DE69725018T2

DE69725018T2 - Gereinigte telomerase

Info

Publication number: DE69725018T2
Application number: DE69725018T
Authority: DE
Inventors: L. Scott WEINRICH; M. Edward ATKINSON; P. Serge LICHTSTEINER; P. Alain VASSEROT; A. Ronald PRUZAN; T. James KEALEY
Original assignee: Geron Corp
Current assignee: Geron Corp
Priority date: 1997-04-04
Filing date: 1997-04-04
Publication date: 2004-06-09
Anticipated expiration: 2017-04-05
Also published as: CA2285672A1; ES2208895T3; EP0981627B1; CA2285672C; ATE250130T1; AU746306B2; JP2001509681A; AU2454897A; HK1029136A1; EP0981627A1; DE69725018D1; WO1998045450A1

Description

Hintergrund der Erfindung
Die amerikanische Bevölkerung altert. Das schnellste Wachstumssegment der Bevölkerung sind Personen mit einem Alter von über 85 Jahren, von denen man eine Zahl von über 30 Millionen im Jahr 2040 erwartet. Dieser demographische Anstieg erzeugt signifikante Notwendigkeiten für Medikamente zur Behandlung von altersbezogenen Krankheiten und führte zum erhöhten Interesse an Alterungsprozessen und Krankheiten, die damit verbunden sind, einschließlich Krebs.
Organismen altern teilweise, weil deren Zellen eine begrenzte Fähigkeit zum Fortsetzen der Teilung aufweisen. Wenn sie diese Grenze erreichen, werden Zellen seneszent. Die Zellseneszenz ist auf die Enden der Chromosomen, die Telomere, einer Zelle zurückgeführt worden. Mit jeder Zellteilung verlieren die Telomeren etwas DNA und werden kürzer. An einem Punkt wird dieses Kürzen kritisch. Zellen spüren dies und hemmen die Chromosomenverdopplung, um einen weiteren Verlust zu vermeiden. Daher ist die Zelle nicht länger fähig, sich zu teilen.
Nicht alle Zellen werden seneszent. Einzellige Organismen und bestimmte Säugerzellen weisen keine feste Zellteilungsgrenze auf. Forscher haben entdeckt, daß viele dieser Zellen ein Ribonukleoproteinenzym, Telomerase genannt, enthalten. Telomerase ersetzt die DNA, die normalerweise von den Telomeren während der Zellteilung verloren geht. (E. H. Blackburn, (1992) Annu. Rev. Biochem. 61: 113–29.) Folglich werden die Telomeren nie über die kritische Länge hinaus gekürzt, und die Zellen erreichen nie die Seneszenz.
Besonders interessant ist, daß Forscher herausfanden, daß die Zellen von vielen humanen Krebsarten Telomerase aufweisen. (C. B. Harley, Mutation Research 1991 256: 271–282.) Dies hilft zu erklären, warum Krebszellen das Teilen fortsetzen, ohne dabei seneszent zu werden. Dies legt auch eine wirksame Waffe im Kampf gegen Krebs nahe: Wenn die Telomeraseaktivität in Krebszellen inhibiert werden kann, wird erwartet, daß die Krebszellen die Seneszenz erreichen und mit der Teilung aufhören.
Entwicklungsverfahren, um die Telomeraseaktivität zu regulieren, erfordern Quellen von gereinigter Telomerase und insbesondere gereinigter humaner Telomerase. Gereinigte Telomerase würde bei Entwicklungs- und Testassays zur Messung der Telomeraseaktivität, um beispielsweise den Assay zu bewerten, und zur Verwendung als Standard in dem Assay nützlich sein. Assays für Telomerase sind zur Charakterisierung von Krebszellen oder Vorkrebszellen nützlich, da die meisten Krebszellen Telomerase exprimieren. Gereinigte Telomerase würde nützlicher sein als unbehandelte Telomerasepräparate, um Regulatoren, Inhibitoren oder Aktivatoren der Telomeraseaktivität in in vitro-Assays zu identifizieren und zu testen. Außerdem würde gereinigte Telomerase eine gründliche biochemische Analyse des Enzymmechanismus erleichtern, was Verständnis für die Entwicklung von Mechanismus-basierenden Regulatoren bereitstellen kann. Gereinigte Telomerase würde ebenso bei der Herstellung von Antikörpern gegen Telomerase nützlich sein. Derartige Antikörper würden wiederum als Reagenzien besonders nützlich sein, um humane Telomerase zu reinigen, und können bei Krebsdiagnose oder -prognose nützlich sein. Gereinigte Telomerase wird ebenso dabei helfen, Aminosäuresequenzinformationen bereitzustellen, die beim Klonen der verschiedenen Komponenten des Ribonukleoproteins nützlich sind.
Obwohl ein Bedarf an gereinigter Telomerase besteht, stellte die Reinigung des humanen Enzyms technische Herausforderungen dar. Telomerase ist ein seltenes Ribonukleoprotein, das in humanen Zellen nur in sehr niedriger Abundanz exprimiert wird. Es ist geschätzt worden, daß humane Zellen, die dafür bekannt sind, daß sie die höchsten Niveaus an Telomeraseaktivität exprimieren, nur etwa einhundert Moleküle des Enzyms pro Zelle aufweisen können. Da Telomerase ein Komplex ist, verhindert die Mehrkomponentenstruktur außerdem dessen Reinigung. Humane Zellen besitzen ebenso verhältnismäßig sehr hohe Niveaus an Nicht-Telomerase-Ribonukleoproteinen. Diese anderen Ribonukleoproteine könnten chromatographische Reinigungseigenschaften ähnlich dem Telomeraseribonukleoprotein aufweisen, was die Reinigung von Telomerase aus humanen Zellen schwierig macht. Daher besteht ein Bedarf an gereinigter Telomerase und insbesondere gereinigter humaner Telomerase.
Zusammenfassung der Erfindung
Humane Telomerase ist auf über 60.000fache Reinheit gegenüber zytoplasmatische rohe Zellpräparate gereinigt worden. Zwei Polypeptide, die mit Fraktionen, die Telomeraseaktivität enthalten, kogereinigt wurden, liegen in den gereinigten Fraktionen in ungefähr stöchiometrischen Mengen vor, wobei die RNA-Komponente von humaner Telomerase isoliert worden ist. Ein Polypeptid weist Aminosäuresequenzen auf, die mit Nukleolin übereinstimmen. Das andere Polypeptid weist Aminosäuresequenzen auf, die mit dem Verlängerungsfaktor 2 homolog übereinstimmen.
In einem Aspekt stellt diese Erfindung Verfahren zum Reinigen von Telomerase bereit. Die Schritte, die in dem Verfahren enthalten sind, hängen von dem erwünschten Reinigungsniveau ab. Ein Verfahren zum Reinigen von Telomerase aus einer verunreinigten Zusammensetzung, die organische Biomoleküle, beispielsweise ein nukleares Extrakt von 293 Zellen, enthält, auf mindestens das 60.000fache im Vergleich zu Rohextrakt (etwa 4% relative Reinheit) beinhaltet:

(1) Kontaktieren der Telomerase mit einer ersten Matrix, die Moleküle bindet, die eine negative Ladung tragen, beispielsweise POROS^® 50 HQ, Trennen der Telomerase von anderen organischen Biomolekülen, die nicht an die Matrix binden, und Sammeln der Telomerase;
(2) Kontaktieren der Telomerase mit einer Matrix, die Moleküle bindet, die eine positive Ladung tragen, beispielsweise POROS^® Heparin 20 HE-1, Trennen der Telomerase von anderen organischen Biomolekülen, die nicht an die Matrix binden, und Sammeln der Telomerase;
(3) Kontaktieren der Telomerase mit einer zweiten Matrix, die Moleküle bindet, die eine negative Ladung tragen, beispielsweise SOURCE 15Q^®, Trennen der Telomerase von anderen organischen Biomolekülen, die nicht an die Matrix binden, und Sammeln der Telomerase;
(4) Kontaktieren der Telomerase mit einem Affinitätsmittel mit einer speziellen Affinität für Telomerase, beispielsweise ein Oligonukleotid mit der Sequenz 5'-cgttcctcttcctgcggcct-3' (Oligo 14ab) (SEQ. ID Nr: 7), Trennen der Telomerase von anderen organischen Biomolekülen, die nicht an das Affinitätsmittel binden, und Sammeln der Telomerase; und
(5) Trennen der Telomerase von anderen organischen Biomolekülen nach der Molekülgröße, Form oder Schwebedichte, beispielsweise Trennen der Moleküle nach der Größe auf einer TosoHaas TSK-Gel*G5000PW_XL-Größentrennsäule, und Sammeln der Telomerase.

Telomerase kann auf mindestens 500.000fache Reinheit durch Hinzufügen eines zweiten Affinitätsschrittes unter Verwendung von Anti-Nukleolinantikörpern oder Anti-TMG-Antikörpern isoliert werden. Telomerase kann auf eine beträchtliche Reinheit (beispielsweise mindestens 1.000.000fach) durch dessen weiteres Isolieren durch Gelelektrophorese gereinigt werden.
Das Reinigungsprotokoll kann ebenso den Schritt des Kontaktierens der Telomerase mit einer Matrix mittlerer Selektivität, Trennen der Telomerase von anderen organischen Biomolekülen, die nicht an die Matrix mittlerer Selektivität binden, und Sammeln der Telomerase, vorzugsweise vor dem Affinitätsschritt, umfassen.
Telomerase kann auf unterschiedliche Niveaus an Reinheit durch Verändern, Wechseln der Reihenfolge oder Weglassen irgendeines der Schritte in dem Reinigungsprotokoll isoliert werden. Jedoch wird jedes Protokoll das Kontaktieren der Telomerase mit einem Affinitätsmittel umfassen. Das Kontaktieren der Telomerase mit mindestens einer Matrix, die Moleküle bindet, die eine negative Ladung oder eine positive Ladung tragen, ist der nächste bevorzugte Schritt oder Schritte, die in das Protokoll eingeschlossen sind.
Die Erfindung stellt ebenso eine Zubereitung eines Säuger-Telomeraseproteins und insbesondere Telomerase mit mindestens 2000facher, mindestens 3000facher, mindestens 20.000facher, mindestens 60.000facher, mindestens 100.000facher, mindestens 500.000facher oder mindestens 1.000.000facher erhöhter relativer Reinheit im Vergleich zu Rohzellextrakten von 293 Zellen bereit. Die Telomerase ist Säuger- und insbesondere humane Telomerase. Die Erfindung stellt ebenso Telomerase bereit, die durch die obigen Reinigungsschritte hergestellt wurde.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 stellt ein Vier-Schritt-Protokoll zur Reinigung von Telomerase dar.
2 stellt ein Fünf-Schritt-Protokoll zur Reinigung von Telomerase dar.
3 stellt ein erstes Sechs-Schritt-Protokoll zur Reinigung von Telomerase dar.
4 stellt ein zweites Sechs-Schritt-Protokoll zur Reinigung von Telomerase dar.
5 zeigt die Ergebnisse eines Primerverlängerungsassays aus einem CHAPS S-100-Extrakt von 293 Zellen (Bahnen 1 bis 5) und aktiven POROS^® 50 HQ-Anionenaustauschchromatographie-Pool (Bahnen 6 bis 10) in der Vier-Schritt-Reinigungsverfahrensweise.
6 zeigt die Ergebnisse eines Primerverlängerungsassays von einer Telomerasezubereitung aus dem aktiven POROS^® 50 HQ-Anionenaustauschchromatographie-Pool (Bahnen 1 bis 4) und dem POROS^® Heparin 20 HE-1-Chromatographie-aktiven Pool (Bahnen 5 bis 8) in dem Vier-Schritt-Reinigungsverfahren.
7 zeigt die Ergebnisse eines Primerverlängerungsassays von einer Telomerasezubereitung aus dem aktiven Oligo 5-Affinitätsisolierungs-Pool (Bahnen 1 bis 4), dem POROS^® Heparin 20 HE-1-Chromatographie-aktiven Pool, eingestellt auf die Salzkonzentration, die zur Affinitätsisolierung (Bahnen 5 bis 7) verwendet wurden, und dem POROS^® Heparin 20 HE-1-aktiven Pool (Bahnen 8 und 9) in dem Vier-Schritt-Reinigungsverfahren.
8 zeigt die Ergebnisse eines Primerverlängerungsassays von Telomerasezubereitungen aus dem POROS^® Heparin 20 HE-1-Chromatographie-aktiven Pool (Bahnen 1 bis 3) und dem POROS^® Spermidin-Chromatographie-aktiven Pool (Bahnen 4 bis 6) in dem Fünf-Schritt-Reinigungsverfahren, und dem Superose^® 6-aktiven Pool (Bahnen 7 bis 9) in dem ersten Sechs-Schritt-Assay.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
I. Definitionen
Wenn nicht anders angegeben, weisen alle technischen und wissenschaftlichen Ausdrücke, die hierin verwendet werden, die Bedeutung auf, die allgemein durch einen Fachmann des Standes der Technik, auf den sich die Erfindung bezieht, verstanden wird. Die folgenden Verweise stellen dem Fachmann eine allgemeine Definition vieler der in dieser Erfindung verwendeten Ausdrücke bereit: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2. Auflage 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker Herausgeber, 1988) und Hale & Marham, The Harper Collies Dictionary of Biology (1991). Wie hierin verwendet, weisen die folgenden Ausdrücke die ihnen zugeschriebenen Bedeutungen auf, wenn nicht anders angegeben.
„Polynukleotid" bezieht sich auf ein Polymer, bestehend aus Nukleotideinheiten (Ribonukleotide; Deoxyribonukleotide; verwandte natürlich vorkommende strukturelle Varianten und synthetische nicht-natürlich vorkommende Analoga davon), die mittels Phosphodiesterbindungen, verwandten natürlich vorkommenden strukturellen Varianten und synthetischen nicht-natürlich vorkommenden Analoga davon vernetzt sind. Daher umfaßt der Ausdruck Nukleotidpolymere, in denen die Nukleotide und die Verbindungen zwischen diesen nichtnatürlich vorkommende Analoga davon umfassen, wie beispielsweise und ohne Beschränkung Phosphorthioate, Phosphoramidate, Methylphosphonate, Chiral-methylphosphonate, 2-O-Methylribonukleotide, Peptidnukleinsäuren („PNAs") und dergleichen. Derartige Polynukleotide können beispielsweise unter Verwendung eines automatisierten DNA-Synthesegerätes synthetisiert werden. „Nukleinsäure" bezieht sich typischerweise auf große Polynukleotide. „Oligonukleotid" bezieht sich typischerweise auf kurze Polynukleotide, die im allgemeinen nicht größer als etwa 50 Nukleotide sind. Es ist selbstverständlich, daß, wenn eine Nukleotidsequenz durch eine DNA-Sequenz (d. h. A, T, G, C) dargestellt wird, dies ebenso eine RNA-Sequenz (d. h. A, U, G, C) umfaßt, in der „U" durch „T" ersetzt wird.
Eine konventionelle Benennung wird hierin verwendet, um Polynukleotidsequenzen zu beschreiben: das linke Ende einer einsträngigen Polynukleotidsequenz ist das 5'-Ende; die Linksrichtung einer doppelsträngigen Polynukleotidsequenz wird als 5'-Richtung bezeichnet. Die Richtung der 5'-zu-3'-Anlagerung von Nukleotiden an naszierende RNA-Transkripte wird als Transkriptionsrichtung bezeichnet. Der DNA-Strang mit derselben Sequenz wie eine mRNA wird als „codierender Strang" bezeichnet; Sequenzen auf dem DNA-Strang, die die selbe Sequenz wie eine mRNA aufweisen, die aus dieser DNA transkripiert wurde, und die 5' zu dem 5'-Ende des RNA-Transkripts lokalisiert sind, werden als „Stromaufwärtssequenzen" bezeichnet; Sequenzen auf dem DNA-Strang, die dieselbe Sequenz wie die RNA aufweisen, und die 3' zu dem 3'-Ende des kodierenden RNA-Transkripts sind, werden als „Stromabwärtssequenzen" bezeichnet.
„Rekombinantes Polynukleotid" bezieht sich auf ein Polynukleotid mit Sequenzen, die nicht natürlich miteinander verbunden sind. Ein amplifiziertes oder vereinigtes rekombinantes Polynukleotid kann in einem geeigneten Vektor eingeschlossen sein, und der Vektor kann verwendet werden, um eine geeignete Wirtszelle zu transformieren. Eine Wirtszelle, die das rekombinante Polynukleotid umfaßt, wird als „rekombinante Wirtszelle" bezeichnet. Das Gen wird dann in der rekombinanten Wirtszelle exprimiert, um beispielsweise ein „rekombinantes Polypeptid" herzustellen. Ein rekombinantes Polynukleotid kann ebenso eine nichtkodierende Funktion (beispielsweise Promoter, Ursprung der Replikation, Ribosomenbindungsstelle usw.) bereitstellen. Geeignete einzellige Wirte umfassen jeden von diesen, die routinemäßig beim Exprimieren der Eukaryot- oder Säuger-Nukleinsäuren verwendet werden, einschließlich beispielsweise Prokaryoten, wie E. coli; und Eukaryoten, einschließlich beispielsweise Pilz, wie Hefepilz; und Säugerzellen, einschließlich Insektenzellen (z. B. Sf9) und Tierzellen, wie CHO, R1.1, B-W, L-M, African Green Monkey Kidney-Zellen (z. B. COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40 und BMT 10) und kultivierten humanen Zellen.
„Expressionskontrollsequenz" bezieht sich auf eine Nukleotidsequenz in einem Polynukleotid, das die Expression (Transkription und/oder Translation) einer Nukleotidsequenz, die operativ daran gebunden ist, reguliert. „Operativ gebunden" bezieht sich auf eine funktionelle Beziehung zwischen zwei Teilen, in der die Aktivität von einem Teil (beispielsweise die Fähigkeit zum Regulieren der Transkription) zu einer Wirkung auf dem anderen Teil (beispielsweise Transkription der Sequenz) führt. Expressionskontrollsequenzen können beispielsweise und ohne Beschränkung Sequenzen von Promotoren (beispielsweise induzierbar oder konstitutiv), Enhancer, Transkriptionsterminatoren, ein Startcodon (d. h. ATG), Spleißsignale für Intronen und Stopcodone umfassen.
„Expressionsvektor" bezieht sich auf einen Vektor, der ein rekombinantes Polynukleotid umfaßt, der Expressionskontrollsequenzen umfaßt, die operativ an eine Nukleotidsequenz, die exprimiert werden soll, gebunden sind. Ein Expressionsvektor umfaßt ausreichend cis-wirkende Elemente zur Expression; andere Elemente zur Expression können durch die Wirtszelle oder ein in vitro-Expressionssystem geliefert werden. Expressionsvektoren umfassen alle die, die im Stand der Technik bekannt sind, wie Cosmide, Plasmide (beispielsweise nackt oder in Liposomen enthalten) und Viren, die das rekombinante Polynukleotid aufnehmen.
„Kodieren" bezieht sich auf die inhärente Eigenschaft von speziellen Sequenzen von Nukleotiden in einem Polynukleotid, wie ein Gen, eine cDNA oder eine mRNA, um als Matrize zur Synthese von anderen Polymeren und Makromolekülen in biologischen Verfahren mit entweder einer definierten Sequenz von Nukleotiden (d. h. rRNA, tRNA und mRNA) oder einer definierten Sequenz von Aminosäuren und den daraus resultierenden biologischen Eigenschaften zu dienen. Daher kodiert ein Gen ein Protein, wenn die Transkription und Translation von mRNA, die durch dieses Gen hergestellt wird, das Protein in einer Zelle oder anderen biologischen Systemen herstellen. Sowohl der kodierende Strang, dessen Nukleotidsequenz mit der mRNA-Sequenz identisch ist und die normalerweise in Sequenzauflistungen bereitgestellt wird, als auch der nicht-kodierende Strang, der als Matrize zur Transkription verwendet wird, eines Gens oder cDNA können als Kodierung des Proteins oder anderen Produktes dieses Gens oder cDNA bezeichnet werden. Wenn nicht anders angegeben, umfaßt eine „Nukleotidsequenz, die eine Aminosäuresequenz kodiert" alle Nukleotidsequenzen, die degenerierte Versionen voneinander sind und die dieselbe Aminosäuresequenz kodieren. Nukleotidsequenzen, die Proteine und RNA kodieren, können Introns umfassen.
„Allelvariante" bezieht sich auf irgendeine von zwei oder mehreren polymorphen Formen eines Gens, die denselben genetischen Genort einnehmen. Allelvariationen entstehen natürlich durch Mutation und können zum phänotypischen Polymorphismus in Populationen führen. Genmutationen können stumm sein (keine Veränderung in dem kodierten Polypeptid) oder können Polypeptide mit veränderten Aminosäuresequenzen kodieren. „Allelvarianten" beziehen sich ebenso auf cDNAs, die von mRNA-Transkriptionen von genetischen Allelvarianten stammen, sowie die Proteine, die durch sie kodiert werden.
„Hybridisierung, spezifisch mit" oder „spezifische Hybridisierung" oder „selektiv hybridisieren mit" bezieht sich auf das Binden, Verdoppeln oder Hybridisieren eines Nukleinsäuremo leküls, bevorzugt auf eine partikuläre Nukleotidsequenz unter stringenten Bedingungen, wenn diese Sequenz in einem komplexen Gemisch (z. B. gesamtzellulär) DNA oder RNA vorliegt.
Der Ausdruck „stringente Bedingungen" bezieht sich auf Bedingungen, unter denen eine Sonde bevorzugt mit seiner Zielteilsequenz und in einem geringeren Maße oder überhaupt nicht mit anderen Sequenzen hybridisiert. „Stringente Hybridisierung" und „stringente Hybridisierungswaschbedingungen" im Rahmen der Nukleinsäurehybridisierungsexperimente, wie Southern- und Northern-Hybridisierungen, sind sequenzabhängig und sind unter verschiedenen Umweltparametern unterschiedlich. Ein umfangreicher Ratgeber zur Hybridisierung von Nukleinsäuren wird in Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry an Molecular Biology-Hybridization with Nuleic Acid Probes Teil I Kapitel 2 „Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, New York gefunden. Im allgemeinen werden hochstringente Hybridisierungs- und Waschbedingungen so gewählt, daß sie etwa 5°C niedriger als der thermische Schmelzpunkt (Tm) für die spezielle Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und pH sind. Der Tm ist die Temperatur (unter definierter Ionenstärke und pH), bei der 50% der Zielsequenz mit einer perfekt abgestimmten Sonde hybridisieren. Hochstringente Bedingungen werden so gewählt, daß sie dem Tm für eine spezielle Sonde entsprechen.
Ein Beispiel von stringenten Hybridisierungsbedingungen zur Hybridisierung von komplementären Nukleinsäuren, die mehr als 100 komplementäre Reste aufweisen, auf dem Filter eines Southern- oder Northern-Blots ist 50% Formalin mit 1 mg Heparin bei 42°C, wobei die Hybridisierung über Nacht durchgeführt wird. Ein Beispiel von hochstringenten Waschbedingungen ist 0,15 M NaCl bei 72°C für etwa 15 Minuten. Ein Beispiel von stringenten Waschbedingungen ist 0,2 × SSC-Waschung bei 65°C für 15 Minuten (siehe Sambrook et al. für eine Beschreibung von SSC-Puffer). Oftmals geht einer Hochstringenzwaschung eine Niedrigstringenzwaschung voraus, um das Hintergrundsondensignal zu entfernen. Ein Beispiel einer mittleren Stringenzwaschung für einen Doppelstrang von beispielsweise mehr als 100 Nukleotiden ist 1 × SSC bei 45°C für 15 Minuten. Ein Beispiel einer Niedrigstringenzwaschung für einen Doppelstrang von beispielsweise mehr als 100 Nukleotiden ist 4 bis 6 × SSC bei 40°C für 15 Minuten. Im allgemeinen zeigt ein Signal-Rausch-Verhältnis von 2 × (oder höher) als das, das für eine nicht verwandte Sonde in dem besonderen Hybridisierungsassay beobachtet wurde, den Nachweis einer spezifischen Hybridisierung.
„Polypeptid" bezieht sich auf ein Polymer, bestehend aus Aminosäureresten, verwandten natürlich vorkommenden strukturellen Varianten und synthetischen nicht-natürlich vorkommenden Analoga davon, die mittels Peptidbindungen, verwandten natürlich vorkommenden strukturellen Varianten und synthetischen nicht-natürlich vorkommenden Analoga davon verbunden sind. Synthetische Polypeptide können synthetisiert werden, beispielsweise unter Verwendung eines automatisierten Polypeptidsynthesegerätes. Der Ausdruck „Protein" bezieht sich typischerweise auf große Polypeptide. Der Ausdruck „Peptid" bezieht sich typischerweise auf kurze Polypeptide.
Eine konventionelle Benennung wird hierin verwendet, um Polypeptidsequenzen darzustellen: das linke Ende einer Polypeptidsequenz ist der Amino-Terminus; das rechte Ende einer Polypeptidsequenz ist der Carboxyl-Terminus.
„Antikörper" bezieht sich auf ein Polypeptid, das im wesentlichen durch ein Immunoglobulingen oder Immunoglobulingene kodiert wird, oder Fragmente davon, die spezifisch einen Analyten (Antigen) binden und erkennen. Die erkannten Immunoglobulingene umfassen die kappa-, lambda-, alpha-, gamma-, delta-, epsilon- und mu-Gene der konstanten Region, sowie die unzähligen Immunoglobulingene der variablen Region. Antikörper existieren beispielsweise als intakte Immunoglobuline oder als eine Vielzahl von gut charakterisierten Fragmenten, die durch Digestion mit verschiedenen Peptidasen hergestellt wurden. Diese umfassen beispielsweise Fab'- und F(ab)'₂-Fragmente. Der Ausdruck „Antikörper", wie hierin verwendet, umfaßt ebenso Antikörperfragmente, die entweder durch die Modifikation von ganzen Antikörpern hergestellt oder die unter Verwendung rekombinanter DNA-Methodik neu synthetisiert wurden.
Ein Antikörper „bindet spezifisch an" oder „ist spezifisch immunreaktiv mit" einem Protein, wenn der Antikörper bei einer Bindungsreaktion fungiert, die für die Gegenwart des Proteins in Gegenwart einer heterogenen Population von Proteinen und anderen biologischen Substanzen bestimmend ist. Daher binden die spezifischen Antikörper unter den festgelegten Immunoassaybedingungen bevorzugt an ein spezielles Protein und binden nicht in einer signifikanten Menge an andere Proteine, die in der Probe vorliegen. Spezifisches Binden an ein Protein unter derartigen Bedingungen erfordert einen Antikörper, der für seine Spezifität für ein spezielles Protein ausgewählt wird. Eine Vielzahl an Immunoassayformaten kann verwendet werden, um Antikörper, die mit einem speziellen Protein spezifisch immunoreaktiv sind, zu selektieren. Beispielsweise werden Festphasen-ELISA-Immunoassays routinemäßig verwendet, um monoklonale Antikörper, die mit einem Protein spezifisch imunnoreaktiv sind, zu selektieren. Siehe Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York, für eine Beschreibung von Immunoassayformaten und Bedingungen, die verwendet werden können, um spezifische Immunoreaktivität zu bestimmen.
„Immunoassay" bezieht sich auf einen Assay, der einen Antikörper verwendet, der einen Analyten spezifisch bindet. Der Immunoassay wird durch die Nutzung von spezifischen Bindungseigenschaften eines speziellen Antikörpers charakterisiert, um den Analyten zu isolieren, zu targetieren und/oder zu quantifizieren.
„Komplementär" bezieht sich auf die topologische Kompatibilität und das Aneinanderpassen von interagierenden Oberflächen von zwei Polynukleotiden. Daher können die zwei Moleküle als komplementär beschrieben werden, und ferner sind die Kontaktoberflächeneigenschaften komplementär zueinander. Ein erstes Polynukleotid ist komplementär zu einem zweiten Polynukleotid, wenn die Nukleotidsequenz des ersten Polynukleotids identisch mit der Nukleotidsequenz des Polynukleotidbindungspartners des zweiten Polynukleotids ist. Daher ist das Polynukleotid, dessen Sequenz 5'-TATAC-3' ist, komplementär zu einem Polynukleotid, dessen Sequenz 5'-GTATA-3' ist.
„Konservative Substitution" bezieht sich auf die Substitution einer Aminosäure in einem Polypeptid mit einer funktionell ähnlichen Aminosäure. Die folgenden sechs Gruppen enthalten jeweils Aminosäuren, die konservative Substitutionen für einander sind:

1) Alanin (A), Serin (S), Threonin (T);
2) Asparaginsäure (D), Glutaminsäure (E);
3) Asparagin (N), Glutamin (Q);
4) Arginin (R), Lysin (K);
5) Isoleucin (I), Leucin (L), Methionin (M), Valin (V); und
6) Phenylalanin (F), Tyrosin (Y), Tryptophan (W).

„Im wesentlichen rein" bedeutet, daß eine Zielspezies die vorliegende, dominierende Spezies ist (d. h. auf Molbasis, reichlicher als irgendeine andere einzelne organische biomolekulare Spezies in der Zusammensetzung), und eine im wesentlichen gereinigte Fraktion eine Zusammensetzung ist, worin die Zielspezies mindestens etwa 50% (auf Molbasis) aller vorliegenden organischen biomolekularen Spezies umfaßt. Im allgemeinen bedeutet eine im wesentlichen reine Zusammensetzung, daß etwa 80% bis 90% oder mehr der organischen biomolekularen Spezies, die in der Zusammensetzung vorliegen, die gereinigte Spezies von Interesse ist. Die Zielspezies wird auf wesentliche Homogenität (kontaminante Spezies können nicht in der Zusammensetzung durch konventionelle Nachweisverfahren festgestellt werden) gereinigt, wenn die Zusammensetzung im wesentlichen aus einer einzelnen organischen biomolekularen Spezies besteht. „Organisches Biomolekül" bezieht sich auf ein organisches Molekül biologischen Ursprungs, beispielsweise Proteine, Nukleinsäuren, Kohlenhydrate oder Lipide. Lösungsmittelspezies, kleine Moleküle (<500 Dalton), Stabilisatoren (z. B. BSA) und elementare Ionenspezies werden nicht als organische biomolekulare Spezies für Zwecke dieser Definition betrachtet.
„Natürlich vorkommend", wie auf einen Gegenstand angewandt, bezieht sich auf die Tatsache, daß der Gegenstand in der Wirklichkeit gefunden werden kann. Beispielsweise ist eine Polypeptid- oder Polynukleotidsequenz, die in einem Organismus (einschließlich Viren) vorliegt, der aus einer Quelle in der Natur isoliert werden kann, und die nicht absichtlich im Labor modifiziert worden ist, natürlich vorkommend.
„Telomerase" oder „Telomerasribonukleoproteinkomplex" bezieht sich auf ein Ribonukleoproteinenzym eukaryotischen Ursprungs, das durch seine Fähigkeit, eine DNA-Sequenz eines eukaryotischen Telomers zu polymerisieren, indentifizierbar ist. Telomerase wird außerdem durch eine RNA-Komponente, die Sequenzen aufweist, die zu mindestens einem Teil der telomeren Wiederholung der Ursprungsspezies komplementär sind, und durch ein oder mehrere Proteinkomponenten gekennzeichnet. Wie hierin verwendet, bezieht sich „tierische Telomerase", „Säuger-Telomerase" und „humane Telomerase" auf Telomerasen, die natürlich in verschiedenen mehrzelligen tierischen, Säuger- bzw. humanen Zellen gefunden werden können, oder Polypeptidkomponenten mit denselben Aminosäuresequenzen und RNA-Komponenten mit denselben Nukleotidsequenzen aufweisen. Humane Telomerase enthält die RNA-Komponente „hTR". (US-Patent 5,583,016, Villeponteau et al.). Der Ausdruck Telo merase umfaßt alle Allelformen von Telomerase, einschließlich Wildtyp- und mutierten Formen.
„Telomeraseproteinkomponente" bezieht sich auf eine Proteinkomponente des Telomerasekernenzyms.
„Telomerasekernenzym" bezieht sich auf die vereinigte Sammlung von Telomerasekomponenten, sowohl der RNA- als auch der Proteinkomponenten, die für Telomeraseaktivität in vitro ausreichend sind.
„Telomerase-assoziiertes Protein" bezieht sich auf ein Protein, das an das Telomerasekernenzym bindet, daß aber nicht für die Telomeraseaktivtität in vitro notwendig ist.
„Telomeraseaktivitätsfaktor" bezieht sich auf ein Protein, das, wenn er von dem Telomerasekernenzym umfaßt wird, die Telomeraseaktivität in vitro verbessert.
„Telomerase-verwandtes Protein" bezieht sich gemeinsam auf Telomeraseproteinkomponenten, Telomerase-assoziierte Proteine und Telomeraseaktivitätsfaktoren.
„Telomeraseaktivität" bezieht sich auf die Synthese von Telomer-DNA durch Telomerase. Ein Assayverfahren zum Nachweis von Telomeraseaktivität ist der TRAP-Assay. Siehe Harley et al., internationale Anmeldung WO 95/13381. Dieser Assay mißt die Menge an radioaktiven Nukleotiden, eingebaut in Verlängerungsprodukte, Polynukleotiden, die durch Nukleotidaddition zu einem Telomerasesubstrat oder Primer gebildet werden. Die eingebaute Radioaktivität kann als Funktion der Intensität einer Bande auf einem PhosphorImager^TM-Schirm, der ein Gel belichtete, auf dem die radioaktiven Produkte getrennt werden, gemessen werden. Ein Testexperiment und ein Kontrollexperiment können optisch unter Verwendung der PhosphorImager^TM-Schirme verglichen werden. Siehe ebenso dem kommerziell erhältlichen TRAP-eze^TM Telomeraseassaykit (Oncor); und Morin, Cell 59: 521–529 (1989).
Sie „spezifische Aktivität" von Telomerase ist die Menge an Telomeraseaktivität pro Menge an Protein in einer Volumeneinheit.
„Gereinigte Telomerase" bezieht sich auf Telomerasezubereitungen mit mindestens 2000fach erhöhter relativer Reinheit. Wie hierin verwendet, weist eine Telomerasezubereitung eine 2000fach erhöhte relative Reinheit auf, wenn die spezifische Aktivität von Telomerase in der Zubereitung mindestens 2000 mal größer ist als die spezifische Aktivität von Telomerase von rohen Zytoplasmaextrakten von suspensionsfähigen 293 Zellen, die hierin nachstehend beschrieben werden, und wie durch den Primerverlängerungsassay, der nachstehend in Beispiel I. A. beschrieben wird, gemessen. Es wird bestimmt, daß in einer Telomerasezubereitung mit etwa 100.000fach erhöhter relativer Reinheit etwa 6% der Proteine Telomerase sind, während in einer Telomerasezubereitung mit etwa 1.000.000fach erhöhter relativer Reinheit etwa 60% der Proteinmoleküle Telomerase sind.
II. Verfahren zur Reinigung von Telomerase
Diese Erfindung stellt gereinigte Telomerase und Verfahren zu deren Herstellung bereit. Insbesondere richtet sich diese Erfindung auf gereinigte Säuger- oder humane Telomerase und rekombinante Telomerase. Diese Erfindung stellt gereinigte Telomerase bereit, die aus allen Zellen, die Telomerase exprimieren, beispielsweise Rohextrakte von normalen Zellen, Krebszellen, immortalisierten Zellen, Menschen- oder Tiergewebe, Tumoren oder aus Zellen, die Telomerase rekombinant exprimieren, isoliert wird.
A. Assay für Telomeraseaktivität
Bei Verfahren zum Reinigen von Telomerase ist es oftmals nützlich, die Gegenwart oder Menge von Telomerase oder Telomeraseaktivität in einer Zubereitung zu bestimmen. Mehrere Assays sind dafür erhältlich. Wie zuvor genannt, ist zum Zweck der Bestimmung der relativen Reinheit das am stärksten bevorzugte Verfahren zum Messen der spezifischen Aktivität von Telomerase der Primerverlängerungsassay. Dieser Assay wird nachstehend in Beispiel I. A beschrieben. Kurz gesagt mißt dieser Assay die Menge an radioaktiven Nukleotiden, die in Polynukleotiden, die auf einer Primersequenz synthetisiert werden, eingebaut sind. Die eingebaute Menge wird als Funktion der Intensität einer Bande auf einem Phosphorabbildungsschirm, der ein Gel belichtete, auf dem die radioaktiven Produkte getrennt werden, gemessen. Ein Testexperiment und ein Kontrollexperiment können durch einen Blick auf den Phosphorabbildungsschirmen verglichen werden. Dieser Assay basierte auf einem Assay, der durch G. B. Morin, (1989) Cell 59: 521–529 beschrieben wird.
Ein anderer Assay für Telomeraseaktivität ist der Dot-Blot-Assay. Der Dot-Blot-Assay ist zum routinemäßigen Screenen nützlich, da er einen hohen Durchsatz aufweist, und hunderte Assays an einem Tag durchgeführt werden können, wobei der größte Teil der Arbeit automatisch durchgeführt wird. Ergebnisse sind am Nachmittag des zweiten Tages erhältlich. Der Dot-Blot-Assay ist zum Vergleichen der Aktivität von Proben bei ungefähr demselben Niveau an Reinheit am wirksamsten und für Proben bei unterschiedlichen Stufen an Reinheit weniger wirksam. Deshalb ist es kein bevorzugter Assay zum Bestimmen der relativen Reinheit. Ein Protokoll für den Dot-Blot-Assay wird in Beispiel I. B bereitgestellt.
Andere Assays beinhalten das Bestimmen der Gegenwart der RNA-Komponente von Telomerase. Die Sequenz der RNA-Komponente von Telomerase für mehrere Spezies ist bekannt. Ein Polynukleotid, das die Sequenz für die RNA-Komponente von humaner Telomerase („hTR") umfaßt, ist isoliert worden. Humane genomische DNA, die hTR kodiert, ist geklont, sequenziert und gelagert worden. Ein als „28–1" bezeichnetes lampda-Klon enthält einen ~15 kb Insert, das Humantelomerase-RNA-Komponente-Gensequenzen enthält. Klon 28–1 wurde bei der American Type Culture Collection gemäß dem Budapester Vertrag hinterlegt und erhielt die Zugangsnummer ATCC 75925. Plasmid pGRN33 enthält ein ~2,5 kb HindIII-SacI-Insert, das Sequenzen von lampda-Klon 28–1 enthält, der die Sequenz von hTR enthält. Plasmid pGRN33 wurde bei der American Type Culture Collection gemäß dem Budapester Vertrag hinterlegt und erhielt die Zugangsnummer ATCC 75926. Ein PstI-Fragment des ~2,4 kb SauIIIA1-HindIII-Fragments von Klon 28–1 enthält ebenso die hTR-Sequenz. Die Sequenz des PstI-Fragments wird in SEQ. ID Nr: 1, nachstehend, bereitgestellt. Die Nukleotide von hTR werden über der Sequenz angegeben und durch Sterne und Zahlen von 1 bis 451 angegeben. Der Matrizenbereich ist unterstrichen.
Für die Sequenz der RNA-Komponente von Telomerase von Menschen, Mäusen, Hefe und Ciliaten siehe Feng et al. (1995) Science 269: 1236–41; Villeponteau et al., US-Patent Nr. 5,583,016; WO 96/01835 (Villeponteau et al.), WO 96/01604 (Andrews et al.), Blasco et al. (1995) Science 269: 1267–1270; Romero and Blackburn (1991) Cell 67: 343–353; Lingner et al. (1994) Genes and Devel, 8: 1984–1988; und Singer and Gottschling (1994) Science 266: 404–409.
Umkehrtranskriptions-PCR („RT-PCR") ist ein nützlicher Assay zum Bestimmen der Menge an Telomerase-RNA, da sie sehr empfindlich ist. Ein Protokoll für einen RT-PCR-Assay wird in Beispiel I. C bereitgestellt. Siehe ebenso US-Patentanmeldung 08/770,565, eingereicht am 20. Dezember 1996. Andere Verfahren zum spezifischen RNA-Nachweis können verwendet werden, beispielsweise Northern Analysis. Ein Protokoll für Northern Analysis wird in Beispiel I. D bereitgestellt. Die Hauptbegrenzung der Verwendung von irgendeinem der hTR-Assays, um Telomerase nachzuweisen, ist, daß die Gegenwart von hTR nicht bedeutet, daß aktive Telomerase vorliegt. Beispielsweise weisen somatische Zellen und einige Fraktionen von teilweise gereinigter Telomerase signifikante Mengen an hTR, aber keine nachweisbare Telomeraseaktivität auf.
Ein anderer sehr empfindlicher Assay für Telomeraseaktivität ist der TRAP-Assay, der in Harley et al., internationale Veröffentlichung WO 95/13381; Harley et al., internationale Anmeldung PCT/US96/09669, eingereicht am 7. Juni 1996, und Kim et al. (1994) Science 266: 2011–2015 beschrieben wird.
B. Reinigungsprotokolle
1. Allgemeine Betrachtungen
Diese Erfindung stellt Verfahren zum Herstellen gereinigter Telomerase aus einer verunreinigten Zusammensetzung, d. h. eine Zusammensetzung, die Telomerase und andere kontaminierende organische Biomoleküle enthält, bereit. Beginnend mit einer verunreinigten Telome rasezusammensetzung umfaßt ein Verfahren, das Telomerase ergibt, die über 60.000fach rein ist, die folgenden Schritte:

(1) Bereitstellen einer verunreinigten Zubereitung, enthaltend Telomerase, beispielsweise ein nukleares Extrakt;
(2) Isolieren von Telomerase von anderen organischen Biomolekülen mit einer ersten Matrix, die Moleküle bindet, die eine negative Ladung tragen, beispielsweise POROS^® 50 HQ;
(3) weiteres Reinigen der Telomerase mit einer Matrix, die Moleküle bindet, die eine positive Ladung tragen, beispielsweise POROS^® Heparin 20 HE-1;
(4) weiteres Reinigen der Telomerase mit einer zweiten Matrix, die Moleküle bindet, die eine negative Ladung tragen, beispielsweise SOURCE 15Q^®;
(5) weiteres Reinigen der Telomerase mit einem Affinitätsmittel, das eine spezifische Affinität für Telomerase aufweist, beispielsweise das Oligonukleotid 14ab, das die Sequenz 5'-cgttcctctt cctgcggcct-3' (SEQ. ID Nr: 7) aufweist; und
(6) weiteres Reinigen der Telomerase von anderen organischen Biomolekülen gemäß der Molekülgröße, Form oder Schwebedichte, beispielsweise Trennen der Moleküle nach der Größe auf einer TosoHaas TSK-Gel*G5000PW_XL-Größentrennsäule.

Zusätzliche Schritte können gegebenenfalls bei den Reinigungsverfahren mit einbezogen werden, um Telomerasezubereitungen mit höherer relativer Reinheit herzustellen. Telomerase kann außerdem mit einem Harz mittlerer Selektivität (vorzugsweise eine Matrix, die Spermidin enthält) vor der Affinitätsreinigung gereinigt werden. Siehe 2.
Die verwendeten spezifischen Reinigungsschritte und deren Sequenz liegen im Ermessen des Fachmanns. Jedoch wird die folgende Anleitung bereitgestellt. Im allgemeinen wird es bevorzugt, mit Schritten mit hoher Kapazität und relativ niedriger Selektivität zu beginnen, gefolgt durch Schritte mit mittlerer Kapazität und/oder Selektivität, gefolgt von Schritten mit geringer Kapazität und hoher Selektivität. Matrizen, die Moleküle binden, die positive oder negative Ladungen tragen, weisen hohe Kapazität auf und sind als frühe Schritte nützlich, da Telomerase in geringen Mengen in Zellen vorliegt und Reinigungsverfahren typischerweise mit großen Mengen an Rohzellextrakt beginnen. Von diesen Harzen wird die Reinigung mit Anionenaustauschharzen zunächst bevorzugt, gefolgt von der Reinigung mit Harzen, die Moleküle binden, die positive Ladungen tragen. Die Reihenfolge kann umgekehrt werden.
Reinigungsschritte mit mittlerer Selektivität und Kapazität werden nach Schritten hoher Kapazität bevorzugt. Diese umfassen Matrizen von mittlerer Selektivität und Trennung, basierend auf Molekülgröße, Form oder Schwebedichte. Während die Reinigung mit Harzen mittlerer Selektivität zunächst bevorzugt wird, müssen die Zwischenreinigungsschritte nicht auf irgendeine besondere Reihenfolge oder Zahl begrenzt werden. In dem oben beschriebenen Vier-Schritt-Reinigungsverfahren sind die Zwischenschritte nicht eingeschlossen.
Matrizen mit spezifischer Affinität weisen relativ niedrige Kapazität, aber hohe Selektivität auf, und werden später in dem Reinigungsverfahren bevorzugt, wenn die Telomerase mit weniger kontaminierenden Materialien vorliegt. Dieser Schritt kann ein einziger Reinigungsschritt sein und ist am nützlichsten, wenn die Telomerase mindestens die 40fache erhöhte relative Reinheit aufweist.
2. Telomerasequelle
Die Reinigung von Telomerase beginnt mit einer verunreinigten Ursprungszusammensetzung, wie ein nukleares Extrakt oder Rohzellextrakt, die vorzugsweise reich an Telomeraseaktivität ist. Einzellige Organismen ohne Begrenzung bei der Anzahl der Zellteilungen, wie Tetrahymena oder Hefe, stellen Telomerase her und sind gute Quellen für ein Zellextrakt bei der Herstellung von Telomerase aus derartigen Organismen. Jedoch stellen bei mehrzelligen Organismen, insbesondere Säugern, nicht alle Zellen Telomerase her. Daher sollten die Quellen aus den erhältlichen Zelltypen identifiziert werden. Bei Säugern sind Keimzellen und -gewebe, Krebszellen und -gewebe und immortalisierten Zellinien alle Telomeraseaktivitätsquellen. Bei Nagetieren und möglicherweise anderen Nicht-Primatensäugern sind einige normale somatische Gewebe, beispielsweise Mausleber, Telomeraseaktivitätsquellen.
Immortalisierte Zellinien sind eine besonders nützliche Quelle von rohen Telomerasezubereitungen, da sie in großen Mengen kultiviert und geerntet werden können, wodurch ein Zellextrakt für große Telomerasezubereitungen bereitgestellt wird. Insbesondere werden bei der Zubereitung von gereinigter humaner Telomerase 293 Zellen bevorzugt. 293 Zellen sind von humanen Urnierenursprungs, die mit Fragmenten von Adenovirus-5-DNA (Graham et al., 1977 J. Gen. Virol. 36: 59–77) umgewandelt worden sind. Die Zellinie, die in Monoschichtkulturen wachsen, wurde dem Wachstum in Suspension angepaßt (Stillman and Gluzman, (1985) Mol. And Cell Bio. 5: 2051–2060). Sie sind von der American Type Culture Collection (ATCC) (Zugangsnr. ATCC CRL 1573) erhältlich.
Rohes nukleares Extrakt kann durch Trennen von Kernen aus Zytoplasma mittels eines langsamlaufenden Spins hergestellt werden. Eine ausführlichere Beschreibung wird in Beispiel VI, Abschnitt A, bereitgestellt.
Das Rohzellextrakt kann in der typischen Weise hergestellt werden. Im allgemeinen können Zellen bei etwa 4°C in Puffern bei physiologischem pH homogenisiert werden. Ein ausführlicheres Protokoll wird in Beispiel II bereitgestellt. 293 Zellen wachsen als Suspensionskulturen in 8 Liter Schleuderflaschen in Joklik's – MEM, 5% Neugeborenenkalbsserum, 2 g/l NaHCO₃, 1% nicht-essentielle Aminosäuren, 1% Glutamin, 1% Penicillin/Streptomycin bei 37°. Die Kulturen werden bei 0,6 × 10⁶ Zellen/ml gehalten und verdoppeln sich alle 24 Stunden. Man kann ebenso einen Zellkulturspezialisten hinzuziehen, um große Chargen an Zellen zu kultivieren. Lieferanten umfassen Analytical Biological Systems (Wilmington, DE), Cellex (Minneapolis, MN) und Berlex (South San Francisco, CA).
Andere Zelltypen, insbesondere die, die ohne weiteres in Suspensionskulturen wachsen (die großes Kultivieren erleichtern), sind ebenso zur Reinigung von humaner Telomerase nützlich. Kandidaten umfassen Zellinien vom B- oder T-Zellstammbaum, wie Namalwa-(Burkitt-Lymphom), Daudi-(Burkitt-Lymphom), Jurkat-(akute T-Zelleukämie) und HUT 78-(Haut-7-Zellymphom)-Linien. Ebenso weisen HeLa-Zellen (Gebärmutterhalskarzinom) Telomeraseaktivität auf. Extrakte von HeLa-Zellen sind vom Computer Cell Culture Center (Mons, Belgium) erhältlich.
Nukleare Extrakte von 293 Zellen sind eine bevorzugte Telomerasequelle. Das Rohzellextrakt von Säugerzellen, die in den Verfahren dieser Erfindung verwendet werden, können ein Ganzzellextrakt oder Zytoplasmaextrakt sein.
Die Menge an verunreinigter Zubereitung, die zum Reinigen von Telomerase benötigt wird, hängt teilweise von der Abundanz von Telomerase in der Zelle, der Menge an Telomerase, die bei jedem Schritt verloren geht, und dem endgültigen Reinigungsgrad und der gewünschten Menge ab. Beispiel III beschreibt die Verwendung von 128 Litern von der 293- Zellsuspensionskultur in einer Verfahrensweise, die die Telomerase um mehr als das 3000fache reinigte.
Als Reinigungsfortschritte wird die Telomerase sowohl reiner als auch verdünnter. In diesem Stadium kann die Telomerase aufgrund von Telomerasehaften an Röhrchen, Schläuchen, Spitzen usw. verloren gehen. Dieser Verlust kann durch die Zugabe von Detergenzien minimiert werden. Insbesondere hemmt die Zugabe von bis zu etwa 0,1% Nonidet P-40 und etwa 1% Tween^®-20 (nicht-ionische Detergenzien) nicht die Telomeraseaktivität, so daß sie zu allen Chromatographiepuffern zugegeben werden können.
3. Matrizen, die Moleküle binden, die eine negative Ladung tragen
Ein bevorzugtes Verfahren zur Reinigung von Telomerase von einem Rohzellextrakt umfaßt das Kontaktieren der Telomerase mit ersten und zweiten Matrizen, die Moleküle binden, die negative Ladungen tragen, das Trennen von Telomerase von anderen organischen Biomolekülen, die nicht an die Matrix binden, und das Sammeln der Telomerase. Matrizen, die Moleküle mit einer negativen Ladung binden, sind zum Reinigen von Telomerase nützlich, da bei einem pH zwischen etwa 6 und etwa 9 der Telomerasekomplex mindestens lokale negative Ladungen aufzuweisen scheint. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Matrix ein Anionenaustauschharz, das in eine Säule gepackt ist. Anionenaustauschharze binden negativ geladene Moleküle. Ein Vorteil der Verwendung des Anionenaustausches bei dieser rohen Herstellungsstufe ist die hohe Bindungskapazität von diesen Harzen.
Beim Isolieren von humaner Telomerase stellen Anionenaustauschharze, die durch funktionelle tertiäre oder quartäre Amingruppen gekennzeichnet sind, die besten Ergebnisse bereit. POROS^® 50 HQ (PerSeptive Biosystems, Cambridge, Massachusetts) und SOURCE 15Q (Pharmacia, Uppsala, Schweden) sind bevorzugte Anionenaustauschharze. Super Q-650M (TosoHaas, Montgomeryville, Pennsylvania), DEAE Sepharose^® CL-6B (Pharmacia, Uppsala, Schweden) und Mono Q^® (Pharmacia, Uppsala, Schweden) sind ebenso nützlich. Beim Eluieren von Fraktionen von dem Anionenaustauschharz wird die Salzschrittelution bevorzugt. Ebenso kann die Elution mit einem linearen Salzgradienten verwendet werden, um Telomerase vorzugsweise unter Verwendung von Gradientenvolumen von weniger als zehn Säulenvolumen zu eluieren.
4. Matrizen, die Moleküle binden, die eine positive Ladung tragen
Ein bevorzugtes Verfahren zum Reinigen von Telomerase umfaßt als zweiten Schritt zwischen zwei Anionenaustausch-Reinigungsschritten das Kontaktieren der Telomerase mit einer Matrix, die Moleküle bindet, die positive Ladungen tragen, das Trennen von Telomerase von anderen organischen Biomolekülen, die nicht an der Säule binden, und das Sammeln der Telomerase. In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt die Matrix Heparin. Insbesondere ist POROS^® Heparin 20 HE-1 (PerSeptive Biosystems, Cambridge, Massachusetts) als Matrix in diesem Schritt nützlich. Andere nützliche Matrizen, die Moleküle binden, die positive Ladungen tragen, umfassen SP Sepharose^® CL-6B und Resource S (Pharmacia, Uppsala, Sweden).
5. Zwischenreinigungsschritte
Nach der Reinigung mit Matrizen hoher Kapazität und vor der Affinitätsmatrixreinigung kann die Telomerase außerdem durch ein oder mehrere Zwischenreinigungsschritte gereinigt werden.
In einem Zwischenreinigungsschritt wird die Telomerase mit Hydroxylapatit kontaktiert, wird die Telomerase von anderen organischen Biomolekülen, die nicht an Hydroxylapatit binden, getrennt, und die Telomerase wird gesammelt. Hydroxylapatit ist eine kristalline Form von Calciumhydroxylphosphat, das die Fähigkeit aufweist, Proteine gemäß ihrem basischen oder sauren Charakter zu binden. Seine Basis der Proteintrennung unterscheidet sich von einfachen Ionenaustauschharzen. Fraktionen können mit Puffern von verschiedener Zusammensetzung eluiert werden.
Ein bevorzugter Zwischenreinigungsschritt umfaßt das Kontaktieren der Telomerase mit einer Matrix mittlerer Selektivität; Trennen der Telomerase von anderen organischen Biomolekülen, die nicht an die Matrix mittlerer Selektivität binden, und Sammeln der Telomerase. Dieser Schritt kann der vierte Schritt der Fünf- oder Sechs-Schritt-Reinigungsschemen, die in den 2 und 3 umrissen werden, sein. Der Hauptzweck dieses Schrittes ist, die Telomerasezubereitung vor deren Kontaktieren mit einem Affinitätsmittel weiter zu reinigen. Die Typen der Matrizen, die in diesem Schritt enthalten sind, weisen im allgemeinen geringe re-Bindungskapazitäten auf, aber können selektiver als Ionenaustauschharze sein, wodurch sich eine größere Reinigung ergibt. Sie binden Telomerase mittels Interaktionen, die komplexer als die Ladung allein sind, und sind beispielsweise nicht so spezifisch wie Antikörper. Bindungsmerkmale können beispielsweise Kombinationen von elektrostatischer Anziehung, hydrophober/hydrophiler Anziehung, Affinität für spezielle Komponenten, wie Nukleinsäuren oder spezielle Aminosäuren in dem Protein, Affinität für chemische funktionelle Gruppen auf Molekülen, und die Vielzahl von Verbindungen umfassen, die bekannt sind und bei der Proteinreinigung für semispezifische Trennungen von Molekülen verwendet werden. Insbesondere und ohne Begrenzung zieht diese Erfindung die Verwendung der folgenden Matrizen mittlerer Selektivität in Betracht.
Matrizen, die ein Polyamin, wie Spermidin oder Spermin, umfassen, werden in diesem Schritt bevorzugt. Diese Moleküle enthalten primäre und sekundäre Amine in Kohlenwasserstoffketten. Sowohl Ladungs- als auch hydrophobe Interaktionen können in das Binden von Telomerase einbezogen sein.
Matrizen, die Polynukleotide umfassen, sind in diesem Schritt nützlich. Bei humaner Telomerase hält Polyguanylsäure Telomeraseaktivität zurück. Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, wird von diesen Matrizen angenommen, daß sie nützlich sind, da Telomerase ein Enzym ist, das DNA synthetisiert und eine RNA-Einheit enthält. Deshalb wird angenommen, daß es Domänen aufweist, die Polynukleotide spezifisch binden.
Matrizen, die zweiwertige Metallionen umfassen, sind ebenso in diesem Schritt nützlich. Metalle können auf festen Trägern durch Moleküle, wie Iminoacetessigsäure oder Nitrilotriessigsäure, chelatisiert werden. Nickel ist das am stärksten bevorzugte Metall und Kupfer und Zink sind ebenso beim Reinigen humaner Telomerase nützlich. Ohne durch eine Theorie eingeschränkt zu sein, geht man davon aus, daß die Metalle selektiv mit speziellen Aminosäureresten in Proteinen interagieren. Histidinreste sind typischerweise bei derartigen Interaktionen einbezogen. In Abhängigkeit des immobilisierten Metalls werden nur die Proteine mit ausreichend lokalen Dichten von Histidinen durch die Säule zurückgehalten. Einige Interaktionen zwischen Metallen und Proteinen können so stark sein, daß das Protein nicht gewonnen werden kann. Daher muß jedes Metall für seinen Nutzen beim Reinigen eines gegebenen Proteins empirisch getestet werden. Das Binden von Telomerase sowie die Freisetzung von Telomerase müssen effizient sein.
Matrizen, die positiv geladene Proteinsubstanzen umfassen, sind ebenso in diesem Schritt des Reinigungsverfahrens nützlich. Wir hierin verwendet, umfassen Proteinsubstanzen Aminosäuren, Polyaminosäuren, Peptide und Proteine. Zwei positiv geladene Materialien, Poly-L-Lysin und Histon, halten selektiv humane Telomerase zurück.
Matrizen, die Aminophenyl-Boronsäure umfassen, halten ebenso humane Telomerase zurück. Obwohl man nicht durch eine Theorie eingeschränkt sein möchte, ist die Affinität von Proteinen für Boronsäure kompliziert, aber umfaßt im wesentlichen eine Interaktion zwischen Diolgruppen auf Proteinen mit der immobilisierten Säure.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird die Telomerase nacheinander mit mindestens 2, mindestens 3 oder mindestens 4 Matrizen mittlerer Selektivität kontaktiert. Da verunreinigende Proteine sich kaum wie Telomerase auf Matrizen mit unterschiedlichen Merkmalen verhalten, verbessert die Verwendung von mehr als einer Matrix das Reinigungsniveau bei diesem Schritt. Die Reihenfolgen, die höhere Ausbeuten und Reinigungen hervorbringen, können empirisch bestimmt werden, und Matrizen mit höherer Kapazität werden früher in der Reihenfolge bevorzugt. Einige Kombinationen von zwei Matrizen hintereinander werden aufgrund ihrer einfachen Trennweisen von beispielsweise einer Säule zweiwertigen Metalls, gefolgt durch eine andere, Spermin, gefolgt von Spermidin, Poly-L-Lysin, gefolgt von Histon, nicht bevorzugt.
Ein anderer Zwischenreinigungsschritt in einem Verfahren, um Telomerase zu reinigen, umfaßt das Trennen der Telomerase von anderen organischen Biomolekülen nach der Molekülgröße, Form oder Schwebedichte und das Sammeln der Telomerase. Dies kann der fünfte Schritt in dem Sechs-Schritt-Reinigungsverfahren, das in 3 umrissen wird, sein. Eine bevorzugte Ausführungsform dieses Schrittes umfaßt das Fraktionieren der Telomerasezubereitung durch Gelfiltrationschromatographie. Größentrenn-Gelmatrizen, die Proteine in der Größenordnung von 200 kD bis 2000 kD trennen, sind am nützlichsten bei der Reinigung von humaner Telomerase. Bevorzugte Matrizen sind HW65 (TosoHaas, Montgomeryville, Pennsylvania), Superose^®6 (Pharmacia, Uppsala, Schweden) und insbesondere TSK-Gel*G5000PW_XL. Eine andere Ausführungsform dieses Schrittes umfaßt Gradientenzentrifugation der Telomerase in Gradienten von verschiedenen Zusammensetzungen, die die Trennung der Moleküle in der Zubereitung ergeben. Bevorzugte Gradienten bestehen aus Cs₂SO₄ oder aus Glycerin. Eine andere Ausführungsform dieses Schrittes umfaßt die Verwendung der Gelelektrophorese, die Moleküle, basierend auf deren Ladung, Größe und Form, trennt. Die Gelzusammensetzungen können in dieser Ausführungsform weit variieren. Ein bevorzugtes Gel ist ein natives Gel, bestehend aus Agarose, Polyacrylamid oder beiden, das unter physiologischen Bedingungen von Pufferstärke und pH läuft, was gewöhnlich den nativen Komplex und die Aktivität von humaner Telomerase erhält.
6. Affinitätsmatrix
Nach den Reinigungsschritten mit hoher Kapazität und nach gegebenenfalls Zwischenreinigungsschritten wird die Telomerase außerdem durch Kontaktieren der Telomerase mit einem Affinitätsmittel mit spezifischer Affinität für Telomerase, Trennen der Telomerase von anderen organischen Biomolekülen, die nicht an das Affinitätsmittel binden, und Sammeln der Telomerase von dem Affinitätsmittel gereinigt. Affinitätsmittel in diesem Schritt des Reinigungsverfahrens sind um Größenordnungen spezifischer für das Binden von Telomerase gegenüber anderen organischen Biomolekülen als die Mittel in anderen Schritten des Verfahrens. Affinitätsmittel mit spezifischer Affinität für Telomerase umfassen beispielsweise Oligonukleotide, die zu der RNA-Komponente von Telomerase komplementär sind, Oligonukleotide (RNA oder DNA) mit einer Primersequenz, die durch die Telomerase erkannt wird, Antikörper, die Epitope von Telomerase oder Telomerase-assoziierten Proteinen erkennen, und Verbindungen, die Telomerase inhibieren. Ein bevorzugtes Affinitätsmittel ist Oligo 14ab, ein Olignukleotid, dessen Sequenz in Tabelle 2 angegeben wird. Anti-Nukleolin-Antikörper und Anti-TMG-Antikörper sind ebenso nützlich.
Oligonukleotide, umfassend eine Nukleotidsequenz komplementär zu einer Sequenz der RNA-Komponente von Telomerase (beispielsweise eine „Antisense-Sequenz"), sind als Affinitätsmittel nützlich. In einer Ausführungsform wird das Oligonukleotid mit einer wiederauffindbaren Markierung, beispielsweise Biotin, verbunden. „Peptidnukleinsäuren", Polymere mit einer Amidhauptkette und angelagerten Basen, sind ebenso als Affinitätsmittel nützlich. Die Markierung kann an einem oder beiden Enden sein. Nach dem Kontaktieren der Telomerase mit dem markierten Affinitätsmittel, wird das Affinitätsmittel mit einem Bindemittel, das an die wiederauffindbare Markierung bindet, beispielsweise Streptavidin oder abgeleitetes Mittel, kontaktiert. Vorzugsweise ist das Bindemittel an einer Matrix befestigt. Dann werden Moleküle, die nicht an das wiederauffindbare Affinitätsmittel banden und daher nicht an das Bindemittel banden, getrennt oder aus dem Gemisch entfernt. Durch Trennen von Telomerase aus dem Affinitätsmittel wird die Telomerase gereinigt.
Die Verwendung von wiederauffindbaren Markierungen ist im Stand der Technik allgemein bekannt. Die wiederauffindbare Markierung und das Bindemittel können jede Sorte von Liganden und Ligandpartnern sein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die wiederauffindbare Markierung Biotin und das Bindemittel ist ImmunoPure^® NeutrAvidin (Pierce, Rockford, IL, Katalognummer 53157). In einer Ausführungsform ist die wiederauffindbare Markierung ein Antigen und das Bindemittel ein Antikörper, der an das Antigen bindet.
Ein allgemeines experimentelles Verfahren zum Testen der Nukleinsäureaffinitätverfahren ist wie folgt: (i) Biotin-markierte Oligonukleotide werden unter verschiedenen Bedingungen mit teilweise gereinigter Telomerase gemischt; (ii) Kügelchen mit angelagertem NeutrAvidin werden zu dem Gemisch zugegeben; (iii) Kügelchen werden aus dem Gemisch abgetrennt (Telomerase, die an dem Oligonukleotid haftete, haftete ebenso an den Kügelchen, so daß die Aktivität aus dem Gemisch erheblich abgereichert wird); (iv) Kügelchen wurden gewaschen, um gebundenes Material zu entfernen (Telomerase geht aus dem Kügelchen ab, und die Aktivität wird wiedergewonnen).
Oligonukleotide, die zu einer Sequenz der RNA-Komponente von humaner Telomerase komplementär sind, wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit als Affinitätsmittel getestet. Oligonukleotide, die in den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, werden in Tabelle 1 angegeben. Jedes der Antisense-Oligos wurde parallel zu einer Kontrolle nicht-spezifischen Oligos getestet. Die Abreicherung bezieht sich auf die Erhaltung von Telomerase durch das Oligo; Wiedergewinnung bezieht sich auf die anschließende Freisetzung von Telomerase aus dem Oligo.
Oligo 14ab ist das bevorzugte Oligo zur Affinitätsreinigung. Oligo 14ab hybridisiert mit einem Bereich von hTR, das in dem Holoenzym zugänglich ist.
Oligo 5 ist ebenso ein gutes Oligonukleotid zur Affinitätsreinigung. Obwohl man nicht an eine Theorie gebunden sein möchte, ist Oligo 5 ein starker nicht-verarbeitbarer Primer, so daß es nicht als Antisense-Ligand fungieren kann; es kann als Primerligand fungieren. Unter Verwendung von Oligo 5 und Eluieren mit variierenden Salzkonzentrationen ist die Telome raseaktivität in einer Gruppe von Fraktionen, enthaltend geringe Niveaus an nachweisbaren Protein (10 μg/ml), gewonnen worden, was dies zu einer stark angereicherten Zubereitung von Telomerase macht. Die Ausbeute von Telomeraseaktivität betrug 29%. (Siehe Beispiel III).
Tabelle 1: Oligonukleotide, komplementär (antisense) zu humaner Telomerase-RNA.
Tabelle 2: Oligonukleotidsequenzen
In einer anderen Ausführungsform dieses Schrittes ist das Affinitätsmittel ein Oligonukleotid mit einer Primersequenz, die durch Telomerase erkannt wird. Das Oligonukleotid wird mit der Telomerase und Dideoxynukleotiden unter Bedingungen für eine Primerverlängerungsreaktion kontaktiert. Dies führt zum Kettenabbruch der DNA-Synthese durch Telomerase. Unter diesen Bedingungen kann die Telomerase an den kettenterminierten Primer anschließen. Der Primer und die daran angelagerte Telomerase werden isoliert. Das Oligonukleotid umfaßt vorzugsweise Sequenzen, von denen herausgefunden worden ist, daß sie effiziente Primer in dem Primerverlängerungsassay sind. Diese umfassen die Sequenz, die durch Telomerase synthetisiert wird, sowie nicht-telomere Sequenzprimer, wie M2/TS. Beispielsweise synthetisiert humane Telomerase telomere DNA-Sequenzen (TTAGGG)_n an dem 3'-Ende der einsträngigen DNA-(und RNA-)-Primer. Daher kann ein Oligonukleotid zum Isolieren humaner Telomerase die Sequenz (TTAGGG)₃ (SEQ. ID Nr: 8) aufweisen. Sequenzen, die durch andere Telomerasen synthetisiert werden, werden beispielsweise in E. H. Blackburn, (1991) TIBS 16: 378–381 identifiziert.
Die obige Ausführungsform wurde unter Verwendung biotinylierter Oligonukleotide als Primer getestet, die anschließend mit NeutrAvidin-Kügelchen wiederaufgefunden wurden. Kontrollen waren nicht-Primeroligos, wie (CCCTAA)₃ (SEQ. ID Nr: 9). Bevorzugte Oligonukleotide zur Affinitätsreinigung in dieser Ausführungsform sind M2/TS und (TTAGGG)₃ (SEQ. ID Nr: 8). Die Sequenz von nützlichen Oligonukleotiden wird in Tabelle 3 angegeben.
Tabelle 3
Oligonukleotidsequenzen:
Mit den verschiedenen verwendeten Primeroligos entsprach die Wirksamkeit der Abreicherung der Stärke des Primers in einem Telomeraseprimerverlängerungsassay. Der M2/TS-Primer zeigte die beste Fähigkeit, die Aktivität anzureichern und zu behalten. Etwas Telomeraseaktivität wurde mit DTT von einer Biotinyl-SS-(TTAGGG)₃-(SEQ. ID Nr: 8)-Primerabreicherung eluiert (das DTT bricht die Disulfidverknüpfung in dem Primer, was ihn von den Kügelchen freisetzt). Die Ausbeute betrug nur 1 bis 5%, aber die Reinheit war wahrscheinlich hoch (Proteinkonzentration war unter dem Nachweis durch Standardproteinassay).
In einer anderen Ausführungsform dieses Schrittes ist das Affinitätsmittel ein Antikörper, der speziell ein Epitop von Telomerase erkennt. Antikörper, die als Affinitätsreagenzien nützlich sind, umfassen Antikörper gegen Nukleolin und Antikörper gegen die Tri-methylguanosin(„TMG")-cap-Struktur, die auf verschiednen kleinen nuklearen RNAs gefunden wurde. Eine Quelle an Antikörpern, die humane Telomerase erkennen können, sind Antikörper, die die Telomerase von anderen Organismen erkennen. Diese Antikörper können mit humaner Telomerase aufgrund von Homologie kreuzreagieren. Primäre Sequenzen der 80 kD und 95 kD Proteinuntereinheiten von Tetrahymena-Telomerase sind für Bereiche von Antigenität und Oberflächenwahrscheinlichkeit analysiert worden. Aus dieser Analyse sind zwei Peptide für 80 kD und eines für 95 kD bestimmt worden.
Diese Peptide weisen die folgenden Sequenzen auf:
Diese Peptide wurden verwendet, um die Antikörper anzureichern. Beim Auswählen der Tetrahymena-Proteinsequenzen für diesen Zweck ist die Auswahl hinsichtlich der Oberflächenwahrscheinlichkeit sehr wichtig, da Antikörper gegen äußere Merkmale von Telomerase höchstwahrscheinlich die Telomeraseaktivität von anderen Organismen immunausfällen. In einer anderen Ausführungsform werden die Antikörper gegen Fusionsproteine, die einen Teil einer Telomerasepolypeptidkomponente tragen, angereicht und in beispielsweise einem E. coli-Expressionssystem hergestellt. In einer anderen Ausführungsform sind die Antikörper von Menschen, die an der Autoimmunkrankheit leiden. In einer anderen Ausführungsform werden die Antikörper aus Antikörpern nachgewiesen, die Epitope auf Enzymen erkennen, die funktionell mit der Telomerase verwandt sind, beispielsweise DNA-Replikationsenzyme und Umkehrtranskriptasen. In einer anderen Ausführungsform werden die Antikörper gegen Peptide aus der Sequenz von humanen Telomeraseproteinen angereichert.
In einer anderen Ausführungsform dieses Schrittes ist das Affinitätsmittel ein Inhibitor der Telomeraseaktivität, der an Telomerase bindet. Telomeraseinhibitoren und Verfahren zu deren Analysieren werden in Prowse et al., US-Patentanmeldung 08/288,501, eingereicht am 10. August 1994, beschrieben. Wenn sie an eine wiederauffindbare Markierung angelagert werden, stellen diese Verbindungen einen Haken bereit, durch den die Telomerase isoliert wird.
Nachdem die Moleküle, die nicht an das Affinitätsmittel binden, entfernt werden, wird die gebundene Telomerase daraus freigesetzt. Wenn das Affinitätsmittel ein Oligonukleotid ist, sind Extreme der Ionenstärke (beispielsweise hoch-(etwa 500 mM NaCl) oder schwachsalzig (null)), Aussetzen hohen Konzentrationen an Nukleotiden und die Verwendung von spaltbaren Oligos (Disulfidoligos, gezeigt in Tabelle 3) bei Versuchen, das gebundene Enzym freizusetzen, ausprobiert worden. Das Waschen einer Oligo-5-Säule mit Salzlösungen mit zunehmender Ionenstärke setzt Telomerase frei.
Wenn die M2/TS-Affinitätssäulenmatrix mit gebundener Telomerase gekocht wurde, und das freigesetzte Material auf einem silbergefärbten SDS-Gel analysiert wurde, waren sehr wenige Banden sichtbar (weniger als 10). Während in diesem Experiment die Telomeraseproteine wahrscheinlich unter der Nachweisgrenze lagen, zeigte dieses Ergebnis, daß sehr wenige andere Proteine an die Affinitätsmatrix gebunden wurden. Daher war die Spezifität dieser Affinitätsabreicherung hoch.
Das Hinzufügen eines zweiten Affinitätsschrittes erhöht signifikant die Reinheit von Telomerase. Wenn beispielsweise einem Oligo-l4ab-Affinitätsschritt eine Affinitätsreinigung mit Anti-Nukleolin oder Anti-TMG folgt, wird die Telomerase um etwa das 500.000fache gereinigt.
7. Reinigung basierend auf Molekülgröße, Form oder Schwebedichte
In einem bevorzugten Verfahren der Erfindung folgt dem Affinitätsreinigungsschritt ein Schritt, umfassend das Trennen der Telomerase von anderen organischen Biomolekülen nach der Molekülgröße, Form und Schwebedichte. Matrizen, die Moleküle nach der Größe trennen, wie Gelausschlußchromatographie, sind in diesem Stadium besonders nützlich. Eine bevorzugte Matrix ist eine TosoHaas TSK-Gel*G5000PW_XL-Größentrennsäule. Telomerase in diesen Fraktionen wurde auf mehr als das 60.000fache relativer Reinheit gereinigt. Fraktionen, die Telomeraseaktivität in diesem Stadium enthalten, wurden durch SDS-PAGE getrennt. Sie enthielten etwa 50 sichtbare Proteinbanden. Das Isolieren der Banden aus dem Gel führt zu einem im wesentlichen reinen Protein.
Gereinigte Telomerase ist nützlich, um Antikörper gegen das Protein herzustellen. Es ist ebenso als Kontrolle in Assays zum Nachweisen von Telomerase in einer Probe nützlich. Rekombinante Telomerase, die in Zellen hergestellt wird, ist zum Immortalisieren dieser Zellen von Nutzen. Die Immortalisierung ist bei der Zubereitung von selbstreplizierenden Zellinien nützlich.
III. Telomerase-verwandte Proteine
Nach dem Reinigen von Telomerase unter Verwendung des Protokolls, das in 4 dargestellt wird, wurden die Proteine in Fraktionen, die Telomeraseaktivität enthielten, durch Gelelektrophorese untersucht. Zwei Polypeptide wurden in den gereinigten Fraktionen, die mit Telomeraseaktivität kogereinigt wurden, und die in ungefähren stöchiometrischen Mengen mit der RNA-Komponente von Telomerase gefunden wurden, nachgewiesen. Ein Protein, das als b120 bezeichnet wurde, wies eine scheinbare Molekularmasse von 120 kD auf SDS-PAGE auf. Ein anders Protein, das als y105 bezeichnet wurde, wies eine scheinbare Molekularmasse von 105 kD auf SDS-PAGE auf.
Die Proteine wurden weiter charakterisiert. Die Proteine wurden mit Protease fragmentiert und die Aminosäuresequenz der Fragmente wurde durch Nanoelektrospray-Massen spektrometrie bestimmt. Dieses Verfahren wird in M. Wilm et al., (1996) „Femtomole sequencing of proteins from polyacrylamide gels by nano-elektrospray mass spectrometry", Nature 379: 466–469 beschrieben. Aminosäuresequenzen von Peptiden, die von b120 und y105 stammen, wurden mit bekannten Aminosäuresequenzen in der Sequenz-Datenbank Genbank verglichen.
Es wurden Peptidfragmente von b120 nachgewiesen, die Aminosäuresequenzen aufweisen, die identisch mit den Sequenzen des Verlängerungsfaktor-2-Homologs („EF2H") sind. Siehe N. Nomura et al., „Prediction of the coding sequences of unidentified human genes. I. The coding sequences of 40 new genes (KIAA0001-KIAA0040) deduced by analysis of randomly sampled cDNA clones from human immature myeloid cell line KG-1", (1994) DNA Res. (JAPAN) 1: 27–35. GENBANK-Zugangsnummer D21163. EF2H ist eine cDNA, die willkürlich aus einer cDNA-Bank isoliert wurde, dessen Sequenz homolog zum Verlängerungsfaktor 2 ist. Seine Funktion ist vorher nicht nachgewiesen worden. Der Verlängerungsfaktor 2 fungiert bei der Translokation von mRNA in dem Ribosom. Polypeptid b 120 wird hierin als „Verlängerungsfaktor-2-Homolog" bezeichnet.
Es wurden Peptidfragmente von y105 nachgewiesen, die Aminosäuresequenzen aufweisen, die identisch mit den Sequenzen von Nukleolin sind. Nukleolin ist ein Nucleolus-residentes Protein, von dem angenommen wird, daß es bei der Ribosomenanordnung fungiert. Siehe beispielsweise M. Srivastava et al. (1989) „Cloning and sequencing of the human nucleolin cDNA", FEBS Letters 250: 99–105 und M. Srivastava et al. (1990) „Genomic organization and chromosomal localization of the human nulceolin gene", J. Biol. Chem., 265: 14922–931. GENBANK-Zugangsnummer M60858 J05584. Polypeptid y105 wird hierin als „Nukleolin" bezeichnet.
IV. Verwendungen von Telomerase-verwandten Proteinen
Telomeraseaktivität kann aus nuklearen Fraktionen mit Anti-Nukleolin-Antikörpern immunausgefällt werden. Da es Telomerase bindet, ist Nukleolin ein Telomerase-assoziiertes Protein. Nukleolin fungiert in vivo als Telomeraseaktivitätsfaktor.
Dementsprechend stellt diese Erfindung Verfahren zum Isolieren von Telomerase bereit, bei denen Telomerase mit Nukleolin kontaktiert wird und der Telomerase-Nukleolin-Komplex von anderen kontaminierenden Molekülen isoliert wird. In einer Ausführungsform wird eine Affinitätsmatrix, die Nukleolin umfaßt, mit der Telomerase kontaktiert, und kontaminierende Moleküle werden aus der Matrix gewaschen. In einer anderen Ausführungsform wird Nukleolin zunächst mit einem Liganden eines Ligandenpaares, wie GST/Glutathion oder Biotin/Streptavidin, derivatisiert und dann mit Telomerase in Kontakt gebracht, um einen Komplex zu bilden. Der Komplex wird auf einer Affinitätsmatrix, die mit dem Bindungspartner derivatisiert wurde, eingefangen. In einer anderen Ausführungsform wird die Telomerase, die mit Nukleolin (entweder natürlich oder durch vorherigen Kontakt mit Telomerase) assoziiert wird, aus einem Gemisch unter Verwendung einer Affinitätsmatrix, die Anti-Nukleolin-Antikörper umfaßt, isoliert.
Nukleolin scheint in dem Verfahren der Telomeraseanordnung und Telomerase-vermittelten Ausdehnung der Telomere von Chromosomen in vivo zu fungieren. Diese Erfindung stellt Verfahren zum Herstellen natürlicher oder rekombinanter Telomerase bereit, die die Exprimierung von rekombinantem Nukleolin in einer Zelle umfassen, die andere Komponenten von Telomerase exprimiert. Derartige Zellen umfassen die, die rekombinante Komponenten von Telomerase exprimieren.
Diese Erfindung stellt Verfahren zum Screenen von Verbindungen bereit, um Mittel zu identifizieren, die die Assoziation von Telomerase-assoziierten Proteinen, wie Nukleolin oder EF2H, mit Telomerase verändern. Die Verfahren umfassen im allgemeinen das Kontaktieren einer Verbindung mit dem Telomerase-assoziierten Protein und/oder mit Telomerase, und Bestimmen, ob die Assoziation zwischen dem Telomerase-assoziierten Protein und Telomerase durch die Gegenwart der Verbindung verändert wird. Eine Veränderung zeigt, daß das Mittel die Telomerasebindung an das assoziierte Protein verändert. Das Binden eines assoziierten Proteins an Telomerase kann durch eine Vielzahl von Mitteln bestimmt werden, einschließlich durch die beschriebenen Verfahren zur Bestimmung, ob Telomerase koisoliert oder mit dem assoziierten Protein ko-nachgewiesen werden kann. Diese Verfahren sind beim Nachweisen von Mitteln, die die Telomeraseanordnung oder Aktivität in vivo modulieren können, nützlich.
Es wird angenommen, daß Nukleolin und EF2H als Telomeraseaktivitätsfaktoren in vivo fungieren. Diese Erfindung stellt Verfahren zum Screenen von Verbindungen bereit, um Mittel nachzuweisen, die Telomeraseaktivität oder Funktion verändern. Die Verfahren umfassen das Exprimieren eines rekombinanten Telomeraseaktivitätsfaktors, wie Nukleolin oder EF2H, in einer Zelle, die Telomerase herstellt, das Kontaktieren der Zelle mit dem Mittel, und das Bestimmen, ob Telomeraseaktivität oder Funktion verändert wird, beispielsweise durch Messen der Telomeraseaktivität oder Telomerlänge. In einem anderen Verfahren wird die Verbindung mit dem Telomeraseaktivitätsfaktor und/oder Telomerase in vitro kontaktiert, und die Fähigkeit des Telomeraseaktivitätsfaktors, die Telomeraktivität zu verändern, wird bestimmt und mit seiner Fähigkeit, Telomeraseaktivität ohne die Gegenwart der Verbindung zu verändern, verglichen.
Diese Erfindung stellt ebenso Verfahren zum Inhibieren der Telomeraseanordnung oder Telomeraseaktivität in vivo durch Inhibieren der Aktivität eines Telomeraseaktivitätsfaktors, wie Nukleolin oder EF2H, bereit. In einer Ausführungsform umfassen die Verfahren die Inhibierung der Telomeraseanordnung oder Aktivität durch Versorgen der Zelle mit einem Antisense-Molekül, das gegen DNA oder RNA gerichtet ist, die den Telomeraseaktivitätsfaktor kodieren. In einer anderen Ausführungsform umfassen die Verfahren das Exprimieren mutierter, nicht-funktioneller Versionen eines Telomeraseaktivitätsfaktors, um als Lockmittel gegen die natürliche Aktivität dieser Proteine zu fungieren. Derartige Mutanten können beispielsweise Fragmente des natürlichen Proteins, Mutanten, umfassend mehrere nichtkonservative Aminosäuresubstitutionen, Additionen, Deletionen und dergleichen, sein.
Sowohl Nukleolin als auch EF2H sind zum Nachweisen anderer Telomerase-verwandter Proteine, die Nukleolin oder EF2H binden, nützlich, wie es beispielsweise unter Verwendung eines Zwei-Hybrid-Screens durchgeführt werden kann. Siehe beispielsweise Chien et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88: 9578. Dieser Screen weist Protein-Protein-Interaktionen in vivo durch Rekonstitution eines Transkriptionsaktivators, des Hefe-Gal4-Transkriptionsproteins, nach. Siehe Fields and Song (1989) Nature 340: 245. Das Verfahren basiert auf den Eigenschaften des Hefe-Gal4-Proteins, das aus trennbaren Domänen besteht, die für das DNA-Binden und die Transkriptionsaktivierung verantwortlich sind. Polynukleotide, normalerweise Expressionsvektoren, die zwei Hybridproteine kodieren, werden aufgebaut. Ein Polynukleotid umfaßt die Hefe-Gal4-DNA-bindende Domäne, die an eine Polypep tidsequenz eines bekannten Proteins (beispielsweise Nukleolin oder EF2H) gebunden ist. Das andere Polynukleotid umfaßt die Gal4-Aktivierungsdomäne, die an eine Polypeptidsequenz eines zweiten Proteins, das getestet werden soll (beispielsweise cDNA von einer Bank), gebunden ist. Die Konstrukte werden in eine Hefewirtszelle eingebracht. Bei der Exprimierung kann das intermolekulare Binden zwischen den angelagerten Teilen der zwei Fusionsproteine die Gal4-DNA-bindende Domäne mit der Gal4-Aktivierungsdomäne wieder aufbauen. Dies führt zur Transkriptionsaktivierung eines Reportergens (beispielsweise lacZ, HIS3), das mit einer Gal4-Bindungstelle operabel vernetzt ist. Variationen von Zwei-Hybrid-Systemen sind verwendet worden, um die in vivo-Aktivität eines proteolytischen Enzyms zu untersuchen. Siehe Dasmahapatra et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89: 4159. Alternativ kann ein interaktives E. coli/BCCP-Screening-System verwendet werden, um interagierende Proteinsequenzen nachzuweisen (d. h. Proteinsequenzen, die heterodimerisieren oder größere Ordnung an Heteromultimeren bilden). Siehe Germino et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 90: 933; Guarente (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 90: 1639. Sobald derartige cDNAs, die derartige interagierende Polypeptide kodieren, nachgewiesen werden, können sie zum Screenen einer Bank von Verbindungen (beispielsweise kleine Molekülbanken) verwendet werden, um Mittel nachzuweisen, die die Bindungsinteraktion inhibieren.
V. Polynukleotide, die Telomerase-verwandte Proteine kodieren
Diese Erfindung stellt ebenso Polynukleotide mit Nukleotidsequenzen, die Telomeraseverwandte Proteine, einschließlich Proteinkomponenten von Telomerase, Telomeraseassoziierte Proteine und Telomeraseaktivitätsfaktoren kodieren, bereit. Nukleotidsequenzen, die Telomerase-verwandte Proteine kodieren, sind von der Aminosäuresequenz dieser Polypeptide und dem Gencode inhärent. Diese Nukleotidsequenzen können bei der Herstellung von rekombinanten Polynukleotiden verwendet werden, die zum Exprimieren Telomeraseverwandter Proteine in verschiedenen Expressionssystemen verwendet werden.
In einer Ausführungsform umfaßt das Polynukleotid die Sequenz von cDNA oder genomischer DNA, die eine Proteinkomponente von Telomerase kodiert. Derartige Polynukleotide werden beispielsweise in der folgenden Weise erhalten. Die vollständigen oder teilweisen Aminosäuresequenzen der Proteinkomponente von Telomerase werden verwendet, um degenerierte Gruppen von Polynukleotidsonden oder -primern zu erzeugen, die die Aminosäure sequenzen kodieren. Da es dem Fachmann allgemein bekannt ist, wird es bevorzugt, Aminosäuresequenzen, die Aminosäuren enthalten, die durch so wenige Codone wie möglich (vorzugsweise einmalige Codone) kodiert werden, auszuwählen, um die Anzahl von möglichen Polynukleotiden, die die Sequenz kodieren, zu verringern. Diese Sonden oder Primer werden dann verwendet, um Polynukleotidsequenzen von cDNA-Banken oder genomischer DNA zu sondieren oder zu amplifizieren. Natürlich vorkommende Polynukleotidsequenzen, die Telomerase-assoziierte Proteine kodieren, werden durch Sequenzierung positiver Klone oder amplifizierter Sequenzen nachgewiesen.
In einem anderen Aspekt stellt diese Erfindung Polynukleotidsonden und -primer von mindestens 7 Nukleotiden bereit, die mit einer natürlich vorkommende Sequenz, die ein Telomerase-assoziiertes Protein kodiert, oder deren Komplement spezifisch hybridisieren. Sonden und Primer sind zum Nachweisen von Polynukleotiden, die Telomeraseproteinkomponenten kodieren, von Nutzen. Der Nachweis der Telomeraseproteinkomponenten-mRNA ist beim Feststellen von Krebs in einer Zelle von Nutzen, da die meisten krebsartigen Zellen Telomerase exprimieren.
In einem anderen Aspekt stellt diese Erfindung Verfahren zum Nachweisen eines Polynukleotids bereit, das eine Proteinkomponente von Telomerase in einer Probe kodiert, umfassend die Schritte (a) Kontaktieren der Probe mit einer Polynukleotidsonde oder -primer, umfassend eine Sequenz von mindestens 7 Nukleotiden, die mit einer Nukleotidsequenz spezifisch hybridisieren, ausgewählt aus der Nukleotidsequenz der Telomeraseproteinkomponente, und (b) Nachweisen, ob das Polynukleotid mit dem Telomeraseproteinkomponenten-Polynukleotid spezifisch hybridisierte. Spezifische Hybridisierung stellt einen Nachweis der Telomeraseproteinkomponente in der Probe bereit.
In einem anderen Aspekt stellt diese Erfindung Verfahren zum Inhibieren der Telomeraseexpression in einer Zelle bereit, umfassend das Bereitstellen der Zelle mit einem inhibierenden Polynukleotid, das an ein Telomeraseproteinkomponenten-Polynukleotid, beispielsweise mRNA, spezifisch bindet. Das inhibierende Polynukleotid kann ein Antisense-Molekül, ein Ribozym, ein Sense-Molekül oder ein Lockmittel sein, das einen inaktiven Lockmitteltelomeraseanalog kodiert.
Rekombinante Polynukleotide, die Expressionskontroll-Expressionskontroll-Sequenzen umfassen, die operabel an eine Nukleotidsequenz, die eine Proteinkomponente von Telomerase kodiert, gebunden sind, sind beim Herstellen großer Mengen an rekombinanter Telomerase von Nutzen. In einer Ausführungsform umfaßt das Verfahren das Bereitstellen der Zelle mit einem Expressionsapparat zur rekombinanten Expression der verwandten Proteine von Telomerase und der RNA-Komponente von Telomerase. Alternativ kann eine Zelle, die bereits ein oder mehrere der Komponenten des Ribonukleoproteins exprimiert, mit einem Expressionsapparat ergänzt werden, um die anderen Komponenten zu exprimieren.
VI. Verfahren zum Hervorrufen einer Immunantwort gegen Telomerase
Gereinigte Telomerase, Telomerase-assoziierte Proteine oder natürliche oder synthetische Peptide, die von diesen stammen, sind ebenso beim Hervorrufen einer Immunantwort bei Tieren nützlich. Demgemäß stellt diese Erfindung Polynukleotid- und Polypeptidvakzine zum Hervorrufen einer humoralen oder zellvermittelten Immunantwort gegen Telomerase, Telomerase-assoziierte Proteine oder Zellen, die sie exprimieren, bereit. Diese Erfindung stellt ebenso Verfahren zum Herstellen von Antikörpern bereit, die Telomerase oder Telomeraseassoziierte Proteine erkennen, sowohl polyklonal als auch monoklonal. Antikörper, die Telomerase oder Telomerase-assoziierte Proteine spezifisch erkennen, sind nützliche Affinitätsmittel in Verfahren zum Isolieren dieser Proteine, oder als Kontrollen in Immunassays für diese. Die Verfahren umfassen das Immunisieren eines Tiers mit gereinigter Telomerase, einem Telomerase-assoziierten Protein oder einem Fragment von irgendeinem davon.
Antikörper, die Telomerase oder ein Telomerase-assoziiertes Protein spezifisch erkennen, sind ebenso zum Nachweisen der Gegenwart dieser Proteine in einer Probe, wie einer Zelle oder ein Gewebe, nützlich. Da Telomerase in den meisten Krebsarten vorliegt, hilft die Identifikation von Telomerase bei der Diagnose von Krebs oder Vorkrebsstadien. Der Nachweis von Telomerase mit Antikörpern ist preisgünstig und bietet Geschwindigkeit und Leichtigkeit. Gereinigte Telomerase oder immunogene Fragmente davon sind ebenso in Vakzinen nützlich, um einen Patienten zu immunisieren.
Ein Polypeptid- oder Polynukleotidvakzin zum Hervorrufen einer Immunantwort gegen Telomerase umfaßt ein immunogenes Telomerase-Polypeptid-Analogon oder ein Polynukleotid, das das Analogon kodiert. In einer Ausführungsform trägt das immunogene Analogon ein MHC-Klasse-I- oder MHC-Klasse-II-Bindungsmotiv. Die Verwendung von Fragmenten von Eigenproteinen als Immunogene ist im Stand der Technik bekannt und wird für Cytotoxic T Lymphocyte Priming in der internationalen Veröffentlichung WO 94/03205 beschrieben. Vakzine, die diese Materialien umfassen, sind beim Behandeln von Krankheiten, die mit der Überexpression von Telomerase, wie Krebs, assoziiert werden, nützlich.
BEISPIELE
I. Telomeraseassayprotokolle
A. Primerverlängerungsassay
a) Assay
Der Primerverlängerungsassay, der in diesem Beispiel beschrieben wird, ist der Standard zum Bestimmen der spezifischen Aktivität zum Zweck der Bestimmung der relativen Reinheit einer Telomerasezubereitung.
Die 40-μl-Telomerasereaktion sollte eine Endkonzentration von:

1. 1 × Telomerasepuffer (siehe unten)
2. 1 mM MgCl₂
3. 2 mM dATP, 2 mM dTTP, 8 μM dGTP
4. 1 μM oder 0,25 μg/Reaktion des Oligoprimers M2/TS
5. 20 μCi/Reaktion von (αP³²-dGTP (0,624 μM dGTP, spez. Aktivität 800 Ci/mmol; NEN) aufweisen.
1. Um die Reaktion zu beginnen, werden 20 μl des 2 × Reaktionsgemisches mit einem gleichen Volumen (20 μl) Enzymextrakt vereinigt. Zur RNase-Kontrolle werden 1 μl RNase A bei 5 mg/ml zu dem Puffergemisch noch vor der Zugabe des Extraktes zugegeben. (Endkonzentration von RNase beträgt 125 μg/ml)
2. Inkubieren bei 30 °C für 90 min (Gesamtvolumen = 40 μl).
3. Um die Reaktion zu stoppen, werden 50 μl TE-Stopplösung (10 mM Tris pH 7,5 und 20 mM EDTA), enthaltend 100 μg/ml RNase A (Stamm = 10 mg/ml; 100 × Verdünnung). zugegeben. Endkonzentration beträgt 55 μg/ml}.
4. Inkubieren bei 37°C für 15 min (Gesamtvolumen = 90 μl).
5. Um Proteine zu beseitigen, werden 50 μl von 10 mM Tris pH 7,5, 0,5% SDS und 300 μg/ml Proteinase K zugegeben. (Endkonzentration von PK beträgt 107 μg/ml und 0,18% SDS; wird jederzeit frisch hergestellt). Für 1 ml: 10 μl 1,0 M Tris 25 μl 20% SDS 30 μl PK (10 mg/ml) 0,935 ml Depc-Wasser
6. Inkubieren bei 37°C für 15 min (Gesamtvolumen = 140 μl).
7. Extrahieren mit einem gleichen Volumen (140 μl) von PCIA (Phenol : Chloroform Isoamylalkohol (25 : 24 : 1)). Übertragen der wässerigen Phase zu einem frischen Röhrchen.
8. Ausfällen der DNA durch Zugeben von 40 μl von 2,5 M NH₄OAC (gut zum Ausfällen kleiner Oligos), enthaltend 100 μg/ml tRNA (10 mg/ml Stammlösung; 100 × Verdünnung, 30 μg Träger/Röhrchen) und 2 bis 3 Volumen (500 μl) kaltes absolutes Ethanol.
9. Setzenlassen bei –20°C für 30 min über Nacht.
10. Schleudern in einer Mikrozentrifuge für 15 min bei Raumtemperatur.
11. Verwerfen des Überstandes und Trocknen des Pellets in einem Geschwindigkeits-Vac oder Lufttrocknen über Nacht. Gegebenenfalls Spülen des Pellets mit 50 μl kaltem Ethanol.
12. Resuspendieren des Pellets in 3 μl Sequenzierungszusatzfarbstoff (99,9% Formamid, 0,05% Xylencyanol und 0,05% Bromphenolblau).
13. Eine Minute Sieden und Abkühlen auf Eis.
14. Laden der Proben auf ein 8% Acrylamid/7 M Harnstoff-Sequenzierungsgel und Laufenlassen bei 1500 V (50 W). (bis BPB etwa 2/3 bis 3/4 des Weges zurücklegte).
15. Übertragen des Gels auf Whatman-Filterpapier und Trocknen bei 80°C für 35 Minuten, und Abkühlen für 15 min vorm Entfernen des Gels aus dem Trockner.
16. Belichten des Gels auf dem Phosphorabbildungsschirm (Molekular Dynamics). Typische Belichtungen liegen zwischen 6 und 24 Stunden.

b) Assay-Lösungen humaner Telomerase 1. 10 × Telomerasepuffer
2. Stopplösung
3. Kalte dNTP's
Verwenden von beispielsweise Pharmacia (Uppsala, Schweden) 100 mM Stammlösungen. Vereinigen von 10 μl dATP und 10 μl dTTP in einem Röhrchen und Lagern bei –20°C oder –70°C.
Man sollte dasselbe Röhrchen nicht mehr als 3 × verwenden, da dNTP's bei wiederholtem Gefrieren/Auftauen instabil werden. Wenn eine Verdünnung hergestellt wird, werden 10 mM Tris.Cl pH 7,5 verwendet (man sollte kein Wasser verwenden, da der saure pH das Nukleotid zerstören wird).
4. Oligoprimer
Herstellen der Sequenz auf einem Synthesegerät oder kommerziell kaufen (beispielsweise Operon). Gelreinigen (10% Acrylamid/7M Harnstoff) des rohe Oligos und Konzentrieren unter Verwendung einer C-18-Säule. Trocknen in einem Geschwindigkeits-Vac und Resuspendieren des Pellets in 10 mM Tris.Cl pH 7,5. Eine 30%ige bis 45%ige Ausbeute wird normalerweise erhalten. Etwa die Hälfte des Oligos geht während der Gekeinigung verloren, und 5% bis 30% gehen aus der Säule verloren. Vorzugsweise Reinigen von 300 bis 600 μg und Resuspendieren des fertigen Pellets in 40 μl des Puffers. Bestimmen der Konzentration durch Ablesen der Extinktion bei 280 nm. Für einen Oligo wird angenommen, daß 1 OD = 30 μg/ml sind.
B. Telomeraseaktivitäs-Dot-Blot-Assay

1. Vereinigen der Komponenten des Assaygemischs:
2. Zugeben von 20 μl des Testextrakts, Mischen und Inkubieren bei 30°C für 90 min.
3. Zugeben von 160 μl von 0,5 M NaOH, 12,5 mM EDTA (Endkonz. = 0,4 M, 10 mM), Mischen und Absetzenlassen bei Raumtemperatur für 5 min.
4. Übertragen der Proben auf eine Silent Monitor, Biodyne^®B (0,45 μM) 96-Lochplatte, dann Plazieren der Platte auf einer Vakuumsaugapparatur, um die Probe zu filtrieren.
5. Abstellen des Vakuums und Zugeben von 200 μl 0,4 M NaOH zu den Löchern, und Anlegen des Vakuums bis der Filter vollkommen trocken ist.
6. Ablösen des Membranfilters, Spülen in 2 × SSC (um NaOH zu neutralisieren) und Plazieren in 50 ml eines vorgewärmten Vorhybridisierungsgemisches (6 × SSC, 1 × Denhardt's, 20 mM NaPhos pH 7,2, 0,4% SDS, depc H₂O) für 1 Stunden bei 65°C.
7. Herstellen der Ribosonde unter Verwendung des Stratagene RNA-Transkriptionskit (HindIII-verdaute pBLRep4-DNA-Matrize, T3 RNA-Polymerase). Um die Reaktion zu stoppen, werden 1 μl RNase-freie DNase zugegeben und bei 37°C 15 min inkubiert, PCIA-Extrakt (gleiches Vol.), Zugeben von 1/10 Vol 3M NaOAc und 2,5 Vol Ethanol, um die RNA-Sonde auszufällen. 10 Minuten Zentrifugieren und Auflösen von RNA in 100 μl TE in depc (Diethylpyrocarbonat) H₂O.
8. Hybridisieren vom Blot durch Zugabe von 50 μl der Sonde pro Filter und Inkubieren über Nacht bei 65°C.
9. Am nächsten Tag wird die Waschlösung (1 × SSC, 0,1% SDS) auf 65°C erwärmt und der Filter zu der Waschlösung übertragen. Schnelles Spülen, Übertagen des Filters zu der frischen Lösung, Verwerfen der Waschung in radioaktiven Abfall und Wiederholen. Weitere viermal Waschen für 15 Minuten bei jeweils 65°C.
10. Entfernen des Filters aus der Waschlösung und Ablassen der überschüssigen Flüssigkeit. Versiegeln in Beutel und Belichten auf dem PI-Schirm für 1 Stunde. Scannen des Schirms und Quantifizieren unter Verwendung eines Gitters.

C. RT-PCR Assay
a. RNA-Zubereitung:

1. RNA wird aus der Säulenfraktion extrahiert: 300 μl/Reaktion.
2. Herstellen von 1 ml 10% SDS, 100 mM EDTA-Lösung frisch vor der Verwendung: 200 μl Stammlösung 500 mM EDTA, 800 μl Stammlösung 10% SDS bis zu 1 ml.
3. Bei jeder Reaktion werden 30 des obigen SDS, EDTA-Puffers und 5 μl der Stammlösung Proteinase K (10 μg/ml) zu jeder Reaktion zugegeben, so daß die Endkonzentration: 1% SDS, 10 mM EDTA, 50 μg Proteinase K beträgt.
4. Inkubieren bei 37°C für 10 min.
5. Phenol : Chloroform-Extralt zweimal (man sollte vorsichtig sein, daß man nicht das weiße Interphasenmaterial verwendet).
6. Zu dem endgültigen Überstand werden 30 μl 3M Natriumacetat zugegeben, und die Nukleinsäuren werden durch Zugabe von 900 μl 100% Ethanol und Inkubation bei –70°C oder mit Trockeneis für 30 min ausgefällt.
7. Um den Niederschlag zu zentrifugieren, Mikrozentrifugieren bei voller Geschwindigkeit für 15 Minuten, Abziehen der gesamten Flüssigkeit und Verwenden von 200 μl 85%igen Ethanol, um das Pellet zu spülen, dann Verwenden des Geschwindigkeits-Vac, um das Pellet zu trocknen.
8. Resuspendieren des Pellets in 30 μl Depc-Wasser. Verwenden von 1 μl Resuspension in 100 μl Depc-Wasser und Ablesen OD_260nm Verwenden OD260 = 40 μg/ml, um die RNA-Konzentration zu berechnen.

b. Erststrang-cDNA-Synthese

1. Verwenden von 0,1 bis 1 μg RNA, die aus jeden Telomerasefraktionen hergestellt wurde, und Mischen mit 40 bis 80 ng Random-Hexamer, bis zu 10 μl. Random-Hexamer, von beispielsweise Pharmacia pd(N)6, insgesamt 50 OD-Einheiten Pulver/Ampulle. Verwenden von 90 OD-Einheit/ml = 2,97 mg/ml, wobei 1 OD-Einheit = 33 μg.
2. Denaturieren bei 95°C für 10 min, Abkühlen auf Eis und Zentrifugieren des Dampfes auf die Spitze des Eppendorf-Röhrchens.
3. Herstellen des Reaktionsgemisches:
Zugeben von 9 ml/jeder Reaktion und Inkubation bei 42°C Wasserbad.
4. Nach 1 bis 2 min Inkubation wird 1 μl Superscript II RTase (BRL) zu dem Gemisch zugegeben und für 60 min bei 42°C inkubiert.
5. Stoppen der Reaktion durch Erwärmen des Röhrchens für 10 min auf 95 bis 98°C. Abkühlen auf Eis und Zentrifugieren des Dampfes.

c. PCR-Amplifikation von cDNA mit spezifischer Primereinheit

1. PCR-Reaktionspuffer:
In 2 μl der erststrängigen cDNA werden 18 μl des obigen PCR-Reaktionspuffers zugegeben. Ein Tropfen von Mineralöl wird dann zu jedem PCR-Röhrchen zugegeben.
2. Einstellen der Bedingung der PCR-Amplifikation für hTR-Klon: 94°C für 34 s, 72°C für 45 s, 72°C für 1,5 min, 20 Durchgänge.
3. Nach PCR werden 5 μl des Produktes mit 10 × DNA-Sequenzierungszusatzfarbstoff gemischt und auf 6%igem nativem Polyacrylamidgel aufgebracht (das Gel braucht nicht vorgelaufen werden). Laufenlassen bei 250 Volt für 90 min. Trocknen des Gels und PI-Belichten.

Es wird klar sein, daß man bekannte Äquivalente in den obigen Protokollen ersetzen kann.
D. Telomerase-RNA-Nachweis durch Northern-Analyse
1. Gelparameter

20 cm langes Gel
1 mm Kamm mit 16 Vertiefungen
5% Acrylamidgel/7M Harnstoff in 1 × TBE

Laufenlassen des Gels über Nacht bei 125 V für etwa 12 h. (das BPB und XC wird das Gel ablaufenlassen). U2 wird nahe dem Boden sein, und hTR wird etwa 1/4 des Wegs in das Gel zurücklegen.
hTR läuft bei etwa 700 nt in Bezug auf DNA-Marker, wenn ein 5%iges Gel verwendet wird. Es erscheint als Duplett.
RNA-Pellets (hergestellt aus 50 bis 100 μl einer Telomerasefraktion) werden in 15 μl Sequenzierungsfarbstoff (deionisiertes Formamid mit Farbstoff) resuspendiert, für einige Minuten gekocht und schnell vorm Beschicken abgekühlt.
Anmerkung:
Wenn ein 1 mm dickes 6%iges Gel verwendet wird und über Nacht läuft, läuft hTR bei etwa 1 kb.
Wenn ein 0,4 cm dickes 5%iges Gel verwendet wird und bei 1000 V (35 bis 40 W) läuft, läuft hTR bei etwa 450 nt. hTR läuft als Einzelband unter Verwendung dieses Verfahrens, aber wenn die Fraktionen nicht gereinigt werden, schmieren die Proben und das Signal wird schlecht.
2. EtBr-Färbung
Färben des Gels für 20 bis 30 min in 0,5 μg/ml EtBr in 1 × TBE, um das snRNP-Profil zu sehen.
3. Elektroblotten
Genie-Transfer-Gerät. Die Übertragung wird auf Hybond N+ durchgeführt. Übertragung: rT° in 1 × TBE für 0,7 h unter Verwendung von 0,95 A.
4. Fixieren der RNA auf der Membran
UV-Vernetzen unter Verwendung eines Stratagen-Vernetzters; Autoeinstellung (120 mj). Vernetzen mit der RNA auf der Membranoberseite.
5. Sondieren
Verwenden von entweder PCR (R3C- und U3B-Primern), um ein radioaktives 154 nt Fragment herzustellen, oder I Hexamer markiert das 154 nt hTR-Fragment unter Verwendung von Klenow. Sondieren bei 65 °C, und die Endwaschung ist in 0,1 × SSC. Durchführen von Blotten unter Verwendung des Church-Protokolls (nachstehend).
6. Phosphorabbildungsanalyse
Belichten des Blots für 5 h auf einer Phosphorabbildungsplatte (beispielsweise Fuji). Die Belichtungszeit kann gekürzt werden, wenn konzentrierte Extrakte verwendet werden. Filmbelichtung: 2 bis 7 Tage in Abhängigkeit des Signals.
Church-Protokoll
Vorhybridisieren in 50 bis 100 ml Church-Lösung (500 mM Na₂HPO₄ pH 7,2, 1 m MEDTA, 1% BSA und 7% SDS). Vorhybridisieren einige Stunden bei 65°C.
Sondieren mit 0,1 μg ³²P-5'-endmarkiertem Oligo (vorderes rxn) (spezifische Aktivität der Sonde sollte ~10⁸ bis 10⁹ cpm/μg betragen). Sondieren über Nacht bei 65°C.
Entfernen des Blots aus dem Beutel bei Raumtemperatur und manuelles Spülen in 2 × SSC (erwärmt auf Hybridisierung T°) zweimal für 1 min pro Waschung, 500 ml pro Waschung. Das wird getan, um die heiße Markierung schnell loszuwerden, die nicht-spezifisch an der Membran haften könnte.
Waschen des Blots 5 × in 2 × SSC (rT°), 0,1% SDS, 5 Minuten pro Waschung, 500 ml pro Waschung bei rT°.
Waschen des Blots 1 × in 0,1 × bis 2 × SSC und 0,1% SDS bei Hybridisierungstemperatur (500 ml) für 30 min.
Plazieren des nassen Blots auf Filterpapier, Einwickeln mit Saran oder Beutel und Belichten zum Film über Nacht.
Anmerkungen:

1. Wenn mehr als ein Blot durchgeführt wird, beginnt das Spülen des zweiten Blots nach dem ersten Blot in der zweiten Waschung von 5 Minuten.
2. Waschungen für 1 Blot: 4 Liter; 400 ml 20 × SSC und 3600 ml ddH₂O. Entfernen von 1 Liter und Zugeben von 15 ml 20%igem SDS zu 3 Liter. (2 × SSC = 300 mM NaCl, daher etwa die Hälfte der Hybridisierungssalzkonzentration)
3. Church-Lösung (100 ml): 1 g BSA zu 50 ml 1M NaPO₄ pH 7,2, 15 ml H₂O, Lösen, dann Zugeben von 0,2 ml 0,5M EDTA und 35 ml 20%iges SDS.

II. Protokolle für Rohzellextrakt aus 293 Zellen
Diese Zubereitung bezieht sich auf ein Minimum an 10⁷-Zellen, entweder Suspension oder anhaftende Zellen. Es kann auf größere Zahlen von Zellen proportional vergrößert werden. Zubereitung von so viel wie 7,7 × 10¹⁰ Zellen ist mit ausgezeichneter Aktivität, aber leicht höheren Hintergrund durchgeführt worden. Außerdem sollte die ganze Verfahrensweise bei 4°C und auf Eis durchgeführt werden.
Wachsen der Zellen auf midlog-Phase. Ausreichend zusätzliche Zellen zum Zählen sollten bereitgestellt werden: die Berechnung der Puffermengen hängt eher von der Anzahl an Zellen als vom Volumen ab.
Entweder CHAPS oder CHAPSO-Detergenz können verwendet werden. Diese zeigen kleine Unterschiede beim Erhalten aktiver Extrakte.
A. Puffer Waschpuffer
Lyse-Puffer (0,5% CHAPS/CHAPSO)
B. Verfahrensweise

1. Für anhaftende Zellen Wachsenlassen von zwei Gruppen von 15-cm-Platten und Verwenden von einer zum Zählen. Wenn die Zellzahl einmal bestimmt worden ist, wird die andere Gruppe zweimal mit 20 ml kaltem PBS gespült. Zugeben von 1 ml PBS und Abstreifen der Zellen in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen. Fortfahren bis Schritt 3.
2. Für Suspensionskulturen Wachsenlassen auf eine Dichte, die 10⁶ Zellen/ml (etwa 6 bis 7 × 10⁵/ml werden bevorzugt) nicht übersteigt. Nach dem Herstellen der Zellzahl Pelletieren der Zellen in 50-ml-Zentrifugenröhrchen bei 200 g/4 °C/5 min. Resuspendieren in kaltem PBS äquivalent zu dem ursprünglichen Volumen.
3. Pelletieren der Zellen in einer klinischen Zentrifuge bei 200 g/4 °C/5 min. Gründliches Resuspendieren in Waschpuffer bei einer Konzentration von 10⁶ Zellen/100λ und Übertragen zu Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugieren der Zellen bei 13.000 U/min für 1 Minute.
4. Entfernen des Waschpuffers und Resuspendieren des Pellets in dem Detergenz-Lyse-Puffer bei einer Konzentration von 10⁶ Zellen/18,5 λ und Übertragen zu einem geeigneten Ultrafugenröhrchen (siehe nachstehend). Stehenlassen auf Eis für 30 min. Bedecken der Oberseite des Röhrchens mit Parafilm, wenn dies für notwendig gehalten wird.
5. Herstellen der richtigen Ausschwingultrafugenrotoren und Abkühlen der entsprechenden Ultrazentrifuge auf 4°C. Für den SW41-Rotor wird die XL-80 Ultrazentrifuge auf 28.500 U/min für 100.000 g eingestellt. Für den TLS-55-Rotor wird die Tischultrazentrifuge auf 39.000 U/min eingestellt.
6. Schleudern der lysierten Zellen für 30 Minuten.
7. Sammeln des klaren wässerigen Teils des Überstandes (dies ist das Extrakt). Aliquotieren des Extraktes in 100 λ Teile und Gefrieren auf Trockeneis. Lagern bei –80°C.

III. Vier-Schritt-Verfahren zum Reinigen von Telomerase
Ein Verfahren zum Herstellen humaner Telomerase, die 3.550fach im Vergleich zu der in Rohzellextrakten gereinigt ist, wird beschrieben. Dieses Verfahren umfaßt vier Schritte hintereinander: 1) CHAPS-Detergens-S-100-Extraktzubereitung aus 293 Zellen; 2) Chromatographie des 5-100-Extrakts auf POROS^®50HQ-Matrix; 3) Chromatographie der aktiven POROS^®50HQ-Fraktionen auf POROS^®20-Heparin-HE-1-Matrix; und 4) Chromatographie der aktiven POROS^®20-Heparin-HE-1-Fraktionen auf Oligo 5-Affinitätsmatrix. Protokolle für jeden Schritt werden bereitgestellt.
In dem ersten Schritt wurden 7,3 × 10¹⁰ 293 Zellen aus 128 Litern Suspensionskultur und CHAPS gesammelt und extrahiert wie in Beispiel II, um 883 ml des CHAPS-S-100-Extrakts zu ergeben.
In dem zweiten Schritt wurde dieses Extrakt der Chromatographie auf einer POROS^®50HQ-Säule unterzogen, und Fraktionen, die Telomeraseaktivität enthielten, wurden für einen aktiven Gesamtpool von 72 ml vereinigt. Dieser Schritt wurde wie folgt durchgeführt:
POROS^®50HQ-Harz (PerSeptive Biosystems, Cambridge, MA, Katalognummer 1-2559-05) wurde in einem gleichen Volumen an Puffer A (20 mM Hepes pH 7,9, 2 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, 10% Glycerin, 0,1% Nonidet P-40, 1 mM Dithiothreitol, 0,2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 1 mM Benzamidin, 1 mM Natriummetabisulfit), der mit 100 mM NaCl (Puffer A/100 mM NaCl) äquilibriert wurde, resuspendiert und die Aufschlämmung wurde durch Gravitation in eine XK 26/20-Chromatographiesäule (Pharmacia, Uppsala, Schweden, Katalognummer 18-1000-72) gepackt.
Die Säule wurde auf einem GradiFrac^®System (Pharmacia, Uppsala, Schweden, Katalognummer 13-2192-01) betrieben. Die Säule wurde mit 3 Säulevolumen von Puffer A/100 mM NaCl äquilibriert, gefolgt von einer Hochsalzwaschung mit 3 Säulenvolumen von Puffer A/2000 mM NaCl. Schließlich wurde die Säule mit 3 Säulenvolumen von Puffer A/100 mM NaCl wieder äquilibriert. Die Bindungskapazität der Säule wurde durch Beschicken zunehmender Mengen an CHAPS-Extrakt bestimmt, bis Telomeraseaktivität in den Durchflußfraktionen nachgewiesen wurde. Es wurde festgestellt, daß die Kapazität von POROS^®50 HQ in dem Bereich von 20 Milligramm CHAPS-Extrakt pro Milliliter Harz liegt.
1,6 Gramm CHAPS-Extrakt wurden auf eine 80 ml POROS^®50HQ-Säule bei einer Fließgeschwindigkeit von 20 ml/min aufgebracht. Die Säule wurde dann mit 3 Volumen Puffer A/100 mM NaCl gewaschen. Eine erste Elution wurde durch Waschen der Säule mit einem 3 Säulenvolumen eines mittleren Salzschrittes (Puffer A/480 mM NaCl) durchgeführt. Telomeraseaktivität wurde durch einen Hochsalzschritt (Puffer A/1050 mM NaCl) wiedergewonnen. Fraktionen aus der Hochsalzelution wurden separat gegen Puffer A über Nacht dialysiert. Fraktionen wurden hinsichtlich der Telomeraseaktivität durch Primerverlängerungsassay gescannt. Aktive Fraktionen wurden zusammengefaßt. Dies wurde mehrere Male wiederholt, um die vollständigen 6,8 Gramm CHAPS-S-100-Extrakt zu verarbeiten.
Um die relative spezifische Aktivität von Telomerase für das CHAPS-S-100-Extrakt und den aktiven POROS^®50HQ-Pool zu bestimmen, wurden die Proteinkonzentrationen für jeden bestimmt (Coomassie Protein Assay Reagent, Pierce Product #23200, Rockford, IL) und die Zubereitungen wurden hinsichtlich der relativen Telomeraseaktivität durch den Primerverlängerungsassay, der in Beispiel I beschrieben wird, verglichen. (5.) Das getrocknete Gel wurde auf einem Phosphorabbildungsschirm für 4 bis 16 h belichtet. Der Schirm wurde gescannt und die Graustufen eingestellt, um eine Abbildung herzustellen, die in Bezug auf die entsprechende Assaytitration linear erscheint. Dies lag normalerweise zwischen 5 und 25 am unteren Ende und 1000 und 2000 am oberen Ende.
Telomeraseaktivität wurde in beliebigen Einheiten gemessen und wurde aus einer optischen Einschätzung des Signals, das aus einer Titration von Fraktionen über einen 10 bis 20fachen Bereich in 2fachen Erhöhungen resultiert, abgeleitet. Relative Vergleiche von Aktivität zwischen Fraktionen wurden aus dem linearen Bereich jeder Titration bestimmt.
Bahnen 1 bis 5 von 5 zeigen Primerverlängerungsprodukte aus Telomeraseaktivität in 1,25 μl bis 20 μl des CHAPS-S-100-Extrakts; Bahnen 6 bis 10 zeigen dasselbe aus einer Titration des aktiven POROS^®50 HQ-Pools. Die Menge an Telomeraseprodukte erhöht sich entsprechend der Menge der Zubereitung, die in den Bahnen 3 bis 5 und in Bahnen 6 bis 10 analysiert werden, was einen linearen Bereich zum Vergleich zwischen den zwei Zubereitungen bereitstellt. Aus dem linearen Bereich für jede Zubereitung wurde bestimmt, daß 20 μl des CHAPS-S-100-Extrakts (Bahn 5) dieselbe Menge an Telomeraseprimerverlängerungsprodukten wie 2,5 μl des aktiven POROS^®50HQ-Pools (Bahn 7) erzeugen. Daher enthalten die Volumen jeweils eine beliebige Einheit an Telomeraseaktivität. Diese beliebige Einheit ist nur für diesen speziellen Vergleich relevant.
Unter Verwendung der Messungen von Volumen, Proteinkonzentration und Volumen pro Telomeraseaktivitätseinheit stellen einfache Berechnungen die Gesamteinheiten und Gesamtproteinmenge bereit, aus denen die relative spezifische Aktivität von Telomerase für die zwei Zubereitungen (Tabelle 4) abgeleitet wurde. Die spezifische Aktivität des aktiven POROS^®50 HQ-Pools (0,037 Einheiten/μg) ist 5,8fach größer als das des CHAPS-S-100-Extrakts (0,0065 Einheiten/μg). Deshalb weist die humane Telomerase in dem aktiven POROS^®50 HQ-Pool eine 5,8fach erhöhte relative Reinheit im Vergleich zu der in dem CHAPS-S-100-Extrakt auf. Die Gesamteinheiten von Telomeraseaktivität in dem aktiven POROS^®HQ-Pool (28.800 Einheiten) stellen 65% von dem in dem CHAPS-S-100-Extrakt (44.150 Einheiten) dar. Deshalb weist die POROS^®HQ-Chromatographie eine Ausbeute von 65% Telomeraseaktivität auf.
In dem dritten Schritt wurden 24 ml eines aktiven POROS^®50 HQ-Pools der Chromatographie auf einer POROS^® Heparin 20 HE-1-Säule unterzogen, und Fraktionen, die Telomeraseaktivität enthielten, wurden für einen aktiven Gesamtpool von 6 ml vereinigt. Die Chromatographie wurde wie folgt durchgeführt.
POROS^®20 HE- wurde von PerSeptive (Cambridge, MA, Katalognummer 1-5229-06) erhalten. Handhabung des Harzes, Packen und Äquilibierung der Säule wurden in exakt derselben Weise, wie für das vorherige Harz beschrieben, durchgeführt, außer daß eine XK 16/20 Chromatographie säule (Pharmacia, Uppsala, Schweden, Katalognummer 18-8773-01) verwendet wurde. Es wurde bestimmt, daß die Bindungskapazität in dem Bereich von 15 mg/ml Harz liegt.
146,4 Milligramm gesammeltes POROS^®50 HQ-Material wurden auf eine 25 ml POROS^® Heparin HE-1-Säule bei einer Fließgeschwindigkeit von 15 ml/min aufgebracht. Die Säule wurde dann mit 3 Volumen Puffer A/100 mM NaCl gewaschen. Eine erste Elution wurde durch Waschen de r Säule mit einem 3 Säulenvolumen eines mittleren Salzschritts (Puffer A/347 mM NaCl) durchgeführt. Die Telomeraseaktivität wurde durch einen Hochsalzschritt (Puffer A/1430 mM NaCl) wiedergewonnen. Fraktionen aus der Hochsalzelution wurden separat gegen Puffer A über Nacht dialysiert. Fraktionen wurden hinsichtlich der Telomeraseaktivität durch Primerverlängerungsassay gescannt. Aktive Fraktionen wurden zusammengefaßt.
Die relative spezifische Aktivität von Telomerase für den aktiven POROS^®50 HQ-Pool und den aktiven POROS^® Heparin 20 HE-1-Pool wurde, wie oben für die vorhergehenden Schritte beschriebe n, exakt bestimmt. Titrationen der zwei Zubereitungen in dem Primerverlängerungsassay werden in 6 gezeigt; gemessene und berechnete Werte werden in Tabelle 4 gezeigt. Diese Daten zeigen, daß die humane Telomerase in dem aktiven POROS^® Heparin 20 HE-1-Pool im Vergleich zu der in dem aktiven POROS^®50 HQ-Pool 6,8fach gereinigt wird. Die kumulative Reinigung nach diesem dritten Schritt ist das Produkt aller vorhergehenden Schritte. Daher weist die humane Telomerase in dem aktiven POROS^® Heparin 20 HE-1-Pool 6,8 × 5,8 = 39,4fach erhöhte relative Reinheit im Vergleich zu der in dem CHAPS-S-100-Extrakt auf. Die Ausbeute der POROS^® Heparin 20 HE-1-Chromatographie beträgt hinsichtlich der Telomeraseaktivität 75% und die kumulative Ausbeute nach diesem dritten Schritt beträgt 49%.
In dem vierten Schritt wurden 0,14 ml eines aktiven POROS^® Heparin 20 HE-1-Pools der Chromatographie auf einer Affinitätsmatrix unter Verwendung von Oligo 5 als Affinitätsligand unterzogen. Fraktionen aus der Affinitätssäule, die Telomeraseaktivität enthielten, wur den für einen aktiven Gesamtpool von 0,4 ml vereinigt. Affinitätschromatographie wurde wie folgt durchgeführt.
UltraLink^TM immobilisierte NeutrAvidin-Kügelchen (Pierce, Rockford, IL, Katalognummer 53151) wurden mit einem gleichen Volumen an Puffer A/100 mM NaCl, das mit 1 mg/ml BSA, 0,2 mg/ml tRNA und 0,2 mg/ml Lachstestikel-DNA ergänzt wurde, 1 Stunde bei 4°C vorbehandelt. Die Kügelchen wurden dann mit 5 Volumen Puffer A/100 mM NaCl gespült.
Oligo 5, ein Antisense-DNA-Oligonukleotid (National Biosciences, Inc., Plymouth, MN), das Nukleotide 407–436 der humanen Telomerase-RNA abdeckt, wurde mit der Sequenz 5' – *gccgagtcct gggtgcacgt cccatagctc – 3' konstruiert (wo *G biotinyliert ist) (SEQ. ID Nr: 4). Oligo 5 wurde bei einer Konzentration von 100 μM zur Verwendung in nachfolgenden Experimenten resuspendiert.
140 μl zusammengefaßtes Heparinmaterial bei einer Proteinkonzentration von 9 mg/ml wurden mit 1,6 mM Oligo 5, 2 mM dTTP, 0,1 mM ddATP, 2 mM dGTP, 50 mM Tris HCl pH 7,5, 1 mM Spermidin, 5 mM β-Mercaptoethanol, 1 mM MgCl₂, 50 mM Kaliumacetat, 1 mM EGTA ergänzt und bei 30°C 1 Stunde inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde zu 400 μl der vorbehandelten NeutrAvidin-Kügelchen zugegeben und bei 4°C 1 bis 4 Stunde(n) gemischt.
Die Aufschlämmung wurde dann in eine kleine Wegwerfsäule gegossen und der Durchfluß wurde abgelassen. Der Durchfluß wurde bis zu dreimal durch die Säule zurückgebracht. Die Säule wurde dann mit mindestens 4 Säulenvolumen Puffer A/100 mM NaCl gewaschen und mit Puffer A/500 mM NaCl eluiert. Fraktionen wurden hinsichtlich der Telomeraseaktivität durch Primerverlängerungsassay getestet.
Die relative spezifische Aktivität von Telomerase für diese zwei Zubereitungen wurde exakt, wie oben für die vorhergehenden Schritte beschrieben, mit einer Ausnahme bestimmt. Telomerase wird aus den POROS^® 50 HQ-, den POROS^® Heparin HE-1- und den Oligo5-Affinitätssäulen in den Reinigungsschritten 2, 3 und 4 durch Erhöhen der Salzkonzentration in dem Waschpuffer freigesetzt. Da Salzkonzentrationen über 100 mM die Telomeraseaktivität inhibieren (7, vergleiche Bahnen 7 und 9), wurden die aktiven Pools aus den Reinigungsschritten 2 und 3 dialysiert, um die Salzkonzentration auf die der Zubereitung, die auf die Säule für diese Schritte aufgebracht wurde, zu verringern. In Reinigungsschritt 4 (Oligo 5 Affinität) wurde der Pool von aktiven Fraktionen nicht entsalzt. Um eine genaue relative Aktivität zu bestimmen, wurde die Salzkonzentration der Zubereitung, die auf der Affinitätssäule (aktiver POROS^® Heparin 20 HE-1-Pool) aufgebracht wurde, so eingestellt, daß sie dieselbe wie der aktive Oligo 5 Affinitäts-Pool aufwies.
Titrationen der zwei Zubereitungen in dem Primerverlängerungsassay werden in 7 gezeigt; gemessene und berechnete Werte werden in Tabelle 4 gezeigt. Diese Daten zeigen, daß die humane Telomerase in dem aktiven Oligo 5-Pool im Vergleich zu der in dem aktiven POROS^® Heparin 20 HE-1-Pool 90fach gereinigt wird. Die kumulative Reinigung nach diesem vierten Schritt beträgt 90 × 6,8 × 5,8 = 3.550. Daher weist die humane Telomerase, die durch dieses Verfahren hergestellt wird, 3.550fach erhöhte relative Reinheit im Vergleich zu der in dem CHAPS-S-100-Extrakt auf. Die Ausbeute des Affinitätschromatographieschrittes beträgt hinsichtlich der Telomeraseaktivität 29%; die kumulative Ausbeute der Telomeraseaktivität beträgt für dieses Verfahren 14%.
IV. Fünf-Schritt-Verfahren zur Reinigung von Telomerase
Ein Verfahren zum Herstellen von humaner Telomerase, die 32.660fach erhöhte relative Reinheit im Vergleich zu der in Rohzellextrakten aufweist, wird beschrieben. Dieses Verfahren umfaßt fünf Schritte hintereinander: 1) CHAPS-Detergens-S-100-Extraktzubereitung aus 293 Zellen; 2) Chromatographie des 5-100-Extrakts auf POROS^® 50 HQ-Matrix; 3) Chromatographie auf aktiven POROS^®50 HQ-Fraktionen auf POROS^® Heparin 20 HE-1-Matrix; 4) Chromatographie der aktiven POROS^® Heparin 20 HE-1-Fraktionen auf POROS^®-Spernüdinmatrix; und 5) Chromatographie der aktiven POROS^®-Spermidin-Fraktionen auf Oligonukleotid-5-Affinitätsmatrix. Protokolle werden zur Zubereitung der Spermidinmatrix und Betreiben der Spermidinsäule bereitgestellt. Protokolle für alle anderen Schritte wurden in dem Vier-Schritt-Verfahren von Beispiel III bereitgestellt.
In dem Fünf-Schritt-Verfahren sind die ersten drei Schritte dieselben wie in dem Vier-Schritt-Verfahren. In dem vierten Schritt wurden 0,7 ml eines aktiven POROS^® Heparin 20 HE-1-Pools der Chromatographie auf einer frisch hergestellten (d. h. nicht kommerziell erhältlichen) POROS^®-Spermidinsäule unterzogen, und Fraktionen, die Telomeraseaktivität enthiel ten, wurden für einen aktiven Gesamtpool von 0,15 ml vereinigt. Die Chromatographie wurde wie folgt durchgeführt.
POROS^®-Spermidin wurde in der folgenden Weise hergestellt. Getrocknetes POROS^® 20 EP (Perseptive 1-6129-03) wurde in einen Verknüpfungspuffer (0,1 M Natriumphosphat, eingestellt auf pH 10,0 mit KOH) eingebracht, um den Kügelchen zu ermöglichen, zu hydratisieren. Die hydratisierten Kügelchen wurden zu einer Wegwerfsäule übertragen und mit dem Verknüpfungspuffer für 20 Bettvolumen gespült. Zwei Bettvolumen eines 0,2M Spermidintetrahydrochlorids (Sigma)-0,1 M Natriumphosphat wurden zugegeben. Die Lösung von Spermidin-Verknüpfungspuffer wurde erneut auf einen pH von 10 eingestellt. (20 ml von 0,1M Natriumphosphat-0,22M Spermidin + 1,5 ml von 1N NaOH = 0,2M Spermidin-0,1M Natriumphosphat pH 10,0). Die Kügelchen wurden mit der Spermidinlösung über Nacht bei Raumtemperatur rotiert. Die Spermidinlösung wurde mit 20 Bettvolumen des Verknüpfungspuffers abgewaschen. Die verbleibenden reaktiven Gruppen der POROS^® 20 EP-Kügelchen wurden mit 2 Bettvolumen von 0,1M Ethanolamin, die in dem Verknüpfungspuffer hergestellt werden, gequencht. Das Gemisch wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur rotiert. Das Gemisch wurde mit 20 Bettvolumen des Verknüpfungspuffers gewaschen. Das Gemisch wurde mit 10 Bettvolumen von Puffer A/100 mM NaCl gewaschen und in Säulen zur Chromatographie gepackt.
Die POROS^®-Spermidinsäule wurde bei 4°C mit 10 Säulenvolumen (CV) von Puffer A/100 mM NaCl vorm Auftragen der Probe äquilibriert. Der aktive Proben-POROS^® Heparin 20 HE-1-Pool wurde in Puffer A auf oder unter 100 mM NaCl dialysiert, wird auf die Säule aufgetragen und bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,6 CV pro Minute chromatographiert. Die Säule wurde dann bei derselben Fließgeschwindigkeit mit 5 CV von Puffer A/100 mM NaCl gewaschen. Die Proteine wurden bei derselben Fließgeschwindigkeit mit den folgenden Schritten eluiert:
–3 CV Puffer A 100 mM KCl-90 mM NaCl
–3 CV Puffer A 150 mM KCl-85 mM NaCl
–3 CV Puffer A 200 mM KCl-80 mM NaCl
–3 CV Puffer A 1000 mM KCl
Proteine wurden bei jedem Schritt eluiert, wobei die Telomerase im wesentlichen aus der POROS^®-Spermidinsäule mit Puffer A/150 mM KCl-85 mM NaCl eluiert wurde. Die relative spezifische Aktivität von Telomerase für diese zwei Zubereitungen wurde bestimmt. Titrationen der zwei Zubereitungen in dem Primerverlängerungsassay werden in 8 gezeigt; gemessene und berechnete Werte werden in Tabelle 5 gezeigt. Diese Daten zeigen, daß die humane Telomerase in dem aktiven POROS^® Spermidin-Pool im Vergleich zu der in dem aktiven POROS^® Heparin 20 HE-1-Pool 9,2fach gereinigt wurde. Die kumulative Reinigung nach diesem vierten Schritt beträgt 9,2 × 6,8 × 5,8 = 363fach gereinigt im Vergleich zu dem CHAPS-S-100-Extrakt. Die Ausbeute der POROS^®-Spermidinchromatographie beträgt hinsichtlich der Telomeraseaktivität 30%, und die kumulative Ausbeute nach diesem vierten Schritt beträgt 14,6%.
Oligo-5-Affinitätschromatographie von aktiven POROS^®-Spermidin-Fraktionen reinigt humane Telomerase um einen Faktor von 90 mit 29% Ausbeute (wie es mit aktiven POROS^® Heparin 20 HE-1-Fraktionen gemacht wird). Daher stellt dieses Fünf-Schritt-Verfahren humane Telomerase her, die 90 × 363 = 32.660fach erhöhte relative Reinheit im Vergleich zu der in CHAPS-S-100-Extrakten aufweist. Die Ausbeute dieses Fünf-Schritt-Verfahrens beträgt 4,2%.
V. Sechs-Schritt-Verfahren zur Reinigung von Telomerase
Ein Verfahren zum Herstellen humaner Telomerase, die im Vergleich zu der in Rohzellextrakten 65.320fach gereinigt ist, wird beschrieben. Dieses Verfahren umfaßt sechs Schritte hintereinander: 1) CHAPS-Detergens-S-100-Extraktzubereitung aus 293 Zellen; 2) Chromatographie des S-100-Extrakts auf POROS^® 50 HQ-Matrix; 3) Chromatographie der aktiven POROS^®50 HQ-Fraktionen auf POROS^® Heparin 20 HE-1-Matrix; 4) Chromatographie der aktiven POROS^® Heparin 20 HE-1-Fraktionen auf POROS^®-Spermidinmatrix; 5) Chromatographie der aktiven POROS^®-Spermidin-Fraktionen auf Superose^®6-Größentrennsäule; und 6) Chromatographie der aktiven Superose^®6-Größentrennsäulen-Fraktionen auf Oligo-5-Affinitätsmatrix. Ein Protokoll zum Betreiben der Superose^®6-Säule wird bereitgestellt. Protokolle für alle anderen Schritte wurden zuvor bereitgestellt.
In dem Sechs-Schritt-Verfahren sind die ersten vier Schritte dieselben wie in dem Fünf-Schritt-Verfahren. In dem fünften Schritt werden 0,02 ml des Materials aus dem aktiven POROS^®-Spermidin-Pool, das in Beispiel IV gesammelt wurde, der Chromatographie auf einer Superose^®6-Größentrennsäule unterzogen, und die Fraktionen, die Telomeraseaktivität enthielten, wurden für einen aktiven Gesamtpool von 0,16 ml vereinigt. Superose^®6-Chromatographie wurde wie folgt durchgeführt.
Die 2,4 ml Superose^®6, PC 3,2/30-Säule von Pharmacia wird mit 2 CV Puffer A/150 mM NaCl bei einer Fließgeschwindigkeit von 40 μl/min äquilibriert. Für jeden Superose^®6-Lauf werden 20 μl der aktiven POROS^®-Spermidinfraktion auf die Säule aufgebracht, die bei einer Fließgeschwindigkeit von 20 μl/min in Puffer A/150 mM NaCl lief. Die Menge an OD₂₈₀-absorbierendem Protein eluiert aus der Säule zwischen 1,00 ml und 1,4 ml. Der Peak der Telomeraseaktivität wird zwischen 1,4 und 1,6 ml an dem hinteren Ende des Peaks von Proteinen eluiert.
Die relative spezifische Aktivität von Telomerase für diese zwei Zubereitungen wurde bestimmt. Titrationen der zwei Zubereitungen in dem Primerverlängerungsassay werden in 8 gezeigt; gemessene und berechnete Werte werden in Tabelle 5 gezeigt. Diese Daten zeigen, daß die humane Telomerase in dem aktiven Superose^®6-Pool im Vergleich zu der in dem aktiven POROS^®-Spermidin-Pool 2fach erhöht gereinigt wird. Die kumulative Reinigung nach diesem fünften Schritt beträgt 2 × 9,2 × 6,8 × 5,8 = 725,7fach relative Reinheit im Vergleich zu dem CHAPS-S-100-Extrakt. Die Ausbeute der Superose^®6-Chromatographie beträgt hinsichtlich der Telomeraseaktivität 20%, und die kumulative Ausbeute nach diesen fünf Schritten beträgt 2,9%.
Die Oligo-5-Affinitätschromatographie von aktiven Superose^®6-Fraktionen kann humane Telomerase im selben Maße wie für aktive POROS^® Heparin 20 HE-1-Fraktionen reinigen. Daher würde dieses Sechs-Schritt-Verfahren humane Telomerase herstellen, die im Vergleich zu der in CHAPS-S-100-Extrakten 90 × 725,7 = 65.320fach gereinigt wird. Die Ausbeute dieses Sechs-Schritt-Verfahrens beträgt 0,85%.
VI. Zweites Sechs-Schritt-Verfahren zur Reinigung von Telomerase
Ein Verfahren zum Herstellen humaner Telomerase, die im Vergleich zu der in Rohzellextrakten über 60.000fach gereinigt wird, wurde durchgeführt. Dieses Verfahren umfaßt sechs Schritte hintereinander: 1) Dounce-Homogenisierung und Nuklearextraktzubereitung aus 293 Zellen; 2) Chromatographie des nuklearen Extrakts auf POROS^® 50 HQ-Matrix; 3) Chromatographie der aktiven POROS^® 50 HQ-Fraktionen auf POROS^® Heparin 20 HE-1-Matrix; 4) Chromatographie der aktiven POROS^® Heparin 20 HE-1-Fraktionen auf SOURCE 15Q^®-Matrix; 5) Chromatographie der aktiven SOURCE 15Q^®-Matrix-Fraktionen auf Oligo 14ab-Affinitätsmatrix; und 6) Chromatographie der aktiven 14ab-Affinitätsmatrix-Fraktionen auf einer TSK-Gel*G5000PW_XL-Größentrennsäule. Protokolle für alle Schritte werden bereitgestellt.
A. Zubereitung von nuklearem Extrakt
1. Zellen
293 Zellen sind eine Adenovirus-transformierte humane Urnierenzellinie. Diese Zellen wachsen ohne weiteres in Suspensionskulturen mit einer optimalen Erntedichte von 0,5 × 10⁹ Zelle pro Liter und einer Verdopplungszeit von 24 Stunden. Zellen wurden von Cellex in Form von nassen Zellpellets auf Trockeneis erhalten. 293 Suspensionskulturen wuchsen in Schleuderkolben und lagen in Vorräten von 2 × 10¹¹ Zellen (aus 400 Litern Kultur) vor. Die 293 Zellen werden geerntet, zweimal in PBS (Ca/Mg-frei) gewaschen, schnell als nasses Zellpellet eingefroren und auf Trockeneis versandt. (Gefrorene Zellen können bei –80°C gelagert werden.)
2. Rohextrakte

a. Zellpellets werden schnell aufgetaut, verpacktes Zellvolumen wird gemessen, dann werden die Zellen in einem gleichen Volumen auf eiskaltem Puffer H suspendiert. Zellen werden auf Eis gehalten und unter Verwendung eines Dounce-Homogenisators, der mit Stößel B und 10 Auf- und Abschlägen ausgestattet war, aufgespalten.
b. Zytoplasma und Kerne werden durch langsames Schleudern getrennt: das Homogenisierungsprodukt wird 10 min, 4°C bei 2500 U/min in einem Beckmann JS4.2 Rotor (1780 Xg) zentrifugiert. Der Überstand wird in saubere Flaschen dekantiert, und das Pellet wird zur nuklearen Extaktzubereitung auf Eis gehalten (siehe nachstehend, Schritt j). Alternativer Schritt b. Wenn die Zeit keine nukleare Extraktzubereitung ermöglicht, kann das nukleare Pellet gelagert werden, aber zunächst muß der Puffer mit Glycerin ergänzt werden. Messen des Volumens des Homogenisierungsproduktes von Schritt a (wird der y-Variable in der nachstehenden Gleichung zugewiesen). Zugeben von 80% eiskaltem Glycerin zu dem Homogenisierungsprodukt, um eine Endkonzentration von 10% zu erhalten. Gut Mischen. Das Volumen von 80% Glycerin, das zuzugeben ist, x, kann durch die Gleichung; x = 0,1y/0,7 bestimmt werden. Genaues Zentrifugieren wie in Schritt b. Schnelles Einfrieren der nuklearen Pellets und Lagern bei –80°C. Die Zugabe von Glycerin verändert keinen der folgenden Extraktionsschritte.
c. Messen des Volumens des Überstandes (wird der y-Variable in der nachstehenden Gleichung zugewiesen). Zugeben von 5M eiskaltem NaCl zu dem Überstand, um eine Endkonzentration von 150 mM zu erhalten. Gut Mischen. Das Volumen von 5M NaCl, das zuzugeben ist, x, kann durch die Gleichung: x = 0,15y/4,85 bestimmt werden.
d. Zentrifugieren des Überstandes für 1 Stunde, 4°C bei 40.000 U/min in einem Beckmann 45Ti Rotor (100K Xg). Vorsichtiges Dekantieren des Überstandes in einen sauberen Behälter.
e. Messen des Volumens des Überstandes. Für jeden Liter des Überstandes allmähliches Zugeben von 259,5 g festem Ammoniumsulfat (45% Endkonzentration). Vorsichtiges Mischen in dem kalten Raum für etwa 30 min.
f. Sammeln des Niederschlags durch Zentrifugieren des Gemisches für 30 Minuten, 4°C bei 10.000 U/min in einem Sorvall-GSA-Rotor. Dekantieren des Überstandes und sehr gutes Abtropfenlassen der Pellets.
g. Resuspendieren der Pellets in Puffer A, der 50 mM NaCl enthielt. Verwenden von 1/5 des Volumens, das in Schritt e gemessen wurde (vor der Zugabe von Ammoniumsulfat) und Resuspendieren der Pellets unter Verwendung eines Dounce-Homogenisators, der mit Stößel A ausgestattet war.
h. Dialysieren in Puffer A, der 50 mM NaCl enthielt, über Nacht mit einem Austausch des Puffers.
i. Sammeln des Dialysats und Zentrifugieren für 30 min, 4°C bei 15.000 U/min in einem Sorvall-SS-34-Rotor. Filtrieren des Überstandes durch Mira-Gewebe. Dies ist das „rohe Zytoplasmaextrakt". Es kann schnell eingefroren und bei –80°C gelagert werden, oder direkt auf die TosoHaas-Super-Q-Säule aufgebracht werden. Das rohe Zytoplasmaextrakt beträgt typischerweise etwa 230 ml bei 25 mg/ml Protein und 10 μl sind hinsichtlich der Telomeraseaktivität in dem konventionellen Primerverlängerungsassay ausreichend.
j. Aus Schritt b das Messen des Volumens von nuklearem Pellet. Resuspendieren der Kerne in 0,5 Volumen Puffer C.
k. Langsames Zugeben eines anderen 0,5 gepackten nuklearen Volumens von Puffer C, der 1,2M NaCl enthielt, während des Verwirbelns.
l. Dounce-Homogenisieren (5 bis 10 Schläge) mit Stößel A.
m. Übertragen in ein Becherglas auf Eis und Rühren für mindestens 30 min.
n. Zentrifugieren für 75 min, 4°C bei 18.000 U/min in einem Sorvall-SS-34-Rotor.
o. Übertragen des Überstandes zu Dialysebeuteln und Dialysieren über Nacht oder 2 × 2 Stunden gegen Hypopuffer, der 100 mM NaCl enthielt.
p. Sammeln des Dialysats und Zentrifugieren für 30 min, 4°C bei 15.000 U/min in einem Sorvall-SS-34-Rotor. Der geklärte Überstand ist das „rohe nukleare Extrakt". Schnelles Einfrieren und Lagern bei –80°C. Das rohe nukleare Extrakt beträgt typischerweise etwa 650 ml bei 7 mg/ml Protein und 10 μl sind hinsichtlich der Telomeraseaktivität in dem konventionellen Assay ausreichend.

B. Erste Anionenaustauschchromatographie

1. Das nukleare Extraktmaterial wird der folgenden Ionenaustauschchromatographie unterzogen. Ein Poros 50 HQ-Harz von PerSeptive Biosystems wird in einem gleichen Volumen des Hypopuffers, der 100 mM NaCl enthielt, resuspendiert, und die Aufschlämmung wird durch Gravitation in eine XK 50/30-Chromatographiesäule (Pharmacia) gepackt.
2. Die Säule läuft auf einem GradiFrac-System (Pharmacia) nachdem sie mit 3 Säulenvolumen des Hypopuffers, der 100 mM NaCl enthielt, äquilibriert wurde, gefolgt durch eine Hochsalzwaschung mit 3 Säulenvolumen des Hypopuffers, der 2000 mM NaCl enthielt. Die Säule wird dann mit 3 Säulenvolumen des Hypopuffers, der 100 mM NaCl enthielt, wieder äquilibriert. Die Kapazität des Harzes für Telomerase liegt in dem Bereich von 20 mg nuklearem Extrakt pro Milliliter Harz.
3. In einer typischen Zubereitung, beginnend mit 2 × 10¹¹ Zellen (600 Gramm Zellen) werden 650 bis 700 ml rohes nukleares Extrakt oder ungefähr 4,7 Gramm an Proteinen auf eine 300-ml-Säule bei einer Fließgeschwindigkeit von 20 ml/min aufgebracht. Die Säule wird dann mit 3 Säulenvolumen des Hypopuffers, der 100 mM NaCl enthielt, gewaschen. Ein mittlerer Sazlwaschschritt wird mit 3 Säulenvolumen des Hypopuffers, der 404 mM NaCl enthielt, durchgeführt. Die Telomeraseaktivität wird durch Hochsalzelution mit Hypopuffer, der 1050 mM NaCl enthielt, wiedergewonnen. Fraktionen aus der Hochsalzelution werden separat gegen Hypopuffer, der 50 mM NaCl enthielt, über Nacht dialysiert und hinsichtlich der Telomeraseaktivität durch konventionellen Assay, bevor sie zusammengefaßt und dem nächsten Reinigungsschritt unterzogen werden, gescannt.

C. Heparinchromatographie

1. 100 bis 120 ml der vereinigten aktiven Fraktionen aus dem vorhergehenden Schritt oder ungefähr 660 Milliliter Proteine werden auf eine 60 ml Poros Heparin 20 HE-1-Säule von PerSeptive Biosystems bei einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min aufgebracht. Die Handhabung des Harzes, das Packen und Äquilibrieren der Säule wird in derselben Weise durchgeführt, wie es für das vorhergehende Harz beschrieben wird, außer daß eine XK 26/20 Chromatographiesäule (Pharmacia) verwendet wird, und daß die Bindungskapazität für diese Säule in dem Bereich von 15 mg/ml Harz liegt. Die Säule wird dann mit 3 Säulenvolumen des Hypopuffers, der 100 mM NaCl enthielt, gewaschen. Ein mittlerer Salzwaschschritt wird mit 3 Säulenvolumen des Hypopuffers, der 290 mM NaCl enthielt, durchgeführt. Die Telomeraseaktivität wird durch Hochsalzelution mit Hypopuffer, der 1430 mM NaCl enthielt, wiedergewonnen. Fraktionen aus der Hochsalzelution werden separat gegen Hypopuffer, der 250 mM NaCl enthielt, über Nacht dialysiert und hinsichtlich der Telomeraseaktivität durch konventionellen Assay, bevor sie zusammengefaßt und dem nächsten Reinigungsschritt unterzogen werden, gescannt.

D. Zweite Anionenaustauschchromatographie

1. 20 bis 40 ml der vereinigten aktiven Fraktionen aus dem vorhergehenden Schritt oder ungefähr 240 Milliliter Proteine werden 1 : 1 mit Hypopuffer verdünnt, bevor sie auf einer 16 ml Source 15Q-Säule von Pharmacia aufgebracht werden. Die Säule läuft normalerweise bei einer maximalen Bindungskapazität bei einer Fließgeschwindigkeit von 5 ml/min auf einem FPLC (Pharmacia). In Abhängigkeit der Zahl an Fraktionen, die aus dem vorhergehenden Schritt zusammengefaßt werden, sind zwei aufeinanderfolgende Läufe erforderlich. Die Handhabung des Harzes, das Packen und Äquilibrieren der Säule wird in derselben Weise durchgeführt, wie es für das vorhergehende Harz beschrieben wurde, außer daß eine HR 16/10 Chromatographiesäule (Pharmacia) verwendet wird, und daß die Bindungskapazität für diese Säule in dem Bereich von 10 mg/ml Harz liegt. Die Säule wird dann mit 3 Säulenvolumen des Hypopuffers, der 100 mM NaCl enthielt, gewaschen. Ein mittlerer Salzwaschschritt wird mit 3 Säulenvolumen des Hypopuffers, der 307 mM NaCl enthielt, durchgeführt. Die Telomeraseaktivität wird durch Hochsalzelution mit Hypopuffer, der 1000 mM NaCl enthielt, wiedergewonnen. Fraktionen aus der Hochsalzelution werden hinsichtlich der Telomeraseaktivität durch konventionellen Assay, bevor sie zusammengefaßt und der Affinitätschromatographie unterzogen werden, gescannt.

Beginnend mit dem nuklearen Extrakt aus 2 × 10¹¹ Zellen, ergibt dieses Teilreinigungsschema 10 ml bei 10 mg/ml Protein, und 2 μl sind hinsichtlich der Telomeraseaktivität in dem konventionellen Assay ausreichend. Die relative Reinheit von Telomerase ist 100fach über dem Rohextrakt mit etwa 30% Ausbeute. Die Telomerasekonzentration beträgt bei quantitativer RNA-Analyse 0,3 pmol/ml. Dieses Material ist zur Affinitätschromatographie geeignet.
Puffer

Puffer H -- 10 mM HEPES-KOH, pH 7,9; 2 mM MgCl₂; 1 mM EGTA; 10 mM KCl Noch vor der Verwendung zugeben: 1 mM DTT; 1 mM Natriummetabisulfit; 1 mM Benzamidin und 0,2 mM PMSF
Puffer A -- 20 mM HEPES-KOH, pH 7,9; 1 mM MgCl₂; 1 mM EGTA; 10% Glycerin Noch vor der Verwendung zugeben: 1 mM DTT; 1 mM Natriummetabisulfit; 1 mM Benzamidin; 0,2 mM PMSF und 5 μg/ml Leupeptin
Puffer C -- 20 mM HEPES-KOH, pH 7,9; 1,5 mM MgCl₂; 0,5 mM EGTA; 20 mM NaCl; 25% Glycerin Noch vor der Verwendung zugeben: 1 mM DTT; 1 mM Natriummetabisulfit; 1 mM Benzamidin und 0,1 mM PMSF
Hypopuffer -- 20 mM HEPES-KOH, pH 7,9; 2 mM MgCl₂; 1 mM EGTA; 10% Glycerin; 0,1% NP-40 Noch vor der Verwendung zugeben: 1 mM DTT; 1 mM Natriummetabisulfit; 1 mM Benzamidin und 0,2 mM PMSF

E. Affinitätschromatographie
485 μl aktiver Source 15Q-Pool bei einer Proteinkonzentration von ungefähr 7 mg/ml wurden mit 100 μg Poly-dT-Oligonukleotid (30-mer), 125 μg Polyuridylsäure (Sigma, St. Louis, MO, Katalognummer P-9528) und 500 Picomol Oligonukleotid 14ab als Ligand (2'-O-Methyl, biotinyliert, Disulfid-vernetzt, RNA-Oligonukleotid, Yale University, New Haven, CT) in einem Gesamtvolumen von 500 μl ergänzt. Oligo 14ab weist die Sequenz 5' – cgttcctctt cctgcggcct – 3' (Oligo 14ab) (SEQ. ID Nr: 7) auf und deckt die Nukleotide 361 bis 380 der humanen Telomerase-RNA ab.
Nach einer Inkubation von 30 Minuten bei Raumtemperatur wird das Gemisch zu 4 bis 6 × 10⁶ Teilchen von MPG^®-Streptavidinkügelchen (CPG, Lincoln Park, NJ, Katalognummer MSTR0510), die mit Puffer A/700 mM NaCl äquilibriert wurden, zugegeben, und den Kügelchen wurde es ermöglicht, sich für ungefähr 10 Minuten abzusetzen. Die Kügelchen wur den dann der magnetischen Trennung unterzogen, der Überstand wurde verworfen und die Kügelchen wurden mit 100 μl Puffer A/700 mM NaCl gewaschen. Die Kügelchen wurden in 20 μl Elutionspuffer (Puffer A, der mit 500 mM Tris HCl pH 8,3 und 100 mM DTT ergänzt wurde) resuspendiert und bei Raumtemperatur 20 Minuten mit häufiger Resuspension inkubiert. Die Kügelchen wurden erneut der magnetischen Trennung unterzogen, der Überstand, der Telomeraseaktivität enthielt, wurde gesammelt und wie er ist für die anschließende Reinigung verwendet.
F. Gelausschluß-Größenchromatographie
Verfolgen der Telomeraseaktivität unter Verwendung des Größenausschlußchromatographen kann auf Affinitäts-gereinigtem Material durchgeführt werden. Das eluierte Material (150 μl, 2 fmol Telomerase/μl) aus der 14ab-Affinitätschromatographie wird auf eine TSK-Gel*G5000PW_XL-Säule (30 cm × 7,8 mm, TosoHaas) angewandt, die bereits in Puffer 'B' äquilibriert wurde. Die Säule wird in demselben Puffer bei einer Fließgeschwindigkeit von 250 μl/min eluiert. Telomeraseaktivitätsprofile und hTR-Mengen werden für die verschiedenen Fraktionen bestimmt. Enzymatische Aktivität als auch hTR-Konzentrationen erreichen ihren Höhepunkt zwischen 7,0 ml und 7,4 ml des Elutionsmittels.
Puffer 'B': 0,2M Triethylamin-CO₂; 1 mM EGTA; 1 mM DTT; 1 mM MgCl₂; 1% Glycerin
G. Aminosäuresequenzanal
Die Aminosäuresequenzen von Peptidfragmenten von b120 und y105 werden wie folgt bestimmt. Acrylamidgele wurden unter Verwendung von Standardprotokollen hergestellt und mit Silberfärbemittel gefärbt. Bei der Gelverringerung waren die Acetamidierung und tryptische Verdauung ähnlich den veröffentlichten Verfahrensweisen (Jeno ~ et al., Analyt. Biochem. 224, 451–455 (1995); Rosenfeld et al., Analyt. Biochem. 203, 173–179 (1992)). Nach dem Waschen mit 100 mM NH₄HCO₃ und Acetonitril wurden die Gelstücke in denn Verdauungspuffer, der 50 mM NH₄HCO₃, 5 mM CaCl₂ und 12,5 ngμl^–1 Trypsin (Boehringer Mannheim, Sequenzierungsgrad) enthielt, bei 4 °C gequollen. Nach 45 min wurde der Überstand aspiriert und mit 5 bis 10 μl desselben Puffers ohne Trypsin ersetzt, um Gelstücke während der enzymatischen Spaltung (37°C, über Nacht) naß zu halten.
Peptide wurde durch drei Wechsel von 5% Ameisensäure und Acetonitril extrahiert und getrocknet. Ungefähr 100 nl POROS R2-Sorbens (Perseptive Biosystems) wurden in die Spitze einer gezogenen GC 100F-10-(CEI, Pangbourne)-Kapillare eingebracht. Man beachte, daß das Harz nicht gepackt ist, und daß keine Fritten- oder andere Mikro-LC-Anordnung notwendig ist. Eine neue Kapillare und ein neuer Teil des Harzes werden für jede Analyse verwendet, um Querverunreinigungen selbst bei dem Femtomolniveau zu vermeiden. Das getrocknete Peptidgemisch wurde in 10 ml 5%iger Ameisensäure gelöst, auf die voräquilibrierte Kapillare aufgebracht, gewaschen und mit 60% Methanol in 5%iger Ameisensäure in der Sprühkapillare eluiert. Das Elutionsvolumen ist 10fach größer als das Harzvolumen, was zu einer guten Peptidgewinnung führt.
Nano-Elektrospray wird auf einem API III-Massenspektrometer (Perkin-Elmer Sciex, Ontario, Canada), wie beschrieben, durchgeführt (Wilm et al., Analyt. Chem. 68: 1–8 (1996); Mann et al., Analyt. Chem. 66, 4390–4399 (1994)). Zur Präkursorionenselektion wurde Quadrupol 1 eingestellt, um ein Massefenster von 2 Da zu übertragen. Die Schrittgröße für die Tandem-Massespektren betrug 0,2 Da und die Auflösung wurde so eingestellt, daß Fragmentmassen bestimmt werden konnten, die besser als 1 Da sind.
Die Genbank wurde durchsucht, um Polypeptide, die Aminosäuresequenzen der y105- und b120-Fragmente enthalten, nachzuweisen. Nukleolin (Genbank M60858 J05584) enthielt Sequenzen von y105, und Verlängerungsfaktor-2-Homolog (Genbank D21163) enthielt Sequenzen von b120.
Die vorliegende Erfindung stellt neue Verfahren zur Reinigung von Telomerase bereit. Obwohl spezielle Beispiele bereitgestellt worden sind, ist die obige Beschreibung illustrativ und nicht einschränkend. Viele Veränderungen der Erfindung werden dem Fachmann nach der Überprüfung dieser Beschreibung offensichtlich. Der Umfang der Erfindung sollte daher nicht in Bezug auf die obige Beschreibung bestimmt werden, sondern sollte stattdessen in Bezug auf die beiliegenden Ansprüche zusammen mit dem ganzen Umfang der Äquivalente bestimmt werden. Alle Veröffentlichungen und Patentunterlagen, die in dieser Anmeldung zitiert werden, werden hierin als Verweise in ihrer Gesamtheit für alle Zwecke im selben Maße wie, wenn jede einzelne Veröffentlichung oder Patentunterlagen so einzeln bezeichnet wurden, aufgenommen.

Claims

Zubereitung eines Säuger-Telomeraseproteins, das durch ein Verfahren erhaltbar ist, das aufweist: a) Trennen des Telomeraseproteins von anderen organischen Biomolekülen; b) Verbinden des getrennten Telomeraseproteins mit einem Oligonucleotid, das eine spezielle Bindungsaktivität für Telomerase aufweist, und c) Gewinnen einer angereicherteren Fraktion aus dem Oligonucleotid, wobei dadurch eine Zubereitung von Säuger-Telomeraseprotein hergestellt wird, das mindestens 2000-fach reiner (in Bezug auf die Telomeraseaktivität pro Proteingewicht) als ein Rohextrakt von 293 Zellen ist.
Zubereitung nach Anspruch 1, wobei die Zubereitung – wenn das Telomeraseprotein mit einem Telomerase-RNA-Komponenten assoziiert ist – eine spezifische Aktivität von mindestens 1 Einheit pro 0,2 μg Protein in einer Telomer-Primer-Verlängerungsbestimmung aufweist, in dem ³²P-markierte Primer-Verlängerung auf einem Gel getrennt und unter Verwendung eines Phosphorabbildungsschirms erfasst werden.
Zubereitung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, welche die Säugertelomerase in einer Konzentration von 2 Femtomol/μl enthält.
Telomerasezubereitung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Telomerase mindestens ~20.000- oder ~60.000-fach reiner als ein Rohextrakt von 293 Zellen ist.
Telomerasezubereitung nach Anspruch 4 mit einer Telomeraseaktivität, die sich in einer Größenordnung von 200–2.000 kDa auftrennt, wenn sie durch Gelfiltrationschromatographie fraktioniert ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Oligonucleotid spezifisch durch Telomeraseprotein erkannt wird.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Oligonucleotid zur Telomerase-RNA-Komponente komplementär ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, welche durch Verbinden einer Fraktion, die Telomeraseprotein enthält, mit einem Oligonucleotid, das zur Telomerase-RNA- Komponente komplementär ist, angereichert ist und eine stärker angereicherte Fraktion gewonnen ist.
Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Telomerase eine humane Telomerase ist.
Verfahren zum Anreichern von Säuger-Telomeraseprotein aus dem Extrakt einer Säugerzelle, welches aufweist: a) Abtrennen der im Extrakt befindlichen Telomerase von anderen organischen Biomolekülen, b) In-Kontakt-Bringen der getrennten Telomerase mit einem Oligonucleotid, das spezifisch durch das Telomeraseprotein erkannt wird, oder das zur Telomerase-RNA-Komponente (SEQ. ID NR: 1) komplementär ist, und c) Sammeln einer stärker angereicherten Fraktion, die Protein enthält, welches das Oligonucleotid bindet.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Oligonucleotid zur Telomerase-RNA-Komponente komplementär ist.
Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, wobei die Schritte b) und c) das Telomeraseprotein in der Zubereitung um mindestens das 90-fache anreichern.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei die Bindung an den Affinitäts-Wirkstoff eine Ausbeute von mindestens 29% ergibt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13, welches aufweist, zur Lösung ein Oligonucleotid zuzusetzen, das zur Telomerase-RNA-Komponente, die mit einer wiederauffindbaren Markierung (wie Biotin} verbunden ist, komplementär ist; und anschließendes Trennen des Oligonucleotids unter Verwendung einer einen die Markierung erfassenden Bindungswirkstoff (wie Avidin) besitzenden Matrix.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 14, welches das Verbinden einer Fraktion, die Telomeraseprotein enthält, mit einer Anionenaustausch-Matrix (wie zum Beispiel einem tertiären oder quartären Aminharz) und Sammeln von bindendem Protein aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 15, welches das Verbinden einer Fraktion, die Telomeraseprotein enthält, mit einer Kationenaustausch-Matrix (wie einer Heparinmatrix) und Sammeln von bindendem Protein aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 16, welches nacheinander erfolgendes Anreichern von Fraktionen, die Telomeraseprotein enthalten, auf einer Vielzahl von unterschiedlichen Ionenaustausch-Matrizen enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 17, welches das Verbinden einer Fraktion, die Telomeraseprotein enthält, mit einer mittlere Selektivität aufweisenden Matrix und Sammeln von bindendem Protein aufweist, wobei die mittlere Selektivität aufweisende Matrix eine Matrix ist, die mindestens einen der folgenden Substituenten aufweist: Hydroxyapatit, ein Polyamin (wie Spermin oder Spermidin), Polyguanylsäure, ein zweiwertiges Metallion (wie Ni**), eine positiv geladene Polyaminosäure (wie Poly-L-lysin), ein positiv geladenes Protein (wie Histon) oder Aminophenylborsäure.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 18, das ferner das Trennen einer Fraktion, die das Telomeraseprotein enthält, durch Gelfiltrationschromatographie aufweist, die imstande ist, Moleküle innerhalb einer Bandbreite von ~200 bis 2.000 kDa zu trennen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 19, wobei die Telomerase aus einem Extrakt von Zellen angereichert ist, die Telomerase stabil exprimieren.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei der Extrakt ein Detergens oder Kernextrakt von 293 Zellen ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 21, wobei das Telomeraseprotein ein humanes Telomeraseprotein ist.
Verwendung einer Telomerasezubereitung nach einem der Ansprüche 1 bis 9 für das in vitro Screenen von Zusammensetzungen, um Wirkstoffe zu identifizieren, welche die Assoziation von Telomerase assoziierten Proteinen ändern.