PL181019B1 - Składnik RNA ssaczej telomerazy i sposób wytwarzania rekombinowanego enzymu telomerazy - Google Patents

Składnik RNA ssaczej telomerazy i sposób wytwarzania rekombinowanego enzymu telomerazy

Info

Publication number
PL181019B1
PL181019B1 PL95318169A PL31816995A PL181019B1 PL 181019 B1 PL181019 B1 PL 181019B1 PL 95318169 A PL95318169 A PL 95318169A PL 31816995 A PL31816995 A PL 31816995A PL 181019 B1 PL181019 B1 PL 181019B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
telomerase
rna component
sequence
rna
human
Prior art date
Application number
PL95318169A
Other languages
English (en)
Other versions
PL318169A1 (en
Inventor
Bryant Villeponteau
Junli Feng
Walter Funk
William H. Andrews
Original Assignee
Geron Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US08/330,123 external-priority patent/US5583016A/en
Priority claimed from US08/472,802 external-priority patent/US5958680A/en
Priority claimed from US08/482,115 external-priority patent/US5776679A/en
Application filed by Geron Corp filed Critical Geron Corp
Publication of PL318169A1 publication Critical patent/PL318169A1/xx
Publication of PL181019B1 publication Critical patent/PL181019B1/pl

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B29—WORKING OF PLASTICS; WORKING OF SUBSTANCES IN A PLASTIC STATE IN GENERAL
    • B29C—SHAPING OR JOINING OF PLASTICS; SHAPING OF MATERIAL IN A PLASTIC STATE, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; AFTER-TREATMENT OF THE SHAPED PRODUCTS, e.g. REPAIRING
    • B29C59/00—Surface shaping of articles, e.g. embossing; Apparatus therefor
    • B29C59/02—Surface shaping of articles, e.g. embossing; Apparatus therefor by mechanical means, e.g. pressing
    • B29C59/04—Surface shaping of articles, e.g. embossing; Apparatus therefor by mechanical means, e.g. pressing using rollers or endless belts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12Y207/07049—RNA-directed DNA polymerase (2.7.7.49), i.e. telomerase or reverse-transcriptase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C12N2310/111—Antisense spanning the whole gene, or a large part of it
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
    • C12N2310/121—Hammerhead
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/13—Decoys
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/15—Nucleic acids forming more than 2 strands, e.g. TFOs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mechanical Engineering (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Shaping Of Tube Ends By Bending Or Straightening (AREA)
  • Extrusion Moulding Of Plastics Or The Like (AREA)

Abstract

1. Skladnik RNA ssaczej telomerazy w postaci zasadniczo czystej, znamienny tym, ze obejmuje sekwencje nukleotydowa zasadniczo identyczna z sekwencja RNA o sekwencji: 50 GGGUDGCGGAGGGAGGGOGGGCCUGGGAGGGGUGGUGGCCAUUUUUUGUC 100 DAACCCOAACUGAGAAGGGCGUAGGCGCCGUGCUUUUGCUCCCCGCGCGC 150 U G UUUU U CUCGCUGACUUUCAGCGGGCGGAAAAGCCUCGGCCUGCCGCCD ' 200 UCCACCGUUCAUUCOAGAGCAAACAAAAAAUGUCAGCUGCUGGCCCGUUC 250 GCCCCUCCCGGGACCUGCGGCGGGUCGCUGCCCAGCCCCCGAACCCCGCC ' 300 UGGAGGCCGCGGOCGGCCGGGGCUUCOCCGGAGGCACCCACUGCCACCGC 350 GAAGAGUUGGGCUCUGUCAGCCGCGGGUCDCUCGGGGGCGAGGGCGAGGU ' ' 400 UCACCGUUOCAGGCCGCAGGAAGAGGAACGGAGCGAGUCCCGCGCGCGGC 450 GCGAUUCCCUGAGCUAUGGGACGUGCACCCAGGACUCGGCUCACACAUGC ' ' 500 AGUUCGCUUUCCG UUGG UGGGGGGAACGCCGAUCGUGCGCAUCCGUCAC ' ' 550 CCCUCGCCGGCAGUGGGGGCUUGUGAACCCCCAAACCUGACUGACUGGGC 559 CAGUGUGCU. 12. Sposób wytwarzania rekombinowanego enzymu telomerazy, znamienny tym, ze obejmuje wprowadzanie do komórki gospodarza eukariotycznego, który wyraza bialkowy skladnik telomerazy, czasteczki rekombinowanego kwasu nukleinowego, obejmujacego pro- motor i sekwencje nukleotydowa kodujaca skladnik RNA ludzkiej telomerazy wedlug jed- nego z zastrz. 1 -4, znamienny tym, ze promotor jest polozony w sposób napedzajacy ekspresje sekwencji nukleotydowej. PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Dziedzina wynalazku
Niniejszy wynalazek dotyczy ludzkiej telomerazy, enzymu rybonukleolitycznego biorącego udział w syntezie ludzkiego telomerowego DNA. Wynalazek dostarcza sposobów i kompozycji związanych z dziedzinąbiologi molekularnej, chemii, farmakologii oraz technologii medycznej i diagnostycznej.
Opis stanu techniki
DNA na końcach lub telomerach chromosomów eukariotycznych zwykle składa się z prostych sekwencji powtórzonych tandemowo. Telomeraza jest enzymem rybonukleolitycznym, który syntetyzuje jedną nić telomerowego DNA przy zastosowaniu jako matrycy sekwencji zawartej w obrębie RNA będącego składnikiem enzymu (nazywanego dalej składnikiem RNA; przyp. tłum). Patrz Blackbum, 1992, Annu. Rev. Biochem. 61:113-129, włączony tu jako odnośnik literaturowy.
Składnik RNA ludzkiej telomerazy nie został do chwili obecnej opisany w literaturze naukowej, jakkolwiek wiadomo, że telomeraza ludzka syntetyzuje powtórzone jednostki telomerowe o sekwencji 5'-TTAGGG-3'. Patrz Morin, 1989, Celi 59: 521-529, i Morin, 1991, Naturę 353: 454-456, włączone tu jako odnośniki literaturowe. Wiedza ta nie była wystarczająca dla umożliwienia izolacji i identyfikacji pozostałej sekwencji nukleotydowej składnika RNA ludzkiej telomerazy. Sekwencja składnika RNA enzymów z Saccharomyces cerevisiae, pewnych gatunków Tetrahymena, jak również z innych orzęsków, takich jak Euplotes i Glaucoma została ustalona i przedstawiona w literaturze naukowej. Patrz Singer i Gottschling, 21 październik 1994, Science 266:404-409; Lingner i wsp., 1994, Genes &Development 8:1984-1988; Greider i Blackbum, 1989, Naturę 337: 331-337; Romero i Blackbum, 1991, Celi 67: 343-353; oraz Shippen-Lentz i Blackbum, 1990, Science 247: 546-552, każda z pozycji włączona tu jako odnośnik literaturowy. Telomerazy z tych orzęsków syntetyzują powtórzone jednostki telomerowe różniące się od ludzkich.
Istnieje ogromna potrzeba dalszych informacji o ludzkiej telomerazie. Pomimo natury, powtórzonych jednostek telomerowego DNA, wydającej się prostą, naukowcy widzą od dawna, że telomery mają ważną rolę biologiczną w uti-zymywaniu struktury i funkcji chromosomów. Ostatnio pojawiły się wśród naukowców spekulacje, że utrata centromerowego DNA może działać jako sygnał rozpoczynający starzenie się komórki i organizmu oraz, że regulacja telomerazy może mieć istotne skutki biologiczne. Patrz Harley, 1991, Mutation Research 256:271-282, włączony tu jako odnośnik literaturowy.
Sposoby wykrywania aktywności telomerazy, jak również identyfikacji składników, które regulują lub wpływają na aktywność telomerazy, łącznie ze sposobami leczenia i diagnozowania starzenia się komórek i unieśmiertelniania poprzez kontrolowanie długości telomerów i aktywności telomerazy zostały również opisane. Patrz publikacje patentowe PCT Nr: 95/13381, opublikowana 18 maja 1995; 95/13382, opublikowana 18 maja 1995 i 93/23572, opublikowana 25 listopada 1993 oraz zgłoszenie patentowe USA bez nadanego numeru zgłoszenia (wynalazcy
181 019
C. Harley, N. Kim S. Weinrich), złożone 7 czerwca 1995; 08/315 214 złożone 28 września 1994; 08/315 216, złożone 28 września 1994; 08/288 501, złożone 10 sierpnia 1994; 08/014 838, złożone 8 lutego 1993; 08/153 051 i 08/151 477, każde złożone 12 listopada 1993; 08/060 952, złożone 13 maja, 1993; 08/038 766, złożone 24 marca 1993 oraz 07/882 438, złożone 13 maja 1992, każda z pozycji włączona tu jako odnośnik literaturowy.
Można by się spodziewać znaczącego ulepszenia i pojawienia się nowych możliwości leczenia za pośrednictwem telomerazy i testów na telomerazę oraz metod przesiewowych, gdyby dostępne były w postaci czystej lub możliwej do wyizolowania kwasy nukleinowe zawierające składnik RNA i/lub kodujące białkowe części składowe telomerazy oraz znana była sekwencja nukleotydowa takich kwasów nukleinowych. Niniejszy wynalazek wychodzi naprzeciw tym i innym potrzebom i dostarcza takich ulepszeń i możliwości.
Streszczenie wynalazku
W pierwszym aspekcie, niniejszy wynalazek dostarcza składnika RNA, jak również genu dla składnika RNA ludzkiej telomerazy w zasadniczo czystej postaci, jak również kwasów nukleinowych zawierających całość lub co najmniej użyteczną część sekwencji nukleotydowej składnika RNA ludzkiej telomerazy. Niniejszy wynalazek dostarcza również kwasów nukleinowych dla składnika RNA z innych gatunków, które to kwasy nukleinowe wykazują istotną homologię ze składnikiem RNA ludzkiej telomerazy, włączając w to między innymi, składnik RNA telomerazy ssaków, takich jak naczelne. Inne użyteczne kwasy nukleinowe według wynalazku, obejmująkwasy nukleinowe o sekwencjach komplementarnych do składnika RNA; kwasy nukleinowe o sekwencjach pokrewnych, ale różniących się od sekwencji nukleotydowych składnika RNA i które oddziaływują ze składnikiem RNA lub genem dla składnika RNA lub białkowym składnikiem ludzkiej telomerazy w użyteczny sposób; oraz kwasy nukleinowe, które nie wykazują znaczącej homologii lub komplementamości do składnika RNA lub genu dla składnika RNA, ale działająna składnik RNA w pożądany i użyteczny sposób. Jak opisano bardziej obszernie poniżej, kwasy nukleinowe według wynalazku, obejmują zarówno cząsteczki DNA, jak i RNA oraz ich zmodyfikowane analogi i służą wielu użytecznym celom.
Jednym z użytecznych kwasów nukleinowych według wynalazku jest antysensowny oligonukleotyd, oligonukleotyd tworzący potrójną helisę albo inny oligonukleotyd lub oligonukleotyd mimetyczny (tj. antysensowny PNA-peptydowy kwas nukleinowy/poliamidowy kwas nukleinowy), które mogą być stosowane in vivo lub in vitro dla hamowania aktywności ludzkiej telomerazy. Takie ohgonukleotydy mogą blokować aktywność telomerazy na wiele sposobów, włączając w to zapobieganie transkrypcji genu dla telomerazy (na przykład poprzez tworzenie potrójnej helisy) lub poprzez wiązanie się ze składnikiem RNA telomerazy w sposób, który uniemożliwia łączenie się części składowych w funkcj onalna ryboproteinąbędącą telomerazą lub nie dopuszcza, aby składnik RNA, po włączeniu się do kompleksu enzymatycznego telomerazy, służył jako matryca dla syntezy telomerowego DNA. Typowo, i w zależności od sposobu działania, te oligonukleotydy według wynalazku, zawierająspecyficznąsekwencję o długości od około 10 do 200 lub więcej nukleotydów, która jest bądź identyczna, bądź komplementarna do specyficznej sekwencji nukleotydowej składnika RNA telomerazy.
Wynalazek dostarcza antysensownych polinukleotydów komplementarnych do sekwencji polinukleotydowych składnika RNA telomerazy, typowo komplementarnych do sekwencji polinukleotydowych, które są zasadniczo identyczne z sekwencją genu dla naturalnie występującego składnika RNA ssaczej telomerazy. Takie antysensowne nukleotydy są wykorzystywane do hamowania transkrypcji i/lub stabilności i/lub funkcjonowania klas składników RNA telomerazy, a zatem wpływają na zmniejszenie poziomu aktywności odpowiedniej telomerazy w komórce (np. komórce nowotworowej pacjenta). Takie antysensowne polinukleotydy mogą funkcjonować jako czynniki modulujące telomerazę poprzez hamowanie tworzenia się funkcjonalnego (aktywnego katalitycznie i o wysokim stopniu wierności) holoenzymu telomerazy, wymaganego dla prawidłowej replikacji telomeru i naprawy w komórce. Antysensowne polinukleotydy mogą być stosowane w połączeniu z innymi schematami leczenia przeciwnowotworowego takimi jak promieniowanie jonizujące lub chemoterapia (np. z czyn
181 019 niklem uszkadzającym DNA, takim jak bleomy cyna, cisplatyna, iperyt azotowy, doksyrubicyna, analogi nukleotydów i temu podobne.
Antysensowne polinukleotydy mogą prowadzić do śmierci komórkowej wrażliwych komórek (np. komórek prowadzących replikacja, wymagających aktywności telomerazy do naprawy DNA lub replikacji). Polinukleotydy antysensowne są zasadniczo identyczne z co najmniej 25 następującymi po sobie nukleotydami sekwencji komplementarnej do sekwencji ujawnionego tutaj RNA ze ssaczej telomerazy. Antysensownymi polinukleotydami sązazwyczaj ssDNA, ssRNA, polinukleotydy ze szkieletem metylofosfonianowym, polinukleotydy ze szkieletem mieszanym, poliamidowe kwasy nukleinowe i tym podobne antysensowne struktury znane w tej dziedzinie. W jednym z aspektów wynalazku antysensowny polinukleotyd jest podawany w celu hamowania transkrypcji i/lub aktywności składnika RNA telomerazy i aktywności telomerazy w komórce, takiej jak w komórce ludzkiej zdolnej do replikacji.
Wynalazek dostarcza nie w pełni kompelementamej matrycy polinukleotydowej, gdzie taki polinukleotyd ma sekwencję zasadniczo identyczną ze ssaczym składnikiem RNA telomerazy i zawiera sekwencję matrycową dla powtórzenia telomerowego, mającą co najmniej jednąniekomplementamązasadę w odniesieniu ludzkiej powtórzonej sekwencji telomerazowej 5'-TTAGGG-3', przy czym pozostała część jest komplementarna. Nie w pełni komplementarny polinukleotyd matrycowy zwykle zawiera pojedynczy niekomplementamy nukleotyd w stosunku do naturalnie występującej sekwencji matrycowej, a może zawierać dwa niekomplementame nukleotydy bądź jako sąsiadujące niekomplementame nukleotydy, bądź tak, że niekomplementame nukleotydy są oddzielone przez jeden lub więcej pasujących (komplementarnych) nukleotydów. Nie w pełni komplementarne polinukleotydy matrycowe według wynalazku, mają na ogół zdolność do wykazywania aktywności telomerazy w połączeniu z ludzkim składnikiem polipetydowym telomerazy, a zatem prowadzą do błędnego wstawienia nukleotydu w wybranych (niekomplementamych) pozycjach nukleotydowych w ludzkiej powtórzonej sekwencji telomerazowej, będącego konsekwencjąreplikacji powtórzenia telomerowego, naprawy i/lub dodania, wytwarzając w ten sposób telomery, które zależą od stałej obecności zmutowanego sensownego składnika RNA telomerazy, koniecznego dla zapewnienia istotnego poziomu replikacji i utrzymania długości telomeru.
Innym użytecznym rodzajem kwasu nukleinowego według wynalazku jest rybozym zdolny do specyficznego cięcia składnika RNA telomerazy, czyniąc ten enzym nieaktywnym. Jeszcze innym rodzajem użytecznego kwasu nukleinowego według wynalazku jest sonda lub starter, który wiąże się specyficznie ze składnikiem RNA ludzkiej telomerazy, a zatem może być zastosowany np. do wykrywania obecności telomerazy w próbce. W końcu, użyteczne kwasy nukleinowe według wynalazku, obejmujązrekombinowane ekspresyjne plazmidy do wytwarzania kwasów nukleinowych według wynalazku. Jednym ze szczególnie użytecznych rodzajów tego typu plazmidów jest plazmid stosowany w terapii genowej człowieka. Użyteczne plazmidy według wynalazku do terapii genowej człowieka są różnego rodzaju, włączając w to nie tylko te, które koduj ą antysensowne oligonukleotydy lub rybozymy, ale również takie, które kieruj ą ekspresj ą składnika RNA ludzkiej telomerazy albo odmiany składnika RNA ludzkiej (lub innych gatunków o sekwencjach składnika RNA zasadniczo homologicznych do ludzkiego składnika RNA) telomerazy lub genu dla telomerazy niosące delecje lub w inny sposób zmienione (zmutowane).
W jednym z wykonań, polinukleotyd mający część komplementarną do składnika RNA ssaczej telomerazy, wystarczającą do specyficznej hybrydyzacji w warunkach fizjologicznych, jest poddawany zmianom poprzez kowalencyjne dołączenie dodatkowego podstawnika chemicznego, bądź w czasie, bądź po zakończeniu syntezy polinukleotydu, co prowadzi do powstania pochodnej polinukleotydu, zdolnej do specyficznej hybrydyzacji z takim składnikiem RNA telomerazy. Pochodna polinukleotydu może odnajdywać endogenną telomerazę mającą taki składnik RNA, gdzie taka pochodna polinukleotydu prowadzi do zmian lub chemicznych modyfikacji składnika RNA i/lub składnika białkowego telomerazy, a zatem modyfikuje, zwykle poprzez obniżenie, aktywność enzymatyczną telomerazy.
181 019
Wynalazek dostarcza polinukleotydów odpowiednich do diagnozowania chorób związanych ze zmienionym poziomem i/lub strukturą składnika RNA telomerazy. Sondy polinukleotydowe obejmujące sekwencje, które są zasadniczo identyczne lub zasadniczo komplementarne do sekwencji nukleotydowej składnikaRNA ssaczej telomerazy, mogąbyć użyte do diagnozowania stanów chorobowych (np. nowotworów lub stanów przednowotworowych) poprzez wykrywanie składnika RNA telomerazy i/lub zmian strukturalnych składnika RNA telomerazy (np. skrócenia, zmian sekwencji, delecji lub wstawień i temu podobnych) i/lub zmian lub powielenia genu dla składnika RNA telomerazy w komórkach pobranych z pacjenta albo do wykrywania patognostycznego allelu dla składnika RNA ssaczej telomerazy (np. poprzez RFLP lub analizę PCR specyficzna dla allelu). Wykrywanie jest często dokonywane poprzez hybrydyzację in situ przy zastosowaniu wyznakowanych (np. 32P, 35S, 14C, 3H, fluorescencyjnych, biotynylowanych, digoksygeninowanych) anty sensownych polinukleotydów komplementarnych do składnika RNA ssaczej telomerazy, jakkolwiek może być użyta technika Northern, hybrydyzacja plamowa (ang. dot biot) lub hybrydyzacja w roztworze z całkowitym RNA lub RNA poli A +, izolowanym z próbek komórek, jak również powielenie poprzez PCR lub LCR przy zastosowaniu starterów specyficznych dla składnika RNA telomerazy. Komórki, które zawierajązmienionąilość (zwykle znacznie więcej) składnika RNA telomerazy, w porównaniu z komórkami nie-nowotworowymi tego samego typu (typów), są identyfikowane jako potencjalne komórki dotknięte chorobą, takie jak komórki przed-nowotworowe lub, niestety, komórki nowotworowe i mogą być identyfikowane jako mające potencjał przerzutowy. Podobnie, poprzez wykrycie patognostycznych zmian lub powielenia locus genu dla składnika RNA telomerazy lub blisko sprzężonych loci w próbce komórek, będzie można identyfikować obecność stanów patologicznych lub predyspozycji do wytworzenia stanów patologicznych (np. nowotworu, choroby genetycznej). Sondy dla składnika RNA ssaczej telomerazy sąrównież stosowane do identyfikacji osób dla celów sądowych, takich jak badanie ojcostwa lub identyfikacja podejrzanych o dokonanie przestępstwa lub nie zidentyfikowanych zmarłych.
W drugim aspekcie wynalazek dostarcza sposobów leczenia stanów chorobowych związanych z aktywnością telomerazy w komórce lub grupie komórek poprzez doprowadzenie do kontaktu komórki (komórek) ze skutecznymi leczniczymi ilościami czynnika, który zmienia aktywność telomerazy w tej komórce. Takie czynniki obejmują kwasy nukleinowe kodujące składnik RNA telomerazy, oligonukleotydy tworzące potrójną helisę, antysensowne nukleotydy, rybozymy i plazmidy oraz inne wektory do terapii genowej (np. wektory adenowirusowe, wektory wirusowe adenosatelitame itd.) służące do terapii genowej człowieka poprzez ekspresję składnika RNA telomerazy, antysensowny RNA w stosunku do składnika RNA telomerazy lub nie w pełni komplementarny składnik RNA telomerazy taki, jak opisano powyżej. W zbliżonym aspekcie wynalazek dostarcza kompozycji farmaceutycznych zawierających takie terapeutyczne czynniki, łącznie z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem lub solą, co może obejmować tworzenie liposomowych kompleksów infekujących, liposomy lub immunoliposomy dla dostarczenia w odpowiednie miejsce czynnika terapeutycznego.
Wynalazek dostarcza również kombinacji takich czynników terapeutycznych z udziałem telomerazy z innymi farmaceutykami, takimi jak czynniki przeciwnowotworowe i inne czynniki cytotoksyczne lub cytostatyczne; czynniki przeciwgrzybowe (np. do leczenia pacjentów z AIDS), nukleotydy, nukleozydy i ich analogi i inne czynniki farmaceutyczne odpowiednie do leczenia stanów chorobowych takich jak nowotworzenie, hiperplazja, infekcja HIV/AIDS i związane z tym stany patologiczne oraz inne choroby charakteryzujące się nienormalnym metabolizmem telomerów. Sposoby mogą obejmować zastosowanie pochodnej polinukleotydu zdolnej do specyficznej hybrydyzacji ze składnikiem RNA w ssaczej telomerazie, gdzie pochodna nukleotydu jest dostarczana do komórek ssaczych mających aktywność telomerazy i hamuje aktywność telomerazy poprzez dotarcie do składnika RNA telomerazy i inaktywację lub zahamowanie aktywności telomerazy.
Wynalazek dostarcza również czynników farmaceutycznych, które hamują nowotworzenie lub apoptozę poprzez modulowanie funkcji telomerazy przez hamowanie lub zwiększenie
181 019 wytwarzania składnika RNA telomerazy; takie czynniki mogąbyć stosowane jako leki. Takie leki znajdą zastosowanie przy leczeniu rozmaitych ludzkich i zwierzęcych chorób, takich jak nowotworzenie, hiperplazja, choroby neurodegeneracyjne, starzenie, AIDS, infekcje grzybowe itp. Czynnik składa się z wektora do terapii genowej, zdolnego do transkrypcji składnika RNA telomerazy lub jego nici komplementarnej, albo alternatywnie, enzymatycznie nieaktywny składnik RNA telomerazy, który będzie kompetytywnie hamował tworzenie funkcjonalnego holoenzymu telomerazy.
W trzecim aspekcie wynalazek dostarcza sposobów diagnozowania do określania poziomu, ilości, lub obecności składnika RNA ludzkiej telomerazy, telomerazy lub aktywności telomerazy w komórce, populacji komórek lub w próbce tkanki albo w ekstrakcie dowolnego z powyższych. W pokrewnym aspekcie wynalazek dostarcza użytecznych odczynników do zastosowania takich sposobów (włączając w to startery i sondy wspomniane powyżej), ewentualnie przygotowane w formie zestawu, łącznie z instrukcjami stosowania zestawu przy wprowadzaniu sposobu diagnozowania.
Niniejszy wynalazek dostarcza sposobu diagnozowania choroby (np. nowotworzenia) u osób chorych, gdzie test diagnostyczny (np. hybrydyzacja polinukleotydu in situ w utrawalonych komórkach poprzez znakowanie sondą dla składnika RNA telomerazy, która specyficznie wiąże się ze składnikiem RNA ludzkiej telomerazy lub sekwencjami genu) jest stosowany do określania, czy w próbce biologicznej z osoby chorej obecne jest wcześniej stwierdzone patognostyczne stężenie składnika RNA telomerazy; jeżeli test wykazuje obecność składnika RNA telomerazy wykraczającą poza normalny zakres (to jest powyżej stwierdzonego wcześniej stężenia patogenostycznego), pacjent jest diagnozowany jako chorujący lub wykazujący predyspozycje do zachorowania.
Polinukleotydy według wynalazku są stosowane do diagnozowania stanów chorobowych lub chorób genetycznych, które obejmująnowotworzenie, hiperplazję, przedwczesne lub nienormalne starzenie komórkowe lub inne stany komórkowe związane z funkcją telomerazy, a bardziej szczegółowo, stany i choroby, które obejmują zmianę struktury lub poziomu składnika RNA telomerazy lub sekwencji genu lub, które są związane z patognostycznym allelem dla składnika RNA telomerazy, który może być wykryty poprzez RFLP i/lub reakcją PCR specyficzną dla allelu albo innymi odpowiednimi sposobami wykrywania. Typowo, sposób ma zastosowanie do diagnozowania choroby (np. nowotworzenia) u ludzi, gdzie test diagnostyczny (np. określenie ilości i/lub struktury składnika RNA telomerazy) jest stosowany do określania, czy w próbce biologicznej z pacjenta obecne jest wcześniej stwierdzone patognostyczne stężenie składnika RNA telomerazy; jeżeli test wykazuje obecność składnika RNA telomerazy wykraczającą poza normalny zakres (to jest powyżej stwierdzonego wcześniej stężenia patognostycznego), pacjent jest diagnozowany jako chorujący lub wykazujący predyspozycje do zachorowania.
W czwartym aspekcie niniejszy wynalazek dostarcza preparatów zrekombinowanej telomerazy i sposobów wytwarzania takich preparatów. A zatem niniejszy wynalazek dostarcza zrekombinowanej ludzkiej telomerazy, która zawiera składniki białkowe ludzkiej telomerazy, jak również składniki białkowe telomerazy z gatunków ssaków ze składnikiem RNA zasadniczo homologicznym do składnika RNA telomerazy, w połączeniu ze zrekombinowanym składnikiem RNA według wynalazku. Takie cząsteczki zrekombinowanego składnika RNA według wynalazku obejmują cząsteczki, które różnią się od naturalnie występujących cząsteczek składnika RNA jednym lub więcej podstawieniem zasad, delecją dodaniem na końcach i/lub wstawieniem, jak również cząsteczki składnika RNA identyczne z naturalnie występującym składnikiem RNA, które są wytwarzane w komórkach zrekombinowanego gospodarza.
Sposób wytwarzania takich cząsteczek zrekombinowanej telomerazy obejmuje transformowanie eukariotycznej komórki gospodarza, w której następuje ekspresja składnika białkowego telomerazy, zrekombinowanym wektorem ekspresyjnym, który koduje cząsteczkę składnika RNA według wynalazku i hodowanie takich komórek gospodarza, transformowanych takim wektorem, w takich warunkach, że składnik białkowy i składnik RNA telomerazy podlegająekspresji i łączą się, z wytworzeniem aktywnej cząsteczki telomerazy, zdolnej do dodawania
181 019 sekwencji (niekoniecznie tej samej sekwencji, która jest dodawana przez natywną telomerazę) do telomerów w chromosomalnym DNA.
Jako piąty aspekt wynalazek dostarcza sposobów oczyszczania składnika białkowego ludzkiej telomerazy, jak również składnika białkowego telomerazy z gatunków ssaków mających składnik RNA zasadniczo homologiczny do składnika RNA ludzkiej telomerazy. Niniejszy wynalazek dostarcza również sposobów izolowania i identyfikowania kwasów nukleinowych kodujących takie składniki białkowe. Jako pokrewne aspekty, niniejszy wynalazek dostarcza oczyszczonej ludzkiej telomerazy z gatunków ssaków mających składnik RNA zasadniczo homologiczny do składnika RNA ludzkiej telomerazy, jak również oczyszczonych kwasów nukleinowych, które kodująjeden lub więcej składników takiej telomerazy. Niniejszy wynalazek dostarcza również kompozycji farmaceutycznych, zawierających jako składnik aktywny białkową część składową telomerazy lub kwas nukleinowy, który koduje lub oddziałowuje z kwasem nukleinowym, który koduje składnik białkowy telomerazy.
Jako szósty aspekt, wynalazek dostarcza sposobów identyfikowania czynników, które modulują (to jest hamują zwiększają lub zmieniają specyficzność) aktywność ssaczej telomerazy. Takimi czynnikami modulującymi telomerazę są często cząsteczki (np. mniejsze niż około 3000 Daltonów) i mogąbyć stosowane do modyfikowania aktywności telomerazy in vitro i in vivo, często w celu działania leczniczego, oraz są stosowane jako odczynniki laboratoryjne i/lub farmaceutyki.
Wynalazek dostarcza sposobów identyfikacji z banku albo bilblioteki czynników, potencjalnego czynnika do modulowania aktywności telomerazy poprzez modulowanie niekowalencyjnego wiązania składnika RNA ssaczej telomerazy ze składnikiem białkowym telomerazy. Składnik RNA telomerazy może być wytwarzany ze zrekombinowanej matrycy w komórce gospodarza lub, jeśli trzeba, syntetyzowany chemicznie. Typowo, doprowadza się do kontaktu składnika białkowego ssaczej telomerazy, takiego, który można oczyścić z komórek, w których następuje ekspresja telomerazy, i z którego może być usunięty naturalnie występujący składnik RNA telomerazy (np. poprzez traktowanie RN Azą), że składnikiem RNA ssaczej telomerazy w odpowiednich wodnych warunkach wiązania celem umożliwienia niekonwalencyjnego związania się RNA i składników białkowych w nieobecności dodawanych czynników (tj. w kontrolnej reakcji wiązania). Siła niekonwalencyjnego oddziaływania pomiędzy składnikiem RNA telomerazy i składnikiem białkowym w obecności jednego lub więcej czynników wybranych z biblioteki lub banku czynników jest porównywana z siłą niekowalencyjnego wiązania w kontrolnej reakcji wiązania, zawierającej składniki RNA i białkowe telomerazy i nie zawierające czynnika (czynników); czynniki, które prowadzą do statystycznie znaczącego wzrostu siły niekowalencyjnego oddziaływania pomiędzy składnikiem RNA telomerazy i składnikiem białkowym są zatem określane jako potencjalne czynniki modulujące telomerazę. Względna siła niekowalencyjnego wiązania może być oznaczona dowolnym z odpowiednich sposobów, włączając w to określenie specyficznego powinowactwa wiązania, takiego jak test współzawodnictwa wiązania, określenie aktywności katalitycznej telomerazy na odpowiedniej matrycy będącej telomerowym powtórzeniem lub innymi odpowiednimi testami funkcjonalnego niekowalencyjnego oddziaływania miedzy RNA i składnikami białkowymi ssaczej telomerazy, takimi jak przesunięcie w żelu lub EMS A (zmiana ruchliwości elektroforetycznej w żelu).
W przypadku testu na niekowalencyjne wiązanie dla wykrycia potencjalnych czynników modulujących telomerazę, jeden ze składników lub oba, składnik RNA telomerazy i składnik białkowy są wyznakowane odpowiednim znacznikiem, który można wykryć i niekowalencyjne wiązanie jest określane oddzielnie, w obecności i nieobecności czynnika wybranego z biblioteki lub banku czynników. Określenie niekowalencyjnego wiązania obejmuje pomiar, w jakim stopniu wyznakowany składnik telomerazy (składnik RNA łub składnik białkowy) wiąże się ze spokrewnionym składnikiem telomerazy (odpowiednio, składnikiem białkowym lub RNA), gdy taki spokrewniony składnik telomerazy jest odrębnie wyznakowany lub jest niewyznakowany, w taki sposób, jak na przykład poprzez wyłapywanie (np. unieruchamianie) związanych kompleksów zawierających taki wyznakowany składnik telomerazy i taki pokrewny składnik te
181 019 lomerazy i oddzielenie (np. poprzez wymywanie) nie związanego, wyznakowanego składnika telomerazy od takich związanych kompleksów, wytwarzając w ten sposób oddzieloną frakcję związanąi wykrywając związane kompleksy w oddzielonej frakcji związanej poprzez określenie obecności możliwego do wykrycia znacznika. Czynniki, które prowadzą do statystycznie znaczącego obniżenia lub zwiększenia niekowalencyjnego wiązania składników RNA i białkowych telomerazy są zatem identyfikowane jako potencjalne czynniki modulujące dla telomerazy. Czynniki, które obniżają niekowalencyjne wiązanie są kandydatami na inhibitory telomerazy (lub antagoniści), podczas gdy czynniki, które zwiększają niekowalencyjne wiązanie składników telomerazy są kandydatami na protagonistów dla telomerazy.
Potencjalnie czynniki modulujące telomerazę są identyfikowane poprzez ich zdolność do powodowania statystycznie znaczącego obniżenia lub zwiększenia aktywności enzymatycznej ssaczej telomerazy, zawierającej składnik białkowy telomerazy i składnik RNA telomerazy.
Potencjalne czynniki modulujące telomerazę są identyfikowane poprzez ich zdolność do powodowania statystycznie znaczącego obniżenia lub zwiększenia transkrypcji reporterowej sekwencji polinukleotydowej (np. genu dla b-galaktozydazy, genu dla lucyferazy, genu HPRT) połączonej w sposób funkcjonalny z sekwencjąregulującątranskrypcję genu dla składnika RNA ssaczej telomerazy, korzystnie składnika RNA ludzkiej telomerazy, w aktywnych metabolicznie komórkach ssaczych. W jednym z wariantów, endogenny gen dla składnika RNA telomerazy w komórce ssaczej jest celem dla homologicznego konstruktu kierującego, w celu umieszczenia polinukleotydowej sekwencji reporterowej tak, aby uzyskać funkcjonalne połączenie z sekwencjami regulującymi transkrypcję (np. promotorem) położonymi na końcu 5' endogennego genu dla składnika RNA telomerazy w locus chromosomalnym endogennego genu.
W alternatywnym wariancie, egzogenny polinukleotyd, zawierający polinukleotyd reporterowy jest połączony w sposób funkcjonalny z transkrypcyjnym regionem regulacyjnym genu dla składnika RNA ssaczej telomerazy (np. promotorem i leżącymi po stronie 5' miejscami wiązania dla czynników transkrypcyjnych), egzogenny polinukleotyd jest przenoszony do ssaczej komórki, gdzie może być nie-homologicznie włączony do chromosomu i/lub utrzymywany lub replikowany jako polinukleotyd episomalny. Czynniki, które prowadzą do statystycznie znaczącego modulowania transkrypcji reporterowego polinukleotydu w komórkach traktowanych tym czynnikiem są zatem identyfikowane jako potencjalne czynniki modulujące dla telomerazy.
Kompozycje do identyfikacji potencjalnych czynników modulujących dla telomerazy zwykle zawierają: (1) składnik białkowy ssaczej telomerazy, taki jaki można oczyścić z komórek ssaczych. w których następuje ekspresja telomerazy, korzystnie z komórek naczelnych (np. człowieka), i który jest zazwyczaj pozbawiony połączonego z nim składnika RNA, o ile taki jest obecny, poprzez działanie RNAząlub inne traktowanie zapewniające usunięcie składnika RNA i zachowanie zdolności białka do odzyskania aktywności telomerazy w obecności pokrewnego składnika RNA telomerazy w odpowiednich warunkach wiązania, (2) składnik RNA ssaczej telomerazy, korzystnie ludzki składnik RNA wytwarzany poprzez transkrypcję zrekombinowanego polinukleotydu w komórce oraz (3) warunki wiązania w wodzie (np. warunki fizjologiczne, warunki testu dla telomerazy), oraz ewentualnie (4) polinukleotyd reporterowy, zawierający co najmniej jedną sekwencję powtórzoną ssaczej telomerazy, która może podlegać replikacji lub wydłużaniu, zwykle komplementarny do sekwencji części matrycowej tego składnika RNA komplementarnej do sekwencji powtórzenia telomerowego, i ewentulanie (5) nukleotydy odpowiednie do replikacji i/lub wydłużania takiej (takich) sekwencji powtórzenia telomerowego polinukleotydu reporterowego w warunkach testu dla telomeru; czynnik jest zazwyczaj dodawany do takiej kompozycji celem oceny niekowalencyjnego wiązania i/lub aktywności telomerazy w porównaniu z kompozycją kontrolną pozbawioną takiego czynnika.
Jako siódmy aspekt, wynalazek dostarcza również alleli nuli genów dla składnika RNA ssaczej telomerazy, takich jakie są wytwarzane poprzez homologiczne kierowanie heterologicznego polinukleotydu do genu dla składnika RNA ssaczej telomerazy celem funkcjonalnej inaktywacji genu dla składnika RNA ssaczej telomerazy. Wynalazek dostarcza zwierząt ze zinaktywowanym genem (ang. knockout), zawierających allel nuli dla składnika RNA ssaczej telomerazy, a jako je
181 019 den z wariantów, dostarcza zwierząt ze zinaktywowanym genem, homozygotycznych względem alleli nuli dla składnika RNA ssaczej telomerazy i zasadniczo pozbawionych aktywności egzogennej telomerazy, będącej wynikiem braku endogennego składnika RNA telomerazy. Takie zwierzęta ze zinaktywowanym genem mają zastosowanie między innymi jako handlowo dostępne produkty do testów toksykologicznych, są sprzedawane do badań w laboratoriach farmaceutycznych dla identyfikacji lub badania czynników modulujących telomerazę, jako zwierzęta domowe oraz jako zwierzęta hodowlane.
Jako ośmy aspekt wynalazek dostarcza sposobu unieśmiertelniania komórek ssaczych, takich jak pożądane komórki do fermentacji w bioreaktorach lub pożądane komórki szczepu, który ma korzystne cechy jako handlowy produkt do badań. Sposób obejmuje wprowadzenie do ssaczych komórek polinukleotydu, dzięki któremu następuje ekspresja funkcjonalnego składnika RNA telomerazy, który ma zdolność do tworzenia funkcjonalnego enzymu telomerazy w obecności białkowego składnika telomerazy.
Inne cechy i zalety wynalazku będą jasne z następującego opisu rysunków, korzystnego wykonania wynalazku, przykładów i zastrzeżeń.
Definicje
Stosowany tutaj termin „polinukleotyd dla składnika RNA telomerazy” odnosi się do polinukleotydu o długości co najmniej 20 nukleotydów, gdzie taki polinukleotyd zawiera odcinek o długości co najmniej 20 nukleotydów, które: są w co najmniej 85 procentach identyczne z sekwencją naturalnie występującego składnika RNA ssaczej telomerazy, typowo, składnika RNA telomerazy naczelnych, takiego jak składnik RNA telomerazy ludzkiej lub małpiej. Niektóre polinukleotydy dla składnika RNA telomerazy, wykazujące zmiany sekwencji w porównaniu z sekwencją naturalnie występującego składnika RNA telomerazy lub sekwencjądo niego komplementarną, mogą być przydatne jako sondy do hybrydyzacji, startery do PCR startery do powlekania LCR, RNA nie w pełni komplementarne i temu podobne.
Stosowany tutaj termin „odpowiada” oznacza, że sekwencja polinukleotydowa jest homologiczna (tj. jest identyczna, nie całkowicie pokrewna ewolucyjnie) do całej lub części sekwencji polinukleotydowej będącej odniesieniem lub, że sekwencja polinukleotydowa jest identyczna z sekwencjąpolipeptydowąbędącąodniesieniem. Dla odróżnienia, stosowany tu termin „komplementarny do” oznacza, że sekwencja komplementarna jest homologiczna do całej lub części sekwencji polinukleotydowej będącej odniesieniem. Jako ilustracja, sekwencja nukleotydowa „TATAC” odpowiada sekwencji „TATAC” i jest komplementarna do sekwencji „GTATA’ będącej odniesieniem.
Następujące terminy są stosowane do opisania zależności między sekwencjami dwóch lub większej liczby polinukleotydów: „sekwencja stanowiąca odniesienie”, „okno porównywania”, „identyczność sekwencji”, „procent identyczności sekwencji” i „zasadnicze podobieństwo”. „Sekwencja stanowiąca odniesienie” jest określoną sekwencją stosowaną jako podstawą jako podstawa do porównania sekwencji; sekwencja stanowiąca odniesienie może być częścią większej sekwencji, na przykład sekwencją odcinka genu o pełnej długości dla składnika RNA telomerazy. W ogólności, sekwencja stanowiąca odniesienie ma długość co najmniej 20 nukleotydów, nierzadko co najmniej 25 nukleotydów, a często co najmniej 50 nukleotydów. Ponieważ w przypadku dwóch polinukleotydów każdy może (1) zawierać sekwencję (tj. część całkowitej sekwencji polinukleotydowej), która wykazuje podobieństwo pomiędzy dwoma polinukleotydami, oraz (2) może ponadto zawierać sekwencję, która różni się między tymi dwoma polinukleotydami, porównywanie sekwencji pomiędzy dwoma (lub większą liczbą) polinukleotydów jest zazwyczaj przeprowadzane poprzez porównywanie sekwencji dwóch polinukleotydów w „oknie porównywania” celem zidentyfikowania i porównania mniejszych regionów podobieństwa sekwencji.
Stosowany tutaj termin „okno porównywania” oznacza odcinek co najmniej 25 następujących po sobie nukleotydów, gdzie sekwencja polinukleotydowa może być porównywana z sekwencją będącą odniesieniem, złożoną z co najmniej 25 następujących po sobie nukleotydów i gdzie część sekwencji polinukleotydowej w oknie porównania może zawierać
181 019 wstawienia lub delecje (to jest przerwy) stanowiące 20 procent lub mniej w porównaniu z sekwencją stanowiącą odniesienie (która nie zawiera wstawień lub delecji) celem optymalnego dopasowania względem siebie dwóch sekwencji. Optymalne dopasowanie sekwencji celem dopasowania okna porównywania może być prowadzone poprzez algorytm lokalnej homologii Smitha i Watermana (1981) Adv. Aopl. Math. 2: 482, poprzez algorytm homologicznego dopasowania wg Needleman i Wunsch (1970), J. Mol. Biol. 48: 443, poprzez poszukiwanie podobieństwa metodą Pearsona i Lipmana (1988) Proc. Natl, Acad. Sci. (USA) 85: 2444, poprzez komputerowe zastosowanie tych algorytmów (GAP BESTFIT, FASTA, i TFASTA w Wisconsin Genetics Software Package Release 20 7,0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), lub przez sprawdzenie, i wybiera się najlepsze dopasowanie (to jest dające najwyższy poziom homologii dla okna porównywania) uzyskane różnymi metodami.
Termin „identyczność sekwencji” oznacza, że dwie sekwencje polinukleotydowe są identyczne (tj. na zasadzie nukleotyd z nukleotydem) w oknie porównywania. „Procent identyczność sekwencji” jest obliczany poprzez porównanie dwóch optymalnie dopasowanych sekwencji w oknie porównywania, określenie liczby pozycji, w których w obu sekwencjach występują identyczne zasady kwasu nukleinowego (na przykład A, T, G, C, U, lub I), uzyskując liczbę pasujących pozycji, podzielenie liczby pasujących pozycji przez całkowitą liczbę pozycji w oknie porównywania (to jest rozmiar okna) i pomnożenie wyniku przez 100, uzyskując procent identyczności sekwencji. Stosowany tu termin „zasadnicze podobieństwo” oznacza właściwość sekwencji polinukleotydowej, gdzie taki polinukleotyd zawiera sekwencję, która wykazuje co najmniej 80 procent identyczności sekwencji, korzystniej co najmniej 85 procent identyczności, a często 89 do 95 procent identyczności sekwencji, najczęściej co najmniej 99 procent identyczności sekwencji, w porównaniu z sekwencją będącą odniesieniem, w oknie porównania obejmującym co najmniej 20 pozycji nukleotydowych, często w oknie obejmującym co najmniej 30-50 nukleotydów, gdzie procent identyczności sekwencji jest obliczony przez porównanie sekwencji będącej odniesieniem do sekwencji polinukleotydowej, która może obejmować delecje lub wstawienia, stanowiące 20 procent lub mniej sekwencji będącej odniesieniem, w oknie porównania. Sekwencja będąca odniesieniem może być fragmentem większej sekwencji, na przykład odcinkiem sekwencji genu pełnej długości dla składnika RNA telomerazy, jak ujawniono tutaj.
Specyficzna hybrydyzacja jest tu zdefiniowana jako tworzenie się hybryd pomiędzy sondą polinukleotydową(np. polinukleotydem według wynalazku, który może zawierać podstawienia, delecje i/lub wstawienia) i specyficznym docelowym polinukleotydem (np. składnikiem RNA telomerazy lub genomową sekwencją genu), gdzie sonda specyficznie hybrydyzuje ze specyficzną sekwencją docelową w taki sposób, że przykładowo, pojedyncze pasmo odpowiadające jednemu lub więcej rodzajowi RNA dla genu dla składnika RNA telomerazy (lub specyficznie ciętych lub poddanych obróbce rodzajów składników RNA telomerazy ) może być zidentyfikowane na filtrze wykonanym techniką Northern, zawierającym RNA otrzymany z odpowiedniego źródła komórek (np. komórek somatycznych, w których następuje ekspresja składnika RNA telomerazy). Polinukleotydy według wynalazku, które specyficznie hybrydyzująze składnikiem RNA ssaczej telomerazy lub ludzkimi sekwencjami telomerowymi mogąbyć otrzymane na podstawie dostarczonych tutaj danych o sekwencji, zgodnie z metodami i zasadami termodynamiki znanymi w tej dziedzinie i opisanymi w Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manuał, Wyd. 2.,(1989). Cold Spring Harbor, N. Y. i Berger i Kimmel, Methods in Enzymology, Vol. 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (1987), Academic Press, Inc., San Diego, CA, które są włączone tutaj jako odnośnik literaturowy.
Stosowany tu termin „odpowiednie warunki wiązania” odnoszą się do warunków wodnych, w których składnik RNA ssaczej telomerazy łączy się ze swoim pokrewnym składnikiem białkowym i tworzy aktywny enzymatycznie holoenzym telomerazy, zdolny do katalitycznej replikacji, naprawy i/lub dodawania powtórzeń telomerowych z odpowiedniej matrycy, zawierającej powtórzenia telomerowe; taka matryca dla powtórzenia telomerowego może być obecna lub nieobecna. Często odpowiednie warunki wiązania mogąbyć warunkami fizjologicz
181 019 nymi. Stosowane tu „warunki fizjologiczne” odnoszą się do temperatury, pH, siły jonowej, lepkości i temu podobnych parametrów biochemicznych, które odpowiadają żywemu organizmowi i/lub zazwyczaj panują wewnątrz komórki w żywej, hodowanej komórce ssaczej, a w szczególności warunki występujące wewnątrz jądra komórki ssaczej. Przykładowo, warunki wewnątrz jądrowe lub cytoplazmatyczne w komórce ssaczej, hodowanej w typowych laboratoryjnych warunkach hodowli, są warunkami fizjologicznymi. Odpowiednie warunki reakcji in vitro w mieszaninach do transkrypcji in vitro są ogólnie warunkami fizjologicznymi, a ich przykładem mogą być rozmaite znane w tej dziedzinie ekstrakty jądrowe. W ogólności, warunki fizjologiczne in vitro mogą obejmować 50-200 mMNaCl lub KC1, pH 6,5-8,5, 20-45°C i 0,001-10 mM jony dwuwartościowe (np. Mg4^, Ca++); korzystnie około 150mMNaCl lub KC1, pH 7,2-7,6,5 mM kation dwuwartościowy i często zawierają 0,01-1,0 procent niespecyficznego białka (np. BSA). Często może być obecny niejonowy detergent (Tween, NP-40, Triton Χ-100), zwykle w stężeniu około 0,001 do 2%, a typowo 0,05-0,2% (obj./obj.). Konkretne warunki wodne mogą być wybrane przez biegłego zgodnie z konwencjonalnymi metodami. Jako ogólna wskazówka, mogąbyć zastosowane następujące wodne warunki buforowe 10-250 mMNaCl, 5-50 mM Tris HC1, pH 5-8, z ewentualnym dodatkiem dwuwartościowego kationu (kationów) i/lub związków chelatujących metale i/lub niejonowych detergentów i/lub reakcji błonowych i/lub czynników zapobiegających pienieniu i/lub scyntylatorów.
Stosowane tu terminy „znacznik” lub „znakowany” odnosi się do włączenia dającego się wykryć markera, np. poprzez włączenie wyznakowanego radioaktywnie aminokwasu lub przyłączenie do polipeptydu reszty biotyny, która może być wykrywana poprzez znakowaną awidynę (np. streptawidynę zawierającą marker fluorescencyjny lub aktywność enzymatyczną którą może być wykrywana metodami optycznymi lub kalorymetrycznymi). Rozmaite sposoby znakowania polipetydów i glikoprotein są znane w tej dziedzinie i mogą być stosowane. Przykłady znaczników dla polipetydów obejmują między innymi, jak następuje: radioizotopy (np. 3H, 14C, 35S, 1251,13Ί), znaczniki fluoroscencyjne (np. FITC, rodamina, lantaninowany fosfor), grupy biotynylowe, ustalone wcześniej epitopy polipeptydowe rozpoznawane przez drugorzędowy wskaźnik (np. sekwencje suwaka leucynowego, miejsce wiązania dla drugorzędowych przeciwciał, polipeptyd aktywujący transkrypcję, domeny wiążące metal, znaczniki epitopów). W niektórych wykonaniach znaczniki są dołączone poprzez ramiona oddzielające różnej długości dla zredukowania potencjalnych zaburzeń sferycznych.
Stosowany tutaj termin „znaczący statystycznie” oznacza wynik (to jest odczyt testu), który znajduje się co najmniej o dwa odchylenia standardowe powyżej lub poniżej średniej z co najmniej trzech odrębnych oznaczeń testu kontrolnego i/lub, który jest statystycznie znaczący, jak określono poprzez test -1 Studenta lub inne przyjęte w tej dziedzinie pomiary oceny istotności statystycznej.
Stosowany tutaj termin „stężenie patognostyczne”, „ilość patognostyczna” lub „patognostyczny wzór hybrydyzacji” odnosi się, odpowiednio, do stężenia, ilości, lub wzoru-lokalizacji składnika RNA telomerazy w próbce, które określają obecność warunków patologicznych (np. nowotworzenia, starzenia, niedoboru oporności, neurodegeneracji, stanu zapalnego itd.) lub predyspozycji do rozwoju choroby nowotworowej, takiej jak rak, mięsak lub białaczka. Patognostyczna ilość jest ilością składnika RNA telomerazy w komórce lub próbce komórek, która wykracza poza granice normalnych klinicznych wartości, określonych poprzez bieżące i/lub retrospektywne statystyczne badania kliniczne. Generalnie, osoba mająca chorobę nowotworową (rak, mięsak lub białaczkę) będzie wykazywać ilość składnika RNA telomerazy w komórce lub próbce tkanki, która pozostaje poza zakresem stężeń występujących u zdrowych, nie dotkniętych chorobą osób; zazwyczaj stężenie jest co najmniej o jedno odchylenie standardowe powyżej średniej wartości normalnej, a częściej o co najmniej o dwa odchylenia standardowe lub więcej powyżej średniej wartości normalnej. Jednakże zasadniczo wszystkie kliniczne testy diagnostyczne prowadzą do powstania pewnego procentu wyników fałszywie pozytywnych i fałszywie negatywnych. Czułość i wybiórczość testu diagnostycznego musi być wystarczająca dla zapewnienia satysfakcjonującej obiektywności diagnostycznej i sprostania odpowiednim regu
181 019 lującymje wymaganiom. Generalnie, metody diagnostyczne według wynalazku są stosowane do identyfikowania osób, które mogąbyć potencjalnie chore, dostarczając dodatkowego parametru do różnicowej diagnozy choroby, postawionej przez kompetentny personel medyczny.
Stosowany tu termin „allel choroby” oznacza allel genu, który może prowadzić do powstania dającej się wykryć choroby. Allel choroby może być dominujący lub recesywny i może prowadzić do choroby bezpośrednio lub wtedy, kiedy jest obecny w połączeniu ze specyficznym tłem genetycznym lub istniejącymi wcześniej warunkami patologicznymi. Allel choroby może być obecny w puli genowej lub może powstać u danej osoby de novo w wyniku mutacji somatycznej.
Termin „czynnik przeciwnowotworowy” jest tu stosowany dla określenia czynników, które mają właściwości funkcjonalne hamowania rozwoju lub postępowania nowotworzenia u człowieka, często włączając w to hamowanie przerzutów lub potencjału przerzutowego.
Stosowany tu termin „połączony w sposób funkcjonalny” odnosi się do łączenia elementów polinukleotydowych z wytworzeniem związku funkcjonalnego. Kwas nukleinowy jest „funkcjonalnie połączony” jeżeli jest połączony w związku funkcjonalnym z sekwencją innego kwasu nukleinowego. Przykładowo, promotor lub wzmacniacz (ang. enhancer) jest połączony w sposób funkcjonalny z sekwencjąkodującą, jeżeli wpływa na transkrypcję sekwencji kodującej. Połączony w sposób funkcjonalny oznacza, że sekwencje DNA, które są połączone, z reguły sąsiadują ze sobą i, jeżeli konieczne jest połączenie dwóch regionów kodujących białka, sąsiadują ze sobą i są w odpowiedniej ramce odczytu. Jednakże, ponieważ wzmacniacze z reguły działają, gdy są oddzielone od promotora przez kilka tysięcy par zasad, a sekwencje intronowe mogą mieć różną długość, niektóre elementy polipeptydowe mogąbyć połączone w sposób funkcjonalny nie sąsiadując ze sobą. Gen strukturalny (np. tk z HSV, który jest w sposób funkcjonalny połączony z sekwencją polinukleotydową odpowiadającą sekwencji regulacyjnej dla transkrypcji endogennego genu, podlega w ogólności ekspresji w zasadniczo taki sam czasowy i specyficzny dla komórki sposób, jak gen występujący naturalnie).
Stosowany tu termin Jednostka transkrypcyjna” lub „kompleks transkrypcyjny” odnosi się do sekwencji polinukleotydowej, która zawiera gen struktury (egzony), dołączony, działający w pozycji cis promotor i inne, sekwencje działające w pozycji cis, konieczne do wydajnej transkrypcji sekwencji strukturalnych, dalsze elementy regulacyjne niezbędne do odpowiedniej tkankowo-specyficznej i rozwojowej transkrypcji sekwencji strukturalnych i dodatkowe sekwencje cis ważne dla wydajnej transkrypcji i translacji (np. miejsce poliadenylacji, sekwencje kontrolujące stabilność mRNA).
Termin „ modulacja transkrypcyjna” stosuje się tu do określenia zdolności do zwiększania lub hamowania transkrypcji sekwencji strukturalnych przyłączonych w pozycji cis. Takie zwiększenie, zmniejszenie lub zahamowanie może być wynikiem zajścia specyficznych zdarzeń, takich ja stymulacja przez induktor lub/i może wyrażać się tylko w niektórych typach komórek.
Stosowany tu termin „transkrypcyjny region regulacyjny” odnosi się do sekwencji DNA zawierającej funkcjonalny promotor i dowolny dołączony element transkrypcyjny (np. wzmacniacz, blok CCA AT, blok TATA, miejsce SP1, itp.) które są niezbędne do transkrypcji sekwencji polinukleotydowych, które są dołączone w sposób funkcjonalny do transkrypcyjnego regionu regualcyjnego.
Stosowany to termin „allel nuli” oznacza, że locus genu zawiera co najmniej jedną mutację lub zmianę strukturalną, taką, że allel nuli jest zasadniczo niezdolny do kierowania wydajną ekspresją funkcjonalnego produktu genu. Komórka ze zinaktywowanym genem jest komórką mającą najmniej jeden allel nuli endogennego genu zazwyczaj będąc homozygotyczną pod względem allelu nuli. A zatem, przykładowo, komórka ze zinaktywowanym genem może być homozygotyczną pod względem allelu nuli w locus składnika RNA telomerazy, tak, że komórka taka jest zasadniczo niezdolna do ekspresji funkcjonalnego składnika RNA telomerazy.
Krótki opis rysunków
Figura 1. Aktywność telomerazy w komórkach, w których następuje ekspresja zmutowanej matrycy TRC3. Ekstrakty frakcjonowane na DEAE-sefarozie ze stabilnych transformantów, w których następuje ekspresja zmutowanej TRC3 były testowane pod kątem aktywności te
181 019 lomerazy przy zastosowaniu konwencjonalnych testów w różnych warunkach reakcji. Ekstrakty z komórek,w których następowała ekspresja MuC+17TRC3 (ścieżki 1,4,7,10,13,16 oznaczone C*), MuC TRC-3 (ścieżki 2, 5, 8,11,14,17 oznaczone C), lub MuA TRC3 (ścieżki 3,6, 9, 12, 15, 18 oznaczone A) były testowane w normalnych warunkach reakcji (ścieżki 1-6), normalnych plus 0,5 mM ddCTP 15 (ścieżki 7-9), normalnych minus dTTP plus 0,5 mM ddTTP (ścieżki 10-12), lub normalnych minus dATP plus 0,5 mM ddATP (ścieżki 13-18). Mieszaniny reakcyjne w ścieżkach 1-9 zawierały 8 μΜ całkowitego dGTP, z czego 1 μΜ stanowił 32P-dGTP (800 Ci/mmol). Dla wykrycia zmutowanej telomerazy mieszaniny reakcyjne w ścieżkach 10-118 zawierały 8 μΜ całkowitego dGTP, z czego 2 μΜ stanowił 32P-dGTP (800 Ci/mol). Ekstrakty traktowano RNAzą wolną od DNAzy (25 μg/ml przez 10 min w 30°C) przed wykonaniem testu na telomerazę (ścieżki 1-3, 16-18). Sąsiednie ścieżki zawierają markery DNA o zaznaczonych wielkościach podanych w nukleotydach (nt).
Figura 2. Ustalony poziom składnika RNA telomerazy (hTR) i RNA GAPDH oznaczano przy zastosowaniu ilościowego RT-PCR. Kontrole wykazują, że wszystkie oznaczenia ilościowe poprzez PCR sąliniowe w zakresie do 25 cykli. RT-PCR analizowano dla pięciu normalnych, negatywnych pod względem telomerazy linii komórkowych (1-5) i pięciu nowotworowych pozytywnych pod względem telomerazy linii komórkowych (6-10): 1). Pierwotne z płuc zarodka; 2) Pierwotne ze skóry ręki zarodka, 3) Pierwotne z prostaty dorosłego; 4) Pierwotne fibroblasty zatokowe; 5) Fibroblasty napletka; 6) Czerniak LOX; 7) Białaczka U251; 8) Rak płuc NCIH23; 9) Nowotwór odbytu 5W620; 10) Guz piersi MCF7. Produkty PCR znakowano 32P, rozdzielano w 6% PA GE, i oznaczano ilościowo przy zastosowaniu urządzenia Phosphorlmager. Względna transkrypcja jest wyrażana w jednostkach arbitalnych.
Figura 3. Średnia długość TRF w komórkach z antysensownym składnikiem RNA telomerazy i komórkach kontrolnych z wektorem. Komórki HeTe7, w których następuje stabilna ekspresja antysensownego 10-3-htR i kontrolnego wektora były selekcjonowane na pożywkach z higromycyną i puromycyną i zbierane 23 PDL po transfekcji. Jądrowy DNA był oczyszczany, przecinany Hinfl i Rsal i poddawany elektroforezie w 0,5% żelu agarozowym. DNA było sondowane w żelu oligonukleotydem (TTAGGG)3 celem wyznakowania skrajnych telomerowych fragmentów restrykcyjnych (TFR). Żel poddawano analizie przy użyciu urządzenia Phosphorlmager z firmy Molecular Dynamie i obliczano średnią wartość TRF, jak opisano (Allsopp i wsp. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89:10114). Prążkowane linie oznaczają średnią wartość TFR dla grup antysensownych i kontrolnych.
Figura 4. Schematyczne przedstawienie metody PCR in situ.
Opis korzystnych wykonań
Niniejszy wynalazek dostarcza sposobów, odczynników, genetycznie zmodyfikowanych zwierząt i komórek oraz kompozycji farmaceutycznych związanych z rybonukleoproteinową ludzką telomerazą.
Stosowana dalej nomenklatura i opisane poniżej procedury laboratoryjne w hodowli komórek, genetyce molekularnej i chemii kwasów nukleinowych oraz hybrydyzacji mogą obejmować dobrze znane i powszechnie stosowane w tej dziedzinie sposoby. Standardowe techniki są stosowane do rekombinowania DNA, syntezy polinukleotydów, hodowli mikroorganizmów i transformacji (np. elektroporacja, infekcja poprzez liposomy). Standardowe techniki i sposoby są stosowane w ogólności zgodnie z konwencjonalnymi metodami z tej dziedziny i według różnych ogólnych odnośników literaturowych (patrz, ogólnie Sambrook i wsp. Molecular Cloning: A Laboratory Manuał, wyd. 2 (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., który jest tu włączony jako odnośnik literaturowy) i które są wskazane w tym dokumencie.
Oligonukleotydy mogą być syntetyzowane w syntetyzatorze oligonukleotydów firmy Applied Bio Systems zgodnie z instrukcjami dostarczonymi przez producenta.
Sposoby powielania w reakcji PCR są opisane w tej dziedzinie (PCR Technology: Pronciples and Applications for DNA Ampilfication wyd. HA Erlich, Freeman Press, New York, NY (1992); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, wyd. Innis, Gelfland, Snisky i
181 019
White, Academic Press, San Diego, CA (1990); Mattila i wsp. (1991) Nucleic Acids Res. 19: 4967; Eckert, K.A. i Kunkel, T.A. (1991) PCR Methods and Amplications 1: 17; PCR, wyd. McPherson, Quirkes i Taylor, IRL Press, Oxford; oraz Patent USA 4 683 202, które są tu dołączone jako odnośniki literaturowe ). Omówienie
Wynalazek jest częściowo następstwem sk łono wania i wyizolowania składnika RN A ludzkiej telomerazy, a także genu dla tegoż składnika RNA, łącznie z towarzyszącymi mu elementami kontroli transkrypcyjnej. Sekwencję nukleotydową składnika RNA ludzkiej telomerazy przedstawiono poniżej. Dla wygody, sekwencję tę przedstawiono stosując standardowe oznaczenia literowe dla poszczególnych nukleotydów (A oznacza ryboadeninę, G ryboguaninę, C rybocytydynę, a U urydynę). Specjaliści dostrzegą w przedstawionej poniżej sekwencji także sekwencję cDNA, w przypadku której rybonukleotydy zastępowane są deoksyrybonukleotydami (przy czym urydyna zastępowana jest tymidyną).
‘ ‘ ‘ ‘ ‘ 50
GGGUUGCGGAGGGAGGGUGGGCCUGGGAGGGGUGGUGGCCAUUUUUUGUC ‘ ‘ * 100 UAACCCUAACUGAGAAGGGCGUAGGCGCCGUGCUUUUGCUCCCCGCGCGC ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ 150
UGUUUUUCUCGCUGACUUUCAGCGGGCGGAAAAGCCUCGGCCUGCCGCCU ‘ ‘ ‘ ‘200
UCCACCGUUCAUUCUAGAGCAAACAAAAAAUGUCAGCUGCUGGCCCGUUC ‘ ‘ ‘ ‘250
GCCCCUCCCGGGACCUGCGGCGGGUCGCUGCCCAGCCCCCGAACCCCGCC • ‘ ‘ ‘ ‘300
UGGAGGCCGCGGUCGGCCGGGGCUUCUCCGGAGGCACCCACUGCCACCGC ‘ ‘ ‘ ‘ ‘350
GAAGAGUUGGGCUCUGUCAGCCGCGGGUCUCUCGGGGGCGAGGGCGAGGU ‘ ‘ ‘ ‘ ‘400
UCACCGUUUCAGGCCGCAGGAAGAGGAACGGAGCGAGUCCCGCGCGCGGC ‘ ‘ ‘ ‘ ‘450
GCGAUUCCCUGAGCUAUGGGACGUGCACCCAGGACUCGGCUCACACAUGC < ‘ ‘ ‘ ‘500
AGUUCGCUUUCCUGUUGGUGGGGGGAACGCCGAUCGUGCGCAUCCGUCAC ‘ ‘ ‘ ‘550
CCCUCGCCGGCAGUGGGGGCUUGUGAACCCCCAAACCUGACUGACUGGGC ‘559
CAGUGUGCU
Powyższą sekwencję przedstawiono w orientacji 5'-3', a zastosowana tu numeracja stanowiła punkt odniesienia dla dalszego opisu. Uważa się, że sekwencja matrycowa składnika RNA zlokalizowana jest w obrębie regionu określonego nukleotydami 50-60 (5'-CUAACCCUAAC-3'), który to region jest komplementarny do telomerowej sekwencji zawierającej mniej więcej jedną i dwie trzecie telomerowej jednostki powtórzeniowej.
Sekwencję tę uzyskano z klonów cDNA oraz z klonu genomowego dla składnika RNA. Gdy składnik RNA jest wpierw transkrybowany z odpowiedniego genu, przynajmniej część produkowanych transkryptów RNA jest znacznie dłuższa, niż przedstawiona powyżej ~ 560-nukleotydowa sekwencja, i w rzeczywistości może obejmować więcej, niż 1000 nukleotydów. Jednakże, prawidłowo funkcjonująca cząsteczka telomerazy może być zbudowana z transkryptów składających się z ~560- nukleotydowej sekwencji, przedstawionej powyżej. Uważa się, że koniec 3' składnika RNA obecnego w natywnej telomerazie odpowiada regionowi określonemu nukleotydami 514-559 w powyższej sekwencji; jedna z analiz wskazuje, iż końcem 3' może być reszta U w pozycji 538. Do utworzenia aktywnej polimerazy mogą być także użyte zre
181 019 kombinowane cząsteczki składnika RNA, zawierające mniej nukleotydów, niż podana powyżej sekwencja obejmująca nukleotydy 1-559.
Klon genomowy zidentyfikowano i wyizolowano z biblioteki genomowej ludzkiego DNA w wektorze lambda FIXII. Klon genomowy, zawierający sekwencje genowe składnika RNA, obejmował wstawkę o długości około 15 kb, i został oznaczony jako klon 28-1. Gen zlokalizowany jest na dystalnym końcu ramienia q w chromosomie 3. Poniżej przedstawiono (w orientacji 5'-3', przy użyciu standardowych oznaczeń nukleotydów) otrzymaną sekwencją klonu 28-1, obejmującą fragment między miejscem rozpoznawanym przez enzym restrykcyjny SWIIA1, leżącym na jednym końcu wstawki o długości około 15 kb, a wewnętrznym miejscem restrykcyjnym dla enzymu HindHl, który to fragment zawiera całą sekwencję dojrzałego składnika RNA wraz z elementami regulującymi transkrypcję genu składnika RNA.
‘ ‘ ‘ ‘ ‘50
GATCAGTTAGAAAGTTACTAGTCCACATATAAAGTGCCAAGTCTTGTACT ‘ ‘ ‘ ‘ *100
CAAGATTATAAGCAATAGGAATTTAAAAAAAGAAATTATGAAAACTGACA ‘ ‘ ‘ ‘ ‘150
AGATTTAGTGCCTACTTAGATATGAAGGGGAAAGAAGGGTTTGAGATAAT ‘ ‘ ‘ ‘ ‘200
GTGGGATGCTAAGAGAATGGTGGTAGTGTTGACATATAACTCAAAGCATT ‘ ‘ ‘ ‘ ‘250
TAGCATCTACTCTATGTAAGGTACTGTGCTAAGTGCAATAGTGCTAAAAA ‘ ‘ ‘ ‘ ‘300
CAGGAGTCAGATTCTGTCCGTAAAAAACTTTACAACCTGGCAGATGCTAT ‘ ‘ ‘ 1 ‘350
GAAAGAAAAAGGGGATGGGAGAGAGAGAAGGAGGGAGAGAGATGGAGAGG ‘ ‘ ‘ ‘ ‘400
GAGATATTTTACTTTTCTTTCAGATCGAGGACCGACAGCGACAACTCCAC . ‘ ‘ ‘ ‘450
GGAGTTTATCTAACTGAATACGAGTAAAACTTTTAAGATCATCCTGTCAT ‘ ‘ ‘ ‘ ‘500
TTATATGTAAAACTGCACTATACTGGCCATTATAAAAATTCGCGGCCGGG ‘ ‘ ‘ ‘ ‘550
TGCGGTGGCTCATACCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAAGCGGGT ‘ ‘ ‘ ‘ ‘600
GGATCACTTGAGCCCTGGCGTTCGAGACCAGCCTGGGCAACATGGTGAAA ‘ ‘ ‘ ‘ ‘650
CCCCCGTCTCTACTAAAAACACAAAAACTAGCTGGGCGTGGTGGCAGGCG ‘ ‘ ‘ ‘ ‘700
CCTGTAATCCCAGCTACTCAGGAGGCTGAGACACGAGAATCGCTTGAACC ‘ ‘ ‘ ‘ ‘750
CGGGAGCAGAGGTTGCAGTGAGCCGAGATCACGCCACTAGACTCCATCCA ‘ ‘ ‘ ‘ ‘800
GCCTGGGCGAAAGAGCAAGACTCCGTCTCAAAAAAAAAAATCGTTACAAT ‘ ‘ ‘ ‘ ‘850
TTATGGTGGATTACTCCCCTCTTTTTACCTCATCAAGACACAGCACTACT ‘ ‘ ‘ ‘ ‘900
TTAAAGCAAAGTCAATGATTGAAACGCCTTTCTTTCCTAATAAAAGGGAG ‘ ‘ ‘ ‘ ‘950
ATTCAGTCCTTAAGATTAATAATGTAGTAGTTACACTTGATTAAAGCCAT ‘ ‘ ‘ ‘ ‘1000
CCTCTGCTCAAGGAGAGGCTGGAGAAGGCATTCTAAGGAGAAGGGGGCAG ‘ ‘ ‘ ‘ 11050
GGTAGGAACTCGGACGCATCCCACTGAGCCGAGACAAGATTCTGCTGTAG
181 019 ‘ ‘ ‘ ‘1100
TCAGTGCTGCCTGGGAATCTATTTTCACAAAGTTCTCCAAAAAATGTGAT ‘ ‘ ‘ ‘ ‘1150
GATCAAAACTAGGAATTAGTGTTCTGTGTCTTAGGCCCTAAAATCTTCCT ‘ ‘ ‘ ‘ ‘1200
GTGAATTCCATTTTTAAGGTAGTCGAGGTGAACCGCGTCTGGTCTGCAGA ‘ ‘ ‘ ‘ ‘1250
GGATAGAAAAAAGGCCCTCTGATACCTCAAGTTAGTTTCACCTTTAAAGA ‘ ‘ ‘ ‘ ‘1300
AGGTCGGAAGTAAAGACGCAAAGCCTTTCCCGGACGTGCGGAAGGGCAAC ‘ ‘ 1 ‘ ‘1350
GTCCTTCCTCATGGCCGGAAATGGAACTTTAATTTCCCGTTCCCCCCAAC * ‘ ‘ ‘ ‘1400
CAGCCCGCCCGAGAGAGTGACTCTCACGAGAGCCGCGAGAGTCAGCTTGG ‘ ‘ ‘ ‘ ‘1450
CCAATCCGTGCGGTCGGCGGCCGCTCCCTTTATAAGCCGACTCGCCCGGC ‘ ‘ ‘ ‘ ‘1500
AGCGCACCGGGTTGCGGAGGGAGGGTGGGCCTGGGAGGGGTGGTGGCCAT ‘ ‘ ‘ ‘ ‘1550
TTTTTGTCTAACCCTAACTGAGAAGGGCGTAGGCGCCGTGCTTTTGCTCC ‘ ‘ ‘ ‘ ‘1600
CCGCGCGCTGTTTTTCTCGCTGACTTTCAGCGGGCGGAAAAGCCTCGGCC ‘ ‘ ‘ ‘ ‘1650
TGCCGCCTTCCACCGTTCATTCTAGAGCAAACAAAAAATGTCAGCTGCTG ‘ ‘ ‘ ‘ ‘1700
GCCCGTTCGCCCCTCCCGGGACCTGCGGCGGGTCGCTGCCCAGCCCCCGA ‘ ‘ ‘ ‘ ‘1750
ACCCCGCCTGGAGGCCGCGGTCGGCCGGGGCTTCTCCGGAGGCACCCACT ‘ ‘ ‘ ‘ ‘1800
GCCACCGCGAAGAGTTGGGCTCTGTCAGCCGCGGGTCTCTCGGGGGCGAG ‘ ‘ ‘ ‘ ‘1850
GGCGAGGTTCACCGTTTCAGGCCGCAGGAAGAGGAACGGAGCGAGTCCCG ‘ ‘ ‘ ‘ ‘1900
CGCGCGGCGCGATTCCCTGAGCTATGGGACGTGCACCCAGGACTCGGCTC * ‘ ‘ ‘ ‘1950
ACACATGCAGTTCGCTTTCCTGTTGGTGGGGGGAACGCCGATCGTGCGCA ‘ ‘ ‘ ‘ ‘2000
TCCGTCACCCCTCGCCGGCAGTGGGGGCTTGTGAACCCCCAAACCTGACT ‘ ‘ ‘ ‘ ‘2050
GACTGGGCCAGTGTGCTGCAAATTGGCAGGAGACGTGAAGGCACCTCCAA ‘ ‘ ‘ ‘ ‘2100
AGTCGGCCAAAATGAATGGGCAGTGAGCCGGGGTTGCCTGGAGCCGTTCC ‘ ‘ ‘ ‘ ‘2150
TGCGTGGGTTCTCCCGTCTTCCGCTTTTTGTTGCCTTTTATGGTTGTATT ‘ ‘ ‘ ‘ ‘2200
ACAACTTAGTTCCTGCTCTGCAGATTTTGTTGAGGTTTTTGCTTCTCCCA ‘ ‘ 4 ‘ ‘2250
AGGTAGATCTCGACCAGTCCCTCAACGGGGTGTGGGGAGAACAGTCATTT ‘ ‘ ‘ ‘ ‘2300 TTTTTTGAGAGATCATTTAACATTTAATGAATATTTAATTAGAAGATCTA ‘ ‘ ‘ ‘ ‘2350
AATGAACATTGGAAATTGTGTTCCTTTAATGGTCATCGGTTTATGCCAGA ‘ ‘ ‘ ‘ ‘2400
GGTTAGAAGTTTCTTTTTTGAAAAATTAGACCTTGGCGATGACCTTGAGC ‘ ‘ ‘2425
AGTAGGATATAACCCCCACAAGCTT
181 019
Sekwencja składnika RNA rozpoczyna się od zasady 1459. W sekwencji tej zidentyfikowano wiele elementów kontroli transkrypcyjnej. W pozycji 1431-1436 znaleziono sekwencję konsensusową (sekwencję wysokiej zgodności) „A/T Box”; w pozycjach 1406-1414 i 1508-1526 znaleziono sekwencje konsensusowe PSE; wpozycji 1399-1406 znaleziono sekwencję konsensusowąCAAT; w pozycji 1354-1359 znaleziono sekwencję konsensusową SP1; a w pozycji 1234-1245 znaleziono sekwencję konsensusową elementu odpowiedzi na β/γ-interferon. W przypadku stabilnej transfekcji ludzkich komórek, takich jak HT1080 (wykazujących ekspresję telomerazy), wektorami zawierającymi sekwencje pozbawione początkowych nukleotydów (do nukleotydu 1159), nie obserwuje się istotnych zmian w poziomie transkrypcji składnika RNA ludzkiej telomerazy.
DNA Samirisciureus, uważnego za jednego z najbardziej odległych genetycznie od człowieka przedstawicieli naczelnych, zawiera gen składnika RNA telomerazy, który ulega powieleniu przy zastosowaniu starterów do PCR, zawierających sekwencje odpowiadające lub komplementarne do ujawnionej sekwencji polinukleotydowej składnika RNA ludzkiej telomerazy. Sądzi się, iż również inne naczelne posiadają geny składnika RNA telomerazy które mogąbyć powielane przy użyciu starterów do PCR skonstruowanych w oparciu o sekwencję genu składnika RNA ludzkiej telomerazy.
Polinukleotydy zawierające sekwencje składnika RNA telomerazy
Ujawnienie sekwencji składnika RNA ssaczej telomerazy i jego genu, co przedstawiono powyżej na przykładzie telomerazy ludzkiej a w fig. 5 na przykładzie telomerazy Samiri sciureus, umożliwiło skonstruowanie polinukleotydów o długości co najmniej 15 nukleotydów, na ogół 20 do 25 nukleotydów, o sekwencji w zasadzie identycznej z sekwencją składnika RNA ssaczej telomerazy lub też ssaczego genu dla składnika RNA. Ponadto, poznanie sekwencji składnika RNA ssaczej telomerazy (i jego genu) umożliwiło skonstruowanie sond do hybrydyzacji kwasów nukleinowych oraz starterów do PCR, które mogąbyć wykorzystane do wykrywania sekwencji DNA i RNA pokrewnego genu i/lub składnika telomerazy w komórce, próbce komórkowej, wycinku tkankowym, naczyniu reakcyjnym, membranie hybrydyzacyjnej, itp.
Polinukleotydy, zawierające sekwencje składnika RNA ssaczej telomerazy, obejmować mogą sekwencje ułatwiające transkrypcję (sekwencje ekspresyjne), sekwencje stabilizujące RNA, itp. Ogólne zasady konstruowania takich polinukleotydów, w oparciu o ujawnioną tutaj informację o sekwencji oraz porady i wskaźniki niniejszego wynalazku, są znane specjalistom z tej dziedziny, i opisane ponadto w Maniatis i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manuał, 2 wyd. (1989), Cold Spring Harbor, N. Y. Nie narzucając w tym względzie żadnych ograniczeń, podać można, jako przykład, polinukleotyd zawierający promotor, i ewentualnie wzmacniacz funkcjonujący w eukariotycznym systemie ekspresyjnym, czy też jeszcze sekwencje niezbędne do replikacji wektora. Typowa eukariotyczna kaseta ekspresyjna zawierałaby sekwencję polinukleotydową, której transkrypcja prowadziłaby do otrzymania transkryptu składnika RNA ssaczej telomerazy; taka sekwencja polinukleotydowa sprzężona jest z umieszczonym przed nią (stosując orientację według kierunku transkrypcji tj. od 5' do 3') odpowiednim promotorom, takim jak promotor HSV tk lub promotor pgk (kinazy fosfoglicerynowej), lub ewentualnie sprzężona jeszcze z wzmacniaczem.
Ponadto, w wypadku gdy nie pożądana jest ekspresja funkcjonalnego składnika RNA telomerazy, polinukleotydy objęte wynalazkiem nie muszą transkrybować funkcjonalnego transkryptu składnika RNA telomerazy. Polinukleotydy objęte wynalazkiem mogą służyć jako sondy hybrydyzacyjne i/lub startery do PCR (arnplimery) i/lub oligomery LCR do wykrywania sekwencji RNA lub DNA składnika RNA telomerazy.
Alternatywnie, polinukleotydy objęte wynalazkiem mogą służyć jako sondy hybrydyzacyjne lub startery do wykrywania sekwencji RNA lub DNA pokrewnych genów, lub genu składnika RNA telomerazy w pokrewnych gatunkach, zazwyczaj gatunków ssaków. W przypadku takich zastosowań, związanych z hybrydyzacją i PCR, polinukleotydy będące przedmiotem wynalazku nie muszą transkrybować funkcjonalnego transkryptu składnika RNA telomerazy. Tak więc, polinukleotydy objęte wynalazkiem mogą zawierać znaczące delecje dodatkowe sekwencje, podstawienia nuk
181 019 leotydowe i/lub transpozycje, o ile zachowana zostaje zdolność do specyficznej hybrydyzacji lub specyficznego powielania sekwencji składnika RNA ssaczej telomerazy.
Klony genomowe lub klony cDNA składnika RNA ssaczej telomerazy, oraz odpowiadające im sekwencje genowe, mogąbyć izolowane z bibliotek klonowych (dostępnych np. z Clontechu, Pało Alto, CA) przy wykorzystaniu sond hybiydyzacyjnych zaprojektowanych na podstawie ujawnionych tutaj sekwencji nukleotydowych, oraz konwencjonalnych hybrydyzacyjnych sposobów przeszukiwania (np., Benton WD i Davis RW (1977) Science 196: 180; Doodspeed i wsp. (1989) Gene 76:1). Gdy pożądany jest klon cDNA, preferuje się biblioteki klonowe zawierające cDNA uzyskane z RNA komórek somatycznych lub RNA innych komórek wykazujących ekspresję składnika RNA telomerazy. Alternatywnie, poprzez chemiczną syntezę oligonukleotydów można skonstruować syntetyczne sekwencje polinukleotydowe, odpowiadające całym lub jedynie częściom ujawnionych tu sekwencji. Ponadto, polimerazowa reakcja łańcuchowa (PCR), wykorzystująca startery oparte na ujawnionych tu danych sekwencyjnych, może być użyta do powielania fragmentów DNA z genomowego DNA, puli RNA, lub z bibliotek klonowych cDNA. Patenty USA nr. 4,683,195 i 4,683,202 opisują ten sposób PCR.
Polinukleotydy takie mają wiele zastosowań i mogąbyć wykorzystywane jako matryce do produkowania funkcjonalnego lub niefunkcjonalnego składnika RN A telomerazy w komórkach, jako komercyjny odczynnik diagnostyczny do standaryzowania testu wykrywającego składnik RNA telomerazy, jako polinukleotydy stosowane w terapii genowej, podawane zwierzętom; polinukleotydy takie mogą być też używane miedzy innymi jako artykuły spożywcze, bogate źródło energii , czynniki ochrony przeciwsłonecznej absorbujące światło UV, oraz środki zwiększające lepkość.
Opisane tu plazmidy, które skonstruowano podczas klonowania składnika RNA ludzkiej telomerazy oraz genu dla składnika RNA, stanowią istotny aspekt niniejszego wynalazku. Plazmidy te mogąbyć wykorzystane do wytwarzania składnika RNA ludzkiej telomerazy, lub jego genu, w zasadniczo czystej postaci, co stanowi jeszcze jeden aspekt wynalazku. Ponadto, specjaliści dostrzegą zapewne, że niniejszy wynalazek dostarcza również wielu innych plazmidów oraz nieplazmidowych kwasów nukleinowych w zasadniczo czystej postaci, które zawierają całą, lub przynajmniej użyteczną część sekwencji nukleotydowej składnika RNA ludzkiej telomerazy, i stanowią użyteczny materiał.
Specjaliści dostrzegą zapewne również istotny punkt wynalazku dotyczący kwasów nukleinowych oraz zawierających ich próbek, który odnosi się do kwasów nukleinowych jako cząsteczek zarówno DNA, jak i RNA, a także do syntetycznych, nie występujących w naturze ich analogów, oraz heteropolimerów deoksyrybonukleotydów, rybonukleotydów, i/lub ich analogów. Szczegółowy skład kwasu nukleinowego lub analogu kwasu nukleinowego, objętych wynalazkiem, zależy od tego, jakie jest przeznaczenie owego materiału, oraz od tego, w jakim środowisku zostanie on umieszczony. Zmodyfikowane lub syntetyczne nukleotydy, nie występujące w naturze, projektowano z myślą o ich różnorakim zastosowaniu i utrzymaniu stabilności w różnych środowiskach, także w tych, w których obecne sąnukleazy, co jest faktem dobrze znanym specjalistom. Zmodyfikowane lub syntetyczne nukleotydy, nie występujące w naturze, mogą różnić się, w porównaniu do występujących w naturze rybo- i deoksyrybonukleotydów, pod względem węglowodanu (cukru), wiązania fosforanowego, lub zasady, występujących w nukleotydzie, a mogą nawet zawierać nienukleotydową zasadę (lub nie zawierać żadnej zasady) w niektórych przypadkach. Porusza ten temat np. Arnold i wsp., w zgłoszeniu patentowym PCT nr. WO 89/02439, zatytułowanym „Non-nucleotide Linking Reagents for Nucleotide Probes”. Skoro więc kwasy nukleinowe objęte wynalazkiem mogą zawierać wiele różnych nukleotydów, to mogą być też użyteczne dla rozmaitych celów.
Izolacja pokrewnych genów
Jak wskazano w powyższym opisie, udostępnienie oczyszczonych kwasów nukleinowych, obejmujących sekwencję składnika RNA ludzkiej telomerazy, dostarcza cennych sposobów i odczynników diagnostycznych oraz terapeutycznych, i może być też źródłem innych poważnych korzyści. Jedną z ważniejszych korzyści, wynikających z niniejszego wynalazku jest fakt, iż spo
181 019 soby oraz odczynniki objęte wynalazkiem mogą być wykorzystane do izolowania składnika RNA, oraz genów dla składnika RNA telomerazy, w przypadku jakiegokolwiek gatunku ssaka, którego składnik RNA jest zasadniczo homologiczny do ludzkiego składnika RNA, objętego niniejszym wynalazkiem. Zwrot „zasadniczo homologiczny” odnosi się do takiego stopnia homologii, jaki jest wymagany dla specyficznej hybrydyzacji sekwencji (oligonukleotydu lub kwasu nukleinowego) ludzkiego składnika RNA z sekwencją kwasu nukleinowego, charakterystyczną dla składnika RNA innego gatunku ssaków. W przypadku takiej zasadniczej homologii, można używać kwasów nukleinowych i sond oligomerowych objętych wynalazkiem do identyfikowania i izolowania sekwencji o istotnym stopniu homologii.
Przykładowo, w celu wykrycia homologicznych sekwencji, sondować można bibliotekę genomowąlub bibliotekę cDNA. Można też używać starterów odpowiadających regionom sekwencji składnika RNA do amplifikacji PCR, przeprowadzonej w łagodnych lub umiarkowanych warunkach, w celu powielenia specyficznej, homologicznej sekwencji kwasu nukleinowego obecnej w preparacie RNA lub DNA danego gatunku ssaka. Przy użyciu tych, oraz innych podobnych technik, można dość łatwo wyizolować nie tylko kwas nukleinowy odpowiadający odmiennemu wariantowi składnika RNA z ludzkich komórek, lecz także kwas nukleinowy odpowiadający homologicznemu składnikowi RNA z komórek innych ssaków, jak chociażby naczelnych, ssaków o dużym znaczeniu weterynaryjnym, np. bydła, owiec, koni, psów i kotów, a także gryzoni, np. szczurów, myszy i chomików. Z kolei owe kwasy nukleinowe mogą zostać wykorzystane do wytwarzania transgenicznych zwierząt, co miałoby dużą wartość w przypadku przeszukiwania i testowania farmaceutyków regulujących aktywność telomerazy. Przykładowo, używając plazmidu objętego wynalazkiem, można wyłączyć (knock-out) gen dla składnika RNA lub też wymienić naturalny gen składnika RNA na zrekombinowany, indukowany gen w komórkach macierzystych zarodka Mus spretus, a następnie doprowadzić do uzyskania transgenicznej myszy, która byłaby użyteczna jako system modelowy lub testowy w badaniach nad chorobami zależnymi od wieku, czy starzenia się. Przykład 9, przedstawiony poniżej, ilustruje, w jaki sposób taka metodologia została wykorzystana do zidentyfikowania i wyizolowania sekwencji składnika RNA u naczelnych.
Inne ssacze homologi ludzkiego i małpiego składnika RNA telomerazy i/lub pokrewnych genów mogąbyć identyfikowane i izolowane poprzez przeszukiwanie odpowiedniej zwierzęcej biblioteki klonów genomowych lub klonów cDNa, np. biblioteki klonów genomowych lub cDNA myszy, szczura, królika, świnki morskiej, chomika, psa, krowy, owcy, wilka, świni lub innej, w odpowiednim wektorze, takim jak sztuczne chromosomy drożdżowe, kosmidy, lub bakteriofagi lamba (np. λ Charon 35), przy użyciu sondy polinukleotydowej zawierającej sekwencję około 20 nukleotydów (lub ich komplementarnych odpowiedników) ludzkiej lub małpiej sekwencji polinukleotydowej składnika RNA telomerazy, lub jego genu. Na ogół, zgodnie z konwencjonalną procedurą hybrydyzacji, stosuje się ścisłe (ostre) warunki hybrydyzacji oraz płukania. Pozytywne klony są izolowane i sekwencjonowane. Przykładowo (dla ilustracji, a nie dla wprowadzenia ograniczeń), polinukleotyd odpowiadający całej długości 559-nukleotydowej sekwencji składnika RNA ludzkiej telomerazy można wyznakować i zastosować jako sondę hybrydyzacyjną do wyizolowania klonów genomowych ze zwierzęcej biblioteki klonów genomowych w ZEMBL4 lub kGEMll (Promega Corporation, Madison, Wisconsin); typowe warunki hybrydyzacji dla przeszukiwania łysinek (Benton i Davis (1978) Science 196: 180; Dunn i wsp. (1989) J. Biol. Chem. 264: 13057) mogąbyć następujące: 50% formamid, 5 x SSC lub SSPE, 1-5 x roztwór Denhardta, 0,1-1% SDS, 100-200 pg pofragmentowanego heterologicznego DNA lub tRNA, 0-10% siarczan dekstranu, 1 χ 105 do 1 χ 107 cpm/ml zdenaturowanej sondy o specyficznej aktywności około 1 χ 108 cpm/pg, oraz inkubacja w temperaturze 42°C-37°C przez około 6-36 godzin. Warunki prehybrydyzacji są w zasadzie identyczne, z wyjątkiem tego, że nie dodaje się sondy a czas inkubacji jest zazwyczaj krótszy. Warunki płukania sąna ogół następujące: 1-3 xSSC, 0,1-1% SDS, 45-70°C, ze zmianą roztworu do płukania po około 5-30 minutach.
181 019
W przypadku izolowania nie należącego do człowieka składnika RNA telomerazy przy użyciu ludzkiej polinukleotydowej sondy dla składnika RNA telomerazy preferuje się często hybrydyzację w łagodniejszych warunkach, takich jak około 39°C i kolejne płukania przy następujących temperaturach: temperatura pokojowa, 37°C, 39°C, 42°C, 45°C, 50°C, 55°C, 60°C, 65°C i 70°C, sprawdzając po każdym etapie sygnał sondy w tle (ewentualnie wykrywając sygnał autoradiograficznie i/lub stosując specjalną aparaturę do tzw. „phospho-imagingu”) i kończąc płukanie po osiągnięciu odpowiedniego stosunku sygnał/szum tła, który ustala się doświadczalnie.
Polinukleotydy zawierające sekwencje o długości około 30-50 nukleotydów, korzystnie przynajmniej 100 nukleotydów, odpowiadające lub komplementarne do przedstawionej tutaj sekwencji nukleotydowej dla ludzkiego i małpiego składnika RNA telomerazy, służyć mogąjako startery do PCR i/lub sondy hybrydyzacyjne do identyfikowania i izolowania genów komórek rozrodczych, odpowiadających ujawnionym sekwencjom genu i składnika RNA. Takie geny komórek rozrodczych można izolować różnymi konwencjonalnymi sposobami, włączając w to (lecz nie ograniczając się do tego) przeszukiwanie hybrydyzacyjne bibliotek genomowych w bakteriofagu λ, lub bibliotek kosmidowych, lub też powielanie sekwencji genomowych techniką PCR, przy czym wykorzystaniu starterów uzyskanych w oparciu o ujawnione tu sekwencje. Biblioteki genomowe człowieka są zazwyczaj udostępniane publicznie, a mogą też być tworzone de novo z ludzkiego DNA.
Jest oczywiste, ze specjalistycznego punktu widzenia, że do polinukleotydów objętych wynalazkiem wprowadzać można podstawienia nukleotydowe, delecje, czy dodatkowe sekwencje. Zróżnicowanie sekwencji nukleotydowej może na przykład wynikać z polimorfolizmu sekwencji różnych alleli, itp. Jednakże, takie podstawienia nukleotydowe, delecje, czy dodatkowe sekwencje, nie powinny w zasadniczy sposób naruszać zdolności polinukleotydowych do hybrydyzowania z przedstwionymi tutaj ludzkimi lub małpimi sekwencjami polinukleotydowymi składnika RNA telomerazy o pełnej długości, przy zastosowaniu ścisłych warunków hybrydyzacji, wystarczających do uzyskania specyficznej hybrydyzacji.
Polinukleotydy, zawierające sekwencje składnika RNA ssaczej telomerazy, mogą być krótkimi oligonukleotydami (np. długości 20-100 zasad), takimi, jakich używa się jako sondy hybrydyzacyjne lub startery do PCR (lub LCR). Sekwencje polinukleotydowe mogą również zawierać część dłuższego polinukleotydu (np. wektor zawierający klon składnika RNA telomerazy) i mogą być połączone z inną sekwencją polinukleotydową poprzez sprzężenie polinukleotydowe. Zazwyczaj, polinukleotydy zawierające sekwencje składnika RNA telomerazy obejmująprzynajmniej 25 kolejnych nukleotydów, które w zasadzie sąidentyczne z występującąw naturze sekwencją składnika RNA telomerazy lub jego genu, przy czym najczęściej polinukleoytydy składnika RNA telomerazy zawierają przynajmniej 50-100 kolejnych nukleotydów, które są zasadniczo identyczne z występującą w naturze sekwencją składnika RNA ssaczej telomerazy. Jednakże specjaliści zauważą zapewne, iż minimalna długość polinukleotydu sekwencji składnika RNA telomerazy, wymaga do specyficznej hybrydyzacji z sekwencją docelową składnika RNA telomerazy, zależeć będzie od kilku czynników: składu G/C, pozycji niesparowanych zasad (o ile takie występują), stopnia unikalności sekwencji w porównaniu z populacją docelowych polinukleotydów, chemicznej natury polinukleotydu (szkielet metylofosfonianowy, poliamidowy kwas nukleinowy, analogi tiofosforanowe, itp.), i innych.
Gdy jest to pożądane, amplimery do PCR przeznaczone zasadniczo do powielania kopii cDNA o pełnej długości mogą być dobierane odpowiednio według uznania osoby mającej doświadczenie praktyczne w tym względzie. W podobny sposób dobierane mogąbyć amplimery przeznaczone do powlekania części genu składnika RNA telomerazy (małpy bądź człowieka).
Każda z tych sekwencji może być użyta jako sonda hybrydyzacyjna lub amplimer do PCR, w celu wykrycia obecności składnika RNA telomerazy, na przykład przy diagnozowaniu choroby nowotworowej, w przypadku której obserwuje się podwyższony lub obniżony poziom składnika RNA w komórkach, lub też przy tak zwanym typowaniu tkanek (tj. identyfikowaniu tkanek wykazujących ekspresję telomerazy), itp. Sekwencje te mogąbyć także wykorzystywane do wykrywania genomowych sekwencji genowych składnika RNA telomerazy w próbce DNA, jak chociażby w przypadku analizy DNA dla celów sądowych (np. poprzez analizę RFLP, rozkład długości produktów PCR, itd.) lub też w przypadku diagnozowania chorób charakteryzujących się występowaniem rearanźacji i/lub powielenia genu składnika RNA telomerazy.
Przykładowo (bez zamiaru wprowadzania ograniczeń), do powielania sekwencji polinukleotydowych składnika RNA telomerazy (np. cDNA), lub też jako sondy hybrydyzacyjne (np. jako biotynylowane, lub znakowane na końcu, sondy oligonukleotydowe) wykorzystywana może być następująca para starterów oligonukleotydowych:
5' -AGCACACTGGCCCAGTCAGTCAGGTTTG-3 '
5'-GGGTTGCGGAGGGAGGGTGGGCCTGGGA-3'
Uwzględniając dostępność ujawnionych tu sekwencji składnika RNA telomerazy, oczywista wydaje się możliwość stosowania innych odpowiednich starterów do PCR, starterów do LCR, sond hybrydyzacyjnych, starterów, itp. Polinukleotydy zawierające sekwencje składnika RNA ludzkiej telomerazy, lub sekwencje do nich komplementarne, służyć mogąjako sondy hybrydyzacyjne lub startery do wykrywania sekwencji RNA lub DNA składnika RNA ssaczej telomerazy.
W przypadku zastosowania do hybrydyzacji bądź reakcji PCR, mogą one zawierać znaczące delecje, dodatkowe sekwencje, podstawienia nukleotydowe i/lub transpozycje, o ile zachowana zostaje specyficzność hybrydyzacji lub powielania sekwencji składnika RNA telomerazy. Jednakże, takie podstawienia nukleotydowe, delecje i dodatkowe sekwencje nie powinny w istotny sposób zaburzać zdolności polinukleotydu do hybrydyzowania z sekwencją składnika RNA telomerazy, lub jego genu, przy zastosowaniu ścisłych warunków hybrydyzacji, wystarczających do uzyskania specyficznej hybrydyzacji.
Przykładowo (bez zamiaru wprowadzania ograniczeń), polinuleotyd zawierający sekwencje składnika RNA ludzkiej telomerazy może obejmować sekwencję od nukleotydu 48 do 209, którą uważa się za wystarczającą do odtworzenia ludzkiego holoenzymu telomerazowego w obecności składnika białkowego telomerazy:
5’-UCUAACCCUAACUGAGAAGGGCGUAGGCGCCGUGCUUUUGCUCCCCGĆGCGC UGUUUUUCUCGCUGACUUUCAGCGGGCGGAAAAGCCUCGGCCUGCCGCCUUCCAC CGUUCAUUCUAGAGCAAACAAAAAAUGUCAGCUGCUGGCCCGUUCGCCCCUCCC-31 lub jako DNA:
*-TCTAACCCTAACTGAGAAGGGCGTAGGCGCCGTGCTTTTGCTCCCCGCGCGC TGTTTTTCTCGCTGACTTTCAGCGGGCGGAAAAGCCTCGGCCTGCCGCCTTCCAC CGTTCATTCTAGAGCAAACAAAAAATGTCAGCTGCTGGCCCGTTCGCCCCTCCC-3·.
Polinukleotyd, zawierający sekwencje składnika RNA ludzkiej telomerazy, może także obejmować lub składać się z nukleotydów 1-559, i zawierać na swych końcach dodatkowe sekwencje złożone z innych nukleotydów lub sekwencji nukleotydowych. Wariant o zmienionej matrycy (template-scrambled) zawierający nukleotydy 48-209, w obrębie których zmieniona została sekwencja matrycowa dla powtórzeń telomerowych, zdolny jest konkurować z okrojonym wariantem składnika RNA, zawierającym dziką sekwencję 48-209, o przyłączenie składnika białkowego telomerazy i odtworzenie holoenzymu telomerazowego.
Analiza strukturalna składnika RNA ludzkiej telomerazy wskazuje regiony posiadające skłonność do tworzenia struktur drugorzędowych, takich jak pętle o kształcie spinki do włosów (hairpin loop). Przykładowo, region rozciągający się mniej więcej od nukleotydu 200 do nukleotydu 350 składnika RNA ludzkiej telomerazy ma w zasadzie charakter takiej pętli o kształcie
181 019 spinki do włosów. Inne części składnika RNA telomerazy mają również dość charakterystyczną strukturę drugorzędową. Biorąc pod uwagę fakt występowania owych struktur drugorzędowych, przy podstawianiu innych sekwencji nukleotydowych wybierać można te, w przypadku których specjalistyczna analiza komputerowa wskazuje na możliwość przyjmowania podobnej struktury drugorzędowej. Wiele programów komputerowych dysponuje możliwością określania sekwencji nukleotydowych przyjmujących zasadniczo zbliżoną strukturę drugorzędową a wśród nich wymienić można programy FOLD, SQUIGGLES, CIRCLES, DOMES, NOUNTAINS i STEMLOOP z pakietu UWGCG Seąuence Anałysis Software Package, oraz inne o podobnych możliwościach. Podobnie, nienukleotydowe analogi strukturalne, takie jak peptydowe kwasy nukleinowe, itp., mogąbyć projektowane z myślą o naśladowaniu charakterystycznej struktury drugorzędowej odpowiednich regionów składnika RNA ludzkiej telomerazy. Takie strukturalne naśladownictwo może być wykorzystane w celach terapeutycznych, lub wielu innych (np. jak konkurencyjne cząsteczki antagonistyczne, itd.j.
CZĄSTECZKI ANTYSENSOWNE
Jednym z wyjątkowo użytecznych typów kwasów nukleinowych, objętych wynalazkiem, jest antysensowny oligonukleotyd, który może być użyty do hamowania aktywności ludzkiej telomerazy, zarówno in vivo, jak i in vitro. Antysensowne oligonukleotydy zawierają specyficzną sekwencję, obejmującą od około 10 do około 25-200 lub więcej nukleotydów (tj. dostatecznie duże, aby tworzyć stabilne struktury dwuniciowe, lecz wystarczająco małe, aby, w zależności od sposobu podawania, można je było w razie potrzeby podawać in vivo), i komplementarną wobec specyficznej sekwencji nukleotydów w składniku RNA ludzkiej telomerazy. Mechanizm działania takich oligonukleotydów obejmować może ich przyłączanie do składnika RNA, powodujące: zapobieganie tworzeniu się funkcjonalnej rybonukleoproteinowej telomerazy, zapobieganie wykorzystywaniu składnika RNA jako matrycy do syntezy telomerowego DNA, destabilizowanie składnika RNA telomerazy i skrócenie jego okresu półtrwania, i/lub hamowanie transkrypcji genu składnika RNA telomerazy.
Przykładowe antysensowne oligonukleotydy objęte wynalazkiem, służące do hamowania aktywności telomerazy in vivo i/lub in vitro obejmować mogą oligonukleotydy, wspomniane powyżej w związku z testami określającymi, czy klon pGRN7 zawierał cDNA dla składnika RNA ludzkiej telomerazy. Trzy takie oligonukleotydy, jak wspomniano powyżej, wykorzystano do zademonstrowania hamowania aktywności telomerazy in vitro. Sekwencję każdego z tych oligonukleotydów przedstawiono poniżej:
T3 5'-CTCAGTTAGGGTTAGACAAA-3’
P3 5'-CGCCCTTCTCAGTTAGGGTTAG-3'
TA3 5’-GGCGCCTACGCCCTTCTCAGTT-3'
Oligonukleotydy te mogąbyć także wykorzystane do hamowania aktywności telomerazy w komórkach człowieka.
Specjaliści dostrzegą zapewne, iż niniejszy wynalazek dostarcza szerokiego wyboru antysensownych oligonukleotydów, zdolnych do hamowania aktywności telomerazy. Innym spośród użytecznych oligonukleotydów, objętych wynalazkiem, jest oligonukleotyd Tel-AU, mający sekwencję 5'-CAGGCCCACCCTCCGCAACC-3', który, jak wszystkie oligonukleotydy objęte wynalazkiem, może być syntezowany przy użyciu nukleotydów tiofosforanowych, fosforanów chiralnometylowych, nukleotydów występujących w naturze, lub też ich mieszanin, w celu osiągnięcia stabilności i pożądanej wartości Tm. Specjaliści zauważą również zapewne, że przy użyciu rozmaitych zmodyfikowanych analogów nukleotydowych, takich jak rybonukleotydy O-metylowe, nukleotydy tiofosforanowe oraz nukleotydy metylofosfonianowe, wyprodukować można kwasy nukleinowe objęte wynalazkiem o większej liczbie pożądanych właściwości (np. oporne na nukleazy, ściślej wiążące komplementarne sekwencje, itp.) niż te, które wyprodukowano korzystając z nukleoetydów występujących w naturze. Inne sposoby otrzymywania oligonukleotydów opornych na nukleazy opisano w zgłoszeniu patentowym PCT nr. 94/12633.
181 019
Dodatkowe zastosowania, ukierunkowane na modulowanie aktywności telomerazy, obejmują sposoby wykorzystujące specyficzne antysensowne polinukleotydy, komplementarne do całej lub części sekwencji składnika RNA ludzkiej telomerazy (hTR), takich jak olinukleotydy antysensowne wobec genu dla składnika RNA ludzkiej telomerazy lub jego transkryptu, oraz okrojone warianty polinukleotydu, które mogą być związane z holoenzymem telomerazowym. Takie komplementarne antysensowne polinukleotydy zawierać mogą podstawienia nukleotydowe, dodatkowe sekwencje, delecje lub transpozycje, o ile utrzymana jest zdolność do specyficznego wiązania sekwencji docelowej, odpowiadającej składnikowi RNA telomerazy lub jego genowi, która to zdolność stanowi w tym wypadku podstawowąwłaściwość funkcjonalnego polinukleotydu. Komplementarne polinukleotydy antysensowne obejmują rozpuszczalne antysensowne oligonukleotydy RNA lub DNA, które mogą specyficznie hybrydyzować z różnymi postaciami składnika RNA telomerazy i zapobiegać tym samym transkrypcji genu składnika RNA telomerazy (Ching i wsp., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:10006; Broder i wsp., (1990) Ann. Int. Med. 113: 604; Loreau i wsp., (1990) FEBS Letters 274: 53; olcenberg i wsp., WO91/11535; U.S.S.N. 07/530,165; WO91/09865; WO91/04753; WO90/13641; orazEP 386563). Antysensowne polinukleotydy hamują więc w ten sposób wytwarzanie funkcjonalnego składnika RNA. Ponieważ ekspresja składnika RNA telomerazy (tempo transkrypcji i/lub stabilność RNA) związana jest aktywacjąi aktywnością enzymatyczną holoenzymu telomerazowego, to antysensowne polinukleotydy, które zapobiegają transkrypcji RNA odpowiadającego składnikowi RNA telomerazy i/lub oddziaływaniu pomiędzy składnikiem RNA telomerazy a składnikiem białkowym ludzkiej telomerazy i/lub oddziaływaniu pomiędzy składnikiem RNA telomerazy a sekwencjami telomerowymi, mogą hamować aktywność telomerazy i/lub odwracać fenotyp (np. nieśmiertelność lub transformację nowotworową) komórek wykazujących aktywność telomerazy przy nieobecności antysensownych polinukleotydów. Efektywne terapeutycznie dawki polinukleotydów, antysensownych wobec składnika RNA telomerazy, mogą być podawane (w odpowiednich układach) podczas leczenia chorób, których patogeneza komórkowa wymaga aktywności telomerazy (np. nowotwory) lub w celu zahamowania produkcji lub podtrzymywania gamet (tj. jako środek antykoncepcyjny), wtedy, gdy jest to pożądane. Wytwarzane polinukleotydy mogą mieć różną długość, choć typowy antysensowny polinukleotyd zawiera sekwencję przynajmniej około 25 kolejnych nukleotydów, które są w istotnym stopniu komplementarne wobec sekwencji polinukleotydowej występującego w naturze składnika RNA telomerazy, przy czym zazwyczaj są całkowicie komplementarne wobec sekwencji składnika RNA ludzkiej telomerazy, a często są komplementarne wobec tej sekwencji składnika RNA ludzkiej telomerazy, która jest z kolei komplementarna wobec telomerowej sekwencji powtórzeniowej, lub też są komplementarne wobec części składnika RNA telomerazy, która wchodzi w kontakt z podjednostką polipeptydową telomerazy.
Polinukleotydy mogą być produkowane z heterologicznych kaset ekspresyjnych w transfekowanej lub transgenicznej komórce. Heterologiczna kaseta ekspresyjna może być częścią wektora używanego w terapii genowej, takiego jak na przykład wektor adenowirusowy, bądź wirusowy wektor adenosatelitamy, lub też inny wektor wykorzystywany w terapii genowej. Heterologiczna kaseta może znajdować się na polinukleotydzie, który nie jest zdolny do samodzielnej replikacji, i który wprowadzany jest do komórek przy pomocy któregokolwiek z wielu dostępnych specjalistom sposobów (np. lipofekcja, biobalistyka, liposomy, immunoliposomy, elektroporacja, itp.). Alternatywnie, antysensowne polinukleotydy mogą być rozpuszczalnymi oligonukleotydami, które podawane są do środowiska zewnętrznego, czyli albo do pożywki hodowlanej in vitro, albo też do przestrzeni śródmiąższowych i płynów ustrojowych (np. krew, płyn mózgowordzeniowy), w przypadku stosowania in vivo. Wykazano, iż rozpuszczalne antysensowne polinukleotydy, obecne w środowisku zewnętrznym, uzyskują dostęp do cytoplazmy i działają hamująco na rozmaite rodzaje RNA. W przypadku niektórych zastosowań, antysensowne polinukleotydy zawierają fragmenty metylofosfonianowe, fragmenty C-5 propenylowe, cukry 2'-fluororybozowe, lub są też poliamidowymi kwasami nukleinowymi (PNA) (Egholm i wsp. (1992) J. Am. Chem. Soc. 114: 1895; Wittung i wsp. (1994) Naturę 368: 561; Egholm i wsp.
181 019 (1993) Naturę 365: 566; Hanvey i wsp. (1992) Science 258: 1481). Ogólne sposoby, odnoszące się do antysensownych polinukleotydów, znaleźć można w: Antisense RNA and DNA, (1988), D.A. Melton, Ed., Cold Spring Harbor, Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.
Dodatkowy aspekt, w ramach antysensownych oligonukleotydów objętych wynalazkiem, stanowi konstrukcja oligonukleotydów, które przyłączają się do podwójnej nici kwasu nukleinowego w obrębie dwuniciowej struktury RNA, albo też w obrębie genu dla składnika RNA, tworząc kwas nukleinowy zawierający potrójną helisę, bądź też trójniciowy kwas nukleinowy, co hamuje aktywność telomerazy. Takie oligonukleotydy objęte niniejszym wynalazkiem, konstruuje się według reguły parowania zasad, w oparciu o sekwencję nukloetydowąskładnika RNA (Cheng i wsp. (1988) J. Biol. Chem. 263; 15110; Ferrin i Camerini-Otero (1991) Science 354: 1494; Ramdas i wsp. (1989) J. Biol. Chem. 264:17395; Strobel i wsp. (1991) Science 254: 1639; Hsieh i wsp. (1990) cytowany wcześniej; Rigas i wsp. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 83: 9591). Olinonukloetydy takie mogą blokować aktywność telomerazy na wiele sposobów, włączając w to zapobieganie transkrypcji genu telomerazy lub przyłączanie się do regionu składnika RNA telomerazy o dwuniciowej strukturze, w sposób zapobiegający tworzeniu przez składnik RNA funkcjonalnej telomerazy rybonukleoproteinowej, albo też zapobiegający wykorzystywaniu składnika RNA jako matrycy dla syntezy telomerowego DNA. Na ogół, w zależności od sposobu działania, tworzące potrójną nić oligonukleotydy, objęte wynalazkiem, obejmują specyficzną sekwencję od około 10 do około 25-200 lub więcej nukleotydów (tj. dostatecznie duże, aby tworzyć stabilnąpotrójnąhelisę, lecz wystarczająco małe, aby w zależności od sposobu podawania, można je było w razie potrzeby podawać in vivo), komplementarnych (w tym kontekście „komplementarny” oznacza zdolny do tworzenia potrójnej helisy) wobec specyficznej sekwencji w składniku RNA telomerazy lub genie dla składnika RNA telomerazy.
Oprócz objętych wynalazkiem oligonukleotydów antysensownych, bądź tworzących potrójną helisę, do hamowania aktywności telomerazy mogą być także użyte oligonukleotydy sensowne, identyczne pod względem sekwencji przynajmniej z częścią składnika RNA ludzkiej telomerazy. Tego typu oligonukleotydy, objęte wynalazkiem, charakteryzują się obecnością albo (1) mniej niż jednego kompletu sekwencji składnika RNA, niezbędnego do tworzenia funkcjonalnego enzymu telomerazy, albo też (2) kompletnej sekwencji składnika RNA, niezbędnej do tworzenia funkcjonalnego enzymu telomerazy, a ponadto podstawienia nukleotydowego lub insercji jednego lub więcej nukleotydów, powodujących, iż RNA staje się niefunkcjonalny. W obu przypadkach obserwuje się zahamowanie aktywności telomerazy w wyniku konkurencyjnego przyłączania „zmutowanego” składnika RNA do składników białkowych ludzkiej telomerazy, powodującego powstanie nieaktywnej cząsteczki telomerazy. Mechanizm działania takich nukleotydów obejmuje więc tworzenie niefunkcjonalnej telomerazy rybonukloproteinowej, lub też zapobieganie tworzeniu funkcjonalnej telomerazy rybonukleoproteinowej. Jako przykład posłużyć może wariant o zmienionej matrycy, zawierający nukleotydy 48-209, w obrębie których zmieniona została sekwencja matrycowa dla powtórzeń telomerowych. Takie warianty o zmienionej matrycy zdolne są do konkurowania o przyłączenie się do składnika białkowego telomerazy. Tego typu sensowne oligonukleotydy, objęte niniejszym wynalazkiem, obejmujązazwyczaj specyficzną sekwencję około 20, 50, 100, 200, 400, 500, lub więcej nukleotydów, identyczną ze specyficzną sekwencją nukleotydów w składniku RNA ludzkiej telomerazy.
Ponadto, antysensowne polinukloetydy zawierać mogą pochodne podstawniki, które w zasadzie nie wpływają na przebieg procesu hybrydyzacji ze składnikiem RNA ssaczej telomerazy. Antysensowne polinukloetydy, które zmodyfikowano, dodając chemiczne podstawniki, mogąbyć wprowadzane do aktywnej metabolicznie komórki eukariotycznej, w celu hybrydyzowania z obecnym tam składnikiem RNA telomerazy. Zazwyczaj, takie antysensowne polinukleotydy tworzy się poprzez derywatyzację, oraz dołączanie dodatkowych podstawników chemicznych, co zachodzi odpowiednio podczas syntezy, oraz po zakończeniu syntezy polinukloetydów, po czym są one kierowane do komplementarnej sekwencji w składniku RNA telomerazy, gdzie powodują zmiany lub chemiczne modyfikacje lokalnej sekwencji DNA i/lub składnika białkowego telomerazy. Korzystnie, dołączane podstawniki chemiczne to: teksafiryna
181 019 europu (III), czynniki sieciujące, psoralen, chelaty metalowe (np. chelat żelazo/EDTA, gdzie żelazo katalizuje cięcie), topoizomerazy, endonukleazy, egzonukleazy, ligazy, fosfodiesterazy, porfiryny fotodynamiczne, leki chemoterapeutyczne (np. adriamycyna, doksyrubicyna), czynniki interkalujące, czynniki modyfikujące zasady, łańcuchy immunoglobulinowe, oraz oligonukleotydy. Chelaty żelazo/EDTA są szczególnie korzystnymi podstawnikami chemicznymi w wypadku, gdy pożądane jest lokalne cięcie sekwencji polinukleotydowej (Hertzberg i wsp. (1982) J. Am. Chem. Soc. 104: 313; Hertzberg i Dervan (1984) Biochemistry 23: 3934; Taylor i wsp. (1984) Tetrahedron 40: 457; Dervan, PB (1986) Science 232: 464). Korzystne sposoby chemicznego przyłączania obejmują: pośrednie wiązanie, np. poprzez przyłączoną reaktywną grupę aminową (Corey i Schultz (1988) Science 238: 1401) oraz inne pośrednie chemiczne sposoby przyłączania, choć wykorzystane może być również przyłączanie poprzez układ streptawidyna/biotyna oraz digoksygenina/przeciwciała przeciwko digoksygeninie. Sposoby chemicznego wiązania podstawników przedstawione są w patentach USA nr. 5,135, 720; 5,093, 245; oraz 5, 055, 556, umieszczonych tu jako odnośniki. Inne sposoby wiązania chemicznego mogąbyć również stosowane, w zależności od uznania osób posiadających pewną praktykę w tym względzie. Polinukleotydy, odpowiadające całemu lub części składnika RNA ssaczej telomerazy (tj. „sensowne” polinukloetydy) mogąbyć również poddawane derywatyzacji i wykorzystywane do reakcji z sekwencjami powtórzeń telomerowych w genomie, w efekcie której produkowane są addukty lub inne modyfikacje środowiska chemicznego w regionach telomerów chromosomów.
MATRYCE Z NIESPAROWANYMI ZASADAMI
Tak więc, inne użyteczne oligonukleotydy, objęte wynalazkiem, obejmują zmienioną lub zmutowaną sekwencję składnika RNA ludzkiej telomerazy. Yu i wsp., 1990, Naturę 344: 126, wykazuj, iż zmutowana postać składnika RNA telomerazy Tetrahymena może być włączona do telomerazy komórek Tetrahymena, oraz że taka inkorporacja ma szkodliwy wpływ na funkcjonowanie tych komórek. Inkorporacja zmutowanych postaci składnika RNA ludzkiej telomerazy może mieć podobny efekt w przypadku ludzkich komórek wykazujących normalnie aktywność telomerazy, przy czym efekt ten nie powinien być obserwowany w przypadku ludzkich komórek nie wykazujących aktywności telomerazy. Takie zmutowane formy obejmują mutację sekwencji 5'-CTAACCCTA-3' do postaci 5'-CAAACCCAA-3', 5'-CCAACCCCAA-3' lub też 5'-CTCACCCTCA-3'. Każda z tych zmienionych sekwencji składnika RNA, zmienia jednostki powtórzeniowe wprowadzane do chromosomalnego DNA, zmieniając w ten sposób strukturę i funkcję chromosomów. Oligonukleotydy takie mogą być projektowane w ten sposób, aby zawierały miejsca rozpoznawane przez enzym restrykcyjny, które to miejsca są użyteczne podczas stosowania sposobu diagnozowania, polegającego na sprawdzaniu obecności zmienionego składnika RNA poprzez trawienie teomerowego DNA, lub innych substratów telomerazy, enzymami restrykcyjnymi.
Aby zilustrować ten aspekt wynalazku przeprowadzono mutagenezę, specyficzną względem miejsca, wykorzystując plazmid (oznaczony jako pGRN33, dostępny w amerykańskiej kolekcji „American Type Culture Collection” pod numerem dostępu ATCC 75926) obejmujący fragment Hindlll-Sacl o długości około 2,5 kb z klonu lambdowego 28-1 (patrz przykład 7, poniżej) oraz miejsce rozpoczynania replikacji SV40 (bez aktywności promotorowej). Otrzymanymi plazmidami, oznaczonymi jako pGRN34 (zawierający 5'-CAAACCCAA-3'), pGRN36 (zawierający 5'-CCAACCCCAA-3'), oraz pGRN37 (zawierający 5'-CTCACCCTCA-3'), trasformowano eukariotyczne komórki gospodarza (pochodna linii komórkowej 293, wykazująca ekspresję dużego antygenu T wirusa SV40), po czym przeprowadzano oznaczanie telomerazy, wykorzystując ekstrakty komórkowe uzyskane z transformantów.
Oznaczenia wykazały, że w wyniku aktywności telomerazy w komórkach powstawały kwasy nukleinowe zawierające zmienione sekwencje, co wskazywało z kolei na to, iż klony genomowe zawierały funkcjonalne geny dla składnika RNA, oraz że plazmidy zawierały zmieniony, lecz funkcjonalny, gen dla składnika RNA. Wyniki te ilustrują, w jaki sposób niniejszy wynalazek dosatrczać może preparatów zrekombinowanej telomerazy oraz sposobów produkowania takich preparatów. Niniejszy wynalazek dostarcza zrekombinowanej ludzkiej telomerazy, która
181 019 obejmuje składniki białkowe telomerazy połączone funkcjonalnie ze zrekombinowanym składnikiem RNA, objętym wynalazkiem. Takie zrekombinowane cząsteczki składnika RNA, objęte wynalazkiem, obejmują zarówno te cząsteczki, które różnią się od występujących w naturze cząsteczek składnika RNA podstawieniem jednego lub większej liczby nukleotydów, delecją, lub insercją jak i cząsteczki składnika RNA, identyczne z cząsteczką składnika RNA występującą w naturze, które produkowane są w zrekombinowanych komórkach gospodarza. Sposób produkowania takich zrekombinowanych cząsteczek telomerazy obejmuje transformację eukariotycznych komórek gospodarza, wykazujących ekspresję składników białkowych telomerazy, zrekombinowanym wektorem ekspresyjnym, kodującym cząsteczkę składnika RNA, objętą wynalazkiem, oraz hodowanie komórek, transformowanych owym wektorem, w warunkach umożliwiających ekspresję składników białkowych i składnika RNA, oraz ich połączenie w cząsteczkę aktywnej telomerazy, zdolnej dodawać sekwencje (niekoniecznie te same sekwencje, które dodawane są przez natywną telomerazę) do telomerów chromosomalnego DNA. Inne użyteczne zastosowania zrekombinowanych wektorów (lub plazmidów) ekspresyjnych dotycząplazmidów, które zawierajągen dla składnika RNA ludzkiej telomerazy z delecją insercją lub inną modyfikacją która sprawia, że gen staje się niefunkcjonalny. Plazmidy takie są szczególnie użyteczne w terapii genowej człowieka, przy wyłączaniu endogennych genów składnika RNA, choć do spowodowania, by trakowane komórki stały się nieodwracalnie śmiertelne, wymagane jest dysponowanie wysoce efektywnym systemem transformacji i rekombinacji.
ZASTOSOWANIA RYBOZYMÓW
Do hamowania aktywności telomerazy wykorzystywać można również inne oligonukleotydy objęte wynalazkiem, zwane rybozymami. W odróżnieniu do antysensownych, czy innych oligonukleotydów opisanych powyżej, które łącząsię z RNA, DNA, lub składnikiem białkowym telomerazy, rybozym nie tylko przyłącza się, ale także w specyficzny sposób przecina, a przez to potencjalnie inaktywuje, docelowy RNA, jakim może być na przykład składnik RNA ludzkiej telomerazy. Rybozym taki zawierać może sekwencje z końców 5' i 3', komplementarne do RNA telomerazowego. Zdolność rybozymu do inaktywacji telomerazy zależy od miejsca cięcia. Patrz zgłoszenie patentowe PCT nr 93/23572, powyżej. Po lekturze sekwencji RNA składnika RNA ludzkiej telomerazy, specjaliści zauważą zapewne, że zawiera ona szereg użytecznych miejsc docelowych dla rybozymu, wrażliwych na cięcie przeprowadzone, przykładowo, przez rybozym, którego drugorzędowa struktura przypomina kształt młotka (hammerhead). Przykładowe rybozymy tego typu, objęte wynalazkiem, obejmują przedstawione poniżej rybozymy, których cząsteczki mają następującą sekwencję:
: 5'-UAGGGUUACUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACAAAAAAU-3';
: 5 ' -UUAGGGUCUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAAGACAAAA- 3 ' ;
: 5'-UCUCAGUCUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAAGGGUUA-3'; oraz : 5·-CCCGAGACUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACCCGCG-3' .
Inne optymalne miejsca docelowe dla hamowania aktywności telomerazy przy użyciu rybozymu można zidentyfikować w sposób opisany w literaturze (Sullivan i wsp., 94/02595, oraz Draper i wsp., 93/23569). Jak to już zostało opisane (Hu i wsp., zgłoszenie patentowe PCT nr 94/03596), pojedynczy nukloetyd może łączyć w sobie funkcje cząsteczki antysensownej i rybozymu. Co więcej, rybozym zawierać może jeden, lub więcej zmodyfikowanych nukleotydów, lub też zmodyfikowane wiązania pomiędzy nukleotydarni, jak opisano powyżej w związku z omówieniem przykładowego antysensownego oligonukloetydu, objętego wynalazkiem. W jednym z aspektów, katalityczna podjednostka RNazy P (ludzkiej lub E. coli) modyfikowana jest w ten sposób (patrz: Altman S (1995) Biotechnology 13: 327), aby powstała sekwencja naprowadzająca (guide seąuence), odpowiadająca części składnika RNA ssaczej telomerazy, która paruje z sekwencją powtórzeniową telomeru; takie warianty RNazy P przecinają sekwencje te lomero we. W innym aspekcie, katalitycznapodjednostkaRNazy P (ludzkiej lub£. coli) modyfikowana jest w ten sposób, aby powstała sekwencja naprowadzająca, komplementarna do części składnika RNA telomerazy, co prowadzi do tego, iż taki wariant RNazy P może ciąć sek
181 019 wencję składnika RNA telomerazy. Tak skonstruowane rybozymy mogą ulegać ekspresji w komórkach i być przenoszone na wiele sposobów (np. liposomy, immunoliposomy, biobalistyka, bezpośrednie wprowadzanie do komórek, itp.). Inne formy rybozymów (rybozymy z grupy I intronów (Cech T (1995) Biotechnology 13; 323) rybozymy o strukturze drugorzędowej w kształcie młotka (Edgington SM (1992) Biotechnology 10: 256) mogąbyć również konstruowane, na podstawie ujawnionej informacji o sekwencji składnika RNA telomerazy, w celu katalizowania cięcia składnika RNA ludzkiej telomerazy i/lub sekwencji powtórzeniowej ludzkich teomerów.
Tak więc, wynalazek dostarcza szerokiej gamy oligonukleotydów hamujących aktywność telomerazy. Oligonukleotydy takie mogąbyć używane w ramach różnych sposobów terapeutycznych, objętych wynalazkiem, stosowanych do leczenia chorób, które to sposoby obejmują podawanie pacjentowi efektywnej terapeutycznie dawki inhibitora lub aktywatora telomerazy, objętych wynalazkiem. Wykorzystując protokoły oznaczeń, opisane we wzmiankowanych wcześniej zgłoszeniach patentowych USA oraz zgłoszeniu patentowym PCT nr 93/23572, mierzyć można poziom inhibicji czy aktywacji telomerazy, określając w ten sposób wielkość terapeutycznie efektywnej dawki podawanego czynnika. Jak zauważono w owych zgłoszeniach i poruszano powyżej, zahamowanie aktywności telomerazy sprawia, że nieśmiertelna komórka staje się śmiertelna, natomiast aktywacja aktywności telomerazy może przedłużyć zdolność komórek do namnażania się. Terapia, polegająca na inhibicji telomerazy, jest skutecznym sposobem leczenia chorób nowotworowych, obejmujących niekontrolowany wzrost nieśmiertelnych komórek, a aktywacja telomerazy jest skutecznym środkiem, zapobiegającym starzeniu się komórek. Dostarczenie czynników hamujących lub blokujących aktywność telomerazy, takich jak oligonukleotyd antysensowny, oligonukloetyd tworzący potrójną helisę, rybozym, czy plazmid kierujący ekspresją zmutowanego składnika RNA telomerazy, zapobiegać może działaniu telomerazy, i ostatecznie prowadzić do starzenia się i śmierci traktowanych komórek.
ASPEKTY TERAPEUTYCZNE I PROFILAKTYCZNE.
Dodatkowo, wynalazek niniejszy dostarcza sposobów terapeutycznych, zapewniających utrzymanie śmiertelności zdrowych komórek; przykładowo, składnik RNA może być modyfikowany, przy użyciu standardowych procedur inżynierii genetycznej, tak, aby uzyskać zdolność do wydeletowania całego lub części genu kodującego składnik (np. poprzez mutagenezę in vitro) na drodze rekombinacji genetycznej. Komórki takie stałyby się nieodwracalnie śmiertelne. Procedura ta jest użyteczna w terapii genowej, gdzie podczas wprowadzania pacjentowi zdrowych komórek, zawierających, w wyniku modyfikacji, plazmidy ekspresyjne, pragnie się mieć pewność, iż nie wprowadza się komórek rakowych, a jeśli takie komórki są wprowadzane, stają się wówczas nieodwracalnie śmiertelne.
Ponieważ telomeraza aktywna jest jedynie w guzach, komórkach rozrodczych, i niektórych komórkach macierzystych systemu krwiotwórczego, to terapia polegająca na inhibicji telomerazy nie wpływa na inne zdrowe komórki. Można jedynie odjąć kroki zapobiegające kontaktowi inhibitora telomerazy z komórkami rozrodczymi, czy macierzystymi, chociaż może nie być to istotne. Przykładowo, ponieważ komórki rozrodcze wykazują aktywność telomerazy, inhibicja telomerazy może wpływać negatywnie na spermatognezę i żywotność nasienia, co sugeruje, że inhibitory telomerazy mogą być skutecznymi środkami antykoncepcyjnymi bądź sterylizacyjnymi. Ten efekt antykoncepcyjny może być jednak niepożądany w przypadku pacjentów otrzymających inhibitor telomerazy, objęty wynalazkiem, leczonych w kierunku raka. W takich przypadkach, objęty wynalazkiem inhibitor telomerazy dostarczany może być w sposób zapewniający, że będzie on produkowany tylko przez okres terapii, w wyniku czego negatywny wpływ na komórki rozrodcze byłby tylko przejściowy.
Inne sposoby terapeutyczne, objęte wynalazkiem, wykorzystują objęty wynalazkiem kwas nukloeinowy (RNA) telomerazy do pobudzania aktywności telomerazy oraz do wydłużania zdolności komórek do namnażania się. Może to być przeprowadzone poprzez dostarczenie komórek funkcjonalnej zrekombinowanej rybonukleoproteiny teomerazowej, objętej wynalazkiem. Przykładowo, rybonukleoproteina może być dostarczona komórce w liposomie, łub też gen dla składnika RNA ludzkiej telomerazy (albo zrekombinowany gen z różnymi elementami
181 019 regulatorowymi) może być użyty w eukariotycznym plazmidzie ekspresyjnym (z lub bez sekwencji kodujących ekspresję składników białkowych telomerazy) w celu aktywowania aktywności telomerazy w różnych zdrowych komórkach człowieka, które w innym wypadku nie wykazują wykrywalnego poziomu aktywności telomerazy, wskutek niskiego poziomu ekspresji składnika RNA lub składnika białkowego telomerazy. Jeśli składnik RNA telomerazy nie wystarcza do pobudzania aktywności telomerazy, wówczas, wraz ze składnikiem RNA, transfekcją objąć można geny wywołujące ekspresję białkowych składników telomerazy, w celu wzbudzenia aktywności telomerazy. Tak więc, wynalazek dostarcza sposobu leczenia przypadków związanych z aktywnością telomerazy w komórce, lub w grupie komórek, poprzez poddawanie tych komórek działaniu terapeutycznie efektywnej dawki czynnika, zmieniającego aktywność telomerazy w komórce.
Komórki, które zawierają dodatkowe kopie genu dla telomerazowego RNA, wykazywać mogą wzrost aktywności telomerazy, oraz, związane z tym, wydłużenie okresu zdolności do namnażania się. Terapia taka może być przeprowadzana in vivo, lub też ex vivo na komórkach, które następnie wprowadzane są do gospodarza. Korzyści wynikające ze stabilizacji lub zwiększenia długości telomerów, poprzez podanie normalnej diploidalnej komórce egzogennych genów telomerazy ex vivo, sąnastępujące: stabilizacja telomerów wstrzymuje starzenie się i pozwala na potencjalnie nieograniczone namnażanie się komórek; a zdrowe diploidalne komórki, o wydłużonej zdolności do namnażania się, mogą być hodowane in vitro dla celów związanych z testowaniem leków, produkowaniem wirusów, itp. Ponadto, komórki macierzyste różnych typów, namnożone ex vivo, mogą być wykorzystywane w terapii komórkowej niektórych chorób, jako odnotowano powyżej.
Stabilizacja telomerowa może mieć działanie uspresyjne względem pojawiania się raka w namnażających się komórkach, poprzez zapobieganie zbyt drastycznemu skracaniu się telomerów w momentach bliskich przesileniu. Podczas przesilenia, obserwuje się ogólnąniestabilność genomową będącą efektem utracenia końca telomerowego, który zapewniał ochronę przed tego typu zjawiskami. Materiał genetyczny ulega „przetasowaniu”, a prawie wszystkie komórki umierają. Nieliczne komórki, którym udaje się przeżyć, są zazwyczaj komórkami aneuploidalnymi, zawierającymi wiele rearanżacji genowych, które to komórki odzyskały stabilność telomerów, dzięki wywołaniu ekspresji telomerazy. Jeśli utrzymując długie telomery zapobiegać można przesileniu, to można też w ten sposób zapobiegać niestabilności związanej z przesileniem, ograniczając jednocześnie ryzyko tego, iż któraś z komórek ulegnie całemu szeregowi mutacji wymaganych do wywołania przerzutowego raka.
Komórkami docelowymi dla telomerazowej terapii genowej (terapii obejmującej zwiększenie aktywności telomerazy w komórkach docelowych) mogą być między innymi komórki macierzyste hematopoezy (AIDS i stan po chemioterapii), komórki śródbłonka naczyń (choroby naczyń serca i mózgu), fibroblasty skóry oraz keranocyty warstwy podstawowej skóry (gojenie ran i oparzenia), chondrocyty (zapalenie stawów), astrocyty mózgowe i komórki mikroglejowe (choroba alzheimera), osteoblasty (osteoporoza), komórki siatkówki (choroby oczu), oraz komórki wysepek trzustkowych (cukrzyca typu I).
Zazwyczaj, sposoby leczenia objęte wynalazkiem obejmują podawanie oligonukleotydu, którego działanie hamuje lub pobudza aktywność telomerazy w warunkach fizjologicznych in vivo, i który jest w tych warunkach stabilny. Jak wspomniano powyżej, modyfikowane kwasy nukleinowe mogą być użyteczne przy osiąganiu takiej stabilności, podobnie jak w przypadku zapewnienia wprowadzenia nukleotydu do pożądanej tkanki, narządu, czy komórki. Użyteczne sposoby wprowadzania oligonukleotydów w celach terapeutycznych opisane są w literaturze (Inouye i wsp., Patent USA nr 5,272,065).
Choć oligonukleotydy można wprowadzać bezpośrednio, jako leki w postaci rozpuszczonej, to można je również wprowadzać używając terapii genowej oraz zrekombinowanych, ekspresyjnych plazmidów DNA, objętych wynalazkiem. Jedne z takich przykładowych plazmidów opisano w przykładzie 8, przedstawionym poniżej. W zasadzie, plazmid taki zwierać będzie promotor, i ewentualnie wzmacniacz (niezależnie od jakiegokolwiek wzmacniacza, który mógłby znajdować się w
181 019 obrębie sekwencji promotorowej) zapewniające kierowanie transkrypcją oligorybonukloetydu, a także inne elementy regulatorowe, służące utrzymaniu stabilności episomalnej, integracji chromosomowej, czy zwiększeniu poziomu transkrypcji, o ile jest to pożądane. Wektory adenowirusowe, wykorzystywane często w terapii genowej, są wektorami odpowiednimi do wykorzystania również w połączeniu z odczynnikami i sposobami objętymi niniejszym wynalazkiem. Patrz: zgłoszenia patentowe PCT nr 94/12650; 94/12649; 94/12629. Promotory użyteczne dla tych celów to: promotor metalotioneiny; konstytutywny główny późny promotor adenowirusowy, promotor MMTV indukowany deksametazonem; promotor SV40; promotor poi III MRP; konstytutywny promotor MPSV; promotor CMV indukowany tetracykliną (jak ludzki wczesny promotor CMV); oraz konstytutywny promotor CMV Plazmid użyteczny w terapii genowej zawierać może inne funkcjonalne elementy, takie jak markery (znaczniki) umożliwiające selekcję, regiony identyfikacyjne, i inne geny. Zrekombinowane ekspresyjne plazmidy DNA mogą być również wykorzystywane do otrzymywania oligonukleotydów objętych wynalazkiem, przeznaczonych do wprowadzania innymi, niż terapia genowa, sposobami, jednakże ekonomiczniejsze wydaje się być produkowanie krótszych oligonukleotydów drogą syntezy chemicznej in vitro.
Inny aspekt dotyczy faktu kształtowania, w ramach wynalazku, składu farmaceutycznego preparatu, obejmującego efektywnąterapeutycznie dawkę inhibitora lub aktywatora telomerazy, objętych wynalazkiem. Skład farmaceutyczny preparatów inhibitora telomerazy obejmować może zmutowany składnik RNA ludzkiej telomerazy, oligonukleotyd antysensowny, bądź też oligonukleotyd tworzący potrójną helisę, które przyłączają się do składnika RNA ludzkiej telomerazy, lub jego genu, albo też rybozym zdolny do przecinania składnika RNA ludzkiej telomerazy, lub wreszcie różne kombinacje powyższych lub innych składników w połączeniu z nośnikiem lub solą możliwymi do zaakceptowania z farmaceutycznego punktu widzenia. Inne przepisy farmaceutyczne, objęte wynalazkiem, dotyczą preparatu aktywatora telomerazy, takiego jak oczyszczona ludzka telomeraza, lub mRNA dla składników białkowych telomerazy i składnika RNA telomerazy, i są stosowane w przypadku leczenia chorób związanych ze starzeniem się. Inny aspekt wynalazku dotyczy zmutowanego sensownego składnika RNA ludzkiej telomerazy, podawanego populacji komórek, przy czym ów zmutowany sensowny składnik RNA telomerazy zawiera, w odniesieniu do sekwencji powtórzeniowej ludzkiej telomerazy, przynajmniej jedną niesparowaną zasadę, lecz zdolny jest do podtrzymywania aktywności ludzkiej telomerazy w połączeniu ze składnikiem polipeptydowym ludzkiej telomerazy, co prowadzi do błędnego wstawiania nukleotydu w wybranej pozycji powtórzenia ludzkiego telomeru, przez co replikacja powstałych w ten sposób telomerów zależna jest od stałej obecności zmutowanego sensownego składnika RNA. Tym samym, dostarcza się nowego sposobu leczenia, w którym zmutowany sensowny składnik RNA telomerazy jest podawany populacji komórek w ciągu czasu wystarczającego dla wprowadzenia sekwencji telomerowych, które są zasadniczo niefunkcjonalne jako matryce dla występującego w naturze składnika RNA ssaczej telomerazy, po czym, poprzez wstrzymanie podawania zmutowanego sensownego składnika RNA telomerazy, doprowadza się do szybkiego skracania długości telomerów w populacji komórek, oraz wzmożonego starzenia się lub śmiertelności komórek.
Czynnik terapeutyczny może być podawany przy zastosowaniu formuły odpowiedniej dla pozajelitowego, donosowego, doustnego, lub innych form podawania leku. Patrz zgłoszenie patentowe PCT nr 93/23572, powyżej.
SPOSOBY DIAGNOSTYCZNE
Oprócz opisanych powyżej przepisów farmaceutycznych oraz sposobów leczenia, wynalazek niniejszy dostarcza również sposobów i odczynników diagnostycznych. Wynalazek dostarcza diagnostycznego sposobu określania poziomu, ilości, lub obecności składnika RNA ludzkiej telomerazy, telomerazy, lub aktywności telomerazy w komórce, populacji komórek, lub próbce tkanki. W innym, pokrewnym aspekcie, wynalazek dosatrcza odczynników użytecznych przy stosowaniu wymienionych sposobów, które mogąbyć ewentualnie umieszczone w zestawie, zawierającym instrukcję użycia owego zestawu w praktyce diagnostycznej. Jak wspomniano
181 019 powyżej w nawiązaniu do testów określających, czy klon pGRN7 zawierał cDNA dla składnika RNA ludzkiej telomerazy, poziom składnika RNA w komórkach nowotworowych był podwyższony. Tak więc, wykrywanie składnika RNA jest w przypadku komórek nowotworowych użyteczne z diagnostycznego punktu widzenia.
Ponadto, sondy i startery, które łączą się specyficznie ze składnikiem RNA ludzkiej telomerazy (lub z którąkolwiek z nici jego genu) może być wykorzystana w diagnostyce do wykrywania obecności kwasu nukleinowego telomerazy w próbce. Startery i sondy są oligonukleotydami komplementarnymi wobec określonych sekwencji, a więc będą się łączyć z docelową sekwencją kwasu nukleinowego. Choć startery i sondy mogą różnić się sekwencją i długością to pierwotnym czynnikiem różnicującym te dwie grupy jest ich funkcja: startery służą do inicjowania syntezy DNA, jak to ma miejsce w przypadku amplifikacji PCR, natomiast sondy sązazwyczaj używane do przyłączania się do docelowych sekwencji kwasów nukleinowych. Typowa długość startera lub sondy może wahać się od 8 do 20-30 lub większej liczby nukleotydów. Starter lub sonda mogą również być znakowane w celu ułatwienia detekcji (do tego celu używa się głównie radioaktywnych lub fluorescencyjnych cząsteczek) lub oczyszczenia/rozdzielenia (do tego celu używa się głównie biotyny bądź awidyny).
Szczególnie korzystny sposób diagnostyczny, objęty wynalazkiem, dotyczy wykrywania sekwencji składnika RNA telomerazy w próbach komórkowych lub tkankowych, pobranych od pacjentów, u których podejrzewa się występowanie raka. Sposoby takie obejmują zazwyczaj przyłączenie wyznakowanej sondy lub startera do sekwencji składnika RNA, w warunkach, w których tylko dokładnie dopasowane (komplementarne) sekwencje wiążą się (hybrydyzują) ze sobą. Wykrycie w próbce wyznakowanego materiału związanego z RNA będzie korelować z obecnością aktywności telomerazy, oraz obecnością komórek rakowych. Niektóre komórki mogą eksprymować składnik RNA telomerazy, jednak pozostają negatywne w teście na obecność telomerazy z powodu braku ekspresji składników białkowych telomerazy. Jeśli występuje potrzeba sprawdzenia obecności aktywności telomerazy w takich komórkach, wówczas wyizolować można wpierw białko, a następnie sprawdzić, czy we frakcji białkowej obecny jest składnik RNA telomerazy, co powinno świadczyć o obecności aktywności telomerazy. Objęte wynalazkiem sposoby diagnostyczne mogą być szczególnie użyteczne podczas wykrywania obecności aktywności telomerazy w biopsjach tkankowych lub wycinkach histologicznych, w przypadku których analizę przeprowadza się in situ, zazwyczaj po powieleniu składnika RNA telomerazy przy użyciu specyficznych starterów, objętych wynalazkiem.
Wynalazek dosatrcza również sond polinukleotydowych dla składnika RNA telomerazy, przeznaczonych do diagnozowania stanów chorobowych (np. nowotworów lub stanów przednowotworowych) poprzez wykrywanie składnika RNA telomerazy, lub wykrywanie zrearanżowanych lub powielonych sekwencji genu dla składnika RNA telomerazy w komórkach pobranych od pacjenta, albo też do wykrywania patognostycznego allelu dla składnika RNA telomerazy (np. poprzez RFLP lub specyficzną dla allelu analizę PCR). Zazwyczaj, detekcję przeprowadza się stosując hybrydyzację in situ przy zastosowaniu wyznakowanych (np. 32P, 35S, 14C, 3H, fluorescencyjnych, biotynylowanych, digoksyfeninowanych) polinukleotydów dla składnika RNA telomerazy, choć może być tu również użyta technika „Northern”, hybrydyzacja plamowa, lub też hybrydyzacja w roztworze (z całkowitym RNA lub poli A+ RNA, izolowanym z próbek komórkowych), a także powielanie poprzez reakcję PCR lub LCR, przy zastosowaniu starterów specyficznych dla składnika RNA telomerazy. Komórki, które zawierają zmienioną ilość składnika RNA telomerazy, w porównaniu z komórkami nienowotworowymi tego samego typu (typów), są identyfikowane jako komórki podejrzane o dotknięcie chorobą. Podobnie, w oparciu o wykrycie w próbce komórkowej rearanżacji patognostycznych lub też powielenia locus genu dla składnika RNA telomerazy, lub innych, blisko sprzężonych, loci, identyfikować można obecność stanów patologicznych lub predyspozycji do wytwarzania stanów patologicznych (np. nowotworu, choroby genetycznej). Sondy polinukleotydowe są również wykorzystywane do indentyfikowania osób dla celów sądowych, jak chociażby w przypadku badania ojcostwa, bądź identyfikacji niezidentyfikowanych zmarłych lub osób podejrzanych o dokonanie przestępstwa.
181 019
W ramach populacji ludzkiej występować mogą niewielkie zmiany w obrębie podstawowej, pierwotnej sekwencji składnika RNA telomerazy, włączając w to warianty alleliczne, polimorfizmy miejsc restrykcyjnych, oraz wrodzone allele chorobowe składnika RNA telomerazy związane z chorobą genetyczną.
Jeśli jest to pożądane, amplimery do reakcji PCR, przeznaczone do powielania kopii składnika RNA telomerazy o pełnej długości, mogąbyć dobierane według uznania specjalisty, posiadającego praktykę w tym względzie. W podobny sposób mogą być odbierane amplimery przeznaczone do powielania części genu lub RNA składnika RNA telomerazy.
EKSPRESJA SKŁADNIKA RNA TELOMERAZY
Zakres użyteczności plazmidów ekspresyjnych, objętych wynalazkiem, zależy od długości i przewidywanej funkcji startera, sondy, lub innego kwasu nukleinowego, zawierającego sekwencje składnika RNA ludzkiej telomerazy. Przykładowo, przy produkowaniu objętego wynalazkiem składnika RNA o pełnej długości wykorzystać można zrekombinowany, ekspresyjny plazmid DNA, objęty wynalazkiem, obejmujący kwas nukleinowy zawierający sekwencję nukleotydową składnika RNA umieszczoną w pozycji, zapewniającej kontrolę trankrypcyjną odpowiedniego promotora. Jako komórki gospodarza dla takiego plazmidu służyć mogą zarówno komórki prokariotyczne, jak i eukoriotyczne, a wybór promotora, a także innych elementów regulacyjnych oraz markerów selekcyjnych, zależeć będzie od rodzaju komórki gospodarza wykorzystywanego do produkcji. Cały gen składnika RNA, tj. promotor, obejmujący sekwencje regulacyjne w regionie 5' genu, oraz region, kodujący składnik RNA, wykorzystany może być do ekspresji składnika RNA w komórkach ludzkich, włączając w to komórki ludzkie, które zostały unieśmiertelnione w wyniku transformacji wirusowej lub raka. Promotor genu składnika RNA podlegać może jednak regulacji, dlatego też z tego oraz innych powodów, warto być może umieszczać sekwencje składnika RNA pod kontrolą ekspresyjną innego promotora. Z kolei z rugiej strony, wykorzystywać można promotor genu składnika RNA, niezależnie od sekwencji kodujących składnika RNA, w celu otrzymania ekspresji innych sekwencji kodujących, będących przedmiotem zainteresowania w konkretnym przypadku. Przykładowo, badać można w ten sposób regulację procesu transkrypcji genu składnika RNA, łącząc promotor genu składnika RNA z reporterową sekwencją kodującą, taką jak chociażby sekwencja kodująca β-galaktozydazy, lub innego enzymu lub białka, których ekspresję można łatwo monitorować. Tak więc, promotor oraz inne elementy regulatorowe genu składnika RNA ludzkiej telomerazy mogąbyć wykorzystywane do ekspresji nie tylko składnika RNA, ale także składników białkowych ludzkiej telomerazy, antysensownych lub innych oligonukleotydów, a także innych produktów genowych, będących przedmiotem zainteresowania, w komórkach ludzkich. Plazmidy ekspresyjne, zawierające cały gen dla składnika RNA ludzkiej telomerazy, wydają się być szczególnie użyteczne dla rozmaitych celów, włączając w to terapię genową. Specjaliści dostrzegą zapewne, że do wytwarzania objętych wynalazkiem użytecznych kwasów nukleinowych można wykorzystywać szeroki zakres plazmidów ekspresyjnych, a używany tu termin „plazmid” odnosi się do każdego typu kwasu nukleinowego (fagowego, wirusowego, chromosomalnego, itd.) który posłużyć może do przenoszenia specyficznej informacji genetycznej do komórek gospodarza, oraz do utrzymywania tej informacji przez pewien okres czasu.
IZOLACJA SKŁADNIKA RNA TELOMERAZY
Odczynniki objęte niniejszym wynalazkiem umożliwiają klonowanie i izolację kwasów nukleinowych, kodujących składniki białkowe ludzkiej telomerazy oraz inne ssacze enzymy telomerazowe, które nie były dotychczas dostępne. Udostępnienie tych kwasów nukleinowych stanowi niewątpliwą korzyść, i jest jakby dopełnieniem korzyści wynikających z dostępu od kwasów nukleinowych, zawierających sekwencje składnika RNA ludzkiej telomerazy. Przykładowo, jak już wcześniej zauważono, korzystne efekty terapeutyczne, związane z niniejszym wynalazkiem, mogąbyć w niektórych przypadkach wzmocnione, dzięki użyciu oczyszczonych preparatów składników białkowych ludzkiej telomerazy, oraz dzięki dostępowi do sekwencji kwasów nukleinowych kodujących te składniki. Objęte wynalazkiem kwasy nukleinowe, kodujące składnik RNA ludzkiej telomerazy, wykorzystane mogą być do izolowania
181 019 kwasów nukleinowych, kodujących składniki białkowe ludzkiej telomerazy, umożliwiając w ten sposób dostęp do wszelkich związanych z tym korzyści. Tak więc, wynalazek dostarcza sposobów izolowania i oczyszczania składników białkowych ludzkiej telomerazy, a także identyfikowania i izolacji kwasów nukleinowych, kodujących składniki białkowe ludzkiej telomerazy. W ramach innego, pokrewnego aspektu, niniejszy wynalazek dostarcza oczyszczonej ludzkiej telomerazy, oczyszczonych kwasów nukleinowych kodujących owe składniki białkowe ludzkiej telomerazy, oraz zrekombinowane plazmidy ekspresyjne dla składników białkowych ludzkiej telomerazy. Wynalazek dostarcza także preparatu farmaceutycznego, zawierającego, jako aktywny składnik, składniki białkowe ludzkiej telomerazy, albo kwasy nukleinowe, które z kolei albo kodują te składniki białkowe, albo też oddzilowywują z kwasami nukleinowymi kodującymi owe składniki białkowe, tak jak na przykład antysensowne oligonukleotydy, rybozymy, lub zrekombinowane ekspresyjne plazmidy DNA dla któregokolwiek z tych kwasów nukleinowych.
Sklonowany składnik RNA ludzkiej telomerazy może być wykorzystany do identyfikowania oraz klonowania kwasów nukleinowych, kodujących składniki białkowe rybonukleoproteinowego enzymu telomerazowego. Do identyfikacji i klonowania składników białkowych wykorzystać można kilka różnych sposobów. Przykładowo, zastosować można wychwytywanie powinowacyjne enzymu (lub też częściowo zdenaturowanego enzymu) wykorzystując do tego jako ligand powinowacyjny, albo (1) sekwencję nukleotydową komplementarną do składnika RNA, która łączyłaby się ze składnikiem RNA nienaruszonego enzymu; albo też (2) składnik RNA, który łączyłby się ze składnikami białkowymi enzymu, częściowo lub całkowicie zdenaturowanego. Ligand mógłby być przymocowany do stałego nośnika, lub też mógłby to być ligand zmodyfikowany (np. biotynylowany), który byłby później immobilizowany na nośniku. Ekspozycja z ekstraktem komórkowym zawierającym ludzką telomerazę, poprzedzająca płukanie i eluowanie związanego z nośnikiem enzymu telomerazowego, daje w efekcie wysoko oczyszczony preparat enzymu telomerazowego. Składniki białkowe mogąbyć ewentualnie jeszcze dalej oczyszczane, lub też bezpośrednio analizowane poprzez sekwencjonowanie białka. Okr eślona już sekwencja białkowa może być wykorzystana do przygotowania starterów i sond, przeznaczonych do klonowania cDNA, lub identyfikowania klonu w banku genomowym, zawierającym kwasy nukleinowe kodujące składnik białkowy telomerazy.
Zastosować można również wychwytywanie powinowacyjne telomerazy z użyciem zmodyfikowanego składnika RNA, wykorzystując transkrybowany in vitro RNA telomerazowy, oraz system odtwarzający aktywność enzymatyczną telomerazy (Autaxier i Greider, 1994, Genes & Development 8, 563-575). RNA jest modyfikowany poprzez dodanie znacznika, podobnie jak to się robi w przypadku oznakowywania determinanty antygenowej. Znacznikiem może być sekwencja RNA, dla której dostępny jest ściśle łączący się z nią ligand, np. przeciwciało specyficzne wobec sekwencji RNA, lub specyficzne względem sekwencji białko wiążące kwasy nukleinowe, lub też barwnik organiczny wiążący się ściśle ze specyficzną sekwencją RNA. Tolerancja telomerazy wobec sekwencji i pozycji znacznika może być testowana przy użyciu standardowych sposobów. Synteza zmienionego składnika RNA oraz etap odtwarzania mogą być również przeprowadzone in vivo. Do izolacji enzymu można następnie wykorzystać wychwytywanie powinowacyjne z użyciem immobilizowanego liganda dla znacznika RNA.
Do izolacji składników białkowych enzymu telomerazowego może być również wykorzystane przeszukiwanie ekspresyjne. Sposób ten obejmuje przeszukiwanie bibliotek ekspresyjnych cDNA przy użyciu wyznakowanego RNA telomerazowego, co prowadzi do identyfikacji cząsteczek cDNA kodujących białka, łączących się specyficznie z RNA telomerazowym. Do izolowania kwasów nukleinowych, kodujących składniki białkowe enzymu telomerazowego zastosować można także podejście od strony genetyki molekularnej, wykorzystujące zahamowanie procesu translacji. Sposób ten obejmuje połączenie sekwencji RNA telomerazowego z (umiejscowioną z nią) sekwencją markera selekcyjnego. Marker selekcyjny funkcjonuje w przypadku ekspresji w odpowiednim systemie. Gdy ekspresji ulega cDNA kodujący telomerazowe białko wiążące RNA, wówczas białko wiąże się z rozpoznawaną przez siebie sekwencją blokując w ten sposób translację markera selekcyjnego, przez co możliwa jest identyfikacja klonu dokującego białko. W innym wariancie tego sposobu, blokada
181 019 translacji markera selekcyjnego umożliwia wzrost stransformowanych komórek. Inne, możliwe do zastosowania, systemy obejmują „system pułapki interakcyjnej” opisany w zgłoszeniu patentowym PCT WO 94/10300; system Jednohybrydowy” opisany przez Li i Herskowitza, 1993, Science 262: 1870-1874, oraz Zervosa i wsp., Celi 72: 223-232; oraz system „dwuhybrydowy” dostępny komercyjnie w firmie Clontech.
Oznaczanie wiązania RNA telomerazowego lub aktywności telomerazowej, w celu detekcji specyficznych białek wiążących oraz aktywności, może być wykorzystane do ułatwienia oczyszczania enzymu telomerazowego oraz identyfikacji kwasów nukleinowych, kodujących składniki białkowe enzymu. Przykładowo, kwasy nukleinowe zawierające sekwencje składnika RNA mogą być użyte jako odczynniki powinowacyjne, wykorzystane do izolacji, identyfikacji oraz oczyszczania peptydów, białek lub innych składników, wiążących się specyficznie z sekwencją zawartą w składniku RNA, takich jak składniki białkowe ludzkiej telomerazy. Dostępnych jest wiele różnych sposobów, jak chociażby przesunięcie żelowe (gel shift), wiązanie z filtrem, technika „footprinting”, Northwestern (sonda RNA stosowana wobec białek poddawanych transferowi), czy sieciowanie pod wpływem światła (photocrosslinking), umożliwiających wykrywanie takiego wiązania i izolowanie składników, które wiążą się specyficznie ze składnikiem RNA. Oznaczenia te mogą być wykorzystywane do identyfikacji białek wiążących, do ich śladowego oczyszczania, do charakteryzowania miejsc wiążących RNA, do określania ciężaru cząsteczkowego białek wiążących, do znakowania białek przed przeprowadzeniem preparatywnej izolacji, oraz do przeprowadzanej następnie immunizacji zwierząt w celu wytworzenia przeciwciał, wykorzystywanych później podczas izolowania białka lub identyfikowania kwasu nukleinowego kodującego białko (w systemie sprzężonych procesów transkrypcji i translacji).
OCZYSZCZANIE SKŁADNIKA BIAŁKOWEGO SSACZEJ TELOMERAZY
Przy użyciu konwencjonalnych sposobów biochemicznych można oczyszczać składnik białkowy ssaczej telomerazy z komórek wykazujących ekspresję telomerazy, takich jak komórki HT1080, komórki 293, oraz odpowiednie inne nieśmiertelne linie komórkowe. Przykładowo (bez intencji ograniczania), telomeraza ludzka z ekstraktów komórkowych może być oczyszczana według zasadniczego opisu zawartego w zgłoszeniu patentowym USA nr 08/288, zgłoszonym 10 sierpnia 1994 roku. Ssacza polimeraza w ekstrakcie może być pozbawiana składnika RNA telomerazy poprzez traktowanie RNazą lub innymi odpowiednimi środkami, prowadzącymi do dysocjacji i/lub degradacji składnika RNA, bez naruszania składnika białkowego telomerazy, zachowującego zdolność do odtworzenia w przypadku dodania egzogennego składnika RNA telomerazy, którym mógłby być wyprodukowany zrekombinowany składnik, lub też inny podobny. Tak oczyszczony, i ewentualnie pozbawiony endogennego składnika RNA telomerazy, składnik białkowy telomerazy może być wykorzystany w opisanym tutaj ateście oznaczeniowym, lub w innych celach.
TERAPIA GENOWA
Przenoszenie egzogennego materiału genetycznego do komórek (tj. transfekcja przy użyciu DNA) jest istotnym sposobem prowadzenia badań podstawowych w zakresie biologii komórki i genetyki molekularnej, a także podstawą dla rozwinięcia skutecznych sposobów ludzkiej terapii genowej. Dotychczas, większość zaakceptowanych w Stanach Zjednoczonych prób przenoszenia genów polega na użyciu niezdolnych do replikacji wektorów wirusowych, zawierających, jako część genomu retrowirusowego, leczniczą sekwencję polinukleotydową (Miller i wsp. (1990) Mol. Cel. Biol. 10: 4239; Kolberg R (1992) J. NIH Res. 4: 43; Cometta i wsp. (1991) Hum. Gene Ther. 2: 215). Również wektory adenowirusowe były opisywane jako potencjalnie użyteczne w terapii genowej człowieka (Rosenfeld i wsp. (1992) Celi 68: 143).
Innym sposobem przenoszenia genów, zaakceptowanym do użytku w przypadku człowieka, jest fizyczny transfer DNA plazmidowego w liposomach, bezpośrednio do komórek nowotworowych in situ. Odmiennie niż wektory wirusowe, które muszą być namnażane w hodowlach komórkowych, DNA plazmidowy może być oczyszczony do stanu homogenności, co zmniejsza możliwość wystąpienia patogennych zanieczyszczeń. W niektórych sytuacjach (np. w komórkach nowotworowych), egzogenny DNA nie musi koniecznie wbudowywać się na stałe w transdukowanych komórkach, gdyż
181 019 przejściowa ekspresja może wystarczać do zabicia komórek nowotworowych. Przenoszenie DNA przy pomocy liposomów opisało wielu badaczy (Wang i Huang (1987) Biochem. Biophys. Res. Commun. 147: 980; Wang i Huang (1989) Biochemistry 28: 9508; Litzinger i Huang (1992) Biochem. Biophys. Acta 1113: 201; Gao i Huang (1991) biochem. Biophys. Res. Commun. 179: 280; Felgner WO91/17424; WO91/16024).
Jako nośniki egzogennych polinukleotydów zostały także opisane immunoliposomy (Wang i Huang (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 84: 7851; Trubetskoy i wsp. (1992) Biochem. Biophys. Acta 1131:311). Teoretycznie należałoby oczekiwać, iż immunoliposomy powinny mieć zwiększoną, w porównaniu z liposomami, specyficzność względem typów komórek, a to dzięki posiadaniu specyficznych przeciwciał, które przypuszczalnie łączą się z antygenami powierzchniowymi specyficznych typów komórek. Behr i wsp. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86: 6982, donoszą o wykorzystaniu lipopoliaminy, jako odczynnika, który samodzielnie umożliwia transfekcję, bez konieczności stosowania jakichkolwiek dodatkowych fosfolipidów do tworzenia liposomów.
Odpowiednio, polinukleotyd zasadniczo identyczny z przynajmniej 25 nukleotydami, korzystnie 50-100 lub większą liczbą nukleotydów sekwencji składnika RNA telomerazy, lub sekwencji komplementarnej do niego, jest funkcjonalnie sprzężony z heterologicznym promotorem, tworząc jednostkę transkrypcyjną zdolną do eksprymowania składnika RNA telomerazy lub polinukleotydu antysensownego wobec składnika RNA telomerazy w komórce ludzkiej. Taka jednostka transkrypcyjna może być zawarta w transgenie, wektorze adenowirusowym, lub innym pośredniku stosowanym w terapii genowej, w celu wprowadzenia do komórek ludzkich, przykładowo w celu leczenia chorób związanych z telomerazą(np. nowotworów). Odpowiednie sposoby wprowadzania konstruktów ekspresyjnych dla sensownego lub antysensownego składnika RNA telomerazy, mogą być w praktyce dobierane według akceptowanych w danym wypadku praktyk oraz wymagań regulacyjnych.
ZASTOSOWANIA DOTYCZĄCE ZWIERZĄT TRANSGENICZNYCH
Klony genomowe składnika RNA ssaczej telomerazy, a szczególnie składnika RNA telomerazy identycznego z mysim składnikiem RNA telomerazy, mogą być wykorzystane do tworzenia homologicznych konstruktów docelowych, w celu wytwarzania komórek oraz transgenicznych zwierząt, posiadających przynajmniej jeden uszkodzony funkcjonalnie allel składnika RNA telomerazy. Wskazówki ułatwiające kontrukcję homologicznych konstruktów docelowych znaleźć można w literaturze specjalistycznej, np.: Rahemtulla i wsp. (1991) Naturę 353:180; Jasin i wsp. (1990) Genes Devel. 4:157; Koh i wsp. (1992) Science 256:1210; Molina i wsp. (1992) Naturę 357: 161; Grusby i wsp. (1991) Science 253: 1417; Bradley i wsp. )1992) Bio/Technology 10: 534. Włączanie homologiczne (homologous tarageting) może być wykorzystane do tworzenia tak zwanych „znokautowanych” myszy („knockouf ’ mice), które mogą być heterozygotyczne lub homozygotyczne względem unieczynnionego allelu składnika RNA telomerazy. Myszy takie mogą być sprzedawane komercyjnie jajko zwierzęta laboratoryjne do badań nad rozwojem systemu odpornościowego, nowotworami, spermatogenezą, mogą być również wykorzystywane jako zwierzęta domowe, jako źródło białka zwierzęcego (artykuł żywnościowy), oraz dla innych celów.
Można również otrzymywać chimerowe myszy transgeniczne, zgodnie ze wskazówkami zawartymi w: Hogan i wsp., Manipulating the Mouse Embryo: A laboraotry Manuał, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) oraz Teratocarcinomas and Embryonic Stern Cells: A pracatical Aproach, E.J. Robertson, ed., IRL Press, Washington, D.C. (1987). Manipulacje dotyczące komórek macierzystych zarodka przeprowadzać można według opublikowanych procedur (Teratocarcinomas and Embryonic Stern Cells: A Practical Approach, E.J. Robertson, ed., IRL Press, Washington, D.C. (1987); Zjilstrai wsp. (1989) Naturę 342:435; oraz Schwartzberg i wsp. (1989) Science 246:799).
Ponadto, cDNA składnika RNA telomerazy lub genomowa kopia genu mogą być wykorzystane do skonstruowania transgenów w celu wywołania ekspresji składnika RNA telomerazy na bardzo wysokim poziomie i/lub w warunkach kontroli transkrypcyjnej, możliwej dzięki sekwencjom kontrolującym transkrypcję, które w naturze nie sąsiadująz genem dla skład
181 019 nika RNA telomerazy. Przykładowo (bez intencji ograniczania), konstytutywny promotor (np. promotor HSV tk lub pgkj lub transkrypcyjna sekwencja regulatorowa specyficzna wobec linii komórkowej (np. promotor/wzmacniacz genu CD4 lub CD8) mogą być funkcjonalnie sprzężone z sekwencją polinukleoetydową składnika RNA telomerazy, tworząc transgen (zazwyczaj w połączeniu z markerem selekcyjnym, takim jak kaseta ekspresyjna genu neo). Transgeny takie mogą być wprowadzane do komórek (np. komórek ES, komórek macierzystych hematopoezy), po czym, stosując konwencjonalne sposoby) otrzymuje się transgeniczne komórki i transgeniczne zwierzęta. Komórki transgeniczne i/lub zwierzęta transgeniczne mogą być wykorzystywane do poszukiwania czynników antynowotworowych i/lub poszukiwania potencjalnych czynników rakotwórczych, jako że nadmierna ekspresja składnika RNA telomerazy lub niewystarczająca ekspresja składnika RNA telomerazy mogą prowadzić do osiągnięcia stanu przednowotworowego, lub nowotworowego.
TESTY OZNACZENIOWE
Polinukloetydy składnika RNA telomerazy, preparaty składnika białkowego telomerazy, telomerowe matryce powtórzeniowe, oraz reakcje przyłączania itp., mogą być otrzymywane i wykorzystywane w praktyce według zamieszczonych poniżej przykładów eksperymentalnych. W zasadzie, składniki białkowe telomerazy uzyskuje się z komórek ssaczy, wykazujących ekspresję telomerazy, poprzez konwencjonalne oczyszczanie i pozbycie się związanego z nimi składnika RNA, co poprzedza wykorzystanie ich w opisanych tu oznaczeniach. Szczegółowe warunki mogą być dobrane zgodnie z konwencjonalnymi sposobami. Poniższe warunki (skład buforu wodnego) mogą być traktowane jako ogólne wskazania: 100-250 mM NaCl, 5-50 mM Tris-HCl, pH 5-8, ewentualnie z dodatkiem dwuwartościowych kationów i/lub związków chelatujących metale i/lub niejonowych detergentów i/lub frakcji membranowych. Jest zrozumiałe dla specjalistów, iż na podstawie tych warunków wprowadzać można zmiany, polegające na wprowadzaniu, odejmowaniu, modyfikowaniu (np. pH), oraz zastępowaniu (np. KC1 wprowadzony zamiast NaCl, lub zamiana buforu) poszczególnych składników. Modyfikacje dotyczące podstawowych warunków reakcji wiązania mogą być wprowadzane tak długo, jak długo w kontrolnych reakcjach obserwuje się specyficzne tworzenie haloenzymu telomerazowego i/lub aktywność telomerazy. Warunki, które nie pozwalają na specyficzne wiązanie i cięcie w reakcjach kontrolnych (do których nie dodano czynnika), nie mogą być stosowane w oznaczeniach poziomu wiązania.
Korzystnie, podczas oznaczania wiązania składnika RNA telomerazy do immobilizowanego składnika białkowego telomerazy, składniki RNA telomerazy znakowane są odpowiednim znacznikiem, umożliwiającym detekcję, najczęściej grupąbiotynylową cząsteczką fluorescencyjną, lub włączonym radioaktywnym nukleotydem. Składnik białkowy telomerazy może być również odpowiednio wyznakowany, między innymi poprzez włączenie radioaktywnego aminokwasu (np. leucyna znakowana 14C, glicyna znakowana 3H, metionina znakowana 35S), poprzez potranslacyjne włączanie radioaktywnego jodu 125I lub l31I (np. reakcja Boltona i Huntera oraz chloramina T), poprzez potranslacyjne włączanie radioaktywnego fosforu 32P (np. .z użyciem fosforylazy i nieorganicznych fosforanów znakowanych radioaktywnie), znakowanie fluorescencyjne poprzez włączanie znacznika fluorescencyjnego (np. fluorosceiny lub rodaminy), lub poprzez inne konwencjonalne sposoby znane specjalistom. W zastosowaniach, w których jeden z rodzajów polipeptydu jest immobilizowany poprzez wiązanie z substratem, drugi składnik jest na ogół znakowany umożliwiającym detekcję znacznikiem.
Wyznakowany składnik RNA lub składnik białkowy telomerazy jest poddawany kontaktowi odpowiednio z immobilizowanym składnikiem białkowym lub składnikiem RNA telomerazy, przy czym określana jest zdolność czynnika do zmiany ilości wyznakowanego składnika, ulegającego immobilizacji (tj. wychwytywaniu przez pokrewny składnik). Czas oraz temperatura inkubacji w reakcji wiązania mogą być zmieniane, o ile wybrane warunki pozwalają na występowanie specyficznego wiązania się w reakcji kontrolnej, do której nie dodano badanego czynnika. Korzystnie, zastosowana temperatura powinna wynosić około przynajmniej 15°C, a korzystniej 35 do 42°C, natomiast czas inkubacji powinien mniej więcej wynosić około przynajmniej 15 sekund, choć korzystniejsze są dłuższe okresy inkubacji, tak aby w niektórych
181 019 zastosowaniach osiągnąć równowagę reakcji wiązania. Kinetyka reakcji przyłączania oraz stabilność termodynamiczna związanych kompleksów określają możliwości dopuszczalnych zmian w zakresie czasu, temperatury, stężenia soli, pH, i innych warunków reakcji. Jednakże, jeśli jest to wymagane w przypadku niektórych szczególnych zastosowań, przeprowadzić można praktyczną kalibrację warunków reakcji wiązania, wykorzystując do tego celu konwencjonalne sposoby, takie jak analiza Scatcharda, analiza Hilla, oraz inne sposoby (Proteins, Structures and Molecular Principles, (1984) Creighton (ed.), W.H. Freeman and Company, New York).
Specyficzne przyłączanie się wyznakowanego składnika białkowego telomerazy do immobilizowanego składnika RNA telomerazy określa się odpowiednio poprzez włączanie niewyznakowanego konkurencyjnego białka (np. albuminy) i/lub niewyznakowanego RNA. Po zakończeniu reakcji, określa się ilość wyznakowanego składnika, związanego specyficznie ze składnikiem immobilizowanym. Przykładowo (bez zamiaru ograniczania), po odpowiednim okresie inkubacji, podczas którego następowało wiązanie, odrzucana jest faza wodna zawierająca wyznakowany, a nie przyłączony składnik białkowy telomerazy, natomiast substrat zawierający związany immobilizowany holoenzym telomerazowy oraz wszelkie inne związane wyznakowane składniki białkowe telomerazy przepłukiwane są odpowiednim buforem, zawierającym ewentualnie niewyznakowany czynnik blokujący (lub czynniki blokujące), który to bufor jest następnie usuwany. Po płukaniu, oznacza się (np. optycznie, enzymatycznie, autoradiograficznie, lub innymi radiochemicznymi sposobami) ilość wyznakowanego materiału związanego specyficznie z immobilizowanym składnikiem.
W niektórych zastosowaniach dodawane są niewyznakowane czynniki blokujące, hamujące niespecyficzne wiązanie się. Przykłady takich czynników blokujących obejmują między innymi: DNA z grasicy cielęcej, DNA z nasienia łososia, RNA drożdżowy, zmieszane sekwencje oligonukleotydowe (losowe lub pseudo losowe) o różnej długości, albumina z surowicy bydlęcej, niejonowe detergenty (NP-40, Tween, Triton Χ-100, itp.) białka z odtłuszczonego mleka w proszku, odczynnik Denhardta, poliwinylopirolina, Ficoll, oraz inne czynniki blokujące. W praktyce, można według własnego uznania dobierać czynniki blokujące, dodawane w odpowiednim stężeniu do reakcji oznaczania wiązania.
W zastosowaniach, w których immobilizowany jest składnik RNA telomerazy lub składnik białkowy telomerazy, stosować można kowalencyjne lub niekowalecyjne wiązania z substratem. Procedury tworzenia wiązań kowalencyjnych obejmują między innymi dobrze scharakteryzowane sposoby znane specjalistom (Kadonga i Tijan (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 83: 5889). Przykładem może być wiązanie kowalencyjne z substratem będącym pochodną bromku cyjanowego (np. Sepharose 4B, będąca pochodną CNBr). Pożądane może być użycie czynnika rozdzielającego (spacera), w celu zredukowania możliwego negatywnego wpływu struktur przestrzennych substratu. Niekowalencyjne wiązania białek z substratem obejmują między innymi przyłączenie białek do naładowanej powierzchni, oraz wiązania za pośrednictwem specyficznych przeciwciał.
W jednym z zastosowań, identyfikuje się czynniki podejrzane o właściwości lecznicze poprzez określanie ich zdolności do blokowania wiązania pomiędzy składnikiem białkowym i składnikiem RNA telomerazy.
Na ogół, składnik RNA telomerazy, wykorzystywany w ramach tych sposobów, zawiera sekwencję składnika RNA ssaczej telomerazy, występującą w naturze, jednakże czasami używa się zmutowanych sekwencji składnika RNA telomerazy, jeśli zmutowana sekwencja RNA telomerazy wiąże się ze składnikiem białkowym telomerazy w warunkach kontrolnego oznaczania (np. w warunkach fizjologicznych).
W jednym z zastosowań, identyfikuje się czynniki podejrzane o modulowanie aktywności telomerazy poprzez określanie ich zdolności do wywoływania znaczącego statystycznie obniżenia lub podwyższenia poziomu trankrypcji dla polinukleotydowej sekwencji reporterowej (np. genu β-galaktozydazy, genu lucyferazy, genu HPRT), sprzężonej funkcjonalnie z sekwencją reguluj ącątrankrypcję genu składnika RNA ssaczej telomerazy, korzystnie genu składnika RNA ludzkiej telomerazy, w aktywnej metabolicznie komórce ssaczej. Gen reporterowy (np. HPRT)
181 019 może być włączony w miejsce restrykcyjne lub przyłączony do tępego końca ds cDNA dla składnika RNA ssaczej telomerazy, tworząc homologiczny konstrukt docelowy lub transgen, w którym (w żywej komórce ssaczej) gen reporterowy znajduje się pod kontrolą transkrypcyjnąendogennego promotora genu dla składnika RNA telomerazy, i związanych z nim elementów kontroli transkrypcji. Czynniki, powodujące zależną od dawki modulację procesu transkrypcji genu reporterowego, sąwięc podejrzane o to, iż sączynnikami modulującymi aktywność telomerazy.
W innym wariancie, do endogennego genu dla składnika RNA telomerazy w komórce ssaczej włączany jest, na zasadzie uprawnionej rekombinacji, homologiczny konstrukt, co prowadzi do umieszczenia reporterowej sekwencji polinukloetydowej w obrębie endogennego genu składnika RNA telomerazy w jego chromosomalnym locus, przy czym sekwencja reporterowa jest sprzężona funkcjonalnie ze znajdującą się przed nią sekwencją regulującą transkrypcję (np. promotorem). W jeszcze innym wariancie, egzogenny polinukloetyd, zawierający polinukloetyd reporterowy, jest sprzężony funkcjonalnie z regionem regulującym transkrypcję genu składnika RNA telomerazy (np. z promotorem i leżącymi za nim miejscami wiązania czynnika transkrypcyjnego), egzogenny polinukloetyd jest wprowadzany do komórki ssaczej, gdzie może integrować się (na drodze rekombinacji nieuprawnionej) w jakieś miejsce w chromosomie i/lub jest utrzymywany lub replikowany jako episomalny polinukleotyd. Czynniki, które powodują statystycznie znaczącą modulację transkrypcji reporterowego polinukleotydu w komórkach traktowanych tym czynnikiem, sąwięc podejrzane o to, iż sączynnikami modulującymi aktywność ssaczej telomerazy.
Czynniki modulujące aktywność telomerazy, które redukują zdolność komórki do reperacji uszkodzeń telomerowych, lub tez hamująreplikację telomerów (np. poprzez konkurencyjne hamowanie endogennej telomerazy typu dzikiego) mogą być podejrzewane o to, iż są czynnikami antynowotworowymi lub czynnikami uwrażliwiającymi, które czynią komórki (np. komórki nowotworowe) wrażliwymi na czynniki uszkadzające telomery (np. czynniki alkilujące oraz promieniowanie jonizujące).
Czynniki o potencjalnym działaniu antynowotworowym są dalej testowane pod względem aktywności antynowotworowej, przy użyciu rytynowo stosowanych testów, przeznaczonych do przewidywania ich użyteczności jako ludzkich leków antynowotworowych. Przykłady takich testów obejmują między innymi: (1) zdolność czynnika do hamowania wzrostu stransformowanych komórek nie wymagających zakotwiczenia, w miękkim agarze, (2) zdolność do redukowania rakotwórczości stransformowanych komórek przeszczepianych do myszy nu/nu, (3) zdolność do odwracania zmian morfologicznych w stransformowanych komórkach, (4) zdolność do redukowania wzrostu przeszczepionych nowotworów u myszy nu/nu, (5) zdolność do hamowania tworzenia się nowotworów lub przednowotworowych komórek w przypadku zwierzęcych modeli spontanicznego lub indukowanego chemicznie procesu rakotwórczego, oraz (6) zdolność do indukowania bardziej zróżnicowanego fenotypu, w stransformowanych komórkach, traktowanych podawanym czynnikiem.
Testy wykrywające zdolność czynników do hamowania łub pobudzania aktywności enzymatycznej telomerazy i/lub wiązania się składnika białkowego telomerazy ze składnikiem RNA telomerazy, dostarczają prostego, i wydajnego sposobu przeszukiwania banków czynników (np. bibliotek związków, bibliotek białek, itp) w celu identyfikowania czynników antagonistycznych i agonistycznych wobec telomerazy. Takie czynniki antagonistyczne lub agonistyczne mogą modulować aktywność telomerazy, i w efekcie modulować zdolność do naprawiania telomerów oraz potencjał replikacyjny.
Podawanie pacjentowi skutecznej dawki czynnika, zdolnego do specyficznego hamowania aktywności telomerazy, może być wykorzystane jako sposób leczniczego lub profilaktycznego traktowania stanów patologicznych (np. raka, zapaleń, chorób limfoproliferacyjnych, chorób autoimmunizacyjnych, chorób zwyrodnieniowych układu nerwowego, itp) które są efektywnie leczone poprzez modulowanie aktywności telomerazy, procesu naprawy i replikacji DNA.
Dla czytającego niniejsze ujawnienie specjalisty będzie wydawało się oczywiste, że wynalazek niniejszy dostarcza cennych odczynników związanych z ludzka telomerazą, a także wielu
181 019 użytecznych sposobów terapeutycznych i diagnostycznych. Powyższy, niezbędny w tym wypadku, opis dostarcza jedynie ograniczonej próbki takich sposobów, co nie powinno być interpretowane jako ograniczanie zakresu wynalazku. Inne cechy i zalety staną się oczywiste w świetle przedstawionych dalej przykładów i zastrzeżeń patentowych.
Przedstawione dalej przykłady opisują specyficzne aspekty wynalazku w celu jego zilustrowania, oraz dostarczenia specjalistom opisu sposobów, wykorzystanych do izolacji oraz identyfikacji składnika RNA ludzkiej telomerazy. Przykłady nie powinny być odbierane jako ograniczenia wynalazku, jako że dostarczają one jedynie specyficznej metodologi, pomocnej przy próbie zrozumienia wynalazku i jego zastosowania w praktyce.
PRZYKŁADY EKSPERYMENTALNE
Omówienie
Sklonowanie składnika RNA ludzkiej telomerazy wymagało zastosowania nowatorskiego sposobu, obejmującego selekcję negatywnąi szereg cykli selekcji pozytywnej, które zostały opisane poniżej. Początkowo jednak, dokonano próby sklonowania składnika RNA przy użyciu odwrotnej transkrypcji oraz sposobu klonowania końców cDNA, nazywanego amplifikacja PCR 5'-RACE. Reakcję odwrotnej transkrypcji zainicjowano starterem identycznym z jednostką powtórzeniową w jednoniciowej części ludzkiego DNA telomerowego, a więc komplementarnym do sekwencji, o której uważa się, iż jest obecna w składniku RNA ludzkiej telomerazy. Starter zawierał również, na swym końcu 5', sekwencję odpowiadającą miejscu rozpoznawanemu przez enzym restrykcyjny. Kiedy jednak cDNA, wyprodukowany na drodze odwrotnej transkrypcji i amplifikacji PCR, został sprawdzony poprzez elektroforezę żelową oraz analizę sekwencji nukleotydowej fragmentów kwasu nukleinowego, odpowiadających prążkom obecnym w żelu, okazało się, iż wykryto jedynie sekwencje rybosomalnego RNA. Na podobne problemy napotykano, gdy próbowano stosować inne warianty podejścia 5'-RACE, z wykorzystaniem wewnętrznych starterów.
Klonowanie zaczęło przynosić sukcesy, gdy zastosowano preparaty cDNA z oczyszczonych preparatów ludzkiej telomerazy, a także z linii komórkowego, wykazujących aktywność ludzkiej telomerazy, oraz z linii komórkowych nie wykazujących aktywności telomerazy. Sposób użyty do otrzymania cDNA opisano szczegółowo w przykładzie 1, przedstawionym poniżej. Aby obniżyć stężenie niepożądanych sekwencji, oraz podwyższyć stężenie pożądanych sekwencji składnika RNA, zastosowano dwa etapy selekcji negatywnej, oraz zakończone sukcesem cykle selekcji pozytywnej, w połączeniu z preparatami cDNA z dwóch ludzkich linii komórkowych.
Etapy selekcji negatywnej obejmowały utworzenie biotynylowanego produktu PCR z cDNA uzyskanego z ludzkich linii komórkowych, które nie wykazywały aktywności telomerazy. Biotynylowany produkt PCR był denaturowany, a następnie rehybrydyzowany w roztworze zawierającym o wiele niższe (stukrotnie) stężenie niebiotynylowanego produktu PCR, otrzymanego z cDNA pochodzącego z ludzkiej linii komórkowej, nie wykazujących aktywności telomerazy. Biorąc pod uwagę możliwość, że komórki, negatywne pod względem aktywności telomerazy, mogą jednak zawierać pewną niewielką ilość składnika RNA, przeprowadzono etap hybrydyzacji, w celu zróżnicowania lub przeprowadzenia selekcji przeciwko RNA ulegającemu wyraźnej ekspresji w obu liniach komórkowych. Po hybrydyzacji, przeprowadzonej przy wartości Cot, dobranej tak, aby pozwolić na hybrydyzację najobficiej reprezentowanego RNA, usuwano niepożądany materiał, łącząc go ze streptawidynylowanymi cząstkami magnetycznymi; przy czym płyn, pozostały po zebraniu cząstek magnetycznych, zawierał oczekiwany cDNA dla składnika RNA ludzkiej telomerazy. Proces powielania sekwencji cDNA przy użyciu reakcji PCR opisano poniżej w przykładzie 2.
Otrzymany materiał był dalej wzbogacany w pożądany cDNA poprzez zastosowanie kolejnych cykli selekcji pozytywnej. Na etapie selekcji pozytywnej, biotynylowana sonda, komplementarna wobec przewidywanej sekwencji matrycowej w składniku RNA ludzkiej telomerazy, była hybrydyzowana z produktem PCR, pochodzącym ze wzbogaconej (poprzez selekcję negatywną) próbki cDNA (powielonego przy użyciu PCR), pochodzącego z linii komórkowej wykazującej ekspresję telomerazy. Po hybrydyzacji, kompleksy (sonda/sekwencja
181 019 docelowa) wiązane były przez awidynylowane kulki magnetyczne, które były następnie zbierane, i używane jako źródło kwasu nukleinowego, wzbogaconego w sekwencje składnika RNA podczas kolejnych cykli selekcji pozytywnej. Proces selekcji pozytywnej opisano bardziej szczegółowo w poniższych przykładach 3 i 4.
Po trzecim cyklu selekcji pozytywnej, rozdzielano produkty powielania, stosując elektroforezę żelową przy czym fragmenty żelu, odpowiadające kwasem nukleinowym o długości około 200 par zasad, były wycinane. Następnie eluowano kwasy nukleinowe z fragmentów żelu i powielano je przy użyciu PCR. Produkty amplikacji PCR były trawione enzymem restrykcyjnym Notl, a potem wstawiane (drogą ligacji) w miejsce Notlplazmidu pBluescript-IISK+, dostępnego komercyjnie w firmie Stratagene. Otrzymane w rezultacie plazmidy były transformowane do komórek gospodarza E. coli, po czym izolowano pojedyncze kolonie, które wykorzystywano jako źródło kwasu nukleinowego dla dalszej analizy i sekwencjonowania DNA. Pewną liczbę klonów, pozytywnych w powyższym teście, analizowano następnie poprzez sekwencjonowanie DNA, oraz przy użyciu wielu innych testów.
Owe inne testy obejmowały: (1) określanie, czy antysensowane ohgonukleotydy, komplementarne wobec domniemanego składnika RNA, hamują aktywność talomerazy w ekstraktach z komórek ludzkich, o których wiadomo było, że zawierajątelomerazę; (2) określanie, czy startery do PCR, specyficzne wobec sekwencji klonu dla domniemanego składnika RNA, mogłyby być używane do powielania kwasu nukleinowego, obecnego w próbce telomerazy, oraz czy obserwowany produkt, o ile w ogóle występuje, odpowiadałby aktywności telomerazy, podczas jej oczyszczania; oraz (3) określanie, czy startery PCR, specyficzne dla sekwencji klonu domniemanego składnika RNA, mogłyby być używane do powielania kwasu nukleinowego, obecnego w większej ilości w ekstraktach komórkowych otrzymanych z komórek, o których wiadomo, iż wykazują wysoką aktywność telomerazy (np. komórkach nowotworowych), niż w ekstraktach komórkowych otrzymanych z komórek, o których wiadomo, iż nie wykazują wcale, albo też wykazują jedynie niewielką aktywność telomerazy.
Tak więc, antysensowne ohgonukleotydy, odpowiadające sekwencjom domniemanego składnika RNA z plazmidu pGRN7, powodowały zahamowanie aktywności telomerazy in vitro. Podobnie, gdy oczyszczono telomerazę z ekstraktów komórkowych, poprzez stosowanie procesu obejmującego (1) chromatografię DEAE; (2) chromatografię przy użyciu Sephadeksu S300; oraz (3) zbieranie poszczególnych frakcji rozdzielanych przy użyciu gradientu glicerolowego, sefarozy SP, lub fenylosefarozy, startery do PCR, specyficzne dla sekwencji składnika RNA z plazmidu pGRN7, powielały kwas nukleinowy o odpowiednich rozmiarach, a ilość produktu powielania korelowała bardzo dobrze z poziomem aktywności telomerazy, obserwowaną w zbieranych frakcjach. W końcowym etapie wykazano, że przy zastosowaniu ekstraktów komórkowych z komórek zdrowych (brak wykrywalnej aktywności telomerazy), komórek rakowych (obecna aktywność telomerazy), oraz komórek jądrowych (obecna aktywność telomerazy), otrzymywano odpowiadającą ilość produktu PCR po przeprowadzeniu odwrotnej transkrypcji i amplifikacji PCR, przy użyciu starterów specyficznych dla domniemanego składnika RNA, zawartego w plazmidzie pGRN7. Protokół dla reakcji RT-PCR opisany został poniżej, w przykładach 5 i 6.
Powyższe wyniki dostarczają przekonywującego dowodu na to, iż sklonowane składnik RNA ludzkiej telomerazy, wobec czego użyto plazmidu pGRN7 do izolowania klonu genomowego dla składnika RNA z ludzkich linii komórkowych, co opisano poniżej w przykładzie 7. Klon genomowy zidentyfikowano i wyizolowano z biblioteki genomowej ludzkiego DNA w wektorze lambda FIXII, otrzymanej z firmy Stratagene. Znaleziony klon, zawierający sekwencje genu dla składnika RNA, obejmował wstawkę o długości około 15 kb, i został oznaczony jako klon 28-1. Klon ten został zdeponowany w amerykańskiej kolekcji „American Type Culture Collection”, gdzie dostępny jest pod numerem 75925. Klonowano następnie, oraz sekwencjonowano, poszczególne fragmenty restrykcyjne, uzyskane z tego faga. Zlokalizowano także gen w dystalnym końcu ramienia q chromosomu 3. Sekwencję dla fragmentu klonu lambdowego 28-1, ograniczonego z jednej strony miejscem rozpoznawanym przez enzym restrykcyjny óawIIIAl, a
181 019 z drugiej strony przez wewnętrzne miejsce restiykcyjne dla HindOA, który to fragment zawiera całą sekwencję dojrzałego składnika RNA, oraz elementy kontroli transkrypcji genu dla składnika RNA, przedstawiono powyżej.
Przykład 1
Otrzymywanie cDNA do amplifikacji metodą PCR
RNA otrzymywano z komórek 293 i IMR-90 poprzez ekstrakcję rodankiem guanidyny lub ekstrakcję mieszaniną fenol/chloroform z frakcji zawierającej oczyszczoną telomerazę. Całkowity RNA z komórek 293 rozdzielano w 2% żelu agarozowym i izolowano z niego cząsteczki RNA o wielkości poniżej 500 bp (par zasad).
Systezę pierwszej nici cDNA prowadzono przy użyciu odwrotnej transkryptazy Superscript™!! (RTaza) otrzymanej z Bethesda Research Laboratories (BRL). Około 0,5 do 1,0 μg RNA mieszano z około 40 ng losowych starterów (6 mer; pdN6) w wodzie, w końcowej objętości 11 μΐ. Roztwór grzano przez 10 min. w 95°C, a następnie schładzano w lodzie przez 5-10 min. Zdenaturowany kwas nukleinowy osadzano przez wirowanie. Mieszaninę zdenaturowanego RNA i starterów zawieszano przez dodawanie składników, w następującej kolejności: 4 μΐ 5x buforu do syntezy pierwszej nici, 2 μΐ 0,1M ditiotreitolu (DTT); 1 μΐ RNAzyny (Pharmacia); oraz 1 μΐ dNTP (z 2,5 mM każdego roztworu wyjściowego). Mieszaninę reakcyjną inkubowano w 42°C przez 1 min., a następnie dodawano 1 μΐ (200 jednostek) RTazy Superscript™ (BRL), mieszano i dalej inkubowano przez 60 min. w 42°C. Otrzymaną mieszaninę reakcyjną, zawierającą nowo zsyntetyzowany cDNA, umieszczano w lodzie do czasu syntezy drugiej nici.
Syntezę drugiej nici cDNA wykonano w następujący sposób. Około 20 μΐ mieszaniny reakcyjnej otrzymanej po syntezie pierwszej nici cDNA (powyżej) mieszano z innymi składnikami, w następującej kolejności: 111,1 μΐ wody; 16 μΐ 10x buforu do ligazy DNA E.coli; 3 μΐ dNTP (z 2,5 mM każdego roztworu wyjściowego); 1,5 μΐ ligazy DNA E.coli(l5 jednostek; BRL); 7,7 μΐ polimerazy DNA E.coli(40 jednostek; Pharmacia) oraz 0,7 μΐ RNazy H E.coli(BRL). Otrzymaną mieszaninę delikatnie mieszano i inkubowano przez 2 godz. w 16°C. Po tym czasie, do probówki z reakcją, dodawano 1 μΐ (10 jednostek) T4 polimerazy DNA i inkubację kontynuowano przez 5 min. w tej samej temperaturze (16°C). Reakcję zatrzymywano, mieszaninę poddawano dwukrotnej ekstrakcji mieszaniną fenol/chloroform, kwasy nukleinowe wytrącano etanolem i wirowano celem osadzenia.
Osad cDNA otrzymany po wirowaniu zawieszano w 20 μΐ buforu TE i podawano ligacji z dwuniciowym oligonukleotydem nazwanym „NotAB” składającym się z dwóch oligonukleotydów (NH2 - aminowa grupa blokująca):
NotA: 5'-pATAGCGGCCGCAAGAATTCA-NH2
No tB: 5'-TGAATTCTTGCGGCCGCTAT-3'
Dwuniciowy oligonukleotyd otrzymano przez zmieszanie 50 μ! oligonukleotydu NotA (lOOpmoli) z 50 μΐ oligonukleotydu NotB (100 pmoli) w 46,25 μΐ wody, grzanie otrzymanego roztworu przez 5 min. w 95°C i dodanie 3,75 μΐ buforu 20xSSC pozostawiając roztwór stale gorącym. Probówkę zawierającą mieszaninę przenoszono do zlewki zawierającej gorącą wodę (temperatura około 70 do 75°Ć), którą powoli schładzano do temperatury poniżej 15°C, tak, że dwa oligonukleotydy mogły hybrydyzować tworząc dwuniciowy oligonukleotyd N otAB. Otrzymany kwas nukleinowy wytrącano i osadzano przez wirowanie.
Dwuniciowy oligonukleotyd NotAB zawieszano w około 30 μΐ buforu TE i ligowano z cDNA w mieszaninie reakcyjnej zawierającej 10 μΐ cDNA otrzymanego w sposób opisany powyżej, około 50 pmol NotAB(stężenie obliczone na podstawie OD260); 2 μΐ 10x buforu do ligazy DNA T4; 1,2 μΐ ligazy DNA T4; 0,2 μΐ 10 mM ATP; oraz wodę do końcowej objętości 20 μΐ. Inkubację prowadzono w 16°C przez noc. Enzym następnie inaktywowano przez grzanie mieszaniny reakcyjnej 10 min. w 65°C. Do typowej amplifikacji PCR używano około 1 do 2 μΐ otrzymanej mieszaniny. Mieszaninę ligacyjnąmożna powielić stosując 10 do 15 cykli (94°C, 45 sek.; 60°C, 45 sek., 72°C, 1,5 min.) i przechowywać w postaci mieszaniny wyjściowej, jak opisano w przykładzie 2.
181 019
Przykład 2
Powielanie cDNA metoda PCR cDNA powielano standardowo poprzez przygotowanie mieszaniny reakcyjnej do amplifikacji złożonej z 5 μΐ 10x buforu do PCR (500 mM KC1); 100 mM Tris pH=8,3; 20 mM MgCl2; 5-8 pl dNTP (2,5 mM każdy); 1 pl polimerazy Taq(Boehringer-Mannheim); 0,1 μΐ białka kodowanego przez gen 32 (Boehringer-Mannheim); 6 pl startera NotB (20 μΜ roztwór wyjściowy); 2 pl cDNA (przygotowanego wg opisu z przykładu 1) i wody do końcowej objętości 50 pl. Następnie na mieszaninę nakraplano 50 do 100 pl oleju mineralnego i powielanie PCR prowadzono przez 10 do 15 cykli 94°C, 45 sek.; 60°C, 45 sek. i 72°C, 1,5 min. Po amplifikacji mieszaninę reakcyjną poddawano ekstrakcji mieszaniną fenol/chloroform, otrzymany kwas nukleinowy wytrącano etanolem i zbierano przez wirowanie. W celu przygotowania mieszaniny wyjściowej osad zawieszano w 100 pl buforu TE.
Przykład 3
Amplifikacja metodą PCR do hybrydyzacji różnicowej i cyklicznej selekcji
W celu otrzymania produktu PCR zarówno do hybrydyzacji różnicowej jak i cyklicznej selekcji, około 1 pl roztworu wyjściowego przygotowanego w sposób jak opisany w przykładzie 2 powielano w 50 pl mieszaniny reakcyjnej do PCR przygotowanej również w sposób opisany w przykładzie 2, z wyjątkiem tego, że prowadzono 21-24 cykli przyłączania i wydłużania starterów, oraz denaturację produktu. Po amplifikacji, mieszaniny reakcyjne poddawano ekstrakcji mieszaniną fenol/chloroform, produkt wytrącano etanolem i zbierano przez wirowanie. Ilość produktu oceniano poprzez barwienie bromkiem etydyny żelu agarozowego, w którym przeprowadzano rozdział elektroforetyczny niewielkiej części mieszaniny reakcyjnej. W celu przeprowadzenia hybrydyzacji różnicowej, powielano bibliotekę cDNA, pochodząca z komórek (IMR-90) nie posiadających telomerazy, w obecności biotynylowanego dUTP. Do wykonania hybrydyzacji różnicowej pobierano cDNA z komórek nie posiadających telomerazy (IMR-90) i cDNA z komórek posiadających telomerazę (293) w stosunku 1:1. Zastosowano standardowe warunki hybrydyzacji: 65°C przez 48-72 godzin. Zazwyczaj około 2 pg kwasów nukleinowych z częściowo oczyszczonego cDNA i negatywnie wyselekcjonowanego materiału używano do przynajmniej dwóch rund cyklicznej selekcji.
Po cyklicznej selekcji, opisanej w przykładzie 4, około 1 do 2 pl wyselekcjonowanych „ściągniętych” produktów (z całkowitej objętości 20 pl) powielano PCR, jak opisano w przykładzie 2, stosując 22 cykle, produkty wytrącano etanolem i zbierano przez wirowanie przygotowując do dalszej cyklicznej selekcji.
Przykład 4
Pozytywna selekcja cDNA powielonego metodą PCR
Etap selekcji pozytywnej, w procesie cyklicznej selekcji użytej do sklonowania składnika RNA ludzkiej telomerazy prowadzono w następujący sposób: około 2 pg cDNA powielonego przez PCR, zawieszono w 25 pl buforu TE, zmieszano z 1,25 pl 20x SSC i otrzymaną mieszaninę grzano w 95°C przez 3 min. Następnie obniżano temperaturę do 60°C przez 5 min. i dodano 1 pl (0,1 pg/pl) biotynylowanych sond R2 i R4. Sekwencje użytych sond podano poniżej. Są to Ometylo-RNA sondy więc U jest O-metylo-urydyną, A jest O-metylo-ryboadeniną, G jest Ometyloryboguaniną, a I jest inozyną.
R2 5'-UUAGGGUUAGII-biotyna
R4 5'-AUUGGGUUAUII-biotyna
Sonda R2 jest specyficzna do powtórzenia występującego w telomerze, natomiast sonda R4 jest specyficzna do RNazy P, której użyto do śledzenia efektywności i wydajności procesu cyklicznej selekcji. Prowadząc cykliczna selekcję równocześnie, lecz oddzielnie dla RNazy P, cząsteczki o znanej sekwencji, można było mieć większe zaufanie, że proces cyklicznej selekcji interesującej nas cząsteczki, w tym przypadku do składnika RNA ludzkiej telomerazy zachodzi prawidłowo. Po dodaniu zarówno sondy R2 jak i R4 do mieszaniny o temperaturze 65°C, tern
181 019 peraturę mieszaniny hybrydyzacyjnej obniżono do 30°C i inkubację prowadzono w tej temperaturze przez 5 min. Dalej obniżano temperaturę mieszaniny reakcyjnej do 14°C i inkubowano w niej przez 60 min. Następnie mieszaninę inkubowano w 4°C przez 2-12 godzin.
Całość mieszaniny hybrydyzacynej, dla każdej z próbek (R2 i R4), dodawano do 400 μΐ 0,5x SSC w 4°C, a następnie przenoszono do probówki ze schłodzonymi w lodzie kulkami magnetycznymi (Promega), które przed użyciem czterokrotnie przepłukiwano 0,5x SSC. Otrzymaną mieszaninę inkubowano 30 min. w 4°C dla zapewnienia całkowitego wiązania kwasu nukleinowego do kulek magnetycznych. Każdą probówkę reakcyjną krótko inkubowano w temperaturze pokojowej, w statywie magnetycznym (Promega) w celu osadzenia kulek. Kulki zawieszano w zimnym 0,5x SSC (600 pl) i przenoszono (w probówce) do lodu. Kulki płukano jeszcze trzy razy w 0,5x SSC w ten sam sposób. Kwas nukleinowy wymywano z kulek zawieszając je w 100 μΐ wody i inkubując 2 min. w 65°C, przed kolejnym umieszczeniem ich w magnetycznym statywie w celu zebrania. Czynność tę powtarzano jeszcze trzykrotnie; inkubując ostatnim razem zawieszone kulki 5 min. w 65°C, przed przeniesieniem do statywu magnetycznego. Wszystkie 100 μΐ frakcje (dla każdej próbki) łączono razem i suszono do uzyskania objętości 20 μΐ w wirówce próżniowej typu SpeedAtac™. Otrzymany DNA powielano metodąPCR w następnej rundzie amplifikacji i selekcji. Po każdej amplifkacji, produkty PCR poddawano dwukrotnej ekstrakcji mieszaniną fenol/chloroform, wytrącano etanolem i zawieszano w 20 μΐ buforu TE.
Produkty PCR sprawdzano zwyczaj elektroforetycznie w żelu agarozowym. Dodatkowo używano różnorodnych kontroli do śledzenia procesu cyklicznej selekcji. Jedną kontrolę stanowiły „ramiona” PCR (oligonukleotydy o określonej sekwencji służące jako miejsca hybrydyzacji startera) wstawione do kwasu nukleinowego zawierającego gen, nadający oporność na neomycynę. Otrzymany kwas nukleinowy mieszano z cDNA powielonym metodąPCR i śledzono w każdej selekcji przez ilościowy PCR. Innąkontrolę stanowiło śledzenie obecności RNazy P w bibliotece przeszukiwanej zarówno pod kątem RNazy P jak i składnika RNA telomerazy.
Przykład 5
Protokół RT-PCR
Pierwszą nić cDNA wytwarzano zasadniczo zgodnie z przepisem podanym w przykładzie 1. Ogólnie RNA był oczyszczany z każdej z frakcji telomerazy zawierającej 0,1 do 1 pg RNA; standardowo używano około jednej trzeciej do jednej piątej RNA otrzymanego z 300 μΐ frakcji. RNA mieszano z 40 - 80 ng losowych heksamerów w objętości 10 μΐ, denaturowano przez 10 min. w 95°C (przy użyciu termocyklera) i schładzano w lodzie. Zdenaturowany RNA i heksamery dodawano do mieszaniny reakcyjnej zawierającej 4 μΐ 5x buforu do syntezy pierwszej nici, dostarczanego przez producenta odwrotnej transkryptazy (RTaza, nabyta w BRL), 2 μ10,1 M DTT, 1 μΐ 10 mM dNTP (każdy), 1 μΐ inhibitora RNazy (Pharmacia) i wodę do końcowej objętości 9 pl. Utworzoną mieszaninę umieszczono w łaźni wodnej o temp. 42°C. Po 1 -2 min. inkubacji dodawano do mieszaniny 1 μΐ RTazy Superscript™ II (BRL). Inkubację kontynuowano przez 60 min. w 42°C. Reakcję zatrzymywano przez grzanie probówki w 95-98°Ć, 10 min. Pierwszą nić cDNA krótko zwirowywano, rozporcjowywano do nowych probówek, szybko zamrażano w suchym lodzie i przechowywano w -80°C lub natychmiast wykorzystywano.
Przykład 6
Amplifikacja cDNA poprzez PCR przy użyciu zestawu specyficznych starterów
W celu otrzymania 20 μΐ mieszaniny do reakcji PCR z radioaktywnie wyznakowanymi nukleotydami, zmieszano 1 μΐ cDNA sporządzonego zgodnie z przepisem podanym w przykładzie 5,20 pmol startera 1,20 pmol startera 2,2,5 μΐ 2,5 mM dNTP, 5 pCi alfa-32P-dATP, 2 jednostki polimerazy Taq(Boehringer-Mannheim), 0,2 pg białka kodowanego przez gen 32 faga T4 (Boehringer-Mannheim), 2 pi 10x buforu ((500 mM KC1, 100 mM Tris-HCl pH8,3, 20 mM MgCl2), oraz wodę do końcowej objętości 20 pl. Następnie, do każdej probówki, dodano po jednej kropli oleju mineralnego.
Warunki amplifikacji PCR klonu niosącego składnik RNA telomerazy były następujące: 94°C przez 45 sek., 60°C przez 45 sek., 72°C przez 1,5 min. Liczba cykli zależała od typu oc zyszczonego materiału, RNA użytego do preparatyki, aie przeważnie wynosiła od 18 do 25. Jak dla wszystkich ilościowych RT-PCR, prowadzono kilka reakcji o różnych profilach cyklu dla każdej próbki, celem ustalenia kiedy amplifikacja PCR staje się wysycona i nieliniowa.
Dla RNazy P, używanej jako kontroli, warunki amplifikacji PCR były następujące: 94°C przez 45 sek., 50°C przez 15 sek. i 72°C przez 1,5 min. Liczba cykli wynosiła od 15 do 22, zależnie od rodzaju próbek. Sekwencje starterów użytych do powielania RNazy P przedstawiono poniżej:
P 3: 5'-GGAAGGTCTGAGACTAG-3 '
P4: 5'-ATCTCCTGCCCAGTCTG-3 '
Produkt PCR otrzymany przy użyciu tych dwóch starterów ma wielkość około 110 bp.
Po przeprowadzeniu reakcji PCR, produkty (5 do 10 μΐ z mieszaniny reakcyjnej) nanoszono na 6% natywny żel poliakrylamidowy i poddawano elektroforezie. Po przeprowadzeniu elektroforezy, żel suszono i w celu analizy eksponowano w kasecie do urządzenia Phosphorlmager™ lub przy zastosowaniu kliszy.
Przykład 7
Klonowanie genu kodującego składnik RNA ludzkiej telomerazy
Procedurę użytą do klonowania genu kodującego składnik RNA ludzkiej telomerazy prowadzono zgodnie z opisem w Maniatis i wsp., Laboratory Molecular Cloning Manuał. Bibliotekę genomowego DNA, pochodzącego z linii komórek fibroblastów WI-38 z ludzkich płuc, skonstruowaną w wektorze fagowym lambda FIXII otrzymano z firmy Stratagene. Faga wysiewano w ilości około 25,000 łysinekna szalkę w trzech zestawach po 15 (150 mm) szalek. Szalki zawierały agar NZY i górną warstwę agarozy NZY; do transformacji fagiem używano komórek XLlBlueMRAP2; transformanty hodowano przez noc, około 16 godzin, w 37°C. Szalki schładzano w 4°C przez 1 godzinę, a następnie łysinki przenoszono na krążki z C/P nylonu (filtr firmy Bio Rad). Proces ten powtarzano w celu otrzymania podwójnego zestawu filtrów dla każdej szalki. Filtry (w dwóch powtórzeniach) denaturowano, neutralizowano, równoważono w buforze 6x SSC, naświetlano promieniami UV, w celu związania kwasu nukleinowego z filtrem i suszono na bibule.
Prehybrydyzację prowadzono przez 1 godz. w 37°C w buforze zawierającym 50% formamid. Filtry hybrydyzowano z radioaktywnie wyznakowaną sondą o wielkości - 218 bp, którą stanowił fragment restrykcyjny Notl pochodzący z plazmidu pGRN7, wyizolowany metodą elektroelucji z 5% żelu poliakrylamidowego po rozdziale elektroforetycznym, a następnie wyznakowany metodą „nick-translation” alfa-32P-dCTP przy użyciu zestawu do, zgodnie z przepisem producenta. Używano około 25 ng (10 pCi znaku) na jeden filtr, a hybrydyzację prowadzono przez noc w 37°C, w buforze do hybrydyzacji zawierającym 50% formamid. Po hybrydyzacji, filtry płukano sześć razy w temperaturze pokojowej; trzy pierwsze płukania przeprowadzano w buforze 6x SSC zawierającym 0,1% SDS, a trzy kolejne w samym bufurze 6x SSC. Po wstępnej ekspozycji kilku podwójnych filtrów w kasecie do urządzenia Phosphor Imager™, przeprowadzonej celem sprawdzenia wydajności hybrydyzacji i intensywności sygnału, filtry płukano w 65°C, w 0,5x SSC. Następnie filtry eksponowano w obecności kliszy Kodak XAR5, używając ekranów wzmacniających, przez około 100 godz. w -70°C.
Jeden silny sygnał pochodził z filtru zawierającego faga, oznaczanego dalej jako 28-1, który niósł gen kodujący składnik RNA ludzkiej telomerazy. Fagi pochodzące z łysinki odpowiadającej obserwowanemu na filtrze sygnałowi ponownie rozsiewano na pojedyncze łysinki na kolejnej szalce, tak, aby otrzymana łysinka (potwierdzona przez hybrydyzację z wyznakowanym plazmidem pGRN7) mogła służyć do otrzymywania DNA tego faga na dużą skalę. Fag 28-1, dostępny w American Type Culture Collection pod Nr dostępu 75925, zawiera ~15 kb wstawkę i posiada kilka fragmentów restrykcyjnych, niosących sekwencje hybrydyzujące z sekwencją składnika RNA z plazmidu pGRN7: 4,2 kb fragment restrykcyjny EcoRI; 4,2 kb fragment restrykcyjny Ciał i 2,5 kb fragment restrykcyjny Hindlll-Sacl. Ostatni fragment zawiera kompletną -560 nukleotydową sekwencję składnika RNA pokazaną powyżej i przyjmuje się, że
181 019 niesie cały gen kodujący składnik RNA. Plazmid niosący 2,5 kb fragment restrykcyjny HindlllSacI w wektorze pBluescript oznaczono jako plasmid pGRN33 ijest dostępny w American Type Cul turę Collection pod Nr dostępu ATCC. Obszar ludzkiego genu może zawierać sekwencje inne od tej we fragmencie 2,5 kb, sekwencje mogą być wyizolowane z DNA faga 28-1 lub z innych klonów fagowych zidentyfikowanych na podstawie hybrydyzacji z fragmentem 2,5 kb (lub inną sondą według wynalazku). Wspomniane powyżej fragmenty restrykcyjne przygotowano w pojedynczych trawieniach enzymatycznych; produkty trawienia izolowano prowadząc elektroforezę w 0,7% żelu agarozowym lub, tylko dla fragmentu ~2,5 kb, w 3% żelu poliakryloamidowym; odpowiednie prążki wycinano z żelu i izolowano do subklonowania używając zestawu GeneClean™ Kit II (z Bio 101, Inc.) lub przez elektroelucję do woreczków dializacyjnych typu Spectropor #2 prowadzona w buforze 0,1 x TBE, przy napięciu 100 V, przez 2 godziny (tylko dla fragmentów ~2,5 kb).
Fragmenty restrykcyjne subklonowano w plazmidach E. coli służących do ekspresji/mutagenezy, pochodnych plazmidów opartych na wektorach pUC lub pBluescriptll, które posiadają również miejsce startu replikacji wirusa SV40 (lecz nie posiadają aktywnego promotora SV40). Otrzymane plazmidy mogą być użyte do otrzymywania zmienionych (zmutowanych) składników RNA i wprowadzania do komórek ludzkich lub innych komórek eukariotycznych w różnych celach, jak opisano powyżej w Opisie korzystnych wykonań wynalazku.
P rzykład 8
Plazmidy niosące antysensowny składnik RNA ludzkiej telomerazy
Plazmidy odpowiedzialne za ekspresję antysensownego składnika RNA otrzymywano przez powielanie PCR kopii cDNA składnika RNA przy użyciu zestawu następujących starterów: (1) NotB i Gl, dających antysensowny kwas nukleinowy mniejszy od cDNA wprowadzonego do plazmidu; oraz (2) NotB i R3C, dających antysensowny kwas nukleinowy pełnej długości (w porównaniu ze wstawkąw plazmidzie). Sekwencję nukleotydowąNotB pokazano w przykładzie 1, powyżej; sekwencje nukleotydowe starterów Gl i R3C przedstawiono poniżej.
Gl: 5' - GAGAAAAACAGCGCGCGGGGAGCAAAAGCA- 3 '
R3 C: 5 ' -GTTTGCTCTAGAATGAACGGTGGAAG-3'
Po amplifikacji PCR, powielone fragmenty klonowano w plazmidzie ekspresyjnym o wielkości 10 kb w miejscu rozpoznawanym przez enzym Pmll; plazmid ten posiada: gen nadający oporność na puromycynę, DHFR, i gen nadający oporność na higromycynę B, jako markery selekcyjne; miejsce startu replikacji SV40; indukowalny promotor ludzkiego genu kodującego metalotioneinę, umieszczony dla umożliwienia ekspresji antysensownej nici genu kodującego składnik RNA ludzkiej telomerazy (można także użyć silniejszego promotora dla otrzymania wyższego poziomy ekspresji), oraz późne miejsca poliadenylacji SV40.
Otrzymanymi plazmidami (oznaczonymi jako pGRN42 dla produktu NotB/Gl i pGRN45 dla produktu NotB/R3C) transfekowano, metodą fosforanu wapnia (patrz Maniatis i wsp., powyżej), linię komórek HT1080 włókniakomięsaka. Komórki linii HT1080 normalnie są unieśmiertelnione; ekspresja antysensownego RNA wobec składnika RNA ludzkiej telomerazy powinna uniemożliwić temu składnikowi RNA łączenie z białkowymi komponentami, blokując tworzenie aktywnej telomerazy i tym samym przywracać komórkom śmiertelność.
Przykład 9
Identyfikacja i izolacja kwasów nukleinowych zawierających składnik RNA z komórek ssaczych (różnych od ludzkich)
Dla zilustrowania jak zaprojektowane oligonukleotydy według wynalazku mogą być wykorzystane przy identyfikacji i izolacji homologicznych kwasów nukleinowych innych gatunków ssaków, startery PCR komplementarne do sekwencji ludzkiego składnika RNA użyto przy powielaniu homologicznych sekwencji PCR. Para starterów użyta do zilustrowania tego aspektu składa się ze startera +10 posiadającego sekwencję 5'-CACCGGGTTGCGGAGGGAGG-3', oraz startera R7, o sekwencji 5'-GGAGGGGCGAACGGGCCAGCA-3'. Genomowy DNA
181 019 otrzymany z tkanek szympansa, małpy amerykańskiej (saimiri, ang. sąuirrel monkey), rezusa i pawiana zawieszono w buforze TE, w stężeniu około 0,5 - 4 mg/ml.
Dla każdego typu tkanki przygotowano mieszaninę do PCR, która zawierała: 1 μΐ genomowego DNA, 48 μΐ Master Mix (Master Mix składa się z lx buforu TaqExtender™ firmy Stratagene, 200 μΜ każdego z dNTP, oraz 0,5 μΜ każdego startera) i 0,5 μΐ mieszaniny w stosunku 1:1 polimerazy Taq (5 jednostek/μΐ, Boehringer Mannheim) i polimerazy Tth (polimeraza TaqExtender™, Stratagene),. Probówki reakcyjne umieszczano w termocyklerze, zaprogramowanym wstępnie na grzanie mieszaniny reakcyjnej w 94°C przez 5 min. a dalej na 27 cykli inkubacji: 94°C przez 30 sek., 63°C przez 10 sek. i 72°C przez 45 sek. Po zakończeniu powielania, około 10 μΐ każdej mieszaniny reakcyjnej nanoszono na 2% żel agarozowy w celu przeprowadzenia elektroforezy. Po zakończeniu elektroforezy, barwieniu żelu, w świetle UV obserwowano w każdej mieszaninie reakcyjnej prążek o przewidywanej (-200 bp) wielkości. Kwasy nukleinowe z tych prążków mogą być klonowane i senwencjonowane. W sposób podobny do klonowania genu kodującego składnik RNA ludzkiej telomerazy, jak opisano powyżej, można klonować inne geny kodujące składniki RNA, pochodzące z każdego z opisanych gatunków ssaków. Przykład 14, poniżej, opisuje szczególny przykład sekwencjonowania genu kodującego składnik RNA telomerazy małpy amerykańskiej.
Przykład 10
Zmutowane sekwencje składnika RNA ludzkiej telomerazy.
Przykład ten pokazuje, że zmiana w sekwencji składnika RNA ludzkiej telomerazy, w obszarze matrycy, zmienia sekwencję syntetyzowaną przez tę telomerazę, prowadząc do zmian w chromosomowych powtórzeniach telomerowych. W celu ustalenia czy modyfikacja sekwencji regionu matrycy TRC3 prowadzi do odpowiednich zmian w powtórzeniach telomerowych syntetyzowanych w miejscach aktywnych ludzkiej telomerazy, sklonowane i zmutagenizowano fragment genu warunkującego ekspresję kompletnego genu kodującego składnik RNA telomerazy (TRC3). Analiza metodą Southema wykazała, że TRC3 hybrydyzuje do jednej kopii genu w genomie ludzkim. Z biblioteki skonstruowanej na fagu lambda wyizolowano genomowąkopię genu TRC3 i wykazano zgodność mapy restrykcyjnej tej kopii z mapąustalonąna podstawie analizy Southem'a, w której wykorzystano jako sondę TRC3. Wyizolowano fragment restrykcyjny Hindlll-Sacl o wielkości 2,6 kb i przeklonowano go do zmodyfikowanej wersji wektora pBluescript, tworząc plazmid pGRN33 niosący genomowąkopię genu TRC3. Zmapowano końce 5' i 3' RNA przy użyciu metod: wydłużania startera (ang.primer extension), RACE PCR i RT-PCR. Wielkość transkryptu RNA, ustalona na -550 zasad była zgodna z migracjąRNA wykazaną techniką Northema. Transkrybowany rejon TRC3, położony centralnie w klonie genomowym, poprzedzony jest sekwencja o długości 1,4 kb.
RNA izolowano z oczyszczonych preparatów telomerazy i używano w następujących eksperymentach. 5' RACE: pierwszą nić cDNA wykonano przy użyciu antysensownych starterów do TRC3 (R3B: 5'-CAACGAACGGCCA GCAGCTGACATT) w obecności 32P-dĄTP. Otrzymane produkty rozdzielano elektroforetycznie w żelu poliakryloamidowym, identyfikowano poprzez autoradiografię, wycinano i izolowano. Oligonukleotyd (NotA: 5'-pATAGCGGCCGCTT GCCTTCA-NH2) ligowano z otrzymaną pierwszą nicią używając ligazy RNA T4 i prowadzono dalej reakcję PCR wykorzystując starter gnieżdżący, R3c (5'-GTTTGCTCTAGAATGAACGGTGGAAG) oraz oligonukleotyd (NotB: 5'-TGAATTCTTGCGGCCGCTAT) komplementarny do oligonukleotydu NotA. Produkty PCR rozdzielano w żelu agarozowym, prążki wycinano i bezpośrednio sekwencjonowano, używając oligonukleotydu G1 (5'-AGAAAAACAGCGCGCGGGGAGCAAAGCA). Mapowanie końca 3': Próby wykonania mapowania metodą 3' RACE zakończyły się niepowodzeniem. Dlatego zastosowano strategię RT-PCR, w której wykorzystano serię antysensownych starterów komplementarnych do sekwencji genomowej DNA przy syntezie pierwszej nici cDNA. Startery tej serii były rozmieszczone w odstępach w wielkości około 150 bp zaczynając od końca 5'transkryptu i posuwając się w kierunku końca 3'. PCR przeprowadzano używając stertera do syntezy pierwszej nici i startera posiadającego sekwencję wewnętrzną znanego transkryptu TRC3 (F3b: 5'-TCTAACCCTAACTG
181 019
AGAAGGGCGTAG). Obserwowano prążki PCR o przewidywanej wielkości zależne od odwrotnej transkryptazy, kiedy zastosowano cDNA wytworzony przy użyciu wszystkich starterów zaprojektowanych dla pozycji +100 to +450 (numeracja odpowiadająca końcowi 5') lecz dla żadnego ze starterów zaprojektowanych dla pozycji +558 do +950. Umiejscawia to przypuszczalny koniec 3' dojrzałego transkryptu TRC3 pomiędzy pozycją +450 a +558. Użycie kolejnych starterów w następnej rundzie RT-PCR zawęziło ten obszar do odcinka pomiędzy +545 i+558.
Przewidywana sekwencja matrycy TRC3 została zmieniona z CUAACCCUA na CCAACCCCA (MuC) lub CAAACCCAA (MuA) poprzez mutegenezę in vitro (wykonaną zgodnie z przepisem według Perez i wsp. (1994) J. Biol. Chem. 269: 22485) plazmidu pGRN33 niosącego genomowa kopię genu. Wprowadzona do funkcjonalnej telomerazy, zmutowana cząsteczka RNA powinna dawać syntezę powtórzenia o sekwencji TTGGGG (MuC) lub TTTGGG (Mua), a nie dzikiego typu TTAGGG. Zmieniona w ten sposób aktywność telomerazy może być łatwo odróżniona od aktywności dzikiego typu ponieważ nie wymaga dłużej obecności dATP do aktywności i jedynie aktywność dzikiego typu powinna być wrażliwa na terminację przez ddATP. Otrzymano również podwójnego mutanta (MuC+17), który oprócz mutacji matrycy MuC posiadał insercję o wielkości 17 bp w pozycji+180 bp. Mutant ten pozwalał na specyficzne wykrywanie zmienionego RNA sondą do insercjio wielkości 17 bp lub na podstawie wielkości.
Fragment 2,6 kb, zawierający genomowa sekwencję był wystarczający do ekspresji TRC3 in vivo. Komórki przejściowo transfekowano plazmidem MuC+17 i RNA syntetyzowany z wprowadzonego DNA wykrywano technikąRT PCR używając sekwencji insertu o wielkości 17 bp jako startera w etapie z odwrotną transkryptazą. RNA wykrywano w komórkach transfekowanych plazmidem MuC+17, a nie wykrywano w komórkach transfekowanych kontrolnie, co wskazuje na to, że genomowy klon o wielkości 2,6 kb jest wystarczający do ekspresji TRC3. Poprzez transfekcję, metodą z fosforanem wapnia, linii komórek HT1080 każdym z trzech plazmidów niosących mutacje, wraz z plazmidem pCMVneo, otrzymano stabilne transformanty. Selekcjonowano klony oporne na G418, a ekspresję MuC+17 RNA potwierdzano metodąRT-PCR (Irving i wsp. (1992) Exp. Celi Res. 202: 161).
W celu sprawdzenia aktywności telomerazy mutantów, analizowano ekstrakty pochodzące z nietransfekowanych komórek i z trzech stabilnych transformantów niosących zintegrowane wektory MuC*, MuC lub MuA (C*, C, or A w fig. 1). Ponieważ spodziewano się, że ekstrakty mutantów będą zawierały aktywność telomerazy zarówno dzikiego typu, jak i zmienioną zastosowano kilka warunków analizy w celu odróżnienia tych aktywności. W normalnych warunkach reakcji (dTTP, 32P-dGTP i dATP), wszystkie trzy ekstrakty otrzymane z serii skonstruowanych mutantów wykazywały aktywność telomerazy dzikiego typu, która była wrażliwa na RNazę (fig. 1, ścieżki 1-6). Jak oczekiwano, aktywność ta nie uległa zmianie po dodaniu do reakcji ddCTP, (fig. 1, ścieżki 7-9) natomiast była znoszona po dodaniu ddTTP (ścieżki 10-12). W przypadku, gdy dATP zastępowano przez ddATP, ekstrakty C (ścieżka 14) i A (ścieżka 15) ciągle wykazywały wrażliwość aktywności telomerazy na RNazę (ścieżki 17 i 18) podczas, gdy ekstrakty C* (ścieżka 13) i kontrolny nie wykazywały takiej właściwości. Otrzymane wyniki wykazują że oporność aktywności telomerazy na ddATP była zmodyfikowana przez MuC lub MuA TRC3 RNA. Dla kontrastu, 17 bp insercja w mutancie C* uniemożliwia odtworzenie telomerazy, wskazując, że proces ten jest zależny od sekwencji TRC3.
W celu potwierdzenia, że mutant MuA syntetyzuje sekwencję (GGGTTT)n, zmodyfikowano istniejącą metodologię PCR dla powielania powtórzeń wytwarzanych przez telomerazę poprzez dodanie do reakcji specyficznego startera telomerazy (Kim i wsp. (1994) Science 266: 2011). Używając syntetycznego startera, ustalono warunki reakcji, w których starter 3' o sekwencji d(CCCAAACCCAAACCCAA) powiela jedynie powtórzenia (TTTGGG)n, a nie powiela powtórzeń zawierających (TTAGGG)n.
Dla odróżnienia powtórzeń telomerowych dodawanych przez dziką formę telomerazy od dodawanych przez formę zmutowaną dwuetapową analizę połączoną ze strategią ograniczającą
181 019 dostępność nukleotydów dla reakcji przeprowadzanej przez telomerazę. Ponieważ MuA i MuC mogą wytwarzać telomerowe powtórzenia o sekwencji (TTTGGG)n i (TTGGGG)n, odpowiednio, ekstrakty komórkowe inkubowano wstępnie z substratem TS, w obecności jedynie dTTP i dGTP, przez 10 min. w temperaturze pokojowej pozwalając na dodanie telomerowych powtórzeń. Pozostałą aktywność telomerazy usuwano przez gotowanie ekstraktów, 5 min. Produkty telomerazy o charakterystycznej sekwencji DNA wykrywano przez powielanie PCR, używając odpowiednich odwrotnych starterów w obecności wszystkich czterech dNTP i śladowych ilości 32P-dCTP jak opisano (Kim i wsp. (1994) jak wyżej). W celu wykrycia produktów MuA, użyto odwrotnego startera (ACCCAA)4 i zastosowano 20 cykli PCR o następujących parametrach: 94°C, 10 sek., 60°C, 30 sek. i 72°C, 30 sek. W celu wykrycia produktów MuC, użyto trzy odwrotne startery: (CCCCAA)3, (CCAACC)3 i (CCAACC)3, które dały produkty PCR o odpowiedniej zmianie ruchliwości elektroforetycznej zgodniej z oczekiwanymi miejscami przyłączania starterów do produktów telomerazy. Zastosowano te same warunki PCR, jak opisane powyżej z wyjątkiem temperatury przyłączania starterów, która wynosiła 50°C. W tych samych warunkach, produkty telomerazy z ekstraktów komórek rozdzielskich lub komórek transfekowanych dziką kopią genu TRC-3 nie powstawały. W testach badających specyficzność warunków amplifikacji PCR, syntetyczne oligonukleotydy zawierające (TTTGGG)n i (TTGGGG)n wytwarzały odpowiednią 6-nukleotydową drabinkę produktów PCR z odwrotnym starterem (ACCCAA)4 lub (CCCCAA)3 odpowiednio, podczas gdy oligonukleotydy zawierające (TTAGGG)n nie dawały żadnych produktów PCR z odwrotnym starterem (ACCCAA)4 lub (CCCCAA)3.
Przy zastosowaniu opisanych warunków ekstrakty z MuA, lecz nie z MuC lub dzikiego typu komórek, wytwarzały produkty przy zastosowaniu zmodyfikowanej metody analizy telomerazy, co wykazuje, że telomeraza z komórek zawierających mutację MuA wytwarza powtórzenia (TTTGGG)n. Podobną metodę zastosowano do analizy mutanta MuC, który syntetyzował powtórzenia(TTGGGG)n. Przedstawione powyżej dane stanowią silny dowód, że gen TRC3 koduje składnik RNA ludzkiej telomerazy i dlatego zmieniono nazwę genu z TRC3 na hTR od ang. human Telomerase RNA.
Przykład 11
Składnik RNA telomerazy w komórkach śmiertelnych i unieśmiertelnionych
W większości komórek nowotworowych aktywność telomerazy wyrażana jest na wysokim poziomie, podczas gdy w większości ludzkich komórek somatycznych, aktywność telomerazy nie jest wykrywalna (Kim i wsp. (1994) jak wyżej). W celu ustalenia czy poziom składnika RNA telomerazy jest podniesiony w unieśmiertelnionych liniach komórek nowotworowych, analizowano poziomy transkryptu składnika RNA telomerazyny i GAPDH stosując RTPCR w pięciu szczepach śmiertelnych komórek pierwotnych, które nie posiadają wykrywalnego poziomu aktywności telomerazy, oraz pięciu unieśmiertelnionych liniach komórek nowotworowych z wysokimi poziomami aktywności telomerazy. Poziom podstawowy transkryptu składnika RNA jest 3 do 12 razy wyższy w liniach komórek nowotworowych niż w komórkach pierwotnych w porównaniu z poziomem transkryptu GAPDH (fig. 2A). Podczas gdy poziom składnika RNA telomerazy jest podwyższony w unieśmiertelnionych komórkach nowotworowych, charakteryzujących się wysoka aktywnością telomerazy, interesujące jest, że niski lecz łatwo wykrywalny poziom składnika RNA telomerazy jest obserwowany w śmiertelnych komórkach pierwotnych, w których nie wykrywa się aktywności telomerazy (ścieżki 1-5).
Poziom składnika RNA telomerazyny badano także w wielu normalnych tkankach ludzkich poprzez analizę typu Northern. Jądro i jajniki mają wysoki poziom składnika RNA telomerazy, co jest zgodne z oczekiwaniami ponieważ tkanki te charakteryzuje wysoki poziom aktywności telomerazy. Jednakże szereg innych tkanek również wytwarza składnik RNA telomerazy (fig. 2B i 2C). Dotyczy to tkanek normalnej nerki, prostaty, i dojrzałej wątroby; żadna z nich nie posiada wykrywalnego poziomu aktywności telomerazy. Wyniki te potwierdzają dane otrzymane z analizy linii komórkowych (fig. 2A) i sugerują że składnik RNA telomerazy może być obecny lecz nieaktywny w wielu ludzkich tkankach. Podobne, tkankowo-specyficzne różnice w ekspresji RNA obserwowane są w tkankach mysich; mimo, że wiele normalnych
181 019 mysich tkanek posiada aktywność telomerazy. Zwiększona represja aktywności telomerazy w komórkach ludzkich może pomóc w wyjaśnieniu dlaczego komórki mysie, w odróżnieniu od komórek ludzkich spontanicznie unieśmiertelniają się w kulturach.
Przykład 12
Ekspresja antysensownego transkryptu hTR (składnika RNA ludzkiej telomerazy) w komórkach HeLa prowadzi do kryzysu i śmierci komórek
W celu zbadania funkcji telomerazy w unieśmiertelnionych komórkach, do komórek HeLa wprowadzono konstrukt służący do ekspresji antysensownego hTR. Fragment restrykcyjny EcoRI o długości 200 bp. zawierający składnik RNA ludzkiej telomerazy od 1 do 193 bp, pochodzącego z klonu cDNA TRC3, wprowadzono w miejsce EcoRI plazmidów p 10-3 i pBB5212 tworząc, odpowiednio, plazmidy ρ 10-3-hTR i pBBB-hTR. Ekspresja antysensownego składnika RNA telomerazy, z plazmidu ρ 10-3-hTR, znajduje się pod kontrolątranskrypcyjnąminimalnego promotora CMV, regulowanego tetracycliną dzięki pięciu operatorom Tet położonych przed sekwencją kodującą w dwóch różnych orientacjach, jak opisano (Gossen i wsp. (1992). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547). Ekspresja antysensownego hTR z plazmidu pBBS-hTR znajduje się pod kontrolą promotora MPSV (Lin i wsp. (1994) Gene 147: 287). W prowadzonej równolegle kontroli ekspresji, do komórek HeLa elektroporowano wektory pozbawione sekwencji kodującej hTR. Klony zawierające antysensowne lub kontrolne plazmidy selekcjonowano w trzech niezależnych eksperymentach. Początkowo, 41 kultur wytwarzających antysensowny hTR rosło identycznie, jak komórki niosące wektor kontrolny. Jednakże, w okresie od 23 do 26 podziałów w populacji komórek (PDL) po transfekcji, 33 z 41 produkujących antysensowny hTR kultur przechodziło kryzys (tabela 1). Kryzys komórek w tych kulturach charakteryzowało znaczne zahamowanie wzrostu w 20 do 26 PD, po którym następowało skupianie się i odłączanie komórek od płytek po okresie jednego tygodnia. W 28 z 33 przypadków, w których komórki przechodziły kryzys obserwowano, niską częstością (< 1%) kolonii rewertantów w przeciągu trzech tygodni od śmierci większości komórek. Pojawiające się rewertanty mogą obrazować przypadki wymknięcia się komórek spod hamującego działania konstruktów dających antysensowny hTR. W porównaniu z klonami antysensownymi, żadna z linii komórkowych niosących wektor kontrolny nie wykazywała zmian we wzroście i śmiertelności przez 50 podziałów.
Tabela 1
Antisensowny hTR prowadzi do zmniejszenia średniej długości TRF i kryzysu komórek Przeprowadzono trzy niezależne eksperymenty, w których komórki HeTe7 (komórki HeLe, w których zachodzi wysoka ekspresja hybrydowego białka represora genu warunkującego oporność na tetracyklinę z produktem genu VP16) transfekowano, stosując metodę elektroporacji, plazmidem pl0-3-hTR, umożliwiającym produkcję antysensownego hTR, znajdującego się pod kontrolą minimalnego promotora CMV, idukowanego białkiem tetracyklina-VP16, lub plazmidem pBBS-hTR pozwalającym na produkcje antysensownego hTR znajdującego się pod kontrolę promotora MPSV (54). [W eksperymentach tych nie obserwowano regulacji ekspresji przez tetracyklinę. W doświadczeniu z wykorzystaniem p 10-3-hTR nie używano tetracykliny, ponieważ eksperymenty kontrolne z lucyferazą lub antysensownym hTR znajdującym się pod kontrolą minimalnego promotora CMV, indukowanego białkiem tetracyklina-VP16 wykazały, że obecność lub brak tetracykliny ma niewielki wpływ na wytwarzanie lucyferazy lub antysensownego hTR w komórkach HeTe7. Rzeczywiście, we wcześniejszych eksperymentach komórki HeTe7 zawierające konstrukty niosące antysensowny hTR, w obecności tetracykliny, w dalszym ciągu przechodziły kryzys w 23 do 26 PDL], W celu kontroli, komórki HeTe7 transfekowano także wektorami wyjściowymi w takich samych warunkach. Od 11 do 18 stabilnych klonów izolowano z każdej serii transfekcji. Klony z wszystkich izolacji wykazywały identyczną morfologię i profil wzrostu do 20 PDL, w którym to czasie wzrost większości klonów wytwarzających antysensowny hTR zmniejszał się znacząco (p 10-3-hTR i pBBS-hTR). Przy PDL 2326, komórki te przechodziły kryzys, charakteryzujący się pojawieniem powiększonych i zaokrąglonych komórek. Nie wszystkie klony wytworzone przez, stransfekowane plazmidem
181 019 pBBS-hTR komórki HeTe7 przechodziły kryzys; 8 klonów wytwarzających antysensowny hTR kontynuowało wzrost podobny do komórek z kultur kontrolnych. Komórki wszystkich klonów zbierano przy PDL 23 i określano średnią długość TRF. Wartość P obliczano metodą nieparzystego t-testu. Dla każdej serii ustalono udział klonów, które przechodziły kryzys.
Plazmid Starzenie komórek Średnia TRF Wartość p Starzejące/wszystkie
1 pl0-3 nie ND 0/7
pl0-3-hTR tak ND 18/18
2 pi 0-3 nie 3,27 ±0,10 0/12
pl0-3-hTR tak 2,72 ± 0,07 0,0003 11/11
3 pBBS nie 3,22 ±0,11 0/13
pBBS-hTRa tak 2,39 ±0,10 0,0008 4/4
pBBS-hTRb nie 3,03 ± 0,20 0,3551 0/8
komórki HeTe7 nie 3,15 ±0,09 Komórki rodzicielskie
W celu ustalenia czy długość telomeru i zahamowanie aktywności telomerazy są skorelowane z przechodzeniem kryzysu komórek klonów wytwarzających antysensowny hRT, analizowano długość telomeru i aktywność telomerazy w kilku, nie przechodzących jeszcze kryzys koloniach kontrolnych i koloniach pochodzących z właściwego eksperymentu zbieranych przy PDL 23. Wszystkie kolonie zawierające wektor kontrolny posiadały średnią długość TRF (3,22 i 3,27 kb) była podobną do linii komórek rodzicielskich (3,15 kb), podczas gdy klony, niosące wektory służące do ekspresji antysensownego hTR, przechodzące kryzys miały średnią długość TRF pomiędzy 2,39 a 2,72 kb lub od 17 do 26% krótszą niż komórki linii rodzicielskich (fig. 3). Otrzymane dane pozostają w zgodnie z obserwowanym brakiem powtórzeń telomerowych w klonach niosących antysensowny hRT co powoduje zahamowanie aktywności telomerazy. Aby sprawdzić to bezpośrednio, analizowano aktywność telomerazy w 14 klonach. Aktywność telomerazy była generalnie niska, ale wykrywalna, w wielu klonach niosących antysensowny hRT, chociaż skrócona długość telomerów świadczy, że poziom ten nie jest wystarczający do utrzymania odpowiedniej długości telomeru - średnia długość TRF obniża się z 3,22 do 2,39 kb (P=0,0008). W 8 klonach zawierających wektory z antysensownym hRT (pBBS-hTRb), które uległy kryzysowi długość telomerów nie była znacząco zmieniona (3,03 w przeciwieństwie do 3,3 kb; P=0,355), a aktywność telomerazy podobna do aktywności kontrolnej. Otrzymane wyniki świadczą o tym, że utrata telomerów prowadzi do kryzysu i kiedy telomer osiągnie długość krytyczną komórka umiera.
Wywołanie procesu starzenia komórek HeLa poprzez ekspresję antysensownego składnika RNA telomerazy dostarcza dalszego potwierdzenia, że zahamowanie aktywności telomerazy może przyczynić się do powstania specyficznej i skutecznej terapii komórek nowotworowych.
Przykład 13
Amplifikacja in situ i wykrywanie produktu
Wykrywanie in situ składnika RNA telomerazy
A. Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH)
Identyfikację komórek posiadających aktywność telomerazy w mieszaninie populacji różnych komórek lub tkanek można prowadzić przy pomocy hybrydyzacji in situ z wyznakowaną sondą rozpoznającą składnik RNA telomerazyny. Próbki komórek utrwalano na szkiełku mikroskopowym, czyniono przepuszczalnymi i używano do hybrydyzacji in situ. Przedstawiono przykładową hybrydyzację in situ zastosowaną dla RNA ludzkiej telomerazy (hTR). Pierwszą denaturację kwasów nukleinowych prowadzono przez zanurzenie szkiełek, w podgrzanym do 70-74°C, roztworem zawierającym 70% zdejonizowany formamid i 2x SSC, na
181 019
2-3 min. Szkiełka przenoszono do schłodzonego w lodzie 70% EtOH, następnie do 95% EtOH i w końcu do 100% EtOH (po 4 min. w każdym roztworze). 100-200 ng (na szkiełko) wyznakowanej sondy htRNA (-500 bp sonda DNA wyznakowana biotyną, digoksygeniną, radioaktywnym izotopem, lub fluorescencyjnie) suszono, zawieszano w 10 μΐ 100% zdejonizowanego formamidu, denaturowano przez inkubację w 75°C przez 8 min. i natychmiast schładzano w lodzie. Dodawano 10 pl 2x buforu do hybrydyzacji (4x SSC; 4x roztwór Denhardta; 20% siarczanu dekstranu; 100 mM Tris, pH 7,5) do 10 μΐ zawieszonej sondy. Mieszaninę sondy z buforem do hybrydyzacji (20 μ1) dodawano do utrwalonej i przepuszczalnej próbki, przykrywano szkiełkiem nakrywkowym i uszczelniano klejem kauczukowym lub lakierem do paznokci. Próbki inkubowano w 37°C przez 8-48 godz. Po hybrydyzacji, zdejmowano szkiełka nakrywkowe, próbki płukano dwukrotnie, w roztworze zawierającym 50% zdejonizowany formamid i 2x SSC, w 37°C, a następnie również dwukrotnie w 2x SSC, w 37°C (po 5 min. każde płukanie). Próbki oglądano pod mikroskopem.
B. Znakowanie in situ z użyciem specyficznego startera (PRINS)
Odmianą tradycyjnej metody detekcji hybrydyzacyjnej in situ jest znakowanie in situ z użyciem specyficznego startera (PRINS). Wykrywanie hTR metodą PRINS polega na wstępnej syntezie hTR cDNA przez odwrotną transkryptazę (RT), a następnie na użyciu metody PRINS z wykorzystaniem hTR-specyficznej sondy oligonukleotydowej do wydłużania łańcucha w obecności znakowanych nukleotydów. Reakcja RT dla hTR może być przeprowadzana z użyciem różnych metod. Jednym z przykładów przeprowadzania reakcji RT jest użycie zestawu GeneAmp do PCR z termostabilną odwrotnątranskryptaząRNA rTth (Perkin Elmer). W metodzie tej, na utrwaloną i przepuszczalną próbkę nanosi się 10 μΐ mieszaniny RT (10 mM Tris-HCl pH 8,3; 90 mM KC1; 1 mM MnCl2; 200 μΜ dNTPs; 2,5 jednostek polimerazy DNA rTth; 0,4 μΜ powrotnego startera (e.g., R7G: 5'-GGAGGGGCGAACGGGCCAGC AG-3']), próbkę przykrywa się szkiełkiem nakrywkowym, uszczelnia lakierem do paznokci, pokrywa olejem mineralnym i inkubuje w 70°Ć przez 30 min. Następnie olej mineralny jest usuwany przez płakanie 5 min. w ksylenie, i 5 min w 100% EtOH. Szkiełko nakrywkowe jest usuwane, przepłukiwane wodą traktowaną DepC, a następnie 100% EtOH i suszone na powietrzu przez 5 min. 10 μΐ mieszaniny do PRINS (5% (v/v) glicerol; 10 mM Tris-HCl, pH, 3; 100 mM KCL; 0,05% (w/v) Tween-20; 0,75 mM EGTA; 2,5 mM MgCl2; 0,4 μΜ startera „do przodu” (ang. forward) [np. U3b: 5'-GCCTGGGAGGGGTGGTGGCTATTTTTTG-3']; 200 μΜ dA, dG, dCTP; 110 μΜ dTTTP; 90 μΜ znakowanego dUTP) nanoszono na próbkę. Preparat przykrywano szkiełkiem nakrywkowym, uszczelniano lakierem do paznokci, pokrywano olejem mineralnym, i inkubowano w 70°C przez 30 min. do 3 godz. Próbkę płukano 3 razy, po 2 min., w buforze do płukania (4x SSC; 0,05% Tween-20) ogrzanym do 70°C. Następnie obserwowano sygnał.
C. RT-PCR in situ
Wykrywanie hTR metoda RT-PCR polega na syntezie cDNA dla docelowego RNA przez odwrotną transkryptazę (wirusowa odwrotna transkryptaza, lub własną aktywność RT termostabilnych polimeraz DNA), po której następuje amplifikacja PCR in situ odpowiedniego cDNA. Szereg różnych reakcji RT można użyć do syntezy cDNA dla hTR, włączając w to przepis RT o którym dyskutowano w sekcji 1 IB. Co więcej w metodzie RT-PCR, można zastosować ten sam bufor i startery jakich używano przy wykrywaniu w metodzie PRINS, lecz zamiast końcowej inkubacji w 70°C przez 30 min. do 3 godz., próbka jest powielana w termocyklerze przez 30-40 cykli 94°C/ 40 sek., 55°C/90 sek. (patrz sekcja HB). Po reakcji PCR, próbkę płucze się 3 razy, przez 2 min., w buforze do płukania (4x SSC; 0,05% Tween-20) ogrzanym do 70°C i obserwuje sygnał.
Innąaltematywąjest powielanie cDNA tworzonego przez wstępną reakcję RT przy użyciu GeneAmp in situ PCR system 1000 i GeneAmp in situ PCR core kit (Perkin Elmer). Można przeprowadzić jednoetapowy RT-PCR in situ na utrwalonej i przepuszczalnej próbce używając przepisu dla GeneAmp EZ rTth RNA PCR w połączeniu z GenAmp in situ PCR system 1000 (Perkin Elmer). W metodzie tej 40-50 μΐ bufoni do reakcji EZ RNA PCR (50 mM bicyna; 115 mM octan potasu; 8% (w/v) glicerol, pH 8,2; 300 μΜ dA, dG, dCTP; 165 μΜ dTTP; 135 μΜ
181 019 znakowanego dUTP; 5-10 jednostek rTth polimerazy DNA; 2,5 mM Mn(OAc)2; 0,45-1 μΜ htRNA-specyficznych starterów np., R7 i U3b nanosi na utrwaloną i przepuszczalną próbkę na szkiełku mikroskopowym, próbkę uszczelnia się przy pomocy silikonowej nakładki i spina postępując według protokołu producenta (GeneAmp in situ PCR system 1000. Perkin Elmer). Próbkę umieszcza się następnie w GeneAmp urządzeniu do PCR in situ i grzeje przez 120 sek. w 94°C, i powiela przez 30-40 cykli 94°C/45 sek. i 60°C/45 sek. Po amplifikacji próbka jest płukana i oglądana jak opisano powyżej.
Dla zredukowania sygnałów tła, które mogąpochodzić z bezpośredniej inkorporacji znaczników fluorescencyjnych w czasie amplifikacji PCR, można zastosować pośrednią detekcję, która składa się z etapu powielania PCR przy użyciu niewyznakowanych nukleotydów (dNTP) po którym następuje hybrydyzacja in situ wykorzystująca znakowaną sondę do hybrydyzacji specyficzną do produktu. W tym przypadku, sygnał jest powielany dowolną metodą RT-PCR opisaną powyżej bez użycia znakowanych nukleotydów (dNTP) czy starterów, i produkt amplifikacji jest wykrywany przez hybrydyzację in situ.
D. Zastosowanie produktu wydłużania startera PCR in situ
Powodzenie PCR in situ zależy od uniemożliwienia wyciekania otrzymanych produktów w cytoplazmie komórkowej na zewnątrz komórki. Dlatego jest prawdą że produkty PCR mniejsze od 500 bp nie są wskazane przy stosowaniu metody PCR in situ. W celu uniemożliwienia wyciekania produktów PCR mniejszych od 500 bp z cytoplazmy komórkowej, powszechnie stosuje się wprowadzenie „dużych” dNTP (np. dUTP znakowany biotyną znacznikiem fluorescencyjnym, digoksygeniną) do produktów PCR. Innym sposobem uniemożliwiającym wyciekanie małych produktów PCR in situ jest wprowadzenie wydłużonych starterów do przepisu PCR in situ.
Metoda ta zakłada użycie startera zawierającego 3-4 powtórzeń 6 bp sekwencji (np. [5'-TTTCCC-3']3.4) na końcu 5', po której następuje sekwencja specyficzna dla sekwencji docelowej (patrz fig. 4, starter 1), w kombinacji z odpowiednim starterem powrotnym (starter 2) i trzecim starterem, który składa się wyłącznie z sekwencji zawierającej powtórzenia (starter 3, np. (5'-TTTCCC-3']4) do powielenia specyficznego miejsca przy użyciu PCR in situ. Obecność startera 3 pozwoli na wydłużenie produktu PCR ze względu na nierównomierne wiązanie startera 3 do 3' końca target produktu PCR. Wydłużanie produktów PCR może być indukowane przez obniżenie temperatury przyłączania startera w początkowych etapach PCR.
Dla przykładu, jeżeli temperatura przyłączania sekwencji docelowej w starterze 1 wynosi 60°C, próbki będą początkowo powielane przez 15-20 cykli 94°C/45°C i 60°C/45°C, a następnie przez 15-20 cykli 94°C/45°C i 50°C/45°C. Obniżenie temperatury przyłączania w drugim etapie PCR będzie sprzyjać wytwarzaniu wydłużonych produktów PCR przez zwiększenie możliwości nierównomiernego wiązania startera 3 do powtórzonych sekwencji. Otrzymane wydłużone produkty PCR będą mniej podatne na wyciekanie z cytoplazmy komórkowej, co w rezultacie da mocniejszy sygnał PCR in situ.
Przykład 14
Składnik RNA telomerazy innych naczelnych (oprócz ludzi)
W celu pokazania możliwości otrzymania sekwencji innych ssaczych składników RNA telomeraz używając starterów zaprojektowanych na podstawie sekwencji składnika RNA ludzkiej telomerazy, użyto starterów o ludzkiej sekwencji do powielenia PCR sekwencji składnika RNA telomerazy genomowego DNA małpy amerykańskiej (ang.sąuirrel monkey), gatunku uważanego za jeden z należących do niższych naczelnych, który jest odległy ewolucyjnie od gatunku ludzkiego.
Genomowy DNA małpy amerykańskiej powielano stosując startery F3b (5'-TCTAACCCTAACTGAGAAGGGCGTAG-3') i H3+20 (5' CTCAAGGTCATCGCCAAGGT-3') jak opisano. Otrzymany pojedynczy prążek DNA został sklonowany w wektorze pBluescriptll SK (Stratagene, San Diego, CA). DNA uzyskanych klonów częściowo zsekwencjonowano używając metody PCR z odwrotnym (ang. reverse), uniwersalnym starterem (5-AACAGCTATGACCATG-3'), starterem - 210-3' (5'-TCACGTCTCCTGCCAATTTGC-3')
181 019 lub starterem H3+20. Poniżej przedstawiono częściowe sekwencje nukleotydowe składnika RNA telomerazy małpy amerykańskiej:
5'-GGCGCGCTTCCCTGAGCTGTGGACGTGCACCAGGACTCGGCTCACACATGCAGT
TCGCTTTCCTGCTGGTGGGGGGACGCCGATCGTGGCCATCCGTCACCCCTCGCCGGC
AGTGGGGGCTTGTGAATCCCTAAATCTGACTGA-3' oraz / -TTTTGAGAGATCATTAAGTATTTAATGAATATTTAGCTAGAAGATCTAAACGAA
AATTCAAGTTGTGTTCCTTTAGTGGTCATCGGTTTATGCCGAAGGTTACAAATTTCT
TCTTTGAAAAATTAGACCATTGGCGATGATCCTTGA- 3 '
Porównanie z sekwencją składnika RNA ludzkiej telomerazy dało następujące dopasowanie, numeracja zgodna z konwencją przyjętą dla genu składnika RNA ludzkiej telomerazy (myślniki oznaczają przerwy wprowadzone dla optymalizacji dopasowania): człowiek CGCGCGGCGCGATTCCCTGAGCTATGGGACGTGCACCCAGGACTCGGCTC 1900 małpa
GGCGCGCTTCCCTGAGCTGT-GGACGTGCACC-AGGACTCGGCTC człowiek ACACATGCAGTTCGCTTTCCTGTTGGTGGGGGGAACGCCGATCGTGCGCA 1950 małpa ACACATGCAGTTCGCTTTCCTGCTGGT-GGGGGGACGCCGATCGTGGCCA człowiek
TCCGTCACCCCTCGCCGGCAGTGGGGGCTTGTGAACCCCCAAACCTGACT 2000 małpa TCCGTCACCCCTCGCCGGCAGTGGGGGCTTGTGAATCCCTAAATCTGACT człowiek GACTGGGCCAGTGTGCTGCAAATTGGCAGGAGACGTGAAGGCACCTCCAA 2050 małpa GA oraz człowiek TTTTTTGAGAGATCATTTAACATTTAATGAATATTTAATTAGAAGATCTA 2300 małpa TTTTGAGAGATCATTAAGTATTTAATGAATATTTAGCTAGAAGATCTA
181 019 człowiek
AATGAACATTGGAAATTGTGTTCCTTTAATGGTCATCGGTTTATGCCAGA 2350 małpa AACGAAAATT - CAAGTTGTGTTCCTTTAGTGGTCATCGGTTTATGCCGAA człowiek
GGTTAGAAGTTTCTTTTTTGAAAAATTAGACC - TTGGCGATGA- CCTTGAGC 2400 małpa
GGTTACAAATTTCTTCTTTGAAAAATTAGACCATTGGCGATGATCCTTGA
Powyższe przykłady opisująróżne aspekty wynalazku i w jaki sposób niektóre kwasy nukleinowe według wynalazku zostały wytworzone. Zamiarem przedstawienia przykładów nie jest wyczerpujący opis wielu różnych wykonań wynalazku, objętych następującymi dalej zastrzeżeniami.
181 019
181 019 κ Ό α>· μ Ν
FIS. 2.
181 019
FIG. 3 dHl υΒθ|ΛΙ jJBl osoąjew eiupa-is
181 019
FIG.
181 019 normalne Warunki testu normal ddC ddT __ddA Assay Conditions
CC AC* CAC* CA CCA CC A CC A Mutant Extract Ekstrakt z mutanta*
123456789 10 1112 1617 18
14 1S
FIG. L
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.
Cena 6,00 zł.

Claims (26)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Składnik RNA ssaczej telomerazy w postaci zasadniczo czystej, znamienny tym, że obejmuje sekwencję nukleotydową zasadniczo identyczną z sekwencją RNA o sekwencji:
    ' ' ' ' '50
    GGGUUGCGGAGGGAGGGUGGGCCUGGGAGGGGUGGUGGCCAUUUUUUGUC ' ' ' ' '100
    UAACCCUAACUGAGAAGGGCGUAGGCGCCGUGCUUUUGCUCCCCGCGCGC ' ' ' ' '150
    UGUUUUUCUCGCUGACUUUCAGCGGGCGGAAAAGCCUCGGCCUGCCGCCU ' ' ' ' '200
    UCCACCGUUCAUUCUAGAGCAAACAAAAAAUGUCAGCUGCUGGCCCGUUC ' ' ' ' '250
    GCCCCUCCCGGGACCUGCGGCGGGUCGCUGCCCAGCCCCCGAACCCCGCC ' ' ' ' '300
    UGGAGGCCGCGGUCGGCCGGGGCUUCUCCGGAGGCACCCACUGCCACCGC ' ' ' ' '350
    GAAGAGUUGGGCUCUGUCAGCCGCGGGUCUCUCGGGGGCGAGGGCGAGGU ' ' ' ' '400
    UCACCGUUUCAGGCCGCAGGAAGAGGAACGGAGCGAGUCCCGCGCGCGGC ' ' ' ' '450
    GCGAUUCCCUGAGCUAUGGGACGUGCACCCAGGACUCGGCUCACACAUGC ' ' ' ' '500
    AGUUCGCUUUCCUGUUGGUGGGGGGAACGCCGAUCGUGCGCAUCCGUCAC ' ' ' ' '550
    CCCUCGCCGGCAGUGGGGGCUUGUGAACCCCCAAACCUGACUGACUGGGC '559
    CAGUGUGCU.
  2. 2. Składnik RNA według zastrz. 1, znamienny tym, że jest składnikiem ludzkiej telemerazy.
  3. 3. Składnik RNA według zastrz. 2, znamienny tym, że jest kodowany przez sekwencję położoną we wstawce ~ 2,5 kb Hindlll-SacI plazmidu pGRN33 (ATCC 75926).
  4. 4. Składnik RNA według zastrz. 3, znamienny tym, że obejmuje sekwencję:
    , X X X X50
    GGGUUGCGGAGGGAGGGUGGGCCUGGGAGGGGUGGUGGCCAUUUUUUGUC χ ' ' ' '100
    UAACCCUAACUGAGAAGGGCGUAGGCGCCGUGCUUUUGCUCCCCGCGCGC , , χ χ x
    UGUUUUUCUCGCUGACUUUCAGCGGGCGGAAAAGCCUCGGCCUGCCGCCU ' χ χ χ χ200
    UC CAC CGUUCAUUCUAGAGCAAAC AAAAAAUGUCAGCUGCUGGCCCGUUC ' χ χ χ χ250
    GCCCCUCCCGGGACCUGCGGCGGGUCGCUGCCCAGCCCCCGAACCCCGCC ' ' ' ' '300
    UGGAGGCCGCGGUCGGCCGGGGCUUCUCCGGAGGCACCCACUGCCACCGC
    181 019 ' ' ' ' '350
    GAAGAGUUGGGCUCUGUCAGCCGCGGGUCUCUCGGGGGCGAGGGCGAGGU ' ' ' ' '400
    UCACCGUUUCAGGCCGCAGGAAGAGGAACGGAGCGAGUCCCGCGCGCGGC ' ' ' ' '450
    GCGAUUCCCUGAGCUAUGGGACGUGCACCCAGGACUCGGCUCACACAUGC ' ' ' ' '500
    AGUUCGCUUUCCUGUUGGUGGGGGGAACGCCGAUCGUGCGCAUCCGUCAC ' ' ' ' '550
    CCCUCGCCGGCAGUGGGGGCUUGUGAACCCCCAAACCUGACUGACUGGGC '559
    CAGUGUGCU.
  5. 5. Sonda oligonukleotydowa albo starter amplifikacji przydatny do wykrywania albo amplifikacji kwasu nukleinowego kodującego składnik RNA ludzkiej telomerazy albo kodującego ją genu, znamienny tym, że oligonukleotyd obejmuje od 10 do 500 nukleotydów identycznych albo komplementarnych z sekwencją genu RNA ludzkiej telomerazy, przy czym gen jest kodowany przez wstawkę ~ 2,5 kb Hindlll-SacI plazmidu pGRN33 (ATCC 75926):
    ' ' ' ' '50
    GATCAGTTAGAAAGTTACTAGTCCACATATAAAGTGCCAAGTCTTGTACT ' ' ' ' '100
    CAAGAT T AT AAGCAAT AGGAAT T TAAAAAAAGAAAT TAT GAAAAC TGACA ' ' ' ' '150
    AGAT T TAGT GCCTAC T TAGATAT GAAGGGGAAAGAAGGGT T T GAGATAAT ' ' ' ' '200
    GT GGGAT GC T AAGAGAAT GGT GGT AGT GT T GACAT AT AAC T C AAAGCAT T ' ' ' ' '250
    TAGCATCTACTCTATGTAAGGTACTGTGCTAAGTGCAATAGTGCTAAAAA ' ' ' ' '300
    CAGGAGTCAGATTCTGTCCGTAAAAAACTTTACAACCTGGCAGATGCTAT ' ' ' ' '350
    GAAAGAAAAAGGGGATGGGAGAGAGAGAAGGAGGGAGAGAGATGGAGAGG ' ' ' ' '400
    GAGAT AT T T TAC TTTTCTTT C AGAT C GAGGAC C GACAGC GAC AAC T C CAC ' ' ' ' '450
    GGAGT T TAT C T AAC T GAATAC GAGTAAAAC T T T TAAGAT CAT CC T GT CAT ' ' ' ' '500
    TTATATGTAAAACTGCACTATACTGGCCATTATAAAAATTCGCGGCCGGG ' ' ' ' '550
    TGCGGTGGCTCATACCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAAGCGGGT ' ' ' ' '600
    GGATCACTTGAGCCCTGGCGTTCGAGACCAGCCTGGGCAACATGGTGAAA ' ' ' ' '650
    CCCCCGTCTCTACTAAAAACACAAAAACTAGCTGGGCGTGGTGGCAGGCG ' ' ' ' '700
    CCTGTAATCCCAGCTACTCAGGAGGCTGAGACACGAGAATCGCTTGAACC ' ' ' ' '750
    CGGGAGCAGAGGTTGCAGTGAGCCGAGATCACGCCACTAGACTCCATCCA
    181 019 ' ' ' ' '800
    GCCTGGGCGAAAGAGCAAGACTCCGTCTCAAAAAAAAAAATCGTTACAAT ' ' ' ' '850
    TTATGGTGGATTACTCCCCTCTTTTTACCTCATCAAGACACAGCACTACT ' ' ' ' '900
    TTAAAGCAAAGTCAATGATTGAAACGCCTTTCTTTCCTAATAAAAGGGAG ' ' ' ' '950
    ATTCAGTCCTTAAGATTAATAATGTAGTAGTTACACTTGATTAAAGCCAT ' ' ' ' '1000
    CCT CTGCT CAAGGAGAGGC TGGAGAAGGCAT TC TAAGGAGAAGGGGGCAG ' ' ' ' '1050 ggtaggaactcggacgcatcccactgagccgagacaagatĘctgctgtag ' ' ' ' ' 1100 tcagtgctgcctgggaatctattttcacaaagttctccaaaaaatgtgat ' ' ' ' '1150 gatcaaaactaggaattagtgttctgtgtcttaggccctaaaatcttcct ' ' ' ' '1200 gtgaattccatttttaaggtagtcgaggtgaaccgcgtctggtctgcaga ' ' ' ' '1250 ggatagaaaaaaggccctctgatacctcaagttagtttcacctttaaaga ' ' ' ' '1300 aggtcggaagtaaagacgcaaagcctttcccggacgtgcggaagggcaac ' ' ' ' '1350 gtccttcctcatggccggaaatggaactttaatttcccgttccccccaac ' ' ' ' '1400 cagcccgcccgagagagtgactctcacgagagccgcgagagtcagcttgg ' ' ' ' '1450
    CCAATCCGTGCGGTCGGCGGCCGCTCCCTTTATAAGCCGACTCGCCCGGC ' ' ' ' '1500
    AGCGCACCGGGTTGCGGAGGGAGGGTGGGCCTGGGAGGGGTGGTGGCCAT ' ' ' ' '1550
    TTTTTGTCTAACCCTAACTGAGAAGGGCGTAGGCGCCGTGCTTTTGCTCC ' ' ' ' '1600
    CCGCGCGCTGTTTTTCTCGCTGACTTTCAGCGGGCGGAAAAGCCTCGGCC ' ' ' ' '1650
    TGCCGCCTTCCACCGTTCATTCTAGAGCAAACAAAAAATGTCAGCTGCTG ' ' ' ' '1700
    GCCCGTTCGCCCCTCCCGGGACCTGCGGCGGGTCGCTGCCCAGCCCCCGA ' ' ' ' '1750
    ACCCCGCCTGGAGGCCGCGGTCGGCCGGGGCTTCTCCGGAGGCACCCACT ' ' ' ' '1800
    GCCACCGCGAAGAGTTGGGCTCTGTCAGCCGCGGGTCTCTCGGGGGCGAG ' ' ' ' '1850
    GGCGAGGTTCACCGTTTCAGGCCGCAGGAAGAGGAACGGAGCGAGTCCCG ' ' ' ' '1900
    CGCGCGGCGCGATTCCCTGAGCTATGGGACGTGCACCCAGGACTCGGCTC ' ' ' ' '1950
    ACACATGCAGTTCGCTTTCCTGTTGGTGGGGGGAACGCCGATCGTGCGCA ' ' ' ' '2000
    TCCGTCACCCCTCGCCGGCAGTGGGGGCTTGTGAACCCCCAAACCTGACT
    181 019 ' ' ' ' '2050
    GACTGGGCCAGTGTGCTGCAAATTGGCAGGAGACGTGAAGGCACCTCCAA ' ' ' ' '2100
    AGTCGGCCAAAATGAATGGGCAGTGAGCCGGGGTTGCCTGGAGCCGTTCC ' ' ' ' '2150
    TGCGTGGGTTCTCCCGTCTTCCGCTTTTTGTTGCCTTTTATGGTTGTATT ' ' ' ' '2200
    ACAACTTAGTTCCTGCTCTGCAGATTTTGTTGAGGTTTTTGCTTCTCCCA ' ' ' ' '2250
    AGGTAGATCTCGACCAGTCCCTCAACGGGGTGTGGGGAGAACAGTCATTT ' ' ' ' '2300
    T T T T T TGAGAGAT CAT T T AACAT T T AAT GAAT AT T T AAT T AGAAGAT C TA ' ' ' ' '2350
    AATGAACATTGGAAATTGTGTTCCTTTAATGGTCATCGGTTTATGCCAGA ' ' ' ' '2400
    GGTTAGAAGTTTCTTTTTTGAAAAATTAGACCTTGGCGATGACCTTGAGC ' ' '2425
    AGTAGGATATAACCCCCACAAGCTT, przy czym oligonukleotyd nie jest dimerem albo innym polimerem 5'-TTAGGG-3'.
  6. 6. Oligonukleotyd według zastrz. 5, znamienny tym, że obejmuje sekwencję od 10 do 500 nukleotydów identycznych albo komplementarnych ze składnikiem RNA ludzkiej telomerazy o sekwencji:
    , A A A A5Q
    GGGUUGCGGAGGGAGGGUGGGCCUGGGAGGGGUGGUGGCCAUUUUUUGUC a a a a a
    UAACCCUAACUGAGAAGGGCGUAGGCGCCGUGCUUUUGCUCCCCGCGCGC ' ' ' ' '150
    UGUUUUUCUCGCUGACUUUCAGCGGGCGGAAAAGCCUCGGCCUGCCGCCU ' ' ' ' '200
    UCCACCGUUCAUUCUAGAGCAAACAAAAAAUGUCAGCUGCUGGCCCGUUC ' ' ' ' '250
    GCCCCUCCCGGGACCUGCGGCGGGUCGCUGCCCAGCCCCCGAACCCCGCC ' ' ' ' '300
    UGGAGGCCGCGGUCGGCCGGGGCUUCUCCGGAGGCACCCACUGCCACCGC ' ' ' ' '350
    GAAGAGUUGGGCUCUGUCAGCCGCGGGUCUCUCGGGGGCGAGGGCGAGGU ' ' ' ' '400
    UCACCGUUUCAGGCCGCAGGAAGAGGAACGGAGCGAGUCCCGCGCGCGGC ' ' ' ' '450
    GCGAUUCCCUGAGCUAUGGGACGUGCACCCAGGACUCGGCUCACACAUGC ' ' ' ' '500
    AGUUCGCUUUCCUGUUGGUGGGGGGAACGCCGAUCGUGCGCAUCCGUCAC ' ' ' ' '550
    CCCUCGCCGGCAGUGGGGGCUUGUGAACCCCCAAACCUGACUGACUGGGC '559
    CAGUGUGCU.
    181 019
  7. 7. Oligonukleotyd według zastrz. 5 albo 6, znamienny tym, że zawiera od 25 do 200 nukleotydów.
  8. 8. Oligonukleotyd według zastrz. 5 albo 6, znamienny tym, że jest sondą i który dalej obejmuje możliwy do wykrycia znacznik.
  9. 9. Rekombinowana cząsteczka kwasu nukleinowego, znamienna tym, że obejmuje promotor i sekwencję nukleotydową koduj ącą składnik RNA ludzkiej telomerazy według jednego z zastrz. 1 -4, znamienna tym, że promotor jest położony w taki sposób, że napędza transkrypcję sekwencji nukleotydowej.
  10. 10. Rekombinowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 9, znamienna tym, że obejmuje sekwencję położoną we wstawce ~ 2,5 kb Hindlll-Sacl plazmidu pGRN33 (ATCC 75926):
    ' ' ' ' '50
    GAT CAGT TAGAAAGT TAC T AGT C CACATATAAAGTGCCAAGTC T TGTAC T ' ' ' ' '100
    CAAGAT T AT AAGC AATAGGAAT T T AAAAAAAGAAAT TAT GAAAAC T GACA ' ' ' ' '150
    AGATTTAGTGCCTACTTAGATATGAAGGGGAAAGAAGGGTTTGAGATAAT ' ' ' ' '200
    GTGGGATGCTAAGAGAATGGTGGTAGTGTTGACATATAACTCAAAGCATT ' ' ' ' '250
    TAGCATCTAC T C TAT GTAAGGTAC TGTGC TAAGT GCAATAGT GC TAAAAA ' ' ' ' '300
    CAGGAGTCAGATTCTGTCCGTAAAAAACTTTACAACCTGGCAGATGCTAT ' ' ' ' '350
    GAAAGAAAAAGGGGATGGGAGAGAGAGAAGGAGGGAGAGAGATGGAGAGG ' ' ' ' '400
    GAGATATTTTACTTTTCTTTCAGATCGAGGACCGACAGCGACAACTCCAC ' ' ' ' '450
    GGAGTTTATCTAACTGAATACGAGTAAAACTTTTAAGATCATCCTGTCAT ' ' ' ' '500
    TTATATGTAAAACTGCACTATACTGGCCATTATAAAAATTCGCGGCCGGG ' ' ' ' '550
    TGCGGTGGCTCATACCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAAGCGGGT ' ' ' ' '600
    GGATCACTTGAGCCCTGGCGTTCGAGACCAGCCTGGGCAACATGGTGAAA ' ' ' ' '650
    CCCCCGTCTCTACTAAAAACACAAAAACTAGCTGGGCGTGGTGGCAGGCG ' ' ' ' '700
    CCTGTAATCCCAGCTACTCAGGAGGCTGAGACACGAGAATCGCTTGAACC ' ' ' ' '750
    CGGGAGCAGAGGTTGCAGTGAGCCGAGATCACGCCACTAGACTCCATCCA ' ' ' ' '800
    GCC T GGGCGAAAGAGCAAGAC TCC GTC TCAAAAAAAAAAATCGT TACAAT ' ' ' ' '850
    TTATGGTGGATTACTCCCCTCTTTTTACCTCATCAAGACACAGCACTACT ' ' ' ' '900
    TTAAAGCAAAGTCAATGATTGAAACGCCTTTCTTTCCTAATAAAAGGGAG ' ' ' ' '950
    AT T CAGTCC T TAAGAT TAATAATGTAGTAGT TACACT TGAT TAAAGCCAT
    181 019 ' ' '1000
    CCTCTGCT CAAGGAGAGGC T GGAGAAGGCAT T C T AAGGAGAAGGGGGC AG ' ' ' ' '1050
    GGTAGGAACTCGGACGCATCCCACTGAGCCGAGACAAGATTCTGCTGTAG ' ' ' ' '1100
    TCAGTGCTGCCTGGGAATCTATTTTCACAAAGTTCTCCAAAAAATGTGAT ' ' ' ' '1150
    GATCAAAACTAGGAATTAGTGTTCTGTGTCTTAGGCCCTAAAATCTTCCT ' ' ' ' '1200
    GTGAATTCCATTTTTAAGGTAGTCGAGGTGAACCGCGTCTGGTCTGCAGA ' ' ' ' '1250
    GGATAGAAAAAAGGCCCTCTGATACCTCAAGTTAGTTTCACCTTTAAAGA ' ' ' ' '1300
    AGGTCGGAAGTAAAGACGCAAAGCCTTTCCCGGACGTGCGGAAGGGCAAC ' ' ' ' '1350
    GTCCTTCCTCATGGCCGGAAATGGAACTTTAATTTCCCGTTCCCCCCAAC ' ' ' ' '1400
    CAGCCCGCCCGAGAGAGTGACTCTCACGAGAGCCGCGAGAGTCAGCTTGG ' ' ' ' '1450
    CCAATCCGTGCGGTCGGCGGCCGCTCCCTTTATAAGCCGACTCGCCCGGC ' ' ' ' '1500
    AGCGCACCGGGTTGCGGAGGGAGGGTGGGCCTGGGAGGGGTGGTGGCCAT ' ' ' ' '1550
    TTTTTGTCTAACCCTAACTGAGAAGGGCGTAGGCGCCGTGCTTTTGCTCC ' ' ' ' '1600
    CCGCGCGCTGTTTTTCTCGCTGACTTTCAGCGGGCGGAAAAGCCTCGGCC ' ' ' ' '1650
    TGCCGCCTTCCACCGTTCATTCTAGAGCAAACAAAAAATGTCAGCTGCTG ' ' ' ' '1700
    GCCCGTTCGCCCCTCCCGGGACCTGCGGCGGGTCGCTGCCCAGCCCCCGA ' ' ' ' '1750
    ACCCCGCCTGGAGGCCGCGGTCGGCCGGGGCTTCTCCGGAGGCACCCACT ' ' ' ' '1800
    GCCACCGCGAAGAGTTGGGCTCTGTCAGCCGCGGGTCTCTCGGGGGCGAG ' ' ' ' '1850
    GGCGAGGTTCACCGTTTCAGGCCGCAGGAAGAGGAACGGAGCGAGTCCCG ' ' ' ' '1900
    CGCGCGGCGCGATTCCCTGAGCTATGGGACGTGCACCCAGGACTCGGCTC ' ' ' ' '1950
    ACACATGCAGTTCGCTTTCCTGTTGGTGGGGGGAACGCCGATCGTGCGCA ' ' ' ' '2000
    TCCGTCACCCCTCGCCGGCAGTGGGGGCTTGTGAACCCCCAAACCTGACT ' ' ' ' '2050
    GACTGGGCCAGTGTGCTGCAAATTGGCAGGAGACGTGAAGGCACCTCCAA ' ' ' ' '2100
    AGTCGGCCAAAATGAATGGGCAGTGAGCCGGGGTTGCCTGGAGCCGTTCC ' ' ' ' '2150
    TGCGTGGGTTCTCCCGTCTTCCGCTTTTTGTTGCCTTTTATGGTTGTATT
    181 019 ' ' ' ' ν2200 acaacttagttcctgctctgcagattttgttgaggtttttgcTtctccca ' ' ' ' '2250
    AGGTAGATCTCGACCAGTCCCTCAACGGGGTGTGGGGAGAACAGTCATTT ' ' ' ' '2300
    T T T T T T GAGAGAT CAT Τ Τ AAC AT Τ ΤΑΑΤ GAAT AT Τ Τ ΑΑΤ Τ AGAAGAT C ΤΑ ' ' ' ' '2350
    AATGAACATTGGAAATTGTGTTCCTTTAATGGTCATCGGTTTATGCCAGA ' ' ' ' '2400
    GGTTAGAAGTTTCTTTTTTGAAAAATTAGACCTTGGCGATGACCTTGAGC ' ' '2425
    AGTAGGATATAACCCCCACAAGCTT.
  11. 11. Rekombinowany szczep bakteryjny pGRN33 (ATCC 75926).
  12. 12. Sposób wytwarzania rekombinowanego enzymu telomerazy, znamienny tym, że obejmuje wprowadzanie do komórki gospodarza eukariotycznego, który wyraża białkowy składnik telomerazy, cząsteczki rekombinowanego kwasu nukleinowego, obejmującego promotor i sekwencję nukleotydową kodującą składnik RNA ludzkiej telomerazy według jednego z zastrz. 1-4, znamienny tym, że promotor jest położony w sposób napędzający ekspresję sekwencji nukleotydowej.
  13. 13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że eukariotyczna komórka gospodarza wyraża składnik białkowy ludzkiej telomerazy.
  14. 14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że składnik RNA ludzkiej telomerazy jest ludzkim składnikiem RNA ludzkiej telomerazy.
  15. 15. Sposób zahamowania aktywności telomerazy w ludzkich komórkach, znamienny tym, że obejmuje przeniesienie do komórek egzogennego rekombinowanego polinukleotydu obejmującego sekwencję nukleotydową co najmniej 10 nukleotydów identycznych albo komplementarnych z sekwencją genu składnika RNA ludzkiej telomerazy, przy czym gen jest kodowany przez wstawkę ~ 2,5 kb Hindlll-Sacl plazmidu pGRN33 (ATCC 75926):
    ' ' ' ' '50
    GAT CAGT TAGAAAGT TAC TAG T C CACAT ATAAAGT GC CAAGT C Τ T G TAC T ' ' ' ' '100
    C AAGAT T AT AAG C AAT AGGAAT Τ T AAAAAAAGAAAT T AT GAAAAC T GACA ' ' ' ' '150
    AGAT T TAGTGCCTACT T AGATAT GAAGGGGAAAGAAGGGT T TGAGATAAT ' ' ' ' '200
    GT GGGAT GC TAAGAGAAT GGT GGT AGT GT T GACAT ATAAC T CAAAGCAT T ' ' ' ' '250
    TAGCATCTACTCTATGTAAGGTACTGTGCTAAGTGCAATAGTGCTAAAAA ' ' ' ' '300
    CAGGAGTCAGATTCTGTCCGTAAAAAACTTTACAACCTGGCAGATGCTAT ' ' ' ' '350
    GAAAGAAAAAGGGGATGGGAGAGAGAGAAGGAGGGAGAGAGATGGAGAGG ' ' ' ' '400
    GAGATATTTTACTTTTCTTTCAGATCGAGGACCGACAGCGACAACTCCAC ' a ' ' '450
    GGAGTTTATCTAACTGAATACGAGTAAAACTTTTAAGATCATCCTGTCAT ' ' ' ' '500
    TTATATGTAAAACTGCACTATACTGGCCATTATAAAAATTCGCGGCCGGG
    181 019 ' ' ' ' ' '550
    TGCGGTGGCTCATACCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAAGCGGGT ' ' ' ' '600
    GGATCACTTGAGCCCTGGCGTTCGAGACCAGCCTGGGCAACATGGTGAAA ' ' ' ' '650
    CCCCCGTCTCTACTAAAAACACAAAAACTAGCTGGGCGTGGTGGCAGGCG ' ' ' ' '700
    CCTGTAATCCCAGCTACTCAGGAGGCTGAGACACGAGAATCGCTTGAACC ' ' ' ' '750
    CGGGAGCAGAGGTTGCAGTGAGCCGAGATCACGCCACTAGACTCCATCCA ' ' ' ' '800
    GCCTGGGCGAAAGAGCAAGACTCCGTCTCAAAAAAAAAAATCGTTACAAT ' ' ' ' '850
    TTATGGTGGATTACTCCCCTCTTTTTACCTCATCAAGACACAGCACTACT ' ' ' ' '900
    TTAAAGCAAAGTCAATGATTGAAACGCCTTTCTTTCCTAATAAAAGGGAG ' ' ' ' '950
    ATTCAGTCCTTAAGATTAATAATGTAGTAGTTACACTTGATTAAAGCCAT ' ' ' ' '1000
    CCTCTGCTCAAGGAGAGGCTGGAGAAGGCATTCTAAGGAGAAGGGGGCAG ' ' ' ' '1050
    GGTAGGAACTCGGACGCATCCCACTGAGCCGAGACAAGATTCTGCTGTAG ' ' ' ' '1100
    TCAGTGCTGCCTGGGAATCTATTTTCACAAAGTTCTCCAAAAAATGTGAT ' ' ' ' '1150
    GATCAAAACTAGGAATTAGTGTTCTGTGTCTTAGGCCCTAAAATCTTCCT ' ' ' ' '1200
    GTGAATTCCATTTTTAAGGTAGTCGAGGTGAACCGCGTCTGGTCTGCAGA ' ' ' ' '1250
    GGATAGAAAAAAGGCCCTCTGATACCTCAAGTTAGTTTCACCTTTAAAGA ' ' ' ' '1300
    AGGTCGGAAGTAAAGACGCAAAGCCTTTCCCGGACGTGCGGAAGGGCAAC ' ' ' ' '1350
    GTCCTTCCTCATGGCCGGAAATGGAACTTTAATTTCCCGTTCCCCCCAAC ' ' ' ' '1400
    CAGCCCGCCCGAGAGAGTGACTCTCACGAGAGCCGCGAGAGTCAGCTTGG ' ' ' ' '1450
    CCAATCCGTGCGGTCGGCGGCCGCTCCCTTTATAAGCCGACTCGCCCGGC ' ' ' ' '1500
    AGCGCACCGGGTTGCGGAGGGAGGGTGGGCCTGGGAGGGGTGGTGGCCAT ' ' ' ' '1550
    TTTTTGTCTAACCCTAACTGAGAAGGGCGTAGGCGCCGTGCTTTTGCTCC ' ' ' ' '1600
    CCGCGCGCTGTTTTTCTCGCTGACTTTCAGCGGGCGGAAAAGCCTCGGCC ' ' ' ' '1650
    TGCCGCCTTCCACCGTTCATTCTAGAGCAAACAAAAAATGTCAGCTGCTG ' ' ' ' '1700
    GCCCGTTCGCCCCTCCCGGGACCTGCGGCGGGTCGCTGCCCAGCCCCCGA ' ' ' ' '1750
    ACCCCGCCTGGAGGCCGCGGTCGGCCGGGGCTTCTCCGGAGGCACCCACT ' ' ' ' '1800
    GCCACCGCGAAGAGTTGGGCTCTGTCAGCCGCGGGTCTCTCGGGGGCGAG ' ' ' ' '1850
    GGCGAGGTTCACCGTTTCAGGCCGCAGGAAGAGGAACGGAGCGAGTCCCG ' ' ' ' '1900
    CGCGCGGCGCGATTCCCTGAGCTATGGGACGTGCACCCAGGACTCGGCTC ' ' ' ' '1950
    ACACATGCAGTTCGCTTTCCTGTTGGTGGGGGGAACGCCGATCGTGCGCA ' ' ' ' '2000
    TCCGTCACCCCTCGCCGGCAGTGGGGGCTTGTGAACCCCCAAACCTGACT ' ' ' ' '2050
    GACTGGGCCAGTGTGCTGCAAATTGGCAGGAGACGTGAAGGCACCTCCAA ' ' ' ' '2100
    AGTCGGCCAAAATGAATGGGCAGTGAGCCGGGGTTGCCTGGAGCCGTTCC ' ' ' ' '2150
    TGCGTGGGTTCTCCCGTCTTCCGCTTTTTGTTGCCTTTTATGGTTGTATT ' ' ' ' '2200
    ACAACTTAGTTCCTGCTCTGCAGATTTTGTTGAGGTTTTTGCTTCTCCCA ' ' ' ' '2250
    AGGTAGATCTCGACCAGTCCCTCAACGGGGTGTGGGGAGAACAGTCATTT ' ' ' ' '2300
    T T T T T T GAGAGAT GAT τ τ AACAT T TAAT GAAT AT T T AAT T AGAAGAT C TA ' ' ' ' '2350
    AATGAACATTGGAAATTGTGTTCCTTTAATGGTCATCGGTTTATGCCAGA ' ' ' ' '2400
    GGTTAGAAGTTTCTTTTTTGAAAAATTAGACCTTGGCGATGACCTTGAGC ' ' '2425
    AGTAGGATATAACCCCCACAAGCTT, przy czym sekwencja nukleotydowa hamuje ekspresję albo łączenie się z telomerazą hTR, zaś sekwencja nukleotydowa nie jest dimerem albo innym polimerem 5'-TTAGGG-3'.
  16. 16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że sekwencja przynajmniej 10 nukleotydów jest sekwencją komplementarną albo identycznąz sekwencją składnika RNA ludzkiej telomerazy:
    ' ' ' ' '50
    GGGUUGCGGAGGGAGGGUGGGCCUGGGAGGGGUGGUGGCCAUUUUUUGUC ' ' ' ' '100
    UAACCCUAACUGAGAAGGGCGUAGGCGCCGUGCUUUUGCUCCCCGCGCGC ' ' ' ' '150
    UGUUUUUCUCGCUGACUUUCAGCGGGCGGAAAAGCCUCGGCCUGCCGCCU ' ' ' ' '200
    UCCACCGUUCAUUCUAGAGCAAACAAAAAAUGUCAGCUGCUGGCCCGUUC
    181 019 ' ' ' ' '250
    GCCCCUCCCGGGACCUGCGGCGGGUCGCUGCCCAGCCCCCGAACCCCGCC ' ' ' ' '300
    UGGAGGCCGCGGUCGGCCGGGGCUUCUCCGGAGGCACCCACUGCCACCGC ' ' ' ' '350
    GAAGAGUUGGGCUCUGUCAGCCGCGGGUCUCUCGGGGGCGAGGGCGAGGU ' ' ' ' '400
    UCACCGUUUCAGGCCGCAGGAAGAGGAACGGAGCGAGUCCCGCGCGCGGC ' ' ' ' '450
    GCGAUUCCCUGAGCUAUGGGACGUGCACCCAGGACUCGGCUCACACAUGC ' ' ' ' '500
    AGUUCGCUUUCCUGUUGGUGGGGGGAACGCCGAUCGUGCGCAUCCGUCAC ' ' ' ' '550
    CCCUCGCCGGCAGUGGGGGCUUGUGAACCCCCAAACCUGACUGACUGGGC '559
    CAGUGUGCU.
  17. 17. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że rekombinowany polinukleotyd dalej obejmuje promotor położony w sposób napędzający ekspresję sekwencji nukleotydowej.
  18. 18. Sposób określania czy próbka zawiera składnik RNA ludzkiej telomerazy, znamienny tym, że obejmuje etapy:
    a) kontaktowanie próbki z sondą oligonukleotydową albo starterem według zastrz 6 albo 7, które swoiście hybrydyzują ze składnikiem RNA ludzkiej telomerazy, i
    b) wykrywania czy oligonukleotydhybrydyzuje swoiście ze składnikiem RNA ludzkiej telomerazy, przy czym wykrywanie swoistej hybrydyzacji określa, że próbka zawiera składnik RNA ludzkiej telomerazy.
  19. 19. Sposób według zastrz. 18, znamienny tym, że oligonukleotyd jest starterem, zaś etap wykrywania obejmuje zapoczątkowanie odwrotnej transkrypcji składnika RNA ludzkiej telomerazy przy użyciu startera i wykrywanie odwrotnego transkryptu, przy czym wykrycie odwrotnego transkryptu wskazuje, że oligonukleotyd swoiście hybrydyzuje ze składnikiem RNA ludzkiej telomerazy.
  20. 20. Sposób według zastrz. 18, znamienny tym, że etap wykrywania dalej obejmuje etapy:
    (i) kontaktowania próbki z drugim oligonukleotydem według zastrz. 6, który swoiście hybrydyzuje ze składnikiem RNA ludzkiej telomerazy, przy czym pierwszy i drugi oligonukleotyd są starterami oligonukleotydowymi o długości od 10 do 30 nukleotydów, (ii) amplifikacji sekwencji nukleotydowej ze składnika RNA ludzkiej telomerazy przy użyciu tych starterów; oraz (iii) wykrywania amplikowanej sekwencji.
  21. 21. Sposób według zastrz. 18, znamienny tym, że etap wykrywania obejmuje wykrywanie in situ.
  22. 22. Sposób według zastrz. 18-21, znamienny tym, żepróbkajestpróbkąludzkąbadanąw kierunku stanu nowotworowego.
  23. 23. Rekombinowany kwas nukleinowy obejmujący promotor, znamienny tym, że promotor obejmuje sekwencję zasadniczo identyczną z sekwencjami regulatorowymi w regionie 5' genu składnika RNA ludzkiej telomerazy, ciągnącym się od sekwencji zgodności ramki CAAT do sekwencji zgodności ramki A/T genu składnika RNA ludzkiej telomerazy zawartej we wstawce ~ 2,5 kb Hindlll-SacI plazmidu pGRN33 (ATCC 75926):
    181 019 ' ' ' ' '50
    GATCAGTTAGAAAGTTACTAGTCCACATATAAAGTGCCAAGTCTTGTACT ' ' ' ' '100
    CAAGATTATAAGCAATAGGAATTTAAAAAAAGAAATTATGAAAACTGACA ' ' ' ' '150
    AGAT T TAGTGCC T AC T T AGAT AT GkAGGGGRAAGRAGGGT T T GAGAT AAT ' ' ' ' '200
    GTGGGATGCTAAGAGAATGGTGGTAGTGTTGACATATAACTCAAAGCATT ' ' ' ' '250
    TAGCAT C TACTC TATGTAAGGTACT GT GC TAAGTGCAATAGT GC TAAAAA ' ' ' ' '300
    CAGGAGTCAGATTCTGTCCGTAAAAAACTTTACAACCTGGCAGATGCTAT ' ' ' ' '350
    GAAAGAAAAAGGGGATGGGAGAGAGAGAAGGAGGGAGAGAGATGGAGAGG ' ' ' ' '400
    GAGATATTTTACTTTTCTTTCAGATCGAGGACCGACAGCGACAACTCCAC ' ' ' ' '450
    GGAGTTTATCTAACTGAATACGAGTAAAACTTTTAAGATCATCCTGTCAT ' ' ' ' '500
    TTATATGTAAAACTGCACTATACTGGCCATTATAAAAATTCGCGGCCGGG ' ' ' ' '550
    TGCGGTGGCTCATACCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAAGCGGGT ' ' ' ' '600
    GGATCACTTGAGCCCTGGCGTTCGAGACCAGCCTGGGCAACATGGTGAAA ' ' ' ' '650
    CCCCCGTCTCTACTAAAAACACAAAAACTAGCTGGGCGTGGTGGCAGGCG ' ' ' ' '700
    CCTGTAATCCCAGCTACTCAGGAGGCTGAGACACGAGAATCGCTTGAACC ' ' ' ' ' '750
    CGGGAGCAGAGGTTGCAGTGAGCCGAGATCACGCCACTAGACTCCATCCA ' ' ' ' '800
    GCCTGGGCGAAAGAGCAAGACTCCGTCTCAAAAAAAAAAATCGTTACAAT ' ' ' ' '850
    TTATGGTGGATTACTCCCCTCTTTTTACCTCATCAAGACACAGCACTACT ' ' ' ' '900
    TTAAAGCAAAGTCAATGATTGAAACGCCTTTCTTTCCTAATAAAAGGGAG ' ' ' ' '950
    AT T CAGT CCT TAAGAT TAATAATGTAGTAGT T ACAC T TGAT TAAAGCCAT ' ' ' ' '1000
    CCTCTGCTCAAGGAGAGGCTGGAGAAGGCATTCTAAGGAGAAGGGGGCAG ' ' ' ' '1050
    GGTAGGAACTCGGACGCATCCCACTGAGCCGAGACAAGATTCTGCTGTAG ' ' ' ' '1100
    TCAGTGCTGCCTGGGAATCTATTTTCACAAAGTTCTCCAAAAAATGTGAT ' ' ' ' '1150
    GATCAAAACTAGGAATTAGTGTTCTGTGTCTTAGGCCCTAAAATCTTCCT ' ' ' ' '1200
    GTGAATTCCATTTTTAAGGTAGTCGAGGTGAACCGCGTCTGGTCTGCAGA
    181 019 ' ' ' ' '1250
    GGATAGAAAAAAGGCCCTCTGATACCTCAAGTTAGTTTCACCTTTAAAGA ' ' ' ' '1300
    AGGTCGGAAGTAAAGACGCAAAGCCTTTCCCGGACGTGCGGAAGGGCAAC ' ' ' ' '1350
    GTCCTTCCTCATGGCCGGAAATGGAACTTTAATTTCCCGTTCCCCCCAAC ' ' ' ' '1400
    CAGCCCGCCCGAGAGAGTGACTCTCACGAGAGCCGCGAGAGTCAGCTTGG ' ' ' ' '1450
    CCAATCCGTGCGGTCGGCGGCCGCTCCCTTTATAAGCCGACTCGCCCGGC ' ' ' ' '1500
    AGCGCACCGGGTTGCGGAGGGAGGGTGGGCCTGGGAGGGGTGGTGGCCAT ' ' ' ' '1550
    TTTTTGTCTAACCCTAACTGAGAAGGGCGTAGGCGCCGTGCTTTTGCTCC ' ' ' ' '1600
    CCGCGCGCTGTTTTTCTCGCTGACTTTCAGCGGGCGGAAAAGCCTCGGCC ' ' ' ' '1650
    TGCCGCCTTCCACCGTTCATTCTAGAGCAAACAAAAAATGTCAGCTGCTG ' ' ' ' '1700
    GCCCGTTCGCCCCTCCCGGGACCTGCGGCGGGTCGCTGCCCAGCCCCCGA ' ' ' ' '1750
    ACCCCGCCTGGAGGCCGCGGTCGGCCGGGGCTTCTCCGGAGGCACCCACT ' ' ' ' '1800
    GCCACCGCGAAGAGTTGGGCTCTGTCAGCCGCGGGTCTCTCGGGGGCGAG ' ' ' ' '1850
    GGCGAGGTTCACCGTTTCAGGCCGCAGGAAGAGGAACGGAGCGAGTCCCG ' ' ' ' '1900
    CGCGCGGCGCGATTCCCTGAGCTATGGGACGTGCACCCAGGACTCGGCTC ' ' ' ' '1950
    ACACATGCAGTTCGCTTTCCTGTTGGTGGGGGGAACGCCGATCGTGCGCA ' ' ' ' '2000
    TCCGTCACCCCTCGCCGGCAGTGGGGGCTTGTGAACCCCCAAACCTGACT ' ' ' ' '2050
    GACTGGGCCAGTGTGCTGCAAATTGGCAGGAGACGTGAAGGCACCTCCAA ' ' ' ' '2100
    AGTCGGCCAAAATGAATGGGCAGTGAGCCGGGGTTGCCTGGAGCCGTTCC ' ' ' ' '2150
    TGCGTGGGTTCTCCCGTCTTCCGCTTTTTGTTGCCTTTTATGGTTGTATT ' ' ' ' '2200
    ACAACTTAGTTCCTGCTCTGCAGATTTTGTTGAGGTTTTTGCTTCTCCCA ' ' ' ' '2250
    AGGTAGATCTCGACCAGTCCCTCAACGGGGTGTGGGGAGAACAGTCATTT ' ' ' ' '2300
    T T T T T T GAGAGAT CAT T TAACAT T TAAT GAATAT T T AAT TAGAAGAT C TA ' ' ' ' '2350
    AATGAACATTGGAAATTGTGTTCCTTTAATGGTCATCGGTTTATGCCAGA ' ' ' ' '2400
    GGTTAGAAGTTTCTTTTTTGAAAAATTAGACCTTGGCGATGACCTTGAGC ' ' '2425
    AGTAGGATATAACCCCCACAAGCTT.
    181 019
  24. 24. Polinukleotyd według zastrz. 23, znamienny tym, że promotor obejmuje sekwencję identyczną albo komplementarną z sekwencjami regulatorowymi, ciągnącym się od sekwencji zgodności ramki CAAT do sekwencji zgodności ramki A/T genu składnika RNA ludzkiej telomerazy.
  25. 25. Polinukleotyd według zastrz. 24, znamienny tym, że promotor obejmuje sekwencję identyczną albo komplementarną z sekwencją ciągnącą się od sekwencji zgodności ramki CAAT do sekwencji zgodności ramki A/T genu składnika RNA ludzkiej telomerazy:
    CAATCCGTGCGGTCGGCGGCCGCTCCCTTTATAAGCCGACTCGCCCGGCAGCGCACC.
  26. 26. Polinukleotyd według jednego z zastrz. 23-25, znamienny tym, że promotor jest położony w sposób napędzający ekspresję genu reporterowego.
    * * *
PL95318169A 1994-07-07 1995-07-06 Składnik RNA ssaczej telomerazy i sposób wytwarzania rekombinowanego enzymu telomerazy PL181019B1 (pl)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US27210294A 1994-07-07 1994-07-07
US08/330,123 US5583016A (en) 1994-07-07 1994-10-27 Mammalian telomerase
US08/472,802 US5958680A (en) 1994-07-07 1995-06-07 Mammalian telomerase
US08/482,115 US5776679A (en) 1994-07-07 1995-06-07 Assays for the DNA component of human telomerase
PCT/US1995/008530 WO1996001835A1 (en) 1994-07-07 1995-07-06 Mammalian telomerase

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL318169A1 PL318169A1 (en) 1997-05-26
PL181019B1 true PL181019B1 (pl) 2001-05-31

Family

ID=27501040

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL95318169A PL181019B1 (pl) 1994-07-07 1995-07-06 Składnik RNA ssaczej telomerazy i sposób wytwarzania rekombinowanego enzymu telomerazy

Country Status (23)

Country Link
EP (2) EP1293565A3 (pl)
JP (2) JPH10505488A (pl)
KR (1) KR100789741B1 (pl)
CN (1) CN1231491C (pl)
AT (1) ATE308554T1 (pl)
AU (1) AU696702B2 (pl)
BG (1) BG63573B1 (pl)
BR (1) BR9508254A (pl)
CA (1) CA2194393C (pl)
CZ (1) CZ3497A3 (pl)
DE (1) DE69534568T2 (pl)
DK (1) DK0778842T3 (pl)
ES (1) ES2251720T3 (pl)
FI (1) FI970026A (pl)
HK (1) HK1011691A1 (pl)
HU (1) HUT78054A (pl)
IS (1) IS4408A (pl)
NO (1) NO970041L (pl)
NZ (1) NZ289720A (pl)
PL (1) PL181019B1 (pl)
RO (1) RO117328B1 (pl)
UA (1) UA47407C2 (pl)
WO (1) WO1996001835A1 (pl)

Families Citing this family (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7067497B2 (en) 1992-09-29 2006-06-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of telomere length by oligonucleotides having a G-core sequence
US5958680A (en) 1994-07-07 1999-09-28 Geron Corporation Mammalian telomerase
US5972605A (en) * 1994-07-07 1999-10-26 Geron Corporation Assays for regulators of mammalian telomerase expression
US5968506A (en) * 1995-08-04 1999-10-19 Geron Corporation Purified telomerase
US6517834B1 (en) 1995-08-04 2003-02-11 Geron Corporation Purified telomerase
US6545133B1 (en) 1995-08-04 2003-04-08 Geron Corporation Methods for purifying telomerase
US5858777A (en) 1995-09-08 1999-01-12 Geron Corporation Methods and reagents for regulating telomere length and telomerase activity
CA2237589A1 (en) * 1995-11-16 1997-05-22 Michael W. Dahm Method of quantifying tumour cells in a body fluid and a suitable test kit
AU2593697A (en) * 1996-03-28 1997-10-17 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Transgenic organisms with altered telomerase activity
US6015710A (en) * 1996-04-09 2000-01-18 The University Of Texas System Modulation of mammalian telomerase by peptide nucleic acids
JPH1052300A (ja) * 1996-06-03 1998-02-24 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 細胞内テロメラーゼ活性の測定法
JPH1028600A (ja) * 1996-07-17 1998-02-03 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd テロメラーゼ活性の測定法
US6808880B2 (en) 1996-10-01 2004-10-26 Geron Corporation Method for detecting polynucleotides encoding telomerase
US6261836B1 (en) 1996-10-01 2001-07-17 Geron Corporation Telomerase
US6093809A (en) 1996-10-01 2000-07-25 University Technology Corporation Telomerase
US6475789B1 (en) 1996-10-01 2002-11-05 University Technology Corporation Human telomerase catalytic subunit: diagnostic and therapeutic methods
US7585622B1 (en) 1996-10-01 2009-09-08 Geron Corporation Increasing the proliferative capacity of cells using telomerase reverse transcriptase
KR20000048820A (ko) 1996-10-01 2000-07-25 게론 코포레이션 텔로머라제 역전사 효소
US6610839B1 (en) 1997-08-14 2003-08-26 Geron Corporation Promoter for telomerase reverse transcriptase
US7390891B1 (en) * 1996-11-15 2008-06-24 Amgen Inc. Polynucleotides encoding a telomerase component TP2
US5919656A (en) * 1996-11-15 1999-07-06 Amgen Canada Inc. Genes encoding telomerase protein 1
EP0951568A1 (en) * 1996-12-20 1999-10-27 Geron Corporation Methods for detecting and inhibiting the rna component of telomerase
US5846723A (en) * 1996-12-20 1998-12-08 Geron Corporation Methods for detecting the RNA component of telomerase
WO1998037181A2 (en) * 1997-02-20 1998-08-27 Whitehead Institute For Biomedical Research Telomerase catalytic subunit gene and encoded protein
DE69725018T2 (de) * 1997-04-04 2004-06-09 Geron Corp., Menlo Park Gereinigte telomerase
US7622549B2 (en) 1997-04-18 2009-11-24 Geron Corporation Human telomerase reverse transcriptase polypeptides
US7413864B2 (en) 1997-04-18 2008-08-19 Geron Corporation Treating cancer using a telomerase vaccine
EP0990037A2 (de) * 1997-06-20 2000-04-05 Bayer Ag Humane katalytische telomerase-untereinheit und deren diagnostische und therapeutische verwendung
EP1571215A3 (en) * 1997-07-01 2007-10-31 Cambia Biosystems LLC Vertebrate telomerase genes and proteins and uses thereof
JP2002514928A (ja) 1997-07-01 2002-05-21 キャンビア バイオシステムス リミティド ライアビリティー カンパニー 脊椎動物テロメラーゼ遺伝子およびタンパク質ならびにその使用
US7378244B2 (en) 1997-10-01 2008-05-27 Geron Corporation Telomerase promoters sequences for screening telomerase modulators
DE19757300A1 (de) * 1997-12-22 1999-06-24 Roche Diagnostics Gmbh Nachweis von Harnblasenkarzinom in einer Urinprobe
GB9801902D0 (en) * 1998-01-29 1998-03-25 Cancer Res Campaign Tech A gene promoter
DE19804372A1 (de) 1998-02-04 1999-08-05 Michael W Dr Dr Dahm Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Tumorzellen in einer Körperflüssigkeit und dazu geeignete Testkits
US7402307B2 (en) * 1998-03-31 2008-07-22 Geron Corporation Method for identifying and killing cancer cells
US6358739B1 (en) * 1999-04-12 2002-03-19 Modex Therapeutiques, S.A. Transiently immortalized cells
WO2000074667A2 (en) * 1999-06-04 2000-12-14 Au Jessie L S Compositions active in telomere damage comprising a taxane and telomerase inhibitor
US6995145B1 (en) 1999-06-04 2006-02-07 Au Jessie L-S Methods and compositions for modulating drug activity through telomere damage
ATE391134T1 (de) 1999-09-10 2008-04-15 Geron Corp Oligonukleotid n3'-p5' thiophosphoramidate: ihre synthese und verwendung
WO2001036971A1 (fr) * 1999-11-16 2001-05-25 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Methode de recherche de substance d'inhibition de liaison entre des sous-unites de telomerase
PL2548880T3 (pl) * 2003-06-23 2019-07-31 Telomerase Activation Sciences, Inc. Kompozycje powodujące wzrost aktywności telomerazy
BRPI0414222B8 (pt) 2003-09-09 2021-05-25 Geron Corp compostos oligonucleotídeos modificados para inibição da telomerase, métodos, composição farmacêutica e usos relacionados
JP4635196B2 (ja) * 2005-03-04 2011-02-16 国立大学法人広島大学 遺伝子導入細胞、及びそれを用いたテロメラーゼ誘導物質の検出方法
WO2008094640A2 (en) 2007-01-30 2008-08-07 Geron Corporation Compounds having anti-adhesive effects on cancer cells
SG175282A1 (en) 2009-04-21 2011-11-28 Genetic Technologies Ltd Methods for obtaining fetal genetic material
JP6021018B2 (ja) * 2011-05-30 2016-11-02 国立大学法人豊橋技術科学大学 改良されたオリゴヌクレオチドおよびそのオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物
US20150125438A1 (en) * 2012-07-20 2015-05-07 Sang Jae Kim Anti-Inflammatory Peptides and Composition Comprising the Same
US9200327B2 (en) 2012-11-30 2015-12-01 Geron Corporation Diagnostic markers for treating cell proliferative disorders with telomerase inhibitors
EP3044326B1 (en) * 2013-09-13 2017-12-06 F. Hoffmann-La Roche AG Application of oligo-dt molecules to avoid generation of high molecular pcr products induced by polya-carrier
JOP20200257A1 (ar) 2014-05-01 2017-06-16 Geron Corp تركيبات أوليجو نوكليوتيد وطرق لتحضيرها
KR101628890B1 (ko) * 2015-09-03 2016-06-09 주식회사 학표벽지 엠보싱 벽지 제조 장치

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4312686A (en) * 1980-02-11 1982-01-26 American Biltrite Inc. Printed and embossed floor covering and method and apparatus for its manufacture
JPH02179729A (ja) * 1988-12-30 1990-07-12 Shinetsu Kogyo Kk ゲートル巻きするラッピングフィルムの製造法
US5489508A (en) * 1992-05-13 1996-02-06 University Of Texas System Board Of Regents Therapy and diagnosis of conditions related to telomere length and/or telomerase activity
WO1995013382A1 (en) * 1993-11-12 1995-05-18 Geron Corporation Therapy and diagnosis of conditions related to telomere length and/or telomerase activity
EP0666313A3 (en) * 1994-01-27 1996-03-06 Univ Iowa State Res Found Inc Targeting telomerase in gene therapy for cancer.
US5876979A (en) * 1994-07-07 1999-03-02 Cold Spring Harbor Laboratory RNA component of mouse, rat, Chinese hamster and bovine telomerase
JPH08294966A (ja) * 1995-04-26 1996-11-12 Nippon Shokubai Co Ltd 樹脂成形品の連続成形方法
JPH10119130A (ja) 1996-10-22 1998-05-12 Japan Steel Works Ltd:The 連続発泡体の製造方法及び装置
KR100815605B1 (ko) * 2002-02-18 2008-03-20 바프렉스 주식회사 공압출 다층필름의 제조방법 및 장치

Also Published As

Publication number Publication date
BG101103A (en) 1997-10-31
WO1996001835A1 (en) 1996-01-25
EP0778842A1 (en) 1997-06-18
DE69534568D1 (de) 2005-12-08
EP0778842A4 (en) 1999-08-11
PL318169A1 (en) 1997-05-26
CA2194393A1 (en) 1996-01-25
HK1011691A1 (en) 1999-07-16
DK0778842T3 (da) 2006-03-20
KR20050058527A (ko) 2005-06-17
DE69534568T2 (de) 2006-07-27
EP1293565A2 (en) 2003-03-19
CA2194393C (en) 2002-06-25
EP0778842B1 (en) 2005-11-02
NZ289720A (en) 1999-03-29
UA47407C2 (uk) 2002-07-15
EP1293565A3 (en) 2004-05-12
CN1158617A (zh) 1997-09-03
CZ3497A3 (en) 1997-10-15
AU2964795A (en) 1996-02-09
FI970026A0 (fi) 1997-01-03
ES2251720T3 (es) 2006-05-01
HUT78054A (hu) 1999-07-28
CN1231491C (zh) 2005-12-14
JPH10505488A (ja) 1998-06-02
JP4068861B2 (ja) 2008-03-26
IS4408A (is) 1997-01-03
AU696702B2 (en) 1998-09-17
BR9508254A (pt) 1997-12-23
NO970041D0 (no) 1997-01-06
KR100789741B1 (ko) 2008-01-02
RO117328B1 (ro) 2002-01-30
FI970026A (fi) 1997-03-03
ATE308554T1 (de) 2005-11-15
BG63573B1 (bg) 2002-05-31
JP2002272489A (ja) 2002-09-24
NO970041L (no) 1997-03-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL181019B1 (pl) Składnik RNA ssaczej telomerazy i sposób wytwarzania rekombinowanego enzymu telomerazy
US6054575A (en) Mammalian telomerase RNA gene promoter
US7732402B2 (en) Mammalian telomerase
US5876979A (en) RNA component of mouse, rat, Chinese hamster and bovine telomerase
JP3869092B2 (ja) ヒトテロメラーゼ触媒性サブユニット
Liu et al. Vault poly (ADP-ribose) polymerase is associated with mammalian telomerase and is dispensable for telomerase function and vault structure in vivo
US6545139B1 (en) DNA sequence encoding the p99 gene and kits for the detection of neoplasia
US5776679A (en) Assays for the DNA component of human telomerase
US20030027300A1 (en) Human hairless gene and protein
AU714540B2 (en) Mammalian telomerase
KR100566766B1 (ko) 포유류텔로머라제
US6013468A (en) RNA component of telomerase
US6759221B1 (en) 14189, a novel human kinase and uses thereof