JP2001081042A - ヒトテロメラーゼ触媒性サブユニット - Google Patents

ヒトテロメラーゼ触媒性サブユニット

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTRT）、ヒト
テロメラーゼの触媒タンパク質サブニットに関する組成
物および方法を提供すること。 【解決手段】 ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTRT)タン
パク質、またはその変異体またはそのフラグメントの、
単離された、実質的に純粋な、または組換えのタンパク
質調製物。本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチ
ドは、ヒト疾患の診断、予後および、処置に有用であ
り、細胞および生物の増殖能力を変化させるのに有用で
あり、ならびにガンのような疾患の処置に有用な化合物
および処置の同定およびスクリーニングに有用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の分野】本発明は、テロメラーゼの触媒サブユニ
ットおよび関連するポリペプチドをコードする新規な核
酸に関する。特に、本発明は、ヒトのテロメラーゼ触媒
サブユニットに関する。本発明は、医学、分子生物学、
化学、薬理学、ならびに医学的診断および予後の技術に
関する方法および組成物を提供する。
【０００２】
【発明の背景】以下の議論は、読者に本発明の分野を紹
介することを意図する。
【０００３】真核生物染色体の末端の完全な複製には特
定の細胞成分が必要であると、長く認識されてきた（Wa
tson、1972、Nature New Biol.、239:197；Olovnikov、
1973、J. Theor. Biol.、41:181）。従来のDNAポリメラ
ーゼによる線状DNA鎖の複製は、RNAプライマーを必要と
し、そして５'末端から３'末端へのみ進行し得る。真核
生物の染色体DNA鎖の５'最末端に結合したRNAがはずれ
るとき、ギャップが挿入される。これは、複製が繰り返
されるたびに、娘鎖の連続的短鎖化を導く。テロメア
（染色体の末端に物理的に位置しているタンパク質−DN
A構造体）のこの短鎖化は、インビトロおよびインビボ
での正常なヒトの体細胞の細胞老化または加齢現象を説
明すると考えられている（例えば、Goldstein、1990、S
cience 249:1129；Martinら、1979、Lab. Invest. 23:8
6；Goldsteinら、1969、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、
64:155；およびSchneiderおよびMitsui, 1976, Proc. N
atl. Acad. Sci. USA, 73:3584を参照のこと)。
【０００４】従って、テロメアの長さおよび完全性（in
tegrity）は、老化段階（すなわち、増殖能の欠如）へ
の細胞の進入と関係する。さらに、細胞がテロメアの長
さを維持（または増大）する能力によって、細胞が老化
するのを免れる、すなわち細胞を不死化させる。
【０００５】テロメアおよびテロメリックDNAの構造
は、数多くの系において研究されてきた（例えば、Harl
eyおよびVilleponteau、1995、Curr.Opin.Genet.Dev.
5:249を参照のこと)。ほとんどの生物において、テロメ
リックDNAは、タンデム（tandem）配置の非常に単純な
配列からなる；ヒトおよび他の脊椎動物では、テロメリ
ックDNAは、配列TTAGGGが数百から数千のタンデム反復
からなる。細胞中でのテロメアの長さを決定および調節
する方法は、PCT公開WO 93/23572およびWO 96/41016に
記載されている。
【０００６】テロメアの維持は、テロメラーゼとして知
られるテロメアに特異的なDNAポリメラーゼの機能であ
る。テロメラーゼは、そのRNA部分の一部をテロメア反
復のDNA合成のための鋳型として用いるリボ核タンパク
質（RNP）である（Morin、1997, Eur. J. Cancer 33:75
0；Yuら、1990, Nature 344:126；SingerおよびGottsch
ling、1994、Science 266:404；AutexierおよびGreide
r、1994, Genes Develop., 8:563；Gilleyら、1995, Ge
nes Develop., 9:2214；McEachernおよびBlackburn、19
95, Nature 367:403；Blackburn、1992, Ann. Rev. Bio
chem., 61:113；Greider、1996, Ann. Rev. Biochem.,
65:337）。ヒトおよび他のテロメラーゼのRNA成分は、
クローン化および特徴付けされている（PCT公開WO 96/0
1835およびFengら、1995, Science 269:1236を参照のこ
と)。しかしながら、テロメラーゼのタンパク質成分の
特徴付けは困難であった。これは、テロメラーゼRNP
（これは、発現される細胞中で、極めて低レベルで存在
する）の精製が困難であることが証明されたことが一因
である。例えば、高レベルのテロメラーゼ活性を発現す
ると知られているヒト細胞は、１細胞当たりわずか約10
0分子の酵素しか有しないと見積もられている。
【０００７】テロメアおよびテロメラーゼと細胞の増殖
能（すなわち、細胞が無限に分裂する能力）との関係に
一致して、テロメラーゼ活性は、不死の細胞株および非
常に多様なセットの腫瘍組織中に検出されるが、正常な
体細胞培養物または腫瘍に隣接する正常な組織中には検
出されない（すなわち、存在しないか、またはアッセイ
の閾を下回った）（米国特許第5,629,154号；同第5,48
9,508号；同第5,648,215号；および同第5,639,613号参
照のこと；また、Morin、1989, Cell 59:521；Shayおよ
びBacchetti 1997, Eur. J. Cancer 33:787；Kimら、19
94, Science 266:2011；Counterら、1992, EMBO J. 11:
1921；Counterら、1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.
A. 91, 2900；Counterら、1994, J. Virol. 68:3410も
参照のこと)。さらに、腫瘍中のテロメラーゼ活性のレ
ベルと、患者の適切な臨床結果との相関関係が報告され
ている（例えば、米国特許第5,639,613号（前出）；Lan
gfordら、1997, Hum. Pathol. 28:416)。テロメラーゼ
活性はまた、ヒトの生殖細胞、増殖中の幹細胞または始
原細胞、および活性化されたリンパ球で検出されてい
る。体細胞の幹細胞または始原細胞、および活性化され
たリンパ球では、テロメラーゼ活性は、典型的には、非
常に低いか、または一時的にのみ発現されるかのいづれ
かである（Chiuら、1996, Stem Cells 14:239；Bodnar
ら、1996, Exp. CellRes. 228:58；Taylorら、1996, J.
Invest. Dermatology 106:759を参照のこと)。
【０００８】ヒトテロメラーゼは、細胞の増殖および老
化に関連するヒトの疾患（例えば、ガン）の診断および
処置のための理想的な標的である。ヒトにおけるガンお
よび他のテロメラーゼ関連の疾患を診断および処置する
方法は、米国特許第5,489,508号、同第5,639,613号およ
び同第5,645,986号に記載されている。テロメラーゼを
モニターすることにより、腫瘍の進行を予想するための
方法は、米国特許第5,639,613号に記載されている。ヒ
トテロメラーゼの触媒タンパク質サブユニットの発見お
よび特徴付けは、テロメラーゼ、ならびに疾患の診断お
よび治療のためのさらなる有用なアッセイを提供する。
さらに、触媒タンパク質サブユニットの一次配列のクロ
ーニングおよび決定は、ヒトのガンおよび細胞増殖能お
よび老化に関連した他の疾患のためのより効果的な治療
を可能にする。
【０００９】
【発明の要旨】本発明は、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素
(hTRT)タンパク質、その変異体またはそのフラグメント
の、単離された、実質的に純粋な、または組換えタンパ
ク質調製物を提供する。
【００１０】本発明は、hTRTタンパク質の、単離され
た、実質的に純粋な、または組換えのタンパク質調製物
であって、該タンパク質が、図１７のhTRTタンパク質と
少なくとも75％の配列同一性を有するアミノ酸配列、そ
の変異体またはそのフラグメントを有することにより特
徴づけられる、タンパク質調製物を提供する。
【００１１】１つの実施態様において、上記hTRTタンパ
ク質は図１６の配列またはそのフラグメントを有する。
【００１２】１つの実施態様において、上記hTRTタンパ
ク質、変異体またはフラグメントはテロメラーゼ触媒活
性を有する。
【００１３】１つの実施態様において、上記タンパク
質、変異体またはフラグメントは、テロメラーゼ触媒活
性を有さない。
【００１４】１つの実施態様において、上記タンパク質
フラグメントは、少なくとも６アミノ酸残基を含む。
【００１５】本発明は、本発明のhTRTタンパク質および
RNAを含む組成物を提供する。
【００１６】この組成物の１つの実施態様において、上
記RNAはテロメラーゼRNAである。
【００１７】この組成物の１つの実施態様において、上
記RNAはヒトテロメラーゼRNA(hTR)である。
【００１８】この組成物の１つの実施態様において、上
記hTRTタンパク質およびhTRは、テロメラーゼ活性を有
するリボ核タンパク質複合体を形成する。
【００１９】この組成物の１つの実施態様において、上
記hTRTタンパク質は図１７に記載の配列を有する。
【００２０】本発明は、hTRTおよびhTRを含む、実質的
に純粋なヒトテロメラーゼを提供する。
【００２１】１つの実施態様において、このテロメラー
ゼは少なくとも約95％の純度である。
【００２２】１つの実施態様において、このヒトテロメ
ラーゼは細胞から単離される。
【００２３】本発明は、hTRTタンパク質またはそのフラ
グメントをコードする核酸配列を含む、単離された、合
成の、実質的に純粋な、または組換えのポリヌクレオチ
ドを提供する。
【００２４】本発明は、図１７に記載のアミノ酸配列、
または該アミノ酸配列中の１またはそれ以上の保存的置
換を含む配列を有するhTRTタンパク質をコードするヌク
レオチド配列を含む、単離された、合成の、実質的に純
粋な、または組換えのポリヌクレオチドを提供する。
【００２５】このポリヌクレオチドの１つの実施態様に
おいて、上記hTRTタンパク質は図１７に記載のアミノ酸
配列を有する。
【００２６】本発明は、hTRTタンパク質、フラグメント
または変異体をコードする組換えポリヌクレオチドであ
って、該ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、デフ
ォルトパラメータを使用するBLASTアルゴリズムを使用
して図１６に記載のヌクレオチド配列と比較した場合、
約0.5未満の最小合計確率(smallest sum probability)
を有する、組換えポリヌクレオチドを提供する。
【００２７】１つの実施態様において、このポリヌクレ
オチドは、ストリンジェントな条件下で、図１６に記載
の配列を有するポリヌクレオチドとハイブリダイズす
る。
【００２８】１つの実施態様において、このポリペプチ
ドは、上記hTRTタンパク質をコードする配列に、作動可
能に連結したプロモーター配列を含む。
【００２９】ポリヌクレオチドの１つの実施態様におい
て、上記プロモーターは天然に存在するhTRTプロモータ
ー以外のプロモーターである。
【００３０】本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含
む発現ベクターを提供する。
【００３１】本発明は、長さが少なくとも10ヌクレオチ
ドから３kbであり、そして天然に存在するhTRT遺伝子ま
たはhTRT mRNA中の連続配列と同一かまたは正確に相補
的である少なくとも10ヌクレオチドの連続配列を含む、
単離された、合成の、実質的に純粋な、または組換えの
ポリヌクレオチドを提供する。
【００３２】１つの実施態様において、上記ポリヌクレ
オチドはDNAである。
【００３３】１つの実施態様において、上記ポリヌクレ
オチドはRNAである。
【００３４】１つの実施態様において、上記ポリヌクレ
オチドは、１またはそれ以上の天然に存在しない合成ヌ
クレオチドを含む。
【００３５】１つの実施態様において、上記ポリヌクレ
オチドは、天然に存在するhTRT遺伝子またはhTRT mRNA
中の前記連続配列と同一である。
【００３６】１つの実施態様において、上記ポリヌクレ
オチドは、天然に存在するhTRT遺伝子またはhTRT mRNA
中の前記連続配列と正確に相補的である。
【００３７】１つの実施態様において、上記ポリヌクレ
オチドは、アンチセンスポリヌクレオチドである。
【００３８】１つの実施態様において、このアンチセン
スポリヌクレオチドは、少なくとも約20ヌクレオチドを
含む。
【００３９】本発明は、本発明の組換えポリヌクレオチ
ドを含む細胞を提供する。
【００４０】１つの実施態様において、この細胞はヒト
細胞である。
【００４１】１つの実施態様において、この細胞は、増
殖能以外は同一であるが前記組換えポリヌクレオチドを
含まない細胞に対して増加した増殖能を有する。
【００４２】１つの実施態様において、この細胞は、テ
ロメラーゼ活性以外は同一であるが前記組換えポリヌク
レオチドを含まない細胞に対して増加したテロメラーゼ
活性レベルを有する。
【００４３】１つの実施態様において、この細胞は不死
である。
【００４４】本発明は、hTRTポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチドを含む非ヒト生物を提供する。
【００４５】この生物の１つの実施態様において、上記
生物はマウス、酵母または細菌である。
【００４６】本発明は、単離された抗体または組換え抗
体、あるいはそのフラグメントであって、該抗体または
フラグメントがhTRTタンパク質と特異的に結合する、抗
体またはフラグメントを提供する。
【００４７】１つの実施態様において、上記抗体は少な
くとも約108Ｍ-1のアフィニティーで結合する。
【００４８】本発明は、本発明の抗体を分泌し得る細胞
を提供する。
【００４９】１つの実施態様において、この細胞はハイ
ブリドーマである。
【００５０】本発明は、本発明の抗体を含む組成物を提
供する。
【００５１】この組成物の１つの実施態様において、上
記抗体はモノクローナル抗体である。
【００５２】本発明は、化合物または処置がhTRTの活性
または発現のモジュレーターであるかどうかを決定する
方法であって、該化合物または処置の施行後に、hTRTタ
ンパク質またはポリヌクレオチドを含む細胞、動物、ま
たは組成物において、活性または発現の変化を検出する
工程を包含する方法を提供する。
【００５３】本発明は、試験化合物がテロメラーゼ逆転
写酵素活性のモジュレーターであるかどうかを決定する
方法を提供する。この方法は、以下の工程を包含する： ａ）hTRTタンパク質を含む組成物を提供する工程； ｂ）このhTRTタンパク質を上記試験化合物と接触させる
工程；および ｃ）このhTRTの活性を測定する工程であって、上記試験
化合物の非存在下でのhTRT活性と比較して上記試験化合
物の存在下で測定されたhTRT活性の変化が、上記試験化
合物がテロメラーゼ逆転写酵素活性を調節することの決
定を提供する、工程。
【００５４】この方法の１つの実施態様において、上記
組成物は組換えhTRTタンパク質を含む細胞である。
【００５５】この方法の１つの実施態様において、上記
組成物はhTRTタンパク質を含む非ヒト生物である。
【００５６】この方法の１つの実施態様において、上記
hTRTタンパク質はインビトロ発現の産物である。
【００５７】この方法の１つの実施態様において、上記
hTRT活性は、テロメラーゼの基質中へのヌクレオチド標
識の組込みをモニターすることによって測定される。
【００５８】この方法の１つの実施態様において、上記
hTRT活性は、拡張されたテロメラーゼ基質へのプローブ
のハイブリダイゼーションをモニターすることによって
測定される。
【００５９】この方法の１つの実施態様において、上記
hTRT活性は、拡張されたテロメラーゼ基質の増幅をモニ
ターすることによって測定される。
【００６０】この方法の１つの実施態様において、上記
hTRT活性は、前記試験化合物に曝された細胞のテロメア
長をモニターすることによって測定される。
【００６１】この方法の１つの実施態様において、上記
hTRT活性は、テロメラーゼが染色体に結合する能力の喪
失をモニターすることによって測定される。
【００６２】本発明は、hTRT活性を調節する化合物を同
定する方法であって、hTRTを該化合物と接触させる工
程、および該hTRTの特性または活性の変化を測定する工
程を包含し、ここで、統計的に有意な変化が、該化合物
をhTRT活性を調節するものとして同定する方法を提供す
る。
【００６３】本発明は、組換えテロメラーゼを調製する
方法であって、組換えhTRTタンパク質とテロメラーゼRN
A成分とを、該組換えタンパク質と該テロメラーゼRNA成
分が会合して、テロメラーゼ基質へのヌクレオチドの付
加を触媒し得るテロメラーゼ酵素を形成する条件下で接
触させる工程を包含する方法を提供する。
【００６４】この方法の１つの実施態様において、上記
hTRTタンパク質は図１７に記載の配列を有する。
【００６５】この方法の１つの実施態様において、上記
hTRTタンパク質はインビトロ発現系において産生され
る。
【００６６】この方法の１つの実施態様において、テロ
メラーゼRNAはインビトロ発現系において共発現する。
【００６７】この方法の１つの実施態様において、上記
テロメラーゼRNAはhTRである。
【００６８】この方法の１つの実施態様において、上記
テロメラーゼRNAはhTRTと混合される。
【００６９】この方法の１つの実施態様において、上記
接触させる工程は細胞中で生じる。
【００７０】この方法の１つの実施態様において、上記
テロメラーゼRNAは前記細胞により天然に発現する。
【００７１】この方法の１つの実施態様において、上記
細胞は、前記接触させる工程の前には、テロメラーゼ活
性を発現しない。
【００７２】この方法の１つの実施態様において、上記
細胞は、前記接触させる工程の後に、テロメラーゼ活性
を発現する。
【００７３】この方法の１つの実施態様において、上記
細胞はヒト細胞である。
【００７４】本発明は、サンプル中のhTRT遺伝子産物を
検出する方法であって、 ａ）上記サンプルを、上記遺伝子産物に特異的に結合す
るプローブと接触させる工程であって、ここで、このプ
ローブおよび上記遺伝子産物が複合体を形成する、工
程、およびこの複合体を検出する工程；または ｂ）上記生物学的サンプル中の上記遺伝子産物を特異的
に増幅する工程であって、ここで、上記遺伝子産物が核
酸である、工程、およびこの増幅産物を検出する工程 を包含し、ここで、この複合体または増幅産物の存在
を、上記生物学的サンプルにおける上記hTRT遺伝子産物
の存在と相関づける、方法を提供する。
【００７５】この方法の１つの実施態様において、上記
遺伝子産物はRNAである。
【００７６】この方法の１つの実施態様において、上記
プローブは核酸である。
【００７７】この方法の１つの実施態様において、上記
遺伝子産物はポリペプチドである。
【００７８】この方法の１つの実施態様において、上記
プローブは抗体である。
【００７９】この方法の１つの実施態様において、上記
サンプルはヒト由来である。
【００８０】この方法の１つの実施態様において、上記
サンプルは少なくとも１つの細胞を含む。
【００８１】この方法の１つの実施態様において、上記
接触させる工程または増幅させる工程はインタクトな細
胞中で生じる。
【００８２】この方法の１つの実施態様において、上記
接触させる工程または増幅させる工程は細胞抽出物中で
生じる。
【００８３】この方法の１つの実施態様において、上記
細胞はヒト細胞である。
【００８４】本発明は、ヒト細胞を含む生物学的サンプ
ル中の少なくとも１つのテロメラーゼ陽性ヒト細胞の存
在を検出する方法であって、 ａ）上記サンプル中のhTRT遺伝子産物の量を測定する工
程、 ｂ）この測定した量をテロメラーゼ陽性細胞を欠くサン
プルに相関するコントロールと比較する工程 を包含し、ここで、このコントロールと比較して、上記
サンプルにおける上記hTRT遺伝子産物のより高いレベル
の存在を、上記生物学的サンプルにおけるテロメラーゼ
陽性細胞の存在と相関づける、方法を提供する。
【００８５】この方法の１つの実施態様において、上記
テロメラーゼ陽性細胞はガン細胞である。
【００８６】この方法の１つの実施態様において、上記
テロメラーゼ陽性細胞は不死細胞である。
【００８７】この方法の１つの実施態様において、上記
テロメラーゼ陽性細胞は胎児細胞である。
【００８８】本発明は、患者におけるテロメラーゼ関連
状態を診断するための方法であって、 ａ）上記患者か
ら細胞または組織サンプルを得る工程； ｂ）この細胞または組織中のhTRT遺伝子産物の量を測定
する工程；および ｃ）この細胞または組織中のhRTR遺伝子産物の量を、同
じタイプの健常な細胞または組織中の量と比較する工程 を包含する方法を提供し、ここで、上記患者由来のサン
プル中のhTRT遺伝子産物の量と、健常な細胞または組織
中の量との差異が、テロメラーゼ関連状態の診断であ
る。
【００８９】この方法の１つの実施態様において、上記
サンプル中の量は、前記健常細胞または組織中の量より
高く、そして前記テロメラーゼ関連状態はガンである。
【００９０】本発明は、患者においてガンを診断する方
法であって、この方法は以下の工程： ａ）上記患者から生物学的サンプルを得る工程；および ｂ）上記患者のサンプルにおいてhTRT遺伝子産物を検出
する工程 を包含する方法を提供し、ここで、上記サンプルにおけ
るhTRT遺伝子産物の検出を、ガンの診断に相関づける。
【００９１】本発明は、患者においてガンを診断する方
法であって、この方法は以下の工程： ａ）患者のサンプルを得る工程； ｂ）上記患者のサンプル中のhTRT遺伝子産物の量を測定
する工程；および ｃ）hTRT遺伝子産物の量を正常値と比較する工程 を包含する方法を提供し、ここで、この正常値より高
い、患者における上記hTRT遺伝子産物の量が、ガンの診
断である。
【００９２】本発明は、患者においてガンを診断する方
法であって、この方法は以下の工程： ａ）少なくとも１つの細胞を含む患者サンプルを得る工
程； ｂ）上記サンプル中の細胞におけるhTRT遺伝子産物の量
を測定する工程；および ｃ）この細胞中のhTRT遺伝子産物の量を、この細胞の正
常値と比較する工程 を包含する方法を提供し、ここで、この正常値より多い
上記サンプル中のhTRT遺伝子産物の量が、ガンの診断で
ある。
【００９３】この方法の１つの実施態様において、上記
サンプルは少なくとも１つの悪性細胞を含む。
【００９４】本発明は、ガン患者に予後を提供する方法
であって、この方法は以下の工程： ａ）上記患者から得たガン細胞中のhTRT遺伝子産物の量
を測定する工程；および ｂ）このガン細胞中のhTRTの量を、このガンの予後と一
致する、１つのガン細胞あたりのhTRTの予後値と比較す
る工程 を包含する方法を提供し、これによって、この予後値で
ある、上記サンプル中の１細胞あたりのhTRの量が特定
の予後を提供する。
【００９５】本発明は、抗ガン処置が、患者におけるガ
ン細胞の増殖能を減少させる能力をモニターする方法で
あって、 ａ）上記患者由来の少なくとも１つのガン細胞中のhTRT
遺伝子産物の量の第１の測定を行う工程； ｂ）上記患者由来の少なくとも１つのガン細胞中のhTRT
遺伝子産物のレベルの第２の測定を行う工程であって、
ここで、この抗ガン処置が該第２の測定の前に上記患者
に施行される、工程；および ｃ）この第１および第２の測定値を比較する工程であっ
て、この第２の測定値におけるhTRT遺伝子産物のより低
いレベルを、抗ガン処置が上記患者におけるガン細胞の
増殖能を減少させる能力と相関づける、工程を包含する
方法を提供する。
【００９６】本発明は、hTRT遺伝子または遺伝子産物の
検出のためのキットであって、hTRT核酸またはその部分
配列(subsequence)、hTRTポリペプチドまたはその部分
配列、および抗hTRT抗体から選択される分子を含む容器
を含む、キットを提供する。
【００９７】１つの実施態様において、このキットは、
hTRT遺伝子またはhTRT mRNAの部分を増幅するために使
用され得る一対のプライマーを含む。
【００９８】１つの実施態様において、このキットは、
hTRT mRNAに特異的にハイブリダイズし得るオリゴヌク
レオチドプローブを含む。
【００９９】本発明は、脊椎動物細胞中に組換えhTRTポ
リヌクレオチドを導入することによって、上記脊椎動物
細胞の増殖能を増大させるための方法であって、ここ
で、この配列がプロモーターに作動可能に連結される方
法を提供する。
【０１００】この方法の１つの実施態様において、上記
ポリヌクレオチドによりコードされるhTRTは、テロメラ
ーゼ触媒活性を有する。
【０１０１】この方法の１つの実施態様において、上記
hTRTポリペプチドは、図１７に記載の配列を有する。
【０１０２】この方法の１つの実施態様において、上記
細胞は哺乳動物細胞である。
【０１０３】この方法の１つの実施態様において、上記
細胞はヒト細胞である。
【０１０４】この方法の１つの実施態様において、上記
細胞はヒト患者由来である。
【０１０５】この方法の１つの実施態様において、上記
細胞はインビトロで培養される。
【０１０６】１つの実施態様において、この方法は、上
記細胞をヒト患者に再導入する工程をさらに包含する。
【０１０７】この方法の１つの実施態様において、上記
組換えポリヌクレオチドは、遺伝子治療ベクターを使用
して患者の少なくとも１つの細胞に導入される。
【０１０８】１つの実施態様において、この方法は、上
記細胞に、プロモーターに作動可能に連結された、hTR
をコードする配列を含むポリヌクレオチドを導入する工
程をさらに包含する。
【０１０９】本発明は、脊椎動物細胞の増殖能を増大さ
せる方法であって、上記細胞中に有効量のhTRTポリペプ
チドを導入する工程を包含する、方法を提供する。
【０１１０】この方法の１つの実施態様において、上記
hTRTポリペプチドはテロメラーゼ触媒活性を有する。
【０１１１】本発明は、薬学的に受容可能なキャリア、
ならびにhTRTポリペプチド、hTRT抗体、hTRTポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチド、およびhTRT核酸また
はその部分配列から選択される分子を含む、薬学組成物
を提供する。
【０１１２】本発明は、細胞内のテロメラーゼ活性レベ
ルの上昇に関連する状態を治療する方法であって、上記
細胞中に、治療有効量の上記テロメラーゼ活性のインヒ
ビターを導入する工程を包含し、ここで、このインヒビ
ターがhTRTポリペプチド、hTRTに結合する抗体、または
hTRTポリヌクレオチドである、方法を提供する。
【０１１３】この方法の１つの実施態様において、上記
インヒビターは、図１６に記載の配列、またはその部分
配列または変異体を含むポリペプチドである。
【０１１４】この方法の１つの実施態様において、上記
ポリペプチドは、非標準的なまたは誘導体化された残基
を含む。
【０１１５】この方法の１つの実施態様において、上記
ポリペプチドは、内因性hTRTのhTRへの結合を阻害す
る。
【０１１６】この方法の１つの実施態様において、前記
細胞に前記インヒビターを導入する上記工程は、前記hT
RTポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはhT
RTポリヌクレオチドで、前記細胞または祖先を形質転換
する工程を包含する。
【０１１７】本発明は、hTRTポリペプチドおよびアジュ
バントを含むワクチンを提供する。
【０１１８】本発明は、hTRT遺伝子を含むトランスジェ
ニック非ヒト生物を提供する。
【０１１９】本発明は、hTRTタンパク質の配列またはそ
の部分配列を含む融合タンパク質をコードするポリヌク
レオチドを提供する。
【０１２０】本発明は、hTRTプロモーター配列を含む組
換えポリヌクレオチドを提供する。
【０１２１】このポリヌクレオチドの１つの実施態様に
おいて、上記hTRTプロモーター配列は、タンパク質コー
ド配列に作動可能に連結される。
【０１２２】このポリヌクレオチドの１つの実施態様に
おいて、上記タンパク質コード配列は、hTRT以外のタン
パク質をコードする。
【０１２３】本発明は、より大きな核酸中に含まれてい
る未知の配列の選択された核酸を単離するための方法で
あって、 （ａ）上記核酸を一対のオリゴヌクレオチドプライマー
と、このプライマーが上記核酸中の相補配列とハイブリ
ダイズし、そしてこのプライマーの３'末端へのヌクレ
オチドの付加によって伸長して、上記核酸にハイブリダ
イズする伸長プライマーを形成するする条件下で接触さ
せて反応混合物を形成させる工程であって、ここで、こ
の一対のオリゴヌクレオチドプライマーは、異なる配列
のプライマーの混合物である少なくとも１つのプライマ
ーを含み、そして該プライマーのうち少なくとも１つは
結合部分で標識されている、工程； （ｂ）工程(ａ)において形成された反応混合物を加熱す
るかまたはそうでなければ処置して、上記核酸とハイブ
リダイズする伸長プライマーを変性させ、次いで上記接
触させる工程(ａ)を繰り返す工程； （ｃ）工程(ｂ)を少なくとも１回から10回繰り返す工
程； （ｄ）この反応混合物を固体支持体上に固定された薬剤
と、二本鎖核酸が上記接触させる工程の間変性しない条
件下で接触させる工程であって、この薬剤は上記結合部
分と特異的に結合し、したがって上記結合部分を含む上
記伸長プライマーに結合する、工程； （ｅ）非特異的に結合した物質を該固体支持体から除去
して、支持体に結合した核酸混合物を調製する工程； （ｆ）上記薬剤は該結合部分に結合したままであり、そ
して二本鎖核酸は変性されて一本鎖核酸を形成する条件
下で、上記支持体に結合した核酸混合物を加熱またはそ
うでなければ変性させる工程；および （ｇ）加熱する工程(ｅ)の後、上記支持体に結合してい
ない任意の一本鎖核酸を単離する工程を包含する、方法
を提供する。
【０１２４】この方法の１つの実施態様において、本法
は、工程(ｇ)で単離された一本鎖核酸を使用する第２の
増幅反応を行う工程をさらに包含する。
【０１２５】この方法の１つの実施態様において、上記
結合部分はビオチンであり、そして上記薬剤はアビジン
またはアビジン化分子である。
【０１２６】本発明は、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(h
TRT)タンパク質またはその変異体またはそれらのフラグ
メントの、単離された、実質的に純粋な、または組換え
タンパク質調製物を提供する。
【０１２７】本発明は、図１７に記載のhTRTタンパク質
と少なくとも75％の配列同一性を有するアミノ酸配列ま
たはその変異体またはそのフラグメントを有することに
よって特徴付けられる、単離された、実質的に純粋な、
または組換えhTRTタンパク質を提供する。
【０１２８】１つの実施態様において、このタンパク質
は図１７に記載の配列を有する。
【０１２９】本発明は、hTRTタンパク質またはそのフラ
グメントをコードする核酸配列を含む、単離された、合
成の、実質的に純粋な、または組換えポリヌクレオチド
を提供する。
【０１３０】１つの実施態様において、このポリヌクレ
オチドは図１６に記載された配列を有する。
【０１３１】本発明は、hTRT遺伝子配列またはhTRT mRN
Aをアッセイまたはスクリーニングすることにおいて、
長さが少なくとも10ヌクレオチドから10kbであり、そし
て天然に存在するhTRT遺伝子またはhTRT mRNA中の連続
配列と同一かまたは正確に相補的である少なくとも10ヌ
クレオチドの連続配列を含むポリヌクレオチドの使用を
提供する。
【０１３２】本発明は、組換え宿主細胞を調製すること
において、長さが少なくとも10ヌクレオチドから10kbで
あり、そして天然に存在するhTRT遺伝子またはhTRT mRN
A中の連続配列と同一かまたは正確に相補的である少な
くとも10ヌクレオチドの連続配列を含むポリヌクレオチ
ドの使用を提供する。
【０１３３】本発明は、本発明において規定されるポリ
ヌクレオチドを含む細胞を提供する。
【０１３４】本発明は、hTRTタンパク質に特異的に結合
する、抗体またはその結合フラグメントを提供する。
【０１３５】本発明は、化合物または処置がhTRTの活性
または発現のモジュレーターであるかどうかを決定する
方法であって、上記化合物または処置の施行後に、hTRT
組換えタンパク質またはポリヌクレオチドを含む細胞、
動物、または組成物において、活性または発現の変化を
検出する工程を包含する、方法を提供する。
【０１３６】本発明は、試験化合物がhTRT活性のモジュ
レーターであるかどうかを決定する方法を提供し、この
方法は以下の工程： （ａ）本発明のhTRTタンパク質を上記試験化合物と接触
させる工程；および （ｂ）上記hTRTタンパク質の活性を測定する工程であっ
て、上記試験化合物の非存在下でのhTRT活性と比較して
上記試験化合物の存在下で測定されたhTRT活性の変化
が、該試験化合物がテロメラーゼ逆転写酵素活性を調節
することの決定を提供する、工程 を包含する。
【０１３７】本発明は、組換えテロメラーゼを調製する
方法を提供し、この方法は以下の工程：本発明の組換え
hTRTタンパク質とテロメラーゼRNA成分とを、この組換
えタンパク質とこのテロメラーゼRNA成分が会合して、
テロメラーゼ基質へのヌクレオチドの付加を触媒し得る
テロメラーゼ酵素を形成する条件下で接触させる工程を
包含する。
【０１３８】本発明は、サンプル中のhTRT遺伝子産物を
検出する方法であって、（ａ）上記サンプルを、上記遺
伝子産物に特異的に結合するプローブと接触させる工程
であって、ここで、このプローブおよび上記遺伝子産物
が複合体を形成する、工程、およびこの複合体を検出す
る工程；または（ｂ）上記生物学的サンプル中の上記遺
伝子産物を特異的に増幅する工程であって、ここで、上
記遺伝子産物が核酸である、工程、およびこの増幅産物
を検出する工程を包含する方法を提供し、ここで、この
複合体または増幅産物の存在を、上記生物学的サンプル
中の上記hTRT遺伝子産物の存在と相関づける。
【０１３９】本発明は、ヒト細胞を含む生物学的サンプ
ル中の少なくとも１つのテロメラーゼ陽性ヒト細胞の存
在を検出する方法を提供し、この方法は以下の工程： （ａ）上記サンプル中のhTRT遺伝子産物の量を測定する
工程、（ｂ）この測定した量をテロメラーゼ陽性細胞を
欠くサンプルに相関するコントロールと比較する工程を
包含し、ここでこのコントロールと比較して、上記サン
プル中の上記hTRT遺伝子産物のより高いレベルの存在
を、上記生物学的サンプルにおけるテロメラーゼ陽性細
胞の存在と相関づける。
【０１４０】本発明は、患者におけるテロメラーゼ関連
状態を診断するための方法であって、 （ａ）上記患者
から細胞または組織サンプルを得る工程；（ｂ）上記細
胞または組織中のhTRT遺伝子産物の量を測定する工程；
および（ｃ）上記細胞または組織中のhTRT遺伝子産物の
量を、同じタイプの健常な細胞または組織中の量と比較
する工程を包含する方法を提供し、ここで、上記患者由
来のサンプル中のhTRT遺伝子産物の量と、健常な細胞ま
たは組織中の量との差異が、テロメラーゼ関連状態を診
断する。
【０１４１】本発明は、脊椎動物細胞におけるhTRTの発
現を増大させることによる、インビトロでの該脊椎動物
細胞の増殖能を増大させるための方法を提供する。
【０１４２】本発明は、脊椎動物細胞の増殖能が増大す
ることにより特徴付けられる状態を処置するための医薬
の製造における、hTRTの発現を増大させる薬剤の使用を
提供する。
【０１４３】この使用の１つの実施態様において、上記
医薬は、老化の影響を阻害するためである。
【０１４４】本発明は、受容可能なキャリア、ならびに
本発明のhTRTタンパク質、変異体またはフラグメント、
本発明のhTRT抗体または結合フラグメント、本発明で規
定されるhTRTタンパク質、変異体またはフラグメントを
コードするポリヌクレオチド、あるいはhTRTタンパク質
をコードする核酸またはその部分配列を含む、薬学組成
物を提供する。
【０１４５】本発明は、ヒト細胞内のテロメラーゼ活性
レベルの上昇に関連する状態を処置するための医薬の製
造における、テロメラーゼ活性のインヒビターの使用を
提供する。
【０１４６】１つの実施態様において、タンパク質、変
異体またはフラグメントは、薬物として使用する。
【０１４７】１つの実施態様において、タンパク質、変
異体またはフラグメントは、医薬の製造において使用さ
れる。
【０１４８】１つの実施態様において、タンパク質、変
異体またはフラグメントは、老化またはガンの影響を阻
害するための医薬の製造において使用される。
【０１４９】１つの実施態様において、ポリヌクレオチ
ドまたはフラグメントは、薬物として使用される。
【０１５０】１つの実施態様において、ポリヌクレオチ
ドまたはフラグメントは、医薬の製造において使用され
る。
【０１５１】１つの実施態様において、ポリヌクレオチ
ドまたはフラグメントは、老化またはガンの影響を阻害
するための医薬の製造において使用される。
【０１５２】本発明は、（ａ）図１６に記載される配列
を有するDNA； （ｂ）このDNAにハイブリダイズし、そしてhTRTタンパ
ク質または変異体をコードする少なくとも10ヌクレオチ
ドのポリヌクレオチド； （ｃ）遺伝コードの結果として、(ａ)および(ｂ)に規定
されるDNA配列に縮重し、そしてhTRTポリペプチドまた
は変異体をコードするDNA配列から選択されるポリヌク
レオチドを提供する。
【０１５３】本発明は、テロメラーゼ逆転写酵素タンパ
ク質またはその変異体、あるいはそれらのフラグメント
の単離されたタンパク質調製物、実質的に純粋なタンパ
ク質調製物、または組換えタンパク質調製物を提供す
る。１つの実施態様において、このタンパク質は、以下
のアミノ酸配列を有する定義されたモチーフを有するこ
とにより特徴付けられる： Trp-R1-X7-R1-R1-R2-X-Phe-Phe-Tyr-X-Thr-Glu-X8〜9-R
3-R3-Arg-R4-X2-Trp ここで、Ｘは任意のアミノ酸でありかつ下付き文字は連
続する残基の数をいい、R1はロイシンまたはイソロイシ
ンであり、R2はグルタミンまたはアルギニンであり、R3
はフェニルアラニンまたはチロシンであり、そしてR4は
リジンまたはヒスチジンである。１つの実施態様におい
て、このタンパク質は、ヒトTRTの配列を有する。他の
実施態様において、本発明は、このようなタンパク質の
部分配列と実質的な配列同一性を有するペプチドおよび
ポリペプチドに関する。
【０１５４】関連する実施態様において、本発明は、テ
ロメラーゼ逆転写酵素タンパク質をコードする、単離さ
れた核酸、実質的に純粋な核酸、または組換え核酸を提
供する。１つの実施態様において、この核酸は、以下の
アミノ酸配列を含むタンパク質をコードする： Trp-R1-X7-R1-R1-R2-X-Phe-Phe-Tyr-X-Thr-Glu-X8〜9-R
3-R3-Arg-R4-X2-Trp 。別の実施態様において、この核酸はヒトTRTタンパク
質をコードする配列を有する。他の実施態様において、
本発明は、このような核酸の部分配列と実質的な配列同
一性または相補性を共有するオリゴヌクレオチドおよび
ポリヌクレオチドに関する。
【０１５５】１つの実施態様において、本発明は、ヒト
テロメラーゼ逆転写酵素（hTRT）タンパク質に関する。
従って、１つの実施態様において、本発明は、hTRTタン
パク質またはその変異体、あるいはそれらのフラグメン
トの、単離されたタンパク質調製物、実質的に純粋なタ
ンパク質調製物、または組換えタンパク質調製物を提供
する。１つの実施態様において、このタンパク質は、図
17のhTRTタンパク質（配列番号２）またはその変異体、
あるいはそれらのフラグメントと少なくとも約75％また
は少なくとも約80％の配列同一性を有するアミノ酸配列
を有することにより特徴付けられる。関連する局面にお
いて、hTRTタンパク質は、配列番号２の配列を有する。
いくつかの実施態様において、タンパク質は、１つ以上
のテロメラーゼ活性（例えば、触媒活性）を有する。１
つの実施態様において、hTRTタンパク質のフラグメント
は、少なくとも６つのアミノ酸残基を有する。
【０１５６】本発明はまた、hTRTタンパク質およびRNA
を含む組成物を提供する。RNAは、テロメラーゼRNA（例
えば、ヒトテロメラーゼRNA）であり得る。１つの実施
態様において、hTRTタンパク質およびヒトテロメラーゼ
RNA（hTR）は、テロメラーゼ活性を有するリボ核タンパ
ク質複合体に由来する。
【０１５７】１つの実施態様において、本発明は、hTRT
タンパク質を含む単離されたヒトテロメラーゼ（例え
ば、hTRTタンパク質を含み、そしてhTRを含む、実質的
に純粋なヒトテロメラーゼ）を提供する。１つの実施態
様において、テロメラーゼは、少なくとも約95％純粋で
ある。テロメラーゼは、細胞（例えば、組換え宿主細胞
またはテロメラーゼ活性を発現する細胞）から単離され
得る。
【０１５８】別の局面において、本発明は、hTRTタンパ
ク質をコードする核酸配列を含む、単離されたポリヌク
レオチド、合成のポリヌクレオチド、実質的に純粋なポ
リヌクレオチド、または組換えポリヌクレオチドを提供
する。１つの実施態様において、このポリヌクレオチド
は、図17（配列番号２）に示すアミノ酸配列を有するhT
RTタンパク質をコードするヌクレオチド配列、あるいは
このアミノ酸配列中に１つ以上の保存的アミノ酸（また
はコドン）置換、または１つ以上の活性を変化させるア
ミノ酸（またはコドン）置換を含む配列を有する。関連
する局面において、このポリヌクレオチドは、図16（配
列番号１）に示す配列を有するポリヌクレオチドにスト
リンジェントな条件下でハイブリダイズする。別の関連
する局面において、このポリヌクレオチドのヌクレオチ
ド配列は、デフォルトパラメーターを有するBLASTアル
ゴリズムを用いて図16（配列番号１）に示すヌクレオチ
ド配列と比較した場合、約0.5未満の最小合計確率を有
する。
【０１５９】別の局面において、本発明は、hTRTタンパ
ク質をコードする配列に作動可能に連結されたプロモー
ター配列を有するポリヌクレオチドを提供する。このプ
ロモーターは、天然に存在するhTRTプロモーター以外の
プロモーターであり得る。関連する局面において、本発
明は、hTRTのプロモーターを含む発現ベクターを提供す
る。
【０１６０】本発明はまた、少なくとも10ヌクレオチド
の長さであり、そして天然に存在するhTRT遺伝子または
hTRT mRNA中の連続する配列に同一であるかまたは正確
に相補的である少なくとも10ヌクレオチドの連続する配
列を含む、単離されたポリヌクレオチド、合成のポリヌ
クレオチド、実質的に純粋なポリヌクレオチド、または
組換えポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施態
様において、このポリヌクレオチドは、RNA、DNAである
か、または１つ以上の天然に存在しない合成ヌクレオチ
ドを含む。１つの局面において、このポリヌクレオチド
は、天然に存在するhTRT遺伝子またはhTRT mRNA中の少
なくとも10の連続するヌクレオチドの連続する配列に同
一であるかまたは正確に相補的である。例えば、このポ
リヌクレオチドは、アンチセンスポリヌクレオチドであ
り得る。１つの実施態様において、アンチセンスポリヌ
クレオチドは、少なくとも約20ヌクレオチドを含む。
【０１６１】本発明は、組換えタンパク質とテロメラー
ゼRNA成分とが会合して、テロメラーゼ基質へのヌクレ
オチドの添加を触媒し得るテロメラーゼ酵素を形成する
ような条件下で、この組換えhTRTタンパク質とこのテロ
メラーゼRNA成分とを接触させることにより、組換えテ
ロメラーゼを調製する方法をさらに提供する。１つの実
施態様において、hTRTタンパク質は、図17（配列番号
２）に示す配列を有する。hTRTタンパク質は、インビト
ロ発現系で産生され得、そしてテロメラーゼRNAと混合
され得るか、または別の実施態様において、テロメラー
ゼRNAはインビトロ発現系で同時に発現され得る。１つ
の実施態様において、テロメラーゼRNAはhTRである。別
の実施態様において、接触は、ヒト細胞のような細胞中
で生じる。１つの実施態様において、細胞は、hTRTとRN
Aとの接触、またはトランスフェクションによるようなh
TRTポリヌクレオチドの導入の前にはテロメラーゼ活性
を有さない。１つの実施態様において、テロメラーゼRN
Aはこの細胞によって天然に発現される。
【０１６２】本発明はまた、本発明の組換えポリヌクレ
オチド（例えば、プロモーターを作動可能に連結したhT
RTタンパク質コード配列を有するポリヌクレオチド）を
含む細胞（例えば、ヒト、マウス、または酵母の細胞）
を提供する。特定の局面において、細胞は、哺乳動物
（例えば、ヒト）由来の細胞のような脊椎動物細胞であ
り、そして組換えポリヌクレオチドを含まないこと以外
は同一である細胞と比較して増加した増殖能力を有する
か、または組換えポリヌクレオチドを含まないこと以外
は同一である細胞と比較して増加したテロメラーゼ活性
レベルを有する。いくつかの実施態様において、細胞は
不死である。
【０１６３】関連する実施態様において、本発明は、ヒ
トテロメラーゼ逆転写酵素ポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチドを含む生物および細胞（例えば、酵母、
植物、細菌、または非ヒト動物（例えば、マウス）のよ
うなトランスジェニック非ヒト生物）を提供する。本発
明はまた、hTRT遺伝子が欠失している（ノックアウト
の）、またはこの遺伝子が天然に存在するhTRT遺伝子産
物を発現しないように変異したトランスジェニック動物
および細胞を提供する。従って、別の実施態様におい
て、トランスジェニック非ヒト動物は、変異したテロメ
ラーゼ遺伝子を有し、テロメラーゼ活性を欠損した動物
であり、TRT欠損が、野生型TRTと比較して減少したレベ
ルのテロメラーゼ活性を有するTRTをコードする変異し
た遺伝子の結果である動物であり、そしてミスセンス変
異、ナンセンス変異、挿入、または欠失を含む１つ以上
の変異を有する変異したTRT遺伝子を有する動物であ
る。
【０１６４】本発明はまた、hTRTタンパク質に特異的に
結合する、単離された抗体または組換え抗体、あるいは
そのフラグメントを提供する。１つの実施態様におい
て、抗体は、少なくとも約108Ｍ-1の親和性で結合す
る。抗体は、モノクローナルであり得るか、またはポリ
クローナル抗血清のようなポリクローナル組成物であり
得る。関連する局面において、本発明は、ハイブリドー
マのような、抗体を分泌し得る細胞を提供する。
【０１６５】本発明はまた、化合物または処置が、テロ
メラーゼ逆転写酵素活性またはhTRT発現のモジュレータ
ーであるか否かを決定するための方法を提供する。この
方法は、化合物の投与または処置の後に、hTRTタンパク
質またはポリヌクレオチドを含む、細胞、動物、または
組成物中の活性または発現における変化を検出またはモ
ニタリングする工程を包含する。１つの実施態様におい
て、この方法は、以下の工程を含む：TRT組成物を提供
する工程、TRTを試験化合物と接触させる工程、およびT
RTの活性を測定する工程。ここで、試験化合物の存在下
でのTRT活性の変化は、その試験化合物がTRT活性を調節
することの指標である。特定の実施態様において、組成
物は、hTRTポリペプチドをコードする組換えポリヌクレ
オチドを含む、細胞、生物、トランスジェニック生物、
または発現系のようなインビトロの系である。従って、
この方法のhTRTは、インビトロ発現の産物であり得る。
種々の実施態様において、テロメラーゼ活性または発現
の検出は、hTRT遺伝子産物の発生量の変化を検出するこ
と、テロメラーゼに対する基質へのヌクレオチド標識の
取り込みをモニタリングすること、伸長したテロメラー
ゼ基質へのプローブのハイブリダイゼーションをモニタ
リングすること、伸長したテロメラーゼ基質の増幅をモ
ニタリングすること、試験化合物に曝された細胞のテロ
メア長をモニタリングすること、テロメラーゼの染色体
への結合能力の喪失をモニタリングすること、またはテ
ロメア構造の蓄積または喪失を測定することにより行わ
れ得る。
【０１６６】１つの局面において、本発明は、生物学的
試料を遺伝子産物と特異的に結合するプローブと接触さ
せ（ここで、プローブと遺伝子産物は複合体を形成す
る）、そして複合体を検出する（ここで、複合体の存在
は、生物学的試料中のhTRT遺伝子産物の存在に相関す
る）ことにより、生物学的試料中のhTRT遺伝子産物を検
出する方法を提供する。遺伝子産物は、RNA、DNA、また
はポリペプチドであり得る。検出のために使用され得る
プローブの例としては、核酸および抗体が挙げられる
が、これらに限定されない。
【０１６７】１つの実施態様において、遺伝子産物は、
遺伝子を増幅し、そして増幅産物を検出することにより
検出される核酸である。ここで、複合体または増幅産物
の存在は、生物学的試料中のhTRT遺伝子産物の存在に相
関する。
【０１６８】１つの実施態様において、生物学的試料
は、ヒト患者のような患者由来である。別の実施態様に
おいて、生物学的試料は、ヒト細胞培養物のようなイン
ビトロ細胞培養物に由来する少なくとも１つの細胞を含
む。
【０１６９】本発明はさらに、ヒト細胞を含む生物学的
試料中の少なくとも１つの不死またはテロメラーゼ陽性
のヒト細胞の存在を検出する方法を提供する。この方法
は、ヒト細胞を含む生物学的試料を得る工程；および高
レベルのhTRT遺伝子産物を有する細胞の試料中の存在を
検出する工程を含み、ここで高レベルのhTRT遺伝子産物
を有する細胞の存在は、生物学的試料中の不死またはテ
ロメラーゼ陽性の細胞の存在に相関する。
【０１７０】本発明はまた、患者におけるテロメラーゼ
に関連する状態を診断するための方法を提供する。この
方法は、患者から細胞または組織の試料を得る工程、細
胞または組織中のhTRT遺伝子産物の量を決定する工程；
および細胞または組織中のhTRT遺伝子産物の量を、同じ
タイプの健康な細胞または組織中の量と比較する工程を
含み、ここで、患者および健康な細胞または組織由来の
試料中のhTRT遺伝子産物との間の量の差異は、テロメラ
ーゼに関連する状態を診断する。１つの実施態様におい
て、テロメラーゼに関連する状態はガンであり、そして
より多量のhTRT遺伝子産物が試料中に検出される。
【０１７１】本発明はさらに、患者においてガンを診断
する方法を提供する。この方法は、患者から生物学的試
料を得る工程、および患者の試料中のhTRT遺伝子産物を
検出する工程を含み、ここで、試料中でのhTRT遺伝子産
物の検出は、ガンの診断に相関する。
【０１７２】本発明はさらに、患者においてガンを診断
する方法を提供する。この方法は、患者の試料を得る工
程、患者の試料中のhTRT遺伝子産物の量を決定する工
程；およびhTRT遺伝子産物の量を正常値またはコントロ
ール値と比較する工程を含み、ここで正常値またはコン
トロール値よりも多い量の患者におけるhTRT遺伝子産物
は、ガンを診断する。
【０１７３】本発明はまた、患者においてガンを診断す
る方法を提供する。この方法は、少なくとも１つの細胞
を含む患者の試料を得る工程；試料中の細胞におけるhT
RT遺伝子産物の量を決定する工程；および細胞のhTRT遺
伝子産物の量をこの細胞についての正常値と比較する工
程を含み、ここで、正常値よりも多量のhTRT遺伝子産物
は、ガンを診断する。１つの実施態様において、試料
は、少なくとも１つの悪性細胞を含むと考えられる。
【０１７４】本発明はまた、ガン患者を予測する（prog
nose）ための方法を提供する。この方法は、患者から得
たガン細胞におけるhTRT遺伝子産物の量を決定する工
程；およびガン細胞中のhTRTの量をガンの予測と一致す
るhTRTの予測値と比較する工程を含み；ここで、予測値
である量の試料中のhTRTは、特定の予測を提供する。
【０１７５】本発明はまた、患者においてガン細胞の増
殖能を減少させるための抗ガン処置の能力をモニタリン
グするための方法を提供する。この方法は、患者由来の
少なくとも１つのガン細胞におけるhTRT遺伝子産物の量
を１回目に測定する工程、患者由来の少なくとも１つの
ガン細胞のhTRT遺伝子産物のレベルを２回目に測定する
工程（ここで、抗ガン処置は２回目の測定の前に患者に
投与される）；そして１回目と２回目の測定値を比較す
る工程（ここで、２回目の測定におけるhTRT遺伝子産物
のより低いレベルは、患者においてガン細胞の増殖能を
減少させるための抗ガン処置の能力に相関する）を含
む。
【０１７６】本発明はまた、hTRT遺伝子または遺伝子産
物の検出のためのキットを提供する。１つの実施態様に
おいて、キットは、hTRT核酸またはその部分配列、hTRT
ポリペプチドまたはその部分配列、および抗hTRT抗体か
ら選択される分子を含有する容器を含む。
【０１７７】本発明はまた、ヒト疾患の処置方法を提供
する。１つの実施態様において、本発明は、哺乳動物細
胞のような脊椎動物細胞の増殖能を増大させるための方
法を提供する。この方法は、組換えポリヌクレオチドを
細胞に導入する工程を含み、ここで、このポリヌクレオ
チドはhTRTポリペプチドをコードする配列を含む。１つ
の実施態様において、hTRTポリペプチドは、図17に示さ
れるような配列を有する。１つの実施態様において、配
列は、プロモーターに作動可能に連結される。１つの実
施態様において、hTRTは、テロメラーゼ触媒活性を有す
る。１つの実施態様において、細胞は、ヒト患者中の細
胞のようなヒトである。別の実施態様において、細胞は
インビトロで培養される。関連する実施態様において、
細胞はヒト患者中に導入される。
【０１７８】本発明はさらに、ヒト疾患を処置するため
の方法を提供する。この方法は、患者中の少なくとも１
つの細胞に組換えhTRTポリヌクレオチドを導入する工程
を含む。１つの実施態様において、遺伝子治療ベクター
が使用される。関連する実施態様において、この方法は
さらに、hTRをコードする配列を含むポリヌクレオチド
（例えば、プロモーターに作動可能に連結されたhTRポ
リヌクレオチド）を細胞に導入する工程を含む。
【０１７９】本発明はまた、脊椎動物細胞の増殖能を増
大させるための方法を提供する。この方法は、細胞に有
効量のhTRTポリペプチドを導入する工程を包含する。１
つの実施態様において、hTRTポリペプチドは、テロメラ
ーゼ触媒活性を有する。本発明はさらに、増大した増殖
能を有する細胞および細胞の子孫を提供する。
【０１８０】本発明はまた、細胞内で上昇したレベルの
テロメラーゼ活性に関連する状態を処置するための方法
を提供する。この方法は、この細胞にこのテロメラーゼ
活性のインヒビターの治療的有効量を導入する工程を含
み、ここで、このインヒビターは、hTRTポリペプチドま
たはhTRTポリヌクレオチドである。１つの実施態様にお
いて、インヒビターは、例えば、図16、17、または20に
示される配列の少なくとも１つの部分配列を含むポリペ
プチドまたはポリヌクレオチドである。さらなる実施態
様において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、
テロメラーゼRNAへの内在性TRTの結合のような、TRT活
性を阻害する。
【０１８１】本発明はまた、hTRTポリペプチドおよびア
ジュバントを含むワクチンを提供する。本発明はまた、
薬学的に受容可能なキャリアおよび以下から選択される
分子を含む薬理学的組成物を提供する：hTRTポリペプチ
ド、hTRTポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
およびhTRT核酸またはその部分配列。 ［発明の詳細な説明］
【０１８２】Ｉ．序文 テロメラーゼは、RNA成分および触媒タンパク質成分を
含むリボ核タンパク質複合体（RNP）である。本発明
は、本明細書中で以下、「TRT」（テロメラーゼ逆転写
酵素）という、テロメラーゼの触媒タンパク質成分のク
ローン化および特徴付けに関する。TRTは、このタンパ
ク質が、テロメラーゼRNA成分（本明細書中以下、「T
R」）を用いて、テロメアDNA反復配列の合成を指示する
RNA依存性DNAポリメラーゼ（逆転写酵素）として作用す
るので、このように命名される。さらに、TRTは、進化
的に他の逆転写酵素と関連する（実施例12を参照のこ
と）。
【０１８３】１つの局面において、本発明は、本明細書
中以下「hTRT」という、ヒトテロメラーゼの触媒タンパ
ク質成分のクローン化および特徴付けに関する。前述の
ように、ヒト（および他の哺乳動物細胞）におけるテロ
メラーゼ活性は、細胞増殖能、細胞不死、および新生物
表現型の発生に相関するので、ヒトTRTは、並外れて興
味深く、そして価値があるものである。例えば、テロメ
ラーゼ活性、および以下の実施例２に実証されるよう
に、ヒトTRT遺伝子産物のレベルは、有寿命性細胞（例
えば、ほとんどのヒト体細胞）と比較して不死のヒト細
胞（例えば、悪性腫瘍細胞および不死細胞株）において
上昇する。
【０１８４】本発明はさらに、以下でいくらか詳細に記
載するように、ヒトの疾患および疾患状態の診断、予
測、および処置のために価値のある方法および組成物を
提供する。細胞の不死化（インビボおよびエクスビ
ボ）、所望の特徴を有するトランスジェニック動物の作
製、および多くの他の使用（その多くは以下に記載され
る）に有用な方法および試薬もまた提供される。本発明
はまた、繊毛虫、真菌類、哺乳動物のような脊椎動物、
および他の生物からTRT遺伝子およびそのタンパク質を
調製、クローン化、または再クローン化するために有用
な方法および試薬を提供する。
【０１８５】以下に詳細に記載されるように、TRTは最
初に、繊毛虫のEuplotes aediculatus由来のテロメラー
ゼの精製後に特徴付けられた。RNAアフィニティークロ
マトグラフィーおよび他の方法を用いて、E.aediculatu
sテロメラーゼの十分な精製により、タンパク質「p12
3」が得られた。驚くべきことに、p123は、テロメラー
ゼホロ酵素のタンパク質サブユニットを構成すると以前
に考えられていたタンパク質（すなわち、Tetrahymena
thermophilaのp80およびp95タンパク質）と関連しな
い。p123 DNAおよびタンパク質の配列（GenBank受託番
号U95964；図13および14）の分析により、テロメラーゼ
の触媒サブユニットとしてのp123の役割と一致する逆転
写酵素（RT）モチーフが明らかになった（図１、４、お
よび11を参照のこと）。さらに、p123は、S.cerevisiae
（酵母）タンパク質Est2pに関連する。Est2pは、S.cere
visiae（GenBank受託番号S5396）においてテロメアの維
持に役割を果たすことが知られていたが、本発明の以前
にはテロメラーゼ触媒サブユニットタンパク質をコード
するとは認識されていなかった（例えば、Lendvayら, 1
996, Genetics, 144：1399を参照のこと）。
【０１８６】１つの局面において、本発明は、開示され
たTRTポリヌクレオチドから作製されるかまたはこれに
由来する核酸プローブおよびプライマー（例えば、TRT
遺伝子およびcDNAのクローン化のため）を用いて；モチ
ーフまたはモチーフ配列あるいは他のTRTエピトープを
特異的に認識する抗体（例えば、クローン化TRT遺伝子
の発現またはTRTタンパク質の精製のため）を用いて；
コンピューターデータベースをスクリーニングすること
により；あるいは他の手段を用いて、新規のTRTを同定
およびクローン化するための試薬および方法を提供す
る。例えば、実施例１に記載のように、S.pombe DNAのP
CR（ポリメラーゼ連鎖反応）増幅を、Euplotesのp123 R
TモチーフのＢ'およびＣから設計した縮重配列プライマ
ーを用いて行った。作製した４つの顕著な産物のうち、
１つは、Euplotesのp123およびS.cerevisiaeのEst2pに
相同なペプチド配列をコードした。このPCR産物をプロ
ーブとして用いて、S.pombe cDNAおよびゲノムライブラ
リーをスクリーニングし、そして逆転写およびPCR（RT-
PCR）によりS.pombe RNAを増幅することにより、S.pomb
eTRTホモログの完全な配列を得た。S.pombe遺伝子の完
全な配列（「trt1」；GenBank受託番号AF015783；図1
5）により、p123およびEst2pとの相同性が、逆転写酵素
モチーフにおいて特に高いことが明らかになった。S.po
mbe trt1はまた、tez1とも呼ばれる。
【０１８７】テロメラーゼRTモチーフに由来する縮重プ
ライマーを用いる増幅をまた、実施例１に記載のよう
に、Oxytricha trifallaxおよびTetrahymena thermophi
laにおけるTRT遺伝子配列を得るために用いた。
【０１８８】本発明のEuplotes p123、S.pombe trt1、
およびS.cerevisiae Est2pの核酸配列を、プログラムBL
AST（Altschulら, 1990, J.Mol. Biol. 215: 403）を用
いるヒトの発現配列タグ（EST）のコンピューター処理
化データベースの検索に使用した。Est2p配列を用いた
このデータベースの検索は、マッチングを示さなかった
が、p123およびtrt1配列を用いた検索は、実施例１に記
載のように、推定的に相同タンパク質をコードするヒト
EST（GenBank受託番号AA281296；配列番号８を参照のこ
と）を同定した。このESTを含むcDNAクローン（本明細
書中以下、「クローン712562」、配列番号３を参照のこ
と）の完全な配列決定により、７つのRTモチーフが存在
することが示された。しかし、このクローンは７つ全て
のモチーフを有する連続するヒトTRTをコードしなかっ
た。なぜなら、モチーフＢ'、Ｃ、Ｄ，およびＥは、よ
りNH2末端のモチーフとは異なるオープンリーディング
フレーム（ORF）に含まれたからである。さらに、モチ
ーフＡおよびＢ'の距離は、３つの以前に特徴付けられ
たTRTの距離よりも実質的に短かかった。クローン71256
2を、I.M.A.G.E.Consortium; Lennonら, 1996, Genomic
s 33：151より得た。
【０１８９】機能的なhTRT（図16、配列番号１を参照の
こと）をコードするcDNAクローンのpGRN121を、実施例
１に記載されるようなヒト293細胞株に由来するcDNAラ
イブラリーから単離した。クローン712562とpGRN121と
の比較により、クローン712562が182塩基対（図24、配
列番号９を参照のこと）の欠失をモチーフＡとモチーフ
Ｂ'との間に有することが示された。pGRN121に存在する
付加的な182塩基対は、単一のオープンリーディングフ
レームのTRTモチーフの全てを配置し、そして他の公知
のTRTと一致する距離に、モチーフＡとモチーフＢ'領域
との間の間隔を増加させる。以下の実施例（例えば、実
施例７）に記載されるように、配列番号１は、配列番号
２の配列を有する触媒的に活性なテロメラーゼタンパク
質をコードする。配列番号２のポリペプチドは、1132残
基を有し、そして約127キロダルトン（kD）の計算分子
量を有する。
【０１９０】以下で議論し、そして以下の実施例９で記
載するように、クローン712562の182塩基対の欠失の特
徴を有するTRT cDNAは、テロメラーゼ陽性細胞（例え
ば、精巣および293細胞）由来のRNAの逆転写後に検出さ
れる。この182塩基対の配列を欠くhTRT RNAは、一般に
「Δ182変異体」といわれ、そして１、２、または数種
を表わし得る。pGRN121 cDNAに見出される182塩基対の
配列を欠くhTRT変異体は完全に活性なテロメラーゼ触媒
酵素をコードしないようであるが、これらは以下に議論
するように、テロメラーゼ調節に役割を有し得、および
／または以下に議論するように、テロメア結合活性また
はhTR結合活性のような部分的テロメラーゼ活性を有し
得る。
【０１９１】従って、１つの局面において、本発明は、
天然に存在するヒトTRT遺伝子またはmRNAの配列を有す
る単離されたポリヌクレオチド（図16に示すような配列
（配列番号１）を有するポリヌクレオチドを含むがこれ
に限定されない）を提供する。関連する局面において、
本発明は、hTRTタンパク質、フラグメント、変異体、ま
たは誘導体をコードするポリヌクレオチドを提供する。
別の関連する局面において、本発明は、hTRT遺伝子また
はmRNAに結合するセンスおよびアンチセンス核酸を提供
する。本発明はさらに、hTRTタンパク質（合成されたか
または天然の供給源から単離されたかによらない）、な
らびにhTRTタンパク質またはそのフラグメントに特異的
に結合する抗体および他の薬剤を提供する。本発明はま
た、例えば、ヒトの疾患に対する診断アッセイおよび予
測アッセイを提供することにより前述の組成物を用いる
方法、テロメラーゼ会合タンパク質の治療薬の開発方法
および治療方法、テロメラーゼ会合タンパク質の同定方
法、ならびにテロメラーゼ活性を活性化または阻害し得
る薬剤のスクリーニング方法を含む、多くの新規の方法
を提供する。本発明の多くの他の局面および実施態様を
以下に提供する。
【０１９２】本発明の１つの局面は、少なくとも10ヌク
レオチド〜約10kb以上の長さであり、そして天然に存在
するhTRT遺伝子またはhTRT mRNA中の連続する配列に同
一であるかまたは正確に相補的である少なくとも10ヌク
レオチドの連続する配列を含むポリヌクレオチドの、hT
RT遺伝子配列またはhTRT mRNAのアッセイまたはスクリ
ーニング、あるいは組換え宿主細胞の調製における使用
である。
【０１９３】本発明のさらなる局面は、脊椎動物細胞の
増大した増殖能に焦点をあてられる状態の処置のための
医薬品の製造におけるhTRTの発現を増大させる薬剤の使
用である。必要に応じて、この医薬品は加齢の効果を阻
害するためのものである。
【０１９４】本発明のなおさらなる局面は、ヒト細胞内
のテロメラーゼ活性のレベルの上昇と関連する状態の処
置のための医薬品の製造における、テロメラーゼ活性の
インヒビターの使用である。
【０１９５】本発明のタンパク質、変異体、およびその
フラグメント、ならびにコードするポリヌクレオチドま
たはそのフラグメントはまた、それぞれ薬剤としての使
用のための本発明のさらなる局面において提供される。
【０１９６】本発明はさらに、本明細書中で定義される
それぞれの場合における、医薬品の製造における（例え
ば、加齢またはガンの効果を阻害するための医薬品の製
造における）、タンパク質、変異体、またはそのフラグ
メント、あるいはポリヌクレオチドまたはそのフラグメ
ントの使用を含む。
【０１９７】本発明の特定の実施態様において、hTRTポ
リヌクレオチドは、配列番号８の389ヌクレオチドのポ
リヌクレオチド以外、および／またはインサートを含む
プラスミドであるクローン712562以外であり、このイン
サートの配列は図18（配列番号３）に示される。
【０１９８】以下の記載は、論題により系統立てられ
る。第II部はさらに、TRTタンパク質のアミノ酸モチー
フの特徴、およびこのようなモチーフを有するタンパク
質をコードするTRT遺伝子を記載する。第III部〜第VI部
は、とりわけ、特にヒトのTRT関連組成物に焦点をおい
て、本発明の核酸、タンパク質、抗体、および精製され
た組成物を記載する。第VII部は、とりわけ、ヒトの疾
患の処置に有用な本発明の方法および組成物を記載す
る。第VIII部は、不死化ヒト細胞株の作製および同定を
記載する。第IX部は、とりわけ、ヒトの疾患の診断のた
めの、本発明の核酸、ポリヌクレオチド、および他の組
成物の使用を記載する。第Ｘ部は、とりわけ、テロメラ
ーゼ活性または発現を調節（例えば、阻害または促進）
する薬剤および処置をスクリーニングおよび同定するの
に有用な本発明の方法および組成物を記載する。第XI部
は、とりわけ、トランスジェニック動物（例えば、テロ
メラーゼノックアウト動物および細胞）を記載する。第
XII部は、第Ｉ部〜第XI部で使用された用語の用語解説
である。第XIII部は、本発明の特定の実施態様に関する
実施例を記載する。論題および副次的な論題による本発
明の記載の系統立ては、明確さを提供し、そしてどのよ
うな方法においても限定されない。
【０１９９】II．TRT遺伝子およびタンパク質 本発明は、単離形態または組換え形態の、天然に存在す
る形態のこのような遺伝子およびタンパク質を含むがこ
れらに限定されない、テロメラーゼ触媒サブユニットタ
ンパク質（すなわち、テロメラーゼ逆転写酵素）の配列
を有する、単離されたおよび／または組換え遺伝子およ
びタンパク質を提供する。代表的には、TRTは、本明細
書中に開示されるように、逆転写酵素（RT）およびテロ
メラーゼ特異的（Ｔ）アミノ酸モチーフを有する大きな
塩基性のタンパク質である。これらのモチーフは多様な
生物にわたって保存されているので、多くの生物のTRT
遺伝子を、本発明の方法を用いて得ることができるか、
または本発明のプライマー、核酸プローブ、および抗体
（例えば、１つ以上のモチーフ配列に特異的なもの）を
用いて同定し得る。
【０２００】他の逆転写酵素に見出されるものと類似で
あるが、TRTに見出される７つのRTモチーフは、特定の
顕著な特徴を有する。例えば、図４に示すように、TRT
RTモチーフ内に、他のRT間で高度に保存される残基中に
多くのアミノ酸置換（矢印で示す）がある。例えば、モ
チーフＣにおいては、活性部位金属イオンと配位結合す
る２つのアスパラギン酸残基（DD）（Kohlstaedtら, 19
92, Science 256：1783; Jacobo-Molinaら, 1993, Pro
c.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 90：6320；Patelら,1995, Bi
ochemistry 34：5351を参照のこと）が、他のRTにおけ
る（F/Y）xDDhと比較して、テロメラーゼRTにおいてはh
xDD(F/Y)の関係で存在する（ここで、「ｈ」は、疎水性
アミノ酸であり、そして「ｘ」は任意のアミノ酸であ
る；Xiongら, 1990, EMBO J. 9：3353；Eickbush, The
Evolutionary Biology of Viruses,(S.Morse編, Raven
Press, NY, 121頁, 1994)を参照のこと）。テロメラー
ゼサブグループの別の規則正しい変化の特徴はモチーフ
Ｅに存在し、ここで、WxGxSxはコンセンサス配列である
かまたはテロメラーゼタンパク質間で保存されている
が、hLGxxhは他のRTの特徴である（Xiongら、前出；Eic
kbush、前出）。このモチーフＥは、「プライマーグリ
ップ」と呼ばれ、そしてこの領域における変異がRNAプ
ライミングに影響するがDNAプライミングに影響しない
ことが報告されている（Powellら, 1997, J.Biol.Chem.
272：13262）。テロメラーゼはDNAプライマー（例え
ば、染色体3'末端）を必要とするので、テロメラーゼが
プライマーグリップ領域で他のRTと異なっているはずで
あることは意外ではない。さらに、モチーフＡとモチー
フＢ'との間の距離は、他のRTの典型的な距離よりもTRT
で長い。これは、右手に似た構造の「フィンガー」領域
内の挿入を示し得る（図３：Kohlstaedtら、前出；Jaco
bo-Molinaら、前出；およびPatelら、前出を参照のこ
と）。
【０２０１】さらに、前述のように、モチーフＴは、TR
Tタンパク質のさらなる顕著な特徴である。このモチー
フＴは、例えば、図４に示すように（W-L-X-Y-X-X-h-h-
X-h-h-X-p-F-F-T-E-X-p-X-X-X-p-X-X-X-Y-X-R-K-X-X-W
[Ｘは任意のアミノ酸であり、ｈは疎水性であり、ｐは
極性である]）、以下の式を用いて記載され得る配列か
らなる： Trp-R1-X7-R1-R1-R2-X-Phe-Phe-Tyr-X-Thr-Glu-X8〜9-R
3-R3-Arg-R4-X2-Trp、 ここで、Ｘは任意のアミノ酸であり、そして下付きは連
続する残基の数をいい、R1はロイシンまたはイソロイシ
ンであり、R2はグルタミンまたはアルギニンであり、R3
はフェニルアラニンまたはチロシンであり、そしてR4は
リジンまたはヒスチジンである。
【０２０２】Ｔモチーフはまた、以下の式を用いて記載
され得る： Trp-R1-X4-h-h-X-h-h-R2-p-Phe-Phe-Tyr-X-Thr-Glu-X-p
-X3-p-X2〜3-R3-R3-Arg-R4-X2-Trp、 ここで、Ｘは任意のアミノ酸であり、そして下付きは連
続する残基の数をいい、R1はロイシンまたはイソロイシ
ンであり、R2はグルタミンまたはアルギニンであり、R3
はフェニルアラニンまたはチロシンであり、R4はリジン
またはヒスチジンであり、ｈはAla、Leu、Ile、Val、Pr
o、Phe、Trp、およびMetから選択される疎水性アミノ酸
であり、そしてｐはGly、Ser、Thr、Tyr、Cys、Asn、お
よびGlnから選択される極性アミノ酸である。
【０２０３】１つの実施態様において、本発明は、図11
に例示されるモチーフ（例えば以下）の１つ以上を含む
単離された天然に存在するTRTタンパク質、および組換
えTRTタンパク質を提供する： モチーフＴ W-X12-FFY-X-TE-X10〜11-R-X3-W-X7-I モチーフＴ' E-X2-V-X モチーフ１ X3-R-X2-PK-X3 モチーフ２ X-R-X-I-X モチーフＡ X4-F-X3-D-X4-YD-X2 モチーフＢ' Y-X4-G-X2-QG-X3-S-X3 モチーフＣ X6-DD-X-L-X3 。 示したTRTタンパク質が１つより多くのTRTモチーフを含
む場合、その順序（NH2−> COOH）は図11に示される通
りである。
【０２０４】１つの実施態様において、本発明は、以下
のスーパーモチーフを含む単離された天然に存在するTR
Tタンパク質を提供する： (NH2)-X300〜600-W-X12-FFY-X-TE-X10〜11-R-X3-W-X7-I
-X5〜20-E-X2-V-X-X5〜2 0-X3-R-X2-PK-X4〜10-R-X-I-X-
X60〜80-X4-F-X3-D-X4-YD-X2-X80〜130-Y-X4-G-X 2-QG-X
3-S-X8-X5〜35-X6-DD-X-L-X3-X10〜20-X12-K 。
【０２０５】これらの試薬について本明細書中に開示さ
れるTRT配列を含む試薬ならびに本明細書中に提供され
る方法および指針（以下で記載される特定の方法論を含
む）が提供されれば、TRT遺伝子およびタンパク質が当
業者により得られ得、単離され得、そして組換え形態で
産生され得ることは当業者には明らかである。例えば、
TRTの特徴的なRTおよびＴモチーフをコードする遺伝子
配列にハイブリダイズするプライマー（例えば、縮重増
幅プライマー）が提供される。例えば、ＴモチーフのFF
YXTE領域、他のTRTモチーフ（以下に議論するよう
に）、またはモチーフまたはコンセンサス配列の組み合
わせをコードする配列にハイブリダイズする１つ以上の
プライマーまたは縮重プライマーが、標的生物のコドン
の使用法に基づいて調製され得、そして標的生物から調
製したゲノムDNAまたはcDNAからTRT遺伝子配列を増幅す
るために使用され得る。縮重プライマーの使用は、当該
分野において周知であり、そして標的生物のコドン優先
度および使用法を考慮し、そしてPCRのアニーリング工
程における塩基のミスマッチを可能にするのに適切な増
幅（例えば、PCR）条件を用いることにより、標的モチ
ーフのアミノ酸を潜在的にコードし得る核酸配列のセッ
トにハイブリダイズするプライマーのセットの使用を伴
う。代表的には、２つのプライマーセットを用いる；し
かし、１つのプライマー（またはこの場合、１つの縮重
プライマーセット）増幅系が周知であり、そしてTRT遺
伝子を得るために使用され得る。
【０２０６】表１は、新規のTRT核酸を、特に脊椎動物
（例えば、ヒトおよび他の哺乳動物）のものから増幅す
るために使用され得る本発明の例示的なプライマーを提
供する。「Ｎ」は、４つ全てのヌクレオチドの等モル混
合物であり、そして括弧内のヌクレオチドは示したヌク
レオチドの等モル混合物である。
【０２０７】
【表１】
【０２０８】１つの実施態様において、増幅されたTRT
核酸は、標的生物から作製されたライブラリー（例え
ば、cDNAライブラリー）に対するコロニーハイブリダイ
ゼーションのためのハイブリダイゼーションプローブと
して使用され、それによりTRTタンパク質コード配列全
体またはその実質的な部分を有する核酸が同定および単
離またはクローン化される。まさに記載したもののよう
な試薬および方法を、本明細書中に記載される方法に従
って用いて、以下に詳細に記載されるように、Oxytrich
a trifallaxおよびTetrahymena thermophilaのTRT遺伝
子配列を得た。以前に特徴付けられなかったTRT遺伝子
のクローン化の後に、配列が通常の方法により決定され
得、そしてコードされるポリペプチドが合成され、そし
てTRT活性（例えば、テロメラーゼ触媒活性）について
（本明細書中に記載されるように、および／または当該
分野で公知のテロメラーゼアッセイにより）アッセイさ
れ得ることが認識される。
【０２０９】本発明の種々のクローン化方法のいずれか
を用いてTRT遺伝子がクローン化され得ることもまた、
当業者には明らかである。なぜなら、TRTモチーフ配列
およびこのような配列を含む本発明の核酸は、このよう
な広範な種々の方法において使用され得るからである。
例えば、実施例１に記載のように、公知のTRTの配列に
基づくプローブを用いる、標的生物由来のDNAライブラ
リーまたは他の核酸ライブラリーへのハイブリダイゼー
ションが使用され得る。縮重PCRプライマーまたは前述
のもののようなこれらの増幅産物がそれ自体標識され
得、そしてハイブリダイゼーションプローブとして使用
され得ることが評価される。別の実施態様において、発
現クローン化方法が用いられる。例えば、TRTモチーフ
または他のTRTエピトープ（例えば、FFYXTEモチーフ）
にまたがるペプチドに特異的に結合する１つ以上の抗体
が、TRTタンパク質を含むリボゾーム複合体およびそれ
をコードするmRNAを単離するために用いられ得る。本発
明のこのような抗体を作製するために、ペプチド免疫原
は、代表的には６アミノ酸と30アミノ酸との間の長さ、
より多くの場合約10〜20アミノ酸の長さである。抗体は
また、TRT配列をコードするクローンを同定するため
に、目的の生物に由来するcDNA発現ライブラリーをプロ
ーブするのに使用され得る。別の実施態様において、公
知のTRTで保存される配列を含むDNAについてのDNAデー
タベースのコンピューター検索もまた、TRT配列を含む
クローンを同定するために用いられ得る。
【０２１０】１つの局面において、本発明は、天然に存
在するTRTタンパク質のアミノ酸配列を有する単離され
たまたは組換えのポリペプチドを含む組成物を提供す
る。通常、天然に存在するTRTは、約80,000ダルトン
（Ｄ）と約150,000Ｄとの間、最も多くの場合約95,000
Ｄと約130,000Ｄとの間の分子量を有する。代表的に
は、天然に存在するTRTは、pH７で正味の正電荷（代表
的には９より大きな計算されたpI）を有する。１つの実
施態様において、ポリペプチドは、本明細書中に定義さ
れるようなテロメラーゼ活性を示す。関連する実施態様
において、ポリペプチドはTRT特異的領域（Ｔモチー
フ）配列を有し、そしてテロメラーゼ活性を示す。本発
明はさらに、このようなポリペプチドのフラグメントを
提供する。本発明はまた、TRTタンパク質をコードする
天然に存在する遺伝子の配列を有する単離されたまたは
組換えのポリヌクレオチドを提供する。本発明は、非脊
椎動物（例えば、酵母）、および哺乳動物のような脊椎
動物（例えば、マウスまたはヒト）からTRTの配列を単
離するために有用な試薬を提供する。単離されたポリヌ
クレオチドは、他の天然に存在するあるいは組換えまた
は合成のベクター核酸配列に関連し得る。代表的には、
単離された核酸は、約300kbより小さく、しばしば約50k
b未満であり、より多くの場合約20kb未満であり、頻繁
には約10kb未満であり、そして時々約５kbまたは２kb未
満の長さである。いくつかの実施態様において、単離さ
れたTRTポリヌクレオチドは、約１kb未満または0.1kb未
満の遺伝子フラグメント、プライマー、またはプローブ
のように、さらに小さい。
【０２１１】III．核酸 Ａ）概要 本発明は、Euplotes、Tetrahymena、S.pombe、またはヒ
トに由来する組換えTRT遺伝子のような、テロメラーゼ
触媒サブユニットタンパク質（TRT）をコードするポリ
ヌクレオチドの配列を有する単離されたそして組換えの
核酸を提供する。例示的なポリヌクレオチドは、図13
（Euplotes）；図15（S.pombe）；および図16（ヒト、G
enBank受託番号AF015950）において提供される。本発明
は、プローブ、プライマー、TRTタンパク質コードポリ
ヌクレオチドなどを含む、TRT遺伝子配列を有するセン
スおよびアンチセンスのポリヌクレオチドを提供する。
【０２１２】Ｂ）ヒトTRT 本発明は、ヒト由来のテロメラーゼ触媒サブユニット
（すなわち、hTRT）の配列を有する核酸を提供する。
【０２１３】１つの局面において、本発明は、ヒトTRT
遺伝子またはRNAの配列または部分配列を有するポリヌ
クレオチドを提供する。１つの実施態様において、本発
明のポリヌクレオチドは、図16に示す配列番号１の配列
またはその部分配列を有する。別の実施態様において、
ポリヌクレオチドは、配列番号３（図18）、配列番号４
（図20）の配列、またはそれらの部分配列を有する。本
発明はまた、本明細書中に開示されるhTRT核酸の配列に
実質的な配列同一性を有するポリヌクレオチドを提供す
る。本明細書中に開示されるhTRT核酸の配列は、例え
ば、配列番号１[図16]、配列番号４[図20]、配列番号６
[図21]、および配列番号７を包含するがこれらに限定さ
れない。従って、本発明は、ヒトTRT遺伝子の天然に存
在する対立遺伝子および本明細書中に開示されるhTRT核
酸配列に関して１つ以上のヌクレオチドの欠失、挿入、
または置換を有する変異ポリヌクレオチド配列を提供す
る。以下に記載されるように、変異核酸は、以下に記載
される組換え法または合成法を用いて、あるいは他の手
段により作製され得る。
【０２１４】本発明はまた、ヒトTRT遺伝子の隣接領域
に由来する配列を有する単離されたおよび組換えのポリ
ヌクレオチドを提供する。このようなポリヌクレオチド
は、hTRT mRNAの非翻訳領域のゲノム配列に由来するポ
リヌクレオチドを含む。代表的なゲノム配列を図21（配
列番号６）に示す。実施例４に記載するように、配列番
号６を、ヒトゲノムライブラリーから単離されたクロー
ンλGФ5を配列決定することにより得た。λGФ5は、hT
RTコード配列の5'側におよそ13,000塩基を含む15キロ塩
基対（kbp）のインサートを含む。このクローンは、hTR
Tプロモーター配列および他のhTRT遺伝子調節配列（例
えば、エンハンサー）を含む。
【０２１５】本発明はまた、ヒトTRT遺伝子のイントロ
ン領域に由来する配列を有する単離されたおよび組換え
ポリヌクレオチドを提供する。代表的なイントロン配列
を、図21（配列番号７；実施例３を参照のこと）に示
す。いくつかの実施態様において、hTRTイントロンは、
真核生物細胞におけるhTRTタンパク質の改良された発現
のための「ミニ遺伝子」に含まれる。
【０２１６】関連する局面において、本発明は、改変さ
れたhTRTポリペプチド、変化したhTRTポリペプチド、お
よび変異hTRTポリペプチドを含む、hTRTタンパク質また
はタンパク質のフラグメントをコードするポリヌクレオ
チドを提供する。１つの実施態様において、コードされ
るhTRTタンパク質またはフラグメントは、図17（配列番
号２）に示されるようなアミノ酸配列を有するか、また
は配列番号２の保存的置換を伴うアミノ酸配列を有す
る。１つの実施態様において、コードされるhTRTタンパ
ク質またはフラグメントは、タンパク質の活性（例え
ば、テロメラーゼ触媒活性）を変化させる置換を有す
る。
【０２１７】遺伝コードの縮重の結果として、hTRTタン
パク質をコードする核酸が、天然に存在するhTRT遺伝子
の配列を有する必要はないが、多数のポリヌクレオチド
が配列番号２のアミノ酸配列を有するhTRTポリペプチド
をコードし得ることが理解される。本発明は、公知のト
リプレット遺伝コードに従ってなされる可能なコドン選
択に基づいて組み合わせを選択することにより作製され
得るヌクレオチド配列のそれぞれのそして全ての可能な
変異を提供し、そしてすべてのこのような変異が本明細
書により特に開示される。従って、いくつかの場合には
天然に存在する配列のヌクレオチド配列にハイブリダイ
ズし得る（適切に選択されたストリンジェンシーの条件
下で）hTRTポリペプチドコードヌクレオチド配列が好ま
しいが、他の場合には実質的に異なるコドンの使用法を
用い、それゆえおそらく天然に存在する配列を有する核
酸にハイブリダイズしないhTRTをコードするヌクレオチ
ド配列を作製することが有利であり得る。
【０２１８】特定の実施態様において、本発明は、本明
細書中に開示されるhTRT核酸の部分配列（例えば、配列
番号１および６）を含む、hTRTオリゴヌクレオチドおよ
びポリヌクレオチドを提供する。本発明の核酸は、代表
的に、例示的なhTRTポリヌクレオチドの少なくとも約1
0、より多くの場合少なくとも約12、または約15の連続
する塩基を含有する。しばしば、本発明の核酸は、例え
ば、ポリペプチドまたは完全長hTRTタンパク質の発現が
意図される場合、より長い配列（例えば、少なくとも約
25、約50、約100、約200、または少なくとも約500〜300
0塩基の長さ）を含む。
【０２１９】なお他の実施態様において、本発明は、配
列番号３または配列番号４のような天然に存在するかま
たは天然に存在しないhTRTポリヌクレオチドに配列相同
性または相補性を有する「Δ182hTRT」ポリヌクレオチ
ドを提供する。これらは、pGRN121に見出される182ヌク
レオチドの配列（配列番号９[図24]）を含まない（そし
てまたクローン712562にも存在しない）。これらのポリ
ヌクレオチドは、部分的に興味深い。なぜなら、これら
は、pGRN121によりコードされるような「完全長」hTRT
ポリペプチド（配列番号２）に見出されるのとは異なる
組み合わせまたは配置のTRTモチーフを含むポリペプチ
ドをコードするからである。以下に議論するように、こ
れらのポリペプチドが天然で（例えば、細胞内のテロメ
ラーゼ発現の調節において）生物学的役割を果たし得、
および／または治療剤として（例えば、野生型タンパク
質の機能を阻害するドミナントネガティブ（dominannt-
negative）産物として）の用途が見出され得ること、あ
るいは例えば、本明細書中に記載されたような他の役割
および用途を有し得ることが意図される。
【０２２０】例えば、pGRN121によりコードされるポリ
ペプチドとは対照的に、クローン712562は、およそ30kD
の計算された分子量を有する259残基のタンパク質（本
明細書では以後「712562 hTRT」）をコードする。71256
2 hTRTポリペプチド（配列番号10[図19]）は、モチーフ
Ｔ，１、２、およびＡを含むが、モチーフＢ'、Ｃ、
Ｄ、およびＥを含まない（図４を参照のこと）。同様
に、治療活性および他の活性を有する変異hTRTポリペプ
チドは、pGRN121 cDNAと類似の核酸から発現され得る
が、例えば、図20（配列番号４）に示される配列を有す
るクローン712562において失われている182塩基対を欠
く。この核酸（本明細書では以後「pro90 hTRT」）は
（これは、本明細書中に記載のような通常の合成または
組換え法を用いて合成され得る）、配列番号１によりコ
ードされるhTRTタンパク質と同じアミノ末端配列を共有
するが、カルボキシ末端領域で異なる807残基（およそ9
0kDの計算分子量）のタンパク質をコードする（最初の7
63残基は共通であり、pro90 hTRTの最後の44残基が「完
全長」hTRTとは異なる）。pro90 hTRTポリペプチドは、
モチーフＴ、１、２、およびＡを含むが、モチーフＢ、
Ｃ、Ｄ、Ｅを含まず、従って、いくつかのテロメラーゼ
活性は有し得るが、全てのテロメラーゼ活性は有さない
ようである。
【０２２１】Ｃ）ヒトTRT核酸の産生 本発明のポリヌクレオチドは、hTRTをコードするポリペ
プチドまたはそのフラグメントの発現、天然に存在する
hTRT遺伝子またはRNAのハイブリダイゼーションおよび
／または増幅のためのセンスまたはアンチセンスのプロ
ーブまたはプライマーとしての使用（例えば、診断適用
または予測適用）、および治療剤（例えば、アンチセン
ス、３重鎖、またはリボザイムの組成物）としての使用
を含むがこれらに限定されない多くの用途を有する。本
開示を精査すれば明らかであるように、これらの用途
は、加齢、ガン、および受精能力、ならびに成長、生
殖、および細胞に基づく産物の製造に関連するヒトの疾
患の診断および処置に巨大な影響を有する。以下の節で
記載するように、本発明のhTRT核酸は、当該分野で周知
の技術を用いて作製（例えば、クローン化、合成、また
は増幅）され得る。
【０２２２】１）クローン化、増幅、および組換え産生 １つの実施態様において、hTRT遺伝子またはcDNAは、hT
RT mRNA、cDNA、またはゲノムDNAに特異的にハイブリダ
イズする核酸プローブを用いてクローン化される。この
目的に適切な１つのプローブは、図16（配列番号１）に
提供される配列の全てまたは一部を有するポリヌクレオ
チド（例えば、その部分配列を含むプローブ）である。
代表的には、標的hTRTゲノムDNAまたはcDNAは、ベクタ
ー（例えば、プラスミド、ファージ、ウイルス、酵母人
工染色体など）に連結され、そしてゲノムまたはcDNAラ
イブラリー（例えば、ヒトの胎盤cDNAライブラリー）か
ら単離され得る。一旦、hTRT核酸が同定されれば、これ
は、当業者に公知の標準的な方法に従って単離され得
る。hTRT遺伝子についてのヒトcDNAライブラリーのスク
リーニングの例示的な例を実施例１に提供する；同様
に、ヒトゲノムライブラリーのスクリーニングの例は、
実施例３および４に見出される。クローン化方法は周知
であり、そして例えば、以下に記載される：Ausubelら,
Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pu
blishing and Wiley-Interscience, NewYork (1997)；B
ergerおよびKimmel (1987) Methods in Enzymology, 第
152巻：Guide to Molecular Cloning Techniques, San
Diego: Academic Press,Inc.；Sambrookら (1989) Mole
cular Cloning：A Laboratory Manual, 第２版、第１〜
３巻, Cold Spring Harbor Laboratory（本明細書では
以後「Sambrook」）；Cashionら、米国特許第5,017,478
号；およびCarr、欧州特許第0,246,864号。
【０２２３】本発明はまた、ポリメラーゼ連鎖反応（PC
R）のような増幅方法により単離されたhTRTのゲノムま
たはcDNAの核酸を提供する。１つの実施態様において、
hTRTタンパク質コード配列は、プライマー5'-GTGAAGGCA
CTGTTCAGCG-3'（「TCP1.1」）および5'-CGCGTGGGTGAGGT
GAGGTG-3'（「TCP1.15」）を用いて、RNAまたはcDNA試
料（例えば、２本鎖胎盤cDNA（Clontech, Palo Alto C
A))から増幅される。いくつかの実施態様において、特
異性を増加させるために、例えば、「ネスティッドPC
R」用に、第３のプライマーまたは第２のプライマー対
が用いられ得る。第２のプライマー対の１例は、5'-CTG
TGCTGGGCCTGGACGATA-3'（「bill TCP6」）および5'-AGC
TTGTTCTCCATGTCGCCGTAG-3'（「TCP1.14」）である。hTR
T核酸の増幅のために有用な多くの他のプライマーおよ
びプライマーの組み合わせが本発明により提供されるこ
とは当業者には明らかである。
【０２２４】さらに、本発明は、hTRTゲノムDNA、cDN
A、またはRNAの任意の特定の領域（例えば、コード領
域、プロモーター領域、および／またはイントロン）ま
たは部分配列を増幅するプライマーを提供する。例え
ば、配列番号１の274/275の位置のhTRTイントロン（実
施例３を参照のこと）は、プライマーTCP1.57およびTCP
1.52（プライマー対１）またはプライマーTCP1.49およ
びTCP1.50（プライマー対２）を用いて（例えば、ゲノ
ムクローンの検出のために）増幅され得る。（プライマ
ー名は、以下の表２に列挙するプライマーをいう。）プ
ライマー対は、個別にまたはネスティッドPCRにおいて
（ここで、プライマーセット１が最初に使用される）使
用され得る。別の例示的な例は、（例えば、cDNAクロー
ンの大きさまたは完全性を評価するために）特異的に増
幅し、それゆえhTRT mRNAの5'末端またはhTRT遺伝子の
5'末端をコードするエキソンを検出するプライマーに関
する。以下のプライマー対は、hTRTの5'末端を増幅する
ために有用である：プライマーK320およびK321（プライ
マー対３）；プライマーK320およびTCP1.61（プライマ
ー対４）；プライマーK320およびK322（プライマー対
５）。このプライマーセットは、セット５の次にセット
４またはセット３、あるいはセット４またはセット５の
次にセット３の順番で、ネスティッドPCRにおいて使用
され得る。さらに別の例示的な例は、mRNAのほぼ真ん中
の３分の１（the middle third）を含む保存されたhTRT
TRTモチーフ領域を増幅または特異的に検出するために
選択されたプライマーを含む（例えば、（例えば、非ヒ
ト生物由来の）TRTクローンを同定するためのハイブリ
ダイゼーションプローブとして使用するために）。以下
のプライマー対は、hTRT核酸のTRTモチーフ領域を増幅
するために有用である：プライマーK304およびTCP1.8
（プライマー対６）、またはプライマーLT1およびTCP1.
15（プライマー対７）。このプライマーセットは、ネス
ティッドPCR実験においてセット６の次にセット７の順
番で使用され得る。
【０２２５】適切なPCR増幅条件は、当業者に公知であ
り、そして１単位のTaqポリメラーゼ（Perkin Elmer, N
orwalk CT）、100μMの各dNTP（dATP、dCTP、dGTP、dTT
P）、１×PCR緩衝液（50mM KCl、10mM Tris、室温にてp
H8.3、1.5mM MgCl2、0.01％ゼラチン）および0.5μMプ
ライマーを含み、94°にて45秒間、55°にて45秒間、お
よび72°にて90秒間を約30サイクルの増幅操作を伴う
（しかし、これらに限定されない）。他の熱安定性DNA
ポリメラーゼ、反応条件、およびサイクリングパラメー
ターもまた、適切な増幅を提供することが当業者には理
解される。hTRT核酸を得るために使用され得る他の適切
なインビトロ増幅方法は、本明細書中以下に記載のもの
を含むがこれらに限定されない。一旦増幅されれば、hT
RT核酸は、所望であれば、通常の分子生物学的方法を用
いて任意の種々のベクター中にクローン化され得るか、
または検出され得るか、さもなければ本発明の方法に従
って利用され得る。
【０２２６】当業者は、上記のように得られたクローン
化または増幅されたhTRT核酸が、化学合成、またはE.co
liのような細菌系（例えば、Ausubelら、前出を参照の
こと）、哺乳動物のような真核生物発現系に形質転換す
ることによる複製のような他の方法を用いて調製または
増加され得ることを認識する。同様に、hTRT RNAが、本
発明のインビトロ方法に従って、または例えば、T7、T
3、またはSP6のようなRNAポリメラーゼにより認識され
るプロモーターを含む市販のベクターを用いるE.coliの
ような細菌系において、またはRNAポリメラーゼプロモ
ーターを含むプライマーを用いるPCR増幅により生成し
たDNAの転写により発現され得る。
【０２２７】本発明はさらに、変化または改変されたhT
RT核酸を提供する。得られたクローン化または増幅され
たhTRT核酸が、当該分野で周知の方法（例えば、部位特
異的変異誘発、リンカースキャニング変異誘発）により
改変（例えば、短縮化、誘導体化、変化）され得るか、
または下記のように新たに簡単に合成され得ることは、
当業者により認識される。変化または改変したhTRT核酸
は、hTRT遺伝子または遺伝子産物のクローン化または操
作を容易にすること、あるいは変異hTRT遺伝子産物を発
現することを含むがこれらに限定されない種々の適用に
有用である。例えば、１つの実施態様において、hTRT遺
伝子配列は、以下に詳細に議論するように、例えば、hT
RTの保存されたモチーフにおける変異により、変化した
特性または活性を有するhTRTポリペプチドをコードする
ように変化される。別の例示的な例において、hTRT核酸
のタンパク質コード領域における変異は、グリコシル化
のパターンを変化させる、コドン優先度を変化させる、
スプライス変異体を産生する、プロテアーゼ感受性部位
を除去する、抗原性ドメインを生じる、比活性を変化さ
せるなどのために導入され得る。他の実施態様におい
て、hTRTおよびその誘導体をコードするヌクレオチド配
列は、コードされるアミノ酸配列を変化させずに変化さ
れる。例えば、より望ましい特性（例えば、天然に存在
する配列から産生される転写物と比較して増加した転写
効率あるいはより大きなまたはより短い半減期）を有す
るRNA転写物が産生される。さらに別の実施態様におい
て、変化したコドンは、特定の原核生物または真核生物
の発現宿主において生じるペプチドの発現速度を増加さ
せるために、特定のコドンが宿主により利用される頻度
に従って選択される。本発明の変異hTRTポリヌクレオチ
ドを調製するために使用され得る有用なインビトロおよ
びインビボ組換え技術は、SambrookらおよびAusubelら
（両方とも前出）に見出される。
【０２２８】上記のように、本発明は、hTRT遺伝子の隣
接（5'または3'）配列およびイントロン配列を有する核
酸を提供する。この核酸は、とりわけ、興味深い。なぜ
なら、これらはhTRT調節に関与し、ならびにhTRTおよび
他の組換えタンパク質またはRNA遺伝子産物の発現に有
用であるプロモーターおよび他の調節エレメントを含む
からである。配列番号６および７に提供される核酸配列
に加えて、さらなるhTRTイントロンおよび隣接配列が、
通常の分子生物学的技術を用いて容易に得られ得ること
が明らかである。例えば、さらなるhTRTゲノム配列は、
上記および実施例４に記載のλクローンGΦ5（ATCC受託
番号209024）から得られ得る。さらに他のhTRTゲノムク
ローンおよび配列は、配列番号１由来の配列または部分
配列を有するhTRT核酸プローブを用いてヒトゲノムライ
ブラリーをスクリーニングすることにより得られ得る。
さらなるクローンおよび配列（例えば、さらにより上
流）が、λGΦ5に由来する標識された配列またはサブク
ローンを用いて適切なライブラリーをプローブすること
により得られ得る。hTRT隣接配列をさらに特徴付けるた
めの他の有用な方法は、Gobindaら, 1993, PCR Meth.Ap
plic. 2：318；Trigliaら, 1988, Nucleic Acids Res.
16：8186；Lagerstromら, 1991, PCR MethodsApplic.
1：111；およびParkerら, 1991, Nucleic Acids Res. 1
9：3055により記載される一般的な方法を含む。
【０２２９】イントロン配列は、hTRTゲノム配列をhTRT
cDNA配列と比較すること（例えば、実施例３を参照の
こと）、S1分析（Ausubelら、前出、第４章を参照のこ
と）、または当該分野で公知の種々の他の手段のような
通常の手段により同定され得る。イントロン配列はま
た、細胞RNAの逆転写後に増幅またはクローン化され得
る、プレmRNA（すなわち、スプライシングされていない
かまたは不完全にスプライシングされたmRNA前駆体）中
に見出され得る。
【０２３０】所望の場合は、クローン化、増幅、さもな
ければ合成されたhTRTまたは他のTRT核酸の配列は、当
該分野で周知のDNA配列決定方法（例えば、Ausubelら、
前出を参照のこと）を用いて決定または確認され得る。
配列決定の有用な方法は、DNAポリメラーゼＩのKlenow
フラグメント、Sequenase（US Biochemical Corp, Clev
eland OH）、Taq DNAポリメラーゼ（Perkin Elmer, Nor
walk CT）、熱安定性T7ポリメラーゼ（Amersham, Chica
go IL）、またはGibco BRL（Gaithersburg MD）により
販売されるELONGASE増幅システムのような組換えポリメ
ラーゼと校正エキソヌクレアーゼとの組み合わせのよう
な酵素を用いる。オリゴヌクレオチド（例えば、化学合
成により新たに作製されたオリゴヌクレオチド）の配列
を配列決定または確認する場合、MaxamおよびGilbertの
方法が好ましいかもしれない（MaxamおよびGilbert, 19
80, Meth.Enz. 65：499；Ausubelら、前出、第７章）。
【０２３１】hTRTまたは他のTRT mRNAの5'非翻訳配列
は、mRNAの逆転写およびその後の得られたcDNAのクロー
ン化および配列決定のような標準的な方法を用いて、
「完全長」hTRTまたは他のcDNAをクローン化することに
より、直接決定され得る。より大きなcDNAを含むように
サイズにより選択された完全長cDNAをスクリーニングま
たは増幅するために好ましいオリゴ（dT）プライムライ
ブラリーが、好ましいかもしれない。ランダムプライム
ライブラリーもまた適切であり、そしてしばしば遺伝子
の5'領域を含むより大きな部分のクローンを含む。Froh
manら, 1988, Proc.Nat.Acad.Sci USA 85：8998に記載
されるRACEプロトコルのような、5'RNA配列を得るため
の他の周知の方法もまた使用され得る。所望である場
合、hTRTまたは他のTRTのmRNAの転写開始部位が、本明
細書中に提供される核酸（例えば、配列番号１の配列を
有する）を用いて、通常の方法により決定され得る。１
つの方法は、配列番号１の5'領域に由来する配列を有す
る標識されたDNAを用いるS1ヌクレアーゼ分析（Ausubel
ら、前出）である。
【０２３２】２）核酸の化学合成 本発明はまた、直接化学合成により生成されるhTRTポリ
ヌクレオチド（RNA、DNA、または修飾された）を提供す
る。化学合成は、一般的に、オリゴヌクレオチドの生成
に、または非標準的ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオ
チドおよびポリヌクレオチド（例えば、プローブ、プラ
イマー、およびアンチセンスオリゴヌクレオチド）に好
ましい。核酸の直接化学合成は、当該分野で公知の方法
により達成され得、例えば、Narangら、1979, Meth. En
zymol. 68:90のホスホトリエステル法；Brownら、Meth.
Enzymol. 68:109 (1979)のホスホジエステル法；Beauc
ageら、Tetra. Lett., 22:1859 (1981)のジエチルホス
ホルアミダイト法；および米国特許第4,458,066号の固
体支持体法がある。化学合成は、代表的には、一本鎖オ
リゴヌクレオチドを生成し、これは相補配列とのハイブ
リダイゼーションによって、またはテンプレートとして
一本鎖を用いるDNAポリメラーゼおよびオリゴヌクレオ
チドプライマーでの重合化によって、二本鎖DNAに変換
され得る。DNAの化学合成は、しばしば、約100または15
0塩基の配列に限定されるが、より長い配列は、より短
い配列の連結によって、またはより精巧な合成方法によ
って得られ得ることが、当業者には認識される。
【０２３３】本発明のhTRT（あるいはhTRまたは他の）
ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドが、所望の
特性（例えば、増加したヌクレアーゼ耐性、より堅い結
合、安定性、または所望のＴM）を与えるために、非標
準塩基（例えば、アデニン、シチジン、グアニン、チミ
ン、およびウリジン以外）または非標準骨格構造を用い
て作製され得ることが認識される。オリゴヌクレオチド
をヌクレアーゼ耐性にするための技法には、PCT公開公
報WO 94/12633に記載される技法が挙げられる。広範な
種々の有用な修飾されたオリゴヌクレオチドが生成され
得、ペプチド-核酸（PNA）骨格（Nielsenら、1991, Sci
ence 254:1497）を有するオリゴヌクレオチド、または
2'-O-メチルリボヌクレオチド、ホスホロチオエートヌ
クレオチド、メチルホスホネートヌクレオチド、ホスホ
トリエステルヌクレオチド、ホスホロチオエートヌクレ
オチド、ホスホルアミデートを組み込んだオリゴヌクレ
オチドが挙げられる。さらに他の有用なオリゴヌクレオ
チドは、2'位に以下の１つを含むアルキルおよびハロゲ
ンで置換された糖部分を含み得る：OH、SH、SCH3、F、O
CN、OCH3OCH3、OCH3O(CH2)nCH3、O(CH2)nNH2、またはO
(CH2)nCH3、ここで、nは１〜約10である；C1〜C10低級
アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、またはアラ
ルキル；Cl；Br；CN；CF3；OCF3；0-、S-、またはN-ア
ルキル；O-、S-、またはN-アルケニル；SOCH3；SO2C
H3；ONO2；NO2；N3；NH2；ヘテロシクロアルキル；ヘテ
ロシクロアルカリル；アミノアルキルアミノ；ポリアル
キルアミノ；置換シリル；RNA切断基；コレステリル
基；葉酸基；レポーター基；インターカレーター；オリ
ゴヌクレオチドの薬物動態学特性を改良するための基；
あるいはオリゴヌクレオチドおよび同様の特性を有する
他の置換基の薬力学特性を改良するための基。葉酸、コ
レステロール、またはオリゴヌクレオチドの取り込みを
促進する他の基（例えば、脂質アナログ）は、任意のヌ
クレオシドの2'位で、あるいは3'末端または5'末端のヌ
クレオシドのそれぞれ3'または5'位で、直接またはリン
カーを介して結合され得る。１つ以上のこのような結合
体が使用され得る。オリゴヌクレオチドはまた、ペント
フラノシル基の代わりにシクロブチルのような糖模倣物
を有し得る。他の実施態様は、少なくとも１つの修飾さ
れた塩基形態またはイノシンのような「普遍塩基」、あ
るいは、キューオシン（queosin）およびワイブトシン
（wybutosine）のような他の非標準塩基ならびに内因性
エンドヌクレアーゼにより容易に認識されないアデニ
ン、シチジン、グアニン、チミジン、およびウリジンの
アセチル、メチル、チオ、および同様に修飾された形態
の含有物を含み得る。本発明はさらに、例えば、ホスホ
ジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエー
ト、メチルホスホネート、ホスホルアミデート、アルキ
ルホスホトリエステル、スルファメート、3'-チオアセ
タール、メチレン（メチリミノ）、3'-N-カルバメー
ト、モルホリノカルバメート、キラルメチルホスホネー
トのような骨格アナログを有するオリゴヌクレオチド、
短鎖アルキルまたはシクロアルキル糖間結合、短鎖ヘテ
ロ原子またはヘテロ環糖間（「骨格」）結合、またはCH
2-NH-O-CH2、CH2-N(CH3)-OCH2、CH2-O-N(CH3)-CH2、CH2
-N(CH3)-N(CH3)-CH2、およびO-N(CH3)-CH2-CH2骨格を有
するヌクレオチド（ここで、ホスホジエステルはO-P-O-
CH2である）、またはこれらの混合物を提供する。モル
ホリノ骨格構造を有するオリゴヌクレオチドもまた有用
である（米国特許第5,034,506号）。
【０２３４】有用な参考文献としては、Oligonucleotid
es and Analogues, A Practical Approach, F. Eckstei
n編, IRL Press at Oxford University Press (1991)；
Antisense Strategies, Annals of the New York Acade
my of Sciences, 600巻, BasergaおよびDenhardt編 (NY
AS 1992)；Milliganら、1993年7月9日, J. Med. Chem.
36(14):1923-1937；Antisense Research and Applicati
ons (1993, CRC Press)その全体および特にSanghviによ
る「核酸のヘテロ環塩基修飾およびアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドにおけるその適用」という表題の15章、An
tisense Therapeutics, Sudhir Agrawal編 (Humana Pre
ss, Totowa, New Jersey, 1996)が挙げられる。
【０２３５】Ｄ）核酸の標識 例えば、hTRTまたは他のオリゴヌクレオチドまたはポリ
ヌクレオチドが核酸プローブとして用いられるべき場
合、本発明の核酸を標識することはしばしば有用であ
る。標識（以下を参照のこと）は、当業者に周知の多く
の手段により組み込まれ得る。１つの実施態様では、増
幅されていない核酸（例えば、mRNA、ポリAmRNA、cDN
A）が標識される。標識された核酸を生成する手段は、
当業者に周知であり、そして、例えば、ニックトランス
レーション、ランダムプライマー標識、末端標識（例え
ば、キナーゼを用いて）、および化学結合（例えば、光
ビオチン化）または合成が挙げられる。他の実施態様で
は、標識は、試料核酸の調製における増幅工程中に同時
に組み込まれる。したがって、例えば、標識されたプラ
イマーまたは標識されたヌクレオチドを用いるポリメラ
ーゼ連鎖反応（PCR）または他の核酸増幅方法は、標識
された増幅産物を提供する。他の実施態様では、標識さ
れたヌクレオチド（例えば、フルオレセイン標識UTPお
よび／またはCTP）を用いる転写増幅が、転写された核
酸中に標識を組み込む。増幅産物はまた、またはあるい
は、増幅が完了した後に標識され得る。
【０２３６】Ｅ）例示のオリゴヌクレオチド 上記および以下に詳細に論じるように、オリゴヌクレオ
チドは、プライマー、プローブ、治療剤、または他のア
ンチセンスオリゴヌクレオチド、三重鎖オリゴヌクレオ
チドとしての用途を含む種々の用途、ならびに本開示か
ら明らかな多くの他の用途について、使用される。表２
〜６は、本発明の実施に使用され得るある例示の特定の
オリゴヌクレオチドを提供する。本発明の多くの他の有
用なオリゴヌクレオチドは、当業者によって本明細書中
に提供される指針に従って合成され得る。
【０２３７】表２〜６において、「seq」は、そのプラ
イマーが配列決定に用いられたかまたは有用であること
を意味し；「PCR」は、そのプライマーがPCRに用いられ
たかまたは有用であることを意味し；「AS」は、そのプ
ライマーがテロメラーゼ活性のアンチセンス阻害に用い
られたかまたは有用であることを意味し；「CL」は、そ
のプライマーがhTRT遺伝子またはRNAのクローニング領
域に用いられたかまたは有用であることを意味し；「mu
t」は、そのプライマーがhTRT遺伝子または遺伝子産物
の変異体を構築するために用いられたかまたは有用であ
ることを意味する。「UC」は「大文字」を意味し、そし
て「lc」は「小文字」を意味する。ミスマッチおよび挿
入（配列番号１に対して）を下線により示し；欠失を
「-」により示す。表２〜６においては、任意の１つの
用途またはセットの用途への任意の特定のオリゴヌクレ
オチドの使用を制限することは意図されないことが理解
される。
【０２３８】
【表２】
【０２３９】
【表３】
【０２４０】
【表４】
【０２４１】
【表５】
【０２４２】
【表６】
【０２４３】IV．TRTタンパク質およびペプチド Ａ）一般 本発明は、特に、テロメラーゼ活性の産生、細胞内での
テロメラーゼ活性の阻害、抗TRT免疫応答の誘導に有用
な種々の広範囲のhTRTタンパク質を、治療剤として、ま
たは臨床アッセイでの標準あるいはコントロールとし
て、hTRTまたはテロメラーゼの活性を活性化または阻害
し得る化合物のスクリーニングでの標的として提供し、
そして、当業者に明白であるか、またはそうでなければ
本明細書中に記載されている多数のその他の使用を提供
する。本発明のhTRTは、以下に例示を目的として詳細に
記載されているように、（例えば、テロメラーゼ陰性細
胞でのテロメラーゼ活性を確認するために有用な）機能
的に活性なタンパク質および（例えば、細胞でのテロメ
ラーゼ活性を阻害するために有用な）変異体、不活性変
異体、hTRTポリペプチド、ならびに、天然に存在するhT
RTおよびテロメラーゼの１種、数種、または全ての機能
活性を示すテロメラーゼRNP（例えば、タンパク質を含
有するリボ核タンパク質複合体）を包含する。
【０２４４】１つの実施態様では、本発明のhTRTタンパ
ク質は、図17（配列番号２）に示される配列、あるいは
そのフラグメントを有するポリペプチドである。別の実
施態様では、hTRTポリペプチドは、アミノ酸残基の内部
の欠損、挿入、または保存的置換によって、配列番号２
とは異なる。関連の実施態様では、本発明は、配列番号
２と実質的な類似性を有するhTRTポリペプチドを提供す
る。本発明はさらに、配列番号２のアミノ酸配列に関し
て、例えば、切形、変異、誘導体化、または他の配列と
の融合（例えば、融合タンパク質を形成する）の様式
で、改変されたhTRTポリペプチドを提供する。さらに、
本発明は、テンプレートRNA（例えば、hTR）と複合体化
された本発明のhTRTタンパク質を含有するテロメラーゼ
RNPを提供する。他の実施態様では、１種以上のテロメ
ラーゼ会合タンパク質は、hTRTタンパク質および／また
はhTRと会合する。
【０２４５】本発明はまた、配列番号５（図20）、配列
番号10（図19）の配列、またはそれらと実質的な類似性
を有するタンパク質、およびそのフラグメント、変異体
または誘導体のような他の天然に存在するhTRT種または
天然に存在しない変異体を提供する。
【０２４６】本発明は、さらに、他のhTRT種および変異
体を提供する。hTRT変異体の１つの例は、クローン7125
62（配列番号３(図18)）または配列番号４(図20)に示さ
れるpro90変異体hTRTによりコードされるmRNAのリボソ
ームフレームシフトより得られ得、従って、全TRTモチ
ーフを有するhTRTポリプチドを合成し得る（一般的な例
は、例えば、Tsuchihashiら、1990, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 87:2516；Craigengenら、1987, Cell 50:1 W
eiss, 1990, Cell 62:117を参照のこと）。リボソーム
フレームシフトは、特定のmRNA配列または二次構造が、
リボソームを停止させ、そして配列中で１ヌクレオチド
を前方または後方に飛ばすときに、生じ得る。従って、
712562 mRNAでのリボソームフレームシフト事象は、約5
23アミノ酸残基ポリペプチドの合成をなし得る。pro90
配列でのリボソームフレームシフト事象は、約1071残基
を有するタンパク質をもたらし得る。リボソームフレー
ムシフトから得られるタンパク質はまた、本発明によっ
て提供される合成または組換え法によって発現され得る
ことが理解される。
【０２４７】ヒトTRTタンパク質、ペプチド、および機
能的に等価のタンパク質が、下記により詳細に議論され
ているような、精製、化学合成、または組換え産生によ
って得られ得る。
【０２４８】Ｂ）TRTタンパク質活性 本発明のTRTポリペプチド（フラグメント、変異体、オ
ルタナティブ(alternative)対立遺伝子産物、および融
合タンパク質を含む）は、天然hTRTに関連する１つ以上
または全ての機能活性を有し得る。本明細書に使用され
ているように、記載以外にhTRTまたは他のTRTポリペプ
チドは、活性が、会合RNA（例えば、hTR）を有さないhT
RTタンパク質またはhTRT会合RNA（例えば、hTR）複合体
中のhTRTタンパク質のいずれかによって示されるときに
は、特定の活性を有すると考えられる。hTRTのhTR結合
活性は、hTRTタンパク質に関連する活性の１つの例であ
る。本発明の核酸（例えば、hTR）およびhTRTポリペプ
チドの複合体を産生する方法は、以下に記載される。
【０２４９】hTRTタンパク質の、天然hTRTと異なる補体
活性を有するような改変（例えば、hTRTポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドの変異または改変、または
天然ポリヌクレオチド配列と異なる配列を有するポリヌ
クレオチドの化学合成を含む、化学的または組換え方法
による）は、治療適用、あるいはhTRTまたはテロメラー
ゼの活性の特異的モジュレーターのスクリーニングに有
用であり得る。さらに、種々のhTRT活性についてのアッ
セイは、hTRTまたはテロメラーゼと相互作用してテロメ
ラーゼ活性を変化させる薬剤（例えば、活性調節剤）を
同定するのに特に有用であり得る。
【０２５０】下記に議論されているように、天然hTRTの
活性は、以下を包含する：テロメラーゼ触媒活性（前進
(processive)活性または非前進(non-processive)活性の
いずれかであり得る）；テロメラーゼ前進性；従来の逆
転写活性；ヌクレオチド分解活性；プライマーまたは基
質（テロメアまたは合成テロメラーゼ基質またはプライ
マー）結合活性；dNTP結合活性；RNA（すなわち、hTR）
結合活性；およびタンパク質結合活性（例えば、テロメ
ラーゼ会合タンパク質、テロメア結合タンパク質、また
はタンパク質−テロメリックDNA複合体への結合）。し
かし、本発明はまた、任意の特定のhTRT活性を有さない
が、hTRTまたは他のTRTタンパク質（例えば、特定の典
型的に短い免疫原ペプチド、阻害性ペプチド）に関連す
るなんらかの有用活性を有するhTRT組成物を提供するこ
とが理解される。
【０２５１】１）テロメラーゼ触媒活性 本明細書で使用されているように、本発明のポリペプド
は、ポリペプチドが、テンプレート核酸（例えば、hT
R）によってコードされる配列の１つの反復（例えば、T
TAGGG）の、部分的、１つ、または２つ以上の付加によ
ってテロメラーゼ基質として機能するDNAプライマーを
伸長し得るとき、「テロメラーゼ触媒活性」を有する。
この活性は、前進的または非前進的であり得る。前進活
性は、DNAが酵素複合体によって放出される前に、テロ
メラーゼRNPがプライマーまたはテロメラーゼに複数の
反復を付加するときに生じる。非前進活性は、テロメラ
ーゼが、プライマーに、部分的、または１つのみの反復
を付加し、そして放出されるときに、生じる。しかし、
インビボにおいて、非前進反応は、引き続く一連の会
合、伸長、および解離により、複数の反復を付加し得
る。これはインビトロにおいて同様に生じ得るが、標準
的なアッセイでのテロメラーゼを超える大過剰モルのプ
ライマーによる標準的なアッセイ条件下では典型的に観
察されない。
【０２５２】非前進活性を有するとしてhTRTポリペプチ
ドを特徴づけるために、従来のテロメラーゼ反応が、典
型的に最高の効果を有する温度およびdGTPを伴う、非前
進反応に好ましい条件、例えば、高温（すなわち、35〜
45℃、典型的には37℃）、低dGTP濃度（1μM以下）、高
プライマー濃度（5μM以上）、および高dATP/TTP濃度
（２mM以上）を用いて実施される。前進活性を有すると
してhTRTポリペプチドを特徴づけるために、従来のテロ
メラーゼ反応が、典型的に最も臨界的である温度および
dGTP濃度を伴う、非前進反応に好ましい条件（例えば、
27〜34℃、典型的には30℃）、高dGTP濃度（10μM以
上）、低プライマー濃度（１μM以下）、および／また
は低dATPおよびTTP濃度（0.3-１mM）を用いて、実施さ
れる。あるいは、TRAPアッセイ（前進活性または適度な
前進活性について）、またはドットブロットアッセイお
よびゲルブロットアッセイ（前進活性について）が使用
され得る。本発明のhTRTポリペプチドは、非前進活性を
有し得るが、前進活性（例えば、hTRTポリペプチドの代
替が、転位（translocation）する能力を減少または除
去するときに）は、単に前進的であり得るか、または両
方の活性を有し得る。
【０２５３】ａ）非前進活性 非前進テロメラーゼ触媒活性は、3'末端がRNAテンプレ
ートにアニールする位置からテンプレート配列の5'末端
にDNAプライマーを伸長し得、典型的には最初のＧ残基
の付加で終わる（例えば、テンプレートがhTRである場
合）。表７に示されているように、付加されるヌクレオ
チドの正確な数は、TTAGGG反復配列におけるプライマー
の3'末端ヌクレオチドの位置に依存する。
【０２５４】
【表７】
【０２５５】従って、４ヌクレオチドが、--TTAGGGプラ
イマーに付加され(i)、一方、６ヌクレオチドが--TTAG
プライマーに付加される(ii)。前進反応においてテロメ
ラーゼによって付加される最初の反復は、この工程と等
価である；しかし、前進反応では、テロメラーゼは、3'
末端が放出され、別の反復のプライマー付加に十分な位
置でのテンプレートの3'領域で再結合する転位工程を実
施する（Morin, 1997,Eur. J. Cancer 33:750を参照の
こと）。
【０２５６】完全な非前進反応は、１つの合成プライマ
ーを使用して、従来のアッセイにおいて１バンドのみを
産生する。この得られたものはまた、末端トランスフェ
ラーゼ活性のような他の酵素によって産生され得るの
で、産物がテロメラーゼ触媒活性の結果であることを証
明することは、いくつかの適用で望まれ得る。テロメラ
ーゼ（hTRTを有する）により生じたバンドは、いくつか
のさらなる特徴によって区別され得る。プライマー末端
に付加されるヌクレオチド数は、プライマー3'末端の位
置に一致するはずである。従って、--TTAGGGプライマー
は、４ヌクレオチドが付加するはずであり、--TTAGプラ
イマーは、６ヌクレオチドが付加するはずである（上記
を参照のこと）。実際に、２つ以上の配列が入れ換った
プライマーが使用され得、これらは、同じ全長を有する
が、異なる5'終端および3'終端を有する。例として、プ
ライマー5'-TTAGGGTTAGGGTTAGGGおよび5'-GTTAGGGTTAGG
GTTAGGの非前進伸長は、その絶対長が１ヌクレオチド差
である産物を生成し得る（22ntの全長のために5'-TTAGG
GTTAGGGTTAGGGに４つが付加され、23ntのために全長の
ために5'-GTTAGGGTTAGGGTTAGGに５つが付加される）。
反応のヌクレオチド依存性は、プライマー末端の位置に
一致するはずである。従って、--TTAGGGプライマー産物
は、dGTP、TTP、およびdATPを要求するが、dCTPは必要
としないはずであり、そして---AGGGTTプライマー産物
は、dGTPおよびdATPを要求し、TTPまたはdCTPを必要と
しないはずである。活性は、hTRを分解して、その結果
テンプレート除去する条件下でのRNAaseまたはミクロコ
ッカスヌクレアーゼの前処理に対して感受性であるはず
である（Morin, 1989, Cell 59:521を参照のこと）。
【０２５７】ｂ）前進活性 実際には、前進活性は、従来のアッセイ、TRAPアッセ
イ、またはゲルブロットアッセイでの６ヌクレオチドラ
ダーの出現によって容易に観察される。ドットブロット
アッセイもまた使用され得るが、このような方法ではラ
ダーは検出されない。従来のアッセイは、Morin, 1989,
Cell 59:521に記載され、これは、その全体において、
そして全目的のために本明細書中で援用される。TRAPア
ッセイは、米国特許第5,629,154号に記載されており、P
CT公開 WO 97/15687、PCT公開 WO 95/13381；Kruppら、
Nucleic Acids Res., 1997, 25:919；および、Wright
ら、1995, Nuc. Acids Res. 23:3794もまた参照のこ
と。これらの各々は、その全体において、そして全目的
のために本明細書中で援用される。ドットブロットアッ
セイは、活性を検出するために使用される（CCCUAA)nプ
ローブの安定なハイブリダイゼーションに要求される３
つ以上の反復を付加しない非前進活性が、同じものが前
進性を生じるかどうか、すなわち、プローブが、予測さ
れるテロメラーゼ基質を検出するかどうかを決定するた
めに、化合物またはhTRT変異体を用いて試験され、次い
でその化合物または変異体が非前進活性を前進活性に変
化し得る様式で、使用され得る。前進テロメラーゼ触媒
活性についての他のアッセイもまた、例えば、Tatemats
uら、1996, Oncogene 13:2265のストレッチPCRアッセイ
で使用され得る。従来のアッセイとドットブロットアッ
セイとの組み合わせのゲルブロットアッセイもまた、使
用され得る。この変法で、従来アッセイが、放射標識ヌ
クレオチドなしに、そして高いdGTP濃度（例えば、0.1
〜２mM）で実施される。従来アッセイの実施後、合成さ
れたDNAは、変性PAGEによって分離され、そしてメンブ
レン（例えば、ニトロセルロース）に移される。次に、
テロメリックDNA（テロメラーゼ産物−伸長したテロメ
ラーゼプライマーまたは基質）が、標識されたテロメリ
ックDNAプローブ（例えば、前出のドットブロットアッ
セイで使用されたようなCCCTAA配列を有するプローブ）
を使用するハイブリダイゼーションのような方法によっ
て検出され得る。この技術の利点は、従来アッセイより
も感度が高く、合成フラグメントのサイズ、および反応
の前進性についての情報を提供することである。
【０２５８】ｃ）活性測定 hTRTポリペプチドのテロメラーゼ活性は、未精製、部分
精製、または実質的に純粋なhTRTポリペプチド（例え
ば、hTRとの会合で）を使用して、インビトロで、また
はインビボ発現後に測定され得る。例えば、細胞（例え
ば、本発明の組換えhTRTポリペプチドを発現する細胞）
でのテロメラーゼ活性は、テロメアの長さの増加または
減少を検出することによってアッセイされ得る。テロメ
ラーゼ触媒活性の典型的なアッセイは、hTRと複合体化
されたhTRTを使用して実施され得る；しかし、オルタナ
ティブテロメラーゼテンプレートRNAが置換され得る
か、またはテロメラーゼ−プライマー結合のような別の
活性を測定するためのアッセイが行われ得る。テロメア
の長さを測定するアッセイは、当該分野で公知であり、
そしてテロメリックDNAへのプローブのハイブリダイゼ
ーション（増幅工程が包含され得る）、およびTRF分
析、すなわち、制限エンドヌクレアーゼ切断後のテロメ
リックDNA制限フラグメント[TRF]の分析、を包含する。
PCT公開WO 93/23572およびWO 96/41016；Counterら、19
92, EMBO J. 11:1921；Allsoppら、1992, Proc. Nat'l.
Acad. Sci. USA 89:10114；Sanno, 1996, Am J Clin P
athol 106:16,およびSanno, 1997, Neuroendocrinology
65:299を参照のこと。
【０２５９】hTRTポリペプチドのテロメラーゼ触媒活性
は、前出のアッセイおよびその他のテロメラーゼ触媒活
性アッセイを使用する多数の方法で測定され得る。１つ
の方法に従って、hTRTタンパク質が、hTRが発現される
（すなわち、細胞で正常に、または組換え発現によるい
ずれかで）テロメラーゼ陰性ヒト細胞で、発現され（例
えば、以下に記載されるように）、そして細胞または細
胞溶解物中のテロメラーゼ活性の存在または非存在が測
定される。適切なテロメラーゼ陰性細胞の例は、IMR 90
（ATCC, #CCL-186）またはBJ細胞（ヒト包皮線維芽細胞
株；例えば、Fengら、1995, Science 269:1236を参照の
こと）。その他の例は、網膜着色上皮細胞（RPE）、ヒ
ト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC; ATCC #CRL-1730）、ヒト
大動脈内皮細胞（HAEC; Clonetics Corp, #CC-2535）、
およびヒト乳房上皮細胞（HME; Hammondら、1984, Pro
c. Nat'l. Acad. Sci. USA 81:5435; Stampfer, 1985,
J. Tissue Culture Methods 9:107）を包含する。別の
実施態様では、hTRTポリペプチドは、テロメラーゼ陽性
細胞で発現され（例えば、hTRT発現ベクターでのトラン
スフェクションによって）、そしてトランスフェクトさ
れていないコントロール細胞に比較して、細胞でのテロ
メラーゼ活性の増加が、ポリペプチドがテロメラーゼ触
媒活性を有する場合に検出される。通常、hTRTを発現す
る適切な発現ベクターでトランスフェクトされた細胞で
のテロメラーゼ触媒活性は、トランスフェクトされてい
ない（コントロール）細胞より、少なくとも約２倍、少
なくとも約５倍、または少なくとも約10倍〜100倍さ
え、または1000倍でさえ、有意に大きく増加する。
【０２６０】別の実施態様では、hTRTタンパク質が、精
製目的のための標識、すなわち「エピトープタグ」を有
する融合タンパク質として（下記を参照のこと）、細胞
(例えば、hTRが発現されるテロメラーゼ陰性細胞で)発
現される。１つの実施態様では、RNPは、タグを特異的
に認識する抗体を使用して細胞から回収される。好まし
いタグは、典型的に、短いかまたは小さく、そして切断
部位、またはhTRTポリペプチドからタグを除去し得る他
の特性を有し得る。適切なタグの例は、Xpress TMエピト
ープ（Invitrogen, Inc., San Diego CA）、および、抗
体または核酸、あるいは実施例６に記載されているよう
な他の等価な方法によって、特異的に結合され得る他の
部分を包含する。別のタグは、例えば、配列番号２のタ
ンパク質の翻訳を開始するATGコドンの上流の配列番号
１に挿入される配列によってコードされるものを包含
し、これは、上流配列への（新しい）メチオニン開始コ
ドンの挿入を包含し得る。
【０２６１】hTRT変異体が、（例えば、融合タンパク質
として）細胞で発現され、次に（例えば、リボ核タンパ
ク質複合体として）単離されるとき、他の細胞タンパク
質（すなわち、テロメラーゼ会合タンパク質）が、単離
された複合体と会合し得る(それに直接的または間接的
に結合し得る)ことが理解される。このような場合に、h
TRT、hTR、および関連タンパク質を含有する複合体につ
いてテロメラーゼ活性をアッセイすることが、ときに望
まれる。
【０２６２】２）他のテロメラーゼまたはTRTタンパク
質の活性 本発明のhTRTポリペプチドは、テロメラーゼ触媒活性を
欠くが、１つ以上の他のテロメラーゼ活性を保持する変
異体を包含する。これらの他の活性、および、このよう
な活性を測定する本発明の方法は、（限定されないが）
以下の節に議論されているものを包含する。
【０２６３】ａ）従来の転写酵素活性 テロメラーゼの従来の逆転写活性は、例えば、Morin, 1
997,前出、およびSpenceら、1995, Science 267:988に
記載されている。hTRTは、逆転写触媒活性に要求される
保存されたアミノ酸モチーフを有するので、hTRTは、あ
る種の外因性（例えば、非hTR）RNAを転写する能力を有
する。従来のRTアッセイは、アニールしたDNAプライマ
ーを伸長することによって、RNAテンプレートを転写す
る酵素の能力を測定する。逆転写活性は、当該分野で公
知の多数の方法、例えば、標識核酸プライマー（例え
ば、RNAまたはDNA）のサイズの増加、または標識dNTPの
取り込みを測定することによって測定され得る(例え
ば、前出Ausubelらを参照こと)。
【０２６４】hTRTはhTRと特異的に会合するので、従来
のRTアッセイに対するDNAプライマー／RNAテンプレート
が、hTRおよび／またはテロメリックDNAプライマーに関
連する特徴を有するように改変され得ることは、理解さ
れる。例えば、RNAは、配列（CCCTAA)nを有し得、ここ
で、ｎは、少なくとも１または少なくとも３、あるいは
少なくとも10以上である。１つの実施態様では、（CCCT
AA)n領域は、RNAの5'末端またはその付近に存在する
（テロメラーゼRNAでのテンプレート領域の5'位置に類
似する）。同様に、DNAプライマーは、TTAGGGテロメア
配列の部分を有する3'末端、例えば、XnTTAG、XnAGGG、
Xn（TTAGGG）qTTAGなどを有し得、ここで、Xは、非テロ
メリック配列であり、そしてnは、8〜20または6〜30で
あり、qは、1〜4である。別の実施態様では、DNAプライ
マーはRNAテンプレートに相補的でない5'末端を有し、
その結果、プライマーがRNAにアニールされるとき、プ
ライマーの5'末端が結合されずに残る。本発明の方法に
適用され得る標準的な逆転写アッセイのさらなる改変
が、当該分野で公知である。
【０２６５】ｂ）ヌクレオチド分解活性 テロメラーゼのヌクレオチド分解活性は、例えば、Mori
n, 1997,前出；CollinsおよびGrieder, 1993, Genes an
d Development 7:1364に記載されている。テロメラーゼ
は、ヌクレオチド分解活性を有する(JoyceおよびSteit
z, 1987, TrendsBiochem, Sci. 12:288)；しかし、テロ
メラーゼ活性は定義されている特性を有する。テロメラ
ーゼは、ヒトおよびTetrahymenaでは、DNAの3'末端が、
DNAテンプレート配列の5'境界に位置するときに、オリ
ゴヌクレオチドの3'末端から、優先的にヌクレオチドを
通常１つだけ除去する。このヌクレチドは、テロメリッ
ク反復（ヒトではTTAGGである）の最初のＧである。テ
ロメラーゼは、優先的にＧ残基を除去するが、その他の
ヌクレオチドに対するヌクレオチド分解活性を有する。
この活性は、モニターされ得る。２つの異なる方法が、
例示目的に本明細書に記載されている。１つの方法は、
全テンプレート配列に結合するプライマーとの従来のテ
ロメラーゼ反応（すなわち、テンプレート境界；ヒトで
は5'-TAGGGATTAGでの終止）である。ヌクレオチド分解
活性は、最終dG残基の、アッセイで提供される放射標識
dGTPとの置換をモニターすることによって観察される。
この置換は、ゲル電気泳動およびオートラジオグラフィ
ーによって示される、開始プライマーのサイズでのバン
ドの出現によってモニターされる。
【０２６６】好ましい方法は、テロメラーゼによって伸
長され得ない「ブロックされた」3'末端を有するDNAプ
ライマーを使用する。3'ブロックプライマーは、標準的
なテロメラーゼアッセイで使用され得るが、3'ヌクレオ
チドがテロメラーゼのヌクレオチド分解活性によって除
去されない限り、伸長されない。この方法の利点は、テ
ロメラーゼ活性が、いくつかの標準的な方法のいずれに
よりモニターされ得、そのシグナルが強く、そして定量
が容易であることである。プライマーの3'末端のブロッ
クは、いくつかの方法によって完了され得る。１つの方
法は、標準的なオリゴヌクレトチド合成法を用いる、プ
ライマーの3'末端での3'-デオキシ-dNTP残基の付加であ
る。この末端は、2'OHを有するが、テロメラーゼに必要
な3'OHを有さない。3'末端をブロックする他の方法は、
例えば、3'ジデオキシ末端、3'アミン末端などに存在す
る。hTRTヌクレオチド分解アッセイに対するプライマー
の例は、5'-TTAGGGTTAGGGTTA(G3'H)であり、ここで、最
後の残基は、3'-デオキシグアノシン残基を示す（Glen
Research, Sterling, VA）。本開示に基づく適切なプラ
イマーに対する多数の他の変化は、当業者に公知であ
る。
【０２６７】ｃ）プライマー（テロメア）結合活性 テロメラーゼプライマー（テロメア）結合活性は、例え
ば、Morin, 1997,前出；Collinsら、1995, Cell 81:67
7; Harringtonら、1995, J. Biol. Chem. 270:8893に記
載されている。テロメラーゼは、テロメリックDNAプラ
イマーに結合する２つの部位を有すると考えられる。プ
ライマー結合に関連するRTモチーフは、hTRTおよび／ま
たはhTRT/hTRはDNAプライマー結合活性を有することを
示す。プライマー結合活性をアッセイするいくつかの方
法が存在する；しかし、ほとんどの方法に共通する工程
は、適切な結合条件下における、標識DNAプライマー
の、hTRTあるいはhTRT/hTRまたは他のTRT/TR組み合わせ
とのインキュベーションである。さらに、ほとんどの方
法は、非結合DNAを、タンパク質結合DNAから分離する手
段を用いる；これらの方法は、以下を包含する。
【０２６８】ｉ）ゲルシフトアッセイ（電気泳動／移動
度シフトアッセイとも呼ばれる）は、非結合DNAプライ
マーが、タンパク質結合DNAプライマーから、非変性ゲ
ル上での電気泳動によって分離されるアッセイである
（Ausubelら、前出）。
【０２６９】ii）マトリックス結合アッセイは、基本技
術に対していくつかの変法を包含し、これは、標識プラ
イマーとのインキュベーションの前または後のいずれか
で、hTRまたはhTRT/hTR複合体のマトリックス（例え
ば、ニトロセルロース）への結合を包含する。hTRTのマ
トリクッスへの結合によって、非結合プライマーが、結
合プライマーから機械的に分離され得る。残りの非結合
DNAは、定量前にメンブレンを洗浄することによって除
去され得る。当業者は、化学的、光化学的、UV架橋結
合、抗体／エピトープ、および非共有的（疎水的、静電
気的など）な相互作用を含む、このようなマトリック
ス、固体支持体、およびメンブレンへの、タンパク質の
結合方法がいくつか存在することを認識する。
【０２７０】DNAプライマーは、テロメラーゼに対して
親和性を有する任意のDNA、例えば、（TTAGGG)n（ここ
で、nは、1〜10であり得、典型的には3〜5である）のよ
うなテロメリックDNAプライマーであり得る。3'末端お
よび5'末端は、反復配列の任意の位置で終わり得る。プ
ライマーはまた、標識または欠損を促進し得る非テロメ
リックDNAの5'または3'の伸長を有し得る。プライマー
はまた、例えば、検出または単離を促進するように誘導
体化され得る。
【０２７１】ｄ）dNTP結合活性 テロメラーゼのdNTP結合活性は、例えば、Morin, 199
7、前出；Spenceら、前出に記載されている。テロメラ
ーゼは、DNAを合成するためにdNTPを必要とする。hTRT
タンパク質は、ヌクレオチド結合活性を有し、そして他
のヌクレオチド結合タンパク質と同様の様式（Kantrowi
tzら、1980,Trends Biochem. Sci. 5:124）で、dNTP結
合についてアッセイされ得る。典型的には、標識された
dNTPまたはdNTPのアナログの結合は、当該分野で公知で
あるように、非テロメラーゼRTタンパク質についてモニ
ターされ得る。
【０２７２】ｅ）RNA（すなわち、hTR）結合活性 テロメラーゼのRNA（すなわち、hTR）結合活性は、例え
ば、Morin, 1997、前出; Harringtonら、1997, Science
275:973; Collinsら、1995, Cell 81:677に記載されて
いる。本発明のTRTタンパク質のRNA結合活性は、標識RN
Aプローブを用いる、前記のDNAプライマー結合アッセイ
と同様の様式でアッセイされ得る。結合および非結合の
RNAの分離方法、およびRNAの検出方法は、当該分野で周
知であり、DNAプライマー結合アッセイについて記載さ
れているのと同様の様式で、本発明の活性アッセイに適
用され得る。RNAは、全長hTR、hTRのフラグメント、ま
たはテロメラーゼまたはhTRTに対して親和性を有するこ
とが実証された他のRNAであり得る。米国特許第5,583,0
16号およびPCT公開第96/40868号を参照のこと。
【０２７３】３）標的としてのテロメラーゼモチーフ 本発明は、前記のように、活性の完全な相補性（前記の
ような）を有する組換えhTRTに加えて、天然に存在する
テロメラーゼまたはhTRTまたは他のTRTタンパク質のテ
ロメラーゼ活性の完全な相補性より少ないhTRTポリペプ
チドを提供する。RTおよびTRTのテロメラーゼ特異的モ
チーフの本明細書の開示を考慮して、前記のモチーフ配
列中に認められるような、保存されたアミノ酸残基の変
化または変異は、治療、薬剤スクリーニング、および特
徴づけ、および他の使用に有用である、活性を失なった
変異体をもたらすことが理解される。例えば、実施例１
に記載されているように、S. pombeの外因性TRT遺伝子
のRTドメインでのモチーフＢ〜Ｄの欠失は、テロメア
が、テロメアプローブのテロメリック反復へのハイブリ
ダイゼーションがほとんど検出されない位置に順次短く
されたハプロイド細胞をもたらす。このことは、テロメ
ラーゼ触媒活性の消失を示す。同様に、モチーフEのWxG
xS部位での変化は、テロメラーゼDNAプライマーの結合
または機能に影響し得る。さらに、モチーフA、B'、お
よびCでのアミノ酸変化は、テロメラーゼの触媒活性に
影響し得る。hTRTのDDモチーフの変異は、テロメラーゼ
活性を、有意に減少または無くし得る（実施例１６を参
照のこと）。
【０２７４】ｃ）hTRTおよびその他のTRTポリペプチド
の合成 本発明は、本明細書に開示されているhTRTおよび他のTR
Tポリペプチドを生産する種々の方法を提供する。下記
の節に、hTRTタンパク質の化学合成合および組換え発現
（融合タンパク質を含む）が、いくぶん詳細に記載され
ている。
【０２７５】１）化学合成 本発明は、当該分野で周知の一般的な化学的な方法を使
用して、全体または部分的に合成されたhTRTポリペプチ
ドを提供する（例えば、Caruthersら、1980, Nucleic A
cids Res.Symp. Ser., 215-223;および、Hornら、1980,
Nucleic AcidsRes. Symp. Ser., 225-232）。例えば、
ペプチド合成は、自動化された合成（例えば、製造者に
よって提供された使用説明書に従う、Perkin Elmer ABI
431APeptide Synthesizerを使用する）を含む、種々の
固相法(Robergeら、1995,Science 269;202)を使用して
実施され得る。全長のタンパク質が必要なときは、より
短いポリペプチドが、ペプチド結合を形成するために、
１つの分子のアミノ末端と他の分子のカルボキシル末端
との縮合によって融合され得る。
【０２７６】新たに合成されたペプチドは、例えば、調
製用高速液体クロマトグラフィー（例えば、Creighton,
Proteins, Structures and Molecular Principles, WH
Freeman and Co, New York NY [1983]）によって、実
質的に精製され得る。合成ペプチド（または、本発明の
任意の他のペプチドまたはポリペプチド）の組成物は、
アミノ酸分析または配列決定（例えば、Edman分解法；C
reighton,前出）によって確認され得る。重要なこと
は、hTRTのアミノ酸配列またはその任意の部分が、直接
合成の間に変化され得るか、および／または化学的方法
を用いて、他のタンパク質からの配列またはそうでなけ
ればその任意の部分と任意の目的のために組合わされ得
て、本発明の変異体ポリペプチドを産生する。
【０２７７】２）hTRTおよびその他のTRTタンパク質の
組換え発現 本発明は、インビトロ（無細胞の）、エクソビボ、また
はインビボ（細胞または生物に基づく）組換え発現系を
使用する、hTRTポリペプチドおよび核酸の発現に有用な
方法、試薬、ベクター、および細胞を提供する。１つの
実施態様では、hTRTタンパク質またはそのフラグメント
の発現は、適切な発現ベクター（すなわち、使用される
発現系に要求される、挿入されたコード配列の転写およ
び翻訳に必須エレメントを有するベクター）へコード配
列を挿入する工程を包含する。従って、１つの局面で、
本発明は、hTRT遺伝子のコード配列に対する配列におい
て、少なくとも25ヌクレオチド、および多くの適用に好
ましくは、本発明のhTRT cDNAまたは遺伝子の50〜100ヌ
クレオチド以上が実質的に同一であるポリヌクレオチド
を提供する。これは、hTRTポリペプチドを発現し得る転
写ユニットを形成するために、プロモーターに作動可能
に連結される。当業者に周知の方法を用いて、hTRT配
列、および、本発明によって提供される適切な転写また
は翻訳制御を有する発現ベクターを構築し得る（例え
ば、Sambrookら、前出、およびAusubelら、前出および
本発明の開示を参照のこと）。
【０２７８】本発明によって提供されるhTRTポリペプチ
ドは、hTRTポリペプチドまたはhTRTタンパク質のフラグ
メントを含有する融合タンパク質を包含する。融合タン
パク質は、化学合成によってもまた産生され得るが、典
型的には組換え方法によって産生される。融合タンパク
質は、hTRTポリペプチド構築物の増強された発現の提
供、または、他の所望の特性（例えば、標識（例えば、
酵素リポーター基）、結合基、または抗体エピトープを
含む）を有するhTRTポリペプチドの産生に有用であり得
る。hTRTおよび増強グリーン蛍光タンパク質（EGFP）配
列を有する融合タンパク質の例が、以下の実施例１５に
記載される。実施例１５および本明細書の他のところに
議論されている使用および適用が、特定の融合タンパク
質に限定されるのではなく、種々の融合構築物の使用の
例示であることは、当業者には明白である。
【０２７９】本発明の融合タンパク質系はまた、hTRTタ
ンパク質またはペプチドの効率的な産生および単離を促
進するために使用され得る。例えば、いくつかの実施態
様では、融合タンパク質の非hTRT配列部分は、融合タン
パク質が非結合成分（例えば細胞溶解物中の非関連タン
パク質）から分離され得るように、固定化分子に特異的
に結合され得る短いペプチドを有する。１つの例は、特
異抗体に結合されるペプチド配列である。別の例は、ニ
ッケルまたは銅イオンを含有する樹脂（すなわち、金属
ーキレートアフィニティークロマトグラフィー）により
結合され得る、ポリヒスチジン部、例えば、（His)6ま
たはヒスチジン−トリプトファン配列を有するペプチド
である。他の例は、固定化免疫グロブリンでの精製を可
能にするプロテインAのドメインまたはフラグメント、
および、FLAGS伸長／アフィニティー精製システム（Imm
unex Corp, Seattle WA）で使用されるドメインを包含
する。いくつかの実施態様では、融合タンパク質は、hT
RTまたは他のTRTポリペプチド配列が、非hTRTペプチド
またはタンパク質の配列から容易に分離され得るよう
な、切断部位を有する。この場合、切断は、化学的（例
えば、臭化シアン、2-(2-ニトロフェニルスルフェニル)
-3-メチル-3'-ブロモインドレン、ヒドロキシルアミ
ン、または低いpH）、または酵素的（例えば、Xa因子、
エンテロキナーゼ）であり得る。融合および切断システ
ムの選択は、部分的には、発現されるhTRTポリペプチド
の部分（すなわち、配列）に依存し得る。融合タンパク
質は、Ausubelら、前出、16節, Krollら、1993, DNA Ce
ll. Biol. 12:441、およびInvitrogen1997カタログ（In
vitrogen Inc, San Diego CA）に一般的に記載されてい
る。エピトープタグまたはタグおよび切断部位を有する
本発明の融合タンパク質の他の例は、下記の実施例６に
提供される。
【０２８０】この節に議論されている発現系はhTRTポリ
ペプチドの発現に注目しているが、同じまたは類似の細
胞、ベクター、および方法が、hTRTポリヌクレオチドの
必ずしも所望する産生をともなうことなく、センスおよ
びアンチセンスのポリヌクレオチドを含む、本発明のhT
RTポリヌクレオチドを発現するために使用され得ること
は、当業者に理解される。典型的には、ポリペプチドの
発現は、適切な開始コドン（例えば、メチオニン）、オ
ープンリーディングフレーム、および、タンパク質を産
生するための核酸配列の翻訳が所望されないときには省
略され得る翻訳調節シグナル（例えば、リボソーム結合
部位、終止コドン）を必要とする。
【０２８１】hTRTポリペプチドおよびポリヌクレオチド
の発現は、本発明によって提供される、任意のいくつか
の関連する利点を達成するように実施され得る。例示的
な利点の１つは、それらが発現される細胞からその後に
単離されるhTRTポリペプチドの発現である（例えば、ワ
クチンとして、またはテロメラーゼ活性を調節する化合
物を同定するためのスクリーニング適用での使用のため
の多量のhTRT産生のため）。第二の例示的な利点は、細
胞の表現型を変化させるために、細胞でのhTRT発現（遺
伝子治療の適用のように）である。非哺乳動物細胞が、
精製のためにhTRTの発現に使用され得、一方、特定の真
核哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）は、hTRTの単離お
よび精製のみならず、細胞での表現型の変化が望まれる
ときに（例えば、遺伝子治療適用でのように増殖能力の
変化に影響するように）、hTRTの発現にも使用され得
る。例示および非限定の目的として、１つ以上のテロメ
ラーゼ活性（例えば、テロメラーゼ触媒活性）を有する
hTRTポリペプチドは、細胞の増殖能力を増加する（例え
ば、細胞を不死化する）ために宿主細胞で発現され得
る。逆に、hTRTアンチセンスポリヌクレオチドまたは阻
害ポリペプチドは、典型的に、細胞（例えば、テロメラ
ーゼ陽性の悪性腫瘍細胞）の増殖能力を減少させるため
に発現され得る。多数の特定の適用が、本明細書中、例
えば、以下の治療適用のための本発明の試薬および方法
の使用の議論に記載されている。
【０２８２】本発明の例示的な有用な発現系（細胞、調
節エレメント、ベクター、および発現）は、当該分野で
周知の一般的な方法（例えば、Ausubelら(前出)の10節
を参照のこと）に従って、hTRTポリヌクレオチドを使用
する、網状赤血球溶解物および小麦胚芽系のような多数
の無細胞系を包含する。別の実施態様では、本発明は、
原核細胞または真核細胞でのhTRT発現のための試薬およ
び方法を提供する。従って、本発明は、hTRTポリヌクレ
オチド、タンパク質、タンパク質部分配列、または融合
タンパク質をコードする核酸を提供する。これらは、単
離細胞、細胞株、細胞培養物、組織および全生物を含
み、当該分野で公知のヒト細胞発現系を含む細菌、真
菌、植物、昆虫、および動物で発現され得る。当業者に
より理解されるように、宿主細胞または無細胞系発現系
に導入されるhTRTポリヌクレオチドは、通常、各宿主ま
たは無細胞系に対して適切な発現制御配列に作動可能に
連結される。
【０２８３】有用な細菌発現系は、E. coli、バチルス
属（例えば、Bacillus subtilus）、他の腸内細菌（例
えば、Salmonella、Serratia、および種々のPseudomona
s種）、または他の細菌宿主（例えば、Streptococcus c
remoris、Streptococcus lactis、Streptococcus therm
ophilus、Leuconostoc citrovorum、Leuconostoc mesen
teroides、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus
lactis、Bifidobacterium bifidum、Bifidobacterium
breve、およびBifidobacterium longum）を、包含す
る。原核生物で有用なhTRT発現構築物は、組換えバクテ
リオファージ、プラスミドまたはコスミドDNA発現ベク
ターなどを包含し、代表的には、プロモーター配列を包
含する。プロモーターの例は、lacプロモーター、Blues
cript7 phagemid(Stratagene, La Jolla CA)またはpSpo
rt1(Gibco BRL)のハイブリッドlacZプロモーターのよう
な誘導プロモーター；ファージーλプロモーター系；ト
リプトファン（trp）プロモーター系；および、ptrp-la
cハイブリッドなどを包含する。細菌発現構築物は、必
要に応じて、リボソーム結合部位、および転写終止シグ
ナル調節配列を包含する。発現に有用な特定のベクター
の例は、例えば、pTrcHis2（Invitrogen, San Diego C
A）、pThioHis A、B、およびC、ならびに当該分野で公
知または開発され得る他の多数のベクター（例えば、Au
sbelを参照のこと）を包含する。細菌に有用なベクター
は、hTRT融合タンパク質の産生を促進するものを包含す
る。細菌細胞での融合タンパク質の高レベル発現に有用
なベクターは、以下に限定されないが、上記のBluescri
pt7（Stratagene）のような、多重機能性E. coliクロー
ニングおよび発現ベクターを包含し、そこで、hTRTタン
パク質、hTRT融合タンパク質、またはhTRTフラグメント
をコードする配列が、ハイブリッドタンパク質が産生さ
れるように、アミノ末端Metおよび後続のβ-ガラクトシ
ダーゼの７残基に対する配列に、インフレームでベクタ
ーに連結され得る（例えば、pINベクター; Van Heekeお
よびSchuster, 1989, J. Biol. Chem., 264:5503）。pG
EXベクター（例えば、pGEX-2TK; Pharmacia Biotech）
のようなベクターもまた、グルタチオンS-トランスフェ
ラーゼ（GST）を有する融合タンパク質として、hTRTタ
ンパク質のような外来ポリペプチドを発現するために使
用され得る。このような融合タンパク質は、グルタチオ
ン−アガロースビーズへの吸着、その後の遊離グルタチ
オンの存在下での溶出によって、溶解細胞から精製され
得る。このような系で産生されたタンパク質は、精製ま
たは他の適用に有用であり得るような、エンテロキナー
ゼ、トロンビン、またはXa因子プロテアーゼ切断部位を
しばしば含み、その結果目的のクローニングされたポリ
ペプチドがGST部分から放出され得る。他の例は、hTRT
およびE. coliマルトース結合タンパク質（MBP）または
E. coliチオレドキシンを含む融合タンパク質である。
細菌細胞で有用なhTRT発現構築物の例は、以下の実施例
６に提供される。
【０２８４】本発明はさらに、Dictyosteliumのような
真菌系、および、好ましくはSaccharomyces cerevisia
e, Pichia pastoris, Torulopsis holmil, Saccharomyc
es fragilis, Saccharomyces lactis, Hansenula polym
orpha、およびCandida pseudotropicalisのような酵母
で発現されるhTRTポリペプチドを提供する。hTRTが酵母
で発現されるときは、プラスミドおよび酵母人工染色体
（YAC）ベクターを含む、多数の適切なベクターが入手
可能である。ベクターは、代表的に、構成または誘導プ
ロモーター（例えば、α因子、アルコールオキシダー
ゼ、PGH、および3-ホスホグリセレートキナーゼまたは
他の解糖酵素）のような発現制御配列、および、必要で
あれば、複製起点、終結配列などを包含する。Pichiaで
の使用に適切なベクターは、pPICZ、His6/pPICZB、pPIC
Zα、pPIC3.5K、pPIC9K、pA0815、pGAP2A、B、および
C、pGAP2αA、B、およびC（Invitrogen, San Diego, C
A）、ならびに当該分野で公知または開発されるべき多
数のベクターを包含する。１つの実施態様では、ベクタ
ーHis6/pPICZB（Invitrogen, San Diego, CA）が、酵母
Pichia pastorisでHis6-hTRT融合タンパク質を発現する
ために使用される。Saccharomycesで有用なベクターの
例は、pYES2（Invitrogen, San Diego, CA）である。酵
母で有用なhTRT発現構築物の例は、以下の実施例６に提
供される。
【０２８５】本発明のhTRTポリペプチドはまた、植物ま
たは植物ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワー
モザイクウイルス、CaMV；タバコモザイクウイルス、TM
V）でトランスフェクトされるか、または細菌発現ベク
ター（例えば、TiまたはpBR322プラスミド）で形質転換
される植物細胞系で発現され得る。植物ウイルス発現ベ
クターが使用される場合には、hTRTコード配列の発現
は、任意の多数のプロモーターによって駆動され得る。
例えば、CaMVの35Sおよび19Sプロモーター（Brissonら,
1984, Nature 310:511-514）のようなウイルスプロモ
ーターは、単独またはTMVからのオメガリーダー配列（T
akamatsuら、1987, EMBO J., 6:307-311）との組み合わ
せで、使用され得る。あるいは、RUBISCOのスモールサ
ブユニット遺伝子由来のプロモーター（Coruzziら、198
4, EMBO J., 3:1671-1680；Broglieら、1984, Science
224:838-843）のような植物プロモーター、または熱シ
ョックプロモーター（WinterおよびSinibaldi, 1991, R
esults Probl. Cell Differ., 17:85）、または貯蔵タ
ンパク質遺伝子プロモーターが、使用され得る。これら
の構築物は、直接DNA形質転換または病原体媒介トラン
スフェクションによって、植物細胞へ導入され得る（こ
のような技術の総説は、HobbsまたはMurry, 1992,MCGRA
W HILL YEARBOOK OF SCIENCE AND TECHONOLOGY McGraw
Hill New YorkNY, 191-196頁 (1992)；または、Weissba
chおよびWeissbach, 1988, METHODS FOR PLANT MOLECUL
AR BIOLOGY, Academic Press, New York NY, 421-463頁
を参照のこと）。
【０２８６】本発明によって提供されるhTRTタンパク質
の発現についての他の発現系は、昆虫系である。好まし
い系は、バキュロウイルスポリヘドリンプロモーターを
使用する。このような系の１つは、Autographa califor
nica核ポリヘドロシスウイルス（AcNPV）が、Spodopter
a frugiperda細胞またはTrichoplusia larvaeにおいて
外来遺伝子を発現するためのベクターとして使用され
る。目的の遺伝子をコードする配列が、ポリヘドリン遺
伝子のようなウイルスの非必須領域にクローニングされ
得、ポリヘドリンプロモーターの制御下に置かれ得る。
hTRTタンパク質をコードするような配列の首尾よい挿入
は、ポリヘドリン遺伝子を不活性化し、コートタンパク
質を欠く組換えウイルスを産生する。次いで、組換えウ
イルスは、S. frugiperda細胞またはTrichoplusia larv
aeを感染させるために使用され、ここで、次いで、hTRT
配列が発現される（一般的な方法については、Smith
ら、J.Virol., 46:584(1983)；Engelhardら、Proc. Nat
l. Acad. Sci. 91:3224-7(1994)を参照のこと）。バキ
ュロウイルス発現についての有用なベクターは、pBlueB
acHis2A、BおよびC、pBlueBac4.5、pMelBacBならびに当
該分野で公知ならびに開発されるべき多数の他のベクタ
ーを包含する。昆虫細胞に有用なhTRT発現構築物の例
は、以下の実施例６に提供される。
【０２８７】本発明はまた、哺乳動物および哺乳動物細
胞での発現系を提供する。上記のように、hTRTポリヌク
レオチドは、hTRTポリペプチドの大量生産（例えば、精
製のため）、または標的細胞の表現型を変化するために
（例えば、遺伝子療法、細胞不死化などの目的のため
に）、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）で発現され得
る。後者の場合には、発現されるhTRTポリヌクレオチド
は、テロメラーゼ触媒活性を有するポリペプチドをコー
ドし得るか、またはコードしなくてもよい。すなわち、
発現が、センスまたはアンチセンスポリヌクレオチド、
阻害または刺激ポリペプチド、ゼロまたは１以上のテロ
メラーゼ活性を有するポリペプチド、ならびに、本明細
書に開示またはこの開示の概説から当業者に明白なその
他の組み合わせおよび変異体であり得る。
【０２８８】本発明の核酸を発現するための適切な哺乳
動物宿主組織培養細胞は、SV40で形質転換されたサル腎
CV1株（COS-7, ATCC CRL 1651）；ヒト胚腎株（293；Gr
ahamら、J. Gen. Virol. 36:59 (1977)）；仔ハムスタ
ー腎細胞（BHK, ATCC CCL 10）；CHO（ATCC CCL 61およ
びCRL 9618）；マウスセルトリ細胞（TM4, Mather, Bio
l. Reprod. 23:243-251 (1980)）；サル腎細胞（CV1 AT
CC CCL 70）；アフリカミドリザル腎細胞（VERO-76, AT
CC CRL 1587）；ヒトけい管ガン細胞（HeLa,ATCC CCL
2）；イヌ腎細胞（MDCK, ATCC CCL 34）；バッファロラ
ット肝細胞（BRL 3A, ATCC CRL 1442）；ヒト肺細胞（W
138, ATCC CCL75）；ヒト肝細胞（HepG2,HB 8065）；マ
ウス乳腫瘍（MMT 060562, ATCC CCL51）；TRI細胞（Mat
herら、Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-46 (1982)；MD
CK細胞（ATCC CCL 34およびCRL 6253）；HEK 293細胞
（ATCC CRL 1573）、および、WI-38細胞（ATCC CCL 75;
ATCC:American Type Culture Collection、Rockville,
MD）を含む、任意の正常有限寿命動物もしくはヒト細胞
あるいは正常または異常な不死化動物もしくはヒト細胞
を包含する。ポリペプチドを発現するための哺乳動物組
織細胞培養物の使用は、Winnacker, FROM GENE TO CLON
ES(VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987）に全般的に考
察されている。
【０２８９】哺乳動物宿主細胞について、ウイルスベー
スおよび非ウイルス発現系が提供される。非ウイルスベ
クターおよび系は、代表的に、タンパク質またはRNAお
よびヒト人工染色体を発現するための発現カセットを有
する、プラスミドおよびエピソームベクターを包含する
（例えば、Harringtonら、1997, Nat Genet 15:345を参
照のこと）。例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）細胞で
のhTRTポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現に有
用な非ウイルスベクターは、pcDNA3.1/His、pEBVHisA、
B、およびC（Invitrogen, San Diego CA）、MPSVベクタ
ー、Invitrogen1997カタログ（Invitrogen Inc, San Di
ego CA）（その全体が本明細書中で援用される）に記載
されている他のベクター、および他のタンパク質につい
ての当該分野で公知の多数の他のベクターを包含する。
哺乳動物細胞で有用なhTRT発現構築物の例は、以下の実
施例６に提供される。
【０２９０】有用なウイルスベクターは、レトロウイル
ス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウ
イルスに基づくベクター、SV40、パピローマウイルス、
HBPエプスタインバーウイルスに基づくベクター、ワク
シニアウイルスベクター、およびセムリキ森林ウイルス
（SFV）を包含する。SFVおよびワクシニアベクターは、
一般的に前出のAusubelらの第16章で議論されている。
ときにはウイルスベクターは、ネイクド形態で導入され
るか、またはウイルスタンパク質以外のタンパク質でコ
ートされるが、これらのベクターは、しばしば、２つの
成分である、改変されたウイルスゲノムおよびそれを囲
むコート構造からなる（一般的に、Smith、 1995, Annu.
Rev. Microbiol. 49:807を参照のこと）。しかし、ベ
クター中のウイルス核酸は、例えば、遺伝子療法用に設
計されるときには、多くの様式で変化され得る。これら
の変化の目的は、入手可能なパッケージングまたはヘル
パー細胞中でベクター形態で増殖し得るその能力を維持
しながら、標的細胞中でウイルスを増殖不能にするこ
と、外因性DNA配列の挿入のためにウイルスゲノム内に
空間を提供すること、および目的遺伝子をコードし、そ
して適切な発現を可能にする新たな配列を組み込むこと
である。従って、ベクター核酸は、一般的に２つの成分
を含む：ヘルパー株での複製およびパッケージングのた
めの必須cis作用ウイルス配列、および外因性遺伝子の
ための転写ユニット。他のウイルス機能は、特定のパッ
ケージングまたはヘルパー細胞株でトランスで発現され
る。アデノウイルスベクター（例えば、ヒト遺伝子療法
における使用のため）は、例えば、Rosenfeldら、1992,
Cell 68:143；PCT公開公報WO 94/12650；同94/12649；
同94/12629に記載されている。アデノウイルスが発現ベ
クターとして使用される場合に、hTRTをコードする配列
は、後期プロモーターおよび３部分からなるリーダー配
列からなる、アデノウイルス転写／翻訳複合体に連結さ
れ得る。ウイルスゲノムのE1またはE3の非必須領域での
挿入は、感染宿主細胞で発現し得る生ウイルスをもたら
す（LoganおよびShenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sc
i., 81:3655）。レトロウイルスゲノム部分としての治
療ポリヌクレオチド配列を有する、複製欠損レトロウイ
ルスベクターが、例えば、Millerら、1990, Mol. Cell.
Biol. 10:4239；Kolberg, 1992, J. NIH Res. 4:43；
および、Cornettaら、1991, Hum.Gene Ther. 2:215に記
載されている。
【０２９１】哺乳動物細胞系では、哺乳動物遺伝子また
は哺乳動物ウイルスからのプロモーターが、しばしば適
切である。適切なプロモーターは、構成的、細胞型特異
的、ステージ特異的、および／または制御もしくは調節
可能（例えば、グルココルチコイドのようなホルモンに
よる）であり得る。有用なプロモーターは、以下に限定
されないが、メタロチオネインプロモーター、構成的ア
デノウイル主要後期プロモーター、デキサメタゾン誘導
MMTVプロモーター、SV40プロモーター、MRPpolIIIプロ
モーター、構成的MPSVプロモーター、テトラサイクリン
誘導CMVプロモーター、（例えば、ヒト即時初期CMVプロ
モーター）、構成的CMVプロモーター、および当該分野
で公知のプロモーター-エンハンサー組み合わせを包含
する。
【０２９２】他の調節エレメントもまた、hTRTポリヌク
レオチドの効果的な発現および／またはhTRTタンパク質
をコードする配列の翻訳に必要とされ得るかまたは望ま
れ得る。翻訳のために、これらのエレメントは、代表的
に、ATG開始コドンおよび隣接のリボソーム結合部位ま
たは他の配列を含む。hTRTタンパク質をコードする配列
では、その開始コドンおよび上流のプロモーター配列が
発現ベクターに挿入されているならば、さらなる翻訳ま
たは他の制御シグナルが必要とされなくてもよい。しか
し、コード配列、またはその部分のみが挿入されるてい
る場合は、外因性転写および／または翻訳制御シグナル
（例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、および
ATG開始コドン）は、しばしば提供されなければならな
い。さらに、開始コドンは、代表的に、所望のタンパク
質の翻訳を確実にするように正しい読み取り枠でなけれ
ばならない。外因性転写エレメントおよび開始コドン
は、天然および合成の両方の種々の起源のものであり得
る。さらに、発現効率は、使用する細胞系に適切なエン
ハンサーを含むことによって促進され得る（Scharfら、
1994, Results Probl. Cell Differ. 20:125；および、
Bittnerら、1987, Meth. Enzymol., 153:516）。例え
ば、SV40エンハンサーまたはCMVエンハンサーが、哺乳
動物宿主細胞での発現を増加するために使用され得る。
【０２９３】hTRT遺伝子産物の発現はまた、ヒト細胞
（例えばテロメラーゼ陰性細胞株）のような細胞で、hT
RTプロモーターまたはエンハンサーの活性化によりなさ
れ（増加され）得る。活性化は、外因性プロモーター活
性化因子の投与、またはhTRT遺伝子の発現を抑制する細
胞成分の阻害を含む、種々の方法によって実施され得
る。逆に、以下に記載されるように、プロモーター機能
の阻害がhTRT遺伝子発現を減少させることが理解され
る。
【０２９４】本発明は、エクジソン（Ecdysone）誘導発
現系（Invitrogen）のような系、およびClontechからの
Tet-OnおよびTet-offテトラサイクリン制御系を使用し
て、hTRTポリペプチドの誘導可能および抑制可能な発現
を提供する。エクジソン誘導発現系は、ステロイドホル
モンエクジソンアナログ、ムリステロンAを使用して、
ヘテロ二量体核レセプターを通じて組換えタンパク質の
発現を活性化する（Noら、1996, Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 93:3346）。本発明の１つの実施態様では、hTRT
は、pINDベクター（Clontech）にクローニングされ、こ
れは、最小の熱ショックプロモーター上流の５つの改変
エクジソン応答エレメント（E/GRE）および複数のクロ
ーニング部位を含む。次いで、その構築物は、エクジソ
ンレセプターを安定に発現する細胞株にトランスフェク
トされる。トランスフェクション後、細胞は、ムリステ
ロンAによって処理され、pINDからの細胞内発現を誘導
する。本発明の別の実施態様では、hTRTポリペプチド
は、Tet-onおよびTet-off発現系（Clontech）を使用し
て発現され、制御された高レベルの遺伝子発現を提供す
る（Gossenら、1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:
5547；Gossenら、1995, Science 268:1766）。
【０２９５】本発明のhTRTベクターは、細胞、組織、器
官、患者、または動物に、種々の方法で導入され得る。
本発明の核酸発現ベクター（代表的にdsDNA）が、塩化
カルシウム形質転換（細菌系用）、エレクトロポレーシ
ョン、リン酸カルシウム処理、リポソーム媒介形質転
換、インジェクションおよびマイクロインジェクショ
ン、弾道法（ballistic method）、バイロソム（viroso
me）、イムノリポソーム、ポリカチオン：核酸複合体、
ネイクドDNA、人工ビリオン、ヘルペスウイルス構造タ
ンパク質VP22（ElliotおよびO'Hare, Cell 88:223）へ
の融合、DNAの薬剤促進取り込み、およびエクスビボ形
質導入のような、周知の方法によって、選択された宿主
細胞に導入され得る。有用なリポソーム媒介DNA輸送法
は、米国特許第5,049,386号、同第4,946,787号；および
同第4,897,355号；PCT公開公報WO 91/17424、同WO 91/1
6024；WangおよびHuang, 1987, Biochem. Biophys. Re
s. Commun.147:980；WangおよびHuang, 1989, Biochemi
stry 28:9508；LitzingerおよびHuang,1992, Biochem.
Biophys. Acta 1113:201; GaoおよびHuang, 1991, Bioc
hem. Biophys. Res. Commun. 179:280に記載されてい
る。イムノリポソームは、外因性ポリヌクレオチドのキ
ャリアとして記載されており（WangおよびHuang, 1987,
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:7851；Trubetskoy
ら、1992, Biochem. Biophys. Acta 1131:311）、おそ
らく特定の細胞型で表面抗原に結合する特異的な抗体の
封入により、リポソームと比較すると、改良された細胞
型特異性を有し得る。Behrら、1989, Proc. Natl. Aca
d. Sci. U.S.A. 86:6982は、リポソームを形成するため
の任意のさらなるリン脂質の必要なしに、それ自身のト
ランスフェクションを媒介する試薬としてリポポリアミ
ンを使用することを報告している。適切な送達方法は、
受容可能な実施および制御要求（例えば、遺伝子療法に
ついてかまたは組換えタンパク質の発現のための細胞株
の産生について）の観点により、実施者によって選択さ
れる。先に挙げた送達方法は、遺伝子療法目的のための
細胞に、組織培養細胞などに核酸を輸送するために使用
され得ることが理解される。
【０２９６】組換えタンパク質の長期間の高収量生産の
ために、しばしば安定な発現が望まれる。例えば、hTRT
を安定に発現する細胞株は、ウイルス複製起点または外
因性発現エレメント、および選択マーカー遺伝子を含む
本発明の発現ベクターを使用して調製され得る。ベクタ
ーの導入後、細胞は、選択培地に交換される前に、栄養
培地中で1〜2日間増殖され得る。選択マーカーの目的
は、選択に対する耐性を付与することであり、その存在
は、選択培地中で導入された配列を首尾良く発現する細
胞の増殖を可能にする。耐性で安定にトランスフェクト
された細胞が、細胞型に適切な組織培養技術を使用し
て、増殖され得る。例えば、当該分野で周知の方法に従
ってDHFR遺伝子でトランスフェクトされた細胞にメチル
トレキセートを投与することによる、増幅工程が包含さ
れ得る。
【０２９７】さらに、宿主細胞株が、挿入配列の発現を
調節するその能力、または所望の様式で発現されたタン
パク質をプロセシングするその能力について選択され得
る。ポリペプチドのこのような修飾は、これらに限定さ
れないが、アセチル化、カルボキシル化、リン酸化、脂
質化、およびアシル化を包含する。翻訳後のプロセシン
グもまた、正しい挿入、折り畳み、および／または機能
に重要であり得る。異なる宿主細胞は、このような翻訳
後の活性について各細胞について特異的な細胞機関およ
び特徴的機構を有するので、特定の細胞が、導入された
外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実
にするために選択され得る。
【０２９８】本発明はまた、hTRTまたは他のTRTポリヌ
クレオチドまたはポリペプチドを発現する、トランスジ
ェニック動物（すなわち、ヒトまたは他のTRT遺伝子配
列についてのトランスジェニック哺乳動物）を提供す
る。１つの実施態様では、hTRTは、トランスジェニック
ウシ、ヤギ、またはウサギのような、トランスジェニッ
ク哺乳動物の乳汁中に分泌される。このような動物の作
製方法は、例えば、HeynekerらのPCT WO 91/08216に見
出され得る。
【０２９９】本明細書中、前記で開示される発現系を使
用して作製された、本発明のhTRTタンパク質および複合
体は、本発明（例えば、下記）によって提供された特定
の方法に従って、当該分野で公知の一般的な種々の方法
を用いて精製され得る。当業者は、化学合成、生物発
現、または精製後に、hTRTタンパク質が、天然に存在す
るテロメラーゼの天然のコンフォメーションとは異なる
コンフォメーションを有することを理解する。それは、
ある場合には、ポリペプチドを変性し（例えば、ジスル
フィドまたは他の結合の還元を含む）、次いで、ポリペ
プチドに好ましいコンフォメーションに再度折り畳むこ
とをもたらすために有用であるか、または必要でさえあ
り得る。生産的な再折り畳みはまた、hTR（またはhTRフ
ラグメント）の存在を必要とする。タンパク質の還元お
よび変性、および再折り畳みの誘導方法は、当業者に周
知である（例えば、Debinskiら、1993., J. Biol. Che
m., 268:14065；KreitmanおよびPastan, 1993, Bioconj
ug. Chem., 4:581；および、Buchnerら、1992, Anal. B
iochem., 205:263；および、McCamanら、1985, J. Biot
ech. 2:177を参照のこと）。さらに、前出のPCT公開公
報WO 96/40868を参照のこと。
【０３００】Ｄ）ヒトTRTおよびヒトテロメラーゼRNA、
テロメラーゼ会合タンパク質、ならびに同時発現および
その他の方法によって産生された他の生体分子の複合体 本発明のhTRTポリペプチドは、インビボおよびインビト
ロにおいて、RNA（例えば、hTR）、タンパク質（例え
ば、テロメラーゼ会合タンパク質）、DNA（例えば、テ
ロメリックDNA、[T2AG3]N）、および（デオキシ）リボ
ヌクレオチドトリホスフェートのようなヌクレオチドを
含む他の生体分子と会合し得る。これらの会合は、本発
明の方法に従って、hTRTの存在または機能のアッセイ、
hTRTまたはテロメラーゼ会合分子の同定または精製、お
よびhTRTまたはテロメラーゼの構造または機能の分析に
利用され得る。
【０３０１】１つの実施態様では、本発明は、例えば、
テロメラーゼホロ酵素を産生するために、核酸、通常は
RNAと複合体化（例えば、会合または結合された）hTRT
を提供する。１つの実施態様では、結合RNAは、テロメ
ラーゼ媒介DNA合成のテンプレートとして作用し得る。h
TRTポリペプチドと複合体化され得るRNAの例は、天然に
存在する宿主細胞テロメラーゼRNA、ヒトテロメラーゼR
NA（例えば、hTR;米国特許第5,583,016号）、hTRサブ配
列またはドメイン、合成RNA、または他のRNAを包含す
る。RNA-hTRTタンパク質複合体（RNP）は、代表的に、
テロメラーゼ触媒活性のような、１つ以上のテロメラー
ゼ活性を示す。これらのhTRT-hTR RNP（または、他のhT
RT-RNA複合体）は、hTRTおよびhTR（または、他のRNA）
のインビトロ（すなわち、細胞を含まない系での）同時
発現によるインビトロ再構築、インビボ再構築、または
エクスビボ再構築を含む、例示目的で以下に記載される
ような、種々の方法によって産生され得る。
【０３０２】従って、本発明は、１つの実施態様で、別
々に精製された成分を混合することによって、インビト
ロで形成されたhTRT-hTR複合体（または、他のhTRT-RNA
複合体）を提供する（「インビトロ再構築」；例えば、
再構築の記載については米国特許第5,583,016号を参照
のこと；さらに、Autexierら、EMBO J. 15:5928を参照
のこと）。
【０３０３】別の実施態様では、本発明は、細胞を含ま
ない転写-翻訳系（例えば、小麦胚芽またはウサギ網状
赤血球溶解物）で、インビトロにおいてhTRTポリペプチ
ドおよびRNA（例えば、hTR）を同時発現することによっ
て産生された、テロメラーゼRNPを提供する。実施例７
に示されるように、組換えhTRTポリペプチドおよびhTR
のインビトロにおける同時発現は、テロメラーゼ触媒活
性（TRAPアッセイによって測定されるような）の産生を
もたらす。
【０３０４】本発明によってさらに、hTRが天然で発現
されるか、またはhTR（または、hTRTタンパク質と複合
体を形成し得る別のRNA）が組換え方法によって導入ま
たは発現される細胞（例えば、哺乳動物細胞）で、hTRT
ポリペプチドを発現することによって産生されるテロメ
ラーゼRNPが提供される。従って、１つの実施態様で、h
TRTは、hTRが存在するテロメラーゼ陰性ヒト細胞（例え
ば、BJまたはIMP90細胞）で発現され、それは、２分子
をRNPにアセンブリし得る。別の実施態様では、hTRT
は、hTRが組換え的に発現されるヒト細胞または非ヒト
細胞で発現される。細胞でのhTR発現方法は、米国特許
第5,583,016号に見出される。さらに、テロメラーゼのR
NA成分をコードするcDNAを含有するクローンは、pGRN33
（ATCC 75926）として寄託されている。ヒトテロメラー
ゼのRNA成分をコードするゲノム配列もまた、λクロー
ン28-1の約15 kbのSauIIIAからHindIIIの挿入物（ATCC
75925）で寄託されている。真核生物細胞での発現に
は、hTRT配列は、代表的に、転写開始配列（RNAポリメ
ラーゼ結合部位）および転写終結配列に作動可能に連結
される（例えば、PCT公開公報WO 96/01835；Fengら、19
95, Science 269:1236を参照のこと）。
【０３０５】本発明はさらに、いわゆる「テロメラーゼ
会合タンパク質」と同時発現および／または会合され
る、組換え産生されたかまたは実質的に精製されたhTRT
ポリペプチドを提供する。従って、本発明は、他のタン
パク質（例えば、テロメラーゼ会合タンパク質）と同時
発現または複合体化されたhTRTを提供する。テロメラー
ゼ会合タンパク質は、ヒトテロメラーゼと同時精製する
タンパク質、および／またはテロメラーゼ機能または活
性を、例えば、テロメラーゼをテロメリックDNAとの会
合に関与させることによって調節する役割をなし得るタ
ンパク質である。テロメラーゼ会合タンパク質の例は、
以下に限定されないが、以下のタンパク質および／また
はそれらのヒトホモログを包含する：ヌクレオリン（Sr
ivastavaら、1989, FEBS Letts. 250:99を参照のこ
と）；EF2H（伸長因子２ホモログ；Nomuraら、1994, DN
A Res. (Japan) 1:27, GENBANK受託番号D21163を参照の
こと）；TP1/TLP1（Harringtonら、1997, Science 275:
973；Nakayama, 1997, Cell 88:875）；Tetrahymena p9
5のヒトホモログまたはp95それ自身（Collinsら、1995,
Cell 81:677）；TPC2（テロメア長調節タンパク質；AT
CC寄託番号97708；TPC3（これもまた、テロメア長調節
タンパク質；ATCC受託番号97707；DNA結合タンパク質B
（dbpB; Horwitzら、1994, J. Biol. Chem. 269:1413
0；および、テロメア反復結合因子（TRF1および2；Chan
gら、1995, Science 270:1663; Chongら、1997,Hum Mol
Genet 6:69）；EST1、3、および4（Lendvayら、1996,
Genetics 144:1399, Nugentら、1996, Science 274:24
9, Lundbladら、1989, Cell 57:633）；および、エンド
キャッピング因子（Cardenasら、1993, Genes Dev. 7:8
83）。
【０３０６】テロメラーゼ会合タンパク質は、hTRTタン
パク質またはhTRT-hTR RNPとの同時精製または結合に基
づいて、同定され得る。あるいは、それらは、hTRT融合
タンパク質、例えば、GST-hTRT融合タンパク質などとの
結合に基づいて、アフィニティー精製（Ausubelら、第2
0章を参照のこと）によって測定されるように、同定さ
れ得る。hTRT会合タンパク質を同定するために適用し得
る、タンパク質-タンパク質相互作用を評価するために
特に有用な技術は、Chienら（Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 88:9578 (1991)；さらに、前出のAusubelらの第20
章を参照のこと）の２ハイブリッドスクリーニング法で
ある。このスクリーニングは、転写アクチベーターであ
る酵母Gal4転写タンパク質（FieldおよびSong, 1989, N
ature 340:245を参照のこと）の再構築を通じて、イン
ビボでのタンパク質-タンパク質相互作用を同定する。
この方法は、DNA結合および転写活性化をもたらす別々
のドメインからなる酵母Gal4タンパク質の特性に基づ
く。２つのハイブリッドタンパク質をコードするポリヌ
クレオチド、通常は発現ベクターが構築される。１つの
ポリヌクレオチドは、hTRT相互作用について試験される
べきタンパク質（例えば、ヌクレオリンまたはEF2H）の
ポリペチド配列に融合された、酵母Gal4 DNA結合ドメイ
ンを含む。あるいは、酵母Gal4 DNA結合ドメインはヒト
細胞からのcDNAに融合されており、従って、テロメラー
ゼ会合タンパク質についてのスクリーニングのためのGa
l4 DNA結合ドメインに融合されたヒトタンパク質のライ
ブラリーを作成する。他のポリヌクレオチドは、hTRTポ
リペプチド配列に融合されたGal4活性化ドメインを含
む。その構築物は、酵母宿主細胞に導入される。発現に
際して、hTHTと試験タンパク質との間の分子間結合は、
Gal4活性化ドメインを有するGal4 DNA結合ドメインを再
構築し得る。これは、Gal4結合部位に作動可能に結合さ
れたレポーター遺伝子（例えば、lacZ、HIS3）の転写活
性化を導く。レポーターの選択またはアッセイによっ
て、hTRT相互作用タンパク質またはテロメラーゼ会合タ
ンパク質を含有する細胞の遺伝子コロニーが、同定され
得る。当業者は、2-ハイブリッドスクリーニングの多数
の変法、例えば、LexA系（Bartelら、1993,Cellular In
teractions in Development: A Practical Approach Ha
rtley, D.A.編(Oxford Univ. Press) 153-79頁）が存在
することを、理解する。
【０３０７】テロメラーゼ会合タンパク質を同定するた
めに有用な他の方法は、3-ハイブリッド系である（例え
ば、Zhangら、1996, Anal. Biochem. 242:68;Licitra
ら、1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:12817を参
照のこと）。テロメラーゼRNA成分は、TRTまたはhTRTタ
ンパク質および試験タンパク質を含むこの系において、
利用され得る。相互作用タンパク質（すなわち、ヘテロ
二量体化するかまたは高次のヘテロ多量体を形成するタ
ンパク質）を同定するために有用な他の方法は、E. col
i/BCCP相互作用スクリーニング系である（Germinoら、
(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:933；Guare
nte (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:1639
を参照のこと）。
【０３０８】本発明はまた、テロメア結合タンパク質
（テロメラーゼ会合タンパク質であり得るか、またはそ
うでなくてもよい）と、hTRT（hTR、その他のRNA、また
は１つ以上のテロメラーゼ会合タンパク質と複合体化さ
れ得るか、またはされなくてもよい）との複合体を提供
する。テロメア結合タンパク質の例は、TRF1およびTRF2
（前出）；mpA1、mpA2、RAP1（Buchmanら、1988, Mol.
Cell. Biol. 8:210, Buchmanら、1988, Mol. Cell. Bio
l. 8:5086）、SIR3およびSIR4（Aparicioら、1991, Cel
l 66:1279）、TEL1（Greenwellら、1995, Cell 82:82
3；Morrowら、1995,Cell 82:831）；ATM（Savitskyら、
1995, Science 268:1749）、エンドキャッピング因子
（Cardenasら、1993, Genes Dev. 7:883）、および対応
するヒトホモログを包含する。前述の複合体は、一般的
に、hTRTおよびhTRまたはテロメラーゼ会合タンパク質
の複合体についての前出の記載のように、例えばインビ
トロまたはインビボでの混合または同時発現によって産
生され得る。
【０３０９】V．抗体および他の結合薬剤 関連する局面において、本発明は、ポリクローナル抗体
およびモノクローナル抗体、抗体フラグメント、一本鎖
抗体、ヒトおよびキメラ抗体を含み、ファージ外皮もし
くは細胞表面タンパク質に融合した抗体または抗体フラ
グメント、および当該分野で公知であり、かつ本明細書
中に記載の他のものを含む、hTRTと特異的に免疫反応す
る抗体を提供する。本発明の抗体は、図17に記載したア
ミノ酸配列（配列番号２）と実質的に同一のアミノ酸配
列を有するポリペプチド、もしくはその免疫原性フラグ
メントまたはそれにより定義されるタンパク質上のエピ
トープを特異的に認識し得、そして結合し得る。本発明
の抗体は、少なくとも約10 7、108、109または1010Ｍ-1
のhTRTに対する特異的結合親和性を示し得、そしてこれ
はポリクローナル、モノクローナル、組換えまたは他の
産物であり得る。本発明はまた、hTRT構造エピトープ
（例えば、hTRTタンパク質またはテロメラーゼRNPの表
面上のエピトープ）を認識する抗hTRT抗体を提供する。
同様に、所望ならば、hTRTタンパク質配列のコンピュー
ターアシスト分析、HIV-1のp66サブユニットのような関
連する逆転写酵素のコンフォメーションに対する比較
（例えば、図３参照）によって、あるいは経験的にコン
フォメーショナルエピトープを同定し得る。コンフォメ
ーショナルエピトープを認識する抗hTRT抗体は、特に、
ヒトテロメラーゼの検出および精製において、ならびに
ヒト疾患の診断および処置において有用性を有する。
【０３１０】抗hTRT抗体の産生については、ヤギ、ヒツ
ジ、ウシ、モルモット、ウサギ、ラットまたはマウスの
ような宿主を、hTRTタンパク質または免疫原性特性を保
持するその任意の部位、フラグメントまたはオリゴペプ
チドでの注射によって免疫化し得る。抗体誘導のための
hTRTポリペプチドの選択において、生物学的活性を保持
する必要はない；しかし、タンパク質フラグメントまた
はオリゴペプチドは、免疫原性、および好ましくは抗原
性でなければならない。免疫原性は、ポリペプチドおよ
びアジュバントを動物（例えば、ウサギ）に注射し、そ
して注射したポリペプチドに対して指向する抗体の出現
をアッセイすることにより測定し得る（例えば、Harlow
およびLane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, COLD
SPRING HARBOR LABORATORY, New York (1988)参照。す
べての目的のために（例えば第５章において）本明細書
中に全部が参考として援用される）。特異的抗体を誘導
するために使用されるペプチドは、典型的には、少なく
とも５個のアミノ酸、好ましくは少なくとも８個のアミ
ノ酸、より好ましくは少なくとも10個のアミノ酸から成
るアミノ酸配列を有する。通常、それらは、配列番号２
のタンパク質のアミノ酸配列の全てまたは隣接部分を模
倣するか、またはそれと実質的な配列同一性を有する。
hTRTタンパク質アミノ酸の短い領域は、キーホールリン
ペットヘモシアニン、およびキメラ分子に対して産生さ
れた抗hTRT抗体のような別のタンパク質の領域に融合さ
れ得る。宿主の種に応じて、種々のアジュバントを用い
て免疫学的反応を増大し得る。
【０３１１】抗原は、動物に適した方法によって決定さ
れた様式で免疫系に対して提示される。これらのおよび
他のパラメーターは、一般に、免疫学者に周知である。
典型的には、注射は肉趾、筋肉内、皮内、リンパ節周辺
または腹腔内に投与する。アフィニティー精製を含む日
常的な方法によって、宿主によって産生された免疫グロ
ブリンを沈殿し、単離し、精製し得る。
【０３１２】免疫原性hTRTペプチドの例示的な例を実施
例８に提供する。さらに、実施例８は抗hTRTポリクロー
ナル抗体の産生および使用を記載する。
【０３１３】Ａ）モノクローナル抗体 hTRTタンパク質およびペプチドに対するモノクローナル
抗体は、培養中の連続する細胞株による、抗体分子の産
生を提供する任意の技術を用いる本発明の方法に従って
調製し得る。これらは、KoehlerおよびMilstein (Natur
e 256:495 [1975])によって最初に記載されたハイブリ
ドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kosbor
ら,1983, Immunol. Today 4:72；Coteら, 1983, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 80:2026)、およびEBVハイブリ
ドーマ技術（Coleら, MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANC
ER THERAPY, Alan R Liss Inc., New York,NY, 77-96頁
[1985])を含むがこれらに限定されない。
【０３１４】ある実施態様において、適切な動物を選択
し、適切な免疫化プロトコルを続けて行う。非ヒトモノ
クローナル抗体（例えば、ネズミ、ウサギ、ウマ）の産
生は周知であり、そして例えば、hTRTまたはそのフラグ
メントを含有する調製物で動物を免疫化することによっ
て達成し得る。ある方法において、適切な時間の後、動
物の脾臓を切り出し、個々の脾臓細胞を、典型的には、
適切な選択条件下で不死化骨髄腫細胞に融合する。その
後、細胞をクローンに分離し、各クローン（例えば、ハ
イブリドーマ）の上清を、抗原の所望の領域に対して特
異的な適切な抗体の産生につき試験する。抗体を産生す
る技術は当該分野で周知である。例えば、Godingら, MO
NOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE (第2
版) Acad.Press, N.Y.およびHarlowおよびLane(前出)を
参照のこと（そのそれぞれにつき、その全部は全ての目
的で本明細書に援用される）。他の適切な技術は、抗原
性ポリペプチドに対する、あるいは、ファージまたは同
様のベクターにおける抗体（後述を参照）のライブラリ
ーの選択に対するリンパ球のインビトロ暴露を含む。
【０３１５】Ｂ）ヒト抗体 本発明の別の局面において、hTRTポリペプチドに対する
ヒト抗体が提供される。ヒト免疫系のエレメントを有す
るトランスジェニック動物を用いて（例えば、米国特許
第5,569,825号および第5,545,806号参照、これらの両方
は全目的のためそれらの全部が本明細書中に参考として
援用される）、あるいはヒト末梢血液細胞を用いて（Ca
saliら, 1986, Science 234:476)、既知の抗原に対する
ヒトモノクローナル抗体をまた作成し得る。いくつかの
ヒト抗体は、競合結合実験によって、あるいは特定のマ
ウス抗体と同一のエピトープ特異性を有するように選択
される。
【０３１６】別の実施態様において、hTRTポリペプチド
に対するヒト抗体は、Huseら, 1989, Science 246:1275
（本明細書中に参考として援用される）によって概説さ
れている一般的なプロトコルに従って、ヒトＢ細胞由来
のDNAライブラリーをスクリーニングすることにより生
産し得る。hTRTポリペプチドに結合する抗体を選択す
る。次いで、このような抗体（または結合フラグメン
ト）をコードする配列をクローン化し、そして増幅す
る。Huseによって記載されているプロトコルは、しばし
ばファージティスプレイ技術とともに使用される。
【０３１７】Ｃ）ヒト化もしくはキメラ抗体 本発明はまた、キメラ、ヒト様またはヒト化されて、そ
れらの標的に対するそれらの親和性を低下させることな
く、それらの潜在的抗原性を低下させた抗hTRT抗体を提
供する。キメラ、ヒト様およびヒト化抗体の調製は当該
分野で記載されている（例えば、米国特許第5,585,089
号および第5,530,101号；Queenら, 1989,Proc. Natl. A
cad. Sci. USA, 86:10029;およびVerhoeyanら, 1988, S
cience 239:1534を参照;その全部は全目的のために本明
細書中に参考として援用される。ヒト化免疫グロブリン
は、実質的にヒト免疫グロブリン由来の可変フレームワ
ーク領域（アクセプター免疫グロブリンという）および
実質的に非ヒト（例えば、マウス）免疫グロブリン由来
の相補性決定領域（ドナー免疫グロブリンという）を有
する。もし存在すれば、定常領域は実質的にヒト免疫グ
ロブリン由来である。
【０３１８】ヒト患者への投与のようないくつかの適用
において、本発明のヒト化（ならびにヒト）抗hTRT抗体
は、ネズミまたは他の種由来の抗体よりも優れたいくつ
かの利点を提供する：（１）ヒト免疫系は、ヒト化抗体
のフレームワークまたは定常領域を外来性のものとして
認識するはずがなく、従って、このような注射された抗
体に対する抗体応答は、全体的に外来性のマウス抗体ま
たは部分的に外来性のキメラ抗体に対してより低いはず
である；（２）ヒト化抗体のエフェクター部分はヒトの
ものであるので、ヒト免疫系の他の部分とより良好に相
互作用し得る；および（３）注射されたヒト化抗体は、
天然に生じるヒト抗体と実質的に等しい半減期を有し、
他の種の抗体よりも少なく、より低い頻度の用量を可能
とする。前述のことから暗に意味されるように、抗hTRT
抗体は疾患の処置に、すなわち、テロメラーゼ陽性細胞
を標的化するための適用を有する。
【０３１９】Ｄ）ファージディスプレイ 本発明はまた、ファージディスプレイ法（例えば、Dowe
rら, WO91/17271およびMcCaffertyら, WO92/01047；お
よびVaughanら, 1996, Nature Biotechnology,14:309；
その全部は全目的のために本明細書中に参考として援用
される）によって生産された抗hTRT抗体（または結合性
組成物）を提供する。これらの方法において、ファージ
のライブラリーが生産される。ここで、メンバーはそれ
らの外表面上に異なる抗体を提示する。抗体は、通常、
FvまたはFabフラグメントとして提示される。所望の特
異性を有する抗体を表示するファージは、hTRTポリペプ
チドに対する親和性の豊富さによって選択される。
【０３２０】ファージディスプレイ法の変形において、
選択されたネズミ抗体の結合特異性を有するヒト化抗体
が生産され得る。この方法において、選択されたネズミ
抗体の重鎖または軽鎖可変領域のいずれかを出発物質と
して用いる。もし、例えば、軽鎖可変領域が出発物質と
して選択される場合、メンバーが同一の軽鎖可変領域
（すなわち、ネズミ出発物質）および異なる重鎖可変領
域を示すファージライブラリーが構築される。重鎖可変
領域は、再編成されたヒト重鎖可変領域のライブラリー
から得られる。hTRTポリペプチドに対する強力な特異的
結合を示すファージ（例えば、少なくとも108Ｍ-1およ
び好ましくは少なくとも109Ｍ-1）が選択される。次い
で、このファージ由来のヒト重鎖可変領域は、さらなる
ファージライブラリーを構築するための出発物質として
働く。このライブラリーにおいて、各ファージは同一の
重鎖可変領域（すなわち、最初のディスプレイライブラ
リーから同定された領域）、および異なる軽鎖可変領域
を表示する。軽鎖可変領域は、再編成されたヒト可変軽
鎖領域のライブラリーから得られる。再度、強力な特異
的結合を示すファージが選択される。これらのファージ
は完全なヒト抗hTRT抗体の可変領域を表示する。これら
の抗体は、通常、ネズミ出発物質と同一または同様のエ
ピトープ特異性を有する。
【０３２１】Ｅ）ハイブリッド抗体 本発明はまた、hTRTポリペプチドに対する抗体の特異性
を共有するが、第２の部位にも特異的に結合し得るハイ
ブリッド抗体を提供する。このようなハイブリッド抗体
において、一方の重鎖および軽鎖対は、通常、抗hTRT抗
体由来であり、他の対は別のエピトープまたはタンパク
質に対して惹起された抗体由来である。この結果、多機
能価の特性、すなわち、少なくとも２つの異なるエピト
ープに同時に結合する能力が得られ、ここで、少なくと
も１つのエピトープは、抗複合体抗体が結合するエピト
ープである。このようなハイブリッドは、各成分抗体を
生産するハイブリドーマの融合によって、あるいは組換
え技術によって形成され得る。このようなハイブリッド
は化合物（すなわち、薬物）をテロメラーゼ陽性細胞に
運搬するために使用され得る（すなわち、細胞傷害薬剤
がガン細胞に送達される）。
【０３２２】本発明の免疫グロブリンをまた、他の遺伝
子由来の機能的領域（例えば、酵素）に融合させて、有
用な特性を有する融合タンパク質（例えば、イムノトキ
シン）を生産し得る。
【０３２３】Ｆ）抗イディオタイプ抗体 また、上記の手法によって単離し得る抗イディオタイプ
抗体もまた有用である。抗イディオタイプ抗体は、例え
ば、動物の一次抗体（すなわち、抗hTRT抗体またはその
hTRT-結合性フラグメント）での免疫化によって調製し
得る。抗hTRT抗体については、一次抗体へのその結合が
hTRTポリペプチドまたはそのフラグメントによって阻害
されるその抗イディオタイプ抗体が選択される。抗イデ
ィオタイプ抗体およびhTRTポリペプチドまたはそのフラ
グメントは共に一次免疫グロブリンに結合するので、抗
イディオタイプ免疫グロブリンはエピトープの「内部イ
メージ」を表し得、そして従って、アッセイにおいてhT
RTポリペプチドに置換し得、あるいはそれを用いて、例
えば患者において抗hTRT抗体を結合（すなわち、不活化
し得る。抗イディオタイプ抗体をまた、テロメラーゼ会
合タンパク質と相互作用し得る。このような抗体の投与
は、hTRT会合タンパク質への結合においてhTRTで滴定す
るか、あるいは競合させることによってテロメラーゼ機
能に影響し得る。
【０３２４】Ｇ）一般 本発明の抗体は任意のイディオタイプ、例えば、IgM、I
gD、IgG、IgAおよびIgEであり得、IgG、IgAおよびIgMが
しばしば好ましい。ヒト化抗体は１より多いクラスまた
はイソタイプ由来の配列を含み得る。
【０３２５】本発明の別の実施態様において、上述のイ
ンタクトな抗体のフラグメントが提供される。典型的に
は、これらのフラグメントは、それらが由来するインタ
クトな抗体とhTRTポリペプチドへの特異的結合について
競合し得、少なくとも107、108、109Ｍ-1、または1010
Ｍ-1の親和性で結合し得る。抗体フラグメントは別々の
重鎖、軽鎖、Fab、Fab'、(ab')2、Fabc、およびFvを含
む。フラグメントは、インタクトな免疫グロブリンの酵
素的または化学的分離によって生じ得る。例えば、F(a
b')2フラグメントは、HarlowおよびLane（前出）に記載
されたような標準的な方法を用い、pH3.0〜3.5において
ペプシンでタンパク消化することによってIgG分子から
得ることができる。Fabフラグメントは、限定的還元に
よってF(ab')2フラグメントから、あるいは還元剤の存
在下でのパパインでの消化によって全抗体から得ること
ができる（一般には、Paul, W.編, FUNDAMENTAL IMMUNO
LOGY第2版 Raven Press, N.Y., 1989, 第7章を参照，そ
の全部はすべての目的のために参考として援用され
る）。フラグメントはまた、組換えDNA技術によって産
生され得る。選択されたフラグメントをコードする核酸
のセグメントは、制限酵素での全長コード配列の消化に
よって、あるいはデノボ合成によって産生される。フラ
グメントはしばしば、ファージ外皮融合タンパク質の形
態で発現される。
【０３２６】上述の免疫グロブリンの多くは、結合特異
性あるいはエフェクター機能の損失、または結合親和性
の過剰な低下（すなわち、約107Ｍ-1未満）の欠失なし
に、可変および定常領域双方において、重要でないアミ
ノ酸置換、付加または欠失を受けることができる。通
常、このような改変を取り入んだ免疫グロブリンは、そ
れらが由来する参照免疫グロブリンに対して実質的な配
列同一性を示す。それが由来する参照免疫グロブリンと
比較して同一の特異性および増加した親和性を有する、
変異免疫グロブリンを選択し得る。ファージディスプレ
イ技術はこのような免疫グロブリンを選択するための有
用な技術を供する。例えば、Dowerら, WO91/17271 McCa
ttertyら, WO 92/01047；およびHuse, WO 92/06204参
照。
【０３２７】本発明の抗体は、修飾を施しても施さなく
ても使用し得る。しばしば、抗体は、検出可能な標識に
共有結合的または非共有結合的のいずれかで結合するこ
とによって標識される。標識結合体として、本発明の抗
体は診断適用において特に有用である。
【０３２８】本発明の抗hTRT抗体は、周知の方法を用い
て精製し得る。本発明の全抗体、それらのダイマー、個
々の軽鎖および重鎖、または他の免疫グロブリン形態
は、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カ
ラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等を含む当該分
野の標準的な手順に従って、本発明の方法および試薬を
用いて精製し得る（一般には、Scopes, PROTEIN PURIFI
CATION; PRINCIPLES ANDPRACTICE 第3版, (Springer-Ve
rlag, N.Y., 1993)を参照)。少なくとも約90〜95％、ま
たは98〜99％さえの、またはそれを以上の均一性の実質
的に純粋な免疫グロブリンが好ましい。
【０３２９】VI．ヒトテロメラーゼの精製 本発明は、前例のない純度の単離されたヒトテロメラー
ゼを提供する。特に、本発明は：組換えまたは非組換え
起源の精製hTRT；必要に応じて１以上のテロメラーゼ会
合タンパク質を含む組換え、非組換え、または混合起源
の精製hTRT-hTR複合体（すなわち、RNP）；精製された
天然に生じるヒトテロメラーゼ等を提供する。さらに、
本発明は、変異体、融合タンパク質、天然に生じるタン
パク質等を含む前記分子および複合体（集合的に、「hT
RTおよび／またはhTRT複合体という）を部分的に、実質
的にまたは高度に精製するための方法および試薬を提供
する。
【０３３０】本開示に先立って、テロメラーゼ酵素複合
体を均一となるまで精製しようとする試みは、限定的な
成功に終わった。前記の適用で供される方法は、粗製細
胞抽出物と比較して、約60,000倍またはそれ以上のテロ
メラーゼの精製を提供する。本発明は、部分的には、本
発明の新規のイムノアフィニティー試薬（例えば、抗hT
RT抗体）、および／またはhTRTの組換え発現について本
明細書中に提供される試薬、細胞、および方法によっ
て、より高い純度のhTRTおよびhTRT複合体をも提供す
る。hTRTおよびhTRT複合体の組換え発現は精製を容易と
する。なぜなら、天然に生じるほとんどの細胞発現で見
い出されるよりもかなり高いレベルで所望の分子を産生
し得る。そして／または組換えhTRT分子を、容易に精製
し得るよう（例えば、エピトープタグとの融合によっ
て）修飾し得るからである。
【０３３１】天然に存在するテロメラーゼは任意のテロ
メラーゼ陽性細胞から精製し得ること、およびとりわ
け、インビトロ、インビボ、もしくはエクソビボ、また
は前出の開示の植物もしくは動物発現系、あるいは当該
分野で公知の他のもの／系のいずれかを用いて、組換え
hTRTおよびhTRT複合体を発現させ、そして精製し得るこ
とが認識させる。
【０３３２】１つの実施態様において、本発明のhTRT、
テロメラーゼおよび他の組成物は、イムノアフィニティ
ー工程を、単独でまたは他の精製工程と組み合わせて用
いて精製される。典型的には、本発明によって提供され
るような固定化されたまたは固定化され得る抗hTRT抗体
を、抗hTRT抗体がhTRT抗原に結合する条件下で所望のhT
RTまたはhTRT−含有複合体を含有する、細胞溶解物のよ
うなサンプルと接触させる。当該分野で周知の方法によ
ってサンプルの未結合成分を除去した後、hTRT組成物
を、所望ならば、実質的に純粋な形態で、抗体から溶出
し得る。１つの実施態様において、当該分野で周知のイ
ムノアフィニティークロマトグラフィー法（例えば、Ha
rlowおよびLane、 前出; およびAusubel, 前出；Herman
sanら, 1992, IMMOBILIZED AFFINITY LIGAND TECHNIQUE
S (Academic Press, San Diego)を参照）を、本発明の
方法に従って用いる。別の例示的な実施態様において、
抗hTRT免疫グロブリン−hTRT複合体の免疫沈降を固定化
プロテインＡを用いて行う。本発明の方法および試薬に
従って使用するのに適した多数の改変および別のイムノ
アフィニティー精製プロトコルは当業者に周知である。
【０３３３】別の実施態様では、それらの高レベルの発
現の結果として、イムノアフィニティー方法に代えて、
またはそれに加えて、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニ
ティーカラム（例えば、イムノアフィニティー）、サイ
ズ排除、アニオンおよびカチオン交換クロマトグラフィ
ー、ゲル電気泳動等のような日常的なタンパク質精製法
を用いて、組換えhTRTタンパク質を精製し得る（一般
に、R. Scopes, PROTEINPURIFICATION, Springer-Verla
g, N.Y. (1982)およびDeutscher, METHODS IN ENZYMOLO
GY VOL.182: GUIDE TO PROTEIN PURIFICATION, Academi
c Press, Inc. N.Y. (1990)を参照)。カチオン交換法
は、hTRTタンパク質の塩基性pIのため特に有用であり得
る。例えば、固定化ホスフェートを、カチオン交換官能
基として使用し得る（例えば、P-11 Phosphocellulose,
Whatman カタログ# 4071またはCellulose Phosphate,
Sigmaカタログ#C 3145)。固定化ホスフェートは、hTRT
精製につき２つの有利な特徴を有する。それは、カチオ
ン交換樹脂であり、それは核酸のホスフェート骨格に対
して物理的類似性を示す。これはアフィニティークロマ
トグラフィーを可能とする。なぜなら、hTRTはhTRおよ
びテロメリックDNAに結合するからである。また、他の
非特異的および特異的核酸アフィニティークロマトグラ
フィー法もまた精製に有用である（例えば、Albertsら,
1971, Methods Enzymol. 21:198；Arnt-Jovinら, 197
5, Eur. J. Biochem. 54:411；Pharmaciaカタログ#27-5
575-02）。hTRTのこの結合機能のさらなる開発は、精製
のための特異的核酸（例えば、テロメラーゼプライマー
またはhTR）アフィニティークロマトグラフィーの使用
を包含し得（Chodoshら, 1986, Mol. Cell. Biol. 6:47
23;Wuら, 1987, Science 238:1247; Kadonaga, 1991, M
ethods Enzymol. 208:10);ヌクレオチドに対する物理的
類似性を示す固定化シブリコンブルー色素は、ヌクレオ
チドのhTRT結合に起因する（例えば、DNA合成のための
基質として）、hTRT精製のための別の有用な樹脂である
（Pharmaciaカタログ#17-0948-01またはSigmaカタログ#
C 1285)。
【０３３４】１つの実施態様において、hTRTタンパク質
は、他のテロメラーゼ成分が同時発現されないインビト
ロまたはインビボ発現系から直接単離される。単離され
たhTRTタンパク質はまた、例えば、（例えば、温和なま
たは他の変性剤への暴露によって）テロメラーゼRNPを
破壊し、そして（例えば、クロマトグラフィーまたはイ
ムノアフィニティークロマトグラフィーのようなルーチ
ンの手段によって）RNP成分を分離することによって、
精製ヒトテロメラーゼまたはhTRT複合体から容易に取得
し得ることが認識される。
【０３３５】テロメラーゼ精製は、（例えば、ELISAに
よって）hTRTの富化を測定することによって、hTRの富
化を測定することによって、または当該分野で公知の他
の方法によってテロメラーゼ活性アッセイ（例えば、TR
APアッセイ、慣習的アッセイ、またはプライマー結合ア
ッセイ）を用いてモニターし得る。
【０３３６】本発明によって提供される精製されたヒト
テロメラーゼ、hTRTタンパク質、およびhTRT複合体は、
１つの実施態様において、高度に精製されている（すな
わち、少なくとも約90％均一、より頻繁には少なくとも
約95％均一）。均一性は、SDS−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動および当該分野で公知の他の手段（例えば、
Ausubelら、前出を参照）のような標準的手段によって
測定し得る。高度に精製されたヒトテロメラーゼ、hTRT
タンパク質、またはhTRT複合体が時には望ましいが、実
質的に精製された（例えば、少なくとも約75％均一）ま
たは部分的に精製された（例えば、少なくとも約20％均
一）ヒトテロメラーゼ、hTRTタンパク質、またはhTRT複
合体が多くの適用で有用であり、本発明によってまた提
供されることが理解される。例えば、部分的に精製され
たテロメラーゼは、テロメラーゼ調節活性、および他の
使用のための試験化合物をスクリーニングするのに有用
である（例えば、後出および前出参照；米国特許第5,64
5,986号参照）。
【０３３７】VII．テロメラーゼ関連疾患の処置 Ａ）序 本発明は、ヒト疾患および疾患状態の処置のために有用
なhTRTポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび抗体を提
供する。本発明の組換えおよび合成hTRT遺伝子産物（タ
ンパク質およびmRNA）を用いて、細胞中のテロメラーゼ
活性を生じさせまたは上昇させ、ならびにそれが所望で
ない細胞中のテロメラーゼ活性を阻害し得る。従って、
細胞中のテロメラーゼ活性（例えば、テロメラーゼ触媒
活性、忠実度、前進性（processivity）、テロメア結合
等）の阻害、活性化または改変を用いて、細胞の増殖能
力を変化させ得る。例えば、悪性腫瘍細胞のような不死
化細胞におけるテロメラーゼ活性の低下は、細胞を有寿
命性ものとし得る。逆に、有寿命性細胞（例えば、ほと
んどのヒト体細胞）におけるテロメラーゼ活性の増加
は、細胞の増殖能力を増加させ得る。例えば、それによ
りテロメア長を増加させる皮膚線維芽細胞におけるhTRT
タンパク質の発現の結果、線維芽細胞増殖能力の増加を
生じ；このような発現は創傷閉塞の年齢-依存性遅延化
を遅延し得るかまたは転地し得る（例えば、West, 199
4, Arch. Derm. 130:87を参照)。
【０３３８】従って、１つの局面において、本発明は、
細胞におけるヒトテロメラーゼ活性の存在、不存在、ま
たは量によって特徴付けられ、本明細書で開示される組
成物および方法を用いる処置に感受性である疾患および
病的状態を処置するのに有用である試薬および方法を提
供する。これらの疾患は、以下により詳細に記載される
ように、ガン、細胞増殖の他の疾患（特に、老化の疾
患）、免疫学的障害、不妊症（または受精能）などを含
む。
【０３３９】Ｂ）ガンの処置 本発明は、腫瘍細胞におけるテロメラーゼ活性を低下さ
せるため、およびガンを処置するための方法および組成
物を提供する。組成物は、アンチセンスオリゴヌクレオ
チド、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドまた
は活性改変タンパク質をコードする遺伝子治療ベクタ
ー、および抗hTRT抗体を含む。テロメラーゼ活性（テロ
メラーゼ陽性細胞）を発現するガン細胞（例えば、悪性
腫瘍細胞）は、内因性テロメラーゼ活性を低下または阻
害することによって死滅化し得る。さらに、テロメラー
ゼレベルは転移可能性のような疾患特徴に相関するので
（例えば、米国特許第5,639,613号；第5,648,215号；第
5,489,508号；Panditaら, 1996, Proc. Am. Ass. Cance
r Res. 37:559)、テロメラーゼ活性におけるいずれの低
下も疾患状態まで癌の攻撃的性質を低下させ得る。（従
来の介在の有効性を増加する）より処置できる本発明
は、固体腫瘍および白血病を含む、広範なタイプのいず
れのガンの処置にも有用な組成物および方法を提供す
る。処置し得るガンのタイプは、限定されないが、：乳
房、前立腺および結腸の腺ガン；肺の全ての形態の気管
支原性ガン；骨髄腫；黒色腫；肝ガン；神経芽腫；乳頭
腫；アプドーマ；分離腫；鰓腫；悪性類ガン腫症候群；
類ガン腫心臓病；ガン腫（例えば、ウォーカーガン、基
底細胞ガン、基底有棘細胞ガン、ブラウン−ペアスガ
ン、腺管ガン、エーリッヒ腫瘍、上皮内ガン、クレブス
２ガン、メルケル細胞ガン、粘液性ガン腫、非小細胞肺
ガン、燕麦細胞ガン、乳頭状ガン、硬性ガン、細気管支
ガン、気管支原生ガン、偏平上皮ガン、および移行上皮
ガン）、組織球障害；白血病（例えば、Ｂ細胞性白血
病、混合細胞性白血病、ヌル細胞性白血病、Ｔ細胞性白
血病、Ｔ細胞性慢性白血病、HTLV-II関連白血病、リン
パ性急性白血病、リンパ性慢性白血病、肥満細胞性白血
病、および骨髄様白血病）；悪性組織球症；ホジキン
病；免疫増殖小；非ホジキンリンパ腫；形質細胞腫；細
網内皮症；黒色腫；軟骨芽細胞腫；軟骨腫；軟骨肉腫；
線維腫；線維肉腫；巨大細胞腫；組織球腫；脂肪腫；脂
肪肉腫；中皮腫；粘液腫；粘液肉腫；骨腫；骨肉腫；ユ
ーイング肉腫；骨膜腫；腺線維症；腺リンパ腫；ガン肉
腫；脊索腫；頭蓋咽頭腫；未分化胚細胞腫；過誤腫；間
葉腫；中腎腫；筋肉腫；エナメル上皮腫；セメント質
腫；歯牙腫；奇形腫；胸腺腫；栄養膜腫；腺ガン；腺
腫；胆管腫；コレステリン腫；円柱腫；嚢胞腺ガン；嚢
胞腺腫；顆粒層腫；半陰陽性卵巣腫瘍；肝ガン；汗腺
腫；島細胞腫；レイディッヒ細胞腫；乳頭腫；セルトリ
細胞腫；膜細胞腫；平滑筋腫；平滑筋肉腫；筋芽細胞
腫；筋細胞腫；筋肉腫；横紋筋腫；横紋筋肉腫；脳室上
衣細胞腫；神経節細胞腫；神経膠腫；髄芽細胞腫；髄膜
腫；神経鞘腫；神経芽細胞腫；神経上皮腫；神経線維
腫；神経腫；傍神経節腫；非クロム親和性傍神経節腫；
被角血管腫；好酸球増加随半性血管類リンパ組織増殖
症；血管腫硬化症；血管腫症；グロムス血管腫；血管内
皮腫；血管腫；血管周囲細胞腫；血管肉腫；リンパ管
腫；リンパ管筋肉腫；リンパ管肉腫；松果体腫；ガン肉
腫；軟骨肉腫；葉状嚢肉腫；線維肉腫；血管肉腫；平滑
筋肉腫；白血肉腫；脂肪肉腫；リンパ管肉腫；筋肉腫；
粘液肉腫；卵巣ガン；横紋筋肉腫；肉腫（例えば、ユー
イング肉腫、実験的肉腫、カポシ肉腫；および肥満細胞
肉腫）；新生物（例えば、骨、乳房、消化系、結直腸、
肝臓、膵臓、下垂体、精巣、眼窩、頭部および頸部、中
枢神経系、聴覚、骨盤、呼吸管、および尿生殖器）；神
経線維腫症、および子宮頸部形成異常）を含む。本発明
は、例えば、hTRT、テロメラーゼ酵素、またはテロメラ
ーゼ活性の脱調節（例えば、異常に高い発現）によっ
て、不死化または過剰増殖状態となった他の病的の状態
の処置のための有用な組成物および方法を提供する。
【０３４０】本発明は、さらに、抗hTRTワクチン、テロ
メラーゼ活性化を妨げる遺伝子治療ベクター、およびテ
ロメラーゼ陽性細胞の特異的死滅を生じる遺伝子治療ベ
クターを含む、ガンの予防のための組成物および方法を
提供する。関連する局面において、後述する遺伝子置換
治療法は、ガンについての遺伝子偏好を「処置する」た
めに使用され得る。
【０３４１】Ｃ）他の病的状態の処置 本発明はまた、テロメラーゼまたはhTRT遺伝子産物の過
少発現または過剰発現によって特徴付けられる疾患また
は疾患状態（ガンに加えて）の処置に有用な組成物およ
び方法を提供する。例としては、細胞増殖の疾患、細胞
老化から生じる疾患（特に、加齢の疾患）、免疫学的障
害、不妊症、免疫不全の疾患などが挙げられる。
【０３４２】加齢のある種の疾患は、細胞におけるテロ
メラーゼ活性の不存在（またはそのかなり低いレベル）
から生じる、減少したテロメア長（より若い細胞と比較
して）による細胞老化に関連する変化によって特徴付け
られる。減少したテロメア長および低下した複製能は後
述のような疾患に寄与する。テロメラーゼ活性およびテ
ロメア長は、例えば、細胞におけるhTRT遺伝子産物（タ
ンパク質およびmRNA）のレベルを増加させることによっ
て増加し得る。hTRT発現が処置となり得る細胞老化に関
連する病的状態の部分的なリストには、アルツハイマー
病、パーキンソン病、ハンチントン病、および卒中；年
齢関連疾患（例えば皮膚萎縮症、エラストリシスおよび
皮膚皺形成）、皮脂腺過形成、老人性黒子、毛髪の白髪
化および脱毛、慢性皮膚潰瘍、および創傷治癒の年齢関
連不全；変性関節病；骨粗鬆症：（例えば、ＢおよびＴ
リンパ球、単球、好中球、好酸球、好塩基球、NK細胞お
よびそれらの各始原細胞のような細胞が関与する）年齢
関連免疫系不全；アテローム性動脈硬化症、カルシウム
沈着、血栓症、および動脈瘤を含む血管系の年齢関連疾
患；糖尿病、筋肉萎縮症、呼吸器疾患、肝臓およびGI管
の疾患、代謝疾患、内分泌腺疾患（例えば、下垂体およ
び副腎の障害）、生殖疾患、および年齢関連斑点変性が
含まれる。これらの疾患および状態は、細胞中のhTRT遺
伝子産物のレベルを増加させて、テロメア長を増加さ
せ、それにより細胞により大きな複製能力を回復させる
かまたは付与することによって処置され得る。このよう
な方法はエクスビボで培養した細胞またはインビボの細
胞に対して実行され得る。１つの実施態様において、細
胞を、テロメラーゼを活性化し、そしてテロメアを長く
するようまず処置し、次いで、hTRT遺伝子およびテロメ
ラーゼ活性を不活化するよう処理する。好ましい実施態
様において、テロメラーゼ活性は、分化に先立ってまた
は分化の間に胚性の生殖細胞または幹細胞において本発
明のベクターによって生じる。
【０３４３】また、本発明は、不妊を処置するに有用な
方法および組成物を提供する。ヒト生殖系細胞（例え
ば、精原細胞、それらの祖先または子孫）は不定期に増
殖し得、そして高テロメラーゼ活性によって特徴付けら
れる。異常なまたは低下したレベルのhTRT遺伝子産物
は、例えば、精子の不適切または異常な産生を生じ、不
妊または生殖の障害に至る。従って、「テロメラーゼを
ベースとする」不妊は、テロメラーゼレベルを増加させ
るための本明細書に記載した方法および組成物を用いて
処置され得る。同様に、テロメラーゼの阻害は、精子形
成、卵子形成、および精子および卵子の生存能に負に影
響（impact)し得るので、本発明のテロメラーゼ阻害性
組成物は、生殖系列細胞におけるhTRT遺伝子産物レベル
を低下させるために使用される場合、避妊効果を有し得
る。
【０３４４】さらに、本発明は、テロメラーゼ活性を低
下させることによって、テロメラーゼ陽性細胞（例え
ば、活性化リンパ球および造血幹細胞）の増殖能力を減
少させるに有用な方法および組成物を提供する。従っ
て、本発明は、免疫抑制を行う手段を提供する。逆に、
本発明の方法および試薬は、処置的介入に先立って、低
レベルのテロメラーゼを発現するかまたはテロメラーゼ
を発現しない細胞（例えば、幹細胞）におけるテロメラ
ーゼ活性および増殖能力を増加させるに有用である。
【０３４５】Ｄ）介入の態様 前記の議論から明らかなように、細胞のテロメラーゼの
レベルまたはテロメラーゼ活性の調節は、細胞の増殖能
力に対して絶大な効果を有し得、従って、疾患の処置に
おいて顕著な有用性を有する。やはり明らかなように、
この調節は、テロメラーゼ活性の減少または活性の増大
のいずれであってもよい。本発明のテロメラーゼ調節分
子は、多数のメカニズムにより作用し得る；これらのう
ちのいくつかを、このサブセクションおよび以下のサブ
セクションに、処置剤を選択する際に実施者を助けるた
めに記載する。しかしながら、本出願人らは、本明細書
に記載した新規な処置剤化合物、組成物および方法につ
いていずれかの特定の作用メカニズムに限定する意図は
ない。
【０３４６】テロメラーゼ活性は、いくつかのメカニズ
ムのうちの任意のもの、またはメカニズムの組合せによ
り減少させ得る。１つのメカニズムは、テロメラーゼ活
性を低下させるためのhTRT遺伝子発現の低下である。こ
の低下は、hTRT遺伝子のmRNAへの転写、プロセシング
（例えば、スプライシング）、mRNAの核輸送または安定
性、hTRTタンパク質を産出するためのmRNAの翻訳、また
はhTRTタンパク質の安定性および機能のレベルにおける
ものであり得る。別のメカニズムは、本明細書中に開示
した方法を用いて同定され得るか、あるいは本明細書に
開示した組成物によって供される阻害性の核酸、ポリペ
プチドまたは他の薬剤（例えば、模倣物、小分子、薬物
およびプロドラッグ）を用いる、テロメラーゼの１また
はそれ以上の活性（例えば、逆転写酵素触媒活性、また
はhTR結合活性）の干渉である。他のメカニズムは、hTR
および／またはテロメラーゼ会合タンパク質の隔離、お
よびその成分サブユニットからのテロメラーゼRNPの組
立ての干渉を含む。関連するメカニズムにおいて、hTRT
プロモーター配列は、トキシンをコードする遺伝子に作
動可能に連結され細胞に導入される；hTRT転写アクチベ
ーターが細胞において発現されるか、または活性化され
る場合、トキシンが発現され、その結果、特定の細胞の
死滅を生じる。
【０３４７】細胞の増殖能を低下させる関連方法は、異
常なテロメリック反復が合成されるように、低い忠実度
合を有するhTRT変異型（すなわち、高い、例えば１％を
超えるエラー率を有するhTRT変異型）を導入することを
含む。これらの異常な反復は、テロメアタンパク質結合
に影響し、そして染色体の再配置および異常に至り、そ
して／または細胞死に至る。
【０３４８】同様に、テロメラーゼ活性は、いくつかの
メカニズムのうちの任意のもの、またはメカニズムの組
合せにより増大させ得る。これらは、細胞におけるhTRT
の量を増大させることを含む。通常、これは、hTRTポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドを、細胞中に導
入することによって行われる（例えば、プロモーターに
作動可能に連結されたhTRT DNA配列を含む組換えにより
産生されたポリペプチド、または安定なhTRT mRNA）。
あるいは、触媒的に活性なhTRTポリペプチドは、それ自
体、例えば、マイクロインジェクションまたは当該分野
で公知の他の手段によって、細胞または組織中に導入さ
れ得る。他のメカニズムにおいて、細胞における内因性
hTRT遺伝子からの発現またはhTRT遺伝子産物の安定性
は、増大させ得る。また、細胞におけるテロメラーゼ活
性は、内因性テロメラーゼインヒビターとテロメラーゼ
RNPとの、または内因性hTRT転写リプレッサーとhTRT遺
伝子との相互作用を干渉すること；hTRT転写アクチベー
ターの発現または活性を増大させること；および本開示
を精査して当業者に明らかな他の手段によって増大させ
得る。
【０３４９】Ｅ）介入薬剤 １）TRTタンパク質およびペプチド １つの実施態様において、本発明は、（例えば、注入、
リポソーム媒介融合、ヒドロゲルの腫瘍［例えば、黒色
腫］表面への適用、ヘルペスウイルス構造タンパク質VP
22への融合または付着、および本明細書に記載されたお
よび当該分野で公知の他の手段によって）標的細胞中に
直接的に導入され得るテロメラーゼ活性を増大または減
少させるテロメラーゼ調節ポリペプチド（すなわち、タ
ンパク質、ポリペプチド、およびペプチド）を提供す
る。第２の実施態様において、本発明のテロメラーゼ調
節タンパク質およびペプチドは、所望のタンパク質また
はペプチドをコードする核酸（例えば、DNA発現ベクタ
ーまたはmRNA）を細胞中に導入することによって、細胞
において発現される。発現は、ベクターおよびプロモー
ターの選択に依存して、構成的または誘導性のいずれか
であり得る（下記の議論を参照）。hTRTをコードするメ
ッセンジャーRNA調製物は、一過性発現（例えば、テロ
メラーゼの一過性活性化）のみが所望である場合、特に
有用である。細胞中への核酸導入および発現のための方
法は、当該分野で周知である（また、本明細書の他の箇
所、例えば、オリゴヌクレオチド、遺伝子治療方法のセ
クションを参照）。
【０３５０】本発明の１つの局面において、細胞におい
てテロメラーゼ活性を増大させるテロメラーゼ調節ポリ
ペプチドが提供される。１つの実施態様において、ポリ
ペプチドは、ヒトテロメリックDNAの合成（hTRのような
RNAテンプレートと組み合わせた）を指示し得る触媒的
に活性なhTRTポリペプチドである。この活性は、例え
ば、TRAPアッセイのようなテロメラーゼ活性アッセイを
用い、前記のように、測定され得る。１つの実施態様に
おいて、ポリペプチドは、配列番号２の1132残基の配列
を有するか、またはその配列と実質的に同一の配列を有
する完全長hTRTタンパク質である。別の実施態様におい
て、ポリペプチドは、配列番号２のhTRTタンパク質の変
異型（例えば、融合ポリペプチド、誘導体化ポリペプチ
ド、短縮型ポリペプチド、保存的に置換されたポリペプ
チド、活性が修飾されたポリペプチドなど）である。融
合または誘導体化タンパク質は、細胞膜を横切るポリペ
プチドの能力を増大させるか、あるいはポリペプチドを
特定された細胞タイプ（例えば、肝臓細胞または腫瘍細
胞）または細胞区画（例えば、核区画）に優先的に送達
されるようにする標的化部分（targeting moiety)を含
み得る。標的化部分の例は、脂質テイル、アミノ酸配列
（例えば、アンテナペディアペプチド）または核局在化
シグナル（NLS；例えば、Xenopusヌクレオプラスミン
Robbinsら, 1991, Cell 64:615)を含む。天然に存在す
るhTRTタンパク質（例えば、配列番号２の配列またはそ
れと実質的に同一な配列を有する）は、細胞核で作用す
る。従って、配列番号２の１またはそれ以上のサブ配列
（例えば、残基193〜196(PRRR)および残基235〜240(PKR
PRR)）は、核局在化シグナルとして作用するようであ
る。この小領域は、多くのNLSが、塩基性アミノ酸（Ｋ
またはＲ）から構成されるか、あるいは３塩基性アミノ
酸（ＫまたはＲ）およびＨまたはＰから構成される４残
基パターン；Ｐから始まり、３残基内に、４残基のうち
に３つのＫまたはＲ残基を含有する塩基性セグメントが
続くパターンを含むという観察（例えば、Nakaiら, 199
2, Genomics 14:897を参照)に基づくNLSであるようであ
る。これらの配列のうちの１つまたは両方および／また
はさらなる局所化配列の欠失は、核へのhTRT輸送に干渉
し、そして／またはhTRTの代謝回転を増加させると予測
され、その核基質へのテロメラーゼの接近を妨げ、そし
て増殖能力を減少させるために有用である。さらに、NS
Lを欠く変異型hTRTポリペプチドは、テロメア長を維持
し得ないためRNPに組み立て得る。何故ならば、得られ
る酵素が核に侵入し得ないからである。
【０３５１】本発明のhTRTポリペプチドは、代表的に
は、特に、それらが、細胞におけるテロメラーゼ活性を
増大させるために使用される場合、標的細胞においてテ
ロメラーゼRNA（例えば、hTR）とで会合する。１つの実
施態様において、導入されたhTRTポリペプチドは内因性
hTRと会合して、触媒的に活性なRNP（例えば、hTRおよ
び配列番号２の配列を有する完全長ポリペプチドを含む
RNP）を形成する。また、このように形成されたRNPは、
他のタンパク質（例えば、テロメラーゼ会合タンパク
質）と会合し得る。他の実施態様において、テロメラー
ゼRNP（hTRTタンパク質、hTRおよび必要に応じて他の成
分を含有する）は、複合体として標的細胞に導入され
る。
【０３５２】関連する実施態様において、hTRT発現ベク
ターは、テロメラーゼRNA（例えば、hTR）発現ベクター
を同時にまたは引き続いて導入されるか、または前もっ
て導入された細胞（またはこの細胞の子孫）に導入され
る。この実施態様において、hTRTタンパク質およびテロ
メラーゼRNAは、細胞において共発現され、そして集合
（assemble）してテロメラーゼRNPを形成する。好まし
いテロメラーゼRNAは、hTRである。細胞におけるhTRの
発現に有用な発現ベクターは、前述されている（米国特
許第5,583,016号を参照）。さらに別の実施態様におい
て、hTRTポリペプチドおよびhTR RNA（または均等物）
は、インビトロで会合して複合体を形成し、次いで、こ
の複合体は、例えば、リポソーム媒介移入によって標的
細胞に導入される。
【０３５３】別の局面において、本発明は、細胞におい
てテロメラーゼ活性を低下させるに有用なhTRTポリペプ
チドを提供する。上記のように、これらの「阻害性」ポ
リペプチドは、直接的に、または組換え核酸の発現によ
って細胞に導入され得る。ペプチド模倣物、または非標
準的アミノ酸（すなわち、遺伝コードによりコードされ
る20アミノ酸またはそれらの通常の誘導体以外のアミノ
酸）を含むポリペプチドは、代表的には、直接的に導入
されることが理解される。
【０３５４】１つの実施態様において、テロメラーゼ活
性の阻害は、正確なテロメア伸長に必要とされる成分の
隔離に由来から生じる。このような成分の例は、hTRTお
よびhTRである。従って、hTRに結合するが、テロメラー
ゼ触媒活性を有しないポリペプチドの投与は、細胞にお
いて内因性テロメラーゼ活性を低下させ得る。関連する
実施態様において、hTRTポリペプチドは、hTR以外の細
胞成分（例えば、１またはそれ以上のテロメラーゼ会合
タンパク質）に結合され得、それにより細胞においてテ
ロメラーゼ活性に干渉する。
【０３５５】別の実施態様において、本発明のhTRTポリ
ペプチドは、内因性に発現されるhTRTタンパク質と、テ
ロメラーゼ機能に必要な別の細胞成分（例えばhTR、テ
ロメリックDNA、テロメラーゼ会合タンパク質、テロメ
ア会合タンパク質、テロメア、細胞周期制御タンパク
質、DNA修復酵素、ヒストンまたは非ヒストン染色体タ
ンパク質など）の相互作用に（例えば、競合によって）
干渉する。
【０３５６】内因性に発現されるhTRTタンパク質と他の
細胞成分との相互作用に影響する本発明の分子（例え
ば、ポリペプチド）を選択することにおいて、本明細書
に記載されるように、hTRTタンパク質の１またはそれ以
上の保存されたモチーフを含む分子が好ましくあり得
る。これらの領域の進化論的保存は、これらのモチーフ
が寄与するヒトテロメラーゼの適切な機能化において重
要な機能を示し、従ってこのモチーフは、一般的には、
hTRTタンパク質機能を変化させて、本発明の変異型hTRT
タンパク質を作製するための有用な部位である。従っ
て、保存されたモチーフ変異を有する変異型hTRTポリペ
プチドは、本発明のいくつかの適用に特に有用である。
【０３５７】別の実施態様において、内因性hTRT遺伝子
の発現は、大量のhTRTポリペプチド（例えば、代表的に
は、内因レベルより少なくとも２倍多い、よりしばし
ば、少なくとも約10倍〜約100倍）の細胞への導入によ
って抑制される。この大量のhTRTは、フィードバックル
ープを介して作用して、hTRT遺伝子の転写、hTRTプレmR
NAのプロセシング、hTRT mRNAの翻訳、またはテロメラ
ーゼRNPの組立ておよび輸送を阻害する。
【０３５８】２）オリゴヌクレオチド ａ）アンチセンス構築物 本発明は、hTRT遺伝子産物の発現をインビトロまたはイ
ンビボで低下させるために使用され得る、方法およびア
ンチセンスオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド
試薬を提供する。本発明のアンチセンス試薬の標的細胞
への投与は、テロメラーゼ活性の低下を生じ、そして高
テロメラーゼ活性によって特徴付けられる疾患（例え
ば、ガン）の処置に特に有用である。いずれかの特定の
メカニズムに限定する意図はないが、アンチセンスオリ
ゴヌクレオチドは、センスhTRT mRNAに結合し、センスh
TRT mRNAの翻訳に干渉すると考えられている。あるい
は、アンチセンス分子は、hTRT mRNAをヌクレアーゼ消
化に対して感受性とし、転写に干渉し、プロセシング、
局在化またはそうでなければRNA前駆体（「プレmRN
A」）に干渉し、hTRT遺伝子からのmRNAの転写を抑制
し、あるいはいくつかの他のメカニズムを介して作用し
得る。しかし、アンチセンス分子がhTRT発現を低下させ
る特定のメカニズムは、重要ではない。
【０３５９】本発明のアンチセンスポリヌクレオチド
は、hTRTをコードするmRNAまたはhTRT遺伝子から転写さ
れるmRNA由来の配列に特異的にハイブリダイズする、少
なくとも７〜10〜代表的には20またはそれ以上のヌクレ
オチドのアンチセンス配列を含む。よりしばしば、本発
明のアンチセンスポリヌクレオチドは、約10〜約50ヌク
レオチド長、または約14〜約35ヌクレオチド長である。
他の実施態様において、アンチセンスポリヌクレオチド
は、約100ヌクレオチド未満または約200ヌクレオチド未
満のポリヌクレオチドである。一般に、アンチセンスポ
リヌクレオチドは、安定な二重鎖を形成するに十分な長
さであるが、所望であれば、インビボに投与するに、十
分に短く（送達の様式に応じて）あるべきである。標的
配列への特異的ハイブリダイゼーションに必要なポリヌ
クレオチドの最小の長さは、とりわけ、いくつかの因子
（例えばG/C含有量、ミスマッチ塩基の位置（もしあれ
ば）、標的ポリヌクレオチドの集団と比較した場合の配
列の独自性の程度、およびポリヌクレオチドの化学的性
質（例えば、メチルホスホネート骨格、ペプチド核酸、
ホスホロチオエート））に依存する。
【０３６０】一般に、特異的ハイブリダイゼーションを
確実にするために、アンチセンス配列は、標的hTRT mRN
A配列と実質的に相補的である。特定の実施態様におい
て、アンチセンス配列は、標的配列に正確に相補的であ
る。しかし、アンチセンスポリヌクレオチドはまた、hT
RT RNAまたはその遺伝子に対応する関連標的配列への特
異的結合が、ポリヌクレオチドの機能的特性として保持
される限り、ヌクレオチドの置換、付加、欠失、トラン
ジション、転位、または修飾、あるいは他の核酸配列ま
たは非核酸部分を含み得る。
【０３６１】１つの実施態様において、アンチセンス配
列は、hTRT mRNAの比較的接近可能な配列（例えば、二
次構造を比較的欠く配列）に相補的である。これは、例
えば、MFOLDプログラム（Genetics Computer Group, Ma
dison, WI)を用いて、予測されるRNA二次構造を解析
し、そして当該分野で公知のようにインビトロまたはイ
ンビボで試験することによって決定され得る。hTRT機能
のアンチセンス抑制について、細胞において試験され得
るオリゴヌクレオチドの例は、配列番号１の配列の以下
の位置：40-60；260-280；500-520；770-790；885-90
5；1000-1020；1300-1320；1520-1540；2110-2130；229
5-2315；2450-2470；2670-2690；3080-3110；3140-316
0；および3690-3710にハイブリダイズし得る（すなわ
ち、実質的に相補的であり得る。）オリゴヌクレオチド
である。効果的なアンチセンス組成物を同定するために
有用な別の方法は、オリゴヌクレオチドの組合せ整列
（combinatorial array）を使用する（例えば、Milner
ら, 1997, Nature Biotechnology 15:537)。
【０３６２】また、本発明は、アンチセンス配列に加え
て（すなわち、アンチhTRTセンス配列に加えて）、配列
を有するアンチセンスポリヌクレオチドを提供する。こ
の場合、アンチセンス配列は、より長い配列のポリヌク
レオチド内に含まれる。別の実施態様において、ポリヌ
クレオチドの配列は、アンチセンス配列から実質的にな
るか、あるいはアンチセンス配列である。
【０３６３】アンチセンス核酸（DNA、RNA、修飾された
もの、アナログなど）は、核酸を生成する任意の適切な
方法（例えば、化学合成および本明細書に開示された組
換え法）を用いて作製され得る。１つの実施態様におい
て、例えば、本発明のアンチセンスRNA分子は、デノボ
（de novo）化学合成によって、あるいはクローニング
によって調製され得る。例えば、hTRT mRNAにハイブリ
ダイズするアンチセンスRNAは、ベクター（例えば、プ
ラスミド）中のプロモーター作動可能に逆方向に連結し
たhTRT DNA配列（例えば、配列番号１、またはそのフラ
グメント）を、挿入（連結）することによって作製され
得る。プロモーターならびに、好ましくは終止シグナル
およびポリアデニル化シグナルが適切に配置される場
合、非コード鎖に対応する挿入された配列の鎖が転写さ
れ、そして本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドと
して作用する。
【０３６４】本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド
は、無細胞抽出物、細胞および動物（哺乳動物およびヒ
トを含む）においてテロメラーゼ活性を阻害するために
使用され得る。例えば、以下のホスホロチオエートアン
チセンスオリゴヌクレオチドはテロメラーゼ活性を阻害
するために使用され得る：
【０３６５】
【化１】
【０３６６】10マイクロモル濃度において、各オリゴヌ
クレオチド、オリゴヌクレオチドＡおよびＢ；Ａ、Ｂ、
ＣおよびＤ；ならびにＡ、ＣおよびＤの混合物は、１日
当たり１回、７日間処理した場合、293個の細胞におい
てテロメラーゼ活性を阻害した。また、アンチセンスhT
R分子（5'-GCTCTAGAATGAAGGGTG-3'がオリゴヌクレオチ
ドＡ、ＢおよびＣ；Ａ、ＢおよびＤ；ならびにＡおよび
Ｃと併用された場合、阻害が観察された。このような実
験で有用なコントロールオリゴヌクレオチドは：
【０３６７】
【化２】
【０３６８】を含む。
【０３６９】目的の特定の適用のために最適な本発明の
アンチセンスオリゴヌクレオチドを決定するために、本
発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドのセットを用い
てスキャンを行い得る。１つの例示的なセットは、hTRT
mRNAにわたり（span）、そしてあるものから次のもの
へ15ヌクレオチドだけずれる30量体オリゴヌクレオチド
である（すなわち、ON1は位置1-30に対応し、TCCCACGTG
CGCAGCAGGACGCAGCGCTGCであり、ON2は位置16-45に対応
し、GCCGGGGCCAGGGCTTCCCACGTGCGCAGCであり、ON3は位
置31-60に対応し、GGCATCGCGGGGGTGGCCGGGGCCAGGGCTで
あり、そしてmRNAの最後まで同様に続く）。このセット
の各メンバーは、本明細書に開示するように阻害活性に
ついて試験され得る。次いで、目的の条件下で阻害活性
を示すオリゴヌクレオチドは、目的の領域を同定し、そ
して目的の領域に対応する本発明の他のオリゴヌクレオ
チド（すなわち、８量体、10量体、15量体など）が、適
用のための好ましい活性を有するオリゴヌクレオチドを
同定ために試験され得る。
【０３７０】アンチセンスポリヌクレオチドに関する一
般的方法については、ANTISENSE RNA AND DNA, (1988),
D.A. Melton編, Cold Spring Harbor Laboratory, Col
d Spring Harbor, NY)を参照。また、Dagleら, 1991, N
ucleic Acids Research, 19:1805も参照。アンチセンス
処置の概説については、例えば、Uhlmannら, Chem. Rev
iews, 90:543-584 (1990)を参照。
【０３７１】ｂ）三重鎖のオリゴヌクレオチドおよびポ
リヌクレオチド 本発明は、（例えば、hTRT RNAの折り畳まれた領域（fo
lded region）において、またはhTRT遺伝子において）
二本鎖または二重鎖のhTRT核酸に結合し、三重らせん含
有または「三重鎖」の核酸を形成するオリゴヌクレオチ
ドおよびポリヌクレオチド（例えば、DNA、RNA、PNAな
ど）を提供する。三重らせんの形成は、例えば、hTRT遺
伝子の転写を妨げることによってhTRT発現の阻害を生
じ、従って、細胞においてテロメラーゼ活性を低下させ
るかまたは消失させる。いずれかの特定のメカニズムに
限定する意図はないが、三重らせん対合は、ポリメラー
ゼ、転写因子、または調整分子の結合が起こるに十分
に、二重らせんが開く能力を弱めると考えられる。
【０３７２】本発明の三重鎖のオリゴヌクレオチドおよ
びポリヌクレオチドは、三重らせん形成の塩基対合則
（例えば、Chengら, 1988, J. Biol. Chem. 263: 1511
0；FerrinおよびCamerini-Otero, 1991, Science 354:
1494；Ramdasら, 1989, J. Biol. CHem. 264:17395；St
robelら, 1991, Science 254:1639；およびRigasら, 19
86, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.83:9591；これらの
それぞれを本明細書中で参考として援用する）ならびに
hTRT mRNAおよび／または遺伝子配列を用いて構築され
る。代表的には、本発明の三重鎖形成オリゴヌクレオチ
ドは、hTRT RNAまたは遺伝子中の特定配列に「相補的
な」、約10から少なくとも約25ヌクレオチドまたはそれ
以上の特定配列を含む（すなわち、安定な三重らせんを
形成するに十分長いが、所望であれば、送達の様式に応
じて、インビボに投与するに十分短い）。この意味で、
「相補的な」とは、安定な三重らせんを形成し得ること
を意味する。１つの実施態様において、オリゴヌクレオ
チドは、hTRT遺伝子の調節領域（例えば、hTRT5'フラン
キング配列、プロモーターおよびエンハンサー）、ある
いは転写開始部位（例えば、転写開始部位から-10と+10
と間）に特異的に結合するように設計される。三重鎖DN
Aを用いる最近の処置の進歩の概説については、Geeら,1
994, MOLECULAR AND IMMUNOLOGIC APPROACHES（Huber
およびCarr）, Futura Publishing Co. Mt Kisco NY、
およびRinislandら, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. US
A 94:5854（共に本明細書中で参考として援用する)。を
参照。
【０３７３】ｃ）リボザイム 本発明はまた、テロメラーゼ活性の阻害に有用なリボザ
イムを提供する。本発明のリボザイムはhTRT mRNAに結
合し、それを特異的に切断し、不活化する。有用なリボ
ザイムはhTRT mRNAに相補的な５'および３'末端配列を
含み得、そして本明細書に開示されるhTRT mRNA配列に
基づいて当業者によって設計され得る（PCT国際公開WO
93/23572参照、前掲）。本発明のリボザイムは、グルー
プＩイントロンリボザイム（Cech, 1995, Biotechnolog
y 13:323)、およびハンマーヘッドリボザイムの他のも
の（Edgington, 1992, Biotechnology 10:256)の特徴を
有するものを含む。
【０３７４】本発明のリボザイムはGUA、GUUおよびGUC
のような切断部位を有するものを含む。本発明における
テロメラーゼ活性のリボザイム媒介阻害のための他の最
適切断部位は、PCT国際公開WO 94/02595およびWO 93/23
569（共に、本明細書中で参考として援用する）に記載
されたものを含む。切断部位を含有する標的hTRT遺伝子
の領域に対応する長さが15および20リボヌクレオチドの
間の短いRNAオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチ
ドをより望ましくし得る二次構造の特徴について評価さ
れ得る。切断部位の適合性はまた、リボヌクレアーゼ保
護アッセイを用いて相補的オリゴヌクレオチドとのハイ
ブリダイゼーションへの接近性を試験することによっ
て、あるいは当該分野で公知の標準的な手法に従ってイ
ンビトロリボザイム活性について試験することによっ
て、評価され得る。
【０３７５】Huら、PCT国際公開WO 94/03596（本明細書
中で参考として援用する）によって記載されているよう
に、アンチセンスおよびリボザイム機能を単一オリゴヌ
クレオチドにおいて組み合わせ得る。さらに、リボザイ
ムは、本発明の例示的なアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドの記載と組み合わせた、前記のように、１以上の修飾
されたヌクレオチドまたはヌクレオチド間の修飾された
結合を含み得る。
【０３７６】１つの実施態様において、本発明のリボザ
イムはインビトロで生成され、細胞または患者に導入さ
れる。別の実施態様において、遺伝子治療法が、エクス
ビボまたはインビボでの標的細胞におけるリボザイムの
発現のために使用される。
【０３７７】ｄ）オリゴヌクレオチドの投与 典型的には、本発明の治療方法は、インビボ生理学的条
件下でテロメラーゼ活性を阻害または刺激するように機
能し、かつ治療的効果のために十分な時間の間その条件
下で比較的安定であるオリゴヌクレオチドの投与を含
む。前記したように、修飾された核酸は、このような安
定性を付与することにおいて、ならびに所望の組織、器
官、または細胞へのオリゴヌクレオチドの送達を標的化
するために有用であり得る。
【０３７８】オリゴ−およびポリ−ヌクレオチドは、適
切な医薬処方物中の薬物として直接的に、あるいは本明
細書に記載されるようなリポソーム、イムノリポソー
ム、バリスティックス、細胞への直接取り込みなどを含
む、核酸の細胞への導入手段によって間接的に送達され
得る。疾患の治療のために、本発明のオリゴヌクレオチ
ドは、治療的有効量で患者に投与される。治療的有効量
は、疾患の徴候を寛解するのに、あるいは例えば、ＴＲ
ＡＰアッセイもしくはテロメラーゼの生物学的機能の他
の適切なアッセイを用いて測定できるように、標的細胞
におけるテロメラーゼ活性を調節させるのに十分な量で
ある。治療目的のためのオリゴヌクレオチドの送達に有
用な方法は、本明細書中で参考として援用する米国特許
第5,272,065号に記載されている。薬学的に活性な化合
物の投与の他の詳細は下記にて提供する。他の実施態様
において、オリゴ−およびポリ−ヌクレオチドは、本発
明の遺伝子治療および組換えDNA発現プラスミドを用い
て送達され得る。
【０３７９】３）遺伝子治療 遺伝子治療とは、それが導入される（典型的には）哺乳
動物細胞において医学的に有用な表現型効果を生じる外
因性ポリヌクレオチドの導入をいう。１つの局面におい
て、本発明は、テロメラーゼ関連状態の処置のための遺
伝子治療法および組成物を提供する。例示的な実施態様
において、遺伝子治療は、hTRT遺伝子産物（例えば、テ
ロメラーゼ活性を増加させるための配列番号２の配列を
有するhTRTポリペプチドに実質的に類似したhTRTタンパ
ク質）または活性を低下させるための阻害性hTRTポリペ
プチドを発現するか、hTRT遺伝子またはmRNA配列を有す
る核酸（例えば、テロメラーゼ活性を低下させるための
アンチセンスRNA）を発現するか、hTRT遺伝子産物の発
現に影響するポリペプチドまたはポリヌクレオチド（例
えば、テロメラーゼ活性を低下させるためのhTRT mRNA
に指向するリボザイム）を発現するか、あるいは内因性
hTRT配列を置換または破壊する（例えば、それぞれ、遺
伝子置換および「遺伝子ノックアウト」）ベクターを細
胞に導入することを含む。多数の他の実施態様が、本明
細書の開示を考慮して当業者に明らかである。１つの実
施態様において、hTRをコードするベクターもまた導入
される。他の実施態様において、テロメラーゼ会合タン
パク質をコードするベクターもまたhTRのためのベクタ
ーと共にまたはそれをともなうことなく導入される。
【０３８０】hTRT遺伝子治療で有用なベクターはウイル
スまたは非ウイルスであり得、本発明のhTRT発現系に関
連して上記したものを含む。遺伝子治療ベクターが本開
示で記載されているようなプロモーターおよび他の調節
またはプロセシング配列を含み得ることは当業者によっ
て理解される。通常、ベクターは、オリゴリボヌクレオ
チドの転写を駆動するように働くプロモーターおよび、
必要に応じて（プロモーター配列内に含まれるいずれか
のものとも別の）エンハンサー、ならびに所望であれ
ば、エビソーム維持または染色体組込みおよび高レベル
転写を提供する他の調節エレメントを含む。遺伝子治療
に有用なプラスミドは、選択マーカー、同定領域、およ
び他の配列のような他の機能的エレメントを含み得る。
さらなる配列は、細胞外部または細胞内の両方における
安定性の付与、特定の器官、組織、または細胞集団への
hTRTヌクレオチド配列（センスまたはアンチセンス）の
送達の標的化、細胞への侵入の媒介、細胞の核への侵入
の媒介、および／または核DNA内への組込みの媒介にお
いて役割を有し得る。例えば、アプタマー様DNA構造、
または他のタンパク質結合部位を用いて、細胞表面レセ
プター、またはレセプターへ結合する血清タンパク質へ
のベクターの結合を媒介させ、それにより細胞へのDNA
導入の効率を増大させ得る。他のDNA部位および構造
は、核膜中のレセプター、あるいは核に進みそれにより
ベクターの核取り込みを促進する他のタンパク質に直接
的にまたは間接的に結合し得る。
【０３８１】適切な遺伝子治療ベクターは、複製起点を
有しても有していなくてもよい。例えば、患者への投与
前のベクターの増殖のためにベクター中に複製起点を含
ませることは有用である。しかし、宿主染色体DNAに組
み込まれるか、あるいは宿主mRNAまたはDNAに結合する
ようにベクターを設計すれば、投与前に複製起点をしば
しば除去できる。いくつかの状況（例えば、腫瘍細胞）
において、外因性DNAを導入細胞に安定に取り込ませる
必要はないであろう。なぜなら、一過性発現は腫瘍細胞
を死滅させるのに十分であり得るからである。
【０３８２】上記のように、本発明はまた、遺伝子置換
処置（すなわち、内因性hTRT遺伝子の組換え遺伝子での
相同組換えによる置換）のための方法および試薬を提供
する。相同組換えによる組込みのために特別に設計した
ベクターを使用することもできる。相同組換えを最適化
するための重要な因子は、染色体配列に対する配列同一
性の程度および相同性の長さを含む。相同組換えを媒介
する特異的配列もまた重要である。何故ならば、組込み
は転写的に活性なDNAでかなり容易に起こるからであ
る。相同標的化構築物を構築するための方法および材料
は例えばMansourら, 1988, Nature 336:348；Bradley
ら, 1992, Bio/Technology 10:534によって記載されて
いる。また、米国特許第5,627,059号；第5,487,992号；
第5,631,153号；および第5,464,764号も参照のこと。１
つの実施態様において、遺伝子置換処置は、調節すべき
hTRT遺伝子の発現を制御する調節配列の全てまたは一部
を改変または置換することを含む。例えば、hTRTプロモ
ーター配列（例えば、配列番号６に見い出されるよう
な）は、（hTRT発現を低下させるか、あるいは転写調節
部位を廃止させるために破壊され得、あるいは外因性プ
ロモーターは、（例えば、hTRT発現を増加させるため
に）置換され得る。
【０３８３】本発明はまた、hTRT「遺伝子ノックアウ
ト」（すなわち、組換えにより産生されたベクターを用
いる内因性hTRT遺伝子の相同組換えによる欠失または破
壊）のための方法および試薬を提供する。遺伝子ノック
アウトにおいて、標的化される配列は調節配列（例え
ば、hTRTプロモーター）、またはRNAもしくはタンパク
質コード配列であり得る。内因性遺伝子の発現を変化さ
せるための相同組換えの使用は米国特許第5,272,071号
（および上記で引用した米国特許）、WO 91/09955、WO
93/09222、WO 96/29411、WO 95/31560、およびWo 91/12
650に詳細に記載されている。また、Moynahanら, 1996,
Hum. Mol. Genet. 5:875参照。
【０３８４】本発明は、さらに、細胞に対して毒性であ
るタンパク質の発現を調節するためのhTRT遺伝子プロモ
ーターを用いて、テロメラーゼ陽性細胞を特異的に死滅
させるか、あるいはテロメラーゼ陰性細胞のテロメラー
ゼ陽性状態への形質転換を妨げるための方法を提供す
る。実施例14に示すように、hTRTプロモーター配列は、
このプロモーターの活性化がレポーター遺伝子によって
コードされるタンパク質の発現が生じるように、レポー
ター遺伝子に作動可能に連結させられ得る。レポーター
タンパク質の代わりに、コードされるタンパク質が細胞
に対して毒性である場合、プロモーターの活性化は細胞
の病的状態または死滅に至る。本発明の１つの実施態様
において、毒性タンパク質をコードする遺伝子に作動可
能に連結したhTRTプロモーターを含むベクターは、ヒト
細胞（例えばヒト患者の細胞）のような細胞に導入さ
れ、hTRTプロモーター活性化因子が発現されるガン細胞
のような細胞の細胞死を生じる。関連する実施態様にお
いて、コードされるタンパク質はそれ自体細胞に対して
毒性ではないが、細胞を他の非毒性薬物に対して感受性
にする活性をコードする。例えば、hTRT−プロモーター
−ヘルペスチミジンキナーゼ(TK)遺伝子融合構築物を腫
瘍細胞に導入し、そしてガンシクロビル（gancyclovir)
またはその等価物を投与することによって腫瘍を処置し
得る（例えば、MooltonおよびWells, 1990, J. Nat'l C
anc. Inst. 82:297参照)。当該分野では、本開示を考慮
して当業者により本発明に従って改変され、そして適用
され得る（hTRT以外のプロモーター配列を用いる）多数
の他の適切な毒性のまたは潜在的に毒性のタンパク質お
よび系が知られている。
【０３８５】遺伝子治療ベクターは、インビボ、インビ
トロ、またはエクスビボで細胞または組織に導入され得
る。エクスビボ治療のために、ベクターは、細胞、例え
ば、患者から採取され、同一患者に自己移植で戻すため
にクローン的に増殖させられる幹細胞に導入され得る
（例えば、その開示が本明細書中で参考として採用され
る米国特許第5,399,493号および第5,437,994号参照）。
標的細胞のテロメラーゼ活性を増加させることを狙った
hTRT遺伝子治療のために標的化され得る細胞としては、
胚幹細胞または胚細胞、前記した特に霊長類またはヒト
細胞、造血幹細胞（AIDSおよび化学療法後）、血管内皮
細胞（心臓および大脳血管病）、皮膚線維芽細胞および
基底皮膚ケラチノサイト（創傷治癒および火傷）、軟骨
細胞（関節炎）、脳の膠星状細胞および小膠細胞（アル
ツハイマー病）、骨芽細胞（骨粗鬆症）、網膜細胞（眼
病）、および膵臓島細胞（Ｉ型糖尿病）および下記表８
〜１７に列挙した細胞のいずれか、ならびに分裂するこ
とが知られている任意の他の細胞タイプが挙げられる
が、これらに限定されない。
【０３８６】本発明の１つの実施態様において、TRT
（例えばhTRT）コード配列（または変異体）に作動可能
に連結した誘導性プロモーターは、インビボまたはイン
ビトロで細胞の増殖能力を調節するために用いられる。
特別の実施態様において、例えば、誘導性プロモーター
の制御下にあるhTRT発現ベクターでトランスフェクトし
たインスリン−産生膵臓細胞が患者に導入される。次い
で、細胞がそれまで可能であったよりも増殖することを
可能にするプロモーター活性化剤（例えば、テトラサイ
クリン）の患者への投与によって、細胞の増殖能力を制
御することができる。次いで、治療する医師によって望
まれるように、細胞増殖が停止され、継続され、あるい
は再開される。
【０３８７】４）ワクチンおよび抗体 hTRT配列を有する免疫原性ペプチドおよびポリペプチド
は、患者において抗hTRT免疫応答を誘発し得る（すなわ
ち、ワクチンとして作用し得る）。例示的な免疫原性hT
RTペプチドおよびポリペプチドは後記実施例６および８
に記載される。免疫応答は、目的のポリペプチドをコー
ドするプラスミドベクターの送達（すなわち、「ネイク
ドDNA」の投与）によって惹起させ得る。目的の核酸
は、注入、リポソーム、または他の投与手段によって送
達することができる。１つの実施態様において、被検体
においてテロメラーゼ発現細胞に対するクラスI MHC拘
束細胞傷害性リンパ球応答を誘発する免疫様式が選択さ
れる。一旦免疫化されれば、個体または動物は、高レベ
ルのテロメラーゼを発現する細胞（例えば、悪性細胞）
に対して高い免疫応答を誘発する。
【０３８８】抗hTRT抗体（例えば、ネズミ、ヒト、また
はヒト化モノクローナル抗体）が患者に投与されて（例
えば、受動免疫化）、テロメラーゼ発現細胞に対する免
疫応答を達成し得る。
【０３８９】Ｆ）薬学的組成物 関連する局面において、本発明は、hTRTオリゴおよびポ
リヌクレオチド、ポリペプチド、および抗体、アゴニス
ト、アンタゴニスト、またはインヒビターを単独で、ま
たは安定化化合物、希釈剤、担体、または別の成分また
は薬剤のような他の薬剤と組み合わせて含む薬学的組成
物を提供する。
【０３９０】本発明の治療用薬剤は、任意の無菌生体適
合性薬学的キャリアー（生理食塩水、緩衝化生理食塩
水、デキストロース、および水を含むが、それらに限定
されない）中で投与され得る。これらの分子のいずれ
も、適切な賦形剤、アジュバント、および／または薬学
的に受容可能なキャリアーと混合する薬学的組成物中に
て、単独で、あるいは他の薬剤、薬物、またはホルモン
と組み合わせて患者に投与され得る。本発明の１の実施
態様において、薬学的に受容可能なキャリアーは薬学的
に不活性である。
【０３９１】薬学的組成物の投与は経口または非経口に
より達成される。非経口送達の方法としては、局所、動
脈内（例えば、腫瘍に直接的に）、筋肉内、皮下、髄
内、クモ膜下腔内、脳室内、静脈内、腹腔内、または鼻
孔内の投与が挙げられる。活性成分に加えて、これらの
薬学的組成物は、賦形剤または薬学的に使用できる製剤
への活性化合物のプロセシングを促進する他の化合物を
含む適切な薬学的に受容可能なキャリアーを含有し得
る。処方および投与のための技術のさらなる詳細は「RE
MINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES」 (Maack Publishi
ng Co., Easton, PA)の最終版に見い出され得る。
【０３９２】経口投与のための薬学的組成物は、経口投
与に適した投与形において当該分野で周知の薬学的に受
容可能なキャリアを用いて処方され得る。このような担
体は、薬学的組成物が患者による摂取に適した錠剤、丸
剤、糖衣剤、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリ
ー、懸濁物などに処方されることを可能とする。PCT国
際公開WO 93/23572参照。
【０３９３】経口使用のための薬学的組成物は、活性化
合物を固体賦形剤と組合せ、所望により得られた混合物
を粉砕し、所望ならば、錠剤または糖衣剤のコアを得る
ために、適切なさらなる化合物を添加した後、顆粒の混
合物をプロセシングすることを介して得られ得る。適切
な賦形剤は炭水化物またはタンパク質充填剤であり、以
下を含むが、それらに限定されない：ラクトース、スク
ロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖；
トウモロコシ、コムギ、イネ、ジャガイモ、または他の
植物由来のデンプン；メチルセルロース、ヒドロキシプ
ロピルメチルセルロース、またはカルボキシメチルセル
ロースナトリウムのようなセルロース；ならびにアラビ
アゴムおよびトラガカントゴムを含むゴム；ならびにゼ
ラチンおよびコラーゲンのようなタンパク質。所望なら
ば、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、アルギン
酸またはその塩（例えば、アルギン酸ナトリウム）のよ
うな崩壊剤または可溶化剤が添加され得る。
【０３９４】糖衣剤コアは、濃縮糖溶液のような適切な
コーティングとともに提供される。これはまた、アラビ
アガム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲ
ル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チ
タン、ラツカー溶液、および適切な有機溶媒または溶媒
混合液をも含有し得る。製品同定のため、または活性化
合物の量（すなわち、用量）を特徴付けるために、染料
または色素が錠剤または糖衣剤に添加され得る。
【０３９５】経口で使用され得る薬学的製剤は、ゼラチ
ンよりなる押込ばめ（push-fit）カプセル、ならびにゼ
ラチンおよびコーティング（例えば、グリセロールまた
はソルビトール）よりなるソフト封着カプセルを含む。
押込ばめカプセルは、ラクトースまたは澱粉のような充
填剤またはバインダー、タルクまたはステアリン酸マグ
ネシウムのような潤滑剤、および所望により安定化剤と
混合した活性な成分を含有し得る。ソフトカプセルで
は、活性化合物は、安定化剤とともにまたはともなわず
に脂肪油、流動パラフィンまたは液状ポリエチレングリ
コールのような適切な液体に溶解または懸濁され得る。
【０３９６】非経口投与用の薬学的処方物は活性化合物
の水溶液を含む。注射のために、本発明の薬学的組成物
は水溶液、好ましくはハンクスの溶液、リンゲル溶液、
または緩衝化生理食塩水のような生理学的に適合する緩
衝液中に処方され得る。水性注射懸濁物は、懸濁物の粘
度を増加させる物質（例えば、ナトリウムカルボキシメ
チルセルロース、ソルビトール、またはデキストラン）
を含有し得る。さらに、活性化合物の懸濁物は、適切な
油状注射懸濁物として調製され得る。適切な親油性溶媒
またはビヒクルは、ゴマ油のような脂肪酸、あるいはオ
レイン酸エチルまたはトリグリセリドのような合成脂肪
酸エステル、またはリポソームを含む。所望により、懸
濁物は、高濃度溶液の製剤を可能にする安定化剤または
化合物の溶解度を増加させる適切な薬剤または試薬を含
有し得る。
【０３９７】局所または鼻孔投与のために、浸透される
べき特定のバリアに対して適切な浸透剤が処方物中で使
用される。このような浸透剤は一般に当該分野で公知で
ある。
【０３９８】本発明の薬学的組成物は、当該分野で公知
の様式と同様の様式（例えば、従来的な混合、溶解、顆
粒化、糖衣剤作製、水簸、乳化、カプセル化、包括、ま
たは凍結乾燥の手段によって）で製造され得る。
【０３９９】薬学的組成物は塩として提供され得、塩
酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、マレイン酸、コハク酸
等を含むが、それらに限定されない多くの酸を用いて形
成され得る。塩は、対応する遊離塩基形態である水性溶
媒または他のプロトン性溶媒により可溶性である傾向に
ある。他の場合において、好ましい調製物は、使用に先
だって、緩衝液と組み合わせた、4.5〜5.5のpH範囲の1m
M-50mMヒスチジン、0.1％〜２％スクロース、２％〜７
％マンニトール中の凍結乾燥粉体であり得る。
【０４００】受容可能なキャリアー中に処方した本発明
の化合物を含む薬学的組成物が調製された後、それらは
適切な容器に入れられ、そして示された状態の治療のた
めに標識され得る。ヒトテロメラーゼタンパク質および
核酸の投与のために、このような標識は投与の量、頻
度、および方法を含む。
【０４０１】本発明で使用するのに適した薬学的組成物
は、活性成分が意図される目的を達成するのに有効な量
で含有される組成物を含む。「治療的有効量」または
「薬理学的有効量」は十分に認識されているフレーズで
あり、意図される薬理学的結果を生じるのに有効な薬剤
の量をいう。従って、治療的有効量は、処置されるべき
疾患の徴候を軽減するのに十分な量である。所定の適用
のための有効量（例えば、治療的有効量）を確認する１
つの有用なアッセイは、標的細胞におけるテロメラーゼ
活性に対する効果を測定することである。実際に投与さ
れる量は、処置が適用されるべき個体に依存し、好まし
くは、所望の効果が顕著な副作用をともなうことなく達
成されるように最適化された量である。治療的有効用量
の決定は十分に当業者の能力内にある。
【０４０２】いずれの化合物についても、治療的有効用
量は、細胞培養アッセイまたは任意の適切な動物モデル
のいずれかにおいて、最初に見積もられ得る。動物モデ
ルはまた、所望の濃度範囲および投与経路を達成するた
めに用いられる。次いで、このような情報を用いて、ヒ
トにおける投与に有用な用量および経路を決定すること
ができる。
【０４０３】治療的有効量とは、徴候または状態を軽減
するタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、オリ
ゴまたはポリヌクレオチド、アゴニスト、またはアンタ
ゴニストの量をいう。このような化合物の治療効果およ
び毒性は、細胞培養または実験動物における標準的な薬
学的手順（例えば、ED50、集団の50％において治療的に
有効な用量；およびLD50、集団の50％に対して致死的で
ある用量）によって決定され得る。治療効果と毒性効果
との間の用量比は治療係数であり、それは比率ED50／LD
50として表され得る。大きな治療係数を呈する薬学的組
成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物実験から
得られたデータが、ヒトでの使用のための量の範囲を公
式化するのに使用される。このような化合物の用量は、
好ましくは、毒性をほとんどまたは全くともなわないED
50を含む循環濃度の範囲内にある。この用量は、使用さ
れる投与形態、患者の感受性、および投与経路に依存し
てこの範囲内で変化する。
【０４０４】正確な用量は、治療されるべき患者を考慮
して、個々の臨床医によって選択される。用量および投
与は、十分なレベルの活性部分を提供するか、または所
望の効果を維持するように調整される。考慮され得るさ
らなる因子としては、疾患状態の重症度（例えば、腫瘍
のサイズおよび位置；患者の年齢、体重、および性別；
投与の食餌制限時間、および頻度、薬物組合せ、反応感
受性、および治療に対する耐性／応答）が挙げられる。
特定の処方物の半減期およびクリアランス速度に応じ
て、持続作用性薬学的組成物は、３〜４日毎に、毎週、
または２週間に１回、投与され得る。特定の用量および
送達の方法に関するガイダンスは文献に提供されている
（本明細書中で参考として援用する米国特許第4,657,76
0号；第5,206,344号；および第5,225,212号参照）。当
業者は、典型的には、タンパク質またはそれらのインヒ
ビターよりもヌクレオチドについての異なる処方物を使
用する。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド
の送達は特定の細胞、状態、位置などに対して特異的で
あり得る。
【０４０５】VIII．不死化した細胞、細胞株および動物
の増大した増殖能力および産生 前記で議論したように、ほとんどの脊椎動物細胞は、培
養において限定された数の分裂（例えば、50〜100分
裂）の後に老化する。しかしながら、ある変異細胞は、
培養中に無限に分裂し得（例えば、HeLa細胞、293細
胞）、そしてこの理由により、研究および産業的適用に
有用である。通常、これらの不死化細胞株は自然発生的
に生じる腫瘍に由来するか、あるいは照射または腫瘍誘
導ウイルスもしくは化学物質にさらすことによる形質転
換に由来する。あいにく、分化した細胞機能を示す細胞
株（特にヒト細胞株）の限定的選択しか利用できない。
さらに、現在利用可能な不死化細胞株は染色体異常（例
えば、異数性、遺伝子再編成、または変異）によって特
徴付けられる。さらに、多くの長期間樹立細胞株は比較
的未分化である（例えば、それらは特定の組織または器
官をユニークに特徴付ける種類の高度に特殊化した産物
を産生しない）。従って、不死化細胞（特にヒト細胞）
を生成する新しい方法に対する必要性がある。不死化細
胞についての１つの用途は、天然タンパク質および組換
えタンパク質（例えば、エリスロポエチン、ヒト成長ホ
ルモン、インスリン等のような治療的ポリペプチド）、
または抗体の生産においてであり、そのために安定で遺
伝的に正常な細胞株が好適である。いくつかの組換えタ
ンパク質の生産について、特殊化された細胞型もまた好
適であり得る（例えば、ヒトインスリンの産生のための
膵臓細胞）。さらには不死化細胞について、または（非
改変細胞と比較して）増大した増殖能力を有する死ぬべ
き運命の細胞でさえ、別の用途は、遺伝子治療のため、
または疾患もしくは損傷細胞または損傷組織の置換のた
めの患者への導入である。例えば、本発明の組換えhTRT
遺伝子またはポリペプチドを含有するまたは発現する自
己免疫細胞を、攻撃的ガン治療（例えば全身照射）の後
に、患者における細胞置換のために使用し得る。不死化
細胞についての別の用途は、治療的用途のための「人
工」組織または器官（例えば、皮膚）のエクスビボ産生
のためである。このような細胞について別の用途は、テ
ロメラーゼ阻害性薬物のような薬物のスクリーニングま
たは有効化のため、あるいはワクチンまたは生物学的試
薬の生産における使用のためである。本発明の細胞のさ
らなる用途は当業者に明らかである。
【０４０６】本発明の不死化細胞および細胞株、ならび
に単に複製能力の増大したものは、細胞においてテロメ
ラーゼ活性を増加させることによって作成される。テロ
メラーゼ活性を増加させるための本明細書に開示した任
意の方法が使用され得る。従って、１つの実施態様にお
いて、細胞は、細胞中のhTRTポリペプチドの量を増加さ
せることによって不死化される。１つの実施態様におい
て、hTRTレベルは、（時々は好ましい安定なトランスフ
ェクションにより）hTRT発現ベクターを細胞に導入する
ことによって増大される。先に議論したように、hTRTコ
ード配列は、通常、細胞中で誘導性または構成的に活性
であり得るプロモーターに作動可能に連結される。
【０４０７】１つの実施態様において、配列番号２（こ
の配列はプロモーター（例えば、構成的に発現されるプ
ロモーター、例えば、配列番号６の配列）に作動可能に
連結している）のポリペプチドをコードする配列からな
るポリヌクレオチドを細胞に導入する。１つの実施態様
において、ポリヌクレオチドは配列番号１の配列を含
む。好ましくは、ポリヌクレオチドはポリアデニル化お
よび終結シグナルを含む。別の実施態様において、エン
ハンサーまたは前出議論の他のもののようなさらなるエ
レメントが含まれる。別の実施態様において、ポリヌク
レオチドはプロモーター配列を含まず、このような配列
は導入されたポリヌクレオチドの組込み（例えば、組換
え、例えば、相同組換え）により標的細胞の内因性ゲノ
ムによって提供される。ポリヌクレオチドは、リポフェ
クション、エレクトロポレーション、ビロソーム、リポ
ソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン：核酸コンジ
ュゲート、ネイクドDNAのような本明細書中に開示され
た任意の方法を含むあらゆる方法によって標的細胞に導
入され得る。
【０４０８】本発明の方法を用いて、任意の脊椎動物細
胞が、培養において、増大した増殖能力を有するように
誘導され得るか、または不死化されそして培養において
無限に維持されるようにさえされ得る。１つの実施態様
において、細胞は哺乳動物のものであり、ヒト細胞が多
くの適用について好ましい。不死化され得るヒト細胞の
例は表８〜１７に列挙されたものを含む。
【０４０９】後記する本発明の「診断」アッセイを用い
て、本発明の不死化細胞を同定および特徴付け得ること
が理解される。
【０４１０】
【表８】
【０４１１】
【表９】
【０４１２】
【表１０】
【０４１３】
【表１１】
【０４１４】
【表１２】
【０４１５】
【表１３】
【０４１６】
【表１４】
【０４１７】
【表１５】
【０４１８】
【表１６】
【０４１９】
【表１７】
【０４２０】IX．診断アッセイ Ａ）はじめに １）TRTアッセイ 本発明は、TRT、好ましくはhTRTおよびテロメラーゼに
対する非常に多様なアッセイを提供する。これらのアッ
セイは、とりわけ、ガンがその例示的な例である多数の
ヒトの疾患の診断および予後について、感度良好、安
価、簡便で広範囲に適用できるアッセイの基礎を提供す
る。前記したように、hTRT遺伝子産物（タンパク質およ
びmRNA）は、通常、ほとんどの正常な死すべき細胞に対
する不滅化ヒト細胞（すなわち、テロメラーゼ−陰性細
胞およびほとんどのテロメラーゼ−陽性正常成体体細
胞）において上昇する。従って、１つの局面において、
本発明は、（悪性腫瘍細胞のような）不滅化または（成
体におけるほとんどの正常体細胞のような）死すべき、
あるいはテロメラーゼ陽性または陰性として細胞を、特
徴付けるために、ヒトまたは他の哺乳動物あるいは真核
生物細胞からの、またはそれを含む試料におけるhTRT遺
伝子産物の存在、不存在または量を検出または測定する
のに有用なアッセイを提供する。
【０４２１】hTRT遺伝子産物（すなわち、タンパク質ま
たはRNA）の存在または不存在によって特徴付けられる
いずれの障害も、本明細書に開示する方法および物質を
用いて診断され得る。後記にてより十分に記載するよう
に、これらは、ガン、加速された細胞増殖の他の疾患、
免疫学的障害、受精、不妊症その他を含む。さらに、テ
ロメラーゼ活性がガン細胞において上昇する程度は転移
能力のような腫瘍の特徴と相関するので、hTRT、mRNAま
たはタンパク質レベルのモニタリングを用いて、腫瘍の
将来のありそうな進行を見積もりまたは予測することが
され得る。
【０４２２】１の局面において、本発明の診断および予
後方法は、ヒトTRT遺伝子産物が（例えば、患者由来
の）生物学的試料中に存在するか否かを測定することを
含む。第２の局面において、（例えば、患者由来の）生
物学的試料におけるhTRT遺伝子産物の豊富さを測定し、
コントロール試料（例えば、正常細胞または組織）にお
ける存在量と比較する。第３の局面において、hTRT遺伝
子産物の細胞または細胞内局在性を細胞または組織試料
において決定する。第４の局面において、宿主（例え
ば、患者）細胞をアッセイして、異常hTRT遺伝子発現
（異常な量、調節、または産物）についての遺伝性の性
質に特徴的な配列を持つ核酸を同定する。これは、例え
ば遺伝子スクリーニングまたは遺伝カウンセリングにお
いて有用である。第５の局面において、本発明のアッセ
イを用いて、（例えば、患者血清中の）抗hTRT抗体の存
在を検出する。以下にいくらか詳細に記載する方法は、
本明細書中に開示した配列および関係を用いて実施し得
る有用なアッセイを示す。しかし、これらのアッセイの
多数の変形または他の適用は、本開示を考慮すれば、当
業者に明らかである。
【０４２３】後記するアッセイは診断および予後方法に
つき提示するが、それらはhTRT遺伝子、遺伝子産物、ま
たは変異体が検出され、定量され、あるいは特徴付けら
れる場合はいつでも使用され得ることは認識される。従
って、例えば、後記する「診断」方法は、hTRTまたはヒ
トテロメラーゼの生産および精製の間におけるhTRTまた
はテロメラーゼのアッセイに、（例えば、不死株を同定
するための）ヒト細胞に由来する細胞株の特徴付けに、
ヒトTRT遺伝子または遺伝子産物（またはそのフラグメ
ント）を含む細胞、非ヒト動物、植物、菌類、細菌また
は他の生物の特徴付けに有用である。
【０４２４】本明細書中で用いる用語「診断」は、病気
（例えば、ガン）、障害（例えば、不妊症、活性化）、
または状態（例えば、受精）の存在または性質を同定す
るその通常の意味を有し、そして用語「予後」は、疾患
または障害のありそうな進展および／または結果を予測
するその通常の意味を有する。これらの２つの用語は臨
床的な場では幾分異なるように使用されるが、「診断
の」との関係において以下に開示されるアッセイまたは
アッセイ様式のいずれも予後の判定に同等に適している
ことが理解される。なぜならば、より高いテロメラーゼ
活性レベルはガン患者についてのより貧弱な予後に関係
することが、十分確立されており、そして本発明が、細
胞中のテロメラーゼ活性と密接に相関するレベルで発現
される、hTRTに特異的な検出方法を提供するからであ
る。
【０４２５】２）ガンの診断および予後 正常または標準範囲を超えるhTRT遺伝子、mRNAまたはタ
ンパク質のレベルの測定は、テロメラーゼ−陽性細胞ま
たは不死化細胞（ある種の腫瘍がその例である）の存在
の指標となる。ある種の胚性および胎児細胞、ならびに
ある種の成体幹細胞はテロメラーゼを発現するので、本
発明はまた、母血液からのテロメラーゼ陽性胎児細胞の
検出または単離によって、妊娠のような他の状態を測定
する方法も提供する。これらの値を用いて、細胞がガン
性として分類されていない、あるいは伝統的方法を用い
て検出もしくは分類されていない場合でさえ、診断、あ
るいは診断の補助をすることができる。従って、本発明
の方法は、少なくともいくつかの例においては初期の段
階において、増大した信頼性をもって、テロメラーゼに
関連するガン性または他の障害の検出または検証を可能
とする。本発明のアッセイは、hTRT遺伝子または遺伝子
産物についての定量的アッセイを供し、それにより適切
な治療レジメンの選択および正確な診断を容易とするこ
とにより、ヒト腫瘍または他の細胞増殖病の異なるクラ
スおよびグレードの間に区別を可能とする。さらに、テ
ロメラーゼ活性のレベルを用いて、良性および悪性腫瘍
の間を識別し得（例えば、米国特許第5,489,508号；Hiy
amaら, 1997, Proc. Am Ass. Cancer Res. 38:637)、侵
潤の内在性を予測し（例えば、米国特許第5,639,613
号；Yashimaら, 1997, Proc. Am Ass. Cancer Res. 38:
326)、そして転移可能性と相関付け得る（例えば、米国
特許第5,648,215号；Panditaら, 1996,Proc. Am Ass. C
ancer Res. 37:559)ので、これらのアッセイは広範囲の
ヒトガンの予防、検出および治療に有用である。
【０４２６】ガン（または上昇したテロメラーゼによっ
て特徴付けられる他の疾患または障害）の予後について
は、特定の腫瘍タイプ、クラスまたはグレードについて
のhTRT遺伝子産物（mRNAまたはタンパク質）または活性
の予後値を後記するように測定する。患者におけるhTRT
タンパク質またはmRNAレベルまたはテロメラーゼ活性は
また（例えば、本明細書中で開示したアッセイを用い
て）測定し、予後レベルと比較し得る。
【０４２７】使用するアッセイに応じて、ある場合に
は、試料中のhTRT遺伝子産物の存在量は、アッセイで検
出され得る場合は常に上昇していると考えられる。テロ
メラーゼ−陽性細胞においてさえhTRT mRNAおよびタン
パク質の存在量は低く、そしてこれらの遺伝子産物は、
正常またはテロメラーゼ−陰性細胞中では希薄であるか
または存在しないため、もし正常細胞中に少しでも存在
するならば、hTRT遺伝子産物を検出するためには、高感
度のアッセイ必要がある。もし感度のより低いアッセイ
が選択されると、hTRT遺伝子産物は健康組織では検出不
能であるが、テロメラーゼ陽性ガンまたは他のテロメラ
ーゼ陽性細胞では検出可能である。代表的には、上昇し
た試料におけるhTRT遺伝子産物の量は、テロメラーゼ陰
性コントロール細胞または成体における健康組織由来の
細胞におけるレベルよりも少なくとも約５倍、頻繁には
少なくとも約10倍、より頻繁には少なくとも約50倍、非
常に頻繁には少なくとも約100〜1000倍高く、ここで、
テロメラーゼ陽性正常細胞のパーセントは非常に低い。
【０４２８】本発明の診断および予後の方法は、あらゆ
る起源のあらゆる細胞もしくは組織型でも使用され得、
そしてそれを用いて、あらゆる起源の不死化または新生
物細胞または腫瘍組織、あるいはガンも検出することが
できる。検出され得るガンの型は、hTRTの治療的適用の
議論で前記でリストした全てのものを含むが、これらに
限定されない。
【０４２９】また、本発明のアッセイは、抗ガン剤レジ
メンで治療されている患者において治療介入の効果をモ
ニターするのにも有用である。モニターされ得る抗ガン
剤レジメンは（化学療法、放射線療法および外科手術を
含めた）全ての現在認められている治療を含み、また、
本明細書に記載するようにテロメラーゼ阻害または活性
化療法のような将来承認される治療をも含む（例えば、
PCT国際公開第96/01835号および第96/40868号および米
国特許第5,583,016号を参照のこと。それらは全て、そ
の全体が、本明細書中に参考として援用される）。
【０４３０】別の局面において、後記するアッセイは、
テロメラーゼ活性の異常調節に関連したガンまたは他の
障害（不妊症、早期老化）に関して偏向を示すhTRT遺伝
子配列におけるある種の変異（変異および遺伝性hTRT対
立遺伝子）を検出するのに有用である。
【０４３１】３）ガン以外の障害の診断 ガンの診断に加えて、本発明のアッセイは多数の他の適
用を有する。本発明は、細胞におけるテロメラーゼまた
はhTRT遺伝子産物の過小または過剰発現により特徴付け
られる障害または疾患の試薬および方法／診断を提供す
る。成体においては、低レベルのテロメラーゼ活性は、
通常、正常ヒト体細胞、例えば幹細胞、活性化リンパ球
および生殖細胞の限定された補集合中に見い出され、そ
して他の体細胞では存在しない。従って、通常は存在せ
ずまたは不活化されている細胞におけるhTRTまたはテロ
メラーゼ活性の検出、またはhTRTが通常は低レベルで存
在する細胞（例えば、幹細胞、活性化リンパ球および生
殖細胞）における異常（すなわち、正常よりも高いまた
は低い）レベルでの検出は、テロメラーゼ関連疾患また
は障害の診断となり得るか、あるいはそれを用いて特定
の細胞型を同定しまたは単離（すなわち、幹細胞を単
離）し得る。このような疾患および障害の例として、細
胞増殖の疾患、免疫学的障害、不妊症、免疫細胞機能の
疾患、妊娠、胎児異常、早期老化などが挙げられる。さ
らに、本発明のアッセイは、患者または細胞−もしくは
動物−ベースのアッセイにおいて、（テロメラーゼ活性
を調節する薬物を含むが、これらに限定されない）治療
介入の有効性をモニターするのに有用である。
【０４３２】１つの局面において、本発明は、不妊症を
診断するのに有用なアッセイを提供する。ヒト生殖細胞
（例えば、精原細胞、それらの祖先または子孫）は無限
増殖が可能であり、そして高テロメラーゼ活性によって
特徴付けられる。hTRT遺伝子産物の異常なレベルまたは
産物あるいは低下したレベルは、不適当なまたは異常な
精子の産生をもたらし得、それは不妊症または生殖障害
につながる。従って、本発明は、「テロメラーゼベース
の」生殖障害の診断および治療のためのアッセイ（方法
および試薬）を提供する。同様に、該アッセイを用い
て、精子生産を標的とするかあるいはそれに間接的に影
響する（そして、hTRTレベルまたはテロメラーゼ活性を
低下させる）避妊薬（例えば、男性避妊薬）の効率をモ
ニターし得る。
【０４３３】別の局面において、本発明は、幹細胞、胎
児細胞、胚細胞、活性化リンパ球および造血幹細胞にお
けるテロメラーゼおよびhTRTのレベルおよび機能を分析
するためのアッセイを提供する。例えば、hTRT遺伝子産
物検出についてのアッセイを用いて、（例えば、活性化
リンパ球の罹患率または始原幹細胞の存在量をモニター
することにより）一般的に免疫機能をモニターし、（上
昇したhTRTレベルに基づいて）活性化リンパ球または幹
細胞を同定しまたは選択しまたは単離し、そして、これ
らの組織を標的とする治療介入（例えば、免疫抑制剤ま
たは幹細胞集団を増やす治療的試み）の効率をモニター
し得る。
【０４３４】本発明はまた、（患者由来の血清中に見い
出される）抗テロメラーゼおよび抗TRT免疫グロブリン
の同定のための有用なアッセイも提供する。本明細書中
に記載される物質およびアッセイを用いて、このような
自己免疫抗体が見い出される患者を同定し、その免疫グ
ロブリンに関連する障害の診断および治療を可能にし得
る。
【０４３５】４）培養中細胞のモニタリング 本明細書中に記載されるアッセイはまた、エクスビボま
たはインビトロの細胞中のhTRT遺伝子産物の発現および
hTRT遺伝子の特徴付けをモニターするのにも有用であ
る。上昇したhTRTレベルは不死化細胞に特徴的であるの
で、本発明のアッセイは、例えば、不死化細胞をスクリ
ーニング、または同定するのに、あるいはhTRT発現また
は機能を阻害することにより不死化細胞を死化し得る薬
剤を同定するのに使用され得る。例えば、このアッセイ
は、細胞におけるhTRTの増大した発現によって、例え
ば、組換えhTRTの発現により、あるいは内因的にコード
されたhTRTの（例えば、プロモーター活性化による）増
大した発現により不死化した細胞を同定するのに有用で
ある。
【０４３６】同様に、これらのアッセイを用いて、トラ
ンスジェニック動物または細胞（例えば、hTRT遺伝子を
含む酵母またはヒト細胞）におけるhTRT発現をモニター
し得る。特に、本発明のhTRTを発現するヒトおよび非ヒ
ト細胞におけるhTRTレベルに対するある種の処置（例え
ば、公知のまたは推定テロメラーゼアンタゴニストの適
用）の効果は、有用な薬物および薬物候補（例えば、テ
ロメラーゼ−活性調節薬物）を同定するのに使用され得
る。
【０４３７】Ｂ）正常な診断値、および予後値 hTRT遺伝子産物の存在または量についてのアッセイは、
アッセイ形式、アッセイすべき試料の性質および求めら
れる情報に依存して、種々の方法で行われ、その結果は
解釈され得る。例えば、hTRT遺伝子産物の定常状態の存
在量はほとんどのヒト体細胞で組織では非常に低いの
で、特定のアッセイにより検出不能である。さらに、一
般に、これらの組織の細胞ではテロメラーゼ活性はな
く、活性の確認をかなり容易とする。逆に、hTRTタンパ
ク質および／またはhTRT mRNAまたはテロメラーゼは、
他のテロメラーゼ陽性組織、例えば悪性腫瘍においては
十分に豊富であり、従って、同じことが同一のアッセイ
を用いて検出され得る。低レベルのテロメラーゼ活性が
通常は検出され得る体細胞タイプにおいてさえ（例え
ば、幹細胞およびある種の活性化された造血系細胞）、
hTRT mRNAのレベルおよびテロメラーゼ活性は不死化細
胞においてレベルの小分率（例えば、約１％またはそれ
未満と見積もられる）であり；従って、不死化および死
すべき細胞は本発明の方法により容易に区別され得る。
「感度がより低い」アッセイを用いる場合、生物学的試
料におけるhTRT遺伝子産物の単なる検出は、さらなる分
析の必要性なくして、それ自体で診断となり得ると理解
される。さらに、後記するアッセイはかなり高感度となし
得るが、それらはまた、所望ならば、(例えば、緩衝液、洗浄
条件、増幅のラウンド数、試薬の賢明な選択、および/また
はシグナル増幅剤の選択により)低感度にもされ得る。従
って、実質的にあらゆるアッセイか、それが、hTRT遺伝子
産物が特別の濃度にて、例えば健康なまたは他のコント
ロール組織よりも高濃度で存在する生物学的試料におい
てのみhTRT遺伝子産物を検出するように設計され得る。
この場合、hTRT mRNAまたはタンパク質のあらゆる検出
可能なレベルが、（造血細胞および他の幹細胞以外の）
誕生後ヒト体細胞組織由来の細胞中で上昇すると考えら
れる。
【０４３８】しかし、いくつかの場合には、特に、正常
体細胞に存在し得るhTRT遺伝子産物の非常に低レベルを
検出し得る非常な高感度のアッセイが用いられる場合に
は、hTRT遺伝子産物発現レベルについて正常またはベー
スライン値（または範囲）を確立するのが望ましい。発
現または正常発現産物の正常レベルは、当業者に周知の
方法に従い且つ本発明の方法および試薬を用いて、生物
のあらゆる特定の集団、サブ集団、またはグループにつ
いても決定され得る。一般に、hTRTタンパク質またはhT
RT mRNAのベースライン（正常）レベルは、正常な（健
常な）披験体、例えばヒト被験体から得られた生物学的
試料（例えば、体液、細胞または組織）におけるhTRTタ
ンパク質および／またはhTRTmRNAの量を定量することに
より測定される。特定の試料および目的のために、細胞
当たり、または腫瘍細胞当たりのベースでhTRT遺伝子産
物の量を定量することを所望し得る。試料の細胞性(cel
lularity)を測定するために、構成的に発現される遺伝
子産物または試料が採取されたタイプの細胞における既
知レベルで発現される他の遺伝子産物のレベルを測定し
得る。あるいは、hTRTタンパク質またはhTRT mRNAの正
常値は、疾患（または恐らくは疾患の）細胞が収集され
たのと同一患者から、または健常な個体から得られる、
健康であることが知られた細胞または組織におけるhTRT
タンパク質／RNAの量を定量することにより測定され得
る。あるいは、ベースラインレベルは、培養中の非不死
化ヒト体細胞に存在するレベルとして、ある場合には定
義され得る。正常（ベースライン）値は、異なる細胞型
の間で（例えば、hTRT mRNAレベルは腎臓よりも睾丸に
おいて高い）、患者の年齢、性別または身体的状態に従
って、幾分異なり得る可能性がある。従って、例えば、
アッセイを用いてガンに関連するhTRTレベルの変化を測
定する場合は、hTRT遺伝子産物発現の正常範囲を測定す
るのに使用される細胞は、調査の性質に依存して、同一
または異なる年齢の個人からの細胞であり得る。分子遺
伝学で使用される標準的な統計方法の適用は、発現のベ
ースラインレベルの決定を可能とし、ならびにこのよう
なベースラインレベルからの有意な偏差の同定を可能と
する。
【０４３９】前記した本発明の診断および予後方法を行
うにおいて、「診断値」および「予後値」に言及するの
が時には有用である。本明細書中で用いる「診断値」と
は、hTRT遺伝子産物の正常（または「ベースライン」）
範囲と比較して、疾患の存在の指標となる試料中に検出
されたhTRT遺伝子産物について決定された値をいう。こ
の疾患は高テロメラーゼ活性（例えば、ガン）、テロメ
ラーゼ活性の不存在（例えば、不妊症）、またはいくつ
かの中間体値により特徴付けられ得る。「予後値」と
は、その疾患（例えば、ガン）について特定の診断およ
び予後に合致する所与の細胞型（例えば、悪性腫瘍細
胞）中に検出されたhTRT遺伝子産物の量をいう。試料中
に検出されたhTRT遺伝子産物の（ゼロ量を含める）量
は、その値の相対的比較が疾患の存在または疾患（例え
ば、ガン）の進行のありそうな結果を示すように、細胞
についての予後値と比較される。１つの実施態様におい
て、例えば、腫瘍予後を評価するために、データが収集
され、異なる腫瘍クラスまたはグレートに関するhTRTレ
ベルの統計的に有意な相関を得る。既知の臨床的結果を
有する被験体から得られた同一の細胞または組織試料に
つき、所定の範囲のhTRTレベルを確立する。十分な数の
測定を行い、比較がなされる統計的に有意な値（または
値の範囲）を得る。次いで、所与の細胞または組織試料
についての所定の範囲のhTRTレベルまたは活性を用い
て、有利な（または不利ではない）予後（例えば、ガン
の場合には「低レベル」）に相関するhTRT遺伝子産物の
レベルについての値または範囲を測定する。ガンの場合
の不利な（またはより不利な）予後に相関する「高レベ
ル」に対応する範囲が同様に測定され得る。次いで、生
物学的試料（例えば、患者試料）からのhTRT遺伝子産物
のレベルを測定し、低いおよび高い範囲と比較し、それ
を用いて臨床的結果を予測し得る。
【０４４０】前記議論は、例示としてガンに対して言及
するものであるが、診断値および予後値はまた他の疾患
（例えば、細胞増殖の疾患）および障害についても測定
され得、そして、ガン以外の疾患または障害について
は、「高」レベルは所望の結果と相関され得、「低」レ
ベルは不利な結果と相関され得ることが理解される。例
えば、いくつかの疾患は、幹細胞、活性化リンパ球、ま
たは生殖系細胞におけるテロメラーゼ活性の欠陥（例え
ば、低レベル）により特徴付けられ得る。このような場
合、（例えば、他の患者または特定の患者における他の
組織由来の）同様の年齢および／またはタイプの細胞に
対するhTRT遺伝子産物の「高」レベルは有利な結果と相
関させられ得る。
【０４４１】このアッセイ方法は、そのように所望され
ない限り、hTRTの絶対値の測定を必ずしも要しないこと
が理解される。なぜならば、相対値は本発明の方法の多
くの適用で十分だからである。定量が望ましい場合、本
発明は、遺伝子産物を定量するためのあらゆる既知の方
法が実質的に使用され得るような試薬を提供する。
【０４４２】また本発明のアッセイを用いて、動物実
験、臨床試験において、あるいは個々の患者の処置をモ
ニターするにおける、特定の治療的処置レジメンの効率
を評価し得る。これらの場合、治療を開始する前に患者
に対してベースラインを確立し、通常は正規ベースに基
づいて、治療経過を介して１回以上アッセイを反復し、
治療の結果として、所望の終点（例えば、アッセイがガ
ンについてのものであればhTRTの発現の低下）に向かっ
てhTRTレベルが動いているか否かを評価するのが望まし
い。
【０４４３】当業者は、hTRT遺伝子産物の量または存在
量に加えて、正常発現レベルおよび正常発現産物との比
較により、変異体または異常な発現パターン（例えば、
RNAスプライシング変異体の異常量）あるいは変異体ま
たは異常発現産物（例えば、変異した転写体、切り詰め
られたもしくはナンセンスポリペプチド）が同定され得
ることを認識する。これらの場合において、「正常」ま
たは「ベースライン」の測定は、健康な生物および／ま
たは組織（すなわち、hTRT発現不調または新生物増殖の
ない生物および／または組織）を同定する工程、および
変異体hTRT遺伝子産物（例えば、スプライシング変異
体）の発現レベルを測定する工程、あるいはhTRT遺伝
子、mRNA、または逆転写されたcDNAを配列決定しまたは
検出して、代表的な（正常な）配列変化を得るまたは検
出する工程を含む。分子遺伝学で使用される標準的な統
計方法の適用は、このようなベースラインレベルからの
有意な偏りの決定を可能とする。
【０４４４】Ｃ）TRT遺伝子産物の検出および定量 本明細書中で強調してきたように、hTRT遺伝子産物は通
常は極端に低いレベルにてほとんどの正常体細胞で見い
出される。例えば、hTRTタンパク質をコードするmRNA
は、これまでに調べた全てのテロメラーゼ−陰性細胞型
では極端に稀であるかまたは存在しない。293細胞のよ
うな不死化細胞においては、hTRT mRNAは細胞当たり約1
00コピーのみで存在し得る一方、正常な体細胞は細胞当
たり１または０コピーしか有し得ない。このように、hT
RT遺伝子産物につき高感度のアッセイが望まれる場合、
シグナルまたは標的増幅技術をアッセイ形式に組み入れ
るのが時々有利であることが明らかである。例えば、Pl
enatら, 1997, Ann. Pathol.17:17（フルオレセイニル-
チラミドのシグナル増幅）；Zehbeら, 1997, J. Patho
l. 150:1553（触媒されたレポーター沈殿）;本明細書中
に挙げた他の文献(例えば、bDNAシグナル増幅、PCRおよ
び他の標的増幅形式につき);および当該分野で知られた
他の技術を参照のこと。 前記したように、本明細書で
開示するアッセイではhTRT mRNAまたはタンパク質を定
量する必要のないことが多い。なぜならば、（その産物
がコントロールの中で、例えばテロメラーゼ陰性細胞で
は検出されないアッセイ条件下での）hTRT遺伝子産物の
検出はそれ自体で診断に十分だからである。別の例とし
て、試験（例えば、腫瘍）およびコントロール（例え
ば、健常細胞）試料中に見い出された産物のレベルが直
接比較される場合、定量は不必要であり得る。
【０４４５】しかし、所望ならば、本明細書中に記載す
るアッセイで測定されるhTRT遺伝子産物の量は、測定の
方法および便宜に依存して、種々の方法で記載され得
る。従って、正常、診断、予後、高量または低量のhTRT
タンパク質／mRNAは、生物学的試料の量当たりの重量の
標準単位として（例えば、グラム組織当たりのピコグラ
ム、1012細胞当たりのピコグラム）、生物学的試料の量
当たりの分子の数として（例えば、転写物／細胞、モル
／細胞）、細胞当たりまたは他の単位量当たりの活性の
単位として、あるいは同様の方法により表現され得る。
hTRT遺伝子産物の量はまた、別の分子の量に対して表現
され得；その例として：試料中のhTRT転写物の数／試料
中の28S rRNA転写物の数：hTRTタンパク質のナノグラム
／全タンパク質のナノグラム等が挙げられる。
【０４４６】２つ（またはそれ以上）の異なる試料にお
けるhTRT遺伝子産物を測定する場合、２つの試料に対す
る比較の共通のベースを有することが時々有用である。
例えば、正常組織の試料とガン性組織の試料とを比較す
る場合、等量の組織（重量、容量、細胞数等）が比較さ
れ得る。あるいは、マーカー分子の等価物（例えば、28
S rRNA、hTR、テロメラーゼ活性、テロメア長、アクチ
ン）が使用され得る。例えば、28S rRNAの10ピコグラム
を含む健常組織試料中のhTRTタンパク質の量が、28S rR
NAの同一量を含む疾患組織の試料と比較され得る。
【０４４７】また、本明細書中に記載したあらゆるアッ
セイが実質的に定量的であるように設計され得ることは
当業者により認識される。代表的には、既知の量または
供給源のhTRT遺伝子産物（例えば、本発明の方法および
組成物を用いて生産したもの）を用いて該アッセイを較
正する。
【０４４８】特定の実施態様において、試料中（または
代表的なサンプリング中の）各細胞におけるhTRT対立遺
伝子または遺伝子産物の存在、不存在、または存在量を
検出するアッセイ形式が選択される。このような形式の
例として、組織学（例えば、シグナル増強または標的増
強増幅工程を伴う免疫組織化学）または蛍光活性化細胞
分析もしくは細胞ソーティング（FACS）によるシグナル
を検出するものが挙げられる。これらの形式は、高度に
異種の細胞集団（例えば、１または数個のタイプのみが
上昇したhTRTレベルを有する多数の細胞型、または異な
るレベルでテロメラーゼを発現する同様の細胞の集団を
含む）を取り扱う場合は、特に有用である。
【０４４９】Ｄ）試料収集 hTRT遺伝子または遺伝子産物（すなわち、mRNAまたはポ
リペプチド）は、好ましくは、生物学的試料中で検出お
よび／または定量される。このような試料は、限定され
るものではないが、細胞（全細胞、細胞画分、細胞抽出
物、および培養された細胞または細胞株を含む）、組織
（血液、血液細胞（例えば、白血球細胞）、および（例
えば、前立腺、乳房、甲状腺等からの）微小針バイオプ
シー試料のような組織試料、体液（例えば、尿、痰、羊
膜液、血液、腹腔液、胸腔液、精液）またはそれから収
集した細胞（例えば、尿からの膀胱細胞、血液からのリ
ンパ球）、培地（培養細胞または細胞株からのもの）、
および洗液（例えば、膀胱および肺）を含む。また、生
物学的試料は、組織学的目的で採取された凍結切片のよ
うな組織の切片も含む。ガンの診断および予後では、試
料はガン性または前ガン性あるいは疑われるガン性組織
または腫瘍から得られる。後者の分析では（例えば、薬
物処理の効果をモニターする場合）、生物学的試料を凍
結するのが時々望ましいであろう。
【０４５０】ある場合には、細胞または組織は、分析の
前に分画される。例えば、患者からの組織パイオプシー
において、周知の方法に従い、セルソーター（例えば、
蛍光活性化セルソーター）を使用して、表面抗原（例え
ば、腫瘍表面抗原）の発現のような特徴に従って細胞を
分けることができる。
【０４５１】試料は典型的にはヒト患者または細胞株か
ら採取されるが、このアッセイを用いて、他の動物から
の試料におけるhTRT相同遺伝子または遺伝子産物を検出
し得る。あるいは、hTRT遺伝子および遺伝子産物は、ヒ
トTRTタンパク質または核酸配列を発現するトランスジ
ェニック動物または生物でアッセイし得る。
【０４５２】試料は、所望すれば、適切な緩衝溶液での
希釈によって必要により前処理し得、あるいは濃縮し得
る。生理学的pHでのリン酸塩、トリス緩衝液等のような
種々の緩衝液を使用する任意の多数の標準的水性緩衝液
が使用され得る。
【０４５３】患者から得られた「生物学的試料」は、
「生物学的試料」または「患者試料」のいずれかとして
呼び得る。「患者試料」の分析が患者からの細胞または
組織の除去を必ずしも要しないことが認識される。例え
ば、適切に標識されたhTRT結合剤（例えば、抗体または
核酸）を患者に注射し、標準的な画像化技術（例えば、
CAT、NMR等）を用いて（標識に結合している場合には）
可視化し得る。
【０４５４】Ｅ）核酸アッセイ １つの実施態様において、本発明は、（スプライシング
または配列変異体およびオルナタナティブ対立遺伝子を
含む）hTRT mRNAの発現を検出および／または定量する
方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、正
常または異常なhTRT遺伝子（またはそのフラグメント）
を検出し、そして分析する方法を提供する。このような
定性または定量アッセイの形態は、限定されるものでは
ないが、シグナルを増幅するまたは増幅しない増幅に基
づくアッセイ、ハイブリダイゼーションに基づくアッセ
イ、および組合せ増幅ハイブリダイゼーションアッセイ
を含み得る。ハイブリダイゼーションと増幅との間の区
別は便宜的にすぎないと当業者によって認識される；以
下の実施例で説明するように、多くのアッセイ様式はハ
イブリダイゼーションおよび増幅の両方の要素を含み、
そのため、類別はある場合では幾分任意的である。
【０４５５】１）核酸の調製 いくつかの実施態様において、試験すべき細胞、組織、
生物、または細胞株から単離した核酸の試料で核酸アッ
セイを行う。核酸（例えば、ゲノムDNA、RNAまたはcDN
A）は、当業者に周知の任意の多数の方法に従って試料
から「単離」され得る。この文脈で、「単離された」と
は、混合物中の任意の他の物質から検出されるべき種ま
たは標的のいずれかの分離をいうが、標的の精製の有意
な程度を必ずしも示さない。当業者は、hTRT遺伝子のコ
ピー数の変化を検出すべき場合、ゲノムDNAが検出すべ
き標的であることを認識する。逆に、遺伝子または複数
の遺伝子の発現レベルを検出すべき場合、RNAが核酸に
基づくアッセイで検出すべき標的である。１つの好まし
い実施態様において、核酸試料は生物学的試料中の全mR
NA（すなわち、ポリ(A)+RNA）である。核酸を単離する
方法は、当業者に周知であり、そして例えば、Tijssen,
P.編 LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MO
LECULAR BIOLOGY: HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID P
ROBES, PART I.THEORY AND NUCLEIC ACID PREPARATION,
Elsevier, N.Y. (1993)第３章（本明細書中で参考とし
て援用される）に記載されている。１つの実施態様にお
いて、全核酸は、酸グアニジニウム−フェノール−クロ
ロホルム抽出法を用いて所定の試料から単離され、そし
てオリゴ−dTカラムクロマトグラフィーによって、ある
いは(dT)n磁性ビーズを用いることによって、ポリ(A)+m
RNAは単離される（例えば、Sambrookら, およびAusubel
ら, 前出を参照）。
【０４５６】別の実施態様において、増幅、ハイブリダ
イゼーションまたは他のアッセイを行う前に核酸（例え
ば、全RNAまたはポリA+RNA）を生物学的試料から単離す
る必要はない。これらの実施態様は、hTRT RNAを測定す
べき場合にある利点を有する。なぜなら、それらは単離
および取り扱いの間にhTRT mRNAの喪失の可能性を低下
させるからである。例えば、前記PCRおよびRT-PCRのよ
うな多くの増幅技術を、浸透した細胞（組織学的検体お
よびFACS分析）、全溶解細胞、またはある細胞抽出物の
ような粗細胞画分を用いて行い得る。好ましくは、工程
は、要すれば、標的核酸（例えば、mRNA）の完全性を保
持するように行われる（例えばRNAaseインヒビターの添
加）。増幅およびハイブリダイゼーションアッセイはま
た、例えば、バイオプシー試料からの薄い組織切片また
は細胞単層（例えば、血液細胞または解離させた組織培
養細胞）からの薄い組織切片においてインサイチュで行
い得る。増幅はまた、インタクトな全細胞または固定し
た細胞で行い得る。例えば、標的hTRT RNAまたはDNAを
増幅するために、固定し、予め浸透させた、またはミイ
クロインジョンした細胞について、ポリメラーゼまたは
リガーゼ、プライマー、および（デオキシ）リボヌクレ
オシド三リン酸（ポリメラーゼを使用する場合）、およ
び逆転写酵素およびプライマー（RNAを転写し、cDNAを
検出すべき場合）を用いて、インサイチュで当該分野で
周知のように、PCR、RT-PCR、またはLCR増幅法を行い得
る。次いで、hTRT RNAを含有する細胞（例えば、テロメ
ラーゼ陽性細胞）または目的のhTRT DNA配列を検出し得
る。この方法は、蛍光標識dNTP、プライマーまたは他の
成分を顕微鏡、FACS分析または同等のものと組み合わせ
て使用する場合にしばしば有用である。
【０４５７】２）増幅に基づくアッセイ １つの実施態様において、本発明のアッセイは、hTRT遺
伝子または遺伝子産物の検出のための増幅に基づくアッ
セイである。増幅に基づくアッセイにおいて、hTRT遺伝
子または転写物（例えば、mRNAまたはcDNA：本明細書中
以後、「標的」ともいう）の全てまたは一部を増幅し、
次いで、増幅産物を直接的または間接的に検出する。テ
ンプレートとして作用すべき基礎となる遺伝子または遺
伝子産物がない場合、（例えば、予測されるサイズの）
増幅産物は生産されず、あるいは増幅は非特異的であ
り、そして典型的には、単一の増幅産物はない。対照的
に、基礎となる遺伝子または遺伝子産物が存在する場
合、標的配列が増幅され、基礎となる遺伝子またはmRNA
の存在および／または量の指標が提供される。標的の増
幅に基づくアッセイは当業者に周知である。
【０４５８】本発明は、hTRT遺伝子および遺伝子産物を
検出するための広範囲のプライマーおよびプローブを提
供する。このようなプライマーおよびプローブは、標的
核酸にハイブリダイズするためにhTRT遺伝子または遺伝
子産物に対して十分に相補的である。プライマーは、典
型的には、少なくとも６塩基、通常は約10と約100塩基
との間、典型的には、約12と約50塩基との間の長さであ
り、そしてしばしば約14と約25塩基との間の長さであ
る。本開示を再検討した当業者は、日常的方法を用い
て、プライマーを選択してhTRT遺伝子または遺伝子産物
の全部または任意の部分を増幅するか、あるいは変異体
遺伝子産物とhTRT対立遺伝子等との間を区別し得る。表
２はhTRT、または特定のhTRT遺伝子産物または領域のPC
R増幅に有用な例示的プライマーを列挙する。当該分野
で知られているように、単一オリゴマー（例えば、米国
特許第5,545,522号）、オリゴマーのネステッド組、ま
たはオリゴマーの変性プールさえも、例えば、後出のTe
trahymena TRT cDNAの増幅によって例示されるように、
増幅について使用され得る。
【０４５９】本発明は、ポリメラーゼ鎖反応（全ての改
変、例えば、逆転写酵素−PCR；Sunrise Amplification
System (Oncor, Inc., Gaithersburg, MD);および当該
分野で公知の多数の他のものを含む）を含む、hTRT遺伝
子または遺伝子産物を増幅しそして検出するための多数
の方法を提供する。１つの例示的実施態様において、PC
R増幅は、核酸試料（例えば、hTRT RNAの逆転写を介し
て得られたcDNA）、100μlの各dNTP（dATP、dCTP、dGTP
およびdTTP；Pharmacia LKB Biotechnology, NJ)、hTRT
−特異的PCRプライマー、１単位／Taqポリメラーゼ（Pe
rkin Elmer, Norwalk, CT)、1×PCR緩衝液（50mM KCl、
10mM Tris、室温でpH8.3、1.5mM MgCl2、0.01％ゼラチ
ン）を含有する50μl溶液中で行い、94℃で45秒間、55
℃で45秒間および72℃で90秒間の約30サイクルの増幅を
行う。しかし、評価されるように、多数の改変を行っ
て、任意の特定の反応のためにPCR増幅を最適化し得
る。
【０４６０】他の適切な標的増幅法は、リガーゼ鎖反応
（LCR：例えば、Wu およびWallace,1989, Genomics 4:5
60；Landegrenら, 1988, Science, 241:1077, Barany,
1991, Proc. Natl. Acd. Sci. USA 88:189およびBarrin
gerら, 1990, Gene, 89:117)；鎖置換増幅（SDA：例え
ば、 Walkerら, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA89:
392-396)；転写増幅（例えば、Kwohら, 1989, Proc. Na
tl. Acd. Sci. USA 86: 1173)；自己維持配列複製（3S
R；例えば、Fahyら, 1992, PCR Methods Appl.1:25, Gu
atelliら, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA，87:187
4)；核酸配列に基づく増幅（NASBA, Cangene, Mississa
uga, Ontario；例えば, Compton, 1991, Nature 350:9
1)；転写に基づく増幅系（TAS)；および自己維持配列複
製系（SSR）を含む。前記した文献のそれぞれを本明細
書中で参考として援用する。１つの有用なPCRの改変はP
CR ELISAである（例えば、Boehringer Mannheimカタロ
グ番号1636111)であり、ここで、ジゴキシゲニン−dUTP
がPCR産物に組み込まれる。PCR反応混合物を変性し、そ
してPCR産物の内部配列にアニールするように設計され
たビオチン標識化オリゴヌクレオチドとハイブリダイズ
させる。ハイブリダイゼーション産物をストレプトアビ
ジン被覆プレートに固定化し、抗ジゴキシゲニン抗体を
用いて検出する。インビトロ増幅法を介して当業者を指
示するのに十分な技術の例は、PCR TECHNOLOGY: PRINCI
PLES AND APPLICATION FOR DNA AMPLIFICATION, H. Erl
ich編、Freeman Press, New York, NY (1992); PCR PRO
TOCOLS: A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, Inni
s, Gelfland, SniskyおよびWhite編, Academic Press,
San Diego,CA (1990)；Mattilaら, 1991, Nucleic Acid
sRes. 19:4967；EckertおよびKunkel, (1991) PCR METH
ODS AND APPLICATIONS 1:17; PCR, McPherson, Quirkes
およびTaylor編, IRL Press, Oxford， 米国特許第4,68
3,195号、第4,683,202号および第4,965,188号；Barring
erら, 1990, Gene, 89:117; Lomellら, 1989, J. Clin.
Chem., 35:1826（すべての目的についてそれぞれを本
明細書中に参考として援用する）に見い出される。
【０４６１】増幅産物を、例えば、ゲル電気泳動により
決定されたサイズによって；ビーズ、膜、スライドまた
はチップのような固体支持体に固定化した標的核酸への
ハイブリダイゼーションによって；配列決定によって；
免疫学的に、例えば、PCR-ELISAによって、蛍光、リン
光、または放射性シグナルによって；または任意の種々
の他の周知の手段によって直接分析し得る。例えば、検
出方法の例示的な例は、プライマーが折り畳みが解けて
それらの標的に結合し、複製が起こる場合のみ蛍光が放
射されるように、フルオレセインに連結したヘアピンル
ープおよびクエンチャーとして働く安息香酸誘導体で増
加したPCRプライマーを使用する。
【０４６２】hTRT mRNAは、典型的には、テロメラーゼ
陽性細胞においてさえ非常に低レベルの極度に稀な転写
物として発現するので、増幅工程から生じたシグナルを
最適化または増大することがしばしば望ましい。これを
行う１つの方法は、増幅のサイクル数を増加することで
ある。例えば、20〜25サイクルが標準的な反応条件下で
ポリメラーゼ鎖反応反応を用いるほとんどのmRNAの増幅
に適するが、多くの試料におけるhTRT mRNAの検出は、
検出様式および増幅の効率に応じて、30〜35サイクルも
の増殖を要し得る。増幅サイクル数を含む増幅条件の賢
明な選択を用いて、試験試料中の標的の閾値量が存在す
る場合のみ（すなわち、高レベルのhTRTmRNAを有する試
料のみが「陽性」結果を生じる）増幅産物が生じるアッ
セイを設計し得ることが認識される。さらに、標的配列
の増幅によって産生されたシグナルを増加するための方
法は既知である。増幅された標的を検出する能力を増加
させる方法は：分岐DNAシグナル増幅（例えば、米国特
許第5,124,246号；Urdea,1994, Bio/Tech. 12:926)；チ
ラミドシグナル増幅（TSA）系（Du Pont):触媒的シグナ
ル増幅(CSA; Dako)；Ｑβレプリカーゼ系（Tyagiら, 19
96, Proc. Natl.Acad. Sci. USA; 93:5395)等のような
シグナル増幅系を含む。
【０４６３】当業者は、いずれの増幅法を用いても、定
量が所望であれば、当該分野で公知の種々の定量方法を
使用し得ることを認識する。例えば、所望の場合、２以
上のポリヌクレオチドを単一試料において共増幅し得
る。この方法は試料中のhTRT mRNAの量を定量する簡便
な方法として使用し得る。なぜなら、逆転写反応および
増幅反応を標的およびコントロールのポリヌクレオチド
に対して同一反応で行うからである。コントロールのポ
リヌクレオチド（通常は既知の濃度またはコピー数で存
在させる）の共増幅を、試料中のhTRTの量と比較して試
料中の細胞数に対する正規化に使用し得る。共増幅反応
のための適切なコントロールのポリヌクレオチドは、ハ
ウスキーピング遺伝子、構成的に発現される遺伝子から
発現されたDNA、RNA、および反応混合物に添加されたイ
ンビトロ合成されたRNAまたはDNAを含む。内因性コント
ロールのポリヌクレオチドは試料中に既に存在するもの
であり、一方、外因性コントロールのポリヌクレオチド
は試料に添加されて、「スパイク」反応を生じる。例示
的なコントロールのRNAは、βアクチンRNA、GAPDH RN
A、snRNA、hTRおよび内因的に発現された28S rRNAを含
む（Khanら, 1992, Neurosci. Lett. 147:114参照）。
外因性コントロールのポリヌクレオチドは合成AW106 cR
NAを含み、これはT7ポリメラーゼによってpAW106からセ
ンス鎖として合成され得る。共増幅法が定量に有用とな
るためには、コントロールおよび標的ポリヌクレオチド
が典型的には共に直線的範囲で増幅されなければならな
いことが理解される。定量PCRについての詳細なプロト
コルは、PCR PROTOCOLS, A GUIDE TO METHODS AND APPL
ICATIONS, Innisら, Acdemic Press, Inc. N.Y. (1990)
およびAusubelら, 前出(Unit 15)およびDiaco, R. (199
5)定量PCRアッセイの設計のための実質的な考察 84-108
頁, Innisら編, Academic Press, New Yorkに見い出し
得る。
【０４６４】内因性または外因性標準のための配列に応
じて、異なるプラスマーのセットを共増幅反応について
使用し得る。競合増幅と呼ばれる１つの方法おいて、定
量PCRは、標的核酸の増幅に使用される同一プライマー
（２つのプライマーのうち１対）を用いて、既知の量の
コントロールの配列を同時に共に増幅することを含む。
非競合的競合として公知の別の実施態様において、コン
トロールの配列および標的配列（例えば、hTRT cDNA）
を異なるプライマー（すなわち、２つのプライマーのう
ち２対）を用いて増幅する。半競合的増幅と呼ばれる別
の実施態様において、３つのプライマーを用い、このう
ちの１つはhTRT特異的であり、このうちの１つはコント
ロール特異的であり、このうちの１つは標的およびコン
トロールの配列の両方にアニールすることができる。半
競合的増幅は、本明細書中で参考として援用される米国
特許第5,629,154号に記載される。
【０４６５】３）ハイブリダイゼーションをベースとす
るアッセイ ａ）一般 核酸ハイブリダイゼーション技術を用いる特異的DNAお
よびRNA測定のための種々の方法が当業者に公知である
（Sambrookら,前出)。ハイブリダイゼーションに基づく
アッセイとは、プローブ核酸が標的核酸にハイブリダイ
ズするアッセイをいう。通常、本発明の核酸ハイブリダ
イゼーションプローブは、hTRT遺伝子またはRNA配列の
隣接配列に全くまたは実質的に同一である。好ましく
は、核酸プローブは少なくとも約10塩基、しばしば少な
くとも約20塩基、そして時々は少なくとも約200塩基以
上の長さである。核酸ハイブリダイゼーションで用いる
核酸プローブ配列を選択する方法は、Sambrookら（前
出）に議論されている。いくつかの様式において、標的
およびプローブのうちの少なくとも一方を固定化する。
固定化核酸は、DNA、RNAまたは別のオリゴヌクレオチド
もしくはポリヌクレオチドであり得、そしてまた、天然
または非天然に存在するヌクレオチド、ヌクレオチドア
ナログ、または骨格を含み得る。このようなアッセイは
サザンブロット、ノーザンブロット、ドットブロットお
よびスロットブロット、高密度ポリヌクレオチドまたは
オリゴヌクレオチドアレイ（例えば、GeneChipTM Affym
etrix)、ディップスティック、ピン、チップ、またはビ
ーズを含む任意のいくつかの様式のいずれかであり得
る。これらの技術の全ては当該分野で周知であり、多く
の市販の診断キットの基礎である。ハイブリダイゼーシ
ョン技術は、一般に、Hamesら編,NUCLEIC ACID HYBRIDI
ZATION, A PRACTICAL APPROACH IRL Press, (1985)；Ga
llおよびPardue, Proc. Natl. Acd. Sci. USA., 63:378
-383 (1969)；およびJohnら, Nature, 223: 582-587 (1
969)に記載される。
【０４６６】種々の核酸ハイブリダイゼーション様式が
当業者に公知である。例えば、１つの通常の様式は、直
接ハイブリダイゼーションであり、ここで、標的核酸は
標識された相補的なプローブにハイブリダイズする。典
型的には、標識された核酸をハイブリダイゼーションに
使用し、この標識は検出可能なシグナルを供する。hTRT
mRNAの存在、不在または量を評価する１つの方法は、
実施例２に例示されるように、試料からのRNAのノーザ
ン転移および標識hTRT特異的核酸プローブのハイブリダ
イゼーションを行うことである。前述したように、全て
が存在する場合、hTRT mRNAは、ほとんどの細胞で非常
に少ない量で存在する。従って、ノーザンハイブリダイ
ゼーションを用いる場合、増幅工程（または、あるい
は、大量の出発RNA）を用いることがしばしば望まし
い。試料中のhTRTタンパク質をコードするDNAの存在、
不在または量を評価するための有用な方法は、試料から
のDNAのサザン転移および標識hTRT特異的核酸プローブ
のハイブリダイゼーションを含む。
【０４６７】他の通常のハイブリダイゼーション様式
は、サンドイッチアッセイおよび競合アッセイまたは置
換アッセイを含む。サンドイッチアッセイは、核酸配列
を検出するかまたは単離する商業的に有用なハイブリダ
イゼーションアッセイである。このようなアッセイは、
固体支持体に共有結合により固定化された「捕獲」核酸
および溶液中の「シグナル」核酸を利用する。生物学的
または臨床的試料は標的核酸を提供する。「捕獲」核酸
および「シグナル」核酸プローブは標的核酸とハイブリ
ダイズして、「サンドイッチ」ハイブリダイゼーション
複合体を形成する。効果的にするために、シグナル核酸
は捕獲核酸とはハイブリダイズし得ない。
【０４６８】ｂ）チップに基づくアッセイおよびスライ
ドに基づくアッセイ 本発明はまた、hTRT核酸がそれにハイブリダイズし得る
（すなわち、固定化オリゴ−またはポリ−ヌクレオチド
のいくらかに対して、しかし通常は全てではなくほとん
どである）固定化オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレ
オチドのアレイを使用するhTRT遺伝子産物のためのプロ
ーブに基づくハイブリダイゼーションアッセイを提供す
る。高密度オリゴヌクレオチドアレイまたはポリヌクレ
オチドアレイは、標的核酸（例えば、hTRT遺伝子、mRNA
またはcDNA）の存在および特徴（例えば、配列）を効率
的に検出するための手段を提供する。インサイチュ合成
のための写真平板技術を用いる表面上で規定された位置
で、定義された配列に相補的な数1000のオリゴヌクレオ
チドを含有するアレイを産生する技術（例えば、米国特
許第5,578,832号；第5,556,752号；および第5,510,270
号；Foderら, 1991,Science 251: 767; Peaseら, 1994,
Proc. Natl. Acd. Sci. USA 91:5022；およびLockhart
ら, 1996, Nature Biotech 14:1675)または規定された
オリゴヌクレオチドの迅速な合成および沈積のための他
の方法（Blanchardら, 1996, Biosensors & Bioelectro
nics, 11:687)が公知である。これらの方法を用いる場
合、既知配列のオリゴヌクレオチド（例えば、20マー）
を誘導体化されたガラススライドのような表面上に直接
合成する。通常、産生されたアレイは冗長であり、検出
されるべきhTRTポリヌクレオチドに特異的なチップ上の
いくつかのオリゴヌクレオチドプローブを有する。
【０４６９】オリゴヌクレオチドプローブの組合せは、
オルタナティブスプライシングされたmRNAを検出する
か、または種々のhTRT対立遺伝子のどれが特定の試料で
発現するかを同定するように設計し得る。
【０４７０】１つの例示的な実施態様において、試験細
胞からの全RNAの逆転写によって調製されたcDNAを増幅
する（例えば、PCRを用いて）。典型的には、増幅産物
を、例えば、蛍光標識したdNTPの取り込みによって標識
する。次いで、標識cDNAを、hTRT遺伝子の種々のサブ配
列に相補的なオリゴヌクレオチドプローブを含むチップ
にハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの位
置を、（例えば、Shalonら, 1996, Genome Research 6:
639またはShenaら, 1996, Genome Res. 6;639の一般的
な方法に従い)決定し、そして配列（または他の情報）
を当該分野で周知の手段によってハイブリダイゼーショ
ンパターンから推定する。
【０４７１】１つの実施態様において、２つのcDNA試料
（それぞれは異なる蛍光基で標識される）を同一チップ
にハイブリダイズさせる。次いで、hTRT遺伝子に相補的
な部位への各標識試料のハイブリダイゼーションの比率
をアッセイする。両試料が同一量のhTRT mRNAを含有す
るならば、２つの蛍光の比率は１：１である（蛍光由来
のシグナルは蛍光のモル感度のいずれの差異のために調
節する必要はないことが認識される）。対照的に、第１
の試料が健康（またはコントロール）組織由来であり、
第２の試料がガン性組織由来のものであれば、第２の試
料で使用する蛍光は優勢である。
【０４７２】ｃ）インサイチュハイブリダイゼーション hTRTタンパク質をコードする遺伝子の発現を検出する別
の手段は、インサイチュハイブリダイゼーションであ
る。インサイチュハイブリダイゼーションアッセイは周
知であり、一般に、Angererら, METHODS ENZYMOL., 15
2:649-660 (1987)およびAusubelら,前出に記載されてい
る。インサイチュハイブリダイゼーションアッセイで
は、細胞または組織検体を、代表的には浸透状態で、代
表的にはガラススライド上の固体支持体に固定する。次
いで、細胞を中程度の温度でハイブリダイゼーション溶
液と接触させて、hTRTに完全にまたは実質的に相補的な
標識核酸プローブ（例えば、35S−標識リボプローブ、
蛍光標識プローブ）のアニーリングを行う。当該分野で
公知のように、洗浄および／またはヌクレアーゼ消化に
よって遊離プローブを除去し、そしてオートラジオグラ
フィーまたは適切な画像化技術によって結合プローブを
スライド上で直接可視化する。
【０４７３】４）変異体の特異的検出 前記および実施例（例えば、実施例９）で説明するよう
に、増幅プライマーまたはプローブを選択して、特定の
欠失、切形、および挿入にまたがり、それによりhTRT m
RNAにおける特定の変異体または異常性の検出を容易と
する増幅産物を供し得る。
【０４７４】検出され得るhTRT変異体遺伝子産物の１つ
の例は、前記および実施例９に記載された産物（配列番
号４）のようなhTRT RNAである。Δ182変異体の、生物
学的機能は、あったとしても、知られていない；しかし
ながら、この変異体によって推定的にコードされる切形
hTRTタンパク質は、例えば、テロメラーゼ成分を決定す
る非機能的テロメラーゼRNPを組み立てることによっ
て、テロメラーゼ活性の調節に関与し得る。あるいはテ
ロメラーゼ活性の負の調節は、全長mRNAを除去し、そし
てhTRT mRNAレベルを低下させ、そしてΔ182 hTRT RNA
レベルを増加させるに至るように、hTRTプレmRNA（未成
熟のmRNA）のプロセシングを指示することによって達成
され得る。これらおよび他の理由で、Δ182変異体を検
出し得ることは有用である。さらに、それらの相対的お
よび／または絶対的な量を比較することは、（Δ182 hT
RT RNA、および全長hTRTタンパク質をコードするhTRT R
NAのような）hTRT RNAの２つの種が存在する試料におい
ては時には望ましい。
【０４７５】本発明はΔ182変異型を検出するための種
々の方法を提供する。例えば、182塩基対欠失をまたが
るプライマー対を用いる増幅により、欠失および非欠失
のhTRTRNAに対応する異なるサイズの産物が得られる。
もし両者が存在すれば、（例えば、ゲル電気泳動によっ
て）サイズに基づいて区別できる。182bp欠失をまたが
る領域を増幅するのに有用なプライマー対の例は、TCP
1.14およびTCP1.15（プライマー組１）、またはTCP1.25
およびbTCP6（プライマー組２）を含む（表２〜６参
照）。これらのプライマー対を、個々に、あるいはプラ
イマー組１をまず用いるネステッドPCR実験で使用する
ことができる。また、本発明のhTRT核酸プローブを用い
るハイブリダイゼーション方法（例えば、ノーザンハイ
ブリダイゼーション）またはRNAse保護アッセイを用い
てhTRT RNA変異体を検出し、そして区別することができ
ることは、当業者には明らかである。
【０４７６】別の適切な方法は、３つのプライマーを用
いるPCR増幅（または同等のもの）を含む。前記にてよ
り詳細に記載した半競合的な定量的PCR方法と類似し
て、１つのプライマーは、（例えば、表１８に例示する
ように）hTRT RNA種のそれぞれに対して特異的であり、
そして１つのプライマーは、両方の種に相補的である
（例えば、TCP1.25(2270-2288））。配列番号１に特異
的なプライマーの例は、182ヌクレオチド配列（すなわ
ち、配列番号１のヌクレオチド2345〜2526）内にアニー
ルするものである（例えば、TCP1.73（2465〜244
5））。例えば、配列番号４（Δ182変異体）に特異的な
プライマーは、配列番号４のヌクレオチド2358〜2339
（すなわち、配列番号１における182ヌクレオチド挿入
に対応する部位）にてアニールするものである。Δ182
hTRT mRNA種の絶対的な量、または全長hTRTタンパク質
をコードする種と比較したその相対的な量を、細胞状態
（例えば、無限増殖の能力）に対して相関させるために
分析することができる。多数の他のプライマーまたは増
幅方法もしくは検出方法を本開示に基づいて選択できる
ことが認識される。
【０４７７】
【表１８】
【０４７８】検出できる他の変異体hTRTの遺伝子または
遺伝子産物は、成熟前の停止コドン、欠失、置換、また
は挿入によって特徴付けられるものを含む。欠失は、遺
伝子、mRNA転写物、またはcDNAの減少したサイズによっ
て検出できる。同様に、挿入は、遺伝子、mRNA転写物、
またはcDNAの増加したサイズによって検出できる。挿入
および欠失はまた、成熟前の停止コドンまたはより長い
オープンリーディングフレームに至るリーディングフレ
ームのシフトを引き起こし得る。置換、欠失、および挿
入は、またプローブハイブリダイゼーションによっても
検出できる。変化はまた、（例えば、ウェスタン分析に
よって）変異体hTRTポリペプチドのサイズの変化を観察
することによって、あるいは適切なようにハイブリダイ
ゼーションまたは特異的増幅によって検出され得る。あ
るいは、変異は、標準的な方法に従って遺伝子または遺
伝子産物を配列決定することによって決定することがで
きる。さらに、前記のように、増幅アッセイおよびハイ
ブリダイゼーションプローブを選択して、特定の異常性
を特異的に標的化することができる。例えば、欠失、置
換、または挿入を含む領域に、それぞれ、特異的に、ハ
イブリダイズするか、あるいはそれを増幅する核酸プロ
ーブまたは増幅プライマーが選択され得る。hTRT遺伝子
がそのような変異を有する場合、プローブは、（１）ハ
イブリダイズしないか、あるいは増幅反応は特異的な増
幅を提供しないか、または増幅産物もしくはハイブリダ
イゼーションシグナルのサイズの変化を引き起こすか；
あるいは（２）プローブまたは増幅反応は、全欠失また
は欠失のいずれかの端部（欠失連結部）を含むか；ある
いは（３）同様に、プローブおよび増幅プライマーは、
点変異または挿入を特異的に標的化するように選択でき
るかのいずれかである。
【０４７９】５）変異hTRT対立遺伝子の検出 hTRT遺伝子中の変異は、疾患開始の原因となり得るか、
あるいは疾患状態に寄与し得る。hTRTのゲノムDNAの変
化は、遺伝子転写のレベルに影響し、hTRTタンパク質中
のアミノ酸残基を変化させ、産生されるべき切形hTRTポ
リペプチドの産生を引き起こし、プレmRNAのプロセシン
グ経路を変化させ（これは、hTRT mRNAレベルを変化さ
せ得る）、同様に他の結果を引き起こし得る。
【０４８０】非hTRT遺伝子座におけるゲノムDNAの変化
はまた、hTRT、hTR、およびテロメラーゼ会合タンパク
質の発現およびプロセシングならびにRNPアセンブリー
および輸送の調節を担う酵素または細胞プロセスを変化
させることによってhTRTまたはテロメラーゼの発現に影
響し得る。hTRTの発現、プロセシング、またはRNPアセ
ンブリーに影響する変化は、ガンの進行、加齢の疾患、
DNA損傷疾患、およびその他で重要であり得る。
【０４８１】hTRT mRNAまたはその遺伝子および遺伝子
制御エレメントにおける変異の検出は、複数の方法に
て、本明細書中の方法に従って達成することができる。
例示的な例は以下のものを含む：プライマースクリーニ
ングと呼ばれる技術を使用できる；その3'末端が、恐ら
くは変異した試料DNA（またはRNA）中のヌクレオチドに
アニールするPCRプライマーを設計する。このDNA（また
はRNA）をプライマーによって増幅する場合、3'末端は
遺伝子中のヌクレオチドにマッチする；このDNAが増幅
されない場合、一方または両方の末端は遺伝子中のヌク
レオチドにマッチせず、これは、変異が存在したことを
示す。同様のプライマー設計を用いて、リガーゼ連鎖反
応（LCR、前記）を用いて点変異についてアッセイする
ことができる。制限フラグメント長多型、RFLP（Pourza
nd, C., Cerutti, P. (1993) Mutat. Res. 288:113-12
1)は、本方法で適用できる別の技術である。種々の制限
酵素で消化したヒトゲノムDNAのサザンブロットを、hTR
T特異的プローブで探る。試料とコントロールとの間の
フラグメントの数またはサイズの差は、実験試料の変
化、通常は挿入または欠失を示す。一本鎖コンホメーシ
ョン多型、SSCP（Orrita, M.ら(1989) PNAS USA 86:276
6-70)は、本方法で適用され得る別の技術である。SSCP
は、変性した野生型および変異体の一本鎖DNA（通常はP
CRによって生じる）の異なる移動に基づく。一本鎖DNA
は、配列特異的な三次元コンホメーションを採る。１塩
基変化ほどの少ない配列の差異は、非変性ゲルでの移動
度の変化をもたらす。SSCPは、その簡便さのために最も
広範囲に使用される変異スクリーニング方法の１つであ
る。変性グラジエントゲル電気泳動、DGGE（Myers, R.
M.,Maniatis, T.およびLerman, L., （1987) Methods i
n Enzymology, 155:501-527)は、本方法で適用され得る
別の技術である。DGGEは、二本鎖DNAの融解挙動に基づ
いて変異を同定する。特殊化された変性電気泳動装置を
利用して、実験およびコントロールDNAの融解プロフィ
ールを観察する；変異を含むDNAは、これらのゲル系に
おいてコントロールと比較して異なる移動度を有する。
議論した例は、通常に使用される方法を示す；当業者に
より公知であり、そして本明細書における教示に従って
適用され得る多くの他の技術が存在する。
【０４８２】Ｆ．核型分析 本発明は、さらに、hTRT配列プローブを用い、および／
またはヒト患者、ヒト細胞株、または非ヒト細胞由来の
染色体におけるhTRT遺伝子配列を検出するかまたは位置
決定する核型分析または他の染色体分析用の方法および
試薬を提供する。１つの実施態様において、増幅（すな
わち、コピー数の変化）、欠失（すなわち、部分的欠
失）、挿入、置換、またはhTRT遺伝子の染色体位置の変
化（すなわち、転座）を、病理学的状態の存在または病
理学的状態（例えば、ガン）を発症する素因と関連付け
ることができる。
【０４８３】本発明により、正常ヒト細胞において、hT
RT遺伝子が染色体5pのテロメアの近くにマップされると
決定された（後記実施例５参照）。最も近いSTSマーカ
ーはD5S678である（実施例８参照）。この位置を用い
て、hTRT遺伝子に密接に連鎖しているマーカーを同定す
ることができる。このマーカーを用いて、YAC、STS、コ
スミド、BAC、ラムダ、またはP1ファージ、あるいはhTR
Tゲノム配列またはコントロールエレメントを含む他の
クローンを同定することができる。このマーカーまたは
遺伝子の位置を用いて、ガンまたは疾患のタイプの出現
と関連する正常hTRT遺伝子位置、編成化または配列の変
化についてヒト組織試料を調べることができる。この情
報は、関連する疾患またはガンについての診断または予
後の方法で使用できる。さらに、hTRT遺伝子に対するい
ずれかの変化の性質は、細胞が不死化する性質に関する
情報を与えることができる。例えば、転座事象は、hTRT
発現の活性化が、hTRTプロモーターを不適切な様式でhT
RT転写を指示する別のプロモーターで置き換えることに
よってある場合には生じることを示し得る。このタイプ
の本発明の方法および試薬を用いて、hTRT活性化を阻害
することができる。この位置はまた、正常体細胞におけ
るhTRT遺伝子抑制の性質、例えば、この位置が非発現性
のヘテロクロマチンの一部であるか否かを決定するため
に有用であり得る。ヘテロクロマチンおよびユークロマ
チンを区別するためのヌクレアーゼ過剰感度アッセイ
は、例えば、Wuら, 1979, Cell 16:797; Groudineおよ
びWeintraub, 1982, Cell 30:131 GrossおよびGarrard,
1988, Ann. Rev. Biochem. 57:159に記載されている。
【０４８４】１つの実施態様において、hTRT遺伝子に対
する変化は、当該分野で公知の種々の方法のいずれかを
用いる核型分析によって同定される。１つの有用な技術
はインサイチュハイブリダイゼーション（ISH）であ
る。典型的には、インサイチュハイブリダイゼーション
技術を核型分析で使用する場合、検出可能なまたは検出
可能に標識されたプローブをインサイチュで染色体試料
にハイブリダイズさせて、hTRT遺伝子配列の位置を決定
する。一般に、ISHは、以下の１つ以上の工程よりな
る：（１）分析すべき組織、細胞、または他の生物学的
組織の固定；（２）標的DNAの接近性を増大させ（例え
ば、加熱またはアルカリでの変性）、および（例えばヒ
トゲノムDNAを用い、反復配列のハイブリダイゼーショ
ン能力を、例えばブロックすることによって）非特異的
結合を低下させるための、生物学的組織のプレハイブリ
ダイゼーション処理；（３）１種以上の核酸プローブ
（例えば、通常の核酸、PNA、または他の核酸アナログ
を含有するプローブ）の、生物学的組織または組織中の
核酸へのハイブリダイゼーション；（４）ハイブリダイ
ゼーションにおいて結合しなかった核酸フラグメントを
除去するためのハイブリダイゼーション後の洗浄；およ
び（５）ハイブリダイズした核酸フラグメントの検出。
これらの各工程で使用する試薬およびそれらの使用のた
めの条件は、個々の適用に応じて変化する。これらの工
程が当業者に周知の種々の方法で改変できることは理解
される。
【０４８５】ISHの１つの実施態様において、hTRTプロ
ーブを蛍光標識で標識する（蛍光インサイチュハイブリ
ダイゼーション、「FISH」）。典型的には、二重色素蛍
光インサイチュハイブリダイゼーションの使用が望まし
く、これは、２つのプローブを利用し、それぞれは異な
る蛍光色素によって標識される。目的のhTRT配列にハイ
ブリダイズする試験プローブを１つの色素で標識し、そ
して異なる領域にハイブリダイズするコントロールプロ
ーブを第２の色素で標識する。動原体領域のような、目
的の染色体の安定な部分にハイブリダイズする核酸を、
コントロールプローブとして用いることができる。この
ようにして、試料間でハイブリダイゼーションの効率の
差を設けることができる。
【０４８６】染色体の異常性を検出するためのISH方法
（例えば、FISH）は、対象核酸のナノグラム量に対して
行うことができる。新鮮なまたは凍結した材料、組織ま
たは切片で可能なように、パラフィン包埋した正常組織
または腫瘍の切片を用いることができる。FISHは限定さ
れた材料に適用され得るので、非培養の原発性腫瘍から
調製したタッチ(touch）調製物もまた使用できる（例え
ば、Kallioniemiら, 1992, Cytogenet. Cell Genet. 6
0:190)。例えば、腫瘍由来の小さなバイオプシー組織試
料を、タッチ調製物に使用できる（例えば、Kallioniem
iら，前掲参照）。吸引バイオプシーから得られた少数
の細胞、または体液（例えば、血液、尿、痰等）中の細
胞も分析できる。出生前診断において、適切な試料は、
羊水、母親血液等を含む。本明細書に開示する方法およ
び試薬に適用可能な有用なハイブリダイゼーションプロ
トコルは、Pinkeloら, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 85:9138；EPO公開第430,402号；Choo編, METHODS
IN MOLECULAR BIOLOGY 第33巻; IN SITU HYBRIDIZATION
PROTOCOLS, Humana Press, Totowa, New Jersey,(199
4)；およびKallioniemiら、前掲に記載されている。
【０４８７】核型分析に有用な他の技術は、例えば、生
物学的試料中の染色体におけるhTRT配列の増幅、欠失、
挿入、置換、または他の再配置を同定するのに使用され
得本発明のhTRTプローブおよびプライマーを用いる、定
量的サザンブロッティング、定量的PCR、または比較ゲ
ノムハイブリダイゼーション（Kallioniemiら，1992,Sc
ience, 258:818)のような技術を含む。
【０４８８】Ｇ．TRTポリペプチドアッセイ １）一般 本発明は、hTRTポリペプチドを検出し、そして定量する
方法および試薬を提供する。これらの方法は、電気泳
動、質量分析、ゲルシフト、キャピラリー電気泳動のよ
うな分析生化学的方法、サイズ排除クロマトグラフィ
ー、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、薄層クロマ
トグラフィー（TLC）、高拡散クロマトグラフィー等の
ようなクロマトグラフィー方法、あるいは流体またはゲ
ル沈降素反応、免疫拡散（一重または二重）、免疫電気
泳動、ラジオイムノアッセイ（RIA）、酵素結合イムノ
ソルベントアッセイ（ELISA）、免疫蛍光アッセイ、ウ
ェスタンブロッティングのような質量分析などの免疫学
的方法、および後記の、そして本開示を考慮して当業者
に明らかな他のものを含む。
【０４８９】２）電気泳動アッセイ １つの実施態様において、hTRTポリペプチドは電気泳動
タンパク質分離で検出される；１つの局面において、二
次元電気泳動系が使用される。電気泳動技術を用いるタ
ンパク質の検出手段は当業者に周知である（一般に、R.
Scopes (1982)PROTEIN PURIFICATION, Springer-Verla
g, N.Y.; Deutscher, (1990) METHODSIN ENZYMOLOGY 第
182巻: GUIDE TO PROTEIN PURIFICATION, Academic Pre
ss, Inc. N.Y.)。
【０４９０】関連する実施態様において、移動度シフト
アッセイ（例えば、Ausubelら、前掲参照）を使用す
る。例えば、標識hTRは、hTRTと会合し、非変性ポリア
クリルアミドゲル等での電気泳動に際して変化した移動
度で移動する。従って、例えば、もし（必要に応じて標
識された）hTRプローブまたは（必要に応じて標識され
た）テロメラーゼプライマーを、hTRTを含有する試料と
混合するか、あるいは（例えば、無細胞発現系におい
て）hTRTと共に共発現させれば、試料中のhTRTタンパク
質（またはhTRTをコードするポリヌクレオチド）の存在
は、hTR移動度の検出可能な変化をもたらす。
【０４９１】３）イムノアッセイ ａ）一般 本発明はまた、本発明の１種以上の抗体試薬を使用する
hTRTポリペプチドの検出のための方法を提供する（すな
わち、イムノアッセイ）。本明細書中で使用されるよう
に、イムノアッセイは、hTRTポリペプチドまたはエピト
ープと特異的に結合する抗体（本明細書では広く定義さ
れるように、そして特に、フラグメント、キメラおよび
他の結合剤を含む）を利用するアッセイである。本発明
の抗体は、例えば、前記したように、当業者に周知の種
々の手段によって作成できる。
【０４９２】本発明の実施に適した多数の十分に確立さ
れた免疫学的結合アッセイ形式が公知である（例えば、
米国特許第4,366,241号；同第4,376,110号；同第4,517,
288号；および同第4,837,168号参照）。例えば、METHOD
S IN CELL BIOLOGY 第37巻:ANTIBODIES IN CELL BIOLOG
Y, Asai編, Academic Press, Inc. New York (1993); B
ASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY 第7版, Stites & Terr
編, (1991); HarlowおよびLane, 前掲[例えば、第14
章］、およびAusubelら,前掲[例えば、第11章］(そのそ
れぞれは、参考として、その全体および全目的で援用さ
れる）参照。典型的には、免疫学的結合アッセイ（また
はイムノアッセイ）は、分析物に特異的に結合し、そし
てしばしばこれを固定化する「捕獲剤」を利用する。１
つの実施態様において、捕獲剤は、抗hTRT抗体のよう
な、hTRTポリペプチドまたはサブ配列に特異的に結合す
る部分である。別の実施態様において、捕獲剤は、hTRT
会合分子が（もしhTRT会合分子が固定化されれば、hTRT
タンパク質が同様に固定化されるように）hTRTに結合さ
れたままとなる条件下でhTRT会合タンパク質またはRNA
に結合することができる。hTRT会合分子が捕獲されるア
ッセイにおいては、例えば、抗hTRT抗体等を用い、会合
するhTRTタンパク質が通常存在し、従って、出できるこ
とが理解される。タンパク質複合体を検出するイムノア
ッセイは当該分野で公知である（例えば、Harlowおよび
Lane（583頁）前掲参照）。
【０４９３】通常、アッセイされるhTRT遺伝子産物は、
検出可能な標識を用いて直接的または間接的に検出され
る。アッセイで使用する個々の標識または検出可能な基
は、アッセイで使用する抗体の特異的な結合を有意に妨
害しない限り、通常、本発明の重要な局面ではない。標
識は、捕獲剤（例えば、抗TRT抗体）に共有結合により
結合させることができるか、あるいは別の抗体のような
第３の部分に結合させることができる。それは、例えば
以下のものに特異的に結合する：（捕獲剤によって認識
される異なるエピトープにおいて）hTRTポリペプチド、
捕獲剤（例えば、抗（第１の抗体）免疫グロブリン；抗
TRT抗体；抗TRT抗体に結合する抗体；または（例えば、
テロメラーゼ関連タンパク質のような関連分子への結合
を介する）抗体／テロメラーゼ複合体。プロテインＡま
たはプロテインＧのような、アッセイで使用される抗体
を結合し得る他のタンパク質をまた、標識してもよい。
いくつかの実施態様において、２つ以上の標識分子（す
なわち、相互に区別できるもの）を使用することは有用
である。さらに、捕獲剤（例えば、抗hTRT抗体）によっ
て結合した（例えば、固定化された）標的が、複合体
（すなわち、hTRTとTRT会合タンパク質、hTR、または他
のTRT会合分子との複合体）である場合、タンパク質ま
たはhTRTタンパク質と会合したRNAを認識する標識抗体
が使用できる。複合体がタンパク質−核酸複合体（例え
ば、TRT-hTR）である場合、レポーター分子は、この複
合体のRNA成分を認識するポリヌクレオチドまたは他の
分子（例えば、酵素）であり得る。
【０４９４】特定のイムノアッセイ形式は、標識成分の
使用を要しない。例えば、凝集アッセイを用いて、標的
抗体の存在を検出することができる。この場合、標的抗
体を含む試料によって抗原でコートされた粒子は凝集す
る。この形式において、この成分は標識されている必要
はなく、標的抗体の存在は単純な視覚的観察によって検
出できる。
【０４９５】ｂ）非競合的アッセイ形式 本発明は、hTRTポリペプチドを検出する競合的および非
競合的イムノアッセイのための方法および試薬を提供す
る。非競合的イムノアッセイは、捕獲された分析物（こ
の場合、hTRT）の量が直接的に測定されるアッセイであ
る。１つのこのようなアッセイは、hTRTタンパク質上の
２つの非干渉性エピトープに対して反応性のモノクロー
ナル抗体を利用する２部位モノクローナルに基づくイム
ノアッセイである。背景情報については、例えば、Madd
oxら, 1983, J. Exp. Med., 158:1211参照。１つの好ま
しい「サンドイッチ」アッセイにおいて、捕獲剤（例え
ば、抗TRT抗体）を固定化される固体基板に直接的に結
合させる。次いで、これらの固定化抗体は、試験試料中
に存在する任意のhTRTタンパク質を捕獲する。次いで、
このように固定化されたhTRTは、すなわち標識を有する
第２の抗hTRT抗体に結合させることによって標識するこ
とができる。あるいは、第２の抗hTRT抗体は、標識を欠
くものであってもよいが、第２の抗体が由来する種の抗
体に対して特異的な標識された第３の抗体によって結合
されてもよい。あるいは、酵素標識のストレプトアビジ
ンのような、第３の標識分子が特異的に結合できるビオ
チンのような検出可能部分で、第２の抗体を修飾するこ
とができる。
【０４９６】ｃ）競合アッセイ形式 競合アッセイにおいて、試料中に存在するhTRTタンパク
質の量は、試料中に存在するhTRTタンパク質によって捕
獲剤（例えば、抗TRT抗体）から置き換えられた（また
は、競合してはずされた）添加された（外因性）hTRTの
量を測定することによって間接的に測定される。１つの
競合アッセイにおいて、既知量の標識hTRTタンパク質を
試料に添加し、次いで、試料を捕獲剤（例えば、hTRTタ
ンパク質を特異的に結合する抗体）と接触させる。抗体
に結合した外因性（標識）hTRTタンパク質の量は、試料
に存在するhTRTタンパク質の濃度に反比例する。１つの
実施態様において、抗体を固体基質に固定化する。抗体
に結合したhTRTタンパク質の量は、TRT／抗体複合体中
に存在するhTRTタンパク質の量を測定すること、あるい
は残存する非複合体化TRTタンパク質の量を測定するこ
とのいずれかによって決定され得る。hTRTタンパク質の
量は、標識されたhTRT分子を提供することによって検出
され得る。
【０４９７】ハプテン阻害アッセイは、競合アッセイの
別の１例である。このアッセイでは、hTRTタンパク質を
固体基質に固定化する。既知量の抗TRT抗体を試料に添
加し、次いで、試料を固定化したhTRTタンパク質と接触
させる。この場合、固定化したhTRTタンパク質に結合し
た抗TRT抗体の量は、試料中に存在するhTRTタンパク質
の量に反比例する。固定化抗体の量は、抗体の固定化画
分または溶液中に残存する抗体の画分のいずれかを検出
することによって検出され得る。この局面において、検
出は、抗体が標識される場合は、直接的であり得、また
は上記のように抗体に特異的に結合する分子に標識を結
合させる場合は間接的であり得る。
【０４９８】ｄ）他のアッセイ形式 本発明はまた、イムノブロット（ウェスタンブロット）
形式を使用することによって、試料中のhTRTの存在を検
出および定量するための試薬および方法を提供する。こ
の形式においては、試料中のhTRTポリペプチドを（例え
ば、分子量に基づいて）ゲル電気泳動によって他の試料
成分から分離し、分離されたタンパク質を適切な固体支
持体（例えば、ニトロセルロースフィルター、ナイロン
フィルター、誘導体化ナイロンフィルターなど）に移
し、そして支持体を本発明の抗TRT抗体と共にインキュ
ベートする。抗TRT抗体は、固体支持体上のhTRTまたは
他のTRTに特異的に結合する。これらの抗体は、直接標
識され得るか、あるいはその後標識された抗体（例え
ば、標識されたヒツジ抗マウス抗体）または抗TRT抗体
に特異的に結合する他の標識試薬を用いて検出され得
る。
【０４９９】他のアッセイ形式は、リポソームイムノア
ッセイ（LIA）を含み、これは特定の分子（例えば、抗
体）に結合し、そしてカプセルに包まれた試薬またはマ
ーカーを放出するように設計されたリポソームを使用す
る。次いで、放出された化学物質を、標準的な技術に従
って検出し得る（Monroeら, 1986, Amer. Clin. Prod.
Rev. 5:34参照)。
【０５００】前記したように、FACS（および同等の機器
または方法）を用いるアッセイ形式は、不均一な試料
（例えば、正常細胞および悪性細胞の両方を含有するバ
イオプシー試料）中のhTRT遺伝子産物を測定する場合に
利点を有する。
【０５０１】ｅ）基質、固体支持体、メンブレン、フィ
ルター 前記したように、アッセイに応じて、抗原、標的抗体、
または抗hTRT抗体を含む様々な成分を、固体表面または
支持体（すなわち、基質、メンブレン、または濾紙）に
結合させ得る。種々の固体表面に生体分子を固定化する
多くの方法は、当該分野で公知である。例えば、固体表
面は、メンブレン（例えば、ニトロセルロース）、マイ
クロタイターディッシュ（例えば、PVC、ポリプロピレ
ン、またはポリスチレン）、試験管（ガラスまたはプラ
スチック）、計量棒（例えば、ガラス、PVC、ポリプロ
ピレン、ポリスチレン、ラテックスなど）、微量遠心分
離管、またはガラスもしくはプラスチックのビーズであ
り得る。所望の成分を、非特異的結合を介して共有結合
または非共有結合させることができる。
【０５０２】広範囲な種々の有機ポリマーおよび無機ポ
リマー（天然および合成の両方）を、固体表面のための
材料として使用し得る。例示的なポリマーは、ポリエチ
レン、ポリプロピレン、ポリ(4-メチルブテン）、ポリ
スチレン、ポリメタクリレート、ポリ(エチレンテレフ
タレート）、レーヨン、ナイロン、ポリ(ビニルブチレ
ート）、ポリビニリデンジフルオリド（PVDF）、シリコ
ーン、ポリホルムアルデヒド、セルロース、酢酸セルロ
ース、ニトロセルロースなどを含む。使用され得る他の
材料は、紙、ガラス、セラミックス、金属、メタロイ
ド、半導体材料、セメントなどを含む。さらに、タンパ
ク質（例えば、ゼラチン）、リポ多糖、シリケート、ア
ガロース、およびポリアクリルアミドのようなゲルを形
成する物質を使用し得る。デキストラン、ポリアルキレ
ングリコールのようないくかの水相を形成するポリマ
ー、またはリン脂質、長鎖（12〜24個の炭素原子）アル
キルアンモニウム塩などのような界面活性剤も適切であ
る。固体表面が多孔質である場合、システムの性質に応
じて種々の孔サイズを使用し得る。
【０５０３】表面の調製において、複数の異なる材料
を、特にラミネートとして使用して、種々の特性を得る
ことが可能である。例えば、ゼラチンのようなタンパク
質コーティングを用いて、非特異的結合の回避、共有結
合の単純化、シグナル検出の増強などを行い得る。
【０５０４】化合物と表面との間の共有結合が所望され
る場合、表面は、通常、多官能性であるか、または多官
能性化され得る。表面に存在し、そして、結合に使用さ
れ得る官能基は、カルボン酸、アルデヒド、アミノ基、
シアノ基、エチレン基、ヒドロキシル基、メルカプト基
などを含み得る。広範囲の種々の化合物を種々の表面に
結合させる方法は周知であり、そして文献に十分に説明
される。例えば、Immobilized Enzymes, Ichiro Chibat
a, Halsted Press, New York, 1978およびCuatrecasas
(1970), J. Biol. Chem. 245 3039参照。
【０５０５】共有結合に加えて、アッセイ成分を非共有
結合させる種々の方法を使用し得る。非共有結合は、典
型的には表面への化合物の非特異的吸着である。
【０５０６】当業者は、イムノアッセイにおいて非特異
的結合を低下させるのがしばしば望ましいことを認識す
る。特に、アッセイが固体基質上に固定化された抗原ま
たは抗体を含む場合、基質への非特異的結合の量を最小
化するのが望ましい。このような非特異的結合を低下さ
せる手段は、当業者に周知である。典型的には、これ
は、タンパク質組成物で基質をコーティングすることを
含む。特に、ウシ血清アルブミン（BSA）、脱脂粉乳、
およびゼラチンのようなタンパク質組成物が広く使用さ
れ、粉乳が時々好ましい。あるいは、表面を、それが１
つの成分に非特異的に結合するが、別の成分には有意に
結合しないように設計する。例えば、コンカナバリンＡ
のようなレクチンを有する表面は、炭水化物含有化合物
を結合するが、グリコシル化を欠く標識タンパク質には
結合しない。アッセイ成分の非共有結合に用いられる種
々の固体表面は、米国特許第4,447,576号および同第4,2
54,082号に概説される。
【０５０７】Ｈ）抗TRT抗体についてのアッセイ 本発明はまた、hTRT特異的免疫グロブリンを検出するた
めの試薬およびアッセイを提供する。１つの実施態様に
おいて、固定化hTRT（例えば、マイクロアッセイプレー
トウェルに結合した組換えhTRT）を、抗hTRT抗体が存在
する場合、固定化hTRTを結合する条件下で患者からの血
清と共にインキュベートする。洗浄して非特異的に結合
した免疫グロブリンを除去した後、結合した血清抗体
を、もしこれらが存在する場合、検出可能に標識された
抗（ヒトIg）抗体を添加することによって検出し得る
（別の実施態様および変形は当業者に周知である；例え
ば、Harlow、前出、第14章参照）。これらのアッセイ
は、動物もしくはヒトの血清または生理食塩水のような
キャリアを含むいずれかの供給源中の抗hTRT抗体を検出
するのに有用である。１つの実施態様において、アッセ
イを用いて、患者におけるhTRTタンパク質に対する免疫
応答、特に自己免疫（例えば、抗テロメラーゼ）応答を
検出またはモニターする。抗hTRT抗体は、自己免疫疾患
または他の病的状態を罹う患者からの血清または他の組
織または液体中に存在し得る。
【０５０８】Ｉ）アッセイの組合せ 本明細書に記載される診断アッセイおよび予後アッセイ
は、種々の組み合わせで実施し得、そしてまた他の診断
試験または予後試験と組み合わせて実施し得る。例え
ば、本方法を使用して患者の試料中に存在するガン細胞
の存在を検出する場合、hTRTの存在を用いて、疾患の段
階、特定の腫瘍が隣接する組織を侵襲しそうか、または
遠くの位置に転移しそうか、およびガンの再発がありそ
うかを決定し得る。さらなる情報を提供し得る試験は、
バイオプシー試料の顕微鏡分析、腫瘍形成性に関連する
抗原（例えば、細胞表面マーカー）の検出（例えば、組
織細胞化学、FACSなどを用いて）、画像化方法（例え
ば、患者への標識した抗腫瘍抗体の投与に際して）、テ
ロメラーゼ活性アッセイ、テロメア長アッセイ、hTRア
ッセイなどを含む。このような組合せ試験は、疾患の進
行に関する有用な情報を提供し得る。
【０５０９】アッセイの組合せが有用な情報を提供し得
ることもまた認識される。例えば、前記したように、hT
RT mRNAについてのアッセイをhTR（ヒトテロメラーゼRN
A）についてのアッセイまたはテロメラーゼ活性（すな
わち、TRAP）アッセイと組み合わせて、テロメラーゼの
アセンブリーおよび機能についての情報を提供し得る。
【０５１０】Ｊ）キット 本発明はまた、テロメラーゼに関連する病的状態を有す
る患者のスクリーニング、モニタリング、診断、および
予後に、または細胞または細胞株におけるhTRTの発現レ
ベルの決定に有用なキットを提供する。キットは、hTRT
遺伝子産物（RNAまたはタンパク質）の存在または非存
在を測定するため、またはhTRT遺伝子の発現を定量する
ための１つ以上の試薬を含む。好ましい試薬は、hTRTの
遺伝子、RNA、cDNA、またはその部分に特異的に結合す
る核酸プライマーおよびプローブに加えて、タンパク
質、ペプチド、抗体、ならびにコントロールのプライマ
ー、プローブ、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ペプ
チドおよび抗体を含む。酵素（例えば、逆転写酵素、DN
Aポリメラーゼ、リガーゼ）、緩衝液、試薬（標識、dNT
P）を含む他の材料を含み得る。
【０５１１】あるいは、キットは、本明細書に記載され
るいずれかの他の成分、hTRTポリペプチドまたはそのサ
ブ配列に特異的に結合する抗体を含み得るか、またはそ
れらと組み合わせ得る。抗体はモノクローナルまたはポ
リクローナルであり得る。抗体を、標識のような別の部
分に結合させ得るか、および／またはそれを固体支持体
（基質）上に固定化し得る。キット（単数または複数）
はまた、hTRTポリペプチド／抗体複合体の検出のため、
またはハイブリダイズした核酸プローブ、ならびにコン
トロールまたは他の試薬として使用する１つ以上のhTRT
ペプチドまたはhTRTタンパク質の検出のための第２の抗
体を含み得る。
【０５１２】抗体またはハイブリダイゼーションプロー
ブは、遊離であるか、または試験管、マイクロタイター
プレート、計量棒などのような固体支持体に固定化され
得る。キットはまた、TRTの検出のためのアッセイにお
ける、抗体またはハイブリダイゼーションプローブの使
用を教示する説明教材を含み得る。キットは、標識の検
出のため、または陽性コントロールおよび陰性コントロ
ールを標識するための適切な試薬、洗浄溶液、希釈緩衝
液などを含み得る。
【０５１３】１つの実施態様において、キットは、hTRT
mRNAを増幅するためのプライマー対を含む。このよう
なキットはまた、hTRTの増幅されたDNAについてのプロ
ーブ、および／またはポリメラーゼ、緩衝液、dNTPなど
を含み得る。別の実施態様において、キットは、プロー
ブ、任意に、標識されたプローブを含む。別の実施態様
において、キットは抗体を含む。
【０５１４】Ｘ．テロメラーゼ活性のモジュレーターの
同定 Ａ．概説 本発明は、テロメラーゼまたはテロメラーゼ成分（例え
ば、hTRTタンパク質）の活性または発現を調節する化合
物および処理を提供する。本発明はまた、テロメラーゼ
の活性または発現を調節する化合物および処理を同定す
るためのアッセイおよびスクリーニング方法（高処理量
スクリーニングを含む）を提供する。テロメラーゼの活
性および発現のこれらのモジュレーター（本明細書では
以後、「モジュレーター」という）は、テロメラーゼア
ゴニスト（これはテロメラーゼの活性および／または発
現を増加させる）およびテロメラーゼアンタゴニスト
（これはテロメラーゼの活性および／また発現を減少さ
せる）を含む。
【０５１５】本発明のモジュレーターは、広範囲の種々
の用途を有する。例えば、テロメラーゼモジュレーター
はヒトの疾患の処置のための有効な処置用薬剤であるこ
とが意図される。アゴニスト活性および転写もしくは翻
訳のアクチベーターについてのスクリーニングは、細胞
内のテロメラーゼ活性（テロメア依存性複製能、または
「部分的」テロメラーゼ活性を含む）を増加させる組成
物を提供する。このようなアゴニスト組成物は、有用な
タンパク質を発現し得る細胞を含む、他の点では正常な
非形質転換細胞を不死化させる方法を提供する。このよ
うなアゴニストはまた、細胞老化を制御する方法を提供
し得る。逆に、アンタゴニスト活性についてのスクリー
ニングは、テロメア依存性複製能を低下させ、それによ
り、ガン細胞のように、そうでなければ不死の細胞を有
寿命にする(mortalizing）組成物を提供する。アンタゴ
ニスト活性についてのスクリーニングは、テロメラーゼ
活性を低下させ、それにより、ガン細胞のような調節さ
れない細胞増殖を示す細胞の無制限な細胞分裂を防ぐ組
成物を提供する。モジュレーターを用いて処置され得る
例示的な疾患および病的状態は、本明細書において、例
えば、第VII節および第IX節（前出）に列記される。一
般に、本発明のモジュレーターは、細胞または生物にお
いてテロメラーゼ活性を増加または減少させるのが所望
される場合は常に使用され得る。従って、疾患の処置で
の使用に加えて、hTRTの発現レベルを増大させるモジュ
レーターを用いて、一般的には第VIII節（前出）に記載
される特性を有する培養ヒト細胞株を作製し得、そして
当業者に明らかである種々の他の用途に使用され得る。
【０５１６】化合物または処置は、化合物の投与または
処置がテロメラーゼ成分をコードする遺伝子（例えば、
hTRT mRNAをコードする遺伝子）の転写の速度またはレ
ベルを変化させるか、テロメラーゼ成分をコードするRN
Aの安定性または転写後プロセシング（例えば、輸送、
スプライシング、ポリアデニル化、または他の修飾）に
影響を与えるか、コードされるタンパク質（例えば、hT
RT）の翻訳、安定性、翻訳後プロセシング、または修飾
に影響を与えるか、あるいはさもなければ機能的（例え
ば、触媒的に活性な）テロメラーゼRNPのレベルを変化
させる場合に、テロメラーゼまたはテロメラーゼ成分の
「発現」を調節する。化合物または処置は化合物の投与
または処置が、第IV(B)章（前出）に記載されたいずれ
かの活性（例えば、進行的または非進行的なテロメラー
ゼ活性；テロメラーゼ進行性；従来の逆転写酵素活性；
核酸分解活性；プライマーまたは基質結合活性；dNTP結
合活性；RNA結合活性；テロメラーゼRNPアセンブリー；
およびタンパク質結合活性を含む）のようなテロメラー
ゼ活性を変化させる場合、テロメラーゼ「活性」に影響
を与える。「活性」における変化と「発現」における変
化との間には必ずしもはっきりした記述ないこと、およ
びこれらの用語は限定のためではなく議論を容易にする
ために使用されることが認識される。本発明のモジュレ
ーターが、例えば、標的細胞の非特異的毒殺によってテ
ロメラーゼ成分の発現を低下させるよりもむしろ、テロ
メラーゼの活性または発現に特異的に（例えば、一般
に、アクチンのようなハウスキーピングタンパク質の発
現を変化させることなく）影響を与えるべきであること
もまた認識される。
【０５１７】Ｂ．テロメラーゼモジュレーターの同定の
ためのアッセイ 本発明は、テロメラーゼまたはテロメラーゼ成分の発現
に影響を与えることができるか、テロメラーゼのDNA複
製能を改変し得るか、あるいはさもなければテロメラー
ゼ酵素およびTRTタンパク質がテロメリックDNAを合成す
る能力（「全活性」）を改変する組成物または化合物を
スクリーニングするための方法および試薬を提供する。
本発明はまた、hTRTの「部分的活性」のいずれかまたは
全てのモジュレーターについてのスクリーニングを提供
する。従って、本発明は、例えば、通常はhTRTタンパク
質またはテロメラーゼが発現されない細胞においてそれ
を発現させることによって、またはテロメラーゼ陽性細
胞においてテロメラーゼの活性レベルを増加させること
によって、テロメラーゼの活性を増加させる薬剤をスク
リーニングするのに使用され得るアッセイを提供する。
【０５１８】テロメラーゼまたはテロメラーゼサブユニ
ットタンパク質またはそれらの触媒的または免疫原性の
フラグメントまたはそのオリゴペプチドを、種々の薬物
スクリーニング技術のいずれかにおいて処置的化合物を
スクリーニングするのに使用し得る。このような試験で
使用されるフラグメントは、溶液中で遊離であるか、固
体支持体に付着しているか、細胞表面に生じるか、また
は細胞内に位置し得る。テロメラーゼまたはサブユニッ
トタンパク質と試験される薬剤との間の結合複合体の形
成は測定され得る。
【０５１９】種々の実施態様において、本発明は、酵素
の活性部位に結合するか；そのRNA部位、テロメラーゼ
会合タンパク質、ヌクレオチド、またはテロメリックDN
AのテロメラーゼまたはhTRTタンパク質への会合を阻害
するか；酵素複合体の解離を促進するか；テロメラーゼ
RNA部位（例えば、hTR）の転写を妨げるか；または本明
細書に記載される「部分活性」のいずれかを阻害するア
ンタゴニストをスクリーニングする方法を含む。本発明
は、hTRとhTRTとの会合またはhTRTとp80もしくはp95の
ヒトホモログまたは別の関連タンパク質との会合、また
はhTRTとテロメラーゼもしくはヌクレオチドとの会合の
ような、核酸および／またはテロメラーゼ関連組成物と
hTRTとの会合を阻害する組成物についてスクリーニング
する方法；hTRまたはhTRTに対する抗体のような、酵素
複合体の解離を促進するか、またはその会合（すなわ
ち、アセンブリー）を促進する組成物についてスクリー
ニングする方法；酵素の進行的に影響を与える薬剤につ
いてスクリーニングする方法；およびhTRに相補的な核
酸のような、テロメラーゼに結合する、核酸および他の
組成物についてスクリーニングする方法を提供する。本
発明は、さらに、hTRT遺伝子の転写および／またはhTRT
遺伝子産物の翻訳を増加または減少させる組成物につい
てのスクリーニングを意図する。本発明はまた、１つの
実施態様において、トランスジェニック動物のような動
物において、テロメラーゼ活性または抗テロメラーゼ活
性を再構成することによって、動物におけるテロメラー
ゼモジュレーターをスクリーニングする方法を意図す
る。本発明は、「ノックアウト」モデルを含むインビボ
アッセイシステムを提供し、ここで、１または数単位の
内因性テロメラーゼ、テロメラーゼRNA部位、および／
またはテロメラーゼ会合タンパク質が欠失または阻害さ
れる。内因性テロメラーゼ活性（完全または部分的）が
残存または欠損し得る。１つの実施態様において、外因
性テロメラーゼ活性（完全活性または部分的）を再構成
する。
【０５２０】本発明の１つの実施態様において、テロメ
ラーゼ活性の種々の異なるクラスのモジュレーターを同
定するための、種々の部分的活性テロメラーゼアッセイ
が提供される。本発明の「部分的活性」アッセイは、
「全活性」テロメラーゼアッセイで検出されないかも知
れないクラスのテロメラーゼ活性モジュレーターの同定
を可能とする。１つの部分的活性アッセイは、TRTおよ
びテロメラーゼの非進行的活性を含む。テロメラーゼの
進行的性質は、Morin (1989) Cell 59:521-529に記載さ
れる；Prowse (1993) 「Identification of a nonproces
sive telomeraseactivity from mouse cells」 Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 90:1493-1497も参照。本発明の別
の部分的活性アッセイは、テロメラーゼの「逆転写酵素
様」活性を利用する。これらのアッセイでは、hTRTタン
パク質の逆転写酵素活性をアッセイする。Lingner (199
7) 「Reverse transcriptase motifs in the catalytic
subunit of telomerase」 Science 276:561-567参照。本
発明の別の部分的活性アッセイは、プライマーの3'鎖か
らの少なくとも１つのヌクレオチド、典型的にはグアノ
シンの酵素の除去を含む、hTRTおよびテロメラーゼの
「核酸分解活性」を利用する。この核酸分解活性は、Co
llins (1993) 「Tetrahymena telomerase catalyzes nuc
leolytic cleavage and nonprocessive elongation」 Ge
nes Dev 7:1364-1376による、テトラヒメナテロメラー
ゼにおいて観察されている。本発明の別の部分的活性ア
ッセイは、この酵素的進行的DNA重合活性の一部として
ヌクレオチドに結合する、hTRTおよびテロメラーゼの能
力を分析することを含む。本発明の別の部分的活性アッ
セイは、テロメア合成のためのテンプレートとして使用
される、そのRNA部位、すなわちヒト細胞についてのhTR
に結合する、hTRTまたはテロメラーゼの能力を分析する
ことを含む。本発明のさらなる部分的活性アッセイは、
インビボで染色体に結合する、またはインビトロもしく
は再構成システムにおいてオリゴヌクレチオドプライマ
ーに結合する、あるいは染色体構造に関連するタンパク
質（このようなタンパク質の例については、Harrington
(1995) J BiolChem 270: 8893-8901を参照)に結合す
る、hTRTおよびテロメラーゼの能力を分析することを含
む。hTRTに結合する染色体構造は、例えば、テロメリッ
ク反復DNA、テロメアタンパク質、ヒストン、核マトリ
ックスタンパク質、細胞分裂／細胞周期制御タンパク質
などを含む。
【０５２１】１つの実施態様において、モジュレーター
の同定のためのアッセイは、１つ以上の細胞（すなわ
ち、「試験細胞」）を試験化合物と接触させる工程、お
よび試験化合物が細胞においてテロメラーゼ（またはテ
ロメラーゼ成分）の発現または活性に影響を与えるか否
かを決定する工程を含む。通常、この決定は、試験化合
物と接触させていない同様の細胞または複数の細胞（す
なわち、コントロール細胞）に対して、試験細胞におけ
る活性または発現を比較する工程を含む。あるいは、細
胞抽出物を、インタクトな細胞の代わりに使用し得る。
関連する実施態様において、試験化合物を多細胞生物
（例えば、植物または動物）に投与する。テロメラーゼ
またはテロメラーゼ成分は、細胞または多細胞生物にと
って全く内因性であり得るか（すなわち、天然に生じる
内因性遺伝子によってコードされる）、または１種以上
の組換えにより発現されるテロメラーゼ成分（例えば、
hTRT、hTR、テロメラーゼ会合タンパク質）を含む組換
え細胞またはトランスジェニック生物であり得るか、ま
たは内因性成分および組換え成分の両方を有し得る。従
って、１つの実施態様において、テロメラーゼ活性モジ
ュレーターを有寿命細胞に投与する。別の実施形態様に
おいて、テロメラーゼ活性モジュレーターを不死化細胞
に投与する。例えば、推定の阻害性組成物を、ガン細胞
のような顕著な量のテロメラーゼ活性を示すことが知ら
れる細胞に投与し、そしてテロメラーゼ活性、テロメア
長、または増殖能力の減少（これらの全てがアンタゴニ
スト活性を有する化合物の指標である）が観察されるか
否かを測定することによって、テロメラーゼ媒介DNA複
製のアンタゴニストを同定し得る。
【０５２２】別の実施態様において、TRT（例えば、hTR
T）およびテンプレートRNA（例えば、hTR）を含むリボ
核タンパク質複合体（RNP）のテロメラーゼ活性の変化
をモニターすることによってモジュレーターが同定さ
れ、（例えば、実施例７、後出に記載されているよう
に）そのRNPはインビトロで再構築される。
【０５２３】さらに別の実施態様において、細胞、動
物、インビトロ発現系、または他の発現系において、TR
T遺伝子産物（例えば、RNAまたはタンパク質）の発現の
変化をモニターすることによってモジュレーターが同定
される。
【０５２４】さらに別の実施態様において、プロモータ
ーまたはエンハンサーのような天然に存在するTRT調節
要素によって全体的にまたは部分的にその発現が調節さ
れる、実施例15に記載のような、レポーター遺伝子の発
現を変化させることによってモジュレーターが同定され
る。関連する実施態様において、テロメラーゼ成分（例
えば、hTRT）、RNA、または遺伝子調節配列（例えば、T
RT遺伝子プロモーター）に結合する試験化合物の能力を
アッセイする。
【０５２５】別の実施態様において、hTRTプレmRNAプロ
セシング、例えば、オルタナティブスプライシングされ
た産物、オルタナティブポリ−アデニル化事象、RNA切
断などの変化を観察することによってモジュレーターが
同定される。関連する実施態様において、変異型hTRTポ
リペプチド（そのうちのいくつかは、優性的に陰性のテ
ロメラーゼ調節活性を有し得る）の産生をモニターする
ことによってモジュレーターの活性を観察することがで
きる。
【０５２６】タンパク質の発現および活性に影響する化
合物の同定のためのアッセイ様式は、バイオテクノロジ
ーおよび医薬産業において周知であり、多数のさらなる
アッセイおよび後記にて提供する例示的アッセイの変形
が当業者に明らかである。
【０５２７】テロメラーゼの活性または発現の変化は、
任意の適切な方法によって測定され得る。テロメラーゼ
成分（例えば、hTRTタンパク質）または前駆体（例え
ば、hTRT mRNA）の発現のレベルの変化は、当業者に周
知の方法を用いてアッセイされ得る。そのうちのいくつ
かは例えば第IX節にて前記され、（例えば、本発明のTR
Tプローブおよびプライマーを用いる）ハイブリダイゼ
ーション、（例えば、本発明の抗TRT抗体を用いる）イ
ムノアッセイ、RNase保護アッセイ、増幅アッセイ、ま
たは本明細書中に記載のもしくは当該分野で公知の任意
の他の適切な検出手段によってTRT遺伝子産物（例え
ば、タンパク質およびRNA）のレベルをモニターするこ
とを含む。試料中の核酸の量を定量すること（例えば、
RNA、例えば、hTRまたはhTRT mRNAのレベルの評価）も
また、シス−またはトランス−転写レギュレーターを評
価するにおいて有用である。
【０５２８】同様に、テロメラーゼ活性の変化は、本明
細書中に記載の方法（例えば、第（IV(B)節、前出）ま
たはテロメラーゼ機能の他のアッセイのような方法を用
いて測定され得る。望まれる場合、テロメラーゼ活性の
定量は、本明細書中に記載した方法を含む任意の方法に
よって行い得る。テロメリック構造の喪失を引き起しま
たは促進し得るテロメラーゼアンタゴニストは、インビ
ボ、エクスビボまたはインビトロでテロメラーゼ活性に
対するそれらの効果をモニターおよび測定することによ
って、または（染色、タグ化したハイブリダイゼーショ
ンプローブまたは他の手段の使用によって測定されたま
たは検出された）テロメア長に対するそれらの効果によ
って、あるいはテロメラーゼ陽性ガン細胞の細胞分裂の
阻害によって（テロメアの臨界的短鎖化は「危機」また
はＭ２老化と呼ばれる現象に至る（Shay, 1991、Bioche
m. Biophys. Acta 1072:1-7) 同定され得、それは、ガ
ン細胞はテロメラーゼの活性化によって迂回するが、テ
ロメラーゼの不存在下では、染色体の欠失および再配置
を介するそれらの老化または死滅に至る。ヒトテロメラ
ーゼ活性のインビボでの再構築は、任意の供給源からの
細胞または動物においてテロメラーゼモジュレーターの
ためのスクリーニング方法を提供する。このようなアゴ
ニストは、テロメア長の変化の測定を含む、本発明の活
性アッセイで同定され得る。細胞においてテロメラーゼ
活性を測定するアッセイの他の例は、テロメア構造の蓄
積または喪失のためのアッセイ、TRAPアッセイまたは定
量的ポリメラーゼ連鎖反応アッセイを含む。
【０５２９】１つの実施態様において、本発明のアッセ
イはまた、試験化合物を欠く平行反応において組み込ま
れた標識の相対量と比較して、標識ヌクレオチドの基質
への組込みによって測定して、hTRTの活性の統計学的に
有意な減少を試験化合物が生じ、それにより、試験化合
物がテロメラーゼインヒビターであると判断される方法
を含む。
【０５３０】また、本発明の方法は、科学および特許文
献に記載され、そして当該分野で公知のプロトコルの改
作に従う。例えば、本発明のテロメラーゼまたはTRTタ
ンパク質を用いて、テロメラーゼ活性のモジュレーター
として作用する組成物を同定する場合、非常に多数の潜
在的に有用な分子を単一の試験でスクリーニングするこ
とができる。モジュレーターは、テロメラーゼ活性に対
して阻害性（アンタゴニスト）または増強性（アゴニス
ト）効果を有し得る。例えば、もし1000のインヒビター
のパネルをスクリーニングすべきであれば、全ての1000
のインヒビターを潜在的に１つのマイクロタイターウェ
ルに入れ、同時に試験することができる。もしこのよう
なインヒビターが見つかれば、1000のプールを100の10
プールに分け、個々のインヒビターが同定されるまでプ
ロセスを反復することができる。
【０５３１】薬物スクリーニングにおいて、多数の化合
物をテロメラーゼモジュレーターとして作用するそれら
の能力について調べる（高処理能力スクリーニングの技
術によって多いに加速されるプロセス）。本明細書に記
載のテロメラーゼ活性についてのアッセイ（全てまたは
部分）を、高処理能力技術で使用するのに適合させるこ
とができる。この目的を達成するために多数の方法が存
在することは当業者には明らかである。
【０５３２】テロメラーゼまたはテロメラーゼタンパク
質サブユニットに対して適切な結合親和性を有する化合
物の高処理能力スクリーニングに適用し得る薬物スクリ
ーニングについての別の技術は、Geysenによる「Determ
ination of Amino Acid Sequence Antigenicity」（本明
細書中で参考として援用される、Geysen, 1984年９月13
日に公開されたWO国際公開84/03564）に詳細に記載され
ている。要約すると、非常に多数の異なる小ペプチド試
験化合物を、プラスチックピンまたはいくつかの他の表
面のような固体基板上で合成する。ペプチド試験化合物
をテロメラーゼのフラグメントまたはテロメラーゼタン
パク質サブユニットと反応させ、そして洗浄する。次い
で、結合したテロメラーゼまたはテロメラーゼタンパク
質サブユニットを、当該分野で周知の方法によって検出
する。実質的に精製したテロメラーゼまたはテロメラー
ゼタンパク質サブユニットはまた、前記薬物スクリーニ
ング技術で使用するプレート上に直接被覆され得る。あ
るいは、非中和抗体を用いてペプチドを捕獲し、固体支
持体に固定化し得る。
【０５３３】本発明はまた、テロメラーゼまたはサブユ
ニットタンパク質に結合し得る中和抗体を、テロメラー
ゼまたはサブユニットタンパク質への結合のために試験
化合物と特異的に競合させる競合的薬物スクリーニング
アッセイの使用を意図する。また、抗体を用いて、テロ
メラーゼまたはサブユニットタンパク質で１つ以上の抗
原決定基を共有する任意のペプチドの存在も検出し得
る。
【０５３４】テロメラーゼ活性のモジュレーターを同定
するさらなる方法は、米国特許第5,645,986号に記載さ
れており、これは、本明細書中で参考として援用され
る。本発明は、hTRTポリヌクレオチド、プローブおよび
プライマー、高度に精製されたhTR、hTRTおよびテロメ
ラーゼ、ならびに抗テロメラーゼおよび抗TRT抗体のよ
うな試薬（その全てを、アッセイ、例えば、コントロー
ル、標準、結合剤またはハイブリダイゼーション剤など
として使用し得る）を供することによって部分的に、以
前に知られた方法の改良を提供することが認識される。
【０５３５】本発明の組換えにより産生されたテロメラ
ーゼおよびTRT（例えば、hTRT）はモジュレーターの同
定のためのアッセイで有用であると認識される。このス
クリーニングアッセイは、テロメラーゼ活性の全体的も
しくは部分的再構成によって、または存在する活性の増
加によって得られたテロメラーゼまたはhTRTを利用し得
る。上記のように、一般に、本発明によって提供される
アッセイおよびスクリーニングを用いて、テロメアーゼ
のテロメリックDNAを合成する能力を試験し得るか、ま
たはhTRTおよびTRTのいくつかまたはすべての「部分的
活性」を試験し得る。このアッセイは、そのRNA部分ま
たは関連タンパク質と共にまたは無しでテロメラーゼを
発現するように操作された細胞のエクスビボ改変を取り
入れることができ、これらを動物に再移植し得、そして
インビボ試験で使用し得る。従って、本発明は、インビ
ボアッセイおよびそこで有用なトランスジェニック動物
を提供する。これらのインビボアッセイ系は、１または
数単位の内因性テロメラーゼ酵素複合体が欠失または阻
害されている「ノックアウト」細胞、ならびに外因性ま
たは内因性テロメラーゼ活性が再構成されまたは活性化
されている細胞を使用し得る。
【０５３６】（部位特異的変異によって）部位特異的様
式で改変して、テロメラーゼ酵素またはTRTタンパク質
のいずれかまたは全ての機能を改変または欠失させたテ
ロメラーゼおよびTRTタンパク質もまた、治療用薬剤を
発見するために本発明のスクリーニングで使用し得る。
例えば、基質DNAに結合する、そのRNA部位（例えばhT
R）に結合する、テロメリックDNAの付加を触媒する、デ
オキシヌクレオチド基質に結合する、核酸分解活性を有
する、テロメア会合タンパク質または染色体構造に結合
するなどのその能力を喪失するようにTRTを操作し得
る。得られた「変異タンパク質」または「ムテイン（mu
teen）」を用いて、TRTタンパク質またはテロメラーゼ
の１つ、いくつかの、または全ての機能または活性を特
異的に調節する化合物を同定し得る。
【０５３７】Ｃ．例示的テロメラーゼモジュレーター １）一般 前記にて言及した試験化合物は、ポリマー（例えば、オ
リゴペプチド、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、お
よびポリヌクレオチド）、小分子、抗体（本明細書では
広く定義される）、糖、脂肪酸、ヌクレオチドおよびヌ
クレオチドアナログ、天然に存在する構造のアナログ
（例えば、ペプチド模倣物、核酸アナログ等）、および
多数の他の化合物を含む、広範な種々の化合物（天然お
よび合成の両方、有機および無機の両方）であり得る。
【０５３８】本発明は、任意の特定の作用メカニズムの
制限なしで、全てのタイプのモジュレーターを提供す
る。例示目的で、モジュレーターの例は、以下の化合物
または処置を含む： （i）hTRTポリペプチド（例えば、酵素の活性部位）ま
たは他のテロメラーゼ成分に結合し、そしてテロメラー
ゼ活性に影響する； （ii）テロメラーゼ成分（例えば、hTRTまたはhTRT-hTR
RNP）の（例えば、前記第IV(D)節に記載したものを含
む）テロメラーゼ会合タンパク質との会合を阻害もしく
は促進し、またはそれからの解離を阻害もしくは促進す
る； （iii）テロメラーゼポリペプチド（例えば、hTRT）
の、テロメラーゼRNA（例えば、hTR）との会合を阻害し
もしくは促進し、またはそれらの解離を阻害しもしくは
促進する； （iv）テロメラーゼポリペプチド（例えば、hTRT）の、
染色体（例えば、テロメア）または染色体DNA（例え
ば、テロメリックDNA）との会合を阻害しもしくは促進
し、またはそれからの解離を阻害しもしくは促進する； （ｖ）（例えば、hTRT遺伝子または別のテロメラーゼ成
分の転写に影響する因子（例えば、転写調節タンパク
質）と相互作用することによって）遺伝子または遺伝子
産物に結合することによって、TRT遺伝子の転写、また
は遺伝子産物の翻訳、輸送または安定性の速度またはレ
ベルを変化させることを包含する、テロメラーゼ成分遺
伝子産物（例えば、hTRT遺伝子の産物）の発現を増加さ
せまたは減少させる。
【０５３９】２）ペプチドモジュレーター テロメラーゼ活性の潜在的なモジュレーターはまた、ペ
プチド（例えば、阻害性ペプチドモジュレイター（アン
タゴニスト）およびアクチベーターペプチドモジュレー
ター（アゴニスト）も含む。例えば、ランダムに生じた
配列を有するオリゴペプチドをスクリーニングして、テ
ロメラーゼ活性のペプチドモジュレーター（アゴニスト
またはインヒビター）を発見し得る。このようなペプチ
ドを直接薬物として用いて、テロメラーゼ活性を阻害し
得る官能基の配向または位置を見い出し得、次いで、こ
れは小分子インヒビターの設計または試験に導かれ、あ
るいは薬理学的利用性を増大させる化学修飾の基礎とな
る。ペプチドは構造的模倣物であり得、テロメラーゼ酵
素およびhTRTタンパク質の特徴的二次構造および／また
は三次構造に基づいて模倣物を設計するための分子モデ
リングプログラムを用いることができる。このような構
造的模倣物もまた、テロメラーゼ活性のモジュレーター
（アゴニストおよびアンタゴニスト）としてインビボで
治療的に用い得る。構造的模倣物はまた、抗テロメラー
ゼまたは抗TRTタンパク質抗体を若起するための免疫原
として使用され得る。
【０５４０】３）テロメラーゼ活性のモジュレーターと
しての阻害性天然化合物 さらに、非常に多数の潜在的に有用な活性修飾化合物
を、供給源物質として天然物質からの抽出物でスリーニ
ングし得る。このような抽出物の供給源は、菌類、放線
菌、藻類、昆虫、原生動物、植物および細菌の多数の種
由来であり得る。次いで、阻害性活性を示すこれらの抽
出物を分析して、活性分子を単離し得る。例えば、Turn
er (1996) J. Ethnopharmacol. 51 (1-3);39-43 ;Suh
(1995) Anticancer Res. 15:233-239を参照のこと。
【０５４１】４）阻害性オリゴヌクレオチド 本発明によって提供される１つの特に有用な組のインヒ
ビターは、機能的hTRTタンパク質の産生を妨げるかまた
は阻害するいずれの場合にも、hTRTタンパク質をコード
するmRNAまたはhTRT遺伝子のいずれかに結合し得るオリ
ゴヌクレオチドを含む。本発明の他のオリゴヌクレオチ
ドは、hTRのようなテロメラーゼのRNA部位と相互作用す
るか、あるいはテロメラーゼまたはhTRTのそのDNA標的
への、または１つのテロメラーゼ成分の別の成分または
基質への結合を妨げ得る。このようなオリゴヌクレオチ
ドはまた、テロメラーゼ酵素、hTRTタンパク質、または
双方のタンパク質およびRNAの両方に結合し得、そして
その進行的活性、その逆転写酵素活性、その核酸分解活
性等のような上記の部分的活性を阻害する。会合は、別
の核酸への配列特異的ハイブリダイゼーションによる
か、またはアプタマーにおけるように一般的結合による
か、または両方により得る。
【０５４２】テロメラーゼ活性は、hTRT mRNAに結合し
得るアンチセンスオリゴヌクレオチドでhTRT mRNAを標
的化することによって阻害し得る。
【０５４３】インヒビターの別の有用なクラスは、hTRT
mRNAまたはhTRの不活化または切断を引き起こすオリゴ
ヌクレオチドを含む。すなわち、オリゴヌクレオチド
は、化学的に修飾されるか、あるいはリボザイム、EDTA
結合オリゴヌクレオチド、またはプソラレンもしくはオ
リゴヌクレオチドに結合した他の架橋試薬のような共有
結合オリゴヌクレオチドの場合のように、このような切
断を生じる酵素活性を有する。上記ように、所望の活性
を有するものについての多くの異なるこのようなオリゴ
ヌクレオチドのプールをスクリーニングし得る。
【０５４４】別の有用なクラスのインヒビターは、ポリ
ペプチドに結合するオリゴヌクレオチドを含む。特異的
なポリペプチド標的に結合する二本鎖または一本鎖のDN
Aあるいは二本鎖または一本鎖のRNA分子は、「アプタマ
ー」と呼ばれる。特異的オリゴヌクレオチド−ポリペプ
チド会合は、静電的相互作用によって媒介され得る。例
えば、アプタマーは、ポリアニオン性のヘパリンに生理
学的に結合する、トロンビン上のアニオン結合性エクソ
サイトに特異的に結合する（Bock (1992) Nature 355:5
64-566)。hTRTタンパク質はhTRおよびそのDNA基質の両
方に結合するので、そして本発明は大量の精製された形
態のhTRTおよび他のTRTタンパク質を提供するので、当
業者は本発明の方法を用い、TRT結合性アプタマーにつ
いて容易にスクリーニングし得る。
【０５４５】テロメラーゼ、hTRT、hTR、またはその部
分に結合するオリゴヌクレオチド（例えば、RNAオリゴ
ヌクレオチド）は、SELEXの技術を用いて産生し得る（T
uerk,1977, Methods Mol. Biol. 67, 2190)。この技術
において、標的への結合に対して高親和性を有する分子
および低親和性を有する分子の間の高程度の区別を引き
起こす条件を用いて、ランダム配列核酸の非常に大きな
プール（106-109）を標的（例えば、hTRT）に結合させ
る。結合した分子を非結合分子から分離し、そして末端
に含まれる特異的核酸配列および適切な増幅試薬によっ
て結合分子を増幅する。このプロセスを、標的に対して
高親和性を有する比較的少数の分子が残るまで数回反復
する。次いで、本明細書中に記載のように、これらの分
子を、テロメラーゼ活性を調節するそれらの能力につい
て試験する。
【０５４６】テロメラーゼ媒介DNA複製のアンタゴニス
トはまた、リボザイムを介するように、相補的配列の認
識または切断を介して、hTRの阻害（Norton (1996) Nat
ureBiotechnology 14:615-619)に基づき得る。
【０５４７】本発明の阻害性オリゴヌクレオチドは、当
該分野で周知の種々の技術を用い、細胞に移入すること
ができる。例えば、特異的修飾なしでオリゴヌクレオチ
ドを細胞質に送達し得る。あるいは、それらは、細胞の
表面膜タンパク質レセプターに付着し、その結果飲食さ
れる、細胞膜と融合するかまたは飲食されるリポソーム
の使用によって、すなわち、リポソームに付着した、ま
たはオリゴヌクレオチドに直接付着したリガンドの使用
により送達し得る。あるいは、細胞を透過性として、宿
主細胞を傷つけることなく、オリゴヌクレオチドの細胞
への輸送を増強し得る。オリゴヌクレオチドを細胞への
輸送が公知の、DNA結合性タンパク質、例えばHBGF-1を
使用できる。
【０５４８】５）阻害性リボザイム 標的RNAを切断するリボザイムの酵素部分に近くに保持
されたリボザイムの標的RNA結合部分を介して標的RNAに
結合することによって、リボザイムは作用する。従っ
て、リボザイムは通常は相補的塩基対形成を介して標的
RNAを認識しそれに結合し、そして一旦正しい部位に結
合すれば、酵素的に作用して、標的RNAを切断し不活化
させる。そのような様式における標的RNAの切断は、切
断がコード配列内で起った場合、コードされたタンパク
質の合成を指向するその能力を破壊する。リボザイムが
そのRNA標的に結合しそれを切断した後、典型的には、
それはRNAから遊離され、従って、新規の標的に反復し
て結合しそれを切断できる。
【０５４９】６）モジュレーターとしての使用のための
テロメラーゼ会合タンパク質の同定 本発明の１つの実施態様において、テロメラーゼを用い
て、テロメラーゼ活性を調節するか、またはさもなけれ
ばそれを補うテロメラーゼ会合タンパク質、すなわち、
テロメラーゼアクセサリータンパク質を同定する。上記
のように、これらのタンパク質またはそのフラグメント
は、テロメラーゼ酵素複合体の解離を引き起こし、また
はその会合を妨げることによって、テロメラーゼ複合体
の構築を妨げることによって、hTRTがその核酸相補体に
またはそのDNAテンプレートに結合するのを妨げること
によって、hTRTがヌクレオチドを結合することを妨げる
ことによりまたは上記のテロメラーゼ酵素もしくはhTRT
タンパク質の部分的活性のいずれか、またはいくつか、
または全てを妨げ、増大させ、または阻害することによ
って機能を調節し得る。
【０５５０】当業者は、本発明の方法を用いて、これら
のテロメラーゼ会合タンパク質どの部分（例えば、ドメ
イン）がテロメラーゼに接触するのかを同定し得る。本
発明の１つの実施態様において、これらのテロメラーゼ
会合タンパク質またはそのフラグメントは、テロメラー
ゼ活性のモジュレーターとして使用される。
【０５５１】７）ドミナントネガティブ（dominant neg
ative）変異体としてのテロメラーゼ関連タンパク質 本発明の１つの実施態様において、テロメラーゼ会合タ
ンパク質は、テロメラーゼ活性のモジュレーターとして
使用される。テロメラーゼ活性タンパク質は、ヒスト
ン、核マトリックスタンパク質、細胞分裂および細胞周
期制御タンパク質等のような染色体構造を含む。本発明
の目的のためにモジュレーターとして使用し得る他のテ
ロメラーゼ会合タンパク質は、p80およびp95タンパク質
ならびにTP1およびTRF-1のようなそれらのヒトホモログ
を含む（Chong, 1995, Science 270:1663-1667)。さら
に、これらのテロメラーゼ会合タンパク質のフラグメン
トは、本発明の方法により当業者によって同定され得、
そしてテロメラーゼ活性のモジュレーターとして使用し
得る。
【０５５２】８）ドミナントネガティブ変異体 上記のように、８つの高度に保存されたモチーフが、異
なる非ヒト種のTRTの間で同定されている（Lingner (19
97) Science 276:561-567もまた、参照のこと)。図４
は、S. pombe Trtlp, Euplotes p123およびS. cerevisi
ae Est2pと比較して、（pGRN121からの）ヒトTRTアミノ
酸配列およびRTモチーフの概略を示す。本発明は、これ
らのモチーフの８個全ての、それぞれにおける保存され
たアミノ酸残基に対するコドンが、単独で、あるいは１
以上のさらなるコドンと組み合わされて、他のコドンの
それぞれに変更された組換えおよび合成核酸を提供す
る。種々の得られたコード配列は非機能的hTRTを発現す
る。例えば、実施例16を参照のこと。従って、本発明
は、例えば、テロメラーゼの部分的活性を有するが、全
活性を有しない非常に広範囲の「変異した」テロメラー
ゼ酵素およびTRTタンパク質を提供する。例えば、１つ
のこのようなテロメラーゼはテロメリック構造に結合し
得るが、テロメラーゼ会合RNA(すなわち、hTR）に結合
し得ない。もし十分に高いレベルで発現されれば、この
ようなテロメラーゼ変異体は、必要なテロメラーゼ成分
（例えば、hTR）を枯渇させ得、それにより、野生型テ
ロメラーゼ活性のインヒビターとして機能する。このよ
うに作用する変異したテロメラーゼは、アンタゴニスト
またはいわゆる「ドミナントネガティブ」変異体であ
る。
【０５５３】９）抗体 一般に、本発明の抗体を用いて、テロメラーゼ酵素およ
びhTRTタンパク質のいずれかのまたは全ての活性を同定
し、精製し、または阻害することができる。抗体は、種
々の方法、例えば、テロメラーゼ複合体またはヌクレオ
チドがそのDNA基質に結合するのを妨げることによっ
て、テロメラーゼの成分が活性複合体を形成するのを妨
げることによって、機能的（テロメラーゼ複合体）４次
構造を維持することによって、または活性に対してアロ
ステリック効果を有する酵素の活性部位または他の部位
の１つに結合することによって、テロメラーゼ活性のア
ンタゴニストとして作用できる（テロメラーゼの異なる
部分的活性は本明細書の他の箇所に詳細に記載されてい
る）。
【０５５４】Ｄ）モジュレーターの合成 本発明のテロメラーゼモジュレーターは、コンビナトリ
アル法および合理的な薬物デザイン技術を含む、薬学的
分野で周知の方法を用いて作製されることが意図され
る。
【０５５５】１）コンビナトリアル化学方法論 合成分子の大ライブラリーの作製および同時スクリーニ
ングは、コンビナトリアル化学における周知の技術を用
いて行い得る。例えば、van Breemen (1997) Anal. Che
m. 69:2159-2164；Lam (1997) Anticancer Drug Des. 1
2:145-167 (1997)参照。
【０５５６】上記のように、コンビナトリアル化学方法
論を用いて、本発明のTRTタンパク質のような、任意の
標的に対する適切な結合親和性および特異性を有する特
異的オリゴヌクレオチド（または化合物）について迅速
にスクリーニングし得る膨大な数のオリゴヌクレオチド
（または他の化合物）を作製し、利用し得る（一般的背
景情報については、Gold (1995) J. of Biol. Chem. 27
0: 13581-13584を参照のこと）。
【０５５７】２）合理的薬物デザイン 合理的薬物デザインは、標的分子の構造解析、合成化
学、および進歩したコンピューター手段を含む方法論の
一体化された組を含む。テロメラーゼ酵素およびhTRTタ
ンパク質のような、タンパク質標的のアンタゴニスト／
インヒビターのようなモジュレーターを設計するのに使
用する場合、合理的薬物デザインの目的は、分子の三次
元の形状および化学を理解することにある。合理的薬物
デザインはＸ線結晶解析データまたはNMRデータによっ
て支援され、今や、本発明によって提供される方法に従
い、本発明によって提供される試薬を用い、hTRTタンパ
ク質およびテロメラーゼ酵素について測定し得る。静電
気学、疎水性および溶媒接近性についての計算も助けに
なる。例えば、Goldren (1997) Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 94:6635-6640を参照のこと。
【０５５８】Ｅ）キット 本発明はまた、試験化合物がTRT活性のモジュレーター
であるか否かの決定を助けるのに使用され得るキットを
提供する。このキットは、典型的には、１つ以上の以下
の成分：実質的に精製されたTRTポリペプチドまたはポ
リヌクレオチド（プローブおよびプライマー含む）：細
胞または無細胞発現系に導入された場合にTRT（例え
ば、hTRT）を発現できるプラスミド；細胞または無細胞
発現系に導入された場合にTR（例えば、hTR）を発現で
きるプラスミド；細胞または細胞株；TRT活性の変化を
検出するための組成物；および試験化合物の存在下にお
けるテロメラーゼ活性の変化は、試験化合物がテロメラ
ーゼ活性を調節する指標であることを示す、TRT活性の
変化を検出し測定するための手段を教示する教示物質、
ならびに１つ以上の容器を含む。このキットはまた、TR
T活性の変化を測定するための、TRAPアッセイ試薬また
は定量的ポリメラーゼ連鎖反応アッセイ用の試薬のよう
な手段を含むことができる。このキットはまた、試験化
合物の存在下におけるテロメラーゼ活性の変化が試験化
合物がテロメラーゼ活性を調節する指標であることを示
す、TRT活性の変化を検出し測定するための手段を教示
する教示物質を含み得る。
【０５５９】XI．トランスジェニック生物（テロメラー
ゼノックアウト細胞および動物モデル） 本発明はまた、コード配列または調節（例えば、プロモ
ーター）配列であり得る、外因性TRT遺伝子配列を含む
トランスジェニック非ヒト多細胞生物（例えば、植物ま
たは非ヒト動物）または単細胞生物（例えば、酵母）を
提供する。１つの実施態様において、この生物は、ヒト
TRTタンパク質の配列を有する外因性TRTポリペプチドを
発現する。この関連する実施態様において、この生物は
また、テロメラーゼRNA成分（例えば、hTR）を発現す
る。
【０５６０】本発明はまた、テロメラーゼ成分（例え
ば、TRTまたはTR）またはテロメラーゼ会合タンパク質
をコードする少なくとも１つの遺伝子が、天然のテロメ
ラーゼが発現されないか、または野生型細胞または野生
型生物と比較した場合低下したレベルまたは異なる活性
で発現されるように、変異または欠失している（すなわ
ち、コード領域または調節領域において）単細胞および
多細胞生物（またはそれ由来の細胞）を提供する。この
ような細胞および生物は、しばしば、「遺伝子ノックア
ウト」細胞または生物といわれる。
【０５６１】本発明は、さらに、内因性テロメラーゼ遺
伝子（例えば、マウスTRT）が存在しているか、または
所望により変異または欠失され、そして外因性テロメラ
ーゼ遺伝子または変異体（例えば、ヒトTRT）が導入さ
れ発現される細胞および生物を提供する。このタイプの
細胞および生物は、例えば、hTRT活性または発現のモジ
ュレーターの同定；テロメラーゼ成分遺伝子における変
異の効果の決定、およびテロメラーゼ活性の発生タイミ
ングおよび組織位置の効果の決定のような他の使用（例
えば、テロメラーゼモジュレーターをいつ投与すべきか
の評価、および任意の可能な副作用の評価）のためのモ
デル系として有用である。
【０５６２】多細胞生物の例としては、植物、昆虫、な
らびにマウス、ラット、ウサギ、サル、類人猿、ブタお
よび他の非ヒト哺乳動物のような非ヒト動物が挙げられ
る。単細胞生物の例は酵母である。
【０５６３】特定の遺伝子（例えば、内因性TRT遺伝
子）の改変または破壊の方法は当業者に周知である。例
えば、Baudinら, 1993, Nucl. Acids Res. 21:3329；Wa
chら,1994, Yeast 10:1793; Rothstein, 1991, Methods
Enzymol. 194:281；Anderson, 1995, Methods Cell Bi
ol. 48:31；Pettittら, 1996, Development 122:4149-4
157; Ramirez-Solisら, 1993, Methods Enzymol. 225:8
55；およびThomasら, 1987, Cell 51:503を参照のこ
と、そのそれぞれは、その全体が全ての目的のために本
明細書中で参考として援用される。
【０５６４】本発明の「ノックアウト」細胞および動物
は、１または数単位の内因性テロメラーゼ酵素複合体が
欠失または阻害されている細胞および動物を含む。テロ
メラーゼ活性の再構成は、細胞または動物を老化から、
またはガン細胞については、テロメアを維持するその無
能力によって引き起こされる細胞死から救済する。内因
性遺伝子の発現を改変する方法は、当業者に周知であ
る。典型的には、このような方法は、調節すべき特定の
遺伝子の発現を制御する全てのまたは一部の調節配列を
改変するかまたは置き換えることを含む。調節配列（例
えば、天然プロモーター）は改変され得る。遺伝子の標
的変異のための従来の技術は、目的の遺伝子を含有する
ゲノムDNAフラグメントをベクターに入れ、続いてチミ
ジンキナーゼを含有するベクター中の選択可能なネオマ
イシン−耐性カセットの回りに標的化遺伝子の関連する
２つのゲノムアームをクローニングすることを含む。次
いで、この「ノックアウト」構築物を適切な宿主細胞、
すなわち、マウス胚性幹（ES）細胞にトランスフェクト
し、これを引き続いてノックアウトベクターで相同組換
えを受けた細胞の選択を可能にする陽性選択（例えば、
ネオマイシン耐性について選択するためにG418を使用）
および陰性選択（例えば、チミジンキナーゼを欠く細胞
を排除するためにFIAUを使用）に供する。このアプロー
チは、目的の遺伝子の不活化に導く。例えば、米国特許
第5,464,764号；同第5,631,153号；同第5,487,992号；
および同第5,627,059号を参照のこと。
【０５６５】内因性遺伝子の「ノックアウト」発現はま
た、相同組換えを使用して異種の核酸を目的の遺伝子の
調節配列（例えば、プロモーター）に導入することによ
って達成され得る。機能的酵素または産物の発現を妨ぐ
ためには、リーディングフレームを改変するか、あるい
はプロモーターを破壊する単純な変異が適切であり得
る。発現をアップレギュレートするために、天然プロモ
ーターは、より高レベルの転写を誘導する異種プロモー
ターで置換され得る。また、例えば、Holzschu (1997)
Transgenic Res. 6:97-106に記載されているように、
「遺伝子トラップ挿入」を用いて宿主遺伝子を破壊する
ことができ、マウスES細胞を用いてノックアウトトラン
スジェニック動物を生産することができる。
【０５６６】相同組換えによる内因性遺伝子の発現の改
変はまた、問題の構造遺伝子を含む核酸配列を用いるこ
とによって達成され得る。異種組換え構築物を標的化す
るために上流配列を利用する。配列番号１のようなTRT
構造遺伝子配列情報を利用し、当業者は、日常的な実験
のみにより相同組換え構築物を作製することができる。
内因性遺伝子の発現を改変するための相同組換えは、米
国特許第5,272,071号、およびWO 91/09955、WO 93/0922
2、WO96/29411、WO95/31560、およびWO91/12650に記載
されている。マイコバクテリウムにおける相同組換え
は、Azad (1996)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:4787;
Baulard (1996) J. Bacteriol. 178:3091；およびPeli
cic (1996) Mol. Microbiol. 20:919によって記載され
ている。動物における相同組換えは、Moynahan (1996)
Hum. Mol. Genet. 5:875によって、植物における相同組
換えはOffinga (1990) EMBO J. 9:3077によって記載さ
れている。
【０５６７】XII．用語解説 以下の用語を以下に定義し、本発明の実施において当業
者にさらなるガイダンスを提供する：アジュバント、対
立遺伝子（および対立遺伝子配列）、アミノ酸（疎水
性、極性、荷電を含む）、保存的置換、制御エレメント
（および調節配列）、誘導体化、検出可能な標識、上昇
したレベル、エピトープ、好ましい予後または好ましく
ない予後、融合タンパク質、遺伝子産物、hTR、不死
の、免疫原および免疫原性、単離された、モジュレータ
ー、モチーフ、核酸（およびポリヌクレオチド）、オリ
ゴヌクレオチド（およびオリゴマー）、作動可能に連結
された、ポリペプチド、プローブ（核酸プローブおよび
抗体プローブ含む）、組換え体、選択系、配列、特異的
結合、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件
（およびストリンジェンシィー）、実質的な同一性（お
よび実質的な類似性）、実質的に純粋な（および実質的
に精製された）、テロメラーゼ陰性およびテロメラーゼ
陽性細胞、テロメラーゼ触媒活性、テロメラーゼに関連
した、および試験化合物。
【０５６８】本明細書中で使用する用語「アジュバン
ト」は、それが混合される抗原に対する免疫応答を増強
する任意の物質のその通常の意味をいう。本発明におい
て有用なアジュバントは、フロイントのアジュバント、
水酸化アルミニウムのような無機物ゲル、ならびにリゾ
レシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペ
プチド、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシ
アニン、およびジニトロフェノールのような表面活性物
質を含むが、これらに限定されない。BCG（Bacillus Ca
lmette-Guerin)およびCorynebacterium parvumは、潜在
的に有用なアジュバントである。
【０５６９】本明細書中で使用する用語「対立遺伝子」
または「対立遺伝子配列」は、核酸配列（すなわち、hT
RTタンパク質をコードする核酸）の別の形態をいう。対
立遺伝子は変異（すなわち、核酸配列における変化）か
ら生じ、一般に、改変されたおよび／または異なって調
節されるmRNAまたはポリペプチドを生成し、その構造お
よび／または機能は改変されてもよく、または改変され
ていなくてもよい。対立遺伝子を生じさせる通常の変異
変化は、一般に、コードされるアミノ酸に影響し得る
か、または影響し得ないヌクレオチドの天然の欠失、付
加、または置換に帰せられる。これらの型の変化のそれ
ぞれは、単独で、他と組み合わせて、または所定の遺伝
子、染色体もしくは他の細胞核酸内で１回以上起こり得
る。いずれの所定の遺伝子も対立遺伝子形態を全く有さ
ないか、１つまたは多くの対立遺伝子形態を有し得る。
本明細書中で使用する用語「対立遺伝子」は、遺伝子ま
たはこの遺伝子から転写されたmRNAのいずれか、または
両方をいう。
【０５７０】本明細書中で使用する「アミノ酸」は、時
々標準的な以下の一文字コードを用いて明記される：ア
ラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、アス
パラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン
（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、リジン
（Ｋ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオ
ニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）、
チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、プロリン
（Ｐ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、システイ
ン（Ｃ）。合成および非天然アミノ酸アナログ（および
／またはペプチド結合）が含まれる。
【０５７１】本明細書中で使用する「疎水性アミノ酸」
とは、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｐ、Ｆ、ＷおよびＭをいう。本
明細書中で使用する「極性アミノ酸」とは、Ｇ、Ｓ、
Ｔ、Ｙ、Ｃ、ＮおよびＱをいう。本明細書中で使用する
「荷電アミノ酸」とは、Ｄ、Ｅ、Ｈ、ＫおよびＲをい
う。
【０５７２】タンパク質を記載する場合、本明細書中で
使用する「保存的置換」は、実質的にタンパク質の活性
を改変しないタンパク質のアミノ酸組成の変化をいう。
従って、特定のアミノ酸配列の「保存的に修飾された変
形」とは、タンパク質活性に重要でないアミノ酸のアミ
ノ酸置換、または重要なアミノ酸の置換でも実質的に活
性を改変しないような、類似の特性（例えば、酸性、塩
基性、正にまたは負に荷電した、極性または非極性等）
を有する他のアミノ酸でのアミノ酸の置換をいう。機能
的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換の表は、当該
分野で周知である。以下の６つの群はそれぞれ、互いに
ついて保存的置換であるアミノ酸を含む：１）アラニン
（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；２）アスパ
ラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギ
ン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、
リシン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン
（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および６）
フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトフ
ァン（Ｗ）（Creighton (1984) Proteins, W. H. Freem
an and Companyも参照のこと)。当業者は、前記の置換
が唯一可能な保存的置換ではないことを認識する。例え
ば、全ての荷電アミノ酸は、それらが正または負である
かにかかわらず、互いについて保存的置換であると考え
られ得る。さらに、コードされた配列において単一のア
ミノ酸または低い割合のアミノ酸を変化させ、付加しま
たは欠失させる個々の置換、欠失または付加もまた、
「保存的に修飾された変形」であり得る。天然または野
生型遺伝子によって使用されるコドンとは異なる１つ以
上のコドンを利用することによって、組換えタンパク質
中に「保存的置換」がなされ得る。この場合、保存的置
換はまた、アミノ酸のコドンを同一のアミノ酸の異なる
コドンで置き換えることを含む。
【０５７３】本明細書中で使用する「制御エレメント」
または「調節配列」は、エンハンサー、プロモーター、
転写ターミネーター、複製起点、染色体組込み配列、5'
および3'非翻訳領域を含み、これらとタンパク質または
他の生物分子が相互作用して転写および翻訳を行う。真
核生物細胞について、制御配列は、プロモーターおよび
好ましくはエンハンサー（例えば、免疫グロブリン遺伝
子、SV40、サイトメガロウイルス、およびポリアデニル
化配列由来する）を含み、そしてスプライスドナーおよ
びアクセプター配列を含み得る。利用されるベクター系
および宿主に依存して任意の数の適切な転写および翻訳
エレメント（構成的および誘導性プロモーターを含む）
が使用され得る。
【０５７４】本明細書中で使用する「誘導体化」ポリヌ
クレオチド、オリゴヌクレオチドまたは核酸は、誘導体
化置換基を含むオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオ
チドをいう。いくつかの実施態様において、置換基は、
相補的なポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーション
に関して実質的に干渉しない。（例えば、既に合成され
たオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの修飾に
よるか、または合成の間に修飾塩基または骨格アナログ
を取り込むことによって）付加された化学置換基で修飾
された誘導体化オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオ
チドを、代謝的に活性な真核生物細胞に導入して、hTRT
DNA、RNAまたはタンパク質にハイブリダイズさせ得
る。ここで、それらは局所的なDNA、RNA、またはタンパ
ク質に対する改変または化学的修飾を生じる。あるい
は、誘導体化オリゴヌクレオチドまたは、ポリヌクレオ
チドは、hTRTポリペプチド、テロメラーゼ−関連タンパ
ク質、あるいはhTRT DNAもしくはhTRT遺伝子産物と相互
作用するか、またはhTRT DNA、RNAもしくはタンパク質
の発現もしくは機能を改変するか、もしくは調節する他
の因子と相互作用させ、そしてそれを改変し得る。例示
的な付着化学置換基は：ユーロピウム（III）テキサフ
ィリン（texaphyrin）、架橋剤、プソラレン、金属キレ
ート（例えば、鉄により触媒される切断についての鉄／
EDTAキレート）、トポイソメラーゼ、エンドヌクレアー
ゼ、エキソヌクレアーゼ、リガーゼ、ホスホジエステラ
ーゼ、光力学ポリフィリン、化学療法剤（例えば、アド
リアマイシン、ドキシルビシン（doxirubicin）、イン
ターカレート剤、塩基修飾剤、免疫グロブリン鎖、およ
びオリゴヌクレオチドを含む。鉄／EDTAキレートは、ポ
リヌクレオチド配列の局所的切断が所望される場合にし
ばしば使用される化学置換基である（Hertzbergら, 198
2, J. Am. Chem. Soc. 104:313；HertzbergおよびDerva
n, 1984, Biochemistry 23:3934；Taylorら, 1984, Tet
rahedron 40:457；Dervan, 1986, Science 232: 46
4）。例示的な付着化学は、例えば、付加された反応性
アミノ基を介する直接的結合（CoreyおよびSchultz (19
88) Science 238:1401, これは本明細書中で参考として
援用される）および他の直接的結合化学を含むがストレ
プトアビジン/ビオチンおよびジゴキシゲニン／抗ジゴ
キシゲニン抗体結合法もまた使用され得る。化学置換基
を結合する方法は、本明細書中で参考として援用される
米国特許第5,135,720号、同第5,093,245号および同第5,
055,556号に提供されている。他の結合化学は、従業者
の裁量にて使用され得る。
【０５７５】本明細書で使用する「検出可能な標識」
は、当該分野における通常の意味を有し、そして分子の
存在を（例えば、物理的または化学的特性により）検出
するか、分子の存在を示すか、または共有結合もしくは
別の方法で会合する別の分子の結合を可能するために使
用されるか、または使用され得る原子（例えば、放射性
核種）、分子（例えば、フルオレセイン）、または複合
体をいう。用語「標識」はまた、基質に作用して検出可
能な原子、分子または複合体を生じる共有結合した分
子、または別の方法で会合した分子（例えば、酵素のよ
うな生物分子）をいう。本発明で使用するのに適した検
出可能な標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫
化学的、電子的、光学的または化学的手段によって検出
可能な任意の組成を含む。本発明において有用な標識
は、標識したストレプトアビジン結合体で染色するため
のビオチン、磁性ビーズ（例えば、DynabeadsTM）、蛍
光色素（例えば、フルオレセイン、テキサスレッド、ロ
ーダミン、緑色蛍光タンパク質、増強された緑色蛍光タ
ンパク質、リサミン、フィコエリトリン、Cy2、Cy3、Cy
3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、FluorＸ［Amersham］、SyBRグ
リーンI＆II［Molecular Probes］等）、放射性標識
（例えば、3Ｈ、125I、35S、14Cまたは32Ｐ）、酵素
（例えば、ヒドロラーゼ、特にアルカリ性ホスファター
ゼのようなホスファターゼ、エステラーゼおよびグリコ
シダーゼ、またはオキシドレダクターゼ、特に西洋ワサ
ビペルオキシダーゼのようなペルオキシダーゼ、および
ELISAにおいて常用される他のもの）、基質、補因子、
インヒビター、化学ルミネセンス基、発色剤、およびコ
ロイド金またはまたは有色ガラスもしくはプラスチック
（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス
等）ビーズのような比色標識を含む。このような標識の
使用を教示する特許は、米国特許第3,817,837号；同第
3,850,752号；同第3,939,350号；同第3,996,345号；同
第4,277,437号；同第4,275,149号；および同第4,366,24
1号を含む。このような標識を検出する手段は、当業者
に周知である。従って、例えば、放射性標識および化学
ルミネセンス標識は、写真フィルムまたはシンチレーシ
ョンカウンターを用いて検出され得、蛍光マーカーは、
（例えば、蛍光活性化セルソーティングにおけるよう
な）放射された光を検出するための光検出器を用いて検
出され得る。酵素標識は、典型的には、基質と共に酵素
を提供し、基質に対する酵素の作用によって生じた反応
産物を検出することによって検出され、比色標識は、有
色標識を単に可視化することにより検出される。従っ
て、標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学
的、電子的、光学的または化学的手段によって検出可能
な任意の組成物である。標識は、当該分野で周知の方法
に従って、アッセイの所望の成分に直接的または間接的
にカップリングされ得る。非放射性標識は、しばしば間
接的手段によって付着される。一般に、リガンド分子
（例えば、ビオチン）は、分子に共有結合している。次
いで、このリガンドは、本質的に検出可能であるか、ま
たはシグナル発生系（例えば、検出可能な酵素、蛍光化
合物、もしくは化学ルミネセンス化合物）に共有結合し
た抗リガンド（例えば、ストレプトアビジン）分子に結
合させる。多数のリガンドおよび抗リガンドが使用され
得る。リガンドが天然の抗リガンド（例えば、ビオチ
ン、チロキシンおよびコルチゾル）を有する場合、それ
を標識された天然の抗リガンドと共に使用することがで
きる。あるいは、いずれのハプテン化合物または抗原化
合物も抗体と組み合わせて用いることができる。また、
この分子は、例えば、酵素または発蛍光団と抱合するこ
とによってシグナル発生化合物に直接結合させることも
できる。標識を検出する手段は、当業者に周知である。
従って、例えば、標識が放射性標識である場合、検出の
ための手段は、シンチレーションカウンター、オートラ
ジオグラフィーにおけるような写真フィルム、または貯
蔵（storage）蛍光体画像化を含む。標識が蛍光標識で
ある場合、それは蛍光色素を適切な波長の光で励起し、
そして得られた蛍光を検出することによって検出するこ
とができる。蛍光は目で、写真フィルムによって、電荷
結合デバイス（charge coupled device）(CCD)または光
電子増倍管等のような電子検出器の使用によって検出す
ることができる。同様に、酵素標識は、酵素に対する適
切な基質を提供し、得られた反応産物を検出することに
よって検出できる。また、単純な比色標識は、標識に結
合する色を観察することによって検出できる。発蛍光団
の対をアッセイで使用する場合、それらは容易に識別さ
れ得るように異なる放射パターン（波長）を有すること
がしばしば好ましいことが認識される。
【０５７６】用語「上昇したレベル」は、コントロール
標準におけるレベル（例えば、診断については、個体ま
たは疾患に罹っていない個体における正常なテロメラー
ゼ陰性細胞におけるレベル、および予後については、例
えば、種々のグレードまたはクラスの腫瘍由来の腫瘍細
胞におけるレベル）よりも上昇したか、またはそれより
も高い細胞におけるhTRT遺伝子産物（または他の特定の
物質または活性）の量をいう。
【０５７７】本明細書中で使用する用語「エピトープ」
は、抗体によって認識される抗原上の部位の通常の意味
を有する。エピトープは、典型的には、全タンパク質の
小さな部分であるアミノ酸のセグメントである。エピト
ープは、立体配座的（すなわち、不連続的）であり得
る。すなわち、それらは、タンパク質のフォールディン
グによって並べられた一次配列の非隣接部分によってコ
ードされるアミノ酸から形成されるものであり得る。
【０５７８】用語「好ましい予後」および「好ましくな
い予後」は、当該分野で公知である。ガンに関して、
「好ましい予後」は、好ましくない予後を有するものと
比較して好ましい予後を有する患者について、腫瘍の後
退またはより長い生存期間の見込みがあることを意味
し、他方、「好ましくない予後」は、腫瘍がより攻撃的
となるらしいことを、すなわち、より速く増殖しおよび
／または転移し、その結果、患者について貧弱な成果ま
たは疾患進行のより迅速な経過をもたらすらしいことを
意味する。
【０５７９】本明細書中で使用する用語「融合タンパク
質」は、複合タンパク質、すなわち、単一のアミノ酸配
列においては通常、共に融合されない２つの（またはそ
れより多くの）異なる異種ポリペプチドよりなる、単一
の隣接するアミノ酸配列をいう。従って、融合タンパク
質は、２つの全く異なるアミノ酸配列または２つの類似
したもしくは同一のポリペプチド配列を含有する単一の
アミノ酸配列を含み得る。但し、これらの配列は、天然
で見い出される単一のアミノ酸配列における同一の立体
配座では通常、共に見い出されない。融合タンパク質
は、一般に、組換え核酸法（すなわち、その融合が本発
明のポリペプチドをコードするセグメントおよび異種タ
ンパク質をコードするセグメントを含む、組換え遺伝子
融合産物の転写および翻訳の結果として）、または当該
分野で周知の化学合成法のいずれかを用いることによっ
て調製することができる。融合タンパク質の非hTRT領域
（単数または複数）は、hTRTポリペプチドのアミノ末端
もしくはカルボキシル末端、または両方に融合されるこ
とができ、あるいは（部位挿入によって、またはアミノ
酸を置き換えることによって）非hTRT領域は、タンパク
質配列の内部に挿入されることができ、あるいは前記の
ものを組合せて行うことができる。
【０５８０】本明細書中で使用する用語「遺伝子産物」
は、遺伝子から転写されたRNA分子、または遺伝子によ
ってコードされるか、もしくはRNAから翻訳されたタン
パク質をいう。
【０５８１】本明細書中で使用する「hTR」（ヒトテロ
メラーゼRNA(human telomerase RNA)）とは、ヒトテロ
メラーゼおよび任意の天然に存在する対立遺伝子および
変異体または組換え変異体のRNA成分をいう。hTRは、そ
の全体が全目的のために、本明細書において参考として
援用される米国特許第5,583,016号に詳細に記載されて
いる。
【０５８２】本明細書中で使用する用語「不死」は、細
胞について言及している場合、テロメラーゼ技術におい
てはその通常の意味を有し、明らかに制限されない複製
能力を有する細胞をいう。不死はまたそれらの非修飾対
照物に対して増大した増殖能を有する細胞を得る。不死
化ヒト細胞の例は、悪性腫瘍細胞、生殖系列細胞、およ
びインビトロで培養された特定の形質転換ヒト細胞株
（例えば、ウイルス性オンコジーンまたはその他による
形質転換により不死化した細胞）である。対照的に、最
も正常なヒト体細胞は有寿命性ものであり、すなわち、
制限された複製能を有し、有限数の細胞分裂の後に老化
する。
【０５８３】本明細書中で使用する用語「免疫原」およ
び「免疫原性」は、当該分野におけるそれらの通常の意
味を有する。すなわち、免疫原は、ヒトまたは動物への
注入に際して適応した免疫応答を誘導できる分子（例え
ば、タンパク質または他の抗原）である。
【０５８４】本明細書中で使用する「単離された」は、
例えば、RNP（例えば、少なくとも１つのタンパク質お
よび少なくとも１つのRNA）のような分子または組成物
を言及する場合、分子または組成物が、それがインビボ
または天然で生じる状態において会合する少なくとも１
つの他の化合物（例えば、タンパク質、他のRNAまたは
他の汚染物）から分離されていることを意味する。従っ
て、RNPが天然で会合する任意の他の成分（例えば、細
胞抽出物における細胞膜）から単離された場合、このRN
Pは単離されたと考えられる。しかしながら、単離され
た組成物はまた実質的に純粋であり得る。
【０５８５】本明細書で使用する「モジュレーター」と
は、テロメラーゼ逆転写酵素（TRT）の「完全な」また
はいずれかの「部分的活性」のいずれかまたは両方を、
何らかの方法で変化させ得る任意の合成または天然の化
合物または組成物をいう。モジュレーターは、アゴニス
トまたはアンタゴニストであり得る。モジュレーター
は、任意の有機および無機化合物であり得る（例えば、
小分子、ペプチド、タンパク質、糖、核酸、脂肪酸等を
含むが、これらに限定されない）。
【０５８６】本明細書中で使用する「モチーフ」とは、
規定されるクラスまたは型の全てのタンパク質に共通
の、または保存されるタンパク質における特徴または構
造を規定する隣接アミノ酸の配列（または隣接アミノ酸
の配列をコードする核酸配列）をいう。モチーフまたは
コンセンサス配列は、保存された残基および保存されて
いない残基の両方を含み得る。モチーフ配列における保
存された残基は、保存された残基または残基のクラス
（すなわち、疎水性、極性、非極性、または他のクラ
ス）が、典型的には、モチーフによって規定されるタン
パク質のクラスの各タンパク質（または遺伝子またはmR
NA）において示された位置に存在することを示す。モチ
ーフはタンパク質のクラスに従って異なり得る。従っ
て、例えば、逆転写酵素は、１つ以上のモチーフによっ
て規定され得るタンパク質のクラスを形成し、そしてこ
のクラスはテロメラーゼ酵素を含む。しかしながら、テ
ロメラーゼ酵素はまた、そのクラスに特徴的なモチーフ
を有する酵素のクラスとしても規定できる。当業者は、
モチーフにおける保存された残基としての残基の同定
は、モチーフによって規定されるクラスの各メンバーが
示された位置において示された残基（または残基のクラ
ス）を有し、そしてクラスの１以上のメンバーが保存さ
れた位置において異なる残基を有し得ることを認識す
る。
【０５８７】本明細書中で使用する用語「核酸」および
「ポリヌクレオチド」は、相互変換的に使用される。用
語「ポリヌクレオチド」の使用は、オリゴヌクレオチド
（すなわち、短いポリヌクレオチド）を排除することを
意図せず、そして合成および／または非天然核酸（すな
わち、核酸アナログまたは修飾された骨格残基または結
合を含む）をいう。
【０５８８】本明細書中で使用する「オリゴヌクレオチ
ド」または「オリゴマー」とは、約７ヌクレオチドまた
はそれ以上の核酸配列、および約100程度のヌクレオチ
ドをいい、これは、プライマー、プローブまたはアンプ
リマー(amplimer)として使用できる。オリゴヌクレオチ
ドは、しばしば、約10と約50ヌクレオチドとの間の長
さ、よりしばしば約14と約35ヌクレオチドとの間、非常
にしばしば約15と約25ヌクレオチドとの間であり、そし
てオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーはまた、合成お
よび／または非天然核酸（すなわち、核酸アナログまた
は修飾された骨格残基または結合を含む）もいう。
【０５８９】本明細書中で使用する用語「作動可能に連
結した」は、２つ以上の核酸（例えば、DNA）セグメン
トの間の機能的関係をいい；例えば、プロモーターまた
はエンハンサーは、それが適切な宿主細胞または他の発
現系においてコード配列の転写を刺激する場合、コード
配列に作動可能に連結している。一般に、作動可能に連
結している配列は隣接しており、シグナル配列の場合に
は、隣接相およびリーディング相の両方である。しかし
ながら、エンハンサーは、その転写をエンハンサーが増
強するコード配列に密接して配置される必要はない。
【０５９０】本明細書中で使用する用語「ポリペプチ
ド」は、用語「タンパク質」と本明細書中で相互変換可
能に使用され、アミド結合によって結合されたアミノ酸
残基からなるポリマー（アミノ酸および結合）をいい、
合成の、天然に存在するおよび天然に存在しないそのア
ナログを含む。ペプチドはポリペプチドの例である。
【０５９１】本明細書中で使用する「プローブ」は、特
異的に別の分子に結合する分子をいう。プローブの１つ
の例は、実質的に相補的な核酸に特異的に結合する（す
なわち、アニールまたはハイブリダイズする）「核酸プ
ローブ」である。プローブの別の例は、対応する抗原ま
たはエピトープに特異的に結合する「抗体プローブ」で
ある。
【０５９２】本明細書中で使用する「組換え」とは、合
成されたかまたはそうでなければインビトロで操作され
たポリヌクレオチド（例えば、「組換えポリヌクレオチ
ド」）、細胞もしくは他の生物学的系において遺伝子産
物を産生するための組換えポリヌクレオチドを用いる方
法、または組換えポリヌクレオチドによってコードされ
るポリペプチド（「組換えタンパク質」）をいう。
【０５９３】本明細書中で使用する「選択系」とは、安
定に形質転換された細胞株の情況において、目的の組換
え核酸を含有する細胞を同定しおよび／または選択する
方法をいう。非常に多様な選択系が形質転換細胞の同定
のために知られており、そして本発明での使用に適切で
ある。例えば、プラスミドまたは他のベクターにより形
質転換された細胞は、周知のamp、gpt、neoおよびhyg遺
伝子、またはそれぞれtk-細胞またはaprt-細胞において
使用できる単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wi
glerら, Cell 11:223-32 [1977])遺伝子およびアデニン
ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowyら, Cell 22:
817 [1980])遺伝子のような他の遺伝子のような、プラ
スミド上に含まれる遺伝子によって付与される抗生物質
に対する耐性によって選択できる。また、抗代謝産物耐
性、抗生物質耐性または除草剤耐性を選択のための基準
として使用することもできる；例えば、耐性をメトトレ
キセートに付与し、遺伝子増幅にも有用であるdhfr（Wi
glerら, Proc. Natl. Acad. Sci., 77:3567 [1980])；
アミノグリコシドネオマイシンおよびG418に対して耐性
を付与するnpt（Colbere-Garapinら, J. Mol. Biol. 15
0:1 [1981])および、それぞれ、クロロスルフロン(chlo
rsulfuron)およびホスフィノトリシン(phosphinotrici
n)アセチルトランスフェラーゼに対する耐性を付与する
alsまたはpat（Murry, McGraw Hill Yearbook of Scien
ce and Technology, McGraw Hill, New York NY, 191-1
96頁 [1992])。さらなる選択可能な遺伝子が記載されて
いる。例えば、トリプトファンの代わりにインドールを
細胞が利用すること可能にするハイグロマイシン耐性付
与遺伝子trpB、ヒスチジンの代わりにヒスチノールを細
胞が利用することを可能にするhisD（HartmanおよびMul
ligan, Proc, Natl. Acad. Sci, 85:8047 [1988])。最
近、可視化マーカーが好まれ、アントシアニン、β-グ
ルクロニダーゼおよびその基質のGUS、ならびにルシフ
ェラーゼおよびその基質のルシフェリンのようなマーカ
ーが、形質転換体を同定するためだけでなく、特異的ベ
クター系に帰せられる一過性または安定なタンパク質発
現の量を定量するために広く利用されている。（Rhodes
ら, Meth, Mol. Biol., 55:121 [1995])。
【０５９４】本明細書中で使用する（他で特に言及しな
い限り）遺伝子、核酸、タンパク質、またはペプチドの
「配列」は、二本鎖DNA分子の片鎖または両鎖における
ヌクレオチドの順序、例えば、コード鎖およびその相補
体の両方の配列、または一本鎖核酸分子の配列をいい、
また、ペプチドまたはタンパク質におけるアミノ酸の順
序をいう。
【０５９５】本明細書中で使用する「特異的結合」は、
多くの他の多様な分子の存在においてでさえ他方の特異
的分子と接触および会合する一方の分子、典型的には抗
体またはポリヌクレオチドの能力をいう。例えば、一本
鎖ポリヌクレオチドは配列が相補的である一本鎖ポリヌ
クレオチドに特異的に結合でき、そして抗体はその対応
する抗原に特異的に結合できる（または「それと特異的
に免疫反応する」）。
【０５９６】本明細書中で使用する「ストリンジェント
なハイブリダイゼーション条件」または「ストリンジェ
ンシー」は、標的に対する正確なほとんど正確な相補性
を有する標的配列およびプローブの融解温度（Ｔm）未
満の約５℃〜約20℃または25℃の範囲の条件をいう。本
明細書中で使用するように融解温度は、二本鎖核酸分子
の集団が半解離して一本鎖になる温度である。核酸のＴ
mを計算する方法は当該分野において周知である（例え
ば、BergerおよびKimmel (1987) METHODS IN ENZYMOLOG
Y, VOL. 152:GUIDE TO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES,
San Diego：Academic Press，Inc．およびSambrooks
ら、(1989) MOLECULAR CLONING : A LABORATORY MANUA
L, 第２版, 第1-3巻 Cold Spring Harbor Laboratory、
以後「Sambrook」) (共に本明細書中で参考として援用
される)。標準的な文献によって示されるように、Ｔm値
の簡単な見積もりは、核酸が1M NaClの水溶液中に存在
する場合等式：Ｔm＝81.5＋0.41（%G+C）によって計算
することができる。（例えば、AndersonおよびYoung, Q
uantitative Filter Hybridization in NUCLEIC ACID H
YBRIDIZATION (1985) を参照のこと)。他の文献は、Ｔm
の計算に構造ならびに配列特徴を考慮するより精巧な計
算を含む。ハイブリッドの融解温度（従ってストリンジ
ェントなハイブリダイゼーションについての条件）は、
プローブの長さおよび性質（DNA、RNA、塩基組成物）お
よび標的の性質（溶液中に存在するまたは固定化される
DNA、RNA、塩基組成物）、ならびに塩および他の成分の
濃度（例えば、ホルムアミド、デキストラン硫酸、ポリ
エチレングリコールの存在および非存在）のような種々
の因子によって影響される。これらの因子の影響は周知
であり、当該分野における標準的な文献で考察されてい
る。例えば、Sambrook（前掲）およびAusubelら（前
掲）を参照のこと。典型的には、ストリンジェントなハ
イブリダイゼーション条件は、pH7.0〜8.3の約1.0M未満
のナトリウムイオン塩濃度、典型的には、約0.01〜1.0M
のナトリウムイオンの塩濃度、ならびに短いプローブ
（例えば、10〜50ヌクレオチド）については少なくとも
約30℃の温度、長いプローブ（例えば、50を超えるヌク
レオチド）については少なくとも約60℃の温度である。
前記したように、ストリンジェントな条件は、ホルムア
ミドのような不安定化剤の添加で達成することもでき、
この場合、より低い温度が使用され得る。
【０５９７】本明細書中で使用する用語「実質的な同一
性」、「実質的な配列同一性」または「実質的な類似
性」は、核酸の情況においては、２つのポリヌクレオチ
ドの間の配列類似性の尺度をいう。実質的な配列同一性
はストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーショ
ン、直接的比較、または他の手段によって決定される。
例えば、２つのポリヌクレオチドは、それらがストリン
ジェントなハイブリダイゼーション条件下で相互に特異
的にハイブリダイズし得る場合、実質的配列同一性を有
するとして同定される。配列同一性の他の程度（例え
ば、「実質的」未満）は、異なるストリンジェンシーの
条件下でのハイブリダイゼーションによって特徴付ける
ことができる。あるいは、実質的な配列同一性は、２つ
のヌクレオチド（またはポリペプチド）配列の間のパー
セント同一性として記載できる。２つの配列は、それら
が少なくとも約60％同一である場合、好ましくは少なく
とも約70％同一である場合、または少なくとも約80％同
一である場合、または少なくとも約90％同一である場
合、または少なくとも約95％もしくは98％〜100％同一
である場合、実質的に同一であると考えられる。配列
（ヌクレオチドまたはアミノ酸）のパーセント同一性
は、典型的には、２つの配列の間の最適アライメントを
決定し、そして２つの配列を比較することによって算定
される。例えば、タンパク質発現で用いる外因性転写物
は、参照配列（例えば、対応する内因性配列）と比較し
た同一性または類似性の特定のパーセントを有するとし
て記載され得る。配列の最適アライメントがNeedleman
およびWunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443の相同性ア
ライメントアルゴリズムによって、PearsonおよびLipma
n (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444の類似
性方法のためのサーチによって、これらのアルゴリズム
のコンピューター実行によって（Wisconsin Genetics S
oftware Package, Genetics Computer Group, 575 Scie
nce Dr.、Madison、WIにおけるGAP、BESTFIT、FASTA、
およびTFASTA)、または検分によって、SmithおよびWate
rman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482の局所相同性アル
ゴリズムを用いて行われ得る。種々の方法によって得ら
れた最良のアライメント（すなわち、最高パーセントの
同一が得られること)を選択する。典型的には、これら
のアルゴリズムは「比較ウィンドウ」(通常は少なくとも1
8ヌクレオチドの長さ)にわたって2つの配列を比較し
て、配列類似性の局所的領域を同定および比較し、従っ
て、小さい付加または欠失(すなわち、ギャップ)を可能
にする。付加および欠失は、典型的には、付加または欠
失を含まない参照配列に対して配列の20パーセント以下
の長さである。特定の長さまたは領域を参照して、２つ
の配列の間の配列同一性を記載することが時々望ましい
(例えば、２つの配列は、少なくとも500塩基対の長さに
わたって少なくとも95％の同一性を有するとして記載さ
れ得る)。通常、長さは少なくとも約50、100、200、30
0、400、または500塩基対、アミノ酸、または他の残基
である。配列同一性のパーセントは、比較の領域にわた
って最適にアライメントされた２つの配列を比較する工
程、同一の核酸塩基(例えば、A、T、C、GまたはU)が両
配列に生じる位置の数を決定して適合された位置の数が
得られ、そして参照配列または比較領域における塩基の
総数と比較して適合した位置の数(またはパーセント)を
決定する工程によって計算される。配列類似性を測定す
るのに適したさらなるアルゴリズムはBLASTアルゴリズ
ムであり、これはAltschul (1990) J. Mol. Biol. 215:
403-410；およびShpaer (1996) Genomics 38:179-191に
記載されている。BLAST解析を実行するためのソフトウ
ェアは、National Center for Biotechnology Informat
ion (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)で公的に入手可能
である。このアルゴリズムは、データベース配列におけ
る同一長さのワードとアラインされる場合に、いくつか
の陽性評価された閾値スコアＴに適合するかまたはそれ
を満足するかのいずれかである問題の配列中に長さＷの
短いワードを同定することによって、最初に高スコアの
配列対（HSP）を同定することを含む。Ｔは隣接するワ
ードスコア閾値といわれる（Altschulら、前掲)。これ
らの最初の隣接ワードのヒットは、それらを含むより長
いHSPを見い出すためのサーチを開始するための核とし
て作用する。ワードのヒットは、累積アライメントスコ
アが増加し得る限り、各配列に沿って両方向に拡張され
る。各方向におけるワードヒットの拡張は：累積アライ
メントスコアがその最大達成値から未知数Ｘだけ遠ざか
る場合；累積スコアが、１以上の負のスコアリング残基
アライメントの累積のために０以下になる場合；または
いずれかの配列の端に到達する場合に停止される。BLAS
TアルゴリズムのパラメーターであるＷ、Ｔ、およびＸ
はアライメントの感度およびスピードを決定する。BLAS
Tプログラムは、デフォールトとして、11のワード長
（Ｗ）、BLOSUM62スコアリングマトリックス（Henikoff
(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919
を参照のこと)の50のアライメント（Ｂ）、10の予測
（Ｅ）、M=5、N=4、および両鎖の比較を使用する。用語
BLASTは、２つの配列の間の類似性の統計的解析を行うB
LASTアルゴリズムをいう。Karlin (1993) Proc. Natl.
Acd. Sci. USA 90:5873-5787を参照のこと。BLASTアル
ゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最
小合計確率（P(N)）であり、これは２つの核酸配列また
はアミノ酸配列の間の適合性が偶然に起こる確率の指標
を提供する。例えば、TRT核酸に対する試験核酸の比較
において最小合計確率が約0.5、0.2、0.1、0.01、また
は0.001未満である場合、核酸はTRT核酸に類似すると考
えられ得る。あるいは、２つの核酸配列が類似するとい
う別の指標は、第１の核酸がコードするポリペプチド
が、第２の核酸によってコードされるポリペプチドと免
疫学的に交差反応性であるということである。
【０５９８】本明細書中で使用する用語「実質的な同一
性」、「実質的な配列同一性」または「実質的な類似
性」は、ポリペプチドの情況においては、２つのポリペ
プチドの間の類似性の程度をいい、ここで、ポリペプチ
ドは、参照配列に対して少なくとも70％の配列同一性、
または参照配列に対して80％、または85％、または100
％の配列同一性、または最も好ましくは10〜20アミノ酸
残基の比較ウィンドウにわたって、90％の同一性を有す
る配列を含む。アミノ酸配列類似性または配列同一性
は、必要であれば、必要とされるギャップを導入するこ
とによって、残基の適合を最適化することによって決定
される。Needlehamら, (1970) J. Mol. Biol. 48:443-4
53; およびSankoffら, 1983, Time Warps, String Edit
s, およびMacromolecules, The Theory and Practice o
f Sequence Comparison, 第１章，Addison-Wesley, Rea
ding, MA; ならびにIntelliGenetics, Mountain View,
CA、およびthe University of Wisconsin Genetics Com
puter Group, Madison, WIからのソフトウェアパッケー
ジを参照のこと。当業者に明らかなように、用語「実質
的な同一性」、「実質的な類似性」および「実質的な配
列同一性」は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに
関して相互変換的に使用できる。
【０５９９】本明細書中で使用する用語「実質的に純粋
な」または「実質的に精製された」は、抗体（例えば、
抗hTRT抗体）のような特定の試薬を含む組成物をいう場
合、この特定の試薬がこの組成物（例えば、溶媒または
緩衝液は含まない）の少なくとも約75％、または少なく
とも約90％、または少なくとも約95％、または少なくと
も約99％以上であることを意味する。従って、例えば、
hTRTポリペプチドに特異的に結合する本発明の好ましい
免疫グロブリン調製物が実質的に精製されている。
【０６００】本明細書中で使用する「テロメラーゼ陰
性」細胞は、テロメラーゼが発現されない、すなわちテ
ロメラーゼ触媒活性のための通常のアッセイまたはTRAP
アッセイを用いてテロメラーゼ触媒活性が検出できない
細胞である。本明細書中で使用する「テロメラーゼ陽
性」細胞は、テロメラーゼが発現される（すなわち、テ
ロメラーゼ活性が検出できる）細胞である。
【０６０１】本明細書中で使用する「テロメラーゼ関連
性」疾患または症状とは、個人の細胞におけるテロメラ
ーゼ活性の異常に高いレベルと相関するか、ほとんどの
正常体細胞についてのいずれのテロメラーゼ活性をも含
み得るか、または正常細胞機能の減損を生じる低レベル
のテロメラーゼ活性と相関する、被験体における疾患ま
たは症状である。テロメラーゼ関連性疾患の例として
は、例えば、ガン（悪性細胞における高いテロメラーゼ
活性）および不妊症（生殖系細胞における低いテロメラ
ーゼ活性）が挙げられる。
【０６０２】本明細書中で使用する「試験化合物」また
は「薬剤」は、任意の合成または天然の化合物または組
成物をいう。この用語は、全ての有機化合物および無機
化合物を含み；例えば、小分子、ペプチド、タンパク
質、糖、核酸、脂肪酸などが挙げられる。
【０６０３】XIII．実施例 以下の実施例は本発明を説明するために提供され、本発
明を限定するものではない。
【０６０４】以下の節において、以下の略語が適用され
る；eq(当量）；Ｍ（モル濃度）；μM（マイクロモル濃
度）；N（規定）；mol（モル）；mmol（ミリモル）；μ
mol（マイクロモル）；nmol（ナノモル）；ｇ（グラ
ム）；mg（ミリグラム）；μg（マイクログラム）；ng
（ナノグラム）；ｌまたはＬ（リットル）；ml（ミリリ
ットル）；μl（マイクロリットル）；cm（センチメー
トル）；mm（ミリメートル）；μm（マイクロメート
ル）；nm（ナノメートル）；℃（度摂氏）；RPN（リボ
核タンパク質）；mreN（2'-O-メチルリボヌクレオチ
ド）；dNTP（デオキシリボヌクレオチド）；dH2O（蒸留
水）；DDT（ジチオスレイトール）；PMSF（フッ化フェ
ニルメチルスルホニル）；TE（10mM Tris HCl、1mM EDT
A、約pH7.2）；KGlu（グルタミン酸カリウム）；SSC
（塩およびクエン酸ナトリウム緩衝液）；SDS（ドデシ
ル硫酸ナトリウム）；PAGE（ポリアクリルアミドゲル電
気泳動）；Novex（Novex, San Diego, CA); BioRad（Bi
o-Rad Laboratories, Hercules, CA）；Pharmacia (Pha
rmacia Biotech, Piscataway, NJ)；Boehringer-Mannhe
im (Boehringer-Mannheim Corp., Concord, CA)；Amers
ham (Amersham, Inc.,Chicago, IL)；Strategene (Stra
tegene Cloning System, La Jolla, CA)；NEB(New Engl
and Biolabs, Beverly, MA); Pierce (Pierce Chemical
Co., Rockford, IL)；Beckman (Beckman Instruments,
Fullerton, CA)；Lab Industries (Lab Industries, I
nc., Berkeley,CA)；Eppendorf (Eppendorf Scientifi
c, Madison, WI)；およびMolecular Dynamics (Molecul
ar Dynamics, Sunnyvale, CA)。
【０６０５】実施例１ テロメラーゼタンパク質およびクローンの単離 以下の実施例は、種々の生物からのテロメラーゼタンパ
ク質およびクローンの単離（euplotes p.123のhTRT、TR
T、およびS. pombe TRTテロメラーゼcDNAクローンを含
む）を詳細に記載する。
【０６０６】Ａ．背景 ｉ）序説 この節は、TRT遺伝子の精製およびクローニングの概説
を提供し、本実施例の以下の節においてより詳細に記載
する。テロメラーゼRNAサブユニットは、繊毛虫、酵母
および哺乳動物において同定されてきたが、この酵素の
タンパク質サブユニットは、本発明の前には、それ自体
が同定されていなかった。繊毛虫原生動物のEuplotes a
ediculatus由来のテロメラーゼの精製により、p123およ
びp43と呼ばれる２つのタンパク質が得られた（以下を
参照; Lingner (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
93:10712)。Euplotes aediculatusは、約8×107個のテ
ロメアおよび約3×105個のテロメラーゼ分子を含有する
大核を有する貧毛の（hypotrichous）繊毛虫である。精
製の後、活性なテロメラーゼ複合体は、66kD RNAサブユ
ニットおよび約123kDおよび43kDの２つのタンパク質に
対応する約230kDの分子量を有した（Linger (1996), 前
掲)。光架橋実験により、より大きいp123タンパク質が
テロメアDNA基質の特異的結合に関与することが示され
た（Lingner, (1996), 前掲)。
【０６０７】このp123およびp43タンパク質を配列決定
し、そしてこれらのタンパク質をコードするcDNAクロー
ンが単離された。これらのEuplotes配列は、Tetrahymen
aのテロメラーゼ会合性タンパク質であるp80およびp95
に関連しないことが見出された。Euplotes p123の配列
解析により逆転写酵素（RT）モチーフが示された。さら
に、他の配列との比較によるEuplotes p123の配列解析
により、Est2タンパク質と呼ばれる酵母ホモログが示さ
れた（Lingner (1997) Science 276:561)。酵母Est2は
インビボにおけるテロメラーゼ維持に必須であることは
以前に示されているが（Lendvay (1996) Genetics 144:
1399)、テロメラーゼ触媒タンパク質としては同定され
ていなかった。部位特異的変異誘発により、酵母Est2の
RTモチーフがインビボおよびインビトロでのテロメアDN
A合成のために必須であることが示された（Lingner(199
7)、前掲)。
【０６０８】ii）S. pombeのテロメラーゼの同定および
特徴付け S. pombeのDNAのPCR増幅を、以下に記載するEuplotes p
123RTモチーフから設計された縮重配列プライマーを用
いて行った。生成された４つの顕著なPCR産物のうち、1
20塩基対バンドが、p123およびEst2に相同なペプチド配
列をコードしていた。このPCR産物をコロニーハイブリ
ダイゼーションにおいてプローブとして用い、S. pombe
のゲノムライブラリーから重複する２つのクローンを、
およびS. pombe cDNAライブラリーから３つのクローン
を同定した。配列分析により、３つのS. pombe cDNAク
ローンのうちのいずれもが全長ではないことが示され、
従って、RT-PCRを用いてタンパク質のＮ末端をコードす
る配列を得た。
【０６０９】これらのクローンの完全な配列決定によ
り、推定のS. pombeテロメラーゼRT遺伝子、trt1が示さ
れた。trt1の完全なヌクレオチド配列は、GenBankに、
アクセス番号AF015783で寄託された（図15を参照のこ
と）。
【０６１０】（触媒サブユニットとしての）S. pombe t
rt1を試験するために、２つの欠失構築物を作製した。
配列の解析により、trt1が116kDの予測される分子量を
有する塩基性タンパク質をコードすることが示された。
p123およびEst2との相同性は、７つの逆転写酵素モチー
フ（下線を施し、およびモチーフ１、２、Ａ、Ｂ、Ｃ、
ＤおよびＥと命名する（図63参照））において特に高い
ことが見出された。別のテロメラーゼ−特異的モチーフ
（Ｔ−モチーフと命名）がまた見出された。36〜71塩基
対の大きさの範囲の15個のイントロンが、コード配列を
中断していた。
【０６１１】触媒サブユニットとしてのS. pombe trt1
を試験するために、２つの欠失構築物を作製した。１つ
はRTドメインにおいてモチーフＢ〜Ｄのみを除去した。
２つ目は、オープンリーディングフレームの99％を除去
した。
【０６１２】S. pombeの両方の変異体の胞子から増殖さ
せたハプロイド細胞は、テロメア反復に対するハイブリ
ダイゼーションがほとんど検出できなくなる点までの進
行的テロメア短鎖化を示した。trt1+/trt1-ディプロイ
ドは胞子を形成し、得られたテトラドを切り開き、アミ
ノ酸を補足した酵母エキス培地で発芽させた（YESプレ
ート、Alfa（1993) Experiments with Fission Yeast,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring H
arbor, NY)。各胞子に由来するコロニーを３日間32℃で
増殖させ、３日毎に新鮮なYESプレートに順次、ストリ
ークした。各ラウンドからのコロニーを、32℃で、６ml
のYES液体培養に入れ、そして静止期まで増殖させた。
ゲノムDNAを調製した。ApaIでの消化した後、DNAを2.3
％アガロースゲル上での電気泳動に供し、エチジウムブ
ロミドで染色して、各レーンにおけるほぼ等しいローデ
ィングを確認し、次いで、ナイロンメンブレンに移し、
テロメアDNAプローブにハイブリダイズさせた。
【０６１３】（典型的には、発芽後の第４ストリークに
おいて）寒天上で増殖の開始が遅延するかまたは増殖で
きないことによって、およびぎざぎざの縁が増大するコ
ロニーによって（図22Cに示したコロニー形態）によっ
て、および細長い細胞の高画分率が増大することによっ
て（図22Dに示す）、老化が示された。細胞を、写真を
とる前に、塩化アンモニウムをグルタミン酸で置き換え
た最小培地（Alfa (1993)，前掲)上で、32℃で２日間、
平板培養した。
【０６１４】個々の拡大された細胞を、解剖顕微鏡で分
離した場合、大部分がさらなる分裂を受けないことが見
出された。同じテロメラーゼ陰性（trt1-）細胞集団
は、分裂を続けるが、頻繁に非分裂子孫を産生する正常
な大きさの細胞を常に含んだ。テロメラーゼ陰性生存種
は、種々のテロメア−複製遺伝子が欠失された発芽酵母
株について記載されているテロメア維持の組換え態様を
使用し得る（Lendvay (1996), 前掲, Lundblad (1993)
Cell 73:347)。
【０６１５】iii）ヒトテロメラーゼの同定および特徴
付けEuplotesの123kDaペプチドおよび核酸配列、ならび
にSchizosaccharomycesタンパク質および対応するcDNA
（tez1）配列を用いる、dbEST（発現された配列タグ）G
enbankデータベースのBLASTサーチによって、ヒトテロ
メラーゼ逆転写酵素（hTRT）cDNAに由来するEST（発現
された配列タグ）を同定した。Genbank AA28196と命名
されたESTは、389ヌクレオチド長であり、これはクロー
ン712562の1679〜2076位(図18)に対応し、I.M.A.G.E. C
onsortium (Human Gemone Center, DOE,Lawrence Liver
more National Laboratory, Livermore, CA)から得られ
た。このクローンは、扁桃腺細胞のフローソーティング
によって得られた胚芽Ｂ細胞のcDNAライブラリーから得
られた。このhTRTcDNAクローンの完全な配列決定は、８
つのテロメラーゼRT（TRT）モチーフの全てを示した。
しかし、このhTRTクローンは、RTモチーフＢ’、Ｃ、
Ｄ、およびＥが、よりＮ末端側のRTモチーフではなく異
なるオープンリーディングフレームに含まれていたの
で、TRTの隣接部分をコードしなかった。さらに、RTモ
チーフＡとＢとの間の距離は、３つの以前に知られてい
る（非ヒト）TRTのものよりも実質的に短かった。
【０６１６】全長cDNAクローンを単離するために、高レ
ベルのテロメラーゼ活性を発現するヒト293細胞株（前
記）に由来するcDNAライブラリーをスクリーニングし
た。293細胞株由来のλcDNAライブラリーを、各約200,0
00プラークを含有する25プールに分配した。プライマー
対、５'-CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA-３'および５'-GGATGAAG
CGGAGTCTGGA-３'でのPCRによって各プールをスクリーニ
ングした。１つの陽性一次プールの６つのサブプール
を、この同じプライマー対を使用するPCRによってさら
にスクリーニングした。一次および二次サブプールスク
リーニングの両方について、hTRTを94℃、45秒；60℃、
45秒；および72℃、90秒での合計31サイクルで増幅し
た。コントロールとして、ハウスキーピング酵素GAPDH
のRNAを、プライマー対５'-CTCAGACACCATGGGGAAGGTGA-
３'および５'-ATGATCTTGAGGCTGTTGTCATA-３'を用い、94
℃、45秒；55℃、45秒；および72℃、90秒での合計16サ
イクルで増幅した。
【０６１７】次いで、二次スクリーニングからの１つの
hTRT陽性サブプールを、クローン#712562の5'領域由来
のプローブを用いたプラークハイブリダイゼーションに
よってスクリーニングした。１つのファージは陽性とし
て同定された（λファージ25-1.1と命名、ATCC209024、
1997年５月12日に寄託）。これは、約４kbのインサート
を含有した。このインサートを切り出し、そしてEcoRI
フラグメントとしてpBluescript II SK+ベクター（Stra
tagene, San Diego、CA）のEcoRI部位にサブクローニン
グした。このcDNAクローンを含有するプラスミドを、pG
RN121と命名した。cDNAインサートは、合計で約４kb対
である。ヒトhTRT cDNA（pGRN121）の完全なヌクレオチ
ド配列を、Genbankに寄託し（アクセス番号AF01595
0）、そしてプラスミドをATCCに寄託した（1997年５月
６日寄託；ATCC209016）。
【０６１８】Ｂ．Euplotes aediculatusの増殖 この実施例では、E. aediculatusの培養物は、David Pr
escott博士（MCDB、University of Colorado）から入手
した。Prescott博士は最初にこの培養を池の水から単離
したが、この培養物はATCC（ATCC#30859）からも入手で
きる。栄養源としてChlorogoniumを含有する15リットル
のガラス製容器中、非滅菌条件下で、Swantonら (Swant
onら, Chromosoma 77:203 [1980])によって記載されて
いるように培養物を増殖させた。密度が約104細胞／ml
に到達した時に、生物を培養物から収集した。
【０６１９】Ｃ．核抽出物の調製 本実施例では、後記するように、E. aediculatusの核抽
出物をLingnerら (Lingnerら, Genes Develop., 8:1984
[1994])の方法をわずかに改変して用いて調製した。簡
潔には、パートＢに記載したように増殖した細胞を15μ
m Nytexフィルターで濃縮し、そして氷上で冷却した。
細胞ペレットを110mlの最終容量のTMS/PMSF/スペルミジ
ンリン酸緩衝液に再懸濁した。ストックのTMS/PMSF/ス
ペルミジンリン酸緩衝液は、0.075gのスペルミジンリン
酸（USB）および0.75mlのPMSF（エタノール中で調製し
た100mMストック由来の）を150mlのTMSに添加すること
によって調製した。TMSは10mM Tris酢酸、10mM MgCl2、
85.5752gのスクロース/リットル、および0.33297gのCaC
l2/リットル、pH7.5を含む。
【０６２０】TMS/PMSF/スペルミジンリン酸緩衝液での
再懸濁の後、8.8mlの10％NP-40および94.1gのスクロー
スを添加し、そして混合物を、オーバーヘッドモーター
に連結させたステンレス鋼撹拌ロッド付きのシリコンガ
ラスビーカーに入れた。混合物を、細胞が完全に溶解す
るまで撹拌した（約20分）。次いで、Beckman JS-13ス
イングアウトローターを用いて、４℃で、7500rpm(8950
×g)で10分間、混合物を遠心分離した。上清を除去し、
そして核ペレットをTMS/PMSF/スペルミジンリン酸緩衝
液で再懸濁し、そしてBeckman JS-13 スイングアウトロ
ーターを用いて、４℃で、7500rpm(8950×g)で５分間、
再度遠心分離した。
【０６２１】上清を除去し、そして核ペレットを、10ｇ
の採集細胞あたり0.5ml緩衝液の容量で、50mM Tris酢
酸、10mM MgCl2、10％グリセロール、0.1％NP-40、0.4M
KGlu、0.5mM PMSF、pH7.5を含む緩衝液で再懸濁した。
次いで、再懸濁した核を約50ストロークでガラスホモジ
ナイザーに入れ、次いで、Eppendorf遠心分離機で、４
℃で、14,000rpmにて25分間遠心分離した。核抽出物を
含有する上清を収集し、液体窒素中で凍結し、そして使
用するまで-80℃で保存した。
【０６２２】Ｄ．テロメラーゼの精製 本実施例では、パートＣに記載したように調製した核抽
出物を用いて、E. aediculatusテロメラーゼを精製し
た。この精製プロトコルにおいて、Affi-Gel-ヘパリン
カラムのクロマトグラフィーによってまずテロメラーゼ
を富化し、そして次いで、アンチセンスオリゴヌクレオ
チドを用いるアフィニティー精製によつて大量に精製し
た。テロメラーゼRNAのテンプレート領域は、テロメラ
ーゼRNP粒子におけるハイブリダイゼーションに利用で
きるので、テロメラーゼについての親和性罠(bait)とし
てのこのテンプレート領域に相補的なアンチセンスオリ
ゴヌクレオチド（すなわち、「アフィニティーオリゴヌ
クレオチド」）を合成した。ビオチン残基を、それをア
ビジンカラムに固定化するために、オリゴヌクレオチド
の5'末端に含めた。
【０６２３】テロメラーゼのオリゴヌクレオチドへの結
合、および徹底的な洗浄に続き、置換オリゴヌクレオチ
ドの使用によってテロメラーゼを溶出させた。アフィニ
ティーオリゴヌクレオチドは、テロメラーゼ−特異的配
列の5'側のテロメラーゼRNAに相補的ではないDNA塩基を
含んだ。置換オリゴヌクレオチドは、その全長につきア
フィニティーオリゴヌクレオチドに相補的であったの
で、アフィニティーオリゴヌクレオチドに結合したテロ
メラーゼよりもよりさらに熱力学的に安定な二本鎖を形
成し得た。従って、置換オリゴヌクレオチドの添加によ
り、カラムからテロメラーゼが溶出された。
【０６２４】45リットル培養から調製した核抽出物を、
合計34mlの核抽出物が収集されるまで凍結した。これは
630リットルの培養物（すなわち、約４×109細胞）に対
応した。核抽出物を緩衝液で410mlに希釈して、最終濃
度20mMのTris酢酸、1mM MgCl2、0.1mM EDTA、33mM KGl
u、10％（容量/容量）グリセロール、１mMジチオスレイ
トール（DTT）、および0.5mMフッ化フェニルメチルスル
ホニル（PMSF）（pH7.5）を得た。
【０６２５】希釈した核抽出物を、同じ緩衝液で平衡化
した、230mlベッド容量および５cm直径の、Affi-Gel-ヘ
パリンゲルカラム（Bio-Rad)に適用し、そして33〜450m
M KGluグラジエント２リットルで溶出し、カラムを、１
カラム容量/時間の流速で、４℃で流した。各50mlの画
分を収集し、そしてパートＥに記載したようにテロメラ
ーゼ活性につき検定した。テロメラーゼを約170mM KGlu
でカラムから溶出した。テロメラーゼを含有する画分
（約440ml）をプールし、そして20mMTris酢酸、10mM Mg
Cl2、１mM EDTA、300mM KGlu、10％グリセロール、1mM
DTTおよび１％Nonidet P-40に調整した。この緩衝液を
「WB」と命名した。
【０６２６】この調製物に、このプール１mlあたり、各
1.5nmolの２種類の競合体DNAオリゴヌクレオチド(5'-TA
GACCTGTTAGTGTACATTTGAATTGAAGC-3'および5'-TAGACCTGT
TAGGTTGGATTTGTGGCATCA-3')、50μg酵母RNA（Sigma)、
および0.3nmolのビオチン標識化テロメラーゼ特異的オ
リゴヌクレオチド(5'-ビオチン-TAGACCTGTTA-(mreG)2-
(rmeU)4-(rmeG)4-(rmeU)4-remG-3')を添加した。テロメ
ラーゼ特異的オリゴヌクレオチドの２-ο-メチルリボヌ
クレオチドは、テロメラーゼRNA；テンプレート領域に
相補的であり；このデオキシリボヌクレオチドは相補的
ではなかった。競合体の非特異的DNAオリゴヌクレオチ
ドの含有は、アフィニティーオリゴヌクレオチドに結合
するかまたは混合物からテロメラーゼを除去するであろ
う混合物中の核酸結合性タンパク質および他の成分の効
果が最小化されるので、精製の効率は増加した。
【０６２７】次いで、この物質を、プール１mlあたり60
μlの懸濁液の容量で、Ultralink固定化ニュートラアビ
ジン（neutravidin）添加（Pierce)カラム物質に添加し
た。0.01％ Nonidet P-40、0.5mg BSA、0.5mg/mlリゾチ
ーム、0.05mg/mlグリコーゲン、および０.１mg/ml酵母R
NAを含有するWBの調製物で、カラム物質を各ブロッキン
グについて15分間、２回プレブロックした。ブロッキン
グは、４℃で回転ホイール(rotating Wheel)を用いて行
い、カラム物質を徹底的にブロックした。最初のブロッ
キング工程の後、そして第２のブロッキング工程前に、
カラム物質を200×ｇで２分間遠心分離してマトリック
スをペレット化した。
【０６２８】プール-カラム混合物を、回転ホイール
（約10rpm；Labindustries)で、30℃で８分間、次いで
さらに４℃で２時間インキュベートして結合させた。次
いで、プール-カラム混合物を200×ｇで２分間遠心分離
し、未結合物質を含む上清を除去した。次いで、プール
-カラム混合物を洗浄した。この洗浄プロセスは、プー
ル-カラム混合物を４℃でWBでリンスする工程、混合物
を15分間４℃でWBで洗浄する工程、WBでリンスする工
程、0.6M KGluを含有しNonidet P-40を含有しないWBで3
0℃で５分間洗浄する工程、WBで25℃で５分間洗浄する
工程、そして最後にWBで再度リンスする工程を包含し
た。最終洗浄後に残る容量を少量に保って、約１：１の
緩衝液に対するカラム物質の比率を生じた。
【０６２９】テロメラーゼを、カラム物質１mlあたり１
nmolの置換デオキシオリゴヌクレオチド(5'-CA4C4A4C2T
A2CAG2TCTA-3')を添加し、そして25℃で30分間インキュ
ベートすることによって、カラム物質から溶出させた。
この物質を、微量遠心分離機（Eppendorf)で、14,000rp
mで２分間遠心分離し、そして溶出物を回集した。毎回
新しい置換オリゴヌクレオチドを用い、溶出手順をさら
に２回反復した。前記したように、置換オリゴヌクレオ
チドはアフィニティーオリゴヌクレオチドに相補的であ
ったので、P-40よりアフィニティーオリゴヌクレオチド
とより熱力学的に安定な複合体を形成した。従って、置
換オリゴヌクレオチドのアフィニティー-結合テロメラ
ーゼへの添加により、天然条件下でテロメラーゼの十分
な溶出が得られた。テロメラーゼは、タンパク質ゲルで
の分析によって判断した場合、この段階で約50％の純度
であるようであった。テロメラーゼのアフィニティー精
製および置換オリゴヌクレオチドでの溶出を、図26（そ
れぞれ、パネルＡおよびＢ）に示す。この図において、
アフィニティーオリゴヌクレオチドの２'-ο-メチル糖
は太線によって示される。この図中の黒色および陰影を
施した楕円は、本発明のタンパク質サブユニットを写実
的に表示することが意図される。
【０６３０】Affi-Gel-ヘパリンカラムクロマトグラフ
ィー後得られた抽出物および物質のタンパク質濃度は、
標準としてBSAを用い、Bradford (Bradford, Anal. Bio
chem., 72:248 [1976])の方法を用いて測定した。テロ
メラーゼ調製物の画分のみをグリセロールグラジエント
でさらに精製した。
【０６３１】テロメラーゼの沈降係数をパートＩに記載
したようにグリセロールグラジエント遠心分離によって
決定した。
【０６３２】以下の表１９は本実施例の方法に従って精
製したテロメラーゼの精製の表である。このテロメラー
ゼは、回収率80％で全細胞抽出物と比較して核抽出物が
12倍富化されている；テロメラーゼの85％は抽出に際し
て核から可溶化された。
【０６３３】
【表１９】
【０６３４】*ＮＡ＝利用できず** この値は（タンパク質ゲルに基づき）50％の純度を仮
定することにより、テロメラーゼの測定量（680pmol）
から計算した。
【０６３５】Ｅ．テロメラーゼ活性 テロメラーゼの精製の各工程において、本実施例に記載
されるように、３つの別のアッセイ（このうちの１つは
活性であった）によって分析した。一般に、テロメラー
ゼアッセイは、0.003〜0.3μlの核抽出物、50mM Tris-C
l（pH7.5）、50mM KGlu、10mM MgCl2、１mM DTT、125μ
M dTTP、125μM dGTP、および約0.2pmolの5'-32Ｐ-標識
オリゴヌクレオチド基質（すなわち、約400,000cpm）を
含有する40μlで行った。オリゴヌクレオチドプライマ
ーを、反応混合物へのそれらの添加に先立って熱変性し
た。反応物を氷上に集め、25℃で30分間インキュベート
した。200μlの10mM Tris-Cl（pH7.5）、15mM EDTA、0.
6％SDS、および0.05mg/mlプロテイナーゼＫの添加によ
って反応を停止させ、そして45℃で少なくとも30分間イ
ンキュベートした。エタノール沈殿の後、当該分野で公
知のように（例えば、 Sambrookら、1989参照）、生成
物を変性８％PAGEゲルで分析した。
【０６３６】Ｆ．テロメラーゼ活性の定量 本実施例では、精製手順を通じてのテロメラーゼ活性の
定量を記載する。dGTPおよび［α-32Ｐ］dTTPの存在下
でオリゴヌクレオチドプライマーの伸長をアッセイする
ことによって定量を達成した。簡潔には、記載されるよ
うに、（Lingnerら, Genes Develop., 8:1984 [199
4])、２μlの［α-32P］dTTP（10mCi/ml、400Ci/mmol：
１Ci＝37GBq)の存在下で、１μMの5'-(G4T4)2-3'オリゴ
ヌクレオチドを20μlの反応混合物中で伸長させ、記載
されるように８％PAGE配列決定ゲルにロードした。
【０６３７】この実験の結果を図28に示す。レーン１で
は、テロメラーゼは存在せず（すなわち、陰性コントロ
ール）；レーン２、５、８および11は0.14fmolのテロメ
ラーゼを含有し；レーン３、６、９および12は、0.42fm
olのテロメラーゼを含有し；そしてレーン４、７、10お
よび13は、1.3fmolのテロメラーゼを含有した。製造業
者の指示を用いて、PhosphorImager (Molecular Dynami
cs)を用いて活性を定量した。これらの条件下では、30
分以内に、１fmolのアフィニティー-精製テロメラーゼ
が21fmolのdTTPを取り込んだとことが決定された。
【０６３８】図28に示されるように、テロメラーゼの特
異的活性は精製手順を通じて有意に変化しなかった。ア
フィニティー-精製テロメラーゼは十分に活性であっ
た。しかしながら、高濃度では、阻害活性が検出され、
そして粗抽出物の活性は直線的でないと決定された。従
って、図28に示したアッセイにおいて、粗抽出物を700-
7000倍希釈した。精製に際し、この阻害活性は除去さ
れ、そして阻害効果は、高酵素濃度においてさえ精製テ
ロメラーゼ調製物では検出されなかった。
【０６３９】Ｇ．ゲル電気泳動およびノーザンブロット パートＥに述べたように、テロメラーゼの精製における
各工程では、調製物を３つの別々のアッセイによって分
析した。本実施例は、画分に存在するテロメラーゼRNA
を定量し、そしてテロメラーゼリボ核タンパク質粒子の
全部を分析するために使用したゲル電気泳動およびブロ
ッティング手順を記載する。
【０６４０】ｉ）変性ゲルおよびノーザンブロット 本実施例では、既知の濃度の合成T7-転写テロメラーゼR
NAを標準として供した。この調査を通じて、RNA成分を
テロメラーゼの尺度として用いた。
【０６４１】E. aediculatusテロメラーゼRNAのファー
ジT7 RNAポリメラーゼ転写のための構築物を（PCR）を
用いて生成した。テロメラーゼRNA遺伝子を、遺伝子の
いずれかの末端にアニールするプライマーを用いて増幅
した。５'末端にアニールするプライマーはまた、転写
されたRNAの切断に際しての天然の５'末端、T7-プロモ
ーター配列、およびサブクローニングのためのEcoRI部
位を生成するためのハンマーヘッド(hammerhead)リボザ
イム配列もコードした。この５'プライマーの配列は、
5'-GCGGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAAGAAACTCTGATGAGG
CCGAAAGGCCGAAACTCCACGAAAGTGGAGTAAGTTTCTCGATAATTGAT
CTGTAG-3'であった。３'プライマーは、天然の３'末端
に転写終結のためのEarI部位、およびクローニングのた
めのBamHI部位を含んだ。この３'プライマーの配列は5'
-CGGGGATCCTCTTCAAAAGATGAGAGGACAGCAAAC-3'であった。
PCR増幅産物をEcoRIおよびBamHIで切断し、そしてpUC19
（NEB）の各部位にサブクローンして「pEaT7」を得た。
このインサートの正確さをDNA配列決定によって確認し
た。T7転写は、Zaugら, Biochemistry 33:14935[1994]
によって記載されているように、EarI線状化プラスミド
で行った。RNAをゲル精製し、そして濃度を測定した
（１＝40μg/mlのＡ260）。このRNAを標準として使用し
て、テロメラーゼの種々の調製物に存在するテロメラー
ゼRNAを決定した。
【０６４２】ハイブリダイゼーションのシグナルはテロ
メラーゼRNAの量に比例し、そして由来するRNA濃度は天
然のゲル電気泳動によって得られたものと合致したが、
それよりもわずかに高かった。既知のT7のRNA転写物濃
度の連続希釈物に対する全細胞RNAにおける全テロメラ
ーゼRNAの量の比較は、各E. aediculatus細胞が約300,0
00テロメラーゼ分子を含有することを示した。
【０６４３】テロメラーゼの可視化を、記載されている
方法を用い（Libgnerら, Genes Develop., 8:1984 [199
4])、そのRNA成分に対するノーザンブロットハイブリダ
イゼーションによって達成した。簡潔には、当該分野で
公知のように（例えば、 Sambrookら, 1989参照）、RNA
（0.5μg/レーン未満または等価）を、８％PAGEで分解
し、そしてHybond-N膜（Amersham)に電気ブロットし
た。このブロットを、10mlの4×SSC、10×デンハルト溶
液、0.1％SDS、および50μg/ml変性ニシン精子DNA中で
一晩ハイブリダイズし、３時間のプレハイブリダイズの
後、2×106cpmプローブ/mlハイブリダイゼーション溶液
を添加した。ランダムに標識したプローブ、全テロメラ
ーゼRNA遺伝子をカバーするPCR産物であった。ブロット
を2×SCC、0.1％SDS中で30分間、そして次いで、45℃で
0.1×SSCおよび0.1％SDS中で１時間、緩衝液を数回交換
しながら洗浄した。
【０６４４】ii）天然ゲルおよびノーザンブロット 本実験では、当該分野で公知であり、そして記載されて
いるように（LamondおよびSproat [1994], 前出)、精製
したテロメラーゼ調製物を、3.5％ポリアクリルアミド
および0.33％アガロースの天然（すなわち、非変性）ゲ
ルで泳動した。テロメラーゼはキシレンシアノール色素
とほとんど一緒に移動した。
【０６４５】天然ゲルにより、テロメラーゼが精製プロ
トコルを通じてRNPとして維持されることを示した。図2
7は、非変性ゲル上の異なる画分におけるテロメラーゼ
ならびにインビトロ転写されたテロメラーゼの移動度を
示すノーザンブロットの写真である。この図において、
レーン１は1.5fmolのテロメラーゼRNAを含有し、レーン
２は4.6fmolのテロメラーゼRNAを含有し、レーン３は14
fmolのテロメラーゼRNAを含有し、レーン４は41fmolの
テロメラーゼRNAを含有し、レーン５は核抽出物（42fmo
lテロメラーゼ）を含有し、レーン６はAffi-Gel-ヘパリ
ン-精製テロメラーゼ（47fmolテロメラーゼ）を含有
し、レーン７はアティニティー-精製テロメラーゼ（68f
mol）を含有し、そしてレーン８はグリセロールグラジ
エント-精製テロメラーゼ（35fmol）を含有した。
【０６４６】図27に示すように、核抽出物においては、
テロメラーゼはRNP粒子にアセンブルし、これはアセン
ブルしていないテロメラーゼRNAよりもゆっくりと移動
した。１％未満の遊離RNAがこの方法によって検出され
た。しかし、よりゆっくりと移動するテロメラーゼRNP
複合体もまた抽出物中で時々検出された。Affi-Gel-ヘ
パリンカラムでの精製に際して、テロメラーゼRNP粒子
は移動度が変化しなかった（図27、レーン６）。しか
し、アティニティー精製に際して、RNA粒子の移動度は
わずかに増加し（図27、レーン７）、これはおそらく、
タンパク質サブユニットまたはフラグメントが喪失した
ことを示す。グリセロールグラジエントでは、アティニ
ティー精製テロメラーゼはサイズが変化しなかったが、
約２％の遊離テロメラーゼRNAが検出され（図27、レー
ン８）、これは少量のRNP粒子のジアセンブルが起こっ
たことを示す。
【０６４７】Ｈ．テロメラーゼタンパク質組成 本実施例では、精製されたテロメラーゼタンパク質組成
の分析を記載する。
【０６４８】パートＤに記載したように得られたグリセ
ロールグラジエント画分を、４〜20％のポリアクリルア
ミドゲル（Novex)で分離した。電気泳動に続き、ゲルを
クーマシーブリリアントブルーで染色した。図29はゲル
の写真を示す。図29に示すゲルの左側に示すように、レ
ーン１および２は分子量マーカー（Pharmacia)を含ん
だ。レーン３〜５はゲルの頂部に示すようにグリセロー
ルグラジエント画分プールを含んだ（すなわち、レーン
３は画分９〜14を含み、レーン４は画分15〜22を含み、
レーン５は画分23〜32を含んだ）。レーン４は、１pmol
のテロメラーゼRNAを含むプールを含有した。レーン６
〜９では、図29のゲルの頂部に示される濃度でBSA標準
を泳動させた（すなわち、レーン６は0.5pmolのBSAを含
み、レーン７は1.5pmolのBSAを含み、レーン８は4.5BSA
を含み、そしてレーン９は15pmolのBSAを含んだ）。
【０６４９】図29に示すように、120および43kDaの分子
量を有するポリペプチドをテロメラーゼと共に精製し
た。43kDaポリペプチドはダブレットとして観察され
た。レーン３における約43kDaのポリペプチドが、レー
ン４のダブレットとは異なって移動したことに注意し
た；それは無関係なタンパク質であろう。120kDaおよび
43kDaダブレットはそれぞれ、BSA標準と比較した場合、
約１pmolのレベルで、クーマシーブリリアントブルーで
染色された。この画分は１pmolのテロメラーゼRNA（そ
の全てはRNP粒子にアセンブルした（図27、レーン８参
照））を含有したので、テロメラーゼRNAに対して化学
量論的な２種のポリペプチドサブユニットがあるようで
あった。しかし、43kDa近辺の２つのタンパク質が別々
の酵素サブユニットである可能性もある。
【０６５０】グリセロールグラジエントでの分画に付さ
なかったアフィニティー-精製テロメラーゼは、それぞ
れ、35kDaおよび37kDaの見かけの分子量を有するさらな
るポリペプチドを含有した。この後者の画分は、少なく
とも50％の純度であると見積もられた。しかし、アフィ
ニティー-精製物質中に存在する35kDaおよび37kDaポリ
ペプチドは、グリセロールグラジエント遠心分離によっ
て再現性よくは分離されなかった。これらのポリペプチ
ドは混成物であり得る。というのは、それらは全ての活
性含有調製物中で見られなかったからである。
【０６５１】Ｉ．沈降係数 テロメラーゼについての沈降係数は、グリセロールグラ
ジエント遠心分離によって決定した。本実施例では、核
抽出物およびアフィニティー-精製テロメラーゼを、１m
M MgCl2、0.1mM EDTA、300mM KGlu、および１mM DTT、p
H7.5を有する20mM Tris酢酸を含有する15〜40％グリセ
ロールグラジエントで分画した。グリセロールグラジエ
ントを、５ml（13×51mm）チューブに注ぎ、そしてSW55
Tiローター（Beckman)を用いて、55,000rpmで４℃で14
時間遠心分離した。
【０６５２】マーカータンパク質を平行グラジエントで
泳動し、アルコールデヒドロゲナーゼ（ADH）について
は7.6Ｓの沈降係数、カタラーゼについては113Ｓ、アポ
フェリチンについては17.3Ｓ、およびチログロブリンに
ついては19.3Ｓの沈降係数を有した。テロメラーゼピー
クを、グラジエント画分の天然ゲル電気泳動、その後の
RNA成分へのブロットハイブリダイゼーションによって
同定した。
【０６５３】図30は、テロメラーゼについての沈降係数
を示すグラフである。図に示されるように、アフィニテ
ィー-精製テロメラーゼは11.5Ｓでカタラーゼと共に移
動し、一方、核抽出物中のテロメラーゼはわずかに速く
沈降し、12.5Ｓ辺りにピークがあった。従って、天然ゲ
ルにおける酵素の移動度と一致して、精製されたテロメ
ラーゼは、タンパク質分解フラグメントまたはゆるく会
合したサブユニットを喪失したように見える。
【０６５４】計算したテロメラーゼについての分子量
は、それが１つの120kDaタンパク質サブユニット、１つ
の43kDaサブユニット、および66kDaの１つのRNAサブユ
ニットより成ると仮定すると、229kDaの合計値となる。
これは、カタラーゼの232kDaの分子量とかなり一致す
る。しかし、沈降係数は分子量、ならびに分子の部分特
異的な容量および摩擦係数（共に、Euplotesテロメラー
ゼRNPについては知られていない）の関数である。
【０６５５】Ｊ．基質の利用性 本実施例では、Euplotesテロメラーゼの基質要件を調べ
た。DNA末端複製に対する１つの簡単なモデルは、半保
存的DNA複製の後、テロメラーゼは二本鎖を延長し、DNA
分子を平滑末端とすることを予測する。このモデルの変
形において、一本鎖3'末端がヘリカーゼまたはヌクレア
ーゼによって複製後に作製される。次いで、結合および
伸長のために、この３'末端をテロメラーゼによって使
用する。
【０６５６】テロメラーゼが平滑末端分子を伸長できる
か否かを決定するために、モデルヘアピンを、それらの
3'末端に位置するテロメリック反復で合成した。これら
のプライマー基質をゲル精製し、ポリヌクレオチドキナ
ーゼで5'末端を標識し、0.4μMで80℃で５分間加熱し、
次いで、加熱ブロック中でゆっくりと室温まで冷却し
て、ヘアピンの再生およびヘリックス形成を行った。非
変性ゲル上での基質移動度は、二量体と比較して非常に
有効なヘアピン形成が存在することを示した。
【０６５７】pH7.5の10mM MgCl2、50mM KGlu、および1m
M DTTを有する20mMトリス酢酸を含有する10μlの反応混
合物中、未標識125μM dGTP、125μM dTTP、および0.02
μM5'末端標識プライマー（5' 32Ｐ標識オリゴヌクレオ
チド基質）を用いてアッセイを行った。これらの混合物
を25℃で30分間インキュベートした。ホルムアミド負荷
緩衝液（すなわち、TBS、ホルムアミド、ブロモチモー
ルブルー、およびシアノール、Sambrook, 1989, 前出)
を添加することによって反応を停止させた。
【０６５８】プライマーをテロメラーゼ無しで
（「−」）、5.9fmolのアフィニティー精製テロメラー
ゼ有りで（「＋」）、または17.6fmolのアフィニティー
精製テロメラーゼ有りで（「＋＋＋」）インキュベート
した。このアッセイで使用したアフィニティー精製テロ
メラーゼを、100kDaの分子量カットオフを有する膜で透
析して置換オリゴヌクレオチドを除去した。反応作製物
を、36％ホルムアミドを含有する８％のPAGE/尿素ゲル
で分離してヘアピンを変性した。この研究で使用したプ
ライマーの配列、ならびにそれらのレーン帰属を表２０
に示す。
【０６５９】
【表２０】
【０６６０】ゲルの結果を図31に示す。レーン1〜15は4
つのＧ残基で終わるテロメリック反復を有する基質を含
有した。レーン16〜30は、4つのＴ残基で終わるテロメ
リック反復を有する基質を含有した。テロメラーゼRNA
テンプレート上の推定の配置を図32に示す。プライマー
対は図32（すなわち、それぞれ、パネルＡおよびパネル
Ｂ）に示されるテンプレート中の２つの非常に異なる位
置でアニールすると推定された。これは、それらの結合
および/または伸長速度に影響を与えるかも知れない。
【０６６１】図33は、図31におけるレーン25〜30のより
弱い露光を示す。図33のより弱い露光を行って、付加さ
れたヌクレオチドおよび伸長産物における中断位置を可
視化した。各対における第３のレーンの伸長させた基質
のパーセントは、図31の底部で示したようにPhosphorIm
agerで定量した。
【０６６２】これらのヘアピンについての基質効率を、
異なる長さの突出を有する二本鎖テロメア様基質と比較
した。４つのＧ残基で終わったモデル基質（図31のレー
ン１〜15参照）は、それを平滑末端とした場合には伸長
しなかった（レーン１〜３参照）。しかし、わずかな伸
長が２塩基の突出長で観察され；伸長は、突出が少なく
とも４塩基長である場合には十分となった。テロメラー
ゼは、４つのＴ残基で終わる二本鎖基質と同様に作用
し、６塩基突出はかなり十分な伸長を要した。図31にお
いては、テロメラーゼとは無関係のレーン10〜15におけ
るプライマー下方のかすかなバンドは、プライマー調製
におけるより短いオリゴヌクレオチドを表す。
【０６６３】図33におけるレーン25〜30のより弱い露光
は伸長産物のラダーを示し、（Lingnerら, Genes Devel
op., 8:1984 [1994]によって記載されているように)最
も暗いバンドはテンプレートの推定5'境界に対応する。
テンプレートにおける他の位置に対応する産物の豊富さ
は、中断および/または解離が、精製テロメラーゼでの
転位の部位以外の部位で起こることを示唆した。
【０６６４】図31に示すように、二本鎖の平滑末端オリ
ゴヌクレオチドは、テロメラーゼに対する基質ではなか
った。これらの分子がテロメラーゼに結合するか否かを
診断するために、競合実験を行った。本実験では、2nM
の配列(G4T4)2を有する5'末端標識基質、または６塩基
突出を有するヘアピン基質を0.125nMテロメラーゼで伸
長させた（図31、レーン25〜27）。同一の未標識オリゴ
ヌクレオチド基質は、伸長につき標識基質と十分に競合
したが、二本鎖平滑末端ヘアピンオリゴヌクレオチドを
競合体として使用した場合は、100倍過剰のヘアピンの
存在下においてさえ、活性の低下は観察されなかった。
【０６６５】これらの結果は、二本鎖の平滑末端オリゴ
ヌクレオチドは、本実施例で試験した濃度および条件に
おいてテロメラーゼに結合できないことを示した。むし
ろ、一本鎖3'末端が結合には必要である。この3'末端は
テロメラーゼRNAテンプレートとの塩基対に対して必要
なようである。
【０６６６】Ｋ．123kDaポリペプチドのクローニング＆
配列決定 本実施例では、Euplotesテロメラーゼの123kDaポリペプ
チド（すなわち、123kDaタンパク質サブユニット）のク
ローニングを記載する。本実験では、前記パートＤで得
られた精製ポリペプチドから得られたペプチド配列にマ
ッチするように設計されたオリゴヌクレオチドプライマ
ーを用いて、テロメラーゼ遺伝子の内部フラグメントを
PCRにより増幅した。当該分野で公知の、そしてCalvio
ら,RNA 1:724-733 [1995]によって記載のnanoESタンデ
ム質量分析方法を用いてポリペプチド配列を決定した。
本実施例で使用したオリゴヌクレオチドプライマーは以
下の配列を有し、縮重位置は括弧に入れて示す。
【０６６７】5'-TCT(G/A)AA(G/A)TA(G/A)TG(T/G/A)GT(G
/A/T/C)A(T/G/A)(G/A)TT(G/A)TTCAT-3'および5'-GCGGAT
CCATGAA(T/C)CC(A/T)GA(G/A)AA(T/C)CC(A/T)AA(T/C)GT-
3'。
【０６６８】50μlの反応物は0.2mM dNTP、0.15μgE. a
ediculatus染色体DNA、0.5μl Taq（Boehringer-Mannhe
im)、0.8μgの各プライマー、および1×反応緩衝液（Bo
ehringer-Mannheim）を含有した。反応物でサーモサイ
クラー（Perkin-Elmer)中で以下を使用してインキュベ
ートした：95℃における5分間、続いての94℃での1分
間、52℃での1分間、およぴ72℃での2分間の30サイク
ル。反応は72℃で10分間のインキュベーションによって
完了した。
【０６６９】ゲノムDNAライブラリーは、平滑末端DNAを
pCR−ScriptプラスミドベクターのSmaI部位にクローニ
ングすることによって染色体E. aediculatusDNAから調
製した（図14）（Stratagene)。このライブラリーは、
放射性標識したゲル精製PCR産物でのコロニーハイブリ
ダイゼーションによってスクリーニングした。陽性クロ
ーンのプラスミドDNAを調製し、そして自動シーケンサ
ー（ABI）の使用により、ジデオキシ方法（Sangerら, P
roc. Natl. Acad. Sci., 74:5463 [1977])または手動に
よって配列決定した。このポリヌクレオチドをコードす
る遺伝子のDNA配列を図13に示す。DNA配列から帰結され
るこの配列における停止コドンはヌクレオチド位置101
に位置付けられ、そしてオープンリーディングフレーム
末端は3193位に位置付けられる。Euplotesの遺伝コード
は、「UGA」コドンがシステイン残基をコードする点
で、他の生物とは異なる。DNA配列から帰結されるポリ
ヌクレオチドのアミノ酸配列を図14に示し、異常アミノ
酸は翻訳の間に挿入され、翻訳後修飾は起こらないと推
定される。
【０６７０】Ｌ．43kDaポリペプチドのクローニング＆
配列決定 本実施例では、テロメラーゼの43kDaポリペプチド（す
なわち、43kDaタンパク質サブユニット）のクローニン
グを記載する。本実験では、対応するテロメラーゼ遺伝
子の内部フラグメントを、前記パートＤで得られた精製
ポリペプチドから得られたペプチド配列に適合するよう
に設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、
PCRによって増幅した。ポリペプチド配列は、当該分野
で公知で、Calvioら,前出によって記載されたnanoESタ
ンデム質量分析方法を用いて決定した。本実施例で使用
したオリゴヌクレオチドプライマーは、以下の配列を有
した。
【０６７１】5'-NNNGTNAC(C/T/A)GG(C/T/A)AT(C/T/A)AA
(C/T)AA-3'、および5'-(T/G/A)G(T/G/A)GT(C/T)TC(T/C)
TG(G/A)TC(G/A)TT(G/A)TA-3'。この配列において「Ｎ」
は４種のヌクレオチド（すなわち、Ａ、Ｔ、Ｇまたは
Ｃ）のいずれかの存在を示す。
【０６７２】PCRはパートＫに記載したように行った。
【０６７３】ゲノムDNAライブララリーを調製し、パー
トＫに記載したようにスクリーニングした。このポリペ
プチドをコードする遺伝子のDNA配列を図34に示す。図3
5に示すように、３つの可能なリーディングフレームを
この配列につき示す。明瞭性のため、アミノ酸配列を、
すべての３つのリーディングフレームにおけるヌクレオ
チド配列の下方に示す。これらのリーディングフレーム
を「ａ」、「ｂ」および「ｃ」と命名する。可能な開始
コドンは、リーディングフレーム「ｃ」中のヌクレオチ
ド84位でコードされる。コード領域は、リーディングフ
レーム「ｂ」中の1501位で終わり得る。この図中のアス
テリスクによって示される初期停止コドンは、ヌクレオ
チド位置337〜350の間の全ての３つのリーディングフレ
ームにおいて起こる。
【０６７４】「La−ドメイン」は太字で示す。さらに下
流では、３つのフレームは停止コドンによっていずれも
中断されないので、タンパク質配列は、異なるリーディ
ングフレームによってコードされるようである。さら
に、精製タンパク質からのペプチド配列は全ての３つの
フレームにおいてコードされる。従って、この遺伝子は
介入配列を含有するようであり、あるいは、RNAが編集
される。他の可能性は、リボソームフレームシフティン
グまたは配列エラーを含む。しかし、La−タンパク質配
列に対する相同性は非常に興味深いままである。また、
Euplotesにおいては、「UGA」コドンはシステイン残基
をコードする。
【０６７５】Ｍ．アミノ酸および核酸比較 本実施例では、種々の報告された配列および123kDaおよ
び43kDaテロメラーゼサブユニットポリペプチドの配列
の間の比較を行った。
【０６７６】ｉ）123kDaのE. aediculatusテロメラーゼ
サブユニットとの比較 123kDaのEuplotes. aediculatusポリペプチドのアミノ
酸配列を、Tetrahymenathermophila（GenBank受託番号#
U25641)の80kDaテロメラーゼタンパク質サブユニットの
配列と比較して、それらの類似性を調べた。このタンパ
ク質をコードするGenBankから得られたヌクレオチド配
列を図42に示す。GenBankから得られたこのタンパク質
のアミノ酸配列を図43に示す。123kDaのE. aediculatus
および89kDaのT. thermophilaの間の配列比較を図36に
示す。この図では、E. aediculatus配列は上の配列であ
り、他方、T. thermophila配列は下の配列である。観察
された同一性は約19％であると決定され、他方、パーセ
ント類似性は約45％であった（この値はいずれのランダ
ムタンパク質配列でも観察されるであろうものと同様で
ある）。図36-39において、同一性は垂直棒線によって
示され、他方、配列間の単一のドットは幾分類似のアミ
ノ酸を示し、配列間の二重ドットはより類似のアミノ酸
を示す。
【０６７７】123kDanoEuplotes aediculatusポリペプチ
ドのアミノ酸配列をまた、Tetrahymena thermｏphila
（GenBank受託番号#U25642)の95kDaテロメラーゼタンパ
ク質サブユニットの配列と比較して、それらの類似性を
調べた。このタンパク質をコードするGenBankから得ら
れたヌクレオチド配列を図44に示す。GenBankから得ら
れたこのタンパク質のアミノ酸配列を図45に示す。この
配列比較を図37に示す。この図では、E. aediculatus配
列は上の配列であり、他方、T. thermｏphila配列は下
の配列である。観察された同一性は約20％であると決定
され、他方、パーセント類似性は約43％（いずれのラン
ダムタンパク質配列でも観察されるであろうものと同様
の値）であった。
【０６７８】特徴的には、123kDaのE. aediculatusポリ
ペプチドのアミノ酸配列は、逆転写酵素の５モチーフ特
徴を含む。この123kDaポリペプチドをまた、種々の逆転
写酵素のポリメラーゼドメインと比較した。図40は推定
酵母ホモログ（L8543.12またはESTp）と123kDaポリペプ
チドとのアライメントを示す。GenBankから得られたL85
43.12のアミノ酸配列を図46に示す。
【０６７９】この比較において４つのモチーフ（Ａ、
Ｂ、ＣおよびＤ）が含まれていた。この図40において、
高度に保存された残基は、黒色バックグラウンド上の白
色文字によって示される。他の配列において保存されて
いるE. aediculatus配列の残基を太文字で示し；「ｈ」
は疎水性アミノ酸の存在を示す。モチーフのアミノ酸残
基の間に位置する数字は配列におけるギャップの長さを
示す。例えば、モチーフＡおよびＢの間に示す「100」
はモチーフ間の配列における100アミノ酸ギャップを反
映する。
【０６８０】前記したように、GenBankサーチは、E. ae
diculatusの123kDaのテロメラーゼサブユニットに対し
ていくらかの相同性を示すアミノ酸配列を含有するかま
たはコードする酵母タンパク質（GenBank受託番号#u206
18）、および遺伝子L8543.12（Est2)を同定した。両タ
ンパク質は、それらのC-末端領域に逆転写酵素モチーフ
を含有する;両タンパク質は、逆転写酵素モチーフの外
部の領域における類似性を有する;このタンパク質は、
同様に塩基性である（E. aediculatusではpI=10.1、お
よび酵母についてはpI=10.0）；および両タンパク質は
大きい（E. aediculatusでは123kDaおよび酵母では103k
Da）という観察に基づくと、これらの配列はそれらの各
テロメラーゼの触媒コアを含む。E. aediculatusおよび
酵母としての２つの系統発生的に区別される生物におけ
る相同性のこの観察に基づいて、ヒトテロメラーゼは同
一の特徴（すなわち、逆転写酵素モチーフ、塩基性であ
る、および大きい［>100kDa］）タンパク質を含有する
であろうと考えられた。
【０６８１】ii）43kDaのE. aediculatusテロメラーゼ
サブユニットとの比較 43kDのEuplotes aediculatusポリペプチドの「La−ドメ
イン」のアミノ酸配列をTetrahymena thermophila（前
記）の95kDaのテロメラーゼタンパク質サブユニットの
配列と比較してそれらの類似性を調べた。この配列比較
を図38に示し、他方、T. thermophila配列は下の配列で
ある。観察された同一性は約23％であると判断され、他
方、パーセント類似性は約46％（任意のランダムタンパ
ク質配列でも観察されるであろうものに類似の値）であ
った。
【０６８２】43kDaのEuplotes aediculatusポリペプチ
ドの「La−ドメイン」のアミノ酸配列をTetrahymena th
ermophila（前記）の80kDaテロメラーゼタンパク質サブ
ユニットの配列と比較してそれらの類似性を調べた。こ
の配列比較を図39に示す。この図においては、E. aedic
ulatus配列は上の配列であり、他方、T. thermophila)
配列は下の配列である。観察された同一性は約26％であ
ると判断され、他方、パーセント類似性は約49％（いず
れのランダムタンパク質配列で観察されるであろうもの
と類似の値）であった。
【０６８３】また、43kDaのE. aediculatusポリペプチ
ドのドメインのアミノ酸配列を、種々の他の生物からの
Laタンパク質と比較した。これらの比較を図41に示す。
この図においては、高度に保存された残基は黒色バック
グラウンド上の白色文字によって示される。他の配列に
おいて保存されているE. aediculatus配列の残基は太字
で示す。
【０６８４】Ｎ．別のもう1つの生物におけるテロメラ
ーゼタンパク質サブユニットの同定 本実施例では、前記これまでの実施例で同定された配列
を用いて、Oxytrichatallaｘ(E. aediculatusとは非常
に区別される関係の繊毛虫)のテロメラーゼタンパク質
サブユニットを同定した。プライマーは、逆転写酵素ド
メインモチーフを含むE. aediculatusの123kDaのポリペ
プチドの保存された領域に基づいて選択した。適切なプ
ライマーを合成し、そしてOxytrichaからの全DNAを用い
るPCR反応で使用した。OxytrichaのDNAは、当該分野で
公知の方法に従って調製した。次いで、PCR産物をクロ
ーン化し、そして当該分野で公知の方法を用いて配列決
定した。
【０６８５】プライマーとして使用したオリゴヌクレオ
チド配列は以下の通りであった：5'-(T/C)A(A/G)AC(T/A
/C)AA(G/A)GG(T/A/C)AT(T/C)CC(C/T/A)(C/T)A(G/A)GG-
3'および5'-(G/A/T)GT(G/A/T)ATNA(G/A)NA(G/A)（G/
A）)TA(G/A)TC(G/A)TC-3')。縮重している位置は括弧に
入れて示し、オルタナティブ塩基は括弧内に示す。
「Ｎ」は4つのヌクレオチドのいずれかを表す。
【０６８６】PCR反応において、50μl反応物は0.2mM dT
NP、0.3μg Oxytricha trifallax染色体DNA、1μl Taq
ポリメラーゼ（Boehringer-Mannheim)、２マイクロモル
の各プライマー、1×反応緩衝液（Boehringer-Mannhei
m）を含有した。以下の条件：95℃における5分、次の94
℃における1分、53℃における1分、および72℃における
1分からなる30サイクル、続いての72℃における10分間
のインキュベーションで、反応物をサーモサイクラー
（Perkin-Elmer)中でインキュベートした。PCR産物をゲ
ル精製し、ジデオキシ法（例えば、Sangerら, Proc, Na
tl. Acad. Sci. 74, 5463-5467(1977))によって配列決
定した。
【０６８７】PCR産物の推定されるアミノ酸配列を決定
し、そしてE. aediculatusの配列と比較した。図47は、
これらの配列のアライメントアラインメントを示し、O.
trifallax配列は頂部上列に、E. aediculatus配列は下
部列に示す。この図から分かるように、本実施例で同定
されたO. trifallaxポリペプチド配列とE. aediculatus
ポリペプチド配列との間には非常に大きな同性がある。
従って、本発明で同定された配列は、他の真核生物にお
ける相同性テロメラーゼタンパク質サブユニットの同定
で有用である。事実、本発明の開発は、本明細書中に記
載のように多数の多様な種において相同性テロメラーゼ
配列を同定した。
【０６８８】Ｏ．テトラヒメナ・テロメラーゼ配列の同
定 本実施例では、Euplotes配列、およびEST2pとの相同性
を共有するThtrahymenaクローンを生成させた。
【０６８９】この実験は、保存されたモチーフに向けら
れた縮重オリゴヌクレオチドプライマーを用いるPCRを
利用して、Thtrahymena、Euplotes、およびEST2p配列の
間の相同性の領域を同定した。本実施例で用いたPCR方
法は、複合体混合物からの稀なDNA配列を特異的に増幅
するように設計された新規の方法である。この方法は、
PCRクローニング方法で通常に遭遇する両端部における
同一のPCRプライマーを用いるDNA産物（すなわち、単一
プライマー産物）の増幅の問題を回避する。これらの単
一プライマー産物は望まないバックグラウンドを生じ、
そしてしばしば、所望の２つのプライマー産物の増幅お
よび検出を曖昧にし得る。本実施例で使用した方法は２
つのプライマー産物につき優先的に選択する。特に、１
つのプライマーをビオチン化し、他方はそうしない。数
ラウンドのPCR増幅の後、ストレプトアビジン磁性ビー
ズを用いて産物を精製し、そして熱変性を用いて２つの
プライマー産物を特異的に溶出する。この方法は、本実
施例に記載の実験以外のセッティングにも使用される。
事実、この方法は、5'および3'；RACEのようなクローニ
ング方法、およびPCRにおいて縮重プライマーを使用す
る任意の方法における予備的工程を含有する、稀なDNA
配列を特異的に増幅することが望まれる適用において使
用される。
【０６９０】第１のPCR実行は、当該分野で公知の方
法、およびFFYXTE領域に対応する「K231」と命名された
配列5'ビオチン-GCCTATTT(TC)TT(TC)TA(TC)(GATC)(GAT
C)(GATC)AC(GATC)GA-3'を有する24量体正方向プライマ
ー、およびDDFL(FIL)I領域に対応する「K220」と命名し
た配列5'-CCAGATAT(GATC)A(TGA)(GATC)A(AG)(AG)AA(AG)
TC(AG)TC-3'を有する23量体逆方向プライマーを用いて
単離したTetrahymenaテンプレート巨大分子DNAを用いて
行った。このPCR反応は、2.5μl DNA(50ng)、4μlの各
プライマー（20μM）、3μl 10xPCR緩衝液、3μl 10xdT
NP、2μl Mg、0.3μlTaqおよび11.2μl dH2Oを含有し
た。混合物を45秒間の94℃、45秒間の37℃、および1分
間の72℃の８サイクルで行った。
【０６９１】このPCR反応物を200μlストレプトアビジ
ン磁性ビーズに結合させ、200μl TEで洗浄し、20μl d
H2Oに再懸濁し、次いで、100℃で2分間沸騰させること
によって熱変性させた。ビーズを引き寄せ、溶出物を取
り出した。次いで、α-32P dATPの0.3μlを含め、PCRを
33サイクル行った以外は、前記条件を用いて2.5μlのこ
の溶出物を引き続いて再増幅した。この反応を５％変性
ポリアクリルアミドゲルで泳動させ、適切な領域をゲル
から切り出した。次いで、これらの産物を、42℃アニー
リング温度を用いた以外は前記した条件下でさらに34サ
イクル再増幅した。
【０６９２】第２のPCR実行は、当該分野で公知の方
法、ならびに領域R(LI)(LI)PKKに対応する「K228」と命
名した配列5'-ACAATG(CA)G(GATC)(TCA)T(GATC)(TCA)T(G
ATC)CC(GATC)AA(AG)AA-3'を有する23量体正方向プライ
マー、およびＣＹＤＳＩＰＲ領域に対応する「K224」と
命名した配列5'-ACGAAT'C(GT)(GATC)GG(TAG)AT(GATC)(G
C)(TA)(AG)TC(AG)TA(AG)CA-3'を有する逆方向プライマ
ーを用いて単離したTetrahymena巨大分子DNAテンプレー
トを用いて行った。このPCR反応は2.5μl DNA(50ng)、
４μlの各プライマー（20μM）、３μl 10xPCR緩衝液、
３μl 10xdNTP、２μl Mg、0.3μl α-32P dATP、0.3μ
l Taq、および10.9μl dH2Oを含有した。この反応を５
％変性ポリアクリルアミドゲルで泳動させ、適当な領域
をゲルから切り出した。これらの産物を、42℃アニーリ
ング温度を用いた以外は前記した条件下でさらに34サイ
クル再増幅した。
【０６９３】泳動１からの10μlの反応作製物を200μlT
E中のストレプトアビジン被覆磁性ビーズに結合させ
た。ビーズを200μl TEで洗浄し、次いで、20μl dH2O
に再懸濁し、熱変性し、溶出物を取り出した。次いで、
泳動２からの反応作製物をビーズに添加し、30μl 0.5
×SSCで希釈した。混合物を94℃〜50℃で加熱した。溶
出物を取り出し、ビーズを55℃で0.5xSSC中で3回洗浄し
た。次いで、ビーズを20μl dH2Oに再懸濁し、加熱変性
し、溶出物を取り出し、「ラウンド１溶出物」と命名
し、保存した。
【０６９４】Tetrahymenaのバンドを単離するために、
ラウンド１溶出物を、正方向プライマーK228およびDIKS
CYD領域に対応する配列5'-CAATTCTC(AG)TA(AG)CA(GATC)
(CG)(TA)(CT)TT(AGT)AT(GA)TC-3'を有する逆方向プライ
マーK227で再増幅した。PCR反応を前記したように行っ
た。反応作製物を５％ポリアクリルアミドゲルで泳動さ
せ；約295ヌクレオチドに対応するバンドをゲルから取
り出し、配列決定した。
【０６９５】168-3と命名したクローンを配列決定し
た。（プライマー配列を含めた）DNA配列は以下のよう
に見い出された：
【０６９６】
【化３】
【０６９７】この遺伝子のさらなる配列は、配列5'-GAG
TGACATAATATACGTGA-3'を有する168-3(「K297」)からの配
列；およびK231(FFYXTE)プライマーに適合するように設
計した１つの独特なプライマーを用いるPCRによって得
られた。168-3と共に、この反応で得られたフラグメン
トの配列は以下の通りである（プライマー配列無し）：
【０６９８】
【化４】
【０６９９】このDNAフラグメントに対応するアミノ酸
配列は以下のように見い出された：
【０７００】
【化５】
【０７０１】次いで、アミノ酸配列を他のテロメラーゼ
遺伝子（EST2p、およびEuplotes）とアラインメントさ
せた。このアラインメントを図53に示す。コンセンサス
配列もこの図に示す。
【０７０２】Ｐ．Schizosaccharomyces pombeテロメラ
ーゼ配列の同定 本実施例において、S. pombeのtez1配列は、E.aedicula
tus p123、およびS. cerevisiae Est2pのホモログとし
て同定された。
【０７０３】図55はこれらの実験の総じての要約を提供
する。この図において、頂部（パネルＡ）は2つの重複
するゲノムクローンの関係および配列決定した5825bpの
部分を示す。「tez1+」と命名した領域は、同様に示す
フランキング配列をともなう、タンパク質コード領域で
あり、5825bp領域の下の四角は、下記のようにtez1破壊
構築物を作製するのに使用した約2kbのHindIIIフラグメ
ントである。
【０７０４】図55の底部半分（パネルＢ）はDNAのこの
同一領域の「クローズアップ」模式図である。「オリジ
ナルPCR」と命名した配列は、記載するように、Euplote
s配列モチーフ4（Ｂ’）およびモチーフ5（Ｃ）に基づ
いて設計した縮重オリゴヌクレオチドプライマー対で生
じさせたオリジナルの縮重PCRフラグメントである。
【０７０５】ｉ）縮重プライマーでのPCR 縮重プライマーを用いるPCRを用いて、S. pombeにおけ
るE. aediculatus p123のホモログを見出した。図56
は、この反応で使用した縮重プライマー（「ポリ4」お
よび「ポリ1」と命名した）の配列を示す。PCR反応(ru
n)は、94℃における5分間のランプ時間、続いての30秒
間の94℃、45秒間の50℃、および30秒間の72℃の30サイ
クル、ならびに72℃の7分間で、先の実施例（例えば、
前記パートＫを参照のこと）に記載したのと同一の緩衝
液を用いて行い、続いて4℃で貯蔵した。PCR反応を、変
化する条件（すなわち、種々のS. pombe DNAの濃度およ
びMgCl2濃度）を用いて行った。PCR産物をアガロースゲ
ルで泳動し、そして前記したようにエチジウムブロミド
で染色した。いくつかのPCR反応の結果、3つのバンドの
生成を生じた（「Ｔ」、「Ｍ」および「Ｂ」と命名し
た）。前記したのと同一の条件を用い、これらのバンド
を再増幅し、そしてゲルで泳動した。図57に示すよう
に、4つのバンドがこの再増幅の後に観察された
（「Ｔ」、「Ｍ1」、「Ｍ2」および「Ｂ」）。次いで、
これらの4つのバンドを、前記したのと同一条件を用い
て再増幅した。図57におけるレーンの頂部から第3のバ
ンドは、テロメラーゼタンパク質についての正しい配列
を含有するものとして同定された。M2と命名したPCR産
物は、図58に示すように、他のテロメラーゼタンパク質
との合理的なマッチを示すことが見い出された。示した
アラインメントに加えて、この図もtez1の実際の配列を
示す。この図において、アステリスクはすべての4つの
配列で共有された残基を示す（Oxytricha 「Ot」; E. aed
iculatus「Ea p123」；S. cerevisiae「Sc p103；およ
びM2）、他方、丸（すなわち、ドット）は類似のアミノ
酸残基を示す。
【０７０６】ii）3'RT PCR さらなる配列情報を得るために、3'および5'RT PCRを、
図58に同定されるテロメラーゼ候補に対して行った。図
59は使用した3'RT PCR戦略の模式図を提供する。まず、
オリゴヌクレオチドプライマー「QT」(5'-CCA GTG AGC
AGA GTG ACG AGG ACT CGA GCT CAA GCT TTT TTT TTT TT
T TT-3')を用いてmRNAからcDNAを調製し、次いでこのcD
NAを「QO」(5'-CCA GTG AGC AGA GTG ACG-3')、および
オリジナルの縮重PCR反応に基づいて設計されたプライ
マー（すなわち、配列5'-G TGT CAT TTC TAT ATG GAA G
AT TTG ATT GAT G-3'を有する「M2-T」）にてのPCR用の
テンプレートとして用いた。「Ql」(5'-GAGGACTCGAGCTCA
AGC-3')、およびオリジナル縮重PCR反応に由来する配列
を用いて設計した別のPCRプライマーまたは「M2-T2」(5'-
AC CTA TCG TTT ACG AAA AAG AAA GGA TCA GTG-3')にて
の第2のPCR反応（すなわち、ネステッド(nested)PC
R）。このPCRで使用した緩衝液は前記したのと同一であ
り、５分間の94℃のランプアップで開始し、続いての30
秒間の94℃、30秒間の55℃、および3分間の72℃の30サ
イクル、続いての72℃の7分間にて増幅を行った。反応
産物は使用するまで4℃で保存した。
【０７０７】iii）ゲノムライブラリーおよびcDNAライ
ブラリーのスクリーニング このさらなる配列情報を得た後、いくつかのゲノムライ
ブラリーおよびcDNAライブラリーをスクリーニングし
て、このテロメラーゼ候補遺伝子を含有するすべてのラ
イブラリーを同定した。使用したアプローチ、ならびに
ライブラリーおよび結果を、図60に示す。この図におい
て、パネルＡはこの実験で試験したライブラリーを列挙
し；パネルＢは使用した領域を示し；パネルＣおよびＤ
はこれらのライブラリーで得られたドットブロットハイ
ブリダイゼーションの結果を示す。次いで、コロニーハ
イブリダイゼーションによって陽性ライブラリーをスク
リーニングして、tez1遺伝子のゲノムおよびcDNAバージ
ョンを得た。本実験において、HindIIIゲノムライブラ
リーからの約3×104コロニーをスクリーニングし、そし
て6つの陽性クローンを同定した（約0.01％）。次い
で、DNAを2つの独立したクローン（Ａ5およびＢ2）から
調製した。図61は、HindIII消化したＡ5およびＢ2陽性
ゲノムクローンで得られた結果を示す。
【０７０８】さらに、cDNA REPライブラリーを使用し
た。約3×105コロニーをスクリーニングし、そして5つ
の陽性クローンを同定した（0.002％）。３つの独立し
たクローン（2-3、4-1、および5-20）からDNAを調製し
た。後の実験において、クローン2-3および5-20は同一
のインサートを含有すると判断された。
【０７０９】iv）5'RT PCR この時点までに生成された遺伝子のcDNAバージョンは完
全ではなかったので、5'RT-PCRを行って全長クローンを
得た。戦略を模式的に図62で示す。この実験において、
以前に同定したtez1の既知領域から設計したDNAオリゴ
ヌクレオチドプライマー「M2-B」(5'-CAC TGA TCC TTT
CTT TTT CGT AAA CGA TAG GT-3')および「M2-B2」(5'-C
ATC AAT CAA ATC TTC CAT ATA GAA ATG ACA-3')を用い
てcDNAを調製した。次いで、リン酸化5'末端（「Ｐ」）
を有するオリゴヌクレオチドリンカーPCR Adapt SfiI(P
-GGG CCG TGT TGG CCT AGT TCT CTG CTC-3')を、このcD
NAの3'末端にて連結し、そしてこの構築物をネステッド
PCR用のテンプレートとして使用した。PCRの最初のラウ
ンドにおいて、PCR Adapt SFIおよびM2-Bをプライマー
として使用し；他方、PCR Adapt SfiII(5'-GAG GAG GAG
AAG AGC AGA GAA CTA GGC CAA CAC GCC CC-3')、およ
びM2-B2を第2ラウンドにおけるプライマーとして使用し
た。ネステッドPCRを使用して反応の特異性を増大させ
た。
【０７１０】ｖ）配列アラインメント 一旦tez1の配列を同定したら、それを以前に記載された
配列と比較した。図63はS. pombe（「S.p. Tezlp」）、S.
cerevisiae（「S.c. Est2p」）およびE. aediculatus p1
23(「E.a. p123」)のテロメラーゼ触媒サブユニットから
のRTドメインのアラインメントを示す。この図におい
て、「ｈ」は疎水性残基を示し、他方、「ｐ」は小極性
残基を示し、そして「ｃ」は荷電残基を示す。アライン
メントの上に示したアミノ酸残基は、Y. XiongおよびT.
H. Eickbush の既知コンセンサスRTモチーフを示す(Y.
XiongおよびT. H. Eickbush, EMBO J., 9: 3353-3362
[1990])。アステリスクは全ての3つのタンパク質で保存
された残基を示す。「モチーフＯ」が、本明細書および
図63において、このテロメラーゼサブユニットに対して
特異的であり、そして一般に逆転写酵素では見出されな
いモチーフとして同定される。従って、それは、テロメ
ラーゼ触媒サブユニットとしての他のアミノ酸配列を同
定するにおいて価値がある。
【０７１１】図64は、Euplotes（「Ea p123」、S. cere
visiae（「Sc Est2p」）、およびS.pombe（「Sp Tezl
p」）からの全体の配列のアラインメントを示す。パネル
Ａにおいて、陰影を施した領域は2つの配列の間で共有
される残基を示す。パネルＢにおいて、陰影を施した領
域は全ての3つの配列の間で共有された残基を示す。
【０７１２】vi）tezlの遺伝子破壊 本実施例では、tezlの破壊の効果を調べた。テロメラー
ゼはテロメア維持に関与するので、もしtezlが実際にテ
ロメラーゼ成分であれば、tezlの破壊は徐々にテロメア
の短縮化を引き起こすであろうと仮定した。
【０７１３】これらの実験において、相同組換えを用い
て、S. pombeにおけるtezl遺伝子を特異的に破壊した。
このアプローチを図65に模式的に示す。図65に示すよう
に、野生型tezlを、ura4またはLEU2マーカーを含有する
フラグメントで置き換えた。
【０７１４】tezl遺伝子の破壊をPCRによって確認し
（図66）、そしてサザンブロットを行って、テロメア長
につきチェックした。図67はこの実験についてのサザン
ブロットの結果を示す。ApaI制限酵素部位がS. pombeに
おけるテロメア配列に直ぐに隣接して存在するので、S.
pombeゲノムDNA調製物のApaI消化はテロメア長の分析
を可能とする。従って、S. pombeからのDNAをApaIで消
化し、そして消化産物をアガロースゲルで泳動し、そし
てテロメア配列特異的プローブでプローブして、破壊し
たS. pombe細胞のテロメアが短縮化されたか否かを判断
した。結果を図67に示す。これらの結果から、tezl遺伝
子の破壊がテロメアの短縮化を引き起こしたことが明ら
かである。
【０７１５】Ｑ．ヒトテロメラーゼタンパク質およびcD
NAのクローニングおよび特徴付け 本実施例では、ヒトテロメラーゼについての核酸および
アミノ酸配列情報を決定した。Euplotes 123kDaペプチ
ドおよび核酸配列、ならびにSchizosaccharomycesタン
パク質および対応するcDNA(tezl)配列を用いて行ったBL
ASTサーチにおいて、部分相同配列をまず同定した。ヒ
ト配列（「hTCP1.1」ともいう）を部分cDNAクローン
（クローン712562）から同定した。このクローンからの
配列を先の実施例に記載したように決定した配列とアラ
インメントした。
【０７１６】図１は、Euplotes（「p123」）、Schizosacc
haromyces(「tezl」)、Est2p（すなわち、Est2核酸配列に
よってコードされ、本明細書において「L8543.12」ともい
うS.cerevisiaeタンパク質）、およびこの比較サーチで
同定されたヒトホモログの配列アラインメントを示す。
図51はtezlのアミノ酸配列を示し、他方、図52はtezlの
DNA配列を示す。図52において、イントロンおよび他の
非コード領域を小文字で示し、他方、エキソン（すなわ
ち、コード領域）を大文字で示す。
【０７１７】図に示すように、これらのタンパク質の間
で高度に保存された領域がある。例えば、図1に示すよ
うに、「モチーフ0」、「モチーフ1」、「モチーフ2」
および「モチーフ3」における同一性の領域がある。同
一のアミノ酸はアステリスク(*)で示し、他方、類似の
アミノ酸残基は丸（●）で示す。このことは、酵母から
繊毛虫からヒトまでの範囲にわたり、広範な真核生物の
間で保存された領域がテロメラーゼモチーフ内にあるこ
とを示す。さらなる生物は同様に配列のこのような保存
された領域を含むと考えられる。図49はヒトテロメラー
ゼモチーフの部分的アミノ酸配列を示し、他方、図50は
対応するDNA配列を示す。
【０７１８】当該分野で公知の、Sangerのジデオキシ配
列決定およびその他の方法を用いて、クローン712562の
完全な配列情報を得た。配列決定で使用したプライマー
のいくつかを表7に示す。これらのプライマーを、プラ
スミド骨格配列またはクローン中のヒトcDNAインサート
の配列のいずれかに相補的な配列に基づいて、クローン
にハイブリダイズするように設計した。
【０７１９】
【表２１】
【０７２０】これらの実験より、クローン712562のEcoR
I-NotIインサートは、ヒトテロメラーゼタンパク質につ
いての部分的オープンリーディングフレームのみを含有
するが、そのタンパク質の活性フラグメントをコードし
得ると判断された。このクローンにおけるオープンリー
ディングフレームは約63kDのタンパク質をコードする。
同定された最長オープンリーディングフレームの配列を
図68に示す。ORFは図に示した「met」にてのATGコドン
で始まる。配列の3'末端におけるポリＡテールも示す。
図69はヒト配列（ヒトテロメラーゼコアタンパク質1、
「Hs TCP1」）、E.aediculatus p123(「Ep p123」)、S. pom
be tezl(「Sp Tezl」)、S. cerevisiae EST2(Sc Est2)、
およびコンセンサス配列からのテロメラーゼ逆転写酵素
タンパク質の仮の予備的アラインメントを示す。この図
では、種々のモチーフが示される。
【０７２１】全長クローンを得るために、cDNAライブラ
リーのプロービングおよび5'-RACEを用いて、以前にク
ローン化されなかった領域の部分をコードするクローン
を得た。これらの実験において、RACE（cDNA末端の迅速
増幅；例えば、M. A. Frohman, 「RACE: cDNA末端の迅
速増幅」，Innisら(編), PCR Protocols: A Guide to Me
thods and Applications [1990], 28-38頁;およびFrohm
anら, Proc. Natl. Acad. Sci., 85:8998-9002 [1988])
を用いて、配列分析用の材料を生成させた。4つのこの
ようなクローンを生成させ、そしてこれを用いてさらな
る5'配列情報を提供した（pFWRP5、6、19および20）。
【０７２２】さらに、ヒトcDNAライブラリー（λへ挿入
された）をクローンのEcoRI-NotIフラグメントでプロー
ブした。「λ25-1.1」と命名した1つのλクローン（ATC
C受託番号#209024）は相補的配列を有するものとして同
定された。図75は、このλクローンの制限地図を示す。
このクローンからのヒトcDNAインサートを、市販のファ
ージミドpBluescriptIISK+（Stratagene)のEcoRI部位へ
EcoRI制限フラグメントとしてサブクローン化して、プ
ラスミド「pGRN121」を作製し、これをATCCに寄託した
（ATCC受託番号#209016）。予備的結果は、プラスミドp
GRN121はヒトテロメラーゼタンパク質をコードする全体
のオープンリーディングフレーム（ORF）を含有するこ
とを示した。
【０７２３】当該分野で公知の技術を用い、プラスミド
pGRN121のcDNAインサートを配列決定した。図70は、こ
の予備的作業に基づいて同定されたプラスミドpGRN121
の制限部位および機能地図を提供する。この予備的配列
分析の結果を図71に示す。この分析から、および図70に
示すように、コード領域についての推定開始部位は、Ec
oRI部位（707位に位置する）から約50ヌクレオチドにて
同定され、そしてヌクレオチド#3571における推定終止
部位に加えて、テロメラーゼ−特異的モチーフ「FFYVT
E」、「PKP」、「AYD」、「QG」および「DD」の位置が
同定された（図72を参照のこと、これは、DNAおよび配
列中のオープンリーディングフレーム（「ａ」、「ｂ」
および「ｃ」）に対応するアミノ酸配列を示す）。しか
し、初期の配列決定作業の予備的性質のため、種々のモ
チーフについてのリーディングフレームはアラインメン
トにおいては見出されなかった。
【０７２４】pGRN121に対して行ったさらなる分析は、
このプラスミドが、クローン712562に存在しないコード
配列の5'末端からの有意な部分を含有したことを示し
た。さらに、pGRN121は、約182ヌクレオチドのインサー
トを含む変異体コード配列を含有することが判明した。
このインサートはこのクローンには存在しないことが判
明した。E. aediculatus配列に関しては、このような変
異体は、テロメラーゼアッセイのような機能的アッセイ
において試験して、試料中の機能的テロメラーゼの存在
を検出し得る。
【０７２５】さらなる配列分析は、pGRN121のcDNA配列
を解明して、図74に示すように約127,000ダルトンの分
子量、および1132アミノ酸の部分をコードする連続した
オープンリーディングフレームを提供した。この分析に
基づくpGRN121の洗練された地図を図73に提供する。hTR
T cDNAのさらなる配列分析の結果を図16に示す（配列番
号1）。
【０７２６】実施例２ hTRTの豊富さと細胞不死性との相関 hTRT mRNAの相対的豊富さを、6つのテロメラーゼ陰性の
有寿命細胞株および6つのテロメラーゼ陽性不死細胞株
において評価した（図5）。hTRT mRNAの定常状態レベル
は、以前に活性テロメラーゼを有することが示されてい
る不死細胞株において有意に増加した。より低レベルの
hTRT mRNAが、いくつかのテロメラーゼ陰性細胞株にお
いて検出された。
【０７２７】hTRT、hTR、TP1（Tetrahymena p80に関連
するテロメラーゼ会合タンパク質［Harringtonら, 199
7, Science 275:973:Nakayamaら, 1997, Cell 88:875])
および（RNAテンプレートの同等量について標準化する
ための）GAPDHについてのRT-PCRを以下の細胞に由来す
るRNAに対して行った：（1）ヒト胎児肺線維芽細胞GF
L、（2）ヒト胎児皮膚線維芽細胞GFS、（3）成人前立腺
線維芽細胞31YO、（4）ヒト胎児膝滑膜線維芽細胞HFS、
（5）新生児包皮線維芽細胞BJ、（6）ヒト胎児肺線維芽
細胞IMR90、および不死化細胞株；（7）メラノーマLOX
IMVI、（8）白血病U251、（9）NCI H23肺ガン、（10）
結腸腺ガンSW620、（11）乳腫瘍MCF7、（12）293アデノ
ウイルスＥ1形質転換ヒト胚腎臓細胞株。
【０７２８】合計31サイクルの間（94℃45秒間、60℃45
秒間、72℃90秒間）、オリゴヌクレオチドプライマーLT
5およびLT6（表２〜６）を用い、hTRT核酸をcDNAから増
幅した。合計16サイクル（94℃45秒間、55℃45秒間、72
℃90秒間）の間、プライマーKI36(5'-CTCAGACACCATGGGG
AAGGTGA)およびK137(5'-ATGATCTTGAGGCTGTTGTCATA)を用
い、GAPDHを増幅した。合計22サイクルの間（94℃45秒
間、55℃45秒間、72℃90秒間）、プライマーF3b(5'-TCT
AACCCTAACTGAGAAGGGCGTAG)およびR3c(5'-GTTTGCTCTAGAA
TGAACGGTGGAAG)を用い、hTRを増幅した。28サイクル（h
TRTと同じサイクル）の間、プライマーTP1.1およびTP1.
2を用い、TP1 mRNAを増幅した。反応産物を8％ポリアク
リルアミドゲルで分離し、SYBR Green（Molecular Prob
es)で染色し、そしてStrom860 (Molecular Dynamics)で
スキャニングすることによって可視化した。図５に示す
結果は、hTRT mRNAレベルは試験した細胞におけるテロ
メラーゼ活性と直接的に相関することを示す。
【０７２９】実施例３ hTRTイントロン配列の特徴付け まず、本実施例に記載したように、ヒトゲノムDNAのPCR
増幅によって推定イントロンを同定し、引き続いて、ゲ
ノムクローンλＧφ5を配列決定することによって確認
した（実施例４を参照のこと）。逆方向プライマーTCP
1.46、TCP1.48、TCP1.50、TCP1.52、TCP1.54、TCP1.5
6、およびTCP1.58（表２〜６を参照のこと）と個々に対
とした正方向プライマーTCP1.57を用い、PCR増幅を行っ
た。TCP1.57/TCP1.46、TCP1.48、TCP1.50、TCP1.52、TC
P1.54またはTCP1.56増幅のゲノムDNAからの産物は、pGR
N121増幅の産物よりも約100塩基対大きかった。TCP1.57
/TCP1.58増幅は、ゲノムDNAまたはpGRN121 DNAのいずれ
についても同一であった。このことは、ゲノムDNAがTCP
1.58およびTCP1.50についての部位の間に挿入を含有し
たことを示した。TCP1.57/TCP1.50およびTCP1.57/TCP1.
52のPCR産物を、プライマーTCP1.39、TCP1.57、およびT
CP1.49を用い、サブクローニングすることなく、直接配
列決定した。
【０７３０】以下で示すように、104塩基のイントロン
配列（配列番号７）が、図16の塩基274および275に対応
する部位において、hTRT mRNAに挿入される（太字で示
す）。
【０７３１】
【化６】
【０７３２】「/」は、スプライス部位を示す；配列は
ヒトイントロンに典型的なコンセンサス5'および3'スプ
ライス部位配列に対して良好なマッチを示す。
【０７３３】このイントロンは、トポイソメラーゼII切
断部位およびNFκB結合部位に特徴的なモチーフを含有
する（図21を参照のこと）。部分的には、トポイソメラ
ーゼIIの発現はほとんどの腫瘍においてアップレギュレ
ートされるので、これらのモチーフは興味深い。それ
は、DNAを切断し、巻き戻し、従って、特定の遺伝子の
発現を増大させることによって、DNAを弛緩させるよう
に機能する。トポイソメラーゼIIのインヒビターは抗腫
瘍剤として作用することが示されている。NFκBの場合
には、この転写因子は、発生の間のテロメラーゼの初期
抑制におけるような、末端分化の間にテロメラーゼの調
節において役割を果たし得、従って、細胞においてテロ
メラーゼ活性を調節する処置的介入のための別の標的で
ある。
【０７３４】実施例４ λファージＧφ５のクローニングおよびhTRTゲノム配列
の特徴付け Ａ．λＧφ5 PCRおよびハイブリダイゼーションによってヒトゲノムD
NAライブラリーをスクリーニングして、hTRT RNAコード
配列を含有するゲノムクローンを同定した。ライブラリ
ーはWI38肺線維芽細胞からのDNAを用いて作製したヒト
線維芽細胞ゲノムライブラリーであった（Stratagene,
カタログ番号946204)。このライブラリーにおいて、部
分的Sau3AIフラグメントをLambda FIX(登録商標)RIIベ
クター（Stratagene）のXhoI部位に、9〜22kbのインサ
ートサイズを有して連結した。
【０７３５】ゲノムライブラリーを各150,000ファージ
のプールに分割し、そして各プールをネステッドPCR
（外側プライマー対TCP1.52およびTCP1.57；内側対TCP
1.49およびTCP1.50、表1を参照のこと）によってスクリ
ーニングした。これらのプライマー対は、hTRTのゲノム
DNAにおける推定イントロン（実施例3、上記を参照のこ
と）にわたり、そしてPCR産物がhTRT cDNAクローンによ
る混入からではなくゲノム供給源由来であることを確認
した。陽性プールをさらに、2000ファージのプールが得
られるまで細分化した。このプールを低密度でプレーテ
ィングし、そして図16の塩基対1552〜2108（それぞれ、
制限部位SphIおよびEcoRV）を含むDNAフラグメントとの
ハイブリダイゼーションを介してスクリーニングした。
【０７３６】２つの陽性クローンを単離し、前記したよ
うにネステッドPCRを介して再度スクリーニングし；両
クローンはPCRにより陽性であった。クローンの1つ(λG
Φ5)をNotIで消化し、約20kbのインサートサイズが明ら
かとなった。引き続いてのマッピング（下記を参照のこ
と）は、インサートサイズが15kbであること、およびフ
ァージGΦ5がcDNA配列の開始部位の上流約13kbのDNAを
含有することを示した。
【０７３７】ファージGΦ5を、制限酵素消化およびDNA
配列決定によってマップした。得られたマップを図7に
示す。ファージDNAをNcoIで消化し、そしてフラグメン
トをpBBS167にクローン化した。得られたサブクローン
をPCRによってスクリーニングして、hTRT cDNAの5'領域
に対応する配列を含有するものを同定した。（hTRT遺伝
子配列および4〜5kbのλベクター配列を有する）9kb Nc
oIフラグメントを含むサブクローン(pGRN140)を部分的
に配列決定して、インサートの方向を決定した。SalIを
用いてpGRN140を消化して、λベクター配列を除去し
て、pGRN144を得た。次いで、pGRN144を配列決定した。
配列決定の結果を図21に提供する。hTRTmRNAの5'末端は
図21の塩基2441に対応する。図7に示すように、2つのAl
u配列エレメントがhTRT cDNAの5'末端の1700塩基対上流
に位置し、そしてhTRTのプロモーター領域に対してそれ
らしい上流限界を提供する。この配列はまた、実施例3
（上記）に記載したイントロンの3'側に、図21における
塩基4173に位置するイントロンを明らかとした。
【０７３８】Ｂ．さらなるゲノムクローン 前記したゲノムクローンに加えて、２つのP1バクテリオ
ファージクローンおよび1つのヒトBACクローンが本発明
の例示的実施態様として提供される。P1インサートは、
通常、75〜100kbであって、BACインサートは、通常、10
0 Kbを超える。
【０７３９】P1クローン（DMPC-HFF#1-477(F6)-GS#1537
1およびDMPC-HEF#1-1103(H6)-GS#15372)を、hTRTの3'末
端を増幅するプライマーTCP1.12およびUTR2を用い、ヒ
ト包皮線維芽細胞（Shepherdら, 1994, PNAS USA 91:26
29)に由来するヒトP1ライブラリーのPCRスクリーニング
によって得た。これらのクローンの両方は、hTRTの5'末
端を増幅するプライマーで、陰性（増幅されない）であ
った。
【０７４０】ヒトBACクローン（326E20）は、RTモチー
フ領域を含むpGRN121（図16；塩基1552〜2695）の1143
bp Sph1/Xmn1フラグメントを用い、BACヒトゲノムライ
ブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニングで得
た。このクローンは遺伝子の5'末端を含むと考えられて
いる。本実施例におけるhTRTゲノムクローンは全体のhT
RT遺伝子を含むと考えられる。
【０７４１】実施例５ hTRT遺伝子の染色体位置 hTRT遺伝子は、全ヒトゲノム（Stanford Human Genome
Centerで作製された)の83RHクローンの中解像度(medium
resolution)Stanford Ｇ3パネルを用い、照射(radiati
on)ハイブリッドマッピング（Boehnkeら, 1991, Am J H
um Genet 49:1174; Walterら, 1994, Nature Genet 7:2
2)によって、染色体5ｐに位置付けられた。ヒトリンパ
芽球様細胞株（ドナー：rM）を10,000ラドのＸ線に暴露
し、次いで、非照射ハムスターレシピエント細胞（A3）
と融合させた。83の独立した体細胞ハイブリッドクロー
ンを単離し、そしてそれぞれは照射ドナー細胞とレシピ
エントハムスター細胞との間の融合事象を表す。G3 DNA
のパネルを、目的の領域においてマーカーを順序付ける
ため、ならびにこれらのマーカー間の距離を確立するた
めに使用した。
【０７４２】RHマッピングで使用したプラスマーは、Bo
ehringer Mannheim Taq緩衝液およびPerkin-Elmer Taq
を用いる94℃45秒間、55℃45秒間、72℃45秒間の45サイ
クルの増幅条件でのTCP1.12およびUTR2であった。83プ
ールを独立して増幅し、そして14(17％)が（346bpバン
ドの出現によって）hTRTについて陽性であると評価し
た。増幅結果をStanford RHサーバーに提出し、次い
で、これはマップ位置5pおよび最も密接なマーカーSTS
D5S678を提供した。
【０７４３】Genethonゲノムマッピングウェブサイトを
問うことによって、マツプ位置は、STSマーカーD5S678:
CEPH YAC 780 C 3サイズ：390,660kbを含有するYACを同
定した。このYACはまた、染色体17マーカー含有した。
この結果は、hTRT遺伝子は染色体5上のテロメア末端近
くにあることを示した。多数の腫瘍において5pのコピー
数が増大した。猫鳴き症候群もまた、この領域における
欠失に対してマップされている。
【０７４４】実施例６ hTRTタンパク質およびポリヌクレオチドの発現用ベクタ
ーの設計および構築細菌におけるhTRTの発現 本実施例の以下の部分は、大量の全長の生物学的活性hT
RTを生成させるためのhTRT発現細菌および真核生物細胞
の発現ベクターの設計を詳細に記載する。この方法での
生物学的に活性なhTRTタンパク質の生成は、いくつかの
例として、テロメラーゼ再構築アッセイ、テロメラーゼ
活性モジュレーターのアッセイ、hTRTの新しく単離され
た種の活性の分析、hTRTと特異的に会合する化合物の同
定および単離、部位特異的に変異したhTRT変異型タンパ
ク質の活性の分析に、および免疫原として有用である。
【０７４５】pThioHis A/h TRT細菌発現ベクター 大量の全長hTRTを生成させるために、細菌発現ベクター
pThioHis A（Invitrogen, San Diego、CA)を発現系とし
て選択した。hTRT−コーディングインサートは、プラス
ミドpGRN121におけるhTRTインサートのヌクレオチド707
〜4776を含む。このヌクレオチド配列は、hTRTタンパク
質の完全なコード配列を含む。
【０７４６】本発明のこの発現ベクターは、細菌におけ
る誘導性発現のために設計される。このベクターを誘導
して、E. coliにおいて、切断可能なHISタグしたチオレ
ドキシン部分および全長hTRTタンパク質よりなる高レベ
ルの融合タンパク質を発現させ得る。この発現系の使用
は、製造業者の説明書に実質的に従った。本発明の得ら
れたベクターによってコードされる融合タンパク質のア
ミノ酸配列を以下に示す;(-*-)はエンテロキナーゼ切断
部位を示す。
【０７４７】
【化７】
【０７４８】pGRN121のhTRTヌクレオチド3272〜4177を
有するpGEX-2TK 本発明のこの構築物を用いて、例えば、hTRTタンパク質
に対するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体
を産生させる目的で、融合タンパク質を生成させる。hT
RTのフラグメントはまた、例えば、ドミナントネガティ
ブ変異体としてテロメラーゼ活性を調節するか、あるい
はテロメラーゼ成分と他のタンパク質または核酸との会
合を防げるような、他の目的のために使用され得る。
【０７４９】大量のhTRTタンパク質フラグメントを生成
させるために、E. coli発現ベクターpGEX-2TK（Pharmac
ia Biotech, Piscataway N.J)を選択し、そして製造業
者の説明書に本質的に従って用いて、本発明の発現ベク
ターを作製した。得られた構築物はプラスミドpGRN121
におけるhTRTインサートのヌクレオチド3272から4177に
由来するインサートを含有する。このベクターは、下記
に示すように、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ配
列（下方に下線）、トロンビン切断配列（二重下線）、
心筋タンパク質キナーゼの認識配列（イタリック体）、
括弧中のクローニングによって導入された残基（[GSVT
K]）およびhTRTタンパク質フラグメント（太字）よりな
る高レベルの融合タンパク質のE. coliにおける発現を
指向する。
【０７５０】
【化８】
【０７５１】この融合タンパク質を発現させると、それ
は不溶性凝集物を形成した。それを、封入体からのタン
パク質の精製と題した節において前記したように一般的
に処理した。具体的には、誘導された細胞をPBS（20mM
リン酸ナトリウム、pH7.4、150mM NaCl）に懸濁し、そ
して超音波処理によって破壊した。NP−40を0.1％まで
添加し、そして混合物を穏やかに混合しつつ4℃で30分
間インキュベートした。4℃で30分間25,000ｇで遠心分
離することによって、不溶性物質を収集した。不溶性物
質をPBS中の4Ｍ尿素中で1回洗浄し、遠心分離によって
収集し、次いでPBS中で再度洗浄した。収集したペレッ
トは、75％を超える融合タンパク質を含有すると評価さ
れた。この物質をスピードバキューム(speed vacuum)中
で乾燥し、次いで、抗体の生成のためのマウスおよびウ
サギへの注射用のアジュバントに懸濁した。グルタチオ
ン-S-トランスフェラーゼ部分からの組換えタンパク質
の分離は、製造業者のに従ってトロンビンを用いる部位
特異的タンパク分解によって達成される。
【０７５２】HIS-8タグを含むpGRN121のhTRTヌクレオチ
ド2426〜3274を有するpGEX-2TK 大量のhTRTのフラグメントを生成させるために、別のE.
coli発現ベクターpGEX−2TK構築物を調製した。この構
築物はプラスミドpGRN121におけるhTRTインサートのヌ
クレオチド2426〜3274に由来するインサートおよび8つ
の連続的ヒスチジン残基（HIS-8タグ）をコードする配
列を含有する。HIS-8 TAGを挿入するために、pGRN121の
hTRTヌクレオチド2426〜3274を有するpGEX-2TKベクター
をBamHIで線状化した。これはGST−トロンビン−心筋タ
ンパク質キナーゼとhTRTコード配列との間の接合におい
てプラスミドを開環させた。BamHI適合末端を有する二
本鎖オリゴヌクレオチドを線状化プラスミドに連結させ
て、hTRT配列の上流の8個のヒスチジン残基のインフレ
ーム導入がなされた。
【０７５３】このベクターは、E. coliにおけるグルタ
チオン-S-トランスフェラーゼ配列（下線）；トロンビ
ン切断配列（二重下線）；心筋タンパク質キナーゼの認
識配列（イタリック体）；括弧内にあるクローニングに
よって導入された３残基の組および５残基の組（［GS
V］および［GSVTK］）；8つの連続ヒスチジン（また二
重下線）；およびhTRTタンパク質フラグメント（太
字）：よりなる融合タンパク質の高レベルの発現を指向
する。
【０７５４】
【化９】
【０７５５】本発明のpGEX-2TKベクターのそれぞれを用
いて、hTRTタンパク質に対してポリクローナル抗体およ
びモノクローナル抗体を生成させる目的のために融合タ
ンパク質を生成させ得る。加えて、この融合タンパク質
を用いて、融合タンパク質内に含まれるhTRTペプチドに
対して生成される抗体をアフィニティー精製し得る。グ
ルタチオンＳ-トランスフェラーゼ部分に由来する組換
えタンパク質の分離は、製造業者の指示に従ってトロン
ビンを用いる部位特異的タンパク分解によって達成する
ことができる。
【０７５６】pGRN121のhTRTヌクレオチド2426〜3274を
有し、HIS-8タグを含まないpGEX-2TK大量のhTRTのフラ
グメントを生成させるために、別のE. coli発現ベクタ
ーpGEX-2TK構築物を調製した。
【０７５７】この構築物は、プラスミドpGRN121におけ
るhTRTインサートのヌクレオチド2426〜3274に由来する
インサートを含むが、前記構築物のHIS-8タグを含まな
い。このベクターは、グルタチオン-S-トランスフェラ
ーゼ（下線）、トロンビン切断配列（二重下線）、心筋
タンパク質キナーゼの認識配列（イタリック体）、括弧
内のクローニングによって導入された残基（[GSVT
K]）、およびhTRTタンパク質フラグメント（太字）より
なる融合タンパク質の高レベルのE. coliにおける発現
を指向する。
【０７５８】
【化１０】
【０７５９】pGRN121のhTRTヌクレオチド1625〜2458を
有するpGEX-2TK 大量のhTRTタンパク質のフラグメントを生成させるため
に、別のE. coli発現ベクターpGEX-2TK構築物を調製し
た。
【０７６０】この構築物はプラスミドpGRN121におけるh
TRTインサートのヌクレオチド1625〜2458に由来するイ
ンサートを含有する。このベクターは、グルタチオン-S
-トランスフェラーゼ（下線）、トロンビン切断配列
（二重下線）、心筋タンパク質キナーゼの認識配列（イ
タリック体）、括弧内のクローニングによって導入され
た残基（[GSVTK]）、およびhTRTタンパク質フラグメン
ト（太字）よりなる融合タンパク質の高レベルのE. col
iにおける発現を指示する。
【０７６１】
【化１１】
【０７６２】pGRN121のhTRTヌクレオチド782〜1636を有
するpGEX-2TK 大量のhTRTタンパク質のフラグメントを生成させるため
に、別のE. coli発現ベクターpGEX-2TK構築物を調製し
た。
【０７６３】この構築物はプラスミドpGRN121におけるh
TRTインサートのヌクレオチド782〜1636に由来するイン
サートを含有する。このベクターは、グルタチオン-S-
トランスフェラーゼ（下線）、トロンビン切断配列（二
重下線）、心筋タンパク質キナーゼについての認識配列
（イタリック体）、括弧内のクローニングによって導入
された残基（[GSVTK]）、およびhTRTタンパク質フラグ
メント（太字）よりなる融合タンパク質の高レベルのE.
coliにおける発現を指向する。
【０７６４】
【化１２】
【０７６５】5'−非コード配列を欠くhTRT cDNAを有す
るpT7FLhTRT 前記のように、1つの実施態様において、本発明は、い
ずれの5'非翻訳hTRT配列も有さない細菌、哺乳動物、酵
母および昆虫の発現ベクターへのクローニングを容易に
するための部位特異的な様式で改変されたhTRTを提供す
る。いくつかの状況において、非タンパク質をコードす
る配列の量を最小にすることは、改善されたタンパク質
産生（収率）および増大したmRNA安定性を可能とする。
本発明のこの実施態様において、hTRT遺伝子の5'非コー
ド領域を、細菌発現ベクターへのクローニングに先立っ
て除去した。
【０７６６】これは、hTRTコード配列の開始コドン（AT
G）に対してすぐ上流（5'側）にさらなる制限エンドヌ
クレアーゼ部位を操作することによって行った（図1
6）。タンパク質のコード領域に対してすぐ5'側の制限
部位の生成は、免疫検出および精製のための、標識およ
びペプチドタグを含む融合タンパク質のような融合タン
パク質をコードする広範囲のベクターの効率的な産生を
可能とする。
【０７６７】詳細には、オリゴヌクレオチド5'−CCGGCC
ACCCCCCATATGCCGCGCGCTCCC−3'を前述したように用い
て、hTRTcDNAのhTRTcDNAヌクレオチドの779〜781をGCG
からCATへと改変した（図16）。これらの3つのヌクレオ
チドは、タンパク質配列を改変しないような、ATG開始
コドン前の最後のヌクレオチドである。配列の変化によ
り、hTRT cDNAにおいて唯一のNdeI制限部位が作製され
た。一本鎖hTRT DNAを部位特異的変異誘発のためのDNA
供給源として使用した。得られたプラスミドを配列決定
して、変異誘発の成功を確認した。
【０７６８】この改変は、pT7FLhTRTと命名した本発明
の以下のプラスミドの構築を可能にする。部位特異的に
改変したhTRT配列（NdeI制限部位の付加）をNdeIおよび
NcoIで消化して、hTRTをコードする核酸フラグメントを
生成した。次いで、このフラグメントを、NdeIおよびSm
aI（また、平滑末端カッター）で予め制限消化したpSL3
418プラスミドにクローン化した。pSL3418は、FLAG配列
（Immunex Corp., Seattle,WA)およびエンテロキナーゼ
配列が上記のNdeI部位からすぐ上流に挿入された、改変
されたpAED4プラスミドである。pT7FLhTRTと命名された
このプラスミドは、T7 RNAポリメラーゼを発現するE. c
oli株における（その5'末端にFlag−タグを有する）全
長hTRTの発現を可能とする。
【０７６９】3'非コード配列を欠くhTRT cDNAを有する
プラスミド 前述したように、本発明は、いくつかのまたは全ての非
コード配列が欠失されたTRTをコードする核酸を含有す
る発現ベクターを提供する。いくつかの状況において、
非タンパク質をコードする配列の量を最小化すること
は、改善されたタンパク質産生（収率）を可能にし、そ
してmRNA安定性を増大させる。本発明のこの実態様にお
いて、hTRTの3'非翻訳領域を、細菌発現プラスミドへの
クローニング前に欠失させる。
【０７７０】前述したように、最初に全長hTRT cDNAを
含有するプラスミドpGRN121を、全てのApaI部位を欠失
させる。これに続いて、3’UTRを含有するMscI-HincII
hTRT制限消化酵素フラグメントを欠失する。次いで、hT
RTの停止コドンを含有するNcoI-XbaI制限消化フラグメ
ントを、pGRN121のNcoI-XbaI部位に挿入して、3’UTRを
欠く以外はpGRN121と同等のpGRN124と命名したプラスミ
ドを作製した。
【０７７１】抗生物質選択マーカーを用いる細菌発現ベ
クター 本発明はまた、形質転換細胞に選択可能表現型を付与す
る選択マーカー、ならびに宿主ゲノムへの組み込みが必
要とされないようなエピソームの維持および複製のため
のコード配列を含有し得る細菌発現ベクターを提供す
る。例えば、このマーカーは抗生物質耐性、特にクロラ
ムフェニコール（Harrod (1977) NucleicAcids res. 2
5:1720-1726を参照のこと)、カナマイシン、Ｇ418、ブ
レオマイシン、およびハイグロマイシンに対する耐性を
コードし得、所望のDNA配列で形質転換したこれらの細
胞の選択を可能にする。例えば、Blondelet-Rouault (1
977)Gene 190:315-317;およびMahan (1995) Proc Natl
Acad Sci USA 92:669-673を参照のこと。
【０７７２】本発明の1つの実施態様において、pBBS235
と命名した、クロラムフェニコール抗生物質耐性遺伝子
が挿入された改変されたBlueScriptプラスミドベクター
(Stratagene, San Diego、CA)に全長hTRTをクローン化
した。TRT ORFがベクターのLacプロモーターの反対方向
となるように、hTRT ORFを含有するpGRN124（前記）か
らのNotIフラグメントを、pBBS235のNotI部位に挿入し
た。これは、本発明のTRT核酸のようなプラスミドイン
サートの変異誘発に適したプラスミドを作製する。pGRN
125と命名したこのプラスミド構築物は、テロメラーゼ
酵素およびTRTタンパク質コード配列のの変異誘発を含
み、T7プロモーターを用いるhTRTのインビトロ転写（お
よびT3プロモーターを用いるアンチセンスhTRTのインビ
トロ転写）のための本発明の方法で使用し得る。
【０７７３】本発明の別の実施態様において、hTRT ORF
を含有するpGRN124からのNcoI制限消化フラグメント
を、TRT ORFがベクターのLacプロモーターと同一方向で
あるようにpBBS235（前記）のNcoI部位にサブクローン
化した。これは、E. coliにおける全長hTRTの発現で使
用し得るpGRN126と命名したプラスミドを作製する。発
現された産物は、ベクターpBBS235によってコードされ
る29個のアミノ酸、続くhTRTの5’UTRによってコードさ
れる18個のアミノ酸、続く全長hTRTタンパク質を含有す
る。
【０７７４】本発明のさらなる実施態様において、pGRN
125のインビトロ変異誘発を行い、hTRT開始ATGコドンを
kozakコンセンサスに変換し、発現ベクターへのクロー
ン化を容易にするためのEcoRIおよびBglII制限消化部位
を作製させる。オリゴヌクレオチド5'−TGCGCACGTGGGAA
GCCCTGGCagatctgAattCcaCcATGCCGCGCGCTCCCCGCTG−3'
（以下の場合における改変されたヌクレオチド）を変異
誘発手順で使用した。得られた発現ベクターをpGRN127
と命名した。
【０７７５】本発明の別の実施態様において、TRT「DD
モチーフ」の第2のAspをアラニンに変換して、非機能的
テロメラーゼ酵素に作製し、従って、優性/陰性変異体
として使用するための変異体TRTタンパク質を作製す
る。hTRTコード配列をオリゴヌクレオチド5'−CGGGACGG
GCTGCTCCTGCGTTTGGTGGAcGcgTTCTTGTTGGTGACACCTCACCTCA
CC−3'を用いてインビトロ変異誘発して、残基869のア
スパラギンコドン（Asp869）をアラニン（Ala）コドン
に変換した。これはまた、MluI制限酵素部位を作製し
た。得られた発現プラスミドをpGRN130と命名し、これ
はまた、pGRN127について記載したkozakコンセンサス配
列含有する。
【０７７６】本発明はまた、hTRTのアンチセンスフラグ
メントを発現させるように設計したベクターを提供す
る。pGRN126プラスミドを、MscIおよびSmaI制限酵素で
完全に切断し、そして再度連結してhTRT ORFの95％以上
を欠失させた。このプロセスの間に、1つのSmaI-MscIフ
ラグメントを再度挿入してCAT活性を再生した。この未
精製プラスミドを、次いで、SalIおよびEcoRIで再度消
化し、そしてhTRT ORFの開始コドンを含有するフラグメ
ントをpBBS212のSalI-EcoRI部位に挿入して、5’UTRお
よび（哺乳動物細胞における）hTRT ORFの73塩基対残基
にわたるアンチセンス配列を発現するアンチセンス発現
プラスミドを作製した。このプラスミドをpGRN135と命
名した。
【０７７７】酵母におけるhTRTテロメラーゼの発現 本発明はまた、大量の全長の生物学的に活性なhTRTを産
生するための、hTRT発現酵母発現ベクターを提供する。
【０７７８】Pichia pastoris発現ベクターpPICZ Bおよ
び全長hTRT 大量の全長の生物学的活性hTRTを産生させるために、Pi
cha pastoris発現ベクターpPICZ B（Invitrogen, San D
iego、CA)を選択した。hTRTコード配列インサートはプ
ラスミドpGRN121におけるhTRTインサートのヌクレオチ
ド659〜4801に由来するものであった。このヌクレオチ
ド配列はhTRTをコードする全長配列を含む。この発現ベ
クターは、高レベルの全長の未修飾hTRTタンパク質のP.
pastorisにおける誘導性発現のために設計される。発現
は酵母プロモーターによって駆動されるが、発現された
配列はhTRT開始および終結コドンを利用する。外因性コ
ドンをクローニングによって導入した。得られたpPICZ
B/hTRTベクターを用いて酵母を形質転換した。
【０７７９】Pichia pastoris発現ベクターhTRT-His6/p
PICZ B pPICZ Bに由来する本発明の第2のPicha pastoris発現ベ
クターはまた、プラスミドpGRN121におけるhTRTインサ
ートのヌクレオチド659〜4801に由来するhTRTをコード
する全長配列を含む。このhTRT-His6/pPICZ B発現ベク
ターは、そのＣ-末端でMycエピトープおよびHis6レポー
タータグ配列を融合した全長hTRTタンパク質をコードす
る。hTRT停止コドンは除去され、そしてMycエピトープ
およびHis6レポータータグならびに停止コドンをコード
するベクター配列によって置換されている。このベクタ
ーは、hTRT配列（下線）、括弧中のベクター配列
（［Ｌ］および［NSAVD］）、Mycエピトープ（二重下
線）、およびHis6 タグ（イタリック体）よりなる、以
下の融合タンパク質の酵母における高レベルの誘導性発
現を指示するように設計される：
【０７８０】
【化１３】
【０７８１】昆虫細胞におけるhTRTの発現 本発明はまた、大量の全長の生物学的に活性なhTRTを産
生するhTRTテロメラーゼ発現昆虫細胞発現ベクターを提
供する。
【０７８２】バキュロウィルス発現ベクターpVL1393お
よび全長hTRT 目的のテロメラーゼコード配列をバキュロウィルス発現
ベクターpVL1393（Invitrogen, San Diego,CA)にクロー
ン化した。この構築物を、Autograph california核多角
体ウイルス（Baculogold-AcMNPV)からの線状化したDNA
とともに、Spodoptera fungupeida（sf−9）細胞に引き
続いて同時トランスフェクトした。得られた組換えバキ
ュロウイルスを引き続いてプラーク精製し、そして標準
的なプロトコルに従って増殖させた。
【０７８３】この発現ベクターは、高レベルの全長hTRT
タンパク質の昆虫細胞における発現を提供する。発現は
バキュロウィルスポリヘドリン遺伝子プロモーターによ
って駆動される。外因性コドンはクローニングによって
導入されなかった。
【０７８４】バキュロウィルス発現ベクターpBlueBacHi
s2 Bおよび全長hTRT 大量の全長の生物学的活性なhTRTを産生するために、バ
キュロウィルス発現ベクターpBlueBacHis2 B（Invitrog
en, San Diego,CA)を制御エレメントの供給源として選
択した。hTRT-コードインサートはプラスミドpGRN121に
おけるhTRTインサートのヌクレオチド707〜4776からな
るものであった。
【０７８５】His6および抗Xpressタグ（Invitrogen）を
有する全長hTRTをまた構築した。このベクターはまた、
プラスミドpGRN121由来のhTRTインサートのヌクレオチ
ド707〜4776からなるインサートを含む。このベクター
は、高レベルの、切断可能6−ヒスチジンおよび抗Xpres
sタグに融合した全長hTRTタンパク質の昆虫細胞におけ
る高レベルの発現を指示し、そして融合タンパク質のア
ミノ酸配列を以下に示す；（−＊−）はエンテロキナー
ゼ切断部位を示す：
【０７８６】
【化１４】
【０７８７】バキュロウィルス発現ベクターpBlueBac4.
5および全長hTRTタンパク質 大量の全長の生物学的に活性なhTRTを産生するために、
第2のバキュロウイルス発現ベクター、pBlueBac4.5 (In
vitrogen, San Diego,CA)を構築した。hTRTをコードす
るインサートはまた、プラスミドpGRN121由来のhTRTの
ヌクレオチド707〜4776よりなるものであった。
【０７８８】バキュロウィルス発現ベクターpMelBacBお
よび全長hTRTタンパク質 大量の全長の生物学的に活性なhTRTを産生するために、
第3のバキュロウィルス発現ベクター、pMelBacB （Invi
trogen,San Diego, CA)を構築した。hTRTをコードする
インサートはまた、プラスミドpGRN121由来のhTRTイン
サートのヌクレオチド707〜4776よりなる。
【０７８９】pMelBacBは、メリチンシグナル配列を用い
て、分泌経路を介する細胞外培地への昆虫細胞における
全長hTRTの発現を指示する。高レベルの全長hTRTがこの
ようにして分泌される。メリチンシグナル配列は排出さ
れる場合は切断されるが、細胞内に維持されるタンパク
質プールの一部である。この理由から、以下の配列にお
いて括弧内に示される。このベクターによってコードさ
れる融合タンパク質の配列を下記に示す：
【０７９０】
【化１５】
【０７９１】哺乳動物細胞におけるhTRTの発現 本発明はまた、上で議論したように、本発明の多くの実
施態様において有用である種々の哺乳動物細胞株におい
て全長の生物学的に活性なタンパク質として大量にhTRT
を産生するためのベクターを提供する。
【０７９２】MPSV-hTRT発現プラスミド 本発明はまた、コード配列を現実には修飾する（例え
ば、コドン使用法を最適化する）ことなく、テロメラー
ゼのような組換えタンパク質の最大の可能な発現を与え
る哺乳動物細胞での使用のための発現系を提供する。1
つの実施態様において、本発明は、本発明のTRTを発現
し得るMPSV哺乳動物発現プラスミド（Lin J-H (1994) G
ene 47:287-292においてpMPSV-TMとして記載されたプラ
スミドpBBS212由来）を提供する。MPSVプラスミドは、
安定なクローンまたは一過性のクローンのいずれかとし
て発現され得る。
【０７９３】この発現系において、hTRTコード配列自体
は変化しないが、外因性転写制御エレメントがベクター
に組み込まれる。サイトメガロウイルス（CMV）エンハ
ンサーによって増強される骨髄増殖性肉腫ウイルス(MPS
V)LTR(MPSV-LTR)プロモーターを転写開始のために組み
込む。このプロモーターは一貫して細胞株におけるより
高い発現レベルを示す（Lin J-H (1994), 前出を参照の
こと)。Kozakコンセンサス配列を翻訳開始のために組み
込み得る（Kozak (1996) Mamm. Genome 7:563-574を参
照のこと)。全ての外因性5'および3'非翻訳hTRT配列を
除去して、これらの配列が上記のように発現を妨げない
ことを確認し得る。全ての外因性配列を有する、完全な
hTRTコード配列を含有するMPSVプラスミドをpGRN133と
命名する。コントロールであるhTRT「アンチセンス」プ
ラスミドをまた構築した。このベクターは、TRTインサ
ートがhTRTのアンチセンス配列である以外はpGRN133と
同一である（このコントロールがベクターとして使用さ
れ得るアンチセンスをpGRN134と命名する）。全ての他
の外因性配列が除去され、そしてKozakコンセンサス配
列を有する完全なhTRTコード配列を含有するMPSVプラス
ミドをpGRN145と命名する。
【０７９４】２つの選択マーカー、PAC（プロマイシン-
N-アセチル−トランスフェラーゼ＝プロマイシン耐性）
およびHygB（ハイグロマイシンＢ＝ハイグロマイシン耐
性）はトランスフェクション後のプラスミドの選択のた
めに存在する（上記の選択マーカーに言及する議論を参
照のこと）。ベクターポリリンカーの両側のマーカーを
使用する二重選択はhTRTコード配列の安定性を増大させ
るはずである。DHFR（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）コー
ド配列を含ませて、安定なクローンが作製された後に発
現カセットの増幅を可能とする。また、遺伝子増幅の他
の手段を使用して、組換えタンパク質収率を増大させ得
る。
【０７９５】本発明はまた、hTRT融合タンパク質を含有
するMPSV哺乳動物発現プラスミドを提供する。１つの実
施態様において、hTRT配列を、その5'非翻訳領域を保持
したまま、IBI FLAG（International Biotechnologies
Inc. (IBI), Kodak, New Haven, CT)のようなエピトー
プフラッグに連結させ、そしてMPSV発現プラスミドに挿
入する（pGRN147と命名する）。この特定の構築物は、K
ozak翻訳開始部位を含む。発現された融合タンパク質
は、M-1抗FLAGオクタペプチドモノクローナル抗体（IB
I, Kodak,前出）を用いて精製され得る。
【０７９６】別の実施態様において、hTRTは部位特異的
に改変される。１つのアミノ酸残基コドンを変異誘発
し、869位のアスパラギン酸をアラニンに変化させる。
その5'非翻訳領域を保持し、そしてKozak配列を組み込
むこのAsp869→Ala hTRT変異体をMPSV発現プラスミドに
挿入し、そしてpGRN146と命名した。Asp869→Ala hTRT
変異体を、さらに、上記のようにFLAG配列を含有するよ
うに操作し、そしてこのインサートをMPSV発現プラスミ
ドにクローン化した。この発現プラスミドをpGRN154と
命名する。特に、pGRN154については、hTRTの「先端」
（5'セグメント）を含有するKozak配列を含むpGRN146由
来のEam1105I制限消化フラグメントをpGRN147（上記を
参照のこと）のEam1105I部位にクローン化して、Kozak
配列、上記のＤ869−>Ａ変異、およびIBIフラッグを有
するhTRTを発現し得るMPSV発現プラスミドを作製する。
【０７９７】本発明の別の実施態様はpGRN146由来の発
現プラスミドである。pGRN152と命名された哺乳動物発
現プラスミドを、（hTRT ORFを含有する）プラスミドpG
RN146からEcoRIフラグメントを切り出すことによって生
成し、そしてpBBS212のEcoRI部位にクローン化して、hT
RTの5’UTRを除去した。このhTRTは、その発現がMPSVプ
ロモーターによって制御されるような方向である。これ
により、Kozakコンセンサス配列およびＤ869−>Ａ変異
を有するhTRTを発現する哺乳動物発現プラスミドを作成
し、そしてMPSVプロモーターを使用する。
【０７９８】本発明は、hTRTを、hTRTコード配列がMPSV
プロモーターによって駆動されるような方向とした哺乳
動物発現ベクターを提供する。例えば、hTRTオープンリ
ーディングフレーム（ORF）を含有するpGRN137由来のEc
oRI制限消化フラグメントをpBBS212（下記参照のこと）
のEcoRI部位にクローン化し、このようにして、hTRTの
5'非翻訳領域（5'-UTR）を除去した。pGRN137を、pGRN1
36のSal 1-SSE 8387I部位へのhTRTのKozak変異を有する
後記のpGRN130からSalI-Sse8387Iフラグメントを切り出
し、MPSVプロモーターから離れてKozakコンセンサス配
列を含有するhTRTを発現する哺乳動物発現プラスミドを
作製することによって構築した。プラスミドpGRN136
を、hTRT ORFを含有するpGRN126からHindIII SalIフラ
グメントを切り出し、そしてそれをプラスミドpBBS242
のHindIII SalI部位にクローニングし、MPSVプロモータ
ーから離れてhTRTを発現する哺乳動物発現プラスミドを
作製することによって構築した。これにより、MPSVプロ
モーターを用いて、Kozakコンセンサス配列を有するhTR
Tを発現するpGRN145と命名された哺乳動物発現プラスミ
ドが作製される。下記のpGRN152 MPSVプロモーター駆動
性哺乳動物発現ベクターも参照のこと。
【０７９９】エピソームベクターpEBVHisを用いる293細
胞で発現されるhTRT エピソームベクターpEBVHis（Invitrogen, San Diego,
CA)を、Ｎ末端発現エピトープタグ、Xpressエピトープ
（Invitrogen, San Diego, CA)に融合したhTRTを含むhT
RT融合タンパク質を発現するように操作した（pGRN122
と命名した）。hTRT ORFを含有するpGRN121由来のNotI
hTRTフラグメントを、hTRT ORFがベクターのラウス肉腫
ウイルス（RSV）プロモーターと同一方向になるよう
に、pEBVHisAのNotI部位にクローン化した。この方向に
おいて、His6フラッグはhTRTのＮ末端に比較的近かっ
た。
【０８００】ベクターをまた、hTRTのアンチセンス配列
およびエピトープタグをインサートとして含むように構
築した（コントロールとして使用できるプラスミドpGRN
123と命名した）。このベクターを293細胞にトランスフ
ェクトし、そしてXpressエピトープに対して特異的な抗
体を用いて、翻訳されたhTRTを同定し、そして単離し
た。pEBVHisは、Ｎ末端ペプチドに融合した目的のタン
パク質を発現するハイグロマイシン耐性EBVエピソーム
ベクターである。このベクターを有する細胞を選択し、
そして増殖させ、次いで、核および細胞質抽出物を調製
した。これらおよびコントロール抽出物を抗Xpress抗体
で免疫沈降させ、免疫沈降したビーズを通常のアッセイ
によってテロメラーゼ活性について試験する。
【０８０１】有寿命性正常ディプロイドヒト細胞におけ
る組換えhTRTの発現 本発明の１つの実施態様において、組換えhTRTおよび必
要なテロメラーゼ酵素複合体成分を、正常なディプロイ
ド有寿命性細胞で発現させて、それらの増殖能力を増
大、あるいはそれらを不死化させ、またはそれらの不死
化を促進し得る。これにより、さもなければ正常な表現
型および核型（karotype）を有するディプロイドの不死
化細胞を得ることができる。上記の、テロメラーゼのこ
の用途は膨大な商業的利用性を有する。
【０８０２】センスhTRT（図16）およびアンチセンスhT
RTをCMVベクターにクローン化した。これらのベクター
を精製し、そして２つの正常な有寿命性のディプロイド
ヒト細胞クローンに一過性にトランスフェクトした。ヒ
トクローンは若い継代のディプロイドヒトBJおよびIMR9
0細胞株であった。
【０８０３】TRAPezeTMキット（Oncor, Inc., Gaithers
burg,MD)を利用するTRAPアッセイを用いるテロメラーゼ
活性の分析は、アンチセンスhTRTではなくセンスhTRTの
トランスフェクションがBJおよびIMR90の両方の細胞株
でテロメラーゼ活性を生じたことを示した。
【０８０４】不死化IMR90ヒト細胞における組換えhTRT
の発現 上記のディプロイドヒトBJおよびIMR90細胞株研究で使
用したCMVベクターにクローン化した同一hTRTセンス構
築物を用いて、不死化SW13ALT経路細胞株（SV40抗原で
不死化したIMR90細胞）を一過性にトランスフェクトし
た。TRAPアッセイ（TRAPeze, Oncor, Inc., Gaithersbu
rg, MD)は、テロメラーゼ活性がセンス構築物でトラン
スフェクトした細胞で生じたことを示した。
【０８０５】哺乳動物細胞におけるhTRTの調節された発
現のためのベクター：hTRTの誘導性および抑制性発現 本発明は、hTRTのような本発明のTRTの発現を誘導また
は抑制するように操作され得るベクターを提供する。例
えば、hTRTコード配列を、Invitrogen (San Diego,CA)
によるエクジソン(Ecdysone)誘導性発現系およびClonte
ch Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA)によるTet-On
およびTet-offテトラサイクリン調節系にクローン化し
得る。このような誘導性発現系は、トランスフェクトし
たTRTの転写のレベルまたは速度を制御することが重要
である本発明の方法で使用するために提供される。例え
ば、本発明は、hTRTの発現を介して不死化された細胞株
を提供し；このような細胞は、Tet-Off系によって提供
されるもののような、転写制御を介する、ベクターによ
るhTRT発現の阻害によって「有寿命性」にし得る。本発
明はまた、hTRTの構成的発現を回避するためにTRTを一
時的にのみ発現する方法を提供し、これは上記のよう
に、トランスフェクトした細胞の所望されない「不死
化」を導き得る。
【０８０６】エクジソン誘導性哺乳動物発現系は、哺乳
動物細胞における目的の遺伝子の調節された発現を可能
にするように設計される。この系は、哺乳動物細胞にお
いてほとんど検出されない基底発現および200倍よりも
大きい誘導性を可能とするその厳密に調節されたメカニ
ズムによって区別される。この発現系はDrosophilaのヘ
テロダイマーエクジソンレセプターに基づく。エクジソ
ン誘導性発現系は、ヘテロダイマー核レセプターを介し
てhTRTの発現を活性化するためにステロイドホルモンエ
クジソンアナログ、ムリステロンＡを使用する。発現レ
ベルは、基底レベルよりも200倍を超え、哺乳動物細胞
生理学に対する効果を有さないと報告されている（「Ec
dysone-Inducible Gene Expression in Mammalian Cell
s and Transgenic Mice」 (1996) Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 93, 3346-3351)。一旦、レセプターがエクジソ
ンまたはムリステロン（エクジソンのアナログ）に結合
すると、レセプターはエクジソン応答性プロモーターを
活性化して、目的の遺伝子の制御された発現をももたら
す。エクジソン誘導性哺乳動物発現系において、ヘテロ
ダイマーレセプターの両方のモノマーは同じベクターで
あるpVgRXRから構成的に発現される。最終的に、目的の
遺伝子の発現を駆動するエクジソン応答性プロモーター
は、目的の遺伝子の転写を駆動する第2のベクターpIND
上に位置する。
【０８０７】hTRTコード配列を、最小の熱ショックプロ
モーターおよび複数クローニング部位の上流の5つの修
飾されたエクジソン応答エレメント（E/GRE）を含有す
るpINDベクター（Clontech Laboratories, Inc., Palo
Alto,CA)にクローン化する。次いで、この構築物を、エ
クジソンレセプターを安定に発現するように予め操作さ
れた細胞株にトランスフェクトする。トランスフェクシ
ョン後、細胞をムリステロンＡで処理して、pIND由来の
細胞内発現を誘導する。
【０８０８】Tet-onおよびTet-off発現系（Clontech，P
alo Alto，CA)は、Tet-Off転写抑制系についてはGossen
(1992)「Tight control of gene expression in mammal
iancells by tetracycline responsive promoters」 Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551；およびTet-On
誘導性転写系についてはGossen (1995) 「Transcription
al activation by tetracycline in mammalian cells」
Science 268:1766-1769によって記載された、調節され
た高レベル遺伝子発現系を利用する。「Tet-Off」形質
転換細胞株においては、テトラサイクリン（Tc）または
ドキシサイクリン（「Dox」はTc誘導体）が培養培地から
除去された場合に遺伝子発現はスイッチが入る。対照的
に、TcまたはDoxの培地への添加によってTet-On細胞株
では発現にスイッチが入る。両方の系は、種々の濃度の
TcまたはDoxに応答して厳密に調節されるべきクローン
化遺伝子の発現を可能にする。
【０８０９】この系は目的の遺伝子の発現のために使用
され得る応答プラスミドとして「pTRE」を使用する。プ
ラスミドpTREはTet応答性PhCMV*-1プロモーターのすぐ
下流にマルチクローニング部位（MCS）を含有する。MCS
の部位の1つに挿入された目的の遺伝子またはcDNAは、
それぞれ、Tet-OffおよびTet-On系においてtTAおよびrt
TA調節タンパク質に応答性である。PhCMV*-1は、７コピ
ーの42bpのtetオペレーター配列（tetO）よりなるTet応
答性エレメント（TRE）を含有する。TREエレメントは、
pTetプラスミドにおける完全なCMVプロモーターの一部
であるエンハンサーを欠く最小CMVプロモーター（PminC
MV）のすぐ上流にある。結果として、PhCMV*-1は、調節
タンパク質のtetO配列への結合の非存在下でサイレント
である。このクローン化インサートは開始コドンを有さ
なければならない。いくつかの場合には、Kozakコンセ
ンサスリボソーム結合部位の付加は発現レベルを改善し
得る；しかし、多くのcDNAがKozak配列の付加なくしてT
et系において効果的に発現されてきた。pTRE-Gene Xプ
ラスミドをpTK-Hygで同時にトランスフェクトして、安
定なトランスフェクタントの選択を可能にする。
【０８１０】Tet-OffまたはTet-On発現系の設定は、一
般に、TREの制御下で適切な調節タンパク質およびTRTを
コードする遺伝子の全コピーを含有する「二重-安定」
細胞株を生成させるための２つの連続的な安定なトラン
スフェクションを必要とする。最初のトランスフェクシ
ョンにおいて、適切な調節タンパク質を、適切な調節タ
ンパク質を発現する、pTet-OffまたはpTet-Onベクター
のような「調節プラスミド」のトランスフェクションに
よって、選択した細胞株に導入する。次いで、pTRE「応
答プラスミド」にクローン化されたhTRTを第2のトラン
スフェクションにおいて導入して、二重-安定Tet-Offま
たはTet-On細胞株を作製する。両方の系は遺伝子発現の
非常に厳密なon/off制御、調節された用量-依存性誘
導、および高い絶対レベルの遺伝子発現を与える。
【０８１１】DHFRおよびアデノウイルス配列を有する組
換えhTRTの発現 pGRN155プラスミド構築物を、哺乳動物細胞におけるhTR
T cDNAの一過性発現のために設計した。Kozakコンセン
サスをhTRT配列の5'末端に挿入する。hTRTインサートは
3'または5’UTRを有さない。hTRT cDNAをp91023(Ｂ)（W
ong (1985) Science 228:810-815)のEcoRI部位に挿入す
る。hTRTインサートはDHFR ORFと同一方向である。これ
により、一過性発現のため特に有用な発現ベクターを作
製する。
【０８１２】プラスミドpGRN155は、アデノウイルスプ
ロモーターのすぐ上流のSV40起点およびエンハンサー、
テトラサイクリン耐性遺伝子、E. coli起点、ならびに
アデノウイルスVAIおよびVAII遺伝子領域を有する。こ
の発現カセットは、以下の順序で以下のものを含む：ア
デノウイルス主要後期プロモーター；アデノウイルス三
部分リーダー；この三部分リーダーの第１のエクソン由
来の5'スプライス部位およびマウス免疫グロブリン遺伝
子由来の3'スプライス部位からなるハイブリッドイント
ロン：hTRT cDNA；マウスDHFRコード配列；およびSV40
ポリアデニル化シグナル。
【０８１３】アデノウイルス三部分リーダーおよびVA R
NAは、ポリシストロン性mRNAが翻訳される効率を増大さ
せることが報告されている。DHFR配列は、ハイブリッド
mRNAの安定性を増大することが報告されている。また、
DHFR配列は、ベクター配列の選択および増幅のためのマ
ーカーを提供し得る。Logan (1984) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 81:3655); Kaufman (1985) Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 82:689；およびKaufman (1988) Focus (Li
fe Technologies, Inc.), 第10巻, 3号)を参照のこと。
【０８１４】本発明の他の発現プラスミドを、例示の目
的で記載する。
【０８１５】pGRN121 hTRTタンパク質をコードする全cDNAを含有するラムダク
ローン25-1.1.6由来のEcoRIフラグメントを、cDNAの5'
末端がベクター中のＴ7プロモーター近くになるよう
に、pBluescriptIISK+のEcoRI部位に挿入した。このベ
クターで使用される選択マーカーはアンピシリンであ
る。
【０８１６】pGRN122 hTRT ORFを含有するpGRN121由来のNotIフラグメント
を、コード配列がRSVプロモーターに作動可能に連結さ
れるようにpEBVHisAのNotI部位に挿入した。このプラス
ミドは、hTRTタンパク質のＮ末端に融合したHis6フラッ
グからなる融合タンパク質を発現する。このベクターで
使用される選択マーカーはアンピシリンまたはハイグロ
マイシンである。
【０８１７】pGRN123 hTRT ORFを含有するpGRN121由来のNotIフラグメント
を、コード配列がRSVプロモーターと反対方向になるよ
うにpEBVHisAのNotI部位に挿入した。従ってアンチセン
スhTRTを発現する。
【０８１８】pGRN124 プラスミドpGRN121を、全てのApaI部位を欠失させ、続
いて3’UTRを含有するMscI-HincIIフラグメントを欠失
させた。次いで、hTRTコード配列の停止コドンを含有す
るNco-XbaIフラグメントをpGRN121のNco-XbaI部位に挿
入して、3’UTRを欠く以外はpGRN121と同等のプラスミ
ドを作製した。これはいくつかの細胞において増大した
発現レベルのために好適であり得る。
【０８１９】pGRN125 hTRTコード配列を含有するpGRN124からのNotIフラグメ
ントを、オープンリーディングフレームがLacプロモー
ターの反対方向となるようにpBBS235のNotI部位に挿入
した。このベクターで使用する選択マーカーはクロラム
フェニコールである。
【０８２０】pGRN126 hTRTコード配列を含有するpGRN124からのNotIフラグメ
ントを、挿入されたhTRTコード配列がLacプロモーター
と同一方向となるようにpBBS235のNotI部位に挿入し
た。
【０８２１】pGRN127 オリゴヌクレオチド5'−ＴＧＣＧＣＡＣＧＴＧＧＧＡＡ
ＧＣＣＣＴＧＧＣａｇａｔｃｔｇＡａｔｔＣＣａＣｃＡ
ＴＧＣＣＧＣＧＣＧＣＴＣＣＣＣＧＣＴＧ−3'をpGRN12
5のインビトロ変異誘発で使用して、hTRTコード配列の
開始ATGコドンをkozakコンセンサス配列に変換し、クロ
ーニングのためのEcoRIおよびBglII部位を作製した。ま
た、オリゴヌクレオチドCOD2866を用いて、AmpSをAmpR
（アンピシリン耐性）に変換し、オリゴヌクレオチドCO
D1941を用いてCatR（クロラムフェニコール耐性）をCat
S（クロラムフェニコール感受性）に変換した。
【０８２２】pGRN128 オリゴヌクレオチド5'−ＴＧＣＧＣＡＣＧＴＧＧＧＡＡ
ＧＣＣＣＴＧＧＣａｇａｔｃｔｇＡａｔｔＣＣａＣｃＡ
ＴＧＣＣＧＣＧＣＧＣＴＣＣＣＣＧＣＴＧ−3'をインビ
トロ変異誘発で用いて、hTRTの開始ATGコドンをkozakコ
ンセンサスに変換し、クローニングのためのEcoRIおよ
びBglII部位を作製した。また、オリゴ5'−ＣＴＧＣＣ
ＣＴＣＡＧＡＣＴＴＣＡＡＧＡＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＣ
ＴＡＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＡＴＧＡＣＡＡＡＴＧＡＡ
ＴＴＣＡＧＡＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＣＣＧＣＧＧ
ＴＧＧＡＧＣＴＣＣＡＧＣ−3'を用いて、Ｃ末端にIBI
Flag（International Biotechnologies Inc. (IBI), Ko
dak, New Haven, CT)を挿入し、クローニングのためのE
coRIおよびBglII部位を作製した。また、COD2866を用い
て、AmpSをAmpRに変換し、COD1941を用いてCatRをCatS
に変換した。
【０８２３】pGRN129 オリゴヌクレオチド5'−ＣＧＧＧＡＣＧＧＧＣＴＧＣＴ
ＣＣＴＧＣＧＴＴＴＧＧＴＧＧＡｃＧｃｇＴＴＣＴＴＧ
ＴＴＧＧＴＧＡＣＡＣＣＴＣＡＣＣＴＣＡＣＣ−3'をイ
ンビトロ変異誘発によって用いて、Asp869をAlaコドン
に変換した（すなわち、DDモチーフの第2Aspをアラニン
に変換して、優性／陰性hTRT変異体を作製した）。これ
はまた、MluI部位も生じた。また、オリゴヌクレオチド
5'−ＣＴＧＣＣＣＴＣＡＧＡＣＴＴＣＡＡＧＡＣＣＡＴ
ＣＣＴＧＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＡＴＧＡＣ
ＡＡＡＴＧＡＡＴＴＣＡＧＡＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣ
ＡＣＣＧＣＧＧＴＧＧＡＧＣＴＣＣＡＧＣ−3'）を用い
て、Ｃ末端にIBI Flagを挿入し、クローニングのための
EcoRIおよびBglII部位を作製した。また、COD2866を用
いて、AmpSをAmpRに変換し、COD1941を用いてCatRをCat
Sに変換した。
【０８２４】pGRN130 オリゴヌクレオチド5'−ＣＧＧＧＡＣＧＧＧＣＴＧＣＴ
ＣＣＴＧＣＧＴＴＴＧＧＴＧＧＡｃＧｃｇＴＴＣＴＴＧ
ＴＴＧＧＴＧＡＣＡＣＣＴＣＡＣＣＴＣＡＣＣ−3'をイ
ンビトロ変異誘発で用いてAsp869コドンをAlaコドンに
変換した（すなわち、DDモチーフの第2Aspをアラニンに
変換して優性／陰性変異型タンパク質を作製した）。こ
れはまた、MluI部位を生じた。また、オリゴヌクレオチ
ド5'−ＴＧＣＧＣＡＣＧＴＧＧＧＡＡＧＣＣＣＴＧＧＧ
ａｇａｔｃｔｇＡａｔｔＣＣａＣｃＡＴＧＣＣＧＣＧＣ
ＧＣＴＣＣＣＣＧＣＴＧ−3'をインビトロ変異誘発で用
いて、hTRTコード配列の開始ATGコドンをkozakコンセン
サス配列に変換し、クローニングのためのEcoRIおよびB
glII部位を作製した。また、COD2866を用いてAmpSをAmp
Rに変換し、COD1941を用いてCatRを変換した。
【０８２５】pGRN131 kozak配列およびIBI Flag変異と共にhTRT ORFを含有す
るpGRN128からのEcoRIフラグメントを、hTRT ORFがMPSV
プロモーターから離れて発現されるように、pBBS212のE
coRI部位に挿入する。プラスミドpBBS212はMPSVプロモ
ーター、CMVエンハンサー、およびSV40ポリアデニル化
部位を含有する。
【０８２６】pGRN132 kozak配列およびIBI Flag変異と共にhTRT ORFを含有す
るpGRN128からのEcoRIフラグメントを、hTRT ORFのアン
チセンスがMPSVプロモーターから離れて発現されるよう
にpBBS212のEcoRI部位に挿入する。
【０８２７】pGRN133 hTRTコード配列を含有するpGRN121からのEcoRIフラグメ
ントを、hTRTタンパク質がMPSVプロモーターの制御下で
発現されるように、pBBS212のEcoRI部位に挿入した。
【０８２８】pGRN134 hTRTコード配列を含有するpGRN121からのEcoRIフラグメ
ントを、hTRTコード配列のアンチセンスがMPSVプロモー
ターの制御下で発現されるように、pBBS212のEcoRI部位
に挿入した。このベクターで使用した選択マーカーはCh
lor/HygB/PACである。
【０８２９】pGRN135 プラスミドpGRN126をMscIおよびSmaIで完全に消化し、
再度連結して、挿入されたhTRTコード配列の95％以上を
欠失させた。1つのSmaI-MscIフラグメントをこのプロセ
スの間に再度挿入して、選択用のCat活性を再度生じさ
せた。次いで、この未精製プラスミドをSalIおよびEcoR
Iで再度消化し、hTRTコード配列の開始コドンを含有す
るフラグメントをpBBS212のSalI-EcoRI部位に挿入し
た。これにより、5’UTRのアンチセンスおよびコード配
列の73塩基を発現するアンチセンス発現プラスミドが作
成される。このベクターで使用した選択マーカーはChlo
r/HygB/PACである。
【０８３０】pGRN136 hTRTコード配列を含有するpGRN126からのHindIII-SalI
フラグメントをpBBS242のHindIII-SalI部位に挿入し
た。
【０８３１】pGRN137 kozak配列を含有するpGRN130からのSalI-Sse8387Ｉフラ
グメントをpGRN136のSalI-Sse8387Ｉ部位に挿入した。
【０８３２】pGRN138 hTRTマイナス3’UTRを含有するpGRN124からのEcoRIフラ
グメントを、hTRTの方向がEGFPドメインと同一になるよ
うに、pEGFP-C2のEcoRI部位に挿入した。
【０８３３】pGRN139 オリゴヌクレオチド5'−ＣＴＧＣＣＣＴＣＡＧＡＣＴＴ
ＣＡＡＧＡＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣ
ＧＡＣＧＡＴＧＡＣＡＡＡＴＧＡＡＴＴＣＡＧＡＴＣＴ
ＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＣＣＧＣＧＧＴＧＧＡＧＣＴＣＣ
ＡＧＣ−3'をインビトロ変異誘発で使用して、pGRN125
におけるhTRTのＣ末端にIBI Flagを挿入し、クローニン
グのためのEcoRIおよびBglIIを作製した。また、COD286
6を用いてAmpSをAmpRに変換し、COD1941を用いてCatRを
CatSに変換した。
【０８３４】pGRN140 ゲノムhTRTの上流配列およびラムダＧ55からのhTRTの第
１イントロンを含有するNcoIフラグメントをpBBS167のN
coI部位に挿入した。このフラグメントはhTRTがLacプロ
モーターと同一方向になるような方向とする。
【０８３５】pGRN141 ゲノムhTRTの上流配列およびラムダＧ55からのhTRTの第
1イントロンを含有するNcoIフラグメントをpBBS167のNc
oI部位に挿入した。このフラグメントを、hTRTがLacプ
ロモーターと反対方向となるような方向とする。
【０８３６】pGRN142 hTRT遺伝子プロモーター領域を含む完全〜15kbpゲノム
インサートを含有するラムダGphi5からのNotIフラグメ
ントを、プラスミドpBBS185のNotI部位に挿入した。こ
のフラグメントは、hTRT ORFがLacプロモーターと反対
方向となるような方向とする。
【０８３７】pGRN143 hTRT遺伝子プロモーター領域を含む完全〜15kbpゲノム
インサートを含有するラムダGphi5からのNotIフラグメ
ントを、プラスミドpBBS185のNotI部位に挿入した。こ
のフラグメントは、hTRT ORFがLacプロモーターと同一
方向となるような方向とする。
【０８３８】pGRN144 ラムダ配列を除去するためのpGRN140のSAL1を欠失。
【０８３９】pGRN145 このベクターを、哺乳動物細胞におけるhTRT配列の発現
用に構築した。hTRTコード配列を含有するpGRN137から
のEcoRIフラグメントを、pBBS212のEcoRI部位に挿入し
て、hTRT mRNAの5’UTRに対応する配列の一部を除去し
た。hTRTコード配列は、それがMPSVプロモーターの制御
下で発現されるような方向とする。このベクターで使用
した選択マーカーはChlor/HygB/PACである。
【０８４０】pGRN146 このベクターを、哺乳動物細胞におけるhTRT配列の発現
のために構築した。hTRTのＤ869Ａ変異を含有するpGRN1
30からのSse8387I−NcoIフラグメントをpGRN137のSse83
87I−NcoI部位に挿入した。このベクターで使用した選
択マーカーはアンピシリン／HygB／PACである。
【０８４１】pGRN147 IBI Flagを含有するpGRN139からのSse8387I−NotIフラ
グメントをpGRN137のSse8387I−NotｇI部位に挿入し
た。
【０８４２】pGRN148 hTRTのプロモーター領域を含有するpGRN144からのBglII
-Eco47IIIフラグメントをpSEAP2のBglII-NruI部位に挿
入してhTRTプロモーター／レポーター構築物を作製し
た。
【０８４３】pGRN149 このベクターは、ｈTRT融合タンパク質発現ベクターを
構築するための中間ベクターである。
【０８４４】変異誘発オリゴ5'−ｃｔｔｃａａｇａｃｃ
ａｔｃｃｔｇｇａｃｔｔｔｃｇａａａｃｇｃｇｇｃｃｇ
ｃｃａｃｃｇｃｇｇｔｇｇａｇｃｔｃｃ−3'を用いて、
pGRN125のインビトロ変異誘発によってhTRTのＣ末端にC
SP45I部位を付加した。hTRTの「停止」コドンを欠失さ
せ、Csp45I部位で置き換えた。このベクターで使用する
選択マーカーはアンピシリンである。
【０８４５】pGRN150 hTRTのプロモーター領域を含有するpGRN144からのBglII
-FspIフラグメントをpSEAP2のBglII-NruI部位に挿入し
て、hTRTプロモーター／レポーター構築物を作製した。
【０８４６】pGRN151 このベクターを、哺乳動物細胞におけるhTRT配列の発現
のために構築した。hTRTコード配列を含有するpGRN147
からのEcoRIフラグメントをpBBS212のEcoRI部位に挿入
して、hTRT mRNAの5’UTRに対応する配列の一部を除去
した。hTRTコード配列は、それがMPSVプロモーターの制
御下で発現されるような方向とする。このベクターで使
用する選択マーカーはChlor/HygB/PACである。
【０８４７】pGRN152 hTRTコード配列を含有するpGRN146からのEcoRIフラグメ
ントをpBBS212のEcoRI部位に挿入して、hTRTの5’UTRに
対応する配列の一部を除去した。hTRTコード配列は、そ
れがMPSＶプロモーターの制御下で発現されるような方
向とする。
【０８４８】pGRN153 hTRTのＤ869−>Ａ変異を含有するpGRN130からのStyIフ
ラグメント（hTRT変異型コード配列）をpGRN158のStyI
部位に挿入して、その5'末端にkozakコンセンサス配
列、その3'末端にIBI FLAG配列（Ｃ−末端コード領
域）、およびＤ869→Ａ変異を有するhTRTコード配列を
含有するプラスミドを得た。
【０８４９】pGRN154 hTRT遺伝子を含有するpGRN153のEcoRIフラグメントを、
hTRT ORFがMPSVプロモーターと同一方向に配向されるよ
うな方向で、プラスミドpBS212のEcoRI部位に挿入し
た。これにより、そのアミノ末端でkozakコンセンサス
配列、そのカルボキシ末端でIBI FLAG、およびＤ869→
Ａ変異を有するhTRTタンパク質を発現するMPSV−指向性
発現プラスミドが作製される。
【０８５０】pGRN155 このベクターを、哺乳動物細胞におけるhTRT配列の発現
のために構築した。このインサートは、5'および3’UTR
を有さないhTRTの全長cDNA、およびkozak配列を含ん
だ。kozakコンセンサスを有しかつ3’UTRも5’UTRも有
さないhTRT cDNAを含有するpGRN145からのEcoRIフラグ
メントを、hTRTがDHFR ORFと同一方向になるように、ｐ
91023（Ｂ）のEcoRI部位に挿入した。これにより、hTRT
のための一過性発現ベクターが作製される。このベクタ
ーで使用した選択マーカーはテトラサイクリンである。
【０８５１】pGRN156 このベクターを、哺乳動物細胞におけるhTRT配列の発現
のために構築した。kozakコンセンサス配列を有しかつ
3’UTRも5’UTRも有さないhTRT cDNAのＤ869Ａ変異を含
有するpGRN146からのEcoRIフラグメントを、hTRTがDHFR
ORFと同一方向となるようにｐ91023（Ｂ）のEcoRI部位
に挿入した。これにより、hTRTについての一過性発現ベ
クターが作製される。このインサートは、5’および3’
UTRを有さないhTRTの全長cDNA、Ｄ869Ａ、およびkozak
配列を含んだ。このベクターで使用した選択マーカーは
テトラサイクリンである。
【０８５２】pGRN157 このベクターを、哺乳動物細胞におけるｈTRT配列の発
現用に構築した。Ｃ−末端のIBI FLAG；kozakコンセン
サスを有しかつ3’UTRも5’UTRも有さないhTRTcDNAを含
有するpGRN147からのEcoRIフラグメントを、hTRTがDHFR
ORFと同一方向となるように、ｐ91023（Ｂ）のEcoRI部
位に挿入した。これにより、hTRT用の一過性発現ベクタ
ーが作製される。このインサートは、5’および3’UTR
を有さないhTRTの全長cDNA、FLAG配列、およびkozak配
列を含んだ。このベクターで使用した選択マーカーはテ
トラサイクリンである。
【０８５３】pGRN158 このベクターを、E. coliにおけるTRT配列の発現および
変異誘発のために構築した。hTRT ORFを含有するpGRN15
1からのEcoRIフラグメントを、hTRT ORFがLacプロモー
ターと反対方向の方向となるように、pBBS183のEcoRI部
位に挿入した。このインサートは5'および3’UTRを有さ
ないhTRTの全長cDNA、FLAG配列、およびkozak配列を含
んだ。hTRTコード配列はＴ7プロモーターによって駆動
される。このベクターで使用した選択マーカーはアンピ
シリンである。
【０８５４】pGRN159 このベクターを、E. coliにおけるTRT配列の発現および
変異誘発のために構築した。EGFPからhTRT融合を含有す
るpGRN138由来のHeI-KpnIフラグメントをpBluescriptII
KS+のXbaI-KpnI部位に挿入した。これにより、融合タン
パク質のためのＴ7発現ベクターが作製される（コード
配列はＴ7プロモーターによって駆動される）。インサ
ートは、EGFPを含む融合タンパク質として3’UTRを有さ
ないhTRTの全長cDNAを含んだ。このベクターで使用した
選択マーカーはアンピシリンである。
【０８５５】pGRN160 このベクターを、哺乳動物細胞におけるアンチセンスhT
R配列の発現のために構築した。コード配列は、MPSVプ
ロモーターに作動可能に連結されている。全長hTR ORF
を含有するpGRN90からのXhoI-NsiIフラグメントをpBBS2
95のSalI-Sse8387I部位に挿入した。これにより、hTRア
ンチセンスRNAを発現する一過性／安定ベクターが作製
される。GPTマーカーをベクターに組み込んだ。このベ
クターで使用する選択マーカーはChlor/gpt/PACであ
る。
【０８５６】pGRN161 このベクターを、哺乳動物細胞においてセンスhTR配列
の発現のために構築した。全長hTR ORFを含有するpGRN8
9からのXhoI-NniIフラグメントをpBBS295のSalI-Sse838
7I部位に挿入した。これにより、センス方向でhTRを発
現する一過性／安定ベクターが作製される。コード配列
はMPSVプロモーターによって駆動される。GPTマーカー
をベクターに組み込んだ。このベクターで使用する選択
マーカーはChlor/gpt/PACである。
【０８５７】pGRN162 全長hTR ORFを含有するpGRN87からのXhoI-NsiIフラグメ
ントを、pBBS295のSalI-Sse8387I部位に挿入した。これ
により、センス方向に短縮されたhTR（＋108位〜＋435
位）を発現する一過性／安定ベクターが作製される。
【０８５８】pGRN163 このベクターを、E. coliにおけるTRT配列の発現および
変異誘発のために構築した。コード配列はＴ7プロモー
ターによって駆動される。オリゴヌクレオチドＲＡ45
（5'−ＧＣＣＡＣＣＣＣＣＧＣＧＣＴＧＣＣＴＣＧＡＧ
ＣＴＣＣＣＣＧＣＴＧＣ−3'）をインビトロ変異誘発で
使用して、hTRTにおける開始metをLeuに変化させ、そし
てLeu後の次の2つのコドンにおいてXhoI部位を導入す
る。また、COD1941を用いて、CatRをCatSに変化させ、B
SPH1部位を導入し、そしてCOD2866を用いて、AmpSをAmp
Rに変化させて、FSP1部位を導入する。このベクターで
使用する選択マーカーはアンピシリンである。
【０８５９】pGRN164 このベクターを、E. coliにおけるhTR配列の発現のため
に構築した。プライマーhTR+1 5'−ＧＧＧＧＡＡＧＣ
ＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＴＴＧ
ＣＧＧＡＧＧＧＴＧＧＧＣＣＴＧ−3'およびhTR＋445
5'−ＣＣＣＣＧＧＡＴＣＣＴＧＣＧＣＡＴＧＴＧＴＧＡ
ＧＣＣＧＡＧＴＣＣＴＧＧＧ−3'を用いて、（hTR＋1に
おけるように）PCRにより5'末端にＴ7プロモーターを有
する全長hTRを含有するpGRN33からのフラグメントを増
幅した。PCR産物のBamHI-HindIII消化物をpUC119のBamH
I-HindIII部位に挿入した。コード配列はＴ7プロモータ
ーに作動可能に連結した。このベクターで使用する選択
マーカーはアンピシリンである。
【０８６０】pGRN165 このベクターを、E. coliにおけるhTRT配列の発現およ
び変異誘発のために構築した。コード配列はＴ7プロモ
ーターに作動可能に連結する。kozak前方末端と共にhTR
T ORFを含有するpGRN145からのEcoRIフラグメントを、h
TRTがＴ7プロモーターと同一方向の方向となるように、
pBluescriptIISK+のEcoRI部位に挿入した。このベクタ
ーで使用する選択マーカーはアンピシリンである。
【０８６１】pGRN166 このベクターを、哺乳動物細胞におけるTRT配列の発現
および変異誘発のために構築した。コード配列はＴ7プ
ロモーターに作動可能に連結する。kozak前方末端およ
び後方末端のIBI flagと共にhTRT ORFを含有するpGRN15
1からのEcoRIフラグメントを、hTRT ORFがＴ7プロモー
ターと同一方向の方向となるようにpBluescriptIISK+の
EcoRI部位に挿入した。このインサートは5'および3’UT
Rを有さないhTRTの全長cDNA、FLAG配列（Immunex Cor
p.,Seattle、WA)、およびkozak配列を含んだ。このベク
ターで使用する選択マーカーはアンピシリンである。
【０８６２】pGRN167 hTRT ORFの5'末端を含有するpGRN144からのAvRII-StuI
フラグメントを、pBBS161のXbaI-StuI部位に挿入した。
【０８６３】pGRN168 最適化hTRT発現カセットを含有するpGRN145からのEcoRI
フラグメントを、hTRTコード配列がミニCMVプロモータ
ーと同一方向となるように、pINDのEcoRI部位に挿入し
た。
【０８６４】pGRN169 最適化hTRT発現カセットを含有するpGRN145からのEcoRI
フラグメントを、hTRTがミニCMVプロモーターと逆方向
になるように、pINDのEcoRI部位に挿入した。
【０８６５】pGRN170 最適化hTRT発現カセットを含有するpGRN145からのEcoRI
フラグメントを、hTRTがミニCMVプロモーターと逆方向
になるように、pIND(sp1)のEcoRI部位に挿入した。
【０８６６】pGRN171 pGRN163からのEco47III-NarIフラグメントを、pGRN167
のEco47III-NarI部位に挿入し、MlL変異をhTRTゲノムDN
Aのフラグメントに入れた。
【０８６７】pGRN172 hTRT ORFにおけるMetからLeuの変異を含有するpGRN171
からのBamHI-StuIフラグメントを、pSEAP2-BasicのBglI
I-NruI部位に挿入した。
【０８６８】pGRN173 hTRTプロモーター領域の5'末端を含有するpGRN144から
のEcoRV-ECO47IIIフラグメントを、pGRN172のSrfI-Eco4
7III部位に挿入した。これにより、Met1−>Leu変異と共
に、hTRT ORFの開始からほぼ2.3kb上流からコード領域
における第1イントロンの直後までのhTRTのプロモータ
ー領域を含有するプロモーターレポータープラスミドが
作製される。
【０８６９】pGRN174 「最適化」hTRT発現カセットを含有するpGRN145からのE
coRIフラグメントを、hTRTがミニCMVプロモーターと同
一方向になるように、pIND(sp1)のEcoRI部位に挿入し
た。
【０８７０】実施例７ テロメラーゼ活性の再構成 Ａ．インビトロにおけるhTRTおよびhTRの共発現 本実施例では、インビトロ無細胞発現系を用いるhTRTお
よびhTRの共発現を記載する。これらの結果は、pGRN121
によってコードされるhTRTポリペプチドが触媒的に活性
なテロメラーゼタンパク質をコードし、テロメラーゼRN
Pのインビトロ再構成（IVR）が組換えにより発現された
hTRTおよびhTRを用いて達成できることを示す。
【０８７１】カップリングした転写−翻訳網状赤血球溶
解物系（Promega TNTTM)に、hTRT（pGRN121;XbaIで消化
した1μg DNA）およびhTR（phTR+1;FspIで消化した1μ
ｇ）の線状化プラスミドを添加することによって、テロ
メラーゼ活性を復元した。phTR+1は、FspIで線状化し、
次いで、T7 RNAポリメラーゼによって転写した場合に、
ヌクレオチド＋1で始まり、hTRのヌクレオチド446まで
伸びる445ヌクレオチド転写体を生じるプラスミドであ
る（Autexierら, 1996, EMBO J. 15:5928)。50μl反応
につき、以下の成分を添加した：2μl TNTTM緩衝液、1
μl TNTTM T7 RNAポリメラーゼ、1μl 1mMアミノ酸混合
物、40ユニットRnasinTM RNaseインヒビター、1μgの各
線状化テンプレートDNA、および25μl TNTTM網状赤血球
溶解物。成分は製造業者によって推奨される比率で添加
し、30℃で90分間インキュベートした。転写は、Ｔ7プ
ロモーターの指示下にあり、また、網状赤血球溶解物の
添加に先立って行うことができ、同様の結果であった。
インキュベーションの後、プログラムされた転写−翻訳
反応の5および10μlを、シグナルを増幅するために20サ
イクルのPCRを用い、前記したようにTRAPによってテロ
メラーゼ活性についてアッセイした（Autexierら,前
掲)。
【０８７２】再構成の結果を図10に示す。アッセイした
各転写／翻訳反応につき、3レーンがある。最初の2レー
ンは二連アッセイであって、第3レーンは、PCR生成人工
物をなくするためのTRAP相に先立って熱変性した（95
℃、5分）二連試料である。
【０８７３】図10に示すように、網状赤血球溶解物は単
独では検出可能なテロメラーゼ活性を有さない（レーン
6）。同様に、hTR単独（レーン1）または全長hTRT遺伝
子（レーン4）のいずれかを溶解物に添加した場合、検
出可能な活性は観察されない。両成分を添加した場合
（レーン2）、特徴的な反復ラダーパターンによって示
されるようにテロメラーゼ活性が生じている。hTRT遺伝
子のカルボキシル末端領域を、NcoIでのベクターの消化
によって除去した場合（「切形hTRT」）、テロメラーゼ
活性はなくなる（レーン3）。レーン5は、切形hTRT単独
の翻訳はテロメラーゼ活性を生じないことを示す。レー
ン「Ｒ8」は、TSR8のTRAPによって生じたテロメラーゼ
産物ラダーについての陽性コントロールを示す（5'−Ａ
ＴＴＣＣＧＴＣＧＡＧＣＡＧＡＧＴＴＡＧ［ＧＧＴＴＡ
Ｇ］7−3'のヌクレオチド配列を有する合成テロメラー
ゼ産物）。
【０８７４】Ｂ．インビトロでのhTRTおよびhTRの混合 テロメラーゼ活性のインビトロ再構成もまた、混合によ
って達成された。hTRプラスミドを添加しないこと以外
は前記のように、hTRTを転写し、翻訳させた。テロメラ
ーゼRNPの復元は、次いで、hTRT翻訳混合物と（phTR+1-
FspからT7 RNAポリメラーゼ転写により予め生じた）hTR
とを、hTRの2μl（1μg）に対してhTRT翻訳混合物2μｌ
の比で混合し、次いで、30℃で90分間インキュベートさ
れることによって達成された。hTRT/hTR復元のこの方法
を「連結復元」または「連結IVR」と呼ぶ。この混合物
においてテロメラーゼ活性は存在する（すなわち、検出
することができる）。DEAEクロマトグラフィーによる活
性の部分的精製の後に、改良されたシグナルが観察され
た。この場合、Millipore Ultrafree-MC DEAE Centrifu
gal Filter Devicesを製造業者に指示に従って使用し
た。使用した緩衝液は、hypo0.1、hypo0.2、およびhypo
1.0であり、ここでhypoは、20mM Hepes-KOH、pH7.9、2m
M MgCl2、1mM EGTA、10％グリセロール、0.1％ NP-40、
1mM DTT、1mMメタ重亜硫酸ナトリウム、1mMベンズアミ
ジン、および0.2mMフッ化フェニルメチルスルホニル（P
MSF）であり、そしてここで0.1、0.2および1.0は、0.
1、0.2または1.0M HClをいう。フィルターをhypo1.0で
予備コンディショニングし、hypo0.1で洗浄し、復元さ
れたテロメラーゼを添加し、カラムをhypo0.1次いでhyp
o0.2で洗浄し、そして再構成されたテロメラーゼを添加
した容量の半分にてhypo1.0で溶出した。この処方物
は、−70℃にて凍結保存することができ、活性を保持す
る。
【０８７５】テロメラーゼ活性を、2工程手法でアッセ
イした。工程1において、放射性標識を使用しなかった
ことを除き、Morin, 1989, Cell 59:521に記載されてい
るように、通常のテロメラーゼアッセイを行った。工程
2において、前記したように、TRAP手法によって、20〜3
0サイクルで、アリコートをアッセイした。25mMトリス
−HCl、pH8.3、50mM酢酸カリウム、1mM EGTA、1mM MgCl
2、2mM dATP、2mM TTP、10μM dGTP、および1μＭプラ
イマー（通常、Ｍ2，5'−ＡＡＴＣＣＧＴＣＧＡＧＣＡ
ＧＡＧＴＴ）の40〜50μlの最終容量中にて、30℃で60
〜180分間、1-10μｌの再構成テロメラーゼをアッセイ
することによって、通常のアッセイを行った。95℃で5
分間加熱することによって反応を停止し、1〜10μｌの
第1工程混合物を工程2のTRAP反応（50μｌ）で続けた。
【０８７６】さらなる実験において、インビトロ復元間
のhTRTおよびhTRの合成を、それぞれ、35Ｓ−メチオニ
ン取り込みおよびノーザンブロッティングによってモニ
ターした。ほぼ予測されたサイズのタンパク質が、相互
に対してほぼ等モル量にて、hTRT（127kD）、hTRT-Nco
（85kD）、およびpro90hTRT（90kD）について合成され
た。ノーザン分析は、hTR合成が正しいサイズ（445ヌク
レオチド）であって、インタクトが優勢であることを示
した。
【０８７７】再構成プロトコル（前掲）の変形は当業者
には明らかである。例えば、復元の時間および温度、お
よび一価塩（例えば、NaCl、KCl、酢酸カリウム、グル
タミン酸カリウムなど）、二価塩（MgCl2、MnCl2、MgSO
4など）。変性剤（尿素、ホルムアミドなど）、界面活
性剤（NP-40、Tween、CHAPSなど）のような成分の存在
または濃度、（免疫沈降、アフィニティーまたは標準的
クロマトグラフイーのような）別の改良された精製手法
を使用することができる。これらのおよび他のパラメー
ターは、特定のアッセイまたは他の再構成プロトコルに
対する条件を最適化するために体系的に変化させること
ができる。
【０８７８】Ｃ．hTRT変異型および融合タンパク質を用
いる再構成 ほぼ野生型レベルで、EGFP-hTRT、増強された緑色蛍光
タンパク質とhTRTとの融合物（実施例6および15参
照）、またはエピトープタグ化hTRT（IBI FLAG、実施例
6参照）両再構成テロメラーゼ活性をhTRを用いて共発現
させた場合、テロメラーゼ触媒活性の再構成が起こっ
た。
【０８７９】対照的に、変異型hTRT、pro90hTRT（RTモ
チーフＢ’、Ｃ、ＤおよびＥを欠く）を使用した場合、
テロメラーゼ活性は復元されなかった。これは、pro90h
TRTが他の部分的活性（例えば、RNA［すなわち、hTR］
結合能力）を有し、前記したようにインビボでテロメラ
ーゼのドミナントネガティブなレギュレーターとして機
能し得るが、十分なテロメラーゼ触媒活性を保有しない
ことを示す。
【０８８０】Ｄ．ゲルブロットおよび通常のテロメラー
ゼアッセイを用いるインビトロ再構成テロメラーゼ活性
のアッセイ 以下の実施例は、インビトロ復元した（IVR）テロメラ
ーゼが増幅に基づくアッセイ（すなわち、TRAP）に加え
て通常のテロメラーゼアッセイを用いてアッセイできる
ことを示す。以下の反応条件：30℃における180分間
の、40μｌ最終容量の25mMトリス−HCl、pH8.3、50mM酢
酸カリウム、1mM EGTA、1mM MgCl2、0.8mMdATP、0.8mM
TTP、1.0mM dGTP、および1μＭプライマー（Ｍ2、前
掲；またはＨ3.03、5'−ＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴ
ＡＧＧＧ）中の1-10μlの連結したIVRテロメラーゼを用
いるゲルブロットアッセイを使用して、パート（Ｂ）に
記載したようなIVRテロメラーゼ（前掲）（「連結復元
方法」）、続いて前記したようにDEAE精製を行ったIVR
テロメラーゼをアッセイした。合成されたテロメリック
DNAを標準的な手法によって単離し、8％ポリアクリルア
ミド／8Ｍ尿素ゲルで分離し、ナイロン膜に移し、ドッ
トブロットアッセイで用いた32P-(CCCTAA)nリボプロー
ブを用いてプローブした。このプローブは、モノＱおよ
びヘパリンクロマトグラフイーによって精製された5μl
の天然核テロメラーゼにつき観察されたラダーと同等の
10μｌのIVRテロメラーゼを表すレーンにおいて、6ヌク
レオチドラダーを同定した。結果は、IVRテロメラーゼ
が天然テロメラーゼと同等の進行的テロメラーゼ触媒活
性を保有することを示す。
【０８８１】また、通常の32P-dGTP取り込みテロメラー
ゼアッセイによって、連結IVRテロメラーゼをアッセイ
した。前記したように、連結再構成方法により調製し、
続いてDEAE精製を行ったIVRテロメラーゼを、進行的お
よび非進行的の両反応条件下でアッセイした。アッセイ
条件は、30℃［進行的反応］または37℃［非進行的反応
用］における180分間の、10μM 32P-dGTP（72Ci／ミリ
モル）［進行的条件のアッセイ用］または1μM 32P-dGT
P（720Ci／ミリモル）［非進行的用］、および1μＭプ
ライマー（すなわち、Ｈ3.03、前掲）を含む、25mMトリ
ス−HCl、pH8.3、50mM酢酸カリウム、1mM EGTA、1mM Mg
Cl2、2mM dATP、2mM TTPの40μlの最終容量の中の5〜10
μｌ連結IVRテロメラーゼであった。合成されたテロメ
リックDNAを標準的な手法によって単離し、そして8％ポ
リアクリルアミド／8Ｍ尿素ゲル配列決定ゲルで分離し
た。進行的反応は、進行的テロメラーゼ反応と合致する
弱い6ヌクレオチドラダーを示し、そして非進行的反応
は、1の反復を付加した。これは、天然テロメラーゼ調
製物を用いるコントロール反応と同等のパターンであ
る。IVRテロメラーゼを用いる通常のアッセイは、本明
細書に記載するテロメラーゼモジュレーターについての
スクリーニング、ならびにテロメラーゼの構造および機
能特性の解明のような他の用途で有用である。
【０８８２】Ｅ．インビトロ復元テロメラーゼはプライ
マー3'末端を認識する 本実験は、IVRテロメラーゼが、天然（精製）テロメラ
ーゼと同等にプライマー3'末端を認識することを示す。
テロメラーゼはプライマー3'末端およびhTRのテンプレ
ート領域との間に塩基対合二重鎖を形成し、そして次の
特定されるヌクレオチドを付加する（Morin, 1989,前
掲）。IVR（組換え）テロメラーゼが同一特性を有する
ことを確認するために、前記にて詳細に記載した2工程
の通常／TRAPアッセイによってアッセイしたIVRおよび
天然のテロメラーゼを用い、−−−ＧＧＧまたは−−−
ＴＡＧ3'末端を有するプラマー（ＡＡＴＣＣＧＴＣＧＡ
ＧＣＡＧＡＧＧＧおよびＡＡＴＣＣＧＴＣＧＡＧＣＡＧ
ＡＴＡＧ）の反応を、−−−ＧＴＴ3'末端（Ｍ2前掲）
を有するプライマーと比較した。標準プライマー（−−
−ＧＴＴ3'末端）と比較すると、−−−ＧＧＧおよび−
−−ＴＡＧプライマーの産物ラダーは、それぞれ、＋4
および＋2シフトし、天然テロメラーゼで観察されたも
のと同一効果であった。この実験は、IVRおよび天然の
テロメラーゼが同様にプライマー末端を認識することを
示す。
【０８８３】これらの結果は、（IVRテロメラーゼが進
行的および非進行的な両触媒活性を保有することを示す
前掲の結果と共に）IVRテロメラーゼが天然もしくは精
製のテロメラーゼと比較して同様の構造および特性を有
することを示す。
【０８８４】実施例８ 抗hTRT抗体の生産 Ａ．hTRTペプチドに対する抗hTRT抗体の生産 抗hTRT抗体を生産するために、アミノ末端残基としてＣ
（システイン）を付加させて、hTRT由来の以下のペプチ
ドを合成した（図54参照）。
【０８８５】
【化１６】
【０８８６】システイン部分を用いて、ペプチドをBSA
およびKLH［キイホールリンペットヘモシアニン］キャ
リアータンパク質に固定化（すなわち、共有結合）させ
た。KLH−ペプチドを抗原として使用した。BSA−ペプチ
ドコンジュゲートを、免疫抗血清の特異性を試験するた
めにELISA用材料として供した。
【０８８７】KLH−ペプチドコンジュゲートをニュージ
ーランド白ウサギに注射した。初回の注射は腋窩および
鼠径リンパ節近位に注射物を置くことによってなされ
る。追加注射は筋肉内で行った。初回の注射のために、
抗原をフロイントの完全アジュバントで乳化し；追加注
射のために、フロイントの不完全アジュバントを用い
た。ウサギには続いて3週間のブーストサイクルを行
い、ここで、20〜25mlの血清を生じる50mlの血液を各ブ
ーストの10日後に採取する。ウェスタンブロットに際し
て、4つのペプチドのそれぞれに対する抗血清は、組換
えhTRT融合タンパク質のhTRT部分（GST-HIS8-hTRT−フ
ラグメント2426〜3274；実施例6参照）を認識した。
【０８８８】PCT出願第97／06012号に記載されているよ
うに生産されたヒト293細胞からの部分的精製テロメラ
ーゼ画分（粗製核抽出物と比較してほぼ1000倍精製）お
よびアフィニティー精製抗Ｓ−2抗体を用い、130kdタン
パク質のダブレットがウェスタンブロットで検出でき
た。感受性化学ルミネセンス検出方法を用いた（SuperS
ignal化学ルミネセンス基質、Pierce）が、ブロットで
のシグナルは弱く、これは、hTRTがこれらの不死化細胞
では低いまたは非常に低い量で存在することを示す。ダ
ブレットの観察は、hTRTの翻訳後修飾、すなわち、リン
酸化またはグリコシル化と合致する。
【０８８９】アフィニティー精製のために、S-2ペプチ
ドを、製造業者のプロトコルに従ってそのＮ末端システ
イン残基を介してSulfoLink (Pierce, Rockford、IL）
に固定化した。KLH-S-2ペプチド抗原で免疫化したウサ
ギからの第1の採血血清をS-2-SulfoLinkに添加し、そし
てＳ−2ペプチドに特異的に結合した抗体を溶出させ
た。
【０８９０】Ｂ．hTRT融合タンパク質に対する抗hTRT抗
体の生産 GST-hTRT融合タンパク質を、実施例6に記載したGST-hTR
Tフラグメント＃4（ヌクレオチド3272〜4177）およびGS
T-HIS8−hTRTフラグメント＃3（ヌクレオチド2426〜327
4）タンパク質としてE. coliで発現させた。融合タンパ
ク質を不溶性タンパク質として精製し、そして抗原の純
度をSDSポリアクリルアミドゲルによってアッセイし、G
ST-hTRTフラグメント＃4組換えタンパク質につき約75％
の純度、およびGST-HIS8-hTRTフラグメント＃3組換えタ
ンパク質につき75％を超える純度が見積もられた。日常
的な方法が、90％を超える純度でこれらのおよび他の融
合タンパク質を得るために用いることができる。これら
の組換えタンパク質を用いて、ウサギおよびマウスの双
方を前記したように免疫化した。
【０８９１】マウスおよびウサギ双方からの第1および
第2採血を、固定化GSTを含有するマトリックスを用い
て、抗GST抗体の除去後における抗hTRT抗体の存在につ
いて、試験した。抗血清を、固定化組換えGST-hTRT融合
タンパク質を用いるウェスタンブロッティングによっ
て、および部分的に精製した天然テロメラーゼ酵素を用
いる免疫沈降によって、抗hTRT抗体について試験した。
これらの初期採血ではシグナルは観察されなかったが、
予測されるような抗hTRT抗体の力価は引き続いての採血
で増加した。
【０８９２】実施例９ Δ182 RNA変異体に対応するhTRT mRNAの検出 ヒト睾丸および293細胞株からのポリA+RNAを、RT-PCRお
よびネスト化プラスマーを用い、hTRT mRNAについて分
析した。第1プライマーセットはTCP1.1およびTCP1.15で
あり；第2プライマーセットはTCP1.14およびBTCP6であ
った。それぞれからの増幅は182bpだけ異なる2つの産物
を与えた；睾丸RNAからの大および小産物を配列決定
し、それぞれ、確かにpGRN121（図16）および712562ク
ローン（図18）に相当することが判明した。変異型hTRT
RNA産物はSW39i、OVCAR4、293、および睾丸からのmRNA
で観察された。
【０８９３】さらなる実験を行って、Δ182 cDNAが逆転
写の人工物ではないことが示された。略言すれば、全長
hTRT RNA（すなわち、欠失なし）を、RT-PCR用のテンプ
レートとして使用するpGRN121のインビトロ転写によっ
て生産した。42℃または50℃で、ランダム−プライマー
または特異的プライマーにて、Superscriptョ逆転写酵素
(Bethesda Research Laboratories, Bethesda, MD)を用
いて別々のcDNA合成反応を行った。15PCRサイクル後、
長い産物が検出できた；しかしながら、小さな産物（す
なわち、欠失に対応する）は30以上のサイクルの後でも
検出できなかった。これは、RT-PCR産物が人工物ではな
いことを示す。
【０８９４】実施例１０ 睾丸hTRT mRNAの配列決定 hTRT RNAの睾丸形態の配列は、ThermoSequenase放射性
標識ターミネーターサイクル配列決定キット（Amersham
Life Science)を用い、睾丸cDNA（Marathon Testes cD
NA, Clontech, San Diego, CA)からのPCRによって生成
したDNAフラグメントの直接的手動配列決定によって決
定した。PCR工程は表２２に示すようにネスト化PCRによ
って行った。全ての場合において、cDNAなしのプライマ
ーとの陰性コントロール反応を行った。コントロール反
応において産物が存在しないことは、存在するcDNAとの
反応に由来する産物が、pGRN121または他の細胞供給源
（例えば、293細胞）からのhTRTの汚染によるものでは
ないことを示した。DNAフラグメントをアガロースゲル
から切り出して、配列決定に先立って、DNAを精製し
た。
【０８９５】pGRN121挿入配列の塩基27〜3553に対応
し、全hTRT ORF（塩基56〜3451）を含有する睾丸mRNA配
列が得られた。この領域において、睾丸およびpGRN121
配列の間で差異はなかった。
【０８９６】
【表２２】
【０８９７】実施例１１ RNase保護によるhTRT mRNAの検出 RNase保護アッセイを、hTRT mRNAまたは変異型mRNAの存
在を検出し、モニターし、または診断するために用いる
ことができる。1の例示的RNase保護プローブは、hTRT m
RNA配列に相補的な配列ならびに追加の非相補的配列よ
りなるインビトロ合成したRNAである。後者の配列は、
アッセイにおける陽性結果から生じるプローブのフラグ
メントと全長プローブとを区別するために含まれる。陽
性アッセイでは、プローブの相補的配列はRNase消化か
ら保護される。何故ならば、それらはhTRT mRNAにハイ
ブリダイズするからである。非相補的配列を、RNaseお
よび標的相補的核酸の存在下で、プローブから消化して
取り去る。
【０８９８】2つのRNase保護プローブを例示のために記
載する：いずれもアッセイで使用できる。プローブはhT
RTに相補的なそれらの配列において異なるが、本実施態
様では、SV40後期mRNAリーダー配列に由来する同一の非
相補的配列を含有する。5'から3'へ、1のプローブは、
非相補的配列の33ヌクレオチドおよび227ヌクレオチド
の全長プローブサイズのhTRTヌクレオチド2513−2707に
相補的な配列の194ヌクレオチドよりなる。5'から3'
へ、第2のプローブは、非相補的配列の33ヌクレオチド
および231ヌクレオチドの全長プローブサイズのhTRTヌ
クレオチド2837−3035に相補的な配列の198ヌクレオチ
ドよりなる。アッセイを行うためには、いずれかのプロ
ーブを、試験試料からのRNA、すなわちポリA+RNAにハイ
ブリダイズさせることができ、次いで、Ｔ1リボヌクレ
アーゼまたはRNaseAを添加する。消化の後、プローブRN
Aを精製し、ゲル電気泳動によって分析する。227ヌクレ
オチドプローブの194ヌクレオチドフラグメントおよび2
31ヌクレオチドプローブの198ヌクレオチドフラグメン
トは試料におけるhTRT mRNAの指標である。
【０８９９】本実施例に記載した例示的RNase保護プロ
ーブは、T7 RNAポリメラーゼを用い、インビトロ転写に
よって生じさせることができる。放射性または他の方法
で標識したリボヌクレオチドを標識プローブの合成用に
含ませることができる。RNAプローブを生産するインビ
トロ転写反応のためのテンプレートはPCR産物である。
これらの例示的プロープは、hTRT遺伝子またはmRNAの対
応する相補的領域にまたがるプライマーを用いるpGRN12
1 DNAのPCR増幅後にＴ7ポリメラーゼを用いて、合成す
ることができる。加えて、下流プライマーはT7 RNAポリ
メラーゼプロモーター配列および非相補的配列を含有す
る。
【０９００】第1のRNase保護プローブの生成のために、
以下のプライマー対（Ｔ701およびリバース01）からのP
CR産物を用いる：
【０９０１】
【化１７】
【０９０２】第2のRNase保護プローブの生成のために、
以下のプライマー対（Ｔ702およびリバース02）からのP
CR産物を用いる；
【０９０３】
【化１８】
【０９０４】実施例１２ hTRTおよび他の逆転写酵素を比較する系統樹の構築 系統樹（図6）を、XiongおよびEickbush (1990, EMBO
J. 9:3353)によって定義された7つのRTドメインの比較
によって構築した。4つのTRT、67のRT、および3つのRNA
ポリメラーゼからのモチーフ1、2、およびＡ−Ｅの配列
アラインメントの後、NJ（隣接結合)方法(Saitouおよび
Nei, 1987, Mol. Biol. Evol. 4:406)を用いて系統樹を
構築した。系統樹の同一枝に位置する同一クラスからの
要素をボックスとして単純化する。各ボックスの長さ
は、そのボックス内の最も発散した要素に対応する。
【０９０５】TRTは、LTR−レトロトランスポゾンおよび
ウイルスRTよりも、msDNA、グループIIイントロン、お
よび非LTR（長末端反復）レトロトランスポゾンに関連
するRTに、より密接に関係するようである。これらの後
者の要素がショウジョウバエにおいてテロメア維持のた
めにテロメラーゼを置き換えたとすれば、レトロ要素の
非LTR枝に対するテロメラーゼRTの関係は興味深い。し
かしながら、最も驚くべき発見は、TRTが、以前に知ら
れているRTのいずれかに関してポリオウイルスのような
プラス鎖RNAウイルスのRNA依存性RNAポリメラーゼにほ
とんど密接に関連している離れた亜群を形成するという
ことである。4つのテロメラーゼ遺伝子が進化的に距離
のある生物−−原生動物、菌類、および哺乳動物−−に
由来することを考慮すると、この別々のグループ分け
は、データセットにおける系統発散の欠如によって説明
することができない。事実、この深い分岐は、テロメラ
ーゼＲＴが、恐らくは第1真核生物とともに始まる古代
群であることを示唆する。
【０９０６】系統樹分析で使用したGenBankタンパク質
同定または受託番号は以下の通りであった：msDNA（945
35、134069、134074、134075、134078）、グループＩＩ
イントロン（483039、101880、1332208、1334433、1334
435、133345、1353081）、ミトコンドリアプラスミド／
RTL（903835、134084）、非ＬＴＲレトロトランスポゾ
ン（140023、84806、103221、103353、134083、43541
5、103015、1335673、85020、141475、106903、13040
2、Ｕ0551、903695、940390、2055276、Ｌ08889）、Ｌ
ＴＲレトロトランスポゾン（74599、85105、130582、99
712、83589、84126、479443、224319、130398、13058
3、1335652、173088、226407、101042、1078824）、ヘ
パドナウイルス（Ｉ18876、1706510、118894）、カウリ
モウイルス（331554、130600、130593、93553）、レト
ロウイルス（130601、325465、74601、130587、13067
1、130607、130629、130589、130631、1346746、13065
1、130635、1780973、130646）。アラインメントはClus
talW 1.5[J. D. Thompson, D. G. Higgins, T. J. Gibs
on, Nucleic Acids Res. 22, 4673 (1994)]およびPHYLI
P 3.5[J. Felsenstein, Cladisfics 5, 164 (1989)]を
用いて分析した。
【０９０７】実施例１３ コントロールプラスミドおよびhTRTをコードするプラス
ミドでの培養ヒト線維芽細胞（BJ）のトランスフェクシ
ョン 本実施例は、哺乳動物細胞における組換えhTRTタンパク
質の発現の結果、活性テロメラーゼが生成されることを
示す。
【０９０８】サブコンフルエントなBJ線維芽細胞をトリ
プシン処理し、そして4×106細胞／mlの濃度にて、新鮮
な培地（10％ウシ胎児血清を含有するDMEM／199）に再
懸濁した。BioRad Gene PulserTMエレクトロポレーター
でのエレクトロポレーションを用い、細胞をトランスフ
ェクトした。必要に応じて、製造業者の指示に従い、Su
perfectTM試薬(Qiagen）を用い、細胞をトランスフェク
トしてもよい。エレクトロポレーションでは、500μｌ
の細胞懸濁液をエレクトロポレーションキュベット（Bi
oRad, 0.4cm電極ギャップ）に入れた。プラスミドDNA
（2μg）をキュベットに添加し、懸濁液を静かに混合
し、そして氷上で５分間インキュベートした。コントロ
ールプラスミド（pBBS212）は、MPSVプロモーターの後
にはインサートを含まず、実験プラスミド（pGRN133）
はMPSVプロモーターからhTRTを発現した。300ボルトお
よび960μFDで細胞をエレクトロポレートした。パルス
を送った後、キュベットを氷上に約5分間置き、その
後、100mm組織培養皿で培地中に播種した。6時間後、培
地を新鮮な培地で置き換えた。トランスフェクションの
72時間後、細胞をトリプシン処理し、PBSで1回洗浄し、
ペレット化し、そして−80℃で凍結保存した。細胞抽出
物を、改変された界面活性剤溶解法（Bodnarら, 1996,
Exp. Cell. Res. 228:58; Kimら, 1994, Science 266:2
011参照,および前掲のTRAPアッセイに関連する特許およ
び出版物に記載される）によって25,000細胞／μlの濃
度で調製し、そして細胞抽出物におけるテロメラーゼ活
性を、改変されたPCRに基づくTRAPアッセイ（Kimら, 19
94, Bodnarら, 1996)を用いて測定した。略言すれば、5
×104細胞当量を反応のテロメラーゼプライマー伸長部
分で用いた。抽出物は、典型的には、PCR増幅に対する
テロメラーゼ伸長反応から直接採取されたが、また、PC
R増幅に先立って、フェノール／クロロホルムで1回、お
よびクロロホルムで1回洗浄抽出され得る。1／5の物質
をTRAP反応のPCR増幅部分で使用した（ほぼ10,000細胞
当量）。TRAP反応の1／2を、図25における各レーンが5,
000細胞当量からの反応産物を表すように、分析のため
にゲルに負荷した。pGRN133でトランスフェクトした細
胞由来の抽出物はテロメラーゼ活性につき陽性であり、
他方、トランスフェクトされない（示さず）またはコン
トロールプラスミドでトランスフェクトされた細胞由来
の抽出物はテロメラーゼ活性を示さなかった。RPE細胞
を用いる同様の実験は、同一の結果を与えた。
【０９０９】また、BJ細胞における再構成はまた、他の
hTRT構築物（すなわち、pGRN145、pGRN155およびpGRN13
8）を用いて行った。これらの構築物を用いる再構成
は、pGRN133トランスフェクト細胞におけるよりも多く
のテロメラーゼ活性が生じるようであった。
【０９１０】最高レベルのテロメラーゼ活性は、pGRN15
5を用いて達成された。前記にて議論したように、pGRN1
55は、hTRTの発現のための制御エレメントとしてアデノ
ウイルス主要後期プロモーターを含有するベクターであ
り、BJ細胞にトランスフェクトした場合、テロメラーゼ
活性を再構成することが示された。
【０９１１】注目すべきことに、hTRT-GFP融合タンパク
質（これは核に局在化する、後記実施例15参照）を用い
て再構成が行われた場合、pGRN138は、インビトロ（実
施例7参照）またはインビボ（BJ細胞へのトランスフェ
クション）のいずれかのテロメラーゼ活性が得られた。
例えば、前記のようにBJ細胞へのトランスフェクション
によって、テロメラーゼ活性は、pGRN133またはpGRN145
を用いるインビトロ再構成から得らる活性に匹敵した。
【０９１２】同様の結果が、本発明のhTRT発現ベクター
を用いる、正常ヒト網膜色素沈着上皮（RPE）のトラン
スフェクションに際して得られた。RPE細胞の老化は、
老化関連の斑状変性の疾患に寄与するか、あるいはそれ
を引き起こすと考えられる。本発明のhTRT発現ベクター
を用いる本発明の方法により処理したRPE細胞は、未処
理細胞と比較して、遅延した老化を示すはずであり、従
って、老化関連の斑状変性を処置または防止する移植療
法で有用である。
【０９１３】実施例１４ プロモーターレポーター構築物 本実施例は、レポーター遺伝子がプロモーターエレメン
トを含有するhTRT上流配列に作動可能に連結したプラス
ミドの構築を記載する。ベクターは、インビボでのシス
およびトランスの転写調節因子の同定およびhTRT発現を
調節（例えば、活性化または阻害）し得る薬剤のスクリ
ーニング（例えば、薬物スクリーニング）を含む多数の
用途を有する。多数のレポーターを使用できるが（例え
ば、ホタルルシフェラーゼ、β−グルクロニダーゼ、β
−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルト
ランスフェラーゼ、およびGFP等）、ヒト分泌アルカリ
ホスファターゼ（SEAP、Clone Tech)を最初の実験で使
用した。SEAPレポーター遺伝子は、膜固定ドメインを欠
く胎盤酵素の切形形態をコードし、それによりタンパク
質がトランスフェクト細胞から効果的に分泌されること
を可能とする。培養培地中で検出されるSEAP活性のレベ
ルは、SEAP mRNAおよびタンパク質の細胞内濃度の変化
に直接比例することが示されている（Bergerら, 1988,
Gene 66:1; Cullenら, 1992, Meth. Enzymol. 216:36
2)。
【０９１４】4つの構築物（pGRN148、pGRN150、「pSEAP
2ベーシック」（プロモーター配列無し＝陰性コントロ
ール）および「pSEAP2コントロール」（SV40初期プロモ
ーターおよびエンハンサーを含有）を、有寿命性細胞お
よび不死細胞に三連にてトランスフェクトした。
【０９１５】プラスミドpGRN148を、図9に例示するよう
に構築した。略言すると、pGRN144からのBgl2-Eco47III
フラグメントを消化し、そしてpSeapBasic（Clonetech,
San Diego、CA)のBglII-NruI部位にクローン化した。
第2のレポーター−プロモーター、プラスミドpGRN150
は、実施例3に記載したhTRTイントロンからの配列を含
み、このイントロンに存在し得る調節配列を使用する。
プロモーター領域後の第2のATGがSEAP ORFの開始ATGと
なるように、開始MetをLeuに変異する。
【０９１６】（hTRTプロモーターを含む）pGRN148およ
びpGRN150構築物を有寿命性細胞（BJ細胞）および不死
細胞（293）にトランスフェクトした。全てのトランス
フェクションを2つのコントロールプラスミド：1つの陰
性コントロールプラスミド（pSEAPベーシック）および1
つの陽性コントロールプラスミド（SV40初期プロモータ
ーおよびSV40エンハンサーを含有するpSEAPコントロー
ル）と平行して行った。
【０９１７】不死細胞では、pGRN148およびpGRN150構築
物は、（SV40初期プロモーターおよびエンハンサーを含
有する）pSEAP2陽性コントロールと同程度に効果的にSE
AP発現を行うようである。対照的に、不死細胞において
は、pSEAP2コントロールのみが検出可能な活性を与え
た。これらの結果は、予測されるように、hTRTプロモー
ター配列が有寿命性細胞ではなく、腫瘍細胞で活性であ
ることを示す。
【０９１８】同様の結果が、別の正常細胞株（RPE、ま
たは網膜色素沈着上皮細胞）を用いて得られた。（2.2K
Bの上流ゲノム配列を含有する）pGRN150でトランスフェ
クトしたRPE細胞において、hTRTプロモーター領域は不
活性であり、他方、pSEAP2コントロールプラスミドは活
性であった。
【０９１９】前記したように、レポーター遺伝子が、プ
ロモーターエレメントを含有するhTRT上流配列に作動可
能に連結しているプラスミドは、一過性および安定なト
ランスフェクション技術の両方を用いる、テロメラーゼ
活性調節剤の同定およびスクリーニングで極めて有用で
ある。1つのアプローチにおいて、例えば、Ausubelら(1
997)(前掲）に従って、（neoのような）真核生物の選択
マーカーとの共トランスフェクションによって、pGRN14
8の安定な形質転換が、テロメラーゼ陰性およびテロメ
ラーゼ陽性の細胞でなされる。得られた細胞株は、例え
ば、試験化合物の存在下または非存在下で、hTRT−プロ
モーター−駆動の発現を比較することによって、推定テ
ロメラーゼ調節剤のスクリーニングに使用される。
【０９２０】本発明のプロモーター−レポーター（およ
び他の）ベクターはまた、トランス−およびシス−作用
性の転写および翻訳調節エレメントを同定するために使
用される。シス−作用性転写調節エレメントの例は、テ
ロメラーゼ遺伝子のプロモーターおよびエンハンサーを
含む。シス−およびトランス−作用性の調節剤の同定お
よび単離は、テロメラーゼの転写および翻訳を調節する
薬剤を同定するためのさらなる方法および試薬を提供す
る。
【０９２１】実施例１５ hTRTの細胞下(subcellular)局在化 hTRTおよび増強された緑色蛍光タンパク質（EGFP；Corm
ackら, 1996, Gene 173:33)の領域を有する融合タンパ
ク質を後記するように構築した。EGFP部分は、融合タン
パク質の存在または位置が容易に決定できるような検出
可能なタグまたはシグナルを提供する。EGFP−融合タン
パク質は正しい細胞区画に局在化するので、この構築物
を用いて、hTRTタンパク質の細胞下局在化を決定するこ
とができる。
【０９２２】Ａ．pGRN138の構築 哺乳動物細胞におけるhTRT-EGFP融合タンパク質の発現
用ベクターは、pGRN124（実施例6参照）由来のEcoRIイ
ンサートをpEGFP-C2（Clonetech,San Diego, CA)のEcoR
I部位に入れることによって構築した。融合タンパク質
のアミノ酸配列を以下に提供する。EGFP残基は太字で示
し、hTRT mRNAの5'非翻訳領域によってコードされる残
基には下線を施し、そしてhTRTタンパク質配列は通常の
字体で示す。
【０９２３】
【化１９】
【０９２４】部分的（例えば、切形的）hTRTコード配列
を用い、他のEGFP融合構築物を作製することができ、後
記するようににこれを用いて、hTRTポリペプチドの特定
の領域の活性を同定することができる。
【０９２５】Ｂ．pGRN138の核局所化および使用 pGRN138でのMIH293細胞およびBJ細胞のトランスフェク
ションにより、組換えにより発現されたhTRTの核局所化
が確認された。pGRN138（EGEP-hTRT）および（EGFPのみ
を発現する）コントロール構築物で細胞をトランスフェ
クトした。EGFP-hTRTの核局所化は、蛍光顕微鏡により
両細胞タイプで明らかである。前記したように、pGRN13
8 hTRT-GFP融合タンパク質は、BJ細胞にトランスフェク
トした場合にはインビトロ転写翻訳系およびインビボ系
の双方で、テロメラーゼ活性の再構成を支持する。
【０９２６】hTRT-EGFP融合タンパク質（または同様の
検出可能な融合タンパク質）を種々の適用で使用するこ
とができる。例えば、本実施例で記載する融合構築物、
またはEGFPの構築物およびhTRTの切形形態を用いて、hT
RT、ならびに細胞核に侵入し、および／または染色体末
端に局所化する変異型を能力を評価することができる。
さらに、pGRN138を用いて安定または一過的にトランス
フェクトされた細胞は、テロメラーゼ調節薬物または化
合物を同定するための化合物をスクリーニングするのに
使用される。核局所化またはテロメラーゼ局所化を妨害
する薬剤は、テロメラーゼインヒビターとして同定でき
る。EGFP-hTRTを安定に発現する腫瘍細胞株はこの目的
に有用であり得る。テロメラーゼの潜在的なモジュレー
ターを、これらのトランスフェクトされた細胞に投与
し、そしてEGFP-hTRTの局所化が評価される。さらに、F
ACSまたは他の蛍光に基づく方法は、hTRTを発現する細
胞を選択して、特に細胞の一過性トランスフェクション
を使用する場合に、薬物スクリーニングのための同種集
団を提供するために使用され得る。
【０９２７】別の適用において、hTRTの領域を変異誘発
させて、抗テロメラーゼ薬物（テロメラーゼ活性モジュ
レーター）についての標的である、核局所化に必要な領
域（例えば、残基193−196（PRRR）および235−240（PK
RPRR）を同定することができる。他の適切な適用は、以
下を含む；一過性トランスフェクション実験のため、お
よびEGFP-hTRTを発現する安定な細胞株を確立する場合
のための両方の効率的な細胞トランスフェクションの蛍
光マーカーとしての融合タンパク質の使用；hTRT変異体
−EGFPが、hTRを細胞質に保持し、テロメラーゼ維持を
防止する不死細胞の全てのhTRを一掃するように、不死
細胞における（核局所化に不十分な）変異した核局所化
シグナルを伴うhTRT-EGFP融合の発現；および免疫沈降
のためのタグ化タンパク質としての使用。
【０９２８】実施例１６ テロメラーゼ触媒活性に対する変異の効果 本実施例は、変化したアミノ酸および変化した触媒活性
を有するhTRT変異型タンパク質を記載する。アミノ酸置
換、続いての機能的分析は、ポリペプチド配列の重要性
および機能を評価する標準的手段である。本実施例は、
逆転写酵素（RT）およびテロメラーゼ（Ｔ）のモチーフ
の変化がテロメラーゼ触媒活性に影響することを示す。
【０９２９】通常の命名法を用いて、変異体を記載す
る；天然分子（hTRT）における標的残基は、一文字コー
ドおよび位置によって同定され、変異タンパク質におけ
る対応する残基は、一文字コードによって示される。従
って、例えば、「K626A」は、hTRTの626位における（す
なわち、モチーフ1における）リジンがアラニンに変化
した変異体を特定する。
【０９３０】Ａ．hTRT FFYxTEモチーフの変異 最初の実験において、標準的な技術を用いるpGRN121の
部位特異的変異誘発によってhTRTのアミノ酸560がフェ
ニルアラニン（Ｆ）からアラニン（Ａ）に変化した、hT
RT変異タンパク質「F560A」をコードするベクターを産
生した。この変異は、TRTのFFYxTEモチーフを破壊す
る。得られたF560A変異ポリヌクレオチドは、35S−メチ
オニンの存在下での無細胞の網状赤血球溶解物転写／翻
訳系を用いて評価されるように、全長hTRTタンパク質の
合成を行うことが示された。
【０９３１】変異ポリペプチドを実施例7で記載したよ
うにhTRTと共翻訳した場合、20サイクルのPCRを用いるT
RAPにより観測されるように、テロメラーゼ活性は検出
されなかったが、コントロールhTRT/hTR共翻訳は活性を
再構成した。TRAPアッセイにおける30サイクルのPCR
で、テロメラーゼ活性は変異hTRTで観察できたが、コン
トロール（野生型）hTRTよりもかなり低かった。
【０９３２】Ｂ．hTRTアミノ酸残基のさらなる部位特異
的変異誘発 標準的な部位特異的変異誘発技術（例えば、Ausubel,前
掲参照)を用い、6つのRTモチーフにおける保存されたア
ミノ酸をアラニンに変化させて、触媒活性に対するそれ
らの貢献を評価した。実施例7に詳細に記載した2工程の
通常の／TRAPアッセイを用いるIVRテロメラーゼを用
い、変異体をアッセイした。
【０９３３】K626A（モチーフ1）、R631A（モチーフ
2）、D712A（モチーフＡ）、Y717A（モチーフＡ）、D86
8A（モチーフＣ）の変異体は、大きく減少したかまたは
検出できないテロメラーゼ活性を有したが、Q833A（モ
チーフＢ）およびG932A（モチーフＥ）の変異体は中レ
ベルの活性を呈した。RTモチーフの外側の2つの変異
体、R688AおよびD897Aは、野生型hTRTと同等の活性を有
した。これらの結果は、逆転写酵素における類似の変異
と合致し（Joyceら, 1994, Ann. Rev. Biochem. 63:77
7)、そしてEst2pで得られた結果と同様である（Lingne
r, 1997, Science 276:561参照）。実験は、酵素活性に
重要および重要でないＲＴモチーフにおける残基を同定
し、そしてhTRTがヒトテロメラーゼの触媒タンパク質で
あることを示す。変異は、例えば、テロメラーゼ活性の
優性／陰性のレギュレーターとしての利用性を有する変
異hTRTポリペプチドを提供する。
【０９３４】既知のTRTのアミノ酸のアライメントは、
テロメラーゼ特異的モチーフ、モチーフＴ（前掲参照）
を同定した。hTRTにおけるこのモチーフの触媒的な役割
を決定するために、標準的な部位特異的変異誘発技術
（Ausubel,前掲)を用いてこのモチーフにおける6つのア
ミノ酸欠失（Δ560−565；FFYxTE）を構築した。実施例
7に詳細を記載した2段階の通常／TRAPアッセイを用い、
欠失をIVRテロメラーゼを用いてアッセイした。Δ560−
565変異体は観察可能なテロメラーゼ活性を25サイクル
のPCRの後に有さず、他方、野生型hTRT IVRテロメラー
ゼは強力なシグナルを生じた。モチーフＴ内の各残基に
おける各アミノ酸を同様な方法で独立して調べた；変異
体F560A、Y562A、T564、およびE565Aは中レベルのテロ
メラーゼ活性を保持し、他方、コントロール変異体F487
Aは活性に対して最小の影響を有した。注目すべきは、
変異体F561Aは、大きく減少したかまたは検出できない
テロメラーゼ活性を有し、他方、活性はその「復帰変異
体」F561A561Fで完全に復帰した。F561A561Fは、変異位
置をその元のフェニルアラニンに変化させる。これは、
観察された低下した活性を説明し得るプラスミドに対し
て他のアミノ酸変化が起こらなかったことを示すコント
ロールである。従って、Ｔモチーフは、テロメラーゼ活
性で絶対的に必要とされることが示された最初の非RTモ
チーフである。
【０９３５】モチーフＴは他の生物由来のTRTの同定で
用いることができ、そしてこのモチーフの変異型を含む
hTRTタンパク質を、テロメラーゼ活性の優性／陰性レギ
ュレーターとして使用することができる。多くの他のRT
とは異なり、テロメラーゼは単一RNAの小部分（すなわ
ち、hTR）と安定に会合し、そして前進的にそれをコピ
ーし、従って、モチーフＴはhTR結合の媒介、反応の進
行性、またはテロメラーゼRTに対してユニークな他の機
能に関与し得る。
【０９３６】実施例１７ 組換えにより発現されたテロメラーゼ成分を用いるテロ
メラーゼ活性モジュレーターについてのスクリーニング 本実施例は、テロメラーゼ活性モジュレーターをスクリ
ーニングし、同定するためのインビトロ再構成されたテ
ロメラーゼの使用を記載する。記載したアッセイは、容
易に（例えば、マルチウェルプレートおよび／またはロ
ボット系を用いる）高処理能力の方法に適合される。ア
ッセイの工程に対する多数の変形は、この開示のレビュ
ーの後に当業者に明らかである。
【０９３７】テロメラーゼ成分（例えば、hTRTおよびhT
R）についての組換えクローンを、製造者の指示に従
い、米国特許第5,324,637号に記載されているTNT(登録
商標)Coupled Reticulocyte溶解物系（Promega)を使
用、以下のインビトロ反応で、そして前記実施例7に記
載されているように、転写および翻訳する（hTRTの
み）。
【０９３８】 試薬 反応当たりの量（μＬ） TNTウサギ網状赤血球溶解物 25 TNT反応緩衝液 2 TNT T7 RNA Pol. 1 AA混合物（完全） 1 プライムRNaseインヒビター 1 無ヌクレアーゼ水 16 XbaI切断のpGRN121[hTRT](0.5μg) 2 FspI切断のpGRN164[hTR](0.5μg) 2 反応物を30℃で2時間インキュベートする。次いで、生
成物をultrafree−MC DEAEフィルター（Millipore)で精
製する。
【０９３９】DMSOに溶解した試験化合物の複数の濃度
（例えば、10μＭ−100μＭ）の存在下および非存在下
で組換えテロメラーゼ産物（IVRP）をアッセイする。2.
5μL IVRP、2.5％DMSO、および1X TRAP緩衝液（20mM Tr
is−HCl、pH8.3、1.5mM MgCl2、63mM KCl、0.05％Tween
20、1.0mM EGTA、0.1mg／mlウシ血清アルブミン）の存
在下、室温にて、試験化合物を25μＬの合計容量中で30
分間プレインキュベートする。プレインキュベーション
の後、25μＬのTRAPアッセイ反応混合物を各試料に添加
する。TRAPアッセイ反応混合物は、1X TRAP緩衝液、50
μl dNTP、2.0μg/mlプライマーACX、4μg/mlプライマ
ーＵ2、0.8attomol／ml TSU2、2ユニット／50μl Taqポ
リメラーゼ（Perkin Elmer)、および2μg/ml［32Ｐ］5'
末端標識プライマーTS（3000Ci／mmol）からなる。次い
で、反応チューブをPCRサーモサイクラー（MJ Researc
h)に入れ、そしてPCRは以下のように行う：30℃におけ
る60分間、20サイクルの｛94℃における30秒、60℃にお
ける30秒、72℃における30秒｝、72℃における1分、10
℃への冷却。TRAPアッセイは、米国特許第5,629,154号
において、前記したように記載されている。使用された
プライマーおよび基質は以下の配列を有する:
【０９４０】
【化２０】
【０９４１】PCR工程の完了後、ブロモフェノールブル
ーを含有する4μlの10Ｘ負荷緩衝液を各反応チューブに
添加し、生成物（20μl）を400Ｖにおいて0.5X TBE中の
12.5％非変性PAGEで泳動する。完了したゲルを続いて乾
燥し、TRAP生成物をPhosphorimagerまたはオートラジオ
グラフィーによって可視化する。試験化合物の存在下に
おけるテロメラーゼ活性を、薬剤を欠く平行反応に対し
て反応生成物中の標識の取り込みを比較することによっ
て測定する。
【０９４２】実施例に記載する以下のクローンを、Amer
ican Type Culture Collection, Rockville, MD 20852,
USAに寄託した： ラムダファージλ25−1.1 ATCC受託番号209024 pGRN121 ATCC受託番号209016 ラムダファージλＧФ５ ATCC受託番号98505 本発明は、hTRTに関する新規な方法および物質、ならび
にテロメラーゼ関連疾患の診断および処置を提供する。
特定の実施例を提供したが、前記の記載は例示的なもの
であって限定的なものではない。本発明の多くの変形が
本明細書のレビューにより当業者に明らかになる。従っ
て、本発明の範囲は、前記の記載を参照することなく決
定されるべきであり、代わりに、等価物のその全範囲と
共に添付の請求の範囲を参照して決定されるべきであ
る。
【０９４３】本出願で引用された全ての刊行物および特
許書類は、それぞれ個々の刊行物または特許書類が個々
に示されるのと同程度に全ての目的でその全体において
参考として援用される。
【０９４４】
【配列表】 SEQUENCE LISTING (1) GENERAL INFORMATION: (i) APPLICANT: (A) NAME: Geron Corporation (B) STREET: 230 Constitution Drive (C) CITY: Menlo Park (D) STATE: California (E) POSTAL CODE (ZIP): 94025 (F) COUNTRY: USA (G) TELEPHONE: (415) 473-7700 (H) TELEFAX: (415) 473-7750 (I) TELEX: (i) APPLICANT: (A) NAME: University Technology Corporation (B) STREET: 3101 Iris Avenue, Suite 250 (C) CITY: Boulder (D) STATE: Colorado (E) POSTAL CODE (ZIP): 80301 (F) COUNTRY: USA (G) TELEPHONE: (303) 440-5495 (H) TELEFAX: (303) 440-5875 (I) TELEX: (ii) TITLE OF INVENTION: Human Telomerase Catalytic Subunit Promoter (iii) NUMBER OF SEQUENCES: 641 (iv) PRIOR APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: US 08/724,643 (B) FILING DATE: 01-OCT-1996 (v) PRIOR APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: US 08/844,419 (B) FILING DATE: 18-APR-1997 (v) PRIOR APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: US 08/846,017 (B) FILING DATE: 25-APR-1997 (v) PRIOR APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: US 08/854,050 (B) FILING DATE: 09-MAY-1997 (v) PRIOR APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: US 08/911,312 (B) FILING DATE: 14-AUG-1997 (v) PRIOR APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: US 08/912,951 (B) FILING DATE: 14-AUG-1997 (v) PRIOR APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: US 08/915,503 (B) FILING DATE: 14-AUG-1997 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:1: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 4015 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: cDNA (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: CDS (B) LOCATION: 56..3454 (D) OTHER INFORMATION: /product= "hTRT" /note= "human telomerase reverse transcriptase (hTRT) catalytic protein component" (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:1: GCAGCGCTGC GTCCTGCTGC GCACGTGGGA AGCCCTGGCC CCGGCCACCC CCGCG ATG 5 8 Met 1 CCG CGC GCT CCC CGC TGC CGA GCC GTG CGC TCC CTG CTG CGC AGC CAC 10 6 Pro Arg Ala Pro Arg Cys Arg Ala Val Arg Ser Leu Leu Arg Ser His 5 10 15 TAC CGC GAG GTG CTG CCG CTG GCC ACG TTC GTG CGG CGC CTG GGG CCC 15 4 Tyr Arg Glu Val Leu Pro Leu Ala Thr Phe Val Arg Arg Leu Gly Pro 20 25 30 CAG GGC TGG CGG CTG GTG CAG CGC GGG GAC CCG GCG GCT TTC CGC GCG 20 2 Gln Gly Trp Arg Leu Val Gln Arg Gly Asp Pro Ala Ala Phe Arg Ala 35 40 45 CTG GTG GCC CAG TGC CTG GTG TGC GTG CCC TGG GAC GCA CGG CCG CCC 25 0 Leu Val Ala Gln Cys Leu Val Cys Val Pro Trp Asp Ala Arg Pro Pro 50 55 60 65 CCC GCC GCC CCC TCC TTC CGC CAG GTG TCC TGC CTG AAG GAG CTG GTG 29 8 Pro Ala Ala Pro Ser Phe Arg Gln Val Ser Cys Leu Lys Glu Leu Val 70 75 80 GCC CGA GTG CTG CAG AGG CTG TGC GAG CGC GGC GCG AAG AAC GTG CTG 34 6 Ala Arg Val Leu Gln Arg Leu Cys Glu Arg Gly Ala Lys Asn Val Leu 85 90 95 GCC TTC GGC TTC GCG CTG CTG GAC GGG GCC CGC GGG GGC CCC CCC GAG 39 4 Ala Phe Gly Phe Ala Leu Leu Asp Gly Ala Arg Gly Gly Pro Pro Glu 100 105 110 GCC TTC ACC ACC AGC GTG CGC AGC TAC CTG CCC AAC ACG GTG ACC GAC 44 2 Ala Phe Thr Thr Ser Val Arg Ser Tyr Leu Pro Asn Thr Val Thr Asp 115 120 125 GCA CTG CGG GGG AGC GGG GCG TGG GGG CTG CTG CTG CGC CGC GTG GGC 49 0 Ala Leu Arg Gly Ser Gly Ala Trp Gly Leu Leu Leu Arg Arg Val Gly 130 135 140 145 GAC GAC GTG CTG GTT CAC CTG CTG GCA CGC TGC GCG CTC TTT GTG CTG 53 8 Asp Asp Val Leu Val His Leu Leu Ala Arg Cys Ala Leu Phe Val Leu 150 155 160 GTG GCT CCC AGC TGC GCC TAC CAG GTG TGC GGG CCG CCG CTG TAC CAG 58 6 Val Ala Pro Ser Cys Ala Tyr Gln Val Cys Gly Pro Pro Leu Tyr Gln 165 170 175 CTC GGC GCT GCC ACT CAG GCC CGG CCC CCG CCA CAC GCT AGT GGA CCC 63 4 Leu Gly Ala Ala Thr Gln Ala Arg Pro Pro Pro His Ala Ser Gly Pro 180 185 190 CGA AGG CGT CTG GGA TGC GAA CGG GCC TGG AAC CAT AGC GTC AGG GAG 68 2 Arg Arg Arg Leu Gly Cys Glu Arg Ala Trp Asn His Ser Val Arg Glu 195 200 205 GCC GGG GTC CCC CTG GGC CTG CCA GCC CCG GGT GCG AGG AGG CGC GGG 73 0 Ala Gly Val Pro Leu Gly Leu Pro Ala Pro Gly Ala Arg Arg Arg Gly 210 215 220 225 GGC AGT GCC AGC CGA AGT CTG CCG TTG CCC AAG AGG CCC AGG CGT GGC 77 8 Gly Ser Ala Ser Arg Ser Leu Pro Leu Pro Lys Arg Pro Arg Arg Gly 230 235 240 GCT GCC CCT GAG CCG GAG CGG ACG CCC GTT GGG CAG GGG TCC TGG GCC 82 6 Ala Ala Pro Glu Pro Glu Arg Thr Pro Val Gly Gln Gly Ser Trp Ala 245 250 255 CAC CCG GGC AGG ACG CGT GGA CCG AGT GAC CGT GGT TTC TGT GTG GTG 87 4 His Pro Gly Arg Thr Arg Gly Pro Ser Asp Arg Gly Phe Cys Val Val 260 265 270 TCA CCT GCC AGA CCC GCC GAA GAA GCC ACC TCT TTG GAG GGT GCG CTC 92 2 Ser Pro Ala Arg Pro Ala Glu Glu Ala Thr Ser Leu Glu Gly Ala Leu 275 280 285 TCT GGC ACG CGC CAC TCC CAC CCA TCC GTG GGC CGC CAG CAC CAC GCG 97 0 Ser Gly Thr Arg His Ser His Pro Ser Val Gly Arg Gln His His Ala 290 295 300 305 GGC CCC CCA TCC ACA TCG CGG CCA CCA CGT CCC TGG GAC ACG CCT TGT 101 8 Gly Pro Pro Ser Thr Ser Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp Thr Pro Cys 310 315 320 CCC CCG GTG TAC GCC GAG ACC AAG CAC TTC CTC TAC TCC TCA GGC GAC 106 6 Pro Pro Val Tyr Ala Glu Thr Lys His Phe Leu Tyr Ser Ser Gly Asp 325 330 335 AAG GAG CAG CTG CGG CCC TCC TTC CTA CTC AGC TCT CTG AGG CCC AGC 111 4 Lys Glu Gln Leu Arg Pro Ser Phe Leu Leu Ser Ser Leu Arg Pro Ser 340 345 350 CTG ACT GGC GCT CGG AGG CTC GTG GAG ACC ATC TTT CTG GGT TCC AGG 116 2 Leu Thr Gly Ala Arg Arg Leu Val Glu Thr Ile Phe Leu Gly Ser Arg 355 360 365 CCC TGG ATG CCA GGG ACT CCC CGC AGG TTG CCC CGC CTG CCC CAG CGC 121 0 Pro Trp Met Pro Gly Thr Pro Arg Arg Leu Pro Arg Leu Pro Gln Arg 370 375 380 385 TAC TGG CAA ATG CGG CCC CTG TTT CTG GAG CTG CTT GGG AAC CAC GCG 125 8 Tyr Trp Gln Met Arg Pro Leu Phe Leu Glu Leu Leu Gly Asn His Ala 390 395 400 CAG TGC CCC TAC GGG GTG CTC CTC AAG ACG CAC TGC CCG CTG CGA GCT 130 6 Gln Cys Pro Tyr Gly Val Leu Leu Lys Thr His Cys Pro Leu Arg Ala 405 410 415 GCG GTC ACC CCA GCA GCC GGT GTC TGT GCC CGG GAG AAG CCC CAG GGC 135 4 Ala Val Thr Pro Ala Ala Gly Val Cys Ala Arg Glu Lys Pro Gln Gly 420 425 430 TCT GTG GCG GCC CCC GAG GAG GAG GAC ACA GAC CCC CGT CGC CTG GTG 140 2 Ser Val Ala Ala Pro Glu Glu Glu Asp Thr Asp Pro Arg Arg Leu Val 435 440 445 CAG CTG CTC CGC CAG CAC AGC AGC CCC TGG CAG GTG TAC GGC TTC GTG 145 0 Gln Leu Leu Arg Gln His Ser Ser Pro Trp Gln Val Tyr Gly Phe Val 450 455 460 465 CGG GCC TGC CTG CGC CGG CTG GTG CCC CCA GGC CTC TGG GGC TCC AGG 149 8 Arg Ala Cys Leu Arg Arg Leu Val Pro Pro Gly Leu Trp Gly Ser Arg 470 475 480 CAC AAC GAA CGC CGC TTC CTC AGG AAC ACC AAG AAG TTC ATC TCC CTG 154 6 His Asn Glu Arg Arg Phe Leu Arg Asn Thr Lys Lys Phe Ile Ser Leu 485 490 495 GGG AAG CAT GCC AAG CTC TCG CTG CAG GAG CTG ACG TGG AAG ATG AGC 159 4 Gly Lys His Ala Lys Leu Ser Leu Gln Glu Leu Thr Trp Lys Met Ser 500 505 510 GTG CGG GAC TGC GCT TGG CTG CGC AGG AGC CCA GGG GTT GGC TGT GTT 164 2 Val Arg Asp Cys Ala Trp Leu Arg Arg Ser Pro Gly Val Gly Cys Val 515 520 525 CCG GCC GCA GAG CAC CGT CTG CGT GAG GAG ATC CTG GCC AAG TTC CTG 169 0 Pro Ala Ala Glu His Arg Leu Arg Glu Glu Ile Leu Ala Lys Phe Leu 530 535 540 545 CAC TGG CTG ATG AGT GTG TAC GTC GTC GAG CTG CTC AGG TCT TTC TTT 173 8 His Trp Leu Met Ser Val Tyr Val Val Glu Leu Leu Arg Ser Phe Phe 550 555 560 TAT GTC ACG GAG ACC ACG TTT CAA AAG AAC AGG CTC TTT TTC TAC CGG 178 6 Tyr Val Thr Glu Thr Thr Phe Gln Lys Asn Arg Leu Phe Phe Tyr Arg 565 570 575 AAG AGT GTC TGG AGC AAG TTG CAA AGC ATT GGA ATC AGA CAG CAC TTG 183 4 Lys Ser Val Trp Ser Lys Leu Gln Ser Ile Gly Ile Arg Gln His Leu 580 585 590 AAG AGG GTG CAG CTG CGG GAG CTG TCG GAA GCA GAG GTC AGG CAG CAT 188 2 Lys Arg Val Gln Leu Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu Val Arg Gln His 595 600 605 CGG GAA GCC AGG CCC GCC CTG CTG ACG TCC AGA CTC CGC TTC ATC CCC 193 0 Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile Pro 610 615 620 625 AAG CCT GAC GGG CTG CGG CCG ATT GTG AAC ATG GAC TAC GTC GTG GGA 197 8 Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro Ile Val Asn Met Asp Tyr Val Val Gly 630 635 640 GCC AGA ACG TTC CGC AGA GAA AAG AGG GCC GAG CGT CTC ACC TCG AGG 202 6 Ala Arg Thr Phe Arg Arg Glu Lys Arg Ala Glu Arg Leu Thr Ser Arg 645 650 655 GTG AAG GCA CTG TTC AGC GTG CTC AAC TAC GAG CGG GCG CGG CGC CCC 207 4 Val Lys Ala Leu Phe Ser Val Leu Asn Tyr Glu Arg Ala Arg Arg Pro 660 665 670 GGC CTC CTG GGC GCC TCT GTG CTG GGC CTG GAC GAT ATC CAC AGG GCC 212 2 Gly Leu Leu 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Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser 165 170 175 Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly 180 185 190 Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu 195 200 205 Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe 210 215 220 Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Ser 225 230 235 240 Gly Arg Thr Gln Ile Ser Ser Ser Ser Phe Glu Phe Ala Ala Ala Ser 245 250 255 Thr Gln Arg Cys Val Leu Leu Arg Thr Trp Glu Ala Leu Ala Pro Ala 260 265 270 Thr Pro Ala Met Pro Arg Ala Pro Arg Cys Arg Ala Val Arg Ser Leu 275 280 285 Leu Arg Ser His Tyr Arg Glu Val Leu Pro Leu Ala Thr Phe Val Arg 290 295 300 Arg Leu Gly Pro Gln Gly Trp Arg Leu Val Gln Arg Gly Asp Pro Ala 305 310 315 320 Ala Phe Arg Ala Leu Val Ala Gln Cys Leu Val Cys Val Pro Trp Asp 325 330 335 Ala Arg Pro Pro Pro Ala Ala Pro Ser Phe Arg Gln Val Ser Cys Leu 340 345 350 Lys Glu Leu Val Ala Arg Val Leu Gln Arg Leu Cys Glu Arg Gly Ala 355 360 365 Lys Asn Val Leu Ala Phe Gly Phe Ala Leu Leu Asp Gly Ala Arg Gly 370 375 380 Gly Pro Pro Glu Ala Phe Thr Thr Ser Val Arg Ser Tyr Leu Pro Asn 385 390 395 400 Thr Val Thr Asp Ala Leu Arg Gly Ser Gly Ala Trp Gly Leu Leu Leu 405 410 415 Arg Arg Val Gly Asp Asp Val Leu Val His Leu Leu Ala Arg Cys Ala 420 425 430 Leu Phe Val Leu Val Ala Pro Ser Cys Ala Tyr Gln Val Cys Gly Pro 435 440 445 Pro Leu Tyr Gln Leu Gly Ala Ala Thr Gln Ala Arg Pro Pro Pro His 450 455 460 Ala Ser Gly Pro Arg Arg Arg Leu Gly Cys Glu Arg Ala Trp Asn His 465 470 475 480 Ser Val Arg Glu Ala Gly Val Pro Leu Gly Leu Pro Ala Pro Gly Ala 485 490 495 Arg Arg Arg Gly Gly Ser Ala Ser Arg Ser Leu Pro Leu Pro Lys Arg 500 505 510 Pro Arg Arg Gly Ala Ala Pro Glu Pro Glu Arg Thr Pro Val Gly Gln 515 520 525 Gly Ser Trp Ala His Pro Gly Arg Thr Arg Gly Pro Ser Asp Arg Gly 530 535 540 Phe Cys Val Val Ser Pro Ala Arg Pro Ala Glu Glu Ala Thr Ser Leu 545 550 555 560 Glu Gly Ala Leu Ser Gly Thr Arg His Ser His Pro Ser Val Gly Arg 565 570 575 Gln His His Ala Gly Pro Pro Ser Thr Ser Arg Pro Pro Arg Pro Trp 580 585 590 Asp Thr Pro Cys Pro Pro Val Tyr Ala Glu Thr Lys His Phe Leu Tyr 595 600 605 Ser Ser Gly Asp Lys Glu Gln Leu Arg Pro Ser Phe Leu Leu Ser Ser 610 615 620 Leu Arg Pro Ser Leu Thr Gly Ala Arg Arg Leu Val Glu Thr Ile Phe 625 630 635 640 Leu Gly Ser Arg Pro Trp Met Pro Gly Thr Pro Arg Arg Leu Pro Arg 645 650 655 Leu Pro Gln Arg Tyr Trp Gln Met Arg Pro Leu Phe Leu Glu Leu Leu 660 665 670 Gly Asn His Ala Gln Cys Pro Tyr Gly Val Leu Leu Lys Thr His Cys 675 680 685 Pro Leu Arg Ala Ala Val Thr Pro Ala Ala Gly Val Cys Ala Arg Glu 690 695 700 Lys Pro Gln Gly Ser Val Ala Ala Pro Glu Glu Glu Asp Thr Asp Pro 705 710 715 720 Arg Arg Leu Val Gln Leu Leu Arg Gln His Ser Ser Pro Trp Gln Val 725 730 735 Tyr Gly Phe Val Arg Ala Cys Leu Arg Arg Leu Val Pro Pro Gly Leu 740 745 750 Trp Gly Ser Arg His Asn Glu Arg Arg Phe Leu Arg Asn Thr Lys Lys 755 760 765 Phe Ile Ser Leu Gly Lys His Ala Lys Leu Ser Leu Gln Glu Leu Thr 770 775 780 Trp Lys Met Ser Val Arg Asp Cys Ala 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Glu Val Ile Ala Ser Ile Ile 995 1000 1005 Lys Pro Gln Asn Thr Tyr Cys Val Arg Arg Tyr Ala Val Val Gln Lys 1010 1015 1020 Ala Ala His Gly His Val Arg Lys Ala Phe Lys Ser His Val Ser Thr 1025 1030 1035 1040 Leu Thr Asp Leu Gln Pro Tyr Met Arg Gln Phe Val Ala His Leu Gln 1045 1050 1055 Glu Thr Ser Pro Leu Arg Asp Ala Val Val Ile Glu Gln Ser Ser Ser １０６０
１０６５ １０７０ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ
Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｍｅｔ １０７５ １０８
０ １０８５ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ａｒｇ
Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｎ １０９０ １０９５
１１００ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｌｅｕ
Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｃｙｓ １１０５ １１１０
１１１５ １１２０ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｌｅｕ
Ｐｈｅ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｇｌｙ １１２５
１１３０ １１３５ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｓｐ
Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ｌｅｕ １１４０
１１４５ １１５０ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ａｒｇ
Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｇｌｕ １１５５ １１６
０ １１６５ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ａｒｇ
Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｖａｌ １１７０ １１７５
１１８０ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｔｈｒ
Ａｌａ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｈｉｓ １１８５ １１９０
１１９５ １２００ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｔｒｐ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｌｅｕ
Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ １２０５
１２１０ １２１５ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｔｙｒ
Ａｌａ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ａｌａ Ｓｅｒ １２２０
１２２５ １２３０ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｌｙｓ
Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌｙｓ １２３５ １２４
０ １２４５ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｌｙｓ
Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｅｕ １２５０ １２５５
１２６０ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｖａｌ
Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｌｅｕ １２６５ １２７０
１２７５ １２８０ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｈｉｓ
Ａｌａ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｐｈｅ His Gln Gln Val Trp Lys Asn Pro Thr Phe Phe Leu Arg Val Ile Ser 1300 1305 1310 Asp Thr Ala Ser Leu Cys Tyr Ser Ile Leu Lys Ala Lys Asn Ala Gly 1315 1320 1325 Met Ser Leu Gly Ala Lys Gly Ala Ala Gly Pro Leu Pro Ser Glu Ala 1330 1335 1340 Val Gln Trp Leu Cys His Gln Ala Phe Leu Leu Lys Leu Thr Arg His 1345 1350 1355 1360 Arg Val Thr Tyr Val Pro Leu Leu Gly Ser Leu Arg Thr Ala Gln Thr 1365 1370 1375 Gln Leu Ser Arg Lys Leu Pro Gly Thr Thr Leu Thr Ala Leu Glu Ala 1380 1385 1390 Ala Ala Asn Pro Ala Leu Pro Ser Asp Phe Lys Thr Ile Leu Asp 1395 1400 1405 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:638: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 18 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:638: AATCCGTCGA GCAGAGTT 1 8 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:639: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 30 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:639: GCGCGGCTTA CCCTTACCCT TACCCTAACC 3 0 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:640: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 18 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:640: ATCGCTTCTC GGCCTTTT 1 8 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:641: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 36 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:641: AATCCGTCGA GCAGAGTTAA AAGGCCGAGA AGCGAT 3 6
【図面の簡単な説明】
【図１】 ヒト、S.pombe（tezl)、S.cerevisiae（EST
2）、およびEuplotesaediculatus（p123）由来のTRTモ
チーフにおける、高度に保存された残基を示す。同一の
アミノ酸はアスタリスク（*）［わずかに上付き］で示
し、他方、類似のアミノ酸残基は、ドット（・）によっ
て示す。図におけるモチーフ「0」はモチーフＴとも呼
ばれ、モチーフ「3」はモチーフＡとも呼ばれる。
【図２】 テロメラーゼタンパク質および他の逆転写酵
素のテロメラーゼ−特異的およびRT特異的配列モチーフ
の位置を示す。テロメラーゼ特異的モチーフＴおよび保
存されたRTモチーフ1.2およびＡ−Ｅの位置を、ボック
スによって示す。白い正方形で示したHIV-1 RTは、図3
に示したこのタンパク質の一部を示す。
【図３】 HIV-1逆転写酵素のp66サブユニットの結晶構
造を示す（Brookhavenコード1HNV）。この図は、全ての
モチーフが示され得るように右側の裏からのものであ
る。
【図４】 複数のテロメラーゼRT（Sp Trtlp（S.pombeT
RT）［本明細書では「tezlp」ともいう］；hTRT（ヒトT
RT）；Ea p123（Euplotesp123）；Sc Est2p（S.cerevis
iaeEs2p））、および他のRTファミリーのメンバー（Sc
al、S.cerevisiaeミトコンドリア由来のシトクロムオキ
シダーゼのグループIIイントロン１−がコードするタン
パク質）、Dm TART（Drosophila melanogaster)のTART
非LTRレトロトランスポゾンエレメント由来の逆転写酵
素）；HIV-1（ヒト免疫不全ウイルス逆転写酵素）配列
アライメントを示す。TRTconおよびRTconは、テロメラ
ーゼRTおよび非テロメラーゼRTについてのコンセンサス
配列を表す。アミノ酸はｈ（疎水性）；ｐ（極性）；ｃ
（荷電）で示される。三角形は、テロメラーゼタンパク
質間で保存されているが、他のRTでは異なる残基を示
す。モチーフＥ下方の実線は、プライマーグリップ領域
を示す。
【図５】 実施例2に記載したテロメラーゼ陰性の有寿
命細胞株およびテロメラーゼ陽性不死細胞株のhTRT RNA
発現を示す。
【図６】 RNA依存性RNAポリメラーゼに基づくテロメラ
ーゼおよびレトロエレメントの可能性のある系統樹を示
す。
【図７】 λローンＧφ5の制限地図を示す。
【図８】 示された（hTRT遺伝子の近くに位置する）ST
SマーカーD5S678の位置と共に染色体5pの地図を示す。
【図９】 hTRTプロモーター−レポータープラスミドの
構築物を示す。
【図１０】 ２ページにわたって、触媒的に活性なヒト
テロメラーゼを生産するためのhTRTおよびhTRのインビ
トロでの同時発現を示す。
【図１１】 ２ページにわたって、4つのTRTタンパク質
からの配列のアラインメントを示し、そして目的のモチ
ーフを同定する。TRTconは、TRTコンセンサス配列を示
す。RTconは、他の逆転写酵素についてのコンセンサス
残基を示す。上方の場合のコンセンサス残基は、TRTタ
ンパク質における絶対的な保存を示す。
【図１２】 配列番号７に対応する示された配列と共
に、hTRTイントロンにおけるトポイソメラーゼII切断部
位およびNFkB結合性部位を示す。
【図１３】 ２ページにわたって、Euplotes123kDaテロ
メラーゼタンパク質サブユニット（EuplotesTRT）をコ
ードするDNAの配列を示す。
【図１４】 Euplotes123kDaテロメラーゼタンパク質サ
ブユニット（EuplotesTRTタンパク質）のアミノ酸配列
を示す。
【図１５】 ５ページにわたって、S.pombeテロメラー
ゼ触媒サブユニット（S.pombeTRT）のDNAおよびアミノ
酸配列を示す。
【図１６】 ２ページにわたって、１にhTRT cDNA配列
を示し、この示された配列は配列番号１に対応する。
【図１７】 図１６のcDNAによってコードされるhTRTタ
ンパク質を示す。この示されたタンパク質配列は配列番
号２に対応する。
【図１８】は、クローン712562の配列を示し、この示さ
れた配列は配列番号３に対応する。
【図１９】 クローン712562によってコードされた259
残基タンパク質を示し、この示された配列は配列番号１
０に対応する。
【図２０】 ７ページにわたって、Δ182変異ポリペプ
チドをコードするオープンリーディングフレームを有す
る核酸の配列を示し、この示された配列は配列番号４に
対応する。また、この図は、このΔ182変異ポリペプチ
ドのアミノ酸配列を示し、この示されたアミノ酸配列は
配列番号５に対応する。
【図２１】 ６ページにわたって、hTRTゲノムクローン
由来の配列を示し、この示された配列は配列番号６に対
応するコンセンサスモチーフおよびエレメントを示し、
トポイソメラーゼII切断部位、NFκB結合性部位、Alu配
列、および他の配列エレメントに特徴的な配列を含む。
【図２２】 実施例１に記載した、酵母におけるTRT遺
伝子の変異の効果を示す。
【図２３】は、配列番号８に対応する、EST AA281296の
配列を示す。
【図２４】は、クローン712562において欠失された182
塩基対の配列を示し、この示された配列は配列番号９に
対応する。
【図２５】は、実施例13に記載したhTRTタンパク質をコ
ードする発現ベクター（pGRN133）またはコントロール
プラスミド（pBBS212）でトランスフェクトしたBJ細胞
からのテロメラーゼ活性についてのアッセイの結果を示
す。
【図２６】は、結合および置換溶出工程を示すテロメラ
ーゼのアフィニティー精製の模式図である。
【図２７】 実施例１に記載した精製プロトコルの間に
得られたテロメラーゼ調製物のノーザンブロットの写真
である。レーン１は、1.5fmolテロメラーゼRNAを含有
し、レーン２は4.6fmolテロメラーゼRNAを含有し、レー
ン３は14fmolテロメラーゼRNAを含有し、レーン４は41f
molテロメラーゼRNAを含有し、レーン５は核抽出物（42
fmolテロメラーゼ）を含有し、レーン６はAffi-Gel-ヘ
パリン精製テロメラーゼ（47fmolテロメラーゼ）を含有
し、レーン７はアフィニティー精製テロメラーゼ（68fm
ol）を含有し、レーン８はグリセロールグラジエント精
製テロメラーゼ（35fmol)を含有した。
【図２８】 精製プロトコルによるテロメラーゼ活性を
示す。
【図２９】 SDS-PAGEゲルの写真であり、Euplotes aed
iculatus由来の約123kDaポリペプチドおよび約43kDaダ
ブレットの存在を示す。
【図３０】 Euplotes aediculatusテロメラーゼの沈降
係数を示すグラフである。
【図３１】 Euplotesテロメラーゼの基質利用性を示す
36％ホルムアミドでのポリアクリルアミド／尿素ゲルの
写真である。
【図３２】 テロメラーゼRNAテンプレート、およびテ
ロメラーゼRNAを有するヘアピンプライマーの推定のア
ラインメントを示す。
【図３３】 より明るい露光レベルで示した、図３１に
示したゲルのレーン25−30の写真である。
【図３４】 Euplotes由来の43kDaテロメラーゼタンパ
ク質サブユニットをコードする遺伝子のDNA配列を示
す。
【図３５】 ４ページにわたって、Euplotes由来の43kD
aテロメラーゼタンパク質サブユニットの３つ全てのオ
ープンリーディングフレームのDNA配列ならびにアミノ
酸配列を示す。
【図３６】 Euplotesの123kDaテロメラーゼタンパク質
サブユニット（上方配列）とT.thermophilaの80kDaポリ
ペプチドサブユニット（下方配列）との間の配列比較を
示す。
【図３７】 E. aediculatusの123kDaテロメラーゼタン
パク質サブユニット（上方配列）とT.thermophilaの95k
Daテロメラーゼポリペプチド（下方配列）との間の配列
比較を示す。
【図３８】 E. aediculatusの43kDaテロメラーゼタン
パク質サブユニットの「Laドメイン」の一部（上方配
列）とT.thermophilaの95kDaポリペプチドサブユニット
の一部（下方配列）との間のベストフィットアラインメ
ントを示す。
【図３９】 E. aediculatusの43kDaテロメラーゼタン
パク質サブユニットの「La−ドメイン」の一部（上方配
列）とT.thermophilaの80kDaポリペプチドサブユニット
の一部（下方配列）との間のベストフィットアラインメ
ントを示す。
【図４０】 E. aediculatusの123kDaテロメラーゼタン
パク質サブユニットのポリメラーゼドメインおよびS.ce
revisiaeミトコンドリアからのシトクロムオキシダーゼ
グループIIイントロン１がコードするタンパク質（al
S.c.（グループII））、Dong (LINE)、および酵母ESTp
(L8543.12)を含む、種々の逆転写酵素のポリメラーゼド
メインのアラインメントおよびモチーフを示す。
【図４１】 43kDaテロメラーゼタンパク質サブユニッ
トのドメインと、種々のLaタンパク質とのアラインメン
トを示す。
【図４２】 T.thermophila80kDaタンパク質サブユニッ
トをコードするヌクレオチド配列を示す。
【図４３】 T.thermophila80kDaタンパク質サブユニッ
トのアミノ酸配列を示す。
【図４４】 T.thermophila95kDaタンパク質サブユニッ
トをコードするヌクレオチド配列を示す。
【図４５】 T.thermophila95kDaタンパク質サブユニッ
トのアミノ酸配列を示す。
【図４６】 Ｌ8543.12（「Est2p」）のアミノ酸配列を
示す。
【図４７】 OxytrichaPCR産物によってコードされるア
ミノ酸配列とEuplotesp123配列とのアラインメントを示
す。
【図４８】 Est2のDNA配列を示す。
【図４９】 ヒトテロメラーゼペプチドモチーフをコー
ドするcDNAクローンからの部分的アミノ酸配列を示す。
【図５０】 ヒトテロメラーゼペプチドモチーフをコー
ドするcDNAクローンの部分DNA配列を示す。
【図５１】 S.pombetrtとも呼ばれるtezlのアミノ酸配
列を示す。
【図５２】 ２ページにわたって、tezlのDNA配列を示
す。イントロンおよび他の非コード領域は小文字で示
し、エクソン（すなわち、コード領域）大文字で示す。
【図５３】 EST2p、Euplotes、およびTetrahymena配
列、ならびにコンセンサス配列のアラインメントを示
す。
【図５４】 抗hTRT抗体の産生に有用なペプチドの配列
を示す。
【図５５】 tezl+は配列決定実験を模式的にまとめ
る。
【図５６】 E. aediculatusp123配列のS.pombeホモロ
グを同定するためのPCRで使用する２つの縮重プライマ
ーを示す。
【図５７】 E. aediculatusp123配列のS.pombeホモロ
グを同定するための縮重プライマーを用いるPCRで生じ
た４つの主要なバンドを示す。
【図５８】 M2 PCR産物と、E. aediculatusp123、S.ce
revisiae、およびOxytricaテロメラーゼタンパク質配列
とのアラインメントを示す。
【図５９】 E. aediculatusp123のS.pombeホモログを
同定するための3’RTPCR戦略を模式的に示す。
【図６０】 S.pombeテロメラーゼタンパク質配列をス
クリーニングするために使用するライブラリーの特徴を
示し、そしてS.pombeテロメラーゼタンパク質配列につ
いてライブラリーをスクリーニングした結果を示す。
【図６１】 S.pombeテロメラーゼ配列を含有するHindI
II−消化された陽性ゲノムクローンを用いて得られた陽
性結果を示す。
【図６２】 全長S.pombeTRTクローンを得るために使用
した、5'RT PCR戦略を模式的に示す。
【図６３】 S.pombe（S.p.）、S.cerevisiae（S.c.）
およびE. aediculatus（E.a.）についての、テロメラー
ゼ触媒サブユニット由来のRTドメインのアラインメント
を示す。
【図６４】 Euplotes（「Ea p123」、S.cerevisiae
（「Sc Est2p」）、およびS.pombe（「Sp Tezlp」）由
来の配列のアラインメントを示す。パネルＡにおいて影
をつけた領域は、２つの配列間で共有される残基を示
す。パネルＢにおいて、影をつけた領域は、３つの全て
の配列間で共有される残基を示す。
【図６５】 S.pombeにおけるテロメラーゼ遺伝子を用
いる中断戦略を示す。
【図６６】 tezlの中断を確認する実験結果を示す。
【図６７】 tezl中断に起因するS.pombeにおけるテロ
メアの進行的短縮化を示す。
【図６８】 ４ページにわたって、クローン712562のEc
oRI-NotIインサートによってコードされる約63kDaのテ
ロメラーゼタンパク質をコードするORFのDNAおよびアミ
ノ酸またはそのフラグメントを示す。
【図６９】 種々の供給源由来の逆転写酵素モチーフの
アラインメントを示す。
【図７０】 プラスミドpGRN121の制限地図および機能
地図を提供する。
【図７１】 ２ページにわたって、hTRT cDNA配列の予
備的核酸配列決定解析の結果を示す。
【図７２】 10ページにわたって、hTRTの予備的核酸配
列および3つのリーディングフレームにおける推定のORF
配列を示す。
【図７３】 プラスミドpGRN121の制限地図および機能
地図を提供する。
【図７４】 ８ページわたって、hTRTの精密な核酸配列
および推定のORF配列を示す。
【図７５】 λクローン25−1.1の制限地図を示す。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１２年９月５日（２０００．９．５）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ヒト、S.pombe（tezl)、S.cerevisiae（EST
2）、およびEuplotesaediculatus（p123）由来のTRTモ
チーフにおける、高度に保存された残基を示す。同一の
アミノ酸はアスタリスク（*）［わずかに上付き］で示
し、他方、類似のアミノ酸残基は、ドット（・）によっ
て示す。図におけるモチーフ「0」はモチーフＴとも呼
ばれ、モチーフ「3」はモチーフＡとも呼ばれる。
【図２】 テロメラーゼタンパク質および他の逆転写酵
素のテロメラーゼ−特異的およびRT特異的配列モチーフ
の位置を示す。テロメラーゼ特異的モチーフＴおよび保
存されたRTモチーフ1.2およびＡ−Ｅの位置を、ボック
スによって示す。白い正方形で示したHIV-1 RTは、図3
に示したこのタンパク質の一部を示す。
【図３】 HIV-1逆転写酵素のp66サブユニットの結晶構
造を示す（Brookhavenコード1HNV）。この図は、全ての
モチーフが示され得るように右側の裏からのものであ
る。
【図４】 複数のテロメラーゼRT（Sp Trtlp（S.pombeT
RT）［本明細書では「tezlp」ともいう］；hTRT（ヒトT
RT）；Ea p123（Euplotesp123）；Sc Est2p（S.cerevis
iaeEs2p））、および他のRTファミリーのメンバー（Sc
al、S.cerevisiaeミトコンドリア由来のシトクロムオキ
シダーゼのグループIIイントロン１−がコードするタン
パク質）、Dm TART（Drosophila melanogaster)のTART
非LTRレトロトランスポゾンエレメント由来の逆転写酵
素）；HIV-1（ヒト免疫不全ウイルス逆転写酵素）配列
アライメントを示す。TRTconおよびRTconは、テロメラ
ーゼRTおよび非テロメラーゼRTについてのコンセンサス
配列を表す。アミノ酸はｈ（疎水性）；ｐ（極性）；ｃ
（荷電）で示される。三角形は、テロメラーゼタンパク
質間で保存されているが、他のRTでは異なる残基を示
す。モチーフＥ下方の実線は、プライマーグリップ領域
を示す。
【図５】 実施例2に記載したテロメラーゼ陰性の有寿
命細胞株およびテロメラーゼ陽性不死細胞株のhTRT RNA
発現を示す。
【図６】 RNA依存性RNAポリメラーゼに基づくテロメラ
ーゼおよびレトロエレメントの可能性のある系統樹を示
す。
【図７】 λローンＧφ5の制限地図を示す。
【図８】 示された（hTRT遺伝子の近くに位置する）ST
SマーカーD5S678の位置と共に染色体5pの地図を示す。
【図９】 hTRTプロモーター−レポータープラスミドの
構築物を示す。
【図１０−１】 図１０−２ととともに、触媒的に活性
なヒトテロメラーゼを生産するためのhTRTおよびhTRの
インビトロでの同時発現を示す。
【図１０−２】 図１０−１とともに、触媒的に活性な
ヒトテロメラーゼを生産するためのhTRTおよびhTRのイ
ンビトロでの同時発現を示す。
【図１１−１】 図１１−２とともに、4つのTRTタンパ
ク質からの配列のアラインメントを示し、そして目的の
モチーフを同定する。TRTconは、TRTコンセンサス配列
を示す。RTconは、他の逆転写酵素についてのコンセン
サス残基を示す。上方の場合のコンセンサス残基は、TR
Tタンパク質における絶対的な保存を示す。
【図１１−２】 図１１−１とともに、4つのTRTタンパ
ク質からの配列のアラインメントを示し、そして目的の
モチーフを同定する。TRTconは、TRTコンセンサス配列
を示す。RTconは、他の逆転写酵素についてのコンセン
サス残基を示す。上方の場合のコンセンサス残基は、TR
Tタンパク質における絶対的な保存を示す。
【図１２】 配列番号７に対応する示された配列と共
に、hTRTイントロンにおけるトポイソメラーゼII切断部
位およびNFkB結合性部位を示す。
【図１３−１】 図１３−２とともに、Euplotes123kDa
テロメラーゼタンパク質サブユニット（EuplotesTRT）
をコードするDNAの配列を示す。
【図１３−２】 図１３−１とともに、Euplotes123kDa
テロメラーゼタンパク質サブユニット（EuplotesTRT）
をコードするDNAの配列を示す。図１３−１の続きのDNA
の配列を示す。
【図１４】 Euplotes123kDaテロメラーゼタンパク質サ
ブユニット（EuplotesTRTタンパク質）のアミノ酸配列
を示す。
【図１５−１】 図１５−２〜図１５−５とともに、S.
pombeテロメラーゼ触媒サブユニット（S.pombeTRT）のD
NAおよびアミノ酸配列を示す。
【図１５−２】 図１５−１および図１５−３〜図１５
−５とともに、S.pombeテロメラーゼ触媒サブユニット
（S.pombeTRT）のDNAおよびアミノ酸配列を示す。図１
５−１の続きのDNAおよびアミノ酸配列を示す。
【図１５−３】 図１５−１〜図１５−２および図１５
−４〜図１５−５とともに、S.pombeテロメラーゼ触媒
サブユニット（S.pombeTRT）のDNAおよびアミノ酸配列
を示す。図１５−１の続きのDNAおよびアミノ酸配列を
示す。図１５−２の続きのDNAおよびアミノ酸配列を示
す。
【図１５−４】 図１５−１〜図１５−３および図１５
−５とともに、S.pombeテロメラーゼ触媒サブユニット
（S.pombeTRT）のDNAおよびアミノ酸配列を示す。図１
５−１の続きのDNAおよびアミノ酸配列を示す。図１５
−３の続きのDNAおよびアミノ酸配列を示す。
【図１５−５】 図１５−１〜図１５−４とともに、S.
pombeテロメラーゼ触媒サブユニット（S.pombeTRT）のD
NAおよびアミノ酸配列を示す。図１５−１の続きのDNA
およびアミノ酸配列を示す。図１５−４の続きのDNAお
よびアミノ酸配列を示す。
【図１６−１】 図１６−２とともに、１にhTRT cDNA
配列を示し、この示された配列は配列番号１に対応す
る。
【図１６−２】 図１６−１とともに、１にhTRT cDNA
配列を示し、この示された配列は配列番号１に対応す
る。図１６−１に示される配列の続きの配列を示す。
【図１７】 図１６−１および図１６−２のcDNAによっ
てコードされるhTRTタンパク質を示す。この示されたタ
ンパク質配列は配列番号２に対応する。
【図１８】 クローン712562の配列を示し、この示され
た配列は配列番号３に対応する。
【図１９】 クローン712562によってコードされた259
残基タンパク質を示し、この示された配列は配列番号１
０に対応する。
【図２０−１】 図２０−２〜図２０−７とともに、Δ
182変異ポリペプチドをコードするオープンリーディン
グフレームを有する核酸の配列を示し、この示された配
列は配列番号４に対応する。また、この図は、このΔ18
2変異ポリペプチドのアミノ酸配列を示し、この示され
たアミノ酸配列は配列番号５に対応する。
【図２０−２】 図２０−１および図２０−３〜図２０
−７とともに、Δ182変異ポリペプチドをコードするオ
ープンリーディングフレームを有する核酸の配列を示
し、この示された配列は配列番号４に対応する。また、
この図は、このΔ182変異ポリペプチドのアミノ酸配列
を示し、この示されたアミノ酸配列は配列番号５に対応
する。図２０−１に示される配列の続きの配列を示す。
【図２０−３】 図２０−１〜図２０−２および図２０
−４〜図２０−７とともに、Δ182変異ポリペプチドを
コードするオープンリーディングフレームを有する核酸
の配列を示し、この示された配列は配列番号４に対応す
る。また、この図は、このΔ182変異ポリペプチドのア
ミノ酸配列を示し、この示されたアミノ酸配列は配列番
号５に対応する。図２０−２に示される配列の続きの配
列を示す。
【図２０−４】 図２０−１〜図２０−３および図２０
−５〜図２０−７とともに、Δ182変異ポリペプチドを
コードするオープンリーディングフレームを有する核酸
の配列を示し、この示された配列は配列番号４に対応す
る。また、この図は、このΔ182変異ポリペプチドのア
ミノ酸配列を示し、この示されたアミノ酸配列は配列番
号５に対応する。図２０−３に示される配列の続きの配
列を示す。
【図２０−５】 図２０−１〜図２０−４および図２０
−６〜図２０−７とともに、Δ182変異ポリペプチドを
コードするオープンリーディングフレームを有する核酸
の配列を示し、この示された配列は配列番号４に対応す
る。また、この図は、このΔ182変異ポリペプチドのア
ミノ酸配列を示し、この示されたアミノ酸配列は配列番
号５に対応する。図２０−４に示される配列の続きの配
列を示す。
【図２０−６】 図２０−１〜図２０−５および図２０
−７とともに、Δ182変異ポリペプチドをコードするオ
ープンリーディングフレームを有する核酸の配列を示
し、この示された配列は配列番号４に対応する。また、
この図は、このΔ182変異ポリペプチドのアミノ酸配列
を示し、この示されたアミノ酸配列は配列番号５に対応
する。図２０−５に示される配列の続きの配列を示す。
【図２０−７】 図２０−１〜図２０−６とともに、Δ
182変異ポリペプチドをコードするオープンリーディン
グフレームを有する核酸の配列を示し、この示された配
列は配列番号４に対応する。また、この図は、このΔ18
2変異ポリペプチドのアミノ酸配列を示し、この示され
たアミノ酸配列は配列番号５に対応する。図２０−６に
示される配列の続きの配列を示す。
【図２１−１】 図２１−２〜図２１−６とともに、hT
RTゲノムクローン由来の配列を示し、この示された配列
は配列番号６に対応するコンセンサスモチーフおよびエ
レメントを示し、トポイソメラーゼII切断部位、NFκB
結合性部位、Alu配列、および他の配列エレメントに特
徴的な配列を含む。
【図２１−２】 図２１−１および図２１−３〜図２１
−６とともに、hTRTゲノムクローン由来の配列を示し、
この示された配列は配列番号６に対応するコンセンサス
モチーフおよびエレメントを示し、トポイソメラーゼII
切断部位、NFκB結合性部位、Alu配列、および他の配列
エレメントに特徴的な配列を含む。図２１−１に示され
る配列の続きの配列を示す。
【図２１−３】 図２１−１〜図２１−２および図２１
−４〜図２１−６とともに、hTRTゲノムクローン由来の
配列を示し、この示された配列は配列番号６に対応する
コンセンサスモチーフおよびエレメントを示し、トポイ
ソメラーゼII切断部位、NFκB結合性部位、Alu配列、お
よび他の配列エレメントに特徴的な配列を含む。図２１
−２に示される配列の続きの配列を示す。
【図２１−４】 図２１−１〜図２１−３および図２１
−５〜図２１−６とともに、hTRTゲノムクローン由来の
配列を示し、この示された配列は配列番号６に対応する
コンセンサスモチーフおよびエレメントを示し、トポイ
ソメラーゼII切断部位、NFκB結合性部位、Alu配列、お
よび他の配列エレメントに特徴的な配列を含む。図２１
−３に示される配列の続きの配列を示す。
【図２１−５】 図２１−１〜図２１−４および図２１
−６とともに、hTRTゲノムクローン由来の配列を示し、
この示された配列は配列番号６に対応するコンセンサス
モチーフおよびエレメントを示し、トポイソメラーゼII
切断部位、NFκB結合性部位、Alu配列、および他の配列
エレメントに特徴的な配列を含む。図２１−４に示され
る配列の続きの配列を示す。
【図２１−６】 図２１−１〜図２１−５とともに、hT
RTゲノムクローン由来の配列を示し、この示された配列
は配列番号６に対応するコンセンサスモチーフおよびエ
レメントを示し、トポイソメラーゼII切断部位、NFκB
結合性部位、Alu配列、および他の配列エレメントに特
徴的な配列を含む。図２１−５に示される配列の続きの
配列を示す。
【図２２】 実施例１に記載した、酵母におけるTRT遺
伝子の変異の効果を示す。
【図２３】 配列番号８に対応する、EST AA281296の配
列を示す。
【図２４】 クローン712562において欠失された182塩
基対の配列を示し、この示された配列は配列番号９に対
応する。
【図２５】 実施例13に記載したhTRTタンパク質をコー
ドする発現ベクター（pGRN133）またはコントロールプ
ラスミド（pBBS212）でトランスフェクトしたBJ細胞か
らのテロメラーゼ活性についてのアッセイの結果を示
す。
【図２６】 結合および置換溶出工程を示すテロメラー
ゼのアフィニティー精製の模式図である。
【図２７】 実施例１に記載した精製プロトコルの間に
得られたテロメラーゼ調製物のノーザンブロットの写真
である。レーン１は、1.5fmolテロメラーゼRNAを含有
し、レーン２は4.6fmolテロメラーゼRNAを含有し、レー
ン３は14fmolテロメラーゼRNAを含有し、レーン４は41f
molテロメラーゼRNAを含有し、レーン５は核抽出物（42
fmolテロメラーゼ）を含有し、レーン６はAffi-Gel-ヘ
パリン精製テロメラーゼ（47fmolテロメラーゼ）を含有
し、レーン７はアフィニティー精製テロメラーゼ（68fm
ol）を含有し、レーン８はグリセロールグラジエント精
製テロメラーゼ（35fmol)を含有した。
【図２８】 精製プロトコルによるテロメラーゼ活性を
示す。
【図２９】 SDS-PAGEゲルの写真であり、Euplotes aed
iculatus由来の約123kDaポリペプチドおよび約43kDaダ
ブレットの存在を示す。
【図３０】 Euplotes aediculatusテロメラーゼの沈降
係数を示すグラフである。
【図３１】 Euplotesテロメラーゼの基質利用性を示す
36％ホルムアミドでのポリアクリルアミド／尿素ゲルの
写真である。
【図３２】 テロメラーゼRNAテンプレート、およびテ
ロメラーゼRNAを有するヘアピンプライマーの推定のア
ラインメントを示す。
【図３３】 より明るい露光レベルで示した、図３１に
示したゲルのレーン25−30の写真である。
【図３４】 Euplotes由来の43kDaテロメラーゼタンパ
ク質サブユニットをコードする遺伝子のDNA配列を示
す。
【図３５−１】 図３５−２〜図３５−４とともに、Eu
plotes由来の43kDaテロメラーゼタンパク質サブユニッ
トの３つ全てのオープンリーディングフレームのDNA配
列ならびにアミノ酸配列を示す。
【図３５−２】 図３５−１および図３５−３〜図３５
−４とともに、Euplotes由来の43kDaテロメラーゼタン
パク質サブユニットの３つ全てのオープンリーディング
フレームのDNA配列ならびにアミノ酸配列を示す。図３
５−１に示される配列の続きの配列を示す。
【図３５−３】 図３５−１〜図３５−２および図３５
−４とともに、Euplotes由来の43kDaテロメラーゼタン
パク質サブユニットの３つ全てのオープンリーディング
フレームのDNA配列ならびにアミノ酸配列を示す。図３
５−２に示される配列の続きの配列を示す。
【図３５−４】 図３５−１〜図３５−３とともに、Eu
plotes由来の43kDaテロメラーゼタンパク質サブユニッ
トの３つ全てのオープンリーディングフレームのDNA配
列ならびにアミノ酸配列を示す。図３５−３に示される
配列の続きの配列を示す。
【図３６】 Euplotesの123kDaテロメラーゼタンパク質
サブユニット（上方配列）とT.thermophilaの80kDaポリ
ペプチドサブユニット（下方配列）との間の配列比較を
示す。
【図３７】 E. aediculatusの123kDaテロメラーゼタン
パク質サブユニット（上方配列）とT.thermophilaの95k
Daテロメラーゼポリペプチド（下方配列）との間の配列
比較を示す。
【図３８】 E. aediculatusの43kDaテロメラーゼタン
パク質サブユニットの「Laドメイン」の一部（上方配
列）とT.thermophilaの95kDaポリペプチドサブユニット
の一部（下方配列）との間のベストフィットアラインメ
ントを示す。
【図３９】 E. aediculatusの43kDaテロメラーゼタン
パク質サブユニットの「La−ドメイン」の一部（上方配
列）とT.thermophilaの80kDaポリペプチドサブユニット
の一部（下方配列）との間のベストフィットアラインメ
ントを示す。
【図４０】 E. aediculatusの123kDaテロメラーゼタン
パク質サブユニットのポリメラーゼドメインおよびS.ce
revisiaeミトコンドリアからのシトクロムオキシダーゼ
グループIIイントロン１がコードするタンパク質（al
S.c.（グループII））、Dong (LINE)、および酵母ESTp
(L8543.12)を含む、種々の逆転写酵素のポリメラーゼド
メインのアラインメントおよびモチーフを示す。
【図４１】 43kDaテロメラーゼタンパク質サブユニッ
トのドメインと、種々のLaタンパク質とのアラインメン
トを示す。
【図４２】 T.thermophila80kDaタンパク質サブユニッ
トをコードするヌクレオチド配列を示す。
【図４３】 T.thermophila80kDaタンパク質サブユニッ
トのアミノ酸配列を示す。
【図４４】 T.thermophila95kDaタンパク質サブユニッ
トをコードするヌクレオチド配列を示す。
【図４５】 T.thermophila95kDaタンパク質サブユニッ
トのアミノ酸配列を示す。
【図４６】 Ｌ8543.12（「Est2p」）のアミノ酸配列を
示す。
【図４７】 OxytrichaPCR産物によってコードされるア
ミノ酸配列とEuplotesp123配列とのアラインメントを示
す。
【図４８】 Est2のDNA配列を示す。
【図４９】 ヒトテロメラーゼペプチドモチーフをコー
ドするcDNAクローンからの部分的アミノ酸配列を示す。
【図５０】 ヒトテロメラーゼペプチドモチーフをコー
ドするcDNAクローンの部分DNA配列を示す。
【図５１】 S.pombetrtとも呼ばれるtezlのアミノ酸配
列を示す。
【図５２−１】 図５２−２とともに、tezlのDNA配列
を示す。イントロンおよび他の非コード領域は小文字で
示し、エクソン（すなわち、コード領域）大文字で示
す。
【図５２−２】 図５２−１とともに、tezlのDNA配列
を示す。イントロンおよび他の非コード領域は小文字で
示し、エクソン（すなわち、コード領域）大文字で示
す。図５２−１に示される配列の続きの配列を示す。
【図５３】 EST2p、Euplotes、およびTetrahymena配
列、ならびにコンセンサス配列のアラインメントを示
す。
【図５４】 抗hTRT抗体の産生に有用なペプチドの配列
を示す。
【図５５】 tezl+は配列決定実験を模式的にまとめ
る。
【図５６】 E. aediculatusp123配列のS.pombeホモロ
グを同定するためのPCRで使用する２つの縮重プライマ
ーを示す。
【図５７】 E. aediculatusp123配列のS.pombeホモロ
グを同定するための縮重プライマーを用いるPCRで生じ
た４つの主要なバンドを示す。
【図５８】 M2 PCR産物と、E. aediculatusp123、S.ce
revisiae、およびOxytricaテロメラーゼタンパク質配列
とのアラインメントを示す。
【図５９】 E. aediculatusp123のS.pombeホモログを
同定するための3’RTPCR戦略を模式的に示す。
【図６０】 S.pombeテロメラーゼタンパク質配列をス
クリーニングするために使用するライブラリーの特徴を
示し、そしてS.pombeテロメラーゼタンパク質配列につ
いてライブラリーをスクリーニングした結果を示す。
【図６１】 S.pombeテロメラーゼ配列を含有するHindI
II−消化された陽性ゲノムクローンを用いて得られた陽
性結果を示す。
【図６２】 全長S.pombeTRTクローンを得るために使用
した、5'RT PCR戦略を模式的に示す。
【図６３】 S.pombe（S.p.）、S.cerevisiae（S.c.）
およびE. aediculatus（E.a.）についての、テロメラー
ゼ触媒サブユニット由来のRTドメインのアラインメント
を示す。
【図６４】 Euplotes（「Ea p123」、S.cerevisiae
（「Sc Est2p」）、およびS.pombe（「Sp Tezlp」）由
来の配列のアラインメントを示す。パネルＡにおいて影
をつけた領域は、２つの配列間で共有される残基を示
す。パネルＢにおいて、影をつけた領域は、３つの全て
の配列間で共有される残基を示す。
【図６５】 S.pombeにおけるテロメラーゼ遺伝子を用
いる中断戦略を示す。
【図６６】 tezlの中断を確認する実験結果を示す。
【図６７】 tezl中断に起因するS.pombeにおけるテロ
メアの進行的短縮化を示す。
【図６８−１】 図６８−２〜図６８−４とともに、ク
ローン712562のEcoRI-NotIインサートによってコードさ
れる約63kDaのテロメラーゼタンパク質をコードするORF
のDNAおよびアミノ酸またはそのフラグメントを示す。
【図６８−２】 図６８−１および図６８−３〜図６８
−４とともに、クローン712562のEcoRI-NotIインサート
によってコードされる約63kDaのテロメラーゼタンパク
質をコードするORFのDNAおよびアミノ酸またはそのフラ
グメントを示す。図６８−１に示される配列の続きの配
列を示す。
【図６８−３】 図６８−１〜図６８−２および図６８
−４とともに、クローン712562のEcoRI-NotIインサート
によってコードされる約63kDaのテロメラーゼタンパク
質をコードするORFのDNAおよびアミノ酸またはそのフラ
グメントを示す。図６８−２に示される配列の続きの配
列を示す。
【図６８−４】 図６８−１〜図６８−３とともに、ク
ローン712562のEcoRI-NotIインサートによってコードさ
れる約63kDaのテロメラーゼタンパク質をコードするORF
のDNAおよびアミノ酸またはそのフラグメントを示す。
図６８−３に示される配列の続きの配列を示す。
【図６９】 種々の供給源由来の逆転写酵素モチーフの
アラインメントを示す。
【図７０】 プラスミドpGRN121の制限地図および機能
地図を提供する。
【図７１−１】 図７１−２とともに、hTRT cDNA配列
の予備的核酸配列決定解析の結果を示す。
【図７１−２】 図７１−１とともに、hTRT cDNA配列
の予備的核酸配列決定解析の結果を示す。図７１−１に
示される配列の続きの配列を示す。
【図７２−１】 図７２−２〜図７２−１０とともに、
hTRTの予備的核酸配列および3つのリーディングフレー
ムにおける推定のORF配列を示す。
【図７２−２】 図７２−１および図７２−３〜図７２
−１０とともに、hTRTの予備的核酸配列および3つのリ
ーディングフレームにおける推定のORF配列を示す。図
７２−１に示される配列の続きの配列を示す。
【図７２−３】 図７２−１〜図７２−２および図７２
−４〜図７２−１０とともに、hTRTの予備的核酸配列お
よび3つのリーディングフレームにおける推定のORF配列
を示す。図７２−２に示される配列の続きの配列を示
す。
【図７２−４】 図７２−１〜図７２−３および図７２
−５〜図７２−１０とともに、hTRTの予備的核酸配列お
よび3つのリーディングフレームにおける推定のORF配列
を示す。図７２−３に示される配列の続きの配列を示
す。
【図７２−５】 図７２−１〜図７２−４および図７２
−６〜図７２−１０とともに、hTRTの予備的核酸配列お
よび3つのリーディングフレームにおける推定のORF配列
を示す。図７２−４に示される配列の続きの配列を示
す。
【図７２−６】 図７２−１〜図７２−５および図７２
−７〜図７２−１０とともに、hTRTの予備的核酸配列お
よび3つのリーディングフレームにおける推定のORF配列
を示す。図７２−５に示される配列の続きの配列を示
す。
【図７２−７】 図７２−１〜図７２−６および図７２
−８〜図７２−１０とともに、hTRTの予備的核酸配列お
よび3つのリーディングフレームにおける推定のORF配列
を示す。図７２−６に示される配列の続きの配列を示
す。
【図７２−８】 図７２−１〜図７２−７および図７２
−９〜図７２−１０とともに、hTRTの予備的核酸配列お
よび3つのリーディングフレームにおける推定のORF配列
を示す。図７２−７に示される配列の続きの配列を示
す。
【図７２−９】 図７２−１〜図７２−８および図７２
−１０とともに、hTRTの予備的核酸配列および3つのリ
ーディングフレームにおける推定のORF配列を示す。図
７２−８に示される配列の続きの配列を示す。
【図７２−１０】 図７２−１〜図７２−９とともに、
hTRTの予備的核酸配列および3つのリーディングフレー
ムにおける推定のORF配列を示す。図７２−９に示され
る配列の続きの配列を示す。
【図７３】 プラスミドpGRN121の制限地図および機能
地図を提供する。
【図７４−１】 図７４−２〜図７４−８とともに、hT
RTの精密な核酸配列および推定のORF配列を示す。
【図７４−２】 図７４−１および図７４−３〜図７４
−８とともに、hTRTの精密な核酸配列および推定のORF
配列を示す。図７４−１に示される配列の続きの配列を
示す。
【図７４−３】 図７４−１〜図７４−２および図７４
−４〜図７４−８とともに、hTRTの精密な核酸配列およ
び推定のORF配列を示す。図７４−２に示される配列の
続きの配列を示す。
【図７４−４】 図７４−１〜図７４−３および図７４
−５〜図７４−８とともに、hTRTの精密な核酸配列およ
び推定のORF配列を示す。図７４−３に示される配列の
続きの配列を示す。
【図７４−５】 図７４−１〜図７４−４および図７４
−６〜図７４−８とともに、hTRTの精密な核酸配列およ
び推定のORF配列を示す。図７４−４に示される配列の
続きの配列を示す。
【図７４−６】 図７４−１〜図７４−５および図７４
−７〜図７４−８とともに、hTRTの精密な核酸配列およ
び推定のORF配列を示す。図７４−５に示される配列の
続きの配列を示す。
【図７４−７】 図７４−１〜図７４−６および図７４
−８とともに、hTRTの精密な核酸配列および推定のORF
配列を示す。図７４−６に示される配列の続きの配列を
示す。
【図７４−８】 図７４−１〜図７４−７とともに、hT
RTの精密な核酸配列および推定のORF配列を示す。図７
４−７に示される配列の続きの配列を示す。
【図７５】 λクローン25−1.1の制限地図を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 43/00 １０５ Ａ６１Ｐ 43/00 １０５ Ｃ０７Ｋ 5/10 Ｃ０７Ｋ 5/10 5/107 5/107 5/117 5/117 7/06 7/06 7/08 7/08 16/40 16/40 Ｃ１２Ｎ 9/12 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 9/12 ＺＮＡ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 1/48 1/48 1/68 Ａ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ 33/50 33/53 Ｄ 33/53 Ｍ 33/566 33/566 33/573 Ａ 33/573 Ｃ１２Ｐ 21/08 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (31)優先権主張番号 ０８／８５１，８４３ (32)優先日 平成９年５月６日(1997．5．6) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／８５４，０５０ (32)優先日 平成９年５月９日(1997．5．9) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／９１１，３１２ (32)優先日 平成９年８月14日(1997．8．14) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／９１２，９５１ (32)優先日 平成９年８月14日(1997．8．14) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／９１５，５０３ (32)優先日 平成９年８月14日(1997．8．14) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (71)出願人 597147706 ユニバーシティ テクノロジー コーポレ イション ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＴＥＣＨＮＯＬＯ ＧＹ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ アメリカ合衆国 コロラド 80301， ボ ールダー， スイート 250， アイリス アベニュー 3101 3101 Ｉｒｉｓ Ａｖｅｎｕｅ， Ｓｕｉ ｔｅ 250， Ｂｏｕｌｄｅｒ， Ｃｏｌ ｏｒａｄｏ 80301， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓ ｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ (72)発明者 トーマス アール． セチ アメリカ合衆国 コロラド 80303， ボ ールダー，ロックモント サークル 1545 (72)発明者 ジョーチム リングナー アメリカ合衆国 コロラド 80303， ボ ールダー，30ティーエイチ ストリート 360 (72)発明者 ナカムラ トオル アメリカ合衆国 コロラド 80303， ボ ールダー，ナンバー204， サンダーバー ド サークル 4940 (72)発明者 カレン ビー． チャップマン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94965, サウサリート， クラウド ビュー ロ ード 71 (72)発明者 グレッグ ビー． モリン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94303, パロ アルト， ジャニス ウェイ 3407 (72)発明者 カルビン ビー． ハーレイ アメリカ合衆国 カリフォルニア 94301, パロ アルト， ユニバーシティ アベ ニュー 1730 (72)発明者 ウィリアム エイチ． アンドリューズ アメリカ合衆国 カリフォルニア 94805, リッチモンド， パーク アベニュー 6102

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 薬学的に受容可能なキャリアおよび以下
    から選択される分子を含む薬学的組成物：テロメラーゼ
    ＲＮＡと会合するときテロメラーゼ触媒活性を示し得る
    ポリペプチドをコードする配列を含むｈＴＲＴポリヌク
    レオチドであって、以下の（ａ）または（ｂ）または
    （ｃ）または（ｄ）であるポリヌクレオチドによりコー
    ドされる、単離された、合成の、実質的に純粋な、また
    は組換えのｈＴＲＴポリペプチド； （ａ）プラスミドＡＴＣＣ２０９０１６の挿入物の配列
    を有するポリヌクレオチド、または（ｂ）該（ａ）に正
    確に相補的なポリヌクレオチドにストリンジェントな条
    件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、または
    （ｃ）配列番号３または配列番号８に正確に相補的なポ
    リヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリ
    ダイズするポリヌクレオチド、または（ｄ）該（ａ）ま
    たは（ｂ）で規定される配列に対し遺伝コードの結果と
    して縮重であるポリヌクレオチドであるポリヌクレオチ
    ド；（ｅ）単離された、または組換えのｈＴＲＴ抗体、
    またはそのフラグメントであって、図１７（配列番号
    ２）に示される配列を有するｈＴＲＴタンパク質に特異
    的に結合する、単離された、または組換えのｈＴＲＴ抗
    体、またはそのフラグメント；または（ｆ）上記ｈＴＲ
    Ｔポリヌクレオチド（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、
    または、長さが少なくとも１２ヌクレオチド〜３ｋｂで
    ある、単離され、合成され、実質的に純粋な、または組
    換えｈＴＲＴポリヌクレオチドであって、かつプラスミ
    ドＡＴＣＣ ２０９０１６の挿入片の配列を有するポリ
    ヌクレオチドの連続配列と同一またはそれに正確に相補
    的である、長さ少なくとも１２ヌクレオチドの連続配列
    を含む、ｈＴＲＴポリヌクレオチド。
  2. 【請求項２】 脊椎動物細胞の増殖能力を増大するた
    め、脊椎動物細胞の増殖能力を低減するため、または増
    大したかまたは低減したテロメラーゼ活性のレベルと関
    連する状態を処置するための医薬の製造におけるｈＴＲ
    Ｔポリヌクレオチドまたはそのフラグメントの使用であ
    って、該ｈＴＲＴポリヌクレオチドが以下を含む、使
    用： （ａ）プラスミドＡＴＣＣ２０９０１６の挿入物の配列
    を有するポリヌクレオチド、または（ｂ）該（ａ）に正
    確に相補的なポリヌクレオチドにストリンジェントな条
    件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、または
    （ｃ）配列番号３または配列番号８に正確に相補的なポ
    リヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリ
    ダイズするポリヌクレオチド、または（ｄ）該（ａ）ま
    たは（ｂ）で規定される配列に対し遺伝コードの結果と
    して縮重であるポリヌクレオチドであるポリヌクレオチ
    ド；または（ｅ）上記ｈＴＲＴポリヌクレオチド
    （ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、または、長さが少な
    くとも１２ヌクレオチド〜３ｋｂである、単離され、合
    成され、実質的に純粋な、または組換えポリヌクレオチ
    ドであって、かつプラスミドＡＴＣＣ ２０９０１６の
    挿入片の配列を有するポリヌクレオチドの連続配列と同
    一またはそれに正確に相補的である、長さ少なくとも１
    ２ヌクレオチドの連続配列を含む、ポリヌクレオチド。
  3. 【請求項３】 脊椎動物細胞の増殖能力を増大するた
    め、脊椎動物細胞の増殖能力を低減するため、または増
    大したかまたは低減したテロメラーゼ活性のレベルと関
    連する状態を処置するための医薬の製造におけテロメラ
    ーゼ逆転写酵素活性またはｈＴＲＴ発現のモジュレータ
    ーの使用であって、 該モジュレーターが、 化合物または処置がｈＴＲＴ ｍＲＮＡまたはタンパク
    質発現のモジュレーターであるか否かを決定する方法で
    あって、細胞、ヒトを除く動物またはｈＴＲＴタンパク
    質もしくはポリヌクレオチドを含む組成物を、化合物ま
    たは処置と接触させる工程の後に、該細胞、ヒトを除く
    動物または組成物におけるｈＴＲＴ ｍＲＮＡまたはタ
    ンパク質発現における変化を検出する工程を包含する方
    法によるか：または ａ）テロメラーゼＲＮＡと会合するときテロメラーゼ触
    媒活性を示し得るポリペプチドをコードする配列を含む
    ｈＴＲＴポリヌクレオチドであって、（ｉ）プラスミド
    ＡＴＣＣ２０９０１６の挿入物の配列を有するポリヌク
    レオチド、または（ｉｉ）該（ｉ）に正確に相補的なポ
    リヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリ
    ダイズするポリヌクレオチド、または（ｉｉｉ）配列番
    号３または配列番号８に正確に相補的なポリヌクレオチ
    ドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポ
    リヌクレオチド、または（ｉｖ）該（ｉ）または（ｉ
    ｉ）で規定される配列に対し遺伝コードの結果として縮
    重であるポリヌクレオチドであるポリヌクレオチドによ
    りコードされるｈＴＲＴタンパク質を含む組成物を提供
    する工程、 ｂ）該組成物中のｈＴＲＴタンパク質を試験化合物と接
    触させる工程、および ｃ）該ｈＴＲＴの活性を測定する工程であって、試験化
    合物の非存在下の活性と比較した該試験化合物の存在下
    で測定されたｈＴＲＴ活性における変化が、該試験化合
    物がテロメラーゼ逆転写酵素活性を調整する決定を提供
    する工程を包含する、試験化合物が、テロメラーゼ逆転
    写酵素活性のモジュレーターであるか否かを決定する方
    法により同定される、使用。
  4. 【請求項４】 前記医薬が老化または癌の影響を阻害す
    るためである、請求項２に記載の使用。
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