NO319982B1

NO319982B1 - Human telomerase katalytisk subenhet

Info

Publication number: NO319982B1
Application number: NO19991588A
Authority: NO
Inventors: Thomas R Cech; William H Andrews; Joachim Lingner; Toru Nakamura; Karen B Chapman; Gregg B Morin; Calvin B Harley
Original assignee: Geron Corp; Univ Technology Corp
Priority date: 1996-10-01
Filing date: 1999-03-31
Publication date: 2005-10-10
Also published as: DE69723531T3; GB2317891C; ES2205132T5; GB2321642A; FR2757177A1; DE841396T1; CN1254376A; DE69739497D1; BR9711844A; AU734089B2; CA2266752A1; DE69739675D1; IL129222A0; NO991588L; JPH10234384A; NO332085B1; JPH11313689A; EP0841396A1; ATE552341T1; EP1783139B8

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører nye nukleinsyrer som koder for den katalytiske subenhet av telomerase og beslektede polypeptider. Særlig er foreliggende oppfinnelse rettet mot den katalytiske subenhet av human telomerase. Oppfinnelsen tilveiebringer fremgangsmåter og blandinger som har relasjon til medisin, molekylærbiologi, kjemi, farmakologi og medisinsk diagnostisk og prognostisk teknologi.

Den følgende diskusjon er ment som en innføring i det felt som foreliggende

oppfinnelse angår.

Det har lenge vært erkjent at den fullstendige replikasjon av endene av eukaryote kromosomer fordrer spesialiserte cellekomponenter (Watson, 1972, Nature New Biol., 239:197; Olovnikov, 1973, J. Theor. Biol., 41:181). Replikasjon av en lineær DNA-kjede gjennom konvensjonelle DNA-polymeraser fordrer en RNA-primer og kan skje bare 5' til 3'. Når den RNA som er bundet til de ytterste 5'-endene av eukaryote kromosomale DNA-kjeder fjernes, dannes et mellomrom som fører til en progressiv forkortelse av datterkjeder ved hver replikasjonsrunde. Denne forkortelse av telomerer, de protein-DNA-strukturer som fysisk er lokalisert i kromosom-endene, antas å være ansvarlig for fenomenet cellulær aldring (se f.eks. Goldstein, 1990, Science 249:1129; Martin et al., 1979, Lab. Invest. 23:86; Goldstein et al., 1969, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 64:155; og Schneider & Mitsui, 1976, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 73:3584) av normale humane somatiske celler in vitro og in vivo.

Lengden og integriteten av telomerer er således relatert til at en celle går over i et aldringstrinn (dvs. tap av proliferativ evne). En celles evne til å opprettholde (eller øke) telomerlengden, kan dessuten tillate at en celle unngår aldring, dvs. blir udødelig.

Strukturen av telomerer og telomerisk DNA har vært undersøkt i mange forskjellige systemer (se f.eks. Harley & Villeponteau, 1995, Curr. Opin. Genet. Dev. 5:249). I de fleste organismer består telomer DNA av tandem-repeterte meget enkle sekvenser. Hos mennesker og andre virveldyr består telomer DNA av hundrevis til tusenvis av tandem-repetisjoner av sekvensen TTAGGG. Metoder for å bestemme og modulere telomerlengder i celler er beskrevet i PCT publikasjon WO 93/23572 og WO 96/41016.

Vedlikeholdet av telomerer er en funksjon av en telomer-spesifikk DNA-polymerase betegnet telomerase. Telomerase er et ribonukleoprotein (RNP) som benytter en del av dets RNA-del som templat for telomer-repeterende DNA-syntese (Morin, 1997, Eur. J. Cancer 33:750; Yu et al., 1990, Nature 344:126; Singer & Gottschling, 1994, Science 266:404; Autexier & Greider, 1994, Genes Develop., 8:563; Gilley et al., 1995, Genes Develop., 9:2214; McEachem & Blackbum, 1995, Nature, 367:403; Blackbum, 1992, Ann. Rev. Biochem., 61:113; Greider, 1996, Ann. Rev. Biochem., 65:337). RNA-komponentene av humane og andre telomeraser er blitt klonet og karakterisert (se PCT publikasjon WO 96/01835 og Feng et al, 1995, Science 269:1236). WO 9601835 beskriver en gensekvens av human tolemerase RNA-komponent såkalt "hTR", men beskriver ikke den separate protein-komponenten av enzymet. WO 96/19580 beskriver sekvenser av 80 kD og 95 kD polypeptidene til speciene. Tetrahymena og foreslår at disse sekvensene var telomerase-polypeptider for disse artene. WO 93/23572 beskriver testmetoder og reagenser anvendelige for bestemmelse av telomerlengde og telomeraseaktivitet. Denne publikasjonen tilveiebringer ikke hTRT(hurnan telomerase reverstranskriptase)-sekvensen, heller ikke tilveiebringes en fremgangsmåte ved hvilken hTRT-sekvensen kunne oppnås. Karakteirseringen av telomerase-proteinkomponentene har vært vanskelig. Delvis skyldes dette at det har vist seg vanskelig å rense telomerase-RNP, som forekommer i ekstremt lave nivåer i celler hvor det uttrykkes. For eksempel har det vært anslått at humane celler som man vet uttrykker høye nivåer av telomeraseaktivitet, kan ha bare ca. ett hundre molekyler av enzymet per celle.

I overensstemmelse med telomerer og telomerasers nære forhold til en celles proliferative kapasitet (dvs. cellens evne til å dele seg i det uendelige), bestemmes telomerase-aktivitet i udødelige cellelinjer og et ekstraordinært spredt utvalg av tumorvev, men påvises ikke (dvs. manglet eller forekom under bestemmelsesterskelen) i normale somatiske cellekulturer eller normale vev nær en tumor (se US-patent 5.629.154; 5.489.508; 5.648.215 og 5.639.613; se også Morin, 1989, Cell 59:521; Shay & Bacchetti 1997, Eur. J. Cancer 33:787; Kim et al, 1994, Science 266:2011; Counter ef al., 1992, EMBO J. 11:1921; Counter et al., 1994, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 91,2900; Counter et al, 1994, J. Virol. 68:3410). Dessuten har en korrelasjon mellom graden av telomeraseaktivitet i en tumor og det sannsynlige kliniske resultat for pasienten vært rapportert (f.eks. US-patent 5.639.613, supra; Langford et al., 1997, Hum. Pathol. 28:416). Telomeraseaktivitet har også vært påvist i humane kimceller, prolifererende stam- eller progenitorceller og i aktiverte lymfocytter. I somatiske stam- eller progenitorceller og i aktiverte lymfocytter er telomeraseaktiviteten i alminnelighet enten meget lav eller bare forbigående uttrykt (se Chiu et al, 1996, Stem Cells 14:239; Bodnar et al, 1996, Exp. Cell Res. 228:58; Taylor et al, 1996, J. Invest. Dermatology 106:759).

Human telomerase er et ideelt mål for diagnostisering og behandling av humane sykdommer relatert til cellulær proliferasjon og aldring, som f.eks. cancer. Metoder for diagnostisering og behandling av cancer og andre telomeraserelaterte sykdommer hos mennesker er beskrevet i US-patent 5.489.508, 5.639.613 og 5.645.986. Metoder for å forutsi tumorutvikling ved å overvåke telomerase er beskrevet i US-patent 5.639.613. Oppdagelsen og karakteriseringen av den humane telomerases katalytiske protein-subenhet medfører ytterligere egnede tester for telomerase og for sykdomsdiagnostisering og behandling. Dessuten vil kloning og bestemmelse av primærsekvensen av den katalytiske protein-subenhet kunne muliggjøre mer effektive terapier for humane cancere og andre sykdommer relatert til cellers proliferative kapasitet og aldring.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et polynukleotid som omfatter en sekvens som koder for et polypeptid som er i stand til å utvise en telomerase katalytisk aktivitet når assosisert med et telomerase-RNA og som er;

(a) et polynukleotid som har sekvensen av innskuddet av plasmid ATCC 209016, eller (b) et polynukleotid som hybridiserer til (a) under stringente betingelser, eller (c) et polynukleotid som hybridiserer til SEQ ID NO : 3, eller SEQ ID NO : 8 under

stringente betingelser, eller

(d) en polynukleotidsekvens som er degenerert som et resultat av den genetiske koden av sekvensen definert i (a) eller (b).

I henhold til et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en blanding som omfatter i det minste 20% human telomerase katalytisk protein som har sekvensen kodet for av polynukleotidet i følge krav 1, blandingen utviser telomerase katalytisk aktivitet kun dersom et telomerase-RNA tilsettes til nevnte blanding slik at den assosieres til nevnte protein. Slike proteiner som er i stand til å utvise telomerase katalytisk aktivitet kan f. eks. kjennetegnes ved å ha et definert motiv som har aminosyresekvensen: Trp-RrX7-R|-Ri-R2-X-Phe-Phe-Tyr-X-Thr-Glu-Xg.9-R3-R3- Arg-R4-X2-Trp, hvor X er en hvilken som helst aminosyre og et subskript refererer til antall påfølgende enheter, Ri er leucin eller isoleucin, R2 er glutamin eller arginin, R3 er fenylalanin eller tyrosin og R4 er lysin eller histidin. Likeledes kan isolert i hovedsak ren eller rekombinert nukleinsyre ifølge oppfinnelsen kode for et protein omfattende en aminosyresekvens: Trp-Ri-X7-Ri-R|-R2-X-Phe-Phe-Tyr-X-Thr-Glu-X8-9-R3-R3- Arg-R4-X2-Trp.

Oppfinnelsen omfatter oligonukleotider og polynukleotider som har tilfelles en betydelig sekvensidentitet eller komplementaritet med en subsekvens av slike nukleinyrer.

Ifølge én utførelsesform vedrører oppfinnelsen human telomerase revers transkriptase (hTRT) protein. Oppfinnelsen tilveiebringer således i én utførelsesform, et isolert, tilnærmet rent, eller rekombinant proteinpreparat av et hTRT-protein, eller en variant derav, eller et fragment derav. I en utførelsesform kjennetegnes proteinet ved at det har en aminosyresekvens med minst ca. 75%, eller minst ca. 80%, sekvensidentitet med hTRT-proteinet i Figur 17 (SEKV. ID. NR:2), eller en variant derav, eller et fragment derav. Ifølge et beslektet aspekt har hTRT-proteinet sekvensen ifølge SEKV. ID. NR:2.1 enkelte utførelsesformer har proteinet én eller flere telomerasevirkninger, så som katalytisk aktivitet. I én utførelsesform har hTRT-proteinfragmentet minst 6 aminosyrerester. I andre utførelsesformer har hTRT-proteinfragmentet minst 8, minst 10, minst 12, minst 15 eller minst 20 påfølgende aminosyrerester av et naturlig forekommende hTRT-polypeptid. I andre utførelses-former har hTRT-proteinfragmentet minst 50 eller minst 100 aminosyrerester.

Oppfinnelsen tilveiebringer også en blanding som omfatter et hTRT-protein ifølge krav 8 for anvendelse som legemiddel. Blandingen utviser telomerase katalytisk aktivitet kun dersom en telomerase-RNA tilsettes til nevnte blanding slik at den assosieres til nevnte protein. Denne RNA kan være en telomerase-RNA, så som en human telomerase-RNA. I ett aspekt av oppfinnelsen omfattes anvendelse av blandingen i følge krav 8, i fremstilling av et kompleks ved kompleksering av en templat RNA-komponent med nevnte protein. I én utførelsesform danner hTRT-proteinet og den humane telomerase-RNA (hTR) fra et ribonukleoprotein, kompleks med en telomeraseaktivitet.

Ifølge én utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen isolert human telomerase som omfatter hTRT-protein, som en tilnærmet ren human telomerase som omfatter hTRT-protein og som omfatter hTR. I én utførelsesform er telomerasen minst ca. 95% ren. Telomerasen kan isoleres fra en celle, så som en rekombinant vertscelle, eller en celle som uttrykker telomeraseaktivitet.

Polynukleotider ifølge oppfinnelsen, som omfatter en nukleinsyresekvens som koder for et hTRT-protein, kan kode for en av aminosyresekvens som angitt i Figur 17 (SEKV. ID. NR:2) eller en sekvens som omfatter én eller flere konservative aminosyre- (eller kodon) substitusjoner eller én eller flere aktivitets-endrende aminosyre- (eller kodon) substitusjoner i nevnte aminosyresekvens. 1 henhold til et beslektet aspekt hybridiserer polynukleotidet under stringente betingelser, til et polynukleotid som har sekvensen angitt i Figur 16 (SEKV. ID. NR:1). I henhold til et annet beslektet aspekt har nukleotidsekvensen av polynukleotidet en minste samlet sannsynlighet (sum probability) på mindre enn ca. 0,5 ved sammenligning med en nukleotidsekvens som angitt i Figur 16 (SEKV. ED. NR:1) under bruk av BLAST-algoritme med de innlagte parametere.

I henhold til et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et polynukleotid som har en promotersekvens operativt koblet til den sekvens som koder for hTRT-proteinet. Promoteren kan være promoteren av hTRT eller en annen promoter enn den naturlig forekommende hTRT-promoter. I ytterligere aspekt av oppfinnelsen tilveiebringes en vektor omfattende polynukleotidet ifølge oppfinnelsen, og en celle inneholdenbde en slik vektor.

Oppfinnelsen tilveiebringer videre en fremgangsmåte for fremstilling av rekombinant telomeraseblanding, kjennetegnet ved den omfatter å uttrykke et polynukleotid i følge krav 1 for å fremstille et polypeptid, kontakte nevnte polypeptid med en templat RNA-komponent, fortrinnsvis en human telomerase RNA-komponent, under betingelser slik at nevnte polypeptid og nevnte telomerase-RNA assosierer for å danne et telomerase-enzym som er i stand til å katalysere addering av nukleotider til et telomerasesubstrat. I én utførelsesform har hTRT-proteinet en sekvens som angitt i Figur 17 (SEKV. ID. NR:2). Dette hTRT-protein kan produseres i et in vitro ekspresjonssystem og blandes med en telomerase RNA eller, ifølge en annen utførelsesform, kan telomerase RNA ko-eksprimeres i in vitro ekspresjons-systemet. I én utførelsesform er telomerase RNA hTR. I en alternativ utførelsesform skjer kontakten i en celle som f.eks. en humancelle. I én utførelsesform har cellen ikke telomeraseaktivitet før kontaktingen av hTRT og RNA eller innføringen, f.eks. ved transfeksjon, av et hTRT-polynukleotid. I én utførelsesform uttrykkes telomerase RNA naturlig av den nevnte celle.

Oppfinnelsen tilveiebringer også en celle, som f.eks. en menneske-, mus- eller gjærcelle som inneholder de rekombinante polynukleotidene ifølge oppfinnelsen, så som et polynukleotid med en hTRT-proteinkodende sekvens som operativt er koblet til en promoter. I henhold til spesielle aspekter er cellen en virveldyrcelle, f.eks. en celle fra et pattedyr, for eksempel et menneske, og som har øket prolifererende evne i forhold til en celle som ellers er identisk, men ikke omfatter det rekombinante polynukleotid, eller har et øket telomeraseaktivitetsnivå i forhold til en celle som ellers er identisk, men ikke omfatter det rekombinante polynukleotid. I enkelte utførelsesformer er cellen udødelig.

Foreliggende oppfinnelse omfatter anvendelse av polynukleotidet ifølge oppfinnelsen, et polypeptid oppnådd ved uttrykking av vektoren ifølge oppfinnelsen, eller en blanding ifølge oppfinnelsen i å øke den proliferative kapasiteten til en vertebrat celle ved å introdusere nevnte polynukleotid, polypeptid eller blanding inn i cellen in vitro.

Det beskrives organismer og celler som omfatter et polynukleotid som koder for et humant telomerase revers transkriptase polypeptid, som f.eks. en transgen ikke-human organisme som gjær, plante, bakterie eller et dyr utenom mennesket, for eksempel en mus. Det beskrives også transgene dyr og celler som et hTRT-gen er deletert fra (slått ut) eller mutert slik at genene ikke uttrykker et naturlig forekommende hTRT-genprodukt. I alternative utførelser har det transgene dyr, utenom mennesket, et mutert telomerase-gen eller er det et dyr som mangler telomeraseaktivitet, et dyr hvis TRT-mangel er resultat av et mutert gen som koder for en TRT som har et redusert telomeraseaktivitetsnivå sammen-lignet med en villtype-TRT og er et dyr som har et mutert TRT-gen med én eller flere mutasjoner, inklusivt missense-mutasjoner, nonsense-mutasjoner, insersjoner eller delesjoner.

Oppfinnelsen tilveiebringer et antistoff eller et bindingsfragment derav, kjennetegnet ved at det spesifikt binder seg et protein i stand til å utvise telomerase katalytisk aktivitet dersom nevnte protein er assosiert med et telomerase-RNA, nevnte protein har en sekvens kodet for av polynukleotidet i følge krav 1, nevnte antistoff eller fragment er fortrinnsvis monoklonal. I én utførelsesform binder antistoffet seg med en affinitet på minst ca. IO<8> M'<1>. Antistoffet kan være en monoklonal eller en polyklonal blanding, så som et polyklonalt antiserum. I henhold til et beslektet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en celle som er i stand til å sekretere antistoffet, så som en hybridom.

Oppfinnelsen tilveiebringer også en fremgangsmåte for bestemmelse av hvorvidt en forbindelse, blanding eller behandling er en modulator av en telomerase revers transkriptaseaktivitet eller ekspresjon omfattende eksponering in vitro av en celle i følge krav 6 for forbindelsen, blandingen eller behandlingen og bestemme hvorvidt der er en forandring i telomerase reverstranskriptase aktivitet eller ekspresjon. Fremgangsmåten innebærer påvisning eller overvåkning av en endring i aktivitet eller ekspresjon i en celle, et dyr eller en blanding som omfatter et hTRT-protein eller polynukleotid etter administrering av forbindelsen eller behandlingen. I én utførelsesform inkluderer fremgangsmåten trinnene: tilveiebringelse av en TRT-blanding, kontakting av TRT med testforbindelsen og måling av aktiviteten av TRT, hvor en forandring av TRT-aktivitet i nærvær av testforbindelsen er en indikator på at testforbindelsen modulerer TRT-aktivitet. I enkelte utførelsesformer er blandingen en celle, en organisme, en transgen organisme eller et in vitro system, så som et ekspresjonssystem som inneholder et rekombinant polynukleotid som koder for et hTRT-polypeptid. Denne hTRT ifølge metoden kan således være et produkt av in vitro ekspresjon. I forskjellige utførelsesformer kan påvisningen av telomeraseaktivitet eller ekspresjon foregå ved å påvise en endring i rikeligheten av et hTRT-genprodukt, og følge inkorporering av en nukleotidmerking i et substrat for telomerase, overvåke hybridisering av en probe til et forlenget telomerasesubstrat, overvåke amplifiseringen av et forlenget telomerasesubstrat, overvåke telomerlengden av en celle eksponert for testforbindelsen, overvåke tapet av telomerasens evne til å binde til et kromosom eller måle akkumuleringen eller tapet av telomerstruktur.

I henhold til ett aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for påvisning av et hTRT-genprodukt, mutant eller variant derav i en prøve, kjennetegnet ved at den omfatter å kontakte nevnte prøve med et polynukleotid i følge krav 1 eller et polynukleotid som omfatter en sekvens på i det minste 12 nukleotider, fortrinnsvis minst 15 nukleotider, identisk til eller eksakt komplementær til en tilstøtende sekvens av polypeptidet av del (a) i følge krav 1, og bestemme hvorvidt et hybridiseringskompleks har blitt dannet. Kompleksets nærvær er korrelert med nærværet av hTRT-genproduktet i den biologiske prøve. Genproduktet kan være RNA, DNA eller et polypeptid. Eksempler på prober som kan benyttes for påvisningen, innbefatter, men er ikke begrenset til, nukleinsyrer og antistoffer.

I én utførelsesform er genproduktet en nukleinsyre som påvises ved å amplifisere genet og påvise amplifikasjonsproduktet, hvor nærværet av komplekset eller amplifikasjonsproduktet er korrelert med nærværet av hTRT-genproduktet i den biologiske prøve.

I én utførelsesform er den biologiske prøve fra en pasient, som f.eks. et menneske. I en annen utførelsesform innbefatter den biologiske prøve minst én celle fra en in vitro celle-kultur, som f.eks. en humancellekultur.

Oppfinnelsen tilveiebringer dessuten en fremgangsmåte for påvisning av nærvær av minst én telomerasepositiv humancelle i en biologisk prøve omfattende humanceller, som omfatter (a) måling av mengde av hTRT-genprodukt, mutant eller variant derav i nevnte prøve ved å utnytte trinnene i fremgangsmåten i følge et hvilket som helst av kravene 18 til 20,

og

(b) sammenligning av mengden av nevnte genprodukt, mutant eller variant slik målt, med en kontroll korrelert til en prøve som mangler telomerasepositive celler, hvor nærvær av høyere mengde av hTRT-genprodukt, mutant eller variant i nevnte prøve som sammenlignet med nevnte kontroll er korrelert med nærvær av telomerasepositive celler i nevnte biologiske prøve.

Oppfinnelsen tilveiebringer også en fremgangsmåte for diagnostisering av en telomeraserelatert tilstand, kjennetegnet ved at den omfatter: (a) bestemmelse av mengde av et hTRT-genprodukt, mutant eller variant i en celle- eller vevsprøve fra en pasient som utnytter trinnene til fremgangsmåten i et hvilket som

helst av kravene 18 til 20, og

(b) sammenligning av mengden av nevnte genprodukt, mutant eller variant i en prøve med en mengde i en frisk celle eller vev av samme type, hvor en forskjellig mengde av nevnte genprodukt i prøven som sammenlignet med den friske cellen eller vevet er diagnostisk for en telomeraserelatert tilstand.

I én utførelsesform er den telomerase-relaterte tilstand cancer, og det påvises en større mengde hTRT-genprodukt i prøven.

Oppfinnelsen tilveiebringer videre en fremgangsmåte for diagnostisering av cancer i en pasient, ved å utta en biologisk prøve fra pasienten og påvise et hTRT-genprodukt i pasient-prøven, hvor påvisningen av hTRT-genproduktet i prøven er korrelert med en cancerdiagnose.

Oppfinnelsen tilveiebringer videre en fremgangsmåte for diagnostisering av cancer i en pasient, ved å utta en pasientprøve, bestemme mengden av hTRT-genproduktet i pasient-prøven; og sammenligne mengden av hTRT-genprodukt med en normal- eller kontrollverdi, hvor en mengde av hTRT-genproduktet i pasienten som er større enn normal- eller kontroll-verdien, er diagnostisk for cancer.

Oppfinnelsen tilveiebringer også en fremgangsmåte for diagnostisering av cancer i en pasient, ved å utta en pasientprøve som inneholder minst én celle; bestemme mengden av et hTRT-genprodukt i en celle i prøven og sammenligne mengden av hTRT-genproduktet i cellen med en normalverdi for cellen, hvor en mengde av hTRT-genproduktet som er større enn normalverdien, er diagnostisk for cancer. I én utførelsesform tenkes prøven å inneholde minst én malign celle.

Fremgangsmåter i henhold til oppfinnelsen muliggjør også en fremgangsmåte for prognostisering av en cancerpasient, ved å bestemme mengden av hTRT-genproduktet i en cancercelle tatt fra pasienten, og sammenligne mengden hTRT i cancercellen med en prognostisk hTRT-verdi som overensstemmer med en prognose for cancerformen, hvor en mengde hTRT i prøven som har den prognostiske verdi, gir den relevante prognose.

Fremgangsmåtene i henhold til oppfinnelsen muliggjør også en fremgangsmåte for overvåkning av en anti-cancerbehandlings evne til å redusere cancercellers proliferative kapasitet i en pasient, ved å foreta en første måling av mengden av et hTRT-genprodukt i minst én cancercelle fra pasienten; foreta en andre måling av nivået av hTRT-genproduktet i minst én cancercelle fra pasienten, hvor anti-cancerbehandlingen administreres til pasienten før den andre målingen; og sammenligne den første og den andre måling, hvor et lavere nivå av hTRT-genproduktet i den andre måling er korrelert med anti-cancerbehandlingens evne til å redusere cancercellers proliferative kapasitet i pasienten.

Oppfinnelsen tilveiebringer også testsett for påvisning av et hTRT-gen, genprodukt mutant eller variant, kjennetegnet ved at nevnte testsett omfatter et polynukleotid i følge krav 1, eller et polynukleotid som omfatter en sekvens på i det minste 12 nukleotider, fortrinnsvis minst 15 nukleotider, identisk til eller eksakt komplementær til en tilstøtende sekvens av polynukleotidsekvensen av del (a) i følge krav 1.1 foretrukne utførelser kan testsettet omfatte et polypeptid oppnåelig ved ekspresjon av en vektor ifølge oppfinnelsen, en blanding ifølge oppfinnelsen eller et antistoff eller bindings-fragment ifølge oppfinnelsen. I én utførelsesform innbefatter settet en beholder som inneholder et molekyl valgt fra en hTRT-nukleinsyre eller subsekvens derav, et hTRT-polypeptid, eller subsekvens derav, og et anti-hTRT-antistoff.

Oppfinnelsen muliggjør også fremgangsmåter for behandling av humansykdommer. I én utførelsesform muliggjør oppfinnelsen en fremgangsmåte for økning av den proliferative evne til en celle fra et virveldyr, så som en pattedyrcelle, ved å føre inn et rekombinant polynukleotid ifølge oppfinnelsen inn i cellen, hvor polynukleotidet omfatter en sekvens som koder for et hTRT-polypeptid. hTRT-polypeptidet kan ha en sekvens som vist i Figur 17. Sekvensen kan være operativt koblet til en promoter. Cellen kan være fra et menneske så som en celle i en humanpasient, eller en celle som føres inn i en humanpasient.

Oppfinnelsen muliggjør videre en fremgangsmåte for behandling av en humansykdom, ved å innføre rekombinant hTRT-polynukleotid i minst én celle i en pasient. En genterapi-vektor kan benyttes. Fremgangsmåten kan ytterligere bestå i å føre inn i cellen et polynukleotid som omfatter en sekvens som koder for hTR, for eksempel et hTR-polynukleotid som operativt er koblet til en promoter.

Oppfinnelsen muliggjør også en fremgangsmåte for å øke en virveldyrcelles proliferative kapasitet, hvor fremgangsmåten omfatter innføring av en effektiv mengde hTRT-polypeptid som omfattet i en blanding ifølge oppfinnelsen i cellen. Oppfinnelsen muliggjør videre celler og celleavkom med øket proliferativ evne.

Oppfinnelsen muliggjør også en fremgangsmåte for behandling av en tilstand assosiert med et forhøyet nivå av telomeraseaktivitet i en celle, som omfatter innføring i nevnte celle av en terapeutisk effektiv mengde av en inhibitor av nevnte telomeraseaktivitet, hvor nevnte inhibitor er et hTRT-polypeptid eller et hTRT-polynukleotid ifølge oppfinnelsen. Inhibitoren kan være et polypeptid eller polynukleotid som omfatter, f.eks. minst en subsekvens av en sekvens vist i Figurene 16,17 eller 20. Polypeptidet eller polynukleotidet kan inhibere en TRT-aktivitet, så som binding av endogen TRT til telomerase RNA.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et polynukleotid ifølge oppfinnelsen eller et polynukleotid som omfatter en sekvens på i det minste 12 nukleotider, eventuelt i det minste 15 nukleotider, identisk til eller eksakt komplementær til en tilstøtende sekvens av et polypeptid av del (a) i følge krav 1, et polypeptid oppnåelig ved ekspresjon av en vektor ifølge oppfinnelsen, en blanding ifølge oppfinnelsen eller et antistoff eller bindingsfragment derav ifølge oppfinnelsen for anvendelse som legemiddel.

I ytterligere et aspekt av foreliggende oppfinnelse tilveiebringes anvendelse av et polynukleotid i følge krav 1 eller et polynukleotid som omfatter en sekvens på i det minste 12 nukleotider, eventuelt i det minste 15 nukleotider, identisk til eller eksakt komplementær til en tilstøtende sekvens av et polypeptid av del (a) i følge krav 1 for fremstilling av et legemiddel. Oppfinnelsen omfatter også anvendelse av et polypeptid oppnåelig ved ekspresjon av en vektor ifølge oppfinnelsen, en blanding ifølge oppfinnelsen eller et antistoff eller bindingsfragment derav ifølge oppfinnelsen for fremstilling av et legemiddel.

I enda ytterligere aspekt av foreliggende oppfinnelse tilveiebringes anvendelse av et polynukleotid ifølge oppfinnelsen, eller et polynukleotid som omfatter en sekvens på minst 12 nukleotider, eventuelt i det minste 15 nukleotider, identisk til eller eksakt komplementær til en tilstøtende sekvens av et polypeptid av del (a) i følge krav 1 for fremstilling av et legemiddel for å øke proliferasjonskapasiteten til en vertebrat celle, redusere proliferasjonskapasiteten til en vertebrat celle, eller behandle en tilstand assosiert med et forhøyet eller redusert nivå av telomeraseaktivitet, polypeptid av del (a) ifølge oppfinnelsen, et polypeptid oppnåelig ved ekspresjon av en vektor ifølge oppfinnelsen, en blanding ifølge oppfinnelsen eller et antistoff eller bindingsfragment ifølge oppfinnelsen, for fremstilling av et legemiddel for å øke proliferasjonskapasiteten til en vertebrat celle, redusere proliferasjonskapasiteten til en vertebrat celle, eller behandle en tilstand assosiert med et forhøyet eller redusert nivå av telomeraseaktivitet.

Foreliggende oppfinnelse omfatter en farmasøytisk blanding som omfatter, et polynukleotid ifølge oppfinnelsen eller et polypeptid som omfatter en sekvens på i det minste 12 nukleotider, eventuelt i det minste 15 nukleotider identisk til eller eksakt komplementær til en tilstøtende sekvens av et polypeptid av del (a) i følge krav 1, et polypeptid oppnåelig ved ekspresjon ay en vektor ifølge oppfinnelsen, en blanding ifølge oppfinnelsen, eller et antistoff eller bindingsfragment ifølge oppfinnelsen, eventuelt sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer.

Andre aspekt ved oppfinnelsen omfatter anvendelse av et polynukleotid som omfatter en sekvens på i det minste 12 nukleotider, eventuelt i det minste 15 nukleotider, identiske til eller eksakt komplementær til en tilstøtende sekvens av polynukleotidet i del (a) i følge krav 1 i fremstilling av en vaksine som er i stand til å utløse en immunrespons, polynukleotid i del (a) ifølge oppfinnelsen, et polypeptid oppnåelig ved ekspresjon av en vektor ifølge oppfinnelsen, en blanding ifølge oppfinnelsen, eller et immunogent fragment av polypeptidet for fremstilling av en vaksine som er i stand til å utløse en immunrespons.

Oppfinnelsen tilveiebringer også immunogent peptid av human telomerase protein, kjennetegnet ved at nevnte peptid omfatter i det minste 8, eventuelt i det minste 10 aminosyrer av et human telomerase protein kodet for av et polynukleotid i følge krav 1 for anvendelse i medisin. Spesielt anvendes et immunogene peptidet ifølge oppfinnelsen for fremstilling av et medikament for behandling av en tilstand mediert av celler som uttrykker høye nivåer av telomerase.

BESKRIVELSE AV FIGURENE

Figur 1 viser sterkt konserverte rester i TRT-motiver fra menneske, & pombe (tezl),

S. cerevisiae (EST2) og Euplotes aediculatus (pl23). Identiske aminosyrer er angitt med en stjerne (<*>) [litt hevet], mens den tilsvarende aminosyrerest er angitt med en prikk (•). Motiv «0» i figuren er også kalt Motiv T; Motiv «3» er også kalt Motiv A. Figur 2 viser lokaliseringen av telomerase-spesifikke og RT-spesifikke sekvensmotiver av telomeraseproteiner og andre reverse transkriptaser. Lokaliseringen av telomerasespesifikt motiv T og konserverte RT-motiver 1,2 og A-E, er innrammet. Det åpne rektanglet merket HIV-1 RT gjengir den del av dette protein som er vist i Figur 3. Figur 3 viser krystallstrukturen av p66-subenheten av HIV-1 revers transkriptase (Brookhaven kode lHNV). Tegningen er fra bakre høyre side for å gjøre det mulig å vise alle motiver. Figur 4 viser gjentatte sekvens-tilpasninger av telomerase RT'er (Sp_Trtlp, S. pombe TRT [her også omtalt som «tezlp»]; hTRT, human TRT; Ea_pl23, Euplotes pl23; Sc_Est2p, S. cerevisiae Est2p) og medlemmer av andre RT-familier (Sc_al, cytokromoksydasegruppe II intron 1-kodet protein fra S. cerevisiae mitokondrier, Dm TART, revers transkriptase fra Drosophila melanogaster TART non-LTR retrotransposable element); HTV-1, human immunsviktvirus revers transkriptase). TRT con og RT con representerer konsensussekvenser for telomerase RT'er og ikke-telomerase RT'er. Aminosyrer er betegnet med h, hydrofob; p, polar; c, ladet. Trekanter viser rester som er konservert blant telomeraseproteiner, men forskjellig i andre RT'er. Linjen under Motiv E fremhever «primer grip»-regionen. Figur 5 viser ekspresjon av hTRT RNA i telomerasenegative dødelige cellestammer og telomerasepositive udødelige cellelinjer som beskrevet i Eksempel 2. Figur 6 viser et mulig fylogenetisk tre av telomeraser og retroelementer med røtter i RNA-avhengige RNA-polymeraser.

Figur 7 viser et restriksjonskart av lamba klon Gcp5.

Figur 8 viser et kart over kromosom 5p med lokaliseringen av STS-markøren D5S678 (lokalisert nær hTRT-genet) angitt.

Figur 9 viser konstruksjonen av et hTRT-promoter-rapportørplasmid.

Figur 10 viser, over to sider, ko-ekspresjon in vitro av hTRT og hTR for å fremstille katalytisk aktiv human telomerase. Figur 11 viser, over to sider, en tilpasning av sekvenser fra fire TRT-proteiner og angir motiver av interesse. TRT con viser en TRT-konsensussekvens. RT con viser konsensusrester for andre reverse transkriptaser. Konsensusrester angitt med store bokstaver angir absolutt konservering i TRT-proteiner. Figur 12 viser et topoisomerase II spaltningssete og NFicB-bindingssetemotiver i et hTRT-intron, hvor sekvensen tilsvarende SEKV. ID. NR:7, er vist. Figur 13 viser, over to sider, sekvensen av den DNA som koder for Euplotes 123 kDa telomeraseprotein-subenheten ( Euplotes TRT). Figur 14 viser aminosyresekvensen av Euplotes 123 kDa telomeraseproteinsubenheten ( Euplotes TRT-protein). Figur 15 viser, over fem sider, DNA- og aminosyresekvensene av den S. pombe telomerase katalytiske subenhet ( S. pombe TRT). Figur 16 viser, over to sider, hTRT cDNA-sekvensen, med den sekvens som tilsvarer SEKV. ID. NR: 1, vist. Figur 17 viser hTRT-proteinet som kodes av cDNA i Figur 16. Den viste proteinsekvens tilsvarer SEKV. ID. NR:2. Figur 18 viser sekvensen av klon 712562, med sekvensen som tilsvarer SEKV. ID. NR:3, vist. Figur 19 viser et 259 resters protein som kodes av klon 712562, med sekvensen tilsvarende SEKV. ID. NR: 10, vist. Figur 20 viser, over syv sider, sekvensen av en nukleinsyre med en åpen leseramme som koder for et Al82 variant polypeptid med sekvensen tilsvarende SEKV. ID. NR:4, vist. Denne figur viser også aminosyresekvensen av dette A182 variant polypeptid, med aminosyresekvensen tilsvarende SEKV: ID. NR:5, vist. Figur 21 viser, over seks sider, sekvens fra en hTRT-genomisk klon, med sekvensen tilsvarende SEKV. ID. NR:6, vist. Konsensusmotiver og elementer er angitt, inklusivt sekvenser som er karakteristiske for et topoisomerase II spaltningssete, NFicB-bindingssete, en Alu-sekvens og andre sekvenselementer. Figur 22 viser effekten av mutasjon av TRT-genet i gjær, som beskrevet i Eksempel 1.

Figur 23 viser sekvensen av EST AA281296, tilsvarende SEKV. ID. NR:8.

Figur 24 viser sekvensen av de deleterte 182 basepar i klon 712562, med sekvensen tilsvarende SEKV. ID. NR:9, vist. Figur 25 viser resultatet av en test på telomeraseaktivitet fra BJ-celler transfektert med en ekspresjonsvektor som koder for et hTRT-protein (pGRN133) eller et kontrollplasmid (pBBS212) som beskrevet i Eksempel 13. Figur 26 er et skjematisk diagram av affinitetsrensingen av telomerase som viser bindings- og fortrengnings-elueringstrinnene. Figur 27 er et fotografi av et northern blott av telomerasepreparater oppnådd under en renseprotokoll, som beskrevet i Eksempel 1. Bane 1 inneholdt 1,5 fmol telomerase RNA, bane 2 inneholdt 4,6 fmol telomerase RNA, bane 3 inneholdt 14 fmol telomerase RNA,

bane 4 inneholdt 41 fmol telomerase RNA, bane 5 inneholdt nukleært ekstrakt (42 fmol telomerase), bane 6 inneholdt Affi-Gel-heparin-renset telomerase (47 fmol telomerase),

bane 7 inneholdt affinitets-renset telomerase (68 fmol) og bane 8 inneholdt glycerol-gradient-renset telomerase (35 fmol).

Figur 28 viser telomeraseaktivitet gjennom en renseprotokoll.

Figur 29 er et fotografi av en SDS-PAGE-gel som viser nærværet av et ca. 123 kDa-polypeptid og en ca. 43 kDa dublett fra Euplotes aediculatus. Figur 30 er et diagram som viser sedimenteringskoeffisienten av Euplotes aediculatus telomerase. Figur 31 er et fotografi av en polyakrylamidVurea-gel med 36% formamid som viser substratutnyttelsen av Euplotes telomerase. Figur 32 viser den antatte tilpasning av telomerase RNA-templat, og hårnålprimere med telomerase RNA. Figur 33 er et fotografi av banene 25-30 i gelen vist i Figur 31, vist med et svakere eksponeringsnivå. Figur 34 viser DNA-sekvensen av genet som koder for 43 kDa telomerase protein-subenheten fra Euplotes. Figur 35 viser, over fire sider, DNA-sekvensen, så vel som aminosyresekvensene av alle tre åpne leserammer av 43 kDa telomeraseprotein-subenheten fra Euplotes. Figur 36 viser en sekvenssammenligning mellom 123 kDa telomeraseprotein-subenheten av Euplotes (øvre sekvens) og 80 kDa polypeptid-subenheten av T. thermophila (nedre sekvens). Figur 37 viser en sekvenssammenligning mellom 123 kDa telomeraseprotein-subenheten av E. aediculatus (øvre sekvens) og 95 kDa telomerasepolypeptidet av T. thermophila (nedre sekvens). Figur 38 viser den beste tilpasningen mellom en del av «La-domenet» av 43 kDa telomeraseproteinsubenheten av E. aediculatus (øvre sekvens) og en del av 95 kDa polypeptidsubenheten av T. thermophila (nedre sekvens). Figur 39 viser den beste tilpasningen mellom en del av «La-domenet» av 43 kDa telomeraseprotein-subenheten av E. aediculatus (øvre sekvens) og en del av 80 kDa polypeptidsubenheten av T. thermophila (nedre sekvens). Figur 40 viser tilpasningen og motivene av polymerasedomenet av 123 kDa telomeraseproteinsubenheten av E. aediculatus og polymerasedomenene av forskjellige reverse transkriptaser, inklusivt et cytokromoksydase gruppe II intron 1-kodet protein fra S. cerevisiae mitokondrier (al S.c. (gruppe H)), Dong (LINE), og gjær ESTp (L8543.12). Figur 41 viser tilpasningen av et domene av 43 kDa telomeraseproteinsubenheten med diverse La-proteiner. Figur 42 viser nukleotidsekvensen som koder for T. thermophila 80 kDa protein-subenheten. Figur 43 viser aminosyresekvensen av T. thermophila 80 kDa proteinsubenheten. Figur 44 viser nukleotidsekvensen som koder for T. thermophila 95 kDa protein-subenheten. Figur 45 viser aminosyresekvensen av T. thermophila 95 kDa proteinsubenheten.

Figur 46 viser aminosyresekvensen av L8543.I2 («Est2p»).

Figur 47 viser tilpasningen av aminosyresekvensen som kodes av Oxytricha PCR-produktet med Euplotes pl23-sekvensen.

Figur 48 viser DNA-sekvensen av Est2.

Figur 49 viser en partiell aminosyresekvens fra en cDNA-klon som koder for humane telomerasepeptidmotiver. Figur 50 viser en partiell DNA-sekvens av en cDNA-klon som koder for humane telomerasepeptidmotiver.

Figur 51 viser aminosyresekvensen av tezl, også betegnet S. pombe trt.

Figur 52 viser, over to sider, DNA-sekvensen av tezl. Introniske og andre ikke-kodende regioner er vist med små bokstaver, og eksoner (dvs. kodende regioner) er vist med store bokstaver. Figur 53 viser tilpasningen av EST2p-, Euplotes- og 7efrø/iy/we/ja-sekvenser, så vel som konsensussekvens. Figur 54 viser sekvenser av peptider egnet til produksjon av anti-hTRT-antistoffer.

Figur 55 er en skjematisk sammenfatning av tez7<+->sekvenseirngsforsøkene.

Figur 56 vser to degenererte primere benyttet ved PCR for å identifisere S. pombe-homologen av E. aediculatus pl23-sekvensene. Figur 57 viser de fire hovedband frembragt ved PCR under bruk av degenererte primere for å identifisere 5. />owi6e-homologen av E. aediculatus pl23-sekvensene.

Figur 58 viser tilpasningen av M2 PCR-produktet med E. aediculatus pl23,

S. cerevisiae og Oxytricha telomeraseproteinsekvenser.

Figur 59 er et skjema som viser 3'RT PCR-strategien for identifisering av S. pombe-homologen av E. aediculatus pl23. Figur 60 viser karakteristika av bibliotekene benyttet til screening av 5. pombe telomeraseproteinsekvenser og viser resultatene av screening av bibliotekene for S. pombe telomeraseproteinsekvenser. Figur 61 viser de positive resultater oppnådd med //i/icfln-kuttede positive genomiske kloner inneholdende S. pombe telomerasesekvens. Figur 62 er et skjema som viser 5'RT PCR-strategien benyttet for å oppnå en full-lengde S. pombe TRT-klon. Figur 63 viser tilpasningen av RT-domener fra telomerase katalytiske subenheter av S. pombe (S.p.), S. cerevisiae (S.c.) ogE. aediculatus (E.a.). Figur 64 viser tilpasningen av sekvensene fra Euplotes («Ea_pl23»), S. cerevisiae («Sc_Est2p») og S. pombe («Sp_Tezlp»). I Rute A antyder de skyggelagte områder rester som er felles for de to sekvensene. I Rute B angir de skyggelagte områder rester som er felles for alle tre sekvensene. Figur 65 viser den opprivningsstrategi som er benyttet med telomerasegenet i S. pombe. Figur 66 viser de eksperimentelle resultater som bekrefter opplivningen av tezl. Figur 67 viser den progressive forkortelse av telomerer i S. pombe som følge av tezl opprivning. Figur 68 viser, over fire sider, DNA og aminosyren av det ORF som koder for et ca.

63 kDa telomeraseprotein som kodes av EcoRI-Notl innskuddet av klon 712562.

Figur 69 viser en tilpasning av reverse transkriptasemotiver fra diverse kilder.

Figur 70 gir et restriksjons- og funksjonskart for plasmid pGRN121.

Figur 71 viser, over to sider, resultatene av en foreløpig nukleinsyresekvensanalyse av en hTRT cDNA-sekvens. Figur 72 viser, over ti sider, den foreløpige nukleinsyresekvens av hTRT og deduserte ORF-sekvenser i tre leserammer.

Figur 73 gir et restriksjons- og funksjonskart over plasmid pGRN121.

Figur 74 viser, over åtte sider, en forbedret nukleinsyresekvens og deduserte ORF-sekvenser av hTRT.

Figur 75 viser et restriksjonskart over lambda klon 25-1.1.

I. INNFØRING

Telomerase er et ribonukleoproteinkompleks (RNP) som omfatter en RNA-komponent og en katalytisk proteinkomponent. Foreliggende oppfinnelse vedrører kloningen og karakteriseringen av den katalytiske proteinkomponent av telomerase, heretter omtalt som «TRT» (telomerase revers transkriptase). TRT har denne betegnelse på grunn av at dette protein virker som en RNA-avhengig DNA-polymerase (revers transkriptase), ved å benytte telomerase RNA-komponenten (heretter «TR») for å styre syntesen av repeterte telomer DNA-sekvenser. Dessuten er TRT evolusjonært beslektet med andre reverse transkriptaser (se Eksempel 12).

I henhold til ett aspekt vedrører foreliggende oppfinnelse kloningen og karakteirseringen av den katalytiske proteinkomponent av human telomerase, heretter omtalt som «hTRT». Human TRT er av ekstraordinær interesse og verdi fordi telomeraseaktiviteten i mennesker (og andre pattedyrceller) korrelerer med celleproliferativ evne, celledødelighet og utviklingen av en neoplastisk fenotype. For eksempel er telomeraseaktivitet og, som vist i Eksempel 2 nedenfor, nivåer av humane TRT-genprodukter forhøyet i udødelige humane celler (f.eks. maligne tumorceller og udødelige cellelinjer) i forhold til dødelige celler (som f.eks. de fleste humane somatiske celler).

Foreliggende oppfinnelse muliggjør videre fremgangsmåter og blandinger egnet for diagnostisering, prognostisering og behandling av humane sykdomstilstander som mer detaljert beskrevet nedenfor. Det beskrives også fremgangsmåter og reagenser egnet for å gjøre celler udødelige ( in vivo og ex vivo), produsere transgene dyr med ønskede karakteristika samt mange andre anvendelser, hvorav flere er beskrevet nedenfor. Det beskrives også fremgangsmåter og reagenser som egner seg for fremstilling, kloning eller rekloning av TRT-gener og proteiner fra ciliater, sopp, virveldyr, så som pattedyr, og andre organismer.

Som beskrevet detaljert nedenfor, ble TRT først karakterisert etter rensing av telomerase fra ciliaten Euplotes aediculatus. Omfattende rensing av E. aediculatus telomerase ved å benytte RNA-affinitetskromatografi og andre metoder førte til proteinet «pl23». Merkelig nok er pl23 ubeslektet med proteiner som tidligere ble antatt å utgjøre protein-subenhetene av telomerase holoenzymet (dvs. p80- og p95-proteinene av Tetrahymena thermophila). Analyse av pl23-DNA- og proteinsekvenser (Genbank tilgangsnummer U95964; Figur 13 og 14) avdekket revers transkriptase (RT) motiver som stemte overens med rollen til pl23 som den katalytiske subenhet av telomerase (se f.eks. Figur 1,4 og 11). Dessuten er pl23 beslektet med et S. cerevisiae (gjær) protein, Est2p, som var kjent for å spille en rolle ved vedlikeholdet av telomerer i 5. cerevisiae (Genbank tilgangsnummer S5396), men som før foreliggende oppfinnelse ikke var ansett som kodende for et telomerase katalytisk subenhetsprotein (se f.eks. Lendvay et al., 1996, Genetics, 144:1399).

I henhold til ett aspekt tilveiebringes reagenser og fremgangsmåter for identifisering og kloning av nye TRT ved å benytte: nukleinsyreprober og primere frembragt eller avledet fra de omtalte TRT-polynukleotidene (f.eks. for kloning av TRT-gener og cDNA); antistoffer som spesifikt gjenkjenner motivene eller motivsekvensene eller andre TRT-epitoper (f.eks. for ekspresjonskloning av TRT-gener eller rensing av TRT-proteiner); screening av databaser eller på annen måte. Som for eksempel beskrevet i Eksempel 1, ble det utført en PCR (polymerase kjedereaksjon) amplifisering av S. pombe DNA med degenererte sekvensprimere konstruert fra Euplotes pl23 RT-motivene B' og C. Av fire frembragte, fremtredende produkter, kodet ett for en peptidsekvens som var homolog med Euplotes pl23 og S. cerevisiae Est2p. Ved å benytte dette PCR-produkt som probe, ble den fullstendige sekvens av 5. pombe TRT-homologen oppnådd ved screening av S. pombe cDNA og genomiske bibliotek og amplifisering av S. pombe RNA ved revers transkripsjon og PCR (RT-PCR). Den fullstendige sekvens av S. pombe genet («titl»; GenBank tilgangsnummer AF015783; Figur 15) viste at homologien med pl23 og Est2p var spesielt høy i motivene fra den reverse transkriptase. S. pombe trtl omtales også som tezl.

Det ble også benyttet amplifisering under bruk av degenererte primere avledet fra telomerase RT-motivene, for å oppnå TRT-gensekvenser i Oxytricha trifallax og Tetrahymena thermophila, som beskrevet i Eksempel 1.

Euplotes pl23, S. pombe trtl, og S. cerevisiae Est2p nukleinsyresekvenser ble benyttet i et databasesøk etter humant uttrykte sekvens-merkinger (EST) ved å benytte programmet BLAST (Altschul et al, 1990, J. Mol. Biol. 215:403). Gjennomsøkning av denne database med Est2p-sekvensen indikerte ikke overensstemmelse, mens søk med pl23- og trtl-sekvenser identifiserte et humant EST (Genbank tilgangsnummer AA281296; se SEKV. ID. NR:8), som beskrevet i Eksempel 1, som antagelig koder for et homologt protein. Fullstendig sekvensering av cDNA-klonen inneholdende EST (heretter «klon 712562»; se SEKV. ID. NR:3) viste at syv RT-motiver forekom. Denne klon kodet imidlertid ikke for et sammenhengende humant TRT med alle syv motivene, fordi motiv B', C, D og E inngikk i en åpen leseramme (ORF) som var forskjellig fra de mer NH2-terminale motivene. I tillegg var avstanden mellom motivene A og B' betydelig kortere enn den for de tre tidligere karakteriserte TRT. Klon 712562 ble anskaffet fra I.M.A.G.E. Consortium; Lennon et al., 1996, Genomics 33:151.

En cDNA-klon, pGRN121, som koder for et funksjonelt hTRT (se Figur 16, SEKV. ID. NR: 1) ble isolert fra et cDNA-bibliotek avledet fra den humane 293-cellelinje som beskrevet i Eksempel 1. Sammenligning av klon 712562 med pGRN121 viste at klon 712562 har en 182 basepars delesjon (se Figur 24, SEKV. ID. NR:9) mellom motivene A og B'. De ytterligere 182 basepar som forekommer i pGRN121, anbringer alle TRT-motivene i en enkelt åpen leseramme og øker avstanden mellom motiv A- og motiv Byregionene til en avstand som stemmer overens med de øvrige kjente TRT. Som beskrevet nedenfor i Eksemplene (f.eks. Eksempel 7), koder SEKV. ID. NR:1 for et katalytisk aktivt telomeraseprotein som har sekvensen ifølge SEKV. ID. NR:2. Polypeptidet med SEKV. ID. NR:2 har 1132 rester og en beregnet molekylvekt på ca. 127 kilodalton (kD).

Som diskutert nedenfor og beskrevet i Eksempel 9, nedenfor, påvises TRT cDNA som har den 182 basepars delesjon som er karakteristisk for klonen 712562, etter revers transkripsjon av RNA fra telomerase-positive celler (f.eks. testikkel- og 293-celler). hTRT RNA som mangler denne 182 basepars sekvens omtales i alminnelighet som «Al 82 varianter» og kan representere én, to eller flere arter. Selv om de hTRT varianter som mangler den 182 basepars sekvensen funnet i pGRN121 cDNA, antagelig ikke koder for et fullt aktivt telomerase katalytisk enzym, kan de som omtalt nedenfor, spille en rolle i telomerase-regulering og/eller ha partiell telomeraseaktivitet, så som telomerbindende eller hTR-bindende aktivitet som diskutert nedenfor.

I henhold til ett aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse således et isolert polynukleotid med en sekvens av et naturlig forekommende humant TRT-gen eller mRNA som innbefatter, men ikke er begrenset til, et polynukleotid som har sekvensen angitt i

Figur 16 (SEKV. ID. NR: 1). I henhold til et beslektet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et polynukleotid som koder for et hTRT-protein, fragment, variant eller derivat. I henhold til et annet beslektet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen sense og antisense nukleinsyrer som binder til et hTRT-gen eller mRNA. Oppfinnelsen tilveiebringer dessuten hTRT-proteiner, enten de er syntetisert eller renset fra naturlige kilder, så vel som antistoffer og andre midler som spesifikt binder et hTRT-protein eller et fragment derav. Foreliggende oppfinnelse muliggjør også nye fremgangsmåter, inklusivt fremgangsmåter som gjør bruk av ovennevnte blandinger, for eksempel ved å føre til diagnostiske og prognostiske tester for humansykdommer, fremgangsmåter for utvikling av terapeutika og terapimetoder, identifisering av telomerase-assosierte proteiner og fremgangsmåter for screening med henblikk på midler som er i stand til å aktivere eller inhibere telomeraseaktivitet. En rekke andre aspekter og utførelsesformer av oppfinnelsen er angitt nedenfor.

Et ytterligere aspekt ved oppfinnelsen er anvendelsen av et middel som øker ekspresjonen av hTRT ved fremstillingen av et medikament til behandling av en tilstand som gir seg uttrykk i økende proliferativ kapasitet i en virveldyrcelle, hvor medikamentet eventuelt er tiltenkt inhibering av aldringsvirkningene.

Nok et aspekt ved oppfinnelsen er anvendelsen av en inhibitor av telomeraseaktivitet ved fremstillingen av et medikament til behandling av en tilstand assosiert med et forhøyet telomeraseaktivitetsnivå i en humancelle.

Proteinene, variantene og fragmentene ifølge oppfinnelsen samt de kodende polynukleotider eller fragmenter tilveiebringes i henhold til et ytterligere aspekt av oppfinnelsen, hver for seg til bruk som legemiddel.

Oppfinnelsen innbefatter videre anvendelsen av et protein, variant eller fragment, eller av et polynukleotid eller fragment som her definert, ved fremstillingen av et medikament, for eksempel ved fremstillingen av et medikament for inhibering av en effekt av aldring eller cancer.

Beskrivelsen nedenfor er organisert etter tema. Del II beskriver videre aminosyremotiver som er karakteristiske for TRT-proteiner, så vel som TRT-gener som koder for proteiner som har slike motiver. Del HI-VI beskriver bl.a. nukleinsyrer, proteiner, antistoffer og rensede blandinger, med spesiell fokusering på humane TRT-Telaterte blandinger. Del VE beskriver bl.a. fremgangsmåter og blandinger som egner seg til behandling av human-sykdommer. Del VEI beskriver produksjon og identifisering av udødeliggjorte human-cellelinjer. Del DC beskriver bl.a. anvendelser av nukleinsyrer, polynukleotider og andre blandinger for diagnostisering av human-sykdommer. Del X beskriver bl.a. fremgangsmåter og blandinger egnet for screening og identifisering av midler og behandlinger som modulerer (f.eks. inhiberer eller fremmer) telomeraseaktivitet eller ekspresjon. Del XI beskriver bl.a. transgene dyr (f.eks. telomerase «knockout»-dyr og celler). Del XII er en liste over termer benyttet i Del I-XI. Del XHI beskriver eksempler som har relasjon til bestemte utførelses-former av oppfinnelsen. Organiseringen av beskrivelsen av oppfinnelsen etter tema og undertema er for å gi klarhet.

II. TRT-GENER OG PROTEINER

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer isolerte og/eller rekombinante gener og proteiner som har sekvensen til et telomerase katalytisk subenhetsprotein (dvs. telomerase revers transkriptase), inklusivt, men ikke begrenset til, de naturlig forekommende former av slike gener og proteiner i isolert eller rekombinant form. I alminnelighet er TRT store basiske proteiner som har revers transkriptase (RT) og telomerasespesifikke (T) aminosyremotiver, slik som her beskrevet. Siden disse motivene er konservert gjennom diverse organismer, kan TRT-gener av adskillige organismer oppnås ved å benytte den beskrevne fremgangsmåten eller identifiseres ved å benytte primere, nukleinsyreprober og antistoffer ifølge oppfinnelsen, som f.eks. de som er spesifikke for én eller flere av motivsekvensene.

De syv RT-motivene som er funnet i TRT har, selv om de ligner de som er funnet i andre reverse transkriptaser, særlige kjennetegn. For eksempel er det som vist i Figur 14 innen TRT RT-motivene en rekke aminosyresubstitusjoner (merket med piler) i rester som er sterkt konservert blant de andre RT. I motiv C forekommer for eksempel de to asparaginsyrerestene (DD) som koordinerer aktive seters metallioner (se Kohlstaedt et al, 1992, Science 256:1783; Jacobo-Molina et al., 1993, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S. A. 90:6320; Patel et al., 1995, Biochemistry 34:5351) i sammenhengen hxDD(F/Y) i telomerase RT sammenlignet med (F/Y)xDDh i de andre RT (hvor «h» er en hydrofob aminosyre og «x» er en hvilken som helst aminosyre; se Xiong et al., 1990, EMBO J. 9:3353; Eickbush, i The Evolutionary Biology of Vimses, (S. Morse, Red. Raven Press, NY, s. 121,1994)). En annen systematisk forandring som er karakteristisk for telomerase-subgruppen forekommer i motiv E, hvor WxGxSx er en konsensussekvens eller er konservert blant telomeraseproteinene, mens hLGxxh er karakteristisk for andre RT (Xiong et al., supra; Eickbush supra). Dette motiv E er kalt «primer grip» og mutasjoner i denne region har vært rapportert å påvirke RNA-priming, men ikke DNA-priming (Powell et al, 1997, J. Biol. Chem. 272:13262). Siden telomerase fordrer en DNA-primer (f.eks. kromosomets 3'-ende), er det ikke uventet at telomerase skulle adskille seg fra andre RT i primer grip-regionen. I tillegg er avstanden mellom motivene A og B' lenger i TRT enn det som er typisk for andre RT, som kan representere et innskudd innen «finger»-regionen av strukturen som ligner en høyre hånd (Figur 3; se Kohlstaedt et al, supra;

Jacobo-Molina et al, supra; og Patel et al, supra).

Som angitt ovenfor er dessuten motiv T et ytterligere kjennetegn på TRT-proteiner. Dette motiv T omfatter som vist for eksempel i Figur 4 (W-L-X-Y-X-X-h-h-X-h-h-X-p-F-F-T-E-X-p-X-X-X-p-X-X-X-Y-X-R-K-X-X-W [X er en hvilken som helst aminosyre, h er hydrofob, p er polar]) en sekvens som kan beskrives ved å benytte formelen:

hvor X er en hvilken som helst aminosyre og indeksene refererer seg til antallet fortløpende rester, R] er leucin eller isoleucin, R2 er glutamin eller arginin, R3 er fenylalanin eller tyrosin og R4 er lysin eller histidin.

T-motivet kan også beskrives ved bruk av formelen:

hvor X er en hvilken som helst aminosyre og en indeks refererer seg til antallet fortløpende rester, R] er leucin eller isoleucin, R2 er glutamin eller arginin, R3 er fenylalanin eller tyrosin, R4 er lysin eller histidin, h er en hydrofob aminosyre valgt fra Ala, Leu, Ile, Val, Pro, Phe, Trp og Met, og p er en polar aminosyre valgt fra Gly, Ser, Thr, Tyr, Cys, Asn og Gin.

TRT-proteiner omfatter vanligvis ett eller flere av motivene illustrert i Figur 11, f.eks:

Når det viste TRT-protein inneholder mer enn ett TRT-motiv, er rekkefølgen (NH2-»COOH) som vist i Figur 11.

Isolerte naturlig forekommende TRT-proteiner kan omfatte følgende supermotiv:

Det vil være klart at fagmannen utrustet med de reagenser, inklusivt de her beskrevne TRT-sekvenser for disse reagensene, og fremgangsmåtene og her gitte veiledning (inklusivt spesifikk metodikk beskrevet nedenfor), kan TRT-gener og proteiner oppnås, isoleres og produseres i rekombinant form av fagmannen. For eksempel tilveiebringes primere (f.eks. degenererte amplifikasjonsprimere) som hybridiserer til gensekvenser som koder for RT- og T-motiver som er karakteristiske for TRT. For eksempel kan én eller flere primere eller degenererte primere som hybridiserer til sekvenser som koder for FFYXTE-regionen av T-motivet, andre TRT-motiver (som diskutert nedenfor) eller kombinasjoner av motiver eller konsensussekvenser, fremstilles på basis av målorganismens kodonanvendelse og benyttes til å amplifisere TRT-gensekvensen fra genomisk DNA eller cDNA fremstillet fra mål-rganismen. Bruk av degenererte primere er velkjent på området og medfører bruk av primersett som hybridiserer til det sett av nukleinsyresekvenser som eventuelt kan kode for aminosyrene til målmotivet, under hensyntagen til kodon-preferanser og anvendelsen av målorganismen, og ved å benytte amplifikasjonsbetingelser (f.eks. PCR) egnet for å tillate basemistilpasninger i hybridiseringstrinnet for PCR. I alminnelighet benyttes to primersett, men enkeltprimer (eller i dette tilfellet et enkelt degenerert primersett) amplifikasjons-systemer er imidlertid velkjent og kan benyttes for å oppnå TRT-gener.

Tabell 1 gir illustrerende primere som kan benyttes til å amplifisere nye TRT-nukleinsyrer, særlig de fra virveldyr (f.eks. mennesker og andre pattedyr). «N» er en ekvimolar blanding av alle fire nukleotidene og nukleotider i parenteser er ekvimolare blandinger av de angitte nukleotidene.

Amplifisert TRT-nukleinsyrer kan benyttes som hybridiseringsprobe for koloni-hybridisering til et bibliotek (f.eks. cDNA-bibliotek) fremstillet fra målorganismen, slik at en nukleinsyre som har hele den TRT-proteinkodende sekvens, eller en vesentlig del av denne, identifiseres og isoleres eller klones. Slike reagenser og fremgangsmåter som nettopp beskrevet, ble benyttet i overensstemmelse med de her beskrevne metoder for å oppnå TRT-gensekvenser av Oxytricha trifallax og Tetrahymena thermophila, som detaljert beskrevet nedenfor. Det vil være klart at etter kloning av et tidligere ikke-karakterisert TRT-gen, kan sekvensen bestemmes etter rutinemetoder og det kodede polypeptid syntetiseres og testes på en TRT-aktivitet, som f.eks. telomerase katalytisk aktivitet (som beskrevet her og/eller ved telomerasetester som er kjent på området).

Det vil også være åpenbart for fagmannen at TRT-gener kan klones ved å benytte én av en rekke kloningsmetoder siden de TRT-motivsekvenser og nukleinsyrer ifølge oppfinnelsen som omfatter slike sekvenser, kan benyttes i et stort utvalg av slike metoder. F. eks. kan det benyttes hybridisering ved bruk av en probe basert på sekvensen av en kjent TRT,

til DNA eller andre nukleinsyrebibliotek fra målorganismen, som beskrevet i Eksempel 1.

Det vil være klart at degenererte PCR-primere eller deres amplifikasjonsprodukter, så som de nedenfor beskrevne, selv kan merkes og benyttes som hybridiseringsprober. I en annen utførelsesform benyttes ekspresjonskloningsmetoder. For eksempel kan én eller flere antistoffer som spesifikt binder peptider som strekker seg over et TRT-motiv eller en annen TRT-epitop, så som FFYXTE-motivet, benyttes for å isolere et ribosomalt kompleks som omfatter et TRT-protein og det mRNA som koder for dette. For utvikling av slike antistoffer ifølge oppfinnelsen har peptid-immunogenene i alminnelighet lengder på mellom 6 og 30 aminosyrer, oftere ca. 10 til 20 aminosyrer. Antistoffene kan benyttes til å probeundersøke et cDNA-ekspresjonsbibliotek avledet fra den aktuelle organisme for å identifisere en klon som koder for en TRT-sekvens. I henhold til en annen utførelsesform kan det også benyttes datasøk av DNA-databaser for DNA som inneholder sekvenser konservert med kjente TRT, for å identifisere en klon som omfatter en TRT-sekvens.

I henhold til ett aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse blandinger som omfatter et isolert eller rekombinant polypeptid som har aminosyresekvensen til et naturlig forekommende TRT-protein. Vanligvis har den naturlig forekommende TRT en molekylvekt på mellom ca. 80.000 dalton (D) og ca. 150.000 D, oftest mellom ca. 95.000 D og ca. 130.000 D. I alminnelighet har det naturlig forekommende TRT en positiv nettoladning ved pH 7 (beregnet pl typisk større enn 9). I én utførelsesform oppviser polypeptidet en telomerase-aktivitet som her definert. Ifølge en beslektet utførelsesform har polypeptidet en TRT-spesifikk regionsekvens (T-motiv) og oppviser en telomeraseaktivitet. Oppfinnelsen tilveiebringer dessuten fragmenter av slike polypeptider. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også et isolert eller rekombinant polynukleotid som har sekvensen til et naturlig forekommende gen som koder for et TRT-protein. Det beskrives reagenser egnet for isolering av en sekvens av et TRT fra ikke-vertebrater (som f.eks. en gjær) og vertebrater, så som pattedyr (f.eks. mus eller menneske). Det isolerte polynukleotid kan forbindes med andre naturlig forekommende eller rekombinante eller syntetiske vektor-nukleinsyresekvenser. I alminnelighet er den isolerte nukleinsyren mindre enn ca. 300 kb, ofte mindre enn ca. 50 kb, enda oftere mindre enn ca. 20 kb, hyppig mindre enn ca. 10 kb og enkelte ganger mindre enn ca. 5 kb eller 2 kb. Ifølge enkelte utførelsesformer er det isolerte TRT-polynukleotid enda mindre, som f.eks. et genfragment, en primer eller probe på mindre enn ca. 1 kb eller mindre enn 0,1 kb.

III. NUKLEINSYRER

A) GENERELT

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer isolerte og rekombinante nukleinsyrer som har en sekvens til et polynukleotid som koder for et telomerase katalytisk subenhetsprotein (TRT), så som et rekombinant TRT-gen fra Euplotes, Tetrahymena, S. pombe eller menneske. Eksempler på polynukleotider er gitt i Figur 13 ( Euplotes) ; Figur 15 ( S. pombe) og Figur 16 (menneske, GenBank tilgangsnummer AF015950). Det beskrives sense og antisense polynukleotider som har en TRT-gensekvens, inklusivt prober, primere, TRT-proteinkodende polynukleotider og lignende.

B) HUMAN TRT

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer nukleinsyrer som har en sekvens av en telomerase katalytisk subenhet fra mennesket (dvs. hTRT).

Ifølge ett aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et polynukleotid som har en sekvens eller subsekvens av et humant TRT-gen eller RNA. I én utførelsesform har polynukleotidet ifølge oppfinnelsen en sekvens i henhold til SEKV. ID. NR:1, vist i Figur 16, eller en subsekvens derav. I en annen utførelsesform har polynukleotidet en sekvens ifølge SEKV. ID. NR.3 (Figur 18), SEKV. ID. NR:4 (Figur 20) eller subsekvenser derav. Oppfinnelsen tilveiebringer også polynukleotider med betydelig sekvensidentitet med de her omtalte hTRT-nukleinsyresekvenser, f.eks. inklusivt, men ikke begrenset til, SEKV. ID. NR:1 [Figur 16], 4 [Figur 20], 6 [Figur 21] og 7). Oppfinnelsen tilveiebringer derfor naturlig forekommende alleler av humane TRT-gener og polynukleotidsekvensvarianter som har én eller flere nukleotid-delesjoner, insersjoner eller substitusjoner i forhold til en her beskrevet hTRT-nukleinsyresekvens. Som beskrevet nedenfor kan nukleinsyrevarianter fremstilles ved å benytte de rekombinante eller syntetiske metodene som er beskrevet nedenfor, eller på annen måte.

Oppfinnelsen tilveiebringer også isolerte og rekombinante polynukleotider som har en sekvens fra en flankerende region av et humant TRT-gen. Slike polynukleotider inkluderer de som skriver seg fra genomiske sekvenser av utranslaterte regioner av hTRT mRNA. Et eksempel på en genomisk sekvens er vist i Figur 21 (SEKV. ID. NR:6). Som beskrevet i Eksempel 4, ble SEKV. ID. NR:6 oppnådd ved å sekvensere en klon, A.G<p5 isolert fra et humant genomisk bibliotek. Lambda GtpS inneholder et 15 kilobasepar (kbp) innskudd som innbefatter ca. 13.000 baser 5' til de hTRT-kodende sekvenser. Denne klon inneholder hTRT-promotersekvenser og andre hTRT-genregulerende sekvenser (f.eks. enhancere).

Det beskrives også isolerte og rekombinante polynukleotider som har en sekvens fra en intronisk region av et humant TRT-gen. Et eksempel på en intronisk sekvens er vist i Figur 21 (SEKV. ID. NR:7); se Eksempel 3). hTRT-introner kan inkluderes i «minigeneD> for forbedret ekspresjon av hTRT-proteiner i eukaryote celler.

I henhold til et beslektet aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse polynukleotider som koder for hTRT-proteiner eller proteinfragmenter, inklusivt modifiserte, endrede og varierende hTRT-polypeptider. Ifølge én utførelsesform har det kodede hTRT-protein eller fragment, en aminosyresekvens som angitt i Figur 17 (SEKV. ID. NR:2), eller med konservative substitusjoner av SEKV. ID. NR:2.1 én utførelsesform har det kodede hTRT-protein eller fragment substitusjoner som endrer en proteinvirkning (f.eks. telomerase-katalytisk aktivitet).

Det vil på grunn av degenereringen av den genetiske kode være klart at den nukleinsyre som koder hTRT-proteinet ikke behøver ha sekvensen til det naturlig forekommende hTRT-gen, men at en lang rekke polynukleotider kan kode for et hTRT-polypeptid som har en aminosyresekvens ifølge SEKV. ID. NR:2. Foreliggende oppfinnelse omfatter enhver mulig variasjon av nukleotidsekvenser som vil kunne oppnås ved å velge kombinasjoner basert på mulige kodonvalg foretatt i overens-stemmelse med kjente genetiske kodetripletter, og alle slike variasjoner er herved beskrevet. Selv om hTRT-polypeptidkodende nukleotidsekvenser som er i stand til å hybridisere til nukleotidsekvensen av den naturlig forekommende sekvens (under passende valg av stringensbetingelser) i enkelte tilfeller kan være å foretrekke, kan det i andre tilfeller være fordelaktig å fremstille nukleotidsekvenser som koder for hTRT, som gjør bruk av en vesentlig forskjellig kodonanvendelse og således kanskje ikke hybridiserer til nukleinsyrer med den naturlig forekommende sekvens.

I henhold til særlige utførelsesformer tilveiebringer oppfinnelsen hTRT oligo- og polynukleotider som omfatter en subsekvens av en her omtalt hTRT-nukleinsyre (f.eks. SEKV. ID. NR:1 og 6). Nukleinsyrene ifølge oppfinnelsen omfatter typisk ca. 10, oftere minst ca. 12 eller 15 påfølgende baser av det eksemplifiserte hTRT-polynukleotid. Nukleinsyrene ifølge oppfinnelsen vil omfatte en lengre sekvens på minst ca. 25, ca. 50, ca. 100, ca. 200 eller minst ca. 500 til 3000 basers lengde, for eksempel når det er meningen å uttrykke et polypeptid eller et full-lengdes hTRT-protein.

«A182hTRT» polynukleotider som har en sekvens identisk eller komplementær med naturlig forekommende eller ikke-naturlig forekommende hTRT-poIynukleotider, så som SEKV. ID. NR:3 eller SEKV. ID. NR:4, som ikke inneholder den 182 nukleotiders sekvens (SEKV. ID. NR:9 [Figur 24] som forekommer i pGRN121 (og også mangler i klon 712562) er av interesse. Disse polynukleotidene er av interesse, delvis fordi de koder for polypeptider som inneholder forskjellige kombinasjoner eller arrangementer av TRT-motiver som er forskjellige fra de som finnes i det «full-lengdes» hTRT-polypeptid (SEKV. ID. NR:2) som f.eks. kodet av pGRN121. Som omtalt nedenfor, er det også tenkelig at disse polypeptidene kan spille en biologisk rolle i naturen (f.eks. ved regulering av telomerase-ekspresjon i celler) og/eller finne anvendelse som terapeutika (f.eks. som dominant-negative produkter som inhiberer funksjonen av villtype proteiner) eller har andre roller og anvendelser, f.eks. som her beskrevet.

I motsetning til polypeptidet som kodes av pGRN121, koder klon 712562 f.eks. for et 259 resters protein med en beregnet molekylvekt på ca. 30 kD (heretter «712562 hTRT»). Dette 712562 hTRT-polypeptid (SEKV. ED. NR:10 [Figur 19]) inneholder motivene T, 1,2 og A, men ikke motiv B', C, D og E (se Figur 4). Tilsvarende kan en hTRT-polypeptidvariant med terapeutiske og andre aktiviteter, uttrykkes fra en lignende nukleinsyre som pGRN121 cDNA, men som mangler de 182 basepar som savnes i klon 712562, f.eks. har sekvensen vist i Figur 20 (SEKV. ED. NR:4). Denne nukleinsyre (heretter «pro90hTRT»), som kan syntetiseres ved å benytte rutinemessig syntese eller rekombinante metoder som her beskrevet, koder for et 807 resters protein (beregnet molekylvekt på ca. 90 kD) som har den samme aminoterminale sekvens som det hTRT-protein som kodes av SEKV. ED. NR:1, men adskiller seg ved den karboksyterminale region (de første 763 restene er felles, mens de siste 44 restene av pro90hTRT er annerledes enn «full-lengdes» hTRT). Dette pro90hTRT-polypeptid inneholder motivene T, 1, 2 og A, men ikke motivene B, C, D og E, og kan således ha enkelte, men sannsynligvis ikke alle, telomeraseaktivitetene.

C. PRODUKSJON AV HUMANE TRT-NUKLEINSYRER

Polynukleotidene ifølge oppfinnelsen har en lang rekke anvendelser, inklusivt, men ikke begrenset til, ekspresjon av polypeptider som koder for hTRT eller fragmenter derav, anvendelse som sense- eller antisenseprober eller primere for hybridisering og/eller amplifisering av naturlig forekommende hTRT-gener eller RNA (f.eks. for diagnostiske eller prognostiske anvendelser) og som terapeutiske midler (f.eks. i antisense-, tripleks- eller ribozymsammensetninger). Som det vil fremgå av en gjennomgang av denne beskrivelse, vil disse anvendelsene ha enorm betydning for diagnostisering og behandling av humane sykdommer relatert til aldring, cancer og fertilitet, så vel som til vekst, reproduksjon og fremstilling av cellebaserte produkter. Som beskrevet i de etterfølgende deler kan hTRT-nukleinsyrene ifølge oppfinnelsen fremstilles (f.eks. klones, syntetiseres eller amplifiseres) ved å benytte velkjente teknikker.

1) KLONING, AMPLIFISERING OG REKOMBINANT PRODUKSJON

hTRT-gener eller cDNA kan klones ved å benytte en nukleinsyreprobe som spesifikt hybridiserer til en hTRT mRNA, cDNA eller genomisk DNA. En passende probe for dette formål er et polynukleotid som har hele, eller en del av, sekvensen angitt i Figur 16 (SEKV. ID. NR:1), som f.eks. en probe som omfatter en subsekvens av denne. I alminnelighet ligeres hTRT-målets genomiske DNA eller cDNA til en vektor (f.eks. et plasmid, fag, virus, kunstig gjærkromosom eller lignende) og kan isoleres fra et genomisk eller cDNA-bibliotek (f.eks. et cDNA-bibliotek fra human placenta). Etter at en hTRT-nukleinsyre er påvist, kan den isoleres i henhold til kjente standardmetoder. Et illustrerende eksempel på screening av et humant cDNA-bibliotek for hTRT-genet er angitt i Eksempel 1. Tilsvarende finnes eksempler på screening av et humant genomisk bibliotek i Eksempel 3 og 4. Kloningsmetodene er velkjente og er beskrevet, for eksempel i Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utg. Bd. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, heretter «Sambrook»); Berger & Kimmel (1987) Methods in Enzymology, Bd. 152: Guide to Molecular Cloning Techniques, San Diego: Academic Press, Inc.; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1997), Cashion et al., US-patent 5.017.478; og Carr, Europeisk patent nr. 0.246.864.

Oppfinnelsen tilveiebringer også hTRT-genomiske eller cDNA-nukleinsyrer isolert ved hjelp av slike amplifiseirngsmetoder som PCR (polymerase kjedereaksjon). I én utførelsesform amplifiseres den hTRT-protein-kodende sekvens fra en RNA- eller cDNA-prøve (f.eks. dobbeltkjedet placental cDNA (Clontech, Palo Alto CA)) ved å benytte primerne 5 '-GTGAAGGCACTGTTCAGCG-3' («TCP1.1») og 5 '-CGCGTGGGTGAGGTGAGGTG-3'

(«TCP 1.15»), En tredje primer eller et annet primerpar kan anvendes, f.eks. for «nestet PCR»

(nøstet PCR) for å øke spesifisiteten. Et eksempel på et andre primerpar er 5 '-CTGTGCTGGGCCTGGACGATA-3' («billTCP6») og

5'-AGCTTGTTCTCCATGTCGCCGTAG-3' («TCP1.14»). Det vil for fagmannen være klart at det kan benyttes adskillige andre primere og primerkombinasjoner som egner seg for amplifisering av hTRT-nukleinsyrer.

Primere som amplifiserer en hvilken som helst spesifikk region (f.eks. kodende regioner, promoterregioner og/eller introner) eller subsekvens av hTRT-genomisk DNA, cDNA eller RNA kan anvendes. For eksempel kan hTRT-intronet i posisjon 274/275 i SEKV. ID. NR:1 (se Eksempel 3) amplifiseres (f.eks. for påvisning av genomiske kloner) ved å benytte primerne TCP1.57 og TCP1.52 (primerpar 1) eller primerne TCP1.49 og TCP1.50 (primerpar 2). (Primernavn refererer seg til primerne angitt i Tabell 2 nedenfor). Primerparene kan benyttes hver for seg eller i en sammenkoblet PCR, hvor primersett 1 benyttes først. Et annet illustrerende eksempel vedrører primere som spesifikt amplifiserer og således påviser, 5'-enden av hTRT mRNA eller det ekson som koder for 5'-enden av hTRT-genet (f.eks. for å fastslå størrelsen eller fullstendigheten av en cDNA-klon). Følgende primerpar er egnet for amplifisering av 5'-enden av hTRT: primerne K320 og K321 (primerpar 3); primerne K320 og TCP 1.61 (primerpar 4); primerne K320 og K322 (primerpar 5). Primersettene kan benyttes i en sammenkoblet PCR i rekkefølgen sett 5, deretter sett 4 eller sett 3, eller sett 4 eller sett 5, og deretter sett 3. Et annet illustrerende eksempel involverer primere valgt for spesifikt å amplifisere eller påvise den konserverte hTRT TRT-motivregion som omfatter tilnærmet den midtre tredjedel av mRNA (f.eks. for bruk som hybridiseringsprobe for å påvise TRT-kloner, for eksempel fra andre organismer enn mennesket). De følgende primerpar er egnet for amplifisering av TRT-motivregionen av hTRT-nukleinsyrer: primerne K304 og TCP1.8 (primerpar 6) eller primerne LT1 og TCP1.15 (primerpar 7). Primersettene kan benyttes i et sammenkoblet PCR-forsøk i rekkefølgen sett 6 og deretter sett 7.

Passende PCR -amplifiseringsbetingelser vil være kjent for fagmannen og innbefatter (men er ikke begrenset til) 1 enhet Taq-polymerase (Perkin Eimer, Norwalk, CT), 100 fiM hver av dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 1 x PCR-buffer (50 mM KC1,10 mM Tris,

pH 8,3 ved romtemperatur, 1,5 mM MgCfe, 0,01% gelatin) og 0,5 \ iM primere, hvorunder amplifiseringen foretas i ca. 30 runder ved 94°C i 45 sekunder, 55°C i 45 sekunder og 72°C i 90 sekunder. Det vil være klart for fagmannen at andre termostabile DNA-polymeraser, reaksjonsbetingelser og cykliseringsparametere også vil gj egnet amplifikasjon. Andre egnede in vitro amplifikasjonsmetoder som kan benyttes for å oppnå hTRT-nukleinsyrer, innbefatter, men er ikke begrenset til, de som er angitt nedenfor. Når hTRT-nukleinsyrene først er amplifisert, kan de eventuelt klones inn i én av en rekke vektorer ved å benytte rutinemessige molekylærbiologiske metoder eller påvises eller på annen måte utnyttes i overensstemmelse med fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen.

Fagmannen vil innse at de klonede eller amplifiserte hTRT-nukleinsyrene oppnådd som beskrevet ovenfor, kan fremstilles eller formeres ved å benytte andre metoder, så som kjemisk syntese eller replikasjon gjennom transformering i bakterielle systemer, så som E. coli (se f.eks. Ausubel et ai, supra) eller eukaryote, så som pattedyr-ekspresjonssystemer. Tilsvarende kan hTRT RNA uttrykkes i henhold til foreliggende in vitro metoder eller i slike bakteriesystemer som E. coli, ved for eksempel å benytte kommersielt tilgjengelige vektorer som inneholder promotere som gjenkjennes av en RNA-polymerase så som T7, T3 eller SP6, eller transkripsjon av DNA utviklet ved PCR-amplifisering under bruk av primere som inneholder en RNA-polymerasepromoter,

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer dessuten endrede eller modifiserte hTRT-nukleinsyrer. Det vil for fagmannen være klart at de oppnådde klonede eller amplifiserte hTRT-nukleinsyrene kan modifiseres (f.eks. trunkeres, derivatiseres, endres) etter velkjente metoder (f.eks. stedsrettet mutagenese, linker-skandrende mutagenese) eller ganske enkelt syntetisert fra grunnen av, som beskrevet nedenfor. De endrede eller modifiserte hTRT-nukleinsyrene egner seg for en rekke anvendelser, inklusivt, men ikke begrenset til, forenkling av kloning eller manipulering av et hTRT-gen eller genprodukt, eller uttrykke en variant av et hTRT-genprodukt. I én utførelsesform endres for eksempel hTRT-gensekvensen slik at den koder for et hTRT-polypeptid med endrede egenskaper eller virkninger, som omtalt detaljert nedenfor, for eksempel ved mutasjon i et konservert motiv av hTRT. I et annet illustrerende eksempel kan mutasjonene i den proteinkodende region av en hTRT-nukleinsyre innføres for å endre glykosyleringsmønstere, for å endre kodonpreferanse, for å frembringe spleisevarianter, fjerne proteasefølsomme seter, frembringe antigene domener, modifisere spesifikk aktivitet og lignende. I andre utførelsesformer endres nukleotidsekvensen som koder for hTRT og dens derivater uten å endre de kodede aminosyresekvenser, for eksempel produksjonen av RNA-transkripter som har mer ønskelige egenskaper, som f.eks. øket translasjonseffektivitet eller en lengre eller kortere halveringstid, sammenlignet med transkripter produsert fra den naturlig forekommende sekvens. I nok en annen utførelsesform velges endrede kodoner for å øke den hyppighet som ekspresjonen av peptidet skjer med i en bestemt prokaryot eller eukaryot ekspresjonsvert i overensstemmelse med den hyppighet som bestemte kodoner utnyttes med av verten. Nyttige in vitro og in vivo rekombinante teknikker som kan benyttes for å fremstille hTRT-polynukleotidvarianter ifølge oppfinnelsen forekommer i Sambrook et al., og Ausubel et al., begge supra.

Som angitt ovenfor tilveiebringes det nukleinsyrer som har flankerende (5' eller 3') og introniske sekvenser av hTRT-genet. Nukleinsyrene er av interesse blant annet fordi de inneholder promoter- og andre regulatorelementer som er involvert i hTRT-regulering og egnet for ekspresjon av hTRT og andre rekombinante proteiner eller RNA-genprodukter. I tillegg til nukleinsyresekvensene gitt i SEKV. ID. NR:6 og 7, er det klart at ytterligere hTRT-intronsekvenser og flankerende sekvenser lett kan oppnås ved å benytte molekylærbiologiske rutineteknikker. For eksempel kan en ytterligere hTRT-genomisk sekvens oppnås fra Lambda klon GOS (ATCC tilgangsnummer 209024), beskrevet ovenfor og i Eksempel 4. Ytterligere andre hTRT-genomiske kloner og sekvenser kan oppnås ved screening av et humant genomisk bibliotek under bruk av en hTRT-nukleinsyreprobe som har en sekvens eller subsekvens fra SEKV. ID. NR:1. Ytterligere kloner og sekvenser (f.eks. enda lenger oppstrøms) kan oppnås ved å benytte merkede sekvenser eller subkloner avledet fra A.GKD5 for probeundersøkelse av passende bibliotek. Andre egnede metoder for videre karakterisering av hTRT-flankerende sekvenser, inkluderer de generelle metodene som er beskrevet av Gobinda et al., 1993, PCR Meth. Applic. 2:318; Triglia et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16:8186; Lagerstrom et al., 1991, PCR Methods Applic. 1:111; og Parker et al., 1991, Nucleic Acids Res. 19:3055.

Introniske sekvenser kan identifiseres ved rutinemetoder, som f.eks. ved å sammenligne den hTRT-genomiske sekvens med hTRT cDNA-sekvensene (se f.eks. Eksempel 3), ved Sl-analyse (se Ausubel et al, supra, i kapittel 4) eller forskjellige andre kjente hjelpemidler. Introniske sekvenser kan også finnes i pre-mRNA (dvs. uspleisede eller ufullstendig spleisede mRNA-forløpere), som kan amplifiseres eller klones etter revers transkripsjon av cellulær RNA.

Om ønskes kan sekvensen av den klonede, amplifiserte eller på annen måte syntetiserte hTRT- eller annen TRT-nukleinsyre bestemmes eller verifiseres ved å benytte velkjente DNA-sekvenseringsmetoder (se f.eks. Ausubel et al., supra). Egnede sekvenseringsmetoder gjør bruk av slike enzymer som Klenow-fragmentet av DNA-polymerase I, Sequenase (US Biochemical Corp., Cleveland OH), Taq DNA-polymerase (Perkin Eimer, Norwalk CT), termostabi! T7-polymerase (Amersham, Chicago IL) eller kombinasjoner av rekombinante polymeraser og korrekturlesende eksonukleaser, så som ELONGASE amplifiseringssystemet som markedsføres av Gibco BRL (Gaithersburg MD). Ved sekvensering eller verifisering av sekvensen av oligonukleotider (som f.eks. oligonukleotid fremstillet fra grunnen ved kjemisk syntese) kan metoden til Max am & Gilbert (Maxam & Gilbert, 1980, Meth. Enz. 65:499; Ausubel et al, supra, kapittel 7), være å foretrekke.

De 5' utranslaterte sekvensene av hTRT eller andre TRT mRNA kan bestemmes direkte ved kloning av et «full-lengde» hTRT eller annen cDNA, ved å benytte standardmetoder, så som revers transkripsjon av mRNA, etterfulgt av kloning og sekvensering av den resulterende cDNA. Foretrukne oligo(dT)-primede bibliotek for screening eller amplifisering av full-lengde cDNA, som er blitt størrelses-selektert for å inkludere større cDNA, kan være å foretrekke. Tilfeldig primede bibliotek egner seg også og innbefatter ofte en større andel av kloner som inneholder 5'-regionene av gener. Andre velkjente metoder for å oppnå 5' RNA-sekvenser, som f.eks. RACE-protokollen beskrevet av Frohman et al, 1988, Proe. Nat. Acad. Sei. USA 85:8998, kan også benyttes. Om ønskes kan transkripsjons-startsstedet for en hTRT-eller annen TRT mRNA bestemmes ved hjelp av rutinemetoder under bruk av de her frembragte nukleinsyrene (f.eks. som har en sekvens ifølge SEKV. ID. NR-.l). En metode er Sl-nuklease-analyse (Ausubel et al supra) hvor det benyttes en merket DNA som har en sekvens fra 5'-regionen av SEKV. ID. NR:1.

2) KJEMISK SYNTESE AV NUKLEINSYRER

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også hTRT-polynukleotider (RNA, DNA eller modifisert) som produseres ved direkte kjemisk syntese. Kjemisk syntese foretrekkes generelt for produksjonen av oligonukleotider eller for oligonukleotider og polynukleotider som inneholder nukleotider som ikke er vanlige (f.eks. prober, primere og antisense oligonukleotider). Direkte kjemisk syntese av nukleinsyrer kan oppnås etter kjente metoder, så som fosfotriester-metoden til Narang et al, 1979, Meth. Enzymol. 68:90; fosfodiestermetoden til Brown et al, Meth. Enzymol. 68:109 (1979); dietylfosforamidittmetoden til Beaucage et al, Tetra. Lett. 22:1859 (1981); og på fast bærer ifølge US-patent 4.458.066. Kjemisk syntese fører i alminnelighet til et enkeltkjedet oligonukleotid som kan omdannes til en dobbeltkjedet DNA ved hybridisering med en komplementær sekvens eller ved polymerisering med en DNA-polymerase og en oligonukleotidprimer ved å benytte enkeltkjeden som templat. Fagmannen vil være kjent med at mens kjemisk syntese av DNA ofte er begrenset til sekvenser på 100 eller 150 baser, kan lengre sekvenser oppnås ved ligering av kortere sekvenser eller ved mer omstendelige syntesemetoder.

Det vil være klart at hTRT (eller hTR eller andre) polynukleotider og oligonukleotider ifølge oppfinnelsen, kan fremstilles ved å benytte uvanlige baser (f.eks. andre enn adenin, cytidin, guanin, tymin og uridin) eller uvanlige skjelett-strukturer for å frembringe ønskede egenskaper (f.eks. øket nukleaseresistens, fastere binding, stabilitet eller ønsket Tm). Teknikker for å gjøre oligonukleotider nukleaseresistente omfatter de som er beskrevet i PCT publikasjon WO 94/12633. Det kan fremstilles et stort utvalg egnede modifiserte oligonukleotider, inklusivt oligonukleotider som har et peptid-nukleinsyre-(PNA)-skjelett (Nielsen et al., 1991, Science 254:1497) eller innbefatter 2'-0-metyl-ribonukleotider, fosfortioatnukleotider, metylfosfonat-nukleotider, fosfotriester-nukleotider, fosfortioatnukleotider, fosfor-amidater. Ytterligere andre egnede oligonukleotider kan inneholde alkyl-og halogen-substituerte sukkerdeler som omfatter én av følgende i 2'-stillingen: OH, SH, SCH3, F, OCN, OCH3OCH3, OCH30(CH2)nCH3,0(CH2)nNH2 eller 0(CH2)„CH3, hvor n er fra 1 til ca. 10; Ci til Cio-lavere alkyl, substituert lavere alkyl, alkaryl eller aralkyl; Cl; Br; CN; CF3; OCF3; O-, S-, eller N-alkyl; O-, S-, eller N-alkenyl; SOCH3; S02CH3; ON02; N02; N3; NH2; heterocykloalkyl; heterocykloalkaryl; aminoalkylamino; polyalkylamino; substituert silyl; en RNA-spaltende gruppe; en kolesterylgruppe; en folatgruppe; en rapportørgruppe; en interkalator; en gruppe for å forbedre de farmakokinetiske egenskapene til et oligonukleotid eller en gruppe til forbedring av de farmakodyna-miske egenskaper av et oligonukleotid og andre substituenter som har lignende egenskaper. Folat, kolesterol eller andre grupper som letter oligonukleotidopptak, så som lipidanaloger, kan konjugeres direkte eller via en linker i 2'-stillmgen av et hvilket som helst nukleosid eller i 3'- eller 5'-stillingen av henholdsvis det 3'-terminale eller 5'-terminale nukleosid. Ett eller flere slike konjugater kan benyttes. Oligonukleotider kan også ha sukkermimetika, så som cyklobutylgrupper, i stedet for pentofuranosylgruppen. Andre utførelsesformer kan omfatte minst én modifisert baseform eller «universell base», så som inosin, eller ha inkludert andre uvanlige baser som queosin og wybutosin, så vel som acetyl-, metyl-, tio- og lignende modifiserte former av adenin, cytidin, guanin, tymin og uridin, som ikke lett gjenkjennes av endogene endonukleaser. Oppfinnelsen tilveiebringer dessuten oligonukleotider som har skjelett-analoger så som fosfodiester, fosfortioat, fosforditioat, metylfosfonat, fosfor-amidat, alkylfosfotriester, sulfamat, 3'-tioacetal, metylen(metylimino), 3'-N-karbamat, morfolinokarbamat, chirale metylfosfonater, nukleotider med kortkjedede alkyl- eller cykloalkyl-intersukker-koblinger, korte kjeder av heteroatomholdige eller hetero-cykliske intersukker-(«skjelett») koblinger eller CH2-NH-0-CH2, CH2-N(CH3)-OCH2, CH2-0-N(CH3)-CH2, CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2

og 0-N(CH3)-CH2-CH2- skjeletter (hvor fosfodiesteren er 0-P-0-CH2), eller blandinger av disse. Anvendelige er også oligonukleotider som har morfolinskjelettstrukturer (US patent 5.034.506).

Nyttige referanser er bl.a. Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, redigert av F. Eckstein, IRL Press Oxford University Press (1991); Antisense Strategies, Aannals of the New York Academy of Sciences, Bd. 600, red. Baserga & Denhardt (NYAS 1992); Milligan et al, 9. juli, 1993, J. Med. Chem. 36(14):1923-1937; Antisense Research and Applications (1993, CRC Press) i sin helhet og særlig kapittel 15 av Sanghvi, med tittelen «Heterocyclic base modifications in nucleic acids and their applications in antisense oligonucleotides.» Antisense Therapeutics, red. Sudhir Agrawal (Humana Press, Totowa, New Jersey, 1996).

D. MERKING AV NUKLEINSYRER

Det er ofte gunstig å merke nukleinsyrene ifølge oppfinnelsen, for eksempel når hTRT eller andre oligonukleotider eller polynukleotider benyttes som nukleinsyreprober. Merkingene (se nedenfor) kan innføres på én av flere velkjente måter. I én utførelsesform merkes en ikke-amplifisert nukleinsyre (f.eks. mRNA, polyA mRNA, cDNA). Fremgangsmåter for fremstilling av merkede nukleinsyrer er velkjente for fagmannen og innbefatter for eksempel nick-translasjon, randomisert primermerking, endemerking (ved å benytte en kinase) og kjemisk konjugering (f.eks. fotobiotinylering) eller syntese. I en annen utførelsesform inkorporeres merkingen samtidig med et amplifiseringstrinn ved fremstillingen av nukleinsyreprøvene. Således vil f. eks. polymerasekjedereaksjon (PCR) eller en annen nukleinsyreamplifiserings-metode med merkede primere eller merkede nukleotider, gi et merket amplifikasjonsprodukt. I en annen utførelsesform inkorporerer transkripsjonsamplifikasjon ved bruk av et merket nukleotid (f.eks. fluoresceinmerket UTP og/eller CTP) en merking i de transkriberte nukleinsyrene. Et amplifikasjonsprodukt kan også, eller alternativt, merkes etter at amplifiseringen er fullført.

E) ILLUSTRERENDE OLIGONUKLEOTIDER

Som angitt ovenfor og detaljert diskutert nedenfor, benyttes oligonukleotider til en rekke anvendelser, inklusivt som primere, prober, som terapeutiske eller andre antisense oligonukleotider, tripleksoligonukleotider og en rekke andre anvendelser som fremgår av denne beskrivelse. Tabell 2 angir enkelte illustrerende spesifikke oligonukleotider som kan benyttes for praktisering av oppfinnelsen. Det vil være klart at tallrike andre egnede oligonukleotider ifølge oppfinnelsen kan syntetiseres av fagmannen ved å følge de her angitte retningslinjer.

I Tabell 2 betyr «seq» at primeren har vært benyttet, eller er egnet for sekvensering; «PCR» betyr at primeren har vært benyttet, eller er egnet for PCR; «AS» betyr at primeren er blitt benyttet, eller er egnet for antisense-inhibering av telomeraseaktivitet; «CL» betyr at primeren er blitt benyttet, eller er egnet ved kloning av regioner av hTRT-gener eller RNA; «mut» betyr at primeren har vært benyttet, eller er egnet til konstruksjon av mutanter av hTRT-gener eller genprodukter. «UC» betyr «upper case» og «lc» betyr «lower case». Mistilpasninger og insersjoner (i forhold til SEKV. ID. NR:1) er angitt ved understreking; delesjoner er angitt ved en «-«. Det skal bemerkes at intet i Tabell 2 er ment å begrense anvendelsen av noe bestemt oligonukleotid til en enkelt anvendelse eller sett av anvendelser.

IV. TRT-PROTEINER OG PEPTIDER

A) GENERELT

Oppfinnelsen kan involvere anvendelse av et bredt utvalg av hTRT-proteiner som bl.a. egner seg for frembringelse av telomeraseaktivitet, inhibering av telomeraseaktivitet i en celle, induksjon av en anti-hTRT immunrespons, som et terapeutisk reagens, som en standard eller kontroll i en diagnostisk test, som mål under screening av forbindelser som er i stand til aktivering eller inhibering av en virkning av hTRT eller telomerase og en rekke andre anvendelser som fagmannen vil innse, eller som på annen måte er beskrevet her. hTRT ifølge oppfinnelsen innbefatter funksjonelt aktive proteiner (egnet for f.eks. å gi telomeraseaktivitet til en telomerasenegativ celle) og varianter, inaktive varianter (anvendelige for f.eks. inhibering av telomeraseaktivitet i en celle), hTRT-polypeptider og telomerase RNP (f.eks. ribonukleoprotein-komplekser som omfatter proteinene) som oppviser én, flere eller samtlige av de funksjonelle virkningene av naturlig forekommende hTRT og telomerase, slik som mer detaljert diskutert for illustrerende formål nedenfor.

I én utførelsesform er hTRT-proteinet som omfattes av blandinger ifølge oppfinnelsen et polypeptid som har en sekvens som angitt i Figur 17 (SEKV. ID. NR:2) eller et fragment derav. I en annen utførelsesform adskiller hTRT-polypeptidet seg fra SEKV. ID. NR:2 ved interne delesjoner, insersjoner eller konservative substitusjoner av aminosyrerester. I en beslektet utførelsesform involverer oppfinnelsen hTRT-polypeptider med tilnærmet likhet med SEKV. ID. NR:2. Oppfinnelsen involverer videre hTRT-polypeptider som er modifisert,

i forhold til aminosyresekvensene av SEKV. ED. NR:2 på en eller annen måte, f.eks. trunkert, mutert, derivatisert eller fusjonert til andre sekvenser (f.eks. for å danne et fusjonsprotein). Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer dessuten telomerase RNP som omfatter et hTRT-protein anvendelig ifølge oppfinnelsen kompleksert med et templat RNA (f.eks. hTR). I andre utførelsesformer er én eller flere telomerase-assosierte proteiner assosiert med hTRT-protein og/eller hTR.

Andre naturlig forekommende hTRT-arter eller ikke-naturlig forekommende varianter, inkluderer f.eks. proteiner som har sekvensen til eller er tilnærmet lik SEKV. ID. NR:5 [Figur 20], SEKV. ID. NR: 10 [Figur 19] og fragmenter, varianter eller derivater derav.

Et eksempel på en hTRT-variant kan være resultat av ribosom-rammeforskyvning av mRNA som kodes av klonen 712562 (SEKV. ID. NR:3 [Figur 18] eller pro90-varianten hTRT vist i SEKV. ED. NR:4 [Figur 20] og således resultere i syntese av hTRT-polypeptider som inneholder alle TRT-motivene (angående et generelt eksempel, se f.eks. Tsuchihashi et al., 1990, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 87:2516; Craigengen et al., 1987, Cell:50:l; Weiss, 1990, Cell 62:117. Ribosom-rammeforskyvning kan forekomme når bestemte mRNA-sekvenser eller sekundære strukturer forårsaker at ribosomet «steiler» og hopper et nukleotid forover eller bakover i sekvensen. En ribosom-rammeforskyvning i 712562 mRNA ville kunne forårsake syntese av et tilnærmet 523 aminosyreresters polypeptid. En ribosomrammeforskyvning av pro90-sekvensen ville kunne resultere i et protein med tilnærmet 1071 rester. Det vil være klart at proteiner som er resultat av ribosomrammeforskyvning også kan uttrykkes ved syntetiske eller rekombinante teknikker.

Humane TRT-proteiner, peptider og funksjonelt likeverdige proteiner, kan oppnås ved rensing, kjemisk syntese eller rekombinant produksjon som mer utførlig diskutert nedenfor.

B) TRT-PROTEINVIRKNINGER

TRT-polypeptidene anvendelige ifølge oppfinnelsen (inklusivt fragmenter, varianter, produkter av alternative alleler og fusjonsproteiner) kan ha én eller flere, eventuelt samtlige, funksjonelle virkninger assosiert med nativt hTRT. Med angitte unntak, ansees her et hTRT eller annet TRT-polypeptid å ha en spesifisert virkning dersom virkningen oppvises enten av hTRT-proteinet uten en assosiert RNA (f.eks. hTR) eller i et hTRT-assosiert RNA (f.eks. hTR) kompleks. Den hTR-bindende virkning av hTRT er et eksempel på en virkning assosiert med hTRT-proteinet. Fremgangsmåter for fremstilling av komplekser av nukleinsyrer (f.eks. hTR) og hTRT-polypeptidene ifølge oppfinnelsen er beskrevet nedenfor.

Modifikasjon av hTRT-proteinet (f.eks. ved kjemiske eller rekombinante midler, inklusivt mutasjon eller modifikasjon av et polynukleotid som koder for hTRT-polypeptidet, eller kjemisk syntese av et polynukleotid som har forskjellig sekvens fra en naturlig polynukleotidsekvens) for å oppnå et forskjellig utvalg av virkninger enn nativ hTRT, kan være nyttig for terapeutiske anvendelser eller ved screening med henblikk på spesifikke modulatorer av hTRT- eller telomerase-virkning. I tillegg kan tester for ulike hTRT-virkninger være særlig nyttige for identifisering av midler (f.eks. aktivitetsmodulerende midler) som gjr interaksjon med hTRT eller telomerase for å endre telomeraseaktivitet.

Virkningene av nativt hTRT, som omtalt nedenfor, innbefatter telomerase katalytisk aktivitet (som kan være enten prosesserende eller ikke-prosesserende); telomerase prosesserbarhet; konvensjonell revers transkriptaseaktivitet; nukleolytisk aktivitet; primer- eller substrat- (telomer eller syntetisk telomerasesubstrat eller primer) bindende aktivitet; dNTP-bindende aktivitet; RNA (dvs. hTR) bindende aktivitet og proteinbindende aktivitet (f.eks. binding til telomerase-assosierte proteiner, telomerbindende proteiner eller til et protein-telomert DNA-kompleks. Det er imidlertid klart at det også tilveiebringer hTRT-sammen-setninger uten noen særlig hTRT-aktivitet, men med en viss nyttig aktivitet i relasjon til hTRT- eller andre TRT-proteiner (f.eks. visse typisk korte immunogene peptider, inhiberende peptider).

1) TELOMERASE KATALYTISK AKTIVITET

Et polypeptid ifølge oppfinnelsen har her «telomerase katalytisk aktivitet» når polypeptidet er i stand til å forlenge en DNA-primer som virker som et telomerasesubstrat ved å addere en partiell, én eller flere enn én repetisjon av en sekvens (f.eks. TTAGGG) som kodes av en templat-nukleinsyre (f.eks. hTR). Denne aktiviteten kan være prosesserende eller ikke-prosesserende. Prosesserende aktivitet forekommer når en telomerase RNP adderer flere repetisjoner til en primer eller telomerase før DNA frigjøres av enzymkomplekset. Ikke-prosesserende aktivitet forekommer når telomerase adderer en partiell, eller bare én, repetisjon til en primer og så frigjøres, ln vivo ville imidlertid en ikke-prosesserende reaksjon kunne addere mange repetisjoner ved suksessive runder av assosiasjon, ekstensjon og dissosiasjon. Dette kan likeledes skje in vitro, men det er ingen typisk observasjon i standardtester som følge av det enormt store molare overskudd av primer i forhold til telomerase under standard testbetingelser.

For å karakterisere et hTRT-polypeptid som et med ikke-prosesserende aktivitet, foretas en konvensjonell telomerasereaksjon ved å benytte betingelser som favoriserer en ikke-prosesserende reaksjon, for eksempel høye temperaturer (dvs. 35-40°C, typisk 37°C), lave dGTP-konsentrasjoner (1 \ iM eller mindre), høye primerkonsentrasjoner (5 uM eller høyere) og høye dATP/TTP-konsentrasjoner (2 mM eller høyere), hvor temperaturen og dGTP i alminnelighet har den største effekt. For å karakterisere et hTRT-polypeptid som et som har prosesserende aktivitet, foretas en konvensjonell telomerasereaksjon ved å benytte betingelser som favoriserer en prosesserende reaksjon (for eksempel 27-34°C, typisk 30°C), høy dGTP-konsentrasjon (10 |iM eller høyere), lav primerkonsentrasjon (1 \ xM eller lavere), og/eller lave dATP og TTP-konsentrasjoner (0,3-1 mm), hvor temperatur og dGTP-konsentrasjon i alminnelighet er det mest avgjørende. Alternativt kan en TRAP-test (for prosesserende eller moderat prosesserende aktivitet) eller dot-blott og gel-blott-tester (for prosesserende aktivitet) benyttes. hTRT-polypeptidet ifølge oppfinnelsen kan ha en ikke-prosesserende aktivitet, men ikke en prosesserende aktivitet (f.eks. dersom en endring av hTRT-polypeptidet reduserer eller eliminerer evnen til translokasjon), kan være utelukkende prosesserende eller kan ha begge aktiviteter.

a) Ikke-prosesserende aktivitet

En ikke-prosesserende telomerase katalytisk aktivitet kan forlenge DNA-primeren fra

den posisjon hvor 3'-enden hybridiserer til RNA-templatet til templatsekvensens 5<*->ende med typisk terminering gjennom addisjonen av den første G-rest (som for eksempel når templatet er hTR). Som vist i Tabell 3 avhenger det nøyaktige antall adderte nukleotider av posisjonen av det 3<*->terminale nukleotid til primeren i TTAGGG-repetisjonssekvensen.

Det adderes således 4 nukleotider til — TTAGGG-primer (i) mens 6 nukleotider adderes til —TTAG-primeren (ii). Den første repetisjon addert av telomerase i enprosesserende reaksjon er likeverdig med dette trinn, men i en prosesserende reaksjon foretar telomerase et translokaliseringstrinn, hvor 3'-enden frigjøres og bindes igjen ved templatets 3'-region i en posisjon som er tilstrekkelig til å prime addisjon av en annen repetisjon (se Monn, 1997, Eur. J. Cancer 33:750).

En fullstendig ikke-prosesserende reaksjon produserer i en konvensjonell test, bare ett bånd under bruk av en enkelt syntetisk primer. Siden dette resultat også vil kunne produseres av andre enzymer, så som terminal transferaseaktivitet, kan det ved enkelte anvendelser være ønskelig å verifisere at produktet er et resultat av en telomerase katalytisk aktivitet. Et telomerase frembragt bånd (omfattende hTRT) adskiller seg ved flere ytterligere karakteristika. Antallet av nukleotider addert til enden av primeren må stemme overens med posisjonen av primerens 3'-ende. En —TTAGGG-primer bør få 4 nukleotider addert og en — TTAG-primer bør få 6 nukleotider addert (se ovenfor). I praksis kan det benyttes to eller flere sekvens-ombyttede primere som har den samme totallengde, men ulike 5'- og 3'-endepunkter. Som et illustrerende eksempel vil den ikke-prosesserende ekstensjon av primerne

5 '-TTAGGGTTAGGGTTAGGG og

5'-GTTAGGGTTAGGGTTAGG utvikle produkter hvis absolutte lengde vil være én nukleotid forskjellig (4 addert til 5'-TTAGGGTTAGGGTTAGGG for en 22 nt totallengde, og 5 addert til 5'-GTTAGGGTTAGGGTTAGG i en 23 nt totallengde). Reaksjonens nukleotid-avhengighet bør stemme overens med posisjonen av primerenden. Et —TTAGGG-primerprodukt skulle fordre dGTP, TTP og dATP, men ikke dCTP, og et -AGGGTT-primerprodukt skulle fordre dGTP og dATP, men ikke TTP eller dCTP. Aktiviteten skulle være følsom for RNAase eller mikrokokk-nuklease forbehandling (se Monn, 1989, Cell 59:521) under betingelser som vil nedbryte hTR og således eliminere templatet.

b) Prosesserende aktivitet

I praksis observeres en prosesserende aktivitet lett gjennom tilsynekomsten av en 6

nukleotiders stige i en konvensjonell test, TRAP-test eller gel-blott-test. En dot-blott-test kan også benyttes, men ved en slik metode påvises ingen stige. Den konvensjonelle test er beskrevet i Morin, 1989, Cell 59:521, som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse. TRAP-testen er beskrevet i US-patent 5.629.154; se også PCT

publikasjon WO 97/15687, PCT publikasjon WO 95/13381; Krupp et al, Nucleic Acids Res., 1997,25:919; og Wright et al, 1995, Nuc. Acids Res. 23:3794, som alle herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse. Dot-blott-testen kan benyttes i et format hvor en ikke-prosesserende aktivitet som ikke adderer de tre eller flere repetisjoner som fordres for stabil hybridisering av (CCCUAA)n proben benyttet for å påvise aktiviteten, testes med forbindelser eller hTRT-varianter for å bestemme hvorvidt den samme utvikler prosesserbarhet, dvs. dersom proben påviser et forventet telomerasesubstrat da er forbindelsen eller mutanten i stand til å endre den ikke-prosesserende aktivitet til en prosesserende aktivitet. Andre tester for prosesserende telomerase katalytisk aktivitet kan også benyttes, f.eks. «stretch» PCR-testen til Tatematsu et al, 1996, Oncogene 13:2265. Gel-blott-testen, en kombinasjon av den konvensjonelle og dot-blott-testen, kan også benyttes. I denne variant foretas en konvensjonell test uten noe radioaktivt merket nukleotid og med høye dGTP-

konsentrasjoner (f.eks. 0,1-2 mM). Etter gjennomføring av den konvensjonelle test fraskilles den syntetiserte DNA ved denaturerende PAGE og overføres til en membran (f.eks. nitrocellulose). Telomer DNA (produktet av telomerase - en forlenget telomeraseprimer eller substrat) kan deretter påvises ved slike metoder som hybridisering, ved å benytte merkede telomere DNA-prober (f.eks. prober inneholdende CCCTAA-sekvensen benyttet i dot-blott-testen ovenfor). En fordel ved denne teknikk er at den er mer følsom enn den konvensjonelle test og gir informasjon om størrelsen av de syntetiserte fragmentene og prosesserbarhet av reaksjonen.

c) Aktivitetsbestemmelser

Telomeraseaktiviteten av et hTRT-polypeptid kan bestemmes ved å benytte et urenset,

delvis renset eller tilnærmet renset hTRT-polypeptid (f.eks. i assosiasjon med hTR) in vitro eller etter ekspresjon, in vivo. For eksempel kan telomerase-aktivitet i en celle (f.eks. en celle som uttrykker et rekombinant hTRT-polypeptid ifølge oppfinnelsen) testes ved å påvise en økning eller minskning i telomerlengden. Typiske tester for telomerase katalytisk aktivitet foretas ved å benytte et hTRT kompleksert med hTR. Alternative telomerasetemplat RNA kan imidlertid substitueres, eller man kan foreta tester for å måle en annen aktivitet, så som telomeraseprimerbinding. Tester for å bestemme lengden av telomerer er kjent på området og inkluderer hybridisering av prober til telomer DNA (et amplifikasjonstrinn kan inkluderes) og TRF-analyse, dvs. analyse av telomere DNA-restriksjonsfragmenter [TRF] etter restriksjons-endonuklease-kutting, se PCT publikasjon WO 93/23572 og WO 96/41016; Counter et al., 1992, EMBO J 11:1921; Allsopp et al., 1992, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 89:10114; Sanno, 1996, Am. J. Clin. Pathol. 106:16 og Sanno, 1997, Neuroendocrinology 65:299.

Den telomerase katalytiske aktivitet av et hTRT-polypeptid kan bestemmes på en rekke måter ved å benytte testene ovenfor og andre telomerase katalytiske aktivitetstester. I henhold til én metode uttrykkes hTRT-proteinet (f.eks. som beskrevet nedenfor) i en telomerasenegativ humancelle, hvor hTR uttrykkes (dvs. enten normalt i cellen eller gjennom rekombinant ekspresjon), og nærvær eller ikke av telomeraseaktivitet i cellen eller cellelysatet bestemmes. Eksempler på egnede telomerasenegative celler er IMR 90 (ATCC, nr. CCL-186) eller BJ-celler (human forhud-fibroblastlinje; se f.eks. Feng et al, 1995, Science 269:1236). Andre eksempler inkluderer RPE- (retinal pigmented epithelial) celler, humane navlestrengs endotelceller (HUVEC; ATCC nr. CRL-1730), humane aorta endotelceller (HAEC; Clonetics Corp. nr. CC-2535) og humane mammaepitelceller (HME; Hammond et al, 1984, Proe. Nati. Acad. Sei., USA 81:5435; Stampfer, 1985, J. Tissue Culture Methods 9:107). I en alternativ utførelsesform uttrykkes hTRT-polypeptidet i en telomerase-positiv celle (f.eks. ved transfeksjon med en hTRT-ekspresjonsvektor), og en økning i telomeraseaktivitet i cellen sammenlignet med en utransfektert kontrollcelle påvises dersom polypeptidet har telomerase katalytisk aktivitet. Vanligvis vil den telomerase katalytiske aktivitet i en celle transfektert med en egnet ekspresjonsvektor som uttrykker hTRT være signifikant øket, så som minst ca. 2 ganger, minst ca. 5 ganger eller endog minst ca. 10 ganger til 100 ganger eller endog 1000 ganger høyere enn i utransfekterte (kontroll) celler.

hTRT-proteinet kan alternativt uttrykkes i en celle (f.eks. en telomerasenegativ celle

hvor hTR uttrykkes) som et fusjonsprotein (se nedenfor) som har en merking eller en «epitopmerking» som hjelp ved rensing. RNP kan gjenvinnes fra cellen ved å benytte et antistoff som spesifikt gjenkjenner merkingen. Foretrukne merkinger er i alminnnelighet korte eller små og kan innbefatte et spaltningssete eller en annen evne som gjør det mulig å fjerne merkingen fra hTRT-polypeptidet. Eksempler på egnede merkinger er bl.a. Xpress™ epitopen (Invitrogen, Inc. San Diego CA) og andre deler som kan bindes spesifikt av et antistoff eller en nukleinsyre, eller en annen tilsvarende metode som beskrevet i Eksempel 6. Alternative merkinger innbefatter de som kodes av innskutte sekvenser, f.eks. innskutt i SEKV. ID. NR:1 oppstrøms for det ATG-kodon som initierer translasjon av proteinet med SEKV. ID. NR:2, som kan innbefatte innføring av et (nytt) metionin-initieringskodon i oppstrømssekvensen.

Når en hTRT-variant uttrykkes i en celle (f.eks. som et fusjonsprotein) og deretter

isoleres (f.eks. som et ribonukleo-proteinkompleks) kan andre celleproteiner (dvs. telomerase-assosierte proteiner) assosieres med (direkte eller indirekte bundet til) det isolerte kompleks. I slike tilfeller vil det iblant være ønskelig å bestemme telomeraseaktivitet for komplekset som inneholder hTRT, hTR og de assosierte proteinene.

2) ANDRE TELOMERASE ELLER TRT-PROTEINVIRKNINGER

hTRT-polypeptidene ifølge oppfinnelsen innbefatter varianter som mangler telomerase katalytisk aktivitet, men bibeholder én eller flere andre telomeraseaktiviteter. Disse andre aktivitetene og fremgangsmåtene for måling av slike aktiviteter innbefatter (men er ikke begrenset til) de som omtales i de etterfølgende avsnitt.

a) Konvensjonell revers transkriptaseaktivitet

Telomerase konvensjonell revers transkriptaseaktivitet er beskrevet i f.eks. Morin,

1997, supra og Spence et al., 1995, Science 267:988. Siden hTRT inneholder konserverte aminosyremotiver som fordres for revers transkriptase katalytisk aktivitet, har hTRT evne til å transkribere visse eksogene (f.eks. non-hTR) RNA. En konvensjonell RT-test måler enzymets evne til å transkribere en RNA-templat ved å forlenge en hybridisert DNA-primer. Revers transkriptaseaktivitet kan måles på en rekke kjente måter, for eksempel ved å overvåke størrelsesøkningen av en merket nukleinsyreprimer (f.eks. RNA eller DNA) eller ved inkorporering av et merket dNTP. Se f.eks. Ausubel et al., supra.

Siden hTRT assosieres spesifikt med hTR, vil det være klart at DNA-primer/RNA-templatet for en konvensjonell RT-test kan modifiseres til å ha karakteristika relatert til hTR og/eller telomer DNA-primer. For eksempel kan RNA ha sekvensen (CCCTAA)n, hvor n er minst 1, eller minst 3, eller minst 10, eller mer. I én utførelsesform er (CCCTAA),, regionen ved eller nær 5'-enden av RNA (tilsvarende 5'-lokaliseringen av templatregioner i telomerase RNA). På lignende måte kan DNA-primeren ha en 3'-ende som inneholder deler av TTAGGG-telomersekvensen, for eksempel XnTTAG, XnAGGG, Xn(TTAGGG)qTTAG, etc, hvor X er en ikke-telomer sekvens og n er 8-20, eller 6-30, og q er 1-4.1 en annen utførelsesform har DNA-primeren en 5'-ende som ikke er komplementær til RNA-templatet, slik at når primeren hybridiseres til RNA forblir 5'-enden av primeren ubundet. Ytterligere modifikasjoner av standard revers transkripsjonstester som kan anvendes for fremgangsmåten er kjent på området.

b) Nukleolytisk aktivitet

Telomerase nukleolytisk aktivitet er beskrevet i f.eks. Morin, 1997, supra; Collins &

Grieder, 1993, Genes and Development 7:1364. Telomerase har en nukleolytisk aktivitet (Joyce & Steitz, 1987, Trends Biochem. Sei. 12:288); mens telomeraseaktivitet har definerende karakteristika. Telomerase fjerner fortrinnsvis nukleotider, vanligvis bare ett, fra 3'-enden av et oligonukleotid når 3'-enden av DNA er anbragt ved 5'-grensen av DNA-templatsekvensen; hos mennesker og i Tetrahymena, er dette nukleotid den første G av den telomere repetisjon (TTAGG i mennesker). Telomerase fjerner fortrinnsvis G-rester, men har nukleolytisk aktivitet overfor andre nukleotider. Denne aktivitet kan overvåkes. Det er her som illustrasjon beskrevet to metoder. Den ene metode involverer en konvensjonell telomerasereaksjon med en primer som binder hele templatsekvensen (dvs. terminering ved templatgrensen; 5'-TAGGGATTAG hos mennesker). Nukleolytisk aktivitet iakttas ved å overvåke erstatningen av den siste dG-rest med en radioaktivt merket dGTP tilsatt i testen. Erstatningen overvåkes ved tilsynekomsten av et bånd på setet for utgangsprimeren, som vist ved gelelektroforese og autoradiografi.

En foretrukket metode gjør bruk av en DNA-primer som har en «blokkert» 3'-ende som ikke kan forlenges av telomerase. Den 3'-blokkerte primer kan benyttes i en standard-telomerasetest, men vil ikke bli forlenget med mindre 3'-nukleotidet fjernes av telomerasens nukleolytiske aktivitet. Fordelen med denne metode er at telomeraseaktiviteten kan overvåkes av én av flere standardmetoder og at signalet er sterkt og lett å kvantifisere. Blokkeringen av 3'-enden av primeren kan oppnås på flere måter. En metode er addisjonen av en 3'-deoksy-dNTP-rest til primerens 3'-ende ved å benytte standardteknikker for oligonukleotidsyntese. Denne terminalen har en 2' OH, men ikke den 3' OH som fordres for telomerase. Det finnes også andre måter å blokkere 3'-terminalen på, for eksempel en 3'-dideoksy-ende, en 3'-amin-ende og andre. Et eksempel på en primer for en hTRT-nukleolytisk test er 5'-TT AGGGTT AGGGTT A (G3-h), hvor den siste resten angir en 3'-deoksy-guanosinrest (Glen Research, Sterling, VA). Mange andre variasjoner av en egnet primer på basis av beskrivelsen er kjent for fagmannen.

c) Primer (telomer) bindingsaktivitet

Telomeraseprimer (telomer) bindingskativitet er beskrevet i f.eks. Morin, 1997, supra;

Collins et al, 1995, Cell, 81:677; Harrington et al, 1995, J. Biol. Chem. 270:8893. Telomerase antas å ha to seter som binder en telomer DNA-primer. RT-motivene assosiert med primerbinding indikerer at hTRT og/eller hTRT/hTR har DNA-primerbindingsaktivitet. Det finnes flere måter å måle primerbindingsaktivitet på. Et trinn som er vanlig for de fleste metoder er imidlertid inkubering av en merket DNA-primer med hTRT eller hTRT/hTR eller andre TRT/TR-kombinasjoner under passende bindingsbetingelser. De fleste metoder anvender også en måte å separere ubundet DNA fra proteinbundet DNA, og slike metoder innbefatter de følgende: i) Gelforskyvningstester (også betegnet elektroforetisk/mobilitetsforskyvnings-tester) er slike hvor ubundet DNA-primer separeres fra proteinbundet DNA-primer ved elektroforese på en ikke-denaturerende gel (Ausubel et al, supra).

ii) Matriks-bindingstester innbefatter flere variasjoner av den grunnleggende teknikk som involverer binding av hTRT eller hTRT/hTR-kompleks til en matriks (f.eks. nitrocellulose) enten før eller etter inkubering med den merkede primer. Ved binding av hTRT til en matriks, kan den ubundne primer mekanisk skilles fra bundet primer. Gjenværende ubundet DNA kan fjernes ved å vaske membranen før kvantifiseringen. Fagmannen vil være kjent med at det er flere måter å koble proteiner til slike matrikser, faste bærere og membraner på, inklusivt kjemiske, fotokjemiske, UV-kryssbindende, antistoff/epitop og ikke-kovalente (hydrofob, elektrostatisk, etc.) interaksjoner.

DNA-primeren kan være en hvilken som helst DNA med en affinitet for telomerase, som for eksempel en telomer DNA-primer som (TTAGGG)„, hvor n kan være 1-10 og typisk utgjør 3-5. 3'- og 5'-terminalene kan ende i en hvilken som helst lokalisering i repetisjonssekvensen. Primeren kan også ha 5'- eller 3'-forlengelser av ikke-telomer DNA som letter merking eller påvisning. Primeren kan også derivatiseres, f.eks. for å lette påvisning eller isolering.

d) dNTP-bindingsaktivitet

Telomerase dNTP-bindingsaktivitet er beskrevet i. f.eks. Morin, 1997, supra, Spence

et al., supra. Telomerase fordrer dNTP for å syntetisere DNA. hTRT-proteinet har en nukleotid-bindingsaktivitet og kan testes for dNTP-binding på en lignende måte som andre nukleotid-bindende proteiner (Kantrowitz et al., 1980, Trends Biochem. Sei. 5:124). Typisk kan binding av en merket dNTP eller dNTP-analog overvåkes slik som kjent for ikke-telomerase RT-proteiner.

e) RNA (dvs. hTR) bindingsaktivitet

Telomerase RNA (dvs. hTR) bindingsaktivitet er beskrevet i f.eks. Morin, 1997,

supra; Harrington et al, 1997, Science 275:973; Collins et al, 1995, Cell 81:677. RNA-bindingsaktiviteten av et TRT-protein kan måles på en lignende måte som den ovenfor beskrevne DNA-primerbindingstest ved å benytte en merket RNA-probe. Metoder for å separere bundet og ubundet RNA og for å påvise RNA, er velkjent på området og kan anvendes til aktivitetstestene på lignende måte som beskrevet for DNA-primerbindingstesten. RNA kan være full lengde hTR, fragmenter av hTR eller andre RNA som har vist seg å ha affinitet for telomerase eller hTRT. Se US-patent 5.583.016 og PCT publikasjon 96/40868.

3) TELOMERASEMOTIVER SOM MÅL

Som angitt ovenfor tilveiebringer foreliggende oppfinnelse i tillegg til rekombinant hTRT med et fullt utvalg (som beskrevet ovenfor) av aktiviteter, hTRT-polypeptider som har mindre enn det fulle utvalg av telomeraseaktiviteter av naturlig forekommende telomerase eller hTRT eller andre TRT-proteiner. I betraktning av det som her er beskrevet av RT og telomerase-spesifikke motiver av TRT, vil det være klart at endringer eller mutasjoner av konserverte aminosyrerester, så som de som finnes i motivsekvensene diskutert ovenfor, vil resultere i tap av aktivitetsmutanter som egner seg for terapeutiske anvendelser, medikament-screening og karakterisering og andre anvendelser. Som beskrevet i Eksempel 1 resulterte for eksempel delesjon av motiv B til og med D i RT-domenene av det endogene TRT-gen i S. pombe i haploide celler hvor telomeren progressivt ble forkortet til det punkt hvor hybridisering av en telomerprobe til telomere repetisjoner nesten ble upåviselige, noe som tyder på tap av telomerase katalytisk aktivitet. Tilsvarende kan endringer i WxGxS-setet av motiv E påvirke telomerase DNA-primerbinding eller funksjon. I tillegg kan endringer av aminosyrene i motivet A, B' og C, påvirke den katalytiske aktivitet av telomerase. Mutasjon av DD-motivet av hTRT kan signifikant redusere eller oppheve telomeraseaktivitet (se Eksempel 16).

C) SYNTESE AV hTRT OG ANDRE TRT-POLYPEPTIDER

Det tilveiebringes et utvalg av metoder for fremstilling av de hTRT- og andre TRT-polypeptider som her er omtalt. I de følgende avsnitt er kjemisk syntese og rekombinant ekspresjon av hTRT-proteiner, inklusivt fusjonsproteiner, beskrevet mer detaljert.

1) KJEMISK SYNTESE

Oppfinnelsen kan involvere hTRT-polypeptider syntetisert, helt eller delvis, ved å benytte velkjente generelle kjemiske metoder (se f.eks. Caruthers et al, 1980, Nucleic Acids Res. Symp. Ser., 215:223; og Horn et al, 1980, Nucleic Acids Res. Symp. Ser., 225-232). For eksempel kan peptidsyntese foretas ved å benytte forskjellige fastfaseteknikker (Roberge et al, 1995, Science 269:202), inklusivt automatisert syntese (f.eks. ved å benytte Perkin Eimer ABI431A peptidsyntese-maskinen, i overensstemmelse med produsentens anvisninger). Når proteinet ønskes i full lengde kan kortere polypeptider fusjoneres ved kondensasjon av aminoenden av ett molekyl med karboksylenden av det andre molekyl, for å danne en peptidbinding.

Det nylig syntetiserte peptid kan renses i det vesentlige for eksempel ved preparativ HPLC (high performance liquid chromatography) (f.eks. Creighton, Proteins, Structures And Molecular Principles, WH Freeman & Co. New York NY [1983]). Sammensetningen av de syntetiske peptidene (eller hvilke som helst andre peptider eller polypeptider) kan bekreftes ved aminosyreanalyse eller sekvensering (f.eks. Edman-nedbrytning; Creighton, supra). Viktig er det også at aminosyresekvensen av hTRT, eller en hvilken som helst del derav, kan endres under direkte syntese og/eller kombineres ved bruk av kjemiske metoder med sekvenser fra andre proteiner eller en hvilken som helst del derav eller for et hvilket som helst formål, for å produsere en polypeptidvariant.

2) REKOMBINANT EKSPRESJON AV hTRT OG ANDRE TRT-PROTEINER

Det tilveiebringes fremgangsmåter, reagenser, vektorer og celler egnet for ekspresjon av hTRT-polypeptider og nukleinsyrer ved å benytte in vitro (cellefrie), ex vivo eller in vivo (celle eller organisme-basert) rekombinante ekspresjonssystemer. I én utførelsesform omfatter ekspresjon av hTRT-proteinet eller et fragment derav, innføring av den kodende sekvens i en passende ekspresjonsvektor (dvs. en vektor som inneholder de nødvendige elementer for transkripsjon og translasjonen av den innskutte kodende sekvens som trengs for det anvendte ekspresjonssystem). Det tilveiebringes et polynukleotid som er tilnærmet sekvensidentisk med en hTRT-genkodende sekvens på minst 25 nukleotider og for mange anvendelser fortrinnsvis 50 til 100 nukleotider eller flere av disse hTRT cDNA eller gener ifølge oppfinnelsen, som operativt er koblet til en promoter for å danne en transkripsjons-enhet som er i stand til å uttrykke et hTRT-polypeptid. Metoder som er velkjent for fagmannen kan benyttes for å konstruere de ekspresjonsvektorene som inneholder en hTRT-sekvens og passende transkripsjons- eller translasjonskontroll (se f.eks. Sambrook et al., supra, Ausubel et ai, supra, og denne beskrivelse).

De hTRT-polypeptider som tilveiebringes inkluderer fusjonsproteiner som inneholder hTRT-polypeptider eller fragmenter av hTRT-proteinet. Fusjonsproteinene produseres i alminnelighet ved rekombinasjon, selv om de også kan fremstilles ved kjemisk syntese. Fusjonsproteiner kan være egnet til å gi forbedret ekspresjon av hTRT-polypeptid-konstruksjonene eller til produksjon av hTRT-polypeptider som har andre ønskelige egenskaper, for eksempel ved at de omfatter en merking (som f.eks. en enzymatisk rapportør-gruppe), en bindende gruppe eller antistoffepitop. Et eksempel på et fusjonsprotein, omfattende hTRT og forbedrede grønn-fluorescerende proteinsekvenser (EGFP) er beskrevet nedenfor i Eksempel 15. Det vil for fagmannen være klart at anvendelsen omtalt i eksempel 15 og forøvrig, ikke er begrenset til det bestemte fusjonsprotein, men tjener som illustrasjon for anvendelsene av ulike fusjonskonstruksjoner.

Fusjonsproteinsystemene kan også benyttes til å forenkle effektiv produksjon og isolering av hTRT-proteiner eller -peptider. I enkelte utførelsesformer omfatter for eksempel non-hTRT-sekvensdelen av fusjonsproteinet et kort peptid som kan bindés spesifikt til et immobilisert molekyl slik at fusjonsproteinet kan adskilles fra ubundne komponenter (så som ubeslektede proteiner i et cellelysat). Et eksempel er en peptidsekvens som er bundet av et spesifikt antistoff. Et annet eksempel er et peptid som omfatter polyhistidin-områder, f.eks.

(His)6 eller histidin-tryptofan-sekvenser som kan bindes av en harpiks som inneholder nikkel-eller kobber-ioner (dvs. metall/chelat-affinitetskromatografi). Andre eksempler omfatter protein A-domener eller fragmenter som muliggjør rensing på immobilisert immunglobulin, og domenet benyttet i FLAGS-ekstensjon/affinitets-rensesystemet (Immunex Corp. Seattle, WA). I enkelte utførelsesformer innbefatter fusjonsproteinet et spaltningssete slik at hTRT-eller en annen TRT-polypeptidsekvens lett kan skilles fra non- hTRT-peptid- eller proteinsekvensen. I så fall kan spaltningen skje kjemisk (f.eks. cyanogenbromid, 2-(2-nitrofenyl-sulfenyI)-3-metyl-3'-bromindolen, hydroksylamin, eller lav pH) eller enzymatisk (f.eks. Faktor Xa, enterokinase). Valget av fusjons- bg spaltningssystem kan tildels avhenge av den

del (dvs. sekvens) av hTRT-polypeptidet som uttrykkes. Fusjonsproteiner er generelt beskrevet i Ausubel et ai, supra, Kap. 16, Kroll et al., 1993, DNA Cell. Biol. 12:441 og i Invitrogen 1997, Katalogen (Invitrogen Inc., San Diego CA). Andre eksempler på fusjonsproteiner med epitopmerkinger og spalrningssteder er angitt nedenfor i Eksempel 6.

Det vil for fagmannen være klart at selv om de ekspresjonssystemer som er diskutert i dette avsnitt er fokusert på ekspresjon av hTRT-polypeptider, vil de samme eller lignende celler, vektorer og metoder, kunne benyttes for å uttrykke hTRT-polynukleotider, inklusivt sense og antisense polynukleotider, uten nødvendigvis noe ønske om produksjon av hTRT-polypeptider. Ekspresjon av et polypeptid fordrer i alminnelighet et passende initieringskodon (f.eks. metionin), en åpen leseramme og translasjonsregulerende signaler (f.eks. et ribosom-bindingssete, et termineringskodon) som kan utelates når det ikke ønskes translasjon av en nukleinsyresekvens for å produsere et protein.

Ekspresjon av hTRT-polypeptidene og polynukleotidene kan foretas for å oppnå én av flere beslektede fordeler. En illustrerende fordel er ekspresjon av hTRT-polypeptider som deretter isoleres fra cellen de er uttrykt i (for eksempel for produksjon av større mengder hTRT for bruk som vaksine eller i anvendelser til screening av forbindelser som modulerer telomeraseaktivitet). En annen illustrerende fordel er ekspresjon av hTRT i en celle for å endre cellens fenotype (som ved genterapeutiske anvendelser). Celler som ikke skriver seg fra pattedyr, kan benyttes for ekspresjon av hTRT for rensing, mens eukaryote, spesielt pattedyrceller (f.eks. humanceller) kan benyttes ikke bare til isolering og rensing av hTRT, men også til ekspresjon av hTRT når det er ønskelig med en fenotype-endring i en celle (f.eks. for å bevirke en endring i proliferativ evne, som ved genterapeutiske anvendelser). Som illustrasjon og uten begrensning, kan hTRT-polypeptider som har én eller flere telomeraseaktiviteter (f.eks. telomerase katalytisk aktivitet) uttrykkes i en vertscelle for å øke cellens proliferative evne (f.eks. immortalisere en celle) og omvendt, kan hTRT-antisense polynukleotider eller inhiberende polypeptider, i alminnelighet uttrykkes for å redusere cellens proliferative evne (f.eks. av en telomerase-positiv malign tumorcelle). En rekke spesifikke anvendelser er her beskrevet, f.eks. i omtalen nedenfor om anvendelser av oppfinnelsen for terapeutiske formål.

Illustrerende nyttige ekspresjonssystemer (celler, regulatorelementer, vektorer og ekspresjon) for foreliggende oppfinnelse innbefatter en rekke cellefrie systemer, som f.eks. reticulocytt-lysat og hvetekim-systemer som gjør bruk av hTRT-polynukleotider i henhold til velkjente generelle metoder (se f.eks. Ausubel et al, supra, i Kap. 10). Ifølge alternative utførelsesformer tilveiebringer oppfinnelsen reagenser og fremgangsmåter for å uttrykke hTRT i prokaryote eller eukaryote celler. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således nukleinsyrer som koder for hTRT-polynukleotider, proteiner, protein-subsekvenser eller fusjonsproteiner som kan uttrykkes i bakterier, sopp, planter, insekter og dyr, inklusivt kjente humancelle-ekspresjonssystemer, herunder isolerte celler, cellelinjer, cellekulturer, vev og hele organismer. Som fagmannen vil forstå vil hTRT-polynukleotider som er innført i en vertscelle eller et cellefritt ekspresjonssystem, vanligvis være operativt koblet til passende ekspresjonskontrollsekvenser for hver vert eller cellefritt system.

Nyttige bakterielle ekspresjonssystemer omfatter E. coli, bacilli (så som Bacillus subtilus), andre Enterobacteriaceae (som Salmonella, Serratia og forskjellige Pseudomonas arter) eller andre bakterieverter (f.eks. Streplococcus cremoris, Streptococcus lactis, Streptococcus thermophilus, Leuconostoc citrovorum, Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus lactis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve og Bifidobacterium longum). De hTRT-ekspresjonskonstruksj onene som egner seg i prokaryoter innbefatter rekombinante bakteriofag-, plasmid- eller cosmid-DNA-ekspresjonsvektorer eller lignende og omfatter i alminnelighet promotersekvenser. Illustrerende promotere er bl.a. induserbare promotere, som f.eks. /ac-promoteren,

hybrid /acZ-promoteren for Bluescript7 fagemid [Stratagene, La Jolla CA] eller pSportl [Gibco BRL]; fag lambda promotersystemer; et tryptofan (trp) promotersystem samt ptrp-lac-hybrider og lignende. Bakterielle ekspresjonskonstruksjoner innbefatter eventuelt regulerende sekvenser for et ribosom-bindingssete og transkripsjonstermineringssignal. Illustrerende eksempler på spesifikke vektorer egnet for ekspresjon, omfatter for eksempel pTrcHis2, (Invitrogen, San Diego, CA), pThioHis A, B & C og en lang rekke andre som er kjent på området eller kan utvikles (se f.eks. Ausubel). Egnede vektorer for bakterier er bl.a. de som

forenkler produksjonen av hTRT-fusjonsproteiner. Egnede vektorer for høynivåekspresjon av fusjonsproteiner i bakterieceller, innbefatter, men er ikke begrenset til, de multifunksjonelle E. coli klonings- og ekspresjonsvektorer som f.eks. Bluescript7 (Stratagene), nevnt ovenfor, hvor sekvensen som koder for hTRT-protein, et hTRT-fusjonsprotein eller et hTRT-fragment, kan ligeres inn i vektoren i ramme med sekvenser for det aminoterminale Met og de etterfølgende 7 rester av p-galaktosidase slik at det dannes et hybridprotein (f.eks. pEN-vektorer; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 264:5503). Vektorer så som pGEX-vektorer (f.eks. pGEX-2TK; Pharmacia Biotech) kan også benyttes for å uttrykke fremmede polypeptider, som f.eks. hTRT-protein, som fusjonsproteiner med glutation-S-transferase (GST). Slike fusjonsproteiner kan renses fra lyserte celler ved adsorpsjon til glutation-agarosekuler og påfølgende eluering i nærvær av fritt glutation. Proteiner fremstillet i slike systemer innbefatter ofte enterokinase-, trombin- eller Faktor Xa-protease-spaltningsseter, slik at det aktuelle klonede polypeptid kan frigjøres fra GST-delen etter ønske, hvilket kan være nyttig ved rensing eller andre anvendelser. Andre eksempler er fusjonsproteiner som omfatter hTRT og det E. coli maltosebindende protein (MBP) eller E. coli thioredoxin. Illustrerende eksempler på hTRT-ekspresjonskonstruksjoner som er nyttige i bakterielle celler er gitt i Eksempel 6 nedenfor.

Det beskrives dessuten hTRT-polypeptider uttrykt i soppsystemer, så som Dictyostelium, og fortrinnsvis gjær, så som Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Torulopsis holmil, Saccharomyces fragilis, Saccharomyces lactis, Hansenula polymorpha og Candida pseudotropicalis. Når hTRT uttrykkes i gjær foreligger en rekke egnede vektorer, inklusivt plasmid og kunstige gjærkromosom- (YAC) vektorer. Vektorene omfatter i alminnelighet ekspresjonskontrollsekvenser, så som konstitutive eller induserbare promotere (f.eks. alfafaktor, alkoholoksydase, PGH og 3-fosfoglyceratkinase eller andre glykolytiske enzymer) og et replikasjonsorigo, termineringssekvenser og lignende. Egnede vektorer for bruk i Pichia er bl.a. pPICZ, His6/pPICZB, pPICZalpha, PPIC3.5K, pPIC9K, pA0815, pGAP2A, B & C, pGAP2alpha, A, B og C (Invitrogen, San Diego, CA) og en rekke andre vektorer som er kjent eller under utvikling. I én utførelsesform benyttes vektoren His6/pPICZB (Invitrogen, San Diego, CA) for å uttrykke et His6-hTRT-fusjonsprotein i gjæren Pichia pastoris. Et eksempel på en vektor som egner seg i Saccharomyces er pYES2 (Invitrogen, San Diego, CA). Illustrerende eksempler på hTRT-ekspresjonskonstruksjoner som er anvendelige i gjær, er gitt i Eksempel 6 nedenfor.

hTRT-polypeptidene kan også uttrykkes i plantecelle-systemer transfektert med plante-eller plantevirus-ekspresjonsvektorer (f.eks. blomkålmosaikkvirus, CaMV; tobakkmosaikk-virus (TMV) eller transformert med bakterielle ekspresjonsvektorer (f.eks. Ti eller pBR322 plasmid). I tilfeller hvor plantevirusekspresjonsvektorer benyttes kan ekspresjonen av en hTRT-kodende sekvens styres av én av flere promotere. For eksempel kan viruspromotere så som 35S og I9S promotere av CaMV (Brisson et al, 1984, Nature 310:511-514) benyttes for seg eller i kombinasjon med omega-ledersekvensen fra TMV (Takamatsu et al, 1987, EMBO J, 6:307-311). Alternativt kan det benyttes plantepromotere som f.eks. fra det lille subenhets-genet av RUBISCO (Coruzzi et al, 1984, EMBO J., 3:1671-1680; Broglie et al, 1984, Science 224:838-843) eller varmesjokk-promotere (Winter & Sinibaldi, 1991, Results Probl. Cell Differ., 17:85) eller lagringsprotein-genpromotere. Disse konstruksjonene kan innføres i planteceller ved direkte DNA-transformasjon eller patogen-mediert transfeksjon (angående oversikter over slike teknikker, se Hobbs eller Murry, 1992, i McGRAW HILL YEARBOOK OF SCIENCE AND TECHNOLOGY McGRAW HILL NEW YORK NY, s. 191-196 [1992]; eller Weissbach & Weissbach, 1988, METHODS FOR PLANT MOLECULAR BIOLOGY, Academic Press, New York, NY, s. 421-463).

Et annet ekspresjonssystem tilveiebragt av oppfinnelsen for ekspresjon av hTRT-protein, er et insektsystem. Et foretrukket system gjør bruk av en baculovirus polyhedrin-promoter. I ett slikt system benyttes Autographa californica nukleært polyhedrosevirus (AcNPV) som vektor for å uttrykke fremmede egner i Spodoptera frugiperda celler eller i TrichoplusiaAarver. Sekvensen som koder for det aktuelle gen kan klones inn i en ikke-essensiell region i viruset, så som polyhedringenet, og anbringes under kontroll av polyhedrin-promoteren. Vellykket innføring av sekvensen, f.eks. ved koding av hTRT-proteinet, vil gjøre polyhedrin-genet inaktivt og produsere rekombinante virus som mangler kappeprotein. De rekombinante virus benyttes deretter til å infisere S. frugiperda- celler eller Trichoplusia- lsrver som hTRT-sekvensen deretter uttrykkes i (angående generelle metoder, se Smith et al, J. Virpl., 46:584 [1983]; Engelhard et al, Proe. Nati. Acad. Sei. 91:3224-7 [1994]). Egnede vektorer for baculovirusekspresjon omfatter pBlueBacHis2 A, B & C, pBlueBac4.5, pMelBacB og en rekke andre vektorer som er kjent eller under utvikling. Illustrerende eksempler på hTRT-ekspresjonskonstruksjoner egnet i insektceller er angitt nedenfor i Eksempel 6.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også ekspresjonssystemer i pattedyr og

pattedyrceller. Som nevnt ovenfor kan hTRT-polynukleotider uttrykkes i pattedyrceller (f.eks. menneskeceller) for produksjon av betydelige mengder hTRT-polypeptider (f.eks. for rensing) eller for å endre en målcelles fenotype (f.eks. for genterapeutiske formål, celleimmortalisering eller annet). I sistnevnte tilfelle kan det uttrykte hTRT-polynukleotid eventuelt kode for et polypeptid med en telomerase katalytisk aktivitet. Det vil si ekspresjonen kan være av et sense eller antisense polynukleotid, et inhibitorisk eller stimulatorisk polypeptid, et polypeptid med null, én eller flere telomeraseaktiviteter, samt andre kombinasjoner og varianter som her er beskrevet eller er åpenbare for fagmannen.

Passende vevskulturceller fra pattedyrverter for ekspresjon av nukleinsyrene ifølge oppfinnelsen, er en hvilken som helst normal dødelig eller normal eller unormal udødelig dyre- eller menneskecelle, inklusivt: apenyre, CV1-linje transformert med SV40 (COS-7, ATCC CRL1651); human embryonisk nyre-linje (293; Graham et al, J. Gen. Virol. 36:59

(1977)); baby-hamster nyreceller (BHK, ATCC CCL 10); CHO (ATCC CCL 61 og CRL 9618); muse Sertoli-celler (TM4, Mather. Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); apenyre-celler (CV1 ATCC CCL 70); Afrikansk grønnapenyreceller (VERO-76, ATCC CRL 1587); humane cervikale karsinomceller (HeLa, ATCC CCL 2); hundenyreceller (MDCK, ATCC CCL 34); buffalo-rotteleverceller (BRL 3A, ATCC CRL 1442); humane lungeceller (W138, ATCC CCL 75); humane leverceller (Hep G2, HB 8065); mus mammatumor (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI-celler (Mather et al, Annals N.Y. Sei. 383:44-46

(1982); MDCK-celler (ATCC CCL 34 og CRL 6253); HEK 293-celler (ATCC CRL 1573); og WI-38-celler (ATCC CCL 75; ATCC: American Type Culture Collection, Rockville, MD). Anvendelsen av vevscellekulturer fra pattedyr for å uttrykke polypeptider er generelt omtalt av Winnacker, FROM GENES TO CLONES (VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987).

For pattedyr-vertsceller tilveiebringes virus-baserte og ikke-virale ekspresjonssystemer. Ucke-virale vektorer og systemer innbefatter plasmider og episomale vektorer, typisk med en ekspresjonskassett for å uttrykke et protein eller RNA, og kunstige humane kromosomer (se f.eks. Harrington et al, 1997, Nat. Genet 15:345). For eksempel innbefatter ikke-virale vektorer som egner seg for ekspresjon av hTRT-polynukleotider og polypeptider i pattedyr, celler (f.eks. humane) pcDNA3. l/His, pEBVHis A, B & C, (Invitrogen, San Diego, CA), MPSV-vektorer, andre beskrevet i Invitrogen 1997 katalogen (Invitrogen Inc., San Diego, CA), som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse, og en rekke andre kjent innen proteinområdet. Illustrative eksempler på hTRT-ekspresjonskonstruksjoner som egner seg i pattedyrceller er angitt nedenfor i Eksempel 6.

Anvendelige virale vektorer omfatter vektorer basert på retrovirus, adenovirus, adeno-assosierte virus, herpesvirus, vektorer basert på SV40, papillomavirus, HBP Epstein Barr-virus, vacciniavirusvektorer og Semliki Forest-virus (SFV). SFV og vacciniavektorer er generelt omtalt av Ausubel et al, supra, Kap. 16. Disse vektorene utgjøres ofte av to komponenter, et modifisert viralt genom og en kappestruktur som omgir det (se generelt Smith, 1995, Annu. Rev. Microbiol. 49:807), men iblant innføres virusvektorer i naken form eller dekket med andre proteiner enn virale proteiner. Den virale nukleinsyre i en vektor kan imidlertid endres på mange måter, for eksempel når den er utviklet for genterapi. Målet med disse endringene er å forhindre vekst av viruset i målceller under opprettholdelse av dets evne til å vokse i vektorform i tilgjengelige pakke- eller hjelperceller, gi rom innen for det virale genom for innføring av eksogene DNA-sekvenser og inkorporere nye sekvenser som koder for og muliggjør riktig ekspresjon av det aktuelle gen. Vektor-nukleinsyrer omfatter således i alminnelighet to komponenter: vesentlig cis-virkende virale sekvenser for replikasjon og pakking i en hjelperlinje og transkripsjonsenheten for det eksogene gen. Andre virale funksjoner uttrykkes i trans i en spesifikk pakke- eller hjelpercellelinje. Adenovirale vektorer (f.eks. for bruk innen human genterapi) er beskrevet f.eks. i Rosenfeld et al., 1992, Cell 68:143; PCT publikasjon WO 94/12650; 94/12649; og 94/12629.1 de tilfeller hvor det benyttes et adenovirus som en ekspresjonsvektor, kan en sekvens som koder for hTRT ligeres inn i et adenovirus transkripsjons/translasjons-kompleks bestående av den sene promoter og den tredelte ledersekvens. Insersjon i en ikke-essensiell El- eller E3-region av det virale genom vil resultere i et levedyktig virus som er i stand til å uttrykke seg i infiserte vertsceller (Logan & Shenk, 1984, Proe. Nati. Acad. Sei., 81:3655). Replikasjonsdefekte retrovirale vektorer som rommer en terapeutisk polynukleotidsekvens som del av det retrovirale genom, er beskrevet i f.eks. Miller et al, 1990, Mol. Cell. Biol. 10:4239; Kolberg, 1992, J. NIH Res. 4:43; og Cornetta et al, 1991, Hum. Gene Ther. 2:215.

I pattedyrecellesystemer er det ofte riktig med promotere fra pattedyrgener eller fra pattedyrvirus. Egnede promotere kan være konstitutive, celletype-spesifikke, stadium-spesifikke og/eller modulerbare eller regulerbare (f.eks. av hormoner så som glukokortikoider). Egnede promotere innbefatter, men er ikke begrenset til, metallotionein-promoteren, den konstitutive adenovirus viktigste sene (major late) promoter, den dekametason-induserbare MMTV-promoter, SV40-promoteren, MRP poini-promoteren, den konstitutive MPSV-promoter, den tetracyklin-induserbare CMV-promoter (så som den humane umiddelbart-tidlige CMV-promoter), den konstitutive CMV-promoter, og promoter/enhancer-kombinasjoner kjent på området.

Andre regulatorelementer kan også fordres eller ønskes for effektiv ekspresjon av et hTRT-polynukleotid og/eller translasjon av en sekvens som koder for hTRT-proteiner. For translasjon innbefatter disse elementene i alminnelighet et ATG-initieirngskodon og tilstøtende ribosom-bindingssete eller andre sekvenser. Forutsatt at deres initieringskodon og oppstrøms promotersekvenser er innskutt i en ekspresjonsvektor, trengs det for sekvenser som koder for hTRT-proteinet ingen ytterligere translasjons- eller andre kontrollsignaler. I de tilfeller hvor det bare er innskutt kodingsseskvens eller en del derav, må det imidlertid ofte tilveiebringes eksogene transkripsjons- og/eller translasjonkontrollsignaler (f.eks. promoteren, ribosom-bindingssetet og ATG-initieirngskodon). Initieringskodonet må i alminnelighet være i den korrekte leseramme for å sikre translasjon av det ønskede protein. Eksogene transkripsjonselementer og initieringskodoner kan være av forskjellig opprinnelse, både naturlige og syntetiske. I tillegg kan ekspresjons-effektiviteten forbedres ved inklusjon av enhancere passende for cellesystemet som benyttes (Scharf et al., 1994, Results Probl. Cell Differ., 20:125; og Bittner et al, Meth. Enzymol., 153:516). For eksempel kan SV40-enhancer eller CMV-enhancer benyttes for å øke ekspresjonen i pattedyrs vertsceller.

Ekspresjon av hTRT-genprodukter kan også skje (økes) ved aktivering av en hTRT-promoter eller enhancer i en celle, som f.eks. en menneskecelle, f.eks. en telomerase-negativ cellelinje. Aktivering kan utføres på en rekke måter, inklusivt administrering av et eksogent promoter-aktiverende middel, eller inhibering av en cellekomponent som undertrykker ekspresjon av hTRT-genet. Omvendt vil det være klart at inhibering av promoter-funksjon, som beskrevet nedenfor, vil redusere hTRT-genekspresjon.

Oppfinnelsen tilveiebringer induserbar og repressiv ekspresjon av hTRT-polypeptider ved å benytte slike systemer som Ecdysone-Inducible Expression System (Invitrogen) og de Tet-On og Tet-Off tetracyklin-regulerte systemer fra Clontech. Det ecdyson-induserbare ekspresjonssystem anvender steroidhormon-ecdyson-analogen, muristeron A, for å aktivere ekspresjon av et rekombinant protein via en heterodimer nukleær reseptor (No et al, 1996, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 93:3346). I én utførelsesform av oppfinnelsen klones hTRT inn i pEND-vektoren (Clontech), som inneholder fem modifiserte ecdyson-responselementer (E/GRE) oppstrøms for en minimal varmesjokk-promoter og det multiple kloningssete. Konstruksjonen transfekteres deretter i cellelinjer som stabilt uttrykker ecdyson-reseptoren. Etter transfeksjon behandles cellene med muristeron A for å indusere intracellulær ekspresjon fra pIND. I en annen utførelsesform av oppfinnelsen uttrykkes hTRT-polypeptidet ved å benytte Tet-on og Tet-off ekspresjonssystemer (Clontech) for å gi regulert, høynivå genekspresjon (Gossen et al, 1992, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 89:5547; Gossen et al, 1995, Science 268:1766). hTRT-vektorene ifølge oppfinnelsen kan innføres i en celle, et vev, organ, en pasient eller et dyr, på en rekke forskjellige måter. Nukleinsyre-ekspresjonsvektorer (typisk dsDNA) ifølge oppfinnelsen kan overføres til den valgte vertscelle ved hjelp av velkjente metoder, så som kalsiumklorid-transformasjon (for bakteriesystemer), elektroporering, kalsiumfosfat-behandling, liposom-mediert transformasjon, injeksjon og mikroinjeksjon, ballistiske metoder, virosomer, immunliposomer, polykatiomnukleinsyre-konjugater, naken DNA, kunstige virioner, fusjoner til herpes virus-strukturproteinet VP22 (Elliot & 0'Hare, Cell 88:2232), agens-forsterket opptak av DNA og ex vivo transduksjon. Anvendelige liposom-medierte DNA overføringsmetoder er beskrevet i US-patent 5.049.386,4.946.787 og 4.897.355; PCT publikasjoner WO 91/17424, WO 91/16024; Wang & Huang, 1987, Biochem. Biophys. Res. Commun. 147:980; Wang & Huang, 1989, Biochemistry 28:9508; Litzinger & Huang, 1992, Biochem. Biophys. Acta 1113:201; Gao & Huang, 1991, Biochem. Biophys. Res. Commun., 179:280. Immunliposomer er blitt beskrevet som bærere av eksogene polynukleotider (Wang & Huang, 1987, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 84:7851; Trubetskoy et al, 1992, Biochem. Biophys. Acta 1131:311) og kan ha forbedret celletype-spesifisitet sammenlignet med liposomer som følge av inklusjonen av spesifikke antistoffer som antagelig binder til overflate-antigener på spesifikke celletyper. Behr et al, 1989, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 86:6982 rapporterer bruk av lipopolyamin som reagens for selv å mediere transfeksjon uten behov for noe ytterligere fosfolipid for å danne liposomer. Egnede avgivnings-metoder vil bli valgt av utøveren ut fra akseptert praksis og myndigheters krav (f.eks. for genterapi eller produksjon av cellelinjer for ekspresjon av rekombinante proteiner). Det vil være klart at avgivelsesmetodene som er nevnt ovenfor kan benyttes for overføring av nukleinsyrer inn i celler for genterapeutiske formål, overføring til vevskulturceller og lignende.

For langvarig produksjon av rekombinante proteiner i høyt utbytte, vil man ofte ønske stabil ekspresjon. For eksempel kan cellelinjer som stabilt uttrykker hTRT fremstilles ved å benytte ekspresjonsvektorer ifølge oppfinnelsen og som inneholder virale replikasjonsorigo eller endogene ekspresjonselementer og et selekterbart markørgen. Etter innføringen av vektoren kan cellene få vokse i 1 til 2 dager i et anriket medium før de flyttes over på selekterbare medier. Formålet med den selekterbare markør er å gi seleksjonsresistens, og dens tilstedeværelse tillater vekst av celler som uttrykker de innførte sekvenser i selektive medier. Resistente, stabilt transfekterte celler kan prolifereres ved å benytte vevskulturteknikker passende for celletypen. Et amplifiseringstrinn, f.eks. ved administrering av metyltrexat til celler transfektert med et DHFR-gen i henhold til velkjente metoder, kan inkluderes.

I tillegg kan en vertscellestamme velges ut fra dens evne til å modulere ekspresjonen av de innskutte sekvenser eller til å prosessere det uttrykte protein på ønsket måte. Slike modifikasjoner av polypeptidet innbefatter, men er ikke begrenset til, acetylering, karboksylering, fosforylering, lipiddannelse og acylering. Post-translasjonell prosessering kan også være viktig for korrekt insersjon, folding og/eller funksjon. Forskjellige vertsceller har cellulært maskineri og karakteristiske mekanismer som er spesifikke for hver celle for slike post-translasjonelle aktiviteter, og en bestemt celle kan således velges for å sikre den korrekte modifisering og prosessering av det innførte, fremmede protein.

Det beskrives også transgene dyr (dvs. pattedyr som er transgene for en human eller annen TRT-gensekvens) som uttrykker et hTRT- eller annet TRT-polynukleotid eller polypeptid. hTRT kan utskilles i melken til et transgent pattedyr, så som en transgen ku, geit eller kanin. Fremgangsmåter for produksjon av slike dyr finnes f.eks. hos Heynecker et al., PCT WO 91/08216. hTRT-proteinene og kompleksene ifølge oppfinnelsen, inklusivt de som er fremstillet ved å benytte de ovenfor omtalte ekspresjonssystemer, kan renses ved å benytte en rekke forskjellige kjente, generelle metoder. Etter kjemisk syntese, biologisk ekspresjon eller rensing, kan hTRT-proteinet ha en konformasjon som er forskjellig fra en nativ konformasjon av naturlig forekommende telomerase. I enkelte tilfeller kan det være fordelaktig, eller endog nødvendig, å denaturere polypeptidet (f.eks. inklusivt reduksjon av disulfid- eller andre bindinger) og deretter bevirke at polypeptidet omfoldes til den foretrukne konformasjon. Produktiv omfolding kan også fordre nærvær av hTR (eller hTR-fragmenter). Metoder for reduksjon og denaturering av proteiner og induksjon av omfolding er velkjent for fagmannen (se f.eks. Debinski et al., 1993, J. Biol. Chem., 268:14065; Kreitman & Pastan, 1993, Bioconjug. Chem., 4:581; og Buchner et al., 1992, Anal. Biochem., 205:263; og McCaman et al., 1985, J. Biotech. 2:177). Se også PCT publikasjon WO 96/40868, supra.

D) KOMPLEKSER AV HUMAN TRT OG HUMAN TELOMERASE RNA,

TELOMERASE-ASSOSIERTE PROTEINER OG ANDRE BIOMOLEKYLER PRODUSERT VED KOEKSPRESJON OG PÅ ANNEN MÅTE

hTRT-polypeptider ifølge oppfinnelsen kan in vivo og in vitro assosiere med andre biomolekyler, inklusivt RNA (f.eks. hTR), proteiner (f.eks. telomerase-assosierte proteiner), DNA (f.eks. telomer DNA, [T2AG3]n), og nukleotider, så som (deoksy)ribonukleotid-trifosfater. Disse assosiasjonene kan utnyttes for å bestemme hTRT-forekomst eller funksjon, identifisere eller rense hTRT eller telomerase-assosierte molekyler og til å analysere hTRT eller telomerasestruktur eller funksjon i henhold til fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse.

I én utførelsesform tilveiebringer foreliggende oppfinnelse hTRT kompleksert med (f.eks. assosiert med eller bundet til) en nukleinsyre, vanligvis en RNA, for eksempel for å

produsere et telomerase holoenzym. I én utførelsesform er den bundne RNA i stand til å virke som templat for telomerase-mediert DNA-syntese. Eksempler på RNA som kan komplekseres med hTRT-polypeptidet, er en naturlig forekommende vertscelle telomerase RNA, en human telomerase RNA (f.eks. hTR; US-patent 5.583.016) en hTR-subsekvens eller domene, en syntetisk RNA eller andre RNA. Dette RNA hTRT-proteinkompleks (en RNP) oppviser i alminnelighet én eller flere telomerasevirkninger, så som telomerase katalytiske aktiviteter. Disse hTRT-hTR RNP (eller andre hTRT RNA-komplekser) kan fremstilles etter forskjellige metoder, som beskrevet som illustrasjon nedenfor, inklusivt in vitro rekonstitusjon, ved koekspresjon av hTRT og hTR (eller annen RNA) in vitro (dvs. i et cellefritt system), in vivo rekonstitusjon eller ex vivo rekonstitusjon.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer i en utførelsesform således et hTRT-hTR-kompleks (eller annet hTRT RNA-kompleks) dannet in vitro ved å blande separat rensede komponenter ( «in vitro rekonstitusjon»; se f.eks. US-patent 5.583.016 angående en beskrivelse av rekonstitusjon; se også Autexier et al., EMBO J. 15:5928).

I en alternativ utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen telomerase RNP fremstillet ved koekspresjon av hTRT-polypeptidet og en RNA (f.eks. hTR) in vitro i et cellefritt transkripsjon/translasjonssystem (f.eks. hvetekim eller kanin-retikulocytt-lysat). Som vist i Eksempel 7 resulterer in vitro koekspresjon av et rekombinant hTRT-polypeptid og hTR i produksjon av telomerase katalytisk aktivitet (som målt ved en TRAP-test).

Videre tilveiebringer foreliggende oppfinnelse telomerase RNA produsert ved ekspresjon av hTRT-polypeptidet i en celle, f.eks. en pattedyrcelle, hvor hTR naturlig uttrykkes eller hvor hTR (eller en annen RNA som er i stand til å danne et kompleks med hTRT-proteinet) innføres eller uttrykkes ved rekombinasjon. I én utførelsesform uttrykkes således hTRT i en telomerase-negativ menneskecelle hvor hTR forekommer (f.eks. BJ- eller IMP90-celler) som lar de to molekylene samles til en RNP. I en annen utførelsesform uttrykkes hTRT i en human eller ikke-human celle som hTR uttrykkes rekombinant i. Fremgangsmåter for ekspresjon av hTR i en celle finnes i US-patent 5.583.016. Dessuten er en klon som inneholder en cDNA som koder for RNA-komponenten av telomerase deponert som pGRN33 (ATCC 75926). Genomiske sekvenser som koder for RNA-komponenten av human telomerase er også deponert i det -15 kb SauIUAl til Hindlll innskuddet av lambda klon 28-1 (ATCC 75925). For ekspresjon i eukaryote celler vil hTRT-sekvensen i alminnelighet operativt bli koblet til en transkripsjons-initieringssekvens (RNA-polymerase-bindingssete) og transkripsjonsterminatorsekvenser (se f.eks. PCT publikasjon WO 96/01835; Feng et al, 1995, Science 269:1236).

Det beskrives rekombinant fremstillede eller tilnærmet rensede hTRT-polypeptider koeksprimert med og/eller assosiert med såkalte «telomerase-assosierte proteiner». Det tilveiebringes således hTRT koeksprimert med eller kompleksert med, andre proteiner (f.eks. telomeraseassosierte proteiner). Telomerase-assosierte proteiner er de proteiner som renses sammen med human telomerase og/eller som kan spille en rolle ved modulering av telomerasefunksjon eller aktivitet, for eksempel ved å delta i assosiasjonen av telomerase med telomer DNA. Eksempler på telomerase-assosierte proteiner innbefatter (men er ikke begrenset til) følgende proteiner og/eller deres humane homologer: nukleolin (se Srivastava et al, 1989, FEBS Letts. 250:99); EF2H (elongeringsfaktor 2-homolog; se Nomura et al, 1994, DNA Res. (Japan) 1:27, GENBANK tilgangsnummer D21163); TP1/TLP1 (Harrington et al, 1997, Science 275:973; Nakayama, 1997, Cell 88:875); den humane homolog av Tetrahymena p95 eller p95 som sådan (Collins et al, 1995, Cell 81:677); TPC2 (et telomerlengde regulerende protein; ATCC tilgangsnummer 97708; TPC3 (også et telomerlengde regulerende protein; ATCC tilgangsnummer 97707; DNA-bindingsprotein B (dbpB; Horwitz et al, 1994, J. Biol. Chem. 269; 14130; og Telomere Repeat Binding Factors (TRF 1 & 2; Chang et al, 1995, Science 270:1663; Chong et al, 1997, Hum Mol Genet 6:69); EST1,3 og 4 (Lendvay et al, 1996, Genetics 144:1399, Nugent et al, 1996, Science 274:249, Lundblad et al, 1989, Cell 57:633); og End-capping Facor (Cardenas et al, 1993, Genes Dev. 7:883).

Telomerase-assosierte proteiner kan identifiseres på grunnlag av rensing sammen med, eller binding til, hTRT-protein eller hTRT-hTR RNP. Som et alternativ kan de identifiseres på grunnlag av binding til et hTRT-fusjonsprotein, f.eks. et GST-hTRT-fusjonsprotein eller lignende, som bestemt ved affinitetsrensing (se Ausubel et al, kap. 20). En særlig egnet teknikk for måling av protein/protein-interaksjoner som kan anvendes for å identifisere hTRT-assosierte proteiner, er 2-hybrid-screeningsmetoden til Chien et al, (Proe. Nati. Acad. Sei. USA 88:9578 [1991]; se også Ausubel et al, supra, i kap. 20). Denne screening identifiserer protein/protein-interaksjoner in vivo gjennom rekonstitusjon av en transkripsjonen aktivator, gjær Gal4-transkripsjonsproteinet (se Fields & Song, 1989, Nature, 340:245. Denne metoden er basert på de egenskaper ved gjær Gal4-protein som består i separerbare domener som er ansvarlige for DNA-binding og transkripsjonen aktivering. Polynukleotider, vanligvis ekspresjonsvektorer, som koder for 2-hybridproteiner konstrueres. Ett polynukleotid omfatter gjær Gal4 DNA-bindingsdomenet fusjonert til en polypeptidsekvens av et protein som skal testes på hTRT-interaksjon (f.eks. nukleolin eller EF2H). Alternativt fusjoneres gjær Gal4 DNA-bindingsdomenet til cDNA fra en menneskecelle, hvorved det dannes et bibliotek av humane proteiner fusjonert til Gal4 DNA-bindingsdomenet for screening med henblikk på telomerase-assosierte proteiner. Det andre polynukleotidet omfatter Gal4-aktiveringsdomenet fusjonert til en hTRT-polypeptidsekvens. Konstruksjonene innføres i en gjærcellevert. Etter ekspresjon kan intermolekylær binding mellom hTRT og testproteinet rekonstituere Gal4 DNA-bindingsdomenet med Gal4-aktiveirngsdomenet. Dette fører til den transkripsjonene aktivering av et rapportørgen (f.eks. lacZ, HIS3) operativt koblet til et Gal4-bindingssete. Ved å selektere for, eller ved å måle rapportøren, kan genkolonier av celler som inneholder et hTRT-interaksjonsprotein eller telomerase-assosiert protein, identifiseres. Det vil for fagmannen være klart at det finnes tallrike variasjoner av 2-hybrid-screeningen, f.eks. LexA-systemet (Bartel et al., 1993, i Cellular Interactions in Development: A Practical Approach Red. Hartley, D.A. (Oxford Univ. Press) s. 153-79).

En annen nyttig metode for å identifisere telomerase-assosierte proteiner er et tre-hybridsystem (se f.eks. Zhang et al., 1996, Anal. Biochem. 242:68; Licitra et al., 1996, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 93:12817). Telomerase RNA-komponenten kan benyttes i dette system med TRT- eller hTRT-proteinet og et testprotein. En annen nyttig metode for identifisering av samvirkende proteiner (dvs. proteiner som heterodimeriserer eller danner høyere orden av heteromultimerer) er det E. co/j'/BCCP-interaktive screeningsystem (se Germino et al., (1993) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 90:933; Guarente (1993) Proe. Nati. Acad. Sei. (USA) 90:1639).

Det kan også tilveiebringes komplekser av telomer-bindende proteiner (som eventuelt kan være telomerase-assosierte proteiner) og hTRT (som eventuelt kan være kompleksert med hTR, andre RNA eller én eller flere telomerase-assosierte proteiner). Eksempler på telomer-bindende proteiner er TRF1 og TRF2 ( supra) ; mpAl, mpA2, RAPI (Buchman et al., 1988, Mol. Cell. Biol. 8:210, Buchman et al., 1988, Mol. Cell. Biol. 8:5086), SER3 og SIR4 (Aparico et al., 1991, Cell 66:1279), TELI (Greenwell et al., 1995, Cell 82:823; Morrow et al. 1995, Cell 82:831); ATM (Savitsky et al., 1995, Science 268;1749), End-capping Factor (Cardenas et al., 1993, Genes Dev. 7:883) og tilsvarende humane homologer. Ovennevnte komplekser kan generelt fremstilles som beskrevet ovenfor for komplekser av hTRT og hTR eller telomerase-assosierte proteiner, f.eks. ved blanding eller koekspresjon in vitro eller in vivo.

V. ANTISTOFFER OG ANDRE BINDINGSMIDLER

I henhold til et beslektet aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse antistoffer som er spesifikt immunreaktive med hTRT, inklusivt polyklonale og monoklonale antistoffer, antistoff-fragmenter, enkeltkjedede antistoffer, humane og kimære antistoffer, inklusivt antistoffer eller antistoff-fragmenter fusjonert til fag-kappe- eller celleoverflateproteiner og andre kjent innen området og beskrevet her. Antistoffene ifølge oppfinnelsen kan spesifikt gjenkjenne og binde polypeptider som har en aminosyresekvens som er tilnærmet identisk til den aminosyresekvens som er angitt i Figur 17 (SEKV. ID. NR:2) eller et immunogent fragment derav, eller en epitop på det derved definerte protein. Antistoffene ifølge

TRO

oppfinnelsen kan oppvise en spesifikk bindingsaffinitet for hTRT på minst 10 ,10 ,10 eller lO^M"1 og kan være polyklonale, monoklonale, rekombinante eller produsert på annen måte. Oppfinnelsen tilveiebringer også anti-hTRT-antistoff som gjenkjenner en hTRT-konformasjonsepitop (f.eks. en epitop på overflaten av hTRT-proteinet eller et

telomerase RNP). Epitoper med lik konformasjon kan eventuelt identifiseres ved datamaskin-assistert analyse av hTRT-proteinsekvensen, sammenligning med konformasjonen av beslektede reverse transkriptaser, så som p66-subenheten av HIV-1 (se Figur 3) eller empirisk. Anti-hTRT-antistoffer som gjenkjenner konformasjonsepitoper er anvendelig, bl.a. ved deteksjon og rensing av human telomerase og ved diagnostisering og behandling av human sykdom.

For produksjon av anti-hTRT-antistoffer kan verter som geiter, sauer, kuer, marsvin, kaniner, rotter eller mus, immuniseres ved injeksjon av hTRT-protein eller en hvilken som helst del, fragment eller oligopeptid derav, som bibeholder immunogene egenskaper. Ved selektering av hTRT-polypeptider for antistoff-induksjon trenger man ikke opprettholde biologisk aktivitet, men proteinfragmentet, eller oligopeptidet, må være immunogent og fortrinnsvis antigent. Immunogenitet kan bestemmes ved å injisere et polypeptid og adjuvans i et dyr (f.eks. en kanin) og teste på tilsynekomst av antistoffer rettet mot det injiserte polypeptid (se f.eks. Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988), som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse, f.eks. i kapittel 5). Peptider benyttet til å indusere spesifikke antistoffer har typisk en aminosyresekvens bestående av minst 5 aminosyrer, fortrinnsvis minst 8 aminosyrer, mer foretrukket minst 10 aminosyrer. Vanligvis vil de etterligne eller ha betydelig sekvensidentitet med alle eller en sammenhengdende del av aminosyresekvensen av proteinet med SEKV. JD. NR:2. Korte strekninger av hTRT-protein-aminosyrene kan fusjoneres med de for et annet protein, så som «keyhole limpet hemocyanin» og et anti-hTRT-antistoff produsert mot det kimære molekyl. Avhengig av vertsarten kan ulike adjuvanser benyttes for å øke immunologisk respons.

Antigenet presenteres for immunsystemet på en måte som avgjøres av metoder som er riktige for dyret. Disse og andre parametere er i alminnelighet velkjente for immunologer. Injeksjonene gis i alminnelighet i fotsålene, intramuskulært, intradermalt, perilymfe-nodalt eller intrapeirtonealt. De immunglobulinene som produseres av verten kan utfelles, isoleres og renses ved hjelp av rutinemetoder, inklusivt affinitetsrensing.

Illustrative eksempler av immunogene hTRT-peptider er angitt i Eksempel 8.1 tillegg beskriver Eksempel 8 produksjonen og anvendelsen av anti-hTRT-polyklonale antistoffer.

A) MONOKLONALE ANTISTOFFER

Monoklonale antistoffer mot hTRT-proteiner og peptider kan fremstilles i overens-stemmelse med fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, ved å benytte en hvilken som helst teknikk som sørger for produksjon av antistoffmolekyler ved hjelp av kontinuerlige cellelinjer i kultur. Disse innbefatter, men er ikke begrenset til, den hybridomteknikk som opprinnelig er beskrevet av Koehler & Milstein (Nature 256:495 [1975], den humane B-celle hybridomteknikk (Kosbor et al., 1983, Immunol. Today 4:72; Cote et al., 1983, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 80:2026) og EBV-hybridomteknikken (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss Inc. New York NY, s. 77-96 [1985].

I én utførelse velges passende dyr og den passende immuniseringsprotokoll følges. Produksjonen av ikke-humane monoklonale antistoffer, f.eks. murine lagomorfa, equine, er velkjent og kan skje for eksempel ved immunisering av et dyr med et preparat inneholdende hTRT eller fragmenter derav. Ifølge en metode uttas milten etter passende tidsrom fra dyrene, og individuelle miltceller fusjoneres til immortaliserte myelomceller under passende seleksjonsbetingelser. Deretter separeres cellene klonalt og supernatantene for hver klon (f.eks. hybridomer) testes for produksjonen av et passende antistoff som er spesifikt for den ønskede region av antigenet. Teknikker for produksjon av antistoffer er velkjent på området. Se f.eks. Goding et al, Monoclonal Antibodies: Phnciples and Practice (2. utg.) Acad. Pres. N.Y., og Harlow & Lane supra, som begge herved refereres til i foreliggende beskrivelse. Andre egnede teknikker involverer in vitro eksponering av lymfocytter overfor de antigene polypeptidene eller alternativt seleksjon av biblioteker av antistoffer i fag eller lignende vektorer (se nedenfor).

B) HUMANE ANTISTOFFER

I henhold til et annet aspekt ved oppfinnelsen tilveiebringes humane antistoffer mot et hTRT-polypeptid. Humane monoklonale antistoffer mot et kjent antigen kan også fremstilles ved å benytte transgene dyr som har elementer av et humant immunsystem (se f.eks. US-patent 5.569.825 og 5.545.806, som begge herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse) eller ved å benytte humane perifere blodlegemer (Casali et al., 1986, Science 234:476). Enkelte humane antistoffer selekteres ved kompetitive bindingsforsøk eller på annen måte for å få samme epitop-spesifisitet som et bestemt muse-antistoff.

I en alternativ utførelsesform kan humane antistoffer mot et hTRT-polypeptid produseres ved screening av et DNA-bibliotek fra humane B-celler i henhold til den generelle fremgangsmåte som er skissert av Huse et al., 1989, Science 246:1275, som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse. Antistoffer som binder til hTRT-polypeptidet selekteres. Sekvenser som koder for slike antistoffer (eller bindingsfragmenter) blir deretter klonet og amplifisert. Fremgangsmåten beskrevet av Huse benyttes ofte med fag-display-teknologi.

C) HUMANISERTE ELLER KIMÆRE ANTISTOFFER

Oppfinnelsen tilveiebringer også anti-hTRT-antistoffer som er gjort kimære, human-like eller humaniserte, for å redusere deres eventuelle antigenitet uten å redusere deres affinitet for deres mål. Fremstilling av kimære, human-like og humaniserte antistoffer har vært beskrevet (se f.eks. US-patent 5.585.089 og 5.530.101; Queen et al., 1989, Proe. Nati. Acad. Sei., USA 86:10029; og Verhoeyan et al, 1988, Science 239:1534; som samtlige herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse). Humaniserte immunglobuliner har variable rammeverk-regioner hovedsakelig fra et humant immunglobulin (betegnet et akseptor-immunglobulin) og komplementaritetsbestemmende regioner i det vesentlige fra et ikke-humant (f.eks. mus) immunglobulin (omtalt som donor-immun-globulinet). De eventuelt forekommende konstante regioner er også i det vesentlige fra et humant immunglobulin.

I enkelte anvendelser som f.eks. administrering til humanpasienter, byr de humaniserte (så vel som humane) anti-hTRT-antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse på enkelte fordeler fremfor antistoffer fra mus eller andre arter: (1) det humane immunsystem skulle ikke gjenkjenne rammeverket av den konstante region av det humaniserte antistoff som fremmed, og antistoffresponsen mot et slikt injisert antistoff burde derfor være mindre enn mot et fullstendig fremmed muse-antistoff eller et delvis fremmed kimært antistoff; (2) siden effektor-delen av det humaniserte antistoffer human, vil den kunne gi bedre interaksjon med andre deler av det humane immunsystem; og (3) injiserte humaniserte antistoffer har en halveringstid som på det nærmeste er lik de for naturlig forekommende humane antistoffer, noe som tillater mindre og mindre hyppige doser enn antistoffer av andre arter. I det foregående ligger det implisitt at anti-hTRT-antistoffer kan finne anvendelse ved behandling av sykdom, dvs. til å målsøke telomerasepositive celler.

D) FAG-DISPLAY

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også anti-hTRT-antistoffer (eller bindende blandinger) fremstillet ved hjelp av fag-displaymetoder (se f.eks. Dower et al., WO 91/17271 og McCafferty et al., WO 92/01047; og Vaughan et al., 1996, Nature Biotechnology,14:309; som samtlige herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse). Ifølge disse metoder produseres bibliotek av fag hvor medlemmer oppviser forskjellige antistoffer på deres utvendige overflater. Antistoffer eksponeres vanligvis som Fv- eller Fab-fragmenter. Fag-eksponerende antistoffer med en ønsket spesifisitet selekteres ved affinitetsanrikning til et hTRT-polypeptid.

Etter en variant av Fag-displaymetoden kan humaniserte antistoffer som har bindings-spesifrsiteten til et selektert murint antistoff, produseres. Etter denne metode benyttes enten den tunge eller den lette kjedes variable region av det selekterte murine antistoff som utgangsmateriale. Dersom for eksempel en lett kjedes variable region velges som utgangsmateriale, konstrueres et fag-bibliotek hvor medlemmene eksponerer den samme lette kjedes variable region (dvs. det murine utgangsmateriale) og en annen tung kjedes variable region. De tunge kjeders variable regioner oppnås fra et bibliotek av omleirede humane tunge kjeders variable regioner. En fag som oppviser sterk spesifikk binding for hTRT-polypeptidet (f.eks. minst 10 og fortrinnsvis minst IO<9> M"<1>) velges. Den humane tunge kjedes variable region fra denne fag tjener deretter som et utgangsmateriale for konstruksjon av et ytterligere fag-bibliotek. I dette bibliotek eksponerer hvert fag den samme tunge kjedes variable region (dvs. regionen identifisert fra det første display-bibliotek) og en annen lett kjedes variable region. Den lette kjedes variable regioner oppnås fra et bibliotek av omleirede humane variable lett kjedes regioner. Igjen velges fag som oppviser sterk spesifikk binding. Disse fag eksponerer de variable regioner av fullstendig humane anti-hTRT-antistoffer. Disse antistoffene har vanligvis den samme eller lignende epitop-spesifisitet som det murine utgangsmaterialet.

E) HYBRID-ANTISTOFFER

Oppfinnelsen tilveiebringer også hybrid-antistoffer som deler spesifisiteten til antistoffer mot et hTRT-polypeptid, men er også i stand til spesifikt å binde til en andre del. I slike hybrid-antistoffer er ett tungt og lett kjedepar vanligvis fra et anti-hTRT-antistoff og det andre par fra et antistoff utviklet mot en annen epitop eller et protein. Dette resulterer i egenskapen multifunksjonell valens, dvs. evne til samtidig å binde minst to ulike epitoper, hvor minst én epitop er den epitop som anti-kompleks-antistoffet binder seg til. Slike hybrider kan dannes ved fusjon av hybridomer som produserer de respektive komponent-antistoffer, eller ved rekombinant teknikk. Slike hybrider kan benyttes til å bringe en forbindelse (dvs. medikament) til en telomerase-positiv celle (dvs. et cytotoksisk middel avgis til en cancercelle).

Immunglobuliner ifølge foreliggende oppfinnelse kan også fusjoneres til funksjonelle regioner fra andre gener (f.eks. enzymer) for å frembringe fusjonsproteiner (f.eks. immun-toksiner) med nyttige egenskaper.

F) ANTI-IDIOTYPE ANTISTOFFER

Også anvendelige er anti-idiotype antistoffer som kan isoleres ved hjelp av ovennevnte fremgangsmåter. Anti-idiotype antistoffer kan fremstilles ved for eksempel immunisering av

et dyr med det primære antistoff (dvs. anti-hTRT-antistoffer eller hTRT-bindende fragmenter derav). For anti-hTRT-antistoffer velges anti-idiotype antistoffer hvis binding til det primære antistoff inhiberes av et hTRT-polypeptid eller fragmenter derav. På grunn av at både det anti-idiotype antistoff og hTRT-polypeptidet, eller fragmenter derav, binder det primære immunglobulin, kan det anti-idiotype immunglobulin representere det «indre bilde» av en epitop og således benyttes i stedet for hTRT-polypeptidet i tester eller benyttes til å binde (dvs. inaktivere) anti-hTRT-antistoffer, f.eks. i en pasient. Anti-idiotype antistoffer kan også gi interaksjon med telomerase-assosierte proteiner. Administering av slike antistoffer kan påvirke telomerasefunksjon ved å titrere ut eller konkurrere med hTRT om binding til hTRT-assosierte proteiner.

G) GENERELT

Antistoffene ifølge oppfinnelsen kan være av en hvilken som helst isotype, f.eks. IgM, IgD, IgG, IgA og IgE, med IgG, IgA og IgM som den som ofte foretrekkes. Humaniserte antistoffer kan omfatte sekvenser fra mer enn én klasse eller isotype.

I henhold til en annen utførelsesform av oppfinnelsen tilveiebringes fragmenter av de intakte antistoffer beskrevet ovenfor. Disse fragmentene kan i alminnelighet konkurrere med det intakte antistoff som de skriver seg fra, når det gjelder spesifikk binding til hTRT-polypeptidet, og de binder seg med en affinitet på minst IO<7>, IO<8>,10<9>M"' eller 1010M"'. Antistoff-fragmenter innbefatter separate tunge kjeder, lette kjeder, Fab, Fab'F(ab')2, Fabc og Fv. Fragmenter kan fremstilles ved enzymatisk eller kjemisk separasjon av intakte immunglobuliner. For eksempel kan et F(ab')2-fragment oppnås fra et IgG-molekyl ved proteolytisk oppslutning med pepsin ved pH 3,0-3,5 ved å benytte standardmetoder, som f.eks. beskrevet i Harlow & Lane, supra. Fab-fragmenter kan oppnås fra F(ab')2-rfagmenter ved begrenset reduksjon eller fra hele antistoff ved oppslutning med papain i nærvær av reduksjonsmidler (se generelt Paul, W., red. FUNDAMENTAL ■ IMMUNOLOGY 2. utg. Raven Press, N.Y., 1989, kap. 7, som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse.). Fragmenter kan også produseres ved rekombinante DNA-teknikker. Segmenter av nukleinsyre som koder for utvalgte fragmenter, fremstilles ved oppslutning av full lengde kodende sekvenser med restriksjons-enzymer eller ved de novo syntese. Ofte uttrykkes fragmenter i form av fag-kappe fusjonsproteiner.

Mange av de ovenfor beskrevne immunglobuliner kan undergå mindre avgjørende aminosyre-substitusjoner, addisjoner eller delesjoner, i både de variable og konstante regioner uten tap av bindingsspesifisitet eller effektorfunksjoner eller utillatelig reduksjon av bindingsaffinitet (dvs. mindre enn ca. 10<7>M_<1>). Vanligvis oppviser immunglobuliner hvor slike endringer inngår, betydelig sekvensidentitet med et referanse-immunglobulin som de er avledet fra. Det kan selekteres et mutert immunglobulin som har den samme spesifisitet og økede affinitet sammenlignet med et referanse-immunglobulin som det er avledet fra. Fag-displayteknologi utgjør nyttige teknikker for selektering av slike immunglobuliner. Se f.eks. Dower et al, WO 91/17271 McCafferty et al, WO 92/01047; og Huse, WO 92/06204.

Antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse kan benyttes med eller uten modifisering. Ofte vil antistoffene bli merket ved enten kovalent eller ikke-kovalent tilkobling av en påvisbar merking. Som merkede bindende enheter er antistoffene ifølge oppfinnelsen særlig egnet for diagnostiske anvendelser.

Anti-hTRT-antistoffene ifølge oppfinnelsen kan renses ved å benytte velkjente metoder. Hele antistoffene, deres dimerer, individuelle lette og tunge kjeder, eller andre immunglobulinformer ifølge foreliggende oppfinnelse, kan renses ved å benytte fremgangsmåtene og reagensene ifølge foreliggende oppfinnelse i henhold til standardprosedyrer, herunder ammoniumsulfatpresipitasjon, affinitetskolonner, kolonnekromatografi, gelelektroforese og lignende (se generelt Scopes, PROTEIN PURIFICATION: PRINCIPLES AND PRACTICE 3. utg. (Springer-Verlag. N.Y., 1994)). Tilnærmet rene immunglobuliner på minst ca. 90 til 95%, eller endog 98 til 99%, eller høyere homogenitet foretrekkes.

VI. RENSING AV HUMAN TELOMERASE

Foreliggende oppfinnelse muliggjør isolert human telomerase av hittil uoppnådd renhet. Særlig muliggjør foreliggende oppfinnelse: renset hTRT av rekombinant eller ikke-rekombinant opprinnelse; rensede hTRT-hTR-komplekser (dvs. RNP) av rekombinant, ikke-rekombinant eller blandet opprinnelse, som eventuelt omfatter ett eller flere telomerase-assosierte proteiner; renset naturlig forekommende human telomerase og lignende. Dessuten tilveiebringer oppfinnelsen fremgangsmåter og reagenser for partiell, betydelig eller høy rensing av ovennevnte molekyler og komplekser, inklusivt varianter, fusjonsproteiner, naturlig forekommende proteiner og lignende (kollektivt omtalt som «hTRT og/eller hTRT-komplekser»).

Før foreliggende beskrivelse hadde forsøk på å rense telomeraseenzymkompleks til homogenitet, hatt liten suksess. Fremgangsmåten tilveiebragt i ovennevnte søknader gir rensing av telomerase med tilnærmet opptil 60.000 ganger eller mer sammenlignet med rå celleekstrakter. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer hTRT og hTRT-komplekser av enda høyere renhet, tildels som følge av de nye immunaffinitetsreagensene (f.eks. anti-hTRT-antistoffer) ifølge foreliggende oppfinnelse og/eller av de reagenser, celler og fremgangsmåter som her er angitt for rekombinant ekspresjon av hTRT. Rekombinant ekspresjon av hTRT og hTRT-komplekser forenkler rensing fordi de ønskede molekyler kan produseres i meget høyere nivå enn de man finner i de best uttrykkende celler som forekommer i naturen, og/eller fordi det rekombinante hTRT-molekyl kan modifiseres (f.eks. ved fusjon med en epitopmerking) slik at det lett lar seg rense.

Det vil være klart at naturlig forekommende telomerase kan renses fra en hvilken som helst telomerase-positiv celle og at rekombinante hTRT og hTRT-komplekser kan uttrykkes og renses bl.a. ved å benytte hvilke som helst av de in vitro, in vivo, ex vivo eller plante- eller dyre-ekspresjonssystemer som er omtalt ovenfor, eller andre systemer kjent på området.

Ifølge én utførelsesform renses hTRT, telomerase og andre blandinger ifølge oppfinnelsen ved å benytte et immunaffinitetstrinn, alene eller i kombinasjon med andre rensetrinn. Typisk bringes et immobilisert eller immobiliserbart anti-hTRT-antistoff, tilveiebragt ifølge foreliggende oppfinnelse, i kontakt med en prøve, som f.eks. et cellelysat som inneholder det ønskede hTRT eller hTRT-holdige kompleks, under betingelser hvor anti-hTRT-antistoff binder hTRT-antigenet. Etter fjerning av de ubundne komponentene i prøven ved hjelp av velkjente metoder, kan hTRT-blandingen eventuelt elueres fra antistoffet i tilnærmet ren form. I én utførelsesform benyttes velkjente immunaffinitetskromatografiske metoder (se f.eks. Harlow & Lane, supra; og Ausubel et al., supra; Hermansan et ai, 1992, Immobilized Affinity Ligand Techniques (Academic Press, San Diego)) i overensstemmelse med oppfinnelsens fremgangsmåter. I en annen illustrativ utførelsesform utføres immunpresipitasjon av anti-hTRT-immunglobuIin-hTRT-komplekser ved å benytte immobilisert protein A. En rekke variante og alternative immunaffinitets-renseprotokoller egnet for bruk i henhold til fremgangsmåtene og reagensene ifølge oppfinnelsen, er velkjente for fagmannen.

Rekombinante hTRT-proteiner kan som følge av deres høye ekspresjonsnivå, renses ved å benytte rutinemessige protein-rensemetoder, så som ammoniumsulfatpresipitasjon, affinitetskolonner (f.eks. immunaffinitet), gelfiltrering, anion- og kation-bytterkromatografi, gelelektroforese og lignende (se generelt R. Scopes, Protein Purification, Springer- Verlag, N.Y. (1982) og Deutscher, Method in Enzymology Bd. 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc., N.Y. (1990)) i stedet for, eller i tillegg til, immunaffinitetsmetoder. Kationbyttermetoder kan være av særlig anvendelse som følge av hTRT-proteinets basiske pl. For eksempel kan immobilisert fosfat benyttes som en funksjonell kationbyttergruppe (f.eks. P-l 1 Phosohocellulose, Whatman Catalog nr. 4071 eller Cellulosephosphat, Sigma Catalog nr. C 3145). Immobilisert fosfat har to fordelaktige trekk ved hTRT-rensing - det er en kationbytterharpiks og den oppviser fysikalsk likhet med nukleinsyrens fosfatskjelett. Dette kan muliggjøre affinitetskromatografi fordi hTRT binder hTR og telomer DNA. Andre uspesifikke og spesifikke nukleinsyreaffinitetskromatografiske metoder egner seg også for rensing (f.eks. Alberts et al., 1971, Methods Enzymol. 21:198; Amt-Jovin et al., 1975, Eur. J. Biochem. 54:411; Pharmacia Catalog nr. 27-5575-02). En videre utnyttelse av denne bindingsfunksjon av hTRT ville kunne inkludere bruk av spesifikk nukleinsyre- (f.eks. telomeraseprimer eller hTR) affinitetskromatografi for rensing (Chodosh et al., 1986, Mol. Cell. Biol. 6:4723; Wu et al., 1987, Science 238:1247; Kadonaga, 1991, Methods Enzymol. 208:10); immobilisert Cibricon BlueDye, som oppviser fysikalsk likhet med nukleotider, er en annen anvendelig harpiks for hTRT-rensing (Pharmacia Catalog nr. 17-0948-01 eller Sigma Catalog nr. C 1285) som følge av hTRT-binding av nukleotider (f.eks. som substrater for DNA-syntese).

hTRT-proteiner kan isoleres direkte fra et in vitro eller in vivo ekspresjonssystem hvor andre telomerasekomponenter ikke koeksprimeres. Det er klart at isolert hTRT-protein også lett kan oppnås fra renset human telomerase eller hTRT-komplekser, for eksempel ved å opprive telomerase RNP (f.eks. ved eksponering for et mildt eller annet denatureringsmiddel) og separere RNP-komponentene (f.eks. ved rutinemetoder, så som kromatografi eller immunaffinitets-kromatografi).

Telomerase-rensingen kan overvåkes ved å benytte en telomerase-aktivitetstest (f.eks. TRAP-testen, konvensjonell test eller primer-bindingstest), ved å måle anrikningen av hTRT (f.eks. ved ELISA), ved å måle anrikningen av hTR eller ved hjelp av andre kjente metoder.

Den rensede humane telomerase, hTRT-proteiner og hTRT-komplekser muliggjort gjennom foreliggende oppfinnelse kan være høyrenset (dvs. minst ca. 90% homogen, oftere minst ca. 95% homogen). Homogeniteten kan bestemmes ved standardmetoder så som SDS-polyakrylamid-gelelektroforese eller på andre kjente måter (se f.eks. Ausubel et al., supra). Det vil også være klart at selv om det iblant ønskes høyrenset human telomerase, hTRT-protein eller hTRT-komplekser, er tilnærmet rensede (f.eks. minst ca. 75% homogene) eller delvis rensede (f.eks. minst ca. 20% homogene) human telomerase, hTRT-protein eller hTRT-komplekser nyttige for mange anvendelser. For eksempel er delvis renset telomerase egnet for screening av testforbindelser for telomerase-modulerende aktivitet og andre anvendelser (se nedenfor og ovenfor; se US-patent 5.645.986).

VII. BEHANDLING AV TELOMERASE-RELATERT SYKDOM

A) INNFØRING

hTRT-polynukleotider, polypeptider og antistoffer er egnet til behandling av human-sykdommer og sykdomstilstander. De rekombinante og syntetiske hTRT-genproduktene (protein og mRNA) ifølge oppfinnelsen kan benyttes til å frembringe eller heve telomerase-aktivitet i en celle, så vel som å inhibere telomeraseaktivitet i celler hvor dette ikke ønskes. Inhibering, aktivering eller annen endring av telomeraseaktivitet (f.eks. telomerase katalytisk aktivitet, pålitelighet, prosessivitet, telomer-binding, etc.) i en celle, kan benyttes til å endre cellens proliferative kapasitet. For eksempel kan reduksjon av telomerase-aktivitet i en udødelig celle, så som en malign tumorcelle, gjøre cellen dødelig. Omvendt, kan økning av

telomeraseaktiviteten i en dødelig celle (f.eks. de fleste humane somatiske celler) øke cellens proliferative kapasitet. For eksempel vil ekspresjon av hTRT-protein i dermale fibroblaster, hvorved telomer-lengden økes, resultere i øket fibroblast-proliferativ kapasitet, og en slik ekspresjon kan forsinke eller reversere den alders-avhengige langsommere sårtilheling (se f.eks. West, 1994, Arch. Derm. 130-87).

Ifølge ett aspekt tilveiebringes reagenser og fremgangsmåter som egner seg for behandling av sykdommer og tilstander kjennetegnet ved nærvær, fravær eller mengden av human telomeraseaktivitet i en celle og som er følsomme overfor behandling ved bruk av de her omtalte blandinger og fremgangsmåter. Som mer fullstendig beskrevet nedenfor, innbefatter disse sydkommene cancere, andre celleproliferasjons-sykdommer (særlig aldringssykdommer), immunologiske forstyrrelser, infertilitet (eller fertilitet) og andre.

B) BEHANDLING AV CANCER

Det beskrives fremgangsmåter og blandinger for reduksjon av telomeraseaktivitet i tumorceller og for cancerbehandling. Blandingene inkluderer antisense oligonukleotider, peptider, genterapivektorer som koder for antisense oligonukleotider eller aktivitets-endrende proteiner, samt anti-hTRT-antistoffer. Cancerceller (f.eks. maligne tumorceller) som uttrykker telomerase-aktivitet (telomerase-positive celler) kan gjøres dødelige ved å minske eller inhibere den endogene telomeraseaktivitet. Siden telomerasenivået korrelerer med sykdoms-karakteristika, som f.eks. metastasepotensialet (f.eks. US-patent 5.639.613; 5.648.215; 5.489.508; Pandita et al., 1996, Proe. Am. Ass. Cancer Res. 37:559) vil dessuten enhver reduksjon av telomeraseaktivitet kunne redusere kreftens aggressive natur til en mer kontrollerbar sykdomtilstand (som øker effektiviteten av tradisjonelle inngrep).

Blandinger og fremgangsmåter kan være egnet for behandling av cancere av et bredt utvalg typer, herunder solide tumorer og leukemier. Cancertyper som kan behandles innbefatter (men er ikke begrenset til): adenokarsinomer i bryst, prostata og tykktarm; alle former for bronkogene karsinomer i lungen; myeloid; melanom; hepatom; neuroblastom; papillom; apudom; choristom; brankiom; malignt karsinoid syndrom; karsinoid hjertesykdom; karsinom (f.eks. Walker, basalcelle, basoskvamøs, Brown-Pearce, duktal, Ehrlichs tumor,

in situ, Krebs 2, Merkelcelle, mucinøs, ikke-småcellet lunge, oatcelle, papillær, scirrøs, bronkiolar, bronkogen, skvamøs celle og transisjonell celle), histiocytiske forstyrrelser; leukemi (f.eks. B-celle, blandet celle, null-celle, T-celle, T-celle kronisk, HTLV-II-assosiert, lymfocytisk akutt, lymfocytisk kronisk, mastcelle og myeloid); malign histiocytose; Hodgkins sykdom; immunproliferative små; non-Hodgkins lymfom; plasmacytom; retikuloendoteliose; melanom; kondroblastom; kondrom; kondrosarkom; fibrom; fibrosarkom; kjempecelle-tumorer; histiocytom; lipom; liposarkom; mesoteliom; myksom; myksosarkom; osteom; osteosarkom; Ewings sarkom; synoviom; adenfibrom; adenolymfom; karsinosarkom; kordom; kraniofaryngiom; dysgerminom; haramtom; mesenkymom; mesonefrom; myosarkom; ameloblastom; sementom; odontom; teratom; tyomom; trofoblastisk tumor; adenkarsinom; adenom; kolangiom; kolesteatom; sylindrom; cystadenomkarsinom; cystadenom; granulosa-celletumor; gynandroblastom; hepatom; hidradenom; øycelletumor; leydigcelletumor;

papillom; sertolicelletumor; tekacelletumor; leiomyom; leiomyosarkom; myoblastom; myom; myosarkom; rabdomyom; rabdomyosarkom; ependymom; ganglioneurom; bliom; medulloblastom; meningiom; nevrolemmom; nevroblastom; nevroepiteliom; nevrofibrom; nevrom; paragangliom; paraganglioma nonchromaffin; angiokeratom; angiolymfoid hyperplasi med eosinofili; skleroserende angiom; angiomatose; glomangiom; hemangioendoteliom; hemangiom; hemangiopericytom; hemangiosarkom; lymfangiom; lymfangimyom; lymfangiosarkom; pinealom; karsinosarkom; kondrosarkom; cytosarkoma phyllodes; fibrosarkom; hemangiosarkom; leiomyosarkom; leukosarkom; liposarkom; lymfangiosarkom; myosarkom; myksosarkom; ovarialkarsinom; rabdomyosarkom; sarkom (f.eks. Ewings, eksperimentell, Kaposis og mastcelle); neoplasmer (f.eks. ben, bryst, fordøyelsessystem, colorektalt, lever, pankreatisk, pituitær, testikulær, orbital, hode og hals, sentralnervesystem, akustisk, pelvisk, respiratorisk og urogenitalt); nevrofibromatose og cervikal dysplasi). Blandinger og fremgangsmåter kan tilveiebringes som er egnet for behandling av andre tilstander, hvor celler er blitt udødeliggjort eller hyperproliferative, f.eks. ved dysregulering (f.eks. abnorm høy ekspresjon) av hTRT, telomerase-enzym eller telomeraseaktivitet.

Blandinger og fremgangsmåter for forhindring av cancere, inkluderer anti-hTRT-vaksiner, genterapi-vektorer som forhindrer telomeraseaktivering og genterapivektorer som resulterer i spesifikk død av telomerase-positive celler. Generstatningsterapimetodene som er beskrevet nedenfor kan benyttes til «behandling» av en genetisk predileksjon for cancere.

C) BEHANDLING AV ANDRE BETINGELSER

Blandinger og fremgangsmåter kan også være egnet til behandling av sykdommer og sykdomstilstander (i tillegg til cancere) som kjennetegnes ved under- eller over-ekspresjon av telomerase eller hTRT-genprodukter. Eksempler innbefatter: celleproliferasjonssykdommer, sykdommer som skriver seg fra cellealdring (særlig aldringssykdommer), immunologiske forstyrrelser, infertilitet, immundysfunksjonssykdommer og andre.

Enkelte aldringssykdommer kjennetegnes ved cellesenilitets-assosierte endringer som følge av redusert telomerlengde (sammenlignet med yngre celler), som skriver seg fra fraværet av (eller betydelig lavere nivåer) av telomeraseaktivitet i cellen. Nedsatt telomerlengde og nedsatt replikasjonsevne bidrar til sykdommene beskrevet nedenfor. Telomeraseaktivitet og telomerlengde kan økes ved for eksempel å øke nivåene av hTRT-genprodukter (protein og mRNA) i cellen. Listen over en del tilstander som er assosiert med cellulær senilitet, hvor hTRT-ekspresjon kan virke terapeutisk, omfatter Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom, Huntingtons sykdom og slag; alders-relaterte sykdommer av integumentet, så som dermal atrofi, elastolyse og rynkedannelse i huden, talgkjertel-hyperplasi, senil lentigo, gråning og tap av hår, kroniske hudulcerasjoner og aldersrelatert svekking av sårtilheling; degenerativ leddsykdom; osteoporose; aldersrelatert svekkelse av immunsystemet (f.eks. som involverer celler som B- og T-lymfocytter, monocytter, neutrofiler, eosinofiler, basofiler, NK-celler og deres respektive progenitorceller); aldersrelaterte sykdommer i vaskulærsystemet, inklusivt aterosklerose, forkalkning, trombose og anevrismer; diabetes, muskelatrofi, respiratoriske sykdommer, sykdommer i lever og GI-trakt, metabolske sykdommer, endokrine sykdommer

(f.eks. forstyrrelser av hypofyse og binyre), reproduksjonssykdommer og aldersrelatert makulær degenerasjon. Disse sykdommene og tilstandene kan behandles ved å øke nivået av hTRT-genprodukter i cellen for å øke telomerlengde, og derved gjenopprette eller tilføre cellen bedre replikasjonsevne. Slike metoder kan utføres på celler dyrket ex vivo eller celler in vivo. I én utførelsesform behandles cellene for først å aktivere telomerase og forlenge telomerer og deretter for å inaktivere hTRT-genet og telomeraseaktivitet. Det utvikles telomeraseaktivitet av en vektor ifølge oppfinnelsen i en embryonisk kim- eller stamcelle før eller under differensiering.

Fremgangsmåter og blandinger kan være egnet til behandling av infertilitet. Humane kimlinjeceller (f.eks. spermatogoniaceller, deres forløpere eller etterfølgere) er i stand til ubegrenset proliferasjon og kjennetegnes ved høy telomeraseaktivitet. Unormale eller forminskede nivåer av hTRT-genprodukter kan resultere for eksempel i utilstrekkelig eller unormal produksjon av spermier, som fører til infertilitet eller reproduksjonsforstyrrelser. «Telomerase-basert» infertilitet kan følgelig behandles ved å benytte de her beskrevne metoder og blandinger til å øke telomerasenivåer. Siden inhibering av telomerase kan ha negativ innvirkning på spermatogenese, oogenese og levedyktigheten av spermier og egg, kan de telomerase-inhiberende blandingene ifølge oppfinnelsen likeledes ha kontraseptive effekter når de benyttes for å redusere hTRT-genproduktnivåer i kimlimjeceller.

Fremgangsmåter og blandinger kan også være egnet for nedsettelse av det proliferative potensialet av telomerase-positive celler, så som aktiverte lymfocytter og hematopoetiske stamceller, ved å redusere telomeraseaktivitet. Det kan således bevirkes immunsuppresjon. Fremgangsmåtene og reagensene ifølge oppfinnelsen egnet til å øke telomeraseaktivitet og det proliferative potensialet i celler, som f.eks. stamceller, som uttrykker et lavt telomerasenivå eller ingen telomerase før det terapeutiske inngrep.

D) INNGREPSMÅTER

Som det fremgår av diskusjonen hittil, kan modulering av telomerasenivået eller av en celles telomeraseaktivitet, ha en sterk effekt på cellens proliferative potensiale og således være til stor nytte ved behandling av sykdom. Det er også klart at denne modulering kan være enten en minskning av telomeraseaktivitet eller en økning av aktiviteten. De telomerasemodulerende molekylene kan virke gjennom en rekke mekanismer, hvorav enkelte er beskrevet i denne og de etterfølgende underavsnitt for å bidra til valget av terapeutiske midler. Søkerne mener imidlertid ikke å begrense de her beskrevne nye terapeutiske forbindelser, blandinger og fremgangsmåter, til noen bestemt virkningsmekanisme.

Telomeraseaktivitet kan minskes gjennom flere mekanismer eller kombinasjoner av mekanismer. En mekanisme er reduksjonen av hTRT-genekspresjonen for å redusere telomeraseaktivitet. Denne reduksjon kan skje på nivået for transkripsjon av hTRT-genet til mRNA, prosessering (f.eks. spleising), nukleær transport eller stabilitet av mRNA, translasjon av mRNA for å produsere hTRT-protein, eller stabilitet og funksjon av hTRT-protein. En annen mekanisme er inngrep i én eller flere av virkningene av telomerase (f.eks. den katalytiske aktivitet av revers transkriptase eller den hTR-bindende aktivitet) ved å benytte inhiberende nukleinsyrer, polypeptider eller andre midler (f.eks. mimetika, små molekyler, medikamenter og prodrugs) som kan identifiseres ved å benytte fremgangsmåten eller som bevirkes av her beskrevne blandinger. Andre mekanismer omfatter sekvestrering av hTR og/eller telomerase-assosierte proteiner og interferens med sammensetningen av telomerase RNP og dens komponent-subenheter. I henhold til en beslektet mekanisme kobles en hTRT-promotersekvens operativt til et gen som koder for et toksin, og innføres i en celle. Dersom, eller når, hTRT-transkripsjonsaktivatorer uttrykkes eller aktiveres i cellen, vil toksinet bli uttrykt og resultere i spesifikt celledrap.

En beslektet metode for å redusere en celles proliferative kapasitet består i å innføre en hTRT-variant med lav pålitelighet (dvs. en variant med høy, f.eks. mer enn 1% feilrate) slik at det syntetiseres abberante telomere repetisjoner. Disse abberante repetisjonene påvirker telomer proteinbinding og fører til kromosomale omleiringer og abberasjoner og/eller fører til celledød.

Tilsvarende kan telomeraseaktivitet økes gjennom én av flere mekanismer, eller en kombinasjon av mekanismer. Disse innbefatter økning av mengden av hTRT i en celle. Vanligvis utføres dette ved å innføre et hTRT-polypeptid-kodende polynukleotid i cellen (f.eks. et rekombinant fremstillet polypeptid omfattende en hTRT DNA-sekvens operativt koblet til en promoter, eller en stabil hTRT mRNA). Alternativt kan et katalytisk aktivt hTRT-polypeptid selv innføres i en celle eller et vev, feks. ved mikroinjeksjon eller på annen kjent måte. 1 henhold til andre mekanismer kan ekspresjon fra det endogene hTRT-gen eller stabiliteten av hTRT-genproduktene i cellen økes. Telomeraseaktivitet i en celle kan også økes ved inngrep i interaksjonen mellom de endogene telomerase-inhibitorer og telomerase RNP eller endogene hTRT transkripsjonsrepressorer og hTRT-genet; ved å øke ekspresjon eller aktivitet av hTRT transkripsjonsaktivatorer og andre måter som ut fra denne beskrivelse vil være åpenbare for fagmannen.

E) INTERVENSJONSMIDLER

1) TRT-PROTEINER & PEPTIDER

Oppfinnelsen muliggjør telomerase-modulerende polypeptider (dvs.proteiner, polypeptider og peptider) som øker eller reduserer telomeraseaktivitet, som kan innføres direkte i en målcelle (f.eks. ved injeksjon, liposom-mediert fusjon, påføring av en hydrogel på tumoren [f.eks. melanom] overflaten, fusjon eller tilkobling til herpesvirus strukturprotein VP22, samt andre her beskrevne kjente måter). Det uttrykkes telomerasemodulerende proteiner og peptider i en celle ved å innføre en nukleinsyre (f.eks. en DNA-ekspresjonsvektor eller mRNA) som koder for det ønskede protein eller peptid i cellen. Ekspresjon kan være enten konstitutiv eller induserbar avhengig av vektoren og valget av promoter (se diskusjon nedenfor). Budbringer RNA-preparater som koder for hTRT er spesielt anvendelige når det bare ønskes forbigående ekspresjon (f.eks. forbigående aktivering av telomerase). Metoder for innføring og ekspresjon av nukleinsyrer i en celle er velkjent på området (se for øvrig ellers i denne beskrivelse, f.eks. avsnitt om oligonukleotider, genterapimetoder).

Telomerasemodulerende polypeptid som øker telomeraseaktiviteten i en celle inkluderer et katalytisk aktivt hTRT-polypeptid som er i stand til å styre syntesen (sammen med en RNA-templat som hTR) av human telomer DNA. Denne aktivitet kan som omtalt ovenfor, måles, f.eks. ved å benytte en telomeraseaktivitetstest, så som en TRAP-test. I én utførelsesform er polypeptidet et full lengde hTRT-protein som har en sekvens tilnærmet identisk med sekvensen av 1132 restene av SEKV. ID. NR:2.1 en annen utførelsesform er polypeptidet en variant av hTRT-proteinet av SEKV. ID. NR:2, så som et fusjonspolypeptid, derivatisert polypeptid, trunkert polypeptid, konservativt substituert polypeptid, aktivitets-modifisert polypeptid eller lignende. En fusjon eller et derivatisert protein kan innbefatte en målsøkende del som øker polypeptidets evne til å gjennombore en cellemembran eller forårsake at polypeptidet fortrinnsvis avgis til en bestemt celletype (f.eks. leverceller eller tumorceller) eller celleområde (f.eks. kjerneområde). Eksempler på målsøkende deler er lipidhaler, aminosyresekvenser, så som «antennapoedia» peptid eller et nukleært lokaliseringssignal (NLS; f.eks. Xenopus nukleoplasmin, Robbins et al., 1991, Cell 64:615). Naturlig forekommende hTRT-protein (f.eks. som har en sekvens som, eller tilnærmet identisk med, SEKV. ID. NR:2) virker i cellekjernen. Det er derfor sannsynlig at én eller flere subsekvenser av SEKV. ID. NR:2, så som restene 193-196 (PRRR) og restene 235-240 (PKRPRR) virker som et nukleært lokaliseringssignal. De små regionene er sannsynligvis NLS-grupper ut fra den observasjon at mange NLS-grupper omfatter et 4 resters mønster sammensatt av basiske aminosyrer (K eller R), eller sammensatt av 3 basiske aminosyrer (K eller R) og H eller P; et mønster som starter med P og etterfølges i løpet av 3 rester med et basisk segment inneholdende 3 K eller R rester av i alt 4 rester (se f.eks. Nakai et al., 1992, Genomics 14:897). Delesjon av den ene eller begge disse sekvensene og/eller ytterligere lokaliserings-sekvenser forventes å gripe inn i hTRT-transporten til kjernen og/eller øke hTRT-omsetningen og er egnet til å forhindre tilgang av telomerase til dens nukleære substrater og senke proliferasjonspotensialet. Dessuten kan en hTRT-polypeptidvariant som mangler NLS settes sammen til et RNP som ikke vil være i stand til å opprettholde telomerlengde fordi det resulterende enzym ikke kan komme inn i kjernen.

I alminnelighet vil hTRT-polypeptidene ifølge oppfinnelsen assosieres i målcellen med en telomerase RNA, så som hTR, spesielt når de benyttes til å øke telomeraseaktivitet i en celle. Et innført hTRT-polypeptid kan assosieres med et endogent hTR for å danne et katalytisk aktivt RNP (f.eks. et RNP som omfatter hTR og et full lengde polypeptid som har en sekvens med SEKV. ED. NR:2). Det således dannede RNP kan også assosiere med andre, f.eks. telomerase-assosierte proteiner. Alternativt kan telomerase RNP (som inneholder hTRT-protein, hTR og eventuelt andre komponenter) innføres som et kompleks til målcellen.

En hTRT-ekspresjonsvektor innføres i en celle (eller avkommet av en celle) som en telomerase RNA (f.eks. hTR) ekspresjonsvektor samtidig, deretter eller tidligere er innført i. hTRT-protein og telomerase RNA koeksprimeres i cellen og settes sammen under dannelse av et telomerase RNP. En foretrukket telomerase RNA er hTR. En ekspresjonsvektor som egner seg for ekspresjon av hTR i en celle er beskrevet ovenfor (se US-patent 5.583.016). Alternativt assosieres hTRT-polypeptidet og hTR RNA (eller tilsvarende) in vitro for å danne et kompleks som så innføres i målcellene, f.eks. ved liposom-mediert overføring.

Noen hTRT-polypeptider kan være egnet til å redusere telomeraseaktivitet i en celle. Som ovenfor kan disse «inhiberende» polypeptider innføres direkte eller ved ekspresjon av rekombinante nukleinsyrer i cellen. Peptidmimetika eller polypeptider om omfatter uvanlige aminosyrer (dvs. andre enn de 20 aminosyrene som kodes av den genetiske kode eller deres normale derivater) vil i alminnelighet bli innført direkte.

Inhibering av telomeraseaktivitet kan være et resultat av sekvestrering av en komponent som er nødvendig for nøyaktig telomer-forlengelse. Eksempler på slike komponenter er hTRT og hTR. Administrering av et polypeptid som binder hTRT, men som ikke har telomerase katalytisk aktivitet, kan således redusere endogen telomeraseaktivitet i cellen. Alternativt kan hTRT-polypeptidet binde en annen cellekomponent enn hTR, som f.eks. én eller flere telomerase-assosierte proteiner, og derved interferere med telomeraseaktiviteten i cellen.

Derfor forstyrrer enkelte hTRT-polypeptider interaksjonen mellom endogent uttrykt hTRT-protein (f.eks. ved konkurranse) og en annen cellekomponent som trengs for telomerasefunksjon, så som hTR, telomer DNA, telomerase-assosierte proteiner, telomer-assosierte proteiner, telomerer, cellecyklus-kontrollproteiner, DNA-reparasjonsenzymer, histon eller ikke-histon-kromosomale proteiner eller andre.

Ved valg av molekyler (f.eks. polypeptider) som påvirker interaksjonen mellom endogent uttrykt hTRT-protein og andre cellekomponenter, vil man kunne foretrekke molekyler som innbefatter ett eller flere av de her beskrevne konserverte motiver av hTRT-proteinet. Den evolusjonære konservering av disse regioner antyder den viktige funksjon som disse motiver bidrar med for riktig funksjon av human telomerase, og motivene er således generelt egnede seter for endring av hTRT-proteinfunksjon for å frembringe hTRT-proteinvairantene. Således vil hTRT-polypeptidvarianter som har mutasjoner i konserverte motiver, være særlig nyttige for enkelte anvendelser.

Ekspresjon av det endogene hTRT-gen undertrykkes ved at det i cellen innføres en stor del hTRT-polypeptid (f.eks. i alminnelighet minst ca. 2 ganger mer, oftere minst ca. 10 til ca. 100 ganger mer enn det endogene nivå) som virker via en tilbakekoblingssløyfe for å inhibere transkripsjon av hTRT-genet, prosessering av hTRT-pre-mRNA, translasjon av hTRT-mRNA eller sammensetning og transport av telomerase RNP.

2) OLIGONUKLEOTIDER

a) ANTISENSE-KONSTRUKSJONER

Fremgangsmåter og antisense-oligonukleotid- eller polynukleotidreagenser kan

benyttes til å redusere ekspresjon av hTRT-genprodukter in vitro eller in vivo. Administrering av antisense-reagensene til en målcelle resulterer i redusert telomerase-aktivitet og er særlig egnet for behandling av sykdommer som kjennetegnes av høy telomeraseaktivitet (f.eks. cancere). Selv om det ikke er meningen å være bundet til noen bestemt mekanisme, antas det at antisense-oligonukleotider binder til og griper inn i translasjonen av sense hTRTmRNA.

Alternativt kan antisense-molekylet gjøre hTRT mRNA følsomt for nuklease-oppslutning, forstyrre transkripsjon, forstyrre prosessering, lokalisering eller på annen måte av RNA-forløpere («pre-mRNA»), undertrykke transkripsjon av mRNA fra hTRT-genet eller virke via en annen mekanisme. Hvilken bestemt mekanisme som antisense-molekylet reduserer hTRT-ekspresjon etter, er imidlertid ikke avgjørende.

Antisense-polynukleotidene omfatter en antisense-sekvens på minst 7 til 10 opptil typisk 20 eller flere nukleotider som spesifikt hybridiserer til en sekvens fra mRNA som koder for hTRT eller mRNA, transkribert fra hTRT-genet. Oftere har antisense-polynukleotidet en lengde fra ca. 10 til ca. 50 nukleotider eller fra ca. 14 til ca. 35 nukleotider. Antisense-polynukleotider kan være polynukleotider på mindre enn ca. 100 nukleotider eller mindre enn ca. 200 nukleotider. Generelt bør antisense-polynukleotidet være tilstrekkelig langt til å danne en stabil dupleks, men tilstrekkelig kort, og avhengig av administrasjonsmåle, til eventuelt å administreres in vivo. Den minste polynukleotidlengde som fordres for spesifikk hybridisering til en målsekvens, avhenger av flere faktorer, så som G/C-innhold, posisjonering av ikke-overensstemmende baser (om forekommende), grad av sekvens-unikhet sammenlignet med populasjonen av mål-polynukleotider og av polynukleotidets kjemiske natur (f.eks. metylfosfonat-skjelett, peptidnukleinsyre, fosfortioat) blant andre faktorer.

For å sikre spesifikk hybridisering er antisense-sekvensen i alminnelighet tilnærmet komplementær med hTRT-målsekvensen. Antisense-sekvensen kan være eksakt komplementær med målsekvensen. Antisense-polynukleotidene kan imidlertid også innbefatte nukleotidsubsti tusj oner, addisjoner, delesjoner, transisjoner, transposisjoner eller modifikasjoner eller andre nukleinsyresekvenser eller ikke-nukleinsyredeler så lenge spesifikk binding til den relevante målsekvens tilsvarende hTRT RNA, eller dets gen, opprettholdes som en funksjonell egenskap ved polynukleotidet.

Antisense-sekvensen kan være komplementær med relativt tilgjengelige sekvenser av hTRT mRNA (f.eks. relativt fri for sekundærstruktur). Dette kan bestemmes ved å analysere predikerte RNA sekundærstrukturer ved for eksempel å benytte MFOLD programmet (Genetics Computer Group, Madison WI) og in vitro eller in vivo testing på kjent måte. Eksempler på oligonukleotider som kan testes for antisense-suppresjon av hTRT-funksjon i celler, er de som er i stand til å hybridisere til (dvs. er tilnærmet komplementære med) følgende posisjoner fra SEKV. ID. NR.1: 40-60; 260-280; 500-520; 770-790; 885-905; 1000-1020; 1300-1320; 1520-1540; 2110-2130; 2295-2315; 2450-2470; 2670-2690; 3080-3110; 3140-3160 og 3690-3710. En annen egnet metode for å identifisere effektive antisense-blandinger gjør bruk av kombinasjonsrekker av oligonukleotider (se f.eks. Milner et al., 1997, Nature Biotechnology 15:537).

Antisense-polynukleotid kan ha sekvenser i tillegg til antisense-sekvensen (dvs. i tillegg til anti-hTRT sense-sekvens). I så fall inngår antisense-sekvensen i et polynukleotid med lenger sekvens. Polynukleotidsekvensen kan bestå i det vesentlige av, eller er, antisense-sekvensen.

Antisense-nukleinsyrene (DNA, RNA, modifiserte, analoger og lignende) kan fremstilles ved å benytte en hvilken som helst egnet metode for å produsere en nukleinsyre, så som kjemisk syntese og her omtalte rekombinante metoder. For eksempel kan antisense RNA-molekyler fremstilles ved de novo kjemisk syntese eller ved kloning. For eksempel kan en antisense RNA som hybridiserer til hTRT mRNA, fremstilles ved å innføre (Iigering) en hTRT DNA-sekvens (f.eks. SEKV. ED. NR:1, eller et fragment derav) i omvendt orientering, operativt koblet til en promoter i en vektor (f.eks. plasmid). Forutsatt at promoteren og, fortrinnsvis terminerings- og polyadenylerings-signaler, er riktig anbragt, vil kjeden av den innskutte sekvens som tilsvarer den ikke-kodende kjede, bli transkribert og virke som et antisense-oligonukleotid.

Antisense-oligonukleotidene kan benyttes til å inhibere telomeraseaktivitet i cellefrie ekstrakter, celler og dyr, inklusivt pattedyr og mennesker. For eksempel kan fosfortioat-antisense-oligonukleotidene: benyttes for å inhibere telomeraseaktivitet. Ved konsentrasjon på 10 mikromolar inhiberte hvert oligonukleotid blandinger av oligonukleotidene A og B; A, B, C og D; samt A, C, og D telomeraseaktivitet i 293 celler når disse ble behandlet én gang per dag i 7 dager. Inhibering ble også observert når et antisense hTR-molekyl (5'-GCTCTAGAATGAAGGGTG-3') ble benyttet i kombinasjon med oligonukleotidene A, B, og C; A B, og D; og A og C. Egnede kontrolloligonukleotider i slike forsøk inkluderer:

For å bestemme det optimale antisense oligonukleotid for den aktuelle anvendelse, kan man foreta en skanning ved å benytte antisense oligonukleotidsett. Et illustrerende sett er det sett av 30-mer oligonukleotider som strekker seg over hTRT mRNA og er forskjøvet ett nukleotid fra de neste 15 nukleotider (dvs. ON1 tilsvarer posisjonene 1-30 og er TCCCACGTGCGCAGCAGGACGCAGCGCTGC, ON2 tilsvarer posisjonene 16-45 og er GCCGGGGCCAGGGCTTCCCACGTGCGCAGC, og ON3 tilsvarer posisjonene 31-60 og er GGCATCGCGGGGGTGGCCGGGCCAGGGCT og så videre til slutten av mRNA). Hvert ledd i dette sett kan testes på inhiberende aktivitet som her beskrevet. De oligonukleotidene som oppviser inhiberende virkning under de aktuelle betingelser, identifiserer da en region av interesse, og andre oligonukleotider tilsvarende regionen av interesse (dvs. 8-merer, 10-merer, 15-merer og så videre) kan testes for å identifisere oligonukleotidet med den foretrukne aktivitet for anvendelsen.

Med hensyn til generelle metoder angående antisense polynukleotider, se Antisense RNA and DNA, (1988), D.A. Melton, red. Cold Spring Harbor Labooratory, Cold Spring Harbor,NY). Se også Dagle et al., 1991, Nucleic Acids Research, 19:1805. For en oversikt angående antisense terapi, se f.eks. Uhlmann et al., Chem. Reviews, 90:543-584 (1990).

b) TRIPLEKS OLIGO- OG POLYNUKLEOTIDER

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer oligo- og polynukleotider (f.eks. DNA, RNA,

PNA eller lignende) som binder til dobbeltkjedede eller dupleks hTRT-nukleinsyrer (f.eks. i en foldet region av hTRT RNA eller i hTRT-genet), under dannelse av en trippelheliks-holdig eller «tripleks»-nukleinsyre. Trippel-heliksdannelse resulterer i inhibering av hTRT-ekspresjon ved for eksempel å forhindre transkripsjon av hTRT-genet, hvorved telomeraseaktiviteten i en celle redusereres eller elimineres. Selv om det ikke er meningen å være bundet til noen bestemt mekanisme, antas det at trippelheliks-paring umuliggjør dobbeltheliksens evne til å åpnes tilstrekkelig til at det kan inntre binding av polymeraser, transkripsjons-faktorer eller regulerende molekyler.

Tripleksoligo- og polynukleotider ifølge oppfinnelsen konstrueres ved å benytte baseparingsreglene for trippelheliksdannelse (se f.eks. Cheng et al, 1988, J. Biol. Chem. 263:15110; Ferrin & Camerini-Otero, 1991, Science 354:1494; Ramdas et al, 1989, J. Biol. Chem. 264:17395; Strobel et al, 1991, Science 254:1639; og Rigas et al, 1986, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 83:9591; som samtlige herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse) og hTRT mRNA og/eller gensekvensen. De tripleks-dannende oligonukleotidene omfatter i alminnelighet en spesifikk sekvens på fra ca. 10 til minst ca. 25 nukleotider eller lengre, som er «komplementære» med en spesifikk sekvens i hTRT RNA eller genet (dvs. tilstrekkelig stor til å danne en stabil trippelheliks, men tilstrekkelig liten, avhengig av administrasjonsmåte, til eventuelt å administreres in vivo). I denne sammenheng betyr «komplementær» i stand til å danne en stabil trippelheliks. Oligonukleotidene kan være konstruert for å binde spesifikt til de regulerende regioner av hTRT-genet (f.eks. den hTRT-5'-flankerende sekvens, promotere og enhancere) eller til transkripsjons-initieringssetet (f.eks. mellom -10 og +10 fra transkripsjons-initieringssetet). Angående en oversikt over nylige terapeutiske fremskritt ved bruk av tripleks-DNA, se Gee et al, i Huber & Carr, 1994, MOLECULAR AND EMMUNOLOGIC APPROACHES, Futura Publishing Co., Mt Kisco NY og Rininsland et al, 1997, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 94:5854, som begge herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse.

c) RIBOZYMER

Ribozymer som egner seg for inhibering av telomeraseaktivitet beskrives. Ribozymene

binder og spalter og inaktiverer spesifikt hTRT mRNA. Egnede ribozymer kan omfatte 5'- og 3'-terminale sekvenser som er komplementære til hTRT mRNA og kan konstrueres av fagmannen på grunnlag av de hTRT mRNA-sekvenser som her er angitt (se PCT publikasjon WO 93/23572, ovenfor). Ribozymer ifølge oppfinnelsen omfatter de som har karakteristi-kaene til gruppe I intron ribozymer (Cech, 1995, Biotechnology 13:323) og andre hammer-hoderibozymer (Edgington, 1992, Biotechnology 10:256).

Ribozymene innbefatter slike som har spaltningsseter som f.eks. GUA, GUU og GUC. Andre optimale spaltningsseter for ribozym-mediert inhibering av telomeraseaktivitet omfatter de som er beskrevet i PCT publikasjon WO 94/02595 og WO 93/23569 som begge herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse. Korte RNA-oligonukleotider med lengde på 15 og 20 ribonukleotider som tilsvarer den region av hTRT-målgenet som inneholder spaltningssetet, kan vurderes med henblikk på sekundærstrukturtrekk som kan gjøre oligonukleotidet mer ønskelig. Spaltnings-setenes egnethet kan også vurderes ved å teste muligheten til hybridisering med komplementære oligonukleotider ved å benytte ribo-nukleasebeskyttelsestester eller ved å teste for in vitro ribozymaktivitet i overensstemmelse med kjente standardprosedyrer.

Som beskrevet av Hu et al., PCT publikasjon WO 94/03596, som herved refereres i foreliggende beskrivelse, kan antisense- og ribozym-funksjoner kombineres i et enkelt oligonukleotid. Ribozymer kan dessuten omfatte én eller flere modifiserte nukleotider eller modifiserte koblinger mellom nukleotider, som beskrevet ovenfor i sammenheng med beskrivelsen av illustrerende antisense-oligonukleotider.

Ribozymene kan utvikles in vitro og innføres i en celle eller pasient. Genterapeutiske metoder kan benyttes for ekspresjon av ribozymer i en målcelle ex vivo eller in vivo.

d) ADMINISTRERING AV OLIGONUKLEOTIDER

I alminnelighet involverer de terapeutiske metodene administrering av et oligonukleotid

som bevirker inhibering eller stimulering av telomeraseaktivitet under fysiologiske in vivo betingelser og som er relativt stabilt under disse betingelsene i tilstrekkelig lang tid for en terapeutisk effekt. Som nevnt ovenfor kan modifiserte nukleinsyrer være egnet til å gi slik stabilitet så vel som til målrettet avgivelse av oligonukleotidet til ønsket vev, organ eller celle.

Oligo- og polynukleotider kan avgis direkte som et medikament i en egnet farmasøytisk formulering, eller indirekte ved å innføre en nukleinsyre i en celle, inklusivt liposomer, immunliposomer, ballistiske midler, direkte opptak i cellen og lignende som her beskrevet. For behandling av sykdom vil oligonukleotidene ifølge oppfinnelsen bli administrert til en pasient i en terapeutisk effektiv mengde. En terapeutisk effektiv mengde er en mengde som er tilstrekkelig til å lindre sykdommens symptomer eller modulere telomeraseaktivitet i målcellen, f.eks. målt ved å benytte en TRAP-test eller annen egnet test på biologisk telomerasefunksjon. Egnede metoder for avgivelse av oligonukleotider for terapeutiske formål er beskrevet i US-patent 5.272.065 som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse. Andre enkeltheter ved administrering av farmasøytisk aktive forbindelser er angitt nedenfor. Oligo- og polynukleotider kan avgis ved bruk av genterapi og rekombinante DNA-ekspresjonsplasmider ifølge oppfinnelsen.

3) GENTERAPI

Med genterapi menes innføring av et ellers eksogent polynukleotid som gir en medisinsk nyttig fenotypisk effekt i de (typisk) pattedyrceller som det overføres til. Det beskrives genterapimetoder og blandinger for behandling av telomerase-assosierte tilstander. Genterapi involverer innføring av en vektor som uttrykker et hTRT-genprodukt (så som et hTRT-protein som er tilnærmet likt det hTRT-polypeptid som har sekvensen ifølge SEKV. ID. NR:2, f.eks. for å øke telomeraseaktivitet, eller et inhiberende hTRT-polypeptid for å redusere aktivitet) i en celle, uttrykker en nukleinsyre som har et hTRT-gen eller en mRNA-sekvens (så som en antisense-RNA, f.eks. for å redusere telomeraseaktivitet), uttrykker et polypeptid eller polynukleotid som ellers påvirker ekspresjon av hTRT-genprodukter (f.eks. et ribozym rettet mot hTRT mRNA for å redusere telomeraseaktivitet) eller erstatter eller river opp en endogen hTRT-sekvens (f.eks. henholdsvis gen-erstatning og «gene knock out»). En rekke andre utførelsesformer vil være åpenbare for fagmannen ved gjennomgang av foreliggende beskrivelse. Alternativt innføres også en vektor som koder for hTR. Også vektorer som koder for telomerase-assosierte proteiner med eller uten en vektor for hTR kan innføres.

Egnede vektorer ved hTRT-genterapi kan være virale eller ikke-virale og innbefatte de som ovenfor er beskrevet i sammenheng med hTRT-ekspresjonssystemene. Det vil være klart for fagmannen at genterapivektorer kan omfatte promotere og andre regulerende eller prosesserende sekvenser, som f.eks. omtalt i denne beskrivelse. Vanligvis vil vektoren omfatte en promoter og eventuelt en enhancer (separat i forhold til en hvilken som helst av de som inngår i promotersekvensene) som tjener til å styre transkripsjon av et oligoribonukleotid, så vel som andre regulatorelementer som eventuelt sørger for episomalt oppretthold eller kromosomal integrasjon og for høynivå transkripsjon. Et egnet plasmid for genterapi kan omfatte andre funksjonelle elementer, så som selekterbare markører, identifiserende regioner og andre sekvenser. De ytterligere sekvensene kan bidra til å gi stabilitet både utenfor og inne i en celle, målrette avgivelse av hTRT-nukleotidsekvenser (sense eller antisense) til et bestemt organ, vev eller en cellepopulasjon, mediere adkomsten til en celle, mediere adkomst til cellekjernen og/eller mediere integrasjon innen en nukleær DNA. For eksempel kan aptamer-lignende DNA-strukturer eller andre seter for proteinbindende deler benyttes for å mediere binding av en vektor til celleoverflatereseptorer eller til serumproteiner som binder til en reseptor og derved øker effektiviteten av DNA-overføring til cellen. Andre DNA-seter og strukturer kan binde direkte eller indirekte til reseptorer i kjernemembranen eller til andre proteiner som går inn i kjernen og derved lette nukleært opptak av en vektor. Andre DNA-sekvenser kan direkte eller indirekte påvirke integrasjonseffektiviteten.

Egnede genterapivektorer kan eventuelt ha et replikasjonsorigo. Det er for eksempel nyttig å inkludere et replikasjonsorigo i en vektor for formering av vektoren før administrering til en pasient. Dette replikasjonsorigo kan imidlertid ofte fjernes før administrering dersom vektoren er konstruert for å integreres i vertens kromosomale DNA eller binde til vertens mRNA eller DNA. I enkelte situasjoner (for eksempel i tumorceller) kan det være unødvendig at det eksogene DNA integreres stabilt inn i den transduserte celle, fordi forbigående ekspresjon kan være tilstrekkelig til å drepe tumorcellene.

Det beskrives også fremgangsmåter og reagenser for gen-erstatningsterapi (dvs. erstatning ved homolog rekombinasjon av et endogent hTRT-gen med et rekombinant gen). Vektorer spesifikt konstruert for integrasjon ved homolog rekombinasjon kan benyttes. Viktige faktorer for optimalisering av homolog rekombinasjon er bl.a. graden av sekvensidentitet og lengden av homologi med kromosomale sekvenser. Den spesifikke sekvens som medierer homolog rekombinasjon er også viktig fordi integrasjon skjer betydelig lettere i transkripsjonen aktiv DNA. Fremgangsmåter og materialer for konstruering av homologe målkonstruksjoner er beskrevet f.eks. av Mansour et al, 1988, Nature 336:348; Bradley et al, 1992, Bio/Technology 10:534. Se også US-patent 5.627.059; 5.487.992; 5.631.153 og 5.464.764. Generstatningsterapi kan involvere endring eller erstatning av alle eller en del av de regulator-sekvensene som styrer ekspresjon av det hTRT-gen som skal reguleres. For eksempel kan hTRT-promotersekvensene (f.eks. slike som forekommer i SEKV. ED. NR:6) opprives for å minske hTRT-ekspresjon eller for å oppheve et transkripsjonskontrollsete) eller kan en eksogen promoter substitueres (f.eks. for å øke hTRT-ekspresjon).

Fremgangsmåter og reagenser for hTRT «gene knock oub> involverer delesjon eller opplivning ved homolog rekombinasjon av et endogent hTRT-gen under bruk av en rekombinant produsert vektor. Ved gen-utslokning kan den målsøkte sekvens være regulator-sekvenser (f.eks. hTRT-promoteren) eller RNA eller proteinkodende sekvenser. Bruken av homolog rekombinasjon for å endre ekspresjon av endogene gener er detaljert beskrevet i US-patent 5.272.071 (og de ovenfor omtalte US-patenter), WO 91/09955, WO 93/09222,

WO 96/29411, WO 95/31560 og WO 91/12650. Se også Moynahan et al, 1996, Hum. Mol. Genet. 5:875.

Fremgangsmåter for spesifikt å drepe telomerase-positive celler eller forhindre transformasjon av telomerasenegative celler til en telomerasepositiv tilstand, involverer å benytte hTRT-genpromoteren til å regulere ekspresjon av et protein som er toksisk for cellen. Som vist i Eksempel 14 kan en hTRT-promotersekvens kobles operativt til et rapportørgen slik at aktivering av promoteren resulterer i ekspresjon av det protein som kodes av rapportørgenet. Dersom, i stedet for et rapportørprotein, det kodede protein er toksisk for cellen, fører aktivering av promoteren til cellemorbiditet eller død. En vektor som omfatter en hTRT-promoter operativt koblet til et gen som koder for et toksisk protein kan innføres i celler, så som humane celler, f.eks. celler i en pasient, som resulterer i celledød av celler hvor det uttrykkes hTRT-promoteraktiverende faktorer, så som cancerceller. Alternativt er det kodede protein ikke selv toksisk for cellen, men utløser en aktivitet som gjør cellen følsom for et ellers ikke-toksisk medikament. For eksempel kan tumorer behandles ved innføring av en genfusjonskonstruksjon av en hTRT-promoter-herpes-tymidinkinase (TK) i tumorceller og administrere gancyklovir eller tilsvarende (se f.eks. Moolton & Wells, 1990, J. Nat'1 Canc. Inst. 82:297). Det er på området kjent en lang rekke andre egnede toksiske eller potensielt toksiske proteiner og systemer (ved å benytte andre promotersekvenser enn hTRT) som kan modifiseres og anvendes av fagmannen etter gjennomgang av denne beskrivelse.

Genterapivektorer kan innføres i celler eller vev in vivo, in vitro eller ex vivo. For ex vivo terapi kan vektorer innføres i celler, f.eks. stamceller, tatt fra pasienten og ved kloning formert for autolog transplantasjon tilbake i samme pasient (se f.eks. US-patent 5.399.493 og 5.437.994, som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse). Celler som kan målsøkes for hTRT-genterapi som har til hensikt å øke telomeraseaktiviteten av en målcelle, innbefatter, men er ikke begrenset til, embryoniske stam- eller kimceller, særlig primat- eller humanceller, som nevnt ovenfor, hematopoetiske stamceller (AIDS og post-kjemoterapi) vaskulære endotelceller (kardiell og cerebral vaskulær sykdom), hudfibroblaster og basale hudkeratinocytter (sårtilheling og forbrenninger), kondrocytter (artritt), hjemeastrocytter og mikrogliaceller (Alzheimers sykdom), osteoblaster (osteoporose), retinaceller (øyesykdommer) og pankreatiske øyceller (Type I diabetes) og en hvilken som helst av de celler som er angitt i Tabell 3 så vel som en hvilken som helst annen celletype som man vet deler seg.

En induserbar promoter operativt koblet til en TRT-, så som hTRT-kodende sekvens (eller variant) kan benyttes for å modulere cellers proliferative kapasitet in vivo eller in vitro. I en særlig utførelsesform innføres for eksempel insulinproduserende pankreasceller som er transfektert med en hTRT-ekspresjonsvektor under kontroll av en induserbar promoter, i en pasient. Cellenes proliferative evne kan deretter kontrolleres ved å administrere pasienten det promoteraktiverende middel (f.eks. tetracyklin) for å gjøre cellene i stand til å formere seg mer enn hva som ellers ville ha vært mulig. Celleproliferasjon kan deretter avbrytes, fortsettes eller reinitieres etter behov av behandlende lege.

4) VAKSINER OG ANTISTOFFER

Immunogene peptider eller polypeptider som har en hTRT-sekvens kan benyttes for å frembringe en anti-hTRT-immunrespons i en pasient (dvs. virke som en vaksine). Eksempler på immunogene hTRT-peptider og polypeptider er beskrevet nedenfor i Eksempel 6 og 8. En immunrespons kan også fremkalles ved å avgi plasmidvektorer som koder for det aktuelle polypeptid (dvs. administrasjon av «naken DNA»). De aktuelle nukleinsyrene kan gis ved injeksjon, liposomer eller annen administrasjonsmåte. I én utførelsesform velges immuniseirngsmåter som i vedkommende individ frembringer en klasse I MHC-begrenset cytotoksisk lymfocytt-respons mot telomerase-uttrykkende celler. Etter immuniseringen vil vedkommende individ eller dyr utløse en forhøyet immunrespons mot celler som uttrykker høye telomerasenivåer (f.eks. maligne celler).

Anti-hTRT-antistoffer, f.eks. murine, humane eller humaniserte monoklonale antistoffer, kan også administreres til en pasient (f.eks. passiv immunisering) for å frembringe en immunrespons mot telomerase-uttrykkende celler.

F) FARMASØYTISKE BLANDINGER

I henhold til beslektede aspekter tilveiebringer oppfinnelsen farmasøytiske blandinger som omfatter hTRT-oligo- og polynukleotider, polypeptider og antistoffer, agonister, antagonister eller inhibitorer, alene eller i kombinasjon med minst ett annet middel, så som en stabiliserende forbindelse, et fortynningsmiddel, en bærer eller et annet virkestoff eller middel.

De terapeutiske midlene ifølge oppfinnelsen kan administreres i en hvilken som helst steril bioforlikelig farmasøytisk bærer, inklusivt, men ikke begrenset til, saltvann, bufferholdig saltvann, dekstrose og vann. Disse molekylene kan administreres til en pasient, eller i kombinasjon med andre midler, medikamenter eller hormoner, i farmasøytiske blandinger hvor de blandes med egnede hjelpestoffer, adjuvanser og/eller farmasøytisk akseptable bærere. I én utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er den farmasøytisk akseptable bærer farmasøytisk inert.

Administrering av farmasøytiske blandinger foretas peroralt eller parenteralt. Fremgangsmåter for parenteral administrering innbefatter topisk, intraarteriell (f.eks. direkte til tumoren), intramuskulært, subkutant, intrameduUært, intratekalt, intraventirkulært, intravenøst, intraperitonealt eller intranasalt. I tillegg til virkestoffene kan disse farmasøytiske blandingene inneholde passende farmasøytisk akseptable bærere som omfatter hjelpestoffer og andre forbindelser som letter prosesseringen av virkestoffene inn i preparater som kan benyttes farmasøytisk. Ytterligere detaljer angående teknikker for formulering og administrering finnes i siste utgave av «Remingtons Pharmaceutical Sciences» (Mack Publishing Co., Easton, PA).

Farmasøytiske blandinger for peroral administrering kan formuleres ved å benytte velkjente farmasøytisk akseptable bærere i doser egnet for peroral administrering. Slike bærere gjør det mulig å formulere de farmasøytiske blandingene til tabletter, piller, drasjéer, kapsler, væsker, gel, siruper, oppslemminger, suspensjoner, etc. egnet for inntak av pasienten. Se PCT publikasjon WO 93/23572.

Farmasøytiske preparater for peroral bruk kan oppnås ved kombinasjon av virkestoffer med faste hjelpestoffer, eventuelt oppmaling av en resulterende blanding og bearbeidning av blandingen av granuler, eventuelt etter tilsetning av passende ytterligere forbindelser, for å oppnå tabletter eller drasjékjerner. Egnede hjelpestoffer er karbohydrat eller protein-fyllstoffer som innbefatter, men ikke er begrenset til, sukkere, inklusivt laktose, sukrose, mannitol eller sorbitol; stivelse fra mais, hvete, ris, potet eller andre planter; cellulose som f.eks. metylcellulose, hydroksypropyl-metylcellulose eller natriumkarboksymetylcellulose; samt gummier inklusivt gummi arabicum og tragant, så vel som proteiner som gelatin og kollagen. Dersom det er ønskelig kan det tilsettes sprengningsmidler eller solubiliseirngsmidler, som f.eks. kryssbundet polyvinylpyrrolidon, agar, alginsyre eller et salt derav, som f.eks. natriumalginat.

Det tilveiebringes drasjékjerner med egnede overtrekk, så som konsentrerte sukker-løsninger som også kan inneholde gummi arabicum, talk, polyvinylpyrrolidon, karbopol-gel, polyetylenglykol og/eller titandioksyd, lakk-løsninger og egnede organiske løsningsmidler eller løsningsmiddelblandinger. Tablett- eller drasje'-overtrekk kan tilsettes farvestoffer eller pigmenter for produktidentifikasjon eller for å angi mengden av virkestoff (dvs. dosering).

Farmasøytiske preparater som kan benyttes peroralt omfatter «push-fit» kapsler fremstillet av gelatin, så vel som myke forseglede kapsler fremstillet av gelatin og et overtrekk som glycerol eller sorbitol. «Push-fit» kapsler kan inneholde virkestoffer blandet med fyllstoff eller bindemidler, som f.eks. laktose eller stivelse, glattemidler så som talk eller magnesium-stearat og eventuelt stabilisatorer. I mykkapsler kan virkestoffet være løst opp eller suspendert i egnede væsker, som f.eks. fete oljer, flytende parafin eller flytende polyetylenglykol med eller uten stabilisatorer.

Farmasøytiske formuleringer for parenteral administrering innbefatter vandige virkestoffløsninger. For injeksjon kan de farmasøytiske blandingene ifølge oppfinnelsen formuleres i vandige løsninger, fortrinnsvis i fysiologisk forlikelige buffere, så som Hanks løsning, Ringers løsning eller fysiologisk buffret saltvann. Vandige injeksjonssuspensjoner kan inneholde substanser som øker suspensjonens viskositet, som f.eks. natriumkarboksymetylcellulose, sorbitol eller dekstran. I tillegg kan suspensjoner av virkestoffene fremstilles som passende oljebaserte injeksjonssuspensjoner. Egnede lipofile løsningsmidler eller bærere innbefatter fete oljer, så som sesamolje eller syntetiske fettsyreestere, som f.eks. etyloleat eller triglycerider eller liposomer. Eventuelt kan suspensjonene også inneholde egnede stabilisatorer eller midler som øker forbindelsenes løselighet for å muliggjøre fremstilling av sterkt konsentrerte løsninger.

For topisk eller nasal administrering benyttes penetreringsbefordrende midler passende for den barriere som skal gjennomtrenges, i formuleringen. Slike penetrerende midler er generelt kjent på området.

De farmasøytiske blandingene ifølge foreliggende oppfinnelse kan fremstilles tilsvarende kjente fremgangsmåter (f.eks. ved hjelp av konvensjonell blanding, oppløsning, granulering, drasjé-fremstilling, oppslemming, emulgering, innkapsling, omslutning eller lyofili sering).

De farmasøytiske blandingene kan tilberedes som et salt og kan dannes med mange syrer, inklusivt, men ikke begrenset til, saltsyre, svovelsyre, eddiksyre, melkesyre, vinsyre, eplesyre, ravsyre, etc. Salter er ofte mer løselige i vandige eller andre protoniske løsnings-midler enn de tilsvarende frie basefarmer. I andre tilfeller kan det foretrukne preparat være et lyofilisert pulver i 1 mM-50 mM histidin, 0,l%-2% sukrose, 2%-7% mannitol i pH-området 4,5 til 5,5, som kombineres med buffer før bruk.

Etter at farmasøytiske blandinger som omfatter en forbindelse ifølge oppfinnelsen formulert i en akseptabel bærer, er fremstillet, kan de anbringes i en passende beholder og merkes for behandling av en indikasjon. For administrering av humane telomeraseproteiner og nukleinsyrer, vil slik merking innbefatte mengde, administrasjonshyppighet og administrasjonsmåle.

Farmasøytiske blandinger ifølge foreliggende oppfinnelse som egner seg for bruk, innbefatter blandinger hvor virkestoffet inngår i en effektiv mengde for å oppnå det tiltenkte formål. «Terapeutisk effektiv mengde» eller «farmakologisk effektiv mengde» er velkjente vendinger og refererer seg til den mengde av et middel som effektivt frembringer det tiltenkte farmakologiske resultat. En terapeutisk effektiv mengde er således en mengde som er tilstrekkelig til å lindre symptomene for den sykdom som behandles. En egnet test for å sikre en effektiv mengde for en gitt anvendelse (f.eks. en terapeutisk effektiv mengde) er å måle effekten på telomeraseaktiviteten i en målcelle. Den faktisk administrerte mengde vil avhenge av vedkommende som skal gis behandlingen og vil fortrinnsvis være en optimalisert mengde slik at den ønskede effekt oppnås uten vesentlige bivirkninger. Bestemmelsen av en terapeutisk effektiv dose vil være velkjent for fagmannen.

For enhver forbindelse kan den terapeutisk effektive dose i første omgang bestemmes i cellekulturtester eller i en passende dyremodell. Dyremodellen benyttes også for å finne et ønskelig konsentrasjonsområde og administrasjonsmåle. Denne informasjon kan deretter benyttes for å bestemme egnede doser og administrasjonsmåler for mennesker.

En terapeutisk effektiv mengde er den mengde av protein, polypeptid, peptid, antistoff, oligo- eller polynukleotid, agonist eller antagonist, som lindrer symptomene eller tilstanden. Terapeutisk effekt og toksisitet av slike forbindelser kan bestemmes ved standard farmasøytiske prosedyrer i cellekulturer eller forsøksdyr (f.eks. ED50, den dose som gir terapeutisk effekt i 50% av populasjonen; og LD50, den dose som er dødelig for 50% av populasjonen). Doseforholdet mellom terapeutisk og toksisk effekt er den terapeutiske indeks, og den kan uttrykkes som forholdet ED50/LD50. Farmasøytiske blandinger som oppviser stor terapeutisk indeks foretrekkes. De data som oppnås fra cellekulturtester og dyreforsøk benyttes til å finne et doseringsområde for human anvendelse. Doseringen av slike forbindelser ligger fortrinnsvis innen et område i kretsløpet som gir konsentrasjoner som innbefatter ED50 med liten eller ingen toksisitet. Doseringen varierer innenfor dette området, avhengig av den anvendte doseringsform, pasientens følsomhet og administrasjonsmåte.

Den nøyaktige dosering velges av behandlende lege med henblikk på pasienten som skal behandles. Dosering og administrasjon justeres for å gi et tilstrekkelig nivå av virkestoffet eller for å opprettholde den ønskede effekt. Andre faktorer som må tas i betraktning er sykdommens alvor (f.eks. tumorstørrelse og lokalisering; pasientens alder, vekt og kjønn; diett, tidspunktet for og hyppigheten av administrering, medikamentkombinasjoner, reaksjonsfølsomheter og toleranse/respons på behandlingen. Langtidsvirkende farmasøytiske blandinger kan administreres hver 3. til 4. dag, hver uke eller annenhver uke, avhengig av formuleringens halveringstid og clearance. Retningslinjer med hensyn til bestemte doseringer og administrasjonsmåter er angitt i litteraturen (se US-patent 4.657.760; 5.206.344 og 5.225.212 som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse). Fagmannen vil i alminnelighet benytte andre formuleringer for nukleotider enn for proteiner eller deres inhibitorer. Likeledes kan administrering av polynukleotider eller polypeptider være spesifikke for bestemte celler, tilstander, lokaliseringer og lignende.

VIII ØKENDE PROLIFERATIV KAPASITET OG PRODUKSJON AV

IMMORTALISERTE CELLER, CELLELINJER OG DYR

Som omtalt ovenfor blir de fleste virveldyrceller for gamle etter et begrenset antall delinger i kultur (f.eks. 50 til 100 delinger). Enkelte cellevarianter er imidlertid i stand til ubegrenset deling i kultur (f.eks. HeLa-celler, 293-celler) og er av denne grunn egnet for forskning og industrielle anvendelser. Vanligvis er disse udødelige cellelinjene avledet fra spontant oppstående tumorer eller ved transformasjon ved eksponering for bestråling eller et tumor-induserende virus eller kjemikalium. Uheldigvis er bare et begrenset utvalg av cellelinjer, spesielt humane cellelinjer som representerer differensiert cellefunksjon, tilgjengelige. Dessuten er de udødelige cellelinjer som i dag er tilgjengelige, kjennetegnet ved kromosomale abnormiteter (f.eks. aneuploidi, gen-omleiringer eller mutasjoner). Dessuten er mange av de lenge etablerte cellelinjene relativt udifferensierte (f.eks. de produserer ikke høyt spesialiserte produkter av den sort som unikt karakteriserer særlige vev eller organ). Det er således behov for nye metoder for utvikling av udødelige celler, spesielt humanceller. En anvendelse av immortaliserte celler er ved produksjon av naturlige proteiner og rekombinante proteiner (f.eks. terapeutiske polypeptider, så som erytropoietin, humant veksthormon, insulin og lignende) eller antistoffer, hvortil en stabil, genetisk normal cellelinje foretrekkes. For produksjonen av enkelte rekombinante proteiner, kan spesialiserte celletyper også være å foretrekke (f.eks. pankreasceller for produksjon av human insulin). En annen anvendelse for immortaliserte celler eller endog dødelige celler som øker proliferativ kapasitet (i forhold til umodifiserte celler) er for genterapeutisk innføring i en pasient eller for erstatning av syke eller ødelagte celler eller vev. For eksempel kan autologe immunceller som inneholder eller uttrykker f.eks. et rekombinant hTRT-gen eller polypeptid ifølge oppfinnelsen, benyttes for celle-erstatning i en pasient etter aggressiv cancerterapi, f.eks. helkroppsbestråling. En annen anvendelse for immortaliserte celler er til ex vivo produksjon av «kunstige» vev eller organer (f.eks. hud) for terapeutisk anvendelse. En annen anvendelse for slike celler er til screening eller validering av medikamenter, så som telomerase-inhiberende medikamenter, eller for bruk ved produksjon av vaksiner eller biologiske reagenser. Andre anvendelser av cellene ifølge oppfinnelsen vil være åpenbare for fagmannen.

De immortaliserte cellene og cellelinjene, så vel som de som kun har øket replikasjonsevne, ifølge oppfinnelsen, fremstilles ved å øke telomeraseaktiviteten i cellen. Enhver av de her omtalte metoder for økning av telomeraseaktivitet kan benyttes. I én utførelsesform immortaliseres celler således ved å øke mengden av et hTRT-polypeptid i cellen. I én utførelsesform økes hTRT-nivåene ved å innføre en hTRT-ekspresjonsvektor i cellen (med stabil transfeksjon enkelte ganger foretrukket). Som omtalt ovenfor er den hTRT-kodende sekvens vanligvis operativt koblet til en promoter som kan være induserbar eller konstitutivt aktiv i cellen.

I én utførelsesform innføres i cellen ett polynukleotid som omfatter en sekvens som koder for et polypeptid med SEKV. ID. NR:2, hvis sekvens operativt er koblet til en promoter (f.eks. en konstitutivt uttrykt promoter, f.eks. en sekvens med SEKV. ID. NR:6). I én utførelsesform omfatter polynukleotidet en sekvens med SEKV. ID. NR:1. Fortrinnsvis innbefatter polynukleotidet polyadenylerings- og terminerings-signaler. I andre utførelses-former er det inkludert ytterligere elementer, så som enhancere eller andre omtalt ovenfor. I en alternativ utførelsesform innbefatter polynukleotidet ikke en promotersekvens, idet en slik sekvens stilles til rådighet av målcellens endogene genom etter integrering (f.eks. rekombinasjon, f.eks. homolog rekombinasjon) av det innførte polynukleotid. Polynukleotidet kan innføres i målcellen etter en hvilken som helst metode, inklusivt metoder som her er beskrevet, så som lipofeksjon, elektroporering, virosomer, liposomer, immun-liposomer, poly-kation/nukleinsyre-konjugater, naken DNA).

Ved bruk av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan enhver virveldyrcelle oppnå en øket proliferativ evne eller endog bli immortalisert og holdes ubegrenset i kultur. I én utførelsesform er cellene pattedyrceller, hvorav humanceller foretrekkes for mange anvendelser. Eksempler på humanceller som kan immortaliseres omfatter de som er angitt i Tabell 3.

Det vil være klart at de nedenfor beskrevne «diagnostiske» tester ifølge oppfinnelsen kan benyttes til å identifisere og karakterisere de immortaliserte cellene ifølge oppfinnelsen.

TABELL 3

HUMANCELLER HVORI hTRT-EKSPRESJON KAN ØKES

Keratiniserende epitelceller

keratinocytt av epidermis (differensierende epidermcelle)

basalcelle av epidermis (stamcelle)

keratinocytt av fingernegler og tånegler

basalcelle fra neglesengen (stamcelle)

hårskaft-celler

medullære, kortikale, kutikulære; hårrotskjede-celler, kutikulære,

fra Huxleys lag, av Henle's lag, eksternt; hårmatriksceller (stamceller)

Celler av fuktig stratifisert barriere-epitel

overflateepitelceller av stratifisert skvamøst epitel fra tunge, munnhule, spiserør, analkanal, distal uretra, vagina,

basalcelle av disse epiteler (stamcelle)

celle av eksternt hornhinneepitel

celle av urinalt epitel (som kler blære og urinkanaler)

Epitelceller spesialisert for eksokrin sekresjon

celler av spyttkjertler

mukosaceller (polysakkaridrik sekresjon)

serøse celler (sekresjon rik på glykoproteinenzymer)

celle av von Ebner's kjertel i tungen (sekresjon for vask over smaksløker) celle av melkekjertel, som skiller ut melk

celle av tårekjertel, som utsondrer tårer

celle av ørevokskjertel, utsondrer voks

celle av ekkrin svettekjertel, utsondrer glykoproteiner (mørk celle)

celle av ekkrin svettekjertel, utsondrer små molekyler (klar celle)

celle av apokrin svettekjertel (luktende sekresjon, kjønnshormonfølsom) celle av Molls kjertel i øyelokk (spesialisert svettekjertel)

celle av talgkjertel, utsondrer lipidrik talg

celle av Bowman's kjertel i nese (sekresjon til overvasking av olfaktorisk epitel) celle av Brunner's kjertel i duodenum, som skiller ut alkalisk løsning av slim og enzymer

celle av sædblære, som utsondrer komponenter av sædvæske, inklusivt fruktose (som drivstoff for svømmende spermier)

celle av prostatakjertel, som skiller ut andre komponenter av sædvæske celle av glandula bulbourethralis, som skiller ut slim celle av Baitholin's kjertel, som skiller ut vaginalsekret celle av Littre's kjertler, som skiller ut slim

celle av uterus-endometrium, som hovedsakelig utskilter karbohydrater

isolert slimcelle fra respirasjons- og fordøyelseskanaler, som utskiller slim mukosacelle av mavesekkens foring

zymogen celle av mavesekk-kjertler, som utskiller pepsinogen syresekreterende celle i mavesekk-kjertel, som utskiller HC1

acinøs celle av pankreas, som utskiller fordøyelsesenzymer og bikarbonat Paneth's celle i tynntarm, som utskiller lysozym

type II pneumocytt av lunge, som utskiller overflateaktivt middel Claracelle av lunge

Celler spesialisert for sekresjon av hormoner

celler av anterior hypofyse, som utskiller veksthormon, folikkelstimulerende hormon, luteiniserende hormon, prolaktin, adrenokortikotropt hormon og

thyroidea-stimulerende hormon,

celle av intermediat-hypofyse, som utskiller melanocytt-stimulerende hormon celler av hypofysens baklapp, som utskiller oksytocin, vasopressin celler av tarm, som utskiller serotonin, endorfin, somatostatin, gastrin,

sekretin, cholecystokinin, insulin og glukagon

celler av skjoldbruskkjertelen som utsondrer thyroidea-hormon, kalsitonin celler av biskjoldbruskkjertelen som utsondrer parathyroidea-hormon, oksyfil-celle celler av binyrene, som utsondrer epinefrin, norepinefrin og steroidhormoner;

mineralokortikoider

glukokortikoider

celler av gonader, som utsondrer testosteron (leydigceller i testiklene)

østrogen (theca interna celle av Graafs folikkel)

progesteron (corpus luteum celle av sprukket Graafs folikkel)

celler av jukstaglomerulært apparat i nyre

jukstaglomerulær celle (utsondrer renin)

macula densa celle

peripolar celle

mesangial celle

Epiteliale absorberende celler i tarm, eksokrine kjertler og uroginitaltrakt «brush border« celle av tarm (med mikrovilli)

«striated duct» celle av eksokrine kjertler

galleblæreepitelcelle

«brush borden) celle av proksimal nyretubulus

distal tubuluscelle av nyre

ikke-ciliar celle av ductulus efferens

epididymal prinsipal celle

epididymal basal celle

Celler spesialisert til metabolisme og lagring hepatocytt (levercelle)

fettceller

hvitt fett

brunt fett

lever-lipocytt

Epitelceller som primært har barrierefunksjon, kledning av lungen, tarmen, eksokrine kjertler og urogenitaltrakten

type I pneumocytt (kler lungens luftrom)

pankreatisk kanalcelle (centroacinær celle)

ikke-stripet kanalcelle av svettekjertel, spyttkjertel, melkekjertel parietalcelle av glomerulus

podocytt av glomerulus

celle av tynt segment av Henies slynge (i nyre) oppsamlingskanalcelle (i nyre)

kanalcelle av sædblære, prost at akj ert el

Epitelceller som kler lukkede indre kroppshulrom vaskulære endotelceller fra blod- og lymfekar

fenestrerte

kontinuerlige

splenoide

synovialcelle (kler ledd-kaviteter, utsondrer hovedsakelig hyaluronsyre serosal-celle (kler peritoneale, plevrale og perikardielle hulrom) skvamøs celle kler perilymfatisk rom i øret celler som kler endolymfatisk rom i øret

skvamøs celle søyleceller av endolymfatisk sekk med mikrovilli

uten mikrovilli

«dark» celle

vestibular membrancelle (ligner koroid plexus-celle) stria vascularis basalcelle

stria vascularis marginalcelle

Claudius-celle

Boettcher-celle

koroid plexus-celle (utsondrer cerebrospinalvæske)

skvamøs celle av pia-arachnoidea

celler av ciliarepitel av øye

pigmentert

ikke-pigmentert

korneal «endotelial» celle

Cilierte celler med fremdriftsfunksjon

av respirasjonstrakt

av ovidukt og av uterus-endometriet (i hunnindivider)

av rete testis og ductulus efferens (i hannindivider)

av sentralnervesystem (ependymcelle som kler hjernehulrom)

Celler spesialisert for sekresjon av ekstracellulær matriks epiteliale:

ameloblast (utsondrer tannemalje)

planum semillunatum-celle av ørets vestibulærapparat (utsondrer proteoglykan)

interdentalcelle av Cortis-organ (utsondrer «tectorial membrane» som

dekker hårceller i Cortis-organ)

ikke-epiteliale (bindevev)

fibroblaster (forskjellige - av løst bindevev, av hornhinne, av sene, av retikulært vev av benmarg, etc.)

pericytt av blodkapillærer

nucleus pulposus-celle av intervertebralbrusken cementoblast/cementocytt (utsondrer benlignende sement av tannrot) odontoblast/odontocytt (utsondrer dentin)

kondrocytter

av hyalinbrusk, av bindevevsbrusk, av elastisk brusk osteoblast/osteocytt

osteoprogenitorcelle (stamcelle av osteoblaster) hyalocytt av øyets glasslegeme

stellatus-celle av ørets perilymfatiske rom

Kontraktile celler

skjelettmuskelceller

røde (langsomme)

hvite (hurtige)

intermediære

muskelspole - nukleær «bag»

muskelspole - nukleær kjede

satelittcelle (stamcelle)

hj ertemuskelceller

ordinær

nodal

Purkinjes muskeltråder glatte muskelceller myoepitelceller av iris av eksokrine kjertler

Celler fra blod og immunsystem røde blodlegemer megakaryocytt makrofager

monocytt bindevevs-makrofag (diverse) Langerhans celler (i epidermis) osteoklast (i ben) dendritisk celle (i lymfoide vev)

mikrogliacelle (i sentralnervesystem) neurofil

eosinofil

basofil

mastcelle T-lymfocytt

hjelper-T-celle suppressor-T-celle

dreper-T-celle B-lymfocytt

IgM

IgG

IgA

IgE

drepercelle stamceller for blodet og immunsystemet (diverse)

Sensoriske transducere fotoreseptorer

staver tapper

blå følsomme grønn følsomme

rød følsomme hørsel

indre hårcelle av Cortis organ

ytre hårcelle av Cortis organ

aksellerasjon og tyngde

type I hårcelle av ørets vestibularapparat

type II hårcelle av ørets vestibularapparat smak

type II smaksløkceller

lukt

olfaktorisk neuron

basalcelle av olfaktorisk epitel (stamcelle for olfaktoriske neuroner) blod pH

carotislegeme-celle

type I

type II

berøring

Merkels-celle av epidermis

primærsensoriske neuroner spesialisert for berøring temperatur

primærsensoriske neuroner spesialisert for temperatur kuldefølsom

varmefølsom

smerte

primærsensoriske neuroner spesialisert for smerte konfigurasjoner og krefter i muskel og skjelettsystemet

proprioceptive primærsensoriske neuroner

Autonome neuroner

kolinerge

adrenerge

peptiderge

Støtteceller av sanseorganer og av perifere neuroner støtteceller for Cortis organ

indre pillarcelle

ytre pillarcelle

indre falangialcelle

ytre falangialcelle

grensecelle

Hensen-celle

støttecelle for vestibularapparat støttecelle for smaksløk (type I smaksløkcelle) støttecelle for olfaktorisk epitel

Schwann-celle

satellittcelle (innkapsler perifere nervecellelegemer)

enterisk gliacelle

Neuroner og gliaceller av sentralnervesystem

neuroner

gliaceller

astrocytt

oligodendrocytt

Linseceller

anterior linseepitelcelle

linsefiber (krystallinholdig celle)

Pigmentceller

melanocytt, retinalpigmentert epitelcelle

Kimceller

oogonium/oocytt

spermatocytt

spermatogonium (stamcelle for spermatocytt)

Nurse Cells

ovaria] folikkelcelle

Sertolicelle (i testikkel)

tymus-epitelcelle

Stamceller

embryonisk stamcelle

. embryonisk kimcelle

voksen stamcelle

føtal stamcelle

IX. DIAGNOSTISKE TESTER

A) INNFØRING

1) TRT-TESTER

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et stort utvalg tester for TRT, fortrinnsvis hTRT og telomerase. Disse testene gir bl.a. grunnlaget for følsomme, billige, lettvinte og vidt anvendelige tester for diagnose og prognose av en rekke humansykdommer, hvorav cancer er et illustrerende eksempel. Som nevnt ovenfor er hTRT-genprodukter (protein og mRNA) vanligvis forhøyet i immortale humanceller i forhold til de fleste normale dødelige celler (dvs. telomerase-negative celler og de fleste telomerase-positive normale somatiske celler hos voksne). I henhold til ett aspekt tilveiebringer oppfinnelsen således tester egnet for påvisning eller måling av nærvær, fravær eller mengde, av et hTRT-genprodukt i en prøve fra, eller inneholdende, humane eller andre pattedyrceller eller eukaryote celler for å karakterisere cellen som udødelig (så som en malign tumorcelle) eller dødelig (som de fleste normale somatiske celler i voksne) eller som telomerase-positive eller negative.

En hvilken som helst tilstand som kjennetegnes ved nærvær eller fravær av et hTRT-genprodukt (dvs. protein eller RNA) kan diagnostiseres ved å benytte de fremgangsmåter og materialer som her er beskrevet. Som mer utførlig beskrevet nedenfor, inkluderer disse cancere, andre sykdommer med aksellerert celleproliferasjon, immunologiske forstyrrelser, fertilitet, infertilitet og andre. Siden den grad som telomeraseaktivitet er forhøyet med i cancerceller er korrelert med tumorens kjennetegn, så som metastasepotensialet, kan således overvåkning av hTRT, mRNA eller proteinnivåer benyttes til å anslå og forutsi den sannsynlige fremtidige utvikling av en tumor.

I henhold til ett aspekt innebærer de diagnostiske og prognostiske metodene ifølge oppfinnelsen bestemmelse av hvorvidt et humant TRT-genprodukt forekommer i en biologisk prøve (f.eks. fra en pasient). I henhold til et andre aspekt bestemmes og sammenlignes rikeligheten av hTRT-genproduktet i en biologisk prøve (f.eks. fra en pasient) med rikeligheten i en kontrollprøve (f.eks. normale celler eller vev). I henhold til et tredje aspekt bestemmes den cellulære eller intracellulære lokalisering av et hTRT-genprodukt i en celle-eller vevsprøve. I henhold til et fjerde aspekt testes vertens (f.eks. pasientens) celler for å påvise nukleinsyrer med sekvenser som er karakteristiske for en arvelig tilbøyelighet til unormal hTRT-genekspresjon (unormal mengde, regulering eller produkt), av den type som er anvendelig ved genetisk screening eller genetisk rådgivning. Testene kan benyttes til å påvise nærvær av anti-hTRT-antistoffer (f.eks. i pasientserum). Fremgangsmåtene som er beskrevet mer detaljert nedenfor, gir indikasjon om anvendelige tester som kan utføres ved å benytte de her omtalte sekvenser og forhold. Adskillige varianter eller andre anvendelser av disse tester vil i betraktning av denne beskrivelse imidlertid være åpenbare for fagmannen.

Det vil innsees at testene nedenfor, selv om de er presentert som diagnostiske og prognostiske metoder, kan benyttes når et hTRT-gen, genprodukt eller variant, skal påvises, kvantifiseres eller karakteriseres. For eksempel er de «diagnostiske» metoder som er beskrevet nedenfor, anvendelige for måling av hTRT eller telomerase under produksjon og rensing av hTRT eller human telomerase, til karakterisering av cellelinjer som skriver seg fra humanceller (f.eks. for å identifisere udødelige linjer), til karakterisering av celler, dyr utenom mennesket, planter, sopp, bakterier eller andre organismer som omfatter et humant TRT-gen eller genprodukt (eller fragmenter derav).

I denne sammenheng har betegnelsen «diagnostisk» sin vanlige mening, nemlig å identifisere forekomsten eller naturen av en sykdom (f.eks. cancer), tilstand (f.eks. infertil, aktivert) eller status (f.eks. fertil), og betegnelsen «prognostisk» har sin vanlige mening, nemlig å forutsi den sannsynlige utvikling og/eller resultatet av en sykdom eller tilstand. Selv om disse to betegnelsene benyttes på en noe forskjellig måte i klinisk sammenheng, er det klart at enhver av de nedenfor omtalte tester eller test-formater med referanse til «diagnose» er like egnet for bestemmelse av prognose, siden det er fastslått at høyere telomeraseaktivitetsnivåer er assosiert med dårligere prognoser for cancerpasienter, og siden foreliggende oppfinnelse tilveiebringer påvisningsmetoder som er spesifikke for hTRT, som uttrykkes i nivåer som er nær korrelert med telomeraseaktiviteten i en celle.

2) DIAGNOSE OG PROGNOSE AV CANCER

Bestemmelsen av et hTRT-gen-, mRNA- eller proteinnivå over normal- eller standard-området gir indikasjon om forekomst av telomerase-positive, eller udødelige celler, hvorav visse tumorceller er eksempler. Siden enkelte embryoniske og føtale celler, i likhet med visse voksne stamceller, uttrykker telomerase, tilveiebringer foreliggende oppfinnelse også fremgangsmåter for bestemmelse av andre tilstander, så som graviditet, ved å påvise eller isolere telomerasepositive føtalceller fra matemalt blod. Disse verdiene kan benyttes for å stille, eller eventuelt bidra til å stille, en diagnose selv når cellene ikke ville ha vært klassifisert som cancerøse eller på annen måte påvist eller klassifisert ved å benytte tradisjonelle metoder. Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse muliggjør derfor mer pålitelig påvisning eller verifisering av cancerøse eller andre tilstander assosiert med telomerase, i det minste i enkelte tilfeller på et tidlig stadium. Testene ifølge oppfinnelsen gjør det mulig å skjelne mellom forskjellige klasser og grader av humantumorer eller andre celle-proliferative sykdommer, ved å stille kvantitative tester for hTRT-genet og genproduktene til rådighet og derved forenkle valget av passende behandlingsregimer og nøyaktige diagnoser. Siden nivåene av telomeraseaktivitet kan benyttes til å skjelne mellom benigne og maligne tumorer (f.eks. US-patent 5.489.508; Hiyama et al, 1997, Proe. Am. Ass. Cancer Res. 38:637) til å forutsi iboende invasjon (f.eks. US-patent 5.639.613; Yashima et al, 1997, Proe. Am. Ass. Cancer Res. 38:326), og til å korrelere med metastatisk potensiale (f.eks. US-patent 5.648.215; Pandita et al, 1996, Proe. Am .Ass. Cancer Res. 37:559), vil dessuten disse testene være egnet for profylakse, påvisning og behandling av et bredt utvalg humane cancere.

For prognose av cancere (eller andre sykdommer eller tilstander karakterisert ved forhøyet telomerase), bestemmes en prognostisk verdi av hTRT-genprodukt (mRNA eller protein) eller aktivitet for en bestemt tumortype, klasse eller grad, som beskrevet nedenfor. hTRT-protein eller mRNA-nivåer eller telomeraseaktivitet i en pasient kan også bestemmes (f.eks. ved å benytte de her beskrevne tester) og sammenlignes med det prognostiske nivå.

Avhengig av den anvendte test vil rikeligheten av et hTRT-genprodukt i en prøve i enkelte tilfeller bli ansett som forhøyet hver gang den er påvisbar ved hjelp av testen. Som følge av den lave rikelighet av hTRT mRNA og protein, selv i telomerase-positive celler og sjeldenheten eller ikke-eksistensen av disse genproduktene i normale eller telomerase-negative celler, fordres følsomme tester for å påvise hTRT-genproduktet dersom det i det hele tatt er tilstede i normale celler. Velges mindre følsomme tester, vil hTRT-genproduktene være upåviselige i friskt vev, men påviselige i telomerase-positive cancerceller eller andre telomerase-positive celler. Mengden av hTRT-genprodukt i en prøve med forhøyet innhold, er i alminnelighet minst ca. 5, ofte minst ca. 10, oftere minst ca. 50 og meget ofte minst ca. 100 til 1000 ganger høyere enn nivåene i telomerase-negative kontrollceller eller celler fra friskt vev fra en voksen person, hvor andelen telomerase-positive normale celler er meget lav.

De diagnostiske og prognostiske metodene ifølge foreliggende oppfinnelse kan benyttes med en hvilken som helst celle- eller vevstype av en hvilken som helst opprinnelse, og kan benyttes til å påvise en udødelig eller neoplastisk celle eller tumorvev eller cancer av en hvilken som helst opprinnelse. Cancertyper som kan påvises innbefatter, men er ikke begrenset til, alle de som ovenfor er omtalt under diskusjonen angående terapeutiske anvendelser av hTRT.

Testene ifølge oppfinnelsen er også egnet til å følge effektiviteten av terapeutiske inngrep i pasienter som står på anti-cancerregimer. Anti-cancer-regimer som kan overvåkes, omfatter alle hittil godkjente behandlinger (inklusivt kjemoterapi, strålebehandling og kirurgi) og innbefatter også behandlinger for fremtidig godkjenning, så som telomerase-inhiberings-eller aktiverings-terapier som her beskrevet. (Se f.eks. PCT publikasjon nr. 96/01835 og 96/40868 og US-patent 5.583.016, som alle herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse).

I henhold til et annet aspekt er de nedenfor beskrevne tester egnet til å påvise visse variasjoner i hTRT-gensekvens (mutasjoner og arvelige hTRT-alleler) som gir indikasjon på en predisposisjon for cancere eller andre tilstander assosiert med unormal regulering av telomeraseaktivitet (infertilitet, prematur aldring).

3) DIAGNOSE AV ANDRE TILSTANDER ENN CANCER

I tillegg til diagnose av cancere har testene ifølge foreliggende oppfinnelse en rekke andre anvendelser. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer reagenser og metoder/diagnose av tilstander eller sykdommer karakterisert ved under- eller over-ekspresjon av telomerase eller hTRT-genprodukter i celler. I voksne finnes normalt et lavt telomeraseaktivitetsnivå i en begrenset del av normale humane somatiske celler, f.eks. stamceller, aktiverte lymfocytter og kimceller, og som mangler i andre somatiske celler. Påvisningen av hTRT eller telomeraseaktivitet i celler hvor den normalt mangler eller er inaktiv, eller påvisning i unormale (dvs. høyere eller lavere enn normale) nivåer i celler som hTRT normalt forekommer i et lavt nivå i (så som stamceller, aktiverte lymfocytter og kimceller) kan således være diagnostisk for en telomerase-relatert sykdom eller tilstand eller benyttes til å identifisere eller isolere en bestemt celletype (dvs. isolere stamceller). Eksempler på slike sykdommer og tilstander omfatter: celleproliferasjonssykdommer, immunologiske forstyrrelser, infertilitet, sykdommer av immuncellefunksjon, graviditet, føtale abnormiteter, prematur aldring og andre. Dessuten er testene ifølge oppfinnelsen egnet til overvåkning av effektiviteten av terapeutiske inngrep (innbefattet, men ikke begrenset til, medikamenter som modulerer telomeraseaktivitet) i en pasient eller i en celle- eller dyre-basert test.

I henhold til ett aspekt tilveiebringer oppfinnelsen tester egnet for diagnostisering av infertilitet. Humane kimceller (f.eks. spermatogonia-celler, deres progenitorceller eller etterkommere) er i stand til uavbrutt proliferasjon og karakterisert ved høy telomeraseaktivitet. Unormale nivåer eller produkter eller nedsatte nivåer av hTRT-genprodukter kan resultere i utilstrekkelig eller unormal produksjon av sædceller, hvilket fører til infertilitet eller produksjonsforstyrrelser. Oppfinnelsen tilveiebringer følgelig tester (metoder og reagenser) for diagnostisering og behandling av «telomerase-baserte» reproduksjonsforstyrrelser. Testene kan likeledes benyttes til å overvåke effektiviteten av prevensjonsmidler (f.eks. for menn) som retter seg mot eller indirekte påvirker spermieproduksjon (og som ville redusere hTRT-nivåer eller telomeraseaktivitet).

I henhold til et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen tester for analyse av telomerase- og hTRT-nivåer og funksjon i stamceller, føtale celler, embryoceller, aktiverte lymfocytter og hematopoetiske stamceller. For eksempel kan tester for hTRT-genprodukt-påvisning benyttes til å overvåke immunfunksjon i sin alminnelighet (f.eks. ved å overvåke prevalensen av aktiverte lymfocytter eller rikeligheten av progenitor-stamceller), til å identifisere eller velge eller isolere aktiverte lymfocytter eller stamceller (basert på forhøyede hTRT-nivåer) og til å overvåke effekten av terapeutiske inngrep som retter seg mot disse vev (f.eks. immunsuppressive midler eller terapeutiske forsøk på å øke en stamcellepopulasjon).

Tester kan egne seg for identifisering av anti-telomerase og anti-TRT-immunglobuliner (funnet i serum fra en pasient). Materialene og testene som her er beskrevet kan benyttes til å identifisere pasienter hvor slike autoimmun-antistoffer er funnet, noe som tillater diagnostisering og behandling av tilstanden assosiert med immunglobulinene.

4) OVERVÅKING AV CELLER I KULTUR

De testene som her er beskrevet er også egnet til å overvåke ekspresjonen av hTRT-genprodukter og karakteirseringen av hTRT-gener i celler ex vivo eller in vitro. I og med at de forhøyede hTRT-nivåene er karakteristiske for immortaliserte celler, kan testene ifølge oppfinnelsen benyttes for eksempel til screening av eller identifisering av immortaliserte celler eller til å påvise et middel som er i stand til å mortalisere immortaliserte celler ved å inhibere hTRT-ekspresjon eller -funksjon. For eksempel vil testen være egnet til å identifisere celler som er immortalisert ved øket ekspresjon av hTRT i cellen, f.eks. ved ekspresjonen av et rekombinant hTRT eller ved øket ekspresjon av et endogent kodet hTRT (f. eks. ved promoteraktivering).

Likeledes kan disse testene benyttes til å overvåke hTRT-ekspresjon i transgene dyr eller celler (f.eks. gjær- eller humanceller som inneholder et hTRT-gen). Særlig kan virkningene av visse behandlinger (f.eks. anvendelse av kjente eller antatte telomerase-antagonister) på hTRT-nivåene i humane og ikke-humane celler som uttrykker hTRT ifølge oppfinnelsen, benyttes for å identifisere egnede medikamenter og medikamentkandidater (f.eks. telomeraseaktivitets-modulerende medikamenter).

B) NORMALE, DIAGNOSTISKE OG PROGNOSTISKE VERDIER

Tester for forekomst eller mengde av hTRT-genprodukter kan foretas og resultatene tolkes på en rekke måter, avhengig av testens format, naturen av prøven som skal testes og hvilken informasjon som søkes. For eksempel er rikeligheten av hTRT-genproduktet i likevektstilstand så lav i de fleste somatiske humanvev at de ikke lar seg påvise med enkelte tester. Det er dessuten i alminnelighet ingen telomeraseaktivitet i cellene i disse vev som gjør verifisering av aktivitet ganske lett. Derimot er hTRT-protein og/eller hTRT mRNA eller telomerase, tilstrekkelig rikelig i andre telomerase-positive vev, f.eks. maligne tumorer, slik at disse kan påvises ved å benytte de samme tester. Selv i de somatiske celletyper hvor lave nivåer av telomeraseaktivitet normalt kan påvises (f.eks. stamceller og visse aktiverte celler i det hematopoetiske system), utgjør nivåene av hTRT mRNA og telomeraseaktivitet en liten brøkdel (f.eks. anslått til ca. 1% eller mindre) av nivåene i udødelige celler; og udødelige og dødelige celler kan således lett adskilles ved hjelp av fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse. Det er klart at når en «mindre følsom» test benyttes kan den blotte påvisning av hTRT-genproduktet i en biologisk prøve i seg selv være diagnostisk uten krav til ytterligere analyse. Selv om de nedenfor beskrevne tester kan bli gjort utsøkt følsomme, kan de også eventuelt gjøres mindre følsomme (f.eks. gjennom omhyggelig valg av buffere, vaske-betingelser, antall amplifiseringsrunder, reagenser og/eller valg av signal-forsterkere). Praktisk talt enhver test kan således utformes slik at den bare påviser hTRT-genprodukter i biologiske prøver, hvor de forekommer i en bestemt konsentrasjon, f.eks.en høyere konsentrasjon enn i friskt eller annet kontrollvev. I dette tilfellet vil ethvert påvisbart nivå av hTRT mRNA eller protein bli ansett som forhøyet i celler fra postnatale humane somatiske vev (til forskjell fra hematopoetiske celler og andre stamceller).

I enkelte tilfeller vil det imidlertid være ønskelig å fastsette normale eller basislinjeverdier (eller områder) for ekspresjonsnivåer av hTRT-genprodukt, særlig når det benyttes meget følsomme tester som er stand til å påvise meget lave nivåer av hTRT-genprodukter som kan forekomme i normale somatiske celler. Normale ekspresjonsnivåer eller normale ekspresjonsprodukter kan bestemmes for enhver populasjon, subpopulasjon eller gruppe av organismer i henhold til velkjente standardmetoder og ved å benytte metodene og reagensene ifølge oppfinnelsen. Generelt bestemmes basislinje (normalnivåer av hTRT-protein eller hTRT mRNA, ved kvantifisering av mengden hTRT-protein og/eller mRNA i biologiske prøver (f.eks. væsker, celler eller vev) tatt fra normale (friske) individer, f.eks. et menneske. For enkelte prøver og formål kan man ønske å kvantifisere mengden av hTRT-genprodukt på per celle-basis eller per tumorcelle-basis. For å bestemme cellulariteten av en prøve kan man måle nivået av et konstitutivt uttrykt genprodukt eller annet genprodukt uttrykt i kjente nivåer i celler av den type som prøven ble tatt fra. Alternativt kan normalverdier av hTRT-protein eller hTRT mRNA bestemmes ved å kvantifisere mengden av hTRT-protein/RNA i celler eller vev som man vet er friske og som er tatt fra samme pasient som syke (eller eventuelt syke) celler er tatt fra, eller fra et friskt individ. Alternativt kan basislinjenivåer i enkelte tilfeller defineres som det nivå som er tilstede i ikke-immortale humane somatiske celler i kultur. Det er mulig at normale (basislinjeverdier) kan variere noe mellom ulike celletyper (for eksempel vil hTRT mRNA-nivåer være høyere i testikler enn i nyre), eller i henhold til pasientens alder, kjønn eller fysiske tilstand. Når det for eksempel benyttes en test for å bestemme endringer i hTRT-nivåer assosiert med cancer, kan cellene som benyttes for å bestemme det normale området av hTRT-genproduktekspresjon, således være celler fra personer av samme eller forskjellig alder, avhengig av undersøkelsens natur. Anvendelse av statistiske standardmetoder benyttet innen molekylær genetikk gjør det mulig å bestemme basislinje-ekspresjonsnivåene så vel som identifisering av signifikante avvik fra slike basislinjenivåer.

Når de diagnostiske og prognostiske metodene ifølge oppfinnelsen utføres som beskrevet ovenfor, vil det enkelte ganger være nyttig å referere til «diagnostiske» og «prognostiske verdien>. I denne sammenheng refererer «diagnostisk verdi» seg til en verdi som bestemmes for hTRT-genproduktet påvist i en prøve som når den sammenlignes med et normal- eller (basislinje-)- område av hTRT-genproduktet, indikerer nærværet av en sykdom. Sykdommen kan være kjennetegnet av høy telomeraseaktivitet (f.eks. cancer), ingen telomeraseaktivitet (f.eks. infertilitet) eller én eller annen mellomliggende verdi. «Prognostisk verdi» refererer seg til en mengde av hTRT-genproduktet påvist i en gitt celletype (f.eks. malign tumorcelle) som overensstemmer med en bestemt diagnose og prognose for sykdommen (f.eks. cancer). Mengden (inklusivt en null-mengde) av hTRT-genproduktet påvist i en prøve, sammenlignes med den prognostiske verdi for cellen, slik at den relative sammenligning av verdiene indikerer forekomst av sykdom eller det sannsynlige resultat av sykdommens (f.eks. cancer) utvikling. Ifølge én utførelsesform, for eksempel for å vurdere tumorprognose, samles data for å oppnå en statistisk signifikant korrelasjon mellom hTRT-nivåer og forskjellige tumorklasser eller stadier. Et på forhånd bestemt område av hTRT-nivåer etableres for den samme celle- eller vevs-prøve tatt fra individer som har kjente kliniske resultater. Et tilstrekkelig antall målinger foretas for å frembringe en statistisk signifikant verdi (eller et område av verdier) som en sammenligning kan foretas mot. Det forutbestemte området av hTRT-nivåer eller aktivitet for en gitt celle- eller vevsprøve, kan deretter benyttes til å bestemme en verdi eller et område for det nivå av hTRT-genprodukt som vil korrelere med en gunstig (eller mindre gunstig) prognose (f.eks. et «lavnivå» når det gjelder cancer). Et område som svarer til et «høyt nivå» korrelert til en (eller en mer) ugunstig prognose når det gjelder cancer, kan likeledes bestemmes. Nivået av hTRT-genprodukt fra en biologisk prøve (f.eks. en pasientprøve) kan deretter bestemmes og sammenlignes med de lave og høye områder og benyttes til å forutsi et klinisk resultat.

Selv om ovennevnte diskusjon refererer seg til cancer som illustrasjon, er det klart at diagnostiske og prognostiske verdier også kan bestemmes for andre sykdommer (f.eks. celleproliferasjonssykdommer) og tilstander, og at for andre sykdommer eller tilstander enn cancer, kan et «høyb> nivå korreleres med det ønskede resultat og et «lavt» nivå korreleres med et ugunstig resultat. For eksempel kan enkelte sykdommer karakteriseres ved en svikt (f.eks. lavt nivå) i telomeraseaktivitet i stamceller, aktiverte lymfocytter eller kimlinjeceller. I slike tilfeller kan «høye» nivåer av hTRT-genprodukter i forhold til celler av lignende alder og/eller type (f.eks. fra andre pasienter eller annet vev fra en bestemt pasient) korreleres med et gunstig resultat.

Det vil være klart at testmetodene ikke nødvendigvis fordrer måling av absolutte hTRT-verdier, med mindre dette er ønsket, siden relative verdier er tilstrekkelig for mange anvendelser av fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse. Når kvantifisering ønskes gir foreliggende oppfinnelse reagenser slik at praktisk talt en hvilken som helst kjent metode for kvantifisering av genprodukter kan benyttes.

Testene ifølge oppfinnelsen kan også benyttes til å vurdere effektiviteten av et bestemt terapeutisk behandlingsregime i dyreforsøk, i kliniske utprøvinger eller ved overvåkning av behandlingen av en enkelt pasient. I disse tilfellene kan det være ønskelig å etablere basis-linjeverdien for pasienten før terapien innledes, og gjenta testene én eller flere ganger under behandlingsforløpet, vanligvis på regulær basis, for å vurdere hvorvidt hTRT-nivåene beveger seg mot det ønskede sluttpunkt (f.eks. redusert ekspresjon av hTRT når det tale om en test for cancer) som resultat av behandlingen.

Fagmannen vil innse at i tillegg til mengden eller rikeligheten av hTRT-genprodukter, kan varierende eller unormale ekspresjonsmønstere (f.eks. unormale mengder RNA-spleisevarianter) eller varierende eller unormale ekspresjonsprodukter (f.eks. muterte transkripter, trunkerte eller ikke-sense polypeptider) også identifiseres ved sammenligning med normale ekspresjonsnivåer og normale ekspresjonsprodukter. I disse tilfellene medfører bestemmelse av «normal» eller «basislinje» identifisering av friske organismer og/eller vev (dvs. organismer og/eller vev uten hTRT-ekspresjons-feilregulering eller neoplastisk vekst) og måling av ekspresjonsnivåer av hTRT-genproduktvariantene (f.eks. spleisevarianter) eller sekvensering eller påvisning av hTRT-genet, mRNA eller revers transkribert cDNA for å oppnå eller påvise typiske (normale) sekvens vairasjoner. Anvendelse av statistiske standardmetoder benyttet innen molekylgenetikken gjør det mulig å bestemme signifikante avvik fra slike basislinjenivå.

C) PÅVISNING OG KVANTIFISERING AV TRT-GENPRODUKTER

Som tidligere understreket finnes hTRT-genprodukter vanligvis i de fleste normale somatiske celler i ekstremt lave nivåer. For eksempel er den mRNA som koder for hTRT-proteinet, ytterst sjelden eller fraværende i alle telomerase-negative celletyper som hittil er undersøkt. I udødelige celler, som f.eks. 293-celler, kan hTRT mRNA forekomme i kun ca. 100 kopier per celle, mens normale somatiske celler kan ha så få som én eller null kopier per celle. Det er således tydelig at når det ønskes høyt følsomme tester for hTRT-genprodukter, vil det iblant være fordelaktig å inkorporere singal- eller mål-søkende amplifiseringteknikker i testformatet. Se for eksempel Plenat et al., 1997, Ann. Pathol. 17:17 (fluoresceinyl-tyramid-signal-amplifikasjon); Zehbe et al., 1997, J. Pathol. 150:1553 (katalysert rapportør-avsetning); andre referanser angitt her (f.eks. for bDNA signal-amplifikasjon, for PCR og andre former av målamplifikasjon) og andre teknikker kjent på området.

Som nevnt ovenfor er det ofte unødvendig å kvantifisere hTRT mRNA eller protein i de tester som her er beskrevet fordi påvisningen av et hTRT-genprodukt (under testbetingelser hvor produktet ikke er påvisbart i kontrollen, f.eks. telomerase-negative celler) i seg selv er tilstrekkelig for en diagnose. Som et annet eksempel kan kvantifisering være overflødig når nivåene av produktet som er funnet i testmaterialet (f.eks. svulst) og kontrollprøve (f.eks. frisk celle) sammenlignes direkte.

Om det er ønskelig kan imidlertid mengden av hTRT-genprodukt målt ved den her beskrevne test, beskrives på en rekke måter, avhengig av målemetoder og hva som er lettvint. Normale diagnostiske, prognostiske, høye eller lave mengder av hTRT-protein/mRNA kan således uttrykkes som standard vektenheter per mengde biologisk prøve (f.eks. pikogram per gram vev, pikogram per IO<12> celler) som antall molekyler per mengde biologisk prøve (f.eks. transkripter/celler, mol/celle), som aktivitetsenheter per celle eller per annen mengdeenhet eller ved lignende metoder. Mengden av hTRT-genprodukt kan også uttrykkes i forhold til mengden av et annet molekyl. Eksempler på dette er: antall hTRT-transkripter i prøve/antall 28S rRNA transkripter i prøve; nanogram av hTRT-protein/nanogram totalprotein; og lignende.

Ved måling av hTRT-genprodukter i to (eller flere) ulike prøver vil det iblant være nyttig å ha en felles basis for sammenligning av de to prøvene. Når for eksempel en prøve av normalt vev og en prøve av cancerøst vev sammenlignes, kan like mengder av vev (som vekt, volum, antall celler, etc.) sammenlignes. Alternativt kan ekvivalenter av et markørmolekyl (f.eks. 28S rRNA, hTR, telomeraseaktivitet, telomerlengde, aktin) benyttes. For eksempel kan mengden av hTRT-protein i en frisk vevsprøve inneholdende 10 pikogram 28S rRNA sammenlignes med en prøve sykt vev inneholdende den samme mengde 28S rRNA.

Det vil også være klart for fagmannen at praktisk talt alle de her beskrevne tester kan gjs en kvantitativ utforming. I alminnelighet benyttes en kjent mengde eller kilde av et hTRT-genprodukt (f.eks. produsert ved å benytte fremgangsmåtene og blandingene ifølge oppfinnelsen) til kalibrering av testen.

I enkelte utførelsesformer velges formater som påviser forekomst, fråvær eller rikelighet av et hTRT-allel eller genprodukt i hver celle i en prøve (eller i en representativ prøve). Eksempler på slike formater er slike som påviser et signal histologisk (f.eks. immun-histokjemisk med signal-forsterkende eller mål-forsterkende amplifikasjonstrinn) eller fluorescensaktivert celleanalyse eller cellesortering (FACS). Disse formatene er særlig fordelaktige når det er tale om en sterkt heterogen cellepopulasjon (f.eks. mange celletyper hvorav bare én eller noen få typer har forhøyede hTRT-nivåer, eller en populasjon av lignende celler som uttrykker telomerase i ulike nivåer).

D) PRØVETAKNING

hTRT-genet eller genproduktet (dvs. mRNA eller polypeptid) påvises og kvantifiseres fortrinnsvis i en biologisk prøve. Slike prøver innbefatter, men er ikke begrenset til, celler (inklusivt helceller, cellefraksjoner, celleekstrakter og dyrkede celler eller cellelinjer), vev inklusivt blod, blodlegemer (f.eks. hvite blodlegemer) og vevsprøver som f.eks. fine nål-biopsiprøver (f.eks. fra prostata, bryst, thyroidea, etc.)), kroppsvæsker (f.eks. urin, spytt, amnionvæske, blod, peritonealvæske, pleuravæske, sæd) eller celler tatt fra disse (f.eks. blæreceller fra urin, lymfocytter fra blod), medier (fra dyrkede celler eller cellelinjer) og utvaskinger (f.eks. av blære og lunge). Biologiske prøver kan også innbefatte snitt av vev, som f.eks. frysesnitt tatt for histologiske formål. For cancerdiagnose og prognose vil prøven bli tatt fra cancerøst eller precancerøst eller antatt cancerøst vev eller tumor. Det vil iblant være

ønskelig å fryse en biologisk prøve for senere analyse (f.eks. ved overvåkning av effekten av medikamentbehandlinger).

I enkelte tilfeller kan cellene eller vevet fraksjoneres før analyse. Eksempelvis kan det ved vevsbiopsi fra en pasient, benyttes en cellesorterer (f.eks. en fluorescensaktivert cellesorterer) for å sortere celler i henhold til slike kjennetegn som ekspresjon av et overflate-antigen (f.eks. et tumor-spesifikt antigen) i henhold til velkjente metoder.

Selv om prøven i alminnelighet tas fra en humanpasient eller cellelinje, kan testene benyttes til å påvise hTRT-homologe gener eller genprodukter i prøver fra andre dyr. Alternativt kan hTRT-gener og genprodukter testes i transgene dyr eller organismer som uttrykker et humant TRT-protein eller nukleinsyresekvens.

Prøven kan om ønskes forbehandles ved fortynning i en passende bufferløsning eller eventuelt konsentreres. Det kan benyttes en av flere vandige standardbufferløsninger, ved å benytte en buffer som f.eks. fosfat, Trisbuffer eller lignende ved fysiologisk pH.

En «biologisk prøve» tatt fra en pasient, kan bli omtalt enten som en «biologisk prøve» eller «pasientprøve». Analyse av en «pasientprøve» behøver ikke nødvendigvis fordre uttak av celler eller vev fra pasienten. For eksempel kan passende merkede hTRT-bindende midler (f.eks. antistoffer eller nukleinsyrer) injiseres i en pasient og synliggjøres (når de er bundet til målet) ved bruk av standard avbildningsteknikk (f.eks. CAT, NMR og lignende).

E) NUKLEINSYRE-BESTEMMELSER

Ifølge én utførelsesform tilveiebringer denne oppfinnelse fremgangsmåter for påvisning og/eller kvantifisering av ekspresjon av hTRT mRNA (inklusivt spleise- eller sekvens-varianter og alternative alleler). I en alternativ utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen fremgangsmåter for påvisning og analysering av normale eller unormale hTRT-gener (eller fragmenter derav). Formen av slike kvalitative og kvantitative tester kan innbefatte, men er ikke begrenset til, amplifikasjonsbaserte tester med eller uten signal-amplifikasjon, hybridiseirngsbaserte tester og kombinerte amplifikasjon/hybirdiseringstester. Fagmannen vil innse at distinksjonen mellom hybridisering og amplifikasjon er gjort for lettvinthets skyld. Som illustrert i eksemplene nedenfor involverer mange testformater elementer av både hybridisering og amplifikasjon slik at kategoriseringen i enkelte tilfeller er noe vilkårlig.

1) FREMSTILLING AV NUKLEINSYRER

I enkelte utførelsesformer foretas nukleinsyrebestemmelser med en prøve av nukleinsyre isolert fra cellen, vevet, organismen eller cellelinjen som skal testes. Nukleinsyren (f.eks. genomisk DNA, RNA eller cDNA) kan være «isolert» fra prøven i henhold til én av en rekke velkjente metoder. I denne sammenheng refererer «isolert» seg til en hvilken som helst separasjon av de arter eller mål som skal påvises, fra en hvilken som helst annen substans i blandingen, uten nødvendigvis å angi en vesentlig grad av rensing av målet. I de tilfeller hvor endringer i kopitallet av hTRT-genet skal påvises, er genomisk DNA det mål som skal påvises. Når derimot ekspresjonsnivåer av et gen eller av gener skal påvises, er RNA-målet som skal påvises i en nukleinsyre-basert test. I én foretrukket utførelsesform er nukleinsyre-prøven den totale mRNA (dvs. poly(A)<+> RNA) i en biologisk prøve. Fremgangsmåter for isolering av nukleinsyrer er velkjent for fagmannen og er beskrevet for eksempel i Tijssen P. red. av Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Elsevier, N.Y. (1993) Kap. 3, som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse. I én utførelses-form isoleres hele nukleinsyren fra en gitt prøve ved å benytte en sur guanidinium/fenol/ kloroform-ekstraksjonsmetode, og poly(A)<+> mRNA isoleres ved oligo-dT kolonnekromatografi eller ved å benytte (dT)n magnetiske kuler (se f.eks. Sambrook et al., og Ausubel et al., supra).

I alternative utførelsesformer er det ikke nødvendig å isolere nukleinsyrer (f.eks. total eller poly(A)<+> RNA) fra den biologiske prøve før amplifisering, hybridisering eller andre tester foretas. Disse utførelsesformene har visse fordeler når hTRT RNA skal måles, fordi de reduserer muligheten for tap av hTRT mRNA under isolering og håndtering. For eksempel kan mange av de ovenfor angitte amplifikasjonsteknikker, som f.eks. PCR og RT-PCR foretas ved å benytte permeabiliserte celler (histologiske prøver og FACS-analyser), hele lyserte celler eller rå cellefraksjoner, så som visse celleekstrakter. Fortrinnsvis tas det om nødvendig, forholdsregler for å opprettholde integriteten av målnukleinsyren (f.eks. mRNA) (f.eks. tilsetning av RNAase-inhibitorer). Amplifikasjons- og hybridiseirngs-tester kan også utføres in situ, for eksempel i tynne vevssnitt fra en biopsiprøve eller fra et celle-monolag (f.eks. blodlegemer eller disaggregerte vevskulturceller). Amplifikasjon kan også foretas i intakte hele celler eller fikserte celler. For eksempel kan det som kjent foretas PCR-, RT-PCR- eller LCR-amplifikasjon in situ, f.eks. ved å benytte en polymerase eller ligase, en primer eller primere og (deoksy)-ribonukleosid-trifosfater (om en polymerase benyttes) og revers transkriptase og primer (dersom RNA skal transkriberes og cDNA påvises) på fikserte, permeabiliserte eller mikroinjiserte celler for å amplifisere mål-hTRT RNA eller -DNA. Celler inneholdende hTRT RNA (f.eks. telomerase-positive celler) eller en hTRT DNA-sekvens av interesse, kan da påvises. Denne metode er ofte egnet når det benyttes fluorescens-merkede dNTP, primere eller andre komponenter i sammenheng med mikroskopi, FACS-analyse eller lignende.

2) AMPLIFIKASJONS-BASERTE BESTEMMELSER

I én utførelsesform er bestemmelsen ifølge foreliggende oppfinnelse amplifikasjons-baserte tester for påvisning av et hTRT-gen eller genprodukt. I en amplifikasjons-basert test amplifiseres hele eller en del av et hTRT-gen eller transkript (f.eks. mRNA eller cDNA; heretter også omtalt som «mål»), og amplifikasjonsproduktet påvises deretter direkte eller indirekte. Når det ikke er noe underliggende gen eller genprodukt som kan virke som templat, produseres ikke noe amplifikasjonsprodukt (f.eks. av den forventede størrelse) eller er amplifikasjonen uspesifikk og i alminnelighet oppnås intet enkelt amplifikasjonsprodukt. Når derimot det underliggende gen eller genproduktene forekommer, amplifiseres målsekvensen, hvilket gir en indikasjon på nærværet og/eller mengden av det underliggende gen eller mRNA. Mål-amplifikasjons-baserte tester er velkjente for fagmannen.

Det tilveiebringes et bredt utvalg av primere og prober for påvisning av hTRT-gener og genprodukter. Slike primere og prober er tilstrekkelig komplementære til hTRT-genet eller genproduktet til å hybridisere til mål-nukleinsyren. Typiske primere har en lengde på minst 6 baser, vanligvis på mellom ca. 10 og ca. 100 baser, typisk mellom ca. 12 og ca. 50 baser, og har ofte en lengde på mellom ca. 14 og ca. 25 baser. Fagmannen vil etter gjennomgang av foreliggende beskrivelse ved bruk av rutinemetoder, kunne velge primere for å amplifisere hele, eller en hvilken som helst del av, hTRT-genet eller genproduktet eller å skjelne mellom variant-genprodukter, hTRT-alleler og lignende. Tabell 2 angir en liste over illustrative primere egnet for PCR-amplifikasjon av hTRT eller spesifikke hTRT-genprodukter eller regioner. Som kjent på området kan det for amplifikasjon benyttes enkle oligomerer (f.eks. US-patent 5.545.522), nestede sett av oligomerer eller endog en degenerert samling av oligomerer, f.eks. som illustrert gjennom amplifiseringen av Tetrahymena TRT cDNA som beskrevet nedenfor.

Oppfinnelsen tilveiebringer et utvalg av metoder for amplifisering og påvisning av et hTRT-gen eller genprodukt, inklusivt polymerasekjedereaksjonen (inklusivt alle varianter, f.eks. revers-transkriptase-PCR; the Sunrise Amplification System (Oncor, Inc. Gaithersburg,MD); og en rekke andre kjente varianter). I én illustrerende utførelsesform foretas PCR-amplifikasjon i en 50 u.L løsning inneholdende nukleinsyreprøven (f.eks. cDNA oppnådd gjennom revers transkripsjon av hTRT RNA), 100 uM av hver dNTP (dATP, dCTP, dGTP og dTTP; Pharmacia LKB Biotechnology, NJ) de hTRT-spesifikke PCR-primere, 1 enhet/Taq-polymerase (Perkin Eimer, Norwalk CT), lx PCR-buffer (50 mM KC1,10 mM Tris, pH 8,3 ved romtemperatur, 1,5 mM MgCh, 0,01% gelatin) hvor amplifikasjonen foretas i ca. 30 runder ved 94°C i 45 sekunder, 55°C i 45 sekunder og 72°C i 90 sekunder. Det er imidlertid klart at det kan foretas adskillige variasjoner for å optimalisere PCR-amplifikasjon for en bestemt reaksjon.

Andre egnede mål-amplifikasjonsmetoder innbefatter ligasekjedereaksjonen (LCR; feks. Wu & Wallace, 1989, Genomics 4:560; Landegren et al., 1988, Science, 241:1077, Barany, 1991, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 88:189 og Barringer et al., 1990, Gene, 89:117); kjede-fortrengningsamplifikasjon (SDA; f.eks. Walker et al., 1992, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 89:392-396); transkripsjonsamplifikasjon (f.eks. Kwoh et al., 1989, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 86:1173); self-sustained sequence replication (3SR; f.eks. Fahy et al., 1992, PCR Methods Appl. 1:25, Guatelli et ai, 1990, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 87:1874); nukleinsyresekvens-basert amplifikasjon (NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario; f.eks. Compton, 1991, Nature, 350:91); det transkripsjons-baserte amplifikasjonssystem (TAS); og SSR (self-sustained sequence replication system). Samtlige ovennevnte publikasjoner inkorporeres herved med hele sitt innhold i foreliggende beskrivelse. En egnet variant av PCR er PCR ELISA (f.eks. Boehringer Mannheim Cat. No.l 636 111) hvor digoksigenin-dUTP inkorporeres i PCR-produktet. PCR-reaksjonsblandingen denatureres og hybridiseres med et biotinmerket oligonukleotid konstruert for å hybridisere til en intern sekvens av PCR-produktet. Hybridiseringsproduktene immobiliseres på streptavidin-dekkede plater og påvises ved å benytte anti-digoksygenin-antistoffer. Eksempler på teknikker som er tilstrekkelige til å innføre fagmannen i in vitro amplifikasjonsmetoder finnes i PCR Technology: Principles and Appliccations for DNA Amplification, H. Erlich, red. Freeman Press, New York, NY (1992); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, red. Innis, Gelfland, Snisky & White, Academic Press, San Diego, CA (1990); Mattila et al., 1991, Nucleic Acids Res. 19:4967; Eckert & Kunkel, (1991) PCR Methods and Applications 1:17; PCR red. McPherson, Quirkes & Taylor, IRL Press, Oxford; US-patenter 4.683.195,4.683.202 og 4.965.188; Barringer et al., 1990, Gene, 89:117; Lomell et al., 1989, J. Clin. Chem. 35:1826, som samtlige herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse.

Amplifiserte produkter kan analyseres direkte, f.eks. ut fra størrelse bestemt ved gelelektroforese; ved hybridisering til en mål-nukleinsyre immobilisert på en fast bærer, så som en kule, membran, objektglass eller chip; ved sekvensering; immunologisk, f.eks. ved PCR-ELIS A, ved påvisning av et fluorescerende, fosforescerende eller radioaktivt signal; eller ved hjelp av én av en rekke andre velkjente metoder. Et illustrativt eksempel på en påvisningsmetode benytter for eksempel PCR-primere forstørret med håmålssløyfer koblet til fluorescein og et benzoesyre-derivat som tjener som undertrykker, slik at fluorescens bare emitteres når primerne folder seg ut for å binde deres mål og replikasjon inntrer.

Siden hTRT mRNA i alminnelighet uttrykkes som et uvanlig sjeldent transkript som forekommer i meget lave nivåer selv i telomerase-positive celler, er det ofte ønskelig å optimalisere eller forsterke det signal som resulterer fra amplifikasjonstrinnet. En måte å gjøre dette på er å øke antall amplifiseirngsrunder. Mens 20-25 runder for eksempel er passende for amplifisering av de fleste mRNA ved å benytte polymerasekjedereaksjonen under standard reaksjonsbetingelser, kan påvisning av hTRT mRNA i mange prøver fordre så mange som 30 til 35 amplifiseirngsrunder, avhengig av deteksjonsmåte og amplifikasjonseffektivitet. Et veloverveid valg av amplifiseringsbetingelser, inklusivt antall amplifikasjonsrunder, kan benyttes for å utvikle en test som resulterer i et amplifikasjonsprodukt kun når prøven inneholder en terskelverdi av målet (dvs. slik at bare prøver med et høyt nivå av hTRT mRNA gir et «positivt» resultat). Dessuten er det kjent metoder for å øke signal produsert ved amplifikasjon av målsekvensen. Metoder for å øke evnen til å påvise det amplifiserte mål, omfatter signalamplifikasjonssystemer, som f.eks.: forgrenet DNA signalamplifikasjon (f.eks. US-patent 5.124.246; Urdea, 1994, Bio/Tech. 12:926); tyramid-signalamplifikasjon- (TSA) system (DuPont); katalytisk signalamplifikasjon (CSA); Dako); Q Beta Replicase systemer (Tyagi et al., 1996, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 93:5395); eller lignende.

Det vil for fagmannen uansett hvilken amplifikasjonsmetode som benyttes, være klart at det kan benyttes en rekke kvantitative metoder dersom kvantifisering ønskes. For eksempel kan to eller flere polynukleotider ko-amplifiseres i en enkelt prøve. Denne metode kan benyttes som en lettvint metode for kvantifisering av mengden av hTRT mRNA i en prøve, siden de reverse transkripsjons- og amplifikasjons-reaksjonene foretas i samme reaksjon for et mål- og kontroll-polynukleotid. Ko-arnplifikasjon av kontroll-polynukleotidet (vanligvis foreliggende i en kjent konsentrasjon eller kjent kopitall) kan benyttes for normalisering til celleantallet i prøven sammenlignet med mengden av hTRT i prøven. Egnede kontroll-polynukleotider for ko-amplifikasjonsreaksjoner innbefatter DNA, RNA uttrykt fra husholdningsgener, konstitutivt uttrykte gener, og in vitro syntetiserte RNA eller DNA tilsatt til reaksjonsblandingen. Endogene kontroll-polynukleotider er de som allerede foreligger i prøven, mens eksogene kontroll-polynukleotider tilsettes til en prøve, hvorved det dannes en

«oppspriteb> reaksjon. Illustrative kontroll-RNA omfatter p-aktin RNA, GAPDH RNA, snRNA, hTR og endogent uttrykt 28S rRNA (se Khan et al, 1992, Neurosci. Lett. 147:114). Eksogene kontroll-polynukleotider omfatter en syntetisk AW106 cRNA, som kan syntetiseres som en sense-kjede fra pAW106 ved T7-polymerase. For at ko-amplifikasjonsmetoden skal være egnet for kvantifisering, må kontroll- og mål-polynukleotider i alminnelighet begge amplifiseres i et lineært område. Detaljerte protokoller for kvantitativ PCR finnes i PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Innis et al, Academic Press, Inc. N.Y.

(1990) og Ausubel et al, supra (Unit 15) og Diaco, R. (1995) Practical Considerations for the Design of Quantitative PCR Assays, i PCR Strategies, s. 84-108, Innis et al, Academic Press, New York.

Avhengig av sekvensen av den endogene eller eksogene standard, kan det benyttes forskjellige primersett for ko-amplifikasjonsreaksjonen. I én metode, betegnet kompetitiv amplifikasjon, involverer kvantitativ PCR samtidig ko-amplifisering av en kjent mengde av en kontrollsekvens ved å benytte de samme primere som er benyttet for amplifikasjon av mål-nukleinsyren (et par av to primere). I en alternativ utførelsesform, kjent som ikke-kompetitiv konkurranse, amplifiseres kontrollsekvensen og målsekvensen (f.eks. hTRT cDNA) ved å benytte forskjellige primere (dvs. to par å to primere). I en annen alternativ utførelsesform, betegnet semi-kompetitiv amplifikasjon, benyttes tre primere, hvorav én er hTRT-spesifikk, én er kontroll-spesifikk og én er i stand til hybridisering både til mål- og kontroll-sekvensene. Semi-kompetitiv amplifikasjon er beskrevet i US-patent 5.629.154, som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse.

3) HYBRIDISERINGS-BASERTE BESTEMMELSER

a) GENERELT

En rekke metoder for spesifikk DNA- og RNA-måling ved å benytte nukleinsyre-hybridiseringsteknikker er kjent for fagmannen (se Sambrook et al, supra). Hybridiserings-baserte bestemmelser refererer seg til bestemmelser hvor en nukleinsyre-probe hybridiseres til en mål-nukleinsyre. Vanligvis er nukleinsyre-hybridiserings-probene helt eller tilnærmet identiske med en sammenhengende sekvens av hTRT-genet eller RNA-sekvensen. Fortrinnsvis har nukleinsyre-prober en lengde på minst ca. 10 baser, ofte minst ca. 20 baser og enkelte ganger minst ca. 200 baser eller mer. Metoder for valg av nukleinsyre-probesekvenser for bruk ved nukleinsyre-hybridisering er omtalt i Sambrook et al, supra. I enkelte formater er minst den ene av målet og proben immobilisert. Den immobiliserte nukleinsyre kan være DNA, RNA eller et annet oligo- eller polynukleotid og kan omfatte naturlige eller ikke-naturlig forekommende nukleotider, nukleotidanaloger eller skjeletter. Slike bestemmelser kan være i ett av flere formater, omfattende: Southern, northern, dot- og slot-blott, high-density polynukleotid eller oligonukleotid-rekker (f.eks. GeneChips™ Affymetrix), dyppe-sticks, stifter, chips eller kuler. Alle disse teknikkene er velkjent på området og utgjør grunnlaget for mange kommersielt tilgjengelige diagnosesett. Hybridiserings-teknikker er generelt beskrevet i Hames et al, Nuclieic Acid Hybridization, A Practical Approach IRL Press (1985); Gall & Pardue Proe. Nati. Acad. Sei., U.S.A. 63:378-383 (1969); og John et al, Nature, 223:582-587 (1969).

En rekke nukleinsyre-hybridiseringsformater er kjent for fagmannen. For eksempel er et vanlig format direkte hybridisering, hvor en mål-mikleinsyre hybridiseres til en merket, komplementær probe. I alminnelighet benyttes det for hybridisering merkede nukleinsyrer, hvor merkingen utgjør det påviselige signal. En metode for å vurdere forekomst, fravær eller mengde av hTRT mRNA er å foreta en northern-overføring av RNA fra en prøve og hybridisering av en merket hTRT-spesifikk nukleinsyre-probe som illustrert i Eksempel 2. Som nevnt ovenfor er hTRT mRNA når den i det hele tatt forekommer, tilstede i meget lave mengder i de fleste celler. Når norhem-hybirdisering benyttes vil det derfor ofte være ønskelig å benytte et amplifikasjonstrinn (eller alternativt, store mengder utgangs-RNA). En egnet metode for vurdering av forekomst, fravær eller kvantitet av DNA som koder for hTRT-proteiner i en prøve, involverer en Southem-overføring av DNA fra en prøve og hybridisering av en merket hTRT-spesifikk nukleinsyre-probe.

Andre vanlige hybridiseringsformater omfatter sandwich-tester og tester basert på konkurranse eller fortrengning. Sandwich-tester er kommersielt egnede hybridiseirngstester for påvisning eller isolering av nukleinsyresekvenser. Slike tester utnytter en «innfangende» nukleinsyre kovalent immobilisert til en fast bærer og en merket «signal» nukleinsyre i løsning. Den biologiske eller kliniske prøve vil stille nukleinsyren til rådighet. Den «innfangende» nukleinsyre og «singab>-nukleinsyre-proben hybridiserer med mål-nukleinsyren for å danne et «sandwich»-hybridiseringskompleks. For å være effektivt må signal-nukleinsyren ikke kunne hybridisere med den innfangende nukleinsyre.

b) CHIP-BASERTE OG OBJEKTGLASS-BASERTE TESTER

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også probe-baserte hybridiserings-tester for

hTRT-genprodukter som benytter rader av immobiliserte oligonukleotider eller polynukleotider som en hTRT-nukleinsyre kan hybridisere til (dvs. til enkelte, men vanligvis ikke alle, eller endog de fleste, av de immobiliserte oligo- eller polynukleotidene). High-density oligonukleotid-rader eller polynukleotid-rader gir hjelpemidler for effektivt å påvise nærvær og karakteristika (f.eks. sekvens) av en mål-nukleinsyre (f.eks. hTRT-gen, mRNA eller cDNA). Det er kjent teknikker for fremstilling av rader inneholdende 1000-vis av oligonukleotider som er komplementære til definerte sekvenser i definerte lokaliseringer på en overflate, ved å benytte fotolitografiske teknikker for syntese in situ (se f.eks. US-patent 5.578.832; 5.556.752 og 5.510.270; Fodoref al, 1991, Science 251:767; Pease et al, 1994, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 91:5022; og Lockhart et al, 1996, Nature Biotech. 14:1675) eller

andre metoder for hurtig syntese og avsetning av definerte oligonukleotider (Blanchard et al., 1996, Biosensors & Bioelectronics 11:687). Når disse metodene benyttes, syntetiseres oligonukleotider (f.eks. 20-merer) av kjent sekvens direkte på en overflate, som f.eks. et derivatisert objektglass. Vanligvis er raden som produseres rikelig og har flere oligonukleotid-prober på den chip som er spesifikk for det hTRT-polynukleotid som skal påvises.

Kombinasjoner av oligonukleotid-prober kan utformes slik at de påviser alternativt spleisede mRNA eller identifisere hvilke av forskjellige hTRT-alleler som uttrykkes i en bestemt prøve.

I én illustrativ utførelsesform amplifiseres (f.eks. ved bruk av PCR) cDNA fremstillet ved revers transkripsjon av total RNA fra en testcelle. I alminnelighet merkes amplifikasjon-produktet, f.eks. ved inkorporering av en fluorescens-merket dNTP. De merkede cDNA hybridiseres deretter til en chip som omfatter oligonukleotid-prober som er komplementære til forskjellige subsekvenser av hTRT-genet. Hybridiseringsposisjonene bestemmes (f.eks. i henhold til den generélle metode til Shalon et al., 1996, Genome Research 6:639 eller Schena et al., 1996, Genome Res. 6:639) og sekvens (eller annen informasjon) avledet fra hybridiseringsmønsteret ved hjelp av velkjente hjelpemidler.

I én utførelsesform hybridiseres to cDNA-prøver som hver er merket med ulike fluorescerende grupper, til den samme chip. Forholdet mellom hybridiseringen av hver merket prøve til steder som er komplementære til hTRT-genet, bestemmes deretter. Dersom begge prøvene inneholder den samme mengde hTRT mRNA, vil forholdet mellom de to fluorescerende gruppene være 1:1 (signalene fra de fluorescerende gruppene kan måtte justeres for å ta hensyn til eventuell forskjell i den molare sensitivitet av de fluorescerende gruppene). Dersom en prøve derimot er fra et friskt (eller kontroll) vev og den andre prøven er fra et cancerøst vev, vil den fluorescerende gruppe benyttet i den andre prøven, dominere.

c) IN SITU HYBRIDISERING

En alternativ måte å påvise ekspresjon av et gen som koder for et hTRT-protein på, er

in situ hybridisering. In situ hybridiseirngstester er velkjente og er generelt beskrevet i Angerer et al., Methods Enzymol, 152:649-660 (1987) og Ausubel et al, supra. I en in situ hybridiseirngstest fikseres celler eller vevsprøver til en fast bærer, i alminnelighet i en permeabilisert tilstand, typisk på et objektglass. Cellene bringes deretter i kontakt med en hybridiseirngstøsning ved en moderat temperatur for å gi mulighet for hybridisering av merkede nukleinsyre-prober (f.eks. <35>S-merkede riboprober, fluorescens-merkede prober) fullstendig eller tilnærmet komplementære til hTRT. Den frie probe fjernes ved vasking og/eller nuklease-oppslutning og bundet probe synliggjøres direkte på objektglasset ved autoradiografi eller ved en passende avbildningsteknikk kjent på området.

4) SPESIFIKK PÅVISNING AV VARIANTER

Som angitt ovenfor og illustrert i eksemplene (f.eks. Eksempel 9), kan amplifikasjons-primere eller prober velges for å gi amplifikasjonsprodukter som spenner over spesifikke delesjoner, trunkeringer og insersjoner, og derved forenkle påvisningen av bestemte varianter eller abnormiteter i hTRT mRNA.

Ett eksempel på et tiTRT-variant-genprodukt som kan påvises er en hTRT RNA som f.eks. et produkt (SEKV. ID. NR:4) beskrevet ovenfor og i Eksempel 9. Den eventuelle biologiske funksjon av Al 82-vairanten(e) er ikke kjent; men det trunkerte hTRT-protein som antas å kodes av varianten, kan være involvert i regulering av telomeraseaktivitet, f.eks. ved sammensetning av en ikke-funksjonell telomerase RNP som titrerer telomerasekomponenter. Alternativt vil negativ regulering av telomeraseaktivitet kunne oppnås ved å styre hTRT pre-mRNA- (nascerende mRNA) prosessering på en måte som fører til eliminering av full-lengdes mRNA og redusering av hTRT mRNA-nivåer og økning av Al 82 hTRT RNA-nivåer. Av denne og andre grunner er evnen til å påvise A182-varianter nyttig. I tillegg vil det enkelte ganger være ønskelig, i prøver hvor to arter hTRT RNA forekommer (så som Al 82 hTRT RNA og hTRT RNA som koder for full-lengdes hTRT-protein) å sammenligne deres relative og/eller absolutte rikelighet.

Oppfinnelsen tilveiebringer et utvalg metoder for påvisning av A182-varianter. For eksempel vil amplifikasjon hvor det benyttes primerpar som spenner over delesjonen på 182 basepar, resultere i produkter med ulik størrelse som tilsvarer de deleterte og udeleterte hTRT RNA, dersom begge er tilstede, hvilket kan kan skjelnes på grunnlag av størrelse (f.eks. ved gelelektroforese). Eksempler på primerpar egnet for amplifisering av den region som spenner over delesjonen på 182 bp, innbefatter TCP 1.14 og TCP 1.15 (primersett 1) eller TCP1.25 og bTCP6 (primersett 2) (se Tabell 2). Disse primerparene kan benyttes individuelt eller i et nestet PCR-forsøk hvor primersett 1 benyttes først. Det vil for fagmannen også være klart at hybridiseringsmetoder (f.eks. northem-hybirdisering) eller RNAse-beskyttelsestester ved bruk av en hTRT-nukleinsyre-probe ifølge oppfinnelsen kan benyttes for å påvise og skille hTRT RNA-varianter.

En annen egnet metode medfører PCR-amplifikasjon (eller tilsvarende) ved å benytte tre primere. Analogt med den semi-kompetitive kvantitative PCR-metode som er beskrevet mer detaljert ovenfor, er én primer spesifikk for hver av hTRT RNA-artene (f.eks. som illustrert i Tabell 4), og én primer er komplementær til begge artene (f.eks. TCP 1.25 (2270-2288)). Et eksempel på en primer spesifikk for SEKV. ID. NR:1 er én som smelter sammen innen 182 nukleotidsekvensen (dvs. nukleotidene 2345 til 2526 av SEKV. ID. NR:1), f.eks. TCP1.73 (2465-2445). For eksempel er en primer som er spesifikk for SEKV. ID. NR:4 (en A182-variant) én som smelter sammen ved nukleotidene 2358 til 2339 av SEKV. ID. NR:4 (dvs. stedet tilsvarende 182 nukleotid-innskuddet i SEKV. ID. NR:1). Den absolutte rikelighet av Al 82 hTRT mRNA-artene eller dens relative rikelighet sammenlignet med artene som koder for det full-lengdes hTRT-protein, kan analyseres for korrelasjon til celletilstand (f.eks. evne til ubegrenset proliferasjon). Det vil være klart at en rekke andre primere eller amplifikasjons- eller påvisningsmetoder kan velges på grunnlag av foreliggende beskrivelse.

Andre hTRT-genvarianter eller genprodukter som kan påvises innbefatter de som karakteriseres ved premature stoppkodoner, delesjoner, substitusjoner eller insersjoner. Delesjoner kan påvises gjennom den forminskede størrelse av genet, mRNA-transkript eller cDNA. Tilsvarende kan insersjoner påvises gjennom størrelsesøkningen av genet, mRNA-transkriptet eller cDNA. Insersjoner og delesjoner ville også kunne forårsake forskyvninger i leserammen som fører til for tidlige stoppkodoner eller lengre åpne leserammer. Substitusjoner, delesjoner og insersjoner kan også påvises ved probe-hybridisering. Endringer kan også påvises ved å iaktta endringer i størrelsen av hTRT-polypeptidvarianten (f.eks. ved westem-analyse) eller alt etter forholdene, ved hybridisering eller spesifikk amplifikasjon. Som et alternativ kan mutasjoner bestemmes ved sekvensering av genet eller genproduktet etter standardmetoder. I tillegg, og som angitt ovenfor, kan amplifikasjonstester og hybridiserings-prober velges for spesifikt å målsøke bestemte abnormiteter. For eksempel kan det velges nukleinsyre-prober eller amplifikasjons-primere som spesifikt henholdsvis hybridiserer til eller amplifiserer den region som omfatter delesjonen, substitusjonen eller insersjonen. Når hTRT-genet inneholder en slik mutasjon, vil proben enten (1) ikke hybridisere eller amplifikasjonsreaksjonen ikke gi spesifikk amplifikasjon eller bevirke en endring i størrelsen av amplifikasjonsproduktet eller hybridiseringssignalet, eller (2) proben eller amplifikasjonsreaksjonen omfatte hele delesjonen eller en ende av delesjonen (delesjonsovergangen); eller (3) kan det tilsvarende velges prober og amplifikasjonsprimere som spesifikt målsøker punktmutasjoner eller insersjoner.

5) PÅVISNING AV MUTANTE hTRT-ALLELER

Mutasjoner i hTRT-genet kan være ansvarlig for initiering av sykdom eller kan bidra til en sykdomstilstand. Endringer av den genomiske DNA av hTRT kan påvirke gen-transkripsjonsnivåer, endre aminosyrerester i hTRT-proteinet, forårsake dannelse av trunkerte hTRT-polypeptider, endre pre-mRNA-prosesseringsveier (som kan endre hTRT mRNA-nivåer) og dessuten ha andre konsekvenser.

Endringer av genomisk DNA i ikke-hTRT-loci kan også påvirke ekspresjon av hTRT eller telomerase, ved å endre de enzymer eller celleprosesser som er ansvarlige for regulering av hTRT, hTR og telomerase-assosiert proteinekspresjon og for prosessering og RNP-sammensetning og transport. Endringer som påvirker hTRT-ekspresjon, prosessering eller RNP-sammensetning kan være vesentlig for cancerutvikling, aldersbetingede sykdommer, sykdommer som følge av DNA-ødeleggelse og andre.

Påvisning av mutasjoner i hTRT mRNA eller dens gen og genkontrollelementer, kan i henhold til de her angitte metoder, oppnås på flere måter. Illustrerende eksempler innbefatter følgende: en teknikk betegnet primerscreening kan benyttes, idet det utvikles PCR-primere hvis 3'-ender hybridiserer til nukleotider i en prøve-DNA (eller RNA) som eventuelt er mutert. Dersom denne DNA (eller RNA) amplifiseres av primerne, da stemte 3'-endene overens med nukleotidet i genet, men dersom DNA ikke amplifiseres, da stemte den ene eller eventuelt begge endene ikke overens med nukleotidene i genet, hvilket indikerer at det forelå en mutasjon. Lignende primerkonstruksjon kan benyttes for bestemmelse av punktmutasjoner, ved å benytte ligase-kjedereaksjonen (LCR, beskrevet ovenfor). Restriksjonsrfagmentlengde-polymorfisme, RFLP (Pourzand, C, Cerutti, P, (1993) Mutat. Res. 288:113-121) er en annen teknikk som kan anvendes i foreliggende metode. Et Southern blott av human genomisk DNA kuttet med forskjellige restriksjonsenzymer, undersøkes med en hTRT-spesifikk probe. Forskjeller i fragmentantall eller størrelse mellom prøve og en kontroll indikerer en endring av den eksperimentelle prøve, vanligvis en insersjon eller delesjon. Enkeltkjede-konformasjons-polymorfisme, SSCP (Orrita, M. et al, (1989) PNAS USA 86:2766-70) er en annen teknikk som kan benyttes i foreliggende metode. SSCP er basert på den ulike migrering av denaturert villtype og mutant enkeltkjedet DNA (vanligvis frembragt ved PCR). Enkeltkjedet DNA vil. anta en tredimensjonal konformasjon som er sekvensspesifikk. Så små sekvensforskjeller som en enkelt base kan resultere i en mobilitetsforskyvning på en ikke-denaturerende gel. SSCP er på grunn av dens enkelhet en av de mest anvendte mutasjons-screeningsmetoder. Denaturerende gradient-gelelektroforese, DGGE (Myers, R.M., Maniatis, T. & Lerman, L.,

(1987) Methods in Enzymology, 155:501-527) er en annen teknikk som kan anvendes i foreliggende metode. DGGE identifiserer mutasjoner basert på smelteoppførselen av dobbelkjedet DNA. Det benyttes spesialisert denaturerende elektroforeseutstyr for å observere smelteprofilen av eksperimentell DNA og kontroll-DNA, idet DNA som inneholder en mutasjon vil ha et annet mobilitetsmønster enn kontrollen i disse gelsystemene. De omtalte eksempler belyser vanlig benyttet metodikk, men det eksisterer mange andre kjente teknikker som kan benyttes på bakgrunn av det som her er beskrevet.

F) KARYOTYPE-ANALYSE

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer dessuten fremgangsmåter og reagenser for karyotype-analyse eller annen kromosomanalyse ved å benytte hTRT-sekvensprober og/eller påvise eller lokalisere hTRT-gensekvenser i kromosomer fra en pasient, humancellelinje eller ikke-humancelle. I én utførelsesform kan amplifikasjon (dvs. endring i kopitall), delesjon (dvs. partiell delesjon), insersjon, substitusjon eller endringer i kromosomlokaliseringen (translokasjon) av et hTRT-gen, korreleres med forekomsten av en patologisk tilstand eller en predisponering for utvikling av en patologisk tilstand (f.eks. cancer).

Det er fastslått av foreliggende oppfinnere at hTRT-genet i normale humanceller kart-legges nær telomeren av kromosom 5p (se Eksempel 5, nedenfor). Den nærmeste STS-markør er D5S678 (se Figur 8). Lokaliseringen kan benyttes til å identifisere markører som er nært forbundet med hTRT-genet. Markøren kan benyttes til å identifisere YAC, STS, cosmider, BAC, lambda eller Pl-fag eller andre kloner som inneholder hTRT-genomiske sekvenser eller kontrollelementer. Markørene eller genlokaliseringen kan benyttes til skanning av humane vevsprøver med henblikk på endringer i den normale hTRT-genlokalisering, organisering eller sekvens som er assosiert med forekomsten av en type cancer eller sykdom. Denne informasjon kan benyttes diagnostisk eller prognostisk for den involverte sykdom eller cancer. Dessuten kan naturen av en hvilken som helst endring av hTRT-genet gi informasjon med hensyn til måten som celler blir udødelige på. For eksempel ville en translokasjonsbegivenhet kunne indikere at aktivering av hTRT-ekspresjon i enkelte tilfeller skjer ved å erstatte hTRT-promoteren med en annen promoter som styrer hTRT-transkripsjon på en feilaktig måte. Fremgangsmåter og reagenser av denne type kan ifølge oppfinnelsen benyttes til å inhibere hTRT-aktivering. Lokaliseringen kan også være nyttig for å bestemme naturen av hTRT-genrepresjon i normale somatiske celler, for eksempel hvorvidt lokaliseringen er del av ikke-uttrykkende heterokromatin. Nuklease-hypersensitivitetstester for å skjelne mellom heterokromatin og eukromatin er beskrevet for eksempel av Wu et al., 1979, Cell 16:797; Groudine & Weintraub, 1982, Cell, 30:131, Gross & Garrard, 1988, Ann. Rev. Biochem. 57:159.

I én utførelsesform identifiseres endringer av hTRT-genet ved karyotype-analyse ved å benytte en hvilken som helst av en rekke kjente metoder. En brukbar teknikk er in situ hybridisering (ISH). Når det benyttes in situ hybridiseringsteknikker for karyotype-analyse hybridiseres i alminnelighet en påvisbar eller påvisbart merket probe, til en kromosomal prøve in situ for å lokalisere en hTRT-gensekvens. Generelt omfatter ISH ett eller flere av følgende trinn: (1) fiksering av vevet, cellen eller annen biologisk struktur som skal analyseres; (2) prehybridiserings-behandling av den biologiske struktur for øke tilgjengeligheten for mål-DNA (f.eks. denaturering med varme eller alkali) og redusere uspesifikk binding (f.eks. ved å blokkere hybridiseringsevnen av repeterende sekvenser, f.eks. ved å benytte human genomisk DNA); (3) hybridisering av én eller flere nukleinsyre-prober (f.eks. konvensjonelle nukleinsyrer, PNA eller prober som inneholder andre nukleinsyre-analoger) til nukleinsyren i den biologiske struktur eller i vevet; (4) post-hybridiseirngsvaskinger for å fjerne nukleinsyre-fragmenter som ikke er bundet under hybridiseringen og (5) påvisning av de hybridiserte nukleinsyrefragmentene. De reagenser som benyttes i hvert av disse trinn og betingelsene for deres anvendelse, varierer med den bestemte anvendelse. Disse trinnene kan modifiseres på en rekke måter som vil være velkjent for fagmannen.

I én utførelsesform av ISH merkes hTRT-proben med en fluorescerende merking (fluorescerende in situ hybridisering; «FISH»). Det er i alminnelighet ønskelig å benytte tofarvet fluorescerende in situ hybridisering, hvor det benyttes to prober som hver er merket med ulike fluorescerende farvestoff. En testprobe som hybriserer til den aktuelle hTRT-sekvens merkes med ett farvestoff og en kontrollprobe som hybridiserer til en annen region, merkes med et annet farvestoff. En nukleinsyre som hybridiserer til en stabil del av det aktuelle kromosom, så som centromer-området, kan benyttes som kontrollprobe. På denne måte kan man ta hensyn til forskjeller mellom hybridiseringseffektiviteten fra prøve til prøve.

ISH-metodene for påvisning av kromosomale abnormiteter (f.eks. FISH) kan foretas på nanogram-mengder av angjeldende nukleinsyrer. Parafin-innleiret normalt vev eller tumorsnitt kan benyttes i likhet med ferskt og nedfrosset materiale, vev eller snitt. Siden FISH kan anvendes på begrenset materiale, kan også «touch»-preparater fremstillet fra ikke-dyrkede primærtumorer også benyttes (se f.eks. Kallioniemi et al., 1992, Cytogenet. Cell Genet. 60:190). For eksempel kan små vevsprøver fra tumorbiopsier benyttes for «touch»-prepareringer (se f.eks. Kallioniemi et al. supra). Små antall celler oppnådd ved aspirasjons-biopsi eller celler i kroppsvæsker (f.eks. blod, urin, spytt og lignende) kan også analyseres. For prenatal diagnostikk vil passende prøver være amnionvæske, maternalt blod og lignende. Egnede hybridiseringsprotokoller for de her beskrevne fremgangsmåter og reagenser er beskrevet i Pinkel et al., 1988, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 85:9138; EPO Pub. Nr. 430.402; Choo, red. Methods in Molecular Biology, Vol. 33: In Situ Hybridization Protocols, Humana Press, Totowa, New Jersey, (1994); og Kallioniemi et al, supra.

Andre egnede teknikker for karyotype-analyse innbefatter for eksempel slike teknikker som kvantitativ Southern blotting, kvantitativ PCR eller komparativ genomisk hybridisering (Kallioniemi et al., 1992, Science, 258:818), ved å benytte de hTRT-prober og primere ifølge oppfinnelsen som kan benyttes for å identifisere amplifikasjon, delesjon, insersjon, substitusjon eller andre omleiringer av hTRT-sekvenser i kromosomer i en biologisk prøve.

G) TRT POLYPEPTID-BESTEMMELSER

1) GENERELT

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer fremgangsmåter og reagenser for påvisning og kvantifisering av hTRT-polypeptider. Disse fremgangsmåtene inkluderer analytiske biokjemiske metoder som f.eks. elektroforese, massespektroskopi, gelforskyvning, kapillær elektroforese, kromatografiske metoder som gelfiltreringskromatografi, HPLC (high performance liquid chromatography), tynnskiktkromatografi (TLC), hyper-diffusjons-kromatografi og lignende, samt diverse immunologiske metoder som væske- eller gel-precipitinreaksjoner, immundiffusjon (enkelt eller dobbelt), immunelektroforese, radio-immunoassay (RIA), ELISA (enzyme-linked immunosorbent assays), immunfluorescens-bestemmelser, western blotting, massespektrometri og andre metoder beskrevet nedenfor og som vil være åpenbare for fagmannen på bakgrunn av denne beskrivelse.

2) ELEKTROFORETISKE BESTEMMELSER

I én utførelsesform påvises hTRT-polypeptidene ved en elektroforetisk protein-separasjon. I henhold til ett aspekt benyttes et todimensjonalt elektroforesesystem. Måter for å påvise proteiner ved bruk av elektroforetiske teknikker er velkjent for fagmannen (se generelt, R. Scopes (1982) Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y.; Deutscher, (1990) Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc. N.Y.).

I en beslektet utførelsesform benyttes en mobilitetsforskyvningstest (se f.eks. Ausubel et al., supra). Merket-hTR vil for eksempel assosiere med hTRT og vandre med endret mobilitet ved elektroforese i en ikke-denaturerende polyakrylamidgel eller lignende. Om for eksempel en (eventuelt merket) hTR-probe eller en (eventuelt merket) telomeraseprimer blandes med en prøve som inneholder hTRT, eller uttrykkes sammen med hTRT (f.eks. i et cellefritt ekspresjonssystem) vil nærværet av hTRT-protein (eller et polynukleotid som koder for hTRT) i prøven således resultere i en påvisbar endring av hTR-mobilitet.

3) IMMUNOASSAYS

a) GENERELT

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også fremgangsmåter for påvisning av hTRT-polypeptider ved å benytte ett eller flere antistoff-reagenser ifølge oppfinnelsen (dvs. immunoassays). I denne sammenheng er en immunoassay en bestemmelse som gjør bruk av et antistoff (som her bredt definert og spesifikt inkluderer fragmenter, kimærer og andre bindende midler) som spesifikt binder et hTRT-polypeptid eller epitop. Antistoffer ifølge oppfinnelsen kan fremstilles på en rekke velkjente måter, f.eks. som beskrevet ovenfor.

Det er kjent en rekke vel etablerte formater av immunologisk bindingsbestemmelse egnet for foreliggende oppfinnelse (se f.eks. US-patent 4.366.241; 4.376.110; 4.517.288 og 4.837.168). Se f.eks. Methods in Cell Biology Volume 37: Antibodies in Cell Biology, Asai, red. Academic Press, Inc. New York (1993); Basic and Clinical Immunology 7* Edition, Stites & Terr, red. (1991); Harlow & Lane, supra [f.eks. kapittel 14] og Ausubel et ai, supra, [f.eks. kapittel 11], som samtlige herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse. I alminnelighet benytter immunologiske bindingsassays (eller immunoassays) et «innfangende middel» til spesifikt å binde og ofte immobilisere analytten. I én utførelsesform er det innfangende middel en del som spesifikt bindes til et hTRT-polypeptid eller en subsekvens, så som et anti-hTRT-antistoff. I en alternativ utførelsesform kan det innfangende middel binde et hTRT-assosiert protein eller RNA under betingelser hvor det hTRT-assosierte molekyl forblir bundet til hTRT (slik at om det hTRT-assosierte molekyl immobiliseres, immobiliseres likeledes hTRT-proteinet). Det er klart at i tester hvor et hTRT-assosiert molekyl innfanges, vil det assosierte hTRT-protein i alminnelighet være tilstede og således kunne påvises, f.eks. ved å benytte et anti-hTRT-antistoff eller lignende. Immunoassays for påvisning av proteinkomplekser er kjent på området (se f.eks. Harlow & Lane, supra, side 583).

Vanligvis bestemmes det hTRT-genprodukt som testes direkte eller indirekte ved å benytte en påvisbar merking. Den bestemte merking eller påvisbare gruppe som benyttes i testen er vanligvis ikke en kritisk del av oppfinnelsen så lenge den ikke signifikant forstyrrer den spesifikke bindingen av det eller de antistoff som benyttes i testen. Merkingen kan være kovalent knyttet til det innfangende middel (f.eks. et anti-TRT-antistoff) eller være tilknyttet en tredje del, så som et annet antistoff, som spesifikt bindes til f.eks.: hTRT-polypeptidet (til en annen epitop enn den som gjenkjennes av det innfangende middel), det innfangende middel (f.eks. et anti-(første antistoff) immunglobulin); et anti-TRT-antistoff; et antistoff som binder et anti-TRT-antistoff; eller et antistoff/telomerase-kompleks (f.eks. via binding til et assosiert molekyl, så som et telomerase-assosiert protein). Andre proteiner som er i stand til å binde et antistoff benyttet i testen, så som protein A eller protein G, kan også merkes. I enkelte utførelsesformer vil det være gunstig å benytte mer enn ett merket molekyl (dvs. slike som kan adskilles fra hverandre). Når dessuten det mål som er bundet (f.eks. immobilisert) av det innfangende middel (f.eks. anti-hTRT-antistoff) er et kompleks (dvs. et kompleks av hTRT og et TRT-assosiert protein, hTR eller annet TRT-assosiert molekyl) kan det benyttes et merket antistoff som gjenkjenner proteinet eller RNA assosiert med hTRT-proteinet. Når komplekset er et protein-nukleinsyrekompleks (f.eks. TRT-hTR), kan rapportørmolekylet være et polynukleotid eller annet molekyl (f.eks. enzym) som gjenkjenner RNA-komponenten av komplekset.

Enkelte former av immunoassay fordrer ikke bruk av merkede komponenter. For eksempel kan agglutineringstester benyttes for å påvise nærværet av mål-antistoffene. I så fall agglutineres antigen-dekkede partikler med prøver som omfatter mål-antistoffene. For dette format behøver ikke komponentene være merket, og nærværet av mål-antistoffet kan enkelt påvises visuelt.

b) IKKE-KOMPETITIVE ASSAY-FORMATER

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer fremgangsmåter og reagenser for kompetitive

og ikke-kompetitive immunoassays for påvisning av hTRT-polypeptider. Dcke-kompetitive immunoassays er tester hvor mengden av innfanget analytt (i dette tilfellet hTRT) måles direkte. En slik test er en tosteds, monoklonalt basert immunoassay som gjør bruk av monoklonale antistoffer som er reaktive overfor to ikke-interfererende epitoper på hTRT-protein. Se f.eks. Maddox et ai, 1983, J. Exp. Med. 158:1211 angående bakgrunns-informasjon. I én foretrukket «sandwich»-test bindes det innfangende middel (f.eks. et anti-TRT-antistoff) direkte til et fast substrat hvor det immobiliseres. Disse immobiliserte antistoffene innfanger deretter ethvert hTRT-protein som forekommer i testprøven. Det således immobiliserte hTRT kan deretter merkes, f.eks. ved binding til et andre anti-hTRT-antistoff som har en merking. Alternativt kan det andre anti-hTRT-antistoff være uten merking, men bli bundet av et merket tredje antistoff som er spesifikt for antistoffer av de arter som det andre antistoff skriver seg fra. Det andre antistoff kan alternativt være modifisert med en påvisbar del, som f.eks. biotin, som et tredje merket molekyl spesifikt kan bindes til, så som enzymmerket streptavidin.

c) KOMPETITIVE BESTEMMELSES-FORMATER

Ved kompetitive tester måles mengden av hTRT-protein i prøven indirekte ved å måle

mengden av et tilsatt (eksogent hTRT fortrengt eller utkonkurrert) fra et innfangende middel (f.eks. anti-TRT-antistoff) av hTRT-proteinet i prøven. I én kompetitiv test tilsettes en kjent mengde merket hTRT-protein til prøven, hvorpå prøven bringes i kontakt med et innfangende middel (f.eks. et antistoff som spesifikt binder hTRT-protein). Mengden av eksogent (merket) hTRT-protein bundet til antistoffet er omvendt proporsjonal med konsentrasjonen av hTRT-proteinet i prøven. I én utførelsesform immobiliseres antistoffet på et fast substrat. Mengden av hTRT-protein bundet til antistoffet kan bestemmes enten ved å måle mengden av hTRT-protein i et TRT/antistoff-kompleks, eller alternativt ved å måle mengden av gjenværende

ikke-kompleksert TRT-protein. Mengden av hTRT-protein kan påvises ved å benytte et merket hTRT-molekyl.

En hapten-inhiberingstest er et annet eksempel på en kompetitiv test. Ved denne test immobiliseres hTRT-protein på et fast substrat. En kjent mengde anti-TRT-antistoff tilsettes til prøven, og prøven bringes deretter i kontakt med det immobiliserte hTRT-protein. I dette tilfellet er den mengde anti-TRT-antistoff som er bundet til det immobiliserte hTRT-protein, omvendt proporsjonal med mengden av hTRT-protein i prøven. Mengden av immobilisert antistoff kan påvises ved enten å påvise den immobiliserte del av antistoffet eller den del av antistoffet som forblir i løsning. I henhold til dette aspekt kan påvisningen være direkte, hvor antistoffet er merket, eller indirekte hvor merkingen er bundet til et molekyl som spesifikt binder til antistoffet slik som ovenfor beskrevet.

d) ANDRE BESTEMMELSES-FORMATER

Oppfinnelsen tilveiebringer også reagenser og fremgangsmåter for påvisning og

kvantifisering av nærværet av hTRT i prøven ved å benytte et immunoblott-format (westem blott). I dette format separeres hTRT-polypeptider i en prøve fra andre prøvekomponenter ved gelelektroforese (f.eks. på basis av molekylvekt), hvorpå de separerte proteiner overføres til en passende fast bærer (så som et nitrocellulose-filter, et nylonfllter, derivatiserte nylonfiltere eller lignende), hvorpå bæreren inkuberes med anti-TRT-antistoffer ifølge oppfinnelsen. Anti-TRT-antistoffer binder spesifikt til hTRT eller andre TRT på den faste bæreren. Antistoffene kan merkes direkte eller alternativt påvises senere ved å benytte merkede antistoffer (f.eks. merkede sau-anti-mus-antistoffer) eller andre merkingsreagenser som spesifikt binder til anti-TRT-antistoffet.

Andre testformater inkluderer liposom-immunoassays (LIA), som benytter liposomer utviklet for å binde spesifikke molekyler (f.eks. antistoffer) og frigjøre innkapslede reagenser eller markører. De frigjorte kjemikaliene kan deretter påvises etter standardteknikker (se Monroe et al., 1986, Amer. Clin. Prod. Rev. 5:34).

Som angitt ovenfor, har testformater som benytter FACS (og tilsvarende instrumenter eller metoder) fordeler når hTRT-genprodukter måles i en heterogen prøve (som f.eks. en biopsiprøve inneholdende både normale og maligne celler).

e) SUBSTRATER, FASTE BÆRERE, MEMBRANER, FILTERE

Som angitt ovenfor, avhengig av testen, kan forskjellige komponenter, inklusivt

antigenet, mål-antistoffet eller anti-hTRT-antistoffet bindes til en fast overflate eller bærer (dvs. et substrat, en membran eller et filterpapir). Det er kjent mange metoder for immobilisering av biomolekyler til diverse faste overflater. For eksempel kan den faste overflate være en membran (f.eks. nitrocellulose), en mikrotiterplate (f.eks. PVC, polypropylen eller polystyren), et reagensglass (glass eller plast), en teststrimmel (f.eks. glass, PVC, polypropylen, polystyren, latex og lignende), et mikrosentirfugerør eller en glass- eller plastkule. Den ønskede komponent kan være kovalent bundet eller ikke-kovalent tilkoblet via uspesifikk binding.

Et stort utvalg organiske og uorganiske polymerer, både naturlige og syntetiske, kan benyttes som materiale for den faste overflate. Illustrative polymerer innbefatter polyetylen, polypropylen, poly(4-metylbuten), polystyren, polymetakrylat, poly(etylen-tereftalat), rayon, nylon, poly(vinyl-butyrat), polyvinyliden-difluorid (PVDF), silikoner, polyformaldehyd, cellulose, celluloseacetat, nitrocellulose og lignende. Andre materialer som kan benyttes er bl.a. papir, glass, keramer, metaller, metalloider, halvleder-materialer, sementer eller lignende. I tillegg kan substanser som danner gel, så som proteiner (f.eks. gelatiner), lipopolysakkarider, silikater, agarose og polyakrylamider, benyttes. Polymerer som danner diverse vandige faser som f.eks. dekstraner, polyalkylenglykoler eller overflateaktive midler, så som fosfolipider, langkjedede (12-24 karbonatomer) alkylammoniumsalter og lignende er også egnet. Når den faste overflaten er porøs, kan det benyttes forskjellige porestørrelser som avhenger av systemets natur.

Ved fremstilling av overflaten kan det benyttes en rekke ulike materialer, særlig som laminater, for å oppnå forskjellige egenskaper. For eksempel kan protein-overtrekk, så som gelatin, benyttes for å unngå uspesifikk binding, forenkle kovalent konjugasjon, forbedre signalpåvisning eller lignende.

Dersom kovalent binding mellom en forbindelse og overflaten ønskes, vil overflaten vanligvis være polyfunksjonell eller i stand til å kunne bli polyfunksjonell. Funksjonelle grupper som kan forekomme på overflaten og benyttes for tilkobling, kan omfatte karboksylsyrer, aldehyder, aminogrupper, cyanogrupper, etylengrupper, hydroksylgrupper, merkaptogrupper og lignende. Måten for tilkobling av et bredt utvalg forbindelser til ulike overflater er velkjent og omfattende illustrert i litteraturen. Se for eksempel Immobilized Enzymes, Ichiro Chibata, Halsted Press, New York, 1978, og Cuatrecasas (1970) J. Biol. Chem., 245 3059).

I tillegg til kovalent binding kan det benyttes diverse metoder for ikke-kovalent binding av en testkomponent. Ikke-kovalent binding er typisk uspesifikk absorpsjon av en forbindelse til overflaten.

Fagmannen vil kjenne til at det ved immunoassay ofte er ønskelig å redusere uspesifikk binding. Særlig når testen involverer et antigen eller et antistoff immobilisert på et fast substrat, er det ønskelig å minske graden av uspesifikk binding til substratet. Måter for å redusere slik uspesifikk binding er velkjent for fagmannen. I alminnelighet innebærer dette å dekke substratet med en proteinaktig sammensetning. I særlig utstrakt bruk er protein-sammensetninger som bovint serumalbumin (BSA), fettfritt melkepulver og gelatin, hvorav melkepulver iblant er å foretrekke. Alternativt er overflaten laget slik at den uspesifikt binder én komponent, men ikke i vesentlig grad binder en annen. For eksempel vil en overflate som bærer et lektin som f.eks. Concanavalin A, binde en karbohydratholdig forbindelse, men ikke et merket protein som mangler glykosylering. Diverse faste overflater for bruk ved ikke-kovalent tilkobling av testkomponenter er angitt i en oversikt i US-patent 4.447.576 og 4.254.082.

H) TESTER FOR ANTI-TRT-ANTISTOFFER

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også reagenser og tester for påvisning av hTRT-spesifikke immunglobuliner. I én utførelsesform inkuberes immobilisert hTRT (f.eks. rekombinant hTRT bundet til en mikrotiterplate-brønn) med serum fra en pasient under betingelser hvor eventuelt forekommende anti-hTRT-antistoff binder det immobiliserte hTRT. Etter vasking for å fjerne uspesifikt bundet immunglobulin, kan bundne serumantistoffer, dersom de er tilstede, påvises ved å tilsette påvisbart merkede anti-(human Ig)antistoffer (alternative utførelsesformer og varianter er velkjent for fagmannen; se f.eks. Harlow, supra, i Kap. 14). Disse testene er egnet til å påvise anti-hTRT-antistoffer i en hvilken som helst kilde, inklusivt serum fra dyr eller menneske eller i en bærer som f.eks. saltvann. I henhold til én utførelsesform benyttes testene for å påvise eller følge en immunrespons, særlig en autoimmun (f.eks. anti-telomerase) respons overfor hTRT-proteiner i en pasient. Anti-hTRT-antistoffer kan forekomme i serum eller annet vev eller væsker fra en pasient som lider av en autoimmun sykdom eller andre tilstander.

I) TESTKOMBINASJONER

De diagnostiske og prognostiske tester som her er beskrevet, kan utføres i ulike kombinasjoner og kan også utføres i forbindelse med andre diagnostiske eller prognostiske tester. Når for eksempel de foreliggende metoder benyttes for å påvise nærvær av cancerceller i en pasientprøve, kan forekomsten av hTRT benyttes til å bestemme stadiet av sykdommen, hvorvidt en bestemt tumor sannsynligvis vil invadere tilstøtende vev eller metastasere til et fjernere sted, og hvorvidt en rekurrens av canceren er sannsynlig. Tester som kan gi ytterligere informasjon er mikroskopisk analyse av biopsiprøver, påvisning av antigener (f.eks. celle-overflatemarkører) assosiert med tumorigenitet (f.eks. ved å benytte histocytokjemi, FACS eller lignende), avbildningsmetoder (f.eks. etter administrering av merkede antitumor-antistoffer til en pasient), telomeraseaktivitetstester, telomerlengde-tester, hTR-tester eller lignende. Slike kombinasjonstester kan gi nyttig informasjon angående utviklingen av en sykdom.

Det er også klart at kombinasjoner av disse tester kan gi nyttig informasjon. Som nevnt ovenfor kan for eksempel tester for hTRT mRNA kombineres med tester for hTR (human telomerase RNA) eller telomeraseaktivitets- (dvs. TRAP) tester for å gi informasjon om telomerasesammensetning og funksjon.

J) ANALYSE-SETT

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også analyse-sett egnet for screening, overvåkning, diagnostisering og prognostisering av pasienter med en telomerase-relatert tilstand eller for bestemmelse av nivået av ekspresjon av hTRT i celler etler cellelinjer. Settene innbefatter ett eller flere reagenser for å bestemme tilstedeværelse eller fravær av et hTRT-genprodukt (RNA eller protein) eller for kvantifisering av ekspresjon av hTRT-genet. Foretrukne reagenser innbefatter nukleinsyreprimere og prober som spesifikt binder til hTRT-genet, RNA, cDNA eller deler derav, sammen med proteiner, peptider, antistoffer og kontrollprimere, prober, oligonukleotider, proteiner, peptider og antistoffer. Andre materialer, inklusivt enzymer (f.eks. reverse transkriptaser, DNA-polymeraser, ligaser), buffere, reagenser (merkinger, dNTP) kan inngå.

Settene kan alternativt omfatte, eller være kombinert med, enhver av de øvrige komponenter som her er beskrevet, eller et antistoff som spesifikt binder til hTRT-polypeptider eller subsekvenser derav. Antistoffet kan være monoklonalt eller polyklonalt. Antistoffet kan være konjugert til en annen del som f.eks. en merking og/eller kan være immobilisert på en fast bærer (substrat). Settene kan også inneholde et andre antistoff for påvisning av hTRT-polypeptid/antistoff-komplekser eller for påvisning av hybridiserte nukleinsyreprober, så vel som ett eller flere hTRT-peptider eller proteiner for bruk som kontroll, eller andre reagenser.

Antistoffet eller hybridiseirngsproben kan være fri eller immobilisert på en fast bærer, som f.eks. et reagensglass, en mikrotiterplate, en teststrimmel og lignende. Settet kan også inneholde bruksanvisninger som beskriver bruken av antistoffet eller hybridiseringproben i en test for påvisning av TRT. Settet kan inneholde passende reagenser for påvisning av merkinger, eller for merking av positive og negative kontroller, vaskeløsninger, fortynnings-buffere og lignende.

Ifølge én utførelsesform innbefatter settet et primerpar for amplifisering av

hTRT mRNA. Et slikt sett kan også omfatte en probe for hTRT-amplifisert DNA og/eller en polymerase, buffer, dNTP og lignende. I en annen utførelsesform omfatter settet en probe, eventuelt en merket probe. I en annen omfatter settet et antistoff.

X) IDENTIFISERING AV MODULATORER AV TELOMERASEAKTIVITET

A. GENERELT

Oppfinnelsen muliggjør forbindelser og behandlinger som modulerer aktiviteten eller ekspresjonen av en telomerase eller telomerasekomponent (f.eks. hTRT-protein). Oppfinnelsen tilveiebringer også tester og screeningmetoder (inklusivt massescreeninger) for identifisering av forbindelser og behandlinger som modulerer telomeraseaktivitet eller ekspresjon. Disse modulatorene av telomeraseaktivitet og ekspresjon (heretter omtalt som «modulatorer») inkluderer telomerase-agonister (som øker telomeraseaktivitet og/eller ekspresjon) og telomerase-antagonister (som minsker telomeraseaktivitet og/eller ekspresjon).

Modulatorene identifisert ifølge oppfinnelsen har et stort anvendelsesområde. For eksempel vil telomerasemodulatorene kunne være effektive terapeutiske midler for behandling av humane sykdommer. Screening med henblikk på agonistaktivitet og transkripsjonene eller translasjonelle aktivatorer sørger for blandinger som øker telomeraseaktivitet i en celle (inklusivt en telomer-avhengig replikasjonsevne eller en «partiell» telomeraseaktivitet). Slike agonistblandinger gir fremgangsmåter for immortalisering av ellers normalt ikke-transformerte celler, inklusivt celler som kan uttrykke nyttige proteiner. Slike agonister kan også føre til fremgangsmåter for kontroll av cellulær aldring. Omvendt fører screening med henblikk på antagonistaktivitet til blandinger som nedsetter telomer-avhengig replikasjonsevne, hvorved ellers udødelige celler, så som cancerceller, mortaliseres. Screening med henblikk på antagonistaktivitet fører til forbindelser som nedsetter telomeraseaktivitet, hvilket forhindrer ubegrenset celledeling av celler som oppviser uregulert cellevekst, så som cancerceller. Sykdommer og tilstander som kan behandles ved å benytte modulatorer er her angitt, f.eks. i avsnitt VII og IX, ovenfor. Generelt kan modulatorene ifølge oppfinnelsen benyttes når det er ønskelig å øke eller minske telomeraseaktivitet i en celle eller organisme. I tillegg til bruk ved behandling av sykdom, kan derfor en modulator som øker hTRT-ekspresjonsnivåer, benyttes til å frembringe en dyrket humancellelinje som har egenskaper som generelt beskrevet i avsnitt VIII, ovenfor, og diverse andre anvendelser som vil være åpenbare for fagmannen.

En forbindelse eller behandling modulerer «ekspresjon» av telomerase eller en telomerasekomponent når administrasjon av forbindelsen eller behandling endrer hastigheten eller nivået av transkripsjon av det gen som koder for en telomerasekomponent (f.eks. det gen som koder for hTRT mRNA), påvirker stabilitet eller post-transkripsjonell prosessering av RNA som koder for en telomerasekomponent (f.eks. transport, spleising, polyadenylering eller annen modifikasjon), påvirker translasjon, stabilitet, post-translasjonell prosessering eller modifisering av et uttrykt protein (f.eks. hTRT) eller på annen måte endrer nivået av funksjonell (f.eks. katalytisk aktiv) telomerase RNP. En forbindelse eller behandling påvirker en telomerase-«aktivitet» når adrnimstrering av forbindelsen eller behandling endrer en telomeraseaktivitet som f.eks. en hvilken som helst aktivitet beskrevet i avsnitt IV(B), ovenfor (f.eks. inklusivt prosesserende eller ikke-prosesserende telomerase katalytisk aktivitet; telomerase-prosesseringsevne; konvensjonell revers transkriptaseaktivitet; nukleolytisk aktivitet; primer eller substrat-bindende aktivitet; dNTP-bindende aktivitet; RNA-bindende aktivitet; telomerase RNP-sammensetnings og protein-bindingsaktivitet). Det skal bemerkes at det ikke nødvendigvis er noe skarpt skille mellom endringer i «aktivitet» og endringer i «ekspresjon» og at disse betegnelsene benyttes for lettvinthets skyld og ikke er ment begrensende. Det skal også bemerkes at modulatorene identifisert ifølge oppfinnelsen spesifikt påvirker telomeraseaktivitet eller ekspresjon (f.eks. uten generelt å endre ekspresjonen av husholdningsproteiner som f.eks. aktin) i stedet for, for eksempel å redusere ekspresjon av en telomerasekomponent gjennom uspesifikk forgiftning av en målcelle.

B. TESTER FOR IDENTIFISERING AV TELOMERASE-MODULATORER

Oppfinnelsen tilveiebringer fremgangsmåter og reagenser for screening av blandinger eller forbindelser som er i stand til å påvirke ekspresjon av en telomerase eller telomerase-komponent, i stand til å modifisere telomerases DNA-replikasjonsevne eller på annen måte modifisere evnen av telomerase-enzymet og TRT-proteinet til å syntetisere telomer DNA («full aktivitet»). Oppfinnelsen fører også til screeninger for modulatorer av én eller samtlige av hTRT's «partielle aktiviteter». Det tilveiebringes således tester som kan benyttes til screening med henblikk på midler som øker aktiviteten av telomerase, for eksempel ved å forårsake at hTRT-protein eller telomerase uttrykkes i en celle hvor den normalt ikke uttrykkes, eller ved å øke telomeraseaktivitetsnivåer i telomerase-positive celler.

Telomerase eller telomerase-subenhetsproteiner eller deres katalytiske eller immunogene fragmenter eller oligopeptider derav, kan benyttes for screening av terapeutiske forbindelser etter en hvilken som helst av en rekke medikament-screeningsteknikker. Fragmentet som benyttes i en slik test kan være fritt i løsning, festet til en fast bærer, holdes på en celleoverflate eller lokalisert intracellulært. Dannelsen av bindingskomplekser mellom telomerase eller subenhetsproteinet og det middel som testes, kan måles.

I forskjellige utførelsesformer innbefatter oppfinnelsen fremgangsmåter for screening med henblikk på antagonister som: binder til enzymets aktive sete; inhiberer assosiasjonen av dets RNA-del, telomerase-assosierte proteiner, nukleotider eller telomer DNA, til telomerase eller hTRT-protein; fremmer dissosieringen av enzymkomplekset; griper inn i transkripsjon av telomerase RNA-delen (f.eks. hTR); eller inhiberer en hvilken som helst av de her beskrevne «partielle aktiviteter». Oppfinnelsen tilveiebringer metoder for screening av blandinger som inhiberer assosieringen av nukleinsyre og/eller telomerase-assosierte blandinger med hTRT, så som assosieringen av hTR med hTRT eller assosieringen av hTRT med de humane homologene av p80 eller p95 eller et annet assosiert protein, eller assosieringen av hTRT med en telomer eller et nukleotid; screening av blandinger som fremmer dissosiasjonen eller fremmer assosiasjonen (dvs. sammensettingen) av enzymkomplekset, så som et antistoff rettet mot hTR eller hTRT; screening med henblikk på midler som påvirker prosesseringsevnen av enzymet; og screening med henblikk på nukleinsyrer og andre blandinger som binder til telomerase, så som en nukleinsyre komplementær til hTR. Det kan dessuten være aktuelt å foreta screening med henblikk på blandinger som øker eller svekker transkripsjonen av hTRT-genet og/eller translasjonen av hTRT-genproduktet. Oppfinnelsen kontemplerer en fremgangsmåte for screening av telomerase-modulatorer i dyr, ved å rekonstituere en telomerase-aktivitet, eller en anti-telomeraseaktivitet i et dyr, som f.eks. et transgent dyr. Oppfinnelsen vedrører også in vivo systemer som innbefatter «knock out» modeller, hvor én eller flere enheter av den endogene telomerase, telomerase RNA-del og/eller telomerase-assosierte proteiner er delet ert eller inhibert. Den endogene telomeraseaktivitet kan opprettholdes helt eller delvis eller mangle. I én utførelsesform rekonstitueres en eksogen telomeraseaktivitet helt eller delvis.

Det tilveiebringes en rekke tester for partiell telomeraseaktivitet for å identifisere en rekke ulike klasser av modulatorer av telomeraseaktivitet. Disse «partielle aktivitets» tester muliggjør identifisering av klasser av telomeraseaktivitetsmodulatorer som ellers eventuelt ikke ville blitt påvist i en «full aktivitets» telomerasetest. En partiell aktivitetstest involverer den ikke-prosesserende aktivitet av TRT og telomerase. Telomerasens prosesserende natur er beskrevet av Morin (1989) Cell 59:521-529; se også Prowse (1993) «Identification of a nonprocessive telomerase activity from mouse cells» Proe. Nati. Acad. Sei. USA 90:1493-1497. En annen partiell aktivitetstest utnytter den «revers-transkriptase-lignende» aktivitet av telomerase. 1 disse testene bestemmer man den reverse transkriptaseaktivitet av hTRT-proteinet. Se Lingner (1997) «Reverse transcriptase motifs in the catalytic subunit of telomerase» Science 276:561-567. En annen partiell aktivitetstest utnytter den «nukleolytiske aktivitet» av hTRT og telomerase, hvilket innebærer enzymets fjerning av minst ett nukleotid, i alminnelighet guanosin, fra en primers 3'-kjede. Denne nukleolytiske aktivitet har vært observert i Tetraftymena- télomerase av Collins (1993) «Tetrahymena telomerase catalyzes nucleolytic cleavage and nonprocessive elongation» Genes Dev 7:1364-1376. En annen partiell aktivitetstest innebærer analysering av hTRT og telomerasers evne til å binde nukleotider som del av dens enzymatiske prosessive DNA-polymeriseringsaktivitet. En annen partiell aktivitetstest innebærer analysering av hTRT eller telomerases evne til å binde dens RNA-del, dvs. hTR for humanceller, benyttet som templat for telomersyntese. Ytterligere partielle aktivitetstester involverer analysering av hTRT og telomerasers evne til å binde kromosomer in vivo eller til å binde oligonukleotidprimere in vitro eller i rekonstituerte systemer, eller til å binde proteiner assosiert med kromosoma] struktur (angående et eksempel på et slikt protein, se Harrington (1995) J. Biol. Chem. 270:8893-8901). Kromosomale strukturer som binder hTRT innbefatter for eksempel telomerisk repetert DNA, telomerproteiner, histoner, nukleært matriksproton, celledelings/cellesyklus-kontrollproteiner og lignende.

I én utførelsesform omfatter en test for identifisering av modulatorer at én eller flere celler (dvs. «testceller») kontaktes med en testforbindelse, og bestemmelse av hvorvidt testforbindelsen bevirker ekspresjon eller aktivitet av en telomerase (eller telomerase-komponent) i cellen. Vanligvis omfatter denne bestemmelse sammenligning av aktiviteten eller ekspresjonen i testcellen med en tilsvarende celle eller celler (dvs. kontrollceller) som ikke er bragt i kontakt med testforbindelsen. Alternativt kan celleekstrakter benyttes i stedet for intakte celler. I henhold til en beslektet utførelsesform administreres testforbindelsen til en flercellet organisme (f.eks. en plante eller et dyr). Telomerasen eller telomerasekomponenten kan være fullstendig endogen for cellen eller den flercellede organisme (dvs. kodet av naturlig forekommende endogene gener) eller være en rekombinant celle eller transgen organisme som omfatter én eller flere rekombinant uttrykte telomerasekomponenter (f.eks. hTRT, hTR, telomerase-assosierte proteiner) eller ha både endogene og rekombinante komponenter. I én utførelsesform administreres således telomeraseaktivitetsmodulatorer til dødelige celler. I en annen utførelsesform administreres telomeraseaktivitetsmodulatorer til udødelige celler. For eksempel kan antagonister av telomerase-mediert DNA-replikasjon påvises ved å administrere den antatt inhiberende blanding til en celle som er kjent for å oppvise signifikant grad av telomeraseaktivitet, så som cancerceller, og måle hvorvidt det forekommer en senkning av telomeraseaktivitet, telomerlengde eller proliferasjonsevne, som samtlige vil tyde på en forbindelse med antagonistaktivitet.

I en annen utførelsesform påvises en modulator ved å overvåke en endring i telomeraseaktivitet av et ribonukleoproteinkompleks (RNP) som omfatter en TRT (f.eks. hTRT) og et templat RNA (f.eks. hTR), hvor denne RNP rekonstitueres in vitro (f.eks. som beskrevet i Eksempel 7, nedenfor).

I ytterligere en annen utførelsesform påvises modulatoren ved å overvåke en endring i ekspresjonen av et TRT-genprodukt (f.eks. RNA eller protein) i en celle, et dyr, et in vitro ekspresjonssystem eller annet ekspresjonssystem.

I ytterligere en annen utførelsesform påvises modulatoren ved å endre ekspresjonen av et rapportørgen, så som det beskrevet i Eksempel 15, hvis ekspresjon reguleres, helt eller delvis, av et naturlig forekommende TRT-regulatorelement, så som en promoter eller enhancer. I en beslektet utførelsesform bestemmes en testforbindelses evne til å binde til en telomerasekomponent (f.eks. hTRT), RNA eller genregulatorsekvens (f.eks. TRT-genpromoteren).

I en annen utførelsesform påvises modulatoren ved å iaktta endringer i prosessering av hTRT pre-mRNA, for eksempel ved alternativt spleisede produkter, alternative polyadenyleringer, RNA-spaltning og lignende. I en beslektet utførelsesform kan aktiviteten av modulatoren iakttas ved å følge produksjonen av hTRT-polypeptidvarianter, hvorav enkelte kan ha dominant negativ telomerasereguleringsaktivitet.

Testformater for identifisering av forbindelser som påvirker ekspresjon og aktivitet av proteiner, er velkjent innen bioteknologisk og farmasøytisk industri, og en rekke ytterligere tester og varianter av de ovenfor angitte illustrerende tester vil være åpenbare for fagmannen.

Endringer i telomeraseaktivitet eller ekspresjon kan måles ved en hvilken som helst passende metode. Endringer i ekspresjonsnivåer av en telomerasekomponent (f.eks. hTRT-protein) eller forløper (f.eks. hTRT mRNA) kan bestemmes ved å benytte velkjente metoder, hvorav enkelte er beskrevet ovenfor, f.eks. i avsnitt IX og innbefatter overvåkning av nivåer av TRT-genprodukter (f.eks. protein og RNA) ved hybridisering (ved f.eks. å benytte TRT-probene og primerne), immunoassays (f.eks. ved å benytte anti-TRT-antistoffene ifølge oppfinnelsen), RNAse-beskyttelsestester, amplifikasjonstester eller en hvilken som helst annen egnet påvisningsmåte som er beskrevet her eller som er kjent på området. Kvantifisering av nukleinsyremengder i en prøve (f.eks. ved å vurdere nivåene av RNA, f.eks. hTR eller hTRT mRNA) er også av verdi ved vurdering av cis- eller trans-transkripsjonelle regulatorer.

Tilsvarende kan endringer i telomeraseaktivitet måles ved å benytte slike metoder som her beskrevet (f.eks. i avsnitt IV(B), supra) eller andre telomerase funksjonstester. Kvantifisering av telomeraseaktivitet kan, når det er ønskelig, foretas etter en hvilken som helst metode, inklusivt de som her er omtalt. Telomerase-antagonister som kan forårsake eller aksellerere tap av telomerstruktur, kan identifiseres ved å overvåke og måle deres effekt på telomeraseaktivitet in vivo, ex vivo eller in vitro eller ved deres effekt på telomerlengde (som målt eller påvist gjennom farving, bruk av merkede hybridiseirngsprober eller på annen måte) eller ganske enkelt ved inhiberingen av celledeling av telomerase-positive cancerceller (kritisk forkortelse av telomerer fører til et fenomen betegnet «krise» eller M2 aldring (Shay, 1991) Biochem. Biophys. Acta 1072:1-7), cancerceller som har omgått telomeraseaktiveringen, men som i fraværet av telomerase vil føre til at de eldes eller dør som følge av kromosomal delesjon og omleiring). Gjenopprettelsen av den humane telomeraseaktivitet in vivo, muliggjør en fremgangsmåte for screening med henblikk på telomerasemodulatorer i celler eller dyr av en hvilken som helst opprinnelse. Slike agonister kan identifiseres ved en aktivitetstest ifølge oppfinnelsen, som innbefatter målinger av endringer i telomerlengde. Andre eksempler på tester som måler telomeraseaktivitet i celler er tester for akkumulering eller tap av telomerstruktur, TRAP-testen eller en kvantitativ polymerase-kjedereaksjonstest.

Ifølge én utførelsesform innbefatter testene ifølge oppfinnelsen også en fremgangsmåte hvor testforbindelsen frembringer en statistisk signifikant senkning av aktiviteten av hTRT målt ved inkorporering av et merket nukleotid, i et substrat i forhold til den relative mengde inkorporert merking i en parallellreaksjon som mangler testforbindelsen, hvorved det fastslås at testforbindelsen er en telomerase-inhibitor.

Fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen kan tilpasses protokoller beskrevet i vitenskapelig og patentlitteratur og som er kjent på området. Når for eksempel en telomerase eller et TRT-protein ifølge oppfinnelsen benyttes til å identifisere blandinger som virker som modulatorer av telomeraseaktiviteter, kan store antall potensielt egnede molekyler underkastes screening i en enkelt test. Modulatorene kan ha en inhiberende (antagonist) eller potenserende (agonist) virkning på telomeraseaktivitet. Dersom for eksempel et utvalg av 1000 inhibitorer skal underkastes screening, kan alle 1000 inhibitorer eventuelt anbringes i en mikrotiterbrønn og testes samtidig. Dersom en slik inhibitor oppdages, kan forrådet på 1000 deles opp i 10 utvalg på 100 og prosessen gjentas inntil en enkelt inhibitor er identifisert.

Ved medikamentscreening undersøkes store antall av forbindelser med henblikk på deres evne til å virke som telomerasemodulatorer, en prosess som sterkt aksellereres av teknikker for massescreening. De her beskrevne tester for fullstendig eller delvis telomerase-aktivitet kan tilpasses anvendelse ved massescreening. Fagmannen vil være kjent med at det finnes en rekke metoder for å oppnå dette.

En annen teknikk for medikamentscreening som kan benyttes ved massescreening av forbindelser og som har passende bindingsaffinitet til telomerasen eller telomeraseprotein-subenheten, er beskrevet i detalj i «Determination of Amino Acid Sequence Antigenicity» av Geysen, (Geysen, WO søknad 84/03564 av 13. september, 1984, som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse). Sammenfatningsvis syntetiseres et stort antall ulike små peptid-testforbindelser på et fast substrat som f.eks. plaststikker eller annen overflate. Peptid-testforbindelsene omsettes med fragmenter av telomerase eller telomerase-proteinsubenheter og vaskes. Bundet telomerase eller telomeraseprotein-subenhet påvises deretter ved velkjente metoder. Vesentlig renset telomerase eller telomeraseprotein-subenhet kan også dekkes direkte på plater for bruk ved ovennevnte medikamentscreeningsteknikker. Alternativt kan de ikke-nøytraliserende antistoffer benyttes for å fange opp peptidet og immobilisere det på en fast bærer.

Det kan også være aktuelt å benytte kompetitive medikamentscreeningstester hvor nøytraliserende antistoffer som er i stand til å binde telomerase eller subenhetsprotein(er) spesifikt konkurrerer med en testforbindelse om binding av telomerase eller subenhetsproteinet. Antistoffer kan også benyttes for å påvise nærvær av ethvert peptid som har én eller flere antigene determinanter tilfelles med telomerasen eller subenhetsproteinet. Andre metoder for å identifisere modulatorer av en telomeraseaktivitet har vært beskrevet i US-patent 5.645.986, som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse. Det skal bemerkes at foreliggende oppfinnelse innebærer forbedringer av tidligere kjente metoder, tildels ved å gi reagenser som f.eks. hTRT-polynukleotider, prober og primere, høyrenset hTR, hTRT og telomerase, så vel som anti-telomerase og anti-TRT-antistoffer som samtlige kan benyttes i tester, f.eks. som kontroller, standarder, bindings- eller hybridiseirngsmidler eller på annen måte.

Det er klart at den rekombinant fremstillede telomerase og TRT (f.eks. hTRT) ifølge oppfinnelsen vil være anvendelig i tester for påvisning av modulatorer. Screeningstesten kan gjøre bruk av telomerase eller hTRT avledet av en fullstendig eller delvis rekonstitusjon av telomeraseaktivitet eller ved en økning av eksisterende aktivitet. Testen eller de screeninger som er tilveiebragt gjennom oppfinnelsen, kan benyttes til å teste telomerasens evne til å syntetisere telomer DNA eller til å teste for en hvilken som helst av de «partielle aktiviteter» av hTRT og TRT i alminnelighet som er beskrevet ovenfor. Testen kan omfatte ex vivo modifikasjon av celler som er blitt manipulert for å uttrykke telomerase med eller uten deres RNA-del eller assosierte proteiner, og disse kan reimplanteres i et dyr som kan benyttes for in vivo testing. Disse in vivo testsystemene kan benytte «knockout» celler, hvor én eller flere enheter av det endogene telomeraseenzymkompleks er deletert eller inhibert, så vel som celler hvor en eksogen eller endogen telomeraseaktivitet er gjenopprettet eller aktivert.

Telomeraser og TRT-proteiner som er blitt modifisert på en stedsspesifikk måte (ved stedsspesifikk mutasjon) for å modifisere eller deletere noen eller alle funksjoner av telomeraseenzymet eller TRT-proteinet, kan også benyttes i screeningene ifølge oppfinnelsen for å oppdage terapeutiske midler. For eksempel kan TRT konstrueres slik at det taper sin evne til å binde substrat DNA, til å binde dets RNA-del (som hTR) til å katalysere addisjonen av telomer DNA, til å binde deoksynukleotidsubstrat, til å ha nukleolytisk aktivitet, til å binde telomer-assosierte proteiner eller kromosomale strukturer og lignende. De resulterende «mutante proteiner» eller «muteiner» kan benyttes til å identifisere forbindelser som spesifikt modulerer én, flere eller samtlige funksjoner eller aktiviteter av TRT-proteinet eller telomerasen.

C. EKSEMPLER PÅ TELOMERASE-MODULATORER

1) GENERELT

De testforbindelser som det ovenfor er referert til, kan være en hvilken som helst av et stort utvalg forbindelser, både naturlig forekommende og syntetiske, organiske og uorganiske og kan innbefatte polymerer (f.eks. oligopeptider, polypeptider, oligonukleotider og polynukleotider), små molekyler, antistoffer (som her vidt definert), sukkere, fettsyrer, nukleotider og nukleotidanaloger, analoger av naturlig forekommende strukturer (f.eks. peptidmimetika, nukleinsyreanaloger og lignende), samt en lang rekke andre forbindelser.

Oppfinnelsen muliggjør modulatorer av alle typer, uten begrensning til noen bestemt virkningsmekanisme. Som illustrasjon innbefatter eksempler på modulatorer, forbindelser eller behandlinger som: (i) binder til hTRT-polypeptidet (f.eks. enzymets aktive sete) eller annen telomerasekomponent og påvirker en telomeraseaktivitet; (ii) inhiberer eller fremmer assosiering, eller inhiberer eller fremmer disassosiering av en telomerasekomponent (f.eks. hTRT eller hTRT-hTR RNP) med eller fra et telomerase-assosiert protein (f.eks. inklusivt de som er beskrevet i avsnitt IV(D), ovenfor); (iii) inhiberer eller fremmer assosiering eller inhiberer eller fremmer disassosiering av telomerase-polypeptider (f.eks. hTRT) med eller fra en telomerase RNA (f.eks. hTR); (iv) inhiberer eller fremmer assosiering eller inhiberer eller fremmer disassosiering av telomerasepolypeptider (f.eks. hTRT) med eller fra kromosomer (f.eks. telomerer) eller kromosomal DNA (f.eks. telomer DNA); (v) øker eller nedsetter ekspresjon av et genprodukt av en telomerase-komponent (f.eks. produktene av hTRT-genet), inklusivt endring av hastigheten eller graden av transkripsjon av TRT-genet, eller translasjon, transport eller stabilitet av et genprodukt eller lignende, gjennom binding til genet eller genproduktet (f.eks. ved interaksjon med en faktor (f.eks. et transkripsjonsregulerende protein) som påvirker transkripsjon av hTRT-genet eller en annen telomerasekomponent).

2) PEPTID-MODULATORER

Potensielle modulatorer av telomeraseaktivitet inkluderer også peptider (f.eks. inhiberende (antagonist) og aktiverende (agonist) peptid-modulatorer). For eksempel kan oligopeptider med vilkårlig genererte sekvenser underkastes screening for å oppdage peptidmodulatorer (agonister eller inhibitorer) av telomeraseaktivitet. Slike peptider kan benyttes direkte som medikamenter eller til å finne den orientering eller posisjon av en funksjonell gruppe som kan inhibere telomeraseaktivitet, som på sin side fører til konstruksjon og testing av et lite inhibitormolekyl eller blir skjelettet for kjemiske modifikasjoner som øker den farmakologiske anvendelse. Peptider kan være strukturmimetika, og det kan benyttes molekylmoduleringsprogrammer for å utvikle mimetika basert på den karakteristiske sekundærstruktur og/eller tertiærstruktur av telomeraseenzym og hTRT-protein. Slike strukturmimetika kan også benyttes terapeutisk, in vivo, som modulatorer av telomeraseaktivitet (agonister og antagonister). Strukturmimetika kan også benyttes som immunogener for å utløse anti-telomerase- eller anti-TRT-protein-antistoffer.

3) INHIBERENDE NATURLIGE FORBINDELSER SOM MODULATORER AV TELOMERASEAKTIVITET

I tillegg kan et stort antall potensielt anvendelige aktivitetsmodifiserende forbindelser finnes ved screening av ekstrakter fra naturlige produkter som kildemateriale. Kilder av slike ekstrakter kan skrive seg fra et stort antall arter av sopp, aktinomyceter, alger, insekter, protozoer, planter og bakterier. De ekstrakter som oppviser inhiberende virkning kan deretter analyseres for å isolere det virksomme molekyl. Se for eksempel Turner (1996) J. Ethnopharmacol. 51(1-3); 39-43; Suh (1995) Anticancer Res. 15:233-239.

4) INHIBERENDE OLIGONUKLEOTIDER

Et særlig egnet utvalg av inhibitorer muliggjort gjennom foreliggende oppfinnelse er oligonukleotider som er i stand til enten å binde mRNA som koder for hTRT-protein eller til hTRT-genet, som i begge tilfeller forhindrer eller inhiberer produksjonen av funksjonelt hTRT-protein. Andre oligonukleotider gir interaksjon med telomerasens RNA-del, så som hTR, eller er i stand til å forhindre binding av telomerase eller hTRT til dets DNA-mål, eller én telomerasekomponent til en annen, eller til et substrat. Slike oligonukleotider kan også binde telomeraseenzymet, hTRT-proteinet, eller både protein og RNA og inhibere en partiell aktivitet som beskrevet ovenfor (så som dets prosesserende aktivitet, dets reverse transkiptaseaktivitet, dets nukleolytiske aktivitet og lignende). Assosiasjonen kan skje gjennom sekvensspesifikk hybridisering til en annen nukleinsyre eller ved generell binding, som i en aptamer, eller begge deler.

Telomeraseaktivitet kan inhiberes ved målsøking av hTRT mRNA med antisense oligonukleotider som er i stand til å binde hTRT mRNA.

En annen anvendelig klasse av inhibitorer er oligonukleotider som forårsaker inaktivering eller spaltning av hTRT mRNA eller hTR. Det vil si at oligonukleotidet er kjemisk modifisert, eller har enzymaktivitet som bevirker slik spaltning, hvilket er tilfelle for et ribozym, et EDTA-bundet oligonukleotid eller et kovalent bundet oligo-nukleotid, så som et psoralen eller et annet kryss-bindende reagensbundet oligonukleotid. Som nevnt ovenfor kan man foreta screening av et utvalg av mange slike forskjellige oligonukleotider med henblikk på de med ønsket aktivitet.

En annen anvendelig klasse av inhibitorer er oligonukleotider som binder polypeptider. Dobbelt- eller enkeltkjedede DNA- eller dobbelt- eller enkeltkjedede RNA-molekyler som binder til spesifikke polypeptid-mål, kalles «aptamerer». Den spesifikke oligonukleotid-polypeptid-assosiasjon kan medieres av elektrostatiske interaksjoner. For eksempel binder aptamerer seg spesifikt til anion-bindende eksoseter på trombin, som fysiologisk binder seg til det polyanioniske heparin (Bock (1992) Nature 355:564-566). Siden hTRT-protein binder både hTR og dets DNA-substrat og siden foreliggende oppfinnelse tilveiebringer hTRT og andre TRT-proteiner i renset form i store mengder, kan fagmannen lett foreta screening med henblikk på TRT-bindende aptamerer ved å benytte fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen.

Oligonukleotider (f.eks. RNA-oligonukleotider) som binder telomerase, hTRT, hTR eller deler derav, kan utvikles ved å benytte SELEX-teknikker (Tuerk, 1997, Methods Mol. Biol. 67,2190). Ved denne teknikk bindes et meget stort antall (106-109) av nukleinsyrer med vilkårlig sekvens direkte til målet (f.eks. TRT) ved å benytte betingelser som forårsaker en stor grad av diskriminering mellom molekyler med høy affinitet og med lav affinitet for binding av målet. De bundne molekylene skilles fra ubundne, og de bundne molekylene amplifiseres i kraft av en spesifikk nukleinsyresekvens som inngår i deres terminaler, og passende amplifikasjons-reagenser. Denne prosess gjentas flere ganger inntil det blir tilbake et relativt lite antall molekyler som har høy bindingsaffinitet for målet. Disse molekylene kan deretter testes på deres evne til å modulere telomeraseaktivitet slik som her beskrevet.

Antagonister av telomerase-mediert DNA-replikasjon kan også være basert på inhibering av hTR (Norton (1996) Nature Biotechnology 14:615-619) gjennom komplementær sekvens-gjenkjenning eller spaltning, som via ribozymer.

De inhiberende oligonukleotidene kan overføres til cellen ved å benytte en rekke velkjente teknikker. For eksempel kan oligonukleotider avgis til cyto-plasmaet uten spesifikk modifikasjon. Alternativt kan de avgis ved bruk av liposomer som fusjonerer med cellemembranen eller er endocytoserte, dvs. ved å benytte ligander festet til liposomet eller direkte til oligonukleotidet, som binder til cellens overflatemembran-proteinreseptorer og resulterer i endocytose. Alternativt kan cellene være permeabilisert for å øke transporten av oligonukleotider inn i cellen, uten å skade vertscellene. Det kan benyttes et DNA-bindende protein, f.eks. HBGF-1, kjent for å transportere et oligonukleotid inn i en celle.

5) INHIBERENDE RIBOZYMER

Ribozymer virker ved binding til et mål-RNA gjennom mål-RNA bindingsdelen av et ribozym som holdes tett inn til en enzymatisk del av det ribozym som spalter RNA-målet. Ribozymet gjenkjenner og binder således et RNA-mål vanligvis gjennom komplementær baseparing og virker etter at det er bundet til det korrekte sted, enzymatisk for å spalte og inaktivere det målsøkte RNA. Slik spaltning av et målsøkt RNA vil ødelegge dets evne til å styre syntesen av et kodet protein dersom spaltningen skjer i den kodende sekvens. Etter at et ribozym har bundet og spaltet dets RNA-mål, frigjøres det i alminnelighet fra denne RNA og kan således gjentatt binde og spalte nye mål.

6) IDENTIFISERING AV TELOMERASE-ASSOSIERTE PROTEINER FOR BRUK SOM MODULATORER

I én utførelsesform av oppfinnelsen benyttes telomerase for å identifisere telomerase-assosierte proteiner, dvs. telomerase-assosierte proteiner som modulerer eller på annen måte komplementerer telomeraseaktivitet. Som nevnt ovenfor kan disse proteinene eller deres fragmenter, modulere funksjonen ved å forårsake disossieringen eller forhindringen av assosiasjonen av telomerase-enzymkomplekset, forhindre sammensettingen av telomerasekomplekset, forhindre hTRT fra binding til dets nukleinsyre-komplement eller til dets DNA-templat, forhindre hTRT fra å binde nukleotider eller forhindre, øke eller inhibere en hvilken som helst av flere eller alle delaktivitetene av telomeraseenzymet eller hTRT-proteinet slik som ovenfor beskrevet.

Fagmannen kan benytte fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen til å identifisere hvilke deler (f.eks. domener) av disse telomerase-assosierende proteiner som kontakter telomerase. Ifølge én utførelsesform av oppfinnelsen benyttes disse telomerase-assosierende proteinene eller deres fragmenter som modulatorer av telomeraseaktivitet.

7) TELOMERASE-ASSOSIERTE PROTEINER SOM DOMINANTE NEGATIVE MUTANTER

Ifølge én utførelsesform av oppfinnelsen benyttes telomerase-assosierte proteiner som modulatorer av telomeraseaktivitet. Telomerase-assosierte proteiner innbefatter kromosomale strukturer, så som histoner, nukleære matriksproteiner, celledelings- og cellesyklus-kontrollproteiner og lignende. Andre telomerase-assosierte proteiner som kan benyttes som modulatorer for formålet ifølge oppfinnelsen er p80- og p95-proteinene og deres humane homologer, så som TP1 og TRF-1 (Chong, 1995, Science 270:1663-1667). I tillegg kan fragmenter av disse telomerase-assosierte proteinene identifiseres av fagmannen i henhold til fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen og benyttes som modulatorer av telomeraseaktivitet.

8) DOMINANT-NEGATIVE MUTANTER

Åtte høyt konserverte motiver innenfor TRT av forskjellige ikke-humane arter er blitt identifisert, som beskrevet ovenfor (se også Lingner (1997) Science 276:561-567). Figur 4 viser et skjema over den humane TRT-aminosyresekvens (fra pGRN121) og RT-motiver sammenlignet med S. pombe Trtlp, Euplotes pl23 og S. cerevisiae Est2p. Rekombinante og syntetiske nukleinsyrer kan tilveiebringes hvor kodonene for de konserverte aminosyrerestene i hver, alene eller sammen med ett eller flere ytterligere kodoner, av alle disse åtte motivene er blitt endret til hvert av de øvrige kodonene. En rekke av de resulterende kodende sekvenser uttrykker et ikke-funksjonelt hTRT. Se for eksempel, Eksempel 16. Det tilveiebringes således for eksempel et stort utvalg av «muterte» telomeraseenzymer og TRT-proteiner som har en partiell telomeraseaktivitet, men ikke full aktivitet. For eksempel er én slik telomerase i stand til å binde telomerstrukturer, men ikke binde telomerase-assosiert RNA (dvs. hTR). Dersom en slik telomerase-mutant uttrykkes i tilstrekkelig høy grad, kan den utarme en nødvendig telomerasekomponent (f.eks. hTR) og derved virke som en inhibitor av villtype telomerase-aktivitet. En mutert telomerase som virker på denne måte, er en antagonist eller såkalt «dominant-negativ» mutant.

9) ANTISTOFFER

Antistoffene ifølge oppfinnelsen kan generelt benyttes til å identifisere, rense eller

inhibere en hvilken som helst eller samtlige aktiviteter av telomeraseenzym og hTRT-protein. Antistoffer kan tjene som antagonister av telomeraseaktivitet på en rekke måter, for eksempel ved å hindre telomerasekomplekset eller nukleotidet fra binding til dets DNA-substrater, ved å hindre telomerasekomponentene i å danne et aktivt kompleks, ved å opprettholde en funksjonell (telomerasekompleks) kvaternær struktur eller ved å binde til ett av enzymets aktive seter eller andre seter som har allosteriske effekter på aktivitet (de forskjellige delaktiviteter av telomerase er beskrevet detaljert annet steds i denne beskrivelse).

D) MODULATORSYNTESE

Det er tanken at telomerasemodulatorene identifiserbare ifølge oppfinnelsen vil bli fremstillet ved å benytte velkjente metoder innen farmasien, inklusivt kombinatoriske metoder og rasjonelle teknikker for medikamentutvikling.

1) KOMBINATORISK KJEMISK METODIKK

Fremstillingen og den samtidige screening av store biblioteker av syntetiske molekyler kan foretas ved å benytte velkjente teknikker innen kombinatorisk kjemi, se for eksempel van Breemen (1997) Anal. Chem. 69:2159-2164; Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12:145-167

(1997).

Som angitt ovenfor kan kombinatorisk kjemisk metodikk benyttes til å frembringe store antall av oligonukleotider (eller andre forbindelser) som hurtig kan underkastes screening med henblikk på spesifikke oligonukleotider (eller forbindelser) som har passende bindingsaffiniteter og spesifisitet rettet mot et hvilket som helst mål, som f.eks. TRT-proteiner ifølge oppfinnelsen (angående generell grunnlagsinformasjon, se Gold (1995) J. of Biol. .Chem. 270:13581-13584).

2) RASJONELL MEDIKAMENTUTVIKLING

Rasjonell medikamentutvikling innebærer et integrert sett av metodikker som inkluderer strukturanalyse av mål-molekyler, syntetisk kjemi og avanserte data-hjelpemidler. Anvendt for å utvikle modulatorer, så som antagonister/inhibitorer av protein-mål, så som telomeraseenzym og hTRT-protein, er formålet med rasjonell medikamentutvikling å forstå et molekyls tredimensjonale form og kjemi. Rasjonell medikamentutvikling har fordel av røntgenkrystallografiske data eller NMR-data, som nå kan bestemmes for hTRT-proteinet og telomeraseenzymet i henhold til de metoder og ved bruk av de reagenser som er tilveiebragt gjennom oppfinnelsen. Beregninger av elektrostatiske egenskaper, hydrofobitet og løselighet er også til hjelp. Se for eksempel Coldren (1997) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 94:6635-6640.

E) ANALYSE-SETT

Det tilveiebringes også sett som kan benyttes til hjelp for å bestemme hvorvidt en testforbindelse er en modulator av en TRT-aktivitet. Settet vil i alminnelighet omfatte én eller flere av følgende komponenter: et tilnærmet renset TRT-polypeptid eller polynukleotid (innbefattende prober og primere); et plasmid som kan uttrykke et TRT (f.eks. hTRT) når det innføres i en celle eller et cellefritt ekspresjonssystem; et plasmid som kan uttrykke et TR (f.eks. hTR) når det innføres i en celle eller i et cellefritt ekspresjonssystem; celler eller cellelinjer; en blanding for å påvise en endring i TRT-aktivitet; og en bruksanvisning som gir instruksjon om påvisning og måling av en endring i TRT-aktiviteten, og som angir at en endring i telomeraseaktiviteten i nærvær av testforbindelsen er en indikator på at testforbindelsen modulerer telomeraseaktivitet, samt én eller flere beholdere. Settet kan også omfatte hjelpemidler, som f.eks. TRAP-testreagenser eller reagenser for en kvantitativ polymerasekjedereaksjon, for å måle en endring i TRT-aktivitet. Settet kan også omfatte en bruksanvisning som gir instruksjon om å påvise og måle en endring i TRT-aktiviteten, og som angir at en endring i telomeraseaktiviteten i nærvær av testforbindelsen er en indikator på at testforbindelen modulerer telomeraseaktiviteten.

XI TRANSGENE ORGANISMER (TELOMERASE KNOCKOUT CELLER OG

DYREMODELLER)

Det beskrives transgene ikke-humane flercellede organismer (f.eks. planter og dyr unntatt mennesket) eller éncellede organismer (f.eks. gjær) omfattende en eksogen TRT-gensekvens som kan være en kodende sekvens eller en regulatorsekvens (f.eks. promoter). Organismen uttrykker et eksogent TRT-polypeptid som har en sekvens av et humant TRT-protein. Organismen kan også uttrykke en telomerase RNA-komponent (f.eks. hTR).

Encellede og flercellede organismer (eller celler fra slike) kan tilveiebringes hvor minst ett gen koder for en telomerasekomponent (f.eks. TRT eller TR) eller hvor et telomerase-assosiert protein er mutert eller deletert (dvs. i en kodende eller regulatorisk region) slik at den native telomerase ikke uttrykkes eller uttrykkes i redusert grad eller med andre virkninger sammenlignet med villtype-celler eller organismer. Slike celler og organismer omtales ofte som gen «knock-out» celler eller organismer.

Celler og organismer kan tilveiebringes hvor et endogent telomerasegen (f.eks. murint TRT) enten er tilstede eller eventuelt er mutert eller deletert, og hvor et eksogent telomerase-gen eller variant (f.eks. humant TRT) er innført og uttrykkes. Celler og organismer av denne type vil være anvendelige for eksempel som modellsystemer for identifisering av modulatorer av hTRT-aktivitet eller ekspresjon; bestemmelse av virkningene av mutasjoner i telomerase-komponentgener og andre anvendelser, som f.eks. bestemmelse av utviklingens tidstilpasning og vevslokalisering av telomeraseaktivitet (f.eks. for å vurdere når en telomerasemodulator skal administreres og for å vurdere eventuelle bivirkninger).

Eksempler på flercellede organismer er planter, insekter og dyr, som f.eks. mus, rotter, kaniner, aper, svin og andre pattedyr. Et eksempel på en encellet organisme er en gjær.

Fremgangsmåter for endring eller forstyrrelse av spesifikke gener (f.eks. endogene TRT-gener) er velkjent for fagmannen, se f.eks. Baudin et al, 1993, Nucl. Acids Res. 21:3329; Wach et al., 1994, Yeast 10:1793; Rothstein, 1991, Methods Enzymol. 194:281; Anderson, 1995, Methods Cell Biol. 48:31; Pettitt et al, 1996, Development 122:4149-4157; Ramirez-Solis et al, 1993, Methods Enzymol. 225:855; og Thomas et al, 1987, Cell 51:503, som samtlige herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse.

«Knockout»-cellene og dyr innbefatter celler og dyr i hvilke én eller flere enheter av det endogene telomeraseenzymkompleks er blitt deletert eller inhibert. Rekonstituering av telomeraseaktivitet vil spare cellen eller dyret fra aldring eller, for cancerceller, celledød forårsaket av dens manglende evne til å opprettholde telomerer. Metoder for å endre ekspresjonen av endogene gener er velkjent for fagmannen. Slike metoder involverer i alminnelighet endring eller erstatning av hele eller en del av de regulatorsekvensene som kontrollerer ekspresjon av det bestemte gen som skal reguleres. Regulatorsekvensene, f.eks. den native promoter kan endres. Den konvensjonelle teknikk for målrettet mutasjon av gener involverer anbringelse av et genomisk DNA-fragment som inneholder det aktuelle gen, i en vektor, etterfulgt av kloning av de to genomiske armene assosiert med det målsøkte gen

omkring en selekterbar neomycinresistenskassett i en vektor som inneholder thymidinkinase. Denne «knockout»-konstruksjon transfekteres deretter inn i den passende vertscellen, dvs. en embryonisk stamcelle (ES) fra mus, og som deretter underkastes positiv seleksjon (under bruk av G418, for eksempel til å selektere for neomycinresistens) og negativ selektering (ved for eksempel å benytte FLAU for å utelukke celler som mangler thymidinkinase) slik at seleksjon av celler som har vært gjenstand for homolog rekombinasjon med «knockout»-vektoren, muliggjøres. Måten fører til inaktivering av det aktuelle gen. Se f.eks. US-patent 5.464.764; 5.631.153; 5.487.992 og 5.627.059.

«Knock out»-ekspresjon av et endogent gen kan også oppnås ved bruk av homolog rekombinasjon for å innføre en heterolog nukleinsyre i regulator-sekvensene (f.eks. promoteren) til det aktuelle gen. For å forhindre ekspresjon av funksjonelt enzym eller produkt, kan enkle mutasjoner som enten endrer leserammen eller river opp promoteren være

egnet. For å oppregulere ekspresjon kan en nativ promoter erstattes med en heterolog promoter som induserer høyere transkripsjonsnivåer. Dessuten kan «gene trap insertion» benyttes for å rive opp et vertsgen, og muse-ES-celler kan benyttes for å produsere transgene «knockout»-dyr, som for eksempel beskrevet i Holzschu (1997) Transgenic Res. 6:97-106.

Endring av ekspresjonen av endogene gener ved homolog rekombinasjon kan også oppnås ved å benytte nukleinsyresekvenser som omfatter det aktuelle strukturgen. Det benyttes oppstrøms-sekvenser for målretting av heterologe rekombinasjonskonstruksjoner. Ved å anvende informasjon angående strukturgensekvenser av TRT, som f.eks. SEKV. LD. NR:1, kan fagmannen gjennom kun rutinemessig eksperimentering, frembringe homologe rekombinasjons-konstruksjoner. Homolog rekombinasjon for å endre ekspresjon av endogene gener er beskrevet i US-patent 5.272.071 og WO 91/09955, WO 93/09222, WO 96/29411, WO 95/31560 og WO 91/12650. Homolog rekombinasjon i mykobakterier er beskrevet av Azad (1996) Proe. Nati. Acad. Sei USA 93:4787; Baulard (1996) J. Bacteriol. 178:3091; og Pelicic (1996) Mol. Microbiol. 20:919. Homolog rekombinasjon i dyr er blitt beskrevet av Moynahan (1996) Hum. Mol. Genet. 5:875, og i planter av Offringa (1990) EMBO J. 9:3077.

XII GLOSSAR

De følgende betegnelser er nedenfor definert for å gi fagmannen ytterligere veiledning i praktisering av oppfinnelsen: adjuvans, allel (& alletisk sekvens), aminosyrer (inklusivt hydrofobe, polare, ladede), konservativ substitusjon, kontrollelementer (& regulator-sekvenser), derivatisert, påvisbar merking, forhøyet nivå, epitop, gunstig og ugunstig prognose, fusjonsprotein, genprodukt, hTR, udødelig (immortal), immunogen og irnmuno-genisk, isolert, modulator, motiv, nukleinsyre (& polynukleotid), oligonukleotider (& oligomerer), operativt koblet, polypeptid, probe (inklusivt nukleinsyreprober & antistoff-prober), rekombinant, seleksjonssystem, sekvens, spesifikk binding, stringente hybridiseringsbetingelser (& stringens), tilnærmet identitet (& tilnærmet likhet), tilnærmet ren (& tilnærmet renset), telomerase-negative og telomerase-positive celler, telomerase katalytisk aktivitet, telomerase-relatert og testforbindelse.

I denne sammenheng viser betegnelsen «adjuvans» til dens ordinære betydning som en hvilken som helst substans som forsterker immunresponsen av et antigen som den er blandet med. Egnede adjuvanser for foreliggende oppfinnelse innbefatter, men er ikke begrenset til, Freunds mineralgeler, som f.eks. aluminiumhydroksyd, og overflateaktive substanser som lysolecitin, pluronic polyoler, polyanioner, peptider, oljeemulsjoner, «keyhole limpet» hemocyanin og dinitrofenol. BCG (Bacillus Calmette-Guerin) og Corynebacterium parvum er potensielt anvendelige adjuvanser.

I denne sammenheng viser betegnelsene «allel» eller «allelisk sekvens» til en alternativ form av en nukleinsyresekvens (dvs. en nukleinsyre som koder for hTRT-protein). Alleler skriver seg fra mutasjoner (dvs. endringer i nukleinsyre-sekvensen) og produserer i alminnelighet endrede og/eller ulikt regulerte mRNA eller polypeptider hvis struktur og/eller funksjon eventuelt kan være endret. Vanlige mutasjonsendringer som gir opphav til alleler tilskrives i alminnelighet naturlige delesjoner, addisjoner eller substitusjoner av nukleotider som eventuelt kan påvirke de kodede aminosyrer. Disse typene av forandringer kan skje hver for seg, i kombinasjon med de øvrige eller én eller flere ganger innen et gitt gen, kromosom eller annen cellulær nukleinsyre. Ethvert gitt gen kan være uten, eller ha én eller mange alleliske former. I denne sammenheng refererer betegnelsen «allel» seg til bare den ene eller både et gen eller en mRNA transkribert fra genet.

I denne sammenheng viser «aminosyrer» iblant til den standardiserte énbokstavskode: Alanin (A), Serin (S), Treonin (T), Asparaginsyre (D), Glutaminsyre (E), Asparagin (N), Glutamin (Q), Arginin (R), Lysin (K), Isoleucin (I), Leucin (L), Metionin (M), Valin (V), Fenylalanin (F), Tyrosin (Y), Tryptofan (W), Prolin (P), Glycin (G), Histidin (H), Cystein (C). Syntetiske og ikke-naturlig forekommende aminosyreanaloger (og/eller peptidbindinger) er inkludert.

I denne sammenheng viser betegnelsen «hydrofobe aminosyrer» til A, L, I, V, P, F, W og M. I denne sammenheng refererer «polare aminosyrer» seg til G, S, T, Y, C, N og Q. I denne sammenheng refererer «ladede aminosyrer» seg til D, E, H, K og R.

I denne sammenheng viser betegnelsen «konservativ substitusjon» når den beskriver et protein, til en endring i proteinets aminosyresammensetning som ikke vesentlig endrer proteinets aktivitet. Således refererer «konservativt modifiserte variasjoner» av en bestemt aminosyresekvens, seg til aminosyresubstitusjoner av de aminosyrene som ikke er avgjørende for proteinaktivitet, eller substitusjon av aminosyrer med andre aminosyrer som har lignende egenskaper (f.eks. sure, basiske, positive eller negativt ladede, polare eller upolare, etc.) slik at substitusjoner av selv kritiske aminosyrer ikke vesentlig endrer aktivitet. Konservative substitusjonstabeller som gir funksjonelt lignende aminosyrer, er velkjent på området. Følgende seks grupper inneholder aminosyrer som innbyrdes utgjør konservative substitusjoner: 1) Alanin (A), Serin (S), Treonin (T); 2) Asparaginsyre (D), Glutaminsyre (E); 3) Asparagin (N), Glutamin (Q); 4) Arginin (R), Lysin (K); 5) Isoleucin (I), Leucin (L), Metionin (M), Valin (V); og 6) Fenylalanin (F), Tyrosin (Y), Tryptofan (W) (se også Creighton (1984) Proteins, W.H. Freeman and Company). Det vil for fagmannen være klart at de ovenfor angitte substitusjoner ikke er de eneste mulige konservative substitusjoner. For eksempel kan man anse alle ladede aminosyrer som konservative substitusjoner for hverandre, enten de er positive eller negative. I tillegg kan individuelle substitusjoner, delesjoner eller addisjoner som endrer, adderer eller deleterer en enkelt aminosyre eller en liten andel av aminosyrer i en kodet sekvens, også være «konservativt modifiserte variasjonen). Man kan også foreta en «konservativ substitusjon» i et rekombinant protein ved å benytte ett eller flere kodoner som adskiller seg fra de kodoner som anvendes av det native gen eller villtype-genet. I så fall inkluderer en konservativ substitusjon også substituering av et kodon for en aminosyre med et kodon for den samme aminosyre.

I denne sammenheng viser betegnelsen «kontrollelementer» eller «regulator-sekvenser» til enhancere, promotere, transkripsjonsterminatorer, replikasjonsorigo, kromosomale integrasjonssekvenser, 5' og 3' utranslaterte regioner som proteiner eller andre biomolekyler virker sammen med for å utføre transkripsjon og translasjon. For eukaryote celler vil kontrollsekvenser innbefatte en promoter og fortrinnsvis en enhancer, f.eks. avledet fra immunglobulingener, SV40, cytomegalovirus og en polyadenyleringssekvens, og kan innbefatte spleise-donor- og akseptorsekvenser. Avhengig av hvilket vektorsystem og hvilken vert som benyttes, kan det anvendes et hvilket som helst antall passende transkripsjons- og translasjonselementer, herunder konstitutive og induserbare promotere.

I denne sammenheng viser betegnelsen «derivatisert» polynukleotid, oligonukleotid eller nukleinsyre seg til oligo- og polynukleotider som omfatter en derivatisert substituent. I enkelte utførelsesformer er substituenten tilnærmet ikke-interfererende med hensyn til hybridisering til komplementære polynukleotider. Derivatiserte oligo- eller polynukleotider som er blitt modifisert med tilføyede kjemiske substituenter (f.eks. ved modifisering av et allerede syntetisert oligo- eller polynukleotid, eller ved inkorporering av en modifisert base eller skjelettanalog under syntesen) kan innføres i en metabolsk aktiv eukaryot celle for å hybridisere med en hTRT DNA, RNA eller et protein, hvor de frembringer en endring eller kjemisk modifikasjon av en lokal DNA, RNA eller et protein. Alternativt kan de derivatiserte oligo- eller polynukleotidene gi interaksjon med og endre hTRT-polypeptider, telomerase-assosierte proteiner eller andre faktorer som virker sammen med hTRT DNA eller hTRT-genprodukter eller endrer eller modulerer ekspresjon eller funksjon av hTRT DNA, RNA eller protein. Illustrerende tilkoblede kjemiske substituenter innbefatter: europium(III)texafyrin, kryss-bindende midler, psoralen, metallchelater (f.eks. jern/EDTA-chelat for jemkatalysert spaltning), topoisomeraser, endonukleaser, eksonukleaser, ligaser, fosfodiesteraser, fotodynamiske porfyriner, kjemoterapeutiske medikamenter (f.eks. adriamycin, doxirubicin), interkallerende midler, base-modifikasjonsmidler, immunglobulinkjeder og oligonukleotider. Jern/EDTA-chelater er kjemiske substituenter som ofte benyttes når det ønskes lokal spaltning av en polynukleotidsekvens (Hertzberg, et al, 1982, J. Am. Chem. Soc. 104-313; Hertzberg & Dervan, 1984, Biochemistry 23:3934; Taylor et al, 1984, Tetrahedron 40:457; Dervan, 1986, Science 232:464). Illustrerende tilkoblende kjemi innbefatter: direkte kobling, f.eks. via en tilføyd reaktiv aminogruppe (Corey & Schultz (1988) Science 238:1401, som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse) og andre former for direkte tilkoblende kjemi, selv om streptavidin/biotin og digoksygenin/anti-digoksygenin antistoff tilkoblings-metoder også kan benyttes. Metoder for tilkobling av kjemiske substituenter er angitt i US-patent 5.135.720, 5.093.245 og 5.055.556, som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse. Andre kjemiske tilkoblingsteknikker basert på brukerens skjønn, kan også benyttes.

I denne sammenheng har betegnelsen «påvisbar merking» den vanlige betydning og

referer seg til et atom (f.eks. radionuklid), molekyl (f.eks. fluorescein), eller kompleks som er eller kan benyttes til å påvise (f.eks. som følge av en fysisk eller kjemisk egenskap), nærværet av et molekyl eller muliggjøre binding av et annet molekyl som det er kovalent bundet til eller på annen måte assosiert med. Betegnelsen «merking» refererer seg også til kovalent bundne eller på annen måte assosierte molekyler (f.eks. et biomolekyl, så som et enzym) som virker på et substrat for å frembringe et påvisbart atom, molekyl eller kompleks. Egnede påvisbare merkinger for bruk for foreliggende oppfinnelse innbefatter enhver blanding som kan påvises ved spektroskopiske, fotokjemiske, biokjemiske, immunkjemiske, elektriske, optiske eller

kjemiske måter. Merkinger som er anvendelige for foreliggende oppfinnelse innbefatter biotin for farving med merket streptavidinkonjugat, magnetiske kuler (f.eks. Dynabeads™), fluorescerende farvestoffer (f.eks. fluorescein, Texasrødt, rhodamin, grønnfluorescerende protein, forsterket grønnfluorescerende protein, lissamin, fykoerytrin, Cy2, Cy3, Cy3.5,Cy5, Cy5.5, Cy7, FluorX [Amersham], SyBR Green I & II [molekylære prober] og lignende), radioaktive merkinger (f.eks. H, I, S, C eller P), enzymer (f.eks. hydrolaser, særlig fosfataser, så som alkalisk fosfatase, esteraser og glykosidaser eller oksyreduktaser, særlig peroksydaser, som f.eks. pepperrot-peroksydase, og andre som vanligvis benyttes ved ELISA), substrater, kofaktorer, inhibitorer, kjemiluminescerende grupper, kromogene midler og kolorimetriske merkinger, som f.eks. kolloidalt gull eller farvede glasskuler eller plastkuler (f.eks. av polystyren, polypropylen, latex, etc). Patenter som omtaler bruken av slike merkinger er bl.a. US-patent 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149; og 4.366.241. Påvisningsanordninger for slike merkinger er velkjent for fagmannen. Således kan for eksempel radioaktive merkinger og kjemiluminescensmerkinger påvises ved å benytte fotografisk film eller scintillasjonstellere, mens fluorescensmarkører kan påvises ved å benytte en fotodetektor som påviser emittert lys (f.eks. som ved fluorescensaktivert cellesortering). Enzymatiske merkinger påvises i alminnelighet ved å forsyne enzymet med et substrat og påvise reaksjonsproduktene produsert gjennom virkningen av enzymet på substratet, og kolorimetriske merkinger påvises ved ganske enkelt å visualisere den farvede merking. En merking er således en hvilken som helst sammensetning som er påvisbar ved spektroskopiske, fotokjemiske, biokjemiske, immunkjemiske, elektriske, optiske eller kjemiske anordninger. Merkingen kan være koblet direkte eller indirekte til den ønskede komponent som skal bestemmes, i henhold til velkjente metoder. Hcke-radioaktive merkinger tilkobles ofte indirekte. Generelt bindes et ligandmolekyl (f.eks. biotin) kovalent til molekylet. Liganden binder seg deretter til et anti-ligandmolekyl (f.eks. streptavidin) som enten er naturlig påvisbart eller kovalent bundet til et signal-genererende system, som f.eks. et påvisbart enzym, en fluorescerende forbindelse eller en kjemiluminescent forbindelse. Det kan benyttes en rekke ligander og anti-ligander. Når en ligand har en naturlig anti-ligand, for eksempel biotin, tyroxin og kortisol, kan den benyttes sammen med de merkede naturlig forekommende anti-ligandene. Alternativt kan ethvert hapten eller enhver antigen-forbindelse benyttes i kombinasjon med et antistoff. Molekylene kan også være direkte konjugert til signal-genererende forbindelser, f.eks. ved konjugasjon med et enzym eller en fluorofor. Måter å påvise merkinger på er velkjent for fagmannen. Når for eksempel merkingen er en radioaktiv merking, innbefatter påvisningsmåtene en scintillasjonsteller, fotografisk film som ved autoradiografi eller «storage phosphor imaging». Når merkingen er en fluorescerende merking, kan den påvises ved å eksitere fluorokromet med den passende lysbølgelengde og påvise den resulterende fluorescens. Fluorescensen kan påvises visuelt, ved hjelp av fotografisk film, ved bruk av elektroniske detektorer, så som ladede koblede anordninger (CCD) eller fotomultiplikatorer og lignende. Tilsvarende kan enzymatiske merkinger påvises ved å stille passende substrater for enzymet til rådighet og påvise det resulterende reaksjonsprodukt. En enkel kolorimetrisk merking kan også påvises ved å observere farven assosiert med merkingen. Det vil være klart at når det i en test benyttes et par av fluoroforer, er det ofte å foretrekke at de har egne emisjonsmønstere (bølgelengder) slik at de lett kan adskilles.

Betegnelsen «forhøyet nivå» viser til en mengde hTRT-genprodukt (eller annen angitt substans eller aktivitet) i en celle som er forhøyet eller høyere enn nivået i en referanse-standard, f.eks. for diagnose, nivået i normale, telomerase-negative celler i et individ eller i andre individer som ikke lider under disse tilstandene, og for prognose, nivået i tumorceller fra et utvalg av graderinger eller klasser av f.eks. tumorer.

I denne sammenheng har betegnelsen «epitop» dens vanlige betydning av et sete på et antigen som gjenkjennes av et antistoff. Epitoper er i alminnelighet segmenter av aminosyrer som er en liten del av hele proteinet. Epitoper kan være konformasjonelle (dvs. diskontinuer-lige). Det vil si de kan dannes av aminosyrer som kodes av ikke-sammenhengende deler av en primærsekvens som er juksta-posisjonert ved proteinfolding.

Betegnelsene «gunstig prognose» og «ugunstig prognose» er kjent på området. I sammenheng med cancere betyr «gunstig prognose» at det er en sjanse for tumorregresjon eller lengre overlevelsestid for pasienter med en gunstig prognose i forhold til de med ugunstige prognoser, mens «ugunstig prognose» betyr at tumoren sannsynligvis vil bli mer aggressiv, dvs. vokse hurtigere og/eller metastasere, som resulterer i et dårlig utfall for pasienten eller et hurtigere forløp av sykdomsutviklingen.

I denne sammenheng viser betegnelsen «fusjonsprotein» til et sammensatt protein, dvs. en enkelt sammenhengende aminosyresekvens som utgjøres av to (eller flere) distinkte heterologe polypeptider som normalt ikke er fusjonert sammen i en enkelt aminosyresekvens. Et fusjonsprotein kan innbefatte en enkelt aminosyresekvens som inneholder to helt forskjellige aminosyresekvenser, eller to lignende eller identiske polypeptidsekvenser, forutsatt at disse sekvensene normalt ikke finnes sammen i samme konfigurasjon i en enkelt aminosyresekvens i naturen. Fusjonsproteiner kan i alminnelighet fremstilles ved å benytte enten rekombinante nukleinsyremetoder, dvs. som resultat av transkripsjon og translasjon av et rekombinant genfusjonsprodukt, hvis fusjon omfatter et segment som koder for et polypeptid ifølge oppfinnelsen, og et segment som koder for et heterologt protein, eller ved • hjelp av velkjente kjemiske syntesemetoder. Fusjonsproteinets non-hTRT-regioner kan fusjoneres til aminoenden av hTRT-polypeptidet eller til karboksylenden eller begge deler, eller non-hTRT-regionen kan innføres i det indre av proteinsekvensen (ved del-innføring eller ved å erstatte aminosyrer) eller kan det foretas kombinasjoner av ovennevnte.

I denne sammenheng viser betegnelsen «genprodukt» til et RNA-molekyl transkribert fra et gen eller et protein som kodes av genet eller er translatert fra RNA.

I denne sammenheng viser betegnelsen «hTR» (human telomerase RNA) til RNA-komponentene av human telomerase og eventuelt naturlig forekommende alleler og varianter eller rekombinantvarianter. hTR er beskrevet detaljert i US-patent 5.583.016, som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse.

I denne sammenheng har betegnelsen «immortal» (udødelig) når det refereres til en celle, sin vanlige betydning på telomeraseområdet og refererer til celler som har tilsynelatende ubegrenset replikasjonspotensiale. Immortal kan også referere seg til celler med øket proliferativ evne i forhold til deres umodifiserte motstykker. Eksempler på immortale humanceller er maligne tumorceller, kimlinjeceller og visse transformerte humane cellelinjer dyrket in vitro (f.eks. celler som blitt udødelige etter transformasjon med virale onkogener eller på annen måte). Derimot er de fleste normale humane somatiske celler dødelige, dvs. har begrenset replikasjonsevne og blir gamle etter et begrenset antall celledelinger.

I denne sammenheng har betegnelsene «immunogen» og «immunogenisk» deres ordinære betydning, dvs. et immunogen er et molekyl, som f.eks. et protein eller annet antigen som kan utløse en adaptiv immunrespons etter injeksjon i en person eller et dyr.

I denne sammenheng viser betegnelsen «isolert» når den refererer seg til et molekyl eller en sammensetning som for eksempel et RNP (f.eks. minst ett protein og minst én RNA) at molekylet eller sammensetningen er adskilt fra minst én annen forbindelse, som f.eks. et protein, andre RNA eller andre kontaminanter som det er forbundet med in vivo eller i dets naturlig forekommende tilstand. Et RNP ansees isolert når dette RNP er isolert fira en hvilken som helst annen komponent som det naturlig er forbundet med, f.eks. cellemembran, som i et celleekstrakt. En isolert sammensetning kan imidlertid også være tilnærmet ren.

I denne sammenheng viser betegnelsen «modulator» til en hvilken som helst syntetisk eller naturlig forbindelse eller sammensetning som på en eller annen måte kan endre både den «fullstendige» eller enhver «partiell» aktivitet av en telomerase revers transkriptase (TRT). En modulator kan være en agonist eller en antagonist. En modulator kan være en hvilken som helst organisk eller uorganisk forbindelse, inklusivt, men ikke begrenset til, for eksempel små molekyler, peptider, proteiner, sukkere, nukleinsyrer, fettsyrer og lignende.

I denne sammenheng viser betegnelsen «motiv» til en sekvens av sammenhengende aminosyrer (eller til en nukleinsyresekvens som koder for en sekvens av sammenhengende aminosyrer) som definerer et trekk eller en struktur i et protein som er felles til, eller konservert, i alle proteiner av en definert klasse eller type. Motivet eller konsensussekvensen kan innbefatte både konserverte og ikke-konserverte rester. De konserverte restene i motiv-sekvensen indikerer at den konserverte rest eller klasse (dvs. hydrofobe, polare, upolare eller annen klasse) av rester typisk forekommer på det angitte sted i ethvert protein (eller gen eller mRNA) av proteinklassen definert av motivet. Motiver kan adskille seg i henhold til proteinklassen. Således kan for eksempel de reverse transkriptaseenzymene danne en klasse av proteiner som kan defineres av ett eller flere motiver, og denne klasse inkluderer telomeraseenzymer. Telomeraseenzymene kan imidlertid også være definert som klassen av enzymer med motiver som er karakteristiske for vedkommende klasse. Det vil for fagmannen være klart at identifiseringen av en rest som en konservert rest i et motiv, ikke betyr at hvert ledd av klassen definert av motivet, har den angitte rest (eller klasse av rester) i den angitte posisjon, og at én eller flere ledd av klassen kan ha en annen rest i den konserverte posisjon.

I denne sammenheng benyttes betegnelsene «nukleinsyre» og «polynukleotid» om hverandre. Bruk av betegnelsen «polynukleotid» er ikke ment å utelukke oligonukleotider (dvs. korte polynukleotider) og kan også referere seg til syntetiske og/eller ikke-naturlig forekommende nukleinsyrer (dvs. omfatte nukleinsyreanaloger eller modifiserte skjelettrester eller koblinger).

I denne sammenheng viser betegnelsene «oligonukleotider» eller «oligomerer» til en nukleinsyresekvens på ca. 7 nukleotider eller mer og opptil ca. 100 nukleotider som kan benyttes som en primer, probe eller amplimer. Oligonukleotider har ofte en lengde på mellom ca. 10 og ca. 50 nukleotider, oftere mellom ca. 14 og ca. 35 nukleotider, meget ofte mellom ca. 15 og ca. 25 nukleotider, og betegnelsen oligonukleotider eller oligomerer kan også stå for syntetiske og/eller ikke-naturlig forekommende nukleinsyrer (dvs. omfatte nukleinsyre-analoger eller modifiserte skjelettrester eller koblinger).

I denne sammenheng viser betegnelsen «operativt koblet» til et funksjonelt forhold mellom to eller flere nukleinsyre- (f.eks. DNA) segmenter. For eksempel er en promoter eller enhancer operativt koblet til en kodende sekvens dersom den stimulerer transkripsjonen av sekvensen i en passende vertscelle eller et annet ekspresjonssystem. I alminnelighet er sekvenser som er operativt koblet, sammenhengende og når det gjelder en signalsekvens, både sammenhengende og i lesefase. Enhancere behøver imidlertid ikke være lokalisert i umiddelbar nærhet til de kodende sekvenser som de forsterker transkripsjonen til.

I denne sammenheng benyttes betegnelsen «polypeptid» avvekslende med betegnelsen «protein» og refererer seg til en polymer sammensatt av aminosyrerester koblet ved amid-koblinger, inklusivt syntetiske, naturlig forekommende og ikke-naturlig forekommende analoger derav (aminosyrer og koblinger). Peptider er eksempler på polypeptider.

I denne sammenheng viser betegnelsen «probe» til et molekyl som spesifikt binder et annet molekyl. Et eksempel på en probe er en «nukleinsyreprobe» som spesifikt binder (dvs. smelter sammen med eller hybridiserer) til en i det vesentlige komplementær nukleinsyre. Et annet eksempel på en probe er en «antistoffprobe» som spesifikt binder til et tilsvarende antigen eller epitop.

I denne sammenheng viser betegnelsen «rekombinant» til et polynukleotid som er syntetisert eller på annen måte manipulert in vitro (f.eks. «rekombinant polynukleotid»), fremgangsmåter for å benytte rekombinante polynukleotider til å produsere genprodukter i celler eller andre biologiske systemer eller til et polypeptid («rekombinant protein») som kodes av et rekombinant polynukleotid.

I denne sammenheng viser betegnelsen «seleksjonssystem» i sammenheng med stabilt transformerte cellelinjer, til en metode for å identifisere og/eller selektere celler inneholdende en aktuell rekombinant nukleinsyre. Et stort utvalg seleksjonssystemer for identifisering av transformerte celler er kjent og egner seg for bruk for foreliggende oppfinnelse. For eksempel kan celler transformert med plasmider eller andre vektorer, selekteres ut fra antibiotika-resistens forårsaket av gener som inngår i plasmidene, så som de velkjente amp-, gpt-, neo- og hyg-genene eller andre gener som f.eks. herpes simplex virus tymidinkinase (Wigler et al., Cell 11:223-32 [1977]) og adenin-fosforibosyltransferasegener (Lowy et al., Cell 22:817

[1980] som kan benyttes i henholdsvis tk- eller aprt-celler. Også antimetabolitt-, antibiotika-eller herbicid-resistens kan benyttes som seleksjonsbasis. Eksempler er dh/ r som gir resistens mot metotrexat og også er egnet for genamplifikasjon (Wigler et al., Proe. Nati. Acad. Sei.

77:3567 [1980]); npt, som gir resistens mot aminoglykosidene neomycin og G-418 (Colbere-Garapin et al, J. Mol. Biol. 150:1 [1981]) og als eller pat, som gir resistens mot henholdsvis klorsulfuron og fosfinotricin-acetyltransferase (Murry, i McGraw Hill Yearbook of Science and Technology, McGraw Hill, New York NY. s. 191-196 [1992]). Ytterligere selekterbare gener er også beskrevet, for eksempel genene trpB, som gir hygromycinresistens og som lar celler utnytte indol i stedet for tryptofan, eller hisD, som lar celler utnytte histinol i stedet for histidin (Hartman & Mulligan, Proe. Nati. Acad. Sei., 85:8047 [1988]). Nylig har anvendelsen av synlige markører oppnådd popularitet med slike markører som antocyaniner, beta-glukuronidase og dens substrat, GUS, og luciferase og dens substrat, luciferin, som har utstrakt anvendelse ikke bare for å identifisere transformanter, men også for å kvantifisere mengden av forbigående eller stabil proteinekspresjon som kan tilskrives et spesifikt vektorsystem (Rhodes et al, Meth. Mol. Biol. 55:121 [1995]).

I denne sammenheng viser betegnelsen «sekvens» av et gen (om intet annet er uttrykkelig angitt), nukleinsyre, protein eller peptid, til rekkefølgen av nukleotider i den ene eller begge kjeder av et dobbeltkjedet DNA-molekyl, f.eks. sekvensen av både den kodende kjede og dens komplement, eller av et enkeltkjedet nukleinsyremolekyl, eller til rekkefølgen av aminosyrer i et peptid eller protein.

I denne sammenheng viser betegnelsen «spesifikk binding» til den evne et molekyl, typisk et antistoff eller polynukleotid, har til å kontakte og assosieres med et annet spesifikt molekyl selv i nærvær av mange andre ulike molekyler. For eksempel kan et enkeltkjedet polynukleotid spesifikt bindes til et enkeltkjedet polynukleotid med komplementær sekvens, og et antistoff spesifikt bindes til (eller «være spesifikt immunreaktivt med») dets tilsvarende antigen.

I denne sammenheng viser betegnelsene «stringente hybridiserings-betingelser» eller «stringens» til betingelser i et område fra ca. 5°C til ca. 20°C eller 25°C under målsekvensens smeltetemperatur (Tm) og en probe med eksakt eller nesten eksakt komplementaritet til målet. Smeltetemperaturen som det her er tale om er den temperatur ved hvilken en populasjon av dobbeltkjedede nukleinsyremolekyler blir halvveis dissosiert til enkeltkjeder. Metoder for beregning av Tm av nukleinsyrer er velkjent på området (se f.eks. Berger & Kimmel (1987) Methods in Enzymology, Bd. 152: Guide to Moelcular Cloning Techniques, San Diego: Academic Press, Inc. og Sambrook et al, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utg. red. Bd. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, heretter «Sambrook») som begge herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse. Som angitt i standardreferanser kan et enkelt estimat av Tm-verdien beregnes med ligningen: Tm=81,5+0,41 (%G+C) når en nukleinsyre er i en vandig løsning av IM NaCl (se f.eks. Anderson & Young, Quantitative Filter Hybridization i Nucleic Acid Hybridization (1985)). Andre referanser inneholder mer sofistikerte beregninger som tar hensyn til strukturelle kjennetegn så vel som sekvens-karakteristika for beregningen av Tm. Smeltetemperaturen av et hybrid (og dermed betingelsene for stringent hybridisering) påvirkes av forskjellige faktorer, som f.eks. probens lengde og natur (DNA, RNA, basesammensetning) og naturen av målet (DNA, RNA, base-sammensetning, foreliggende i løsning eller immobilisert og lignende) og konsentrasjonen av salter og andre komponenter (f.eks. nærvær eller fravær av formamid, dekstransulfat, polyetylenglykol). Virkningen av disse faktorene er velkjente og er omtalt i standardreferanser innen området, f.eks. Sambrook, supra og Ausubel et al,, supra. Typiske stringente hybridiseringsbetingelser er saltkonsentrasjoner på mindre enn ca. 1,0 M natriumioner, typisk ca. 0,01 til 1,0M natriumioner ved pH 7,0 til 8,3, og temperaturer på minst ca. 30°C for korte prober (f.eks. 10 til 50 nukleotider) og minst ca. 60°C for lange prober (f.eks. mer enn 50 nukleotider). Som nevnt kan stringente betingelser også oppnås ved tilsetning av destabiliseirngsmidler, som f.eks. formamid, og i så fall kan lavere temperaturer benyttes.

I denne sammenheng viser betegnelsene «tilnærmet identitet», «tilnærmet sekvensidentitet» eller «tilnærmet likhet» i sammenheng med nukleinsyrer, til et mål for sekvenslikhet mellom to polynukleotider. Tilnærmet sekvensidentitet kan bestemmes ved hybridisering under stringente betingelser, ved direkte sammenligning eller på annen måte. For eksempel kan to polynukleotider sies å ha tilnærmet sekvensidentitet dersom de er i stand til spesifikt å hybridisere til hverandre under stringente hybridiseringsbetingelser. Andre grader av sekvensidentitet (f.eks. mindre enn «tilnærmet») kan kjennetegnes ved hybridisering under andre stringensbetingelser. Alternativt kan tilnærmet sekvensidentitet beskrives som en prosentandel identitet mellom to nukleotid- (eller polypeptid) sekvenser. To sekvenser ansees tilnærmet identiske når de er minst ca. 60% identiske, fortrinnsvis minst ca. 70% identiske eller minst ca. 80% identiske eller minst ca. 90% identiske eller minst ca. 95% eller 98% til 100% identiske. Prosent sekvensidentitet (nukleotid eller aminosyre) beregnes i alminnelighet ved å bestemme den optimale tilpasning mellom to sekvenser og sammenligne de to sekvensene. For eksempel kan et eksogent transkript benyttet for proteinekspresjon, sies å ha en viss prosent identitet eller likhet sammenlignet med en referansesekvens (f.eks. den tilsvarende endogene sekvens). Optimal tilpasning av sekvenser kan foretas ved å benytte den lokale homologialgoritme til Smith & Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482, ved hjelp av homologi-tilpasningsalgoritmen til Needleman & Wunsch (1970), J. Mol. Biol. 48:443, ved søking etter likhet-metoden til Pearson & Lipman (1988) Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 85:2444, ved datamaskinberegninger av disse algoritmene (GAP, BESTFIT, FASTA og TFASTA i Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), eller ved visuell bedømmelse. Den beste tilpasning (dvs. som resulterer i den høyeste prosentandel identitet) frembragt ved de ulike metodene velges. I alminnelighet sammenligner disse algoritmene de to sekvensene over et «sammenligningsvindu» (vanligvis minst 18 nukleotiders lengde) for å identifisere og sammenligne lokale regioner av sekvenslikhet under tillatelse av små addisjoner eller delesjoner (dvs. gaps). Addisjoner og delesjoner er i alminnelighet 20% eller mindre av sekvenslengden i forhold til referansesekvensen som ikke omfatter addisjoner eller delesjoner. Det er iblant ønskelig å beskrive sekvensidentitet mellom to sekvenser med referanse til en bestemt lengde eller region (f.eks. to sekvenser kan beskrives som å ha minst 95% identitet over en lengde på minst 500 basepar). Vanligvis vil lengden være minst 50,100, 200, 300,400 eller 500 basepar, aminosyrer eller andre rester. Prosentandelen av sekvensidentitet ble beregnet ved å sammenligne to optimalt tilpassede sekvenser over sammenligningsområdet, bestemme antall posisjoner hvor den identiske nukleinsyrebase (f.eks. A, T, C, G eller U) forekommer i begge sekvenser, for å gi antall overensstemmende posisjoner, og bestemme antallet (eller andelen) overensstemmende posisjoner sammenlignet med det totale antall baser i referansesekvensen eller regionen som sammenlignes. En ytterligere algoritme som egner seg for bestemmelse av sekvenslikhet er BLAST-algoritmen som er beskrevet i Altschul (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410; og Shpaer (1996) Genomics 38:179-191. Programvare for BLAST-analyser er offentlig tilgjengelig ved National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Denne algoritme innebærer først identifisering av høyt-skårende sekvenspar (HSP) ved å identifisere korte ord av lengde W i det søk som enten stemmer overens eller tilfredsstiller en viss positiv terskelverdi T, når den stilles på linje med et ord av samme lengde i en databasesekvens. T omtales som skåreterskel for nabo-ordet (Altschul et al, supra). Disse første nabo-ordtreff virker som kimer for å initiere søk for å finne lengre HSP som inneholder disse. Ordtreffene forlenges i begge retninger langs hver sekvens så langt som den kumulative tilpasningsskåre kan økes. Forlengelse av ordtreffene i hver retning stanses: når den kumulative tilpasningsskåre minker med mengden X fra dens maksimalt oppnådde verdi; når den kumulative skåre går mot null eller lavere som følge av akkumuleringen av én eller flere resttilpasninger av negativ skåre; eller når slutten av hver sekvens nås. BLAST-algoritmeparameterne W, T og X bestemmer følsomheten og hastigheten av tilpasningen. BLAST-programmet benytter som fast innstilling en ordlengde (W) på 11, BLOSUM62 skårematriks- (se Henikoff (1992) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 89:10915-10919) tilpasninger (B) på 50, forventning (E) på 10, M=5, N=4, og en sammenligning av begge kjeder. Betegnelsen BLAST refererer seg til BLAST-algoritmen som foretar en statistisk analyse av likheten mellom to sekvenser; se f.eks. Karlin (1993) Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 90:5873-5887. Et mål for likhet som BLAST-algoritmen gir, er den minste samlede sannsynlighet (P(N)), som gir en indikasjon på med hvilken sannsynlighet en overensstemmelse mellom to nukleotid- eller aminosyresekvenser tilfeldig ville inntre. For eksempel kan en nukleinsyre ansees å være lignende en TRT-nukleinsyre dersom den minste samlede sannsynlighet ved en sammenligning av testnukleinsyren med en TRT-nukleinsyre er mindre enn ca. 0,5,0,2,0,1,0,01 eller 0,001. En annen alternativ indikasjon på at to nukleinsyresekvenser er lignende, er at det polypeptid som den første nukleinsyre koder for, er immunologisk kryssreaktivt med det polypeptid som kodes av den andre nukleinsyren.

I denne sammenheng viser betegnelsene «tilnærmet identitet», «tilnærmet sekvensidentitet» eller «tilnærmet likhet» når det er tale om et polypeptid, til en grad av likhet mellom to polypeptider, hvor ett polypeptid omfatter en sekvens med minst 70% sekvensidentitet i forhold til en referansesekvens, eller 80%, eller 85% eller opptil 100%, sekvensidentitet i forhold til referansesekvensen, eller mest foretrukket, 90% identitet over et sammenligningsvindu på ca. 10-20 aminosyrerester. Aminosyresekvenslikhet, eller sekvensidentitet, bestemmes ved å optimalisere overensstemmelser mellom rester, om nødvendig ved å innføre mellomrom. Se Needleham et al., (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453; og Sankoff et al., 1983, Time Warps, String Edits, and Macromolecules, The Theory and Practice of Sequence Comparison, Chapter one, Addison-Wesley, Reading, MA; samt programvare fra IntelliGenetics, Mountain View, CA, og University of Wisconsin Genetics Computer Group, Madison, WI. Som fagmannen vil innse kan betegnelsene «tilnærmet identitet», «tilnærmet likhet» og «tilnærmet sekvensidentitet» bli benyttet om hverandre når det gjelder polypeptider eller polynukleotider.

I denne sammenheng viser betegnelsene «tilnærmet ren» eller «tilnærmet renset» når det er tale om en blanding som omfatter et bestemt reagens, så som et antistoff (f.eks. et anti-hTRT-antistoff) at det angitte reagens er minst ca. 75%, eller minst ca. 90%, eller minst ca. 95% eller minst ca. 99% eller mer av blandingen (utenom, f.eks. løsningsmiddel eller buffer). Et foretrukket immunglobulinpreparat ifølge oppfinnelsen som spesifikt binder et hTRT-polypeptid, er for eksempel tilnærmet renset.

I denne sammenheng viser betegnelsen «telomerase-negativ» til en celle hvor det ikke uttrykkes telomerase, dvs. det kan ikke påvises noen telomerase katalytisk aktivitet ved å benytte en konvensjonell test eller en TRAP-test for telomerase katalytisk aktivitet. I denne sammenheng er en «telomerase-positiv» celle en celle hvori telomerase uttrykkes (dvs. telomeraseaktivitet kan påvises).

I denne sammenheng er en «telomerase-relatert» sykdom eller tilstand en sykdom eller tilstand hos vedkommende som er korrelert med et unormalt høyt nivå av telomerase-aktivitet i celler og som kan innbefatte enhver telomeraseaktivitet for de fleste normale somatiske celler, eller som er korrelert med et lavt nivå av telomeraseaktivitet som resulterer i svekkelse av normal cellefunksjon. Eksempler på telomerase-relaterte tilstander er f.eks. cancer (høy telomeraseaktivitet i maligne celler) og infertilitet (lav telomeraseaktivitet i kimlinjeceller).

I denne sammenheng refererer «testforbindelse» eller «middel» til enhver syntetisk eller naturlig forbindelse eller blanding. Betegnelsen inkluderer alle organiske og uorganiske forbindelser, inklusivt for eksempel små molekyler, peptider, proteiner, sukkere, nukleinsyrer, fettsyrer og lignende.

XIII EKSEMPLER

De etterfølgende eksempler illustrerer foreliggende oppfinnelse og er ikke ment som noen begrensning.

I de etterfølgende avsnitt gjelder følgende forkortelser: ekv. (ekvivalenter); M (molar); HM (mikromolar); N (normal); mmol (millimol); ^mol (mikromol); nmol (nanomol);

g (gram); mg (milligram); \ ig (mikrogram); ng (nanogram); L (liter); mL (milliliter);

uL (mikroliter); cm (centimeter); mm (millimeter); nm (mikrometer); nm (nanometer);

°C (Celsiusgrader); RNP (ribonukleoprotein; mreN(2'-0-metylribonukleotider); dNTP

(deoksyribonukleotid); dH20 (destillert vann); DDT (ditiotreitol); PMSF (fenylmetylsulfonylfluorid); TE (10 mM Tris HC1, 1 mM EDTA, ca. pH 7,2); KGlu (kaliumglutamat); SSC (salt-og natriumcitratbuffer); SDS (natriumdodekylsulfat); PAGE (polyakrylamidgelelektroforese); Novex (Novex, San Diego, CA); BioRad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA); Pharmacia

(Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ); Boehringer-Mannheim (Boehringer-Mannheim Corp.,

Concord, CA); Amersham (Amersham Inc., Chicago, LL); Stratagene (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA); NEB (New England Biolabs, Beverly, MA); Pierce (Pierce Chemical Co., Rockford, IL); Beckman (Beckman Instruments, Fullerton, CA); Lab Industries (Lab Industries, Inc., Berkeley, CA); Eppendorf (Eppendorf Scientific, Madison, WT); og Molecular Dynamics (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).

EKSEMPEL 1

ISOLERING AV TELOMERASEPROTEINER OG KLONER

Det følgende eksempel beskriver mer detaljert isoleringen av telomeraseproteiner og kloner fra diverse organismer, inklusivt euplotene p.123, hTRT, TRT og S. pombe TRT telomerase cDNA-kloner.

A. Bakgrunn

i) Innføring

Dette avsnitt gir en oversikt over rensingen og kloningen av TRT-gener, som er mer detaljert beskrevet i etterfølgende avsnitt i dette eksempel. Mens telomerase RNA-subenheter er blitt identifisert i ciliater, gjær og pattedyr, er protein-subenheter av enzymet som sådanne ikke blitt identifisert før foreliggende oppfinnelse. Rensing av telomerase fra den flimmer-hårede protozo Euplotes aediculatus førte til to proteiner, betegnet pl23 og p43 (se nedenfor; Lingner (1996) Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 93:10712). Euplotes aediculatus er et hypotrikøst eiliat som har en makrokjerne inneholdende ca. 8 x 10 telomerer og ca. 3 x 10 molekyler telomerase. Etter rensing hadde det aktive telomerasekompleks en molekylmasse på ca. 230 kD, tilsvarende en 66 kD RNA-subenhet og to proteiner på ca. 123 kD og 43 kD (Lingner (1996) supra). Fotokryssing/sammenkoblings-forsøk tydet på at det større pl23-protein var involvert i spesifikk binding av det telomere DNA-substrat (Lingner (1996) supra).

pl23- og p43-proteinene ble sekvensert, og de cDNA-kloner som kodet for disse proteinene ble isolert. Disse £w/?/otø.s-sekvensene ble funnet å være ubeslektet med de Tetrahymena telomerase-assosierte proteinene p80 og p95. Sekvensanalyse av Euplotes pl23 avdekket reverse transkriptase- (RT) motiver. Videre avdekket sekvensanalyse av Euplotes pl23 sammenlignet med andre sekvenser, en gjærhomolog, betegnet Est2-protein (Lingner

(1997) Science 276:561). Gjær Est2 var tidligere vist å være essensiell for telomer-opprettholdelse in vivo (Lendvay (1996) Genetics 144:1399), men var ikke blitt identifisert som et telomerase katalytisk protein. Stedsspesifikk mutagenese viste at RT-motivet av gjær Est2 er essensielt for telomer DNA-syntese in vivo og in vitro (Lingner (1997) supra).

ii) Identifisering og karakterisering av S. pombe telomerase

PCR-amplifikasjon av S. pombe DNA ble foretatt med degenererte sekvensprimere konstruert fra Euplotes pl23 RT-motiver som beskrevet nedenfor. Av de frembragte fire fremherskende PCR-produktene kodet et bånd på 120 basepar en peptidsekvens som var homolog med pl23 og Est2. Dette PCR-produkt ble benyttet som probe ved koloni-hybridisering og identifiserte to overlappende kloner fra et S. pombe genomisk bibliotek og tre fra et S. pombe cDNA-bibliotek. Sekvensanalyse viste at ingen av de tre S. pombe cDNA-klonene var av full lengde, så RT-PCR ble benyttet for å oppnå de sekvenser som kodet for proteinets N-terminal.

Fullstendig sekvensering av disse klonene avdekket et antatt S. pombe telomerase RT-gen, trtl. Den fullstendige nukleotidsekvens av trtl er blitt deponert i GenBank, tilgangsnummer AF015783 (se Figur 15).

For å teste S. pombe trtl (som en katalytisk subenhet) ble det frembragt to delesjons-konstruksjoner. Analyse av sekvensen viste at trtl kodet for et basisk protein med en predikert molekylmasse på 116 kD. Det ble funnet at homologien med pl23 og Est2 var spesielt høy i de syv reverse transkriptasemotivene, som er understreket og betegnet motiv 1,2, A, B, C, D og E (se Figur 63). Et ytterligere telomerase-spesifikt motiv, betegnet T-motivet, ble også funnet. Femten introner varierende i størrelse fra 36 til 71 basepar, avbrøt den kodende sekvens.

For å teste S. pombe trtl som katalytisk subenhet ble det frembragt to delesjons-konstruksjoner. Den ene med kun fjernet motiv B til og med D i RT-domenet. Den andre fjernet 99% av den åpne leseramme.

Haploide celler dyrket fra S. pombe- sporer av begge mutanter oppviste progressiv telomerforkortelse til det punkt hvor hybridisering til telomere repetisjoner nesten ble upåviselige. En trtl+/ trtl~ diploid ble sporulert og de resulterende tetrader dissekert og spiret på et gjærekstraktmedium supplert med aminosyrer (en YES-plate, Alfa (1993) Experiments with Fission Yeast, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Kolonier utviklet fra hver spore ble dyrket ved 32°C i tre dager og suksessivt utstreket på friske YES-plater tredje hver dag. En koloni fra hver runde ble anbragt i 6 mL YES-væskekultur ved 32°C og dyrket til stasjonærfase. Genomisk DNA ble fremstillet. Etter oppslutning med Apal, ble DNA underkastet elektroforese på en 2,3% agarosegel, farvet med etidiumbromid for å bekrefte tilnærmet lik påsetting i hver bane, og deretter overført til en nylonmembran og hybridisert til en telomer DNA-probe.

Aldring ble indikert gjennom den forsinkede vekststart eller sviktende vekst på agar (typisk etter den fjerde utstrykning etter spiring) og av kolonier med økende riflede kanter (kolonimorfologi vist i Figur 22C) og ved tiltagende høye fraksjoner av lange celler (som vist i Figur 22D). Cellen ble utplatet på Minimal Medium (Alfa (1993) supra) med glutaminsyre i stedet for ammoniumklorid i to dager ved 32°C før fotografering.

Når forstørrede enkeltceller ble fraskilt på disseksjonsmikroskopet, ble størsteparten funnet å ikke dele seg ytterligere. Den samme telomerase-negative ( trtl ) cellepopulasjon inneholdt alltid celler med normal størrelse som fortsatte å dele seg, men som ofte produserte ikke-delende avkom. De telomerase-negative overlevende kan benytte en rekombinasjonsmåte for telomer-opprettholdelse, hvilket er dokumentert i knoppskytende gjærstammer som har fått deletert diverse telomer-replikasjonsgener (Lendvay (1996) supra, Lundblad (1993) Cell 73:347).

iii) Identifisering og karakterisering av human telomerase

En EST (expressed sequence tag) avledet fra human telomerase revers transkriptase (hTRT) cDNA ble identifisert gjennom et BLAST-søk av dbEST (expressed sequence tag) GenBank databasen ved å benytte Euplotes 123 kDa peptidet og nukleinsyresekvenser, så vel som Schizosaccharomyces- <p>rotemet og tilsvarende cDNA (tezl) sekvenser. EST, betegnet GenBank AA28196, er 389 nukleotider langt og tilsvarer posisjonene 1679 til 2076 av klon 712562 (Figur 18), ble anskaffet fra I.M.A.G.E. Consortium (Human Genome Center, DOE, Lawrence Livermore National Laboratory, Livermore, CA). Denne klonen ble tatt fra et cDNA-bibliotek av germinale B-celler oppnådd ved strømningssortering av tonsillceller. Fullstendig sekvensering av denne hTRT cDNA-klon viste alle åtte telomerase RT (TRT) motivene. Denne hTRT-klonen kodet imidlertid ikke en sammenhengende del av en TRT fordi RT-motivene B', C, D og E inngikk i en annen åpen leseramme enn de mer N-terminale RT-motivene. Dessuten var avstanden mellom RT-motivene A og B vesentlig kortere enn mellom de tre tidligere kjente (ikke-humane) TRT.

For å isolere en full lengdes cDNA-klon, ble et cDNA-bibliotek avledet fra den humane 293-cellelinje (beskrevet ovenfor) som uttrykker høye nivåer av telomeraseaktivitet, underkastet screening. Et lambda cDNA-bibliotek fra 293-cellelinjen ble fordelt på 25 forråd inneholdende ca. 200.000 plakk hver. Hvert forråd ble underkastet screening ved PCR med primerparet 5'-CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA-3' og

5 '-GGATGAAGCGGAGTCTGGA-3'. Seks underforråd av et positivt primærforråd ble underkastet videre screening ved PCR ved å benytte det samme primerpar. For screeningen av både det primære og det sekundære underforråd, ble hTRT amplifisert i totalt 21 runder ved: 94°C, 45 sekunder; 60°C, 45 sekunder; og 72°C, 90 sekunder. Som en kontroll ble RNA av husholdningsenzymet GAPDH, amplifisert ved å benytte primerparet

i totalt 16 runder ved 94°C, 45 sekunder; 55°C, 45 sekunder; og 72°C, 90 sekunder.

Et hTRT-positivt underforråd fra den andre screeningen ble deretter underkastet screening ved plakkhybridisering med en probe fra 5'-regionen av klon nr. 712562. En fag ble positivt identifisert (betegnet lambda phage 25-1.1, ATCC 209024, deponert 12. mai, 1997). Den inneholdt et ca. 4 kilobasers innskudd, som ble eksidert og subklonet inn i EcoRI-setet av pBluescriptLTSK+-vektoren (Stratagene, San Diego, CA) som et EcoRI-fragment. Dette cDNA-klon-holdige plasmid ble betegnet pGRN121. Dette cDNA-innskudd utgjør totalt tilnærmet 4 kilobasepar. Den fullstendige nukleotidsekvens av den humane hTRT cDNA (pGRN121) er deponert i Genbank (tilgangsnummer AF015950) og plasmidet er deponert i ATCC (ATCC 209016, deponert 6. mai, 1997).

B. Dyrkning av Euplotes aediculatus

I dette eksempel ble kulturer av E. aediculatus anskaffet fra Dr. David Prescott, MCDB, University of Colorado. Dr. Prescott isolerte opprinnelig denne kultur fra dam-vann selv om denne organismen også er tilgjengelig fra ATCC (ATCC nr. 30859). Kulturene ble dyrket som beskrevet av Swanton et al., (Swanton et al., Chromosoma 77:203 [1980]), under ikke-sterile betingelser i 15 liters glassbeholdere inneholdende Chlorogonium som næringskilde. Organismene ble høstet fra kulturen når tettheten nærmet seg IO<4> celler/mL.

C. Fremstilling av kjerneekstrakter

I dette eksempel ble kjerneekstrakter av E. aediculatus fremstillet ved å benytte fremgangsmåten til Lingner et al., Lingner et al., Genes Develop., 8:1984 [1994]), meci, mindre modifkasjoner, som angitt nedenfor. I korthet ble celler dyrket som beskrevet i Del B, konsentrert med 15 (am Nytex -filtere og avkjølt på is. Cellepelleten ble resuspendert i et sluttvolum på llOmLTMS/PMSF/spermidin-fosfatbuffer. TMS/PMSF/spermidin-fosfat-stambufferen ble fremstillet ved å tilsette 0,075 g spermidinfosfat (USB) og 0,75 mL PMSF (fra 100 mM stamløsning fremstillet i etanol) til 150 mL TMS. TMS omfattet 10 mM Tris-acetat, 10 mM MgCU, 85,5752 g sukrose/liter og 0,33297 g CaCl2/liter, pH 7,5.

Etter resuspensjon i TMS/PMSF/spermidin-fosfatbuffer, ble 8,8 mL 10% NP-40 og 94,1 g sukrose tilsatt og blandingen anbragt i et silikonbehandlet glassbeger med en rørestav av rustfritt stål forbundet med en overhead-motor. Blandingen ble omrørt inntil cellene var fullstendig lysert (ca. 20 minutter). Blandingen ble deretter sentrifugert i 10 minutter ved 7500 rpm. (8950 x g) ved 4°C under bruk av en Beckman JS-13 swing-out rotor. Supematanten ble fjernet og nukleinpelleten resuspendert i TMS/PMSF/spermidin-fosfatbuffer og på nytt sentrifugert i 5 minutter ved 7500 rpm. (8950 x g) ved 4°C under bruk av en Beckman JS-13 swing-out rotor.

Supematanten ble fjernet og nukleinpelleten resuspendert i en buffer bestående av 50 mM Tris-acetat, 10 mM MgCl2, 10% glycerol, 0,1% NP-40,0,4M KGlu, 0,5 mM PMSF, pH 7,5, i et volum på 0,5 mL buffer per 10 g høstede celler. De resuspenderte kjernene ble deretter knust i en glasshomogenisator med ca. 50 stemplinger og deretter sentrifugert i 25 minutter ved 14.000 rpm. ved 4°C i en Eppendorf sentrifuge. Supematanten som inneholdt kjerneekstraktet, ble oppsamlet, nedfrosset i flytende nitrogen og oppbevart ved -80°C inntil anvendelse.

D. Rensing av telomerase

I dette eksempel ble kjerneekstrakter fremstillet som beskrevet i Del C, benyttet til å rense E. aediculatus telomerase. I henhold til denne rensemetode ble telomerase først anriket ved kromatografi på en Affi-Gel-heparinkolonne og deretter grundig renset ved affinitetsrensing med et antisense oligonukleotid. Siden templatregionen av telomerase RNA er tilgjengelig for hybridisering i telomerase RNP-partikkelen, ble det syntetisert et antisense oligonukleotid (dvs. «affinitets-oligonukleotidet») som var komplementært til denne templatregion, som et affinitetstilbud for telomerasen. En biotinrest ble inkludert i 5'-enden av oligonukleotidet for å immobilisere det til en avidinkolonne.

Etter binding av telomerasen til oligonukleotidet og omfattende vasking, ble telomerasen eluert ved bruk av et fortrengnings-oligonukleotid. Affinitets-oligonukleotidet innbefattet DNA-baser som ikke var komplementære med telomerase RNA 5' til den telomerase-spesifikke sekvens. Siden fortrengnings-oligonukleotidet var komplementært til affinitets-oligonukleotidet over hele dets lengde, var det mulig å danne en mer termodynamisk stabil dupleks enn telomerasen bundet til affinitets-oligonukleotidet. Tilsetning av fortrengnings-oligonukleotidet resulterte således i eluering av telomerase fra kolonnen.

Kjerneekstraktene fremstillet fra 45 liters kulturer ble nedfrosset inntil det var oppsamlet totalt 34 mL kjerneekstrakt. Dette tilsvarte 630 liter kultur (dvs. ca. 4 x IO<9> celler). Kjemeekstraktet ble fortynnet med en buffer til 410 mL, for å gi en sluttkonsentrasjon på

20 mM Tris-acetat, 1 mM MgCl2, 0,1 mM EDTA, 33 mM KGlu, 10% (vol/vol) glycerol,

1 mM ditiotreitol (DTT) og 0,5 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF), ved pH 7,5.

Det fortynnede kjerneekstrakt ble avsatt på en Affi-Gel-hepairngelkolonne (Bio-Rad), med et 230 mL skiktvolum og 5 cm diameter, ekvilibrert i den samme buffer og eluert med en 2 liter gradient fra 33 til 450 mM KGlu. Kolonnen ble holdt ved 4°C med en strømningshastighet på 1 kolonnevolum/time. Fraksjoner på 50 mL ble oppsamlet og testet på telomeraseaktivitet som beskrevet i Del E. Telomerase eluertes fra kolonnen ved ca. 170 mM KGlu. Fraksjoner som inneholdt telomerase (ca. 440 mL) ble slått sammen og justert til 20 mL Tris-acetat, 10 mM MgCl2,1 mM EDTA, 300 mM KGlu, 10% glycerol, 1 mM DTT og 1% Nonidet P-40. Denne bufferen ble betegnet «WB».

Til denne tilberedning ble det tilsatt 1,5 nmol av hver av to konkurrerende

DNA oligonukleotider (5'-TAGACCTGTTAGTGTACATTTGAATTGAAGC-3') og (5'-TAGACCTGTTAGGTTGGATTTGTGGCATCA-3'), 50 \ ig gjær RNA (Sigma) og 0,3 nmol biotinmerket telomerase-spesifikk oligonukleotid (5'-biotin-TAGACCTGTTA-(mreG)2-(rmeU)4-(rmeG)4-(rmeU)4-remG-3') per mL av forrådet. 2-O-metyl-ribo-nukleotidene av de telomerase-spesifikke oligonukleotidene var komplementære til telomerase RNA; templatregion; deoksyribonukleotidene var ikke komplementære. Inklusjonen av konkurrerende, ikke-spesifikke DNA-oligonukleotider øket renseeffektiviteten, idet virkningene av nukleinsyre-bindingsproteiner og andre komponenter i blandingen som enten ville binde til affinitetsoligonukleotidet eller fjerne telomerasen fra blandingen, var minimalisert.

Dette materialet ble deretter tilsatt til Ultralink immobilisert nøytravidin pluss (Pierce) kolonnemateriale i et volum på 60 uL suspensjon per mL forråd. Kolonnematerialet ble på forhånd blokkert to ganger i 15 minutter med et preparat av WB inneholdende 0,01% Nonidet P-40,0,5 mg BSA, 0,5 mg/mL lysozym, 0,05 mg/mL glykogen og 0,1 mg/mL gjær RNA. Blokkeringen ble foretatt ved 4°C under bruk av et roterende hjul for å blokkere kolonnematerialet grundig. Etter det første blokkeringstrinn, og før det andre blokkeringstrinn, ble kolonnematerialet sentrifugert ved 200 x g i 2 minutter for å pelletere matriksen.

Forråd/kolonne-blandingen ble inkubert i 8 minutter ved 30°C og deretter i ytterligere 2 timer ved 4°C på et roterende hjul (ca. 10 rpm.; Labindustries) for å muliggjøre binding. Forråd/kolonne-blandingen ble deretter sentrifugert 200 x g i 2 minutter, hvorpå supematanten som inneholdt ubundet materiale, ble fjernet. Forråd/kolonne-blandingen ble deretter vasket. Denne vaskeprosessen omfattet de trinn å rense forråd/kolonne-blandingen med WB ved 4°C, vaske blandingen i 15 minutter med WB ved 4°C, rense med WB, vaske i 5 minutter ved 30°C med WB inneholdende 0,6M KGlu og intet Nonidet P-40, vaske 5 minutter ved 25°C med WB og tilslutt rense på nytt med WB. Det gjenværende volum etter den siste vasking ble holdt lite for å oppnå forhold mellom buffer og kolonnemateriale på ca. 1:1.

Telomerase ble eluert fra kolonnematerialet ved tilsetning av 1 nmol fortrengende deoksyoligonukleotid (5'-CA4C4A4C2TA2CAG2TCTA-3') per mL kolonnemateriale og inkubering ved 25°C i 30 minutter. Materialet ble sentrifugert i 2 minutter ved 14.000 rpm. i en mikrosentrifuge (Eppendorf) og eluatet oppsamlet. Elueringen ble gjentatt to ganger til under bruk av frisk fortrengnings-oligonukleotid hver gang. Siden fortrengnings-oligonukleotidet var komplementært til affinitets-oligonukleotidet, dannet det et mer termodynamisk stabilt kompleks med affinitets-oligonukleotidet enn P-40. Tilsetning av fortrengnings-oligonukleotid til en affinitets-bundet telomerase resulterte således i effektiv eluering av telomerase under native betingelser. Ifølge analyse på en proteingel syntes telomerasen å være ca. 50% ren på dette trinn. Affinitetsrensingen av telomerase og eluering med en fortrengnings-oligonukleotid er vist i Figur 26 (henholdsvis A og B). I denne figur er 2'-0-metyl-sukkerne av affinitets-oligonukleotidet angitt med fet strek. De mørke og skyggelagte ovale formene i denne figur er ment å representere de grafiske protein-subenhetene.

Proteinkonsentrasjonene av ekstraktet og av materiale oppnådd etter Affi-Gel-heparin-kolonnekromatografi ble bestemt ved å benytte metoden ifølge Bradford (Bradford, Anal. Biochem., 72:248 [1976]) under bruk av BSA som standard. Bare en brøkdel av telomerase-preparatet ble renset videre på en glycerolgradient.

Sedimenterings-koeffisienten av telomerase ble bestemt ved glycerol-gradient-sentrifugering som beskrevet i Del I.

Tabell 5 nedenfor er en rensetabell for telomerase renset i henhold til metodene i dette eksempel. Telomerasen ble anriket 12 ganger med hensyn til kjerneekstrakter sammenlignet med helcelleekstrakter, med en gjenvinning på 80%; 85% telomerase ble solubilisert fra kjerner etter ekstraksjon.

E. Telomeraseaktivitet

På hvert trinn av telomeraserensingen, ble preparatet analysert ved tre separate tester, hvorav den ene var aktivitet som beskrevet i dette eksempel. Generelt ble telomerase-bestemmelsene foretatt i 40 u.L inneholdende 0,003-0,3 uL kjerneekstrakt, 50 mM Tris-Cl (pH 7,5), 50 mM KGlu, 10 mM MgCl2,1 mM DTT, 125 uM dTTP, 125 uM dGTP og ca.

0,2 pmol <5>'- P-merket oligonukleotidsubstrat (dvs. ca. 400.000 cpm.). Oligonukleotidprimere ble varmedenaturert før de ble tilsatt til reaksjonsblandingen. Reaksjonsblandingen ble tilberedt på is og inkubert i 30 minutter ved 25°C. Reaksjonene ble stanset ved tilsetning av 200 uL 10 mM Tris-Cl (pH 7,5), 15 mM EDTA, 0,6% SDS og 0,05 mg/mL proteinase K, og inkubert i minst 30 minutter ved 45°C. Etter etanolpresipitasjon ble disse produktene analysert på denaturerende 8% PAGE-gel på kjent måte (se f.eks. Sambrook et al, 1989).

F. Beregning av telomeraseaktivitet

I dette eksempel er beregningen av telomeraseaktivitet i løpet av renseprosessen beskrevet. Beregningen ble gjort ved å måle forlengelsen av oligonukleotidprimere i nærvær av dGTP og [ct-32P]dTTP. I korthet ble 1 \ xU 5,-(G4T4)2-3' oligonukleotid forlenget i en 20 uL reaksjonsblanding i nærvær av 2 jaL [a-<32>P]dTTP (10 mCi/mL, 400 Ci/mmol;

1 Ci=37 GBq) og 125 uM dGTP som beskrevet (Lingner é* al, Genes Develop., 8:1984

[1994]) og avsatt på en 8% PAGE sekvenseringsgel slik som beskrevet.

Resultatene av denne undersøkelse er vist i Figur 28.1 bane 1 er telomerase ikke tilstede (dvs. en negativ kontroll); bane 2, 5, 8 og 11 inneholdt 0,14 fmol telomerase; banene 3, 6, 9 og 12 inneholdt 0,42 fmol telomerase; og banene 4, 7, 10 og 13 inneholdt 1,3 fmol telomerase. Aktiviteten ble beregnet ved å benytte en Phosphorlmager (Molecular Dynamics) ved å benytte produsentens instruksjoner. Det ble under disse betingelsene bestemt at 1 fmol affinitetsrenset telomerase inkorporerte 21 fmol dTTP i løpet av 30 minutter.

Som vist i Figur 28 endret den spesifikke aktivitet av telomerase seg ikke vesentlig under renseprosessen. Affinitetsrenset telomerase var fullstendig aktiv. Det ble imidlertid ved høye konsentrasjoner fastslått en inhiberende aktivitet og at aktiviteten av råekstrakter ikke var lineær. I testen vist i Figur 28, ble råekstraktet derfor fortynnet 700-7000 ganger. Etter rensing ble den inhiberende aktivitet fjernet, og det ble ikke påvist noen inhiberende effekt i de rensede telomerasepreparatene selv ved høye enzymkonsentrasjoner.

G. Gelelektroforese og northern blott

Som angitt i Del E, ble preparatet i hvert trinn av telomeraserensingen analysert ved tre separate tester. Dette eksempel beskriver de gelelektroforese og blottings-prosedyrer som ble benyttet for å kvantifisere telomerase RNA som forekom i fraksjonene, og analysere integriteten av telomerase ribonukleoprotein-partikkelen.

i) Denaturerende gel og northern blott

I dette eksempel tjente syntetisk T7-transkribert telomerase RNA av kjent konsentrasjon som standard. Gjennom hele undersøkelsen ble RNA-komponenten benyttet som et mål på telomerase.

En konstruksjon for fag T7 RNA polymerase-transkripsjon av E. aediculatus telomerase RNA ble fremstillet ved å benytte PCR. Telomerase RNA-genet ble amplifisert med primere som hybridiserte til endene av genet. Primeren som hybridiserte ved 5'-enden kodet også for en hammerhode-ribozymsekvens for å frembringe den naturlig 5'-ende etter spaltning av den transkriberte RNA, en T7-promotersekvens og et EcoRl- sete for subkloning. Sekvensen av denne 5'-primeren var

3-primeren innbefattet et £arl-sete for terminering av transkripsjon ved den naturlig 3'-ende og et ÆamHI-sete for kloning. Sekvensen av denne 3'-primeren var

5'-CGGGGATCCTCTTCAAAAGATGAGAGGACAGCAAAC-3<\> PCR-amplifikasjonsproduktet ble spaltet med EcoRl og Bamffl og subklonet inn i de respektive seter av pUC19 (NEB) for å gi «pEaT7». Riktigheten av dette innskudd ble bekreftet ved DNA-sekvensering. T7-transkripsjon ble foretatt som beskrevet av Zaug et al., Biochemistry 33:14935 [1994] med iuirl-linearisert plasmid. RNA ble gelrenset og konsentrasjonen bestemt (en A260 på

1=40 u,g/mL). Denne RNA ble benyttet som en standard for å bestemme den telomerase RNA som forekom i forskjellige telomerasefremstiIlinger.

Hybridiseringssignalet var proporsjonalt med mengden telomerase RNA, og de avledede RNA-konsentrasjonene var i overensstemmelse med, men svakt høyere enn, de oppnådd ved nativ gelelektroforese. Sammenligning av mengden av hel telomerase RNA i helcelle RNA med seriefortynninger av kjente T7 RNA-transkripsjonskonsentrasjoner, tydet på at hver E. aediculatus- celle inneholdt ca. 300.000 telomerasemolekyler.

Visualiseringen av telomerasen skjedde ved Northern blott hybridisering til dens RNA-komponent ved å benytte beskrevne fremgangsmåter (Linger et al., Genes Develop., 8:1984

[1994]). I korthet ble RNA (0,5 u.g/bane eller mindre) separert på en 8% PAGE og elektro-blottet over på en Hybond-N-membran (Amersham) på kjent måte (se f.eks. Sambrook et al., 1989). Blottet ble hybridisert over natten i 10 mL 4x SSC, 10x Denhardts løsning, 0,1% SDS og 50 u.g/mL denaturert sildesperma DNA. Etter prehybridisering i 3 timer ble det tilsatt 2x IO<6> cpm probe/mL hybridiseringsløsning. Den tilfeldig merkede probe var et PCR-produkt som dekket hele telomerase RNA-genet. Blottet ble vasket med flere bufferskiftninger i 30 minutter i 2x SSC, 0,1% SDS og deretter vasket i 1 time i 0,1 x SSC og 0,1% SDS ved 45°C.

ii) Native gel og Northern blott

I dette forsøk ble det rensede telomerasepreparat analysert på native (dvs. ikke-denaturerende) gel av 3,5% polyakrylamid og 0,33% agarose, slik som kjent på området og beskrevet (Lamond & Sproat, [1994], supra). Telomerasen ko-migrerte tilnærmet med xylen-cyanol-farvestoffet.

Resultatene fra de native gel tydet på at telomerase ble opprettholdt som et RNP under renseprosessen. Figur 27 er et fotografi av et northern blott som viser mobiliteten av telomerasen i forskjellige fraksjoner på en ikke-denaturerende gel, så vel som in vitro transkribert telomerase. Bane 1 inneholdt 1,5 fmol telomerase RNA, bane 2 inneholdt 4,6 fmol telomerase RNA, bane 3 inneholdt 14 fmol telomerase RNA, bane 4 inneholdt 41 fmol telomerase RNA, bane 5 inneholdt kjerneekstrakt (42 fmol telomerase), bane 6 inneholdt Affi-Gel-heparinrenset telomerase (47 fmol telomerase), bane 7 inneholdt affinitets-renset telomerase (68 fmol) og bane 8 inneholdt glycerolgradient-renset telomerase (35 fmol).

Som vist i Figur 27 var telomerasen i kjerneekstrakter samlet i en RNP-partikkel som vandret langsommere enn ikke-samlet telomerase RNA. Mindre enn 1% fri RNA ble påvist ved denne metode. Et langsommere vandrende telomerase RNP-kompleks ble enkelte ganger også påvist i ekstrakter. Etter rensing på Affi-gel-heparinkolonnen endret telomerase RNP-partikkelen ikke sin mobilitet (Figur 27, bane 6). Etter affinitetsrensing øket imidlertid mobiliteten av RNA-partikkelen litt (Figur 27, bane 7), noe som kanskje indikerer at en protein-subenhet eller et fragment var gått tapt. På glycerolgradienter endret ikke størrelsen av den affinitetsrensede telomerase seg, men ca. 2% fri telomerase RNA kunne påvises (Figur 27, bane 8), hvilket tyder på at det hadde skjedd en liten grad av fraskilling av RNP-partikkelen.

H. Telomerase-proteinsammensetning

I dette eksempel beskrives analysen av den rensede telomerase-proteinsammensetning.

Glycerolgradientfraksjoner oppnådd som beskrevet i Del D, ble separert på en 4-20% polyakrylamidgel (Novex). Etter elektroforese ble gelen farvet med Coomassie brilliantblått.

Figur 29 viser et fotografi av gelen. Bane 1 og 2 inneholdt molekylmasse-markører (Pharmacia) som angitt på venstre side av gelen vist i Figur 29. Banene 3-5 inneholdt glycerolgradientfraksjonsforråd som angitt øverst på gelen (dvs. bane 3 inneholdt fraksjonene 9-14, bane 4 inneholdt fraksjonene 15-22 og bane 5 inneholdt fraksjonene 23-32). Bane 4 inneholdt forrådet med 1 pmol telomerase RNA. I banene 6-9 ble det kjørt BSA-standarder i konsentrasjoner angitt øverst i gelen i Figur 29 (dvs. bane 6 inneholdt 0,5 pmol BSA, bane 7 inneholdt 1,5 pmol BSA, bane 8 inneholdt 4,5 pmol BSA og bane 9 inneholdt 15 pmol BSA).

Som vist i Figur 29 ble polypeptider med molekylmasser på 120 og 43 kDa renset sammen med telomerasen. Polypeptidet på 43 kDa ble observert som en dublett. Det ble registrert at polypeptidet på ca. 43 kDa i bane 3 vandret annerledes enn dubletten i bane 4, og det kan være ubeslektet protein. 120 kDa- og 43 kDa-dubletten antok begge farve med Coomassie brilliantblått i et nivå på ca. 1 pmol ut fra sammenligning med BSA-standarder. Siden denne fraksjon inneholdt 1 pmol telomerase RNA, som i sin helhet var samlet i en RNP-partikkel (se Figur 27, bane 8), synes det å være to polypeptid-subenheter som er støkiometriske med telomerase RNA. Det er imidlertid også mulig at de to proteinene på ca.

43 kDA er separate enzym-subenheter.

Affinitetsrenset telomerase som ikke var underkastet fraksjonering på en glycerolgradient, inneholdt ytterligere polypeptider med tilsynelatende molekylmasser på henholdsvis 35 og 37 kDa. Sistnevnte fraksjon ble anslått å være minst 50% ren. De 35 kDa og 37 kDa polypeptidene som forekom i det affinitetsrensede materialet ble ikke reproduserbart separert ved glycerolgradient-sentrifugering. Disse polypeptidene kan være forurensninger siden de ikke var synlige i preparater som inneholdt alle aktiviteter.

I. Sedimenterings-koeffisient

Sedimenterings-koeffisienten for telomerase ble bestemt ved glycerolgradient-sentrifugering. I dette eksempel ble kjerneekstrakt og affinitetsrenset telomerase fraksjonert på 15-40% glycerolgradienter inneholdende 20 mM Tris-acetat, med 1 mM MgCtø, 0,1 mM EDTA, 300 mM KGlu og 1 mM DTT, ved pH 7,5. Glycerolgradienter ble helt over i 5 mL (13x51 mm) rør og sentrifugert ved å benytte en SW55Ti-rotor (Beckman) ved 55.000 rpm i 14 timer ved 4°C.

Markørproteiner ble undersøkt i en parallell gradient og hadde en sedimenterings-koeffisient på 7,6 S for alkohol-dehydrogenase (ADH), 113 S for katalase, 17,3 S for apoferritin og 19,3 S for thyroglobulin. Telomerasetoppen ble identifisert ved nativ gelelektroforese av gradientrfaksjoner, etterfulgt av blott-hybirdisering til dens RNA-komponent.

Figur 30 er et diagram som viser sedimenterings-koeffisienten for telomerase. Som vist i denne figur ko-sedimenterte affinitetsrenset telomerase med katalase ved 11,5 S, mens

telomerase i kjerneekstrakter sedimenterte litt hurtigere, med en topp på ca. 12,5 S. Overens-

. stemmende med mobiliteten av enzymet i native gel synes derfor renset telomerase å ha tapt et proteolytisk fragment eller en løst assosiert subenhet.

Den beregnede molekylmasse for telomerase gir, om det antas at den består av én

120 kDa protein-subenhet, én 43 kDa subenhet og én RNA-subenhet på 66 kDa, totalt 229 kDa. Dette er i nær overensstemmelse med katalases molekylmasse på 232 kDa. Sedimenterings-koeffisienten er imidlertid en funksjon av molekylmassen så vel som av det partielle spesifikke volum og molekylets friksjons-koeffisient, som begge er ukjent for Euplotes telomerase RNP.

J. Substratutnyttelse

I dette eksempel ble substratkravene til Euplotes telomerase undersøkt. En enkel modell for DNA-ende replikasjon forutsier at telomerase etter semikonservativ DNA-replikasjon, forlenger dobbeltkjedede, butt-endede DNA-molekyler. I en variant av denne modell frembringes en enkeltkjedet 3'-ende av en helicase eller nuklease etter replikasjon. Denne 3'-ende benyttes deretter av telomerase for binding og forlengelse.

For å bestemme hvorvidt telomerase er i stand til å forlenge butt-endede molekyler, ble det syntetisert hårnåler med telomeriske repetisjoner anbragt i deres 3'-ender. Disse primer-substratene ble gelrenset, 5'-ende-merket med polynukleotidkinase, oppvarmet ved 0,4 \ iM til 80°C i 5 minutter og deretter langsomt avkjølt til romtemperatur i en varmeblokk for å muliggjøre renaturering og heliksdannelse av hårnålen. Substratmobilitet på en ikke-denaturerende gel tydet på at det forelå en meget effektiv hårnålsdannelse, sammenlignet med dimerisering.

Tester ble foretatt med umerket 125 \ iM dGTP, 125 uM dTTP og 0,02 uM 5'-ende-merket primer (5'-<32>P-merket oligonukleotidsubstrat) i 10 f^L reaksjons-blandinger som inneholdt 20 mM Tris-acetat med 10 mM MgCl2,50 mM KGlu og 1 mM DTT, ved pH 7,5. Disse blandingene ble inkubert ved 25°C i 30 minutter. Reaksjonene ble stanset ved tilsetning av formamid-ladningsbuffer (dvs. TBE, formamid, bromtymolblått og cyanol, Sambrook, 1989, supra).

Primere ble inkubert uten telomerase («-«), med 5,9 fmol affinitetsrenset telomerase eller med 17,6 fmol affinitetsrenset telomerase («+++»). Affinitetsrenset telomerase benyttet for denne test, ble dialysert med en membran som hadde en molekylær begrensning på 100 kDa, for å fjerne fortrengnings-oligonukleotidet. Reaksjonsprodukter ble separert på en 8% PAGE/ureagel inneholdende 36% formamid, for å denaturere hårnålene. Sekvensene for primerne benyttet i denne undersøkelse, så vel som deres bane-tilordninger, er vist i Tabell 6.

Gel-resultatene er vist i Figur 31. Banene 1-15 inneholdt substrater med telomere repetisjoner som ender med fire G-rester. Bane 16-30 inneholdt substrater med telomere repetisjoner som ender med fire T-rester. Den antatte tilpasning på telomerase RNA-templatet er angitt i Figur 32. Det ble antatt at primersettene hybriserer til to meget forskjellige posisjoner i templatet vist i Figur 32 (dvs. henholdsvis rute A og rute B). Dette kan ha påvirket deres bindings- og/eller forlengelsesgrad.

Figur 33 viser en svakere eksponering av banene 25-30 i Figur 31. Den svakere eksponering av Figur 33 ble tatt for å muliggjøre visualisering av de adderte nukleotidene og posisjonene for opphold i forlengede produkter. Prosent substrat forlenget for den tredje bane i hvert sett, ble kvantifisert på en Phosforlmager, som angitt nederst i Figur 31.

Substrateffektivitetene for disse hårnålene ble sammenlignet med dobbeltkjedede telomer-lignende substrater med overheng av varierende lengder. Et modellsubstrat som endte med fire G-rester (se bane 1-15 i Figur 31) ble ikke forlenget når det var butt-endet (se bane 1-3). En viss svak forlengelse ble imidlertid observert med en overheng-lengde på to baser, mens forlengelsen ble effektiv når overhenget var på minst 4 baselengder. Telomerasen virket på lignende måte med et dobbeltkjedet substrat som endte med fire T-rester, med krav til et 6-basers overheng for høyeffektiv forlengelse. I Figur 31 representerer de svake båndene nedenfor de primerne i bane 10-15 som er uavhengige av telomerase, kortere oligonukleotider i primerpreparatene.

Den svakere eksponering av banene 25-30 i Figur 33 viser en stige av forlengede produkter, med de mørkeste bånd overensstemmende med den antatte 5'-grense av templatet (som beskrevet av Lingner et al., Genes Develop., 8:1984 [1994]. Rikeligheten av produkter som tilsvarer andre posisjoner i templatet tyder på at pausering og/eller dissosiasjon inntrer på andre steder enn setet for translokalisering, med den rensede telomerase.

Som vist i Figur 31 var dobbeltkjedede, butt-endede oligonukleotider ikke substrater for telomerase. For å bestemme hvorvidt disse molekylene ville binde til telomerase ble det foretatt et konkurranseforsøk. I dette forsøk ble 2 nM 5'-ende-merket substrat med sekvensen

(G4T4)2, eller et hårnålsubstrat med et overheng på 6 baser, forlenget med 0,125 nM telomerase (Figur 31, bane 25-27). Selv om de samme umerkede oligonukleotidsubstratene konkurrerte effektivt om forlengelse med merket substrat, ble det ikke observert noen aktivitetsreduksjon når de dobbeltkjedede butt-endede håmål-oligonukleotidene ble benyttet som konkurrenter, selv i nærvær av hårnåler i 100 gangers overskudd.

Disse resultatene tyder på at dobbeltkjedede, butt-endede oligonukleotider ikke kan binde til telomerase i de konsentrasjoner og betingelser som er testet i dette eksempel. Derimot fordres en enkeltkjedet 3'-ende for binding. Det er sannsynlig at denne 3'-ende fordres for å bas ep are med telomerase RNA-templatet.

K. Kloning & sekvensering av 123 kDa polypeptidet

I dette eksempel beskrives kloningen av 123 kDa polypeptidet av Euplotes-telomerasen (dvs. 123 kDa protein-subenheten). I undersøkelsen ble et indre fragment av telomerasegenet amplifisert ved PCR med oligonukleotidprimere konstruert for å stemme overens med peptidsekvenser som ble oppnådd fra det rensede polypeptid oppnådd i Del D, ovenfor. Polypeptidsekvensen ble bestemt ved å benytte den nanoES-tandem massespektro-skopimetode som er kjent på området og beskrevet av Calvio et al., RNA 1:724-733 [1995]. Oligonukleotidprimerne benyttet i dette eksempel hadde følgende sekvenser, med degenererte posisjoner vist i parenteser.

En 50 u.L reaksjon inneholdt 0,2 mM dNTP, 0,15 ug E. aediculatus kromosomal DNA, 0,5 jiL Taq (Boehringer-Mannheim), 0,8 \ i% av hver primer og lx reaksjonsbuffer (Boehringer-Mannheim). Reaksjonsblandingen ble inkubert i en Thermocycler (Perkin-Elmer) ved å benytte følgende betingelser - 5 minutter ved 95°C, etterfulgt av 30 runder på 1 minutt ved 94°C, 1 minutt ved 52°C og 2 minutter ved 72°C. Reaksjonen ble fullført ved en 10 minutters inkubering ved 72°C.

Det ble fremstillet et genomisk DNA-bibliotek fra den kromosomale E. aediculatus DNA ved å klone butt-endet DNA inn i Smal-setet av pCR-Script plasmidvektor (Stratagene)

Figur 14. Dette bibliotek ble underkastet screening ved kolonihybirdisering, med det radioaktivt merkede gelrensede PCR-produkt. Plasmid DNA av positive kloner ble fremstillet og sekvensert ved hjelp av dideoksymetoden (Sanger et al., Proe. Nati. Acad. Sei., 74:5463

[1977] eller manuelt gjennom bruk av en automatisert sekvenseirngsmaskin (ABI). DNA-sekvensen av genet som koder for dette polypeptid, er vist i Figur 13. Startkodonet i denne sekvens, utledet fra DNA-sekvensen, er lokalisert i nukleotidposisjon 101, og den åpne leseramme ender i posisjon 3193. Den genetiske kode fra Euplotes adskiller seg fra andre organismer ved at «UGA» kodonet koder for en cysteinrest. Aminosyresekvensen av polypeptidet utledet fra DNA-sekvensen, er vist i Figur 14 og forutsetter at ingen uvanlige aminosyrer er innskutt under translasjon og at det ikke forekommer noen post-translasjonell modifikasjon.

L. Kloning & sekvensering av 43 kDa polypeptidet

I dette eksempel beskrives kloningen av 43 kDa polypeptidet av telomerase (dvs. 43 kDa protein-subenheten). I undersøkelsen ble et indre fragment av det tilsvarende telomerasegen amplifisert ved PCR med oligonukleotidprimere konstruert for å stemme overens med peptidsekvenser som ble oppnådd fra det rensede polypeptid oppnådd i Del D, ovenfor. Polypeptidsekvensen ble bestemt ved å benytte den nanoES-tandem massespektro-skopimetode som er kjent på området og beskrevet av Calvio et al., supra. Oligonukleotidprimeme benyttet i dette eksempel, hadde de følgende sekvenser:

og

5'-(T/G/A)GC(T/G/A)GT(C/T)TC(T/C)TG(G/A)TC(G/A)TT(G/A)TA-3'. I denne sekvens indikerer «N» nærvær av en hvilken som helst av de fire nukleotidene (dvs. A, T, G eller C).

PCR ble foretatt som beskrevet i Del K.

Et genomisk DNA-bibliotek ble fremstillet og underkastet screening som beskrevet i Del K. DNA-sekvensen av genet som koder for dette polypeptid, er vist i Figur 34. Tre potensielle leserammer er vist for sekvensen, som vist i Figur 35. For å tydeliggjøre er aminosyresekvensen angitt nedenfor nukleotidsekvensen i alle tre leserammene. Disse leserammene er betegnet «a», «b» og «c». Et mulig startkodon er kodet i nukleotidposisjon 84 i leseramme «c». Den kodende region kunne ende i posisjon 1501 i leseramme «b». Tidlige stoppkodoner, i denne figur angitt med stjerner, forekommer i alle tre leserammer mellom nukleotidposisjonene 337-350.

«La-domenet» er angitt med fete typer. Lenger nedstrøms synes proteinsekvensen å kodes av andre leserammer siden ingen av de tre rammene avbrytes av stoppkodoner. Dessuten kodes peptidsekvenser fira renset protein i alle tre rammer. Dette gen synes derfor å inneholde intervenerende sekvenser, eller alternativt er RNA rettet (editert). Andre muligheter er ribosomal ramme-forskyvning eller sekvensfeil. Homologien med La-proteinsekvensen er imidlertid fortsatt av betydelig interesse. Nok en gang, i Euplotes koder «UGA»-kodonet for en cysteinrest.

M. Aminosyre og nukleinsyre sammenligninger

I dette eksempel ble det foretatt sammenligninger mellom forskjellige rapporterte sekvenser og sekvensene av de 123 kDa og 43 kDa telomerase-subenhetspolypeptidene.

i) Sammenligninger med 123 kDa E. aediculatus telomerase-subenheten

Aminosyresekvensen av 123 kDa Euplotes aediculatus polypeptidet ble sammenlignet med sekvensen av 80 kDa telomerase protein-subenheten av Tetrahymena thermophila (GenBank tilgangsnummer U25641) for å undersøke deres likhet. Nukleotidsekvensen anskaffet fra GenBank, som koder for dette protein, er vist i Figur 42. Aminosyresekvensen av dette protein som oppnådd fra GenBank, er vist i Figur 43. Sekvenssammenligningen mellom 123 kDa E. aediculatus og 80 kDa T. thermophila er vist i Figur 36.1 denne figur er E. aediculatus- sekvensen den øvre sekvens, mens T. thermophila- sekvensen er den nedre sekvens. Den observerte identitet ble bestemt til å være ca. 19%, mens den prosentuelle likhet var ca. 45%, verdier som ligner de som ville bli registrert for en hvilken som helst vilkårlig proteinsekvens. I Figur 36-39 er identiteter angitt ved loddrette streker, mens enkeltprikker mellom sekvensene indikerer aminosyrer med en viss likhet, og dobbeltprikker mellom sekvensene indikerer mer like aminosyrer.

Aminosyresekvensen av 123 kDa Euplotes aediculatus polypeptidet ble også sammenlignet med sekvensen av 95 kDa telomerase protein-subenheten av Tetrahymena thermophila (GenBank tilgangsnummer U25642), for å undersøke deres likhet. Den nukleotidsekvens oppnådd fra GenBank, som koder for dette protein, er vist i Figur 44. Aminosyresekvensen av dette protein, som oppnådd fra GenBank, er vist i Figur 45. Denne sekvenssammenligningen er vist i Figur 37.1 denne figur er E. aediculatus- sekvensen den øvre sekvens, mens T. thermophila- sekvensen er den nedre sekvens. Den observerte identitet ble bestemt til å være ca. 20%, mens den prosentuelle likhet var ca. 43%, verdier som ligner de som ville bli registrert for en hvilken som helst vilkårlig proteinsekvens.

Det er av betydning at aminosyresekvensen av 123 kDa E. aediculatus polypeptidet inneholder de fem motivene som er karakteristiske for reverse transkriptaser. Polypeptidet på 123 kDa ble også sammenlignet med polymerase-domenene av forskjellige reverse transkriptaser. Figur 40 viser tilpasningen av 123 kDa polypeptidet med den antatte gjærhomolog (L8543.12 eller ESTp). Aminosyresekvensen av L8543.12 oppnådd fra GenBank, er vist i Figur 46.

Fire motiver (A, B, C og D) ble tatt med i denne sammenligning. I denne Figur 40 er sterkt konserverte rester angitt med hvite bokstaver på sort bakgrunn. Rester av E. aediculatus- sekvenser som er konservert i de andre sekvenser, er angitt med fete typer; «h» angir nærværet av en hydrofob aminosyre. Tallene anbragt mellom motivenes aminosyrerester indikerer lengden av mellomrom i sekvensene. For eksempel viser «100» mellom motivene A og B et 100 aminosyrers mellomrom i sekvensen mellom motivene.

Som nevnt ovenfor identifiserte GenBank-søk et gjærprotein (GenBank tilgangsnummer U20618) og gen L8543.12 (Est2) som inneholder eller koder for en aminosyresekvens som viser en viss homologi med E. aediculatus 123 kDa telomerase-subenheten. På grunnlag av observasjonene om at begge proteinene inneholder reverse transkriptasemotiver i deres C-terminale region, deler begge proteinene likhet i regioner utenfor det reverse transkriptasemotiv. Proteinene har lignende basitet (pl=10,l for E. aediculatus og pl=10,0 for gjæren), og begge proteinene er store (123 kDa for E. aediculatus og 103 kDa for gjæren), og disse sekvensene omfatter deres respektive telomerasers katalytiske kjerne. På basis av denne observasjon av homologi i to så fylogenetisk adskilte organismer som E. aediculatus og gjær, kan det tenkes at human telomerase kunne inneholde et protein som har de samme karakteristika (dvs. reverse transkriptasemotiver, er basisk og stort [>100 kDa]).

ii) Sammenligninger med 43 kDa E. aediculatus telomerase-subenheten

Aminosyresekvensen av «La-domenet» av 43 kDa Euplotes aediculatus- po\ ypeptidet ble sammenlignet med sekvensen av 95 kDa telomerase protein-subenheten av Tetrahymena thermophila (beskrevet ovenfor) for å undersøke deres likhet. Denne sekvenssammenligningen er vist i Figur 38, hvor T. thermophila- sékvensen er den nedre sekvens. Den observerte identitet ble bestemt å være ca. 23%, mens den prosentuelle likhet var ca. 46%, verdier som tilsvarer det som ville bli observert for en hvilken som helst vilkårlig proteinsekvens.

Aminosyresekvensen av «La-domenet» av 43 kDa Euplotes aediculatus- po\ ypeptidel ble sammenlignet med sekvensen av 80 kDa telomerase protein-subenheten av Tetrahymena thermophila (beskrevet ovenfor) for å undersøke deres likhet. Denne sekvenssammenligningen er vist i Figur 39, hvor E. aediculatus- sekvensen er den øvre sekvens, mens T. thermophila- sekvensen er den nedre sekvens. Den observerte identitet ble bestemt å være ca. 26%, mens den prosentuelle likhet var ca. 49%, verdier som tilsvarer det som ville bli observert for en hvilken som helst vilkårlig proteinsekvens.

Aminosyressekvensen av et domene av 34 kDa E. aediculatus polypeptidet ble også sammenlignet med La-proteiner fra forskjellige andre organismer. Disse sammenligningene er vist i Figur 41.1 denne figur er sterkt konserverte rester angitt med hvite bokstaver på sort bakgrunn. Rester av E. aediculatus- sékvenser som er konservert i den andre sekvens, er angitt med fete typer.

N. Identifikasjon av telomerase protein-subenheter i en annen organisme

I dette eksempel ble de sekvenser som ble identifisert i foregående eksempler, benyttet til å identifisere telomerase protein-subenheter i Oxytricha trifallax, et ciliat som er meget fjernt beslektet med E. aediculatus. Primere ble valgt på basis av den konserverte region av E. aediculatus 123 kDa polypeptidet som omfattet motivene for det reverse transkriptase-domenet. Egnede primere ble syntetisert og benyttet i en PCR-reaksjon med total DNA fra Oxytricha. Oxytricha DNA ble fremstillet i henhold til kjente metoder. PCR-produktene ble deretter klonet og sekvensert ved å benytte kjente metoder.

Oligonukleotidsekvensene benyttet som primere var som følger:

og

5'-(G/A/T)GT(G/A/T)ATNA(G/A)NA(G/A)(G/A)TA(G/A)TC(G/A)TC-3'). Degenererte posisjoner er vist i parenteser, med de alternative baser vist i parentesene. «N» representerer en hvilken som helst av de fire nukleotidene.

Ved PCR-reaksjonen inneholdt en 50 u.L reaksjon 0,2 mL dNTP, 0,3 ug Oxytricha

trifallax kromosomal DNA, 1 u.L ra^-polymerase (Boehringer-Mannheim), 2 mikromolar av hver primer, lx reaksjonsbuffer (Boehringer-Mannheim). Reaksjonsblandingen ble inkubert i en Thermocycler (Perkin-Elmer) under følgende betingelser: 5 minutter ved 95°C, 30 runder bestående av 1 minutt ved 94°C, 1 minutt ved 53°C og 1 minutt ved 72°C, etterfulgt av en 10 minutters inkubering ved 72°C. PCR-produktet ble gelrenset og sekvensert ved hjelp av dideoksymetoden (f.eks. Sangere/ al., Proe. Nati. Acad. Sei. 74,5463-5467 (1977).

Den deduserte aminosyresekvensen av PCR-produktet ble bestemt og sammenlignet med E. aediculatus- sékvemen. Figur 47 viser tilpasningen av disse sekvensene, med O. trifallax- sekvensen vist i den øvre rad og E. aediculatus- sekvensen vist i den nedre rad. Som det fremgår av denne figuren er det en betydelig del homologi mellom O. trifallax polypeptidsekvensen identifisert i dette eksempel og E. aediculatus polypeptidsekvensen. Det er således klart at de sekvenser som er identifisert heri, er nyttige til identifisering av homologe telomerase protein-subenheter i andre eukaryote organismer. Utviklingen av foreliggende oppfinnelse har faktisk identifisert homologe telomerase-sekvenser i mange ulike arter som her er beskrevet.

O. Identifisering av Tetrahymena telomerasesekvenser

I dette eksempel ble det produsert en Tetrahymena- klon som har homologi tilfelles med .Eup/ø/es-sekvensene og med EST2p.

Dette forsøk gjør bruk av PCR med degenererte oligonukleotidprimere rettet mot konserverte motiver for å identifisere homologiregioner mellom Tetrahymena-, Euplotes- og EST2p-sekvenser. PCR-metoden benyttet i dette eksempel er en ny metode utviklet for spesifikt å amplifisere skjeldne DNA-sekvenser fra komplekse blandinger. Ved denne metode unngås problemet med amplifikasjon av DNA-produkter med den samme PCR-primer i begge ender (dvs. enkeltprimerprodukter) som ofte påstøtes i PCR-kloningsmetoder. Disse enkelt-primerproduktene produserer uønsket bakgrunn og kan ofte tilsløre amplifikasjonen bg påvisningen av det ønskede to-primerproduktet. Metoden benyttet i dette forsøk selekterer fortrinnsvis for to-primerprodukter. Særlig er den ene primeren biotinylert og den andre ikke. Etter flere runder PCR-amplifikasjon renses produktene ved å benytte magnetiske streptavidinkuler, og to primerprodukter elueres spesifikt under bruk av varmedenaturering. Denne metode finner anvendelse i andre situasjoner enn forsøkene beskrevet i dette eksempel. Metoden kan faktisk benyttes i anvendelser hvor det er ønskelig å spesifikt amplifisere skjeldne DNA-sekvenser, inklusivt de innledende trinn av kloningsmetoder, så som 5'- og 3'-RACE og enhver metode som benytter degenererte primere ved PCR.

En første PCR-omgang ble foretatt ved å benytte Te/ra/iymeiia-templat makronukleært DNA isolert ved å benytte kjente metoder, og 24-mer foroverprimeren med sekvensen

betegnet «K231», tilsvarende FFYXTE-regionen, og 23-mer revers primeren med sekvensen 5'-CCAGATAT(GATC)A(TGA)(GATC)A(AG)(AG)AA(AG)TC(AG)TC-3', betegnet

«K220», tilsvarende DDFL(FLL)I-regionen. Denne PCR-reaksjon inneholdt 2,5 nL DNA

(50 ng), 4 nL av hver primer (20 yM), 3 nL 10x PCR-buffer, 3 nLlOx dNTP, 2 uL Mg,

0,3 nL Taq og 11,2 nL dt^O. Blandingen ble cyklisert i 8 runder ved 94°C i 45 sekunder, 37°C i 45 sekunder og 72°C i 1 minutt.

Denne PCR-reaksjon ble bundet til 200 nL magnetiske streptavidinkuler, vasket med 200 nL TE, resuspendert i 20 nL dH20 og deretter varmedenaturert ved koking ved 100°C i 2 minutter. Kulene ble trukket ned og eluatet uttatt. Deretter ble 2,5 mL av dette eluat amplifisert på nytt ved å benytte ovennevnte betingelser med det unntak at 0,3 nL av ct-<32>P dATP ble inkludert og PCR foretatt i 33 runder. Denne reaksjonen ble foretatt på en 5% denaturerende polyakrylamidgel og det aktuelle området skåret ut fra gelen. Disse produktene ble deretter amplifisert på nytt i ytterligere 34 runder under ovennevnte betingelser, med unntak av at en hybridiseringstemperatur på 42°C ble benyttet.

En andre PCR ble foretatt under bruk av et Tetrahymena makronukleært DNA-templat isolert ved å benytte kjente metoder, og den 23-mer forover primeren med sekvensen

betegnet «K228», tilsvarende regionen R(LI)(LI)PKK, og en revers primer med sekvensen

betegnet «K224», tilsvarende CYDSIPR-regionen. Denne PCR-reaksjon inneholdt 2,5 ^iL DNA (50 ng), 4 uL av hver primer (20 uM), 3 \ iL 10x PCR-buffer, 3 uL 10x dNTP, 2 \ iL Mg, 0,3 uL a-<32>P dATP, 0,3 uL Taq og 10,9 \ ih dH20. Denne reaksjonsblanding ble undersøkt på en 5% denaturerende polyakrylamidgel, og den riktige region snittet ut fra gelen. Disse produktene ble deretter amplifisert på nytt i ytterligere 34 runder under ovennevnte betingelser, med unntak av at en hybridiseringstemperatur på 42°C ble benyttet.

Ti uL av reaksjonsproduktet fra første omgang ble bundet til magnetiske streptavidin-belagte kuler i 200 |aL TE. Kulene ble vasket med 200 uL TE og deretter resuspendert i 20 dPLiO, varmedenaturert og eluatet fjernet. Reaksjonsproduktet fra omgang 2 ble deretter tilsatt til kulene og fortynnet med 30 uL 0,5x SSC. Blandingen ble oppvarmet fra 94°C til 50°C, eluatet ble uttatt og kulene vasket tre ganger i 0,5x SSC ved 55°C. Kulene ble deretter resuspendert i 20 uL dH20, varmedenaturert og eluatet uttatt, betegnet «runde 1 eluat» og oppbevart.

For å isolere Tetrahymena- båndet ble runde 1 eluatet amplifisert på nytt med forover primeren K228 og revers primer K227 med sekvensen

5'-CAATTCTC(AG)TA(AG)CA(GATC)(CG)(TA)(CT)TT(AGT)AT(GA)TC-3'tilsvarende DLKSCYD-regionen. PCR-rekasjonene ble foretatt som beskrevet ovenfor. Reaksjonsproduktene ble analysert på en 5% polyakrylamidgel, og båndet tilsvarende de ca. 295 nukleotidene ble snittet ut fra gelen og sekvensert.

Klonen betegnet 168-3 ble sekvensert. DNA-sekvensen (inklusivt primersekvenser) ble funnet å være:

Ytterligere sekvenser av dette gen ble oppnådd ved PCR under bruk av en unik primer konstruert for å stemme overens med sekvensen fra 168-3 («K297» med sekvensen 5'-GAGTGACATAATATACGTGA-3'ogK231 (FFYXTE)-primer. Sekvensen av fragmentet oppnådd ved denne reaksjon, sammen med 168-3, er som følger (uten primer-sekvensene):

Aminosyresekvensen tilsvarende dette DNA-fragment ble funnet å være:

Denne aminosyresekvens ble deretter tilpasset i forhold til andre telomerasegener (EST2p, og Euplotes). Tilpasningen er vist i Figur 53. En konsensussekvens er også vist i denne figuren.

P. Identifisering av Schizosaccharomyces pombe telomerasesekvenser

I dette eksempel ble tezl-sekvensen av S. pombe identifisert som en homolog av E. aediculatus pl23 og S. cerevisiae Est2p.

Figur 55 gir en generell sammenfatning av disse forsøkene. I denne figuren viser den øvre del (Fig. 55A) forholdet mellom to overlappende genomiske kloner og den 5825 bp del som ble sekvensert. Regionen angitt ved «tezl+ » er den proteinkodende region, med de flankerende sekvenser som også er angitt, boksen under 5825 bp-regionen er et ca. 2 kb i/i'w<ÆII-fragment som ble benyttet for å fremstille tezl-opprivnings-konstruksjonen, slik som beskrevet nedenfor.

Den nedre halvdel av Figur 55 (Fig. 55B) er et skjematisk «nærbilde» av den samme DNA-region. Sekvensene betegnet «original PCR» er det opprinnelige degenererte PCR-fragment som ble fremstillet med et degenerert oligonukleotid primerpar konstruert på basis av £wp/ø/es-sekvensmotiv 4 (B') og motiv 5 (C), som beskrevet.

i) PCR med degenererte primere

PCR ved bruk av degenererte primere, ble benyttet for å finne homologen av E. aediculatus pl23 i S. pombe. Figur 56 viser sekvensene av de degenererte primerne (betegnet «poly 4» og «poly 1») benyttet for reaksjonen. PCR-omgangene ble foretatt ved å benytte samme buffer som beskrevet i tidligere eksempler (se f.eks. Del K, ovenfor) med en 5 minutters innledningstid ved 94°C, etterfulgt av 30 runder ved 94°C i 30 sekunder, 50°C i 45 sekunder og 72°C i 30 sekunder, og 7 minutter ved 72°C, etterfulgt av oppbevaring ved 4°C. PCR-omganger ble foretatt ved å benytte varierte betingelser (dvs. forskjellige konsentrasjoner av S. pombe DNA og MgCb-konsentrasjoner). PCR-produktene ble analysert på agarosegel og farvet med etidiumbromid som beskrevet ovenfor. Flere PCR resulterte i produksjon av tre bånd (betegnet «T», «M» og «B»). Disse båndene ble reamplifisert og analysert på gel underbruk av de samme betingelsene som ovenfor. Fire bånd ble observert etter denne reamplifisering («T», «Ml», «M2» og «B»), som vist i Figur 57. Disse fire båndene ble deretter reamplifisert ved å benytte de samme betingelsene som beskrevet ovenfor. Det tredje båndet ovenfra i banen i Figur 57, ble fastslått å inneholde den korrekte sekvens for et telomeraseprotein. PCR-produktet betegnet M2, viste seg å oppvise en rimelig overensstemmelse med andre telomeraseproteiner, som antydet i Figur 58.1 tillegg til de viste tilpasninger, viser denne figuren også den aktuelle sekvens av tezl. I denne figur angir stjernene rester felles for alle fire sekvenser ( Oxytricha «Ot»; E. aediculatus «Ea_pl23»; S. cerevisiae «Sc_pl03» og M2), mens sirklene (dvs. prikker) angir lignende aminosyrerester.

ii) 3' RT PCR

For å oppnå ytterligere sekvensinformasjon, ble 3' og 5' RT PCR foretatt på de telomerasekandidater som er angitt i Figur 58. Figur 59 er et skjema over den anvendte 3' RT PCR-strategi. Først ble cDNA fremstillet fra mRNA ved å benytte oligonukleotid-primeren «Qr» (5'-CCA GTG AGC AGA GTG ACG AGG ACT CGA GCT CAA GCT TTT TTT TTT TTT TT-3'), deretter benytte denne cDNA som templat for PCR med «Q0» (5'-CCA GTG AGC AGA GTG ACG-3') og en primer konstruert basert på den originale degenererte PCR-reaksjon (dvs. «M2-T» med sekvensen 5'-G TGT CAT TTC TAT ATG GAA GAT TTG ATT GAT G-3'). Den andre PCR-reaksjon (dvs. nestet PCR) med «Qj»

(5'-GAG GAC TCG AGC TCA AGC-3') og en annen PCR-primer konstruert med en sekvens avledet fra den opprinnelige degenererte PCR-reaksjon eller «M2-T2» (5'-AC CTA TCG TTT ACG AAA AAG AAA GGA TCA GTG-3'). De buffere som ble benyttet for denne PCR var de samme som beskrevet ovenfor med amplifikasjon foretatt ved å begynne med en økning opp til 94°C i 5 minutter, etterfulgt av 30 runder ved 94°C i 30 sekunder, 55°C i 30 sekunder og 72°C i 3 minutter, etterfulgt av 7 minutter ved 72°C. Reaksjonsproduktene ble oppbevart ved 4°C inntil bruk.

iii) Screening av genomiske og cDNA-bibliotek

Etter å ha oppnådd denne ytterligere sekvensinformasjon, ble flere genomiske og cDNA-bibliotek underkastet screening for å identifisere eventuelle bibliotek som inneholdt dette telomerase-kandidatgen. Måten som ble benyttet og likeledes bibliotekene og resultatene er vist i Figur 60.1 denne figur viser rute A de bibliotek som ble testet i dette forsøk; rute B viser de anvendte regioner; rute C og D viser dot-blott-hybridiseringsresultatene oppnådd med disse bibliotekene. Positive bibliotek ble deretter underkastet screening ved koloni-hybridisering for å oppnå genomisk og cDNA-versjon av tezl -genet. I dette forsøk var ca.

3x IO<4> kolonier fra det HindlR genomiske bibliotek gjenstand for screening, og det ble identifisert 6 positive kloner (ca. 0,01%). DNA ble deretter fremstillet fra to uavhengige kloner (A5 og B2). Figur 61 viser resultatene oppnådd med de //zn<ÆLI-kuttede A5 og B2 positive genomiske klonene.

I tillegg ble det benyttet cDNA REP-bibliotek. Ca. 3 x IO<5> kolonier ble underkastet screening og 5 positive kloner ble identifisert (0,002%). DNA ble fremstillet fra tre uavhengige kloner (2-3,4-1 og 5-20). I senere forsøk ble det bestemt at klonene 2-3 og 5-20 inneholdt identiske innskudd.

iv) 5' RT PCR

Siden cDNA-versjonen av genproduktet ikke var fullstendig til dette punkt, ble det foretatt 5' RT PCR for å oppnå en klon av full lengde. Strategien er vist skjematisk i Figur 62. I dette forsøk ble cDNA fremstillet ved å benytte DNA oligonukleotidprimer «M2-B»

(5'-CAC TGA TCC TTT CTT TTT CGT AAA CGA TAG GT-3') og «M2-B2» (5'-C ATC AAT CAA ATC TTC CAT ATA GAA ATG ACA-3'), konstruert fra kjente regioner av det tidligere identifiserte tezl. En oligonukleotid-linker PCR Adapt Sfil med en fosforylert 5<*->ende («P") (P-GGG CCG.TGT TGG CCT AGT TCT CTG CTC-3') ble deretter ligert til 3'-enden av denne cDNA, og denne konstruksjonen ble benyttet som templat for nestet PCR. I den første PCR-runde ble PCR Adapt AFI og M2-B benyttet som primere, mens PCR Adapt

SfiLT (5-GAG GAG GAG AAG AGC AGA GAA CTA GGC CAA CAC GCC CC-3') og

M2-B2 ble benyttet som primere i den andre runden. Nestet PCR ble benyttet for å øke reaksjonsspesifisiteten.

v) Sekvenstilpasninger

Etter at sekvensen av tezl var identifisert, ble den sammenlignet med tidligere beskrevne sekvenser. Figur 63 viser tilpasningen av RT-domener fra telomerase katalytiske subenheter av 5. pombe («S.p. Tezlp»), S. cerevisiae («S.c. Est2p"), og E. aediculatus pl23 («E.a.pl23»). I denne figur indikerer «h» hydrofobe rester, mens «p" indikerer små polare rester og «c» indikerer ladede rester. Aminosyrerestene angitt over tilpasningen viser et kjent konsensus RT-motiv av Y. Xiong & T.H. Eickbush (Y. Xiong & T.H. Eickbush, EMBO J., 9:3353-3362 [1990]). Stjernene indikerer rester som er konservert for alle tre proteinene. «Motiv O» er her og i Figur 63 identifisert som et spesifikt motiv for denne telomerase-subenhet og som i alminnelighet ikke finnes i reverse transkriptaser. Det er derfor verdifullt ved identifisering av andre aminosyresekvenser som telomerase katalytiske subenheter.

Figur 64 viser tilpasningen av hele sekvenser fra Euplotes («Ea_pl23»), S. cerevisiae («Sc_Est2p"), og S. pombe («Sp_Tezlp"). I Del A indikerer de skyggelagte områdene rester som to sekvenser har tilfelles. I Del B angir de skyggelagte områdene rester som alle tre sekvenser har tilfelles.

vi) Genetisk opplivning av tezl

I dette eksempel ble virkningen av opplivning av tezl undersøkt. Siden telomerase er involvert i telomer-vedlikehold, var en hypotese at dersom tezl faktisk var en telomerase-komponent, ville opprivning av tezl gradvis forårsake telomer-forkortelse.

I disse forsøkene ble homolog rekombinasjon benyttet for å rive opp tøz7-genet spesifikt i S. pombe. Denne fremgangsmåten er skjematisk illustrert i Figur 65. Som angitt i

Figur 65 ble villtype tezl erstattet med et fragment som inneholdt ura4- eller £,£L/2-markøren.

Opplivningen av tezl-genet ble bekreftet ved PCR (Figur 66) og et Southern-blott ble foretatt for å kontrollere telomer-lengde. Figur 67 viser Southern-blott resultater for dette forsøk. Siden et j4/?a/-restriksjonsenzymsete forekommer i umiddelbar nærhet til telomersekvensen i S. pombe, muliggjør Apal- kutting av S. pombe genomiske DNA-preparater, analyse av telomer-lengde. DNA fra S. pombe ble derfor kuttet med Apal og oppslutnings-produktene analysert på en agarosegel og probeundersøkt med en telomerisk sekvensspesifikk probe for å bestemme hvorvidt telomerene av opprevet S. pombe- celler var forkortet. Resultatene er vist i Figur 67. Ut fra disse resultatene var det klart at opplivningen av tezl-genet forårsaket en forkortelse av telomerene.

Q. Kloning og karakterisering av humant telomeraseprotein og cDNA

I dette eksempel ble nukleinsyre- og aminosyresekvensinformasjon for human telomerase bestemt. Det ble først identifisert homologe delsekvenser gjennom et BLAST-søk ved å benytte Euplotes 123 kDa peptidet og nukleinsyresekvenser samt Schizosaccharomyces-protein og tilsvarende cDNA ( tezl) sekvenser. Humansekvensene (også omtalt som «hTCPl.l») ble identifisert fra en partiell cDNA-klon (klon 712562). Sekvenser fra denne klon ble bragt på linje med sekvensene bestemt som beskrevet i tidligere eksempler.

Figur 1 viser sekvenstilpasningen av Euplotes («pl23»), Schizosaccharomyces («tezl»), Est2p (dvs. S. cerevjsiae-proteinet kodet av Est2 nukleinsyresekvensen og her også omtalt som «L8543.12») og den humane homolog som ble identifisert i dette sammen-ligningssøket. Figur 51 viser aminosyresekvensene av tezl, mens Figur 52 viser DNA-sekvensen av tezl. I Figur 52 er introner og andre ikke-kodende regioner vist med små bokstaver, mens eksonene (dvs. kodende regioner) er vist i kapiteler.

Som vist i figurene er det blant disse proteiner regioner som er sterkt konservert. For eksempel viser Figur 1 at det er identiske regioner i «Motiv 0», «Motiv 1», «Motiv 2» og «Motiv 3». Identiske aminosyrer er angitt med en stjerne (<*>), mens lignende aminosyrerester er angitt med en sirkel (•). Dette tyder på at det innenfor telomerasemotivene er regioner som er konservert blant et bredt utvalg eukaryoter, som strekker seg fra gjær til ciliater til mennesket. Det kan godt tenkes at ytterligere organismer likeledes vil inneholde slike konserverte sekvensregioner. Figur 49 viser den partielle aminosyresekvens av de humane telomerasemotivene, mens Figur 50 viser den tilsvarende DNA-sekvens.

Sanger dideoksy-sekvensering og andre kjente metoder ble benyttet for å oppnå fullstendig sekvensinformasjon om klon 712562. Enkelte av primerne benyttet ved sekvenseringen er vist i Tabell 7. Disse primerne ble konstruert for å hybridisere til klonen, på basis av sekvenskomplementaritet enten til plasmidskjelettsekvensen eller sekvensen av det humane cDNA-innskudd i klonen.

Ut fra disse forsøkene ble det fastslått at EcoRI-Notl-innskuddet i klon 712562 bare inneholder en partiell åpen leseramme for det humane telomeraseprotein, selv om det kan kode for et aktivt fragment av dette protein. Den åpne leseramme i klonen koder for et ca. 63 kD protein. Sekvensen av den lengste identifiserte åpne leseramme er vist i Figur 68. Den åpne leseramme (ORF) begynner ved ATG-kodonet med «met» angitt på figuren. Poly A-halen i 3'-enden av sekvensen er også vist. Figur 69 viser en forsøksvis preliminær tilpasning av telomerase reverse transkriptaseproteiner fra den humane sekvens (human Telomerase Core Protein 1, «Hs TCP1»), E. aediculatus pl23 («Ep pl23»), S. pombe tezl («Sp Tezl»),

S. cerevisiae EST2 («Sc Est2») og konsensussekvensen. I denne figur er det angitt diverse motiver.

For å oppnå en full lengdes klon ble et cDNA-bibliotek probeundersøkt under bruk av 5'-RACE for å oppnå kloner som koder for deler av de tidligere uklonede regioner. I disse forsøkene ble RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends; se f.eks. M.A. Frohman, «RACE: Rapid Amplification of cDNA Ends», i Innis et al., (red.) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications [1990], s. 28-38; og Frohman et al,. Proe. Nati. Acad. Sei., 85:8998-9002 [ 1988]) for å utvikle materiale for sekvensanalyse. Fire slike kloner ble utviklet og benyttet til å gi ytterligere 5'-sekvensinformasjon (pFWRP5, 6,19 og 20).

I tillegg ble humane cDNA-bibliotek (innskutt i lambda) probeundersøkt med klonens EcoRI-Notl-fragment. En lambda-klon, betegnet «lambda 25-1.1» (ATCC tilgangsnummer 209024) ble fastslått å inneholde komplementære sekvenser. Figur 75 viser et restriksjonskart av denne lambda-klon. Det humane cDNA-innskudd fra denne klon ble subklonet som et ÆcoRI-restriksjonsfragment inn i £cøRI-setet til kommersielt tilgjengelig fagemid pBluescriptIISK+ (Stratagene) for å frembringe plasmidet «pGRNl 21», som ble deponert hos ATCC (ATCC tilgangsnummer 209016). Preliminære resultater tydet på at plasmidet pGRN121 inneholdt hele den åpne leseramme- (ORF) sekvens som koder for det humane telomeraseprotein.

cDNA-innskuddet av plasmid pGRN121 ble sekvensert ved å benytte kjente teknikker.

Figur 70 gir et restriksjonssete og funksjonskart av plasmid pGRN121 identifisert på basis av dette preliminære arbeid. Resultatene av denne preliminære sekvensanalyse er vist i Figur 71. Ut fra denne analyse, og som vist i Figur 70, ble et antatt startsete for den kodende region identifisert ca. 50 nukleotider fra ÆcøRI-setet (lokalisert i posisjon 707), og lokaliseringen av de telomerase-spesifikke motivene «FFYVTE», «PKP», «AYD», «QG» og «DD» ble identifisert, i tillegg til et antatt stoppsete ved nukleotid nr. 3571 (se Figur 72, som viser denne DNA og tilsvarende aminosyresekvenser for de åpne leserammer i sekvensen «a», «b» og «c»). Som følge av den foreløpige natur av dette tidligere sekvenseringsarbeid, ble imidlertid leserammene for de ulike motivene ikke funnet å være på linje.

Ytterligere analyser foretatt på pGRN121 tydet på at plasmidet inneholdt betydelige deler fra 5'-enden av den kodende sekvens som ikke forekom på klon 712562. Dessuten ble pGRN121 funnet å inneholde en kodende sekvensvariant som innbefattet et innskudd på ca. 182 nukleotider. Dette innskuddet viste seg å mangle i klonen. Som med E. aediculatus-sekvensene kan slike varianter testes i funksjonstester, som f.eks. telomerasetester, for å påvise nærværet av funksjonell telomerase i en prøve.

Videre sekvenanalyser viste at cDNA-sekvensen av pGRN121 ga en sammenhengende åpen leseramme som koder for et protein med en molekylvekt på ca. 127.000 dalton med 1132 aminosyrer som vist i Figur 74. Et forbedret kart av pGRN121 basert på denne analyse, er vist i Figur 73. Resultatene av ytterligere sekvensanalyse av hTRT cDNA er presentert i Figur 16

(SEKV. LD. NR:1).

EKSEMPEL 2

KORRELASJON MELLOM hTRT-RIKELIGHET OG CELLE-UDØDELIGHET

Den relative rikelighet av hTRT mRNA ble fastslått i seks telomerase-negative dødelige cellestammer og i seks telomerase-positive udødelige cellelinjer (Figur 5). Likevektsnivået av hTRT mRNA var signifikant øket i udødelige cellelinjer som tidligere var vist å ha aktiv telomerase. Lavere nivåer av hTRT mRNA ble påvist i enkelte telomerase-negative cellestammer.

RT-PCR for hTRT, hTR, TP1 (telomerase-assosiert protein relatert til Tetrahymena p80 [Harrington et al, 1997, Science 275:973; Nakayama et al, 1997, Cell 88:875]) og GAPDH (for å normalisere for like mengder av RNA-templat) ble foretatt på RNA fra følgende celler: (1) humane føtale lungefibroblaster, GFL, (2) humane føtale hudfibroblaster, GFS, (3) voksen prostata-stromale fibroblaster, 31 YO, (4) humane føtale kne-synovial-fibroblaster, HSF, (5) neonatale forhudsfibroblaster, BJ, (6) humane føtale lungefibroblaster, (LMR 90) og udødelige cellelinjer: (7) melanom LOX LMVI, (8) leukemi U251, (9) NCI h23 lungekarsinom, (10) kolonadenokarsinom SW620, (11) brysttumor, MCF7, (12) 293 adenovirus El transformert human embryonisk nyrecellelinje.

hTRT-nukleinsyre ble amplifisert fra cDNA ved å benytte oligonukleotid-primeme LT5 og LT6 (Tabell 2) i totalt 31 runder (94°C, 45 sekunder, 60°C, 45 sekunder, 72°C, 90 sekunder). GAPDH ble amplifisert ved å benytte primerne Kl36

og

Kl37 ^'-ATGATCTTGAGGCTGTTGTCATA) i totalt 16 runder (94°C, 45 sekunder, 55°C, 45 sekunder, 72°C, 90 sekunder). hTR ble amplifisert ved å benytte primerne F3b

(5 '-TCTAACCCTAACTGAGAAGGGCGTAG) og

R3c (5'-GTTTGCTCTAGAATGAACGGTGGAAG) i totalt 22 runder (94°C, 45 sekunder, 55°C, 45 sekunder, 72°C, 90 sekunder). TP1 mRNA ble amplifisert ved å benytte primerne TP1.1 og TP1.2 i 28 runder (samme cyklisering som hTRT). Reaksjonsproduktene ble separert på en 8% polyakrylamidgel, farvet med SYBR Green (Molacular Probes) og visualisert ved skanning på en Storm 860 (Molecular Dynamics). Resultatene, vist i Figur 5, viser at hTRT mRNA-nivåer korrelerer direkte med telomeraseaktivitetsnivåer i undersøkte celler.

EKSEMPEL 3

KARAKTERISERING AV EN hTRT-INTRONISK SEKVENS

Et antatt intron ble først identifisert ved PCR-amplifikasjon av humant genomisk DNA, som beskrevet i dette eksempel, og deretter bekreftet ved sekvensering av den genomiske klon XGOS (se Eksempel 4). PCR-amplifikasjon ble foretatt ved å benytte foroverprimeren TCP1.57, individuelt paret med revers primerne TCP1.46, TCP1.48, TCP1.50, TCP1.52, TCP1.54, TCP1.56 og TCP1.58 (se Tabell 2). Produktene fra genomisk DNA av TCP 1.57/TCP 1.46, TCP1.48, TCP1.50, TCP1.52, TCP1.54 eller TCP1.56 amplifikasjonene var ca. 100 basepar større enn produktene av pGRN121 amplifikasjonene. TCP1.57/TCP1.58 amplifikasjonen var den samme både på genomisk og pGNR121 DNA. Dette tydet på at den genomiske DNA inneholdt en insersjon mellom setene for TCP 1.58 og TCP1.50. PCR-produktene av TCP 1.57/TCP 1.50 og TCP 1.57/TCP 1.52 ble sekvensert direkte uten subkloning ved å benytte primerne TCP1.39, TCP1.57 og TCP1.49.

Som vist nedenfor er den 104-basers introniske sekvens (SEKV. LD. NR:7) innskutt i hTRT mRNA (vist med fete typer) ved den overgang som tilsvarer basene 274 og 275 i

Figur 16:

Den angitte «/»indikerer spleiseovergangene. Sekvensen viser god overensstemmelse med konsensus 5'- og 3'-spIeisesetesekvenser som er typiske for humane introner.

Dette intron inneholder motiver som er karakteristiske for et topoisomerase II spaltningssete og et NFicB-bindingssete (se Figur 21). Disse motivene er av interesse tildels fordi ekspresjon av topoisomerase II er oppregulert i de fleste tumorer. Det virker ved å relaksere DNA ved kutting og gjenoppvikling av DNA og derved øke ekspresjon av bestemte gener. Inhibitorer av topoisomerase II har vært vist å virke som anti-tumormidler. Når det gjelder NFkB, spiller denne transkripsjons-faktor en rolle ved regulering av telomerase under terminal differensiering, så som ved tidlig represjon av telomerase under utvikling, og er således et annet mål for terapeutiske inngrep for å regulere telomeraseaktivitet i celler.

EKSEMPEL 4

KLONING AV LAMBDA FAG G0>5 OG KARAKTERISERING AV hTRT

GENOMISKE SEKVENSER

A. Lambda G<D5

Et humant genomisk DNA-bibliotek ble underkastet screening ved PCR og hybridisering for å identifisere en genomisk klon inneholdende hTRT RNA-kodende sekvenser. Biblioteket var et humant fibroblast-genomisk bibliotek fremstillet ved å benytte DNA fra W138 lungefibroblastceller (Stratagene, Kat. nr. 946204). I dette bibliotek ligeres partielle Sau3AI-fragmenter inn i Xhol-setet av Lambda FLX®n vektor (Stratagene) med en innskuddsstørrelse på 9-22 kb.

Det genomiske bibliotek ble oppdelt i forråd på 150.000 fag hver og hvert forråd underkastet screening ved nestet PCR (ytre primerpar TCP1.52 & TCP1.57; indre par TCP1.49 & TCP1.50, se Tabell 1). Disse primerparene spenner over et antatt intron (se Eksempel 3, ovenfor) i den genomiske DNA av hTRT og sikret at PCR-produktene var avledet fra en genomisk kilde og ikke fra kontaminering av hTRT cDNA-klonen. Positive forråd ble videre underinndelt inntil det ble oppnådd et forråd på 2000 fag. Dette forrådet ble utplatet i lav tetthet og underkastet screening ved hybridisering med et DNA-fragment som innbefattet baseparene 1552-2108 i Figur 16 (restriksjonsseter henholdsvis SphI og EcoRV).

To positive kloner ble isolert og underkastet ny screening via nestet PCR som beskrevet ovenfor. Begge klonene var ifølge PCR positive. En av klonene (X.G05) ble kuttet med Noti, og viste en innskuddsstørrelse på ca. 20 kb. Påfølgende kartlegging (se nedenfor) tydet på at innskuddstørrelsen var 15 kb og at fag GOS inneholdt ca. 13 kb DNA oppstrøms fra cDNA-sekvensens startsted.

Fag GOS ble kartlagt ved restriksjonsenzymkutting og DNA-sekvensering. Det resulterende kart er vist i Figur 7. Fag DNA ble kuttet med Ncol og fragmentene klonet inn i pBBS167. De resulterende subkloner ble screenet ved PCR for å identifisere de som inneholdt en sekvens tilsvarende 5'-regionen av hTRT cDNA. En subklon (pGRN140) inneholdende et 9 kb Ncøl-fragment (med hTRT-gensekvens og 4-5 kb Lambda vektorsekvens) ble delvis sekvensert for å bestemme orienteringen av innskuddet. pGRN140 ble kuttet ved bruk av Sali for å fjerne lambda-vektorsekvenser, hvilket resulterte i pGRN144. pGRN144 ble deretter sekvensert. Resultatene av sekvenseringen er vist i Figur 21. 5'-enden av hTRT mRNA tilsvarer base 2441 i Figur 21. Som angitt i Figur 7, er to Alu-sekvenselementer lokalisert 1700 basepar oppstrøms for hTRT cDNA 5'-enden og utgjør en sannsynlig oppstrøms-begrensning for promoterregionen av hTRT. Sekvensen viser også et intron posisjonert ved basene 4173 i Figur 21, 3' til intronet beskrevet i Eksempel 3, ovenfor.

B. Ytterligere genomiske kloner

I tillegg til den ovenfor beskrevne genomiske klon tilveiebringes to Pl bakteriofag-kloner og én human BAC-klon som illustrative utførelsesformer av oppfinnelsen. Pl innskudd er vanligvis 75-100 kb, og BAC-innskudd er vanligvis over 100 kb.

Pl-klonene (DMPC-HFF#1-477(F6)-GS# 15371 ogDMPC-HEF#l-1103(H6)-GS#15372) ble oppnådd ved PCR-screening av et humant Pl-bibliotek avledet fra humane forhudfibroblastceller {Shepherd et al, 1994, PNAS USA 91:2629) ved bruk av primere TCP 1.12 og UTR2 som amplifiserer 3'-enden av hTRT. Disse klonene var begge negative (amplifiserte ikke) med primere som amplifiserer 5'-enden av hTRT.

Den humane BAC-klon (326 E 20) ble oppnådd med en hybridiserings-screening av et BAC humant genomisk bibliotek under bruk av et 1143 bp Sphl/Xmnl-fragment av pGRN121 (Figur 16; basene 1552-2695) som omfatter RT-motivregionen. Klonen antas å inkludere 5'-enden av genet. De hTRT-genomiske klonene i dette eksempel antas å omfatte hele hTRT-genet.

EKSEMPEL 5

KROMOSOMAL LOKALISERING AV hTRT-GENET

hTRT-genet ble lokalisert til kromosom 5p ved bestrålingshybridkartlegging (Boehnke et al, 1991, Am. J. Hum. Genet. 49:1174; Walter et al, 1994, Nature Genet. 7:22) ved å benytte det middels oppløsende Stanford G3 utvalg av 83 RH-kloner av menneskets hele genom (frembragt ved Stanford Human Genome Center). En human lymfoblastoidcellelinje (donor; rM) ble eksponert for 10.000 rad røntgenbestråling og ble deretter fusjonert med ikke- . bestrålte hamster-resipientceller (A3). Det ble isolert 83 uavhengige somatiske cellehybrid-kloner som hver representerer en fusjon mellom en bestrålt donorcelle og en hamster-resipientcelle. Utvalget av G3 DNA ble benyttet for rekvirere markører i det aktuelle området så vel som til å fastslå avstanden mellom disse markørene.

Primeren benyttet for RH-kartlegging var TCP1.12 og UTR2 med amplifikasjons-betingelsene: 94°C, 45 sekunder, 55°C, 45 sekunder, 72°C, 45 sekunder, i 45 runder under bruk av Boehringer Mannheim Taq-buffer og Perkin Eimer Taq. De 83 utvalgene ble amplifisert uavhengig og 14 (17%) ga positiv skår for hTRT (gjennom tilsynekomst av et 346 bp bånd). Amplifikasjonsresultatene ble oversendt Stanford RH-server, som deretter ga kartlokalisering, 5p, og den næmeste markør, STS D5S678.

Ved å forespørre Genethon genome mapping web site, identifiserte kartlokaliseringen et YAC som inneholder STS markøren D5S678: CEPH YAC 780_C_3 størrelse: 390-660 kb. Dette YAC inneholdt også kromosom 17 markører. Dette resultat tydet på at hTRT-genet er på kromosom 5, nær telomerenden. Det forekommer også øket kopiantall av 5p i en rekke tumorer. Cri-du-chat-syndromet har også vært kartlagt til delesjoner i denne region.

EKSEMEL 6

DESIGN OG KONSTRUKSJON AV VEKTORER FOR EKSPRESJON AV hTRT-PROTEINER OG POLYNUKLEOTIDER

Ekspresjon av hTRT i bakterier

Den etterfølgende del av dette eksempel gir detaljer angående konstruksjon av hTRT-uttrykkende bakterielle og eukaryote celleekspresjonsvektorer for å produsere store mengder full lengdes biologisk aktivt hTRT. Utvikling av biologisk aktivt hTRT-protein på denne måte er egnet for telomerase rekonstitueirngstester, testing med henblikk på telomeraseaktivitetsmodulatorer, analyse av aktiviteten av nylig isolerte arter av hTRT, identifisering og isolering av forbindelser som spesifikt assosierer med hTRT, analyse av aktiviteten av et hTRT-variantprotein som er blitt stedsspesifikt mutert og som et immunogen, bare for å nevne noen få eksempler.

pThioHis A/hTRT bakteriell ekspresjonsvektor

For å produsere store mengder full lengdes hTRT ble den bakterielle ekspresjonsvektoren pThioHis A (Invitrogen, San Diego, CA) valgt som et ekspresjonssystem. Det hTRT-kodende innskudd inkluderer nukleotidene 707 til 4776 av hTRT-innskuddet i plasmidet pGRN121. Denne nukleotidsekvens inkluderer den fullstendig kodende sekvens for hTRT-proteinet.

Denne ekspresjonsvektor ifølge oppfinnelsen er konstruert for induserbar ekspresjon i bakterier. Vektoren kan induseres til i E. coli å uttrykke høye nivåer av et fusjonsprotein sammensatt av en avspaltbar, His-merket thioredoxin-del og det full lengdes hTRT-protein. Anvendelsen av ekspresjonssystemet var i det vesentlige overensstemmende med produsentens instruksjoner. Aminosyresekvensen av det fusjonsprotein som kodes av den resulterende vektor ifølge oppfinnelsen, er vist nedenfor, hvor (-<*->) angir et enterokinase-spaltningssete:

pGEX-2TK med hTRT-nukleotider 3272 til 4177 av pGRN121

Denne konstruksjon ifølge oppfinnelsen benyttes til å produsere fusjonsprotein, f.eks. med det formål å danne polyklonale og monoklonale antistoffer mot hTRT-protein. Fragmenter av hTRT kan også benyttes for andre formål som f.eks. å modulere telomerase-aktivitet, for eksempel som en dominant-negativ mutant eller forhindre assosiasjonen av en telomerasekomponent med andre proteiner eller nukleinsyrer.

For å produsere store mengder av et hTRT-proteinfragment ble E. coli ekspresjonsvektoren pGEX-2TK (Pharmacia Biotech, Piscataway, N.J.) valgt, og benyttet i det vesentlige i henhold til produsentens instruksjoner for å fremstille en ekspresjonsvektor ifølge oppfinnelsen. Den resulterende konstruksjon inneholdt et innskudd avledet fra nukleotidene 3272 til 4177 av hTRT-innskuddet i plasmidet pGNR121. Vektoren styrer ekspresjon i E. coli av høye nivåer av et fusjonsprotein sammensatt av glutation-S-transferasesekvens (understreket nedenfor), trombinspaltningssekvens (dobbelt understreket), gjenkjenningssekvens for hjertemuskel-proteinkinase (kursivert), rester innført ved kloning i hakeparenteser ([GSVTK]) og hTRT-proteinfiragment (fete typer) som vist nedenfor:

Når dette fusjonsprotein ble uttrykt, dannet det uløselige aggregater. Det ble behandlet generelt som ovenfor beskrevet i avsnittet med tittelen rensing av proteiner fra inklusjonslegemer. Nærmere bestemt ble induserte celler suspendert i PBS (20 mM natriumfosfat, pH 7,4,150 mM NaCl) og opprevet ved ultralydbehandling. NP-40 ble tilsatt til 0,1%, og blandingen ble inkubert i 30 minutter ved 4°C under forsiktig blanding. Det uløselige materialet ble oppsamlet ved sentrifugering ved 25.000 g i 30 minutter ved 4°C. Det uløselige materialet ble vasket én gang i 4 M urea i PBS, oppsamlet ved sentrifugering og deretter vasket igjen i PBS. Den uttatte pellet ble anslått å inneholde mer enn 75% fusjonsprotein. Dette materialet ble tørket i et hurtigvakuum, deretter suspendert i adjuvans for injeksjon i mus og kaniner for utvikling av antistoffer. Separasjon av det rekombinante protein fra glutation-S-transferasedelen oppnås ved stedsspesifikk proteolyse under bruk av trombin i henhold til produsentens instruksjoner.

pGEX-2TK med hTRT-nukleotider 2426 til 3274 av pGRN121 med HIS-8-merking

For å produsere store mengder av et fragment av hTRT ble det fremstillet en annen E. coli ekspresjonsvektor pGEX-2TK-konstruksjon. Denne konstruksjon inneholder et innskudd avledet fra nukleotidene 2426 til 3274 av hTRT-innskuddet i plasmidet pGRN121 og en sekvens som koder for 8 påfølgende histidinrester (HIS-8-merking). For å skyte inn HIS-8-merkingen ble pGEX-2TK-vektoren med hTRT-nukleotidene 2426 til 3274 av pGRN121 linearisert med BamHI. Dette åpnet plasmidet ved overgangen mellom GST-trombin-hjertemuskel-proteinkinasen og den hTRT-kodende sekvens. Et dobbeltkjedet oligonukleotid med BamHI-kompatible ender ble ligert til det lineariserte plasmid, hvilket resulterte i i-ramme innføring av åtte histidinrester oppstrøms for hTRT-sekvensen.

Vektoren styrer ekspresjon i E. coli av høye nivåer av et fusjonsprotein sammensatt av glutation-S-transferasesekvens (understreket), trombin-spaltningssekvens (dobbelt understreket), gjenkjenningssekvens for hjertemuskel-proteinkinase (kursivert); et sett på tre og et sett fem rester innført ved kloning er angitt i hakeparenteser ([GSV] og [GSVTK]); åtte påfølgende histidiner (også dobbelt understreket) og hTRT-proteinfragment (fete typer):

Begge pGEX-2TK-vektorene ifølge oppfinnelsen kan benyttes til å frembringe fusjonsprotein med det formål å utvikle polyklonale og monoklonale antistoffer mot hTRT-protein. I tillegg kan dette fusjonsprotein benyttes til å affinitetsrense antistoffer utviklet mot hTRT-peptider som inngår i fusjonsproteinet. Separasjon av det rekombinante protein fra glutation-S-transferasedelen kan oppnås ved stedsspesifikk proteolyse ved å benytte trombin i henhold til produsentens instruksjoner.

pGEX-2TK med hTRT-nukleotidene 2426 til 3274 av pGRN121, ingen IIIS-8-merking

For å produsere store mengder av et fragment av hTRT ble det fremstillet en annen E. coli ekspresjonsvektor pGEX-2TK-konstruksjon.

Denne konstruksjon inneholder et innskudd avledet fra nukleotidene 2426 til 3274 av hTRT-innskuddet i plasmidet pGRN121, men uten HIS-8-merkingen av konstruksjonen beskrevet ovenfor. Vektoren styrer ekspresjon i E. coli av høye nivåer av et fusjonsprotein sammensatt av glutation-S-transferasesekvens (understreket), trombinspaltningssekvens (dobbelt understreket), gjenkjenningssekvens for hjertemuskel-proteinkinase (kursivert), rester innført ved kloning i hakeparenteser ([GSVTK]) og hTRT-proteinfragment (fete typer):

pGEX-2TK med hTRT-nukleotidene 1625 til 2458 av pGRN121

For å fremstille store mengder av et fragment av hTRT-protein, ble det fremstillet en annen E. coli ekspresjonsvektor pGEX-2TK-konstruksjon.

Denne konstruksjon inneholder et innskudd avledet fra nukleotidene 1625 til 2458 av hTRT-innskuddet i plasmidet pGRN121. Vektoren styrer ekspresjon i E. coli av høye nivåer av et fusjonsprotein sammensatt av glutation-S-transferase (understreket), trombinspaltningssekvens (dobbelt understreket), gjenkjenningssekvens for hjertemuskel-proteinkinase (kursivert), rester innført ved kloning i hakeparenteser ([GSVTK]) og hTRT-proteinfragment (fete typer):

pGEX-2TK med hTRT-nukleotidene 782 til 1636 av pGRN121

Denne konstruksjon inneholder et innskudd avledet fra nukleotidene 782 til 1636 av hTRT-innskuddet i plasmidet pGRN121. Vektoren styrer ekspresjon i E. coli av høye nivåer av et fusjonsprotein sammensatt av glutation-S-transferase (understreket), trombinspaltningssekvens (dobbelt understreket), gjenkjenningssekvens for hjertemuskel-proteinkinase (kursivert), rester innført ved kloning i hakeparenteser ([GSVTK]) og hTRT-proteinfragment (fete typer):

pT7FLhTRT med hTRT cDNA som mangler 5' ikke-kodende sekvens

Som beskrevet ovenfor tilveiebringer oppfinnelsen i én utførelsesform, et hTRT som er stedsspesifikt modifisert for å lette kloning inn i bakterie-, pattedyr-, gjær- og insekt-ekspresjonsvektorer uten noen 5'-utranslatert hTRT-sekvens. Under enkelte omstendigheter muliggjør minimalisering av mengden av ikke-proteinkodende sekvens, forbedret protein-roduksjon (utbytte) og øket mRNA-stabilitet. I denne utførelsesform av oppfinnelsen ble hTRT-genets 5' ikke-kodende region fjernet før kloning inn i en bakteriell ekspresjonsvektor.

Dette ble foretatt ved å konstruere et ytterligere restriksjonsendonukleasested umiddelbart oppstrøms (5') for startkodonet (ATG) av den hTRT-kodende sekvens (Figur 16). Opprettelsen av et restriksjonssete umiddelbart 5' for proteinets kodende region, muliggjør effektiv produksjon av et stort utvalg vektorer som koder for fusjonsproteiner, så som fusjonsproteiner omfattende merkinger og peptid TAGs for immunpåvisning og rensing.

Nærmere bestemt ble oligonukleotidet

S^CCGGCCACCCCCCATATGCCGCGCGCTCCCO', benyttet som beskrevet ovenfor for å modifisere hTRT cDNA nukleotidene 779 til 781 av hTRT cDNA (Figur 16) fra GCG til CAT. Disse tre nukleotidene er de siste nukleotidene før ATG startkodonet slik at de ikke modifiserer proteinsekvensen. Sekvensendringen resulterer i dannelse av et unikt Ndel-restriksjonssete i hTRT cDNA. Enkeltkjedet hTRT DNA ble benyttet som en DNA-kilde for den stedsrettede mutagenese. Det resulterende plasmid ble sekvensert for å bekrefte at mutagenesen var vellykket.

Denne modifikasjon tillot konstruksjonen av følgende plasmid ifølge oppfinnelsen, betegnet pT7FLhTRT. Den stedsspesifikt modifiserte hTRT-sekvens (addisjon av Ndel-restriksjonssetet) ble kuttet med Ndel og Noti (og fylt ut med Klenow-enzym for å frembringe butt-endet DNA) for å frembringe et hTRT-kodende nukleinsyrefragment. Fragmentet ble deretter klonet inn i et pSL3418-plasmid som tidligere var restriksjonskuttet med Ndel og Smal (som også gir butte ender). pSL3418 er et modifisert pAED4-plasmid som en FLAG-sekvens (Immunex Corp., Seattle, WA) og en enterokinasesekvens skytes inn i umiddelbart oppstrøms for det ovennevnte Ndel-sete. Dette plasmid, betegnet pT7FLhTR muliggjør ekspresjon av full lengdes hTRT (med en FLAG-merking i dets 5'-ende) i en E. coli stamme som uttrykker T7 RNA-polymerase.

Plasmider med hTRT cDNA som mangler 3' ikke-kodende sekvens

Som diskutert ovenfor tilveiebringer oppfinnelsen ekspresjonsvektorer som inneholder TRT-kodende nukleinsyrer hvor enkelte eller alle ikke-kodende sekvenser er blitt deletert. Under enkelte omstendigheter muliggjør minimalisering av mengden av ikke-proteinkodende sekvens forbedret proteinproduksjon (utbytte) og øker mRNA-stabilitet. I denne utførelses-form av oppfinnelsen deleteres den 3'-utranslaterte region av hTRT før kloning inn i et bakt eri elt ekspresjonsplasmid.

Plasmidet pGRN121 som inneholder den full lengdes hTRT cDNA, ble som omtalt ovenfor, først befridd for alle Apal-seter. Dette ble etterfulgt av delesjon av det Mscl-

HincLT hTRT-restriksjonsenzymfragment som inneholdt 3'UTR. NcoI-Xbal-restriksjons-fragmentet som inneholdt stoppkodonet av hTRT, ble deretter skutt inn i NcoI-Xbal-setet av pGRN121 for å fremstillet et plasmid som var ekvivalent med pGRN121, betegnet pGRN124, bortsett fra at det mangler 3'UTR.

Bakterielle ekspresjonsvektorer som benytter antibiotiske seleksjonsmarkorer

Oppfinnelsen tilveiebringer også bakterielle ekspresjonsvektorer som kan inneholde seleksjonsmarkører for å gi transformerte celler og sekvenser som koder for episomalt vedlikehold og replikasjon, en selekterbar fenotype slik at det ikke fordres integrasjon i vertsgenomet. For eksempel kan markøren kode for antibiotisk resistens, særlig resistens mot kloramfenikol (se Harrod (1997) Nucleic Acids Res. 25:1720-1726), kanamycin, G418, bleomycin og hygromycin, for å muliggjøre seleksjon av de celler som er transformert med de ønskede DNA-sekvenser, se for eksempel Blondelet-Rouault (1997) Gene 190:315-317; og Mahan (1995) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 92:669-673.

I én utførelsesform av oppfinnelsen ble full lengdes hTRT klonet inn i en modifisert Bluescript plasmidvektor (Stratagene, San Diego, CA), betegnet pBBS235, som det var innskutt et kloramfenikol antibiotisk resistensgen i. Notl-fragmentet fra pGRN124 (omtalt ovenfor) inneholdende hTRT ORF i Notl-setet av pBBS235 slik at TRT ORF er i motsatt orientering av vektorens Lac-promoter. Dette danner et plasmid som er egnet for mutagenese av plasmidinnskudd, så som TRT-nukleinsyrer ifølge oppfinnelsen. Denne plasmid-konstruksjon, betegnet pGRN125, kan benyttes i de metoder ifølge oppfinnelsen som involverer mutagenese av telomeraseenzym og TRT-proteinkodende sekvenser og for in vitro transkripsjon av hTRT ved å benytte T7-promoteren (og in vitro transkripsjon av anti-

sense hTRT under bruk av T3-promoteren).

I en annen utførelsesform av oppfinnelsen ble Notl-restriksjonsfragmenter fra pGRN124 som inneholdt hTRT ORF, subklonet inn i Notl-setet av pBBS235 (beskrevet ovenfor) slik at TRT ORF er i samme orientering som vektorens Lac-promoter. Dette danner et plasmid, betegnet pGRN126, som kan benyttes for ekspresjon av full lengdes hTRT i E. coli. Det uttrykte produkt vil inneholde 29 aminosyrer kodet av vektoren pBBS235, etterfulgt av 18 aminosyrer kodet av 5'UTR av hTRT, etterfulgt av det full lengdes hTRT-protein.

I en ytterligere utførelsesform av oppfinnelsen ble det foretatt in vitro mutagenese av pGRN125 for å omdanne det hTRT-initierende ATG-kodon til en Kozak konsensussekvens og frembringe EcoRI og BglU-restriksjons-oppslutningsseter for å lette kloning inn i ekspresjonsvektorer. Oligonukleotidet

3' (endrede nukleotider med små bokstaver) ble benyttet i mutageneseprosessen. Den resulterende ekspresjonsvektor ble betegnet pGRNl 27.

I en annen utførelsesform av oppfinnelsen ble den andre Asp i TRT «DD motiv» omdannet til alanin for å frembringe et ikke-funksjonelt telomeraseenzym, hvorved det ble frembragt et mutant TRT-protein for bruk som en dominant/negativ mutant. Den hTRT-kodende sekvens ble mutagenisert in vitro ved å benytte oligonukleotidet

S^CGGGACGGGCTGCTCCTGCGTTTGGTGGAcGcgTTCTTGTTGGTGACACCT

CACCTCACC-3' for å omdanne asparaginkodonet for resten 869 (Asp 869) til et alanin (Ala) kodon. Dette frembragte også et Mlul-restriksjonsenzymsete. Det resulterende ekspresjonsplasmid ble betegnet pGRN130 som også inneholder Kozak konsensus-sekvensen beskrevet for pGRN127.

Oppfinnelsen tilveiebringer også en vektor konstruert for å uttrykke et antisense sekvensfragment av hTRT. pGRN126-plasmidet ble kuttet for utfylling med Mscl- og Smal-restriksjonsenzymer og religert for å deletere over 95% av hTRT ORF. Ett Smal-Mscl-fragment ble innført igjen under prosessen for å gjenopprette CAT-aktivitet. Dette urensede plasmid ble deretter på nytt kuttet med Sali og EcoRI og fragmentet inneholdende initieringskodonet for hTRT ORF ble skutt inn i Sall-EcoRI-setene av pBBS212 for å fremstille et antisense ekspresjonsplasmid som uttrykker den antisensesekvens som spenner over 5'UTR og de 73 basepar-restene av hTRT ORF (i pattedyrceller). Dette plasmid ble betegnet pGRN135.

Ekspresjon av hTRT telomerase i gjær

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også hTRT-uttrykkende gjærekspresjons-vektorer for å produsere større mengder full lengdes biologisk aktivt hTRT.

Pichia pastoris ekspresjonsvektor pPICZ B og full lengde hTRT

For å produsere store mengder full lengdes biologisk aktivt hTRT ble Pichia pastoris ekspresjonsvektoren pPICZ B (Invitrogen, San Diego, CA) valgt. Innskuddet av den hTRT-kodende sekvens var avledet fra nukleotidene 659 til 4801 av hTRT-innskuddet i plasmid pGRN121. Denne nukleotidsekvens inkluderer den full lengdes sekvens som koder for hTRT. Denne ekspresjonsvektor er utviklet for induserbar ekspresjon i P. pastoris av høye nivåer full lengdes, umodifisert hTRT-protein. Ekspresjonen styres av en gjærpromoter, men den uttrykte sekvens gjør bruk av hTRT-initierings- og termineringskodonene. Ingen eksogene kodoner ble innført gjennom kloningen. Den resulterende pPICZ B/hTRT-vektor ble benyttet til å

transformere gjæren.

Pichia pastoris ekspresjonsvektor hTRT-His6/pPICZ B

En andre Pichia pastoris ekspresjonsvektor ifølge oppfinnelsen avledet fra pPICZ B, inneholder også den full lengdes sekvens som koder for hTRT avledet fra nukleotidene 659 til 4801 av hTRT-innskuddet i plasmid pGRN121. Denne hTRT-His6/pPICZ B ekspresjonsvektor koder for full lengdes hTRT-protein fusjonert ved dens C-terminal til Myc-epitop- og His6-rapportørmerkingssekvensene. hTRT stoppkodonet er blitt fjernet og erstattet med vektorsekvenser som koder for Myc-epitopen og His6 rapportørmerkingen så vel som for et stoppkodon. Denne vektoren er utviklet for å styre høynivå induserbar ekspresjon i gjær av det følgende fusjonsprotein, som består av hTRT-sekvens (understreket), vektorsekvenser i hakeparenteser ([L] og [NSAVD]) Myc-epitopen (dobbelt understreket) og His6-merkingen (kursivert):

Ekspresjon av hTRT i insektceller

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også hTRT telomerase-uttrykkende insektcelle-ekspresjonsvektorer som produserer store mengder full lengdes biologisk aktivt hTRT.

Baculovirus ekspresjonsvektor pVL1393 og ful) lengdes hTRT

Den aktuelle telomerase-kodende sekvens ble klonet inn i Baculovirus ekspresjonsvektoren pVL1393 (Invitrogen, San Diego, CA). Denne konstruksjonen ble deretter ko-transfektert inn i Spodoptera fungupeida (sf-9) celler med linearisert DNA fra Autograph california nukleært polyhedrosevirus (Baculogold-AcMNPV). De oppnådde rekombinante baculovirus ble deretter plakkrenset og ekspandert ved å følge standardprotokoller.

Denne ekspresjonsvektor sørger for ekspresjon av høye nivåer full lengdes hTRT-protein i insektceller. Ekspresjonen styres av en baculoviral polyhedrin genpromoter. Ingen eksogene kodoner ble innført ved kloningen.

Baculovirus ekspresjonsvektor pBlueBacHis2 B og full lengdes hTRT

For å produsere store mengder full lengdes, biologisk aktivt hTRT, ble baculovirus ekspresjonsvektoren pBlueBacHis2 B (Invitrogen, San Diego, CA) valgt som kilde for kontrollelementer. Det hTRT-kodende innskudd besto av nukleotidene 707 til 4776 av hTRT-innskuddet i plasmid pGRN121.

Et full lengdes hTRT med en His6 og Anti-Xpress-merkinger (Invitrogen) ble også konstruert. Denne vektoren inneholder også et innskudd bestående av nukleotidene 707 til 4776 av hTRT-innskuddet fra plasmidet pGRN121. Vektoren styrer ekspresjon i insektceller av høye nivåer av full lengdes hTRT-protein fusjonert til spaltbare 6-histidin og Anti-Xpress-merkinger, og aminosyresekvensen av fusjonsproteinet er vist nedenfor, hvor (-<*->) angir enterokinase-spaltningssetet:

Baculovirus ekspresjonsvektor pBlueBac4.5 og full lengdes hTRT-protein

For å produsere store mengder full lengdes biologisk aktivt hTRT, ble en andre baculovirus ekspresjonsvektor, pBlueBac4.5 (Invitrogen, San Diego, CA) konstruert. Det hTRT-kodende innskudd besto også av nukleotidene 707 til 4776 av hTRT fra plasmidet pGRN121.

Baculovirus ekspresjonsvektor pMelBacB og full lengdes hTRT-protein

For å produsere store mengder full lengdes biologisk aktivt hTRT, ble en tredje baculovirus ekspresjonsvektor, pMelBacB (Invitrogen, San Diego, CA) konstruert. Det hTRT-kodende innskudd besto også av nukleotidene 707 til 4776 av hTRT-innskuddet fra plasmidet pGRN121.

pMeLBacB styrer ekspresjon av full lengdes hTRT i insektceller mot det ekstra-cellulære medium gjennom sekresjonsveien ved å benytte melittin-signalsekvensen. Det sekreteres derved høye nivåer av full lengdes hTRT. Melittin-signalsekvensen fraspaltes etter ekskresjon, men er del av det proteinforråd som forblir intracellulært. Av den grunn er den angitt i parenteser i den etterfølgende sekvens. Sekvensen av det fusjonsprotein som kodes av vektoren, er vist nedenfor:

Ekspresjon av hTRT i pattedyrceller

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også vektorer for å produsere hTRT i store mengder som full lengdes, biologisk aktivt protein i en rekke pattedyr-cellelinjer, og som er anvendelige for mange utførelsesformer av oppfinnelsen, som omtalt ovenfor.

MPSV-hTRT ekspresjonsplasmider

Oppfinnelsen tilveiebringer også et ekspresjonssystem for bruk i pattedyrceller som gir den høyest mulige ekspresjon av rekombinant protein, så som telomerase, uten virkelig å modifisere den kodende sekvens (f.eks. optimalisere kodonanvendelse). I én utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen MPSV pattedyr-ekspresjonsplasmider (fra plasmid pBBS212, beskrevet som pMPSV-TM i Lin J-H (1994) Gene 47:287-292) som er i stand til å uttrykke TRT ifølge oppfinnelsen. MPSV-plasmidene kan uttrykkes enten som stabile eller transiente kloner.

Mens den hTRT-kodende sekvens selv er uendret, er eksogene transkripsjonene kontrollelementer inkorporert i vektoren i dette ekspresjonssystemet. Den myeloproliferative sarkomvirus (MPSV) LTR (MPSV-LTR) promoter, forsterket av cytomegalovirus (CMV) enhanceren, er inkorporert for initiering av transkripsjon. Denne promoter viser konsekvent høyere ekspresjonsnivåer i cellelinjer (se Lin J-H (1994) supra). En Kozak konsensus-sekvens kan inkorporeres for translasjonsinitiering (se Kozak (1996) Mamm. Genome 7:563-574). Alle uvedkommende 5' og 3' utranslaterte hTRT-sekvenser kan fjernes for å sikre at disse sekvensene ikke forstyrrer ekspresjonen slik som diskutert ovenfor. Det MPSV-pIasmid som inneholder den fullstendige hTRT-kodende sekvens, med alle uvedkommende sekvenser inkludert, er betegnet pGRN133. Det ble også konstruert et kontroll hTRT «antisense» plasmid. Denne vektor er identisk med pGRN133 bortsett fra at TRT-innskuddet er antisense-sekvensen av hTRT (antisense-sekvensen hvis kontroll kan benyttes som en vektor, er betegnet pGRN134). MPSV-plasmidet som inneholder den fullstendige hTRT-kodende sekvens, med alle øvrige uvedkommende sekvenser fjernet og som inneholder Kozak konsensussekvensen, er betegnet pGRN145.

To seleksjonsmarkører, PAC (puromycin-N-acetyl-transferase=puromycinresistens) og HygB (hygromycin B=hygromycinresistens) er tilstede for seleksjon av plasmidene etter transfeksjon (se diskusjon angående selekterbare markører ovenfor). Dobbelt seleksjon ved bruk av markører på begge sider av vektor-polylinkeren, burde øke stabiliteten av den hTRT-kodende sekvens. En DHFR (dihydrofolatreduktase) kodende sekvens inkluderes for å muliggjøre amplifikasjon av ekspresjonskassetten etter at stabile kloner er fremstillet. Andre genamplifikasjonsmåter kan også benyttes for å øke utbyttet av rekombinant protein.

Oppfinnelsen tilveiebringer også MPSV pattedyrekspresjonsplasmider som inneholder hTRT-fusjonsproteiner. I én utførelsesform er hTRT-sekvensen, under bibehold av dens 5' utranslaterte region, koblet til en epitopmerking, så som LBI FLAG (International Biotechnologies Inc. (LBI), Kodak, New Haven, CT) og innskutt i MPSV ekspresjonsplasmidet (betegnet pGRN147). Denne spesielle konstruksjon inneholder et Kozak translasjonsinitieringssete. Det uttrykte fusjonsprotein kan renses ved å benytte M-l og anti-FLAG oktapeptid-monoklonal-antistoffet (LBI, Kodak, supra).

I en annen utførelsesform er hTRT stedsspesifikt endret. Et aminosyrekodon er mutagenisert, idet asparaginsyre i posisjon 869 er endret til alanin. Den Asp869-»Ala hTRT-mutant som bibeholder sin 5<*> utranslaterte region og inkorporerer en Kozak-sekvens, ble innskutt i et MPSV-ekspresjonsplasmid og betegnet pGRN146. Asp869-»Ala hTRT-mutanten ble manipulert videre for å inneholde FLAG-sekvensen, som beskrevet ovenfor, og innskuddet klonet inn i et MPSV-ekspresjonsplasmid. Et slikt ekspresjonsplasmid er betegnet pGRN154-I. For pGRN154-I er et Eaml 1051 restriksjonskuttet fragment fra pGRN146 som inneholder den Kozak-sekvensholdige «frontende» (5'-segment) av hTRT, klonet inn i Eamll05I-setene til pGRN147 (se ovenfor) for å danne et MPSV-ekspresjonsplasmid som er i stand til å uttrykke hTRT med en Kozak-sekvens, den ovenfor beskrevne D869-»A-mutasjon og IBI-merket.

En annen utførelsesform av oppfinnelsen er et ekspresjonsplasmid avledet fra pGRN146. Pattedyr-ekspresjonsplasmidet, betegnet pGRN152, ble utviklet ved å eksidere EcoRI-fragmentet fra plasmidet pGRN146 (inneholdende hTRT ORF) og klone dette inn i EcoRI-setet av pBBS212 for å fjerne 5'UTR av hTRT. Dette hTRT er orientert slik at dets ekspresjon kontrolleres av MPSV-promoteren. Dette danner et pattedyr-ekspresjonsplasmid som uttrykker hTRT med en Kozak konsensussekvens og D869->A-mutasjonen og gjør bruk av MPSV-promoteren.

Oppfinnelsen tilveiebringer en pattedyr-ekspresjonsvektor hvor hTRT er orientert slik at den hTRT-kodende sekvens drives av MPSV-promoteren. For eksempel ble et EcoRI-restriksjonsfragment fra pGRN137, som inneholdt den hTRT åpne leseramme (ORF), klonet inn i EcoRI-setet av pBBS212 (se nedenfor), hvorved den 5' utranslaterte region (5'-UTR) av hTRT ble fjernet. pGRN137 ble konstruert ved å eksidere et SalI-Sse8387I-fragment fra pGRN130, beskrevet nedenfor, inneholdende Kozak-mutasjonen av hTRT, inn i Sall-SSE 83871-setene av pGRN136, under dannelse av et pattedyr-ekspresjonsplasmid som uttrykker hTRT inneholdende en Kozak konsensussekvens til siden for MPSV-promoteren. Dette danner et pattedyr-ekspresjonsplasmid, betegnet pGRN145, som uttrykker hTRT med en Kozak konsensussekvens som benytter MPSV-promoteren. Se også den pGRN152 MPSV-promoter-styrte pattedyr-ekspresjonsvektor som er beskrevet nedenfor.

hTRT uttrykt i 293-celler ved bruk av episomal vektor pEBVHis

En episomal vektor, pEBVHis (Invitrogen, San Diego, CA) ble konstruert for å uttrykke et hTRT-fusjonsprotein omfattende hTRT fusjonert til et N-terminalt ekstensjons-epitopmerke, Xpress-epitopen (Invitrogen, San Diego, CA) (betegnet pGRN122). Notl-hTRT-fragmentet fra pGRN121 inneholdende hTRT ORF ble klonet inn i Notl-setet av pEBVHisA slik at hTRT ORF er i samme orientering som Rous Sarcoma virus- (RSV) vektorens promoter. I denne orientering er His6-merket relativt nærmere N-terminalen av hTRT.

Det ble også konstruert en vektor inneholdende som innskudd, antisense-sekvensen av hTRT og epitop-merkingen (plasmidet betegnet pGRN123, som kan benyttes som en kontroll). Vektoren ble transfektert inn i 293-celler og translatert hTRT identifisert og isolert ved å benytte et antistoff spesifikt for Xpress-epitopen. pEBVHis er en hygromycinresistent EBV-episomal vektor som uttrykker det aktuelle protein fusjonert til et N-terminalt peptid. Celler som bærer vektoren selekteres og ekspanderes og deretter fremstilles kjeme- og cytoplasma-ekstrakter. Disse og kontrollekstrakter immunpresipiteres med Anti-Xpress-antistoff, og de immunpresipiterte kulene testes med henblikk på telomeraseaktivitet ved hjelp av en konvensjonell test.

Ekspresjon av rekombinant hTRT i dødelige, normale diploide humanceller

I én utførelsesform av oppfinnelsen kan rekombinant hTRT og nødvendige telomerase-enzymkomplekskomponenter uttrykkes i normale, diploide dødelige celler for å øke deres proliferative evne eller immortalisere dem eller lette deres immortalisering. Dette gjør det mulig å oppnå diploide udødelige celler med en ellers normal fenotype og karyotype. Som omtalt ovenfor har denne anvendelse av telomerase enorm kommersiell anvendelighet.

Sense hTRT (Figur 16) og antisense hTRT ble klonet inn i en CMV-vektor. Disse vektorene ble renset og forbigående transfektert inn i to normale, dødelige, diploide human-cellekloner. Humanklonene var «young passage» diploide humane BJ og LMR90 cellestammer.

Analyse av telomeraseaktivitet ved å benytte en TRAP-test (under anvendelse av TRAPeze™ Kit (Oncor, Inc. Gaithersburg, MD) viste at transfeksjonen av sense hTRT, men ikke antisense hTRT, utviklet telomeraseaktivitet i både BJ- og LMR90-cellestammer.

Ekspresjon av rekombinant hTRT i immortaliserte IMR90-humanceller

Ved å benytte den samme hTRT sense-konstruksjon klonet inn i CMV-vektorer benyttet i de ovenfor beskrevne diploide humane BJ- og IMR90-cellestamme-undersøkelser, ble immortaliserte SW13 ALT cellelinjen (en LMR90-celle immortalisert med SV40 antigen) forbigående transfektert. En TRAP-test (TRAPeze, Oncor, Inc. Gaithersburg, MD) vist at telomeraseaktiviteten var utviklet i de sense-konstruksjons-transfekterte cellene.

Vektorer for regulert ekspresjon av hTRT i pattedyrceller: induserbar og repressiv ekspresjon av hTRT

Oppfinnelsen tilveiebringer vektorer som kan manipuleres for å indusere eller undertrykke ekspresjonen av TRT ifølge oppfinnelsen, så som hTRT. For eksempel kan den hTRT-kodende sekvens klones inn i det ecdyson-induserbare ekspresjonssystem fra Invitrogen (San Diego, CA) og det Tet-On og Tet-off tetracyklin-regulerte system fra Clontech Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA). Slike induserbare ekspresjonssystemer tilveiebringes for bruk i fremgangsmåter hvor det er viktig å kontrollere nivået eller hastigheten av transkripsjon av transfektert TRT. For eksempel tilveiebringer oppfinnelsen cellelinjer som er immortalisert gjennom ekspresjonen av hTRT. Slike celler kan gjøres «dødelige» ved inhibering av hTRT-ekspresjon med vektoren gjennom transkripsjonene kontroller, så som tilveiebragt gjennom Tet-Off-systemet. Oppfinnelsen tilveiebringer også fremgangsmåter for kun forbigående å uttrykke TRT for å unngå den konstitutive ekspresjon av hTRT som kan føre til uønsket «immortalisering» av de transfekterte cellene, som diskutert ovenfor.

Det ecdyson-induserbare pattedyr-ekspresjonssystem er utviklet for å muligjøre

regulert ekspresjon av det aktuelle gen i pattedyrceller. Systemet utmerker seg ved dets strengt regulerte mekanisme som praktisk talt ikke tillater noen påvisbar basalekspresjon og mer enn 200 gangers induserbarhet i pattedyrceller. Ekspresjonssystemet er basert på den heterodimere ecdyson-reseptoren fra Drosphila. Det ecdyson-induserbare ekspresjonssystem gjør bruk av en steroidhormon-ecdysonanalog, muristeron A, for å aktivere ekspresjon av hTRT via en heterodimer nukleær reseptor. Ekspresjonsnivåer har vært rapportert å overskride 200 ganger basalnivåene uten noen cellefysiologisk effekt på pattedyr «Ecdysone-Inducible Gene Expression in Mammalian Cells and Transgenic Mice» (1996) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 93, 3346-3351). Når reseptoren binder ecdyson eller muristeron, en analog av ecdyson, aktiverer

reseptoren en ecdyson-responderende promoter for å gi kontrollert ekspresjon av det aktuelle gen. I det ecdyson-induserbare pattedyr-ekspresjonssystem uttrykkes begge monomerene av den heterodimere reseptor konstitutivt fra den samme vektor, pVgRXR. Den ecdyson-responderende promoter, som i siste omgang driver ekspresjonen av det aktuelle gen, lokaliseres på en andre vektor, pLND, som driver transkripsjonen av det aktuelle gen.

Den hTRT-kodende sekvens klones inn i pIND-vektoren (Clontech Laboratories, Inc. Palo Alto, CA) som inneholder 5 modifiserte ecdyson-responselementer (E/GRE) oppstrøms for en minimal varmesjokkpromoter og det multiple kloningssetet. Konstruksjonen transfekteres deretter i cellelinjer som er blitt manipulert for stabilt å uttrykke ecdyson-reseptoren. Etter transfeksjon behandles cellene med muristeron A for å indusere intracellulær ekspresjon fra pLND.

Tet-on og Tet-off ekspresjonssystemene (Clontech, Palo Alto, CA) gir tilgang til de regulerte høynivå genekspresjonssystemene som er beskrevet av Gossen (1992) «Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline responsive promoters» Proe. Nati. Acad. Sei. USA 89:5547-5551, for Tet-Off transkripsjonsrepresjonssystemet og Gossen

(1995) «Transcriptional activation by tetracycline in mammalian cells», Science 268:1766-1769 for det Tet-On induserbare transkripsjonssystem. I «Tet-Off» transformerte cellelinjer

slås genekspresjon på når tetracyklin (Tc) eller doksycyklin («Dox»; et Tc-derivat) fjernes fra dyrkningsmediet. Derimot slås ekspresjon på i Tet-On celler ved tilsetning av Tc eller Dox til mediet. Begge systemer tillater at ekspresjon av klonede gener reguleres nøyaktig som respons på varierende konsentrasjoner av Tc eller Dox.

Dette system benytter «pTRE» som et responsplasmid som kan benyttes til å uttrykke et gen av interesse. Plasmid pTRE inneholder et multipelt kloningssete (MCS) umiddelbart nedstrøms for den Tet-responderende PhCMV<*->l promoter. Gener eller cDNA av interesse innskutt i ett av setene i dette MCS vil gi respons på de tTA og rtTA-regulerende proteiner i henholdsvis Tet-Off- og Tet-On-systemene. PhCMVM inneholder det Tet-responderende element (TRE) som består av syv kopier av Tet-operatorsekvensen (tetO) på 42 bp. TRE-elementet er umiddelbart oppstrøms for den minimale CMV-promoter (PminCMV), som mangler den enhancer som er del av den komplette CMV-promoter i pTet-plasmidene. Følgelig er PhCMVM taus ved fravær av binding av regulatorproteiner til tetO-sekvensene. Det klonede innskudd må ha et initieringskodon. I enkelte tilfeller kan addisjon av et Kozak konsensus-ribosombindingssete forbedre ekspresjonsnivåer, men mange cDNA er blitt effektivt uttrykt i Tet-systemer uten addisjonen av en Kozak-sekvens. pTRE-gen X-plasmider kotransfekteres med pTK-Hyg for å muliggjøre seleksjon av stabile transfektanter.

Oppstilling av et Tet-Off eller Tet-On ekspresjonssystem fordrer i alminnelighet to påfølgende stabile transfeksjoner for å frembringe en «double-stable» cellelinje som inneholder integrerte kopier av gener som koder for det passende regulatorprotein og TRT under kontroll av et TRE. I den første transfeksjon innføres det riktige regulatorprotein i den foretrukne cellelinje ved transfeksjon av et «regulatorplasmid», så som pTet-Off eller pTet-On vektoren som uttrykker de riktige regulatorproteinene. Det hTRT som er klonet inn i pTRE «respons-plasmidet» innføres deretter i den andre transfeksjonen for å frembringe «double-stable» Tet-Off eller Tet-On cellelinjen. Begge systemer gir meget nøyaktig på/av-kontroll av genekspresjon, regulert dose-avhengig induksjon og høye absolutte genekspresjonsnivåer.

Ekspresjon av rekombinant hTRT med DHFR og adenovirussekvenser

pGRN155 plasmidkonstruksjonen ble utviklet for transient ekspresjon av hTRT cDNA i pattedyrceller. En Kozak konsensussekvens innføres ved 5'-enden av hTRT-sekvensen. hTRT-innskuddet inneholder ingen 3' eller 5' UTR. hTRT cDNA innføres i EcoRI-setet av p91023(B) (Wong (1985) Science 228:810-815). hTRT-innskuddet er i samme orientering som DHFR ORF. Dette gjør ekspresjonsvektoren særlig egnet for transient ekspresjon.

Plasmid pGRN155 inneholder SV40-origo og enhancer umiddelbart oppstrøms for en adenoviruspromoter, et tetracyklinresistensgen, et E. coli origo og en adenovirus VAI og VALI genregion. Denne ekspresjonskassett inneholder i følgende rekkefølge: adenovirus «major late» promoteren; den adenovirus tredelte leder; et hybrid-intron bestående av et 5' spleisesete fra det første ekson av den tredelte leder og et 3' spleisesete fra muse-immunglobulingenet; hTRT cDNA; den mus-DHFR-kodende sekvens og SV40 polyadenyleringssignalet.

Den adenovirus tredelte lederen og VA RNA har vært rapportert å øke effektiviteten som polycistroniske mRNA translateres med. DHFR-sekvenser har vært rapportert å øke stabiliteten av hybrid mRNA. DHFR-sekvenser kan også utgjøre en markør for seleksjon og amplifikasjon av vektorsekvenser. Se Logan (1984) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81:3655); Kaufman (1985) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 82:689; og Kaufman (1988) Focus (Life Technologies, Inc.), Bd. 10, nr. 3). Dette gjør ekspresjonsvektoren særlig egnet for transient ekspresjon.

Andre ekspresjonsplasmider ifølge oppfinnelsen er beskrevet som illustrasjon.

pGRN121

EcoRI-fragmentet fra lambda klon 25-1.1.6 som inneholder hele den cDNA som koder for hTRT-proteinet, ble innført i EcoRI-setet av pBluescripfHSK+ slik at 5'-enden av denne cDNA er nær T7-promoteren i vektoren. Den selekterbare markør som benyttes med denne vektor er ampicillin.

pGRN122

Det Notl-fragment fra pGRN121 som inneholder hTRT ORF ble innført i Notl-setet av pEBVHisA slik at den kodende sekvens er operativt koblet til RSV-promoteren. Dette plasmid uttrykker et fusjonsprotein sammensatt av et His6-merke fusjonert til N-terminalen av hTRT-proteinet. Den selekterbare markør som benyttes med denne vektor, er ampicillin eller hygromycin.

pGRN123

Not-I-fragmentet fra pGRN121 som inneholder hTRT ORF ble innført i Notl-setet av pEBVHisA slik at den kodende sekvens er i motsatt orientering i forhold til RSV-promoteren, og således uttrykker antisense hTRT.

pGRN124

Plasmid pGRN121 ble befridd for alle Apal-seter etterfulgt av delesjon av det Mscl-HincLl-fragment som inneholdt 3'UTR. Det Nco-Xbal-fragmentet som inneholder stoppkodonet for den hTRT-kodende sekvens, ble deretter satt inn i Nco-Xbal-setene av pGRN121 for å fremstille et plasmid tilsvarende pGRN121 bortsett fra at det manglet 3'UTR, hvilket kan være å foretrekke for økede ekspresjonsnivåer i enkelte celler.

pGRN125

Notl-fragmentet fra pGRN124 som inneholder den hTRT-kodende sekvens, ble innført i Notl-setet av pBBS235 slik at den åpne leserammen er i omvendt orientering til Lac-promoteren. Den selekterbare markør som benyttes med denne vektor er kloramfenikol.

pGRN126

Notl-fragmentet fra pGRN124 som inneholder den hTRT-kodende sekvens, ble innført i Notl-setet av pBBS235 slik at den innskutte hTRT-kodende sekvens er i samme orientering som Lac-promoteren.

pGRN127

Oligonukleotidet 5 '-TGCGCACGTGGGAAGCCCTGGCagatctgAattCCaCcATGC

CGCGCGCTCCCCGCTG-3' ble benyttet i in vitro mutagenese av pGRN125 for å omdanne det initierende ATG-kodon av den hTRT-kodende sekvens til en Kozak konsensussekvens og frembringe EcoRI- og Bglll-seter for kloning. Dessuten ble oligonukleotid COD2866 benyttet til å omdanne AmpS til AmpR (ampicillinresistent) og oligonukleotid COD1941 benyttet til å omdanne CatR (kloramfenikolresistent) til CatS (kloramfenikolsensitiv).

pGRN128

Oligonukleotidet 5'-TGCGCACGTGGGAAGCCCTGGCagatctgAattCCaCcATGC

CGCGCGCTCCCCGCTG-3' ble benyttet i in vitro mutagenese for å omdanne det initierende ATG-kodon av hTRT til en Kozak konsensussekvens og frembringe EcoRI- og Bglll-seter for kloning. Dessuten benyttes oligo5'-CTGCCCTCAGACTTCAAGACCATCCTGGACTACA

AGGACGACGATGACAAATGAATTCAGATCTGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTC

CAGC-3' for å innføre LBI-merket (International Biotechnologies Inc., (IBI) Kodak, New

Haven, CT) ved C-terminalen og frembringe EcoRI- og Bglll-seter for kloning. Dessuten ble COD2866 benyttet til å omdanne AmpS til AmpR og COD1941 benyttet til å omdanne CatR til CatS.

pGRN129

Oligonukleotidet 5'-CGGGACGGGCTGCTCCTGCGTTTGGTGGAcGcgTTCTTG TTGGTGACACCTCACCTCACC-3' ble benyttet ved in vitro mutagenese for å omdanne Asp869 til et Ala-kodon (dvs. den andre Asp av DD-motivet ble omdannet til alanin for å danne en dominant/negativ hTRT-mutant). Dette danner også et Mlul-sete. Oligonukleotid

5'-CTGCCCTCAGACTTCAAGACCATCCTGGACTACAAGGACGACGATGACAAA

TGAATTCAGATCTGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTCCAGC-3' ble dessuten benyttet til å sette inn LBI-merket ved C-terminalen og danne EcoRI- og Bglll-seter for kloning. Dessuen ble COD2866 benyttet for å omdanne AmpS til AmpR og COD1941 benyttet for å omdanne CatR til CatS.

pGRN130

Oligonukleotidet 5 '-GGGACGGGCTGCTCCTGCGTTTGGTGGAcGcgTTCTTGTT GGTGACACCTCACCTCACC-3' ble også benyttet ved in vitro mutagenese for å omdanne Asp869-kodonet til et Ala-kodon (dvs. den andre Asp av DD-motivet ble omdannet til alanin for å frembringe en dominant/negativ proteinvariant). Dette dannet også et Mlul-sete. Dessuten ble oligonukleotidet 5'-TGCGCACGTGGGAAGCCCTGGCagatctgAattCCaCcA TGCCGCGCGCTCCCCGCTG-3' benyttet ved in vitro mutagenese for å omdanne det initierende ATG-kodon av den hTRT-kodende sekvens til en Kozak konsensussekvens og danne EcoRI- og BglLI-seter for kloning. Dessuen ble COD2866 benyttet for å omdanne AmpS til AmpR og COD1941 benyttet for å omdanne CatR.

pGRN131

EcoRI-fragmentet fra pGRN128 inneholdende hTRT ORF med Kozak-sekvens og IBI-merke mutasjoner innføres i EcoRI-setet av pBBS212 slik at hTRT ORF uttrykkes til siden for MPSV-promoteren. Plasmid pBBS212 inneholder en MPSV-promoter, CMV-enhanceren og SV40 polyadenyleringssetet.

pGRN132

EcoRI-fragmentet fra pGRN128 inneholdende hTRT ORF med Kozak-sekvens og LBI-merke mutasjoner innføres i EcoRI-setet av pBBS212 slik at antisense-sekvensen av hTRT ORF uttrykkes til siden for MPSV-promoteren.

pGRN133

EcoRI-fragmentet fra pGRN121 inneholdende den hTRT-kodende sekvens, ble skutt inn i EcoRI-setet av pBBS212 slik at hTRT-proteinet uttrykkes under kontroll av MPSV-promoteren.

pGRN134

EcoRI-fragmentet fra pGRN121 inneholdende den hTRT-kodende sekvens, ble skutt inn i EcoRI-setet av pBBS212 slik at antisense av den hTRT-kodende sekvens uttrykkes under kontroll av MPSV-promoteren. De selekterbare markører som ble benyttet med denne vektor er Chlor/HygB/PAC.

pGRN135

Plasmid pGRN126 ble oppsluttet fullstendig med Mscl og Smal og religert for å deletere over 95% av den innskutte hTRT-kodende sekvens. Ett Smal-MscI-fragment ble satt inn igjen under prosessen for å gjenopprette Cat-aktiviteten for seleksjon. Dette urensede plasmid ble deretter oppsluttet på nytt med Sali og EcoRI, hvorpå fragmentet som inneholdt initieringskodonet av den hTRT-kodende sekvens, ble innskutt i Sall-EcoRI-setene til pBBS212. Dette utgjør et antisense-ekspresjonsplasmid som uttrykker antisense av 5'UTR og 73 baser av den kodende sekvens. Den selekterbare markør som ble benyttet med denne vektor er Chlor/HygB/PAC.

pGRN136

HindU-Sall-fragmentet fra pGRN126 inneholdende den hTRT-kodende sekvens, ble innskutt i Hindm-Sall-setet av pBBS242.

pGRN137

SalI-Sse8387I-fragmentet fra pGRN130 inneholdende Kozak-sekvensen, ble innskutt i SalI-Sse8387I-setene av pGRN136.

pGRN138

EcoRI-fragmentet fra pGRN124 inneholdende hTRT minus 3'UTR, ble innskutt i EcoRI-setet av pEGFP-C2 slik at orienteringen av hTRT-sekvensen er den samme som i EGFP-domenet.

pGRN139

Oligonukleotidet 5'-CTGCCCTCAGACTTCAAGACCATCCTGGACTACAAGG

ACGACGATGACAAATGAATTCAGATCTGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTCCAG

C-3 ble benyttet for å innføre IBI-merket i C-terminalen av hTRT i pGRN125 og frembringe EcoRI- og Bglll-seter for kloning. Dessuten ble COD2866 benyttet for å omdanne AmpS til AmpR og COD1941 benyttet for å omdanne CatR til CatS.

pGRN140

Ncol-fragmentet som inneholder oppstrømssekvensene av genomisk hTRT og det første intron av hTRT fra lambdaG55, ble innskutt i Ncol-setet av pBBS167. Fragmentet er slik orientert at hTRT er i samme retning som Lac-promoteren.

pGRN141

Ncol-fragmentet som inneholder oppstrømssekvensene av genomisk hTRT og det første intron av hTRT fra lambdaG55, ble innskutt i Ncol-setet av pBBS167. Fragmentet er slik orientert at hTRT er i motsatt retning av Lac-promoteren.

pGRN142

Notl-fragmentet fra lambdaGphi5 inneholdende det fullstendige -15 kbp genomiske innskudd inklusivt hTRT genpromoterregionen, ble innskutt i Notl-setet av plasmid pBBS185. Fragmentet er slik orientert at hTRT ORF er i motsatt orientering av Lac-promoteren.

pGRN143

Notl-fragmentet fra lambdaGphi5 inneholdende det fullstendige ~15 kbp genomiske innskudd inklusivt hTRT genpromoterregionen, ble innskutt i Notl-setet av plasmid pBBSl 85. Fragmentet er slik orientert at hTRT ORF er i samme orientering som Lac-promoteren.

pGRN144

Sall-delesjon av pGRN140 for å fjerne lambda-sekvenser.

pGRN145

Denne vektor ble konstruert for ekspresjonen av hTRT-sekvenser i pattedyrceller. EcoRI-fragmentet fra pGRN137 inneholdende den hTRT-kodende sekvens, ble innskutt i EcoRI-setet av pBBS212, for å fjerne den del av sekvensen som tilsvarte 5'UTR av

hTRT mRNA. Den hTRT-kodende sekvens er slik orientert at den uttrykkes under kontroll av MPSV-promoteren. Den selekterbare markør benyttet med denne vektor er Chlor/HygB/PAC.

pGRN146

Denne vektor ble konstruert for ekspresjonen av hTRT-sekvenser i pattedyrceller. Sse8387I-NotI-fragmentet fra pGRN130 inneholdende D869A-mutasjonen av hTRT, ble innskutt i Sse8387I-NotI-setene av pGRN137. Den selekterbare markør benyttet med denne vektor er ampicillin/HygB/PAC.

pGRN147

Sse8387I-NotI-fragmentet fra pGRN139 inneholdende IBI-merket, ble innskutt i Sse8387I-NotI-setene av pGRN137.

pGRN148

BglII-Eco47III-fragmentet fra pGRN144 inneholdende promoterregionen av hTRT, ble innskutt i BglU-NruI-setene av pSEAP2 for å fremstille en hTRT-promoter/rapportør-konstruksjon.

pGRN149

Denne vektor er en intermediær vektor for konstruksjon av en hTRT-fusjonsprotein-ekspresjonsvektor. Den mutagene oligomer 5'-cttcaagaccatcctggactttcgaaacgcggccgccacc gcggtggagctcc-3' ble benyttet for å addere et CSP45I-sete ved C-terminalen av hTRT ved in vitro mutagenese av pGRN125. «Stopp»-kodonet av hTRT ble deletert og erstattet med et Csp45I-sete. Den selekterbare markør som benyttes med denne vektor er ampicillin.

pGRN150

BglU-FspI-fragmentet fra pGRN144 inneholdende promoterregionen av hTRT, ble innskutt i BglLT-NruI-setene av pSEAP2 for å fremstille en hTRT-promoter/rapportør-konstruksjon.

pGRN151

Denne vektor ble konstruert for ekspresjonen av hTRT-sekvenser i pattedyrceller. EcoRI-fragmentet fra pGRN147 inneholdende den hTRT-kodende sekvens, ble innskutt i EcoRI-setet av pBBS212, for å fjerne den del av sekvensen som tilsvarte 5'UTR av

pGRN152

EcoRI-fragmentet fra pGRN146 inneholdende den hTRT-kodende sekvens, ble innskutt i EcoRI-setet av pBBS212 for å fjerne den del av sekvensen som tilsvarte 5'UTR av hTRT. Den hTRT-kodende sekvens er orientert slik at den uttrykkes under kontroll av MPSV-promoteren.

pGRN153

Styl-fragmentet fra pGRN130 inneholdende D869->A-mutasjonen av hTRT (hTRT-kodende sekvensvariant) ble innskutt i Styl-setene av pGRN158 for å frembringe et plasmid inneholdende den hTRT-kodende sekvens med en Kozak konsensussekvens ved dets 5'-ende og en D3I FLAG-sekvens i dets 3'-ende (den C-terminale kodende region) og D869-»A-mutasjonen.

pGRN154

EcoRI-fragmentet av pGRN153 inneholdende hTRT-genet, ble innskutt i EcoRI-setet av plasmid pBBS212 i en slik orientering at hTRT ORF er orientert i den samme retning som MPSV-promoteren. Dette danner et MPSV-styrt ekspresjonsplasmid som uttrykker hTRT-proteinet med en Kozak konsensussekvens ved dets aminoterminale ende, et LBI FLAG ved dets karboksyterminale ende og D869->A-mutasjonen.

pGRN155

Denne vektoren ble konstruert for ekspresjon av hTRT-sekvenser i pattedyrceller. Innskuddet inkluderte full-lengde cDNA av hTRT minus 5' og 3'UTR, og Kozak-sekvenser. EcoRI-fragmentet fra pGRN145 inneholdende hTRT cDNA med Kozak konsensussekvensen og ingen 3' eller 5'UTR, ble innskutt i EcoRI-setet av p91023(B) slik at dette hTRT er i samme orientering som DHFR ORF. Dette fører til en transient ekspresjonsvektor for hTRT. Den selekterbare markør benyttet med denne vektor er tetracyklin.

pGRN156

Denne vektor ble konstruert for ekspresjon av hTRT-sekvenser i pattedyr. EcoRI-fragmentet fra pGRN146 inneholdende D869A-mutasjonen av hTRT cDNA med Kozak konsensussekvensen og ingen 3' eller 5'UTR, ble innskutt i EcoRI-setet av p91023(B), slik at hTRT er i samme orientering som DHFR ORF. Dette utgjør en transient ekspresjonsvektor for hTRT. Innskuddet inkluderte full lengdes cDNA av hTRT minus 5' og 3'UTR, D869A og Kozak-sekvenser. Den selekterbare markør benyttet med denne vektor er tetracyklin.

pGRN157

Denne vektor ble konstruert for ekspresjon av hTRT-sekvenser i pattedyrceller. EcoRI-fragmentet fra pGRN147 inneholdende hTRT cDNA med LBI FLAG ved C-terminalen; Kozak konsensussekvensen og ingen 3' eller 5'UTR, ble innskutt i EcoRI-setet av p91023(B), slik at hTRT er i samme orientering som DHFR ORF. Dette utgjør en transient ekspresjonsvektor for hTRT. Innskuddet inkluderte full lengdes cDNA av hTRT minus 5' og 3'UTR, LBI FLAG-sekvensen og Kozak-sekvenser. Den selekterbare markør benyttet med denne vektor er tetracyklin.

pGRN158

Denne vektoren ble konstruert for ekspresjon og mutagenese av TRT-sekvenser i E. coli. EcoRI-fragmentet fra pGRNl51 inneholdende hTRT ORF, ble innskutt i EcoRI-setet av pBBS183, slik at hTRT ORF er orientert i motsatt retning av Lac-promoteren. Innskuddet inkluderte full lengdes cDNA av hTRT minus 5' og 3'UTR, IBI FLAG-sekvensen og Kozak-sekvenser. Den hTRT-kodende sekvens styres av en T7-promoter. Den selekterbare markør benyttet med denne vektor er ampicillin.

pGRN159

Denne vektoren ble konstruert for ekspresjon og mutagenese av TRT-sekvenser i E. coli. Nhel-Kpnl-fragmentet fra pGRN138 inneholdende EGFP til hTRT-fusjonen ble innskutt i Xbal-Kpnl-setene av pBluescirptILKS+. Dette fører til en T7-ekspresjonsvektor for fusjonsproteinet (den kodende sekvens styres av en T7-promoter). Innskuddet inkluderte full lengdes cDNA av hTRT minus 3'UTR som et fusjonsprotein med EGFP. Den selekterbare markør benyttet med denne vektor er ampicillin.

pGRN160

Denne vektor ble konstruert for ekspresjonen av antisense hTR-sekvenser i pattedyrceller. Den kodende sekvens er operativt koblet til en MPSV-promoter. Xhol-Nsil-fragmentet fra pGRN90 inneholdende den full lengdes hTR ORF, ble innskutt i Sall-Sse8387I-setene til pBBS295. Dette utgjør en transient/stabil vektor som uttrykker hTR antisense RNA. En GPT-markør ble inkorporert i vektoren. De selekterbare markører benyttet med denne vektor, er Chlor/gpt/PAC.

pGRN161

Denne vektor ble konstruert for ekspresjonen av sense hTR-sekvenser i pattedyrceller. XhoI-Nnil-fragmentet fra pGRN89 inneholdende den full lengdes hTR ORF, ble innskutt i SalI-Sse8387I-setene til pBBS295. Dette utgjør en transient/stabil vektor som uttrykker hTR i sense-orientering. Den kodende sekvens styres av en MPSV-promoter. En GPT-markør ble inkorporert i vektoren. De selekterbare markører benyttet med denne vektor er Chlor/gpt/PAC.

pGRN162

XhoI-Nsil-fragmentet fra pGRN87 inneholdende den full lengdes hTR ORF, ble innskutt i SalI-Sse8387I-setene til pBBS295. Dette utgjør en transient/stabil vektor som uttrykker trunkert hTR (fra posisjon +108 til +435) i sense-orienteringen.

pGRN163

Denne vektor ble konstruert for ekspresjon og mutagenese av TRT-sekvenser i E. coli. Den kodende sekvens styres av en T7-promoter. Oligonukleotidet RA45 (5'-GCCACCCCC GCGCTGCCTCGAGCTCCCCGCTGC-3') benyttes ved in vitro mutagenese for å endre den initierende met i hTRT til Leu og innføre et Xhol-sete i de neste to kodoner etter Leu. COD941 ble dessuten benyttet til å endre CatR til CatS, og innfører et BSPHl-sete, og COD2866 ble benyttet til å endre AmpS til AmpR, under innføring av et FSPl-sete. Den selekterbare markør benyttet med denne vektor er ampicillin.

pGRN164

Denne vektor ble konstruert for ekspresjon av hTR-sekvenser i E. coli.

Primerne hTR+1 5' -GGGG AAGCTTT AAT ACG ACTC ACTAT AGGGTTGCGG AGGG TGGGCCTG-3' oghTR+445 5'-CCCCGGATCCTGCGCATGTGTGAGCCGAGTCC TGGG-3' ble benyttet til ved PCR å amplifisere et fragment fra pGRN33 inneholdende den fulle lengde hTR med T7-promoteren og 5'-enden (som i hTR+1). En BamHI-Hindm-oppslutning av PCR-produktet ble satt i BamHI-HindlLI-setene til pUCl 19. Den kodende sekvens ble operativt koblet til en T7-promoter. Den selekterbare markør benyttet med denne vektor er ampicillin.

pGRN165

Denne vektor ble konstruert for ekspresjon og mutagenese av hTRT-sekvenser i E. coli. Den kodende sekvens er operativt koblet til en T7-promoter. EcoRI-fragmentet fra pGRN145 inneholdende hTRT ORF med en Kozak-frontende, ble innskutt i EcoRI-setet av pBluescriptIISK+ slik at hTRT er orientert i samme retning som T7-promoteren. Den selekterbare markør benyttet med denne vektor er ampicillin.

pGRN166

Denne vektor ble konstruert for ekspresjon og mutagenese av TRT-sekvenser i pattedyrceller. Den kodende sekvens er operativt koblet til enT7-promoter. EcoRI-fragmentet fra pGRNl 51 som inneholdt hTRT ORF med en Kozak frontende og IBI-merke i den bakre ende, ble innskutt i EcoRI-setet av pBluescriptIISK+ slik at hTRT ORF er orientert i samme retning som T7-promoteren. Innskuddet innbefattet full-lengde cDNA av hTRT minus 5' og 3'UTR, FLAG-sekvens (Immunex Corp., Seattle, WA) og Kozak-sekvenser. Den selekterbare markør benyttet med denne vektor er ampicillin.

pGRN167

AvRn-StuI-fragmentet fra pGRN144 inneholdende 5'-enden av hTRT ORF, ble innskutt i Xbal-StuI-setene av pBBS161.

pGRN168

EcoRI-fragmentet fra pGRN145 inneholdende den optimaliserte hTRT-ekspresjonskassett, ble skutt inn i EcoRI-setet av pLND, slik at den hTRT-kodende sekvens er i samme orientering som miniCMV-promoteren.

pGRN169

EcoRI-fragmentet frapGRN145 inneholdende den optimaliserte hTRT-ekspresjonskassett ble innskutt i EcoRI-setet av pLND slik at hTRT er i motsatt orientering av miniCMV-promoteren.

pGRN170

EcoRI-fragmentet fra pGRN145 inneholdende den optimaliserte hTRT-ekspresjonskassett ble innskutt i EcoRI-setet av pIND (spl) slik at hTRT er i motsatt orientering av miniCMV-promoteren.

pGRN171

Eco47UI-NarI-fragmentet fra pGRN163 ble innskutt i Eco47III-NarI-setene av pGRN167, idet MIL-mutasjonen ble satt inn i et fragment av den hTRT-genomiske DNA.

pGRN172

BamHI-StuI-fragmentet fra pGRN171 inneholdende Met til Leu-mutasjonen i

hTRT ORF, ble innskutt i BglLI-NruI-setene av pSEAP2-Basic.

pGRN173

EcoRV-Eco47HI-fragmentet fra pGRN144 inneholdende 5'-enden av hTRT-promoterregionen, ble innskutt i SrfI-Eco47ILI-seter i pGRNl 72. Dette utgjør et promoter-rapportørplasmid som inneholder promoterregionene hTRT fra ca. 2,3 kb oppstrøms fra starten av hTRT ORF til umiddelbart etter det første intron i den kodende region, med Metl ->Leu-mutasjon.

pGRN174

EcoRI-fragmentet fra pGRN145 inneholdende den «optimaliserte» hTRT-ekspresjonskassett, ble innført i EcoRI-setet av pLND(spl) slik at dette hTRT er i samme orientering som miniCMV-promoteren.

EKSEMPEL 7

REKONSTITUERING AV TELOMERASEAKTIVITET

A. Koekspresjon av hTRT og hTR in vitro

I dette eksempel beskrives koekspresjonen av hTRT og hTR ved bruk av et in vitro cellefritt ekspresjonssystem. Disse resultatene viser at hTRT polypeptidet som kodes av pGRN121, koder et katalytisk aktivt telomeraseprotein og at in vitro rekonstitusjon (IVR) av telomerase RNP kan oppnås ved å benytte rekombinant uttrykt hTRT og hTR.

Telomeraseaktivitet ble rekonstituert ved å addere lineariserte plasmider av hTRT

(pGRN121; 1 ug DNA kuttet med Xbal) og hTR (phTR+1; 1 ug kuttet med Fspl) til et koblet transkripsjons/translasjons-retikulocytt-lysatsystem (Promega TNT™). phTR+1 er et plasmid som når det lineari seres med Fspl og deretter transkriberes med T7 RNA-polymerase, danner et 445 nukleotiders transkript som begynner ved nukleotid +1 og strekker seg til nukleotid 446 av hTR (Autexier et al., 1996, EMBO J 15:5928). For en 50 uL reaksjon ble følgende komponenter tilsatt: 2 nL TNT™-buffer, 1 nL TNT™ T7 RNA-polymerase, 1 nL 1 mM aminosyreblanding, 40 enheter Rnasin™ RNaseinhibitor, 1 ng hver av linearisert templat DNA og 25 nL TNT™ reticulocytt-lysat. Komponentene ble deretter tilsatt i forholdet anbefalt av produsenten og inkubert i 90 minutter ved 30°C. Transkripsjonen ble styrt av T7-promoteren og kunne også foretas før tilsetningen av reticulocyttlysat, med tilsvarende resultater. Etter inkubering ble 5 og 10 uL av den programmerte transkripsjons/translasjons-reaksjonen testet for telomeraseaktivitet ved TRAP som tidligere beskrevet (Autexier et al., supra) ved å benytte 20 runder PCR for å amplifisere signalet.

Resultatene av rekonstitueringen er vist i Figur 10. For hver bestemt transkripsjons/ translasjonsreaksjon er det tre baner: de første to banene er parallellbestemmelser og den tredje banen er en parallellprøve varmedenaturert (95°C, 5 minutter) før TRAP-fasen for å utelukke PCR-frembragte artefakter.

Som vist i Figur 10 har retriculocyttlysat alene ingen påvisbar telomeraseaktivitet (bane 6). Likeledes iakttas ingen påvisbar aktivitet når enten hTRT alene (bane 1) eller full lengde hTRT-gen (bane 4) tilsettes til lysatet. Når begge komponentene tilsettes (bane 2), utvikles telomeraseaktivitet som vist gjennom det karakteristiske repeterte stigemønster. Når karboksylterminalregionen av hTRT-genet fjernes ved oppslutning av vektoren med Ncol («trunkert hTRT») oppheves telomeraseaktiviteten (bane 3). Bane 5 viser at translasjon av det trunkerte hTRT alene ikke frembringer telomeraseaktivitet. Bane «R8» viser en positiv kontroll for en telomerase-produktstige frembragt ved TRAP eller TSR8, et syntetisk telomeraseprodukt som har en nukleotidsekvens på

5 '-ATTCCGTCGAGC AGAGTTAG[GGTTAG]7-3'.

B. Blandinger av hTRT og hTR in vitro

In vitro rekonstituering av telomeraseaktivitet ble også oppnådd ved blanding. hTRT ble transkribert og translatert som beskrevet ovenfor, men uten addisjonen av hTR-plasmidet. Rekonstituering av telomerase RNP ble deretter oppnådd ved å blande hTRT translasjons-blandingen med hTR (tidligere frembragt ved T7 RNA-polymerase-transkripsjon fra phTR+l-Fsp) i forholdet 2 uL hTRT translasjonsblanding til 2 uL hTR (1 ug) og deretter inkubert i 90 minutter ved 30°C. Denne hTRT/hTR-rekonstitusjonsmetode er omtalt som «koblet rekonstitusjon» eller «koblet IVR». Telomeraseaktivitet forekommer (dvs. kan påvises) i denne blanding. Forbedret signal ble observert etter delvis rensing av aktiviteten ved DEAE-kromatografi. I dette tilfellet ble Millipore Ultrafree-MC DEAE Centrifugal Filter Devices benyttet i henhold til produsentens anvisninger. De anvendte buffere var hypoO.l, hypo0.2 og hypol.O, hvor hypo er 20 mM Hepes-KOH, pH 7,9, 2 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 10% glycerol, 0,1% NP-40,1 mM DTT, 1 mM Na-metabisulfitt, 1 mM benzamidin og 0,2 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF), og hvor 0.1,0.2 og 1.0 refererer seg til 0,1,0,2 eller 1,0 M KO. Filterne ble prekondisjonert med hypol .0, vasket med hypoO.l og den rekonstituerte telomerase påsatt, hvorpå kolonnen ble vasket med hypoO.l deretter med hypo0.2 og den rekonstituerte telomerase eluert med hypol.O med halvparten av det påsatte volum. Formuleringen kunne oppbevares nedfrosset til -70°C og beholde aktivitet.

Telomeraseaktivitet ble målt i en totrinnsprosess. I det første trinn ble det foretatt en konvensjonell telomerasebestemmelse som beskrevet i Morin, 1989, Cell 59:521, bortsett fra at det ikke ble benyttet noen radioaktiv merking. I det andre trinn ble en alikvot analysert ved hjelp av TRAP-prosedyren i 20-30 runder som beskrevet ovenfor. Den konvensjonelle bestemmelse ble foretatt ved å bestemme 1-10 uL rekonstituert telomerase i 40-50 uL sluttvolum av 25 mM Tris-HCl, pH 8,3,50 mM K-acetat, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl2, 2 mM dATP, 2 mM TTP, 10 uM dGTP og 1 uM primer

(vanligvis M2. 5 '-AATCCGTCGAGCAGAGTT) ved 30°C i 60-180 minutter. Reaksjonen ble stanset ved oppvarming til 95°C i 5 minutter, og 1-10 uL av blandingen fra det første trinn ble overført til TRAP-reaksjonen (50 uL) i det andre trinn.

I ytterligere forsøk ble syntesen av hTRT og hTR under in vitro rekonstituering, overvåket ved henholdsvis <35>S-metionin-inkorporering og northern-blotting. Proteiner av tilnærmet forventet størrelse, ble syntetisert for hTRT (127 kD), hTRT-Nco (85 kD) og pro90hTRT (90 kD) i tilnærmet like molare mengder i forhold til hverandre. Northern-analysen tydet på at hTR-syntesen var av korrekt størrelse (445 nukleotider) og i det vesentlige var intakt.

Varianter av de ovenfor beskrevne rekonstitusjonsmetoder vil være åpenbare for fagmannen. For eksempel tiden og temperaturen for rekonstitueringen, samt nærvær eller konsentrasjon av komponenter, som f.eks. monovalent salt (f.eks. NaCl, KC1, kaliumacetat, kaliumglutamat og lignende), divalent salt (MgCb, MnCh, MgS04 og lignende), denatureirngsmidler (urea, formamid og lignende), overflateaktive midler (NP-40, Tween, CHAPS, og lignende) og alternativt forbedrede renseprosedyrer (som f.eks. immunpresipitasjon, affinitets- eller standardkromatografi) kan benyttes. Disse og andre parametere kan varieres på en systematisk måte for å optimalisere betingelser for særlige tester eller andre rekonstitueirngsmetoder.

C. Rekonstituering ved bruk av hTRT varianter og fusjonsproteiner

Rekonstituering av telomerase katalytisk aktivitet inntrådte når EGFP-hTRT, en fusjon av det forbedrede grønnfluorescerende protein til hTRT (se Eksempel 6 og 15) eller epitop-merket hTRT (LBI FLAG, se Eksempel 6), begge gjenopprettet telomeraseaktivitet til ca. villtype-nivå, ble koeksprimert med hTR.

Derimot ble telomeraseaktivitet ikke gjenopprettet når en variant hTRT, pro90hTRT (som manglet RT-motivene B', C, D og E) ble benyttet. Dette viser at pro90hTRT ikke har full telomerase katalytisk aktivitet, selv om det kan ha andre delaktiviteter (f.eks. RNA [dvs. hTR] bindende evne og virke som dominant-negativ regulator av telomerase in vivo, som beskrevet ovenfor).

D. Bestemmelse av in vitro rekonstituert telomeraseaktivitet ved å benytte gel-blott og konvensjonell telomerasebestemmelse

Det følgende eksempel viser at in vitro rekonstituert (IVR) telomerase kan bestemmes ved å benytte konvensjonelle telomerasbestemmelser i tillegg til amplifikasjonsbaserte tester (dvs. TRAP). IVR-telomerase som beskrevet i Del(B), ovenfor (den «koblet rekonstitusjonsmetode») etterfulgt av DEAE-rensing, som beskrevet ovenfor, ble analysert ved å benytte gel-blott-testen under bruk av følgende reaksjonsbetingelser: 1-10 uL koblet IVR-telomerase i 40 uL sluttvolum av 25 mM Tris HCl, pH 8,3,50 mM K-acetat, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl2, 0,8 mM dATP, 0,8 mM TTP, 1,0 mM dGTP og 1 uM primer (M2, supra; eller H3.03, 5'-TT AGGGTT AGGGTT AGGG) ved 30°C i 180 minutter. Den syntetiserte telomere DNA ble isolert ved hjelp av standardmetoder, separert på en 8% polyakrylamid, 8 M ureagel, overført til en nylonmembran og probeundersøkt ved å benytte P-(CCCTAA)n riboproben benyttet i dot-blott-testen. Denne probe identifiserte en seks nukleotiders stige i den bane som representerer 10 uL IVR-telomerase som var lik stigen observert for 5 uL nativ nukleær telomerase renset ved monoQ- og heparin-kromatografi. Resultatene viser at IVR-telomerase har prosesserende telomerase katalytisk aktivitet som tilsvarer nativ telomerase.

Koblet IVR-telomerase ble også bestemt ved hjelp av den konvensjonelle P-dGTP-inkorporeirngs-telomerasebestemmelse. IVR-telomerase fremstillet ved hjelp av den koblede rekonstitusjonsmetoden etterfulgt av DEAE-rensing, som beskrevet ovenfor, ble testet både under prosesserende og ikke-prosesserende reaksjonsbetingelser. Testbetingelsene var: 5-10 nL koblet IVR-telomerase i 40 uL sluttvolum av 25 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM K-acetat, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl2,2 mM dATP, 2 mM TTP, med 10 uM <32>P-dGTP

(72 Ci/mmol) [for testing av prosesserende betingelser] eller 1 uM <32>P-dGTP (720 Ci/mmol)

[for ikke-prosesserende], og 1 uM primer (dvs. H3.03, supra) ved 30°C [for den prosesserende reaksjon] eller 37°C [for den ikke-prosesserende reaksjon] i 180 minutter. Den syntetiserte telomere DNA ble isolert etter standardmetoder og separert på en 8% polyakrylamid, 8 M urea-gel. Den prosesserende reaksjon viste en svak seks nukleotiders stige

overensstemmende med en prosesserende telomerasereaksjon, og den ikke-prosesserende reaksjon adderte én repetisjon, et mønster som er likeverdig med en kontrollreaksjon med en nativ telomerasefremstilling. Konvensjonelle tester ved bruk av IVR-telomerase er anvendelige ved screeninger med henblikk på telomerasemodulatorer, som her beskrevet, i likhet med andre anvendelser, som f.eks. utforskning av de strukturelle og funksjonelle egenskaper ved telomerase.

E. In vitro rekonstituert telomerase gjenkjenner primer 3'-terminaler

Dette forsøk viser at IVR-telomerase gjenkjenner primer 3'-terminaler som er ekvivalente med nativ (renset) telomerase. Telomerase danner en baseparet dupleks mellom primer 3'-enden og templatregionen av hTR og adderer de neste angitte nukleotidene (Morin, 1989, supra). For å bekrefte at IVR (rekombinant) telomerase har den samme egenskap, ble reaksjonene til primere med GGG eller —TAG 3'-terminaler

(AATCCGTCGAGCAGAGGG og AATCCGTCGAGCAGATAG) sammenlignet med en primer som hadde en —GT 3'-terminal (M2 supra) ved å benytte IVR, og nativ telomerase bestemt ved hjelp av den totrinns konvensjonelle TRAP-test som er angitt i detalj ovenfor. Produkstigene av —GGG og —TAG primere ble forskjøvet henholdsvis +4 og +2, sammenlignet med standardprimeren (—GTT 3'-ende), den samme effekt som ble observert med nativ telomerase. Dette forsøk demonstrerer at IVR og native telomeraser gjenkjenner primerender på en lignende måte.

Disse resultatene (sammen med resultatene ovenfor som viser at IVR-telomerase har både prosesserende og ikke-prosesserende katalytisk aktivitet) tyder på IVR-telomerase har lignende struktur og egenskaper sammenlignet med nativ eller renset telomerase.

EKSEMPEL 8

PRODUKSJON AV ANTI-hTRT-ANTISTOFFER

A. Produksjon av anti-hTRT-antistoffer mot hTRT-peptider

For å produsere anti-hTRT-antistoffer ble følgende peptider fra hTRT syntetisert med addisjonen av C (cystein) som den aminoterminale rest (se Figur 54).

S-l: FFY VTE TTF QKN RLF FYR KSV WSK

S-2: RQH LKR VOL RDV SEA EVR QHR EA

S-3: ART FRR EKR AER LTS RVK ALF SVL NYE

A-3: PAL LTS RLR FIP GPD GLR PIV NMD YVV

Cysteindelen ble benyttet for å immobilisere (dvs. kovalent koble) peptidene til BSA og KLH [keyhole limpet hemocyanin] bærerproteiner. KLH-peptidene ble benyttet som antigen. BSA-peptidkonjugatene tjente som materiale for ELISA for testing av spesifisiteten av immun-antisera.

KLH-peptidkonjugatene ble injisert i New Zealand hvite kaniner. Initial-injeksjonene gjøres ved å anbringe injektet proksimalt til de aksillare og ingvinale lymfeknutene. Påfølgende injeksjoner ble foretatt intramuskulært. For initialinjeksjoner ble antigenet emulgert med Freunds komplette adjuvans; for påfølgende injeksjoner ble Freunds ufullstendige adjuvans benyttet. Kaninene følger en tre ukers booster-injeksjonscyklus, hvor 50 mL blod som gir 20-25 mL serum, uttas 10 dager etter hver boosterdose. Antisera mot hver av de fire peptidene gjenkjente hTRT-delen av rekombinant hTRT-fusjonsprotein (GST-HISg-hTRT-fragment 2426 til 3274; se Eksempel 6) på western-blott.

Ved å benytte en delvis renset telomerasefraksjon fra humane 293-celler (ca. 1000 gangers rensing sammenlignet med et rått kjerneekstrakt) som ble produsert som beskrevet i PCT søknad nr. 97/06012, og affinitetsrensede anti-S-2-antistoffer, kunne en 130 kd proteindublett påvises på et Western-blott. Det ble benyttet en følsom kjemiluminescens-påvisningsmetode (SuperSignal kjemiluminescens-substrates, Pierce), men signalet på dette blott var svakt, hvilket tyder på at hTRT forekommer i lav eller meget lav rikelighet i disse immortale cellene. Iakttagelsen av en dublett stemmer overens med en post-translasjonell modifikasjon av hTRT, dvs. fosforylering eller glykosylering.

For affinitetsrensing ble S-2-peptidet immobilisert til SulfoLink (Pierce, Rockford IL) gjennom dens N-terminale cysteinrest i henhold til produsentens anvisning. Det første uttatte blodserum fra en kanin immunisert med KLH-S-2-peptidantigenet ble avsatt over denne S-2-SulfoLink, og antistoffer spesifikt bundet til S-2-peptidet ble eluert.

B. Fremstilling av anti-hTRT-antistoffer mot hTRT fusjonsproteiner

GST-hTRT fusjonsproteiner ble uttrykt i E. coli som GST-hTRT-fragment nr. 4 (nukleotidene 3272-4177) og GST-HIS8-hTRT-fragment nr. 3 (nukleotidene 2426 til 3274) proteinene beskrevet i Eksempel 6. Fusjonsproteinene ble renset som uløselig protein, og renheten av antigenene testet på SDS polyakrylamidgel, og det GST-hTRT-fragment nr. 4 rekombinante protein anslått å være ca. 75% rent og det GST-HIS8-hTRT-fragment nr. 3 rekombinante protein mer enn 75% rent. Det kan benyttes rutinemetoder for å oppnå disse og andre fusjonsproteiner i en renhet på mer enn 90%. Disse rekombinante proteinene ble benyttet til å immunisere både kaniner og mus slik som beskrevet ovenfor.

De første og andre blodprøver fra både mus og kaniner ble testet på nærværet av anti-hTRT-antistoffer etter at anti-GST-antistoffer var uttatt, ved å benytte en matriks inneholdende immobilisert GST. Antiserumet ble testet med henblikk på anti-hTRT-antistoffer ved Westem-blotting under bruk av immobilisert rekombinant GST-hTRT fusjonsprotein, og ved immunpresipitasjon under bruk av delvis renset nativt telomeraseenzym. Selv om det ikke ble observert noe signal i disse tidligere blodprøvene, øket titerne av anti-hTRT-antistoffer som forventet i senere blodprøver.

EKSEMPEL 9

PÅVISNING AV EN hTRT mRNA SOM SVARER TIL Al 82 RNA-VARI ANTEN

poly A<+>RNA fra humane testikler og 293-cellelinjen ble analysert med henblikk på hTRT mRNA under bruk av RT-PCR og nestede primere. Det første primersettet var TCP 1.1 og TCP1.15; det andre primersettet var TCP1.14 og BTCP6. Amplifikasjon fra hvert av disse ga to produkter som adskilte seg ved 182 bp; hvor de større og mindre produktene fra testikkel RNA ble sekvensert og funnet å tilsvare nøyaktig henholdsvis pGRN121 (Figur 16) og klon 712562 (Figur 18). hTRT RNA-variantproduktet er blitt observert i mRNA fra SW39i; OVCAR4,293 og testikler.

Det ble foretatt ytterligere eksperimenter for å demonstrere at Al 82 cDNA ikke var en artefakt av revers transkripsjon. I korthet ble full lengde hTRT RNA (dvs. uten delesjonen) produsert ved in vitro transkripsjon av pGRN121 for bruk som templat for RT-PCR. Separate cDNA-syntesereaksjoner ble foretatt ved å benytte Superscript® revers transkriptase (Bethesda Research Laboratories, Bethesda MD) ved 42°C eller 50°C og med tilfeldige primere eller med en spesifikk primer. Etter 15 PCR-runder var det lengre produktet påvisbart, mens den mindre produktet (tilsvarende delesjonen) ikke var påvisbart selv etter 30 eller flere runder. Dette tyder på at RT-PCR-produktet ikke er en artefakt.

EKSEMPEL 10

SEKVENSERING AV TESTIKKEL hTRT mRNA

Sekvensen av testikkelformen av hTRT RNA ble bestemt ved direkte manuell sekvensering av DNA-fragmenter frembragt ved PCR fra testikkel cDNA (Marathon Testes cDNA, Clontech, San Diego, CA) ved å benytte et ThermoSequenase radiolabeled terminator cycle sequencing kit (Amersham Life Science). PCR-trinnet ble foretatt ved en nestet PCR som vist i Tabell 8.1 alle tilfellene ble det foretatt en negativ kontrollreaksjon med primere, men uten cDNA. Fravær av produkt i kontrollreaksjonen viste at produktene oppnådd ved omsetningen med cDNA tilstede, ikke skyldtes forurensning av hTRT fra pGRN121 eller andre cellekilder (f.eks. 293-celler). DNA-fragmentene ble snittet ut fra agarosegel for å rense DNA før sekvensering.

Testikkel mRNA-sekvensen som tilsvarer basene 27 til 3553 i den innskutte pGRNl21 -sekvens og som inneholdt hele hTRT ORF (base 56 til 3451) ble oppnådd. Det var ingen forskjeller mellom testikkel- og pGRNl21-sekvensene i denne region.

EKSEMPEL 11

PÅVISNING AV hTRT mRNA VED RNASE-BESKYTTELSE

RNase-beskyttelsestester kan benyttes for å påvise, overvåke eller diagnostisere nærværet av en hTRT mRNA eller mRNA-variant. En illustrerende RNase-beskyttelseprobe er en in vitro syntetisert RNA bestående av sekvenser som er komplementære til hTRT mRNA-sekvenser i tillegg til ikke-komplementære sekvenser. Sistnevnte sekvenser er inkludert for å skjelne den full-lengde probe fra det fragment av proben som skriver seg fra et positivt testresultat. I en positiv test er probens komplementære sekvenser beskyttet mot RNase-oppslutning fordi de er hybridisert til hTRT mRNA. De ikke-komplementære sekvensene kuttes bort fra proben i nærvær av RNase og komplementært nukleinsyre-mål.

To RNase-beskyttelsesprober som begge kan benyttes i testen, er beskrevet som illustrasjon. Probene adskiller seg i deres sekvenskomplementaritet overfor hTRT, men inneholder identiske ikke-komplementære sekvenser, som i denne utførelsesform er avledet fra den SV-40 sene mRNA-ledersekvens. Fra 5'-3' utgjør én probe 33 nukleotider av ikke-komplementær sekvens og 194 nukleotider av en sekvens komplementær til hTRT nukleotidene 2513-2707 for en full-lengdes probe med størrelse 227 nukleotider. Fra 5'-3' utgjøres den andre probe av 33 nukleotider ikke-komplementær sekvens og 198 nukleotider av en sekvens som er komplementær med hTRT nukleotidene 2837-3035 for en full-lengdes probe med størrelse 231 nukleotider. For å foreta testen kan den ene av probene hybridiseres til RNA, dvs. poly A<+> RNA fra en testprøve, hvorpå Tl-ribonuklease og RNase A tilsettes. Etter oppslutning renses probe RNA og analyseres ved gelelektroforese. Påvisning av et 194 nukleotidfragment av 227 nukleotidproben eller et 198 nukleotidfragment av 231 nukleotidproben tyder på hTRT mRNA i prøven.

De illustrerende RNase-beskyttelsesprober som er beskrevet i dette eksempel kan utvikles ved in vitro transkripsjon under bruk av T7 RNA-polymerase. Radioaktive eller på annen måte merkede ribonukleotider kan inkluderes for syntese av merkede prober. Templatene for in vitro transkripsjonsreaksjonen for å fremstille RNA-prober, er PCR-produkter. Disse illustrerende probene kan syntetiseres ved å benytte T7-polymerase etter PCR-amplifikasjon av pGRN121 DNA under bruk av primere som spenner over den tilsvarende region av hTRT-genet eller mRNA. I tillegg inneholder nedstrøms primeren T7 RNA-polymerase promotersekvenser og de ikke-komplementære sekvensene.

For utvikling av den første RNase-beskyttelsesprobe benyttes PCR-produktet fra følgende primerpar (T701 og reversOl):

For utvikling av den andre RNase-beskyttelsesprobe benyttes PCR-produktet fra følgende primerpar (T702 og revers02):

EKSEMPEL 12

KONSTRUKSJON AV ET FYLOGENETISK TRE SOM SAMMENLIGNER hTRT

OG ANDRE REVERSE TRANSKRIPTASER

Et fylogenetisk tre (Figur 6) ble konstruert ved sammenligning av de syv RT-domenene som er definert av Xiong & Eickbush (1990, EMBO J. 9:3353). Etter sekvens-tilpasning av motivene 1, 2 og A-E fra 4 TRT-, 67 RT- og 3 RNA-polymeraser, ble treet konstruert ved å benytte NJ- (Neighbor Joining) metoden (Saitou & Nei, 1987, Mol. Biol. Evol. 4:406). Elementer fra den samme klasse som er lokalisert på den samme gren av treet er forenklet som en boks. Lengden av hver boks tilsvarer det mest avvikende element innen vedkommende boks.

TRT synes å være nærmere beslektet med slike RT som er assosiert med msDNA, gruppe fl-introner, og non-LTR (Long Terminal Repeat) retrotransposoner enn med LTR-retrotransposonet og virale RT. Forholdet mellom telomerase RT og non-LTR-grenen av retroelementer er interessant dersom disse sistnevnte elementene har erstattet telomerase for telomer opprettholdelse i Drosophila. Det mest slående funn er imidlertid at TRT danner en egen undergruppe, nesten like nært beslektet med de RNA-avhengige RNA-polymeraser av pluss-kjedede RNA-virus som f.eks. poliovirus, som til en hvilken som helst av de tidligere kjente RT. I betraktning av at de fire telomerasegenene kommer fra evolusjonsmessig fjerne organismer - protozoer, sopp og pattedyr - kan denne separate gruppering ikke forklares ved mangel på fylogenetisk diversitet i datasettet. I stedet tyder denne dype todeling på at telomerase RT er en eldgammel gruppe som muligens stammer fra den første eukaryot.

GenBank proteinidentifikasjon eller tilgangsnummere benyttet i den fylogenetiske analyse, var: msDNA (94535, 134069, 134074, 134075, 134078), gruppe D introner (483039, 101880, 1332208,1334433,1334435, 133345,1353081), mitokondrie-plasmid/RTL (903835, 134084), non-LTR retrotransposoner (140023, 84806, 103221, 103353, 134083,435415, 103015,1335673, 85020,141475,106903,130402, U0551,903695,940390,2055276, L08889), LTR retrotransposoner (74599, 85105, 130582,99712, 83589, 84126,479443, 224319,130398, 130583, 1335652,173088,226407, 101042, 1078824), hepadnavirus (118876, 1706510, 118894), caulimovirus (331554, 130600,130593,93553), retrovirus (130601, 325465, 74601, 130587, 130671, 130607, 130629, 130589, 130631, 1346746, 130651, 130635,1780973,130646). Tilpasning ble analysert ved bruk av ClustalW 1.5 [J. D. Thompson, D.G. Higgins, T.J. Gibson, Nucleic Acids Res. 22,4673 (1994)] og PHYLIP 3.5 [J. Felsenstein, Cladisfics 5, 164 (1989)].

EKSEMPEL 13

TRANSFEKSJON AV DYRKEDE HUMANE FIBROBLASTER (BJ) MED

KONTROLLPLASMID OG PLASMID SOM KODER hTRT

Dette eksempel viser at ekspresjon av rekombinant hTRT-protein i en pattedyrcelle resulterer i utvikling av en aktiv telomerase. Subkonfluente BJ-fibroblaster ble trypsinisert og resuspendert i ferskt medium (DMEM/199 inneholdende 10% føtalt kalveserum) i en konsentrasjon på 4 x IO<6> celler/mL. Cellene ble transfektert ved å benytte elektroporering med BioRad Gene Pulser™ electroporator. Eventuelt kan man også transfektere celler ved å benytte Superfect™ reagens (Qiagen) i henhold til produsentens instruksjoner. For elektroporering ble 500 uL av cellesuspensjonen anbragt i en elektroporeringskyvette (BioRad,

0,4 cm elektrode gap). Plasmid DNA (2 ug) ble tilsatt til kyvettene og suspensjonen ble forsiktig blandet og inkubert på is i 5 minutter. Kontrollplasmidet (pBBS212) inneholdt intet innskudd etter MPSV-promoteren, og det eksperimentelle plasmid (pGRN133) uttrykte hTRT fra MPSV-promoteren. Cellene ble elektroporert med 300 Volt og 960 uFD. Etter at pulsen

var avgitt ble kyvettene anbragt på is ca. 5 minutter før utplating på 100 mm vevskulturskåler i medium. Etter 6 timer ble mediet erstattet med ferskt medium. 72 timer etter transfaksjonen ble cellene trypsinisert, vasket én gang med PBS, pelletert og oppbevart nedfrosset ved -80°C. Celleekstrakter ble fremstillet i en konsentrasjon på 25.000 celler/uL ved en modifisert detergent-lyseringsmetode (se Bodnar et al., 1996, Exp. Cell Res. 228:58; Kim et al., 1994, Science 266:2011, og som beskrevet i patenter og publikasjoner med relasjon til TRAP-testen, ovenfor) og telomeraseaktivitet i celleekstraktene ble bestemt ved å benytte en modifisert PCR-basert TRAP-test (Kim et al., 1994, Bodnar et al., 1996). I korthet ble 5 x IO<4> celleekvivalenter benyttet i reaksjonens telomeraseprimer-ekstensjonsdel. Selv om ekstraktet i alminnelighet tas direkte fra telomerase-ekstensjonsreaksjonen til PCR-amplifikasjon, kan man også ekstrahere én gang med fenol/kloroform og én gang med kloroform før PCR-amplifikasjonen. En femtedel av materialet ble benyttet i PCR-amplifikasjonsdelen av TRAP-reaksjonen (ca. 10.000 cellekvivalenter). Halvparten av TRAP-reaksjonsblandingen ble avsatt på gelen for analyse, slik at hver bane i Figur 25 representerer reaksjonsprodukter fra 5.000 celleekvivalenter. Ekstrakter fra celler transfektert med pGRN133 var positive med henblikk på telomeraseaktivitet, mens ekstrakter fra utransfekterte (ikke vist) eller kontrollplasmid-transfekterte celler ikke oppviste noen telomeraseaktivitet. Lignende forsøk ved bruk av RPE-celler ga det samme resultat.

Rekonstituering i BJ-celler ble også foretatt ved å benytte andre hTRT-konstruksjoner (dvs. pGRN145, pGRN155 og pGRN138). Rekonstituering ved å benytte disse konstruksjonene syntes å resultere i mer telomeraseaktivitet enn i de pGRN133 transfekterte cellene.

Det høyeste telomeraseaktivitetsnivå ble oppnådd ved å benytte pGRN155. Som diskutert ovenfor er pGRNl 55 en vektor som inneholder adenovirusets «major late» promoter som et kontrollerende element for ekspresjonen av hTRT og som viste seg å gjenopprette telomeraseaktivitet når den ble transfektert inn i BJ-celler.

Særlig når rekonstitusjon ble foretatt ved å benytte hTRT-GFP-fusjonsproteinet pGRN138 (som lokaliseres til kjernen, se Eksempel 15, nedenfor) enten in vitro (se Eksempel 7) eller in vivo (transfeksjon til BJ-celler) resulterte dette i telomeraseaktivitet. Ved transfeksjon inn i BJ-celler, for eksempel som beskrevet ovenfor, var telomeraseaktiviteten sammenligbar med den som skrev seg fra rekonstitusjon in vitro ved bruk av pGRN133 eller pGRN145.

Lignende resultater ble oppnådd etter transfeksjon av normalt humant retinalt pigmentert epitel (RPE) med hTRT-ekspresjonsvektorene ifølge oppfinnelsen. Aldringen av RPE-celler antas å bidra til eller forårsake, den aldersrelaterte sykdom maculadegenerasjon. RPE-celler behandlet i henhold til fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen under bruk av hTRT-ekspresjonsvektorer ifølge oppfinnelsen, burde oppvise forsinket aldring sammenlignet med ubehandlede celler, og således være egnet ved transplantasjon for å behandle eller forhindre aldersrelatert maculadegenerasjon.

EKSEMPEL 14

PROMOTER RAPPORTØRKONSTRUKSJON

Dette eksempel beskriver konstruksjonen av plasmider hvor rapportørgener er operativt koblet til hTRT oppstrømssekvenser inneholdende promoterelementer. Vektorene har en rekke anvendelser, inklusivt identifisering av cis- og trans-transkripsjonelle regulator-faktorer in vivo og for screening av midler som er i stand til å modulere (f.eks. aktivere eller inhibere) hTRT-ekspresjon (f.eks. medikament-screening). Selv om det kan benyttes en rekke rapportører (f.eks. ildflue-luciferase, P-glukuronidase, p-galaktosidase, kloramfenikolacetyl-transferase og GFP og lignende) ble humansekretert alkalisk fosfatase (SEAP; Clone Tech) benyttet for de innledende forsøk. SEAP-rapportørgenet koder for en trunkert form av placenta-enzymet som mangler membranforankirngsdomenet, hvorved proteinet lar seg utsondre effektivt fra transfekterte celler. Nivåer av SEAP-aktivitet påvist i kulturmediet, har vært vist å være direkte proporsjonale med endringer i intracellulære konsentrasjoner av SEAP mRNA og protein (Berger et ai, 1988, Gene 66:1; Cullen et ai, 1992, Meth. Enzymol. 216:362).

Fire konstruksjoner (pGRN148, pGRNISO, «pSEAP2 basic» (ingen promotersekvenser = negativ kontroll) og «pSEAP2 control» (inneholder den SV40 tidlige promoter og enhancer) ble i tre paralleller transfektert inn i dødelige og udødelige celler.

Plasmid pGRN148 ble konstruert som illustrert i Figur 9.1 korthet ble et Bgin-Eco47lff-fragment fra pGRN144 oppsluttet og klonet inn i Bglll-NruI-setet av pSeap2Basic (Clontech, San Diego, CA). En andre rapportørpromoter, plasmid pGRNISO, inkluderer sekvenser fra hTRT-intronet beskrevet i Eksempel 3 for å anvende regulator-sekvenser som kan forekomme i intronet. Den initierende Met muteres til Leu, slik at den andre ATG etter promoterregionen vil være det initierende ATG av SEAP ORF.

pGRN148- og pGRNl 50-konstruksjonene (som inkluderer hTRT-promoteren) ble transfektert inn i dødelige (BJ-celler) og udødelige (293-celler). Alle transfeksjonene ble foretatt parallelt med to kontrollplasmider; et negativt kontrollplasmid (pSEAP basic) og ett positivt kontrollplasmid (pSEAP kontroll som inneholder den SV40 tidlige promoter og SV40 enhanceren).

I udødelige celler synes pGRN148- og pGRNl 50-konstruksjoner å drive SEAP-ekspresjonen like effektivt som den pSEAP2 positive kontroll (inneholdende den SV40 tidlige promoter og enhancer). I dødelige celler derimot ga bare pSEAP2 kontrollen påvisbar aktivitet. Disse resultatene tyder som forventet, på at hTRT promotersekvensene er aktive i tumorceller, men ikke i dødelige celler.

Lignende resultater ble oppnådd ved å benytte andre normale cellelinjer (RPE eller retinate pigmentepitelceller). I RPE-celler transfektert med pGRNISO (inneholdende 2,2 KB av oppstrøms genomisk sekvens) var hTRT promoterregionen inaktiv, mens pSEAP2 kontrollplasmidet var aktivt.

Som nevnt ovenfor er plasmider hvor rapportørgener er operativt koblet til hTRT oppstrømssekvenser som inneholder promoterelementeri usedvanlig nyttige for identifikasjon og screening av telomeraseaktivitetsmodulerende midler, ved å benytte både transiente og stabile transfeksjonsteknikker. For eksempel fremstilles stabile transformanter av pGRN148 i telomerase-negative og telomerase-positive celler, ved kotransfeksjon med en eukaryot selekterbar markør (som f.eks. ned) i henhold til Ausubel et al., 1997, supra. De resulterende cellelinjer benyttes for screening av antatte telomerase-modulerende midler, for eksempel ved å sammenligne hTRT promoter-styrt ekspresjon i og uten nærvær av en testforbindelse.

Promoter-rapportør- (og andre) vektorer ifølge oppfinnelsen benyttes også for å identifisere trans- og cis-virkende transkripsjonene og translasjonelle regulatorelementer. Eksempler på cis-virkende transkripsjonene regulatorelementer er bl.a. promotere og enhancere av telomerasegenet. Identifiseringen og isoleringen av cis- og trans-virkende regulatormidler fører til ytterligere metoder og reagenser for identifisering av midler som modulerer transkripsjon og translasjon av telomerase.

EKSEMPEL 15

SUBCELLULÆR LOKALISERING AV hTRT

Et fusjonsprotein som har hTRT og forsterkede grønnfluorescerende protein-regioner (EGFP; Cormack et al, 1996, Gene 173:33) ble konstruert som beskrevet nedenfor. EGFP-delen gir en påvisbar merking eller signal slik at nærvær eller lokalisering av fusjonsproteinet lett kan bestemmes. Siden EGFP-fusjonsproteiner er lokalisert i de riktige cellulære rom, kan denne konstruksjon benyttes til å bestemme den subcellulære lokalisering av hTRT-protein.

A. Konstruksjon av pGRN138

Én vektor for ekspresjon av et hTRT-EGFP fusjonsprotein i pattedyrceller ble konstruert ved å anbringe EcoRI-innskuddet fra pGRN124 (se Eksempel 6) inn i EcoRI-setet

av pEGFP-C2 (Clontech, San Diego, CA). Aminosyresekvensen av fusjonsproteinet er angitt nedenfor. EGFP-rester er i fete typer, rester som kodes av den 5-utranslaterte region av hTRT mRNA er understreket og hTRT-proteinsekvensen er i normal font.

Andre EGFP-fusjonskonstruksjoner kan fremstilles ved å benytte partiell (f.eks. trunkert) hTRT-kodende sekvens og benyttes slik som beskrevet nedenfor, til å identifisere aktiviteter i bestemte områder av hTRT-polypeptidet.

B. Nukleær lokalisering og anvendelser av pGRNl38

Transfeksjon av NLH293- og BJ-celler med pGRN138 bekreftet den nukleære lokalisering av rekombinant uttrykt hTRT. Celler ble transfektert med pGRN138 (EGFP-hTRT) og med en kontrollkonstruksjon (som kun uttrykker EGFP). Nukleær lokalisering av EGFP-hTRT er ved fluorescensmikroskopi tydelig i begge celletyper. Som nevnt ovenfor støtter pGRN138 hTRT-EGFP-fusjonsproteinet gjenopprettelse av telomeraseaktivitet både i et in vitro transkripsjons/translasjons-system og in vivo når det transfekteres inn i BJ-celler.

hTRT-EGFP-fusjonsproteinene (eller lignende påvisbare fusjonsproteiner) kan benyttes i en rekke anvendelser. For eksempel kan fusjonskonstruksjonen beskrevet i dette eksempel eller en konstruksjon av EGFP og en trunkert form av hTRT, benyttes til å vurdere den evne hTRT og varianter har til å innta en cellekjerne og/eller lokaliseres i kromosom-endene. I tillegg benyttes celler som er stabilt eller transient transfektert med pGRNl 38 for

screening av forbindelser for å identifisere telomerase-modulerende medikamenter eller forbindelser. Midler som griper inn i den nukleære lokalisering eller telomer-lokalisering, kan identifiseres som telomerase-inhibitorer. Tumorcellelinjer som stabilt uttrykker EGFP-hTRT kan være anvendelige for dette formål. Potensielle modulatorer av telomerase vil bli administrert til disse transfekterte cellene og lokaliseringen av EGFP-hTRT bli fastslått. I tillegg kan FACS eller andre fluorescens-baserte metoder benyttes til å selektere celler som uttrykker hTRT for å gi homogene populasjoner for medikament-screening, særlig når det benyttes transient transfeksjon av celler.

Ved andre anvendelser kan regioner av hTRT mutageniseres til å identifisere regioner (f.eks. restene 193-196 (PRRR) og 235-240 (PKRPRR)) som fordres for nukleær lokalisering, og som er mål for anti-telomerasemedikamenter (telomeraseaktivitetsmodulatorer). Andre anvendelser omfatter: bruk av fusjonsproteinet som en fluorescens-markør av effektiv celletransfeksjon både for transiente transfeksjonsforsøk og ved etablering av stabile cellelinjer som uttrykker EGFP-hTRT;

ekspresjon av en hTRT-EGFP-fusjon med muterte nukleære lokaliseringssignaler (defekt med hensyn til nukleær lokalisering) i udødelige celler slik at hTRT mutant EGFP oppfanger alle hTR av de udødelige cellene, beholder det i cytoplasmaet og forhindrer telomer-opprettholdelse; og

bruk som et merket protein for immunpresipitasjon.

EKSEMPEL 16

EFFEKT AV MUTASJON PÅ TELOMERASE KATALYTISK AKTIVITET

Dette eksempel beskriver hTRT proteinvarianter som har endrede aminosyrer og endret telomerase katalytisk aktivitet. Aminosyresubstitusjoner etterfulgt av funksjonell analyse er en standardmåte å vurdere betydningen og funksjonen av en polypeptidsekvens på. Dette eksempel viser at endringer i de reverse transkriptase- (RT) og telomerase- (T) motivene påvirker telomerase katalytisk aktivitet.

Det benyttes konvensjonell nomenklatur for å beskrive mutanter: mål-resten i det native molekyl (hTRT) angis med énbokstavskode og posisjon, og den tilsvarende rest i mutantproteinet angis med énbokstavskode. Således angir for eksempel «K626A» en mutant hvor lysinet i posisjon 626 (dvs. i motiv 1) av hTRT er endret til alanin.

A. Mutasjon av hTRT FFYxTE motiv

I innledende forsøk ble det fremstillet en vektor som koder for et hTRT mutantprotein «F560A», hvor aminosyren 560 i hTRT var endret fra fenylalanin (F) til alanin (A) ved stedsrettet mutagenese av pGRN121 under bruk av standardtekinkker. Denne mutasjon river opp TRT FFYxTE-motivet. Det resulterende F560A mutante polynukleotid ble vist å styre syntese av et full-lengdes hTRT-protein, hvilket ble fastslått ved å benytte et cellefritt retikulocyttlysat-transkripsjons/-translasjonssystem i nærvær av <35>S-metionin.

Når mutantpolypeptidet ble kotranslatert med hTR som beskrevet i Eksempel 7, ble det ved hjelp av TRAP under bruk av 20 runder PCR, ikke påvist noen telomeraseaktivitet, mens en kontroll hTRT/hTR-kotranslasjon gjenopprettet aktivitet. Med 30 runder PCR i TRAP-bestemmelsen, var det med den mutante hTRT mulig å observere telomeraseaktivitet, men den var betydelig lavere enn kontrollen (villtype hTRT).

B. Ytterligere stedsrettet mutagenese av hTRT aminosyrerester

Konserverte aminosyrer i seks RT-motiver ble endret til alanin ved å benytte standardteknikker for stedsrettet mutagenese (se f.eks. Ausubel, supra) for å vurdere deres bidrag til katalytisk aktivitet. Mutantene ble bestemt ved å benytte IVR-telomerase under bruk av den totrinns konvensjonelle TRAP-test som er detaljert beskrevet i Eksempel 7.

K262A- (motiv 1), R631A- (motiv 2), D712A- (motiv A), Y717A- (motiv A), D868A-(motiv C) mutanter hadde betydelig redusert eller upåvisbar telomeraseaktivitet, mens Q833A- (motiv B) og G932A- (motiv E) mutanter oppviste midlere aktivitetsnivåer. To mutasjoner utenom RT-motivene, R688A og D897A, hadde aktivitet som var likeverdig med villtype hTRT. Disse resultatene stemte overens med analoge mutasjoner i reverse transkriptaser (Joyce et al., 1994, Ann. Rev. Biochem. 63:777) og ligner resultater oppnådd med Est2p (se Lingner, 1997, Science 276:561). Forsøkene identifiserer rester i RT-motivet som er avgjørende og ikke-avgj ørende for enzymatisk aktivitet, og viser at hTRT er det katalytiske protein av human telomerase. Mutasjonene fører til hTRT-polypeptidvarianter som kan anvendes, f.eks. som dominant/negative regulatorer av telomeraseaktivitet.

Aminosyretilpasning av de kjente TRT identifiserte et telomerase-spesifikt motiv, motiv T (se ovenfor). For å bestemme den katalytiske rolle av dette motiv i hTRT, ble det konstruert en seks aminosyrers delesjon i dette motiv (A560-565; FFYxTE) ved å benytte standardteknikker for stedsrettet mutagenese (Ausubel, supra). Delesjonen ble analysert ved å benytte IVR-telomerase under bruk av den totrinns konvensjonelle/tTRAP-test som er detaljert beskrevet i Eksempel 7. Denne A560-565 mutant hadde ingen observerbar telomeraseaktivitet etter 25 runder PCR, mens villtype hTRT IVR-telomerase frembragte et sterkt signal. Hver aminosyre i hver rest i motiv T, ble uavhengig undersøkt på lignende måte. Mutantene 560A, Y562A, T564 og E565A beholdt midlere telomeraseaktivitetsnivåer, mens en kontrollmutant, F487A, hadde minimal effektiv på aktiviteten. Særlig hadde mutant F561A sterkt redusert eller upåvisbar telomeraseaktivitet, mens aktiviteten var fullt gjenopprettet i dens «revertant», F561A561F. F561A561F endrer den muterte posisjon tilbake til dens opprinnelige fenylalanin. Dette er en kontroll som viser at det i plasmidet ikke inntrådte andre aminosyreendringer som kunne forklare den iakttatte nedsatte aktivitet. T-motivet er således det første non-RT-motiv som er vist å være absolutt nødvendig for telomeraseaktivitet.

Motiv T kan benyttes for identifisering av TRT fra andre organismer, og hTRT-proteiner som omfatter varianter av dette motiv, kan benyttes som en dominant/negativ regulator av telomeraseaktivitet. Til forskjell fra de fleste andre RT assosierer telomerase stabilt med og kopierer, en liten del av en enkel RNA (dvs. hTR), og motiv T kan således være involvert i mediering av hTR-binding, prosesserbarheten av reaksjonen eller andre funksjoner som er unike for telomerase RT.

EKSEMPEL 17

SCREENING MED HENBLIKK PÅ TELOMERASEAKTIVITETSMODULATORER VED Å BENYTTE REKOMBINANT UTTRYKTE TELOMERASEKOMPONENTER

Dette eksempel beskriver anvendelsen av in vitro rekonstituert telomerase til screening og identifisering av telomeraseaktivitetsmodulatorer. Den beskrevne test lar seg lett tilpasse

masseundersøkelser (ved å benytte flerbrønnsplater og/eller robotsystemer). På bakgrunn av denne beskrivelse vil adskillige variasjoner i analysetrinnene være åpenbare for fagmannen.

Rekombinantkloner for telomeraseforbindelser (f.eks. hTRT og hTR) transkriberes og translateres (bare hTRT) i den etterfølgende in vitro reaksjon og som beskrevet i Eksempel 7 ovenfor, ved å benytte det TNT®T7 Coupled Reticulocyte Lysate System (Promega), som er beskrevet i US-patent 5.324.637 i henhold til produsentens instruksjoner:

Reaksjonsblandingen inkuberes ved 30°C i 2 timer. Produktet renses deretter på et ultrafree-MC DEAE-filter (Millipore).

Det rekombinante telomeraseprodukt (rVRP) analyseres med og uten nærvær av ulike konsentrasjoner testforbindelser som solubiliseres i DMSO (f.eks. 10 uM-100 uM). Testforbindelser preinkuberes i et totalvolum på 25 uL i 30 minutter ved romtemperatur i nærvær av 2,5 uL F/RP, 2,5% DMSO og lx TRAP-buffer (20 mM Tris-HCl, pH 8,3,1,5 mM MgCl2, 63 mM KC1, 0,05% Tween 20, 1,0 mM EGTA, 0,1 mg/mL bovint serumalbumin). Etter preinkuberingen tilsettes 25 uL av TRAP-testreaksjonsblandingen til hver prøve. TRAP-testreaksjonsblandingen består av lx TRAP-buffer, 50 uL dNTP, 2,0 ug/mL primer ACX,

4 ug/mL primer U2, 0,8 attomol/mL TSU2, 2 enheter/50 uL Taq-polymerase (Perkin Eimer) og 2 u.g/mL [ P]5'-endemerket primer TS (3000 Ci/mmol). Reaksjonsrørene anbringes deretter i PCR thermocycler (MJ Research) og PCR foretas som følger: 60 minutter ved 30°C, 20 runder på {30 sek. ved 94°C, 30 sek. ved 60°C, 30 sek. ved 72°C}, 1 minutt ved 72°C, nedkjøling til 10°C. TRAP-testen er som nevnt ovenfor, beskrevet i US-patent 5.629.154. De anvendte primere og substrater har sekvensene:

Etter at PCR-trinnet er fullført tilsettes 4 uL av 10X ladningsbuffer inneholdende bromfenolblått til hvert reagensrør, og produktene (20 uL) analyseres på en 12,5% ikke-denaturerende PAGE i 0,5X TBE ved 400 V. Den ferdige gel tørkes og TRAP-produktene visualiseres ved hjelp av Phosphorimager eller ved autoradiografi. Telomeraseaktiviteten i nærvær av testforbindelsen måles ved å sammenligne inkorporeringen av merking i reaksjonsproduktet med en parallell reaksjon uten midlet.

Følgende kloner beskrevet i Eksemplene, er blitt deponert hos American Type Culture Collection, Rockville, MD 20852, USA:

Lambda fag X25-1.1 ATCC tilgangsnummer 209024

Claims

1. Polynukleotid, karakterisert ved at det omfatter en sekvens som koder for et polypeptid som er i stand til å utvise en telomerase katalytisk aktivitet når assosisert med et telomerase-RNA og som er; (a) et polynukleotid som har sekvensen av innskuddet av plasmid ATCC 209016, eller (b) et polynukleotid som hybridiserer til (a) under stringente betingelser, eller (c) et polynukleotid som hybridiserer til SEQ LD NO : 3, eller SEQ LD NO : 8 under stringente betingelser, eller (d) en polynukleotidsekvens som er degenerert som et resultat av den genetiske koden av sekvensen definert i (a) eller (b).

2. Polynukleotid i følge krav 1, karakterisert ved at det er operabelt forbundet med en promoter.

3. Anvendelse av et polynukleotid i følge krav 1, i måling eller screening av en hTRT-gensekvens eller hTRT-RNA.

4. Anvendelse av et polynukleotid i følge krav 1 eller krav 2, for fremstilling av en rekombinant vertscelle.

5. Vektor, karakterisert ved at den inneholder et polynukleotid i følge krav 1.

6. Celle, karakterisert ved at den inneholder en vektor ifølge krav 5.

7. In vitro anvendelse av en ekspresjonsvektor, inneholdende et polynukleotid i følge krav 1, i å uttrykke et polypeptid i stand til å utvise en telomerase katalytisk aktivitet når assosiert med et telomerase-RNA.

8. Blanding, karakterisert ved at den omfatter i det minste 20% human telomerase katalytisk protein som har sekvensen kodet for av polynukleotidet i følge krav 1, blandingen utviser telomerase katalytisk aktivitet kun dersom et telomerase-RNA tilsettes til nevnte blanding slik at den assosieres til nevnte protein.

9. Anvendelse av blandingen i følge krav 8, i fremstilling av et kompleks ved kompleksering av en templat RNA-komponent med nevnte protein.

10. Anvendelse av et polynukleotid i følge krav 1, i å øke den proliferative kapasitet til en vertebrat celle ved å introdusere nevnte polynukleotid inn i cellen in vitro.

11. Anvendelse av et polynukleotid oppnåelig ved ekspresjon av en vektor ifølge krav 5, i å øke den proliferative kapasitet til en vertebrat celle ved å introdusere nevnte polypeptid inn i cellen in vitro.

12. Anvendelse av en blanding i følge krav 8, i å øke den proliferative kapasitet i en vertebrat celle ved å introdusere nevnte blanding inn i cellen in vitro.

13. Fremgangsmåte for fremstilling av en rekombinant telomeraseblanding, karakterisert ved at den omfatter å uttrykke et polynukleotid i følge krav 1 for å fremstille et polypeptid, kontakte nevnte polypeptid med en templat RNA-komponent, fortrinnsvis en human telomerase RNA-komponent, under betingelser slik at nevnte polypeptid og nevnte telomerase-RNA assosierer for å danne et telomerase-enzym som er i stand til å katalysere addering av nukleotider til et telomerasesubstrat.

14. Antistoff eller bindingsfragment derav, karakterisert ved at det spesifikt binder seg et protein i stand til å utvise telomerase katalytisk aktivitet dersom nevnte protein er assosiert med et telomerase-RNA, nevnte protein har en sekvens kodet for av polynukleotidet i følge krav 1, nevnte antistoff eller fragment er fortrinnsvis monoklonal.

15. Hybridoma, karakterisert ved at den er i stand til å sekretere antistoffet i følge krav 14.

16. Fremgangsmåte for å bestemme hvorvidt en forbindelse, blanding eller behandling er en modulator av telomerase reverstranskriptase aktivitet eller ekspresjon, omfattende eksponering in vitro av en celle i følge krav 6 for forbindelsen, blandingen eller behandlingen og bestemme hvorvidt der er en forandring i telomerase reverstranskriptase aktivitet eller ekspresjon.

17. Fremgangsmåte for å tilveiebringe et legemiddel, karakterisert ved at den omfatter utføring av trinnene i fremgangsmåten ifølge krav 16, og deretter formulere en modulator av telomerase reverstranskriptase aktivitet eller hTRT-ekspresjon identifisert ved nevnte fremgangsmåte for farmasøytisk anvendelse for å oppnå modulering av telomerase reverstranskriptase aktivitet eller hTRT-ekspresjon.

18. Fremgangsmåte for å detektere et hTRT-genprodukt, mutant eller variant derav i en prøve, karakterisert ved at den omfatter å kontakte nevnte prøve med et antistoff eller bindingsfragment i følge krav 14 og bestemme hvorvidt et kompleks har blitt dannet med et hTRT-genprodukt, mutant eller variant.

19. Fremgangsmåte for å detektere et hTRT-genprodukt, mutant eller variant derav i en prøve, karakterisert ved at den omfatter å kontakte nevnte prøve med et polynukleotid i følge krav 1 eller et polynukleotid som omfatter en sekvens på i det minste 12 nukleotider, fortrinnsvis minst 15 nukleotider, identisk til eller eksakt komplementær til en tilstøtende sekvens av polypeptidet av del (a) i følge krav 1, og bestemme hvorvidt et hybridiseringskompleks har blitt dannet.

20. Fremgangsmåte for å detektere et hTRT-genprodukt, mutant eller variant derav i en prøve, karakterisert ved at den omfatter å benytte et polynukleotid som omfatter en sekvens på i det minste 12 nukleotider, fortrinnsvis minst 15 nukleotider, identisk til eller eksakt komplementær til en tilstøtende sekvens av polypeptidet av del (a) i følge krav l, i en amplifiseringsfremgangsmåte og bestemme hvorvidt et spesifikt amplifiseringsprodukt har blitt dannet.

21. Fremgangsmåte for detektering av nærvær av i det minste en telomerase positiv-human celle i en biologisk prøve omfattende humane celler, karakterisert ved at den omfatter; (a) måling av mengde av hTRT-genprodukt, mutant eller variant derav i nevnte prøve ved å utnytte trinnene i fremgangsmåten i følge et hvilket som helst av kravene 18 til 20, og (b) sammenligning av mengden av nevnte genprodukt, mutant eller variant slik målt, med en kontroll korrelert til en prøve som mangler telomerasepositive celler, hvor nærvær av høyere mengde av hTRT-genprodukt, mutant eller variant i nevnte prøve som sammenlignet med nevnte kontroll er korrelert med nærvær av telomerase-positive celler i nevnte biologiske prøve.

22. Fremgangsmåte for diagnostisering av en telomerase-relatert tilstand, karakterisert ved at den omfatter; (a) bestemmelse av mengde av et hTRT-genprodukt, mutant eller variant i en celle- eller vevsprøve fra en pasient som utnytter trinnene til fremgangsmåten i et hvilket som helst av kravene 18 til 20, og (b) sammenligning av mengden av nevnte genprodukt, mutant eller variant i en prøve med en mengde i en frisk celle eller vev av samme type, hvor en forskjellig mengde av nevnte genprodukt i prøven som sammenlignet med den friske cellen eller vevet er diagnostisk for en telomerase-relatert tilstand.

23. Testsett for deteksjon av et hTRT-gen, genprodukt, mutant eller variant, karakterisert ved at nevnte testsett omfatter et polynukleotid i følge krav 1 eller et polynukleotid som omfatter en sekvens på i det minste 12 nukleotider, fortrinnsvis minst 15 nukleotider, identisk til eller eksakt komplementær til en tilstøtende sekvens av polynukleotidsekvensen av del (a) i følge krav 1.

24. Testsett for deteksjon av et hTRT-gen, genprodukt, mutant eller variant, karakterisert ved at nevnte testsett omfatter et polypeptid oppnåelig ved ekspresjon av en vektor i følge krav 5.

25. Testsett for deteksjon av et hTRT-gen, genprodukt, mutant eller variant, karakterisert ved at nevnte testsett omfatter en blanding i følge krav 8.

26. Testsett for deteksjon av et hTRT-gen, genprodukt, mutant eller variant, karakterisert ved at nevnte testsett omfatter et antistoff eller bindings-fragment i følge krav 14.

27. Polynukleotid i følge krav 1, eller et polynukleotid som omfatter en sekvens på i det minste 12 nukleotider, eventuelt i det minste 15 nukleotider, identisk til eller eksakt komplementær til en tilstøtende sekvens av et polypeptid av del (a) i følge krav 1 for anvendelse som legemiddel.

28. Polypeptid, karakterisert ved a t det er oppnåelig ved ekspresjon aven vektor i følge krav 5, for anvendelse som et legemiddel.

29. Blanding i følge krav 8, for anvendelse som legemiddel.

30. Antistoff eller bindingsfragment i følge krav 14, for anvendelse som et legemiddel.

31. Anvendelse av et polynukleotid i følge krav 1 eller et polynukleotid som omfatter en sekvens på i det minste 12 nukleotider, eventuelt i det minste 15 nukleotider, identisk til eller eksakt komplementær til en tilstøtende sekvens av et polypeptid av del (a) i følge krav 1 for fremstilling av et legemiddel.

32. Anvendelse av et polynukleotid oppnåelig ved ekspresjon av en vektor i følge krav 5, for fremstilling av et legemiddel.

33. Anvendelse av en blanding i følge krav 8, for fremstilling av et legemiddel.

34. Anvendelse av et antistoff eller bindingsfragment i følge krav 14, i fremstilling av et legemiddel.

35. Anvendelse av et polynukleotid i følge krav 1, eller et polynukleotid som omfatter en sekvens på i det minste 12 nukleotider, eventuelt i det minste 15 nukleotider, identisk til eller eksakt komplementær til en tilstøtende sekvens av et polypeptid av del (a) i følge krav 1 for fremstilling av et legemiddel for å øke proliferasjonskapasiteten til en vertebrat celle, redusere proliferasjonskapasiteten til en vertebrat celle, eller behandle en tilstand assosiert med et forhøyet eller redusert nivå av telomeraseaktivitet.

36. Anvendelse av et polypeptid oppåelig ved ekspresjon av en vektor i følge krav 5, i fremstilling av et legemiddel for å øke proliferasjonskapasiteten i en vertebrat celle, redusere proliferasjonskapasiteten til en vertebrat celle, eller behandle en tilstand assosiert med et forhøyet eller redusert nivå av telomeraseaktivitet.

37. Anvendelse av en blanding i følge krav 8 i fremstilling av et medikament for å øke proliferasjonskapasiteten i en vertebrat celle, redusere proliferasjonskapasiteten i en vertebrat celle, eller behandle en tilstand assosiert med et forhøyet eller redusert nivå av telomerase-aktivitet.

38. Anvendelse av et antistoff eller bindingsfragment i følge krav 14, i fremstilling av et legemiddel for å øke proliferasjonskapasiteten i en vertebrat celle, redusere proliferasjonskapasiteten i en vertebrat celle, eller behandle en tilstand assosiert med et forhøyet eller redusert nivå av telomeraseaktivitet.

39. Farmasøytisk blanding, karakterisert ved at den omfatter et polynukleotid i følge krav 1, eller et polynukleotid som omfatter en sekvens på i det minste 12 nukleotider, eventuelt i det minste 15 nukleotider identisk til eller eksakt komplementær til en tilstøtende sekvens av et polypeptid av del (a) i følge krav 1, eventuelt sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer.

40. Farmasøytisk blanding, karakterisert ved at den omfatter et polynukleotid oppnåelig ved ekspresjon av en vektor i følge krav 5, eventuelt sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer.

41. Farmasøytisk blanding, karakterisert ved at den omfatter en blanding i følge krav 8, eventuelt sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer.

42. Farmasøytisk blanding, karakterisert ved at den omfatter et antistoff eller et bindingsfragment i følge krav 14, eventuelt sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer.

43. Anvendelse av et polynukleotid som omfatter en sekvens på i det minste 12 nukleotider, eventuelt i det minste 15 nukleotider, identiske til eller eksakt komplementær til en tilstøtende sekvens av polynukleotid i del (a) i følge krav 1 i fremstilling av en vaksine som er i stand til å utløse en immunrespons.

44. Anvendelse av et polypeptid oppnåelig ved ekspresjon av et polynukleotid i følge krav 1 i en vektor i følge krav 5, eller et immunogent fragment derav i fremstilling av en vaksine som er i stand til å utløse en immunrespons.

45. Anvendelse av en blanding i følge krav 8 i fremstilling av en vaksine som er i stand til å utløse en immunresponse.

46. Immunogent peptid av human telomerase protein, karakterisert ved at nevnte peptid omfatter i det minste 8, eventuelt i det minste 10 aminosyrer av et human telomerase protein kodet for av et polynukleotid i følge krav 1 for anvendelse i medisin.

47. Anvendelse av et immunogent peptid av human telomerase protein, karakterisert ved at nevnte peptid omfatter i det minste 5, eventuelt i det minste 8 eller i det minste 10 aminosyrer av human telomerase protein kodet for av et polynukleotid i følge krav 1 for fremstilling av et medikament for behandling av en tilstand mediert av celler som uttrykker høye nivåer av telomerase.