으로 구성된 융합 단백질의 고농도의 이.콜리에서의 발현을 유도한다:
Figure 111999002929091-pct00041
pGRN121의 hTRT 뉴클레오티드 1625 내지 2458을 가진 pGEX-2TK
hTRT 단백질의 단편을 다량으로 생산하기 위해, 또 다른 이.콜리 발현 벡터 pGEX-2TK 구성체를 제조하였다.
이 구성체는 플라스미드 pGRN121에서 hTRT 삽입체의 뉴클레오티드 1625 내지 2458에서 유래한 삽입체를 포함한다. 이 벡터는 글루타치온-S-트랜스퍼라제 서열(아래 서열에서 밑줄친 부분), 트롬빈 절단 서열(2중으로 밑줄침), 심근 단백질 키나제에 대한 인지 서열(이탤릭체), 클로닝에 의해 도입된 잔기([GSVTK]) 및 hTRT 단백질 단편(굵은 활자체)으로 구성된 융합 단백질의 고농도의 이.콜리에서의 발현을 유도한다:
Figure 111999002929091-pct00042
pGRN121의 hTRT 뉴클레오티드 782 내지 1636을 가진 pGEX-2TK
hTRT 단백질의 단편을 다량으로 생산하기 위해, 또 다른 이.콜리 발현 벡터 pGEX-2TK 구성체를 제조하였다.
이 구성체는 플라스미드 pGRN121에서 hTRT 삽입체의 뉴클레오티드 782 내지 1636에서 유래한 삽입체를 포함한다. 이 벡터는 글루타치온-S-트랜스퍼라제 서열(아래 서열에서 밑줄친 부분), 트롬빈 절단 서열(2중으로 밑줄침), 심근 단백질 키나제에 대한 인지 서열(이탤릭체), 클로닝에 의해 도입된 잔기([GSVTK]) 및 hTRT 단백질 단편(굵은 활자체)으로 구성된 융합 단백질의 고농도의 이.콜리에서의 발현을 유도한다:
Figure 111999002929091-pct00043
5'-비암호 서열이 결핍된 hTRT cDNA를 가진 pT7FLhTRT
전술한 바와 같이, 일 양태로, 본 발명은 어떠한 5' 비해독 TRT 서열도 없이 박테리아, 포유류, 효모 및 곤충 발현 벡터내로의 클로닝을 촉진하기 위한 부위 특이적 방법으로 변형된 TRT를 제공한다. 어떤 상황에서는, 비단백질을 암호화하는 서열의 양을 최소화함으로써 단백질 생산(수율)을 향상시키고, mRNA 안정성을 증가시킬 수 있다. 본 발명의 이러한 양태에서는, TRT 유전자 5' 비암호 영역은 박테리아 발현 벡터내로 클로닝하기 전에 제거하였다.
이것은 hTRT 암호 서열(도 16의 개시(ATG) 코돈의 바로 상류(5')에 추가의 제한 엔도뉴클레아제 부위를 공학적으로 조작함으로써 수행하였다. 5'쪽으로 단백질의 암호 영역의 바로 앞에 제한 부위를 생성시킴으로써, 면역 검출 및 정제용으로 표지 및 펩티드 TAG를 포함하는 융합 단백질과 같은 융합 단백질을 암호화하는 다양한 벡터를 효율적으로 제조할 수 있다.
구체적으로, 올리고뉴클레오티드 5'-CCGGCCACCCCCCATATGCCGCGCGCTCCC-3'을 전술한 바와 같이 사용하여 hTRT cDNA 뉴클레오티드 779 내지 781을 GCG로부터 CAT로 변형시켰다. 이들 3개 뉴클레오티드가 ATG 개시 코돈전의 마지막 뉴클레오티드이고, 따라서 이들은 단백질 서열을 변형시키지 않는다. 서열의 변화는 hTRT cDNA의 특이 NdeI 제한 부위의 생성을 초래한다. 1본쇄 hTRT DNA를 부위 지향성 돌연변이 유발의 DNA 공급원으로서 사용하였다. 생성된 플라스미드를 서열 분석하여 돌연변이 유발의 성공 여부를 확인하였다.
이러한 변형은 pT7FLhTRT로 명명된 본 발명의 다음과 같은 플라스미드를 구성하였다. 부위 특이적으로 변형된 hTRT 서열(NdeI 제한 부위의 첨가)을 NdeI 및 NotI로 처리하고, (클리나우 단편으로 충전하여 평활 말단이 있는 DNA를 생성시켜) hTRT를 암호화하는 핵산 단편을 생성시켰다. 그 다음, 이 단편을 NdeI 및 SmaI(역시 평활 말단을 만드는 절단 효소)으로 이미 제한 효소 처리한 pSL3418 플라스미드내로 클로닝하였다. pSL3418은 FLAG 서열(워싱턴주 시애틀 소재의 임뮤넥스 코포레이션) 및 엔테로키나제 서열이 상기 언급한 NdeI 부위로부터 바로 상류에 삽입된 변형된 pAED4 플라스미드이다. pT7FLhTR로 명명된 이 플라스미드는 T7 RNA 폴리머 라제를 발현시키는 이.콜리 균주에서 전길이의 hTRT(5' 말단에서 플랙-태그를 가짐)를 발현시킨다.
3'-비암호 서열이 결핍된 hTRT cDNA를 가진 플라스미드
전술한 바와 같이, 본 발명은 일부 또는 전부의 비암호 서열이 결실된 TRT-암호 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 어떤 상황에서는, 비단백질 암호 서열의 양을 최소화하면, 단백질 생산(수율)이 향상되고, mRNA 안정성이 증가된다. 본 발명의 이러한 양태에서, hTRT의 3' 비해독 영역은 박테리아 발현 플라스미드내로 클로닝하기 전에 결실된다.
전술한 바와 같이 전길이의 hTRT cDNA를 포함하는 플라스미드 pGRN121을 먼저 모든 ApaI 부위를 결실시켰다. 그 다음, 3'UTR을 포함하는 MscI-HincII hTRT 제한 효소 처리 단편을 결실시켰다. 그 다음, hTRT의 종결 코돈을 포함하는 NcoI-XbaI 제한 효소 처리 단편을 3'UTR이 결핍된 것을 제외하고는 pGRN124로 명명된 pGRN121의 NcoI-XbaI 부위내로 삽입하였다.
항생물질 선별 마커를 사용하는 박테리아 발현 벡터
본 발명은 또한 형질전환된 세포상에 선별 가능한 표현형을 부여하는 선별 마커, 및 숙주 게놈내로의 통합이 필요 없도록 에피좀 유지 및 복제를 암호화하는 서열을 포함할 수 있는 박테리아 발현 벡터를 제공한다. 예를 들면, 상기 마커는 항생물질 내성, 특히 클로람페니콜 내성(문헌[Harrod(1997) Nucleic Acids Res. 25:1720-1726] 참조), 카나마이신 내성, G418 내성, 블레오마이신 내성 및 하이그로마이신 내성을 암호화하여 목적 DNA 서열로 형질전환시킨 세포들의 선별을 가능 하게 할 수 있다. 예컨대, 문헌[Blondelet-Rouault(1997) Gene 190:315-317; and Mahan(1995) Proc Natl Acad Sci 미국 92:669-673] 참조.
본 발명의 일 양태에서, 전길이의 hTRT는 클로람페니콜 항생물질 내성 유전자가 삽입되어 있고, pBBS235로 명명된 변형된 블루스크립트 플라스미드 벡터(캘리포니아 샌 디에고 소재의 스트라타진)내로 클로닝하였다. hTRT ORF를 포함하는 pGRN124(상기함)로부터 얻은 NotI 단편의 pBBS235의 NotI 부위내로의 도입은 TRT ORF가 벡터의 Lac 프로모터의 반대 방향으로 배향되도록 수행된다. 이러한 과정은 본 발명의 TRT 핵산과 같은 플라스미드 삽입체의 돌연변이 유발에 적합한 플라스미드를 제조한다. pGRN125로 명명된 이러한 플라스미드 구성체는 텔로머라제 효소 및 TRT 단백질 암호 서열의 돌연변이 유발과 관련된 본 발명의 방법에 그리고 T7 프로모터를 사용하는 hTRT의 시험관내 전사(및 T3 프로모터를 사용하는 안티센스 hTRT의 시험관내 전사)에 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, hTRT ORF를 포함하는 pGRN124로부터 NotI 제한효소 처리 단편을 TRT ORF가 벡터의 Lac 프로모터와 동일한 방향이 되도록 pBBS235(전술함)의 NotI 부위내로 서브클로닝하였다. 이러한 과정은 이.콜리에서 전길이의 hTRT의 발현에 사용될 수 있는 pGRN126으로 명명된 플라스미드를 제조한다. 발현된 생성물은 벡터 pBBS235가 암호화하는 29개 아미노산, 이어서, hTRT의 5'UTR이 암호화하는 18개의 아미노산, 이어서 전길이의 hTRT 단백질을 포함할 것이다.
본 발명의 추가의 양태에서, hTRT 개시 ATG 코돈을 코작 일치 서열로 전환시 키고, 발현 벡터내로의 클로닝을 촉진하기 위한 EcoRI 및 BglII 제한 효소 처리 부위를 생성시키기 위해, pGRN125의 시험관내 돌연변이 유발법을 실시하였다. 돌연변이 유발 과정에는 다음과 같은 올리고뉴클레오티드를 사용하였다:
5'-TGCGCACGTGGGAAGCCCTGGCagatctgAattCcaCcATGCCGCGCGCTCCCCGCTG-3'(소문자는 변형된 뉴클레오티드). 생성되는 발현 벡터는 pGRN127로 명명하였다.
본 발명의 또 다른 양태에서, TRT "DD 모티프"의 두 번째 Asp을 알라닌으로 전환하여 비기능성 텔로머라제 효소를 생성시키고, 따라서 우성/음성 돌연변이체로서 사용하기 위한 돌연변이 TRT 단백질을 생성시켰다. hTRT 암호 서열은 다음과 같은 올리고뉴클레오티드를 사용하여 시험관내에서 돌연변이를 유발하여 잔기 869(Asp869)의 아스파르트산 코돈을 알라닌(Ala) 코돈으로 전환시켰다:
5'-CGGGACGGGCTGCTCCTGCGTTTGGTGGAcGcgTTCTTGTTGGTGACACCTCACCTCACC-3'. 이 과정은 또한 MluI 제한 효소 부위도 생성시켰다. 생성된 발현 플라스미드는 GRN130으로 명명되었고, 이는 또한 pGRN127에 대해 기재한 바와 같이 코작 일치 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 hTRT의 안티센스 서열 단편을 발현시키도록 조작된 벡터를 제공한다. pGRN126 플라스미드는 MscI 및 SmaI 제한 효소로 완전히 절단하고, 재결찰하여 hTRT ORF의 95이상을 결실시켰다. 하나의 SmaI-MscI 단편은 그 과정중에 재삽입되어 CAT 활성을 재생하였다. 이러한 정제되지 않은 플라스미드는 SalI 및 EcoRI으로 재처리하고, hTRT ORF의 개시 코돈을 포함하는 단편을 pBBS212의 SalI-EcoRI 부분내로 삽입하여 hTRT ORF의 73개 염기쌍 잔기 및 5'UTR에 걸치는 안티센 스 서열을 발현시키는 안티센스 발현 플라스미드를 제조하였다. 이 플라스미드를 pGRN135로 명명하였다.
효모에서의 hTRT 텔로머라제의 발현
본 발명은 또한 전길이의 생물학적 활성이 있는 TRT를 다량으로 생산하기 위한 TRT-발현용 효모 발현 벡터를 제공한다.
피치아 파스토리스 발현 벡터 pPICZ B 및 전길이의 hTRT
전길이의 생물학적 활성이 있는 TRT를 다량으로 생산하기 위해서는, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris ) 발현 벡터 pPICZ B(캘리포니아주 샌 디에고 소재의 인비트로겐)를 선택하였다. hTRT-암호 서열 삽입체는 플라스미드 pGRN121에서 hTRT 삽입체의 뉴클레오티드 659 내지 4801로부터 유래하였다. 이 뉴클레오티드 서열은 hTRT를 암호화하는 전길이의 서열을 포함한다. 이 발현 벡터는 피. 파스토리스에서 전길이의 변형되지 않은 hTRT를 고농도로 유도 발현시키도록 조작한다. 발현은 효모 프로모터에 의해 유발되나, 발현된 서열은 hTRT 개시 및 종결 코돈을 이용한다. 클로닝에 의해 외래의 코돈은 도입하지 않았다. 생성된 pPICZ B/hTRT 벡터를 사용하여 효모를 형질전환시켰다.
피치아 파스토리스 발현 벡터 hTRT-His6/pPICZ B
pPICZ B에서 유래한 본 발명의 두 번째 피치아 파스토리스 발현 벡터는 또한 플라스미드 pGRN121에서 hTRT 삽입체의 뉴클레오티드 659 내지 4801에서 유래한 hTRT를 암호화하는 전길이의 서열을 포함한다. 이 hTRT-His6/pPICZ B 발현 벡터는 그 C-말단에서 Myc 에피토프 및 His6 리포터 표지 서열에 융합된 전길이의 hTRT 단 백질을 암호화한다. hTRT 종결 코돈은 제거되고, 종결 코돈 뿐만 아니라 Myc 에피토프 및 His6 리포터 표지를 암호화하는 벡터 서열로 대체된다. 이 벡터는 효모에서 다음과 같은 융합 단백질의 고농도의 유도 발현을 유발할 수 있도록 조작한 것으로서, 이 융합 단백질은 hTRT 서열(밑줄침), 벡터 서열([L] 및 [NSAVD]) 및 Myc 에피토프(이중으로 밑줄침) 및 His6 표지(이탤릭체)로 구성된다:
Figure 111999002929091-pct00044
곤충 세포에서의 hTRT의 발현
본 발명은 또한 전길이의 생물학적 활성 hTRT를 다량으로 생산하는 hTRT 텔로머라제 발현용 곤충 세포 발현 벡터를 제공한다.
바쿨로비루스 발현 벡터 pVL1393 및 전길이의 hTRT
당해 TRT 암호 서열을 바쿨로비루스 발현 벡터 pVL1393(캘리포니아 샌 디에고 소재의 인비트로겐)내로 클로닝하였다. 이 구성체는 이어서 오토그라파 캘리포니카 핵 다면증 비루스(바쿨로골드-AcMNPV)로부터 얻은 선형화된 DNA와 함께 스포 돕테라 프루기페르다(sf-9) 세포내로 동시 형질감염시켰다. 얻어진 재조합 바쿨로비루스는 이어서 플라크 정제하고 다음과 같은 표준 프로토콜을 따라 증가시켰다.
이 발현 벡터는 고농도의 전길이 hTRT 단백질을 곤충 세포에서 발현시킨다. 발현은 바쿨로비루스 폴리헤드린 유전자 프로모터에 의해 유발된다. 클로닝에 의해 외래의 코돈은 도입시키지 않았다.
바쿨로비루스 발현 벡터 pBlueBacHis2 B 및 전길이 hTRT
전길이의 생물학적 활성 hTRT를 다량으로 생산하기 위해, 바쿨로비루스 발현 벡터 pBlueBacHis2 B(캘리포니아 샌 디에고 소재의 인비트로겐)를 제어 요소 공급원으로서 선택하였다. hTRT-암호 삽입체는 플라스미드 pGRN121에서 hTRT 삽입체의 뉴클레오티드 707 내지 4776으로 구성되었다.
His6 및 항-Xpress 태그(인비트로겐)를 가진 전길이 hTRT도 구성하였다. 이 벡터는 또한 플라스미드 pGRN121로부터 유래한 hTRT 삽입체의 뉴클레오티드 707 내지 4776으로 구성되는 삽입체를 포함한다. 이 벡터는 절단 가능한 6-히스티딘 및 항-Xpress 표지에 융합된 고농도의 전길이 hTRT 단백질의 곤충 세포에서의 발현을 유도하는데, 융합 단백질의 아미노산 서열은 아래에 나타내며, 별표(*)는 엔테로키나제 절단 부위를 나타낸다:
Figure 111999002929091-pct00045
Figure 111999002929091-pct00046
바쿨로비루스 발현 벡터 pBlueBac4.5 및 전길이 hTRT 단백질
전길이의 생물학적 활성 TRT를 다량으로 생산하기 위해, 제2 바쿨로비루스 발현 벡터인 pBlueBac4.5(캘리포니아 샌 디에고 소재의 인비트로겐)를 구성하였다. hTRT-암호 삽입체는 또한 플라스미드 pGRN121에서 유래한 hTRT의 뉴클레오티드 707 내지 4776으로 구성되었다.
바쿨로비루스 발현 벡터 pMelBacB 및 전길이 TRT 단백질
전길이의 생물학적 활성 hTRT를 다량으로 생산하기 위해, 제3 바쿨로비루스 발현 벡터인 pMelBacB(캘리포니아 샌 디에고 소재의 인비트로겐)를 구성하였다. hTRT-암호 삽입체는 또한 플라스미드 pGRN121에서 유래한 hTRT의 뉴클레오티드 707 내지 4776으로 구성되었다.
pMelBacB는 멜리틴 신호 서열을 사용하여 분비 경로를 통해 세포외 배지로 곤충 세포에서의 전길이 hTRT의 발현을 유도한다. 멜리틴 신호 서열은 분비시에 절단되나, 세포내에 잔존하는 단백질 푸울의 일부이다. 이러한 이유로, 그것은 다음 서열에서 괄호 안에 나타낸다. 이 벡터가 암호화하는 융합 단백질의 서열은 아래에 나타낸다:
Figure 111999002929091-pct00047
포유류 세포에서의 hTRT의 발현
본 발명은 전술한 본 발명의 다수의 양태에 유용하고, 다양한 포유류 세포주에서 전길이의 생물학적 활성 단백질로서 다량으로 hTRT를 생산하는 벡터를 제공한다.
MPSV-hTRT 발현 플라스미드
본 발명은 또한 암호 서열을 실제로 변형시키지 않고(예컨대 코돈 용례를 최적화하여) 텔로머라제와 같은 재조합 단백질의 최대로 가능한 발현을 제공하고, 표유류 세포에 사용하기 위한 발현계를 제공한다. 한 가지 양태로, 본 발명은 본 발명의 TRT를 발현시킬 수 있는 MPSV 포유류 발현 플라스미드(문헌[Lin J-H(1994) Gene 47:287-292]에 기재된 계를 사용함)를 제공한다. MPSV 플라스미드는 안정한 클론 또는 일시적 클론으로서 발현될 수 있다.
상기 발현계에서는, hTRT 암호 서열 자체가 변화하지 않는 반면에, 외래의 전사 제어 요소를 벡터내로 도입시킨다. 골수 증식성 육종 비루스(MPSV) LTR(MPSV-LTR) 프로모터는 시토메칼로비루스(CMV) 인핸서에 의해 증폭되는 것으로 전자 개시를 위해 도입한다. 이 프로모터는 세포주에서 보다 높은 발현을 나타낸다(Lin J-H(1994)의 상기 문헌 참조). 코작 일치 서열은 해독 개시를 위해 도입할 수 있다(문헌[Kozak(1996) Mamm. Genome 7:563-574] 참조). 모든 이상 5' 및 3' 비해독 hTRT 서열을 제거하여 전술한 바와 같이 이들 서열이 발현을 방해하지 않도록 할 수 있다. 완전 hTRT 암호 서열을 포함하나, 모든 이상 서열은 제거된 MPSV 플라스미드는 pGRN133으로 명명되었다. 대조군인 hTRT "안티센스" 플라스미드도 구성하였다. 이 벡터는 TRT 삽입체가 hTRT의 안티센스 서열(벡터로서 사용될 수 있는 대조군 안티센스는 pGRN 134로 명명됨)인 것을 제외하고는 pGRN133과 동일하다. 기타 모든 외래성 서열을 제거한 완전 hTRT 암호 서열과 코작 일치 서열을 포함하는 MPSV 플라스미드는 pGRN145로 표시하였다.
두 개의 선별 마커, 즉 PAC(퓨로마이신-N-아세틸-트랜스퍼라제= 퓨로마이신 내성) 및 HygB(하이그로마이신 B= 하이그로마이신 내성)는 형질감염후 플라스미드의선별을 위해 존재한다(상기에서 선별용 마커와 관련하여 언급함). 벡터 폴리링커의 양쪽에 마커를 사용하는 이중 선별은 hTRT 암호 서열의 안정성을 증가시킨다. 안정한 클론을 만든 후에 발현 카세트를 증폭시키기 위해서는 DHFR(디히드로폴레이 트 리덕타제)을 암호화하는 서열이 포함된다. 유전자 증폭의 기타 수단을 사용하여 재조합 단백질 수율을 증가시킬 수도 있다.
본 발명은 또한 hTRT 융합 단백질을 포함하는 MPSV 포유류 발현 플라스미드를 제공한다. 일 양태로, 그 5' 비해독 영역을 보유하는 hTRT 서열은 IBI FLAG(코네티컷주 뉴 헤이븐 소재의 바이오테크놀로지스 인코포레이티드(IBI), 코닥)과 같은 에피토프 플랙에 연결시키고, MPSV 발현 플라스미드(pGRN147로 명명됨)내로 삽입하였다. 이 구체적인 구성체는 코작 해독 개시 부위로 구성된다. 발현된 융합 단백질은 M-1 항-플랙 옥타펩티드 모노클로널 항체(상기 IBI, 코닥)를 사용하여 정제할 수 있다.
또 다른 양태로, hTRT는 부위 특이적으로 변화시킨다. 하나의 아미노산 잔기 코돈을 돌연변이시켜 위치 869의 아스파르트산을 알라닌으로 대체한다. 그 5' 비해독 영역을 보유하고 코작 서열을 포함하는 이러한 Asp869→Ala hTRT 돌연변이체를 MPSV 발현 플라스미드내로 삽입하고, pGRN146으로 명명하였다. Asp869→Ala hTRT 돌연변이체는 전술한 바와 같이 FLAG 서열 및 MPSV 발현 플라스미드내로 클로닝된 삽입체를 포함하도록 추가로 조작하였다. 이 발현 플라스미드는 pGRN154로 명명하였다. 구체적으로, pGRN154의 경우, hTRT의 코작 서열 포함 "전단"(5'분절)을 포함한 pGRN146에서 유래한 Eam1105I 제한 효소 처리 단편을 pGRN147(상기 참조)의 Eam1105I 부위내로 클로닝하여 코작 서열, 상기 D869→A 돌연변이 및 IBI 플랙을 가진 hTRT를 발현시킬 수 있는 MPSV 발현 플라스미드를 제조하였다.
본 발명의 또 다른 양태는 pGRN146에서 유래한 발현 플라스미드이다. pGRN152로 명명된 포유류의 발현 플라스미드는 플라스미드 pGRN146(포유류 세포에서 TRT ORF를 포함)으로부터 EcoRI 단편을 절제하여 생성시키고, pBBS212의 EcoRI 부위내로 클로닝하여 hTRT의 5'UTR을 제거하였다. hTRT는 그 발현이 MPSV 프로모터에 의해 제어되도록 배향된다. 이 과정은 코작 일치 서열 및 D869→A 돌연변이를 가진 hTRT를 발현시키고, MPSV 프로모터를 사용하는 포유류 발현 플라스미드를 제조한다.
본 발명은 hTRT 암호 서열이 MPSV 프로모터에 의해 구동되도록 hTRT가 배향된 포유류 발현 벡터를 제공한다. 예를 들면, hTRT 개방형 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 pGRN137에서 유래한 EcoR1 제한 효소 처리 단편을 pBBS212(하기 참조)의 EcoR1 부위내로 클로닝하여 hTRT의 5' 비해독 영역(5'-UTR)을 제거하였다. pGRN137은 pGRN136의 Sal1-SSE 8387I 부위내로 hTRT의 코작 돌연변이를 포함하는 후술하는 바와 같은 pGRN130으로부터 SalI-Sse8387I 단편을 절제하여, MPSV 프로모터로부터 코작 일치 서열을 포함하는 hTRT를 발현시키는 포유류 발현 플라스미드를 형성하도록 구성하였다. 플라스미드 pGRN136은 hTRT ORF를 포함하는 pGRN126으로부터 HindIII SalI 단편을 절제하고, 그것을 플라스미드 pBBS242의 HindIII SalI 부위내로 클로닝하여, MPSV 프로모터로부터 hTRT를 발현시키는 포유류 발현 플라스미드를 형성하도록 구성하였다. 이러한 과정은 MPSV 프로모터를 사용하여 코작 일치 서열을 가진 hTRT를 발현시키는 pGRN145로 명명된 포유류 발현 플라스미드를 제조한다. 또한 후술하는 pGRN152 MPSV 프로모터에 의해 유발되는 포유류 발현 벡터를 참조할 수 있다.
에피좀 벡터 pEBVHis를 사용하는 293 세포에서의 hTRT 발현
에피좀 벡터 pEBVHis(캘리포니아 샌 디에고 소재의 인비트로겐)를 조작하여 N-말단 연장 에피토프 표지, Xpress 에피토프(캘리포니아 샌 디에고 소재의 인비트로겐)(pGRN122로 명명됨)에 융합된 hTRT를 포함하는 hTRT 융합 단백질을 발현시켰다. hTRT ORF를 포함하는 pGRN121로부터 얻은 NotI hTRT 단편을 hTRT ORF가 벡터의 로우스 육종 비루스(RSV) 프로모터와 동일한 방향으로 존재하도록 pEBVHisA의 NotI 부위내로 클로닝하였다. 이 방향으로 His6 플랙은 hTRT의 N-말단에 상대적으로 더 가까웠다.
삽입체로서 hTRT 및 에피토프 태그의 안티센스 서열을 포함하는 벡터(대조군으로 사용할 수 있는 pGRN123으로 명명된 플라스미드)도 구성되었다. 이 벡터로 293 세포를 형질감염시키고, Xpress 에피토프에 특이적인 항체를 사용하여 동정되고 분리되는 hTRT를 해독하였다. pEBVHis는 N-말단 펩티드에 융합된 당해 단백질을 발현시키는 하이그로마이신 내성 EBV 에피좀 벡터이다. 이 벡터를 보유하는 세포를 선별하고, 세포수를 증가시킨 다음, 핵 및 세포질 추출물을 준비하였다. 이들 추출물 및 대조군 추출물은 Xpress 항체로 면역 침전시키고, 면역 침전된 비드는 통상의 분석법으로 텔로머라제 활성에 대해 시험하였다.
유한 증식성의 정상 이배체 인간 세포에서의 재조합 TRT의 발현
본 발명의 일 양태로, 재조합 TRT 및 필요한 텔로머라제 효소 복합체 성분은 정상의 이배체의 유한 증식성 세포에서 발현되어 그 증식능을 증가시키거나 또는 이 세포들을 불멸화하거나 또는 이 세포들의 불멸화를 촉진할 수 있다. 이로써, 다 른 정상의 표현형 및 핵형을 가진 이배체 불멸성 세포를 얻을 수 있다. 전술한 바와 같이, 텔로머라제의 이러한 사용은 엄청난 상업적 용도를 가진다.
센스 hTRT(도 16) 및 안티센스 hTRT를 CMV 벡터내로 클로닝하였다. 이들 벡터를 정제하고, 두 개의 정상의 유한 증식성 이배체 인간 세포 클론내로 일시적으로 형질감염시켰다. 인간 클론은 어린 계대 이배체 인간 BJ 및 IMR90 세포 계통이었다.
트래피즈(상표명) 키트(매릴랜드주 게이더스버그 소재의 온코르 인코포레이티드)를 이용하는 트랩(TRAP) 분석법을 사용하는 텔로머라제 활성의 분석으로부터 센스 hTRT의 형질감염(안티센스 hTRT의 경우는 아님)은 BJ 및 IMR90 세포 계통에서 둘다 텔로머라제 활성을 생성시켰음을 알 수 있다.
무한 증식성 IMR90 인간 세포에서의 재조합 hTRT의 발현
전술한 이배체 인간 BJ 및 IMR90 세포 계통 연구에 사용된 CMV 벡터내로 클로닝된 동일한 hTRT 센스 구성체를 사용하여, 불멸화된 SW13 ALT 경로의 세포주(SV40 항원으로 불멸화된 IMR90 세포)는 일시적으로 전사되었다. 트랩 분석(트래피즈, 매릴랜드주 게이더스버그 소재의 온코르 인코포레이티드)은 텔로머라제 활성이 센스 구성체 형질감염된 세포에서 생성되었음을 입증하였다.
포유류 세포에서의 hTRT의 조절 발현용 벡터: hTRT의 유도성 및 억제성 발현
본 발명은 hTRT와 같은 본 발명의 TRT의 발현을 유도 또는 억제하도록 조작될 수 있는 벡터를 제공한다. 예를 들면, hTRT 암호 서열은 인비트로겐(캘리포니아 주 샌 디에고)의 엑디손-유도성 발현계 및 클론테크 래보러토리즈 인코포레이티드(캘리포니아주 팔로 알토)의 테트-온(Tet-On) 및 테트-오프(Tet-Off) 테트라사이클린 조절되는 계내로 클로닝할 수 있다. 그러한 유도성 발현계는 형질감염된 TRT의 전사 농도 또는 전사 속도를 제어하는 것이 중요한 경우에 본 발명의 방법에 사용하기 위해 제공된다. 예를 들면, 본 발명은 hTRT의 발현을 통해 불멸화된 세포주를 제공하는데; 그러한 세포는 테트-오프계에 의해 제공되는 것들과 같은 전사 제어를 통해 벡터에 의한 hTRT 발현의 저해에 의해 "유한증식성"으로 될 수 있다. 본 발명은 또한 전술한 바와 같이 형질감염된 세포의 원치 않는 "무한증식성화"를 초래할 수 있는 hTRT의 연속 발현을 피하기 위해 일시적으로만 TRT를 발현시키는 방법을 제공한다.
엑디손-유도성 포유류 발현계는 포유류 세포에서 당해 유전자의 조절된 발현을 허용하도록 조작된다. 이 계는 검출 가능한 기본 발현을 거의 허용하지 않으며, 포유류 세포에서보다 200배 이상의 유도능을 허용한다. 발현계는 초파리의 이종이량체 엑디손 수용체에 근거한다. 엑디손-유도성 발현계는 스테로이드 호르몬 엑디손 유사체인 뮤리스테론 A를 사용하여 이종 이량체의 핵 수용체를 통해 TRT의 발현을 활성화한다. 발현 농도는 포유류 세포 생리학에 영향이 없는 기본 농도에 비해 200배를 초과하는 것으로 보고되었다("Ecdysone-Inducible Gene Expression in Mammalian Cells and Transgenic Mice"(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 3346-3351). 수용체가 엑디손 또는 엑디손의 유사체인 뮤리스테론에 일단 결합하면, 수용체는 당해 유전자의 제어된 발현을 얻기 위해 엑디손-반응성 프로모터를 활성화한다. 엑디손-유도성 포유류 발현계에서, 이종 이량체 수용체의 두 단량체는 동일한 벡터인 pVgRXR로부터 연속적으로 발현된다. 엑디손-반응성 프로모터는 당해 유전자의 발현을 궁극적으로 유발하는 것으로서 제2 벡터인 pIND상에 위치하여 당해 유전자의 전사를 유발한다.
hTRT 암호 서열은 pIND 벡터(캘리포니아주 팔로 알토 소재의 클론테크 래보러토리즈 인코포레이티드)에서 클로닝하는데, 이 벡터는 최소 열충격 프로모터 및 다수의 클로닝 부위 상류의 5개의 변형된 엑디손 반응 요소(E/GRE)를 포함한다. 구성체는 엑디손 수용체를 안정하게 발현시키도록 사전 조작된 세포주에서 형질감염된다. 형질감염후, 세포를 뮤리스테론 A로 처리하여 pIND로부터 세포내 발현을 유도한다.
테트-온 및 테트-오프 발현계(캘리포니아주 팔로 알토 소재의 클론테크)는 조절되는 고농도의 유전자 발현계의 수단이 되는데, 참고 문헌으로는 테트-오프 전사 억제계에 대해서는 문헌[Gossen(1992) "Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline responsive promoters" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551]; 및 테트-온 유도성 전사계에 대해서는 문헌[Gossen(1995) "Transcriptional activation by tetracycline in mammalian cells" Science 268:1766-1769]이 있다. "테트-오프" 형질전환 세포주에서, 유전자 발현은 테트라사이클린(Tc) 또는 독시사이클린("Dox"; Tc 유도체)이 배양 배지로부터 제거될 때 개시된다. 대조적으로, 테트-온 세포주에서는 배지에 Tc 또는 Dox를 첨가하면 개시된다, 두 계는 클로닝된 유전자의 발현이 다양한 농도의 Tc 또는 Dox에 반응하여 세밀하게 조절되도록 한다.
이 계는 당해 유전자를 발현시키는 데 사용될 수 있는 반응 플라스미드로서 "pTRE"를 사용한다. 플라스미드 pTRE는 Tet-반응성 PhCMV* -1 프로모터의 바로 하류에 다수의 클로닝 부위(MCS)를 포함한다. MCS의 부위중의 하나에 삽입된 당해 유전자 또는 cDNA는 테트-오프 및 테트-온계에서 각각 tTA 및 rtTA 조절 단백질에 반응할 것이다. PhCMV* -1은 테트-반응성 요소(TRE)를 포함하며, 이 요소는 42 bp의 tet 오퍼레이터 서열(tetO)의 7개 사본으로 구성되어 있다. TRE 요소는 최소 CMV 프로모터(PminCMV)의 바로 상류에 존재하는데, 이것은 pTet 플라스미드에서 완전 CMV 프로모터의 일부인 인핸서가 결핍되어 있다. 결국, PhCMV* -1은 tetO 서열에 조절 단백질의 결합이 부재하는 경우에는 침묵성이다. 클로닝된 삽입체는 개시 코돈을 가져야 한다. 일부 경우에는, 코작 일치 리보좀 결합 부위의 첨가가 발현 농도를 향상시킬 수 있으나, 다수의 cDNA는 코작 서열을 첨가하지 않고 Tet 계에서 효율적으로 발현되었다. pTRE-유전자 X 플라스미드는 안정한 형질감염체를 선별할 수 있게 하는 pTK-Hyg로 동시 형질감염된다.
테트-오프 또는 테트-온 발현계의 확립에는 일반적으로 TRE의 제어하에 적당한 조절 단백질 및 TRT를 암호화하는 유전자의 통합된 사본을 포함하는 "이중 안정성" 세포주를 생성시키기 위해 두 번의 연속적인 안정한 형질감염이 필요하다. 첫 번째 형질감염에서는 적당한 조절 단백질을 발현시키는 pTet-Off 또는 pTet-On 벡터와 같은 "조절 플라스미드"의 형질감염에 의해 선택되는 세포주내로 적당한 조절 단백질이 도입된다. 그 다음, pTRE "반응 플라스미드"에서 클로닝된 hTRT는 제2 형질감염에서 도입되어 이중 안정성 테트-오프 또는 테트-온 세포주를 생성시킨다. 두 계는 유전자 발현, 조절되는 용량 의존적 유도 및 높은 절대 농도의 유전자 발현의 매우 세밀한 온/오프 제어를 제공한다.
DHFR 및 아데노비루스 서열을 가진 재조합 TRT의 발현
pGRN155 플라스미드 구성체는 포유류 세포에서 hTRT cDNA를 일시적으로 발현시키도록 조작하였다. 코작 일치 서열은 hTRT 서열의 5' 말단에 삽입한다. hTRT 삽입체는 3' 또는 5' UTR을 포함한다. hTRT cDNA는 p91023(B)(Wong(1985) Science 228:810-815)의 EcoRI 부위내로 삽입한다. hTRT 삽입체는 DHFR ORF와 동일한 방향으로 삽입된다.
플라스미드 pGRN155는 아데노비루스 프로모터의 바로 상류의 SV40 기원 및 인핸서, 테트라사이클린 내성 유전자, 이.콜리 기원 및 아데노비루스 VAI 및 VAII 유전자 영역을 포함한다. 이 발현 카세트는 다음 순서로 아데노비루스 주요 후기 프로모터; 아데노비루스 3부분 리더; 3부분 리더의 첫 번째 엑손에서 유래한 5' 스플라이스 부위 및 마우스 임뮤노글로불린 유전자에서 유래한 3' 스플라이스 부위로 구성되는 하이브리드 인트론; hTRT cDNA; 마우스 DHFR 암호 서열; 및 SV40 폴리아데닐화 신호를 포함한다.
아데노비루스 3부분 리더 및 VA RNA는 폴리시스트론 mRNA가 해독되는 효율을 증가시키는 것으로 보고되었다. DHFR 서열은 하이브리드 mRNA의 안정성을 향상시키는 것으로 보고되었다. DHFR 서열은 또한 선별용 마커 및 벡터 서열의 증폭을 제공 할 수 있다. 문헌[Logan(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655); Kaufman (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:689; and Kaufman (1988) Focus (Life Technologies, Inc.), Vol.10, no. 3)] 참조. 이로써, 일시적 발현에 특히 유용한 발현 벡터가 제조된다.
예시 목적으로 기재하는 본 발명의 다른 발현 플라스미드
pGRN121
hTRT 단백질을 암호화하는 전체 cDNA를 포함하는 람다 클론 25-1.1.6으로부터 얻은 EcoRI 단편을 cDNA의 5' 말단이 벡터내 T7 프로모터 근처에 위치하도록 p블루스크립트IISK+의 EcoRI 부위내로 삽입하였다. 이 벡터와 함께 사용되는 선별용 마커는 앰피실린이다.
pGRN122
hTRT ORF를 포함하는 pGRN121로부터 얻은 NotI 단편을 암호 서열이 RSV 프로모터에 작동 가능하게 연결되도록 pEBVHisA의 NotI 부위내로 삽입하였다. 이 벡터와 함께 사용되는 선별용 마커는 앰피실린 또는 하이그로마이신이다.
pGRN123
hTRT ORF를 포함하는 pGRN121로부터 얻은 NotI 단편을 암호 서열이 RSV 프로모터와 반대 방향으로 위치하여 안티센스 hTRT를 발현시키도록 pEBVHisA의 NotI 부위내로 삽입하였다.
pGRN124
플라스미드 pGRN121에서 모든 ApaI 부위를 결실시킨 다음, 3'UTR을 포함하는 MscI-HincII 단편을 결실시켰다. hTRT 암호 서열의 종결 코돈을 포함하는 Nco-XbaI 단편을 pGRN121의 Nco-XbaI 부위내로 삽입하여 3'UTR이 결핍된 것을 제외하고는 pGRN121과 동등한 플라스미드를 제조하였는데, 이것은 일부 세포에서의 증가된 발현 농도에 바람직할 수 있다.
pGRN125
hTRT 암호 서열을 포함하는 pGRN124로부터 얻은 NotI 단편을 개방형 리딩 프레임이 Lac 프로모터의 반대 방향으로 위치하도록 pBBS235의 NotI 부위내로 삽입하였다. 이 벡터와 함께 사용되는 선별용 마커는 클로람페니콜이다.
pGRN126
hTRT 암호 서열을 포함하는 pGRN124로부터 얻은 NotI 단편을 삽입된 hTRT 암호 서열이 Lac 프로모터와 동일한 방향으로 위치하도록 pBBS235의 NotI 부위내로 삽입하였다.
pGRN127
다음과 같은 올리고뉴클레오티드를 pGRN125의 시험관내 돌연변이 유발에 사용하여 hTRT 암호 서열의 개시 ATG 코돈을 코작 일치 서열로 전환시키고, 클로닝을 위해 EcoRI 및 BglII 부위를 생성시켰다:
5'-TGCGCACGTGGGAAGCCCTGGCagatctgAattCCaCcATGCCGCGCGCTCCCCGCTG-3'. 또한, 올리고뉴클레오티드 COD2866을 사용하여 AmpS를 AmpR(암피실린 내성)로 전환시키고, 올리고뉴클레오티드 COD1941을 사용하여 CatR(클로람페니콜 내성)을 CatS(클로람페니콜 민감성)으로 전환시켰다.
pGRN128
다음과 같은 올리고뉴클레오티드를 시험관내 돌연변이 유발에 사용하여 hTRT의 개시 ATG 코돈을 코작 일치 서열로 전환시키고, 클로닝을 위해 EcoRI 및 BglII 부위를 생성시켰다:
5'-TGCGCACGTGGGAAGCCCTGGCagatctgAattCCaCcATGCCGCGCGCTCCCCGCTG-3'.
또한, 다음과 같은 올리고뉴클레오티드를 사용하여 C-말단에 IBI 플랙(코네티컷주 뉴 헤이븐 소재의 인터내쇼날 바이오케크놀로지스 인코포레이티드(IBI), 코닥)을 삽입하고, 클로닝을 위해 EcoRI 및 BglII 부위를 생성시켰다:
5'-CTGCCCTCAGACTTCAAGACCATCCTGGACTACAAGGACGACGATGACAAATGAATTCAGATCTGCG GCCGCCACCGCGGTGGAGCTCCAGC-3'.
또한, COD2866을 사용하여 AmpS를 AmpR로 전환시키고, COD1941을 사용하여 CatR을 CatS로 전환시켰다.
pGRN129
다음과 같은 올리고뉴클레오티드를 시험관내 돌연변이 유발에 사용하여 Asp869를 Ala 코돈으로 전환시켰다(즉, DD 모티프의 두 번째 Asp를 알라닌으로 전환시켜 우성/음성 hTRT 돌연변이체를 생성시켰다):
5'-CGGGACGGGCTGCTCCTGCGTTTGGTGGAcGcgTTCTTGTTGGTGACACCTCACCTCACC-3'.
이것은 또한 MluI 부위를 생성시켰다.
또한, 다음과 같은 올리고뉴클레오티드를 사용하여 C-말단에 IBI 플랙을 삽입하고, 클로닝을 위해 EcoRI 및 BglII 부위를 생성시켰다:
5'-CTGCCCTCAGACTTCAAGACCATCCTGGACTACAAGGACGACGATGACAAATGAATTCAGATCTGCGG
CCGCCACCGCGGTGGAGCTCCAGC-3'.
또한, COD2866을 사용하여 AmpS를 AmpR로 전환시키고, COD1941을 사용하여 CatR을 CatS로 전환시켰다.
pGRN130
다음과 같은 올리고뉴클레오티드를 시험관내 돌연변이 유발에 사용하여 Asp869 코돈을 Ala 코돈으로 전환시켰다(즉, DD 모티프의 두 번째 Asp를 알라닌으로 전환시켜 우성/음성 변형체 단백질을 생성시켰다):
5'-CGGGACGGGCTGCTCCTGCGTTTGGTGGAcGcgTTCTTGTTGGTGACACCTCACCTCACC-3'.
이것은 또한 MluI 부위를 생성시켰다.
또한, 다음과 같은 올리고뉴클레오티드를 시험관내 돌연변이 유발에 사용하여 hTRT 암호 서열의 개시 ATG 코돈을 코작 일치 서열로 전환시키고, 클로닝을 위해 EcoRI 및 BglII 부위를 생성시켰다:
5'-TGCGCACGTGGGAAGCCCTGGCagatctgAattCcaCcATGCCGCGCGCTCCCCGCTG-3'.
또한, COD2866을 사용하여 AmpS를 AmpR로 전환시키고, COD1941을 사용하여 CatR을 전환시켰다.
pGRN131
코작 서열 및 IBI 플랙 돌연변이와 함께 hTRT ORF를 포함하는 pGRN128로부터 얻은 EcoRI 단편을 hTRT ORF가 MPSV 프로모터로부터 발현되도록 pBBS212의 EcoRI 부위내로 삽입하였다. 플라스미드 pBSS212는 MPSV 프로모터, CMV 인핸서 및 SV40 폴리아데닐화 부위를 포함한다.
pGRN132
코작 서열 및 IBI 플랙 돌연변이와 함께 hTRT ORF를 포함하는 pGRN128로부터 얻은 EcoRI 단편을 hTRT ORF의 안티센스가 MPSV 프로모터로부터 발현되도록 pBBS212의 EcoRI 부위내로 삽입하였다.
pGRN133
hTRT 암호 서열을 포함하는 pGRN121로부터 얻은 EcoRI 단편을 hTRT 단백질이 MPSV 프로모터의 제어하에 발현되도록 pBBS212의 EcoRI 부위내로 삽입하였다.
pGRN134
hTRT 암호 서열을 포함하는 pGRN121로부터 얻은 EcoRI 단편을 hTRT 암호 서열의 안티센스가 MPSV 프로모터의 제어하에 발현되도록 pBBS212의 EcoRI 부위내로 삽입하였다. 이 벡터와 함께 사용되는 선별용 마커는 Chlor/HygB/PAC이다.
pGRN135
플라스미드 pGRN126을 MscI 및 SmaI로 완전히 처리하고, 삽입된 hTRT 암호 서열의 95이상이 결실되도록 재결찰하였다. 이 과정중에 하나의 SmaI-MscI 단편을 재삽입하여 선별을 위해 Cat 활성을 재생시켰다. 이 정제되지 않은 플라스미드를 SalI 및 EcoRI로 재처리하고, hTRT 암호 서열의 개시 코돈을 포함하는 단편을 pBBS212의 SalI-EcoRI 부위내로 삽입하였다. 이로써, 암호 서열의 73개 염기 및 5'UTR의 안티센스를 발현시키는 안티센스 발현 플라스미드를 제조한다. 이 벡터와 함께 사용되는 선별용 마커는 Chlor/HygB/PAC이다.
pGRN136
hTRT 암호 서열을 포함하는 pGRN126으로부터 얻은 HindIII-SalI 단편을 pBBS242의 HindIII-SalI 부위내로 삽입하였다.
pGRN137
코작 서열을 포함하는 pGRN130으로부터 얻은 SalI-Sse8387I 단편을 pGRN136의 SalI-Sse8387I 부위내로 삽입하였다.
pGRN138
3'UTR이 제외된 hTRT를 포함하는 pGRN124로부터 얻은 EcoRI 단편을 hTRT의 방향이 EGFP 도메인과 동일하도록 pEGFP-C2의 EcoRI 부위내로 삽입하였다.
pGRN139
다음과 같은 올리고뉴클레오티드를 사용하여 pGRN125의 hTRT의 C-말단에 IBI 플랙을 삽입하고, 클로닝을 위해 EcoRI 및 BglII 부위를 생성시켰다:
5'-CTGCCCTCAGACTTCAAGACCATCCTGGACTACAAGGACGACGATGACAAATGAATTCAGATCTGCGG
CCGCCACCGCGGTGGAGCTCCAGC-3'.
또한, COD2866을 사용하여 AmpS를 AmpR로 전환시키고, COD1941을 사용하여 CatR을 CatS로 전환시켰다.
pGRN140
람다G55로부터 얻은 hTRT의 첫 번째 인트론 및 게놈 hTRT의 상류 서열을 포함하는 NcoI 단편을 pBBS167의 NcoI 부위내로 삽입하였다. 단편은 hTRT가 Lac 프로모터와 동일한 방향으로 위치하도록 배향된다.
pGRN141
람다G55로부터 얻은 hTRT의 첫 번째 인트론 및 게놈 hTRT의 상류 서열을 포함하는 NcoI 단편을 pBBS167의 NcoI 부위내로 삽입하였다. 단편은 hTRT가 Lac 프로모터와 반대 방향으로 위치하도록 배향된다.
pGRN142
이 벡터는 이.콜리에서 TRT 서열의 발현 및 돌연변이 유발을 위해 구성하였다. 람다 GN5(lac 배향)로부터 얻은 프로모터 클론을 사용하였다. 이 벡터와 함께 사용되는 선별용 마커는 앰피실린이다. hTRT 유전자 프로모터 영역을 포함하는 완전한 ~15 kbp의 게놈 삽입체를 보유한 람다Gphi5로부터 얻은 NotI 단편을 플라스미드 pBBS185의 NotI 부위내로 삽입하였다. 이 단편은 hTRT ORF가 Lac 프로모터와 반대 방향으로 위치하도록 배향된다.
pGRN143
이 벡터는 이.콜리에서 TRT 서열의 발현 및 돌연변이 유발을 위해 구성하였다. hTRT 유전자 프로모터 영역을 포함하는 완전한 ~15 kbp의 게놈 삽입체를 보유한 람다Gphi5로부터 얻은 NotI 단편을 플라스미드 pBBS185의 NotI 부위내로 삽입하였다. 이 단편은 hTRT ORF가 Lac 프로모터와 동일한 방향으로 위치하도록 배향된다. 이 벡터와 함께 사용되는 선별용 마커는 앰피실린이다.
pGRN144
람다 서열을 제거하기 위한 pGRN140의 SAL1 결실
pGRN145
이 벡터는 포유류 세포에서 hTRT 서열의 발현을 위해 구성하였다. hTRT 암호 서열을 포함하는 pGRN137로부터 얻은 EcoRI 단편을 pBBS212의 EcoRI 부위내로 삽입하여 hTRT mRNA의 5'UTR에 상응하는 서열의 일부를 제거하였다. hTRT 암호 서열은 이것이 MPSV 프로모터의 제어하에 발현되도록 배향된다. 이 벡터와 함께 사용되는 선별용 마커는 Chlor/HygB/PAC이다.
pGRN146
이 벡터는 포유류 세포에서 hTRT 서열의 발현을 위해 구성하였다. hTRT의 D869A 돌연변이를 포함하는 pGRN130으로부터 얻은 Sse8387I-NotI 단편을 pGRN137의 Sse8387I-NotI 부위내로 삽입하였다. 이 벡터와 함께 사용되는 선별용 마커는 앰피실린/HygB/PAC이다.
pGRN147
IBI 플랙을 포함하는 pGRN139로부터 얻은 Sse8387I-NotI 단편을 pGRN137의 Sse8387I-NotI 부위내로 삽입하였다.
pGRN148
hTRT의 프로모터 영역을 포함하는 pGRN144로부터 얻은 BflII-Eco47III 단편을 pSESP2의 BglII-NruI 부위내로 삽입하여 hTRT 프로모터/리포터 구성체를 제조하였다.
pGRN149
이 벡터는 이.콜리에서 TRT 서열의 발현 및 돌연변이 유발을 위해 구성하였다. 돌연변이된 올리고 5'-cttcaagaccatcctggactttcgaaacgcggccgccaccgcggtggagctc c-3'을 사용하여 pGRN125의 시험관내 돌연변이 유발에서 hTRT의 C-말단의 CSP45I 부위에 첨가하였다. hTRT의 "정지" 코돈을 결실시키고, Csp45I 부위로 대체하였다. 이 벡터와 함께 사용되는 선별용 마커는 앰피실린이다.
pGRN150
hTRT의 프로모터 영역을 포함하는 pGRN144로부터 얻은 BglII-FspI 단편을 pSEAP2의 BglII-NruI 부위내로 삽입하여 hTRT 프로모터/리포터 구성체를 제조하였다.
pGRN151
이 벡터는 포유류 세포에서 hTRT 서열의 발현을 위해 구성하였다. hTRT 암호 서열을 포함하는 pGRN147로부터 얻은 EcoRI 단편을 pBBS212의 EcoRI 부위내로 삽입하여 hTRT mRNA의 5'UTR에 상응하는 서열의 일부를 제거하였다. hTRT 암호 서열은 이것이 MPSV 프로모터의 제어하에 발현되도록 배향된다. 이 벡터와 함께 사용되는 선별용 마커는 Chlor/HygB/PAC이다.
pGRN152
hTRT 암호 서열을 포함하는 pGRN146으로부터 얻은 EcoRI 단편을 pBBS212의 EcoRI 부위내로 삽입하여 hTRT의 5'UTR에 상응하는 서열의 일부를 제거하였다. hTRT 암호 서열은 이것이 MPSV 프로모터의 제어하에 발현되도록 배향된다.
pGRN153
hTRT의 D869→A 돌연변이(hTRT 변형체 암호 서열)를 포함하는 pGRN130으로부터 얻은 StyI 단편을 pGRN158의 StyI 부위내로 삽입하여 그 5'-말단에 코작 일치 서열, 그 3'-말단(C-말단 암호 영역)에 IBI 플랙 서열, 및 D869→A 돌연변이를 가진 hTRT 암호 서열을 포함하는 플라스미드를 제조하였다.
pGRN154
이 벡터는 포유류 세포에서 hTRT 서열의 발현을 위해 구성하였다. hTRT 유전자를 포함하는 pGRN153의 EcoRI 단편을 hTRT ORF가 MPSV 프로모터와 동일한 방향으로 배향되도록 플라스미드 pBBS212의 EcoRI 부위내로 삽입하였다. 이로써, 그 아미노 말단에 코작 일치 서열, 그 카르복시 말단에 IBI 플랙 서열, 및 D869→A 돌연변이를 가진 hTRT 단백질을 발현시키는 MPSV-유도된 발현 플라스미드를 제조하였다. 이 벡터와 함께 사용되는 선별용 마커는 앰피실린/HygB/PAC이다.
pGRN155
이 벡터는 포유류 세포에서 hTRT 서열의 발현을 위해 구성하였다. 삽입체는 5' 및 3' UTR이 없는 hTRT의 전길이의 cDNA, 및 코작 서열을 포함하였다. 코작 일치 서열을 보유하고 3' 또는 5' UTR을 보유하지 않는 hTRT cDNA를 포함하는 pGRN145로부터 얻은 EcoRI 단편을 hTRT가 DHFR ORF와 동일한 방향으로 배향되도록 p91023(B)의 EcoRI 부위내로 삽입하였다. 이로써, hTRT에 대한 일시적 발현 벡터를 제조하였다. 이 벡터와 함께 사용되는 선별용 마커는 테트라사이클린이다.
pGRN156
이 벡터는 포유류 세포에서 hTRT 서열의 발현을 위해 구성하였다. 코작 일치 서열을 보유하고 3' 또는 5' UTR을 보유하지 않는 hTRT cDNA의 D869A 돌연변이를 포함하는 pGRN145로부터 얻은 EcoRI 단편을 hTRT가 DHFR ORF와 동일한 방향으로 배 향되도록 p91023(B)의 EcoRI 부위내로 삽입하였다. 이 삽입체는 5' 및 3' UTR이 없는 hTRT의 전길이의 cDNA, 및 코작 서열을 포함하였다. 이 벡터와 함께 사용되는 선별용 마커는 테트라사이클린이다.
pGRN157
이 벡터는 포유류 세포에서 hTRT 서열의 발현을 위해 구성하였다. C-말단에 IBI 플랙과 함께 코작 일치 서열을 보유하고 3' 또는 5' UTR을 보유하지 않는 hTRT cDNA를 포함하는 pGRN147로부터 얻은 EcoRI 단편을 hTRT가 DHFR ORF와 동일한 방향으로 배향되도록 p91023(B)의 EcoRI 부위내로 삽입하였다. 이 삽입체는 5' 및 3' UTR이 없는 hTRT의 전길이의 cDNA, IBI 플랙 서열 및 코작 서열을 포함하였다. 이 벡터와 함께 사용되는 선별용 마커는 테트라사이클린이다.
pGRN158
이 벡터는 이.콜리 세포에서 TRT 서열의 발현 및 돌연변이 유발을 위해 구성하였다. hTRT ORF를 포함하는 pGRN151로부터 얻은 EcoRI 단편을 hTRT가 Lac 프로모터와 반대 방향으로 배향되도록 pBBS183의 EcoRI 부위내로 삽입하였다. 이 삽입체는 5' 및 3' UTR이 없는 전길이의 cDNA, IBI 플랙 서열 및 코작 서열을 포함하였다. hTRT 암호 서열은 T7 프로모터에 의해 작동되었다. 이 벡터와 함께 사용되는 선별용 마커는 앰피실린이다.
pGRN159
이 벡터는 이.콜리 세포에서 TRT 서열의 발현 및 돌연변이 유발을 위해 구성하였다. hTRT 융합체에 대한 EGFP를 포함하는 pGRN138로부터 얻은 NheI-KpnI 단편 을 p블루스크립트IIKS+의 XbaI-KpnI 부위내로 삽입하였다. 이로써, 융합 단백질에 대한 T7 발현 벡터가 제조되었다(암호 서열은 T7 프로모터에 의해 작동된다). 이 삽입체는 3' UTR이 없는 hTRT의 전길이의 cDNA를 EGFP와의 융합 단백질로서 포함하였다. 이 벡터와 함께 사용되는 선별용 마커는 앰피실린이다.
pGRN160
이 벡터는 포유류 세포에서 안티센스 hTR 서열의 발현을 위해 구성하였다. 암호 서열은 MPSV 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있다. 전길이의 hTRT ORF를 포함하는 pGRN90으로부터 얻은 XhoI-NsiI 단편을 pBBS295의 SalI-Sse8387I 부위내로 삽입하였다. 이로써, hTR 안티센스 RNA를 발현시키는 일시적/안정한 벡터가 제조되었다. GPT 마커가 벡터내로 도입되었다. 이 벡터와 함께 사용되는 선별용 마커는 Chlor/gpt/PAC이다.
pGRN161
이 벡터는 포유류 세포에서 센스 hTR 서열의 발현을 위해 구성하였다. 전길이의 hTRT ORF를 포함하는 pGRN89로부터 얻은 XhoI-NniI 단편을 pBBS295의 SalI-Sse8387I 부위내로 삽입하였다. 이로써, hTR을 센스 방향으로 발현시키는 일시적/안정한 벡터가 제조되었다. 암호 서열은 MPSV 프로모터에 의해 작동된다. GPT 마커가 벡터내로 도입되었다. 이 벡터와 함께 사용되는 선별용 마커는 Chlor/gpt/PAC이다.
pGRN162
전길이의 hTRT ORF를 포함하는 pGRN87로부터 얻은 XhoI-NsiI 단편을 pBBS295 의 SalI-Sse8387I 부위내로 삽입하였다. 이로써, 절두된 hTR(위치 +108로부터 +435)을 센스 방향으로 발현시키는 일시적/안정한 벡터가 제조되었다.
pGRN163
이 벡터는 이.콜리 세포에서 TRT 서열의 발현 및 돌연변이 유발을 위해 구성하였다. 암호 서열은 T7 프로모터에 의해 작동된다. 올리고뉴클레오티드 RA45(5'-GCCACCCCCGCGCTGCCTCGAGCTCCCCGCTGC-3')를 시험관내 돌연변이 유발에 사용하여 hTRT의 개시 met를 Leu로 변화시키고, Leu 다음의 두 개 코돈에 XhoI 부위를 도입시켰다. 또한 COD 1941을 사용하여 CatR을 CatS로 변화시키고, BSPH1 부위를 도입시키며, COD 2866을 사용하여 AmpS를 AmpR로 변화시켜 FSP1 부위를 도입시켰다. 이 벡터와 함께 사용되는 선별용 마커는 앰피실린이다.
pGRN164
이 벡터는 이.콜리 세포에서 센스 hTR 서열의 발현을 위해 구성하였다. 프라이머 hTR+1 5'-GGGGAAGCTTTAATACGACTCACTATAGGGTTGCGGAGGGTGGGCCTG-3' 및 hTR+45 5'-CCCCGGATCCTGCGCATGTGTGAGCCGAGTCCTGGG-3'을 사용하여 5' 말단에 T7 프로모터를 보유한 전길이의 hTR을 포함하는 pGRN33으로부터 얻은 단편을 PCR로 증폭시켰다(hTR+1에서처럼). PCR 생성물의 BamHI-HindIII 처리물을 pUC119의 BamHI-HindIII 부위내로 삽입하였다. 암호 서열은 T7 프로모터에 작동 가능하게 연결되었다. 이 벡터와 함께 사용되는 선별용 마커는 앰피실린이다.
pGRN165
이 벡터는 이.콜리에서 hTRT 서열의 발현 및 돌연변이 유발을 위해 구성하였 다. 암호 서열은 T7 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있다. 코작 전단부와 함께 hTRT ORF를 포함하는 pGRN145로부터 얻은 EcoRI 단편을 hTRT가 T7 프로모터와 동일한 방향으로 배향되도록 p블루스크립트IISK+의 EcoRI 부위내로 삽입하였다. 이 벡터와 함께 사용되는 선별용 마커는 앰피실린이다.
pGRN166
이 벡터는 포유류 세포에서 TRT 서열의 발현 및 돌연변이 유발을 위해 구성하였다. 암호 서열은 T7 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있다. 후단부에 코작 전단부 및 IBI 플랙과 함께 hTRT ORF를 포함하는 pGRN151로부터 얻은 EcoRI 단편을 hTRT ORF가 T7 프로모터와 동일한 방향으로 배향되도록 p블루스크립트IISK+의 EcoRI 부위내로 삽입하였다. 이 삽입체는 5' 및 3' UTR이 없는 hTRT의 전길이의 cDNA, 플랙 서열(워싱턴주 시애틀 소재의 임뮤넥스 코포레이션) 및 코작 서열을 포함하였다. 이 벡터와 함께 사용되는 선별용 마커는 앰피실린이다.
pGRN167
hTRT ORF의 5' 말단을 포함하는 pGRN144로부터 얻은 AvRII-StuI 단편을 pBBS161의 XbaI-StuI 부위내로 삽입하였다.
pGRN168
이 벡터는 포유류 세포에서 hTRT 서열의 발현을 위해 구성하였다. 최적화된 hTRT 발현 카세트를 포함하는 pGRN145로부터 얻은 EcoRI 단편을 hTRT 암호 서열이 미니CMV 프로모터와 동일한 방향으로 배향되도록 pIND의 EcoRI 부위내로 삽입하였다. 이 벡터와 함께 사용되는 선별용 마커는 앰피실린/네오마이신/카나마이신이다.
pGRN169
이 벡터는 포유류 세포에서 hTRT 서열의 발현을 위해 구성하였다. 최적화된 hTRT 발현 카세트를 포함하는 pGRN145로부터 얻은 EcoRI 단편을 hTRT가 미니CMV 프로모터와 역방향으로 배향되도록 pIND의 EcoRI 부위내로 삽입하였다. hTRT는 인비트로겐으로부터 입수한 엑디손-유도성 발현계내로 클로닝하였다. 삽입체는 5' 및 3' UTR이 없는 hTRT의 전길이의 cDNA 및 코작 서열을 포함하였다. 이 벡터와 함께 사용되는 선별용 마커는 앰피실린/네오마이신/카나마이신이다.
pGRN170
이 벡터는 포유류 세포에서 안티센스 hTRT 서열의 발현을 위해 구성하였다. 최적화된 hTRT 발현 카세트를 포함하는 pGRN145로부터 얻은 EcoRI 단편을 hTRT가 미니CMV 프로모터와 반대 방향으로 배향되도록 pIND(sp1)의 EcoRI 부위내로 삽입하였다. hTRT는 pIND(sp1) 서열을 사용하여 인비트로겐으로부터 입수한 엑디손-유도성 발현계내로 클로닝하였다. 삽입체는 5' 및 3' UTR이 없는 hTRT의 전길이의 cDNA 및 코작 서열을 포함하였다. 이 벡터와 함께 사용되는 선별용 마커는 앰피실린/네오마이신/카나마이신이다.
pGRN171
pGRN163로부터 얻은 Eco47III-NarI 단편을 pGRN167의 Eco47III-NarI 부위내로 삽입하여 hTRT 게놈 DNA의 단편내로 M1L 돌연변이를 도입시켰다.
pGRN172
hTRT ORF에 Met→Leu 돌연변이를 포함하는 pGRN171로부터 얻은 BamHI-StuI 단편을 pSEAP2-Basic의 BglII-NruI 부위내로 삽입하였다.
pGRN173
hTRT 프로모터 영역의 5' 말단을 포함하는 pGRN144로부터 얻은 EcoRV-ECO47III 단편을 pGRN172의 SrfI-Eco47III 부위내로 삽입하였다. 이로써, Met→Leu 돌연변이와 함께, hTRT ORF의 개시부에서 약 2.3 kb 상류로부터 암호 영역의 첫 번째 인트론 바로 다음까지의 hTRT의 프로모터 영역을 포함하는 프로모터 리포터 플라스미드를 제조하였다.
pGRN174
"최적화된" hTRT 발현 카세트를 포함하는 pGRN145로부터 얻은 EcoRI 단편을 hTRT가 미니CMV 프로모터와 동일한 방향으로 배향되도록 pIND(sp1)의 EcoRI 부위내로 삽입하였다.
실시예 7
텔로머라제 활성의 재구성
A. hTRT 및 hTR의 시험관내 동시 발현
이 실시예에서는 시험관내 무세포 발현계를 사용하여 hTRT와 hTR을 동시발현하는 것에 대하여 기재한다. 이 실시예의 결과는 pGRN121에 의해 암호된 hTRT 폴리펩티드가 촉매적 활성 텔로머라제 단백질을 암호하고 재조합적으로 발현된 hTRT와 hTR을 사용하여 텔로머라제 RNP를 시험관내 재구성(IVR)할 수 있음을 증명한다.
텔로머라제 활성은 hTRT을 보유한 선형화된 플라스미드(pGNP121; 1 ㎍ DNA를 XbaI로 절단함)와 hTR을 보유한 선형화된 플라스미드(phTR+1; 1 ㎍ DNA를 FspI로 절단함)를 쌍을 이룬 전사-해독 망상적혈구 용해물계(프로메가 TNTTM )에 첨가하여 재구성하였다. phTR+1은 FspI로 선형화한 뒤 T7 RNA 폴리머라제로 전사시키면 뉴클레오티드 +1에서 부터 시작하여 hTR의 뉴클레오티드 446으로 전개되는 445 뉴클레오티드 전사물을 생성한다[Autexier et al., 1996, EMBO J 15:5928]. 이 반응액 50 ㎕에는 다음과 같은 성분을 첨가하였다: TNTTM 완충액 2 ㎕, TNTTM T7 RNA 폴리머라제 1 ㎕, 1 mM 아미노산 혼합물 1 ㎕, RnasinTM RNase 억제제 40 유니트, 각각 선형화된 주형 DNA 1 ㎍ 및 TNTTM 망상적혈구 용해물 25 ㎕. 이 성분들은 제조자가 제시한 비율로 첨가하고 30 ℃에서 90 분 동안 항온처리하였다. T7 프로모터의 유도하에 전사를 실시하였으며, 또한 망상적혈구 용해물을 첨가하기 전에 전사를 실시한 경우에도 유사한 결과가 얻어졌다. 항온처리한 후, 프로그램된 전사-해독 반응물 5 ㎕ 및 10 ㎕를 사용하여 PCR을 20회 실시하므로써 시그널을 증폭시키고 전술한 바와 같이 TRAP(Autexier et al., 전술한 문헌 설명 참조)으로 텔로머라제 활성을 분석하였다.
재구성 결과는 도 10A 및 도 10B에 도시하였다. 분석된 전사/해독 반응물은 3개의 레인에 장입하였다. 처음 2개의 레인은 이반복 분석물이고 3번째 레인은 PCR 유래의 가공물을 판명하기 위한 TRAP 단계 이전에 열변성시킨(95 ℃, 5 분) 이반복 시료이다.
도 10A 및 도 10B에 도시한 바와 같이, 망상적혈구 용해물 자체에서는 텔로 머라제 활성이 관찰되지 않았다(레인 6). 이와 유사하게, hTR 단독물(레인 1)이나 전길이 hTRT 유전자(레인 4)를 용해물에 첨가한 경우에도 검측가능한 활성이 전혀 관찰되지 않았다. 2가지 성분을 첨가한 경우(레인 2), 텔로머라제 활성이 반복적인 사다리 패턴을 특징으로 하면서 나타났다. 상기 벡터를 NcoI으로 분해하여 hTRT 유전자의 카르복시 말단 영역을 제거한 경우("절두형 hTRT") 텔로머라제 활성은 소실되었다(레인 3). 레인 5는 절두형 hTRT 단독물을 해독한 경우 텔로머라제 활성을 나타내지 않는다는 것을 보여준다. 레인 "R8"은 뉴클레오티드 서열이 5'-ATTCCGTCGAGCAGAGTTAG[GGTTAG]7 -3'인 합성 텔로머라제 생성물인 TSR8을 TRAP하여 만든 텔로머라제 생성물 사다리에 대한 양성 대조군이다.
B. hTRT와 hTR의 시험관내 혼합
텔로머라제 활성을 시험관내 재구성하기 위하여 혼합을 실시하였다. hTRT는 hTR 플라스미드를 첨가하지 않고 전술한 바와 같이 전사 및 해독하였다. 이 hTRT 해독 혼합물과 hTR(phTR+1-Fsp로부터 T7 RNA 폴리머라제 전사를 통해 미리 제조함)을 hTRT 해독 혼합물 2 ㎕ 대 hTR(1 ㎍) 2 ㎕의 비로 혼합한 뒤 30 ℃에서 90 분 동안 항온처리하여 텔로머라제 RNP를 재구성시켰다. 이와 같은 hTRT/hTR 재구성 방법은 "연쇄 재구성" 또는 "연쇄 IVR"이라고 부른다. 이 혼합물에서 텔로머라제 활성이 제시되었다(즉, 검출가능함). 이 활성을 DEAE 크로마토그래피로 부분 정제한 후에는 더욱 향상된 시그널이 관찰되었다. 이 때 밀리포어 울트라프리(Millipore Ultrafree)-MC DEAE Centrifugal Filter Devices를 제조자의 지시에 따라 사용하였다. 완충액으로는 hypo0.1, hypo2.0 및 hypo1.0을 사용하였고, 여기에서 hypo는 Hepes-KOH(pH 7.9) 20 mM, MgCl2 2mM, EGTA 1mM, 10글리세롤, 0.1NP-40, 1mM DTT, Na-메타비설파이트 1mM, 벤즈아미딘 1mM 및 페닐메틸설포닐플루오라이드 (PMSF) 0.2 mM을 포함하는 것이고, 0.1, 0.2 및 1.0은 KCl 0.1M, 0.2M 또는 1.0M을 의미한다. 필터는 hypo1.0으로 예비처리한 뒤, hypo0.1로 세척해두고, 여기에 재구성된 텔로머라제를 적재하며, 컬럼은 hypo0.1과 뒤이어 hypo0.2로 세척하고 재구성된 텔로머라제를 장입량의 절반 가량의 부피인 hypo1.0으로 용출시켰다. 그 결과 얻어진 제조물은 -70 ℃에서 동결 보존하면 활성을 보유한다.
텔로머라제 활성은 다음과 같은 2 단계 방법으로 분석하였다. 제1 단계에서는 방사능표지를 사용하지 않은 것을 제외하고는 문헌[Morin, 1989, Cell 59:521]에 기재된 바와 같이 종래 텔로머라제 활성을 실시하였다. 제2 단계에서는 전술한 바와 같이 20 내지 30 사이클 동안 일정량을 TRAP 절차로 분석하였다. 종래 분석법은 Tris HCl(pH 8.3) 25 mM, K-아세테이트 50 mM, EGTA 1mM, MgCl2 1mM, dATP 2mM, TTP 2mM, dGTP 10 μM 및 프라이머(통상 M2,5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT) 1 μM을 함유하는 용액에 재구성된 텔로머라제 1 내지 10 ㎕를 첨가하여 최종 부피를 40 내지 50 ㎕로 하여 30 ℃에서 60 내지 180 분 동안 반응시켜 실시하였다. 이 반응은 95 ℃에서 5 분 동안 가열하고 종결시키고 제1 단계 혼합물 1 내지 10 ㎕를 사용하여 제2 단계 TRAP 반응(50 ㎕)을 실시하였다.
또 다른 실험으로, 시험관내 재구성 동안 hTRT와 hTR이 합성되는지를 35 S-메티오닌 병입률과 노던 블롯팅으로 각각 모니터하였다. hTRT(127 kD), hTRT-Nco(85 kD) 및 pro90hTRT(90kD)에 상응하는 대략 예상 크기의 단백질이 각각 동등한 몰량으로 합성되었다. 노던 분석 결과는 hTR 합성물이 정확한 크기(445개 뉴클레오티드)이고 주로 천연상태임을 시사하였다.
전술한 재구성 방법은 당업자라면 충분히 변형하여 사용할 수 있다. 예컨대, 재구성 시간과 온도, 1가 염(예, NaCl, KCl, 아세트산칼륨, 글루탐산칼륨 등), 2가 염(예, MgCl2 , MnCl2 , MgSO4 등), 변성제(우레아, 포름아미드 등), 계면활성제(NP-40, Tween, CHAPS 등)의 첨가 또는 농도 및 개선된 다른 정제 절차(예컨대, 면역침전법, 친화도 크로마토그래피 또는 표준 크로마토그래피)를 이용할 수 있다. 이와 같은 변수 및 기타 변수는 특정 분석법이나 기타 재구성 방법의 조건을 최적화할 수 있는 체계적 방법으로 변화시킬 수 있다.
C. hTRT 변형체 및 융합 단백질을 이용한 재구성
텔로머라제 활성이 대략 야생형 수준으로 재구성된, 증가된 녹색 형광성 단백질과 hTRT의 융합체인 EGFP-hTRT(실시예 6 및 15 참조) 또는 에피토프 태그를 가진 hTRT(IBI FLAG, 실시예 6 참조)는 hTR과 동시발현시킨 경우 둘다 텔로머라제 촉매 활성의 재구성을 일으켰다.
이와 반대로, 변형체 hTRT, pro90hTRT(RT 모티프 B', C, D 및 E가 누락됨)를 사용한 경우에는 텔로머라제 활성이 재구성되지 않았다. 이와 같은 결과는 pro90hTRT가 부분 활성(예컨대, 전술한 바와 같은 텔로머라제의 주요 음성 조절인자로서의 RNA[즉, hTR] 결합 성질 및 기능)은 보유하지만 완전한 텔로머라제 촉매 활성을 보유하지 않음을 증명하는 것이다.
D. 겔 블롯과 종래 텔로머라제 분석법을 이용한 시험관내 재구성된 텔로머라제 활성 분석
다음 실시예는 시험관내 재구성된(IVR) 텔로머라제를 종래 텔로머라제 분석법 외에도 증폭을 기본으로 한 분석법(즉, TRAP)을 사용하여 분석할 수 있다는 것을 증명한 것이다. 상기 파트 B에서 설명한 바와 같이 IVR 텔로머라제는 상기 방법("연쇄 재구성 방법")후 전술한 바와 같이 DEAE 정제를 실시한 뒤, 다음과 같은 반응 조건을 사용하여 겔 블롯 분석법으로 분석하였다: Tris HCl(pH 8.3) 25mM, K-아세테이트 50 mM, EGTA 1 mM, MgCl2 1mM, dATP 0.8 mM, TTP 0.8mM, dGTP 1.0mM 및 프라이머 1 μM(전술한 M2; 또는 H3.03, 5'-TTAGGGTTAGGGTTAGGG)를 포함하는 용액에 연쇄 IVR 텔로머라제 1 내지 10 ㎕를 첨가한 최종 40 ㎕ 부피의 반응액을 30 ℃에서 180 분 동안 처리한다. 이와 같이 합성된 말단소립 DNA를 표준 절차로 단리하고, 8폴리아크릴아미드, 8M 우레아 겔에서 분리한 다음, 나일론 막으로 전이시킨 뒤 점블롯 분석에 사용되는 32 P-(CCCTAA)n 리보프로브를 사용하여 탐침하였다. 이 프로브는 IVR 텔로머라제 10 ㎕를 나타내는 레인에서 6개의 뉴클레오티드 사다리를 감별하였는데, 이것은 천연의 핵 텔로머라제 5 ㎕를 모노Q 및 헤파린 크로마토그래피로 정제한 경우 관찰되는 사다리와 동등한 것이었다. 이와 같은 결과는 IVR 텔로머라제가 천연 텔로머라제와 동등한 점진적 텔로머라제 촉매 활성을 보유한다는 것을 나타낸다.
또한, 종래 32 P-dGTP 병입 텔로머라제 분석법으로 연쇄 IVR 텔로머라제를 분 석하였다. 전술한 바와 같이 연쇄 재구성 방법에 이어 DEAE 정제법으로 제조한 IVR 텔로머라제를 사용하여 가공적 반응 조건과 비가공적 반응 조건하에서 분석하였다. 분석 조건은 Tris-HCl 25mM(pH8.3), K-아세테이트 50mM, EGTA 1mM, MgCl2 1mM, dATP 2mM, TTP 2mM과 32 P-dGTP(72Ci/mmol) 10 μM[가공적 조건의 분석법] 또는 32 P-dGTP(720 C2 /mmol) 1 μM(비가공적 조건) 및 프라이머(즉, H3.03 상기 참조) 1 μM를 함유하는 용액에 연쇄 IVR 텔로머라제 5 내지 10 ㎕를 첨가한 최종 반응액 40 ㎕를 30 ℃[가공적 반응] 또는 37 ℃[비가공적 반응]에서 180 분 동안 처리하는 것으로 구성된다. 합성된 말단소립 DNA는 표준 방법으로 단리하고 8폴리아크릴아미드, 8M 우레아를 함유하는 서열분석용 겔에서 분리하였다. 가공적 반응은 가공적 텔로머라제 반응과 일치하는 약한 6개 뉴클레오티드 사다리를 나타내었고, 비가공적 반응은 천연 텔로머라제 제조물을 이용한 대조 반응과 동일한 패턴으로 1개의 반복체를 추가하였다. IVR 텔로머라제를 이용한 종래 분석법은 본 명세서에 기재된 바와 같이 텔로머라제 조절인자의 선별에 유용할 뿐만 아니라 텔로머라제의 구조적 성질과 기능적 성질을 규명하기 위한 용도와 같은 기타 용도에도 유용하다.
E. 프라이머 3' 말단을 인식하는 시험관내 재구성된 텔로머라제
이 실험은 IVR 텔로머라제가 천연(정제된) 텔로머라제와 동등한 프라이머 3' 말단을 인식한다는 것을 증명한 것이다. 텔로머라제는 프라이머 3' 말단과 hTR의 주형 영역 사이에 염기쌍 2본쇄를 형성하고 다음에 특정 뉴클레오티드를 첨가한다(Morin, 1989, 전술한 문헌 설명 참조). IVR(재조합) 텔로머라제가 동일한 성질을 보유하는지를 입증하기 위하여, ---GGG 또는 ---TAG 3' 말단(AATCCGTCGAGCAGAGGG 및 AATCCGTCGAGCAGATAG)를 보유한 프라이머의 반응과 ---GTT 3' 말단(M2 상기 참조)을 보유한 프라이머의 반응을 IVR 및 천연 텔로머라제를 사용하여 전술한 2단계 종래/TRAL 분석법으로 분석하므로써 비교하였다. ---GGG 프라이머와 ---TAG 프라이머의 생성물 사다리는 표준 프라이머(---GTT 3' 말단)와 비교했을 때 각각 +4 및 +2 만큼 이동하였는 바, 천연 텔로머라제와 동일한 효과를 나타내는 것으로 관찰되었다. 이 실험을 통해 IVR과 천연 텔로머라제가 유사한 방식으로 프라이머 말단을 인식한다는 것이 입증되었다.
이 결과(및 IVR 텔로머라제가 진행성 촉매 활성과 비진행성 촉매 활성을 보유함을 나타내는 전술한 결과)는 IVR 텔로머라제가 천연 또는 정제된 텔로머라제와 비교했을 때 유사한 구조와 성질을 보유한다는 것을 시사한다.
실시예 8
항hTRT 항체 제조
A. hTRT 펩티드에 대한 항hTRT 항체의 제조
항hTRT 항체를 생성하기 위하여 아미노 말단 잔기로서 C(시스테인)를 첨가하여 다음과 같은 hTRT 유래의 펩티드를 합성하였다(도 54 참조).
S-1 : FFY VTE TTE QKN RLF FYR KSV WSK
S-2 : RQH LKR VQL RDV SEA EVR QHR EA
S-3 : ART FRR EKR AER LTS RVK ALF SVL NYE
A-3 : PAL LTS RLR FIP KPD GLR PIV NMD YVV
사용된 시스테인 부는 펩티드를 BSA 및 KLH(키홀 림펫 헤모시아닌) 캐리어 단백질에 고정(즉, 공유 결합)시키기 위한 것이다. 이 KLH 펩티드는 항원으로 사용하였다. BSA-펩티드 접합체는 ELISA에서 면역 항혈청의 특이성을 시험하기 위한 물질로서 사용하였다.
이 KLH-펩티드 접합체를 뉴질랜드 화이트 래빗에 주사하였다. 1차 주사는 보조 림프절 및 서혜 림프절의 근접부에 주사제 투여로 처치하였다. 이어서 근육내 주사하였다. 1차 주사시, 항원은 프로인트 완전 보조제로 유화시켰고, 그 후 주사액에는 프로인트 불완전 보조제를 사용하였다. 그 다음, 이 래빗을 3주 면역자극 사이클로 처리하였으며, 각 면역자극 처리 10일 후에 혈액 50 ㎖(혈청 20 내지 25 ㎖ 생성)을 채혈하였다. 4종의 펩티드 각각에 대한 항혈청은 웨스턴 블롯에서 재조합 hTRT 융합 단백질의 hTRT부(GST-HIS8 -hTRT 단편 2426 내지 3274, 실시예 6 참조)를 인식하였다.
PCT 출원 번호 97/06012에 기재된 바와 같이 제조한 인간 293 세포의 부분 정제된 텔로머라제 분획(미정제 핵 추출물에 비하여 약 1000 배 정제)과 친화도 정제된 항S2 항체를 사용하면 130 kd 단백질 이본쇄를 웨스턴 블롯에서 검출할 수 있다. 감응성이 높은 화학발광 검출법을 사용하였으나(SuperSignal 화학발광 기질, 피어스 제품), 블롯의 시그널이 약하였고, 즉 hTRT이 이 무한증식 세포에서 저농도 또는 극히 미량으로 존재한다는 것을 암시하였다. 관찰되는 이본쇄는 hTRT의 해독후 변형, 즉 인산화 또는 글리코실화와 일치하는 것이었다.
친화도 정제 시, S-2 펩티드는 제조자의 프로토콜에 따라 N 말단 시스테인 잔기를 통해 SulfoLink(미국 일리노이주 록포드에 소재하는 피어스 제품)에 고정시켰다. KLH-S-2 펩티드 항원으로 면역화시킨 래빗에서 채혈한 1차 혈액의 혈청을 S-2-SulfoLink 상에 장입한 다음, S-2 펩티드에 특이적으로 결합된 항체를 용출시켰다.
B. hTRT 융합 단백질에 대한 항hTRT 항체의 제조
GST-hTRT 융합 단백질은 실시예 6에 기재된 GST-hTRT 단편 #4(뉴클레오티드 3272 내지 4177) 및 GST-HIS8-hTRT 단편 #3(뉴클레오티드 2426 내지 3274)의 단백질로 이.콜리 중에서 발현시켰다. 이 융합 단백질은 불용성 단백질로 정제되었고, 이 항원의 순도를 SDS 폴리아크릴아미드 겔에서 분석한 결과 GST-hTRT 단편 #4 재조합 단백질은 약 75이고 GST-HIS8-hTRT 단편 #3 재조합 단백질은 75이상인 것으로 추정되었다. 이 단백질 및 기타 융합 단백질은 통상의 방법을 사용하면 90이상의 순도로 얻을 수 있다. 이 재조합 단백질을 사용하면 전술한 바와 같이 래빗과 마우스를 모두 면역화할 수 있다.
마우스와 래빗에서 채혈한 1차 및 2차 혈액을 사용하여 고정화된 GST를 포함하는 매트릭스로 항GST 항체를 제거한 후 항hTRT 항체의 존재를 시험하였다. 이 항혈청을, 고정화된 재조합 GST-hTRT 융합 단백질을 이용한 웨스턴 블롯팅과 부분 정제된 천연 텔로머라제 효소를 이용한 면역침전법으로 항hTRT 항체를 시험하였다. 이와 같은 초기 혈액에서는 어떤 시그널도 관찰되지 않은 반면, 이후 혈액에서는 추정된 바와 같이 항hTRT 항체의 역가는 증가하였다.
실시예 9
△182 RNA 변형체에 상응하는 hTRT mRNA의 검출
인간 정소와 293 세포주 유래의 폴리 A+ RNA를 사용하여 RT-PCR과 네스트형 프라이머로 hTRT mRNA를 분석하였다. 1차 프라이머 군으로 TCP1.1과 TCP1.15, 2차 프라이머 군으로 TCP1.14와 BTCP6을 사용하였다. 증폭 후 각각 182 bp의 차이가 나는 2가지 생성물을 얻었으며, 이와 같이 얻은 정소 RNA의 큰 생성물과 소 생성물을 서열분석한 결과, 각각 pGRN121(도 16)과 712562 클론(도 18)에 정확하게 상응하는 것으로 밝혀졌다. SW39i, OVCAR4, 293 및 정소 유래의 mRNA에서는 변형 hTRT RNA 생성물이 관찰되었다.
실험을 더 실시하여 △182 cDNA가 역전사의 가공물이 아니라는 것을 입증하였다. 간략히 설명하면, RT-PCR의 주형으로 사용한 pGRN121을 시험관내 전사하여 전길이 hTRT RNA(즉, 결실부가 전혀 없음)를 만들었다. 이와 별도로 무작위 프라이머 또는 특정 프라이머를 가지고 42 ℃ 또는 50 ℃에서 Superscript(등록상표명) 역전사효소(미국 매릴랜드주 베데스다에 소재하는 베데스다 리서치 레보레이토리스 제품)를 사용하여 cDNA 합성 반응을 실시하였다. 큰 생성물은 15회 PCR 사이클 후 검출할 수 있었는데 반해, 작은 생성물은 30 사이클후에도 검출할 수 없었다. 이와 같은 결과는 RT-PCR 생성물이 가공물이 아님은 시사한다.
실시예 10
정소 hTRT mRNA의 서열분석
정소에 존재하는 hTRT RNA 형태의 서열은 ThermoSequenase 방사능표지된 종결인자 사이클 서열분석 키트(아머샴 라이프 사이언스)를 사용하여 정소 cDNA(미국 캘리포니아주 산디에고에 소재하는 클론테크 제품인 Marathon Testes cDNA)로부터 PCR법으로 만든 DNA 단편을 직접 수동 서열결정하여 분석하였다. 이 PCR 단계는 표 8에 기재된 바와 같이 네스트형 PCR로 실시하였다. 모든 경우마다 cDNA 없이 프라이머를 이용한 음성 대조 반응을 실시하였다. 대조 반응 중에 생성물이 존재하지 않는 것은 첨가된 cDNA의 반응으로부터 유도된 생성물이 pGRN121이나 다른 세포 원료(예, 293 세포)에서 유래되는 hTRT 오염물에 의하여 생성된 것이 아니라는 것을 증명하는 것이다. 이 DNA 단편을 아가로스 겔로부터 절제하여 DNA를 정제한 뒤 서열분석하였다.
그 결과, pGRN121 삽입 서열의 염기 27 내지 3553에 상응하고 전체 hTRT ORF(염기 56 내지 3451)를 포함하는 정소 mRNA 서열을 얻었다. 이 영역 중의 pGRN121 서열과 정소의 서열 간에는 어떤 차이도 없었다.
단편 프라이머 제1군 프라이머 제2군 최종 크기 서열에 대한 프라이머
OA na K320/K322 208 K320, K322
A K320/TCP1.43 TCP1.40/TCP1.34 556 TCP1.52, TCP1.39, K322, TCP1.40, TCP1.41, TCP1.30, TCP1.34, TCP1.49
B TCP1.42/TCP1.32B TCP1.35/TCP1.21 492 TCP1.35, TCP1.28, TCP1.38, TCP1.21, TCP1.46, TCP1.33, TCP1.48
C TCP1.65/TCP1.66 TCP1.67/TCP1.68 818 TCP1.67, TCP1.32, TCP1.69, TCP1.68, TCP1.24, TCP1.44, K303
D2 K304/billTCP6 LT1/TCP1.6 546 LT2, LT1, TCP1.6, bTCP4, TCP1.13, TCP1.77, TCP1.1
D3 TCP1.12/TCP1.7 TCP1.14/TCP1.15 604 TCP1.6, TCP1.14, TCP1.73, TCP1.78, TCP1.25, TCP1.15, TCP1.76
EF na TCP1.74/TCP1.7 201 TCP1.74, TCP1.7, TCP1.75, TCP1.15, TCP1.3
E TCP1.3/TCP1.4 TCP1.2/TCP1.9 687 TCP1.2, TCP1.8, TCP1.9, TCP1.26
F TCP1.26/UTR2 TCP1.10/TCP1.4 377 TCP1.4, TCP1.10, TCP1.11
실시예 11
RNASE 차단에 의한 hTRT mRNA의 검출
RNase 차단 분석법은 hTRT mRNA 또는 변형 mRNA의 존재를 검출, 모니터 또는 확인하는데 사용할 수 있다. 예컨대, 1가지 RNAse 차단 프로브는 hTRT mRNA 서열에 상보적인 서열과 추가의 비상보적 서열을 포함하는 시험관내 합성된 RNA이다. 여기에서 사용된 비상보적 서열은 이 분석에서 양성 결과를 나타내는 프로브 단편과 전길이 프로브를 구별하기 위한 것이다. 양성 분석법에서, 프로브의 상보적 서열은 RNase 분해로부터 차단되는데, 그 이유는 hTRT mRNA에 하이브리드화되어 있기 때문이다. 비상보적 서열은 RNase와 표적의 상보적 핵산에 의하여 프로브로부터 분해된 다.
예시용으로 2가지 RNAse 차단 프로브에 대하여 설명하겠고, 이 중 어느 1가지든지 이 분석법에 사용할 수 있다. 이 프로브들은 hTRT에 상보적인 서열들에 차이가 있으며, 비상보적 서열은 이 경우 SV40 후기 mRNA 리더 서열에서 유래된 비상보적 서열은 동일하다. 5'에서 3' 방향인 1개의 프로브는 비상보적 서열의 33개 뉴클레오티드와 hTRT 뉴클레오티드 2513 내지 2707에 상보적인 194개 뉴클레오티드 서열을 포함하여 전길이 프로브의 크기는 227개 뉴클레오티드이다. 5'에서 3' 방향인 제2 프로브는 비상보적 서열의 33개 뉴클레오티드와 hTRT 뉴클레오티드 2837 내지 3035에 상보적인 198개 뉴클레오티드 서열을 포함하여 전길이 프로브의 크기는 231개 뉴클레오티드이다. 이 분석을 위해, 이 프로브 중 어느 1가지를 시험 시료 유래의 RNA, 즉 폴리A+ RNA와 하이브리드화시키고, 여기에 T1 리보뉴클레아제와 RNase A를 첨가하였다. 분해 후, 프로브 RNA를 정제하고 겔 전기영동으로 분석하였다. 그 결과 227개 뉴클레오티드 프로브의 194개 뉴클레오티드 단편이나 231 뉴클레오티드 프로브의 198개 뉴클레오티드 단편이 검출되면 시료 중에 hTRT mRNA가 존재함을 나타내는 것이다.
이 실시예에 기재한 RNAse 차단 프로브는 T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 시험관내 전사로 생성할 수 있다. 방사능활성이나 기타 표지된 리보뉴클레오티드는 표지된 프로브를 합성하는데 사용할 수 있다. RNA 프로브를 생성하기 위한 시험관내 전사 반응의 주형은 PCR 생성물이다. 이와 같은 프로브는 hTRT 유전자 또는 mRNA의 해당 상보 영역에 위치하는 프라이머를 사용하여 pGRN121 DNA를 PCR 증폭한 뒤 T7 폴리머라제를 사용하여 합성할 수 있다. 또한, 하류의 프라이머는 T7 RNA 폴리머라제 프로모터 서열과 비상보적 서열을 포함한다.
1차 RNAse 차단 프로브를 제조하기 위하여 다음과 같은 프라이머 쌍(T701와 reverse01)으로부터 얻어지는 PCR 생성물을 사용하였다.
T701
5'-GGGAGATCT TAATACGACTCACTATAG ATTCA GGCCATGGTG CTGCGCCGGC TGTCA GGCTCCC ACGACGTAGT CCATGTTCAC-3' 및
reverse01
5'-GGGTCTAGAT CCGGAAGAGTGT CTGGAGCAAG-3'
2차 RNase 차단 프로브를 제조하기 위하여, 다음과 같은 프라이머 쌍(T702와 reverse02)으로부터 얻어지는 PCR 생성물을 사용하였다.
T702
5'-GGGAGATCT TAATACGACTCACTATAG ATTCA GGCCATGGTG CTGCGCCGGC TGTCA GGGCG GCCTTCTGGA CCACGGCATA CC-3' 및
reverse02
5'-G GTCTAGA CGATATCC ACAGGGCCTG GCGC-3'
실시예 12
hTRT와 기타 역전사효소를 비교하는 진화계통수의 작제
진화계통수(도 6)는 문헌[Xiong and Eickbush(1990, EMBO J.9:3353)]에 기재된 7개의 RT 도메인을 비교하여 작제하였다. 4개의 TRT, 67개의 RT 및 3개의 RNA 폴리머라제 유래의 모티프 1, 2 및 A 내지 E를 서열 정렬한 후 NJ(이웃 결합) 방법[Saitou and Nei, 1987, Mol.Biol.Evol. 4:406]을 사용하여 계통수를 작제하였다. 계통수의 동일 가지에 위치한 동급의 인자는 박스로 간략히 표시하였다. 각 박스의 길이는 그 박스 중에서 가장 분기된 인자에 해당하는 것이다.
TRT는 LTR 레트로트란스포손과 바이러스 RT 보다 msDNA, 제II군 인트론 및 비LTR(장말단 반복체) 레트로트란스포손과 관련된 RT와 더욱 밀접한 관련이 있는 것으로 나타난다. 역인자들의 비LTR 가지와 텔로머라제 RT의 관계는 특히 상기 역인자를 드로소필라의 말단소립 유지에 사용되는 텔로머라제 대신 사용한 경우 흥미로운 것이었다. 하지만, 가장 놀라운 것은, TRT가 공지의 RT 중 어느 1가지에 대한 폴리오바이러스와 같이 + 가닥의 RNA 바이러스의 RNA 의존적 RNA 폴리머라제와 매우 근연성이 있는 별도의 서브그룹을 형성한다는 점이다. 이 4가지 텔로머라제 유전자가 진화적으로 거리가 먼 유기체, 즉 원생 생물, 진균류 및 포유류에서 얻어진 점을 고려하면 이와 같은 분리된 그룹화를 통해 데이터 군의 진화계통적 분화성이 부족하다는 것을 설명할 수는 없다. 그 대신, 초기 2분화를 통해 텔로머라제 RT는 조상 군, 아마도 최초 진핵 생물에서 기원하는 것으로 추정된다.
진화계통 분석에 사용된 진뱅크의 단백질 이름과 수탁번호는 다음과 같다. msDNA(94535, 134069, 134074, 134075, 134078), 제II군 인트론(483039, 101880, 1332208, 1334433, 1334435, 133345, 1353081), 미토콘드리아 플라스미드/RTL(903835, 134084), 비LTR 레트로트란스포손(140023, 84806, 103221, 103353, 134083, 435415, 103015, 1335673, 85020, 141475, 106903, 130402, U0551, 903695, 940390, 2055276, L08889), LTR 레트로트란스포손(74599, 85105, 130582, 99712, 83589, 84126, 479443, 224319, 130398, 130583, 1335652, 173088, 226407, 101042, 1078824), 헤파드나바이러스(I 18876, 1706510, 118894), 카울리모바이러스(331554, 130600, 130593, 93553), 레트로바이러스(130601, 325465, 74601, 130587, 130671, 130607, 130629, 130589, 130631, 1346746, 130651, 130635, 1780973, 130646). 정렬은 ClustalW 1.5[J.D.Thompson, D.G.Higgins, T.J.Gibson, Nucleic Acid Res. 22, 4673(1994)] 및 PHYLIP3.5[J.Felsenstein, Cladisfics 5, 164(1989)]를 사용하여 분석하였다.
실시예 13
대조용 플라스미드와 hTRT 암호성 플라스미드를 이용한 인간 섬유아세포(BJ) 배양물의 형질감염
이 실시예는 재조합 hTRT 단백질을 포유류 세포에서 발현시키면 활성 텔로머라제를 생성한다는 것을 증명한 것이다.
준전면생장성으로 배양한 BJ 섬유아세포를 트립신처리한 뒤, 새 배지(10소 태내 혈청을 함유하는 DMEM/199)에 4 x 106 세포/㎖의 농도로 재현탁시켰다. 이 세포를 BioRad Gene PulserTM 전기사출기로 전기사출시켜 형질감염시켰다. 선택적으로, SuperfectTM 시약(퀴아겐)을 제조자의 지시에 따라 사용하여 세포를 형질감염시킬 수도 있다. 전기사출 후, 세포 현탁액 500 ㎕를 전기사출 큐벳(바이오래드 제품, 0.4 ㎝ 전극 갭)에 주입하였다. 이 큐벳에 플라스미드 DNA(2 ㎍)를 첨가하고 그 현탁액을 천천히 혼합한 다음 얼음에 5분 동안 방치하였다. 대조용 플라스미드(pBBS212)에는 MPSV 프로모터 뒤에 어떤 삽입체도 첨가하지 않았고, 실험용 플라스미드(pGRN133)는 MPSV 프로모터에 의해 hTRT를 발현하였다. 세포는 300 볼트와 960 μFD에서 전기사출시켰다. 펄스를 가한 후, 큐벳을 얼음 상에 약 5 분 동안 방치한 다음, 100 ㎜ 조직 배양 접시 중의 배지에서 평판배양하였다. 6 시간 후, 배지를 새 배지로 교환하였다. 형질감염 72 시간 후, 세포를 트립신처리하고 PBS로 1회 세척한 다음, 펠릿화하고 -80 ℃에 동결 저장하였다. 계면활성제 용해 변형 방법[Bodnar et al., 1996, Exp.Cell Res. 228:58; Kim et al., 1994, Science 266:2011, TRAP 분석법에 관한 특허와 문헌들에 기재됨]을 사용하여 세포 추출물을 25,000 세포/㎕의 농도로 제조하고, PCR을 기본으로 한 TRAP 변형 분석법(Kim et al., 1994, Bodnar et al., 1996)을 사용하여 이 세포 추출물 중의 텔로머라제 활성을 분석하였다. 간략히 설명하면, 반응물의 텔로머라제 프라이머 연장 과정을 위해 5 x 104 세포 당량을 사용하였다. 이 추출물을 텔로머라제 연장 반응액에서 직접 취하여 PCR 증폭에 사용하는 것이 일반적이나, 다시 페놀/클로로포름으로 1회, 클로로포름으로 1회 추출한 후 PCR 증폭에 사용할 수도 있다. 이 물질의 1/5을 TRAP 반응의 PCR 증폭 단계에 사용하였다(약 10,000 세포 당량). TRAP 반응액의 1/2은 분석을 위해 겔에 장입하였으며, 그 결과인 도 25에서 각 레인은 5,000 세포 당량의 반응 생성물을 나타낸다. 형질감염시키지 않거나(도시 안됨) 대조용 플라스미드로 형질감염시킨 세포의 추출물은 텔로머라제 활성을 전혀 나타내지 않은데 반해 pGRN133으로 형질감염시킨 세포의 추출물은 양성의 텔로머라제 활 성을 나타내었다. 이와 유사한 실험 결과가 RPE 세포의 경우에도 나타났다.
또한, 기타 hTRT 작제물(즉, pGRN145, pGRN155 및 pGRN138)을 이용하여 BJ 세포에서의 재구성을 실시하였다. 이 작제물을 사용한 재구성 결과, pGRN133 형질감염 세포에서 보다 우수한 텔로머라제 활성을 나타내는 것으로 관찰되었다.
최고의 텔로머라제 활성은 pGRN155를 사용한 경우 나타났다. 전술한 바와 같이, pGRN155는 hTRT 발현의 조절 인자로서 아데노바이러스 주요 후기 프로모터를 포함하는 벡터이고 BJ 세포를 형질감염시켰을 때 텔로머라제 활성을 재구성하는 것으로 나타났다.
주목할 것은, hTRT-GFP 융합 단백질 pGRN138(핵에 위치, 이하 실시예 15 참조)을 사용한 재구성을 시험관내(실시예 7) 또는 생체내(BJ 세포 형질감염)에서 실시한 경우 텔로머라제 활성이 얻어진다는 것이다. 예컨대 전술한 바와 같이 BJ 세포의 형질감염 시, 얻어지는 텔로머라제 활성은 pGRN133 또는 pGRN145를 사용하여 시험관내에서 재구성시 얻어지는 결과를 비교할만한 수준이었다.
이와 유사한 결과는 본 발명의 hTRT 발현 벡터로 정상인의 레티날 유색의 상피 세포(RPE)를 형질감염시킨 경우 얻어졌다. RPE 세포의 노쇠는 연령 관련된 황반 변성을 일으키거나 원인을 제공하는 것으로 추정된다. 본 발명의 hTRT 발현 벡터를 사용하여 본 발명의 방법에 따라 처리한 RPE 세포는 처리되지 않은 세포에 비하여 노쇠가 지연되는 것으로 나타나고, 따라서 연령 관련된 황반 변성을 치료하거나 예방하는 이식 치료법에 유용하다.
실시예 14
프로모터 리포터 작제물
이 실시예는 리포터 유전자가 프로모터 인자를 포함하는 hTRT 상류 서열에 작동가능하게 결합된 플라스미드의 작제에 관하여 예시한 것이다. 이 벡터는 다양한 용도를 갖고 있는데, 그 예로는 생체내 시스 및 트란스 조절 인자의 동정 및 hTRT 발현을 조절(예, 활성화 또는 억제)할 수 있는 제제의 선별(예, 약물 선별)에 사용할 수 있다. 또한, 다양한 리포터를 사용할 수 있지만(예, 개똥벌레 루시퍼라제, β-글루쿠로니다제, β-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 트란스퍼라제 및 GFP 등), 인간의 분비형 알칼리성 포스파타제(SEAP; 클론테크)를 초기 실험에 사용하였다. SEAP 리포터 유전자는 막 고착 도메인이 결실된 태반 효소의 절두 형태를 암호하고, 따라서 단백질을 형질감염 세포로부터 효과적으로 분비시킨다. 배양액에서 검출되는 SEAP 활성의 정도는 SEAP mRNA 및 단백질의 세포내 농도 변화에 직접 비례하는 것으로 관찰되었다(Berger et al., 1988, Gene 66:1, Cullen et al., 1992, Meth. Enzymol.216:362).
4 가지 작제물(pGRN148, pGRN150, "pSEAP2 basic"(프로모터 서열 없음 = 음성 대조군) 및 "pSEAP2 대조군"(SV40 초기 프로모터와 인헨서를 포함함)을 사용하여 유한증식성 세포와 무한증식성 세포를 3반복으로 형질감염시켰다.
플라스미드 pGRN148은 도 9에 기재된 바와 같이 작제하였다. 간략히 설명하면, 먼저 pGRN144 유래의 Bgl2-Eco47III 단편을 분해하고, pSeap2Basic(미국 캘리포니아주 산디에고에 소재하는 클론테크 제품)의 BglII-NruI 부위에 클로닝하였다. 2차 리포터-프로모터인 플라스미드 pGRN150에는 실시예 3에 기재된 hTRT 인트론의 서열을 포함시켜, 이 인트론에 존재할 수 있는 조절 서열을 이용하였다. 개시 Met를 Leu로 변이시켜 프로모터 영역 이후의 2번째 ATG가 SEAP ORF의 개시 ATG가 되게 만들었다.
pGRN148 및 pGRN150 작제물(hTRT 프로모터 포함)을 이용하여 유한증식성 세포(BJ 세포) 및 무한증식성 세포(293 세포)를 형질감염시켰다. 모든 형질감염에는 2개의 대조용 플라스미드, 즉 음성 대조용 플라스미드(pSEAP basic)와 양성 대조용 플라스미드(SV40 초기 프로모터와 SV40 인헨서를 포함하는 pSEAP 대조군)를 함께 사용하였다.
무한증식성 세포에서, pGRN148과 pGRN150 작제물은 pSEAP2 양성 대조군(SV40 초기 프로모터와 인헨서 포함)과 같은 효율로 SEAP 발현을 유도하는 것으로 나타난다. 이와 반대로, 유한증식성 세포에서는 pSEAP2 대조군 만이 검출가능한 활성을 제공하였다. 이와 같은 결과는 예상한 바와 같이 hTRT 프로모터 서열은 유한증식성 세포가 아닌 종양 세포에서 활성적임을 시사하는 것이다.
또한, 다른 정상 세포주(RPE 또는 레티날 유색성 상피 세포)를 사용한 경우에도 유사한 결과가 얻어졌다. pGRN150(2.2 KB의 상류 게놈 서열 포함)으로 감염시킨 RPE 세포에서 hTRT 프로모터 영역은 불활성인 반면 pSEAP2 대조 플라스미드는 활성적이었다.
전술한 바와 같이, 리포터 유전자가 프로모터 인자를 포함하는 hTRT 상류 서열에 작동가능하게 결합된 플라스미드는 순간 형질감염법과 안정한 형질감염 기법을 사용하여 텔로머라제 활성 조절제를 감별하고 선별하는데 매우 유용하다. 1가지 방법으로, 예컨대 pGRN148의 안정한 형질전환체는 텔로머라제 음성 세포와 텔로머라제 양성 세포를 문헌[Ausubel et al., 1997, 전술한 문헌 설명 참조]에 따라 진핵용 선택 마커(예, neo)로 동시형질감염시켜 만들었다. 그 결과 얻어지는 세포주를 사용하여 시험 화합물의 존재 및 부재 하에 hTRT-프로모터 유도성 발현을 비교하여 추정상의 텔로머라제 조절제를 선별하였다.
또한, 본 발명의 프로모터-리포터(및 기타) 벡터를 사용하여 트란스 작용성 및 시스 작용성인 전사 및 해독 조절 인자들을 감별하였다. 시스 작용성 전사 조절인자의 예로는 텔로머라제 유전자의 프로모터 및 인헨서를 포함한다. 시스작용성 및 트란스 작용성 조절제의 감별 및 분리를 통해 텔로머라제의 전사와 해독을 조절하는 제제를 동정할 수 있는 기타 방법과 시약을 얻을 수 있다.
실시예 15
hTRT의 준세포성 위치 결정
hTRT 및 증강된 녹색 형광성 단백질(EGFP; Cormack et al., 1996, Gene 173:33) 영역을 보유한 융합 단백질은 다음에 기재되는 바와 같이 제조하였다. EGFP 부는 융합 단백질의 존재 또는 위치를 쉽게 측정할 수 있는 검출용 태그 또는 시그널을 제공한다. EGFP 융합 단백질은 정확한 세포 구역에 위치하기 때문에 이 작제물을 사용하면 hTRT 단백질의 준세포성 위치를 측정할 수 있다.
A. pGRN138의 작제
포유류 세포에서 hTRT-EGFP 융합 단백질을 발현하기 위한 벡터는 pGRN124(실시예 6 참조)의 EcoRI 삽입체를 pEGFP-C2(미국 캘리포니아주 산디에고에 소재하는 클론테크 제품)의 EcoRI 부위에 삽입하여 작제하였다. 이 융합 단백질의 아미노산 서열은 다음과 같다. EGFP 잔기는 진하게 표시한 것이고 hTRT mRNA의 5' 비해독 영역에 의해 암호된 잔기는 밑줄을 표시한 것이며, hTRT 단백질 서열은 정상 글자이다.
Figure 111999002929091-pct00048
Figure 111999002929091-pct00049
기타 EGFP 융합 작제물은 부분(예, 절두형) hTRT 암호 서열을 사용하여 제조할 수 있으며, 다음에 기재되는 바와 같이 hTRT 폴리펩티드 중 특정 영역의 활성을 감별하는데 사용할 수 있다.
B. pGRN138의 핵 편재화 및 용도
pGRN138을 이용하여 NIH293 세포와 BJ 세포를 형질감염하여 재조합 발현된 hTRT의 핵 편재화를 확인하였다. pGRN138(EGFP-hTRT)과 대조용 작제물(EGFP만 발현)을 이용하여 세포를 형질감염시켰다. 형광 현미경으로 상기 두 세포 종류를 조 사한 결과 EGFP-hTRT가 핵에 편재하는 것으로 뚜렷하게 나타났다. 전술한 바와 같이, pGRN138hTRT-GFP 융합 단백질은 시험관내 전사 해독계 및 BJ 세포의 형질감염시 생체내에서 텔로머라제 활성이 재구성된다는 것을 지지한다.
hTRT-EGFP 융합 단백질(또는 유사한 검출가능한 융합 단백질)은 다양한 용도로 사용할 수 있다. 예컨대, 이 실시예에 기재된 융합 작제물이나, EGFP와 절두형 hTRT의 작제물은 hTRT와 변형체가 세포 핵으로 도입되고(또는) 염색체 말단에 위치하는 성질에 대하여 평가하는데 사용할 수 있다. 또한, pGRN138로 안정하게 또는 일시적으로 형질감염된 세포는 텔로머라제 조절 약물이나 화합물을 감별하는 화합물 선별시 사용될 수 있다. 핵 편재화 또는 말단소립 편재화를 방해하는 제제는 텔로머라제 억제제로 감별할 수 있다. 이와 같은 용도에는 EGFP-hTRT를 안정하게 발현하는 종양 세포주를 사용할 수 있다. 이와 같은 형질감염된 세포에 텔로머라제의 잠재적 조절인자를 투여하면 EGFP-hTRT의 편재화를 측정할 수 있다. 또한, FACS 또는 기타 형광성을 기본으로 한 방법을 사용하여도 hTRT를 발현하는 세포를 선택하여, 특히 세포를 순간 형질감염시킨 경우 약물 선별용의 균질 개체군을 제공할 수 있다.
다른 용도로서, hTRT의 영역을 돌연변이시키면 핵 편재화에 필요한 영역(예, 잔기 193 내지 196(PRRR) 및 235 내지 240(PKRPRR))을 감별할 수 있고, 이 영역이 항텔로머라제 약물(텔로머라제 활성 조절인자)의 표적이 된다. 기타 용도는 다음과 같다.
1. 순간 형질감염 실험과 EGFP-hTRT를 발현하는 안정한 세포주를 형성하는 경우 효과적인 세포 형질감염의 형광성 표지인자로 사용되는 융합 단백질의 용도.
2. 무한증식성 세포에서 돌연변이된 핵 편재화 시그널(핵 편재화 결손)을 보유한 hTRT-EGFP 융합체를 발현시켜 hTRT 돌연변이체-EGFP가 무한증식성 세포의 모든 hTR을 제거하고 세포질에 유지되게 하여 말단소립의 유지를 저해하는 용도.
3. 면역침전에 사용하기 위한 태그화된 단백질의 용도.
실시예 16
텔로머라제 촉매 활성에 미치는 돌연변이 효과
이 실시예는 변형된 아미노산과 변형된 텔로머라제 촉매 활성을 보유한 hTRT 변형 단백질에 대하여 예시한 것이다. 폴리펩티드 서열의 중요성과 기능을 측정하는 표준 방법은 아미노산 치환과, 그 다음 기능적 분석이다. 이 실시예는 역전사효소(RT)와 텔로머라제(T) 모티프의 변화가 텔로머라제 촉매 활성에 영향을 미친다는 것을 증명한 것이다.
돌연변이체는 통상적인 명명법을 사용하여 기재하였다. 천연 분자(hTRT)의 표적 잔기는 1문자 코드와 위치로 나타내고, 돌연변이 단백질 중의 상응하는 잔기는 1분자 코드로 표시하였다. 따라서, 예컨대 "K626A"는 hTRT의 위치 626(즉, 모티프 1)에 있는 리신이 알라닌으로 변화된 돌연변이를 나타낸다.
A. hTRT FFYxTE 모티프의 돌연변이
첫 실험으로, hTRT 돌연변이 단백질 "F560A"을 암호하는 벡터를 hTRT의 아미노산 560을 pGRN121의 부위 지시성 돌연변이유발법으로 표준 기법에 따라 페닐알라닌(F)에서 알라닌(A)으로 변화시켜 제조하였다. 이 돌연변이는 TRT FFYxTE 모티프 를 붕괴한다. 형성되는 F560A 돌연변이 폴리뉴클레오티드는, 35 S-메티오닌의 존재하에 무세포 망상적혈구 용해물 전사/해독계를 사용하여 평가한 경우 전길이 hTRT 단백질을 직접 합성하는 것으로 관찰되었다.
이 돌연변이 폴리펩티드는 실시예 7에 기재된 바와 같이 hTR과 동시 해독되면, PCR 20회 사이클을 이용하여 TRAP 시 관찰되는 바와 같이 텔로머라제 활성을 전혀 나타내지 않는 반면, 대조용 hTRT/hTR의 동시해독은 활성을 재구성하였다. TRAP 분석법에서 PCR을 30회 실시한 경우에는 돌연변이 hTRT에서도 텔로머라제 활성이 관찰되었지만 대조용(야생형) hTRT 보다는 상당히 낮았다.
B. hTRT 아미노산 잔기의 추가 부위 지시성 돌연변이유발
6개의 RT 모티프에 있는 보존적인 아미노산을 표준 부위 지시성 돌연변이유발 기법(예컨대, Ausubel, 전술한 문헌 설명 참조)을 사용하여 알라닌으로 변화시켜 촉매 활성의 기여도를 평가하였다. 이 돌연변이체는 실시예 7에 상세히 기재된 바와 같이 2 단계 종래/TRAP 분석법에 의한 IVR 텔로머라제를 사용하여 분석하였다.
K626A(모티프 1), R631A(모티프 2), D712A(모티프 A), Y717A(모티프 A), D868A(모티프 C) 돌연변이체는 텔로머라제 활성이 크게 감소되거나 검출할 수 없을 정도인 반면, Q833A(모티프 B) 및 G932A(모티프 E) 돌연변이체는 중간 정도의 활성도를 나타내었다. RT 모티프 외측에서의 2가지 돌연변이, R688A와 D897A는 야생형 hTRT와 동등한 활성을 나타내었다. 이 결과는 역전사효소에 대한 유사 변이체(Joyce et al., 1994, Ann.Rev.Biochem. 63:777)와 일치하였고, Est2p(Lingner, 1997, Science 276:561 참조)에 의해 얻어지는 결과와 유사하였다. 이 실험은 RT 모티프 중의 잔기가 효소 활성에 중요한지, 중요하지 않은지를 감별하고 hTRT가 인간 텔로머라제의 촉매 단백질임을 증명한 것이다. 이 돌연변이는 예컨대 텔로머라제 활성의 주요/음성 조절인자로서의 유용성을 보유하는 변형 hTRT 폴리펩티드를 제공한다.
공지 TRT들과 아미노산 정렬을 통해 텔로머라제 특이적 모티프인 모티프 T(상기 설명 참조)를 감별하였다. 이 모티프가 hTRT에서 나타내는 촉매적 역할을 측정하기 위하여 표준 부위 지시성 돌연변이 유발법(Ausubel et al., 상기 문헌 참조)을 사용하여 이 모티프에 6개 아미노산 결실부(△560 내지 565; FFYxTE)를 만들었다. 결실은 실시예 7에 기재된 2 단계 종래/TRAP 분석법을 사용하여 IVR 텔로머라제로 분석하였다. △560 내지 565 돌연변이체는 PCR 25회 사이클 후 텔로머라제 활성을 나타내지 않은 반면, 야생형 hTRT IVR 텔로머라제는 강한 시그널을 나타냈다. 모티프 T중의 각 잔기에 해당하는 각 아미노산에 대하여 유사한 방법으로 각각 조사하였다. 즉, 돌연변이체 F560A, Y562A, T564 및 E565A는 중간 정도의 텔로머라제 활성을 보유하는 반면, 대조 돌연변이체인 F487A는 활성에 최소 영향을 미쳤다. 돌연변이 F561A는 텔로머라제 활성이 현저하게 감소되거나 검출불가능할 정도이었는데, 이에 반해 이것의 "역전체"인 F561A561F는 활성을 완전히 보유하고 있었다. F561A561F는 돌연변이 위치가 다시 본래의 페닐알라닌으로 변화된 것이다. 이것은 활성을 감소시킬만한 어떤 기타 아미노산 변화가 플라스미드에 존재하지 않는다는 것을 입증하는 대조군이다. 따라서, T 모티프는 텔로머라제 활성에 절대적으로 필 요한 것으로 관찰되는 최초의 비RT 모티프이다.
모티프 T는 다른 유기체 유래의 TRT를 감별하는데 사용할 수 있고, 이 모티프의 변형체를 포함하는 hTRT 단백질은 텔로머라제 활성의 주요/음성 조절인자로 사용할 수 있다. 대부분의 기타 RT와 달리, 텔로머라제는 1본쇄 RNA(즉, hTR) 중 작은 부분과 안정하게 회합하여 점진적으로 복사하며, 따라서 모티프 T는 hTR 결합, 반응의 진행성 또는 텔로머라제 RT에 고유한 기타 기능을 매개하는데 관여할 수 있다.
실시예 17
재조합 발현성 텔로머라제 성분을 이용한 텔로머라제 활성 조절인자의 선별
이 실시예는 텔로머라제 활성 조절인자를 선별하고 감별하는데 있어 시험관내 재구성된 텔로머라제의 용도를 예시한 것이다. 이 분석법은 고효율의 방법(예컨대, 다중 웰 평판 및/또는 로보트 시스템 이용)으로 쉽게 변형시킬 수 있다. 이 분석법에 포함되는 단계들에 대하여 다양한 변형이 가능하다는 것은 당업자에게는 자명한 것이다.
텔로머라제 성분(예, hTRT 및 hTR)의 재조합 클론은 미국 특허 제5,324,637호에 기재된 TNT(등록상표명) T7 쌍을 이룬 망상적혈구 용해물 시스템(프로메가)을 제조자의 지시에 따라 사용하고, 실시예 7에 기재되어 있을 뿐만 아니라 다음에 상세히 설명되는 시험관내 반응으로 전사 및 해독하였다(hTRT 만).
시약 반응물 당 함량(μL)
TNT 래빗 망상적혈구 용해물 25
TNT 반응 완충액 2
TNT T7 RNA Pol. 1
AA 혼합물(완전) 1
프라임 RNase 억제제 1
뉴클레아제 제거 수 16
Xba1 절단된 pGRN121[hTRT](0.5 ㎍) 2
Fsp1 절단된 pGRN164[hTR](0.5 ㎍) 2
이 반응물은 30 ℃에서 2 시간 동안 항온처리하였다. 생성물은 그 다음 울트라프리-MC DEAE 필터(밀리포어) 상에서 정제하였다.
재조합 텔로머라제 생성물(IVRP)은 DMSO(예, 10 내지 100 μM)에 용해시킨 다양한 농도의 시험 화합물을 첨가 및 무첨가하에 분석하였다. 시험 화합물은 총 부피 25 ㎕ 중에서 IVRP 2.5 ㎕, 2.5DMSO 및 1X TRAP 완충액(20 mM Tris-HCl, pH 8.3, 1.5 mM MgCl2 , KCl 63 mM, 0.05Tween 20, 1.0 mM EGTA, 0.1 ㎎/㎖ 소혈청 알부민)의 존재하에 실온에서 30 분 동안 예비항온처리하였다. 예비항온처리 후, TRAP 분석의 반응 혼합물 25 ㎕를 각 시료에 첨가하였다. TRAP 분석용 반응 혼합물은 1x TRAP 완충액, dNTP 50 ㎕, 프라이머 ACX 2.0 ㎍/㎖, 프라이머 U2 4 ㎍/㎖, TSU2 0.8 attomol/㎖, Taq 폴리머라제(퍼킨 엘머 제품) 2 유니트/50 ㎕ 및 [32 P]5'말단 표지된 프라이머 TS(3000 Ci/mmol) 2 ㎍/㎖을 포함한다. 이 반응액을 포함하는 튜브를 PCR 고온순환기(MJ 리서치)에 배치하고 PCR은 다음과 같이 실시하였다. 30 ℃에서 60분, {94 ℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72 ℃에서 30초} 사이클 20회, 72 ℃에서 1분, 그 다음 10 ℃로 냉각. TRAP 분석은 전술한 바와 같이 미국 특허 제5,629,154호에 개시되어 있다. 사용된 프라이머와 기질은 그 서열이 다음과 같다.
TS 프라이머(5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3');
ACX 프라이머(5'-GCGCGG[CTTACC]3CTAACC-3');
U2 프라이머(5'-ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3');
TSU2(5'-AATCCGTCGAGCAGAGTTAAAAGGCCGAGAAGCGAT-3')
PCR 단계를 완료한 후, 브로모페놀 블루를 함유하는 10X 장입 완충액 4 ㎕를 각 반응 튜브에 첨가하고 생성물(20 ㎕)을 0.5x TBE 중의 12.5비변성 PAGE에서 400V 하에 전개시켰다. 전개 완료 후 겔을 건조하고 Phosphorimager 또는 자동방사능사진으로 TRAP 생성물을 가시화하였다. 시험 화합물의 존재하에 텔로머라제 활성은 반응 생성물에 라벨을 첨가한 것과 제제를 첨가하지 않는 반응액을 동시에 비교하여 측정한다.
***
실시예에 기재된 다음과 같은 클론은 미국 매릴랜드주 20852 록빌에 소재하는 미국 모식균 배양 수집소에 기탁되어 있다.
람다 파지 λ25-1.1 ATCC 기탁 번호 209024
pGRN121 ATCC 기탁 번호 209016
람다 파지 λG
Figure 111999002929091-pct00011
5 ATCC 기탁 번호 98505
***
본 발명은 hTRT에 관한 신규 방법과 물질 및 텔로머라제 관련 질환의 치료 방법을 제공한다. 전술한 구체적인 실시예는 본 발명을 설명하는 것이지 제한하기 위한 것이 아니다. 본 발명의 다양한 변형은 당업자라면 본 명세서의 설명을 통해 충분히 실시가능할 것이다. 따라서, 본 발명의 영역은 본 명세서를 기준으로 하는 것이 아니라 첨부되는 청구의 범위와 이것의 동등한 전범위를 기준으로 하여 결정되어야 한다.
본 명세서에 인용된 모든 공개 문헌과 특허 서류는 각각 표시되어 있을 지라도 동등한 정도로 본 발명에 참고 인용된 것이다.

Claims (145)

  1. a) 서열 번호 2의 8개 내지 20개의 연속한 아미노산;
    b) 서열 번호 2의 20개 내지 100개의 연속한 아미노산;
    c) 서열 번호 2의 100개 내지 1132개의 연속한 아미노산; 또는
    d) 텔로머라제 "T" 모티프(서열 번호 11, 서열 번호 12 또는 서열 번호 13)
    를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드로서,
    단, 상기 폴리뉴클레오티드는 GenBank 서열 AA281296, AA311750 또는 AA299878과 동일하지 않은 것인 분리된 폴리뉴클레오티드.
  2. 텔로머라제 역전사효소(TRT) 단백질을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드로서, 하기 a), b), c), d), e) 또는 f) 중 하나로 구성되고, 단, 상기 폴리뉴클레오티드는 GenBank 서열 AA281296, AA311750 또는 AA299878과 동일하지 않은 것인 분리된 폴리뉴클레오티드:
    a) 서열 번호 1의 25개 내지 100개의 연속한 뉴클레오티드;
    b) 서열 번호 1의 500개 내지 3000개의 연속한 뉴클레오티드;
    c) 서열 번호 1의 전체 오픈 리딩 프레임(open reading frame);
    d) ATCC 기탁 번호 209016의 25개 내지 100개의 연속한 뉴클레오티드;
    e) ATCC 기탁 번호 209016의 500개 내지 3000개의 연속한 뉴클레오티드; 또는
    f) ATCC 기탁 번호 209016의 전제 오픈 리딩 프레임.
  3. 텔로머라제 역전사효소(TRT) 단백질을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드로서, 상기 폴리뉴클레오티드는 Tm 보다 5℃ 내지 25℃ 낮은 온도에서 1M NaCl의 수용액 내에서 서열 번호 1에 상보적인 서열을 가지는 DNA에 하이브리드화되고, 상기 Tm은 동일한 반응 조건하에서 서열 번호 1의 서열을 가지는 이중가닥 DNA의 융점인 것인 분리된 폴리뉴클레오티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 하기 a), b), c), d), e) 또는 f) 중 1 이상의 특성을 가지는 것인 분리된 폴리뉴클레오티드:
    a) 전체 길이의 텔로머라제 역전사효소(TRT) 단백질을 암호화하는 특성;
    b) 텔로머라제 RNA와 결합시 텔로머라제 촉매 활성을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 특성;
    c) ATCC 209016 플라스미드의 삽입물에 특이적으로 하이브리드화되는 표지된 프로브인 특성;
    d) ATCC 209016 플라스미드의 삽입물의 일부를 특이적으로 증폭시키는 한 셋트의 프라이머 중 하나인 특성;
    e) 발현 벡터인 특성; 또는
    f) 포유동물 세포 내에서 텔로머라제 역전사효소(TRT)의 발현을 특이적으로 억제하는 안티센스 폴리뉴클레오티드인 특성.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항의 폴리뉴클레오티드로 유전적으로 변형시킴으로써 증식능(proliferative capacity)이 증가된, 분리된 포유동물 세포.
  6. 제5항에 따라 증식능이 증가된 세포로서, 간세포, 신경 세포(성상교세포, 희돌기교세포 또는 뉴론을 포함함), 수축성 세포(심근 세포를 포함함), 지방 세포, 섬유아세포, 혈관 내피 세포, 호르몬(인슐린, 글루카곤 또는 갑상선 호르몬을 포함함)을 분비하는 세포, 상피 또는 점막 세포, 혈액 세포 또는 면역계 세포(T 또는 B 림프구, 비만 세포, 호산구, 단핵구 또는 대식세포를 포함함), 골아세포, 연골세포, 또는 줄기 세포(성인 줄기 세포를 포함함)인 것인 세포.
  7. 텔로머라제 역전사효소(TRT) 단백질 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드 또는 키메릭 분자로서, 상기 텔로머라제 역전사효소(TRT) 단백질 서열은 하기 a), b), c) 또는 d) 중 하나로 구성되는 것인 분리된 폴리펩티드 또는 키메릭 분자:
    a) 서열 번호 2의 8개 내지 20개의 연속한 아미노산;
    b) 서열 번호 2의 20개 내지 100개의 연속한 아미노산;
    c) 서열 번호 2의 100개 내지 1132개의 연속한 아미노산; 또는
    d) 텔로머라제 "T" 모티프(서열 번호 11, 서열 번호 12 또는 서열 번호 13).
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항의 폴리뉴클레오티드 내에서 암호화된 분리된 폴리펩티드, 또는 제7항에 따른 폴리펩티드로서, 하기 a) b) 또는 c) 중 1 이상의 특성을 가지고. 하기 i), ii), iii) 또는 iv) 중 1 이상의 기능을 가지는 것인 폴리펩티드:
    a) 포유동물 세포에 의해 정상적으로 발현되지 않는 특성;
    b) 재조합 발현의 산물인 특성; 또는
    c) 분리되어 실질적으로 텔로머라제 RNA 성분이 없는 특성;
    i) 전체 길이의 텔로머라제 단백질인 기능;
    ii) 텔로머라제 RNA와 결합시 텔로머라제 촉매 활성을 가지는 기능;
    iii) 텔로머라제의 우성-음성(dominant-negative) 돌연변이체인 기능; 또는
    iv) 인간 텔로머라제 역전사효소(hTRT)에 대한 특이적 면역 반응을 위한 면역원성인 기능.
  9. 텔로머라제 촉매 활성을 가지는 단백질-RNA 효소 복합체를 제조하는 방법으로서,
    a) 텔로머라제 RNA 성분과 제7항의 폴리펩티드가 결합되어 텔로머라제 기질에의 뉴클레오티드 첨가를 촉매 작용하는 텔로머라제 효소를 형성시키는 조건 하에서, 제7항의 폴리펩티드를 텔로머라제 RNA 성분과 접촉시키는 단계; 또는
    b) 텔로머라제 RNA 성분을 발현하는 세포에서 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항의 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  10. 화합물이 텔로머라제 활성의 조절자(modulator)인지 여부를 결정하는 방법으로서,
    a) 화합물을 제9항에 따라 제조된 텔로머라제 효소와 화합시키는 단계; 및
    b) 상기 화합의 결과로서 복합체의 텔로머라제 활성이 조절되는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  11. 서열 번호 2로 구성된 아미노산 서열을 가지는 단백질에 특이적으로 결합하는, 분리된, 모노클로날, 또는 재조합 항체.
  12. 샘플 내 텔로머라제 역전사효소(TRT)를 암호화하는 핵산을 검출하는 방법으로서,
    a) 폴리뉴클레오티드가 샘플 내의 TRT 핵산과 특이적으로 하이브리드화되는 조건 하에서, 샘플을 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 따른 폴리뉴클레오티드 프로브와 화합시키는 단계; 및 상기 화합으로 형성된 하이브리드를 검출하는 단계; 또는
    b) 폴리뉴클레오티드가 샘플 내의 TRT 핵산을 특이적으로 증폭시키는 조건 하에서, 샘플을 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 따른 폴리뉴클레오티드 프라이머와 화합시키는 단계; 및 상기 화합으로 형성된 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  13. 샘플 내의 텔로머라제 역전사효소(TRT) 폴리펩티드를 검출하는 방법으로서,
    항체가 샘플 내의 TRT 폴리펩티드와 결합하는 조건 하에서, 샘플을 제11항에 따른 항체와 화합시키는 단계; 및 상기 화합으로 형성된 항체-폴리펩티드 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  14. 샘플 내의 텔로머라제 역전사효소(TRT) 유전자 또는 유전자 산물을 검출하기 위한 킷트로서, TRT를 암호화하는 핵산에 특이적으로 하이브리드화되거나 또는 TRT를 암호화하는 핵산을 특이적으로 증폭시키는, 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 따른 폴리뉴클레오티드; 또는 TRT 단백질에 특이적으로 결합하는 제11항에 따른 항체를 포함하는 것인 킷트.
  15. 인간 텔로머라제 역전사효소(hTRT)에 대해 특이적 면역 반응을 유발시키는 조성물로서, 하기 a), b), c), d), e), f) 또는 g) 중 1 이상을 포함하는 것인 조성물:
    a) 서열 번호 2의 8개의 연속한 아미노산으로 구성된 폴리펩티드;
    b) 서열 번호 2의 10개의 연속한 아미노산으로 구성된 폴리펩티드;
    c) 서열 번호 2의 15개의 연속한 아미노산으로 구성된 폴리펩티드;
    d) 서열 번호 2의 20개의 연속한 아미노산으로 구성된 폴리펩티드;
    e) 서열 번호 2의 50개의 연속한 아미노산으로 구성된 폴리펩티드;
    f) 상기 폴리펩티드 a), b) 또는 c)를 포함하는 키메릭 분자; 또는
    g) 상기 a), b), c) 또는 d) 중 어느 것을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  16. 제15항에 있어서, 수산화알루미늄과 같은 면역학적 아쥬반트(adjuvant)를 추가로 포함하는 것인 조성물.
  17. 투여된 포유동물 세포의 증식능을 증가시키는 약학 조성물로서,
    a) 텔로머라제 RNA와 결합시 텔로머라제 촉매 활성을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항의 폴리뉴클레오티드; 또는
    b) 텔로머라제 RNA와 결합시 텔로머라제 촉매 활성을 가지는 제7항의 폴리펩티드를 포함하는 것인 약학 조성물.
  18. 1 이상의 하기 특성을 가지는 폴리뉴클레오티드 프로모터 부위:
    a) ATCC 기탁 번호 98505로서 기탁된 플라스미드 Gφ5 내의 50개 내지 200개의 연속한 뉴클레오티드로 구성된 특성;
    b) 플라스미드 Gφ5 내의 200개 내지 1700개의 연속한 뉴클레오티드로 구성된 특성;
    c) 서열 번호 6의 cDNA 서열의 개시 위치의 상부 영역에 위치하는 50개 내지 200개의 연속한 뉴클레오티드로 구성된 특성; 또는
    d) 서열 번호 6의 cDNA 서열의 개시 위치의 상부 영역에 위치하는 200개 내지 1700개의 연속한 뉴클레오티드로 구성된 특성.
  19. Tm 보다 5℃ 내지 25℃ 낮은 온도에서 1M NaCl의 수용액 내에서 서열 번호 6에 상보적인 서열을 가지는 DNA에 하이브리드화되는 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 프로모터 부위로서, 상기 Tm은 동일한 반응 조건하에서 서열 번호 6의 서열을 가지는 이중가닥 DNA의 융점인 것인 폴리뉴클레오티드 프로모터 부위.
  20. 제18항에 있어서, 프로모터 서열이 이종 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결되어, 상기 이종 서열이 인간 텔로머라제 역전사효소(hTRT)를 발현하는 세포내에서 우선적으로 전사되는 것인 폴리뉴클레오티드.
  21. 제20항에 있어서, 이종 뉴클레오티드 서열이 세포 내에서 발현시 세포에 독성이 있는 유전자인 것인 폴리뉴클레오티드.
  22. 제20항에 있어서, 이종 뉴클레오티드 서열이 세포를 약물 독성에 보다 민감하도록 해주는 촉매 활성(티미딘 키나제 활성을 포함함)을 암호화하는 유전자인 것인 폴리뉴클레오티드.
  23. 제20항에 있어서, 이종 뉴클레오티드 서열이 레포터 유전자(형광 또는 인광을 띠거나 또는 효소 활성을 가지는 산물을 암호화하는 유전자를 포함함)인 것인 폴리뉴클레오티드.
  24. 암을 가지는 환자에서 인간 텔로머라제 역전사효소(hTRT)를 발현하는 세포를 사멸시키는 약제를 제조하는데 있어서, 제20항 내지 제22항 중 어느 하나의 항에 따른 폴리뉴클레오티드를 사용하는 방법.
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