JPH09154575A - テロメラーゼ - Google Patents
テロメラーゼInfo
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- JPH09154575A JPH09154575A JP8282948A JP28294896A JPH09154575A JP H09154575 A JPH09154575 A JP H09154575A JP 8282948 A JP8282948 A JP 8282948A JP 28294896 A JP28294896 A JP 28294896A JP H09154575 A JPH09154575 A JP H09154575A
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ヒトテロメラーゼを提供する。
【解決手段】 本発明は、ヒト染色体末端部分テロメア
ＤＮＡ部分の３’末端をプライマーにして、繰り返し配
列の一本鎖を延長する活性を有する酵素（テロメラー
ゼ）に関する。本発明のテロメラーゼは、癌に対する診
断薬などの開発に有用である。
ＤＮＡ部分の３’末端をプライマーにして、繰り返し配
列の一本鎖を延長する活性を有する酵素（テロメラー
ゼ）に関する。本発明のテロメラーゼは、癌に対する診
断薬などの開発に有用である。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はテロメラーゼ(Telom
erase)に関し、より詳細にはヒトテロメアＤＮＡ部分の
３’末端をプライマーにして、繰り返し配列の一本鎖を
延長する活性を有する蛋白質に関する。
erase)に関し、より詳細にはヒトテロメアＤＮＡ部分の
３’末端をプライマーにして、繰り返し配列の一本鎖を
延長する活性を有する蛋白質に関する。
【０００２】
【従来の技術】真核生物の染色体ＤＮＡは直鎖状二本鎖
からなる。一本の染色体はひとつづきの二本鎖ＤＮＡを
含むと考えられ、染色体末端部分はテロメアと称され、
染色体の安定化などに必要な特殊な構造をとっており、
ＤＮＡからなる末端テロメアＤＮＡがある。テロメアＤ
ＮＡは短い繰返し配列からなり、哺乳類では5'TTAGGG3'
の６塩基が数百回繰り返して１０ｋｂもの長さになって
いる。直鎖状ＤＮＡが複製する際に、リーディング鎖も
ラギング鎖も一番端の５’末端のＲＮＡプライマーはＤ
ＮＡで置き換えることができないので、通常の複製機構
では複製のつど、少なくともプライマー分だけは短縮せ
ざるを得ない。実際、ヒトの体細胞を培養して継代を続
けるとテロメアＤＮＡが短縮する。個体レベルでも、年
齢の高いヒトの細胞ほどテロメアＤＮＡが短いことがわ
かった。ＤＮＡ型癌ウイルスでトランスフォームした細
胞は、正常細胞の分裂寿命の限界を超えて増殖を継続す
ることができるが、テロメアＤＮＡは短縮し続け、限界
にまで短縮すると染色体の安定性が保てなくなり、細胞
は死滅する。このことは、ヒト体細胞には細胞分裂回数
（複製回数）に絶対的な限界があることを意味してい
る。
からなる。一本の染色体はひとつづきの二本鎖ＤＮＡを
含むと考えられ、染色体末端部分はテロメアと称され、
染色体の安定化などに必要な特殊な構造をとっており、
ＤＮＡからなる末端テロメアＤＮＡがある。テロメアＤ
ＮＡは短い繰返し配列からなり、哺乳類では5'TTAGGG3'
の６塩基が数百回繰り返して１０ｋｂもの長さになって
いる。直鎖状ＤＮＡが複製する際に、リーディング鎖も
ラギング鎖も一番端の５’末端のＲＮＡプライマーはＤ
ＮＡで置き換えることができないので、通常の複製機構
では複製のつど、少なくともプライマー分だけは短縮せ
ざるを得ない。実際、ヒトの体細胞を培養して継代を続
けるとテロメアＤＮＡが短縮する。個体レベルでも、年
齢の高いヒトの細胞ほどテロメアＤＮＡが短いことがわ
かった。ＤＮＡ型癌ウイルスでトランスフォームした細
胞は、正常細胞の分裂寿命の限界を超えて増殖を継続す
ることができるが、テロメアＤＮＡは短縮し続け、限界
にまで短縮すると染色体の安定性が保てなくなり、細胞
は死滅する。このことは、ヒト体細胞には細胞分裂回数
（複製回数）に絶対的な限界があることを意味してい
る。
【０００３】一方、単細胞の原生動物や酵母では、増殖
を繰り返してもテロメアＤＮＡは短縮しない。テロメア
ＤＮＡ部分の３’末端をプライマーにして、繰返し配列
の一本鎖を延長するテロメラーゼという酵素があるから
である。テロメラーゼは鋳型ＲＮＡをもったＲＮＡ酵素
であり、一種の逆転写酵素である。６塩基ずつを一つの
単位として延長する。原生動物の繊毛虫類では鋳型ＲＮ
Ａの塩基配列が報告されていたが、ヒトでも最近明らか
になりつつある。
を繰り返してもテロメアＤＮＡは短縮しない。テロメア
ＤＮＡ部分の３’末端をプライマーにして、繰返し配列
の一本鎖を延長するテロメラーゼという酵素があるから
である。テロメラーゼは鋳型ＲＮＡをもったＲＮＡ酵素
であり、一種の逆転写酵素である。６塩基ずつを一つの
単位として延長する。原生動物の繊毛虫類では鋳型ＲＮ
Ａの塩基配列が報告されていたが、ヒトでも最近明らか
になりつつある。
【０００４】従来、テロメラーゼ酵素活性の測定は非常
に感度が低く、テロメラーゼ活性を発現している１０7
個の細胞抽出液と３０μＣｉの放射性ヌクレオチドを用
いて分析し、反応産物を電気泳動した後、３日から１週
間も露光してようやく検出できる程度であった。しか
し、反応産物をＰＣＲで増幅することによって著しく高
感度に検出する方法（ＴＲＡＰ法）が開発されつつあ
る。これによって、各種の細胞・組織でのアッセイが容
易になり、酵素精製への道が開け、酵素阻害剤スクリー
ニングも現実のものとなってきている。
に感度が低く、テロメラーゼ活性を発現している１０7
個の細胞抽出液と３０μＣｉの放射性ヌクレオチドを用
いて分析し、反応産物を電気泳動した後、３日から１週
間も露光してようやく検出できる程度であった。しか
し、反応産物をＰＣＲで増幅することによって著しく高
感度に検出する方法（ＴＲＡＰ法）が開発されつつあ
る。これによって、各種の細胞・組織でのアッセイが容
易になり、酵素精製への道が開け、酵素阻害剤スクリー
ニングも現実のものとなってきている。
【０００５】生殖細胞が増殖するたびにテロメアＤＮＡ
が短縮したのでは種が絶滅する。ヒトの生殖細胞・精子
は年齢によらずテロメアＤＮＡの長さは一定である（１
２〜１５ｋｂ）。最近、上述したテロメラーゼ活性測定
法の改良に伴い、睾丸、卵巣にはテロメラーゼ活性があ
ることがわかった。受精卵から初期発生の段階の細胞に
はテロメラーゼがあって、細胞分裂を繰り返してもテロ
メアＤＮＡは短縮しないと考えられる。将来生殖細胞に
なる細胞群では、このままテロメラーゼが発現し続ける
のに対し、体細胞に分化する細胞群ではどこかの時点で
テロメラーゼの発現を抑制するスイッチが入るものと考
えられる。テロメアＤＮＡは、間期の細胞では核膜周辺
にあり、染色体を形成すると末端に位置する。テロメア
ＤＮＡそのものには蛋白質をコードする遺伝子は存在し
ないが、染色体を安定に保つためには不可欠で、これを
欠く染色体ＤＮＡ末端は分解あるいは融合しやすい。
が短縮したのでは種が絶滅する。ヒトの生殖細胞・精子
は年齢によらずテロメアＤＮＡの長さは一定である（１
２〜１５ｋｂ）。最近、上述したテロメラーゼ活性測定
法の改良に伴い、睾丸、卵巣にはテロメラーゼ活性があ
ることがわかった。受精卵から初期発生の段階の細胞に
はテロメラーゼがあって、細胞分裂を繰り返してもテロ
メアＤＮＡは短縮しないと考えられる。将来生殖細胞に
なる細胞群では、このままテロメラーゼが発現し続ける
のに対し、体細胞に分化する細胞群ではどこかの時点で
テロメラーゼの発現を抑制するスイッチが入るものと考
えられる。テロメアＤＮＡは、間期の細胞では核膜周辺
にあり、染色体を形成すると末端に位置する。テロメア
ＤＮＡそのものには蛋白質をコードする遺伝子は存在し
ないが、染色体を安定に保つためには不可欠で、これを
欠く染色体ＤＮＡ末端は分解あるいは融合しやすい。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】ところで、齧歯類の初
代培養細部が癌化するには、癌らしい表現型を与える癌
遺伝子(例えば、ｒａｓ)の働きと、不死化を与える癌遺
伝子（例えば、ｍｙｃ）の両方が必要であることが確立
している。一方、ヒトの癌組織の細胞が不死化している
かどうかは疑いがもたれていたが、前述のＴＲＡＰ法に
よって、ヒト癌組織にも多くの場合テロメラーゼ活性が
あることがわかった。これまでに知られている癌化に伴
う遺伝子発現変化のなかでは最も相関性の高いものであ
る。これに対して、ほとんどの正常細胞はテロメラーゼ
活性がないか、例外的にあっても極めて弱い。従って、
テロメラーゼは癌に対する診断薬として、またテロメラ
ーゼの阻害剤は癌に対する治療剤として利用できると推
察される。しかしながら、ヒトテロメラーゼを単離・精
製した例は知られていない。本発明者は、以前より上記
のヒトテロメラーゼにつき、鋭意研究を重ねてきたが、
その本体を単離し精製することに初めて成功した。本発
明はかかる知見に基づいてなされもので、本発明は癌の
診断薬、治療剤などの開発に有用なヒトテロメラーゼを
提供することを目的とする。
代培養細部が癌化するには、癌らしい表現型を与える癌
遺伝子(例えば、ｒａｓ)の働きと、不死化を与える癌遺
伝子（例えば、ｍｙｃ）の両方が必要であることが確立
している。一方、ヒトの癌組織の細胞が不死化している
かどうかは疑いがもたれていたが、前述のＴＲＡＰ法に
よって、ヒト癌組織にも多くの場合テロメラーゼ活性が
あることがわかった。これまでに知られている癌化に伴
う遺伝子発現変化のなかでは最も相関性の高いものであ
る。これに対して、ほとんどの正常細胞はテロメラーゼ
活性がないか、例外的にあっても極めて弱い。従って、
テロメラーゼは癌に対する診断薬として、またテロメラ
ーゼの阻害剤は癌に対する治療剤として利用できると推
察される。しかしながら、ヒトテロメラーゼを単離・精
製した例は知られていない。本発明者は、以前より上記
のヒトテロメラーゼにつき、鋭意研究を重ねてきたが、
その本体を単離し精製することに初めて成功した。本発
明はかかる知見に基づいてなされもので、本発明は癌の
診断薬、治療剤などの開発に有用なヒトテロメラーゼを
提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は前記課題を解決
するためになされたものであり、その要旨は、下記の理
化学的性質及び生理活性を有するＲＮＡ蛋白質であるこ
とを特徴とするヒトテロメラーゼである。 ゲル濾過法による推定分子量が約３００ｋである、 ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元条件下）による推定分子量
が、少なくとも約１４０ｋ、８０ｋ及び５０ｋの構成蛋
白からなる会合体である、 ヒト染色体末端部分テロメアＤＮＡ部分の３’末端を
プライマーにして、繰り返し配列の一本鎖を延長する活
性を有する。
するためになされたものであり、その要旨は、下記の理
化学的性質及び生理活性を有するＲＮＡ蛋白質であるこ
とを特徴とするヒトテロメラーゼである。 ゲル濾過法による推定分子量が約３００ｋである、 ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元条件下）による推定分子量
が、少なくとも約１４０ｋ、８０ｋ及び５０ｋの構成蛋
白からなる会合体である、 ヒト染色体末端部分テロメアＤＮＡ部分の３’末端を
プライマーにして、繰り返し配列の一本鎖を延長する活
性を有する。
【０００８】
【発明の実施の形態】本発明のテロメラーゼはヒト癌細
胞が産生（発現）しており、当該細胞、特にヒト白血病
細胞より効率よく、しかも高収率で単離することができ
る。ここで、原料として用いられるヒト白血病細胞（ナ
マルバ細胞）は、テロメラーゼ単離を目的として、当該
酵素の高生産株（他株より１０倍量の生産性）をクロー
ン化したものである。また、癌細胞の他に、本発明のテ
ロメラーゼは血液幹細胞及び生殖細胞でも発現してお
り、これらの細胞からも本発明のテロメラーゼを得るこ
とができる。
胞が産生（発現）しており、当該細胞、特にヒト白血病
細胞より効率よく、しかも高収率で単離することができ
る。ここで、原料として用いられるヒト白血病細胞（ナ
マルバ細胞）は、テロメラーゼ単離を目的として、当該
酵素の高生産株（他株より１０倍量の生産性）をクロー
ン化したものである。また、癌細胞の他に、本発明のテ
ロメラーゼは血液幹細胞及び生殖細胞でも発現してお
り、これらの細胞からも本発明のテロメラーゼを得るこ
とができる。
【０００９】本発明のテロメラーゼは上記の原料から得
ることができる。上記の原料からの本発明のテロメラー
ゼの製造は、基本的にはこの種の生体物質からの蛋白質
性物質の分離に汎用される通常の方法と同様にして、目
的とするテロメラーゼの物理的、化学的性質を利用した
各種の処理操作に従い実施することができる。当該処理
操作としては、例えば、遠心分離、分子ふるいクロマト
グラフィー（ゲル濾過）、電気泳動、イオン交換クロマ
トグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、透析
法などが挙げられ、必要に応じてこれらの方法を適宜組
み合わせることで実施できる。特に、本発明者の研究に
よれば、本発明のテロメラーゼは、セファロースＣＬ−
６Ｂ、ＤＥＡＥ−セファデックス、ヘパリン−アフィニ
ティ、ヒドロキシアパタイト、フェニルセファロース、
スペルミンアガロース及びＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧ−
アフィニティなどのクロマトグラフィーによる精製が最
適である。
ることができる。上記の原料からの本発明のテロメラー
ゼの製造は、基本的にはこの種の生体物質からの蛋白質
性物質の分離に汎用される通常の方法と同様にして、目
的とするテロメラーゼの物理的、化学的性質を利用した
各種の処理操作に従い実施することができる。当該処理
操作としては、例えば、遠心分離、分子ふるいクロマト
グラフィー（ゲル濾過）、電気泳動、イオン交換クロマ
トグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、透析
法などが挙げられ、必要に応じてこれらの方法を適宜組
み合わせることで実施できる。特に、本発明者の研究に
よれば、本発明のテロメラーゼは、セファロースＣＬ−
６Ｂ、ＤＥＡＥ−セファデックス、ヘパリン−アフィニ
ティ、ヒドロキシアパタイト、フェニルセファロース、
スペルミンアガロース及びＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧ−
アフィニティなどのクロマトグラフィーによる精製が最
適である。
【００１０】特に好ましい精製法の一例としては、まず
本発明のテロメラーゼを産生又は含有している原料、例
えば、ナマルバ細胞をホモジナイズした後、抽出緩衝液
で抽出し、１５万ｇで遠心後、その上清をＳ１５０画分
として得る。活性物質を含有する当該上清を、ＤＥＡＥ
等の陰イオン交換体を使用するイオン交換クロマトグラ
フィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、ヘ
パリン−セファロースクロマトグラフィー、ヒドロキシ
アパタイトクロマトグラフィー、ＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ
ＧＧ−アフィニティクロマトグラフィー、スペルミンア
ガロースクロマトグラフィー及びゲル濾過に順次かけて
精製することにより本発明のテロメラーゼを得ることが
できる。上記の各処理の操作、条件は、通常のこの種の
方法におけるそれらと同様のものとすることができる。
上記の方法により、本発明のテロメラーゼが単離・精製
され、これは前記の特性にて特定される。なお、本発明
のテロメラーゼは上記の例で調製されたものに限定され
るものではない。分離・精製の操作、条件などは適宜変
更して実施することができる。更に、前記の理化学的性
質及び生理活性を有する限り、如何なる原料、由来、製
法、条件により調製されたものでも本発明に包含され
る。
本発明のテロメラーゼを産生又は含有している原料、例
えば、ナマルバ細胞をホモジナイズした後、抽出緩衝液
で抽出し、１５万ｇで遠心後、その上清をＳ１５０画分
として得る。活性物質を含有する当該上清を、ＤＥＡＥ
等の陰イオン交換体を使用するイオン交換クロマトグラ
フィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、ヘ
パリン−セファロースクロマトグラフィー、ヒドロキシ
アパタイトクロマトグラフィー、ＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ
ＧＧ−アフィニティクロマトグラフィー、スペルミンア
ガロースクロマトグラフィー及びゲル濾過に順次かけて
精製することにより本発明のテロメラーゼを得ることが
できる。上記の各処理の操作、条件は、通常のこの種の
方法におけるそれらと同様のものとすることができる。
上記の方法により、本発明のテロメラーゼが単離・精製
され、これは前記の特性にて特定される。なお、本発明
のテロメラーゼは上記の例で調製されたものに限定され
るものではない。分離・精製の操作、条件などは適宜変
更して実施することができる。更に、前記の理化学的性
質及び生理活性を有する限り、如何なる原料、由来、製
法、条件により調製されたものでも本発明に包含され
る。
【００１１】
【発明の効果】前述のように、組織や細胞のテロメラー
ゼ活性は、癌化に伴う遺伝子発現変化のなかでは最も相
関性の高いものであり、テロメラーゼ活性の測定は前癌
状態や癌の診断に有用である。本発明のテロメラーゼ
は、かかるテロメラーゼ活性測定の標準品として利用で
きる。また当該テロメラーゼの抗体を調製することによ
りテロメラーゼを免疫学的方法にて高感度で測定するこ
とができるので、本発明のテロメラーゼは上記抗体を調
製する際の抗原として有用である。更に、本発明のテロ
メラーゼに対する阻害剤あるいは当該テロメラーゼのｍ
ＲＮＡに対するアンチセンスは癌に対する治療薬として
も有用である。従って、本発明のテロメラーゼは、癌に
対する診断薬、治療剤などの開発、研究に有用である。
ゼ活性は、癌化に伴う遺伝子発現変化のなかでは最も相
関性の高いものであり、テロメラーゼ活性の測定は前癌
状態や癌の診断に有用である。本発明のテロメラーゼ
は、かかるテロメラーゼ活性測定の標準品として利用で
きる。また当該テロメラーゼの抗体を調製することによ
りテロメラーゼを免疫学的方法にて高感度で測定するこ
とができるので、本発明のテロメラーゼは上記抗体を調
製する際の抗原として有用である。更に、本発明のテロ
メラーゼに対する阻害剤あるいは当該テロメラーゼのｍ
ＲＮＡに対するアンチセンスは癌に対する治療薬として
も有用である。従って、本発明のテロメラーゼは、癌に
対する診断薬、治療剤などの開発、研究に有用である。
【００１２】
【実施例】以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に
説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定
されるものではない。なお、実施例におけるカラム溶出
液のテロメラーゼ活性の測定は下記の方法にて行なっ
た。テロメラーゼ活性測定方法 テロメラーゼ活性の測定は、Kimらの方法(Science 266,
2011-2015, 1994)を改変した下記のＴＲＡＰ法（ＰＣ
Ｒ法）にて行なった。まず、下記の組成からなる反応液
（最終４０μｌ）を調製した。 ２０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ８．３） １．５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ６０ｍＭ ＫＣｌ 0.005 ％ Ｔｗｅｅｎ ２０ １ｍＭ ＥＧＴＡ それぞれ５０μＭのｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ＴＴＰ，ｄＣＴＰ ０．１μｇ ＴＳオリゴヌクレオチド(5'AATCCGTCGAGCAGAGTT3') １μｇ Ｔ4 gene S32 protein 0.1mg/ml ＢＳＡ（ヌクレアーゼフリー） ４μＣｉ ［α−32Ｐ］ｄＣＴＰ 試験サンプル 上記の反応液を２３℃で２０分間インキュベートし、更
に９４℃で２分間インキュベートした。次いで、０．１
μｇのＣＸプライマー(5'CCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA3')
を加え、直ちに７２℃にて２Ｕ Ｔａｑポリメラーゼを
加えて混合後、１ドロップのミネラル油を加え、ＰＣＲ
法(94℃ 30秒, 50℃ 30秒, 72℃ 60秒)により増幅させ
た（２７サイクル）。９４℃で５分間インキュベートし
た後、氷中で冷却し、試料を電気泳動(10% ポリアクリ
ルアミドゲル, 20mA, 1.5時間)に付し、ゲルを乾燥後、
フィルムに一夜感光させた。
説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定
されるものではない。なお、実施例におけるカラム溶出
液のテロメラーゼ活性の測定は下記の方法にて行なっ
た。テロメラーゼ活性測定方法 テロメラーゼ活性の測定は、Kimらの方法(Science 266,
2011-2015, 1994)を改変した下記のＴＲＡＰ法（ＰＣ
Ｒ法）にて行なった。まず、下記の組成からなる反応液
（最終４０μｌ）を調製した。 ２０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ８．３） １．５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ６０ｍＭ ＫＣｌ 0.005 ％ Ｔｗｅｅｎ ２０ １ｍＭ ＥＧＴＡ それぞれ５０μＭのｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ＴＴＰ，ｄＣＴＰ ０．１μｇ ＴＳオリゴヌクレオチド(5'AATCCGTCGAGCAGAGTT3') １μｇ Ｔ4 gene S32 protein 0.1mg/ml ＢＳＡ（ヌクレアーゼフリー） ４μＣｉ ［α−32Ｐ］ｄＣＴＰ 試験サンプル 上記の反応液を２３℃で２０分間インキュベートし、更
に９４℃で２分間インキュベートした。次いで、０．１
μｇのＣＸプライマー(5'CCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA3')
を加え、直ちに７２℃にて２Ｕ Ｔａｑポリメラーゼを
加えて混合後、１ドロップのミネラル油を加え、ＰＣＲ
法(94℃ 30秒, 50℃ 30秒, 72℃ 60秒)により増幅させ
た（２７サイクル）。９４℃で５分間インキュベートし
た後、氷中で冷却し、試料を電気泳動(10% ポリアクリ
ルアミドゲル, 20mA, 1.5時間)に付し、ゲルを乾燥後、
フィルムに一夜感光させた。
【００１３】実施例１テロメラーゼの単離・精製 ナマルバ細胞（テロメラーゼ高産生株）を１０％ＦＣＳ
添加ＲＰＭＩ-１６４０培地で培養後、リン酸緩衝食塩
水で洗浄した。抽出緩衝液(10mM HEPES, pH8.0, 3mM KC
l, 1mM MgCl2, 1mM DTT, 1mM PMSF, 10U/ml PNasin)で
１回すすいで、氷中に１０分間置いた。細胞をホモジナ
イズした後、氷中に３０分間置き、遠心(40,000xg, 10
分間)し、1/50量の5M NaClを加え、６０分間遠心した(1
50,000xg)。上清を、0.15M NaClを含む緩衝液Ａ(20mM T
ris-HCl, pH7.5, 5mM 2ME, 1mM MgCl2, 10% グリセロー
ル)で平衡化したDEAE-セファロース(DEAE-Sepharose)カ
ラムにかけ、0.15-0.8M NaCl/緩衝液Ａで溶出した。活
性画分(0.4-0.5M NaCl)を集め、50mMのNaClを含む緩衝
液Ａに対して透析した後、緩衝液Ａで平衡化したヘパリ
ン−セファロース（Heparin-Sepharose）カラムにか
け、0.05-0.1M NaCl/緩衝液Ａで溶出した。活性画分(0.
25-0.4M NaCl)を集め、緩衝液Ｂ(20mM リン酸カリウム,
pH7.0, 1mM MgCl2, 5mM 2ME)に対して透析した後、緩
衝液Ｂで平衡化したヒドロキシアパタイトカラムにか
け、0.02-0.6M リン酸カリウム/緩衝液Ｂで溶出した。
活性画分(0.25-0.8M)を集め、緩衝液Ｃ(50mM Tris-酢
酸, pH8.2, 5mM 2ME, 3.5mM MgCl2, 1mM spermidene,
2.5mM EGTA, 20mM KCl, 25mM NaCl)に対して透析した。
試料に、2mM dATP, 2mM TTP, 2μg/0.1ml T4 gene S32
proteinとなるようにそれぞれを添加し、(TTAGGG)2を結
合させたアフィニティカラム(同じ緩衝液で平衡化)にか
けてインキュベート後、0-0.1M NaClで溶出させた。カ
ラムに弱く結合している活性画分(NaClの濃度勾配をか
けると直ちに溶出されてくる)を集め、濃縮後、0.1M Na
Clを含む緩衝液Ａに対して透析した。セファロース CL-
6Bによるゲル濾過を行ない、約３００ｋに相当する部分
に溶出されてくる画分(フラクション２２〜２６）を集
め、濃縮することにより、本発明のテロメラーゼを得
た。各フラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元条件下）
で分析した結果を図１（下方）に示す（左側のレーンは
分子量マーカーであり、２９ｋ、３５ｋ、４２ｋ、５５
ｋ、６８ｋ、９８ｋ及び２２０ｋの標準蛋白質を用い
た）。なお、図１の上方は、前述の方法で測定した各フ
ラクションのテロメラーゼ活性を示す。図１に示される
ように、テロメラーゼ活性はフラクション２２〜２６に
認められ、当該フラクションはＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元
条件下）で少なくとも約１４０ｋ、８０ｋ及び５０ｋの
バンドからなることが確認された。
添加ＲＰＭＩ-１６４０培地で培養後、リン酸緩衝食塩
水で洗浄した。抽出緩衝液(10mM HEPES, pH8.0, 3mM KC
l, 1mM MgCl2, 1mM DTT, 1mM PMSF, 10U/ml PNasin)で
１回すすいで、氷中に１０分間置いた。細胞をホモジナ
イズした後、氷中に３０分間置き、遠心(40,000xg, 10
分間)し、1/50量の5M NaClを加え、６０分間遠心した(1
50,000xg)。上清を、0.15M NaClを含む緩衝液Ａ(20mM T
ris-HCl, pH7.5, 5mM 2ME, 1mM MgCl2, 10% グリセロー
ル)で平衡化したDEAE-セファロース(DEAE-Sepharose)カ
ラムにかけ、0.15-0.8M NaCl/緩衝液Ａで溶出した。活
性画分(0.4-0.5M NaCl)を集め、50mMのNaClを含む緩衝
液Ａに対して透析した後、緩衝液Ａで平衡化したヘパリ
ン−セファロース（Heparin-Sepharose）カラムにか
け、0.05-0.1M NaCl/緩衝液Ａで溶出した。活性画分(0.
25-0.4M NaCl)を集め、緩衝液Ｂ(20mM リン酸カリウム,
pH7.0, 1mM MgCl2, 5mM 2ME)に対して透析した後、緩
衝液Ｂで平衡化したヒドロキシアパタイトカラムにか
け、0.02-0.6M リン酸カリウム/緩衝液Ｂで溶出した。
活性画分(0.25-0.8M)を集め、緩衝液Ｃ(50mM Tris-酢
酸, pH8.2, 5mM 2ME, 3.5mM MgCl2, 1mM spermidene,
2.5mM EGTA, 20mM KCl, 25mM NaCl)に対して透析した。
試料に、2mM dATP, 2mM TTP, 2μg/0.1ml T4 gene S32
proteinとなるようにそれぞれを添加し、(TTAGGG)2を結
合させたアフィニティカラム(同じ緩衝液で平衡化)にか
けてインキュベート後、0-0.1M NaClで溶出させた。カ
ラムに弱く結合している活性画分(NaClの濃度勾配をか
けると直ちに溶出されてくる)を集め、濃縮後、0.1M Na
Clを含む緩衝液Ａに対して透析した。セファロース CL-
6Bによるゲル濾過を行ない、約３００ｋに相当する部分
に溶出されてくる画分(フラクション２２〜２６）を集
め、濃縮することにより、本発明のテロメラーゼを得
た。各フラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元条件下）
で分析した結果を図１（下方）に示す（左側のレーンは
分子量マーカーであり、２９ｋ、３５ｋ、４２ｋ、５５
ｋ、６８ｋ、９８ｋ及び２２０ｋの標準蛋白質を用い
た）。なお、図１の上方は、前述の方法で測定した各フ
ラクションのテロメラーゼ活性を示す。図１に示される
ように、テロメラーゼ活性はフラクション２２〜２６に
認められ、当該フラクションはＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元
条件下）で少なくとも約１４０ｋ、８０ｋ及び５０ｋの
バンドからなることが確認された。
【図１】ゲル濾過法により精製された本発明の酵素のテ
ロメラーゼ活性及び電気泳動の結果を示す写真である。
ロメラーゼ活性及び電気泳動の結果を示す写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/56 ＡＤＵ
Claims (1)
- 【請求項１】 下記の理化学的性質及び生理活性を
有するＲＮＡ蛋白質であることを特徴とするヒトテロメ
ラーゼ。 ゲル濾過法による推定分子量が約３００ｋである、 ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元条件下）による推定分子量
が、少なくとも約１４０ｋ、８０ｋ及び５０ｋの構成蛋
白からなる会合体である、 ヒト染色体末端部分テロメアＤＮＡ部分の３’末端を
プライマーにして、繰り返し配列の一本鎖を延長する活
性を有する。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP8282948A JPH09154575A (ja) | 1995-10-04 | 1996-10-04 | テロメラーゼ |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| JP7-284559 | 1995-10-04 | ||
| JP28455995 | 1995-10-04 | ||
| JP8282948A JPH09154575A (ja) | 1995-10-04 | 1996-10-04 | テロメラーゼ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09154575A true JPH09154575A (ja) | 1997-06-17 |
Family
ID=26554841
Family Applications (1)
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| JP8282948A Withdrawn JPH09154575A (ja) | 1995-10-04 | 1996-10-04 | テロメラーゼ |
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| Country | Link |
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