BRPI9712254B1 - vetor viral, de clonagem ou de expressão, microorganismo transgênico, composição farmacêutica, kit para detectar um polinucleotídeo htrt ou fragmento deste, usos de um polinucleotídeo, de um peptídeo, de um microorganismo transgênico e de um vetor, e, métodos de obtenção de um peptídeo recombinante de htrt, para inibir a expressão de htrt, para aumentar a capacidade replicativa de uma célula, para detectar um polinucleotídeo htrt ou fragmento deste, para avaliar uma condição associada com expressão alterada de htrt, para expressar um gene heterólogo, para extinguir seletivamente uma célula expressando trt, e para mapear um composto de teste para uma habilidade para modular a atividade promotora de trt - Google Patents

vetor viral, de clonagem ou de expressão, microorganismo transgênico, composição farmacêutica, kit para detectar um polinucleotídeo htrt ou fragmento deste, usos de um polinucleotídeo, de um peptídeo, de um microorganismo transgênico e de um vetor, e, métodos de obtenção de um peptídeo recombinante de htrt, para inibir a expressão de htrt, para aumentar a capacidade replicativa de uma célula, para detectar um polinucleotídeo htrt ou fragmento deste, para avaliar uma condição associada com expressão alterada de htrt, para expressar um gene heterólogo, para extinguir seletivamente uma célula expressando trt, e para mapear um composto de teste para uma habilidade para modular a atividade promotora de trt Download PDF

Info

Publication number
BRPI9712254B1
BRPI9712254B1 BRPI9712254A BRPI9712254A BRPI9712254B1 BR PI9712254 B1 BRPI9712254 B1 BR PI9712254B1 BR PI9712254 A BRPI9712254 A BR PI9712254A BR PI9712254 A BRPI9712254 A BR PI9712254A BR PI9712254 B1 BRPI9712254 B1 BR PI9712254B1
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
seq
nucleic acids
htrt
cell
telomerase
Prior art date
Application number
BRPI9712254A
Other languages
English (en)
Inventor
B Harley Calvin
B Morin Gregg
Lingner Joachim
B Chapman Karen
R Cech Thomas
Nakamura Toru
H Andrews William
Original Assignee
Geron Corp
Univ Colorado Regents
Univ License Equity Holdings Inc
Univ Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27575511&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=BRPI9712254(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from US08/851,843 external-priority patent/US6093809A/en
Priority claimed from US08/854,050 external-priority patent/US6261836B1/en
Priority claimed from US08/912,951 external-priority patent/US6475789B1/en
Application filed by Geron Corp, Univ Colorado Regents, Univ License Equity Holdings Inc, Univ Technology filed Critical Geron Corp
Publication of BRPI9712254B1 publication Critical patent/BRPI9712254B1/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/14—Drugs for dermatological disorders for baldness or alopecia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/12—Drugs for disorders of the metabolism for electrolyte homeostasis
    • A61P3/14—Drugs for disorders of the metabolism for electrolyte homeostasis for calcium homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/06—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/38—Drugs for disorders of the endocrine system of the suprarenal hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1276—RNA-directed DNA polymerase (2.7.7.49), i.e. reverse transcriptase or telomerase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12Y207/07049—RNA-directed DNA polymerase (2.7.7.49), i.e. telomerase or reverse-transcriptase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/15—Nucleic acids forming more than 2 strands, e.g. TFOs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
    • Y10S530/828—Cancer

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Dermatology (AREA)

Abstract

preparação proteínica isolada e de htrt, fragmento de proteína de htrt, telomerase humana, polinucleotídeo isolado, vetor de expressão , célula, organismo não humano, antocorpo isolado ou recombinante, processos para determinar se um composto ou tratamento é um modulador de uma atividade ou expresão de htrt, se um composto de teste é um modulador de uma atividade de transcriptase reversa de telomerase, para idenficar um composto que modula a atividadede htrt, para preparar telomerase recombinantwe, para detectar um produto de gente de htrt em uma amostra e a presença de pelo menosuma célula humana positiva de telomerase em uma amostra biológica, para diagnosticar uma condição relacionada a telomerase em um paciente e câncer para fornecer um prognóstico para um paciente de câncer, para monitorar a capacidade de um tratamento anti-câncer, para reduzir a capacidade proliferativa das células cancerígenas em uma paciente, para aumentar a capacidade proliferativa de uma célula de vertebrado, para tratar uma condição associada com um nível elevado de atividade de telomerase dentro de uma ceélula, para isolar ácido nucleico selecionado de sequência desconhecida, para detectar um produto do gene de htrt em uma amostra e a presença de pelo menos uma célula humana positiva de telomerase em uma amostra biológica, ,kit para a detecção de um gene ou produto do gene de htrt, composições farmacológica e farmacêutica, vacina, proteína htrp isolada, usos de um polinucleotídeo, anticorpo e de um agente de aumento da expressão de htrt, proteína, variante ou fragmento, e, uso de uma proteína, polipeptídeo ou fragmento e uso dos mesmos". a invenção provê composições e processos relacionados à transcriptase reversa da telomerase humana (htrt), a subunidade catalítica da telomerase humana. os polinucleotídeos e polipeptídeos da invenção são úteis para o diagnóstico, prognóstico e tratamento de doenças humanas, para mudar a capacidade proliferativa de células e organismos, e para identificação e triagem de compostos e tratamentos úteis para tratamento de doenças tais como cânceres.

Description

“VETOR VIRAL, DE CLONAGEM OU DE EXPRESSÃO, MICROORGANISMO TRANSGÊNICO, COMPOSIÇÃO
FARMACÊUTICA, KIT PARA DETECTAR UM POLINUCLEOTÍDEO HTRT OU FRAGMENTO DESTE, USOS DE UM POLINUCLEOTÍDEO, DE UM PEPTÍDEO, DE UM MICROORGANISMO TRANSGÊNICO E DE UM VETOR, E, MÉTODOS DE OBTENÇÃO DE UM PEPTÍDEO RECOMBINANTE DE HTRT, PARA INIBIR A EXPRESSÃO DE HTRT, PARA AUMENTAR A CAPACIDADE REPLICATIVA DE UMA CÉLULA, PARA DETECTAR UM POLINUCLEOTÍDEO HTRT OU FRAGMENTO DESTE, PARA AVALIAR UMA CONDIÇÃO ASSOCIADA COM EXPRESSÃO ALTERADA DE HTRT, PARA EXPRESSAR UM GENE HETERÓLOGO, PARA EXTINGUIR SELETIVAMENTE UMA CÉLULA EXPRESSANDO TRT, E PARA MAPEAR UM COMPOSTO DE TESTE PARA UMA HABILIDADE PARA MODULAR A ATIVIDADE PROMOTORA DE TRT”
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção é relacionada a novos ácidos nucléicos codificando a subunidade catalítica da telomerase e polipeptídeos relacionados. Em particular, a presente invenção é direcionada à subunidade catalítica da telomerase humana. A invenção provê processos e composições
relacionadas à medicina, biologia molecular, química, farmacologia diagnóstico médico e tecnologia de prognóstico.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
A seguinte discussão pretende introduzir o campo da presente invenção ao leitor.
Há muito foi reconhecido que a replicação completa das extremidades de cromossomas eucarióticos requer componentes celulares especializados (Watson, 1972, Nature New Biol., 239: 197; Olovnikov, 1973,
J. Theor. Biol., 41: 181). A replicação de um filamento linear de DNA por polimerases convencionais de DNA requer um iniciador de RNA, e pode prosseguir apenas de 5’ a 3’. Quando a ligação de RNA nos términos extremos de 5’ de filamentos eucarióticos de DNA cromossômico é removida, um hiato é introduzido, conduzindo a um encurtamento progressivo de filamentos filhas com cada série de replicação. Este encurtamento de telômeros, as estruturas de DNA de proteínas fisicamente localizadas nas extremidades dos cromossomas, julga-se responder pelo fenômeno da senescência celular ou envelhecimento (ver, por exemplo, Goldstein, 1990, Science 249: 1129; Martin et al., 1979, Lab. Invest. 23: 86; Goldstein et al., 1969, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 64: 155; e Schneider e
Mitsui, 1976, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 73: 3584) de células somáticas humanas normais in vitro e in vivo.
O comprimento e a integridade dos telômeros são, assim, relacionados à entrada de uma célula em um estágio senescente (isto é, perda da capacidade proliferativa). Além disso, a capacidade de uma célula de Z 5* manter (ou aumentar) o comprimento do telômero pode permitir que uma célula escape da senescência, isto é, se tome imortal.
A estrutura de telômeros e o DNA telomérico foram investigados em numerosos sistemas (ver, por exemplo, Harley e
Villeponteau, 1995, Curr. Opin. Genet. Dev. 5: 249). Na maioria dos organismos, o DNA telomérico consiste de um arranjo em tandem de sequências muito simples; em seres humanos e outros vertebrados, o DNA telomérico consiste de centenas e milhares de repetições em tandem da sequência TTAGGG. Processos para determinar e modular comprimento telomérico em células são descritos nos Pedidos PCT WO 93/23572 e WO
96/41016.
A manutenção de telômeros é uma função de uma polimerase de DNA específica de telômero, conhecidas como telomerase. A telomerase é uma ribonucleoproteína (RNP) que usa uma porção de sua porção de RNA 15 como um modelo para a síntese de DNA de repetição do telômero (Morin, 1997, Eur. J. Câncer 33: 750; Yu et al., 1990, Nature 344: 126; Singer e Gottschling, 1994, Science 266: 404; Autexier e Greider, 1994, Genes Develop., 8: 563; Gilley et al., 1995, Genes Develop., 9: 2214; McEachem e Blackbum, 1995, Nature 367: 403; Blackbum, 1992, Ann. Rev. Biochem., 61: 20 113; Greider, 1996, Ann. Rev. Biochem., 65: 337). Os componentes de RNA de seres humanos e outras telomerases foram clonados e caracterizados (ver Publicação do PCT WO 96/01835 e Feng et al., 1995, Science 269: 1236). No entanto, a caracterização dos componentes proteínicos de telomerase foi difícil. Em parte, isto é porque foi provado ser difícil purificar o RNP
telomerase, que está presente em níveis extremamente baixos em células em ·· · · ··· · · · ··· que ele é expresso. Por exemplo, foi estimado quej-às'· c’úfuhâs’i • · ·· · ··· ·♦· ··· · conhecidas por expressarem altos níveis de atividade de telomerase, podem ter apenas cerca de uma centena de moléculas da enzima por célula.
Consistente com o relacionamento de telômeros e telomerase com a capacidade proliferativa de uma célula (isto é, a capacidade da célula em dividir-se indefinidamente), a atividade de tolemerase é detectada em linhagens imortais celulares e um conjunto extraordinariamente diverso de tecidos tumorais, mas não é detectado (isto é, estava ausente ou abaixo do limiar do ensaio) em culturas de células somáticas normais ou tecidos normais adjacentes a um tumor (ver Patente U.S. 6.629.154, 5.489.508, 5.648.215 e 5.639.613; ver também Morin, 1989, Cell 59: 521; Shay e Bacchetti 1997, Eur. J. Câncer 33: 787; Kim et al., 1994, Science 266: 2011; Counter et al., 1992, EMBO J. 11: 1921; Counter et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 91, 2900; Counter et al., 1994, J. Virol. 68: 3410). Além disso, uma correlação entre o nível de atividade da telomerase em um tumor e o resultado clínico provável do paciente foi relatada (por exemplo, a Patente U.S. 5.639.613, acima, Langford et al., 1997, Hum. Pathol. 28: 416). A atividade de telomerase foi também detectada em células germinativas humanas, tronco proliferativo ou células progenitoras, e linfócitos ativados. Em tronco somático ou células progenitoras, e em linfócitos ativados, a atividade de telomerase é tipicamente ou muito baixa ou apenas transientemente expressa (ver Chiu et al., 1996, Stem Cells 14: 239; Bodnar et al., 1996, Exp. Cell. Res. 228: 58; Taylor et al., 1996, J. Invest. Dermatology 106: 759).
A telomerase humana é um alvo ideal para diagnosticar e tratar de doenças humanas relacionadas à proliferação e senescência celular, tal como o câncer. Processos para diagnosticar e tratar câncer e outras doenças relacionadas à telomerase em seres humanos são descritos nas
V)
(proteína catalítica^!
Patentes U.S. 5.489.508, 5,639.613 e 5.645.986. Processos para prognosticar ·· · · ··· · ♦ · ·♦· · a progressão de tumores mediante monitoração da telcÊfieta^ fãô-dpácritos :·:
na Patente U.S. 5.639.613. A descoberta e a caracterização da subunidade de a telomerase humana deve prover ensaios adicionais úteis quanto à telomerase e quanto ao diagnóstico e terapia da doença. Além disso, a clonagem e determinação da sequência principal da subunidade de proteína catalítica deve permitir mais terapias eficazes quanto aos cânceres humanos e outras doenças relacionadas à capacidade proliferativa e à senescência. BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção provê uma preparação de proteína | isolada^ substancialmente pura ou recombinante, de uma proteína transcriptase reversa da tolemerase, ou uma variante desta, ou um seu fragmento. Em uma modalidade, a proteína é caracterizada como tendo um motivo definido que tenha uma sequência de aminoácido: Trp|R^7]RrRi-R^^Phe-Phe-Tyr^X-Thr-Glu-3|.9|R3-R3-Arg0<í^X2-Trp onde X é qualquer aminoácido e um subscrito se refere ao número de resíduos consecutivos, Rj é leucina ou isoleucina, R2 é glutamina ou arginina, R3 é fenilalanina ou tirosina, e R4 é lisina ou histidina. Em uma modalidade, a proteína tem uma sequência de(TRT humana^Em outras modalidades, a invenção diz respeito a peptídeos e polipeptídeos compartilhando a identidade substancial da sequência com uma subsequência de tais proteínas.
Em uma modalidade relacionada, a invenção provê um ácido nucleico substancialmente puro ou recombinante, que codifica uma proteína transcriptase reversa da tolemerase. Em uma modalidade, o ácido nucleico codifica uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácidos:
Trp-R1-X7-R1-R1-R2-X-Phe-Phe-Tyr-X-Thr-Glu-X8.9-R3-R3Arg-R4-X2-Trp. Em outra modalidade, o ácido nucleico tem uma sequência que codifica a proteína TRT humana. Em outras modalidades, a invenção diz η
respeito a oligonucleotídeos e polinucleotídeos compartilhando a identidade ·· · · ··· · · · ··· · • · · ·· · ·· · · · · · · ou complementaridade substancial da sequência com úmi sute*eqúê£iciá’ àjã tais ácidos nucleicos.
Em uma modalidade, a invenção diz respeito a proteína transcriptase reversa da tolemerase humana ^ijTRT). Assim, em uma modalidade, a invenção provê uma preparação de proteína isolada, substancialmente pura ou recombinante, de uma proteína hTTR, ou uma variante desta, ou um seu fragmento. Em uma modalidade, a proteína pe caracterizada por ter uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 75% ou pelo menos cerca de 80% de identidade da sequência Pa proteína hTRT da Figura 17 (SEQUÊNCIA ID NO: 2), ou uma variante desta, ou um seu fragmento. Em um aspecto relacionado, a proteína hTRT tem a sequência da SEQUÊNCIA ID NO: 2. Em algumas modalidades, a proteína tem uma ou mais atividades de telomerase, tal como a atividade catalítica. Em algumas modalidades, a proteína tem uma ou mais atividades telomerase, tais como atividade catalítica. Em uma modalidade, o fragmento de proteína hTRT tem pelo menos 6 resíduos de aminoácidos. Em uma modalidade, o fragmento de proteína hTRT tem pelo menos 6 resíduos de__aminoácidosZEm outras
modalidades, o fragmento de proteína hTRT tem pelo menos 8, pelo menos cerca de 10, pelo menos cerca de 12, pelo menos cerca de 15 ou pelo menos cerca de 20 resíduos de aminoácidos contíguos de um polipeptídeo hTRT de ocorrência natural. Ainda em outras modalidades, o fragmento de proteína hTRT tem pelo menos cerca de 50 ou pelo menos cerca de 100 resíduos de aminoácidos.
A invenção também provê uma composição compreendendo uma proteína hTRT e um RNÁ. O RNA pode ser uma RNA telomerase, tal como um RNA telomerase humana. Em uma modalidade, a proteína hTRT e o RNA (hTR) tolemerase humana de um complexo ribonucleoproteínico com uma atividade de telomerase.
Em uma modalidade, a invenção provê telomerase humana ·· · · ··« ♦ · · ··· * ·· · ·· ··♦ ♦ · · · · · isolada compreendendo proteína hTRT, tal como umà*’teiornerasé húntfáná: ··: substancialmente pura, consistindo de proteína hTRT e compreendendo hTR. Em uma modalidade, a telomerase é pelo menos cerca de 95% pura. A telomerase pode ser isolada de uma célula, tal como uma célula hospedeira recombinante em uma célula que expressa atividade telomerase.
Em outro aspecto, a invenção provê um polinucleotídeo isolado, sintético, substancialmente puro, ou recombinante, compreendendo uma sequência de ácido nucleico, que codifica uma proteína hTRT. Em uma modalidade, o polinucleotídeo tem uma sequência de nucleotídeos codificando uma proteína hTRT que tem uma sequência de amino ácido, conforme apresentado na Figura 17 (SEQUÊNCIA ID NO: 2) ou uma sequência que compreende uma ou mais substituições de aminoácido (ou códon) conservativo, ou uma ou mais substituições de aminoácido (ou códon) de alteração da atividade, na dita sequência de aminoácido. Em um aspecto relacionado, o polinucleotídeo hibridiza sob condições estringentes a um polinucleotídeo tendo a sequência apresentada na Figura 16 (SEQUÊNCIA ID NO: 1). Em outro aspecto relacionado, a sequência de nucleotídeos do polinucleotídeo tem uma menor probabilidade de soma de menos do que cerca de 0,5, quando comparada a uma sequência de nucleotídeos como apresentado na Figura 16 (SEQUÊNCIA ID NO: 1) usando o algoritmo BLAST com parâmetros padrão (default).
Em outro aspecto, a invenção provê um polinucleotídeo tendo uma sequência de promotor operavelmente ligada à sequência codificando a proteína hTRT. O promotor pode ser um promotor diferente do promotor de hTRT de ocorrência natural. Em um aspecto relacionado, a invenção provê um vetor de expressão compreendendo o promotor do hTRT.
A invenção também provê um polinucleotídeo isolado, sintético, substancialmente puro, ou recombinante, que tem pelo menos dez
nucleotídeos de comprimento e compreende uma sequência contígua de pelo t menos dez nucleotídeos, que é idêntico ou exatamente»CoiJipIêmeiâaria:úniã * sequência contígua em um gene de hTRT de ocorrência natural ou hTRT mRNA. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo é um RNA, um DNA ou contém um ou mais nucleotídeos sintéticos de ocorrência não natural. Em um aspecto, o polinucleotídeo é idêntico ou exatamente complementar à sequência contígua de pelo menos dez nucleotídeos contíguos em um gene hTRT de ocorrência natural ou hTRT mRNA. Por exemplo, o polinucleotídeo pode ser um polinucleotídeo anti-sentido. Em uma modalidade, o 10 polinucleotídeo anti-sentido compreende pelo menos cerca de 20 nucleotídeos.
A invenção ainda provê um processo de preparo de telomerase recombinante mediante contato de uma proteína hTRT recombinante com um componente de RNA telomerase sob condições tais que dita proteína 15 recombinante e dito componente de RNA telomerase se associam para formar uma enzima telomerase capaz de catalisar a adição de nucleotídeos a um substrato de telomerase. Em uma modalidade, a proteína hTRT tem uma sequência conforme se apresenta na Figura 17 (SEQUÊNCIA ID NO: 2). A proteína hTRT pode ser produzida em um sistema de expressão in vitro e 20 misturada com um RNA telomerase ou, em outra modalidade, o RNA telomerase pode ser co-expresso no sistema de expressão in vitro. Em uma modalidade, o RNA telomerase é hTR. Em uma modalidade alternativa, o contato ocorre em uma célula, tal como uma célula humana. Em uma modalidade, a célula não tem atividade telomerase antes do contato da hTRT 25 e do RNA, ou da introdução, tal como por transfecção, de um polinucleotídeo de hTRT. Em uma modalidade, o RNA telomerase é expresso naturalmente pela dita célula.
A invenção também provê uma célula, tal como uma célula humana, de camundongo ou de levadura, contendo os polinucleotídeos
1Μ recombinantes da invenção, tais como um polinucleotídeo com uma
Λ. Λ Λ · > j · tf·* 9 · · * Λ t· ♦ * * ç sequência codificando a proteína hTRT operavelmente ltgacía áMm promotor.**
Em aspectos particulares, a célula é uma célula vertebrada, tal como uma célula de um mamífero, por exemplo um ser humano, e tem uma capacidade proliferativa aumentada relativa a uma célula que é, por outro lado, idêntica, mas não contém o polinucleotídeo recombinante ou tem um nível de atividade telomerase aumentado, em relação a uma célula que é, por outro lado, idêntica, porém não compreende o polinucleotídeo recombinante. Em algumas modalidades, a célula é imortal.
Em modalidades relacionadas, a invenção provê organismos e células compreendendo um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo de transcriptase reversa da tolemerase humana, tal como um organismo transgênico não humano como uma levedura, uma planta, uma bactéria ou um animal não humano, por exemplo um camundongo. A invenção também provê quanto a animais e células transgênicas, das quais um gene hTRT tenha sido deletado (eliminado) ou modificado de tal modo que o gene não expresse um produto de gene hTRT de ocorrência natural. Assim sendo, em modalidades alternativas, o animal transgênico não humano tem um gene telomerase modificado, é um animal deficiente em uma atividade telomerase, é um animal cuja deficiência TRT é um resultado de um gene modificado codificando um TRT tendo um nível reduzido de uma atividade telomerase em comparação com um TRT de tipo selvagem, e é um animal tendo um gene de TRT modificado com uma ou mais mutações, incluindo mutações de sentido equívoco, mutações sem sentido, inserções ou deleções.
A invenção também provê um anticorpo isolado ou recombinante, ou um seu fragmento, que especificamente se liga a uma proteína de hTRT. Em uma modalidade, o anticorpo se liga com uma afinidade de pelo menos cerca de ΙΟ8 Μ*1. O anticorpo pode ser monoclonal ou pode ser uma composição policlonal, tal como um anti-soro policlonal·
• · • ·· anticorpo, tal como u:
A invenção também provê um processo para determinar se um composto ou tratamento é um modulador de uma atividade de transcriptase reversa de telomerase ou expressão de hTRT. O processo envolve detectar ou monitorar uma modificação na atividade ou expressão em uma célula, animal ou composição compreendendo uma proteína de hTRT ou polinucleotídeo, seguindo-se a administração do composto ou tratamento. Em uma modalidade, o processo inclui as etapas de: prover uma composição de TRT, colocar em contato o TRT com o composto de teste e medir a atividade do TRT, onde uma modificação na atividade de TRT na presença do composto de teste é um indicador de que o composto de teste modula a atividade de TRT. Em certas modalidades, a composição é uma célula, um organismo, um organismo transgênico ou um sistema in vitro, tal como um sistema de expressão, que contém um polinucleotídeo recombinante codificando um polipeptídeo de hTRT. Assim, a hTRT do processo pode ser um produto de expressão in vitro. Em várias modalidades, a detecção da atividade ou expressão de telomerase pode ser/fetectando-se uma modificação em abundância de um produto de gene de hTRT, monitorando a incorporação de um rótulo de nucleotídeo em um substrato por telomerase, hibridização de monitoração de uma sonda para um substrato estendido de telomerase, ampliação de monitoração de um substrato de telomerase estendida, comprimento de telômero de monitoração de uma célula exposta ao composto de teste, monitorando a perda da capacidade da telomerase para ligar-se a um cromossoma, ou medir o acúmulo ou perda de estrutura telomerase.
Em um aspecto, a invenção proporciona um processo de detecção de um produto de gene de hTRT em uma amostra biológica, mediante contato da amostra biológica com uma sonda que especificamente ·· · · ··· · · · ··· · liga o produto de gene, em que a sonda e o projáUtí) hj;:ge4e.ft)rdià^*W • · ·· · ··· ··· ··· · (· complexo, e detecção do complexo, onde a presença do complexo é correlacionada com a presença do produto de gene de hTRT na amostra biológica. O produto de gene pode ser RNA, DNA ou um polipeptídeo. Exemplos de sondas que podem ser usadas para a detecção incluem, mas a estes não se limitam, ácidos nucleico e anticorpos.
Em uma modalidade, o produto do gene é um ácido nucleico, que é detectado por amplificação do gene e detecção do produto de 10 ampliação, onde a presença do complexo ou o produto de ampliação é correlacionado com a presença do produto de gene de hTRT na amostra biológica.
Em uma modalidade, a amostra biológica é de um paciente, tal como um paciente humano. Em outra modalidade, a amostra biológica inclui 15 pelo menos uma célula de uma cultura celular in vitro, tal como uma cultura celular humana.
A invenção ainda provê um processo para detectar a presença de pelo menos uma célula humana positiva imortal ou de telomerase, em uma amostra biológica compreendendo células humanas mediante obtenção da 20 amostra biológica compreendendo células humanas; e detectar a presença na amostra de uma célula tendo um alto nível de um produto de gene de hTRT, onde a presença de uma célula tendo um alto nível do produto de gene de hTRT é correlacionada com a presença de células positivas imortais ou de telomerase na amostra biológica.
A invenção também provê um processo para diagnosticar uma condição relacionada a telomerase em um paciente, mediante a obtenção de uma amostra celular ou de tecido do paciente, determinando a quantidade de um produto de gene de hTRT na célula ou tecido; e comparar a quantidade do produto de gene de hTRT na célula ou tecido com a quantidade em uma célula ou tecido saudável do mesmo tipo, onde uma quantidade diferente do ·· · · ··· · · · ··· · • · · · · ··· ····· · produto do gene de hTRT na amostra do paciente: é-ja: célula” oü'teêijdo *· · · ·· · ··· ··· ··· · · saudável é o diagnóstico de uma condição relacionada com a telomerase. Em uma modalidade, a condição relacionada com a telomerase é câncer e uma maior quantidade do produto de gene de hTRT é detectada na amostra.
A invenção ainda provê um processo de diagnosticar câncer em um paciente mediante obtenção de uma amostra biológica do paciente, e detectar um produto de gene de hTRT na amostra do paciente, onde a detecção do produto de gene de hTRT na amostra é correlacionada com um 10 diagnóstico de câncer.
A invenção ainda provê um processo de diagnosticar câncer em um paciente, pela obtenção de uma amostra do paciente, determinar a quantidade de produto de gene de hTRT na amostra do paciente; e comparar a quantidade de produto de gene de hTRT com um valor normal ou de 15 controle, onde a quantidade do produto de gene de hTRT no paciente, que é maior do que o valor normal ou de controle, é o diagnóstico de câncer.
A invenção também provê um processo de diagnosticar câncer em um paciente, mediante a obtenção de uma amostra do paciente contendo pelo menos uma célula; determinar a quantidade de um produto de gene de 20 hTRT em uma célula na amostra; e comparar a quantidade de produto de gene de hTRT na célula com um valor normal para a célula, em que uma quantidade do produto de gene de hTRT maior do que o valor normal, é o diagnóstico de câncer. Em uma modalidade, acredita-se que a amostra contenha pelo menos uma célula maligna.
A invenção também provê um processo para prognosticar um paciente de câncer mediante a determinação da quantidade de produto de gene de hTRT em uma célula cancerígena obtida do paciente; e comparar a quantidade de hTRT na célula cancerígena com um valor de prognóstico de hTRT consistente com um prognóstico para o câncer; onde uma quantidade
11?
de hTRT na amostra que está no valor de prognóstico provê o prognóstico ·· · · ··· · · · ··· * particular. :·’ : ’·:.·’ 7::·:
• · ·· · ··· ··· ·♦· · ·
A invenção igualmente provê um processo para monitorar a capacidade de um tratamento anti-câncer para reduzir a capacidade 5 proliferativa das células cancerígenas em um paciente, fazendo uma primeira medição da quantidade de um produto de gene de hTRT em pelo menos uma célula cancerígena do paciente; fazendo uma segunda medição do nível do produto de gene de hTRT em pelo menos uma célula cancerígena do paciente, em que o tratamento anti-câncer seja administrado ao paciente antes 10 da segunda medição; e comparar a primeira e a segunda medições, onde um nível inferior do produto de gene de hTRT na segunda medição seja correlacionada com a capacidade de um tratamento anti-câncer para reduzir a capacidade proliferativa das células cancerígenas no paciente.
A invenção também provê kits para a detecção de um gene de 15 hTRT ou produto de gene. Em uma modalidade, o kit inclui um recipiente que inclui uma molécula selecionada de um ácido nucleico de hTRT ou sua subsequência, um polipeptídeo de hTRT ou sua subsequência, e um anticorpo anti-hTRT.
A invenção também provê processos de tratamento de doenças ~20 de seres humanos. Em uma modalidade, a invenção provê um processo para aumentar a capacidade proliferativa de uma célula de vertebrados, tal como uma célula de mamífero, pela introdução de um polinucleotídeo recombinante na célula, em que dito polinucleotídeo compreende uma sequência codificando um polipeptídeo de hTRT. Em uma modalidade, o 25 polipeptídeo de hTRT tem uma sequência como se mostra na Figura 17. Em uma modalidade, a sequência é operavelmente ligada a um promotor. Em uma modalidade, o hTRT tem atividade catalítica de telomerase. Em uma modalidade, a célula é humana, tal como uma célula em um paciente humano. Em uma modalidade alternativa, a célula pe cultivada in vitro. Em uma modalidade relacionada, a célula é introduzida em um paciente humano.
·· · · ··· · · · ··· ·
A invenção ainda provê um procesjò fiafaj t^âtifr due&pa • « ·· · ··· ··· ··· * · humana introduzindo-se o polinucleotídeo recombinante de hTRT em pelo menos uma célula em um paciente. Em uma modalidade, um vetor de terapia do gene é usado. Em uma modalidade relacionada, o processo ainda consiste da introdução na célula de um polinucleotídeo que compreende uma sequência codificando hTR, por exemplo um polinucleotídeo de hTR operavelmente ligado a um promotor.
A invenção também provê um processo para aumentar a capacidade proliferativa de uma célula de vertebrado, dito processo compreendendo a introdução na célula de uma quantidade eficaz de polipeptídeo de hTRT. Em uma modalidade, o polipeptídeo de hTRT tem uma atividade catalítica de telomerase. A invenção ainda provê células e progênie celular com capacidade proliferativa aumentada.
A invenção também provê um processo para tratar uma condição associada com um elevado nível de atividade de telomerase dentro de uma célula, compreendendo a introdução na dita célula de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor da dita atividade de telomerase, em que dito inibidor é um polipeptídeo de hTRT ou um polinucleotídeo de hTRT. Em uma modalidade, o inibidor é um polipeptídeo ou um polinucleotídeo compreendendo, por exemplo, pelo menos uma subsequência de uma sequência apresentada nas Figuras 16, 17 ou 20. Em modalidades adicionais, o polipeptídeo ou polinucleotídeo inibe uma atividade de TRT, tal como a ligação do TRT endógeno ao RNA da telomerase.
A invenção também provê uma vacina que compreende um polipeptídeo de hTRT e um adjuvante. A invenção também provê composições farmacológicas contendo um portador farmaceuticamente aceitável e uma molécula selecionada de: um polipeptídeo de hTRT, um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo de hTRT, e um ácido nucleico ãO de hTRT, ou suas subsequências.
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS p i V: P *: p p • · ·· · ··· ··· ··· · ·
A Figura 1 apresenta resíduos altamente conservados em motivos de TRT de ser humano, S. pombe (tezl), S. cerevisiae (EST2) e
Euplotes aediculatus (pl23). Aminoácidos idênticos são indicados com um
CaKsÓo, asterisco (*) [levemente elevado], enquanto os resíduos de aminoácidos similares são indicados por um ponto (·). Motivo “0” na figura também é chamado de Motivo T; Motivo “3” também é chamado de Motivo A.
A Figura 2 apresenta a localização de motivos de sequência específica de telomerase e específica de RT de proteínas de telomerase e outras transcriptases reversas. As localizações do motivo T específico de telomerase e motivos 1, 2 e A-E de RT conservados, são indicados por retângulos. O retângulo aberto rotulado de HIV-1 RT delineia a porção desta proteína mostrada na Figura 3.
A Figura 3 apresenta a estrutura de cristal da subunidade p66 de HIV-1 de transcriptase reversa (código de Brookhaven 1HNV). A observação é das costas da mão direita para permitir que todos os motivos sejam mostrados.
A Figura 4 mostra o alinhamento de sequências múltiplas de telomerase Rts (Sp_Trtlp, S. pombe TRT [também referida aqui como “tezlp”]; hTRT, TRT humano; Ea_pl23, Euplotes pl23; Sc_Est2p, S. cerevisiae Est2p) e membros de outras famílias de RT (Sc_al, proteína intron grupo II citocromo oxidase codificada 1 das mitocôndrias de S. cerevisiae, Dm_TART, transcriptase reversa do elemento retrotransponível não-LTR da Drosophila melanogaster TART). TRT con e RT con representam sequências de consenso para os Rts de telomerase e Rts de não-telomerase. Os aminoácidos são designados com um h, hidrofóbicos; p, polar; c, carregado. Os triângulos mostram resíduos que são conservados entre as proteínas de telomerase, mas diferentes em outras RTs. A linha sólida abaixo do motivo E salienta a região de controle do iniciador.
• · · · ··· · · · ··· ·
A Figura 5 mostra a expressão RNÂ le^TRl· eyh ’e:ep*^-£le • * ♦ · · ··· ··· ··· · · células mortais de telomerase negativa e linhagens de células imortais de telomerase positiva, como se descreve no Exemplo 2.
A Figura 6 mostra um uma possível árvore filogenética de telomerases e retroelementos enraizados com polimerases de RNA dependentes de RNA.
A Figura 7 mostra um mapa de restrição do clone lambda Θφ5.
A Figura 8 mostra um mapa do cromossoma 5p com a localização do marcador STS D5S678 (localizado próximo ao gene hTRT) indicado.
A Figura 9 mostra a construção de um plasmídeo promotorrepórter de hTRT.
A Figura 10, em duas páginas, mostra a coexpressão in vitro de hTRT e hTR para produzir cataliticamente a telomerase humana ativa.
A Figura 11, em duas páginas, mostra um alinhamento de sequências de quatro proteína de TRT e identifica motivos de interesse. TRT con mostra uma sequência de consenso de TRT. RT con mostra resíduos de consenso para outras transcriptases reversas.
A Figura 12 mostra um sítio de divagem de Topoisomerase II e motivos do sítio de ligação NFkB em um intron hTRT, com a sequência mostrada correspondendo à SEQUÊNCIA ID NO: 7
A Figura 13, em duas páginas, mostra a sequência do DNA codificando a subunidade de proteína telomerase Euplotes 123 kDa (Euplotes TRT).
A Figura 14 mostra a sequência de aminoácidos da subunidade de proteína telomerase Euplotes 123 kDa (proteína Euplotes TRT).
A Figura 15, em cinco páginas, mostra o DNA e as sequências ·· · · ··· · · · «·· « de aminoácidos da subunidade catalítica telomerase • * *· · ··· ··« ··· « · TRT).
A Figura 16, em duas páginas, mostra a sequência de cDNA hTRT, com a sequência mostrada correspondente à SEQUÊNCIA ID NO: 1.
A Figura 17 mostra a proteína de hTRT codificada pelo cDNA e da Figura 16. A sequência de proteína mostrada corresponde à SEQUENCIA IDNO:2.
A Figura 18 mostra a sequência do clone 712562, com a sequência mostrada correspondente à SEQUÊNCIA ID NO: 3.
A Figura 19 mostra uma proteína residual 259 codificada pelo A clone 712562, com a sequência mostrada correspondente à SEQUENCIA ID NO: 10.
A Figura 20 mostra, em sete páginas, a sequência de um ácido nucleico com uma estrutura de leitura aberta codificando um polipeptídeo de variante Δ182,com a sequência mostrada correspondente à SEQUÊNCIA ID NO: 4. Esta figura também mostra a sequência de aminoácido deste polipeptídeo de variante Δ182, com a sequência de aminoácido mostrada correspondente à SEQUÊNCIA ID NO: 5.
A Figura 21 mostra, em seis páginas, a sequência de um clone genômico de hTRT, com a sequência mostrada correspondente à SEQUÊNCIA ID NO: 6. Os motivos e elementos do consenso são indicados, incluindo as sequências características de um sítio de divagem de topoisomerase II, sítios de ligação NFkB, uma sequência Alu e outros elementos da sequência.
A Figura 22 mostra o efeito da mutação do gene TRT em levedura, como descrito no Exemplo 1.
A Figura 23 mostra a sequência de EST AA281296, correspondente à SEQUÊNCIA ID NO: 8.
A Figura 24 mostra a sequência dos 182 pares de base deletados no clone 712562, com a sequência mòsttadaj çúrirespohdéntèqà
SEQUÊNCIA ID NO: 9.
A Figura 25 mostra os resultados de um ensaio quanto à atividade de telomerase das células BJ transfectadas com um vetor de expressão codificando uma proteína hTRT (pGRN133) ou um plasmídeo de controle (pBBS212), como descrito no Exemplo 13.
A Figura 26 é um diagrama esquemático da purificação de afinidade de telomerase mostrando a ligação e as etapas de elução de deslocamento.
A Figura 27 é uma fotografia de uma mancha do Norte de preparações de telomerase obtidas durante um protocolo de purificação, como descrito no Exemplo 1. A faixa 1 continha 1,5 finol de RNA telomerase, a faixa 2 continha 4,6 imoles de RNA telomerase, a faixa 3 continha 14 imoles de RNA telomerase, a faixa 4 continha 41 imoles de RNA telomerase, a faixa 5 continha extrato nuclear (42 imoles de telomerase), a faixa 6 continha telomerase purificada de heparina Affi-Gel (47 imoles de telomerase), a faixa 7 continha telomerase purificada por afinidade (68 imoles) e a faixa 8 continha telomerase purificada com gradiente de glicerol (35 imoles).
A Figura 28 mostra a atividade de telomerase através de um protocolo de purificação.
A Figura 29 é uma fotografia de um gel SDS-PAGE, mostrando a presença de um polipeptídeo de aproximadamente 123 kDa e um dubleto de aproximadamente 43 kDa de Euplotes aediculatus.
A Figura 30 é um gráfico mostrando o coeficiente de sedimentação de Euplotes aediculatus telomerase.
A Figura 31 é uma fotografia de um gel de poliacrilamida/uréia com 36% de formamida, mostrando a utilização do substrato de Euplotes telomerase.
• · · » ··· « · e «·**
A Figura 32 mostra os alinhamentoS-pqtaiiivOs '^ohmptlèipííle * * * * · ·««··«··· · · RNA telomerase e iniciadores de grampo de cabelo com RNA telomerase.
A Figura 33 é uma fotografia das faixas 25 a 30 do gel mostrado na Figura 31, mostrado em um nível de exposição mais claro.
A Figura 34 mostra a sequência de DNA do gene codificando a subunidade proteínica de telomerase de 43 kDa de Euplotes.
A Figura 35 mostra, em quatro páginas, a sequência de DNA, bem como as sequências de aminoácidos de todas as três estruturas de leitura aberta da subunidade proteínica de telomerase de 43 kDa de Euplotes.
A Figura 36 mostra uma comparação de sequências entre a subunidade proteínica de telomerase de 123 kDa de Euplotes (sequência superior) e a subunidade de polipeptídeo de 80 kDa de T. thermophila (sequência inferior).
A Figura 37 mostra uma comparação de sequências entre a subunidade proteínica de telomerase de 123 kDa de E. aediculatus (sequência superior) e o polipeptídeo de telomerase de 95 kDa de T. thermophila (sequência inferior).
A Figura 38 mostra o alinhamento melhor ajustado entre uma porção do “domínio LA” da subunidade proteínica da telomerase de 43 kDa de E. aediculatus (sequência superior) e uma porção da subunidade de polipeptídeo de 95 kDa de T. thermophila (sequência inferior).
A Figura 39 mostra o alinhamento melhor ajustado entre uma porção do “domínio LA” da subunidade proteínica da telomerase de 43 kDa de E. aediculatus (sequência superior) e uma porção da subunidade de polipeptídeo de 80 kDa de T. thermophila (sequência inferior).
A Figura 40 mostra o alinhamento e motivos do domínio de polimerase da subunidade proteínica de telomerase de 123 kDa de E. aediculatus e os domínios de polimerase de várias transcriptases reversas incluindo uma proteína intron grupo II citocromo oxidase codificada 1 das • · · ' “ ♦ v 4 »· · * mitocôndrias de S. cerevisiae (al S.c. (grupo II)), ©opg^I^lNÈj.é levedúça « ·· · ····«*··» · w
ESTp (L8543.12).
A Figura 41 mostra o alinhamento de um domínio da subunidade proteínica de telomerase de 43 kDa com várias proteínas La.
A Figura 42 mostra a sequência de nucleotídeos codificando a subunidade proteínica de 80 kDa.
A Figura 43 mostra a sequência de aminoácidos da subunidade proteínica de 80 kDa de T. thermophila.
A Figura 44 mostra a sequência de nucleotídeos codificando a subunidade proteínica de 95 kDa de T. thermophila.
A Figura 45 mostra a sequência de aminoácidos da subunidade proteínica de 95 kDa de T. thermophila.
A Figura 46 mostra a sequência de aminoácidos de L8543.12 (“Est2p”).
A Figura 47 mostra o alinhamento da sequência de aminoácidos codificada pelo produto de PCR Oxytricha com a sequência Euplotes p 123.
A Figura 48 mostra a sequência de DNA de Est2.
A Figura 49 mostra uma sequência de aminoácidos parcial de um clone de cDNA codificando os motivos de peptídeos de telomerase humana.
A Figura 50 mostra uma sequência de DNA parcial de um clone de cDNA codificando os motivos de peptídeos de telomerase humana.
A Figura 51 mostra a sequência de aminoácido de tezl, também chamada S. pombe trt.
A Figura 52, em duas páginas, a sequência de DNA de tezl. Regiões intrônicas e outras de não codificação são mostradas em caixa baixa e os exons (isto é, as regiões de codificação) são mostrados em caixa alta.
A Figura 53 mostra o alinhamento de EST2p; As sequências • « ‘ - « t · i *. « fr
Euplotes e Tetrahymena, bem como a sequência de tOnsensq: ' * « *»*·««·« · «
A Figura 54 mostra as sequências de peptídeos úteis para a produção de anticorpos anti hTRT.
A Figura 55 é um sumário esquemático das experiências de sequenciação tezl+.
A Figura 56 mostra dois iniciadores degenerados usados em PCR para identificar o homólogo S. pombe das sequências pl23 de E. aediculatus.
A Figura 57 mostra as quatro bandas principais produzidas em PCR usando iniciadores degenerados para identificar o homólogo 5. pombe das sequências p 123 de E. aediculatus.
A Figura 58 mostra o alinhamento do produto PCR M2 com as sequências proteínicas de telomerase de E. aediculatus pl23, S. cerevisiae e Oxytricha.
A Figura 59 é um esquema mostrando a estratégia PCR de RT 3’ para identificar o homólogo S. pombe do E. aediculatus pl23.
A Figura 60 mostra características das coleções usadas para triar as sequências proteínicas de telomerase de S. pombe, e mostra os resultados da triagem das coleções para as sequências proteínicas de telomerase de S. pombe.
A Figura 61 mostra os resultados positivos obtidos com os clones genômicos positivos digeridos por HindUI contendo a sequência de telomerase de S. pombe.
A Figura 62 é um esquema mostrando a estratégia PCR de RT 5’ usada para obter um clone de TRT de S. pombe de comprimento pleno.
A Figura 63 mostra o alinhamento dos domínios de RT das subunidades catalíticas da telomerase para S. pombe (S.p.), S. cerevisiae (S.C.) e E. aediculatus (E.a.).
A Figura 64 mostra o alinhamento das sequências teEuplotes • · · * * * * * ··*··· * · (“Ea_pl23”), S. cerevisiae (“Sc_Est2p”) e S. pomfyè (“SjFJezipY^ JUa-Êàiiiel
A, as áreas sombreadas indicam resíduos compartilhados entre duas sequências. No painel B, as áreas sombreadas indicam resíduos compartilhados entre todas as três sequências.
A Figura 65 mostra a estratégia de ruptura usada com os genes de telomerase em S. pombe.
A Figura 66 mostra os resultados experimentais confirmando a ruptura de tezl.
A Figura 67 mostra o encurtamento progressivo de telômeros em S. pombe devido à ruptura de tezl.
A Figura 68 mostra, em quatro páginas, o DNA e o aminoácido do ORF codificando uma proteína de telomerase de aproximadamente 63 kDa codificada pelo inserto EcoRI-Notl do clone 712562.
A Figura 69 mostra um alinhamento de motivos de transcriptase reversa de várias fontes.
A Figura 70 provê um mapa de restrição e de função do plasmídeo pGRN 121.
A Figura 71 mostra, em duas páginas, os resultados da análise preliminar de sequenciação de ácido nucleico de uma sequência de cDNA de hTRT.
A Figura 72 mostra, em dez páginas, a sequência preliminar de ácido nucleico de hTRT e sequências de ORF deduzidas em três estruturas de leitura.
A Figura 73 provê um mapa de restrição e de função do plasmídeo pGRN 121.
A Figura 74 mostra, em oito páginas, a sequência de ácido nucleico refinada e as sequências de ORF deduzidas de hTRT.
A Figura 75 mostra um mapa de restrição do clone lambda 251 · 1. *;·♦*···»······** DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
I. INTRODUÇÃO
A telomerase é um complexo de ribonucleoproteína (RNP) compreendendo um componente de RNA e um componente catalítico de proteína. A presente invenção diz respeito à clonagem e caracterização do componente catalítico de proteína da telomerase, daqui em diante referida como “TRT” (transcriptase reversa de telomerase). TRT é assim denominado, porque esta proteína atua como uma polimerase de DNA dependente de RNA (transcriptase reversa), usando o componente de RNA da telomerase (doravante aqui denominado “TR”), para a síntese direta das sequências de repetição do DNA do telômero. Além disso, o TRT é evolucionário em relação a outras transcriptases reversas (ver Exemplo 12).
Em um aspecto, a presente invenção diz respeito à clonagem e caracterização do componente catalítico de proteína da telomerase humana, daqui em diante referido como “hTRT”. A TRT humana é de extraordinário interesse e valor, porque, como observado acima, a atividade de tolemerase em seres humanos (e outras células de mamíferos) se correlaciona com a capacidade proliferativa celular, com a imortalidade celular e com o desenvolvimento de um fenótipo neoplástico. Por exemplo, a atividade de telomerase e, como demonstrado no Exemplo 2, abaixo, os níveis de produtos do gene de TRT humana, são elevados em células humanas imortais (tal como nas células tumorais malignas e nas linhagens de células imortais) em relação às células mortais (tal como a maioria das células somáticas humanas).
A presente invenção ainda provê processos e composições valiosas para o diagnóstico, prognóstico e tratamento de doenças humanas e condições de doença, como descrito em alguns detalhes abaixo. São também
fornecidos processos e reagentes úteis para imortalizar as células (in vivo e ex ·· · · ··· · ·- -*Φ · · * · · ·* ·♦· vivo), produzindo animais transgênicos com caráct^rj^tijças:.desejáveis,: e numerosos outros usos, muitos dos quais são descritos abaixo. A invenção também provê processos e reagentes úteis para preparar, clonar ou reclonar 5 genes e proteínas de TRT de ciliatos, fungos, vertebrados, tais como mamíferos, e outros organismos.
Como descrito em detalhes abaixo, a TRT foi inicialmente caracterizada em seguida à purificação da telomerase do ciliato Euplotes aediculatus. A purificação extensiva de telomerase de E. aediculatus, usando a cromatografia de afinidade de RNA e outros processos, produziu a proteína “pl23”. Surpreendentemente, pl23 não está relacionado com as proteínas que se acreditava anteriormente constituir as subunidades proteínicas da holoenzima da telomerase (isto é, as proteínas p80 e p95 de Tetrahymena thermophila). A análise do DNA pl23 e das sequências de proteínas (N- de
Acesso U95964 do Genbank; Figuras 13 e 14) revelou os motivos da transcriptase reversa (RT) consistente com o papel de pl23 como a subunidade catalítica da telomerase (ver, por exemplo, as Figuras 1, 4 e 11). Além disso, pl23 é relacionado com uma proteína de S. cerevisiae (levedura), Est2p, que se sabia desempenhar um papel na manutenção de “720 telômeros na S. cerevisiae (N2 de Acesso S5396 do Genbank), porém, antes da presente invenção, não era reconhecida como codificando uma proteína da subunidade catalítica da telomerase (ver, por exemplo, Lendvay et al., 1996, Genetics, 144: 1399).
Em um aspecto, a presente invenção provê reagentes e processos para identificar e clonar novos TRTs usando: sondas e iniciadores de ácido nucleico derivados dos polinucleotídeos de TRT (por exemplo, para os genes de clonagem de TRT e cDNAs); anticorpos que especificamente reconhecem os motivos ou as sequências motivo ou outros epítopos de TRT (por exemplo, para os genes de TRT de clonagem de expressão ou purificação de proteínas de TRT); mediante a triagem das bases de dados de computador; ou outros meios. Por exemplo, comd de£crjtô no,Exemplo 1, a ampliação do PCR (reação da cadeia de polimerase) de DNA de S. pombe foi realizada com os iniciadores de sequência degenerada designados dos 5 motivos B’ e C de RT dos Euplotes pl23. De quatro produtos proeminentes gerados, um codificava um homólogo da sequência de peptídeos a Euplotes pl23 e S. cerevisiae Est2p. Usando-se este produto de PCR como uma sonda, a sequência completa do homólogo de TRT de S. pombe foi obtida por triagem de cDNA de S. pombe e coleções genômicas, e ampliando-se o RNA IX 10 de S. pombe por transcripção reversa e PCR (PCR de RT). A sequência completa do gene de S. pombe (“trtl” ; N- de Acesso AF015783 do GenBank;
Figura 15) revelou que a homologia com pl23 e Est2p era especialmente elevada nos motivos de transcriptase reversa. O trtl de S. pombe também é referido como tezl.
A ampliação usando iniciadores degenerados derivados dos motivos de RT de telomerase também foi usada para obter as sequência do gene de TRT em Oxytricha trifallax e Tetrahymena thermophila, como descrito no Exemplo 1.
As sequências de ácido nucleico dèffuplotes^j^, trtl de S. pombe e Est2p de S. cerevisiae da invenção foram usadas em uma pesquisa de base de dados computadorizada de marcadores de sequências expressão (EST) humanas usando-se o programa BLAST (Altschul et al., 1990, J. Mol.
Biol. 215:403). A busca desta base de dados com a sequência Est2p não indicou uma união, mas a busca com as sequências pl23 e trtl identificaram 25 um EST humano (N2 de Acesso AA281296 do Genbank; ver SEQUÊNCIA
ID NO: 8) como descrito no Exemplo 1, putativamente codificando uma proteína homóloga. A sequenciação completa do clone de cDNA contendo o
EST (doravante “clone 712562”; ver SEQUÊNCIA ID NO: 3) mostrou que sete motivos de RT estavam presentes. No entanto, este clone não codificou um TRT humano contíguo com todos os sete motivos, porque ps mQti.vps B’, « Z * · * ·* ·* * · * · ·*β
C, D e E estavam contidos em uma diferente estrutura‘deiieatura aWrta*(ORF) em relação aos outros motivos terminais de NH2. Além disso, a distância entre os motivos A e B’ era substancialmente mais curta do que aquela dos três TRTs previamente caracterizados. O clone 712562 foi obtido do
1. M.A.G.E. Consortium; Lennon et al., 1996, Genomics 33: 151.
Um clone de cDNA, pGRN121, codificando um hTRT funcional (ver Figura 16, SEQUÊNCIA ID NO: 1) foi isolado de uma coleção de cDNA derivado da linhagem celular 293 de seres humanos, como descrito no Exemplo 1. A comparação do clone 712562 com pGRN121 mostrou que o clone 712562 tem uma deleção de 182 pares de base (ver Figura 24, SEQUÊNCIA ID NO: 9) entre os motivos A e B’. Os 182 pares de base adicionais presentes em pGRN121 colocam todos os motivos de TRT em uma estrutura única de leitura aberta, e aumenta o espaçamento entre as regiões do motivo A e do motivo B’ até uma distância consistente com os outros TRTs conhecidos. Como se descreve abaixo nos Exemplos (por exemplo, Exemplo 7), a SEQUÊNCIA ID NO: 1 codifica uma proteína de telomerase cataliticamente ativa, tendo a sequência da SEQUENCIA ID NO:
2. O polipeptídeo de SEQUÊNCIA ID NO: 2 tem 1132 resíduos e um peso molecular calculado de cerca de 127 quilodaltons (kD).
Como apresentado abaixo, e descrito no Exemplo 9, abaixo, os cDNAs de TRT possuindo a característica de deleção de 182 pares de base do clone 712562, são detectados seguindo-se à transcrição reversa de RNA das células positivas de telomerase (por exemplo, 293 células de testículos). Os RNAs de hTRT em que falta esta sequência de 182 pares de base, são referidos geralmente como “variantes Δ182” e podem representar uma, duas ou várias espécies. Não obstante as variantes de hTRT careçam da sequência de 182 pares de base encontradas no cDNA de pGRN121 sejam improváveis de codificar uma enzima catalítica de telomerase completamente ativa, elas podem desempenhar um papel na regulação da telomerase* como digçqtido abaixo, e/ou têm atividade de telomerase parcial, iaÚcòmâ. atividade :de ligação a telômero ou ligação a hTR, como se discute abaixo.
Assim, em um aspecto, a presente invenção provê um polinucleotídeo isolado com uma sequência de um gene ou mRNA de TRT humano de ocorrência natural, incluindo, mas não se limitando a isto, um polinucleotídeo tendo a sequência como apresentada na Figura 16 (SEQUÊNCIA ID NO: 1). Em um aspecto relacionado, a invenção provê um polinucleotídeo codificando uma proteína, fragmento, variante ou derivado de hTRT. Em outro aspecto relacionado, a invenção provê ácidos nucleico de sentido e de anti-sentido, que se ligam a um gene de hTRT ou mRNA. A invenção ainda provê proteínas de hTRT, se sintetizadas ou purificadas de fontes naturais, bem como anticorpos e outros agentes que especificamente ligam uma proteína de hTRT ou um seu fragmento. A presente invenção também provê muitos novos processos, incluindo processos que empregam as composições acima mencionadas, por exemplo provendo ensaios de diagnóstico e de prognóstico quanto a doenças humanas, processos para desenvolver terapêuticas e processos de terapia, identificação de proteínas associadas com telomerase, e processos para analisar agentes capazes de ativar ou inibir a atividade da telomerase. Numerosos outros aspectos e modalidades da invenção são fornecidos abaixo.
Um aspecto da invenção é o uso de um polinucleotídeo que seja pelo menos dez nucleotídeos a cerca de 10 kb ou mais de comprimento, e compreenda uma sequência contígua de pelo menos dez nucleotídeos, que seja idêntica ou exatamente complementar a uma sequência contígua em um gene de hTRT de ocorrência natural, ou mRNA de hTRT em ensaio ou triagem quanto a uma sequência de gene de hTRT ou mRNA de hTRT, ou no preparo de uma célula hospedeira recombinante.
Um outro aspecto da invenção é o uso de um agente de aumento da expressão de hTRT na fabricação de um medicamento.para o ·· ! .·»·**·· · · · » · · *··*·· · · ·**!·· tratamento de uma condição dirigida pela capacidâdè prôBferâtiva:«rb§cehte de uma célula de vertebrados, opcionalmente um medicamento para inibir os efeitos do envelhecimento.
Ainda um outro aspecto da invenção é o uso de um inibidor de atividade da telomerase na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma condição associada com um elevado nível de atividade de telomerase dentro de uma célula humana.
As proteínas, variantes e fragmentos da invenção, e os polinucleotídeos ou fragmentos de codificação, também são, cada um, fornecidos em um outro aspecto desta invenção para uso como um farmaco.
A invenção ainda inclui o uso de uma proteína, variante ou fragmento, ou de um polinucleotídeo ou fragmento, em cada caso como aqui definido, na fabricação de um medicamento, por exemplo na fabricação de um medicamento para inibir um efeito do envelhecimento ou do câncer.
Outro aspecto da invenção é um polinucleotídeo selecionado de:
(a) DNA tendo uma sequência conforme apresentado na Figura 16;
(b) polinucleotídeo de pelo menos 10 nucleotídeos, que hidridizam a uma sequência de codificação para uma tal variante; e (c) sequências de DNA que são degeneradas como um resultado do código genético para as sequências de DNA definidas em (a) e (b) e que codificam um polipeptídeo ou variante de hTRT.
Em certas modalidades da presente invenção, os polinucleotídeos de hTRT são diferentes aos polinucleotídeos de 389 nucleotídeos da SEQUENCIA ID NO: 8 e/ou outros clones que não o 712562, o plasmídeo contendo um inserto, a sequência da qual o inserto é mostrado na Figura 18 (SEQUÊNCIA ID NO: 3).
A descrição abaixo é organizada por tópico. .A Parte Il.ajnda descreve motivos de aminoácidos característicos lie prolfeinas.dé. T-RT; bèm como genes de TRT codificando proteínas tendo tais motivos. As Partes III a VI descrevem, inter alia, ácidos nucleico, proteínas, anticorpos e composições purificadas da invenção, com focalização particular nas composições relacionadas a TRT humano. A Parte VII descreve, inter alia, processos e composições da invenção úteis para o tratamento de doenças humanas. A Parte VIII descreve a produção e a identificação de linhagens de células humanas imortalizadas. A Parte IX descreve, inter alia, os usos dos ácidos nucleicos, polinucleotídeos e outras composições da invenção, para o diagnóstico de doenças humanas. A Parte X descreve, inter alia, processos e composições da invenção, úteis para triar e identificar agentes e tratamentos que modulam (por exemplo, inibem ou promovem) a atividade ou expressão da telomerase. A Parte XI descreve, inter alia, animais transgênicos, por exemplo, animais e células de knockout de telomerase). A Parte XII é um glossário de termos usados nas Partes I a XI. A Parte XIII descreve exemplos relacionados a modalidades específicas da invenção. A organização da descrição da invenção por tópicos e subtópicos é para prover clareza, e não para limitá-la de qualquer forma.
II. GENES E PROTEÍNAS DE TRT
A presente invenção provê genes e proteínas isoladas e/ou recombinantes tendo a sequência de uma proteína de subunidade catalítica de telomerase (isto é, transcriptase reversa de telomerase), incluindo, mas não se limitando a isso, as formas de ocorrência natural de tais genes e proteínas, em forma isolada ou recombinante. Tipicamente, as TRTs são proteínas grandes e básicas tendo motivos de aminoácidos de transcriptase reversa (RT) e específicos detelomerase (T), como aqui descrito. Tendo em vista que estes motivos são conservados através dos diversos organismos, os genes de TRT de numerosos organismos podem ser obtidos usando-se os processos da invenção ou identificados usando-se iniciadores, sondas de ácido nucleico e T ’ ········ · · ··· 2 • · * · · φ*·ζ *}*♦·· ·· anticorpos da invenção, tais como aqueles específ[to^ p4tá uiâa:üulmais”(ias sequências do motivo.
Os sete motivos de RT encontrados nas TRTs, embora similares àqueles encontrados em outras transcriptases reversas, têm marcas de contraste particulares. Por exemplo, como mostrado na Figura 4, dentro dos motivos de RT dos TRT existem várias substituições de aminoácidos (marcadas com flechas) nos resíduos altamente conservados entre os outros RTs. Por exemplo, no motivo C, os dois resíduos de ácido aspártico (DD) que coordenam os íons de metais de sítio ativo (ver Kohlstaedt et al., 1992, Science 256: 1783; Jacobo-Molina et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 90: 6320; Patel et al., 1995, Biochemistry 34: 5351) ocorrem no contexto hxDD(F/Y) nos RTs da telomerase, em comparação com (F/Y)xDDh nos outros Rts (onde “h” é um aminoácido hidrofóbico e “x” é qualquer aminoácido; ver Xiong et al., 1990, EMBO J. 9: 3353; Eickbush, em The Evolutionary Biology of Viruses (S. Morse, Ed., Raven Press, NY, p. 121, 1994)). Outra característica de mudança sistemática do subgrupo de telomerase ocorre no motivo E, onde WxGxSx é uma sequência de consenso ou é conservado entre as proteínas de telomerase, enquanto hLGxxh é característico de outros Rts (Xiong et al., acima; Eickbush acima). Este motivo E é chamado de “controle do iniciador” e mutações nesta região foram relatadas como afetando o início do RNA mas não o início do DNA (Powell et al., 1997, J. Biol. Chem. 272: 13262). Tendo em vista que a telomerase requer um iniciador de DNA (por exemplo, a extremidade 31 do cromossoma), não se espera que a telomerase deve diferir dos outros Rts na região de controle do iniciador. Além disso, a distância entre os motivos A e B’ é maior nos TRTs do que é típico para outros Rts, o que pode representar uma inserção dentro da região dos “dedos” da estrutura, que se assemelha a uma mão direita (Figura 3; ver Kohlstaedt et al., acima; Jacobo-Molina et al., acima; e Patel et al., acima).
’ 5 ' ······♦··· t*· Σ • ζ * · · ,· ·· · J · 5 ·· ·φ·
Além do mais, como observado MâtívohT^ ühia marca de contraste adicional de proteínas de TRT. Este motivo T, como mostrado, por exemplo, na Figura 4 (W-L-X-Y-X-X-h-h-X-p-F-F-T-E-X-pX-X-X-p-X-X-X-Y-X-R-K-X-X-W- [X é qualquer aminoácido, h é hidrofóbico, p é polar]), compreende uma sequência que pode ser descrita usando-se a fórmula:
Trp-R1-X7-R1-R1-R2-X-Phe-Phe-Tyr-X-Thr-Glu
-X8.9-R3-R3-Arg-R4-X2-Trp onde X é qualquer aminoácido e o subscrito se refere ao número de resíduos consecutivos, Ri é leucina ou isoleucina, R2 é glutamina ou arginina, R3 é fenilalanina ou tirosina, e R4 é lisina ou histidina.
O motivo T também pode ser descrito usando-se a fórmula:
Trp-R1-X4-h-h-X-h-h-R2-p-Phe-Phe-Tyr-X-Thr-GluX-p-X3-p-X2.3-R3-R3-Arg-R4-X2-Trp onde X é qualquer aminoácido e um subscrito se refere ao número de resíduos consecutivos, Ri é leucina ou isoleucina, R2 é glutamina ou arginina, R3 é fenilalanina ou tirosina, R4 é lisina ou histidina, h é aminoácido hidrofóbico selecionado de Ala, Leu, Ile, Vai, Pro, Phe, Trp e Met, e p é um aminoácido polar selecionado de Gly, Ser, Thr, Tyr, Cys, Asn e Gin.
Em uma modalidade, a presente invenção provê proteínas de TRT isoladas de ocorrência natural e recombinantes, compreendendo um ou mais dos motivos ilustrados na Figura 11, por exemplo,
Motivo T W-X12-FFY-X-TE-X10.n-R-X3-W-X7-I
Motivo T’ E-X2-V-X
Motivo 1 X3-R-X-I-X
Motivo A X4-F-X3-D-X4-YD-X2
Motivo B’ Y-X4-G-X2-QG-X3-S-X8
3Ύ
motivo de TRT, a ordem (NH2 - > COOH) é como mostrado na Figura 11. Em uma modalidade, a presente invenção provê proteínas de
TRT isoladas de ocorrência natural, compreendendo o seguinte supermotivo:
(NH2)-X300.600-W-X12-FFY-X-TE-X10.11-R-X3-W-X7-I-X5.20-E-
Será evidente a uma pessoa experiente, provida com os reagentes, incluindo as sequências de TRT aqui apresentadas para aqueles reagentes e os processos e orientação aqui propiciados (incluindo as metodologias específicas descritas abaixo, os genes de TRT e as proteínas podem ser obtidas, isoladas e produzidas na forma recombinante por uma pessoa de experiência normal. Por exemplo, os iniciadores (por exemplo os iniciadores de ampliação degenerados) são proporcionados, os quais hibridizam as sequências de genes codificando os motivos de RT e de T característicos de TRT. Por exemplo, um ou mais iniciadores ou iniciadores degenerados, que hibridizam a sequências codificando a região FFYXTE do motivo T, outros motivos de TRT (como discutido abaixo), ou combinações de motivos ou sequências de consenso, podem ser preparados com base na utilização do códon do organismo alvo, e usados para amplificar a sequência do gene de TRT do DNA ou cDNA genômicos preparados do organismo alvo. O uso de iniciadores degenerados é bem conhecido na técnica e vinculam o uso de conjuntos de iniciadores que hibridizem ao conjunto de sequências de ácido nucleico que podem potencialmente codificar os aminoácidos do motivo alvo, levando-se em conta as preferências do códon e a utilização do organismo alvo, e mediante condições de ampliação (por exemplo, PCR) apropriadas para permitir as más combinações de base nas etapas de fortalecimento do PCR. Tipicamente, dois conjuntos de iniciadores conjunto de iniciador degenerado umco) são usados; no entanto, os sistemas de iniciadores únicos (ou, neste caso., um • · ♦ * i · · ·· · « são usados para se obter genes de TRT.
ben}‘ cdnüéoidos. é.pádem*ier
A Tabela 1 provê iniciadores ilustrativos da invenção, que podem ser usados para ampliar novos ácidos nucleicos de TRT, particularmente aqueles de vertebrados (por exemplo, seres humanos e outros mamíferos). “N” é uma mistura equimolar de todos os quatro nucleotídeos, e os nucleotídeos dentro de parênteses são misturas equimolares dos nucleotídeos especificados.
TABELA 1
Iniciadores degenerados ilustrativos para ampliação de ácidoso nucleicos de
TRT
Motivo Direção 5 '-seauência-3'
a FFYVTE Dianteiro TT(CT)TT(CT)TA(CT)GTNACNGA
b FFYVTE Reverso TCNGTNAC(GA)TA(GA)AA(GA)AA
c RFIPKP Dianteiro (CA)GNTT(CT)AT(ACT)CCNAA(AG)CC
d RFIPKP Reverso GG(TC)TTNGG(TGA)AT(GA)AANC
e AYDTI Dianteiro GCNTA(CT)GA(CT)ACNAT
f AYDTI Reverso TANGT(GA)TC(GA)TANGC
g GIPOG Dianteiro GGNAT(ACT)CCNCA(AG)GG
h GIPOGS Reverso (GC)(AT)NCC(TC)TGNGG(TGA)ATNCC
I LVDDFL Dianteiro (CT)TNGTNGA(CT)GA(CT)TT(CT)(CT)T
j DDFLLVT Reverso GTNACNA(GA)NA(GA)(GA)AA(GA)TC(GA)TC
Combinações de iniciadores preferidas (y - sim; n = não.
Reverso
Dianteiro b d f h i
a- n s s y y
c- n n s y y
e- n n n y y
g- n n η n y
i- n n η n n
15 Em uma modalidade, um ácido nucleico de TRT ampliado é
usado como uma sonda de hibridização para hibridização da colônia a uma coleção (por exemplo, coleção de cDNA) produzida do organismo alvo, de
tal modo que um ácido nucleico tendo a sequência inteira de codificação da ·* · · ·*♦ t * a * a ·· í *i ·**· *·*··* proteína de TRT, ou uma porção substancial desta,’é iqeQjlScalptá isolado jou clonado. Reagentes e processos, tais como aqueles recém descritos, foram usados de acordo com os processos aqui descritos para se obter as sequência de genes de TRT de Oxytricha trifallax e Tetrahymena thermophila, como descrito em detalhes abaixo. Será reconhecido que, seguindo a clonagem de um gene de TRT não previamente caracterizado, a sequência pode ser determinada por processos de rotina e o polipeptídeo codificado sintetizado e ensaiado quanto a uma atividade de TRT, tal como a atividade catalítica de telomerase (como descrito aqui e/ou por ensaios de telomerase conhecidos na técnica).
Será também evidente àqueles versados, que os genes de TRT podem ser clonados usando-se qualquer um de uma variedade de processos de clonagem da invenção, porque as sequências de motivos de TRT e os ácidos nucleicos da invenção, compreendendo tais sequências, podem ser usados em uma ampla variedade de tais processos. Por exemplo, a hibridização usando-se uma sonda com base na sequência de um TRT conhecido, a DNA, ou outras coleções de ácido nucleico do organismo alvo, como descrito no Exemplo 1, podem ser usadas. Observar-se-á que o PCR “20 degenerado ou seus produtos de ampliação, tais como aqueles descritos acima, podem eles próprios ser rotulados e usados como sondas de hibridização. Em outra modalidade, processos de clonagem de expressão são usados. Por exemplo, um ou mais anticorpos que especificamente liguem peptídeos que alcancem um motivo de TRT ou outro epítopo de TRT, tal como o motivo FFYXTE, podem ser empregados para isolar um complexo ribossômico compreendendo uma proteína de TRT e o mRNA que o codifica. Para gerar tais anticorpos da invenção, os imunogenes de peptídeos estão tipicamente entre 6 e 30 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente cerca de 10 a 20 aminoácidos de comprimento. Os anticorpos podem também ser usados para sondar uma coleção de expressão de cDNA derivada do ·' · t; ·ί Λ Λ Γ : · organismo de interesse, para identificar um clone éridSTiçân^o.Á^ £çqtfêHêia de TRT. Em outra modalidade, as buscas por computados de bases de dados de DNA para sequência contendo DNAs conservadas com TRTs conhecidos, também podem ser usadas para identificar um clone compreendendo a sequência de TRT.
Em um aspecto, a presente invenção provê composições compreendendo um polipeptídeo isolado ou recombinante tendo a sequência de aminoácidos de uma proteína de TRT de ocorrência natural. Usualmente, a TRT de ocorrência natural tem um peso molecular entre cerca de 80000 daltons (D) e cerca de 150000 D, mais frequentemente entre cerca de 95000 D e cerca de 130000 D. Tipicamente, a TRT de ocorrência natural tem uma carga líquida positiva em pH 7 (pl calculado tipicamente maior do que 9). Em uma modalidade, o polipeptídeo apresenta uma atividade de telomerase como aqui definida. Em uma modalidade relacionada, o polipeptídeo tem uma sequência da região específica de TRT (motivo T) e apresenta uma atividade de telomerase. A invenção ainda provê fragmentos de tais polipeptídeos. A presente invenção também provê polipeptídeos isolados ou recombinantes tendo a sequência de uma gene de ocorrência natural codificando uma proteína de TRT. A invenção provê reagentes úteis para isolar a sequência de uma TRT de não vertebrados (tais como uma levedura) e vertebrados, tais como mamíferos (por exemplo murino ou humano). O polinucleotídeo isolado pode ser associado com outras sequências de ácido nucleico de vetor de ocorrência natural ou recombinante ou sintético. Tipicamente, o ácido nucleico isolado é menor do que cerca de 300 kb, frequentemente menor do que 50 kb, mais frequentemente menor do que cerca de 20 kb, frequentemente menor do que cerca de 10 kb e, algumas vezes, menor do que cerca de 5 kb ou 2 kb, de comprimento. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo de TRT isolado é até menor, tal como um fragmento, iniciador ou sonda de gene de menos do que cerca de 1 kb ou *· ! · ç '*· ·· ·** ·*· j, J ( menos do que 0,1 kb. [ ’ | .*· f ú.·?
III. ÁCIDOS NUCLÉICOS
A) GENERALIDADES
A presente invenção provê ácidos nucléicos isolados e recombinantes tendo uma sequência de um polinucleotídeo codificando uma proteína da subunidade catalítica de telomerase (TRT), tal como um gene de TRT recombinante de Euplotes, Tetrahymena, S. pombe ou humanos. Polinucleotídeos exemplares são providos na Figura 13 (Euplotes)', a Figura 15 (S. pombe) e Figura 16 (humano, N2 de Acesso AFO15950 do GenBank). A presente invenção provê polinucleotídeos de sentido e anti-sentido tendo uma sequência de gene de TRT, incluindo sondas, iniciadores, polinucleotídeos codificando a proteína de TRT, e outros.
B) TRT HUMANO
A presente invenção provê ácidos nucléicos tendo uma sequência de uma subunidade catalítica de telomerase de seres humanos (isto é, hTRT).
Em um aspecto, a invenção provê um polinucleotídeo tendo uma sequência ou subsequência de um gene de TRT humano ou RNA. Em uma modalidade, o polinucleotídeo da invenção tem uma sequência da SEQUÊNCIA ID NO: 1 mostrada na Figura 16 ou uma sua subsequência. Em outra modalidade, o polinucleotídeo tem uma sequência das SEQUÊNCIA ID NO: 3 (Figura 18), SEQUÊNCIA ID NO: 4 (Figura 20), ou subsequências destas. A invenção também provê polinucleotídeos com identidade substancial de sequências às sequências de ácido nucleico de hTRT aqui apresentadas, por exemplo incluindo, mas a estas não se limitando, as SEQUÊNCIAS ID NOS: 1 (Figura 16), 4 (Figura 20), 6 (Figura 21), e 7. Assim, a invenção provê alelos de ocorrência natural de genes humanos de TRT e sequências variantes de polinucleotídeos tendo uma ou mais deleções,
inserções ou substituições de nucleotídeos, relativas a uma sequência de •· · · ··· · · · ···· ácido nucleico de hTRT aqui apresentadas. Coiffo hà^toJgVáiKà,\áci$los nucleicos variantes podem ser produzidos usando-se os processos recombinantes ou sintéticos descritos abaixo ou por outros meios.
A invenção também provê polinucleotídeos isolados e recombinantes tendo uma sequência de uma região de flanco de gene de TRT humano. Tais polinucleotídeos incluem aqueles derivados de sequências genômicas de regiões não transladadas do mRNA de hTRT. Um exemplo de sequência genômica é mostrado na Figura 21 (SEQUÊNCIA ID NO: 6). Como descrito no Exemplo 4, a SEQUÊNCIA ID NO: 6 foi obtida por sequenciação de um clone, λΰΦ5, isolado de uma coleção genômica humana. Lambda ΘΦ5 contém um inserto de pares de 15 quilobases (kbp), incluindo aproximadamente 13000 bases 5’ às sequências codificando hTRT. Este clone contém as sequências do promotor de hTRT e outras sequências regulatórias do gene hTRT (por exemplo, intensificadores).
A invenção também provê polinucleotídeos isolados e recombinantes tendo uma sequência de uma região intrônica de um gene de TRT humano. Uma sequência intrônica de exemplo é mostrada na Figura 21 (SEQUÊNCIA ID NO: 7; ver Exemplo 3). Em algumas modalidades, os introns de hTRT são incluídos em “minigenes” para a expressão melhorada de proteínas de hTRT em células eucarióticas.
Em um aspecto relacionado, a presente invenção provê polinucleotídeos que codificam as proteínas de hTRT ou fragmentos de proteínas, incluindo polipeptídeos alterados e variantes de hTRT. Em uma modalidade, a proteína ou fragmento codificados de hTRT têm uma sequência de aminoácidos como apresentado na Figura 17 (SEQUENCIA ID NO: 2), ou com substituições conservativas da SEQUÊNCIA ID NO: 2. Em uma modalidade, a proteína ou fragmento de hTRT codificado tem substituições que modificam uma atividade da proteína (por exemplo, atividade catalítica da telomerase).
·· · · ··· · · · ··· · • · · · · · ·· · · · · · ·
Será observado que, como um resn!tâdçr:dâ degeneráçãôjdo código genético, o ácido nucleico codificando a proteína de hTRT não necessita ter a sequência de um gene de hTRT de ocorrência natural, mas que uma multiplicidade de polinucleotídeos pode codificar um polipeptídeo de hTRT tendo uma sequência de aminoácidos da SEQUÊNCIA ID NO: 2. A presente invenção provê cada e toda a variação possível da sequência de nucleotídeo, que possa ser produzida mediante seleção de combinações com base em escolhas possíveis de códon feitas de acordo com códigos genéticos tripletos conhecidos, e todas de tais variações são aqui especificamente apresentadas. Assim, embora em alguns casos as sequências de nucleotídeos codificando polipeptídeo de hTRT, que sejam capazes de hibridizar à sequência de nucleotídeos da sequência de ocorrência natural (sob condições de estringência apropriadamente selecionadas) sejam preferidas, pode ser vantajoso, em outros casos, produzir sequências de nucleotídeos codificando hTRT que empreguem uma utilização de códon substancialmente diferente e assim talvez não hibridizem a ácidos nucleicos com a sequência de ocorrência natural.
Em modalidades particulares, a invenção provê oligo- e polinucleotídeos de hTRT que compreendem uma subsequência de um ácido nucleico de hTRT aqui apresentada (jpor exemplo, SEQUÊNCIAS ID NOS: 1 e 6). Os ácidos nucleicos da invenção tipicamente compreendem pelo menos cerca de 10, mais frequentemente pelo menos cerca de 12 ou cerca de 15 bases consecutivas do polinucleotídeo exemplificado de hTRT. Frequentemente, o ácido nucleico da invenção compreenderá uma sequência mais longa, tal como pelo menos cerca de 25, cerca de 50, cerca de 100, cerca de 200 ou pelo menos cerca de 500 a 3000 bases de comprimento, por exemplo quando a expressão de um polipeptídeo, ou proteína de hTRT de comprimento completo, seja pretendida.
• ·· ·
Em ainda outras modalidades, a presente invenção provê polinucleotídeos “Δ182 hTRT” ··· · tendo uma:·’sequência: .rdêritica:*:ou • * A·· · ··· ··· ··· · · complementar aos polinucleotídeos de hTRT de ocorrência natural ou de ocorrência não natural, tal como as SEQUÊNCIA ID NO: 3 ou SEQUÊNCIA ID NO: 4, que não contêm a sequência de 182 nucleotídeos (SEQUÊNCIA
ID NO: 9 [Figura 24]) encontrada em pGRN121 (e também ausente no clone
712562). Estes polinucleotídeos são de interessem, em parte, porque eles codificam polipeptídeos que contêm diferentes combinações ou arranjos de motivos de TRT.d.QS £iicDntFadoK'n<^polipeptídeo de hTRT de “comprimento completo” (SEQUÊNCIA ID NO: 2L-tal como é codificado por pGRN121. Como discutido abaixo, considera-se que estes polipeptídeos possam desempenhar um papel biológico por natureza (por exemplo, em regular a expressão da telomerase em células) e/ou encontrar utilização como terapêuticos (por exemplo, como produtos dominantes negativos que inibem a função de proteínas do tipo selvagem) ou têm outros papéis e usos, por exemplo como aqui descrito.
Por exemplo, ao contrário do polipeptídeo codificado por pGRN121, o clone 712562 codifica uma proteína de 259 resíduos com um peso molecular calculado de aproximadamente 30 kD (doravante “712562 hTRT”). O polipeptídeo 712562 hTRT [SEQUÊNCIA ID NO: 10 (Figura 19)] contém os motivos T, 1, 2 e A, mas não os motivos B’, C, D e E (Ver Figura 4). De forma semelhante, um polipeptídeo de hTRT variante com atividades terapêuticas e outras, pode ser expresso de um ácido nucleico semelhante ao cDNA pGRN121, mas carente dos 182 pares de base que faltam no clone 712562, por exemplo tendo a sequência mostrada na Figura 20 (SEQUÊNCIA id no: 4). Este ácido nucleico (daqui em diante “pro90 hTRT”), que pode ser sintetizado usando-se processos sintéticos ou recombinantes de rotina, como aqui descrito, codifica uma proteína de 807 resíduos (peso molecular calculado de aproximadamente 90 kD), que compartilha a mesma sequência terminal de amino como a proteína de hTRT ·· · · ··· · · · ··· · codificada pela SEQUÊNCIA ID NO: 1, mas Jfv^rgçs na jegião* fêrminal carbóxi (os primeiros 763 resíduos são comuns, os últimos 44 resíduos de pro90 hTRT são diferentes da hTRT de “comprimento completo”. O polipeptídeo pro90 hTRT contém os motivos T, 1, 2 e A, mas não os motivos B, C, D, C e, assim, pode ter algumas, mas não provavelmente todas, as atividades de telomerase.
C) PRODUÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS DE TRT HUMANO
Os polinucleotídeos da invenção têm numerosos usos, incluindo, mas não se limitando, a expressão de polipeptídeos codificando hTRT ou seus fragmentos, uso como sondas ou iniciadores de sentido ou anti-sentido para hibridização e/ou ampliação de genes de hTRT de ocorrência natural, ou RNAs (por exemplo para aplicações de diagnóstico ou de prognóstico), e como agentes terapêuticos (por exemplo, em composições anti-sentido, triplex ou ribozimas). Como será evidente após uma revisão da descoberta, estes usos terão enorme impacto no diagnóstico e tratamento de doenças humanas relacionadas ao envelhecimento, câncer e fertilidade, assim como no cultivo, reprodução e fabricação de produtos com base celular. Como descrito nas seções a seguir, os ácidos nucleicos de hTRT da invenção podem ser produzidos (por exemplo, clonados, sintetizados ou ampliados ) usando-se técnicas bem conhecidas na ciência.
1) PRODUÇÃO POR CLONAGEM, AMPLIAÇÃO E RECOMBINANTE
Em uma modalidade, os genes de hTRT ou cDNAs são clonados usando-se uma sonda de ácido nucleico, que especificamente hibridiza a um mRNA, cDNA ou DNA genômico de hTRT. Uma sonda adequada para esta finalidade é um polinucleotídeo tendo toda ou parte da sequência fornecida na Figura 16 (SEQUÊNCIA ID NO: 1), tal como um sonda compreendendo uma sua subsequência. Tipicamente, o DNA genômico ou cDNA de hTRT alvo é ligado em um vetor (por exemplo, um
cromossoma artificial plasmídeo, fago, vírus, levedura, ou outros) e pode ser ·· · · ··· · · · ··· · • · · ·· ··· «···· · isolado de uma coleção genômica ou de cDNA (por exemptfo^ümâ côlççãd de cDNA placentário humano). Uma vez um ácido nucleico de hTRT seja identificado, ele pode ser isolado de acordo com processos padrão conhecidos daqueles versados na técnica. Um exemplo ilustrativo de triagem de uma coleção de cDNA humano quanto ao gene de hTRT é fornecido no Exemplo 1; de forma semelhante, um exemplo de triagem de uma coleção genômica humana é encontrado nos Exemplos 3 e 4. Processos de clonagem são bem conhecidos e são descritos, por exemplo, em Sambrook et al., (1989) MOLECULAR CLONING: UM MANUAL DE LABORATÓRIO, 2â Edição, Volumes 1 a 3, Cold Spring Harbor Laboratory, doravante “Sambrook”); Berger e Kimmel (1987) METHODS IN ENZYMOLOGY, Volume 152: GUIDE TO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES, San Diego: Academic Press, Inc.; Ausubel et al., CURRENTE PROTOCOLS IN
MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing and Wiley-Intescience, Nova Iorque (1997); Cashion et al., Patente U.S. 5.017.478; e Carr, Patente Européia 0.246.864.
A invenção também provê ácidos nucleicos genômicos ou de cDNA de hTRT isolados por processos de ampliação, tais como a reação em cadeia polimerase (PCR). Em uma modalidade, a sequência de codificação proteínica de hTRT é ampliada de uma amostra de RNA ou de cDNA [por exemplo cDNA placentário de filamento duplo (Clontech, Paio Alto CA)] usando os iniciadores 5’-GTGAAGGCACTGTTCAGCG-3’ (“TCP1.1”) e 5’CGCGTGGGTGAGGTGAGGTG-3 (“TCP 1.15”). Em algumas modalidades, um terceiro iniciador ou segundo par de iniciadores, podem ser usados, por exemplo por “PCR reunido”, para aumentar a especificidade. Um exemplo de um segundo par CTGTGCTGGGCCTGGACGATA-3 ’
AGCTTGTTCTCCATGTCGCCGTAG-3 ’ (“billTCP6”) (“TCP1.14”). Será evidente de iniciadores
5’5’42 àqueles de experiência, que numerosos outros iniciadores e combinações de ·: ·’♦ ·*· : iniciadores, úteis para ampliação de ácidos jnuGleipcjs de.;jLn<J:,:’são propiciados pela presente invenção.
Além disso, a invenção provê iniciadores que ampliam qualquer região específica (por exemplo, regiões de codificação, regiões promotoras e/ou introns) ou subsequência de DNA, cDNA ou RNA genômicos de hTRT. Por exemplo, o intron de hTRT na posição 274/275 da SEQUÊNCIA ID NO: 1 (ver Exemplo 3) pode ser ampliado (por exemplo por detecção de clones genômicos), usando-se os iniciadores TCP 1.49 e TCP1.50 (par de iniciadores 1) ou os iniciadores TCP1.49 e TCP1.50 (par de iniciadores 2) (O nome do iniciador se refere aos iniciadores listados na Tabela 2 abaixo). Os pares de iniciadores podem ser usados individualmente ou em um PCR reunido, onde o conjunto conjunto 1 de iniciadores é usado primeiramente. Outro exemplo ilustrativo diz respeito a iniciadores que especificamente ampliam e, assim, detectam a extremidade 5’ do mRNA de hTRT ou o exon codificando a extremidade 5’ do gene de hTRT (por exemplo, para avaliar o tamanho ou inteireza de um clone de cDNA). Os seguintes pares de iniciadores são úteis para ampliar a extremidade 5’ de hTRT: os iniciadores K320 e K321 (par de iniciadores 3); os iniciadores K320 e TCP 1,61 (par de iniciadores 4); iniciadores K320 e K322 (par de iniciadores 5). Os conjuntos de iniciadores podem ser usados em um PCR reunido no conjunto de ordem 5, depois o conjunto 4 ou conjunto 3, ou conjunto 4 ou o conjunto 5, depois o conjunto 3. Ainda outro exemplo ilustrativo envolve iniciadores escolhidos para ampliar ou detectar especificamente a região do motivo TRT de hTRT conservado compreendendo aproximadamente o terço médio do nRNA (por exemplo, para uso como uma sonda de hibridização para identificar os clones de TRT, por exemplo organismos não humanos). Os seguintes pares de iniciadores são úteis para ampliar a região do motivo de TRT de ácidos nucleicos de hTRT:
os iniciadores K304 e TCP1.8 (par de iniciadores 6), ou iniciadores LT1 e usados em uma experiência de PCR reunido no conjunto de origem 6, depois conjunto 7.
Condições adequadas de ampliação de PCR são conhecidas daqueles de experiência e incluem (mas não se limitam a estes) 1 unidade de polimerase Taq (Perkin Elmer,Norwalk CT), 100 μΜ cada dNTP (dATP, dCTP,dGTP, dTTP), 1 x tampão de PCR (KC1 50 mM, Tris 10 mM, pH 8,3 em temperatura ambiente, MgCl2 1,5 mM, gelatina 0,01%) e iniciadores 0,5 μΜ, com o desenvolvimento da ampliação por cerca de 30 ciclos a 94° por 45 segundos, 55° durante 45 segundos e 72° por 90 segundos. Será reconhecido por aqueles de experiência na técnica, que outras DNA polimerases termoestáveis, condições de reação, e parâmetros de ciclagem proverão também ampliação adequada. Outros processos de ampliação in vitro adequados, que podem ser usados para obter ácidos nucleicos de hTRT, incluem, mas não se limitam a estes, aqueles aqui apresentados abaixo. Uma vez ampliados, os ácidos nucleicos de hTRT podem ser clonados, se desejável, em qualquer um de uma variedade de vetores, usando-se processos biológicos moleculares de rotina, ou detectados ou de outra forma utilizados de acordo com os processos da invenção.
Uma pessoa de experiência observará que os ácidos nucleicos de hTRT ampliados obtidos como descrito acima, podem ser preparados ou propagados usando-se outros processos, tais como a síntese química ou replicação, mediante transformação nos sistemas bacterianos, tais como E. coli (ver, por exemplo, Ausubel et al, acima), ou sistemas de expressão eucarióticos, tais como de mamíferos. De forma semelhante, o RNA de hTRT pode ser expresso de acordo com os presentes processos in vitro, ou em sistemas bacterianos, tais como E. coli, usando, por exemplo, vetores comercialmente disponíveis contendo promotores reconhecidos por um RNA polimerase, tal como T7, T3 ou SP6, ou transcrição de DNA gerada por ampliação de PCR usando iniciadores contendo’ üm-:i5roiiiojtôr”-:d:f: RNA polimerase.
A presente invenção ainda provê ácidos nucléicos de hTRT modificados. Será reconhecido por uma pessoa de experiência, que os ácidos nucleico de hTRT ampliados obtidos podem ser modificados (por exemplo truncados, derivados, alterados) por processos bem conhecidos na técnica (por exemplo, mutagênese dirigida ao sítio, mutagênese de varredura de ligador) ou simplesmente sintetizados de novo como descrito acima. Os ácidos nucléicos de hTRT modificados são úteis para uma variedade de aplicações, incluindo, mas não se limitado a isso, a facilidade de clonagem ou manipulação de um gene ou produto de gene de hTRT, ou expressando um produto de gene de hTRT variante. Por exemplo, em uma modalidade, a sequência de genes de hTRT é alterada de tal modo que codifique um polipeptídeo de hTRT com propriedades ou atividades alteradas, como debatido em detalhes abaixo, por exemplo, por mutação em um motivo conservado de hTRT. Em outro exemplo ilustrativo, as mutações na região de codificação proteínica de um ácido nucleico de hTRT, podem ser introduzidas para alterar os padrões de glicosilação, para mudar a preferência do códon, para produzir variantes de união, remover sítios sensíveis a protease, criar domínios antigênicos, modificar a atividade específica, e outros. Em outras modalidades, a sequência de nucleotídeos codificando o hTRT e seus derivados, é modificada sem alterar as sequências de aminoácidos codificadas, por exemplo, a produção de transcritos de RNA tendo mais propriedades desejáveis, tais como eficiência de translação aumentada ou uma maior ou menor meia vida, em comparação com os transcritos produzidos da sequência de ocorrência natural. Em ainda outras modalidades, os códons alterados são selecionados para aumentar o índice em que a expressão do peptídeo ocorre em um hospedeiro de expressão procariótica ou eucariótica de acordo com a frequência com que os códons ··» · ·'· **í .s *. b. ;·:
particulares são utilizados pelo hospedeiro. Técnicas úecojrabiiJaijfès^XV^ e in vivo úteis que podem ser empregadas para preparar os polinucleotídeos variantes de hTRT da invenção, são encontradas em Sambrook et al. e 5 Ausubel et al., ambos acima.
Como observado acima, a presente invenção provê ácidos nucléicos tendo sequências de flanco (5’ ou 3’) e intrônicas do gene de hTRT. Os ácidos nucléicos são de interesse, inter alia, porque eles contêm promotor e outros elementos regulatórios envolvidos na regulação de hTRT e 10 úteis para a expressão de hTRT e outras proteínas recombinantes ou produtos de genes de RNA. Será evidente que, além das sequências de ácidos nucléicos fornecidas nas SEQUÊNCIAS ID NOS: 6 e 7, o intron adicional de hTRT e as sequências de flanco podem ser facilmente obtidas usando-se técnicas biológicas moleculares de rotina. Por exemplo, a sequência 15 genômica adicional de hTRT pode ser obtida do clone Lambda ΘΦ5 (Acesso n- 209024 ATCC) descrito acima e no Exemplo 4. Ainda outros clones e sequências genômicas de hTRT podem ser obtidos por triagem de uma coleção genômica humana, usando uma sonda de ácido nucleico de hTRT tendo uma sequência ou subsequência da SEQUÊNCIA ID NO: 1. Clones e —20 sequências adicionais (por exemplo, ainda mais a montante) podem ser obtidas mediante o uso de sequências ou subclones rotulados derivados de λΰΦ5 para sondar coleções apropriadas. Outros processos úteis para outra caracterização de sequências de flanco de hTRT, incluem aqueles processos gerais descritos por Gobinda et al., 1993, PCR Meth. Applic. 2: 318; Triglia 25 et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 8186; Lagerstrom et al., 1991, PCR Methods Applic. 1:111; e Parker et al., 1991, Nucleic Acids Res. 19: 3055.
As sequências intrônicas podem ser identificadas por meios de rotina, tais como por comparação da sequência genômica de hTRT com as sequências cDNA de hTRT (ver, por exemplo, o Exemplo 3), por análise de ól
Sl (ver Ausubel et al., acima, no Capítulo 4), ou vários outros meios x·· · conhecidos na técnica. As sequências intrômàa$ frmlbefri«^rótemuser encontradas em pre-mRNA (isto é, precursores de mRNA não unidos ou incompletamente unidos), que podem ser ampliados ou clonados em seguida à transcrição reversa do RNA celular.
Quando desejável, a sequência de hTRT clonado, ampliado ou de outra forma sintetizado ou outro ácido nucleico de TRT, pode ser determinada ou verificada usando-se os processos de sequenciação de DNA bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Ausubel et al., acima). Processos de sequenciação utilizáveis empregam tais enzima como o fragmento de Klenow da polimerase I de DNA, Sequenase (US Biochemical Corp., Cleveland OH), polimerase DNA Taq (Perkin Elmer, Norwalk CT), polimerase T7 termostável (Amersham, Chicago IL), ou combinações de polimerases recombinantes e exonucleases de revisão de provas, tais como o Sistema de Ampliação ELONGASE comercializado por Gibco BRL (Gaithersburg MD). Quando a sequenciação ou verificação da sequência de oligonucleotídeos (tal como o oligonucleotídeo produzido de novo por síntese química), o processo de Maxam e Gilbert pode ser preparado (Maxam e Gilbert, 1980, Meth. Enz. 65: 499; Ausubel et al., acima, Capítulo 7). As sequências não transladadas 5’ de hTRT ou outros mRNAs de TRT podem ser determinados diretamente por clonagem de um hTRT de “comprimento completo” ou outro cDNA usando processos padrão, tais como a transcrição reversa de mRNA, seguida por clonagem e sequenciação do cDNA resultante. Coleções preferidas de oligo(dT)-primed para triagem ou amplificação de cDNAs de comprimento completo que tenham sido selecionados por tamanho para incluir cDNAs maiores, podem ser preferidas. Coleções iniciadas aleatoriamente também são adequadas e frequentemente incluem uma maior proporção de clones que contêm as regiões 5’ dos genes. Outros processos bem conhecidos para se obter sequências de RNA 5’, tais
como o protocolo RACE descrito por Frohman et al., 1988, Proc. Nat. Acad.
·· · · · · · · · · · ♦ · · ·· · ·· ··· ····· ·
Sei USA 85: 8998, também podem ser utilizados»’*S$ àáséjáÍéE.Q’jsítio”be partida da transcrição de um hTRT ou outro mRNA de TRT, pode ser determinado por processos de rotina usando-se os ácidos nucleicos aqui propiciados (por exemplo, tendo uma sequência de SEQUÊNCIA ID NO: 1).
Um processo é a análise de SI nuclease (Ausubel et al., acima), usando um DNA rotulado tendo uma sequência da região 5’ da SEQUÊNCIA ID NO: 1. SÍNTESE QUÍMICA DE ÁCIDOS NUCLEICOS
A presente invenção também provê polinucleotídeos de hTRT (RNA, DNA ou modificados), que são produzidos por síntese química direta.
A síntese química é geralmente preferida para a produção de oligonucleotídeos ou para oligonucleotídeos e polinucleotídeos contendo nucleotídeos não padrão (por exemplo, sondas, iniciadores e oligonucleotídeos anti-sentido). A síntese química direta de ácidos nucleicos pode ser realizada por processos conhecidos na técnica, tal como o processo de fosfotriéster de Narang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68-90; o processo de fosfodiéster de Brown et al., Meth. Enzymol. 68: 109 (1979); o processo de dietilfosforamidita de Beaucage et al., Tetra. Lett., 22: 1859 (1981); e o processo de suporte sólido da Patente U.S. 4.458.066. A síntese química —20 tipicamente produz um oligonucleotídeo de filamento único, que pode ser convertido em DNA de filamento duplo por hibridização com uma sequência complementar, ou por polimerização com uma DNA polimerase e um iniciador de oligonucleotídeo, usando o filamento único como um modelo. Uma pessoa experiente reconhecerá que, embora a síntese química de DNA 25 seja frequentemente limitada a sequências de cerca de 100 ou 150 bases, sequências mais longas podem ser obtidas pela ligação de sequências mais curtas ou por processos sintéticos mais elaborados.
Será observado que os polinucleotídeos e oligonucleotídeos de hTRT (ou hTR ou outra) da invenção podem ser produzidos usando-se bases
Ú3 não padrão (por exemplo diferentes de adenina, citidina, guanina, timina e ·· · · ··· · · · ··· · uridina) ou estruturas de espinha dorsal não padrãâ*para Jardas desejáveis (por exemplo, a resistência da nuclease aumentada, ligação mais ajustada, estabilidade ou uma TM desejada). As técnicas para tomar os oligonucleotídeos resistentes à nuclease incluem aquelas descritas na publicação PCR WO 94/12633. Uma ampla variedade de oligonucleotídeos modificados úteis podem ser produzidos, incluindo os oligonucleotídeos tendo uma estrutura de peptídeo-ácido nucleico (PNA) (Nielsen et., 1991, Science 254: 1497) ou incorporando 2’-0-metil ribonucleotídeos, nucleotídeos de fosfototioato, nucleotídeos de metil fosfonato, nucleotídeos de fosfotriéster, nucleotídeos de fosfototioato, fosforamidatos. Ainda outros oligonucleotídeos úteis podem conter porções de alquila e açúcar substituído por halogeno, compreendendo uma das seguintes, na posição 2’: OH, SH, SCH3, F, OCN, OCH3OCH3, OCH3O(CH2O(CH2)nCH3, O(CH2)nNH2 ou
O(CH2)nCH3 onde n é de 1 a cerca de 10; alquila inferior Cj a C10, alquila, alcarila ou aralquila inferior substituídas; Cl; Br; CN; CF3; OCF3; O-, S- ou N-alquila; O-, S- ou N-alquenila; SOCH3; SO2CH3; ONO2; NO2; N3; NH2; heterocicloalquila; heterocicloalcarila; aminoalquilamino; polialquilamino; silila substituída; um grupo de divagem de RNA; um grupo colesterila; um ~20 grupo de folato; um grupo repórter; um intercalador; um grupo para melhorar as propriedades farmacocinéticas de um oligonucleotídeo; ou um grupo para melhorar as propriedades farmacodinâmicas de um oligonucleotídeo e outros substituintes tendo propriedades similares. Os grupos de folato, colesterol ou outros, que facilitam a absorção do oligonucleotídeo, tais como análogos lipídicos, podem ser conjugados diretamente ou através de um ligador na posição 2’ de qualquer nucleosídeo ou na posição 3’ ou na 5’ do nucleosídeo 3’-terminal ou 5’-terminal, respectivamente. Um ou mais de tais conjugados podem ser usados. Os oligonucleotídeos também podem ter miméticos de açúcar, tais como ciclobutilas no lugar do grupo pentofuranosil. Outras
6Η modalidades podem incluir pelo menos uma forma de base modificada ou ·· · · ··· · · · ··· · “base universal”, tal como a inosina, ou a inclusacç dê óutrasybâsès: il|o padrão, tais como queosina e wybutosine, bem como acetil-, metil-, tio- e as formas similarmente modificadas de adenina, citidina, guanina, timina e 5 uridina, que não são tão facilmente reconhecidas por endonucleases endógenas. A invenção ainda provê oligonucleotídeos tendo análogos da estrutura, tais como fosfodiéster, fosforotioato, fosfotoditioato, metilfosfonato, fosforamidato, fosfotriéster de alquila, sulfamato, 3’tioacetal, metileno(metilimino), 3’-N-carbamato, morfolino carbamato, 10 quiral-metil fosfonatos, nucleotídeos com articulações inter-açúcar de alquila ou cicloalquila de cadeia curta, articulações inter-açúcar (“espinha dorsal”) heteroatômicas e heterocíclicas de cadeia curta, ou espinhas dorsais de CH2NH-O-CH2, CH2-N(CH3)-OCH2, CH2-O-N(CH3)-CH2, CH2-N(CH3)-N(CH3)CH2 e O-N(CH3)-CH2-CH2 (onde o fosfodiéster é O-P-O-CH2), ou misturas 15 deles. Também utilizáveis são os oligonucleotídeos tendo estruturas de espinha dorsal de morfolino (Patente U.S. 5.034.506).
Referências úteis incluem Oligonucleotídes and Analogues, A Practical Approach, editado por F. Eckstein, IRL Press at Oxford University Press (1991); Antisense Strategies, Annals of the New York Academy of ~20 Sciences, Volume 600, Editores Baserga e Denhardt (NYAS 1992); Milligan et al, 9 de julho de 1993, J. Med. Chem. 36 (14): 1923-1937; Antisense Research and Applications (1993, CRC Press), em sua totalidade e especificamente no Capítulo 15, por Sanghvi, intitulado Heterocyclic base modifications in nucleic acids and their applications in antisense 25 oligonucleotídes. Antisense Therapeutics, editor Sudhir Agrawal (Humana Press, Totowa, Nova Jérsei, 1996).
D) ÁCIDOS NUCLEICOS DE ROTULAÇÃO
É frequentemente útil rotular os ácidos nucleico da invenção, por exemplo, quando o hTRT ou outros oligonucleotídeos ou polinucleotídeos devam ser usados como sondas de ácido nucleico. Ps rótulos ·· · · ··· · · · ··· · • · · · · · ·· « · · · · · (ver abaixo) podem ser incorporados por qualquer ttfnjdéritcè os váriósünèibs bem conhecidos daqueles de experiência na técnica. Em uma modalidade, um ácido nucleico não ampliado (por exemplo, mRNA, mRNA poliA, cDNA) é rotulado. Os meios de produção de ácidos nucleicos rotulados são bem conhecidos daqueles versados na técnica e incluem, por exemplo, translação de corte, rotulagem de iniciador aleatório, rotulagem de extremidade (por exemplo, usando uma cinase), e conjugação química (por exemplo, fotobiotinilação) ou síntese. Em outra modalidade, o rótulo é simultaneamente incorporado durante uma etapa de ampliação na preparação dos ácidos nucleicos de amostra. Assim, por exemplo, a reação em cadeia da polimerase (PCR) ou outro processo de ampliação do ácido nucleico com iniciadores rotulados ou nucleotídeos rotulados fornecerão um produto de ampliação rotulado. Em outra modalidade, a ampliação da transcrição usando um nucleotídeo rotulado (por exemplo, UTP rotulado por fluoresceína e/ou CTP) incorpora um rótulo nos ácidos nucleicos transcritos. Um produto de ampliação pode, também, ou altemativamente, ser rotulado após a ampliação esteja completa.
E) OLIGONUCLEOTÍDEOS ILUSTRATIVOS
Como observado acima e discutido em detalhes abaixo, os oligonucleotídeos são usados por uma variedade de usos, incluindo como iniciadores, sondas, terapêuticos ou outros oligonucleotídeos anti-sentido, oligonucleotídeos triplex, e numerosos outros usos como é evidente desta apresentação. A Tabela 2 provê certos oligonucleotídeos ilustrativos específicos que podem ser usados na prática da invenção. Será observado que numerosos outros oligonucleotídeos utilizáveis da invenção podem ser sintetizados por uma pessoa experiente, seguindo a orientação aqui fornecida.
Na Tabela 2, “seq” significa que o iniciador foi usado, ou é utilizável, para sequenciação; “PCR” significa que o iniciador foi usado, ou é utilizável, para PCR; “AS” significa que o iniciador foi usado, ou é utilizável ·· · · ··· · · · ··· · • « · · · · ·· ·»··· · para inibição anti-sentido da atividade de telomerase^ “’ÇfÇ sigmficalgúe: o iniciador foi usado, ou é utilizável, nas regiões de clonagem dos genes de hTRT ou RNA, “mut” significa que o iniciador foi usado, ou é utilizável, 5 para construir mutantes de genes ou produtos de genes de hTRT, “UC” significa “caixa alta” e “lc” significa “caixa baixa”. Combinações mal feitas e inserções (relativas à SEQUÊNCIA ID NO: 1) são indicadas por sublinhado; deleções são indicadas por um Observar-se-á que nada na Tabela 2 intenta limitar o uso de qualquer oligonucleotídeo particular a qualquer 10 utilização única ou conjunto de utilizações.
TABELA 2
OLIGONUCLEOTÍDEOS UTILIZÁVEIS
V) α
O a
< o O <J O O o
CJ H ί- t ~ o ω
u o O '< < O ο u g <J ί- u c
Ι- O O o u ο o
Ο o H o o o <
£Q
o rs m VI <õ Ό
• ·· ·
XXX
• · ·· • ·
XXXXXXXXX
TABELA 2 (cont.)
• · • · • · ··
X X
X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X
X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X
X X XX
X XX ·· » ···
XXX (cO
TABELA 2 (cont.)
rt GJ ·—-í ca ca ca a ca
o Λ o ca o «? o *3 o
3 e Λ a ca 3 ca 3
Λ ca ca A ca A ca
Ό 1) Ό <υ Ό Ό Ό
3 C Λ CL g X CL 3 3 3 3 3 3
Q X^/ 3 3 X—✓ 3 X—·* 3
£ CN rS Tt Z o
m Tf 0Ί O r- oo CS Uh Ό o o O o Ξ Uh
O T“^ o O O o o o O ÍX.] O CL s s s £
s § s § § § s s s O D P □ 3 j J
J _) H W w K co co
X XX
SLW F1N/SLW F1C amplia uma peça de 893 nt de pGRN121 (782 a 1636)
z O Z
CN CN m
Ph Ph PP
£ £
u u u
00 00 00
· ··· · a ·>·»♦ ♦ * · <» · «»·♦·<·· · • fΛ · ♦ · · · *· »· « * ·· · ··· · **· • « ♦ · A ♦ ♦ ·*4 «« · ·4· ·*♦ ·&· ·· xxxxxxxxxxxxxxxxxx
TABELA 2 (cont.)
CÚ CÚ X? ca ca
X5 cj Ό ca XJ ca
Um Ca Ui Um
C3 Um Λ CL ca ca
CL CL CL
<υ υ xj Q 4>
X5 X) X5
C/) V) g Vi Vi
C α 3
O o o O
*o Ό X) XJ
*o Ό »O Ό
o O O O
CN + x m + CN + cn +
UH r- >—m I—I
CN m Pá r* r* r* K C
C3 o ca CQ V“H c ca CQ
ca CQ Ό CN o W xr ca Tf ca
.2 xf .2 CN o CN .2
CN »-✓ ω r* CN '55 r* CN
II O II cn S—✓ II m w II
o Ví o o Q O o
íca r-H tca
Q Vi Ví
cr cr 3 cr 3 cr
<υ Q <D Pl υ Pl ω
w Vi « ίΛ
H U E- h E- H E-
p4 Ví c ei Vi α Vi C ei
E- O H o E- O E-
Λ O x o x o x
II C3 II ca II ca II
o u o u O Um ca υ
□ CL □ CL P CL □
O
υ 2 ω
η
Pl Pl Pl
£ £ £
uJ U
00 00 00
C3
CN c-* CN
CN
Z c£
O
CL
Q Ό
Q CL «
.2 CL r· α
C3
O X r* 1 £
ÇZ) z
PL u 00
Γ•—4 tJ-
Ο ο ο ί- (J < υ < <r
ο < ο 0 0 E- 0
Ο ο ο ο Ο 0 υ r \ < 0 Η
Ο < ο ο ο 0 Ε- ç_, 0
υ ο < υ ο < υ p 0 b
ο ο < < υ υ 0 E- Η
ο < ο ο Ο υ < Η 0 b Ρ
£ < ο Η 0 υ ο Ο Γ } ο Η υ 0 0 0 υ υ
0 rn 0 υ 0 υ υ 0
ο (J < ο Ε- υ p υ 0
0 Μ ο < υ 0 < Q 0 υ
ο 0 ο ο 0 f-l 0 0
ο Η < ο Ε- 0 Ε- Ε- < 0
ο 0 Ο υ ο υ 0 0 υ ο 0
ο ο ο υ < 0 < υ Ε-
Η < ο ο ο < 0 < 0 <
< Ο Η < Ε- ο 0 Ε- 0 υ υ
Ο < 0 ο υ < E- 0 υ
0 ο Ο Η 0 0 υ < Ε- υ
ο ο 0 0 < 0 υ 0 0 0
o © © ©
CN CN Tf cn
o O o O m m
00 (N Os o T~M CN CN
o KO 1 CN 1 vr> 1 r* 1 c\ 1 i © 1 © 1 © 1 © 1 ΜΊ
© o O u-» © © CN ·—· O\
o o o r* oo © m <n CN
TT CN r-* 00 ,-1 (N CN
··« * · · ♦ · <
« ' ' · · • ··
c. * ♦
V «··
Λ·’· · * ·· ♦ '· · «
A· ··«
Λ ♦ ♦* ·»· « *
2450-2470 GAGGCCACTGCTGGCCTCATT fosforotioato
0 O 0 O O O
rt α C3 Λ Λ C3
O .2 ’.2 .2 O O
**•4
O o 0 0 O O
Ix Ix Sx tx tx ix
Q O 0 ,o ,0 ,0
Cx Cm Cí <XM C*x (*x
(Λ ω V) ω (Λ
O O 0 ,o ,O ,O
Cm Cí Cm <4-M <XM t*x
O 0 0 0
CA »X XO xX
xo rx xX r* xH
CN m m co Γ-
1 1 t 1
O 0 0 0 r- 1
r* 00 CA 1 x^
<0 0 xX XO un un
CN m co m xX
XH CN CN
xM xX xX
Pm Pm Pm P-*
H H H H
IV. PROTEÍNAS E PEPTÍDEOS DE TRT *· « )·· · · · ··· · , ._______ _ ____ __*'<··· ········
A) GENERALIDADES · * · ·* · * /· ··· * Λ « ·♦· · « 9 J· · ·
A invenção provê uma ampla variedade de proteínas de hTRT utilizáveis para, inter alia, produção de atividade de telomerase, inibição de atividade de telomerase em uma célula, indução de uma resposta imune antihTRT, como um reagente terapêutico, como um padrão ou controle em um ensaio diagnóstico, como um alvo em uma triagem de compostos capazes de ativação ou inibição de uma atividade de hTRT ou telomerase, e numerosos outros usos que serão evidentes a uma pessoa versada, ou que são de outra forma aqui descritos. A hTRT da invenção inclui proteínas funcionalmente ativas (utilizáveis, por exemplo, para conferir atividade de telomerase em uma célula negativa à telomerase) e variantes, variantes inativas (úteis para, por exemplo, inibir a atividade de telomerase em uma célula), polipeptídeos de hTRT e RNPs de telomerase (por exemplo, complexos de ribonucleoproteínas compreendendo as proteínas) que apresentam uma, várias ou todas as atividades funcionais de hTRT e telomerase de ocorrência natural, conforme discutido em maiores detalhes para fins ilustrativos, abaixo.
Em uma modalidade, a proteína de hTRT da invenção é um polipeptídeo tendo uma sequência como se apresenta na Figura 17 (SEQUÊNCIA ID NO: 2), ou um seu fragmento. Em outra modalidade, o polipeptídeo de hTRT difere da SEQUÊNCIA ID NO: 2 por deleções, inserções ou substituições conservativas internas de resíduos de aminoácidos. Em uma modalidade relacionada, a invenção provê polipeptídeos de hTRT com substancial similaridade à SEQUÊNCIA ID NO: 2. A invenção ainda provê polipeptídeos de hTRT que são modificados, relativos à sequência de aminoácidos da SEQUÊNCIA ID NO: 2, de alguma maneira, por exemplo, truncada, transformada, derivada ou fundida a outras sequências (por exemplo para formar uma proteína de fusão). Além do mais, a presente invenção provê RNPs de telomerase compreendendo uma proteina.de hTRT ·: ·*: :· : :
da invenção, complexada com um RNA modelo (pôr jexsmplaJ.híÉ^. Em outras modalidades, uma ou mais proteínas associadas com telomerase é associada com a proteína de hTRT e/ou hTR.
A invenção também provê outras espécies de hTRT de ocorrência natural ou variantes de ocorrência não natural, tais como proteínas tendo a sequência ou uma substancial similaridade da SEQUÊNCIA ID NO: 5 (Figura 20), SEQUÊNCIA ID NO: 10 (Figura 19), e fragmentos, variantes, e seus derivados.
A invenção fornece ainda outras espécies e variantes de hTRT.
Um exemplo de uma variante de hTRT pode resultar de transferência de estrutura ribossômica de mRNA codificado pelo clone 712562 [SEQUÊNCIA ID NO: 3 (Figura 18)] ou a hTRT variante pro90 mostrada na SEQUÊNCIA ID NO: 4 (Figura 20), e assim resultar na síntese de polipeptídeos de hTRT contendo todos os motivos de TRT (para um exemplo geral, ver, por exemplo, Tsuchihashi et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87: 2516; Craigengen et al., 1987, Cell 50: 1; Weiss, 1990, Cell 62: 117). A transferência de estrutura ribossômica pode ocorrer quando sequências de mRNA específicas ou estruturas secundárias façam com que o ribossoma “20 “paralise” e pule um nucleotídeo para a frente ou para trás na sequência.
Assim, um evento de transferência de estrutura ribossômica na mRNA 712562 pode causar a síntese de um polipeptídeo residual de aproximadamente 523 aminoácidos. Um evento de transferência de estrutura ribossômica na sequência pro90 deve resultar em uma proteína com 25 aproximadamente 1071 resíduos. Será observado que as proteínas resultantes da transferência de estrutura ribossômica também pode ser expressa por técnicas sintéticas ou recombinantes fornecidas pela invenção.
As proteínas, peptídeos e proteínas funcionalmente equivalentes de TRT humana, podem ser obtidas por purificação, síntese
QL química ou produção recombinante, como discutido em maiores, .d.etalhes ·: ·*: ·’: :·* · · abaixo. : : ..·: ··’ :
B) ATIVIDADES PROTEÍNICAS DE TRT
Os polipeptídeos de TRT da invenção (incluindo fragmentos, variantes, produtos de alelos alternativos e proteínas de fusão) podem ter uma ou mais, ou todas, as atividades funcionais associadas com a hTRT nativa. Exceto como observado, como aqui usado, uma hTRT ou outro polipeptídeo de TRT são considerados como tendo atividade especificada se a atividade for apresentada ou pela proteína de hTRT sem um RNA associado (por exemplo, hTR), ou em um complexo de RNA associado por hTRT (por exemplo, hTR). A atividade de ligação de hTR de hTRT é um exemplo de uma atividade associada com a proteína de hTRT. Processos para produzir complexos de ácidos nucleicos (por exemplo, hTR) e os polipeptídeos de hTRT da invenção, são descritos abaixo.
A modificação da proteína de hTRT (por exemplo por meios químicos ou recombinantes, incluindo mutação ou modificação de um polinucleotídeo codificando o polipeptídeo de hTRT ou síntese química de um polinucleotídeo que tenha uma sequência diferentes de uma sequência de polinucleotídeo nativo) para ter um complemento de atividades diferente da —20 hTRT nativa, pode ser utilizável em aplicações terapêuticas ou na triagem quanto a moduladores específicos de hTRT ou atividade de telomerasa. Além disso, os ensaios para as várias atividades de hTRT podem ser particularmente úteis para a identificação de agentes (por exemplo, agentes de modulação de atividade) que interagem com hTRT ou telomerase, para modificar a atividade de telomerase.
As atividades de hTRT nativa, como apresentado abaixo, inclui a atividade catalítica de telomerase (que pode ser, ou atividade processiva ou não processiva); a processividade da telomerase; a atividade de transcriptase reversa convencional; a atividade nucleolítica; a atividade de
ligação do iniciador ou substrato (telômero ou substrato» ou iniciador de ·*· : ? ·: ·’: ·*: i·. ?,· telomerase sintética); atividade de ligação de ·αΝΤΕ;: ^tiyidádcC.de5 ligação
RNA (isto é, hTR); e atividade de ligação proteínica (por exemplo, ligação a proteínas associadas à telomerase, proteínas de ligação a telômero, ou a um complexo de DNA telomérico proteínico). Será entendido, no entanto, que a presente invenção também provê composições de hTRT sem qualquer atividade particular de hTRT, mas com alguma atividade útil relacionada à hTRT ou outras proteínas de TRT (por exemplo, certos peptídeos imunogênico tipicamente cursos, peptídeos inibitórios).
1) ATIVIDADE CATALÍTICA DE TELOMERASE <·
Como aqui usado, um polipeptídeo da invenção tem “atividade catalítica de telomerase”, quando o polipeptídeo é capaz de estender um iniciador de DNA que funcione como um substrato de telomerase, pela adição de uma, ou mais do que uma, repetição parcial de uma sequência (por exemplo, TTAGGG) codificada por um ácido nucleico modelo (por exemplo, hTR). Esta atividade pode ser processiva ou não processiva. A atividade processiva ocorre quando um RNP de telomerase adiciona múltiplas repetições a um iniciador ou telomerase antes que o DNA seja liberado pelo complexo enzimático. A atividade não processiva ocorre —20 quanto a telomerase adiciona uma, ou apenas uma, repetição parcial a um iniciador, e é então liberada. In vivo, no entanto, uma reação não processiva pode adicionar múltiplas repetições por sucessivos ciclos de associação, extensão e dissociação. Isto pode ocorrer in vitro também, mas não é tipicamente observado em ensaios padrão, devido ao imensamente grande 25 excesso molar do iniciador sobre a telomerase em condições de ensaio padrão.
Para caracterizar um polipeptídeo de hTRT como tendo atividade não processiva, uma reação convencional de telomerase é realizada usando-se condições que favoreçam uma reação não processiva, por exemplo altas temperaturas (isto é, 35° a 40°C, tipicamente 37°C)A .baixas concentrações de dGTP (1 μΜ ou menos), altas JCoiícÕíít4açaesjdo‘.imciaâor (5 μΜ ou mais elevadas), e altas concentrações de dATP/TTP (2 mM ou mais elevadas), com a temperatura e dGTP tipicamente tendo o maior efeito. Para caracterizar um polipeptídeo de hTRT como tendo atividade processiva, uma reação convencional de telomerase é realizada usando-se condições que favorecem uma reação processiva (por exemplo, 27 a 34°C, tipicamente 30°C), concentração elevada de dGTP (10 μΜ ou maior), baixa concentração de iniciador (1 μΜ ou menor), e/ou baixas concentrações de dATP e TTP (0,3 a 1 mM), com temperatura e concentração típica de dGTP sendo a mais crítica. Alternativamente, um ensaio TRAP (quanto à atividade processiva ou moderadamente processiva) ou os ensaios dot-blot e gel-blot (quanto à atividade processiva) podem ser usados. O polipeptídeo de hTRT da invenção pode possuir uma atividade não processiva, mas não uma atividade processiva (por exemplo, se uma alteração do polipeptídeo de hTRT reduzir ou eliminar a capacidade para translocar-se), pode ser unicamente processiva, ou pode possuir ambas as atividades.
a) ATIVIDADE NÃO PROCESSIVA
Uma atividade catalítica de telomerase pode estender o iniciador de DNA da posição onde a extremidade 3’ tempera o modelo de RNA para a extremidade 5’ da sequência de modelo, tipicamente terminando com a adição do primeiro resíduo G (como, por exemplo, quando o modelo é hTR). Como mostrado na Tabela 3, o número exato de nucleotídeos adicionados é dependente da posição do nucleotídeo terminal 3’ do iniciador na sequência de repetição TTAGGG.
(RNA) (RNA)
TABELA 3
4« 4·* * · 4· * • 4 ·· · Ο
Atividade não Processiva :
i) ---------TTAGGGttag(DNA) '-----AUCCCAAUC5 ’
ü) ---------TTAGggttag(DNA) •3 >-----AUCCCAAUC--------5'
Em DNA, UC = iniciador, lc = nucleotídeos adicionados
Assim, 4 nucleotídeos são adicionados ao iniciador — TTAGGG (i) enquanto 6 nucleotídeos são adicionados ao iniciador —TTAG (ii). A primeira repetição adicionada por telomerase em uma reação processiva é equivalente a esta etapa; no entanto, em uma reação processiva a telomerase realiza uma etapa de translocação onde a extremidade 3’ é liberada e religada na região 3’ do modelo em uma posição suficiente para iniciar a adição de outra repetição (ver Morin, 1997, Eur. J. Câncer 33:750).
Uma reação completamente não processiva produz apenas uma banda em um ensaio convencional usando um iniciador sintético único. Tendo em vista que este resultado também pode ser produzido por outras enzimas, tais como uma atividade transferase, pode ser desejável em algumas aplicações verificar se 0 produto é um resultado de uma atividade catalítica de telomerase. Uma banda gerada de telomerase (compreendendo hTRT) pode ser distinguida por várias características adicionais. O número de nucleotídeos adicionados à extremidade do iniciador deve ser consistente com a posição da extremidade 3’ do iniciador. Assim, um iniciador — TTAGGG deve ter 4 nucleotídeos adicionados e um iniciador --TTAG deve ter 6 nucleotídeos adicionados (ver acima). Na prática, dois ou mais iniciadores de sequência permutada podem ser usados, os quais tenham 0 mesmo comprimento global, mas diferentes pontos finais 5’ e 3’. Como um exemplo ilustrativo, a extensão não processiva dos iniciadores 5’TTAGGGTTAGGGTTAGGG e 5’-GTTAGGGTTAGGGTTAGG gerará >0 produtos cujo comprimento absoluto será um nucleotídeo diferente (4 adicionados a 5’-TTAGGGTTAGGGTTAGGG?;pak.w’(;^iitótbj total de 22 nt 5’-GTTAGGGTTAGGGTTAGG para um comprimento total de 23 nt). A dependência do nucleotídeo da reação deve ser consistente com a 5 posição do término do iniciador. Assim, um produto iniciador —TTAGGG deve requerer dGTP, TTP e dATP, mas não dCTP, e um produto iniciador — AGGGTT deve requerer dGTP e dATP, mas não TTP ou dCTP. A atividade deve ser sensível a pré-tratamento de RNAase ou de nuclease microcócico (ver Morin, 1989, Cell 59: 521) sob condições que degradem hTR e, assim, 10 eliminem o modelo.
b) ATIVIDADE PROCESSIVA
Na prática, uma atividade processiva é facilmente observada pelo aparecimento de uma escada de seis nucleotídeos em um ensaio convencional, ensaio TRAP, ou ensaio de gel-blot. Um ensaio de dot-blot 15 também pode ser usado, mas nenhuma escada é detectada em um tal processo. O ensaio convencional é descrito em Morin, 1989, Cell 59: 521, que é aqui incorporado em sua totalidade e para todas as finalidades. O ensaio TRAP é descrito na Patente U.S. 5.629.154; ver também a publicação da PCT WO 97/15687, a publicação PCT WO 95/13381; Krupp et al., ~20 NucleicAcids Res., 1997, 25, 919; e Wright et al., 1995, Nuc. Acids Res. 23:
3794, cada uma das quais é aqui incorporada em sua totalidade e para todas as finalidades. O ensaio dot-blot pode ser usado em um formato em que uma atividade não processiva, que não adicione as três ou mais repetições requeridas para a hibridização estável da sonda (CCCUAA)n usada para detectar a atividade, é testado com compostos ou variantes de hTRT, para determinar se os mesmos geram processividade, isto é, se a sonda detecta um substrato de telomerase esperado, depois o composto ou mutante é capaz de mudar a atividade não processiva em uma atividade processiva. Outros ensaios para a atividade catalítica de telomerase processiva também podem
·· ser utilizados, por exemplo o ensaio de estiramento. do P.CR.dç Tatematsu et • : i : ; .··· · · · · ·** r • * ··· ·· al., 1996, Oncogene 13: 2265. O ensaio de gel-Blot· ufrlá cdm&inâçãó *cfos ensaios convencionais com o dot-blot também pode ser usado. Nesta variação, um ensaio convencional é realizado sem qualquer nucleotídeo 5 radio-rotulado e com elevadas concentrações de dGTP (por exemplo, 0,1 a 2 mM). Após realizar o ensaio convencional, o DNA sintetizado é separado por desnaturação do PAGE e transferido para uma membrana (por exemplo, nitrocelulose). O DNA telomérico (o produto da telomerase - um iniciador ou substrato de telomerase estendida) pode então ser detectado por processos 10 tais como hibridização, usando-se sondas de DNA telomérico rotuladas (por exemplo, sondas contendo a sequência CCCTAA, como usado no ensaio dotblot acima). Uma vantagem desta técnica é que ela é mais sensível do que o ensaio convencional e proporciona informação acerca do tamanho dos fragmentos sintetizados e da processividade da reação.
c) DETERMINAÇÕES DA ATIVIDADE
A atividade detelomerase de um polipeptídeo de hTRT pode ser determinada usando-se um polipeptídeo de hTRT não purificado, parcialmente purificado ou substancialmente purificado (por exemplo, em associação com hTR), in vitro, ou após expressão in vivo. Por exemplo, a “20 atividade de telomerase em uma célula (por exemplo, uma célula expressando um polipeptídeo recombinante de hTRT da invenção) pode ser ensaiada detectando-se um aumento ou redução no comprimento dos telômeros. Tipicamente, os ensaios quanto à atividade catalítica da telomerase são realizados empregando-se uma hTRT complexada com hTR;
no entanto, RNAs padrão alternativos de telomerase podem ser substituídos, ou pode-se conduzir os ensaios para medir outra atividade, tal como a ligação de telomerase-iniciador. Ensaios para determinar o comprimento de telômeros são conhecidos na técnica e incluem a hibridização de sondas ao DNA telomérico (uma etapa de ampliação pode ser incluída) e análise de
TRF, isto é, a análise dos fragmentos de restriçãQ d.e DNA telomérico :: : :: ·· ·’? :··: ·· · ·· · 2 · ·· · · (TRFs), em seguida à digestão da endonuclease de:restriçãô, ver:pu£licâç3es
PCTWO 93/23572 eWO 96/41016; Counter et al., 1992, EMBOJ. 11: 1921; Allsopp et al., 1992, Proc. Nat’l. Acad. Sei. USA 89: 10114; Sanno, 1996, Am 5 J Clin Pathol 106: 16 e Sanno, 1997, Neuroendocrinology 65: 299.
A atividade catalítica de telomerase de um polipeptídeo de hTRT pode ser determinada por vários meios, usando-se os ensaios acima e outros ensaios de atividade catalítica de telomerase. De acordo com um processo, a proteína de hTRT é expressa (por exemplo, como descrito abaixo) 10 em uma célula humana negativa de telomerase, em que a hTR é expressa (isto é, ou normalmente na célula ou através de expressão recombinante), e a presença ou ausência de atividade de telomerase na célula ou no lisato celular são determinadas. Exemplos de células negativas de telomerase adequadas são a IMR 90 (ATCC, CCL-186) ou células BJ (linhagem de fibroblasto de 15 prepúcio humano; ver, por exemplo, Feng et al., 1995, Science 269: 1236).
Outros exemplos incluem as células epiteliais pigmentadas retinais (RPE), células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC; ATCC CRL-1730), células endoteliais aórticas humanas (HAEC; Clonetics Corp., CC-2535) e células epiteliais mamárias humanas (HME; Hammond et al., 1984, Proc.
“20 Nat’l. Acad. Sei. USA 81: 5435; Stampfer, 1985, J. Tissue CultureMethods 9: 107). Em uma modalidade alternativa, o polipeptídeo de hTRT é expresso (por exemplo, por transfecção com um vetor de expressão de hTRT) em uma célula positiva de telomerase, e um aumento na atividade de telomerase na célula em comparação com uma célula transfectada de controle, é detectado 25 se o polipeptídeo tiver atividade catalítica de telomerase. Comumente, a atividade catalítica de telomerase em uma célula transfectada com um vetor de expressão adequado expressando hTRT, será aumentada significativamente, tal como pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, ou mesmo pelo menos cerca de 10 vezes a 100 vezes ou, mesmo,
1000 vezes mais elevada do que em células não transfectadas. (de çontrole).
··* : *.í .· · · / ·. · .
Em uma modalidade alternativa/a :pro‘têínef· de •••hTRT: é expressa em uma célula (por exemplo, uma célula negativa de telomerase, em que a hTR é expressa) como uma proteína de fusão (ver abaixo) tendo um 5 rótulo ou uma “marcador de epítopo” para auxiliar na purificação. Em uma modalidade, o RNP é recuperado da célula usando um anticorpo que especificamente reconhece o marcador. Marcadores preferidos são tipicamente curtos ou pequenos e podem incluir um sítio de divagem ou outra propriedade que permita que o marcador seja removido do polipeptídeo 10 de hTRT. Exemplos de marcadores adequados incluem o epítopo Xpress® (Invitrogen, Inc., San Diego, CA), e outras porções que podem estar especificamente ligadas por um anticorpo ou ácido nucleico ou outro processo equivalente, tal como aquele descrito no Exemplo 6. Marcadores alternativos incluem aqueles codificados por sequências interseridas, por 15 exemplo na SEQUÊNCIA ID NO: 1 a montante do códon de ATG que inicia a translação da proteína da SEQUÊNCIA ID NO: 2, que pode incluir a inserção de um (novo) códon de iniciação de metionina na sequências a montante.
Será observado que, quando uma variante de hTRT é expressa “20 em uma célula (por exemplo, como uma proteína de fusão) e subsequentemente isolada (por exemplo, como um complexo ribonucleoproteínico), outras proteínas celulares (isto é, proteínas associadas à telomerase) podem ser associadas com (direta ou indiretamente ligada a) o complexo isolado. Em tais casos, algumas vezes será desejável ensaiar a 25 atividade detelomerase quanto ao complexo contendo hTRT, hTR e proteínas associadas.
2) OUTRAS ATIVIDADES DE TELOMERASE OU PROTEÍNAS TRT
Os polipeptídeos de hTRT da invenção incluem variantes que carecem da atividade catalítica de telomerase, mas retêm uma ou mais de outras atividades de telomerase. Estas outras atividades e os processos da • · · ··! í · · ··· « * · * · * e ·* · · · · · · invenção para medir tais atividades, incluem (mal’ não.se: liiàitámlg’psfefe) aquelas discutidas nas seguintes seções.
a) ATIVIDADE DE TRANSCRIPTASE REVERSA CONVENCIONAL
A atividade de transcriptase reversa convencional de telomerase é descrita em, por exemplo, Morin, 1997, acima, e Spence et al., 1995, Science 267: 988. Tendo em vista que a hTRT contém motivos de aminoácido conservados, que são requeridos pela atividade catalítica de transcriptase reversa, a hTRT tem a capacidade de transcrever certos RNAs exógenos (por exemplo, não hTR). Um ensaio de RT convencional mede a capacidade da enzima de transcrever um padrão de RNA mediante extensão de um iniciador de DNA temperado. A atividade de transcriptase reversa pode ser medida de numerosas maneiras conhecidas na técnica, por exemplo mediante monitoração do aumento de tamanho de um iniciador de ácido nucleico rotulado (por exemplo, RNA ou DNA), ou incorporação de um dNTP rotulado. Ver, por exemplo, Ausubel et al., acima.
Uma vez que a hTRT especificamente se associa com hTR, pode ser observado que o iniciador DNA/padrão de RNA para um ensaio de RT convencional pode ser modificado para ter características relacionadas a ~20 hTR e/ou um iniciador de DNA telomérico. Por exemplo, o RNA pode ter a sequência (CCCTAA)n, onde n é pelo menos 1, ou pelo menos 3, ou pelo menos 10 ou mais. Em uma modalidade, a região de (CCCTAA)n está no término 5’ do RNA ou próximo a ele (similar às localizações 5’ das regiões padrão em RNAs de telomerase). De forma semelhante, o iniciador de DNA 25 pode ter um término 3’ que contém porções da sequência do telômero TTAGGG, por exemplo XnTTAG, XnAGGG, Xn(TTAGGG)qTTAG, etc., onde X é uma sequência não telomérica e n é de 8 a 20, ou de 6 a 30, e q é de 1 a 4. Em outra modalidade, o iniciador de DNA tem um término 5’ que é não complementar ao padrão RNA, de tal modo que, quando o iniciador seja temperado ao RNA, o término 5’ do iniciador permanece desligado.
• J · · * ·**ί · · ·*· ·** *
Modificações adicionais de ensaios de transcrição rêversa.pâdrãp^qqç* podem ser aplicadas aos processos da invenção, são conhecidos na técnica.
b) ATIVIDADE NUCLEOLÍTICA
A atividade nucleolítica da telomerase é descrita em, por exemplo, Morin, 1997, acima; Collins e Grieder, 1993, Genes e Development 7: 1364. A telomerase possui uma atividade nucleolítica (Joyce e Steitz, 1987, Trends Biochem. Sei. 12: 288); entretanto, a atividade de telomerase tem características de definição. A telomerase de preferência remove 10 nucleotídeos, comumente apenas um, da extremidade 3’ de um oligonucleotídeo, quando a extremidade 3’ do DNA está posicionada no limite de 5’ da sequência padrão de DNA, em seres humanos e Tetrahymena, este nucleotídeo é o primeiro G da repetição telomérica (TTAGG em seres humanos). A telomerase preferencialmente remove os resíduos G, mas tem 15 atividade nucleolítica contra outros nucleotídeos. Esta atividade pode ser monitorada. Dois processos diferentes são aqui descritos para fins ilustrativos. Um processo envolve uma reação de telomerase convencional com um iniciador que liga a sequência padrão inteira (isto é, terminando na limitação padrão; 5’-TAGGGATTAG em seres humanos). A atividade =410 nucleolítica é observada por monitoração da substituição do último resíduo dG com um dGTP radio-rotulado provido no ensaio. A substituição é monitorada pelo aparecimento de uma banda no tamanho do iniciador de partida, como mostrado por eletroforese de gel e autorradiografia.
Um processo preferido usa um iniciador de DNA que tem um término 3’ “bloqueado” que não pode ser estendido por telomerase. O iniciador bloqueado 3’ pode ser usado em um ensaio padrão de telomerase, mas não serão estendidos, a menos que o nucleotídeo 3’ seja removido pela atividade nucleolítica de telomerase. A vantagem deste processo é que a atividade de telomerase pode ser monitorada por qualquer dos meios diversos
Ύ0 meios padrão, e o sinal é forte e fácil de se quantificar. O bloqueio do • · · * ' · término 3’ do iniciador pode ser realizado de váriasmaneítás.
a adição de um resíduo 3’-deóxi-dNTP no término 3’ do iniciador usando técnicas padrão de síntese de oligonucleotídeos. Este término tem um 2’ OEÍ mas não o 3’ OH requerido para a telomerase. Outros meios de bloquear o término 3’ existem, por exemplo um término dideóxi 3’ , um término amina 3’, e outros. Um exemplo de um iniciador para um ensaio nucleolítico de hTRT é5’-TTAGGGTTAGGGTTA (G3-H), onde o último resíduo denota um resíduo 3’-deóxi-guanosina (Glen Research, Sterling, VA). Numerosas outras variações para um iniciador adequado, com base na invenção, são conhecidas daqueles de experiência na técnica.
c) ATIVIDADE DE LIGAÇÃO DO INICIADOR (TELÔMERO)
A atividade de ligação do iniciador (telômero) da telomerase é descrita em, por exemplo, Morin, 1997, acima; Collins et al., 1995, Cell 81: 677; Harrington et al., 1995, J. Biol. Chem. 270: 8893. Acredita-se que a telomerase tenha dois sítios, que ligam um iniciador de DNA telomérico. Os motivos de RT associados com a ligação do iniciador indicam que hTRT e/ou hTRT/hTR possuem a atividade de ligação do iniciador de DNA. Existem vários meios de ensaiar a atividade de ligação do iniciador; no entanto, uma etapa comum à maioria dos processos é a incubação de um iniciador de DNA rotulado com hTRT ou hTRT/hTR ou outras combinações de TRT/TR sob condições de ligação apropriadas. Igualmente, a maioria dos processos emprega um meio de separar DNA não ligado do DNA ligado à proteína; aqueles processos incluem os seguintes:
(i) Os ensaios de deslocamento de gel (também chamados de ensaios de deslocamento eletroforético/mobilidade) são aqueles em que o iniciador de DNA não ligado é separado do iniciador de DNA ligado à proteína por eletroforese em um gel não desnaturante (Ausubel et al., acima).
(ii) Os ensaios de ligação da matriz incluem várias variações à feprocésseèé técnica básica, que envolve a ligação do complexo de hTRT ou hTRT/hTR a uma matriz (por exemplo, nitrocelulose), ou antes ou apó^a, incubação cofre o iniciador rotulado. Mediante a ligação da hTRT a uma matriz, o iniciador não ligado pode ser mecanicamente separado do iniciador ligado. O DNA 5 residual não ligado pode ser removido por lavagem da membrana antes da quantificação. Aqueles de experiências reconhecem que existem vários meios de acoplar as proteínas a tais matrizes, suportes sólidos e membranas, incluindo interações químicas, fotoquímicas, reticulação de UV, anticorpo/epítopo, e não covalentes.
O iniciador DNA pode ser qualquer DNA com uma afinidade para com a telomerase, tal como, por exemplo, um iniciador DNA telomérico (TTAGGG)n, onde n pode ser 1 a 10 e é, tipicamente, 3 a 5. Os términos 3’ e 5’ podem terminar em qualquer localização da sequência de repetição. O iniciador pode também ter as extensões 5’ ou 3’ de DNA não telomérico, que podem facilitar a rotulagem ou detecção. O iniciador pode ser derivado, por exemplo, para facilitar a detecção ou o isolamento.
d) ATIVIDADE DE LIGAÇÃO dNTP
A atividade de ligação de dNTP telomerase é descrita em, por exemplo, Morin, 1997, acima; Spence et al., acima. A telomerase requer ^0 dNTPs para sintetizar DNA. A proteína de hTRT tem uma atividade de ligação de nucleotídeos e pode ser ensaiada quanto à ligação de dNTP de uma maneira similar a outras proteínas de ligação de nucleotídeos (Kantrowitz et al., 1980, Trends Biochem. Sei. 5:124). Tipicamente, a ligação de um dNTP ou análogo de dNTP pode ser monitorada como é conhecido na 25 técnica para as proteínas RT não telomerase.
e) ATIVIDADE DE LIGAÇÃO DE RNA (isto é, hTR)
A atividade de ligação de RNA telomerase (isto é, hTR) é descrita em, por exemplo, Morin, 1997, acima; Harrington et al., 1997, Science 275: 973; Collins et al., 1995, Cell 81: 677. A atividade de ligação de
RNA de uma proteína TRT da invenção, pode ser ensaiada de uma maneira ·· · · ··· · · · ··· · • · · ·· ··· ····· · similar ao ensaio de ligação do iniciador de DNA’dçsérítj5 atimà--úsâfidè-se • · ·· · ··· ··· ··· · · uma sonda de RNA rotulada. Processos para separar RNA ligado e não ligado e para detectar RNA, são bem conhecidos na técnica, e podem ser aplicados aos ensaios de atividade da invenção de uma maneira similar àquela descrita para o ensaio de ligação do iniciador de DNA. O RNA pode ser hTR de comprimento completo, os fragmentos de hTR ou outros RNAs demonstraram ter uma afinidade para com a telomerase ou hTRT. Ver a Patente U.S. 5.583.016 e Pub. PCT 96/40868.
3) MOTIVOS DE TELOMERASE COMO ALVOS
A presente invenção, como observado acima, provê, além da hTRT recombinante com um complemento completo (como descrito acima) de atividades, polipeptídeos de hTRT tendo menos do que o complemento completo das atividades de telomerase de telomerase de ocorrência natural ou 15 hTRT ou outras proteínas de TRT. Será observado que, em vista desta invenção dos motivos de RT e específico de telomerase de TRT, alteração ou mutação de resíduos de aminoácidos conservados, tal como são encontrados nas sequências de motivo discutidas acima, resultarão em mutantes de perda de atividade úteis para triagem e caracterização terapêutica e de “20 medicamentos, e outros usos. Por exemplo, como descrito no Exemplo 1, a deleção dos motivos B a D nos domínios RT do gene de TRT endógeno em S. pombe resultou em células haplóides em que o telômero progressivamente encurtou até o ponto onde a hibridização de uma sonda de telômero a repetições teloméricas se tomou quase indetectável, indicando uma perda de 25 atividade catalítica de telomerase. De forma semelhante, as alterações no sítio WxGxS do motivo E podem afetar a ligação ou função do iniciador de DNA da telomerase. Adicionalmente, as alterações dos aminoácidos nos motivos A, B’ e C podem afetar a atividade catalítica de telomerase. A mutação do motivo DD de hTRT pode significativamente reduzir ou abolir a atividade de
telomerase (ver Exemplo 16).
C) SÍNTESE DE hTRT E OUTROS POLIPEPÍ'ídEàs:í)Í tt<Í: • · ·· · ··· ··· ···
A invenção provê uma variedade de processos para produzir a hTRT e outros polipeptídeos de TRT aqui apresentados. Nas seguintes seções, a síntese química e a expressão recombinante de proteínas de hTRT, incluindo proteínas de fusão, é descrita em alguns detalhes.
1) SÍNTESE QUÍMICA
A invenção provê polipeptídeos de hTRT sintetizados, inteiramente ou em parte, usando processos químicos gerais bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Caruthers et al., 1980, Nucleic Acids Res. Symp.
Ser., 215-223; e Hom et al., 1980, Nucleic Acids Res. Symp. Ser., 225-232).
Por exemplo, a síntese de peptídeos pode ser realizada usando-se várias técnicas de fase sólida (Roberge et al., 1995, Science 269: 202), incluindo a síntese automatizada (por exemplo, usando o Sintetizador de Peptídeos ABI
431A da Perkin Elmer, de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante). Quando a proteína de comprimento completo é desejada, polipeptídeos mais curtos podem ser fundidos por condensação do término amino de uma molécula com o término carboxila da outra molécula, para formarem uma ligação peptídeo.
“20 O peptídeo recentemente sintetizado pode ser substancialmente purificado, por exemplo, por cromatografia líquida preparativa de alto desempenho [por exemplo, Creighton, PROTEINS, STRUCTURES AND MOLECULAR PRINCIPLES, WH Freeman and Co.,
Nova Iorque NY (1983)]. A composição dos peptídeos sintéticos (ou quaisquer outros peptídeos ou polipeptídeos da invenção), podem ser confirmados por análise ou sequenciação de aminoácidos (por exemplo, o procedimento de degradação de Edman; Creighton, acima). De forma importante, a sequência de aminoácidos de hTRT, ou qualquer de suas partes, pode ser alterada durante a síntese direta e/ou combinada, usando-se processos químicos com sequências de outras proteínas ou de outra forma, o ·· ♦ · ··· · · · ··· * qualquer de suas partes ou para qualquer fmilld^dbj para prôdüaij.jum • · ·· · ··· ··· ··· · · polipeptídeo variante da invenção.
2) EXPRESSÃO RECOMBINANTE DE hTRT E OUTRAS PROTEÍNAS 5 DE TRT
A presente invenção provê processos, reagentes, vetores e células úteis para expressão de polipeptídeos de hTRT e ácidos nucleicos, usando sistemas de expressão recombinantes in vitro (isento de células), ex vivo ou in vivo (com base celular ou em organismos). Em uma modalidade, a 10 expressão da proteína de hTRT, ou seu fragmento, compreende a inserção da sequência de codificação em um vetor apropriado de expressão (isto é, um vetor que contenha os elementos necessários para a transcrição e translação da sequência de codificação inserida, requeridas para o sistema de expressão empregado). Assim, em um aspecto, a invenção provê quanto a um 15 polinucleotídeo substancialmente idêntico em sequência a um gene de hTRT codificando sequência de pelo menos 25 nucleotídeos, e preferivelmente para muitas aplicações 50 a 100 nucleotídeos ou mais, dos cDNAs de hTRT ou genes da invenção, que é operavelmente ligado a um promotor para formar uma unidade de transcrição capaz de expressar um polipeptídeo de hTRT. “20 Processos bem conhecidos daqueles experientes na técnica podem ser usados para construir os vetores de expressão contendo uma sequência de hTRT e controles transcricionais ou translacionais apropriados providos pela presente invenção (ver, por exemplo, Sambrook et al., acima, Ausubel et al, acima, e esta invenção.
Os polipeptídeos de hTRT providos pela invenção incluem proteínas de fusão que contêm polipeptídeos ou fragmentos de hTRT da proteína de hTRT. As proteínas de fusão são tipicamente produzidas por meios recombinantes, embora elas possam também ser produzidas por síntese química. As proteínas de fusão podem ser úteis em prover expressão acentuada das construções de polipeptídeos de hTRT, ou na produção de ·· · · ··· · · · ···· polipeptídeos de hTRT tendo outras propriedades1 cfesujáveíj, por/exemplo • · ·· · ·«· ··· ··· · · compreendendo um rótulo (tal como um grupo repórter enzimático), grupo de ligação ou epítopo de anticorpo. Um exemplo de proteína de fusão, 5 compreendendo hTRT e sequências de proteínas fluorescentes verdes acentuadas, é descrito no Exemplo 15, abaixo. Será evidente a uma pessoa versada, que os usos e aplicações examinados no Exemplo 15 e em outra parte do presente relatório, não são limitadas à proteína de fusão particular, mas são ilustrativas dos usos das várias construções de fusão.
Os sistemas de proteínas de fusão da invenção podem também ser usados para facilitar a produção eficiente e o isolamento de proteínas ou peptídeos de hTRT. Por exemplo, em algumas modalidades, a porção da sequência não de hTRT da proteína de fusão, compreende um peptídeo curto que pode ser especificamente limitado a uma molécula imortalizada, de tal modo que a proteína de fusão possa ser separada dos componentes não limitados (tais como as proteínas não relacionadas em um lisado celular). Um exemplo é uma sequência de peptídeos que é ligada por um anticorpo específico. Outro exemplo é um peptídeo compreendendo tratos de polihistidina, por exemplo (His)6 ou sequências de histidina-triptofano, que =4!0 podem ser ligados por uma resina contendo íons de níquel ou de cobre (isto é, cromatografia de afinidade de quelato de metal). Outros exemplos incluem os domínios ou fragmentos de Proteína A, que permitem a purificação na imunoglobulina imobilizada, e o domínio utilizado no sistema de purificação de extensão/afinidade FLAGS (Immunex Corp., Seattle WA). Em algumas modalidades, a proteína de fusão inclui um sítio de divagem, de modo que a hTRT ou outra sequência de polipeptídeo de TRT podem ser facilmente separadas do peptídeo não de hTRT ou sequência proteínica. Neste caso, a divagem pode ser química (por exemplo brometo de cianogênio, 2-(2nitrofenilsulfenil)-3-metil-3’-bromoindolene, hidroxilamina, em pH baixo) ou enzimática (por exemplo, fator Xa, enterocinase). A escolha dos sistemas • · · · · ·· · · · ··· « de fusão e de divagem pode depender, em parte, dipqrç&p;(is’lp e,: seqiiêáqia) • · ·· · ··· ··· ··· · · do polipeptídeo de hTRT que está sendo expresso. As proteínas de fusão geralmente são descritas em Ausubel et al., acima, Capítulo 16, Kroll et al.,
1993, DNA Cell Biol. 12: 441, e o Catálogo 1997 da Invitrogen (Invitrogen
Inc., San Diego CA). Outro exemplo de proteínas de fusão da invenção com marcadores de epítopo ou sítios de marcadores e divagem, são providos no Exemplo 6, abaixo.
Será observado por aqueles versados, que, não obstante os sistemas de expressão examinados nesta seção sejam focalizados na expressão de polipeptídeos de hTRT, as mesmas células ou similares, vetores e processos podem ser usados para expressar polinucleotídeos de hTRT da invenção, incluindo os polinucleotídeos de sentido e de anti-sentido, sem necessariamente a produção desejável de polipeptídeos de hTRT.
Tipicamente, a expressão de um polipeptídeo requer um códon de iniciação adequado (por exemplo, metionina), estrutura de leitura aberta e sinais translacionais regulatórios (por exemplo, um sítio de ligação ribossômica, um códon de término), que podem ser omitidos quando a translação de uma sequência de ácido nucleico para produzir uma proteína, não é desejada.
±0 A expressão de polipeptídeos e polinucleotídeos de hTRT pode ser realizada para concluir qualquer dos vários benefícios relacionados providos pela presente invenção. Um benefício ilustrativo é a expressão de polipeptídeos de hTRT que sejam subsequentemente isolados da célula em que eles são expressos (por exemplo para a produção de grandes quantidades 25 de hTRT para utilização como vacina ou em aplicações de triagem para identificar compostos que modulem atividade de telomerase). Um segundo beneficio ilustrativo é a expressão de hTRT em uma célula, para mudar o fenótipo da célula (como em aplicações de terapia de genes). Células de não mamíferos podem ser usadas para expressão de hTRT para purificação, enquanto as células eucarióticas especialmente de mamíferos (por exemplo, ·· · · ··· · · · ···« • · ♦ ·· · ·· ···«· · células humanas) podem ser usadas não apenas para isoluraenío je‘ntfrificíaèão de hTRT, mas também para expressão de hTRT, quando uma modificação no fenótipo em uma célula for desejada (por exemplo, para efetuar uma modificação na capacidade proliferativa como nas aplicações de terapia de genes). Por meio de ilustração, e não de limitação, os polipeptídeos de hTRT, tendo uma ou mais atividades de telomerase (por exemplo, atividade catalítica de telomerase), podem ser expressos em uma célula hospedeira para aumentar a capacidade proliferativa de uma célula (por exemplo, imortalizar 10 uma célula) e, reciprocamente, polinucleotídeos anti-sentido de hTRT ou polipeptídeos inibitórios tipicamente podem ser expressos para reduzir a capacidade proliferativa de uma célula (por exemplo, de uma célula tumoral maligna positiva de telomerase). Numerosas aplicações específicas são aqui descritas, por exemplo no exame das aplicações dos reagentes e processos da 15 invenção, quanto às aplicações terapêuticas, abaixo.
Sistemas ilustrativos de expressão utilizáveis (células, elementos regulatórios, vetores e expressão) da presente invenção incluem diversos sistemas isentos de células, tais como os sistemas de lisado reticulócito e de germe de trigo, usando polinucleotídeos de hTRT de acordo ”20 com processos gerais bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Ausubel et al., acima, no Capítulo 10). Em modalidades alternativas, a invenção provê reagentes e processos para expressar hTRT em células procarióticas ou eucarióticas. Assim, a presente invenção provê ácidos nucleicos codificando polinucleotídeos de hTRT, proteínas, subsequências de proteínas ou proteínas 25 de fusão, que podem ser expressas em bactérias, fungos, plantas, insetos e animais, incluindo os sistemas de expressão celular humanos conhecidos na ciência, incluindo células isoladas, linhagens celulares, culturas celulares, tecidos e organismos inteiros. Como será entendido por aqueles de experiência, os polinucleotídeos de hTRT introduzidos em uma célula hospedeira ou sistema de expressão livre de células, são comumente ligados ·· · · ··« e · · «·· 4 • · · * · · · · » * · · de forma operável a sequências apropriadas de cònfrôl£:Ue:exóressão:tíara cada hospedeiro ou sistema livre de células.
Sistemas de expressão bacterianos utilizáveis incluem E. coli, bacilos (tais como Bacillus subtilus), outras enterobacteriáceas (tais como Salmonella, Serratia e várias Pseudomonas species) ou outros hospedeiros bacterianos (por exemplo, Streptococcus cremoris, Streptococcus lactis, Streptococcus thermophilus, Leuconostoc citrovorum, Leuconostoc mes enter oides, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus lactis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve e Bifidobacterium longum). As construções de expressão de hTRT utilizáveis em procariotas incluem bacteriófago recombinante, plasmídeos ou vetores de expressão de DNA cosmídio ou coisa parecida, e tipicamente incluem sequências de promotores. Promotores ilustrativos incluem promotores indutíveis, tais como o promotor lac, opromotor híbrido lacZ do fagemídeo Bluescript 7 [Stratagene, La Jolla, CA] ou pSportl [Gibco BRL]; sistemas promotores lambda de fago; um sistema promotor de triptofano (trp); e híbridos ptrp-lac, e outros. Construções bacterianas de expressão opcionalmente incluem um sítio de ligação ribossômica e sequências regulatórios de sinal de terminação da transcrição. Exemplos ilustrativos de vetores específicos para expressão incluem, por exemplo, pTrcHis2 (Invitrogen, San Diego, CA), pThioHis A, B e C, e numerosos outros conhecidos na técnica ou que possam ser desenvolvidos (ver, por exemplo, Ausubel). Vetores utilizáveis quanto às bactérias incluem aqueles que facilitam a produção de proteínas de fusão de hTRT. Vetores que podem ser empregados para expressão de alto nível de proteínas de fusão em células bacterianas, incluem, mas não se limitam a estes, os vetores multifuncionais de clonagem e de expressão de E. coli, tais como Bluescript7 (Stratagene), observado acima, em que a sequência de codificação da proteína de hTRT, uma proteína de fusão de hTRT ou um fragmento de hTRT, podem ser ligados no vetor em estrutura com as *· y · ·♦· · e_ * * · · ·· ♦ * 9 · · sequências para o terminal amino Met e os subáe’qi|ert<£$' 7 -re^fdXb^.dte’. B- * · ♦ · 9 ··· ♦»· ··· 'w ♦ ’ galactosidase, de modo que uma proteína híbrida seja produzida (por exemplo, vetores pIN; Van Heeke e Schuster, 1989, J. Biol. Chem., 264:
5503). Vetores, tais como os vetores pGEX (por exemplo, pGEX-2TK;
Pharmacia Biotech), também podem ser usados para expressar polipeptídeos estranhos, tais como proteínas de hTRT, como proteínas de fusão com glutationa S-transferase (GST). Tais proteínas de fusão podem ser purificadas das células lisadas, mediante adsorção em contas de glutationa-agarose, seguido por elução na presença de glutationa livre. As proteínas produzidas em tais sistemas frequentemente incluem enterocinase, trombina ou sítios de divagem de protease do fator Xa, de maneira que o polipeptídeo clonado de interesse possa ser liberado da porção de GST à vontade, já que pode ser útil na purificação ou outras aplicações. Outros exemplos são as proteínas de fusão que compreendem hTRT e a Proteína de Ligação Maltose (MBP) de E. coli ou tiorredoxina de E. coli. Exemplos ilustrativos de construções de expressão de hTRT úteis em células bacterianas, são fornecidos no Exemplo 6, abaixo.
A invenção ainda provê polipeptídeos de hTRT expressos em “20 sistemas fungicos, tais como Dictyostelium e, preferivelmente, levedura, tal como Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Torulopsis holmil, Saccharomyces fragilis, Saccharomyces lactis, Hansenula polymorpha e Candida pseudotropicalis. Quando a hTRT é expressa em levedura, vários vetores adequados acham-se disponíveis, incluindo os vetores de 25 cromossomas artificiais de plasmídeo e de levedura (YACs). Os vetores tipicamente incluem sequências de controle da expressão, tais como promotores constitutivos ou indutíveis (poro exemplo, tal como o fator alfa, a álcool oxidase, PGH, e 3-fosfoglicerato cinase ou outras enzimas glicolíticas), e uma origem de replicação, sequências de terminação e outros, como desejável. Vetores adequados para uso em Pichia incluem pPICZ, His6/pPICZB, pPICZalfa, pPIC3.5K, pPIC9K, p&üâl5* í&lW? L.C, pGAP2alfa A, B e C (Invitrogen, San Diego, CA) e numerosos outros conhecidos na técnica ou a serem desenvolvidos. Em uma modalidade, o vetor His6/pPICZB (Invitrogen, San Diego, CA) é usado para expressar uma proteína de fusão His6-hTRT na Pichia pastoris da levedura. Um exemplo de um vetor utilizável em Saccharomyces é o pYES2 (Invitrogen, San Diego, CA). Exemplos ilustrativos de construções de expressão de hTRT úteis em levedura, são fornecidos no Exemplo 6, abaixo.
Os polipeptídeos de hTRT da invenção podem também ser expressos em sistemas celulares vegetais transfectados com vetores de expressão de plantas ou de vírus de plantas (por exemplo, o vírus mosaicos da couve-flor, CaMV; vírus mosaicos do tabaco, TMV), ou transformados com vetores de expressão bacteriana (por exemplo, Ti ou plasmídeo pBR322). Em casos em que os vetores de expressão do vírus vegetal são usados, a expressão de uma sequência codificando hTRT pode ser conduzida por qualquer um dentre vários promotores. Por exemplo, promotores virais, tais como os promotores 35S e 19S de CaMV (Brisson et al., 1984, Nature 310: 511-514), podem ser usados sozinhos ou em combinação com a ^0 sequência ômega principal do TMV (Takamatsu et al., 1987, EMBO J., 6: 307-311). Altemativamente, os promotores vegetais, tais como aquele do gene de subunidade pequena de RUBISCO (Coruzzi et al., 1984, EMBO J., 3: 1671-1680; Broglie et al., 1984, Science 224: 838-843) ou promotores de choque térmico (Winter e Sinibaldi, 1991, Results Probl. Cell Differ., 17:
85), ou promotores de gene proteínicos de armazenagem, podem ser usados.
Estas construções podem ser introduzidas em células vegetais por transformação direta de DNA ou transfecção mediada por patógeno [para verificação de tais técnicas, ver Hobbs ou Murry, 1992, em McGraw Hill Year Book of Science and Technology, McGraw Hill, Nova Iorque, NY, pp.
€'Ύ 191-196 (1992); ou Weissbach e Weissbach, 1988, Methods for Plant • · · · · ·· · · · ··· · ·· * ·· ··· ····· ♦
Molecular Biology, Academic Press, Nova Iorque, J
Outro sistema de expressão propiciado pela invenção para expressão de proteína de hTRT, e um sistema de insetos. Um sistema 5 preferido usa um promotor de baculovírus de poliedrina. Em um tal sistema, o vírus da poli-hedrose nuclear de Autographa californica (AcNPV) é usado como um vetor para expressar genes estranhos em células de spodoptera frugiperda ou em larvas de Trichoplusia. A sequência codificando o gene de interesse pode ser clonada em uma região não essencial do vírus, tal como o 10 gene de poliedrina, e colocado sob controle do promotor da poliedrina. Inserção de sucesso da sequência, por exemplo, codificando a proteína de hTRT, tomará o gene da poliedrina inativo e produzirá vírus recombinante carente da proteína de cobertura. Os vírus recombinantes são, então, usados para infectar as células de S. frugiperda ou larvas de Trichoplusia, em que a 15 sequência de hTRT é, então, expressa (ver, quanto a processos gerais, Smith et al., J. Virol., 46: 584 [1983]; Engelhard et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 91: 3224-7 [1994]). Vetores úteis para expressão de baculovírus incluem pBIueBacHis2 A, B e C, pBlueBac4,5, pMelBacB e numerosos outros I conhecidos na técnica ou a serem desenvolvidos. Exemplos ilustrativos de construções de expressão de hTRT úteis em células de insetos, são providos no Exemplo 6, abaixo.
A presente invenção também provê sistemas de expressão em células de mamíferos. Como observado acima, os polinucleotídeos de hTRT podem ser expressos em células de mamíferos (por exemplo, células 25 humanas), para a produção de quantidades significativas de polipeptídeos de hTRT (por exemplo, para purificação) ou para mudar o fenótipo de uma célula alvo (por exemplo, para finalidades de terapia de genes, imortalização celular, ou outras). No último caso, o polinucleotídeo de hTRT expresso pode, ou não, codificar um polipeptídeo com uma atividade catalítica de telomerase. Isto é, a expressão pode ser de um polinucleotídeo de sentido ou ·· · · ··· · · · ··· ς anti-sentido, um polipeptídeo inibitório ou estimuladorj um polipeptídeo :cbm zero, uma ou mais atividades de telomerase, e outras combinações e variantes aqui apresentadas ou evidentes a uma pessoa experiente, após verificação desta invenção.
Células de cultura de tecido de hospedeiro mamífero adequadas para expressar os ácidos nucleicos da invenção, incluem qualquer célula de animal ou humana, mortal normal ou normal ou imortal anormal, incluindo: linhagem CV1 de rim de macacos transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linhagem de rim embriônico humano [293; Graham et al., J. Gen. Virol. 36: 59 (1977)]; células de rim de hamster filhote (BHK, ATCC CCL 10); CHO (ATCC CCL 61 e CRL 9618); células de Sertoli de camundongos [TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)]; células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde africano (VERO-76, atcc cri 1587); CÉLULAS DE CARCINOMA CERVICAL HUMANO (HeLa, ATCC CCL 2; células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de rim de rato búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmões humanos (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sei. 383: 44-46 (1982); células MDCK (ATCC CCL 34 e CRL 6253); células HEK 293 (ATCC CRL 1573); e células WI-38 (ATCC CCL 75; ATCC: American Type Culture Collection, Rockville, MD). O uso de cultura celular de tecidos de mamíferos para expressar polipeptídeos, é examinado de uma maneira geral em Winnacker, From Genes to Clones (VCH Publishers, Nova Iorque, NY, 1987).
Quanto a células de hospedeiro mamífero, são fornecidos sistemas de expressão não virais. Vetores e sistemas não virais incluem plasmídeos e vetores epissômicos, tipicamente com um cassete de expressão para expressar uma proteína ou RNA, e cromossomas artificiais humanos ·· · · · ·· · · · ··· * ·· · · · ··· ····· · (ver, por exemplo, Harrington et al, 1997, Nat Genei 15:’345). iPor exemplo, vetores não virais úteis para expressão de polinucleotídeos e polipeptídeos de hTRT em células de mamíferos (por exemplo seres humanos), incluem 5 pcDNA3.1/His, pRBVHis A, B e C (Invitrogen, San Diego, CA), vetores
MPSV, outros descritos no Catálogo de 1997 da Invitrogen (Invitrogen Inc., San Diego, CA), que é aqui incorporado em sua totalidade, e numerosos outros conhecidos na técnica para outras proteínas. Exemplos ilustrativos de construções de expressão de hTRT úteis em células de mamíferos, são 10 fornecidos no Exemplo 6, abaixo.
Vetores virais úteis incluem os vetores com base em retrovírus, adenovírus, vírus adeno-associados, vírus do herpes, vetores com base em SV40, papilomavírus, vírus Epstein-Barr HBP, vetores do vírus da vacínia e vírus Semliki Forest (SFV). SFV e vetores da vacínia são 15 examinados no geral em Ausubel et al., acima, Capítulo 16. Estes vetores são frequentemente compostos de dois componentes, um genoma viral modificado e uma estrutura de cobertura circundando-o (ver, no geral, Smith, 1995, Annu. Rev. Microbiol. 49: 807), embora algumas vezes os vetores
virais sejam introduzidos na forma nua ou revestidos com proteínas que não as proteínas virais. No entanto, o ácido nucleico viral em um vetor pode ser modificado de muitas maneiras, por exemplo quando designado para terapia de gene. Os objetivos destas modificações são incapacitar o crescimento dos vírus em células alvo, enquanto se mantém sua capacidade de crescer na forma de vetor em reuniões disponíveis ou células auxiliares (indutoras) para 25 prover espaço dentro do genoma viral para inserção de sequências de DNA exógeno, e incorporar novas sequências que codifiquem e capacitem a expressão apropriada do gene de interesse. Assim, os ácido nucleicos vetores geralmente compreendem dois componentes: sequências virais essenciais cisatuantes para replicação e reunião em uma linhagem auxiliar e a unidade de
transcrição para o gene exógeno. Outras funções virais são expressas em ·· · · ··· · · · ··· * ·· · ·· ··· ···· · · trans, em uma reunião específica ou linhagem de células’*âuxiiiares-'Vetorés adenovirais (por exemplo para uso em terapia de genes humanos) são descritos em, por exemplo, Rosenfeld et al., 1992, Cell 68: 143; publicações 5 PCT WO 94/12650; 94/12649 e 94/12629. Em casos onde um adenovírus seja usado como um vetor de expressão, uma sequência codificando hTRT pode ser ligada em um complexo de transcrição/translação de adenovírus, consistindo do promotor tardio e da sequência principal tripartida. A inserção em uma região El ou E3 não essencial do genoma viral resultará em um vírus 10 viável capaz de expressar em células hospedeiras infectadas (Logan e Shenk,
1984, Proc. Natl. Acad. Sei., 81: 3655). Os vetores retrovirais defectivos de replicação abrigando uma sequência de polinucleotídeo terapêutico como parte do genoma retroviral, são descritos, por exemplo, em Miller et al., 1990, Mol. Cell. Biol. 10: 4239; Kolberg, 1992, J. NIHRes. 4: 43; e Cometta et al., 1991, Hum. Gene Ther. 2: 215.
Em sistemas celulares de mamíferos, os promotores dos genes de mamíferos ou de vírus de mamíferos, são com frequência apropriados. Promotores adequados podem ser constitutivos, específico do tipo celular, ^20 específico de estágio e/ou modulável ou regulável (por exemplo por hormônios como glicocorticóides). Promotores utilizáveis incluem, mas a estes não se limitam, o promotor de metalotioneína, o promotor tardio principal de adenovírus constitutivo, o promotor MMTV indutível de dexametasona, o promotor SV40, o promotor MRP polIII, o promotor MPSV constitutivo, o promotor CMV indutível por tetraciclina (tal como o promotor 25 CMV precoce imediato humano), o promotor CMV constitutivo e as combinações intensificadoras do promotor conhecidas na técnica.
Outros elementos reguladores podem também ser requeridos ou desejados para expressão eficiente de um polinucleotídeo de hTRT e/ou translação de uma sequência codificando proteínas de hTRT. Para translação, estes elementos tipicamente incluem um códon de iniciação de ATG e sítio de ligação ribossômico adjacente ou outras sequências.:*Para:;sq^u^ftèi^s codificando a proteína de hTRT, contanto que seu códon de iniciação e sequências de promotores a montante sejam inseridas em um vetor de 5 expressão, nenhum sinal translacional adicional ou outro de controle, pode ser necessário. No entanto, nos casos em que apenas a sequência de codificação, ou uma sua porção, seja inserida, os sinais de controle transcricional exógeno e/ou translacional (por exemplo, o promotor, o sítio de ligação ribossômica e o códon de iniciação de ATG), devem ser providos 10 com frequência. Além disso, o códon de iniciação deve tipicamente estar na estrutura de leitura correta para assegurar a translação da proteína desejada. Elementos transcricionais exógenos e códons de iniciação, podem ser de várias origens, tanto naturais como sintéticas. Além do mais, a eficiência de expressão pode ser acentuada pela inclusão de intensificadores apropriados 15 ao sistema celular em uso (Scharf et al., 1994, Results Probl. Cell Differ. 20:
125; e Bittner et al. 1987, Meth. Enzymol., 153: 516). Por exemplo, o intensificador SV40 ou o intensificador CMV podem ser usados para aumentar a expressão em células hospedeiras de mamíferos.
A expressão dos produtos do gene de hTRT também podem ser efetuados (aumentados) por ativação de um promotor ou intensificador de hTRT em uma célula tal como uma célula humana, por exemplo, uma linhagem celular negativa de telomerase. A ativação pode ser realizada de uma variedade de maneiras, incluindo a administração de um agente de ativação de promotor exógeno, ou inibição de um componente celular que 25 suprima a expressão do gene de hTRT. Observar-se-á que, reciprocamente, a inibição da função de promotor, como descrito abaixo, reduzirá a expressão do gene de hTRT.
A invenção provê expressão indutível e reprimível de polipeptídeos de hTRT, usando-se o sistema tal como o Sistema de Expressão
Indutível por Ecdisona (Invitrogen) e os sistemas da Clontech regulados por ·· · · ··· · · · ··· * • · · · · · ·· · · · · · * tetraciclina Tet-On e Tet-off. O sistema de expressão Hndiitiv^.gpr^óS^ôha usa um análogo de ecdisona de hormônio esteróide, muristerona A, para ativar a expressão de uma proteína recombinante através de um receptor 5 nuclear heterodimérico (No et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93:
3346). Em uma modalidade da invenção, a hTRT é clonada no vetor pIND (Clontech), que contém cinco elementos de resposta de ecdisona modificada (E/GREs) a montante de um promotor de choque térmico mínimo e no sítio de clonagem múltipla. A construção é então transfectada em linhagens 10 celulares estavelmente expressando o receptor de ecdisona. Após a transfecção, as células são tratadas com muristerona A para induzir a expressão intracelular de pIND. Em outra modalidade da invenção, o polipeptídeo de hTRT é expresso usando-se os sistemas de expressão Tet-on e Tet-off (Clontech), para prover expressão regulada de alto nível do gene 15 (Gossen et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 5547; Gossen et al., 1995, Science 268: 1766).
Os vetores de hTRT da invenção podem ser introduzidos em uma célula, tecido, órgão, paciente ou animal, por uma variedade de ê processos. Os vetores de expressão de ácido nucleico (tipicamente dsDNA) da invenção, podem ser transferidos para a célula hospedeira escolhida, por processos bem conhecidos, tais como transformação de cloreto de cálcio (para sistemas bacterianos), eletroporação, tratamento de fosfato de cálcio, transformação mediada por lipossoma, injeção e microinjeção, processos balísticos, virossomas, imunolipossomas, conjugados de policátion:ácido nucleico, DNA nu, virions artificiais fusão à proteína VP22 estrutural do vírus do herpes (Elliot e O’Hare, Cell 88: 223), absorção de DNA acentuada por agente, e transdução ex vivo. Processos úteis de transferência de DNA mediada por lipossoma são descritos nas Patentes U.S. 5.040.386, U.S. 4.946.787 e U.S. 4.897.355, nas publicações das WO 91/17424, WO
91/16024, e em Wang e Huang, 1987, Biochem. Biophys. Res. Commun. 147:
·· · · ··· · · · ··· ·
980; Wang e Huang, 1989, Biochemistry 28: 9508pLiízinger ej Hjia£g,’*l^|2,
Biochem. Biophys. Acta 1113: 201; Gao e Huang, 1991, Biochem. Biophys.
Res. Commun. 179: 280. Os imunolipossomas têm sido descritos como portadores de polinucleotídeos exógenos (Wang e Huang, 1987, Proc. Natl.
Acad. Sei. U.S.A. 84: 7851; Trubetskoy et al., 1992, Biochem. Biophys. Acta 1131: 311) e podem ter especificidade do tipo celular melhorada, em comparação com os lipossomas, em virtude da inclusão de anticorpos específicos, que presumivelmente ligam a antígenos superficiais em tipos 10 celulares específicos. Behr et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 86:
6982 relata o uso de lipopoliamina como um reagente para mediar a própria transfecção, sem a necessidade de qualquer fosfolipídeo para formar lipossomas. Processos de liberação adequados serão selecionados por médicos tendo em vista as práticas aceitáveis e as exigências reguladoras (por exemplo, para a terapia de genes ou a produção de linhagens celulares, para expressão de proteínas recombinantes). Será observado que os processos de liberação listados acima podem ser usados para transferência de ácidos nucleico para células, para fins de terapia de genes, transferência para células
de cultura de tecidos, e outros.
Para a produção de proteínas recombinantes de alto rendimento, de longo prazo, a expressão estável será frequentemente desejada. Por exemplo, as linhagens celulares que expressam estavelmente HTRT podem ser preparadas usando-se vetores de expressão da invenção, que contêm origens virais de replicação ou elementos de expressão endógena 25 e um gene marcador selecionável. Em seguida à introdução do vetor, pode-se permitir que as células germinem por 1 a 2 dias em um meio enriquecido antes que eles sejam ligados ao meio seletivo. A finalidade do marcador selecionável é conferir resistência à seleção, e. sua presença permite o crescimento de células que sucessivamente expressam as sequências
introduzidas no meio seletivo. Células resistentes, estavelmente ·· · · ··· · · · ··♦ · ·· · · · ··· ····· · transfectadas, podem ser proliferadas usando-se téchícás efescultura dé íêcioos apropriadas ao tipo de célula. Uma etapa de ampliação, por exemplo por administração de metiltrexato a células transfectadas com um gene DHFR de 5 acordo com processos bem conhecidos na técnica, pode ser incluída.
Demais, uma cepa de células hospedeiras pode ser escolhida quanto à sua capacidade para modular a expressão das sequências inseridas ou para processar a proteína expressa na forma desejada. Tais modificações do polipeptídeo incluem, mas não se limitam a estas, acetilação, 10 carboxilação, fosforilação, lipidação e acilação. O processamento póstranslacional também pode ser importante para inserção correta, duplicação e/ou funcionamento. Células hospedeiras diferentes têm maquinaria celular e mecanismos característicos específicos para cada célula para tais atividades pós-translacionais e, assim, uma célula particular pode ser escolhida para 15 garantir a modificação e o processamento corretos da proteína estranha introduzida.
A presente invenção também provê animais transgênicos (isto é, mamíferos transgênicos para uma sequência de gene humano ou outro gene
de TRT) expressando um hTRT ou outro polinucleotídeo ou polipeptídeo de TRT. Em uma modalidade, a hTRT é secretada no leite de um mamífero transgênico, tal como um bovino, cabra ou coelho transgênicos. Processos para produção de tais animais são encontrados, por exemplo, em Heyneker et a/., PCT WO 91/08216.
As proteínas de hTRT e os complexos da invenção, incluem aqueles produzidos usando-se os sistemas de expressão aqui descritos acima, podem ser purificados usando-se uma variedade de processos gerais conhecidos na técnica de acordo com os processos específicos providos pela presente invenção (por exemplo, abaixo). Uma pessoa versada na técnica reconhecerá que, após a síntese química, expressão biológica ou purificação, • · ·♦ ·· a proteína de hTRT pode possuir uma conformação diferente daquela de uma • ··· · conformação nativa de telomerase de ocorrêiíeía: natural:. .grrt. algojis exemplos, pode ser de ajuda ou, mesmo, necessário, desnaturar (por exemplo, incluindo a redução de dissulfeto ou outras articulações) o polipeptídeo e, então, fazer o polipeptídeo reduplicar na conformação preferida. A reduplicação produtiva pode também requerer a presença de hTR (ou fragmentos de hTR). Processos de redução e desnaturação de proteínas e induzir a reduplicação, são bem conhecidos daqueles experientes na técnica (ver, por exemplo, Debinski et al., 1993, J. Biol. Chem., 268: 14065; Kreitman e Pastan,1993, Bioconjug. Chem., 4: 581; e Buchner et al., 1992,
Anal. Biochem., 205: 263; e McCaman et al, 1985, J. Biotech. 2: 177). Ver também a Publicação PCT WO 96/40868, acima.
D) COMPLEXOS DE TRT HUMANA E RNA DE TELOMERASE HUMANA, PROTEÍNAS ASSOCIADAS À TELOMERASE, E OUTRAS BIOMOLÉCULAS PRODUZIDAS POR CO-EXPRESSÃO E
OUTROS MEIOS.
Os polipeptídeos da hTRT da invenção podem associar-se in vivo e in vitro com outras biomoléculas, incluindo RNAs (por exemplo, hTR), proteínas (por exemplo, proteínas associadas à telomerase), DNA [por exemplo, DNA telomérico (T2AG3)J, e nucleotídeos, tais como (deóxi)ribonucleotídeo trifosfatos. Estas associações podem ser aproveitadas para ensaiar a presença ou a função da hTRT, para identificar ou purificar a hTRT ou moléculas associadas à telomerase, e analisar a hTRT ou a estrutura ou função de telomerase, de acordo com os processos da presente invenção.
Em uma modalidade, a presente invenção provê hTRT complexado com (por exemplo, associado ou ligado a) um ácido nucleico, comumente um RNA, por exemplo para produzir uma holoenzima de telomerase. Em uma modalidade, o RNA ligado é capaz de atuar como um padrão para a síntese de DNA mediada por telomerase. Exemplos de RNAs
que podem ser complexados com o polipeptídeo de hTRT, incluem um RNA ·· · · ··♦ · · · ··♦ ♦ ·· · ·· * · * · θ ·· detelomerase de célula hospedeira de ocorrência’ natural, Jum :l^NX*‘fíe ·· • ·♦ «· telomerase humana (por exemplo, hTR (por exemplo, hTR; Patente U.S.
5.583.016), uma subsequência ou domínio de hTR, um RNA sintético, ou outros RNAs. O complexo proteínico RNA-hTRT (um RNP) tipicamente apresenta uma ou mais atividades de telomerase, tais como atividades catalíticas de telomerase. Estes RNPs de hTRT-hTR (ou outros complexos hTRT-RNA) podem ser produzidos por uma variedade de processos, como descrito abaixo quanto às finalidades ilustrativas, incluindo a reconstituição in vitro por co-expressão de hTRT e hTR (ou outro RNA) in vitro (isto é, em um sistema livre de célula), reconstituição in vivo ou reconstituição ex vivo.
Assim, a presente invenção provê, em uma modalidade, um complexo hTRT-hTR (ou outro complexo hTRT-RNA) formado in vitro por mistura separada dos componentes purificados (“reconstituição in vitro”; ver, por exemplo, a Patente U.S. 5.583.016 quanto a uma descrição de reconstituição; ver também Autexier et al., EMBO J. 15: 5928).
Em uma modalidade alternativa, a invenção provê RNPs de telomerase produzidos por co-expressão do polipeptídeo de hTRT e um RNA
(por exemplo, hTR) in vitro em um sistema de transcrição-translação livre de célula (por exemplo, germe de trigo ou lisado reticulócito de coelho). Como mostrado no Exemplo 7, a co-expressão in vitro de um polipeptídeo de hTRT e hTR resulta na produção de atividade catalítica de telomerase (como medido por um ensaio TRAP).
Ainda propiciados pela presente invenção estão os RNPs de telomerase produzidos por expressão do polipeptídeo de hTRT em uma célula, por exemplo, uma célula de mamífero, em que a hTR é naturalmente expressa ou em que a hTR (ou outro RNA capaz de formar um complexo com a proteína de hTRT) é introduzida ou expressa por meio recombinante. Assim, em uma modalidade, hTRT é expressa em uma célula humana negativa de telomerase, em que hTR está presente (por exemplo, células BJ ·« · · ··· ♦ ♦ · ··· ♦ ·· · · · · ·· · · · · · * ou IMP90), permitindo que as duas moléculas sé' uiiami em.jum !Ém outra modalidade, a hTRT é expressa em uma célula humana ou não humana, em que hTR é expressa recombinantemente. Processos para expressão de 5 hTR em uma célula são encontrados na Patente U.S. 5.583.016. Além disso, um clone contendo um cDNA codificando o componente de RNA de telomerase, foi colocado sob depósito como pGRN33 (ATCC 75926).
Sequências genômicas codificando o componente de RNA de telomerase humana, acham-se também sob depósito no inserto SauIIIAl a 10 HindIII de ~15 kb do clone lambda 28-1 (ATCC 75925). Quanto à expressão em células eucarióticas, a sequência de hTRT tipicamente será operavelmente ligada a uma sequência de iniciação da transcrição (sítio de ligação da polimerase de RNA) e sequências do terminador de transcrição (ver, por exemplo, a Publicação PCT WO 96/01835; Feng et al., 1995, Science 269: 15 1236).
A presente invenção ainda provê polipeptídeos de hTRT recombinantemente produzidos ou substancialmente purificados, coexpressos e/ou associados com as assim chamadas “proteínas associadas com 'l telomerase”. Assim, a presente invenção provê hTRT co-expressa com ou “20 complexada com outras proteínas (por exemplo, proteínas associadas com telomerase). As proteínas associadas com telomerase são aquelas proteínas que se co-purificam com a telomerase humana e/ou que podem desempenhar um papel na função ou atividade de modular a telomerase, por exemplo por participar na associação da telomerase com DNA telomérico. Exemplos de 25 proteínas associadas com telomerase incluem (mas não se limitam a estas) as seguintes proteínas e/ou seus homólogos humanos: nucleolin (ver Srivastava et al., 1989, FEBS Letts. 250: 99); EF2EÍ (fator de alongamento 2 homolog; ver Nomura et al., 1994, DNA Res. (Japão) 1:27, GENBANK acesso D21163); TP1/TLP1 (Harrington et al., 1997, Science 275: 973; Nakayama,
1997, Cell 88: 875); o homólogo humano do Tetrahymena p95 ou o próprio ·· · « ·«· * » · e·· * p95 (Collins et al., 1995, Cell 81: 677); TPC2 (uiirá pròfema jegúlgtoría”(|e comprimento telômero; número de acesso ATCC 97708; TPC3 (também uma proteína regulatória de comprimento telômero; número de acesso ATCC 97707. proteína B de ligação a DNA (dbpB; Horwitz et al, 1994, J. Biol. Chem. 269: 14130; e Fatores de Ligação de Repetição de Telômero (TRF 1 e 2; Chang et al., 1995, Science 270: 1663; Chong etal., 1997, Hum Mol Genet 6: 69); EST1, 3 e 4 (Lendvay et al., 1996, Genetics 144: 1399, Nugent et al., 1996, Science 274: 249, Lundblad et al., 1989, Cell 57: 633); e fator de cobertura final (Cardenas et al., 1993, Genes Dev. Ί: 883).
As proteínas associadas à telomerase podem ser identificadas na base de co-purificação ou ligação com a proteína de hTRT do RNP hTRThTR. Altemativamente, elas podem ser identificadas na base da ligação a uma proteína de fusão de hTRT, por exemplo uma proteína de fusão GSThTRT ou coisa parecida, como determinado pela purificação de afinidade (ver Ausubel et al., Capítulo 20). Uma técnica particularmente útil para avaliar interações proteína-proteína, que é aplicável para identificar as proteínas associadas a hTRT, é o processo de duas triagens híbridas de Chien et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 9578 [1991]; ver também Ausubel et al., acima, no Capítulo 20). Esta triagem identifica as interações proteínaproteína in vivo através da reconstituição de um ativador transcricional, a proteína de transcrição de levedura Gal4 (ver Fields e Song, 1989, Nature 340: 245. O processo se baseia nas propriedades da proteína de levedura Gal4, que consiste de domínios separáveis responsáveis pela ligação de DNA e ativação transcricional. Os polinucleotídeos, comumente vetores de expressão, codificando duas proteínas híbridas, são construídos. Um polinucleotídeo compreende o domínio de ligação do DNA de levedura Gal4 fundido a uma sequência de polipeptídeos de uma proteína a ser testada quanto a uma interação de hTRT (por exemplo, nucleolin de EF2H).
<33
Altemativamente, o domínio de ligação do DNA da levedura Gal4 é fundido tl · ♦ » · · *·· * • · · · « ·»* ····♦* * r aos cDNAs de uma célula humana, assim criando iimà çtíl®çã,4,(|^ jftoíéftfís humanas fundidas ao domínio de ligação do DNA Gal4 para triar quanto às proteínas associadas à telomerase. O outro polinucleotídeo compreende o domínio de ativação Gal4 fundido a uma sequência de polipeptídeo de hTRT. As construções são introduzidas em uma célula hospedeira de levedura. Após expressão, a ligação intermolecular entre hTRT e a proteína de teste podem reconstituir o domínio de ligação de DNA Gal4 com o domínio de ativação Gal4. Isto conduz à ativação transcricional de um gene repórter (por exemplo, lacZ, HIS3) operavelmente ligado a um sítio de ligação Gal4. Mediante seleção para, ou mediante ensaio do repórter, as colônias de genes de células que contêm uma proteína de interação de hTRT ou proteína associada à telomerase, podem ser identificadas. Aqueles de experiência observarão que existem numerosas variações da triagem de 2 híbridos, por exemplo o sistema LexA (Bartel et al., 1993, em Cellular Interactions in Development'. A Practical Approach, Ed. Hartley, D. A. (Oxford Univ. Press) pp. 153-179).
Outro processo útil para identificar as proteínas associadas à telomerase é um sistema de três híbridos (ver, por exemplo, Zhang et al., 1996, Anal. Biochem, 242: 68; Licitra et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93: 12817). O componente de RNA de telomerase pode ser utilizado neste sistema com a proteína de TRT ou de hTRT e uma proteína de teste. Outro processo útil para identificar proteínas de interação, particularmente (isto é, proteínas que heterodimerizam ou formam heteromultímeros de ordem mais elevada), é o sistema de triagem interativa E. coli/BCCP (ver Germino et al. (1993) Poroc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 90: 933; Guarente (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. (U.S. A.) 90: 1639).
A presente invenção também provê complexos de proteínas de ligação de telômeros (que podem ou não ser proteínas associadas à telomerase) e hTRT (que podem ou não ser complexadas com hTR, outros ·« « 4 4·«· 4 · • * · · · ·«· 4 4 4*4 ·
RNAs, ou uma ou mais proteínas associadas à téibmeráséj.jExènlpíçsMe proteínas de ligação de telômeros incluem TRF1 eTRF2 (acima); mpAl, mpA2,RAPl (Buchman et al., 1988, Mol. Cell. Biol. 8: 210, Buchman et al., 5 1988, Mol. Cell. Biol. 8: 5086), SIR3 e SIR4 (Aparicio et al., 1991, Cell 66:
1279), TEL1 (Greenwell et al., 1995, Cell 82: 823; Morrow et al., 1995, Cell 82: 831); ATM (Savitsky et al., 1995, Science 268: 1749), fator de cobertura final (Cardenas et al., 1993, Genes Dev. T. 883), e homólogos humanos correspondentes. Os complexos acima mencionados podem ser produzidos de 10 modo geral como descrito acima para os complexos hTRT e hTR ou proteínas associadas à telomerase, por exemplo mediante a mistura ou coexpressão in vitro ou in vivo.
V. ANTICORPOS E OUTROS AGENTES DE LIGAÇÃO
Em um aspecto relacionado, a presente invenção provê anticorpos que são especificamente imuno-reativos com hTRT, incluindo anticorpos policlonais e monoclonais, fragmentos de anticorpos, anticorpos de cadeia única, anticorpos humanos e quiméricos, incluindo anticorpos ou fragmentos de anticorpos fundidos à cobertura de fago ou às proteínas superficiais celulares, e outros conhecidos na técnica e aqui descritos. Os 20 anticorpos da invenção podem, especificamente, reconhecer e ligar polipeptídeos que têm uma sequência de aminoácidos que é substancialmente idêntica à sequência do aminoácido apresentada na Figura 17 (SEQUÊNCIA ID NO: 2), ou um seu fragmento imunogênico ou epítopo na proteína por ela definida. Os anticorpos da invenção podem apresentar uma afinidade de 25 ligação específica para hTRT de pelo menos cerca de 107, 108, 109 ou IO10 M* ’, e pode ser policlonal, monoclonal, recombinante ou de outra forma produzida. A invenção também provê anticorpos anti-hTRT que reconhecem um epítopo conformacional de hTRT (por exemplo, um epítopo na superfície da proteína de hTRT ou um RNP de telomerase). Epítopos provavelmente
WI conformacionais podem ser identificados, se desejável, por análise assistida *· « a *«« · · · »*· ♦ por computador, da sequência de proteína de hTRrF,’ejn<dc«npw|.ra^ã(l*càilÍ*^ conformação das transcriptases reversas relacionadas, tais como a subunidade p66 de HIV-1 (ver, por exemplo, a Figura 3), ou empiricamente. Os 5 anticorpos anti-hTRT que reconhecem os epítopos conformacionais têm utilidade, entre outros, na detecção e purificação da telomerase humana e no diagnóstico e tratamento de doenças humanas.
Para a produção de anticorpos anti-hTRT, hospedeiros tais como cabras, carneiros, vacas, porquinhos da índia, coelhos, ratos ou camundongos, podem ser imunizados por injeção com proteína de hTRT ou qualquer porção, fragmento ou oligopeptídeo desta, que retenha propriedades imunogênicas. Na seleção de polipeptídeos de hTRT para indução de anticorpos, não se necessita reter atividade biológica; no entanto, o fragmento de proteína, ou oligopeptídeo, deve ser imunogênico e, preferivelmente, antigênico. A imunogenicidade pode ser determinada injetando-se um polipeptídeo e adjuvante em um animal (por exemplo, um coelho) e ensaiando-se quanto ao aparecimento de anticorpos dirigidos contra o polipeptídeo injetado (ver, por exemplo, Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nova Iorque (1988), io que é incorporado em sua totalidade e para todas as finalidades, por exemplo no Capítulo 5). Os peptídeos usados para induzir anticorpos específicos tipicamente têm uma sequência de aminoácidos consistindo de pelo menos 10 aminoácidos. Comumente, eles imitam ou têm substancial identidade de sequência a toda, ou a uma porção contígua, da sequência de aminoácido da 25 proteína de SEQUÊNCIA ID NO: 2. Alongamentos curtos dos aminoácidos da proteína de hTRT podem ser fundidos com aqueles de outra proteína, tal como a hemocianina de moluscos lapa de buraco de fechadura, e um anticorpo anti-hTRT produzido contra a molécula quimérica. Dependendo da espécie de hospedeiro, vários adjuvantes podem ser usados para aumentar a resposta imunológica.
' · · ·»· · · · ··· · • · · * ···*···· ·
O antígeno é apresentado ao sistema rnirrêie em jOma IpAja determinada por processos apropriados para o animal. Estes e outros „ parâmetros são geralmente bem conhecidos dos imunologistas. Tipicamente, ·. 5 as injeções são dadas nas patas, intramuscularmente, intradermicamente, na perilinfa nodal ou intraperitonealmente. As imunoglobulinas produzidas pelo hospedeiro pode ser precipitada, isolada e purificada por processos de rotina, incluindo a purificação de afinidade.
Exemplos ilustrativos de peptídeos de hTRT imunogênicos 10 são providos no Exemplo 8. Além disso, o Exemplo 8 descreve a produção e o uso de anticorpos policlonais anti-hTRT.
A) ANTICORPOS MONOCLONAIS
Anticorpos monoclonais a proteínas e peptídeos de hTRT podem ser preparados de acordo com os processos da invenção, usando-se 15 qualquer técnica que proporcione a produção de moléculas de anticorpos por linhagens de células contínuas em cultura. Estas incluem, mas não se limitam a estas, a técnica de hibridomas originalmente descrita por Koehler e Milstein \Nature 256: 495 (1975)], a técnica de hibridoma de célula B humana (Kosbor et al., 1983, Immunol. Today 4: 72; Cote et al., 1983, Proc. Natl.
-fzo Acad. Sei. USA, 80: 2026), e a técnica de EBV-hibridoma [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, Alan R. Liss Inc., Nova Iorque, ΝΥ,ρρ. 77-96(1985)].
Em uma modalidade, animais apropriados são selecionados e o protocolo de imunização apropriado é seguido. A produção de anticorpos 25 monoclonais não humanos, por exemplo de murino, lagomorpha, eqüinos, é bem conhecida e pode ser realizada, por exemplo, por imunização de um animal com uma preparação contendo hTRT ou seus fragmentos. Em um processo, após o período de tempo apropriado, os baços dos animais são excisados e as células esplênicas individuais são fundidas, tipicamente, em
103 células de mieloma imortalizadas sob condições de seleção apropriadas. Após ·*· · ·*· *· ·· · · · · · · isso, as células são clonalmente separadas e os §6bte^(|ânifcs:dejjçâ&*àone (por exemplo, hibridoma) são testados quanto à produção de um anticorpo específico apropriado para a região desejada do antigeno. As técnicas para produzir anticorpos são bem conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, Goding et al., Monoclonal Antibodies: Principies and Practice (2- Ed.) Acad. Press, N.Y., e Harlow e Lane, acima, cada dos quais é incorporado em sua totalidade e para todos os propósitos. Outras técnicas adequadas envolvem a exposição in vitro de linfócitos aos polipeptídeos antigênicos ou, altemativamente, a seleção de coleções de anticorpos em fago ou vetores similares (ver abaixo).
B) ANTICORPOS HUMANOS
Em outro aspecto da invenção, os anticorpos humanos contra um polipeptídeo de hTRT são fornecidos. Os anticorpos monoclonais humanos contra um antigeno conhecido, pode também ser produzido usandose animais transgênicos tendo elementos de um sistema imune humano (ver, por exemplo, as Patentes U.S. 5.569.825 e U.S. 5.545.806, ambas as quais são incorporadas por referência em sua totalidade, para todos os propósitos) ou usando-se células sanguíneas periféricas humanas (Casali et al., 1986, Science 234: 476). Alguns anticorpos humanos são selecionados por experiências de ligação competitiva ou, de outra forma, para terem a mesma especificidade de epítopo de um anticorpo particular de camundongos.
Em uma modalidade alternativa, os anticorpos humanos para um polipeptídeo de hTRT podem ser produzidos por triagem de uma coleção de DNA de células B humanas, de acordo com o protocolo geral delineado por Huse et al., 1989, Science 246: 1275, que é incorporado por referência. Os anticorpos ligando-se ao polipeptídeo de hTRT são selecionados. As sequências codificando tais anticorpos (ou fragmentos de ligação) são, então, clonados e ampliados. O protocolo descrito por Huse é frequentemente usado com a tecnologia de exposição de fago.
·· · · ··· · · · ··· ·
C) ANTICORPOS HUMANIZADOS OU QUlMÉktéoXl X H
A invenção também provê anticorpos anti-hTRT, que são tomados quiméricos, semelhantes aos humanos ou humanizados, para reduzir 5 sua antigenicidade potencial, sem reduzir sua afinidade quanto a seu alvo. A preparação de anticorpos quiméricos, semelhantes aos humanos e humanizados, tem sido descrita na técnica (ver, por exemplo, as Patentes U.S. 5.585.089 e 5.530.101; Queen et al., 1989, Proc. Nat’l Acad. Sei. USA 86: 10029; e Verhoeyan et al., 1988, Science 239: 1534; cada dos quais é 10 incorporado por referência em sua totalidade e para todos os propósitos). As imunoglobulinas humanizadas têm regiões de estrutura variável substancialmente de uma imunoglobulina humana (denominada de uma imunoglobulina aceptora) e regiões determinantes de complementaridade substancialmente de uma imunoglobulina não humana (por exemplo, de 15 camundongo) (referida como a imunoglobulina doadora). A(s) região(ões) constante(s), se presente(s), é(são) também substancialmente de uma imunoglobulina humana.
Em algumas aplicações, tais como a administração a pacientes humanos, os anticorpos anti-hTRT humanizados (bem como humanos) da 20 presente invenção oferecem várias vantagens sobre os anticorpos de murino ou de outras espécies: (1) o sistema imune humano não deve reconhecer a estrutura ou a região constante do anticorpo humanizado como estranho e, portanto, a resposta do anticorpo contra um tal anticorpo injetado deve ser menor do que contra um anticorpo de camundongo totalmente estranho ou 25 um anticorpo quimérico parcialmente estranho; (2) tendo em vista que a porção efetora do anticorpo humanizado é humana, ela pode interagir melhor com outras partes do sistema imune humano; e (3) anticorpos humanizados injetados têm uma meia-vida essencialmente equivalente aos anticorpos humanos de ocorrência natural, permitindo doses menores e menos
100 iz?ó frequentes do que os anticorpos de outras espécies. Como implícito do acima, ·· · · ··· · · · ··· · ·· · ·· · ·· ····· · os anticorpos de hTRT têm aplicação no tratamento ’^hfdo.^n^,:lsfo ê*j das células alvo positivas de telomerase.
D) EXPOSIÇÃO DE FAGO
A presente invenção também provê anticorpos anti-hTRT (ou composições de ligação) produzidos por processos de exposição de fago (ver, por exemplo, Dower et al., WO 91/17271 e McCafferty et al., WO 92/01047; e Vaughan et al., 1996, Nature Biotechnology, 14: 309; cada dos quais é incorporado por referência em sua totalidade para todas as finalidades).
Nestes processos, as coleções de fato são produzidas, nas quais os membros expõem diferentes anticorpos em suas superfícies externas. Os anticorpos são comumente expostos como fragmentos de Fv ou Fab. Os anticorpos de exposição de fato com uma especificidade desejada são selecionados por enriquecimento de afinidade a um polipeptídeo de hTRT.
Em uma variação do processo de exposição de fato, os anticorpos humanizados que têm a especificidade de ligação de um anticorpo de murino selecionado, podem ser produzidos. Neste processo, ou a região variável de cadeia pesada ou a de cadeia leve do anticorpo de murino selecionado, é usada como um material de partida. Se, por exemplo, uma io região variável de cadeia leve for selecionada como o material de partida, uma coleção de fago é construída, na qual os membros apresentam a mesma região variável de cadeia leve (isto é, o material de partida de murino) e uma região variável de cadeia pesada diferente. As regiões variáveis de cadeia pesada são obtidas de uma coleção de regiões variáveis de cadeia pesada humanas re-organizadas. Um fago apresentando uma ligação específica forte para o polipeptídeo de hTRT (por exemplo, pelo menos 108 e, preferivelmente, pelo menos 109 M1) é selecionado. A região variável de cadeia pesada humana deste fago, então, serve como um material de partida para construir uma outra coleção de fago. Nesta coleção, cada fago expõe a
101
L<3ó mesma região variável de cadeia pesada (isto é, a região identificada da • · · · *· · · · · · · · · · • · * · · · ·· · · · · · · primeira coleção de exposição) e uma regiã$>*’ y^aij^Vjèl .&Qf.Q&iejh“Íeve diferente. As regiões variáveis de cadeia leve são obtidas de uma coleção de regiões de cadeia leve variáveis humanas re-organizadas. Novamente, os fagos apresentando forte ligação específica, são selecionados. Estes fagos expõem as regiões variáveis de anticorpos anti-hTRT completamente humanos. Estes anticorpos comumente têm a mesma especificidade de epítopo ou similar, como o material de partida de murinos.
E) ANTICORPOS HÍBRIDOS
A invenção também provê anticorpos híbridos, que compartilham a especificidade de anticorpos contra um polipeptídeo de hTRT, mas também são capazes de ligação específica a uma segunda porção. Em tais anticorpos híbridos, um par de cadeias pesada e leve é usualmente de um anticorpo anti-hTRT, e o outro par, de um anticorpo surgido contra outro epítopo ou proteína. Isto resulta na propriedade de valência multi-funcional, isto é, a capacidade de ligar pelo menos dois epítopos diferentes simultaneamente, onde pelo menos um epítopo é o epítopo ao qual o anticorpo anti-complexo de liga. Tais híbridos podem ser formados por fusão de hibridomas produzindo os respectivos anticorpos componentes, ou por técnicas recombinantes. Tais híbridos podem ser usados para transportar um composto (isto é, um medicamento) a uma célula positiva à telomerase (isto é, um agente citotóxico é liberado a uma célula cancerígena).
As imunoglobulinas da presente invenção também podem ser fundidas a regiões funcionais de outros genes (por exemplo, enzimas), para produzir proteínas de fusão (por exemplo, imunotoxinas) tendo propriedades úteis.
F) ANTICORPOS ANTI-IDIOTÍPICOS
Igualmente úteis são os anticorpos anti-idiótipos, que podem ser isolados pelos procedimentos acima. Os anticorpos anti-idiotípicos
102 podem ser preparados, por exemplo, por imunização de um animal com o ♦ · *·· · · *· · « · ♦ · ♦ · · · · anticorpo principal (isto é, anticorpos anti-hTkT ’otri séug. ^rjgtpejltüi de ligação a hTRT). Quanto aos anticorpos anti-hTRT, anticorpos anti-idiótipos, , cuja ligação ao anticorpo principal é inibida poro um polipeptídeo de hTRT i 5 ou seus fragmentos, são selecionados. Uma vez que tanto o anticorpo antiidiotípico quanto o polipeptídeo de hTRT ou seus fragmentos, se ligam à imunoglobulina primária, a imunoglobulina anti-idiotípica pode representar a “imagem interna” de um epítopo e, assim, pode substituir o polipeptídeo de hTRT nos ensaios, ou pode ser usada para ligar (isto é, inativar) os anticorpos 10 anti-hTRT, por exemplo, em um paciente. Os anticorpos anti-idiótipo podem também interagir com proteínas associadas à telomerase. Anticorpos antiidiótipos também podem interagir com proteínas associadas à telomerase. A administração de tais anticorpos pode afetar a função da telomerase mediante remoção por titulação ou competição com hTRT na ligação às proteínas 15 associadas a hTRT.
G) GERAL
Os anticorpos da invenção podem ser de qualquer isótipo, por exemplo IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, com IgG, IgA e IgM sendo
frequentemente preferidos. Os anticorpos humanizados podem compreender sequências de mais do que uma classe ou isótipo.
Em outra versão da invenção, são fornecidos fragmentos dos anticorpos intactos descritos acima. Tipicamente, estes fragmentos podem competir com o anticorpo intacto de que eles foram derivados para ligação específica ao polipeptídeo hTRT e ligarem-se com uma afinidade de pelo 25 menos 10Á 10^, 1()9 M“l, ou ΙΟ^θ MÊ Fragmentos de anticorpos incluem cadeias pesadas separadas, cadeias leves, Fab, Fab' F(ab')2, Fabc e Fv. Os fragmentos podem ser produzidos por separação enzimática ou química de imunoglobulinas intactas. Por exemplo, um fragmento F(ab')2 pode ser obtido de uma molécula IgG por digestão proteolítica com pepsina em pH
103
3,0-3,5, empregando-se métodos padrão tais como aqueles descritos em
Harlow e Lane, supra. Os fragmentos Fab podem ser obtidos de .^agM^itos
F(ab')2 Por redução limitada, ou de anticorpo inteiro por digestão com papaína, na presença de agentes de redução (vide genericamente Paul, W., ed
FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY 2ND Raven Press, N.Y., 1989, Ch. 7, incorporado por referência em sua totalidade para todas as finalidades). Os fragmentos podem também ser produzidos por técnicas de DNA recombinante. Os segmentos dos ácidos nucleicos codificando fragmentos selecionados são produzidos por digestão de seqüências de codificação de 10 inteiro-comprimento com enzimas de restrição, por pela síntese de novo.
Com freqüência os fragmentos são expressos na forma de proteínas de fusão com revestimento-fago.
Muitas das imunoglobulinas descritas acima podem sofrer substituições, adições ou deleções de aminoácidas não críticas nas regiões 15 tanto variável como constante, sem perda da especificidade de ligação ou funções efetoras, ou redução intolerável da afinidade de ligação (isto é, abaixo de cerca de 10? M“i). Usualmente, as imunoglobulinas incorporando tais alterações exibem substancial identidade de seqüência com uma imunoglobulina de referência de que elas foram derivadas. Uma ^0 imunoglobulina mutada pode ser selecionada tendo a mesma especificidade e afinidade aumentada, em comparação com uma imunoglobulina de referência de que ela foi derivada. A tecnologia de exibição-do-fago oferece técnicas úteis para selecionar tais imunoglobulinas. Vide, por exemplo, Dower e outros, WO 91/17271 McCafferty e outros, WO 92/01047; e Huse, WO,
92/06204.
sem modificação. Freqüentemente, os anticorpos serão rotulados pela união, covalente ou não-covalentemente, de um rótulo detectável. Como as entidades de ligação rotuladas, os anticorpos da invenção são particularmente
Os anticorpos da presente invenção podem ser usados com ou
104 úteis em aplicações diagnosticas.
·· · · ··· · · · ··· ·
Os anticorpos anti-hTRF da invençãí>‘pédbín’séj púrjôçadòs * · ·· · ··· ··· ··· · · empregando-se métodos bem conhecidos. Os inteiros anticorpos, seus dímeros, cadeias individuais leves e pesadas ou outras formas de 5 imunoglobulina da presente invenção podem ser purificados empregando-se os métodos e reagentes da presente invenção de acordo com procedimentos padrão da arte, incluindo precipitação de sulfato de amônio, colunas de afinidade, cromatografia de coluna, eletroforese gel e similares (vide genericamente Scopes, PROTEIN PURIFICATION: PRINCÍPIOS AND 10 PRACTICE 3a. Edição (Springer-Verlag, N.Y., 1994)). Imunoglobulinas substancialmente puras, de pelo menos cerca de 90 a 95%, ou mesmo 98 a 99% ou mais de homogeneidade, são preferida.
VI. PURIFICAÇÃO DA TELOMERASE HUMANA
A presente invenção fornece telomerase humana isolada de 15 pureza sem-precedente. Em particular, a presente invenção fornece: hTRF purificada de origem recombinante ou não-recombinante; os complexos hTRT-hTRT purificados (isto é, RNPs), de origem recombinante, nãorecombinante ou mista, opcionalmente compreendendo uma ou mais proteínas associadas da telomerase; telomerase humana purificada, io naturalmente ocorrente; e similares. Além disso, a invenção fornece métodos e reagentes para parcial, substancial ou altamente purificar as moléculas e complexos acima, incluindo variantes, proteínas de fusão, proteínas naturalmente ocorrentes e similares (coletivamente referidas como hTRT e/ou complexos hTRT).
Antes da presente descrição, tentativas têm sido feitas para purificar o complexo de enzima de telomerase satisfazendo a homogeneidade com sucesso limitado. Os métodos fornecidos nas aplicações acima listadas fornecem purificação da telomerase por aproximadamente até 60.000 vezes ou mais, em comparação com os extratos de células brutas. A presente
105
4θ
1W invenção fornece hTRT e complexos hTRT ou mesmo pureza maior, em parte em consequência dos novos reagentes de imunoaTiàidádé (tio£«èx€fnjl?lb.{ * · ·· · v·· ··· ··· · · anticorpos anti-hTRT) da presente invenção e/ou reagentes, células e métodos providos aqui para expressão recombinante de hTRT. A expressão recombinante de hTRT e complexos hTRT facilita a purificação, porque as moléculas desejadas podem ser produzidas em níveis muito mais elevados do que os encontrados na maioria das células se expressando ocorrendo na natureza e/ou porque a molécula hTRT recombinante pode ser modificada (por exemplo, por fusão com um rótulo de epítopo), de modo que ela pode ser facilmente purificada.
Será reconhecido que a telomerase naturalmente ocorrente pode ser purificada de qualquer célula telomerase-positiva e os hTRT e complexos de hTRT recombinantes podem ser expressos e purificados, empregando-se, entre outros, quaisquer sistemas de expressão de planta ou animal in vitro, in vitro, e ex vivo descritos acima, ou outros/sistemas conhecidos na arte.
Em uma versão, a hTRT, telomerase e outras composições da invenção são purificadas usando-se uma etapa de imunoafinidade, sozinha ou em combinação com outras etapas de purificação. Tipicamente, um anticorpo anti-hTRT imobilizado ou imobilizável, como provido pela presente invenção, é contatado com uma amostra, tal como um lisado celular, que contém a desejada hTRT ou complexo contendo-hTRT sob condições em que o anticorpo anti-hTRT liga-se ao antígeno de hTRT. Após remoção dos componentes não-ligados da amostra pelos métodos bem conhecidos na arte, a composição de hTRT pode ser eluída, se desejado, do anticorpo, em forma substancialmente pura. Em uma versão, são empregados os métodos de cromatografia de imunoafinidade bem conhecidos na arte (vide, por exemplo, Harlow e Lane, supra; e Ausubel, supra; Hermansan e outros 1992, IMOBILIZED AFFINITY LIGAND TECHNIQUES (Academic Press, San
106
Diego)), de acordo com os métodos da invenção. Em outra versão ilustrativa, a imunoprecipitação de anti-hTRT-imunoglobuliiÍa*-cbrtif>lêxds • · ·· · ··· ··· ··· · · realizada usando-se Proteína A imobilizada. Numerosas variações e protocolos de purificação de imunoafinidade alternativos, adequados para uso de acordo com os métodos e reagentes da invenção, são bem conhecidos daqueles hábeis.
Em outra versão, as proteínas hTRT recombinantes podem, como conseqüência de seu elevado nível de expressão, ser purificadas usando-se métodos de purificação de proteína de rotina, tais como 10 precipitação de sulfato de amônio, colunas de afinidade (por ex., imunoafinidade), exclusão de tamanho, cromatografia de troca aniônica e catiônica, eletroforese gel e similares (vide, genericamente, R. Scopes, PROTEIN PURIFICATION, Springer-Verlag, N.Y. (1982) e Deutscher, METHODS IN ENZYMOLOGY VOL. 182: GUIDE TO PROTEIN 15 PURIFICATION, Academic Press, Inc., N.Y. (1990)) em vez de, ou em adição a, métodos de imunoafinidade. Os métodos de troca catiônica podem ser particularmente úteis devido ao pi básico da proteína hTRT. Por exemplo, fosfato imobilizado pode ser usado como um grupo funcional de permuta catiônica (por exemplo, Fosfocelulose P-ll, catálogo de Whatman #4071 ou io Fosfato de Celulose, catálogo Sigma #C3145). O fosfato imobilizado tem dois aspectos vantajosos para purificação de hTRT - é uma resina de troca catiônica e apresenta semelhança física com a cadeia principal do fosfato do ácido nucleico. Isto pode permitir cromatografia de afinidade, porque a hTRT liga-se a hTR e DNA telomérico. Outros métodos de cromatografia de 25 afinidade de ácido nucleico não específicos e específicos são úteis para purificação (por exemplo, Alberts e outros, 1971, Methods Enzymol. 21:198: Amt-Jovin e outros, 1975, Eur. J. Biochem. 54:411; Pharmacia catalog # 275575-02). Mais exploração desta função de ligação da hTRT poderia incluir o uso de cromatografia de afinidade de ácido nucleico específico (por exemplo,
107 iniciação de telomerase ou hTR) para purificação (Chodosh e outros, 1986, ·· · · ··· · · · ··· «
Mol. Cell. Biol. 6:4723: Wu e outros, 1987, Science* 238^124¾ ÍCadôú‘agja· ' · · ·♦ · ··· ··· ··· · ^ ·
1991, Methods Enzymol. 208.10); Corante Azul Cibricon imobilizado, que apresenta semelhança física com os nucleotídeos, é outra resina útil para purificação de hTRT (Pharmacia catalog # 17-0948-01 ou Sigma catalog # Cl285), devido à ligação hTRT de nucleotídeos (por exemplo, como substratos para síntese do DNA).
Em uma versão, as proteínas de hTRT são isoladas diretamente de um sistema de expressão in vitro ou in vivo, em que outros componentes da telomerase não são coexpressos. Será reconhecido que a proteína de hTRT isolada pode também ser prontamente obtida de telomerase humana purificada ou complexos de hTRT, por exemplo, rompendo-se a telomerase RNP (por exemplo, por exposição a um suave ou outro desnaturante) e separando-se os componentes de RNP (por exemplo, por 15 meios de rotina, tais como cromatografia ou cromatografia de imunoafinidade).
A purificação da telomerase pode ser monitorada empregando-se um ensaio de atividade de telomerase (por exemplo, o ensaio TRAP, ensaio convencional, ou ensaio de ligação-iniciação), medindo-se o 20 enriquecimento de hTRT (por exemplo, por ELISA), medindo-se o enriquecimento de hTR ou outros métodos conhecidos na arte.
A telomerase humana purificada, proteínas hTRT e complexos hTRT, providos pela presente invenção, são, em uma versão, altamente purificados (isto é, pelo menos cerca de 90% homogêneos). A 25 homogeneidade pode ser determinada por meios padrão, tais como eletroforese gel SDS-poliacrilamida e outros meios conhecidos na arte (vide, por exemplo, Ausubel e outros, supra). Será entendido que, embora a telomerase humana altamente purificada, proteína de hTRT, ou complexos de hTRT sejam, às vezes, desejadas, a telomerase humana substancialmente
108
115 purificada (por exemplo, pelo menos cerca de 75% homogênea) ou ·· · · ··· ♦ · · ··· · ·· · ·· ··· ····· · parcialmente purificada (por exemplo, pelo mênpsj: çêrçà homogênea), a proteína hTRT ou complexos de hTRT são úteis em muitas aplicações e são também providos pela presente invenção. Por exemplo, a 5 telomerase parcialmente purificada é útil para selecionar os compostos de teste para atividade moduladora da telomerase e outros usos (vide, infra e supra; vide Patente U.S. No. 5.645.986).
VIL TRATAMENTO DE DOENÇA RELACIONADA COM A TELOMERASE
A) INTRODUÇÃO
A presente invenção fornece polinucleotídeos hTRT, polipeptídeos e anticorpos úteis para o tratamento de doenças humanas e condições doentias. Os produtos genéticos de hTRT recombinante e sintética (proteína e mRNA) da invenção podem ser usados para criar ou elevar a 15 atividade da telomerase em uma célula, bem como para inibir a atividade da telomerase em células em que não é desejada. Assim, a inibição, ativação ou de outro modo alterar a atividade da telomerase (por exemplo, atividade catalítica da telomerase, fidelidade, processabilidade, ligação telomérica etc.) em uma célula pode ser usada para mudar a capacidade proliferativa da 20 célula. Por exemplo, a redução da atividade da telomerase em uma célula imortal, tal como uma célula tumoral maligna, pode tomar a célula mortal. Ao contrário, o aumento da atividade da telomerase em uma célula mortal (por exemplo, a maioria das células somáticas humanas) pode aumentar a capacidade proliferativa da célula. Por exemplo, a expressão da proteína 25 hTRT em fibroblastos dérmicos, desse modo aumentando o comprimento do telômero, resultará em capacidade proliferativa aumentada do fibroblasto; tal expressão pode tomar lento o ou inverter a lentidão dependente da idade de fechamento da ferida (vide, por exemplo, West, 1994, Arch. Drm. 130:87).
Assim, em um aspecto, a presente invenção fornece reagentes
109 e métodos úteis para tratar doenças e condições caracterizadas pela presença, ·*· ♦ ·*· ··· ♦ · · ··· * ausência ou grau de atividade de telomerase humana êm iimâ tféltfláé * * ♦· * ······ ·· · · · susceptíveis de tratamento, usando-se as composições e métodos aqui descritos. As doenças incluem, como descrito mais totalmente abaixo, cânceres, outras doenças de proliferação celular (particularmente doenças do envelhecimento), distúrbios imunológicos, infertilidade (ou fertilidade) e outros.
B) TRATAMENTO DE CÂNCER
A presente invenção fornece métodos e composições para reduzir a atividade da telomerase em células tumorais e para tratar câncer. As composições incluem oligonucleotídeos anti-sentido, peptídeos, vetores de terapia genética codificando oligonucleotídeos anti-sentido ou proteínas alterando a atividade e anticorpos anti-hTRT. Células cancerosas (por exemplo, células tumorais malignas) que expressam a atividade de telomerase (células telomerase-positivas) podem ser mortalizadas diminuindo-se ou inibindo-se a atividade da telomerase endógena. Além disso, tendo em vista que os níveis de telomerase correlacionam-se com as características da doença, tais como potencial metastático (por exemplo, Patente U.S. no. 5.639.613; 5.648.215; 5.489.508; Pandita e outros, 1996, Proc. Am. Ass. Câncer Res. 37:559), qualquer redução da atividade da telomerase podería reduzir a natureza agressiva de um câncer a um estado doentio mais manejável (aumentando a eficácia das intervenções tradicionais).
A invenção fornece composições e métodos úteis para tratamento de cânceres de qualquer um de uma larga variedade de tipos, incluindo tumores sólidos e leucemias. Tipos de câncer que podem ser tratados incluem (mas não são limitados a): adenocarcinoma do peito, próstata e cólon; todas as formas de carcinoma broncogênico do pulmão; mielóide; melanona; hepatoma; neuroblastoma; papiloma; apudoma;
110
11_·^ coristoma; branquioma; síndrome de carcinóide maligno, doença do coração
Brown-Pearce, ductal, tumor de Ehrlich, in situ, Krebs 2, célula merkel, mucinoso, microcelular do pulmão, célula em grão de aveia, papilar, cirroso, 5 bronquiolar, broncogênico, célula escamosa e célula transicional), distúrbios histiocíticos; leucemia (por exemplo, célula B, célula misturada, célula nula, célula T, célula T crônica, HTLV-II-associada, linfocítica aguda, linfocítica crônica, mastócito e mielóide); histiocitose maligna; doença de Hodgkin; small imunoproliferativo; linfoma de não-Hodgkin; plasmacitoma; 10 reticuloendoteliose; melanona; condroblastoma. condroma; condrosarcoma, fibroma; fibrosarcoma, tumores de células gigantes, histiocitoma; lipoma; liposarcoma; mesotelioma, moxoma, mixossarcoma, osteoma, osteossarcoma; lipoma; lipossarcoma; mesotelioma; mixoma; mixossarcoma; osteoma; osteossarcoma; sarcoma de Ewing; sinovioma; adenofibroma; 15 adenolinfoma; carcinossarcoma; cordoma, caraniofaringioma; disgerminoma;
hamartoma; mesenquimoma; mesonefroma; miossarcoma; ameloblastoma; cementoma; odentomar; teratoma; timoma; tumor trofoblástico; adenocarcinoma; adenoma; colangioma; colesteatoma; cilindroma; cistadenocarcinoma, cistadenoma; tumor da célula da granulosa; 20 ginandroblastoma; hepatoma; hidradenoma; tumor da célula das ilhotas tumor da célula de Leydig; papiloma; tumor da célula de Sertoli; tumor da célula da teca, leiomioma; leiomiossarcoma; mioblastoma; mioma; miossarcoma; rabdomioma, rabdomiossarcoma; ependimoma; ganglioneuroma; glioma; meduloblastoma; meningioma; neurilemoma; 25 neuroblastoma; neuroepitelioma, neurofibroma, neuroma; paraganglioma, paraganglima não-cromafin; angioceratoma; angiolimfóide, hiperplasia com eosinofilia; angioma esclerosante; angiomatose, glomangiona; hemangioendotelioma; hemangioma; hemangiopericitoma;
hemangiossarcoma; linfangioma; linfangiomioma; linfangiossarcoma;
111 ±±G pinealoma; carcinomassarcona; condrossarcoma; cistossarcoma filodos;
fibrossarcoma; ·*· · ·*· **· ·· «· ··· * hemangiossarcoma; leiomiossareôiria;’·: :leitCQSS^rbÓ)’ính «4 ·· · ··· ··« ··« *
lipossarcoma; linfangiossarcoma; miossarcoma; mixossarcoma; carcinoma ovariano; rabdomiossarcoma; sarcoma (por exemplo, de Ewing, experimental, de Kaposi e de mastócito); neoplasmas (por exemplo, osso, peito, sistema digestivo, colorretal, fígado, pancreáticos, pituitários, testiculares, orbitais, da beça e pescoço, do sistema nervoso central, acústicos, pélvicos, do trato respiratório e urogenitais; neurofibromatoses e displasia cervical). A invenção fornece composições e métodos úteis para tratamento de outras condições em que as células tomaram-se imortalizadas ou hiperproliferativas, por exemplo, por desregulação (por exemplo, expressão anormalmente elevada) de hTRT, enzima de telomerase ou atividade de telomerase.
A presente invenção fornece ainda composições e métodos para prevenção de cânceres, incluindo vacinas anti-hTRT, vetores de terapia genética que evitam ativação da telomerase e vetores de terapia genética que resultam em morte específica das células telomerase-positivas. Em um aspecto relacionado, os métodos de terapia de substituição genética descritos abaixo podem ser usados para tratar uma predileção genética para cânceres.
C) TRATAMENTO DE OUTRAS CONDIÇÕES
A presente invenção também fornece composições e métodos úteis para tratamento de doenças e condições doentias (além de cânceres), caracterizadas por sub ou super-expressão de telomerase ou produtos genéticos hTRT. Exemplos incluem: doenças de proliferação celular, doenças resultantes de senescência celular (particularmente doenças do envelhecimento), distúrbios imunológicos, infertilidade, doenças da disfunção imune e outras.
Certas doenças do envelhecimento são caracterizadas por mudanças associadas à senescência, devido ao reduzido comprimento do
112 telômero (em comparação com células mais novas), resultante da ausência ·*· · ·*· ·*· ·· ·*· ·*· ·*· í (ou níveis muito mais baixos de atividade de telomerase’ nâ pél.uiar.*; ©:
Φ 9 ·♦ φ ·····<··· φ Φ comprimento diminuído do telômero e a capacidade replicativa diminuída contribuem para doenças tais como aquelas descritas abaixo. A atividade de telomerase e comprimento do telômero podem ser aumentados, por exemplo, aumentando-se os níveis dos produtos genéticos hTRT (proteína e mRNA) na célula. Uma listagem parcial das condições associadas com a senescência celular, em que a expressão hTRT pode ser terapêutica, inclui doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntigton e acidente vascular cerebral; doenças relacionadas com a idade do integumento, tais como atrofia dérmica, elastólise e enrugamento da pele, hiperplasia da glândula sebácea, lentigo senil, engrisalhamento do cabelo e perda de cabelo, úlceras crônicas da pele e deterioração de cura de ferimento relacionada com a idade; doença degenerativa das juntas; osteoporose; deterioração do sistema imune relacionado com a idade (por exemplo, envolvendo células tais como linfócitos B e T, monócitos, neutrófilos, eiosinófilos, basófilos, células NK e seus respectivos progenitores); doenças relacionadas com a idade do sistema vascular, incluindo aterosclerose, calcificação, trombose e aneurismas; diabete, atrofia muscular, doenças respiratórias, doenças do fígado e do Trato GI, doenças metabólicas, doenças endócrinas (por exemplo, distúrbios da glândula pituitária e adrenal), doenças reprodutivas e degeneração macular relacionada com a idade. Estas doenças e condições podem ser tratadas aumentando-se os níveis de produtos genéticos hTRT na célula, para aumentar o comprimento do telômero, desse modo restaurando ou dando maior capacidade replicativa à célula. Tais métodos podem ser realizados em células cultivadas ex vivo ou células in vivo. Em uma versão, as células são primeiro tratadas para ativar a telomerase e encompridar os telômeros e, em seguida, tratadas para inativar o gene de hTRT e a atividade de telomerase. Em uma versão preferida, a atividade de telomerase é gerada por um vetor da
113 invenção em um germe embriônico ou célula-tronco antes da ou durante a diferenciação. P ί Μ/ 1 ? FJ· • * ·♦ · ··· ··· ·
A presente invenção também provê métodos e composição úteis para tratar infertilidade. As células da linha germinativa humana (por exemplo, células espermatogônias, seus progenitores ou descendentes) são capazes de proliferação indefinida e caracterizados por elevada atividade de telomerase. Níveis anormais ou diminuídos de produtos genéticos hTRT podem resultar, por exemplo, de produção inadequada ou anormal de Espermatozóides, conduzindo à infertilidade ou distúrbios da reprodução. Portanto, a infertilidade baseada na telomerase pode ser tratada usando-se os métodos e composições aqui descritos para aumentar os níveis de telomerase. Similarmente, tendo em vista que a inibição da telomerase pode impactar negativamente a espermatogênese, oogênese e a viabilidade do esperma e do óvulo, as composições inibitórias da telomerase da invenção podem ter efeitos contraceptivos quando usadas para reduzir os níveis dos produtos genéticos da hTRT em células da linha germinativa.
Além disso, a invenção fornece métodos e composição úteis para diminuir o potencial proliferativo das células telomerase-positivas, tais como linfócitos ativados e células-tronco hematopoiéticas, pela redução da atividade da telomerase. Assim, a invenção fornece meios para realizar a imunossupressão. Contrariamente, os métodos e reagentes da invenção são úteis para aumentar a atividade da telomerase e potencial proliferativo das células, tais como células-tronco, que expressam um baixo nível de telomerase ou nenhuma telomerase antes da intervenção terapêutica.
D) MODOS DE INTERVENÇÃO
Como é óbvio pela discussão anterior, a modulação do nível de telomerase ou atividade de telomerase de uma célula pode ter um efeito profundo sobre o potencial proliferativo da célula e, assim, tem grande utilidade no tratamento da doença. Como é também óbvio, esta modulação
114
pode ser uma diminuição da atividade da telomerase ou um aumento da :*· í .·. ··: .·. ;·· :
atividade. As moléculas moduladoras da telomerase dârinyenção j|oçtóip*aiqal··:
através de diversos mecanismos; alguns destes são descritos nesta e nas subseções seguintes, para auxiliar o praticante na seleção dos agentes terapêuticos. Entretanto, os requerentes não pretendem ser limitados a qualquer mecanismo particular de ação para os novos compostos, composições e métodos terapêuticos aqui descritos.
A atividade da telomerase pode ser diminuída através de quaisquer dos diversos mecanismos ou combinações de mecanismos. Um mecanismo é a redução da expressão genética da hTRT para reduzir a atividade de telomerase. Esta redução pode ser no nível de transcrição do gene da hTRT dentro do mRNA, processamento (por exemplo, união), transporte nuclear ou estabilidade do mRNA, translação do mRNA para produzir proteína de hTRT, ou estabilidade e função da proteína de hTRT.
Outro mecanismo é a interferência com uma ou mais atividades de telomerase (por exemplo, a atividade catalítica de transcriptase inversa, ou a atividade de ligação-hTR), empregando-se ácidos nucléicos inibitórios, polipeptídeos ou outros agentes (por exemplo, miméticos, moléculas pequenas, medicamentos e promedicamentos) que podem ser identificados usando-se os métodos, ou é provido pelas composições aqui descritas. Outros mecanismos incluem seqüestro de hTR e/ou proteínas associadas com a telomerase e interferência com o conjunto da RNP telomerase de suas subunidades componentes. Em um mecanismo relacionado, uma seqüência promotora de hTRT é operavelmente ligada a um gene codificando uma toxina e introduzido dentro de uma célula; se ou quando os ativadores transcricionais de hTRT forem expressos ou ativados na célula, a toxina será expressa, resultando em morte de células específicas.
Um método relacionado para reduzir a capacidade proliferativa de uma célula envolve introduzir uma variante de hTRT com
115 baixa fidelidade (isto é, uma com uma elevada, por exemplo, maior do que
1%, taxa de erro), de modo que as repetições telornericás âbáraritpá £|6·ϊ sintetizadas. Estas repetições aberrantes afetam a ligação da proteína telômera e conduzem a rearranjos e aberrações cromossomais e/ou conduzem à morte celular.
Similarmente, a atividade de telomerase pode ser aumentada através de quaisquer dos diversos mecanismos, ou uma combinação de mecanismos. Estes incluem aumento da quantidade de hTRT em uma célula. Usualmente, isto é realizado introduzindo-se um polinucleotídeo codificando-polipeptídeo hTRT dentro da célula (por exemplo, um polipeptídeo recombinantemente produzido, compreendendo uma seqüência de DNA hTRT operavelmente ligada a um promotor, ou um mRNA de hTRT estável. Altemativamente, um polipeptídeo de hTRT cataliticamente ativo pode ele próprio ser introduzido dentro de uma célula ou tecido, por exemplo, por microinjeção ou outro meio conhecido na arte. Em outros mecanismos, a expressão do gene hTRT endógeno ou a estabilidade dos produtos genéticos hTRT na célula podem ser aumentadas. A atividade de telomerase de uma célula pode também ser aumentada interferindo-se com a interação dos inibidores de telomerase endógena e da telomerase RNP ou dos repressores de transcrição de hTRT endógena e do gene hTRT; aumentandose a expressão ou atividade dos ativadores da transcrição hTRT; e outros meios evidentes para aqueles hábeis quando da revisão desta descrição.
E) AGENTES DE INTERVENÇÃO
1) PROTEÍNAS & PEPTÍDEOS DE TRT
Em uma versão, a invenção fornece polipeptídeos moduladores da telomerase (isto é, proteínas, polipeptídeos e peptídeos), que aumentam ou reduzem a atividade de telomerase, que pode ser introduzida dentro de uma célula alvo diretamente (por exemplo, por injeção, fusão mediada por lipossoma, aplicação de um hidrogel à superfície do tumor [por
116 exemplo, melanoma], fusão ou ligação à proteína estrutural do vírus da ·*· » » · **· »X Λ .·* J herpes VP22 e outros meios descritos aqui e conhecido» ria tfrtej). ,Eip TÔJ&á·· segunda versão, as proteínas e peptídeos moduladores da telomerase da invenção são expressos em uma célula introduzindo-se um ácido nucleico (por exemplo, um vetor ou mRNA de expressão de DNA) codificando a desejada proteína ou peptídeo dentro da célula. A expressão pode ser constitutiva ou indutiva, dependendo do vetor e escolha do promotor (vide discussão abaixo). As preparações de RNA mensageiro codificando hTRT são especialmente úteis quando somente expressão transiente (por exemplo, ativação transiente de telomerase) é desejada. Métodos para introdução e expressão dos ácidos nucléicos dentro de uma célula são bem conhecidos na arte (também, vide em outra parte desta especificação, por exemplo, seções sobre oligonucleotídeos, métodos de terapia genética).
Em um aspecto da invenção, é fornecido um polipeptídeo modulador da telomerase, que aumenta a atividade da telomerase em uma célula. Em uma versão, o polipeptídeo é um polipeptídeo de hTRT cataliticamente ativo, capaz de dirigir a síntese (em conjunto com um padrão de RNA, tal como hTR) do DNA telomérico humano. Esta atividade pode ser medida, como discutido acima, por exemplo, empregando-se um ensaio de atividade de telomerase, tal como um ensaio TRAP. Em uma versão, o polipeptídeo é uma proteína de hTRT de comprimento total, tendo uma seqüência de ou substancialmente idêntica à seqüência de 1132 resíduos da SEQÜÊNCIA ID NO: 2. Em outra versão, o polipeptídeo é uma variante da proteína de hTRT da SEQÜÊNCIA ID NO. 2, tal como um polipeptídeo de fusão, polipeptídeo derivado, polipeptídeo truncado, polipeptídeo conservativamente substituído, polipeptídeo modificado pela atividade, ou similar. Uma proteína de fusão ou derivada pode incluir uma metade de alvejamento que aumenta a capacidade do polipeptídeo atravessar uma membrana de célula ou faz com que o polipeptídeo seja suprido a um tipo de
117 célula específico (por exemplo, células de fígado ou células tumorais) preferencialmente ou compartimento de células (por exemplo· «bnipgrtmj^idí·: nuclear) preferencialmente. Exemplos de metades de alvejamento incluem causas de lipídeos, seqüências amino ácidas tais como peptídeo de antennapoedia ou um sinal de localização nuclear (NLS; por ex., nucleoplasmina àcXenopus, Robins e outros, 1991, Cell 64:615). A proteína de hTRT naturalmente ocorrente (p. ex., tendo uma seqüência de ou substancialmente idêntica à SEQUENCIA ID NO: 2) atua no núcleo da célula. Assim, é provável que uma ou mais subseqüências da SEQÜÊNCIA ID NO: 2, tais como os resíduos 193-196 (PRRR) e resíduos 235-240 (PKRPRR) atue como um sinal de localização nuclear. As pequenas regiões são provavelmente NLSs, com base na observação de que muitas NLSs compreendem uma configuração de 4 resíduos composta de aminoácidos básicos (K ou R), ou composta de três amino ácidos básicos (K ou R) e H ou P; uma configuração começando com P e seguida dentro de 3 resíduos por um segmento básico, contendo 3 resíduos K ou R em cada 4 resíduos (vide, por exemplo, Nakai e outros, 1992, Genomics 14:897). A deleção de uma ou de ambas destas seqüências e/ou seqüências de localização adicionais esperase interferir com o transporte de hTRT para o núcleo e/ou aumentar a rotatividade da hTRT e é útil para evitar o acesso da telomerase para seus substratos nucleares e diminuir o potencial proliferativo. Além disso, um polipeptídeo de hTRT variante, sem NLS, pode reunir-se dentro de uma RNP, que não será capaz de manter o comprimento do telômero, porque a enzima resultante não pode penetrar no núcleo.
Os polipeptídeos de hTRT da invenção tipicamente serão associados na célula alvo com um RNA de telomerase, tal como hTR, especialmente quando eles telomerase em uma célula, introduzido associa-se com forem usados para aumentar a atividade da
Em uma versão, um polipeptídeo de hTRT uma hTR endógena, para formar uma RNP
118 cataliticamente ativa (por exemplo, uma RNP compreendendo hTR e um ·· · · ··· · · · ··· polipeptídeo de comprimento total, tendo uma seqüênciâ*da;SÊj^ÜÊNGjÀlí): NO: 2). A RNP assim formada pode também associar-se com outras, por ex., proteínas associadas-com-telomerase. Em outras versões, a RNP de telomerase (contendo proteína de hTRT, hTR e, opcionalmente, outros componentes) é introduzida como um complexo na célula alvo.
Em uma versão relacionada, um vetor de expressão de hTRT é introduzido dentro de uma célula (ou progênie de uma célula), dentro da qual um vetor de expressão de RNA de telomerase (por exemplo, hTR) é introduzido simultânea, subseqüentemente ou previamente. Nesta versão, a proteína de hTRT e o RNA de telomerase são coexpressos na célula e se reúnem para formar uma RNP de telomerase. Um RNA de telomerase preferido é hTR. Um vetor de expressão, útil para expressão de hTR em uma célula, é descrito acima (vide, Patente U.S. 5.583.016). Em ainda outra versão, o polipeptídeo de hTRT e RNA de hTR (ou equivalente) são associados in vitro para formarem um complexo, que é então introduzido dentro das células alvo, por exemplo, por transferência mediada por lipossoma.
Em outro aspecto, a invenção fornece polipeptídeos de hTRT, úteis para reduzir a atividade de telomerase em uma célula. Como acima, estes polipeptídeos inibidores podem ser introduzidos diretamente ou por expressão dos ácidos nucleicos recombinantes dentro da célula. Será reconhecido que os miméticos de peptídeo ou polipeptídeos compreendendo amino ácidos não-padrão (isto é, outros que não os 20 amino ácidos codificados pelo código genético ou seus derivados normais) serão tipicamente introduzidos diretamente.
Em uma versão, a inibição da atividade da telomerase resulta do sequestro de um componente requerido para o alongamento preciso do telômero. Exemplos de tais componentes são hTRT e hTR. Assim, a
119 administração de um polipeptídeo que se liga a hTR, mas que não tem ·· · · · · · · · · ··· atividade catalítica de telomerase, pode reduzir a ati^iHajié«jift’t^loXLçrà^ • · ·· · ··· ··· ··♦ · endógena dentro da célula. Em uma versão relacionada, o polipeptídeo de hTRT pode ligar-se a um componente de célula que não hTR, tal como uma ou mais proteínas associadas-com-a-telomerase, desse modo interferindo com a atividade da telomerase dentro da célula.
Em outra versão, os polipeptídeos de hTRT da invenção interferem (por exemplo, por competição) com a interação da proteína de hTRT expressa endogenamente e outro componente celular requerido para função da telomerase, tal como hTR, DNA telomérico, proteínas associadascom-a-telomerase, proteínas associadas-com-telômeros, telômeros, proteínas de controle do ciclo celular, enzimas de reparo do DNA, proteínas cromossomais histona ou não-histona, ou outros.
Ao selecionar as moléculas (por ex., polipeptídeos) da invenção, que afetam a interação da proteína de hTRT expressa endogenamente e outros componentes celulares, pode-se preferir moléculas que incluem um ou mais dos motivos conservados da proteína de hTRT, como descrito aqui. A conservação evolucionária destas regiões indica a importante função no apropriado funcionamento da telomerase humana contribuída por estes motivos e os motivos são assim geralmente sítios úteis para mudar a função da proteína de hTRT, para criar proteínas de hTRT variantes da invenção. Assim, os polipeptídeos de hTRT variantes, tendo mutações em motivos conservados, serão particularmente úteis para algumas aplicações da invenção.
Em outra versão, a expressão do gene da hTRT endógeno é reprimida pela introdução, dentro da célula, de uma grande quantidade de polipeptídeo de hTRT (por exemplo, tipicamente pelo menos cerca de 2vezes mais do que o nível endógeno, mais freqüentemente pelo menos cerca de 10 a cerca de 100 vezes), que atua via um lupe de realimentação, para
120 inibir a transcrição do gene de hTRT, processamento do pré-mRNA de ·· · · ··· · · · ··· · hTRT, translação do mRNA de hTRT ou agrupamento e:ttaíisf>é>ete da RNP. 7::·:
··*«·· «·· ··· ··· · ·
2) OLIGONUCLEOTÍDEOS
a) CONSTRUÇÕES ANTISSENTIDO
A invenção fornece métodos e oligonucleotídeos anti-sentido ou reagentes de polinucleotídeos, que podem ser usados para reduzir a expressão dos produtos genéticos da hTRT in vitro ou in vivo. A administração dos reagentes anti-sentido da invenção a uma célula alvo resulta em atividade de telomerase reduzida e é particularmente útil para o tratamento de doenças caracterizadas por elevada atividade de telomerase (por exemplo, cânceres). Sem pretender ficar limitado por qualquer mecanismo particular, [acredita-se que os oligonucleotídeos anti-sentido ligam-se a e interferem com a translação do mRNA da hTRT.j Altemativamente, a molécula anti-sentido pode tomar o mRNA de hTRT susceptível de digestão de nuclease, interferir com a transcrição, interferir com o processamento, localização ou, por outro lado, com os precursores do RNA (pré-mRNA), reprimir a transcrição do mRNA do gene da hTRT ou atuar através de algum outro mecanismo. Entretanto, o mecanismo particular pelo qual a molécula anti-sentido reduz a expressão da hTRT não é crítico.
Os polinucleotídeos anti-sentido da invenção compreendem uma seqüência anti-sentido de pelo menos 7 a 10 a tipicamente 20 ou mais nucleotídeos que especificamente hibridizam com uma seqüência de mRNA codificando hTRT ou mRNA transcrito do gene da hTRT. Mais freqüentemente, o polinucleotídeo anti-sentido da invenção é de cerca de 10 a cerca de 50 nucleotídeos de comprimento e de cerca de 14 a cerca de 35 nucleotídeos de comprimento. Em outras versões, os polinucleotídeos antisentido são polinucleotídeos de menos do que cerca de 100 nucleotídeos ou menos do que cerca de 200 nucleotídeos. Em geral, o polinucleotídeo antisentido deve ser bastante comprido para formar um duplex estável, porém
121
bastante curto, dependendo do modo de suprimento, para administrar in vivo, ·· · · ··♦ · · · ··· · se desejado. O comprimento mínimo de um polinuclechfd3o:rhefúêtid©‘ párX;:·· • · ·· · ········· · · hibridização específica com uma seqüência alvo depende de diversos fatores, tais como conteúdo G/C, posicionamento das bases desigualadas (se existirem), grau de imparidade das seqüências em comparação com a população de polinucleotídeos alvo, e natureza química do polinucleotídeo (por ex., cadeia principal de metilfosfonato, ácido nucleico de peptídeo, fosforotioato), entre outros fatores.
Genericamente, para assegurar hibridização específica, a seqüência anti-sentido é substancialmente complementar à seqüência de mRNA de hTRT alvo. Em certas versões, a seqüência anti-sentido é exatamente complementar à seqüência alvo. Os polinucleotídeos anti-sentido podem também incluir, entretanto, substituições, adições, deleções, transições, transposições ou modificações de nucleotídeos, ou outras seqüências de ácido nucleico ou metades de ácido não-nucleico, contanto que ligação especifica na seqüência alvo relevante, correspondendo ao RNA de hTRT ou seu gene, seja retida como uma propriedade funcional do polinucleotídeo.
Em uma versão, a seqüência anti-sentido é complementar a seqüências relativamente acessíveis do mRNA da hTRT (por exemplo, relativamente desprovida de estrutura secundária). Isto pode ser determinado analisando-se as estruturas secundárias de RNA preditas, empregando-se, por exemplo, o programa MFOLD (Genetics Computer Group, Madison WI) e testando-se in vitro ou in vivo, como é sabido na arte. [Exemplos de oligonucleotídeos que podem ser testados nas células para supressão antisentido da função hTRT são aqueles capazes de hibridizar com (isto é,
Λ • ·· A substancialmente complementares a) seguintes posições da SEQUENCIA ID NO:1: 40-60; 260-280; 500-520; 770-790; 885-905; 1000-1020; 1300-1320;
1520-1540; 2110-2130; 2295-2315; 24502470; 2670-2690; 3080-3110;
122
3140-3160; e 3690-3710. Outro método útil para identificar composições ·· · · ··· · · · ··· · anti-sentido eficazes utiliza agrupamentos çón&mâtonjis’/ ‘.Ué.
• · ·· · ··· ··· ··· · · oligonucleotídeos (vide, por exemplo, Milner e outros, 1997, Nature Biotechnology 15:537).
A invenção também fornece um polinucleotídeo anti-sentido, que tem as seqüências em adição à seqüência anti-sentido (isto é, em adição à seqüência anti-hTRT-sentido). Neste caso, a seqüência anti-sentido é contida dentro de um polinucleotídeo de seqüência mais longa. Em outra versão, a seqüência do polinucleotídeo consiste essencialmente da ou é a seqüência 10 anti-sentido.
Os ácidos nucleicos anti-sentido (DNA, RNA, análogos modificados e similares) podem ser produzidos utilizando-se qualquer método adequado para produzir um ácido nucleico, tal como a síntese química e os métodos recombinantes aqui descritos. Em uma versão, por 15 exemplo, as moléculas de RNA anti-sentido da invenção podem ser preparadas pela síntese química sob nova forma ou por clonagem. Por exemplo, um RNA anti-sentido que hibridiza com mRNA de hTRT pode ser produzido inserindo-se (ligando-se) uma seqüência de DNA de hTRT (por ex., SEQÜÊNCIA ID No: 1, ou seu fragmento) em orientação reversa, 20 operavelmente ligada a um promotor de um vetor (por exemplo, plasmídeo). Desde que o promotor e, preferivelmente, os sinais de terminação e poliadenilação sejam apropriadamente posicionados, o filamento da seqüência inserida, correspondendo ao filamento de não-codificação, será transcrito e atuará como um oligonucleotídeo anti-sentido da invenção.
Os oligonucleotídeos anti-sentido da invenção podem ser usados para inibir a atividade de telomerase em extratos livres de célula, células e animais, incluindo mamíferos e humanos. Por exemplo, os oligonucleotídeos anti-sentido de fosforotioato:
A) 5'-GGCATCGCGGGGGTGGCCGGG
123
Β) 5'-CAGCGGGGAGCGCGCGGCATC
C) 5'-CAGCACCTCGCGGTAGTGGCTp Σ Μ f 1 ? ? £ Η • · ·· · ··· ··« ··· · ·
D) 5'-GGACACCTGGCGGAAGGAGGG podem ser usados para inibir a atividade da telomerase. Em concentração 10 micromolar cada oligonucleotídeo, misturas de oligonucleotídeos A e Β; A, B, C e D; e A, C e D inibiram a atividade de telomerase em 293 células, quando tratadas uma vez por dia durante sete dias. A inibição foi também observada quando uma molécula hTR antisentido (5'-GCTCTAGAATGAAGGGTG-3') foi usada em combinação com os oligonucleotídeos A, B e C; A, B e D; e A e C. Os oligonucleotídeos de controle úteis de tais experimentos incluem:
51) 5'-GCGACGACTGACATTGGCCGG
52) 5'-GGCTCGAAGTAGCACCGGTGC
53) 5'-GTGGGAACAGGCCGATGTCCC
Para determinar o oligonucleotídeo anti-sentido ideal da invenção para a aplicação particular de interesse, pode-se realizar uma varredura utilizando-se os conjuntos de oligonucleotídeos anti-sentido da invenção. Um conjunto ilustrativo é o conjunto de oligonucleotídeos 30-mer, que abarca o mRNA de hTRT e são deslocados um do seguinte por quinze nucleotídeos (isto é, ON1 corresponde às posições 1-30 e é TCCCACGTGCGCAGCAGGACGCAGCGCTGC, ON2 corresponde às posições 16-45 e é GCCGGGGCCAGGGC TTCCCACGTGCGCAGC e ON3 corresponde às posições 31-60 e é GGCATCGCGGGGGTGGCCGGGGCCAGGGCT e assim em diante até o fim do mRNA). Cada membro deste conjunto pode ser testado quanto à atividade inibitória, como aqui descrito. Aqueles oligonucleotídeos que apresentam atividade inibitória sob as condições de interesse que identificam uma região de interesse e outros oligonucleotídeos da invenção correspondendo à região de interesse (isto é, 8-mers, 10-mers,15-mers, etc.)
124 w
podem ser testados para identificar o oligonucleotídeo com a atividade ·· · · ··· · · · ··· · preferida para a aplicação. :·: · :·· /’ y ^·: H • · ·· · ··· ··· ··· · ·
Para métodos gerais relativos aos polinucleotídeos antisentido, vide ANTISENSE RNA AND DNA (1988), D.A. Melton, Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). Vide também Dagle e outros, 1991, Nucleic Acids Research, 19:1805. Para uma revisão da terapia anti-sentido, vide, p. ex., Uhlmann e outros, Chem. Reviews, 90:543-584 (1990).
b) ÓLIGO E POLINUCLEOTÍDEOS TRIPLEX
A presente invenção fornece óligo e polinucleotídeos (por exemplo, DNA, RNA, PNA ou similar) que se ligam a ácidos nucleicos de hTRT de duplo-filamento ou duplexes (por exemplo, em uma região dobrada do RNA de hTRT ou do gene hTRT), formando um ácido nucleico contendo uma hélice tripla ou triplex. A formação de hélice tripla resulta na inibição da expressão da hTRT, por exemplo, prevenindo-se a transcrição do gene hTRT, assim reduzindo ou eliminando a atividade de telomerase em uma célula. Sem pretender ficar preso por qualquer mecanismo particular, acredita-se que o emparelhamento de hélice tripla compromete a capacidade da hélice dupla de abrir-se suficientemente para que ocorram a ligação das polimerases, os fatores de transcrição ou as moléculas reguladoras.
Os oligos e polinucleotídeos triplex da invenção são construídos usando-se as regras de emparelhamento-base da formação de hélice tripla (vide, por exemplo, Cheng e outros, 1988, J. Biol. Chem. 263: 15110; Ferrin e Camerini-Otero, 1991, Science 354:1494; Ramdas e outros, 1989, J. Biol. Chem. 264:17395: Strobel e outros, 1991, Science 254:1639; e Rigas e outros, 1986, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 83: 9591; cada um dos quais é incorporado aqui por referência) e o mRNA de hTRT e/ou seqüência genética. Tipicamente, os oligonucleotídeos formadores de triplex da invenção compreendem uma seqüência específica de cerca de 10 a pelo
125
1345 menos cerca de 25 nucleotídeos ou maior, complementar a uma seqüência ·· · · ··· « · · ··· · específica do RNA de hTRT ou gene (isto é, bastante grakdti ρΜ^^οφίβί {ηϊ$: H • « ·· · ··· ··· ··· · · hélice tripla estável, porém bastante pequena, dependendo do modo de suprimento, para administrar in vivo, se desejado). Neste contexto, complementar significa capaz de formar uma hélice tripla estável. Em uma versão, os oligonucleotídeos são projetados para ligarem-se especificamente às regiões reguladoras do gene de hTRT (por exemplo, a seqüência de flanqueamento-5' de hTRT, promotores e intensificadores) ou ao sítio de início da transcrição (p. ex., entre -10 e +10 a partir do sítio de início da transcrição). Para uma revisão dos recentes avanços terapêuticos empregando-se DNA triplex, vide Gee e outros, em Huber e Carr, 1994,
Molecular and Imunologic Approaches, Futura Publishing Co, Mt Kisco NY e Rininsland e outros, 1997, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94:5854, sendo ambos incorporados aqui por referência.
c) RIBOZIMAS
A presente invenção também supre ribozimas úteis para inibição da atividade de telomerase. Os ribozimas da invenção ligam e especificamente clivam e inativam o mRNA hTRT. Ribozimas úteis podem compreender seqüências de terminal-5' e 3', complementares ao mRNA de hTRT e podem ser construídos por uma pessoa hábil, com base na seqüência de mRNA hTRT aqui descrita (vide publicação PCT WO 93/23572, supra). Os ribozimas da invenção incluem aqueles tendo características dos ribozimas de intron do grupo I (Cech, 1995, Biotechnology 13:323) e outros ribozimas cabeça de martelo (Edgingto, 1992, Biotechnology 10:256).
Os ribozimas da invenção incluem aqueles tendo sítios de divagem tais como GUA, GUU e GUC. Outros sítios de divagem ideais para inibição da atividade da telomerase mediada por ribozima, de acordo com a presente invenção, incluem aqueles descritos nas publicações PCT WO 94/02595 e WO 93/23569, ambas incorporadas aqui por referência. Os
126
Í31 oligonucleotídeos de RNA curtos, entre 15 e 20 ribonucleotídeos de ·· · ♦ ··· · ♦ ♦ ··· · comprimento, correspondendo à região do gene de hTB-T M^4,:'cottçn:ct<3:O: H • * ·· · ·»« ··· ··· · · sítio de divagem, podem ser avaliados pelos aspectos estruturais secundários, que podem tomar o oligonucleotídeo mais desejável. A adequabilidade dos sítios de divagem pode também ser avaliada testando-se a acessibilidade à hibridização com oligonucleotídeos complementares, empregando-se ensaios de proteção de ribonuclease, ou testando-se quanto à atividade do ribozima in vitro, de acordo com os procedimentos padrão conhecidos da arte.
Como descrito por Hu e outros, a publicação PCT WO 94/03596, incorporada aqui por referência, as funções anti-sentido e do ribozima podem ser combinadas em um único oligonucleotídeo. Além disso, os ribozimas podem compreender um ou mais nucleotídeos modificados ou ligações modificadas entre nucleotídeos, como descrito acima, em conjunto com a descrição dos oligonucleotídeos anti-sentido ilustrativos da invenção.
Em uma versão, os ribozimas da invenção são gerados in vitro e introduzidos dentro de uma célula ou paciente. Em outra versão, os métodos de terapia genética são usados para expressão dos ribozimas em uma célula alvo ex vivo ou in vivo.
d) ADMINISTRAÇÃO DOS OLIGONUCLEOTÍDEOS
Tipicamente, os métodos terapêuticos da invenção envolvem a administração de um oligonucleotídeo, que funciona para inibir ou estimular a atividade de telomerase, sob condições fisiológicas in vivo, e é relativamente estável sob aquelas condições, por um período de tempo suficiente para um efeito terapêutico. Como citado acima, os ácidos nucleicos modificados podem ser úteis em dar tal estabilidade, bem como para suprimento de alvej amento do oligonucleotídeo no tecido, órgão ou célula desejado.
Os oligo e poli-nucleotídeos podem ser fornecidos diretamente como um medicamento em uma formulação farmacêutica
127 adequada, ou indiretamente, por meio da introdução de um ácido nucleico dentro de uma célula, incluindo lipossomas, imunolifids^omâs* Wíslipó^,*: :‘í absorção direta dentro das células e similares como descrito aqui. Para tratamento de doença, os oligonucleotídeos da invenção serão administrados a um paciente em uma quantidade terapeuticamente eficaz. Uma quantidade terapeuticamente eficaz é uma quantidade suficiente para melhorar os sintomas da doença ou modular a atividade de telomerase dentro da célula alvo, por exemplo, como pode ser medido empregando-se um ensaio TRAP ou outro ensaio adequado ou função biológica de telomerase. Métodos úteis 10 para suprimento de oligonucleotídeos para fins terapêuticos são descritos na
Patente U.S. 5.272.065, incorporada aqui por referência. Outros detalhes da administração dos compostos farmaceuticamente ativos são fornecidos abaixo. Em outra versão, os oligo e poli-nucleotídeos podem ser supridos empregando-se terapia genética e os plasmídeos de expressão de DNA 15 recombinantes da invenção.
3) TERAPIA GENÉTICA
A terapia genética refere-se à introdução de um polinucleotídeo de outro modo exógeno, que produz um efeito fenotípico medicalmente útil sobre (tipicamente) a(s) célula(s) de mamíferos, dentro das 20 quais ele é transferido. Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos de terapia genética e composições para tratamento das condições associadasa-telomerase. Em versões ilustrativas, a terapia genética envolve a introdução, dentro de uma célula, de um vetor que expressa um produto genético de hTRT (tal como uma proteína de hTRT substancialmente similar 25 ao polipeptídeo de hTRT, tendo a seqüência da SEQÜÊNCIA ID NO: 2, p.
ex., para aumentar a atividade da telomerase, ou um polipeptídeo hTRT inibidor para reduzir a atividade), expressa um ácido nucleico tendo um gene de hTRT ou uma seqüência de mRNA (tal como um RNA anti-sentido, por ex., para reduzir a atividade da telomerase), expressa um polipeptídeo ou
128 polinucleotídeo que, de outro modo, afeta a expressão dos produtos genéticos ♦ < · - ' ·'- · V 4 ·* » ♦ » » fc · < » ♦· « « M 9 t · de hTRT (por exemplo, um ribozima direcionado para?mÃNÃ;hTRT|B‘parã's H reduzir a atividade da telomerase), ou substitui ou rompe uma seqüência de hTRT endógena (por exemplo, substituição de gene e eliminação de gene, respectivamente). Numerosas outras versões serão evidentes para uma pessoa hábil quando da revisão desta descrição. Em uma versão, um vetor codificando hTR é também introduzido. Em outra versão, vetores codificando proteínas associadas-a-telomerase são também introduzidas com ou sem um vetor para hTR.
Vetores úteis na terapia genética hTRT podem ser virais e não-virais e incluem aqueles descritos acima, em relação aos sistemas de expressão hTRT da invenção. Será entendido por aqueles hábeis na arte que os vetores de terapia genética podem compreender promotores e outras seqüências reguladoras ou de processamento, tais como são aqui descritas.
Usualmente, o vetor compreenderá um promotor e, opcionalmente, um intensificador (separado de qualquer um contido dentro das seqüências promotoras),que servem para acionar a transcrição de um oligoribonucleotídeo, bem como outros elementos reguladores que provêm manutenção epissomal ou integração cromossomal e para transcrição de elevado nível, se desejado. Um plasmídeo útil para terapia genética pode compreender outros elementos funcionais, tais como marcadores selecionáveis, regiões de identificação e outras seqüências. As seqüências adicionais podem ter papéis de conferência de estabilidade, tanto fora como dentro de uma célula, suprimento de alvejamento de seqüências de nucleotídeos hTRT (sentido ou anti-sentido) em um órgão, tecido ou população de célula especificado, mediando a entrada dentro de uma célula, mediando a entrada dentro do núcleo de uma célula e/ou mediando a integração dentro do DNA nuclear. Por exemplo, estruturas de DNA semelhantes-a-aptâmero, ou outros sítios de metades de ligação de proteína,
129 podem ser usados para mediar a ligação de um vetor aos receptores da superfície celular ou às proteínas do soro que se ligam a uiii receptor,’<de‘sse .
t ' · · ··· ··· · · · · modo aumentando a eficiência da transferência do DNA para dentro da • célula. Outros sítios e estruturas de DNA podem direta ou indiretamente ligarem-se a receptores da membrana nuclear ou a outras proteínas que penetram dentro do núcleo, desse modo facilitando a absorção nuclear de um vetor. Outras seqüências de DNA podem direta ou indiretamente afetar a eficiência da integração.
Vetores de terapia genética adequados podem ou não ter uma origem de replicação. Por exemplo, é útil incluir uma origem de replicação em um vetor para propagação do vetor, antes da administração a um paciente. Entretanto, a origem da replicação pode, com freqüência, ser removida antes da administração, se o vetor for projetado para integrar-se dentro do DNA cromossomal hospedeiro ou ligar-se ao mRNA ou DNA hospedeiro. Em algumas situações (por exemplo, células tumorais) pode não ser necessário que o DNA exógeno integre-se estavelmente dentro da célula transduzida, porque a expressão transiente pode ser suficiente para matar as células tumorais.
Como citado, a presente invenção também fornece métodos e reagentes para terapia de substituição genética (isto é, substituição por recombinação homóloga de um gene de hTRT endógeno por um gene recombinante). Podem ser usados vetores especificamente projetados para integração por recombinação homóloga. Fatores importantes para otimizar a recombinação homóloga incluem o grau de identidade da seqüência e extensão da homologia para as seqüências cromossomais. A seqüência específica mediando a recombinação homóloga é também importante, porque a integração ocorre muito mais facilmente em DNA transcricionalmente ativo. Métodos e materiais para construir construções de alvejamento homólogas são descritos, por exemplo, Mansour e outros, 1988, Nature
130
336:348: Bradley e outros, 1992, Bio/Technology 10: 534. Vide também.as ··. * Λ Λ Λ · · ♦ versão, a terapia de substituição genética envolve alterar ou substituir todas ou uma parte das seqüências reguladoras controlando a expressão do gene de 5 hTRT que é para ser regulado. Por exemplo, as seqüências promotoras de hTRT (por exemplo, tais como são encontradas na SEQÜÊNCIA ID NO: 6) podem ser rompidas (para diminuir a expressão de hTRT ou para abolir um sítio de controle transcricional) ou um promotor exógeno (por ex., aumentar a expressão da hTRT) substituído.
A invenção também fornece métodos e reagentes para eliminação de gene de hTRT (isto é, deleção ou rompimento por recombinação homóloga de um gene de hTRT endógeno, empregando-se um vetor recombinantemente produzido). Na eliminação de gene, as seqüências alvejadas podem ser seqüências reguladoras (por exemplo, o promotor hTRT), ou seqüências de codificação de RNA ou proteína. O uso de recombinação homóloga, para alterar a expressão dos genes endógenos, é descrito em detalhes na Patente U.S. No. 5.272.072 (e nas patentes U.S. citadas acima), WO 91/09955, WO 93/09222, WO 96/29411, WO 95/31560 e WO 91/12650. Vide também Moinahan e outros, 1996, Hum. Mol. Genet.
5:875.
A invenção fornece ainda métodos para especificamente matar as células de telomerase-positiva, ou evitar a transformação de células de telomerase-negativa para um estado de telomerase-positiva, empregando-se o promotor de gene hTRT para regular a expressão de uma proteína tóxica para 25 a célula. Como mostrado no Exemplo 14, uma seqüência promotora hTRT pode ser operavelmente ligada a um gene repórter, de modo que a ativação do promotor resulta em expressão da proteína codificada pelo gene repórter. Se, em vez de uma proteína repórter, a proteína codificada for tóxica para a célula, a ativação do promotor conduz para a morbidez ou morte da célula.
131
Em uma versão da presente invenção, um vetor compreendendo um promotor de hTRT, operavelmente ligado a um gene codificando Umã: proteína tóxica’,e introduzido dentro das células, tais como células humanas, por exemplo, células de um paciente humano, resultando em morte celular das células em 5 que os fatores ativadores do promotor hTRT são expressos, tais como células de câncer. Em uma versão relacionada, a proteína codificada não é ela própria tóxica para uma célula, porém codifica uma atividade que toma a célula sensível a um medicamento de outro modo não-tóxico. Por exemplo, os tumores podem ser tratados introduzindo-se uma construção de fusão de 10 gene de cinase de timidina (TK) de Herpes-promotor-hTRT dentro das células e administrando-se ganociclovir ou o equivalente (vide, p.ex., Moolton e Wells, 1990, J. Nat. Canc. Inst. 82:297). A arte sabe de numerosas outras proteínas e sistemas tóxicos adequados ou potencialmente tóxicos (empregando-se seqüências promotoras que não a hTRT) que podem ser 15 modificados e aplicados de acordo com a presente invenção por uma pessoa hábil na arte, quando da revisão desta descrição.
Os vetores de terapia genética podem ser introduzidos dentro das células ou tecidos in vivo, in vitro ou ex vivo. Para terapia ex vivo, os vetores podem ser introduzidos dentro das células, p. ex., células-tronco, 20 tiradas dos pacientes e clonalmente propagadas para transplante autólogo de volta dentro do mesmo paciente (vide, p. ex., as Patentes U.S. nos. 5.399.493 e 5.437.994, cuja descrição é aqui incorporada por referência). Células que podem ser alvejadas para terapia genética hTRT com o objetivo de aumentar a atividade da telomerase de uma célula alvo incluem mas não são limitadas a 25 células-tronco ou germinativa embriônicas, particularmente células de primatas ou humanas, como citado acima, células-tronco hematopoiéticas (AIDS e pós-quimioterapia), células endoteliais vasculares (doença vascular cardíaca e cerebral), fibroblastos de pele e ceratinócitos de pele basal (cura de ferimento e queimaduras), condrócitos (artrite), astrócitos cerebrais e células
132 microgliais (Doença de Alzheimer), osteoblastos (osteoporose), células ·· · · ··· · · · ··· * retinais (doenças oculares) e células das ilhotas pancrèátichs fdi4bsteáípQ:I)*é quaisquer das células listadas na Tabela 3 abaixo, bem como quaisquer outros tipos de célula sabidas dividirem-se.
Em uma versão da invenção, um promotor indutível, operavelmente ligado a uma seqüência (ou variante) de codificação TRT, tal como hTRT, é usado para modular a capacidade proliferativa das células in vivo ou in vitro. Em uma versão particular, por exemplo, células pancreáticas produzindo insulina, transfectadas com um vetor de expressão hTRT sob o 10 controle de um promotor indutível, são introduzidas dentro de um paciente. A capacidade proliferativa das células pode, então, ser controlada pela administração ao paciente do agente de ativação de promotor (por exemplo, tetraciclina), para possibilitar que as células multipliquem-se mais do que de outro modo seria possível. A proliferação celular pode então ser terminada, continuada ou reiniciada, como desejado pelo médico do tratamento.
4) VACINAS E ANTICORPOS
Peptídeos imunogênicos ou polipeptídeos tendo uma seqüência hTRT, podem ser usados para elicitar uma resposta imune antihTRT em um paciente (isto é, atuar como uma vacina). Peptídeos e 20 polipeptídeos hTRT imunogênicos representativos são descritos abaixo nos Exemplos 6 e 8. Uma imune resposta pode também ser criada suprindo-se vetores de plasmídeo, codificando o polipeptídeo de interesse (isto é, administração de DNA desnudo). Os ácidos nucleicos de interesse podem ser supridos por injeção, lipossomas, ou outros meios de administração. Em 25 uma versão, são escolhidos os modos de imunização que eliciam no indivíduo uma resposta de linfócita citotóxica restringida por MHC Classe I contra as células expressando telomerase. Uma vez imunizado, o indivíduo ou animal eliciará uma imune resposta intensificada contra células expressando elevados níveis de telomerase (por exemplo, células malignas).
133
10« ···
Os anticorpos anti-hTRT, por exemplo, anticorpos *? d ·’: **ί ·· » · monoclonais de murinos, humanos ou humanizados :podêmj(a^h&ra.:s’êr administrados a um paciente (por exemplo, imunização passiva), para realizar uma imuno-resposta contra células expressando telomerase.
F) COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS
Em aspectos relacionados, a invenção supre composições farmacêuticas que compreendem oligo e polinucleotídeos hTRT, polipeptídeos, e anticorpos, agonistas, antagonistas ou inibidores, sozinhos ou em combinação com pelo menos um outro agente, tal como um composto estabilizante, diluente, veículo ou outro ingrediente ou agente ativo.
Os agentes terapêuticos da invenção podem ser administrados em qualquer veículo farmacêutico biocompatível, incluindo porém não limitado a solução salina, solução salina tamponada, dextrose e água. Qualquer uma destas moléculas pode ser administrada a um paciente sozinha 15 ou em combinação com outros agentes, medicamentos ou hormônios, em composições farmacêuticas em que é misturada com excipiente(s) adequado(s), adjuvantes, e/ou veículos farmaceuticamente aceitáveis. Em uma versão da presente invenção, o veículo farmaceuticamente aceitável é farmaceuticamente inerte.
A administração de composições farmacêuticas é realizada oral ou parenteralmente. Métodos de suprimento parenteral incluem administração tópica, intra-arterial (por ex., diretamente ao tumor), intramuscular, intraperitoneal ou intranasal. Além dos ingredientes ativos, estas composições farmacêuticas podem conter veículos farmaceuticamente aceitáveis adequados, compreendendo excipientes e outros compostos que facilitem o processamento dos compostos ativos em preparações que podem ser usadas farmaceuticamente. Mais detalhes sobre técnicas para formulação e administração podem ser encontrados na mais recente edição de Remington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co., Easton PA).
134
133
As composições farmacêuticas para administração oral podem ser formuladas usando-se veículos farmaceuticâmeaite: :âcçji,táy.ejX conhecidos da arte, em dosagens adequadas para administração oral.
. Tais veículos possibilitam que as composições farmacêuticas * 5 sejam formuladas como tabletes, pílulas, drágeas, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, lamas, suspensões etc., adequados para ingestão pelo paciente. Vide publicação PCT WO 93/23572.
As preparações farmacêuticas para uso oral podem ser obtidas através de combinação de compostos ativos com excipiente sólido, 10 opcionalmente moendo-se uma mistura resultante e processando-se a mistura de grânulos, após adicionar compostos adicionais adequados, se desejado, para obterem-se tabletes ou núcleos de drágea. Excipientes adequados são cargas de carboidrato ou proteína, que incluem mas não são limitadas a açúcares, incluindo lactose, sacarose, manitol ou sorbitol, amido de milho, 15 trigo, arroz, batata ou outras plantas; celulose tais como metil celulose, hidroxipropilmetil-celulose ou carboximetilcelulose sódica; e gomas | incluindo arábica e tragacanto; bem como proteínas tais como gelatina e colágeno. Se desejado, agentes desintegrantes ou solubilizantes podem ser adicionados, tais como a polivinil pirrolidona reticulada, agar, ácido algínico 20 ou um seu sal, tal como alginato de sódio.
Núcleos de drágea são providos com revestimentos adequados, tais como soluções de açúcar concentradas, que podem também - conter goma arábica, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietileno glicol e/ou dióxido de titânio, soluções de verniz e solventes orgânicos 25 adequados ou misturas de solventes. Corantes ou pigmentos podem ser adicionados aos revestimentos de tabletes ou drágeas para identificação do produto ou para caracterizar a quantidade de composto ativo (isto é, dosagem).
As preparações farmacêuticas que podem ser usadas
135 oralmente incluem cápsulas de empurrar-ajustar feitas de gelatina, bem como **· · j*· **· ·· ·;·;}, ! .
cápsulas macias seladas, feitas de gelatina e uni^reye^iitnejitQbtal. úornô glicerol ou sorbitol. As cápsulas de empurrar-ajustar podem conter ingredientes ativos misturados com uma carga ou aglutinantes tais como lactose ou amidos, lubrificantes tais como tal ou estearato de magnésio e, opcionalmente, estabilizantes. Nas cápsulas macias, os compostos ativos podem ser dissolvidos ou suspensos em líquidos adequados, tais como óleos graxos, parafina líquida ou polietileno glicol líquido, com ou sem estabilizantes.
As formulações farmacêuticas para administração parenteral incluem soluções aquosas de compostos ativos. Para injeção, as composições farmacêuticas da invenção podem ser formuladas em soluções aquosas, preferivelmente em tamponantes fisiologicamente compatíveis, tais como solução de Hank, solução de Ringer ou solução salina fisiologicamente 15 tamponada. As suspensões de injeção aquosa podem conter substâncias que aumentam a viscosidade das suspensão, tais como carboximetil celulose sódica, sorbitol ou dextrano. Adicionalmente, suspensões dos compostos ativos podem ser preparadas como suspensões de injeção oleosa apropriadas. Solventes lipofílicos adequados ou veículos incluem óleos graxos tais como 20 óleo de sésamo ou ésteres de ácido graxo sintético, tais como oleato de etila ou triglicerídeos, ou lipossomas. Opcionalmente, a suspensão pode também conter estabilizantes ou agentes adequados, que aumentem a solubilidade dos compostos, para permitir a preparação de soluções altamente concentradas.
Para administração tópica ou nasal, penetrantes apropriados para a barreira particular a ser permeada são usados na formulação. Tais penetrantes são geralmente conhecidos na arte.
As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser manufaturadas de uma maneira similar àquela conhecida na arte (por ex., por meio de processos de mistura, dissolução, granulação, produção de
136 tm drágeas, pulverização, emulsificação, encapsulação, coletagem ou ·· · * ··· · 4» · · liofilização). :·’ i f ú’ <·
A composição farmacêutica pode ser fornecida como um sal e pode ser formada com muitos ácidos, incluindo porém não limitado a clorídrico, sulfurico, acético, láctico, tartárico, málico, succínico etc. Os sais tendem a ser mais solúveis em água ou outros solventes protônicos, que são as formas de base livre correspondentes. Em outros casos, a preparação preferida pode ser um pó liofilizado em histidina 1 mM-50 mM, 0,l%-2% sacarose, 2%-7% manitol, em uma faixa de pH de 4,5 a 5,5, que é combinado com tampão antes do uso.
Após as composições farmacêuticas compreendendo um composto da invenção, formuladas em um veículo aceitável, terem sido preparadas, elas podem ser colocadas em um recipiente apropriado e rotuladas para tratamento de uma condição indicada. Para administração de 15 proteínas de telomerase humana e ácidos nucleicos, tal rotulação incluiría quantidade, freqüência e método de administração.
Composições farmacêuticas adequadas para uso na presente invenção incluem composições em que os ingredientes ativos são contidos em uma quantidade efetiva, para obter-se a finalidade pretendida.
Quantidade terapeuticamente eficaz ou quantidade farmacologicamente eficaz são frases bem reconhecidas e referem-se àquela quantidade de agente eficaz para produzir o resultado farmacológico pretendido. Assim, uma quantidade terapeuticamente eficaz é uma quantidade suficiente para melhorar os sintomas da doença sendo tratada. Um ensaio útil de verificar uma quantidade eficaz para uma dada aplicação (por exemplo, uma quantidade terapeuticamente eficaz) é medindo-se o efeito da atividade da telomerase em uma célula alvo. A quantidade atualmente administrada será dependente do indivíduo a que o tratamento é para ser aplicado e, preferivelmente, será uma quantidade otimizada, de modo que o efeito
137 desejado é conseguido sem efeitos colaterais significativos. A determinação ? 3 **· '*í ·’· ϊ.
de uma dose terapeuticamente eficaz está bem dentrÇ d^ cá^áci^dê.dàjqvèrês hábeis na arte.
. Para qualquer composto, a dose terapeuticamente eficaz pode * 5 ser estimada inicialmente nos ensaios de cultura celular ou em qualquer modelo animal apropriado. O modelo animal é também usado para obter uma faixa de concentração desejável e via de administração. Tais informações podem então ser usadas para determinar doses úteis e vias de administração em humanos.
Uma quantidade terapeuticamente eficaz refere-se àquela quantidade de proteína polipeptídeo, peptídeo, anticorpo, oligo ou polinucleotídeo, agonista ou antagonistas que melhoram os sintomas ou condição. A eficácia terapêutica e a toxicidade de tais compostos podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos padrão em culturas de células ou animais experimentais (por ex., ED50, a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população; e LD50, a dose letal para 50% da população). A proporção da dose entre os efeitos terapêuticos e tóxicos é 0 índice terapêutico e pode ser expressa como a relação ED50/LD50. As composições farmacêuticas que exibem grandes índices terapêuticos são preferidas. Os 20 dados obtidos dos ensaios de cultura de célula e estudos animais são usados na formulação de uma faixa de dosagem para uso humano. A dosagem de tais compostos situa-se preferivelmente dentro de uma faixa de concentrações de circulação que incluem ED50 com pouca ou sem nenhuma toxicidade. A dosagem varia dentro desta faixa, dependendo da forma de dosagem 25 empregada, da sensibilidade do paciente e da via de administração.
A dosagem exata é escolhida pelo médico individual, em vista do paciente a ser tratado. A dosagem e administração são ajustadas para fornecer suficientes níveis da metade ativa ou para manter o efeito desejado.
Fatores adicionais, que podem ser levados em consideração, incluem a
138
1Μ3 severidade do estado doentio (por ex., tamanho do tumor e local; idade,.ρ.ε,βο « ·· ·♦ ·; V £ « e sexo do paciente; dieta, tempo e freqüência: de: admmistraçãcf, combinação(ões) de medicamentos, sensibilidades de reação e tolerância/resposta à terapia). Composições farmacêuticas de longa ação podería ser administradas a cada 3 a 4 dias, toda semana, ou uma vez cada duas semanas, dependendo da meia-vida e taxa de depuração da formulação particular. Orientação quanto às dosagens particulares e métodos de suprimento é fornecida na literatura (vide Patentes US nos. 4.657.760: 5.206.344: e 5.225.212, aqui incorporadas por referência). Aqueles hábeis na arte tipicamente empregarão diferentes formulações para nucleotídeos do que para proteínas ou seus inibidores. Similarmente, o suprimento de polinucleotídeos ou polipeptídeos pode ser específico para as células, condições, locações particulares e similares.
VIII. CAPACIDADE PROLIFERATIVA CRESCENTE E PRODUÇÃO DE
CÉLULAS IMORTALIZADAS, LINHAGENS DE CÉLULAS E ANIMAIS.
Como discutido acima, a maioria das células de vertebrados senescem após um número finito de divisões em cultura (por ex., 50 a 100 divisões). Certas células variantes, entretanto, são capazes de dividirem-se infinitamente em cultura (por ex., células HeLa, 293 células) e, por esta 20 razão, são úteis para pesquisa e aplicações industriais. Usualmente estas linhagens de células imortais são derivadas de tumores surgindo expontaneamente ou por transformação por exposição à radiação ou um vírus ou produto químico indutor do tumor. Infelizmente, uma seleção limitada de linhagens de células, especialmente linhagens de células humanas, 25 representando função celular diferenciada, está disponível. Além disso, as linhagens de células imortais, presentemente disponíveis, são caracterizadas por anormalidades cromossomais (por exemplo, aneuplóide, rearranjos de genes ou mutações). Além disso, muitas linhagens de células há muito tempo estabelecidas são relativamente indiferenciadas (por ex., elas não produzem
139
Lmh produtos altamente especializados, de modo que caracterizam unicamente ·· · · · ·· · · · ···· ·· ♦ ·♦ ··· ····· · tecidos ou órgãos particulares). Assim, há necessidade:dêirtóvds jriétôdíjs:de gerar células imortais, especialmente células humanas. Um uso para as células imortalizadas é na produção de proteínas naturais e proteínas recombinantes (por exemplo, polipeptídeos terapêuticos tais como eritropoietina, hormônio do crescimento humano, insulina e similares), ou anticorpos para os quais é preferida uma linha de célula estável, geneticamente normal. Para a produção de algumas proteínas recombinantes, tipos especializados de células podem também ser preferidos (por exemplo, células pancreáticas para a produção de insulina humana). Outro uso para as células imortalizadas ou mesmo células mortais, com capacidade proliferativa aumentada (relativa a células não-modificadas) é para introdução em um paciente para terapia genética ou para substituição de células ou tecidos doentios ou avariados. Por exemplo, células imunes autólogas, contendo ou expressando, por ex., um gene ou polipeptídeo de hTRT recombinantes da invenção, podem ser usadas para substituição de célula em um paciente, após terapia agressiva do câncer, por exemplo, irradiação do inteiro corpo. Outro uso para células imortalizadas é para produção ex vivo de tecidos ou órgãos artificiais (por exemplo, pele) para uso terapêutico. Outro uso para tais células é para triagem ou validação de medicamentos, tais como medicamentos inibidores da telomerase, ou para uso na produção de vacinas ou reagentes biológicos. Usos adicionais das células da invenção serão evidentes àqueles de habilidade.
As células e linhagens de células imortalizadas, bem como aquelas de capacidade simplesmente replicativa aumentada da invenção, são produzidas aumentando-se a atividade da telomerase na célula. Qualquer método aqui revelado para aumentar a atividade da telomerase pode ser usado. Assim, em uma versão, as células são imortalizadas aumentando-se a quantidade de polipeptídeo de hTRT na célula. Em uma versão, os níveis de
140 hTRT são aumentados introduzindo-se um vetor de expressão de hTRT ·· · · ··· · · · ··· * dentro da célula (com transfecção estável às vezes pie’fehdd):*CcÍnx®:di§dü;tídp acima, a seqüência de codificação hTRT é usualmente operavelmente ligada * a um promotor, que pode ser indutível ou constitutivamente ativo na célula.
Em uma versão, um polinucleotídeo, compreendendo uma seqüência codificando um polipeptídeo da SEQÜÊNCIA ID NO: 2, cuja seqüência é operavelmente ligada a um promotor (por ex., um promotor constitutivamente expresso, por exemplo, uma seqüência da SEQÜÊNCIA ID NO: 6), é introduzido na célula. Em uma versão, o polinucleotídeo 10 compreende uma seqüência da SEQÜÊNCIA ID NO: 1. Preferivelmente, o polinucleotídeo inclui poliadenilação e sinais de terminação. Em outras versões, elementos adicionais tais como intensificadores ou outros, discutidos acima, são incluídos. Em uma versão alternativa, o polinucleotídeo não inclui uma seqüência promotora, tal seqüência sendo provida pelo genoma 15 endógeno da célula alvo em seguida à integração (por ex., recombinação, por ex., recombinação homóloga) do polinucleotídeo introduzido. O polinucleotídeo pode ser introduzido na célula alvo por qualquer método, incluindo qualquer método aqui descrito, tal como lipofecção, eletroporação, virossomas, lipossomas, imunolipossomas, conjugados de policátion:ácido 20 nucleico, DNA desnudo).
Empregando-se os métodos da invenção, qualquer célula vertebrada pode ser feita ter uma aumentada capacidade proliferativa ou mesmo ser imortalizada e sustentada indefinidamente em cultura. Em uma versão, as células são mamíferas, com células humanas preferidas para 25 muitas aplicações. Exemplos de células humanas que podem ser imortalizadas incluem aquelas da Tabela 3.
Será reconhecido que os ensaios diagnósticos da invenção descrita abaixo podem ser usados para identificar e caracterizar as células imortalizadas da invenção.
141
6
TABELA 3 ·· · · ··· · · · ··· ·
Células Humanas em que a Expressão da hTRT-PodeiSSefÂènjdnjtdjâ; :·:
• · · · · ········· · ·
Células epiteliais ceratinizantes
Ceratinócito da epiderme (célula epidérmica diferenciante)
Célula basal da epiderme (célula-tronco)
Ceratinócito das unhas digitais e unhas dos pés
Célula basal do leito ungueal (célula tronco)
Células do pedículo piloso medulares, corticais, cuticulares; células da bainha radicular do cabelo, cuticulares, da camada de Huxley, da camada de Henle extema; célula da matriz do cabelo (célula tronco)
Células dos Epitélios da Barreira Estratificada Úmida
Célula epitelial de superfície do epitélio escamoso estratificado da língua, cavidade oral, esôfago, canal anal, uretra distai, vagina
Célula basal destes epitélios (célula tronco)
Célula do epitélio comeal externo
Célula do epitélio urinário (revestimento da bexiga e dutos urinários) Células Epiteliais Especializadas para Células de Secreção Exócrina
Células da glândula salivar célula mucosa (serecção rica em polissacarídeo) célula serosa (secreção rica em enzimas de glicoproteína célula de glândula de von Ebner da língua (secreção para lavagem sobre os botões gustativos)
Célula da glândula mamária, secretando leite
Célula da glândula lacrimal, secretando lágrimas
Célula da glândula ceruminosa da orelha, secretando cera
Célula da glândula do suor écrina, secretando glicoproteínas (célula escura) Célula da glândula do suor écrina, secretando pequenas moléculas (célula
142
1ΜΎ
·.
clara) ··* · · ·♦· · · · ··· *
Célula da glândula do suor apócrina (secreçãc)·’ oífcfcfffífa’: sernsfvyl :ao • · ·· · ··· ··· ··· · · hormônio do sexo)
Célula da glândula de Moll da pálpebra (glândula do suor especializada)
Célula da glândula sebácea, secretando sebo rico em lipídeos
Célula da glândula de Bowman do nariz (secreção para lavagem sobre o epitélio olfativo)
Célula da glândula de Brunner no duodeno, secretando solução alcalina de muco e enzimas
Célula da vesícula seminal, secretando componentes de fluido seminal, incluindo frutose (como combustível para esperma nadante)
Célula da glândula da próstata, secretando outros componentes de fluido seminal
Célula da glândula bulbouretral, secretando muco
Célula da glândula de Bartholin, secretando lubrificante vaginal
Célula da glândula de Littré, secretando muco
Célula do endométrio do útero, secretando principalmente carboidratos
Célula caliciforme isolada dos tratos respiratórios e digestivo, secretandomuco
Célula mucosa da linhagem do estômago
Célula zimogênica da glândula gástrica, secretando pepsinogênio
Célula oxíntica da glândula gástrica, secretando HCI
Célula acinar do pâncreas, secretando enzimas digestivas e bicarbonato
Célula de Paneth do intestino delgado, secretando lisozima
Pneumócito tipo II do pulmão, secretando tensoativo
Célula de Clara do pulmão
Células Especializadas para Secreção de Hormônios
Células da pituitária anterior, secretando hormônio do crescimento, hormônio estimulante do
143 folículo, hormônio luteinizante, prolactina, hormônio adrenocorticotrópico e hormônio estfeu|aú<£:da’jnpfc(®:, :·:
• · ·· · ··· ··· ··· · ·
Célula da pituitária intermediária, secretando hormônio estimulante do melanócito
Células da pituitária posterior, secretando oxitocina, vasopressina
Células do intestino, secretando serotonina, endorfma, somatostatina, gastrina, secretina, colecistocinina, insulina e glucagon
Células da glândula tiróide, secretando hormônio da tiróide, calcitonina
Células da glândula paratiróide, secretando hormônio da paratiróide, célula oxifílica
Células da glândula adrenal, secretando epinefrina, norepinefrina e hormônios esteróides;
mineralocorticóides glucocorticóides
Células das gônadas, secretando testosterona (célula de Leydig dos testículos) estrogênio (célula interna da teca do folículo ovariano) progesterona (célula do corpo lúteo do folículo ovariano rompido)
Células do aparelho justaglomerular do rim célula justaglomerular (secretando renina)
Célula da mácula densa
Célula peripolar
Célula mesanglial
Células Absortivas Epiteliais do Intestino, Glândulas Exócrinas e Trato Urogenital
144
Célula limítrofe da escova do intestino (com microvilosidades) ·· · · ··· · · · ··· »
Célula do duto estriado das glândulas exócrinas ··’ : :·: ·’’ *·: í*: ·:·· • * ·· · ··· ··· ··· · ·
Célula epitelial da vesícula biliar
Célula limítrove da escova do túbulo proximal do rim
Célula do túbulo distai do rim
Célula não-ciliada dos dúctulos eferentes
Célula principal epidimária
Célula basal epidimária
Células Especializadas para Metabolismo e Armazenagem hepatócito (célula do fígado)
Células gordurosas gordura branca gordura castanha lipócito do fígado
Células Espiteliais Servindo Principalmente a uma Função Barreira, Revestimento do Pulmão, Intestino, Glândulas Exócrinas e Trato Urogenital.
Pneumócito tipo I (revestimento do espaço aéreo do pulmão)
Célula do duto pancreático (célula centroacinar)
Célula do duto não-estriado da glândula do suor, glândula salivaria, glândula mamária
Célula parietal do glomérolo do rim
Podócito do glomérolo do rim
Célula do segmento delgado do lupe de Henle (no rim)
Célula de duto coletante (do rim)
Célula de duto da vesícula seminal, glândula da próstata
Células Epiteliais Revestindo Cavidades Corporais Internas Fechadas
Células endoteliais vasculares dos vasos sangüíneos e linfáticos fenestradas
145 contínuas «· ♦ ♦ ·*♦ · · * ··· >
esplênicas / *; *.·: ,·: ?· ·’*:
• * ·♦ « ·♦* ·♦· ··· · ·
Célula sinovial (revestindo cavidades das juntas, secretando largamente ácido hialurônico)
Célula serosa (revestindo as cavidades peritoneal, pleural e pericardial)
Célula escamosa, revestindo o espaço perilinfático da orelha
Células revestindo o espaço endolinfático da orelha
Célula escamosa
Células colunares do saco endolinfático com microvilosidades sem microvilosidades
Célula escura
Célula da membrana vestibular (lembrando a célula do plexo coróide)
Célula basal da estria vascular
Célula marginal da estria vascular
Célula de Claudius
Célula de Boettcher
Célula do plexo coróide (secretando fluido cerebroespinhal)
Célula escamosa do pia-aracnóide
Células do epitélio ciliar do olho pigmentadas não-pigmentadas
Célula endotelial comeal
Células Ciliadas com Função Propulsiva do trato respiratório do oviduto e do endométrio do útero (em fêmeas) da rede reticular e duto eferente (em machos) do sistema nervoso central (célula ependimal revestindo as cavidades do cérebro)
146
Ú_<5_L
Célula Especializada para Secreção de Matriz Extracelular ; · . * ♦ ♦♦ epiteliais: : * « *»· ·*’ amenoblasto (secretando o esmalte do dente) célula do plano semilunar do aparelho vestibular da orelha (secretando proteoglicano) célula interdental do órgão de Corti (secretando membrana tectorial cobrindo as células pilosas do órgão de Corti) não-epiteliais (tecido conectivo) fibroblastos (vários dos tecidos conectivos soltos, da córnea, do tendão, do tecido reticular da medula óssea etc.) pericito do capilar sangüíneo célula do núcleo polposo do disco intervertebral cementoblasto/cementócito (secretando camada semelhante a osso da raiz dos dentes) ondoblasto/ondotócito (secretando dentina do dente) condrócitos de cartilagem de hialina, de fibrocartilagem de cartilagem elástica osteoblasto/osteócito célula osteoprogenitora (célula tronco de osteoblastos) hialócito do corpo vítreo do olho célula estrelada do espaço perilinftático da orelha
Células Contrateis
Células muscular esqueléticas vermelhas (lentas) brancas (rápidas)
Intermediárias
147
1<5Χ músculo fusiforme - saco nuclear músculo fusiforme - cadeia nuclear · · ··’ • i · célula satélite (célula tronco) * Células do músculo do coração ordinárias nodais fibra de Purkinje
Células do músculo liso
Células epiteliais da íris das glândulas exócrinas
Células do Sangue e do Sistema Imune
Glóbulos vermelhos
Megacariócitos
Macrófagos monócitos macrófago do tecido conectivo (vários) célula de Langerhans (da epiderme) osteoclasto (do osso) célula dendrítica (em tecidos linfóides) célula microglial (no sistema nervoso central)
Neutrófilo
Eosófilo
Basófilo mastócito linfócito T
Célula T auxiliar
Célula T supressora
Célula T exterminadora
148
Linfócito Β
IgM h: ί :4:·:1 ·····♦··
IgG
IgA
IgE
Célula exterminadora
Células tronco para o sistema sanguíneo e imune (várias)
Transdutores Sensoriais
Fotorreceptores bastão cones sensível ao azul sensível ao verde sensível ao vermelho
Audição célula pilosa interna do órgão de Corti célula pilosa externa do órgão de Corti
Aceleração e gravidade célula pilosa tipo I do aparelho vestibular da orelha célula pilosa tipo II do aparelho vestibular da orelha
Paladar célula botão do palador tipo II
Olfato neurônio olfativo célula basal do epitélio olfativo (célula tronco para neurônios olfativos) pH do sangue célula do corpo carótido tipo I
149
Η tipo II ··. · ·_ ··· ... ... ,
Toque : · j / j y y ;·.
• · ·· · ··· ··· ··· · · célula de Merkel da epiderme neurônios sensoriais primários, especializados para toque
Temperatura neurônios sensoriais primários especializados para temperatura sensíveis ao frio sensíveis ao calor
Dor neurônios sensoriais primários, especializados para a dor
Configurações e forças do sistema musculoesquelético neurônios sensoriais primários proprioceptivos
Neurônios Anatômicos
Colinérgicos
Adrenérgicos
Peptidérgicos
Células de Suporta dos Órgãos do Sentido e dos Neurônios Periféricos
Células de suporte do órgão de Corti célula do pilar interno célula do pilar externo célula falangeal interna célula falangeal externa célula limítrofe célula de Hensen
Célula de suporte do aparelho vestibular
Célula de suporte do botão do paladar (célula do botão do paladar tipo I)
Célula de suporte do epitélio olfativo
Célula de Schwann
150
Célula satélite (corpos celulares nervosos periféricos encapsulantes) ·· · · ··· ·
Célula glial entérica :·’ · *··’· ’ • · ·· · ··· «
Neurônios e Células Gliais do Sistema Nervoso Central ♦ Neurônios
Células gliais astrócito oligodendrócito
Células de Lente
Célula epitelial da lente anterior
Fibra da lente (célula contendo cristalino)
Células Pigmentares
Melanócito, célula epitelial pigmentada retinal
Células Germinativas
Oogônio/oócito
Espermatócito
Espermatogônio (célula tronco para espermatócito)
Células Alimentadoras
Célula do folículo ovariano
Célula de Sertoli (nos testículos)
Célula epitelial do timo
Células Tronco
Célula tronco embriônica
Célula germinativa embriônica
Célula tronco de adulto
Célula tronco fetal
IX. ENSAIOS DIAGNÓSTICOS
A) INTRODUÇÃO
1) ENSAIOS DE TRT
A presente invenção supre uma larga variedade de ensaios
151 para TRT, preferivelmente hTRT, e telomerase. Estes ensaios fornecem, entre outras coisas, a base para ensaios sensíveis, não dispéridijos®fc;’cóhv’ehieh,t^s:€J * * ♦· · ··· ♦·· ··· · · largamente aplicáveis para diagnose e prognose de diversas doenças humanas, das quais o câncer é um exemplo ilustrativo. Como citado acima, 5 os produtos genéticos de hTRT (proteína e mRNA) são usualmente elevados nas células humanas imortais em relação à maioria das células normais (isto é, células telomerase-negativa e maioria das células somáticas de adulto normais telomerase-positiva). Assim, em um aspecto, a invenção fornece ensaios úteis para detectar ou medir a presença, ausência ou quantidade de 10 um produto genético hTRT em uma amostra de ou contendo células humanas ou outros mamíferos ou eucarióticas, para caracterizar as células como imortais (tais como uma célula de tumor maligno) ou mortais (tais como a maioria das células somáticas normais em adultos) ou uma telomerase positiva ou negativa.
Qualquer condição caracterizada pela presença ou ausência de um produto genético de hTRT (isto é, proteína ou RNA) pode ser diagnosticada empregando-se os métodos e materiais aqui descritos. Estes incluem, como descrito mais totalmente abaixo, cânceres, outras doenças de proliferação celular acelerada, distúrbios imunológicos, fertilidade, 20 infertilidade e outros. Além disso, tendo em vista que o grau a que a atividade de telomerase é elevada nas células cancerosas é correlacionado com as características do tumor, tais como potencial metastático, monitoração hTRT, mRNa ou níveis de proteína podem ser usados para estimar e predizer a provável progressão futura de um tumor.
Em um aspecto, os métodos diagnósticos e prognósticos da invenção acarretam a determinação de se um produto genético TRT humana está presente em uma amostra biológica (por exemplo, de um paciente). Em um segundo aspecto, a abundância do produto genético de hTRT em uma amostra biológica (por exemplo, de um paciente) é determinada e comparada
152
Ιού com a abundância em uma amostra de controle (por exemplo, células ou ·*· · ··· · · · ··· · tecidos normais). Em um terceiro aspecto, a lócâlifcição*j ςθΐιίΐάζ’.σΐζ • · ♦· · ··· ··· ··· · · intracelular de um produto genético de hTRT é determinada em uma amostra de célula ou tecido. Em um quarto aspecto, as células hospedeiras (por exemplo, paciente) são ensaiadas para identificar os ácidos nucleicos com as características de seqüência de uma tendência herdável para expressão genética de hTRT (quantidade anormal, regulação, ou produto), tal como é utilizável na triagem genética ou aconselhamento genético. Em um quinto aspecto, os ensaios da invenção são usados para detectar a presença de anticorpos anti-hTRT (por ex., em soro de paciente). Os métodos descritos abaixo com algum detalhe são indicativos dos ensaios utilizáveis que podem ser realizados empregando-se as seqüências e relações aqui descritas.
Entretanto, numerosas variações ou outras aplicações destes ensaios serão evidentes àqueles de habilidade comum na arte, em vista desta descrição.
Será reconhecido que, embora os ensaios abaixo sejam apresentados em termos de métodos diagnósticos e prognósticos, eles podem ser usados sempre que um gene de hTRT, produto genético ou variante é para ser detectado, quantificado ou caracterizado. Assim, por exemplo, os métodos diagnósticos descritos abaixo são utilizáveis para ensaios de hTRT 20 ou telomerase, durante a produção e purificação da hTRT ou telomerase humana, para caracterização das linhagens de células derivadas de células humanas (por ex., para identificar linhagens imortais), para caracterização de células, animais não-humanos, plantas, fungos, bactérias ou outros organismos que compreendam um gene de TRT humana ou produto genético 25 (ou seus fragmentos).
Como aqui usado, o termo diagnóstico tem seu sentido usual de identificar a presença ou natureza de uma doença (por ex., câncer), condição (por ex., infértil, ativada), ou situação (por ex., fértil) e o termo prognóstico tem seu sentido usual de predizer o desenvolvimento provável
153 e/ou resultado de uma doença ou condição. Embora estes dois termos sejam :·. : .·. ··: .·. .·. :·· :
usados de maneiras um tanto diferentes em um cènáiio’*j:líni$o,**dpV$’:sfeç * · ·· · ··· ··· ··· · · entendido que quaisquer dos ensaios ou formatos de ensaio descritos abaixo, * com referência a diagnose, são igualmente adequados para determinação da prognose, porque é bem estabelecido que níveis mais elevados de atividade de telomerase são associados com prognoses mais fracos para pacientes com câncer e porque a presente invenção fornece métodos de detecção específicos para hTRT, que seja expressa em níveis que se correlacionem proximamente com a atividade da telomerase em uma célula.
2) DIAGNOSE E PROGNOSE DO CÂNCER
A determinação de um gene de hTRT, mRNA ou nível de proteína acima da faixa normal ou padrão é indicativa da presença de células de telomerase-positiva, ou imortais, das quais certas células tumorais são exemplos. Em vista de certas células embriônicas e fetais, bem como certas 15 células-tronco de adulto, expressarem telemorase, a presente invenção também fornece métodos para determinar outras condições, tais como gravidez, pela detecção ou isolamento das células fetais de telomerase positiva de sangue materno. Estes valores podem usar usados para produzir, I ou auxiliar na produção de, um diagnóstico, mesmo quando as células tenham sido classificadas como cancerosas ou de outro modo detectadas ou classificadas usando-se métodos tradicionais. Assim, os métodos da presente invenção permitem a detecção ou verificação de condições cancerosas ou outras, associadas com a telomerase, com confiança aumentada, e pelo menos em alguns exemplos em um estágio mais prematuro. Os ensaios da invenção permitem a discriminação entre diferentes classes e graus de tumores humanos ou outras doenças proliferativas das células, ao prover ensaios quantitativos para o gene da hTRT e produtos genéticos e, desse modo, facilitam a seleção dos apropriados regimes de tratamento e diagnoses precisas. Além disso, tendo em vista que os níveis da atividade da telomerase
154 podem ser usados para distinguir entre tumores benignos e malignos (por ex., ·*· z ·*» ··· · · ♦ ··♦ ·
Patente U.S. no. 5.489.508; Hyama e outros, 1997,:-Prêc>Afn.*;A^S.’(táhchf • * ·♦ · ··· ··· ··· · ·
Res. 38:637), para predizer imanecência de invasão (por ex., Patente U.S. no. 5.639.613; Yashima e outros, 1997, Proc. Am Ass. Câncer Res. 38:326) e para correlacionar com o potencial metastático (por ex., Patente U.S. no. 5.648.215; Pandita e outros, 1996, Proc. Am. Ass. Câncer Res. 37:559), estes ensaios serão úteis para a profilaxia, detecção e tratamento de uma larga variedade de cânceres humanos.
Para prognose de cânceres (ou de outras doenças ou condições caracterizadas por telomerase elevada), um valor prognóstico do produto genético de hTRT (mRNA ou proteína) ou atividade para um tipo, classe ou grau de tumor particular, é determinado abaixo. Os níveis de proteína ou mRNA de hTRT ou a atividade da telomerase em um paciente podem também ser determinados (p. ex., usando-se os ensaios aqui descritos) e comparados com o nível prognóstico.
Dependendo do ensaio usado, em alguns casos a abundância de um produto genético de hTRT de uma amostra será considerada elevada sempre que for detectável pelo ensaio. Devido à baixa abundância do mRNA e proteína de hTRT, mesmo em células de telomerase-positiva, e à raridade ou não existência destes produtos genéticos em células normais ou de telomerase-negativa, ensaios sensíveis são necessários para detectar o produto genético da hTRT, se presente em absoluto em células normais. Se ensaios menos sensíveis forem selecionados, os produtos genéticos de hTRT será indectáveis no tecido saudável, porém serão detectáveis no câncer de telomerase-positiva ou outras células de telomerase-positiva. Tipicamente, a quantidade do produto genético de hTRT em uma amostra elevada é de pelo menos cerca de cinco, freqüentemente pelo menos cerca de dez, mais freqüentemente pelo menos cerca de 50 e muito freqüentemente pelo menos cerca de 100 a 1000 vezes mais elevado do que os níveis nas células de
155 controle de telomerase-negativa ou células de tecidos saudáveis de um adulto, onde a percentagem das células normais de’ têlô^raíe-JpbsâiVaM muito baixo.
Os métodos diagnósticos e prognósticos da presente invenção podem ser empregados com qualquer tipo de célula ou tecido de qualquer origem e podem ser usados para detectar uma célula imortal ou neoplástica, ou tecido tumoral, ou câncer, de qualquer origem. Tipos de câncer que podem ser detectados incluem mas não são limitados a todos aqueles listados acima na discussão de aplicações terapêuticas de hTRT.
Os ensaios da invenção são também úteis para monitorar a eficácia da intervenção terapêutica em pacientes sendo tratados com regimes anti-câncer. Os regimes anti-câncer, que podem ser monitorados, incluem todos os tratamentos presentemente aprovados (incluindo quimioterapia, terapia de radiação e cirurgia) e também inclui tratamentos a serem aprovados no futuro, tais como terapias de inibição ou ativação da telomerase, como aqui descrito (vide, p. ex., Publicação PCT Nos. 96/01835 e 96/40868 e Patente U.S. no. 5.583.016, todas incorporadas por referência em sua totalidade).
Em outro aspecto, os ensaios descritos abaixo são úteis para detectar certas variações da seqüência genética da hTRT (mutações e alelos de hTRT herdáveis), que são indicativos de uma predileção por cânceres ou outras condições associadas com a regulação anormal da atividade de telomerase (infertilidade, envelhecimento prematuro).
3) DIAGNOSE DE CONDIÇÕES QUE NÃO CÂNCER
Além da diagnose de cânceres, os ensaios da presente invenção têm numerosas outras aplicações. A presente invenção fornece reagentes e métodos/diagnose de condições ou doenças caracterizadas por sub ou super-expressão da telomerase ou produtos genéticos de hTRT em células. Em adultos, um baixo nível de atividade de telomerase é
156 normalmente encontrado em um complemento limitado de células somáticas *** ♦ ·** **· ·· <*· í*· » humanas normais, por exemplo, células-tronco, linfacitòs aiitfadjDS.-ê jeérojasí ♦ · ··· »·· ··* · · germinativas e é ausente de outras células somáticas. Assim, a detecção da atividade da hTRT ou telomerase em células em que está normalmente ausente ou inativa, ou a detecção em níveis anormais (isto é, mais elevados ou mais baixos do que o normal) em células em que a hTRT está normalmente presente em um baixo nível (tal como células-tronco, linfócitos ativados e células germinativas), podem ser diagnósticos de uma doença ou condição relacionada com a telomerase ou podem ser usadas para identificar 10 ou isolar um tipo específico de célula (isto é, para isolar células-tronco). Exemplos de tais doenças e condições incluem: doenças de proliferação de célula, distúrbios imunológicos, infertilidade, doenças da função celular imune, gravidez, anormalidades fetais, envelhecimento prematuro e outras. Além disso, os ensaios da invenção são úteis para monitorar a eficácia da 15 intervenção terapêutica (incluindo porém não limitado a medicamentos que modulam a atividade da telomerase) em um paciente ou em um ensaio baseado em célula ou animal.
Em um aspecto, a invenção fornece ensaios úteis para diagnosticar a infertilidade. As células germinativas humanas (por exemplo, 20 células de espermatogônios, seus progenitores ou descendentes) são capazes de proliferação indefinida e caracterizadas por elevada atividade de telomerase. Níveis ou produtos anormais ou níveis diminuídos dos produtos genéticos de hTRT podem resultar em inadequada ou anormal produção de espermatozóides, conduzindo a infertilidade ou distúrbios de reprodução. 25 Portanto, a invenção fornece ensaios (métodos e reagentes) para diagnose e tratamento dos distúrbios reprodutivos baseados-na-telomerase. Similarmente, os ensaios podem ser usados para monitorar a eficácia de contraceptivos (p. ex., contraceptivos masculinos) que alvejam ou indiretamente afetam a produção de esperma (e que reduziríam os níveis de
157 hTRT ou atividade da telomerase).
J · ♦ * ·*Em outro aspecto, a invenção fornece? èn§aiqs;pai;a da telomerase e níveis e função de hTRT em células-tronco, células fetais, • células embriônicas, linfócitos ativados e células-tronco hematopoiéticas. Por 5 exemplo, os ensaios para a detecção do produto genético de hTRT podem ser usados para monitorar a função imune genericamente (p. ex., por monitoração da prevalência dos linfócitos ativados ou abundantes das células-tronco progenitoras), para identificar ou selecionar ou isolar os linfócitos ou células-tronco ativados (com base nos níveis de hTRT elevados) 10 e para monitorar a eficácia das intervenções terapêuticas alvejando estes tecidos (p. ex., agentes imunossupressivos ou tentativa terapêutica para expandir uma população de célula-tronco).
A invenção também fornece ensaios úteis para identificação de imunoglobulinas anti-telomerase ou anti-TRT (encontradas no soro de um 15 paciente). Os materiais e ensaios aqui descritos podem ser usados para identificar pacientes em que tais anticorpos auto-imunes são encontrados, permitindo diagnóstico e tratamento da condição associada com as imunoglobulinas.
I 4) MONITORAÇÃO DE CÉLULAS EM CULTURA
Os ensaios descritos aqui são também úteis para monitorar a expressão dos produtos genéticos de hTRT e caracterização dos genes de hTRT em células ex vivo ou in vitro. Tendo em vista que os níveis elevados de hTRT são característicos de células imortalizadas, os ensaios da invenção podem ser usados, por exemplo, para triar, ou identificar, células 25 imortalizadas ou para identificar um agente capaz de mortalizar células imortalizadas, pela inibição da expressão ou função de hTRT. Por exemplo, o ensaio será útil para identificar células imortalizadas por expressão aumentada de hTRT na célula, por exemplo, pela expressão de uma hTRT recombinante ou pela expressão aumentada de uma hTRT endogenamente
158 codificada (p. ex., pela ativação do promotor).
· > · ·*· w
Similarmente, estes ensaios podem ser áisadqs^paía Jnóniforsu:
• · · · · ··· ·· · · a expressão da hTRT em animais ou células transgênicas (p. ex., células de levedura ou humanas, contendo um gene de hTRT). Em particular, os efeitos de certos tratamentos (p. ex., aplicação de antagonistas da telomerase conhecidos ou putativos) sobre os níveis da hTRT em células humanas e nãohumanas, expressando a hTRT da invenção, podem ser usados para identificar medicamentos úteis e candidatos a medicamentos (p. ex., medicamentos moduladores da atividade da telomerase).
B) VALORES NORMAIS, DIAGNÓSTICOS E PROGNÓSTICOS
Os ensaios quanto a presença ou quantidade de produtos genéticos de hTRT podem ser realizados e os resultados interpretados em uma variedade de maneiras, dependendo do formato do ensaio, da natureza da amostra sendo ensaiada e da informação procurada. Por exemplo, a 15 abundância de estado constante dos produtos genéticos de hTRT é tão baixa na maioria dos tecidos somáticos humanos que eles são indetectáveis por certos ensaios. Além disso, não há geralmente atividade de telomerase nas
células destes tecidos, tomando a verificação da atividade muito fácil. Contrariamente, a proteína de hTRT e/ou mRN de hTRT ou telomerase são suficientemente abundantes em outros tecidos telomerase-positiva, por exemplo, tumores malignos, de modo que os mesmos podem ser detectados empregando-se os mesmos ensaios. Mesmo naqueles tipos de células somáticas, em que os baixos níveis da atividade de telomerase podem normalmente ser detectados (por ex., células-tronco e certas células ativadas do sistema hematopoiético), os níveis de mRNA de hTRT e da atividade de podem ser facilmente distinguidas pelos métodos da presente invenção. Será apreciado que, quando um ensaio menos sensível é usado, a simples telomerase são uma pequena fração (por ex., estimada em cerca de 1% ou menos) dos níveis nas células imortais; assim, as células imortais e mortais
159 detecção do produto genético de hTRT em uma amostra biológica pode ela ;·, j φ·φ ««j ... ··· .
própria ser diagnostica, sem a exigência de análises* aiiicíoiiaiá. Μςϊίιίφέβο, • · ·· · ··· ··· ··· · · embora os ensaios descritos abaixo podem ser refinadamente sensíveis, eles podem também, se desejado, ser tomados menos sensíveis (p. ex., através de criteriosa escolha dos tampões, condições de lavagem, números de ciclos de ampliação, reagentes e/ou escolha dos ampliadores de sinal). Assim, virtualmente qualquer ensaio pode ser projetado de modo que ele detecte os produtos genéticos de hTRT somente em amostras biológicas em que eles estejam presentes em uma concentração particular, p. ex., uma concentração mais elevada do que em tecido saudável ou outro de controle. Neste caso, qualquer nível detectável mRNA ou proteína de hTRT será considerado elevado em células de tecido somático humano pós-natal (outras que não células hematopoiéticas e outras células-tronco).
Em alguns casos, entretanto, será desejável estabelecer valores (ou faixas) normais ou de linha de base para os níveis de expressão do produto genético de hTRT, particularmente quando ensaios muito sensíveis, capazes de detectar níveis muito baixos de produtos genéticos de hTRT, que possam estar presentes em células somáticas normais, são usados. Níveis normais de expressão ou produtos de expressão normais podem ser 20 determinados para qualquer população particular, subpopulação ou grupo de organismos, de acordo com métodos padrão bem conhecidos daqueles hábeis na arte e empregando-se os métodos e reagentes da invenção. Genericamente, níveis de linha de base (normais) de proteína de hTRT ou mRNA de hTRT são determinados quantificando-se a quantidade de proteína e/ou mRNA de 25 hTRT em amostras biológicas (p. ex., fluidos, células ou tecidos) obtidas de indivíduos normais (saudáveis), p. ex., um indivíduo humano. Para certas amostras e finalidades, pode-se desejar quantificar a quantidade de produto genético de hTRT em uma base por célula ou por célula tumoral. Para determinar a celularidade de uma amostras, pode-se medir o nível de um
160
16-5 produto genético constitutivamente expresso ou outro produto genético ·*· * >·» ··· · · · ··· · expresso em níveis conhecidos em células do tipò jãa’’inie *h jahieTsíf^ :φί retirada. Altemativamente, os valores normais da proteína de hTRT ou mRNA de hTRT podem ser determinados quantificando-se a quantidade de 5 proteína/RNA de hTRT em células ou tecidos sabidos serem saudáveis, que são obtidos do mesmo paciente de que as células doentias (ou possivelmente doentias) são coletadas ou de um indivíduo saudável. Altemativamente, os níveis da linha de base podem ser definidos em alguns casos como o nível presente em células somáticas humanas não-imortais em cultura. É possível 10 que os valores normais (linha de base) possam diferir um tanto entre diferente tipos de células (por ex., os níveis de mRNA de hTRT serão mais elevados em testículos do que no rim), ou de acordo com a idade, sexo ou condição física de um paciente. Assim, por exemplo, quando um ensaio é usado para determinar mudanças nos níveis de hTRT associados com câncer, as células 15 usadas para determinar a faixa normal da expressão do produto genético da hTRT podem ser células de pessoas da mesma ou de diferente idade, dependendo da natureza da investigação. A aplicação de métodos estatístico padrão, usados na genética molecular, permite a determinação de níveis de expressão de linha de base, bem como permite a identificação de 20 significativos desvios de tais níveis da linha de base.
Na execução dos métodos diagnósticos e prognósticos da invenção, como descrito acima, às vezes será útil referir-se a valores diagnósticos e prognósticos. Como aqui usado, o valor diagnóstico refere-se a um valor que é determinado para o produto genético de hTRT 25 detectado em uma amostra que, quando comparada com uma faixa normal (ou linha de base) do produto genético de hTRT, é indicativo da presença de uma doença. A doença pode ser caracterizada por elevada atividade de telomerase (p. ex., câncer), a ausência de atividade de telomerase (por ex., infertilidade) ou algum valor intermediário. O valor prognóstico refere-se a
161 uma quantidade do produto genético de hTRT detectado em um determinado ·*· · ·*· ·*· · · · ··· · tipo de célula (p. ex., célula tumoral maligna), qiie’ é: coàsistdnte*’ çdiifjií^a x x · · ·· · ··· ··· ··· * · diagnose e prognose particulares para a doença (p. ex., câncer). A quantidade (incluindo uma quantidade zero) do produto genético de hTRT detectado em uma amostra é comparada com o valor prognóstico para a célula, de modo que a comparação relativa dos valores indica a presença da doença ou o provável resultado da progressão da doença (p. ex., câncer). Em uma versão, por exemplo, para avaliar a prognose tumoral, são coletados dados para obter-se uma correlação estatisticamente significativa de níveis de hTRT com diferentes classes ou graus de tumores. Uma faixa predeterminada de níveis de hTRT é estabelecida para a mesma amostra de célula ou tecido obtida de indivíduos tendo resultados clínicos conhecidos. Um número suficiente de medições é feito para produzir um valor estatisticamente significativo (ou faixa de valores) a que uma comparação será feita. Uma faixa predeterminada 15 de níveis ou atividade de hTRT para uma determinada amostra de célula ou tecido pode então ser usada para determinar um valor ou faixa para o nível do
produto genético de hTRT que se correlacionaria com a prognose favorável (ou menos infavorável) (p. ex., um baixo nível no caso do câncer). Uma faixa correspondendo a um nível elevado, correlacionada com uma (ou uma mais) desfavorável prognose, no caso de câncer, pode similarmente ser determinada. O nível do produto genético de hTRT de uma amostra biológica (p. ex., uma amostra de paciente) pode então ser determinado e comparado com as baixas e elevadas faixas e usado para predizer um resultado clínico.
Embora a discussão acima refira-se a câncer para ilustração, será entendido que valores diagnósticos e prognósticos podem também ser determinados para outras doenças (p. ex., doenças de proliferação celular) e condições em que, para doenças ou condições que não câncer, um nível elevado pode ser correlacionado com o resultado desejado e um nível baixo correlacionado com um resultado desfavorável. Por exemplo,
162 algumas doenças podem ser caracterizadas por uma deficiência (p. ex., baixo ·*· · .*· **: · · · ··· · nível) de atividade de telomerase das células-troncò, ilifrfoóitds *aíiyà(Jqs-:^)u * · ·· · ··· ··· ··· · · células da linha germinativa. Em tais casos, níveis elevados de produtos genéticos de hTRT relativos a células de similares idade e/ou tipo (por ex., de outros pacientes ou outros tecidos de um paciente particular) podem ser correlacionados com um resultado favorável.
Será apreciado que os métodos de ensaio não necessariamente requerem medição de valores absolutos de hTRT, a não ser que seja assim desejado, porque os valores relativos são suficientes para muitas aplicações 10 dos métodos da presente invenção. Onde a quantificação for desejável, a presente invenção fornece reagentes para que virtualmente qualquer método conhecido para quantificar os produtos genéticos possa ser usado.
Os ensaios da invenção podem também ser usados para avaliar a eficácia de um regime de tratamento terapêutico particular em estudos 15 animais, em experiências clínicas ou na monitoração do tratamento de um paciente individual. Nestes casos, pode ser desejável estabelecer a linha de base para o paciente antes de começar a terapia e repetir os ensaios uma ou mais vezes através do curso do tratamento, usualmente em uma base regular, para avaliar se os níveis de hTRT estão avançando para o ponto final 20 desejado (p. ex., expressão reduzida de hTRT quando o ensaio for para câncer), como um resultado do tratamento.
Uma pessoa hábil apreciará que, além da quantidade ou abundância dos produtos genéticos de hTRT, padrões de expressão variantes ou anormais (p. ex., quantidades anormais de RNA unido variantes) ou 25 produtos de expressão variantes ou anormais (p. ex., transcritos mutados, polipeptídeos truncados ou sem sentido) podem também ser identificados por comparação com níveis de expressão normal e produtos de expressão normal. Nestes casos, a determinação de normal ou linha de base envolve identificar organismos saudáveis e/ou tecidos (isto é, organismos e/ou tecidos
163
1G2 sem desregulação da expressão de hTRT ou crescimento neoplástico) e medir os níveis de expressão dos produtos genéticos derhTRT: yariánté unindo variantes), ou seqüenciando-se ou detectando-se o gene de hTRT, mRNA ou cDNA transcrito reverso, para obter ou detectar as variações de 5 seqüência típicas (normais). A aplicação de métodos estatístico padrão, usados em genética molecular, permite a determinação de significativos desvios de tais níveis de linha de base.
C) DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE PRODUTOS GENÉTICOS
DE TRT são usualmente encontrados na maioria das células somáticas normais em níveis extremamente baixos. Por exemplo, o mRNA codificando a proteína de hTRT é extremamente raro ou ausente em todos os tipos de células de telomerase-negativa estudadas até aqui. Em células imortais, tais como 293 15 células, o mRNA de hTRT pode estar presente em somente cerca de 100 cópias por célula, enquanto as células somáticas normais podem ter tão poucas quanto uma ou zero cópia por célula. Será assim evidente que, quando ensaios altamente sensíveis para os produtos genéticos de hTRT forem desejados, será às vezes vantajoso incorporar tecnologias de ampliação de 20 sinal ou alvo dentro do formato de ensaio. Vide, por exemplo, Plenat e outros, 1997, Ann. Pathol. 17:17 (ampliação de sinal de fluoresceiniltiramida); Zehbe e outros, 1997, J. Pathol. 150; 1553 (deposição do repórter catalisado); outras referências listadas aqui (p. ex., para ampliação de sinal de bDNA, para PCR e outros formatos de ampliação alvo); e outras técnicas 25 conhecidas na arte.
Como citado acima, é com freqüência desnecessário quantificar o mRNA ou proteína de hTRT nos ensaios aqui descritos, porque a detecção de um produto genético de hTRT (sob condições de ensaio em que o produto não é detectável no controle, p. ex., células de telomerase-negativa)
164
é por si próprio suficiente para uma diagnose. Como outro exemplo, quando ·*· ♦ ·*· ·*· ·« · * ··· · os níveis do produto encontrado em um teste (p. exi/tuínôí )’e (Jopjft-Qlbfe.Í^x.
• · ·· · ··· ··· ··· · · célula saudável) as amostras são diretamente comparadas, a quantificação
pode ser supérflua.
Quando desejado, entretanto, as quantidades do produto genético de hTRT medidas nos ensaios aqui descritos podem ser descritas em uma variedade de maneiras, dependendo do método de medição e conveniência. Assim, quantidades normais, diagnosticas, prognosticas, elevadas ou baixas de proteína/mRNA de hTRT podem ser expressas como 10 unidades padrão de peso por quantidade de amostra biológica (por ex., picogramas por grama de tecido, picogramas por 1012 células), como um número de moléculas por quantidade de amostra biológica (p. ex., transcritos/célula, moles/célula), como unidades de atividade por célula ou por outra quantidade unitária, ou por métodos similares. A quantidade do produto genético de hTRT pode também ser expressa em relação à quantidade de outra molécula; exemplos incluem: número de transcritos de hTRT na amostra/número de transcritos de rRNA 28S da amostra;
nanogramas de proteína de hTRT/nanogramas de proteína total; e similares.
Quando medindo-se os produtos genéticos de hTRT em duas (ou mais) diferentes amostras, às vezes será útil ter-se uma base comum de comparação para as duas amostras. Por exemplo, quando comparando uma amostra de tecido normal e uma amostra de tecido canceroso, iguais quantidades de tecido (em peso, volume, número de células etc.) podem ser comparadas. Altemativamente, equivalentes de uma molécula marcadora (p. 25 ex., 28S rNA, hTR, atividade de telomerase, comprimento do telômero, actina) podem ser usados. Por exemplo, a quantidade de proteína de hTRT em uma amostra de tecido saudável, contendo 10 picogramas de 28S rNA, pode ser comparada com uma amostra de tecido doentio, contendo a mesma quantidade de 28S rNA.
165
Será também reconhecido por aqueles de habilidade que ·*· * »·» ··* ·· ,·« »·> ·*· · virtualmente quaisquer dos ensaios aqui descritos pddénvsef pfojetqdo^para ser quantitativos. Tipicamente, uma quantidade conhecida ou fonte de um produto genético de hTRT (p. ex., produzido usando-se os métodos e composições da invenção) é usada para calibrar o ensaio.
Em certas versões, os formatos do ensaio que detectam a presença, ausência ou abundância de um alelo de hTRT ou produto genético de cada célula de uma amostra (ou de uma amostragem representativa) são escolhidos. Exemplos de tais formatos incluem aqueles que detectam um 10 sinal por histologia (p. ex., imuno-histoquímica com etapas de ampliação intensificadoras do sinal ou intensificadoras do alvo) ou análise celular ativada por fluorescência ou separação de célula (FACS). Estes formatos são particularmente vantajosos quando lidando-se com uma população de células altamente heterogêneas (p. ex., contendo múltiplos tipos de células, em que somente um ou alguns tipos têm níveis elevados de hTRT, ou uma população de células similares expressando telomerase em diferentes níveis).
D) COLETA DE AMOSTRA
O gene ou produto genético de hTRT (isto é, mRNA ou polipeptídeo) é preferivelmente detectado e/ou quantificado em uma amostra 20 biológica. Tais amostras incluem mas não são limitadas a células (incluindo células inteiras, frações de células, extratos de células e células cultivadas ou linhagens de células), tecido (incluindo sangue, células sangüíneas (p. ex., glóbulos brancos), e amostras de tecido, tais como amostras de biópsia com agulha fina (p. ex., da próstata, seio, tiróide etc.)), fluidos corporais (p. ex., 25 urina, esputo, fluido aminiótico, sangue, fluido peritoneal, fluido pleural, sêmen) ou células coletadas deles (p. ex., células da bexiga da urina, linfócitos do sangue), meios (de células clivadas ou linhagens de células) e lavagens (p. ex., da bexiga e pulmão). As amostras biológicas podem também incluir seções de tecidos, tais como seções congeladas, retiradas para fins
166 / 5 histológicos. Para diagnose e prognose do câncer, uma amostra será obtida de um tecido ou tumor canceroso ou pré-canceroso oujsüs})eJê^Ue’jc^flíç£ok9..:Às vezes será desejável congelar uma amostra biológica para análise posterior (p. ex., quando monitorando a eficácia de tratamentos com medicamentos).
Em alguns casos, as células ou tecidos podem ser fracionados antes da análise. Por exemplo, em uma biópsia de tecido de um paciente, um separador de célula (p. ex., um separador de célula ativado por fluorescência) pode ser usado para separar as células de acordo com características tais como expressão de um antígeno de superfície (p. ex., um antígeno específico 10 de tumor), de acordo com métodos bem conhecidos.
Embora a amostra seja tipicamente retirada de um paciente humano ou linhagem de célula, os ensaios podem ser usados para detectar genes ou produtos genéticos homólogos de hTRT de amostras de outros animais. Altemativamente, os genes de hTRT e produtos genéticos podem ser ensaiados em animais transgênicos ou organismos expressando uma seqüência de proteína ou ácido nucleico de TRT humana.
A amostra pode ser pré-tratada como necessário por diluição em uma solução de tampão apropriada ou concentrada, se desejado. Qualquer uma de diversas soluções tampão aquosas padrão, empregando uma 20 variedade de tampões, tais como fosfato, Tris-tampão ou similares, em pH fisiológico, pode ser usada.
Uma amostra biológica, obtida de um paciente, pode ser referida como uma amostra biológica ou um amostra de paciente. Será apreciado que a análise de uma amostra de paciente não necessita 25 necessariamente requerer remoção de células ou tecido do paciente. Por exemplo, agentes de ligação-hTRT apropriadamente rotulados (p. ex., anticorpos ou ácidos nucleicos) podem ser injetados em um paciente e visualizados (quando ligados ao alvo) empregando-se tecnologia de formação de imagem padrão (p. ex., CAT, NMR e similares).
167
Ε) ENSAIOS DE ÁCIDO NUCLEICO ··„ · · ··♦ » . <.»·«, __ · ♦ * · 9 ·· · · 4 ·
Em uma versão, esta invenção forhècè méíõdús.-dç-d^ebíar * * * *· · ·♦· ··« ··· '· · e/ou quantificar expressão de mRNAs de hTRT (incluindo variantes de união ou seqüência e alelos alternativos). Em uma versão alternativa, a invenção
fornece métodos para detectar e analisar genes de hTRT normais ou anormais (ou seus fragmentos). A forma de tais ensaios qualitativos ou quantitativos pode incluir mas não é limitada a ensaios baseados em ampliação, com ou se um ampliação de sinais, ensaios baseados em hibridização e ensaios de combinação de ampliação-hibridização. Será observado por aqueles de habilidade que a distinção entre hibridização e ampliação é somente por conveniência: como ilustrado nos exemplos abaixo, muitos formatos de ensaio envolvem elementos tanto de hibridização como ampliação, a fim de que a categorização seja um tanto arbitrária em alguns casos.
1) PREPARAÇÃO DOS ÁCIDOS NUCLEICOS
Em algumas versões, os ensaios de ácido nucleico são realizados com uma amostra de ácido nucleico isolado da célula, tecido, organismo ou linhagem de célula a ser testada. O ácido nucleico (por ex., DNA, RNA ou cDNA genômico) podem ser isolados da amostra, de acordo com qualquer um de diversos métodos bem conhecidos daqueles hábeis na arte. Neste contexto, isolado refere-se a qualquer separação das espécies ou alvo a ser detectado por qualquer outra substância da mistura, porém não necessariamente indica um grau significativo de purificação do alvo. Uma pessoa hábil apreciará que, onde alterações do número de cópias do gene de hTRT foram ser detectadas, o DNA genômico é o alvo a ser detectado. Contrariamente, onde os níveis de expressão de um gene ou genes forem para ser detectados, o RNA é o alvo a ser detectado em um ensaio baseado em ácido nucleico,. Em uma versão preferida, a amostra de ácido nucleico é o mRNA total (isto é, poli(A)+RNA) de uma amostra biológica. Métodos para isolar ácidos nucleicos são bem conhecidos daqueles hábeis na arte e são
168
ÍT5
descritos, por exemplo, por Tijssen, P. ed. de Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hibridizátioá •Ngbl,eid’íAqid Probes, Part I. Theory e Nucleic Acid Preparation, Elsevier, N.Y. (1993), Cap. 3, que é incorporado aqui por referência. Em uma versão, o ácido nucleico total é isolado de uma determinada amostra, empregando-se um método de extração de guanidínio ácido-fenol-clorofórmio e poli(A)+mRNA é isolado por cromatografia de coluna oligo-dT ou utilizando-se contas magnéticas (dT)n (vide, p. ex., Sambrook e outros e Ausubel e outros acima).
Nas versões alternativas, não é necessário isolar os ácidos nucleicos (p. ex., RNA poliA+ ou total) da amostra biológica antes de realizar a ampliação, hibridização ou outros ensaios. Estas versões têm certas vantagens quando o RNA de hTRT é para ser medido, porque ele reduz a possibilidade de perda de mRNA de hTRT durante o isolamento e manuseio. Por exemplo, muitas técnicas de ampliação, tais como PCR e RT-PCR, definidas acima, podem ser realizadas utilizando-se células permeabilizadas (espécimes histológicos e análises FACS), células lisadas inteiras ou frações de células brutas, tais como certos extratos de células. Preferivelmente, são providências são tomadas para preservar a integridade do ácido nucleico alvo (p. ex., mRNA) se necessário (p. ex., adição de inibidores de RNAse). Os ensaios de ampliação e hibridização podem também ser realizados in situ, por exemplo, nas seções do tecido delgado de uma amostra de biópsia ou de uma monocamada de célula (p. ex., células sanguíneas ou células de cultura de tecido desagregado). A ampliação pode também ser realizada em uma célula inteira intacta ou células fixadas, como é bem sabido na arte, in situ, p. ex., empregando-se uma polimerase ou ligase, um iniciador ou iniciador(es) e trifostados de (deóxi)ribonucleosídeo (se uma polimerase for empregada) e transcriptase reversa e iniciador (se o RNA for para ser transcrito e o cDNA for para ser detectado) ou células fixas, permeabilizadas ou microinjetadas, para ampliar o RNA ou DNA de hTRT alvo. As células contendo RNA de
169
Uh hTRT (p. ex., células de telomerase-positiva) ou uma seqüência de DNA de · · - r*· «í .·. - . t** ! hTRT de interesse podem então ser detectadas' «E&fe «Ύηβίοσο ·’έ,\ eam • t · ··· · · ·* · freqüência, útil quando dNTPs, iniciadores ou outros componentes fluorescentemente-rotulados são usados em conjunto com microscopia, análise FACS ou o equivalente.
2) ENSAIOS À BASE DE AMPLIAÇÃO
Em uma modalidade, os ensaios da presente invenção são ensaios com base em ampliação para detecção de um gene de hTRT ou produto de gene. Em um ensaio com base em ampliação, a totalidade ou parte de um gene ou transcrito de hTRT (por exemplo, mRNA ou cDNA; daqui em diante também referido como “alvo”) é ampliada, e o produto da ampliação é então detectado direta ou indiretamente. Quando não existir nenhum gene subjacente ou produto de gene para atuar como padrão, nenhum produto de ampliação é produzido (por exemplo, do tamanho esperado), ou a ampliação é não específica e tipicamente nenhum produto de ampliação único existe. Ao contrário, quando o gene subjacente ou produto do gene está presente, a sequência alvo é ampliada, fornecendo uma indicação da presença e/ou da
quantidade do gene subjacente ou mRNA. Os ensaios com base na ampliação são bem conhecidos daqueles de experiência na técnica.
A presente invenção provê uma ampla variedade de iniciadores e sondas para detectar genes de hTRT e produtos do gene. Tais iniciadores e sondas são suficientemente complementares ao gene de hTRT ou produto do gene, para hibridizar ao ácido nucleico alvo. Os iniciadores têm tipicamente pelo menos 6 bases de comprimento, comumente entre cerca 25 de 10 e cerca de 100 bases, tipicamente entre cerca de 12 e cerca de 50 bases, e frequentemente entre cerca de 14 e cerca de 25 bases de comprimento. Uma pessoa de experiência, tendo examinado a presente invenção, estará apta, usando os processos de rotina, a selecionar iniciadores para ampliar a totalidade, ou uma porção, do gene ou produto de gene de hTRT, ou a
170
distinguir entre os produtos de genes variantes, alelos de hTRT, e outros. A ·· · · · ·· · · · ···«
Tabela 2 relaciona iniciadores ilustrativos úteis pat&: ajn^Uçãci de: PCR àd • « ·· · ··· ··· ··· · · hTRT, ou produtos ou regiões do gene específico de hTRT. Como é conhecido na técnica, oligômeros únicos (por exemplo, Patente U.S. 5.545.522), conjuntos agrupados de oligômeros, ou mesmo um conjunto degenerado de oligômeros, podem ser empregados para ampliação, por exemplo, como ilustrado pela ampliação do cDNA de TRT Tetrahymena, como descrito abaixo.
A invenção provê uma variedade de processos para ampliar e detectar um gene ou produto de gene de hTRT, incluindo a reação em cadeia de polimerase (incluindo todas as variantes, por exemplo PCR de transcriptase reversa; o Sistema de Ampliação Sunrise (nascer do sol) (Oncor, Inc., Gaithersburg MD); e numerosos outros conhecidos na técnica). Em uma modalidade ilustrativa, a ampliação de PCR é realizada em uma solução de 50 μΐ contendo a amostra de ácido nucleico (por exemplo, cDNA obtido através da transcrição reversa de RNA de hTRT), 100 μΜ em cada dNTP (dATP, dCTP, dGTP e dTTP; Pharmacia LKB Biotechnology, NJ), o(s) iniciador(es) de PCR específico de hTRT, 1 unidade/polimerase Taq (Perkin Elmer, Norwalk, CT), 1 x tampão de PCR (KC1 50 mM, Tris 10 mM, pH 8,3 em temperatura ambiente, MgCl2 1,5 mM, 0,01% de gelatina) com a operação de ampliação por cerca de 30 ciclos a 94° por 45 segundos, 55° por segundos e 72° por 90 segundos. No entanto, como será observado, * variações numerosas podem ser feitas para otimizar a ampliação de PCR para qualquer reação particular.
Outros processos de ampliação alvo adequados incluem a reação de cadeia ligase (LCR; por exemplo, Wu e Wallace, 1989, Genomics 4:560; Landegren et al., 1988, Science, 241: 1077, Barany, 1991, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 189 e Barringer et al., 1990, Gene, 89: 117); a ampliação de deslocamento de filamento (SDA; por exemplo, Walker et al., 1992, Proc.
171
1^6
Natl. Acad. Sei. U.S.A. 89: 392-396); ampliação da transcrição (por exemplo, ·· · · ··· · · · ··· ·
Kwoh et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, §6: ·1 f*Í3$; íeplicaçãQ • · ·· · ···A··· ··· · · sequência auto-sustentada (3SR; por exemplo, Fahy et al., 1992, PCR
Methods Appl. 1:25, Guatelli et al., 1990, Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 87:
1874); a ampliação com base na sequência de ácido nucleico (NASBA,
Cangene, Mississauga, Ontário; por exemplo, Compton, Nature 350:
91); o sistema de ampliação com base na transcrição (TAS); e o sistema de replicação de sequência auto-sustentada (SSR). Cada uma das publicações acima mencionadas é aqui incorporada por referência. Uma variante útil de
PCR é PCR ELISA (por exemplo, Boehringer Mannheim Cat. 1 636 111), em que digoxigenina-dUTP é incorporado no produto de PCR. A mistura de reação de PCR é desnaturada e hibridizada com um oligonucleotídeo rotulado de biotina, designado para temperar uma sequência interna do produto de PCR. Os produtos de hibridização são imobilizados em placas revestidas de 15 estreptavidina e detectados usando-se anticorpos anti-digoxigenina.
Exemplos de técnicas suficientes para orientar as pessoas experientes através dos processos de ampliação in vitro, são encontrados em PCR Technology: Principies and Applications for DNA Amplification, H. Erlich, Ed. Freeman Press, Nova Iorque, NY (1992); PCR Protocols: A Guide to Methods and 20 Applications, Edits. Innis, Gelfland, Snisky e White, Academic Press, San
Diego, CA (1990); Mattila et al., 1991, NucleicAcids REs. 19: 4967; Eckert e * Kunkel, (1991) PCR Methods and Applications 1: 17; PCR, edits. Mc .* Pherson, Quirkes e Taylor, IRL Press, Oxford; Patentes U.S. 4.683.195,
4.683.202 e 4.965.188; Barringer et al., 1990, Gene, 89: 117; Lomell et al.,
1989, J. Clin. Chem., 35: 1826, cada dos quais é aqui incorporado para todas as finalidades.
Produtos ampliados podem ser diretamente analisados, por exemplo por tamanho, determinado por eletroforese de gel; por hibridização em um ácido nucleico alvo imobilizado em um suporte sólido, tal como uma
172 conta, membrana, lâmina ou lasca; por sequenciação; imunologicamente, por ·· · · ··· · · · ··· « exemplo por PCR-ELISA, mediante detecção de: ;«üiii Μ^Τ’ίίΙμόιίβδζ^ιΙ^, • · ·· · ··· ··· ··· · · fosforescente ou radioativo; ou por qualquer dentre uma variedade de outros meios bem conhecidos. Por exemplo, um exemplo ilustrativo de um processo de detecção utiliza iniciadores de PCR aumentados com alças tipo grampo de cabelo ligadas a fluoresceína e um derivado de ácido benzóico, que serve como um extintor, de tal modo que a fluorescência seja emitida apenas quando os iniciadores se desdobram para ligar seus alvos, e ocorre a replicação.
Tendo em vista que o mRNA de hTRT é tipicamente expresso como um transcripto extremamente raro, presente em muito baixos níveis, mesmo em células positivas de telomerase, é frequentemente desejável otimizar ou aumentar o sinal resultante da etapa de ampliação. Um meio para fazer isto é aumentar o número de ciclos de ampliação. Por exemplo, embora 20 a 25 ciclos sejam adequados para ampliação da maioria dos mRNAs usando a reação em cadeia polimerase sob condições de reação padrão, a detecção de mRNA de hTRT em muitas amostras pode requerer tanto quanto 30 a 35 ciclos de ampliação, dependendo do formato da detecção e da eficiência de ampliação. Será reconhecido que a escolha judiciosa das condições de ampliação, incluindo o número de ciclos de ampliação, pode ser usada para projetar um ensaio que resulte em um produto de ampliação % apenas quando exista uma quantidade limite do alvo na amostra de teste (isto é, de modo que apenas as amostras com um alto nível de mRNA de hTRT dê um resultado “positivo”). Além disso, processos são conhecidos para aumentar o sinal produzido por ampliação da sequência alvo. Processos para aumentar a capacidade de detectar o alvo ampliado incluem o sistema de ampliação de sinal, tal como: ampliação de sinal de DNA ramificado (por exemplo, Patente U.S. 5.124.246; Urdea, 1994, Bio/Tech. 12: 926); sistema (DuPont) de ampliação do sinal de tiramida (TSA); ampliação do sinal νη
7%
catalítico (CSA; Dako); Sistemas Q Beta Replicase (Tyagi et al., 1996, Proc.
Nat. Acad. Sei. USA, 93: 5395); ou outros.
Uma pessoa de experiência na técnica observará que, qualquer que seja o processo de ampliação usado, uma variedade de processos quantitativos conhecidos na técnica pode ser usada se a quantificação for desejada. Por exemplo, quando desejável, dois ou mais polinucleotídeos podem ser co-ampliados em uma amostra única. Este processo pode ser usado como um processo conveniente de quantificação da quantidade de mRNA de hTRT em uma amostra, porque a transcrição reversa e as reações de ampliação são realizadas na mesma reação para um polinucleotídeo alvo e de controle. A co-ampliação do polinucleotídeo de controle (usualmente presente em uma concentração conhecida ou número de cópias) pode ser usada para normalização do número de células na amostra, em comparação com a quantidade de hTRT na amostra. Polinucleotídeos de controle adequados para reações de co-ampliação incluem DNA, RNA expresso dos genes domésticos, genes constitutivamente expressos , e RNAs sintetizados in vitro ou DNAs adicionados à mistura de reação. Polinucleotídeos de controle endógenos são aqueles que já se encontram presentes na amostra, enquanto os polinucleotídeos exógenos de controle são adicionados à amostra, criando uma reação “reforçada”. Os RNAs de controle ilustrativo incluem o RNA β-actina, RNA GAPDH, snRNAs, hTR e rRNA 28S endogenamente expresso (ver Khan et al., 1992, Neurosci. Lett. 147: 114). Polinucleotídeos exógenos de controle incluem um cRNA AW106 sintético, que pode ser sintetizado como um filamento de sentido de pAW106 mediante polimerase T7. Será observado que, para o processo de co-ampliação a ser utilizável para quantificação, os polinucleotídeos alvo e de controle devem, ambos, ser tipicamente ampliados em uma faixa linear. Protocolos detalhados para PCR quantitativo podem ser encontrados em PCR Protocols, a Guide to Methods and Applications, Innis et al., Academic Press, Inc., NY, (1990) e
174
Ausubel et al., supra (Unidade 15) e Diaco, R. (1995) Practical ·· · · ··· · · · ··· * ·· · · · ··· ····· ·
Considerations for the Deisgn of Quantitative PCR çtn Qtzdtegi&t Sê
PCR, p. 84-108, Innis et al. editores, Academic Press, Nova Iorque.
Dependendo da sequência do padrão endógeno e exógeno, os conjuntos de iniciadores diferentes podem ser usados para a reação de coampliação. Em um processo, denominado ampliação competitiva, o PCR quantitativo envolve simultaneamente a co-ampliação de uma quantidade conhecida de uma sequência de controle, usando os mesmos iniciadores usados para ampliação do ácido nucleico alvo (um par de 2 iniciadores). Em 10 uma modalidade alternativa, conhecida como competição não competitiva, a sequência de controle e a sequência alvo (por exemplo, cDNA de hTRT) são ampliadas usando-se iniciadores diferentes (isto é, 2 pares de 2 iniciadores). Em outra modalidade alternativa, denominada ampliação semi-competitiva, três iniciadores são usados, um dos quais é específico de hTRT, um dos quais 15 é específico de controle, e um dos quais é capaz de temperar a ambas as sequências, alvo e de controle. A ampliação semi-competitiva é descrita na Patente U.S. 5.629.154, que é aqui incorporada por referência.
3) ENSAIOS COM BASE NA HIBRIDIZAÇÃO
a) GENERALIDADES
Uma variedade de processos para medições específicas de
DNA e de RNA, usando-se técnicas de hibridização de ácido nucleico, são conhecidas daqueles versados na técnica (ver Sambrook et al., acima). Os ensaios com base na hibridização se referem a ensaios em que um ácido nucleico sonda é hibridizado em um ácido nucleico alvo. Comumente, as 25 sondas de hibridização de ácido nucleico da invenção são inteira ou substancialmente idênticas a uma sequência contígua do gene de hTRT ou sequência de RNA. Preferivelmente, sondas de ácido nucleico são pelo menos cerca de 10 bases, frequentemente pelo menos cerca de 20 bases, e algumas vezes pelo menos cerca de 200 bases ou mais, de comprimento.
175
Processos de seleção de sequências sonda de ácido nucleico para uso na ·· · * · ·· · · · ··· » hibridização de ácido nucleico, são examinados emi<Satnb^ôkYí’dZ.,*‘sHpía; Em alguns formatos, pelo menos um dentre alvo e sonda é imobilizado. O ácido nucleico imobilizado pode ser DNA, RNA ou outro oligo- ou 5 polinucleotídeo, e pode compreender nucleotídeos de ocorrência natural ou não natural, análogos de nucleotídeos, ou espinhas dorsais. Tais ensaios podem estar em qualquer dentre vários formatos, incluindo, dot e slot blots do Sul e do Norte, sistemas de polinucleotídeo ou oligonucleotídeo de alta densidade (por exemplo, GeneChips® Affymetrix), varetas, pinos, lascas ou 10 contas medidoras. Todas estas técnicas são bem conhecidas na técnica e são a base de muitos kits de diagnósticos comercialmente disponíveis. As técnicas de hibridização são geralmente descritas em Hames et al., eds., Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach IRL Press (1985); Gall e Pardue Proc. Natl. Acad. Sei., U.S.A., 63: 378-383 (1969); e John et al., Nature, 223: 58215 587(1969).
Uma variedade de formatos de hibridização de ácido nucleico é conhecida daqueles experientes na técnica. Por exemplo, um formato comum é a hibridização direta, em que um ácido nucleico alvo é hibridizado em uma sonda complementar rotulada. Tipicamente, ácidos nucleicos 20 rotulados são usados para hibridização, com o rótulo fornecendo o sinal detectável. Um processo para avaliar a presença, ausência, ou a quantidade de mRNA de hTRT, é realizando uma transferência do Norte de RNA de uma amostra, e hibridização de uma sonda de ácido nucleico específica de hTRT, como ilustrado no Exemplo 2. Como foi observado acima, o mRNA de 25 hTRT, quando presente sob qualquer condição, está presente em muito pequena quantidade na maioria das células. Portanto, quando a hibridização do Norte for usada, será frequentemente desejável usar uma etapa de ampliação (ou, altemativamente, grandes quantidades de RNA de partida). Um processo utilizável para avaliar a presença, ausência ou quantidade de
176 lSL
DNA codificando ou as proteínas de hTRT em uma amostra, envolve uma ·· · ·> ··♦ · * · ··· * transferência de Ro Sul de DNA de uma amostra e hdjrídlzâçiãffcíê urfiàÁófida· • · ·· · ··-» ··♦ ··· · * de ácido nucleico específica de hTRT, rotulada.
Outros formatos comuns de hibridização incluem os ensaios 5 de intercalação (sanduíche) e ensaios de competição ou deslocamento. Os ensaios de sanduíche são ensaios de hibridização comercialmente úteis para detectar ou isolar sequências de ácido nucleico. Tais ensaios utilizam um ácido nucleico de “captura” covalentemente imobilizado em um suporte sólido e um ácido nucleico de “sinal” rotulado em solução. A amostra 10 biológica ou clínica proverá o ácido nucleico alvo. O ácido nucleico de “captura” e a sonda de ácido nucleico de “sinal” hibridizam com o ácido nucleico alvo, para formar um complexo de hibridização de “sanduíche”. Para ser eficaz, o ácido nucleico de sinal não pode hibridizar com o ácido nucleico de captura.
b) ENSAIOS COM BASE EM LASCAS E COM BASE EM LÂMINAS
A presente invenção também provê ensaios de hibridização com base em sondas para os produtos de gene de hTRT empregando os sistemas de oligonucleotídeos ou polinucleotídeos imobilizados, aos quais um ácido nucleico de hTRT pode hibridizar (isto é, a alguns, mas comumente 20 não todos, ou mesmo a maioria, dos oligo- ou polinucleotídeos imobilizados). Sistemas de oligonucleotídeos ou sistemas de polinucleotídeos de alta densidade provêem um meio para eficientemente detectar a presença e características (por exemplo, sequência) de um ácido nucleico alvo (por exemplo, gene, mRNA ou cDNA de hTRT). Técnicas são conhecidas para 25 produzir sistemas contendo milhares de oligonucleotídeos complementares para sequências definidas, em localizações definidas em uma superfície, usando técnicas fotolitográficas para a síntese in situ (ver, por exemplo, as Patentes U.S. 5.578.832, 5.556.752 e 5.510.270; Fodor et al., 1991, Science 251: 767; Pease et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91: 5022; e Lockhart
ΧΊΊ ,r.
et al., 1996, Nature Biotech 14: 1675) ou outros processos para a síntese e «' V ♦ ♦ · * ♦ « · · £ ♦ V deposição rápida de oligonucleotídeos (Blanchard etitl.,·!^^, ífyopèiistifò íêj <· A '»4 · ····<<·<· *·
Bioelectronics 11: 687). Quando estes processos são usados, os oligonucleotídeos (por exemplo, 20-mers) de sequência conhecida são sintetizados diretamente em uma superfície, tal como uma lâmina de vidro derivatizada. Usualmente, o sistema produzido é redundante, tendo várias sondas de oligonucleotídeos na lasca específica para o polinucleotídeo de hTRT a ser detectado.
Combinações de sondas de oligonucleotídeo podem ser 10 projetadas para detectar mRNAs altemativamente fixados, ou para identificar qual dos vários alelos de hTRT é expresso em uma amostra particular.
Em uma modalidade ilustrativa, o cDNA preparado por transcrição reversa de RNA total de uma célula teste é ampliado (por exemplo, usando PCR). Tipicamente, o produto de ampliação é rotulado, por 15 exemplo, por incorporação de um dNTP rotulado fluorescentemente. Os cDNAs rotulados são, então, hibridizados em uma lasca compreendendo sondas de oligonucleotídeo complementares a várias subsequências do gene de hTRT. As posições de hibridização são determinadas (por exemplo, de acordo com os processos gerais de Shalon et al., 1996, Genome Research 6: 20 639 ou Schena et al., 1996, Genome Res. 6: 639), e sequência (ou outra informação) deduzida do padrão de hibridização, por meios bem conhecidos na técnica.
Em uma modalidade, duas amostras de cDNA, cada uma rotulada com um grupo fluorescente diferente, são hibridizados à mesma 25 lasca. A relação da hibridização de cada amostra rotulada para sítios complementares ao gene de hTRT, é então ensaiada. Se ambas as amostras contiverem a mesma quantidade de mRNA de hTRT, a relação das duas fluoritas será de 1:1 (será observado que o sinal das fluoritas pode necessitar ser ajustado por conta de qualquer diferença na sensibilidade molar das
178 to fluoritas). Ao contrário, se uma amostra for de um tecido saudável (ou controle) e a segunda amostra for de um tecido cancfefíefen% $ flliQríta V&dá na segunda amostra predominará.
c) HIBRIDIZAÇÃO IN SITU
Um meio alternativo para detectar a expressão de um gene codificando uma proteína de hTRT é a hibridização in situ. Os ensaios de hibridização in situ são bem conhecidos e são de uma forma geral descritos em Angerer et al., Methods Enzymol., 152: 649-660 (1987) e Ausubel et al, supra. Em um ensaio de hibridização in situ, os espécimes de células ou de tecidos são fixados a um suporte sólido, tipicamente em um estado permeabilizado, tipicamente em uma lâmina de vidro. As células são então colocadas em contato com uma solução de hibridização em uma temperatura moderada, para permitir a têmpera de sondas de ácido nucleico rotulado (por exemplo, ribossondas 35S-rotuladas, sondas fluorescentemente rotuladas) completa ou substancialmente complementar a hTRT. A sonda livre é removida por lavagem e/ou digestão de nuclease, e a sonda ligada é visualizada diretamente na lâmina por autorradiografia ou por técnicas apropriadas de formação de imagem, como é conhecido na técnica.
4) DETECÇÃO ESPECÍFICA DE VARIANTES
Como observado acima e ilustrado nos Exemplos (por exemplo, Exemplo 9), os iniciadores ou sondas de ampliação podem ser selecionados para proverem produtos de ampliação que abarcam deleções, mutilações e inserções específicas, dessa forma facilitando a detecção de variantes específicas ou anormalidades no mRNA de hTRT.
Um exemplo de um produto de gene variante de hTRT que pode ser detectado é um RNA de hTRT, tal como um produto (SEQUÊNCIA ID NO: 4) descrito acima e no Exemplo 9. A função biológica, se houver, da(s) variante(s) Δ182 não é conhecida; no entanto, a proteína de hTRT mutilada putativamente codificada pela variante pode estar envolvida na
179
Uh regulação da atividade de telomerase, por exemplo, por montagem de um ·*· · ·*· **· ·· ·*· · · · · ······ · · ·····
RNP de telomerase não funcional que titula os coifípohq£ftés dfc iélomerasc. Altemativamente, a regulação negativa da atividade de telomerase pode ser realizada dirigindo-se o processamento pré-mRNA de hTRT (mRNA 5 nascente) de uma maneira conduzindo à eliminação do mRNA de comprimento completo e reduzindo os níveis de mRNA de hTRT e aumentando os níveis de RNA de hTRT Δ182. Por estas e outras razões, a capacidade de detectar variantes Δ182 é útil. Além disso, será algumas vezes desejável, em amostras em que duas espécies de RNA de hTRT estejam 10 presentes (tais como um RNA de hTRT Δ182 e RNA de hTRT codificando a proteína de hTRT de comprimento completo), comparar sua abundância relativa e/ou absoluta.
A invenção provê uma variedade de processos para a detecção de variantes Δ182. Por exemplo, a ampliação usando pares de iniciadores 15 abarcando a deleção de 182 pares de base, resultará em produtos diferentemente dimensionados, correspondentes aos RNAs de hTRT deletados ou não deletados, se ambos estiverem presentes, que podem ser distinguidos na base do tamanho (por exemplo, por eletroforese de gel). Exemplos de pares de iniciadores úteis para ampliar a região que abarca a 20 deleção de 182 pares de base, TCP 1.14 e TCP 1.15 (conjunto de iniciadores 1), ou TCP 1,25 e bTCP6 (conjunto de iniciadores 2) (ver Tabela 2). Estes pares de iniciadores podem ser usados individualmente ou em uma experiência de PCR agrupado, onde o conjunto de iniciadores 1 é usado primeiro. Será também evidente a uma pessoa versada, que os processos de 25 hibridização (por exemplo a hibridização do Norte) ou os ensaios de proteção de RNAse usando uma sonda de ácido nucleico de hTRT da invenção, podem ser usados para detectar e distinguir variantes de RNA de hTRT. Outro processo adequado vincula a ampliação de PCR (ou o equivalente) usando-se três iniciadores. Análogo ao processo de PCR quantitativo semi-competitivo
180 ό
descrito em maiores detalhes acima, um iniciador é específico a cada uma das ·· · · ··· · · · ··· · • · · · · · ·· · · · · · · espécies de RNA de hTRT (por exemplo, como iluÇtra^o^^^ábQlèáJ^úifi iniciador é complementar a ambas as espécies [por exemplo, TCP1.25 (22702288)]. Um exemplo de um iniciador específico à SEQUÊNCIA ID NO: 1 é um que tempera dentro da sequência de 182 nucleotídeos (isto é, nucleotídeos 2345 a 2526 da SEQUÊNCIA ID NO: 1), por exemplo, TCP1.73 (2465-2445). Por exemplo, um iniciador específico à SEQUÊNCIA ID NO: 4 (uma variante Δ182) é um que tempera nos nucleotídeos 2358 a 2339 da SEQUÊNCIA ID NO: 4 (isto é, o sítio correspondente à inserção do nucleotídeo 182 na SEQUÊNCIA ID NO: 1). A abundância absoluta da espécie de mRNA de hTRT Δ182 ou sua abundância relativa, em comparação com a espécie codificando a proteína de hTRT de comprimento completo, pode ser analisada quanto à correlação com o estado celular (por exemplo, capacidade para proliferação indefinida). Será observado que numerosos outros iniciadores ou processos de ampliação ou detecção podem ser selecionados com base na presente invenção.
TABELA 4
Iniciadores ilustrativos
Espécies Al82 (por ex., SEQ. ID NO. 4) iniciador específico
5 '-GGCACTGGACGTAGGACGTG-3 hTRT (SEQ. ID NO. 1) iniciador específico (TCP1.73):
'-CACTGCTGGCCTCATTCAGGG-3
Iniciador comum (dianteiro) (TCP1.25):
'-TACTGCGTGCGTCGGTATG-3 '
Outros genes ou produtos de genes variantes de hTRT que podem ser detectados incluem aqueles caracterizados por códons prematuros de interrupção, deleções, substituições ou inserções. As deleções podem ser detectadas pelo tamanho decrescente do gene, transcrito de mRNA, ou cDNA. De forma semelhante, as inserções podem ser detectadas pelo
181
1½ tamanho aumentado do gene, transcrito de mRNA, ou cDNA. As inserções e ·· · ····· · ····· ·· · ·· ··· ····· · deleções também podem causar deslocamentos na Estatura’dàjcít^raqüú conduz aos códons prematuros de interrupção ou estrutura de leitura aberta mais longas. Substituições, deleções e inserções também podem ser 5 detectadas por hibridização de sonda. Alterações podem também ser detectadas por modificações de observação no tamanho do polipeptídeo variante de hTRT (por exemplo, pela análise Ocidental) ou por hibridização ou ampliação específica, conforme seja apropriado. Altemativamente, as mutações podem ser determinadas por sequenciação do gene ou produto de 10 gene, de acordo com processos padrão. Além disso, e como observado acima, os ensaios de ampliação e as sondas de hibridização podem ser selecionadas para alvejar especificamente anormalidades particulares. Por exemplo, as sondas de ácido nucleico ou os iniciadores de ampliação, podem ser selecionados de modo que especificamente hibridizem ou ampliem, 15 respectivamente, a região englobando a deleção, a substituição ou a inserção.
Quando o gene de hTRT abriga uma tal mutação, a sonda (1) ou falhará em hibridizar, ou a reação de ampliação falhará em prover ampliação específica, ou causará uma modificação no tamanho do produto de ampliação ou sinal de hibridização; (2) ou a sonda ou a reação de ampliação englobará toda a 20 deleção ou qualquer extremidade da deleção (junção de deleção); (3) ou, de forma semelhante, as sondas e os iniciadores de ampliação podem ser selecionados de modo que especificamente alvejem mutações ou inserções de pontos.
5) DETECÇÃO DE ALELOS MUTANTES DE hTRT
As mutações no gene de hTRT podem ser responsáveis pelo início da doença ou podem contribuir para uma condição de doença. Alterações do DNA genômico de hTRT podem afetar os níveis de transcrição do gene, mudar os resíduos de aminoácidos na proteína de hTRT, fazer com que os polipeptídeos de hTRT a serem produzidos sejam mutilados, alterar as
182
Í8Y vias de processamento do pré-mRNA (que pode alterar os níveis de mRNA ·· · · ··· · · · ··· · ·· · ·· · ·· ·«··· ♦ de hTRT), e causar também outras consequências. :·* : f f*. ·J :*j
Alterações do DNA genômico em locais não de hTRT também podem afetar a expressão de hTRT ou telomerase, mediante alteração das enzimas ou processos celulares que são responsáveis em regular a expressão de proteína associada a hTRT, hTR e telomerase, e processamento e montagem de RNP e transporte. Alterações que podem afetar a expressão, o processamento ou a montagem de RNP de hTRT, podem ser importantes quanto à progressão do câncer, quanto a doenças do envelhecimento, quanto a doenças de danos do DNA, e outros.
A detecção de mutações no mRNA de hTRT ou seu gene e elementos de controle do gene, podem ser realizados de acordo com os processos presentes, de múltiplas maneiras. Exemplos ilustrativos incluem o seguinte: Uma técnica denominada triagem do iniciador pode ser empregada;
iniciadores de PCR são projetados, cujos términos 3’ temperam os nucleotídeos em um DNA (ou RNA) de amostra, que são possivelmente modificados. Se o DNA (ou RNA) for ampliado pelos iniciadores, então os términos 3’ uniu-se aos nucleotídeos no gene; se o DNA não for ampliado, então um ou ambos os términos não uniram-se aos nucleotídeos no gene, indicando que uma mutação estava presente. Projeto de iniciador similar pode ser usado para ensaiar as mutações de ponto, usando a Reação em Cadeia Ligase (LCR, descrito acima). O polimorfismo de restrição (fragmento) do comprimento, RFLP (Pourzand, C., Cerutti, P. (1993) Mutat. Res 288: 113-121), é outra técnica que pode ser aplicada no presente processo. Uma mancha do Sul de DNA genômico humano digerido com várias enzimas de restrição é sondada com uma sonda específica de hTRT. As diferenças no número ou nos tamanhos dos fragmentos entre a amostra e um controle, indicam uma alteração da amostra experimental, usualmente uma inserção ou deleção. O polimorfismo de conformação de filamento
183 único, SSCP (Orrita, M. et al. (1989) PNAS USA 86: 2766-2770) é outra ·· · · ··· · · · ··· * ·· · ·· ··· ····· · técnica que pode ser aplicada no presente processófÕ $$£P.ke:í>qSm: Âi migração diferencial de DNA desnaturado tipo selvagem e mutante de filamento único (comumente gerado por PCR). O DNA de filamento único 5 adquirirá uma conformação tridimensional que é específica da sequência. As diferenças de sequência tão pequenas quanto uma modificação de base única, pode resultar em uma alteração de mobilidade em gel não desnaturado. O SSCP é um dos processos de triagem de mutações mais amplamente usados, por causa de sua simplicidade. A Eletroforese em Gel de Gradiente 10 Desnaturante, DGGE (Myers, R. M., Maniatis, T. e Lerman, L., (1987)
Methods in Enzymology, 155: 501-527), é outra técnica que pode ser aplicada no presente processo. A DGGE identifica as mutações com base na comportamento de fusão de DNA de duplo filamento. O equipamento especializado de eletroforese desnaturante é utilizado para observar o perfil 15 de fusão de DNAs experimentais e de controle: um DNA contendo uma mutação terá uma mobilidade diferente comparada ao controle nestes sistemas em gel. Os exemplos discutidos ilustram a metodologia comumente empregada; muitas outras técnicas existem, as quais são conhecidas daqueles de experiência na técnica, e podem ser aplicadas de acordo com o que aqui se 20 apresenta.
F. ANÁLISE DO CARIÓTIPO
A presente invenção ainda provê processos e reagentes para a análise de cariótipo ou outras análises cromossômicas, usando sondas de sequência de hTRT e/ou detectando ou localizando as sequências de genes de 25 hTRT em cromossomas de um paciente humano, linhagem de células humanas, ou células não humanas. Em uma modalidade, a ampliação (isto é, a mudança no número de cópias), a deleção (isto é, deleção parcial), inserção, substituição ou modificações na locação cromossômica (por exemplo, translocação) de um gene de hTRT, podem ser correlacionadas com a
184 presença de uma condição patológica ou uma predisposição ao desenvolvimento de uma condição patológica (por exêmplQuqándçr);.’ . j ··:
Foi determinado pelos presentes inventores, que, em células humanas normais, os mapas do gene de hTRT se juntam ao telômero do cromossoma 5p (ver Exemplo 5, abaixo). O marcador STS mais próximo é o D5S678 (ver Figura 8). A locação pode ser usada para identificar marcadores que sejam intimamente ligados ao gene de hTRT. Os marcadores podem ser usados para identificar os YACs, STSs, cosmídeos, BACs, lambda ou fago Pl, ou outros clones que contenham sequências genômicas de hTRT ou elementos de controle. Os marcadores ou a locação do gene podem ser usados para examinar as amostras de tecido humano, para alterações na locação, organização ou sequência do gene de rTRT normal, o que é associado com a ocorrência de um tipo de câncer ou doença. Esta informação pode ser usada em uma forma de diagnóstico ou de prognóstico quanto à doença ou ao câncer envolvidos. Além disso, a natureza de quaisquer alterações no gene de hTRT pode ser informativa, como para a natureza pela qual as células se tomam imortais. Por exemplo, um evento de translocação pode indicar que a ativação da expressão de hTRT ocorre em alguns casos mediante substituição do promotor de hTRT por outro promotor que dirija a transcrição de hTRT de uma maneira apropriada. Processos e reagentes da invenção deste tipo podem ser usados para inibir a ativação de hTRT. A locação pode também ser útil para determinar a natureza da repressão do gene de hTRT em células somáticas normais, por exemplo, se a locação for parte de heterocromatina de não expressão. Os ensaios de hipersensibilidade da nuclease para distinguir a heterocromatina e a eucromatina são descritos, por exemplo, em Wu et al., 1979, Cell 16 16: 797; Groudine e Weintraub, 1982, Cell 30: 131 Gross e Garrard, 1988, Ann. REv. Biochem. 57: 159.
Em uma modalidade, as alterações ao gene de hTRT são identificadas por análise de cariótipo, usando-se qualquer um de uma
185 variedade de processos conhecidos na técnica. Uma técnica utilizável é a ·· · · ··« · · · ··· * • · · · · · ·· · · · · · · hibridização in situ (ISH). Tipicamente, quando técnicas jjè •hibridizagão: fn\ situ forem usadas para análise de cariótipo, uma sonda detectável ou detectavelmente rotulada é hibridizada a uma amostra cromossômica in situ, para locar uma sequência de gene de hTRT. Em geral, ISH compreende uma ou mais das seguintes etapas: (1) fixação do tecido, célula ou outra estrutura biológica a ser analisada; (2) tratamento de pré-hibridização da estrutura biológica, para aumentar a acessibilidade do DNA alvo (por exemplo, desnaturação com calor ou álcali), e para reduzir a ligação não específica (por 10 exemplo, mediante bloqueio da capacidade de hibridização das sequências respectivas, por exemplo usando-se DNA genômico humano); (3) hibridização de uma ou mais sondas de ácido nucleico (por exemplo, ácidos nucleicos convencionais, PNAs, ou sondas contendo outros análogos de ácido nucleico) ao ácido nucleico na estrutura biológica ou tecido; (4) 15 lavagens de pós-hibridização para remover fragmentos de ácido nucleico não ligado na hibridização; e (5) detecção dos fragmentos de ácido nucleico hibridizado. Os reagentes usados em cada uma destas etapas e condições para seu uso, variam dependendo da aplicação particular. Será observado que estas etapas podem ser modificadas de várias maneiras bem conhecidas daqueles 20 versados na técnica.
Em uma modalidade de ISH, a sonda de hTRT é rotulada com um rótulo fluorescente (hibridização fluorescente in situ; “FISH”). Tipicamente, é desejável usar hibridização in situ fluorescente de cor dupla, em que são utilizadas duas sondas, cada uma rotulada por uma diferente 25 tintura fluorescente. Uma sonda de teste que hibridiza à sequência de hTRT de interesse, é rotulada com uma tintura, e uma sonda de controle que hibridiza a uma região diferente é rotulada com uma segunda tintura. Um ácido nucleico que hibridiza a uma porção estável do cromossoma de interesse, tal como a região do centrômero, pode ser usado como a sonda de
186 controle. Desta maneira, pode-se levar em conta as diferenças entre a ·· · · ··· · · · ··· « • · · ·« · ·· «·««« « eficiência de hibridização de amostra para amostra. :·* : ’·:·.* : 7::·:
Os processos de ISH para detectar anormalidades cromossômicas (por exemplo, FISH), podem ser realizados em quantidades 5 de nanograma dos ácidos nucleicos em tópico. O tecido normal ou as seções tumorais com parafina embutida podem ser usados, como o pode o material, tecidos ou seções frescos ou congelados. Uma vez que FISH pode ser aplicado a material limitado, as preparações de toque preparadas dos tumores primários não cultivados também podem ser usadas (ver, por exemplo, 10 Kallioniemi et al, 1992, Cytogenet. Cell Genet. 60: 190). Por exemplo, as amostras pequenas de tecidos de biópsia dos tumores podem ser usadas para preparações de toque (ver, por exemplo, Kallioniemi et al, acima). Números pequenos de células obtidas da biópsia por aspiração ou células em fluidos corporais (por exemplo, sangue, urina, esputo e outros) também podem ser 15 analisados. Para o diagnóstico pré-natal, amostras apropriadas incluirão o fluido amniótico, o sangue maternal, e outros. Protocolos de hibridização úteis aplicáveis aos processos e reagentes aqui apresentados, são descritos em Pinkel et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85: 9138; Publicação EPO 430.402; Choo, ed., Methods in Molecular Biology, Vol. 33: In situ 20 Hybridization Protocols, Humana Press, Totowa, Nova Jérsei (1994); e Kallioniemi et al., acima.
Outras técnicas úteis para a análise do cariótipo incluem, por exemplo, técnica como a mancha do Sul quantitativa, o PCR quantitativo, ou a hibridização genômica comparativa (Kallioniemi et al., 1992, Science, 258: 25 818), usando as sondas e iniciadores de hTRT da invenção, que podem ser usados para identificar a ampliação, deleção, inserção, substituição ou outros rearranjos das sequências de hTRT em cromossomos em uma amostra biológica.
G. ENSAIOS DE POLIPEPTÍDEOS DE trt
187
1) GENERALIDADES • · · · ··· ♦ ♦ · ···· • · · · · · »· ·«·«· ·
A presente invenção provê processos afeágêrftes para‘detectar: e quantificar polipeptídeos de hTRT. Estes processos incluem processos bioquímicos analíticos, tais como processos de eletroforese, espectroscopia de massa, alteração de gel, eletroforese capilar, cromatográfico, tais como cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), cromatografia em camada fina (TLC), cromatografia em hiperdifusão, e outras, ou vários processos imunológicos, tais como reações fluídicas ou de precipitina gel, imunodifusão (única ou dupla), 10 imunoeletroforese, radioimunoensaio (RIA), análises imunoabsorventes ligadas à enzima (ELISAs), ensaios imunofluoresceente, mancha do Ocidente, espectrometria de massa, e outros descritos abaixo e evidentes para aqueles de experiência na técnica, após exame deste relatório.
2) ENSAIO ELETROFORÉTICO
Em uma modalidade, os polipeptídeos de hTRT são detectados em uma separação de eletroforética de proteínas; em um aspecto, é empregado um sistema bidimensional de eletroforese. Meios para detectar proteínas usando-se técnicas eletroforéticas são bem conhecidos daqueles versados na técnica (ver, de forma geral, R. Scopes (1982) Protein 20 Purification, Springer-Verlag, N.Y.; Deutscher (1990) Methods in Enzymology, Vol. 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc., N.Y.).
Em uma modalidade relacionada, um ensaio de alteração da mobilidade (ver, por exemplo, Ausubel et al., acima) é empregado. Por 25 exemplo, hTR rotulado se associará com hTRT e migrará com mobilidade alterada após a eletroforese em um gel de poliacrilamida de não desnaturação ou coisa parecida. Assim, por exemplo, se uma sonda de hTR (opcionalmente rotulada) ou um iniciador de telomerase (opcionalmente rotulado) for misturado com uma amostra contendo hTRT, ou co-expressa com hTRT (por
188
1^3 exemplo, em um sistema de expressão livre de célula), a presença de proteína • 4 · · ··· 4 · · 444 * de hTRT (ou um polinucleotídeo codificando hTRT) lia amostra, iies.ialt2fa*em:
uma alteração detectável de mobilidade de hTR.
3) IMUNOENSAIOS
a) GENERALIDADES
A presente invenção também provê processos para a detecção de polipeptídeos de hTRT empregando um ou mais reagentes de anticorpos da invenção (isto é, imunoensaios). Como aqui empregado, um imunoensaio é um ensaio que utiliza um anticorpo (como aqui amplamente definido, e especificamente inclui fragmentos, quimeras e outros agentes de ligação) que especificamente liga um polipeptídeo de hTRT ou epítopo. Os anticorpos da invenção podem ser produzidos por uma variedade de meios bem conhecidos daqueles experientes na técnica, por exemplo, como descrito acima.
Vários formatos de ensaios de ligação imunológica bem estabelecidos, adequados para a prática da invenção, são conhecidos (ver, por exemplo, as Patentes U.S. 4.366.241, 4,376.110, 4.517.288 e 4.837.168). Ver, por exemplo, Methods in Cell Biology, Volume 37: Antibodies in Cell Biology, Asai, ed. Academic Press, Inc., Nova Iorque (1993); Basic and Clinicai Immunology, Ί- Edição, Stites & Terr, eds. (1991); Harlow e Lane, acima (por exemplo, Capítulo 14), e Ausubel et al., acima (por exemplo, Capítulo 11), cada dos quais é aqui incorporado por referência em sua totalidade e para todas as finalidades. Tipicamente, os ensaios de ligação imunológica (ou imunoensaios) utilizam um “agente de captura” para especificamente ligar-se ao analisado e, frequentemente, imobilizá-lo. Em uma modalidade, o agente de captura é uma porção que especificamente se liga a um polipeptídeo ou subsequência de hTRT, tal como um anticorpo anti-hTRT. Em uma modalidade alternativa, o agente de captura pode ligar uma proteína ou RNA associados a hTRT, sob condições em que a molécula associada a hTRT permanece ligada à hTRT (de tal modo que, de a molécula
189 associada à hTRT for imobilizada, a proteína de hTRT será similarmente *· · · ·»· · · · ♦·· · ·· · · · ♦ ·· ····· · imobilizada). Será entendido que, em ensaios eirf que: :úmh .rfioTéculh:
' · ·Α ·· · ··· ··· ··· · · associada à hTRT seja capturada, a proteína de hTRT associada comumente estará presente e, assim, poderá ser detectada, por exemplo usando-se um anticorpo anti-hTRT ou coisa parecida. Os imunoensaios para detectar complexos proteínicos são conhecidos na técniea (ver, por exemplo, Harlow e Lane, acima, na página 583).
Comumente, o produto do gene de hTRT sendo ensaiado, é detectado direta ou indiretamente usando-se um rótulo detectável. O rótulo particular ou grupo detectável usado no ensaio não é comumente um aspecto crítico da invenção, contanto que ele não interfira significativamente com a ligação específica do anticorpo ou anticorpos usados no ensaio. O rótulo pode ser covalentemente ligado ao agente de captura (por exemplo, um anticorpo anti-hTRT), ou pode ser ligado a uma terceira porção, tal como 15 outro anticorpo, que especificamente ligue a, por exemplo: polipeptídeos de hTRT (em um epítopo diferente do reconhecido pelo agente de captura), o agente de captura [por exemplo, uma imunoglobulina anti-(primeiro anticorpo)]; um anticorpo anti-hTRT; um anticorpo que liga um anticorpo anti-TRT; ou um complexo de anticorpo/telomerase (por exemplo, através da 20 ligação a uma molécula associada, tal como uma proteína associada à telomerase). Outras proteínas capazes de ligar um anticorpo usado no ensaio, tal como a proteína A ou a proteína G, também podem ser rotuladas. Em algumas modalidades, será útil usar mais do que uma molécula rotulada (isto é, aquelas que podem ser distinguidas uma das outras). Além disso, quando o 25 alvo ligado (por exemplo, imobilizado) pelo agente de captura (por exemplo, anticorpo anti-hTRT) é um complexo (isto é, um complexo de hTRT e uma proteína associada a TRT, hTR ou outra molécula associada a TRT), um anticorpo rotulado que reconhece a proteína ou RNA associado com a proteína de hTRT, pode ser usado. Quando o complexo é um complexo de
190
166 proteína-ácido nucleico (por exemplo, TRT-hTR), a molécula repórter pode ·· · · ♦·· · · « ··· · ser um polinucleotídeo ou outra molécula (por eâziiAa}’ quê* reconheça o componente de RNA do complexo.
Alguns formatos de imunoensaios não requerem o uso de componentes rotulados. Por exemplo, os ensaios de aglutinação podem ser usados para detectar a presença dos anticorpos alvo. Neste caso, as partículas revestidas de antígenos são aglutinadas por amostras que compreendem os anticorpos alvo. Neste formato, os componentes não necessitam ser rotulados, e a presença do anticorpo alvo pode ser detectada por inspeção visual simples.
b) FORMATOS DE ENSAIOS NÃO COMPETITIVOS
A presente invenção provê processos e reagentes para imunoensaios competitivos e não competitivos, para detectar polipeptídeos de hTRT. Os imunoensaios não competitivos são ensaios em que a 15 quantidade de analisado capturado (neste caso hTRT) é diretamente medida.
Um tal ensaio é um imunoensaio de dois sítios, com base monoclonal, utilizando anticorpos monoclonais reativos a dois epítopos de não interferência na proteína de hTRT. Ver, por exemplo, Maddox et al., 1983, J. Exp. Med., 158: 1211 para informações de base. Em um ensaio de “sanduíche” preferido, o agente de captura (por exemplo, um anticorpo antiTRT) é ligado diretamente a um substrato sólido, onde ele é imobilizado. Estes anticorpos imobilizados, então, capturam qualquer proteína presente na amostra de teste. O hTRT, assim imobilizado, pode então ser rotulado, isto é, por ligação a um segundo anticorpo anti-hTRT conduzindo um rótulo.
Altemativamente, o segundo anticorpo anti-hTRT pode carecer de um rótulo, mas ser ligado por um terceiro anticorpo rotulado específico a anticorpos da espécie da qual o segundo anticorpo é derivado. O segundo anticorpo, altemativamente, pode ser modificado por uma porção detectável, tal como biotina, à qual a terceira molécula rotulada pode especificamente ligar-se, tal
191
1% como a estreptavidina rotulada por enzima.
c) FORMATOS DE ENSAIOS COMPETITIVOS ί·: | M f. 1 ? ? :
• · ♦ ♦ · ··· ··· ··· ·
Em ensaios competitivos, a quantidade de proteína de hTRT presente na amostra é medida indiretamente, mediante medição da 5 quantidade de um hTRT adicionado (exógeno) deslocado (ou de competição à distância) de um agente de captura (por exemplo, anticorpo anti-hTRT) pela proteína de hTRT presente na amostra. Em um ensaio competitivo, uma quantidade conhecida de proteína de hTRT rotulada é adicionada à amostra, e a amostra é então colocada em contato com um agente de captura (por 10 exemplo, um anticorpo que especificamente liga a proteína de hTRT). A quantidade de proteína de hTRT exógena (rotulada) ligada ao anticorpo é inversamente proporcional à concentração de proteína de hTRT presente na amostra. Em uma modalidade, o anticorpo é imobilizado em um substrato sólido. A quantidade de proteína de hTRT ligada ao anticorpo pode ser 15 determinada, ou por medição da quantidade de proteína de hTRT presente em um complexo de TRT/anticorpo, ou alternativamente pela medição da quantidade remanescente de proteína de TRT não complexada. A quantidade de proteína de hTRT pode ser detectada provendo-se uma molécula de hTRT rotulada.
Um ensaio de inibição de hapteno é outro exemplo de um ensaio competitivo. Neste ensaio, a proteína de hTRT é imobilizada em um substrato sólido. Uma quantidade conhecida de anticorpo anti-TRT é acrescentada à amostra, e a amostra é então colocada em contato com a proteína de hTRT imobilizada. Neste caso, a quantidade de anticorpo anti25 TRT ligada à proteína de hTRT imobilizada é inversamente proporcional à quantidade de proteína de hTRT presente na amostra. A quantidade de anticorpo imobilizado pode ser detectada mediante detecção, ou da fração imobilizada de anticorpo, ou da fração do anticorpo que permanece em solução. Neste aspecto, a detecção pode ser direta, onde o anticorpo é
192 rotulado, ou indireta, onde o rótulo é ligado a uma molécula que ·· · · ·*♦ · · 4 »·5 especificamente se liga ao anticorpo, como acima descfíto| ./* I *.! \ L:
* 4 ·♦ ♦ *·· ·*· »»· · ·
d) OUTROS FORMATOS DE ENSAIOS
A invenção também provê reagentes e processos para detectar e quantificar a presença de hTRT na amostra, mediante o uso de formato de imunomanchamento (mancha Ocidental). Neste formato, os polipeptídeos de hTRT em uma amostra são separados dos componentes da outra amostra por eletroforese em gel (por exemplo, na base do peso molecular), as proteínas separadas são transferidas para um suporte sólido adequado (tal como um 10 filtro de nitrocelulose, um filtro de náilon, um filtro de náilon derivatizado, ou coisa parecida), e o suporte é incubado com anticorpos anti-TRT da invenção. Os anticorpos anti-TRT especificamente se ligam a hTRT ou a outra TRT no suporte sólido. Estes anticorpos podem ser diretamente rotulados ou, altemativamente, podem ser subsequentemente detectados 15 usando-se anticorpos rotulados (por exemplo, anticorpos anti-camundongos de carneiro rotulados) ou outros reagentes de rotulação que especificamente ligam ao anticorpo anti-TRT.
Outros formatos de ensaios incluem os imunoensaios lipossômicos (LIA), que usam lipossomas projetados para ligar moléculas 20 específicas (por exemplo, anticorpos) e liberar reagentes ou marcadores encapsulados. Os produtos químicos liberados podem, então, ser detectados de acordo com técnicas padrão (ver Monroe et al., 1986, Amer. Clin. Prod. Rev. 5: 34).
Como observado acima, os formatos de ensaios usando FACS (e instrumentos ou processos equivalentes) têm vantagens quando se mede os produtos de gene de hTRT em uma amostra heterogênea (tal como uma amostra de biópsia contendo tanto células normais quanto malignas).
e) SUBSTRATOS, SUPORTES SÓLIDOS, MEMBRANAS E FILTROS
Como observado acima, dependendo do ensaio, vários
193 componentes, incluindo o antígeno, anticorpo rotulado, ou anticorpo anti·*» 4 4 ··» 4 ♦ 4 4 • 4 · 4» · · <· « 4 4 « 4 · hTRT, podem ser ligados a uma superfície sólida ôú áuç^tífe (*ísío g' Jlrrit·:
substrato, membrana ou papel de filtro). Muitos processos para imobilização de biomoléculas em uma variedade de superfícies sólidas, são conhecidos na 5 técnica. Por exemplo, a superfície sólida pode ser uma membrana (por exemplo, nitrocelulose), um prato microtitulador (por exemplo, PVC, polipropileno, poliestireno, látex e outros), um tubo microcentrifugador, ou uma conta de vidro ou de plástico. O componente desejado pode ser covalentemente ligado ou não covalentemente ligado através de ligação não específica.
Uma ampla variedade de polímeros orgânicos e inorgânicos, tanto naturais quanto sintéticos, pode ser empregada como o material para a superfície sólida. Polímeros ilustrativos incluem o polietileno, polipropileno, poli(4-metilbuteno), poliestireno, polimetacrilato, poli(tereftalato de etileno), 15 raion, náilon, poli(butirato de vinila), difluoreto de polivinilideno (PVDF), siliconas, poliformaldeído, celulose, celulose, acetato, nitrocelulose e outros. Outros materiais, que podem ser empregados, incluem papel, vidros, cerâmicos, metais, metalóides, materiais semicondutores, cimentos e outros.
Além disso, substâncias que formam géis, tais como proteínas (por exemplo, 20 gelatinas), lipopolissacarídeos, silicatos, agarose e poliacrilamidas, podem ser usadas. Polímeros que formam várias fases aquosas, tais como dextranos, polialquileno glicóis ou tensoativos, tais como fosfolipídeos, sais de alquilamônio de cadeia longa (12 a 24 átomos de carbono) e outros também são adequados. Quando a superfície sólida é porosa, vários tamanhos de 25 poros podem ser empregados, dependendo da natureza do sistema.
No preparo da superfície, uma pluralidade de materiais diferentes pode ser empregada, particularmente como laminados, para obter várias propriedades. Por exemplo, revestimentos proteínicos, tais como gelatina, podem ser usados para evitar ligação não específica, simplificar
194 íeô conjugação covalente, intensificar a detecção do sinal, ou coisa parecida.
Se a ligação covalente entre um compfeStcj e’-^:su$ei;ffcid JW·· «4 4 4·4 ··· ··· 4 · desejada, a superfície será comumente polifuncional ou será capaz de ser polifuncionalizada. Grupos funcionais que podem estar presentes na superfície e usados para ligação, podem incluir ácidos carboxílicos, aldeídos, grupos amino, grupos ciano, grupos etilênicos, grupos hidroxila, grupos mercapto e outros. A maneira de ligar uma ampla variedade de compostos a várias superfícies, é bem conhecida e é amplamente ilustrada na literatura. Ver, por exemplo, Immobilized Enzymes, Ichiro Chibata, Halsted Press, Nova
Iorque, 1978, e Cuatrecasas (1970) J. Biol. Chem. 245 3059.
Além da ligação covalente, vários processos para ligar não covalentemente um componente do ensaio, podem ser empregados. A ligação não covalente é tipicamente a absorção não específica de um composto, à superfície.
Uma pessoa de experiência na técnica observará que é frequentemente desejável reduzir a ligação não específica em imunoensaios. Particularmente, quando o ensaio envolve um antígeno ou anticorpo imobilizado em um substrato sólido, é desejável minimizar a quantidade de ligação não específica ao substrato. Meios de reduzir tal ligação não específica são bem conhecidos daqueles de experiência na técnica. Tipicamente, isto envolve o revestimento do substrato com uma composição proteinácea. Em particular, as composições de proteínas, tais como a albumina de soro bovino (BSA), o leite em pó desnatado, e gelatina, são amplamente usadas, com o leite em pó sendo algumas vezes preferido.
Altemativamente, a superfície é delineada de tal forma que ela se liga não especificamente a um componente, mas não significativamente liga a outro. Por exemplo, uma superfície conduzindo uma lecitina, tal como a Concanavalina A, se liga a um composto contendo carboidrato, mas não a uma proteína rotulada em que falta a glicosilação. Várias superfícies sólidas
195 • 9« * · · · '·· · • · ·· · · examinadas nas Patentes U.S. 4.447.576 e 4.254.082. s: s para uso em ligação não covalente de componentes de ensaios são
I <
H) ENSAIOS QUANTO A ANTICORPOS ANTI-TRT
A presente invenção também provê reagentes e ensaios para detectar imunoglobulinas específicas de hTRT. Em uma modalidade, a hTRT imobilizada (por exemplo hTRT recombinante ligado a um recipiente de placa de microensaio) é incubada com soro de um paciente sob condições em que os anticorpos anti-hTRT, se presentes, se ligam a hTRT imobilizado. Após a lavagem para remover a imunoglobulina não especificamente ligada, 10 anticorpos de soro ligados, podem ser detectados, se estiverem presentes, mediante adição de anticorpos anti-(Ig humano detectavelmente rotulados (modalidades e variações alternativas são bem conhecidas daqueles de experiência na técnica; ver, por exemplo, Harlow, acima, no Capítulo 14). Estes ensaios são úteis para detectar anticorpos anti-hTRT em qualquer fonte 15 que inclua soro animal ou humano ou um portador como solução salina. Em uma modalidade, os ensaios são usados para detectar ou monitorar uma resposta imune a proteínas de hTRT em um paciente, particularmente uma resposta autoimune (por exemplo, anti-telomerase). Os anticorpos anti-hTRT podem estar presentes no soro ou em outros tecidos ou fluidos, de um 20 paciente sofrendo de uma doença autoimune ou outra condição.
I) COMBINAÇÕES DE ENSAIOS
Os ensaios diagnósticos e prognósticos aqui descritos podem ser realizados em várias combinações e podem também ser realizados em conjunção com outros testes diagnósticos ou prognósticos. Por exemplo, 25 quando os presentes processos são usados para detectar a presença de células cancerígenas em amostras do paciente, a presença de hTRT pode ser usada para determinar o estágio da doença, se um tumor particular provavelmente invadir o tecido vizinho ou metastatizar um local distante, e se uma recorrência do câncer for provável. Testes que possam prover informações
196 οΖοί adicionais incluem a análise microscópica de amostras, de. biópsia, a detecção ί :X.·* *: ’’· *’·· :
de antígenos (por exemplo, os marcadores de í supecricies:. celula^ês?, associados com tumorigenicidade (por exemplo, usando histocitoquímica, FACS ou outros), processos de formação de imagem (por exemplo, após administração a um paciente de anticorpos anti-tumorais rotulados), ensaios de atividade de telomerase, ensaios de comprimento de telômero, ensaios de hTR, ou coisa parecida. Tais testes de comparação podem prover informação útil com respeito à progressão de uma doença.
Reconhecer-se-á também que combinações de ensaios podem prover informação útil. Por exemplo, e como observado acima, os ensaios quanto a mRNA de hTRT podem ser combinados com ensaios quanto a hTR (RNA de telomerase humana) ou ensaios de atividade de telomerase (isto é,
TRAP), para prover informação acerca da montagem e função da telomerase.
3) KITS
A presente invenção igualmente provê kits úteis para a triagem, monitoração, diagnóstico e prognóstico de pacientes com uma condição relacionada à telomerase, ou para determinação do nível de expressão de hTRT em células ou linhagens de células. Os kits incluem um ou mais reagentes para determinar a presença ou ausência de um produto do 20 gene de hTRT (RNA ou proteína) ou para quantificar a expressão do gene de hTRT. Reagentes preferidos incluem os iniciadores e sondas de ácido nucleico, que especificamente se ligam ao gene de hTRT, RNA, cDNA, ou porções destes, juntamente com proteínas, peptídeos, anticorpos e iniciadores de controle, sondas, oligonucleotídeos, proteínas, peptídeos e anticorpos.
Outros materiais, incluindo enzimas (por exemplo, transcriptases reversas, polimerases de DNA, ligases), tampões, reagentes (rótulos, dNTPs), podem ser incluídos.
Os kits podem incluir altemativamente, ou em combinação com qualquer dos outros componentes aqui descritos, um anticorpo que
197 especificamente se ligue a polipeptídeos de hTRT ou..suas subseguências. O ’’· ·· ·· ·’. · anticorpo pode ser monoclonal ou policlonal. O anticdrpcípode ser.ccmjhgatiò’: a outra porção, tal como um rótulo e/ou pode ser imobilizado em um suporte sólido (substrato). O(s) kit(s) também pode(m) conter um segundo anticorpo para detecção de complexos de polipeptídeo/anticorpo de hTRT ou para detecção de sondas de ácido nucleico hibridizado, bem como um ou mais peptídeos ou proteínas de hTRT para uso como controle, ou outros reagentes.
O anticorpo ou sonda de hibridização pode ser livre ou imobilizado em um suporte sólido, tal como um tubo de teste, uma placa microtituladora, uma haste de mergulho, e outros. O kit também pode conter materiais instrutivos ensinando a utilização do anticorpo ou sonda de hibridização em um ensaio, para a detecção de TRT. O kit pode conter reagentes apropriados para a detecção de rótulos, ou para rotular controles positivos e negativos, soluções de lavagem, tampões de diluição e outros.
Em uma modalidade, o kit inclui um par de iniciadores para ampliar mRNA de hTRT. Um tal kit também pode incluir uma sonda para DNA ampliado de hTRT e/ou uma polimerase, tampão, dNTPs e outros. Em outra, o kit compreende uma sonda, opcionalmente uma sonda rotulada. Em outra, o kit compreende um anticorpo.
X. IDENTIFICAÇÃO DE MODULADORES DE ATIVIDADE DE TELOMERASE
A. GENERALIDADES
A invenção provê compostos e tratamentos que modulam a atividade ou a expressão de uma telomerase ou componente de telomerase (por exemplo, proteína de hTRT). A invenção também provê ensaios e processos de triagem (incluindo triagem de alto rendimento), para identificação de compostos e tratamentos que modulam a atividade ou expressão de telomerase. Estes moduladores da atividade e expressão de telomerase (daqui em diante referido como “moduladores”) incluem os
198 agonistas de telomerase (que aumentam a atividade e/ou expressão da • · : * : ·*· ·*· ·** · telomerase) e antagonistas da telomerase (que reduzem .$· fcti^daçle\e7©ir:
expressão da telomerase).
Os moduladores da invenção possuem uma ampla variedade de usos. Por exemplo, considera-se que os moduladores de telomerase sejam agentes terapêuticos eficazes para tratamento de doenças humanas. A triagem quanto à atividade agonista, e ativadores transcricionais ou translacionais, provê composições que aumentam a atividade de telomerase em uma célula (incluindo uma capacidade replicativa dependente de telômero, ou atividade 10 de telomerase “parcial”). Tais composições agonistas provêem processos de imortalizar de outra forma células normais não transformadas, incluindo células que podem expressar proteínas úteis. Tais agonistas também podem prover processos de controle da senescência celular. Ao contrário, a triagem da atividade antagonista provê composições que decrescem a capacidade 15 replicativa dependente de telômero, assim mortalizando as células de outra forma imortais, tais como as células cancerígenas. A triagem de atividade antagonista provê composições que reduzem a atividade de telomerase, por esse meio evitando a divisão celular ilimitada das células que apresentam crescimento celular irregular, tais como as células cancerosas. Doenças e 20 condições ilustrativas que podem ser tratadas usando-se moduladores, são aqui listadas, por exemplo nas Seções VII e IX acima. Em geral, os moduladores da invenção podem ser usados onde quer que seja desejável para aumentar ou reduzir uma atividade de telomerase em uma célula ou organismo. Assim sendo, além do uso no tratamento da doença, um 25 modulador que aumenta os níveis de expressão de hTRT pode ser usado, para produzir uma linhagem celular humana cultivada tendo propriedades como as de uma forma geral descritas na Seção VIII acima, e vários outros usos que serão evidentes a uma pessoa experiente.
Um composto ou tratamento modula a “expressão” da
199 telomerase ou um componente de telomerase, quando a administração do ·· · · ··· · composto ou o tratamento modifica a taxa ou o nível Üe frajlèçriçâo codificando um componente de telomerase (por exemplo, o gene codificando mRNA de hTRT), afeta a estabilidade ou o processamento pós-transcricional 5 de RNA codificando um componente de telomerase (por exemplo, transporte, união, poliadenilação ou outra modificação), afeta a translação, a estabilidade, o processamento pós-translacional ou a modificação de uma proteína codificada (por exemplo, hTRT), ou de outra forma modifica o nível de RNP de telomerase funcional (por exemplo, cataliticamente ativo). Um 10 composto ou tratamento afeta uma “atividade” de telomerase quando a administração do composto ou o tratamento modifica uma atividade de telomerase, tal como qualquer atividade descrita na Seção IV (B), supra (por exemplo, incluindo a atividade catalítica de telomerase processiva e não processiva; processividade da telomerase; atividade de transcriptase reversa 15 convencional; atividade nucleolítica; atividade de ligação do iniciador ou do substrato; atividade de ligação do dNTP; atividade de ligação do RNA; montagem do RNP de telomerase; e atividade de ligação proteínica). Será observado que não existe necessariamente uma delineação nítida entre as modificações em “atividade” e as modificações em “expressão”, e que estes 20 termos são usados para facilidade de exame e não para limitação. Observarse-á que os moduladores da invenção devem, especificamente, afetar a atividade ou expressão de telomerase (por exemplo, sem geralmente modificar a expressão de proteínas domésticas, tais como a actina), ao invés de, por exemplo, reduzir a expressão de um componente de telomerase por 25 envenenamento de uma célula alvo.
B. ENSAIOS PARA IDENTIFICAÇÃO DE MODULADORES DE TELOMERASE
A invenção provê processos e reagentes para examinar composições ou compostos capazes de afetar a expressão de uma telomerase
200 ou componente de telomerase, capaz de modificar a capacidade replicativa de • · * ··: í · · ··· · •••íí ♦!·;··♦ ·
DNA da telomerase, ou de outra forma modificar a capacidade* dqlenzima.íie·*·: telomerase e proteína de TRT, para sintetizar o DNA telomérico (“atividade completa”). A invenção também provê exames para moduladores de qualquer 5 uma ou de todas as “atividades parciais” da hTRT. Assim, a presente invenção provê ensaios que podem ser usados para avaliar quanto aos agentes que aumentam a atividade de telomerase, por exemplo, fazendo com que a proteína de hTRT ou telomerase a ser expressa em uma célula em que ela normalmente não é expressa, ou aumentando os níveis de atividade da 10 telomerase em células positivas de telomerase.
A telomerase ou proteínas de subunidades de telomerase, ou seus fragmentos ou oligopeptídeos catalíticos ou imunogênicos, podem ser usadas para examinar os compostos terapêuticos em qualquer de uma variedade de técnicas de triagem de medicamentos. O fragmento empregado 15 em um tal teste pode ser livre em solução, fixo a um suporte sólido, conduzido em uma superfície celular, ou locado intracelularmente. A formação dos complexos de ligação, entre a telomerase ou a proteína de subunidade e o agente em teste, pode ser medida.
Em várias modalidades, a invenção inclui processos para 20 triagem de antagonistas que: se ligam ao sítio ativo da enzima; inibem a associação de sua porção de RNA, proteínas associadas à telomerase, ou DNA telomérico para telomerase ou proteína de hTRT; promover a desassociação do complexo enzimático; interferir com a transcrição da porção de RNA de telomerase (por exemplo, hTR); ou inibir qualquer uma 25 das “atividades parciais” aqui descritas. A invenção provê processos para avaliar quanto às composições que inibem a associação de ácido nucleico e/ou composições associadas à telomerase com hTRT, tal como a associação de hTR com hTRT ou a associação de hTRT com os homólogos humanos de p80 ou p95 ou outra proteína associada, ou associação de hTRT com um
201 o^-Qé>
telômero ou um nucleotídeo; a avaliação de composições que promovam a :: : : : ·* ·'; ·*. ü':
desassociação ou promovam a associação (isto é, a mõntágejh·) d^.qQnjpJexcH enzimático, tal como um anticorpo dirigido a hTR ou hTRT; triagem de agentes que efetuam a processividade da enzima; e triagem de ácidos nucleicos e outras composições que se ligam à telomerase, tais como um ácido nucleico complementar a hTR. A invenção ainda considera a triagem de composições que aumentam ou reduzem a transcrição do gene de hTRT e/ou a translação do produto de gene de hTRT. A invenção também considera um processo de triagem de moduladores de telomerase em animais, em uma modalidade, mediante reconstituição de uma atividade de telomerase, ou uma atividade anti-telomerase, em um animal, tal como um animal transgênico. A invenção provê sistemas de ensaios in vivo, que incluem modelos de , em que uma ou várias unidades da telomerase endógena, porção de RNA de telomerase e/ou proteínas associadas à telomerase, tenham sido deletadas ou inibidas. A atividade de telomerase endógena, completa ou parcial, pode permanecer ou estar ausente. Em uma modalidade, uma atividade de telomerase exógena, completa ou parcial, é reconstituída.
Em uma modalidade da invenção, uma variedade de ensaios de telomerase de atividade parcial é provida para identificar uma variedade 20 de diferentes classes de moduladores de atividade de telomerase. Os ensaios de “atividade parcial” da invenção permitem a identificação de classes de moduladores de atividade de telomerase, que poderíam, de outra forma, não ser detectados em um ensaio de telomerase de “atividade completa”. Um ensaio de atividade parcial envolve a atividade não-processiva de TRT e 25 telomerase. A natureza processiva de telomerase é descrita por Morin (1989) Cell 59: 521-529; ver também Prowse (1993) “Identification of a nonprocessive telomerase activity ffom mouse cells” Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 1493-1497. Outro ensaio de atividade parcial da invenção aproveita a atividade telomerase “semelhante Pa transcriptase reversa”. Nestes ensaios,
202 ensaia-se a atividade de transcriptase reversa da proteína de hTRT. Ver t·· : .·. ··· Φ·Β #·β ··· |
Lingner (1997) “Reverse transcriptase motifs in the càtatyftc .^u^úírit .pf·:
telomerase” Science 276: 561-567. Outro ensaio de atividade parcial da invenção aproveita a “atividade nucleolítica” de hTRT e telomerase, envolvendo a remoção da enzima de pelo menos um nucleotídeo, tipicamente guanosina, do filamento 3’ de um iniciador. Esta atividade nucleolítica foi observada na Tetrahymena telomerase por Collins (1993) “Tetrahymena telomerase catalizes nucleolytic cleavage and nonprocessive elongation” Genes Dev. 7: 1364-1376. Outro ensaio de atividade parcial da invenção envolve a análise da capacidade de hTRT e da telomerase, de ligar-se a nucleotídeos como parte de sua atividade de polímerização de CNA processivo enzimático. Outro ensaio de atividade parcial da invenção envolve a análise da capacidade de hTRT ou da telomerase, para ligar sua porção de RNA, isto é, hTR para células humanas, usadas como um padrão para a 15 síntese de telômero. Ensaios adicionais de atividade parcial da invenção envolve a análise da capacidade de hTRT e de telomerase, de ligar-se a cromossomas in vivo, ou para ligar iniciadores de oligonucleotídeos in vitro ou em sistemas reconstituídos, ou para ligar as proteínas associadas com a estrutura cromossômica (ver, quanto a um exemplo de uma tal proteína, 20 Harrington (1995) J. Biol. Chem. 270: 8893-8901). As estruturas cromossômicas que ligam hTRT incluem, por exemplo, o DNA telomérico de repetição, as proteínas de telômeros, as histonas, a proteína de matriz nuclear, as proteínas de controle da divisão celular/ciclo celular, e outros.
Em uma modalidade, um ensaio para identificação de moduladores compreende colocar em contato uma ou mais células (isto é, “células de teste”) com um composto de teste, e determinar se o composto de teste afeta a expressão ou a atividade de uma telomerase (ou componente de telomerase) na célula. Comumente, esta determinação compreende comparar a atividade ou a expressão na célula de teste, em comparação com uma célula
203 ou células similares (isto é, células de controle) que não tenham sido • · Z ·*· ··: : · · ··· · ·· · ·· · *· ♦···· · colocadas em contato com o composto de teste. Altemà’tivhníéi1te,.bs;ex.tfalps: celulares podem ser usados no lugar das células intatas. Em uma modalidade relacionada, o composto de teste é administrado a um organismo multicelular 5 (por exemplo, uma planta ou um animal). A telomerase ou componente de telomerase pode ser completamente endógeno à célula ou organismo multicelular (isto é, codificado por genes endógenos de ocorrência natural), ou pode ser um organismo celular recombinante ou organismo transgênico, compreendendo um ou mais componentes de telomerase recombinantemente 10 expresso (por exemplo, hTRT, hTR, proteínas associadas à telomerase), ou podem ter componentes tanto endógeno quanto recombinante. Assim, em uma modalidade, os moduladores da atividade da telomerase são administrados a células mortais. Em outra modalidade, os moduladores de atividade da telomerase são administrados a células imortais. Por exemplo, os 15 antagonistas da replicação de DNA mediada por telomerase podem ser identificados mediante a administração da composição inibitória putativa, a uma célula que se saiba apresenta quantidades significativas de atividade de telomerase, tal como as células do câncer, e medindo-se se uma redução na atividade da telomerase, comprimento do telômero, ou capacidade 20 proliferativa, é observada, todos dos quais são indicativos de um composto com atividade antagonista.
Em outra atividade, um modulador é identificado por monitorar uma modificação em atividade de uma telomerase de um complexo de ribonucleoproteína (RNP), compreendendo uma TRT (por exemplo, 25 hTRT) e um RNA padrão (por exemplo, hTR), RNP que é reconstituído in vitro (por exemplo, como descrito no Exemplo 7, abaixo).
Em ainda outra modalidade, o modulador é identificado pela monitoração de uma modificação na expressão de um produto de gene de TRT (por exemplo, RNA ou proteína) em uma célula, animal, sistema de
204 expressão in vitro, ou outro sistema de expressão.
·*· ♦ ·*· ·*· ·ί ·*· ·*♦ ;·* ·
Em ainda outra modalidade, o modulador :é.tà$iitiFiGa‘dçf'pêÍá·:
modificação da expressão de um gene repórter, tal como aquele descrito no
Exemplo 15, cuja expressão é regulada, no todo ou em parte, por um elemento regulatório da TRT de ocorrência natural, tal como um promotor ou um intensificador. Em uma modalidade relacionada, a capacidade de um composto de teste de ligar-se a um componente de telomerase (por exemplo, hTRT), RNA ou sequência regulatória do gene (por exemplo, o promotor do gene de TRT), é ensaiada.
Em outra modalidade, o modulador é identificado mediante observação de modificações no processamento de pré-mRNA de hTRT, por exemplo, produtos altemativamente unidos, eventos alternativos de poliadenilação, divagem de RNA, e outros. Em uma modalidade relacionada, a atividade do modulador pode ser observada por monitoração da produção de 15 polipeptídeos variantes de hTRT, alguns dos quais podem possuir atividade de regulação da telomerase negativa dominante.
Os formatos de ensaios para identificação de compostos que afetam a expressão e a atividade das proteínas, são bem conhecidos nas indústrias biotecnológicas e farmacêuticas, e numerosos ensaios adicionais e 20 variações dos ensaios ilustrativos providos acima, serão evidentes àqueles de experiência.
As modificações na atividade ou expressão de telomerase podem ser medidas por qualquer processo adequado. Modificações nos níveis de expressão de um componente de telomerase (por exemplo, proteína de 25 hTRT) ou precursor (por exemplo mRNA de hTRT), podem ser ensaiadas usando-se processos bem conhecidos daqueles versados, algumas das quais são aqui descritas acima, por exemplo, na Seção IX, e incluindo os níveis de monitoração dos produtos de gene de TRT (por exemplo, proteína e RNAs) por hibridização (por exemplo ,usando-se as sondas e iniciadores de TRT da
205 d
invenção), ensaios de proteção RNAse, ensaios de ampliação, ou qualquer outro meio de detecção adequado aqui descrito ou conftecídós aa técirfc#.’ Âf :·: quantidades de quantificação de ácido nucleico em uma amostra (por exemplo, os níveis de avaliação de RNA, por exemplo, hTR ou mRNA de 5 hTRT) também são úteis na avaliação de reguladores cis- ou transtranscricionais.
De forma semelhante, as modificações na atividade da telomerase podem ser medidas usando-se processos como aqueles aqui descritos (por exemplo, na Seção IV (B), acima) ou outros ensaios da função 10 da telomerase. A quantificação da atividade de telomerase, quando desejada, pode ser realizada por qualquer processo, incluindo aqueles aqui apresentados. Os antagonistas da telomerase que podem causar ou acelerar a perda de estrutura telomérica, podem ser identificados pela monitoração e medição do seu efeito sobre a atividade da telomerase in vivo, ex vivo ou in 15 vitro, ou por seus efeitos no comprimento do telômero (medido ou detectado através de manchamento, uso de sondas de hibridização marcadas ou outros meios) ou, simplesmente, pela inibição da divisão celular de células de câncer positivas a telomerase (encurtamento crítico de telômeros conduz a um fenômeno denominado “crise” ou senescência M2 (Shay, 1991) Biochem.
Biophys. Acta 1072: 1-7), as quais têm sido contornadas pela ativação da telomerase, mas que, na ausência de telomerase, conduzirá à sua senescência ou morte através da deleção e reorganização cromossômicas). A reconstituição da atividade de telomerase humana in vivo proporciona um processo de triagem para moduladores de telomerase em células ou animais 25 de qualquer origem. Tais agonistas podem ser identificados em um ensaio de atividade da invenção, incluindo medições de modificações no comprimento do telômero. Outros exemplos de ensaios de medição da atividade de telomerase em células, incluem ensaios quanto ao acúmulo ou perda de estrutura de telômero, o ensaio TRAP ou um ensaio de reação em cadeia de
206 polimerase quantitativa.
: *’· ·: ·’· ·’· :·· :
Em uma modalidade, os ensaios da invehçãb ijÊmbéèiánalúêm:·: ··· ♦·· ··« · · um processo onde o composto de teste produz uma redução estatisticamente significativa na atividade da hTRT medida pela incorporação de um nucleotídeo rotulado em um substrato, em comparação com a quantidade relativa do rótulo incorporado em uma reação paralela carente do composto de teste, dessa forma determinando que o composto de teste seja um inibidor de telomerase.
Os processos da invenção são sensíveis às adaptações dos protocolos descritos na literatura científica e de patentes e conhecidos na técnica. Por exemplo, quando uma telomerase ou proteína de TRT desta invenção são usadas para identificar composições que atuam como moduladores das atividades de telomerase, grandes números de moléculas potencialmente úteis podem ser examinadas em um teste único. Os moduladores podem ter um efeito inibitório (antagonista) ou de potenciação (agonista) na atividade da telomerase. Por exemplo, se um painel de 1000 inibidores deve ser examinado, todos os 1000 inibidores podem potencialmente ser colocados em um reservatório microtitulador e analisados simultaneamente. Se um tal inibidor for descoberto, então a reunião dos 1000 pode ser subdividida em 100 conjuntos de 100 e o processo repetido, até que um inibidor individual seja identificado.
Na triagem de medicamentos, grandes quantidades de compostos são examinadas quanto à sua capacidade de atuar como moduladores de telomerase, um processo grandemente acelerado pelas 25 técnicas de triagem de elevado rendimento. Os ensaios quanto à atividade de telomerase, completos ou parciais, aqui descritos, podem ser adaptados para serem usados em uma técnica de alto rendimento. Aqueles experientes na técnica observarão que existem numerosos processos para a realização deste propósito.
207
Outra técnica para a triagem de medicamentos, que pode ser : :*ς ·* ·*· ··. :·· :
aplicada para triagem de alto rendimento dos compostof qu-e ipha afinidade Be «·· ligação adequada à telomerase ou subunidade proteínica de telomerase, é descrita em detalhes em “Determination of Amino Acid Sequence
Antigenicity” por Geysen (Geysen, Pedido WO 84/03564, publicado em 13 de setembro de 1984, aqui incorporado por referência). Em resumo, grandes quantidades de diferentes compostos de teste de peptídeos pequenos são sintetizadas em um substrato sólido, tal como pinos de plástico ou alguma outra superfície. Os compostos de teste de peptídeos são relacionados com 10 fragmentos de telomerase ou subunidades proteínicas de telomerase, e lavados. A telomerase ou subunidade proteínica de telomerase ligadas são então detectadas por processos bem conhecidos na técnica. A telomerase purificada ou a subunidade proteínica de telomerase substancialmente purificadas também podem ser revestidas diretamente nas placas, para uso 15 nas técnicas de triagem de medicamentos acima mencionadas.
Altemativamente, anticorpos não neutralizantes podem ser usados para capturar o peptídeo e imobilizá-lo em um suporte sólido.
Esta invenção também considera o uso de ensaios competitivos de triagem de medicamentos, em que os anticorpos 20 neutralizantes capazes de telomerase de ligação ou proteína(s) de subunidades, especificamente competem com um composto de teste quanto à telomerase de ligação ou a proteína de subunidade. Os anticorpos podem também ser usados para detectar a presença de qualquer peptídeo que compartilhe um ou mais determinantes antigênicos com a telomerase ou 25 proteína de subunidade.
Processos adicionais para identificar moduladores de uma atividade de telomerase foram descritos na Patente U.S. 5.645.986, que é aqui incorporada por referência. Será observado que a presente invenção provê melhoramentos a processos previamente conhecidos, em parte por fornecer
208 reagentes tais como polinucleotídeos de hTRT, sondas e iniciadores, hTR, ·* ·’: ·*· :··: hTRT e telomerase altamente purificadas, bem comei ^hÇicofpçrs ;anfe-:·: telomerase e anti-TRT, todos dos quais podem ser usados em ensaios, por exemplo, como controles, padrões, agentes de ligação ou de hibridização, ou outros.
Será reconhecido que a telomerase e a TRT recombinantemente produzida (por exemplo, hTRT) da invenção será útil em ensaios para identificação de moduladores. O ensaio de triagem pode utilizar a telomerase ou a hTRT derivada por uma reconstituição completa ou parcial de atividade de telomerase, ou por um aumento da atividade existente. O ensaio ou os exames providos pela invenção podem ser usados para analisar quanto à capacidade da telomerase de sintetizar o DNA telomérico ou de analisar quanto a qualquer uma ou todas das “atividades parciais” de hTRT e TRTs em geral, como descrito acima. O ensaio pode incorporar modificação ex vivo de células que tenham sido manipuladas para expressar a telomerase com ou sem sua porção de RNA ou proteínas associadas, e estas podem ser reimplantadas em um animal, as quais podem ser usadas para análise in vivo. Assim, esta invenção provê ensaios in vivo e animais transgênicos de utilidade nela. Estes sistemas de ensaios in vivo podem empregar células de em que uma ou várias unidades do complexo enzimático de telomerase endógena tenham sido deletadas ou inibidas, bem como células em que uma atividade de telomerase exógena e endógena seja reconstituída ou ativada.
As telomerases e as proteínas de TRT que tenham sido modificadas de uma maneira específica do sítio (por mutação específica do sítio), para modificarem ou deletarem qualquer ou todas as funções da enzima de telomerase ou a proteína de TRT, também podem ser empregadas nos exames da invenção, para descobrir agentes terapêuticos. Por exemplo, a
TRT pode ser desenvolvida para perder sua capacidade de ligar o DNA do
209
substrato, para ligar sua porção de RNA (como hTR), para catalisar a adição ·*« · *·ί .i · » »·» * · ♦ * * uN * · · · ♦ do DNA telomérico, para ligar o substrato de deoxijiuc|le.qtí^eoj\5)ara*tfe’f atividade nucleolítica, para ligar proteínas ou estruturas cromossômicas associadas a telômero, etc. As “proteínas mutantes” ou “muteens” podem ser usadas para identificar compostos que especificamente modulem um, vários, ou todas as funções ou atividades da proteína de TRT ou telomerase.
C. EXEMPLOS DE MODULADORES DE TELOMERASE
1) GENERALIDADES
Os compostos de teste referidos acima podem ser quaisquer de uma grande variedade de compostos, tanto de ocorrência natural quanto sintéticos, orgânicos e inorgânicos, e incluindo polímeros (por exemplo, oligopeptídeos, polipeptídeos, oligonucleotídeos e polinucleotídeos), moléculas pequenas, anticorpos (como amplamente aqui definidos), açúcares, ácidos graxos, nucleotídeos e análogos de nucleotídeos, análogos de estruturas de ocorrência natural (por exemplo, miméticos de peptídeos, análogos de ácido nucleico, e outros), e numerosos outros compostos.
A invenção provê moduladores de todos os tipos, sem limitação a qualquer mecanismo particular de ação. Para fins ilustrativos, exemplos de moduladores incluem compostos ou tratamentos que:
(i) se ligam ao polipeptídeo de hTRT (por exemplo, o sítio ativo da enzima) ou outro componente de telomerase, e afetam uma atividade de telomerase;
(ii) inibem ou promovem a associação, ou inibem ou promovem a desassociação de um componente de telomerase (por exemplo, hTRT ou o RNP de hTRT-hTR), com ou de uma proteína associada à telomerase (por exemplo, incluindo aquelas descritas na Seção IV (D), supra);
(iii) inibem ou promovem a associação, ou inibem ou promovem a desassociação, de polipeptídeos de telomerase (por exemplo,
210 hTRT) com ou de um RNA de telomerase (por exemplo, hTR);
»*· · ·*. **í Λ · · ··· * • · φ · · * · * * X * (iv) inibem ou promovem a associáçãct, ,b'u· iifibem;* oü :*j promovem a desassociação, de polipeptídeos de telomerase (por exemplo, hTRT) com ou de cromossomas (por exemplo, telômeros) ou DNA cromossômicos (por exemplo, DNA telomérico);
(v) aumentam ou reduzem a expressão de um produto de gene de componente da telomerase (por exemplo, produtos do gene de hTRT), incluindo modificação da taxa ou nível de transcrição do gene de TRT, ou translação, transporte ou estabilidade de um produto de gene, ou coisa parecida, mediante ligação ao gene ou produto de gene [por exemplo, por interação com um fator (por exemplo, uma proteína regulatória da transcrição) que afeta a transcrição do gene de hTRT ou outro componente de telomerase).
2) MODULADORES DE PEPTÍDEOS
Moduladores potenciais da atividade de telomerase também incluem peptídeos [por exemplo, moduladores peptídicos inibitórios (antagonistas) e ativadores (agonistas)]. Por exemplo, oligopeptídeos com sequências aleatoriamente geradas podem ser triados para descobrir moduladores peptídicos (agonistas ou inibidores) de atividade de telomerase.
Tais peptídeos podem ser usados diretamente como medicamentos, ou para encontrar a orientação ou posição de um grupo funcional que possa inibir a atividade de polimerase que, em seguida, conduz à delineação e análise de um inibidor de molécula pequena, ou se toma a espinha dorsal para modificações químicas que aumentam a utilidade farmacológica. Os peptídeos podem ser miméticos estruturais, e pode-se usar programas de modelagem molecular para projetar miméticos com base na estrutura secundária característica e/ou estrutura terciária da enzima de telomerase e proteína de hTRT. Tais miméticos estruturais também podem ser usados terapeuticamente, in vivo, como moduladores da atividade de telomerase
211 oLí(p (agonistas e antagonistas). Miméticos estruturais também podem ser usados í ·* «*» ·% :
como imunógenos para eliciar os anticorpos de proteíjfa ínjj*te!oáierâ&£ ou anti-TRT.
3) COMPOSTOS INIBITÓRIOS NATURAIS COMO MODULADORES
DA ATIVIDADE DE TELOMERASE
Além disso, um grande número de compostos modifícadores da atividade, potencialmente úteis, pode ser triado em extratos de produtos naturais como um material fonte. Fontes de tais extratos podem ser de um grande número de espécies de fungos, actinomyces, algas, insetos, protozoa, 10 plantas e bactérias. Aqueles extratos apresentando atividade inibitória podem, então, ser analisados para isolar a molécula ativa. Ver, por exemplo, Tumer (1996) J. Ethnopharmacol 51 (1-3): 39-43; Suh (1995) Anticancer Res. 15: 233-239.
4) OLIGONUCLEOTÍDEOS INIBITÓRIOS
Um conjunto particularmente útil de inibidores providos pela presente invenção, inclui oligonucleotídeos que são capazes, ou de se ligarem ao mRNA codificando a proteína de hTRT, ou ao gene de hTRT, em qualquer caso prevenindo ou inibindo a produção de proteína funcional de hTRT. Outros oligonucleotídeos da invenção interagem com a porção de
RNA da telomerase, tal como hTR, ou são capazes de prevenir a ligação de telomerase ou hTRT a seu DNA alvo, ou um componente de telomerase a outro, ou a um substrato. Tais oligonucleotídeos podem também ligar-se à enzima de telomerase, proteína de hTRT, ou tanto à proteína quanto ao RNA, e inibir uma atividade parcial como descrito acima (tal como sua atividade processiva, sua atividade de transcriptase reversa, sua atividade nucleolítica, etc.) A associação pode ser através da hibridização específica da sequência a outro ácido nucleico, ou por ligação geral, como em um aptâmero, ou ambas.
A atividade de telomerase pode ser inibida por alvejamento do mRNA de hTRT com oligonucleotídeos anti-sentido capazes de ligar o
212 mRNA de hTRT.
íí 1 fí *“ »s ·*» ·% r:
Outra classe útil de inibidores inclui (jlig.bnutléotídeôa**qii® H causam a inativação ou divagem do mRNA de hTRT ou do hTR. Isto é, o oligonucleotídeo é quimicamente modificado, ou tem atividade enzimática, que causa tal divagem, tal como é o caso quanto a uma ribozima, um oligonucleotídeo acorrentado por EDTA, ou um oligonucleotídeo covalentemente ligado, tal como um psoralém ou outro oligonucleotídeo ligado a reagente de reticulação. Como observado acima, pode-se examinar um agrupamento de muitos diferentes de tais oligonucleotídeos, no lugar 10 daqueles com a atividade desejada.
Outra classe útil de inibidores inclui oligonucleotídeos que ligam a polipeptídeos. moléculas de DNA de duplo filamento ou de filamento único ou de RNA de filamento duplo ou único, que ligam a alvos de polipeptídeos específicos, são chamados de “aptâmeros”. A associação 15 específica de oligonucleotídeo-polipeptídeo pode ser mediada por interações eletrostáticas. Por exemplo, os aptâmeros especificamente se ligam a exósitos de ligação de ânion em trombina, que fisiologicamente se liga Pa heparina polianiônica [Bock (1992) Nature 355: 564-566]. Tendo em vista que a proteína de hTRT se liga tanto a hTR quanto a seu substrato de DNA, e uma 20 vez que a presente invenção provê hTRT e outras proteínas de TRT na forma purificada em grandes quantidades, aqueles de experiência na técnica podem facilmente examinar os aptâmeros de ligação a TRT usando os processos da invenção.
Os oligonucleotídeos (por exemplo, oligonucleotídeos de 25 RNA), que se ligam à telomerase, hTRT, hTR ou porções destas, podem ser gerados usando-se as técnicas de SELEX (Tuerk, 1997, Methods Mol Biol 67, 2190). Nesta técnica, um aglomerado muito grande (105-109) de ácidos nucleico de sequência aleatória, é ligado ao alvo (por exemplo, hTRT), usando-se condições que causam uma grande quantidade de discriminação
213
Μ entre as moléculas com alta afinidade e baixa afinidade para ligar o alvo. As : í i »·· ··. :moléculas ligadas são separadas das não ligadas, e as molBcj$ags ljfjaíj^sãa ··· ampliadas em virtude de uma sequência de ácido nucleico específica incluída em seus términos e reagentes de ampliação adequados. Este processo é reiterado por várias vezes até que um número relativamente pequeno de moléculas permaneça, que possuam alta afinidade de ligação em relação ao alvo. Estas moléculas podem, então, ser analisadas quanto à sua capacidade para modularem a atividade de telomerase, como aqui descrito.
Os antagonistas de replicação de DNA mediada por telomerase também podem basear-se na inibição de hTR [Norton (1996)
Nature Biotechnology 14: 615-619] através do reconhecimento ou divagem da sequência complementar, como através de ribozimas.
Os oligonucleotídeos inibitórios da invenção podem ser transferidos para a célula, usando-se uma variedade de técnicas bem conhecidas nesta ciência. Por exemplo, os oligonucleotídeos podem ser liberados no citoplasma sem modificação específica. Altemativamente, eles podem ser liberados mediante o uso de lipossomas, que se fundem com a membrana celular ou são endocitosados, isto é, mediante o emprego de ligandos fixados ao lipossoma ou diretamente ao oligonucleotídeo, que se liga aos receptores de proteína da membrana superficial da célula resultante na endocitose. Altemativamente, as células podem ser permeabilizadas para intensificar o transporte dos oligonucleotídeos para a célula, sem lesar as células hospedeiras. Pode-se usar uma proteína de ligação ao DNA, por exemplo HBGF-1, conhecida para transportar um oligonucleotídeo para uma célula.
5) RIBOZIMAS INIBITÓRIOS
As ribozimas atual por ligação a um RNA alvo, através da porção de ligação do RNA alvo de uma ribozima, que é retida em proximidade íntima com uma porção enzimática da ribozima que cliva o
214
RNA alvo. Assim, a ribozima reconhece e liga um RNA alvo, usualmente
F: : ·8 ··· ·*· :·· s através de emparelhamento de base complementar, e uila fe£ljgadojap.sítjQ :·; correto, atua enzimaticamente para clivar e inativar o RNA alvo. A divagem de um RNA alvo de uma tal maneira destruirá sua capacidade para dirigir a síntese de uma proteína codificada, se a divagem ocorrer na sequência de codificação. Após uma ribozima ter ligado e clivado seu RNA alvo, é tipicamente liberada daquele RNA e, assim, pode ligar e clivar novos alvos, repetidamente.
6) IDENTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS ASSOCIADAS À TELOMERASE. PARA USO COMO MODULADORES
Em uma modalidade da invenção, a telomerase é usada para identificar as proteínas associadas à telomerase, isto é, proteínas acessórias da telomerase, que modulam ou de outra forma complementam a atividade de telomerase. Como observado acima, estas proteínas ou seus fragmentos podem modular a função, causando a dissociação o prevenindo a associação do complexo enzimático da telomerase, evitando a montagem do complexo de telomerase, evitando a ligação da hTRT a seu complemento de ácido nucleico ou a seu padrão de DNA, evitando a ligação da hTRT aos nucleotídeos, ou evitando, aumentando ou inibindo qualquer uma, diversas ou todas as atividades parciais da enzima de telomerase ou proteína de hTRT, como descrito acima.
Uma pessoa de experiência na técnica pode usar os processos da invenção para identificar que porções (por exemplo, domínios) destas proteínas de associação à telomerase, fazem contato com a telomerase. Em uma modalidade da invenção, estas proteínas ou seus fragmentos de associação à telomerase, são usados como moduladores da atividade de telomerase.
7) PROTEÍNAS ASSOCIADAS À TELOMERASE COMO MUTANTES NEGATIVOS DOMINANTES
215
Em uma modalidade da invenção, as proteínas associadas à ·· · · ··· · · · ··· · telomerase são usadas como moduladores de atiVíd^dê-idâ' t$lQrtiçrâ£fc.:As * · ·· · ··· ··· ··· · · proteínas associadas à telomerase incluem estruturas cromossômicas, tais como histonas, proteínas de matriz nuclear, divisão celular e proteínas de 5 controle do ciclo celular, e outras. Outras proteínas associadas à telomerase, que podem ser usadas como moduladores para a finalidade da invenção, incluem as proteínas p80 e p95 e seus homólogos humanos, tais como TP1 e TRF-1 (Chong, 1995, Science 270: 1663-1667). Além disso, os fragmentos destas proteínas associadas à telomerase podem ser identificadas pelo técnico 10 experimentado, de acordo com os processos da invenção e usados como moduladores de atividade da telomerase.
8) MUTANTES NEGATIVOS DOMINANTES.
Oito motivos altamente conservados foram identificados entre
TRTs de diferentes espécies não humanas, como descrito acima (ver, 15 também, Lingner (1997) Science 276: 561-567_. A Figura 4 mostra um esquema da sequência de aminoácidos da TRT humana (de pGRN121) e motivos RT, em comparação com Trtlp de S. pombe, pl23 de Euplotes e Est2p de S. cerevisiae. A presente invenção provê ácidos nucleicos recombinantes e sintéticos, em que os códons para os resíduos de 20 aminoácidos conservados em cada, sozinhos ou em conjunção com um ou mais códons adicionais, de todos os oitos destes motivos, foram modificados para cada um dos outros códons. Uma variedade das sequências de codificação resultantes expressam uma hTRT não funcional. Ver, por exemplo, o Exemplo 16. Assim, a presente invenção provê, por exemplo, 25 uma ampla variedade de enzimas de telomerase “transformadas” e proteínas de TRT que têm uma atividade parcial, mas não atividade completa de telomerase. Por exemplo, um tal telomerase é capaz de ligar estruturas teloméricas, mas não ligam RNA associado à telomerase (isto é, hTR). Se expresso em níveis bastante elevados, um tal mutante de telomerase pode
216 exaurir um componente necessário de telomerase (por exemplo, hTR) e dessa ·· · · ··· · · · ··· · forma funcionar como um inibidor da atividade da Jélcím*etasê*iip’o:selvagbtn.
• · ·· · ··· ··· ··· · · Uma telomerase transformada, agindo desta maneira, é um antagonista ou um assim chamado mutante “negativo dominante”.
9) ANTICORPOS
Em geral, os anticorpos da invenção podem ser usados para identificar, purificar ou inibir qualquer ou toda atividade da enzima de telomerase e proteína de hTRT. Os anticorpos podem atuar como antagonistas da atividade de telomerase por uma variedade de meios, por 10 exemplo evitando que o complexo de telomerase ou o nucleotídeo se ligue a seus substratos de DNA, evitando que os componentes da telomerase formem um complexo ativo, mantendo uma estrutura quaternária funcional (complexo de telomerase) ou ligando-se a um dos sítios ativos da enzima ou outros sítios que tenham efeitos alostéricos em atividade (as diferentes 15 atividades parciais da telomerase são descritas em detalhes em outra parte deste relatório descritivo).
D) SÍNTESE DOS MODULADORES
Considera-se que os moduladores de telomerase da invenção sejam produzidos usando-se processos bem conhecidos na ciência 20 farmacêutica, incluindo os processos combinatórios e as técnicas racionais de planejamento de medicamentos.
1) METODOLOGIA DA QUÍMICA COMBINATÓRIA
A criação e triagem simultânea de grandes coleções de moléculas sintéticas podem ser realizadas usando-se técnicas bem conhecidas 25 da química combinatória, por exemplo, ver Van Breemen (1997) Anal Chem 69: 2159-2164; Lam Anticancer Drug Des 12: 145-167 (1997).
Como observado acima, a metodologia da química combinatória pode ser usada para criar vastos números de oligonucleotídeos (ou outros compostos), que podem ser rapidamente examinados quanto a
217 oligonucleotídeos específicos (ou compostos) que tenham afinidades de ·· · ····· · ····· ligação apropriadas e especificidades em direção a È|üa3qúêK alvo,€ai-tômb.:as proteínas de TRT da invenção (para informação geral de base, Gold (1995) J. ofBiol. Chem. 270: 13581-13584).
2) PLANEJAMENTO RACIONAL DE MEDICAMENTOS
O planejamento racional de medicamentos envolve um conjunto integrado de metodologias, que inclui a análise estrutural de moléculas alvo, químicas sintéticas e ferramentas computacionais avançadas. Quando usados os moduladores de planejamento, tais como 10 antagonistas/inibidores dos alvos proteínicos, tais como a enzima de telomerase e a proteína de hTRT, o objetivo do planejamento racional de medicamentos deve entender uma conformação tridimensional da molécula e química. O planejamento racional de medicamentos é auxiliado por dados cristalográficos de raio-X ou dados de RMN, que podem agora ser 15 determinados para a proteína de hTRT e a enzima de telomerase, de acordo com os processos e usando os reagentes providos pela invenção. Os cálculos sobre a eletrostática, as hidrofobicidades e a acessibilidade do solvente, são também de ajuda. Ver, por exemplo, Coldren (1997), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94: 6635-6640.
E)KITS
A invenção também provê kits que podem ser usados para auxiliar em determinar se um composto de teste é um modulador de uma atividade de TRT. O kit tipicamente incluirá um ou mais dos seguintes componentes: um polipeptídeo ou polinucleotídeo de TRT substancialmente 25 purificado (incluindo sondas e iniciadores); um plasmídeo capaz de expressar uma TRT (por exemplo, hTRT), quando introduzido em uma célula ou sistema de expressão livre de células; um plasmídeo capaz de expressar uma TR (por exemplo, hTR), quando introduzido em uma célula ou sistema de expressão livre de células; células ou linhagens celulares; uma composição
218
Λλ!>
para detectar uma troca na atividade da TRT; e um material instrutivo ·· · · · ·· · · · ···· • · · · · · ·· · · · · · · ensinando um meio para detectar e medir uma mèdifícàçãô ré. atiyi’d^^é*ile
TRT, indicando que uma modificação na atividade da telomerase na presença do composto de teste é um indicador de que o composto de teste modula a atividade de telomerase, e um ou mais recipientes. O kit também pode incluir meios tais como os reagentes do ensaio TRAP ou reagentes para um ensaio de reação em cadeia de polimerase quantitativa, para medir uma modificação na atividade de TRT. O kit pode também incluir material instrutivo ensinando um meio para se detectar e medir uma modificação na atividade de TRT, indicando que uma mudança na atividade da telomerase na presença do composto de teste, é um indicador de que o composto de teste modula a atividade de telomerase.
XI. ORGANISMOS TRANSGÊNICOS (CÉLULAS DE KNOCKOUT DA TELOMERASE E MODELOS DE ANIMAIS
A invenção também provê organismos multicelulares transgênicos não humanos (por exemplo, plantas e animais não humanos) ou organismos unicelulares (por exemplo, levedura), compreendendo uma sequência exógena de gene de TRT, que pode ser uma sequência de codificação ou uma sequência regulatória (por exemplo, promotora). Em uma modalidade, o organismo expressa um polipeptídeo exógeno de TRT, tendo uma sequência de uma proteína de TRT humana. Em uma modalidade relacionada, o organismo também expressa um componente de RNA de telomerase (por exemplo, hTR).
A invenção também provê organismos unicelulares e multicelulares (ou células deles), em que pelo menos um gene codificando um componente de telomerase (por exemplo, TRT ou TR) ou proteína associada à telomerase, é transformada ou deletada (isto é, em uma região de codificação ou regulatória), de tal modo que a telomerase nativa não seja expressa, ou seja expressa em níveis reduzidos ou com atividades diferentes
219 quando comparadas às células ou organismos tipo selvagem. Tais células e ·*· · *· ··· · · · ··♦ · organismos são frequentemente referidos como ®êliàa^:Qü (jrgtíntórifçá-jde • * ·· · ··· ··· ·*· · · “knockout de gene”.
A invenção ainda provê células e organismos em que um gene 5 endógeno de telomerase (por exemplo, TRT de murinos) está, ou presente ou opcionalmente transformado ou deletado, e um gene exógeno de telomerase ou variante (por exemplo, TRT humano) está introduzido e expresso. As células e organismos deste tipo serão úteis, por exemplo, como sistemas modelo para identificar moduladores de atividade ou expressão de hTRT;
determinar os efeitos de mutações em genes componentes da telomerase, e outros usos, tais como determinar regulação do ritmo desenvolvente e locação do tecido da atividade da telomerase (por exemplo, avaliando-se quando administrar um modulador de telomerase e para avaliar quaisquer efeitos colaterais potenciais).
Exemplos de organismos multicelulares incluem as plantas, os insetos e animais não humanos, tais como camundongos, ratos, coelhos, macacos, símios, porcos e outros animais não humanos. Um exemplo de um organismo unicelular é uma levedura.
Processos para alteração ou rompimento de genes específicos 20 (por exemplo, genes endógenos de TRT) são bem conhecidos daquelas pessoas experientes; ver, por exemplo, Baudin et al., 1993, Nucl. Acids Res. 21: 3329; Wach et al., 1994, Yeast 10: 1793; Rothstein, 1991, Methods Enzymol. 194: 281; Anderson, 1995, Methods Cell Biol. 48: 31; Pettitt et al., 1996, Development 122: 4149-4157; Ramirez-Solis et al., 1993, Methods 25 Enzymol. 225: 855; e Thomas et al., 1987, Cell 51: 503, cada um dos quais é aqui incorporado por referência em sua totalidade, para todos os propósitos.
As células de “knockout” e animais da invenção incluem células e animais em que uma ou várias unidades do complexo de enzima endógena de telomerase tenham sido deletadas ou inibidas. A reconstituição
220
JobÓ da atividade da telomerase salvará a célula ou o animal da senescência ou, ··* · · ··· | · · ··· · quanto às células cancerígenas, da morte das células* pbr^^Hiicq^^dhdê.de • · ·· · ··· ··· *·· « * manter telômeros. Processos de alteração da expressão de genes endógenos são bem conhecidos daqueles de experiência na técnica. Tipicamente, tais processos envolvem a alteração ou a substituição de todas, ou de uma porção, das sequências regulatórias que controlam a expressão do gene particular a ser regulado. As sequências regulatórias, por exemplo o promotor nativo, podem ser alteradas. A técnica convencional para a mutação alvejada de genes envolve a colocação de um fragmento de DNA genômico contendo o 10 gene de interesse em um vetor, seguido por clonagem dos dois braços genômicos associados com o gene alvejado ao redor de um cassete selecionável de resistência à neomicina em um vetor contendo timidina cinase. Esta construção de “knockout” é então transfectada na célula hospedeira apropriada, isto é, uma célula-tronco (ES) embriônica de 15 camundongo, que é subsequentemente submetida a seleção positiva (usandose G418, por exemplo, para selecionar quanto à resistência à neomicina) e seleção negativa (usando, por exemplo, FIAU, para excluir as células carentes de timidina cinase), permitindo a seleção de células que tenham sofrido recombinação homóloga com o vetor de knockout. Esta abordagem 20 conduz à inativação do gene de interesse. Ver, por exemplo, as Patentes U.S.
5.464.764, 5.631.153, 5,487.992 e 5.627.059.
A expressão de “knockout” de um gene endógeno também pode ser realizada pelo uso de recombinação homóloga para introduzir um ácido nucleico heterólogo nas sequências regulatórias (por exemplo, 25 promotor) do gene de interesse. Para evitar a expressão de enzima ou produto funcional, mutações simples que, ou alteram a estrutura de leitura, ou rompem o promotor, podem ser adequadas. Para regular ascendentemente a expressão, um promotor nativo pode ser substituído por um promotor heterólogo, que induz a níveis mais elevados de transcrição. Igualmente, a
221 “inserção de retenção de gene” pode ser usada para romper um gene ·*· * *· ·*· · · ·♦· * hospedeiro, e células ES de camundongos podem sfcf ijtiik^duspafaprôdúzir • · ·· · ··· ··· ··· · · animais transgênicos de knockout, como descrito, por exemplo, em Holzschu (1997) Transgenic Res 6: 97-106.
A alteração da expressão de genes endógenos por recombinação homóloga também pode ser efetuada usando-se sequências de ácido nucleico, que contenham o gene estrutural em questão. As sequências de montante são utilizadas para alvejar construções heterólogas de recombinação. Utilizando a informação da sequência do gene estrutural de 10 TRT, tal como a SEQUÊNCIA ID NO: 1, uma pessoa experiente na técnica pode criar construções homólogas de recombinação com apenas a experimentação de rotina. A recombinação homóloga para alterar a expressão de genes endógenos é descrita nas Patentes U.S. 5.272.071 e WO 91/09955, WO 93/09222, WO 96/29411, WO 95/31560 e WO 91/12650. A 15 recombinação homóloga em micobactérias é descrita por Azad (1996) Proc.
Natl. Acad. Sei. USA 93: 4787; Baulard (1996) J. Bacteriol. 178: 3091; e Pelicic (1996) Mol. Microbiol. 20: 919. A recombinação homóloga em animais foi descrita por Moynahan (1996) Hum. Mol. Genet. 5: 875, e em plantas, por Offringa (1990) EMBO J. 9: 3077.
XII. GLOSSÁRIO
Os seguintes termos são definidos abaixo para prover orientação adicional a uma pessoa de experiência na prática da invenção: adjuvante, alelo (e sequência alélica), aminoácidos (incluindo os hidrofóbicos, polares, carregados), substituição conservativa, elementos de 25 controle (e sequências regulatórias), derivado, rótulo detectável, nível elevado, epítopo, prognóstico favorável e desfavorável, proteína de fusão, produto de gene, hTR, imortal, imunógeno e imunogênico, isolado, modulador, motivo, ácido nucleico (e polinucleotídeo), oligonucleotídeos (e oligômeros), operavelmente ligado, polipeptídeo, sonda (incluindo sondas de
222
À27 ácido nucleico e sondas de anticorpos), recombinante, sistema de seleção, ·*· · ·* ·*· ·! ·* «·* ·** · sequência, ligação específica, condições estringpnt^s :4s’*fifbriêiizâçãa.j(e • · ·· · ··· ··· ··· · · estringência), identidade substancial (e similaridade substancial), substancialmente puro (e substancialmente purificado), células negativas de telomerase e positivas de telomerase, atividade catalítica de telomerase, relacionado à telomerase, e composto de teste.
Como aqui empregado, o termo “adjuvante” se refere a seu significado comum de qualquer substância que acentue a resposta imune a um antigeno, com o qual esteja misturada. Os adjuvantes úteis na presente 10 invenção incluem, mas a estes não se limitam, os géis minerais de Freund, tais como o hidróxido de alumínio, e substâncias tensoativas, tais como lisolecitina, polióis plurônicos, poliânions, peptídeos, emulsões oleosas, hemocianina de moluscos lapa de buraco de fechadura, e dinitrofenol. O BCG (Bacillus de Calmette-Guerin) e o Corynebacterium parvum são 15 adjuvantes potencialmente úteis.
Como aqui empregados, os termos “alelo” ou “sequência alélica” se referem a uma forma alternativa de uma sequência de ácido nucleico (isto é, um ácido nucleico codificando proteína de hTRT). Os alelos resultam de mutações (isto é, modificações na sequência de ácido nucleico), e 20 geralmente produzem mRNAs ou polipeptídeos alterados e/ou diferentemente regulados, cuja estrutura e/ou função podem ou não ser alteradas. Modificações mutacionais comuns que fazem surgir alelos são geralmente referidas como deleções, adições ou substituições naturais de nucleotídeos, que podem ou não afetar os aminoácidos codificados. Cada um 25 destes tipos de modificações pode ocorrer sozinho, em combinação com os outros, ou uma ou mais vezes dentro de um dado gene, cromossoma ou outro ácido nucleico celular. Qualquer gene dado pode ter nenhuma, uma ou muitas formas alélicas. Como aqui empregado, o termo “alelo” se refere a um ou a ambos dentre um gene ou um mRNA transcrito do gene.
223
Como aqui empregado, “aminoácidos” são algumas vezes ·*· · ·*· **· · · · ··· ♦ especificados usando-se o código padrão de uma fétrfc: :41jâmÍia^Aí jS^iiJia • · ·· · ··· ··· ··· · · (S) , Treonina (T), Ácido aspártico (D), Ácido glutâmico (E), Asparagina (N), Glutamina (Q), Arginina (R), Lisina (K), Isoleucina (I), Leucina (L),
Metionina (M), Valina (V), Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W), Prolina (P), Glicina (G), Histidina (H), Cisteína (C). Os análogos de aminoácidos sintéticos e de ocorrência não natural (e/ou ligações peptídicas) estão incluídos.
Como aqui empregados, “aminoácidos hidrofóbicos” se 10 referem a A, L, I, V, P, F, W e M. Como aqui empregados, “aminoácidos polares” se referem a G, S, T, Y, C, N e Q. Como aqui empregados, “aminoácidos carregados” se referem a D, E, Η, K e R.
Como aqui empregado, “substituição conservativa”, quando descrevendo uma proteína, se refere a uma modificação na composição do 15 aminoácido da proteína que não altera substancialmente a atividade da proteína. Assim, “variações conservativamente modificadas” de uma sequência particular de aminoácidos, se refere a substituições de aminoácidos daqueles aminoácidos que não são críticos para a atividade da proteína ou substituição de aminoácidos por outros aminoácidos tendo propriedades 20 semelhantes (por exemplo, ácidas, básicas, positiva ou negativamente carregadas, polares ou não polares, etc.), de tal modo que as substituições de quaisquer aminoácidos críticos não alteram substancialmente a atividade. Tabelas de substituições conservativas, fornecendo aminoácidos fimcionalmente semelhantes, são bem conhecidas na técnica. Os seguintes 25 seis grupos contêm, cada um, aminoácidos que são substituições conservativas de um para com o outro: 1) Alanina (A), Serina (S), Treonina (T) ; 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutâmico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V) e 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano
224 (W) (ver também Creighton (1984) Proteins, W. H. Freeman and Company).
·· · · ··· · · · ··· <t
Uma pessoa de experiência na técnica observará 4de:a£*Íubsiituit(Ms?4ci#ia identificadas não são apenas substituições conservativas possíveis. Por exemplo, pode-se considerar todos os aminoácidos carregados como substituições conservativas entre si, quer eles sejam positivos quer negativos. Além disso, substituições, deleções ou adições individuais que alterem, adicionem ou deletem um aminoácido único ou um pequeno percentual de aminoácidos em uma sequência codificada, também podem ser “variações conservativamente modificadas”. Pode-se também produzir uma “substituição conservativa” em uma proteína recombinante, utilizando-se um ou mais códons que difiram dos códons empregados pelo gene tipo nativo ou selvagem. Neste exemplo, uma substituição conservativa também inclui a substituição de um aminoácido por um códon, com um códon diferente para o mesmo aminoácido.
Como aqui usado, “elementos de controle” ou “sequências regulatórias” incluem intensificadores, promotores, terminadores de transcrição, origens de replicação, sequências de integração cromossômica, regiões não transladadas 5’ e 3’, com os quais as proteínas ou outras biomoléculas interagem para realizar a transcrição e a translação. Quanto às 20 células eucarióticas, as sequências de controle incluirão um promotor e, preferivelmente, um intensificador, por exemplo derivado dos genes de imunoglobulina, SV40, citomegalovírus e uma sequência de poliadenilação, e podem incluir sequências de união doadoras e aceptoras. Dependendo do sistema de vetores e do hospedeiro utilizado, qualquer número de elementos 25 adequados de transcrição e de translação, incluindo promotores constitutivos e indutíveis, podem ser usados.
Como aqui empregado, um polinucleotídeo, oligonucleotídeo ou ácido nucleico “derivado” se refere a oligo- e polinucleotídeos, que compreendem um substituinte derivado. Em algumas modalidades, o
225
substituinte é substancialmente não interferente com respeito à hibridização a polinucleotídeos complementares. Os oligo- ou pfolniu&htftí&QS1 çtérfoatlps • · ·· · ··· ··· ··· · · que tenham sido modificados com substituintes químicos anexados (por exemplo, por modificação de um oligo- ou polinucleotídeo já sintetizado, ou por incorporação de um análogo modificado de base ou de espinha dorsal durante a síntese), podem ser introduzidos em uma célula eucariótica metabolicamente ativa, para hibridizar-se com um DNA, RNA ou proteína de hTRT, onde eles produzem uma alteração ou modificação química a um
DNA, RNA ou proteína locais. Altemativamente, os oligo- ou polinucleotídeos derivados podem interagir e alterar os polipeptídeos de hTRT, as proteínas associadas à telomerase, ou outros fatores que interajam com o DNA de hTRT ou produtos de gene de hTRT, ou alterem ou modulem a expressão ou função de DNA, RNA ou proteína de hTRT. Substituintes químicos ligados ilustrativos incluem: európio (III) texafirina, agentes de reticulação, psoralém, quelatos metálicos (por exemplo, quelato de ferro/EDTA para divagem catalisada do ferro), topoisomerases, endonucleases, exonucleases, ligases, fosfodiesterases, porfirinas fotodinâmicas, medicamentos quimioterapêuticos (por exemplo, adriamicina, doxirrubicina), agentes de intercalação, agentes de modificação de base, 20 cadeias de imunoglobulina, e oligonucleotídeos. Quelatos de Ferro/EDTA são substituintes químicos frequentemente usados, onde a divagem local de uma sequência de polinucleotídeos é desejada (Hertzberg et al., 1982, J. Am. Chem. Soc. 104: 313; Hertzberg e Dervan, 1984, Biochemistry 23: 3934; Taylor et al., 1984, Tetrahedron 40: 457; Dervan, 1986, Science 232: 464. As 25 químicas ilustrativas de ligação incluem: articulação direta, por exemplo, através de um grupo amino reativo apenso (Corey and Schultz (1988) Science 238: 1401, que é aqui incorporada por referência) e outras químicas de articulação direta, não obstante os processos de articulação de estreptavidina/biotina e digoxigenina/anticorpo anti-digoxigenina também
226
2ΛΔ possam ser empregados. Processos para ligar substituintes químicos são fornecidos nas Patentes U.S. 5.135.720, 5.093.245 h:5Í054-^6j que^ãp.âqjii • · ·· · ··· ··· ··· · » incorporadas por referência. Outras químicas de articulação podem ser usadas, à discrição do médico atendente.
Como aqui usado, um “rótulo detectável” tem o significado comum na técnica e se refere a um átomo (por exemplo, radionuclídeo), molécula (por exemplo, fluoresceína) ou complexo, que é ou pode ser usado para detectar (por exemplo, devido a uma propriedade física ou química), indicar a presença de uma molécula ou para permitir a ligação de outra 10 molécula, à qual ele está covalentemente ligado ou de outra forma associado.
O termo “rótulo” também se refere a moléculas covalentemente ligadas ou de outra forma associadas (por exemplo, uma biomolécula, tal como uma enzima), que atue sobre um substrato para produzir um átomo, molécula ou complexo detectável. Rótulos detectáveis adequados para uso na presente 15 invenção incluem qualquer composição detectável por meios de espetroscopia, fotoquímica, bioquímica, imunoquímica, elétricos, óticos ou químicos. Rótulos utilizáveis na presente invenção incluem a biotina para manchamento com o conjugado de estreptavidina rotulada, contas magnéticas (por exemplo, Dynabeads®), corantes fluorescentes [por exemplo, 20 fluoresceína, vermelho do Texas, rodamina, proteína fluorescente verde, proteína fluorescente verde acentuado, lissamina, ficoeritrina, Cy2, Cy3, Cy3,5, Cy5, Cy5,5, Cy7, FluorX (Amersham), SyBR Green I e II (Sondas Moleculares), e outros], radiorrótulos (por exemplo, 3H, 1251, 35S, ,4C ou 32P), enzimas (por exemplo hidrolases, particularmente fosfatases, tais como 25 fosfatase alcalina, estearases e glicosidases, ou oxidorredutases, particularmente peroxidases, tais como a peroxidase da raiz forte, e outras comumente usadas nos ELISAs), substratos, cofatores, inibidores, grupos quimioluminescentes, agentes cromogênicos e rótulos colorimétricos, tais como ouro coloidal ou contas de vidro ou de plástico coloridos (por exemplo,
227 poliestireno, polipropileno, látex etc.). As patentes que apresentam o uso de tais rótulos incluem a Patente U.S. 3.817.833,3.SáO»75’Í, • ♦ ·· · ··♦ ··· ·»· · · 3.996.345, 4.277.437, 4.275.149 e 4.366.241. Meios de detecção de tais rótulos são bem conhecidos daqueles de experiência na técnica. Assim, por exemplo, os radiorrótulos e os rótulos quimioluminescentes podem ser detectados usando-se filme fotográfico ou contadores de cintilação, marcadores fluorescentes podem ser detectados usando-se um fotodetector para detectar a luz emitida (por exemplo, como nas espécies de células ativadas por fluorescência). Os rótulos enzimáticos são tipicamente detectados provendo-se a enzima com um substrato e detectando-se o produto da reação produzido pela ação da enzima sobre o substrato, e os rótulos colorimétricos são detectados simplesmente visualizando-se a rótulo colorido. Assim, um rótulo é qualquer composição detectável por meios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, imunoquímicos, elétricos, óticos ou químicos. O rótulo pode ser acoplado direta ou indiretamente ao componente desejado do ensaio, de acordo com processos bem conhecidos na técnica. Rótulos não radioativos são frequentemente ligados por meios indiretos. Geralmente, uma molécula de ligando (por exemplo, biotina) é covalentemente ligada à molécula. O ligando então se liga a uma molécula anti-ligando (por exemplo, estreptavidina), que é, ou inerentemente detectável ou covalentemente ligada, a um sistema de geração de sinal, tal como uma enzima detectável, um composto fluorescente ou um composto quimioluminescente. Vários ligandos e anti-ligandos podem ser usados. Quando um ligando tiver um anti-ligando natural, por exemplo biotina, tiroxina e cortisol, ele pode ser usado em conjunção com os anti-ligandos rotulados de ocorrência natural. Altemativamente, qualquer composto haptênico ou antigênico pode ser usado em combinação com um anticorpo. As moléculas também podem ser conjugadas diretamente a compostos de geração de sinal, por exemplo, por conjugação com uma enzima ou
228 fluoróforo. Meios de detecção de rótulos são bem conhecidos daqueles de experiência na técnica. Assim, por exemplo, quanjdõ b rótulo ·fqr’ uihlfphflo radioativo, o meio para detecção inclui um contador de cintilação, um filme fotográfico como na auto-radiografia, ou imageamento de fósforo de armazenamento. Quando o rótulo for um rótulo fluorescente, ele pode ser detectado por excitação do fluorocromo com a apropriado comprimento de onda, e detectando-se a fluorescência resultante. A fluorescência pode ser detectada visualmente, por meio de filme fotográfico, pelo uso de detectores eletrônicos, tais como os dispositivos de carga acoplados (CCDs) ou fotomultiplicadores e outros. De forma semelhante, os rótulos enzimáticos podem ser detectados provendo-se substratos apropriados para a enzima, e detectando-se o produto de reação resultante. Igualmente, rótulos colorimétricos simples podem ser detectados pela observação da cor associada com o rótulo. Observar-se-á que, quando pares de fluoróforos são usados em um ensaio, é frequentemente preferível que eles tenham padrões (comprimentos de onda) de emissão distintos, de modo que eles possam ser facilmente distinguidos.
A expressão “nível elevado” se refere a uma quantidade de produto de gene de hTRT (ou outra substância ou atividade especificadas) em uma célula, que é maior do que o nível em um padrão de referência, por exemplo, para diagnóstico, o nível em células negativas de telomerase normais em um indivíduo ou em outros indivíduos não sofrendo da condição, e para prognóstico, o nível em células tumorais de uma variedade de graduações ou classes de, por exemplo, tumores.
Como aqui empregado, o termo “epítopo” tem seu significado comum de um sítio em um antígeno reconhecido por um anticorpo. Os epítopos são tipicamente segmentos de aminoácidos que são uma pequena porção de toda a proteína. Os epítopos podem ser conformacionais (isto é, descontínuos). Isto é, eles podem ser formados de aminoácidos codificados
229 por partes não contíguas de uma sequência primária que tenha sido justaposta
4 » » » por reduplicação proteínica. r’ * *·· f
As expressões “prognóstico favorável” e “prognóstico desfavorável “ são conhecidas na técnica. No contexto de cânceres, “prognóstico favorável” significa que existe uma probabilidade de regressão tumoral ou tempo de sobrevivência mais longo para os pacientes com um prognóstico favorável em relação àqueles com prognóstico desfavorável, enquanto “prognóstico desfavorável” significa que ser provável que o tumor seja mais agressivo, isto é, cresça mais rápido e/ou metastatize, resultando em um mau efeito ou em um curso mais rápido de progressão da doença para o paciente.
Como aqui usado, a expressão “proteína de fusão” se refere a uma proteína compósito, isto é, uma sequência única de aminoácido contíguo, composta de dois (ou mais) polipeptídeos heterólogos distintos, que não são normalmente fundidos juntos em uma única sequência de aminoácidos. Assim, uma proteína de fusão pode incluir uma sequência de aminoácidos única, que contenha duas sequências de aminoácido inteiramente distintas, ou duas sequências de polipeptídeos similares ou idênticas, contanto que estas sequências não sejam normalmente encontradas juntas na mesma configuração em uma única sequência de aminoácidos encontrada na natureza. As proteínas de fusão podem, em geral, ser preparadas usando-se ou processos de ácidos nucleicos recombinantes, isto é, como resultado de transcrição e translação de um produto de fusão de genes recombinantes, cuja fusão compreenda um segmento codificando um polipeptídeo da invenção e um segmento codificando uma proteína heteróloga, ou por processos de síntese química bem conhecidos na técnica. A(s) região(ões) de não-hTRT da proteína de fusão pode(m) ser fundida(s) ao término amino do polipeptídeo de hTRT ou ao término carboxila, ou a ambos, ou a região de não-hTRT pode ser inserida no interior da sequência
230
J-bó proteínica (mediante inserção da porção ou por aminoácidos de substituição), ou combinações dos acima podem ser realizadas. :·’ $ M f ‘'« ?*. s.í * « · *·· ··· «·* % 4
Como aqui empregada, a expressão “produto de gene” , se refere a uma molécula de RNA transcrita de um gene, ou a uma proteína codificada pelo gene ou transladada do RNA.
Como aqui empregado, “hTR” (RNA de telomerase humana) se refere ao componente RNA de telomerase humana e quaisquer alelos e variantes de ocorrência natural, ou variantes recombinantes. O hTR é descrito em detalhes na Patente U.S. 5.583.016, que fica aqui incorporada por 10 referência em sua totalidade e para todas as finalidades.
Como aqui usado, o termo “imortal”, quando se referir a uma célula, tem sua conotação normal na técnica de telomerase, e se refere a células que têm aparentemente potencial replicativo ilimitado. Imortal pode também referir-se a células com capacidade proliferativa aumentada em 15 relação a suas contrapartes não modificadas. Exemplos de células humanas imortais são as células de tumores malignos, células de linhagens germinativas e certas linhagens de células humanas transformadas cultivadas in vitro (por exemplo, células que tenham se tomado imortais em seguida à transformação por oncogenes virais ou de outra forma). Ao contrário, as 20 células somáticas humanas mais normais são mortais, isto é, têm potencial replicativo limitado e se tomam senescentes após um número finito de divisões celulares.
Como aqui empregados, os termos, “imunógeno” e “imunogênico” têm seu significado comum na técnica, isto é, um imunógeno 25 é uma molécula, tal como uma proteína ou outro antígeno, que pode eliciar uma resposta imune adaptável após injeção em uma pessoa ou em um animal.
Como aqui usado, “isolado”, quando referir-se a uma molécula ou composição, tal como, por exemplo, um RNP (por exemplo, pelo menos uma proteína e pelo menos um RNA), significa que a molécula
231 ou composição são separadas de pelo menos um outro composto, tal como
associada in vivo ou em seu estado de ocorrência natural. Assim, um RNP é considerado isolado quando o RNP tenha sido isolado de qualquer outro 5 componente com que esteja associado, por exemplo membrana celular, como em um extrato celular. Uma composição isolada também pode, entretanto, ser substancialmente pura.
Como aqui usado, “modulador” se refere a qualquer composto ou composição sintética ou natural, que possa modificar-se de qualquer 10 forma, ou tanto a “completa” quanto qualquer “atividade parcial” de uma transcriptase reversa de telomerase. Um modulador pode ser um agonista ou um antagonista. Um modulador pode ser qualquer composto orgânico e inorgânico, incluindo, mas não se limitando a estes, por exemplo, moléculas pequenas, peptídeos, proteínas, açúcares, ácidos nucleicos, ácido graxos e 15 outros.
Como aqui empregado, “motivo” se refere a uma sequência de aminoácidos contíguos (ou a uma sequência de ácido nucleicos, que codifica uma sequência de aminoácidos contíguos), que define um aspecto ou estrutura em uma proteína que seja comum a, ou conservada em, todas as 20 proteínas de uma classe ou tipo definidos. O motivo ou sequência de consenso pode incluir tanto resíduos conservados quanto não conservados. Os resíduos conservados na sequência de motivo indicam que o resíduo ou classe conservada (isto é, hidrofóbicos, polares, não polares, ou outra classe) de resíduos está tipicamente presente no locação indicada em cada proteína 25 (ou gene ou mRNA) da classe de proteínas definida pelo motivo. Os motivos podem diferir de acordo com a classe de proteínas. Assim, por exemplo, as enzimas de transcriptase reversa formam uma classe de proteínas que podem ser definidas por um ou mais motivos, e esta classe inclui as enzimas de telomerase. No entanto, as enzimas de telomerase também podem ser
232 definidas como a classe de enzimas com motivos característicos para aquela classe. Aqueles de experiência reconhecem que a iden$fieáeSo 3de*CiiXi^sWo A x x · ♦ ·· · ··· ··· ··· · · como um resíduo conservado em um motivo, não significa que cada membro da classe definida pelo motivo tenha o resíduo indicado (ou classe de resíduos) na posição indicada, e que um ou mais membros da classe podem ter um resíduo diferente na posição conservada.
Como aqui empregados, os termos “ácido nucleico” e “polinucleotídeo” são usados intercambiavelmente. O uso do termo “polinucleotídeo” não pretende excluir os oligonucleotídeos (isto é, polinucleotídeos curtos) e também pode referir-se a ácidos nucléicos sintéticos e/ou de ocorrência natural (isto é, compreender análogos de ácido nucleico ou resíduos ou articulações de espinha dorsal).
Como aqui usados “oligonucleotídeos” ou “oligômeros” se referem a uma sequência de ácido nucleico de aproximadamente 7 nucleotídeos ou maior, e tanto quanto aproximadamente 100 nucleotídeos, que pode ser usada como um iniciador, sonda ou amplímero. Os oligonucleotídeos são frequentemente entre cerca de 10 e cerca de 50 nucleotídeos de comprimento, mais frequentemente entre cerca de 14 e cerca de 35 nucleotídeos, muito frequentemente entre cerca de 15 e cerca de 25 nucleotídeos, e os termos oligonucleotídeos ou oligômeros também podem referir-se a ácidos nucléicos sintéticos e/ou de ocorrência não natural (isto é, compreendendo análogos de ácido nucleico ou resíduos ou articulações de espinha dorsal modificados).
Como aqui usada, a expressão “operavelmente ligado” se refere a um relacionamento funcional entre dois ou mais segmentos de ácidos nucléicos (por exemplo, DNA): por exemplo, um promotor ou intensificador é operavelmente ligado a uma sequência de codificação, se ele estimular a transcrição da sequência em uma célula hospedeira apropriada ou outro sistema de expressão. Geralmente, as sequências que são operavelmente
233 ligadas são contíguas, e no caso de uma sequência de sinal, tanto contígua ·· · ····· · ····* quanto na fase de leitura. No entanto, os mtensific^dbr^s:iÍ^ô’npcpS^tait} sqr • · ·· · ··· ··· ··· · · locados em proximidade íntima às sequências de codificação, cuja transcrição eles acentuam.
Como aqui usado, o termo “polipeptídeo” é aqui usado intercambiavelmente com o termo “proteína”, e se refere a um polímero composto de resíduos de aminoácido ligado por articulações de amida, incluindo seus análogos sintéticos, de ocorrência natural e de ocorrência não natural (aminoácidos e articulações). Peptídeos são exemplos de polipeptídeos.
Como aqui empregado, uma “sonda” se refere a uma molécula que especificamente liga outra molécula. Um exemplo de uma sonda é uma “sonda de ácido nucleico”, que especifícamente liga (isto é, tempera ou hibridiza) a um ácido nucleico substancialmente complementar. Outro exemplo de uma sonda é uma “sonda de anticorpo” que especificamente se liga a um antigeno ou epítopo correspondente.
Como aqui usado, “recombinante” se refere a um polinucleotídeo sintetizado ou de outra forma manipulado in vitro (por exemplo, “polinucleotídeo recombinante”), a processos de uso de polinucleotídeos recombinantes para produzir produtos de gene em células ou outros sistemas biológicos, ou a um polipeptídeo (“proteína recombinante”) codificado por um polinucleotídeo recombinante.
Como aqui usado, um “sistema de seleção”, no contexto de linhagens celulares estavelmente transformadas, se refere a um processo para identificar e/ou selecionar células contendo um ácido nucleico recombinante de interesse. Uma grande variedade de sistemas de seleção é conhecida para identificação de células transformadas e é adequada para uso com a presente invenção. Por exemplo, as células transformadas por plasmídeos ou outros vetores podem ser selecionados por resistência a antibióticos conferida por
234 genes contidos nos plasmídeos, tais como os bem conhecidos genes amp, gpt, ·· · · ··· · · ····· neo e hyg, ou outros genes como a timidina cinase d^v^irsjcioliêrpés’ ámples • · ·· · ··· ··· ··· · · [Wigler et al., Cell 11: 223-32 (1977)] e genes de adenina fosforribosiltransferase [Lowy et al., Cell 22: 817 (1980)], que podem ser empregados em células tk- ou aprt-, respectivamente. Igualmente, a resistência a antimetabólito, antibiótico ou herbicida pode ser usada como a base para a seleção; por exemplo, dhfr, que confere resistência a metotrexato e é também útil para a ampliação do gene [Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sei., 77: 3567 (1980)]; npt, que confere resistência aos aminoglicosídeos neomicina e G-418 [Colbere-Garapin et al., J. Mol. Biol., 150:1 (1981)] e ais ou pat, que conferem resistência a clorsulfuron e fosfinotricina acetiltransferase, respectivamente [Murry, em McGraw Hill Yearbook of Science and Technology, McGraw Hill, Nova Iorque, NY, pp 191-196, (1992)]. Foram descritos genes adicionais selecionáveis, por exemplo genes que conferem resistência à higromicina, trpB, que permite que as células utilizem incol no lugar de triptofano, ou hisD, que permite que as células utilizem histinol no lugar de histidina [Hartman e Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sei., 85: 8047 (1988)]. Recentemente, o uso de marcadores visíveis ganhou popularidade com marcadores tais como antocianinas, beta-glicuronidase e seu substrato, GUS, e luciferase e seu substrato, luciferina, sendo amplamente usados não apenas para identificar transformantes, mas também para quantificar a quantidade de expressão proteínica transiente ou estável atribuível a um sistema específico de vetor [Rhodes et al., Meth. Mol. Biol., 55: 121 (1995)]
Como aqui usada, a “sequência” de um gene (a menos que especificamente de outra forma estabelecido), ácido nucleico, proteína ou peptídeo, se refere à ordem de nucleotídeos, em qualquer ou em ambos os filamentos de uma molécula de DNA de duplo filamento, por exemplo a sequência de ambos os filamentos de codificação e seu complemento, ou de
235 uma molécula de ácido nucleico de filamento único, ou à ordem de ·· · ····· · ····· aminoácidos em um peptídeo ou proteína. p ’· M *: ^·: y • · ·· · ··· ··· ··· · ·
Como aqui usado, “ligação específica” se refere à capacidade de uma molécula, tipicamente um anticorpo ou polinucleotídeo, de fazer contato e associar-se com outra molécula específica, mesmo na presença de muitas outras diversas moléculas. Por exemplo, um polinucleotídeo de filamento único pode especificamente ligar-se a um polinucleotídeo de filamento único, que seja complementar na sequência, e um anticorpo especificamente se liga a (ou “é especificamente imunorreativo com”) seu antígeno correspondente.
Como aqui usado, “condições estringentes de hibridização” ou “estringência” se referem a condições em uma faixa de cerca de 5°C a cerca de 20°C ou 25°C abaixo da temperatura de fusão (Tm) da sequência alvo, e uma sonda com complementaridade exata ou quase exata com o alvo. Como aqui usada, a temperatura de fusão é a temperatura em que uma população de moléculas de ácido nucleico de filamento duplo se toma meio-dissociada em filamentos únicos. Processos para calcular a Tm de ácidos nucleicos são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Berger e Kimmel (1987) Methods in Enzymology, Vol. 152: Guide to Molecular Cloning Techniques, San Diego: Academic Press, Inc. e Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2- Edição, Vols. 1 a 3, Cold Spring Harbor Laboratory, doravante “Sambrook”), ambos aqui incorporados por referência). Como indicado por referências padrão, uma estimativa simples do valor da Tm pode ser calculada pela equação: Tm = 81,5 + 0,41 (%G + C), quando um ácido nucleico está em solução aquosa em NaCl 1 M [ver, por exemplo, Anderson e Young, Quantitative Filter Hybridization in Nucleic Acid Hybridization (1985)]. Outras referências incluem computações mais sofisticadas, que levam em conta as características estruturais, bem como de sequência, para o cálculo da Tm. A temperatura de fusão de um híbrido (e, assim, as condições
236 para a hibridização estringente) é afetada por vários fatores, tais como o ·· · · ··· · · · ··· · comprimento e a natureza (DNA, RNA, composiçãb: dê base) ‘Ja^sonüí^ ê.a • · ·· · ··· ··· ··· · · natureza do alvo (DNA, RNA, composição de base, presentes na solução ou imobilizados, e outros), e a concentração de sais e outros componentes (por exemplo, a presença ou ausência de formamida, sulfato de dextrano, polietileno glicol). Os efeitos destes fatores são bem conhecidos e são discutidos em referências padrão na técnica, por exemplo Sambrook, acima, e Ausubel et al, acima. Tipicamente, as condições estringentes de hibridização são concentrações de sal de menos do que cerca de 1,0 M de íons de sódio, tipicamente cerca de 0,01 a 1,0 M de íon de sódio a pH 7,0 a 8,3, e temperaturas de pelo menos cerca de 30°C para sondas curtas (por exemplo 10 a 50 nucleotídeos), e pelo menos cerca de 50°C para sondas longas (por exemplo, maiores do que 50 nucleotídeos). Como observado, condições estringentes podem também ser obtidas com a adição de agentes de desestabilização, tais como formamida, em cujo caso temperaturas inferiores podem ser empregadas.
Como aqui usado, as expressões “identidade substancial”, “identidade substancial de sequência” ou “similaridade substancial” no contexto de ácidos nucleico, se referem a uma medida da similaridade de sequência entre dois polinucleotídeos. A identidade substancial de sequência pode ser determinada por hibridização sob condições estringentes, por comparação direta, ou outros meios. Por exemplo, dois polinucleotídeos podem ser identificados como tendo identidade substancial de sequência, se eles foram capazes de especificamente hibridizar um ao outro sob condições estringentes de hibridização. Outros graus de identidade de sequência (jpor exemplo, menos do que “substancial”), podem ser caracterizados por hibridização sob diferentes condições de estringência. Alternativamente, a identidade substancial de sequência pode ser descrita como uma identidade percentual entre duas sequências de nucleotídeos (ou polipeptídeo). Duas
237
Am sequências são consideradas substancialmente idênticas quando elas são pelo ·· · ····· · ····· menos cerca de 60% idênticas, preferivelmente pálb cjerpâ • · ·· · ··· ··· ··· · · idênticas, ou pelo menos cerca de 80% idênticas, ou pelo menos cerca de 90% idênticas, ou pelo menos cerca de 95% ou 98% a 100% idênticas. A identidade percentual de sequência (nucleotídeo ou aminoácido) é tipicamente calculada determinando-se o alinhamento ótimo entre duas sequências, e comparando-se as duas sequências. Por exemplo, um transcrito exógeno usado para expressão proteínica pode ser descrito como tendo um certo percentual de identidade ou similaridade, em comparação com uma sequência de referência (por exemplo, a sequência endógena correspondente). O alinhamento ótimo de sequências pode ser conduzido usando-se o algoritmo de homologia local de Smith e Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482, pelo algoritmo do alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443, pela busca pelo processo de similaridade de Pearson e Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 2444, por implementações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), ou por inspeção. O melhor alinhamento (isto é, que resulta no mais elevado percentual de identidade) gerado pelos vários processos, é selecionado. Tipicamente, estes algoritmos comparam as duas sequências através de uma “janela de comparação” (usualmente pelo menos 18 nucleotídeos de comprimento) para identificar e comparar as regiões locais de similaridade de sequência, assim permitindo pequenas adições ou deleções (isto é, intervalos). As adições e deleções são tipicamente 20 por cento ou menos do comprimento da sequência, em relação à sequência de referência, que não inclui adições ou deleções. É desejável às vezes descrever a identidade de sequência entre duas sequências, com referência a um comprimento ou região particulares (por exemplo, duas sequências podem ser descritas como tendo pelo menos 95%
238
JH3 de identidade através de um comprimento de pelo menos 500 pares de base).
·· · · · ·· · · · ···· • · · ·· · ·· ····· ·
Usualmente, o comprimento será pelo menos de 50’ noOj:2DO^A6O?;*4D0:au 500 pares de base, aminoácidos ou outros resíduos. O percentual da identidade de sequência é calculado por comparação de duas sequências otimamente alinhadas através da região de comparação, determinando-se o número de posições em que a base idêntica de ácido nucleico (por exemplo, A, T, C, G ou U) ocorre em ambas as sequências, para produzir o número de posições unidas, e determinar o número (ou percentual) de posições unidas, em comparação com o número total de bases na sequência de referência ou região de comparação. Um algoritmo adicional que é adequado para determinar a similaridade da sequência é o algoritmo BLAST, que é descrito em Altschul (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410; e Shpaer (1996) Genomics 38: 179-191. O software para realizar as análises BLAST é publicamente disponível no National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo envolve primeiro a identificação os pares de sequência de elevada marcação (HSPs) mediante identificação de palavras curtas de comprimento W na sequência em questão que, ou une ou satisfaz alguma classificação T limiar avaliada como positiva, quando alinhada com uma palavra do mesmo comprimento em uma sequência de banco de dados. T é referido como o limiar da vizinhança da classificação da palavra (Altschul et al., acima). Estas recuperações iniciais da palavra na vizinhança atuam como sementes para iniciar as buscas para encontrar HSPs mais longos contendo-os. As recuperações da palavra são estendidas em ambas as direções ao longo de cada sequência até que a classificação do alinhamento cumulativo possa ser aumentada. A extensão das recuperações da palavra em cada direção é parada quando: a classificação cumulativa do alinhamento cai fora pela quantidade X de seu máximo valor obtido; a classificação cumulativa vai a zero ou abaixo, devido ao acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduos de classificação negativa; ou o final
239 de qualquer sequência é alcançado. Os parâmetros W, T e X do algoritmo ·· · · ··· · ♦ · «·· *
BLAST determinam a sensibilidade e velocidade · cfej :.p • ♦ ·♦ · ··· ··· ··· · · programa BLAST usa como parâmetros básicos um comprimento de palavra (W) de 11, a matriz de classificação BLOSUM62 [ver Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 10915-10919] alinhamentos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=-4, e uma comparação de ambos os filamentos. O termo BLAST se refere ao algoritmo, que realiza uma análise estatística da similaridade entre duas sequências; ver, por exemplo, Karlin (1993) Proc.
Natl. Acad. Sei. USA 90: 5873-5787. Uma medida da similaridade provida pelo algoritmo BLAST é a menor probabilidade da soma (P(N)), que fornece uma indicação da probabilidade pela qual uma união entre duas sequências de nucleotídeo ou de aminoácido deve ocorrer por acaso. Por exemplo, um ácido nucleico pode ser considerado semelhante a um ácido nucleico TRT se a menor probabilidade de soma em uma comparação do ácido nucleico de teste para um ácido nucleico TRT for menos do que cerca de 0,5, 0,2, 0,1,
0,01 ou 0,001. Altemativamente, outra indicação de que duas sequências de ácido nucleico são similares, é que o polipeptídeo, que o primeiro ácido nucleico codifica, é imunologicamente de reação cruzada com o polipeptídeo codificado pelo segundo ácido nucleico.
Como aqui usados, as expressões “substancial identidade”, “substancial identidade de sequência” ou “substancial similaridade”, no contexto de um polipeptídeo, se refere a um grau de similaridade entre dois polipeptídeos, em que um polipeptídeo compreende uma sequência com pelo menos 70% de identidade de sequência a uma sequência de referência, ou 80%, ou 85%, ou até 100% de identidade de sequência à sequência de referência, ou o mais preferível, 90% de identidade através de uma janela de comparação de cerca de 10 a 20 resíduos de aminoácido. A similaridade da sequência de aminoácido, ou identidade de sequência, é determinada pela otimização das uniões de resíduos, se necessário, por introdução de
240 intervalos, como requerido. Ver Needleham et al. (1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453; e Sankoff et al., 1983, Time W.àrfcs/^ &tri$gf ^’dfysf‘\e • * · ··· ·*· ··« · · Macromolecules, The Theory and Practice of Sequence Comparison, Capítulo Um, Addison-Wesley, Reading, MA; e pacotes de software da IntelliGenetics, Mountain View, CA, e a University of Wisconsin Genetics Computer Group, Madison, WI. Como será evidente a uma pessoa experiente, as expressões “substancial identidade”, “substancial similaridade” e “substancial identidade de sequência” podem ser usadas intercambiavelmente com respeito a polipeptídeos ou polinucleotídeos.
Como aqui empregadas, as expressões “substancialmente pura” ou “substancialmente purificada”, quando se referindo a uma composição compreendendo um reagente especificado, tal como um anticorpo (por exemplo, um anticorpo anti-hTRT), significa que o reagente especificado é pelo menos cerca de 75%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 99% ou mais, da preparação preferida de imunoglobulina da invenção, que especificamente se liga a um polipeptídeo de hTRT, substancialmente purificado.
Como aqui empregada, uma célula “negativa de telomerase” é aquela em que a telomerase não é expressa, isto é, nenhuma atividade de telomerase catalítica pode ser detectada usando-se um ensaio convencional ou um ensaio TRAP para atividade de telomerase catalítica. Como usado aqui, uma célula de “telomerase positiva” é uma célula em que a telomerase é expressa (isto é, a atividade de telomerase pode ser detectada).
Como aqui usado, uma doença ou condição “relacionadas a telomerase” é uma doença ou condição em um indivíduo que está correlacionado com um alto nível anormal de atividade de telomerase em células do dito indivíduo, que pode incluir, absolutamente, qualquer atividade de telomerase para as células somáticas mais normais, ou que está correlacionado com um baixo nível de atividade de telomerase, que resulta
241 em deterioração da função de uma célula normal. Exemplos de condições • · · * · a 4 4 to · * relacionadas com a telomerase incluem, por exemplo, felta*atívjdadp ' 4 4 4 C ·»« 4«f 4* V « de telomerase em células malignas) e infertilidade (baixa atividade de telomerase em células de linhagens germinativas).
Como aqui usados, “composto de teste” ou “agente” referemse a quaisquer compostos ou composições sintéticas ou naturais. O termo inclui todos os compostos orgânicos e inorgânicos, incluindo, por exemplo, moléculas pequenas, peptídeos, proteínas, açúcares, ácidos nucleicos, ácidos graxos e outros.
XIII. EXEMPLOS
Os seguintes exemplos são fornecidos para ilustrar a presente invenção, e não para limitá-la.
Nas seções seguintes, aplicam-se as seguintes abreviaturas: eq (equivalentes), M (Molar), μΜ (micromolar), N (Normal), mol (moles), mmol (milimoles), gmol (micromol), nmol (nanomoles), g (gramas), mg (miligramas), gg (microgramas), ng (nanogramas), 1 ou L (litros), ml (mililitros), gl (microlitro), cm (centímetros), mm (milímetros), gm (micrômetros), nm (nanômetros), °C (graus centígrados), RPN (ribonucleoproteína), mreN (2’-O-metilribonucleotídeos), dNTP (desoxiribonucleotídeo), dH2O (água destilada), DDT (ditiotreitol), PMSF (fluoreto de fenilmetilsulfonila), TE (10 mM Tri HC1, 1 mM de EDTA, aproximadamente pH 7,2), KGlu (glutamato de potássio), SSC (tampão de sal e citrato de sódio), SDS (dodecil sulfato de sódio), PAGE (eletroforese de gel de poliacrilamida), Novex (Novex, San Diego, CA), BioRad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), Farmácia (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), Boehringer-Mannhein (Boehringer-Mannhein Corp., Concord, CA), Amersham (Amerscham, inc., Chicago, IL), Stratagene (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA), NEB (New England Biolabs, Beverly, MA),Pierce (Pierce Chemicals Co, Rockford, IL, Beckman (Beckman Instruments,
242 οΙΛΙΎ
Fullerton, CA), Lab Industries (Lab Industries, Inc., Berkeley, CA), ·♦ · a · -> 4 ·_· φ
Eppendorf (Eppendorf Scientific, Madison, WI) Ιό MM^uI&r*«Dyh|cçil(|s l '· · ··· ··· · (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).
EXAMPLO 1
Isolamento das proteínas de telomerase e clones
O exemplo seguinte detalha o isolamento das proteínas de telomerase e clones de vários organismos, incluindo os clones euplotes p. 123, hTRT, TRT e S. pombe TRT telemerase cDNA.
A. FUNDAMENTO
i) INTRODUÇÃO
Esta seção fornece uma vista da purificação e clonagem de genes TRT, que são descritos em maiores detalhes nas seções subsequentes deste exemplo. Enquanto subunidades de telomerase RNA foram identificadas em ciliados, leveduras e mamíferos, subunidades protéicas da enzima não foram identificadas como tal, anterior a presente invenção. A purificação da telomerase a partir do protozoário ciliado Euplotes aediculatus produziu duas proteínas, denominadas pl23 e p43 (ver infra, Lingner (1996) Proc. Natl. Acade. Sei. U.S.A. 93:10712). O Euplotes aediculatus é um hipotricoso ciliado tendo um macronúcleo contendo cerca de 8 x 107 telômeros e cerca de 3 x 105 moléculas de telomerase. Após a purificação, o complexo ativo de telomerase teve uma massa molecular de cerca de 230 kD, correspondendo a uma subunidade 66 kD RNA e duas proteínas de cerca de 123 kD e 43kD (Lingner, (1996) supra).
As proteínas pl23 e p43 foram sequenciadas e os clones cDNA que codificaram estas proteínas foram isolados. Estas sequências Euplotes foram observadas como sendo não relacionadas às proteínas p80 e p95 associadas à telomerase Tetrahymena. A análise de sequência do Euplotes pl23 revelou motivos de transcriptase reversa (RT). Além disso, a sequência de análise do Euplotes pl23 por comparação a outras sequências
243 revelou uma levedura homóloga, denominada proteína. Est2..(Lin@aqr.(J? 9^7^.. ·· · *2· ·· ··· ·
Science 276:561). A Levedura Est2 previamente mostrôu seresseftóiaT ffêra’ a manutenção do telômero in vivo (Lendvay (1996) Genetics 144:1399) mas não foi identificada como uma proteína de telomerase catalítica. A mutagênese específica do local demonstrou que os motivos RT da levedura Est2 são essenciais para a síntese do DNA telomérico in vivo e in vitro [Lingner (1997) supra].
ii) IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DA TELOMERASE de 5. pombe
A ampliação PCR do DNA de S. pombe foi realizada com iniciadores de sequência degenerada designados dos motivos RT do Euplotes pl23, como descritos abaixo. Dos quatro produtos PCR proeminentes gerados, uma banda de 120 pares de base codificou uma sequência peptídica homóloga para pl23 e Est2. Este produto PCR foi usado como uma prova em hibridização de colônia e identificados dois clones de superposição de uma coleção genômica de S. pombe e três de uma coleção de cDNA de S. pombe. A análise sequencial revelou que nenhum dos três clones do cDNA de S. pombe eram de comprimento completo, assim os RT-PCR foram usados para se obter as sequências codificando a proteína do N-término.
O sequenciamento completo destes clones revelou um gene putativo de telomerase de RT de S. pombe, trt\ foi depositado no GenBank, número de acesso AFO15783 (ver Figura 15).
Para testar o trt\ S. pombe (como uma subunidade catalítica), duas deleções construídas foram criadas. A análise da sequência mostrou que o trt 1 codificou uma proteína básica com uma massa molecular prognosticada de 116 kD. Foi observado que a homologia com pl23 e Est2 foi especialmente alta nos sete motivos de transcriptase reversa, sublinhados e designados como motivos 1, 2, A, B, C, D e E (ver Figura 63). Um motivo adicional específico em telomerase, designado o motivo-T, também foi
244 observado. Quinze introns, variando em tamanho de J6 3 7J pares de base^ : : : : : .· ·: ·.: :
·· · ··· · · · · interromperam a sequência de código. ' : ··*: ..........
Para testar 0 trt 1 do S. pombe como uma subunidade catalítica, duas construções de deleções foram criadas. Uma removeu apenas motivos B através de D nos domínios de RT. A segunda removeu 99% da estrutura de leitura aberta.
As células haplóide cultivadas a partir de esporos de S. pombe de ambos os mutantes mostraram um encurtamento progressivo de telômero no ponto onde a hibridização para repetições teloméricas tomam-se quase indetectáveis. Uma trt\+/trtV diplóide foi esporulada e os tétrades foram dissecados e germinados em um meio de extrato de levedura suplementado com aminoácidos (uma lâmina YES, Alfa (1993) Experiments with Fission Yeast, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). As colônias derivadas de cada esporo foram cultivadas a 32°C por três dias, e esfriados sucessivamente por uma lâmina YES nova a cada três dias. Uma colônia de cada ciclo foi colocada em seis ml de cultura líquida YES a 32°C e crescendo em fase estacionária. Um DNA genômico foi preparado. Após digestão com Apal, o DNA foi submetido a eletroforese em um gel de agarose a 2,3%, manchado com brometo de etídio para confirmar um carregamento aproximadamente igual em cada faixa, então transferido para uma membrana de nylon e hibridizado para uma prova de DNA telomérico.
Senescência foi indicada por um retardo no início do crescimento ou uma queda no crescimento em agar (tipicamente na quarta esfriada após a germinação) e por colônias com crescentes bordas esfarrapadas (colônia morfologicamente mostrada na Figura 22C) e por um crescimento de frações altas de células alongadas (como mostrado na Figura 22D). As células foram laminadas em meio mínimo (Alfa (1993) supra) com cloreto de amônio substituído por ácido glutâmico por dois dias a 32°C anterior à fotografia.
245 /u5Q
Quando células individuais ampliada?, fQrajn..separadas :no í·* · *·· »· · ·* ··« * microscópio de dissecação, foi observado que a maióna’nã<5 sofreu-divisão adicional. A mesma população de células de telomerase negativa (trtl') sem contendo células de tamanho normal as quais continuaram a dividir, mais que frequentemente produziram progênitos não divididos. Os sobreviventes negativos de telomerase podem usar um modo recombinacional de manutenção de telômero como documentado em linhagens de fermentos brotados que têm vários genes de replicação de telômero deletados (Lendvay (1996) supra, Lundblad (1993) Cell 73:347).
iii) IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE TELOMERASE
HUMANA
Um EST (rótulo expresso de sequência) derivado de cDNA de transcriptase reversa (hTRT) de telomerase humana foi identificado por uma pesquisa BLAST do dbEST (rótulo expresso de sequência) banco de dados do GenBank usando-se o peptídeo Euplotes 123 kDa e sequências de ácido nucleico, bem como a proteína Schizosaccharomyces e as sequências cDNA (tezl) correspondentes. O EST, designado GenBank AA28196, tendo 389 nucleotídeos de comprimento e correspondendo às posições 1679 a 2076 do clone 712562 (Figura 18), foi obtido do I.M.A.G.E. Consortium (Human Genome Center, DOE Lawrence Livermore National Laboratory, Livermore, CA). Este clone foi obtido a partir de uma coleção de cDNA de células germinais B derivadas de fluxo escolhido de células tonsilas. O sequenciamento completo deste clone hTRT de cDNA mostrou todos os oito motivos RT (TRT) de telomerase. Contudo, este clone hTRT não codifica uma porção contígua de um TRT por causa do RT, os motivos B’, C, D e E, foram contidos em uma borda de leitura aberta diferente do que o mais Nterminal dos motivos RT. Além disso, a distância entre os motivos RT, A e B foi substancialmente mais curta do que aquela dos três TRTs (não humano) previamente conhecidos.
246 tf
Para isolar um clone de cDNA de comprirpento. completo, uma coleção de cDNA derivada da linhagem celular È'93-: do:áeres- humanos (descrito acima) que expressa níveis altos de atividade de telomerase, foram tríadas. Uma coleção lambda de cDNA proveniente da linhagem celular 293 foi dividida em 25 conjuntos contendo aproximadamente 200.000 placas cada. Cada conjunto foi triado por PCR com o par iniciador 5’CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA-3’ e 5’-GGATGAAGCGGAGTCTGGA3’. Seis subconjuntos de um conjunto positivo primário foram triados ainda por PCR usando-se este mesmo par iniciador. Para ambos os subconjuntos, o 10 primário e o secundário, triados, o hTRT foi ampliado para um total de 31 ciclos a: 94°C, 45 segundos; 60°C, 45 segundos; e 72°C, 90 segundos. Como um controle, o RNA de uma enzima de preparação GAPDH foi ampliada usando-se o par iniciador 5’-CTCAGACACCATGGGGAAGGTGA-3’ e 5’ATGATCTTGAGGCTGTTGTCATA-3’ para um total de 16 ciclos a 94°C, 15 45 segundos; 55°C, 45 segundos; e 72°C, 90 segundos.
Um subgrupo hTRT positivo proveniente da triagem secundária foi então triado por hibridização de placa com uma prova a partir da região 5’ do clone #712562. Um fago foi positivamente identificado (designado fago Lambda 25-1.1, ATCC209024, depositado em 12 de maio de 20 1997). Conteve um inserto de aproximadamente quatro quilo base, que foi excisado e subclonado dentro do local EcoRI do vetor pBluescript II SK+ (Stratagene, San Diego, CA) como um fragmento de EcoRI. Este plasmídeo contendo clone de cDNA foi designado pGRN121. O inserto de cDNA totaliza aproximadamente 4 pares de quilo base. A sequência nucleotídea 25 completa do hTRT cDNA (pGRN121) de ser humano foi depositado no GenBank (acesso AF015950) e o plasmídeo foi depositado com a ATCC (ATCC 209016, depositado em 6 de maio de 1997).
B CULTIVO DE EUPLOTES AEDICULATUS
Neste Exemplo, culturas de E. aediculatus foram obtidas do
247
Dr. David Prescott, MCDB, University of Colorado ...O JDr,^ Rrescott ,í§qI©u ·.* ΐ *.í .* · ·* ·* **j *' originariamente esta cultura a partir de água de ufri áçudê, emóürâ* êste organismo esteja também disponível da ATCC (ATCC #30859). As culturas foram cultivadas como descrito por Swanton e outros, (Swanton e outros,
Chromossoma 77:203 [1980]), sob condições não esterilizadas, em recipientes de vidro de 15 litros contendo Chlorogonium como uma fonte de alimento. Os organismos foram colhidos das culturas quando a densidade atingiu aproximadamente 104 células/ml.
C. PREPARCÂO PARA EXTRATOS NUCLEARES
Neste Exemplo, extratos nucleares de E. aediculatus foram preparados usando-se o método de Lingner e outros, (Lingner et. al., Genes Develop., 8:1984 [1994]), com modificações mínimas, como indicado abaixo. Resumidamente, as células cultivadas como descrito na parte B foram concentradas com filtros Nytex de 15 pm e resfriado em gelo. O grão de célula foi recolocado em suspensão em um volume final de 110 ml de tampão TMS/PMSF/fosfato de espermidina. O estoque do tampão TMS/PMSF/fosfato de espermidina foi preparado por adição de 0,075 g de fosfato de espermidina (USB) e 0,75 ml de PMSF (de um estoque a 100 mM preparado em etanol) em 150 ml de TMS. O TMS compreendendo 10 mM de 20 triacetato, 10 mM de MgCl2, 85,5752 g de sacarose por litro e 0,33297 g de
CaCl2 por litro, pH 7,5.
Após a ressuspensão em um tampão TMS/PMSF/fosfato de espermidina, 8,8 ml de NP-40 a 10% e 94,1 g de sacarose foram adicionados e a mistura colocada em um béquer de vidro siliconizado com um bastão de 25 agitação de aço inoxidável adaptado a um motor suspenso. A mistura foi agitada até que as células ficassem completamente lisadas (aproximadamente 20 minutos) a mistura foi então centrifugada por 10 minutos a 7.500 rpm (8.950 x g), a 4°C, usando-se um rotor externo de agitação Beckman JS-13. O sobrenadante foi removido e o grão do núcleo foi recolocado em suspensão
248 • · ·· em um tampão TMS/PMSF/fosfato de espermjífina . e...centrifB£&d(j •••♦J»·**· ·*·· · ♦ · ♦ * · ·* · · novamente, por 5 minutos a 7.500 rpm (8.950 x g), a ^C/usánUo^seifnYtOtor externo de agitação Beckman JS-13.
O sobrenadante foi removido e o grão do núcleo foi recolocado em suspensão em um tampão compreendendo de 50 mM de triacetato, 10 mM de MgCl2, 10% de glicerol, 0,1% de NP-40, 0,4 M de KGlu, 0,5 mM de PMSF, pH 7,5, a um volume de 0,5 ml de tampão por 10 g de células colhidas. Os núcleos recolocados em suspensão foram então introduzidos em um homogeneizador de vidro com aproximadamente 50 golpes, e então centrifugado por 25 minutos a 14.000 rpm a 4°C, em uma centrífuga Eppendorf. O sobrenadante contendo o extrato nuclear foi coletado, congelado em nitrogênio líquido, e guardado a -80°C até ser usado.
D. PURIFICAÇÃO DE TELOMERASE
Neste Exemplo, os extratos nucleares preparados como descrito na parte C foram usados para purificar a E. aediculatus telomerase.
Neste protocolo de purificação, a telomerase foi primeiro enriquecida por cromatografia em uma coluna Affi-Gel-heparina, e então extensivamente purificada por purificação de afinidade com um oligonucleotídeo antisentido. Como uma região padrão de RNA de telomerase é acessível para 20 hibridização na partícula RNP de telomerase, um oligonucleotídeo antisentido (isto é, a “afinidade oligonucleotídea) foi sintetizado o qual era complementar a sua região padrão como uma isca para atelomerase. Um resíduo de biotina foi incluído no final 5’ do oligonucleotídeo para imobilizalo em uma coluna avidínica.
Seguindo a ligação da telomerase ao oligonucleotídeo, e a lavagem extensiva, a telomerase foi eluída pelo uso de um oligonucleotídeo de deslocamento. A oligonucleotídeo de afinidade incluiu as bases de DNA que não eram complementares ao RNA 5’ de telomerase para a sequência específica de telomerase. Como o oligonucleotídeo de deslocamento era
249
JOH complementar ao oligonucleotídeo de afinidade por se.14 comprimento .inteiro • · ♦ ·.· ,· j .· .* ··· ··· ele era capaz de formar um duplex termodinamicameiite ôiaiâ estável· άσ qúe ’ a ligação da telomerase ao oligonucleotídeo de afinidade. Assim, a adição do oligonucleotídeo de deslocamento resultou na elução da telomerase da coluna.
Os extratos nucleares preparados a partir de 45 litros de culturas foram congelados até que um tòtal de 34 ml de extrato nuclear fosse coletado. Isto correspondeu a 630 litros de cultura (isto é, aproximadamente 4 x 109 células). O extrato nuclear foi diluído com um tampão para 410 ml, para fornecer concentrações finais de 20 mM de triacetato, 1 mM de MgCl2, 0,1 mM de EDTA, 33 mM de KGlu, 10% (vol/vol) de glicerol, 1 mM de ditiotreitol (DTT), e 0,5 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF), a um pH de 7,5.
O extrato nuclear diluído foi aplicado a uma coluna (Bio-Rad) de gel Affi-Gel-heparina, com um volume de leito de 230 ml e 5 cm de diâmetro, equilibrado no mesmo tampão e eluído com um gradiente de 2 litros de 33 a 450 mM de KGlu. A coluna foi operada a 4°C, a uma razão de fluxo de 1 volume de coluna/hora. Frações de 50 ml cada foram coletadas e ensaiadas para atividade de telomerase como descrito na parte E. A telomerase foi eluída da coluna em aproximadamente 170 mM KGlu. Frações contendo telomerase (aproximadamente 440 ml) foram reunidas e ajustadas para 20 mM de triacetato, 10 mM de MgCl2, 1 mM de EDTA, 300 mM de KGlu, 10% de glicerol, 1 mM de DTT e 1% de Nonidet P-40. Este tampão foi designado como “WB”.
Para esta preparação, 1,5 nmol de cada um dos dois competidores de nucleotídeos DNA (5’TAGACCTGTTAGTGTACATTTGAATTGAAGC-3’) e (5’TAGACCTGTTAGGTTGGATTTGTGGCATCA-3’), 50 pg de RNA de levedura (Sigma), e 0,3 nmol de oligonucleotídeo específico de telomerase
250 rotulado de biotina (5’-biotina-TAGACCTGTTA-(mreG)2-(nueUí)4;(nneG)4r • · * · t ,· · ·* ·* **· ··· (rmeU)4-remG-3’), foram adicionados por ml dá boíêção:’·· Õs:,,2’-d-: metilribonucleotídeos dos oligonucleotídeos específicos de telomerase foram complementares ao RNA de telomerase; região de padrão; os desoxirribonucleotídeos não eram complementares. A inclusão do competidor, os oligonucleotídeos de DNA não específicos aumentaram a eficiência da purificação, conforme os efeitos das proteínas de ligação de ácido nucleico e outros componentes na mistura, que deviam ou ligar-se ao oligonucleotídeo de afinidade ou remover a telomerase da mistura, eram minimizados.
Este material foi então adicionado ao material de coluna de neutravidina plus (Pierce) imobilizada por Ultralink, em um volume de 60 μΐ de suspensão por ml da coleção. O material de coluna foi pré-bloqueado por duas vezes durante 16 minutos cada bloqueio, com uma preparação de WB contendo Nonidet P-40 0,01%, 0,5 mg BS A, 0,5 mg/ml de lisozima, 0,05 mg/ml de glicogênio e 0,1 mg/ml de RNA de levedura. O bloqueio foi conduzido a 4°C, usando-se uma roda giratória para bloquear cuidadosamente o material da coluna. Após a primeira etapa de bloqueio, e antes da segunda etapa de bloqueio, o material da coluna foi centrifugado a 200 x g por 2 minutos, para pelotizar a matriz.
A mistura da coluna da coleção foi incubada por 8 minutos em 30°C, e depois por um adicional de 2 horas a 4°C, em uma roda giratória (aproximadamente 10 rpm; Labindustries), para permitir a ligação. A mistura da coluna da coleção foi então centrifugada a 200 x g por 2 minutos, e o sobrenadante contendo material não ligado foi removido. A mistura da coluna da coleção foi então lavada. Este processo de lavagem incluiu as etapas de enxaguar a mistura da coluna de coleção com WB a 4°C, lavando a mistura por 15 minutos com WB a 4°C, enxaguando com WB, lavando por 5 minutos a 30°C com WB contendo 0,6 M de KGlu, e nenhum Nonidet P-40,
251
366 lavando por 5 minutos a 25°C com WB, e finalmente enxaguando .no.vamen.te com WB. O volume restante após a lavagem final foi: mántíãõ apequeno,”-âe * modo a produzir uma relação de tampão para o material da coluna de aproximadamente 1:1.
A telomerase foi eluída do material da coluna pela adição de 1 nmol de desoxioligonucleotídeo (5’-CA4C4A4O2TA2GAG2TCTA-3’) de deslocamento por ml de material da coluna, e incubando-se a 25 °C durante minutos. O material foi centrifugado por 2 minutos a 14000 rpm em uma microcentrifugadora (Eppendorf), e o eluato coletado. O procedimento de elução foi repetido duas vezes mais, usando-se oligonucleotídeo de deslocamento fresco a cada vez. Como mencionado acima, tendo em vista que o oligonucleotídeo de deslocamento foi complementar ao oligonucleotídeo de afinidade, formou-se um complexo termodinamicamente mais estável com o oligonucleotídeo de afinidade, do que o P-40. Assim, a adição do oligonucleotídeo de deslocamento a uma telomerase ligada por afinidade resultou em elução eficiente da telomerase sob condições nativas. A telomerase pareceu ser de aproximadamente 50% de pureza neste estágio, como julgado por análise em um gel proteínico. A purificação da telomerase por afinidade e a elução com um oligonucleotídeo de deslocamento é mostrada na Figura 26 (painéis A e B, respectivamente). Nesta figura, os açúcares 2’-(9-metila do oligonucleotídeo de afinidade são indicados pela linha em negrito. As formas ovais negras e sombreadas nesta figura intentam representar graficamente as subunidades proteínicas da presente invenção.
As concentrações proteínicas do extrato e o material obtido em seguida à cromatografia de coluna de Affi-Gel-heparina, foram determinadas usando-se o processo de Bradford [Bradford, Anal. Biochem., 72: 248 (1976)], usando BSA como o padrão. Apenas uma fração da preparação de telomerase foi ainda purificada em um gradiente de glicerol.
O coeficiente de sedimentação da telomerase foi determinado
252 por centrifugação do gradiente de glicerol, como descnto^a.ParitelL...... ··· ·. .* j ,·* ,·' ··:
A Tabela 5 abaixo é uma tabela fia ;purificaçãtf· pará a* telomerase purificada de acordo com os processos deste Exemplo. A telomerase foi enriquecida 12 vezes em extratos nucleares, em comparação com os a totalidade dos extratos celulares, com uma recuperação de 80%; 85% de telomerase foram solubilizados a partir dos núcleos, após extração.
TABELA 5
Purificação da telomerase
Fração Proteína (mg) Telomerase (pmol de RNP) Telomerase/ Proteína/pmol de RNP/mg Recuperação (%) Fator de purificação
Extrato nuclear 2020 1720 100 1
Heparina 125 1040 60 10
Afinidade 0,3** 680 40 2670
Gradiente glicerol NA* NA* 25 NA*
* NA = não disponível ** Este valor foi calculado da quantidade medida de telomerase (680 pmoles), adotando-se uma pureza de 50% (com base em um gel proteínico).
E. ATIVIDADE DE TELOMERASE
Em cada etapa na purificação de telomerase, a preparação foi analisada por três separados ensaios, um dos quais referia-se à atividade, como descrito neste exemplo. Em geral, os ensaios de telomerase foram realizados em 40 μΐ contendo de 0,003 a 0,3 μΐ de extrato nuclear, 50 mM Tris-Cl (pH 7,5), 50 mM KGlu, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 125 μΜ dTTP, 125 μΜ dGTP, e aproximadamente 0,2 pmoles de substrato de oligonucleotídeo rotulado 5’-32P-rotulado (isto é, aproximadamente 400000 cpm). Os iniciadores de oligonucleotídeos foram desnaturados a quente antes de sua adição à mistura de reação. As reações foram construídas sobre gelo e
253 incubadas por 30 minutos a 25 °C. As reações foram jnterr.onjpidas,pela
o,05 mg/ml de proteinase K, e incubadas por pelo menos 30 minutos a 45°C. Após a precipitação de etanol, os produtos foram analisados em géis PAGE 8% desnaturantes, como conhecido na técnica (ver, por exemplo, Sambrook etal., 1989).
F. QUANTIFICAÇÃO DA ATIVIDADE DA TELOMERASE
Neste exemplo, é descrita a quantificação da atividade da telomerase através do procedimento de purificação. A quantificação foi efetuada mediante ensaio do alongamento de iniciadores de oligonucleotídeos, na presença de dGTP e [ot-32P]dTTP. Brevemente, 1 μΜ oligonucleotídeo 5’-(G4T4)2-3’ foi estendido em uma mistura de reação de 20 μΐ na presença de 2 μΐ de [oc-32P]dTTP(10 mCi/ml, 400 Ci/mmol; 1 Ci = 37 GBq) e 125 μΜ dGTP como descrito [Lingner et al., Genes Develop., 8: 1984 (1994)] e carregado em um gel de sequenciação PAGE 8%, como descrito.
Os resultados deste estudo são mostrados na Figura 28. Na coluna 1, nenhuma telomerase se acha presente (isto é, um controle negativo); as colunas 2, 5, 8 e 11 continham 0,14 finol de telomerase; as colunas 3, 6, 9 e 12 continham 0,42 finol de telomerase; e as colunas 4, 7, 10 e 13 continham 1,3 finol de telomerase. A atividade foi quantificada usandose um Phospholmager (Molecular Dynamics) usando as instruções do fabricante. Determinou-se que, sob estas condições, 1 finol de telomerase purificada por afinidade incorporasse 21 finol de dTTP em 30 minutos.
Como mostrado na Figura 28, a atividade específica da telomerase não modifica significativamente através do procedimento de purificação. A telomerase purificada por afinidade estava completamente ativa. No entanto, foi determinado que em altas concentrações, uma atividade inibitória fosse detectada e a atividade de extratos brutos não fosse linear.
254
Assim, no ensaio mostrado na Figura 28, o extrato bruto foi diluído ?*· s ·*· *’ *· “ ’ * * *·
7000 vezes. Após a purificação, esta atividade iniWtófia Tôi rêmbvadâ^e’*· nenhum efeito inibitório foi detectado nas preparações de telomerase purificada, mesmo em altas concentrações de enzimas.
G. ELETROFORESE EM GEL E MANCHA NO NORTE
Como estabelecido na Parte E, em cada etapa na purificação da telomerase, a preparação foi analisada por três separados ensaios. Este exemplo descreve a eletroforese em gel e os procedimentos de manchamento usados para quantificar o RNA de telomerase presente nas frações, e analisar 10 a integridade da partícula de ribonucleoproteína da telomerase.
i) GÉIS DESNATURANTES E MANCHAS DO NORTE
Neste exemplo, o RNA sintético de telomerase transcrita T7 de concentração conhecida, serviu como padrão. Na totalidade deste exame, o componente de RNA foi usado como uma medida da telomerase.
Uma construção para a transcrição do fago T7 do RNA polimerase de E. aediculatus telomerase telomerase foi produzida, usando-se (PCR). O gene de RNA telomerase foi ampliado com iniciadores que foram temperados em qualquer extremidade do gene. O iniciador, que se temperou na extremidade 5’, também codificou uma sequência de ribozima cabeça de martelo para gerar a extremidade natural 5’ após a divagem do RNA transcrito, uma sequência do promotor T7, e um sítio AcdRI para subclonagem. A sequência desta iniciador 5’ era 5’GCGGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAAGAAACTCTGATGA
GGCCGAAAGGCCGAAACTCCACGAAAGTGGAGTAAGTTTCTCGAT
AATTGATCTGTAG-3’. O iniciador 3’ incluiu um sítio Ear\ para término de transcrição na extremidade natural 3’, e um sítio BawHI para clonagem. A sequência deste iniciador 3’ era 5’CGGGGATCCTCTTCAAAAGATGAGAGGACAGCAAAC-3’. O produto de ampliação do PCR foi clivado com AcoRI e BazwHI, e subclonado nos
XcQ>
255 respectivos sítios de pUC19 (NEB), para dar “pEaT7”. A justeza deste inserto ·· · · · ·· · · · ···· foi confirmada por sequenciação de DNA. A trátfscii^Q·!'’!
• · ·· · ··· ··· ··· · · como descrito por Zaug et al., Biochemistry 33: 14935 (1994), com o plasmídeo linearizado em Earl. O RNA foi purificado em gel e a 5 concentração foi determinada (um A260 de 1 = 40 μg/ml). Este RNA foi usado como um padrão para determinar o RNA de telomerase presente em várias preparações de telomerase.
O sinal de hibridização foi proporcional à quantidade de RNA de telomerase, e as concentrações de RNA derivado eram consistentes com 10 aquelas obtidas por eletroforese em gel, porém levemente mais elevadas. A comparação da quantidade todo o RNA de telomerase em todo o RNA celular para as diluições em série de concentrações conhecidas do transcripto de RNA T7 indicou que cada célula de E. aediculatus continha aproximadamente 300.000 moléculas de telomerase.
A visualização da telomerase foi realizada por hibridização da mancha do Norte a seu componente de RNA, usando os processos como descrito [Linger et al., Genes Develop., 8: 1984 (1994)]. Resumidamente, o RNA (menos ou igual a 0,5 μg/faixa) foi resolvido em um PAGE 8% e eletromanchado em uma membrana Hybond-N (Amersham), como conhecido 20 na técnica (ver, por exemplo, Sambrook et al., 1989). A mancha foi hibridizada durante a noite em 10 ml de 4x SSC, lOx de solução de Denhardt, 0,1% SDS e 50 μg/ml de DNA de esperma de arenque desnaturado. Após a pré-hibridização por 3 horas, 2 x 106 cpm de sonda/ml de solução de hibridização, foram adicionados. A sonda aleatoriamente rotulada era um 25 produto de PCR que cobriu todo o gene de RNA de telomerase. A mancha foi lavada com várias mudanças de tampão por 30 minutos em 2x SSC, 0,1% SDS e, então, lavada por 1 horas em 0,lx SSC e 0,1% SDS a 45°C.
ii) GÉIS NATIVOS E MANCHAS DO NORTE
Nesta experiência, a preparação de telomerase purificada foi
256 desenvolvida em géis nativos (isto é, não desnaturação) de 3,5% de ·· · ····· · ····· poliacrilamida e 0,33% de agarose, como conhecidj@:n£. tébçíc^ e’desèfftógor • · ·· · ··· ··· ··· · f [Lamond e Sproat, (1994), acima]. A telomerase co-migrou aproximadamente com o corante de xileno cianol.
Os resultados do gel nativo indicou que a telomerase foi mantida como um RNP na totalidade do protocolo de purificação. A Figura 27 é uma fotografia de uma mancha do Norte, mostrando a mobilidade da telomerase em diferentes frações em um gel de não desnaturação, assim como a telomerase transcrita in vitro. Nesta Figura, a coluna 1 continha 1,5 10 fmol de RNA de telomerase, a coluna 2 continha 4,6 fmoles de RNA de telomerase, a coluna 3 continha 14 fmoles de RNA de telomerase, a coluna 4 continha 41 fmoles de RNA de telomerase, a coluna 5 continha extrato nuclear (42 fmoles de telomerase), a coluna 6 continha telomerase purificada em heparina Affi-Gel (47 fmoles de telomerase), a coluna 7 continha 15 telomerase purificada por afinidade (68 fmoles) e a coluna 8 continha telomerase purificada em gradiente de glicerol (35 fmoles).
Como mostrado na Figura 27, em extratos nucleares, a telomerase foi montada em uma partícula de RNP, que migrou mais lentamente do que o RNA de telomerase não montado. Menos do que 1% de 20 RNA livre foi detectado por este processo. No entanto, um complexo de RNP de telomerase de migração mais lenta também foi, algumas vezes, detectado nos extratos. Após a purificação na coluna de heparina Affi-Gel, a partícula de RNP de telomerase não se modificou na mobilidade (Figura 27, coluna 6). No entanto, após a purificação por afinidade, a mobilidade da partícula de 25 RNA aumentou levemente (Figura 27, coluna 7), talvez indicando que a subunidade ou fragmento de proteína havia sido perdido. Nos gradientes de glicerol, a telomerase purificada por afinidade não se modificou em tamanho, mas aproximadamente 2% de RNA de telomerase livre era detectável (Figura 27, coluna 8), sugerindo que uma pequena quantidade de desmontagem da
257
• · · partícula de RNP havia ocorrido.
H. COMPOSIÇÃO PROTEÍNICA DE TELOMER&SÊ M / • · · · ·
Neste exemplo, são descritas as análises da composição proteínica de telomerase purificada.
As frações do gradiente de glicerol obtidas como descrito na
Parte D, foram separadas em um gel de poliacrilamida 4-20% (Novex). Em seguida à eletroforese, o gel foi manchado com azul brilhante de Coomassie. A Figura 29 mostra uma fotografia do gel. As colunas 1 e 2 continham marcadores de massa molecular (Pharmacia), como indicado no lado esquerdo do gel mostrado na Figura 29. As colunas 3 a 5 continham grupos de fração de gradiente de glicerol, como indicado no topo do gel (isto é, a coluna 3 continha as frações 9 a 14, a coluna 4 continha as frações 15 a 22 e a coluna 5 continha frações 23 a 32). A coluna 4 continha o grupo com 1 pmol de RNA de telomerase. Nas colunas 6 a 9, padrões de BSA foram desenvolvidos em concentrações indicadas no topo do gel na Figura 29 (isto é, a coluna 6 continha 0,5 pmol de BSA, a coluna 7 continha 1,5 pmol de BSA, a coluna 8 continha 4,5 pmoles de BSA, e a coluna 9 continha 15 pmoles de BSA).
Como mostrado na Figura 29, os polipeptídeos com massa 20 moleculares de 120 e 43 kDa co-purificados com a telomerase. O polipeptídeo de 43 kDa foi observado como um dubleto. Observou-se que o polipeptídeo de aproximadamente 43 kDa na coluna 3 migrou diferentemente do dubleto na coluna 4; pode ser uma proteína não relacionada. O dubleto de 120 kDa e 43 kDa foi, cada um, manchado com azul brilhante de Coomassie, 25 aproximadamente no nível de 1 pmol, em comparação com os padrões de BSA. Tendo em vista que esta fração continha 1 pmol de RNA de telomerase, todo do qual foi montado em uma partícula de RNP (ver Figura 27, coluna 8), parece haver duas subunidades de polipeptídeo que são estequiométricas com o RNA de telomerase. No entanto, é também possível que as duas proteínas
258 ao redor de 43 kDa sejam subunidades enzimáticas separadas.
·· · · ··· · · · ··· ·
A telomerase purificada por afinidaxiè, :qúé nâó:fôi: submetida
17 ·>·!········ a fracionamento em um gradiente de glicerol, continha polipeptídeos adicionais com massas moleculares evidentes de 35 e 37 kDa, respectivamente. Esta última fração foi estimada como sendo pelo menos 50% pura. No entanto, os polipeptídeos de 35 kDa e de 37 kDa, que estavam presentes no material purificado por afinidade, não eram reprodutivelmente separados por centrifugação do gradiente de glicerol. Estes polipeptídeos podem ser contaminantes, já que eles não eram visíveis em todas as preparações contendo a atividade.
I. COEFICIENTE DE SEDIMENTAÇÃO
O coeficiente de sedimentação para a telomerase foi determinado por centrifugação do gradiente de glicerol. Neste exemplo, o extrato nuclear e a telomerase purificada por afinidade foram fracionados em gradientes de glicerol 15-40% contendo Tris 20 mM-acetato, com MgCl2 1 mM, EDTA 0,1 mM, KGlu 300 mM e DTT 1 mM, em pH 7,5. Os gradientes de glicerol foram escoados em tubos de 5 ml (13 x 51 mm) e centrifugados usando-se um rotor SW55TÍ (Beckman) a 55000 rpm por 14 horas a 4°C.
Proteínas marcadoras foram desenvolvidas em um gradiente paralelo, e tinha um coeficiente de sedimentação de 7,6 S para álcool desidrogenase (ADH), 113 S para catalase, 17,3 S para apoferritina, e 19,3 S para tireoglobulina. O pico da telomerase foi identificado por eletroforese de gel nativo de frações gradientes, seguida por hibridização da mancha a seu componente de RNA.
A Figura 30 é um gráfico mostrando o coeficiente de sedimentação para a telomerase. Como mostrado nesta figura, a telomerase purificada por afinidade co-sedimentou-se com catalase em 11,5 S, enquanto a telomerase em extratos nucleares sedimentou-se levemente mais rápido, chegando ao pico ao redor de 12,5 S. Portanto, consistente com a mobilidade
259
26Μ da enzima em géis nativos, a telomerase purificada parece ter perdido um ·· · · ··· · · · ···* fragmento proteolítico ou uma subunidade frouxardsTité associada»: o F ·········· * · ·· · ··· ··· ··· · ·
A massa molecular calculada para a telomerase, se for considerado consistir de uma subunidade proteínica de 120 kDa, uma subunidade de 43 kDa e uma subunidade de RNA de 66 kDa, alcança um total de 229 kDa. Isto está de acordo com a massa molecular da catalase de 232 kDa. Entretanto, o coeficiente de sedimentação é uma função da massa molecular, bem como o volume específico parcial e o coeficiente de atrito da molécula, ambos dos quais são desconhecidos pelo RNP da telomerase de Euplotes.
J. UTILIZAÇÃO DO SUBSTRATO
Neste exemplo, as exigências do substrato da Euplotes telomerase, foram examinadas. Um modelo simples para a extremidade de replicação do DNA prediz que, após a replicação semi-conservativa do DNA, a telomerase se estende em moléculas de DNA de extremidade embotada de duplo filamento. Em uma variação deste modelo, uma extremidade 3’ de filamento único é criada por uma helicase ou nuclease após a replicação. Esta extremidade 3’ é então usada pela telomerase, para ligação e extensão.
Para determinar se a telomerase é capaz de alongar as moléculas de extremidade embotada, grampos de cabelo de modelo foram sintetizados com as repetições teloméricas posicionadas em suas extremidades 3’. Estes substratos iniciadores foram purificados em gel, a extremidade 5’ foi rotulada com polinucleotídeo cinase, aquecida em 0,4 μΜ a 80°C por 5 minutos, e então lentamente esfriada à temperatura ambiente em um bloco de aquecimento, para permitir a restauração e a formação de hélice dos grampos de cabelo. A mobilidade do substrato em um gel não desnaturante indicou que a formação de grampos de cabelo muito eficiente estava presente, em comparação com a dimerização.
Ensaios foram realizados com dGTP de 125 μΜ, dTTP de 125
260 μΜ e iniciador de extremidade 5’ rotulada de 0,02 μΜ (substrato de ·· · ····· · · ··· · • · · · · · ·* · · · · · · oligonucleotídeo rotulado 5’-32P) em μΐ de mistura^*d4 rç$çgo,,&q£ çb*n4jfch$m Tris 20 mM-acetato, com MgCl2 10 mM, KGlu 50 mM e DTT 1 mM, em pH 7,5. Estas misturas foram incubadas a 25°C por 30 minutos. As reações 5 foram interrompidas pela adição de tampão de carga de formamida (isto é, TBE, formamida, azul de bromotimol, e cianol, Sambrook, 1989, acima).
Os iniciadores foram incubados sem telomerase (“-”), com 5,9 fmoles de telomerase purificada por afinidade (“+”), ou com 17,6 fmol de telomerase purificada por afinidade (“+++”). A telomerase purificada por 10 afinidade usada neste ensaio foi dializada com uma membrana tendo um corte de 100 kDa, de modo a remover o oligonucleotídeo de deslocamento. Os produtos de reação foram separados em um gel PAGE 8%/uréia contendo 36% de formamida,para desnaturar os grampos de cabelo. As sequências dos iniciadores usados neste estudo, bem como suas indicações de colunas, são 15 mostradas na Tabela 6.
TABELA 6: Sequências de iniciadores
. Trilha ' Sequência de iniciadores (5’ a 3’)
1-3 C4(A4C4)3CACA(G4T4)3G4
4-6 C2(A4C4)3CACA(G4T4)3G4
7-9 (A4C4)3CACA(G4T4)3G4
10-12 A,C4(A4C4)2CACA(G4T4)3G4
13-15 C4(A4C4)2CACA(G4T4)3
16-18 (A4C4)3CACA(G4T4)3
19-21 A2C4(A4C4)2CACA(G4T4)3
22-24 C4(A4C4)2CACA(G4T4)3
25-27 C2(A4C4)2CACA(G4T4)3
28-30 (A4C4)2CACA(G4T4)3
Os resultados do gel são mostrados na Figura 31. As colunas 1
261 a 15 continham substratos com terminações de repetições teloméricas com ·· · · ··♦ | · · ··· · quatro resíduos G. As colunas 16 a 30 continham siésfirafcjsTcoínÍ£rnÍifraç*®£s • *· ·· · ··· ·»· · * de repetições teloméricas, com quatro resíduos T. O alinhamento putativo no padrão de RNA de telomerase é indicado na Figura 32. Foi considerado que os conjuntos de iniciadores temperam em duas posições muito diferentes no gabarito mostrado na Figura 32 (isto é, Painel A e Painel B, respectivamente). Isto pode ter afetado sua taxa de ligação e/ou alongamento.
A Figura 33 mostra uma exposição mais clara das colunas 25 a 30 da Figura 31. A exposição mais clara da Figura 33 foi tomada para permitir visualização dos nucleotídeos que são adicionados e as posições de pausa nos produtos alongados. O percentual de substrato alongado para a terceira coluna em cada conjunto foi quantificado em um Phosphorlmager, como indicado no fundo da Figura 31.
As eficiências do substrato para estes grampos de cabelo foram comparadas com substratos semelhantes a telômeros de filamento duplo, com projeções de diferentes comprimentos. Um substrato modelo que terminava com quatro resíduos G (ber as colunas 1 a 15 da Figura 31), não foi alongado quando ele terminava embotado (ver colunas 1 a 3). No entanto, leve extensão foi observada com um comprimento da projeção de duas bases; o alongamento tomou-se eficiente quando a projeção era de pelo menos 4 bases de comprimento. A telomerase atuou de uma maneira semelhante com um substrato de duplo filamento, que terminou com quatro resíduos T, com uma projeção de 6 bases requerida para alongamento altamente eficiente. Na Figura 31, as bandas débeis abaixo dos iniciadores nas colunas 10 a 15, que são independentes de telomerase, representam oligonucleotídeos mais curtos nas preparações do iniciador.
A exposição mais clara das colunas 25 a 30 na Figura 33 mostra uma escada de produtos alongados, com as bandas mais escuras correlacionando-se com os limites putativos de 5 ’ do padrão [como descrito
262
ΑοΥ por Lingner et al., Genes Develop., 8: 1984 (1994)]. A abundância dos ·· · · ··· · · · ··· · produtos que correspondem às outras posições ncj*f>aÍirãÍ>/sugeFHiÍií*qiÍe: a pausa e/ou a dissociação ocorrem nos sítios diferentes do sítio de translocação com a telomerase purificada.
Como mostrado na Figura 31, os oligonucleotídeos de terminações embotadas, não eram substratos para a telomerase. Para determinar se estas moléculas ligavam com a telomerase, uma experiência de competição foi realizada. Nesta experiência, 2 nM de substrato rotulado de extremidade 5’ com a sequência (G4T4)2, ou um substrato em grampo de cabelo com uma projeção de seis bases, foi estendido com 0,125 mM de telomerase (Figura 31, colunas 25 a 27). Não obstante os mesmos substratos de oligonucleotídeo não rotulados competissem eficientemente com o substrato rotulado quanto à extensão, nenhuma redução da atividade foi observada quando os oligonucleotídeos em grampos de cabelo de extremidade embotada de duplo filamento foram usados como competidores, mesmo na presença de grampos de cabelo em excesso centuplicado.
Estes resultados indicaram que os oligonucleotídeos de extremidades embotadas, de duplo filamento, não se podem ligar à telomerase nas concentrações e condições analisadas neste exemplo. Ao F invés, uma extremidade 3’ de filamento único é requerida para a ligação. E provável que esta extremidade 3’ seja requerida para par de base com o padrão de RNA de telomerase.
K. CLONAGEM E SEOUENCIACÃO DO POLIPEPTÍDEO DE 123 kDa
Neste exemplo, a clonagem do polipeptídeo de 123 kDa de telomerase de Euplotes (isto é, a subunidade proteínica de 123 kDa) é descrita. Neste estudo, um fragmento interno do gene de telomerase foi ampliado por PCR, com os iniciadores de oligonucleotídeos projetados para unir sequências de peptídeos, que foram obtidos do polipeptídeo purificado obtido na Parte D, acima. A sequência de polipeptídeos foi determinada
263 <36> $ usando-se os processos de espectroscopia de massa nanoES tandem, ·· · 4 ··· · * 4 ··* 4 * 4 * · ·· 4 4 4 4 4 * conhecidos na técnica e descritos por Calvio et 724·;733’(Πί)ξ>$).
Os iniciadores de oligonucleotídeos usados neste exemplo tinhas as seguintes sequências, com as posições que foram degeneradas mostradas em parênteses: 5’-TCT(G/A)
AA(G/A)TA(G/A)TG(T/G/A)GT(G/A/T/C)A(T/G/A)(G/A)TT(G/A)TTCAT-3’,e ’-GCGGATCCATGAA(T/C)CC(A/T)GA(G/A)AA(T/C)CC(A/T) AA (T/C)GT-3 ’.
Uma reação de 50 μΐ continha dNTPs 0,2 mM, 0,15 pg de DNA cromossômico de E. aediculatus, 0,5 μΐ Taq (Boehringer-Mannheim), 0,8 pg de cada iniciador, e lx de tampão de reação (Boehringer-Mannheim). A reação foi incubada em um dispositivo de termociclagem (Perkin-Elmer), usando-se o seguinte: 5 minutos a 95°C, seguidos por 30 ciclos de 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 52°C e 2 minutos a 72°C. A reação foi completada por uma incubação de 10 minutos a 72°C.
Uma coleção de DNA genômico foi preparada do DNA cromossômico de E. aediculatus, mediante clonagem de DNA de extremidade embotada, no sítio Smá\. do vetor plasmídeo pCR-Script, Figura 14 (Stratagene). Esta coleção foi examinada por hibridização de colônia, com o produto de PCR radiorrotulado purificado em gel. O DNA plasmídeo de clones positivos foi preparado e sequenciado pelo processo dideóxi [Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sei., 74: 5463 (1977)] ou manualmente, através do uso de um sequenciador automático (ABI). A sequência do DNA do gene codificando este polipeptídeo é mostrada na Figura 13. O códon de partida nesta sequência inferida da sequência de DNA, está localizado na posição 101 do nucleotídeo, e a estrutura de leitura aberta termina na posição 3193. O código genético de Euplotes difere dos outros organismos em que o códon “UGA” codifica um resíduo de cisteína. A sequência de aminoácidos do polipeptídeo inferido da sequência de DNA é mostrada na Figura 14, e considera que nenhum aminoácido incomum é inserido durante a translação e
264 nenhuma modificação pós-translacional ocorre.
·· · · ··· · · · ··· ·
L. CLONAGEM E SEOUENCIACÃO DO POLIPÊPTÍDÉ©· DE 43 küà: H ......~ T i----Β B4 B BB4 »*« BBB--W ·
Neste exemplo, a clonagem do polipeptídeo de 43 kDa de telomerase (isto é, a subunidade proteínica de 43 kDa) é descrita. Neste estudo, um fragmento interno do gene de telomerase correspondente foi ampliado por PCR, com os iniciadores de oligonucleotídeo projetados para unir sequências de peptídeos que foram obtidas do polipeptídeo purificado obtido na Parte D, acima. A sequência de polipeptídeos foi determinada usando-se os processos de espectroscopia de massa nanoEs tandem, conhecidos na técnica e descritos por Calvio et al., supra. Os iniciadores de oligonucleotídeos usados neste exemplo tinha as seguintes sequências: 5’NNNGTNAC(C/T/A)GG(C/T/A)AT(C/T/A) AA(C/T)AA-3’, e 5’(T/G/A)GC(T/G/A)GT(C/T)TC(T/C)TG(G/A)TC (G/A)TT(G/A)TA-3 ’.
Neste sequência, “N” indica a presença de qualquer dos quatro nucleotídeos (isto é, A, T, G ou C). O PCR foi realizado como descrito na parte K.
Uma coleção de DNA genômico foi preparada e analisada como descrito na Parte K. A sequência de DNA do gene codificando este polipeptídeo é mostrada na Figura 34. Três estruturas potenciais de leitura são mostradas para esta sequência, como mostrado na Figura 35. Para clareza, a sequência de aminoácido é indicada abaixo da sequência de nucleotídeos em todos as três estruturas de leitura. Estas estruturas de leitura são designadas como “a”, “b” e “c”. Um possível códon de partida é codificado na posição 84 do nucleotídeo na estrutura de leitura “c”. A região de codificação deve terminar na posição 1501 na estrutura de leitura “b”. Os códons de interrupção primitivos, indicados por asteriscos nesta figura, ocorrem em todas as três estruturas entre as posições 337 a 350 de nucleotídeos.
O “domínio La” é indicado em tipo de face em negrito. Ainda a jusante, a sequência proteínica parece ser codificada por estruturas de
265 ·· leitura diferentes, já que nenhuma das três estruturas é interrompida por ··· · · · ··· ·
- - · ·· · · · · · · códons de interrupção. Além disso, as sequênciaá*de:p*eptí*dets.da*pfâtèíha purificada são colocadas e, todas as três estruturas. Portanto, este gene parece conter sequências intervenientes ou, na alternativa, o RNA é editado. Outras possibilidades incluem a substituição da estrutura ribossômica ou erros da sequência. No entanto, a homologia à sequência de proteína La permanece de significativo interesse. Novamente, em Euplotes, o códon “UGA” codifica um resíduo de cisteína.
M. COMPARAÇÕES DE AMINOÁCIDOS E ÁCIDOS NUCLEICOS
Neste exemplo, as comparações entre as várias sequências relatadas e as sequências dos polipeptídeos da subunidade de telomerase de 123 kDa e 43 kDa foram produzidas.
i) COMPARAÇÕES COM A SUBUNIDADE DE TELOMERASE DE E. AEDICULATUS DE 123 kDa.
A sequência de aminoácido do polipeptídeo de Euplotes aediculatus de 123 kDa foi comparada com a sequência da subunidade proteínica de telomerase de 80 kDa de Tetrahymena thermophila (acesso U25641 do GenBank), para examinar sua similaridade. A sequência de nucleotídeos como obtida do GenBank, codificando esta proteína, é mostrada na Figura 42. A sequência de aminoácidos deste proteína, como obtida do GenBank, é mostrada na Figura 43. A comparação da sequência entre a E. aediculatus de 123 kDa e T. thermophila de 80 kDa, é mostrada na Figura 36. Nesta figura, a sequência de aediculatus é a sequência superior, enquanto a sequência T. thermophila é a sequência inferior. A identidade observada foi determinada como sendo de aproximadamente 19%, enquanto a similaridade percentual foi de aproximadamente 45%, valores similares ao que deve ser observado com qualquer sequência proteínica aleatória. Nas Figuras 36 a 39, as identidades são indicadas por barras verticais, enquanto os pontos simples entre as sequências indicam aminoácidos um tanto semelhantes, e os pontos
266
ÜA1 duplos entre as sequências indicam aminoácidos mais semelhantes.
·· · · ·«· ♦ · ···· 4
·.· 4 ·· · ·· ······
A sequência de aminoácidos db’ polibeptíüeo* .Eünlbtes * · 4 4·1 · A ··· ··· ··· 4· aediculatus de 123 kDa também foi comparada com a sequência da subunidade proteínica de telomerase de 95 kDa de Tetrahymena thermophila (acesso U25642 do GenBank), para examinar sua similaridade. A sequência de nucleotídeos, conforme obtida do GenBank, codificando esta proteína, é mostrada na Figura 44. A sequência de aminoácidos desta proteína, como obtida do GenBank, é mostrada na Figura 45. Esta comparação de sequências é mostrada na Figura 37. Nesta figura, a sequência de E. aediculatus é a sequência superior), enquanto a sequência de T. thermophila é a sequência inferior. A identidade observada foi determinada como sendo de aproximadamente 20%, enquanto a similaridade percentual foi de aproximadamente 43%, valores similares ao que deve ser observado com qualquer sequência aleatória de proteínas.
Significativamente, a sequência de aminoácidos do polipeptídeo de E. aediculatus de 123 kDa, contém os cinco motivos característicos de transcriptases reversas. O polipeptídeo de 123 kDa também foi comparado com os domínios da polimerase de várias transcriptases reversas. A Figura 40 mostra o alinhamento do polipeptídeo de 123 kDa com o homólogo putativo de levedura (L8543.12 ou ESTp). A sequência de aminoácidos de L8543.12 obtida do GenBank, é mostrada na Figura 46.
Quatro motivos (A, B, C e D) foram incluídos nesta comparação. Nesta Figura 40, resíduos altamente conservados são indicados por letras brancas sobre um fundo preto. Os resíduos das sequências de E. aediculatus, que são conservados na outra sequência, são indicados em negrito; o “h” indica a presença de um aminoácido hidrofóbico. Os numerais localizados entre os resíduos de aminoácidos dos motivos, indicam o comprimento dos intervalos nas sequências. Por exemplo, o “100” mostrado entre os motivos A e B refletem um intervalo de 100 aminoácidos na
267 sequência entre os motivos.
·· · « ··· · · · ··· * • · J ·· ··· ····<· ·
Como notado acima, as pesquisas do’ (SenÈánkl identificaram uma proteína de levedura (Acesso u20618 do GenBank), e o gene L8543.12 (Est2) contendo ou codificando a sequência de aminoácidos que mostra alguma homologia à subunidade de telomerase de 123 kDa da E. aediculatus. Com base nas observações de que ambas as proteínas contêm motivos de transcriptase reversa em suas regiões C-terminais; ambas as proteínas compartilham similaridade em regiões fora do motivo de transcriptase reversa; as proteínas são de forma semelhante básicas (pl = 10,1 para E. aediculatus e pl = 10,0 para a levedura); e ambas as proteínas são grandes (123 kDa para E. aediculatus e 103 kDa para a levedura), estas sequências compreendem o núcleo catalítico de suas telomerases respectivas. Foi considerado, com base nesta observação da homologia em dois organismos filogeneticamente distintos como E. aediculatus e levedura, que a telomerase humana deve conter uma proteína que tenha as mesmas características [isto é, motivos de transcriptase reversa, são básicos e grandes (> 100 kDa)].
ii) COMPARAÇÕES COM A SUBUNIDADE DE TELOMERASE DE E. AEDICULATUS DE 43 kDa
A sequência de aminoácidos do “domínio La” do polipeptídeo de Euplotes aediculatus de 43 kDa, foi comparada com a sequência da subunidade proteínica da telomerase de 95 kDa de Tetrahymena thermofila (descrita acima), para examinar sua similaridade. Esta comparação de sequências é mostrada na Figura 38, embora a sequência de T. Thermophila é a sequência inferior. A identidade observada foi determinada como sendo de aproximadamente 23%, enquanto a similaridade percentual foi de aproximadamente 46%, valor similar ao que deve ser observado com qualquer sequência proteínica aleatória.
A sequência de aminoácidos do “domínio La” do polipeptídeo de Euplotes aediculatus foi comparada com a sequência da subunidade
268
JA3 proteínica da telomerase de 80 kDa de Tetrahymena thermofila (descrita ·· · · *·· · v · »·· V • · » · · · ·· ····· « acima), para examinar sua similaridade. Esta corhpa£a£ã(f dj. S&UlHíhM é mostrada na Figura 39. Nesta figura, a sequência de E. aediculatus é a sequência superior, enquanto a sequência de T. thermophila é a sequência inferior. A identidade observada foi determinada como sendo de enquanto a similaridade percentual foi de valor similar ao que deve ser observado com aproximadamente 26%, aproximadamente 49%, qualquer sequência proteínica aleatória.
A sequência de aminoácidos de um domínio do polipeptídeo de E. aediculatus de 43 kDa também foi comparada com as proteínas La de vários outros organismos. Estas comparações são mostradas na Figura 41. Nesta figura, os resíduos altamente conservados são indicados por letras brancas sobre um fundo preto. Os resíduos das sequências de E. aediculatus, que são conservados na outra sequência, são indicados em negrito.
N. IDENTIFICAÇÃO DAS SUBUNIDADES PROTEÍNICAS DE
TELOMERASE EM OUTRO ORGANISMO
Neste exemplo, as sequências identificadas nos exemplos anteriores acima, foram usadas para identificar as subunidades proteínicas de telomerase de Oxytricha trifallax, um ciliato que é muito de longe relacionado com E. aediculatus. Os iniciadores foram escolhidos com base na região conservada do polipeptídeo de 123 kDa de E. aediculatus, que compreendia os motivos do domínio da transcriptase reversa. Iniciadores adequados foram sintetizados e usados em uma reação de PCR com DNA total de Oxytricha. O DNA de Oxytricha foi preparado de acordo com processos conhecidos na técnica. Os produtos de PCR foram então clonados e sequenciados, usando-se processos conhecidos na técnica.
As sequências de oligonucleotídeos usadas como os iniciadores, foram como segue:
’-(T/C)A(A/G)AC(T/A/C)AA(G/A)GG(T/A/C)AT(T/C)CC(C/T/A) (C/T)A(G/A)GG-3 ’ e
269 <2ΛΗ 5’-(G/A/T)GT(G/A/T)ATNA(G/A)NA(G/A)(G/A) TA(G/A)TC(G/A)TC-3 ’).
»> * * *«· ♦ · * ·** ·
As posições que foram degeneradas são mostradas’ em'jôarêniesèss; conràs bases alternativas mostradas dentro de parênteses. “N” representa qualquer um dos quatro nucleotídeos. Na reação PCR, uma reação de 50 μΐ continha dNPs 0,2 mM, 0,3 μg de DNA cromossômico de Oxytricha trifallax, 1 μΐ de polimerase Taq (Boehringer-Mannheim), 2 micromolares de cada iniciador, tampão de reação de lx (Boehringer-Mannheim). A reação foi incubada em dispositivo de termociclagem (Perkin-Elmer), sob as seguintes condições: 5 minutos a 95°C, 30 ciclos consistindo de 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 53°C e minuto a 72°C, seguidos por uma incubação de 10 minutos a 72°C. O produto de PCR foi purificado em gel e sequenciado pelo processo dideóxi (por exemplo, Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 74, 5463-5467 (1977).
A sequência de aminoácidos deduzida do produto de PCR foi determinada e comparada com a sequência de E. aediculatus. A Figura 47 mostra o alinhamento destas sequências, com a sequência de O. trifallax mostrada na fila do topo, e a sequência de E. aediculatus mostrada na fila do fundo. Como pode ser observado desta figura, existe uma grande quantidade de homologia entre a sequência de polipeptídeos de O. trifallax, identificada neste Exemplo, com a sequência de polipeptídeos de E. aediculatus. Assim, fica claro que as sequências identificadas na presente invenção são úteis para a identificação das subunidades proteínicas homólogas de telomerase em outros organismos eucarióticos. Realmente, o desenvolvimento da presente invenção identificou sequências homólogas de telomerase em espécies múltiplas diversas, como aqui descrito.
O. IDENTIFICAÇÃO DAS SEQUÊNCIAS DETELOMERASE DE TETRAHYMENA
Neste exemplo, um clone de Tetrahymena foi produzido, o qual compartilha homologia com as sequências de Euplotes, e EST2p.
Esta experiência utilizou PCR com iniciadores de
270 oligonucleotídeos degenerados, dirigidos contra motivos conservados, para ·· * * tf*'» ♦ · · ··· · • · · · · · *· *·!»·· · identificar regiões de homologia entre as sequênciayTá/râhf7nd^a;’jEttj97<ííH e EST2p. O processo de PCR usado neste exemplo é um novo processo delineado para ampliar especificamente as sequências de DNA das misturas complexas. Este processo evita o problema de ampliação de produtos de DNA com o mesmo iniciador de PCR em ambas as extremidades (isto é, produtos de iniciador único) comumente encontrado em processos de clonagem de PCR. Estes produtos de iniciador único produzem produtos de formação indesejáveis e podem, com frequência, obscurecer a ampliação e detecção do produto de dois iniciadores desejáveis. O processo usado nesta experiência preferivelmente seleciona produtos de dois iniciadores. Em particular, um iniciador é biotinilado e o outro não o é. Após várias séries de ampliação de PCR, os produtos são purificados usando-se contas magnéticas de estreptavidina, e os produtos de dois iniciadores são especificamente eluídos usando-se desnaturação térmica. Este processo encontra uso em montagens outras que não as experiências descritas neste exemplo. Realmente, este processo encontra uso em aplicação em que se deseja especificamente ampliar sequências raras de DNA, incluindo as etapas preliminares nos processos de clonagem, tais como 5’ e 3; RACE, e qualquer processo que use iniciadores degenerados em PCR.
Uma primeira série foi conduzida usando-se DNA macronuclear padrão de Tetrahymena isolado usando-se processos conhecidos na técnica, e iniciador dianteiro 24-mer com a sequência de 5’ biotina-GCCTATTT(TC)TT(TC)TA(TC)(GATC)(GATC)(GATC)AC (GATC)GA-3’ designado como “K231”, correspondente à região FFYXTE, e o iniciador reverso de 23-mer com a sequência 5’CCAGATAT(GATC)A(TGA)(GATC)A(AG)(AG)AA(AG)TC(AG)TC-3’, designado como “K220”, correspondente à região DDFL(FIL)I. Esta reação do PCR continha 2,5 μΐ de DNA (50 ng), 4 μΐ de cada iniciador (20 μΜ), 3 μΐ
271
ΙΟχ tampão de PCR, 3 μΐ lOx dNTPs, 2 μΐ Mg, 0,3 μΐ de Taq e 11,2 μΐ de dH,O. A mistura foi submetida a 8 ciclos de 94°C por H^^eéúiidos, 37?Ttwr 45 segundos, e 72°C por 1 minuto.
Esta reação de PCR foi ligada a 200 μΐ de contas magnéticas de etreptavidina, lavadas com 200 μΐ de TE, recolocado em suspensão em 20 μΐ de dH2O e, depois, desnaturado termicamente por ebulição a 100°C durante 2 minutos. As contas foram extraídas e o eluado removido. Então, 2,5 μΐ deste eluato foi subsequentemente re-ampliado, usando-se as condições acima, com a exceção sendo que 0,3 μΐ de oc-32P dATP foi incluído, e o PCR foi realizado por 33 ciclos. Esta reação foi realizada em um gel de poliacrilamida de desnaturação a 5%, e a região apropriada foi cortada do gel. Estes produtos foram então re-ampliados por um adicional de 34 ciclos, sob as condições listadas acima, com a exceção sendo que uma temperatura de têmpera de 42°C foi usada.
Uma segunda operação do PCR foi conduzida usando-se padrão de DNA macronuclear de Tetrahymena isolado usando-se processos conhecidos na técnica, e o iniciador dianteiro de 23-mer com a sequência 5’ACAATG(CA)G(GATC)(TCA)T(GATC)(TCA)T (GATC)CC(GATC)AA(AG)AA-3’, DESIGNADO COMO “K228”, correspondente à região R(LI)(LI)PKK, e um iniciador reverso com a sequência 5’-ACGAATC(GT)(GATC)GG(TAG)AT(GATC)(GC)(TA) (AG)TC(AG)TA(AG)CA-3’, designada “K224”, correspondente à região CYDSIPR. Esta reação do PCR continha 2,5 μΐ de DNA (50 ng), 4 μΐ de cada iniciador (20 μΜ), 3 μΐ lOx tampão de PCR, 3 μΐ lOx dNTPs, 2 μΐ Mg, 0,3 μΐ α-32Ρ dATP, 0,3 μΐ Taq, e 10,9 μΐ de dH2O. Esta reação foi desenvolvida em um gel de poliacrilamina de desnaturação a 5%, e a região apropriada foi cortada do gel. Estes produtos foram re-ampliados poro um adicional de 34 ciclos, sob as condições listadas acima, com a exceção sendo que uma temperatura de têmpera de 42°C foi usada.
272
Dez μΐ do produto de reação do desenvolvimento 1 foram * r J ·«··<····· ··· · • · · · · ········ · ligados a contas magnéticas revestidas de estreptavíSirfe sms2Qd puLdE T.E. Âs contas foram lavadas com 200 μΐ de TE, e depois recolocadas em suspensão em 20 μΐ de dH2O, desnaturadas a quente, e o eluato foi removido. O produto 5 de reação do desenvolvimento 2 foi então adicionado às contas e diluídos com 30 μΐ de 0,5x SSC. A mistura foi aquecida de 94°C a 50°C. O eluato foi removido e as contas foram lavadas por três vezes em 0,5x SSC a 55°C. As contas foram então recolocadas em suspensão em 20 μΐ de dH2O, desnaturada a quente, e o eluato foi removido, designado como “eluato do round 1”, e 10 salvo.
Para isolar a banda Tetrahymena, o eluato de round 1 foi reampliado com o iniciador dianteiro K228 e o iniciador reverso K227 com a sequência 5’-CAATTCTC(AG)TA(AG)CA(GATC)(CG)(TA) (CT)TT(AGT) AT(GA)TC-3’, correspondente à região DIKSCYD. As reações de PCR 15 foram conduzidas como descrito acima. Os produtos de reação foram desenvolvidos em um gel de poliacrilamida a 5%; a banda correspondente a aproximadamente 295 nucleotídeos foi cortada do gel e sequenciada.
O clone designado como 168-3 foi sequenciado. A sequência de DNA (incluindo as sequências de iniciadores) foi observada ser: GATTACTCCCGAAGAAAGGATCTTTCCGTCCAATCATGACTTTCTTAAGAAA GGACAAGCAAAAAAATATTAAGTTAAATCTAAATTAAATTCTAATGGATAG CCAACTTGTGTTTAGGAATTTAAAAGACATGCTGGGATAAAAGATAGGATA CTCAGTCTTTGATAATAAACAAATTTCAGAAAAATTTGCCTAATTCATAGAG AAATGGAAAAATAAAGGAAGACCTCAGCTATATTATGTCACTCTAGACATA AAGACTTGCTAC.
A sequência adicional deste gene foi obtida por PCR usandose um iniciador único projetado para unir a sequência do 168-3 (“K297” com a sequência 5’-GAGTGACATAATATACGTGA-3’; e o iniciador K231 (FFYXTE). A sequência do fragmento obtido desta reação, juntamente com 168-3, é como segue (sem as sequências do iniciador):
273
AAACACAAGGAAGGAAGTCàAATATTCTATTACCGTAAAQCAATATÇQM ·· · ·· ··· ···· · · • · · ·····
AITAGTGAGTAAAITAACTAITGTCAAAGTAAGAÁYltAStrTtCftaVíÁÂtS AATAAATAAATGAAAAATAATTTTTATCAAAAAATTTAGCTTGAAGAGGAG AATTTGGAAAAAGTTGAAGAAAAATTGATACCAGAAGATTCATTTTAGAAA TACCCTCAAGGAAAGCTAAGGATTATACCTAAAAAAGGATCTTTCCGTCCA ATCATGACTTTCTTAAGAAAGGAGAAGCAAAAAAATATTAAGTTAAATCTA AATTAAATTCTAATGGATAGCCAACTTGTGTTTAGGAATTTAAAAGACATG
CTGGGATAAAAGATAGGATACTCAGTCTTTGATAATAAACAAATTTCAGAA AAATTTGCCTAATTCATAGAGAAATGGAAAAATAAAGGAAGACCTCAGCTA TATTATGTCACTCTA.
A sequência de aminoácidos correspondente a este fragmento de DNA foi observada ser:
KHKEGSQIFYYRKPIWKLVSKLTIVKVRIQFSEKNKQMKNNFYQKIQLEEENLE KVEEKLIPEDSFQKYPQGKLRIIPKKGSFRPIMTFLRKDKQKNIKLNLNQILMDS QLVFRNLKDMLGQKIGYSVFDNKQISEKFAQFIEKWKNKGRPQLYYVTL.
Esta sequência de aminoácidos foi então alinhada com outros genes de telomerase (EST2p, e Euplotes). O alinhamento é mostrado na 5 Figura 53. Uma sequência de consenso também é mostrada nesta Figura.
P. IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIAS DE TELOMERASE DE SCHIZOSA CCHAROMYCES POMBE
Neste exemplo, a sequência tezl de S. pombe foi identificada como um homólogo do E. aediculatus p 123, e S. cerevisiae Est2p.
A Figura 55 provê um sumário global destas experiências.
Nesta Figura, a porção do topo (Painel A) mostra o relacionamento de dois clones genômicos de sobreposição, e a porção de 5825 pares de base que foi sequenciada. A região designada em “tezE” é a região de codificação proteínica, com as sequências de flanco indicadas também, a caixa sob a região de 5825 pares de base é um fragmento de aproximadamente 2 kb HindTÍI, que foi usada para produzir a construção da ruptura de tazl, como
274
ÜT0 descrito abaixo.
·· · · ··· · · · ····
A metade do fundo da Figura 55 (PÍihi jé’úh?ÃJds£:iÍpf esquemático desta mesma região de DNA. A sequência designada como “PCR original” é o fragmento original de PCR degenerado, que foi gerado 5 com um par de iniciadores de oligonucleotídeos degenerados designados com base no motivo 4 da sequência de Euplotes (B’) e motivo 5 (C), como descrito.
i) PCR COM INICIADORES DEGENERADOS
O PCR usando iniciadores degenerados foi usado para se encontrar o homólogo do E. aediculatus pl23 em S. pombe. A Figura 56 apresenta as sequências dos iniciadores degenerados (designadas como “poli 4” e “poli 1”), usadas nesta reação. As séries de PCR foram conduzidas usando-se o mesmo tampão, como descrito nos exemplos anteriores (ver, por exemplo, a Parte K, acima), com um tempo ascendente de 5 minutos a 94°C, seguido por 30 ciclos de 94°C por 30 segundos, 50°C por 45 segundos, e 72°C por 30 segundos, e 7 minutos a 72°C, seguido por armazenagem a 4°C. As séries de PCR foram conduzidas usando-se condições variadas (isto é, várias concentrações de DNA de S. pombe e concentrações de MgCl2). Os produtos de PCR foram desenvolvidos em géis de agarose e manchados com “20 brometo de etídio, como descrito acima. Várias séries de PCR resultaram na produção de três bandas (designadas como “T”, “M” e “B”). Estas bandas foram re-ampliadas e desenvolvidas em géis usando-se as mesmas condições descritas acima. Quatro bandas foram observadas seguindo-se esta reampliação (“T”, “Ml”, “M2” e “B”), como mostrado na Figura 57. Estas quatro bandas foram então re-ampliadas usando-se as mesmas condições descritas acima. A terceira banda do topo da coluna na Figura 57, foi identificada como contendo a sequência correta para uma proteína de telomerase. O produto de PCR designado como M2 foi observado mostrar uma união razoável com outras proteínas de telomerase, como indicado na
275
J-W
Figura 58. Além do alinhamento mostrado, esta figura também mostra a ·· · · ··· · · · ··· · sequência real de tezl. Nesta figura, os asteàsc(js:.jLijdicjaip: jpê^dtjs • · ·· · ··· ··· ··· · · partilhados com todas as quatro sequências (Oxytricha “Ot”; E. aediculatus “Ea_pl23”. S. cerevisiae “Sc_pl03”; e M2), enquanto os círculos (isto é, os pontos) indicam resíduos de aminoácidos similares.
ii) PCR DA RT 3’
Para obter informação de sequências adicionais, o PCR da RT 3’ e 5’ foram conduzidos no candidato de telomerase identificado na Figura 58. A Figura 59 provê um esquema da estratégia de RT 3’ usada. Primeiro, o cDNA foi preparado de mRNA usando um iniciador de oligonucleotídeo “QT” (5-CCA GTG AGC AGA GTG ACG AGG ACT CGA GCT CAA GCT TTT TTT TTT TTT TT-3’), depois usando este cDNA como um padrão para PCR com “Qo” (5’-CCA GTG AGC AGA GTG ACG-3’), e um iniciador designado com base na reação original de PCR degenerado (isto é, “M2-T” com a sequência 5’-G TGT CAT TTC TAT ATG GAA GAT TTG ATT GAT G-3’). A segunda reação de PCR (isto é, PCR reunido) com “Qj” (5’-GAG GAC TCG AGC TCA AGC-3’), e outro iniciador de PCR designado com a sequência derivada da reação de PCR degenerado original ou “M2-T2” (5’AC CTA TCG TTT ACG AAA AAG AAA GGA TCA GTG-3’). Os tampões usados neste PCR foram os mesmos descritos acima, com ampliação conduzida começando com um ascendência de 94°C por 5 minutos, seguidos por 30 ciclos de 94°C por 30 segundos, 55°C por 30 segundos, e 72°C por 3 minutos, seguidos por 7 minutos a 72°C. Os produtos de reação foram armazenados a 4°C até a utilização.
iii) TRIAGENS DE COLEÇÕES GENÔMICAS E DE cDNA
Após obter esta informação adicional das sequências, várias coleções genômicas e de cDNA foram examinadas para se identificar qualquer coleções que contivessem este gene candidato de telomerase. A abordagem usada, bem como as coleções e resultados, são apresentados na
276
Figura 60. Nesta Figura, o Painel A relaciona as coleções analisadas nesta • · · · ··· · · · ···· experiência: o Painel B mostra as regiões usadas; pipòstrám • · ♦· · ··· ··· ··· · · os resultados de hibridização da mancha de pontos obtidos com estas coleções. As coleções positivas foram então triadas por hibridização de colônias para se obter a versão genômica e de cDNA do gene tezl. Nesta experiência, aproximadamente 3 x 104 colônias da coleção genômica HindW. foram triadas e seis clones positivos foram identificados (aproximadamente 0,01%). O DNA foi então preparado de dois clones independentes (A5 e B2). A Figura 61 mostra os resultados obtidos com os clones genômicos positivos A5 e B2 digeridos por ZfzwdlIL
Além disso, as coleções REP de cDNA foram usadas. Aproximadamente 3 x 105 colônias foram triadas, e 5 clones positivos foram identificados (0,002%). O DNA foi preparado de três clones independentes (2-3, 4-1 e 5-20). Nas últimas experiências, foi determinado que os clones 23 e 5-20 continham insertos idênticos.
iv)PCRDERT5’
Como a versão de cDNA do gene produzido neste ponto não estava completa, o PCR de RT 5’foi conduzido para se obter um clone de comprimento completo. A estratégia é esquematicamente apresentada na Figura 62. Nesta experiência, o cDNA foi preparado usando-se iniciador de oligonucleotídeo de DNA “M2-B” (5’-CAC TGA TCC TTT CTT TTT CGT AAA CGA TAG GT-3’) E “M2-B2” (5’-C ATC AAT CAA ATC TTC CAT ATA GAA ATG ACA-3’), delineados das regiões de tezl conhecidas identificadas previamente. Um PCR do ligador de oligonucleotídeo Adapt Sfil com uma extremidade 5’ fosforilada (“P”) (P-GGG CCG TGT TGG CCT AGT TCT CTG CTC-3’; foi então ligado na extremidade 3’ deste cDNA, e esta construção foi usada como o padrão para o PCR reunido. No primeiro round do PCR, o PCR Adapt SFI e M2-B foram usados como os iniciadores; enquanto o PCR Adapt SfiII (5-GAG GAG GAG AAG AGC AGA GAA
277
CTA GGC CAA CAC GCC CC-3’), e M2-B2 foram usados como iniciadores • · · · ··· · · · ···« no segundo round. O PCR reunido foi usado para apmântar:a’ êspecffitidaüe • · ·· · ··· ··· ··· · · da reação.
v) ALINHAMENTO DAS SEQUÊNCIAS
Uma vez a sequência de tezl ter sido identificada, ela foi comparada com as sequências previamente descritas. A Figura 63 mostra o alinhamento dos domínios de RT das subunidades catalíticas de telomerase de S. pombe (“S.p. Tezlp”), S. cerevisiae (“S.c. Est2p”) e E. aediculatus pl23 (“E.a. pl23”). Nesta figura, “h” indica resíduos hidrofóbicos, enquanto “p” indica pequenos resíduos polares, e “c” indica resíduos carregados. Os resíduos de aminoácidos indicados acima do alinhamento mostram um motivo de RT de consenso conhecido de Y. Xiong e T. H. Eickbush [Y. Xiong e T. H. Eickbush, EMBO J., 9: 3352-3362 (1990)]. Os asteriscos indicam os resíduos que são conservados para todas as três proteínas. O “motivo O” é aqui identificado e na Figura 63 como um motivo específico a esta subunidade de telomerase, e não encontrado em transcriptases reversas em geral. É, portanto, valioso na identificação de outras sequências de aminoácidos como subunidades catalíticas de telomerase.
A Figura 64 mostra o alinhamento das sequências inteiras de Euplotes (“Ea_pl23”), S. cerevisiae (“Sc_Est2p”) e S. pombe (“Sp_Tezlp”). No Painel A, as áreas sombreadas indicam resíduos compartilhados entre duas sequências. No Painel B, as áreas sombreadas indicam resíduos compartilhados entre todas as três sequências.
ví) ROMPIMENTO GENÉTICO DE tezl
Neste exemplo, os efeitos de rompimento de tezl foram examinados. Como a telomerase está envolvida na manutenção do telômero, foi feita a hipótese de que, se tezl fosse realmente um componente da telomerase, o rompimento de tezl deve causar encurtamento gradual do telômero.
278
Α>3>
Nestas experiências, a recombinação homóloga foi usada para ·· · · ··· · · · ··· · romper o gene tezl em S. pombe especificam$fte*· fejstâ • · ·· · ··· ··· ··· · · esquematicamente ilustrada na Figura 65. Como indicado na Figura 65, o tezl tipo selvagem foi substituído por um fragmento contendo o marcador ura4ou LEU2.
O rompimento do gene tezl foi confirmado por PCR (Figura 66), e uma mancha do Sul foi realizada para conferir quanto ao comprimento do telômero. A Figura 67 mostra os resultados da mancha do Sul para esta experiência. Tendo em vista que um sítio da enzima de restrição Apal está presente imediatamente adjacente à sequência telomérica em S. pombe, a digestão de Apal de preparações de DNA genômico de S. pombe permite análise do comprimento do telômero. Assim, o DNA de S. pombe foi digerido com Apal e os produtos da digestão foram desenvolvidos em um gel de agarose e sondados com uma sonda específica da sequência telomérica para determinar se os telômeros das células rompidas de S. pombe foram encurtados. Os resultados são mostrados na Figura 67. Destes resultados, ficou claro que o rompimento do gene tezl causou um encurtamento dos telômeros.
O. CLONAGEM E CARACTERIZAÇÃO DA PROTEÍNA E DO cDNA DA TELOMERASE HUMANA
Neste exemplo, a informação da sequência de ácido nucleico e de aminoácidos quanto à telomerase humana, foi determinada. Sequências parciais homólogas foram primeiro identificadas em uma busca de BLAST, conduzida usando-se as sequências de peptídeos e ácido nucleico de Euplotes de 123 kDa, bem como proteína de Schizosaccharomyces e cDNA correspondente (tezl). As sequências humanas (também referidas como “hTCPl.l” foram identificadas de um clone de cDNA parcial (clone 712562). As sequências deste clone foram alinhadas com as sequências determinadas como descrito nos Exemplos anteriores.
279
A Figura 1 mostra o alinhamento das sequências de Euplotes (“pl23”), Schizosaccharomyces (“tezl”), Est2p (isto:é,:.:a*pipt&rna: :S.
• · ·· · ·«· ··· ··· · · cerevisiae codificada pela sequência de ácido nucleico Est2, e também referida até aqui como “L8543.12”), e o homólogo humano identificado nesta busca de comparação. A Figura 51 mostra a sequência de aminoácido de tezl, enquanto a Figura 52 mostra a sequência de DNA de tezl. Na Figura 52, os introns e outras regiões de não codificação, são mostrados em caixa baixa, enquanto os exons (isto é, as regiões de codificação) são mostradas em caixa alta.
Como mostrado nas figuras, existem regiões que são altamente conservadas entre estas proteínas. Por exemplo, como mostrado na Figura 1, existem regiões de identidade nos “Motivo 0”, “Motivo 1”, “Motivo 2” e “Motivo 3”. Os aminoácidos idênticos são indicados com um asterisco (*), enquanto os resíduos de aminoácidos similares são indicados por um círculo (·). Isto indica que existem regiões dentro dos motivos de telomerase que são conservadas entre uma ampla variedade de eucariotes, variando de levedura a ciliados a seres humanos. Considera-se que organismos adicionais conterão da mesma forma tais regiões conservadas da sequência. A Figura 49 mostra a sequência parcial de aminoácidos dos motivos de telomerase humana, enquanto a Figura 50 mostra a sequência de DNA correspondente.
A sequenciação de dideóxi de Sanger e outros processos foram usados, como conhecido na técnica, para obter informação completa da sequência do clone 712562. Alguns dos iniciadores usados na sequenciação são mostrados na Tabela 7. Estes iniciadores foram designados para hibridizar o clone, com base na complementaridade da sequência, ou para a sequência de plasmídeos da espinha dorsal, ou a sequência do inserto de cDNA humano no clone.
TABELA 7. Iniciadores
280
331 Iniciador Sequênciç: ‘1··?: ’***·
TCP1.1 * · · GTGAAGGCACTGTTCAGCG
TCP 1.2 GTGGATGATTTCTTGTTGG
TCP 1.3 ATGCTCCTGCGTTTGGTGG
TCP 1.4 CTGGACACTCAGCCCTTGG
TCP 1.5 GGCAGGTGTGCTGGACACT
TCP 1.6 TTTGATGATGCTGGCGATG
TCP 1.7 GGGGCTCGTCTTCTACAGG
TCP 1.8 CAGCAGGAGGATCTTGTAG
TCP1.9 TGACCCCAGGAGTGGCACG
TCP1.10 TCAAGCTGACTCGACACCG
TCP1.11 CGGCGTGACAGGGCTGC
TCP1.12 GCTGAAGGCTGAGTGTCC
TCP1.13 TAGTÇCATGTTCACAATCG
Destas experiências, foi determinado que o inserto de EcoRINotl do clone 712562 contém apenas uma estrutura de leitura aberta parcial para a proteína da telomerase humana, embora ela possa codificar um fragmento ativo daquela proteína. A estrutura de leitura aberta no clone 5 codifica uma proteína de aproximadamente 63 kD. A sequência da mais longa estrutura de leitura aberta identificada é mostrada na Figura 68. A ORF começa no códon ATG com a “met” indicada na Figura. A cauda poli A na extremidade 3’ da sequência também é mostrada. A Figura 69 mostra uma tentativa de alinhamento preliminar das proteínas de transcriptase reversa da 10 telomerase da sequência humana (Proteína do Núcleo da Telomerase humana
1, “Hs TCP1”, E. aediculatus pl23 (“Ep pl23)”, S. pombe tezl (“Sp Tezl”),
S. cerevisiae EST2 (Sc Est2”), e sequência de consenso. Nesta figura, vários motivos são indicados.
Para se obter um clone de tamanho completo, a sondagem de
281 uma coleção de cDNA e 5’-RACE foram usados para obter clones ·· · · ··· · · · ··· · codificando porções das regiões previamentd»: êe&jlíftiáila^?
• · ♦· · ··· ··· ··· · · experiências, RACE (Ampliação Rápida de Extremidades de cDNA; ver, por exemplo, Μ. A. Frohman, “RACE: Rapid Amplification of cDNA Endsf em Innis et al. (eds.), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (1990), pp. 28-38; e Frohman et al., Proc. Natl. Acad. Sei., 85: 8998-9002 (1988), foi usado para gerar material para análise de sequências. Quatro de tais clones foram gerados e usados para prover informação de sequências 5’ adicionais (pFWRP5, 6, 19 e 20).
Além disso, as coleções de cDNA humano Inserido em lambda) foram sondadas com o fragmento EcoRI-Notl do clone. Um clone lambda, designado “lambda 25-1.1” (acesso 209024 da ATCC), foi identificado como contendo sequências complementares. A Figura 75 mostra um mapa de restrição para este clone lambda. O inserto de cDNA humano deste clone foi subclonado como um fragmento de restrição EcoRI no sítio
EcoRl do fagemídeo comercialmente disponível pBluescriptIISK + (Stratagene), para criar o plasmídeo “pGRN121”, que foi depositado com a ATCC (acesso 209016 da ATCC). Os resultados preliminares indicaram que o plasmídeo pGRN121 contém a sequência inteira da estrutura de leitura aberta (ORF) codificando a proteína de telomerase humana. O inserto de cDNA do plasmídeo pGRN121 foi sequenciado usando-se técnicas conhecidas nesta ciência. A Figura 70 provê um sítio de restrição e um mapa de função do plasmídeo pGRN121 identificado com base neste trabalho preliminar. Os resultados desta análise preliminar da sequência são mostrados na Figura 71. Desta análise, e como conhecido na Figura 70, um sítio de partida putativo para a região de codificação, foi identificado em aproximadamente 50 nucleotídeos do sítio EcoRI (localizado na posição 707), e a locação dos motivos específicos de telomerase, “FFYVTE”, “PKP”, “AYD”, “QG” E “DD”, foram identificados, além de um sítio putativo de
282 • ··· · · · ··· * interrupção no nucleotídeo 3571 (Ver Figura 72, que mostra o DNA e as ·· sequências correspondentes de aminoácidos para :a‘s :eátiuturisl«àq‘:lélíii^ • · ·· · ·«· ··· ··· · · aberta na sequência (“a”, “b” e “c”). No entanto, devido à natureza preliminar do trabalho antecipado de sequenciação, as estruturas de leitura para os vários motivos foram verificados não estarem em alinhamento.
A análise adicional conduzida no pGRN121 indicou que o plasmídeo continha porções significativas da extremidade 5’ da sequência de codificação não presente no clone 712562. Além disso, o pGRN121 foi observado conter uma sequência variante de codificação, que inclui um inserto de aproximadamente 182 nucleotídeos. Este inserto foi verificado estar ausente do clone. Conforma as sequências de E. aediculatus, tais variantes podem ser analisadas em ensaios funcionais, tais como ensaios de telomerase, para detectar a presença de telomerase funcional em uma amostra.
Outra análise de sequências resolveu a sequência de cDNA de pGRN121, para prover uma estrutura contígua de leitura aberta, que codifica uma proteína de peso molecular de aproximadamente 127000 daltons, e 1132 aminoácidos, como mostrado na Figura 74. Um mapa refinado de pGRN121, com base nesta análise, é fornecido na Figura 73. Os resultados da análise adicional de sequências do cDNA de hTRT são apresentados na Figura 16 (SEQUÊNCIA ID NO: 1).
EXEMPLO 2
Correlação da abundância de hTRT e imortalidade da célula
A abundância relativa de mRNA de hTRT foi avaliada em seis cepas de células mortais negativas de telomerase e seis linhagens de células imortais positivas de telomerase (Figura 5). O nível de estado estacionário de mRNA de hTRT foi significativamente aumentado em linhagem de células imortais que haviam sido previamente mostradas como tendo telomerase ativa. Níveis mais baixos do mRNA de hTRT foram detectados em algumas
283
Μ cepas de células negativas de telomerase.
·· 9 · ··· · · · ··· *
O PCR de RT para hTRT,hTR, TBÍ ípfejQÍnâj telomerase relacionada a Tetrahymena p80 (Harrington et al., 1997, Science 275: 973)] e GAPDH (para normalizar quanto a quantidades iguais de padrões de RNA) foi realizado em RNA derivado das seguintes células: (1) fibroblastos de GFL de pulmão fetal humano, (2) GFS de fibroblastos da pele fetal humana, (3) fibroblastos 31 YO estromais da próstata de adultos, (4) fibroblastos HSF sinoviais de joelho fetal humano, (5) fibroblastos BJ do prepúcio de recém-nascido, (6) fibroblastos IMR90 de pulmão fetal humano, e linhagens de células imortalizadas: (7) melanoma LOX IMVI, (8) leucemia U251, (9) carcinoma de pulmão NCI H23, (10) adenocarcinoma do cólon SW620, (11) tumor das mamas MCF7, linhagem celular de rim embriônico humano transformada por adenovírus El de (12) 293.
O ácido nucleico de hTRT foi ampliado do cDNA usando iniciadores LT5 e LT6 de oligonucleotídeos (Tabela 2), para um total de 31 ciclos (94°C 45 segundos, 60°C 45 segundos, 72°C 90 segundos). GAPDH foi ampliado usando-se os iniciadores Kl 36 (5’CTCAGACACCATGGGGAAGGTGA) e Kl 37 (5’ATGATCTTGAGGCTGTTGTCATA), para um total de 16 ciclos (94°C 45 segundos, 55°C 45 segundos, 72°C 90 segundos). hTR foi ampliado usandose iniciadores F3b (5’-TCTAACCCTAACTGAGAAGGGCGTAG) e R3c (5’-GTTTGCTCTAGAATGAACGGTGGAAG) para um total de 22 ciclos (94°C 45 segundos, 55°C 45 segundos, 72°C 90 segundos). O mRNA de TP1 foi ampliado usando-se iniciadores TP1.1 e TP1.2 para 28 ciclos (os mesmos ciclos da hTRT). Os produtos de reação foram resolvidos em um gene de poliacrilamida 8%, manchado com Verde SYBR (Sondas Moleculares) e visualizado por varredura em uma Storm 860 (Molecular Dynamics). Os resultados, mostrados na Figura 5, demonstram que níveis de mRNA de hTRT se correlacionam diretamente com os níveis de atividade de telomerase
284 nas células ensaiadas.
EXEMPLO 3 P í :4 ? 1 ?* ? Γ: *·:
« * ·« · ··· ♦ ·♦ ··· · ·
Caracterização de uma sequência intrônica de hTRT
Um intron putativo foi primeiro identificado por ampliação de PCR de DNA genômico humano, como descrito neste exemplo, e subsequentemente confirmado por sequenciação do clone genômico λΰφ5 (ver Exemplo 4). A ampliação do PCR foi realizada usando-se o iniciador dianteiro TCP1.57 emparelhado individualmente com os iniciadores reversos TCP1.46, TCP1.48, TCP1.50, TCP1.52, TCP1.54, TCP1.56 e TCP1.58 (ver Tabela 2). Os produtos do DNA genômico das ampliações TCP1.57/ TCP1.46, TCP1.48, TCP1.50, TCP1.52, TCP1.54 ou TCP1.56 foram de aproximadamente 100 pares de base maiores do que os produtos das ampliações pGRN121. A ampliação TCP1.57/TCP1.58 foi a mesma ou em DNA genômico ou pGRN121. Isto indicou que o DNA genômico continha uma inserção entre os sítios para TCP1.58 e TCP1.50. Os produtos PCR de TCP1.57/ TCP1.50 e TCP1.57/ TCP1.52 foram sequenciados diretamente sem subclonagem, usando-se os iniciadores TCP1.39, TCP1.57 e TCP1.49.
Como mostrado abaixo, a sequência intrônica de 104 bases (SEQUÊNCIA ID NO: 7) é inserida no mRNA de hTRT (mostrado em negrito) na junção correspondente às bases 274 e 275 da Figura 16:
CCCCCCGCCGCCCCCTCCTTCCGCCAG/GTGGGCCTCCCCGGGGTCGGCG TCCGGCTGGGGTTGAGGGCGGCCGGGGGGAACCAGCGACATGCGGAGAGC !
AGCGCAGGCGACTCAGGGCGCTTCCCCCGCAG/GTGTCCTGCCTGAAGGA I GCTGGTGGCCCGAGTGCTGCAG
A indica as junções de ligação; a sequência mostra boas uniões às sequências dos sítios de união 5’ e 3’ típicas para introns humanos.
Este intron contém característica de motivos de um sítio de divagem de uma topoisomerase II e um sítio de ligação NFkB (ver Figura 21). Estes motivos são de interesse, em parte, porque a expressão de topoisomerase II é supra&
A1Z
285
O fago Θφ5 foi mapeado por digestão de enzima de restrição e sequenciação de DNA. O mapa resultante é mostrado na Figura 7. O DNA de fago foi digerido com Ncol e os fragmentos clonados em pBBS167. Os subclones resultantes foram examinados por PCR para identificar aqueles contendo sequência correspondente à região 5’ do cDNA de hTRT. Um subclone (pGRN140) contendo um fragmento Ncol de 9 kb (com a sequência do gene de hTRT e 4 a 5 kb da sequência do vetor lambda) foi parcialmente sequenciado para determinar a orientação do inserto. O pGRN 140 foi digerido usando Sall para remover as sequências do vetor lambda, resultando em pGRN144. pGRN144 foi então sequenciado. Os resultados da sequenciação são fornecidos na Figura 21. A extremidade 5’ do mRNA de hTRT corresponde à base 2428 da Figura 21. Como indicado na Figura 7, dois elementos Alu da sequência são locados cerca de 1800 pares de base a montante da extremidade 5’ do cDNA de hTRT e fornece um limite provavelmente a montante à região do promotor de hTRT. A sequência também revela um intron começando na posição 4160 da Figura 21, 3’ ao intron descrito no Exemplo 3, acima.
B. Clones genômicos adicionais
Além do clone genômico descrito acima, dois clones bacteriófagos Pl e um clone BAC humano são fornecidos como modalidades ilustrativas da invenção. Os insertos Pl são usualmente de 75 a 100 kb, e os insertos BAC são usualmente acima de 100 kb.
Os clones Pl (DMPC-HFF#1-477(F6) -GS #15371 e (DMPC-HEF#11103(H6) -GS #15372) foram obtidos por triagem de PCR de uma coleção de Pl humano derivado de células de fibroblasto de prepúcio humano (Shepherd et al., 1994, PNAS USA 91: 2629), usando iniciadores TCP1.12 e UTR2, que ampliam a extremidade 3’ de hTRT. Estes clones eram ambos negativos (falharam na amplificação) com iniciadores que amplificam a extremidade 5’ de hTRT.
286 o29i (sítios de restrição Sphl e EcoRV, respectivamente).
• * ·♦ »· ♦ · · ··♦ ··”·****
Dois clones positivos foram isoladosjd rfc-ê^aftiiija&5$«âtj%\*é$ « · ««» · «·>· « »1 de PCR aglomerado como descrito acima; ambos os clones eram positivos por PCR. Um destes clones (λθφ5) foi digerido com Notl, revelando um tamanho de inserto de aproximadamente 20 kb. O mapeamento subsequente (ver abaixo) indicou que o tamanho do inserto era de 15 kb e que o fago Θφ5 contém aproximadamente 13 kb de DNA a montante do sítio de partida da sequência de cDNA.
O fago Οφ5 foi mapeado por digestão de enzima de restrição e 10 sequenciação de DNA. O mapa resultante é mostrado na Figura 7. O DNA de fago foi digerido com Ncol e os fragmentos clonados em pBBS167. Os subclones resultantes foram examinados por PCR para identificar aqueles contendo sequência correspondente à região 5’ do cDNA de hTRT. Um subclone (pGRN140) contendo um fragmento Ncol de 9 kb (com a sequência 15 do gene de hTRT e 4 a 5 kb da sequência do vetor lambda) foi parcialmente sequenciado para determinar a orientação do inserto. O pGRN 140 foi digerido usando Sall para remover as sequências do vetor lambda, resultando em pGRN144. pGRN144 foi então sequenciado. Os resultados da sequenciação são fornecidos na Figura 21. A extremidade 5’ do mRNA de 20 hTRT corresponde à base 2441 da Figura 21. Como indicado na Figura 7, dois elementos Alu da sequência são locados 1700 pares de base a montante da extremidade 5’ do cDNA de hTRT e fornece um limite provavelmente a montante à região do promotor de hTRT. A sequência também revela um intron posicionado nas bases 4173 da Figura 21, 3’ ao intron descrito no
Exemplo 3, acima.
B. Clones genômicos adicionais
Além do clone genômico descrito acima, dois clones bacteriófagos PI e um clone BAC humano são fornecidos como modalidades ilustrativas da invenção. Os insertos PI são usualmente de 75 a 100 kb, e os
287 insertos BAC são usualmente acima de 100 kb.
Os clones PI (DMPC-HFF#l-477(Fâ)í-è^4153*1 Lé (ÓÍifeHEF#l-1103(H6) -GS #15372) foram obtidos por triagem de PCR de uma coleção de PI humano derivado de células de fibroblasto de prepúcio humano (Shepherd et al., 1994, PNAS USA 91: 2629), usando iniciadores TCP1.12 e UTR2, que ampliam a extremidade 3’ de hTRT. Estes clones eram ambos negativos (falharam na amplificação) com iniciadores que amplificam a extremidade 5’ de hTRT.
O clone BAC humano foi obtido com um exame de hibridização de uma coleção genômica humana BAC usando um fragmento Sphl/Xmnl de 1143 pares de base de pGRN121 (Figura 16; bases 15522695), que encerra a região do motivo da RT. Acredita-se que o clone inclua a extremidade 5’ do gene. Os clones genômicos de hTRT neste exemplo, como se acredita, encerram o gene de hTRT inteiro.
EXEMPLO 5
Locação cromossômica do gene de hTRT
O gene de hTRT foi localizado para o cromossoma 5p por mapeamento híbrido de radiação (Boehnke et al., 1991, Am JHum Genet 49: 1174; Walter et al., 1994, Nature Genet 7: 22), usando-se o painel Stanford G3 de resolução do meio dos clones de HR 83 do genoma humano total (criado no Stanford Human Genome Center). Uma linhagem celular linfoblastóide humana (doador; rM) foi exposta a 10000 rad de raios-x e foi então fundida com células (A3) receptoras não irradiadas de hamster. Oitenta e três clones híbridos de células somáticas independentes foram isolados, e cada um representa um evento de fusão entre uma célula doadora irradiada e uma célula receptora de hamster. O painel de DNA G3 foi usado para marcadores de ordenação na região de interesse, bem como estabelecer a distância entre estes marcadores.
Os iniciadores usados para o mapeamento de RH foram
288
TCP1.12 e UTR2 com condições de ampliação de 94°C 45 segundos, 55°C 45 segundos, 72°C 45 segundos, por 45 ciclos ukânjlojôftaúiqao.-T^q Boehringer Mannheim e Taq da Perkin-Elmer. As 83 reuniões foram ampliadas independentemente e 14 (17%) classificadas positivas quanto a 5 hTRT (pelo aparecimento de uma banda de 346 pares de base). Os resultados da ampliação foram submetidos ao servidor RH Stanford, que então forneceu a locação do mapa, 5p, e o marcador mais próximo, STS D5S678.
Mediante exame do sítio da tela de mapeamento do genoma de Genethon, a locação no mapa identificou um YAC que contém o marcador 10 D5S678 de STS: DEPH YAC 780_C_3 Size: 390.660 kb. Este YAC também continha 17 marcadores de cromossomas. Este resultado indicou que o gene de hTRT está no cromossoma 5, próximo da extremidade telomérica. Existem números de cópias aumentados de 5p em vários tumores. A síndrome do miado do gato (síndrome de Lejune) também foi mapeada em 15 deleções nesta região.
EXEMPLO 6
Projeto e construção de vetores para expressão de proteínas e polinucleotídeos de hTRT
EXPRESSÃO DE hTRT EM BACTÉRIAS
A seguinte porção deste exemplo detalha o projeto de vetores de expressão de células bacterianas e eucarióticas de expressão de hTRT, para produzir grandes quantidades de hTRT de comprimento completo biologicamente ativa. A geração desta maneira de proteína de hTRT biologicamente ativa é útil para os ensaios de reconstituição da telomerase, 25 analisando quanto aos moduladores da atividade de telomerase, análise da atividade de espécies recentemente isoladas de hTRT, identificando e isolando compostos que especificamente se associam com hTRT, análise da atividade de uma proteína variante de hTRT que tenha sido modificada especificamente ao sítio, e como um imonógeno, como uns poucos exemplos.
289
J9M
VETOR DE EXPRESSÃO BACTERIANA pThioHis A/hTRT ·*· * · · **· ·· ·*· ·* J·· í
Para produzir grandes quantidades d^hifl-T completo, o vetor de expressão bacteriana pThioHis A (Invitrogen, San
Diego, CA) foi selecionado como um sistema de expressão. O inserto de codificação de hTRT inclui os nucleotídeos de 707 a 4776 do inserto de hTRT no plasmídeo pGRN 121. Esta sequência de nucleotídeos inclui a sequência de codificação completa para a proteína de hTRT.
Este vetor de expressão da invenção é projetado para expressão indutível em bactérias. O vetor pode ser induzido a expressar, em 10 E. coli, altos níveis de uma proteína de fusão composta de uma porção de tioredoxina clivável marcada HIS e a proteína de hTRT de comprimento completo. O uso do sistema de expressão estava em acordo substancial com as instruções do fabricante. A sequência de aminoácidos da proteína de fusão codificada pelo vetor resultante da invenção, é mostrada abaixo; (-*- denota 15 um sítio de divagem de enterocinase:
290
MSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAHWCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAK
LRIDHNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSkèdL^áFXDiNLÂGjdsdiD • · ·· ······
V · ·· · ··· ··· ··· · ·
DDK- * -VPMHELEIFEFAAASTQRCVLLRTWEALAPATPAMPRAPRCRAVRSLLRSHY
REVLPLATFVRRLGPQGWRLVQRGDPAAFRALVAQCLVCVPWDARPPPAAPSFRQVSC LKELVARVLQRLCERGAKNVLAFGFALLDGARGGPPEAFTTSVRSYLPNTVTDALRGS GΆWGLLLRRVGDDVL·VHL·L·ARCALFVLVAP S C AYQ VCG Ρ P LYQLGAATQARP P PHASG PRRRLGCERAWNHSVREAGVPLGLPAPGARRRGGSASRSLPLPKRPRRGAAPEPERTP VGQGSWAHPGRTRGPSDRGFCWSPARPAEEATSLEGALSGTRHSHPSVGRQHHAGPP STSRPPRPWDTPCPPVYAETKHFLYSSGDKEQLRPSFLLSSLRPSLTGARRLVETIFL GSRPWMPGTPRRLPRLPQRYWQMRPLFLELLGNHAQCPYGVLLKTHCPLRAAVTPAAG VCAREKPQGSVAAPEEEDTDPRRLVQLLRQHSSPWQVYGFVRACLRRLVPPGLWGSRH NERRFLRNTKKFISLGKHAKLSLQELTWKMSVRDCAWLRRSPGVGCVPAAEHRLREEI LAKFLHWLMSVYWELLRSFFYVTETTFQKNRLFFYRKSVWSKLQSIGIRQHLKRVQL RELSEAEVRQHREARPALLTSRLRFIPKPDGLRPIVNMDYWGARTFRREKRAERLTS RVKALFSVLNYERARRPGLLGASVLGLDDIHRAWRTFVLRVRAQDPPPELYFVKVDVT GAYDTIPQDRLTEVIASIIKPQNTYCVRRYAWQKAAHGHVRKAFKSHVSTLTDLQPY MRQFVAHLQETSPLRDAWIEQSSSLNEASSGLFDVFLRFMCHHAVRIRGKSYVQCQG IPQGSILSTLLCSLCYGDMENKLFAGIRRDGLLLRLVDDFLLVTPHLTHAKTFLRTLV RGVPEYGCWNLRKTWNFPVEDEALGGTAFVQMPAHGLFPWCGLLLDTRTLEVQSDY SSYARTSIRASLTFNRGFKAGRNMRRKLFGVLRLKCHSLFLjDLQVNSLQTVCTNIYKI LLLQAYRFHACVLQLPFHQQVWKNPTFFLRVISDTASLCYSILKAKNAGMSLGAKGAA GPLPSEAVQWLCHQAFLLKLTRHRVTYVPLLGSLRTAQTQLSRKLPGTTLTALEAAAN PALPSDFKTILD pGEX-2TK COM NUCLEOTÍDEOS 3272 A 4177 DE hTRT DE pGRN121
Esta construção da invenção é usada para produzir proteína de fusão para, por exemplo, a finalidade de aumento de anticorpos policlonais e 5 monoclonais para a proteína de hTRT. Os fragmentos de hTRT também podem ser usados para outras finalidades, tais como para modular a atividade de telomerase, por exemplo como um mutante negativo dominante ou para evitar a associação de um componente de telomerase com outras proteínas ou
291 ácidos nucleico.
Para produzir grandes quantidaâês: de: júm:# fragmento: de proteína de hTRT, o vetor de expressão de E. coli pGEX-2TK (Pharmacia
Biotech, Piscataway N.J.) foi selecionado e usado essencialmente de acordo com as instruções do fabricante, para produzir um vetor de expressão da invenção. A construção resultante contém um inserto derivado dos nucleotídeos 3272 a 4177 do inserto de hTRT no plasmídeo pGRN121. O vetor dirige a expressão no E. coli de altos níveis de uma proteína de fusão composta de sequência de glutationa-S-transferase (sublinhada abaixo), sequência de divagem de trombina (duplamente sublinhada), sequência de reconhecimento para a cinase de proteína do músculo do coração (em itálico), resíduos introduzidos por clonagem em colchetes ([GSVTK]) e fragmento proteínico (em negrito), como mostrado abaixo.
^ΡΙΡσΥνΚΙΚσύνΟΡΤΚύΒύΕΥύΕΕΚΥΕΕΗύΥΕΕΡΕΟΡΚΝΚΝΚΚΡΕΙΌΡΕΡΡΝΡΡΥΥ ΙΡΟΡνΚΡΤΟ5ΜΑΙΙΚΥΙΆΡΚΗΝΜΕσσ0ΡΚΕΡΆΕΙ5ΜΡΕσΑνΡΡΤΚΥσν5ΚΤΆΥ5ΚΡΕΕ ΤΏΚνΡΡη3ΚΙ>ΡΕΜΙιΚΜΡΕΡΚΡ(2ΗΚΤΥ1>ΝσΡΗνΤΗΡΡΡΜΡΥΡΑΙιΡννΡΥΜηΡΜ(3ΒΡΆΡΡ KLVCFKKRIEAIPOIDKYLKSSKYIAWPI.OGWOATFGGGPHPPKSDLVPRGS&RA.SVr GSVTK] IPQGSILSTLLCSLCYGDlíErrKLFAGIRIUDGLLLRLVDDFLLVTPHLTHAKT FLRTLVRGVPEYGCWNLRKTWNFPVEDEALGGTAFVQMPAHGLFPWCGLLLDTRTL EVQSDYSSYARTSIRASVTFNRGFKAGRNMRRKLFGVLRLKCHSLFLDLQVNSLQTVC TNIYKILLLQAYRFHACVLQLPFHQQVWKNPTFFLRVISDTASLCYSILKAKNAGMSL GAKGAAGPLPSEAVQWLCHQAFLLKLTRHRVTYVPLLGSLRTAQTQLSRKLPGTTLTA LEAAANPALPSDFKTILD
Quando esta proteína de fusão foi expressa, ela formou agregados insolúveis. Ela foi tratada de forma geral como descrito acima, na seção intitulada purificação de proteínas dos corpos de inclusão. Especificamente, as células induzidas foram colocadas em suspensão em PBS (fosfato de sódio 20 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM) e rompidas por energia da onda sonora (sonication). Adicionou-se NP-40 a 0,1%, e a mistura foi incubada por 30 minutos a 4°C com mistura branda. O material insolúvel foi colhido por centrifugação a 25000 g por 30 minutos a 4°C. O material insolúvel foi lavado uma vez em uréia 4M em PBS, colhido por
292 centrifugação, depois lavado novamente em PBS. Estimou-se que a pelota ·· · · ··· · · · ··· · colhida contivesse mais do que 75% de proteína játe jfuSãqfÊstç.niâtériáhfoi • * ·· « ··· ··· ··· · · secado em um vácuo de velocidade, depois colocado em suspensão em adjuvante para injeção em camundongos e coelhos para a geração de 5 anticorpos. A separação da proteína recombinante da porção de glutationa Stransferase é realizada por proteólise específica do sítio usando-se trombina, de acordo com instruções do fabricante.
pGEX-2TK COM OS NUCLEOTÍDEOS DE hTRT 2426 A 3274 DE pGRN121 COM MARCAÇÃO HIS-8
Para produzir grandes quantidades de um fragmento de hTRT, outra construção de vetor de expressão de E. coli pGEX-2TK foi preparada.
Esta construção contém um inserto derivado de nucleotídeos 2426 a 3274 do inserto de hTRT no plasmídeo pGRN121 e uma sequência codificando oito resíduos consecutivos de histidina (marcador HIS-8). Para inserir o marcador 15 HIS-8, o vetor pGEX-2TK com os nucleotídeos de hTRT 2426 a 3274 de pGRN121 foi linearizado com BamHI. Isto abriu o plasmídeo na junção entre o GST-trombina-cinase proteínica de músculo de coração e a sequência de codificação de hTRT. Um oligonucleotídeo de filamento duplo com extremidades BamHI compatíveis foi ligado ao plasmídeo linearizado, 20 resultando na introdução na estrutura de oito resíduos de histidina a montante da sequência de hTRT.
O vetor dirige a expressão em E. coli de altos níveis de uma proteína de fusão composta da sequência de glutadiona-S-transferase (sublinhada); sequência de divagem de trombina (duplamente sublinhada);
sequência de reconhecimento para cinase proteínica de músculo do coração (em itálico); um conjunto de três e um conjunto de cinco resíduos introduzidos por clonagem acham-se em colchetes ([GSV] e [GSVTK]); oito histidinas consecutivas (também duplamente sublinhadas); e fragmento de proteína de hTRT (em negrito):
293
MSPILGYWKIKCtLVOPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDECtDKWRNKKFELGLEFP NLPYYIDGDVKLTOSMAIIRYlADKHNMLCfGCPK&RAELSMLEGAVLDIR.YGVS RIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRr.CHKTYLNGbhfyTaPgV^ÜriL DVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPOIDKYLKSSKYIÁWPLOGWQÂTFGG GDHPPKSDLVPRGS^SHGSVlHHHHHHHHrGSVTKIMSVYWELLRSFFYV TETTFQKNRLFFYRPSVWSKLQSIGIRQHLKRVQLRELSEAEVRQHREARP ALLTSRLRFIPKPDGLRPIVNMDYWGARTFRREKRAERLTSRVKALFSVL NYERARRPGLLGASVLGLDDIHRAWRTFVLRVRAQDPPPELYFVKVDVTG AYDTIPQDRLTEYIASIIKPQNTYCVRRYAWQKAAHGHVRKAFKSHVSTL TDLQPYMRQFVAHLQETSPLRDAWIEQSSSLNEASSGLFDVFLRFMCHHA VRIRGKSYVQCQGI
Cada um dos vetores pGEX-2TK da invenção podem ser utilizados para produzir proteína de fusão para a finalidade de elevar os anticorpos policlonais e monoclonais para a proteína de hTRT. Adicionalmente, esta proteína de fusão pode ser usada para anticorpos de purificação da afinidade elevados a peptídeos de hTRT, que são encerrados dentro da proteína de fusão. A separação da proteína recombinante da porção de glutationa S-transferase pode ser realizada por proteólise específica do sítio, usando-se trombina de acordo com instruções do fabricante. pGEX-2TK COM NUCLEOTÍDEOS DE hTRT 2426 A 3274 DE pGRN121, SEM A MARCAÇÃO HIS-8
Para produzir grandes quantidades de um fragmento de hTRT, outra construção do vetor de expressão de E. coli pGEX-2TK foi preparada.
Esta construção contém um inserto derivado de nucleotídeos
2426 a 3274 do inserto de hTRT no plasmídeo pGRN121, mas sem o marcador HIS-8 da construção descrita acima. O vetor dirige a expressão em E. coli de altos níveis de uma proteína de fusão composta de glutationa-Stransferase (sublinhada), sequência de divagem de trombina (duplamente sublinhada); sequência de reconhecimento para cinase proteínica de músculo do coração (em itálico), resíduos introduzidos por clonagem em colchetes ([GSVTK]) e fragmento de proteína de hTRT (em negrito):
294
Μ3ΡΙΕΘΥΝΚΙΚΘΏνθΡΤΕΤ.Τ,ΏΕΥΒΡ,ΕΚΥΕΕΗΕΥΕΕΡ^ρΚΝ^ΝΚΚΕΕύΘύΕΡΡΝΏΡΥΥ
IDGDVKLTQSKAIIRYIADKHNMLGGCPKERAETSMTjEfGÁvÍtÍ)mCXS^>À^KOFE ΤΡΚνΡΕΡβΚηΡΕΜηΚΜΕΕΡΕΏΩΗΚΊΎΕΝσΡΗνΤΗΡΡΡΜΙ,ΥηΑΡΡννΚΫΜΡΡΜσί,ΡΑΕΡ
ΚΡνθΕΚΚΡΙΕΑΙΡΟΤΡΚΥΡΚ55ΚΥΤΆν?ΡΡθσΝΟΑΤΕσσθΡΗΡΡΚ5ΡΕνΡΗ03ΕΗΑ5νΓ GSVTK] MSVYVVELLRSFFYVTETTFQKNRLFFYRPSVWSKLQSIGIRQHLKRVQLRE LSEAEVRQHREARPALLTSRLRFIPKPDGLRPIVNMDYWGARTFRREKRAERLTSRK ALFSVLNYERARRPGLLGASVLGLDDIHRAWRTFVLRVRAQDPPPEYFVKVDVTGAYD TIPQDRLTEVIASIIKPQNTYCVRRYAVVQKAAHGVRKAFKSHVSTLTDLQPYMRQFV AHLQETSPLRDAWIEQSSSLNEASGLFDVFLRFMCHHAVRIRGKSYVQCQGI pGEX~2TK COM NUCLEOTÍDEOS DE hTRT 1625 A 2458 DE pGRN121
Para produzir grandes quantidades de um fragmento de proteína de hTRT, outra construção do vetor de expressão de E. coli pGEX5 2TK foi preparada.
Esta construção contém um inserto derivado de nucleotídeos 1625 a 2458 do inserto de hTRT no plasmídeo pGRN121. O vetor dirige a expressão em E. coli de altos níveis de uma proteína de fusão composta de glutationa-S-transferase (sublinhada), sequência de divagem de trombina 10 (duplamente sublinhada); sequência de reconhecimento para cinase proteínica de músculo do coração (em itálico), resíduos introduzidos por clonagem em colchetes ([GSVTK]) e fragmento de proteína de hTRT (em negrito):
mspilgy,wkikglvoptrllleyleekyeehlyerdegdkwrnkkfelglefp NT.PYYIDGDVKLTOSMAnRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGV SRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRIOEKTYLNGDHVIHPDFMLYDA t.dwiamopmcldafpklvcfkkrieaipoidkylksskyiawplogwoatfg GGDHPPKSOLVPRGSRR4SVTGSVTK1ATSLEGALSGTRHSHPSVGROHHAGP PSTSRPPRPWDTPCPPVYAETKHFLYSSGBKEQLRPSFLLSSLRPSLTGARR LVETIFLGSRPWMPGTPRRLPRLPQRYWQMRPLFLELLGNHAQCPYGVLL KTHCPLRAAVTPAAGVCAREKPQGSVAAPEEEDTDPRRLVQLLRQHSSPW
QVYGFVI^CLRia,VPP^WGSRHNERRFLRNTKKFISLGKHAKLSLQELT'
WKMSVRDCAWLRRSPGVGCVPAAEHRLREEILAKELHWLMSVYWELLR S pGEX-2TK COM NUCLEOTÍDEOS DE hTRT 782 A 1636 DE
295 pGRN121 ·· *· *·· ·· ·*· · ··· *
Para produzir grandes quantidade^âejuçíf fr*agbiçjjtfl*cíç:lÍ^RT, outra construção do vetor de expressão de E. coli pGEX-2TK foi preparada.
Esta construção contém um inserto derivado de nucleotídeos
782 a 1636 do inserto de hTRT no plasmídeo pGRN121. O vetor dirige a expressão em E. coli de altos níveis de uma proteína de fusão composta de glutationa-S-transferase (sublinhada), sequência de divagem de trombina (duplamente sublinhada); sequência de reconhecimento para cinase proteínica de músculo do coração (em itálico), resíduos introduzidos por clonagem em colchetes ([GSVTK]) e fragmento de proteína de hTRT (em negrito):
ΜδΡίυσΥ^ΤΚσηνΟΡΤΚΏΏΏΕΥηΕΕΚΥΕΕΗΏΥΕΚΡΕΟΡΚΝΒΝΚΚΓΕΙ^ΕΡΡΝΡΡΥΥ
TDGDVKT.TOSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRTAYSKDFE ΤΡΚνΡΕΤ.ΕΚΤ.ΡΕΜΡΚΜΕΕΡΕΤ,ΩΗΚΤΥΡΝσΡΗνΤΗΡΡΕΓίΡΥΡΑΡΡννΡΥΜΡΡΜΟΡΡΆΕΡ KLVCFKKRTF,ATP0IPKYLKSSKYIAWPL0GW0ATFGGGDHPPKSPLVPRG5RRASVÍ GSVTK) MPRAPRCRAVRSLLSHYREVLPLATFVRRLGPQGWRLVQRGDPAAFRALVAQ CLVCVPWDARPPAAPSFRQVSCLKELVARVLQRLCERGAKNVLAFGFALLDGARGGPP EATTSVRSYLPNTVTDALRGSGAWGLLLRRVGDDVLVHLLARCALFVLVAPCAYQVCG PPLYQLGAATQARPPPHASGPRRRLGCERAWNHSVREAGVPLGLPAPGARRRGGSASR SLPLPKRPRRGAAPEPERTPVGQGSWAHPGRTRGPSDRGFCWSPARPAEEATSL pT7FLhTRT COM cDNA DE hTRT CARENTE DA SEQUÊNCIA DE NÃO CODIFICAÇÃO DE 5’
Como descrito acima, em uma modalidade, a invenção provê uma hTRT que é modificada de uma maneira específica do sítio, para facilitar a clonagem em levedura bacteriana de mamíferos e vetores de expressão de insetos, sem qualquer sequência de hTRT não transladada. Em algumas circunstâncias, minimizar a quantidade de sequência de codificação não proteínica permite produção (rendimento) proteínica melhorada e estabilidade de mRNA aumentada. Nesta modalidade da invenção, a região de não codificação 5’ do gene de hTRT foi removida antes da clonagem em um vetor de expressão bacteriano.
Isto foi efetuado construindo-se um sítio de endonuclease de
296 restrição adicional logo a montante (5’) do códon de partida (ATG) da ·*· · ··· · · · ··· * sequência de codificação de hTRT (Figura 16).:·Α jcri^ç^ô &tib; de * · ♦· *· ··· ··· ··· · · restrição a quase 5’ da região de codificação da proteína, permite a produção eficiente de uma ampla variedade de vetores que codificam as proteínas de fusão, tais como as proteínas de fusão compreendendo rótulos e
MARCADORES de peptídeos, para imunodetecção e purificação.
Especificamente, o oligonucleotídeo 5’- CCGGCCACCCC
CCATATGCCGCGCGCTCCC-3’ foi usado como descrito acima, para modificar os nucleotídeos de cDNA de hTRT 779 a 781 do cDNA de hTRT (Figura 16) de GCG para CAT. Estes 3 nucleotídeos são os últimos nucleotídeos antes do códon de partida ATG, de modo que eles não modificam a sequência proteínica. A modificação na sequência resulta na criação de um sítio de restrição único de Ndel no cDNA de hTRT. O DNA de hTRT de filamento único foi usado como uma fonte de DNA para a mutagênese dirigida ao sítio. O plasmídeo resultante foi sequenciado para confirmar o sucesso da mutagênese.
Esta modificação permitiu a construção do plasmídeo seguinte da invenção, designado pT7FLhTRT. A sequência de hTRT modificada especificamente no sítio (adição do sítio de restrição Ndel) foi digerida com Ndel e Notl (e enchida com enzima Klenow para gerar DNA de terminação embotada) para gerar uma hTRT codificando o fragmento de ácido nucleico. O fragmento foi então clonado em um plasmídeo pSL3418 previamente digerido por restrição com Ndel e Smal (também um cortador de extremidade embotada). O pSL 3418 é um plasmídeo pAED4 modificado, em que uma sequência FLAG (Immunex Corp., Seattle WA) e uma sequência de enterocinase são inseridas logo a montante do sítio de Ndel acima referenciado. Este plasmídeo, designado pT7FLhTR, permite a expressão de hTRT de comprimento completo [com um rótulo Flag (Flag-Tag) em sua extremidade 5’] em uma cepa de E. coli expressando a polimerase de RNA
3O>
Τ7.
297
PLASMÍDEOS COM cDNA DE hTRT CARENTEÍDÃ sfebÜEMCÍU pE • · ·· · ··· ··· ··· · ·
NÃO CODIFICAÇÃO 3’
Como referido acima, a invenção provê vetores de expressão 5 contendo ácidos nucleicos de codificação de TRT em que algumas ou todas as sequências de não codificação haviam sido deletadas. Em algumas circunstâncias, minimizar a quantidade de sequências proteínicas de não codificação permite produção (rendimento) melhorada de proteínas e aumenta a estabilidade do mRNA. Nesta modalidade da invenção, a região 10 não transladada 3’ de hTRT é deletada antes da clonagem em um plasmídeo bacteriano de expressão.
O plasmídeo pGRN121, contendo o cDNA de hTRT de comprimento completo, como debatido acima, foi primeiro deletado de todos os sítios Apal. Isto foi seguido pela deleção do fragmento da enzima de 15 digestão da restrição MscI-HincII de hTRT contendo o 3’UTR. O fragmento de digestão da restrição Ncol-Xbal contendo o códon de interrupção de hTRT foi então inserido no sítio Ncol-Xbal de pGRN121, para produzir um plasmídeo equivalente a pGRN121, designado pGRN124, exceto que faltava o 3’UTR.
—20 VETORES DE EXPRESSÃO BACTERIANA USANDO MARCADORES ANTIBIÓTICOS DE SELEÇÃO
A invenção também provê vetores de expressão bacteriana que podem conter marcadores de seleção para conferir um fenótipo selecionável em células transformadas e sequências codificando a 25 manutenção e replicação epissômicas, de tal modo que a integração no genoma hospedeiro não é necessária. Por exemplo, o marcador pode codificar resistência antibiótica, particularmente resistência a cloranfenicol (ver Harrod (1997) Nucleic Acids Res. 25: 1720-1726), canamicina, G418, bleomicina e higromicina, para permitir a seleção daquelas células transformadas com as
298
303 sequências desejadas de DNA, ver, por exemplo, Blondelet-Rouault (1997) Gene 190: 315-317; e Mahan (1995) Proc. Natl. Àcai ».7734 ^-6^9-^-73.
• · ·· · ··· ··· ··· · 4
Em uma modalidade da invenção, a hTRT de comprimento completo foi clonada em um vetor plasmídeo BlueScript modificado (Stratagene, San Diego, CA), designado pBBS235, em que um gene de resistência a antibiótico cloranfenicol havia sido inserido. O fragmento Notl do pGRN124 (referido acima) continha a ORE de hTRT no sítio Notl de pBBS235, de modo que a ORF de TRT ficasse na orientação oposta do promotor Lac do vetor. Isto produz um plasmídeo adequado para a mutagênese dos insertos do plasmídeo, tal como os ácidos nucleicos de TRT da invenção. Esta construção de plasmídeo, designada pGRN125, pode ser usada nos processos da invenção envolvendo mutagênese da enzima de telomerase e sequências de codificação da proteína de TRT e para transcrição in vitro de hTRT usando o promotor T7 (e a transcrição in vitro da hTRT anti-sentido usando o promotor T3).
Em outra modalidade da invenção, os fragmentos de digestão da restrição Notl de pGRN124 contendo a ORF de hTRT, foram subclonados no sítio Notl de pBBS235 (descrito acima), de modo que a ORF de TRT esteja na mesma orientação do promotor Lac do vetor. Isto produz o plasmídeo, designado pGRN126, que pode ser usado para a expressão de hTRT de comprimento completo em E. coli. O produto expresso conterá 29 aminoácidos codificados pelo vetor pBBS235, seguido por 18 aminoácidos codificados pelo 5’UTR de hTRT, seguido pela proteína de hTRT de comprimento completo.
Em outra modalidade da invenção, a mutagênese in vitro de pGRN125 foi produzida para converter o códon ATG de iniciação da hTRT em um consenso Kozak e criar os sítios de digestão de restrição de EcoRI e BglII, para facilitar a clonagem nos vetores de expressão. O oligonucleotídeo 5’TGCGCACGTGGGAAGCCCTGGCagatctgAattCcaCcATGCCGCGCGC
299
TCCCCGCTG-3’ (nucleotídeos alterados em caixa baixa) foi usado no ·*· · ·*· ·*· ·· ·» ·* ··· * procedimento de mutagênese. O vetor de expresáao reàylianlje jx5i.<tóiíb$ado pGRN127.
Em outra modalidade da invenção, o segundo Asp do “motivo DD” de TRT foi convertido em uma alanina, para criar uma enzima de telomerase não funcional, assim criando uma proteína de TRT mutante para uso como um mutante dominante/negativo. A sequência de codificação da hTRT foi mutagenizada in vitro usando-se o oligonucleotídeo 5’CGGGACGGGCTGCTCCTGCGTTTGGTGGAcGcgTTCTTGTTGGTGAC ACCTCACCTCACC-3’, para converter o códon de asparagina para o resíduo 869 (Asp869) em um códon de alanina (Ala). Isto também criou um sítio de enzima de restrição Mlul. O plasmídeo de expressão resultante foi designado pGRN130, que também contém a sequência de consenso Kozak como descrito quanto a pGRN127.
A invenção também provê um vetor designado para expressar um fragmento de hTRT de sequência anti-sentido. O plasmídeo pGRN126 foi cortado para conclusão com as enzimas de restrição Mscl e Smal e religado para deletar mais de 95% da ORF de hTRT. Um fragmento Smal-Mscl foi reinserido durante o processo, para re-criar a atividade CAT. Este plasmídeo não purificado foi então re-digerido com Sall e EcoRI e o fragmento contendo o códon de iniciação da ORF de hTRT foi inserido nos sítios SallEcoRI de pBBS212,para produzir um plasmídeo de expressão anti-sentido expressando a sequência anti-sentido expandindo a 5’UTR e resíduos de 73 pares de base da ORF de hTRT (em células de mamíferos). Este plasmídeo foi designado pGRN135.
EXPRESSÃO DE TELOMERASE DE hTRT EM LEVEDURA
A presente invenção também provê vetores de expressão de levedura expressando hTRT, para produzir grandes quantidades de hTRT biologicamente ativa de comprimento completo.
300
Ò06
VETOR DE EXPRESSÃO DE PICHIA PASTORIS pPICZ Β E hTRT DE COMPRIMENTO COMPLETO P í Μ ? 1 P P £ Ls • · ·· · ··· ··· ··· « ·
Para produzir grandes quantidades de hTRT biologicamente ativa de comprimento completo, o vetor de expressão de Pchia pastoris pPICZ B (Invitrogen, San Diego, CA) foi selecionado. O inserto da sequência de codificação de hTRT foi derivado dos nucleotídeos 659 a 4801 do inserto de hTRT no plasmídeo pGRN121. Esta sequência de nucleotídeos inclui a sequência de comprimento completo de hTRT. Este vetor de expressão é designado para expressão indutível em P. pastoris de altos níveis de proteína de hTRT não modificada de comprimento completo. A expressão é conduzida por um promotor de levedura, mas a sequência expressa utiliza a iniciação de hTRT e códons de terminação. Nenhum códon exógeno foi introduzido pela clonagem. O vetor resultante pPICZ B/h TRT foi usado para transformar a levedura.
VETOR DE EXPRESSÃO DE pichia pastoris hTRT-His6/pPICZ B
Um segundo vetor de expressão de Pichia pastoris da invenção derivado de pPICZ B, também contém a sequência de comprimento completo codificando hTRT derivada dos nucleotídeos 659 a 4801 do inserto da hTRT no plasmídeo pGRN121. Este vetor de expressão hTRTHis6/pPICZ B codifica a proteína de hTRT de comprimento completo fundida em seu término C ao epítopo Myc e sequências de marcação do repórter His6. O códon de interrupção de hTRT foi removido e substituído pelas sequências de vetores codificando o epítopo Myc e a marcação do repórter His6, bem como um códon de interrupção. Este vetor é designado para dirigir expressão indutível de alto nível em levedura da seguinte proteína de fusão, que consiste da sequência de hTRT (sublinhada), sequências de vetores em colchetes ([L] e [NSAVD]), o epítopo Myc (duplamente sublinhado) e o marcador His6 (em itálico):
301
ÒO(p
MPRAPRCRAVRSLLRSHYREVLPLATFVRRLGPClG^L.VQRQDRAAFRALVA OCLVCVPWDARPPPAAPSFROVSCLKFJWARVLGRLrÉgGAKNtyAffqEÂfo. DGARGGPPEAFTTSVRSYLPNTVTDALRGSGAWGLLLRRVGDDVLVHLLARC ALFVLVAPSCAYOVCGPPLYOLGAATOARPPPHASGPRRRLGCERAWNHSVR eagvplglpapgarrrggsasrslplpkrprrgaapepertpvgogswahpgr trgpsdrgfcvvsparpaeeatslegalsgtrhshpsvgrohhagppstsrppr pwdtpcppvyaetkhflyssgdkeolrpsfllsslrpsltgarrlvetiflgsrp wmegtprrlprlporywqmrplflellgnhaocpygvllkthcplraavtpa· agvcarekpogsvaapeeedtdprrlvqllrohsspwovygfvraclrrlvp eglwgsrhnerrflrntkkfislgkhaklsloeltwkmsvrdcawlrrspgv ggvpaaehrlreeilakflhwlmsvyvvellrsffyvtettfoknrlffyrks yWSKLOSIGIROHLKRVOLRELSEAEVROHREARPALLTSRLRFIPKPDGLRPIV NMDYVVGARTFRREKRAERLTSRVKALFSVLNYERARRPGLLGASVLGT.DDIH. RAWRTFVLRVRAODPPPELYFVKVDVTGAYDTIPODRLTEVIASIIKPONTYCV rryavvòkaahghvrkafkshvstltdlopymrofvahloetspt.rdavvie OSSSLNEASSGLFDVFLRFMCHHAVRIRGKSYVOCOGIPOGSILSTI.LCSLCYGD MENKLFAGIRRDGLLLRLVDDFLLVTPHLTHAKTFLRTLVRGVPEYGCVVNLR KTVVNFPVEDEALGGTAFVOMPAHGLFPWCGLLLDTRTLEVOSDYSSYARTSl RASLTFNRGFKAGRNMRRKLFGVLRLKCHSLFLDLOWSLOTVCTNIYKir.I,IO AYRFHACVLQLPFHOOVWKNPTFFLRVISDTASLCYSILKAKNAGMSLGAKGA AGPLPSEAVOWLCfíOAFLLKLTRHRVTYVPLLGSLRTAOTOLSRKLPGTTLTA LEAAANPALPSDFKTlLDrLlEOKLlSEEDLrNSAVDl/ffl·/^//
EXPRESSÃO DE hTRT EM CÉLULAS DE INSETOS
A presente invenção também provê vetores de expressão de células de insetos de expressão de telomerase de hTRT, que produz grandes quantidades de hTRT biologicamente ativa de comprimento completo.
VETOR DE EXPRESSÃO DE BACULOVÍRUS pVL1393 E hTRT DE COMPRIMENTO COMPLETO
A sequência de codificação da telomerase de interesse foi clonada no vetor de expressão do baculovírus pVL1393 (Invitrogen, San Diego, CA). Esta construção foi subsequentemente co-transfectada em 10 células de Spodoptera fungupeida (sf-9) com DNA linearizado do vírus poliedrose nuclear Autograph california (Baculogold-AcMNPV). Os baculovírus recombinantes obtidos foram subsequentemente purificados em placa e expandidos seguindo-se os protocolos padrão.
O vetor de expressão provê expressão em células de inseto de
302
3ογ altos níveis de proteína de hTRT de comprimento completo. A expressão é ·*· · ·*· **· «2 · ♦·· * conduzida por um promotor do gene de polieítfiria *Haculêvir’aí.’: NeÀftum códon exógeno foi introduzido pela clonagem.
VETOR DE EXPRESSÃO DO BACULOVÍRUS pBlueBacHis2 Β E hTRT DE COMPRIMENTO COMPLETO
Para produzir grandes quantidades de hTRT biologicamente ativo de comprimento completo, o vetor de expressão de baculovírus pBlueBacHis2 B (Invitrogen, San Diego, CA) foi selecionado como uma fonte de elementos de controle. O inserto de codificação de hTRT de 10 nucleotídeos 707 a 4776 do inserto de hTRT no plasmídeo pGRN121.
Um hTRT de comprimento completo com marcadores His6 e Anti-Xpress (Invitrogen) foi também construído. Este vetor também contém um inserto consistindo de nucleotídeos 707 a 4776 do inserto de hTRT do plasmídeo pGRN121. O vetor dirige a expressão nas células de insetos de 15 altos níveis de proteína de hTRT de comprimento completo, para uma 6histidina clivável e rótulos Anti-Xpress, e a sequência de aminoácidos da proteína de fusão é mostrada abaixo; (-*-) denota sítio de divagem da enterocinase:
303
ÒOÍ>
MPRGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDL-*-DPSSRSAAGTME
FAAASTQRCVLLRTWEALAPATPAMPRAPRCRA^JlstufeKYÍEYLÉLAJ'ÊyR rlgpqgwrlvqrgdpaafralvaqclvcvpwdãrpÍpaapsprqvsclíceiIv ARVLQRLCERGAKNVLAFGFALLDGARGGPPEAFTTSVRSYLPNTVTDALRGS GAWGLLLRRVGDDVLVHLLARCALFVLVAPSCAYQVCGPPLYQLGAATQARP PPHASGPRRRLGCERAWNHSVREAGVPLGLPAPGARRRGGSASRSLPLPKRPR RGAAPEPERTPVGQGSWAHPGRTRGPSDRGFCVVSPARPAEEATSLEGALSGT RHSHPSVGRQHHAGPPSTSRPPRPWDTPCPPVYAETKHFLYSSGDKEQLRPSFL LSSLRPSLTGARRLVETIFLGSRPWMPGTPRRLPRLPQRYWQMRPLFLELLGNH AQCPYGVLLKTHCPLRAAVTPAAGVCAREKPQGSVAAPEEEDTDPRRLVQLLR QHSSPWQVYGFVRACLRRLVPPGLWGSRHNERRFLRNTKKFISLGKHAKLSLQ ELTWKMSVRDCAWLRRSPGVGCVPAAEHRLREEILAKFLHWLMSVYVVELLR SFFYVTETTFQKNRLFFYRKSVWSKLQSIGIRQHLKRVQLRELSEAEVRQHREA RPALLTSRLRFIPKPDGLRPIVNMDYVVGARTFRREKRAERLTSRVKALFSVLN YERARRPGLLGASVLGLDDIHRAWRTFVLRVRAQDPPPELYFVKVDVTGAYD TIPQDRLTEVIASIIKPQNTYCVRRYAVVQKAAHGHVRKAFKSHVSTLTDLQPY MRQFVAHLQETSPLRDAVVIEQSSSLNEASSGLFDVFLRFMCHHAVRIRGKSY VQCQGIPQGSILSTLLCSLCYGDMENKLFAGIRRDGLLLRLVDDFLLVTPHLTH AKTFLRTLVRGVPEYGCVVNLRKTVVNFPVEDEALGGTAFVQMPAHGLFPWC· GLLLDTRTLEVQSDYSSYARTSIRASLTFNRGFKAGRNMRRKLFGVLRLKCHS LFLDLQVNSLQTVCTNIYKILLLQAYRFHACVLQLPFHQQVWKNPTFFLRVISD TASLCYSILKAKNAGMSLGAKGAAGPLPSEAVQWLCHQAFLLKLTRHRVTYV PLLGSLRTAQTQLSRKLPGTTLTALEAAANPALPSDFKTILD
VETOR DE EXPRESSÃO DE BACULOVÍRUS pBlueBac4,5 e PROTEÍNA DE hTRTDE COMPRIMENTO COMPLETO
Para produzir grandes quantidades de hTRT biologicamente ativo de comprimento completo, um segundo vetor de expressão de 5 baculovírus, pBlueBac4,5 B (Invitrogen, San Diego, CA) foi construído. O inserto de codificação de hTRT também consistiu de nucleotídeos 707 a 4776 da hTRT do plasmídeo pGRN121.
VETOR DE EXPRESSÃO DE BACULOVÍRUS pMeiBacB E
PROTEÍNA DE hTRT DE COMPRIMENTO COMPLETO
Para produzir grandes quantidades de hTRT biologicamente ativo de comprimento completo, um terceiro vetor de expressão de baculovírus, pMeiBacB (Invitrogen, San Diego, CA) foi construído. O inserto de codificação de hTRT também consistiu de nucleotídeos 707 a 4776 do inserto de hTRT do plasmídeo pGRN121.
304
203
O pMeIBacB dirige a expressão do hTRT de comprimento ·♦ · * ··· 9 · * ♦·» · • · J * * J » r completo em células de insetos para o meio jéxtfaçélfila^,^|Xa£psf(feí via secretória usando-se a sequência de sinal de melitina. Altos níveis de hTRT de comprimento completo são assim secretados. A sequência de sinal de 5 melitina é clivada após a excreção, mas é parte do conjunto de proteínas que permanece intracelularmente. Por essa razão, é indicado em parênteses na seguinte sequência. A sequência da proteína de fusão codificada pelo vetor é mostrada abaixo:
(MKFLVNVALVFMVVYISYIYA)-*-DPSSRSAAGTMEFAAASTQRCVLL
RTWEALAPATPAMPRAPRCRAVRSLLRSHYREVLPLATFVRRLGPQGWRLVQ rgdpaafralvaqclvcvpwdarpppaapsfrqvsclkelvarvlqrlcerg AKNVLAFGFALLDGARGGPPEAFTTSVRSYLPNTVTDALRGSGAWGLLLRRV GDDVLVHLLARCALFVLVAPSCAYQVCGPPLYQLGAATQARPPPHASGPRRRL GCERAWNHSVREAGVPLGLPAPGARRRGGSASRSLPLPKRPRRGAAPEPERTP VGQGSWAHPGRTRGPSDRGFCVVSPARPAEEATSLEGALSGTRHSHPSVGRQH HAGPPSTSRPPRPWDTPCPPVYAETKHFLYSSGDKEQLRPSFLLSSLRPSLTGAR RLVETIFLGSRPWMPGTPRRLPRLPQRYWQMRPLFLELLGNHAQCPYGVLLKT HCPLRAAVTPAAGVCAREKPQGSVAAPEEEDTDPRRLVQLLRQHSSPWQVYG FVRACLRRLVPPGLWGSRHNERRFLRNTKKFISLGKHAKLSLQELTWKMSVRD CAWLRRSPGVGCVPAAEHRLREEILAKFLHWLMSVYVVELLRSFFYVTETTFQ KNRLFFYRKSVWSKLQSIGIRQHLKRVQLRELSEAEVRQHREARPALLTSRLRF IPKPDGLRPIVNMDYVVGARTFRREKRAERLTSRVKALFSVLNYERARRPGLL GASVLGLDDIHRAWRTFVLRVRAQDPPPELYFVKVDVTGAYDTIPQDRLTEVI ASIIKPQNTYCVRRYAVVQKAAHGHVRKAFKSHVSTLTDLQPYMRQFVAHLQ ETSPLRDAWIEQSSSLNEASSGLFDVFLRFMCHHAVRIRGKSYVQCQGIPQGSI LSTLLCSLCYGDMENKLFAGIRRDGLLLRLVDDFLLVTPHLTHAKTFLRTLVRG VPEYGCVVNLRKTWNFPVEDEALGGTAFVQMPAHGLFPWCGLLLDTRTLEV QSDYSSYARTSIRASLTFNRGFKAGRNMRRKLFGVLRLKCHSLFLDLQVNSLQ TVCTNIYKILLLQAYRFHACVLQLPFHQQVWKNPTFFLRVISDTASLCYSILKA . KNAGMSLGAKGAAGPLPSEAVQWLCHQAFLLKLTRHRVTYVPLLGSLRTAQT
QLSRKLPGTTLTALEAAANPALPSDFKTILD
EXPRESSÃO DE hTRT EM CÉLULAS DE MAMÍFEROS
A presente invenção também provê vetores para produzir hTRT em grandes quantidades como proteína biologicamente ativa de comprimento completo, em uma variedade de linhagens de células de mamíferos, que são úteis em muitas modalidades da invenção, como discutido acima.
305 òiO PLASMÍDEOS DE EXPRESSÃO DE MPSV-hTRT
A invenção também provê um jist^ni^ íiê'jexprêásh^ í^ara • *9+9 ·*> »·* 999 v · utilização em células de mamíferos, que produz a expressão mais alta possível de proteína recombinante, tal como telomerase, sem realmente modificar a sequência de codificação (por exemplo, otimizando a utilização do códon). Em uma modalidade, a invenção provê plasmídeos de expressão em mamíferos MPSV (do plasmídeo pBBS212, descrito como pMPSV-TM em Lin J-H (1994) Gene 47: 287-292) capazes de expressar as TRTs da invenção. Os plasmídeos MPSV podem ser expressos ou como estáveis ou 10 como clones transientes.
Neste sistema de expressão, embora a própria sequência de codificação da hTRT seja imutável, os elementos de controle transcricional exógeno são incorporados no vetor. O promotor LTR do vírus do sarcoma mieloproliferativo (MPSV) (MPSV-LTR, intensificado pelo intensificador 15 citomegalovírus (CMV), é incorporado para iniciação transcricional. Este promotor consistentemente mostra níveis mais elevados de expressão em linhagens celulares [ver Lin J-H (1994) acima]. Uma sequência de consenso Kozak pode ser incorporada para iniciação da translação [ver Kozak (1996) Mamm. Genome 7: 563-574]. Todas as sequências estranhas de hTRT não 20 transladada 5’ e 3’ podem ser removidas para assegurar que estas sequências não interfiram com a expressão, como apresentado acima. O plasmídeo de MPSV contendo a sequência completa de codificação de hTRT, com todas as sequências estranhas incluídas, é designado pGRN133. Um plasmídeo de controle “anti-sentido” de hTRT também foi construído. Este vetor é idêntico 25 a pGRN133, exceto que o inserto de TRT é a sequência anti-sentido de hTRT (o anti-sentido, cujo controle pode ser usado como um vetor, é designado pGRN134). O plasmídeo de MPSV contendo a sequência de codificação de hTRT completa com todas as outras sequências estranhas removidas e contendo a sequência de consenso Kozak, é designado pGRN145.
306
311
Dois marcadores de seleção, PAC (Puromicin-N-acetil·*· · ··· t · *·* · transferase = resistência de Puromicina) e HygB (Hlgiomi«mâ:HÃ^4^têiJcia de Higromicina), acham-se presentes para a seleção dos plasmídeos após a transfecção (ver exame com referente a marcadores selecionáveis, acima). A seleção dupla, usando marcadores em ambos os lados do poli-ligador de vetores, deve aumentar a estabilidade da sequência de codificação da hTRT. Uma DHFR (diidrofolato redutase) codificando a sequência é incluído para permitir a ampliação do cassete de expressão após os clones estáveis serem ^20 produzidos. Outro meio de ampliação do gene também pode ser usado para aumentar as produções de proteína recombinante.
A invenção também provê plasmídeos de expressão de mamíferos de MPSV contendo proteínas de fusão de hTRT. Em uma modalidade, a sequência de hTRT, embora retendo sua região 5’ não transladada, é ligada a uma bandeira do epítopo, tal como a IBI FLAG (Intemational Biotechnologies Inc. (IBI), Kodack, New Haven, CT) e inserida no plasmídeo de expressão de MPSV (designado pGRN 147). Esta construção particular contém um sítio de iniciação da translação Kozak. A proteína de fusão expressa pode ser purificada usando-se o anticorpo monoclonal de octapeptídeo Ml anti-FLAG (IBI, Kodak, supra).
Em outra modalidade, a hTRT é alterada especificamente ao sítio. Um códon de resíduo de aminoácido é mutagenizado, mudando o ácido aspártico na posição 869 em uma alanina. Este mutante de hTRT Asp869>Ala, retendo sua região não transladada 5’ e incorporando uma sequência Kozak, foi inserido em um plasmídeo de expressão MPSV e designado pGRN146. O mutante de hTRT Asp869->Ala foi ainda construído para conter a sequência de FLAG, como descrito acima, e o inserto clonado em um plasmídeo de expressão de MPSV. Um tal plasmídeo de expressão é designado pGRN154-I. Especificamente, para pGRN154-I, um fragmento de digestão de restrição Eam 11051 de pGRN 146 contendo a “extremidade
307
312frontal” contendo a sequência Kozak (segmento 5’) de hTRT é clonado nos :·. : .·. ··:.v .·. :·· i sítios Eam 11051 de pGRN147 (ver acima), para? fjrlduzs* utn^lasnJMM de expressão de MPSV capaz de expressar hTRT com uma sequência Kozak, a mutação acima descrita D869-> e a bandeira IBI.
Outra modalidade da invenção é um plasmídeo de expressão derivado de pGRN146. O plasmídeo de expressão de mamíferos, designado pGRN, foi gerado por excisão do fragmento EcoRI do plasmídeo pGRN146 (contendo a ORF de hTRT) e clonado no sítio EcoRI de pBBS212 para remover o 5’UTR de hTRT. A hTRT é orientada de modo que sua expressão 10 seja controlada pelo promotor de MPSV. Isto produz um plasmídeo de expressão de mamíferos que expressa hTRT com uma sequência de consenso Kozac e a mutação D869->A, e usa o promotor de MPSV.
A invenção provê um vetor de expressão de mamíferos em que a hTRT é orientada de modo que a sequência de codificação da hTRT 15 seja conduzida pelo promotor de MPSV. Por exemplo, um fragmento de digestão da restrição de EcoRI de pGRN137 contendo a estrutura de leitura aberta da hTRT (ORF) foi clonado no sítio EcoRI de pBBS212 (ver abaixo), assim removendo a região não transladada 5’ (5’-UTR) da hTRT. pGRN137 foi construído excisando-se um fragmento SalI-Sse8387I de pGRN130, 20 descrito abaixo, contendo a mutação Kozak de hTRT nos sítios Sal 1-SSE 83871 de pGRN136, produzindo um plasmídeo de expressão de mamíferos expressando a hTRT contendo uma sequência de consenso de Kozak fora do promotor de MPSV. O plasmídeo pGRN foi construído excisando-se um fragmento HindIII Sall do pGRN 126 contendo a ORF de hTRT e clonando-a 25 nos sítios HindIII Sall, pBBS242, produzindo um plasmídeo de expressão de mamíferos, designados pGRN145, que expressa hTRT com uma sequência de consenso Kozak usando o promotor de MPSV. Ver também o vetor de expressão de mamíferos conduzidos pelo promotor de MPSV pGRN 152 descrito abaixo.
308
343 hTRT EXPRESSA EM 293
EPISSÔMICO pEBVHis
CÉLULAS,
USANDO. YETQR • · ·· ··· ····· ·
Um vetor epissômico, pEBVHis (Invitrogen, San Diego, CA) foi construído para expressar uma proteína de fusão de hTRT, 5 compreendendo hTRT fundido a um rótulo de epítopo de extensão Nterminal, o epítopo Xpress (Invitrogen, San Diego, CA) (designado pGRN 122). O fragmento de hTRT Notl de pGRN121 contendo a ORF de hTRT, foi clonado no sítio Notl de pEBVHisA, de modo que a ORF de hTRT fique na mesma orientação do promotor do Rous Sarcoma Virus (RSV) do vetor. Nesta orientação, a bandeira His6 ficou relativamente mais próxima do término N da hTRT.
Foi também construído um vetor contendo como um inserto a sequência anti-sentido de hTRT e o rótulo do epítopo (o plasmídeo designado de pGRN123, que pode ser usado como um controle). O vetor foi 15 transfectado em 293 células e transladada a hTRT identificada e isolada usando-se um anticorpo específico para o epítopo Xpress. pEBVHis é um vetor epissômico de EBV resistente à higromicina, que expressa a proteína de interesse fundida a um peptídeo N-terminal. As células conduzindo o vetor são selecionadas e expandidas, depois os extratos nucleares e citoplásmicos 20 são preparados. Estes extratos nucleares e de controle são imunoprecipitados com anticorpo anti-Xpress, e as contas imunoprecipitadas são analisadas quanto à atividade de telomerase, pelo ensaio convencional.
hTRT RECOMBINANTE DE EXPRESSÃO EM CÉLULAS MORTAIS DIPLÓIDES HUMANAS NORMAIS
Em uma modalidade da invenção, a hTRT recombinante e os componentes necessários do complexo de enzimas de telomerase, podem ser expressos em células mortais diplóides normais, para aumentar sua capacidade proliferativa ou para imortalizá-las, ou para facilitar a sua imortalização. Isto permite que se obtenha células imortais diplóides com um
309
ΜΗ fenótipo e cariótipo de outra forma normal. Como examinado. açinja,.e§íç.
• · · · · · ·· · · · · · · ······ · · · ·· · · emprego da telomerase tem enorme utilidade comerciai.’ As KtkT»ileííse9Ítidõ”*: (Figura 16) e a hTRT anti-sentido foram clonados em um vetor de CMV.
Estes vetores foram purificados e transientemente transfectados em dois clones de células humanas mortais diplóides normais. Os clones humanos eram cepas jovens BJ e IMR90 diplóides humanas de passagem.
A análise da atividade de telomerase usando um ensaio TRAP utilizando o Kit TRAPeze® (Oncor, Inc., Gaithersburg, MD) mostrou que a transfecção hTRT de sentido - mas não hTRT anti-sentido - gerou atividade de telomerase em ambas as cepas celulares BJ e IMR90.
A EXPRESSÃO DE hTRT RECOMBINANTE EM CÉLULAS HUMANAS IMR90 IMORTALIZADAS
Usando-se a mesma construção de sentido de hTRT clonada em vetores CMV usados nos estudos das cepas celulares BJ e IMR90 15 humanas diplóides descritos acima, a linhagem celular da via de SW13 ALT imortalizada (uma célula de IMR90 imortalizada com antígeno SV40) foi transientemente transfectada. Um ensaio TRAP (TRAPeze, Oncor, Inc., Gaithersburg, MD) demonstrou que a atividade de telomerase foi gerada nas células transfectadas de construção de sentido.
“70 VETORES PARA EXPRESSÃO REGULADA DE hTRT EM CÉLULAS DE MAMÍFEROS: EXPRESSÃO INDUTÍVEL E REPRESSÍVEL DE hTRT
A invenção provê vetores que podem ser manipulados para induzir ou reprimir a expressão das TRTs da invenção, tais como hTRT. Por exemplo, a sequência de codificação de hTRT pode ser clonada no Sistema de Expressão Indutível por Ecdisona (San Diego, CA) e nos sistemas regulados por tetraciclina Tet-On e Tet-off da Clontech Laboratories, Inc. (Paio Alto, Ca). Tais sistemas de expressão indutíveis são fornecidos para uso nos processos da invenção, onde seja importante controlar o nível ou
310 índice de transcrição de TRT transfectada. Por exemplo» a.iqy.eqçãp prçy.ê.
···*·· · · · ·· · linhagens celulares imortalizadas através da expressão: 'deihTRÍf; ^ai&O^kilds podem ser tomadas “mortais” pela inibição da expressão de hTRT pelo vetor através de controles transcricionais, tais como aqueles providos pelo sistema de Tet-Off. A invenção também provê processos de expressar TRT apenas transientemente para evitar a expressão constitutiva de hTRT, que pode conduzir à “imortalização” indesejável das células transfectadas, como apresentado acima.
O Sistema de Expressão de Mamíferos Indutível por Ecdisona é projetado para permitir expressão regulada do gene de interesse em células de mamíferos. O sistema é caracterizado por seu mecanismo firmemente regulado, que quase não permite nenhuma expressão basal e indutibilidade maior do que 200 vezes em células de mamíferos. O sistema de expressão se baseia no receptor de ecdsona heterodimérica de Drosophila. O Sistema de
Expressão Indutível por Ecdisona usa um análogo da ecdisona de hormônios esteróides, muristerona A, para ativar a expressão de hTRT através de um receptor nuclear heterodimérico. Os níveis de expressão foram relatados excederem 200 vezes sobre os níveis basais sem qualquer efeito sobre a fisiologia celular dos mamíferos (“Ecdysone-Inducible Gene Expression in 20 Mammalian Cells and Transgenic Mice” (1996) Proc. Natl. Acad. Sei. USA
93, 3346-3351). Uma vez o receptor se ligue à ecdisona ou à muristerona, um análogo da ecdisona, o receptor ativa um promotor responsivo à ecdisona para dar expressão controlada do gene de interesse. No Sistema de Expressão de Mamíferos indutível por Ecdisona, ambos os monômeros do receptor 25 heterodimérico são constitutivamente expresso do mesmo vetor, pVgRXR. O promotor responsivo à ecdisona, que finalmente conduz a expressão do gene de interesse, é localizado em um segundo vetor, pIND, que conduz a transcrição do gene de interesse.
A sequência de codificação da hTRT é clonada no vetor pIND
311 (Clontech Laboratories, Inc., Paio Alto, CA), que ..contém..5.. elementos.
······ · · ····· • · · ··· ♦ · · · ··· modificados de resposta à ecdisona (E/GREs) à montante Ueúm promotor'de : choque térmico mínimo e do sítio de clonagem múltipla. A construção é então transfectada em linhagens celulares que tenham sido pré-construídas para estavelmente expressarem o receptor de ecdisona. Após a transfecção, as células são tratadas com mutisterona A para induzir a expressão intracelular a partir de pIND.
Os sistemas de expressão Tet-on e Tet-off (Clontech, Paio Alto, CA) dão acesso aos sistemas regulados de expressão do gene de alto 10 nível descritos por Gossen (1992) “Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline responsive promoters” Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 5547-5551, para o sistema de repressão da transcrição Tet-Off; e Gossen (1995) “Transcriptional activation by tetracycline in mammalian cells” Science 268: 1766-1769, para o sistema transcricional indutível Tet15 On. Nas linhagens celulares transformadas “Tet-Off”, a expressão do gene é ligada quando a tetraciclina (Tc) ou a doxiciclina (“Dox”; um derivado da Tc) é removida do meio de cultura. Ao contrário, a expressão é ligada em linhagens celulares Tet-On pela adição de Tc ou Dox ao meio. Ambos os sistemas permitem a expressão de genes clonados serem intimamente “20 regulados em resposta às concentrações variáveis de Tc ou Dox.
Este sistema usa o “pTRE” como um plasmídeo de resposta que pode ser usado para expressar um gene de interesse. O plasmídeo pTRE contém um sítio de clonagem múltipla (MCS) imediatamente a jusante do promotor PhCMV*-l responsivo a Tet. Os genes ou cDNAs de interesse 25 inseridos em um dos sítios no MCS serão responsivos às proteínas regulatórias de tTA e rtTA nos sistemas Tet-Off e Tet-On, respectivamente., respectivamente. O PhCMV*-l contém o elemento responsivo a Tet (TRE), que consiste de sete cópias da sequência do operador tet de 42 pares de base (TETo). O elemento TRE é logo a montante do promotor de CMV mínimo
312 (PminCMV), que carece do intensificador, que é parte .do promotor completo.
na ausência de ligação de proteínas regulatórias às sequência tetO. O inserto clonado deve ter um códon de iniciação. Em alguns casos, a adição de um sítio de ligação ribossômico de consenso Kozak pode melhorar os níveis de expressão; no entanto, muitos cDNAs foram eficientemente expressos em sistemas Tet sem a adição de uma sequência Kozak. Os plasmídeos pTREGene X são cotransfectados com pTK-Hyg, para permitir a seleção de transfectantes estáveis.
O ajuste de um sistema de expressão Tet-Off ou Tet-On geralmente requer duas transfecções consecutivas estáveis para criar uma linhagem celular “duplamente estável” que contenha cópias integradas de genes codificando a proteína regulatória apropriada e a TRT sob o controle de uma TRE. Na primeira transfecção, a proteína regulatória apropriada é introduzida na linhagem celular de escolha, por transfecção de um “plasmídeo regulador”, tal como o vetor pTet-Off ou pTet-on, que expressa as proteínas regulatórias apropriadas. A hTRT clonada no “plasmídeo de resposta” pTRE, é então introduzida na segunda transfecção para criar a linhagem celular duplamente estável Tet-Off ou Tet-On. Ambos os sistemas —20 dão controle muito firme on/off da expressão do gene, indução dependente de dose regulada, e níveis altos absolutos da expressão do gene.
hTRT RECOMBINANTE DE EXPRESSÃO COM SEQUÊNCIAS DE DHFR E ADENOVÍRUS
A construção de plasmídeo de pGRN155 foi projetada para expressão transiente de cDNA de hTRT em células de mamíferos. Um consenso de Kozak é inserido na extremidade 5’ da sequência de hTRT. O inserto de hTRT não contém nenhuma UTR 3’ ou 5’. O cDNA de hTRT é inserido no sítio EcoRI de p91023(B) [Wong (1985) Science 228: 810-815] O inserto da hTRT fica na mesma orientação do ORF de DHFR.
313
313
O plasmídeo pGRN155 contém a.,orjgejn...S.V4.0 ,e...o. intensificador logo a montante de um promotor de adênÓvírtiS, uhtfgdfee^e · resistência à tetraciclina, uma origem de E. coli e uma região do gene de adenovírus VAI e VAII. Este cassete de expressão contém, na seguinte 5 ordem: o último promotor principal de adenovírus; o líder tripartido de adenovírus; um intron híbrido consistindo de um sítio de união 5’ do primeiro exon do líder tripartido e um sítio de união 3’ do gene de imunoglobulina de camundongos; o cDNA de hTRT; a sequência de codificação de DHFR de camundongos; e o sinal de poliadenilação SV40. O 10 líder tripartido de adenovírus e os RNAs de VA foram apresentados como aumentando a eficiência com que os mRNAs policistrônicos são transladados. As sequências de DHFR foram apresentadas como intensificando a estabilidade de mRNA híbrido. As sequências de DHFR também podem prover um marcador para seleção e ampliação de sequências 15 de vetor. Ver Logan (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81: 3655); Kaufman (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82: 689; e Kaufman (1988) Focus (Life Technologies, Inc.), Vol 10, n- 3. Isto toma o vetor de expressão particularmente útil para expressão transiente.
Outros plasmídeos de expressão da invenção são descritos para fins ilustrativos.
pGRN121
O fragmento EcoRI do clone lambda 25-1.1.6 contendo a proteína inteira de hTRT codificando cDNA foi inserido no sítio EcoRI de pBluescriptIISK+, de tal modo que a extremidade 5’ do cDNA ficasse 25 próximo do promotor T7 no vetor. O marcador selecionável que é usado com esta vetor é a ampicilina.
pGRN122
O fragmento Notl do pGRN121 contendo o ORF de hTRT foi inserido no sítio Notl de pEBVHisA de modo que a sequência de codificação
314 fosse operavelmente ligada ao promotor de RSV. Este plasmídeo çxpre^a, ······ · · · ·· · · uma proteína de fusão composta de uma bandeira ElisóFfuâdiSaUo^rmtáahK’’· da proteína de hTRT. O marcador selecionável que é usado com esta vetor é a ampicilina ou higromicina.
pGRN123
O fragmento Notl de pGRN121 contendo o ORF foi inserido no sítio Notl de pEBVHisA, de modo que a sequência de codificação ficasse na orientação oposta do promotor RSV, assim expressando a hTRT antisentido.
pGRN124
O plasmídeo pGRN121 foi deletado de todos os sítios Apal, seguido por deleção do fragmento MscI-HincII contendo a 3’UTR. O fragmento Nco-Xbal contendo o códon de interrupção da sequência de codificação de hTRT, foi então inserido nos sítios Nco-Xbal de pGRN121, 15 para produzir um plasmídeo equivalente ao pGRN121, exceto faltando o 3’UTR, que pode ser preferido para níveis de expressão aumentados em algumas células.
pGRN125
O fragmento Notl de pGRN124 contendo o a sequência de “20 codificação de hTRT foi inserido no sítio Notl de pBBS235, de modo que a estrutura de leitura aberta ficasse na orientação oposta do promotor Lac. O marcador selecionável que é usado com este vetor é o cloranfenicol.
pGRN126
O fragmento Notl de pGRN124 contendo a sequência de 25 codificação de hTRT foi inserido no sítio Notl de pBBS235, de modo que a sequência de codificação de hTRT inserida ficasse na mesma orientação do promotor Lac.
pGRN127
O oligonucleotídeo 5 ’TGCGCACGTGGGAAGCCCT
315
GGCagatctgAatt CcaCcATGCCGCGCGCTCCCCGÇTG-3: £qí . u$adp • · · ·· ··· · · · ♦ · · mutagênese in vitro de pGRN125 para converter o ccícloii ATG db toiéiaÇÍo ’ da sequência de codificação de hTRT em uma sequência de consenso Kozak, e criar sítio de EcoRI e BglII para clonagem. Igualmente, o oligonucleotídeo
COD2866 foi usado para converter AmpS em AmpR (resistente à ampicilina) e oligonucleotídeo COD1941 foi usado para converter CatR (resistente a cloranfenicol) em CatS (sensível a cloranfenicol).
pGRN128
O oligonucleotídeo 5’TGCGCACGTGGGAAGCCCTGGC agatctgAatt CCaCcATGCCGCGCGC TCCCCGCTG-3’ é usado em mutagênese in vitro para converter o códon ATG de iniciação de hTRT em um consenso Kozak, e criar sítios de EcoRI e BglII para clonagem. Igualmente, o oligonucleotídeo 5’-CTGCCCTCAGAC
TTCAAGACCATCCTGGACTACAAGGACGACG A T GACAAATGAA
TTCAGATCTGCGGCCGCCACCGC GGTGGAGCTCC AGC-3’ é usado para inserir a Bandeira IBI (Intemational Biotechnologies Inc. (IBI), Kodak, New Haven, CT) no término C e criar sítios de EcoRI e BglII para clonagem. Igualmente, COD2866 é usado para converter AmpS em AmpR, e COD1941 é usado para converter CatR em CatS.
“70 pGRN129
O oligonucleotídeo CGGGACGGGCTGCTCCTGC GTTTGGTGGAcGcgTTCTTGTTGGT GACACCTCACCTCACC-3 ’, foi usado por mutagênese in vitro para converter o códon Asp869 em um códon Ala (isto é, a segunda Asp do motivo DD foi convertida em uma Alanina, 25 para criar um mutante de hTRT dominante/negativo. Isto também criou um sítio de Mlul. Igualmente, o oligonucleotídeo 5’CTGCCCTCAGACTTCAAGACCA-TCCTGGACTACAAGGACGA CGA TGACAAATGAATTCAGATCTGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTCC AGC-3’ foi usado para inserir a Bandeira IBI no término C e criar os sítios
316
EcoRI e BglII para clonagem. Igualmente, COD286.6 Jcú.. usado^para.
• * í ·,· ,· *t ,· ·* ** ··* converter AmpS em AmpR e COD1941 foi usado pára tonvérter GafR èm :
CatS.
pGRN130
O oligonucleotídeo 5’- CGGGACGGGCTGCTCCT
GCGTTTGGTGGAcGcgTTCTTGTTGGTGACACCTCACCTCACC-3 ’, foi usado na mutagênese in vitro para converter o códon Asp869 em um códon Ala (isto é, a segunda Asp do motivo DD foi convertida em uma Alanina, para produzir uma proteína variante dominante/negativa. Isto também criou 10 um sítio Mlul. Igualmente, o oligonucleotídeo 5’TGCGCACGTGGGAAGCCCTGGC agatctgAat tCCaCcATGCCGCGCG CTCCCCGCTG-3’ foi usado na mutagênese in vitro para converter o códon de iniciação ATG da sequência de codificação de hTRT em uma sequência de consenso e criar sítios EcoRI e BglII para clonagem. Igualmente, COD2866 15 foi usado para converter AmpS em AmpR e COD1941 foi usado para converter CatR.
pGRN131
O fragmento EcoRI de pGRN128 contendo o ORF de hTRT com a sequência Kozak e mutações da Bandeira IBI, é inserido no sítio “20 EcoRI de pBBS212, de modo que a ORF de hTRT seja expresso fora do promotor de MPSV. O plasmídeo pBSS212 contém um promotor MPSV, o intensificador CMV e o sítio de poliadenilação SV40.
pGRN132
O fragmento EcoRI de pGRN128 contendo o ORF de hTRT com a sequência Kozak e mutações da Bandeira IBI, é inserido no sítio EcoRI de pBBS212, de modo que o anti-sentido da ORF de hTRT seja expresso fora do promotor de MPSV.
pGRN133
O fragmento EcoRI de pGRN121 contendo a sequência de
317 codificação de hTRT foi inserido no sítio EcoRI de pELBS212. de modo que. a ** x ········ ···*·· ··<*··· · · ····· ······ · · · | ··· proteína de hTRT seja expressa sob o controle do promotor dê MPSV·.· :·· ’· : pGRN134
O fragmento EcoRI de pGRN121 contendo a sequência de codificação de hTRT foi inserido no sítio EcoRI de pBBS212, de modo que o anti-sentido da sequência de codificação de hTRT seja expressa sob o controle do promotor de MPSV. Os marcadores selecionáveis usados com este vetor são Chlor/HygB/PAC.
pGRN135
O plasmídeo pGRN 126 foi digerido até conclusão com Mscl e
Smal e religado para deletar acima de 95% da sequência de codificação de hTRT inserida. Um fragmento Smal-Mscl foi re-inserido durante o processo para recriar a atividade Cat para seleção. Este plasmídeo não purificado foi então re-digerido com Sall e EcoRI e o fragmento contendo o códon de iniciação da sequência de codificação de hTRT foi inserida nos sítios sallEcoRI de pBBS212. Isto produz um plasmídeo de expressão anti-sentido expressando o anti-sentido da 5’UTR e 73 bases da sequência de codificação. Os marcadores selecionáveis usados com este vetor são Chlor/HygB/PAC. pGRN136
O fragmento HindIII-SalI de pGRN126 contendo a sequência de codificação de hTRT foi inserido nos sítios HindIII-SalI de pBBS242. pGRN137
O fragmento SalI-Sse8387I de pGRN130 contendo a sequência Kozak foi inserido nos sítios SalI-Sse8387I de pGRN136.
pGRN138
O fragmento EcoRI de pGRN 124 contendo hTRT menos a 3’UTR foi inserido no sítio EcoRI de pEGFP-C2, tal que a orientação da hTRT fosse a mesma do domínio de EGFP.
pGRN139
318
nucleotídeoCTGCCCTCAGACT.TCAAGACCATCCT.
• « · ·· ♦ ·· ♦ · · · · · ··*··· | · · ·· · · GGACTA-CAAGGACGACGATGACAAAGAATTCÃGÁTCT GG&GècÒ ·
CCACCGCGGTGGAGCTCCAGC-3’ FOI usado para inserir a Bandeira IBI no término C de hTRT em pGRN125 e criar sítios de EcoRI e BglII para clonagem. Igualmente, COD2866 foi usado para converter AmpS em AmpR, e COD1941 foi usado para converter CatR em CatS.
pGRN140
O fragmento Ncol contendo as sequências de montante da hTRT genômica e o primeiro intron de hTRT de lambda G55, foi inserido no 10 sítio Ncol de pBBS167. O fragmento é orientado de modo que a hTRT fique na mesma direção do promotor Lac.
pGRN141
O fragmento Ncol contendo as sequências de montante da hTRT genômica e o primeiro intron de hTRT de lambda G55, foi inserido no 15 sítio Ncol de pBBS167. O fragmento é orientado de modo que a hTRT fique na direção oposta do promotor Lac.
pGRN142
O fragmento Notl de lambdaGphi5 contendo o inserto genômico completo de ~15 kbp incluindo a região do promotor do gene de ~2.Q hTRT, foi inserido no Notl do plasmídeo pBBS185. O fragmento é orientado de modo que a ORF da hTRT fique na orientação oposta à do promotor Lac. pGRN143
O fragmento Notl de lambdaGphi5 contendo o inserto genômico completo de ~15 kbp incluindo a região do promotor do gene de 25 hTRT, foi inserido no sítio Notl do plasmídeo pBBS185. O fragmento é orientado de modo que a ORF da hTRT fique na mesma orientação do promotor Lac.
pGRN144
Deleção de SAL1 de pGRN140 para remover as sequências
319 lambda.
pGRN145
Este vetor foi construído para a expressão das sequências de hTRT em células de mamíferos. O fragmento de EcoRI de pGRN137 contendo a sequência de codificação de hTRT foi inserido no sítio EcoRI de pBBS212, para remover a porção da sequência correspondente ao 5’UTR de mRNA de hTRT. A sequência de codificação de hTRT é orientada de modo que ela seja expressa sob o controle do promotor de MPSV. Os marcadores selecionáveis usados com este vetor são Chlor/HygB/PAC.
pGRN146
Este vetor foi construído para a expressão das sequências de hTRT em células de mamíferos. O fragmento Sse8387I-NotI de pGRN130 contendo a mutação D869A de hTRT foi inserido nos sítios Sse8387I-NotI de pGRN137. Os marcadores selecionáveis usados com este vetor são Ampicilina/HygB/PAC.
pGRN147
O fragmento Sse8387I-NotI de pGRN139 contendo a Bandeira IBI foi inserido nos sítios Sse8387I-NotI de pGRN137.
PGRN148
O fragmento BglII-Eco47III de pGRN 144 contendo a região do promotor de hTRT, foi inserido nos sítios BglII-NruI de pSEAP2, para produzir uma construção de promotor/reporter de hTRT.
pGRN149
Este vetor é um vetor intermediário para construir um vetor de expressão de proteína de fusão de hTRT. O oligo 5’cttcaagaccatcctggactttcgaaa-cgcggccgccaccgcggtggagctcc-3 ’ mutagênico foi usado para adicionar um sítio CSP45I no término C de hTRT por mutagênese in vitro de pGRN 125. O códon “interrupção” de hTRT foi deletado e substituído por um sítio Csp45I. O marcador selecionável que é usado com
320
este vetor é a ampicilina. ·· · · ··· · · · «·· í ·· · · · · ·· · · · · · · 4· · ·· · · · ♦ * ··*
pGRN150 • · ·· ♦ ··· ··· · ·
O fragmento BglII-FspI de pGRN144 contendo a região do promotor de hTRT, foi inserido nos sítios BglII-NruI de pSEAP2, para 5 produzir uma construção de promotor/repórter de hTRT.
pGRN151
Este vetor foi construído para a expressão das sequências de hTRT em células de mamíferos. O fragmento EcoRI de pGRN147 contendo a sequência de codificação de hTRT foi inserido no sítio EcoRI de pBBS212 10 para remover a porção da sequência correspondente ao r’UTR do mRNA de hTRT. A sequência de codificação de hTRT é orientada de modo que seja expressa sob o controle do promotor de MPSV. Os marcadores selecionáveis usados com este vetor são Chlor/HygB/PAC.
pGRN152
O fragmento de EcoRI de pGRN146 contendo a sequência de codificação de hTRT foi inserido no sítio de EcoRI de pBBS212, para remover a porção da sequência correspondente ao 5’UTR da hTRT. A sequência de codificação da hTRT é orientada de modo que ela seja expressa sob o controle do promotor de MPSV.
~20 pGRN153
O fragmento Styl de pGRN130 contendo mutação D869-->A de hTRT (sequência de codificação variante de hTRT) foi inserida nos sítios Styl de pGRN158, para produzir um plasmídeo contendo a sequência de codificação de hTRT com uma sequência de consenso Kozak em sua 25 extremidade 5’, uma sequência IBIFLAG em sua extremidade 3’ (a região de codificação do término C), e a mutação D869-->A.
pGRN154
O fragmento de EcoRI de pGRN153 contendo o gene de hTRT foi inserido no sítio de EcoRI de pBS212, em uma orientação tal que o
321
ORF de hTRT seja orientado na mesma direção do prpmotor de MPSV. Lstq .·* *» V \s produz um plasmídeo de expressão dirigido a MPSV que fexprèssa-a:protema · hTRT com uma sequência de consenso Kozak em sua extremidade terminal amino, um IBI FLAG em sua extremidade terminal carbóxi, e a mutação 5 D869—>A.
pGRN155
Este vetor foi construído para a expressão das sequências de hTRT em células de mamíferos. O inserto incluiu cDNA de comprimento completo de hTRT menos 5’ e 3’ UTR, e sequências Kozak. O fragmento 10 EcoRI de pGRN145 contendo o cDNA de hTRT com o consenso Kozak e sem 3’ ou 5’ UTR, foi inserido no sítio EcoRI de p91023(B), de tal modo que a hTRT estivesse na mesma orientação do ORF de DHFR. Isto produz um vetor de expressão transiente para hTRT. O marcador selecionável usado com este vetor é a tetraciclina.
pGRN156
Este vetor foi construído para a expressão das sequências de hTRT em células de mamíferos. O fragmento EcoRI de pGRN146 contendo a mutação D869A do cDNA de hTRT com o consenso Kozak e sem 3’ ou 5’ UTR, foi inserido no sítio EcoRI de p91023(B), de tal modo que a hTRT “20 estivesse na mesma orientação do ORF de DHFR. Isto produz um vetor de expressão transiente para hTRT. O inserto incluiu cDNA de comprimento completo de hTRT menos 5’ e 3’ UTR, D869A, e sequências Kozak. O marcador selecionável usado com este vetor é a tetraciclina.
pGRN157
Este vetor foi construído para a expressão das sequências de hTRT em células de mamíferos. O fragmento EcoRI de pGRN147 contendo o cDNA de hTRT com a IBI FLAG no término C; o consenso Kozak e sem 3’ ou 5’ UTR no sítio EcoRI de p91023(B), de tal modo que a hTRT estivesse na mesma orientação do ORF de DHFR. Isto produz um vetor de expressão
322
537 transiente para hTRT. 0 inserto incluiu cDNA de comprimento. completo.dei * <1 · · » ·* ·*· * · ♦ · ****** s ·*·**· ··· hTRT menos 5’ e 3’ UTR, a sequência IBI FLAG e as sêquêricias’KOzàk/b*: marcador selecionável usado com este vetor é a tetraciclina.
pGRN158
Este vetor foi construído para a expressão e mutagênese das sequências de TRT em E. coli. O fragmento EcoRI de pGRN151 contendo o ORF de hTRT foi inserido no sítio EcoRI de pBBS183, de modo que o ORF de hTRT fosse orientado na direção oposta à do promotor Lac. O inserto incluiu cDNA de comprimento completo de hTRT menos 5’ e 3’ UTR, 10 sequência IBI FLAG e sequências Kozak. A sequência de codificação de hTRT é conduzida poro um promotor T7. O marcador selecionável usado com este vetor é a ampicilina.
pGRN159
Este vetor foi construído para a expressão e mutagênese das 15 sequências de TRT em E. coli. O fragmento Nhel-Kpnl de pGRN138 contendo o EGFP para fusão de hTRT foi inserido nos sítios Xbal-Kpnl de pBluescroptIIKS+. Isto produz um vetor de expressão T7 para a proteína de fusão (a sequência de codificação é conduzida por um promotor T7). O inserto incluiu cDNA de comprimento completo de hTRT menos 3’ UTR, “20 como uma proteína de fusão com EGFP. O marcador selecionável usado com este vetor é a ampicilina.
pGRN160
Este vetor foi construído para a expressão das sequências de hTR em células de mamíferos. A sequência de codificação é operavelmente 25 ligada a um promotor de MPSV. O fragmento Xhol-Nsil de pGRN90 contendo o ORF de hTR de comprimento completo foi inserido nos sítios SalI-Sse8387I de pBBS295. Isto produz um vetor transiente/estável expressando o RNA anti-sentido de hTR. Um marcador foi incorporado no vetor. Os marcadores selecionáveis usados com este vetor são
323
Chlor/gpt/PAC. • 4 » · **4 · ♦ · ··> • 4 · · tf 4 4 4 4 £ 4 · 9 4 ··
pGRNlól ·· 4 44 · 9 9 9 · • « 4 · · · · · · • * 4« 4 ··♦ 999 999 ·
Este vetor foi construído para a expressão das sequências de hTR de sentido em células de mamíferos. O fragmento Xhol-Nnil de pGRN89 contendo ORF de hTR de comprimento completo foi inserido nos sítios SalI-Sse8387I de pBBS295. Isto produz um vetor transiente/estável expressando o hTR na orientação do sentido. A sequência de codificação é conduzida por um promotor de MPSV. Um marcador de GPT foi incorporado no vetor. Os marcadores selecionáveis usados com este vetor são Chlor/gpt/PAC.
pGRN162
O fragmento Xhol-Nsil de pGRN87 contendo o ORF de hTR de comprimento completo foi inserido nos sítios SalI-Sse8387I de pBBS295. Isto produz um vetor transiente/estável expressando o hTR truncado (da posição +108 à +435) na orientação do sentido.
pGRN163
Este vetor foi construído para a expressão e mutagênese de sequências de TRT em E. coli. A sequência de codificação é conduzida por um promotor T7. O oligonucleotídeo RA45 (5’-GCCACCCCC GCGCTGCCTCGAGCTCCCCGCTGC-3’) é usado na mutagênese in vitro para modificar a iniciação observada em hTRT para Leu, e introduzir um sítio Xhol nos dois códons seguintes após o Leu. Igualmente COD 1941 foi usado para modificar CatR em CatS, e introduzir um sítio BSPH1, e COD 2866 foi usado para modificar AmpS em AmpR, introduzindo um sítio FSP1. O marcador selecionável usado com este vetor é a ampicilina.
pGRN164
Este vetor foi construído para a expressão de sequências de hTR em E. coli. Os iniciadores hTR+1 5’GGGGAAGCTTTAATACGACTCACTATAGGGTTGCGGAGGGTGGGC
324
CTG-3’ e hTR+445 5’-CCCCGGATCCXGÇGCAJGTGT.GAG • · · 9 9 ·«· ····· · • · · · Φ g *9 9 99 9^9
CCGAGTCCTGGG-3 ’ foram usados para ampliar por**PCÍR.tfrfi f?âghtehto’*âe · pGRN33 contendo o hTR de comprimento completo com o promotor T7 na extremidade 5’ (como em hTR+1). Uma digestão de BamHI-HindIII do produto de PCR foi posto nos sítios BamHI-HindIII de pUCl 19. A sequência de codificação operavelmente ligada a um promotor T7. O marcador selecionável usado com este vetor é a ampicilina.
pGRN165
Este vetor foi construído para a expressão e mutagênese de sequências de hTRT em E. coli. A sequência de codificação é operavelmente ligada a um promotor T7. O fragmento EcoRI de pGRN 145 contendo ORF de hTRT com uma extremidade frontal Kozak foi inserida no sítio EcoRI de pBluescriptIISK+ de modo a que a hTRT fosse orientada na mesma direção do promotor T7. O marcador selecionável usado com este vetor é a 15 ampicilina.
pGRN166
Este vetor foi construído para a expressão e mutagênese de sequências de TRT em células de mamíferos. A sequência de codificação é operavelmente ligada a um promotor T7. O fragmento EcoRI de pGRN151 —20 contendo ORF hTRT com uma extremidade frontal Kozak e bandeira IBI na extremidade traseira, foi inserido no sítio EcoRI de pBluescriptIISK+, de modo que ORF de hTRT é orientado na mesma direção do promotor T7. O inserto incluiu cDNA de comprimento completo de hTRT menos 5’ e 3’ UTR, sequência FLAG (Immunex Corp., Seattle WA), e sequências Kozac. O 25 marcador selecionável usado com este vetor é a ampicilina.
pGRN167
O fragmento AvRII-StuI de pGRN 144 contendo a extremidade 5’ do ORF de hTRT foi inserido nos sítios Sbal-StuI de pBBSlól.
325 pGRN168 .. . ...
* ····:·· • · · · · <
O fragmento EcoRI de pGRN145 dontêndô1 o· expressão de hTRT otimizado foi inserido no sítio EcoRI de pIND, de tal • ··· · • · · · · · .· .· ··. S.S eâssête‘’(ie · modo que a sequência de codificação de hTRT esteja na mesma orientação do promotor miniCMV.
pGRN169
O fragmento EcoRI de pGRN145 contendo o cassete de expressão de hTRT otimizado foi inserido no sítio EcoRI de pIND, de tal modo que a hTRT esteja na orientação inversa do promotor miniCMV.
pGRN170
O fragmento EcoRI de pGRN145 contendo o cassete de expressão de hTRT otimizado foi inserido no sítio EcoRI de pIND(spl), de tal modo que a hTRT esteja na orientação oposta do promotor miniCMV. pGRN171
O fragmento Eco47III-NarI de pGRN163 foi inserido nos sítios Eco47III-NarI de pGRN167, colocando a mutação de MIL em um fragmento do DNA genômico de hTRT.
pGRN172
O fragmento BamHI-StuI de pGRN171 contendo a mutação —20 de Met em Leu no ORF de hTRT, foi inserido nos sítios BglII-NruI de pSEAP2-Básico;
pGRN173
O fragmento EcoRV-ECO47III de pGRN144 contendo a extremidade 5’ da região do promotor de hTRT, foi inserido nos sítios Srfl25 Eco47III de pGRN172. Isto produz um plasmídeo repórter promotor que contém a região do promotor de hTRT de aproximadamente 2,3 kb a montante da partida do ORF de hTRT, para logo após o primeiro intron na região de codificação, com a mutação Metl—>Leu.
pGRN174
326
Ò3A
O fragmento EcoRI de pGRN 145 contendo o cassete de ··* · · ··· · · · ··· · expressão de hTRT “otimizado” foi inserido no sítio dej EcoRI 4épÍNIÍ(Spl), de tal modo que a hTRT ficasse na mesma orientação do promotor miniCMV.
EXEMPLO 7
Reconstituição da atividade de telomerase
A. CO-EXPRESSÃO DE hTRT E hTR/TV VITRO
Neste exemplo, a co-expressão de hTRT e de hTR usando um sistema de expressão isento de células in vitro, é descrita. Estes resultados 10 demonstram que o polipeptídeo de hTRT codificado por pGRN121 codifica uma proteína de telomerase cataliticamente ativa e que a reconstituição in vitro (IVR) do RNP da telomerase, pode ser realizada usando-se hTRT e hTR recombinantemente expresso.
A atividade de telomerase foi reconstituída pela adição de 15 plasmídeos linearizados de hTRT (pGRN121; lgg de DNA digerido com Xba I) e hTR (phTR+1; 1 gg digerido com FspI) a um sistema de lisado reticulócito de transcrição-translação acoplado (Promega TNT®). phTR+1 é um plasmídeo que, quando linearizado com FspI e, então, transcrito por polimerase de RNA T7, gera um transcrito de 445 nucleotídeos começando ^20 com nucleotídeo +1 e estendendo-se ao nucleotídeo 446 de hTR (Autexier et al, 1996, EMBO J15: 5928). para uma reação de 50 gl, foram adicionados os seguintes componentes: 2 gl de tampão TNT® 1 gl de polimerase de RNA de TNT® T7, 1 gl de mistura de aminoácido 1 mM, 40 unidades de inibidor RNase Rnasin®, 1 gg de cada DNA padrão linearizado, e 25 gl de lisado de 25 reticulócito de TNT®. Os componentes foram adicionados na relação recomendada pelo fabricante e foram incubados por 90 minutos a 30°C. A transcrição esteve sob a direção do promotor T7 e pôde também ser realizada antes da adição de lisado de reticulócito com resultados semelhantes. Após a incubação, 5 e 10 gl da reação programada de transcrição-translação foram
327 ensaiados quanto à atividade de telomerase por TRAP, como anteriormente ·· · · ··· · · · ··· · • · ♦ · · ··· ····· · descrito (Autexier et al, acima), usando 20 cièfos: de· PCB pâr#’ áftiMar o • · ·· · ··· ··· ··· · · sinal.
Os resultados da reconstituição são mostrados na Figura 10. Para cada reação de transcrição/translação ensaiada existem 3 colunas: as primeiras 2 colunas são ensaios em duplicata e a terceira coluna é uma amostra em duplicata desnaturada por calor (95 °C, 5 minutos) antes da fase de TRAP, para expulsar os artefatos gerados por PCR.
Como mostrado na Figura 10, o lisado de reticulócito apenas não tem nenhuma atividade de telomerase detectável (coluna 6). De forma semelhante, nenhuma atividade detectável é observada quando, ou hTR sozinho (coluna 1), ou gene de hTRT de comprimento completo (coluna 4), são adicionados ao lisado. Quando ambos os componentes são adicionados (coluna 2), a atividade de telomerase é gerada como demonstrado pelo padrão característico de escada repetição. Quando a região terminal carboxila do gene de hTRT é removida por digestão do vetor com TVcoI (“hTRT truncada”), a atividade de telomerase é abolida (coluna 3). A coluna 5 mostra que a translação da hTRT truncada sozinha não gera atividade de telomerase. A coluna 5 mostra que a translação da hTRT truncada sozinha não gera a atividade da telomerase. A coluna “R8” mostra um controle positivo para uma escada do produto de telomerase gerada por TRAP de TSR8, um produto de telomerase sintética tendo uma sequência de nucleotídeos de 5’ATTCCGTCGAGC AGAGTTAG[GGTTAG]7-3 ’.
B. MISTURA DE hTRT E hTR IN VITRO
A reconstituição in vitro de atividade de telomerase também foi realizada por mistura. A hTRT foi transcrita e transladada como descrito acima, mas sem a adição do plasmídeo de hTR. A reconstituição do RNP de telomerase foi então executada misturando-se a mistura de translação de hTRT com hTR (previamente gerada por transcrição polimerase de RNA T7
328 de phTR+l-Fsp) na relação de 2 μΐ de mistura de translação de hTRT para 2 ·· · · ··· · · · ··· · μΐ de hTR (1 με), depois incubada por 90 minuids k pix5t}e&$o de reconstituição de hTRT/hTR é referido como “reconstituição ligada” ou “IVR ligada”. A atividade da telomerase está presente (isto é, pode ser detectada) 5 neste mistura. Sinal melhorado foi observado seguindo-se purificação parcial *
da atividade por cromatografia DEAE. Neste caso, foram usados os Dispositivos de Filtro Centrífugo Ultrafree-MC DEAE da Millipore, de acordo com as instruções do fabricante. Os tampões usados foram hypo0,l, hypo0,2 e hypo 1,0, onde hypo é Hepes 20 mM-KOH, pH 7,9, MgCl2 2 mM, 10 EGTA 1 mM, glicerol 10%, NP-40 0,1%, DTT 1 mM, Na 1 mMmetabissulfito, benzamidina 1 mM e fenilmetilsulfonilfluoreto 0,2 mM (PMSF), e onde 0,1, 0,2 e 1,0 se referem a KC1 0,1, 0,2 ou 1,0 M. Os filtros foram pré-condicionados com hypo 1,0, lavados com hypoO,l, a telomerase reconstituída foi carregada, a coluna foi lavada com hypo0,l, depois com 15 hypo0,2, e a telomerase reconstituída foi eluida com hypo 1,0 em metade do volume com que foi carregada. Esta formulação deve ser armazenada congelada a -70°C e retém a atividade.
A atividade de telomerase foi ensaiada em um procedimento de duas etapas. Na etapa um, um ensaio convencional de telomerase foi ”20 realizado como descrito em Morin, 1989, Cell 59: 521, exceto que nenhum radio-rótulo foi usado. Na etapa dois, uma alíquota foi ensaiada pelo procedimento TRAP por 20 a 30 ciclos, como descrito acima. O ensaio convencional foi realizado ensaiando-se de 1 a 10 μΐ de telomerase reconstituída em 40 a 50 μΐ, volume final, de Tris 25 mM-HCl, pH 8,3, K 50 25 mM-acetato, EGTA 1 mM, MgCl2 1 mM, dATP 2 mM, TTP 2 mM, dGTP 10 uM, e iniciador 1 uM (comumente M2, 5’-AATCCGTCGAGCAGAGTT) a 30°C por 60 a 180 minutos. A reação foi interrompida por aquecimento a 95 °C por 5 minutos e 1 a 10 μΐ da mistura da primeira etapa foi carregada na reação TRAP da etapa dois (50 μΐ).
329
3>3>Η
Em experiências adicionais, a síntese de hTRT e hTR durante ·♦ · · ··· · · · ··· 4 a reconstituição in vitro foi monitorada por 3^-jd^icáijna e • · ·· · ··· ··· ··· · · mancha do Norte, respectivamente. Proteínas aproximadamente do tamanho previsto foram sintetizada por hTRT (127 kD), hTRT-Nco (85 kD) e pro90hTRT (90 kD) em aproximadamente iguais quantidades molares em relação uma com a outra. A análise do Norte indicou que a síntese de hTR era do tamanho correto (445 nucleotídeos) e estava predominantemente intacta.
Variações dos protocolos de reconstituição, acima, serão evidentes àqueles de experiência. Por exemplo, o tempo e a temperatura de reconstituição, e a presença ou concentração dos componentes, tais como sal monovalente (por exemplo, NaCl, KC1, acetato de potássio, glutamato de potássio, e outros), sal divalente (MgCl2, MnCl2, MgSO4 e outros), desnaturantes (uréia, formamida e outros), detergentes (NP-40, Tween, CHAPS e outros), e procedimentos alternativos de purificação melhorada (tais como a cromatografia de imunoprecipitação, afinidade ou padrão) podem ser empregados. Estes e outros parâmetros podem ser variados de uma forma sistemática para otimizar as condições para ensaios específicos ou outros protocolos de reconstituição.
C. RECONSTITUIÇÃO USANDO VARIANTES DE hTRT E ^0 PROTEÍNAS DE FUSÃO
A reconstituição da atividade catalítica da telomerase ocorreu quando EGFP-hTRT, uma fusão da proteína fluorescente verde intensificada em hTRT (ver Exemplos 6 e 15), ou hTRT marcado por epítopo (IBI FLAG, ver Exemplo 6), ambos reconstituídos por atividade da telomerase em níveis aproximadamente do tipo selvagem, foram co-expressos com hTR.
Ao contrário, a atividade de telomerase não foi reconstituída quando uma hTRT variante, pro90hTRT (carente dos motivos de RT B’, C, D e E) foi usada. Isto demonstra que pro90hTRT não possui atividade catalítica de telomerase completa, embora possa ter outras atividades parciais [por
330 ?>2>Ó exemplo, capacidade de ligação de RNA (isto é, hTR) e função como · . · ··· * J»., i regulador negativo dominante de telomerase in vhú/côijip’d$sçritp'apirf^).
* · ·*· ··* ♦ ·
D. ENSAIO DE ATIVIDADE DE TELOMERASE RECONSTITUÍDA IN VITRO USANDO A MANCHA DE GEL E O ENSAIO 5 CONVENCIONAL DE TELOMERASE
O seguinte exemplo demonstra que a telomerase reconstituída in vitro (IVR) pode ser ensaiada usando-se ensaios convencionais de telomerase, além de ensaios com base em ampliação (isto é, TRAP). A telomerase IVR como descrita na parte (B) acima (o “processo de 10 reconstituição ligada”), seguida por purificação de DEAE, como descrito acima, foi ensaiada usando-se o ensaio da mancha de gel utilizando-se as seguintes condições de reação: 1 a 10 μΐ de telomerase IVR ligada em 40 μΐ, volume final, de Tris 25 mM-HCl, pH 8,3, K 50 mM-acetato, EGTA 1 mM, MgCl2 1 mM, dATP 0,8 mM, TTP 0,8 mM, dGTP 1,0 mM e iniciador 1 uM 15 (M2, acima, ou H3.03, 5’-TTAGGGTTAGGGTTAGGG) a 30°C por 180 minutos. O DNA telomérico sintetizado foi isolado por procedimentos padrão, separado em uma poliacrilamina, gel de uréia 8 M, transferido para uma membrana de náilon, e sondado usando-se a ribossonda 32P-(CCCTAA)n usada no ensaio de dot-blot. A sonda identificou uma escada de seis “20 nucleotídeos na coluna representando 10 μΐ de telomerase IVR, que era equivalente à escada observada para 5 μΐ de telomerase nuclear nativa purificada por cromatografia de mono Q e heparina. Os resultados mostram que a telomerase IVR possui atividade catalítica de telomerase processiva equivalente à telomerase nativa.
A telomerase IVR ligada também foi ensaiada pelo ensaio convencional de telomerase de incorporação de 32P-dGTP. A telomerase IVR preparada pelo processo de reconstituição ligada, seguido por purificação de DEAE, como descrito acima, foi ensaiada tanto sob condições de reação processiva, quanto não processiva. As condições do ensaio foram 5 a 10 μΐ de
331
3¾ telomerase IVR ligada em volume final de 40 μΐ de Tris 25 mM-HCl, pH 8,3, k 50 mM-acetato, EGTA 1 mM, MgCl21 mM, dATP i-fnMjjTTP^hlM^com 10 uM de 32P-dGTP (72 Ci/mmol) [para ensaio de condições processivas] ou 1 uM de 32P-dGTP (720 Ci/mmol) [para não-processivas], e 1 uM de iniciador (isto é, H3.03, acima) a 30°C (para a reação processiva), ou 37°C (para a reação não processiva) por 180 minutos. O DNA telomérico sintetizado foi isolado por procedimentos padrão e separado em um gel de sequenciação de poliacrilamida 8%, gel de uréia 8 Μ. A reação processiva mostrou uma escada débil de seis nucleotídeos consistente com uma reação '10 de telomerase processiva, e a reação não processiva adicionou uma repetição, um padrão equivalente a uma reação de controle com uma preparação de telomerase nativa. Ensaios convencionais usando a telomerase IVR são úteis em exames de moduladores de telomerase, como aqui descrito, bem como outros usos, tais como elucidação das propriedades estruturais e funcionais da 15 telomerase.
E. A TELOMERASE RECONSTITUÍDA IN VITRO RECONHECE OS TÉRMINOS 3’ DOS INICIADORES
Esta experiência demonstra que a telomerase IVR reconhece os términos 3’ do iniciador, equivalentemente à telomerase nativa “20 (purificada). A telomerase forma um duplex emparelhado com a base entre a extremidade 3’ do iniciador e uma região padrão de hTR, e adiciona o nucleotídeo seguinte especificado (Morin, 1989, acima). Para se verificar que a telomerase IVR (recombinante) tem a mesma propriedade, as reações dos iniciadores com os términos —GGG ou —TAG 3 ’ (AATCCGTCGAGCAGAGGG e AATCCGTCGAGCAGATAG) foram comparadas com um iniciador tendo um término —GTT (M2 acima) usando telomerase IVR e nativa ensaiada pelo ensaio convencional/TRAP de duas etapas detalhado acima. As escadas do produto dos iniciadores —GGG e — TAG foram deslocadas +4 e +2, respectivamente, em comparação com o
332
33Ύ iniciador padrão (extremidade 3’ —GTT), q·.mesmo., ofeifo .como foi ·* Â í* * ·* ·* **. ‘ * observado com a telomerase nativa. Esta experiência·* demonstra.:q’úè as telomerases IVR e nativa reconhecem os términos do iniciador de uma maneira semelhante.
Estes resultados (juntamente com os resultados supra mostrando que a telomerase de IVR possui tanto atividade catalítica processiva, quanto não processiva), indicam que a telomerase IVR tem estrutura e propriedades semelhantes em comparação com a telomerase nativa ou purificada.
EXEMPLO 8
Produção de anticorpos anti-hTRT
A. PRODUÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-hTRT CONTRA OS PEPTÍDEOS hTRT
Para produzir anticorpos anti-hTRT, os seguintes peptídeos de hTRT foram sintetizados com a adição de C (cisteína) como o resíduo terminal amino (ver Figura 54).
S-l: FFY VTE TTF QKN RLF FYR KSV WSK
S-2: RQH LKR VQL RDV SEA EVR QHR ÉA
S-3: ART FRR EKR AER LTS RVK ALF SVL NYE A-3: PAL LTS RLR FIP KPD GLR PIV NMD YVV
A porção de cisteína foi usada para imobilizar (isto é, ligar covalentemente) os peptídeos às proteínas portadoras BSA e KLH (hemocianina de moluscos lapa de buraco de fechadura). Os KLH-peptídeos 20 foram usados como antígenos. Os conjugados BSA-peptídeo serviram como material para ELISAs para analisar a especificidade dos anti-soros imunes.
Os conjugados KLH-peptídeo foram injetados em coelhos brancos da Nova Zelândia. As injeções iniciais foram feitas colocando-se o injetante próximo aos linfono dos axilares e inguinais. Injeções subsequentes foram aplicadas intramuscularmente. Para as injeções iniciais, o antígeno foi
333
33^ emulsificado com adjuvante completo de Freund;. .paça .as. injeções
9* 1 ·· ·* · φ· · ·· · · subsequentes, foi usado adjuvante incompleto cfe “FifeiHld;..Gs «dolêlhos seguiram um ciclo de reforço de três semanas, em que 50 ml de sangue produzindo 20 a 25 ml de soro, foram retirados 10 dias após cada reforço. Os anti-soros contra cada um dos quatro peptídeos reconheceram a porção de hTRT de proteína de fusão de hTRT recombinante (fragmento de GST-HIS8hTRT 2426 a 3274; ver Exemplo 6) em manchas de Ocidente.
Usando uma fração de telomerase parcialmente purificada de
293 células humanas (purificação de aproximadamente 1000 vezes em comparação com um extrato nuclear bruto) que foi produzida como descrito no pedido PCT 97/06012, e anticorpos anti-S-2 purificados por afinidade, um dubleto proteínico de 130 kd pôde ser detectado em uma mancha do Ocidente. Um processo de detecção de quimioluminescência sensível foi empregado (substrato de quimioluminescência SuperSignal, Pierce), mas o sinal na mancha foi fraco, sugerindo que a hTRT está presente em baixa ou muito baixa abundância nestas células imortais. A observação de um dubleto é consistente com uma modificação pós-translacional de hTRT, isto é, fosforilação ou glicosilação.
Para purificação por afinidade, o peptídeo S-2 foi imortalizado “20 em SulfoLink (Pierce, Rockford IL) através de seu resíduo de cisteína de terminal N, de acordo com o protocolo do fabricante. O primeiro soro do sangramento de um coelho imunizado com o antigeno de peptídeo KLH-S-2, foi carregado no S-2-SulfoLink, e os anticorpos especificamente ligados ao peptídeo S-2 foram eluídos.
B. PRODUÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-hTRT CONTRA AS
PROTEÍNAS DE FUSÃO DE hTRT.
As proteínas de fusão GST-hTRT foram expressas em E. coli como as proteínas de fragmento 4 de GST-hTRT (nucleotídeos 3272 a 4177) e o fragmento 3 de GST-HIS8-11TRT (nucleotídeos 2426 a 3274) descritas no
334
Exemplo 6. As proteínas de fusão foram purificadas çomQ proteína insolúvel, j· · ·· ·* j e· * ·· · · e a pureza dos antígenos foi ensaiada por géis de poliàérilámãda’d^;SI>S e estimada como sendo de cerca de 75% de pureza para a proteína recombinante de fragmento 4 de GST-hTRT, e mais do que 75% de pureza para a proteína recombinante de fragmento 3 de GST-HIS8-hTRT. Os processos de rotina podem ser empregados para se obter estas e outras proteínas em uma pureza maior do que 90%. Estas proteínas recombinantes foram usadas para imunizar tanto coelhos quanto camundongos, como descrito acima.
Os primeiro e segundo sangramentos, tanto de camundongos quanto de coelhos, foram analisados quanto à presença de anticorpos antihTRT, após remoção de anticorpos anti-GST, usando-se uma matriz contendo GST imobilizado. Os anti-soros foram analisados quanto aos anticorpos antihTRT por manchamento do Ocidente, usando-se proteína de fusão de GSThTRT recombinante imobilizada, e por imunoprecipitação, usando-se enzima de telomerase nativa parcialmente purificada. Embora nenhum sinal tivesse sido observado nestes primeiros sangramentos, os títulos dos anticorpos antihTRT, como esperado, aumentaram nos sangramentos subsequentes.
EXEMPLO 9 “20 Detecção de um mma de hTRT correspondente à variante de RNA Δ182
RNA poli A+ de testículos humanos e a linhagem de 293 células, foram analisados quanto ao mRNA de hTRT, usando-se RT-PCR e iniciadores reunidos. O primeiro conjunto de iniciadores foi TCP1.1 e TCP1.15; o segundo conjunto de iniciadores foi TCP1.14 e BTCP6. A 25 ampliação de cada um deu dois produtos diferindo por 182 pares de base; os produtos maiores e menores do RNA de testículos foram sequenciados e observou-se corresponderem exatamente a pGRN121 (Figura 16) e ao clone 712562 (Figura 18), respectivamente. O produto variante de RNA de hTRT foi observado em mRNA de SW39i, OVCAR4, 293, e Testes.
335
Experiências adicionais foram realizadas p.ara demonstrar que ·’ ·* : ·: ·’· ·’· ··*·:
o cDNA Δ182 não era um artefato da transcrição reversa; Rêsuinidãiííetiie, o RNA de hTRT de comprimento completo (isto é, sem a deleção) foi produzido por transcrição in vitro de pGRN121 para utilização como um 5 padrão para RT-PCR. As reações de síntese de cDNA foram realizadas usando-se a transcriptase reversa de Superscript® (Bethesda Research
Laboratories, Bethesda MD) a 42°C ou 50°C, e com iniciadores aleatórios ou um iniciador específico. Após 15 ciclos de PCR, o produto mais longo foi
detectável; no entanto, o produto menor (isto é, correspondente à deleção) não foi detectável, mesmo após 30 ou mais ciclos. Isto indica que o produto RT-PCR não é um artefato.
EXEMPLO 10
Sequenciação de mRNA de hTRT de testículos
A sequência desta forma de RNA de hTRT de testículos foi determinada por sequenciação manual direta de fragmentos de DNA gerados por PCR de cDNA de testículos (Marathon Testes cDNA, Clontech, San Diego CA) usando-se um kit de sequenciação cíclico de terminador radiorrotulado ThermoSequenase (Amersham Life Science). A etapa de PCR foi realizada por um PCR reunido, como mostrado na Tabela 8. Em todos os io casos, uma reação de controle negativa com iniciadores, mas sem cDNA, foi realizada. A ausência de produto na reação de controle demonstrou que os produtos derivados da reação com cDNA presentes, não foram devidos a contaminação de hTRT de pGRN121 ou outras fontes celulares (por exemplo, 293 células). Os fragmentos de DNA foram excisados de géis de 25 agarose para purificar o DNA antes da sequenciação.
A sequência de mRNA de testículos correspondente às bases 27 a 3553 da sequência do inserto pGRN121, e contendo a ORF de hTRT inteira (bases 56 a 3451), foi obtida. Nenhuma diferença havia entre as sequências dos testículos e de pGRN121 nesta região.
336
00Λ
Tabela 8
Iniciadores para SEQ K320.K322 TCP1.521TCP1.39,K322,TCP1.40,TCP1.41,TCP1.30,TCP1.34,TCP1.49 CO 'T CL O H rí cn Cl U H xo“ T. CL U H N CL O H co ΓΊ CL u H co CM CL υ H ví ΓΊ 52 u H TCP1.67,TCP1.32,TCP1.69,TCP1.68,TCP1.24,TCP1.44,K303 || Ξ u b tU r-- cu O b cn cu O b T a. U b x> vo cu (J b b P J TCP1.6.TCP1.14.TCP1.73.TCP1.78.TCP1.25.TCP1.15.TCP1.76 || 1 TCP1.74,TCP1.7,TCP1.75,TCP1.15,TCP1.3 \o cu O b cu U b 00 cu U b cs cu O b TCP1.4,TCPl.10.TCPl.il II
oo Ό CM CO xo •O· r* Γ-
c « o Cv —a ΤΓ s O 00 Γ*
3 .2 H CM V“> CO V-» CM xo cn
oo
C4 cn CM Ό r* rr
cm * o
ΓΊ CL CL CL CL CL cu
u u o xo O o Cl O
ó o CM b b '-s. t: b b u p
α O V-) r* u b TT Ό O
I—1 X. •5T rn \o 1.2
s* CL CL o- ü a. Cl CL CL
o o o u b u υ o o
O b b b b b b b
Q
CM Ό
cn XO r-
r--H cn CL CL xo CL 1.4 2
u o u b o CL b
O ’S G Cl CJ 1 t CM tr v-i F CM u b D xo
b T xo TT o ΓΊ CM
'c1 O CL CL ‘ CL CL
o ΓΊ u u m o o o
o b b b c b b
o
α
<D VO < ca U D2 m Q Cl UJ ω uu
μ-t
337
EXEMPLO 11 .. .
• · · • · « detecção de mRNA de hTRT por proteção de RNÁse?
Os ensaios de proteção de RNase podem ser usados para detectar, monitorar ou diagnosticar a presença de um mRNA de hTRT ou mRNA variante. Uma sonda ilustrativa de proteção de RNAse é um RNA sintetizado in vitro que é compreendido das sequências complementares às sequências de mRNA de hTRT e sequências adicionais não complementares.
Estas últimas sequências são incluídas para distinguir a sonda de
comprimento completo do fragmento da sonda que resulta de um resultado positivo no ensaio: em um ensaio positivo, as sequências complementares da sonda são protegidas da digestão de RNase, porque elas hibridizam a mRNA de hTRT. As sequências não complementares são digeridas fora da sonda na presença de RNase e ácido nucleico alvo complementar.
Duas sondas de proteção RNAse são descritas para propósitos ilustrativos; ou podem ser usadas no ensaio. As sondas diferem em suas sequências complementares d hTRT, mas contêm sequências não complementares idênticas, nesta modalidade, derivadas da sequência líder de
mRNA tardio de SV40. De 5’-3’, um sonda é compreendida de 33 nucleotídeos de sequência não complementar e 194 nucleotídeos de sequência complementar a nucleotídeos de hTRT 2513 a 2707 para um tamanho de sonda de comprimento completo de 227 nucleotídeos. De 5’-3’, a segunda sonda é compreendida de 33 nucleotídeos de sequência não complementar e de 198 nucleotídeos de sequência complementar aos nucleotídeos de hTRT 2837 a 3035 para um tamanho de sonda de comprimento completo de 231 nucleotídeos. Para conduzir o ensaio, qualquer sonda pode ser hibridizada a RNA, isto é, poliA + RNA, de uma amostra de teste, e ribonuclease TI e RNase A são então adicionados. Após a digestão, o RNA da sonda é purificado e analisado por eletroforese em gel. A detecção de um fragmento de 194 nucleotídeos da sonda de 227 nucleotídeos ou um
338 fragmento de 198 nucleotídeos da sonda de 231 nuqleptícljsos, é. indicativo de mRNA de hTRT na amostra. * '* ··*: ··’· ·’·.·.'·
As sondas de proteção de RNAse ilustrativas descritas neste exemplo podem ser geradas por transcrição in vitro, usando-se polimerase dé
RNA T7. Ribonucleotídeos radioativos ou de outra forma rotulados podem
ser incluídos para a síntese de sondas rotuladas. Os padrões para a reação de transcrição in vitro para produzir as sondas de RNA, são produtos do PCR. Estas sondas ilustrativas podem ser sintetizadas usando-se a polimerase T7 seguindo-se à ampliação de PCR de DNA de pGRN121, usando iniciadores que alcancem a região complementar correspondente do gene de hTRT ou mRNA. Além disso, o iniciador a jusante contém as sequências promotoras de polimerase de RNA T7 e as sequências não complementares.
Para a geração da primeira sonda de proteção RNAse, o produto de PCR do seguinte par de iniciadores (T701 e reversoOl) é usado:
T701 5-GGGAGATCT TAATACGACTCACTATAG ATTCA GGCCATGGTG
CTGCGCCGGC TGTCA GGCTCCC ACGACGTAGT CCATGTTCAC-3'; and reverseOl 5-GGGTCTAGATCCGGAAGAGTGTCTGGAGCAAG-3'.
Para a geração da segunda sonda de proteção RNAse, o produto de PCR do seguinte par de iniciadores (T702 e reverso02) é usado: T702 5-GGGAGATCTTAATACGACTCACTATAG ATTCA GGCCATGGTG CTGCGCCGGC TGTCA GGGCG GCCTTCTGGA CCACGGCATA CC-3'; and reverse02 5’-G GTCTAGAÇGATATCC ACAGGGCCTG GCGC-3'.
EXEMPLO 12
Construção de um hTRT de comparação de árvore fílogenética e outras transcriptases reversas
Uma árvore fílogenética (Figura 6) foi construída por comparação dos sete domínios de RT definidos por Xiong e Eickbush (1990, EMBOJ. 9: 3353). Após o alinhamento sequencial dos motivos 1, 2 e A-E de 4 TRTs, 67 RTs e 3 RNA polimerases, a árvore foi construída usando-se o
339 processo da NJ (Junção de Vizinhança) (Saitou e0JHei, 1987, Mol. Biol. Evol.
• · · » * ·* '· *· ·* t*1 ·
4: 406). Os elementos da mesma classe, que são’íocádòs.no.Jjiesmo raihp da árvore, são simplificados como uma caixa. O comprimento de cada caixa corresponde ao elemento mais divergente dentro daquela caixa.
Os TRTs parecem ser mais intimamente relacionados aos RTs associados com msDNA, introns do grupo II e retrotransposons de não LTR (Repetição de Terminal Longo), do que ao retrotransposon de LTR e RTs virais. O relacionamento dos RTs de telomerase ao ramo de não LTR de
retroelementos é intrigante, dado que estes últimos elementos têm a telomerase substituída para a manutenção de telômero em Drosophila. No entanto, a descoberta mais surpreendente é que os TRTs formam um subgrupo discreto, quase tão intimamente relacionados às polimerases de RNA dependente de RNA de vírus de RNA de filamento positivo, tais como o poliovírus, quanto a qualquer dos RTs anteriormente conhecidos.
Considerando que os quatro genes de telomerase vêm de organismos evolucionariamente distantes — protozoário, fungos e mamíferos -- este agrupamento separado não pode ser explicado por falta de diversidade filogenética no conjunto de dados. Ao invés, esta bifurcação profunda sugere que os RTs de telomerase sejam um grupo ancião, talvez originando-se com 20 o primeiro eucarioto.
A identificação de proteínas do GenBank, ou os números de acesso usados na análise filogenética, foram: msDNAs (94535, 134069, 134074, 134075, 134078), introns do grupo II (483039, 101880, 1332208, 1334433, 1334435, 133345, 1353081), plasmídeo mitocondrial/RTL (903835, 134084), retrotransposons não LTR (140023, 84806, 103221,
103353, 134083, 435415, 103015, 1335673, 85020, 141475, 106903,
130402, U0551, 903695, 940390, 2055276, L08889), retrotransposons LTR (74599, 85105, 130382, 99712, 83589, 84126, 479443, 224319, 130398,
130583, 1335652, 173088, 226407, 101042, 1078824), hepadnavírus (I
340
18876, 1706510, 118894), caulimovírus (331554, 130600, 130593, 93553), .: . ’*· : λ . · retrovírus (130601, 325465, 74601, 130587, 13Ô674; UQ0O7tÃW29,
130589, 130631, 1346746, 130651, 130635, 1780973, 130646). O
alinhamento foi analisado usando-se ClustalW 1,5 [J. D. Thompson, D. G.
Higgins, T. J. Gibson, NucleicAcids Res. 22, 4673 (1994)] e PHYLIP 3m5 [J.
Felsenstein, Cladisfics 5,164 (1989)].
EXEMPLO 13
transfecção de fíbroblastos humanos cultivados (bj) com plasmídeo de controle e hTRT de codificação de plasmídeos
Este exemplo demonstra que a expressão de proteína de hTRT recombinante em uma célula de mamífero resulta na geração de uma telomerase ativa.
Os fíbroblastos BJ foram tripsinados e recolocados em suspensão em meio recente (DMEM/199 contendo 10% de Soro Fetal de 15 Bezerro) em uma concentração de 4 x 106 células/ml. As células foram transfectadas usando-se eletroporação com o eletroparador BioRad Gene Pulser®. Opcionalmente, pode-se também transfectar células usando o reagente Superfect® (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. Para a eletroporação, 500 μΐ da suspensão celular foram colocados em uma cubeta ^20 de eletroporação (BioRad, intervalo do eletrodo de 0,4 cm). O DNA do plasmídeo (2 gg) foi adicionado às cubetas e a suspensão foi suavemente misturada e incubada sobre gelo por 5 minutos. O plasmídeo de controle (pBBS212) não continha nenhum inserto atrás do promotor de MPSV e do hTRT expresso do plasmídeo experimental (pGRN 133) do promotor de 25 MPSV. As células foram submetidas a eletroporação a 300 Volts e 960 gFD.
com meio recente. 72 horas após a transfecção, as células foram tripsinadas,
Após o pulso ter sido liberado, as cubetas foram colocadas sobre gelo por aproximadamente 5 minutos antes da colocação em placa sobre pratos de cuirnra de tecido dc IuG uim nu mciu. Apúo 6 liviaS, g mciG foi
Μ
341
lavadas uma vez com PBS, pelotizadas e armazenadas congeladas a -80°C. Os extratos celulares foram preparados em uma?tofrd€jifraç|ío’.:de: • * ·· · ··· ··· ··· · · células/μΐ por um processo de lise de detergente modificado (ver Bodnar et al., 1996, Exp. Cell Res. 228: 58; Kim et al., 1994, Science 266: 2011, e como descrito nas patentes e publicações relativas ao ensaio TRAP acima) e a atividade de telomerase nos extratos celulares foi determinada usando-se um ensaio TRAP modificado com base em PCR (Kim et al., 1994, Bodnar et al., 1996). Resumidamente, equivalentes de 5 x 104 células foram usados na porção de extensão do iniciador de telomerase da reação. Embora o extrato seja tipicamente tomado diretamente da reação de extensão da telomerase para a ampliação do PCR, pode-se também extrair uma vez com fenol/clorofórmio e uma vez com clorofórmio, antes da ampliação do PCR.
Um quinto do material foi usado na porção de ampliação do PCR da reação
TRAP (aproximadamente 10000 equivalentes celulares). Metade da reação 15 TRAP foi carregada de 5000 equivalentes celulares. Os extratos das células transfectadas com pGRN133 eram positivos quanto à atividade de telomerase, enquanto os extratos das células não transfectadas (não mostradas) ou das células transfectadas por plasmídeo de controle não mostraram qualquer atividade de telomerase. Experiências semelhantes 20 usando-se células RPE deram o mesmo resultado.
. A reconstituição em células BJ também foi realizada usandose outras construções de hTRT (isto é, pGRN145, pGRN155 e pGRN138). A ♦·„ reconstituição usando estas construções pareceram resultar em mais atividade de telomerase do que nas células transfectadas de pGRN133.
O mais elevado nível de atividade de telomerase foi obtido usando-se pGRN155. Como discutido acima, pGRN é um vetor contendo o promotor tardio principal de adenovírus como um elemento de controle para a expressão de ηικι, e foi observado rccunstiiuii α auvidadc dc tclomcruGC quando transfectado em células BJ.
342
Notavelmente, quando a reconstituição usando a proteína de fusão de GFP de hTRT pGRN138 (que se localizaifíojnúèljáõjvçf'
15, abaixo) foi realizada, ou in vitro (ver Exemplo 7) ou in vivo (transfecção nas células BJ), a atividade da telomerase resultou. Pela transfecção nas células BJ, por exemplo, como descrito acima, a atividade de telomerase foi Ç comparável àquela resultante da reconstituição in vitro, usando-se pGRN133 oupGRN145.
Resultados semelhantes foram obtidos após a transfecção de epitélio pigmentado retinal humano normal (RPE) com os vetores de 10 expressão de hTRT da invenção. Acredita-se que a senescência de células
REP contribua ou cause a doença de degeneração macular relacionada à idade. As células RPE tratadas de acordo com os processos da invenção, usando-se os vetores de expressão de hTRT da invenção, devem apresentar senescência retardada, em comparação com as células não tratadas, e assim 15 ser úteis em terapias de transplante para tratar ou evitar a degeneração macular relacionada à idade.
EXEMPLO 14
Construção de repórter promotor
Este exemplo descreve a construção de plasmídeos em que os genes repórteres são operavelmente ligados às sequências a montante de hTRT contendo os elementos promotores. Os vetores possuem numerosas utilizações, incluindo a identificação de fatores cis e trans transcricionais regulatórios in vivo, e para a triagem de agentes capazes de modulação (por exemplo, ativação ou inibição) da expressão de hTRT (por exemplo, triagem de medicamentos). Não obstante vários repórteres possam ser usados (por exemplo a luciferase vaga-lume, a β-glucuronidase, a β-galactosidase, a cloranfenicol acetil transferase, e GFP e outras), a fosfatase alcalina secretada de seres humanos (SJBAF; Clone fech) foi usada cm cxpciiênuius íulciaiõ. C gene repórter SEAP codifica uma forma truncada da enzima placentária, que
343 carece do domínio de ancoragem da membrana, dessa forma permitindo que ·*· * ··· · · · ··· · a proteína seja secretada eficientemente das célulaá-trânáfiçtadêas^Qs^ívhjs de atividade de SEAP detectados no meio de cultura têm-se mostrado serem diretamente proporcionais às mudanças nas concentrações intracelulares de 5 mRNA e proteína de SEAP (Berger et al., 1988, Gene 66:1; Cullen et al., 1992, Meth. Enzymol. 216: 362).
Quatro construções [pGRN148, pGRN150, “pSEAP2 basic” (nenhuma sequência promotora = controle negativo) e “pSEAP2 control” (contém o promotor e intensificador primitivo SV40)] foram transfectadas 10 em triplicata em células mortais e imortais.
O plasmídeo pGRN148 foi construído como ilustrado na Figura 9. Resumidamente, um fragmento Bgl2-Eco47III de pGRN144 foi digerido e clonado no sítio BglII-NruI de pSeap2Basic (Clontech, San Diego,CA). Um segundo repórter-promotor, o plasmídeo pGRN150, inclui as 15 sequências do intron hTRT descritas no Exemplo 3, para empregar sequências regulatórias que possam estar presentes no intron. O Met de iniciação é transformado em Leu, de modo que o segundo ATG seguindo-se à região promotora, será a ATG de iniciação do ORF SEAP.
As construções de pGRN148 e pGRN150 (que incluem o 20 promotor de hTRT), foram transfectadas em células mortais (células BJ) e imortais (293). Todas as transfecções foram feitas em paralelo com dois plasmídeos de controle: um plasmídeo de controle negativo (pSEAP basic) e um plasmídeo de controle positivo (controle pSEAP que contém o promotor primitivo SV40 e o intensificador SV40).
Nas células imortais, as construções de pGRN148 e pGRN150 parecem conduzir a expressão de SEAP tão eficientemente quanto o controle positivo de pSEAP2 (contendo o promotor e intensificador primitivos SV40). Ao contrário, em ceiuias morrais apenas u uuuuulc pSLAP2 àprcõcntGU atividade detectável. Estes resultados indicam que, como esperado, as
344
sequências promotoras de hTRT são ativas em células tumorais, mas não em ·*· · ·*· ··· ·· * * ··· · células mortais. :·’ ; ’··’· ” · ·· ······ * * ·♦ · ··· ··· ··· · ·
Resultados semelhantes foram obtidos usando-se a linhagem celular normal (RPE ou células epiteliais pigmentadas retinais). Nas células
RPE transfectadas compGRN150 (contendo 2,2 KB de sequência genômica de montante), a região do promotor de hTRT ficou inativa, enquanto o plasmídeo de controle pSEAP2 ficou ativo.
Como observado acima, os plasmídeos em que os genes repórteres são operavelmente ligados às sequências de montante de hTRT, contendo elementos promotores, são extremamente úteis para a identificação e triagem dos agentes modulatórios da atividade da telomerase, usando tanto técnicas de transfecção transientes, quanto estáveis. Em uma abordagem, por exemplo, os transformantes estáveis de pGRN148 são produzidos em células negativas de telomerase e positivas de telomerase, por co-transfecção com um marcador eucariótico selecionável (tal como neo), de acordo com Ausubel et al., 1997, acima. As linhagens celulares resultantes são usadas para triagem de agentes putativos modulatórios de telomerase, por exemplo por comparação da expressão conduzida por promotor de hTRT, na presença e na ausência de um composto de teste.
Os vetores promotores-repórteres (e outros) da invenção são também usados para identificar elementos regulatórios transcricionais e translacionais de atuação trans e cis. Exemplos de elementos regulatórios transcricionais de atuação cis incluem os promotores e intensificadores do gene da telomerase. A identificação e o isolamento de agentes regulatórios de atuação cis e trans fornecem outros processos e reagentes para identificar agentes que modulam a transcrição e a translação da telomerase.
EXEMPLO 15
Localização subceiuiar ae ήικι
Uma proteína de fusão tendo regiões de proteína de hTRT e
345 fluorescente verde intensificada (EGFP; Cormack et al., 1996, Gene 173: 33) ·· · · ··· · · · ··· · ·· · ·· ··· ····« · foi construída como descrito abaixo. A porção de EÈrFP p&JÁê ,$ji&
ou sinal detectável, de modo que a presença ou localização da proteína de fusão podem ser facilmente determinadas. Tendo em vista que as proteínas de 5 fusão de EGFP se localizam nos compartimentos celulares corretos, esta construção pode ser usada para determinar a locação subcelular dá proteína de hTRT.
A. CONSTRUÇÃO DE pGRN138
Um vetor para expressão de uma proteína de fusão de EGFP de hTRT em células de mamíferos foi construído colocando-se o inserto de EcoRI do pGRN 124 (ver Exemplo 6) no sítio EcoRI de pEGFP-C2 (Clontech, San Diego, CA). A sequência de aminoácidos da proteína de fusão é fornecida abaixo. Os resíduos de EGFP estão em itálico, os resíduos codificados pela região não transladada 5’ de mRNA de hTRT estão sublinhados, e a sequência proteínica de hTRT está em tipo normal.
mvskgeelftgwpilveldgdvnghkfsvsgegegdatygkltlkficttgklpvpwpt lvttltygvqcfsrypdhmkqhdffksampegyvqertiffkddgnyktraevkfegdtl VNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLA DHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKS GRTQIS S S .qFEFAA.ASTORCVLLRTWgaT.AP.a.TPAM PRAP RCRAVRSLLRSHYREVLPLA TFVRRLGPQGWRLVQRGDPAAFRALVAQCLVCVPWDARPPPAAPSFRQVSCLKELVARVL QRLCERGAKNVLAFGFALLDGARGGPPEAFTTSVRSYLPNTVTDALRGSGAWGLLLRRVG DDVLVHLLARCALFVLVAPSCAYQVCGPPLYQLGAATQARPPPHASGPRRRLGCERAWNH svreagvplglpapgarrrggsasrslplpkrprrgaapepertpvgqgswahpgrtrgp sdrgfcwsparpaeeatslegalsgtrhshpsvgrqhhagppstsrpprpwdtpcppvy ’ aetkhflyssgdkeqlrpsfllsslrpsltgarrlvetiflgsrpwmpgtprrlprlpqr ywqmrplflellgnhaqcpygvllkthcplraavtpaagvcarekpqgsvaapeeedtdp * * RRLVQLLRQHSSPWQVYGFVRACLRRLVPPGLWGSRHNERRFLRNTKKFISLGKHAKLSL
QELTWKMSVRDCAWLRRS PGVGCVPAAEHRLREEILAKFLHWLMS VYWELLRS FFYVTE TTFQKNRLFFYRPSVWSKLQSIGIRQHLKRVQLRELSEAEVRQHREARPALLTSRLRFIP KPDGLRPIVNMDYWGARTFRREKRAERLTSRVKALFSVLNYERARRPGLLGASVLGLDD IHRAWRTFVLRVRAQDPPPELYFVKVDVTGAYDTIPQDRLTEVIASIIKPQNTYCVRRYA WQKAAHGHVRKAFKSHVSTLTDLQPYMRQFVAHLQETSPLRDAWIEQSSSLNEASSGL fdvflrfmchhavrirgksyvqcqgipqgsilstllcslcygdmenklfagirrdglllr lvddfllvtphlthaktflrtlvrgvpeygcwnlrktwnfpvedealggtafvqmpah glfpwcgllldtrtlevqsdyssyartsirasvtfnrgfkagrnmrrklfgvlrlkchsl t?T ΓΊΤ ΓΚΤΓ* T irrfrr -ν «p λ · « —- — _____ — _
----* · ·’ ’ '-**·.* λ. fííwir x r cuav i o ilkaknagmslgakgaagplpseavqwlchqafllkltrhrvtyvpllgslrtaqtqlsr
KLPGTTLTALEAAANPALPSDFKTILD
346
Outras construções de fusão de EGFP podem ser produzidas usando-se a sequência de codificação de hTRT: parcial* (poi/exenipk5, truncada, e usadas, como descrito abaixo, para identificar atividades de regiões particulares do polipeptídeo de hTRT.
B. LOCALIZAÇÃO NUCLEAR E USOS DE pGRN138
A transfecção de células NIH 293 e BJ com pGRN138, confirmou a localização nuclear de hTRT recombinantemente expressa. As células foram transfectadas com pGRN138 (EGFP-hTRT) e com uma construção de controle (expressando apenas EGFP). A localização nuclear do 10 EGFP-hTRT é evidente em ambos os tipos de células, mediante microscopia de fluorescência. Como observado acima, a proteína de fusão de GFP de hTRT pGRN138 suporta a reconstituição da atividade de telomerase, em um sistema de translação da transcrição tanto in vitro, quanto in vivo, quando transfectadas em células B J.
As proteínas de fusão hTRT-EGFP (ou proteínas de fusão detectáveis semelhantes) podem ser usadas em uma variedade de aplicações. Por exemplo, a construção de fusão descrita neste exemplo, ou uma construção de EGFP e uma forma truncada de hTRT, podem ser usadas para avaliar a capacidade de hTRT e variantes de entrarem em um núcleo celular 20 e/ou localizar nas extremidades cromossômicas. Além disso, as células estavelmente ou transientemente transfectadas com pGRN138 são usadas para triagem dos compostos, para identificar os medicamentos ou compostos modulatórios da telomerase. Agentes que interferem com a localização nuclear ou localização do telômero, podem ser identificados como inibidores 25 de telomerase. As linhagens de células tumorais estavelmente expressando EGFP-hTRT podem ser úteis para esta finalidade. Moduladores potenciais de telomerase serão administradas a estas células transfectadas e a localização do EGFP-hTRT serão avaliadas. Atem disso, r aCS ou outros processos com base na fluorescência podem ser usados para selecionar células expressando
347 particularmente quando a transfecção transiente de células‘eefnjgegâdaí ζ Em outras aplicações, as regiões da hTRT podem mutagenizada para identificar regiões [por exemplo resíduos 193 a 5 (PRRR) e 235 a 240 (PKRPRR)] necessárias para localização nuclear, hTRT, para prover populações homogêneas para triagem de medicamentos, • · • · • ··· • · ♦ ser
196 que são alvos para medicamentos anti-telomerase (moduladores de atividade de telomerase). Outras aplicações incluem:
o uso da proteína de fusão como um marcador fluorescente de transfecção celular eficiente para ambas as experiências de transfecção 10 transiente, e quando do estabelecimento de linhagens celulares estáveis expressando EGFP-hTRT;
expressão de uma fusão de hTRT-EGFP com sinais de localização nuclear transformados (deficientes quanto à localização nuclear) em células imortais, de modo que o EGFP mutante de hTRT recupere todo o 15 hTR das células imortais, retendo-o no citoplasma e evitando a manutenção do telômero; e uso como uma proteína marcada para imunoprecipitação.
EXEMPLO 16
Efeito da mutação na atividade catalítica da telomerase
Este exemplo descreve proteínas variantes de hTRT, tendo aminoácidos alterados e atividade catalítica de telomerase alterada. As substituições de aminoácidos, seguidas por análise funcional, e um meio padrão de avaliação da importância e função de uma sequência de polipeptídeos. Este exemplo demonstra que modificações nos motivos da transcriptase reversa (RT) e da telomerase (T) afetam a atividade catalítica da telomerase.
A nomenclatura convencional é empregada para descrever mutantes: o resíduo aívo na moíécuía nauva (hTRT) c íuciiíííjlvciuu pui código e posição de uma letra, e o resíduo correspondente na proteína
348 mutante é indicado por código de uma letra. Assim, por exemplo, “K626A” í·. ; ··::·:
especifica um mutante em que a lisina na posição 62^(1^0^,:^0 Jnptiyó T) 4$ hTRT, é modificada em uma alanina.
A. MUTAÇÃO DE MOTIVO FFYxTE DE hTRT
Em experiências iniçiais, foi produzido um vetor codificando uma proteína mutante de hTRTU“F560A”< no qual o aminoácido 560 de hTRT foi modificado de fenilalanina (F) em alanina (A) por mutagênese dirigida ao sítio de pGRN121, usando técnicas padrão. Esta mutação rompe o motivo FFYxTE de TRT. O polinucleotídeo mutante F560A resultante foi 10 observado dirigir a síntese de uma proteína de hTRT de comprimento completo, avaliada usando-se um sistema de transcrição/translação de lisado de reticulócito isento de células, na presença de 35S-metionina.
Quando o polipeptídeo mutante foi co-transladado com hTR, como descrito no Exemplo 7, nenhuma atividade foi detectada, como 15 observado por TRAP usando-se 20 ciclos de PCR, enquanto uma cotranslação de hTRT/hTR de controle reconstituiu a atividade. Com 30 ciclos de PCR no ensaio TRAP, a atividade de telomerase era observável com a hTRT mutante, mas foi consideravelmente mais baixa do que na hTRT de controle (tipo selvagem).
!θ B. MUTAGÊNESE ADICIONAL DIRIGIDA AO SÍTIO DE RESÍDUOS DE AMINOÁCIDOS DE hTRT
Os aminoácidos conservados em seis motivos de RT foram modificados em alanina, usando-se as técnicas padrão de mutagênese dirigida ao sítio (ver, por exemplo, Ausubel, acima), para avaliar sua contribuição à 25 atividade catalítica. Os mutantes foram ensaiados utilizando-se a telomerase IVR usando o ensaio de duas etapas convencional/TRAP detalhado no Exemplo 7.
Os muranies K626A (niuiivu 1), R631A (muuvu 2), D712A (motivo A), Y717A (motivo A) D868A (motivo C) tiveram atividade de
349 telomerase grandemente reduzida ou não detectável, enquanto os motivos 0833A (motivo B) e G932A (motivo E) apresentaramjníVpiâ iiitqFfnetiíáribfc * V .1« « tl t IVI I e níveis intermediários de atividade. Dois mutantes fora dos motivos RT, R688A e D897A, tiveram atividade equivalente à hTRT tipo selvagem. Estes resultados foram consistentes com as mutações análogas em transcriptases reversas (Joyce et al., 1994, Ann. Rev. Biochem. 63: 777) e são similares aos resultados obtidos com Est2p (ver Lingner, 1997, Science 276: 561). As experiências identificam resíduos nos motivos RT críticos e não críticos para a atividade enzimática e demonstram que a hTRT é a proteína catalítica da 10 telomerase humana. As mutações fornecem polipeptídeos variantes de hTRT que têm utilidade, por exemplo, como reguladores dominantes/negativos de atividade de telomerase.
O alinhamento de aminoácidos dos TRTs conhecidos identificaram um motivo específico de telomerase, o motivo T (ver acima). 15 Para determinar o papel catalítico deste motivo na hTRT, uma deleção de seis aminoácidos neste motivo (Δ560-565; FFYxTE) foi construída usando-se as técnicas padrão de mutagênese dirigida ao sítio (Ausubel, acima). A deleção foi ensaiada usando-se a telomerase IVR usando o ensaio de duas etapas convencional/TRAP detalhado no Exemplo 7. O mutante Δ560-565 não teve 20 qualquer atividade de telomerase observável após 25 ciclos de PCR, enquanto a telomerase de IVR de hTRT tipo selvagem produziu um sinal forte. Cada aminoácido em cada resíduo no motivo T foi examinado independentemente, de uma maneira semelhante; os mutantes F560A, Y562A, T564 e E565A retiveram níveis intermediários de atividade de 25 telomerase, enquanto um mutante de controle, F487A, tiveram efeito mínimo sobre a atividade. Notavelmente, o mutante F561A teve atividade de telomerase grandemente reduzida ou não detectável, enquanto a atividade foi compietamente restaurada cm seu úcvciícuíu”, F3Ó1A5Ó1F. F5Ó1A3Ó1F modifica a posição transformada de volta à sua fenilalanina original. Este é
350 um controle que demonstra que nenhuma outra mudança no aminoácido · 4 · ··· · * w· w 3 · « « Λ » » p * »· « 3 · · · · ocorreu ao plasmídeo que é responsável pela atividade rednzida gbseryadà
Assim, o motivo T é o primeiro motivo não RT apresentado como sendo absolutamente necessário à atividade de telomerase.
O motivo T pode ser usado para identificação de TRTs a partir de outros organismos, e proteínas de hTRT compreendendo variantes deste motivo podem ser usadas como um regulador dominante/negativo da atividade de telomerase. Ao contrário da maioria de outros RTs, a telomerase estavelmente se associa, e processivamente copia, uma pequena porção de um RNA único (isto é, hTR), e assim o motivo T pode ser envolvido em ligação de hTR de mediação, a processividade da reação, ou outras funções únicas ao RT da telomerase.
EXEMPLO 17
Exame quanto aos moduladores da atividade da telomerase, usando componentes de telomerase recombinantemente expressos
Este exemplo descreve o uso de telomerase reconstituída in vitro para exame e identificação dos moduladores da atividade de telomerase. O ensaio descrito é facilmente adaptado a processos de alta produção (por exemplo, usando placas de múltiplos reservatórios e/ou sistemas robóticos). Numerosas variações nas etapas do ensaio serão evidentes a uma pessoa experiente na técnica, após exame desta apresentação.
Os clones recombinantes para os componentes da telomerase (por exemplo, hTRT e hTR) são transcritos e transladados (apenas hTRT) em uma reação in vitro como segue e como descrito no Exemplo 7 acima, usando o sistema de lisado do Reticulócito Acoplado TNT® T7 (Promega), que é descrito na Patente U.S. 5.324.637, seguindo-se as instruções do fabricante: REAGENTE QUANT. POR REAÇÃO (μΐ)
Lisado de Rericuíóciio de Coeíno TNT 25
Tampão de reação de TNT 2
351 • · · · ··· · · · ·«·· • · · · · · ·· · · · · · · ·!···· · · ····· ·· · ··· · · · Λ · ··· · · ·· · ··· ··· ··♦ · ·
Pol. de RNA de TNT T7 Mistura AA (completa) Inibidor prime RNase Água isenta de nuclease Corte Xbal pGRN121 [hTRT] (0,5 pg) Corte Fspl pGRN164 [hTR] (0,5 pg)
A reação é incubada a 30°C por 2 horas. O produto é então purificado em um filtro de DEAE ultrafree-MC (Millipore).
O produto de telomerase recombinante (IVRP) é ensaiado na presença e ausência de concentrações múltiplas de compostos de teste, que são solubilizadas em DMSO (por exemplo, de 10 pM a 100 pM). Os compostos de teste são pré-incubados em um volume total de 25 pl durante 30 minutos em temperatura ambiente na presença de 2,5 pl de IVRP, DMSO 2,5% e 1 X tampão TRAP (Tris 20 mM-HCl, pH 8,3, MgCl2 1,5 mM, KC1 63 mM, Tween 20 0,05%, EGTA 1,0 mM, 0,1 mg/ml de albumina de soro bovino). Seguindo-se à pré-incubação, 25 pl da mistura de reação do ensaio TRAP são adicionados a cada amostra. A mistura de reação do ensaio TRAP é composta de 1 X tampão TRAP, 50 pl de dNTP, 2,0 pg/ml de iniciador ACX, 4 pg/ml de iniciador U2, 0,8 attomol/ml de TSU2, 2 unidades/50 pl de polimerase Taq (Perkin Elmer), e 2 pg/ml de iniciador TS rotulado [32P] na extremidade 5’ (3000 Ci/mmol). Os tubos de reação foram então colocados no dispositivo de termociclagem de PCR (MJ Research) e o PCR foi realizado como segue: 60 minutos a 30°C, 20 ciclos de {30 segundos a 94°C, 30 segundos a 60°C, 30 segundos a 72°C}, 1 minuto a 72°C, esfriamento a 10°C. O ensaio TRAP é descrito, como observado acima, na Patente U.S. 5.629.154. Os iniciadores e o substrato usado tiveram as sequências: Iniciador TS (5’-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3’); Iniciador ACX (5'-GCUCUG[d íaucjjctaacc-j j; iniciador uz (5’-ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3’) TSU2;
352
3<5Υ (5’-AATCCGTCGAGCAGA GTTAAAAGGCCGAGAAGCGAT-3’).
·· · · ··· · · · ··· ·
Após completa a etapa de PCR, 4 μΐ de t^paojde*carga’10X.: ··:
contendo azul de bromofenol, são adicionados a cada tubo de reação e os produtos (20 μΐ) são desenvolvidos em um PAGE não desnaturado 12,5% em
0,5X TBE a 400 V. O gel completo é subsequentemente secado e os produtos
TRAP são visualizados por Phosphorimager ou por autorradiografia. A atividade de telomerase na presença do composto de teste é medida por comparação da incorporação de rótulo no produto de reação para uma reação paralela em que falta o agente.
Os seguintes clones descritos nos Exemplos foram depositados na American Type Culture Collection, Rockville, MD 20852, USA:
Lambda fago λ 25-1.1 Número de acesso ATCC 209024 pGRN 121 Número de acesso ATCC 209016
Lambda fago λϋφ5 Número de acesso ATCC 98505
A presente invenção provê novos processos e materiais relativos à hTRT e ao diagnóstico e tratamento de doenças relacionadas à telomerase. Não obstante tenham sido fornecidos exemplos específicos, a descrição acima é ilustrativa e não restritiva. Muitas variações da invenção se tomarão evidentes para aquelas pessoas versadas na técnica, após exame deste relatório descritivo. O escopo da invenção deve, portanto, ser determinado, não com referência à descrição supra, mas, ao invés, deve ser determinado com referência às reivindicações anexas, juntamente com seu escopo completo de equivalentes.
Todas as publicações e documentos de patentes citados neste pedido, são incorporados por referência em sua totalidade, para todas as finalidades, na mesma extensão como se cada publicação ou documento de paieme fossem desse modo individualuicmc nidiuadus.

Claims (32)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Vetor de clonagem, vetor de expressão ou vetor viral, caracterizado pelo fato de ter uma sequência de ácidos nucléicos que tem uma sequência idêntica ou exatamente complementar à sequência de ácidos nucléicos de:
    SEQIDNO: 1;
    SEQ ID NO: 4;
    ácidos nucléicos 40-60 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 55-75 da SEQ ID NO 1;
    ácidos nucléicos 151-171 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 260-280 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 500-520 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 770-790 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 885-905 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 1000-1020 da SEQ ID NO: 1;
    ácidos nucléicos 1300-1320 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 1520-1540 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 56-910 da SEQ ID NO: 1;
    ácidos nucléicos 899-1732 de SEQ ID NO:1; ou ácidos nucléicos 56-1732 de SEQ ID NO:1.
  2. 2. Vetor de clonagem, vetor de expressão ou vetor viral, caracterizado pelo fato de ter uma seqüência de nucleotídeo consistindo em uma seqüência de pelo menos 25 nucleotídeos consecutivos idênticos ou exatamente complementares aos ácidos nucléicos 56 a 910 de SEQ ID NO: 1 ou aos ácidos nucléicos 899 a 1732 de SEQ ID NO: 1.
  3. 3. Célula recombinante de microorganismo transgênico isolada, caracterizada pelo fato de ter uma sequência de nucleotídeos que consiste de uma sequência de pelo menos 25 nucleotídeos consecutivos idênticos ou exatamente complementar aos ácidos nucléicos 56 a 910 de SEQ
    ID NO: 1 ou aos ácidos nucléicos 899 a 1732 de SEQ ID NO: 1.
  4. 4. Célula recombinante de microorganismo transgênico isolada, caracterizada pelo fato de ter uma sequência de ácidos nucléicos que tem uma sequência idêntica ou exatamente complementar à sequência de ácidos nucléicos de:
    SEQ IDNO: 1;
    SEQ ID NO: 4;
    ácidos nucléicos 40-60 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 55-75 da SEQ ID NO 1;
    ácidos nucléicos 151-171 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 260-280 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 500-520 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 770-790 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 885-905 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 1000-1020 da SEQ ID NO: 1;
    ácidos nucléicos 1300-1320 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 1520-1540 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 56-910 de SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 899-1732 de SEQ ID NO:1; ou ácidos nucléicos 56 a 1732 de SEQ ID NO:1.
  5. 5. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de ter um ácido nucléico que tem uma sequência idêntica ou exatamente complementar à sequência de ácido nucléico de:
    SEQ IDNO: 1;
    SEQ IDNO: 4;
    ácidos nucléicos 40-60 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 260-280 de SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 55-75 da SEQ ID NO 1;
    ácidos nucléicos 151-171 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 500-520 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 770-790 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 885-905 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 1000-1020 da SEQ ID NO: 1;
    ácidos nucléicos 1300-1320 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 1520-1540 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 2110-2130 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 2295-2315 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 2450-2470 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 2670-2690 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 3080-3110 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 3140-3160 da SEQ ID NO: 1;
    ácidos nucléicos 56-910 de SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 899-1732 de SEQ ID NO:1; ou ácidos nucléicos 56-1732 de SEQ ID NO:1;
    e um estabilizador farmaceuticamente aceitável.
  6. 6. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de ter uma proteína transcriptase reversa de telomerase humana (hTRT), que tem uma seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:5 e um estabilizador farmaceuticamente aceitável.
  7. 7. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de ter um peptídeo de hTRT que tem de 10 a 20 aminoácidos da SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:5, e um estabilizador farmaceuticamente aceitável.
  8. 8. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de compreender um peptídeo de hTRT que consiste de pelo menos 8 ou pelo menos 10 aminoácidos, em que o peptídeo tem a sequência:
    FFYVTETTFQKNRLFFYRKSVWSK (SEQ ID NO:232);
    RQHLKRVQLRDVSEAEVRQHREA (SEQ ID NO:233);
    ARTFRREKRAERLTSRVKALFSVLNYE (SEQ ID NO:234);
    AKFLHWLMSVYVVELLRSFFYVTETTFQ (SEQ ID
    NO.-235);
    LFFYRKSVWSKLQSIGIRQHLKRVQLRDVS(SEQ ID
    NO:236); ou
    PALLTSRLRFIPKPDGLRPIVNMDYVV(SEQ ID NO:237);
    ou um fragmento do mesmo de pelo menos 8 aminoácidos ou pelo menos 10 aminoácidos de comprimento e um estabilizador farmaceuticamente aceitável.
  9. 9. Método de obtenção de um peptídeo de hTRT recombinante, caracterizado pelo fato de expressar em um microorganismo transgênico uma sequência de ácidos nucléicos tendo a sequência idêntica à sequência de ácidos nucléicos de:
    SEQIDNO: 1;
    SEQ ID NO: 4;
    ácidos nucléicos 56-910 de SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 899-1732 de SEQ ID NO:1; ou ácidos nucléicos 56-1732 de SEQ ID NO:1.
  10. 10. Método para inibir a expressão de hTRT in vitro ou ex vivo em uma célula, caracterizado pelo fato de contactar a célula com polinucleotídeo anti-sentido ou ribozima consistindo dos ácidos nucléicos 40-60 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 260-280 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 55-75 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 151-171 daSEQIDNO:l;
    ácidos nucléicos 500-520 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 770-790 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 885-905 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 1000-1020 da SEQ ID NO: 1;
    ácidos nucléicos 1300-1320 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 1520-1540 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 2110-2130 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 2295-2315 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 2450-2470 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 2670-2690 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 3080-3110 da SEQ ID NO:1; ou ácidos nucléicos 3140-3160 da SEQ ID NO:1; ou um fragmento de ácido nucléico do mesmo de pelo menos 12 nucleotídeos consecutivos de comprimento.
  11. 11. Método para aumentar a capacidade replicativa de uma célula in vitro ou ex vivo, caracterizado pelo fato de expressar na célula uma sequência de ácidos nucléicos que compreende a sequência de ácidos nucléicos da SEQ ID NO:1.
  12. 12. Método para detectar um polinucleotídeo hTRT ou fragmento deste em uma amostra, caracterizado pelo fato de combinar a amostra com um reagente sob condições de hibridização estringentes onde o reagente hibridiza com o polinucleotídeo ou fragmento, e detecta qualquer híbrido formado; em que o reagente é um polinucleotídeo que tenha sequência idêntica ou complementar a:
    SEQ IDNO: 1;
    SEQ ID NO: 4;
    ácidos nucléicos 40-60 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 55-75 da SEQ ID NO 1;
    ácidos nucléicos 151-171 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 260-280 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 500-520 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 770-790 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 885-905 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 1000-1020 da SEQ ID NO: 1;
    ácidos nucléicos 1300-1320 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 1520-1540 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 2110-2130 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 2295-2315 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 2450-2470 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 2670-2690 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 3080-3110 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 3140-3160 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 56-910 de SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 899-1732 de SEQ ID NO:1; ou ácidos nucléicos 56-1732 de SEQ ID NO:1.
  13. 13. Kit para detectar um polinucleotídeo hTRT ou fragmento deste, caracterizado pelo fato de possuir em uma embalagem adequada:
    (i) um polinucleotídeo tendo uma sequência idêntica ou complementar a:
    SEQ IDNO: 1;
    SEQ ID NO: 4;
    ácidos nucléicos 40-60 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 55-75 da SEQ ID NO 1;
    ácidos nucléicos 151-171 da SEQ ID NO: 1;
    ácidos nucléicos 260-280 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 500-520 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 770-790 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 885-905 da SEQ ID NO.T;
    ácidos nucléicos 1000-1020 da SEQ ID NO: 1;
    ácidos nucléicos 1300-1320 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 1520-1540 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 2110-2130 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 2295-2315 da SEQ ID NO: 1;
    ácidos nucléicos 2450-2470 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 2670-2690 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 3080-3110 da SEQ ID NO: 1;
    ácidos nucléicos 3140-3160 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 56-910 de SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 899-1732 de SEQ ID NO:1; ou ácidos nucléicos 56-1732 de SEQ ID NO:1; e (ii) um rótulo detectável.
  14. 14. Método para avaliar uma condição em um paciente associada com expressão alterada de hTRT, caracterizado pelo fato de detectar um polinucleotídeo que codifica uma proteína hTRT em uma amostra de um paciente ex vivo ou in vitro, como definido na reivindicação 12.
  15. 15. Método de acordo com a reivindicação 14 caracterizado pelo fato de que a condição é câncer.
  16. 16. Uso de um polinucleotídeo idêntico ou complementar a um ácido nucléico selecionado do grupo:
    SEQ IDNO: 1;
    SEQ ID NO: 4;
    ácidos nucléicos 40-60 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 55-75 da SEQ ID NO 1;
    ácidos nucléicos 151-171 daSEQIDNO:l;
    ácidos nucléicos 260-280 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 500-520 da SEQ ID NO: 1;
    ácidos nucléicos 770-790 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 885-905 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 1000-1020 da SEQ ID NO: 1;
    ácidos nucléicos 1300-1320 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 1520-1540 da SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 56-910 de SEQ ID NO:1;
    ácidos nucléicos 899-1732 de SEQ ID NO:1; ou ácidos nucléicos 56-1732 de SEQ ID NO:1, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para o tratamento de câncer.
  17. 17. Uso de um polinucleotídeo compreendendo SEQ ID NO:1, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para aumentar capacidade proliferativa em um tecido.
  18. 18. Uso de um peptídeo consistindo de pelo menos 10 aminoácidos em que o peptídeo tem a sequência:
    SEQ ID NO:2;
    FFYVTETTFQKNRLFFYRKSVWSK (SEQ ID NO:232);
    RQHLKRVQLRDVSEAEVRQHREA (SEQ ID NO:233);
    ARTFRREKRAERLTSRVKALFSVLNYE (SEQ ID NO:234);
    AKFLHWLMSVYVVELLRSFFYVTETTFQ (SEQ ID NO:235);
    LFFYRKSVWSKLQSIGIRQHLKRVQLRDVS (SEQ ID NO:236); or
    PALLTSRLRFIPKPDGLRPIVNMDYVV (SEQ ID NO:237);
    ou um fragmento do mesmo de pelo menos 10 aminoácidos de comprimento, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para o tratamento de uma doenças relacionadas a uma sub ou super-expressão da holoenzima da telomerase.
  19. 19. Uso de um peptídeo consistindo de pelo menos 8 aminoácidos em que o peptídeo tem a sequência:
    FFYVTETTFQKNRLFFYRKSVWSK (SEQ ID NO:232);
    RQHLKRVQLRDVSEAEVRQHREA (SEQ ID NO:233);
    ARTFRREKRAERLTSRVKALFSVLNYE (SEQ ID NO:234);
    AKFLHWLMSVYVVELLRSFFYVTETTFQ (SEQ ID NO:235);
    LFFYRKSVWSKLQSIGIRQHLKRVQLRDVS (SEQ ID NO:236); or
    PALLTSRLRFIPKPDGLRPIVNMDYVV (SEQ ID NO:237);
    ou um fragmento do mesmo de pelo menos 8 aminoácidos de comprimento, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para eliciar uma resposta imunológica anti-TRT.
  20. 20. Uso de uma célula como definida na reivindicação 4, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para o tratamento de doenças relacionadas a uma sub ou super-expressão da holoenzima da telomerase.
  21. 21. Uso da célula tendo uma sequência de nucleotídeo exógena compreendendo a SEQ ID NO: 1, como definida na reivindicação 4, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para aumentar a capacidade de crescimento proliferativo em um tecido.
  22. 22. Vetor de clonagem, vetor de expressão ou vetor viral, caracterizado pelo fato de ter uma sequência promotora que tenha pelo menos uma das seguintes características:
    (a) compreende os ácidos nucléicos 1-2441 da SEQ ID NO: 6;
    ou (b) compreende uma seqüência de pelo menos 25 nucleotídeos consecutivos (ou pelo menos 50 nucleotídeos consecutivos) (ou pelo menos 100 nucleotídeos consecutivos) da seqüência de (a) operavelmente ligada a um gene heterólogo.
  23. 23. Vetor de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o gene heterólogo é:
    (i) um gene repórter; ou (ii) um gene que, quando expresso em uma célula, é tóxico para a célula ou confere à célula maior suscetibilidade a toxicidade de uma droga.
  24. 24. Vetor de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o gene heterólogo codifica uma proteína que é fluorescente, fosforescente, ou tem atividade enzimática.
  25. 25. Vetor de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o gene heterólogo codifica timidina quinase.
  26. 26. Método para expressar um gene heterólogo em uma célula expressando TRT, caracterizado pelo fato de introduzir na célula um vetor como definido em qualquer uma das reivindicações 22-25.
  27. 27. Célula de microorganismo transgênico, caracterizada pelo fato de conter o vetor exógeno como definido em qualquer uma das reivindicações 22-25.
  28. 28. Método para extinguir seletivamente uma célula expressando TRT, caracterizado pelo fato de introduzir na célula de um vetor como definido na reivindicação 23 ou 25.
  29. 29. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula cancerígena.
  30. 30. Método para mapear um composto de teste para uma habilidade para modular a atividade promotora de TRT, caracterizado pelo fato de combinar o composto de teste com uma célula compreendendo o vetor e um gene repórter como definido na reivindicação 23 ou 24, e detectar qualquer efeito do composto de teste na expressão do gene repórter.
  31. 31. Uso de um vetor como definido em qualquer uma das reivindicações 22, 23 ou 25, caracterizado pelo fato de ser para preparação de um medicamento para o tratamento de doenças relacionadas a uma sub ou super-expressão da holoenzima da telomerase.
  32. 32. Uso de um vetor como definido em qualquer uma das
    5 reivindicações 22, 23 ou 25, caracterizado pelo fato de ser para preparação de um medicamento para o tratamento de câncer.
BRPI9712254A 1996-10-01 1997-10-01 vetor viral, de clonagem ou de expressão, microorganismo transgênico, composição farmacêutica, kit para detectar um polinucleotídeo htrt ou fragmento deste, usos de um polinucleotídeo, de um peptídeo, de um microorganismo transgênico e de um vetor, e, métodos de obtenção de um peptídeo recombinante de htrt, para inibir a expressão de htrt, para aumentar a capacidade replicativa de uma célula, para detectar um polinucleotídeo htrt ou fragmento deste, para avaliar uma condição associada com expressão alterada de htrt, para expressar um gene heterólogo, para extinguir seletivamente uma célula expressando trt, e para mapear um composto de teste para uma habilidade para modular a atividade promotora de trt BRPI9712254B1 (pt)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US72464396A 1996-10-01 1996-10-01
US84441997A 1997-04-18 1997-04-18
US84601797A 1997-04-25 1997-04-25
US08/851,843 US6093809A (en) 1996-10-01 1997-05-06 Telomerase
US08/854,050 US6261836B1 (en) 1996-10-01 1997-05-09 Telomerase
US91550397A 1997-08-14 1997-08-14
US91131297A 1997-08-14 1997-08-14
US08/912,951 US6475789B1 (en) 1996-10-01 1997-08-14 Human telomerase catalytic subunit: diagnostic and therapeutic methods
PCT/US1997/017885 WO1998014593A2 (en) 1996-10-01 1997-10-01 Human telomerase catalytic subunit

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BRPI9712254B1 true BRPI9712254B1 (pt) 2019-01-15

Family

ID=27575511

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR9711844-3A BR9711844A (pt) 1996-10-01 1997-10-01 Preparação de proteìna isolada, substancialmente pura ou recombinante, proteìna de trt isolada, substancialmente pura ou recombinante protéina de trt isolada, substancialmente pura ou recombinante, protéina de trt isolada ou uma sua variante, ou um seu fragmento, polinucleotìdeo, sintético, substancialmente puro ou recombinante, ácido nucléico isolado, codificando uma proteìna de trt, vetor de expressão, célula transfectada, animal não-humano, ou sua progênie, animal não-humano transgênico, anticorpo ou seu fragmento de ligação, anticorpo, especificamente imunorreativo sob condições imunologicamente reativas, para uma proteìna de trt ou seu fragmento imunogênico, processos de determinar se um composto ou tratamento é um modulador de uma atividade ou expressão de trt, de determinar se um composto de teste é um modulador de uma atividade de trt, de preparar telomerase recombinante, de detectar um produto genético de trt em uma amostra, de detectar a presença de pelo menos uma célula humana positiva de telomerase em uma amostra biológica compreendendo células humanas, de diagnosticar uma condição relacionada com a telomerase em um mamìfero, para aumentar a capacidade proliferativa de uma célula de vertebrado in vitro, para detectar a presença de yuma sequência de polinucleotìdeo codificando pelo menos uma parte de uma trt em uma amostra bilógica, para produzir um polinucleotìdeo, para detectar a expressão ou presença de uma trt em uma amostra biológica, usos de ummpolinucleotìdeo, de um agente que aumenta a expressão ou atividade de uma trt, de um inibidor da expressão ou atividade de telomerase de uma proteìna, variante ou fragmento, composição farmacêutica, polipeptìdeo substancialmente purificado, sequência de polinucleotìdeo isolado, complexo de telomerase, composição, telomerase substancialmente pura, polipeptìdeo de trt isolado, ácido nucléico isolado.
BRPI9712254A BRPI9712254B1 (pt) 1996-10-01 1997-10-01 vetor viral, de clonagem ou de expressão, microorganismo transgênico, composição farmacêutica, kit para detectar um polinucleotídeo htrt ou fragmento deste, usos de um polinucleotídeo, de um peptídeo, de um microorganismo transgênico e de um vetor, e, métodos de obtenção de um peptídeo recombinante de htrt, para inibir a expressão de htrt, para aumentar a capacidade replicativa de uma célula, para detectar um polinucleotídeo htrt ou fragmento deste, para avaliar uma condição associada com expressão alterada de htrt, para expressar um gene heterólogo, para extinguir seletivamente uma célula expressando trt, e para mapear um composto de teste para uma habilidade para modular a atividade promotora de trt
BR9712254-8A BR9712254A (pt) 1996-10-01 1997-10-01 Preparação proteìnica isolada e de htrt, fragmento de proteìna de htrt,telomerase humana,polinucleotìdeo isolado, vetor de expressão, célula,organismo não humano, antocorpo isolado ou recombinante, processos para determinar se um composto ou tratamento é um modulador de uma atividade ou expressão de htrt, se um composto de teste é um modulador de uma atividade de transcriptase reversa de telomerase, para identificar um composto que modula a atividade de htrt, para preparar telomerase recombinante, para detectar um produto de gente de htrt em uma amostra e a presença de pelo menosuma célula humana positiva de telomerase em uma amostra biológica, para diagnosticar uma condição relacionada a telomerase em um paciente e câncer para fornecer um prognóstico para um paciente de câncer, para monitorar a capacidade de um tratamento anti-câncer, para reduzir a capacidade proliferativa das células cancerìgenas em uma paciente, para aumentar a capacidade proliferativa de uma célula de vertebrado, para tratar uma condição associada com um nìvel elevado de atividade de telomerase dentro de uma célula, para isolar um ácido nucleico selecionado de sequência desconhecida,para detectar um produto do gene de htrt em uma amostra e a presença de pelo menos uma célula humana positiva de telomerase em uma amostra biológica, kit para a detecção de um gene ou produto do gene de htrt, composições farmacológica e farmacêutica, vacina, proteìna htrt isolada, usos de um polinucleotìdeo, anticorpo e de um agente de aumento da expressão de htrt, proteìna, variante ou fragmento,e, uso de uma proteìna, polipeptìdeo ou fragmento uso dos mesmos.

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR9711844-3A BR9711844A (pt) 1996-10-01 1997-10-01 Preparação de proteìna isolada, substancialmente pura ou recombinante, proteìna de trt isolada, substancialmente pura ou recombinante protéina de trt isolada, substancialmente pura ou recombinante, protéina de trt isolada ou uma sua variante, ou um seu fragmento, polinucleotìdeo, sintético, substancialmente puro ou recombinante, ácido nucléico isolado, codificando uma proteìna de trt, vetor de expressão, célula transfectada, animal não-humano, ou sua progênie, animal não-humano transgênico, anticorpo ou seu fragmento de ligação, anticorpo, especificamente imunorreativo sob condições imunologicamente reativas, para uma proteìna de trt ou seu fragmento imunogênico, processos de determinar se um composto ou tratamento é um modulador de uma atividade ou expressão de trt, de determinar se um composto de teste é um modulador de uma atividade de trt, de preparar telomerase recombinante, de detectar um produto genético de trt em uma amostra, de detectar a presença de pelo menos uma célula humana positiva de telomerase em uma amostra biológica compreendendo células humanas, de diagnosticar uma condição relacionada com a telomerase em um mamìfero, para aumentar a capacidade proliferativa de uma célula de vertebrado in vitro, para detectar a presença de yuma sequência de polinucleotìdeo codificando pelo menos uma parte de uma trt em uma amostra bilógica, para produzir um polinucleotìdeo, para detectar a expressão ou presença de uma trt em uma amostra biológica, usos de ummpolinucleotìdeo, de um agente que aumenta a expressão ou atividade de uma trt, de um inibidor da expressão ou atividade de telomerase de uma proteìna, variante ou fragmento, composição farmacêutica, polipeptìdeo substancialmente purificado, sequência de polinucleotìdeo isolado, complexo de telomerase, composição, telomerase substancialmente pura, polipeptìdeo de trt isolado, ácido nucléico isolado.

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR9712254-8A BR9712254A (pt) 1996-10-01 1997-10-01 Preparação proteìnica isolada e de htrt, fragmento de proteìna de htrt,telomerase humana,polinucleotìdeo isolado, vetor de expressão, célula,organismo não humano, antocorpo isolado ou recombinante, processos para determinar se um composto ou tratamento é um modulador de uma atividade ou expressão de htrt, se um composto de teste é um modulador de uma atividade de transcriptase reversa de telomerase, para identificar um composto que modula a atividade de htrt, para preparar telomerase recombinante, para detectar um produto de gente de htrt em uma amostra e a presença de pelo menosuma célula humana positiva de telomerase em uma amostra biológica, para diagnosticar uma condição relacionada a telomerase em um paciente e câncer para fornecer um prognóstico para um paciente de câncer, para monitorar a capacidade de um tratamento anti-câncer, para reduzir a capacidade proliferativa das células cancerìgenas em uma paciente, para aumentar a capacidade proliferativa de uma célula de vertebrado, para tratar uma condição associada com um nìvel elevado de atividade de telomerase dentro de uma célula, para isolar um ácido nucleico selecionado de sequência desconhecida,para detectar um produto do gene de htrt em uma amostra e a presença de pelo menos uma célula humana positiva de telomerase em uma amostra biológica, kit para a detecção de um gene ou produto do gene de htrt, composições farmacológica e farmacêutica, vacina, proteìna htrt isolada, usos de um polinucleotìdeo, anticorpo e de um agente de aumento da expressão de htrt, proteìna, variante ou fragmento,e, uso de uma proteìna, polipeptìdeo ou fragmento uso dos mesmos.

Country Status (21)

Country Link
US (4) US6166178A (pt)
EP (6) EP1783139B8 (pt)
JP (7) JP2001510985A (pt)
KR (2) KR100530483B1 (pt)
CN (3) CN1254376A (pt)
AT (3) ATE245194T1 (pt)
AU (2) AU734089B2 (pt)
BR (3) BR9711844A (pt)
CA (3) CA2266752A1 (pt)
DE (5) DE69723531T3 (pt)
EA (2) EA199900355A1 (pt)
ES (1) ES2205132T5 (pt)
FI (1) FI990655A0 (pt)
FR (1) FR2757177A1 (pt)
GB (2) GB2321642B8 (pt)
HK (1) HK1156967A1 (pt)
IL (2) IL129103A0 (pt)
NO (2) NO319982B1 (pt)
NZ (1) NZ334709A (pt)
SG (1) SG94355A1 (pt)
WO (2) WO1998014592A2 (pt)

Families Citing this family (173)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5958680A (en) 1994-07-07 1999-09-28 Geron Corporation Mammalian telomerase
US6517834B1 (en) 1995-08-04 2003-02-11 Geron Corporation Purified telomerase
US6545133B1 (en) 1995-08-04 2003-04-08 Geron Corporation Methods for purifying telomerase
DE19681033D2 (de) 1995-11-16 1999-03-18 Michael W Dahm Verfahren zur Quantifizierung von Tumorzellen in einer Körperflüssigkeit und dazu geeignete Testkits
US6881571B1 (en) * 1998-03-11 2005-04-19 Exonhit Therapeutics S.A. Qualitative differential screening
US6607898B1 (en) 1996-03-26 2003-08-19 Oncomedx, Inc. Method for detection of hTR and hTERT telomerase-associated RNA in plasma or serum
US6093809A (en) 1996-10-01 2000-07-25 University Technology Corporation Telomerase
US6475789B1 (en) 1996-10-01 2002-11-05 University Technology Corporation Human telomerase catalytic subunit: diagnostic and therapeutic methods
US6610839B1 (en) 1997-08-14 2003-08-26 Geron Corporation Promoter for telomerase reverse transcriptase
EP1783139B8 (en) 1996-10-01 2009-09-23 Geron Corporation Human telomerase catalytic subunit
US6261836B1 (en) 1996-10-01 2001-07-17 Geron Corporation Telomerase
US7585622B1 (en) 1996-10-01 2009-09-08 Geron Corporation Increasing the proliferative capacity of cells using telomerase reverse transcriptase
US6777203B1 (en) 1997-11-19 2004-08-17 Geron Corporation Telomerase promoter driving expression of therapeutic gene sequences
US6808880B2 (en) 1996-10-01 2004-10-26 Geron Corporation Method for detecting polynucleotides encoding telomerase
US6444650B1 (en) * 1996-10-01 2002-09-03 Geron Corporation Antisense compositions for detecting and inhibiting telomerase reverse transcriptase
US7390891B1 (en) 1996-11-15 2008-06-24 Amgen Inc. Polynucleotides encoding a telomerase component TP2
JP2001507570A (ja) * 1996-11-26 2001-06-12 バイラー・カレッジ・オブ・メディスン 染色体末端へのテロメラーゼのアクセスを阻害する阻害剤の同定
WO1998037181A2 (en) * 1997-02-20 1998-08-27 Whitehead Institute For Biomedical Research Telomerase catalytic subunit gene and encoded protein
US7413864B2 (en) 1997-04-18 2008-08-19 Geron Corporation Treating cancer using a telomerase vaccine
US7622549B2 (en) 1997-04-18 2009-11-24 Geron Corporation Human telomerase reverse transcriptase polypeptides
US20050013825A1 (en) * 1997-04-18 2005-01-20 Geron Corporation Vaccine containing the catalytic subunit of telomerase for treating cancer
WO1998059040A2 (de) * 1997-06-20 1998-12-30 Bayer Aktiengesellschaft Humane katalytische telomerase-untereinheit und deren diagnostische und therapeutische verwendung
CN1270634A (zh) 1997-07-01 2000-10-18 卡姆比亚生物系统有限责任公司 脊椎动物端粒酶基因和蛋白质及其用途
EP1571215A3 (en) * 1997-07-01 2007-10-31 Cambia Biosystems LLC Vertebrate telomerase genes and proteins and uses thereof
US7378244B2 (en) 1997-10-01 2008-05-27 Geron Corporation Telomerase promoters sequences for screening telomerase modulators
WO1999027113A1 (en) * 1997-11-26 1999-06-03 Geron Corporation Mouse telomerase reverse transcriptase
DE19757984A1 (de) * 1997-12-24 1999-07-01 Bayer Ag Regulatorische DNA-Sequenzen aus der 5'-Region vom Gen der humanen katalytischen Telomerase-Untereinheit udn deren diagnostische und therapeutische Verwendung
DE19804372A1 (de) * 1998-02-04 1999-08-05 Michael W Dr Dr Dahm Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Tumorzellen in einer Körperflüssigkeit und dazu geeignete Testkits
US6639057B1 (en) * 1998-03-26 2003-10-28 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Monoclonal antibody against human telomerase catalytic subunit
US6337200B1 (en) * 1998-03-31 2002-01-08 Geron Corporation Human telomerase catalytic subunit variants
JP2002509716A (ja) 1998-03-31 2002-04-02 ユニバーシティ テクノロジー コーポレイション テロメラーゼ抗原に対する免疫応答を惹起するための方法および組成物
US7402307B2 (en) 1998-03-31 2008-07-22 Geron Corporation Method for identifying and killing cancer cells
US20030105315A1 (en) * 1998-04-09 2003-06-05 Metagen Pharmaceuticals Gmbh Human nucleic acid sequences from ovarian tumor tissue
US7030211B1 (en) * 1998-07-08 2006-04-18 Gemvax As Antigenic peptides derived from telomerase
US6900049B2 (en) 1998-09-10 2005-05-31 Cell Genesys, Inc. Adenovirus vectors containing cell status-specific response elements and methods of use thereof
US6667176B1 (en) 2000-01-11 2003-12-23 Geron Corporation cDNA libraries reflecting gene expression during growth and differentiation of human pluripotent stem cells
AU1331100A (en) 1998-10-29 2000-05-22 Dana-Farber Cancer Institute Cancer immunotheraphy and diagnosis using universal tumor associated antigens, including htert
GB9900298D0 (en) * 1999-01-07 1999-02-24 Medical Res Council Optical sorting method
WO2000043501A2 (de) * 1999-01-22 2000-07-27 Humboldt-Universität Zu Berlin Universitätsklinikum Charite GEGEN DIE KATALYTISCHE UNTEREINHEIT DER HUMANEN TELOMERASE (hTERT) GERICHTETE RIBOZYME
DK1147181T3 (da) * 1999-02-04 2004-09-20 Geron Corp Telomerase revers transkriptase transskriptionelle regulatoriske sekvenser
US7960540B2 (en) 1999-04-08 2011-06-14 Advanced Cancer Therapeutics, Llc Antiproliferative activity of G-rich oligonucleotides and method of using same to bind to nucleolin
CA2370000A1 (en) 1999-04-08 2000-10-19 Uab Research Foundation Antiproliferative activity of g-righ oligonucleotides and method of using same to bind to nucleolin
US8114850B2 (en) 1999-04-08 2012-02-14 Advanced Cancer Therapeutics, Llc Antiproliferative activity of G-rich oligonucleotides and method of using same to bind to nucleolin
AU781376B2 (en) * 1999-04-09 2005-05-19 Biomira Inc. Telomerase-specific cancer vaccine
US6358739B1 (en) * 1999-04-12 2002-03-19 Modex Therapeutiques, S.A. Transiently immortalized cells
DE19916929A1 (de) * 1999-04-15 2000-10-19 Bayer Ag Ein automatisierbarer Schnelltest zum Nachweis von Krebserkrankungen auf der Basis von Telomerase(hTC) mRNA mit spezifischen Primern und Sonden
US6995145B1 (en) 1999-06-04 2006-02-07 Au Jessie L-S Methods and compositions for modulating drug activity through telomere damage
US20050255596A1 (en) * 1999-09-07 2005-11-17 West Michael D Methods of repairing tandemly repeated DNA sequences and extending cell life-span nuclear transfer
KR100858465B1 (ko) 1999-09-10 2008-09-16 제론 코포레이션 올리고뉴클레오티드 엔3'→피5' 티오포스포라미데이트,이의 합성 및 용도
FR2798673B1 (fr) * 1999-09-16 2004-05-28 Exonhit Therapeutics Sa Methodes et compositions pour la detection d'evenements pathologiques
US6399384B1 (en) 1999-09-17 2002-06-04 Reneuron Limited Conditional immortalization of cells
AU1309101A (en) * 1999-11-16 2001-05-30 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Method of searching for substance inhibiting binding between telomerase subunits
GB9927353D0 (en) * 1999-11-19 2000-01-19 Cantab Pharma Res Virus preparation and use
US6664046B1 (en) * 1999-12-16 2003-12-16 Roche Molecular Systems, Inc. Quantitation of hTERT mRNA expression
KR20010096991A (ko) * 2000-04-19 2001-11-08 임정빈 텔로머레이즈의 프로모터에 특정하게 결합하는더블유티이1 절편, 그 유전자, 발현벡터 및 그것을 이용한세포성장 억제 방법
US6458589B1 (en) 2000-04-27 2002-10-01 Geron Corporation Hepatocyte lineage cells derived from pluripotent stem cells
IT1318504B1 (it) * 2000-05-08 2003-08-27 Talent Srl Metodo e apparecchiatura per la diagnosi precoce di tumori vescicalisu campioni di urina.
US6331399B1 (en) 2000-05-16 2001-12-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of tert expression
US6492171B2 (en) * 2000-05-16 2002-12-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of TERT expression
US7250294B2 (en) 2000-05-17 2007-07-31 Geron Corporation Screening small molecule drugs using neural cells differentiated from human embryonic stem cells
EP1158055A1 (fr) 2000-05-26 2001-11-28 Xu Qi University of Teaxs Laboratoire de Leucémie Chen Méthode pour le diagnostic de cancers
US7078491B1 (en) 2000-09-21 2006-07-18 Amgen Inc. Selective binding agents of telomerase
US6576464B2 (en) 2000-11-27 2003-06-10 Geron Corporation Methods for providing differentiated stem cells
AU2002235141A1 (en) 2000-11-27 2002-06-03 Geron Corporation Glycosyltransferase vectors for treating cancer
WO2002048319A1 (en) * 2000-12-14 2002-06-20 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Telomerase immortalized human liver cell lines
US6906237B2 (en) * 2001-02-27 2005-06-14 G. Scott Herron Vivo assay for anti angiogenic compounds
US20040063922A1 (en) * 2001-04-17 2004-04-01 Conrad Charles A. Methods and compositions for catalytic DNA exchange in a sequence specific manner
WO2002091999A2 (en) * 2001-05-09 2002-11-21 Geron Corporation Treatment for wounds
GB0112342D0 (en) * 2001-05-21 2001-07-11 Norsk Hydro As Polypeptides
WO2003008577A1 (fr) * 2001-07-16 2003-01-30 Fuyuki Ishikawa Nouvelles cellules transformees, methode de criblage d'agent anti-vieillissement et agents anti-vieillissement
US7150989B2 (en) * 2001-08-10 2006-12-19 Cornell Research Foundation, Inc. Telomerase immortalized neural progenitor cells
AUPR769701A0 (en) * 2001-09-14 2001-10-11 Li, He Telomerase inhibitory peptides and uses thereof
WO2003035884A2 (de) * 2001-10-18 2003-05-01 Heart Biosystems Gmbh Transiente immortalisierung von zellen durch onkogenproteine oder telomerproteine
CA2466732A1 (en) * 2001-10-22 2003-05-01 University Of Rochester Telomerase interference
JPWO2003038076A1 (ja) * 2001-10-31 2005-02-24 株式会社レノメディクス研究所 不死化間葉系細胞及びその利用
CN102008503B (zh) 2001-12-07 2018-10-09 阿斯特利亚斯生物治疗股份公司 人胚胎干细胞衍生的造血细胞
GB2415432B (en) 2001-12-07 2006-09-06 Geron Corp Islet cells from human embryonic stem cells
DE10163130B4 (de) * 2001-12-20 2009-05-14 Cyto Tools Gmbh Apoptotisch wirksame Peptide und diese umfassende pharmazeutische Zusammensetzungen
WO2003054545A1 (fr) * 2001-12-21 2003-07-03 Mitsubishi Kagaku Iatron, Inc. Procede permettant de detecter un anticorps anti-telomerase
GB0200929D0 (en) * 2002-01-16 2002-03-06 Univ Glasgow Tissue rejection
EP1474522B1 (en) * 2002-01-18 2012-03-07 Morphotek, Inc. A method for generating engineered cells for locus specific gene regulation and analysis
US20030175961A1 (en) * 2002-02-26 2003-09-18 Herron G. Scott Immortal micorvascular endothelial cells and uses thereof
US20050106729A1 (en) * 2002-05-03 2005-05-19 Mark Irvin Rosenblatt Gene transfer methods and compositions
AU2003239901A1 (en) * 2002-05-28 2003-12-12 Kathy M. Ensrud Crisp polypeptides as contraceptives and inhibitors of sperm capacitation
US7294708B2 (en) * 2002-05-31 2007-11-13 Beijing Institute Of Biotechnology Telomerase reverse transcriptase fragments and uses thereof
US7262025B2 (en) * 2002-06-18 2007-08-28 Zymogenetics, Inc. Hybrid vector having a cytomegalovirus enhancer and myeloproliferative sarcoma virus promoter
US7285415B2 (en) 2002-07-11 2007-10-23 The Regents Of The University Of California Oligodendrocytes derived from human embryonic stem cells for remyelination and treatment of spinal cord injury
AU2003290689A1 (en) 2002-11-08 2004-06-03 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Transgenic ungulates having reduced prion protein activity and uses thereof
US7166692B2 (en) 2003-03-04 2007-01-23 Canbrex Bio Science Walkersville, Inc. Intracellular delivery of small molecules, proteins, and nucleic acids
US8771982B2 (en) * 2003-04-30 2014-07-08 Duke University Chimeric molecule and nucleic acid encoding same
BRPI0411856A (pt) 2003-06-23 2006-08-29 Geron Corp composições e métodos para o aumento da atividade de telomerase
AU2004272340B2 (en) * 2003-09-12 2008-01-03 Dana Farber Cancer Institute Immortalisation of mammalian cells and therapeutic applications of said cells
EP1522858A1 (en) * 2003-10-10 2005-04-13 Jean-Christophe Roegel Methods for selecting compounds using antibodies with activity as agonist, antagonist or allosteric modulators
US7473418B2 (en) 2004-03-25 2009-01-06 Cell Genesys, Inc. Pan cancer oncolytic vectors and methods of use thereof
US7420099B2 (en) 2004-04-22 2008-09-02 Kirin Holdings Kabushiki Kaisha Transgenic animals and uses thereof
EP1745144B1 (en) 2004-05-11 2010-12-01 Axiogenesis Ag Assay for drug discovery based on in vitro differentiated cells
AU2005285483A1 (en) * 2004-08-05 2006-03-23 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and compositions for cell activation
US8697139B2 (en) 2004-09-21 2014-04-15 Frank M. Phillips Method of intervertebral disc treatment using articular chondrocyte cells
JP2006242618A (ja) * 2005-03-01 2006-09-14 Univ Of Tokyo 組織ｆｉｓｈ法によるテロメア量を指標とした癌の診断
JP4635196B2 (ja) * 2005-03-04 2011-02-16 国立大学法人広島大学 遺伝子導入細胞、及びそれを用いたテロメラーゼ誘導物質の検出方法
RU2007137122A (ru) * 2005-03-09 2009-04-20 Борд Оф Риджентс, Дзе Юниверсити Оф Техас Систем (Us) НОВЫЙ ПРОМОТОР hTMC И ВЕКТОРЫ ДЛЯ ОПУХОЛЕСЕЛЕКТИВНОЙ И ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЭКСПРЕССИИ ТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ ПРОТИВОРАКОВЫХ ГЕНОВ
US20090305236A1 (en) * 2005-05-11 2009-12-10 Genetic Technologies Limited Methods of enriching fetal cells
EP1748067A1 (en) * 2005-07-29 2007-01-31 Institut Pasteur Polynucleotides encoding MHC class I-restricted hTERT epitopes, analogues thereof or polyepitopes
DK2281875T3 (en) 2005-12-21 2018-06-06 Univ Catholique Louvain Isolated liver stem cells
US8415153B2 (en) 2006-06-19 2013-04-09 Geron Corporation Differentiation and enrichment of islet-like cells from human pluripotent stem cells
US20080131442A1 (en) * 2006-06-26 2008-06-05 Science Applications International Corporation IgY antibodies to human telomerase reverse transcriptase
WO2008002285A1 (en) * 2006-06-26 2008-01-03 Science Applications International Corporation Igy antibodies to human telomerase reverse transcriptase
AU2013203229C1 (en) * 2006-07-28 2015-10-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Improved vaccines and methods for using the same
CN105132439A (zh) 2006-07-28 2015-12-09 宾夕法尼亚大学托管会 改进的疫苗及其使用方法
BRPI0719865A2 (pt) 2006-10-12 2016-03-15 Angeletti P Ist Richerche Bio molécula de ácido nucleico, proteína de fusão purificada, vetor, célula hospedeira, processo para expressar uma proteína de fusão, e, método para tratar um paciente sofrendo de ou predisposto a um câncer
EP3255061B1 (en) 2006-11-03 2021-06-16 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Selective immunodepletion of endogenous stem cell niche for engraftment
EP1994942A1 (en) * 2007-05-25 2008-11-26 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Pharmaceutical compositions comprising telomerase, and uses thereof
ES2751997T3 (es) 2008-01-14 2020-04-02 Conventus Orthopaedics Inc Aparato de reparación de fracturas
US9782565B2 (en) 2008-10-01 2017-10-10 Covidien Lp Endoscopic ultrasound-guided biliary access system
US9186128B2 (en) 2008-10-01 2015-11-17 Covidien Lp Needle biopsy device
US11298113B2 (en) 2008-10-01 2022-04-12 Covidien Lp Device for needle biopsy with integrated needle protection
US8968210B2 (en) 2008-10-01 2015-03-03 Covidien LLP Device for needle biopsy with integrated needle protection
US9332973B2 (en) 2008-10-01 2016-05-10 Covidien Lp Needle biopsy device with exchangeable needle and integrated needle protection
WO2010121294A1 (en) 2009-04-21 2010-10-28 Genetic Technologies Limited Methods for obtaining fetal genetic material
MX338100B (es) * 2009-07-09 2016-04-01 Janssen Biotech Inc Celulas derivadas de tejido cardiaco.
EP2523614A4 (en) 2010-01-15 2017-02-15 Conventus Orthopaedics, Inc. Rotary-rigid orthopaedic rod
WO2011091052A1 (en) 2010-01-20 2011-07-28 Kyle Taylor Apparatus and methods for bone access and cavity preparation
SI2536830T1 (sl) 2010-02-16 2019-12-31 Ultimovacs As Polipeptidi
US9249452B2 (en) * 2010-02-26 2016-02-02 Zhu Zhen Pirot Method of detecting and assaying telomerase activity of telomerase bound by anti-telomerase antibodies
JP2013521880A (ja) 2010-03-08 2013-06-13 コンベンタス オーソピディックス， インコーポレイテッド 骨インプラントを固定するための装置および方法
AU2011236653B2 (en) 2010-04-08 2016-10-27 The University Court Of The University Of Edinburgh Chondrogenic progenitor cells, protocol for derivation of cells and uses thereof
WO2012026309A1 (ja) * 2010-08-23 2012-03-01 公立大学法人横浜市立大学 抗ｐａｄ４抗体医薬の創成
CN102093980B (zh) * 2010-12-10 2013-04-17 梁伟国 永生化人椎间盘髓核细胞体系的制备方法
US8420617B2 (en) * 2011-03-11 2013-04-16 Biocell Laboratories Multiantivirus compound, composition and method for treatment of virus diseases
CN102676518B (zh) * 2012-02-27 2013-09-18 华侨大学 一种新型抗肿瘤amiRNA序列及其应用
EP2639299A1 (en) 2012-03-16 2013-09-18 Invectys Universal cancer peptides derived from telomerase
WO2013169077A1 (ko) * 2012-05-11 2013-11-14 주식회사 카엘젬백스 악액질 예방 또는 치료용 조성물
KR102578891B1 (ko) * 2012-05-11 2023-09-15 주식회사 젬백스앤카엘 항염증 활성을 갖는 펩티드 및 이를 포함하는 조성물
BR112014032677A2 (pt) * 2012-06-27 2019-01-15 Univ Rutgers ensaios rápido para ativação de célula t por medições de rna usando citometria de fluxo
US20150125438A1 (en) * 2012-07-20 2015-05-07 Sang Jae Kim Anti-Inflammatory Peptides and Composition Comprising the Same
KR102038487B1 (ko) 2012-09-19 2019-10-30 주식회사 젬백스앤카엘 텔로머라제 펩티드를 포함하는 항균 또는 항진균용 조성물
WO2014046481A1 (ko) * 2012-09-19 2014-03-27 주식회사 카엘젬백스 세포 투과성 펩티드, 그를 포함한 컨쥬게이트 및 그를 포함한 조성물
ES2802253T3 (es) * 2012-09-19 2021-01-18 Gemvax & Kael Co Ltd Péptido de penetración celular, conjugado que comprende el mismo y composición que comprende el conjugado
KR102166542B1 (ko) 2012-09-28 2020-10-16 주식회사 젬백스앤카엘 줄기세포 검출을 위한 텔로머라제 유래 펩티드 및 조영물질의 컨쥬게이트 및 이를 포함하는 조영제
KR102093093B1 (ko) 2012-12-13 2020-03-25 주식회사 젬백스앤카엘 피부 노화 개선용 조성물
KR102106756B1 (ko) 2012-12-13 2020-05-06 주식회사 젬백스앤카엘 자외선에 의한 피부 손상 예방 또는 치료용 조성물
EP3988112A1 (en) 2013-02-22 2022-04-27 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Methods relating to telomere extension
US10138488B2 (en) 2013-03-28 2018-11-27 Invectys Cancer vaccine for dogs
AU2014242915B2 (en) 2013-03-28 2018-08-09 Invectys A cancer vaccine for cats
MX2015017103A (es) 2013-06-11 2016-11-07 Harvard College Celulas beta derivadas de células madre ( sc-beta ) y composiciones y métodos para generarlas.
JP6601915B2 (ja) 2013-10-28 2019-11-06 アンヴェクティ 皮膚細胞への電気的遺伝子導入
PL3062824T3 (pl) 2013-10-28 2020-06-15 Invectys Szczepionka zawierająca dna kodujący telomerazę
EP2871235A1 (en) 2013-11-07 2015-05-13 Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) New methods to produce active hTERT
US10022132B2 (en) 2013-12-12 2018-07-17 Conventus Orthopaedics, Inc. Tissue displacement tools and methods
KR102166549B1 (ko) 2014-01-10 2020-10-16 주식회사 젬백스앤카엘 혈뇌장벽 투과성 펩티드 및 이를 포함하는 컨쥬게이트
EP3822364B1 (en) 2014-08-26 2023-05-10 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Engraftment of stem cells with a combination of an agent that targets stem cells and modulation of immunoregulatory signaling
EP3370764A4 (en) 2015-11-05 2019-07-17 The Regents of The University of California CELLS MARKED BY LIPID CONJUGATES AND METHODS OF USING THE SAME
JP6820935B2 (ja) 2016-01-19 2021-01-27 ファイザー・インク がんワクチン
IL267912B2 (en) 2017-01-30 2023-09-01 Univ Leland Stanford Junior A genotoxic matching regimen for stem cell transplantation
US10631881B2 (en) 2017-03-09 2020-04-28 Flower Orthopedics Corporation Plating depth gauge and countersink instrument
US11351246B2 (en) 2017-05-09 2022-06-07 Invectys SAS Recombinant measles vaccine expressing hTERT
US10918426B2 (en) 2017-07-04 2021-02-16 Conventus Orthopaedics, Inc. Apparatus and methods for treatment of a bone
WO2019070740A2 (en) 2017-10-02 2019-04-11 Fred Hutchinson Cancer Research Center LUTENING HORMONE RECEPTOR BINDING AGENTS AND LUTINISING HORMONE AGONISTS FOR IDENTIFICATION, MULTIPLICATION, REMOVAL AND MODIFICATION OF PRIMITIVE STEM CELL POPULATIONS
CN108715863B (zh) * 2018-05-30 2020-09-11 吉林大学 一种肿瘤靶向性载体pcTERT及其构建方法及其应用
CN110827920B (zh) * 2018-08-14 2022-11-22 武汉华大医学检验所有限公司 测序数据分析方法和设备及高通量测序方法
SG11202102255VA (en) * 2018-09-05 2021-04-29 Readcoor Llc Methods and systems for therapeutic agent analysis
KR20210057024A (ko) * 2018-09-06 2021-05-20 더 보드 오브 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 텔로머라제 완전효소 복합체 및 이의 사용 방법
WO2020076976A1 (en) 2018-10-10 2020-04-16 Readcoor, Inc. Three-dimensional spatial molecular indexing
CN109545039A (zh) * 2019-01-15 2019-03-29 苏州大学 一种核孔复合体结构模型教具及其使用方法
AU2020311877B2 (en) 2019-07-05 2024-01-04 Case Western Reserve University Priming media and methods for stem cell culture and therapy
JP2021151979A (ja) * 2020-03-24 2021-09-30 均 石井 再生医療薬
CN116870195A (zh) * 2020-09-22 2023-10-13 浙江愈方生物科技有限公司 一种灭活性端粒酶、具有其的腺病毒和人造mRNA及应用
JP2022119144A (ja) * 2021-02-03 2022-08-16 均 石井 パーキンソン病治療薬
JP2022151412A (ja) * 2021-03-23 2022-10-07 均 石井 脳卒中治療薬
CN113355303B (zh) * 2021-06-07 2023-06-16 中元汇吉生物技术股份有限公司 一种m-mlv逆转录酶突变体及其应用
WO2023141534A1 (en) * 2022-01-19 2023-07-27 Northwestern University Agents that target telomerase reverse transcriptase (tert) for treating cancer and sensitizing cancer cells to genotoxic therapy
CN114920802B (zh) * 2022-05-16 2023-05-23 中国地质大学（武汉） 调节端粒酶限速蛋白运动的多肽探针及其复合物和方法
CN116364195B (zh) * 2023-05-10 2023-10-13 浙大城市学院 一种基于预训练模型的微生物遗传序列表型预测方法

Family Cites Families (149)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US912629A (en) 1908-08-29 1909-02-16 Conrad L Stueber Foundation-top for pipe-carriers.
NL154598B (nl) 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
US3817837A (en) 1971-05-14 1974-06-18 Syva Corp Enzyme amplification assay
US3939350A (en) 1974-04-29 1976-02-17 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Fluorescent immunoassay employing total reflection for activation
US3996345A (en) 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4277437A (en) 1978-04-05 1981-07-07 Syva Company Kit for carrying out chemically induced fluorescence immunoassay
US4275149A (en) 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4254082A (en) 1978-06-12 1981-03-03 Miles Laboratories, Inc. Specific binding-adsorbent assay test means
US4657760A (en) 1979-03-20 1987-04-14 Ortho Pharmaceutical Corporation Methods and compositions using monoclonal antibody to human T cells
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
JPS57502090A (pt) 1980-07-18 1982-11-25
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4366241A (en) 1980-08-07 1982-12-28 Syva Company Concentrating zone method in heterogeneous immunoassays
US4554101A (en) * 1981-01-09 1985-11-19 New York Blood Center, Inc. Identification and preparation of epitopes on antigens and allergens on the basis of hydrophilicity
US4517288A (en) 1981-01-23 1985-05-14 American Hospital Supply Corp. Solid phase system for ligand assay
US5055556A (en) 1981-10-06 1991-10-08 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. Univ. Fluorescent conjugates for analysis of molecules and cells
JPS58215453A (ja) 1982-06-09 1983-12-14 Toray Silicone Co Ltd 室温硬化後塗装可能なオルガノポリシロキサン組成物
NZ207394A (en) 1983-03-08 1987-03-06 Commw Serum Lab Commission Detecting or determining sequence of amino acids
FR2542494B1 (fr) 1983-03-08 1985-08-16 Sevylor International Combinaison protectrice, utilisable notamment en atmosphere irradiee
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5272065A (en) 1983-10-20 1993-12-21 Research Foundation Of State University Of New York Regulation of gene expression by employing translational inhibition of MRNA utilizing interfering complementary MRNA
US4946787A (en) 1985-01-07 1990-08-07 Syntex (U.S.A.) Inc. N-(ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US5049386A (en) 1985-01-07 1991-09-17 Syntex (U.S.A.) Inc. N-ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)Alk-1-YL-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US5206344A (en) 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
CA1291031C (en) 1985-12-23 1991-10-22 Nikolaas C.J. De Jaeger Method for the detection of specific binding agents and their correspondingbindable substances
GB8612087D0 (en) 1986-05-19 1986-06-25 Ici Plc Hybridisation probes
US5001225A (en) 1986-12-08 1991-03-19 Georgetown University Monoclonal antibodies to a pan-malarial antigen
US4889806A (en) 1987-04-15 1989-12-26 Washington University Large DNA cloning system based on yeast artificial chromosomes
US5017478A (en) 1987-07-16 1991-05-21 Berlex Laboratories, Inc. Transfected cells containing plasmids having genes oriented in opposing directions and methods of using
US5124246A (en) 1987-10-15 1992-06-23 Chiron Corporation Nucleic acid multimers and amplified nucleic acid hybridization assays using same
US5093245A (en) 1988-01-26 1992-03-03 Applied Biosystems Labeling by simultaneous ligation and restriction
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5075227A (en) * 1989-03-07 1991-12-24 Zymogenetics, Inc. Directional cloning
JPH02307059A (ja) 1989-05-23 1990-12-20 Seiko Instr Inc 反応容器
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5399493A (en) 1989-06-15 1995-03-21 The Regents Of The University Of Michigan Methods and compositions for the optimization of human hematopoietic progenitor cell cultures
US5437994A (en) 1989-06-15 1995-08-01 Regents Of The University Of Michigan Method for the ex vivo replication of stem cells, for the optimization of hematopoietic progenitor cell cultures, and for increasing the metabolism, GM-CSF secretion and/or IL-6 secretion of human stromal cells
US5464764A (en) 1989-08-22 1995-11-07 University Of Utah Research Foundation Positive-negative selection methods and vectors
US5545522A (en) 1989-09-22 1996-08-13 Van Gelder; Russell N. Process for amplifying a target polynucleotide sequence using a single primer-promoter complex
US5225212A (en) 1989-10-20 1993-07-06 Liposome Technology, Inc. Microreservoir liposome composition and method
EP0502976B1 (en) 1989-12-01 1996-07-03 Pharming B.V. Production of recombinant polypeptides by bovine species and transgenic methods
AU647741B2 (en) 1989-12-01 1994-03-31 Regents Of The University Of California, The Methods and compositions for chromosome-specific staining
US5272071A (en) 1989-12-22 1993-12-21 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Method for the modification of the expression characteristics of an endogenous gene of a given cell line
ES2151463T5 (es) 1989-12-22 2012-10-29 Merck Serono Sa Constructos de ADN para la activación y la modificación de la expresión de genes endógenos
EP0466874A1 (fr) 1990-02-09 1992-01-22 Asulab S.A. Micromoteur electrostatique a champ radial realise par microfabrication photolithographique et procede de realisation d'un tel micromoteur
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
WO1991017424A1 (en) 1990-05-03 1991-11-14 Vical, Inc. Intracellular delivery of biologically active substances by means of self-assembling lipid complexes
SE468913B (sv) 1990-05-16 1993-04-05 Igesto Ab Saekerhetskrok
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
ATE158021T1 (de) 1990-08-29 1997-09-15 Genpharm Int Produktion und nützung nicht-menschliche transgentiere zur produktion heterologe antikörper
IL99552A0 (en) 1990-09-28 1992-08-18 Ixsys Inc Compositions containing procaryotic cells,a kit for the preparation of vectors useful for the coexpression of two or more dna sequences and methods for the use thereof
KR100198659B1 (ko) 1996-05-16 1999-06-15 구본준 메모리 셀, 메모리 장치 및 그의 제조 방법
DE69216385T2 (de) 1991-10-11 1997-06-12 Promega Corp Gekoppelte transkription und translation in zellfreien eukaryoten-extrakten
US5641670A (en) 1991-11-05 1997-06-24 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
US6270989B1 (en) 1991-11-05 2001-08-07 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and delivery
PT101031B (pt) 1991-11-05 2002-07-31 Transkaryotic Therapies Inc Processo para o fornecimento de proteinas por terapia genetica
AU687736B2 (en) 1992-05-11 1998-03-05 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Method and reagent for inhibiting viral replication
US5645986A (en) 1992-05-13 1997-07-08 Board Of Reagents, The University Of Texas System Therapy and diagnosis of conditions related to telomere length and/or telomerase activity
US5639613A (en) 1992-05-13 1997-06-17 Board Of Regents, University Of Texas System Methods for cancer diagnosis and prognosis
US5648215A (en) 1992-05-13 1997-07-15 Board Of Regents, The University Of Texas System Telomerase diagnostic methods
US5489508A (en) * 1992-05-13 1996-02-06 University Of Texas System Board Of Regents Therapy and diagnosis of conditions related to telomere length and/or telomerase activity
US5629154A (en) 1993-11-12 1997-05-13 Geron Corporation Telomerase activity assays
AU4769893A (en) 1992-07-17 1994-02-14 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Method and reagent for treatment of animal diseases
US6107062A (en) 1992-07-30 2000-08-22 Inpax, Inc. Antisense viruses and antisense-ribozyme viruses
GB2273932A (en) 1992-11-24 1994-07-06 Stiefel Laboratories Stable oligonucleotides
US5674703A (en) 1992-12-02 1997-10-07 Woo; Savio L. C. Episomal vector systems and related methods
TW402639B (en) 1992-12-03 2000-08-21 Transkaryotic Therapies Inc Protein production and protein delivery
WO1994012649A2 (en) 1992-12-03 1994-06-09 Genzyme Corporation Gene therapy for cystic fibrosis
EP0686200A4 (en) 1993-01-27 1997-07-02 Oncor Inc AMPLIFICATION OF NUCLEIC ACID SEQUENCES
US6120764A (en) 1993-06-24 2000-09-19 Advec, Inc. Adenoviruses for control of gene expression
US6140087A (en) 1993-06-24 2000-10-31 Advec, Inc. Adenovirus vectors for gene therapy
US5919676A (en) 1993-06-24 1999-07-06 Advec, Inc. Adenoviral vector system comprising Cre-loxP recombination
WO1995013382A1 (en) * 1993-11-12 1995-05-18 Geron Corporation Therapy and diagnosis of conditions related to telomere length and/or telomerase activity
US5578832A (en) 1994-09-02 1996-11-26 Affymetrix, Inc. Method and apparatus for imaging a sample on a device
US5583016A (en) 1994-07-07 1996-12-10 Geron Corporation Mammalian telomerase
RO117328B1 (ro) * 1994-07-07 2002-01-30 Geron Corp Componenta rna a telomerazei de mamifere, plasmida recombinanta, de exprimare a acesteia, si metoda pentru detectarea prezentei unei stari neoplazice
US5597697A (en) 1994-09-30 1997-01-28 Diamond; Paul Screening assay for inhibitors and activators of RNA and DNA-dependent nucleic acid polymerases
US5698686A (en) * 1994-10-20 1997-12-16 Arch Development Corporation Yeast telomerase compositions
US5556752A (en) 1994-10-24 1996-09-17 Affymetrix, Inc. Surface-bound, unimolecular, double-stranded DNA
WO1996019580A2 (en) * 1994-12-19 1996-06-27 Cold Spring Harbor Laboratory Telomerase protein component
CA2221602A1 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Cold Spring Harbor Laboratory Essential oligonucleotides of vertebrate telomerase
WO1997015687A1 (en) 1995-06-07 1997-05-01 Geron Corporation Telomerase activity assays
US5722998A (en) 1995-06-07 1998-03-03 Intermedics, Inc. Apparatus and method for the control of an implantable medical device
US5741677A (en) 1995-06-07 1998-04-21 Geron Corporation Methods for measuring telomere length
US6545133B1 (en) 1995-08-04 2003-04-08 Geron Corporation Methods for purifying telomerase
US5968506A (en) 1995-08-04 1999-10-19 Geron Corporation Purified telomerase
WO1997006012A1 (en) 1995-08-04 1997-02-20 International Business Machines Corporation Stamp for a lithographic process
US6517834B1 (en) 1995-08-04 2003-02-11 Geron Corporation Purified telomerase
JPH09154575A (ja) 1995-10-04 1997-06-17 Soosei:Kk テロメラーゼ
JPH09164575A (ja) 1995-12-13 1997-06-24 Japan Steel Works Ltd:The 流れ模様を有する樹脂板の製造方法およびその装置
US6015710A (en) 1996-04-09 2000-01-18 The University Of Texas System Modulation of mammalian telomerase by peptide nucleic acids
US5853719A (en) 1996-04-30 1998-12-29 Duke University Methods for treating cancers and pathogen infections using antigen-presenting cells loaded with RNA
US5770422A (en) * 1996-07-08 1998-06-23 The Regents Of The University Of California Human telomerase
US5747317A (en) 1996-07-08 1998-05-05 Tularik Inc. Human telomerase RNA interacting protein gene
US5724021A (en) 1996-07-09 1998-03-03 Stephen C. Perrone Self-contained, programmable, time interval alarm reminder device for eyedrop medication administration and a means for affixing such to eyedrop/medication container
WO1998007838A1 (fr) 1996-08-21 1998-02-26 Mitsubishi Chemical Corporation Proteine de telomerase d'animaux superieurs et gene codant pour elle
AU4030697A (en) 1996-08-28 1998-03-19 Shonen Yoshida Proteins having telomerase activity
DE19638482A1 (de) 1996-09-20 1998-04-02 Bosch Gmbh Robert Verfahren zur Auswahl einer Sendefrequenz
US6093809A (en) 1996-10-01 2000-07-25 University Technology Corporation Telomerase
US6475789B1 (en) 1996-10-01 2002-11-05 University Technology Corporation Human telomerase catalytic subunit: diagnostic and therapeutic methods
US6261836B1 (en) 1996-10-01 2001-07-17 Geron Corporation Telomerase
US6610839B1 (en) 1997-08-14 2003-08-26 Geron Corporation Promoter for telomerase reverse transcriptase
US6777203B1 (en) 1997-11-19 2004-08-17 Geron Corporation Telomerase promoter driving expression of therapeutic gene sequences
EP1783139B8 (en) 1996-10-01 2009-09-23 Geron Corporation Human telomerase catalytic subunit
US6767719B1 (en) 1997-11-26 2004-07-27 Geron Corporation Mouse telomerase reverse transcriptase
US6444650B1 (en) 1996-10-01 2002-09-03 Geron Corporation Antisense compositions for detecting and inhibiting telomerase reverse transcriptase
US7585622B1 (en) 1996-10-01 2009-09-08 Geron Corporation Increasing the proliferative capacity of cells using telomerase reverse transcriptase
US6808880B2 (en) 1996-10-01 2004-10-26 Geron Corporation Method for detecting polynucleotides encoding telomerase
US5890326A (en) 1996-11-06 1999-04-06 Hill-Rom, Inc. Head wall for a hospital room
US5919656A (en) 1996-11-15 1999-07-06 Amgen Canada Inc. Genes encoding telomerase protein 1
US7390891B1 (en) * 1996-11-15 2008-06-24 Amgen Inc. Polynucleotides encoding a telomerase component TP2
JP2001507570A (ja) 1996-11-26 2001-06-12 バイラー・カレッジ・オブ・メディスン 染色体末端へのテロメラーゼのアクセスを阻害する阻害剤の同定
WO1998037181A2 (en) * 1997-02-20 1998-08-27 Whitehead Institute For Biomedical Research Telomerase catalytic subunit gene and encoded protein
US6617119B2 (en) 1997-02-21 2003-09-09 The Regents Of The University Of California Assay for specific strains of multiple disease related conformations of a protein
DE69725018T2 (de) * 1997-04-04 2004-06-09 Geron Corp., Menlo Park Gereinigte telomerase
US6485789B1 (en) 1997-04-14 2002-11-26 3M Innovative Properties Company Fluorochemical composition containing a condensation product of a fluorochemical polyether and a poly-isocyanate to impart stain release properties to a substrate
US7622549B2 (en) 1997-04-18 2009-11-24 Geron Corporation Human telomerase reverse transcriptase polypeptides
US7413864B2 (en) 1997-04-18 2008-08-19 Geron Corporation Treating cancer using a telomerase vaccine
US20050013825A1 (en) 1997-04-18 2005-01-20 Geron Corporation Vaccine containing the catalytic subunit of telomerase for treating cancer
US6201830B1 (en) 1997-06-11 2001-03-13 Texas Instruments Incorporated Low computation idle transmission method for DSL modems
WO1998059040A2 (de) * 1997-06-20 1998-12-30 Bayer Aktiengesellschaft Humane katalytische telomerase-untereinheit und deren diagnostische und therapeutische verwendung
CN1270634A (zh) 1997-07-01 2000-10-18 卡姆比亚生物系统有限责任公司 脊椎动物端粒酶基因和蛋白质及其用途
US7378244B2 (en) 1997-10-01 2008-05-27 Geron Corporation Telomerase promoters sequences for screening telomerase modulators
WO1999027113A1 (en) 1997-11-26 1999-06-03 Geron Corporation Mouse telomerase reverse transcriptase
DE19757984A1 (de) 1997-12-24 1999-07-01 Bayer Ag Regulatorische DNA-Sequenzen aus der 5'-Region vom Gen der humanen katalytischen Telomerase-Untereinheit udn deren diagnostische und therapeutische Verwendung
AU1785099A (en) 1998-01-08 1999-07-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Novel gene having reverse transcriptase motif
GB9801902D0 (en) 1998-01-29 1998-03-25 Cancer Res Campaign Tech A gene promoter
JP2002509716A (ja) 1998-03-31 2002-04-02 ユニバーシティ テクノロジー コーポレイション テロメラーゼ抗原に対する免疫応答を惹起するための方法および組成物
US6337200B1 (en) * 1998-03-31 2002-01-08 Geron Corporation Human telomerase catalytic subunit variants
US7402307B2 (en) 1998-03-31 2008-07-22 Geron Corporation Method for identifying and killing cancer cells
EP1085892A4 (en) 1998-06-12 2002-07-17 Sloan Kettering Inst Cancer VACCINE STRATEGY FOR THE PREVENTION AND TREATMENT OF CANCER
US7030211B1 (en) 1998-07-08 2006-04-18 Gemvax As Antigenic peptides derived from telomerase
DK1147181T3 (da) 1999-02-04 2004-09-20 Geron Corp Telomerase revers transkriptase transskriptionelle regulatoriske sekvenser
AU781376B2 (en) 1999-04-09 2005-05-19 Biomira Inc. Telomerase-specific cancer vaccine
WO2000073420A2 (en) 1999-06-02 2000-12-07 Whitehead Institute For Biomedical Research Creation of human tumorigenic cells and uses therefor
US6354941B2 (en) 1999-11-03 2002-03-12 516 Holdings Electronic system for a game of chance
AU2001241533A1 (en) 2000-02-15 2001-08-27 The Regents Of The University Of California A universal vaccine and method for treating cancer employing telomerase reverse transcriptase
WO2002091999A2 (en) 2001-05-09 2002-11-21 Geron Corporation Treatment for wounds
JP2002348474A (ja) 2001-05-23 2002-12-04 Dow Corning Toray Silicone Co Ltd ポリオルガノシロキサンマイクロエマルジョン組成物および化粧料原料
US20030143228A1 (en) 2001-10-29 2003-07-31 Baylor College Of Medicine Human telomerase reverse transcriptase as a class-II restricted tumor-associated antigen
US7294708B2 (en) 2002-05-31 2007-11-13 Beijing Institute Of Biotechnology Telomerase reverse transcriptase fragments and uses thereof
KR100705868B1 (ko) 2003-05-06 2007-04-10 후지 덴키 디바이스 테크놀로지 가부시키가이샤 반도체 장치 및 그 제조 방법

Also Published As

Publication number Publication date
GB9804859D0 (en) 1998-04-29
GB9720890D0 (en) 1997-12-03
EP0932686A2 (en) 1999-08-04
EP0841396B1 (en) 2003-07-16
KR100530483B1 (ko) 2006-01-09
CN1291231B (zh) 2010-06-02
DE19743497A1 (de) 1998-08-20
JPH10234384A (ja) 1998-09-08
GB2321642B8 (en) 2006-08-22
ES2205132T3 (es) 2004-05-01
CA2267664C (en) 2013-06-11
FI990655A (fi) 1999-03-24
ES2205132T5 (es) 2012-06-18
US20090269739A1 (en) 2009-10-29
NO20053120L (no) 1998-04-02
NO319982B1 (no) 2005-10-10
GB2321642B (en) 2000-02-09
EA199900355A1 (ru) 2000-08-28
EA199900349A1 (ru) 2000-06-26
EP0841396B2 (en) 2012-04-11
KR20000048820A (ko) 2000-07-25
WO1998014593A3 (en) 1999-02-18
DE841396T1 (de) 1998-09-24
JP2001523947A (ja) 2001-11-27
AU734089B2 (en) 2001-06-07
AU4807397A (en) 1998-04-24
EP1333094A3 (en) 2005-02-09
DE69739497D1 (de) 2009-08-27
EP1783139A2 (en) 2007-05-09
BR9711844A (pt) 2000-01-18
US7517971B1 (en) 2009-04-14
CN102021153B (zh) 2016-05-25
EP1783139B1 (en) 2009-07-15
SG94355A1 (en) 2003-02-18
WO1998014592A2 (en) 1998-04-09
JP3869092B2 (ja) 2007-01-17
WO1998014593A2 (en) 1998-04-09
NO991588D0 (no) 1999-03-31
NO991588L (no) 1999-05-31
EP1333094B1 (en) 2012-04-04
BR9712254A (pt) 2000-01-18
EP1783139B8 (en) 2009-09-23
CN1254376A (zh) 2000-05-24
HK1156967A1 (zh) 2012-06-22
CN1291231A (zh) 2001-04-11
DE69739675D1 (de) 2010-01-07
EP1783139A3 (en) 2007-05-23
JPH11313689A (ja) 1999-11-16
CA2267664A1 (en) 1998-04-09
DE69723531T2 (de) 2004-05-27
CN102021153A (zh) 2011-04-20
CA2266752A1 (en) 1998-04-09
CA2645721A1 (en) 1998-04-09
NZ334709A (en) 2001-06-29
GB2317891A (en) 1998-04-08
FR2757177A1 (fr) 1998-06-19
JPH11253177A (ja) 1999-09-21
KR20000048839A (ko) 2000-07-25
JP4070331B2 (ja) 2008-04-02
ATE552341T1 (de) 2012-04-15
JP2001081042A (ja) 2001-03-27
FI990655A0 (fi) 1999-03-24
GB2317891B (en) 1998-08-19
IL129222A0 (en) 2000-02-17
JP4852576B2 (ja) 2012-01-11
US6617110B1 (en) 2003-09-09
EP0954585B1 (en) 2009-11-25
CA2645721C (en) 2015-05-12
NO20053120D0 (no) 2005-06-24
US8222392B2 (en) 2012-07-17
AU4803697A (en) 1998-04-24
JP2001510985A (ja) 2001-08-07
WO1998014593A9 (en) 1999-05-14
GB2317891C (en) 2015-06-24
DE69723531D1 (de) 2003-08-21
EP1333094A2 (en) 2003-08-06
GB2321642A (en) 1998-08-05
ATE449851T1 (de) 2009-12-15
JP2009040779A (ja) 2009-02-26
IL129103A0 (en) 2000-02-17
EP0841396A1 (en) 1998-05-13
WO1998014592A3 (en) 1999-04-01
US6166178A (en) 2000-12-26
EP2213740A1 (en) 2010-08-04
ATE245194T1 (de) 2003-08-15
NO332085B1 (no) 2012-06-18
DE69723531T3 (de) 2012-09-06
EP0954585A2 (en) 1999-11-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2205132T5 (es) Subunidad catalítica de la telomerasa humana
US7199234B2 (en) Regulatory segments of the human gene for telomerase reverse transcriptase
US7195911B2 (en) Mammalian cells that have increased proliferative capacity
US7750121B2 (en) Antibody to telomerase reverse transcriptive
US8709995B2 (en) Method for eliciting an immune response to human telomerase reverse transcriptase
US7413864B2 (en) Treating cancer using a telomerase vaccine
US20050013825A1 (en) Vaccine containing the catalytic subunit of telomerase for treating cancer
AU763956B2 (en) Promoter for human telomerase reverse transcriptase
NZ510761A (en) Human telomerase promoter and in vitro use is described