DE19743497A1 - Katalytische Untereinheit menschlicher Telomerase - Google Patents
Katalytische Untereinheit menschlicher TelomeraseInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Nucleinsäuren und
Polypeptide, die die katalytische Untereinheit von Telome
rase codieren. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfin
dung die katalytische Untereinheit von menschlicher Telome
rase. Die Erfindung stellt Verfahren und Zusammensetzungen
bereit, die die Medizin, Molekularbiologie, Chemie, Pharma
kologie und medizinische diagnostische und prognostische
Verfahren betreffen.
Die folgende Diskussion soll den Leser in das Gebiet, auf
das sich die vorliegende Erfindung bezieht, einführen. Das
Zitieren verschiedener Literaturstellen in diesem Abschnitt
soll nicht als ein Eingeständnis einer Vorwegnahme der Er
findung verstanden werden.
Es ist schon lange bekannt, daß die vollständige Replikation
der Enden von eukaryotischen Chromosomen spezialisierte
Zellbestandteile erfordert (Watson, Nature New. Biol. 239
(1972), 197 und Olovnikov, J. Theor. Biol. 41 (1973), 181)
Die Replikation eines linearen DNA-Strangs durch übliche
DNA-Polymerasen erfordert einen RNA-Primer und sie kann nur
in 5'-3'-Richtung fortschreiten. Bei Entfernung der an das
äußere 5'-Ende chromosomaler eukaryotischer DNA-Stränge ge
bundene RNA wird eine Lücke eingeführt, was zu einer fort
schreitenden Verkürzung der Tochterstränge bei jeder Repli
kationsrunde führt. Diese Verkürzung von Telomeren, die die
an den Enden von Chromosomen physisch lokalisierten Pro
tein/DNA-Strukturen darstellen, scheint der Grund für das
Phänomen der zellulären Seneszenz oder Alterung (siehe z. B.
Goldstein, Science 249 (1990), 1129; Martin et al., Lab.
Invest. 23 (1979), 86; Goldstein et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 64 (1969), 155 und Schneider und Mitsui, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 73 (1976), 3584) normaler menschlicher
somatischer Zellen in vitro und in vivo zu sein.
Die Länge und Integrität von Telomeren steht somit mit dem
Eintritt einer Zelle in einen seneszenten Status (d. h. den
Verlust der Proliferationsfähigkeit) in Zusammenhang. Dar
über hinaus dürfte die Fähigkeit einer Zelle die Telomer
länge zu bewahren (oder zu steigern) es der Zelle erlauben,
der Seneszenz zu entgehen, d. h. unsterblich zu werden.
Die Struktur von Telomeren und Telomer-DNA wurde in zahlrei
chen Systemen untersucht (siehe z. B. Harley und
Villeponteau, Curr. Opin. Genet. Dev. 5 (1995), 249). In den
meisten Organismen besteht Telomer-DNA aus einem Tandemarray
von sehr einfachen Sequenzen; in Menschen und anderen Verte
braten besteht Telomer-DNA aus hunderten bis tausenden von
Tandemwiederholungseinheiten der Sequenz TTAGGG. Verfahren
zur Bestimmung und Modulierung der Telomerlänge in Zellen
sind in den PCT-Veröffentlichungen WO 93/23572 und WO
96/41016 beschrieben.
Die Wahrung von Telomeren ist eine Funktion einer Telomer
spezifischen DNA-Polymerase, die als Telomerase bekannt ist.
Telomerase ist ein Ribonucleoprotein (RNP), das einen Anteil
seiner RNA-Einheit als eine Matrize für die Synthese der
DNA-Telomer-Wiederholungseinheiten verwendet (Morin, Eur. J.
Cancer 33 (1997), 750; Yu et al., Nature 344 (1990) 126;
Singer und Gottschling, Science 266 (1994), 404; Autexier
und Greider, Genes Develop. 8 (1994), 563; Gilley et al.,
Genes Develop. 9 (1995), 2214; Mc Eachern und Blackburn,
Nature 367 (1995), 403; Blackburn, Ann. Rev. Biochem. 61
(1992), 113; Greider, Ann. Rev. Biochem. 65 (1996), 337).
Die RNA-Bestandteile von menschlichen und anderen Telomera
sen wurden cloniert und charakterisiert (siehe die PCT-Veröf
fentlichung WO 96/01835 und Feng et al., Science 269 (1995),
1236). Die Charakterisierung der Proteinbestandteile von Te
lomerase war jedoch schwierig. Dies rührt teilweise daher,
daß es sich als schwierig herausgestellt hat, Telomerase-RNP
zu reinigen, das in Zellen, in denen es exprimiert wird, nur
in äußerst geringen Konzentrationen vorhanden ist. Bei
spielsweise nahm man an, daß menschliche Zellen, von denen
man weiß, daß sie hohe Spiegel an Telomerase-Aktivität ex
primieren lediglich etwa 100 Enzymmoleküle pro Zelle besit
zen.
Übereinstimmend mit der Beziehung von Telomeren und Telome
rase mit der Proliferationsfähigkeit einer Zelle (d. h. der
Fähigkeit einer Zelle, sich unbegrenzt zu teilen), wurde Te
lomerase-Aktivität in unsterblichen Zellinien und in ausge
sprochen unterschiedlichen Arten von Tumorgeweben nachgewie
sen, sie wurde jedoch nicht in normalen somatischen Zellkul
turen oder normalen Geweben in Nachbarschaft eines Tumors
(siehe US-Patente mit den Nummern 5,629,154; 5,489,508;
5,648,215 und 5,639,613; siehe auch Morin, Cell 59 (1989),
521; Shay und Bacchetti, Eur. J. Cancer 33 (1997), 787; Kim
et al., Science 266 (1994), 2011; Counter et al., EMBO J. 11
(1992), 1921; Counter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91
(1994), 2900 und Counter et al., J. Virol. 68 (1994), 3410)
nachgewiesen (d. h. war nicht vorhanden oder unter der Nach
weisgrenze des Assays). Darüber hinaus wurde über einen Zu
sammenhang zwischen dem Spiegel an Telomeraseaktivität in
einem Tumor und des wahrscheinlichen klinischen Verlaufs der
Krankheit des Patienten berichtet z. B. US-Patent Nr.
5,639,613, a.a.O., und Langford et al., Hum. Pathol. 28
(1997), 416). Telomerase-Aktivität wurde auch in menschli
chen Keimzellen, proliferierenden Stammzellen oder Nachkom
men davon und aktivierten Lymphocyten nachgewiesen. In soma
tischen Stammzellen oder den Nachkommen davon und in akti
vierten Lymphocyten ist die Telomerase-Aktivität typischer
weise entweder sehr gering oder nur transient exprimiert
(siehe Chiu et al., Stem Cells 14 (1996), 239, Bodnar et.,
Exp. Cell Res. 228 ( 1996), 58 und Taylor et al., J. Invest.
Dermatology 106 (1996), 759).
Menschliche Telomerase ist ein ideales Ziel für die Diagnose
und Behandlung menschlicher Krankheiten, die sich auf zellu
läre Proliferation und Seneszenz, wie beispielsweise Krebs,
beziehen. Verfahren zur Diagnose und Behandlung von Krebs
und anderen mit Telomerase in Zusammenhang stehenden Krank
heiten in Menschen sind in den US-Patenten Nr. 5,489,508,
5,639,613 und 5,645,986 beschrieben. Verfahren zur Vorher
sage des Fortschreitens eines Tumors durch Beobachtung von
Telomerase sind in dem US-Patent Nr. 5,639,613 beschrieben.
Das Auffinden und die Charakterisierung der katalytischen
Protein-Untereinheit menschlicher Telomerase würde zusätzli
che nützliche Assays für Telomerase und für die Diagnose und
Therapie von Krankheiten bereitstellen. Darüber hinaus würde
es die Clonierung und die Bestimmung der Primärsequenz der
katalytischen Protein-Untereinheit erlauben, wirksamere The
rapien für menschlichen Krebs und andere Krankheiten, die
mit der Proliferationsfähigkeit und Seneszenz von Zellen zu
sammenhängen, bereitzustellen.
Die vorliegende Erfindung stellt eine isolierte, im wesent
lichen reine oder rekombinante Proteinpräparation eines Te
lomerase-reverse Transkriptase-Proteins oder einer Variante
oder eines Fragments davon bereit. In einer Ausführungsform
weist das Protein folgende Aminosäuresequenz auf:
Trp-R1-X7-R1-R1-R2-X-Phe-Phe-Tyr-X-Thr-Glu-X8-9-R3-R3-Arg-R4-X2-Trp
wobei X eine beliebige Aminosäure ist und eine tiefgestellte
Zahl sich auf die Anzahl von aufeinanderfolgenden Resten be
zieht, R1 Leucin ist oder Isoleucin, R2 Glutamin oder Argi
nin, R3 Phenylalanin oder Tyrosin und R4 Lysin oder Histi
din. In einer Ausführungsform hat das Protein eine Sequenz
von menschlicher TRT. In anderen Ausführungsformen betrifft
die Erfindung Peptide und Polypeptide, die mit einer Unter
sequenz solcher Proteine im wesentlich Sequenzidentität ge
meinsam haben.
In einer verwandten Ausführungsform stellt die Erfindung
eine isolierte, im wesentlichen reine oder rekombinante
Nucleinsäure bereit, die ein Telomerase-reverse Trans
kriptase-Protein kodiert. In einer Ausführungsform hat das
Protein die folgende Aminosäuresequenz:
Trp-R1-X7-R1-R1-R2-X-Phe-Phe-Tyr-X-Thr-Glu-X8-9-R3-R3-Arg-R4-X2-Trp.
In einer Ausführungsform hat die Nucleinsäure eine Sequenz
menschlicher TRT. In weiteren Ausführungsformen betrifft die
Erfindung Oligonucleotide und Polynucleotide, die mit einer
Untereinheit solcher Nucleinsäuren wesentliche Sequenziden
tität gemeinsam haben.
Ein erfindungsgemäßer Aspekt betrifft menschliche Telome
rase-reverse Transkriptase (hTRT). Somit stellt die Erfin
dung in einer Ausführungsform eine isolierte, im wesentli
chen reine oder rekombinante Proteinpräration eines
menschlichen Telomerase-reverse Transkriptase (hTRT)-Pro
teins oder einer Variante oder eines Fragments davon bereit.
In einer Ausführungsform ist das Protein durch eine Amino
säure gekennzeichnet mit mindestens etwa 75% oder minde
stens etwa 80% Sequenzidentität zu dem hTRT-Protein von
SEQ. ID. Nr. 2 (Fig. 17) oder eine Variante oder eines
Fragments davon. In einer verwandten Ausführungsform hat das
hTRT-Protein die Sequenz von SEQ. ID. Nr. 2. In einigen Aus
führungsformen weist das Protein eine oder mehrere Telome
rase-Aktivitäten auf, beispielsweise katalytische Aktivität.
In einer Ausführungsform weist das hTRT-Proteinfragment min
destens 6 Aminosäurereste auf.
Die Erfindung stellt auch eine, ein hTRT-Protein und eine
RNA umfassende Zusammensetzung bereit. Die RNA kann eine Te
lomerase-RNA sein, beispielsweise eine RNA menschlicher Te
lomerase. In einer Ausführungsform bilden das hTRT-Protein
und die RNA menschlicher Telomerase einen Ribonucleoprotein
komplex mit einer Telomerase-Aktivität.
Ein erfindungsgemäßer Aspekt betrifft die Bereitstellung
isolierter menschlicher Telomerase, beispielsweise einer im
wesentlichen reinen menschlichen Telomerase, die menschliche
Telomerase-reverse Transkriptase (hTRT) und menschliche Te
lomerase RNA (hTR) umfaßt. In einer Ausführungsform hat die
Telomerase eine Reinheit von mindestens etwa 95%. Die Telo
merase kann aus einer Zelle isoliert sein.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft die
Bereitstellung eines isolierten, synthetischen, im wesentli
chen reinen oder rekombinanten Polynucleotids, das eine ein
hTRT-Protein codierende Nucleinsäuresequenz umfaßt. In einer
Ausführungsform hat das Polynucleotid eine Nucleotidsequenz,
die ein hTRT-Protein codiert, das eine in SEQ. ID. Nr. 2 an
gegegebene Aminosäuresequenz hat, oder eine Sequenz, die
eine oder mehrere konservative Substitutionen in dieser Ami
nosäuresequenz umfaßt. Ein verwandter Aspekt betrifft die
Bereitstellung eines Polynucleotids, das unter stringenten
Bedingungen mit einem Polynucleotid mit der Sequenz von SEQ.
ID. Nr. 1 hybridisiert. In einer weiteren verwandten Ausfüh
rungsform hat die Nucleotidsequenz des Polynucleotids eine
kleinste Summenwahrscheinlichkeit von weniger als etwa 0,5
im Vergleich zu einer in SEQ. ID. Nr. 1 angegebenen Nucleo
tidsequenz mittels des BLAST-Algorithmus unter Verwendung
von Voreinstellungsparametern.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt betrifft die Bereit
stellung eines Polynucleotids mit einer Promotorsequenz, die
mit der das hTRT-Protein codierenden Sequenz funktionell
verknüpft ist. Der Promotor kann ein Promotor sein, der
nicht dem natürlich vorkommenden hTRT-Promotor entspricht.
Ein verwandter erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft die
Bereitstellung eines Expressionsvektors, der das hTRT-Poly
nucleotid umfaßt.
Die Erfindung stellt auch ein isoliertes, synthetisches, im
wesentlichen reines oder rekombinantes Polynucleotid bereit,
das eine Länge von mindestens 10 Nucleotiden aufweist und
eine aufeinanderfolgende Sequenz von mindestens 10 Nucleoti
den umfaßt, die zu einer aufeinanderfolgenden Sequenz in
einem natürlich vorkommenden hTRT-Gen oder hTRT-mRNA iden
tisch oder genau komplementär ist. In einigen Ausführungs
formen ist das Polynucleotid eine RNA, eine DNA, oder es
enthält ein oder mehrere nicht natürlich vorkommende, syn
thetische Nucleotide. In einer Ausführungsform ist das Poly
nucleotid identisch oder genau komplementär zu der aufeinan
derfolgenden Sequenz von mindestens 10 aufeinanderfolgenden
Nucleotiden in einem natürlich vorkommenden hTRT-Gen oder
einer hTRT-mRNA. Beispielsweise kann das Polynucleotid ein
"antisense"-Polynucleotid sein. In einer anderen Ausfüh
rungsform umfaßt das antisense-Polynucleotid mindestens etwa
20 Nucleotide.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung re
kombinanter Telomerase durch Inkontaktbringen eines rekom
binanten hTRT-Proteins mit einem Telomerase-RNA-Bestandteil
unter solchen Bedingungen bereit, daß das rekombinante Pro
tein und der Telomerase-RNA-Bestandteil zur Bildung eines
Telomerase-Enzyms assoziieren das die Hinzufügung von
Nucleotiden zu einem Telomerase-Substrat katalysieren kann.
In einer Ausführungsform hat das hTRT-Protein die Sequenz
von SEQ. ID. Nr. 2. Das hTRT-Protein kann in einem in vitro-
Expressionssystem hergestellt und mit einer Telomerase-RNA
vermischt werden; in einer anderen Ausführungsform wird die
Telomerase-RNA in dem in vitro-Expressionssystem coexpri
miert. In einer Ausführungsform ist die Telomerase-RNA
menschliche Telomerase-RNA. In einer alternativen Ausfüh
rungsform geschieht das Inkontaktbringen in einer Zelle,
beispielsweise einer menschlichen Zelle. In einer Ausfüh
rungsform weist die Zelle keine Telomeraseaktivität vor dem
Inkontaktbringen von hTRT und der RNA eines hTRT-Polynucleo
tids (oder der Einführung z. B. durch Transfektion) auf. In
einer Ausführungsform wird die Telomerase-RNA natürlicher
weise von der Zelle exprimiert.
Die Erfindung stellt auch eine Zelle bereit, beispielsweise
eine menschliche Zelle, Mauszelle oder Hefezelle, die die
erfindungsgemäßen rekombinanten Polynucleotide enthält, bei
spielsweise ein Polynucleotid mit einer mit einem Promotor
funktionell verknüpften, ein hTRT-Protein codierende Se
quenz. Hinsichtlich bestimmter Aspekte ist die Zelle eine
Vertebratenzelle, beispielsweise eine Zelle eines Säugers,
z. B. eines Menschen, und weist eine erhöhte Proliferations
fähigkeit relativ zur Zelle auf, die ansonsten identisch
ist, jedoch nicht das rekombinante Polynucleotid umfaßt,
oder sie weist einen erhöhten Telomerase-Aktivitätsspiegel
auf, relativ zu einer Zelle, die ansonsten identisch ist,
jedoch nicht rekombinante Polynucleotide umfaßt. In einigen
Ausführungsformen ist die Zelle unsterblich.
Verwandte erfindungsgemäße Ausführungsformen betreffen die
Bereitstellung von Organismen und Zellen, die ein Poly
nucleotid umfassen, das ein menschliches Telomerase-reverse
Transkriptase-Polypeptid ist. Dazu zählen ein transgener
nicht-menschlicher Organismus, wie beispielsweise Hefe, eine
Pflanze oder Bakterium oder ein Tier, beispielsweise eine
Maus. Die Erfindung stellt auch transgene Tiere und Zellen
bereit, bei denen ein hTRT-Gen deletiert wurde ("knocked
out") oder so mutiert wurde, daß das Gen ein natürlich vor
kommendes hTRT-Genprodukt nicht exprimiert. Somit hat in al
ternativen Ausführungsformen das transgene Tier ein mutier
tes Telomerasegen, ist ein hinsichtlich einer Telomerase-Ak
tivität defizientes Tier, ist ein Tiere dessen TRT-Defizienz
das Ergebnis eines mutierten Gens ist, das eine TRT mit
einem herabgesetzten Spiegel an Telomerase-Aktivität im Ver
gleich zu einem Wildtyp-TRT besitzt oder ein Tier mit einem
mutierten TRT-Gen mit einer oder mehreren Mutationen, wozu
"missense" Mutationen, "nonsense"-Mutationen, Insertionen
und Deletionen zählen.
Die Erfindung stellt auch einen isolierten oder rekombinan
ten Antikörper oder ein Fragment davon bereit, die an hTRT-Pro
tein spezifisch binden. In einer Ausführungsform bindet
der Antikörper mit einer Affinität von mindestens etwa
108M⁻1. Der Antikörper kann eine monoclonale oder poly
clonale Zusammensetzung, beispielsweise ein polyclonales
Antiserum, sein. Ein verwandter erfindungsgemäßer Aspekt
betrifft die Bereitstellung einer Zelle, die den Antikörper
sezernieren kann, beispielsweise ein Hybridom.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Nachweis zur
Verfügung, ob eine Verbindung oder eine Behandlung ein Modu
lator einer reversen Transkriptase-Aktivität von Telomerase
oder der hTRT-Expression ist durch den Nachweis oder die
Überwachung einer Veränderung in der Aktivität oder Expres
sion in einer Zelle, einem Tier oder einer Zusammensetzung,
die ein hTRT-Protein oder entsprechendes Polynucleotid um
faßt, nach Verabreichung der Verbindung oder der Behandlung.
In einer Ausführungsform beinhaltet das Verfahren die fol
genden Schritte: Bereitstellung einer TRT-Zusammensetzung,
Inkontaktbringen der TRT mit der Testverbindung und Messung
der Aktivität der TRT, wobei eine Veränderung in der TRT-Ak
tivität in Gegenwart der Testverbindung ein Indikator dafür
ist, ob die Testverbindung TRT-Aktivität moduliert. In be
stimmten Ausführungsformen ist die Zusammensetzung eine
Zelle, ein Organismus, ein transgener Organismus oder ein in
vitro-System, beispielsweise ein Expressionssystem, das ein
ein hTRT-Polypeptid codierendes rekombinantes Polynucleotid
enthält. Somit kann die menschliche Telomerase-reverse
Transkriptase dieses Verfahrens ein Produkt einer in vitro-
Expression sein. In verschiedenen Ausführungsformen kann der
Nachweis einer Telomerase-Aktivität oder -Expression dadurch
erfolgen, daß eine Veränderung in der Häufigkeit eines hTRT-Gen
produkts dadurch nachgewiesen wird, daß der Einbau einer
Nucleotidmarkierung in ein Substrat für Telomerase überwacht
wird, die Hybridisierung einer Sonde mit einem verlängerten
Telomerase-Substrat, die Amplifikation eines verlängerten
Telomerase-Substrats, die Telomerlänge einer der Testverbin
dung ausgesetzten Zelle und der Verlust der Fähigkeit der
Telomerase an ein Chromosom zu binden oder durch die Messung
der Anreicherung oder des Verlusts einer Telomerstruktur.
Ein erfindungsgemäßer Aspekt betrifft die Bereitstellung
eines Verfahrens zum Nachweis eines menschlichen Telomerase
reverse Transkriptase (hTRT)-Genprodukts in einer biologi
schen Probe durch Inkontaktbringen der biologischen Probe
mit einer Sonde, die das Genprodukt spezifisch bindet, wobei
die Sonde und das Genprodukt einen Komplex bilden, und durch
den Nachweis des Komplexes, wobei das Vorhandensein des Kom
plexes mit dem Vorhandensein des hTRT-Genprodukts in der
biologischen Probe korreliert. Das Genprodukt kann RNA, DNA
oder ein Polypeptid sein. Zu den Beispielen für Sonden, die
zum Nachweis verwendet werden können, zählen, jedoch ohne
Beschränkung darauf, Nucleinsäuren und Antikörper.
In einer Ausführungsform ist das Genprodukt eine Nuclein
säure, die durch Amplifikation des Gens und Nachweis des
Amplifikationsprodukts nachgewiesen wird, wobei das Vorhan
densein des Komplexes oder des Amplifikationsprodukts mit
dem Vorhandensein des hTRT-Genprodukts in der biologischen
Probe korreliert.
In einer Ausführungsform ist die biologische Probe von einem
Patienten beispielsweise einem menschlichen Patienten. In
einer weiteren Ausführungsform enthält die biologische Probe
mindestens eine Zelle aus einer in vitro-Zellkultur, bei
spielsweise einer Kultur menschlicher Zellen.
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zum Nachweis des
Vorhandenseins mindestens einer unsterblichen oder Telome
rase-positiven menschlichen Zelle in einer menschlichen Zel
len umfassenden biologischen Probe bereit, wobei die
menschliche Zellen umfassende biologische Probe erhalten
wird und das Vorhandensein einer Zelle mit einem hohen Spie
gel eines hTRT-Genprodukts in der Probe nachgewiesen wird,
wobei das Vorhandensein einer Zelle mit einem hohen Spiegel
an dem hTRT-Genprodukt mit dem Vorhandensein von unsterbli
chen oder Telomerase-positiven Zellen in der biologischen
Probe korreliert. Die Erfindung stellt auch ein Verfahren
bereit zur Diagnose eines mit Telomerase in Zusammenhang
stehenden Zustands in einem Patienten durch Gewinnung einer
Zelle oder einer Gewebeprobe von dem Patienten, Bestimmung
der Menge eines menschlichen Telomerase-reverse
Transkriptase (hTRT)-Genprodukts in der Zelle oder dem Ge
webe und dem Vergleich der Menge des hTRT-Genprodukts in der
Zelle oder dem Gewebe mit der Menge in einer gesunden Zelle
oder einem gesunden Gewebe des gleichen Typs, wobei eine
unterschiedliche Menge des hTRT-Genprodukts in der Probe von
dem Patienten im Vergleich zu der gesunden Zelle oder im ge
sunden Gewebe ein diagnostisches Anzeichen für einen mit Te
lomerase in Zusammenhang stehenden Zustand ist. In einer
Ausführungsform ist der mit Telomerase in Zusammenhang ste
hende Zustand Krebs.
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren bereit zur Diag
nose von Krebs in einem Patienten durch Gewinnung einer
Probe von dem Patienten und den Nachweis eines menschlichen
Telomerase-reverse-Transkriptase-(hTRT)-Genprodukts in der
Probe von dem Patienten, wobei der Nachweis des hTRT-Genpro
dukts in der Probe mit einer Diagnose von Krebs korreliert.
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren bereit zur
Diagnose von Krebs in einem Patienten durch Gewinnung einer
Patientenprobe, Bestimmung der Menge des menschlichen Telo
merase-reverse Transkriptase (hTRT)-Genprodukts in der Pati
entenprobe und den Vergleich der Menge des hTRT-Genprodukts
mit einem normalen Wert oder Kontrollwert, wobei eine Menge
des hTRT-Genprodukts in dem Patienten, die in dem Vergleich
zu dem Normalwert oder Kontrollwert größer ist, ein diagno
stisches Anzeichen für Krebs ist.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren bereit zur Diagnose
von Krebs in einem Patienten durch Gewinnung einer Patien
tenprobe, die mindestens eine Zelle enthält, Bestimmung der
Menge des hTRT-Genprodukts, in einer Zelle in der Probe und
den Vergleich der Menge des hTRT-Genprodukts in der Zelle
mit einem für die Zellen normalen Wert, wobei eine Menge des
hTRT-Genprodukts die über dem Normalwert liegt, ein diagno
stisches Anzeichen für Krebs ist. In einer Ausführungsform
wird davon ausgegangen, daß die Probe mindestens eine
maligne Zelle enthält.
Die Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zur Bereitstel
lung einer Prognose für einen Krebspatienten bereit, wobei
die Menge des hTRT-Genprodukts in einer von dem Patienten
erhaltenen Krebszelle bestimmt wird und die Menge von hTRT
in der Krebszelle mit einem prognostischen Wert für hTRT pro
Krebszelle, konsistent mit einer Prognose hinsichtlich Krebs
ist, wobei eine hTRT-Menge pro Zelle in der Probe, die bei
dem prognostischen Wert liegt, die spezielle Prognose be
reitstellt.
Die Erfindung stellt außerdem ein Verfahren bereit zur Über
wachung der Wirksamkeit einer Antikrebsbehandlung, die Pro
liferationskapazität von Krebszellen in einem Patienten her
abzusetzen, dadurch, daß zuerst eine Messung der Menge eines
hTRT-Genprodukts in mindestens einer Krebszelle von dem Pa
tienten durchgeführt wird, eine zweite Messung hinsichtlich
des Spiegels an hTRT-Genprodukts in mindestens einer Krebs
zelle des Patienten durchgeführt wird, wobei die Antikrebs
behandlung dem Patienten vor der zweiten Messung oder zur
gleichen Zeit verabreicht wird und durch den Vergleich der
ersten mit der zweiten Messung, wobei ein niedriger Spiegel
an hTRT-Genprodukt in der zweiten Messung mit der Wirksam
keit einer Antikrebsbehandlung korreliert, die Prolifera
tionskapazität von Krebszellen in dem Patienten herabzuset
zen.
Die Erfindung stellt auch Kits für den Nachweis eines hTRT-Gens
oder Genprodukts zur Verfügung. In einer Ausführungs
form enthält der Kit einen Behälter, der ein Molekül umfaßt,
ausgewählt aus einer hTRT-Nucleinsäure oder einer Unterse
quenz davon, ein hTRT-Polypeptid oder eine Untersequenz da
von und einen anti-hTRT-Antikörper. Die Erfindung stellt
auch Behandlungsverfahren für menschliche Krankheiten zur
Verfügung. Ein erfindungsgemäßer Aspekt betrifft die Bereit
stellung eines Verfahrens zur Steigerung der Proliferations
kapazität einer Vertebratenzelle, beispielsweise einer
Säugerzelle, durch Einführung eines rekombinanten Poly
nucleotids in die Zelle, wobei das Polynucleotid eine Se
quenz umfaßt, die ein menschliches Telomerase-reverse
Transkriptase (hTRT)-Polypeptid umfaßt. In einer Ausfüh
rungsform hat das hTRT-Polypeptid eine Sequenz von SEQ. ID.
Nr. 2 (Fig. 17). In einer Ausführungsform ist die Sequenz
mit einem Promotor funktionell verknüpft. In einer Ausfüh
rungsform weist die hTRT katalytische Aktivität von Telome
rase auf. In einer Ausführungsform ist die Zelle menschlich,
beispielsweise eine Zelle in einem menschlichen Patienten.
In einer alternativen Ausführungsform wird die Zelle in
vitro kultiviert. In einer verwandten Ausführungsform wird
die Zelle in einen menschlichen Patienten eingeführt.
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren bereit zur Behand
lung einer menschlichen Krankheit durch Einführung eines re
kombinanten hTRT-Polynucleotids in mindestens eine Zelle in
einem Patienten. In einer Ausführungsform wird ein Vektor
für Gentherapie verwendet. In einer verwandten Ausführungs
form besteht das Verfahren ferner in der Einführung eines
Polynucleotids in die Zelle, das eine menschliche Telome
rase-RNA codierende Sequenz umfaßt, beispielsweise ein hTRT-Poly
nucleotid, das mit einem Promotor funktionell verknüpft
ist.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren bereit zur Steige
rung der Proliferationsfähigkeit einer Vertebratenzelle, wo
bei das Verfahren die Einführung einer wirksamen Menge eines
menschlichen Telomerase-reverse Transkriptase (hTRT)-Poly
peptids in die Zelle umfaßt. In einer Ausführungsform hat
das hTRT-Polypeptid katalytische Aktivität von Telomerase.
Die Erfindung stellt ferner Zellen und Nachkommen der Zellen
mit erhöhter Proliferationskapazität bereit.
Die Erfindung stellt auch Arzneimittel bereit, die einen
pharmazeutisch verträglichen Träger enthalten und ein Mole
kül ausgewählt aus: einem hTRT-Polypeptid, einem ein hTRT-Poly
peptid codierenden Polynucleotid und einer hTRT-Nuclein
säure oder einer Untersequenz davon.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren bereit zur Behand
lung eines Zustands, der mit einem erhöhten Spiegel an Telo
merase-Aktivität innerhalb einer Zelle assoziiert ist, wobei
das Verfahren die Einführung einer therapeutisch wirksamen
Menge eines Inhibitors von Telomerase-Aktivität in die Zelle
umfaßt, wobei der Inhibitor ein hTRT-Polypeptid oder ein
hTRT-Polynucleotid ist. In einer Ausführungsform ist der In
hibitor ein Polypeptid, das die Sequenz von SEQ. ID. Nr.
oder 4 oder eine Untersequenz davon umfaßt. In weiteren Aus
führungsformen hemmt das Polypeptid eine TRT-Aktivität, bei
spielsweise die Bindung endogener TRT an Telomerase-RNA.
Die Erfindung stellt auch ein Vakzin bereit, das ein hTRT-Poly
peptid und ein Adjuvans umfaßt.
Fig. 1 zeigt hochkonservierte Feste in TRT-Motiven von
Menschen, S. pombe (tez1), S. cerevisiae (EST2) und
Euplotes aediculatus (p123). Identische Aminosäuren
sind mit einem Sternchen (*) gekennzeichnet, wäh
rend ähnliche Aminosäurereste durch einen Punkt (⚫)
gekennzeichnet sind. Motiv "0" in der Figur wird
auch Motiv T genannt; Motiv "3" wird auch Motiv A
genannt.
Fig. 2 zeigt die Lage Telomerase-spezifischer Motive und
RT-spezifischer Sequenzmotive von Telomerase-Pro
teinen und anderen reversen Transkriptasen. Die
Lage des Telomerase-spezifischen Motivs T und der
konservierten RT-Motive 1, 2 und A-E sind durch ge
füllte Kästchen gekennzeichnet. Das mit einem offe
nen Rechteck gekennzeichnete HIV-1 RT kennzeichnet
den in Fig. 3 gezeigten Anteil dieses Proteins.
Fig. 3 zeigt die Kristallstruktur der p66-Untereinheit von
HIV-1-reverse Transkriptase ("Brookhaven code"
1HNV). Die Ansicht ist vom rechten Handrücken aus
gesehen, dargestellt, damit alle Motive erkennbar
sind.
Fig. 4 zeigt mehrere Sequenzausrichtungen von Telomerase-
RTs (Sp_Trt1p, S. pombe TRT (hier auch mit "tez1p"
bezeichnet); bTRT, menschliche TRT; Ea_123, Euplo
tes p123; Sc_Est2p, S. cerevisiae Est2P) und Mit
glieder anderer RT-Familien (S_a1, Cytochrom-oxi
dase Gruppe II Intron I-codiertes Protein von S.
cerevisiae-Mitochondrien, Dm_TART, reverse
Transkriptase von Drosophila melanogaster TART-nicht-
LTR-Retrotransposon-Element); HIV-1, reverse
Transkriptase von menschlichem HIV). TRT con und RT
con repräsentieren "Consensus"-Sequenzen für Telo
merase-RTs und nicht-Telomerase-RTs. Aminosäuren
sind gekennzeichnet mit einem h, hydrophob; p, po
lar; c, geladen. Dreiecke bezeichnen Reste, die in
nerhalb der Telomerase-Proteine konserviert sind,
in anderen RTs jedoch unterschiedlich sind. Die
dicke Linie unter Motiv E bezeichnet den "Primer
griff" ("primer grip")-Bereich.
Fig. 5 zeigt die Expression von hTRT-RNA in Telomerase-ne
gativen sterblichen Zellstämmen und Telomerase-po
sitiven unsterblichen Zellinien, wie in Beispiel 2
beschrieben.
Fig. 6 zeigt einen möglichen phylogenetischen Stammbaum
von Telomerasen und Retroelementen mit RNA-abhängi
gen RNA-Polymerasen als Wurzel.
Fig. 7 zeigt eine Restriktionskarte des lambda-Clons GΦ5.
Fig. 8 zeigt eine Karte von Chromosom 5p mit der Lage des
STS-Markers D5S678 (der in der Nähe des hTRT-Gens
lokalisiert ist).
Fig. 9 zeigt die Konstruktion eines hTRT-Promotor-Repor
terplasmids.
Fig. 10 (zwei Seiten) zeigt die in vitro-Coexpression von
hTRT und hTR zur Herstellung katalytisch aktiver
menschlicher Telomerase.
Fig. 11 (zwei Seiten) zeigt die Ausrichtung von Sequenzen
von vier TRT-Proteinen und intressierende Motive
sind gekennzeichnet. TRT con bezeichnet eine TRT-"Con
sensus"-Sequenz. RT con bezeichnet "Consensus"-
Reste bei anderen reversen Transkriptasen. "Consen
sus"-Reste mit Großbuchstaben kennzeichnen absolute
Konservierung in TRT-Proteinen.
Fig. 12 zeigt eine Topoisomerase II-Spaltstelle und NFκB-Bin
dungsstellen-Motive in einem hTRT-Intron, wobei
die gezeigte Sequenz SEQ. ID. Nr. W (Fig. 12) ent
spricht.
Fig. 13 (zwei Seiten) zeigt die Sequenz der DNA, die die
Euplotes 123 kD-Telomerase-Proteinuntereinheit co
diert (Euplotes TRT-Protein).
Fig. 14 zeigt die Aminosäuresequenz der Euplotes 123 kD-Te
lomerase-Proteinunterheit (Euplotes TRT-Protein).
Fig. 15 (vierzehn Seiten) zeigt die DNA- und Aminosäurese
quenzen der katalytischen Untereinheit der S.
pombe-Telomerase (S. pombe-TRT).
Fig. 16 (zwei Seiten) zeigt die hTRT-cDNA-Sequenz, wobei
die gezeigte Sequenz SEQ. ID. Nr. 1 entspricht.
Fig. 17 zeigt das hTRT-Protein, codiert durch die cDNA von
Fig. 16. Die gezeigte Proteinsequenz entspricht
SEQ. ID. Nr. 2.
Fig. 18 zeigt die Sequenz des Clons 712562, wobei die ge
zeigte Sequenz SEQ. ID. Nr. 3 entspricht.
Fig. 19 zeigt ein Protein mit 259 Resten, das von dem Clon
712562 codiert wird, wobei die gezeigte Sequenz
SEQ. ID. Nr. 10 entspricht.
Fig. 20 (sieben Seiten) zeigt die Sequenz einer Nuclein
säure mit einem offenen Leserahmen, die eine Δ182-Poly
peptidvariante codiert, wobei die gezeigte Se
quenz SEQ. ID. Nr. 4 entspricht. Diese Figur zeigt
auch die Aminosäuresequenz dieser Δ182-Polypeptid
variante, wobei die gezeigte Aminosäuresequenz SEQ.
ID. Nr. 5 entspricht.
Fig. 21 (sechs Seiten) zeigt die Sequenz eines genomischen
hTRT-Clons, wobei die gezeigte Sequenz SEQ. ID. Nr.
6 entspricht. "Consensus"-Motive und Elemente sind
angegeben, dazu gehören auch Sequenzen, die charak
teristisch sind für eine Topoisomerase II-Spalt
stelle, NFκB-Bindungsstellen, eine Alu-Sequenz und
andere Sequenzelemente.
Fig. 22 zeigt die Auswirkung einer Mutation des TRT-Gens in
Hefe, wie in Beispiel 1 beschrieben.
Fig. 23 zeigt die Sequenz von EST AA281296, die SEQ. ID.
Nr. 8 entspricht.
Fig. 24 zeigt die Sequenz der 182 Basenpaare, die in Clon
712562 deletiert sind, wobei die gezeigte Sequenz
SEQ. ID. Nr. 9 entspricht.
Fig. 25 zeigt die Ergebnisse eines Assays auf Telomerase-
Aktivität von BJ-Zellen, die mit einem ein hTRT-Pro
tein codierenden Expressionsvektor (pGRN133)
oder einem Kontrollplasmid (pBBS212) transfiziert
wurden, wie in Beispiel 13 beschrieben.
Fig. 26 ist ein schematisches Diagramm hinsichtlich der Af
finitätsreinigung von Telomerase, das die Bindungs
schritte und Elutionsschritte durch Verdrängung
zeigt.
Fig. 27 ist ein Photo eines Northern-Blots von Telomerase-
Präparationen, die während des in Beispiel 1 be
schriebenen Reinigungsprotokolls erhalten wurden.
Spur 1 enthielt 1,5 fMol Telomerase-RNA, Spur 2 4,6
fMol, Spur 3 14 fMol, Spur 4 41 fMol, Spur 5 nucle
ären Extrakt (42 fMol Telomerase), Spur 6 Affi-Gel-
Heparin-gereinigte Telomerase (47 fMol Telomerase),
Spur 7 affinitätsgereinigte Telomerase (68 fMol)
und Spur 8 über Glyceringradienten gereinigte
Telomerase (35 fMol).
Fig. 28 zeigt Telomerase-Aktivitäten während eines Reini
gungsprotokolls.
Fig. 29 ist ein Photo eines SDS-PAGE-Gels, das die Anwesen
heit eines Polypeptids mit etwa 123 kD und einer
Dublette mit etwa 43 kD von Euplotes aediculatus
zeigt.
Fig. 30 ist eine Graphik, die den Sedimentationskoeffizien
ten von Euplotes aediculatus-Telomerase zeigt.
Fig. 31 ist ein Photo eines Polyacrylamid/Harnstoff-Gels
mit 36% Formamid, das die Substratverwertung von
Euplotes-Telomerase zeigt.
Fig. 32 zeigt die vermeuteten Ausrichtungen von Telomerase-
RNA-Matrize und Haarnadelstruktur-Primern mit Telo
merase-RNA.
Fig. 33 ist ein Photo der Spuren 25 bis 30 des in Fig. 31
gezeigten Gels mit geringerer Belichtung.
Fig. 34 zeigt die DNA-Sequenz des Gens, das die 43 kD-Telo
merase-Proteinuntereinheit von Euplotes codiert.
Fig. 35 (vier Seiten) zeigt die DNA-Sequenz sowie die Ami
nosäuresequenzen aller drei offenen Leserahmen der
43 kD Telomerase-Proteinuntereinheit von Euplotes.
Fig. 36 zeigt einen Sequenzvergleich zwischen der 123 kD-Telo
merase-Proteinuntereinheit von Euplotes (obere
Sequenz) und der 80 kD-Polypeptid-Untereinheit von
T. thermophila (untere Sequenz).
Fig. 37 zeigt einen Sequenzvergleich zwischen der 123 kD-Telo
merase-Proteinunterheit von E. aediculatus
(obere Sequenz) und dem 95 kD-Telomerase-Polypeptid
von T. thermophila (untere Sequenz).
Fig. 38 zeigt die "best-fit"-Ausrichtung zwischen einem
Teil der "La-Domäne" der 43 kD-Telomerase-Protein
untereinheit von E. aediculatus (obere Sequenz) und
einem Teil der 95 kD-Polypeptiduntereinheit von T.
thermophila (untere Sequenz).
Fig. 39 zeigt die "best-fit"-Ausrichtung zwischen einem
Teil, der "La-Domäne" der 43 kD-Telomerase-Protein
untereinheit von E. aediculatus (obere Sequenz) und
einem Teil der 80 kD-Polypeptid-Untereinheit von T.
thermophila (untere Sequenz).
Fig. 40 zeigt die Ausrichtung und die Motive der Polyme
rase-Domäne der 123 kD-Telomerase-Proteinunterein
heit von E. aediculatus und der Polymerase-Domänen
von verschiedenen reversen Transkriptasen, wozu
auch ein Cytochrom-Oxidase-Gruppe II Intron 1-co
diertes Protein von S. cerevisiae-Mitochondrien (a1
S.c. (Gruppe II)) zählen, Dong (LINE) und Hefe ESTp
(L8543.12).
Fig. 41 zeigt die Ausrichtung einer Domäne der 43 kD Telo
merase-Proteinuntereinheit mit verschiedenen La-
Proteinen.
Fig. 42 zeigt die Nucleotidsequenz, die T. thermophila 80
kD-Protein-Untereinheit codiert.
Fig. 43 zeigt die Aminosäuresequenz der T. thermophila 80
kD-Protein-Untereinheit.
Fig. 44 zeigt die Nucleotidsequenz, die die T. thermophila
95 kD-Protein-Untereinheit codiert.
Fig. 45 zeigt die Aminosäuresequenz der T. thermophila 95
kD Protein-Untereinheit.
Fig. 46 zeigt die Aminosäuresequenz von L8543.12 ("Est2p").
Fig. 47 zeigt die Ausrichtung der durch das Oxytricha PCR-Pro
dukt codierten Aminosäuresequenz mit der Euplo
tes p123-Sequenz.
Fig. 48 zeigt die DNA-Sequenz von Est2.
Fig. 49 zeigt die partielle Aminosäuresequenz eines cDNA-Clons,
der Peptidmotive menschlicher Telomerase Co
diert.
Fig. 50 zeigt die partielle DNA-Sequenz eines cDNA-Clons,
der Peptidmotive menschlicher Telomerase codiert.
Fig. 51 zeigt die Aminosäuresequenz von tez1, das auch als
S. pombe trt bezeichnet wird.
Fig. 52 (zwei Seiten) zeigt die DNA-Sequenz von tez1.
Intron-Bereiche und andere nicht codierende Berei
che sind in Kleinbuchstaben gezeigt und Exons (d. h.
codierende Bereich) sind mit Großbuchstaben angege
ben.
Fig. 53 zeigt die Ausrichtung von EST2p, Euplotes und
Tetrahymena-Sequenzen, sowie "Consensus"-Sequenzen.
Fig. 54 zeigt die Sequenzen von Peptiden, die für die Her
stellung von anti-hTRT-Antikörpern nützlich sind.
Fig. 55 ist eine schematische Zusammenfassung der tez1⁺-Se
quenzierungsexperimente.
Fig. 56 zeigt zwei degenerierte Primer, die in der PCR zur
Identifizierung des S. pombe-Homologen zu den E.
aediculatus p123-Sequenzen verwendet wurden.
Fig. 57 zeigt die vier Hauptbanden, die in der PCR mit den
degenerierten Primern zur Identifizierung des S.
pombe-Homologen, zu den E. aediculatus p123-Sequen
zen verwendet wurden.
Fig. 58 zeigt die Ausrichtung des M2-PCR-Produkts mit E.
aediculatus p123, S. cerevisiae und Oxytricha-Telo
merase-Proteinsequenzen.
Fig. 59 ist ein Schema, das die 3'-RT-PCR-Strategie für die
Identifizierung des S. pombe-Homologen zu dem E.
aediculatus p123 zeigt.
Fig. 60 zeigt Merkmale der Banken, die verwendet wurden, um
nach S. pombe Telomerase-Proteinsequenz zu screenen
und die Ergebnisse des Screenings.
Fig. 61 zeigt die positiven Ergebnisse, die mit den
HindIII-gespaltenen positiven genomischen Clonen
erhalten wurden, die die S. pombe-Telomerase-Se
quenz enthalten.
Fig. 62 ist ein Schema, das die 5'-RT-PCR-Strategie zeigt,
die zum Erhalt des S. pombe TRT-Clons mit vollstän
diger Länge verwendet wurde.
Fig. 63 zeigt die Ausrichtung von RT-Domänen von katalyti
schen Untereinheiten von Telomerase für S. pombe
(S.p.), S. cerevisiae (S.c.) und E. aediculatus
(E.a.).
Fig. 64 zeigt die Ausrichtung von Sequenzen von Euplotes
("Ea_p123"), S. cerevisiae ("Sc_Est2p") und S.
pombe ("Sp_Tez1p"). In Teil A kennzeichnen die
schattierten Bereiche Reste, die beide Sequenzen
gemeinsam haben. In Teil B bezeichnen die schat
tierten Bereiche Reste, die alle drei Sequenzen ge
meinsam haben.
Fig. 65 zeigt die für die Telomerase-Gene in S. pombe ver
wendete Disruptionsstrategie.
Fig. 66 zeigt die experimentellen Ergebnisse, die die Dis
ruption von tez1 bestätigen.
Fig. 67 zeigt die progressive Verkürzung von Telomeren in
S. pombe aufgrund der Disruption von tez1.
Fig. 68 (vier Seiten) zeigt die DNA-Sequenz und Aminosäure
sequenz des ORF, der ein Telomerase-Protein von
etwa 63 kD codiert oder ein Fragment davon, codiert
von der EcoRI-NotI-Insertion des Genbank-Clons
#AA281296.
Fig. 69 zeigt eine Ausrichtung von reverser Transkriptase-
Motiven aus verschiedenen Quellen.
Fig. 70 ist eine Restriktionskarte und funktionelle Karte
von Plasmid pGRN121.
Fig. 71 (zwei Seiten) zeigt die Ergebnisse von vorläufigen
Analysen der Nucleinsäure-Sequenzierung einer hTRT-cDNA-Se
quenz.
Fig. 72 (10 Seiten) zeigt die vorläufige Nucleinsäure von
hTRT und die abgeleiteten ORF-Sequenzen in den drei
Leserahmen.
Fig. 73 ist eine Restriktionskarte und funktionelle Karte
von Plasmid pGRN121.
Fig. 74 (8 Seiten) zeigt die verbesserte Nucleinsäurese
quenz und abgeleitete ORF-Sequenzen von hTRT.
Fig. 75 zeigt eine Restriktionskarte des lambda-Clons 25-
1.1.
Fig. 76 zeigt eine Karte der Restriktions-Stellen und
Bereiche von DNA pGRN144.4.
Telomerase ist ein Ribonucleoproteinkomplex (RNP), der einen
RNA-Bestandteil und einen katalytischen Protein-Bestandteil
umfaßt. Die vorliegende Erfindung betrifft die Clonierung
und Charakterisierung des katalytischen Proteinbestandteils
der Telomerase, der nachstehend "TRT" (Telomerase-reverse-
Transkriptase) bezeichnet wird. Dieses Protein wird deshalb
als TRT bezeichnet, weil es als eine RNA-abhängige DNA-Poly
merase arbeitet, wobei der RNA-Bestandteil der Telomerase
(nachstehend mit "TR" bezeichnet) zur Steuerung der Synthese
der Telomer-DNA-Wiederholungssequenzen verwendet wird.
Darüber hinaus ist TRT mit anderen reversen Transkriptasen
evolutionär verwandt (siehe Beispiel 12).
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Clonie
rung und Charakterisierung des katalytischen Proteinbestand
teil der menschlichen Telomerase, die nachstehend als "hTRT"
bezeichnet wird. Menschliche TRT ist deshalb von außeror
dentlichem Interesse und Wert, da, wie nachstehend ange
merkt, Telomerase-Aktivität in Menschen (und weiteren Säu
ger-Zellen) mit der Eigenschaft der Zellproliferation, Zell
immortalität und der Entwicklung eines neoplastischen Phäno
typs korreliert. Beispielsweise ist in unsterblichen mensch
lichen Zellen (z. B. maligne Tumorzellen und unsterbliche
Zellinien) die Telomerase-Aktivität und, wie in Beispiel 2
nachstehend gezeigt, die Menge an Genprodukten menschlicher
TRT gegenüber sterblichen Zellen (z. B. den meisten menschli
chen somatischen Zellen) erhöht.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner Verfahren und Zusam
mensetzungen bereit, die zur Diagnose, Prognose und zur Be
handlung von menschlichen Erkrankungen und Krankheitszustän
den von Wert ist, wie dies nachstehend ausführlich beschrie
ben wird. Außerdem werden Verfahren und Reagenzien zur Ver
fügung gestellt, die zur Immortalisierung von Zellen (in
vivo und ex vivo) von Nutzen sind, wobei transgene Tiere mit
erwünschten Merkmalen hergestellt werden, sowie zahlreiche
weitere Verwendungsmöglichkeiten, die zum großen Teil nach
stehend beschrieben werden. Die Erfindung stellt auch Ver
fahren und Agenzien bereit, die für die Herstellung, die
Clonierung und Re-Clonierung von TRT-Genen und -Proteinen
aus Ciliaten, Pilzen, Vertebraten, beispielsweise Säugern,
und anderen Organismen von Nutzen sind.
Wie nachstehend ausführlich beschrieben wird, wurde TRT zu
erst nach Reinigung von Telomerase aus dem Ciliaten Euplotes
aediculatus charakterisiert. Die umfassende Reinigung von E.
aediculatus Telomerase unter Verwendung von RNA-Affinitäts
chromatographie und weiterer Verfahren lieferte das Protein
"p123". Überraschenderweise stellte sich heraus, daß p123
mit Proteinen, von denen bisher angenommen wurde, daß sie
Proteinuntereinheiten des Telomerase-Holoenzyms darstellen
(d. h. die p80 und p95-Proteine von Tetrahymena thermophila)
nicht verwandt ist. Die Analyse der Sequenzen der p123-DNA
und des Proteins (Genbank-Zugangsnummer U95964; Fig. 13
und 14) ergab das Vorhandensein von Motiven von reverser
Transkriptase (RT), was mit der Rolle von p123 als kataly
tische Untereinheit der Telomerase konsistent ist (siehe
z. B. Fig. 11). Darüber hinaus ist p123 mit dem Est1p-Pro
tein aus S. cerevisiae (Hefe) verwandt, von dem bekannt war,
daß es eine Rolle bei der Aufrechterhaltung der Telomere in
S. cerevisiae spielt (Genbank-Zugangsnummer S5396). Es wurde
jedoch vor der vorliegenden Erfindung nicht erkannt, daß
dieses ein Protein einer katalytischen Untereinheit von Te
lomerase codiert (siehe beispielsweise Lendvay et al., Gene
tics 144 (1996), 1399).
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Reagenzien
und Verfahren zur Identifizierung und Clonierung neuer TRTs
unter Verwendung von: Nucleinsäuresonden und Primern, die
von den offenbarten TRT-Polynucleotiden erzeugt oder abge
leitet sind (z. B. zur Clonierung von TRT-Genen und cDNAs);
Antikörpern, die Motive, Motivsequenzen oder andere TRT-Epi
tope spezifisch erkennen (z. B. zur Expressionsclonierung
von TRT-Genen oder zur Reinigung von TRT-Proteinen); das
Screening von Computer-Datenbanken; oder weiterer Hilfsmit
tel. Beispielsweise wurde die in Beispiel 1 beschriebene
PCR-Amplifikation (Polymerase-Kettenreaktion) von DNA von S.
pombe mit Primern mit degenerierten Sequenzen, die anhand
der Euplotes p123 RT Motive B' und C entworfen wurden, aus
gewählt. Von den vier erzeugten Hauptprodukten codierte
eines eine Peptidsequenz, die homolog ist zur Euplotes p123
und S. cerevisiae Est2p. Die vollständige Sequenz des zur S.
pombe TRT homologen Proteins wurde unter Verwendung dieses
PCR-Produkts als Sonde durch Screenen von cDNA- und genomi
schen Banken von S. pombe und Amplifikation von S. pombe RNA
durch reverse Transkription und PCR (RT-PCR) erhalten. Die
vollständige Sequenz des S. pombe Gens (trt1''; Genbank-
Zugangsnummer AF015783; Fig. 15) ergab, daß die Homologie
zwischen p123 und Est2p in den Motiven für reverse
Transkriptase besonders hoch war.
Die Amplifikation unter Verwendung von degenerierten Pri
mern, die von den Telomerase RT-Motiven abgeleitet waren,
wurde auch zum Erhalt von TRT-Gensequenzen aus Oxytricha
trifallax und Tetrahymena thermophila, wie in Beispiel 1
beschrieben, verwendet.
Die erfindungsgemäßen Sequenzen Euplotes p123, S. pombe trt1
und S. cerevisiae Est2p wurden bei der Suche in computeri
sierten Datenbanken von menschlichen exprimierten Sequenzen
"tags" (ESTs) unter Verwendung des Programms "BLAST"
(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215 (1990), 403) verwendet.
Die Suche in dieser Datenbank mit der Est2p-Sequenz ergab
keine Übereinstimmung, ein menschliches EST (Genbank-Zu
gangsnummer AA281296; siehe SEQ. ID. Nr. 8) konnte jedoch
wie in Beispiel 1 beschrieben durch Suche mit p123- und
trt1-Sequenzen identifiziert werden. Dieses menschliche EST
codiert vermutlich ein homologes Protein. Die vollständige
Sequenzierung des cDNA-Clons, der das EST enthält
(nachstehend als "Clon 712562" bezeichnet; siehe SEQ. ID.
Nr. 3) zeigte das Vorhandensein von sieben RT-Motiven. Die
ser Clon konnte jedoch ein zusammenhängendes menschliches
TRT nicht codieren, da die Motive B', C, D und E im Ver
gleich zu den mehr NH2-terminal gelegenen Motiven in einem
unterschiedlichen offenen Leserahmen (ORF) enthalten waren.
Darüber hinaus war der Abstand zwischen den Motiven A und B'
wesentlich geringer als bei den bereits charakterisierten
TRTs. (Clon 712562 wurde von dem I.M.A.G.E.-Consortium er
halten; Lennon et al., Genomics 33 (1996), 151).
Der cDNA-Clon pGRN121, der ein funktionales hTRT codiert
(SEQ. ID. Nr. 1) wurde aus einer cDNA-Bank isoliert, die von
der humanen Zellinie 293 stammte (siehe Beispiel 1). Der
Vergleich des Clons 712562 mit pGRN121 ergab, daß Clon
712562 zwischen den Motiven A und B' eine Deletion von 182
Basenpaaren (SEQ. ID. Nr. 9) aufweist. Die in pGRN121 zu
sätzlich vorhandenen 182 Basenpaare führen dazu, daß alle
TRT-Motive in einem einzigen offenen Leserahmen vorhanden
sind, und daß sich der Abstand zwischen den Bereichen des
Motivs A und des Motivs B' so vergrößert, daß dies kon
sistent ist mit dem Abstand bei anderen bekannten TRTs. Wie
nachstehend in den Beispielen beschrieben (z. B. Beispiel 7)
codiert SEQ. ID. Nr. 1 ein katalytisch aktives Telomerase-
Protein mit der Sequenz von SEQ. ID. Nr. 2. Das Polypeptid
von SEQ. ID. Nr. 2 weist 1132 Aminosäuren und ein geschätz
tes Molekulargewicht von etwa 127 Kilodaltons (kD) auf.
Wie nachstehend diskutiert und in Beispiel 9 beschrieben,
werden die für den Clon 712562 charakteristische Deletion
von 182 Basenpaaren aufweisende TRT-cDNAs im Anschluß an die
reverse Transkription von mRNA aus Telomerase-positiven Zel
len (z. B. Testes- und 293-Zellen) nachgewiesen. hTRT-RNAs,
denen diese Sequenz von 182 Basenpaaren fehlt, werden allge
mein als "Δ182-Varianten" bezeichnet und diese können eine,
zwei oder mehrere Spezies repräsentieren. Die hTRT-Varian
ten, denen die in der pGRN121-cDNA (SEQ. ID. Nr. 1) gefun
dene Sequenz von 182 Basenpaaren fehlt, codieren zwar
höchstwahrscheinlich kein Telomerase-Enzym mit vollständiger
katalytischer Aktivität, sie können jedoch eine Rolle bei
der Telomerase-Regulation, wie nachstehend beschrieben,
spielen und/oder partielle Telomerase-Aktivität aufweisen,
beispielsweise eine Aktivität für die Telomer-Bindung oder
hTR-Bindung, wie nachstehend diskutiert.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht somit in der
Bereitstellung eines isolierten Polynucleotids mit einer Se
quenz eines natürlich vorkommenden menschlichen TRT-Gens
oder einer mRNA, wobei ein Polynucleotid mit der Sequenz von
SEQ. ID. Nr. 1 eingeschlossen ist, allerdings ohne jedoch
darauf beschränkt zu sein. Ein verwandter Aspekt der vorlie
genden Erfindung betrifft die Bereitstellung eines Poly
nucleotids, das ein hTRT-Protein codiert, ein Fragment, eine
Variante oder ein Derivat. Ein weiterer verwandter Aspekt
der vorliegenden Erfindung betrifft die Bereitstellung von
"sense"- und "antisense"-Nucleinsäuren, die an ein hTRT-Gen
oder mRNA binden. Die vorliegende Erfindung stellt ferner
hTRT-Proteine bereit, die entweder synthetisiert oder von
natürlichen Quellen gereinigt wurden, sowie Antikörper und
weitere Agenzien, die spezifisch ein hTRT-Protein oder ein
Fragment davon binden. Die vorliegende Erfindung stellt auch
viele neue Verfahren bereit, zu denen Verfahren gehören, die
die vorstehend erwähnten Zusammensetzungen verwenden, bei
spielsweise durch Bereitstellung von diagnostischen und pro
gnostischen Assays bezüglich menschlicher Erkrankungen, Ver
fahren zur Entwicklung von Arzneimitteln und therapeutischen
Verfahren, zur Identifizierung von Telomerase-assoziierten
Proteinen und Verfahren zum Screenen nach Agenzien, die Te
lomerase-Aktivität aktivieren oder hemmen können. Zahlreiche
weitere Aspekte und Ausführungsformen der vorliegenden Er
findung werden nachstehend bereitgestellt.
Ein Aspekt der Erfindung ist die Verwendung eines
Polynucleotids, das eine Länge von etwa 10 kb oder mehr
aufweist, und eine aufeinanderfolgende Sequenz von
mindestens 10 Nucleotiden umfaßt, die zu einer
aufeinanderfolgenden Sequenz in einem natürlich vorkommenden
hTRT-Gen oder einer hTRT-mRNA identisch oder genau
komplementär ist zum Untersuchen oder dem Screenen (nach)
einer hTRT-Gensequenz oder einer hTRT-mRNA oder zur
Herstellung einer rekombinanten Wirtszelle. Ein weiterer
Aspekt der Erfindung ist die Verwendung eines Agens, das die
Expression von hTRT erhöht, zur Herstellung eines
Arzneimittels zur Behandlung eines Zustands, der durch die
Erhöhung der Proliferationskapazität einer Vertebratenzelle
behandelt wird, wobei gegebenenfalls das Arzneimittel zur
Hemmung der Auswirkungen des Alterns verwendet wird.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung
eines Inhibitors von Telomerase-Aktivität bei der
Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Zustands,
der mit einem erhöhten Spiegel an Telomerase-Aktivität
innerhalb einer menschlichen Zelle assoziiert ist. Die
erfindungsgemäßen Proteine, Varianten und Fragmente und die
codierenden Polynucleotide oder Fragmente, werden auch in
einem weiteren Aspekt dieser Erfindung zur Verwendung als
Arzneimittel bereitgestellt.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung eines Proteins,
einer Variante oder eines Fragments davon oder eines
Polynucleotids oder Fragments, wie hier definiert, bei der
Herstellung eines Medikaments, beispielsweise bei der
Herstellung eines Medikaments zur Hemmung eines Effekts des
Alterns oder von Krebs.
In bestimmten erfindungsgemäßen Ausführungsformen sind die
hTRT-Polynucleotide nicht das Polynucleotid mit 389
Nucleotiden von SEQ. ID. Nr. 8 und/oder nicht Clon 712562,
das Plasmid, das eine Insertion enthält mit der Sequenz von
SEQ. ID. Nr. 3 in Fig. 18.
Die nachstehende Beschreibung ist nach Themen aufgebaut.
Teil II beschreibt weitere für TRT-Proteine charakteristi
sche Aminosäuremotive. Die Teile III bis VI beschreiben un
ter anderem Nucleinsäuren, Proteine, Antikörper und gerei
nigte Zusammensetzungen der Erfindung, wobei der Schwerpunkt
auf mit menschlicher TRT verwandten Zusammensetzungen liegt.
Teil VII beschreibt unter anderem Verfahren und Zusammen
setzungen der Erfindung, die zur Behandlung von menschlichen
Erkrankungen von Nutzen sind. Teil VIII beschreibt die Her
stellung und Identifizierung von immortalisierten menschli
chen Zellinien. Teil IX beschreibt unter anderem die Verwen
dung der erfindungsgemäßen Nucleinsäuren, Polynucleotide und
weiterer Zusammensetzungen zur Diagnose von menschlichen Er
krankungen. Teil X ist ein Glossar der in den Teilen I bis
IX verwendeten Bezeichnungen. Teil XI beschreibt Beispiele,
die sich auf spezifische erfindungsgemäße Ausführungsformen
beziehen. Die Beschreibung der Erfindung ist nach Themen und
Unterthemen gegliedert, um den Stoff verständlicher zu ma
chen, stellt jedoch in keiner Weise eine Einschränkung dar.
Die vorliegende Erfindung stellt isolierte und/oder rekom
binante Gene und Proteine bereit, die eine Sequenz einer ka
talytischen Untereinheit des Telomerase-Proteins (d. h. Telo
merase-reverse-Transkriptase) aufweisen, wozu, allerdings
ohne Beschränkung darauf, die natürlich vorkommenden Formen
solcher Gene und Proteine in isolierter oder rekombinanter
Form gehören. Typischerweise sind TRTs große, basische Pro
teine mit für reverse Transkriptase (RT) und Telomerase-spe
zifischen Aminosäuremotiven, so wie dies hier offenbart ist.
Da diese Motive innerhalb unterschiedlicher Organismen kon
serviert sind, können TRT-Gene zahlreiche Organismen unter
Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren oder unter Ver
wendung erfindungsgemäßer Primer, Nucleinsäuresonden und An
tikörpern, beispielsweise solcher, die für ein oder mehrere
der Motivsequenzen spezifisch sind, erhalten werden.
Die sieben in TRTs gefundenen RT-Motive ähneln zwar den in
anderen reversen Transkriptasen gefundenen, weisen jedoch
besondere Kennzeichen auf. Beispielsweise gibt es innerhalb
der TRT-RT-Motive wie in Fig. 4 gezeigt, eine Reihe von
Aminosäuresubstitutionen (mit Pfeil markiert) in Aminosäure
resten, die innerhalb der anderen RTs hoch konserviert sind.
Beispielsweise kommen die zwei Asparaginsäurereste (DD) im
Motiv C, die die Metallionen im aktiven Zentrum koordinieren
(siehe Kohlstaedt et al., Science 256 (1992), 1783; Jacobo-
Molina et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993), 6320;
Patel et al., Biochemistry 34 (1995), 5351) in dem Kontext
hxDD(F/Y) in den RTs von Telomerase vor, während diese in
den anderen RTs im Kontext (F/Y)xDDh vorkommen, wobei h eine
hydrophobe Aminosäure ist und "x" eine beliebige Aminosäure
ist; siehe Xiong et al., EMBO J. 9 (1990) 3353; Eickbush, in
The Evolutionary Biology of Viruses (S. Morse Herausg.
Raven-Press, NY, S. 121 (1994)). Weitere für die Telomerase-
Untergruppen charakteristische systematische Austausche kom
men in dem Motiv E vor, in dem WxGxSx eine "Consensus"-Se
quenz darstellt oder innerhalb der Telomerase-Proteine
konserviert ist, während hLGxxh für andere RTs charakteri
stisch ist (Xiong et al., a.a.O; Eickbush, a.a.O.). Dieses
Motiv E wird als der "Primer-Griff" (primer-grip) bezeichnet
und es wurde beschrieben, daß Mutationen in diesem Bereich
das "RNA-Priming" beeinflussen, jedoch nicht das "DNA-Pri
ming" (Powell et al., J. Biol. Chem. 272 (1997), 13262).
Da Telomerasen einen DNA-Primer, (z. B. das 3'-Ende des Chro
mosoms) benötigen, ist es nicht überraschend, daß sich Telo
merase von anderen RTs im Bereich des "Primer-Griffs" unter
scheidet. Darüber hinaus ist die Entfernung zwischen den Mo
tiven A und B' in den TRTs größer wie dies typischerweise in
den anderen RTs der Fall ist, wobei dies eine Insertion in
nerhalb des "Finger"-Bereichs der Struktur, die einer rech
ten Hand ähnelt, darstellen kann (Fig. 3; siehe Kohlstaedt
et al., a.a.O.; Jacobo-Molina et al., a.a.O.; und Patel et
al., a.a.O.).
Weiterhin ist das T-Motiv, wie vorstehend erwähnt, ein zu
sätzliches Kennzeichen von TRT-Proteinen. Das beispielsweise
in den Fig. 4 gezeigte T-Motiv (W-L-X-Y-X-X-h-h-X-h-h-X-p-
F-F-Y-X-T-E-X-p-X-X-X-p-X-X-X-Y-X-R-K-X-X-W, wobei X eine
beliebige Aminosäure ist, h hydrophob und p polar ist) um
faßt eine Sequenz, die unter Verwendung der folgenden Formel
beschrieben werden kann:
Trp-R1-X7-R1-R1-R2-X-Phe-Phe-Tyr-X-Thr-Glu-
X8-9-R3-R3-Arg-R4-X2-Trp
wobei X eine beliebige Aminosäure ist und die tiefgestellte
Zahl sich auf eine Zahl von aufeinanderfolgenden Resten be
zieht, R1 Leucin oder Isoleucin ist, R2 Glutamin oder Argi
nin, R3 Phenylalanin oder Tyrosin und R4 Lysin oder Histidin
ist.
Das T-Motiv kann auch unter Verwendung der folgenden Formel
beschrieben werden:
Trp-R1-X4-h-h-X-h-h-R2-p-Phe-Phe-Tyr-X-Thr-Glu-
X-p-X3-p-X2-3-R3-R3-Arg-R4-X2-Trp
wobei X eine beliebige Aminosäure ist und sich eine tiefge
stellte Zahl auf eine Anzahl von aufeinanderfolgenden Resten
bezieht, R1 Leucin oder Isoleucin ist, R2 Glutamin oder Ar
ginin, R3 Phenylalanin oder Tyrosin, R4 Lysin oder Histidin,
h eine hydrophobe Aminosäure ausgewählt als Ala, Leu, Ile,
Val, Pro, Phe, Trp, und Met und p eine polare Aminosäure
ausgewählt als Gly, Ser, Thr, Tyr, Cys, Asn und Gln ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Er
findung isolierte, natürlich vorkommende und rekombinante
TRT-Proteine bereit, die eines oder mehrere der in Fig. 11
dargestellten Motive umfassen, beispielsweise,
Motiv T W-X12-FFY-X-TE-X10-11-R-X3-W-X7-I
Motiv T' E-X2-V-X
Motiv 1 X3-R-X2-PK-X3
Motiv 2 X-R-X-I-X
Motiv A X4-F-X3-D-X4-YD-X2
Motiv B' Y-X4-G-X2-QG-X3-S-X8
Motiv C X6-DD-X-L-X3.
Motiv T W-X12-FFY-X-TE-X10-11-R-X3-W-X7-I
Motiv T' E-X2-V-X
Motiv 1 X3-R-X2-PK-X3
Motiv 2 X-R-X-I-X
Motiv A X4-F-X3-D-X4-YD-X2
Motiv B' Y-X4-G-X2-QG-X3-S-X8
Motiv C X6-DD-X-L-X3.
Wenn das gezeigte TRT-Protein mehr als ein TRT-Motiv ent
hält, ist die Reihenfolge (NH2→COOH) wie in Fig. 4 ge
zeigt.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Er
findung isolierte, natürlich vorkommende TRT-Proteine be
reit, die folgendes Supermotiv umfassen:
(NH2)-X300-600-W-X12-FFY-X-TE-X10-11R-X3-W-X7-I-X5-20-E-X2-V-X-X5-20-X3-R-X2-
PK-X4-10-R-X-I-X-X60-80-X4-F-X3-D-X4YD-X2-X80-130-Y-X4-G-X2-QG-X3-S-X-8-X5-35-
X6-DD-X-L-X3-X10-20-X12-K.
Es ist für den Fachmann, der über die hier offenbarten Rea
genzien, einschließlich der TRT-Sequenzen verfügt, offen
sichtlich, daß mit diesen Reagenzien und den hier bereitge
stellten Verfahren und Lehren (einschließlich spezifischer
nachstehend beschriebenen Verfahrensweisen) TRT-Gene und
-Proteine vom Fachmann erhalten, isoliert und in rekombinan
ter Form hergestellt werden können. Beispielsweise werden
Primer (z. B. degenerierte Amplifikationsprimer) bereitge
stellt, die mit Gensequenzen hybridisieren, die für TRT cha
rakteristische RT- und T-Motive codieren. Beispielsweise
können einer oder mehrere Primer oder degenerierte Primer
hergestellt werden, die mit Sequenzen hybridisieren, die den
FFYXTE-Bereich des T-Motivs, weitere TRT-Motive (wie nach
stehend diskutiert) oder Kombinationen von Motiven oder
"Consensus"-Sequenzen codieren, basierend auf der Codon-Ver
wendung des Zielorganismus, und zur Amplifikation der TRT-Gen
sequenz aus genomischer DNA oder cDNA, die von dem Ziel
organismus hergestellt wurde, verwendet werden. Die Verwen
dung von degenerierten Primern ist auf dem Fachgebiet gut
bekannt. Dazu gehören auch Primersätze, die mit dem Satz von
Nucleinsäuresequenzen hybridisieren, die möglicherweise die
Aminosäuren des Zielmotivs codieren. Dabei muß die Bevorzu
gung und Verwendung bestimmter Codons innerhalb des Zielor
ganismus in Erwägung gezogen werden. Dabei werden auch Am
plifikations- (z. B. PCR)-Bedingungen angewandt, die geeignet
sind, Fehlpaarungen von Basen bei den Anlagerungsschritten
der PCR zu erlauben. Typischerweise werden zwei Primer ver
wendet, Amplifikationssysteme mit einem einzigen Primer
(oder in diesem Fall ein Satz mit einem einzelnen degene
rierten Primer) sind allgemein bekannt, und diese können
auch zum Erhalt von TRT-Genen verwendet werden.
Tabelle 1 zeigt Beispiele von erfindungsgemäßen Primern, die
zur Amplifikation neuer TRT-Nucleinsäuren, insbesondere sol
chen aus Vertebraten (z. B. Säuger), verwendet werden können.
"N" ist ein äquimolares Gemisch aller vier Nucleotide und
Sequenzen in Klammern stellen äquimolare Gemische der ange
gebenen Nucleotide dar.
Tabelle 1
Beispiele degenerierter Primer zur Amplifikation von TRT-Nuclein
säuren
In einer Ausführungsform wird eine amplifizierte TRT-Nuclein
säure als Hybridisierungssonde zur Kolonie-Hybridi
sierung mit einer Genbank (z. B. einer cDNA-Bank), die aus
dem Zielorganismus hergestellt wurde, verwendet, wobei eine
Nucleinsäure mit der das gesamte TRT-Protein oder einen we
sentlichen Anteil davon codierende Sequenz identifiziert und
isoliert oder cloniert wird. Reagenzien und Verfahren, wie
beispielsweise die gerade beschriebenen, werden in Überein
stimmung mit den hier beschriebenen Verfahren zum Erhalt von
TRT-Gensequenzen aus Oxytricha trifallax und Tetrahymena
thermophila, wie nachstehend ausführlich beschrieben, ver
wendet. Natürlich kann im Anschluß an die Clonierung eines
bisher nicht charakterisierten TRT-Gens die Sequenz durch
Routineverfahren bestimmt und das codierte Polypeptid syn
thetisiert und auf eine TRT-Aktivität, beispielsweise der
katalytischen Aktivität von Telomerase, untersucht werden
(wie hier beschrieben und/oder mittels auf dem Fachgebiet
bekannter Telomerase-Assays).
Es ist für den Fachmann auch offensichtlich, daß TRT-Gene
unter Verwendung einer Vielzahl von erfindungsgemäßen Clo
nierungsverfahren cloniert werden können, da die TRT-Motiv
sequenzen und die solche Sequenzen umfassenden erfindungsge
mäßen Nucleinsäuren in einer großen Anzahl solcher Verfahren
verwendet werden können. Beispielsweise kann Hybridisierung
unter Verwendung einer Sonde, die auf der Sequenz einer be
kannten TRT basiert mit DNA- oder weiteren Nucleinsäure-Ban
ken aus dem Zielorganismus, wie in Beispiel 1 beschrieben,
verwendet werden. Degenerierte PCR-Primer oder ihre Amplifi
kationsprodukte, beispielsweise die vorstehend beschriebe
nen, können selbst markiert sein und als Hybridisierungsson
den verwendet werden. In einer weiteren Ausführungsform wer
den Expressionsclonierungs-Verfahren angewandt. Beispiels
weise können einer oder mehrere Antikörper, die Peptide spe
zifisch binden, die ein TRT-Motiv oder ein anderes TRT-Epi
top umspannen, beispielsweise das FFYXTE-Motiv (wobei X
eine beliebige der 20 Standard-Aminosäuren darstellt) spezi
fisch binden, zur Isolation eines ribosomalen Komplexes ver
wendet werden, der ein TRT-Protein und die dieses codierende
mRNA umfaßt. Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Antikör
per weisen die Peptid-Immunogene typischerweise eine Länge
von 6 bis 30 Aminosäuren auf, bevorzugt 10 bis 20 Aminosäu
ren. Die Antikörper können auch zum Absuchen einer cDNA-Ex
pressionsbank, die von dem gewünschten Organismus stammt,
zur Identifikation eines eine TRT-Sequenz codierenden Clons
verwendet werden. In einer weiteren Ausführungsform können
zur Identifikation eines eine TRT-Sequenz codierten Clons
DNA-Datenbanken per Computer nach DNAs durchsucht werden,
die innerhalb bekannter TRTs konservierte Sequenzen enthal
ten.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die
Bereitstellung von Zusammensetzungen, die ein isoliertes
oder rekombinantes Polypeptid mit der Sequenz eines natür
lich vorkommenden TRT-Proteins umfassen. Üblicherweise hat
die natürlich vorkommende TRT ein Molekulargewicht zwischen
etwa 80 000 Daltons (d) und etwa 150 000 d, bevorzugt zwi
schen etwa 95 000 d und etwa 130 000 d. Typischerweise hat
die natürlich vorkommende TRT bei einem pH-Wert von 7 eine
positive Gesamtladung (wobei der geschätzte pI typischer
weise über 9 liegt). In einer Ausführungsform weist das Po
lypeptid eine wie hier definierte Telomerase-Aktivität auf.
In einer verwandten Ausführungsform weist das Polypeptid
eine Sequenz für einen TRT-spezifischen Bereich (T-Motiv)
auf und eine Telomerase-Aktivität. Die Erfindung stellt fer
ner Fragmente solcher Polypeptide bereit. Die vorliegende
Erfindung stellt außerdem isolierte oder rekombinante Poly
nucleotide mit der Sequenz eines natürlich vorkommenden, ein
TRT-Protein codierenden Gens bereit. Die Erfindung stellt
auch isolierte TRT-Polynucleotide mit einer Sequenz einer
TRT eines Nicht-Vertebraten (z. B. von Hefe) und Vertebraten,
beispielsweise Säugern (z. B. Mäusen oder Menschen) bereit.
Die isolierten Polynucleotide können mit anderen natürlich
vorkommenden oder Vektor-Nucleinsäuresequenzen assoziiert
sein. Typischerweise liegt die Länge der isolierten Nuclein
säure unter etwa 300 kb, bevorzugt unter etwa 50 kb, mehr
bevorzugt unter etwa 20 kb und am meisten bevorzugt unter
etwa 10 kb. Gelegentlich liegt die Länge unter etwa 5 kb
oder 2 kb. In einigen Ausführungsformen ist das isolierte
TRT-Polynucleotid sogar noch kleiner, beispielsweise handelt
es sich dabei um ein Genfragment, einen Primer oder eine
Sonde mit einer Länge unter etwa 1 kb oder 0,1 kb.
Die vorliegende Erfindung stellt isolierte und rekombinante
Nucleinsäuren bereit mit einer Sequenz eines Polynucleotids,
das eine katalytische Untereinheit des Telomerase-Proteins
(TRT) codiert, beispielsweise ein rekombinantes TRT-Gen aus
Euplotes, Tetrahymena, S. pombe oder Menschen. Beispiele für
Polynucleotide sind dargestellt in Fig. 13 (Euplotes), Fig.
15 (S. pombe) und Fig. 16 (Mensch, Genbank-Zugangsnum
mer AF15950). Die vorliegende Erfindung stellt "sense"- und
"anti-sense"-Polynucleotide mit einer TRT-Gensequenz bereit,
dazu zählen auch Sonden, Primer, TRT-Protein-codierende Po
lynucleotide und ähnliches.
Die vorliegende Erfindung stellt Nucleinsäuren bereit mit
einer Sequenz einer katalytischen Untereinheit einer Telome
rase aus Menschen (d. h. hTRT).
Ein Aspekt der Erfindung betrifft die Bereitstellung eines
Polynucleotids mit einer Sequenz oder Untersequenz eines
menschlichen TRT-Gens oder einer RNA. In einer Ausführungs
form besitzt das erfindungsgemäße Polynucleotid eine Sequenz
der SEQ. ID. Nr. 1 (Fig. 16) oder eine Untersequenz davon.
In einer weiteren Ausführungsform weist das Polynucleotid
eine Sequenz der SEQ. ID. Nr. 3 (Fig. 18), SEQ. ID. Nr. 4
(Fig. 20) oder Untersequenzen davon auf. Die Erfindung
stellt auch Polynucleotide mit im wesentlichen zu den hier
offenbarten hTRT-Nucleinsäuresequenzen identischen Sequenzen
bereit, beispielsweise SEQ. ID. Nr. 1 und die weiteren of
fenbarten Sequenzen (z. B. SEQ. ID. Nr. 4, 6 (Fig. 21) und 7
(Fig. 12)). Somit stellt die Erfindung natürlich vorkom
mende Allele der menschlichen TRT-Gene und Varianten der Po
lynucleotidsequenzen bereit mit einer oder mehreren Nucleo
tiddeletionen, Insertionen oder Substitutionen, bezogen auf
eine hier offenbarte hTRT-Nucleinsäuresequenz. Wie nachste
hend beschrieben, können Varianten der Nucleinsäuren unter
Verwendung der nachstehend beschriebenen Rekombinationsver
fahren oder synthetischer Verfahren oder durch andere Mittel
hergestellt werden.
Die Erfindung stellt auch isolierte und rekombinante Poly
nucleotide mit einer Sequenz eines flankierenden Bereichs
eines menschlichen TRT-Gens bereit. Zu diesen Polynucleoti
den zählen solche, die von genomischen Sequenzen von
untranslatierten Bereichen der hTRT-mRNA abstammen. Ein Bei
spiel für eine genomische Sequenz ist SEQ. ID. Nr. 6 (Fig.
21). Wie in Beispiel 4 beschrieben, wurde SEQ. ID. Nr. 6
durch Sequenzierung des Clons λGΦ5, der aus einer menschli
chen Genombank isoliert wurde, erhalten. λGΦ5 enthält eine
Insertion mit einer Länge von 15 Kilobasenpaaren (kbp), die
ungefähr 13 000 Basen 5' zu den hTRT codierenden Sequenzen
einschließen. Dieser Clon enthält hTRT-Promotorsequenzen und
weitere regulatorische Sequenzen des hTRT-Gens (z. B. Enhan
cer).
Die Erfindung stellt auch isolierte und rekombinante Poly
nucleotide mit einer Sequenz aus einem Intronbereich eines
menschlichen TRT-Gens bereit. Ein Beispiel für eine Intron
sequenz ist SEQ. ID. Nr. 7 (siehe Beispiel 3 und Fig. 12).
In einigen Ausführungsformen sind hTRT-Introns in
"Minigenen" zur verbesserten Expression von hTRT-Proteinen
in eukaryotischen Zellen eingeschlossen.
Ein verwandter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft
die Bereitstellung von Polynucleotiden, die hTRT-Proteine
oder Proteinfragmente codieren, dazu zählen modifizierte und
geänderte hTRT-Polypeptide und Varianten der hTRT-Polypep
tide. In einer Ausführungsform weist das codierte hTRT-Pro
tein oder Fragment eine wie in SEQ. ID. Nr. 2 (Fig. 17) ge
zeigte Aminosäuresequenz auf oder eine Aminosäuresequenz mit
konservativen Austauschen der SEQ. ID. Nr. 2. In einer Aus
führungsform weisen das codierte hTRT-Protein oder -Fragment
Austausche auf, die eine Aktivität des Proteins (z. B. kata
lytische Aktivität von Telomerase) aufweisen. Natürlich müs
sen aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes die
das hTRT-Protein codierenden Nucleinsäuren nicht die Sequenz
eines natürlich vorkommenden hTRT-Gens aufweisen, d. h. eine
Vielzahl von Polynucleotiden kann ein hTRT-Polypeptid mit
einer Aminosäuresequenz von SEQ. ID. Nr. 2 codieren. Die
vorliegende Erfindung stellt jede mögliche Variation von
Nucleotidsequenzen bereit, die durch die Auswahl von Kombi
nationen hergestellt werden, die auf der Auswahl möglicher
Codons in Übereinstimmung mit dem bekannten genetischen Tri
plett-Code basieren. All diese Variationen sind hiermit aus
drücklich offenbart. Zwar sind somit in einigen Fällen hTRT-Poly
peptid codierende Nucleotidsequenzen, die mit den
Nucleotidsequenzen der natürlich vorkommenden Sequenz (unter
entsprechend ausgewählten Bedingungen der Stringenz) hybri
disieren können, bevorzugt, es kann jedoch in anderen Fällen
vorteilhaft sein, hTRT-codierende Nucleotidsequenzen herzu
stellen, die eine im wesentlichen unterschiedliche Condon
verwendung aufweisen.
In bestimmten Ausführungsformen stellt die Erfindung hTRT-Oli
go- und -Polynucleotide bereit, die eine Untersequenz ei
ner hier offenbarten hTRT-Nucleinsäure umfassen (z. B. SEQ.
ID. Nr. 1, 4, 6 und 7). Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuren
umfassen typischerweise mindestens etwa 10, bevorzugt minde
stens etwa 12 oder etwa 15 aufeinanderfolgende Basen des er
läuterten hTRT-Polynucleotids auf. Oft umfassen die erfin
dungsgemäßen Nucleinsäuren auch eine längere Sequenz, bei
spielsweise eine Sequenz mit einer Länge von mindestens etwa
25, etwa 50, etwa 100, etwa 200 oder mindestens etwa 500 Ba
sen, beispielsweise wenn die Expression eines Polypeptids
angestrebt wird. In einigen Ausführungsformen der vorliegen
den Erfindung unterscheidet sich das hTRT-Polynucleotid von
einem Polynucleotid mit der Sequenz von EST AA281296 (SEQ.
ID. Nr. 8).
Weitere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung stellen
"Δ182hTRT"-Polynucleotide bereit mit einer Sequenz, die na
türlich vorkommende oder nicht natürlich vorkommende hTRT-Poly
nucleotide codieren, beispielsweise SEQ. ID. Nr. 3 oder
SEQ. ID. Nr. 4, die nicht die in pGRN121 aufgefundene 182
Basenpaarsequenz (SEQ. ID. Nr. 9 (Fig. 24)), die in Clon
712562 ebenfalls fehlt) enthalten. Diese Polynucleotide sind
teilweise von Interesse, da sie Polypeptide codieren, die
Kombinationen von TRT-Motiven enthalten, die sich von dem in
hTRT-Polypeptid mit vollständiger Länge gefundenen (SEQ. ID.
Nr. 2), beispielsweise dem von pGRN121 codierten Polypeptid,
unterscheiden. Wie nachstehend diskutiert, wird davon ausge
gangen, daß diese Polypeptide in der Natur eine biologische
Rolle spielen können (z. B. bei de 99999 00070 552 001000280000000200012000285919988800040 0002019743497 00004 99880r Regulation der Expression
von Telomerase in Zellen) und/oder als Arzneimittel Verwen
dung finden können (z. B. als dominant-negative Produkte, die
die Funktion des Wildtyp-Proteins hemmen) oder daß diese Po
lypeptide weitere Rollen und Verwendungen, beispielsweise
die hier beschriebenen, aufweisen.
Beispielsweise codiert Clon 712562 im Gegensatz zu dem Clon
pGRN121 ein Protein mit 259 Aminosäureresten und einem ge
schätzten Molekulargewicht von ungefähr 30 kD (nachstehend
als "712562 hTRT" bezeichnet. Das 712562 hTRT-Polypeptid
(SEQ. ID. Nr. 10 (Fig. 19)) enthält die Motive T, 1, 2 und
A, jedoch nicht die Motive B', C, D und E. In ähnlicher
Weise kann eine Variante des hTRT-Polypeptids mit therapeu
tischen und weiteren Aktivitäten von einer Nucleinsäure ex
primiert werden, die der pGRN121-cDNA gleicht, der jedoch
die 182 Basenpaare fehlen, die der Clon 712562 nicht auf
weist, beispielsweise mit der Sequenz SEQ. ID. Nr. 4. Diese
Nucleinsäure (nachstehend mit "pro90hTRT" bezeichnet), die
unter Verwendung von Routine-Syntheseverfahren oder rekom
binanten Verfahren, wie sie hier beschrieben sind, syntheti
siert werden kann, codiert ein Protein mit 807 Aminosäure
resten (geschätztes Molekulargewicht etwa 90 kD) das diesel
ben Amino-terminalen Sequenzen wie das von SEQ. ID. Nr. 1
codierte hTRT-Protein aufweist, jedoch am Carboxy-terminalen
Bereich abweicht (die ersten 763 Aminosäurereste haben beide
Proteine gemeinsam, die letzten 44 Aminosäurereste von
pro90hTRT unterscheiden sich von dem hTRT mit vollständiger
Länge). Das pro90hTRT-Polypeptid enthält die Motive T, 1, 2
und A, nicht jedoch die Motive B, C, D und E und kann daher
einige, jedoch nicht alle Telomerase-Aktivitäten aufweisen.
Für die erfindungsgemäßen Polynucleotide ergeben sich zahl
reiche Anwendungen. Dazu zählen, allerdings ohne Beschrän
kung darauf, die Expression von Polypeptiden, die hTRT oder
Fragmente davon codieren, die Verwendung als "sense"- oder
"antisense"-Sonden oder Primer zur Hybridisierung und/oder
Amplifikation von natürlich vorkommenden hTRT-Genen oder
RNAs (z. B. für diagnostische oder prognostische Anwendungen)
und als Arzneimittel (z. B. in "antisense"-, Triplex- oder
Ribozym-Zusammensetzungen). Nach Lektüre dieser Offenbarung
ist offensichtlich, daß diese Anwendungsmöglichkeiten eine
gewaltige Auswirkung auf die Diagnose und die Behandlung von
menschlichen Erkrankungen, die sich auf Alterung, Krebs und
Fruchtbarkeit beziehen, und darüber hinaus auf das Wachstum,
die Reproduktion und die Herstellung von Produkten, die auf
Zellen basieren, haben. Wie in den nachstehenden Abschnitten
beschrieben, können die erfindungsgemäßen hTRT-Nucleinsäuren
unter Verwendung bekannter Techniken (z. B. durch Clonierung,
Synthese oder Amplifikation) hergestellt werden.
In einer Ausführungsform werden hTRT-Gene oder cDNAs unter
Verwendung einer Nucleinsäuresonde cloniert, die an hTRT-mRNA,
cDNA oder genomische DNA spezifisch hybridisiert. Eine
für diesen Zweck geeignete Probe ist ein Polynucleotid mit
der Sequenz, die in SEQ. ID. Nr. 1 bereitgestellt wird oder
eine Untersequenz davon. Typischerweise wird die genomische
DNA oder cDNA mit dem Ziel-hTRT in einen Vektor ligiert
(z. B. ein Plasmid, Phage, Virus, künstliches Hefechromosom
etc.) und sie kann in einer genomischen Bank oder cDNA-Bank
(z. B. einer cDNA-Bank von menschlicher Plazenta) gefunden
werden. Nachdem eine hTRT-Nucleinsäure identifiziert ist,
kann sie gemäß dem Fachmann bekannten Standardverfahren iso
liert werden. Ein das Screenen einer menschlichen cDNA-Bank
nach dem hTRT-Gen veranschaulichendes Beispiel ist Beispiel
1; ein ähnliches Beispiel, das sich auf das Screenen einer
menschlichen genomischen Bank bezieht, ist Beispiel 4. Clo
nierungsverfahren sind allgemein bekannt und beispielsweise
in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
2nd Ed., Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, ( 1989);
Berger und Kimmel, Methods In Enzymology, Vol. 152: Guide To
Molecular Cloning Techniques, San Diego: Academic Press,
Inc. (1987); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular
Biology, Green Publishing and Wiley-Interscience, New York
(1997); Cashion et al., US-Patent Nr. 5 017 478; und Carr.
EP-B1-0 246 864, beschrieben.
Die Erfindung stellt ferner genomische hTRT-Nucleinsäuren
oder cDNA-hTRT-Nucleinsäuren zur Verfügung, die durch Ampli
fikationsverfahren wie z. B. die Polymerasekettenreaktion
(PCR), isoliert wurde, zur Verfügung. In einer Ausführungs
form wird die das hTRT-Protein codierende Sequenz aus einer
RNA-Probe oder cDNA-Probe amplifiziert (z. B. doppelsträngige
Plazenta-cDNA (Clontech, Palo Alto CA)) unter Verwendung der
Primer
5'-GTGAAGGCACTGTTCAGCG-3' ("TCP1.1") und
5'-CGCGTGGGTGAGGTGAGGTG-3 ("TCP1.15").
5'-GTGAAGGCACTGTTCAGCG-3' ("TCP1.1") und
5'-CGCGTGGGTGAGGTGAGGTG-3 ("TCP1.15").
In einigen Ausführungsformen kann ein dritter Primer oder
ein zweites Primerpaar verwendet werden, beispielsweise für
"nested PCR" zur Erhöhung der Spezifität. Ein Beispiel eines
zweiten Primerpaares ist
5'-CTGTGCTGGGCCTGGACGATA-3' ("billTCP6") und
5'-AGCTTGTTCTCCATGTCGCCGTAG-3' ("TCP1.14").
5'-CTGTGCTGGGCCTGGACGATA-3' ("billTCP6") und
5'-AGCTTGTTCTCCATGTCGCCGTAG-3' ("TCP1.14").
Für den Fachmann ist es offensichtlich, daß zahlreiche an
dere Primer und Primerkombinationen, die für die Amplifika
tion von hTRT-Nucleinsäuren von Nutzen sind, durch die vor
liegende Erfindung bereitgestellt werden.
Darüber hinaus stellt die Erfindung Primer zur Verfügung,
die einen beliebigen spezifischen Bereich amplifizieren
(beispielsweise codierende Bereiche, Promotorbereiche
und/oder Introns) oder eine Untersequenz genomischer hTRT-DNA,
cDNA oder RNA. Beispielsweise kann das hTRT-Intron an
der Position 274/275 von SEQ. ID. Nr. 1 (siehe Beispiel 3)
amplifiziert werden (z. B. zum Nachweis genomischer Clone)
unter Verwendung der Primer TCP1.57 und TCP1.52 (Primerpaar
1) oder der Primer TCP1.49 und TCP1.50 (Primerpaar 2). (Die
Bezeichnungen für die Primer beziehen sich auf die in der
nachstehenden Tabelle 2 aufgelisteten Primer). Die Primer
paare können individuell oder in einer "nested PCR" verwen
det werden, in der der Primersatz 1 zuerst verwendet wird.
Ein weiteres veranschaulichendes Beispiel bezieht sich auf
Primer, die spezifisch das 5'-Ende der hTRT-mRNA oder das
Exon, das das 5'-Ende des hTRT-Gens codiert, amplifizieren
und somit nachweisen (z. B. um die Größe oder die Vollstän
digkeit eines cDNA-Clons zu beurteilen). Die folgenden Pri
merpaare sind zur Amplifikation des 5'-Endes von hTRT von
Nutzen: Primer K320 und K321 (Primerpaar 3); Primer K320 und
TCP1.61 (Primerpaar 4); Primer K320 und K322 (Primerpaar 5).
Die Primersätze können in einer "nested PCR" in der
Reihenfolge Satz 5, dann Satz 4 oder Satz 3, oder Satz 4 und
dann Satz 3 verwendet werden. Ein weiteres veranschaulichen
des Beispiel betrifft Primer, die zur spezifischen
Amplifikation oder zum spezifischen Nachweis des konser
vierten hTRT-TRT-Motivbereichs ausgewählt wurden, der etwa
das mittlere Drittel der mRNA umfaßt (z. B. zur Verwendung
als Hybridisierungssonde zur Identifizierung von TRT-Clonen
aus nicht-menschlichen Organismen). Die folgenden Primer
paare sind zur Amplifikation des TRT-Motivbereichs von hTRT-Nuclein
säuren von Nutzen: Primer K304 und TCP1.8 (Primerpaar
6), oder Primer LT1 und TCP1.15 (Primerpaar 7). Die
Primersätze können in einem Experiment mit "nested PCR" in
der Reihenfolge Satz 6, dann Satz 7 verwendet werden.
Geeignete Bedingungen für die PCR-Amplifikation sind dem
Fachmann bekannt. Dazu gehören (ohne Beschränkung darauf) 1
Einheit Taq-Polymerase (Perkin Elmer, Norwalk CT), jeweils
100 µM dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 1 × PCR-Puffer (50 mM
KCl, 10 mM Tris, pH-Wert 8,3 bei Raumtemperatur, 1,5 mM
MgCl2, 0,01% Gelatine) und 0,5 µM Primer, wobei die Ampli
fikation etwa 30 Cyclen bei 94°C für 45 Sekunden, 55°C für
45 Sekunden und 72°C für 90 Sekunden umfaßt. Es ist für den
Fachmann offensichtlich, daß andere thermostabile DNA-Poly
merasen, Reaktionsbedingungen und Parameter bezüglich der
Cyclen ebenfalls eine geeignete Amplifikation liefern. Wei
tere geeignete Verfahren für die Amplifikation in vitro, die
zum Erhalt von hTRT-Nucleinsäuren verwendet werden können,
umfassen, jedoch ohne Beschränkung darauf, die nachstehend
beschriebenen Verfahren. Nach Amplifikation können die hTRT-Nuclein
säuren, falls erwünscht, unter Verwendung von Routi
neverfahren der Molekularbiologie in einer Vielzahl von Vek
toren cloniert werden, nachgewiesen oder auf andere Art und
Weise in Übereinstimmung mit den erfindungsgemäßen Verfahren
angewandt werden.
Es ist dem Fachmann bewußt, daß die wie vorstehend beschrie
ben erhaltenen clonierten oder amplifizierten hTRT-Nuclein
säuren unter Verwendung weiterer Verfahren hergestellt oder
vermehrt werden können, beispielsweise durch chemische Syn
these oder Replikation durch Transformation in bakterielle
Systeme wie beispielsweise E. coli (siehe beispielsweise
Ausubel et al., a.a.O.) oder eukaryotische Expressions
systeme, beispielsweise Säuger-Expressionssysteme. In ähnli
cher Weise kann hTRT-RNA in Übereinstimmung mit den erfin
dungsgemäßen in vitro-Verfahren oder in bakteriellen Syste
men wie E. coli exprimiert werden, beispielsweise ohne Ver
wendung von im Handel erhältlichen Vektoren, die Promotoren
enthalten, die von einer RNA-Polymerase erkannt werden, wie
beispielsweise T7, T3 oder SP6 oder durch Transkription von
DNA, die durch PCR-Amplifikation erzeugt wurde, unter Ver
wendung von Primern, die einen RNA-Polymerase-Promotor ent
halten.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner veränderte oder mo
difizierte hTRT-Nucleinsäuren bereit. Für den Fachmann ist
es offensichtlich, daß die erhaltenen clonierten oder ampli
fizierten hTRT-Nucleinsäuren durch allgemein bekannte Ver
fahren (z. B. ortsgerichtete Mutagenese, "Linker-Scanning"-
Mutagenese) modifiziert werden können, beispielsweise ver
kürzt, derivatisiert, verändert), oder einfach de novo, wie
nachstehend beschrieben, synthetisiert werden können. Die
veränderten oder modifizierten hTRT-Nucleinsäuren sind für
eine Vielzahl von Anwendungsmöglichkeiten von Nutzen, zu
denen ohne Beschränkung darauf die Erleichterung der Clonie
rung, die Manipulation eines hTRT-Gens oder Genprodukts oder
die Expression einer Variante eines hTRT-Genprodukts gehö
ren. In einer Ausführungsform wird beispielsweise die hTRT-Gen
sequenz so verändert, daß sie ein hTRT-Polypeptid mit
veränderten Eigenschaften oder Aktivitäten codiert, wie dies
ausführlich nachstehend diskutiert wird, beispielsweise
durch Mutation in einem konservierten Motiv von hTRT. In ei
nem weiteren veranschaulichenden Beispiel können die Muta
tionen in dem das Protein codierenden Bereich einer hTRT-Nuclein
säure zur Veränderung des Glykosylierungsmusters, zur
Veränderung von Codon-Präferenzen, zur Herstellung von
Spleiß-Varianten, zur Entfernung von Protease-empfindlichen
Stellen, zur Erzeugung von antigenen Domänen, zur Modifika
tion der spezifischen Aktivität etc. eingeführt werden. In
weiteren Ausführungsformen wird die hTRT und seine Derivate
codierende Sequenz ohne Änderung der codierten Aminosäurese
quenzen verändert, beispielsweise zur Herstellung von RNA-Transkrip
ten mit mehr erwünschten Eigenschaften, wie bei
spielsweise erhöhte Translationeffizienz oder eine größere
oder kürzere Halbwertszeit im Vergleich zu Transkripten, die
von der natürlich vorkommenden Sequenz hergestellt wurden.
In einer weiteren Ausführungsform werden zur Erhöhung der
Expressionsrate des Peptids in einem speziellen prokaryoti
schen oder eukaryotischen Expressionswirt gemäß der Fre
quenz, mit der bestimmte Codons von dem Wirt verwendet wer
den, veränderte Codons ausgewählt. Nützliche in vitro und in
vivo-Rekombinationsverfahren, die zur Herstellung der erfin
dungsgemäßen hTRT-Polynucleotidvarianten verwendet werden
können, können in Sambrook et al. und Ausubel et al.,
a.a.O., gefunden werden.
Wie bereits vorstehend erwähnt, stellt die vorliegende Er
findung Nucleinsäuren mit flankierenden (5' oder 3') und In
tron-Sequenzen des hTRT-Gens bereit. Die Nucleinsäuren sind
u. a. deshalb von Interesse, da sie Promotoren und weitere
regulatorische Elemente enthalten, die an der hTRT-Regula
tion beteiligt und zur Expression von hTRT und anderer re
kombinanter Proteine oder RNA-Genprodukte von Nutzen sind.
Es ist offensichtlich, daß zusätzlich zu den in SEQ. ID. Nr.
6 (Fig. 21) und 7 bereitgestellten Nucleinsäuresequenzen
zusätzliche hTRT-Intronsequenzen und flankierende Sequenzen
unter Verwendung von Routineverfahren der Molekularbiologie
einfach erhalten werden können. Beispielsweise kann eine zu
sätzliche genomische hTRT-Sequenz durch weitere Sequenzie
rung des Lambda-Clons GΦ5, der vorstehend und in Beispiel 4
beschrieben ist, erhalten werden. Darüber hinaus können wei
tere genomische hTRT-Clone und Sequenzen durch Screenen ei
ner menschlichen genomischen Bank unter Verwendung einer
hTRT-Nucleinsäuresonde mit einer Sequenz oder Untersequenz
von SEQ. ID. Nr. 1 erhalten werden. Weitere Clone und Se
quenzen (z. B. noch weiter stromaufwärts) können unter Ver
wendung von markierten Sequenzen oder Subclonen, die von
λGΦ5 stammen, zum Absuchen geeigneter Genbanken erhalten
werden. Andere nützliche Verfahren zur weiteren Charakteri
sierung von flankierenden hTRT-Sequenzen sind die allgemei
nen Verfahren, die von Gobinda et al., PCR Meth. Applic. 2
(1993), 318; Triglia et al., Nucleic Acids Res. 16 (1988),
8186; Lagerstrom et al., PCR Methods Applic. 1 ( 1991), 111;
und Parker et al., Nucleic Acids Res. 19 (1991), 3055, be
schrieben werden.
Intron-Sequenzen können durch Routinemittel identifiziert
werden, beispielsweise durch Vergleich der genomischen hTRT-Se
quenz mit hTRT-cDNA-Sequenzen (siehe beispielsweise Bei
spiel 3), durch S1-Analyse (siehe Ausubel et al., a.a.O.;
Kapitel 4), oder zahlreiche weitere auf dem Fachgebiet be
kannte Mittel. Intron-Sequenzen können auch in prä-mRNA
(d. h. ungespleißten oder unvollständig gespleißten mRNA-Vor
läufern) gefunden werden. Diese können amplifiziert oder
nach reverser Transkription von zellulärer RNA cloniert wer
den.
Falls erwünscht, kann die clonierte, amplifizierte oder an
derweitig synthetisierte hTRT-Nucleinsäure oder andere TRT-Nuclein
säure bestimmt oder unter Verwendung von allgemein
bekannten Verfahren für die DNA-Sequenzierung verifiziert
werden (siehe beispielsweise Ausubel et al., a.a.O.). Bei den
nützlichen Sequenzierungsverfahren werden Enzyme wie bei
spielsweise das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I,
Sequenase (US Biochemical Corp., Cleveland OH), Taq DNA-Poly
merase (Perkin Elmer, Norwalk CT), thermostabile T7-Poly
merase (Amersham, Chicago IL), oder Kombinationen von
rekombinanten Polymerasen und Exonucleasen mit
"proofreading"-Aktivität angewandt, beispielsweise das ELON-
GASE-Amplifikations-System, das von Gibco BRL (Gaithersburg
MD) erhältlich ist. Zur Sequenzierung oder Verifizierung der
Sequenz von Oligonucleotiden, (wie z. B. Oligonucleotiden,
die durch die de novo-chemische Synthese hergestellt wurden)
wird das Verfahren von Maxam und Gilbert bevorzugt (Maxam
und Gilbert, Meth. Enz. 65 (1980), 499; Ausubel et al.,
a.a.O., Kapitel 7).
Die 5'-untranslatierten Sequenzen von hTRT oder anderen TRT-mRNAs
können durch Clonierung einer hTRT mit "vollständiger
Länge" oder einer anderen cDNA unter Verwendung von Stan
dardverfahren wie der reversen Transkription von mRNA und im
Anschluß daran durch Clonierung und Sequenzierung der erhal
tenen cDNA direkt bestimmt werden. Bevorzugte durch
oligo(dT)-"priming" erhaltene Genbanken zum Screenen oder
Amplifizieren von cDNAs mit vollständiger Länge, die zum
Einschluß größerer cDNAs nach Größe selektiert wurden, wer
den bevorzugt. Durch "Zufalls-Priming" erhaltene Genbanken
sind ebenfalls geeignet. Diese enthalten oft einen größeren
Anteil von Clonen, die 5'-Bereiche von Genen enthalten. Es
können weitere allgemein bekannte Verfahren zum Erhalt von
5'-RNA-Sequenzen verwendet werden, beispielsweise das von
Frohman et al., Proc. Nat. Acad. Sci., USA 85 (1988), 8998,
beschriebene RACE-Protokoll. Falls erwünscht, kann die Tran
skriptions-Startstelle einer hTRT oder einer anderen TRT-mRNA
durch Routineverfahren unter Verwendung der hier be
reitgestellten Nucleinsäuren (z. B. solcher mit der Sequenz
von SEQ. ID. Nr. 1) bestimmt werden. Ein Verfahren ist die
S1-Nuclease-Analyse (Ausubel et al., a.a.O.), bei der eine
markierte DNA mit einer Sequenz des 5'-Bereichs von SEQ. ID.
Nr. 1 verwendet wird.
Die vorliegende Erfindung stellt auch hTRT-Polynucleotide
(RNA, DNA oder modifiziert) bereit, die durch direkte chemi
sche Synthese hergestellt werden. Chemische Synthese wird im
allgemeinen für die Herstellung von Oligonucleotiden oder
von Oligonucleotiden und Polynucleotiden, die Nicht-Stan
dardnucleotide enthalten (z. B. Sonden, Primer und
"antisense"-Oligonucleotide) bevorzugt. Die direkte chemi
sche Synthese von Nucleinsäuren kann durch auf dem Fachge
biet bekannte Verfahren erfolgen, beispielsweise durch das
Phosphotriester-Verfahren von Narang et al., Meth. Enzymol.
68 (1979), 90; das Phosphodiester-Verfahren von Brown et
al., Meth. Enzymol. 68 (1979), 109; das Diethylphosphorami
dit-Verfahren von Beaucage et al., Tetra. Lett. 2 (1981),
1859; und das Verfahren des US-Patents Nr. 4 458 066, bei
dem ein fester Träger verwendet wird. Durch die chemische
Synthese wird typischerweise ein einzelsträngiges Oligo
nucleotid hergestellt, das durch Hybridisierung mit einer
komplementären Sequenz oder durch Polymerisation mit einer
DNA-Polymerase und eines Oligonucleotidprimers unter Verwen
dung des Einzelstrangs als Matrize in eine doppelsträngige
DNA umgewandelt werden kann. Der Fachmann ist sich dessen
bewußt, daß zwar die chemische Synthese von DNA oft auf Se
quenzen von etwa 100 oder 150 Basen beschränkt ist, längere
Sequenzen jedoch durch Ligierung der kürzeren Sequenzen oder
durch ausgefeiltere Syntheseverfahren erhalten werden kön
nen.
Die erfindungsgemäßen hTRT-Polynucleotide und Oligonucleo
tide (oder hTRT- oder weitere Polynucleotide oder Oligo
nucleotide) können unter Verwendung von Nicht-Standardbasen
(z. B. solche, die sich von Adenin, Cytidin, Guanin, Thymin
und Uridin unterscheiden) oder Nicht-Standard-Rückgratstruk
turen zur Erzielung gewünschter Eigenschaften (z. B. erhöhte
Nuclease-Resistenz, engere Bindung, Stabilität oder ein ge
wünschter TM) hergestellt werden. Zu den für die Herstellung
von Nuclease-resistenten Oligonucleotiden zählen die in der
PCT-Veröffentlichung WO 94/12633 beschriebenen Verfahren.
Eine große Anzahl von nützlichen modifizierten Oligonucleo
tiden kann hergestellt werden, dazu zählen Oligonucleotide
mit einem Peptid-Nucleinsäure (PNA)-Rückgrat (Nielsen et
al., Science 254 (1991), 1497) oder der Einbau von 2'-O-Me
thylribonucleotiden, Phosphorthioat-Nucleotiden, Methyl
phosphonat-Nucleotiden, Phosphotriester-Nucleotiden N Phos
phorthioat-Nucleotiden und Phosphoramidaten. Weitere nützli
che Oligonucleotide können Alkyl- und Halogen-substituierte
Zuckeranteile enthalten, die an der 2'-Position eine der
folgenden Gruppen enthalten: OH, SH, SCH3, F, OCN, OCH3OCH3,
OCH3O(CH2)nCH3, O(CH2)nNH2 oder O(CH2)nCH3, wobei n von 1
bis etwa 10 ist; C1 bis C10-Niederalkyl, substituiertes Nie
deralkyl, Alkaryl oder Aralkyl; Cl; Br; CN; CF1; OCF3; O-,
S-, oder N-Alkyl; O-, S-, oder N-Alkenyl; SOCH3, SO2CH3;
ONO2; NO2; N3, NH2; Heterocycloalkyl; Heterocycloalkaryl;
Aminoalkylamino; Polyalkylamino, substituiertes Silyl; eine
RNA-spaltende Gruppe, eine Cholesteringruppe, eine Folat
gruppe, eine Reportergruppe, ein Intercalator, eine Gruppe
zur Verbesserung der pharmacokinetischen Eigenschaften eines
Oligonucleotids; oder eine Gruppe zur Verbesserung der phar
macodynamischen Eigenschaften eines Oligonucleotids und wei
terer Substituenten mit ähnlichen Eigenschaften. Folat, Cho
lesterin und weitere Gruppen, die die Aufnahme des Oligo
nucleotids erleichtern, wie beispielsweise Lipid-Analoga,
können direkt oder über einen Linker an der 2'-Position je
des Nucleosids oder an der 3'- oder 5'-Position des 3'-ter
minalen bzw. 5'-terminalen Nucleosids konjugiert werden. Es
können eines oder mehrere solcher Konjugate verwendet wer
den. Oligonucleotide können auch Zucker "mimetics" aufwei
sen, beispielsweise Cyclobutyle anstelle der Pentofuranosyl
gruppe. Weitere Ausführungsformen können mindestens eine mo
difizierte Basenform oder eine "universelle Base" wie Inosin
beinhalten oder den Einschluß von anderen Nicht-Standardba
sen wie Queosin und Wybutosin sowie Acetyl-, Methyl-, Thio- und
ähnlich modifizierte Formen von Adenin, Cytidin, Guanin,
Thymin und Uridin, die von Endonucleasen nicht so leicht er
kannt werden. Die Erfindung stellt ferner Oligonucleotide
mit Rückgratanalogen bereit, dazu gehören Phosphodiester,
Phosphorthioat, Phosphordithioat, Methylphosphonat, Phospho
ramidat, Alkylphosphotriester, Sulfamat, 3'-Thioacetyl, Me
thylen(methylimino), 3'-N-Carbamat, Morpholincarbamat,
Chiral-Methylphosphonate, Nucleotide mit kurzkettigen Alkyl- oder
Cycloalkylverknüpfungen zwischen den Zuckern, kurzket
tige Verknüpfungen ("Rückgratverknüpfungen") zwischen den
Zuckern mit unterschiedlichen Atomen oder solche die hete
rocyclisch sind oder CH2-NH-OCH2, CH2-N(CH3)-OCH2,
CH2(-N(CH3)-CH2, CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2 und O-N(CH3)-CH2-CH2-Rück
grate (wobei Phosphodiester O-P-O-CH2 ist), oder Mi
schungen dieser Verbindungen. Von Nutzen sind außerdem Oli
gonucleotide mit Morpholino-Rückgrat-Struktur (US-Patent Nr.
5 034 506).
Zur weiteren nützlichen Literatur zählt: Oligonucleotides
and Analogues, A Practical Approach, F. Eckstein (Herausg.)
IRL Press bei Oxford University Press (1991); Antisense
Strategies, Annals of the New York Academy of Sciences, Bd.
600, Baserga und Denhardt (Herausg.) (NYAS 1992), Milligan
et al., J. Med. Chem. 36 (14) (9. Juli 1993), 1923-1937; An
tisense Research and Applications (1993, CRC Press) die ge
samte Veröffentlichung und speziell Kapitel 15 von Sanghvi,
mit dem Titel "Heterocyclic base modifications in nucleic
acids and their applications in antisense oligonucleotides."
Antisense Therapeutics, Sudhir Agrawal (Herausgeber (Humana
Press, Totowa, New Jersey, 1996).
Es ist oft von Nutzen, die erfindungsgemäßen Nucleinsäuren
zu markieren, beispielsweise wenn die hTRT oder andere Oli
gonucleotide oder Polynucleotide als Nucleinsäuresonden ver
wendet werden sollen. Die Markierungen (siehe nachstehend)
können durch beliebige, dem Fachmann allgemein bekannte Mit
tel eingebaut werden. In einer Ausführungsform wird eine
nicht-amplifizierte Nucleinsäure (z. B. mRNA, poly-A-mRNA,
cDNA) markiert. Mittel zur Herstellung markierter Nuclein
säuren sind dem Fachmann allgemein bekannt. Dazu gehören
beispielsweise Nick-Translation, Markierung mittels
"Zufalls-Priming", Endmarkierung (z. B. unter Verwendung ei
ner Kinase) und chemische Konjugation (z. B. Photobiotinylie
rung). In einer weiteren Ausführungsform wird die Markierung
gleichzeitig während eines Amplifikationsschritts bei der
Herstellung der Proben-Nucleinsäuren eingebaut. Somit lie
fern beispielsweise die Polymerasekettenreaktion (PCR) oder
andere Nucleinsäureamplifikationsverfahren mit markierten
Primern oder markierten Nucleotiden ein markiertes Amplifi
kationsprodukt. In einer weiteren Ausführungsform wird durch
Transkriptionsamplifikation unter Verwendung eines markier
ten Nucleotids (z. B. Fluorescein-markiertes UTP und/oder
CTP) eine Markierung in die transkribierten Nucleinsäuren
eingebaut. Ein Amplifikationsprodukt kann auch oder alterna
tiv nach Beendigung der Amplifikation markiert werden.
Wie bereits vorstehend angemerkt und nachstehend ausführlich
diskutiert werden Oligonucleotide für eine Vielzahl von Ver
wendungsmöglichkeiten verwendet, beispielsweise als Primer,
Sonden, therapeutische oder andere "antisense"-Oligonucleo
tide und Triplex-Oligonucleotide. Zahlreiche weitere Verwen
dungsmöglichkeiten ergeben sich aus der vorliegenden Be
schreibung. Tabelle 2 veranschaulicht bestimmte spezifische
Oligonucleotide, die bei der Ausführung der Erfindung ver
wendet werden können. Natürlich können zahlreiche weitere
nützliche erfindungsgemäße Oligonucleotide durch den Fach
mann anhand der hier zur Verfügung gestellten Lehre synthe
tisiert werden.
In Tabelle 2 bedeutet "seq", daß der Primer zur Sequenzie
rung verwendet wurde oder dafür von Nutzen ist; "PCR" bedeu
tet, daß der Primer zur PCR verwendet wurde oder dafür von
Nutzen ist; "AS" bedeutet, daß der Primer zur "antisense"-Hem
mung von Telomerase-Aktivität verwendet wurde oder dafür
von Nutzen ist; "CL" bedeutet, daß der Primer zur Clonierung
von Bereichen von hTRT-Genen oder RNA verwendet wurde oder
dafür von Nutzen ist; "mut" bedeutet, daß der Primer zur
Konstruktion von Mutanten von hTRT-Genen oder Genprodukten
verwendet wurde oder für von Nutzen ist. "UC" bedeutet
"Upper case" [Großschreibung], und "lc" bedeutet "lower
case" [Kleinschreibung). Fehlpaarungen und Insertionen
(relativ zu SEQ. ID Nr. 1) sind unterstrichen; Deletionen
werden durch ein "-" angegeben. Selbstverständlich soll
keine der Angaben in Tabelle 2 eine Einschränkung der Ver
wendung eines bestimmten Oligonucleotids auf irgendeine Ein
zelverwendung oder einen Satz von Anwendungsmöglichkeiten
beschränken.
Die Erfindung stellt eine große Vielzahl von hTRT-Proteinen
bereit, die unter anderem zur Hemmung von Telomerase-Aktivi
tät in einer Zelle von Nutzen sind, zur Induktion einer
anti-hTRT-Immunantwort, als ein therapeutisches Reagenz, als
Standard oder Kontrolle in einem diagnostischen Assay, als
ein Ziel beim Screenen nach Aktivierung oder Hemmung einer
Aktivität von hTRT oder Telomerase und zahlreiche weitere
Anwendungsmöglichkeiten sind entweder hier beschrieben oder
für den Fachmann offensichtlich. Zu den erfindungsgemäßen
hTRT-Proteinen gehören funktionell aktive Proteine (die z. B.
zur Übertragung von Telomerase-Aktivität in eine Telomerase
negative Zelle von Nutzen sind) und Varianten, inaktive Va
rianten (die z. B. zur Hemmung von Telomerase-Aktivität in
einer Zelle von Nutzen sind), hTRT-Polypeptide, Proteine und
Telomerase-RNPs (z. B. die Proteine umfassenden Ribonucleo
proteinkomplexe), die eine, verschiedene oder alle funktio
nelle Aktivitäten von natürlich vorkommender hTRT und Telo
merase aufweisen, wie dies zur Veranschaulichung noch aus
führlicher nachstehend diskutiert wird.
In einer Ausführungsform ist das erfindungsgemäße hTRT-Pro
tein ein Polypeptid mit der Sequenz von SEQ. ID. Nr. 2
(Fig. 17) oder ein Fragment davon. In einer weiteren Aus
führungsform unterscheidet sich das hTRT-Polypeptid von
SEQ. ID. Nr. 2 durch interne Deletion, Insertionen oder kon
servative Austausche von Aminosäureresten. In einer verwand
ten Ausführungsform stellt die Erfindung hTRT-Polypeptide
bereit, die der SEQ. ID. Nr. 2 im wesentlichen gleichen. Die
Erfindung stellt ferner hTRT-Polypeptide bereit, die bezogen
auf die Aminosäuresequenz von SEQ. ID. Nr. 2 modifiziert
sind, d. h. beispielsweise verkürzt, mutiert, derivatisiert
oder an andere Sequenzen fusioniert sind (beispielsweise zur
Bildung eines Fusionsproteins). Darüber hinaus stellt die
vorliegende Erfindung Telomerase-RNPs bereit, die ein erfin
dungsgemäßes hTRT-Protein umfassen, das mit einer Matrizen-
RNA einen Komplex bildet (z. B. hTR). In weiteren Ausfüh
rungsformen sind eines oder mehrere Telomerase-assoziierte
Proteine mit einem hTRT-Protein und/oder hTR assoziiert.
Die Erfindung stellt auch weitere natürlich vorkommende
hTRT-Spezies oder nicht natürlich vorkommende Varianten zur
Verfügung, beispielsweise Proteine mit der Sequenz von SEQ.
ID. Nr. 5 (Fig. 20), SEQ. ID. Nr. 10 (Fig. 19) oder einer
im wesentlichen gleichen Sequenz und Fragmente, Varianten
oder Derivate davon.
Die Erfindung stellt aber noch weitere hTRT-Spezies und Va
rianten bereit. Ein Beispiel einer hTRT-Variante kann durch
ribosomale Leserahmenverschiebung von mRNA, die durch den
Clon 712562 (SEQ. ID. Nr. 3 (Fig. 18)) codiert wird resul
tieren oder durch die pro90 hTRT-Variante, die in SEQ. ID.
Nr. 4 (Fig. 20) gezeigt ist und diese resultieren in der
Synthese von hTRT-Polypeptiden, die alle TRT-Motive enthal
ten (siehe als allgemeines Beispiel beispielsweise Tsuchi
hashi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 2516;
Craigengen et al., Cell 50 (1987), 1; Weiss, Cell 62 (1990),
117). Ribosomale Leserahmenverschiebung kann auftreten, wenn
spezifische mRNA-Sequenzen oder Sekundärstrukturen bewirken,
daß das Ribosom "verharrt" und innerhalb der Sequenz ein
Nucleotid vorwärts oder rückwärts springt. Somit könnte eine
ribosomale Leserahmenverschiebung auf der mRNA von 712562
die Synthese eines Polypeptids mit etwa 523 Aminosäureresten
bewirken. Eine derartige ribosomale Leserahmenverschiebung
auf der Sequenz von pro90 könnte ein Protein mit etwa 1071
Resten ergeben. Es ist offensichtlich, daß die sich aus ei
ner ribosomalen Leserahmenverschiebung ergebenden Proteine
auch durch die durch die Erfindung bereitgestellten synthe
tischen Verfahren oder Rekombinationsverfahren exprimiert
werden können.
Menschliche TRT-Proteine, Peptide und funktionell äquiva
lente Proteine können durch Reinigung, chemische Synthese
oder rekombinante Produktion, wie dies ausführlicher nach
stehend diskutiert wird, erhalten werden.
Die erfindungsgemäßen TRT-Polypeptide einschließlich Frag
mente, Varianten, Produkte von alternativen Allelen und Fu
sionsproteine) können eine, mehrere oder alle der mit nati
ver hTRT assoziierten funktionellen Aktivitäten aufweisen.
Falls nicht anders angegeben, wird hier davon ausgegangen,
daß eine hTRT oder ein anderes TRT-Polypeptid eine angege
bene Aktivität aufweist, falls sich die Aktivität entweder
von dem hTRT-Protein ohne eine assoziierte RNA (z. B. HTR)
oder in einem Komplex aus hTRT mit assoziierter RNA (z. B.
hTR) zeigt. Die hTR-bindende Aktivität von hTRT ist ein
Beispiel für eine mit dem hTRT-Protein assoziierte
Aktivität. Verfahren zur Herstellung von Komplexen aus
Nucleinsäuren (z. B. hTR) und den erfindungsgemäßen hTRT-Poly
peptiden werden nachstehend beschrieben.
Die Modifizierung der hTRT-Proteine (z. B. durch chemische
oder rekombinante Mittel einschließlich der Mutation oder
Modifikation eines Polynucleotids, das das hTRT-Polynucleo
tid codiert, oder die chemische Synthese eines Polynucleo
tids mit einer Sequenz, die sich von der nativen Polynucleo
tidsequenz unterscheidet) zur Erzielung eines unterschiedli
chen Satzes von Aktivitäten im Vergleich zu nativer hTRT
kann bei therapeutischen Anwendungen oder ein Screenen nach
spezifischen Modulatoren von hTRT oder Telomerase-Aktivität
von Nutzen sein. Darüber hinaus können Assays für eine Reihe
von hTRT-Aktivitäten zur Identifizierung von Agenzien (z. B.
die Aktivität modulierende Agenzien) von besonderem Nutzen
sein, die mit hTRT oder Telomerase zur Veränderung der Telo
meraseaktivität interagieren.
Die Aktivitäten von nativer hTRT beinhalten, wie nachstehend
diskutiert, katalytische Aktivität von Telomerase (wobei es
sich entweder um eine prozessive oder nicht-prozessive Akti
vität handeln kann); Telomerase-Prozessivität; Aktivität von
konventioneller reversen Transkriptase; nucleolytische Akti
vität; Primer- oder Substrat- (Telomer-, synthetisches Telo
merase-Substrat- oder Primer-) bindende Aktivität, dNTP-bin
dende Aktivität; RNA- (d. h. hTR-) bindende Aktivität; und
Protein-bindende Aktivität (z. B. Bindung an Telomerase-asso
ziierte Proteine, Telomer-bindende Proteine oder an einen
Komplex aus Protein und telomerer DNA). Natürlich stellt die
vorliegende Erfindung auch hTRT-Zusammensetzungen bereit,
ohne eine besondere hTRT-Aktivität, jedoch mit nützlichen
Aktivitäten, die mit hTRT oder anderen TRT-Proteinen in be
zug stehen (z. B. bestimmte kurze immunogene Peptide, hem
mende Peptide).
Wie hier verwendet, hat ein erfindungsgemäßes Polypeptid
"katalytische Aktivität von Telomerase", wenn das Polypeptid
in der Lage ist, einen DNA-Primer oder Substrat durch Hinzu
fügung von einem partiellen, einem oder mehr als einem Re
peat mit einer Sequenz (z. B. TTAGGG), die von einer Matri
zen-Nucleinsäure (z. B. hTR) codiert wird, zu verlängern.
Diese Aktivität kann prozessiv oder nicht-prozessiv sein.
Prozessive Aktivität liegt dann vor, wenn eine Telomerase-
RNP mehrfach Wiederholungseinheiten an einem Primer oder Te
lomerase anfügt, bevor die DNA von dem Enzymkomplex freige
setzt wird. Nicht prozessive Aktivität liegt dann vor, wenn
Telomerase eine partielle oder eine Wiederholungseinheit an
einen Primer anfügt und danach freigesetzt wird. In vivo
könnte jedoch eine nicht-prozessive Reaktion mehrfach Wie
derholungseinheiten durch aufeinanderfolgende Runden der As
soziation, Verlängerung und Dissoziation anfügen. Dies kann
aber auch in vitro vorkommen, wird jedoch typischerweise in
Standardassays nicht beobachtet aufgrund des sehr großen mo
laren Überschusses an Primern gegenüber Telomerase unter
Standard-Assaybedingungen.
Zur Charakterisierung eines hTRT-Polypeptids bezüglich einer
nicht-prozessiven Aktivität wird eine übliche Telomerase-
Reaktion durchgeführt unter Bedingungen, die eine nicht-pro
zessive Reaktion begünstigen beispielsweise bei hohen Tempe
raturen, d. h. 35-40°C, typischerweise 37°C, niedrigen dGTP-Kon
zentrationen (1 µM oder weniger), hohen Primer-Konzentra
tionen (5 µM oder mehr), und hohen dATP/TTP-Konzentrationen
(2 mM oder mehr), wobei die Temperatur und die dGTP typi
scherweise die größte Auswirkung haben. Zur Charakterisie
rung eines hTRT-Polypeptids bezüglich prozessiver Aktivität
wird eine übliche Telomerase-Reaktion durchgeführt unter
Verwendung von Bedingungen, die eine prozessive Reaktion be
günstigen, beispielsweise 27 bis 34°C, typischerweise 30°C,
hohe dGTP-Konzentration (10 µM oder mehr), niedrige Primer-
Konzentration (1 µM oder weniger) und/oder niedrige dATP- und
TTP-Konzentrationen (0,3-1 mM), wobei die Temperatur und
die für dGTP typische Konzentration am kritischsten sind.
Alternativ können ein TRAP-Assay (für prozessive oder
moderat-prozessive Aktivität) oder der Dot-Blot- und Gel-
Blot-Assay (für prozessive Aktivität) verwendet werden. Das
erfindungsgemäße hTRT-Polypeptid kann eine nicht-prozessive
Aktivität, jedoch keine prozessive Aktivität aufweisen (z. B.
wenn eine Änderung des hTRT-Polypeptids die Fähigkeit zur
Translokation verringert reduziert oder eliminiert), es kann
aber auch nur prozessiv sein oder es kann beide Aktivitäten
besitzen.
Eine nicht-prozessive katalytische Aktivität von Telomerase
kann den DNA-Primer von der Position, an der das 3'-Ende
sich an die RNA-Matrize anlagert, zu dem 5'-Ende der Matrize
hin verlängern; diese Verlängerung endet typischerweise mit
der Anfügung des ersten G-Rests (z. B. wenn die Matrize hTR
ist). Wie in Tabelle 3 gezeigt, hängt die genaue Anzahl der
hinzugefügten Nucleotide von der Position des 3'-terminalen
Nucleotids des Primers innerhalb der TTAGG-Wiederholungsse
quenz ab.
Tabelle 3
Nicht-Prozessive Aktivität
in DNA, UC = Primer, lc = angefügte Nucleotide.
Somit werden an den --TTAGGG-Primer (i) 4 Nucleotide ange
fügt, während an den --TTAG-Primer (ii) 6 Nucleotide ange
fügt werden. Die in einer prozessiven Reaktion durch Telome
rase angefügte erste Wiederholungseinheit entspricht diesem
Schritt; in einer prozessiven Reaktion führt Telomerase je
doch einen Translokationsschritt durch, wobei das 3'-Ende
freigesetzt wird und an einer Position, am 3'-Bereich der
Matrize, die ausreicht, die Anfügung einer weiteren Wieder
holungseinheit zu primen, erneut gebunden wird (siehe Morin,
Eur. j. Cancer 33 (1997), 750).
Eine vollständig nicht-prozessive Reaktion führt lediglich
zur Produktion einer Bande in einem üblichen Assay unter
Verwendung eines einzigen synthetischen Primers. Da dieses
Ergebnis auch durch andere Enzyme hervorgerufen werden kann,
beispielsweise die Aktivität einer terminalen Transferase,
kann es bei einigen Anwendungen wünschenswert sein, zu veri
fizieren, daß das Produkt das Ergebnis einer katalytischen
Aktivität von Telomerase ist. Eine durch Telomerase (hTRT)
erzeugte Bande kann durch verschiedene zusätzliche Merkmale
unterschieden werden. Die Anzahl an Nucleotiden, die an das
Ende des Primers angefügt wird, sollte mit der Position des
Primerterminus übereinstimmen. Somit sollte ein --TTAGGG-Pri
mer 4 angefügte Nucleotide aufweisen und ein --TTAG-Pri
mer 6 Nucleotide (siehe vorstehend). In der Praxis können
zwei oder mehr in der Sequenz permutierte Primer, die die
gleiche Gesamtlänge, jedoch unterschiedliche 5'- und 3'-End
punkte aufweisen, verwendet werden. Zur Veranschaulichung
soll folgendes Beispiel dienen. Die nicht-prozessive Verlän
gerung des Primers TTAGGGTTAGGGTTAGGG und GTTAGGGTTAGGGTTAGG
wird Produkte erzeugen, deren absolute Länge sich in einem
Nucleotid unterscheidet (zu TTAGGGTTAGGGTTAGGG werden 4 an
gefügt zu einer Gesamtlänge von 22 nt und zu
GTTAGGGTTAGGGTTAGG werden 5 angefügt zu einer Gesamtlänge
von 23 nt). Die Nucleotidabhängigkeit der Reaktion sollte
mit der Position des Primerterminus übereinstimmen. Somit
sollte ein Produkt des --TTAGGG-Primers dGTP, TTP und dATP,
jedoch nicht dCTP benötigen und ein Produkt des --AGGGTT-Pri
mers sollte die dGTP und dATP, jedoch nicht TTP oder dCTP
benötigen. Die Aktivität sollte gegenüber der Vorbehandlung
mit RNAse oder Micrococcus-Nuclease unter Bedingungen, die
zum Abbau von hTR und so zur Eliminierung der Matrize füh
ren, empfindlich sein (siehe Morin, Cell 59 (1989) 521).
In der Praxis kann eine prozessive Aktivität leicht durch
das Auftreten einer Leiter von 6 Nucleotiden in einem übli
chen Assay, einem TRAP-Assay, Gel-Blot-Assay oder dem Dot-
Blot-Assay leicht beobachtet werden. Der übliche Assay wird
in Morin, Cell 59 (1989), 521, auf das hier vollinhaltlich
Bezug genommen wird, der TRAP-Assay wird in dem US-Patent
Nr. 5 629 154 beschrieben; siehe auch die PCT-Veröffentli
chung WO 97/15687, die PCT-Veröffentlichung WO 95/13381;
Krupp et al., Nucleic Acids Res. 25 (1997), 919 und Wright
et al., Nuc. Acids Res. 23 (1995), 3794, auf die hier voll
inhaltlich Bezug genommen wird. Der Dot-Blot-Assay ist aus
führlich in der parallelen US-Patentanmeldung mit der Se
rien-Nr. 08/833,377, eingereicht am 4. April 1997, beschrie
ben, auf die hier vollinhaltlich Bezug genommen wird. Die
vorstehend angegebenen Literaturstellen sind hiermit durch
die Bezugnahme vollständig und für alle Zwecke mit aufgenom
men. Andere Assays bezüglich einer prozessiven katalytischen
Aktivität von Telomerase können auch verwendet werden,
beispielsweise der "Stretch-PCR"-Assay von Tatematsu et al.,
Oncogene 13 (1996), 2265. Der Gel-Blot-Assay, eine
Kombination von üblichen und Dot-Blot-Assays kann ebenfalls
verwendet werden. Bei dieser Variante wird ein üblicher
Assay mit einem radioaktiv markierten Nucleotid und mit
hohen dGTP-Konzentrationen (z. B. 0,1-2 mM) durchgerührt.
Nach Durchführung des üblichen Assays wird die
synthetisierte DNA durch denaturierende PAGE aufgetrennt und
auf eine Membran (z. B. Nitrocellulose) überführt. Telomer-
DNA (das Produkt von Telomerase - ein verlängerter
Telomerase-Primer oder Substrat) kann im Anschluß daran
durch Verfahren wie Hybridisierung unter Verwendung
markierter Telomer-DNA-Sonden (z. B. die CCCTAA-Sequenz
enthaltende Sonden, wie sie in dem Dot-Blot-Assay wie
vorstehend verwendet werden) nachgewiesen werden. Ein
Vorteil dieses Verfahrens ist, daß diese empfindlicher als
der übliche Assay sind und Informationen über die Größe der
synthetisierten Fragmente und die Prozessivität der Reaktion
liefern.
Die Telomerase-Aktivität eines hTRT-Polypeptids kann unter
Verwendung eines ungereinigten, partiell gereinigten oder im
wesentlichen gereinigten hTRT-Polypeptids (z. B. in Assozia
tion mit hTR) in vitro oder nach Expression in vivo bestimmt
werden. Beispielsweise kann Telomerase-Aktivität in einer
Zelle (z. B. einer Zelle, die ein rekombinantes erfindungsge
mäßes hTRT-Polypeptid exprimiert) durch Bestimmung der Län
genzunahme oder -Abnahme der Telomere nachgewiesen werden.
Typische Assays bezüglich einer katalytischen Aktivität von
Telomerase können unter Verwendung eines Komplexes von hTRT
und hTR durchgeführt werden. Es können jedoch alternative
Telomerase-Matrizen-RNAs substituiert sein oder man kann
Assays zur Bestimmung einer anderen Aktivität wie
Telomerase-Primerbindung durchführen. Assays zur Bestimmung
der Länge der Telomere sind auf dem Fachgebiet bekannt. Dazu
zählen die Hybridisierung von Sonden an Telomer-DNA (ein
Amplifikationsschritt kann aufgenommen werden) und eine TRF-Ana
lyse, d. h. die Analyse von Telomer-DNA-Restriktionsfrag
menten (TRFs) nach einem Restriktionsendonuclease-Verdau
(siehe die PCT-Veröffentlichungen WO 93/235572 und WO
96/41016; Counter et al., EMBO J. 1 (1992), 921; Allsopp
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 0114; Sanno,
Am. J. Clin. Pathol. 106 (1996), 16 und Sanno,
Neuroendocrinology 65 (1997), 229.
Die katalytische Aktivität von Telomerase eines hTRT-Poly
peptids kann durch eine Reihe von Verfahren nachgewiesen
werden, wobei die vorstehend beschriebenen Assays und wei
tere Assays bezüglich einer katalytischen Aktivität von Te
lomerase verwendet werden können. Bei einem Verfahren wird
das hTRT-Protein in einer Telomerase-negativen menschlichen
Zelle, in der hTR exprimiert wird (d. h. entweder normaler
weise in der Zelle oder durch rekombinante Expression), ex
primiert (z. B. wie nachstehend beschrieben) und die Gegen
wart oder Abwesenheit von Telomerase-Aktivität wird in der
Zelle oder im Zellysat bestimmt. Beispiele für geeignete Te
lomerase-negative Zellen sind IMR 90 (ATCC, #CCL-186) oder
BJ-Zellen (eine menschliche Vorhautfibroblastenlinie; siehe
beispielsweise Feng et al., Science 269 (1995), 1236). Zu
weiteren Beispielen zählen pigmentierte Retinal-Epithel
zellen (RPE), menschliche Nabelschnurarterienepithelzellen
(HUVEG; ATCC #CRL-1730), menschliche Aortaendothelzellen
(HAEC; Clonetics Corp., #CC-2535) und menschliche Brust
epithelzellen (HME; Hammond et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 81 (1984), 5435; Stampfer, T., Tissue Culture Methods 9
(1985), 107). In einer alternativen Ausführungsform wird das
hTRT-Polypeptid in einer Telomerase-positiven Zelle (z. B.
durch Transfektion mit einem hTRT-Expressionsvektor) expri
miert und eine Steigerung der Telomerase-Aktivität in der
Zelle im Vergleich zu einer nicht-transfizierten Kontroll
zelle wird dann nachgewiesen, wenn das Polypeptid eine kata
lytische Aktivität von Telomerase aufweist. Üblicherweise
ist die katalytische Aktivität von Telomerase in einer mit
einem geeigneten Expressionsvektor transfizierten Zelle, die
hTRT exprimiert, signifikant erhöht, das heißt sie ist um
mindestens etwa das 2fache, mindestens etwa das 5fache oder
sogar mindestens etwa das 10fache bis 100fache oder sogar
1000fache höher im Vergleich zu untransfizierten (Kontroll)-
Zellen.
In einer weiteren alternativen Ausführungsform wird das
hTRT-Protein in einer Zelle (z. B. einer Telomerase-negativen
Zelle, in der hTR exprimiert wird, als ein Fusionsprotein
(siehe nachstehend) mit einer Markierung oder einem "Epitop
tag" zur Erleichterung der Reinigung exprimiert. In einer
Ausführungsform wird das RNP aus der Zelle unter Verwendung
eines Antikörpers gewonnen, der das "tag" spezifisch er
kennt. Bevorzugte "tags" sind typischerweise kurz oder klein
und sie können eine Spaltstelle oder andere Eigenschaften
aufweisen, die es gestatten, das "tag" von dem hTRT-Polypep
tid zu entfernen. Zu den Beispielen von geeigneten "tags"
gehören das "Xpres"-Epitop (Invitrogen, Inc. San Diego CA)
und weitere Anteile, die von einem Antikörper oder Nuclein
säure spezifisch gebunden werden können. Weitere äquivalente
Verfahren sind beispielsweise in Beispiel 6 beschrieben. In
einer alternativen Ausführungsform zählen zu den "tags" sol
che, die von inserierten Sequenzen codiert werden. Bei
spielsweise von Sequenzen, die in SEQ. ID. Nr. 1 stromauf
wärts des ATG-Codons inseriert sind, das die Translation des
Proteins von SEQ. ID. Nr. 2 initiiert, wobei die Insertion
eines (neuen) Methionin-Initiationscodons in die stromauf
wärts gelegene Sequenz mit eingeschlossen sein kann.
Natürlich können bei der Expression einer hTRT-Variante in
einer Zelle (beispielsweise als ein Fusionsprotein) und der
darauffolgenden Isolation (z. B. als ein Ribonucleoprotein
komplex) andere Zellproteine (d. h. Telomerase-assoziierte
Proteine) mit dem isolierten Komplex assoziiert sein (direkt
oder indirekt daran gebunden). In solchen Fällen wird es
manchmal wünschenswert sein, Telomerase-Aktivität in dem
Komplex zu bestimmen, der hTRT, BTR und die assoziierten
Proteine enthält.
Zu den erfindungsgemäßen hTRT-Polypeptiden zählen Varianten,
denen eine katalytische Aktivität von Telomerase fehlt, die
jedoch eine oder mehrere andere Aktivitäten von Telomerase
beibehalten haben. Zu diesen anderen Aktivitäten und erfin
dungsgemäßen Verfahren zur Messung solcher Aktivitäten gehö
ren (jedoch ohne Einschränkung darauf) die in den folgenden
Abschnitten diskutierten:
Die übliche Telomerase-Aktivität bezüglich reverser Tran
skriptase wird beispielsweise in Morin (1997), a.a.O., und
Spence et al., Science 267 (1995) 988, beschrieben. Da hTRT
konservierte Aminosäuremotive enthält, die für die katalyti
sche Aktivität von reverser Transkriptase erforderlich sind,
weist hTRT die Fähigkeit auf, exogene (d. h. nicht-hTR) RNAs
zu transkribieren. In einem üblichen RT-Assay wird die Fä
higkeit des Enzyms zur Transkription einer RNA-Matrize durch
die Verlängerung eines angelagerten DNA-Primers gemessen.
Die Aktivität von reverser Transkriptase kann durch zahlrei
che auf dem Fachgebiet bekannte Möglichkeiten bestimmt wer
den, beispielsweise durch Beobachtung der Zunahme der Größe
eines markierten Nucleinsäureprimers (z. B. RNA oder DNA)
oder des Einbaus eines markierten dNTPs. Siehe beispiels
weise Ausubel et al., a.a.O.
Da hTRT spezifisch mit hTR assoziiert, kann natürlich der
DNA-Primer/RNA-Matrize für ein übliches RT-Assay zur Erzie
lung von Merkmalen, die mit hTR und einem Telomer-DNA-Primer
in bezug stehen, modifiziert werden. Beispielsweise kann die
RNA die Sequenz (CCCTAA)n aufweisen, wobei n mindestens 1,
mindestens 3, mindestens 10 oder größer ist. In einer Aus
führungsform liegt der (CCCTAA)n-Bereich bei oder in der
Nähe des 5'-Endes der RNA (ähnlich zu der 5'-Lokalisierung
von Matrizenbereichen in Telomerase-RNAs). In ähnlicher
Weise kann der DNA-Primer ein 3'-Ende aufweisen, das Anteile
der TTAGGG-Telomersequenz aufweist, beispielsweise XnTTAG,
XnAGGG, Xn(TTAGGG)qTTAG, etc., wobei X eine nicht-Telomer-
Sequenz ist und n 8-20 oder 60-30 ist und q 1 bis 4 ist. In
einer weiteren Ausführungsform weist der DNA-Primer ein 5'-Ende
auf, das zu der RNA-Matrize nicht komplementär ist, so
daß bei Anlagerung das 5'-Ende ungebunden bleibt. Zusätzli
che Modifikationen von Standard-Assays bezüglich reverser
Transkription, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren ange
wandt werden können, sind auf dem Fachgebiet bekannt.
Nucleolytische Aktivität von Telomerase wird beispielsweise
beschrieben in Morin, 1997, a.a.O. Collins und Grieder, Ge
nes and development 7 (1993) 1364. Telomerase besitzt eine
nucleolytische Aktivität (Joyce und Steitz, Trends Biochem.
Sci. 12 (1987), 288), jedoch weist die Telomerase-Aktivität
besondere Merkmale auf. Telomerase entfernt Nucleotide, üb
licherweise nur eines, vom 3'-Ende, wenn das 3'-Ende der DNA
an der 5'-Grenze der DNA-Matrize positioniert ist. In Men
schen und bei Tetrahymena ist dieses Nucleotid das erste G
der Telomer-Wiederholungseinheit (TTAGG im Menschen). Telo
merase entfernt bevorzugt G-Reste, weist jedoch keine
nucleolytische Aktivität gegenüber anderen Nucleotiden auf.
Diese Aktivität kann überwacht werden. Hier werden zur Ver
anschaulichung zwei unterschiedliche Verfahren beschrieben.
Ein Verfahren beinhaltet eine übliche Telomerase-Reaktion
mit einem Primer, der die gesamte Matrizensequenz bindet
(d. h. an der Matrizengrenze endet; -TAGGGATTAG im Men
schen). Nucleolytische Aktivität wird durch Überwachung des
Austauschs des letzten dG-Restes gegen ein in dem Assay zur
Verfügung gestelltes radioaktiv markiertes dGTP nachgewie
sen. Der Austausch wird durch Auftreten einer Bande mit der
Größe des Ausgangsprimers in der Gelelektrophorese und Auto
radiographie überwacht.
In einem bevorzugten Verfahren wird ein DNA-Primer verwen
det, der ein "blockiertes" 3'-Ende aufweist, das durch Telo
merase nicht verlängert werden kann. Der 3'-blockierte Pri
mer kann in Standard-Telomerase-Assays verwendet werden, er
wird jedoch solange nicht verlängert, bis das 3'-Nucleotid
durch die nucleolytische Aktivität von Telomerase entfernt
wird. Der Vorteil dieses Verfahrens besteht darin, daß Telo
merase-Aktivität durch verschiedene Standardmaßnahmen über
wacht werden kann, und das Signal stark und leichter zu
quantifizieren ist. Die Blockierung des 3'-Endes des Primers
kann auf verschiedene Weise erreicht werden. In einem Ver
fahren wird ein 3'-Desoxy-dNTP-Rest an das 3'-Ende des Pri
mers unter Verwendung von Standard-Oligonucleotidsynthese
verfahren angefügt. Dieses Ende weist ein 2'OH auf, jedoch
nicht das für Telomerase erforderliche 3'OH. Es gibt noch
weitere Möglichkeiten zur Blockierung des 3'-Endes, bei
spielsweise die Verwendung eines 3'-Didesoxy-Endes eines 3'-Amin-
Endes etc. Ein Beispiel für einen Primer für einen As
say bezüglich einer nucleolytischen Aktivität von hTRT ist
5'-TTAGGGTTAGGGTTA (G3'H), wobei der letzte Rest einem 3'-Desoxy
guanosinrest entspricht (Glen Research, Sterling,
VA). Dem Fachmann sind zahlreiche weitere Varianten bezüg
lich eines kleinen Primers, die auf der hier zur Verfügung
gestellten Lehre basieren, bekannt.
Primer (Telomer)-Bindungsaktivität von Telomerase wird bei
spielsweise von Morin, 1997, a.a.O.; Collins et al., Cell 81
(1995), 667 und Harrington et al., J. Biol. Chem. 270
(1995), 8893 beschrieben. Man nimmt an, daß Telomerase zwei
Stellen aufweist, die einen Telomer-DNA-Primer binden. Die
mit der Primerbindung assoziierten RT-Motive zeigen, daß
hTRT und/oder hTRT/hTR DNA-Primer-Bindungsaktivität auf
weist. Es gibt verschiedene Möglichkeiten, Primer-Bindungs
aktivität zu bestimmen. Allerdings haben die meisten Verfah
ren einen Schritt gemeinsam, nämlich die Inkubation eines
markierten DNA-Primers mit hTRT oder hTRT/hTR oder anderen
TRT/TR-Kombinationen unter geeigneten Bindungsbedingungen.
Die meisten Verfahren verwenden auch ein Mittel zur Abtren
nung ungebundener DNA von Protein-gebundener DNA. Diese Ver
fahren beinhalten folgende Schritte:
- i) Gel-"shift"-Assays (die auch als "electrophoretic/mobility shift"-Assays bezeichnet werden) sind Assays, bei denen ungebundener DNA-Primer von Protein gebundenem DNA-Primer durch Elektrophorese in einem nicht denaturierenden Gel abgetrennt wird (Ausubel et al., a.a.O).
- ii) Matrixbindungs-Assays beinhalten verschiedene Variatio nen hinsichtlich des Grundverfahrens. Dazu gehören die Bin dung der hTRT oder des hTRT/hTR-Komplexes an eine Matrix (z. B. Nitrocellulose) entweder vor oder nach Inkubation mit dem markierten Primer. Durch die Bindung der hTRT an eine Matrix kann der ungebundene Primer von dem gebundenen Primer mechanisch abgetrennt werden. Restliche ungebundene DNA kann durch Waschen der Membran vor der Quantifizierung entfernt werden. Es ist für den Fachmann offensichtlich, daß es ver schiedene Möglichkeiten zur Kopplung von Proteinen an solche Matrices, feste Träger und Membranen gibt, dazu gehören bei spielsweise chemische, photochemische und UV-Quervernetzung, Antikörper/Epitop und nicht-kovalente, hydrophobe, (elektrostatische etc.) Interaktionen.
Als DNA-Primer kann jede DNA mit einer Affinität für Telome
rase verwendet werden, beispielsweise ein Telomer-DNA-Pri
mer, wie (TTAGGG)n, wobei n 1 bis 10 sein kann und typi
scherweise 3 bis 5 ist. Die 3'- und 5'-Enden können an jeder
Position der Wiederholungssequenz enden. Die Primer können
auch 5'- oder 3'-Verlängerungen von Nicht-Telomer-DNA auf
weisen, die eine Markierung oder einen Nachweis erleichtern
können. Die Primer können auch derivatisiert sein, um bei
spielsweise den Nachweis oder die Isolierung zu erleichtern.
dNTP-Bindungsaktivität von Telomerase wird beispielsweise in
Morin, 1997, a.a.O., und Spence et al., a.a.O. beschrieben.
Telomerase benötigt für die Synthese von DNA dNTPs. Das
hTRT-Protein weist eine Nucleotid-Bindungsaktivität auf und
es kann hinsichtlich einer dNTP-Bindung ähnlich wie andere
Nucleotid-bindende Proteine untersucht werden (Kantrowitz et
al., Trends Biochem. Sci. 5 (1980), 124). Typischerweise
wird die Bindung eines markierten dNTPs oder eines dNTP-Ana
logs überwacht, so wie dies auf dem Fachgebiet für Nicht-Te
lomerase-RT-Proteine bekannt ist.
RNA (d. h. hTR)-Bindungsaktivität von Telomerase wird bei
spielsweise in Morin, 1997, a.a.O., beschrieben, Harrington
et al., Science 275 ( 1997), 973 und Collins et al., Cell 81
(1995), 677. Die RNA-Bindungsaktivität eines erfindungsgemä
ßen TRT-Proteins kann auf ähnliche Weise wie dies vorstehend
bezüglich des DNA-Primer-Bindungsassays beschrieben wurde,
unter Verwendung einer markierten RNA-Sonde nachgewiesen
werden. Verfahren zur Abtrennung gebundener und nicht-gebun
dener RNA und zum Nachweis von RNA sind auf dem Fachgebiet
gut bekannt. Diese können für die erfindungsgemäßen Aktivi
tätsassays auf ähnliche Weise wie dies für den DNA-Primer-
Bindungsassay beschrieben wurde, angewandt werden. Bei der
RNA kann es sich um hTR mit vollständiger Länge handeln,
Fragmente von hTR oder andere RNAs, für die gezeigt werden
kann, daß sie eine Affinität für Telomerase oder hTRT auf
weisen. Siehe US-Patent Nr. 5,583,016 und PCT-Veröffentli
chung Nr. 96/40868 (siehe auch USSN 08/478,352, eingereicht
am 7. Juni 1995).
Wie bereits vorstehend angemerkt, stellt die vorliegende Er
findung hTRT-Polypeptide bereit, die nicht den vollen Satz
(wie vorstehend beschrieben) an Telomerase-Aktivitäten von
natürlich vorkommender Telomerase, hTRT oder anderen TRT-Pro
teinen aufweisen. Es ist angesichts der hier vorliegenden
Beschreibung von RT und von Telomerase-spezifischen Motiven
von TRT offensichtlich, daß Änderungen oder Mutationen von
konservierten Aminosäureresten, die in den oben diskutierten
Motivsequenzen gefunden werden können, zur Entstehung von
Mutanten mit Aktivitätsverlusten führen, die für therapeuti
sche Zwecke, zum Screenen und zur Charakterisierung von Arz
neimitteln und für weitere Anwendungsmöglichkeiten von Nut
zen sind. Beispielsweise führt die Deletion der Motive B in
den RT-Domänen des endogenen TRT-Gens in S. pombe, wie in
Beispiel 1 beschrieben, zu haploiden Zellen, in denen eine
progressive Telomerverkürzung bis zu dem Punkt, an dem eine
Hybridisierung mit Telomer-Wiederholungseinheiten fast nicht
mehr nachweisbar war, beobachtet werden konnte, was einen
Verlust einer katalytischen Aktivität von Telomerase an
zeigt. Auf ähnliche Weise können Änderungen in der WxGxS-Stelle
von Motiv E die DNA-Primerbindung oder Funktion von
Telomerase beeinflussen. Darüber hinaus können Änderungen
der Aminosäuren in den Motiven A, B' und C die katalytische
Aktivität von Telomerase beeinflussen. Die Mutation des DD-Mo
tivs von hTRT kann Telomerase-Aktivität erheblich verrin
gern oder aufheben (siehe Beispiel 16).
Die Erfindung stellt eine Reihe von Verfahren zur Herstel
lung der hier offenbarten hTRT und anderer TRT-Polypeptide
bereit. In den folgenden Abschnitten wird die chemische Syn
these und die rekombinante Expression von hTRT-Proteinen,
einschließlich Fusionsproteinen ausführlich beschrieben.
Die Erfindung stellt hTRT-Polypeptide bereit, die ganz oder
teilweise unter Verwendung von allgemeinen, auf dem Fachge
biet gut bekannten chemischen Verfahren synthetisiert wurden
(siehe beispielsweise Caruthers et al., Nucleic Acids Res.
Symp. Ser. (1980) 215-223 und Horn et al. Nucleic Acids
Res. Symp. Ser. (1980), 225-232). Beispielsweise kann eine
Peptidsynthese unter Verwendung verschiedener Festphasenver
fahren durchgeführt werden (Roberge et al., Science 269
(1995) 202), darunter fällt auch die automatische Synthese
(z. B. unter Verwendung des Peptid Synthesizers ABI 431A von
Perkin Elmer gemäß den Anweisungen des Herstellers). Wenn
ein Protein mit vollständiger Länge erwünscht ist, können
kürzere Polypeptide durch Kondensation des Aminoterminus ei
nes Moleküls mit dem Carboxylterminus des anderen Moleküls
zur Bildung einer Peptidbindung fusioniert werden.
Die neu synthetisierten Peptide können wesentlich gereinigt
werden, beispielsweise durch präparative HPLC (siehe bei
spielsweise Creighton Proteins, Structures and Molecular
Principles, WH Freeman and Co., New York NY (1983). Die Zu
sammensetzung der synthetischen Peptide (oder beliebiger an
derer erfindungsgemäßer Peptide oder Polypeptide) kann durch
Aminosäureanalyse oder Sequenzierung (z. B. das Verfahren des
Edman-Abbaus; Creighton, a.a.O.) bestätigt werden. Es ist
wichtig anzumerken, daß die Aminosäuresequenz von hTRT oder
einem beliebigen Teil davon während der Synthese verändert
werden kann und/oder unter Verwendung chemischer Verfahren
mit Sequenzen von anderen Proteinen kombiniert werden kann.
Dies kann auch anderweitig durchgeführt werden und einen be
liebigen Teil der Aminosäuresequenzen für jeden beliebigen
Zweck zur Herstellung einer Variante der erfindungsgemäßen
Polypeptide umfassen.
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren, Reagenzien, Vek
toren und Zellen bereit, die zur Expression von hTRT-Poly
peptiden und Nucleinsäuren von Nutzen sind, wobei in vitro
(zellfrei), ex vivo oder in vivo (auf Zellen oder Organismen
basierende) rekombinante Expressionssysteme verwendet wer
den. In einer Ausführungsform umfaßt die Expression des
hTRT-Proteins oder eines Fragments davon die Insertion der
codierenden Sequenz in einen geeigneten Expressionsvektor
(d. h. ein Vektor, der die erforderlichen Elemente für die
Transkription und Translation der inserierten codierenden
Sequenz enthält). Somit betrifft ein Aspekt der Erfindung
die Bereitstellung eines Polynucleotids, das in der Sequenz
im wesentlichen identisch ist zu einer ein hTRT-Gen codie
renden Sequenz von mindestens 25 Nucleotiden und vorzugs
weise für viele Anwendungsmöglichkeiten 50 bis 100 Nucleoti
den oder mehr der erfindungsgemäßen hTRT-cDNAs oder Gene,
das zur Bildung einer Transkriptionseinheit, die ein hTRT-Poly
peptid exprimieren kann, mit einem Promotor funktionell
verknüpft ist. Zur Konstruktion der Expressionsvektoren, die
eine durch die vorliegende Erfindung bereitgestellte hTRT-Se
quenz und geeignete Transkriptionskontrollen oder Transla
tionskontrollen enthalten, können dem Fachmann gut bekannte
Verfahren angewandt werden (siehe beispielsweise Sambrook et
al., a.a.O., Ausubel et al., a.a.O. und die vorliegende Be
schreibung).
Zu den erfindungsgemäßen hTRT-Polypeptiden zählen Fusions
proteine, die hTRT-Polypeptide oder Fragmente des hTRT-Pro
teins enthalten. Die Fusionsproteine werden typischer
weise rekombinant hergestellt, sie können jedoch auch che
misch synthetisiert werden. Fusionsproteine können zur Er
zielung einer erhöhten Expression der hTRT-Polypeptidkon
strukte von Nutzen sein oder zur Herstellung von hTRT-Poly
peptiden mit anderen gewünschten Eigenschaften beispiels
weise eine Markierung umfassen (z. B. eine enzymatische Re
portergruppe), eine bindende Gruppe oder ein Antikörper-
Epitop umfassen. Ein Beispiel für ein Fusionsprotein, das
hTRT und "enhanced green fluorescent protein" (EGFP)-Sequen
zen umfaßt, ist nachstehend in Beispiel 15 beschrieben. Es
ist für den Fachmann offensichtlich, daß die in Beispiel 15
und an anderen Stellen hier diskutierten Verwendungen und
Anwendungsmöglichkeiten nicht auf die spezifischen Fusions
proteine beschränkt sind, sondern die Verwendungsmöglichkei
ten für die verschiedenen Fusionskonstrukte veranschaulichen
sollen.
Die erfindungsgemäßen Fusionsproteinsysteme können auch zur
Erleichterung der effizienten Herstellung und Isolierung von
hTRT-Proteinen oder Peptiden verwendet werden. Beispiels
weise umfaßt in einigen Ausführungsformen der Nicht-hTRT-Se
quenzanteil des Fusionsproteins ein kurzes Peptid, das an
ein immobilisiertes Molekül spezifisch gebunden werden kann,
so daß das Fusionsprotein von nicht-gebundenen Bestandteilen
(wie nicht verwandte Proteine in einem Zellysat) abgetrennt
werden kann. Ein Beispiel dafür ist eine Peptidsequenz, die
von einem spezifischen Antikörper gebunden wurde. Ein wei
teres Beispiel ist ein Peptid, das Polyhistidin-Spuren um
faßt, beispielsweise (His)6 oder Histidin-Tryptophan-Sequen
zen, die durch ein Harz gebunden werden können, das Nickel- oder
Kupferionen enthält (d. h. Metallchelat-Affinitätschro
matographie). Zu weiteren Beispielen zählen Protein A-Domä
nen oder Fragmente, die die Reinigung auf immobilisierten
Immunglobulin erlauben, und die in dem "FLAGS"-Verlänge
rungs/-Affinitäts-Reinigungssystem verwendete Domäne
(Immunex Corp., Seattle WA). In einigen Ausführungsformen
enthält das Fusionsprotein eine Spaltstelle, so daß die
hTRT-Sequenz oder eine andere TRT-Polypeptidsequenz von der
Nicht-hTRT-Peptidsequenz oder Nicht-hTRT-Proteinsequenz
leicht abgetrennt werden kann. In diesem Fall kann die Spal
tung chemisch erfolgen (z. B. mit Bromcyan, 2-(2-Nitrophenyl
sulfonyl)-3-methyl-3'-bromindolen, Hydroxylamin oder niedri
ger pH-Wert) oder enzymatisch (z. B. mit Faktor Xa, Enteroki
nase). Die Auswahl des Fusions- und Spaltsystems kann teil
weise von dem Anteil (d. h. der Sequenz) des zu exprimieren
den hTRT-Polypeptids abhängen. Fusionsproteine sind allge
mein beschrieben in Ausubel et al., a.a.O, Kapitel 16, Kroll
et al., DNA cell. Biol. 12 (1993), 441 und in dem Invitro
gen-Katalog von 1997 (Invitrogen Inc., San Diego CA). Wei
tere Beispiele für erfindungsgemäße Fusionsproteine mit
Epitop-"tags" oder "tags" und Spaltstellen werden nachste
hend in Beispiel 6 bereitgestellt.
Es ist für den Fachmann offensichtlich, daß sich die in die
sem Abschnitt diskutierten Expressionssysteme zwar auf die
Expression von hTRT-Polypeptiden konzentrieren, jedoch die
gleichen oder ähnliche Zellen, Vektoren und Verfahren zur
Expression von erfindungsgemäßen hTRT-Polypeptiden verwendet
werden können, dazu gehören auch "sense"- und "antisense"-Poly
nucleotide, wobei die Herstellung von hTRT-Polypeptiden
nicht notwendigerweise erwünscht ist. Typischerweise erfor
dert die Expression eines Polypeptids ein geeignetes Initia
tionscodon (z. B. Methionin), einen offenen Leserahmen und
Translationsregulationssignale (z. B. eine Ribosomenbindungs
stelle, ein Terminationscodon), die fehlen können, wenn die
Translation einer Nucleinsäuresequenz zur Herstellung eines
Proteins nicht erwünscht ist.
Die Expression von hTRT-Polypeptiden und Polynucleotiden
kann durchgeführt werden, um die Vorteile zu nutzen, die mit
den der vorliegenden Erfindung bereitgestellten Vorteilen
einhergehen. Ein Beispiel eines solchen Vorteils ist die Ex
pression von hTRT-Polypeptiden, die im Anschluß daran von
der Zelle, in der sie exprimiert wurden, isoliert werden
(z. B. zur Herstellung großer Mengen von hTRT zur Verwendung
als ein Vakzin). Ein zweites Beispiel für einen solchen Vor
teil ist die Expression von hTRT in einer Zelle zur Verände
rung des Phänotyps der Zelle (wie bei Anwendungen in der
Gentherapie). Nicht-Säugerzellen können für die Expression
von hTRT zur Reinigung verwendet werden, während eukaryoti
sche Zellen, insbesondere Säugerzellen (z. B. menschliche
Zellen) nicht nur für die Isolation und Reinigung von hTRT
verwendet werden können, sondern auch zur Expression von
hTRT, wenn eine Veränderung im Phänotyp in einer Zelle er
wünscht ist (z. B. um eine Änderung in der Fähigkeit zur Pro
liferation z. B. bei Anwendungen in der Gentherapie zu errei
chen). hTRT-Polypeptide mit einer oder mehreren Telomerase-
Aktivitäten (z. B. der katalytischen Aktivität von Telome
rase) können beispielsweise, allerdings ohne Beschränkung
darauf, in einer Wirtszelle exprimiert werden, um so die Fä
higkeit einer Zelle zur Proliferation zu erhöhen (z. B. um
eine Zelle zu immortalisieren). Im Gegensatz dazu können
hTRT- "antisense"-Polynucleotide oder hemmende Polypeptide
typischerweise zur Herabsetzung der Fähigkeit einer Zelle
zur Proliferation exprimiert werden (z. B. bei einer Telome
rase-positiven malignen Tumorzelle). Zahlreiche spezifische
Anwendungsmöglichkeiten werden hier beschrieben, beispiels
weise bei der nachstehenden Diskussion der Verwendungen der
erfindungsgemäßen Reagenzien und Verfahren für therapeuti
sche Anwendungen.
Zu den Beispielen von nützlichen erfindungsgemäßen Expressi
onssystemen (Zellen, regulatorische Elemente, Vektoren und
Expression) gehören eine Reihe von zell-freien Systemen, wie
beispielsweise ein Retikulocytenlysat und Weizenkeim-Sy
steme, die hTRT-Polynucleotide gemäß allgemeiner, auf dem
Fachgebiet gut bekannter Verfahren verwenden (siehe bei
spielsweise Ausubel et al., a.a.O., Kapitel 10). In alterna
tiven Ausführungsformen stellt die Erfindung Reagenzien und
Verfahren zur Expression von hTRT in prokaryotischen oder
eukaryotischen Zellen bereit. Die vorliegende Erfindung
stellt somit Nucleinsäuren bereit, die hTRT-Polynucleotide
codieren, Proteine, Protein-Untersequenzen oder Fusionspro
teine, die in Bakterien, Pilzen, Pflanzen, Insekten und Tie
ren, einschließlich Menschen, auf dem Fachgebiet bekannten
Zellexpressionssystemen einschließlich isolierter Zellen,
Zellinien, Zellkulturen, Geweben und ganzen Organismen ex
primiert werden können. Es ist für den Fachmann offensicht
lich, daß die in eine Wirtszelle oder ein zellfreies Expres
sionssystem eingeführten hTPT-Polynucleotide üblicherweise
mit einer geeigneten Expressionskontrollsequenz für jeden
Wirt oder jedes zellfreie System funktionell verknüpft sind.
Zu den nützlichen bakteriellen Expressionssystemen gehören
E. coli, Bacilli (wie beispielsweise Bacillus subtilis), an
dere Enterobacteriaceae (wie Salmonella, Serratia und zahl
reiche Pseudomonasarten) oder andere bakterielle Wirte (z. B.
Streptococcus cremoris, Streptococcus lactis, Streptococcus
thermophilus, Leuconostoc citrovorum, Leuconostoc mesente
roides, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus lactis, Bi
fidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve und Bifidobac
terium longum). Zu den in Prokaryoten nützlichen hTRT-Ex
pressionskonstrukten gehören rekombinante Bakteriophagen,
Plasmid- oder Cosmid-DNA-Expressionsvektoren oder ähnliche
und diese beinhalten typischerweise Promotorsequenzen. Zu
den Beispielen für Promotoren zählen induzierbare Promoto
ren, wie der lac-Promotor, der Hybrid-lacZ-Promotor des
"Bluescript7"-Phagemids (Stratagene, La Jolla CA) oder
pSport1 (Gibco BRL); Promotorsysteme vom Phagen lambda; ein
Tryptophan (trp)-Promotorsystem; ptrp-lac-Hybride etc. Die
bakteriellen Expressionskonstrukte enthalten gegebenenfalls
eine Ribosomenbindungsstelle und regulatorische Signalse
quenzen für die Termination der Transkription. Zu den veran
schaulichenden Beispielen von spezifischen Vektoren, die für
die Expression von Nutzen sind, zählen pTrcHis2 (Invitrogen,
San Diego CA), pThioHis A, B & C und zahlreiche andere auf
dem Fachgebiet bekannte Vektoren oder solche, die entwickelt
werden können (siehe beispielsweise Ausubel, a.a.O). Zu den
für Bakterien nützlichen Vektoren gehören solche, die die
Herstellung von hTRT-Fusionsproteinen erleichtern. Zu den
für die Expression von Fusionsproteinen in bakteriellen Zel
len mit hohem Niveau nützlichen Vektoren zählen, allerdings
ohne Beschränkung darauf, die multifunktionalen Clonierungs- und
Expressionsvektoren für E. coli, beispielsweise der vor
stehend erwähnte Bluescript7 (Stratagene), bei dem die ein
hTRT-Protein, ein hTRT-Fusionsprotein oder ein hTRT-Fragment
codierende Sequenz im Leserahmen mit Sequenzen für das ami
noterminale Met und die sich daran anschließenden 7 Reste
der β-Galactosidase in den Vektor ligiert werden kann, so
daß ein Hybridprotein hergestellt wird (z. B. pIN-Vektoren;
van Heeke und Schuster, J. Biol. ehem. 264 (1989), 5503).
Vektoren, wie beispielsweise pGEX-Vektoren (z. B. pGEX-2TK;
Pharmacia Biotech) können auch zur Expression von Fremdpoly
peptiden wie einem hTRT-Protein als Fusionsproteine mit
Glutathion-S-Transferase (GST) verwendet werden. Solche Fu
sionsproteine können von lysierten Zellen durch Adsorption
an Glutathion-Agarose-Kügelchen und anschließender Elution
in Gegenwart von freiem Glutathion gereinigt werden. In sol
chen Systemen hergestellte Proteine enthalten oft Protease-
Spaltstellen für Enterokinase, Thrombin oder Faktor Xa, so
daß das erwünschte clonierte Polypeptid von der GST-Einheit,
falls erwünscht, freigesetzt werden kann, was bei der Reini
gung oder anderen Anwendungsmöglichkeiten von Nutzen ist.
Weitere Beispiele sind Fusionsproteine, die hTRT und das
Maltose-bindende Protein von E. coli (MBP) oder Thioredoxin
von E. coli umfassen. Veranschaulichende Beispiele von in
bakteriellen Zellen nützlichen hTRT-Expressionskonstrukten
werden in dem nachstehenden Beispiel 6 bereitgestellt.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner hTRT-Polypeptide zur
Verfügung, die in Pilzsystemen wie beispielsweise Dictyoste
lium und vorzugsweise Hefe wie beispielsweise Saccharomyces
cerevisiae, Pichia pastoris, Torulopsi holmil, Saccharomyces
fragilis, Saccharomyces lactis, Hansenula polymorpha und
Candida pseudotropicalis exprimiert wurden. Für die Expres
sion von hTRT in Hefe stehen eine Reihe von geeigneten Vek
toren zur Verfügung, zu denen Plasmid- und YACs-Vektoren ge
hören (YACs = künstliche Hefechromosomen). Die Vektoren ent
halten typischerweise Expressionskontrollsequenzen, wie z. B.
konstitutive oder induzierbare Promotoren (z. B. den α-Faktor,
Alkoholoxidase, PGH und 3-Phosphoglyceratkinase oder andere
glykolytische Enzyme), einen Replikationsursprung, Termina
tionssequenzen etc., je nachdem, was erwünscht ist. Zu den
zur Verwendung in Pichia geeigneten Vektoren gehören pPICZ,
His6/pPICZB, pPICZalpha, pPIC3.5K, pPIC9K, pA0815 pGAP2A, B
& C, pGAP2alpha A, B und C (Invitrogen, San Diego, CA) und
zahlreiche weitere auf dem Fachgebiet bekannte oder noch zu
entwickelnde Vektoren. In einer Ausführungsform wird der
Vektor His6/pP1CZB (Invitrogen, San Diego, CA) zur Ex
pression eines His6-hTRT-Fusionsproteins in der Hefe Pichia
pastoris verwendet. pYES2 (Invitrogen, San Diego, CA) ist
ein Beispiel für einen in Saccharomyces nützlichen Vektor.
Veranschaulichende Beispiele von in Hefe nützlichen hTRT-Ex
pressionskonstrukten werden in dem nachstehenden Beispiel 6
bereitgestellt.
Die erfindungsgemäßen hTRT-Polypeptide können auch in Pflan
zenzellensystemen exprimiert werden, die mit Pflanzen- oder
Pflanzenvirus-Expressionsvektoren (z. B. mit Blumenkohl
mosaikvirus, CaMV; Tabakmosaikvirus, TMV) transfiziert oder
mit bakteriellen Expressionsvektoren (Ti oder dem Plasmid
pBR322) transformiert wurden. In Fällen, bei den Pflanzenvi
rus-Expressionsvektoren verwendet werden, kann die Expres
sion einer hTRT-codierenden Sequenz durch eine Reihe von
Promotoren gesteuert werden. Beispielsweise können virale
Promotoren wie die 35S und 19S-Promotoren von CaMV (Brisson
et al., Nature 310 (1984) 511-514) allein oder in Kombina
tion mit der Omega Leader-Sequenz von TMV verwendet werden
(Takamatsu et al., EMBO J. 6 (1987) 307-311). In einer al
ternativen Ausführungsform können Pflanzenpromotoren wie der
Promotor von dem Gen für die kleine Untereinheit von RUBISCO
(Coruzzi et al., EMBO J. 3 (1984) 1671 bis 1680 und Broglie
et al., Science 224 (1984), 838-843) oder Hitzeschockpromo
toren (Winter und Sinibaldi, Results Probl. Cell Differ. 17
(1991), 85 oder Promotoren von Genen für Speicherproteine
verwendet werden. Diese Konstrukte können durch direkte DNA-Trans
formation oder pathogen-vermittelte Transfektion in
Pflanzenzellen eingeführt werden (zum weiteren Studium die
ser Verfahren sei verwiesen auf Hobbs oder Murry (1992) in
McGraw Hill Yearbook of Science and Technology, McGraw Hill
New York NY, S. 191-196 (1992), oder Weissbach und Weissbach
(1988), Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press,
New York NY, S. 421-463).
Ein weiteres, durch die vorliegende Erfindung bereitgestell
tes Expressionssystem zur Expression eines hTRT-Proteins ist
ein Insektensystem. Bei einem bevorzugten System wird ein
Baculovirus-Polyhedrin-Promotor verwendet. In einem dieser
Systeme wird der nucleäre Polyhedrosis-Virus von Autographa
californica (AcNPV) als Vektor zur Expression von Fremdgenen
in Spodoptera frugiperda-Zellen oder in Trichoplusia-Larven
verwendet. Die das gewünschte Gen codierende Sequenz kann in
einen nicht-essentiellen Bereich des Virus, beispielsweise
das Polyhedringen, cloniert werden und unter die Kontrolle
des Polyhedrinpromotors gestellt werden. Die erfolgreiche
Insertion der Sequenz, die beispielsweise das hTRT-Protein
codiert, führt zur Inaktivierung des Polyhedringens und es
wird ein rekombinantes Virus hergestellt, dem das Hüllpro
tein fehlt. Die rekombinanten Viren werden dann zur Infek
tion von S. frugiperda-Zellen oder Trichoplusia-Larven ver
wendet, in denen dann die hTRT-Sequenz exprimiert wird
(siehe bezüglich allgemeiner Verfahren Smith et al., J.
Virol. 46 (1983), 584 und Engelhard et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. 91 (1994) 3224-7). Zu den für die Baculovirus-
Expression nützlichen Vektoren zählen pBlueBacHis2 A, B & C;
pBlueBac4.5; pMelBacB und zahlreiche andere auf dem Fachge
biet bekannte Vektoren oder noch zu entwickelnde Vektoren.
Veranschaulichende Beispiele von hTRT-Expressions-Konstruk
ten, die in Insektenzellen von Nutzen sind, werden in dem
nachstehenden Beispiel 6 bereitgestellt.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Expressionssysteme in
Säugern und Säugerzellen bereit. Wie bereits vorstehend an
gemerkt, können hTRT-Polynucleotide in Säugerzellen (z. B.
menschlichen Zellen) für die Herstellung von signifikanten
Mengen von hTRT-Polypeptiden (z. B. zur Reinigung) oder zur
Veränderung des Phänotyps einer Zielzelle (z. B. für Zwecke
der Gentherapie, Zellimmortilisation etc.) exprimiert wer
den. Im letzteren Fall kann das exprimierte hTRT-Polynucleo
tid ein Polypeptid mit einer katalytischen Aktivität von Te
lomerase codieren oder auch nicht. Das heißt, es kann ein
"sense" oder "antisense"-Polynucleotid, ein hemmendes oder
stimulierendes Polypeptid, ein Polypeptid mit null, einer
oder mehreren Telomerase-Aktivitäten exprimiert werden. Wei
tere Kombinationen und Varianten sind für den Fachmann nach
Lesen dieser Beschreibung offensichtlich.
Zu den für die Expression der erfindungsgemäßen Nucleinsäu
ren geeigneten Gewebekultur-Säugerzellen gehören jede nor
male sterbliche, normale oder abnorme unsterbliche tierische
oder menschliche Zelle. Dazu gehören: die mit SV40 transfor
mierte Affennierenlinie CVI (COS-7, ATCC CRL 1651), die men
schliche embrionale Nierenlinie (293) (Graham et al., J.
Gen. Virol. 36 (1977), 59), die Babyhamsternierenzellen
(BHK, ATCC CCL 10), CHO (ATCC CCL 61 und CRL 9618), Maus-
Sertolizellen (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23 (1980) 243-251),
Affennierenzellen (CV1, ATCC CCL 70), Nierenzellen der
Afrikanischen Grünen Meerkatze (VERO-76, ATCC CRL 1587),
menschliche Cervix-Karzinomzellen (HeLa, ATCC CCL 2), Hun
denierenzellen (MDCK, ATCC CCL 34), Büffelrattenleberzellen
(BRL 3A, ATCC CRL 1442), menschliche Lungenzellen (W138,
ATCC CCL 75), menschliche Leberzellen (HEP G2, HB 8065),
Maus-Brusttumor (MMT 060562, ATCC CCL 51) und TRI-Zellen
(Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982), 44-46,
MDCK (ATCC CCL 34 und CRL 6253), HEK 293 (ATCC CRL 1573),
WI-38 (ATCC CCL 75) (ATCC: American Type Culture Collection
Rockville, MD)). Die Verwendung von Säuger-Gewebezellkul
turen zur Expression von Polypeptiden wird allgemein in
Winnacker, FROM GENES TO CLONES (VCH-Verlag, N.Y., N.Y.,
1987) erläutert.
Für Säugerwirtszellen werden auf Viren basierende und nicht
virale Expressionssysteme bereitgestellt. Zu den nicht-vira
len Vektoren und Systemen gehören Plasmide, episomale Vekto
ren, typischerweise mit einer Expressionskassette für Ex
pression eines Proteins oder einer RNA, und menschliche
künstliche Chromosomen (siehe z. B. Harrington et al., Nat
Genet 15 (1997), 345). Zu den für die Expression von hTRT-Poly
nucleotiden und Polypeptiden in Säugerzeilen (z. B.
menschlichen Zellen) nützlichen nicht-viralen Vektoren gehö
ren pcDNA3.1/His, pEBVHis A, B & C (Invitrogen, San Diego
CA), MPSV-Vektoren, andere in dem Invitrogen-Katalog von
1997 beschriebene Vektoren (Invitrogen Inc., San Diego CA),
der aufgrund der Bezugnahme vollständig zum Offenbarungsge
halt der vorliegenden Beschreibung zählt, sowie bezüglich
weiterer Proteine zahlreiche andere auf dem Fachgebiet be
kannte Vektoren und Systeme. Veranschaulichende Beispiele
von in Säugerzellen nützlichen hTRT-Expressionskonstrukten
werden nachstehend in Beispiel 6 bereitgestellt.
Zu den nützlichen viralen Vektoren zählen Vektoren, die auf
Retroviren basieren, Adenoviren, adeno-assoziierte Viren,
Herpesviren, auf SV40 basierende Vektoren, Papilloma Viren,
HBP-Epstein Barr Virus, Vaccinia Virus-Vektoren und "Semliki
Forest"-Virus (SFV). SFV und Vacciniavektoren werden allge
mein in Ausubel et al., a.a.O., Kapitel 16 diskutiert. Diese
Vektoren sind oft aus zwei Komponenten aufgebaut, einem mo
difizierten viralen Genom und einer dieses umgebenden Hüll
struktur (siehe allgemein Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49
(1995), 807). Allerdings werden gelegentlich virale Vektoren
in nackter Form oder umhüllt mit Proteinen, die nicht zu vi
ralen Proteinen zählen, eingeführt. Die virale Nucleinsäure
in einem Vektor kann jedoch auf vielfältige Weise verändert
werden, beispielsweise wenn dies für die Gentherapie er
wünscht ist. Ziele dieser Veränderungen sind das Wachstum
des Virus in Zielzellen zu verhindern und Beibehaltung sei
ner Fähigkeit in Vektorform in verfügbaren Pack- oder Hel
ferzellen zu wachsen, um Raum innerhalb des viralen Genoms
zur Insertion von exogenen DNA-Sequenzen bereitzustellen und
um neue Sequenzen einzufügen, die das gewünschte Gen codie
ren und eine geeignete Expression ermöglichen. Somit umfas
sen Vektor-Nucleinsäuren im allgemeinen zwei Bestandteile:
essentielle in cis wirkende Viralsequenzen zur Replikation
und Verpackung in einer Helferlinie und die Transkriptions
einheit für das exogene Gen. Andere virale Funktionen werden
in einer spezifischen Verpackungs- oder Helfer-Zellinie in
trans exprimiert. Adenovirus-Vektoren (z. B. zur Verwendung
in der Gentherapie bei Menschen) sind beispielsweise in
Rosenfeld et al., Cell 68 (1992), 143 und in den PCT-Veröf
fentlichungen WO 94/12650; 94/12649 und 94/12629 beschrie
ben. In Fällen, in denen als Expressionsvektor ein Adeno
virus verwendet wird, kann eine hTRT codierende Sequenz in
einen Adenovirus-Transkriptions/Translations-Komplex ligiert
werden, der aus dem späten Promotor und der dreiteiligen
Leadersequenz besteht. Die Insertion in einen nicht-essenti
ellen E1- oder E3-Bereich des viralen Genoms ergibt ein le
bensfähiges Virus, das in infizierten Wirtszellen exprimie
ren kann (Logan und Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. 81 (1984),
3655). Replikations-defiziente retrovirale Vektoren, die
eine therapeutische Polynucleotidsequenz als Teil des retro
viralen Genoms enthalten, werden beispielsweise beschrieben
in Miller et al., Mol. Cell. Biol. 10 (1990) 4239; Kolberg,
J. NIH Res. 4 ( 1992), 43 und Cornette et al., Hum. Gene
Ther. 2 (1991), 215.
In Säuger-Zellsystemen sind oft Promotoren von Säugergenen
oder Säugerviren geeignet. Geeignete Promotoren können kon
stitutiv sein, Zelltyp-spezifisch, Stadium-spezifisch
und/oder modulierbar oder regulierbar (z. B. durch Hormone,
wie beispielsweise Glucocorticoide). Zu nützlichen Promoto
ren zählen, jedoch ohne Beschränkung darauf, der
Metallothionein-Promotor, der konstitutive "Major late"-Pro
motor von Adenovirus, der Dexamethason-induzierbare MMTV,
der SV40-Promotor, der MRP polIII-Promotor, der konstitutive
MPSV-Promotor, der Tetracyclin-induzierbare CMV-Promotor
(wie beispielsweise der menschliche "immediate-early" CMV-Pro
motor), der konstitutive CMV-Promotor und auf dem Fachge
biet bekannte Promotor-Enhancer-Kombinationen.
Für eine effiziente Expression eines hTRT-Polynucleotids
und/oder die Translation einer hTRT-Proteine codierenden Se
quenz können auch weitere regulatorische Elemente erforder
lich oder erwünscht sein. Für die Translation beinhalten
diese Elemente typischerweise ein ATG-Initiationscodon und
eine benachbarte Ribosomen-Bindungsstelle oder andere Se
quenzen. Für das hTRT-Protein codierende Sequenzen sind,
falls dessen Initiationscodon und stromaufwärts gelegene
Promotorsequenzen in einen Expressionsvektor inseriert sind,
keine zusätzlichen Translationssignale oder andere Kontroll
signale erforderlich. In Fällen jedoch, in denen nur eine
codierende Sequenz oder ein Teil davon inseriert ist, müssen
oft exogene Transkriptions- und/oder Translations-Kontroll
signale (z. B. der Promotor, die Ribosomenbindungsstelle und
das ATG-Initiationscodon) bereitgestellt werden. Darüber
hinaus muß das Initiationscodon typischerweise im korrekten
Leserahmen vorliegen, um die Translation des gewünschten
Proteins zu gewährleisten. Exogene Transkriptionselemente
und Initiationscodons können von zahlreichen Quellen, sowohl
natürlichen als auch synthetischen, stammen. Zusätzlich kann
die Effizienz der Expression durch die Einfügung von für das
verwendete Zellsystem geeigneten Enhancern verstärkt werden
(Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20 (1994), 125
und Bittner et al., Meth. Enzymol. 153 (1987), 516). Bei
spielsweise kann zur Steigerung der Expression in Säuger-
Wirtszellen der SV40-Enhancer oder der CMV-Enhancer verwen
det werden.
Die Expression von hTRT-Genprodukten kann auch durch Akti
vierung eines hTRT-Promotors oder Enhancers in einer Zelle,
wie beispielsweise einer menschlichen Zelle, z. B. einer Te
lomerase-negativen Zellinie, bewirkt (erhöht) werden. Die
Aktivierung kann durch eine Reihe von unterschiedlichen Maß
nahmen erreicht werden. Dazu zählen die Verabreichung eines
einen exogenen Promotor aktivierenden Agens oder die Hemmung
eines zellulären Bestandteils, der die Expression des hTRT-Gens
unterdrückt. Natürlich wird umgekehrt die Hemmung der
Promotorfunktion, so wie dies nachstehend beschrieben ist,
die hTRT-Genexpression herabsetzen.
Die Erfindung stellt die induzierbare und reprimierbare Ex
pression von hTRT-Polypeptiden unter Verwendung solcher Sy
steme wie des Ecdyson-induzierbaren Expressionssystems
(Invitrogen) und die "Tet-On and Tet-off" Tetracyclin-regu
lierten Systeme von Clontech bereit. Bei dem durch Ecdyson
induzierbaren Expressionssystem wird ein Analogon des
Steroidhormons Ecdyson, Muristeron A zur Aktivierung der Ex
pression eines rekombinanten Proteins über einen heterodimä
ren nucleären Rezeptor verwendet (No et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 93 (1996), 3346). In einer Ausführungsform
wird hTRT in den pIND-Vektor (Clontech) cloniert, der fünf
modifizierte Ecdyson-Reaktionselemente (E/GREs) stromauf
wärts eines minimalen Hitzeschockpromotors und der Mehr
fachclonierungsstelle enthält. Dieses Konstrukt wird dann in
den Ecdyson-Rezeptor stabil exprimierenden Zellinien trans
fiziert. Nach der Transfektion werden die Zellen zur Induk
tion der intrazellulären Expression von pIND mit Muristeron
A behandelt. In einer anderen Ausführungsform wird das hTRT-Poly
peptid unter Verwendung der "Tet-on and Tet-off"-Expres
sionssysteme (Clontech) neben den beschriebenen regulierten
Hochniveau-Genexpressionssystemen exprimiert (Gossen et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 5547 und Gossen et
al., Science 268 (1995), 1766).
Die erfindungsgemäßen hTRT-Vektoren können in eine Zelle,
ein Gewebe, Organ, einen Patienten oder ein Tier durch eine
Reihe von Verfahren eingeführt werden. Die erfindungsgemäßen
Nucleinsäureexpressionsvektoren (typischerweise dsDNA) kön
nen in die gewählte Wirtszelle durch allgemein bekannte Ver
fahren wie die Calciumchlorid-Transformation (für bakteri
elle Systeme), Elektroporation, Calciumphosphat-Behandlung,
Liposomen-vermittelte Transformation, Injektion und Mikroin
jektion, ballistische Verfahren, Virosomen, Immunoliposomen,
Polykation:Nucleinsäure-Konjugate, nackte DNA, künstliche
Virione, Fusion an das Herpesvirus-Strukturprotein VP22
(Elliot und O'Hare, Cell 88, 223) durch Agens-verstärkte
Aufnahme von DNA und ex-vivo-Transduktion transferiert wer
den. Nützliche Liposomen-vermittelte DNA-Transferverfahren
sind in den US-Patenten Nr. 5,049,386, 4,946,787 und
4,897,355, in den PCT-Veröffentlichungen WO 91/17424 und WO
91/16024 beschrieben sowie in Wang und Huang, Biochem. Bio
phys. Res. Commun. 147 (1987), 980; Wang und Huang, Bioche
mistry 28 (1989), 9508; Litzinger und Huang, Biochem. Bio
phys. Acta 1113 (1992), 201; Gao und Huang, Biochem. Bio
phys. Res. Commun. 179 (1991), 280. Immunliposomen als Trä
ger für exogene Polynucleotide wurden ebenfalls beschrieben
(Wang und Huang, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 7851
und Trubetskoy et al., Biochem. Biophys. Acta 1131 ( 1992),
311). Diese dürften im Vergleich zu Liposomen eine verbes
serte Zelltyp-Spezifität aufgrund des Einschlusses von spe
zifischen Antikörpern, die vermutlich an Oberflächenantigene
auf spezifischen Zelltypen binden, verbesserte Zelltypenspe
zifität aufweisen. Behr et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
86 (1989), 6982, berichten über die Verwendung von Lipopoly
amin als ein Reagenz zur Vermittlung der Transfektion
selbst, wobei es nicht nötig ist, zur Bildung von Liposomen
irgendein zusätzliches Phospholipid zuzugeben. Geeignete
Einführungsverfahren können vom Fachmann im Hinblick auf ge
eignete Praktiken und Erfordernisse bezüglich der Regulation
(z. B. zur Gentherapie oder zur Herstellung von Zellinien zur
Expression von rekombinanten Proteinen) ausgewählt werden.
Natürlich können die oben aufgezählten Einführungsverfahren
auch zum Transfer von Nucleinsäuren in Zellen für die Gen
therapie, den Transfer in Gewebekulturzellen etc. verwendet
werden.
Für die langfristige Herstellung von rekombinanten Proteinen
mit hoher Ausbeute ist oft eine stabile Expression er
wünscht. Beispielsweise können hTRT stabil exprimierende
Zellinien unter Verwendung der erfindungsgemäßen Ex
pressionsvektoren hergestellt werden, die virale Replika
tionsursprünge oder endogene Expressionselemente und ein se
lektierbares Markergen enthalten. Nach der Einschleusung des
Vektors kann man die Zellen 1 bis 2 Tage in angereicherten
Medien wachsen lassen, bevor man zu Selektivmedien wechselt.
Der selektierbare Marker dient dazu, zur Selektion eine Re
sistenz zu verleihen. Seine Gegenwart erlaubt das Wachstum
von Zellen, die die eingeschleusten Sequenzen in Selektivme
dien erfolgreich exprimieren. Resistente und stabil transfi
zierte Zellen können unter Verwendung von für den entspre
chenden Zelltyp geeigneten Gewebekulturverfahren vermehrt
werden. Ein Amplifikationsschritt kann eingefügt werden,
beispielsweise durch Verabreichung von Methyltrexat an mit
einem DHFR-Gen transfizierten Zellen gemäß auf dem Fachge
biet allgemein bekannter Verfahren.
Zusätzlich kann ein Wirtszellstamm gewählt werden hinsicht
lich seiner Fähigkeit, die Expression der inserierten Se
quenzen zu modulieren oder das exprimierte Protein auf die
gewünschte Weise zu prozessieren. Zu solchen Modifikationen
des Polypeptids zählen, allerdings ohne Beschränkung darauf,
Acetylierung, Carboxylierung, Phosphorylierung, Lipidierung
und Acylierung. Die post-translationale Prozessierung kann
auch für die korrekte Insertion, Faltung und/oder Funktion
wichtig sein. Die verschiedenen Wirtszellen verfügen über
eine zelluläre Maschinerie und charakteristische Mechanismen
für solche post-translationale Aktivitäten, die für jede
Zelle spezifisch sind. Somit kann eine bestimmte Zelle zur
Gewährleistung der korrekten Modifikation und Prozessierung
des eingeschleusten Fremdproteins gewählt werden.
Die vorliegende Erfindung stellt auch transgene Tiere (d. h.
Säuger, die bezüglich einer menschlichen oder anderen TRT-Gen
sequenz transgen sind), bereit, die ein hTRT- oder ein
anderes TRT-Polynucleotid oder Polypeptid exprimieren. In
einer Ausführungsform wird hTRT in der Milch eines transge
nen Säugers, wie beispielsweise eines transgenen Rinds, ei
ner Ziege oder eines Kaninchens, sezerniert. Verfahren zur
Herstellung solcher Tiere können beispielsweise in Heyneker
et al., PCT WO 91/08216 gefunden werden.
Die erfindungsgemäßen hTRT-Proteine und Komplexe, zu denen
die durch die vorstehend beschriebenen Expressionssysteme
hergestellten zählen, können unter Verwendung einer Reihe
von allgemeinen, auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren in
Übereinstimmung mit den durch die vorliegende Erfindung be
reitgestellten spezifischen Verfahren (wie beispielsweise
nachstehend beschrieben) gereinigt werden. Es ist für den
Fachmann offensichtlich, daß nach chemischer Synthese, bio
logischer Expression oder Reinigung das hTRT-Protein eine
Konformation besitzen kann, die sich von der nativen Konfor
mation von natürlich vorkommender Telomerase unterscheidet.
In einigen Fällen mag es hilfreich oder sogar nötig sein,
das Polypeptid zu denaturieren (was beispielsweise die Re
duktion von Disulfid- oder anderen Bindungen beinhalten
kann) und danach das Polypeptid zu einer Rückfaltung in die
bevorzugte Konformation zu bringen. Eine korrekte Rückfal
tung kann auch die Gegenwart von hTR (oder hTR-Fragmenten)
erforderlich machen. Verfahren zur Reduktion und Denaturie
rung von Proteinen und zur Induktion der Rückfaltung sind
dem Fachmann bekannt (siehe beispielsweise Debinski et al.,
J. Biol. Chem. 268 (1993), 14065; Kreitman und Pastan, Bio
conjug. Chem. 4 (1993), 581; und Buchner et al.; Anal Bio
chem. 205 (1992), 263 und McCaman et al., J. Biotech.
(1985), 177). (Siehe auch USSN 08/478,352, eingereicht am 7.
Juni 1995, a.a.O.).
Erfindungsgemäße hTRT-Polypeptide können in vivo und in vi
tro mit anderen Biomolekülen assoziieren, wozu RNAs (z. B.
hTR), Proteine (z. B. Telomerase-assoziierte Proteine), BNA
(z. B. Telomer-DNA, [T2AG3]N) und Nucleotide wie (Desoxy)-ri
bonucleotid-triphosphate gehören. Diese Assoziationen kön
nen dazu verwendet werden, um die Anwesenheit oder Funktion
von hTRT nachzuweisen, um hTRT oder Telomerase-assoziierte
Moleküle zu identifizieren oder zu reinigen und um die
Struktur oder Funktion von hTRT oder Telomerase gemäß den
erfindungsgemäßen Verfahren zu analysieren.
In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung
hTRT bereit, das mit einer Nucleinsäure, üblicherweise einer
RNA einen Komplex bildet (z. B. damit assoziiert oder daran
gebunden ist). In einer Ausführungsform kann die gebundene
RNA als eine Matrize für eine Telomerase-vermittelte DNA-Syn
these fungieren. Zu den Beispielen für RNAs, die mit dem
hTRT-Polypeptid einen Komplex bilden können, zählen eine na
türlich vorkommende Wirtszell-Telomerase-RNA, eine menschli
che Telomerase-RNA (z. B. hTR; US-Patent Nr. 5,583,016), eine
hTR-Untersequenz oder -Domäne, eine synthetische RNA oder
andere RNAs. Der RNA-hTRT-Proteinkomplex (ein RNP) weist ty
pischerweise eine oder mehrere Telomerase-Aktivitäten auf,
beispielsweise katalytische Aktivitäten von Telomerase.
Diese hTRT-hTR-RNPs (oder andere hTRT-RNA-Komplexe) können
mittels einer Reihe von Verfahren, wie sie nachstehend zur
Veranschaulichung beschrieben sind, hergestellt werden, dazu
gehören in vitro-Rekonstitution und Coexpression von hTRT
und hTR (und einer anderen RNA) in vitro (d. h. in einem
zellfreien System) in vivo oder ex vivo.
Somit stellt die vorliegende Erfindung in einer Ausführungs
form einen hTRT-hTR-Komplex (oder einen anderen hTRT-RNA-Kom
plex) bereit, der in vitro durch Mischen getrennt gerei
nigter Bestandteile gebildet wurde ("in vitro-Rekonstitu
tion"; siehe beispielsweise US-Patent Nr. 5,583,016 bezüglich
einer Beschreibung der Rekonstitution und USSN 08/478,352,
eingereicht am 7. Juni 1995; siehe auch Autexier et al.,
EMBO J. 15; 5928).
In einer alternativen Ausführungsform stellt die Erfindung
Telomerase-RNPs bereit, die durch Coexpression des hTRT-Poly
peptids und einer RNA (z. B. hTR) in vitro in einem zell
freien Transkriptions/Translations-System (z. B. Weizenkeim
lysat oder Kaninchen-Reticulocytenlysat) hergestellt wurden.
Wie in Beispiel 7 gezeigt, führt die Coexpression eines re
kombinanten hTRT-Polypeptids und von hTR in vitro zur Her
stellung von katalytischer Aktivität von Telomerase
(gemessen durch einen TRAP-Assay).
Die vorliegende Erfindung stellt darüber hinaus Telomerase-
RNPs bereit, die durch Expression des hTRT-Polypeptids in
einer Zelle, beispielsweise einer Säugerzelle, hergestellt
werden, in der hTR natürlicherweise exprimiert wird, oder in
die hTR (oder eine andere RNA, die mit dem hTRT-Protein
einen Komplex bilden kann) eingeführt wird, oder durch Re
kombination exprimiert wird. Somit wird in einer Ausfüh
rungsform hTRT in einer Telomerase-negativen menschlichen
Zelle, in der hTR vorhanden ist (z. B. BJ- oder IMP90-Zellen)
exprimiert, was die Assemblierung beider Moleküle zu einem
RNP erlaubt. In einer weiteren Ausführungsform wird hTRT in
einer menschlichen oder nicht-menschlichen Zelle, in der hTR
rekombinant exprimiert wird, exprimiert. Verfahren zur Ex
pression von hTR in einer Zelle können in dem US-Patent
5,583,016 gefunden werden. Der Clon pGRN33, der eine die
RNA-Komponente von Telomerase codierende cDNA enthält, wurde
ferner hinterlegt (ATCC 75926). Die RNA-Komponente von
menschlicher Telomerase codierenden genomischen Sequenzen
wurden als ∼15 kb SauIIIA1 bis HindIII-Insertion des Clons
28-1 hinterlegt (ATCC 75925). Zur Expression in eukaryoti
schen Zellen wird die hTRT-Sequenz typischerweise mit einer
Transkriptions-Initiationssequenz (RNA-Polymerase-Bindungs
stelle) und Transkriptions-Terminationssequenzen funktionell
verknüpft (siehe beispielsweise PCT-Veröffentlichung WO
96/01835; Feng et al., Science 269 (1995), 1236).
Die vorliegende Erfindung stellt darüber hinaus rekombinant
hergestellte oder im wesentlichen gereinigte hTRT-Polypep
tide bereit, die mit sogenannten "Telomerase-assoziierten
Proteinen" coexprimiert und/oder assoziiert sind. Somit
stellt die vorliegende Erfindung hTRT bereit, das mit ande
ren Proteinen (z. B. Telomerase-assoziierten Proteinen) coex
primiert wird oder mit diesen einen Komplex bildet. Unter
Telomerase-assoziierten Proteinen versteht man solche Pro
teine, die mit menschlicher Telomerase mit aufgereinigt wer
den und/oder eine Rolle bei der Modulation der Telomerase
funktion oder -Aktivität spielen können, beispielsweise
dadurch, daß sie an der Assoziation von Telomerase mit
Telomer-DNA beteiligt sind. Zu den Beispielen für
Telomerase-assoziierte Proteine gehören (jedoch ohne Be
schränkung darauf) die folgenden Proteine und/oder ihre
menschlichen Homologe: Nucleolin (siehe die parallele US-Pa
tentanmeldung mit der Serien-Nr. 08/833,377 und Srivastava
et al., FEBS Letts. 250 (1982), 99); EF2H (das Homolog zum
Elongationsfaktor 2; siehe die parallele US-Patentanmeldung
Nr. 08/8 99999 00070 552 001000280000000200012000285919988800040 0002019743497 00004 9988033,377 und Nomura et al., DNA Res. (Japan) 1 (1994),
27, GENBANK Zugangsnummer #D21163), TP1/TLP1 (Harrington et
al., Science 275 (1997), 973); Nakayama et al., Cell 88
(1997), 875; das menschliche Homolog zu Tetrahymena p95
(Collins et al., Cell 81 (1995) 677); TPC2 (ein die Telomer
länge regulierendes Protein; ATCC-Zugangsnummer 97708 (siehe
USSN 08/710,249 und 08/713,922, beide am 13. September 1996
eingereicht)), TPC3 (ebenfalls ein die Telomerlänge regulie
rendes Protein; ATCC-Zugangsnummer 97707 (siehe USSN
08/710,249 und 08/713,922, beide eingereicht am 13. Septem
ber 1996)), DNA-bindendes Protein B (dbpB; Horwitz et al.,
J. Biol. Chem. 269 (1994), 14130) und der die Telomer-
Wiederholungseinheit bindende Faktor (TRF 1 & 2; Chang et
al., Science 270 ( 1995), 1663; Chong et al., Hum. Mol.
Genet. 6 (1997), 69; ESTI, 3 und 4 (Lendvay et al., Genetics
144 (1996), 1399; Nugent et al., Science 274 (1996), 249 und
Lundblad et al., Cell 57 (1989), 633) und der "End-capping"-
Faktor (Cardenas et al., Genes Dev. 7 (1993), 883).
Telomerase-assoziierte Proteine können auf der Basis der
Mitaufreinigung mit oder der Bindung an hTRT-Protein oder
das hTRT-hTR-RNP identifiziert werden. In einer alternativen
Ausführungsform können sie auf der Basis der Bindung an ein
hTRT-Fusionsprotein, beispielsweise ein GST-hTRT-Fusionspro
tein etc. identifiziert werden, wie dies durch Affinitäts
reinigung erfolgen kann (siehe Ausubel et al., Kapitel 20).
Ein besonders nützliches Verfahren zur Bestimmung von Pro
dein/Protein-Interaktionen und zur Identifizierung von hTRT-asso
ziierten Proteinen ist das "two hybrid screen"-Verfahren
von Chien et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991),
9578; siehe auch Ausubel et al., a.a.O., Kapitel 20). Durch
dieses Screenen können Protein/Protein-Interaktionen in vivo
durch Rekonstitution eines Transkriptionsaktivators, dem
Hefe-Gal4-Transkriptionsprotein identifiziert werden (siehe
Fields und Song, Nature 340 (1989), 245). Dieses Verfahren
basiert auf den Eigenschaften des Hefe-Gal4-Proteins, das
aus trennbaren Domänen besteht, die für die DNA-Bindung und
transkriptionelle Aktivierung verantwortlich sind. "Two
hybrid"-Proteine codierende Polynucleotide, üblicherweise
Expressionsvektoren, werden konstruiert. Ein Polynucleotid
umfaßt die Hefe-Gal4-DNA-bindende Domäne, die an eine Poly
peptidsequenz eines auf eine hTRT-Interaktion zu testenden
Proteins fusioniert ist (z. B. Nucleolin oder EF2H). In einer
alternativen Ausführungsform ist die Hefe-Gal4-DNA-bindende
Domäne an cDNAs aus einer menschlichen Zelle fusioniert, wo
durch eine Bank von menschlichen Proteinen, die an die Gal4-DNA-bin
dende Domäne fusioniert sind, zum Screenen nach Telo
merase-assoziierten Proteinen hergestellt wird. Die anderen
Polynucleotide umfassen die Gal4-Aktivierungsdomäne, die an
eine hTRT-Polypeptidsequenz fusioniert ist. Die Konstrukte
werden in eine Hefewirtszelle eingeführt. Nach Expression
kann die intermolekulare Bindung zwischen hTRT und dem Test
protein die Gal4-DNA-bindende Domäne mit der Gal4-aktivie
renden Domäne rekonstituieren. Dies führt zu der transkrip
tionellen Aktivierung eines Reportergens (z. B. lacZ, His3),
das mit einer Gal4-Bindungsstelle funktionell verknüpft ist.
Durch Auswählen oder Untersuchung können Reportergen-Zellko
lonien identifiziert werden, die ein mit hTRT interagieren
des Protein oder ein Telomerase-assoziiertes Protein enthal
ten. Für den Fachmann ist es offensichtlich, daß es zahlrei
che Variationen des "2-hybrid-screen"-Systems gibt, bei
spielsweise das LexA-System (Bartel et al., in Cellular In
teractions in Development: A Pratical Approach, Hartley
(Herausg.), D.A. (Oxford Univ. Press (1993), S. 153-179)).
Ein weiteres nützliches Verfahren zum Identifizieren von Te
lomerase-assoziierten Proteinen ist ein "three-hybrid"-
System (siehe beispielsweise Zhang et al., Anal. Biochem.
242 (1996), 68 und Licitra et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 93 (1996), 12817). Die Telomerase-RNA-Komponente kann in
diesem System mit der TRT oder dem hTRT-Protein und einem
Testprotein verwendet werden. Ein weiteres nützliches Ver
fahren zur Identifizierung von interagierenden Proteinen
(d. h. von Proteinen, die heterodimerisieren oder Heteromul
timere höherer Ordnung bilden) ist insbesondere das E.
coli/BCCP "interaktive Screening"-System (siehe Germino et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993), 933 und Guarente,
Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 90 (1993), 1639).
Die vorliegende Erfindung stellt auch Komplexe aus Telomer
bindenden Proteinen bereit (bei denen es sich um Telomerase
assoziierte Proteine handeln kann oder nicht) und hTRT (die
mit hTR, anderen RNAs oder einem oder mehreren Telomerase
assoziierten Proteinen komplexiert sein kann oder nicht). Zu
den Beispielen von Telomer-bindenden Proteinen gehören TRF1
und TRF2 (a.a.O.) rnpA1, rnpA2, RAP1 (Buchman et al., Mol.
Cell. Biol. 8 (1988), 210, Buchman et al., Mol. Cell. Biol.
8 (1988), 5086), SIR3 und SIR4 (Aparicio et al., Cell 66
(1991), 1279), TEL1 (Greenwell et al., Cell 82 (1995), 823;
Morrow et al., Cell 82 (1995), 831); ATM (Savitsky et al.,
Science 268 (1995), 1749), "end-capping"-Faktor (Cardenas et
al., Genes Dev. 7 (1993), 883) und die entsprechenden
menschlichen Homologe. Die vorstehend erwähnten Komplexe
können allgemein, so wie es vorstehend für Komplexe aus hTRT
und hTR oder Telomerase-assoziierten Proteinen beschrieben
wurde, hergestellt werden, beispielsweise durch Vermischen
oder Coexpression in vitro oder in vivo.
Ein verwandter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft
Antikörper, die mit hTRT spezifisch immunreaktiv sind. Dazu
gehören polyclonale und Monoclonale Antikörper,
Antikörperfragmente, Antikörper mit einer einzelnen Kette,
menschliche und chimäre Antikörper, einschließlich
Antikörper oder Antikörper-Fragmente, die an Phagenhüll- oder
Zelloberflächenproteine fusioniert sind und weitere auf
dem Fachgebiet bekannte und hier beschriebene. Die
erfindungsgemäßen Antikörper können Polypeptide spezifisch
erkennen und binden, die eine Aminosäuresequenz aufweisen,
die mit der Aminosäuresequenz von SEQ. ID. Nr. 2 im
wesentlichen identisch ist, oder ein immunogenes Fragment
davon, oder ein Epitop auf dem dadurch definierten Protein.
Die erfindungsgemäßen Antikörper können eine spezifische
Bindungsaffinität für hTRT von mindestens etwa 107, 108, 109
oder 1010 M⁻1 aufweisen. Sie können polyclonal oder
monoclonal sein, rekombinant oder auf andere Weise
hergestellt. Die Erfindung stellt auch anti-hTRT-Antikörper
bereit, die ein Konformationsepitop von hTRT erkennen
(beispielsweise ein Epitop auf der Oberfläche des hTRT-Pro
teins oder eines Telomerase-RNPs). Wahrscheinliche
Konformationsepitope können, falls erwünscht, durch
computergestützte Analyse der hTRT-Proteinsequenz
identifiziert werden, durch Vergleich mit der Konformation
von verwandten reversen Transkriptasen, wie beispielsweise
der p66-Untereinheit von HIF-1 (siehe beispielsweise Fig.
3) oder empirisch. Anti-hTRT-Antikörper, die
Konformationsepitope erkennen, sind unter anderem bei dem
Nachweis und der Reinigung von menschlicher Telomerase und
bei der Diagnose und der Behandlung von menschlichen
Erkrankungen von Nutzen.
Für die Herstellung von anti-hTRT-Antikörpern können Wirte
wie beispielsweise Ziegen, Schafe, Kühe, Meerschweinchen,
Kaninchen, Ratten oder Mäuse durch Injektion mit einem hTRT-Pro
tein oder einem beliebigen Anteil, einem Fragment oder
Oligopeptid davon, der immunogene Eigenschaften beibehalten
hat, immunisiert werden. Für die Auswahl von hTRT-Poly
peptiden zur Antikörperinduktion ist es nicht nötig, daß
diese biologische Aktivität beibehalten wird, das
Proteinfragment oder Oligopeptid muß jedoch immunogen und
vorzugsweise antigen sein. Die Immunogenität kann durch
Injektion eines Polypeptids und eines Adjuvans in ein Tier
(z. B. ein Kaninchen) und durch Untersuchung des Auftretens
von Antikörpern, die gegen das injizierte Polypeptid
gerichtet sind, nachgewiesen werden (siehe beispielsweise
Harlow und Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Laboratory, New York (1988), beispielsweise
Kapitel 5, und dieses Dokument ist durch Bezugnahme in
seiner Gesamtheit und für alle Zwecke Bestandteil dieser
Beschreibung). Zur Induktion spezifischer Antikörper
verwendete Peptide weisen typischerweise eine
Aminosäuresequenz auf, die aus mindestens fünf Aminosäuren
besteht, vorzugsweise mindestens 8 Aminosäuren und mehr
bevorzugt mindestens 10 Aminosäuren. Üblicherweise nehmen
sie die gesamte Aminosäuresequenz des Proteins mit SEQ. ID.
Nr. 2 oder einen Teil davon auf, oder besitzen eine dazu im
wesentlichen identische Sequenz. Kurze Strecken der
Aminosäure des hTRT-Proteins können mit denen anderer
Proteine fusioniert werden, wie beispielsweise das "Keyhole
limpet"-Hemocyanin und einen anti-hTRT-Antikörper, der gegen
das chimäre Molekül hergestellt wurde. In Abhängigkeit von
der verwendeten Wirtsart können verschiedene Adjuvantien zur
Steigerung der Immunantwort verwendet werden.
Das Antigen wird dem Immunsystem auf eine Weise präsentiert,
die durch für das Tier geeignete Verfahren ermittelt wurde.
Diese sowie andere Parameter sind dem Immunologen im
allgemeinen gut bekannt. Typischerweise werden die
Injektionen in die Fußballen, intramuskulär, intradermal, in
die Perilymphknoten oder intraperitoneal verabreicht. Die
durch den Wirt hergestellten Immunglobuline können
präzipitiert, isoliert und gemäß Routineverfahren, zu denen
Affinitätsreinigung zählt, gereinigt werden.
Veranschaulichende Beispiele von immunogenen hTRT-Peptiden
werden in Beispiel 8 bereitgestellt. Zusätzlich beschreibt
Beispiel 8 die Herstellung und die Verwendung von
polyclonalen anti-hTRT-Antikörpern.
Monoclonale Antikörper gegen hTRT-Proteine und Peptide können
in Übereinstimmung mit den erfindungsgemäßen Verfahren unter
Verwendung jedes Verfahrens, das für die Herstellung von
Antikörpermolekülen durch kontinuierliche Zellinien in
Kultur geeignet ist, hergestellt werden. Zu diesen Verfahren
zählen, jedoch ohne Beschränkung darauf, das ursprünglich
beschriebene Hybridom-Verfahren von Koehler und Milstein
(Nature 256 (1975), 495), das Hybridom-Verfahren mit
menschlichen B-Zellen (Kosbor et al., Immunol. Today 4
( 1983), 72 und Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80
(1983), 2026), und das EBV-Hybridom-Verfahren (Cole et al.
Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss Inc.
New York NY, S. 77-96 (1985)).
In einer Ausführungsform werden geeignete Tiere ausgewählt
und das geeignete anzuwendende Immunisierungsprotokoll. Die
Herstellung von nicht-menschlichen monoclonalen Antikörpern,
beispielsweise von der Maus, von Lagomorpha und vom Pferd
ist allgemein bekannt und kann beispielsweise durch
Immunisierung eines Tiers mit einer hTRT oder Fragmente
davon enthaltenden Präparation erfolgen. In einem Verfahren
wird nach einem geeigneten Zeitraum die Milz der Tiere
herausgeschnitten und einzelne Milzzellen werden
typischerweise mit immortalisierten Myelomzellen unter
geeigneten Selektionsbedingungen fusioniert. Danach werden
die Zellen clonal getrennt und die Überstände von jedem Clon
(z. B. Hybridom) bezüglich der Herstellung eines geeigneten
Antikörpers, der für den gewünschten Bereich des Antigens
spezifisch ist, getestet. Verfahren zur Herstellung von
Antikörpern sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt. Siehe
beispielsweise Goding et al., Monoclonal Antibodies:
Principles and Practice (2. Ausgabe), Acad. Press, N.Y., und
Harlow und Lane, a.a.O., wobei beide Veröffentlichungen
durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit und für alle Zwecke als
Bestandteil dieser Beschreibung anzusehen sind. Zu anderen
geeigneten Verfahren zählen die in vitro-Exposition von
Lymphocyten gegenüber den antigenen Polypetiden oder,
alternativ, eine Auswahl von Antikörperbanken in
Phagenvektoren oder ähnlichen Vektoren (siehe die
nachstehende Beschreibung).
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die
Bereitstellung von menschlichen Antikörpern gegen ein hTRT-Poly
peptid. Menschliche monaclonale Antikörper gegen ein
bekanntes Antigen können auch unter Verwendung von
transgenen Tieren hergestellt werden, die Elemente eines
menschlichen Immunsystems besitzen (siehe beispielsweise US-Pa
tent Nr. 5,569,825 und 5,545,806, wobei beide Dokumente
durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit und für alle Zwecke als
Bestandteil dieser Beschreibung anzusehen sind) oder unter
Verwendung von menschlichen peripheren Blutzellen (Casali et
al., Science 234 (1986), 476). Einige menschliche Antikörper
werden durch kompetitive Bindungsexperimente ausgewählt oder
so, daß sie dieselbe Epitop-Spezifität aufweisen wie ein
spezieller Mausantikörper.
In einer weiteren Ausführungsform können menschliche
Antikörper gegen ein hTRT-Polypeptid durch Screenen einer
DNA-Bank aus menschlichen B-Zellen gemäß dem von Huse et
al., Science 246 (1989), 1275 beschriebenen allgemeinen
Protokoll hergestellt werden. Dieses Dokument ist aufgrund
der Bezugnahme ebenfalls als Teil der vorliegenden
Beschreibung anzusehen. An das hTRT-Polypeptid bindende
Antikörper werden ausgewählt. Diese Antikörper (oder ein
bindendes Fragment) codierenden Sequenzen werden dann
cloniert und amplifiziert. Das von Huse beschriebene
Protokoll wird oft mit der "phage-display"-Technologie
verwendet.
Die Erfindung stellt auch anti-hTRT-Antikörper bereit, die
als chimäre, menschlichen Antikörper ähnelnden oder
humanisierte Antikörper hergestellt wurden, um so ihre
potentielle Antigenität jedoch nicht ihre Affinität
gegenüber dem Ziel herabzusetzen. Die Herstellung von
chimären und humanisierten Antikörpern bzw. von den
menschlichen Antikörpern ähnelnden Antikörpern wurde auf dem
Fachgebiet beschrieben (siehe beispielsweise US-Patent Nr.
5,585,089 und 5,530,101; Queen et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 86 (1989), 10029 und Verhoeyan et al., Science 239
(1988), 1534, wobei diese Dokumente aufgrund der Bezugnahme
in ihrer Gesamtheit und für alle Zwecke als Gegenstand
dieser Beschreibung anzusehen sind). Humanisierte
Immunglobuline weisen variable Grundgerüstbereiche auf, die
im wesentlichen von einem humanen Immunglobulin stammen (mit
der Bezeichnung Akzeptor-Immunglobulin) und die
Komplementarität der determinierenden Bereiche, die im
wesentlichen von einem nicht-menschlichen Immunglobulin
(z. B. von der Maus) stammen (mit der Bezeichnung Donor-
Immunglobulin). Die (der) konstante(n) Bereich(e)
stammt/stammen, falls vorhanden, auch im wesentlichen von
einem menschlichen Immunglobulin.
Bei einigen Anwendungen, beispielsweise bei der
Verabreichung an menschliche Patienten, bieten die
erfindungsgemäßen humanisierten (sowie die menschlichen)
anti-hTRT-Antikörper eine Reihe von Vorteilen gegenüber
Antikörpern von Mäusen oder anderen Spezies: (1) das
menschliche Immunsystem sollte das Grundgerüst oder den
konstanten Bereich des humanisierten Antikörpers nicht als
fremd erkennen und daher sollte die Antikörper-Antwort gegen
einen solchen injizierten Antikörper geringer ausfallen als
gegen einen vollständig fremden Maus-Antikörper oder einen
partiell fremden chimären Antikörper; (2) da der
Effektorbereich des humanisierten Antikörpers menschlich
ist, dürfte er mit anderen Teilen des menschlichen
Immunsystems besser interagieren, und (3) injizierte
humanisierte Antikörper weisen eine Halbwertszeit auf, die
im wesentlichen zu der von natürlich vorkommenden
menschlichen Antikörpern äquivalent ist, was es erlaubt,
kleinere und weniger häufige Dosen im Vergleich zu
Antikörpern anderer Spezies zu verabreichen.
Die vorliegende Erfindung stellt auch anti-hTRT-Antikörper
(oder bindende Zusammensetzung) bereit, die durch "phage
display"-Verfahren hergestellt wurden (siehe beispielsweise
Dower et al., WO 91/17271 und McCafferty et al., WO 92/01047
sowie Vaughan et al., Nature Biotechnology 14 (1996), 309,
wobei diese Dokumente aufgrund der Bezugnahme in ihrer
Gesamtheit und für alle Zwecke als Bestandteil dieser
Beschreibung anzusehen sind). Bei diesen Verfahren werden
Phagenbanken hergestellt, in denen Mitglieder auf ihren
äußeren Oberflächen unterschiedliche Antikörper
präsentieren. Antikörper werden gewöhnlich als Fv- oder Fab-
Fragmente präsentiert. Phagen, die Antikörper mit einer
gewünschten Spezifität präsentieren, werden durch
Affinitätsanreicherung mit einem hTRT-Polypeptid ausgewählt.
Bei einer Variation des "phage-display"-Verfahrens können
humanisierte Antikörper mit der Bindungsspezifität eines
ausgewählten Maus-Antikörpers hergestellt werden. Bei diesem
Verfahren wird der variable Bereich entweder der schweren
oder der leichten Kette des ausgewählten Maus-Antikörpers
als Ausgangsmaterial verwendet. Wenn beispielsweise der
variable Bereich einer leichten Kette als Ausgangsmaterial
ausgewählt wird, wird eine Phagenbank hergestellt, in der
Mitglieder den variablen Bereich derselben leichten Kette
(d. h. des Ausgangsmaterials von der Maus) und einen
variablen Bereich einer unterschiedlichen schweren Kette
präsentieren. Die variablen Bereiche der schweren Kette
werden von einer Bank mit menschlichen rearrangierten
variablen Bereichen der schweren Kette erhalten. Ein Phage,
der eine starke spezifische Bindung an das hTRT-Polypeptid
zeigt (z. B. mindestens 108 und vorzugsweise mindestens 109 M⁻1)
wird ausgewählt. Der variable Bereich der menschlichen
schweren Kette von diesem Phagen dient dann als
Ausgangsmaterial für die Herstellung einer weiteren
Phagenbank. In dieser Bank präsentiert jeder Phage denselben
variablen Bereich der schweren Kette, d. h. den von der
ersten Präsentationsbank identifizierte Bereich, und einen
unterschiedlichen Bereich der leichten Kette. Die variablen
Bereiche der leichten Kette werden von einer Bank aus
menschlichen rearrangierten variablen Regionen der leichten
Kette erhalten. Wieder wird ein Phage, der eine starke
spezifische Bindung zeigt, ausgewählt. Diese Phagen
präsentieren die variablen Bereiche von vollständig
menschlichen anti-hTRT-Antikörpern. Diese Antikörper weisen
üblicherweise die gleiche oder eine ähnliche
Epitopspezifität auf, wie das von der Maus stammende
Ausgangsmaterial.
Die Erfindung stellt auch Hybrid-Antikörper bereit, die die
Spezifität mit Antikörpern gegen in hTRT-Polypeptid
gemeinsam haben, jedoch auch eine zweite Einheit spezifisch
binden können. In diesen Hybrid-Antikörpern stammt
normalerweise ein Paar aus einer schweren und leichten Kette
von einem anti-hTRT-Antikörper und das andere Paar von einem
Antikörper, der gegen ein anderes Epitop oder Protein
gerichtet ist. Dies führt zu der Eigenschaft einer
multifunktionellen Valenz, d. h. der Fähigkeit, mindestens
zwei verschiedene Epitope gleichzeitig binden zu können,
wobei mindestens ein Epitop das Epitop ist, an das der anti-
Komplex-Antikörper bindet. Solche Hybride können durch
Fusion der entsprechenden Bestandteilsantikörpern
herstellenden Hybridome gebildet werden oder durch
Kombinationsverfahren.
Erfindungsgemäße Immunglobuline können auch mit
funktionellen Bereichen von anderen Genen (z. B. Enzymen) zur
Herstellung von Fusionsproteinen (z. B. Immuntoxinen) mit
nützlichen Eigenschaften fusioniert werden.
Auch anti-idiotypische Antikörper, die mittels der
vorstehend beschriebenen Verfahren isoliert werden können,
sind von Nutzen. Anti-idiotypische Antikörper können
beispielsweise durch Immunisierung eines Tiers mit dem
primären Antikörper (d. h. anti-hTRT-Antikörpern oder hTRT-bin
denden Fragmenten davon) präpariert werden. Für anti
hTRT-Antikörper werden anti-idiotypische Antikörper
ausgewählt, deren Bindung an den primären Antikörper durch
ein hTRT-Polypeptid oder Fragmente davon gehemmt wird. Da
sowohl der anti-idiotypische Antikörper als auch das hTRT-Poly
peptid oder Fragmente davon, das primäre Immunglobulin
binden, kann das anti-idiotypische Immunglobulin das
"interne Bild" eines Epitops repräsentieren und somit in
Assays das hTRT-Polypeptid ersetzen, oder es kann dazu
verwendet werden, anti-hTRT-Antikörper, beispielsweise in
einem Patienten, zu binden (d. h. zu inaktivieren). Anti
idiotypische Antikörper können auch mit Telomerase
assoziierten Proteinen interagieren. Die Verabreichung
solcher Antikörper könnte eine Telomerase-Funktion durch
Austitrieren hTRT-assoziierter Proteine beeinflussen.
Die erfindungsgemäßen Antikörper können zu einem beliebigen
Isotyp gehören, beispielsweise IgM, IgD, IgG, IgA und IgE,
wobei IgG, IgA und IgM oft bevorzugt sind. Humanisierte
Antikörper können auch Sequenzen von mehr als einer Klasse
oder eines Isotyps umfassen.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform werden
Fragmente der intakten vorstehend beschriebenen Antikörper
bereitgestellt. Typischerweise können diese Fragmente mit
dem intakten Antikörper, von dem sie abstammen, um die
spezifische Bindung an das hTRT-Polypeptid konkurrieren und
sie binden mit einer Affinität von 107, 108, 109 M⁻1, oder
1010 M⁻1. Zu den Antikörperfragmenten zählen getrennte
schwere Ketten, leichte Ketten, Fab, Fab'F(ab')2, Fabc und
Fv. Fragmente können durch enzymatische oder chemische
Trennung von intakten Immunglobulinen hergestellt werden.
Beispielsweise kann ein F(ab')2-Fragment aus einem IgG-Mole
kül durch proteolytische Spaltung mit Pepsin bei einem
pH-Wert von 3,0-3,5 mit Standardverfahren, wie sie
beispielsweise in Harlow und Lane, a.a.O., beschrieben sind,
erhalten werden. Fab-Fragmente können aus F(ab')2-Fragmenten
durch limitierte Reduktion aus einem ganzen Antikörper durch
Spaltung mit Papain in Gegenwart von Reduktionsmitteln
erhalten werden (siehe allgemein Paul, W. (Herausg.)
Fundamental Immunology 2nd Raven Press, N.Y., 1989, Kapitel
7, wobei dieses Dokument durch Bezugnahme in seiner
Gesamtheit und für alle Zwecke als Bestandteil dieser
Beschreibung angesehen werden kann). Fragmente können auch
durch DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt werden.
Nucleinsäuresegmente, die ausgewählte Fragmente codieren,
werden durch Spaltung codierender Sequenzen vollständiger
Länge mit Restriktionsenzymen hergestellt oder durch de
novo-Synthese. Oft werden Fragmente in Form eines Phagen-
Fusionshüllproteins exprimiert.
Viele der vorstehend beschriebenen Immunglobuline können
unkritische Aminosäuresubstitutionen, Additionen oder
Deletionen sowohl in den variablen als auch in den
konstanten Bereichen ohne Verlust von Bindungsspezifität
oder Effektorfunktionen oder nicht tolerierbare Herabsetzung
der Bindungsaktivität (d. h. unter etwa 107 M⁻1) durchlaufen.
Üblicherweise zeigen Immunglobuline mit solchen Änderungen
eine im wesentlichen identische Sequenz, verglichen mit
einem Referenzimmunglobulin von dem sie abstammen. Ein
mutiertes Immunglobulin kann ausgewählt werden, das die
gleiche Spezifität und eine erhöhte Affinität aufweist im
Vergleich zu einem Referenzimmunglobulin, von dem es
abstammt. Die "phage-display"-Technologie bietet nützliche
Verfahren zur Selektion solcher Immunglobuline. Siehe
beispielsweise Dower et al., WO 91/17271, McCafferty et al.,
WO 92/01047 und Huse, WO 92/06204.
Die erfindungsgemäßen Antikörper können mit oder ohne
Modifikation verwendet werden. Häufig werden die Antikörper
durch entweder kovalente oder nicht-kovalente Anfügung einer
nachweisbaren Markierung markiert. Als markierte
Bindungseinheiten sind die erfindungsgemäßen Antikörper bei
diagnostischen Anwendungen von besonderem Nutzen.
Die erfindungsgemäßen anti-hTRT-Antikörper können unter
Verwendung allgemein bekannter Verfahren gereinigt werden.
Die vollständigen Antikörper, ihre Dimere, individuellen
leichten und schweren Ketten oder andere erfindungsgemäßen
Immunglobulinformen können unter Verwendung der
erfindungsgemäßen Verfahren und Reagenzien in
Übereinstimmung mit auf dem Fachgebiet üblichen
Standardverfahren, zu denen Ammoniumsulfatpräzipitation,
Affinitätssäulen, Säulenchromatographie, Gelelektrophorese
etc. gehören, gereinigt werden (siehe allgemein Scopes,
Protein Purification: Principles and Practice, S. Ausgabe
(Springer-Verlag, N.Y.; 1993). Bevorzugt sind im
wesentlichen reine Immunglobuline mit mindestens etwa 90 bis
95% oder sogar 98 bis 99% oder darüber liegender
Homogenität.
Die vorliegende Erfindung stellt isolierte menschliche
Telomerase mit bisher nicht erreichter Reinheit bereit.
Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung bereit:
gereinigte hTRT rekombinanten oder nicht-rekombinanten
Ursprungs; gereinigte hTRT-hTR-Komplexe (d. h. RNPs),
rekombinanten, nicht-rekombinanten oder gemischten
Ursprungs, die gegebenenfalls ein oder mehrere Telomerase
assoziierte Proteine umfassen; gereinigte natürlich
vorkommende menschliche Telomerase; etc. Darüber hinaus
stellt die Erfindung Verfahren und Reagenzien bereit, um die
vorstehend beschriebenen Moleküle und Komplexe
einschließlich von Varianten, Fusionsproteinen, natürlich
vorkommenden Proteinen etc. (die kollektiv als "hTRT
und/oder hTRT-Komplexe" bezeichnet werden) in partiell
gereinigter, im wesentlich gereinigter oder hochgereinigter
Form gewinnen zu können. Bevor diese Erfindung gemacht
wurde, wurden Versuche unternommen, den Telomerase-Enzym-
Komplex bis zur Homogenität zu reinigen, jedoch mit
begrenztem Erfolg (siehe beispielsweise die parallele US-Pa
tentanmeldung mit der Serien-Nr. 08/833,377, eingereicht
am 4. April 1997 und 08/510,736, eingereicht am 4. August
1995 sowie die PCT-Anmeldung Nr. 97/06012, eingereicht am 4.
April 1997. Diese Dokumente sind aufgrund der Bezugnahme als
Bestandteil dieser Beschreibung hinsichtlich nützlicher
Reinigungsverfahren anzusehen). Die in den vorstehend
aufgeführten Anmeldungen bereitgestellten Verfahren erlauben
es, Telomerase bis etwa 60 000fach oder höher im Vergleich
zu Zellrohextrakten zu reinigen. Die vorliegende Erfindung
stellt hTRT und hTRT-Komplexe mit sogar doch höherer
Reinheit bereit, teilweise dank der neuen erfindungsgemäßen
Immunoaffinitätsreagenzien, (z. B. anti-hTRT-Antikörper)
und/oder der hier für die rekombinante Expression von hTRT
zur Verfügung gestellten Reagenzien, Zellen und Verfahren.
Die rekombinante Expression von hTRT und hTRT-Komplexen
erleichtert die Reinigung, da die gewünschten Moleküle in
wesentlich höherer Konzentration im Vergleich zu den meisten
in der Natur vorkommenden exprimierenden Zellen hergestellt
werden und/oder weil die rekombinanten hTRT-Moleküle so
modifiziert werden können (z. B. durch Fusion mit einem
Epitop-"tag"), daß sie leicht gereinigt werden können.
Es ist offensichtlich, daß natürlich vorkommende Telomerase
aus einer Telomerase-positiven Zelle gereinigt werden kann.
Rekombinante hTRT und hTRT-Komplexe können u. a. unter
Verwendung beliebiger in vitro, in vivo, ex vivo,
pflanzlichen oder tierischen Expressionssystemen, die
vorstehend beschrieben wurden, oder andere auf dem
Fachgebiet bekannte Systeme exprimiert und gereinigt werden.
In einer Ausführungsform werden die hTRT, Telomerase und
andere erfindungsgemäßen Zusammensetzungen mittels eines
Immunoaffinitätsschritts gereinigt, wobei entweder nur
dieser Schritt oder eine Kombination mit weiteren
Reinigungsschritten durchgeführt wird. Typischerweise wird
ein immobilisierter oder immobilisierbarer anti-hTRT-Anti
körper, so wie er von der vorliegenden Erfindung
bereitgestellt wird, mit einer Probe, beispielsweise einem
Zellysat, das die gewünschte hTRT oder den hTRT-enthaltenden
Komplex enthält, unter Bedingungen in Kontakt gebracht, bei
denen ein anti-hTRT-Antikörper das hTRT-Antigen bindet. Nach
Entfernung von nicht gebundenen Bestandteilen der Probe
durch auf dem Fachgebiet allgemein bekannte Verfahren kann
die hTRT-Zusammensetzung, falls erwünscht, von dem
Antikörper in im wesentlichen reiner Form eluiert werden. In
einer Ausführungsform werden auf dem Fachgebiet gut bekannte
Immunoaffinitätschromatographieverfahren verwendet (siehe
beispielsweise Harlow und Lane, a.a.O., Ausubel, a.a.O., und
Hermansan et al., 1992, Immobilized Affinity Ligand
Techniques (Academic Press, San Diego)) in Übereinstimmung
mit den erfindungsgemäßen Verfahren. In einer weiteren
veranschaulichenden Ausführungsform wird eine
Immunpräzipitation von anti-hTRT-Immunglobulin-hTRT-Kom
plexen unter Verwendung von immobilisiertem Protein A
durchgeführt. Dem Fachmann sind zahlreiche Variationen und
alternative Immunoaffinitätsreinigungsprotokolle, die zur
Verwendung in Übereinstimmung mit den erfindungsgemäßen
Verfahren und Reagenzien geeignet sind, gut bekannt.
In einer weiteren Ausführungsform können rekombinante hTRT-Pro
teine als Folge ihrer Expression mit hohem Niveau mittels
Routine-Proteinreinigungsverfahren gereinigt werden,
beispielsweise durch Ammoniumsulfatpräzipitation,
Affinitätssäulen (z. B. Immunoaffinität), Ausschluß nach
Größe ("size-exclusion"), Anionen- und Kationen-
Austauschchromatographie, Gelelektrophorese etc. (siehe
allgemein R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag,
N.Y. (1982) und Deutscher, Methods in Enzymology 182: Guide
to Protein Purification, Academic Press, Inc. N.Y. (1990))
anstelle von Immunoaffinitätsverfahren oder zusätzlich dazu.
Kationenaustauschverfahren können aufgrund des basischen pI-Werts
des hTRT-Proteins besonders nützlich sein.
Beispielsweise kann immobilisiertes Phosphat als eine
funktionelle Kationenaustauschgruppe (z. B. P-11
Phosphocellulose, Whatman-Katalog #4071 oder
Cellulosephosphat, Sigma-Katalog #C 3145) verwendet werden.
Immobilisiertes Phosphat hat bezüglich der hTRT-Reinigung
zwei vorteilhafte Merkmale - es ist ein
Kationenaustauschharz und es zeigt physikalisch eine
Ähnlichkeit mit dem Phosphatrückgrat von Nucleinsäuren.
Daher kann auch die "Pseudo"-Affinitätschromatophie
verwendet werden, da hTRT hTR und Telomer-DNA bindet. Andere
nicht-spezifische Nucleinsäure-Affinitätschromatographie
verfahren sind zur Reinigung ebenfalls von Nutzen (siehe
beispielsweise die parallele US-Patentanmeldung mit der
Serien-Nr. 08/833,377; Albers et al., Methods Enzymol. 21
(1971), 198; Arnt-Jovin et al., Eur. J. Biochem. 54 (1975),
411 und den Pharmacia-Katalog #27-5575-02). Die weitere
Nutzung dieser wahrscheinlichen Bindungsfunktion von hTRT
würde die Verwendung von spezifischen Nucleinsäuren (z. B.
Primer oder hTR) bei Affinitätschromatographie zur Reinigung
beinhalten (Chodosh et al., Mol. Cell. Biol. 6 (1986), 4723;
Wu et al., Science 238 (1987), 1247 und Kadonaga, Methods
Enzymol. 208 (1991), 10); immobilisierter "Cibricon Blue"-Farb
stoff, der physikalisch Nucleotiden ähnelt, stellt
aufgrund der hTRT-Bindung von Nucleotiden (z. B. als
Substrate für die DNA-Synthese) ein weiteres nützliches Harz
für die Reinigung von hTRT dar (Pharmacia-Katalog #17-0948-01
oder Sigma-Katalog #C 1285).
In einer Ausführungsform werden hTRT-Proteine direkt von
einem in vitro oder in vivo-Expressionssystem isoliert, in
dem andere Telomerase-Bestandteile nicht coexprimiert
werden. Isoliertes hTRT-Protein kann natürlich auch leicht
von gereinigter menschlicher Telomerase oder hTRT-Komplexen
beispielsweise durch Aufbrechen des Telomerase-RNPs (z. B.
durch Exposition gegenüber einem milden oder einem anderen
Denaturierungsmittel) und Abtrennung der RNP-Bestandteile
(z. B. durch Routinemaßnahmen wie Chromatographie oder
Immunoaffinitätschromatographie) gereinigt werden.
Die Telomerase-Reinigung kann unter Verwendung eines Assays
bezüglich einer Telomerase-Aktivität (z. B. den TRAP-Assay,
einen üblichen Assay oder einen Primer-Bindungs-Assay)
überwacht werden, durch Bestimmung der hTRT-Anreicherung
(z. B. durch ELISA), durch Bestimmung der hTR-Anreicherung
oder durch weitere auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren.
Die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellte
gereinigte menschliche Telomerase, die hTRT-Proteine und
hTRT-Komplexe, sind in einer Ausführungsform hochgereinigt
(d. h. mindestens zu etwa 90% homogen, vorzugsweise
mindestens zu etwa 95% homogen). Die Homogenität kann durch
Standardmaßnahmen bestimmt werden, beispielsweise durch SDS-Poly
acrylamidgelelektrophorese und andere auf dem Fachgebiet
bekannte Mittel (siehe beispielsweise Ausubel et al.,
a.a.O.). Zwar sind gelegentlich hochgereinigte menschliche
Telomerase, hTRT-Protein oder hTRT-Komplexe erwünscht, aber
natürlich sind auch im wesentlich gereinigte (z. B. mit
wenigstens etwa 75% Homogenität) oder partiell gereinigte
(z. B. mindestens zu etwa 20% homogen) menschliche
Telomerase, hTRT-Protein oder hTRT-Komplexe für viele
Anwendungen auch von Nutzen und diese werden durch die
vorliegende Erfindung ebenfalls bereitgestellt.
Beispielsweise ist partiell gereinigte Telomerase nützlich
für das Screenen von Testverbindungen bezüglich einer
Telomerase-modulierenden Aktivität und für weitere
Verwendungen (siehe beispielsweise die parallele US-Pa
tentanmeldung mit der Serien-Nr. .. . .. . . (Anwalts-Register-
Nr. 015389-002500, eingereicht am 14. August 1997,
vorstehend zitiert, und US-Patent-Nr. 5,645,986, USSN
08/151,477, eingereicht am 12. November 1993 und USSN
08/288,501, eingereicht am 10. August 1994).
Die vorliegende Erfindung stellt hTRT-Polynucleotide,
-Polypeptide und -Antikörper bereit, die für die Behandlung
von menschlichen Erkrankungen und Krankheitszuständen von
Nutzen sind. Die rekombinanten und synthetischen
erfindungsgemäßen hTRT-Genprodukte (Protein und mRNA) können
dazu verwendet werden, um Telomerase-Aktivität in einer
Zelle zu erzeugen oder zu erhöhen, aber auch um Telomerase-
Aktivität in einer Zelle zu hemmen, in der dies nicht
erwünscht ist. Somit kann die Hemmung, Inaktivierung oder
anderweitige Veränderung einer Telomerase-Aktivität (z. B.
einer katalytischen Aktivität von Telomerase, Genauigkeit,
Prozessivität, Telomer-Bindung etc.) In einer Zelle zur
Veränderung der Proliferationsfähigkeit der Zelle verwendet
werden. Beispielsweise kann die Herabsetzung von
Telomeraseaktivität in einer immortalisierten Zelle, wie
beispielsweise einer malignen Tumorzelle, die Zelle
mortalisieren. Umgekehrt kann die Steigerung der Telomerase-
Aktivität in einer sterblichen Zelle (wozu beispielsweise
die meisten menschlichen somatischen Zellen gehören) zur
Steigerung der Proliferationsfähigkeit der Zelle führen.
Beispielsweise führt die Expression eines hTRT-Proteins in
Hautfibroblasten, wodurch die Telomerlänge ansteigt, zu
einer erhöhten Proliferationskapazität der Fibroblasten;
eine solche Expression kann die altersabhängige
Verlangsamung des Wundverschlusses verlangsamen oder
umkehren (siehe beispielsweise West, Arch. Derm. 130 (1994),
87).
Somit betrifft ein Aspekt der vorliegenden Erfindung die
Bereitstellung von Reagenzien und Verfahren, die bei der
Behandlung von Erkrankungen und Zuständen von Nutzen sind,
die durch die Anwesenheit, das Fehlen oder die Menge von
menschlicher Telomerase-Aktivität in einer Zelle
gekennzeichnet sind und die auf eine Behandlung unter
Verwendung der hier beschriebenen Zusammensetzungen und
Verfahren ansprechen. Zu diesen Erkrankungen zählen, so wie
dies ausführlich und nachstehend beschrieben wird,
Krebserkrankungen, andere Erkrankungen bezüglich der
Zellproliferation (insbesondere Erkrankungen bezüglich der
Alterung, immunologische Funktionsstörungen, Unfruchtbarkeit
(oder Fruchtbarkeit) etc.
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren und
Zusammensetzungen zur Herabsetzung von Telomerase-Aktivität
in Tumorzellen und zur Behandlung von Krebs bereit.
Krebszellen (z. B. maligne Tumorzellen), die Telomerase-
Aktivität exprimieren (Telomerase-positive Zellen) können
durch Herabsetzung oder Hemmung der endogenen Telomerase-
Aktivität mortalisiert werden. Darüber hinaus könnte jede
Herabsetzung der Telomerase-Aktivität die aggressive Natur
einer Krebserkrankung hin zu einem leichter zur
therapierenden Krankheitsstatus (durch Steigerung der
Wirksamkeit von konventionellen Behandlungsmethoden)
herabsetzen, da Telomerasespiegel mit Krankheitskennzeichen,
wie beispielsweise dem Potential zur Metastasenbildung
korrelieren (siehe beispielsweise US-Patent Nr. 5,639,613;
5,648,215; 5,489,508 und Pandita et al., Proc. Am. Ass.
Cancer Res. 37 (1996), 559).
Die Erfindung stellt Zusammensetzungen und Verfahren bereit,
die bei der Behandlung einer großen Anzahl von
unterschiedlichen Krebstypen von Nutzen sind, einschließlich
von soliden Tumoren und Leukämien. Zu den Krebsarten, die
behandelt werden können gehören (jedoch ohne Beschränkung
darauf): das Adenokarzinom der Brust, der Prostata und des
Dickdarms; alle Formen von Lungenkrebs, der von den
Bronchien ausgeht; Knochenmarkskrebs, das Melanom, das
Hepatom, das Neuroblastom; das Papillom; das Apudom, das
Choristom, das Branchiom; das maligne Karzinoid-Syndrom; die
Karzinoid-Herzerkrankung; das Karzinom (z. B. Walker-
Karzinom, Basalzellen-Karzinom, basosquamöses Karzinom,
Brown-Pearce-Karzinom, duktales Karzinom, Ehrlich-Tumor,
insitu-Karzinom, Krebs-2-Karzinom, Merkel-Zellen-Karzinom,
Schleimkrebs, nicht-kleinzelliges Bronchialkarzinom,
Haferzellen-Karzinom, papilläres Karzinom, szirrhöses
Karzinom, bronchiolo-alveoläres Karzinom, Bronchiai-
Karzinom, Plattenepithelkarzinom und Transitionalzell-
Karzinom); histiocytische Funktionsstörung; Leukämie z. B.
in Zusammenhang mit B-Zellen-Leukämie, Gemischt-Zellen-
Leukämie, Nullzellen-Leukämie, T-Zellen-Leukämie, chronische
T-Zellen-Leukämie, HTLV-II-assoziierte Leukämie, akut
lymphozytische Leukämie, chronisch-lymphozytische Leukämie,
Mastzell-Leukämie und myeloische Leukämie), maligne
Histiocytose, Hodgkin-Krankheit, klein Immunproliferativ;
non-Hodgkin-Lymphom, solitärer Plasmazelltumor;
Reticuloendotheliose, Melanom, Chondroblastom; Chondrom,
Chondrosarkom; Fibrom; Fibrosarkom; Riesenzell-Tumore;
Histiocytom, Lipom; Liposarkom; Mesotheliom, Myxom;
Myxosarkom; Osteom; Osteosarkom; Ewing-Sarkom; Synoviom;
Adenofibrom; Adenolymphom; Karcinosarkom, Chordom,
Craniopharyngiom, Dysgerminom, Hamartom; Mesenchymom;
Mesonephrom, Myosarkom, Ameloblastom, Cementom; Odontom;
Teratom; Thymom, Chorioblastom; Adenokarzinom, Adenom;
Cholangiom; Cholesteatom; Cylindrom; Cystadenocarcinom,
Cystadenom; Granulosazelltumor; Gynandroblastom, Hepatom;
Hidradenom; Inselzelltumor; Leydig-Zelltumor; Papillom;
Sertoli-Zell-Tumor, Thekazelltumor, Leiomyom; Leiomyosarkom;
Myoblastom; Myom; Myosarkom; Rhabdomyom; Rhabdomyosarkom;
Ependymon; Ganglioneurom, Gliom; Medulloblastom, Meningiom;
Neurilemmom; Neuroblastom; Neuroepitheliom, Neurofibrom,
Neurom, Paragangliom, nicht-chromaffines Paragangliom,
Angiokeratom, angiolymphoide Hyperplasie mit Eosinophilie;
sclerosierendes Angiom; Angiomatose; Glomangiom;
Hemangioendotheliom; Hemangiom; Hemangiopericytom,
Hemangiosarkom; Lymphangiom, Lymphangiomyom,
Lymphangiosarkom; Pinealom; Carcinosarkom; Chondrosarkom;
Cystosarkom phyllodes; Fibrosarkom; Hemangiosarkom;
Leiomyosarkom; Leukosarkom; Liposarkom; Lymphangiosarkom;
Myosarkom; Myxosarkom, Ovarialkarzinom, Rhabdomyosarkom;
Sarkom (z. B. Ewing-Sarkom, experimentell, Kaposi-Sarkom und
Mastzell-Sarkom); Neoplasmen (z. B. Knochen-Neoplasmen,
Brust-Neoplasmen, Neoplasmen des Verdauungssystems,
colorektale Neoplasmen, Leber-Neoplasmen, Pankreas-
Neoplasmen, Hirnanhang-Neoplasmen, Hoden-Neoplasmen, Orbita-
Neoplasmen, Neoplasmen des Kopfes und Halses, des
Zentralnervensystems, Neoplasmen des Hörorgans, des Beckens,
des Atmungstrakts und des Urogenitaltrakts);
Neurofibromatose und cervicale Plattenepuitheldysplasie).
Die Erfindung stellt Zusammensetzungen und Verfahren bereit,
die zur Behandlung anderer Zustände von Nutzen sind, bei
denen Zellen immortalisiert oder hyperproliferativ wurden,
beispielsweise durch Disregulation (z. B. abnorm hohe
Expression) von hTRT, dem Telomeraseenzym oder Aktivität.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner Zusammensetzungen
und Verfahren zur Prävention von Krebserkrankungen zur
Verfügung, dazu zählen anti-hTRT, Vakzine, Gentherapie-
Vektoren, die die Aktivierung von Telomerase verhindern und
Gentherapie-Vektoren, die den spezifischen Tod von
Telomerase-positiven Zellen zur Folge haben. In einem
verwandten Aspekt können die nachstehend beschriebenen
Genaustausch-Therapieverfahren zur "Behandlung" einer
genetischen Prädisposition für Krebserkrankungen verwendet
werden.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Zusammensetzungen und
Verfahren bereit, die zur Behandlung von Erkrankung und
Krankheitszuständen (zusätzlich zu Krebserkrankungen) von
Nutzen sind, die durch eine unter- oder Überexpression von
Telomerase oder hTRT-Genprodukten gekennzeichnet sind. Zu
den Beispielen gehören: Erkrankungen bezüglich der
Zellproliferation, Erkrankungen, die von Zellseneszenz
herrühren (insbesondere Erkrankungen bezüglich des Alterns),
immunologische Funktionsstörung und Unfruchtbarkeit,
Erkrankungen bezüglich einer Immun-Fehlfunktion etc.
Bestimmte Erkrankungen bezüglich des Alterns sind durch mit
der Zellseneszenz-assoziierte Veränderungen aufgrund einer
verringerten Telomerlänge (verglichen mit jüngeren Zellen)
gekennzeichnet. Diese sind die Folge des Fehlens (oder eines
viel geringeren Niveaus) von Telomerase-Aktivität in der
Zelle. Eine verringerte Telomerlänge und eine verringerte
Replikationsfähigkeit tragen zu den nachstehend
beschriebenen Erkrankungen bei. Telomerase-Aktivität und
Telomerlänge kann beispielsweise dadurch erhöht werden, daß
das Niveau an hTRT-Genprodukten (Protein und mRNA) in der
Zelle erhöht wird. Nachstehend wird ein Teil der
Krankheitszustände aufgezählt, die mit zellulärer Seneszenz
assoziiert sind, bei denen hTRT-Expression eine
therapeutische Wirkung zeigen kann: Alzheimer-Erkrankung,
Parkinson-Erkrankung, Huntington-Erkrankung und
Schlaganfall, mit dem Alter in Zusammenhang stehende
Erkrankungen des Integuments, beispielsweise Hautatrophie,
Elastolyse und Faltenbildung der Haut,
Talgdrüsenhyperplasie, Bildung von Altersflecken, das
Ergrauen der Haare und der Haarausfall, chronische
Hautgeschwüre, und mit der Alterung in Zusammenhang stehende
Verschlechterung der Wundheilung; degenerative
Gelenkerkrankungen, Osteoporose; mit der Alterung in
Zusammenhang stehende Schwächung des Immunsystems (wobei
beispielsweise Zellen beteiligt sind, die B- und T-Lym
phocyten, Monocyten, Neutrophile, Eosinophile, Basophile,
NK-Zellen und ihre entsprechenden Vorläufer); mit der
Alterung in Zusammenhang stehende Erkrankungen des
vaskulären Systems, dazu zählen Atherosclerose, Verkalkung,
Thrombose und Aneurysmen; Diabetes, Muskelatrophie;
Atemwegserkrankungen, Erkrankungen der Leber und des Darm-
Verdauungstrakts, Stoffwechselkrankheiten, endokrine
Krankheiten (z. B. Funktionsstörungen der Hirnanhangdrüse und
Nebennieren), reproduktive Erkrankungen und mit der Alterung
in Zusammenhang stehende Makuladegeneration. Diese
Krankheiten und Zustände können dadurch behandelt werden,
daß das Niveau an hTRT-Genprodukten in der Zelle erhöht
wird, um dadurch die Telomerlänge zu erhöhen, wobei die
Replikationsfähigkeit der Zelle wiederhergestellt oder
erhöht wird. Solche Verfahren können ex vivo an kultivierten
Zellen oder in vivo an Zellen ausgeführt werden. In einer
Ausführungsform werden die Zellen zuerst zur Aktivierung von
Telomerase und Verlängerung der Telomere behandelt und
danach erfolgt eine Behandlung zur Inaktivierung des hTRT-Gens
und von Telomerase-Aktivität.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird Telomerase-
Aktivität durch einen erfindungsgemäßen Vektor in einer
embryonalen Keimzelle oder Stammzelle erzeugt (siehe USSN
08/591,246, eingereicht am 18. Januar 1996; USSN 08/376,327,
eingereicht am 20. Januar 1995; Pederson et al.; USSN
. . .. . .., eingereicht am 13. Juni 1997, eine sog.
"contination-in-part"-Anmeldung von USSN 08/665,217,
eingereicht am 14. Juni 1996 und USSN 08/829,372,
eingereicht am 31. März 1997) vor oder während der
Differenzierung.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren und
Zusammensetzungen bereit, die zur Behandlung von
Unfruchtbarkeit von Nutzen sind. Menschliche Keimbahnzellen
(z. B. Stammsamenzellen, ihre Vorläufer oder Abkömmlinge)
können unbegrenzt proliferieren und sind durch eine hohe
Telomerase-Aktivität gekennzeichnet. Abnormale oder
verringerte Konzentrationen von hTRT-Genprodukten können
beispielsweise dazu führen, daß es zu einer unzulänglichen
oder abnormalen Produktion von Spermatozoen kommt, was zu
Unfruchtbarkeit oder Funktionsstörungen bei der Reproduktion
führt. Somit kann eine auf "Telomerase basierende"
Unfruchtbarkeit unter Verwendung der hier beschriebenen
Verfahren und Zusammensetzung zur Erhöhung der Telomerase-
Konzentrationen behandelt werden. Da die Hemmung von
Telomerase die Spermatogenese, Oogenese sowie die
Lebensfähigkeit von Sperma und Eiern negativ beeinflussen
kann, können die erfindungsgemäßen Telomerase-hemmenden
Zusammensetzungen empfängnisverhütende Wirkungen haben, wenn
sie in Keimbahnzellen zur Herabsetzung der Konzentrationen
von hTRT-Genprodukten verwendet werden.
Die Erfindung stellt ferner Verfahren und Zusammensetzungen
zur Verfügung, die zur Verringerung des proliferativen
Potentials von Telomerase-positiven Zellen durch
Herabsetzung der Telomerase-Aktivität verwendet werden kann,
beispielsweise bei aktivierten Lymphocyten und
hematopoietischen Stammzellen. Somit stellt die Erfindung
Mittel für die Bewirkung einer Immunsuppression bereit.
Umgekehrt sind die erfindungsgemäßen Verfahren und
Reagenzien von Nutzen zur Steigerung der Telomerase-
Aktivität und des proliferativen Potentials in Zellen, wie
beispielsweise Stammzellen, die vor dem therapeutischen
Eingriff einen niedrigen Telomerase-Spiegel oder keine
Telomerase exprimieren.
Aufgrund der vorstehenden Diskussion ist es klar, daß die
Modulation des Telomerase-Spiegels oder der Telomerase-
Aktivität einer Zelle eine ausgeprägte Auswirkung auf das
proliferative Potential der Zelle haben kann und somit bei
der Behandlung einer Erkrankung von großem Nutzen ist. Es
ist ebenfalls klar, daß diese Modulation entweder durch eine
Verringerung von Telomerase-Aktivität oder eine
Aktivitätssteigerung erfolgen kann. Die Telomerase
modulierenden erfindungsgemäßen Moleküle können durch eine
Reihe von Mechanismen wirken; einige dieser Mechanismen
werden in dieser und den nachstehenden Unterabschnitten
beschrieben, um so dem Anwender bei der Auswahl
therapeutischer Mittel zu helfen. Die Anwender beabsichtigen
jedoch bezüglich der hier beschriebenen neuen Arzneimittel,
Zusammensetzungen und Verfahren keiner Beschränkung auf
einen bestimmten Wirkungsmechanismus.
Telomerase-Aktivität kann durch verschiedene Mechanismen
oder Kombinationen von Mechanismen verringert werden. Ein
Mechanismus ist die Herabsetzung der hTRT-Genexpression zur
Herabsetzung von Telomerase-Aktivität. Diese Herabsetzung
kann auf dem Stadium der Transkription des hTRT-Gens in mRNA
stattfinden, bei der Prozessierung (z. B. dem Spleißen), beim
nucleären Transport oder hinsichtlich der Stabilität von
mRNA, bei der Translation von mRNA zur Herstellung von hTRT-Pro
tein oder hinsichtlich der Stabilität und Funktion von
hTRT-Protein. Ein weiterer Mechanismus bezieht sich auf
Störung einer oder mehrerer Telomerase-Aktivitäten, (z. B.
die katalytische Aktivität von reverser Transkriptase oder
der hTR-Bindungs-Aktivität) durch Verwendung hemmender
Nucleinsäuren, Polypeptiden, oder anderer Agenzien (z. B.
imitierende Agenzien ("mimetics"), kleine Moleküle,
Medikamente und Medikamentenvorstufen ("pro-drugs")), die
unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren
identifiziert werden können oder durch die hier
beschriebenen Zusammensetzungen bereitgestellt werden. Zu
weiteren Mechanismen zählen die Sequestrierung von hTR
und/oder Telomerase-assoziierten Proteinen und die Störung
der Assemblierungen des Telomerase-RNPs aus den
Bestandteilen der Untereinheiten. Bei einem verwandten
Mechanismus wird eine hTRT-Promotorsequenz mit einem Gen
funktionell verknüpft, das ein Toxin codiert, und dieses
Konstrukt in eine Zelle eingeführt. Falls oder dann, wenn
transkriptionelle Aktivatoren für hTRT in der Zelle
exprimiert oder aktiviert werden, wird das Toxin exprimiert,
was zu einer spezifischen Abtötung der Zelle führt.
Ein verwandtes Verfahren zur Herabsetzung der
Proliferationsfähigkeit einer Zelle beinhaltet die
Einführung einer hTRT-Variante mit geringer Genauigkeit,
d. h. einer Variante mit einer hohen Fehlerrate,
beispielsweise über 1%, so daß abweichende Telomer-
Wiederholungseinheiten synthetisiert werden. Diese
abweichenden Wiederholungseinheiten wirken sich auf die
Telomer-Proteinbindung aus und führen zu chromosomalen
Rearrangements und Anomalien und/oder führen zum Tod der
Zelle.
Auf ähnliche Weise kann die Telomerase-Aktivität durch
verschiedene Mechanismen oder eine Kombination von
Mechanismen gesteigert werden. Zu diesen gehören die
Steigerung der Menge von hTRT in einer Zelle. Üblicherweise
wird dies durch Einführung eines ein hTRT-Polypeptid
codierenden Polynucleotids in die Zelle erreicht (z. B.
mittels eines rekombinant hergestellten Polypeptids, das
eine mit einem Promotor funktionell verknüpfte hTRT-DNA-Se
quenz umfaßt oder eine stabile hTRT-mRNA). In einer
alternativen Ausführungsform kann ein katalytisch aktives
hTRT-Polypeptid selbst in eine Zelle oder ein Gewebe,
beispielsweise durch Mikroinjektion oder andere auf dem
Fachgebiet bekannte Maßnahmen eingeschleust werden. Bei
anderen Mechanismen kann die Expression des endogenen hTRT-
Gens oder die Stabilität von hTRT-Genprodukten in der Zelle
gesteigert werden. Telomerase-Aktivität in einer Zelle kann
auch durch Störung der Interaktion von endogenen Telomerase-
Inhibitoren und dem Telomerase-RNP oder von endogenen
Repressoren der hTRT-Transkription und dem hTRT-Gen
gesteigert werden, darüber hinaus durch Steigerung der
Expression oder Aktivität von Aktivatoren der hTRT-Trans
kription sowie weitere Maßnahmen, die für den Fachmann
nach Lesen dieser Beschreibung offensichtlich sind.
In einer Ausführungsform stellt die Erfindung Telomerase
modulierende Polypeptide (d. h. Proteine, Polypeptide und
Peptide) bereit, die Telomerase-Aktivität steigern oder
herabsetzen. Diese können in eine Zielzelle direkt (z. B.
durch Injektion, Liposomen-vermittelte Fusion, Applikation
eines Hydrogels auf die Tumoroberfläche (z. B. bei einem
Melanom, Fusion oder Anheftung des Strukturproteins VP22 des
Herpes-Virus und weitere hier beschriebene und auf dem
Fachgebiet bekannte Verfahren) eingeführt werden. In einer
zweiten Ausführungsform werden erfindungsgemäße Telomerase
modulierenden Proteine und Peptide in einer Zelle durch
Einführung einer Nucleinsäure (z. B. eines DNA-Ex
pressionsvektors oder mRNA), die das gewünschte Protein
oder Peptid in der Zelle codiert, in einer Zelle exprimiert.
Die Expression kann entweder konstitutiv oder induzierbar
sein, was von dem Vektor und der Wahl des Promotors (siehe
die nachstehende Diskussion) abhängt. Präparationen von
Messenger-RNA, die hTRT codieren, sind besonders dann von
Nutzen, wenn lediglich eine transiente Expression (z. B. die
transiente Aktivierung von Telomerase) erwünscht ist.
Verfahren zur Einführung und Expression von Nucleinsäuren in
eine Zelle sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt (siehe
darüber hinaus andere Stellen in dieser Beschreibung,
beispielsweise die Abschnitte über Oligonucleotide und
Gentherapieverfahren).
Ein Aspekt dieser Erfindung betrifft ein Telomerase
modulierendes Polypeptid, das Telomerase-Aktivität in einer
Zelle erhöht. In einer Ausführungsform ist das Polypeptid
ein katalytisch aktives hTRT-Polypeptid, das die Synthese
von menschlicher Telomer-DNA (in Verbindung mit einer RNA-Ma
trize, wie beispielsweise hTR) steuern kann. Diese
Aktivität kann wie vorstehend diskutiert gemessen werden,
beispielsweise unter Verwendung eines Telomerase-
Aktivitätsassays, wie beispielsweise einem TRAP-Assay. In
einer Ausführungsform ist das Polypeptid ein hTRT-Protein
mit vollständiger Länge und einer Sequenz, die der Sequenz
von 1132 Resten von SEQ. ID. Nr. 2 entspricht oder im
wesentlichen identisch dazu ist. In einer weiteren
Ausführungsform ist das Polypeptid eine Variante des hTRT-Pro
teins von SEQ. ID. Nr. 2, beispielsweise ein
Fusionspolypeptid, derivatisiertes Polypeptid, verkürztes
Polypeptid, Polypeptid mit konservativen Substitutionen etc.
Ein Fusions- oder derivatisiertes Protein kann eine
"targeting"-Einheit enthalten, die die Fähigkeit des
Polypeptids die Zellmembran zu durchdringen steigert, oder
bewirkt, daß das Polypeptid einem spezifischen Zelltyp (z. B.
Leberzellen oder Tumorzellen) oder Zellkompartimenten (z. B.
dem nucleären Kompartiment) bevorzugt zugeführt wird. Zu den
Beispielen für solche "Zielsetzungs"-Einheiten gehören
Lipidschwänze, Aminosäuresequenzen, wie beispielsweise das
"antennapedia"-Peptid (siehe USSN 08/838,545, eingereicht am
9. April 1997) oder ein nucleäres Lokalisationssignal (NLS;
z. B. Xenopus-Nucloplasmin; Robbins et al., Cell 64 (1991),
615). Natürlich vorkommendes hTRT-Protein (z. B. mit einer
Sequenz, die SEQ. ID. Nr. 2 entspricht oder dazu im
wesentlichen identisch ist) wirkt im Zellnucleus. Daher ist
es wahrscheinlich, daß eine oder mehrere Untersequenzen von
SEQ. ID. Nr. 2, beispielsweise die Reste 193 bis 196 (PRRR)
und die Reste 235-240 (PKRPRR) als nucleäres
Lokalisationssignal wirken. Die kleinen Bereiche sind
wahrscheinlich NLSs. Dies beruht auf der Beobachtung, daß
viele NLSs ein Muster mit vier Resten umfassen, das aus
basischen Aminosäuren (K oder R) oder drei basischen
Aminosäuren (K oder R) und H oder P zusammengesetzt ist;
einem Muster, das mit P beginnt, woran sich innerhalb dreier
Reste ein basisches Segment anschließt, das 3 K- oder R-Reste
von vier Resten enthält (siehe beispielsweise Nakai et
al., Genomics 14 (1992) 897). Es wird davon ausgegangen, daß
die Deletion einer dieser Sequenzen oder beider und/oder
zusätzlicher Lokalisationssequenzen den hTRT-Transport in
den Nucleus stört und/oder den hTRT-Umsatz steigert und
somit zur Verhinderung des Zugangs von Telomerase zu seinen
nucleären Substraten der Herabsetzung des proliferativen
Potentials von Nutzen ist. Darüber hinaus könnte eine hTRT-Vari
ante, der das NLS fehlt, sich zu einem RNP assemblieren,
das nicht mehr die Telomer-Länge aufrechterhalten kann, da
das daraus hervorgehenden Enzym nicht )n den Nucleus
hineingelangen kann.
Die erfindungsgemäßen hTRT-Polypeptide sind typischerweise
in der Zielzelle mit einer Telomerase-RNA, wie
beispielsweise hTR, assoziiert, wenn sie zur Steigerung von
Telomerase-Aktivität in einer Zelle verwendet werden. In
einer Ausführungsform assoziiert ein eingeführtes hTRT-Poly
peptid mit einer endogenen hTR zur Bildung eines
katalytisch aktiven RNP (z. B. eines RNPs, das die hTR und
ein Polypeptid mit vollständiger Länge und einer Sequenz von
SEQ. ID. Nr. 2 umfaßt). Das so gebildete RNP kann auch mit
weiteren, beispielsweise Telomerase-assoziierten, Proteinen
assoziieren. In weiteren Ausführungsformen wird das
Telomerase-RNP (das hTRT-Protein, hTR und gegebenenfalls
weitere Bestandteile enthält) als Komplex in die Zielzelle
eingeführt.
In einer ähnlichen Ausführungsform wird ein hTRT-Ex
pressionsvektor in eine Zelle (oder die Nachkommenschaft
einer Zelle) eingeführt, in die ein Telomerase-RNA (z. B.
hTR)-Expressionsvektor gleichzeitig, danach oder vorher
eingeführt wird. In dieser Ausführungsform werden hTRT-Pro
tein und Telomerase-RNA in der Zelle coexprimiert und sie
assemblieren zur Bildung eines Telomerase-RNPs. Eine
bevorzugte Telomerase-RNA ist hTR zusammen. Ein für die
Expression von hTR. Ein für die Expression von hTR in einer
Zelle nützlicher Expressionsvektor wurde vorstehend
beschrieben (siehe US-Patent 5,583,016). In einer weiteren
Ausführungsform sind das hTRT-Polypeptid und die hTR-RNA
(oder ein Äquivalent) zur Bildung eines Komplexes, der dann
in die Zielzellen eingeführt wird, in vitro assoziiert. Ein
weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Bereitstellung
von hTRT-Polypeptiden, die zur Herabsetzung der Telomerase-
Aktivität in einer Zelle nützlich sind.
Wie vorstehend beschrieben, können diese "hemmenden"
Polypeptide entweder direkt in die Zelle eingeführt werden
oder durch Expression von rekombinanten Nucleinsäuren in der
Zelle erzeugt werden. Peptid-"Imitatoren" oder Polypeptide,
die Nicht-Standard-Aminosäuren umfassen (d. h. Aminosäuren,
die nicht den durch den genetischen Code codierten 20
Aminosäuren oder deren normalen Derivaten entsprechen)
werden normalerweise direkt eingeführt.
In einer Ausführungsform führt die Hemmung der Telomerase-
Aktivität zu der Sequestrierung eines Bestandteils, der für
die genaue Telomerverlängerung erforderlich ist. Beispiele
für solche Bestandteile sind hTRT und hTR. Somit kann die
Verabreichung eines Polypeptids, das hTR bindet, jedoch
keine katalytische Aktivität von Telomerase aufweist, die
endogene Telomerase-Aktivität in der Zelle herabsetzen. In
einer verwandten Ausführungsform kann das hTRT-Polypeptid
einen Zellbestandteil binden, bei dem es sich nicht um hTR
handelt, beispielsweise ein Telomerase-assoziiertes Protein
(oder mehrere), wodurch die Telomerase-Aktivität in der
Zelle gestört wird.
In einer anderen Ausführungsform stören die
erfindungsgemäßen hTRT-Polypeptide die Interaktion von
endogen exprimiertem hTRT-Protein und einer anderen für die
Telomerase-Funktion erforderlichen zellulären Komponente,
beispielsweise hTR, Telomer-DNA, Telomerase-assoziierte
Proteine, Telomer-assoziierte Proteine, Telomere, den
Zellcyclus kontrollierende Proteine, DNA-Reparaturenzyme,
Histone oder nicht-Histon-chromosomale Proteine etc.
(beispielsweise durch Kompetition).
Durch Auswahl von erfindungsgemäßen Molekülen (z. B.
Polypeptiden), die sich auf die Interaktion von endogen
exprimiertem hTRT-Protein und weiteren zellulären
Bestandteilen auswirken, kann man Moleküle bevorzugen, die,
wie hier beschrieben, eines oder mehrere der konservierten
Motive des hTRT-Proteins enthalten. Die evolutionäre
Konservierung dieser Bereiche zeigt, daß diese Motive eine
wichtige Funktion in dem korrekten Arbeiten der menschlichen
Telomerase beisteuern. Diese Motive sind somit allgemein
nützliche Bereiche, um die Funktion des hTRT-Proteins zur
Erzeugung von erfindungsgemäßen hTRT-Proteinvarianten zu
verwenden. Somit sind hTRT-Polypeptidvarianten mit
Mutationen in konservierten Motiven von besonderem Nutzen.
In einer weiteren Ausführungsform wird die Expression des
endogenen hTRT-Gens durch Einführung einer großen Menge an
hTRT-Polypeptid in die Zelle (z. B. typischerweise mindestens
etwa mehr als 2fach im Vergleich zu dem endogenen Spiegel,
vorzugsweise etwa mindestens 10 bis etwa 100fach)
reprimiert. Dieses wirkt über eine Prüfkopplungsschleife und
hemmt so die Transkription des hTRT-Gens, die Prozessierung
der hTRT-prä-mRNA, die Translation der hTRT-mRNA oder die
Assemblierung und den Transport des Telomerase-RNPs.
Die Erfindung stellt Verfahren und "antisense"-Oligo
nucleotide oder Polynucleotidreagenzien zur Verfügung,
die zur Herabsetzung der Expression von hTRT-Genprodukten in
vitro oder in vivo verwendet werden können. Die
Verabreichung der erfindungsgemäßen "antisense"-Reagenzien
an eine Zielzelle führt zu einer herabgesetzten Telomerase-
Aktivität und ist für die Behandlung von Erkrankungen
besonders nützlich, die durch eine hohe Telomerase-Aktivität
gekennzeichnet sind (z. B. bei Krebserkrankungen). Es wird
davon ausgegangen, wobei hier keine Einschränkung auf einen
bestimmten Mechanismus beabsichtigt ist, daß "antisense"-Oligo
nucleotide an die "sense"-hTRT-mRNA binden und deren
Translation stören. Alternativ können die "antisense"-Mole
küle die hTRT-mRNA für eine Spaltung mit Nuclease
empfindlich machen, die Transkription, Prozessierung oder
Lokalisierung stören oder auf andere Weise RNA-Vorläufer
("prä-mRNA") stören, die Transkription von mRNA des hTRT-Gens
reprimieren oder über einige andere Mechanismen wirken.
Der bestimmte Mechanismus, durch den die "antisense"-Mole
küle die hTRT-Expression herabsetzen, ist jedoch nicht
kritisch.
Die erfindungsgemäßen "antisense"-Polynucleotide umfassen
eine "antisense"-Sequenz mit mindestens 7 bis 10 oder mehr
Nucleotiden, die mit eine Sequenz von mRNA, die humane TRT
codiert, oder mRNA, die von dem hTRT-Gen transkribiert wird,
spezifisch hybridisieren. Vorzugsweise weist das
erfindungsgemäße "antisense"-Polynucleotid eine Länge von
etwa 10 bis etwa 50 Nucleotiden oder von etwa 14 bis etwa 35
Nucleotiden auf. In weiteren Ausführungsformen handelt es
sich bei den "antisense"-Polynucleotiden um Polynucleotide,
die kürzer als etwa 100 Nucleotide oder kürzer als etwa 200
Nucleotide sind. Im allgemeinen sollten die "antisense"-Poly
nucleotide lang genug sein, um eine stabile Doppelhelix
zu bilden, jedoch kurz genug (in Abhängigkeit von der Art
der Zuführung) um, falls erwünscht, in vivo verabreicht
werden zu können. Die minimale Länge eines Polynucleotids,
die für eine spezifische Hybridisierung mit einer
Zielsequenz erforderlich ist, hängt von verschiedenen
Faktoren ab, beispielsweise vom G/C-Gehalt, der Lage von
fehlgepaarten Basen (falls vorhanden), dem Ausmaß der
Einzigartigkeit der Sequenz im Vergleich zu der Population
von Ziel-Polynucleotiden, der chemischen Natur des
Polynucleotids (z. B. kann es sich um ein Methylphosphonat-
Rückgrat handeln, eine Peptid-Nucleinsäure, ein
Phosphorothioat) etc. Im allgemeinen ist die "antisense"-Se
quenz zur Gewährleistung einer spezifischen Hybridisierung
zu der Ziel-hTRT-mRNA-Sequenz im wesentlichen komplementär.
In bestimmten Ausführungsformen ist die "antisense"-Sequenz
genau komplementär zu der Zielsequenz. Die "antisense"-Poly
nucleotide können jedoch auch Nucleotid-Substitutionen,
Additionen, Deletionen, Transitionen, Transpositionen oder
Modifikationen enthalten, solange die spezifische Bindung an
die relevante Zielsequenz, die hTRT-RNA oder deren Gen
entspricht, als eine funktionelle Eigenschaft des
Polynucleotids beibehalten wird.
In einer Ausführungsform ist die "antisense"-Sequenz zu
relativ zugänglichen Sequenzen der hTRT-mRNA (z. B.
Sequenzen, die relativ wenig Sekundärstrukturen aufweisen)
komplementär. Dies kann durch Analyse der vorhergesagten
RNA-Sekundärstrukturen bestimmt werden, beispielsweise
mittels des MFOLD-Programms (Genetics Computer Group,
Madison WI) und durch auf dem Fachgebiet bekannte in vitro- oder
in vivo-Tests. Beispiele für Oligonucleotide, die
hinsichtlich einer "antisense"-Suppression der hTRT-Funktion
getestet werden können, sind Oligonucleotide, die mit den
folgenden Positionen von SEQ. ID. Nr. 1 hybridisieren können
(d. h. im wesentlichen komplementär sind): SEQ. ID. Nr. 1:
40-60; 260-280; 500-520; 770-790, 885-905; 1000-1020; 1300-1320;
1520-1540; 2110-2130; 2295-2315; 2450-2470, 2670-2690;
3080-3110; 3140-3160; und 3690-3710. Bei einem weiteren
nützlichen Verfahren zur Identifizierung von effektiven
"antisense"-Zusammensetzungen werden kombinatorische Arrays
von Oligonucleotiden verwendet (siehe beispielsweise Milner
et al., Nature Biotechnology 15 (1997), 537).
Die Erfindung stellt auch ein "antisense"-Polynucleotid
bereit, das Sequenzen zusätzlich zu der "antisense"-Sequenz
aufweist (z. B. zusätzlich zu der anti-hTRT-"sense"-Sequenz).
In diesem Fall ist die "antisense"-Sequenz in einem
Polynucleotid mit einer längeren Sequenz enthalten. In einer
weiteren Ausführungsform besteht die Sequenz des
Polynucleotids im wesentlichen aus der "antisense"-Sequenz
oder sie stellt diese dar.
Die "antisense"-Nucleinsäuren (DNA, RNA, Modifizierte DNA
oder RNA-Analoge etc.) können unter Verwendung jedes zur
Herstellung von Nucleinsäuren geeigneten Verfahrens,
beispielsweise den hier beschriebenen Verfahren, hergestellt
werden. In einer Ausführungsform können erfindungsgemäße
"antisense"-RNA-Moleküle beispielsweise durch chemische
Synthese de novo oder durch Clonierung hergestellt werden.
Beispielsweise kann eine "antisense"-RNA, die mit hTRT-mRNA
hybridisiert, dadurch hergestellt werden, daß eine hTRT-DNA-Se
quenz (z. B. SEQ. ID. Nr. 1 oder ein Fragment davon) in
umgekehrter Orientierung funktionell mit einem Promotor
verknüpft in einen Vektor (z. B. ein Plasmid) inseriert
(ligiert) wird. Unter der Voraussetzung, daß der Promotor
und vorzugsweise Terminations- und Polyadenylierungssignale
korrekt positioniert sind, wird der Strang der inserierten
Sequenz, der dem nicht-codierenden Strang entspricht,
transkribiert, und dieser wirkt als ein erfindungsgemäßes
"antisense"-Oligonucleotid.
Die erfindungsgemäßen "antisense"-Oligonucleotide können zur
Hemmung der Telomerase-Aktivität in zellfreien Extrakten,
Zellen und Tieren, einschließlich Säugern und Menschen,
verwendet werden. Die Phosphorothioat-"antisense"-
Oligonucleotide:
können beispielsweise zur Hemmung von Telomerase-Aktivität
verwendet werden. Bei einer Konzentration von 10 µM
hemmte(n) jedes Oligonucleotid; Gemische der Oligonucleotide
A und B; A, B, C und D; und A, C und D die Telomerase-
Aktivität in 293-Zellen, wenn diese 7 Tage einmal pro Tag
behandelt wurden. Eine Hemmung wurde auch mit einem
"antisense"-hTR-Molekül (5'-GCTCTAGAATGAAGGGTG-3')
beobachtet, wenn dies mit den Oligonucleotiden A, und C;
A, B und D; und A und C kombiniert war. u den für solche
Experimente nützlichen Kontroll- und Oligonucleotiden
zählen:
Um für die für eine bestimmte gewünschte Anwendung optimalen
erfindungsgemäßen "antisense"-Oligonucleotide bestimmen zu
können, kann man ein Scanning unter Verwendung eines Satzes
von erfindungsgemäßen "antisense"-Oligonucleotiden
durchführen. Ein Beispiel für einen solchen Satz ist der
Satz von 30-mer Oligonucleotiden, die die hTRT-mRNA
umspannen und wobei eines von dem nächsten um 15 Nucleotide
versetzt ist, (d. h. ON1 entspricht den Positionen 1-30 und
ist
TCCCACGTGCGCAGCAGGACGCAGCGCTGC, ON2 entspricht Positionen
16-45 und ist GCCGGGGCCAGGGCTTCCCACGTGCGCAGC, und ON3
entspricht den Positionen 31-60 und ist
GGCATCGCGGGGGTGGCCGGGGCCAGGGCT usw. bis zum Ende der mRNA).
Jedes Mitglied dieses Satzes kann hinsichtlich seiner
hemmenden Aktivität, wie hier beschrieben, getestet werden.
Jene Oligonucleotide, die unter den gewünschten Bedingungen
eine hemmende Aktivität zeigen, kennzeichnen dann einen
gewünschten Bereich. Weitere erfindungsgemäße
Oligonucleotide, die dem gewünschten Bereich entsprechen
(d. h. 8-mere, 10-mere, 15-mere etc.) können zur
Identifikation des Oligonucleotids mit der für die Anwendung
bevorzugten Aktivität getestet werden.
Bezüglich allgemeiner Verfahren, die sich auf antisense-
Polynucleotide beziehen, siehe Antisense RNA and DNA (1988),
D.A. Melton, (Herausg., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor, N.Y.) und Dagle et al., Nucleic Acids
Research 19 (1991), 1805. Bezüglich eines Übersichtsartikels
der die "antisense"-Therapie betrifft, siehe beispielsweise
Uhlmann et al., Chem. Reviews 90 (1990) 543-584.
Die vorliegende Erfindung stellt Oligo- und Polynucleotide
(z. B. DNA, RNA oder PNA) bereit, die an doppelsträngige oder
Duplex-hTRT-Nucleinsäuren binden, (z. B. in einem gefalteten
Bereich der hTRT-RNA oder im hTRT-Gen), wobei eine
Nucleinsäure gebildet wird, die eine Dreifach-Helix enthält
oder eine "triplex"-Nucleinsäure. Die Bildung einer
Dreifach-Helix führt zur Hemmung der hTRT-Expression,
beispielsweise durch die Verhinderung der Transkription des
hTRT-Gens, wodurch Telomerase-Aktivität in einer Zelle
herabgesetzt oder eliminiert wird. Es wird davon ausgegangen
(wobei jedoch nicht beabsichtigt ist, an einen bestimmten
Mechanismus gebunden zu sein), daß die Dreifach-Helixpaarung
die Fähigkeit der Doppelhelix sich für die Bindung von
Polymerasen, Transkriptionsfaktoren oder regulatorischen
Molekülen ausreichend zu öffnen, stört.
Erfindungsgemäße Triplex-Oligo- und Polynucleotide werden
unter Anwendung der Basenpaarungsregeln für die Bildung von
Dreifach-Helices konstruiert (siehe beispielsweise Cheng et
al., J. Biol. Chem. 263 ( 1988), 15110; Ferrin und Camerini-
Otero, Science 354 (1991), 1494; Ramdas et al., J. Biol.
Chem. 264 (1989), 17395; Strobel et al., Science 254 (1991),
1639 und Rigas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986),
9591, wobei durch Bezugnahme jedes dieser Dokumente als
Bestandteil dieser Beschreibung anzusehen ist) und den hTRT-mRNA- und/oder
Gensequenzen. Typischerweise umfassen die
erfindungsgemäßen Triplex-formenden Oligonucleotide eine
spezifische Sequenz von etwa 10 bis mindestens etwa 25
Nucleotiden oder eine längere Sequenz, die zu einer
spezifischen Sequenz in der hTRT-RNA der dem Gen
"komplementär" ist (d. h. lang genug, um eine stabile
Dreifach-Helix bilden zu können, jedoch kurz genug, in
Abhängigkeit von der Art der Zulieferung, um, falls
gewünscht, in vivo verabreicht werden zu können). In diesem
Zusammenhang bedeutet "komplementär" die Fähigkeit zur
Bildung einer stabilen Dreifach-Helix. In einer
Ausführungsform werden Oligonucleotide so entworfen, daß sie
spezifisch an die regulatorischen Bereiche des hTRT-Gens
(z. B. die hTRT-5'-flankierende Sequenz, Promotoren und
Enhancer) oder die Transkriptions-Initiationsstelle (z. B.
zwischen -10 und +10 von der
Transkriptionsinitiationsstelle) spezifisch binden.
Bezüglich eines Übersichtsartikels neuerer therapeutischer
Fortschritte, bei denen Triplex-DNA verwendet wird, siehe
Gee et al., in Huber und Carr, 1994, Molecular and
Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco NY
und Rininsland et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997),
5854, wobei beide Dokumente durch Bezugnahme als Bestandteil
dieser Beschreibung anzusehen sind.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Ribozyme bereit, die
zur Hemmung von Telomerase-Aktivität von Nutzen sind. Die
erfindungsgemäßen Ribozyme binden, spalten spezifisch und
inaktivieren hTRT-mRNA. Nützliche Ribozyme können 5'- und
3'-terminale Sequenzen umfassen, die zu der hTRT-mRNA
komplementär sind, und diese können vom Fachmann auf der
Basis der hier beschriebenen hTRT-mRNA-Sequenz konstruiert
werden (siehe PCT-Veröffentlichung WO 93/23572, a.a.O.). Zu
den erfindungsgemäßen Ribozymen gehören Ribozyme mit den
Merkmalen der Gruppe I-Intron-Ribozyme (Cech, Biotechnology
13 (1995), 323) und "hammerhead"-Ribozyme (Edgington,
Biotechnology 10 (1992), 256).
Zu den erfindungsgemäßen Ribozymen zählen Ribozyme mit
Spaltstellen wie GUA, GUU und GUC. Zu weiteren optimalen
Spaltstellen für die Ribozym-vermittelte Hemmung von
Telomerase-Aktivität gemäß der vorliegenden Erfindung
gehören jene, die in den PCT-Veröffentlichungen WO 94/02595
und WO 93/23569 beschrieben sind, wobei beide Dokumente
durch Bezugnahme als Bestandteil dieser Beschreibung
anzusehen sind. Kurze RNA-Oligonucleotide mit einer Länge
von 15 und 20 Ribonucleotiden, die einem Bereich des Ziel
hTRT-Gens entsprechen, der eine Spaltstelle enthält, können
bezüglich Sekundärstrukturmerkmalen, die zu
wünschenswerteren Oligonucleotiden führen, bewertet werden.
Die Eignung der Spaltstellen kann auch durch Testen der
Zugänglichkeit zur Hybridisierung mit komplementären
Oligonucleotiden bewertet werden, wobei "Ribonuclease-
Protection"-Assays angewandt werden, oder indem die Ribozym-
Aktivität in vitro gemäß auf dem Fachgebiet bekannter
Standardverfahren getestet wird.
Wie von Hu et al., PCT-Veröffentlichung WO 94/03596
beschrieben, können "antisense"- und Ribozym-Funktionen in
einem einzigen Oligonucleotid kombiniert werden. Dieses
Dokument ist hier ebenfalls durch Bezugnahme als Gegenstand
dieser Beschreibung anzusehen. Darüber hinaus können
Ribozyme eine oder mehrere modifizierte Nucleotide oder
modifizierte Bindungen zwischen Nucleotiden umfassen, wie
dies vorstehend im Zusammenhang mit der Beschreibung von
veranschaulichenden erfindungsgemäßen Oligonucleotiden
beschrieben ist.
In einer Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen
Ribozyme in vitro erzeugt und in eine Zelle oder einen
Patienten eingeführt. In einer anderen Ausführungsform
werden Gentherapieverfahren zur Expression von Ribozymen in
einer Zielzelle ex vivo oder in vivo angewandt.
Typischerweise gehört zu den erfindungsgemäßen
therapeutischen Verfahren die Verabreichung eines
Oligonucleotids das so wirkt, daß es unter physiologischen
Bedingungen in vivo Telomerase-Aktivität hemmen der
stimulieren kann und das unter diesen Bedingungen für einen
Zeitraum, der für eine therapeutische Wirkung ausreicht,
relativ stabil ist. Wie bereits vorstehend angegeben, können
modifizierte Nucleinsäuren bei der Verleihung einer solchen
Stabilität von Nutzen sein, aber auch für die gezielte
Zulieferung des Oligonucleotids an das gewünschte Gewebe,
Organ oder die gewünschte Zelle.
Oligo- und Polynucleotide können direkt als Arzneimittel in
einer geeigneten pharmazeutischen Formulierung zugeliefert
werden, oder indirekt durch Mittel zur Einführung einer
Nucleinsäure in eine Zelle, wozu Liposome, Immunliposome,
ballistische Verfahren, die direkte Aufnahme in Zellen etc.,
so wie dies hier beschrieben ist, gehören. Zur Behandlung
einer Erkrankung werden die erfindungsgemäßen
Oligonucleotide an den Patienten in einer therapeutisch
wirksamen Menge verabreicht. Eine therapeutisch wirksame
Menge ist die Menge, die ausreicht, um die
Krankheitssymptome zu lindern oder die Telomerase-Aktivität
in der Zielzelle zu modulieren, wie dies beispielsweise
unter Verwendung eines TRAP-Assays oder anderer geeigneter
Assays bezüglich der biologischen Funktion von Telomerase
bestimmt werden kann. Für die Zulieferung von
Oligonucleotiden für therapeutische Zwecke geeignete
Verfahren sind in dem US-Patent 5,272,065, das hiermit durch
Bezugnahme als Bestandteil dieser Beschreibung anzusehen
ist, beschrieben. Weitere Details bezüglich der
Verabreichung von pharmazeutisch aktiven Verbindungen sind
nachstehend beschrieben. In einer weiteren Ausführungsform
können Oligo- und Polynucleotide unter Verwendung von
Gentherapie und der erfindungsgemäßen rekombinanten DNA-Ex
pressionsplasmide zugeliefert werden.
Gentherapie bezieht sich auf die Einführung eines ansonsten
exogenen Polynucleotids, das auf die (typischerweise)
Säuger-Zelle(n), in das (die) es überführt wird, eine
medizinisch nützliche phänotypische Auswirkung hat. Ein
Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die
Bereitstellung von Gentherapieverfahren und
Zusammensetzungen für die Behandlung von Telomerase
assoziierten Zuständen. In veranschaulichenden
Ausführungsformen gehört zu der Gentherapie die Einführung
eines Vektors in eine Zelle, der ein hTRT-Genprodukt
exprimiert (z. B. ein hTRT-Protein, das im wesentlichen dem
hTRT-Polypeptid mit einer Sequenz von SEQ. ID. Nr. 2
gleicht, beispielsweise um Telomerase-Aktivität zu steigern,
oder ein inhibitorisches hTRT-Polypeptid zur Herabsetzung
der Aktivität), die Expression einer Nucleinsäure mit einer
Sequenz eines hTRT-Gens oder einer hTRT-mRNA (z. B. einer
"antisense"-RNA, um beispielsweise Telomerase-Aktivität
herabzusetzten), die Expression eines Polypeptids oder
Polynucleotids, das auf andere Weise die Expression von
hTRT-Genprodukten beeinflußt (z. B. ein Ribozym, das zur
Herabsetzung von Telomerase-Aktivität gegen hTRT-mRNA
gerichtet ist) oder den Austausch, oder das Unterbrechen
einer endogenen hTRT-Sequenz (z. B. "gene replacement" und
"gene knockout"). Für den Fachmann sind nach Lesen dieser
Beschreibung zahlreiche weitere Ausführungsformen
offensichtlich. In einer Ausführungsform wird auch ein hTR-co
dierender Vektor eingeführt. In einer weiteren
Ausführungsform werden auch Telomerase-assoziierte Proteine
codierende Vektoren mit oder ohne einen Vektor für hTR
eingeführt.
Für die hTRT-Gentherapie nützliche Vektoren können viral
oder nicht-viral sein. Dazu zählen die im Zusammenhang mit
den erfindungsgemäßen hTRT-Expressionssystemen vorstehend
beschriebenen Vektoren. Es ist für den Fachmann
offensichtlich, daß Gentherapie-Vektoren Promotoren und
andere regulatorische oder für die Prozessierung benötigte
Sequenzen umfassen können, beispielsweise die hier
beschriebenen. Üblicherweise umfassen die Vektoren einen
Promotor und gegebenenfalls einen Enhancer (unabhängig von
einem Enhancer, der innerhalb der Promotorsequenzen bereits
vorhanden ist), die zur Steuerung der Transkription eines
Oligoribonucleotids dienen, sowie weitere regulatorische
Elemente, die für die Beibehaltung des Vektors als Episom
oder für die chromosomale Integration und Transkription auf
hohem Niveau sorgen, falls erwünscht. Ein für die
Gentherapie nützliches Plasmid kann weitere funktionelle
Elemente umfassen, beispielsweise selektierbare Marker,
Identifizierungsbereiche und weitere Sequenzen. Zusätzliche
Sequenzen können eine Rolle dabei spielen, sowohl außerhalb
als auch innerhalb der Zelle Stabilität zu verleihen, um für
die zielgerichtete Zulieferung von hTRT-Nucleotidsequenzen
("sense" oder "antisense") zu einem gewünschten Organ,
Gewebe oder einer Zellpopulation zu bewirken, oder den
Eintritt in eine Zelle, in den Nucleus einer Zelle und/oder
die Integration innerhalb nucleärer DNA zu vermitteln.
Beispielsweise können Aptamer-ähnliche DNA-Strukturen oder
andere Stellen der Einheiten, die Proteine binden, dazu
verwendet werden, um die Bindung eines Vektors an
Zelloberflächenrezeptoren oder an Serumproteine zu
vermitteln, die an einen Rezeptor binden, wodurch die
Effizienz des DNA-Transfers in die Zelle erhöht wird. Andere
DNA-Stellen und Strukturen können direkt oder indirekt an
Rezeptoren in der nucleären Membran oder an andere Proteine,
die in den Nucleus wandern, binden, wodurch die nucleäre
Aufnahme eines Vektors erleichtert wird. Andere DNA-Se
quenzen können direkt oder indirekt die Effizienz der
Integration beeinflussen.
Geeignete Vektoren für die Gentherapie können einen
Replikationsursprung besitzen oder auch nicht.
Beispielsweise ist es nützlich für die Vermehrung des
Vektors vor der Verabreichung an einen Patienten einen
Replikationsursprung in einen Vektor einzubauen. Der
Replikationsursprung kann jedoch oft vor der Verabreichung
entfernt werden, wenn der Vektor so entworfen ist, daß er
sich in die chromosomale DNA des Wirts integrieren soll oder
an die mRNA oder DNA des Wirts binden soll. In einigen
Situationen (z. B. bei Tumorzellen) mag es nicht notwendig
sein, daß sich die exogene DNA in die transduzierte Zelle
stabil integriert, da eine transiente Expression ausreichen
kann, um Zellen abzutöten.
Wie bereits erwähnt, stellt die vorliegende Erfindung auch
Verfahren und Reagenzien für die "gene replacement"-Therapie
zur Verfügung (d. h. der Austausch eines endogenen hTRT-Gens
gegen ein rekombinantes Gen durch homologe Rekombinaton). Es
können dafür speziell für eine Integration durch homologe
Rekombination entworfene Vektoren verwendet werden. Zu den
für die Optimierung der homologen Rekombination wichtige
Faktoren zählen das Ausmaß der Sequenzidentität und die
Länge der Homologie zu chromosomalen Sequenzen. Die
spezifische, die homologe Rekombination vermittelnde Sequenz
ist ebenfalls wichtig, da eine Integration in
transkriptionell aktive DNA wesentlich leichter stattfindet.
Verfahren und Substanzen zur Konstruktion von Konstrukten
für eine zielgerichtete homologe Rekombination sind
beispielsweise beschrieben in Mansour et al., Nature 336
(1988), 348; Bradley et al., Bio/Technology 10 (1992), 534
und darüber hinaus in US-Patent Nr. 5,627,059; 5,487,992, 5,631,153
und 5,464,764. In einer Ausführungsform umfaßt die
"gene replacement"-Therapie die Änderung oder den Austausch
aller regulatorischen Sequenzen oder eines Teils davon, die
die Expression des zu regulierenden hTRT-Gens kontrollieren.
Beispielsweise können die hTRT-Promotorsequenzen (z. B.
solche, die in SEQ. ID. Nr. 6 (Fig. 21) vorkommen)
unterbrochen werden (um so die hTRT-Expression zu verringern
oder eine Kontrollstelle für die Transkription zu
eliminieren) oder gegen einen exogenen Promotor ausgetauscht
sein, beispielsweise um die hTRT-Expression zu erhöhen.
Die Erfindung stellt auch Verfahren und Reagenzien für den
hTRT-"gene knockout" bereit (d. h. die Deletion oder
Unterbrechung eines endogenen hTRT-Gens durch homologe
Rekombination unter Verwendung eines rekombinant
hergestellten Vektors). Bei diesem "gene knockout" können
die als Ziel in Betracht gezogenen Sequenzen regulatorische
Sequenzen sein (z. B. der hTRT-Promotor) oder RNA- oder
Protein-codierende Sequenzen. Die Veränderung der Expression
von endogenen Genen durch homologe Rekombination ist
ausführlich beschrieben in dem US-Patent Nr. 5,272,071 (und
den vorstehend zitierten US-Patenten), WO 91/09955, WO
93/09222, WO 96/29411, WO 95/31560 und WO 91/12650. Siehe
auch Moynahan et al., Hum. Mol. Genet. 5 (1996) 875.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner Verfahren zur
spezifischen Abtötung Telomerase-positiver Zellen oder zur
Verhinderung der Transformation von Telomerase-negativen
Zellen zu einem Telomerase-positiven Status bereit, wobei
der hTRT-Genpromotor zur Regulation der Expression eines für
die Zelle toxischen Proteins verwendet wird. Wie in Beispiel
14 gezeigt, kann eine hTRT-Promotorsequenz mit einem
Reportergen funktionell verknüpft sein, so daß die
Aktivierung des Promotors zur Expression des von dem
Reportergen codierten Proteins führt. Falls anstelle eines
Reporterproteins das codierte Protein für die Zelle toxisch
ist, führt die Aktivierung des Promotors zur Zellmorbidität
oder zum Tod der Zelle. Bei einer erfindungsgemäßen
Ausführungsform wird ein Vektor, der ein ein toxisches
Protein codierendes Gen umfaßt, das mit einem hTRT-Promotor
funktionell verknüpft ist in Zellen, wie menschliche Zellen,
beispielsweise Zellen in einem menschlichen Patienten,
eingeführt, was zum Zelltod bei denjenigen Zellen führt, in
denen hTRT-Promotor aktivierende Faktoren exprimiert werden,
wie beispielsweise Krebszellen. Bei einer verwandten
Ausführungsform ist das codierte Protein selbst nicht
toxisch für eine Zelle, codiert jedoch eine Aktivität, die
die Zelle gegenüber einem ansonsten nicht-toxischen
Wirkstoff empfindlich macht. Tumore können beispielsweise
durch Einführung eines hTRT-Promotor-Herpes-Thymidinkinase
(TK)-Genfusionskonstrukts in Tumorzellen und die
Verabreichung von Gangcyclovir oder des Äquivalents
behandelt werden (siehe beispielsweise Moolton und Wells, J.
Natl. Canc. Inst. 82 (1990), 297). Auf dem Fachgebiet sind
auch zahlreiche weitere geeignete toxische oder potentiell
toxische Proteine und Systeme bekannt (wobei sich von hTRT
unterscheidende Promotorsequenzen verwendet werden), die vom
Fachmann nach Lesen dieser Beschreibung gemäß der
vorliegenden Erfindung modifiziert und verabreicht werden
können.
Vektoren für die Gentherapie können in Zellen oder Gewebe in
vivo, in vitro oder ex vivo eingeführt werden. Für die ex
vivo-Therapie können Vektoren in von dem Patienten
entnommene Stammzellen eingeführt werden und für die
autologe Rücktransplantation in den selben Patienten clonal
propagiert werden (siehe beispielsweise die US-Patente 5,399,493
und 5,437,994, wobei durch Bezugnahme diese Dokumente
als Bestandteil der Beschreibung angesehen werden können).
Zu den Zellen, die als Ziel für die hTRT-Gentherapie mit dem
Ziel der Steigerung der Telomerase-Aktivität in einer
Zielzelle in Betracht kommen, zählen, allerdings ohne
Beschränkung darauf, Embryonalzellen oder Keimzellen,
insbesondere Primatenzellen oder menschliche Zellen, wie
vorstehend angemerkt, hematopoetische Stammzellen (AIDS und
nach der Chemotherapie), vaskuläre Endothelialzellen,
(Erkrankungen der Herzgefäße und zerebralen Gefäße)
Hautfibroblasten und Unterhautkeratinocyten (Wundheilung und
Verbrennungen) Chondrocyten (Arthritis), Hirnastrocyten und
Microglialzellen (Alzheimer Krankheit), Osteoblasten
(Osteoporose) Retinazellen (Augenerkrankungen) und Pankreas-
Inselzellen (Typ I Diabetes) sowie die in der nachstehenden
Auflistung 1 aufgezählten Zellen.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wird ein mit
einer TRT-codierenden Sequenz (oder einer Variante davon)
funktionell verknüpfter induzierbarer Promotor zur
Modulation der Proliferationsfähigkeit von Zellen in vivo
oder in vitro verwendet. In einer besonderen Ausführungsform
werden beispielsweise Insulin-produzierende Pankreaszellen,
die mit einem hTRT-Expressionsvektor unter der Kontrolle
eines induzierbaren Promotors transfiziert sind, in einen
Patienten eingeführt. Die Proliferationsfähigkeit der Zellen
kann dann durch Verabreichung des den Promotor aktivierenden
Mittels (z. B. Tetracyclin) an den Patienten kontrolliert
werden, wobei dadurch sich die Zellen stärker vermehren
können, als dies ansonsten möglich gewesen wäre. Die
Zellproliferation kann dann, je nach dem, wie es von dem
behandelnden Arzt gewünscht wird, beendet, fortgesetzt oder
erneut initiiert werden.
Immunogene Peptide oder Polypeptide mit einer hTRT-Sequenz
können dazu verwendet werden, um eine anti-hTRT-Immunantwort
in einem Patienten hervorzurufen (d. h. sie können als Vakzin
wirken). Beispiele für immunogene hTRT-Peptide und
Polypeptide sind nachstehend in den Beispielen 6 und 8
beschrieben. Eine Immunantwort kann auch durch Zulieferung
von Plasmidvektoren, die das gewünschte Polypeptid codieren
(d. h. die Verabreichung von "nackter DNA") ausgelöst werden.
Die gewünschten Nucleinsäuren können durch Injektion,
Liposome oder andere Verabreichungsmaßnahmen zugeliefert
werden. In einer Ausführungsform werden Immunosierungsarten
ausgewählt, die in der Versuchsperson bzw. dem Patienten
eine auf die MHC Klasse I restringierte Antwort
cytotoxischer Lymphocyten gegen Telomerase exprimierende
Zellen auslösen. Nach der Immunisierung wird in der Person
oder dem Tier eine erhöhte Immunantwort gegen Zellen
hervorgerufen, die hohe Konzentrationen von Telomerase
exprimieren (z. B. maligne Zellen).
Anti-hTRT-Antikörper, beispielsweise von der Maus, vom
Menschen, oder humanisierte monoclonale Antikörper können
ebenfalls zur Erzielung einer Immunantwort gegen Telomerase
exprimierende Zellen verabreicht werden (z. B. passive
Immunisierung).
Verwandte Aspekte der vorliegenden Erfindung beziehen sich
auf die Bereitstellung von Arzneimitteln, die hTRT-Oligo- und
-Polynucleotide, -Polypeptide und -Antikörper,
-Agonisten, -Antagonisten oder -Hemmstoffe, allein oder in
Kombination mit mindestens einem weiteren Mittel, wie
beispielsweise einer stabilisierenden Verbindung, einem
Verdünnungsmittel, einem Träger oder einem anderen aktiven
Bestandteil oder Agens, umfassen.
Die erfindungsgemäßen Arzneimittel können in einem sterilen,
biokompatiblen pharmazeutischen Träger, zu dem
beispielsweise, jedoch ohne Beschränkung darauf, eine
Kochsalzlösung, gepufferte Kochsalzlösung, Dextrose und
Wasser gehören, verabreicht werden. Jedes dieser Moleküle
kann dem Patienten allein verabreicht werden oder in
Kombination mit anderen Mitteln, Arzneimitteln oder
Hormonen, in Arzneimitteln, wo es mit einem oder mehreren
geeigneten Exzipienten, Hilfsstoffen und/oder pharmazeutisch
verträglichen Trägern vermischt ist. In einer
erfindungsgemäßen Ausführung ist der pharmazeutisch
verträgliche Träger pharmazeutisch inert.
Die Verabreichung der Arzneimittel kann oral oder parenteral
erfolgen. Zu den Verfahren für die parenterale Verabreichung
gehören die topische, intra-arterielle (z. B. direkt zu dem
Tumor), intramuskuläre, subkutane, intramedulläre,
intrathekale, intraventrikuläre, intravenöse,
intraperitoneale oder intranasale Verabreichung. Zusätzlich
zu den aktiven Bestandteilen können diese Arzneimittel
geeignete pharmazeutisch verträgliche Träger umfassen, die
Exzipienten und andere Verbindungen umfassen, die die
Verarbeitung der aktiven Bestandteile zu Zubereitungen
erleichtern, die pharmazeutisch verwendet werden können.
Weitere Details bezüglich Verfahren zur Formulierung und
Verabreichung können in der neuesten Ausgabe von
"Remington's Pharmaceutical Sciences" (Maack Publishing Co.,
Easton PA) gefunden werden.
Arzneimittel für die orale Verabreichung können unter
Verwendung von auf dem Fachgebiet gut bekannten
pharmazeutisch verträglichen Trägern in Dosen, die für eine
orale Verabreichung geeignet sind, formuliert werden. Solche
Träger erlauben die Formulierung der Arzneimittel als
Tabletten, Pillen, Dragees, Kapseln, Flüssigkeiten, Gele,
Sirups, Aufschlämmungen, Suspensionen etc., die für die
Aufnahme durch den Patienten geeignet sind. Siehe PCT-Ver
öffentlichung WO 93/23572.
Arzneimittel für die orale Verwendung können durch die
Kombination von aktiven Bestandteilen mit einem festen
Exzipienten, gegebenenfalls durch Mahlen eines erhaltenen
Gemischs, erhalten werden und Weiterverarbeitung des
Granulatgemisches nach Zugabe geeigneter zusätzlichen
Verbindung, um so, falls erwünscht, Tabletten oder
Drageekerne zu erhalten. Geeignete Exzipienten sind
Kohlenhydrat- oder Proteinfüllstoffe, dazu zählen,
allerdings ohne Beschränkung darauf, Zucker, einschließlich
Lactose, Saccharose, Mannit oder Sorbit; Stärke aus Mais,
Weizen, Reis, Kartoffel oder anderen Pflanzen; Cellulose,
wie beispielsweise Methylcellulose,
Hydroxypropylmethylcellulose oder
Natriumcarboxymethylcellulose und Gummis, zu denen Gummi
arabicum und Tragacanthharz zählen, sowie Proteine, wie
beispielsweise Gelatine und Collagen. Falls erwünscht,
können den Zerfall bewirkende oder solubisierende Agenzien
zugegeben werden, beispielsweise quervernetztes
Polyvinylpyrrolidon, Agar, Alginsäure oder ein Salz davon,
beispielsweise Natriumalginat.
Drageekerne werden mit geeigneten Überzügen versehen,
beispielsweise konzentrierten Zuckerlösungen, sie können
auch Gummi arabicum, Talk, Polyvinylpyrrolidon, "Carbopol"-Gel,
Polyethylenglykol und/oder Titandioxid, Lacklösungen
und geeignete organische Lösungsmittel oder Lösungsgemische
enthalten. Zu den Überzügen für die Tabletten oder Dragees
können Farbstoffe oder Pigmente zugefügt werden, um das
Produkt zu kennzeichnen oder die Menge an aktivem Wirkstoff
(d. h. die Dosierung) zu kennzeichnen.
Zu den oral zu verwendenden Arzneimitteln gehören aus
Gelatine hergestellte Steckkapseln sowie weiche
verschlossene Kapseln, die aus Gelatine und einem Überzug
aus Glycerin oder Sorbit hergestellt sind. Steckkapseln
können die aktiven Bestandteile, vermischt mit einem
Füllstoff oder Bindemitteln enthalten, dazu gehören Lactose
oder Stärken, Gleitmittel, wie Talg oder Magnesiumstearat,
und gegebenenfalls Stabilisatoren. In weichen Kapseln können
die aktiven Verbindungen in geeigneten Flüssigkeiten gelöst
oder suspendiert sein, beispielsweise in Fettsäuren,
flüssigem Paraffin oder flüssigem Polyethylenglykol mit oder
ohne Stabilisatoren. Zu den Arzneimitteln für die
parenterale Verabreichung gehören wäßrige Lösungen mit
aktiven Verbindungen. Für die Injektion kann das
erfindungsgemäße Arzneimittel in wäßrige Lösungen formuliert
werden, vorzugsweise in physiologisch kompatible Puffer, wie
beispielsweise Hank's-Lösung, Ringer-Lösung oder in
physiologisch gepufferter Kochsalzlösung. Wäßrige
Suspensionen für die Injektion können Substanzen enthalten,
die die Viskosität der Suspension erhöhen, wie
beispielsweise Natriumcarboxymethylcellulose, Sorbit oder
Dextran. Zusätzlich können Suspensionen der aktiven
Verbindungen als geeignete ölige Injektionssuspensionen
hergestellt werden. Zu den geeigneten lipophilen
Lösungsmitteln oder Vehikeln gehören Fettsäuren, wie
beispielsweise Sesamöl oder synthetische Fettsäureester, wie
beispielsweise Ethyloleat oder Triglyceride oder Liposome.
Gegebenenfalls können die Suspensionen auch geeignete
Stabilisatoren enthalten, oder Mittel, die die Löslichkeit
der Verbindungen erhöhen, um so die Herstellung von
hochkonzentrierten Lösungen zu gestatten.
Für die topische oder nasale Verabreichung werden in der
Formulierung Penetrantien verwendet, die für die spezifische
zu durchdringenden Barrieren geeignet sind. Solche
Penetrantien sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt.
Die erfindungsgemäßen Arzneimittel können durch Verfahren,
die den auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren gleichen,
hergestellt werden (z. B. durch übliche Vermischungs-,
Lösungs-, Granulierungs-, Drageeherstellungs-,
Pulverisierungs-, Emulgierungs-, Einkapselungs-, Einschluß- oder
Lyophilisierungsverfahren).
Die Arzneimittel können als ein Salz bereitgestellt werden
und können mit vielen Säuren hergestellt werden, dazu
zählen, allerdings ohne Beschränkung darauf, Salzsäure,
Schwefelsäure, Essigsäure, Milchsäure, Weinsäure,
Apfelsäure, Bernsteinsäure etc. Salze neigen dazu, in
wäßrigen oder anderen protonischen Lösungsmitteln löslicher
zu sein als die entsprechende Form der freien Base. In
anderen Fällen kann die bevorzugte Zubereitung ein
lyophilisiertes Pulver in 1 mM-50 mM Histidin, 0,1% bis 2%
Saccharose, und 2% bis 7% Mannit bei einem pH-Wert im
Bereich von 4,5 bis 5,5 sein, das vor der Verwendung mit
einem Puffer kombiniert wird.
Nach der Herstellung der Arzneimittel, die eine in einem
verträglichen Träger formulierte erfindungsgemäße Verbindung
umfassen, können sie in einen geeigneten Behälter gegeben
und entsprechend der Behandlung eines angegebenen
Krankheitszustands markiert werden. Bei der Verabreichung
von menschlichen Telomerase-Proteinen und -Nucleinsäuren
würde zu einer solchen Markierung die Angabe der Menge und
Häufigkeit der Verabreichung sowie des
Verabreichungsverfahrens zählen.
Zu den für die erfindungsgemäße Verwendung geeigneten
Arzneimitteln zählen Zusammensetzungen, bei denen die
aktiven Bestandteile zur Erzielung des gewünschten Zwecks in
einer wirksamen Menge enthalten sind. "Therapeutisch
wirksame Menge" oder "pharmakologisch wirksame Menge" sind
allgemein gebräuchliche Ausdrücke und beziehen sich auf die
Menge eines Agens, der das gewünschte pharmakologische
Ergebnis wirksam hervorrufen kann. Somit ist eine
therapeutisch wirksame Menge eine Menge, die ausreicht, um
die Symptome der zu behandelnden Erkrankung zu verbessern.
Ein nützliches Assay zur Bestimmung einer wirksamen Menge
für eine vorgegebene Anwendung (z. B. einer therapeutisch
wirksamen Menge) besteht in der Messung des Effekts auf
Telomerase-Aktivität in einer Zielzelle. Die tatsächlich
verabreichte Menge hängt von der zu behandelnden Person ab
und stellt vorzugsweise eine so optimierte Menge dar, daß
der gewünschte Effekt ohne wesentliche Nebenwirkungen
erzielt wird. Die Bestimmung einer therapeutisch wirksamen
Dosis liegt im Bereich der Fähigkeiten des Fachmanns.
Für jede beliebige Verbindung kann die therapeutisch
wirksame Dosis anfänglich entweder in Zellkulturassays oder
mittels eines geeigneten Tiermodells bestimmt werden. Das
Tiermodell wird auch dazu verwendet, um einen geeigneten
Konzentrationsbereich und einen geeigneten Verabreichungsweg
zu ermitteln. So gewonnene Informationen können dann dazu
verwendet werden, nützliche Dosen und Verabreichungswege im
Menschen zu bestimmen.
Eine therapeutisch wirksame Menge bezieht sich auf die Menge
an Protein, Polypeptid, Peptid, Antikörper, Oligo- oder
Polynucleotid, Agonist oder Antagonist, die die Symptome
oder den Zustand bessert. Die therapeutische Wirksamkeit und
Toxizität solcher Verbindungen kann durch pharmazeutische
Standardprozeduren in Zellkulturen oder an Versuchstieren
bestimmt werden (z. B. ED50, die in 50% der Population
therapeutisch wirksame Dosis; und LD50, die in 50% der
Population tödliche Dosis). Der therapeutische Index
bezeichnet das Dosisverhältnis zwischen therapeutischen und
toxischen Wirkungen und es kann als das Verhältnis ED50/LD50
ausgedrückt werden. Pharmazeutische Zusammensetzungen, die
einen großen therapeutischen Index aufweisen, sind
bevorzugt. Die von Zellkulturassays und Tierstudien
gewonnenen Daten werden zur Bestimmung des
Dosierungsbereichs für die Anwendung beim Menschen
verwendet. Die Dosierung solcher Verbindungen liegt
vorzugsweise innerhalb eines Bereichs von
Umlaufkonzentrationen, die die ED50 einschließen, mit einer
geringen oder keiner Toxizität. Die Dosierung variiert
innerhalb dieses Bereichs in Abhängigkeit von der
angewandten Dosierungsform, der Empfindlichkeit des
Patienten und des Verabreichungswegs.
Die exakte Dosierung wird von dem jeweiligen Arzt individuell
für den zu behandelnden Patienten ausgewählt. Die Dosierung
und Verabreichung werden so eingestellt, daß sie einen
ausreichenden Spiegel der aktiven Ei 99999 00070 552 001000280000000200012000285919988800040 0002019743497 00004 99880nheit bereitstellen,
oder den gewünschten Effekt aufrechterhalten.
Zu den zusätzlichen Faktoren, die beachtet werden müssen,
zählen die Schwere des Krankheitszustands (beispielsweise
die Tumorgröße und -Lage; das Alter, das Gewicht und
Geschlecht des Patienten; die Ernährung sowie der Zeitpunkt
und die Häufigkeit der Verabreichung, die Kombination(en)
von Arzneimittel, Reaktionsempfindlichkeit und Toleranz
gegenüber bzw. Ansprechen auf die Therapie). Langwirkende
Arzneimittel können alle 3 bis 4 Tage verabreicht werden,
jede Woche, oder einmal alle 2 Wochen in Abhängigkeit von
der Halbwertszeit und der "clearance"-Rate der speziellen
Formulierung. Eine Anleitung bezüglich spezieller
Dosierungen und Darreichungsverfahren ist in der Literatur
zu finden (siehe US-Patent Nr. 4,657,760, 5,206,344 und
5,225,212, wobei diese Dokumente durch Bezugnahme als
Bestandteil dieser Beschreibung angesehen werden können).
Der Fachmann wird für Nucleotide andere Formulierungen
verwenden als für Proteine oder ihre Inhibitoren. Genauso
ist die Verabreichung von Polynucleotiden oder Polypeptiden
spezifisch für bestimmte Zellen, Zuständen, Lagen etc.
Wie bereits vorstehend diskutiert, zeigen die meisten
Vertebratenzellen nach einer begrenzten Anzahl von Teilungen
in der Kultur (z. B. 50 bis 100 Teilungen) Seneszenz.
Bestimmte Zellvarianten können sich jedoch in Kultur
unbegrenzt teilen (z. B. HeLa-Zellen, 293-Zellen) und sind
aus diesem Grund von Nutzen für die Forschung und
industrielle Anwendung. Gewöhnlich werden solche
unsterblichen Zellinien von spontan entstehenden Tumoren
oder nach Transformation durch Exposition gegenüber
Strahlung oder einem Tumor-induzierenden Virus oder einer
Tumor-induzierenden Chemikalie erhalten. Leider steht nur
eine begrenzte Auswahl von Zellinien, insbesondere von
menschlichen Zellinien, die differenzierte Zellfunktion
zeigen, zur Verfügung. Darüber hinaus sind die zur Zeit
verfügbaren unsterblichen Zellinien durch chromosomale
Anomalien gekennzeichnet (z. B. Aneuploidie, Gen-
Rearrangements oder Mutationen). Ferner sind viele der
bereits lang etablierten Zellinien relativ undifferenziert
(z. B. stellen sie nicht solch hochspezialisierte Produkte
her, die für bestimmte Gewebe oder Organe einzigartig sind).
Es besteht somit ein Bedarf an neuen Verfahren zur Erzeugung
unsterblicher Zellen, insbesondere menschlicher Zellen. Eine
Verwendung von immortalisierten Zellen bezieht sich auf die
Herstellung von natürlichen Proteinen und rekombinanten
Proteinen (z. B. therapeutische Polypeptide) oder Antikörper,
für die eine stabile genetisch normale Zellinie bevorzugt
wird. Für die Herstellung einiger rekombinanter Proteine
können auch spezialisierte Zelltypen bevorzugt werden (z. B.
Pankreaszellen für die Herstellung von menschlichem
Insulin). Eine weitere Verwendungsmöglichkeit für
immortalisierte Zellen ist die Einführung in einen Patienten
für eine Gentherapie oder für den Austausch von erkrankten
oder beschädigten Zellen oder Gewebe. Beispielsweise können
autologe Immunzellen, die beispielsweise ein
erfindungsgemäßes rekombinantes hTRT-Gen oder Polypeptid
enthalten oder exprimieren für einen Zellaustausch in einem
Patienten nach einer aggressiven Krebstherapie,
beispielsweise nach der Bestrahlung des gesamten Körpers,
verwendet werden. Eine weitere Verwendungsmöglichkeit für
immortalisierte Zellen besteht in der ex vivo-Herstellung
von "künstlichen" Geweben oder Organen (z. B. Haut) für eine
therapeutische Anwendung. Eine weitere Verwendung solcher
Zellen besteht im Screenen nach Wirkstoffen oder der
Bestätigung der Wirkung von Wirkstoffen, beispielsweise
Telomerase-hemmenden Wirkstoffen, oder bei der Herstellung
von Vakzinen. Für den Fachmann sind weitere
Verwendungsmöglichkeiten der erfindungsgemäßen Zellen
offensichtlich.
Die erfindungsgemäßen immortalisierten Zellen und Zellinien
sowie solche mit lediglich erhöhter Replikationsfähigkeit
werden durch Steigerung von Telomerase-Aktivität in der
Zelle erzeugt. Es kann dabei jedes hier beschriebene
Verfahren zur Steigerung von Telomerase-Aktivität angewendet
werden. Somit werden in einer Ausführungsform Zellen durch
Steigerung der Menge an hTRT-Polypeptid in der Zelle
immortalisiert. In einer Ausführungsform wird der hTRT-Spie
gel durch Einführung eines hTRT-Expressionsvektors in
die Zelle (wobei gelegentlich eine stabile Transfektion
bevorzugt wird) erhöht. Wie bereits vorstehend diskutiert
ist die hTRT-codierende Sequenz normalerweise mit einem
Promotor funktionell verknüpft, der in der Zelle induzierbar
oder konstitutiv aktiv sein kann.
In einer Ausführungsform umfaßt ein Polynucleotid eine
Sequenz, die ein Polypeptid der SEQ. ID. Nr. 2 umfaßt, wobei
die Sequenz mit einem Promotor (z. B. einem konstitutiv
exprimierten Promotor, z. B. eine Sequenz von SEQ. ID. Nr. 6
(Fig. 6)) funktionell verknüpft ist und wobei das
Polynucleotid in die Zelle eingeführt wird. In einer
Ausführungsform umfaßt das Polynucleotid eine Sequenz von
SEQ. ID. Nr. 1. Vorzugsweise enthält das Polynucleotid
Polyadenylierungs- und Terminationssignale. In weiteren
Ausführungsformen sind zusätzliche Elemente, wie Enhancer
oder solche wie sie vorstehend diskutiert wurden, enthalten.
In einer alternativen Ausführungsform enthält das
Polynucleotid keine Promotorsequenz, wobei dann eine solche
Sequenz durch das endogene Genom der Zielzelle nach
Integration (z. B. durch Rekombination, z. B. homologe
Rekombination) des eingeführten Polynucleotids
bereitgestellt wird. Das Polynucleotid kann durch jedes
beliebige Verfahren in die Zielzelle eingeführt werden, dazu
zählen die hier beschriebenen Verfahren (wie beispielsweise
Lipofektion, Elektroporation, Virosome, Liposome,
Immunliposome, Polykation/Nucleinsäure-Konjugate, nackte
DNA).
Unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren kann eine
beliebige Vertebraten-Zelle dazu gebracht werden, eine
gesteigerte Proliferationsfähigkeit zu zeigen oder sogar
immortalisiert zu sein und in Kultur unbegrenzt erhalten zu
bleiben. In einer Ausführungsform sind die Zellen
Säugerzellen, wobei für viele Anwendungen menschliche Zellen
bevorzugt sind. Zu den menschlichen Zellen, die
immortalisiert werden können, gehören die in Auflistung 1
aufgezählten Zellen.
Natürlich können die nachstehend beschriebenen
erfindungsgemäßen "diagnostischen" Assays dazu verwendet
werden, um die erfindungsgemäßen immortalisierten Zellen zu
identifizieren und zu charakterisieren.
Hornbildende Epithel-Zellen
Keratinocyten der Epidermis (sich differenzierende Epidermiszellen)
Basalzellen der Epidermis (Stammzellen)
Keratinocyten der Fingernägel und Zehennägel
Basalzellen des Nagelbetts (Stammzellen)
Zellen des Haarschafts
medulläre, kortikale, kutikuläre Zellen; Zellen der Haarwurzelscheide, kutikuläre Zellen, Zellen der Huxley- Schicht, externe Zellen der Henle-Schicht; Haarkeimzellen (Stammzellen).
Keratinocyten der Epidermis (sich differenzierende Epidermiszellen)
Basalzellen der Epidermis (Stammzellen)
Keratinocyten der Fingernägel und Zehennägel
Basalzellen des Nagelbetts (Stammzellen)
Zellen des Haarschafts
medulläre, kortikale, kutikuläre Zellen; Zellen der Haarwurzelscheide, kutikuläre Zellen, Zellen der Huxley- Schicht, externe Zellen der Henle-Schicht; Haarkeimzellen (Stammzellen).
Oberflächen-Epithelzellen des mehrschichtigen
Plattenepithels der Zunge, der Mundhöhle, der Speiseröhre,
des Analkanals, der distalen Harnröhre, der Vagina
Basalzellen dieser Epithele (Stammzellen)
Zellen des äußeren Hornhautepithels
Zellen des Harnepithels (das die Blase und die Harnleiter auskleidet).
Basalzellen dieser Epithele (Stammzellen)
Zellen des äußeren Hornhautepithels
Zellen des Harnepithels (das die Blase und die Harnleiter auskleidet).
Zellen der Speicheldrüsen
schleimsezernierende Zellen (Sekret reich an Polysacchariden)
seröse Drüsenzellen (Sekret reich an Glycoproteinenzymen)
Zellen der von Ebner-Drüsen in der Zunge (Sekret umspült die Geschmacksknospen)
Zellen der Brustdrüse, sezernieren Milch
Zellen der Tränendrüse, sezernieren Tränen
Zellen der Zeruminaldrüse des Ohres, sezernieren Zerumen
Zellen der ekkrinen Schweißdrüsen, sezernieren Glycoproteine (dunkle Zellen)
Zellen der ekkrinen Schweißdrüsen, sezernieren kleine Moleküle (helle Zellen)
Zellen der apokrinen Schweißdrüsen (Duftsekret, Geschlechtshormon-sensitiv)
Zellen der Moll-Drüsen im Augenlid (spezialisierte Schweißdrüse)
Zellen der Talgdrüsen, sezernieren Lipid-reiches Sebum
Zellen der Bowman-Drüsen in der Nase (Sekret umspült das Riechepithel)
Zellen der Brunner-Drüsen im Duodenum, sezernieren alkalische Lösung bestehend aus Schleim und Enzymen
Zellen der Samenblase, sezernieren Bestandteile der Samenflüssigkeit einschließlich Fructose (als Treibstoff für darin schwimmende Spermien)
Zellen der Vorsteherdrüse, sezernieren andere Bestandteile der Samenflüssigkeit
Zellen der Bulbourethraldrüse, sezernieren Schleim
Zellen der Bartholin-Drüse, sezernieren Vaginalsekret
Zellen der Littre-Drüse, sezernieren Schleim
Zellen der Uterusschleimhaut, sezernieren vornehmlich Kohlenhydrate
isolierte Becherzellen des Atmungs- und Verdauungstrakts, sezernieren Schleim
schleimsezernierende Zellen der Magenschleimhaut
Hauptzellen der Magendrüsen, sezernieren Pepsinogen
Parietalzellen der Magendrüsen, sezernieren HCl
Acinuszellen der Bauchspeicheldrüse, sezernieren Verdauungsenzyme und Bicarbonat
Paneth-Zellen des Dünndarms, sezernieren Lysozym
Typ-II-Alveolarzellen der Lunge, sezernieren Surfactant
Clara-Zellen der Lunge.
schleimsezernierende Zellen (Sekret reich an Polysacchariden)
seröse Drüsenzellen (Sekret reich an Glycoproteinenzymen)
Zellen der von Ebner-Drüsen in der Zunge (Sekret umspült die Geschmacksknospen)
Zellen der Brustdrüse, sezernieren Milch
Zellen der Tränendrüse, sezernieren Tränen
Zellen der Zeruminaldrüse des Ohres, sezernieren Zerumen
Zellen der ekkrinen Schweißdrüsen, sezernieren Glycoproteine (dunkle Zellen)
Zellen der ekkrinen Schweißdrüsen, sezernieren kleine Moleküle (helle Zellen)
Zellen der apokrinen Schweißdrüsen (Duftsekret, Geschlechtshormon-sensitiv)
Zellen der Moll-Drüsen im Augenlid (spezialisierte Schweißdrüse)
Zellen der Talgdrüsen, sezernieren Lipid-reiches Sebum
Zellen der Bowman-Drüsen in der Nase (Sekret umspült das Riechepithel)
Zellen der Brunner-Drüsen im Duodenum, sezernieren alkalische Lösung bestehend aus Schleim und Enzymen
Zellen der Samenblase, sezernieren Bestandteile der Samenflüssigkeit einschließlich Fructose (als Treibstoff für darin schwimmende Spermien)
Zellen der Vorsteherdrüse, sezernieren andere Bestandteile der Samenflüssigkeit
Zellen der Bulbourethraldrüse, sezernieren Schleim
Zellen der Bartholin-Drüse, sezernieren Vaginalsekret
Zellen der Littre-Drüse, sezernieren Schleim
Zellen der Uterusschleimhaut, sezernieren vornehmlich Kohlenhydrate
isolierte Becherzellen des Atmungs- und Verdauungstrakts, sezernieren Schleim
schleimsezernierende Zellen der Magenschleimhaut
Hauptzellen der Magendrüsen, sezernieren Pepsinogen
Parietalzellen der Magendrüsen, sezernieren HCl
Acinuszellen der Bauchspeicheldrüse, sezernieren Verdauungsenzyme und Bicarbonat
Paneth-Zellen des Dünndarms, sezernieren Lysozym
Typ-II-Alveolarzellen der Lunge, sezernieren Surfactant
Clara-Zellen der Lunge.
Zellen des Hypophysenvorderlappens, sezernieren
Wachstumshormon, Follikel-stimulierendes Hormon,
luteinisierendes Hormon, Prolactin, adrenocorticotropes
Hormon und thyreotropes Hormon
Zellen des Hypophysenmittellappens, sezernieren melanocytenstimulierendes Hormon
Zellen des Hypophysenhinterlappens, sezernieren Oxytocin, Vasopressin
Zellen des Intestinums, sezernieren Serotonin, Endorphin, Somatostatin, Gastrin, Sekretin, Cholecystokinin, Insulin und Glucagon
Zellen der Schilddrüse, sezernieren Schilddrüsenhormon, Calcitonin
Zellen der Nebenschilddrüse, sezernieren Parathormon, oxyphile Zellen
Zellen der Nebenniere, sezernieren Epinephrin, Norepinephrin und Steroidhormone Mineralocorticoide, Glucocorticoide
Zellen der Gonaden, sezernieren Testosteron (Leydig-Zellen der Hoden)
Östrogen (innere Thekazellen des Eifollikels)
Progesteron (Gelbkörperzellen des geborstenen Eifollikels)
Zellen des juxtaglomerulären Apparats der Niere
juxtaglomeruläre Zellen (sezernieren Renin)
Macula-densa-Zellen
peripolare Zellen
Mesangialzellen.
Zellen des Hypophysenmittellappens, sezernieren melanocytenstimulierendes Hormon
Zellen des Hypophysenhinterlappens, sezernieren Oxytocin, Vasopressin
Zellen des Intestinums, sezernieren Serotonin, Endorphin, Somatostatin, Gastrin, Sekretin, Cholecystokinin, Insulin und Glucagon
Zellen der Schilddrüse, sezernieren Schilddrüsenhormon, Calcitonin
Zellen der Nebenschilddrüse, sezernieren Parathormon, oxyphile Zellen
Zellen der Nebenniere, sezernieren Epinephrin, Norepinephrin und Steroidhormone Mineralocorticoide, Glucocorticoide
Zellen der Gonaden, sezernieren Testosteron (Leydig-Zellen der Hoden)
Östrogen (innere Thekazellen des Eifollikels)
Progesteron (Gelbkörperzellen des geborstenen Eifollikels)
Zellen des juxtaglomerulären Apparats der Niere
juxtaglomeruläre Zellen (sezernieren Renin)
Macula-densa-Zellen
peripolare Zellen
Mesangialzellen.
Bürstensaumzellen des Intestinums (mit Kleinzotten)
mehrschichtige Ductuszellen exokriner Drüsen
Gallenblasen-Epithelzellen
Bürstensaumzellen des proximalen Tubulus der Niere
distale Tubuluszellen der Niere
nicht-bewimperte Zellen des Ductulus efferens
Nebenhoden-Hauptzellen
Nebenhoden-Basalzellen.
mehrschichtige Ductuszellen exokriner Drüsen
Gallenblasen-Epithelzellen
Bürstensaumzellen des proximalen Tubulus der Niere
distale Tubuluszellen der Niere
nicht-bewimperte Zellen des Ductulus efferens
Nebenhoden-Hauptzellen
Nebenhoden-Basalzellen.
Hepatocyten (Leberzellen)
Fettzellen
weiße Fettzellen
braune Fettzellen
Lipocyten der Leber.
Fettzellen
weiße Fettzellen
braune Fettzellen
Lipocyten der Leber.
Typ-I-Pneumocyten (kleiden den Luftraum der Lunge aus)
Pankreasgangzellen (zentroazinäre Zellen)
nicht-mehrschichtige Ductuszellen der Schweißdrüse, der Speicheldrüse, der Brustdrüse
Parietalzellen des Nierenglomerulus
Podocyten des Nierenglomerulus
Zellen des dünnen Segments der Henle-Schleife (in der Niere)
Sammelrohrzellen (in der Niere)
Ductuszellen der Samenblase, Vorsteherdrüse.
Pankreasgangzellen (zentroazinäre Zellen)
nicht-mehrschichtige Ductuszellen der Schweißdrüse, der Speicheldrüse, der Brustdrüse
Parietalzellen des Nierenglomerulus
Podocyten des Nierenglomerulus
Zellen des dünnen Segments der Henle-Schleife (in der Niere)
Sammelrohrzellen (in der Niere)
Ductuszellen der Samenblase, Vorsteherdrüse.
vasculäre Endothelzellen der Blutgefäße und der Lymphgefäße
fenestrierte Zellen
kontinuierliche Zellen
Milzzellen
Synovialzellen (kleiden die Gelenkhöhlen aus, sezernieren vornehmlich Hyaluronsäure)
Serosazellen (kleiden die Peritoneal-, Pleura- und Perikardhöhle aus)
Plattenepithelzellen, die den perilymphatischen Raum des Ohrs auskleiden
Zellen, die den endolymphatischen Raum des Ohrs auskleiden
Plattenepithelzellen
hochprismatische Epithelzellen des Saccus endolymphaticus
mit Kleinzotten
ohne Kleinzotten
"dunkle" Zellen
Zellen der Reissner-Membran (die den Zellen des Plexus choroideus ähneln)
vaskuläre Stria-Basalzellen
vaskuläre Stria-von-Ebner-Halbmond-Zellen
Claudius-Zellen
Böttcher-Zellen
Plexus-choroideus-Zellen (sezernieren Gehirn- und Rückenmarksflüssigkeit)
Plattenepithelzellen der weichen Hirn- und Rückenmarkshaut
Ziliarepithelzellen des Auges
pigmenthaltige Zellen
nicht-pigmenthaltige Zellen
Zellen des inneren Korneaepithels.
fenestrierte Zellen
kontinuierliche Zellen
Milzzellen
Synovialzellen (kleiden die Gelenkhöhlen aus, sezernieren vornehmlich Hyaluronsäure)
Serosazellen (kleiden die Peritoneal-, Pleura- und Perikardhöhle aus)
Plattenepithelzellen, die den perilymphatischen Raum des Ohrs auskleiden
Zellen, die den endolymphatischen Raum des Ohrs auskleiden
Plattenepithelzellen
hochprismatische Epithelzellen des Saccus endolymphaticus
mit Kleinzotten
ohne Kleinzotten
"dunkle" Zellen
Zellen der Reissner-Membran (die den Zellen des Plexus choroideus ähneln)
vaskuläre Stria-Basalzellen
vaskuläre Stria-von-Ebner-Halbmond-Zellen
Claudius-Zellen
Böttcher-Zellen
Plexus-choroideus-Zellen (sezernieren Gehirn- und Rückenmarksflüssigkeit)
Plattenepithelzellen der weichen Hirn- und Rückenmarkshaut
Ziliarepithelzellen des Auges
pigmenthaltige Zellen
nicht-pigmenthaltige Zellen
Zellen des inneren Korneaepithels.
des Atmungstrakts
der Eileiter und der Gebärmutterschleimhaut (bei der Frau)
des Haller-Netzes und des Ductulus efferens (beim Mann)
des zentralen Nervensystems (Ependymzellen, die die Hirnhöhle auskleiden).
der Eileiter und der Gebärmutterschleimhaut (bei der Frau)
des Haller-Netzes und des Ductulus efferens (beim Mann)
des zentralen Nervensystems (Ependymzellen, die die Hirnhöhle auskleiden).
Epithelzellen:
Ameloblasten (sezernieren den Zahnschmelz)
Ebner-Halbmondzellen des Gleichgewichtsorgans des Ohrs (sezernieren Proteoglycan)
Interdentalzellen des Corti-Organs (sezernieren Membrana tectoria, die die Haarzellen des Corti-Organs bedeckt)
Nichtepithelzellen (Bindegewebe)
Fibroblasten (verschiedene Fibroblasten des lockeren Bindegewebes, der Kornea, der Sehnen, des retikulären Bindegewebes des Knochenmarks, etc.)
Pericyten der Blutkapillaren
Nucleus-pulposus-Zellen der Bandscheibe
Cementoblasten/Cementocyten (sezernieren knochenartigen Zementum der Zahnwurzel)
Odontoblasten/Odontocyten (sezernieren das Zahndentin) Chondrocyten
Hyalinknorpel, Faserknorpel, elastische Knorpel
Osteoblasten/Osteocyten
Osteoprogenitorzellen (Stammzellen der Osteoblasten)
Hyalocyten des Glaskörpers des Auges
Sternzellen dem perilymphatischen Raums des Ohres.
Ameloblasten (sezernieren den Zahnschmelz)
Ebner-Halbmondzellen des Gleichgewichtsorgans des Ohrs (sezernieren Proteoglycan)
Interdentalzellen des Corti-Organs (sezernieren Membrana tectoria, die die Haarzellen des Corti-Organs bedeckt)
Nichtepithelzellen (Bindegewebe)
Fibroblasten (verschiedene Fibroblasten des lockeren Bindegewebes, der Kornea, der Sehnen, des retikulären Bindegewebes des Knochenmarks, etc.)
Pericyten der Blutkapillaren
Nucleus-pulposus-Zellen der Bandscheibe
Cementoblasten/Cementocyten (sezernieren knochenartigen Zementum der Zahnwurzel)
Odontoblasten/Odontocyten (sezernieren das Zahndentin) Chondrocyten
Hyalinknorpel, Faserknorpel, elastische Knorpel
Osteoblasten/Osteocyten
Osteoprogenitorzellen (Stammzellen der Osteoblasten)
Hyalocyten des Glaskörpers des Auges
Sternzellen dem perilymphatischen Raums des Ohres.
Skelettmuskelzellen
rote Zellen (langsam)
weiße Zellen (schnell)
intermediäre Zellen
Kernhaufenzellen der Muskelspindel
Kernkettenzellen der Muskelspindel
Satellitenzellen (Stammzellen)
Herzmuskelzellen
normale Zellen
Knotenzellen
Purkinje-Faserzellen
Zellen der glatten Muskulatur
Myoepithelzellen
der Iris
der exokrinen Drüsen.
rote Zellen (langsam)
weiße Zellen (schnell)
intermediäre Zellen
Kernhaufenzellen der Muskelspindel
Kernkettenzellen der Muskelspindel
Satellitenzellen (Stammzellen)
Herzmuskelzellen
normale Zellen
Knotenzellen
Purkinje-Faserzellen
Zellen der glatten Muskulatur
Myoepithelzellen
der Iris
der exokrinen Drüsen.
rote Blutkörperchen
Megakaryocyten
Makrophagen
Monocyten
Makrophagen des Bindegewebes (verschiedene Arten)
Langerhans-Zellen (in der Epidermis)
Osteoklasten (im Knochen)
dendritische Zellen (im Lymphgewebe)
Mikrogliazellen (im zentralen Nervensystem)
Neutrophile
Eosinophile
Basophile
Mastzellen
T-Lymphocyten
T-Helferzellen
T-Suppressorzellen
zytotoxische T-Zellen
B-Lymphocyten
IgM
IgG
IgA
IgE
Killerzellen
Stammzellen für das Blut- und Immunsystem (verschiedene Arten).
Megakaryocyten
Makrophagen
Monocyten
Makrophagen des Bindegewebes (verschiedene Arten)
Langerhans-Zellen (in der Epidermis)
Osteoklasten (im Knochen)
dendritische Zellen (im Lymphgewebe)
Mikrogliazellen (im zentralen Nervensystem)
Neutrophile
Eosinophile
Basophile
Mastzellen
T-Lymphocyten
T-Helferzellen
T-Suppressorzellen
zytotoxische T-Zellen
B-Lymphocyten
IgM
IgG
IgA
IgE
Killerzellen
Stammzellen für das Blut- und Immunsystem (verschiedene Arten).
Photorezeptorzellen
Stäbchenzellen
Zapfenzellen
blau-empfindliche Zellen
grün-empfindliche Zellen
rot-empfindliche Zellen
Zellen des Hörorgans
innere Haarzelle des Corti-Organs
äußere Haarzelle des Corti-Organs
Zellen zur Wahrnehmung von Beschleunigung und Schwerkraft
Typ-I-Haarzellen des Gleichgewichtsorgans des Ohrs
Typ-II-Haarzellen des Gleichgewichtsorgans des Ohrs
Geschmackszellen
Typ-II-Geschmacksknospenzellen
Zellen zur Wahrnehmung von Gerüchen
Riechneuronen
Basalzellen des Riechepithels (Stammzellen für Riechneuronen)
Zellen zur Bestimmung des pH-Wertes des Bluts
Karotiskörperzellen
Typ-I-Zellen
Typ-II-Zellen
Zellen zur Wahrnehmung von Berührungen
Merkelzellen der Epidermis
primäre sensible Neuronen, auf Wahrnehmung von Berührungen spezialisiert
Zellen zur Wahrnehmung von Temperatur
primäre sensible Neuronen, auf Wahrnehmung von Temperatur spezialisiert
Kälte-empfindliche Zellen
Wärme-empfindliche Zellen
Zellen zur Wahrnehmung von Schmerz
primäre sensible Neuronen, auf Wahrnehmung von Schmerz spezialisiert
Strukturen und Kräfte im Bewegungsapparat
proprioceptive primäre sensible Neuronen.
Stäbchenzellen
Zapfenzellen
blau-empfindliche Zellen
grün-empfindliche Zellen
rot-empfindliche Zellen
Zellen des Hörorgans
innere Haarzelle des Corti-Organs
äußere Haarzelle des Corti-Organs
Zellen zur Wahrnehmung von Beschleunigung und Schwerkraft
Typ-I-Haarzellen des Gleichgewichtsorgans des Ohrs
Typ-II-Haarzellen des Gleichgewichtsorgans des Ohrs
Geschmackszellen
Typ-II-Geschmacksknospenzellen
Zellen zur Wahrnehmung von Gerüchen
Riechneuronen
Basalzellen des Riechepithels (Stammzellen für Riechneuronen)
Zellen zur Bestimmung des pH-Wertes des Bluts
Karotiskörperzellen
Typ-I-Zellen
Typ-II-Zellen
Zellen zur Wahrnehmung von Berührungen
Merkelzellen der Epidermis
primäre sensible Neuronen, auf Wahrnehmung von Berührungen spezialisiert
Zellen zur Wahrnehmung von Temperatur
primäre sensible Neuronen, auf Wahrnehmung von Temperatur spezialisiert
Kälte-empfindliche Zellen
Wärme-empfindliche Zellen
Zellen zur Wahrnehmung von Schmerz
primäre sensible Neuronen, auf Wahrnehmung von Schmerz spezialisiert
Strukturen und Kräfte im Bewegungsapparat
proprioceptive primäre sensible Neuronen.
cholinerge Neuronen
adrenerge Neuronen
peptiderge Neuronen
adrenerge Neuronen
peptiderge Neuronen
Stützzellen des Corti-Organs
innere Pfeilerzellen
äußere Pfeilerzellen
innere Phalangealzellen
äußere Phalangealzellen
Grenzzellen
Hensen-Zellen
Stützzellen des Gleichgewichtsorgans
Stützzellen der Geschmacksknospen (Typ-I-Ge schmacksknospenzellen)
Stützzellen des Riechepithels
Schwann-Zellen
Satellitenzellen (umschließen die peripheren Nervenzellen)
Darm-Gliazellen.
innere Pfeilerzellen
äußere Pfeilerzellen
innere Phalangealzellen
äußere Phalangealzellen
Grenzzellen
Hensen-Zellen
Stützzellen des Gleichgewichtsorgans
Stützzellen der Geschmacksknospen (Typ-I-Ge schmacksknospenzellen)
Stützzellen des Riechepithels
Schwann-Zellen
Satellitenzellen (umschließen die peripheren Nervenzellen)
Darm-Gliazellen.
Neuronen
Gliazellen
Astrocyten
Oligodendrocyten.
Gliazellen
Astrocyten
Oligodendrocyten.
Epithelzellen der Vorderlinse
Linsenfaserzellen (Kristallin-enthaltende Zellen).
Linsenfaserzellen (Kristallin-enthaltende Zellen).
Melanocyten
pigmenthaltige Epithelzellen der Netzhaut.
pigmenthaltige Epithelzellen der Netzhaut.
Oogonium, Oocyten
Spermatocyten
Spermatogonium (Stammzellen für Spermatocyten).
Spermatocyten
Spermatogonium (Stammzellen für Spermatocyten).
Eifollikelzellen
Sertolizellen (in den Hoden)
Thymus-Epithelzellen.
Sertolizellen (in den Hoden)
Thymus-Epithelzellen.
embryonale Stammzellen
embryonale Keimzellen
Stammzellen des Erwachsenen
fötale Stammzellen.
embryonale Keimzellen
Stammzellen des Erwachsenen
fötale Stammzellen.
Die vorliegende Erfindung stellt eine große Anzahl von
Assays für TRT, vorzugsweise hTRT, und Telomerase bereit.
Diese Assays liefern unter anderem die Basis für
empfindliche, preiswerte, leicht zu handhabende und in einem
weiten Bereich anwendbare Assays für die Diagnose und
Prognose einer Reihe von menschlichen Erkrankungen, zu denen
als veranschaulichendes Beispiel Krebs zählt. Wie bereits
vorstehend angemerkt, ist die Menge an hTRT-Genprodukten
(Protein und mRNA) in unsterblichen menschlichen Zellen im
Vergleich zu den meisten normalen sterblichen Zellen (d. h.
Telomerase-negative Zellen und die meisten Telomerase
positiven normalen somatischen Zellen von Erwachsenen)
gewöhnlich erhöht. Somit besteht ein Aspekt der Einfügung in
der Bereitstellung von Assays, die zum Nachweis unter der
Bestimmung der Anwesenheit, des Fehlens oder der Menge eines
hTRT-Genprodukts in einer Probe, um so die Zellen als
unsterblich (beispielsweise eine maligne Tumorzelle),
sterblich (wie beispielsweise die meisten somatischen Zellen
in Erwachsenen), als Telomerase-positiv oder Telomerase
negativ charakterisieren zu können, wobei die Probe von
menschlichen oder anderen Säugerzellen oder eukaryotischen
Zellen stammt oder diese enthält.
Jeder Zustand, der durch die Anwesenheit oder das Fehlen
eines hTRT-Genprodukts (d. h. Protein oder RNA)
gekennzeichnet ist, kann unter Verwendung der hier
beschriebenen Verfahren und Substanzen diagnostiziert
werden. Zu diesen gehören, so wie dies ausführlicher
nachstehend beschrieben wird, Krebserkrankungen, andere mit
beschleunigter Zellproliferation einhergehende Erkrankungen,
immunologische Funktionsstörungen, Fruchtbarkeit,
Unfruchtbarkeit etc. Da das Ausmaß, in dem Telomerase-
Aktivität in Krebszellen erhöht ist, mit den Merkmalen des
Tumors, beispielsweise dem Potential zur Metastasenbildung,
korreliert, kann durch Überwachung der hTRT-, mRNA- oder
Protein-Spiegel die wahrscheinliche zukünftige Entwicklung
eines Tumors abgeschätzt und vorhergesagt werden.
In einem Aspekt gehört zu den erfindungsgemäßen
diagnostischen und prognostischen Verfahren die Bestimmung,
ob ein menschliches TRT-Genprodukt in einer biologischen
Probe (z. B. von einem Patienten) vorhanden ist. Ein zweiter
Aspekt betrifft die Bestimmung der Menge eines hTRT-Gen
produkts in einer biologischen Probe (z. B. von einem
Patienten) und den Vergleich mit der Menge in einer
Kontrollprobe (z. B. normale Zellen oder Gewebe). Ein dritter
Aspekt betrifft die Bestimmung der zellulären oder
intrazellulären Lokalisierung eines hTRT-Genprodukts in
einer Zell- oder Gewebeprobe. Ein vierter Aspekt betrifft
die Untersuchung von Wirtszellen (z. B. eines Patienten) zur
Identifizierung von Nucleinsäuren mit Sequenzen die
charakteristisch für eine vererbbare Neigung für eine
anormale hTRT-Genexpression sind (anormale Menge, Regulation
oder anormales Produkt), wobei dies von Nutzen ist beim
genetischen Screenen oder bei einer genetischen Beratung.
Ein fünfter Aspekt betrifft die Verwendung der
erfindungsgemäßen Assays zum Nachweis des Vorhandenseins von
anti-hTRT-Antikörpern (z. B. in Patientenserum). Die
ausführlicher nachstehend beschriebenen Verfahren stellen
nützliche Assays dar, die unter Verwendung der hier
beschriebenen Sequenzen und Zusammenhänge ausgeführt werden
können. Für den Fachmann sind natürlich zahlreiche
Variationen oder weitere Anwendungsmöglichkeiten dieser
Assays offensichtlich.
Zwar sind die vorstehend beschriebenen Assays im
Zusammenhang mit diagnostischen und prognostischen Verfahren
beschrieben, sie können jedoch immer dann verwendet werden,
wenn ein hTRT-Gen, Genprodukt oder eine Variante
nachgewiesen, quantifiziert oder charakterisiert werden
soll. Somit sind beispielsweise die nachstehend
beschriebenen "diagnostischen" Verfahren zur Untersuchung
von hTRT oder Telomerase während der Herstellung und
Reinigung von hTRT oder menschlicher Telomerase, für die
Charakterisierung von Zellinien, die von menschlichen Zellen
stammen (z. B. zur Identifizierung unsterblicher Linien), für
die Charakterisierung von Zellen, Tieren, Pflanzen, Pilzen,
Bakterien oder anderen Organismen, die ein menschliches TRT-Gen
oder Genprodukt (oder Fragmente davon) enthalten, von
Netzen.
Der hier verwendete Ausdruck "diagnostisch" besitzt seine
normale Bedeutung, nämlich die Identifizierung der
Anwesenheit oder der Natur der Erkrankung (beispielsweise
Krebs), eines Zustands (z. B. unfruchtbar, aktiviert), eines
Status (z. B. fruchtbar) und der Ausdruck "prognostisch" hat
ebenfalls seine übliche Bedeutung, nämlich die Prognose der
wahrscheinlichen Entwicklung und/oder des Ausgangs einer
Erkrankung oder eines Zustands. Zwar werden diese beiden
Bezeichnungen in einem klinischen Umfeld gelegentlich auf
unterschiedliche Weise verwendet. Jeder der nachstehend
beschriebenen Assays oder Assayformate im Bezug auf
"Diagnose" ist gleichermaßen geeignet für das Stellen einer
Prognose, da es inzwischen klar ist, daß höhere Spiegel an
Telomerase-Aktivität mit einer schlechteren Prognose für
Krebspatienten in Zusammenhang stehen und da die vorliegende
Erfindung Nachweisverfahren bereitstellt, die für hTRT
spezifisch sind, das mit Konzentrationen exprimiert wird,
die mit Telomerase-Aktivität in einer Zelle eng korrelieren.
Die Bestimmung eines hTRT-Gens-, -mRNA- oder -Protein-
Spiegels der über dem normalen oder Standardbereich liegt,
zeigt die Anwesenheit von Telomerase-positiven Zellen oder
unsterblichen Zellen an, zu denen beispielsweise bestimmte
Tumorzellen zählen. Da bestimmte embryonale und fötale
Zellen sowie bestimmte "erwachsene" Stammzellen Telomerase
exprimieren, stellt die vorliegende Erfindung auch Verfahren
zur Bestimmung anderer Zustände wie z. B. Schwangerschaft,
durch den Nachweis oder die Isolierung von Telomerase
positiven fötalen Zellen aus dem Blut der Mutter. Diese
Werte können dazu verwendet werden, eine Diagnose zu
erstellen oder sie können bei der Erstellung einer Diagnose
hilfreich sein, selbst wenn die Zellen unter Verwendung
traditioneller Methoden nicht als krebsartig hätten
klassifiziert werden oder anderweitig nachgewiesen oder
klassifiziert werden können. Somit erlauben die
erfindungsgemäßen Verfahren den Nachweis oder die
Verifikation von krebsartigen oder anderen Zuständen, die
mit Telomerase assoziiert sind, mit erhöhter Zuverlässigkeit
und möglicherweise in einem früheren Stadium. Die
erfindungsgemäßen Assays erlauben die Unterscheidung
zwischen Klassen und Stadien von menschlichen Tumoren oder
anderen mit der Zellproliferation in Zusammenhang stehenden
Erkrankungen, dadurch, daß sie quantative Assays für das
hTRT-Gen und -Genprodukte bereitstellen und damit die Wahl
geeigneter Behandlungsvorgehensweisen sowie genaue Diagnosen
erleichtern. Da der Spiegel an Telomerase-Aktivität dazu
verwendet werden kann, um zwischen gutartigen und malignen
Tumoren zu unterscheiden (z. B. US-Patent Nr. 5,489,508 und
Hiyama et al., Proc. Am Ass. Cancer Res. 38 (1997), 637), um
das Bevorstehen einer Invasion vorherzusagen (z. B. US-Patent
Nr. 5,639,613 und Yashima et al., Proc. Am. Ass. Cancer Res.
38 (1997), 326) und um eine Korrelation mit dem Potential
zur Metastasenbildung herzustellen (z. B. US-Patent Nr.
5,648,215 und Pandita et al., Proc. Am Ass. Cancer Res. 37
(1996), 559), werden diese Assays darüber hinaus für die
Prophylaxe, den Nachweis und die Behandlung einer großen
Anzahl von menschlichen Krebsarten von Nutzen sein.
Für die Prognose von Krebserkrankungen (oder anderer
Erkrankungen oder Zustände, die durch eine erhöhte
Telomerase-Konzentration gekennzeichnet sind) wird ein
prognostischer Wert für ein hTRT-Genprodukt (mRNA oder
Protein) oder die Aktivität für einen bestimmten Tumortyp,
Tumorklasse oder ein Tumorstadium, wie nachstehend
beschrieben, bestimmt. Der Spiegel an hTRT-Protein oder
-mRNA oder Telomerase-Aktivität in einem Patienten, kann
beispielsweise unter Verwendung der hier beschriebenen
Assays bestimmt und mit dem prognostischen Spiegel
verglichen werden.
In Abhängigkeit von dem verwendeten Assay wird in einigen
Fällen die Häufigkeit eines hTRT-Genprodukts in einer Probe
als erhöht angesehen werden, wann immer es durch den Assay
nachweisbar ist. Aufgrund der geringen Menge von hTRT-mRNA
und Protein selbst in Telomerase-positiven Zellen und der
Seltenheit oder des Fehlens dieser Genprodukte in normalen
oder Telomerase-negativen Zellen sind empfindliche Assays
erforderlich, um nachweisen zu können, ob die hTRT-Gen
produkte überhaupt in normalen Zellen vorhanden sind.
Wenn weniger empfindliche Assays ausgewählt werden, werden
zwar hTRT-Genprodukte in gesundem Gewebe nicht nachweisbar
sein, jedoch in Telomerase-positivem Krebs- oder bei anderen
Telomerase-positiven Zellen. Typischerweise beträgt die
Menge eines hTRT-Genprodukts in einer Probe mit einer
erhöhten Konzentration mindestens etwa das 5fache, häufiger
mindestens etwa das 10fache, noch häufiger mindestens das
50fache und sehr oft mindestens das etwa 100- bis 1000fache
im Vergleich zum Spiegel von Telomerase-negativen
Kontrollzellen oder Zellen von gesunden Geweben eines
Erwachsenen, wobei der Prozentsatz von Telomerase-positiv
normalen Zellen sehr gering ist.
Die erfindungsgemäßen diagnostischen und prognostischen
Verfahren können bei jeder Zelle oder jedem Gewebetyp jeden
Ursprungs verwendet werden und sie können zum Nachweis einer
unsterblichen oder neoplastischen Zelle, eines Tumorgewebes
oder eines Krebses jeden Ursprungs verwendet werden. Zu den
Krebsarten, die nachgewiesen werden können, zählen, jedoch
ohne Beschränkung darauf, all jene, die hinsichtlich der
Diskussion der therapeutischen Anwendung von hTRT vorstehend
aufgezählt wurden.
Die erfindungsgemäßen Assays sind darüber hinaus zur
Überwachung der Wirksamkeit einer therapeutischen
Intervention in Patienten, die wegen einer Krebserkrankung
behandelt werden, von Nutzen. Zu den Behandlungen von Krebs,
die überwacht werden können, gehören alle gegenwärtig
empfohlenen Therapieformen (einschließlich Chemotherapie
Bestrahlungstherapie und chirurgische Maßnahmen) und dazu
zählen auch zukünftige Behandlungen, beispielsweise die hier
beschriebenen Therapien, die sich auf die Hemmung oder
Aktivierung von Telomerase beziehen (siehe beispielsweise
PCT-Veröffentlichung Nr. 96/01835 und 96/40868 und US-Patent
Nr. 5,583,016; sowie auch US-Patentanmeldungen mit der
Serien Nr. 08/472,802 und 08/482,115, die beide am 7. Juni
1995 eingereicht wurden; 08/521,634, eingereicht am 1.
August 1995; 08/714,482, eingereicht am 16. September 1996
und 08/770,564 und 08/770,565, die beide am 20. Dezember
1996 eingereicht wurden, wobei all diese Dokumente aufgrund
der Bezugnahme in ihrer Gesamtheit als Bestandteil dieser
Beschreibung angesehen werden können).
In einem weiteren Aspekt sind die nachstehend beschriebenen
Assays für den Nachweis bestimmter Variationen in der hTRT-Gen
sequenz (Mutationen und vererbbare hTRT-Allele) von
Nutzen, die eine Prädisposition für Krebserkrankungen oder
andere Zustände anzeigt, die mit einer anormalen Regulation
der Telomerase-Aktivität assoziiert sind (Unfruchtbarkeit,
vorzeitiges Altern).
Zusätzlich zu der Diagnose von Krebserkrankungen haben die
erfindungsgemäßen Assays zahlreiche weitere
Anwendungsmöglichkeiten. Die vorliegende Erfindung stellt
Reagenzien und Verfahren zur Diagnose von Zuständen oder
Erkrankungen bereit, die durch eine Unter- oder
Überexpression von Telomerase oder hTRT-Genprodukten in
Zellen charakterisiert sind. In Erwachsenen wird ein
niedriger Spiegel an Telomerase-Aktivität normalerweise bei
einer begrenzten Art von normalen menschlichen somatischen
Zellen gefunden, beispielsweise Stammzellen, aktivierten
Lymphocyten und Keimzellen. Die Telomerase-Aktivität fehlt
bei anderen somatischen Zellen. Somit ist der Nachweis von
hTRT oder Telomerase-Aktivität in Zellen, in denen diese
normalerweise fehlen oder inaktiv sind, oder der Nachweis
eines anormalen Spiegels (d. h. eines höheren oder
niedrigeren im Vergleich zum normalen) in Zellen, in denen
hTRT normalerweise nur mit einem niedrigen Spiegel vorhanden
ist (wie beispielsweise Stammzellen, aktivierte Lymphocyten
und Keimzellen) ein diagnostisches Anzeichen für eine mit
Telomerase in Zusammenhang stehende Erkrankung oder einen
Zustand. Dieser Nachweis kann auch zur Identifizierung oder
Isolierung spezifischer Zelltypen verwendet werden. Zu den
Beispielen für solche Erkrankungen und Zustände gehören:
Erkrankungen bezüglich der Zellproliferation, immunologische
Funktionsstörungen, Unfruchtbarkeit, Erkrankungen
hinsichtlich der Immunzellfunktion, Schwangerschaft, fötale
Anormalität, vorzeitige Alterung etc. Darüber hinaus sind
die erfindungsgemäßen Assays zur Überwachung der Wirksamkeit
einer therapeutischen Intervention (wozu, ohne Beschränkung
darauf, Wirkstoffe gehören, die Telomerase-Aktivität
modulieren) bei einem Patienten oder in einem Assay, der auf
Zellen oder einem Tier basiert. Ein Aspekt der Erfindung
betrifft die Bereitstellung von Assays, die zur Diagnose von
Unfruchtbarkeit von Nutzen sind. Menschliche Keimzellen
(z. B. Stammsamenzellen, Vorläufer oder Nachkommen) können
unbegrenzt proliferieren und sind durch eine hohe
Telomerase-Aktivität gekennzeichnet. Anormale oder
verringerte Spiegel an hTRT-Genprodukten oder anormale
Produkte können zu einer unzulänglichen oder anormalen
Produktion von Spermatozoen führen, was zu Unfruchtbarkeit
oder Funktionsstörungen hinsichtlich der Reproduktion führt.
Somit stellt die Erfindung Assays (Verfahren und Reagenzien)
zur Diagnose und Behandlung von auf "Telomerase-basierenden"
Funktionsstörungen bezüglich der Produktion bereit. Bei
einer ähnlichen Anwendung können die Assays zur Überwachung
der Wirksamkeit von Empfängnisverhütungsmitteln (z. B.
Empfängnisverhütungsmittel für Männer bzw. männliche Tiere)
verwendet werden, die gegen die Spermaproduktion als Ziel
gerichtet sind oder diese indirekt beeinflussen (und die den
hTRT-Spiegel oder Telomerase-Aktivität reduzieren sollen).
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die
Bereitstellung von Assays zur Analyse der Telomerase- und
hTRT-Spiegel und deren Funktion in Stammzellen, fötalen
Zellen, embryonalen Zellen, aktivierten Lymphocyten und
hämatopoetischen Stammzellen. Beispielsweise können Assays
für den Nachweis von hTRT-Genprodukten zur allgemeinen
Überwachung der Immunfunktion verwendet werden (z. B. zur
Überwachung des Vorherrschens aktivierter Lymphocyten oder
des gehäuften Auftretens von Vorläufer-Stammzellen), um
aktivierte Lymphocyten oder Stammzellen zu identifizieren,
auszuwählen oder zu isolieren, basierend auf erhöhten hTRT-Spie
geln, und um die Wirksamkeit von therapeutischen
Interventionen, die gegen diese Gewebe als Ziel gerichtet
sind, zu überwachen (z. B. immunsuppressive Agenzien oder
therapeutische Bemühungen, eine Stammzellpopulation zu
vergrößern).
Die Erfindung stellt auch Assays zur Verfügung, die für die
Identifizierung von anti-Telomerase- und anti-TRT-Immun
globulinen (die im Serum eines Patienten gefunden
werden) von Nutzen sind. Die hier beschriebenen Substanzen
und Assays können zur Identifizierung von Patienten
verwendet werden, in denen solche Autoimmun-Antikörper
gefunden werden, was eine Diagnose und die Behandlung des
mit den Immunglobulinen assoziierten Zustands erlaubt.
Die hier beschriebenen Assays sind auch für die Überwachung
der Expression von hTRT-Genprodukten und der
Charakterisierung von hTRT-Genen in Zellen ex vivo oder in
vitro von Nutzen. Da erhöhte hTRT-Spiegel charakteristisch
für immortalisierte Zellen sind, können die
erfindungsgemäßen Assays beispielsweise für das Screenen
nach immortalisierten Zellen oder deren Identifizierung
verwendet werden oder zur Identifizierung eines Wirkstoffs,
der immortalisierte Zellen durch Hemmung der hTRT-Expression
oder -Funktion wieder mortalisieren kann. Beispielsweise ist
dieser Assay für die Identifizierung von Zellen von Nutzen,
die durch eine erhöhte Expression von hTRT in der Zelle,
beispielsweise der Expression einer rekombinanten hTRT, oder
durch erhöhte Expression einer endogen codierten hTRT (z. B.
durch Promotoraktivierung) immortalisiert wurden.
Auf ähnliche Weise können diese Assays auch zur Überwachung
der hTRT-Expression in transgenen Tieren oder Zellen (z. B.
in Hefe oder menschlichen Zellen, die ein hTRT-Gen
enthalten) verwendet werden. Insbesondere können die
Auswirkungen von bestimmen Behandlungen (z. B. die
Verabreichung eines bekannten oder vermuteten Telomerase-
Antagonisten) bezüglich des hTRT-Spiegels in Menschen und
nicht-menschlichen Zellen, die die erfindungsgemäße hTRT
exprimieren zur Identifizierung von nützlichen Wirkstoffen
und Wirkstoffkandidaten (z. B. Telomerase-Aktivität
modulierende Wirkstoffe) verwendet werden.
Assays hinsichtlich des Vorhandenseins oder der Menge eines
hTRT-Genprodukts können auf verschiedene Art und Weise
ausgeführt und ebenso die Ergebnisse auf verschiedene Art
und Weise interpretiert werden, was von dem Assayformat, der
Natur der zu untersuchenden Probe und der erwünschten
Information abhängt. Beispielsweise ist die Menge an hTRT-Gen
produkten in den meisten menschlichen somatischen Geweben
im Fließgleichgewicht so gering, daß diese durch bestimmte
Assays nicht nachweisbar sind. Darüber hinaus ist im
allgemeinen in diesen Zellen keine Telomerase-Aktivität
vorhanden, so daß die Verifikation der Aktivität ziemlich
leicht ist. Umgekehrt findet sich hTRT-Protein und/oder
hTRT-mRNA oder Telomerase in anderen Telomerase-positiven
Geweben, beispielsweise malignen Tumoren, in ausreichender
Menge, so daß diese unter Verwendung der gleichen Assays
nachgewiesen werden können. Selbst in jenen somatischen
Zelltypen, in denen normalerweise ein geringer Spiegel an
Telomerase-Aktivität nachgewiesen werden kann (z. B.
Stammzellen und bestimmte aktivierte Zellen des
Hämatopoetischen Systems), ist der Spiegel an hTRT-mRNA und
Telomerase-Aktivität sehr gering (z. B. schätzungsweise etwa
1% oder weniger) im Vergleich zu dem Spiegel in
unsterblichen Zellen; somit können unsterbliche und
sterbliche Zellen mittels der erfindungsgemäßen Verfahren
leicht unterschieden werden. Wenn ein "weniger
empfindlicher" Assay verwendet wird, kann der bloße Nachweis
des hTRT-Genprodukts in einem biologischen Probe selbst für
die Diagnose verwendet werden, ohne daß es erforderlich ist,
eine zusätzliche Analyse durchzuführen. Zwar können die
nachstehend beschriebenen Assays mit einer ausgezeichneten
Empfindlichkeit ausgestattet werden, sie können darüber
hinaus auch, falls erwünscht, mit einer geringeren
Empfindlichkeit ausgestattet werden (z. B. durch geeignete
Wahl von Puffern, Waschbedingungen, Anzahl der
Amplifikationsrunden, Reagenzien und/oder Auswahl von
Signalverstärkern). Somit kann im Prinzip jeder Assay so
gestaltet werden, daß er hTRT-Genprodukte nur in den
biologischen Proben nachweist, in denen diese in einer
bestimmten Konzentration vorhanden sind, beispielsweise in
einer höheren Konzentration als in gesundem oder einem
anderen Kontrollgewebe. In diesem Fall wird jeder
nachweisbare Spiegel an hTRT-mRNA oder hTRT-Protein als in
Zellen von post-natalem menschlichem somatischem Gewebe
erhöht erachtet (im Unterschied zu hämatopoetischen Zellen
und anderen Stammzellen).
In einigen Fällen kann es jedoch wünschenswert sein, normale
Werte oder Basiswerte (oder Bereiche) für die hTRT-Gen
produkt-Expressionsspiegel zu etablieren insbesondere,
wenn sehr empfindliche Assays verwendet werden, die einen
sehr geringen Spiegel an hTRT-Genprodukten, die in normalen
somatischen Zellen vorhanden sein können, nachweisen können.
Normale Spiegel der Expression oder von normalen
Expressionsprodukten können für jede bestimmte Population,
Unterpopulation oder Gruppen von Organismen gemäß dem
Fachmann gut bekannter Standardverfahren bestimmt werden. Im
allgemeinen werden Basisspiegel (normale Spiegel) an hTRT-Pro
tein oder hTRT-mRNA durch Quantifizierung der Menge an
hTRT-Protein und/oder -mRNA in biologischen Proben (z. B.
Flüssigkeiten, Zellen oder Geweben) bestimmt, die von
normalen (gesunden) Individuen (z. B. einem Menschen)
erhalten wurden. Für bestimmte Proben und Zwecke kann es
erwünscht sein, die Menge eines hTRT-Genprodukts pro Zelle
oder pro Tumorzelle zu quantifizieren. Um die Zellmenge
einer Probe zu bestimmen, kann der Spiegel eines konstitutiv
exprimierten Genprodukts oder eines anderen Genprodukts
bestimmt werden, das in Zellen des Typs, von dem die Probe
genommen wurde, mit bekanntem Spiegel exprimiert wird.
Alternativ können normale Werte eines hTRT-Proteins oder
einer hTRT-mRNA dadurch bestimmt werden, daß die Menge an
hTRT-Protein/RNA in Zellen oder Geweben, von denen bekannt
ist, daß sie gesund sind, und die von dem gleichen Patienten
stammen, von dem die erkrankten (oder möglicherweise
erkrankten) Zellen entnommen wurden, oder von einem gesunden
Individuum, quantifiziert wird.
Alternativ können in einigen Fällen Basisspiegel als der
Spiegel definiert werden, der in nicht-unsterblichen
menschlichen somatischen Zellen in Kultur vorhanden ist. Es
ist möglich, daß normale Werte (Basiswerte) zwischen
verschiedenen Zelltypen etwas differieren (z. B. ist der
hTRT-mRNA-Spiegel in Hoden höher als in der Niere) oder auch
entsprechend dem Alter, Geschlecht oder dem physischen
Zustand eines Patienten. Wenn daher beispielsweise ein Assay
zur Bestimmung von Veränderungen im hTRT-Spiegel, die mit
Krebs assoziiert sind, verwendet wird, können die für die
Bestimmung des normalen Bereichs an hTRT-Genprodukt-
Expression verwendeten Zellen von Personen des gleichen oder
eines unterschiedlichen Alters stammen, je nach der Art der
Untersuchung. Die Anwendung von in der Molekulargenetik
verwendeten statistischen Standardverfahren erlaubt die
Bestimmung von Basis-Expressionsspiegeln sowie von
signifikanten Abweichungen von solchen Basisspiegeln.
Für die Durchführung der erfindungsgemäßen Diagnose- und
Prognose-Verfahren wie sie vorstehend beschrieben wurden
kann es manchmal zweckmäßig sein, sich auf "diagnostische"
und "prognostische" Werte zu beziehen. Der hier verwendete
Ausdruck "diagnostischer Wert" bezieht sich auf einen Wert,
der für das in einer Probe nachgewiesene hTRT-Genprodukt
bestimmt wurde, und der beim Vergleich mit einem normalen
Bereich (oder "Basisbereich") für das hTRT-Genprodukt das
Vorhandensein einer Erkrankung anzeigt. Diese Erkrankung
kann durch hohe Telomerase-Aktivität gekennzeichnet sein
(z. B. Krebs), das Fehlen von Telomerase-Aktivität (z. B.
Unfruchtbarkeit) oder durch einen Zwischenwert.
Der Ausdruck "prognostischer Wert" bezieht sich auf eine
Menge des hTRT-Genprodukts, die in einem gegebenen Zelltyp
nachgewiesen wurde (z. B. einer malignen Tumorzelle) und die
konsistent ist mit einer bestimmten Diagnose oder Prognose
für die Erkrankung (z. B. Krebs). Die Menge des in einer
Probe nachgewiesenen hTRT-Genprodukts (einschließlich der
Menge null) wird mit dem prognostischen Wert für die Zelle
verglichen, so daß der relative Vergleich der Werte das
Vorhandensein einer Erkrankung oder den Ausgang der
Entwicklung der Erkrankung (z. B. Krebs) anzeigt. In einer
Ausführungsform werden beispielsweise für die Durchführung
einer Tumorprognose Daten gesammelt, um so eine statistisch
signifikante Korrelation an hTRT-Spiegel mit verschiedenen
Tumorklassen oder -Stadien zu erhalten. Für die gleiche
Zellprobe oder Gewebeprobe, die von Individuen mit bekannten
klinischen Ergebnissen stammt, wird ein prädeterminierter
Bereich an hTRT-Spiegeln etabliert. Eine ausreichende Anzahl
von Messungen wird durchgeführt, um so einen statistisch
signifikanten Wert (oder einen Bereich von Werten) zu
ermitteln, mit dem dann ein Vergleich durchgeführt wird. Der
prädeterminierte Bereich von hTRT-Spiegeln oder hTRT-Ak
tivität für eine gegebene Zellprobe oder Gewebeprobe kann
dann zur Bestimmung eines Werts oder Bereichs für den
Spiegel an hTRT-Genprodukten verwendet werden, der mit einer
günstigen (oder ungünstigen) Prognose (z. B. einem "niedrigen
Spiegel" im Fall von Krebs) korrelieren würde. Ein einem
"hohen Spiegel" entsprechender Bereich, der mit einer (oder
mehreren) ungünstigen Prognose(n) im Fall von Krebs
korreliert, kann auf ähnliche Weise bestimmt werden. Der
Spiegel eines hTRT-Genprodukts einer biologischen Probe
(z. B. einer Patientenprobe) kann dann bestimmt, mit den
niedrigen und hohen Bereichen verglichen und zur Prognose
eines klinischen Verlaufs verwendet werden.
Zwar bezieht sich die vorstehende Diskussion zur
Veranschaulichung auf Krebs, diagnostische und prognostische
Werte können aber auch für andere Erkrankungen (z. B.
Erkrankungen bezüglich der Zellproliferation) und Zustände
bestimmt werden und bei Erkrankungen oder Zuständen, bei
denen es sich nicht um Krebs handelt, kann ein "hoher"
Spiegel mit dem gewünschten Verlauf und ein "niedriger"
Spiegel mit einem ungünstigen Verlauf korrelieren.
Beispielsweise können einige Erkrankungen durch eine
Defizienz (z. B. einen niedrigen Spiegel) an Telomerase-
Aktivität in Stammzellen aktivierten Lymphocyten oder
Keimbahnzellen gekennzeichnet sein. In solchen Fällen können
"hohe" Spiegel an hTRT-Genprodukten bezogen auf Zellen des
gleichen Alters und/oder des gleichen Typs (z. B. von anderen
Patienten oder anderen Geweben in einem bestimmten
Patienten) mit einem günstigen Verlauf korrelieren.
Natürlich erfordern die Assayverfahren nicht unbedingt die
Bestimmung von absoluten Werten an hTRT, es sei denn, es ist
erwünscht, da relative Werte für viele Anwendungen der
erfindungsgemäßen Verfahren ausreichend sind. In den Fällen,
in denen eine Quantifizierung wünschenswert ist, stellt die
vorliegende Erfindung Reagenzien bereit, so daß praktisch
jedes bekannte Verfahren zur Quantifizierung von
Genprodukten verwendet werden kann.
Die erfindungsmäßigen Assays können auch zur Beurteilung der
Wirksamkeit eines bestimmten therapeutischen
Behandlungsvorgehens bei Untersuchungen an Tieren, bei
klinischen Tests oder bei der Überwachung der Behandlung
einen einzelnen Patienten verwendet werden. In diesen Fällen
kann es wünschenswert sein, den Basisspiegel für den
Patienten vor dem Beginn der Therapie zu etablieren und
während des Verlaufs der Behandlung die Assays einmal oder
öfter zu wiederholen, überlicherweise in regelmäßigen
Abständen, um zu überprüfen, ob sich die hTRT-Spiegel auf
einen gewünschten Endpunkt hin (z. B. verringerte hTRT-Ex
pression, wenn es sich um einen Assay für Krebs handelt)
als ein Ergebnis der Behandlung bewegen.
Für den Fachmann ist es offensichtlich, daß zusätzlich zu
der Quantität oder Häufigkeit von hTRT-Genprodukten auch
verschiedene oder anormale Expressionsmuster (z. B. anormale
Mengen von RNA-Spleiß-Varianten) oder anormale
Expressionsprodukte oder Expressionsproduktvarianten,
beispielsweise mutierte Transkripte, verkürzte oder "non
sense"-Polypeptide) durch Vergleich mit normalen
Expressionsspiegeln und normalen Expressionsprodukten
identifiziert werden können. In diesen Fällen beinhaltet die
Bestimmung von "normal" oder "Basis-" die Identifizierung
gesunder Organismen und/oder Gewebe (d. h. Organismen
und/oder Gewebe ohne Dysregulation der hTRT-Expression oder
neoplastisches Wachstum) und die Bestimmung des
Expressionsspiegels von hTRT-Genproduktvarianten (z. B.
Spleiß-Varianten) oder die Sequenzierung oder den Nachweis
des hTRT-Gens, -mRNA oder reverser transkribierter cDNA, um
so typische (normale) Sequenzvarianten zu erhalten oder zu
bestimmen. Die Anwendung von Statistiken und
Standardverfahren, die in der Molekulargenetik verwendet
werden, erlaubt die Bestimmung von signifikanten
Abweichungen von solchen Basisspiegeln.
Wie hier betont, werden hTRT-Genprodukte normalerweise in
den meisten normalen somatischen Zellen mit einem extrem
niedrigen Spiegel gefunden. Beispielsweise ist die hTRT-Pro
tein codierende mRNA in allen bisher untersuchten
Telomerase-negativen Zelltypen äußerst selten oder sie
fehlt. In unsterblichen Zellen, beispielsweise 293-Zellen,
kann hTRT-mRNA lediglich in einer Anzahl von etwa 100 Kopien
pro Zelle vorhanden sein, während normale somatische Zellen
lediglich eine oder gar keine Kopie pro Zelle aufweisen. Es
ist somit offensichtlich, daß es manchmal vorteilhaft sein
wird, in das Assayformat Signal- oder
Zielamplifikationsverfahren einzuschließen, wenn
hochempfindliche Assays für hTRT-Genprodukte erwünscht sind.
Siehe beispielsweise Plenat et al., Ann. Pathol. 17 (1997),
17 (Fluoresceinyl-Tyramidsignal-Amplifikation); Zehbe et
al., J. Pathol. 150 (1997), 1553 ("catalyzed reporter
deposition"); weitere hier aufgezählte Literaturhinweise
(z. B. für bDNA-Signalamplifikation, für PCR und andere
Zielamplifikationsformate), sowie weitere auf dem Fachgebiet
bekannte Verfahren.
Wie bereits vorstehend angemerkt, ist es oft nicht nötig,
die hTRT-mRNA oder das hTRT-Protein in den hier
beschriebenen Assays zu quantifizieren, da der Nachweis
eines hTRT-Genprodukts (unter Assaybedingungen, bei denen
das Produkt in einer Kontrolle, beispielsweise Telomerase
negativen Zellen) nicht nachweisbar ist, an sich für eine
Diagnose ausreichend ist. Bei einem weiteren Beispiel kann
eine Quantifizierung überflüssig sein, nämlich dann, wenn
die in einer Testprobe (z. B. Tumor) und Kontrollprobe
(gesundenen Zellen) gefundenen Produktspiegel direkt
verglichen werden.
Falls erwünscht können die in den hier beschriebenen Assays
gemessenen Mengen an hTRT-Genprodukt jedoch auf verschiedene
Art und Weise beschrieben werden, was von dem Meßverfahren
und der Zweckmäßigkeit abhängt. Somit können normale,
diagnostische, prognostische, hohe oder geringe Mengen an
hTRT-Protein/mRNA ausgedrückt werden als Standard-
Gewichtseinheiten pro Menge einer biologischen Probe (z. B.
Picogramm pro Gramm Gewebe, Picogramm pro 1012 Zellen) als
eine Anzahl von Molekülen pro Menge einer biologischen Probe
(z. B. Transkripte/Zelle, Mol/Zelle), als Aktivitätseinheiten
pro Zelle oder pro Menge einer anderen Einheit oder durch
ähnliche Verfahren. Die Menge eines hTRT-Genprodukts kann
auch in Relation zu der Menge eines anderen Moleküls
ausgedrückt werden. Zu den Beispielen gehören die Anzahl von
hTRT-Transkripten in einer Probe/die Anzahl von 28S rRNA-Trans
kripten einer Probe; Nanogramm hTRT-Protein/Nanogramm
Gesamtprotein, etc.
Wenn hTRT-Genprodukte in zwei (oder mehr) unterschiedlichen
Proben bestimmt werden, ist es gelegentlich zweckmäßig, eine
gemeinsame Vergleichsbasis für die zwei Proben zu haben.
Beispielsweise können bei dem Vergleich einer Probe mit
normalem Gewebe und einer Probe mit Krebsgewebe gleiche
Mengen an Gewebe (bezüglich Gewicht, Volumen, Anzahl von
Zellen etc.), verglichen werden. In einer alternativen
Ausführungsform können Äquivalente eines Markermoleküls
(z. B. 28S RNA, hTR, Telomerase-Aktivität, Telomer-Länge,
Aktin) verwendet werden. Beispielsweise kann die Menge an
hTRT-Protein in einer Probe gesunden Gewebes, die 10
Picogramm 28S rRNA enthält, mit einer Probe mit erkranktem
Gewebe, das die gleiche Menge an 28S RNA enthält,
verglichen werden.
Für den Fachmann ist es offensichtlich, daß praktisch jeder
der hier beschriebenen Assays als ein quantitativer Assay
gestaltet werden kann. Typischerweise kann zur Kalibrierung
des Assays eine bekannte Menge oder Quelle eines hTRT-Gen
produkts (das z. B. unter Verwendung der erfindungsgemäßen
Verfahren und Zusammensetzung hergestellt wurde) verwendet
werden.
In bestimmten Ausführungsformen werden Assayformate
ausgewählt, die die Anwesenheit, das Fehlen oder die
Häufigkeit eines hTRT-Allels oder -Genprodukts in jeder
Zelle in einer Probe (oder in einer repräsentativen
Stichprobe) nachweisen können. Zu den Beispielen für solche
Assayformate gehören jene, mit denen ein Signal mittels
Histologie (z. B. Immunhistochemie mit Signalverstärkern oder
zielverstärkenden Amplifikationsschritten) nachgewiesen
werden kann, fluoreszenz-aktivierte Zellanalyse oder
Zellsortierung (FACS). Diese Assayformate sind besonders
dann von Vorteil, wenn man es mit einer hochheterogenen
Zellpopulation zu tun hat (z. B. einer Zellpopulation, die
viele unterschiedliche Zelltypen enthält, in denen nur ein
Zelltyp oder nur wenige erhöhte hTRT-Spiegel auftreten oder
eine Population von ähnlichen Zellen, die Telomerase mit
verschiedenen Spiegeln exprimieren).
Das hTRT-Gen oder -Genprodukt (d. h. mRNA oder Polypeptid)
wird vorzugsweise in einer biologischen Probe nachgewiesen
und/oder quantifiziert. Zu solchen Proben gehören,
allerdings ohne Beschränkung darauf, Zellen (einschließlich
ganzer Zellen, Zellfraktionen, Zellextrakten und
kultivierten Zellen oder Zellinien), Gewebe (einschließlich
Blut), Blutzellen (z. B. weiße Blutzellen), Gewebeproben,
beispielsweise Feinnadelbiopsieproben (z. B. von der
Prostata, Brust, Schilddrüse etc., Körperflüssigkeiten
(z. B. Urin, Sputum, Amnionflüssigkeit, Blut,
Peritonealflüssigkeit, Pleural-Flüssigkeit, Samen) oder
daraus gewonnene Zellen (z. B. Blasenzellen aus Urin,
Lymphocyten aus Blut), Medien (von kultivierten Zellen oder
Zellinien) und Waschflüssigkeiten (z. B. von der Blase und
Lunge). Zu den biologischen Proben können auch
Gewebeschnitte gehören, beispielsweise Gefrierschnitte, die
für histologische Zwecke entnommen wurden. Für die Diagnose
und Prognose von Krebs wird eine Probe von einem kanzerösen,
prokanzerösen oder vermutlich kanzerösem Gewebe oder Tumor
entnommen. Es kann gelegentlich wünschenswert sein, eine
biologische Probe für die spätere Analyse einzufrieren (z. B.
wenn die Wirksamkeit von Behandlungen mit Wirkstoffen
überwacht wird).
In einigen Fällen können die Zellen oder Gewebe vor der
Analyse fraktioniert werden. Beispielsweise kann bei einer
Gewebebiopsie von einem Patienten ein Zellsortierer (z. B.
ein Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierer) verwendet werden,
um Zellen nach Merkmalen, wie beispielsweise der Expression
eines Oberflächenantigens (z. B. eines tumorspezifischen
Antigens) gemäß allgemein bekannter Verfahren zu sortieren.
Zwar wird die Probe üblicherweise von einem menschlichen
Patienten oder Zellinie entnommen, die Assays können jedoch
auch zum Nachweis von homologen hTRT-Genen oder
entsprechenden Genprodukten in Proben von Tieren verwendet
werden. Alternativ können hTRT-Gene und -Genprodukte in
transgenen Tieren oder Organismen, die ein menschliches TRT-Pro
tein oder entsprechende Nucleinsäuresequenz exprimieren,
untersucht werden.
Die Probe kann, falls nötig, durch Verdünnung in einer
geeigneten Pufferlösung vorbehandelt werden oder
konzentriert werden, falls dies erwünscht ist. Es kann eine
Reihe von wäßrigen Standardpufferlösungen bei
physiologischem pH-Wert verwendet werden, wobei eine Reihe
von Puffern angewandt werden kann, beispielsweise Phosphat,
Tris-Puffer etc.
Der Ausdruck "biologische Probe", die von einem Patienten
erhalten wurde, kann entweder als "biologische Probe" oder
"Patientenprobe" bezeichnet werden. Bei einer Analyse einer
"Patientenprobe" müssen nicht unbedingt Zellen oder Gewebe
von dem Patienten entnommen werden. Beispielsweise können
geeignet markierte hTRT-bindende Agenzien (z. B. Antikörper
oder Nucleinsäuren) in den Patienten injiziert und (nach
Bindung an das Ziel) unter Verwendung von Standard-
Bildgebungstechniken (z. B. CAT, NMR etc.) sichtbar gemacht
werden.
In einer Ausführungsform stellt die Erfindung Verfahren zum
Nachweis und/oder der Quantifizierung der Expression von
hTRT-mRNAs (einschließlich Spleiß-Varianten oder
Sequenzvarianten und alternative Allele) bereit. In einer
alternativen Ausführungsform stellt die Erfindung Verfahren
zum Nachweis und der Analyse normaler oder anormaler hTRT-Gene
(oder eines Fragments davon) bereit. Zu den Formaten
solcher qualitativer oder quantitativer Assays gehören,
allerdings ohne Beschränkung darauf, auf Amplifikation
basierende Assays mit oder ohne Signalamplifikation, auf
Hybridisierung basierende Assays und auf der Kombination
Amplifikation/Hybridisierung basierende Assays. Es ist für
den Fachmann offensichtlich, daß die Unterscheidung zwischen
Hybridisierung und Amplifikation nur aus
Zweckmäßigkeitsgründen durchgeführt wird: Wie in den
nachstehenden Beispielen veranschaulicht, beinhalten viele
Assayformate sowohl Elemente der Hybridisierung als auch
Amplifikation, so daß in einigen Fällen die Kategorisierung
etwas willkürlich ist.
In einigen Ausführungsformen werden Nucleinsäure-Assays mit
einer Nucleinsäureprobe, die aus der zu untersuchenden
Zelle, oder Zellinie oder dem zu untersuchenden Gewebe oder
Organismus isoliert wurde. Die Nucleinsäure (z. B. genomische
DNA, RNA oder cDNA) kann aus einer Probe gemäß einer Reihe
von dem Fachmann bekannten Verfahren "isoliert" werden. In
diesem Zusammenhang bezieht sich der Ausdruck "isoliert" auf
jede Abtrennung der Spezies oder des Ziels, das nachgewiesen
werden soll, von jeder anderen Substanz in dem Gemisch, dies
bezeichnet jedoch nicht unbedingt einen wesentlichen
Reinheitsgrad des Ziels. Es ist für den Fachmann
offensichtlich, daß bei dem Nachweis von Änderungen in der
Kopienanzahl des hTRT-Gens das nachzuweisende Ziel
genomische DNA ist. Umgekehrt ist in einem auf einer
Nucleinsäure basierenden Assay RNA das nachzuweisende Ziel,
wenn Expressionsspiegel eines Gens oder von Genen
nachgewiesen werden sollen. In einer bevorzugten
Ausführungsform ist die Nucleinsäureprobe Gesamt-mRNA (d. h.
poly(A)⁺RNA) in einer biologischen Probe. Verfahren zur
Isolierung von Nucleinsäuren sind dem Fachmann gut bekannt
und beispielsweise beschrieben in Tijssen, P. (Herausg.) in
Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology:
Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part I. Theory and
Nucleic Acid Preparation, Elsevier, N.Y. (1993), Kapitel 3,
wobei dieses Dokument durch Bezugnahme als Bestandteil
dieser Beschreibung anzusehen ist. In einer Ausführungsform
wird Gesamt-Nucleinsäure aus einer Probe unter Verwendung
eines sauren Guanidin/Phenol/Chloroform-
Extraktionsverfahrens isoliert und poly(A)⁺mRNA durch oligo
dT-Säulenchromatographie oder durch die Verwendung von
magnetischen (dT)n Kügelchen (siehe z. B. Sambrook et al.,
und Ausubel et al., a.a.O.).
In alternativen Ausführungsformen ist die Isolation von
Nucleinsäuren (z. B. Gesamt-RNA oder poly-A⁺RNA) aus der
biologischen Probe vor der Durchführung von Amplikation,
Hybridisierung oder anderen Assays nicht erforderlich. Diese
Ausführungsformen haben bestimmte Vorteile im Fall, daß
hTRT-RNA gemessen werden soll, da sie die Wahrscheinlichkeit
verringern, daß hTRT-mRNA während der Isolation und der
Handhabung verlorengeht. Beispielsweise können viele
Amplifikationsverfahren, wie beispielsweise PCR und RT-PCR
(reverse Transkriptase-PCR) unter Verwendung
permeabilisierter Zellen (histologische Proben und FACS-Ana
lysen) lysierter Gesamtzellen oder hoher Zellfraktionen,
wie beispielsweise bestimmter Zellextrakte, durchgeführt
werden. Vorzugsweise werden Schritte unternommen, um die
Integrität der Zielnucleinsäure (z. B. mRNA), falls
erforderlich, zu bewahren (z. B. durch Zugabe von RNAase-
Inhibitoren). Amplifikations- und Hybridisierungs-Assays
können auch in situ durchgeführt werden, beispielsweise in
dünnen Gewebeabschnitten einer Biopsieprobe oder einer
einlagigen Zellschicht (z. B. Blutzellen oder voneinander
getrennte Zellen einer Gewebekultur). Die Amplifikation kann
auch in intakten ganzen Zellen oder fixierten Zellen
durchgeführt werden. Beispielsweise können PCR-, RT-PCR-,
oder LCR-Amplifikationsverfahren, so wie dies auf dem
Fachgebiet bekannt ist, in situ durchgeführt werden,
beispielsweise unter Verwendung einer Polymerase oder
Ligase, eines Primers oder von Primern und (Desoxy)-
Ribonucleosid-Triphosphaten (wenn eine Polymerase verwendet
wird) und reverser Transkriptase und einem Primer (wenn RNA
transkribiert und die cDNA nachgewiesen werden soll) an
fixierten, permeabilisierten oder mikroinjizierten Zellen,
um so die Ziel-hTRT-RNA oder -DNA zu amplifizieren. hTRT-RNA
enthaltende Zellen (z. B. Telomerase-positive Zellen) oder
eine gewünschte hTRT-DNA-Sequenz können dann nachgewiesen
werden. Dieses Verfahren ist oft dann zweckmäßig, wenn
Fluoreszenz-markierte dNTPs, Primer oder andere Bestandteile
in Verbindung mit Mikroskopie, einer FACS-Analyse oder
äquivalenten Verfahren verwendet werden.
In einer Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen Assays
zum Nachweis eines hTRT-Gens oder -Genprodukts auf
Amplifikation basierende Assays. In einem auf Amplifikation
basierenden Assay wird ein gesamtes hTRT-Gen oder
-Transkript oder ein Teil davon (z. B. mRNA oder cDNA,
nachstehend als "Ziel" bezeichnet) amplifiziert und das
amplifizierte- Produkt wird anschließend direkt oder indirekt
nachgewiesen. Falls kein Gen oder Genprodukt vorhanden ist,
das als Matrize wirken kann, wird kein Amplifikationsprodukt
hergestellt (z. B. mit der erwarteten Größe) oder die
Amplifikation ist unspezifisch und es entsteht üblicherweise
kein einzelnes Amplifikationsprodukt. Im Gegensatz dazu wird
die Zielsequenz amplifiziert, wenn das fragliche Gen oder
Genprodukt vorhanden ist, was somit die Anwesenheit und/oder
die Menge an entsprechendem Gen oder an entsprechender mRNA
anzeigt. Auf Amplifikation basierende Assays sind dem
Fachmann gut bekannt.
Die vorliegende Erfindung stellt eine große Vielzahl an
Primern und Sonden zum Nachweis von hTRT-Genen und
Genprodukten bereit. Solche Primer und Proben sind zu dem
hTRT-Gen oder Genprodukt ausreichend komplementär, um an die
Zielnucleinsäure hybridisieren zu können. Primer weisen
üblicherweise eine Länge von mindestens 6 Basen auf,
vorzugsweise von etwa 10 bis etwa 100 Basen, mehr bevorzugt
von etwa 12 bis etwa 50 Basen und am meisten bevorzugt
zwischen etwa 14 und etwa 25 Basen. Der Fachmann wird nach
Lesen dieser Beschreibung in der Lage sein, unter Verwendung
von Routineverfahren Primer auszuwählen, mit denen das
gesamte hTRT-Gen oder -Genprodukt oder ein Anteil davon
amplifiziert werden kann oder mit denen zwischen Genprodukt-
Varianten, hTRT-Allelen etc. unterschieden werden kann. In
Tabelle 2 sind Beispiele von Primern aufgezählt, die für
eine PCR-Amplifikation der hTRT oder spezifischer hTRT-Gen
produkte oder -Bereiche von Nutzen sind. Es ist auf dem
Fachgebiet bekannt, daß einzelne Oligomere (siehe
beispielsweise US-Patent Nr. 5,545,522) "nested sets" von
Oligomeren oder sogar ein Pool von degenerierten Oligomeren
für die Amplifikation verwendet werden kann, beispielsweise,
wie dies für die nachstehend beschriebene Amplifikation der
Tetrahymena TRT-cDNA veranschaulicht wird.
Die Erfindung stellt eine Vielzahl von Verfahren zur
Amplifikation und zum Nachweis eines hTRT-Gens oder
-Genprodukts bereit. Dazu gehören die Polymerase-
Kettenreaktion (einschließlich aller Varianten,
beispielsweise die Reverse-Transkriptase-PCR; das "Sunrise
Amplification System" (Oncor, Inc., Gaithersburg MD) und
zahlreiche weitere auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren. In
einer veranschaulichenden Ausführung wird die PCR-Am
plifikation in einer Lösung von 50 µl durchgeführt, die
die Nucleinsäureprobe enthält (z. B. eine durch reverse
Transkription von hTRT-RNA erhaltene cDNA), jeweils 100 µM
dNTP (dATP, dCTP, dGTP und dTTP; Pharmacia LKB
Biotechnology, NJ) der (die) hTRT-spezifischen PCR-Primer, 1
Einheit Taq-Polymerase (Perkin Elmer, Norwalk CT), 1 × PCR-Puf
fer (50 mM KCl, 10 mM Tris, pH-Wert 8,3 bei
Raumtemperatur, 1,5 mM MgCl2 und 0,01% Gelatine), wobei die
Amplifikation mit etwa 30 Cyclen durchgeführt wird, jeweils
45 Sekunden bei 94°C, 45 Sekunden bei 45°C und 90 Sekunden
bei 72°C. Es können jedoch natürlich für bestimmte
Reaktionen zur Optimierung der PCR-Amplifikation zahlreiche
Variationen eingeführt werden.
Zu weiteren geeigneten Zielamplifikationsverfahren gehören
die Ligase-Kettenreaktion (LCR) (siehe z. B. Wu und Wallace,
Genomics 4 (1989), 560; Landegren et al., Science 241
(1988), 1077, Barany, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991),
189 und Barringer et al., Gene 89 (1990), 117), die
Strangverdrängungs-Amplifikation (SDA) (siehe z. B. Walter et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 392-396); die
Transkriptions-Amplifikation (siehe z. B. Kwoh et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 1173), "self-sustained
sequence"-Replikation (3SR) (siehe z. B. Fahy et al., PCR
Methods Appl. 1 (1992) 25 und Guatelli et al., Proc. bat.
Acad. Sci. USA 87 (1990) 1874); die Nucleinsäuresequenz
basierte Amplifikation (NASBA, Cangene, Mississauga,
Ontario; siehe z. B. Compton, Nature 350 (1991) 91); das
Transkriptions-basierte Amplifikationssystem (TAS); und das
"self-sustained-sequence"-Replikationssystem (SSR). Jede der
vorstehenden Veröffentlichungen ist aufgrund der Bezugnahme
als Bestandteil dieser Beschreibung anzusehen. Eine
zweckmäßige PCR-Variante ist der PCR-ELISA (z. B. Boehringer
Mannheim Kat. Nr. 1 636 111), wobei Digoxigenin-dUTP in das
PCR-Produkt eingebaut wird. Das PCR-Reaktionsgemisch wird
denaturiert und mit einem Biotin-markierten Oligonucleotid
hybridisiert, das so entworfen wurde, daß es an eine interne
Sequenz des PCR-Produkts binden kann. Die
Hybridisierungsprodukte werden an mit Streptavidin
überzogenen Trägern immobilisiert und unter Verwendung von
anti-Digoxigenin-Antikörpern nachgewiesen. Beispiele für in
vitro-Amplifikationsverfahren, die dem Fachmann ausreichend
Anleitung geben, können in folgenden Veröffentlichungen
gefunden werden: PCR Technology: Principles and Applications
for DNA Amplification, H. Erlich (Herausg.) Freeman Press,
New York, NY (1992); PCR Protocols: A Guide to Methods and
Applications, Herausg. Innis, Gelfland, Snisky, und White,
Academic Press, San Diego, CA (1990); Mattila et al.,
Nucleic Acids Res. 19 (1991), 4967; Eckert und Kunkel, PCR
Methods and Applications 1 (1991), 17; PCR, Herausg.
McPherson, Quirkes und Taylor, IRL Press, Oxford; U.S.-Pa
tent Nr. 4,683,195, 4,683,202 und 4,965,188; Barringer et
al., Gene 89 (1990), 117; Kwoh et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 86 (1989), 1173; Guatelli et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 87 (1990) 1874; Lomell et al., J. Clin. ehem. 35
(1989), 1826. Jedes dieser Dokumente ist durch Bezugnahme
als Bestandteil dieser Beschreibung anzusehen.
Amplifizierte Produkte können direkt analysiert werden (z. B.
anhand der durch Gelelektrophorese bestimmten Größe), durch
Hybridisierung an einer Zielnucleinsäure, die an einem
festen Träger immobilisiert ist, beispielsweise einem
Kügelchen, einer Membran, einer Scheibe oder einem Chip;
durch Sequenzierung; immunologisch (z. B. durch PCR-ELISA),
durch Nachweis eines fluoreszierenden phosphoreszierenden
oder radioaktiven Signals oder durch eine Reihe weiterer
allgemein bekannter Maßnahmen. In einem veranschaulichenden
Beispiel für ein Nachweisverfahren werden beispielsweise
PCR-Primer verwendet, die mit Hilfe von Haarnadelschleifen
("hairpin loops") vergrößert wurden, die mit Fluorescein
verknüpft sind und einem Benzoesäure-Derivat, das als
quenchende Verbindung dient, so daß nur dann eine
Fluoreszenz emittiert wird, wenn sich die Primer zur Bindung
ihrer Ziele entfalten und Replikation stattfindet.
Da hTRT-mRNA normalerweise als ein äußerst seltenes
Transkript exprimiert wird, das selbst in Telomerase
positiven Zellen nur in sehr niedrigen Konzentrationen
vorhanden ist, ist es oft wünschenswert, das durch einen
Amplifikationsschritt erhaltene Signal zu optimieren oder zu
verstärken. Eine Möglichkeit dafür besteht in der Erhöhung
der Anzahl von Amplifikationszyklen. Beispielsweise sind
zwar 20 bis 25 Cyclen für die Amplifikation der meisten
mRNAs mittels der Polymerasekettenreaktion unter
Standardreaktionsbedingungen ausreichend, der Nachweis von
hTRT-mRNA kann jedoch in vielen Proben in Abhängigkeit von
dem Nachweisformat 30 bis 35 Amplifikationszyklen benötigen.
Durch sorgfältige Auswahl der Amplifikationsbedingung
einschließlich der Anzahl von Amplifikationszyklen kann ein
Assay entworfen werden, der nur dann zu einem
Amplifikationsprodukt führt, wenn eine Schwellenwertmenge
des Ziels in der Testprobe vorhanden ist (d. h. so daß nur
Proben mit einem hohen Spiegel an hTRT-mRNA ein "positives"
Ergebnis zeigen). Darüber hinaus sind Verfahren bekannt, um
das durch Amplifikation der Zielsequenz erzeugte Signal zu
verstärken. Zu den Verfahren zur Verbesserung der Fähigkeit
ein amplifiziertes Ziel nachzuweisen, gehören
Signalamplifikationssysteme, beispielsweise:
Signalamplifikation mit verzweigter DNA "branched DNA signal
amplification" (s. z. B. US-Patent Nr. 5,124,246 und Urdea,
Bio/Tech. 12 (1994), 926); das "tyramide"-Signal
amplifikationssystem (TSA, DuPont); Amplifikation mit
einem katalytischen Signal ("catalytic signal amplification"
(CSA) (Dako); Q Beta-Replicase-Systeme (Tyagi et al., Proc.
Nat. Acad. Sci. USA 93 (1996), 5395) etc.
Es ist für den Fachmann offensichtlich, daß unabhängig von
dem verwendeten Amplifikationsverfahren eine Vielzahl von
auf dem Fachgebiet bekannten quantitativen Verfahren zur
Quantifizierung verwendet werden kann, falls dies erwünscht
ist. Beispielsweise können, falls erwünscht, zwei oder mehr
Polynucleotide in einer einzigen Probe gemeinsam
amplifiziert werden. Dieses Verfahren kann als ein
zweckmäßiges Verfahren zur Quantifizierung der hTRT-mRNA-Menge
in einer Probe verwendet werden, da sowohl die reverse
Transkription als auch Amplifikationsreaktionen im gleichen
Reaktionsgemisch für ein Ziel- und Kontroll-Polynucleotid
durchgeführt werden. Die gemeinsame Amplifikation mit dem
Kontrollpolynucleotid (das normalerweise in einer bekannten
Konzentration oder einer bekannten Kopienanzahl vorhanden
ist) kann zur Normalisierung der Anzahl von Zellen in der
Probe im Vergleich zu der Menge an hTRT in der Probe
verwendet werden. Zu den geeigneten Kontroll-Polynucleotiden
für Coamplifikationsreaktionen gehören DNA von
"housekeeping"-Genen exprimierte RNA, konstitutiv
exprimierte Gene und in vitro synthetisierte RNAs oder DNAs,
die zu dem Reaktionsgemisch gegeben werden. Zu den endogenen
Kontroll-Polynucleotiden zählen solche, die bereits in der
Probe vorhanden sind, während exogene Kontroll-
Polynucleotide einer Probe zugegeben werden, wodurch eine
Reaktion "mit Schuß" ("spiked") erzeugt wird. Zu den
Beispielen für Kontroll-RNAs zählen β-Actin-RNA, GAPDH RNA,
snRNAs, hTR und endogen exprimierte 28S rRNA (siehe Khan et
al., Neurosci. Lett. 147 (1992), 114. Zu exogenen Kontroll-
Polynucleotiden gehören eine synthetische AW106-cRNA, die
von pAW106 als "sense"-Strang -mittels T7-Polymerase
synthetisiert werden kann. Damit das
Coamplifikationsverfahren für eine Quantifizierung verwendet
werden kann, müssen sowohl die Kontroll-Nucleotide als auch
die Ziel-Polynucleotide üblicherweise in einem linearen
Bereich amplifiziert werden. Ausführliche Protokolle für
eine quantitative PCR können gefunden werden in PCR
Protocols, A Guide to Methods and Applications, Innis et
al., Academic Press, Inc. N.Y. (1990) und Ausubel et al.,
a.a.O. (Einheit 15) und Diaco, R. (1995) Practical
Considerations for the Design of Quantitative PCR Assays, in
PCR Strategies, S. 84-108, Innis et al. Herausg. Academic
Press, New York.
In Abhängigkeit von der Sequenz des endogenen oder exogenen
Standards können unterschiedliche Primersätze für die
Coamplifikationsreaktion verwendet werden. Bei einem
Verfahren, der sogenannten kompetitiven Amplifikation,
beinhaltet die quantitative PCR die gleichzeitige
Coamplifikation mit einer bekannten Menge einer
Kontrollsequenz, wobei die gleichen Primer, die für die
Zielnucleinsäure verwendet werden, benutzt werden (ein Paar
mit zwei Primern). In einer alternativen Ausführungsform,
die als nicht-kompetitive Amplifikation bekannt ist, werden
die Kontrollsequenz und die Zielsequenz (z. B. hTRT-cDNA)
unter Verwendung unterschiedlicher Primer (d. h. 2 Paare von
2 Primern) amplifiziert. In einer weiteren alternativen
Ausführungsform, der sogenannten semi-kompetitiven
Amplifikation, werden drei Primer verwendet, wobei einer
hTRT-spezifisch, einer kontroll-spezifisch und einer in der
Lage ist, sich sowohl an Zielsequenzen als auch
Kontrollsequenzen anzulagern. Semi-kompetitive Amplifikation
wird in dem US-Patent Nr. 5,629,154 beschrieben, das hiermit
durch Bezugnahme als Bestandteil dieser Beschreibung
angesehen werden kann.
Eine Vielzahl von Verfahren für die spezifische Messung von
DNA und RNA mit Hilfe von Nucleinsäure-
Hybridisierungsverfahren sind dem Fachmann bekannt (siehe
Sambrook et al., a.a.O.). Auf Hybridisierung basierende
Assays betreffen Assays, bei denen eine Nucleinsäuresonde an
eine Zielnucleinsäure hybridisiert wird. Üblicherweise sind
die erfindungsgemäßen Nucleinsäure-Hybridisierungssonden
vollständig oder im wesentlichen identisch zu einer
zusammenhängenden Sequenz des hTRT-Gens oder der
entsprechenden RNA-Sequenz Vorzugsweise sind die
Nucleinsäuresonden mindestens etwa 10 Basen lang, mehr
bevorzugt mindestens etwa 20 Basen und am meisten bevorzugt
etwa 200 Basen oder länger. Verfahren zur Auswahl von
Nucleinsäuresondensequenzen zur Verwendung bei der
Nucleinsäurehybridisierung werden in Sambrook et al., a.a.O.
diskutiert. In einigen Formaten sind entweder das Ziel oder
die Sonde oder beide immobilisiert. Bei der immobilisierten
Nucleinsäure kann es sich um eine DNA, RNA oder ein anderes
Oligo- oder Polynucleotid handeln. Diese können natürlich
oder nicht natürlich vorkommende Nucleotide,
Nucleotidanaloga oder Rückgrate umfassen. Solche Assays
können in verschiedenen Formaten verwendet werden,
beispielsweise: Southern, Northern "dot" und "slot" Blots,
Polynucleotid- oder Oligonucleotid-Arrays mit hoher Dichte
(z. B. Genechips/Affymetrix), Meßstäbchen, Meßnadeln
("pins"), Chips oder Kügelchen. All diese Verfahren sind auf
dem Fachgebiet allgemein bekannt und sie stellen die Basis
vieler im Handel erhältlicher diagnostischer Kits dar.
Hybridisierungstechniken werden allgemein beschrieben in
Hames et al., Herausg. Nucleic Acid Hybridization, A
Practical Approach IRL Press (1985); Gall und Pardue, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 63 (1969), 378-383 und John et al.,
Nature, 223 (1969) 582-587.
Dem Fachmann sind eine Vielzahl von Formaten für die
Nucleinsäurehybridisierung bekannt. Beispielsweise stellt
die direkte Hybridisierung ein übliches Format dar, wobei
eine Zielnucleinsäure mit einer markierten komplementären
Sonde hybridisiert wird. Gewöhnlich werden markierte
Nucleinsäuren für die Hybridisierung verwendet, wobei die
Markierung das nachweisbare Signal liefert. Ein Verfahren
zur Beurteilung der Anwesenheit, des Fehlens oder der Menge
an hTRT-mRNA besteht in der Durchführung eines Northern-
Transfers von RNA aus einer Probe und der Hybridisierung mit
einer markierten hTRT-spezifischen Nucleinsäuresonde, so wie
dies in Beispiel 2 veranschaulicht ist. Wie bereits
vorstehend angemerkt, ist hTRT-mRNA, wenn überhaupt, in den
meisten Zellen nur in sehr geringen Mengen vorhanden. Somit
ist es bei der Verwendung einer Northern-Hybridisierung oft
wünschenswert, einen Amplifikationsschritt oder alternativ
große Mengen an Ausgangs-RNA zu verwenden. Ein zweckmäßiges
Verfahren zur Beurteilung der Anwesenheit, des Fehlens oder
der Menge von hTRT-Proteine codierender DNA in einer Probe
umfaßt einen Southern-Transfer von DNA aus einer Probe und
die Hybridisierung mit einer markierten hTRT-spezifischen
Nucleinsäuresonde.
Zu weiteren üblichen Hybridisierungsformaten gehören
"Sandwich"-Assays und Kompetitions- oder Verdrängungs-
Assays. Bei den "Sandwich"-Assays handelt es sich um im
Handel erhältliche zweckmäßige Hybridisierungsassays zum
Nachweis und zur Isolierung von Nucleinsäuresequenzen. In
solchen Assays werden eine "Einfang"-Nucleinsäure, die
kovalent an einen festen Träger immobilisiert ist, und eine
markierte "Signal"-Nucleinsäure in Lösung verwendet. Die
biologische oder klinische Probe liefert die
Zielnucleinsäure. Die "Einfang"-Nucleinsäure- und die
"Signal"-Nucleinsäuresonde hybridisieren mit der
Zielnucleinsäure, wobei ein "Sandwich"-Hy
bridisierungskomplex gebildet wird. Für die Wirksamkeit
ist es erforderlich, daß die Signalnucleinsäure mit der
"Einfang"-Nucleinsäure hybridisieren kann.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner auf einer Sonde
basierende Hybridisierungsassays für hTRT-Genprodukte
bereit, wobei Arrays von immobilisierten Oligonucleotiden
oder Oligonucleotiden verwendet werden, an die eine hTRT-Nuclein
säure hybridisieren kann (d. h. an einige, jedoch
normalerweise nicht an alle, oder nicht einmal an die
meisten der immobilisierten Oligo- oder Polynucleotide).
Oligonucleotid-Arrays mit hoher Dichte oder Polynucleotid-
Arrays stellen ein Mittel für den effizienten Nachweis des
Vorhandenseins und der Merkmale (z. B. der Sequenz) einer
Zielnucleinsäure (z. B. ein hTRT-Gen, -mRNA oder -cDNA) dar.
Es sind Techniken bekannt, mit denen sich Arrays herstellen
lassen, die tausende von zu definierten Sequenzen
komplementäre Oligonucleotide an definierten Positionen auf
einer Oberfläche enthalten, wobei für die Synthese in situ
photolithographische Verfahren verwendet werden (siehe z. B.
US-Patent Nr. 5,578,832, 5,556,752 und 5,510,270; Fodor et
al., Science 251 (1991), 767; Pease et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 91 (1994), 5022 und Lockhart et al., Nature
Biotech 14 (1996); 1675) oder andere Verfahren zur schnellen
Synthese und Anlagerung von definierten Oligonucleotiden
(Blanchard et al., Biosensors & Bioelectronics 11 (1996),
687). Bei Anwendung dieser Verfahren werden Oligonucleotide
(z. B. 20-mere) mit bekannter Sequenz direkt auf einer
Oberfläche, beispielsweise auf einer Scheibe mit
derivatisiertem Glas synthetisiert. Normalerweise ist das
hergestellte Array redundant mit einigen
Oligonucleotidsonden auf dem Chip, die für das
nachzuweisende hTRT-Polynucleotid spezifisch sind.
Kombinationen von Oligonucleotidsonden können so entworfen
werden, daß alternativ gespleißte mRNAs nachgewiesen werden
können oder um festzustellen, welches von verschiedenen
hTRT-Allelen in einer bestimmten Probe exprimiert wird.
In einer veranschaulichenden Ausführungsform wird durch
reverse Transkription von Gesamt-RNA von einer Testzelle
präparierte cDNA amplifiziert (z. B. mittels PCR).
Normalerweise ist das amplifizierte Produkt markiert,
beispielsweise durch Einbau eines fluoreszenzmarkierten
dNTPs. Die markierten cDNAs werden dann mit einem Chip
hybridisiert, der Oligonucleotidsonden umfaßt, die zu
verschiedenen Untersequenzen des hTRT-Gens komplementär
sind. Die Hybridisierungspositionen werden bestimmt (z. B.
gemäß den allgemeinen Verfahren von Shalon et al., Genome
Research 6 (1996), 639 oder Schena et al., Genome Res. 6
(1996) 639) und aus dem Hybridisierungsmuster die Sequenz
(oder eine andere Information) durch auf diesem Fachgebiet
gut bekannte Verfahren abgeleitet.
In einer Ausführungsform werden zwei cDNA-Proben mit dem
gleichen Chip hybridisiert, wobei jede mit einer
unterschiedlichen Fluoreszenzgruppe markiert ist. Das
Verhältnis der Hybridisierung jeder markierten Probe zu
Stellen, die komplementär zu dem hTRT-Gen sind, wird dann
untersucht. Falls beide Proben die gleiche Menge an hTRT-mRNA
enthalten, beträgt das Verhältnis der beiden
Fluoreszenzsignale 1 : 1. Dabei muß das Signal der
Fluoreszenzen nicht so eingestellt werden, daß jedem
Unterschied in der molaren Empfindlichkeit der
Fluoreszenzsignale Rechnung getragen wird.
Im Gegensatz dazu wird das in der zweiten Probe verwendete
Fluoreszenzsignal vorherrschen, falls die erste Probe von
einem gesunden (oder Kontroll)-Gewebe stammt, und die zweite
Probe von einem kanzerösen Gewebe.
Ein alternatives Verfahren zum Nachweis der Expression eines
ein hTRT-Protein codierenden Gens ist in situ-
Hybridisierung. In situ-Hybridisierungsassays sind gut
bekannt und allgemein beschrieben in Angerer et al., Methods
Enzymol. 152 (1987), 649-660 und Ausubel et al., a.a.O. In
einem in situ-Hybridisierungsassay sind Zellen oder
Gewebeproben an einem festen Träger fixiert, der sich
typischerweise in einem permeabilisierten Zustand befindet,
typischerweise auf einer Glasscheibe. Die Zellen werden dann
mit einer Hybridisierungslösung bei einer moderaten
Temperatur hybridisiert, um so die Anlagerung von markierten
Nucleinsäuresonden zu gestatten (z. B. 35S-markierte
Ribosonden, Fluoreszenz-markierte Sonden), die komplementär
oder im wesentlichen komplementär zu hTRT sind. Freie Sonde
wird durch Waschen und/oder Spaltung mit Nuclease entfernt
und die gebundene Sonde wird direkt auf der Scheibe durch
Autoradiographie oder ein geeignetes bildgebendes Verfahren,
so wie dies auf dem Fachgebiet bekannt ist, sichtbar
gemacht.
Wie bereits vorstehend angemerkt und in den Beispielen (z. B.
Beispiel 9) veranschaulicht, können Amplifikations-Primer
oder -Sonden ausgewählt werden, um Amplifikationsprodukte zu
liefern, die spezifische Deletion, Verkürzungen und
Insertionen umspannen, wodurch der Nachweis von spezifischen
Varianten oder Anormalitäten in der hTRT-mRNA erleichtert
wird. Ein Beispiel eines Genprodukts einer hTRT-Variante,
das nachgewiesen werden kann, ist eine hTRT-RNA, wie
beispielsweise ein vorstehend und in Beispiel 9
beschriebenes Produkt (SEQ. ID. Nr. 4). Die biologische
Funktion der 182-Variante(n) ist nicht bekannt, falls
überhaupt eine vorhanden ist. Das von der Variante
vermutlich codierte verkürzte hTRT-Protein könnte jedoch an
einer Regulation von Telomerase-Aktivität beteiligt sein,
beispielsweise durch Assemblierung eines nicht-funktionellen
Telomerase-RNPs, der Telomerase-Bestandteile titriert.
Alternativ könnte eine negative Regulation von Telomerase-
Aktivität durch Steuerung der hTRT-prä-mRNA (naszierende
mRNA) auf eine Weise erzielt werden, die zu einer
Eliminierung der mRNA und der Herabsetzung des hTRT-mRNA-Spie
gels führt. Aus diesen und weiteren Gründen ist die
Möglichkeit 182 -Varianten entdecken zu können von Nutzen.
Zusätzlich mag es gelegentlich wünschenswert sein, in
Proben, in denen zwei Spezies von hTRT-RNA vorhanden sind
(z. B. eine 182-hTRT-RNA und eine das hTRT-Protein mit
vollständiger Länge codierende hTRT-RNA), deren relative
und/oder absolute Häufigkeit zu vergleichen.
Die Erfindung stellt eine Vielzahl von Verfahren zum
Nachweis von 182-Varianten bereit. Beispielsweise führt eine
Amplifikation unter Verwendung von Primerpaaren, die die
182-Basenpaardeletion umspannen, zu Produkten
unterschiedlicher Größe, die den deletierten und
undeletierten hTRT-RNAs (falls beide vorhanden sind)
entsprechen und diese können auf Grund ihrer Größe (z. B.
durch Gelelektrophorese) unterschieden werden. Zu den
Beispielen für Primerpaare, die zur Amplifikation des
Bereichs, der die 182 bp-Deletion umspannt, nützlich sind,
gehören TCP1.14 und TCP1.15 (Primersatz 1) oder TCP1.25 und
bTCP6 (Primersatz 2) (siehe Tabelle 2). Diese Primerpaare
können getrennt verwendet werden oder in einem PCR-Ex
periment mit "nested"-Primern, wobei der Primersatz 1
zuerst benutzt wird. Es ist für den Fachmann auch
offensichtlich, daß Hybridisierungsverfahren (z. B. Northern-
Hybridisierung) oder RNAse-Schutzassays zum Nachweis von
hTRT-RNA-Varianten oder um solche Varianten unterscheiden zu
können, unter Verwendung der erfindungsgemäßen hTRT-Nuclein
säuresonde verwendet werden können.
Ein weiteres geeignetes Verfahren umfaßt PCR-Amplifikation
(oder ein äquivalentes Verfahren) mit drei Primern. Ein
Primer ist spezifisch zu jeder hTRT-RNA-Spezies (z. B. wie in
Tabelle 4 veranschaulicht) und ein Primer ist komplementär
zu beiden Spezies (z. B. TCP1.25 (2270-2288)) - analog zu dem
semi-kompetitiven quantitativen PCR-Verfahren, das
ausführlicher vorstehend beschrieben ist. Ein Beispiel eines
Primers, der spezifisch zu SEQ. ID. Nr. 1 ist, ist ein
Primer, der sich innerhalb der Sequenz von 182 Nucleotiden
(d. h. Nucleotide 2345 bis 2526 von SEQ. ID. Nr. 1) anlagert,
z. B. TCP1.73 (2465-2445). Ein Primer, der zu SEQ. ID. Nr. 4
(eine Δ182-Variante) spezifisch ist, ist beispielsweise ein
Primer, der an die Nucleotide 2358-2339 von SEQ. ID. Nr. 4
anlagert (d. h. der Stelle, die der Insertion von 182
Nucleotiden in SEQ. ID. Nr. 1 entspricht). Die absolute
Häufigkeit der Δ182-hTRT-mRNA-Spezies oder deren relative
Häufigkeit im Vergleich zu der Spezies, die das hTRT-Protein
mit vollständiger Länge codiert, kann bezüglich einer
Korrelation mit dem Zellstatus (z. B. der Fähigkeit zur
unbegrenzten Proliferation) analysiert werden. Zahlreiche
weitere Primer können ausgehend von der vorliegenden
Beschreibung ausgewählt werden.
182-Spezies (z. B. SEQ. ID. Nr. 4) spezifischer Primer:
5'-GGCACTGGACGTAGGACGTG-3
hTRT (SEQ. ID. Nr. 1) spezifischer Primer (TCP1.73):
5'-CACTGCTGGCCTCATTCAGGG-3
Gemeinsamer (vorwärts) -Primer (TCP1.25):
5'-TACTGCGTGCGTCGGTATG-3.
5'-GGCACTGGACGTAGGACGTG-3
hTRT (SEQ. ID. Nr. 1) spezifischer Primer (TCP1.73):
5'-CACTGCTGGCCTCATTCAGGG-3
Gemeinsamer (vorwärts) -Primer (TCP1.25):
5'-TACTGCGTGCGTCGGTATG-3.
Zu den weiteren hTRT-Genen von Varianten oder den
entsprechenden Genprodukten, die nachgewiesen werden können,
gehören solche, die durch Codons, die zu einem vorzeitigen
Stop führen, Deletionen, Substitutionen oder Insertionen
charakterisiert sind. Deletionen können anhand der
verringerten Größe des Gens, des mRNA-Transkripts oder der
cDNA nachgewiesen werden. Auf ähnliche Weise gönnen
Insertionen anhand der gesteigerten Größe des Gens, des
mRNA-Transkripts oder der cDNA nachgewiesen werden.
Insertionen und Deletionen können auch eine Verschiebung des
Leserahmens hervorrufen, was zur Entstehung von Codons für
einen frühzeitigen Stop oder längerer offener Leserahmen
führt. Substitutionen können durch Hybridisierung mit einer
Sonde nachgewiesen werden. Diese Veränderungen werden
dadurch nachgewiesen, daß Veränderungen der Größe der hTRT-Poly
peptid-Variante untersucht werden (z. B. durch Western-
Analyse) oder durch Hybridisierung oder spezifische
Amplifikation, je nach dem, wie es zweckmäßig erscheint.
Alternativ können Mutationen durch Sequenzierung des Gens
oder des Genprodukts gemäß Standardverfahren bestimmt
werden. Darüber hinaus und wie bereits vorstehend angemerkt,
können Amplifikationsassays und Hybridisierungssonden
ausgewählt werden, um auf bestimmte Anormalitäten spezifisch
abzielen zu können. Beispielsweise können Nucleinsäuresonden
oder Amplifikationsprimer ausgewählt werden, die spezifisch
mit der Region hybridisieren, die die Deletion, Substitution
oder Insertion enthält bzw. diese spezifisch amplifiziert.
An der Stelle, wo das hTRT-Gen eine solche Mutation enthält
(1) hybridisiert die Sonde entweder nicht, oder die
Amplifikationsreaktion liefert keine spezifische
Amplifikation oder wird zu einer Veränderung der Größe des
Amplifikationsprodukts oder des Hybridisierungssignals
führen; oder (2) die Sonde oder Amplifikationsreaktion
umfaßt die gesamte Deletion oder beide Enden der Deletion
(Deletionsverbindungspunkt) oder (3) ähnlicherweise können
Sonden und Amplifikationsprimer ausgewählt werden, die
spezifisch auf Punktmutationen oder Insertionen abzielen.
Mutationen im hTRT-Gen könnten für die Entstehung einer
Erkrankung verantwortlich sein oder könnten zu einem
Krankheitszustand beitragen. Veränderungen der genomischen
DNA von hTRT könnten die Spiegel der Gentranskription
beeinflussen, zu Veränderungen von Aminosäureresten im hTRT-Pro
tein führen, dazu führen, daß verkürzte hTRT-Polypeptide
hergestellt werden, die Prozessierungswege der prä-mRNA
ändern (was die hTRT-mRNA-Spiegel verändern kann) und auch
weitere Konsequenzen zur Folge haben.
Änderungen der genomischen DNA in Nicht-hTRT-Loci können
auch die Expression von hTRT oder Telomerase durch
Veränderung der Enzyme oder zellulären Prozesse
beeinflussen, die für die Regulation der Expression von
hTRT, hTR und Telomerase-assoziierten Proteinen
verantwortlich sind, sowie für die Prozessierung und die
RNP-Assemblierung und den Transport. Änderungen, die die
hTRT-Expression, die Prozessierung oder RNP-Assemblierung
betreffen, könnten auch für den Verlauf einer
Krebserkrankung, für Alterserkrankungen, für Krankheiten
hinsichtlich eines DNA-Schadens etc. wichtig sein.
Der Nachweis von Mutationen in hTRT-mRNA oder dem
entsprechenden Gen und Genkontrollelementen kann auf
vielfältige Weise gemäß den hier beschriebenen Verfahren
durchgeführt werden. Dazu gehören folgende
veranschaulichende Beispiele: Es kann ein Verfahren, das als
"Primer-Screening" bezeichnet wird, verwendet werden; es
werden PCR-Primer entworfen, deren 3'-Enden sich an
Nucleotide in einer Proben-DNA (oder RNA), die
möglicherweise mutiert sind, anlagern. Falls die DNA (oder
RNA) durch die Primer amplifiziert wird, paaren die 3'-Enden
mit den Nucleotiden im Gen, falls die DNA nicht amplifiziert
wird, dann paaren entweder eines oder beide Enden nicht mit
den Nucleotiden im Gen, was die Anwesenheit einer Mutation
anzeigt. Auf ähnliche Weise können Primer so entworfen
werden, daß Punktmutationen unter Verwendung der Ligase-
Kettenreaktion (LCR, vorstehend beschrieben) nachgewiesen
werden können. Eine weitere Technik, die bei dem
vorliegenden Verfahren angewandt werden kann, basiert auf
Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus, RFLP (Pourzand,
C., Cerutti, P. Mutat. Res. 288 (1993), 113-121). Dabei wird
ein Southern-Blot menschlicher genomischer DNA, die mit
verschiedenen Restriktionsenzymen gespalten wurde, mit einer
hTRT-spezifischen Sonde hybridisiert. Unterschiede
hinsichtlich der Fragmentanzahl oder Fragmentgrößen zwischen
der Probe und einer Kontrolle zeigen eine Veränderung der
experimentellen Probe an, normalerweise eine Insertion oder
Deletion. Einzelstrang-Konformationspolymorphismus, SSCP,
(Orrita, M. et. al., PNAS USA 86 (1989), 2766-70) ist eine
weitere Technik, die für das vorliegende Verfahren angewandt
werden kann. SSCP basiert auf der unterschiedlichen
Wanderung von denaturierten einzelsträngigen DNAs des
Wildtyps bzw. einer Mutante (die normalerweise durch PCR
erzeugt wurden). Einzelsträngige DNA nimmt eine
dreidimensionale Konformation ein, die sequenzspezifisch
ist. Auch Sequenzunterschiede, die lediglich eine einzelne
Base betreffen, können zu einer Mobilitätsverschiebung in
einem nicht-denaturierenden Gel führen. SSCP ist aufgrund
seiner Einfachheit eines der am häufigsten verwendeten
Verfahren zum Mutations-Screenen. Eine weitere Technik, die
bei dem vorliegenden Verfahren angewandt werden kann, ist
die denaturierende Gradientengelelektrophorese, DGGE (Myers
et al., Methods in Enzymology 155 (1987), 501-527). Mittels
DGGE können Mutationen aufgrund des Schmelzverhaltens
doppelsträngiger DNA identifiziert werden. Zur Analyse des
Schmelzprofils von experimenteller DNA und Kontroll-DNA wird
eine spezielle Ausrüstung für denaturierende Elektrophorese
verwendet: Eine eine Mutation enthaltende DNA besitzt eine
unterschiedliche Mobilität in diesen Gelsystemen im
Vergleich zur Kontrolle. Die diskutierten Beispiele
veranschaulichen allgemein angewandte Verfahren, darüber
hinaus gibt es zahlreiche andere Verfahren, die dem Fachmann
bekannt sind.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner Verfahren und
Reagenzien zur Analyse des Karyotyps oder für andere
Chromosomen-Analysen bereit, wobei hTRT-Sequenzsonden
verwendet werden und/oder der Nachweis oder die
Lokalisierung von hTRT-Gensequenzen in Chromosomen eines
Patienten, einer menschlichen Zellinie oder einer nicht
menschlichen Zelle. In einer Ausführungsform kann die
Amplifikation (d. h. eine Veränderung in der Kopienanzahl),
Deletion (d. h. partielle Deletion), Insertion, Substitution
oder Veränderungen in der chromosomalen Lokalisierung (z. B.
Translokation) eines hTRT-Gens mit dem Vorhandensein eines
pathologischen Zustands oder einer Prädisposition für die
Entwicklung eines pathologischen Zustands (z. B. Krebs)
korreliert sein.
Es wurde in der vorliegenden Erfindung festgestellt, daß in
normalen menschlichen Zellen das hTRT-Gen nahe dem Telomer
von Chromosom 5p kartiert (siehe das nachstehende Beispiel
5). Der am nächsten benachbarte STS-Marker ist D5S678.
Dessen Lage kann zur Identifizierung von Markern verwendet
werden, die mit dem hTRT-Gen eng gekoppelt sind. Diese
Marker können zur Identifizierung von YACs, STSs, Cosmiden,
BACs, lambda-Phagen oder P1-Phagen oder anderen Clonen
verwendet werden, die genomische hTRT-Sequenzen oder
-Kontrollelemente enthalten. Die Marker oder die Lage des
Gens können verwendet werden, um menschliche Gewebeproben
hinsichtlich Veränderungen in der normalen Lage des hTRT-Gens,
dessen Organisation oder Sequenz, die mit dem
Auftreten eines Krebstyps oder einer Krankheit assoziiert
sind, zu untersuchen. Diese Information kann dann für die
Diagnose oder Prognose hinsichtlich der beteiligten
Krankheit oder des Krebses verwendet werden. Darüber hinaus
kann die Art jeder Veränderung des hTRT-Gens eine
Information über die Ursachen liefern, durch die Zellen
unsterblich werden. Beispielsweise könnte ein
Translokationsereignis anzeigen, daß die Aktivierung der
hTRT-Expression in manchen Fällen durch Austausch des hTRT-Pro
motors gegen einen anderen Promotor geschieht, der die
hTRT-Transkription auf ungünstige Weise steuert.
Erfindungsgemäße Verfahren und Reagenzien dieses Typs können
zur Entwicklung von Strategien verwendet werden, mit denen
hTRT-Aktivierungsprozesse bekämpft werden können. Die Lage
ist auch für die Bestimmung der Natur der hTRT-Genrepression
in normalen somatischen Zellen von Nutzen, beispielsweise
bei der Untersuchung, ob die Lage innerhalb eines Teils von
nicht-exprimierendem Heterochromatin ist. Assays, die auf
einer Nuclease-Überempfindlichkeit basieren, zur
Unterscheidung zwischen Heterochromatin und Euchromatin sind
beispielsweise beschrieben in Wu et al., Cell 16 (1979),
797; Groudine und Weintraub, Cell 30 (1982), 131 und Gross
und Garrard, Ann. Rev. Biochem. 57 (1988), 159.
In einer Ausführungsform werden Veränderungen des hTRT-Gens
durch Analyse des Karyotyps identifiziert, wobei zahlreiche
auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren verwendet werden
können. Ein zweckmäßiges Verfahren ist die in situ-
Hybridisierung (ISH). Wenn in situ-Hybridisierungsverfahren
für die Karyotyp-Analyse verwendet werden, wird
normalerweise eine nachweisbare oder nachweisbar markierte
Probe mit einer chromosomalen Probe in situ zur
Lokalisierung einer hTRT-Gensequenz hybridisiert. Im
allgemeinen umfaßt ISH einen oder mehrere der folgenden
Schritte: (1) Fixierung des Gewebes, der Zelle oder der
anderen zu analysierenden biologischen Struktur; (2)
Vorhybridisierungsbehandlung der biologischen Struktur zur
Steigerung der Zugänglichkeit der Ziel-DNA (z. B.
Denaturierung mit Hitze oder Alkali) und zur Verringerung
einer unspezifischen Bindung (z. B. durch Blockierung des
Hybridisierungsvermögens repetitiver Sequenzen (z. B. mittels
menschlicher genomischer DNA); (3) Hybridisierung von einer
oder mehreren Nucleinsäuresonden (z. B. übliche
Nucleinsäuren, PNAs oder andere Nucleinsäure-Analoge) mit
der Nucleinsäure in der biologischen Struktur oder dem
Gewebe; (4) Waschschritte nach der Hybridisierung zur
Entfernung von Nucleinsäurefragmenten, die während der
Hybridisierung nicht gebunden waren und (5) Nachweis der
hybridisierten Nucleinsäurefragmente. Die in jedem dieser
Schritte verwendeten Reagenzien und anzuwendenden
Bedingungen hängen von der jeweiligen Anwendung ab.
Natürlich können diese Schritte auf vielfältige Weise
modifiziert werden, wie dies dem Fachmann bekannt ist.
In einer Ausführungsform der ISH wird die hTRT-Sonde mit
einem Fluoreszenzmarker markiert (in situ
Fluoreszenzhybridisierung; "FISH"). Normalerweise ist es
wünschenswert, eine "zwei-Farben"-Fluoreszenz-in-situ-
Hybridisierung anzuwenden, bei denen zwei mit einem
unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoff markierte Sonden
verwendet werden. Eine Testsonde, die mit der gewünschten
hTRT-Sequenz hybridisiert, wird mit einem Farbstoff
markiert, und eine Kontrollsonde, die mit einem anderen
Bereich hybridisiert wird, wird mit einem zweiten Farbstoff
markiert. Als Kontrollsonde kann eine Nucleinsäure verwendet
werden, die mit einem stabilen Bereich des gewünschten
Chromosoms, beispielsweise dem Zentromerbereich,
hybridisiert. Auf diese Weise kann Unterschieden in der
Effizienz der Hybridisierung, die von Probe zu Probe
schwanken kann, Rechnung getragen werden.
Die ISH-Verfahren zum Nachweis chromosomaler Anomalien (z. B.
FISH) können an Nanogrammengen der fraglichen Nucleinsäuren
durchgeführt werden. Es können in Paraffin eingebettete
normale Gewebe oder Tumorsektionen verwendet werden, aber
auch frisches oder gefrorenes Material, Gewebe oder
Sektionen. Da FISH bei diesem begrenzten Material angewandt
werden kann, können auch Präparationen von nicht
kultivierten primären Tumoren, die nur in Spuren hergestellt
werden können ("touch"-Präparationen) verwendet werden
(siehe z. B. Kallioniemi et al., Cytogenet. Fell Genet. 60
(1992) 190). Beispielsweise können kleine Biopsie-
Gewebeproben von Tumoren für "touch"-Präparationen verwendet
werden (siehe z. B. Kallioniemi et al., a.a.O.). Es können
auch kleine Anzahlen von Zellen analysiert werden, die durch
Saugbiopsie erhalten wurden oder Zellen in
Körperflüssigkeiten (z. B. Blut, Urin, Sputum etc.)
analysiert werden. Für eine pränatale Diagnose zählen
Amnionflüssigkeit, Blut der Mütter etc. zu den geeigneten
Proben. Zweckmäßige für die hier beschriebenen Verfahren und
Reagenzien anwendbare Hybridisierungsprotokolle sind
beschrieben in Pinkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85
(1988), 9138; EP-A1-0 430 402; Choo (Herausg. Methods in
Molecular Biology Vol. 33: In Situ Hybridization Protocols,
Humana Press-Totowa, New Jersey (1994) und Kallioniemi et
al., a.a.O.
Zu weiteren für die Karyotyp-Analyse nützlichen Verfahren
zählen beispielsweise Verfahren wie quantitatives Southern-
Blotting, quantitative PCR oder vergleichende genomische
Hybridisierung (Kallioniemi et al., Science 258 (1992),
818), wobei die erfindungsgemäßen hTRT-Sonden und -Primer
zur Identifikation einer Amplifikation, Deletion, Insertion,
Substitution von hTRT-Sequenzen in Chromosomen in einer
biologischen Probe oder andere Rearrangements von hTRT-Se
quenzen verwendet werden können.
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren und Reagenzien
zum Nachweis und zur Quantifizierung von hTRT-Polypeptiden
bereit. Zu diesen Verfahren zählen analytische biochemische
Verfahren, beispielsweise Elektrophorese,
Massenspektroskopie, "Gel shift", Kapillarelektrophorese,
chromatographische Verfahren, beispielsweise
Größenausschluß, Hochdruckflüssigkeitschromatographie
(HPLC), Dünnschichtchromatographie (TLC),
Hyperdiffusionschromatographie etc., oder verschiedene
immunologische Verfahren, beispielsweise Flüssigkeits- oder
Gel-Präzipitin-Reaktion, Immundiffusion (Einzel- oder
Doppel-), Immunelektrophor 99999 00070 552 001000280000000200012000285919988800040 0002019743497 00004 99880ese, Radioimmunassay (RIA),
enzymverbundene Immunabsorptionsbestimmungen (ELISAs),
Immunfluoreszenz-Assays, Western-Blotting,
Massenspektrometrie und weitere Verfahren, die nachstehend
beschrieben werden und für den Fachmann nach Lesen dieser
Beschreibung offensichtlich sind.
In einer Ausführungsform werden die hTRT-Polypeptide durch
elektrophoretische Proteinauftrennung nachgewiesen. Ein
Aspekt betrifft ein zweidimensionales Elektrophoresesystem.
Mittel zum Nachweis von Proteinen unter Verwendung von
Elektrophoreseverfahren sind dem Fachmann gut bekannt (siehe
allgemein R. Scopes (1982) Protein Purification, Springer-
Verlag, N.Y.; Deutscher, Methods in Enzymology Vol. 182
(1990): Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc., N.Y.
In einer ähnlichen Ausführungsform wird ein "mobility
shift"-Assay verwendet (siehe z. B. Ausubel et al., a.a.O.).
Beispielsweise assoziiert markierte hTR mit hTRT und wandert
mit veränderter Mobilität bei der Elektrophorese in einem
nicht-denaturierten Polyacrylamidgel etc. Somit führt
beispielsweise dann, wenn eine markierte hTR-Sonde oder ein
markierter Telomerase-Primer mit einer hTRT enthaltenden
Probe vermischt wird oder mit hTRT coexprimiert wird, (z. B.
in einem zellfreien Expressionssystem) das Vorhandensein von
hTRT-Protein (oder eines hTRT codierenden Polynucleotids) in
der Probe zu einer nachweisbaren Änderung der hTRT-Mo
bilität.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren zum Nachweis
von hTRT-Polypeptiden bereit, wobei eine oder mehrere
erfindungsgemäße Antikörperreagenzien verwendet werden (d. h.
Immunassays). Wie hier verwendet, bezeichnet ein Immunassay
einen Assay, bei dem ein Antikörper (wie hier ausführlich
definiert gehören dazu auch Fragmente, chimäre und andere
bindende Agenzien) verwendet wird, der spezifisch an ein
hTRT-Polypeptid oder -Epitop bindet. Erfindungsgemäße
Antikörper können durch eine Vielzahl von dem Fachmann
bekannten Verfahren, beispielsweise den vorstehend
beschriebenen, hergestellt werden.
Es ist eine Anzahl von gut etablierten immunologischen
Bindungs-Assayformaten bekannt, die für die Durchführung der
Erfindung geeignet sind (siehe z. B. US-Patente 4,366,241,
4,376,110, 4,517,288 und 4,837,168 und Methods in Cell
Biology Volume 37: Antibodies in Cell Biology, Asai,
Herausg. Academic Press, Inc. New York (1993); Basic and
Clinical Immunology, 7. Ausgabe, Stites & Terr Herausg.
(1991) Harlow und Lane, a.a.O.) z. B. Kapitel 14) und Ausubel
et al., a.a.O. (z. B. Kapitel 11), wobei jedes dieser
Dokumente durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit und für alle
Zwecke als Bestandteil dieser Beschreibung angesehen werden
kann. Typischerweise wird in immunologischen Bindungsassays
(oder Immunassays) ein "Einfang"-Agens zur spezifischen
Bindung an den Analyten und oft auch dessen Immobilisierung
verwendet. In einer Ausführungsform ist das "Einfang"-Agens
eine Einheit, die an ein hTRT-Polypeptid oder eine
Untersequenz spezifisch bindet, beispielsweise ein anti
hTRT-Antikörper. In einer alternativen Ausführungsform kann
das "Einfang"-Agens unter solchen Bedingungen an hTRT
assoziiertes Protein oder -RNA binden, bei denen das hTRT-asso
ziierte Molekül an die hTRT gebunden bleibt (so daß,
falls das hTRT-assoziierte Molekül immobilisiert ist, das
hTRT-Protein ähnlich immobilisiert ist). In Assays, bei
denen ein hTRT-assoziiertes Molekül eingefangen wird, wird
normalerweise das assoziierte hTRT-Protein, beispielsweise
mittels eines anti-hTRT-Antikörpers oder ähnlichem
nachgewiesen werden. Immunassays zum Nachweis von
Proteinkomplexen sind auf dem Fachgebiet bekannt (siehe z. B.
Harlow und Lane, a.a.O., S. 583).
Normalerweise wird das zu untersuchenden hTRT-Genprodukt
direkt oder indirekt mittels einer nachweisbaren Markierung
nachgewiesen. Die in dem Assay verwendete spezielle
Markierung bzw. die nachweisbare Gruppe ist normalerweise
kein kritischer Aspekt der Erfindung solange diese nicht die
spezifische Bindung des in dem Assay verwendeten Antikörpers
oder den Antikörper wesentlich stört. Die Markierung kann
mit dem "Einfang"-Agens kovalent verknüpft sein (z. B. ein
anti-TRT-Antikörper) oder er kann an eine dritte Einheit
angeknüpft sein, beispielsweise einem anderen Antikörper,
der beispielsweise an das hTRT-Polypeptid spezifisch bindet
(an ein anderes Epitop als das, das von dem "Einfang"-Agens
erkannt wird, das "Einfang"-Agens (z. B. ein anti- (erster
Antikörper) Immunglobulin); ein anti-TRT-Antikörper; ein
Antikörper, der an einen anti-TRT-Antikörper bindet oder ein
Antikörper/Telomerase-Komplex (z. B. über die Bindung an ein
assoziiertes Molekül, beispielsweise ein Telomerase
assoziiertes Protein). Andere Proteine, die an dem in dem
Assay verwendeten Antikörper binden können, z. B. Protein A
oder Protein G, können auch markiert sein. In einigen
Ausführungsformen kann es zweckmäßig sein, mehr als ein
markiertes Molekül zu verwenden (d. h. solche, die
voneinander unterschieden werden können). Zusätzlich kann
ein markierter Antikörper, der das Protein oder die RNA, die
mit dem hTRT-Protein assoziiert ist, erkennt, verwendet
werden, wenn das durch das "Einfang"-Agens (z. B. ein anti
hTRT-Antikörper) gebundene (beispielsweise immobilisierte)
Ziel ein Komplex ist (d. h. ein Komplex aus hTRT und einem
TRT-assoziierten Protein, hTR oder einem anderen TRT-asso
ziierten Molekül. Wenn es sich bei dem Komplex um einen
Protein/Nucleinsäure-Komplex (z. B. TRT-hTR) handelt, kann
das Reportermolekül ein Polynucleotid oder ein anderes
Molekül (z. B. ein Enzym) sein, das die RNA-Komponente des
Komplexes erkennt.
Bei einigen Immunassayformaten ist die Verwendung von
markierten Bestandteilen nicht erforderlich. Beispielsweise
können Agglutinationsassays zum Nachweis des Vorhandenseins
der Ziel-Antikörper verwendet werden. In diesem Fall werden
Antigen-geschichtete Partikel durch die Zielantikörper
enthaltenden Proben agglutiniert. Bei diesem Assay-Format
müssen die Bestandteile nicht markiert sein und die
Anwesenheit des Ziel-Antikörpers kann durch einfache
visuelle Überprüfung nachgewiesen werden.
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren und Reagenzien
für kompetitive und nicht-kompetitive Immunassays zum
Nachweis von hTRT-Polypeptiden bereit. Bei nicht
kompetitiven Immunassays handelt es sich um Assays, bei
denen die Menge des eingefangenen Analyten (in diesem Fall
hTRT) direkt gemessen wird. Ein Beispiel für einen solchen
Assay ist ein auf monoclonalen Antikörpern basierender "two
site"-Immunassay, bei dem monoclonale Antikörper verwendet
werden, die mit zwei nicht-interferierenden Epitopen auf dem
hTRT-Protein reaktionsfähig sind. Siehe beispielsweise Maddox
et al, J. Exp. Med. 158 (1983), 1211 bezüglich
Hintergrundinformation. In einem bevorzugten "Sandwich"-As
say wird das "Einfang"-Agens (z. B. ein anti-TRT-Anti
körper) direkt an ein festes Substrat gebunden, wo es
immobilisiert wird. Diese immobilisierten Antikörper fangen
dann jedes in der Testprobe vorhandene hTRT-Protein ein. Das
so immobilisierte hTRT kann dann markiert werden, d. h. durch
Bindung an einen zweiten, eine Markierung tragenden anti
hTRT-Antikörper. In einer alternativen Ausführungsform kann
der zweite anti-hTRT-Antikörper zwar keine Markierung
aufweisen, jedoch durch einen markierten dritten Antikörper
gebunden werden, der spezifisch für Antikörper der Spezies
ist, von der der zweite Antikörper stammt. In einer weiteren
alternativen Ausführungsform kann der zweite Antikörper mit
einer nachweisbaren Einheit modifiziert sein, beispielsweise
Biotin, die ein drittes markiertes Molekül spezifisch binden
kann, beispielsweise Enzym-markiertes Streptavidin.
In kompetitiven Assays wird die Menge des in einer Probe
vorhandenen hTRT-Proteins indirekt durch Messung der Menge
an zugegebenen (exogenen) hTRT bestimmt, das durch das in
(z. B. einem anti-TRT-Antikörper) verdrängt, oder
wegkompetitiert wurde. In einem dieser kompetitiven Assays
wird eine bekannte Menge eines markierten hTRT-Proteins zu
der Probe gegeben und danach die Probe mit einem "Einfang"-Agens
(z. B. einem Antikörper, der hTRT-Protein spezifisch
bindet) in Kontakt gebracht. Die Menge an exogenem
(markiertem) an dem Antikörper gebundenem hTRT-Protein ist
umgekehrt proportional zu der Konzentration an in der Probe
vorhandenem hTRT-Protein. In einer Ausführungsform ist der
Antikörper auf einem festen Substrat immobilisiert. Die
Menge an hTRT-Protein, das an den Antikörper gebunden ist,
kann entweder durch Messung der Menge an hTRT-Protein, die
in einem TRT-Antikörper-Komplex vorhanden ist, bestimmt
werden oder alternativ durch Bestimmung der Menge an
übrigbleibendem nicht-komplexierten TRT-Protein. Die Menge
an hTRT-Protein kann durch die Bereitstellung eines
markierten hTRT-Moleküls nachgewiesen werden.
Ein Hapten-Hemmungsassay stellt ein weiteres Beispiel für
einen kompetitiven Assay dar. In diesem Assay ist hTRT-Pro
tein auf einem festen Substrat immobilisiert. Eine
bekannte Menge an anti-TRT-Antikörper wird zu der Probe
gegeben und danach die Probe mit dem immobilisierten hTRT-Pro
tein in Kontakt gebracht. In diesem Fall ist die Menge an
anti-TRT-Antikörper, der an das immobilisierte hTRT-Protein
gebunden ist, umgekehrt proportional zu der Menge an hTRT-Pro
tein, das in der Probe vorhanden ist. Die Menge an
immobilisiertem Antikörper kann entweder durch Nachweis der
immobilisierten Antikörperfraktion bestimmt werden, oder der
Antikörperfraktion, die in Lösung bleibt. Dabei kann der
Nachweis direkt sein, im Falle, wenn der Antikörper markiert
ist, oder indirekt, im Falle, daß die Markierung an ein
Molekül gebunden ist, das an den vorstehend beschriebenen
Antikörper spezifisch bindet.
Die Erfindung stellt auch Reagenzien und Verfahren zum
Nachweis und zur Quantifizierung des Vorhandenseins von hTRT
in der Probe mittels eines Immunblots (Westernblot)-Formats
bereit. In diesem Format werden hTRT-Polypeptide in einer
Probe von anderen Bestandteilen der Probe durch
Gelelektrophorese (z. B. auf der Basis des
Molekulargewichts), die abgetrennten Proteine auf einen
geeigneten festen Träger überführt (z. B. ein
Nitrocellulosefilter, ein Nylonfilter, ein derivatisierter
Nylonfilter etc.) und der Träger wird mit erfindungsgemäßen
anti-TRT-Antikörpern inkubiert. Die anti-TRT-Antikörper
binden spezifisch an hTRT oder anderem TRT auf dem festen
Träger. Diese Antikörper können entweder direkt markiert
sein oder sie können alternativ anschließend unter
Verwendung markierter Antikörper (z. B. markierten Schaf
anti-Maus-Antikörpern) nachgewiesen werden oder mittels
anderer markierter Reagenzien, die spezifisch an den anti-
TRT-Antikörper binden.
Zu weiteren Assayformaten zählen Liposom-Immunassays (LIA),
bei denen Liposome verwendet werden, die so konstruiert
wurden, daß sie spezifische Moleküle (z. B. Antikörper)
binden und eingekapselte Reagenzien oder Marker freisetzen.
Die freigesetzten Chemikalien können im Anschluß daran gemäß
Standardverfahren nachgewiesen werden (siehe Monroe et al.,
Amer. Clin. Prod. Rev. 4 (1986), 34).
Wie bereits vorstehend erwähnt, besitzen Assay-Formate, die
FACS (und äquivalente Instrumente oder Verfahren) verwenden,
Vorteile, wenn hTRT-Genprodukte in einer heterogenen Probe
(z. B. einer sowohl normale als auch maligne Zellen
enthaltenden Biopsieprobe) gemessen werden.
Wie bereits vorstehend angemerkt, können in Abhängigkeit von
dem Assay verschiedene Bestandteile, einschließlich dem
Antigen, Zielantikörper oder anti-hTRT-Antikörper, an eine
feste Oberfläche oder einen festen Träger (d. h. ein
Substrat, eine Membran oder Filterpapier) gebunden sein.
Viele Verfahren zur Immobilisierung von Biomolekülen an eine
Vielzahl von festen Oberflächen sind auf dem Fachgebiet
bekannt. Die feste Oberfläche kann beispielsweise eine
Membran sein (z. B. Nitrocellulose), eine Mikrotiterplatte
(z. B. PVC, Polypropylen oder Polystyrol), ein Teströhrchen
(Glas oder Plastik), ein Teststreifen (z. B. Glas, PVC,
Polypropylen, Polystyrol, Latex etc.), ein Gefäß für eine
Mikrozentrifuge oder ein Glas- oder Plastikkügelchen. Der
gewünschte Bestandteil kann kovalent gebunden sein oder
durch unspezifische Bindung nicht-kovalent angeknüpft sein.
Eine große Anzahl verschiedener organischer und
anorganischer Polymere, die sowohl natürlich als auch
synthetisch sein können, können als Material für die feste
Oberfläche verwendet werden. Zu solchen Polymeren zählen
Polyethylen, Polypropylen, Poly(4-methylbuten), Polystyrol,
Polymethacrylat, Poly(ethylenterephthalat), Rayon, Nylon,
Poly(vinylbutyrat), Polyvinylidendifluorid (PVDF), Silikone,
Polyformaldehyd, Cellulose, Celluloseacetat, Nitrocellulose
etc. Zu den weiteren Materialien, die verwendet werden
können, zählen Papier, Gläser, Keramiken, Metalle,
Metalloide, Materialien mit Halbleitereigenschaften, Zemente
etc. Zusätzlich können gelbildende Substanzen verwendet
werden, beispielsweise Proteine (z. B. Gelatinen),
Lipopolysaccharide, Silikate, Agarose und Polyacrylamide.
Geeignet sind auch Polymere, die mehrere wäßrige Phasen
bilden, beispielsweise Dextrane, Polyalkylenglykole oder
Tenside, beispielsweise Phospholipide, langkettige (12 bis
24 Kohlenstoffatome) Alkylammoniumsalze etc. Bei porösen
festen Oberflächen können in Abhängigkeit von der Art des
Systems verschiedene Porengrößen verwendet werden.
Zur Herstellung der Oberfläche kann eine Vielfalt von
verschiedenen Substanzen zum Erhalt verschiedener
Eigenschaften verwendet werden, insbesondere als Laminate.
Beispielsweise können zur Vermeidung einer unspezifischen
Bindung, zur Vereinfachung einer kovalenten Konjugation, zur
Verstärkung des Signalnachweises etc. Proteinbeschichtungen
wie Gelatine, verwendet werden.
Wenn eine kovalente Bindung zwischen einer Verbindung und
der Oberfläche erwünscht ist, ist die Oberfläche
normalerweise polyfunktionell oder sie kann polyfunktionell
gemacht werden. Zu den funktionellen Gruppen, die auf der
Oberfläche vorhanden und für eine Verknüpfung verwendet
werden können, gehören Carboxylsäuren, Aldehyde,
Aminogruppen, Cyangruppen, Ethylengruppen, Hydroxylgruppen,
Mercaptogruppen etc. Die Art und Weise, wie solche
Verknüpfungen durchgeführt werden können, ist für eine große
Anzahl von Verbindungen an verschiedene Oberflächen
allgemein bekannt und in der Literatur ausführlich
beschrieben. Siehe beispielsweise Immobilized Enzymes,
Ichiro Chibata, Halsted Press, New York, 1978 und
Cuatrecasas, J. Biol. Chem. 245 (1970) 3059).
Zusätzlich zur kovalenten Bindung können verschiedene
Verfahren zur nicht-kovalenten Bindung eines
Assaybestandteils verwendet werden. Eine nicht-kovalente
Bindung ist typischerweise die unspezifische Absorption
einer Verbindung an die Oberfläche.
Natürlich ist die Herabsetzung einer unspezifischen Bindung
in Immunassays wünschenswert. Insbesondere dann, wenn der
Assay ein Antigen oder einen Antikörper beinhaltet, der auf
einem festen Substrat immobilisiert ist, ist die Minimierung
der Menge an unspezifischer Bindung an das Substrat
wünschenswert. Mittel zur Herabsetzung einer solchen
unspezifischen Bindung sind dem Fachmann gut bekannt. Dies
beinhaltet typischerweise die Beschichtung des Substrats mit
einer Proteinzusammensetzung. Insbesondere Proteinzusammen
setzungen, die beispielsweise Rinderserumalbumin (BSA),
fettfreies Milchpulver und Gelatine werden häufig verwendet,
wobei gelegentlich Milchpulver bevorzugt wird. In einer
alternativen Ausführungsform kann die Oberfläche so
gestaltet sein, daß sie einen Bestandteil unspezifisch
bindet, einen anderen jedoch nicht wesentlich bindet.
Beispielsweise bindet eine ein Lectin, wie beispielsweise
Concanavalin A, tragende Oberfläche eine Kohlenhydrat
enthaltende Verbindung, jedoch nicht ein unglykosyliertes
markiertes Protein. Die US-Patente Nr. 4,447,576 und
4,254,082 geben einen Überblick über verschiedene feste
Oberflächen zur Verwendung bei der nicht-kovalenten
Verknüpfung von Assay-Bestandteilen.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Reagenzien und Assays
zum Nachweis von hTRT-spezifischen Immunglobulinen bereit.
In einer Ausführungsform wird immobilisierte hTRT (z. B.
rekombinante hTRT, die an die Vertiefung einer
Mikrotiterplatte gebunden ist) mit Serum von einem Patienten
unter Bedingungen inkubiert, bei denen anti-hTRT-Antikörper,
wenn sie vorhanden sind, die immobilisierte hTRT binden.
Nach dem Waschen zur Entfernung von unspezifisch gebundenem
Immunglobulin können gebundene Serumantikörper, falls sie
vorhanden sind, durch Zugabe von nachweisbar markierten
anti-(menschliches Ig)-Antikörpern nachgewiesen werden
(alternative Ausführungsform oder Variationen sind dem
Fachmann gut bekannt; siehe beispielsweise Harlow, a.a.O.,
Kapitel 14). Diese Assays sind für den Nachweis von anti
hTRT-Antikörpern in beliebigen Quellen einschließlich
tierischem oder menschlichem Serum oder einem Träger, wie
beispielsweise Kochsalzlösung, von Nutzen. In einer
Ausführungsform werden die Assays zum Nachweis oder zur
Überwachung einer Immunantwort auf hTRT-Proteine in einem
Patienten verwendet, insbesondere einer Autoimmunantwort
(z. B. anti-Telomerase). Anti-hTRT-Antikörper können im
Serum, an den Geweben oder Flüssigkeiten von einem Patienten
vorhanden sein, der an einer Autoimmunkrankheit oder einem
anderen Zustand leidet.
Die hier beschriebenen diagnostischen und prognostischen
Assays können in verschiedenen Kombinationen und auch in
Verbindung mit anderen diagnostischen oder prognostischen
Tests durchgeführt werden. Wenn beispielsweise die
vorliegenden Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins von
Krebszellen in einer Patientenprobe verwendet werden, kann
die Anwesenheit von hTRT dazu benutzt werden, um das
Krankheitsstadium zu bestimmen, ob es wahrscheinlich ist,
daß ein bestimmter Tumor in angrenzendes Gewebe eindringt
oder zu einem entfernten Standort metastasiert und ob ein
erneutes Auftreten des Krebses wahrscheinlich ist. Zu den
Tests, die zusätzliche Informationen liefern können, gehören
die mikroskopische Analyse von Biopsieproben, der Nachweis
von Antigenen (z. B. Zelloberflächenmarkern), die mit einer
möglichen Tumorentstehung assoziiert sind (z. B. mittels
Histocytochemie, FACS etc.), bildgebende Verfahren (z. B.
nach Verabreichung eines markierten anti-Tumor-Antikörpers
an einen Patienten), Telomerase-Aktivitätsassays,
Telomerase-Längenassays, hTR-Assays etc. Solche kombinierten
Tests können bezüglich des Fortschreitens einer Krankheit
nützliche Information liefern.
Die Kombination von Assays kann auch nützliche Information
liefern. Beispielsweise können, wie bereits vorstehend
angemerkt, Assays für hTRT-mRNA mit Assays für hTR (RNA)
oder Telomerase-Aktivität (d. h. TRAP) kombiniert werden, um
so Informationen über Telomerase-Assemblierung und -Funktion
zu liefern.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Kits bereit, die das
Screenen, die Überwachung, Diagnose und Prognose bei
Patienten mit einem mit Telomerase in Zusammenhang stehenden
Zustand von Nutzen sind oder zur Bestimmung des
Expressionsspiegels von hTRT in Zellen oder Zellinien. Die
Kits enthalten eines oder mehrere Reagenzien zur Bestimmung
des Vorhandenseins oder des Fehlens eines hTRT-Genprodukts
(RNA oder Protein) oder zur Quantifizierung der Expression
des hTRT-Gens. Zu den bevorzugten Reagenzien gehören
Nucleinsäureprimer und Sonden, die an das hTRT-Gen, -RNA,
-cDNA oder Anteile davon binden, aber auch Proteine,
Peptide, Antikörper und Kontroll-Primer, -Sonden,
-Oligonucleotide, -Proteine, -Peptide und -Antikörper.
Weitere Substanzen können aufgenommen werden, dazu gehören
Enzyme (z. B. reverse Transkriptasen, DNA-Polymerasen,
Ligasen), Puffer und Reagenzien (Markierungen, dNTPs).
Die Kits können alternativ oder in Kombination mit
irgendwelchen anderen hier beschriebenen Bestandteilen einen
Antikörper enthalten, der spezifisch an hTRT-Polypeptide
oder Untersequenzen davon bindet. Es kann ein monoclonaler
oder polyclonaler Antikörper sein. Der Antikörper kann an
eine weitere Einheit konjugiert sein, beispielsweise eine
Markierung und/oder er kann auf einem festen Träger
(Substrat) immobilisiert sein. Der (die) Kit(s) kann
(können) auch einen zweiten Antikörper zum Nachweis von
hTRT-Polypeptid/Antikörper-Komplexen oder zum Nachweis von
hybridisierten Nucleinsäuresonden enthalten, sowie ein oder
mehrere hTRT-Peptide oder -Proteine zur Kontrolle oder
andere Reagenzien.
Der Antikörper oder die Hybridisierungssonde kann frei
vorliegen oder an einen festen Träger immobilisiert sein,
beispielsweise ein Teströhrchen, eine Mikrotiterplatte, ein
Teststäbchen etc. Der Kit kann auch Anleitungen enthalten,
die die Verwendung des Antikörpers oder der
Hybridisierungssonde in einem Assay zum Nachweis einer
Prädisposition für TRT beschreiben. Der Kit kann geeignete
Reagenzien zum Nachweis von Markierungen oder zur Markierung
positiver und negativer Kontrollen, Waschlösungen,
Verdünnungspuffer etc. enthalten.
In einer Ausführungsform enthält der Kit ein Primerpaar zur
Amplifikation von hTRT-mRNA. Ein solcher Kit kann auch eine
Sonde für amplifizierte hTRT-DNA und/oder eine Polymerase,
Puffer, dNTPs etc. enthalten. In einer weiteren
Ausführungsform umfaßt der Kit eine Sonde, gegebenenfalls
eine markierte Sonde. In einer anderen Ausführungsform
umfaßt der Kit einen Antikörper.
Die Erfindung stellt Verbindungen und Behandlungen bereit,
die die Aktivität oder Expression einer Telomerase oder
eines Telomerase-Bestandteils (z. B. hTRT-Protein)
modulieren. Die Erfindung stellt auch Assays und Screening-
Verfahren (einschließlich Screening-Verfahren mit hohem
Durchsatz) zur Identifizierung von Verbindungen und
Behandlungen bereit, die Telomerase-Aktivität oder
-Expression modulieren. Zu diesen Modulatoren von
Telomerase-Aktivität und -Expression (die nachstehend als
"Modulatoren" bezeichnet werden) gehören Telomerase-
Agonisten (die Telomerase-Aktivität und/oder -Expression
steigern) und Telomerase-Antagonisten (die Telomerase-
Aktivität und/oder Expression herabsetzen).
Die erfindungsgemäßen Modulatoren haben eine große Anzahl
von Anwendungsmöglichkeiten. Beispielsweise wird davon
ausgegangen, daß Telomerase-Modulatoren wirksame
therapeutische Mittel zur Behandlung von menschlichen
Krankheiten sind. Das Screenen nach agonistischer Aktivität
und Aktivatoren der Transkription oder Translation erlaubt
die Bereitstellung von Zusammensetzungen, die eine
Telomerase-Aktivität in einer Zelle (einschließlich einer
Telomer-abhängigen Replikationsfähigkeit oder einer
"partiellen" Telomerase-Aktivität) steigern können. Solche
agonistischen Zusammensetzungen erlauben auch die
Bereitstellung von Verfahren zur Immortalisierung von
ansonsten normalen untransformierten Zellen, wozu Zellen
gehören, die nützliche Proteine exprimieren können. Solche
Agonisten erlauben auch die Bereitstellung von Verfahren zur
Regulierung zellulärer Seneszenz. Umgekehrt erlaubt das
Screenen nach antagonistischer Aktivität die Bereitstellung
von Zusammensetzungen, die eine Telomer-abhängige
Replikationsfähigkeit herabsetzen und dadurch Zellen
mortalisieren, die ansonsten unsterblich sind,
beispielsweise Krebszellen. Das Screenen nach
antagonistischer Aktivität erlaubt die Bereitstellung von
Zusammensetzungen, die Telomerase-Aktivität herabsetzen und
dadurch eine unbegrenzte Zellteilung von Zellen, die ein
unreguliertes Zellwachstum zeigen, beispielsweise
Krebszellen, verhindern. Beispiele von Erkrankungen und
Zuständen, die mittels der Modulatoren behandelt werden
können, sind hier aufgezählt, beispielsweise in den
vorstehenden Abschnitten VII und IX. Im allgemeinen können
die erfindungsgemäßen Modulatoren immer dann verwendet
werden, wenn eine Steigerung oder eine Herabsetzung einer
Telomerase-Aktivität in einer Zelle oder einem Organismus
erwünscht ist. Somit kann ein Modulator, der hTRT-Ex
pressionsspiegel steigert, zusätzlich zur Verwendung bei
der Krankheitsbehandlung zur Herstellung einer kultivierten
menschlichen Zellinie verwendet werden, die Eigenschaften
aufweist, wie sie allgemein in dem vorstehenden Abschnitt
VIII beschrieben sind und er weist zahlreiche andere
Anwendungsmöglichkeiten auf, die für den Fachmann
offensichtlich sind.
Eine Verbindung oder Behandlung moduliert die "Expression"
von Telomerase oder eines Telomerase-Bestandteils, wenn die
Verabreichung der Verbindung oder der Behandlung die
Transkriptionsrate oder den Transkriptionsspiegel des einen
Telomerase-Bestandteil codierenden Gens (z. B. hTRT-mRNA
codierenden Gens) verändert, beeinflußt die Stabilität oder
die posttranskriptionale Prozessierung von einen Telomerase-
Bestandteil codierende RNA (z. B. Transport, Spleißen,
Polyadenylierung oder eine andere Modifizierung), beeinflußt
Translation, Stabilität, posttranslationale Prozessierung
oder die Modifizierung eines codierten Proteins (z. B. hTRT)
oder verändert auf andere Art und Weise den Spiegel an
funktionellem (z. B. katalytisch aktivem) Telomerase-RNP.
Eine Verbindung oder Behandlung beeinflußt dann eine
Telomerase-"Aktivität", wenn die Verabreichung der
Verbindung oder Behandlung eine Telomerase verändert,
beispielsweise jene, die in dem vorstehenden Abschnitt IV(B)
beschrieben sind (z. B. gehören dazu eine prozessive oder
nicht-prozessive katalytische Aktivität von Telomerase;
Telomerase-Prozessivität, konventionelle reverse
Transkriptase-Aktivität; nucleolytische Aktivität; Primer- oder
Substrat-bindende Aktivität; dNTP-bindende Aktivität;
RNA-bindende Aktivität; Beeinflussung der Telomerase-RNP-As
semblierung und Protein-bindende Aktivität). Es gibt nicht
unbedingt eine scharfe Abgrenzung zwischen Änderung in der
"Aktivität" und Veränderungen in der "Expression". Diese
Ausdrücke werden zur Erleichterung der Diskussion, jedoch
nicht zur Einschränkung verwendet. Die erfindungsgemäßen
Modulatoren sollten Telomerase-Aktivität oder -Expression
beeinflussen (z. B. ohne allgemein die Expression von
"housekeeping"-Proteinen, wie Actin, ändern) und nicht
beispielsweise die Expression eines Telomerase-Bestandteils
durch unspezifische Vergiftung einer Zielzelle herabsetzen.
Die Erfindung stellt Verfahren und Reagenzien zum Screenen
nach Zusammensetzungen oder Verbindungen bereit, die die
Expression einer Telomerase oder eines Telomerase-
Bestandteils beeinflussen können, die Replikationsfähigkeit
von Telomerase bezüglich DNA modifizieren können oder
anderweitig die Fähigkeit des Telomerase-Enzyms und des TRT-Pro
teins Telomer-DNA synthetisieren zu können ("volle
Aktivität") modifizieren. Die Erfindung stellt auch
Screening-Verfahren für Modulatoren einer beliebigen
"partiellen Aktivität" von hTRT oder allen dieser
Aktivitäten bereit. Somit stellt die vorliegende Erfindung
Assays bereit, die zum Screenen nach Agensien verwendet
werden können, die die Aktivität von Telomerase steigern,
beispielsweise dadurch, daß sie dazu führen, daß hTRT-Pro
tein oder Telomerase in einer Zelle exprimiert wird, in
der diese normalerweise nicht exprimiert wird, oder durch
Steigerung der Spiegel an Telomerase-Aktivität in
Telomerase-positiven Zellen.
Telomerase oder Proteine einer Telomerase-Untereinheit,
deren katalytische oder immunogene Fragmente oder
Oligopeptide davon können zum Screenen nach therapeutischen
Verbindungen in einer Vielzahl von Verfahren zum Screenen
von Wirkstoffen verwendet werden. Das in einem solchen Test
verwendete Fragment kann frei in Lösung vorliegen, an einen
festen Träger fixiert sein, von einer Zelloberfläche
getragen, oder intrazellulär lokalisiert sein. Die Bildung
von Bindungskomplexen zwischen Telomerase oder dem
Untereinheitenprotein und dem zu testenden Agens kann
gemessen werden.
In verschiedenen Ausführungsformen zählen zu der Erfindung
Verfahren zum Screenen nach Antagonisten, die an das aktive
Zentrum des Enzyms binden; die Assoziierung seiner RNA-Ein
heit, von Telomerase-assoziierten Proteinen, Nucleotiden
oder Telomer-DNA an Telomerase oder hTRT-Protein hemmen; die
Dissoziierung des Enzymkomplexes fördern; die Transkription
der Telomerase-RNA-Einheit (z. B. hTR) stören oder eine der
hier beschriebenen "partiellen Aktivitäten" hemmen. Die
Erfindung betrifft auch das Screenen nach Zusammensetzungen,
die die Assoziierung von Nucleinsäure und/oder Telomerase
assoziierten Zusammensetzungen mit hTRT, z. B. die
Assoziierung von hTR mit hTRT oder die Assoziierung von hTRT
mit dem menschlichen Homolog von p80 oder einem anderen
assoziierten Protein oder die Assoziierung von hTRT mit
einem Telomer oder einem Nucleotid hemmen; das Screenen nach
Zusammensetzung, die die Dissoziierung oder Assoziierung
(d. h. Assemblierung) des Enzymkomplexes fördern,
beispielsweise ein Antikörper, der gegen hTR oder hTRT
gerichtet ist; das Screenen nach Agensien, die die
Prozessivität des Enzyms beeinflussen und das Screenen nach
Nucleinsäuren und anderen Zusammensetzungen, die Telomerase
binden, wie beispielsweise eine zu hTR komplementäre
Nucleinsäure. Die Erfindung zieht darüber hinaus auch das
Screenen nach Zusammensetzungen in Betracht, die die
Transkription des hTRT-Gens und/oder die Translation des
hTRT-Genprodukts erhöhen oder herabsetzen. Die Erfindung
zieht auch ein Screening-Verfahren in Betracht, Telomerase-
Modulatoren in Tieren, in einer Ausführungsform durch die
Rekonstitution einer Telomerase-Aktivität oder einer anti-
Telomerase-Aktivität in ein Tier, beispielsweise in einem
transgenen Tier. Die Erfindung stellt auch in vivo-
Assaysysteme bereit, zu denen "knockout"-Modelle gehören,
bei denen eine oder verschiedene Einheiten der endogenen
Telomerase, der Telomerase-RNA-Einheit und/oder Telomerase
assoziierte Proteine deletiert oder gehemmt wurden. Dabei
kann die endogene Telomerase-Aktivität vollständig oder
partielle erhalten geblieben sein. In einer Ausführungsform
wird eine exogene Telomerase-Aktivität voll oder partiell
rekonstituiert.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wird eine Reihe
von Assays hinsichtlich einer partiellen Telomerase-
Aktivität bereitgestellt, die die Identifizierung einer
Vielfalt verschiedener Klassen von Modulatoren von
Telomerase-Aktivität erlauben. Die erfindungsgemäßen
"Teilaktivitäts"-Assays erlauben die Identifizierung von
Modulatorklassen von Telomerase-Aktivität, die ansonsten in
einem "Vollaktivitäts"-Telomerase-Assay nicht hätten
nachgewiesen werden können. Bei einem Teilaktivitäts-Assay
ist die nicht-prozessive Aktivität von TRT und Telomerase
beteiligt. Die prozessive Natur der Telomerase wird von
Morin, Cell 59 (1989), 521-529 beschrieben; siehe auch
Prowse "Identification ot a nonprocessive telomerase
activity from mouse cells" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90
(1993), 1493-1497. Bei einem weiteren erfindungsgemäßen
Teilaktivitäts-Assay wird die "Reverse Transpriptase
ähnliche"-Aktivität von Telomerase genutzt. Bei diesen
Assays wird die reverse Transkriptase-Aktivität des hTRT-Pro
teins untersucht; siehe Lingner "Revese transcriptase
motifs in the catalytic subunit of telomerase", Science 276
(1997), 561-567. Bei einem weiteren erfindungsgemäßen
Teilaktivitäts-Assay wird die "nucleolytische Aktivität" von
hTRT und Telomerase, zu der die Entfernung von mindestens
einem Nucleotid vom 3'-Strang, typischerweise Guanosin,
durch das Enzym beinhaltet, genutzt. Diese nucleolytische
Aktivität wurde in Tetrahymena-Telomerase von Collins
"Tetrahymena telomerase catalyzes nucleolytic cleavage and
nonprocessive elongation" Genes Dev. 7 (1993), 1364-1376
beobachtet. Bei einem weiteren erfindungsgemäßen
Teilaktivitäts-Assay ist eine Analyse der Fähigkeit von hTRT
und Telomerase als Teil deren Aktivität hinsichtlich der
prozessiven DNA-Polymerisation bezeichnet. Ein weiterer
erfindungsgemäßer Teilaktivitäts-Assay beinhaltet die
Analyse der Fähigkeit von hTRT oder Telomerase, deren RNA-Ein
heit zu binden, d. h. hTR menschliche Zellen, die als eine
Matrize für die Telomer-Synthese verwendet wird. Weitere
erfindungsgemäße Teilaktivitäts-Assays beinhalten die
Analyse der Fähigkeit von hTRT und Telomerase-Chromosomen in
vivo zu binden oder Oligonucleotid-Primer in vitro oder in
rekonstituierten Systemen zu binden, oder Proteine zu
binden, die mit chromosomalen Strukturen assoziiert sind
(siehe bezüglich eines Beispiels für ein solches Protein
Harrington, J. Biol. Chem. 270 (1995), 8893-8901). Zu den
chromosomalen Strukturen, die hTRT binden, gehören
beispielsweise DNA der Telomer-Wiederholungseinheit,
Telomer-Proteine, Histone, nucleäres Matrixprotein,
Kontrollproteine für die Zellteilung oder den Zellcyclus
etc.
In einer Ausführungsform umfaßt ein Assay zur
Identifizierung von Modulatoren das Inkontaktbringen von
einer oder mehreren Zellen (d. h. "Testzellen") mit einer
Testverbindung und die Bestimmung, ob die Testverbindung die
Expression oder Aktivität einer Telomerase (oder eines
Telomerase-Bestandteils) in der Zelle beeinflußt.
Üblicherweise umfaßt diese Bestimmung den Vergleich der
Aktivität oder der Expression in der Testzelle mit einer
ähnlichen Zelle oder Zellen (d. h. Kontrollzellen), die mit
der Testverbindung nicht in Kontakt gebracht wurden. In
einer alternativen Ausführungsform können anstelle von
intakten Zellen Zellextrakte verwendet werden. In einer
verwandten Ausführungsform wird die Testverbindung an einen
multizellulären Organismus (z. B. eine Pflanze oder ein Tier)
verabreicht. Die Telomerase oder der Telomerase-Bestandteil
kann für die Zelle oder den multizellulären Organismus
vollständig endogen sein (d. h. von natürlich vorkommenden
endogenen Genen codiert), es kann sich auch um eine
rekombinante Zelle oder einen transgenen Organismus handeln,
der einen oder mehrere rekombinant exprimierte Telomerase-
Bestandteile umfaßt (z. B. hTRT, hTR, Telomerase-assoziierte
Proteine) oder die Zelle bzw. der multizelluläre Organismus
kann sowohl endogene als auch rekombinante Bestandteile
aufweisen. Somit werden in einer Ausführungsform Telomerase-
Aktivitäts-Modulatoren an sterbliche Zellen verabreicht. In
einer weiteren Ausführungsform werden Telomerase-Aktivitäts-
Modulatoren an unsterbliche Zellen verabreicht.
Beispielsweise können Antagonisten der Telomerase
vermittelten DNA-Replikation dadurch identifiziert werden,
daß die vermutlich hemmende Zusammensetzung an eine Zelle
verabreicht wird, von der bekannt ist, daß sie signifikante
Mengen an Telomerase-Aktivität aufweist, beispielsweise
Krebszellen.
In einer weiteren Ausführungsform wird ein Modulator durch
Überwachung einer Veränderung in einer Telomerase-Aktivität
eines Ribonucleoprotein-Komplexes (RNP) identifiziert, der
eine TRT (z. B. hTRT) und eine Matrizen-RNA (z. B. hTR)
umfaßt, wobei der RNP in vitro rekonstituiert wird (wie
beispielsweise in dem nachstehenden Beispiel 7 beschrieben).
In einer weiteren Ausführungsform wird der Modulator durch
Überwachung einer Veränderung in der Expression eines TRT-Gen
produkts (z. B. RNA oder Protein) in einer Zelle, einem
Tier, einem in vitro-Expressionssystem oder anderem
Expressionssystem identifiziert.
In einer weiteren Ausführungsform wird der Modulator anhand
der Änderung der Expression eines Reportergens
identifiziert, beispielsweise eines solchen, wie es in
Beispiel 15 beschrieben wird, wobei dessen Expression ganz
oder teilweise durch ein natürlich vorkommendes TRT-regu
latorisches Element, beispielsweise einen Promotor oder
Enhancer, reguliert wird. In einer verwandten
Ausführungsform wird die Fähigkeit einer Testverbindung
einen Telomerasebestandteil (z. B. hTRT) zu binden, RNA oder
eine Gen-regulatorische Sequenz (z. B. den TRT-Genpromotor)
untersucht.
In einer weiteren Ausführungsform wird der Modulator durch
die Beobachtung von Veränderungen in der hTRT-prä-mRNA-Pro
zessierung identifiziert, wobei sich dies beispielsweise
auf alternativ gespleißte Produkte, alternative
Polyadenylierungsereignisse, RNA-Spaltung etc. bezieht. In
einer verwandten Ausführungsform kann die Aktivität des
Modulators durch Überwachung der Herstellung von hTRT-Poly
peptiden untersucht werden, von denen einige eine
Aktivität für eine dominant-negative Telomerase-Regulation
besitzen können.
Assay-Formate für die Identifizierung von Verbindungen, die
die Expression und Aktivität von Proteinen beeinflussen,
sind in der biotechnologischen und pharmazeutischen
Industrie gut bekannt und für den Fachmann sind zusätzliche
Assays und Variationen der vorstehend zur Veranschaulichung
bereitgestellten Assays offensichtlich.
Veränderungen in Telomerase-Aktivität oder -Expression
können durch jedes geeignete Verfahren gemessen werden. Für
Änderungen im Expressionsspiegel eines Telomerase-
Bestandteils (z. B. des hTRT-Proteins) oder eines Vorläufers
(z. B. hTRT-mRNA) können unter Verwendung von dem Fachmann
gut bekannten Verfahren untersucht werden. Einige dieser
Verfahren sind hier beschrieben, beispielsweise in Abschnitt
IX und dazu zählt die Überwachung der Spiegel von TRT-Gen
produkten (z. B. Protein und RNAs) durch Hybridisierung
(z. B. unter Verwendung der erfindungsgemäßen TRT-Sonden und
-Primer), Immunassays (z. B. mittels der erfindungsgemäßen
anti-TRT-Antikörper), RNAse-Schutzassays,
Amplifikationsassays oder jedes andere für einen Nachweis
geeignete Mittel, das hier beschrieben oder auf dem
Fachgebiet bekannt ist. Die Quantifizierung der Mengen an
Nucleinsäure in einer Probe (z. B. die Bestimmung von RNA-Spie
geln, beispielsweise hTR- oder hTRT-mRNA) ist ebenfalls
für die Bestimmung von transkriptionellen Regulatoren in cis
oder trans von Nutzen.
Auf ähnliche Weise können Veränderungen in einer Telomerase-
Aktivität unter Verwendung der hier (z. B. in Abschnitt IV
(B), s. o.) beschriebenen Verfahren oder anderer Assays
bezüglich einer Telomerase-Funktion gemessen werden. Die
Quantifizierung von Telomerase-Aktivität kann, falls
erwünscht, durch jedes Verfahren, einschließlich der hier
beschriebenen, durchgeführt werden. Telomerase-Antagonisten,
die den Verlust einer Telomer-Struktur bewirken oder
beschleunigen, können durch Überwachung oder Messung ihres
Effekts auf Telomerase-Aktivität in vivo, ex vivo oder in
vitro identifiziert werden, aufgrund ihrer Auswirkungen auf
die Telomer-Länge (durch Anfärbung oder die Verwendung von
"tagged"-Hybridisierungssonden) oder einfach durch die
Untersuchung der Zellteilung von Telomerase-positiven
Krebszellen (kritisches Verkürzen von Telomeren führt zu
einem "Kriese" bezeichneten Phänomen oder zur M2-Seneszenz
(Shay, Biochem. Biophys. Acta 1072 (1991) 1-7), wobei dies
durch die Aktivierung von Telomerase bei den Krebszellen
umgangen wird, jedoch bei dem Fehlen von Telomerase zu deren
Seneszenz führt oder zu deren Tod aufgrund einer
chromosomalen Deletion und eines chromosomalen
Rearrangements). Die Rekonstitution von menschlicher
Telomerase-Aktivität in vivo liefert ein Verfahren zum
Screenen nach Telomerase-Modulatoren in Zellen oder Tieren
jeden Ursprungs. Solche Agonisten können in einem
erfindungsgemäßen Aktivitätsassay identifiziert werden, was
die Bestimmung von meßbaren Veränderungen in der Telomer-
Länge, wie vorstehend beschrieben, einschließt. Weitere
Beispiele von Assays zur Messung von Telomerase-Aktivität in
Zellen beinhalten die Akkumulation oder den Verlust von
Telomer-Strukturen, den TRAP-Assay oder einen Assay
bezüglich einer quantitativen Polymerase-Kettenreaktion.
In einer Ausführungsform umfassen die erfindungsgemäßen
Assays auch ein Verfahren, bei dem die Testverbindung für
eine statistisch signifikante Herabsetzung in der Aktivität
von hTRT im Vergleich zu den relativen Mengen einer
eingebauten Markierung in einer Parallelreaktion sorgt, bei
der das Agens fehlt, wodurch nachgewiesen werden kann, daß
das Agens ein Telomerase-Inhibitor ist.
Die erfindungsgemäßen Verfahren können anhand von
Protokollen adaptiert werden, die in der wissenschaftlichen
Literatur und der Patentliteratur beschrieben sind, und auf
dem Fachgebiet bekannt sind. Beispielsweise können dann,
wenn eine erfindungsgemäße Telomerase oder ein TRT-Protein
zur Identifizierung von Zusammensetzungen verwendet wird,
die als Modulatoren von Telomerase-Aktivitäten wirken, eine
große Anzahl von möglicherweise nützlichen Molekülen in
einem einzigen Test gescreent werden. Die Modulatoren können
auf eine Telomerase-Aktivität eine hemmende (Antagonisten)- oder
potenzierende (Agonisten)-Wirkung aufweisen.
Beispielsweise können dann, wenn ein Feld von 1000
Inhibitoren gescreent werden soll, im Prinzip alle 1000
Inhibitoren in eine Mikrotiterplattenvertiefung gegeben und
gleichzeitig getestet werden. Wenn ein solcher Inhibitor
entdeckt wird, kann dann der Pool von 1000 in 10 Pools von
100 aufgeteilt werden und der Prozeß solange wiederholt
werden, bis ein individueller Inhibitor identifiziert ist.
Beim Screenen von Wirkstoffen wird eine hohe Anzahl von
Verbindungen hinsichtlich ihrer Fähigkeit als Telomerase-
Modulatoren zu wirken, untersucht, wobei dieser Prozeß durch
Verfahren des Screening mit hohem Durchsatz ("high troughput
screening") stark beschleunigt wird. Die hier beschriebenen
Assays für eine vollständige oder partielle Telomerase-
Aktivität können zur Verwendung in einem Verfahren mit hohem
Durchsatz adaptiert werden. Es ist für den Fachmann
offensichtlich, daß für diesen Zweck zahlreiche Verfahren
zur Verfügung stehen.
Ein weiteres Verfahren zum Screenen von Wirkstoffen, das für
das Screenen von Verbindungen mit geeigneten
Bindungsaffinitäten für die Telomerase oder ein Protein
einer Telomerase-Untereinheit mit hohem Durchsatz verwendet
werden kann, ist ausführlich in "Determination of Amino Acid
Sequence Antigenicity", von Geysen beschrieben (Geysen, PCT-Ver
öffentlichung WO 84/034564, veröffentlicht am 13.
September 1984, wobei dieses Dokument durch Bezugnahme als
Bestandteil dieser Beschreibung angesehen werden kann).
Zusammenfassend kann gesagt werden, daß eine große Anzahl
von unterschiedlichen kleinen Peptid-Testverbindungen auf
einem festen Substrat, beispielsweise Plastikstiften oder
einer anderen Oberfläche, synthetisiert wird. Die Peptid-
Testverbindungen werden mit Fragmenten von Telomerase oder
Proteinuntereinheiten von Telomerase zur Reaktion gebracht
und gewaschen. Gebundene Telomerase oder eine Telomerase-
Proteinuntereinheit wird dann durch allgemein bekannte
Verfahren nachgewiesen. Im wesentlichen gereinigte
Telomerase bzw. eine Telomerase-Protein-Untereinheit kann
auch direkt auf Platten zur Verwendung bei den vorstehend
erwähnten Verfahren zum Screenen von Wirkstoffen als
Beschichtung aufgebracht werden. In einer alternativen
Ausführungsform können nicht-neutralisierende Antikörper zum
Einfangen des Peptids und zu dessen Immobilisierung auf
einem festen Träger verwendet werden.
In dieser Erfindung wird auch die Verwendung von
kompetitiven Assays zum Screenen von Wirkstoffen in Betracht
gezogen, bei denen neutralisierende Antikörper, die
Telomerase oder (ein) Untereinheiten-Protein(e) binden
können, spezifisch mit einer Testverbindung um die Bindung
an Telomerase oder das Untereinheiten-Protein konkurrieren.
Auf diese Weise können die Antikörper zum Nachweis des
Vorhandenseins eines Peptids verwendet werden, das eine
oder mehrere antigene Determinanten mit der Telomerase oder
einer Protein-Untereinheit gemeinsam hat.
Weitere Verfahren zur Identifizierung von Modulatoren einer
Telomerase-Aktivität sind, beschrieben in US-Patent
5,645,986 und USSN 08/151,477, eingereicht am 12. November
1993 sowie USSN 08/288,501, eingereicht am 10. August 1994,
wobei diese Dokumente durch Bezugnahme als Bestandteil
dieser Beschreibung angesehen werden können. Die vorliegende
Erfindung stellt auch Verbesserungen von bereits bekannten
Verfahren bereit, teilweise dadurch, daß Reagenzien
bereitgestellt werden, beispielsweise hTRT-Polynucleotide,
-Sonden und -Primer, hoch-gereinigte hTR, hTRT und
Telomerase sowie anti-Telomerase- und anti-TRT-Antikörper,
die alle in den Assays verwendet werden können,
beispielsweise als Kontrollen, Standard-, Bindungs- oder
Hybridisierungsagensien oder anderweitig.
Die rekombinant hergestellte erfindungsgemäße Telomerase und
TRT (z. B. hTRT) ist natürlich in Assays zur Identifizierung
von Modulatoren von Nutzen. Bei den Screening-Assays können
auch Telomerase oder hTRT verwendet werden, die aus einer
vollen oder partiellen Rekonstitution von Telomerase-
Aktivität oder von einer Vermehrung einer existierenden
Aktivität abstammen. Die durch die Erfindung
bereitgestellten Assays oder Screeningverfahren können dazu
verwendet werden, die Fähigkeit von Telomerase zu testen,
Telomer-DNA zu synthetisieren oder für einen Test
hinsichtlich einer oder aller "partiellen Aktivitäten" von
hTRT und TRTs, wie vorstehend allgemein beschrieben. Der
Assay kann die ex vivo-Modifizierung von Zellen beinhalten,
die zur Expression von Telomerase mit oder ohne deren RNA-Ein
heit oder assoziierten Proteinen manipuliert wurde, und
diese können in ein Tier reimplantiert werden, das für einen
in vivo-Test verwendet werden kann. Somit stellt die
Erfindung in vivo-Assays und dafür nützliche transgene Tiere
bereit. In diesen in vivo-Assay-Systemen können "knockout"-Zel
len verwendet werden, bei denen eine oder mehrere
Einheiten des endogenen Telomerase-Enzym-Komplexes deletiert
oder gehemmt wurden, sowie Zellen, bei denen eine exogene
oder endogene Telomerase-Aktivität rekonstituiert oder
aktiviert ist.
Telomerasen und TRT-Proteine, die ortsspezifisch (z. B. durch
ortsgerichtete Mutation) zur Modifizierung oder Deletion
einer oder aller Funktionen des Telomerase-Enzyms oder des
TRT-Proteins modifiziert wurden, können ebenso zur
Entdeckung therapeutischer Agensien in den erfindungsgemäßen
Screening-Verfahren angewandt werden. Beispielsweise kann
TRT so manipuliert werden, daß es seine Fähigkeit verliert,
Substrat-DNA zu binden, seine RNA-Einheit (wie hTR) zu
binden, die Hinzufügung von Telomer-DNA zu katalysieren,
Desoxynucleotid-Substrate zu binden, nucleolytische
Aktivität aufzuweisen, Telomer-assoziierte Proteine oder
chromosomale Strukturen zu binden etc. Die erhaltenen
"Mutanten-Proteine" oder "Muteine" können zur
Identifizierung von Verbindungen verwendet werden, die eine,
mehrere oder alle Funktionen oder Aktivitäten des TRT-Pro
teins oder der Telomerase spezifisch modulieren.
Bei den Testverbindungen, auf die vorstehend hingewiesen
wurde, kann es sich um eine große Vielzahl von Verbindungen
handeln, sowohl natürlich vorkommende als auch synthetische,
organische und inorganische Verbindungen, sowie Polymere
(z. B. Oligopeptide, Polypeptide, Oligonucleotide und
Polynucleotide) sowie kleine Moleküle, Antikörper (wie hier
ausführlich definiert), Zucker, Fettsäuren, Nucleotide und
Nucleotid-Analoge, Analoge von natürlich vorkommenden
Strukturen (z. B. Peptid-"Imitatoren", Nucleinsäureanaloge
etc.) und zahlreiche weitere Verbindungen.
Die Erfindung stellt alle Arten von Modulatoren bereit ohne
Beschränkung auf einen bestimmten Wirkungsmechanismus. Zum
Zweck der Veranschaulichung werden im folgenden Beispiele
für Modulatoren, zu denen Verbindungen oder Behandlungen
zählen, aufgelistet:
- (i) Sie binden an das hTRT-Polypeptid (z. B. das aktive Zentrum des Enzyms) oder an einen anderen Telomerasebestandteil und beeinflussen eine Telomerase-Aktivität;
- (ii) sie hemmen oder fördern die Assoziierung oder hemmen oder fördern die Dissoziierung eines Telomerase- Bestandteils (z. B. hTRT oder das hTRT-hTR-RNP) mit einem Telomerase-assoziierten Protein (zu denen beispielsweise die im vorgehenden Abschnitt IV(D) zählen);
- (iii) sie hemmen oder fördern die Assoziierung oder hemmen oder fördern die Dissoziierung von Telomerase- Polypeptiden (z. B. hTRT) mit einer Telomerase-RNA (z. B. hTR);
- (iv) sie hemmen oder fördern die Assoziierung oder hemmen oder fördern die Dissoziierung von Telomerase- Polypeptiden (z. B. hTRT) mit Chromosomen (z. B. Telomeren) oder chromosomaler DNA (z. B. Telomer-DNA);
- (v) sie steigern oder senken die Expression eines Genprodukts eines Telomerase-Bestandteils (z. B. Produkte des hTRT-Gens), wozu auch Veränderungen der Rate oder des Spiegels der Transkription des TRT-Gens oder der Translation zählen, der Transport oder die Stabilität eines Genprodukts etc. durch Bindung an das Gen oder Genprodukt (z. B. durch Wechselwirkung mit einem Faktor (z. B. ein die Transkription regulierendes Protein), der die Transkription des hTRT-Gens oder eines anderen Telomerase-Bestandteils beeinflußt).
Zu den möglichen Modulatoren von Telomerase-Aktivität zählen
auch Peptide (z. B. hemmende (Antagonist) und aktivierende
(Agonist) Peptid-Modulatoren). Beispielsweise können
Oligopeptide mit nach dem Zufallsprinzip erzeugten Sequenzen
gescreent werden, um so Peptidmodulatoren (Agonisten oder
Inhibitoren) von Telomerase-Aktivität auffinden zu können.
Solche Peptide können direkt als Wirkstoffe verwendet
werden, oder um die Orientierung oder Lage einer
funktionellen Gruppe aufzufinden, die eine Telomerase-
Aktivität hemmen kann, was wiederum zum Entwurf und dem
Austesten eines inhibitorischen kleinen Moleküls führt, oder
wobei das Peptid das Rückgrat für chemische Modifizierung
wird, die dessen pharmakologischen Verwendungsmöglichkeiten
steigern. Bei dem Peptid kann es sich um strukturelle
"Imitatoren" handeln, und Molekülmodulierungsprogramme
können verwendet werden, um "Imitatoren" basierend auf der
charakteristischen Sekundär- und/oder Tertiärstruktur eines
Telomerase-Enzyms und hTRT-Proteins zu entwerfen. Solche
strukturellen "Imitatoren" können auch in vivo als
Modulatoren von Telomerase-Aktivität (Agonisten und
Antagonisten) verwendet werden. Strukturelle "Imitatoren"
können auch als Immunogene zur Erzeugung von anti-
Telomerase- oder anti-TRT-Protein-Antikörpern verwendet
werden.
Darüber hinaus kann eine große Anzahl von möglicherweise
nützlichen aktivitätsmodifizierenden Verbindungen in
Extrakten von natürlichen Produkten als Ausgangsmaterial
gescreent werden. Solche Extrakte können aus einer großen
Anzahl von Quellen stammen, nämlich den Spezies Pilze,
Actinomyceten, Algen, Insekten, Protozoen, Pflanzen und
Bakterien. Die Extrakte, die inhibitorische Aktivität
zeigen, können dann zur Isolierung des aktiven Moleküls
analysiert werden. Siehe beispielsweise Turner, J.
Ethnopharmacol. 51 (1-3) (1996), 39-43 und Suh, Anticancer
Res. 15 (1995) 233-239.
Zu einem besonders nützlichen Satz an Inhibitoren, die durch
die vorliegende Erfindung bereitgestellt werden, gehören
Oligonucleotide, die entweder an eine hTRT-Protein
codierende mRNA binden können, oder an das hTRT-Gen, wobei
in beiden Fällen die Herstellung von funktionellem hTRT-Pro
tein verhindert oder gehemmt wird. Andere
erfindungsgemäße Oligonucleotide interagieren mit der RNA-Ein
heit von Telomerase, beispielsweise hTR, oder können die
Bindung von Telomerase oder hTRT an sein jeweiliges DNA-Ziel,
oder von einem Telomerase-Bestandteil an einen anderen
oder an ein Substrat verhindern. Solche Oligonucleotide
können auch das Telomerase-Enzym hTRT-Protein oder Protein
und RNA und, wie bereits vorstehend beschrieben, eine
partielle Aktivität inhibieren (wie z. B. deren prozessive
Aktivität, reverse Transkriptase-Aktivität, nucleolytische
Aktivität etc.). Die Assoziierung kann über eine Sequenz
spezifische Hybridisierung an eine andere Nucleinsäure oder
durch eine allgemeine Bindung, wie beispielsweise einem
Aptamer, oder durch beides erfolgen.
Telomerase-Aktivität kann dadurch gehemmt werden, daß die
hTRT-mRNA mit "anti-sense"-Oligonucleotiden als Ziel
versehen wird, die die hTRT-mRNA binden können.
Zu einer weiteren nützlichen Klasse von Inhibitoren zählen
Oligonucleotide, die eine Inaktivierung oder Spaltung von
hTRT-mRNA oder hTR bewirken. Dabei ist das Oligonucleotid
chemisch modifiziert, oder weist enzymatische Aktivität auf,
was solch eine Spaltung bewirkt. Zu solchen Oligonucleotiden
zählen Ribozyme oder an ein Oligonucleotid gebundenes EDTA.
Es kann sich auch um eine kovalente Bindung handeln,
beispielsweise Psoralen oder quervernetzende Reagenzien, die
an ein Oligonucleotid gebunden sind. Wie bereits vorstehend
angemerkt, kann ein Pool von vielen unterschiedlichen
solcher Oligonucleotide nach solchen mit der gewünschten
Aktivität gescreent werden.
Zu einer weiteren Klasse von nützlichen Inhibitoren zählen
Oligonucleotide, die Polypeptide binden. Doppel- oder
einzelsträngige DNA-Moleküle oder doppel- oder
einzelsträngige RNA-Moleküle, die an spezifische
Polypeptidziele binden, werden "Aptamere" genannt. Die
spezifische Oligonucleotid/Polypeptid-Assoziierung kann
durch elektrostatische Wechselwirkungen vermittelt werden.
Beispielsweise binden Aptamere spezifisch an Anionen
bindende Außenseiten auf Thrombin, das an das polyanionische
Heparin physiologisch bindet (Bock, Nature 355 (1992), 564-566).
Da hTRT-Protein sowohl an hTR als auch deren DNA-Sub
strat bindet, und da die vorliegende Erfindung hTRT- und
andere TRT-Proteine in gereinigter Form in großen Mengen
bereitstellt, kann der Fachmann unter Verwendung der
erfindungsgemäßen Verfahren leicht nach TRT-bindenden
Aptameren screenen.
Oligonucleotide (z. B. RNA-Oligonucleotide), die Telomerase,
hTRT, HTR oder Anteile davon binden, können mittels der
SELEX-Verfahren erzeugt werden (Tuerk, Methods Mol. Biol. 67
(1997), 2190). Bei diesem Verfahren wird ein sehr großer
Pool (106-109) aus Nucleinsäuren mit Zufallssequenzen unter
Bedingungen an das Ziel (z. B. hTRT) gebunden, die einer sehr
starken Unterscheidung zwischen Molekülen mit hoher
Affinität und niedriger Affinität bezüglich der Bindung des
Ziels führen. Die gebundenen Moleküle werden von nicht
gebundenen abgetrennt und die gebundenen Moleküle kraft
einer spezifischen Nucleinsäuresequenz, die in ihren Enden
enthalten ist, und mittels geeigneter
Amplifikationsreagenzien amplifiziert. Dieser Prozeß wird
verschiedene Male solange wiederholt, bis eine relativ
kleine Anzahl von Molekülen übrig bleibt, die eine hohe
Bindungsaffinität für das Ziel aufweisen. Diese Moleküle
können im Anschluß daran auf ihre Fähigkeit Telomerase-
Aktivität zu modulieren, wie hier beschrieben, getestet
werden.
Antagonisten einer Telomerase-vermittelten DNA-Replikation
können auch auf einer Hemmung von hTR (Norton, Nature
Biotechnology 14 (1996) 615-619) über komplementäre Sequenz-
Erkennung oder -Spaltung, wie dies bei Ribozymen der Fall
ist, basieren.
Die erfindungsgemäßen inhibitorischen Oligonucleotide können
unter Verwendung einer Vielfalt von auf dem Fachgebiet gut
bekannten Verfahren in die Zelle transferiert werden.
Beispielsweise können Oligonucleotide spontan ohne
spezifische Modifikation in das Plasma transportiert werden.
In einer alternativen Ausführungsform können sie mittels
Liposomen, die mit der zellulären Membran fusionieren oder
durch Endocytose aufgenommen werden, zugeliefert werden,
d. h. durch die Verwendung von an das Liposom angehefteten
Liganden oder durch direkte Anheftung an das Oligonucleotid,
wobei diese dann an Oberflächenmembran-Proteinrezeptoren der
Zelle binden, was zu einer Endocytose führt. In einer
alternativen Ausführungsform können die Zellen zur
Steigerung des Transports der Oligonucleotide in die Zelle
ohne Verletzung der Wirtszellen permeabilisiert werden. Es
kann auch ein DNA-bindendes Protein, beispielsweise HBGF-1,
von dem bekannt ist, daß es ein Oligonucleotid in eine Zelle
transportieren kann, verwendet werden.
Ribozyme wirken durch Bindung an eine Ziel-RNA über den die
Ziel-RNA bindenden Anteil eines Ribozyms, der in enger
Nachbarschaft zu einem enzymatischen Anteil der RNA gehalten
wird, der die Ziel-RNA spaltet. Somit erkennt und spaltet
das Ribozym eine Ziel-RNA normalerweise über Paarung mit
komplementären Basen und nachdem es an der richtigen Stelle
gebunden ist wirkt es als Enzym, wobei es die Ziel-RNA
spaltet und inaktiviert. Die Spaltung einer Ziel-RNA auf
eine solche Weise zerstört deren Fähigkeit, die Synthese
eines codierten Proteins zu steuern, vorausgesetzt, die
Spaltung geschieht in der codierenden Sequenz. Nachdem ein
Ribozym sein RNA-Ziel gebunden und gespalten hat, wird es
typischerweise von der RNA freigesetzt, so daß es wiederholt
neue Ziele binden und spalten kann.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wird die
Telomerase zur Identifizierung von Telomerase-assoziierten
Proteinen verwendet, d. h. Telomerase-assoziierten Proteinen,
die Telomerase-Aktivität modulieren oder ansonsten ergänzen.
Wie bereits vorstehend angemerkt, können diese Proteine oder
Fragmente davon eine Funktion dadurch modulieren, daß sie
die Dissoziierung des Telomerase-Enzymkomplexes bewirken
oder die Assoziierung verhindern, die Assemblierung des
Telomerase-Komplexes verhindern, hTRT an deren Bindung an
ihre, eine ergänzende Einheit darstellende Nucleinsäure
hindern oder an ihre Bindung an ihre DNA-Matrize, hTRT an
der Bindung von Nucleotiden hindern, oder eine, oder mehrere
oder alle der Teilaktivitäten des Telomerase-Enzyms oder des
hTRT-Proteins, wie bereits vorstehend beschrieben,
verhindern, steigern oder hemmen.
Der Fachmann kann die erfindungsgemäßen Verfahren für den
Nachweis dafür verwenden, welche Anteile (z. B. Domänen)
dieser Telomerase-assoziierten Proteine mit Telomerase in
Kontakt kommen. In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform
werden diese Telomerase assoziierten Proteine oder Fragmente
davon als Modulatoren von Telomerase-Aktivität verwendet.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform werden
Telomerase-assoziierte Proteine als Modulatoren von
Telomerase-Aktivität verwendet. Zu Telomerase-assoziierten
Proteinen zählen chromosomale Strukturen, beispielsweise
Histone, Proteine der nucleären Matrix, Kontrollproteine der
Zellteilung/des Zellcyclus etc. Zu weiteren Telomerase
assoziierten Proteinen, die für den erfindungsgemäßen Zweck
als Modulatoren verwendet werden können, zählen p80 und p95,
das menschliche Protein und ihre menschlichen Homologe,
beispielsweise TP1 und TRF-1 (Chong, Science 270 (1995),
1663-1667). Zusätzlich können Fragmente dieser Telomerase
assoziierten Proteine vom Fachmann gemäß den
erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert und als
Modulatoren von Telomerase-Aktivität verwendet werden.
Acht hochkonservierte Motive wurden innerhalb der TRTs
verschiedener nicht-menschlicher Spezies identifiziert, wie
bereits vorstehend beschrieben (siehe auch Lingner, Science
276 (1997), 561-567). Fig. 4 zeigt ein Schema der
menschlichen TRT (hTRT)-codierenden cDNA-Sequenz (von
pGRN121) und von RT-Motiven im Vergleich zu S. pombe-Trt1p,
Euplotes p123 und S. cerevisiae Est2p. Die vorliegende
Erfindung stellt rekombinante und synthetische Nucleinsäuren
bereit, in denen die Codons für die konservierten
Aminosäurereste in jedem der acht Motive gegen jedes der
anderen Codons ausgetauscht wurden. Eine Vielzahl der
erhaltenen codierten Sequenzen exprimieren eine nicht
funktionelle hTRT. Siehe beispielsweise Beispiel 16. Somit
stellt die vorliegende Erfindung beispielsweise eine große
Anzahl von "mutierten" Telomerase-Enzymen und TRT-Proteinen
zur Verfügung, die eine Teilaktivität von Telomerase
aufweisen, jedoch nicht die gesamte Aktivität.
Beispielsweise kann eine solche Polymerase telomere
Strukturen binden, jedoch nicht Telomerase-assoziierte RNA
(d. h. hTR). Solch eine Telomerase-Mutante kann, wenn sie in
ausreichend hoher Konzentration exprimiert wird, zur
Verarmung eines notwendigen Telomerase-Bestandteils (z. B.
hTR) führen und dadurch als ein Inhibitor von Wildtyp-
Telomerase-Aktivität fungieren. Eine auf diese Weise
wirkende mutierte Telomerase stellt einen Antagonisten dar
oder eine sogenannte "dominant-negative" Mutante.
Die erfindungsgemäßen Antikörper können allgemein zur
Identifizierung, Reinigung oder Hemmung irgendeiner oder
aller Aktivitäten eines Telomerase-Enzyms und hTRT-Proteins
verwendet werden. Antikörper können als Antagonisten von
Telomerase-Aktivität auf verschiedene Weise wirken,
beispielsweise dadurch, daß sie verhindern, daß der
Telomerase-Komplex oder das Nucleotid an deren DNA-Substrate
bindet, dadurch, daß sie verhindern, daß die Telomerase-
Bestandteile einen aktiven Komplex bilden, durch
Aufrechterhaltung einer funktionellen (Telomerase-Komplex)
quaternären Struktur oder durch Bindung an eine der aktiven
Zentren des Enzyms oder an andere Stellen, die allosterische
Auswirkungen auf Aktivität haben (die unterschiedlichen
Teilaktivitäten von Telomerase sind ausführlich an anderer
Stelle dieser Beschreibung beschrieben).
Die erfindungsgemäßen Telomerase-Modulatoren können mittels
Verfahren, die in der Pharmazie gut bekannt sind, entworfen
oder hergestellt werden, dazu gehören kombinatorische
Verfahren und "rational drug design"-Verfahren.
Die Herstellung und das simultane Screenen von großen Banken
aus synthetischen Molekülen kann mittels gut bekannter
Verfahren der kombinatorischen Chemie ausgeführt werden,
siehe beispielsweise van Breemen, Abal. Chem. 69 (1997),
2159-2164 und Lam, Anticancer Drug Des. 12 (1997), 145-167.
Wie bereits vorstehend angemerkt, kann die Methodik der
kombinatorischen Chemie dazu verwendet werden, eine riesige
Anzahl von Oligonucleotiden zu erzeugen, die hinsichtlich
spezifischer Oligonucleotide, die geeignete
Bindungsaffinitäten besitzen, sehr schnell gescreent werden
können und Spezifitäten gegen ein beliebiges Ziel, wie die
erfindungsgemäßen TRT-Proteine, können genutzt werden (siehe
für eine allgemeine Hintergrundinformation Gold, J. of Biol.
ehem. 270 (1995), 13581-13584).
"Rational drug design" beinhaltet einen integrierten Satz an
Methoden, zu denen die Strukturanalyse von Zielmolekülen,
synthetische Chemie und fortgeschrittene Computerverfahren
zählen. Bei der Verwendung zum Entwurf von Modulatoren,
beispielsweise Antagonisten/Inhibitoren von Proteinzielen,
wie beispielsweise das Telomerase-Enzym und hTRT-Protein,
besteht das Ziel von "rational drug design" in einem
Verständnis der dreidimensionalen Gestalt und der Chemie
eines Moleküls. "Rational drug design" wird unterstützt von
Daten, die durch Röntgenstrukturanalyse oder NMR gewonnen
wurden und die nun für das hTRT-Protein und Telomerase-Enzym
gemäß den durch die Erfindung bereitgestellten Verfahren und
unter Verwendung der erfindungsgemäßen Reagenzien bestimmt
werden können. Hilfreich sind auch Berechnungen hinsichtlich
elektrostatischer Eigenschaften, Hydrophobizitäten und der
Lösungsmittelzugänglichkeit. Siehe beispielsweise Coldren,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997), 6635-6640.
Die Erfindung stellt auch Kits bereit, die zu einer
Bestimmung dafür verwendet werden können, ob eine
Testverbindung ein Modulator einer TRT-Aktivität ist. Der
Kit beinhaltet typischerweise eine oder mehrere der
folgenden Bestandteile: ein im wesentlichen gereinigtes TRT-Poly
peptid oder Polynucleotid (einschließlich Sonden und
Primern), ein Plasmid, das eine TRT (z. B. hTRT) exprimieren
kann, wenn es in eine Zelle oder ein zellfreies
Expressionssystem eingeführt wird; ein Plasmid, das eine TR- (z. B. hTR)
exprimieren kann, wenn es in eine Zelle oder ein
zellfreies Expressionssystem eingeführt wird; Zellen oder
Zellinien; eine Zusammensetzung zum Nachweis einer
Veränderung in einer TRT-Aktivität und eine Anleitung die
zeigt, wie eine Veränderung in der TRT-Aktivität
nachgewiesen und gemessen werden kann, wobei angezeigt wird,
daß eine Änderung in der Telomerase-Aktivität in Gegenwart
der Testverbindung ein Indikator dafür ist, ob die
Testverbindung die Telomerase-Aktivität moduliert und ein
Behälter. Der Kit kann auch Mittel enthalten, wie
beispielsweise ein TRAP-Assay oder ein Assay, der auf einer
quantitativen Polymerase-Kettenrekation beruht, um so eine
Änderung in einer TRT-Aktivität messen zu können. Der Kit
kann auch eine Anleitung dafür enthalten, wie eine
Veränderung in der TRT-Aktivität nachgewiesen und gemessen
werden kann, wobei angezeigt wird, daß eine Veränderung in
der Telomerase-Aktivität in Anwesenheit der Testverbindung
ein Indikator dafür ist, ob die Testverbindung die
Telomerase-Aktivität moduliert
Die Erfindung stellt auch transgene nicht-menschliche
mehrzellige Organismen (z. B. Pflanzen und Tiere) oder
einzellige Organismen (z. B. Hefe) bereit, die eine exogene
TRT-Gensequenz enthalten, bei der es sich um eine codierende
Sequenz oder eine regulatorische Sequenz (z. B. einen
Promotor) handeln kann. In einer Ausführungsform exprimiert
der Organismus ein exogenes TRT-Polypeptid mit einer Sequenz
von einem menschlichen TRT-Protein. In einer verwandten
Ausführungsform exprimiert der Organismus auch einen
Telomerase-RNA-Bestandteil (z. B. hTR).
Die Erfindung stellt auch einzellige und mehrzellige
Organismen (oder Zellen davon) bereit, bei denen mindestens
ein, eine Telomerase-Untereinheit (z. B. TRT oder TR) oder
ein Telomerase-assoziiertes Protein codierendes Gen mutiert
oder deletiert ist (d. h. in einem codierenden oder
regulatorischen Bereich), so daß keine native Telomerase
exprimiert wird oder diese mit einem herabgesetzten Spiegel
exprimiert oder im Vergleich zu Wildtypzellen oder
Organismen mit unterschiedlichen Aktivitäten exprimiert
wird. Solche Zellen und Organismen werden oft als "gene
knock-out"-Zellen oder -Organismen bezeichnet.
Die Erfindung stellt ferner Zellen und Organismen bereit,
bei denen ein endogenes Telomerase-Gen (z. B. Maus-TRT)
mutiert oder deletiert ist und ein exogenes Telomerase-Gen
(z. B. für menschliche TRT) eingeführt und exprimiert wird.
Zellen und Organismen dieses Typs sind beispielsweise als
Modellsysteme von Nutzen, um: Modulatoren von hTRT-Aktivität
oder -Expression zu identifizieren; die Auswirkungen von
Mutationen in Genen für Telomerase-Bestandteile bestimmen zu
können und beispielsweise das Timing im Hinblick auf den
Entwicklungszustand und die Gewebelokalisierung von
Telomerase-Aktivität bestimmen zu können (um beurteilen zu
können, wann ein Telomerase-Modulator verabreicht werden
soll und um mögliche Nebenwirkungen feststellen zu können).
Zu den Beispielen für mehrzellige Organismen gehören
Pflanzen, Insekten und Tiere, wie beispielsweise Mäuse,
Ratten, Kaninchen, Affen, Menschenaffen, Schweine und andere
Säuger. Ein Beispiel für einen einzelligen Organismus ist
Hefe.
Verfahren zur Änderung oder Unterbrechung eines spezifischen
Gens (z. B. endogener TRT-Gene) sind dem Fachmann gut
bekannt, siehe beispielsweise Baudin et al., Nucl. Acids
Res. 21 (1993), 3329; Wach et al., Yeast 10 (1994) 1793;
Rothstein, Methods Enzymol. 194 (1991), 281; Anderson,
Methods Cell Biol. 48 (1995), 31; Pettitt et al.,
Development 122 (1996), 4149-4157; Ramirez-Solis et al.,
Methods Enzymol. 225 (1993), 855 und Thomas et al., Cell 51
(1987), 503, wobei jedes dieser Dokumente durch Bezugnahme
in seiner Gesamtheit und für alle Zwecke als Bestandteil der
Beschreibung anzusehen ist.
Zu den erfindungsgemäßen "knockout"-Zellen und -Tieren
gehören Zellen und Tiere, in denen eine oder mehrere
Einheiten des endogenen Telomerase-Enzymkomplexes deletiert
oder gehemmt sind. Die Rekonstitution von Telomerase-
Aktivität bewahrt die Zelle oder das Tier vor dem
unvermeidlichen Zelltod, der durch dessen Unvermögen,
Telomere zu bewahren, bedingt ist. Verfahren zur Änderung
der Expression von endogenen Genen sind dem Fachmann gut
bekannt. Typischerweise beinhalten solche Verfahren die
Veränderung oder den Austausch aller regulatorischen
Sequenzen, die die Expression eines bestimmten zu
regulierenden Gens kontrollieren, oder eines Anteils davon.
Die regulatorischen Sequenzen, beispielsweise der native
Promotor, können verändert werden. Das übliche Verfahren für
eine zielgerichtete Mutation von Genen beinhaltet die
Einfügung eines, das gewünschte Gen enthaltenden genomischen
DNA-Fragments in einen Vektor, wonach sich die Clonierung
von zwei genomischen Armen um eine selektierbare Neomycin-
Resistenzkassette in einem Thymidinkinase enthaltenden
Vektor anschließt. Mit diesem "knock-out"-Konstrukt wird
dann eine geeignete Zelle transfiziert, d. h. eine embryonale
Stammzelle (ES) der Maus, wobei die Zellen danach einer
positiven Selektion (mittels G418 und beispielsweise auf
Neomycin-Resistenz zu selektieren) und einer negativen
Selektion (wobei beispielsweise FIAU verwendet wird, um
Zellen auszuschließen, denen Thymidinkinase fehlt)
unterworfen werden. Dies erlaubt die Selektion von Zellen,
die mit dem "knockout"-Vektor eine homologe Rekombination
eingegangen sind. Dieses Vorgehen führt zur Inaktivierung
des gewünschten Gens. Siehe beispielsweise die US-Patente
5,464,764; 5,631,153; 5,487,992 und 5,627,059.
"Knocking out"-Expression eines endogenen Gens kann auch
erreicht werden mittels homologer Rekombination, die zur
Einführung einer heterologen Nucleinsäure in die
regulatorischen Sequenzen (z. B. einen Promotor) des
gewünschten Gens verwendet wird. Um die Expression von
funktionellem Enzym oder Produkt zu verhindern, sind
einfache Mutationen geeignet, die entweder den Leserahmen
ändern oder den Promotor unterbrechen. Zur Hochregulation
der Expression kann ein nativer Promotor gegen einen
heterologen Promotor ausgetauscht werden, der höhere
Transkriptionsspiegel induziert. Es kann auch die "gene trap
insertion" verwendet werden, um ein Wirtsgen zu
unterbrechen. Embryonale Stammzellen (ES) der Maus können
zur Herstellung von transgenen "knockout"-Tieren verwendet
werden, wie dies beispielsweise in Holzschu Transgenic Res.
6 (1997), 97-106 beschrieben ist.
Die Änderung der Express Ion von endogenen Genen durch
homologe Rekombination kann auch unter Verwendung von
Nucleinsäuresequenzen erreicht werden, die das fragliche
Strukturen enthalten. Stromaufwärts gelegene Sequenzen
werden dafür verwendet, um Konstrukte bezüglich einer
heterologen Rekombination zum Ziel zu führen. Unter
Verwendung der Information hinsichtlich des TRT-Struk
turgens, beispielsweise SEQ. ID. Nr. 1, kann der
Fachmann Konstrukte für eine homologe Rekombination
herstellen, was lediglich Routineexperimente erforderlich
macht. Homologe Rekombination zur Änderung der Expression
von endogenen Genen ist beschrieben in US-Patent Nr.
5,272,071 und WO 91/09955, WO 93/09222, WO 96/29411, WO
95/31560 und WO 91/12650. Homologe Rekombination in
Mycobakterien ist beschrieben in Azad Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 93 (1996), 4787; Baulard, J. Bacteriol. 178 (1996), 3091
und Pelicic, Mol. Microbiol. 20 (1996), 991. Homologe
Rekombination in Tieren ist beschrieben von Moynahan, Hum.
Mol. Genet. 5 (1996), 875 und in Pflanzen von Offringa, EMBO
J. 9 (1990) 3077.
Die folgenden Bezeichnungen werden nachstehend definiert, um
dem Fachmann bei der Ausführung der Erfindung eine
zusätzliche Anleitung zu geben: Adjuvans, Allel (&
Allelsequenz), Aminosäuren (einschließlich hydrophobe,
polare, geladene), konservative Substitution,
Kontrollelemente (und regulatorische Sequenzen)
derivatisiert, nachweisbare Markierung, erhöhter Spiegel,
Epitop, günstige und ungünstige Prognose, Fusionsprotein,
Genprodukt, hTR, unsterblich, Immunogen und immunogen,
isoliert, Modulator, Motiv, Nucleinsäure (& Polynucleotid),
Oligonucleotide (& Oligomere), funktionell verknüpft,
Polypeptide, Sonde (einschließlich Nucleinsäuresonden und
Antikörpersonden), rekombinant, Selektionssystem, Sequenz,
spezifische Bindung, stringente Hybridisierungsbedingungen
(& Stringenz), wesentliche Identität (& wesentliche
Ähnlichkeit), im wesentlichen rein (& im wesentlichen
gereinigt), Telomerase-negative und Telomerase-positive
Zellen, katalytische Aktivität von Telomerase, Telomerase
verwandt und Testverbindung.
Der hier verwendete Ausdruck "Adjuvans" betrifft in seiner
normalen Bedeutung jede Substanz, die die Immunantwort
gegenüber einem Antigen, mit dem es vermischt ist, erhöht.
Zu den für die vorliegende Erfindung nützlichen Adjuvantien
gehören, jedoch ohne Beschränkung darauf, Freund's Adjuvans,
Mineralgele, wie Aluminiumhydroxid, und oberflächenaktive
Substanzen, beispielsweise Lysolecithin, pluronische
Polyole, Polyanionen, Peptide, Ölemulsionen, "Keyhole
limpet"-Hemocyanin und Dinitrophenol. BCG ("Bacillus
Calmette-Guerin") und Corynebacterium parvum sind ebenfalls
nützliche Adjuvantien.
Die hier verwendete Bezeichnung "Allel" oder "Allelsequenz"
betrifft eine alternative Form einer Nucleinsäuresequenz
(d. h. einer hTRT-Protein codierenden Nucleinsäure). Allele
sind das Ergebnis von Mutationen (d. h. Änderungen in der
Nucleinsäuresequenz) und es kommt dadurch im allgemeinen zur
Herstellung veränderter und/oder unterschiedlich regulierter
mRNAs oder Polypeptide, deren Struktur und/oder Funktion
geändert sein kann oder nicht. Übliche auf Mutationen
beruhende Änderungen, die zur Entstehung von Allelen führen,
werden allgemein natürlichen Deletionen, Additionen oder
Substitutionen von Nucleotiden zugeschrieben, die die
codierten Aminosäuren beeinflussen können oder auch nicht.
Jede Art dieser Änderung kann allein vorkommen, in
Kombination mit den anderen oder einmal oder öfter innerhalb
eines gegebenen Gens, Chromosoms oder einer anderen
zellulären Nucleinsäure. Jedes gegebene Gen kann keine, eine
oder viele allele Formen haben. Die hier verwendete
Bezeichnung für "Allel" bezieht sich entweder auf ein Gen
oder eine von dem Gen transkribierte mRNA oder beides.
Die hier beschriebenen "Aminosäuren" werden gelegentlich
durch den Standard-Einbuchstabencode bezeichnet: Alanin (A),
Serin (S), Threonin (T), Asparaginsäure (D), Glutaminsäure
(E), Asparagin (N), Glutamin (Q), Arginin (R), Lysin (K),
Isoleucin (I), Leucin (L), Methionin (M), Valin (V),
Phenylalanin (F), Tyrosin (Y), Tryptophan (W), Prolin (P),
Glycin (G), Histidin (H), Cystein (C). Dazu zählen auch
synthetische und nicht-natürlich vorkommende Aminosäure-
Analoge (und/oder Peptidverknüpfungen).
Der hier verwendete Ausdruck "hydrophobe Aminosäuren"
bezieht sich auf A, L, I, V, P, F, W und M. Der hier
verwendete Ausdruck "polare Aminosäuren" bezieht sich auf G,
S, T, Y, C, N und Q. Der hier verwendete Ausdruck "geladene
Aminosäuren" bezieht sich auf D, E, H, K und R.
Der hier verwendete Ausdruck "konservative Substitution"
bezieht sich bei der Beschreibung eines Proteins auf eine
Veränderung in der Aminosäurezusammensetzung des Proteins,
die die Aktivität des Proteins nicht wesentlich verändert.
Somit bezieht sich der Ausdruck "konservativ modifizierte
Variationen" einer bestimmten Aminosäuresequenz auf
Aminosäuresubstitutionen, bei denen Aminosäuren ausgetauscht
sind, die für die Proteinaktivität nicht kritisch sind, oder
auf die Substitution von Aminosäuren gegen andere
Aminosäuren mit ähnlichen Eigenschaften (sauer, basisch,
positiv oder negativ geladen, polar oder nicht-polar etc.),
so daß die Substitutionen selbst von kritischen Aminosäuren
die Aktivität nicht wesentlich ändern. Tabellen hinsichtlich
konservativer Substitution, die funktionell ähnliche
Aminosäuren aufzählen, sind auf dem Fachgebiet gut bekannt.
Die folgenden sechs Gruppen enthalten jeweils Aminosäuren,
die gegenüber einander konservative Substitutionen
darstellen: 1) Alanin (A), Serin (S), Threonin (T); 2)
Asparaginsäure (D), Glutaminsäure (E); 3) Asparagin (N),
Glutamin (Q); 4) Arginin (R), Lysin (K), 5) Isoleucin (I),
Leucin (L) Methionin (M); Valin (V); und 6) Phenylalanin
(F), Tyrosin (Y), Tryptophan (W) (siehe auch Creighton,
Proteins, (1984), W.H. Freeman and Company). Für den
Fachmann ist es offensichtlich, daß die vorstehend
angegebenen Austausche nicht die einzigen möglichen
konservativen Substitutionen darstellen. Beispielsweise
könnte man den Austausch einer geladenen Aminosäure gegen
eine andere geladene Aminosäure als konservative
Substitution erachten, unabhängig davon, ob sie positiv oder
negativ geladen ist. Zusätzlich sind individuelle
Substitutionen, Deletionen oder Additionen, die eine
einzelne Aminosäure oder einen kleinen Prozentsatz von
Aminosäuren in einer codierten Sequenz ändern, hinzufügen
oder deletieren, ebenfalls "konservativ modifizierte
Variationen". Eine "konservative Substitution" kann in ein
rekombinantes Protein dadurch eingeführt werden, daß ein
oder mehrere Codons verwendet werden, die sich von den
Codons unterscheiden, die von dem nativen Gen oder Wildtyp-
Gen verwendet werden. In diesem Fall beinhaltet eine
konservative Substitution auch die Substitution eines Codons
für eine Aminosäure gegen ein anderes Codon für dieselbe
Aminosäure.
Die hier verwendeten Bezeichnungen "Kontrollelemente" oder
"regulatorische Sequenzen" beinhalten Enhancer, Promotoren,
Transkriptionsterminatoren, Replikationsursprünge,
chromosomal integrierte Sequenzen, 5'- und 3'-nicht
translatierte Bereiche, mit denen Proteine oder andere
Biomoleküle zur Durchführung von Transkription und
Translation interagieren. Bei eukaryotischen Zellen
enthalten die Kontrollsequenzen einen Promotor und
vorzugsweise einen Enhancer, der beispielsweise von
Immunglobulingenen, SV40, Cytomegalovirus stammt, und eine
Polyadenylierungssequenz. Sie können auch Donor- und
Akzeptor-Sequenzen für die Spleißung enthalten. Je nach
verwendetem Vektorsystem und verwendetem Wirt kann eine
beliebige Anzahl von geeigneten Transkriptions- und
Translationselementen zu denen auch konstitutive und
induzierbare Promotoren gehören, verwendet werden.
Die hier verwendete Bezeichnung "derivatisierte(s)"
Polynucleotid, Oligonucleotid oder Nucleinsäure bezieht sich
auf ein Oligo- oder Polynucleotid, das einen derivatisierten
Substituenten umfaßt. In einigen Ausführungsformen ist der
Substituent im wesentlichen hinsichtlich der Hybridisierung
mit komplentären Polynucleotiden nicht störend.
Derivatisierte Oligo- oder Polynucleotide, die mit
hinzugefügten chemischen Substituenten modifiziert wurden
(z. B. durch Modifikation eines bereits synthetisierten
Oligo- oder Polynucleotids oder durch Einbau einer
modifizierten Base oder eines Rückgrat-Analogen während der
Synthese) können in eine metabolisch aktive eukaryotische
Zelle eingeführt werden, um mit einer hTRT-DNA, -RNA oder
einem hTRT-Protein zu hybridisieren, wobei sie eine
Veränderung oder chemische Modifikation an einer dortigen
DNA, RNA oder einem dortigen Protein erzeugen. In einer
alternativen Ausführungsform können die derivatisierten
Oligo- oder Polynucleotide mit hTRT-Polypeptiden,
Telomerase-assoziierten Proteinen oder anderen Faktoren, die
mit hTRT-DNA oder hTRT-Genprodukten interagieren, in
Wechselwirkung treten und diese ändern, oder die Expression
oder Funktion von hTRT-DNA oder -RNA oder -Proteinen ändern
oder modulieren. Zu den Beispielen für angeknüpfte chemische
Substituenten zählen: Europium (III) texaphyrin,
quervernetzende Mittel, Psoralen, Metallchelate (z. B.
Eisen/EDTA-Chelat für eine Eisen-katalysierte Spaltung),
Topoisomerasen, Endonucleasen, Exonucleasen, Ligasen,
Phosphodiesterasen, photodynamische Porphyrine,
chemotherapeutische Wirkstoffe (z. B. Adriamycin,
Doxirubicin), interkalierende Mittel, Basen-modifizierende
Mittel, Immunglobulinketten und Oligonucleotide. Eisen/EDTA-Che
late sind chemische Substituenten, die oft dann verwendet
werden, wenn eine lokale Spaltung einer Polynucleotidsequenz
erwünscht ist (Hertzberg et al., J. Am. Chem. Soc. 104
(1982), 313; Hertzberg und Dervan, Biochemistry 23 (1984),
3934; Taylor et al., Tetrahedron 40 (1984), 457 und Dervan,
Science 232 (1986), 464). Zu Beispielen von chemischen
Verfahren zur Anknüpfung zählen: direkte Verbindung z. B.
über eine angehängte reaktive Aminogruppe (Corey und
Schultz, Science 238 (1988), 1401, wobei dieses Dokument
durch Bezugnahme als Bestandteil dieser Beschreibung
anzusehen ist) und andere chemische Verfahren für direkte
Verbindungen, wobei allerdings auch Verbindungsverfahren für
Streptavidin/Biotin und Digoxigenin/anti-Digoxigenin-
Antikörper verwendet werden können. Verfahren zur Kopplung
chemischer Substituenten werden bereitgestellt in den US-Pa
tenten 5,135,720, 5,093,245, und 5,055,556, die aufgrund
der Bezugnahme als Bestandteil dieser Beschreibung angesehen
werden können. Andere chemische Kopplungsverfahren liegen im
Ermessen des Fachmanns.
Die hier verwendete Bezeichnung "nachweisbare Markierung"
besitzt die auf dem Fachgebiet übliche Bedeutung und
betrifft ein Atom (z. B. ein Radionuclid), Molekül (z. B.
Fluorescein) oder einen Komplex, der dafür verwendet wird
oder dafür verwendet werden kann, um die Anwesenheit eines
Moleküls nachzuweisen (z. B. aufgrund einer physikalischen
oder chemischen Eigenschaft) oder anzuzeigen, oder um die
Bindung eines anderen Moleküls zu ermöglichen, an das es
kovalent gebunden oder eng assoziiert ist. Die Bezeichnung
"Markierung" bezieht sich auch auf kovalent gebundene oder
eng assoziierte Moleküle (z. B. ein Biomolekül,
beispielsweise ein Enzym), das auf ein Substrat zur
Erzeugung eines nachweisbaren Atoms, Moleküls oder Komplexes
einwirkt. Zu den für die erfindungsgemäße Verwendung
geeigneten nachweisbaren Markierungen zählen alle
Zusammensetzungen, die durch spektroskopische,
photochemische, biochemische, immunchemische, elektrische,
optische oder chemische Mittel nachweisbar sind. Zu den für
die vorliegende Erfindung nützlichen Markierungen gehören
Biotin zur Anfärbung mit markiertem Streptavidin-Konjugat,
magnetische Kügelchen (z. B. Dynabeads\),
Fluoreszenzfarbstoffe (z. B. Fluorescein, Texas-rot,
Rhodamin, grün-fluoreszierendes Protein ("green fluorescent
protein"), verstärktes grün-fluoreszierendes Protein
("enhanced green fluorescent protein"), Lissamin,
Phycoerythrin, Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, "FluorX"
(Amersham), "SyBR Green I & II" (Molecular Probes), etc.),
radioaktive Markierungen (z. B. 3H, 125I, 35S, 14C oder 32P),
Enzyme (z. B. Hydrolasen, insbesondere Phosphatasen, wie
beispielsweise alkalische Phosphatase, Esterasen und
Glycosidasen oder Oxidoreductasen, insbesondere Peroxidasen,
wie beispielsweise Meerrettichperoxidase und andere
üblicherweise in einem ELISA verwendete Enzyme), Substrate,
Cofaktoren, Inhibitoren, chemiluminescente Gruppen,
chromogene Mittel und colorimetrische Markierungen, wie
beispielsweise kolloidales Gold oder gefärbte Glas- oder
Plastik (z. B. Polystyrol, Polypropylen, Latex etc.)-
Kügelchen. Zu denen Patenten, deren Lehre die Verwendung
solcher Markierungen betrifft, zählen US-Patent 3,817,837;
3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149 und
4,366,241. Mittel zum Nachweis solcher Markierungen sind dem
Fachmann gut bekannt. Somit können beispielsweise
radioaktive Markierungen und chemilumineszente Markierungen
mittels eines photographischen Films oder
Szintillationszählern nachgewiesen werden und
Fluoreszenzmarker können zum Nachweis von emittiertem Licht
mit einem Photodetektor (z. B. bei der Fluoreszenz
aktivierten Zellsortierung) nachgewiesen werden.
Enzymatische Markierungen werden typischerweise dadurch
nachgewiesen, daß das Enzym mit einem Substrat versehen wird
und daß durch die Wirkung des Enzyms auf das Substrat das
erzeugte Reaktionsprodukt nachgewiesen wird.
Colorimetrischen Markierungen werden einfach durch
Sichtbarmachung der gefärbten Markierung nachgewiesen. Somit
ist eine Markierung jede Zusammensetzung, die durch
spektroskopische, photochemische, biochemische,
immunchemische, elektrische, optische oder chemische Mittel
nachweisbar ist. Die Markierung kann an den gewünschten
Assay-Bestandteil gemäß auf dem Fachgebiet gut bekannter
Verfahren direkt oder indirekt gekoppelt werden. Nicht
radioaktive Markierungen werden oft durch indirekte Mittel
angebracht. Im allgemeinen ist ein Ligandenmolekül (z. B.
Biotin) kovalent an das Molekül gebunden. Der Ligand bindet
dann ein anti-Ligandenmolekül (z. B. Streptavidin), das
entweder inhärent nachweisbar ist oder an ein ein Signal
erzeugendes System kovalent gebunden ist, wie beispielsweise
ein nachweisbares Enzym, eine fluoreszierende Verbindung
oder eine chemilumineszierende Verbindung. Es kann eine
Reihe von Liganden und anti-Liganden verwendet werden. In
den Fällen, in denen ein Ligand einen natürlichen anti-
Liganden aufweist, beispielsweise Biotin, Thyroxin oder
Cortison, kann er in Verbindung mit den markierten,
natürlich vorkommenden anti-Liganden verwendet werden.
Alternativ kann jedes Hapten oder jede antigene Verbindung
in Kombination mit einem Antikörper verwendet werden. Die
Moleküle können auch direkt an signalerzeugende Verbindungen
konjugiert sein, beispielsweise durch Konjugation mit einem
Enzym oder Fluorophor. Mittel zum Nachweis von Markierungen
sind dem Fachmann gut bekannt. Somit zählen beispielsweise
dann, wenn die Markierung eine radioaktive Markierung ist,
zu den Nachweismitteln ein Szintillationszähler,
photographischer Film, wie bei der Autoradiographie, oder
eine Bildgebung mittels gespeichertem Phosphor ("storage
phosphor imaging"). Eine Fluoreszenzmarkierung kann durch
Anregung des Fluorchroms mit Licht einer geeigneten
Wellenlänge und dem Nachweis der erhaltenen Fluoreszenz
nachgewiesen werden. Die Fluoreszenz kann visuell
nachgewiesen werden, mit Hilfe eines photographischen Films,
mittels eines elektronischen Detektors, wie beispielsweise
ladungsgekoppelte Vorrichtungen (CCDs) oder
Sekundärelektronenvervielfacher etc. Auf ähnliche Weise
können enzymatische Markierungen dadurch nachgewiesen
werden, daß für das Enzym die geeigneten Substrate
bereitgestellt werden, und das erhaltene Reaktionsprodukt
nachgewiesen wird. Auch können einfache colorimetrische
Markierungen durch die Beobachtung der mit der Markierung
assoziierten Farbe nachgewiesen werden. Wenn Paare von
Fluorophoren in einem Assay verwendet werden, wird es oft
bevorzugt, daß diese unterschiedliche Emissionsmuster
(Wellenlängen) besitzen, so daß sie leicht unterschieden
werden können.
Die Bezeichnung "erhöhter Spiegel" bezieht sich auf eine
Menge an hTRT-Genprodukt (oder einer anderen angegebenen
Substanz oder Aktivität) in einer Zelle, die erhöht ist,
oder höher im Vergleich mit dem Spiegel in einem
Referenzstandard, zu dem Spiegel in normalen Telomerase
negativen Zellen in einer Person oder in anderen Personen,
die nicht an dem entsprechenden Zustand leiden,
beispielsweise für eine Diagnose, und für eine Prognose, zum
Spiegel in Tumorzellen von einer Reihe von Stadien, oder
Klassen von beispielsweise Tumoren.
Der hier verwendete Ausdruck "Epitop" hat seine übliche
Bedeutung, d. h. er bezieht sich auf eine Stelle auf einem
Antigen, die von einem Antikörper erkannt wird. Epitope sind
typische Abschnitte von Aminosäuren, die einen kleinen
Anteil des Gesamtproteins darstellen. Epitope können die
Konformation betreffen (d. h. diskontinuierlich). Das heißt,
sie können durch Aminosäuren gebildet werden, die von nicht-
zusammenhängenden Teilen an Primersequenz codiert werden,
und die aufgrund der Proteinfaltung nebeneinander zu liegen
kommen.
Die Bezeichnungen "günstige Prognose" und "ungünstige
Prognose" sind auf dem Fachgebiet bekannt. Im Zusammenhang
mit Krebs bedeutet "günstige Prognose", daß sich ein Tumor
wahrscheinlich zurückbilden wird, oder längere
Überlebenschancen für Patienten mit einer günstigen Prognose
bestehen im Vergleich zu denen mit einer ungünstigen
Prognose, während der Ausdruck "ungünstige Prognose"
bedeutet, daß der Tumor wahrscheinlich aggressiver ist, was
zu einem schlechten Krankheitsverlauf für den Patienten
führt oder einem schnellerem Fortschreiten der Krankheit.
Der hier verwendete Ausdruck "Fusionsprotein" bezieht sich
auf ein zusammengesetztes Protein, d. h. eine einzelne
zusammenhängende Aminosäuresequenz, die aus zwei (oder
mehreren) unterschiedlichen heterologen Polypeptiden
aufgebaut ist, die normalerweise nicht in einer einzigen
Aminosäuresequenz zusammen fusioniert sind. Somit kann ein
Fusionsprotein eine einzelne Aminosäuresequenz beinhalten,
die zwei vollkommen verschiedene Aminosäuresequenzen enthält
oder zwei ähnliche oder identische Polypeptidsequenzen,
vorausgesetzt, daß diese Sequenzen normalerweise nicht
zusammen in einer einzigen Aminosäuresequenz aufgefunden
werden. Fusionsproteine können allgemein unter Verwendung
entweder von Nucleinsäure-Rekombinationsverfahren
hergestellt werden, d. h. als das Ergebnis von Transkription
und Translation eines rekombinanten Genfusionsprodukts,
wobei die Fusion einen Abschnitt umfaßt, der ein
erfindungsgemäßes Polypeptid codiert und einen Abschnitt,
der ein heterologes Protein codiert, oder durch auf dem
Fachgebiet allgemein bekannte chemische Syntheseverfahren.
Der (die) nicht-hTRT-Bereich(e) des Fusionsproteins können
an den Aminoterminus des hTRT-Polypeptids, den Carboxy-
Terminus oder beide fusioniert werden.
Der hier verwendete Ausdruck "Genprodukt" bezieht sich auf
ein von einem Gen transkribiertes RNA-Molekül oder ein
Protein, das von dem Gen codiert oder von der RNA
translatiert wird.
Der hier verwendete Ausdruck "hTR" (menschliche Telomerase-
RNA) bezieht sich auf den RNA-Bestandteil von menschlicher
Telomerase und aller natürlich vorkommender Allele und
Varianten oder rekombinate Varianten. hTR wird ausführlich
in dem US-Patent Nr. 5,583,016 beschrieben, das durch
Bezugnahme in seiner Gesamtheit und für alle Zwecke als
Bestandteil dieser Beschreibung angesehen werden kann.
Der hier verwendete Ausdruck "unsterblich" hat, wenn er sich
auf eine Zelle bezieht, seine normale Bedeutung auf dem
Telomerase betreffenden Fachgebiet und bezieht sich auf
Zellen, die ein offensichtlich unbegrenztes replikatives
Potential besitzen. Der Ausdruck "unsterblich" kann sich
auch auf Zellen mit erhöhter Proliferationsfähigkeit im
Vergleich zu ihren unmodifizierten Gegenstücken beziehen.
Beispiele für unsterbliche menschliche Zellen sind maligne
Tumorzellen, Keimbahnzellen und bestimmte transformierte
menschliche Zellinien, die in vitro kultiviert sind (z. B.
Zellen, die nach Transformation durch virale Oncogene
unsterblich wurden). Im Gegensatz dazu sind die meisten
normalen menschlichen somatischen Zellen sterblich, d. h. sie
besitzen ein begrenztes replikatives Potential und werden
nach einer ähnlichen Zahl von Zellteilungen senescent.
Die hier verwendeten Ausdrücke "Immunogen" und "immunogen"
haben die auf diesem Fachgebiet übliche Bedeutung, d. h. ein
Immunogen ist ein Molekül, beispielsweise ein Protein oder
ein anderes Antigen, das eine adaptive Immunantwort nach
Injektion in eine Person oder ein Tier auslöst.
Der hier verwendete Ausdruck "isoliert" bedeutet, wenn er
sich auf ein Molekül oder eine Zusammensetzung bezieht,
beispielsweise auf ein RNP (z. B. mindestens ein Protein und
mindestens eine RNA), daß das Molekül oder die
Zusammensetzung von mindestens einer weiteren Verbindung
(z. B. ein Protein, andere RNAs oder andere Verunreinigungen
mit denen es in vivo oder in seinem natürlich vorkommenden
Status assoziiert ist, abgetrennt wurde. Somit wird ein RNP
dann als "isoliert" angesehen, wenn er beispielsweise von
einer Zellmembran, beispielsweise aus einem Zellextrakt,
isoliert wurde. Eine isolierte Zusammensetzung kann jedoch
auch im wesentlichen rein sein.
Der hier verwendete Begriff "Modulator" bezieht sich auf
jede synthetische oder natürliche Verbindung oder
Zusammensetzung, die auf beliebige Weise sowohl die "volle"
oder jede "Teilaktivität" einer Telomerase-reversen
Transkriptase (TRT) verändern kann. Ein Modulator kann ein
Agonist oder ein Antagonist sein. Ein Modulator kann,
allerdings ohne Beschränkung darauf, eine beliebige
organische oder anorganische Verbindung sein. Dazu gehören
beispielsweise kleine Moleküle, Peptide, Proteine, Zucker,
Nucleinsäure, Fettsäuren etc. Die hier verwendete
Bezeichnung "Motiv" bezieht sich auf eine Sequenz von
aufeinanderfolgenden Aminosäuren (oder auf eine
Nucleinsäuresequenz, die eine Sequenz von
aufeinanderfolgenden Aminosäuren codiert), die ein Merkmal
oder eine Struktur in einem Protein definiert, die allen
Proteinen einer definierten Klasse oder eines definierten
Typs gemeinsam ist, oder innerhalb dieser Proteine
konserviert ist. Das Motiv oder die "Konsensus"-Sequenz
können sowohl konservierte als auch nicht-konservierte Reste
enthalten, die konservierten Reste in der Motivsequenz
zeigen jedoch an, daß der konservierte Rest oder die Klasse
von Resten (d. h. hydrophob, polare nicht-polar oder eine
andere Klasse) typischerweise an der angegebenen Position in
jedem Protein (oder Gen oder mRNA) der Klasse von Proteinen,
die durch das Motiv definiert sind, vorhanden ist. Motive
können sich entsprechend der Proteinklasse unterscheiden.
Somit bilden beispielsweise die reverse Transkriptase-Enzyme
eine Klasse von Proteinen, die durch eines oder mehrere
Motive definiert sein kann und zu dieser Klasse gehören auch
Telomerase-Enzyme. Die Telomerase-Enzyme können jedoch als
die Klasse von Enzymen mit Motiven definiert werden, die für
diese Klasse charakteristisch sind. Es ist für den Fachmann
offensichtlich, daß die Identifizierung eines Restes als
konservierter Rest in einem Motiv nicht bedeutet, daß jedes
Mitglied der durch das Motiv definierten Klasse diesen
angegebenen Rest (oder Klasse von Resten) an der angegebenen
Position aufweist und daß eines oder mehrere Mitglieder der
Klasse einen unterschiedlichen Rest an der konservierten
Position besitzen kann (können).
Die hier verwendeten Ausdrücke "Nucleinsäure" und
"Polynucleotid" werden gegenseitig austauschbar verwendet.
Bei der Verwendung des Ausdrucks "Polynucleotid" ist der
Ausschluß von Oligonucleotiden (d. h. kurzen Polynucleotiden)
nicht beabsichtigt und dieser Ausdruck kann sich auch auf
synthetische und/oder nicht-natürlich vorkommende
Nucleinsäuren beziehen (d. h. Nucleinsäure-Analoge oder
modifizierte Rückgratreste oder Bindungen umfassen).
Die hier verwendeten Ausdrücke "Oligonucleotide" oder
"Oligomere" beziehen sich auf eine Nucleinsäuresequenz aus
etwa 7 Nucleotiden oder mehr und bis zu etwa 700
Nucleotiden, die als eine Sonde oder "Amplimer" verwendet
werden können. Oligonucleotide weisen vorzugsweise eine
Länge von zwischen etwa 10 und etwa 50 Nucleotiden auf, mehr
bevorzugt von etwa 14 bis etwa 35 Nucleotiden und am meisten
bevorzugt von etwa 15 bis etwa 25 Nucleotiden und dieser
Ausdruck kann sich auch auf synthetische und/oder nicht
natürlich vorkommende Nucleinsäuren beziehen (d. h.
Nucleinsäure-Analoge oder modifizierte Rückgratreste oder
Bindungen umfassen).
Der hier verwendete Ausdruck "funktionell verknüpft" bezieht
sich auf eine funktionelle Beziehung zwischen zwei oder mehr
Nucleinsäuresegmenten (z. B. DNA): Beispielsweise ist ein
Promotor oder Enhancer mit einer codierenden Sequenz
funktionell verknüpft, wenn er die Transkription der Sequenz
in einer geeigneten Wirtszelle oder einem anderen
Expressionssystem stimuliert. Sequenzen, die funktionell
verknüpft sind, sind im allgemeinen aufeinanderfolgend und
im Fall einer Signalsequenz sowohl aufeinanderfolgend und im
Leserahmen. Enhancer müssen jedoch nicht in enger
Nachbarschaft zu den codierenden Sequenzen, deren
Transkription sie erhöhen sollen, gelegen sein.
Der hier verwendete Ausdruck "Polypeptid" und die
Bezeichnung "Protein" werden gegenseitig austauschbar
verwendet und beziehen sich auf ein Polymere das aus
Aminosäureresten zusammengesetzt ist, wozu synthetische,
natürlich vorkommende und nicht natürlich vorkommende
Analoge davon zählen. Peptide sind Beispiele für
Polypeptide.
Der hier verwendete Ausdruck "Sonde" bezieht sich auf ein
Molekül, das ein anderes Molekül spezifisch bindet. Ein
Beispiel einer Sonde ist eine "Nucleinsäuresonde", die an
eine im wesentlichen komplementäre Nucleinsäure spezifisch
bindet (d. h. sich anlagert oder hybridisiert). Ein weiteres
Beispiel einer Sonde ist eine "Antikörper-Sonde" die an ein
entsprechendes Antigen oder Epitop spezifisch bindet.
Der hier verwendete Ausdruck "rekombinant" bezieht sich auf
ein Polynucleotid, das in vitro synthetisiert oder auf
andere Weise manipuliert wurde (z. B. ein "rekombinantes
Polynucleotid"), auf Verfahren, die sich auf die Verwendung
rekombinanter Polynucleotide zur Herstellung von
Genprodukten in Zellen oder anderen biologischen Systemen
beziehen oder auf ein Polypeptid ("rekombinantes Protein"),
das von einem rekombinanten Polynucleotid codiert wird 99999 00070 552 001000280000000200012000285919988800040 0002019743497 00004 99880.
Der hier verwendet Ausdruck "Selektionssystem" bezieht sich
im Zusammenhang mit stabil transformierten Zellinien auf ein
Verfahren zur Identifizierung und/oder Selektion von Zellen,
die eine gewünschte rekombinante Nucleinsäure enthalten.
Eine große Vielzahl von Selektionssystemen zur
Identifizierung von transformierten Zellen ist bekannt und
diese sind zur Anwendung bei der vorliegenden Erfindung
geeignet. Beispielsweise können durch Plasmide oder andere
Vektoren transformierte Zellen durch die Resistenz gegen
Antibiotika selektiert werden, die durch auf den Plasmiden
enthaltene Gene verliehen wird, beispielsweise die gut
bekannten Gene amp, gpt, neo und hyg oder andere Gene, wie
beispielesweise die Herpes simplex-Virus-Thymidinkinase-Gene
(Wigler et al., Cell 11 (1977), 223-32 und das
Adeninphosphoribosyltransferasegen (Lowy et al., Cell 22
(1980), 817), die in tk⁻- bzw. aprt⁻-Zellen verwendet werden
können. Auch die Resistenz gegen einen Antimetaboliten, ein
Antibiotikum oder Herbizid kann als Basis für eine Selektion
verwendet werden; beispielsweise dhfr, das Resistenz gegen
Metotrexat verleiht und auch für eine Genamplifikation von
Nutzen ist (Wigler et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 77 (1980),
3567); npt, das Resistenz gegen die Aminoglykoside Neomycin
und G-418 verleiht (Colbere-Garapin et al., J. Mol. Biol.
150 (1981), 1) und als oder pat, die Resistenz gegen
Chlorsulfuron bzw. Phosphinotricin-Acetyltransferase
verleihen (Murry, in McGraw Hill Yearbook of Science and
Technology, McGraw Hill, New York NY, Seiten 191-196
(1992)). Es werden weitere selektierbare Gene beschrieben,
beispielsweise trpB, ein Gen das Hygromycin-Resistenz
verleiht und Zellen erlaubt anstelle von Tryptophan Indol zu
verwenden, oder hisD, das es Zellen erlaubt anstelle von
Histidin Histinol zu verwenden (Hartman und Mulligan, Proc.
Natl. Acad. Sci., 85 (1988), 8047). Erst kürzlich hat die
Verwendung von sichtbaren Markern große Popularität
erreicht, wobei solche Marker wie Anthocyanine, β-
Glucuronidase und dessen Substrat, GUS und Luciferase und
dessen Substrat, Luciferin, nicht nur zur Identifizierung
von Transformanten beide Verwendung finden sondern auch zur
Quantifizierung der Menge von transienter oder stabiler
Proteinexpression, die einem spezifischen Vektorsystem
zugeschrieben werden kann (Rhodes et al., Meth. Mol. Biol 55
(1995), 121).
Der hier verwendete Ausdruck "Sequenz" eines Gens, einer
Nucleinsäure, eines Proteins oder Peptids bezieht sich
(falls nicht spezifisch anders angegeben) auf die Anordnung
von Nucleotiden entweder in einem Strang oder beiden
Strängen eines doppelsträngigen DNA-Moleküls, beispielsweise
auf die Sequenz sowohl des codierenden Strangs als auch des
dazu komplementären Strangs, oder in einem einzelsträngigen
Nucleinsäuremolekül, oder auf die Anordnung von Aminosäuren
in einem Peptid oder Protein.
Der hier verwendete Ausdruck "spezifisch bindend" bezieht
sich auf die Fähigkeit eines Moleküls, typischerweise eines
Antikörpers oder Polynucleotids, mit einem anderen
spezifischen Molekül selbst in Gegenwart von vielen anderen
unterschiedlichen Molekülen in Kontakt zu kommen und zu
assoziieren. Beispielsweise kann ein einzelsträngiges
Polynucleotid spezifisch an ein einzelsträngiges
Polynucleotid, das in seiner Sequenz komplementär ist,
spezifisch binden, und ein Antikörper bindet spezifisch an
sein korespondierendes Antigen (oder "ist spezifisch
immunreaktiv damit").
Der hier verwendete Ausdruck "stringente
Hybridisierungsbedingungen" oder "Stringenz" bezieht sich
auf Bedingungen im Bereich von etwa 5°C bis etwa 20°C oder
25°C unter der Schmelztemperatur (Tm) der Zielsequenz und
einer- Sonde mit einer exakten oder fast exakten
Komplementarität zum Ziel. Der hier verwendete Ausdruck
"Schmelztemperatur" bezieht sich auf die Temperatur, bei der
eine Population von doppelsträngigen Nucleinsäuremolekülen
halb in Einzelstränge dissoziiert. Verfahren zur Berechnung
des Tm von Nucleinsäuren sind auf dem Fachgebiet allgemein
bekannt (siehe z. B. Berger und Kimmel (1987) Methods in
Enzymology, Bd. 152: Guide to Molecular Cloning Techniques,
San Diego: Academic Press, Inc. und Sambrook et al., (1989)
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Bände 1-3,
Cold Spring Harbor Laboratory (nachstehend als "Sambrook"
bezeichnet), wobei beide Dokumente aufgrund der Bezugnahme
als Bestandteil dieser Beschreibung angesehen werden
können). Wie in Standardreferenzen angegeben, dann eine
einfache Bestimmung des Tm-Wertes anhand der Gleichung: Tm =
81,5 + 0,41 (% G + C) berechnet werden, wenn eine
Nucleinsäure sich in wäßriger Lösung bei 1 M NaCl befindet
(siehe z. B. Anderson und Young, Quantitative Filter
Hybridization in: Nucleic Acid Hybridization (1985)). Andere
Referenzen enthalten verfeinerte Berechnungen, wobei sowohl
strukturellen Merkmalen als auch Sequenzmerkmalen bei der
Berechnung des Tm Rechnung getragen wird. Die
Schmelztemperatur eines Hybrids (und somit die Bedingungen
für eine stringente Hybridisierung) werden durch
verschiedene Faktoren beeinflußt, beispielsweise die Länge
und Art (DNA, RNA, Basenzusammensetzung) der Sonde und der
Art des Ziels (DNA, RNA, Basenzusammensetzung, in Lösung
vorhanden oder immobilisiert etc.) und der Konzentration von
Salzen und anderen Bestandteilen (z. B. das Vorhandensein
oder Fehlen von Formamid, Dextransulfat, Polyethylenglykol).
Die Auswirkungen dieser Faktoren sind allgemein bekannt und
werden in Standardreferenzen bezüglich dieses Fachgebiets
diskutiert; siehe z. B. Sambrook, a.a.O., und Ausubel et al.,
a.a.O. Typischerweise entsprechen stringente
Hybridisierungsbedingungen Salzkonzentrationen unter etwa
1,0 M Natriumionen, typischerweise etwa 0,01 bis 1,0 M
Natriumionen bei einem pH-Wert von 7,0 bis 8,3 und
Temperaturen von mindestens etwa 30°C für kurze Sonden (z. B.
10 bis 50 Nucleotide) und mindestens etwa 60°C für lange
Sonden (z. B. über 50 Nucleotide). Wie bereits angemerkt,
können stringente Bedingungen auch durch die Zugabe von
destabilisierenden Mitteln wie beispielsweise Formamid
erreicht werden, wobei in diesem Fall niedrigere
Temperaturen angewandt werden können.
Der hier verwendete Ausdruck "wesentliche Sequenzidentität"
im Zusammenhang mit Nucleinsäuren bezieht sich auf das
Ausmaß von Sequenzähnlichkeit zwischen zwei Polynucleotiden.
Wesentliche Sequenzidentität kann durch Hybridisierung unter
stringenten Bedingungen, durch direkten Vergleich oder
andere Maßnahmen bestimmt werden. Beispielsweise können zwei
Polynucleotide als wesentliche Sequenzidentität aufweisend
identifiziert werden, wenn sie miteinander unter stringenten
Hybridisierungsbedingungen spezifisch hybridisieren können.
Andere Grade an Sequenzidentität (z. B. weniger als
"wesentlich" können durch Hybridisierung unter
unterschiedlichen Stringenz-Bedingungen charakterisiert
werden. Alternativ kann wesentliche Sequenzidentität als ein
Prozentsatz an Identität zwischen zwei Nucleotidsequenzen
(oder Polypeptidsequenzen) beschrieben werden. Zwei
Sequenzen werden dann als wesentlich identisch erachtet,
wenn sie zu mindestens etwa 60% identisch sind, bevorzugt
mindestens etwa 70%, mindestens etwa 80%, mindestens etwa
90% oder mindestens etwa 95 oder 98 bis 100%. Die
prozentuale Sequenzidentität (Nucleotid oder Aminosäure)
wird typischerweise durch Bestimmung der optimalen
Ausrichtung zwischen zwei Sequenzen oder durch Vergleichen
der zwei Sequenzen berechnet. Beispielsweise kann ein für
eine "sense"-Suppression verwendetes exogenes Transkript als
ein bestimmter Prozentsatz an Identität oder Ähnlichkeit im
Vergleich zu einer Referenzsequenz (z. B. der
korrespondierenden endogenen Sequenz) aufweisen, beschrieben
werden. Die optimale Ausrichtung von Sequenzen kann unter
Verwendung des Algorithmus von Smith und Waterman, Adv.
Appl. Math. 2 (1981), 482, der sich auf die lokale Homologie
bezieht ("local homology algorithm") durchgeführt werden,
durch den Algorithmus, der sich auf die Homologie-
Ausrichtung bezieht, ("homology alignment algorithm") von
Needleman und Wunsch, J. Mol. Biol. 48 (1970), 443, durch
das "search for similarity"-Verfahren von Pearson und
Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 2444, durch
Ausführung dieser Algorithmen mittels Computer (GAP,
BESTFIT, FASTA und TFASTA in dem Software-Paket von
Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science
Dr., Madison, WI) oder durch Betrachtung. Die beste
Ausrichtung (die den höchsten Prozentsatz an Identität
ergibt), die durch die verschiedenen Verfahren erzeugt
wurde, wird ausgewählt. Typischerweise vergleichen diese
Algorithmen zwei Sequenzen über ein "Vergleichsfenster"
(normalerweise mit einer Länge von mindestens 18
Nucleotiden) um so lokale Bereiche an Sequenzähnlichkeit
identifizieren und vergleichen zu können, wobei kleine
Additionen oder Deletionen (d. h. Lücken) erlaubt sind.
Additionen und Deletionen betragen typischerweise 20% oder
weniger der Länge der Sequenz relativ zu der
Referenzsequenz, die keine Additionen oder Deletionen
enthält. Es ist gelegentlich wünschenswert, Sequenzidentität
zwischen zwei Sequenzen im Bezug auf eine bestimmte Länge
oder einen bestimmten Bereich zu beschreiben (z. B. können
zwei Sequenzen als mindestens 95% Identität über eine Länge
von mindestens 500 Basenpaaren aufweisend beschrieben
werden). Normalerweise beträgt die Länge mindestens etwa 50,
100, 200, 300, 400 oder 500 Basenpaare, Aminosäuren oder
andere Reste. Der Prozentsatz an Sequenzidentität wird durch
Vergleich zweier optimal ausgerichteter Sequenzen über den
Vergleichsbereich berechnet, die Bestimmung der Anzahl an
Positionen, an denen die identischen Nucleinsäurebase (z. B.
A, T, C, G oder U) in beiden Sequenzen vorkommt, um so die
Anzahl an gepaarten Positionen zu ermitteln, und durch
Bestimmung der Anzahl (oder des Prozentsatzes) an gepaarten
Positionen im Vergleich zu der Gesamtanzahl von Basen in der
Referenzsequenz oder der Vergleichsregion. Ein zusätzlicher
Algorithmus, der für die Bestimmung von Sequenzähnlichkeit
geeignet ist, ist der BLAST-Algorithmus, der beschrieben ist
in Altschul, J. Mol. Biol. 215 (1990), 403-410 und Shpaer,
Genomics 38 (1996), 179-191. Software zur Durchführung von
BLAST-Analysen ist öffentlich erhältlich bei National Center
for Biotechnology Information
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Dieser Algorithmus
beinhaltet zuerst die Identifizierung von Sequenzpaaren mit
denen viele Treffer erreicht werden ("high scoring sequence
pairs, HSPs)") durch die Identifizierung kurzer Wörter mit
der Länge W in der Abfragesequenz, die mit einem positiv
bewerteten Punkt T übereinstimmen oder diesen erfüllen, wenn
sie gegen ein Wort derselben Länge in einer Datenbanksequenz
ausgerichtet werden. T bezieht sich auf die "neighborhood
word score threshold" (Altschul et al., a.a.O.). Diese
anfänglichen Treffer des Nachbarschaftsworts wirken als
Ausgangspunkte für die Initiierung von Suchvorgängen, die
zur Auffindung von längeren, diese enthaltenden HSPs führen
sollen. Die Worttreffer werden in beiden Richtungen entlang
jeder Sequenz verlängert, soweit der Treffer bezüglich der
kumulativen Ausrichtung erhöht werden kann. Die Verlängerung
der Worttreffer in jeder Richtung kommt zum Stillstand,
wenn: der Treffer bezüglich der kumulativen Ausrichtung
verringert sich um die Menge X von dem maximal erreichbaren
Wert; der kumulative Treffer geht gegen 0 oder darunter
aufgrund der Akkumulation von einer oder mehreren
Ausrichtungen von negative Treffer erzielenden Resten; oder
das Ende jeder Sequenz ist erreicht. Die Parameter W, T und
X des BLAST-Algorithmus bestimmen die Empfindlichkeit und
die Schnelligkeit der Ausrichtung. Das LAST-Programm
verwendet als Voreinstellung eine Wortlänge (W) von 11, die
"BLOSUM62 scoring matrix" (siehe Henikoff, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 89 (1992), 10915-10919), Ausrichtungen (B) von 50,
Erwartung (E) von 10, M=5, N=-4, und eines Vergleichs beider
Stränge. Der Ausdruck BLAST bezieht sich auf den BLAST-Algo
rithmus, der eine statistische Analyse der Ähnlichkeit
zwischen zwei Sequenzen durchführt; siehe beispielsweise
Karlin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993), 5873-5787.
Eine durch den BLAST-Algorithmus gelieferte
Ähnlichkeitsmessung ist die kleinste Wahrscheinlichkeit der
Summe ("smallest rum probability") (P(N)), die die
Wahrscheinlichkeit anzeigt, mit der eine Paarung zwischen
zwei Nucleotiden oder Aminosäuresequenzen zufällig vorkommen
würde. Beispielsweise kann eine Nucleinsäure als zu einer
TRT-Nucleinsäure ähnlich erachtet werden, wenn die kleinste
Wahrscheinlichkeit der Summe ("smallest sum probability")
beim Vergleich der Test-Nucleinsäure mit einer TRT-Nuclein
säure weniger als etwa 0,5, 0,2, 0,1, 0,01 oder 0,001
ist. Alternativ ist ein anderes Anzeichen dafür, daß zwei
Nucleinsäuresequenzen ähnlich sind, daß das Polynucleotid,
das die erste Nucleinsäure codiert, mit dem von der zweiten
Nucleinsäure codierten Polypeptid immunologisch
kreuzreagiert.
Die hier verwendeten Ausdrücke "wesentliche Identität" oder
"wesentliche Ähnlichkeit" im Zusammenhang mit einem
Polypeptid bezieht sich auf den Grad an Ahnlichkeit zwischen
zwei Polypeptiden, bei denen ein Polypeptid eine Sequenz mit
mindestens 70%, 80%, 85% oder bis zu 100%
Sequenzidentität umfaßt, bezogen auf eine Referenzsequenz
oder am meisten bevorzugt 90% Identität über ein
Vergleichsfenster von etwa 10 bis 20 Aminosäureresten.
Aminosäuresequenzähnlichkeit oder Sequenzidentität wird
durch Optimierung der Paarung der Reste bestimmt, falls
nötig durch die Einführung von Lücken, soweit dies
erforderlich ist. Siehe Needleham et al., J. Mol. Biol 48
(1970), 443-453; Sankoff et al. (1983) Time Warps, String
Edits, and Macromolecules: The Theory and Practice of
Sequenze Comparison, Kapitel Eins, Addison-Wesley, Reading,
MA; und Software-Pakete von IntelliGenetics, Mountain View,
CA und der University of Wisconsin Genetics Computer Group,
Madison, WI. Es ist für den Fachmann offensichtlich, daß die
Bezeichnungen "wesentliche Identität", "wesentliche
Ähnlichkeit" und "wesentliche Sequenzidentität" bezüglich
Polypeptiden oder Polynucleotiden gegenseitig austauschbar
verwendet werden können.
Der hier verwendete Ausdruck "wesentlich rein" oder
"wesentlich gereinigt" bedeutet dann, wenn er sich auf eine
Zusammensetzung bezieht, die ein angegebenes Reagens
enthält, beispielsweise einen Antikörper (z. B. einen anti
hTRT-Antikörper), daß das angegebene Reagens mindestens etwa
75%, mindestens etwa 90%, mindestens etwa 95%, mindestens
etwa 99% oder mehr der Zusammensetzung (ohne beispielsweise
Puffer) darstellt. Somit ist beispielsweise eine bevorzugte
erfindungsgemäße Immunglobulin-Präparation, die spezifisch
ein hTRT-Polypeptid bindet, im wesentlichen gereinigt.
Wie hier verwendet, ist eine "Telomerase-negative" Zelle
eine Zelle, in der Telomerase nicht exprimiert wird, d. h. es
kann keine katalytische Aktivität von Telomerase unter
Verwendung eines üblichen Assays oder eines TRAP-Assays für
katalytische Aktivität von Telomerase nachgewiesen werden.
Wie hier verwendet, ist eine "Telomerase-positive" Zelle
eine Zelle, in der Telomerase exprimiert wird (d. h.
Telomerase-Aktivität kann nachgewiesen werden).
Wie hier verwendet, ist eine "mit Telomerase in Zusammenhang
stehende" Krankheit oder ein Zustand eine Krankheit oder ein
Zustand in einem Versuchsobjekt, die (der) mit einem anormal
hohen Spiegel an Telomerase-Aktivität in Zellen des
Versuchsobjekts korreliert, wobei dies jede Telomerase-
Aktivität für die meisten normalen somatischen Zellen
umfassen kann, oder die (der) mit einem niedrigen Spiegel an
Telomerase-Aktivität korreliert, der zu einer
Beeinträchtigung einer normalen Zellfunktion führt. Zu den
Beispielen für mit Telomerase in Zusammenhang stehende
Zustände gehören beispielsweise Krebs (hohe Telomerase-
Aktivität in malignen Zellen) und Unfruchtbarkeit (geringe
Telomerase-Aktivität in Keimbahnzellen).
Der hier verwendete Ausdruck "Testverbindung" bezieht sich
auf jede synthetische oder natürliche Verbindung oder
Zusammensetzung. Zu diesem Ausdruck zählen alle organischen
und anorganischen Verbindungen einschließlich beispielsweise
kleine Moleküle, Peptide, Proteine, Zucker, Nucleinsäuren,
Fettsäuren etc.
Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung der
vorliegenden Erfindung und sollen keine Einschränkung dar
stellen.
In den folgenden Abschnitten werden die folgenden Abkürzun
gen verwendet: eq (Äquivalente); M (Molar); µM (Mikromolar);
N (Normal), Mol (Mole), mMol (Millimole) µMol (Mikromole);
nMol (Nanomole); g (Gramm), mg (Milligramm); µg (Mikro
gramm), ng (Nanogramm); l oder L (Liter), ml (Milliliter),
µl (Mikroliter); cm (Zentimeter); mm (Millimeter); µm
(Mikrometer), nm (Nanometer); °C (Grad Celsius); RPN (Ribo
nucleoprotein); remN(2'-O-Methylribonucleotide); dNTP (Des
oxyribonucleotid); dH2O (destilliertes Wasser); DDT (Dithio
hreitol); PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid); TE (10 mM
Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH-Wert etwa 7,2); KGlu (Kaliumgluta
mat); SSC (Salz- und Natriumcitratpuffer); SDS (Natriumdo
decylsulfat); PAGE (Polyacrylamidgelelektrophorese); Novex
(Novex, San Diego, CA); BioRad (Bio-Rad Laboratories,
Hercules, CA), Pharmacia (Pharmacia Biotech, Piscataway,
NJ), Boehringer-Mannheim (Boehringer-Mannheim Corp.,
Concord, CA); Amersham (Amersham, Inc., Chicago, IL);
Stratagene (Strategene Cloning Systems, La Jolla, CA); NEB
(New England Biolabs, Beverly, MA); Pierce (Pierce Chemical
Co., Rockford IL); Beckman (Beckman Instruments, Fullerton,
CA), Lab Industries (Lab Industries, Inc., Berkeley, CA),
Eppendorf (Eppendorf Scientific, Madison, WI); und Molecular
Dynamics (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).
Das folgende Beispiel beschreibt ausführlich die Isolierung
von Telomerase-Proteinen und -Clonen von verschiedenen Orga
nismen, einschließlich der hTRT- und S. pombe-Telomerase
cDNA-Clone.
Der Abschnitt gibt einen Überblick über die Reinigung und
Clonierung, die in nachfolgenden Abschnitten dieses Bei
spiels ausführlicher beschrieben werden. Telomerase-RNA-Unter
einheiten wurden zwar in Ciliaten, Hefe und Säugern
identifiziert, vor der vorliegenden Erfindung wurden jedoch
Protein-Untereinheiten des Enzyms als solche nicht identifi
ziert. Die Reinigung von Telomerase von dem Protozoan
Euplotes aediculatus ergab zwei Proteine, die mit p123 und
p43 bezeichnet werden (siehe nachstehend; Lingner, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996) 10712). Euplotes aediculatus
ist ein hypotricher Ciliat mit einem Macronucleus, der etwa
8 × 107 Telomere und etwa 3 × 105 Telomerasemoleküle ent
hält. Nach der Reinigung zeigte der aktive Telomerase-Kom
plex ein Molekulargewicht von etwa 230 kD, was einer RNA-Unter
einheit von 66 kD und zwei Proteinen von etwa 123 kD
und 43 kD entspricht (siehe vorstehend Lingner (1996)). Ex
perimente mit Photo-Quervernetzung zeigten an, daß das
größere p123-Protein an der spezifischen Bindung des Telo
mer-DNA-Substrats beteiligt war (Lingner (1996), a.a.O.).
Die p123- und p43-Proteine wurden sequenziert und die diese
Proteine codierenden cDNA-Clone isoliert. Es stellte sich
heraus, daß diese Euplotes-Sequenzen mit den Telomerase-as
soziierten Proteinen von Tetrahymena p80 und p95 nicht ver
wandt sind. Die Sequenzanalyse des Euplotes-p123 ergab die
Anwesenheit von Motiven von reverser Transkriptase (RT).
Weiterhin wurde durch die Sequenzanalyse des Euplotes p123
ein homologes Hefeprotein gefunden, das als Est2-Protein be
zeichnet wird (Lingner, Science 276 (1997), 561). Es konnte
kürzlich gezeigt werden, daß das Hefe-Est2 für die Auf
rechterhaltung von Telomeren in vivo essentiell ist
(Lendvay, Genetics 144 (1996), 1399), es wurde jedoch nicht
als ein katalytisches Telomerase-Protein identifiziert.
Ortsgerichtete Mutagenese zeigte, daß die RT-Motive von
Hefe-Est2 für die Synthese von Telomer-DNA in vivo und in
vitro essentiell sind (Lingner (1997) a.a.O.).
Die PCR-Amplifikation von S. pombe-DNA wurde mit degenerier
ten Sequenzprimern, die nach den Euplotes-p123-RT-Motiven,
wie nachstehend beschrieben, entworfen wurden, durchgeführt.
Eines der erzeugten vier Haupt-PCR-Produkte war eine Bande
von 120 Basenpaaren, die eine zu p123 und Est2 homologe Pep
tidsequenz codierte. Dieses PCR-Produkt wurde als Sonde bei
Koloniehybridisierung verwendet und damit konnten zwei über
lappende Clone aus einer genomischen Bank von S. pombe und
drei von einer cDNA-Bank von S. pombe identifiziert werden.
Die Sequenzanalyse ergab, daß keiner der drei S. pombe-cDNA-Clone
eine vollständige Länge auswies, deshalb wurde zum Er
halt von Sequenzen, die den N-Terminus des Proteins codie
ren, reverse Transkriptase (RT)-PCR verwendet.
Die vollständige Sequenzierung dieser Clone zeigte ein ver
mutliches S. pombe-Telomerase-RT-Gen, trt1. Die vollständige
Nucleotidsequenz von trt1 wurde bei GenBank mit der Zugangs
nummer AF015783 hinterlegt. Die Analyse der Sequenz ergab,
daß trt1 ein basisches Protein mit einem geschätzten Moleku
largewicht von 116 kD codiert. Es zeigte sich, daß die Homo
logie zu p123 und Est2 in den sieben reverse Transkriptase-
Motiven außergewöhnlich hoch war. Diese Motive sind unter
strichen und als Motive 1, 2, A, B, C, D und E bezeichnet
(siehe Fig. 1). Es wurde ein zusätzliches Telomerase-spezi
fisches Motiv gefunden, das als das T-Motiv bezeichnet
wurde. 15 Introns im Größenbereich von 36 bis 71 Basenpaaren
unterbrachen die codierende Sequenz.
Um S. pombe-trt1 als eine katalytische Untereinheit zu te
sten, wurden zwei Deletionskonstrukte erzeugt. Bei einem
wurden nur die Motive B bis D in den RT-Domänen entfernt.
Bei dem zweiten wurden 99% des offenen Leserahmens ent
fernt.
Haploide Zellen, die aus S. Dombe-Sporen von beiden Mutanten
gewachsen waren, zeigten fortschreitende Telomer-Kürzung bis
zu dem Punkt, an dem eine Hybridisierung an Telomer-Wieder
holungseinheiten praktisch nicht mehr nachweisbar war. Ein
trt1⁺/trt1⁻-Diploid wurde sporulieren gelassen und die er
haltenen Tetraden wurden gegliedert und auf einem Hefeex
trakt-Medium, das mit Aminosäure supplementiert war, auskei
men gelassen (eine YES-Platte, Alfa, (1993) Experiments with
Fission Yeast, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor, NY). Die von jeder Spore erhaltenen Kolonien
wurden 3 Tage bei 32°C gezüchtet und alle drei Tage auf fri
schen YES-Platten ausgestrichen. Eine Kolonie aus jeder
Runde wurde bei 32°C in 6 ml einer YES-Flüssigkultur gegeben
und bis zur stationären Phase gezüchtet. Es wurde genomische
DNA präpariert. Nach der Spaltung mit ApaI wurde die DNA auf
einem 2,3%igem Agarosegel elektrophoretisiert, zur Bestäti
gung, daß in jeder Spur etwa gleiche Mengen gegeben wurden,
mit Ethidiumbromid angefärbt, danach auf eine Nylon-Membran
transferiert und mit einer Telomer-DNA-Sonde hybridisiert.
Seneszenz wurde angezeigt durch den verzögerten Beginn der
Unfähigkeit auf Agar wachsen zu können (typischerweise beim
vierten Ausstreichen nach der Keimung), durch Kolonien mit
Rändern, die in zunehmendem Maße ausgefranst waren (die Ko
loniemorphologie ist in Fig. 22B gezeigt) und durch eine
hohe Anzahl von Fraktionen verlängerter Zellen, die immer
mehr zunahmen (wie in Fig. 22C gezeigt). Zellen wurden auf
Minimalmedium (Alfa, (1993), a.a.O.), wobei Glutaminsäure
gegen Ammoniumchlorid ausgetauscht war, 2 Tage bei 32°C vor
dem Photographieren ausplattiert.
Bei der Trennung einzelner vergrößerter Zellen unter dem
Dissektions-Mikroskop zeigte sich, daß die Mehrheit der Zel
len keiner weiteren Teilung unterlag. Die gleiche Telome
rase-negative (trt1⁻) Zellpopulation enthielt immer Zellen
mit normaler Größe, die fortführen sich zu teilen, jedoch
häufig sich nicht teilende Nachkommen hervorbrachten. Die
Telomerase-negativen überlebenden Zellen könnten einen Re
kombinationsmodus der Telomer-Bewahrung verwenden, wie dies
für knospende Hefestämme dokumentiert wurde, mit denen ver
schiedene Gene für die Telomer-Replikation deletiert sind
(Lendvay (1996) a.a.O. und Lundblad Cell 73 (1993), 347.
Ein von menschlicher Telomerase-reverse Transkriptase
(hTRT)-cDNA stammendes EST (exprimerte Sequenz-"tag") wurde
durch eine BLAST-Suche der dbEST (exprimierte Sequenz-"tag")
GenBank-Datenbank identifiziert und als Genbank AA28196 be
zeichnet, wobei die Euplotes-123 kD Peptid und die entspre
chenden Nucleinsäuresequenzen sowie das Schizosaccharomyces-
Protein und korrespondierende cDNA (tez1)-Sequenzen verwen
det wurden. Das AA281296 EST weist eine Länge von 389
Nucleotiden auf und die Positionen seiner Reste in dem hTRT-cDNA-Clon
(Fig. 16) liegen zwischen den Resten 1679 bis
2076. Ein die EST-Sequenz enthaltender Clon, der die Be
zeichnung Clon #712562 (Fig. 18) trägt, wurde von dem
I.M.A.G.E.-Consortium (Human Genome Center, DOE, Lawrence
Livermore National Laboratory, Livermore, CA) erhalten. Die
ser Clon wurde aus einer cDNA-Bank von aufkeimenden B-Zellen
erhalten, die aus einer Fließsortierung ("flow sorting") von
Mandelzellen stammten. Die vollständige Sequenzierung dieses
hTRT-cDNA-Clons ergab die Anwesenheit aller acht Telomerase-
RT(TRT)-Motive, wie dies in Fig. 1 gezeigt ist. Dieser
hTRT-Clon codierte keinen aneinandergrenzenden Bereich von
TRT, da die RT-Motive B', C, D und E im Vergleich zu den
mehr N-terminal gelegenen RT-Motiven in einem anderen offe
nen Leserahmen enthalten waren. Zusätzlich war die Entfer
nung zwischen den RT-Motiven A und B wesentlich geringer als
die der drei bereits bekannten (nicht-menschlichen) TRTs.
Um einen cDNA-Clon mit vollständiger Länge Isolieren zu kön
nen, wurde eine cDNA-Bank, die von der menschlichen Zellinie
293 (die vorstehend beschrieben wurde) stammt, die hohe
Spiegel an Telomerase-Aktivität exprimiert, gescreent. Eine
lambda-cDNA-Bank von der Zellinie 293 wurde in 25 Pools auf
geteilt, die jeweils etwa 200 000 Plaques enthielten. Jeder
Pool wurde mittels PCR mit den Primerpaaren
5'-CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA-3' und 5'-GGATGAAGCGGAGTCTGGA-3' ge
screent. Sechs Sub-Pools eines positiven primären Pools wur
den mittels PCR unter Verwendung desselben Primerpaars wei
ter gescreent. Sowohl bei dem Screenen des primären Pools
und des sekundären Sub-Pools wurde hTRT mit insgesamt 31
Cyclen amplifiziert, 45 Sekunden bei 94°C, 45 Sekunden bei
60°C und 90 Sekunden bei 72°C. Als Kontrolle wurde RNA des
"house-keeping"-Enzyms GAPDH mittels der Primerpaare
5'-CTCAGACACCATGGGGAAGGTGA-3' und 5'-ATGATCTTGAGGCTGTTGTCATA-3'
mit insgesamt 16 Cyclen amplifiziert, jeweils 45 Sekunden
bei 94°C, 45 Sekunden bei 55°C und 90 Sekunden bei 72°C.
Ein hTRT-positiver Sub-Pool aus dem sekundären Screenen
wurde dann mittels Plaque-Hybridisierung mit einer Sonde von
dem 5'-Bereich von Clon #712562 gescreent. Ein Phage konnte
als positiv identifiziert werden (mit der Bezeichnung
Lambda-Phage 25-1.1, ATCC 209024, hinterlegt am 12. Mai
1997). Er enthielt eine Insertion von etwa 4 Kilobasen,
diese wurde ausgeschnitten und in die EcoRI-Stelle des
"Bluescript II SK+"-Vektors (Stratagene, San Diego, CA) als
ein EcoRI-Fragment subcloniert. Dieses den cDNA-Clon enthal
tende Plasmid erhielt die Bezeichnung pGRN121. Die cDNA-In
sertion weist insgesamt eine Länge von etwa 4 Kilobasen
paaren auf. Die vollständige Nucleotidsequenz der menschli
chen hTRT-cDNA (pGRN121) wurde bei Genbank hinterlegt (Zu
gangsnummer AF015950) und bei der ATCC mit der Zugangsnummer
ATCC 209016 am 6. Mai 1997.
Die in diesem Beispiel verwendeten Kulturen von E.
aediculatus wurden von Dr. David Prescott, MCDB, University
of Colorado, erhalten. Dr. Prescott isolierte diese Kultur
ursprünglich aus Wasser eines Teichs, dieser Organismus ist
aber auch von der ATCC erhältlich (ATCC #30859). Kulturen
wurden wie von Swanton et al., (Swanton et al., Chromosoma
77 (1980), 203) in 15-Liter-Glasbehältern gezüchtet, die
Chlorogonium als eine Nahrungsquelle enthielten. Die Orga
nismen wurden nach Erreichen einer Dichte von etwa
104 Zellen/ml von den Kulturen geerntet.
In diesem Beispiel wurden nucleäre Extrakte von E.
aediculatus mittels des Verfahrens von Lingner et al.,
Lingner et al., Genes Develop. 8 (1994) 1984) mit den nach
stehend beschriebenen geringen Modifikationen präpariert.
Zusammengefaßt wurden Zellen, die wie in Teil B beschrieben
gezüchtet wurden, mit 15 µm Nytex-Filtern konzentriert und
auf Eis gekühlt. Das Zellpellet wurde zu einem Endvolumen
von 110 ml TMS/PMSF/Spermidinphosphat-Puffer resuspendiert.
Der TMS/PMSF/Spermidinphosphat-Vorratspuffer wurde durch
Zugabe von 0,075 g Spermidinphosphat (USB) und 0,75 ml PMSF
(aus einer in Ethanol hergestellten 100 mM Vorratslösung) zu
150 ml TMS hergestellt. TMS enthielt 10 mM Tris-Acetat, 10 mM
MgCl2, 85,5752 g Saccharose/Liter und 0,33297 g CaCl2/Liter,
pH-Wert 7,5.
Nach Resuspendierung in TMS/PMSF/Spermidinphosphat-Puffer
wurden 8,8 ml 10% NP-40 und 94,1 g Saccharose zugegeben.
Das Gemisch wurde in einen silikonisierten Glasbecher mit
einem Rührstab aus rostfreiem Stahl, der an einem darüber
befindlichen Motor angebracht war, gegeben. Das Gemisch
wurde gerührt, bis die Zellen vollständig lysiert waren
(etwa 20 Minuten). Das Gemisch wurde dann 10 Minuten bei
7500 UpM (8950 × g) bei 4°C mittels eines Beckman JS-13-Aus
schwingrotors zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt
und das Pellet aus Nuclei in TMS/PMSF/Spermidinphosphat-Puf
fer resuspendiert, danach erneut 5 Minuten bei 7500 UpM
(8950 × g) bei 4°C mittels eines Beckman JS-13-Ausschwingro
tors zentrifugiert.
Der Überstand wurde entfernt und das Pellet aus Nuclei in
einem Puffer resuspendiert, der 50 mM Tris-Acetat, 10 mM
MgCl2, 10% Glycerin, 0,1% NP-40, 0,4 M KGlu, 0,5 mM PMSF,
pH-Wert 7,5 enthielt, wobei ein Puffervolumen von 0,5 ml pro
10 g geernteter Zellen verwendet wurde. Die resuspendierten
Nuclei wurden danach in einem "dounced"-Glashomogenisator
mit etwa 50 Auf- und Abbewegungen homogenisiert und danach
25 Minuten mit 14 000 UpM bei 4°C in einer Eppendorf-Zentri
fuge zentrifugiert. Der den nucleären Extrakt enthaltene
Überstand wurde gesammelt, in flüssigem Stickstoff eingefro
ren und bis zu seiner Verwendung bei -80°C aufbewahrt.
In diesem Beispiel wurden wie in Teil C beschrieben, präpa
rierte nucleäre Extrakte zur Reinigung von E. aediculatus-
Telomerase verwendet. Bei diesem Reinigungsprotokoll wurde
Telomerase zuerst durch Chromatographie auf einer Affi-Gel-
Heparinsäule angereichert und danach ausgiebig durch Affini
tätsreinigung mit einem "antisense"-Oligonucleotid gerei
nigt. Da der Matrizenbereich von Telomerase-RNA in dem Telo
merase RNP-Partikel einer Hybridisierung zugänglich ist,
wurde ein "antisense"-Oligonucleotid (d. h. das "Affinitäts
oligonucleotid") als ein "Affinitätsköder" für die Telome
rase synthetisiert, wobei dieses Oligonucleotid zu diesem
Matrizenbereich komplementär war. Ein Biotinrest wurde an
das 5'-Ende des Oligonucleotids angefügt, damit dieses an
einer Avidinsäule immobilisiert werden konnte.
Nach der Bindung der Telomerase an das Oligonucleotid und
gründlichem Waschen wurde die Telomerase mittels eines Ver
drängungsoligonucleotids eluiert. Das Affinitätsoligonucleo
tid enthielt DNA-Basen, die zu der 5' zu der Telomerase-spe
zifischen Sequenz gelegenen Telomerase-RNA nicht komplemen
tär war. Da das Verdrängungs-Oligonucleotid zu dem Affini
täts-Oligonucleotid über seine gesamte Länge komplementär
war, konnte es eine thermodynamisch stabilere Duplex bilden
als die Telomerase, die an das Affinitäts-Oligonucleotid ge
bunden war. Somit führte die Zugabe des Verdrängungs-Oligo
nucleotids zu der Elution der Telomerase von der Säule.
In diesem Beispiel wurden aus 45 Liter-Kulturen präparierte
nucleäre Extrakt gefroren, bis eine Gesamtmenge von 34 ml an
nucleärem Extrakt gewonnen werden konnte. Dies entsprach 630
Liter Kultur (etwa 4 × 109 Zellen). Der nucleäre Extrakt
wurde mit einem Puffer auf 410 ml verdünnt, wobei Endkonzen
trationen von 20 mM Tris-Acetat, 1 mM MgCl2, 0,1 mM EDTA, 33
mM KGlu, 10% (Vol./Vol.) Glycerin, 1 mM Dithiothreitol
(DTT) und 0,5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) bei
einem pH-Wert von 7,5 erhalten wurden.
Der verdünnte nucleäre Extrakt wurde auf eine Affi-Gel-Hepa
rin-Gelsäule (Bio-Rad) mit einem Endvolumen von 230 ml und
einem Durchmesser von 5 cm gegeben, mit dem gleichen Puffer
äquilibriert und mit einem 2 Liter-Gradienten von 33 bis 450
mM KGlu eluiert. Die Säule wurde mit einer Fließgeschwindig
keit von einem Säulenvolumen/Stunde bei 4°C betrieben. Frak
tionen von jeweils 50 ml wurden gesammelt und nach einer Te
lomerase-Aktivität wie in Teil D beschrieben, untersucht.
Telomerase eluierte von der Säule bei etwa 170 mM KGlu. Te
lomerase enthaltende Fraktionen (etwa 440 ml) wurden verei
nigt und eingestellt auf 20 mM Tris-Acetat, 10 mM MgCl2, 1
mM EDTA, 300 mM KGlu, 10% Glycerin, 1 mM DTT und 1%
Nonidet P-40. Dieser Puffer wurde mit "WB" bezeichnet.
Zu dieser Präparation wurden jeweils 1,5 mMol der zwei kom
petitorischen DNA-Oligonucleotide
(5'-TAGACCTGTTAGTGTACATTTGAATTGAAGC-3') und
(5'-TAGACCTGTTAGGTTGGATTTGTGGCATCA-3'), 50 µg Hefe-RNA
(Sigma) und 0,3 nMol Biotin-markiertes Telomerase-spezifi
sches Oligonucleotid (5'-Biotin-TAGACCTGTTTA-(rmeG)2-
(rmeU)4-(rmeG)4-rmeG-3')) pro ml des Pools gegeben. Die 2-O-Methyl
ribonucleotide der Telomerase-spezifischen Oligo
nucleotide waren zu dem Matrizenbereich der Telomerase-RNA
komplementär; die Desoxyribonucleotide waren nicht komple
mentär. Der Einschluß von kompetitorischen, nicht-spezifi
schen DNA-Oligonucleotiden erhöhte die Wirksamkeit der
Reinigung, da die Auswirkungen von Nucleinsäure-bindenden
Proteinen und anderen Bestandteilen in dem Gemisch, die
entweder an das Affinitätsnucleotid binden oder die
Telomerase aus dem Gemisch entfernen würden, minimiert
wurden.
Dieses Material wurde dann zu einem "Ultralink"-immobili
sierten "Neutravidin plus" (Pierce)-Säulenmaterial bei einem
Volumen von 60 µl Suspension pro ml Pool gegeben. Das Säu
lenmaterial wurde zweimal jeweils 15 Minuten vorblockiert,
wobei eine Präparation von WB verwendet wurde, die 0,01%
Nonidet P-40, 0,5 mg BSA, 0,5 mg/ml Lysozym, 0,05 mg/ml Gly
cogen und 0,1 mg/ml Hefe-RNA enthielt. Die Blockierung wurde
mittels einer sich drehenden Scheibe durchgeführt, um so das
Säulenmaterial gründlich zu blockieren. Nach dem ersten und
vor dem zweiten Blockierungsschritt wurde das Säulenmaterial
2 Minuten bei 200 × g zur Pelletierung der Matrix zentrifu
giert.
Das Gemisch aus Pool und Säule wurde auf einer rotierenden
Scheibe (etwa 10 UpM; Labindustries) 8 Minuten bei 30°C und
im Anschluß daran nochmals 2 Stunden bei 4°C inkubiert, um
so die Bindung zu erlauben. Das Gemisch aus Pool und Säule
wurde dann 2 Minuten bei 200 × g zentrifugiert und der unge
bundenes Material enthaltende Überstand wurde entfernt. Das
Gemisch aus Pool und Säule wurde danach gewaschen. Dieser
Waschprozeß umfaßte folgende Schritte: Spülen des Gemischs
aus Pool und Säule bei 4°C mit WB, 15 Minuten Waschen des
Gemisches bei 4°C mit WB, Spülen mit WB, 5 Minuten Waschen
bei 30°C mit 0,6 M KGlu und kein Nonidet P-40 enthaltendem
WB, 5 Minuten Waschen bei 25°C mit WB und zuletzt wiederum
Spülen mit WB. Das nach dem letzten Waschschritt verblei
bende Volumen wurde gering gehalten, um so ein Verhältnis
von Puffer zu Säulenmaterial von etwa 1 : 1 zu erreichen.
Telomerase wurde von dem Säulenmaterial durch Zugabe von 1
nMol Verdrängungs-Oligonucleotid (5'-CA4C4A4C2TA2CAG2TCTA-3'),
pro ml Säulenmaterial und 30 Minuten Inkubation bei
25°C inkubiert. Das Material wurde 2 Minuten bei 14 000 UpM
in einer Mikrozentrifuge (Eppendorf) zentrifugiert und das
Eluat gesammelt. Die Elutionsprozedur wurde noch zweimal
wiederholt, wobei jeweils frisches Verdrängungs-Oligonucleo
tid verwendet wurde. Wie bereits vorstehend angemerkt,
formte das Verdrängungsoligonucleotid mit dem Affinitätsoli
gonucleotid einen thermodynamisch stabileren Komplex im Ver
gleich zu Telomerase, da es zu dem Affinitäts-Oligonucleotid
komplementär war. Somit wurde durch die Zugabe des Verdrän
gungs-Oligonucleotids zu einer Affinitäts-gebundenen Telome
rase eine wirksame Elution von Telomerase unter nativen Be
dingungen erzielt. In diesem Stadium schien die Polymerase
etwa 50% rein zu sein, dies wurde anhand einem Analyse auf
einem Proteingel bestimmt. Die Affinitäts-Reinigung von Te
lomerase und Elution mit einem Verdrängungs-Oligonucleotid
ist in Fig. 26 (Spur A bzw. B) gezeigt. In dieser Figur
werden die 2'-O-Methylzucker des Affinitäts-Oligonucleotids
durch die dicke Linie angezeigt. Die schwarzen und schat
tierten ovalen Formen sollen in dieser Figur graphisch die
erfindungsgemäßen Protein-Untereinheiten darstellen.
Die Proteinkonzentrationen des Extrakts und des nach Affi-
Gel-Heparin-Säulenchromatographie erhaltenen Materials wurde
mittels des Verfahrens von Bradford bestimmt (Bradford,
Anal. Biochem. 72 (1976), 248), wobei für die Standards BSA
verwendet wurde. Lediglich eine Fraktion der Telomerase-Prä
paration wurde auf einem Glyceringradienten weiter gerei
nigt.
Der Sedimentationskoeffizient von Telomerase wurde durch
Glycerin-Gradientenzentrifugation, wie in Teil I beschrie
ben, bestimmt.
Tabelle 5 stellt eine Telomerase bezüglich einer Reinigung
für Telomerase dar, die gemäß den Verfahren dieses Beispiels
gereinigt wurde. Die Telomerase war im Vergleich zu den Ge
samtzellextrakten in nucleären Extrakten 12fach angerei
chert, wobei eine Ausbeute von 80% erzielt wurde; 35% der
Telomerase wurden nach Extraktion aus Nuclei solubilisiert.
Reinigung von Telomerase
Reinigung von Telomerase
Bei jedem Schritt bei der Reinigung von Telomerase wurde die
Präparation mittels drei getrennter Assays analysiert, einer
dieser Assays beruhte auf der Bestimmung der Aktivität, wie
in diesem Beispiel beschrieben. Im allgemeinen wurden Telo
merase-Assays in einem Volumen von 40 µl ausgeführt, das
0,003 bis 0,3 µl nucleären Extrakt, 50 mM Tris-Cl (pH-Wert
7,5), 50 mM KGlu, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 125 µM dTTP, 125 µM
dGTP und etwa 0,2 pMol 5'-32P-markiertes Oligonucleotidsub
strat (d. h. etwa 400 000 cpm) enthielt. Oligonucleotidprimer
wurden vor der Zugabe zum Reaktionsgemisch hitze-denatu
riert. Die Reaktionen wurden auf Eis zusammengestellt und 30
Minuten bei 25°C inkubiert. Die Reaktionen wurden durch
Zugabe von 200 µl 10 mM Tris-Cl (pH-Wert 7,5), 15 mM EDTA,
0,6% SDS und 0,05 mg/ml Proteinase K gestoppt und minde
stens 30 Minuten bei 45°C inkubiert. Nach Ethanolpräzipita
tion wurden die Produkte auf denaturierenden 8%ige PAGE-Ge
len analysiert, wie dies auf dem Fachgebiet bekannt ist
(siehe z. B. Sambrook et al,, 1989).
In diesem Beispiel wird die Quantifizierung von Telomerase-
Aktivität während der Reinigungsprozedur beschrieben. Die
Quantifizierung wurde durch Untersuchung der Verlängerung
von Oligonucleotidprimern in Gegenwart von dGTP und [α-32P]dTTP
erreicht.
Kurz zusammengefaßt 1 µM 5'-(G4T4)2-3'-Oligonucleotid wurde
in einem 20 µl-Reaktionsgemisch in Gegenwart von 2 µl [α-32P]dTTP
(10 mCi/ml, 400 Ci/mMol; 1 Ci = 7 GBq) und 125 µM
dGTP wie in Lingner et al., (Genes Develop. 8 (1994), 1984)
beschrieben verlängert und auf ein 8%ige PAGE-Sequenzie
rungsgel, so wie dies auf dem Fachgebiet bekannt ist, aufge
tragen (siehe z. B. Sambrook et al., 1989).
Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in Fig. 28 gezeigt.
In Spur 1 ist keine Telomerase vorhanden (d. h. negative Kon
trolle), die Spuren 2, 5, 8 und 11 enthielten 0,14 fMol Te
lomerase; die Spuren 3, 6, 9 und 12 enthielten 0,42 fMol Te
lomerase und die Spuren 4, 7, 10 und 13 enthielten 1,3 fMol
Telomerase. Die Aktivität wurde mittels eines
"PhosphorImager" (Molecular Dynamics) gemäß den Anweisungen
des Herstellers quantifiziert. Die Messung ergab, daß unter
diesen Bedingungen 1 fMol affinitätsgereinigte Telomerase 21
fMol dTTP in 30 Minuten einbaute.
Wie in dieser Figur gezeigt, änderte sich die spezifische
Aktivität der Telomerase nicht wesentlich während der Reini
gungsprozedur. Affinitätsgereinigte Telomerase war vollstän
dig aktiv. Bei hohen Konzentrationen konnte jedoch eine in
hibitorische Aktivität nachgewiesen werden und die Aktivität
der Rohextrakte war nicht linear. Daher wurde in dem in Fig.
28 gezeigten Assay der hohe Extrakt 700-7000fach ver
dünnt. Durch die Reinigung wurde die inhibitorische Aktivi
tät entfernt und es wurde selbst bei hohen Enzymkonzentra
tionen keine inhibitorische Wirkung in den Präparationen von
gereinigter Telomerase nachgewiesen.
Wie in Teil E angegeben, wurde bei jedem Reinigungsschritt
für Telomerase die Präparation mittels dreier getrennter
Assays analysiert. In diesem Beispiel werden Gelelektropho
rese-Prozeduren und Blotting-Prozeduren beschrieben, die zur
Quantifizierung von in Fraktionen enthaltener Telomerase-RNA
und zur Analyse der Integrität des Telomerase-Ribonucleopro
tein-Partikels verwendet wurden.
In diesem Beispiel diente eine synthetische T7-transkri
bierte Telomerase-RNA mit bekannter Konzentration als
Standard. Während dieser Untersuchung wurde der RNA-Bestand
teil als ein Maß für Telomerase verwendet.
Es wurde mittels der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ein
Konstrukt für die Transkription von E. aediculatus-Telome
rase-RNA durch die T7-Phagen-RNA-Polymerase hergestellt. Das
Telomerase-RNA-Gen wurde mit Primern amplifiziert, die sich
an die beiden Enden des Gens anlagerten. Die Primer, die
sich an das 5'-Ende anlagerten, codierten auch eine
"hammerhead"-Ribozymsequenz, um so das natürliche 5'-Ende
nach Spaltung der transkribierten RNA zu erzeugen, eine T7-Pro
motorsequenz und eine EcoRI-Stelle für die Subclonierung.
Die Sequenz dieses 5'-Primers war
5'-GCGGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAAGAAACTCTGATGAGGCCGAAAGGCCGAAACTCCACGAAAGTGGAGTAAGTTTCTCGATAATTGATCTGTAG-3'.
Der 3'-Primer enthielt eine Earl-Stelle für die Termi
nation der Transkription an dem natürlichen 3'-Ende und eine
BamHI-Stelle für die Clonierung. Die Sequenz dieses 3'-Pri
mers war 5'-CGGGGATCCTCTTCAAAAGATGAGAGGACAGCAAAC-3'. Das
PCR-Amplifikationsprodukt wurde mit EcoRI und BamHI gespal
ten und in die entsprechenden Stellen von pUC19 (NEB) sub
cloniert, wobei "pEaT7" erhalten wurde. Durch DNA-Sequenzie
rung wurde die korrekte Insertion bestätigt. T7-Transkrip
tion wurde wie von Zaug et al., Biochemistry 33 (1994) 14935
beschrieben mit einem EarI-linearisierten Plasmid durchge
führt. Die RNA wurde gelgereinigt und die Konzentration be
stimmt (bei A260 von 1 = 40 µg/ml). Die RNA wurde als
Standard zur Bestimmung der in verschiedenen Präparationen
von Telomerase vorhandenen Telomerase-RNA als Standara ver
wendet.
Das Hybridisierungssignal war proportional zu der Menge an
Telomerase-RNA und die abgeleiteten RNA-Konzentrationen
stimmten mit den durch native Gelelektrophorese erhaltenen
Konzentrationen im Prinzip überein, waren jedoch leicht hö
her. Der Vergleich der Menge an gesamter Telomerase-RNA in
Gesamt-Zell-RNA mit seriellen Verdünnungen von bekannten T7-RNA-Trans
kriptkonzentrationen zeigte an, daß jede
aediculatus-Zelle etwa 300 000 Telomerase-Moleküle enthielt.
Die Sichtbarmachung der Telomerase wurde durch Northern-
Blot-Hybridisierung an deren RNA-Bestandteil erzielt, wobei
die von Lingner et al. beschriebenen Verfahren verwendet
wurden (Lingner et al., Genes Develop. 8 (1994), 1984). Kurz
zusammengefaßt RNA (0,5 µg/Spur oder weniger) wurde durch
8%ige PAGE aufgetrennt und auf eine "Hybond-N"-Membran
(Amersham), wie dies auf dem Fachgebiet bekannt ist, elek
trogeblottet (siehe z. B. Sambrook et al. 1989). Der Blot
wurde in 10 ml 4 × SSC, 10 × Denhardt-Lösung, 0,1% SDS und
50 µl/ml denaturierte Heringssperma-DNA über Nacht hybridi
siert. Nach 3 Stunden Vorhybridisierung wurden 2 × 106 cpm-
Sonde/ml Hybridisierungslösung zugegeben. Die zufallsmar
kierte Sonde war ein PCR-Produkt, das das gesamte Telome
rase-RNA-Gen bedeckte. Der Blot wurde bei verschiedenen Puf
feraustauschen 30 Minuten 2 × SSC, 0,1% SDS und danach 1
Stunde in 0,1 × SSC und 0,1% SDS bei 45°C gewaschen.
In diesem Experiment wurde die Präparation an gereinigter
Polymerase auf nativen (d. h. nicht-denaturierenden) Gelen
aus 3,5% Polyacrylamid und 0,33% Agarose aufgetrennt, wie
dies auf dem Fachgebiet bekannt und von Lamond und Sproat
beschrieben ist (Lamond and Sproat (1994), a.a.O.) Die Telo
merase comigrierte etwa mit dem Farbstoff Xylencyanol.
Die Ergebnisse mit nativen Gelen zeigten an, daß während des
Reinigungsverfahrens Telomerase als RNP beibehalten wurde.
Fig. 27 ist ein Foto eines Northern-Blots, das die Mobili
tät der Telomerase in verschiedenen Fraktionen auf einem
nicht-denaturierenden Gel zeigt, sowie die Mobilität von in
vitro-transkribierter Telomerase. Spur 1 in dieser Figur
enthielt 1,5 fMol Telomerase-RNA, Spur 2 4,6 fMol Telome
rase-RNA, Spur 3 14 fMol Telomerase-RNA, Spur 4 41 fMol-Te
lomerase-RNA, Spur 5 nucleären Extrakt (42 fMol Telomerase),
Spur 6 Affi-Gel-Heparin-gereinigte Telomerase (47 fMol Telo
merase), Spur 7 affinitätsgereinigte Telomerase (68 fMol)
und Spur 8 über einen Glycerolgradienten gereinigte Telome
rase (35 fMol).
Wie in Fig. 27 gezeigt, war in nucleären Extrakten die Te
lomerase zu einem RNP-Partikel assembliert, der langsamer
wanderte als nicht-assemblierte Telomerase-RNA. Durch dieses
Verfahren wurde weniger als 1% freie RNA nachgewiesen. Es
konnte jedoch in Extrakten gelegentlich auch ein langsamer
wandernder Telomerase-RNP-Komplex nachgewiesen werden. Nach
Reinigung auf der Affi-Gel-Heparinsäule wies der Telomerase-
RNP-Partikel keine Veränderung in der Mobilität auf (Fig.
27, Spur 6). Nach Affinitätsreinigung war jedoch die
Mobilität des RNA-Partikels leicht erhöht (Fig. 27, Spur
7), was vielleicht anzeigt, daß eine Protein-Untereinheit
oder ein -Fragment verlorenging. Auf Glyceringradienten
veränderte die affinitätsgereinigte Telomerase ihre Größe
nicht, es waren jedoch etwa 2% freie Telomerase-RNA
nachweisbar (Fig. 27, Spur 8), was nahelegt, daß eine ge
ginge Disassemblierung des RNP-Partikels eingetreten war.
In diesem Beispiel ist die Analyse der gereinigten Telome
rase-Protein-Zusammensetzung beschrieben.
In diesem Beispiel wurden die in Teil D erhaltenen Glyce
ringradienten-Fraktionen auf einem 4 bis 20%igen Poly
acrylamidgel (Novex) aufgetrennt. Nach der Elektrophorese
wurde das Gel mit Coomassie-Brilliant-Blau angefärbt. Fig.
29 zeigt ein Photo dieses Gels. Die Spuren 1 und 2 enthiel
ten Molekulargewichtsmarker (Pharmacia) wie dies auf der
linken Seite des in Fig. 29 gezeigten Gels angezeigt ist.
Die Spuren 3 bis 5 enthielten vereinigte Glycerin-Gradien
tenfraktionen, wie dies oberhalb des Gels angezeigt ist
(d. h. Spur 3 enthielt Fraktionen 9-14, Spur 4 Fraktionen 15-22
und Spur 5 Fraktionen 23-32). Spur 4 enthielt den Pool
mit 1 pMol Telomerase-RNA. In den Spuren 6 bis 9 wurden BSA-Stan
dards mit den oberhalb des Gels in Fig. 29 angezeigten
Konzentrationen laufen gelassen (d. h. Spur 6 enthielt 0,5
pMol BSA, Spur 7 1,5 pMol BSA, Spur 8 4,5 pMol BSA und Spur
9 15 pMol BSA).
Wie in Fig. 29 gezeigt ist, wurden Polypeptide mit einem
Molekulargewicht von 120 und 43 kD zusammen mit der Telome
rase aufgereinigt. Das 43 kD-Polypeptid trat als eine
Dublette auf. Es wurde festgestellt, daß das Polypeptid mit
etwa 43 kD in Spur 3 anders wanderte als die Dublette in
Spur 4, es könnte sich dabei um ein nicht-verwandtes Protein
handeln. Das 120 kD-Protein und die 43 kD-Dublette zeigen
beide nach Anfärbung mit "Coomassie-Brilliant-Blau" einen
Spiegel von etwa 1 pMol im Vergleich zu BSA-Standards. Da
diese Fraktion 1 pMol Telomerase-RNA enthielt, die vollstän
dig zu einem RNP-Partikel assembliert war (siehe Fig. 27,
Spur 8), scheint es zwei Polypeptid-Untereinheiten zu geben,
die zu der Telomerase-RNA stöchiometrisch sind. Es kann
jedoch auch möglich sein, daß die zwei Proteine um 43 kD
getrennte Enzym-Untereinheiten sind.
Affinitätsgereinigte Telomerase, die nicht einer Fraktionie
ung auf einem Glyceringradienten unterworfen wurde,
enthielt zusätzliche Polypeptide mit einem geschätzten Mole
kulargewicht von 35 bzw. 37 kD. Es wurde geschätzt, daß
diese letztere Fraktion zu mindestens 50% rein ist. Die
hier in dem affinitätsgereinigten Material vorhandenen 35
kD- und 37 kD-Polypeptide wurden jedoch durch Glyceringradi
enten-Zentrifugation nicht reproduzierbar aufgetrennt. Diese
Polypeptide können Verunreinigungen darstellen, da sie nicht
in allen Aktivitäts-enthaltenden Präparationen sichtbar wa
ren.
Der Sedimentationskoeffizient für Telomerase wurde durch
Glyceringradienten-Zentrifugation bestimmt. In diesem Bei
spiel wurden nucleärer Extrakt und affinitäts-gereinigte Te
lomerase auf 15-40%igen Glyceringradienten fraktioniert,
die 20 mM Tris-Acetat, 1 mM MgCl2, 0,1 mM EDTA, 300 mM KGlu
und 1 mM DTT, pH-Wert 7,5, enthielten. Glyceringradienten
wurden in 5 ml-Röhrchen (13 × 51 mm) gegeben und mittels
eines SW55Ti-Rotors (Beckman) 14 Stunden mit 55 000 UpM bei
4°C zentrifugiert.
In einem parallelen Gradienten wurden Marker-Proteine laufen
gelassen; es ergab sich ein Sedimentationskoeffizient von
7,6 S für Alkoholdehydrogenase (ADH), 113 S für Katalase,
17,3 S für Apoferritin und 19,3 S für Thyroglobulin. Der Te
lomerase-Peak wurde durch Elektrophorese von Gradientenfrak
tionen auf einem nativen Gel und im Anschluß daran Blot-Hy
bridisierung an deren RNA-Komponente identifiziert.
Fig. 30 ist eine graphische Darstellung, die den Sedimenta
tionskoeffizienten für Telomerase zeigt. Wie in dieser Figur
gezeigt ist, co-sedimentierte affinitätsgereinigte Telome
rase mit Katalase bei 11,5 S, während Telomerase aus nucleä
ren Extrakten etwas schneller sedimentierte mit dem Peak um
12,5 S. Somit scheint gereinigte Telomerase ein proteolyti
sches Fragment oder eine lose assoziierte Untereinheit ver
loren zu haben, was mit der Mobilität des Enzyms in nativen
Gelen übereinstimmt.
Das geschätze Molekulargewicht für Telomerase ergibt einen
Gesamtwert von insgesamt 229 kD, wenn man davon ausgeht, daß
sie aus einer Protein-Untereinheit mit 120 kD, einer Pro
tein-Untereinheit mit 43 kD und einer RNA-Untereinheit mit
66 kD besteht. Dies ist in enger Übereinstimmung mit dem Mo
lekulargewicht von 232 kD von Katalase. Der Sedimentations
koeffizient ist jedoch nicht nur eine Funktion des Moleku
largewichts sondern auch des spezifischen Teilvolumens und
des Reibungskoeffizienten des Moleküls, wobei beide Parame
ter für das Telomerase-RNP nicht bekannt sind.
In diesem Beispiel wurden die Erfordernisse von Telomerase
hinsichtlich des Substrats untersucht. Ein einfaches Modell
für die Replikation von DNA-Enden geht von der Annahme aus,
daß nach semi-konservativer DNA-Replikation Telomerase dop
pelsträngige, mit glatten Enden versehene DNA-Moleküle ver
längert. Bei einer Variation dieses Modells wird davon aus
gegangen, daß ein einzelsträngiges 3'-Ende durch eine Heli
case oder Nuclease nach Replikation erzeugt wird. Dieses 3'-Ende
wird dann von der Telomerase für die Bindung und Ver
längerung verwendet.
Um zu bestimmen, ob Telomerase mit glatten Enden versehene
Moleküle verlängern kann, wurden Modell-Haarnadelstrukturen
mit an deren 3'-Enden gelegenen Telomer-Wiederholungseinhei
ten synthetisiert. Diese Primersubstrate wurden gelgerei
nigt, mit Polynucleotidkinase 5'-endmarkiert, 5 Minuten bei
80°C und bei 0,4 µM erhitzt und dann in einem Hitzeblock
langsam auf Raumtemperatur abgekühlt, um so eine Renaturie
rung und Helixbildung der Haarnadelstrukturen zu erlauben.
Die Substratmobilität auf einem nicht-denaturierenden Gel
zeigte, daß im Vergleich zur Dimerisierung eine sehr effizi
ente Haarnadelbildung vorhanden war.
In diesem Beispiel wurden Assays durchgeführt mit unmarkier
tem 125 µM dGTP, 125 µM dTTP und 0,02 µM 5'-endmarkierten
Primer (5'-32P-markiertem Oligonucleotid-Substrat) in 10 µl
Reaktionsgemischen, die 20 mM Tris-Acetat enthielten mit 10
mM MgCl2, 50 mM KGlu und 1 mM DTT bei einem pH-Wert von 7,5.
Diese Gemische wurden 30 Minuten bei 25°C inkubiert. Die Re
aktionen wurden durch Zugabe von Formamid-Auftragspuffer ge
stoppt (d. h. TBE, Formamid, Bromthymol-Blau und -Cyanol,
Sambrook, 1989, a.a.O.).
Primer wurden ohne Telomerase inkubiert ("-"), mit 5,9 fMol
affinitätsgereinigter Telomerase ("+"), oder mit 17,6 fMol
affinitätsgereinigter Telomerase ("+++"). Die in diesem
Assay verwendete affinitätsgereinigte Telomerase wurde mit
einer Membran mit einer molekularen Ausschlußgrenze von 100
kD dialysiert, um so das Verdrängungsoligonucleotid zu ent
fernen. Die Reaktionsprodukte wurden auf einem 8%igen PAGE
(Harnstoffgel, das zur Denaturierung der Haarnadelstruktur
36% Formamid enthielt) aufgetrennt. Die Sequenzen der in
dieser Untersuchung verwendeten Primer sowie ihre Spurzuord
nungen sind in Tabelle 6 gezeigt.
Primersequenzen
Primersequenzen
Die mit den Gelen erhaltenen Ergebnisse sind in Fig. 31 ge
zeigt. Die Spuren 1-15 enthielten Substrate mit Telomer-Wie
derholungseinheiten, die mit vier G-Resten endeten. Die Spu
ren 16-30 enthielten Substrate mit Telomer-Wiederholungsein
heiten, die mit vier T-Resten endeten. Die mutmaßliche Aus
richtung auf der Telomerase-RNA-Matrize ist in Fig. 32 ange
geben. Es wird angenommen, daß die Primersätze sich an zwei
verschiedenen Positionen in der in Fig. 32 gezeigten
Matrize (d. h. 32A bzw. 32B). Dies könnte ihre Bindungs- und/oder
Verlängerungsrate beeinflußt haben.
Fig. 33 zeigt eine geringere Belichtung der Spuren 25-30
von Fig. 31. Die geringere Belichtung von Fig. 33 wurde
deshalb durchgeführt, um die Sichtbarmachung der Nucleotide
zu erlauben, die zugegeben wurden, und der Verzögerungsposi
tionen in verlängertem Produkten. Der Prozentsatz an verlän
gerten Substrat wurde für jede dritte Linie eines Satzes auf
einem "Phosphorlmager", wie dies in der Fig. 31 unten ge
zeigt ist, quantifiziert.
Die Wirksamkeit dieser Haarnadelstrukturen als Substrat
wurde mit doppelsträngigen Telomer-ähnlichen Strukturen mit
Überhängen unterschiedlicher Länge verglichen. Ein Modell
substrat, das mit vier G-Resten endete (siehe die Spuren 1
bis 15 von Fig. 31), wurde dann nicht verlängert, wenn es
ein glattes Ende enthielt (siehe Spuren 1-3). Es wurde je
doch eine leichte Verlängerung mit einer Überhanglänge von
zwei Basen beobachtet. Die Verlängerung wurde jedoch effizi
ent, wenn der Überhang etwa 4 Basen lang war. Die Telomerase
wirkte auf ähnliche Weise mit einem doppelsträngigen Sub
strat, das mit vier T-Resten endete, wobei ein Überhang von
6 Basen für eine hocheffiziente Verlängerung erforderlich
war. Die schwachen Banden unter den Primern in den Spuren
10-15 von Fig. 31, die unabhängig von Telomerase sind,
stellen kürzere Oligonucleotide in den Primerpräparationen
dar.
Durch die schwächere Belichtung der Spuren 25-30 in Fig. 33
zeigt sich eine Leiter von verlängerten Produkten, wobei die
dunkelsten Banden mit der vermutlichen 5'-Grenze der Matrize
korrelieren (wie von Lingner et al., Genes Develop. 8
(1994), 1984 beschrieben). Das häufige Auftreten von Produk
ten, die anderen Positionen in der Matrize entsprechen,
legte nahe, daß ein "Innehalten" und/oder eine "Dissoziie
rung mit der gereinigten Polymerase an Stellen vorkommt, die
nicht der Translokationsstelle entsprechen.
Wie in Fig. 31 gezeigt, waren doppelsträngige, mit glatten
Enden versehene Oligonucleotide keine Substrate für Telome
rase. Um herauszufinden, ob diese Moleküle an Telomerase
binden können, wurde ein Kompetitionsexperiment durchge
führt. In diesem Experiment wurden 2 nM 5'-endmarkiertes
Substrat mit der Sequenz (G4T4)2 bzw. ein Haarnadelsubstrat
mit einem Überhang von sechs Basen mit 0,125 mM Telomerase
verlängert (Fig. 31, Spuren 25-27). Obwohl die gleichen un
markierten Oligonucleotidsubstrate effizient mit dem mar
kierten Substrat bezüglich der Verlängerung konkurrierten,
wurde keine Herabsetzung an Aktivität beobachtet, wenn die
doppelsträngigen, mit glatten Enden versehenen Haarnadel-
Oligonucleotide als Kompetitoren verwendet wurden, selbst in
Gegenwart eines 100fachen Überschusses von Haarnadelstruk
turen.
Diese Ergebnisse zeigten an, daß doppelsträngige, mit glat
ten Enden versehene Oligonucleotide bei dem in diesem Bei
spiel getesteten Konzentrationen Telomerase nicht binden
können, d. h. ein einzelsträngiges 3'-Ende ist für eine Bin
dung erforderlich. Wahrscheinlich wird dieses 3'-Ende für
eine Basenpaarung mit der Telomerase-RNA-Matrize benötigt.
In diesem Beispiel wird die Clonierung des 123 kD-Poly
peptids von Telomerase, (d. h. die 123 kD-Protein-Unterein
heit) beschrieben. In dieser Untersuchung wurde ein internes
Fragment des Telomerasegens mittels PCR amplifiziert. Es
wurden Oligonucleotid-Primer verwendet, die so konstruiert
waren, daß sie mit den von dem im vorstehenden Teil D
erhaltenen gereinigten Polypeptid erhaltenen Peptidsequenzen
übereinstimmten. Die Polypeptidsequenz wurde mittels des
"nanoES-Tandem" -Massenspektroskopieverfahrens bestimmt, das
auf dem Fachgebiet bekannt und von Calvio et al., RNA 1
(1995), 724-733 beschrieben ist. Die in diesem Beispiel
verwendeten Oligonucleotidprimer hatten die folgenden
Sequenzen, wobei degenerierte Positionen in Klammern gezeigt
sind: 5'-
TCT(G/A)AA(G/A)TA(G/A)TG(T/G/A)GT(G/A/T/C)A(T/G/A)(G/A)TT(G/A)TTCAt-3' und
5'-GCGGATCCATGAA(T/C)CC(A/T)GA(GA)AA(T/C)CC(A/T)AA(T/C)GT-3'.
5'-GCGGATCCATGAA(T/C)CC(A/T)GA(GA)AA(T/C)CC(A/T)AA(T/C)GT-3'.
Eine 50 µl-Reaktion enthielt 0,2 mM dNTPs, 0,15 µg E.
aediculatus chromosomale DNA, 0,5 µl Taq (Boehringer Mann
heim), jeweils 0,8 µg Primer und 1 × Reaktionspuffer
(Boehringer Mannheim). Die Reaktion wurde in einem
"Thermocycler" (Perkin-Elmer) inkubiert, wobei 5 Minuten bei
95°C inkubiert wurde, danach folgten 30 Cyclen von jeweils 1
Minute bei 94°C, 1 Minute bei 52°C und 2 Minuten bei 72°C.
Die Reaktion wurde durch 10minütige Inkubation bei 72°C ver
vollständigt.
Eine genomische DNA-Bank wurde aus der chromosomalen DNA von
E. aediculatus durch Clonierung von DNA mit glatten Enden in
die 5mal genannte Stelle des "pCR-Script"-Plasmidvektors
(Stratagene) präpariert. Diese Bank wurde durch Koloniehy
bridisierung mit dem radioaktiv markierten gel-gereinigten
PCR-Produkt gescreent. Die Plasmid-DNA von positiven Clonen
wurde präpariert und gemäß dem Didesoxy-Verfahren sequen
ziert (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 74 (1977),
5463) oder manuell mittels eines automatischen Sequenzierge
räts (ABI). Die DNA-Sequenz des Gens, das dieses Polypeptid
codiert, ist in Fig. 13 gezeigt. Das von der DNA-Sequenz
abgeleitete Startcodon liegt in dieser Sequenz bei dem
Nucleotid an der Position 101 und der offene Leserahmen en
det an Position 3193. Der genetische Code von Euplotes
unterscheidet sich von anderen Organismen dadurch, daß das
"UGA"-Codon einen Cystein-Rest codiert. Die von der DNA-Se
quenz abgeleitete Aminosäuresequenz des Polypeptids ist in
Fig. 14 gezeigt. Dabei wurde angenommen, daß keine unge
wöhnlichen Aminosäuren während der Translation eingebaut
werden und keine posttranslationalen Modifizierungen vorkom
men.
In diesem Beispiel wird die Clonierung des 43 kD-Polypeptids
von Telomerase (d. h. der 43 kD-Protein-Untereinheit) be
schrieben. Bei dieser Untersuchung wurde ein internes Frag
ment des Telomerase-Gens mittels PCR amplifiziert, wobei
Oligonucleotidprimer verwendet wurden, die so entworfen wur
den, daß sie zu den Peptidsequenzen passen, die von dem im
vorstehenden Teil D erhaltenen gereinigten Polypeptid erhal
ten wurden. Die Polypeptidsequenz wurde mittels der auf dem
Fachgebiet bekannten und von Calvio et al., RNA 1 (1995),
724-733 beschriebenen "nanoES-Tandem"-Massenspektroskopie
verfahren bestimmt. Die in diesem Beispiel verwendeten
Oligonucleotidprimer hatten die folgenden Sequenzen:
5'-NNNGTNAC(C/T/A)GG(C/T/A)AT(C/T/A)AA(C/T)AA-3' und
5'-(T/G/A)GC(T/G/A)GT(C/T)TC(T/C)TG(G/A)TC(G/A)TT(G/A)TA-3'.
5'-NNNGTNAC(C/T/A)GG(C/T/A)AT(C/T/A)AA(C/T)AA-3' und
5'-(T/G/A)GC(T/G/A)GT(C/T)TC(T/C)TG(G/A)TC(G/A)TT(G/A)TA-3'.
In dieser Sequenz bedeutet "N" die Anwesenheit eines von
vier Nucleotiden (d. h. A, T, G oder C).
Eine 50 µl-Reaktion enthielt 0,2 mM dNTPs, 0,2 µg E.
aediculatus chromosomale DNA, 0,5 µl Taq (Boehringer Mann
heim), jeweils 0,8 µg Primer und 1 × Reaktionspuffer
(Boehringer Mannheim). Die Reaktion wurde in einem
"Thermocycler" (Perkin-Elmer) inkubiert, wobei 5 Minuten bei
95°C inkubiert wurde, danach folgten 30 Cyclen von jeweils 1
Minute bei 94°C, 1 Minute bei 52°C und 1 Minute bei 72°C.
Die Reaktion wurde durch 10minütige Inkubation bei 72°C ver
vollständigt.
Eine genomische DNA-Bank wurde aus der chromosomalen DNA von
E. aediculatus durch Clonierung von DNA mit glatten Enden in
die SmaI genannte Stelle des "pCR-Script"-Plasmidvektors
(Stratagene) präpariert. Diese Bank wurde durch Koloniehy
bridisierung mit den radioaktiv markierten gel-gereinigten
PCR-Produkten gescreent. Die Plasmid-DNA von positiven Clo
nen wurde präpariert und gemäß dem Didesoxy-Verfahren se
quenziert (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 74 (1977),
5463) oder manuell mittels eines automatischen Sequenzierge
räts (ABI). Die DNA-Sequenz des Gens, das dieses Polypeptid
codiert, ist in Fig. 34 gezeigt. Drei mögliche Leserahmen
sind für diese Sequenz gezeigt, wie dies in Fig. 35 darge
stellt ist. Aus Gründen der Übersichtlichkeit ist die Amino
säuresequenz unter der Nucleotidsequenz für alle drei Le
serahmen angegeben. Diese Leserahmen tragen die Bezeichnun
gen "a", "b" und "c". Ein mögliches Startcodon wird an der
Nucleotidposition 84 im Leserahmen "c" codiert. Der codie
rende Bereich könnte an Position 1501 in Leserahmen "b" en
den. Codons für einen vorzeitigen Stop, die in dieser Figur
mit Sternchen bezeichnet sind, kommen in allen drei Leserah
men zwischen den Nucleotidpositionen 337-350 vor.
Die "La-Domäne" ist durch fette Buchstaben gekennzeichnet.
Weiter stromabwärts scheint die Proteinsequenz durch unter
schiedliche Leserahmen codiert zu sein, da keiner dieser Le
serahmen durch Stopcodons unterbrochen ist. Darüber hinaus
sind Peptidsequenzen von dem gereinigten Protein in allen
drei Leserahmen codiert. Somit scheint dieses Gen Intronse
quenzen zu enthalten, oder, alternativ, die RNA wird edi
tiert. Zu weiteren Möglichkeiten zählen ribosomale Leserah
menverschiebung oder Sequenzierungsfehler. Die Homologie zu
der Sequenz des La-Proteins bleibt jedoch von großem
Interesse. Es soll nochmals angemerkt werden, daß in
Euplotes das "UGA"-Codon einen Cystein-Rest codiert.
In diesem Beispiel werden Vergleiche zwischen veröffentlich
ten Sequenzen und den Sequenzen der 123 kD- und 43 kD-Telo
merase-Polypeptid-Untereinheiten durchgeführt.
Die Aminosäuresequenz des 123 kD-Polypeptids von Euplotes
aediculatus wurde mit der Sequenz der 80 kD-Telomerase-Pro
tein-Untereinheit von Tetrahymena thermophila (GenBank-Zu
gangsnummer #U25641) zur Untersuchung ihrer Ähnlichkeit
verglichen. Die dieses Protein codierende Nucleotidsequenz,
die von GenBank erhalten wurde ist in Fig. 42 gezeigt. Die
Aminosäuresequenz dieses Proteins, so wie es von GenBank er
halten wurde, ist in Fig. 43 gezeigt. Der Sequenzvergleich
zwischen dem 123 kD-Protein von E. aediculatus und dem 80
kD-Protein von T. thermophila ist in Fig. 36 gezeigt. In
dieser Figur stellt die Sequenz von E. aediculatus die obere
Sequenz dar und die Sequenz von T. thermophila die untere
Sequenz. In dieser sowie in den Fig. 37-39 sind Identitä
ten durch vertikale Balken angezeigt, während einzelne
Punkte zwischen den Sequenzen Aminosäuren mit etwas Ähnlich
keit anzeigen und Doppelpunkte zwischen den Sequenzen Amino
säuren mit größerer Ahnlichkeit anzeigen. Die nachgewiesene
Identität lag bei etwa 19%, während der Prozentsatz an Ähn
lichkeit etwa 45% betrug. Diese Werte ähneln denen, die mit
einer beliebigen Zufallsproteinsequenz beobachtet werden.
Die Aminosäuresequenz des 123 kD-Polypeptids von Euplotes
aediculatus wurde auch mit der Sequenz der 95 kD-Telomerase-
Protein-Untereinheit von Tetrahymena thermophila (GenBank-
Zugangsnummer #U25642) zur Untersuchung der Ähnlichkeiten
verglichen. Die von GenBank erhaltene, dieses Protein codie
rende Nucleotidsequenz ist in Fig. 44 gezeigt. Die Amino
säuresequenz des von GenBank erhaltenen Proteins erhaltenen
Proteins ist in Fig. 45 gezeigt, und der Sequenzvergleich
in Fig. 37. In dieser Figur ist die Sequenz von E.
aediculatus die obere Sequenz und die Sequenz von T.
thermophila die untere Sequenz. Identitäten sind durch ver
tikale Balken angezeigt. Die beobachtete Identität betrug
etwa 20%, während der Prozentsatz an Ähnlichkeit etwa 43%
betrug. Diese Werte ähneln den Werten, die man mit einer be
liebigen Zufallsproteinsequenz beobachtet.
Es ist auffallend, daß die Aminosäuresequenz des 123 kD-Pro
teins von E. aediculatus die fünf Motive enthält, die cha
rakteristisch für reverse Transkriptasen sind. Das 123 kD-Poly
peptid wurde auch mit den Polymerase-Domänen von ver
schiedenen reversen Transkriptasen verglichen. Fig. 40
zeigt die Ausrichtung des 123 kD-Polypeptids mit dem vermut
lichen Hefe-Homologen (L8543.12 oder ESTp). Die Aminosäure
sequenz von L8543.12 (oder ESTp), die von GenBank erhalten
wurde, ist in Fig. 46 gezeigt.
Vier Motive (A, B, C und D) waren Bestandteil dieses Ver
gleichs. In Fig. 40 sind hochkonservierte Reste durch weiße
Buchstaben auf schwarzem Hintergrund gekennzeichnet. Reste
der Sequenzen von E. aediculatus, die in der anderen Sequenz
konserviert sind, sind durch Fettdruck gekennzeichnet. Das
"h" bezeichnet das Vorhandensein einer hydrophoben Amino
säure. Die Ziffern zwischen den Aminosäureresten der Motive
bezeichnen die Menge von Lücken innerhalb der Sequenzen.
Beispielsweise betrifft die "100" zwischen den Motiven A und
B eine Lücke von 100 Aminosäuren in der Sequenz zwischen den
Motiven.
Durch das Absuchen der Genbank konnte ein Hefeprotein
(GenBank Zugangsnummer #u20618) und das Gen "L8543.12"
(Est2) identifiziert werden, das etwas Homologie zu der 123
kD-Telomerase-Untereinheit von E. aediculatus zeigt. Anhand
der Beobachtung, daß beide Proteine reverse Transkriptase-
Motive in ihren C-terminalen Bereichen enthalten; daß beiden
Proteinen gemeinsam ist, daß sie Ähnlichkeit in Bereichen
außerhalb des reverse Transkriptase-Motivs zeigen; daß die
Proteine ähnlich basisch sind (pI = 10,1 für E. aediculatus
und pI = 10,0 für Hefe); und beide Proteine groß sind (123
kD für E. aediculatus und 103 kD für Hefe) kann gefolgert
werden, daß diese Sequenzen den katalytischen Kern ihrer
entsprechenden Telomerasen umfassen. Aufgrund dieser Beob
achtung bezüglich der Homologie zwischen zwei phylogenetisch
entfernten Organismen wie E. aediculatus und Hefe wird davon
ausgegangen, daß menschliche Telomerase ein Protein enthält,
das dieselben Merkmale aufweist (d. h. reverse Transkriptase-
Motive aufweist, basisch ist und groß (< 100 kD)).
Die Aminosäuresequenz der "La-Domäne" des 43-kD-Polypeptids
von Euplotes aediculatus wurde mit der Sequenz der 95 kD-Te
lomerase-Protein-Untereinheit von Tetrahymena thermophila
(vorstehend beschrieben) zur Untersuchung deren Ähnlichkeit
verglichen. Der Sequenzvergleich ist in Fig. 38 gezeigt. In
dieser Figur ist die E. aediculatus-Sequenz die obere Se
quenz und die Sequenz von T. thermophila ist die untere Se
quenz. Identitäten sind mit vertikalen Balken gekennzeich
net. Die beobachtete Identität betrug etwa 23%, während der
Prozentsatz an Ähnlichkeit etwa 46% betrug. Diese Werte
ähneln denen, die man mit beliebigen Zufallsproteinsequenzen
beobachten würde.
Die Aminosäuresequenz der "La-Domäne" des 43 kD-Polypeptids
von Euplotes aediculatus wurde mit der Sequenz der 80 kD-Te
lomerase-Protein-Untereinheit von Tretrahymena thermophila
(vorstehend beschrieben) zur Untersuchung deren Ähnlichkeit
verglichen. Der Sequenzvergleich ist in Fig. 39 gezeigt. In
dieser Figur ist die Sequenz von E. aediculatus die obere
Sequenz und die Sequenz von T. thermophila die untere Se
quenz. Identitäten sind mit vertikalen Balken gekennzeich
net. Die beobachtete Identität betrug etwa 26%, während der
Prozentsatz an Ähnlichkeit etwa 49% betrug. Diese Werte
ähneln denen, die man mit beliebigen Zufallsroteinsequenzen
beobachten würde.
Die Aminosäuresequenz einer Domäne des 43 kD-Polypeptids von
E. aediculatus wurde auch mit La-Proteinen von zahlreichen
anderen Organismen verglichen. Diese Vergleiche sind in Fig.
41 gezeigt. In dieser Figur sind hochkonservierte Reste
durch weiße Buchstaben auf schwarzem Hintergrund gekenn
zeichnet. Reste der Sequenzen von E. aedicuiatus, die in der
anderen Sequenz konserviert sind, sind durch Fettdruck ge
kennzeichnet.
In diesem Beispiel wurden die in den vorstehenden Beispielen
identifizierten Sequenzen zur Identifizierung der Telome
rase-Protein-Untereinheiten von Oxytricha trifallax verwen
det. Dies ist ein Ciliat, der mit E. aediculatus nur sehr
entfernt verwandt ist. In diesem Beispiel wurden basierend
auf dem konservierten Bereich des 123 kD-Polypeptids von E.
aediculatus Primer ausgewählt, die die Motive der reversen
Transkriptase-Domäne umfaßten. Geeignete Primer wurden syn
thetisiert und in einer PCR-Reaktion mit Gesamt-DNA von
Oxytricha verwendet. Oxytricha-DNA wurde gemäß auf dem Fach
gebiet bekannter Verfahren präpariert. Die PCR-Produkte wur
den danach unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannter
Verfahren cloniert und sequenziert.
Die für die Primer verwendeten Oligonucleotidsequenzen wa
ren: 5'-
(T/C)A(A/G)AC(T/A/C)AA(G/A)GG(T/A/C)AT(T/C)CC(C/T/A)(C/T)A(G/A)GG-3'
5'-(G/A/T)GT(G/A/T)ATNA(GA)NA(G/A)(G/A)TA(G/A)TC(G/A)TC-3'.
5'-(G/A/T)GT(G/A/T)ATNA(GA)NA(G/A)(G/A)TA(G/A)TC(G/A)TC-3'.
Positionen, die degeneriert waren, sind in Klammern gezeigt,
wobei die alternativen Basen in den Klammern gezeigt sind.
"N" entspricht einem beliebigen Nucleotid aus den vier
Nucleotiden.
Die PCR-Reaktion (50 µl) enthielt 0,2 mM dNTPs, 0,3 µg chro
mosomale DNA von Oxytricha trifallax, 1 µl Taq-Polymerase
(Boehringer Mannheim), jeweils 2 µM Primer, 1 × Reaktions
puffer (Boehringer Mannheim). Das Reaktionsgemisch wurde in
einem "Thermocycler" (Perkin-Elmer) unter den folgenden Be
dingungen inkubiert: 1 × 5 Minuten bei 95°C, 30 Cyclen je
weils 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 53°C und 1 Minute bei
72°C, danach 1 × 10 Minuten bei 72°C. Das PCR-Produkt wurde
gelgereinigt und mittels des Didesoxy-Verfahrens (siehe z. B.
Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 74 (1977), 5463-5467)
oder anderer auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren sequen
ziert.
Von dem PCR-Produkt wurde die Aminosäuresequenz abgeleitet
und mit der Sequenz von E. aediculatus verglichen. Fig. 47
zeigt die Ausrichtung dieser Sequenzen, wobei die Sequenz
von O. trifallax in der oberen Reihe gezeigt ist und die E.
aediculatus-Sequenz in der unteren Reihe gezeigt ist. Wie
aus dieser Figur ersichtlich ist, besteht ein großer Grad an
Homologie zwischen der in diesem Beispiel identifizierten O.
trifallax Polypeptidsequenz und der Polypeptidsequenz von E.
aediculatus. Somit ist es klar, daß die in der vorliegenden
Erfindung identifizierten Sequenzen für die Identifizierung
von homologen Telomerase-Protein-Untereinheiten in anderen
eukaryotischen Organismen von Nutzen sind. Tatsächlich konn
ten aufgrund der erfindungsgemäßen Entwicklung homologe Te
lomerase-Sequenzen in zahlreichen unterschiedlichen Spezies
identifiziert werden.
In diesem Beispiel wurde ein Tetrahymena-Clon erzeugt, der
Homologie mit den Euplotes-Sequenzen und EST2p aufweist.
Bei diesem Experiment wurde eine PCR mit degenerierten Oli
gonucleotidprimern verwendet, die gegen konservierte Motive
gerichtet waren, um so Homologiebereiche zwischen Tetra
hymena-, Euplotes- und EST2p-Sequenzen identifizieren zu
können. Das in diesem Beispiel verwendete PCR-Verfahren
stellt ein neues Verfahren dar, das zur spezifischen Ampli
fikation von seltenen DNA-Sequenzen aus komplexen Gemischen
entworfen wurde. Bei diesem Verfahren wird das Problem der
Amplifikation von DNA-Produkten mit dem gleichen PCR-Primer
an beiden Enden (d. h. Produkte, eines einzelnen Primers),
dem man in PCR-Clonierungsverfahren üblicherweise begegnet,
vermieden. Durch diese Produkte eines einzelnen Primers wird
ein unerwünschter Hintergrund erzeugt und dies kann oft die
Amplifikation und den Nachweis des gewünschten Produkts von
zwei Primern erschweren. Bei diesem in diesen Experimenten
verwendeten Verfahren wird bevorzugt auf Produkte von zwei
Primern selektiert. Das besondere ist, daß ein Primer bioti
nyliert ist und der andere nicht. Nach mehreren PCR-Amplifi
kationsrunden werden die Produkte unter Verwendung von
magnetischen Streptavidin-Kügelchen gereinigt und Produkte
von zwei Primern werden mittels Hitzedenaturierung spezi
fisch eluiert. Dieses Verfahren findet auch im Rahmen ande
rer Experimente, die in diesen Beispielen nicht beschrieben
wurden, seine Verwendung. Tatsächlich ist dieses Verfahren
bei Anwendungen in Gebrauch, bei denen es wünschenswert ist,
seltene DNA-Sequenzen zu amplifizieren, wozu die einleiten
den Schritte bei Clonierungsverfahren, beispielsweise 5' und
3, gehören, RACE und jedes Verfahren, das in der PCR degene
rierte Primer verwendet.
Ein erster PCR-Lauf wurde unter Verwendung von macronucleä
rer DNA von Tetrahymena- als Matrize durchgeführt, die gemäß
auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren isoliert wurde. Es
wurde ein 24-mer-Vorwärts-Primer verwendet mit der Sequenz
5'-Biotin-
GCCTATTT(TC)TT(TC)TA(TC)(GATC)(GATC)(GATC)AC(GATC)GA-3', die
als "K231" bezeichnet wird, und dem FFYXTE-Bereich ent
spricht und der 23-mer-Rückwärts-Primer mit der Sequenz
5'-CCAGATAT(GATC)A(TGA)(GATC)A(AG)(AG)AA(AG)TC(AG)TC-3', der
als "K220" bezeichnet wird und dem DDFL(FIL)I-Bereich ent
spricht. Diese PCR-Reaktion enthielt 2,5 µl DNA (50 ng), je
weils 4 µl Primer (20 µM), 3 µl 10 × PCR-Puffer, 3 µl 10 × dNTPs,
2 µl Mg, 0,3 µl Taq und 11,2 µl dH2O. Mit dem Gemisch
wurden 8 Cyclen durchgeführt, jeweils 45 Sekunden bei 94°C
45 Sekunden bei 37°C und 1 Minute bei 72°C.
Das Gemisch der PCR-Reaktion wurde an 200 µl magnetische
Streptavidin-Kügelchen gebunden, mit 200 µl TE gewaschen, in
20 µl dH2O resuspendiert und danach durch 2minütiges Kochen
bei 100°C hitzedenaturiert. Die Kügelchen wurden herunterge
zogen und das Eluat wurde entfernt. Danach wurden 2,5 µl
dieses Eluats erneut unter den vorstehenden Bedingungen
amplifiziert, mit der Ausnahme, daß 0,3 µl α-32P dATP ent
halten war und 33 PCR-Cyclen durchgeführt wurden. Das Reak
tionsgemisch wurde auf einem denaturierendem 5%igen Poly
acrylamidgel aufgetrennt und der geeignete Bereich aus dem
Gel ausgeschnitten. Diese Produkte wurden mit weiteren 34
Cyclen unter den vorstehend aufgezählten Bedingungen erneut
amplifiziert, außer, daß die Anlagerungstemperatur 42°C be
trug.
Ein zweiter PCR-Lauf wurde unter Verwendung von makronucleä
rer DNA von Tetrahymena, die unter Verwendung von auf dem
Fachgebiet bekannten Verfahren isoliert wurde, als Matrize
durchgeführt, wobei der 23-mer-Vorwärts-Primer mit der Se
quenz 5'-
ACAATG(CA)G(GATC)(TCA)T(GATC)(TCA)T(GATC)CC(GATC)AA(AG)AA-3'
mit der Bezeichnung "228" verwendet wurde, der nach dem Be reich R(LI) (LI)PKK entspricht und eines reversen Primers mit der Sequenz 5'- ACGAATC(GT)(GATC)GG(TAG)AT(GATC)(GC)(TA)(AG)TC(AG)TA(AG)CA-3'
mit der Bezeichnung "K224", der dem CYDSIPR-Bereich ent spricht. Diese PCR-Reaktion enthielt 2,5 µl DNA (50 ng), je weils 4 µl Primer (20 µM), 3 Ml 10 × PCR-Puffer, 3 µl 10 × dNTPs, 2 µl Mg, 0,3 µl α-32P-dATP, 0,3 µl Taq und 10,9 µl dH2O. Das Reaktionsgemisch wurde auf einem denaturierendem 5%igen Polyacrylamidgel aufgetrennt und der geeignete Be reich aus dem Gel ausgeschnitten. Diese Produkte wurden mit 34 zusätzlichen Cyclen erneut unter den vorstehend angegebe nen Bedingungen amplifiziert, außer daß die Anlagerungstem peratur 42°C betrug.
mit der Bezeichnung "228" verwendet wurde, der nach dem Be reich R(LI) (LI)PKK entspricht und eines reversen Primers mit der Sequenz 5'- ACGAATC(GT)(GATC)GG(TAG)AT(GATC)(GC)(TA)(AG)TC(AG)TA(AG)CA-3'
mit der Bezeichnung "K224", der dem CYDSIPR-Bereich ent spricht. Diese PCR-Reaktion enthielt 2,5 µl DNA (50 ng), je weils 4 µl Primer (20 µM), 3 Ml 10 × PCR-Puffer, 3 µl 10 × dNTPs, 2 µl Mg, 0,3 µl α-32P-dATP, 0,3 µl Taq und 10,9 µl dH2O. Das Reaktionsgemisch wurde auf einem denaturierendem 5%igen Polyacrylamidgel aufgetrennt und der geeignete Be reich aus dem Gel ausgeschnitten. Diese Produkte wurden mit 34 zusätzlichen Cyclen erneut unter den vorstehend angegebe nen Bedingungen amplifiziert, außer daß die Anlagerungstem peratur 42°C betrug.
10 µl des Reaktionsprodukts aus Lauf 1 wurden an magnetische
Streptavidin-beschichtete Kügelchen in 200 µl TE gebunden.
Die Kügelchen wurden mit 200 µl TE gewaschen und danach in
20 µl dH2O resuspendiert, hitzedenaturiert und das Eluat
wurde entfernt. Das Reaktionsprodukt aus Lauf 2 wurde danach
zu den Kügelchen gegeben und mit 30 µl 0,5 × SSC verdünnt.
Das Gemisch wurde auf 94°C erhitzt und auf 50°C abkühlen ge
lassen. Das Eluat wurde entfernt und die Kügelchen wurden
dreimal in 0,5 × SSC bei 55°C gewaschen. Die Kügelchen wur
den danach in 20 µl dH2O resuspendiert, hitzedenaturiert,
und das Eluat mit der Bezeichnung "Runde 1-Eluat" entfernt
und aufbewahrt.
Zur Isolierung der Tetrahymena-Bande wurde das Runde 1-Eluat
mit dem Vorwärts-Primer K228 und den reversen Primer K227
mit der Sequenz 5'-
CAATTCTC(AG)TA(AG)CA(GATC)(CG)(TA)(CT)TT(AGT)AT(GA)TC3' (SEQ ID
was dem DIKSCYD-Bereich entspricht, erneut amplifiziert. Die
PCR-Reaktionen wurden wie vorstehend beschrieben durchge
führt. Die Reaktionsprodukte wurden auf einem 5%igen Poly
acrylamidgel aufgetrennt, die etwa 295 Nucleotide entspre
chende Bande aus dem Gel ausgeschnitten und sequenziert.
Der Clon mit der Bezeichnung 168-3 wurde sequenziert. Es
wurde folgende DNA-Sequenz (einschließlich der Primersequen
zen) gefunden:
Eine zusätzliche Sequenz dieses Gens wurde mittels PCR er
halten, wobei ein neuer Primer verwendet wurde, der so kon
struiert war, daß er mit der Sequenz von 168-3 ("K297" mit
der Sequenz 5'-GAGTGACATAATATACGTGA-3'; paart und der Primer
K231 (FFYXTE). Die Sequenz des aus dieser Reaktion erhalte
nen Fragments, zusammen mit 1683 ist wie folgt (ohne die
Primersequenzen):
Die diesem DNA-Fragment entsprechende Aminosäuresequenz ist:
Diese Aminosäuresequenz wurde gegen andere Telomerase-Gene
(EST2p und Euplotes) ausgerichtet. Die Ausrichtung ist in
Fig. 53 gezeigt. Eine "Consensus"-Sequenz ist in dieser Fi
gur ebenfalls gezeigt.
In diesem Beispiel wurde die tez1-Sequenz von S. pombe als
ein Homologes von p123 von E. aediculatus und Est2p von S.
cerevisiae identifiziert.
Fig. 55 zeigt eine Zusammenfassung dieser Experimente. In
dieser Figur zeigt der obere Bereich (Teil A) die Beziehung
wischen den beiden überlappenden genomischen Clonen und den
Bereich von 5825 bp, der sequenziert wurde. Die mit "tez1"
bezeichnete Region entspricht dem Protein codierenden Be
reich, wobei auch die flankierenden Sequenzen gezeigt sind.
Die Box unterhalb des Bereichs von 5825 bp ist ein HindIII-Frag
ment von etwa 2 kb, das zur Herstellung des tez1-Disrup
tionskonstrukts, wie nachstehend beschrieben, verwendet
wurde.
Die untere Hälfte von Fig. 55 (Teil B) ist ein "aufge
schlüsseltes" Schema des gleichen DNA-Bereichs. Die als
"Original-PCR" bezeichnete Sequenz ist das ursprüngliche de
generierte PCR-Fragment, das mit dem degenerierten Oligo
nucleotid-Primerpaar erzeugt wurde, das auf der Basis der
Sequenz von Motiv 4 (B') und Motiv 5 (C) von Euplotes, wie
in den vorstehenden Beispielen beschrieben, entworfen worden
war.
Eine PCR unter Verwendung der genetischen Primer wurde ver
wendet, um in S. pombe das zu p123 von E. aediculatus homo
loge Protein zu finden. Fig. 56 zeigt die Sequenzen der in
dieser Reaktion verwendeten degenerierten Primer (bezeichnet
als "poly 4" und "poly 1"). Die PCR-Läufe wurden unter den
gleichen Pufferbedingungen wie in den vorstehenden Beispie
len beschrieben durchgeführt (siehe beispielsweise den vor
stehenden Teil K) mit einer 5minütigen "ramp"-Zeit von
94°C, wonach sich 30 Cyclen für jeweils 30 Sekunden bei
94°C, 45 Sekunden bei 50°C und 30 Sekunden bei 72°C an
schlossen, dann 7 Minuten bei 72°C, und anschließend wurde
das Reaktionsgemisch bei 4°C aufbewahrt. Die PCR-Läufe wur
den unter unterschiedlichen Bedingungen durchgeführt (d. h.
erschiedene Konzentrationen an DNA von S. pombe und ver
schiedene MgCl2-Konzentrationen). Die PCR-Produkte wurden
auf Agarosegelen aufgetrennt und mit Ethidiumbromid wie vor
stehend beschrieben angefärbt. Verschiedene PCR-Läufe erga
ben die Produktion von 3 Banden (mit "T", "M" und "B" be
zeichnet). Diese Banden wurden unter den gleichen Bedingun
gen wie vorstehend beschrieben erneut amplifiziert und auf
Gelen aufgetrennt. Nach dieser erneuten Amplifikation wurden
vier Banden beobachtet ("T", "M1", "M2" und "B"), wie in Fig.
57 gezeigt. Diese vier Banden wurden dann unter den
gleichen Bedingungen wie vorstehend beschrieben erneut
amplifiziert. Die dritte Bande von dem oberen Bereich der
Spur in Fig. 57 wurde als eine Bande identifiziert, die die
richtige Sequenz für ein Telomerase-Protein enthielt. Es
zeigte sich, daß das mit M2 bezeichnete PCR-Produkt zu
anderen Telomerase-Proteinen relativ gut paßt, wie dies in
Fig. 58 gezeigt ist. Zusätzlich zu der gezeigten
Ausrichtung zeigt diese Figur auch die tatsächliche Sequenz
von tez1. In dieser Figur bezeichnen Sternchen Reste, die
alle vier Sequenzen gemeinsam haben (Oxytricha "OT"; E.
aediculatus "Ea_123", S. cerevisiae "Sc_p103" und M2), und
die Kreise (d. h. Punkte) kennzeichnen ähnliche
Aminosäurereste.
Um eine zusätzliche Sequenzinformation zu erhalten, wurden
3'- und 5'-RT-PCR an dem in Fig. 58 angegebenen Telomerase-
Kandidaten durchgeführt. Fig. 59 zeigt ein Schema der
verwendeten 3'-RT-PCR-Strategie. Zuerst wurde mittels des
Oligonucleotidprimers "-T" (5'-CCA GTG AGC AGA GTG ACG AGG
ACT CGA GCT CAA GCT TTT TTT TTT TTT TT-3'; aus mRNA cDNA
präpariert, danach diese cDNA als eine Matrize für OCR mit
"QO" (5'-CCA GTG AGC AGA GTG ACG-3'; verwendet und ein
Primer auf der Basis der ursprünglichen degenerierten PCR-Reak
tion entworfene, (d. h. "M2-T" mit der Sequenz 5'-G TGT
CAT TTC TAT ATG GAA GAT TTG ATT GAT G-3'). Die-zweite PCR-Reak
tion (d. h. "nested" PCR) wurde mit "QI" (5'-GAG GAC TCG
AGC TCA AGC-3'); und einem weiteren PCR-Primer, der mit
einer Sequenz entworfen wurde, die von der ursprünglichen
degenerierten PCR-Reaktion stammte oder "M2-T2" mit der Se
quenz 5'-AC CTA TCG TTT ACG AAA AAG AAA GGA TCA GTG-3';
durchgeführt. Die in dieser PCR verwendeten Puffer entspra
chen den vorstehend beschriebenen, wobei die durchgeführte
Amplifikation mit einem 5minütigem "ramp up" bei 94°C be
gann, wonach sich 30 Cyclen von jeweils 30 Sekunden bei
94°C, 30 Sekunden bei 55°C und 3 Minuten bei 72°C anschlos
sen, danach wurde 7 Minuten bei 72°C inkubiert. Die Reakti
onsprodukte wurden bis zu ihrer Verwendung bei 4°C aufbe
wahrt.
Nach Erhalt dieser zusätzlichen Sequenzinformation wurden
verschiedene genomische und cDNA-Banken gescreent, um somit
alle Banken identifizieren zu können, die diesen Kandidaten
für das Telomerase-Gen enthielten. Die verwendete Vorgehens
weise sowie die Genbanken und Ergebnisse sind in Fig. 60 ge
zeigt. In dieser Figur werden in Teil A die in diesem Expe
riment getesteten Genbanken aufgezählt; Teil B zeigt die
verwendeten Bereiche; die Teile C und D zeigen die mit die
sen Banken erhaltenen Ergebnisse der Dot-Blot-Hybridisie
rung. Positive Banken wurden dann zum Erhalt des genomischen
tez1-Gens und einer cDNA-Version des tez1-Gens durch Kolo
niehybridisierung gescreent. In diesem Experiment wurden
etwa 3 × 104 Kolonien von der genomischen HindIII-Bank ge
screent und es konnten sechs positive Clone identifiziert
werden (etwa 0,01%). Danach wurde DNA von zwei unabhängigen
Clonen (A5 und 32) präpariert. Fig. 61 zeigt die mit den
HindIII-gespaltenen positiven genomischen Clone A5 und B2
erhaltenen Ergebnisse.
Zusätzlich wurden cDNA-REP-Banken verwendet. Es wurden etwa
3 × 105 Kolonien gescreent und es konnten 5 positive Clone
(0,002%) identifiziert werden. Von drei unabhängigen Clonen
(2-3, 4-1 und 5-20) wurde DNA präpariert. In späteren Expe
rimenten wurde herausgefunden, daß 2-3 und 5-20 identische
Insertionen enthielten.
Da die cDNA-Version des Genprodukts bis zu diesem Punkt
nicht vollständig war, wurde zum Erhalt eines Clons voll
ständiger Länge eine 5'-RT-PCR durchgeführt. Die Strategie
ist schematisch in Fig. 62 gezeigt. Bei diesem Experiment
wurde cDNA präpariert mittels des DNA-Oligonucleotid-Primers
"M2-B" (5'-CAC TGA TCC TTT CTT TTT CGT AAA CGA TAG GT-3');
und "M2-B2" (5'-C ATC AAT CAA ATC TTC CAT ATA GAA ATG ACA-3');
die anhand von bekannten und bereits früher identifi
zierten Bereichen von tez1 entworfen worden waren. Ein Oli
gonucleotid-Linker "PCR Adapt SfiI" mit einem phosphorylier
ten 5'-Ende ("P") (p-GGG CCG TGT TGG CCT AGT TCT CTG CTC-3');
wurde danach mit dem 3'-Ende dieser cDNA ligiert und
dieses Konstrukt wurde als die Matrize für eine "nested"-PCR
verwendet. In der ersten PCR-Runde wurden PCR Adapt SFI und
M2-B als Primer verwendet. In der zweiten Runde wurde PCR
Adapt SfiII (5-GAG GAG GAG AAG AGC AGA GAA CTA GGC CAA CAC
GCC CC-3'); und M2-B2 (5'-ATC AAT CAA ATC TTC CAT ATA GAA
ATG ACA-3'); als Primer verwendet. "Nested"-PCR wurde zur
Steigerung der Spezifität der Reaktion verwendet.
Nachdem die Sequenz von tez1 bestimmt war, wurde sie mit be
reits früher beschriebenen Sequenzen verglichen. Fig. 63
zeigt die Ausrichtung von reverser Transkriptase (RT)-Domä
nen von katalytischen Telomerase-Untereinheiten von S. pombe
("S.p. Tez1p"), S. cerevisiae ("S.c. Est2p"), und E.
aediculatus p123 ("E.a. p123"). In dieser Figur bezeichnet
"h" hydrophobe Reste, "p" kleine polare Reste und "c" ge
ladene Reste. Die über der Ausrichtung angegebenen Aminosäu
rereste zeigen das "Consensus"-RT-Motiv von Y. Xiong und
T.H. Eickbush (Y. Xiong und T.H. Eickbush, EMBO J. 9 (1990)
3353-3362). die Sternchen bezeichnen die Reste, die in allen
drei Proteinen konserviert sind. "Motiv O" wurde hier als
ein Motiv identifiziert, das spezifisch für diese Telome
rase-Untereinheit ist und im allgemeinen in reversen
Transkriptasen nicht gefunden wird. Es ist somit wertvoll,
um andere Aminosäure Sequenzen als gute Kandidaten für kata
lytische Telomerase-Untereinheiten identifizieren zu können.
Fig. 64 zeigt die Ausrichtung der gesamten Sequenzen von
uplotes ("Ea_123"), S. cerevisiae ("Sc_Est2p") und S.
pombe ("Sp_Tez1p"). In Teil A kennzeichnen schattierte Be
reiche Reste, die beide Sequenzen gemeinsam haben. In Teil B
bezeichnen schattierte Bereiche Reste, die alle drei Sequen
zen gemeinsam haben.
In diesem Beispiel wurden die Auswirkungen einer Disruption
von tez1 untersucht. Da Telomerase an der Telomer-Beibehal
tung beteiligt ist, wurde davon ausgegangen, daß, falls tez1
tatsächlich ein Telomerase-Bestandteil ist, die Disruption
von tez1 zu einer graduellen Telomer-Verkürzung führen
sollte.
In diesen Experimenten wurde zur spezifischen Disruption des
tez1-Gens in S. pombe homologe Rekombination verwendet.
Diese Vorgehensweise ist schematisch in Fig. 65 gezeigt.
Wie in Fig. 65 angegeben, wurde Wild-Typ-tez1 gegen ein
Fragment, das den ura4- oder LEU2-Marker enthielt, ausge
tauscht.
Die Disruption des tez1-Gens wurde durch PCR bestätigt (Fig.
66) und ein Southern-Blot wurde zur Überprüfung der Te
lomer-Länge durchgeführt. Fig. 67 zeigt die Southern-Blot-
Ergebnisse dieses Experiments. Da eine ApaI-Restriktions
enzymstelle im unmittelbaren Anschluß zu einer Telomer-Se
quenz in S. pombe vorhanden ist, erlaubt die Spaltung von
genomischen DNA-Präparationen von S. pombe die Analyse der
Telomer-Länge. Somit wurde DNA von S. pombe mit ApaI ge
schnitten, die Spaltprodukte wurden auf einem Agarosegel
aufgetrennt und diese dann mit einer für eine Telomer-Se
quenz spezifischen Sonde hybridisiert, um so herauszufinden,
ob die Telomere der disruptierten S. pombe-Zellen verkürzt
waren. Die Ergebnisse sind in Fig. 67 gezeigt. Aus diesen
Ergebnissen konnte geschlossen werden, daß eine Disruption
des tez1-Gens eine Verkürzung der Telomere bewirkte.
In diesem Beispiel wurde die Information bezüglich der
Nucleinsäuresequenz und Aminosäuresequenz für menschliche
Telomerase ermittelt. Partiell homologe Sequenzen wurden zu
erst mittels einer BLAST-Suche identifiziert, die mittels
der Euplotes 123 kD-Peptid- und Nucleinsäuresequenzen sowie
der Sequenzen des Schizosaccharomyces-Proteins und der kor
respondierenden cDNA (tez1)-Sequenz. Die menschlichen Se
quenzen (auch mit "hTCP1.1" bezeichnet) wurden von einem
partiellen cDNA-Clon ermittelt (Clon 712562). Sequenzen von
diesem Clon wurden gegen die wie in vorherigen Beispielen
beschrieben bestimmten Sequenzen ausgerichtet.
Fig. 1 zeigt die Sequenzausrichtung von Euplotes ("p123"),
Schizosaccharomyces ("tez1"), Est2p (d. h. das von der Est2-Nuclein
säuresequenz codierte Protein von S. cerevisiae, das
hier auch mit "L8543.12" bezeichnet wird) und dem in dieser
Vergleichssuche identifizierten menschlichen Homologen.
Fig. 51 zeigt die Aminosäuresequenz von tez1 und Fig. 52
die DNA-Sequenz von tez1. In Fig. 52 sind die Introns und
andere nicht codierende Bereiche mit kleinen Buchstaben dar
gestellt und die Exons (d. h. codierenden Bereiche) in
Großbuchstaben.
Wie in Fig. 75 gezeigt, gibt es Bereiche, die unter diesen
Proteinen hochkonserviert sind. Beispielsweise zeigt sich in
dieser Figur, daß es Identitätsbereiche "Motiv 0", "Motiv
1", "Motiv 2" und "Motiv 3" gibt. Die identischen Aminosäu
ren sind durch ein Sternchen (*) gekennzeichnet und die ähn
lichen Aminosäurereste durch einen Kreis (⚫). Dies zeigt,
daß es Bereiche innerhalb der Telomerase-Motive gibt, die
innerhalb einer großen Anzahl von Eukaryoten, die von der
Hefe über Ciliate bis zum Menschen reichen, konserviert
sind. Es wird davon ausgegangen, daß weitere Organismen
ebenso solche konservierten Sequenzbereiche enthalten. Fig.
49 zeigt die partielle Aminosäuresequenz des Clons, der
menschliche Telomerase-Motive codiert und Fig. 50 die kor
respondierende DNA-Sequenz des Genbank-Clons #AA281296.
Um die Information über die Sequenz des Genbank-Clons
#AA281296 zu vervollständigen wurden die Sanger-Didesoxy-Se
quenzierung und andere auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren
angewandt. Einige der bei der Sequenzierung verwendeten Pri
mer sind in Tabelle 7 gezeigt. Diese Primer wurden so ent
worfen, daß sie mit dem Clon (GenBank-Zugangsnummer
#AA281296) hybridisieren; dies basierte auf Sequenzkomple
mentarität entweder zu der Sequenz des Plasmidrückgrats oder
der Sequenz der Insertion der menschlichen cDNA im Clon.
Primer
Primer
Anhand dieser Experimente wurde herausgefunden, daß die
EcoRI-NotI-Insertion des Genbank-Clons #AA281296 nur einen
partiellen offenen Leserahmen für das menschliche Telome
rase-Protein enthält, allerdings könnte er ein aktives Frag
ment dieses Proteins codieren. Der offene Leserahmen im Clon
codiert ein Protein von etwa 63 kD. Die Sequenz des längsten
ermittelten offenen Leserahmens ist in Fig. 68 gezeigt. Der
offene Leserahmen (ORF) beginnt an dem ATG-Codon mit dem in
der Figur gekennzeichneten "met". Der poly-A-Schwanz am 3'-Ende
der Sequenz ist ebenfalls gezeigt. Fig. 69 zeigt eine
vorläufige Ausrichtung von reverser Transkriptase-Proteinen
von Telomerase von der menschlichen Sequenz (menschliches
Telomerase "Core Protein 1", "HS TCP1"), E. aediculatus p123
("Ep p123"), S. pombe tez1 ("Sp Tez1"), S. cerevisiae EST2
("Sc Est2") und der "Consensus"-Sequenz. In dieser Figur
sind verschiedene Motive angegeben.
Um einen vollständigen Clon zu erhalten, wurden die Hybridi
sierung einer cDNA-Bank und 5'-RACE durchgeführt, um so
Clone zu erhalten, die Bereiche von bisher nicht clonierten
Bereichen codieren. In diesen Experimenten wurde zur Erzeu
gung von Material für eine Sequenzanalyse RACE angewandt
(schnelle Amplifikation von cDNA-Enden, "Rapid Amplification
of cDNA Ends"; siehe z. B. M. A. Frohman, "RACE: Rapid
Amplification of cDNA Ends", in Innis et al. (Herausg.) PCR-Pro
tocols: A Guide to Methods and Applications (1990) S. 28-38,
und Frohman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85 (1988)
8998-9002). Vier solcher Clone wurden erzeugt und zur Be
reitstellung zusätzlicher 5'-Sequenzinformation (pFWRP5, 6,
19 und 20) verwendet.
Zusätzlich wurden menschliche cDNA-Banken (in lambda inse
riert) mit dem EcORI-NotI-Fragment des Clons (#AA281296) hy
bridisiert. Ein lambda-Clon mit der Bezeichnung "lambda 25-1.1"
(ATCC-Zugangsnummer #209024) wurde gefunden, der kom
plementäre Sequenzen enthielt. Fig. 75 zeigt eine Restrik
tionskarte dieses lambda-Clons. Die Insertion von humaner
DNA wurde von diesem Clon als ein EcORI-Restriktionsfrag
ment in die EcoRI-Stelle des Im Handel erhältlichen
"phagemids" pBluescriptIIsK+ (Stratagene) subcloniert, wo
durch das Plasmid "pGRN121" erzeugt wurde, das bei der ATCC
hinterlegt wurde (ATCC-Zugangsnummer #209016). Vorläufige
Ergebnisse zeigten, daß das Plasmid pGRN121 die vollständige
Sequenz des offenen Leserahmens (ORF) enthält, der das
menschliche Telomerase-Protein codiert.
Die cDNA-Insertion von Plasmid pGRN121 wurde unter Verwen
dung von auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren sequenziert.
Fig. 70 zeigt eine Karte des Plasmids pGRN121 bezüglich Re
striktionsstellen und Funktion, deren Bestimmung auf dieser
vorläufigen Arbeit basiert. Die Ergebnisse dieser vorläufi
gen Sequenzanalyse sind in Fig. 71 gezeigt. Aufgrund dieser
Analyse, und wie in Fig. 70 gezeigt, wurde eine vermutliche
Startstelle für den codierenden Bereich bei einer Position,
die etwa 50 Nucleotide von der EcoRI-Stelle entfernt liegt,
gefunden (bei Position 707 gelegen) und die Lage der Telome
rase-spezifischen Motive "FFYVTE", "PKP", "AYD", "QG" und
"DD". Zusätzlich wurde eine vermutliche Stopstelle bei
Nucleotid #3571 gefunden (siehe Fig. 72). Fig. 72 zeigt
die DNA-Sequenzen und entsprechenden Aminosäuresequenzen für
die offenen Leserahmen in der Sequenz ("a", "b" und "c")
Aufgrund der vorläufigen Natur dieser frühen Sequenzierungs
arbeiten stellte sich jedoch heraus, daß die Leserahmen für
die verschiedenen Motive nicht richtig ausgerichtet sind.
Eine zusätzliche mit pGRN121 durchgeführte Analyse ergab,
daß das Plasmid signifikante Bereiche des 5'-Endes der co
dierenden Sequenzen enthielt, die auf dem Genbank-Clon mit
der Zugangsnummer #AA281296 nicht vorhanden sind. Es stellte
sich weiterhin heraus, daß pGRN121 eine Variante der codie
renden Sequenz enthält, 99999 00070 552 001000280000000200012000285919988800040 0002019743497 00004 99880 die eine Insertion von etwa 182
Nucleotiden enthält. Es zeigte sich, daß diese Insertion in
dem Genbank-Clon mit der Zugangsnummer #AA281296 fehlt. Sol
che Varianten können wie die E. aediculatus-Sequenzen in
funktionellen Assays getestet werden, beispielsweise Telome
rase-Assays, um so das Vorhandensein einer funktionellen Te
lomerase in einer Probe nachweisen zu können.
Durch eine weitere Sequenzanalyse konnte die cDNA-Sequenz
von pGRN121 bestimmt werden, wobei ein zusammenhängender of
fener Leserahmen gefunden wurde, der ein Protein mit einem
Molekulargewicht von etwa 127 000 Dalton und 1132 Aminosäu
ren, wie in Fig. 74 gezeigt, codiert. Eine auf dieser Ana
lyse basierende verbesserte Karte von pGRN121 ist in Fig.
73 gezeigt. Die Ergebnisse der zusätzlichen Sequenzanalyse
der hTRT-cDNA sind in Fig. 16 gezeigt.
Die relative Häufigkeit von hTRT-mRNA wurde in sechs Stämmen
von Telomerase-negativen sterblichen Zellen und sechs Zelli
nien von Telomerase-positiven unsterblichen Zellen bewertet
Fig. 5). Der Fließgleichgewicht kleinere Spiegel von hTRT-mRNA
war in unsterblichen Zellen, für die früher gezeigt
werden konnte, daß sie aktive Telomerase besitzen, signifi
kant erhöht. Niedrigere Spiegel der hTRT-mRNA wurden in
einigen Stämmen Telomerase-negativer Zellen entdeckt.
Es wurde RT-PCR für hTRT, hTR, TP1 (Telomerase-assoziiertes
Protein, das mit Tetrahymena p80 verwandt ist (Harrington et
al., Science 275 (1997), 973 und Nakayama et al, Cell 88
(1997), 875)) und GAPDH (um für gleiche Mengen an RNA-Ma
trize zu normalisieren) mit RNA ausgeführt, die von den fol
genden Zellen stammte: (1) Menschliche fötale Lungenfibro
blasten GFL, (2) menschliche fötale Hautfibroblasten GFS,
(3) erwachsene Prostata Stromal-Fibroblasten 31 YO, (4)
menschliche fötale Kniesynovial-Fibroblasten HSF, (5) neona
tale Vorhaut-Fibroblasten BJ, (6) menschliche fötale Lungen
fibroblasten IMR90 und die immortalisierten Zellinien: (7)
Melanom LOX IMVI, (8) Leukämie U251, (9) Lungenkrebs NCI
H23, (10) Colon-Adenocarcinom SW620, (11) Brusttumor MCF7,
(12) 293 Adenovirus-E1-transformierte menschliche embryonale
Nierenzellinie.
hTRT-Nucleinsäure wurde von cDNA mittels der Oligonucleotid
primer LT5 und LT6 amplifiziert (Tabelle 2) mit insgesamt 31
Cyclen (94°C 45 s, 60°C 45 s, 72°C 90 s). GAPDH wurde mit
tels des Primers K136 (CTCAGACACCATGGGGAAGGTGA) und K137
(ATGATCTTGAGGCTGTTGTCATA) mit insgesamt 16 Cyclen amplifi
ziert (94°C 45 s, 55°C 45 s, 72°C 90 s). hTR wurde mit den
Primern F3B (TCTAACCCTAACTGAGAAGGGCGTAG) und R3c
(GTTTGCTCTAGAATGAACGGTGGAAG) mit insgesamt 22 Cyclen ampli
fiziert (94°C 45 s, 55°C 45 s, 72°C 90 s). TP1-mRNA wurde
mit den Primern TP1.1 und TP1.2 in 28 Cyclen (die Cyclen wa
ren die gleichen wie für hTRT) amplifiziert. Die Reaktions
produkte wurden auf einem 8%igen Polyacrylamidgel aufge
trennt, mit "SYBR Green" (Molecular Probes) angefärbt und
durch Scannen auf einem "Storm 860" (Molecular Dynamics)
sichtbar gemacht. Die in Fig. 5 dargestellten Ergebnisse
zeigen, daß hTRT-mRNA-Spiegel direkt mit den Spiegeln an Te
lomerase-Aktivität in den getesteten Zellen korrelieren.
Ein vermutetes Intron wurde zuerst durch PCR-Amplifikation
menschlicher genomischer DNA, wie in diesem Beispiel be
schrieben, identifiziert und das Ergebnis wurde im Anschluß
daran durch Sequenzierung des genomischen Clons λGΦ5 (siehe
Beispiel 4) bestätigt. PCR-Amplifikation wurde mittels des
Vorwärts-Primers TCP1.57 durchgeführt, der in Kombination
mit den einzelnen reversen Primern TCP1.46, TCP1.48,
TCP1.50, TCP1.52, TCP1.54, TCP1.56 und TCP1.58 kombiniert
wurde (siehe Tabelle 2). Die Produkte von genomischer DNA
der Amplifikation mit TCP1.57/TCP1.46, TCP1.48, TCP1.50,
TCP1.52, TCP1.54 oder TCP1.56 waren etwa 100 Basenpaare län
ger als die Produkte der pGRN121-Amplifkationen. Die Ampli
fikation mit TCP1.57/TCP1.58 war bei Verwendung genomischer
DNA und pGRN121-DNA gleich. Dies zeigte, daß die genomische
DNA eine Insertion zwischen den Stellen für TCP1.58 und
TCP1.50 enthielt. Die PCR-Produkte von TCP1.57/TCP1.50 und
TCP1.57/TCP1.52 wurden ohne Subclonierung mit den Primern
TCP1.39, TCP1.57 und TCP1.49 direkt sequenziert.
Wie nachstehend gezeigt, ist die Intron-Sequenz von 104 Ba
sen (SEQ. ID. Nr. 7) (Fig. 12) in der hTRT-mRNA (in Fett
druck gezeigt) an der Verbindung, die den Basen 274 und 275
von SEQ. ID. Nr. 1 entspricht, inseriert:
"/" kennzeichnet die Spleißpunkte, die Sequenz zeigt gute
Übereinstimmungen mit den "Consensus-5'- und 3'-Spleiß
punktsequenzen, die typisch für menschliche Introns sind.
Dieses Intron enthält Motive, die charakteristisch für eine
Spaltstelle für Topoisomerase II sind und eine NFκB-Bin
dungsstelle (siehe Fig. 21). Diese Motive sind teilweise
deshalb von Interesse, da die Expression von Topoisomerase
II in den meisten Tumoren hoch reguliert ist. Topoisomerase
II bewirkt eine Relaxierung von DNA durch Schneiden und er
neutes Auffinden der DNA, wodurch die Expression bestimmter
Gene erhöht wird. Es konnte gezeigt werden, daß Inhibitoren
von Topoisomerase II als anti-Tumor-Agenzien wirken. Im
Falle von NFκB könnte dieser Transkriptionsfaktor eine Rolle
bei der Regulation von Telomerase während der terminalen
Differenzierung spielen. NFκB könnte eine Rolle spielen bei
der frühen Repression von Telomerase während der Entwicklung
und stellt somit ein weiteres Ziel für eine therapeutische
Intervention hinsichtlich der Regulierung von Telomerase-Ak
tivität in Zellen dar.
Eine menschliche genomische DNA-Bank wurde mittels PCR und
Hybridisierung gescreent, wobei ein hTRT-RNA codierende Se
quenzen enthaltender genomischer Clon gefunden wurde. Bei
der Bank handelt es sich um eine genomische Bank von
menschlichen Fibroblasten, die mittels DNA von WI38 Lungen
fibroblastenzellen hergestellt wurde (Stratagene, Katalog
#946204). In dieser Bank sind partielle Sau3AI-Fragmente in
die XhoI-Stelle des Lambda-Vektors FIXRII (Stratagene) mit
einer Insertionsgröße von 9-22 kb inseriert.
Diese genomische Bank wurde in Pools von jeweils 150 000
Phagen aufgeteilt und jeder Pool durch "nested" PCR ge
screent (äußeres Primerpaar TCP1.52 & TCP1.57; inneres Pri
merpaar TCP1.49 & TCP1.50, siehe Tabelle 1). Diese Primer
paare umspannen ein vermutetes Intron (siehe das vorstehende
Beispiel 3) in der genomischen DNA von hTRT und sie gewähr
leisten, daß das PCR-Produkt von einer genomischen Quelle
stammte und nicht von einer Verunreinigung durch den hTRT-cDNA-Clon.
Positive Pools wurden weiter aufgeteilt, bis ein
Pool von 2000 Phagen erhalten wurde. Dieser Pool wurde mit
niedriger Dichte ausplattiert und durch Hybridisierung mit
einem DNA-Fragment, das die Basenpaare 1552-2108 von SEQ.
ID. Nr. 1 umfaßt (Restriktionsstellen SphI bzw. ECoRV) ge
screent.
Zwei positive Clone wurden isoliert und erneut über "nested"
PCR wie vorstehend beschrieben gescreent. Beide Clone waren
am Rande der PCR positiv. Einer der Clone (λGΦ5) wurde mit
NotI gespalten, wobei sich eine Insertionsgröße von etwa 20
kb zeigte. Die nachfolgende Kartierung (siehe unten) ergab
eine Insertionsgröße von 15 kb und zeigte, daß der Phage GΦ5
etwa 13 kb an DNA stromaufwärts von der Startstelle der
cDNA-Sequenz enthält.
Der Phage GΦ5 wurde mittels Restriktionsenzymspaltung und
DNA-Sequenzierung kartiert. Die erhaltene Karte ist in Fig.
7 gezeigt. Die Phagen-DNA wurde mit NcoI gespalten und die
Fragmente in pBBS167 cloniert. Die erhaltenen Subclone wur
den durch PCR gescreent, um jene zu identifizieren, die Se
quenzen enthalten, die dem 5'-Bereich der hTRT-cDNA entspre
chen. Ein Subclon (pGRN140), der ein NcoI-Fragment von 9 kb
(mit der hTRT-Gensequenz und 4 bis 5 kb der lambda-Vektor-
Sequenz) enthielt, wurde partiell sequenziert, um die Orien
tierung der Insertion zu bestimmen. pGRN140 wurde zur Ent
fernung von lambda-Vektor-Sequenzen mit SalI geschnitten,
wobei pGRN144 erhalten wurde. pGRN144 wurde danach sequen
ziert. Vorläufige Ergebnisse der Sequenzierung sind in Fig.
76 gezeigt und die Ergebnisse einer weiteren Sequenzierung
sind in SEQ. ID. Nr. 6 (Fig. 21) bereitgestellt. Das 5'-Ende
der hTRT-mRNA entspricht der Base 2441 von SEQ. ID. Nr.
6 (Fig. 21). Wie in Fig. 7 gezeigt, liegen zwei Alu-Se
quenzelemente 1700 Basenpaare stromaufwärts von dem 5'-Ende
der hTRT-cDNA und diese liefern wahrscheinlich die stromauf
wärts gelegene Grenze hinsichtlich des Promotorbereichs von
hTRT. Die Sequenz besitzt auch ein Intron, das bei der Base
4173 (SEQ. ID. Nr. 6) (Fig. 21) liegt, 3' gelegen zu dem in
dem vorstehenden Beispiel 3 beschriebenen Intron.
Zusätzlich zu dem vorstehend beschriebenen genomischen Clon
werden zwei P1-Bacteriophagenclone und ein menschlicher BAC-Clon
als veranschaulichende erfindungsgemäße Ausführungsfor
men bereitgestellt. Die P1-Insertionen haben gewöhnlich eine
Länge von 75 bis 100 kb und die BAC-Insertionen üblicher
weise von mehr als 100 kb.
Die P1-Clone (DMPC-HFF#1-477(F6)-GS#15371 und DMPC-HEF#1-1103(H6)-GS#15372)
wurden durch PCR-Screenen einer menschli
chen P1-Bank erhalten, die von menschlichen Vorhaut-Fibro
blastenzellen stammte (Shepherd et al., PNAS USA 91 (1994)
2629) wobei die Primer TCP1.12 und UTR2 verwendet wurden,
die das 3'-Ende von hTRT amplifizieren. Diese Clone waren
beide negativ mit Primern, die das 5'-Ende von hTRT amplifi
zieren (d. h. es fand keine Amplifikation statt).
Der menschliche BAC-Clon (326 E 20) wurde mittels eines Hy
bridisierungs-Screenings einer menschlichen genomischen BAC-Bank
mittels eines 1143 bp SphI/XmnI-Fragments von SEQ. ID.
Nr. 1 (Basen 1552-2695) erhalten, das den FT-Motivbereich
umfaßt. Es wird davon ausgegangen, daß dieser Clon das 5'
enthält. Es wird davon ausgegangen, daß die genomischen
hTRT-Clone in diesem Beispiel das gesamte hTRT-Gen umfassen.
Das hTRT-Gen wurde auf dem Chromosom 5p durch "radiation
hybrid"-Kartierung lokalisiert (Boehnke et al., Am. J. Hum.
Genet. 49 (1991) 1174 und Walter et al., Nature Genet. 7
(1994) 22) unter Verwendung des "medium resolution Stanford
G3 panel" von 83 RH-Clonen des gesamten menschlichen Genoms
(erzeugt am Stanford Human Genome Center). Eine menschliche
Lymphoblastoid-Zellinie (Donor; rM) wurde gegen 10 000 rad
Röntgenstrahlen exponiert und dann mit nicht bestrahlten
Hamster-Rezipientenzellen (A3) fusioniert. 83 unabhängige
Hybridclone aus somatischen Zellen wurden isoliert, wobei
jeder Clon ein Fusionsereignis zwischen einer bestrahlten
Donorzelle und einer Hamster-Rezipientenzelle darstellt. Die
DNA von Tafel G3 wurde zum Ordnen von Markern in dem ge
wünschten Bereich sowie zur Etablierung der Entfernung zwi
schen diesen Markern verwendet.
Die für die RH-Kartierung verwendeten Primer waren TCP1.12
und UTR2, wobei 45 Cyclen mit Taq-Puffern von Boehringer
Mannheim und Taq-Polymerase von Perkin-Elmer verwendet wur
den, jeweils 45 Sekunden 94°C, 45 Sekunden 55°C und 45 Se
kunden 72°C. Die 83 Pools wurden unabhängig voneinander
amplifiziert und 14 (17%) waren positiv hinsichtlich hTRT
(durch Auftreten einer Bande von 346 bp). Die Amplifika
tionsergebnisse wurden dem "Stanford RH server" eingegeben,
der dann die Kartenposition 5p und den nächsten Marker, STS
D5S678 lieferte.
Durch Abfragen der "Genethon genom mapping" - web site
konnte bei der Kartierung ein YAC identifiziert werden, das
den STS-Marker D5S678 enthält: CEPH YAC 780_C_3, Größe:
390 660 kb. Dieses YAC enthielt auch Marker für das Chromo
som 17. Dieses Ergebnis zeigte an, daß sich das hTRT-Gen auf
Chromosom 5 befindet, nahe dem Telomer-Ende. In einer Reihe
von Tumoren gibt es erhöhte Kopienanzahlen für 5p. Das Kat
zenschrei-Syndrom wurde auch zu Deletionen in diesem Bereich
kartiert.
Das folgende Beispiel beschreibt ausführlich den Entwurf von
hTRT-exprimierenden bakteriellen Expressionsvektoren, mit
denen große Mengen an biologisch aktivem hTRT mit vollstän
diger Länge (SEQ. ID. Nr. 2) hergestellt werden können. Die
Erzeugung von biologisch aktivem hTRT-Protein auf diese
Weise ist von Nutzen für die Telomerase-Rekonstitutionsas
says, für die Untersuchung von Modulatoren von Telomerase-
Aktivität, für die Analyse der Aktivität von neu isolierten
Spezies von hTRT, zur Identifizierung und Isolierung von
Verbindungen, die spezifisch mit hTRT assoziieren, für die
Analyse der Aktivität einer hTRT-Proteinvariante, die, wie
vorstehend beschrieben, ortsspezifisch mutiert wurde, und
als ein Immunogen, um nur einige Beispiele zu nennen.
Um große Mengen an hTRT (SEQ. ID. Nr. 2) mit vollständiger
Länge herstellen zu können, wurde der bakterielle Expressi
onsvektor pThioHis A (Invitrogen, San Diego, CA) als Expres
sionssystem ausgewählt. Die hTRT-codierende Insertion ent
hält die Nucleotide 707 bis 4776 der hTRT-Insertion im Plas
mid pGRN121 (SEQ. ID. Nr. 1). Diese Nucleotidsequenz enthält
die vollständige codierende Sequenz des hTRT-Proteins (SEQ.
ID. Nr. 2).
Dieser erfindungsgemäße Expressionsvektor kann für induzier
bare Expressionen in Bakterien entworfen werden. Die Induk
tion der Expression kann erfolgen, um in E. coli hohe Spie
gel eines Fusionsproteins zu codieren, das aus einer spalt
baren, "HIS-tagged" Thioredoxineinheit und dem hTRT-Protein
mit vollständiger Länge zusammengesetzt ist. Die Verwendung
des Expressionssystems erfolgte im wesentlichen gemäß den
Anleitungen des Herstellers. Die Aminosäuresequenz des von
dem erfindungsgemäßen erhaltenen Vektor codierten Fusions
proteins wird nachfolgend gezeigt: (-*-) kennzeichnet eine
Spaltstelle für Enterokinase;
Dieses erfindungsgemäße Konstrukt wird für die Herstellung
von Fusionsprotein verwendet, beispielsweise um polyclonale
und monoclonale Antikörper gegen das hTRT-Protein erhalten
zu können. Fragmente von hTRT können auch für andere Zwecke
verwendet verwendet werden, beispielsweise zur Modulation
von Telomerase-Aktivität, z. B. als eine dominant-negative
Mutante oder um die Assoziierung von Telomerase mit anderen
Proteinen oder Nucleinsäuren zu verhindern.
Zur Produktion großer Mengen eines hTRT-Proteinfragments
wurde der E. coli-Expressionsvektor pGEX-2TK (Pharmacia Bio
tech, Piscataway N.J.) ausgewählt und im wesentlichen nach
den Anleitungen des Herstellers verwendet. Damit wurde ein
erfindungsgemäßes Expressionssystem hergestellt. Das erhal
tene Konstrukt enthält eine Insertion, die von den Nucleoti
den 3272 bis 4177 der hTRT-Insertion im Plasmid pGRN121
stammt. Der Vektor steuert die Expression von hohen Spiegeln
eines Fusionsproteins in E. coli, das aus der Glutathion-S-Trans
ferase-Sequenz (nachstehend unterstrichen) der Spalt
sequenz für Thrombin (doppelt unterstrichen), der Erken
nungssequenz für Herzmuskel-Proteinkinase (kursiv), durch
Clonierung eingeführte Reste (in Klammern, GSVTK) und dem
hTRT-Proteinfragment (in Fettdruck) (SEQ. ID. Nr. 38) die
nachfolgend gezeigt, zusammengesetzt ist:
Bei der Expression dieses Fusionsproteins wurden unlösliche
Aggregate gebildet. Es wurde allgemein wie vorstehend im Ab
schnitt "Reinigung von Proteinen aus Einschlußkörperchen"
behandelt. Dabei wurden induzierte Zellen in PBS (20 mM Na
triumphosphat, pH-Wert 7,4 und 150 mM NACl) suspendiert und
durch Ultraschallbehandlung aufgebrochen. NP-40 wurde bis zu
0,1% zugegeben und das Gemisch 30 Minuten bei 4°C unter
leichtem Mischen inkubiert. Das unlösliche Material wurde
durch 30minütige Zentrifugation mit 25 000 g bei 4°C gewon
nen. Das unlösliche Material wurde einmal in 4 M Harnstoff
in PBS gewaschen, durch Zentrifugation gewonnen und dann er
neut in PBS gewaschen. Es wurde geschätzt, daß das gewonnene
Pellet mehr als 75% Fusionsprotein enthielt. Dieses Mate
rial wurde in einem Vakuum schnell getrocknet, danach für
die Injektion in Mäuse und Kaninchen zur Erzeugung von Anti
körpern in einem Adjuvans suspendiert. Die Abtrennung des
rekombinanten Proteins von der Glutathion-S-Transferase-Ein
heit wird durch ortsspezifische Proteolyse mittels Thrombin
gemäß den Anleitungen des Herstellers durchgeführt.
Zur Herstellung großer Mengen eines Fragments von hTRT wurde
ein weiteres E. coli-Expressionsvektor pGEX-2TK (Pharmacia
Biotech, Piscataway N.J.)-Konstrukt hergestellt. Dieses Kon
strukt enthält eine Insertion, die von den Nucleotiden 2426
bis 3274 der hTRT-Insertion im Plasmid pGRN121 (SEQ. ID. Nr.
1) und eine Sequenz, die acht aufeinanderfolgende Histidin
reste codiert (HIS-8-Tag). Um dieses "HIS-8-TAG" zu inserie
ren, wurde der Vektor pGEX-2TK mit den hTRT-Nucleotiden 2426
bis 3274 von pGRN121 mit BamHI linearisiert. Dadurch wird
das Plasmid an der Verbindung zwischen GST-Thrombin-Herzmus-
Kelproteinase und der hTRT codierenden Sequenz geöffnet. Zu
dem linearisierten Plasmid wurde ein doppelsträngiges Oligo
nucleotid mit BamHI-kompatiblen Enden, wie dies in der nach
stehend gezeigten Sequenz zu sehen ist, ligiert, was die
Einführung von acht Histidin-Resten stromaufwärts der hTRT-Se
quenz im Leserahmen ergab.
Der Vektor steuert in E. coli die Expression von hohen Spie
geln eines Fusionsproteins, das zusammengesetzt ist aus der
Glutathion-S-Transferase-Sequenz (unterstrichen); der Spalt
sequenz für Thrombin (doppelt unterstrichen); der Erken
nungssequenz für Herzmuskel-Proteinkinase (kursiv); einem
Satz von drei und einem Satz von fünf Resten, die durch Clo
nierung eingeführt wurden (GSV und GSVTK); acht aufeinander
folgenden Histidinen (auch doppelt unterstrichen) und dem
hTRT-Proteinfragment (in Fettdruck) (SEQ. ID. Nr. 39):
Dieser Vektor kann zur Herstellung von Fusionsprotein zur
Erzeugung von polyclonalen und monoclonalen Antikörpern ge
gen ein hTRT-Protein verwendet werden. Dieses Fusionsprotein
kann außerdem dazu verwendet werden, um gegen hTRT-Peptide,
die innerhalb des Fusionsproteins enthalten sind, gerichtete
Antikörper einer Affinitätsreinigung zu unterwerten. Die Ab
trennung des rekombinanten Proteins von der Glutathion-S-Trans
ferase-Einheit kann durch ortsspezifische Proteolyse
mittels Thrombin gemäß den Anweisungen des Herstellers er
zielt werden.
Zur Herstellung großer Mengen eines hTRT-Fragments wurde ein
anderes E. coli-Expressionsvektor pGEX-2TK (Pharmacia
Biotech, Piscataway N.J.)-Konstrukt hergestellt. Dieses Vek
torkonstrukt kann zur Herstellung von Fusionsprotein für die
Erzeugung von polyclonalen und monoclonalen Antikörpern ge
gen das hTRT-Protein verwendet werden. Dieses Fusionsprotein
kann außerdem dazu verwendet werden, gegen hTRT-Peptide, die
in dem Fusionsprotein enthalten sind, gerichtete Antikörper
einer Affinitätsreinigung zu unterwerfen.
Dieses Konstrukt enthält eine Insertion, die von den Nucleo
tiden 2426 bis 3274 der hTRT-Insertion im Plasmid pGRN121
(SEQ. ID. Nr. 1) stammt, jedoch ohne das "His-8-tag". Der
Vektor steuert in E. coli die Expression von hohen Spiegeln
eines Fusionsproteins, das zusammengesetzt ist aus Gluta
thion-S-Transferase (unterstrichen), einer Spaltsequenz für
Thrombin (doppelt unterstrichen), einer Erkennungssequenz
für die Herzmuskel-Proteinkinase (kursiv), durch Clonierung
eingeführte Reste (in Klammern, GSVTK) und das hTRT-Protein
fragment (in Fettdruck) (SEQ. ID. Nr. 40):
Die Abtrennung des rekombinanten Proteins von der Gluta
thion-S-Transferase-Einheit kann durch ortsspezifische Pro
teolyse mittels Thrombin gemäß den Angaben des Herstellers
erzielt werden.
Zur Herstellung großer Mengen eines hTRT-Proteinfragments
wurde ein weiteres E. coli-Expressionsvektor pGEX-2TK
(Pharmacia Biotech, Piscataway N.J.)-Konstrukt hergestellt.
Dieses Vektorkonstrukt kann zur Herstellung von Fusionspro
tein zur Erzeugung polyclonaler und monoclonaler Antikörper
gegen ein hTRT-Protein verwendet werden. Darüber hinaus kann
dieses Fusionsprotein dazu verwendet werden, gegen hTRT-Pep
tide, die in dem Fusionsprotein enthalten sind, gerichtete
Antikörper einer Affinitätsreinigung zu unterwerfen.
Dieses Konstrukt enthält eine Insertion, die von den Nucleo
tiden 1625 bis 2458 der hTRT-Insertion im Plasmid pGRN121
(SEQ. ID. Nr. 1) stammt. Der Vektor steuert in E. coli die
Expression von hohen Spiegeln eines Fusionsproteins das zu
sammengesetzt ist aus Glutathion-S-Transferase (unterstri
chen), einer Spaltsequenz für Thrombin (doppelt unterstri
chen), einer Erkennungssequenz für Herzmuskel-Proteinkinase
(kursiv), durch Clonierung eingeführte Reste (in Klammern,
GSVTK) und dem hTRT-Proteinfragment (in Fettdruck) (SEQ. ID.
Nr. 41):
Die Abtrennung des rekombinanten Proteins von der Gluta
thion-S-Transferase-Einheit wird durch ortsgerichtete Pro
teolyse mittels Thrombin gemäß den Anweisungen des Herstel
lers erzielt.
Zur Herstellung großer Mengen eines hTRT-Proteinfragments
wurde ein weiteres E. coli-Expressionsvektor pGEX-2TK
(Pharmacia Biotech, Piscataway N.J.)-Konstrukt hergestellt.
Dieses Vektorkonstrukt kann zur Herstellung von Fusionspro
tein zur Erzeugung polyclonaler und monoclonaler Antikörper
gegen ein hTRT-Protein verwendet werden. Darüber hinaus kann
dieses Fusionsprotein dazu verwendet werden, gegen hTRT-Pep
tide, die in dem Fusionsprotein enthalten sind, gerichtete
Antikörper einer Affinitätsreinigung zu unterwerfen.
Dieses Konstrukt enthält eine Insertion, die von den Nucleo
tiden 782 bis 1636 der hTRT-Insertion im Plasmid pGRN121
(SEQ. ID. Nr. 1) stammt. Der Vektor steuert in E. coli die
Expression von hohen Spiegeln eines Fusionsproteins, das zu
sammengesetzt ist aus Glutathion-S-Transferase (unterstri
chen), einer Spaltsequenz für Thrombin (doppelt unterstri
chen), einer Erkennungssequenz für Herzmuskel-Proteinkinase
kursiv), durch Clonierung eingeführte Reste (in Klammern,
GSVTK) und einem hTRT-Proteinfragment (in Fettdruck) (SEQ.
ID. Nr. 42):
Die Abtrennung des rekombinanten Proteins von der Gluta
thion-S-Transferase-Einheit wird durch ortsspezifische Pro
teolyse mittels Thrombin gemäß den Anleitungen des Herstel
lers erzielt.
Wie bereits vorstehend beschrieben, stellt die Erfindung in
einer Ausführungsform ein hTRT bereit, das zur Erleichterung
der Clonierung in bakterielle, Säuger-, Hefe- und Insekten-
Expressionsvektoren auf ortsgerichtete Weise modifiziert ist
und keine 5'-untranslatierte hTRT-Sequenz enthält. Unter
manchen Umständen erlaubt die Minimierung der Menge an
nicht-Protein-codierender Sequenz die verbesserte Protein
herstellung (Ausbeute) und führt zu einer erhöhten mRNA-Sta
bilität. In dieser erfindungsgemäßen Ausführungsform wurde
vor der Clonierung in dem bakteriellen Expressionsvektor der
5'-nicht-codierende Bereich von hTRT entfernt.
Dies wurde durch Erzeugung einer zusätzlichen Restriktions
schnittstelle unmittelbar stromaufwärts (5') von dem Start
codon (ATG) der hTRT-codierenden Sequenz (Fig. 16) bewirkt.
Die Erzeugung einer Restriktionsschnittstelle unmittelbar 5'
zum codierenden Bereich des Proteins gestattet die effizi
ente Herstellung einer großen Anzahl von Vektoren, die Fusi
onsproteine codieren, beispielsweise Fusionsproteine, die
Markierungen und Peptid-"TAGs" enthalten zum Immunnachweis
und zur Reinigung.
In diesem Fall wurde das Oligonucleotid
5'-CCGGCCACCCCCCATATGCCGCGCGCTCCC-3', wie oben beschrieben,
zur Modifikation der hTRT-cDNA-Nucleotide 779 bis 781der
hTRT-cDNA (Fig. 16) von GCG zu CAT verwendet. Diese 3
Nucleotide sind die letzten Nucleotide vor dem ATG-Startco
don, somit führt diese Änderung nicht zur Modifikation der
Proteinsequenz. Die Sequenzänderung führt zur Erzeugung
einer einzigen NdeI-Restriktionsstelle in der hTRT-cDNA.
Einzelsträngige hTRT-DNA wurde als eine DNA-Quelle für die
ortsgerichtete Mutagenese verwendet. Das erhaltene Plasmid
wurde zur Bestätigung einer erfolgreichen Mutagenese sequen
ziert.
Diese Modifikation erlaubte die Konstruktion des nachfolgend
beschriebenen erfindungsgemäßen Plasmids mit der Bezeichnung
pT7FLhTRT. Die ortsspezifisch modifizierte hTRT-Sequenz
Hinzufügung der NdeI-Restriktionsstelle) wurde mit NdeI und
NotI gespalten, wobei ein hTRT-Fragment erzeugt wurde. Die
ses Fragment wurde danach in ein pSL3418-Plasmid cloniert,
das vorher mit NdeI und SmaI (auch ein Restriktionsenzym bei
dessen Spaltung glatte Enden entstehen) geschnitten worden
war, cloniert. pSL 3418 ist ein modifiziertes paED4-Plasmid,
In das eine FLAG-Sequenz (Immunex Corp. Seattle WA) und eine
Enterokinase-Sequenz unmittelbar stromaufwärts von der vor
stehend erwähnten NdeI-Stelle inseriert wurden. Dieses Plas
mid mit der Bezeichnung pT7FLhTR erlaubt die Expression von
hTRT mit vollständiger Länge (mit einem "Flag-Tag" an ihrem
5'-Ende) in einem E. coli Stamm, der T7-RNA-Polymerase ex
primiert.
Die Erfindung stellt auch einen Säuger-Expressionsvektor be
reit, in dem hTRT so orientiert ist, daß die hTRT-codierende
Sequenz durch den MPSV-Promotor (nachstehend beschriebene
gesteuert wird. Ein EcoRI-Restriktionsfragment von pGRN137,
das den hTRT-ORF enthält, wurde in die EcoRI-Stelle von
pBBS212 (siehe nachstehend) cloniert, wodurch der 5'-un
translatierte Bereich (5'-UTR) von hTRT entfernt wurde
pGRN137 wurde durch Ausschneiden eines SalI-Sse8387 I-Frag
ments von pGRN130 (nachstehend beschrieben), das die Kozak-
Mutation von hTRT in den SalI-SSE 8387I-Stellen von pGRN136
enthält, konstruiert, wodurch ein Säuger-Expressionsplasmid
entsteht, das hTRT (eine "Kozak-Consensus"-Sequenz enthält)
von dem MPSV-Promotor exprimiert) (pGRN136 wurde durch Aus
schneiden eines HindIII-SalI-Fragments von pGRN126 konstru
iert, das den hTRT-ORF enthält und Clonierung in die
HindIII-SalI-Stellen von pBBS242. Dadurch entsteht ein Säu
gerexpressionsplasmid, das hTRT vom MPSV-Promotor expri
miert). Dadurch wurde ein Säuger-Expressionsplasmid mit der
Bezeichnung pGRN145 erhalten, das hTRT mit einer "Kozak-Con
sensus"-Sequenz unter Verwendung des MPSV-Promotors expri
miert. Siehe auch den pGRN152-MPSV-Promotor gesteuerten Säu
ger-Expressionsvektor, der nachstehend beschrieben wird.
Wie bereits vorstehend diskutiert, stellt die Erfindung TRT-co
dierende Nucleinsäuren enthaltende Expressionsvektoren be
reit, in denen einige oder alle nicht-codierenden Sequenzen
deletiert wurden. Unter manchen Umständen erlaubt die Mini
mierung der Menge an nicht-Protein-codierender Sequenz die
verbesserte Proteinproduktion (Ausbeute) und sie erhöht die
mRNA-Stabilität. In dieser erfindungsgemäßen Ausführungsform
wurde vor der Clonierung in das bakterielle Expressionsplas
mid der 3'-nicht-translatierte Bereich von hTRT deletiert.
Das Plasmid pGRN121, das hTRT-cDNA mit vollständiger Länge,
wie vorstehend diskutiert, enthält, wurde zuerst hinsicht
lich aller APAI-Stellen deletiert. Danach folgte die Dele
tion des MscI-HincII-hTRT-Restriktionsfragments, das den 3'-UTR
enthält. Das NcoI-XbaI-Fragment, das das Stopcodon von
hTRT enthält, wurde dann in die NcoI-XbaI-Stelle von pGRN121
inseriert, wobei ein Plasmid mit der Bezeichnung pGRN124 er
halten wurde, das äquivalent zu pGRN121 ist, außer daß ihm
der 3'-UTR fehlt.
Die Erfindung stellt auch bakterielle Expressionsvektoren
bereit, die Selektionsmarker zur Verleihung eines selektier
baren Phänotyps in transformierten Zellen enthält, und Se
quenzen, die für die Beibehaltung des Vektors als Episom und
Replikation codieren, so daß die Integration in das Wirtsge
nom nicht erforderlich ist. Beispielsweise kann der Marker
die Biotikaresistenz codieren, beispielsweise Resistenz ge
gen Chloramphenicol (siehe Harrod, Nucleic Acids Res. 25
(1997), 1720-1726), Kanamycin, G418, Bleomycin und Hygromy
cin, was die Selektion der Zellen erlaubt, die mit den ge
wünschten DNA-Sequenzen transformiert wurden; siehe bei
spielsweise Blondelet-Rouault, Gene 190 (1997), 315-317 und
Mahan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995), 669-673.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wurde die hTRT
mit vollständiger Länge (SEQ. ID. Nr. 1) in einen modifi
zierten "BlueScript"-Plasmidvektor (Stratagene, San Diego,
CA) cloniert, der die Bezeichnung pBBS235 trägt, und in dem
ein Resistenzgen für das Antibiotikum Chloramphenicol inse
riert worden war. Das NotI-Fragment von pGRN124 (vorstehend
diskutiert), das den hTRT-ORF enthält, wurde in die NotI-Stel
le von pBBS235 cloniert, so daß der TRT-ORF in der umge
kehrten Richtung bezogen auf den lac-Promotor des Vektors
vorliegt. Dadurch entsteht ein Plasmid, das für die Mutage
nese von Plasmidinsertionen geeignet ist, beispielsweise den
erfindungsgemäßen TRT-Nucleinsäuren. Dieses Plasmidkonstrukt
mit der Bezeichnung pGRN125 wird in den erfindungsgemäßen
Verfahren verwendet, die Mutagenese von Telomerase-Enzym und
TRT-Protein codierenden Sequenzen beinhalten. Es kann auch
für die in vitro-Transkription von hTRT mittels des T7-Pro
motors und die in vitro-Transkription von "antisense"-hTRT
mittels des T3-Promotors verwendet werden.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform wurden
die hTRT-ORF enthaltenden NotI-Restriktionsfragmente von
pGRN124 in die NotI-Stelle von pBBS235 (nachstehend be
schrieben) subcloniert, so daß der TRT-ORF die gleiche
Orientierung hat wie der lac-Promotor des Vektors. Dadurch
entsteht ein Plasmid mit der Bezeichnung pGRN126, das zur
Expression von hTRT mit vollständiger Länge in E. coli ver
wendet werden kann. Das exprimierte Produkt enthält 29 Ami
nosäuren, die von dem Vektor pBBS235 codiert werden, woran
sich 18 Aminosäuren anschließen, die von dem 5'-UTR von hTRT
codiert werden und danach folgt das hTRT-Protein mit voll
ständiger Länge.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform wurde
zur Konvertierung des ATG-Initiationscodons von hTRT in
einem "Kozak-Consensus"-Sequenz und zur Erzeugung von EcoRI- und
BglII-Restriktionsschnittstellen zur Erleichterung der
Clonierung in die bakteriellen Expressionsvektoren eine in
vitro-Mutagenese von pGRN125 durchgeführt.
Bei dieser Mutagenese-Prozedur wurde das Oligonucleotid
5'-TGCGCACGTGGGAAGCCCTGGCagatctgAattCcaCcATGCCGCGCGCTCCCCGCTG-3'
(SEQ. ID. Nr. 43) verwendet. Dieser neue Expressionsvektor
erhielt die Bezeichnung pGRN127.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform wurde
das zweite Asp des TRT-"DD-Motivs" (vorstehend beschrieben)
zu einem Alanin umgewandelt, um ein nicht-funktionelles Te
lomerase-Enzym zu erzeugen und damit ein Mutanten-TRT-Pro
tein zur Verwendung in Experimenten mit dominant/negativen
Mutanten. hTRT (SEQ. ID. Nr. 1) wurde in vitro mutagenisiert
mit dem Oligonucleotid
5'-CGGGACGGGCTGCTCCTGCGTTTGGTGGAcGcgTTCTTGTTGGTGACACCTCACCTCACC-3'
(SEQ. ID. Nr. 44), um das Asparagin bei dem Rest 869
(Asp869) (von SEQ. ID. Nr. 2) zu einem Alanin (Ala)-Codon
umzuwandeln. Dadurch wurde auch eine MluI-Restriktions
schnittstelle erzeugt. Dieses Expressionsplasmid erhielt die
Bezeichnung pGRN130 und enthält auch die "Kozak-Consensus"-Se
quenz wie für pGRN127 beschrieben.
Die Erfindung stellt auch einen Vektor bereit, der zur Ex
pression eines "antisense"-Sequenzfragments von hTRT entwor
fen wurde. Das Plasmid pGRN126 wurde mit den Restriktions
enzymen MscI und SmaI vollständig gespalten und erneut li
giert, wobei über 95% des hTRT-ORF in Säugerzellen dele
tiert wurden. Ein SmaI-MscI-Fragment wurde während dieses
Prozesses, um wieder CAT-Aktivität zu erzeugen, erneut inse
riert. Dieses ungereinigte Plasmid wurde dann erneut mit
SalI und EcoRI geschnitten und das Initiationscodon von hTRT
enthaltende Fragment in die SalI-EcoRI-Schnittstellen von
pBBS212 (vorstehend beschrieben) inseriert. Dadurch entstand
ein "antisense"-Expressionsplasmid, das die "antisense"-Se
quenz exprimiert, die den 5'-UTR und 73 Basenpaarreste des
hTRT-ORF umspannt. Dieses Plasmid erhielt die Bezeichnung
pGRN135.
Im folgenden Beispiel wird im Detail die Konstruktion der
erfindungsgemäßen hTRT-exprimierenden Hefe-Expressionsvekto
ren zur Produktion großer Mengen an biologisch aktiver hTRT
(SEQ. ID. Nr. 2) mit vollständiger Länge dargestellt. Die
Verwendung von biologisch aktiver hTRT in vielen erfindungs
gemäßen Ausführungen ist vorstehend beschrieben.
Zur Produktion großer Mengen an biologisch aktivem hTRT
wurde der Pichia pastoris-Expressionsvektor pPICZ B
Invitrogen, San Diego, CA) ausgewählt. Die Insertion für
die hTRT-codierende Sequenz stammte von den Nucleotiden 659
bis 4801 der hTRT- Insertion im Plasmid pGRN121 (SEQ. ID. Nr.
1). Diese Nucleotidsequenz enthält die hTRT codierende Se
quenz in voller Länge (SEQ. ID. Nr. 2). Dieser Expressions
vektor wurde für die induzierbare Expression von hohen Men
gen an unmodifiziertem hTRT-Protein (SEQ. ID. Nr. 2) mit
vollständiger Länge in P. pastoris entworfen. Die Expression
wird von einem Hefepromotor gesteuert, die exprimierte Se
quenz verwendet jedoch die hTRT-Initiations- und Termina
tionscodons. Keine exogenen Codons wurden durch die Clonie
rung eingeführt. Der erhaltene Vektor pPICZ B/hTRT
(Invitrogen, San Diego, CA) wurde zur Transformation der
Hefe verwendet.
Ein zweiter erfindungsgemäßer Pichia pastoris-Expressions
vektor, der von pPICZ B (Invitrogen, San Diego, CA) abgelei
tet war, enthält auch die hTRT codierende Sequenz mit voll
ständiger Länge (SEQ. ID. Nr. 2) die von den Nucleotiden
659 bis 4801 der hTRT-Insertion im Plasmid pGRN121 (SEQ. ID.
Nr. 1) stammt. Dieser Expressionsvektor hTRT-His6/pPICZ B
codiert das hTRT-Protein (SEQ. ID. Nr. 2) mit vollständiger
Länge und fusioniert mit dem Myc-Epitop- und His6-Reporter-
Sequenzen an seinem C-Terminus. Das hTRT-Stopcodon wurde
entfernt und durch Vektorsequenzen ersetzt die das Myc-
Epitop und das His6-Reporter-"tag" sowie ein Stopcodon co
dieren. Dieser Vektor wurde zur Steuerung der induzierbaren
Expression des nachfolgenden Fusionsproteins mit hohen Spie
geln in Hefe entworfen, wobei dieses Fusionsprotein aus
hTRT-Sequenz (unterstrichen), Vektorsequenzen (in Klammern L
und NSAVD) dem Myc-Epitop (doppelt unterstrichen) und dem
His6-"tag" (kursiv) (SEQ. ID. Nr. 45) besteht:
Im folgenden Beispiel ist ausführlich die Konstruktion von
hTRT-Telomerase exprimierenden Expressionsvektoren für In
sektenzellen zur Herstellung großer Mengen an biologisch ak
tivem hTRT mit vollständiger Länge (SEQ. ID. Nr. 2 und SEQ.
ID. Nr. 4) beschrieben.
Die gewünschte Telomerase codierende Sequenz wurde in den
Baculovirus-Expressionsvektor pVL1393 (Invitrogen, San
Diego, CA) cloniert. Dieses Konstrukt wurde danach in
Spodoptera fungupeida (sf-9)-Zellen mit linearisierter DNA
des Autograph California-nucleäre-Polyhedrosis-Virus
(Baculogold-AcMNPV) cotransfiziert. Die erhaltenen rekom
binanten Baculoviren wurden im Anschluß daran plaque-gerei
nigt und gemäß veröffentlichter Protokolle expandiert.
Dieser Expressionsvektor erlaubt die Expression von hohen
Spiegeln an hTRT-Protein mit vollständiger Länge in Insek
tenzellen. Die Expression wird von einem Baculovirus-Polyhe
drin-Genpromotor gesteuert. Keine exogenen Codons wurden
durch die Clonierung eingeführt.
Zur Herstellung großer Mengen an biologisch aktivem hTRT mit
vollständiger Länge (SEQ. ID. Nr. 2) wurde der Baculovirus-
Expressionsvektor pBlueBacHis2 B (Invitrogen, San Diego, CA)
als eine Quelle für Kontrollelemente ausgewählt. Die hTRT-co
dierende Insertion bestand aus den Nucleotiden 707 bis
4776 von der hTRT- Insertion im Plasmid pGRN121 (SEQ. ID. Nr. 1),
die die hTRT codierende Sequenz mit vollständiger Länge
(SEQ. ID. Nr. 2) enthält.
Ein hTRT mit vollständiger Länge mit einem His6- und "anti-
Xpress tags" (Invitrogen) wurde ebenfalls konstruiert. Die
ser Vektor enthält eine Insertion, die aus den Nucleotiden
707 bis 4776 der hTRT-Insertion von Plasmid pGRN121 (SEQ.
ID. Nr. 1) besteht. Dieser Vektor steuert die Expression von
hohen Spiegeln an hTRT-Protein mit vollständiger Länge, das
an ein spaltbares 6-Histidin und "anti-Xpress tags" fusio
niert ist in Insektenzellen. Die Aminosäuresequenz des Fusi
onsproteins ist nachstehend gezeigt; (-*-) kennzeichnet eine
Spaltstelle für Enterokinase:
Zur Herstellung großer Mengen an biologisch aktiven hTRT mit
vollständiger Länge (SEQ. ID. Nr. 2) wurde ein zweiter Bacu
lovirus-Expressionsvektor, pBlueBac4.5 (Invitrogen, San
Diego, CA), konstruiert. Die hTRT-codierende Insertion be
stand aus den Nucleotiden 707 bis 4776 von der hTRT vom
Plasmid pGRN121 (SEQ. ID. Nr. 1). Diese Nucleotidsequenz
enthält die hTRT-codierende Sequenz mit vollständiger Länge
(SEQ. ID. Nr. 2).
Zur Herstellung großer Mengen an biologisch aktivem hTRT mit
vollständiger Länge (SEQ. ID. Nr. 2) wurde ein dritter Bacu
lovirus-Expressionsvektor pMelBacB (Invitrogen, man Diego,
CA), konstruiert. Die hTRT-codierende Insertion besteht auch
aus den Nucleotiden 707 bis 4776 von der hTRT-Insertion vom
Plasmid pGRN121 (SEQ. ID. Nr. 1). Diese Nucleotidsequenz
enthält die hTRT codierende Sequenz mit vollständiger Länge
(SEQ. ID. Nr. 2).
pMelBacB steuert die Expression von hTRT mit vollständiger
Länge (SEQ. ID. Nr. 2) in Insektenzellen in das extrazellu
läre Medium über den sekretorischen Stoffwechselweg unter
der Verwendung der Melittin-Signalsequenz. Somit werden hohe
Spiegel an hTRT mit vollständiger Länge (SEQ. ID. Nr. 2) se
zerniert. Die Melittin-Signalsequenz wird nach Ausscheidung
gespalten, ist jedoch ein Teil des Proteinpools, der intra
zellulär verbleibt. Aus diesem Grund ist sie in der folgen
den Sequenz in Klammern angegeben. Die von dem Vektor co
dierte Sequenz des Fusionsproteins (SEQ. ID. Nr. 38) ist
nachstehend gezeigt:
Die erfindungsgemäße rekombinante hTRT kann in großen Mengen
als biologisch aktive hTRT mit vollständiger Länge (SEQ. ID.
Nr. 2) in einer Vielzahl von Säuger-Zellinien hergestellt
werden. Diese biologisch aktive, in Säugern hergestellte
hTRT ist in vielen erfindungsgemäßen Ausführungsformen, wie
vorstehend diskutiert, von Nutzen.
Die Erfindung stellt auch ein Expressionssystem für die Ver
wendung in Säugerzellen zur Verfügung, das die höchstmögli
che Expression eines rekombinanten Proteins, wie beispiels
weise Telomerase, bereitstellt, ohne daß dabei die codie
rende Sequenz modifiziert werden muß (beispielsweise durch
Optimierung der Codonverwendung). In einer Ausführungsform
stellt die Erfindung ein MPSV-Säuger-Expressionssysteme be
reit, das die erfindungsgemäßen TRTs von Plasmid pBBS212 ex
primieren kann, beschrieben als pMPSV-TM in Lin J.H., Gene 47
(1994), 287-292. Die MPSV-Plasmide können entweder als sta
bile oder transiente Clone exprimiert werden.
In diesem Expressionssystem werden exogene Kontrollelemente
für die Transkription in den Vektor eingebaut, während die
hTRT codierende Sequenz (SEQ. ID. Nr. 1) selbst unverändert
bleibt. Der durch den Cytomegalovirus (CMV)-Enhancer ver
stärkte "myeloproliferative Sarkoma"-Virus (MPSV) LTR (MPSV-LTR)-Pro
motor wird für die Initiation der Transkription ein
gebaut. Dieser Promotor zeigt durchweg höhere Expressions
spiegel in Zellinien (siehe Lin, J.H (1994) a.a.O.). Eine
"Kozak-Consensus"-Sequenz kann für die Initiation der Trans
lation eingebaut werden (siehe Kozak, Mamm. Genome 7 (1996),
563-574). Alle extra vorliegenden nicht-translatierten 5'- und
3'-hTRT-Sequenzen können entfernt werden, um so sicher
zustellen, daß diese Sequenzen die Expression nicht stören,
wie bereits vorstehend diskutiert. Das die vollständige hTRT
codierende Sequenz enthaltende MPSV-Plasmid, das alle extra-
Sequenzen enthält, trägt die Bezeichnung pGRN133. Ein Kon
troll-hTRT-"antisense"-Plasmid wurde ebenfalls konstruiert.
Dieser Vektor ist identisch mit pGRN133, außer daß die TRT-In
sertion die "antisense"-Sequenz von hTRT SEQ. ID. Nr. 1
ist (dieser "antisense"-Kontrollvektor trägt die Bezeichnung
pGRN134). Das MPSV-Plasmid, das die vollständige hTRT-codie
rende Sequenz enthält, bei dem jedoch alle extra-Sequenzen
entfernt wurden, und das die "Kozak-Consensus"-Sequenz ent
hält, trägt die Bezeichnung pGRN155.
Zwei Selektionsmarker, PAC (Puromycin-N-acetyl-Transferase = Puro
mycin-Resistenz) und HygB (Hygromycin B = Hygromycin-Re
sistenz) sind für die Selektion der Plasmide nach Transfek
tion vorhanden (siehe die vorstehende Diskussion, die sich
auf selektierbare Marker bezieht). Doppelselektion unter
Verwendung von Markern auf beiden Seiten des Vektor-Polylin
kers sollte die Stabilität der hTRT codierenden Sequenz er
höhen. Eine DHFR (Dihydrofolat-Reduktase) codierende Sequenz
wird eingebaut, um die Amplifikation der Expressionskassette
nach der Erzeugung stabiler Clone zu erlauben. Weitere Maß
nahmen zur Genamplifikation können ebenfalls zur Steigerung
der Ausbeuten an rekombinanten Proteinen verwendet werden.
Die Erfindung stellt auch MPSV-Säuger-Expressionsplasmide
bereit, die hTRT-Fusionsproteine enthalten. In einer Ausfüh
rungsform ist die hTRT-Sequenz, die ihren 5'-nicht-transla
tierten Bereich beibehalten hat, mit einem Epitop-"flag"
verknüpft, beispielsweise im IBI FLAG (Intranational Bio
technologies Inc. (IBI) Kodak, New Haven, CT) und in das
MPSV-Expressionsplasmid inseriert (mit der Bezeichnung
pGRN147). Dieses spezielle Konstrukt enthält eine "Kozak"-Ini
tiationsstelle für die Translation. Das exprimierte Fusi
onsprotein kann unter Verwendung des monoclonalen Antikör
pers M-1 anti-FLAG-Octapeptid (IBI, Kodak a.a.O.) gereinigt
werden.
In einer weiteren Ausführungsform ist hTRT ortsspezifisch
verändert. Ein Aminosäurerest-Codon ist mutagenisiert, wobei
Asparaginsäure an Position 869 (SEQ. ID. Nr. 1) in ein Ala
nin überführt wurde. Diese Asp869→Ala-hTRT-Mutante, die
ihren 5'-nicht-translatierten Bereich beibehalten hat, und
in die eine "Kozak"-Sequenz eingebaut worden war, wurde in
ein MPSV-Expressionsplasmid inseriert und erhielt die Be
zeichnung pGRN146. Die Asp869→Ala-hTRT-Mutanten, wurde so
weiter modifiziert, daß sie FLAG-Sequenz, wie vorstehend be
schrieben, enthielt, und die clonierte Insertion wurde in
ein MPSV-Expressionsplasmid inseriert. Dieses Expressions
plasmid wurde mit pGRN154 bezeichnet. Insbesondere wird für
pGRN154 ein Eam1105I-Restriktionsfragment von pGRN146, das
die "Kozak"-Sequenz enthielt, die wiederum das "front end"
(5'-Segment) von hTRT enthielt, in die Eam1105I-Stellen von
pGRN147 (siehe vorstehend) cloniert, um so ein MPSV-Expres
sionsplasmid zu konstruieren, das hTRT zusammen mit einer
"Kozak"-Sequenz und der vorstehend beschriebenen D869→A-Mu
tation und das "IBI-flag" exprimieren kann.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform stellt ein
weiteres Expressionsplasmid bereit, das von pGRN146 stammt.
Das Säuger-Expressionsplasmid mit der Bezeichnung pGRN152
wurde durch Ausschneiden des EcoRI-Fragments von Plasmid
pGRN146 (das den hTRT-ORF enthält) erzeugt und zur Entfer
nung des 5'-UTR von hTRT in die EcoRI-Stelle von pBBS212
cloniert. Die hTRT ist so orientiert, daß deren Expression
durch den MPSV-Promotor kontrolliert wird. Dadurch entsteht
ein Säuger-Expressionsplasmid, das hTRT zusammen mit einer
"Kozak-Consensus"-Sequenz und der D869→A-Mutation unter Ver
wendung des MPSV-Promotors exprimiert.
Der episomale Vektor, pEBVHis (Invitrogen, an Diego, CA)
wurde so modifiziert, daß er ein hTRT (SEQ. ID. Nr. 2)-Fusi
onsprotein exprimiert, das hTRT mit einem Epitop-"tag" einer
N-terminalen Verlängerung das "Xpress"-Epitop (Invitrogen,
San Diego, CA) umfaßt, exprimiert (mit der Bezeichnung
pGRN122). Das NotI-hTRT-Fragment von pGRN121, das den offe
nen Leserahmen (ORF) von hTRT enthält, wurde in die NotI-Stel
le von pEBVHisA cloniert, so daß der hTRT-ORF in der
gleichen Orientierung ist wie der Rous Sarkom-Virus (RSV)-Pro
motor des Vektors. In dieser Orientierung war das "His6
flag" verhältnismäßig näher am N-Terminus der hTRT.
Es wurde auch ein Kontrollvektor konstruiert, der als Inser
tion die "antisense"-Sequenz von hTRT enthielt und das
Epitop-"tag" (das Kontrollplasmid wurde mit pGRN123 bezeich
net). Der Vektor wurde in 293-Zellen transfiziert und die
translatierte hTRT identifiziert und mittels eines für das
"Xpress"-Epitop spezifischen Antikörpers isoliert. pEBVHis
ist ein Hygromycin resistenter episomaler EBV-Vektor, der
das gewünschte Protein fusioniert an ein N-terminales Peptid
exprimiert. Die den Vektor tragenden Zellen werden selek
tiert und expandiert und danach werden nucleäre und cyto
plasmatische Extrakte präpariert. Diese sowohl Kontrollex
trakte werden mit anti-Xpress-Antikörper immunpräzipitiert
und die immunpräzipierten Kügelchen werden mittels eines ty
pischen Assays auf Telomerase-Aktivität getestet.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform können rekom
binante hTRT und notwendige Telomerase-Enzymkomplex-Bestand
teile in normalen dipoliden sterblichen Zellen exprimiert
werden, um so deren direkte Immortalisierung zu erreichen
oder deren Immortalisierung zu erleichtern. Dies würde einem
erlauben, diploide unsterbliche Zellen zu erhalten, mit
einem ansonsten normalen Phänotyp und Karyotyp. Wie bereits
vorstehend diskutiert, hat diese Verwendung von Telomerase
eine enorme kommerzielle Bedeutung.
"Sense"-hTRT (Fig. 16) und "antisense"-hTRT (SEQ. ID. Nr.
45) wurden in einem CMV-Vektor cloniert. Diese Vektoren wur
den gereinigt und in zwei Clone von normalen sterblichen di
ploiden menschlichen Zellen transfiziert. Die menschlichen
Clone waren die frisch passagierten diploiden menschlichen
Zellstämme BJ und IMR90.
Die Analyse von Telomerase-Aktivität mittels eines TRAP-As
says (mittels des "TRAPeze" Kit (Oncor, Inc., Gaithersburg,
MD)) ergab, daß bei Transfektion mit "sense"-hTRT sowohl in
dem Zellstamm BJ als auch IMR90 Telomerase-Aktivität erzeugt
wurde, jedoch nicht bei Transfektion mit "antisense"-hTRT.
Unter Verwendung des gleichen hTRT-"sense"-Konstrukts, das
in die CMV-Vektoren cloniert war, die bei den vorstehend be
schriebenen Studien mit diploiden menschlichen BJ- und
IMR90-Zellstämmen verwendet wurden, wurde die immortali
sierte SW13 ALT-"pathway"-Zellinie (eine mit SV40-Antigen
immortalisierte IMR90-Zelle) transient transfiziert. Mittels
eines TRAP-Assays (TRAPeze, Oncor, Inc., Gaithersburg, MD)
konnte gezeigt werden, daß Telomerase-Aktivität mit dem
"sense"-Konstrukt in transfizierten Zellen erzeugt wurde.
Die Erfindung stellt Vektoren bereit, die manipuliert werden
können, um so die Expression der erfindungsgemäßen TRTs,
beispielsweise hTRT, induzieren oder reprimieren zu können.
Beispielsweise wurde hTRT (SEQ. ID. Nr. 1) in das Ecdyson-in
duzierbare Expressionssystem von Invitrogen (San Diego, CA)
und die "Tet-On- and Tet-Off"-Tetracyclin-regulierten
Systeme von Clontech Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA) clo
niert. Solche induzierbaren Expressionssysteme werden für
solche erfindungsgemäßen Verfahren bereitgestellt, bei denen
es wichtig ist, den Spiegel oder die Rate der Transkription
von transfizierter TRT kontrollieren zu können. Beispiels
weise stellt die Erfindung Zellinien bereit, die mittels der
Expression von hTRT immortalisiert sind. Solche Zellen kön
nen durch Hemmung der hTRT-Expression durch den Vektor mit
tels dessen Kontrollelementen für die Transkription, bei
spielsweise dem "Tet-Off"-System "sterblich" gemacht werden.
Die Erfindung stellt auch Verfahren bereit, bei denen TRT
lediglich transient exprimiert wird, um so die konstitutive
Expression von hTRT zu vermeiden, was zu einer unerwünschten
"Immortalisierung" der transfizierten Zellen, wie bereits
vorstehend diskutiert, führen könnte.
Das Ecdyson-induzierbare Säuger-Expressionssystem wurde hin
sichtlich der Möglichkeit der regulierten Expression des ge
wünschten Gens in Säugerzellen entworfen. Das System ist
durch seinen fest regulierten Mechanismus gekennzeichnet,
der in Säugerzellen praktisch keine Basaltranskription ge
stattet und eine mehr als 200fache Induzierbarkeit auf
weist. Das Expressionssystem basiert auf dem heterodimären
Ecdyson-Rezeptor von Drosophila. Bei dem Ecdyson-induzierba
ren Expressionssystem wird ein Analoges des Steroidhormons
Ecdyson, Muristeron A zur Aktivierung der Expression von
hTRT über einen heterodimären nucleären Rezeptor verwendet.
Es wurde von Expressionsspiegeln berichtet, die mehr als
200fach über den Basisspiegeln lagen, wobei keine Auswir
kung auf die Physiologie der Säugerzelle auftrat (No,
"Ecdysone-Inducible Gene Expression in Mammalian Cells and
Transgenic Mice", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996),
3346-3351). Nach Bindung von Ecdyson oder Muristeron, einem
Analogen von Ecdyson, aktiviert der Rezeptor einen auf
Ecdyson ansprechenden Promotor, was zur kontrollierten Ex
pression des gewünschten Gens führt. In dem Ecdyson-induzier
baren Säuger-Expressionssystem werden beide Monomere des he
terodimären Rezeptors konstitutiv von demselben Vektor
pVgRXR exprimiert. Der auf Ecdyson ansprechende Promotor,
der letztlich die Expression des gewünschten Gens steuert,
ist auf einem zweiten Vektor pIND lokalisiert, der die
Transkription des gewünschten Gens steuert.
hTRT wird in den Vektor pIND (Clontech Laboratories, Inc.,
Palo Alto, CA) cloniert, der 5 modifizierte auf Ecdyson an
sprechende Elemente (E/GREs) stromaufwärts eines minimalen
Hitzeschock-Promotors enthält und die Mehrfach-Clonierungs
stelle. Mit diesem Konstrukt werden danach Zellinien trans
fiziert, die vorher so verändert wurden, daß sie den
Ecdyson-Rezeptor stabil exprimieren. Nach der Transfektion
werden die Zellen zur Induktion intrazellulärer Expression
von pIND mit Muristeron A behandelt.
Die "Tet-on and Tet-off"-Expressionssysteme (Clontech, Palo
Alto, CA) erlauben den Zugang zu den regulierten Gen-Expres
sionssystemen mit einer Expression auf hohem Niveau, die von
Gossen "Tight control of gene expression in mammalian cells
by tetracycline responsive promoters", Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 89 (1992), 5547-5551, hinsichtlich des "Tet-Off"-Trans
kriptions-Repressionssystems beschrieben wurden, siehe
auch Gossen, "Transcriptional activation by tetracycline in
mammalian cells", Science 268 (1995), 1766-1769 hinsichtlich
des "Tet-On"-induzierbaren Transkriptionssystems. In "Tet-
Off"-transformierten Zellinien wird die Genexpression ange
schaltet, wenn Tetracyclin (Tc) oder Doxycyclin ("Dox", ein
Tc-Derivat) von dem Kulturmedium entfernt werden. Im Gegen
satz dazu wird in "Tet-On"-Zellinien die Expression durch
die Zugabe von Tc oder "Dox" zu dem Medium angeschaltet.
Beide Systeme erlauben die festregulierte Expression clo
nierter Gene als Antwort auf unterschiedliche Konzentratio
nen von Tc oder "Dox".
Bei diesem System wird "pTRE" als ein "Antwort"-Plasmid ver
wendet, das zur Expression eines gewünschten Gens verwendet
werden kann. pTRE enthält eine Mehrfachclonierungsstelle
(MCS) unmittelbar stromabwärts des auf Tet ansprechenden
PhCMV*-1-Promotors. Gewünschte cDNAs oder Gene, die in eine
der Stellen in der MCS inseriert wurden, sprechen auf die
regulatorischen Proteine tTA und rtTA in den "Tet-Off"- bzw.
"Tet-On"-Systemen an. PhCMV*-1 enthält das auf Tet anspre
chende Element (TRE), das aus sieben Kopien der tet-Opera
torsequenz mit 42-bp (tetO) besteht. Das TRE-Element ist un
mittelbar stromaufwärts des minimalen CMV-Promotors
(PminCMV), dem der Enhancer fehlt, der Teil des vollständi
gen CMV-Promotors in den pTet-Plasmiden ist. Als Konsequenz
ist PhCMV*-1 bei einem Fehlen der Bindung von regulatori
schen Proteinen an die tetO-Sequenzen abgeschaltet. Die clo
nierte Insertion muß ein Initiationscodon besitzen. In eini
gen Fällen kann die Zugabe einer "Kozak-Consensus"-Riboso
menbindungsstelle die Expressionsspiegel verbessern. Es wur
den jedoch viele cDNAs in Tet-Systemen effizient exprimiert
ohne die Zugabe einer "Kozak"-Sequenz. "pTRE-Gen X"-Plasmide
werden mit pTK-Hyg cotransfiziert, was die Selektion stabi
ler Transfektanten erlaubt.
Die Etablierung eines "Tet-Off"- oder "Tet-On"-Expressions
systems erfordert im allgemeinen zwei aufeinanderfolgende
stabile Transfektionen, um so eine "doppelstabile" Zellinie
zu erzeugen, die integrierte Kopien von Genen enthält, die
das geeignete regulatorische Protein und TRT unter der Kon
trolle eines auf tet ansprechenden Elements (TRE) enthalten.
Bei der ersten Transfektion wird ein geeignetes regulatori
sches Protein in die Zellinie der Wahl durch Transfektion
eines "Regulator-Plasmids", beispielsweise eines "pTet-Off"- oder
"pTet-On"-Vektors, das die geeigneten regulatorischen
Proteine exprimiert, eingeführt. Die in das in das pTRE
"Antwortplasmid" clonierte hTRT wird danach in der zweiten
Transfektion eingeführt, um so die doppelstabile "Tet-Off"- oder
"Tet-On"-Zellinie zu erzeugen. Beide Systeme ergeben
eine sehr genaue ein/aus-Kontrolle der Genexpression, eine
regulierte dosisabhängige Induktion und hohe absolute Spie
gel der Genexpression.
Das pGRN155-Plasmidkonstrukt wurde für die transiente Ex
pression von hTRT-cDNA in Säugerzellen entworfen. Eine
"Kozak-Consensus"-Sequenz wird an dem 5'-Ende der hTRT-Se
quenz inseriert. Die hTRT-Insertion enthält keine 3'- oder
5'-nicht-translatierten Sequenzen (UTR). Die hTRT-cDNA wird
in die EcoRI-Stelle von p91023(B) inseriert (Wong, Science
228 (1985), 810-815). Die hTRT-Insertion befindet sich in
derselben Orientierung wie der offene Leserahmen (ORF) von
DHFR. Dadurch ist der Expressionsvektor für eine transiente
Expression von besonderem Nutzen.
pGRN155 enthält den SV40-Replikationsstartpunkt und
-Enhancer unmittelbar stromaufwärts eines Adenovirus-Promo
tors, ein Gen für Tetracyclinresistenz, einen E. coli-Repli
kationsstartpunkt und einen VAI- und VAII-Genbereich von
Adenovirus. Diese Expressionskassette enthält in der folgen
den Reihenfolge: den späten Hauptpromotor von Adenovirus;
den dreiseitigen Leader von Adenovirus; ein Hybridintron,
das aus einer 5'-Spleißstelle vom ersten Exon des dreiseiti
gen Leaders und einer 3'-Spleißstelle des Immunglobulingens
der Maus besteht; die hTRT-cDNA; die Maus-DHFR-codierende
Sequenz und das SV40-Polyadenylierungssignal.
Jetzt wurde beschrieben, daß der dreiseitige Leader von
Adenovirus und die VA-RNAs die Effizienz, mit der poly
cistronische mRNAs translatiert werden, erhöht. Es wurde
auch berichtet, daß die DHFR-Sequenz die Stabilität von Hy
brid-mRNA verstärkt. Die DHFR-Sequenz kann auch einen Marker
zur Selektion und Amplifikation von Vektorsequenzen liefern
(siehe Logan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 3655;
Kaufman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985), 689 und
Kaufman (1988) persönliche Mitteilung, Focus (Life
Technologies, Inc.), Bd. 10 Nr. 3).
Für Zwecke der Veranschaulichung wird die folgende Liste von
Expressionsplasmiden bereitgestellt.
Das EcoRI-Fragment des lambda-Clons 25-1.1.6, das die ge
samte das hTRT-Protein codierende cDNA enthält, inseriert in
die EcoRI-Stelle von pBluescriptIISK+, so daß das 5'-Ende
der cDNA in der Nähe des T7-Promotors im Vektor ist. Der in
diesem Vektor verwendete selektierbare Marker ist Ampicil
lin.
Das NotI-Fragment von pGRN121, das die den hTRT-ORF (offenen
Leserahmen) codierende Sequenz enthält, inseriert in die
NotI-Stelle von pEBVHisA, so daß die codierende Sequenz mit
dem RSV-Promotor funktionell verknüpft ist. Dieses Plasmid
exprimiert ein Fusionsprotein, das aus einem mit dem N-Ter
minus des hTRT-Proteins fusionierten "His6-flag" zusammenge
setzt ist. Dar verwendbare Marker, der mit diesem Vektor
verwendet wird, ist Ampicillin oder Hygromycin.
Das NotI-Fragment von pGRN121, das die den hTRT-ORF (offener
Leserahmen) codierende Sequenz enthält, inseriert in die
NotI-Stelle von pEBVHisA, so daß die codierende Sequenz im
Vergleich zu dem RSV-Promotor in der entgegengesetzten Rich
tung orientiert ist, so daß "antisense"-hTRT exprimiert
wird.
Alle APAI-Stellen in pGRN121 deletiert und danach erfolgte
die Deletion des den 3'-UTR ("untranslatierten Bereich")
enthaltenden MscI-HincII-Fragments. Das das Stopcodon der
hTRT codierenden Sequenz enthaltende Nco-XbaI-Fragment wurde
danach in die Nco-XbaI-Stellen von pGRN121 inseriert, wo
durch ein Plasmid entstand, das äquivalent zu pGRN121 ist,
außer daß ihm der 3'-UTR fehlt. Dieses Plasmid kann vorzugs
weise für gesteigerte Expressionsspiegel in einigen Zellen
verwendet werden.
Das die hTRT codierende Sequenz enthaltende NotI-Fragment
von pGRN124 inseriert in die NotI-Stelle von pBBS235, so daß
der offene Leserahmen im Vergleich zu dem lac-Promotor in
der gegenläufigen Orientierung ist. Der nachweisbare Marker,
der mit diesem Vektor verwendet wird, ist Chloramphenicol.
Das die hTRT codierende Sequenz enthaltende NotI-Fragment
von pGRN124, inseriert in die NotI-Stelle von pBBS235, so
daß die hTRT codierende Sequenz in der gleichen Orientierung
wie der lac-Promotor inseriert ist.
Das Oligonucleotid 5'-TGCGCACGTGGGAAGCCCTGGCagatctgAattCCaCcATGCCGcGCGCTCCCCGCTG-3'
wurde für die in vitro-Mutagenese von pGRN125 zur Um
wandlung des Initiationscodons ATG der hTRT codierenden Se
quenz in eine "Kozak-Consensus"-Sequenz verwendet und zur
Erzeugung von EcoRI- und BglII-Stellen für die Clonierung.
COD2866 wurde auch zur Umwandlung von AmpS zu AmpR (Ampicil
lin-Resistenz) verwendet und COD1941 wurde zur Umwandlung
von CatR (Chloramphenicol-Resistenz, zu CatS (Chlorampheni
col-Empfindlichkeit) umgewandelt.
Das Oligonucleotid 5'-
TGCGCACGTGGGAAGCCCTGGCagatctgAattCCaCcATDCCGCGCGCTCCCCGCTG-3'
wurde für die in vitro-Mutagenese verwendet, um so das
Initiationscodon ATG von hTRT in einem "Kozak-Consensus"-Se
quenz umzuwandeln und EcoRI und BglII-Stellen für die Clo
nierung zu erzeugen. Es wurde auch das Oligonucleotid 5'-
CTGCCCTCAGACTTCAAGACCATCCTGGACTACAAGGACGACGATGACAAATGAATTCAGATCTGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTCCAGC-3'
zur Insertion des "IBI Flag" (International Biotechnolgies
Inc. (IBI) Kodak, New Haven, CT) am C-Terminus verwendet und
zur Erzeugung von EcoRI- und BglII-Stellen für die Clonie
rung. COD2866 wurde auch zur Umwandlung von AmpS zu AmpR
verwendet und COD1941 zur Umwandlung von CatR zu CatS.
Das Oligonucleotid 5'-
CGGGACGGGCTGCTCCTGCGTTTGGTGGAcGcgTTCTTGTTGGTGACACCTCACCTCACC-3'
wurde zur in vitro-Mutagenese zur Umwandlung von
Asp869 in ein Ala-Codon verwendet (d. h. das zweite Asp des
DD-Motivs wurde für dominant/negative Experimente in ein
Alanin umgewandelt). Dadurch wurde auch eine MluI-Stelle er
zeugt. Auch das Oligonucleotid 5'-
CTGCCCTCAGACTTCAAGACCATCCTGGACTACAAGGACGACGATGACAAATGAATTCAGATCTGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTCCAOC-3'
wurde zur Insertion des "IBI Flag" (IBI, New Haven, CT) am
C-Terminus verwendet und zur Erzeugung von EcoRI- und BglII-Stel
len für die Clonierung. Auch COD2866 wurde zur Umwand
lung von AmpS zu AmpR verwendet und COD1941 zur Umwandlung
von CatR zu CatS.
Das Oligonucleotid 5'-
CGGGACGGGCTGCTCCTGCGTTTGGTGGAcGcgTTCTTGTTGGTGACACCTCACCTCACC-3'
wurde bei einer in vitro-Mutagenese zur Umwand
lung des Asp869-Codons in ein Ala-Codon verwendet (d. h. das
zweite Asp des DD-Motivs wurde zur Erzeugung einer domi
nant/negativen Proteinvariante in ein Alanin umgewandelt).
Dadurch wurde auch eine MluI-Stelle erzeugt. Auch das Oligo
nucleotid 5'-
TGCGCACGTGGGAAGCCCTGGCagatctgAattCCaCcATGCCGCGCGCTCCCCGCTG-3'
wurde bei einer in vitro-Mutagenese zur Umwandlung des
Initiationscodons ATG der hTRT-codierenden Sequenz in eine
"Kozak-Consensus"-Sequenz verwendet und zur Erzeugung von
EcoRI und BglII-Stellen für die Clonierung. Auch COD2866
wurde zur Umwandlung von AmpS zu AmpR (Ampicillin-Resistenz)
verwendet und COD1941 zur Umwandlung von CatR (Chlorampheni
col-Resistenz) zu CatS (Chloramphenicol-Empfindlichkeit).
Das EcoRI-Fragment von pGRN128, das die hTRT-ORF mit einer
"Kozak"-Sequenz und "IBI Flag" (IBI, New Haven, CT)-Mutatio
nen enthält, inseriert in die EcoRI-Stelle von pBBS212, so
daß der hTRT-ORF von dem MPSV-Promotor exprimiert wird.
Das EcoRI-Fragment von pGRN128, das den hTRT-ORF mit einer
"Kozak"-Sequenz und "IBI Flag" (IBI, New Haven, CT)-Mutatio
nen enthält, inseriert in die EcoRI-Stelle von pBBS212, so
daß die "antisense"-Sequenz des hTRT-ORF vom MPSV-Promotor
exprimiert wird.
Das EcoRI-Fragment von pGRN121, das die hTRT-codierende Se
quenz enthält, inseriert in die EcoRI-Stelle von pBBS212, so
daß das hTRT-Protein unter der Kontrolle des MPSV-Promotors
exprimiert wird.
Das EcoRI-Fragment von pGRN121, das die hTRT-codierende Se
quenz enthält, inseriert in die EcoRI-Stelle von pBBS212, so
daß die "antisense"-Sequenz der hTRT codierenden Sequenz
unter der Kontrolle des MPSV-Promotors exprimiert wird. Die
mit diesem Vektor verwendeten selektierbaren Marker sind
Chlor/HygB/PAC.
pGRN126 wurde vollständig mit MscI und SmaI geschnitten und
zur Deletion von mehr als 95% der inserierten hTRT codie
renden Sequenz erneut ligiert. Ein SmaI-MscI-Fragment wurde
während dieses Prozesses erneut inseriert, um so für die Se
lektion die Cat-Aktivität wieder zu erzeugen. Dieses un
gereinigte Plasmid wurde dann erneut mit SalI und EcoRI ge
schnitten und das das Initiationscodon der hTRT codierenden
Sequenz enthaltende Fragment in die SalI-EcoRI-Stellen von
pBBS212 inseriert. Danach entstand ein "antisense"-Expressi
onsplasmid, das die "antisense"-Sequenz des 5'-UTR und von
73 Basen der codierenden Sequenz exprimiert. Die mit diesem
Vektor verwendbaren selektierbaren Marker sind
Chlor/HygB/PAC.
Das HindIII-SalI-Fragment von pGRN126, das die hTRT codie
rende Sequenz enthält, inseriert in die HindIII-SalI-Stellen
von pBBS242.
Das SalI-Sse8387I-Fragment von pGRN130, das die "Kozak"-Se
quenz enthält, inseriert in die SalI-Sse8387I-Stellen von
pGRN136.
Das EcoRI-Fragment von pGRN124, das hTRT ohne den 3'-UTR
enthält, inseriert in die EcoRI-Stelle von pEGFP-C2, so daß
die Orientierung von hTRT dieselbe ist wie für die EGFP-Do
mäne.
Das Oligonucleotid 5'-
CTGCCCTCAGACTTCAAGACCATCCTGGACTACAAGGACGACGATGACAAATGAATTCAGATCTGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTCCAGC-3'
wurde zur Insertion des "IBI Flag" (IBT, New Haven, CT) am
Terminus von hTRT in pGRN125 mittels in-vitro-Mutagenese
verwendet und zur Erzeugung von EcoRI- und BglII-Stellen für
die Clonierung. Auch COD2866 wurde zur Umwandlung von AmpS
zu AmpR (Ampicillin-Resistenz) verwendet und COD1941 zur Um
wandlung von CatR (Chloramphenicol-Resistenz) zu CatS
(Chloramphenicol-Empfindlichkeit).
Das NcoI-Fragment, das die stromaufwärts gelegene Sequenz
von genomischer hTRT und das erste Intron von hTRT von
lambdaG55 enthält, inseriert in die NcoI-Stelle von pBBS167.
Das Fragment ist so orientiert, daß hTRT sich in derselben
Richtung befindet wie der lac-Promotor.
Das NcoI-Fragment, das die stromaufwärts gelegenen Sequenzen
der genomischen hTRT und das erste Intron von hTRT von
lambdaG55 enthält, inseriert in die NcoI-Stelle von pBBS167.
Dieses Fragment ist so orientiert, daß hTRT im Vergleich zu
dem lac-Promotor in der gegenläufigen Richtung ist.
Das NotI-Fragment vom lambdaGΦ5, das die vollständige genomi
sche ∼15 kbp-Insertion, einschließlich des hTRT-Gen
promotorbereichs enthält, wurde in die NotI-Stelle von
Plasmid pBBS185 inseriert. Das Fragment ist so orientiert,
daß der hTRT-ORF sich in einer zu dem lac-Promotor gegen
sätzlichen Orientierung befindet.
Das NotI-Fragment vom lambdaGΦ5, das die vollständige genomi
sche ∼15 kbp-Insertion, einschließlich des hTRT-Gen
promotorbereichs enthält, wurde in die NotI-Stelle von
Plasmid pBBS185 inseriert. Das Fragment ist so orientiert,
daß der hTRT-ORF sich in einer zu dem lac-Promotor selben
Orientierung befindet.
SalI-Deletion von pGRN140 zur Entfernung von lambda-Sequen
zen.
Dieser Vektor wurde zur Expression von hTRT-Sequenzen in
Säugerzellen konstruiert. Das EcoRI-Fragment von pGRN137,
das die hTRT-codierende Sequenz enthält, inseriert in die
EcoRI-Stelle von pBBS212 zur Entfernung des Anteils der Se
quenz, der dem 5'-UTR von hTRT-mRNA entspricht. Die hTRT co
dierende Sequenz ist so orientiert, daß sie unter der Kon
trolle des MPSV-Promotors exprimiert wird. Die mit diesem
Vektor verwendeten selektierbaren Marker sind
Chlor/HygB/PAC.
Dieser Vektor wurde für die Expression von hTRT-Sequenzen in
Säugerzellen konstruiert. Das Sse8387I-NotI-Fragment von
pGRN130, das die D869A-Mutation von hTRT enthält, inseriert
in die Sse8387I-NotI-Stellen von pGRN137. Die mit diesem
Vektor verwendeten selektierbaren Marker sind Ampicil
lin/HygB/PAC.
Das Sse8387I-NotI-Fragment von pGRN139, das das "IBI Flag"
(IBI, New Haven, CT) enthält, inseriert in die Sse8387I-
NotI-Stellen von pGRN137.
Das BglII-Eco47III-Fragment von pGRN144, das den Promotorbe
reich von hTRT enthält, inseriert in BglII-NruI-Stellen von
pSEAP2, wobei ein hTRT-Promotor/Reporter-Konstrukt entstand.
Dieser Vektor ist ein Zwischenvektor für die Konstruktion
eines Expressionsvektors für ein hTRT-Fusionsprotein. Das
mutagene Oligonucleotid
3' wurde zur Anfügung einer Csp45I-Stelle an den C-Terminus
von hTRT durch in vitro-Mutagenese von pGRN125 verwendet.
Das "Stop"-Codon von hTRT wurde deletiert und gegen eine
Csp45I-Stelle ausgetauscht.
Der mit diesem Vektor verwendete selektierbare Marker ist
Ampicillin.
Das GblII-FspI-Fragment von pGRN144, das den Promotorbereich
von hTRT enthält, inseriert in die BglII-NruI-Stellen von
pSEAP2, wodurch ein hTRT-Promotor/Reporter-Konstrukt ent
stand.
Dieser Vektor wurde zur Expression von hTRT-Sequenzen in
Säugerzellen konstruiert. Das EcoRI-Fragment von pGRN147,
das die hTRT codierende Sequenz enthält, inseriert in die
EcoRI-Stelle von pBBS212, um so den Anteil der Sequenz zu
entfernen, der dem 5'-UTR der hTRT-mRNA entspricht. Die hTRT
codierende Sequenz ist so orientiert, daß sie unter der Kon
trolle des MPSV-Promotors exprimiert wird. Die mit diesem
Vektor verwendeten Marker sind Chlor/HygB/PAC.
Das EcoRI-Fragment von pGRN146, das die hTRT codierende Se
quenz enthält, inseriert in die EcoRI-Stelle von pBBS212 zur
Entfernung des Anteils der Sequenz, der dem 5'-UTR von hTRT
entspricht. Die hTRT codierende Sequenz ist so orientiert,
daß sie unter der Kontrolle des MPSV-Promotors exprimiert
wird.
Das StyI-Fragment von pGRN130, das die D869→A-Mutation von
hTRT enthält (eine hTRT-Variante codierende Sequenz) wurde
in die StyI-Stellen von pGRN158 inseriert, wodurch ein Plas
mid erhalten wurde, das die hTRT codierende Sequenz mit
einer "Kozak-Consensus"-Sequenz an seinem 5'-Ende, eine "IBI
FLAG"-Sequenz an seinem 3'-Ende der den C-Terminus codie
rende Bereich und die D869→A-Mutation enthält.
Das das hTRT-Gen enthaltende EcoRI-Fragment von pGRN153,
wurde in die EcoRI-Stelle von Plasmid pBS212 so inseriert,
daß der hTRT-ORF sich in derselben Orientierung befindet wie
der MPSV-Promotor. Dadurch entsteht ein MPSV-gesteuertes Ex
pressionsplasmid, das das hTRT-Protein mit einer "Kozak-Con
sensus"-Sequenz an seinem aminoterminalen Ende eine "IBI
FLAG" an seinem C-Terminus und die D869→A-Mutation expri
miert.
Dieser Vektor wurde zur Expression von hTRT-Sequenzen in
Säugerzellen konstruiert. Die Insertion enthielt cDNA von
hTRT in vollständiger Länge ohne 5'- und 3'-UTR und "Kozak"-Se
quenzen. Das EcoRI-Fragment von pGRN145, das die hTRT-cDNA
mit der "Kozak-Consensus"-Sequenz jedoch keine 3'- oder 5'-UTR
enthält, wurde in die EcoRI-Stelle von p91023(B) inse
riert, so daß das hTRT in derselben Orientierung ist wie der
DHFR-ORF. Dadurch entsteht ein Expressionsvektor für die
transiente Expression von hTRT. Der mit diesem Vektor ver
wendete selektierbare Marker ist Tetracyclin.
Dieser Vektor wurde zur Expression von hTRT-Sequenzen in
Säugerzellen konstruiert. Das EcoRI-Fragment von pGRN146,
das die D869A-Mutation der hTRT-cDNA mit der "Kozak-Consen
sus"-Sequenz ohne 3'- oder 5'-UTR enthält, inseriert in die
EcoRI-Stelle von p91023(B), so daß hTRT in der gleichen Ori
entierung ist wie der DHFR-ORF. Dadurch entsteht ein Expres
sionsvektor für die transiente Expression von hTRT. Die In
sertion enthielt cDNA von hTRT mit vollständiger Länge ohne
5'- und 3'-UTR, D869A und "Kozak"-Sequenzen. Der mit diesem
Vektor verwendete selektierbare Marker ist Tetracyclin.
Dieser Vektor wurde für die Expression von hTRT-Sequenzen in
Säugerzellen konstruiert. Das EcoRI-Fragment von pGRN147,
das die hTRT-cDNA mit dem "Kodak flag" am C-Terminus ent
hält, und die "Kozak-Consensus"-Sequenz ohne 3'- oder
5'-UTR, inseriert in die EcoRI-Stelle von p91023(B), so daß
hTRT in der gleichen Orientierung ist wie der DHFR-ORF. Da
durch entsteht ein Expressionsvektor für die transiente Ex
pression von hTRT. Die Insertion enthielt cDNA von hTRT mit
vollständiger Länge ohne 5'- und 3'-UTR eine "FLAG"-Sequenz
(Immunex Corp., Seattle, WA) und "Kozak"-Sequenzen. Der mit
diesem Vektor verwendete selektierbare Marker ist Tetra
cyclin.
Dieser Vektor wurde für die Expression und Mutagenese von
TRT-Sequenzen in E. coli konstruiert. Das EcoRI-Fragment von
pGRN151, das den hTRT-ORF enthält, inseriert in die EcoRI-Stel
le von pBBS183, so daß der hTRT-ORF im Vergleich zu dem
lac-Promotor in der gegenläufigen Orientierung vorliegt. Die
Insertion enthielt cDNA von hTRT mit vollständiger Länge
ohne 5'- und 3'-UTR, eine "FLAG"-Sequenz (Immunex Corp.,
Seattle, WA) und "Kozak"-Sequenzen. Die codierende Sequenz
wird von einem T7-Promotor gesteuert. Der mit diesem Vektor
verwendete selektierbare Marker ist Ampicillin.
Dieser Vektor wurde zur Expression und Mutagenese von TRT-Se
quenzen in E. coli konstruiert. Das HeI-KpnI-Fragment von
pGRN138, das die Fusion von EGFP an hTRT enthält, inseriert
in die XbaI-KpnI-Stellen von pBlueScriptIIKS+. Dies ergibt
einen T7-Expressionsvektor für das Fusionsprotein (die Co
dierende Sequenz wird von einem T7-Promotor gesteuert)
Diese Insertion enthält hTRT-cDNA mit vollständiger Länge
ohne den 3'-UTR als ein Fusionsprotein mit EGFP. Der mit
diesem Vektor verwendete selektive Marker ist Ampicillin.
Dieser Vektor wurde zur Expression von "antisense"-hTR-Se
quenzen in Säugerzellen konstruiert. Die codierende Sequenz
wird von einem MPSV-Promotor gesteuert. Das XhoI-NsiI-Frag
ment von pGRN90, das hTR mit vollständiger Länge enthält in
seriert in die SalI-SSE/83871-Stellen von pBBS295. Dies er
gibt einen transienten stabilen Vektor, der hTR in der "an
tisense"-Orientierung exprimiert. Ein GPT-Marker wurde in
den Vektor eingebaut. Die mit diesem Vektor verwendeten se
lektierbaren Marker sind Chlor/gpt/PAC.
Dieser Vektor wurde zur Expression von "sense"-HT-Sequenzen
in Säugerzellen konstruiert. Ein XhoI-NsiI-Fragment von
pGRN89, das hTR mit vollständiger Länge enthält, inseriert
in die SalI-SSE8387I-Stellen von pBBS295. Dies ergibt einen
transienten/stabilen Vektor, der hTR in der "sense"-Orien
tierung exprimiert. Die codierende Sequenz wird von einem
MPSV-Promotor gesteuert. Ein GPT-Marker wurde in den Vektor
eingebaut. Die mit diesem Vektor verwendeten Marker sind
Chlor/gpt/PAC.
Ein XhoI-NsiI-Fragment von pGRN87, das hTR mit vollständiger
Länge enthält, inseriert in die SalI-SSE8387I-Stellen von
pBBS295. Dies ergibt einen transienten/stabilen Vektor, der
verkürzte hTR (von Position +108 bis +435) in der "sense"-Orien
tierung exprimiert.
Dieser Vektor wurde zur Expression und Mutagenese von TRT-Se
quenzen in E. coli konstruiert. Die codierende Sequenz
wird von einem T7-Promotor gesteuert. RA45
(5'-GCCACCCCCGCGCTGCCTCGAGCTCCCCGCTGC-3')
wird in einer in vitro-Mutagenese zur Überführung des In
itiations-Met in hTRT zu Leu verwendet und zur Einführung
einer XhoI-Stelle in den beiden nächsten Codons nach dem
Leu. Auch COD 1941 wurde zur Überführung von CatR nach CatS
und Einführung einer BSPHI-Stelle verwendet und COD 2866 zur
Überführung vom AmpS zu AmpR, wobei eine FspI-Stelle einge
führt wurde. Der mit diesem Vektor verwendete selektierbare
Marker ist Ampicillin.
Dieser Vektor wurde für die Expression von hTR-Sequenzen in
E. coli konstruiert. Die Primer hTR+1
GGGGAAGCTTTAATACGACTCACTATAGGGTTGCGGAGGGTGGGCCTG-3'
und hTR +445
CCCCGGATCCTGCGCATGTGTGAGCCGAGTCCTGGG-3'
wurden zur Amplifikation eines Fragments von pGRN33 mittels
PCR verwendet, das hTR mit vollständiger Länge und dem T7-Pro
motor an seinem 5'-Ende (wie in hTR+1) enthält. Eine
BamHI-HindIII-Spaltung des PCR-Produkts wurde in die BamHI-HindIII-Stel
len von pUC119 inseriert. Die codierende Sequenz
wird von einem T7-Promotor gesteuert. Der mit diesem Vektor
verwendete selektierbare Marker ist Ampicillin.
Dieser Vektor wurde für die Expression und Mutagenese von
hTRT-Sequenzen in E. coli verwendet. Die codierende Sequenz
wird von einem T7-Promotor gesteuert. Ein EcoRI-Fragment von
pGRN145, das den hTRT-orf mit einer "Kozak"-Sequenz am vor
deren Ende enthält, inseriert in die EcoRI-Stelle von
pBluescriptIISK+, so daß hTRT in derselben Orientierung vor
liegt wie der T7-Promotor. Der mit diesem Vektor verwendete
selektierbare Marker ist Ampicillin.
Dieser Vektor wurde zur Expression und Mutagenese von TRT-Se
quenzen in Säugerzellen konstruiert. Die codierende Se
quenz wird von einem T7-Promotor gesteuert. Das EcoRI-Frag
ment von pGRN151, das den hTRT-ORF mit einer "Kozak"-Sequenz
am vorderen Ende enthält und ein "IBI flag" am hinteren
Ende, inseriert in die EcoRI-Stelle von pBluescriptIISK+ so
daß hTRT in der gleichen Orientierung vorliegt wie der T7-Pro
motor. Die Insertion enthielt hTRT-cDNA mit vollständiger
Länge ohne 5'- und 3'-UTR, eine "FLAG"-Sequenz (Immunex
Corp. Seattle, WA) und "Kozak"-Sequenzen. Der mit diesem
Vektor verwendete selektierbare Marker ist Ampicillin.
Ein AvrII-StuI-Fragment von pGRN144, das das 5'-Ende des
hTRT-ORF enthält, inseriert in die XbaI-StuI-Stellen von
pBBS161.
Das die optimierte hTRT-Expressionskassette enthaltende
EcoRI-Fragment von pGRN145 wurde in die EcoRI-Stelle von
pIND so inseriert, daß die hTRT codierende Sequenz in der
selben Orientierung ist wie der miniCMV-Promotor.
Das die optimierte hTRT-Expressionskassette enthaltende
EcoRI-Fragment von pGRN145 wurde so in die EcoRI-Stelle von
pIND inseriert, daß das hTRT in der umgekehrten Orientierung
ist, bezogen auf den miniCMV-Promotor.
Das die optimierte hTRT-Expressionskassette enthaltende
EcoRI-Fragment von pGRN145 wurde so in die EcoRI-Stelle von
piND(sp1) inseriert, daß das hTRT in der gegenläufigen Ori
entierung vorliegt, bezogen auf den miniCMV-Promotor.
Das Eco47II-NarI-Fragment von pGRN163 inseriert in die
Eco47III-NarI-Stellen von pGRN167.
Damit wird die MIL-Mutation in ein Fragment der genomischen
hTRT-DNA eingeführt.
Das BamHI-StuI-Fragment von pGRN171, das in hTRT die Muta
tion Met zu Leu enthält, inseriert in die BglII-NruI-Stellen
von pSEAP2-"Basic".
Das EcoRV-Eco47III-Fragment von pGRN144, das das 5'-Ende des
hTRT-Promotorbereichs enthält, wurde in die SrfI-Eco47III-Stel
len von pGRN172 inseriert. Dadurch entstand ein Promo
tor/Reporter-Plasmid, das den Promotorbereich von hTRT von
etwa 2,3 kb stromaufwärts des Starts des hTRT-ORF bis unmit
telbar nach dem ersten Intron im codierenden Bereich mit der
Met1→Leu-Mutation enthält.
Das die "optimierte" hTRT-Expressionskassette enthaltende
EcoRI-Fragment von pGRN145 wurde in die EcoRI-Stelle von
pIND(sp1) so inseriert, daß das hTRT dieselbe Orientierung
hat wie der miniCMV-Promotor.
In diesem Beispiel wird die Co-Expression von hTRT und hTR
mittels eines zellfreien in vitro-Expressionssystems be
schrieben. Die Ergebnisse zeigen, daß das von pGRN121 co
dierte hTRT-Polypeptid ein katalytisch aktives Telomerase-
Protein codiert, und daß die in vitro-Rekonstitution (IVR)
des Telomerase-RNPs unter Verwendung rekombinant exprimier
ter hTRT und hTR erzielt werden kann.
Telomerase-Aktivität wurde durch Zugabe linearisierter Plas
mide mit hTRT (pGRN121; 1 µg DNA, gespalten mit XbaI) und
hTR (pHTR+1; 1 µg, gespalten mit FspI) zu einem gekoppelten
Transpriptions/Translations-Reticulocyten-Lysat (Promega
TNT®) rekonstituiert. pHTR+1 ist ein Plasmid, das nach Li
nearisierung mit FspI und anschließender Transkription durch
T7-RNA-Polymerase ein Transkript mit 445 Nucleotiden er
zeugt, das mit dem Nucleotid +1 beginnt und sich bis zu dem
Nucleotid 446 von hTR erstreckt (Autexier et al., EMBO J. 15
(1996), 5928). Für eine 50 µl-Reaktion wurden die folgenden
Bestandteile zugegeben: 2 µl TNT®-Puffer, µl TNT®-T7-RNA-Poly
merase, 1 µl 1 mM Aminosäuregemisch, 40 Einheiten
Rnasin® RNase-Inhibitor, jeweils 1 µg linearisierte Matri
zen-DNA und 25 µl TNT®-Reticulocytenlysat. Die Bestandteile
wurden in dem vom Hersteller empfohlenen Verhältnis zugefügt
und 90 Minuten bei 30°C inkubiert. Die Transkription wurde
durch den T7-Promotor gesteuert und sie konnte auch vor der
Zugabe von Reticulocytenlysat mit ähnlichen Ergebnissen
durchgeführt werden. Nach der Inkubation wurden 5 und 10 µl
der programmierten Transkriptions/Translations-Reaktion hin
sichtlich Telomerase-Aktivität mittels des vorstehend be
schriebenen TRAP-Assays (Autexier et al., a.a.O.) unter Ver
wendung von 20 PCR-Cyclen zur Signalamplifikation unter
sucht.
Die Ergebnisse der Rekonstitution sind in Fig. 10 gezeigt.
Für jede Transkriptions-Translations-Reaktion gibt es drei
Spuren. Die ersten zwei Spuren sind Duplikat-Assays und die
dritte Spur ist eine zum Ausschluß PCR-erzeugter Artefacte
vor der TRAP-Phase hitzedenaturierte (95°C, 5 Minuten) Du
plikatprobe.
Wie in Fig. 10 gezeigt, hat das Reticulocytenlysat keine
nachweisbare Telomerase-Aktivität (Spur 6). In ähnlicher
Weise wird keine nachweisbare Aktivität beobachtet, wenn
entweder hTR allein (Spur 1) oder das hTRT-Gen mit vollstän
diger Länge (Spur 4) zu dem Lysat gegeben werden. Wenn beide
Komponenten zugegeben werden (Spur 2), wird Telomerase-Akti
vität erzeugt, wie dies anhand des charakteristischen Mu
sters von Wiederholungsleitern gezeigt wird. Wenn der car
boxyterminale Bereich des hTRT-Gens durch Spaltung des Vek
tors mit NcoI entfernt wird ("verkürztes hTRT") wird Telome
rase-Aktivität aufgehoben (Spur 3 ). Spur 5 zeigt, daß die
Translation der verkürzten hTRT allein keine Telomerase-Ak
tivität erzeugt. Spur "R8" zeigt eine positive Kontrolle für
eine Telomerase-Produktleiter, die durch "TRAP" von TSR8
(einem synthetischen Telomerase-Produkt mit einer Nucleotid
sequenz des Standards für Quantifizierung) erzeugt wird
(5'-ATTCCGTCGAGCAGAGTTAG[GGTTAG]7-3')).
Die in vitro-Rekonstitution von Telomerase-Aktivität wurde
auch durch Vermischen erzielt. hTRT wurde, wie vorstehend
beschrieben, transkribiert und translatiert, jedoch ohne die
Zugabe des hTR-Plasmids. Die Rekonstitution des Telomerase-
RNP wurde dann durch Vermischen des hTRT-Translationsgemi
sches mit hTR (vorher durch die Transkription mit T7-RNA-Po
lymerase von phTR+1-Fsp erzeugt) im Verhältnis von 2 µl
hTRT-Translationsgemisch zu 2 µl hTR (1 µg) und anschließen
der 90minütiger Inkubation bei 30°C erzielt. Dieses Verfah
ren der hTRT-hTR-Rekonstitution wird als "verbundene Rekon
stitution" oder "verbundene IVR" bezeichnet. In diesem Ge
misch ist Telomerase-Aktivität vorhanden (d. h. kann nachge
wiesen werden). Ein verbessertes Signal wurde nach partiel
ler Reinigung der Aktivität durch DEAE-Chromatographie beob
achtet. In diesem Fall wurde eine "Millipore Ultrafree-MC
DEAE Zentralfilter"-Vorrichtungen gemäß Standardverfahren
(d. h. gemäß den Anweisungen des Herstellers) verwendet. Die
verwendeten Puffer waren: hypo0.1, hypo0.2 und hypo1.0, wo
bei hypo 20 mM Hepes-KOH, pH-Wert 7,9, 2 mM MgCl2, 1 mM
EGTA, 10% Glycerin, 0,1% NP-40, 1 mM DTT, 1 mM Natriumme
tabisulfit, 1 mM Benzamidin und 0,2 mM Phenylmethylsulfonyl
fluorid (PMSF) ist und wobei sich 0.1, 0.2 und 1.0 auf 0,1,
0,2 oder 1,0 M KCl beziehen. Die Filter wurden mit hpyo1.0
vorkonditioniert, mit hypo0.1 gewaschen, danach wurde die
rekonstituierte Telomerase aufgeladen, die Säule mit hypo0.1
und im Anschluß daran hypo0.2 gewaschen und die rekonstitu
ierte Telomerase wurde mit hypo1.0 mit dem halben Volumen
im Vergleich zu dem Aufladvolumen eluiert. Diese Zubereitung
konnte bei -70°C in gefrorenem Zustand aufbewahrt werden und
sie behält Aktivität.
Telomerase-Aktivität wurde in einem zweistufigen Verfahren
untersucht. Im ersten Schritt wurde ein üblicher Telomerase-
Assay wie von Morin, Cell 59 (1989), 521 beschrieben durch
geführt, außer daß keine radioaktive Markierung verwendet
wurde. Bei dem zweiten Schritt wurde ein Aliquot mittels des
"TRAP"-Verfahrens für 20 bis 30 Cyclen (wie vorstehend be
schrieben) untersucht. Der übliche Telomerase-Assay wurde so
durchgeführt, daß 1 bis 10 µl rekonstituierte Telomerase
untersucht wurden in 25 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,3, 50 mM Ka
liumacetat, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl21 2 mM DATP, 2 mM TTP, 10 µM
dGTP und 1 µM Primer (üblicherweise M2,
AATCCGTCGAGCAGAGTT) in einem Endvolumen von 40 bis 50 µl bei
30°C und für 60 bis 180 Minuten. Die Reaktion wurde durch
5minütiges Erhitzen auf 95°C gestoppt und mit 1-10 µl des
Gemisches des ersten Schritts wurde der zweite Schritt, die
"TRAP"-Reaktion (50 µl) durchgeführt.
In zusätzlichen Experimenten wurde die Synthese von hTRT und
hTR während einer in vitro-Rekonstitution anhand des Einbaus
von 35S-Methionin bzw. Northern blotting überwacht. Proteine
mit etwa der vorhergesagten Größe wurden für hTRT (127 kD),
hTRT-Nco (85 kD) und pro90hTRT (90 kD) in etwa äquimolaren
Mengen (relativ zueinander) synthetisiert. Die Northern-Ana
lyse zeigte, daß die hTR-Synthese die korrekte Größe (445
Nucleotide) aufwies und vorherrschend intakt war.
Für den Fachmann sind Variationen des oben beschriebenen Re
konstitutionsprotokolls offensichtlich. Beispielsweise kön
nen folgende Parameter variiert werden: Rekonstitutionszeit
und Temperatur, das Vorhandensein oder die Konzentration von
Bestandteilen wie monovalente Salze (z. B. NaCl, Cl, Kalium
acetat, Kaliumglutamat etc.), divalente Salze (MgCl2, MnCl2,
MgSO4, etc.), Denaturierungsmittel Harnstoff, Formamid
etc.), Detergenzien (NP-40, Tween, CHAPS, etc.). Es können
auch alternative verbesserte Reinigungsverfahren (z. B. Im
munpräzipitation, Affinitätschromatographie oder Standard
chromatographie) angewandt werden. Diese und andere Parame
ter können auf systematische Weise variiert werden, um so
die Bedingungen für bestimmte Assays oder andere Rekonstitu
tionsprotokolle zu optimieren.
Rekonstitution von katalytischer Telomerase-Aktivität trat
auf, wenn EGFP-hTRT eine Fusion des "enhanced green
fluorescent-Protein an hTRT (siehe Beispiel 15) oder
"Epitop-tagged" hTRT (IBI FLAG, siehe Beispiels 6) mit hTR
coexprimiert wurden, wobei beide Telomerase-Aktivität auf
ungefähr Wildtyp-Spiegel rekonstituierten.
Im Gegensatz dazu wurde Telomerase-Aktivität nicht rekonsti
tuiert, wenn die hTRT-Variante pro90hTRT (der die RT-Motive
B', C, D und E fehlen) verwendet wurde. Dies zeigt, daß
pro90hTRT keine katalytische Telomerase-Aktivität besitzt,
wobei diese andere Aktivitäten besitzen könnte (z. B. die Fä
higkeit zur RNA (d. h. hTR)-Bindung und sie könnte auch als
dominant-negativer Regulator von Telomerase in vivo, wie
vorstehend beschrieben, wirken.
Das folgende Beispiel zeigt, daß in vitro-rekonstituierte
Telomerase (IVR) zusätzlich zu auf Amplifikation basierenden
Assays, (d. h. TRAP) mittels üblicher Telomerase-Assays un
tersucht werden kann. Telomerase wurde in vitro rekonstitu
iert (IVR) wie in Teil (B) vorstehend beschrieben (das "ver
bundene Rekonstitutions"-Verfahren) wonach sich eine DEAE-Reini
gung, wie vorstehend beschrieben, anschloß. Die IVR-Te
lomerase wurde mittels des Gel-Blot-Assays unter den folgen
den Reaktionsbedingungen untersucht: bis 10 µl IVR-Telome
rase in 25 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,3, 50 mM Kaliumacetat, 1 mM
EGTA, 1 mM MgCl2, 0,8 mM dATP, 0,8 mM TTP, 1,0 mM dGTP
und 1 µM Primer (M2, AATCCGTCGAGCAGAGTT; oder H3.03,
TTAGGGTTAGGGTTAGGG) für 180 Minuten bei 30°C und einem End
volumen von 40 µl. Die synthetisierte Telomer-DNA wurde an
hand von Standard-Verfahren isoliert, auf einem Gel mit 8%igem
Polyacrylamid und 8 M Harnstoff aufgetrennt, auf eine
Nylon-Membran transferiert und unter Verwendung der in dem
Dot-Blot-Assay verwendeten 32P-(CCCTAA)n-Ribonucleotidsonde
abgesucht. Mittels dieser Sonde konnte eine Leiter von sechs
Nucleotiden in der Spur identifiziert werden, die 10 µl IVR-Telo
merase repräsentiert, was äquivalent war zu der Leiter,
die für 5 µl nativer nucleärer, mit "mono Q" und Heparin
chromatographie gereinigter Telomerase beobachtet wurde. Die
Ergebnisse zeigen, daß IVR-Telomerase äquivalent zu nativer
Telomerase eine prozessive katalytische Telomerase-Aktivität
aufweist.
Die IVR-Telomerase ("verbundene Rekonstitution") wurde auch
anhand des üblichen, auf dem Einbau von 32P-dGTP basierenden
Telomerase-Assays untersucht. Die so rekonstituierte Telome
rase, die danach über DEAE-Reinigung, wie vorstehend be
schrieben, gereinigt wurde, wurde sowohl unter prozessiven
als auch nicht-prozessiven Reaktionsbedingungen untersucht.
Die Assay-Bedingungen waren: 5-10 µl rekonstituierte Telome
rase ("verbundene Rekonstitution") in 25 mM Tris-HCl, pH-Wert
8,3, 50 mM Kaliumacetat, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl9, 2 mM
dATP, 2 mM TTP mit 10 µM 32P-dGTP (72 Ci/mMol) (für den As
say hinsichtlich prozessiver Bedingungen) oder 1 µM 32P-dGTP
(720 Ci/mMol) (für nicht-prozessive Bedingungen) und 1 µM
Primer (d. h. H3.03 TTAGGGTTAGGGTTAGGG) bei 0°C für die
prozessive Reaktion) oder 37°C für die nicht-prozessive Re
aktion für 180 Minuten in einem Endvolumen von 40 µl. Die
synthetisierte Telomer-DNA wurde mittels Standardverfahren
isoliert und auf einem Sequenzierungsgel mit 8%igem Poly
acrylamid und 8 M Harnstoff aufgetrennt. Die prozessive Re
aktion zeigte eine schwächere Leiter von sechs Nucleotiden,
was mit einer prozessiven Telomerase-Reaktion übereinstimmt
und bei der nicht-prozessiven Reaktion wurde eine Wiederho
lungseinheit hinzugefügt, ein Muster, das äquivalent zu der
Kontrollreaktion mit einer Präparation nativer Telomerase
ist. Übliche Assays unter Verwendung von Telomerase
"verbundene Rekonstitution" sind bei der Suche nach Telome
rase-Modulatoren, wie hier beschrieben, nützlich, sowie auch
bei anderen Anwendungen, wie beispielsweise der Aufklärung
von strukturellen und funktionellen Eigenschaften von Telo
merase.
Dieses Experiment zeigt, daß durch "verbundene Rekonstitu
tion" hergestellte Telomerase 3'-Enden von Primern erkennt,
äquivalent zu nativer (gereinigter) Telomerase. Telomerase
bildet eine Basen-gepaarte Duplex zwischen dem 3'-Ende eines
Primers und dem Matrizenbereich von hTR und fügt das nächste
vorgesehene Nucleotid an (Morin, 1989, a.a.O.). Um zu veri
fizieren, daß (rekombinante) IVR-Telomerase ("verbundene Re
konstitution) die gleiche Eigenschaft aufweist, wurden die
Reaktionen von Primern mit ---GGG oder ---TAG-3'-Enden
(AATCCGTCGAGCAGAGGG bzw. AATCCGTCGAGCAGATAG) mit einem Pri
mer verglichen mit einem ---GTT 3'-Terminus (M2;
AATCCGTCGAGCAGAGTT; der Standard-"TRAP"-Primer), wobei in
vitro rekonstituierte und native Telomerase verwendet wur
den, die durch den Zwei-Stufen Assay (üblich/TRAP), der vor
stehend ausführlich beschrieben wurde, untersucht wurden.
Die Produktleitern der Primer ---GGG und ---TAG verschoben
wich um +4 bzw. +2 im Vergleich zu dem Standardprimer (---GTT
3'-Ende); derselbe Effekt wurde mit nativer Telomerase
beobachtet. Dieses Experiment zeigt, daß in vitro-rekonsti
tuierte ("verbundene Rekonstitution") und native Telomerase
Primerenden auf die gleiche Weise erkennen.
Diese Ergebnisse (zusammen mit den vorstehenden Ergebnissen,
die zeigen, daß IVR-Telomerase sowohl prozessive als auch
nicht-prozessive katalytische Aktivität besitzt) zeigen an,
daß IVR-Telomerase eine ähnliche Struktur und ähnliche
Eigenschaften im Vergleich zu nativer oder gereinigter Telo
merase besitzt.
Zur Herstellung von anti-hTRT-Antikörpern wurden die folgen
den Peptide von hTRT mit der Hinzufügung von C (Cystein) als
der Amino-terminale Rest (siehe Fig. 54) synthetisiert:
Die Cystein-Einheit wurde zur Immobilisierung (d. h. kova
lente Verknüpfung) der Peptide an BSA- und KLH- ("Keyhole
limpet" Hämocyanin)-Trägerproteine verwendet. Die KLH-Pep
tide wurden als Antigen verwendet. Die BSA-Peptidkonjugate
dienten als Material für ELISAs zum Testen der Spezifität
von Immunantiseren.
Die KLH-Peptidkonjugate wurden in "New Zealand White"-Kanin
chen injiziert. Die einleitenden Injektionen wurden proximal
zu den Lymphknoten der Achselhöhle und der Leisten verab
reicht. Nachfolgende Injektionen wurden intramuskulär gege
ben. Für einleitende Injektionen war das Antigen mit voll
ständigem Freund'schen Adjuvans emulgiert, für nachfolgende
Injektionen wurde unvollständiges Freund'sches Adjuvans ver
wendet. Bei den Kaninchen folgte ein Auffrischungs-Impf
cyclus von 3 Wochen, wobei 50 ml Blut, die 20 bis 25 ml Se
rum lieferten, 10 Tage nach jeder Auffrischungsimpfung ent
nommen wurden. Antiseren gegen jedes der vier Peptide er
kannten die hTRT-Einheit von rekombinantem hTRT-Fusionspro
tein (GST-HIS8-hTRT-Fragment 2426 bis 3274) auf Western-
Blots (siehe Beispiel 6).
Unter Verwendung einer partiell gereinigten Telomerase-Frak
tion von menschlichen 293-Zellen (eine etwa 1000fache Rei
nigung im Vergleich zum nucleären Rohextrakt), die gemäß der
Beschreibung in der parallelen US-Patentanmeldung mit der
Serien-Nr. 08/833,37 (siehe auch PCT-Anmeldung Nr. 97/06012)
hergestellt und mit anti-S-2-Antikörpern affinitätsgereinigt
worden war, konnte auf einem Western-Blot eine 130 kD-Pro
teindublette nachgewiesen werden. Es wurde ein empfindliches
Chemilumineszenz-Nachweisverfahren angewandt ("SuperSignal"-Chemi
lumineszenzsubstrate, Pierce), das Signal auf dem Blot
war jedoch schwach, was darauf hindeutet, daß hTRT in diesen
unsterblichen Zellen in geringer oder sehr geringer Häufig
keit vorhanden ist. Das Auftreten einer Dublette ist konsi
stent mit einer posttranslationalen Modifizierung von hTRT,
d. h. Phosphorylierung oder Glykosylierung.
Zur Affinitätsreinigung wurde das S-2-Peptid an "SulfoLink"
(Pierce, Rockford, IL) über seinen N-terminalen Cysteinrest
gemäß dem Protokoll des Herstellers immobilisiert. Erstes
Blutserum von einem mit dem KLH-S-2-Peptid an die genimmuni
sierten Kaninchen wurde über eine S-2-"SulfoLink" geladen
und spezifisch an das S-2-Peptid gebundene Antikörper wurden
eluiert.
GST-hTRT-Fusionsproteine wurden in E. coli als das GST-hTRT-Frag
ment #4 (Nucleotide 3272-4177) und das GST-His8-hTRT-Frag
ment #3 (Nucleotide 2426 bis 3274), die in Beispiel 6
beschrieben, exprimiert. Die Fusionsproteine wurde als un
lösliches Protein gereinigt und die Reinheit des Antigens
wurde über SDS-Polyacrylamidgele untersucht und auf etwa 75%
Reinheit bezüglich des rekombinanten Proteins GST-hTRT-Frag
ment #4 und über 75% Reinheit für das rekombinante Pro
tein GST-His8-hTRT-Fragment #3 geschätzt. (Routineverfahren
können zur Gewinnung dieser und anderer Fusionsproteine mit
einer Reinheit über 90% verwendet werden). Diese rekom
binanten Proteine wurden zur Immunisierung sowohl von "New
Zealand White"-Kaninchen als auch weiblichen Balb/c-Mäusen
verwendet. Für einleitende Injektionen wurde das Antigen mit
vollständigen Freund'schem Adjuvans emulgiert, für nachfol
gende Injektionen wurde unvollständiges Freund'sches Adju
vans verwendet. Für die Kaninchen und Mäuse erfolgte ein 3wöchi
ger Auffrischungsimpfcyclus, wobei Blut 10 Tage nach
jeder Auffrischungsimpfung entnommen wurde.
Die erste und zweite Blutentnahme sowohl von den Mäusen als
auch den Kaninchen wurde hinsichtlich der Anwesenheit von
anti-hTRT-Antikörpern nach Entfernung von anti-GST-Antikör
pern unter Verwendung einer immobilisiertes GST enthaltenden
Matrix getestet. Die Antiseren wurden auf anti-hTRT-Antikör
pern durch Western-Blots unter Verwendung eines Immobili
sierten rekombinanten GST-hTRT-Fusionsproteins getestet und
mittels Immunpräzipitation unter Verwendung des partiell
gereinigten nativen Telomeraseenzyms. Bei diesen frühen
Blutentnahmen konnte kein Signal beobachtet werden; es wird
davon ausgegangen, daß sich die Titer von anti-hTRT-Antikör
pern bei nachfolgenden Blutentnahmen erhöhen.
Poly-A⁺-RNA von menschlichen Hoden und der 293-Zellinie
wurde hinsichtlich hTRT-mRNA mittels RT-PCR und "nested"-Pri
mern analysiert. Der erste Primersatz war TCP1.1 und
TCP1.15, der zweite Primersatz TCP1.14 und billTCP6. Die
Amplifikation mit beiden Primersätzen ergab zwei Produkte,
die sich um 182 bp unterschieden. Die größeren 34917 00070 552 001000280000000200012000285913480600040 0002019743497 00004 34798und kleineren
Produkte von RNA aus Hoden wurde sequenziert und es stellte
sich heraus, daß sie genau pGRN121 (Fig. 16) bzw. dem Clon
712562 (Fig. 18) entsprachen. Das hTRT-RNA-Produkt der Va
riante wurde in mRNA von SW39i, OVCAR4, 293 und Hoden beob
achtet.
Zusätzliche Experimente wurden durchgeführt, um zu zeigen,
daß die Δ182 cDNA nicht ein Artefact der reversen Transkrip
tion war. Kurz zusammengefaßt, hTRT-RNA (d. h. ohne Deletion)
wurde durch in vitro-Transkription von pGRN121 zur Verwen
dung als Matrize für RT-PCR hergestellt. Getrennt davon wur
den cDNA-Synthese-Reaktionen mittels der "Superscript®" re
verser Transkriptase (Bethesda Research Laboratories,
Bethesda MD) bei 42°C oder 50°C mit Zufallsprimern oder
einem spezifischen Primer durchgeführt. Nach 15 PCR-Cyclen
war das längere Produkt nachweisbar, jedoch nicht das klei
nere Produkt (d. h. das der Deletion entsprechende, selbst
nicht nach 30 oder mehr Cyclen. Dieses zeigt an, daß das RT-PCR-Pro
dukt kein Artefact ist.
Die Sequenz der in Hoden vorzufindenden Form von hTRT-RNA
wurde durch direkte Manuell-Sequenzierung von DNA-Fragmenten
bestimmt, die mittels PCR von Hoden-cDNA ("Marathon"-Hoden
cDNA, Clontech, San Diego, CA) unter Verwendung eines
"ThermoSequenase radiolabeled terminator cycle"-Sequenzie
rungskits (Amersham Life Science) erzeugt. Die PCR-Reaktio
nen wurden mittels "nested"-PCR,- wie in Tabelle 7 gezeigt,
durchgeführt, soweit nicht anders angegeben. In allen Fällen
wurde eine negative Kontrollreaktion mit Primern, jedoch
ohne cDNA durchgeführt. Das Fehlen eines Produkts in der
Kontrollreaktion zeigte, daß die von der Reaktion mit cDNA
stammenden Produkte nicht aufgrund einer Kontamination mit
hTRT von pGRN121 oder anderen Zellquellen (z. B. 293-Zellen)
vorhanden waren. Die DNA-Fragmente wurden zur Reinigung der
DNA vor der Sequenzierung aus Agarosegelen ausgeschnitten.
Die Sequenz der Hoden-mRNA, die den Basen 27 bis 3553 der
Insertionssequenz von pGRN121 (SEQ. ID. Nr. 1) entspricht
und den gesamten hTRT-ORF (Basen 56 bis 3451) wurde erhal
ten. In diesem Bereich zeigten sich keine Unterschiede zwi
schen den Hoden- und pGRN121-Sequenzen.
RNase-Schutzassays können zum Nachweis, zur Überwachung oder
zur Diagnose hinsichtlich der Anwesenheit einer hTRT-mRNA
oder der mRNA einer Variante verwendet werden. Eine veran
schaulichende Sonde für einen solchen Assay ist eine in
vitro-synthetisierte RNA, die Sequenzen umfaßt, die komple
mentär zu hTRT-mRNA-Sequenzen sind, und zusätzliche, nicht
komplementäre Sequenzen. Die letzteren Sequenzen sind des
halb von Vorteil, um die Sonde mit vollständiger Länge von
dem Fragment der Sonde unterscheiden zu können, das von
einem positiven Ergebnis in dem Assay herrührt. In einem po
sitiven Assay werden die komplementären Sequenzen der Sonde
vor einer Spaltung mit RNase geschützt, da sie mit der hTRT-mRNA
hybridisiert sind. Die nicht-komplementären Sequenzen
werden von der Sonde in Gegenwart von RNase und komplementä
rer Zielnucleinsäure abgespalten.
Zwei Sonden für die RNase-Schutzassays sind zur Veranschau
lichung beschrieben, wobei jede in dem Assay verwendet wer
den kann. Die Sonden unterscheiden sich in ihren zu hTRT
komplementären Sequenzen, enthalten jedoch identische nicht
komplementäre Sequenzen, die in dieser Ausführungsform von
der späten Leadersequenz der mRNA von SV40 stammen. In 5'-3'-Rich
tung umfaßt die erste Sonde 33 Nucleotide einer
nicht-komplementären Sequenz und 194 Nucleotide einer Se
quenz, die komplementär zu den hTRT-Nucleotiden 2513 bis
2707 ist für eine Größe der Sonde mit vollständiger Länge
von 227 Nucleotiden. In 5'-3'-Richtung umfaßt die zweite
Sonde 33 Nucleotide einer nicht komplementären Sequenz und
198 Nucleotide einer Sequenz, die komplementär zu den hTRT-Nucleo
tiden 2837 bis 3035 ist für eine Größe der Sonde mit
vollständiger Länge von 231 Nucleotiden. Zur Durchführung
des Assays kann jede der beiden Sonden mit RNA d. h. PolyA⁺-RNA
von einer Testprobe hybridisiert werden und im Anschluß
daran werden T1-Ribonuclease und RNase A zugegeben. Nach der
Spaltung wird die Sonden-RNA gereinigt und durch Gelelektro
phorese analysiert. Der Nachweis eines 194 Nucleotide langen
Fragments der Nucleotidsonde mit einer Länge von 227 Nucleo
tiden oder eines 198 Nucleotide langen Fragments der Sonde
mit einer Länge von 231 Nucleotiden ist ein Zeichen für die
Anwesenheit von hTRT-mRNA in der Probe.
Die in diesem Beispiel beschriebenen veranschaulichenden
Sonden für den RNase-Schutzassay können durch in vitro-
Transkription mittels T7-RNA-Polymerase erzeugt werden. Ra
dioaktive oder anderweitig markierte Ribonucleotide können
für die Synthese von markierten Sonden eingeschlossen wer
den. Die Matrizen für die in vitro-Transkriptionsreaktion
zur Herstellung der RNA-Sonden sind PCR-Produkte. Diese il
lustrativen Sonden können nach PCR-Amplifikation von
pGRN121-DNA mittels Primern, die den entsprechenden komple
mentären Bereich des hTRT-Gens oder der hTRT-mRNA umspannen,
mit T7-Polymerase synthetisiert werden. Außerdem enthält der
Stromabwärts-Primer T7-RNA-Polymerase-Promotorseauenzen und
die nicht-komplementären Sequenzen.
Für die Erzeugung der ersten Sonde für den RNase-Schutzassay
wird das PCR-Produkt von dem folgenden Primer-Paar T701 und
reverse 01) verwendet:
T701 5'-GGGAGATCT TAATACGACTCACTATAG ATTCA GGCCATGGTGCTGCGCCGGC TGTCA GGCTCCC ACGACGTAGT CCATGTFCAC-3'
und reverse 01
5'-GGGTCTAGAT CCGGAAGAGTGT CTGGAGCAAG-3'.
T701 5'-GGGAGATCT TAATACGACTCACTATAG ATTCA GGCCATGGTGCTGCGCCGGC TGTCA GGCTCCC ACGACGTAGT CCATGTFCAC-3'
und reverse 01
5'-GGGTCTAGAT CCGGAAGAGTGT CTGGAGCAAG-3'.
Zur Erzeugung der zweiten Sonde für den RNase-Schutzassay
wird das PCR-Produkt von dem folgenden Primerpaar (T702 und
reverse 02) verwendet:
T702 5'-GGGAGATCT TAATACGACTCACTATAG ADCA GGCCATGGTGCTGCGCCGGC TGTCA GGGCG GCCTTCTGGA CCACGGCATA CC-3'
und reverse 02
5'-G GTCTAGA CGATATCC ACAGGGCCTG GCGC-3'.
T702 5'-GGGAGATCT TAATACGACTCACTATAG ADCA GGCCATGGTGCTGCGCCGGC TGTCA GGGCG GCCTTCTGGA CCACGGCATA CC-3'
und reverse 02
5'-G GTCTAGA CGATATCC ACAGGGCCTG GCGC-3'.
Ein phylogenetischer Stammbaum (Fig. 6) wurde durch Ver
gleich der sieben von Xiong und Eickbush (EMBO J. 9 (1990),
3353) RT-Domänen konstruiert. Nach Sequenzausrichtung der
Motive 1, 2- und A-E von 4 TRTs, 67 RTs und 3 RNA-Polymerasen
wurde der Stammbaum unter Verwendung des "NJ ("Neighbor
Joining")-Verfahrens (Saitou und Nei, Mol. Biol. Ecol. 4
(1987), 406) konstruiert. Elemente von der gleichen Klasse,
die auf dem gleichen Zweig des Stammbaums lokalisiert sind,
sind vereinfacht als Kästchen wiedergegeben. Die Länge jedes
Kästchens entspricht dem am meisten divergenten Element in
nerhalb des Kästchens.
Die TRTs scheinen mit den RTs, die mit msDNA, Gruppe II-In
trons und nicht-LTR (lange terminale Wiederholungseinhei
ten)-Retrotransposons enger verwandt zu sein als mit dem
LTR-Retrotransposon und viralen RTs. Die Verwandtschaft der
Telomerase-RTs zu dem nicht-LTR-Zweig von Retroelementen ist
sehr interessant, geht man davon aus, daß diese letzteren
Elemente Telomerase für die Telomer-Beibehaltung in
Drosophila ausgetauscht haben. Die auffallendste Beobachtung
st jedoch, daß die TRTs eine diskrete Untergruppe bilden,
die mit den RNA-abhängigen RNA-Polymerasen von +-strängigen
RNA-Viren, wie beispielsweise Poliovirus, beinahe genau so
eng verwandt ist wie mit einem der bereits bekannten RTs.
Wenn man in Erwägung zieht, daß die vier Telomerasegene von
evolutionär entfernten Organismen stammen, - Protozoen,
Pilze und Säuger - kann diese getrennte Gruppierung nicht
durch das Fehlen von phylogenetischer Vielfalt in dem Daten
satz erklärt werden. Diese frühzeitige Aufgabelung legt
statt dessen nahe, daß die Telomerase-RTs eine sehr alte
Gruppe sind, die vielleicht mit dem ersten Eukaryoten ent
stand.
GenBank-Protein-Identifizierungnummern oder Zugangsnummern,
die für phylogenetische Analyse verwendet wurden, sind:
msDNAs (94535, 134069, 134074, 134075, 134078), Gruppe II Introns (483039, 101880, 1332208, 1334433, 1334435, 133345, 1353081), mitochondriales Plasmid/RTL (903835, 134084), nicht-LTR Retrotransposons (140023, 84806, 103221, 103353, 134083, 435415, 103015, 1335673, 85020, 141475, 106903, 130402, U0551, 903695, 940390, 2055276, L08889), LTR-Retro transposons (74599, 85105, 130582, 99712, 83589, 84126, 479443, 224319, 130398, 130583, 1335652, 173088, 226407. 101042, 1078824), Hepadnaviren (I 18876, 1706510, 18894), Caulimoviren (331554, 130600, 130593, 93553), Retroviren (130601, 325465, 74601, 130587, 130671, 130607, 130629, 130589, 130631, 1346746, 130651, 130635, 1780973, 130646) Die Ausrichtung wurde mittels "ClustalW 1.5" (J.D. Thompson, D.G. Higgins, T.J. Gibson, Nucleic Acids Res. 22, (1994), 4673) und "PHYLIP 3.5" (J. Felsenstein, Cladisfics 5 (1989), 164) analysiert.
msDNAs (94535, 134069, 134074, 134075, 134078), Gruppe II Introns (483039, 101880, 1332208, 1334433, 1334435, 133345, 1353081), mitochondriales Plasmid/RTL (903835, 134084), nicht-LTR Retrotransposons (140023, 84806, 103221, 103353, 134083, 435415, 103015, 1335673, 85020, 141475, 106903, 130402, U0551, 903695, 940390, 2055276, L08889), LTR-Retro transposons (74599, 85105, 130582, 99712, 83589, 84126, 479443, 224319, 130398, 130583, 1335652, 173088, 226407. 101042, 1078824), Hepadnaviren (I 18876, 1706510, 18894), Caulimoviren (331554, 130600, 130593, 93553), Retroviren (130601, 325465, 74601, 130587, 130671, 130607, 130629, 130589, 130631, 1346746, 130651, 130635, 1780973, 130646) Die Ausrichtung wurde mittels "ClustalW 1.5" (J.D. Thompson, D.G. Higgins, T.J. Gibson, Nucleic Acids Res. 22, (1994), 4673) und "PHYLIP 3.5" (J. Felsenstein, Cladisfics 5 (1989), 164) analysiert.
Dieses Beispiel zeigt, daß die Expression eines rekombinan
ten hTRT-Proteins in einer Säugerzelle zur Erzeugung einer
aktiven Telomerase führt.
Subkonfluente BJ-Fibroblasten wurden trypsinisiert und in
frischem Medium (DMEM/199, 10% fötales Kälberserum enthal
tend) bei einer Konzentration von 4 × 106 Zellen/ml resus
pendiert. Die Zellen wurden mittels Elektroporation mit dem
"Gene Pulser™"-Elektroporator von BioRad transfiziert. Ge
gebenenfalls kann man auch Zellen unter Verwendung des "Su
perfect™"-Reagenz (Quiagen) gemäß den Anleitungen des Her
stellers transfizieren. Für die Elektroporation wurden 500 µl
Zellsuspension in eine Elektroporationsküvette (BioRad,
0,4 cm Elektrodenabstand) gegeben. Plasmid-DNA (2 µg) wurden
zu den Küvetten gegeben und die Suspension vorsichtig ge
mischt und auf Eis 5 Minuten inkubiert. Das Kontrollplasmid
(pBBS212) enthielt keine Insertion hinter dem MPSV-Promotor
und das experimentelle Plasmid (pGRN133) exprimierte hTRT
vom MPSV-Promotor. Die Zellen wurden bei 300 V und 960 µFD
einer Elektroporation unterworfen. Nach Abgabe des Impulses
wurden die Küvetten vor der Plattierung auf 100 mm-Gewebe
kulturplatten in Medium etwa 5 Minuten auf Eis gehalten.
Nach 6 Stunden wurde das Medium gegen neues Medium ausge
tauscht. 72 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen
trypsinisiert, einmal mit PBS gewaschen, pelletiert und in
gefrorenem Zustand bei -80°C aufbewahrt. Zellextrakte wurden
bei einer Konzentration von 25 000 Zellen/µl durch ein modi
fiziertes Lyseverfahren mittels Detergentien präpariert
(siehe Bodnar et al., Exp. Cell Res. 28 (1996), 8 und Kim
et al., Science 266 (1994) 2011 und die Beschreibung in Pa
tenten und Publikationen, die sich auf den vorstehenden
TRAP-Assay beziehen) und Telomerase-Aktivität in den Zellex
trakten wurde mittels eines modifizierten auf PCR basieren
den TRAP-Assays bestimmt (Kim et al., 1994, Bodnar et al.,
1996). Kurz zusammengefaßt, 5 × 104 Zelläquivalente wurden
für den Telomerase-Primer Verlängerungsteil der Reaktion
verwendet. Während der Extrakt typischerweise direkt von der
Telomerase-Verlängerungsreaktion zu der PCR-Amplifikation
gegeben wird, kann man auch einmal mit Phenol/Chloroform und
einmal mit Chloroform vor der PCR-Amplifikation extrahieren.
Ein fünftel des Materials wurde in dem PCR-Amplifikationsan
teil der TRAP-Reaktion verwendet (etwa 10 000 Zelläquiva
lente). Die Hälfte der TRAP-Reaktion wurde zur Analyse auf
ein Gel geladen, so daß jede Spur in Fig. 25 Reaktionspro
dukte von 5000 Zelläquivalenten repräsentiert. Extrakte von
mit pGRN133 transfizierten Zellen waren hinsichtlich Telome
rase-Aktivität positiv, während Extrakte von nicht-transfi
zierten Zellen (nicht gezeigt) oder mit dem Kontrollplasmid
transfizierten Zellen keine Telomerase-Aktivität zeigten.
Ähnliche Experimente mit RPE-Zellen ergaben das gleiche Er
gebnis.
Rekonstitution in BJ-Zellen wurde auch mittels anderer hTRT-Kon
strukte durchgeführt (d. h. pGRN145, pGRN155 und pGRN138).
Die Rekonstitution unter Verwendung dieser Konstrukte schien
zu einer stärkeren Telomerase-Aktivität zu führen im Ver
gleich zu mit pGRN133 transfizierten Zellen.
Der höchste Spiegel an Telomerase-Aktivität wurde mit
pGRN155 erzielt. Wie bereits vorstehend diskutiert ist
pGRN155 ein Vektor, der den späten Hauptpromotor von Adeno
virus als ein Kontrollelement für die Expression von hTRT
enthält und es zeigte sich, daß damit Telomerase-Aktivität
rekonstituiert werden konnte bei Transfektion in BJ-Zellen.
Bemerkenswerterweise ergab die Rekonstitution unter Verwen
dung mit dem hTRT-GFP-Fusionsprotein pGRN138 (das im Nucleus
lokalisiert wird, siehe das nachstehende Beispiel 15) entwe
der in vitro (siehe Beispiel 7) oder mit in vivo-Rekonstitu
tionssystemen (Transfektion in BJ-Zellen), ergab Telomerase-
Aktivität. Wenn in BJ-Zellen, wie beispielsweise vorstehend
beschrieben, transfiziert wurde, war die Telomerase-Aktivi
tät mit der vergleichbar, die sich aus der Rekonstitution
mit pGRN133 oder pGRN145 ergab.
Ähnliche Ergebnisse wurden nach Transfektion von normalen
menschlichen pigmenthaltigen retinalen Epithelzellen (RPE)
mit den erfindungsgemäßen hTRT-Expressionsvektoren erhalten.
Es wird davon ausgegangen, daß die Seneszenz von RPE-Zellen
zu der Erkrankung der mit dem Alter zusammenhängenden
Macula-Degeneration führt oder dazu beiträgt. Gemäß den er
findungsgemäßen Verfahren mit den erfindungsgemäßen hTRT-Ex
pressionsvektoren behandelte RPE-Zellen sollten eine verzö
gerte Seneszenz aufweisen im Vergleich zu unbehandelten Zel
len und so von Nutzen sein bei Transplantationstherapien zur
Behandlung oder zur Verhinderung der mit dem Alter zusammen
hängenden Macula-Degeneration.
Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion von Plasmiden,
bei denen Reportergene mit stromaufwärts gelegenen hTRT-Se
quenzen, die Promotorelemente enthalten, funktionell ver
knüpft sind. Diese Vektoren weisen zahlreiche Anwendungsmög
lichkeiten auf, wozu die Identifizierung von in cis und
trans wirkenden Regulationsfaktoren der Transkription in
vivo und das Screening nach Agenzien die die hTRT-Expres
sion modulieren können (z. B. Aktivierung oder Hemmung) zäh
len (beispielsweise das Screenen von Wirkstoffen). Es können
zwar eine Reihe von Reportergenen verwendet werden (bei
spielsweise Leuchtkörperchen-Luciferase, β-Glucuronidase, β-
Galactosidase, Chloramphinicolacetyltransferase und GFP),
zur einleitende Experimente wurde jedoch die sezernierte
menschliche alkalische Phosphatase (SEAP; CloneTech) verwen
det. Das SEAP-Reportergen codiert eine verkürzte Form des
Enzym aus Plazenta, dem die Domäne für die Membran-Veranke
rung fehlt, wodurch die effiziente Sekretion des Proteins
aus transfizierten Zellen ermöglicht wird. Es konnte gezeigt
werden, daß die Spiegel an SEAP-Aktivität, die in dem Kul
turmedium nachgewiesen werden, direkt proportional zu Verän
derungen in intrazellulären Konzentrationen von SEAP-mRNA
und -Protein sind (Berger et al., Gene 66 (1988), 1 und
Cullen et al., Meth. Enzymol 216 (1992), 362).
Vier Konstrukte (pGRN148, pGRN150, "pSEAP2 basic" (keine
Promotorsequenz = negative Kontrolle) und "pSEAP2 control"
(das den frühen SV40-Promotor und Enhancer enthält) wurden
in dreifacher Ausfertigung in sterblichen und unsterblichen
Zellen transfiziert.
Plasmid pGRN148 wurde wie in Fig. 9 veranschaulicht kon
struiert. Kurz zusammengefaßt wurde ein BglII-Eco47III-Frag
ment von pGRN144 gespalten und in die BglII-NruI-Stelle von
pSEAp2Basic (Clontech, San Diego, CA) cloniert. Ein zweiter
Reporterpromotor, das Plasmid pGRN150, enthält die Sequenzen
von dem in Beispiel 3 beschriebenen hTRT-Intron, um so regu
latorische Sequenzen, die in dem Intron vorhanden sein kön
nen, verwenden zu können. Das Initiationscodon Met ist zu
Leu mutiert, so daß das zweite dem Promotorbereich folgende
ATG das Initiations-ATG des SEAP-ORF ist.
Die Konstrukte pGRN148 und pGRN150, die den hTRT-Promotor
enthalten, wurden in sterbliche (BJ-Zellen) und unsterbliche
(293)-Zellen transfiziert. Alle Transfektionen wurden paral
lel mit zwei Kontrollplasmiden durchgeführt. Ein Plasmid als
negative Kontrolle (pSEAP basic) und ein Plasmid als posi
tive Kontrolle ("pSEAP control", das den frühen SV40-Promo
tor und den SV40-Enhancer enthält).
In unsterblichen Zellen scheinen die Konstrukte pGRN148 und
pGRN150 die SEAP-Expression genauso effizient zu steuern,
wie die positive "pSEAP2 control" (die den frühen SV40-Pro
motor und -Enhancer enthält). Im Gegensatz dazu ergab in
sterblichen Zellen nur die "pSEAP2 control" nachweisbare Ak
tivität. Diese Ergebnisse zeigen, daß, wie erwartet, hTRT-Pro
motorsequenzen in Tumorzellen aktiv sind, jedoch nicht in
sterblichen Zellen.
Ähnliche Ergebnisse wurden mit einer weiteren normalen
Zellinie (RPE), (pigmenthaltige, retinale Epithelzellinie)
erhalten. In RPE-Zellen, die mit pGRN150 (das 2,2 kb an
stromaufwärts gelegener genomischer Sequenz enthält) trans
fiziert sind, war der hTRT-Promotorbereich inaktiv, während
das Plasmid "pSEAP2 control" aktiv war.
Wie bereits vorstehend angemerkt, sind Plasmide, bei denen
Reportergene zur stromaufwärts gelegenen hTRT-Sequenz, die
Promotorelemente enthalten, funktionell verknüpft sind, aus
gesprochen nützlich für die Identifizierung und das Scree
ning von Telomerase-Aktivität modulierende Agenzien, wobei
sowohl Verfahren der transienten als auch der stabilen
Transfektion verwendet werden können. Bei einer Vorgehens
weise werden beispielsweise stabile Transformanten von
pGRN148 in Telomerase-negativen und Telomerase-positiven
Zellen durch Cotransfektion mit einem eukariotischen selek
tierbaren Marker (wie z. B. neo) gemäß Ausubel et al., 1997,
a.a.O.) hergestellt. Die erhaltenen Zellinien werden dann
für das Screenen von vermuteten Telomerase-modulierenden
Agenzien verwendet, beispielsweise durch Vergleich der hTRT-Pro
motor-gesteuerten Expression in Gegenwart oder Abwesen
heit einer Testverbindung.
Die erfindungsgemäßen Promotor-Reporter-Vektoren (und an
dere) werden auch zur Identifizierung von in trans und in
cis wirkenden Regulationselementen für die Transkription und
Translation verwendet. Zu den Beispielen für in cis wirken
den regulatorischen Elementen der Transkription zählen Pro
motoren und Enhancer des Telomerasegens. Die Identifizierung
und Isolierung von in cis und in trans wirkenden regulatori
schen Agenzien führt zur Bereitstellung weiterer Verfahren
und Reagenzien zur Identifizierung von Agenzien, die die
Transkription und Translation von Telomerase modulieren.
Ein Fusionsprotein mit hTRT und "enhanced green fluorescent
protein" (EGFP; Cormack et al., Gene 173 (1996), 33)-Berei
chen wurde wie nachstehend beschrieben konstruiert. Die
EGFP-Einheit liefert ein nachweisbares "tag" oder Signal,
womit das Vorhandensein oder die Lage des Fusionsproteins
leicht bestimmt werden kann. Da EGFP-Fusionsproteine in den
korrekten zellulären Kompartimenten lokalisiert sind, kann
dieses Konstrukt zur Bestimmung der subzellulären Lage des
hTRT-Proteins verwendet werden.
Ein Vektor zur Expression eines hTRT-EGFP-Fusionsproteins in
Säugerzellen wurde konstruiert durch Integration der EcoRI-In
sertion von pGRN124 (siehe Beispiel 6) in die EcoRI-Stelle
von pEGFP-C2 (Clontech, San Diego, CA). Die Aminosäurese
quenz des Fusionsproteins ist nachstehend gezeigt. EGFP-Re
ste sind in Fettdruck, durch den 5'-untranslatierten Bereich
von hTRT-mRNA codierte Reste sind unterstrichen und die
hTRT-Proteinsequenz ist in normaler Schrift angegeben.
Weitere EGFP-Fusionskonstrukte wurden unter Verwendung einer
partiellen (z. B. verkürzten) hTRT codierenden Sequenz herge
stellt, und, wie nachstehend beschrieben, zur Identifizie
rung von Aktivitäten bestimmter Bereiche des hTRT-Polypep
tids verwendet.
Die Transfektion von NIH 293- und BJ-Zellen mit pGRN138 er
laubte die Bestätigung der nucleären Lokalisation von rekom
binant exprimierter hTRT. Zellen wurden mit pGRN138 (EGFP-hTRT)
und einem Kontrollkonstrukt (nur EGFP exprimiert)
transfiziert. Die nucleäre Lokalisation der EGFP-hTRT ist in
beiden Zelltypen offensichtlich (bestimmt durch Fluoreszenz
mikroskopie). Wie bereits vorstehend angemerkt, unterstützt
das pGRN138 hTRT-GFP-Fusionsprotein die Rekonstitution von
Telomerase-Aktivität sowohl in einem in vitro-Transkripti
ons/Translationssystem als auch in vivo, wenn es in BJ-Zel
len transfiziert wird.
hTRT-EGFP-Fusionsproteine (oder ähnliche nachweisbare Fusi
onsproteine) werden für eine Vielzahl von Anwendungen ver
wendet. Beispielsweise wird das in diesem Beispiel beschrie
bene Fusionskonstrukt oder ein EGFP-Konstrukt und eine ver
kürzte Form von hTRT zur Beurteilung der Fähigkeit von hTRT
und Varianten, in einen Zellnucleus einzutreten und/oder an
die Chromosomenenden anlagern zu können, verwendet. Außerdem
werden stabil oder transient mit pGRN138 transfizierte Zel
len für das Screenen nach vermuteten Telomerase-modulieren
den Wirkstoffen oder Verbindungen verwendet. Agenzien, die
die nucleäre Lokalisation oder Telomer-Lokalisation stören,
werden als Telomerase-Inhibitoren identifiziert. Für diesen
Zweck sind Tumorzellinien, die EGFP-hTRT stabil exprimieren,
verwendet. Potentielle Modulatoren von Telomerase werden
diesen transfizierten Zellen verabreicht und die Lokalisa
tion der EGFP-hTRT kann bewertet werden. Außerdem werden
FACS oder andere auf Fluoreszenz basierende Verfahren ver
wendet, um hTRT exprimierende Zellen selektieren zu können,
womit homogene Populationen für das Screenen von Wirkstoffen
bereitgestellt werden, insbesondere wenn die transiente
Transfektion von Zellen angewandt wird.
Bei anderen Anwendungen können Bereiche der hTRT zur Identi
fikation von Bereichen (z. B. Reste 193-196 (PRRR) und Reste
235-240 (PKRRRR)) mutagenisiert werden, die für die nucleäre
Lokalisation erforderlich sind, wobei diese Bereiche Ziele
für anti-Telomerase-Wirkstoffe (Modulatoren von Telomerase-
Aktivität) sind. Zu den weiteren Anwendungen gehören:
Verwendung des Fusionsproteins als Fluoreszenzmarker für die effiziente Zelltransfektion, sowohl für Experimente hin sichtlich transienter Transfektion als auch für die Etablie rung EGFP-hTRT-exprimierender stabiler Zellinien;
Expression eines hTRT-EGFP-Fusionsproteins mit mutierten Signalen für nucleäre Lokalisation (defizient für nucleäre Lokalisation) in unsterblichen Zellen, damit das hTRT-Mutan ten-EGFP alle hTR der unsterblichen Zellen einfängt, sie im Cytoplasma zurückhält und die Telomer-Aufrechterhaltung ver hindert;
Das GFP kann auch als ein "tag" für Immunpräzipitation ver wendet werden.
Verwendung des Fusionsproteins als Fluoreszenzmarker für die effiziente Zelltransfektion, sowohl für Experimente hin sichtlich transienter Transfektion als auch für die Etablie rung EGFP-hTRT-exprimierender stabiler Zellinien;
Expression eines hTRT-EGFP-Fusionsproteins mit mutierten Signalen für nucleäre Lokalisation (defizient für nucleäre Lokalisation) in unsterblichen Zellen, damit das hTRT-Mutan ten-EGFP alle hTR der unsterblichen Zellen einfängt, sie im Cytoplasma zurückhält und die Telomer-Aufrechterhaltung ver hindert;
Das GFP kann auch als ein "tag" für Immunpräzipitation ver wendet werden.
Dieses Beispiel beschreibt Experimente hinsichtlich der Ver
änderung von hTRT-Aminosäuren, sowie die Auswirkung von Ami
nosäureaustauschen in hTRT auf katalytische Aktivität von
Telomerase. Der Austausch von Aminosäuren und im Anschluß
daran die funktionelle Analyse ist ein Standardverfahren zur
Bewertung der Bedeutung und Funktion einer Polypeptidse
quenz. Dieses Beispiel zeigt, daß Veränderungen in den re
verse-Transkriptase (RT)- und Telomerase-T-Motiven katalyti
sche Aktivität von Telomerase beeinflussen und es liefert
eine zusätzliche Bestätigung der katalytischen Natur des
hTRT-Polypeptids.
Die übliche Nomenklatur wird zur Beschreibung der Mutanten
verwendet: Der Zielrest im nativen Molekül (hTRT) wird durch
den Ein-Buchstaben-Code und die Position angegeben und der
entsprechende Rest in dem Mutantenprotein ist durch den Ein-
Buchstaben-Code angegeben. Somit kennzeichnet beispielsweise
der Ausdruck "K626A" eine Mutante, bei der das Lysin an Po
sition 626 (d. h. im Motiv 1) von hTRT gegen ein Alanin aus
getauscht ist.
In einleitenden Experimenten wurde ein mutiertes hTRT-Pro
tein codierender Vektor, "F560A" hergestellt, bei dem die
Aminosäure 560 von SEQ. ID. Nr. 2 von Phenylalanin (F) zu
Alanin (A) durch ortsgerichtete Mutagenese von pGRN121 mit
tels Standardverfahren geändert wurde. Diese Mutation unter
bricht das TRT FFYxTE-Motiv. Es konnte gezeigt werden, daß
das erhaltene mutierte F560A-Polynucleotid die Synthese
eines hTRT-Proteins mit vollständiger Länge steuert, wie
dies unter Verwendung eines zellfreien Reticulocytenlysat-
Transkriptions/Translationssystem in Gegenwart von 35S-Me
thionin bestimmt werden konnte.
Bei Translation des mutierten Polypeptids zusammen mit hTRT,
wie in Beispiel 7 beschrieben, wurde mittels des TRAP-Assays
unter Verwendung von 20 PCR-Cyclen keine Telomerase-Aktivi
tät entdeckt, während die Kontroll-Cotranslation von hTRT-hTR-Ak
tivität rekonstituierte. Bei Verwendung von 30 PCR-Cyc
len im TRAP-Assay war Telomerase-Aktivität mit der mu
tierten hTRT nachweisbar, sie war jedoch beträchtlich gerin
ger im Vergleich zu der Kontroll (Wildtyp)-hTRT.
Konservierte Aminosäuren in sechs RT-Motiven wurden zu Ala
nin abgeändert, um ihren Beitrag zur katalytischen Aktivität
zu beurteilen, wobei Standardverfahren für die ortsgerich
tete Mutagenese verwendet wurden (siehe beispielsweise
Ausubel, a.a.O.). Die Mutanten wurden mittels IVR-Telomerase
untersucht, wobei der in Beispiel 7 ausführlich beschriebene
Zwei-Schritt-Assay (üblich/TRAP) verwendet wurde.
Die Mutanten K626A (Motiv 1), R631A (Motiv 2), D712A (Motiv
A), Y717A (Motiv A) und D868A (Motiv C) zeigten stark herab
gesetzte oder nicht-nachweisbare Telomerase-Aktivität, wäh
rend die Mutanten Q833A (Motiv B) und G932A (Motiv E) mitt
lere Aktivitätsspiegel aufwiesen. Zwei Mutationen außerhalb
der RT-Motive (R688A und D897A) zeigten Aktivität, die äqui
valent zu der Aktivität von Wildtyp-hTRT war. Diese Ergeb
nisse waren konsistent mit analogen Mutationen in reverser
Transkriptase (Joyce et al., Ann. Rev. Biochem. 63 (1994),
777), und ähnlich zu dem mit Est2P erhaltenen Ergebnissen
(siehe Lingner, Science 276 (1997), 561). Durch diese Expe
rimente konnten Reste in den RT-Motiven identifiziert wer
den, die für enzymatische Aktivität kritisch sind. Diese Ex
perimente zeigen auch das hTRT, das das katalytische Protein
von menschlicher Telomerase ist. Durch die Mutationen werden
hTRT-Polypeptidvarianten erzeugt, die als dominant-negative
Regulatoren von Telomerase-Aktivität verwendet werden kön
nen.
Durch Aminosäureausrichtung der bekannten TRTs konnte das
Telomerase-spezifische Motiv T (siehe vorstehend) identifi
ziert werden. Um die katalytische Rolle dieses Motivs in
hTRT zu bestimmen, wurde eine Deletion von sechs Aminosäuren
in diesem Motiv (Δ560-565; FFYxTE) unter Verwendung von
Standardverfahren für die ortsgerichtete Mutagenese konstru
iert (Ausubel, a.a.O.). Die Deletion wurde unter Verwendung
von IVR-Telomerase mittels in Beispiel 7 ausführlich be
schriebener Zwei-Schritt-Assays (üblich/TRAP) untersucht.
Die Mutante Δ560-565 zeigte keine nachweisbare Telomerase-
Aktivität nach 25 PCR-Cyclen, während Wildtyp-hTRT-IVR-Telo
merase ein starkes Signal erzeugte. Jeder Aminosäurerest in
Motiv T wurde auf ähnliche Weise unabhängig untersucht. Die
Mutanten F560A, Y562A, T564 und E565A behielten mittlere
Spiegel an Telomerase-Aktivität bei, während die Kontrollmu
tante F487A eine minimale Auswirkung auf die Aktivität
hatte. Bemerkenswerterweise zeigte die Mutante F561A eine
stark herabgesetzte oder nicht nachweisbare Telomerase-Akti
vität, während in ihrer "Revertante" F561A561F Aktivität
voll wiederhergestellt war. Bei der F561A561F befindet sich
an der mutierten Position wieder das ursprüngliche Phe
nylalanin. Dies stellt eine Kontrolle dar, die zeigt, daß
keine weiteren Aminosäureaustausche in dem Plasmid vorkamen,
die die beobachtete verringerte Aktivität hätten erklären
können. Somit ist das T-Motiv das erste Nicht-RT-Motiv, für
das gezeigt werden konnte, daß es für Telomerase-Aktivität
erforderlich ist.
Motiv T ist von Nutzen für die Identifizierung von TRTs von
anderen Organismen und als ein potentieller domi
nant/negativ-Regulator von Telomerase-Aktivität. Im Gegen
satz zu den meisten anderen RTs assoziierte Telomerase sta
bil mit einem kleinen Anteil einer einzelnen RNA (d. h. hTR)
und kopiert diesen prozessiv, somit könnte das Motiv T an
der Vermittlung der hTR-Bindung, der Prozessivität der Reak
tion oder anderen Funktionen beteiligt sein, die für die Te
lomerase-RT einzigartig sind.
In diesem Beispiel wird die Verwendung von in vitro-rekon
stituierter Telomerase zum Screenen und zur Identifizierung
von Modulatoren von Telomerase-Aktivität beschrieben. Der
beschriebene Assay kann leicht für Verfahren mit hohem
Durchsatz adaptiert werden (z. B. mittels Platten mit vielfa
chen Vertiefungen und/oder Robotertechniksystem). Für den
Fachmann sind die zahlreichen Variationsmöglichkeiten hin
sichtlich der Assayschritte offensichtlich.
Rekombinante Clone für Telomerase-Bestandteile (z. B. TRT
und hTRR) werden in einer in vitro-Reaktion wie folgt und in
dem vorstehend beschriebenen Beispiel 7 mittels des TNT® T7-ge
koppelten Reticulocytenlysat-Systems (Promega; das in US-Pa
tent Nr. 5,324,637 beschrieben ist und gemäß den Angaben
des Herstellers verwendet wurde) transkribiert und transla
tiert (nur hTRT):
Reagenz | |
Menge pro Reaktion (µl) | |
TNT-Kaninchen-Reticulocytenlysat | 25 |
TNT-Reaktionspuffer | 2 |
TNT T7-RNA-Polymerase | 1 |
AA-Gemisch (vollständig) | 1 |
"Prime" RNase-Inhibitor | 1 |
Nuclease-freies Wasser | 16 |
XbaI-geschnittenes pGRN121 (hTRT, 0,5 µg) | 2 |
FspI-geschnittenes pGRN164 (hTR, 0,5 µg) | 2 |
Die Reaktion wird 2 Stunden bei 30°C inkubiert. Danach wird
das Produkt auf einem "ultrafree-MC" DEAE-Filter (Millipore)
gereinigt.
Das rekombinante Telomerase-Produkt (IVRP) wird in Gegenwart
oder Abwesenheit vielfacher Konzentrationen an Testverbin
dungen, die in DMSO (z. B. 10 µM bis 100 µM) solubilisiert
wurden, untersucht. Die Testverbindungen werden 30 Minuten
bei Raumtemperatur in einem Gesamtvolumen von 25 µl vorinku
biert, in der Gegenwart von 2,5 µl IVRP, 2,5% DMSO und 1 ×
TRAP-Puffer (20 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,3, 1,5 mM MgCl2, 63 mM
KCl, 0,05% Tween 20, 1,0 mM EGTA und 0,1 mg/ml Rinderse
rumalbumin) vorinkubiert. Nach der Vorinkubation werden zu
jeder Probe 25 µl TRAP-Assay-Reaktionsgemisch zugegeben. Das
TRAP-Assay-Reaktionsgemisch besteht aus 1 × TRAP-Puffer, 50 µl
dNTP, 2,0 µg/ml Primer ACX, 4 µg/ml Primer U2, 0,8 Atto
mol/ml TSU2, 2 Einheiten 50 µl Taq-Polymerase (Perkin Elmer)
und 2 µg/ml [32P]5'-endmarkierter Primer TS (3000 Ci/mMol).
Die Röhrchen mit dem Reaktionsgemisch werden dann in den
PCR-Thermocycler (MJ Research) gestellt und die PCR wird wie
folgt durchgeführt: 60 Minuten bei 30°C, 20 Cyclen von je
weils 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 60°C und 30 Se
kunden bei 72°C, dann 1 Minute bei 72°C und Abkühlen auf
10°C. Der TRAP-Assay ist, wie bereits vorstehend erwähnt, in
dem US-Patent Nr. 5,629,154 beschrieben. Die verwendeten
Primer und Substrate haben die Sequenzen:
TS-Primer: (5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3');
ACX-Primer: (5'-GCGCGG[CTTACC]3CTAACC-3');
U2-Primer: (5'-ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3');
TSU2: (5'-AATCCGTCGAGCAGAGTTAAAAGGCCGAGAAGCGAT-3'):
TS-Primer: (5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3');
ACX-Primer: (5'-GCGCGG[CTTACC]3CTAACC-3');
U2-Primer: (5'-ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3');
TSU2: (5'-AATCCGTCGAGCAGAGTTAAAAGGCCGAGAAGCGAT-3'):
Nach Beendigung des PCR-Schritts werden zu jedem Reaktions
röhrchen 4 µl 10 × Bromphenolblau enthaltender Auftragspuf
fer zugegeben und die Produkte (20 µl) auf einem 12,5%igen
nicht-denaturierenden PAGE-Gel in 0,5 × TBE bei 400 V laufen
gelassen. Nach Beendigung des Gellaufs wird das Gel getrock
net und die TRAP-Produkte werden mittels des
"Phosphorimager" oder durch Autoradiographie sichtbar ge
macht. Die Telomerase-Aktivität in Gegenwart der Testverbin
dung wird dadurch gemessen, daß der Einbau der Markierung in
das Reaktionsprodukt mit einer Parallelreaktion ohne das
Agens verglichen wird.
Die folgenden in den Beispielen beschriebenen Clone wurden
bei der American Type Culture Collection, Rockville,
MD20852, USA hinterlegt.
Lambda-Phage λ 25-1.1: ATCC-Zugangsnummer 209024
pGRN121: ATCC-Zugangsnummer 209016
Lambda-Phage λGΦ5 ATCC-Zugangsnummer 98505.
Lambda-Phage λ 25-1.1: ATCC-Zugangsnummer 209024
pGRN121: ATCC-Zugangsnummer 209016
Lambda-Phage λGΦ5 ATCC-Zugangsnummer 98505.
Die vorliegende Erfindung stellt neue Verfahren und Substan
zen zur Diagnose und der Behandlung von mit Telomerase in
Zusammenhang stehenden Krankheiten bereit. Es wurden spezi
fische Beispiele bereitgestellt, die vorstehende Beschrei
bung dient jedoch nur zur Veranschaulichung und soll keine
Einschränkung darstellen. Für den Fachmann sind nach Lesen
der Beschreibung viele Variationsmöglichkeiten hinsichtlich
der Erfindung offensichtlich. Der Umfang der Erfindung wird
somit nicht durch die vorstehende Beschreibung bestimmt,
sondern soll durch die nachstehenden Patentansprüche zusam
men mit dem vollen Umfang ihrer Äquivalente bestimmt werden.
Alle in dieser Anmeldung zitierten Publikationen und Patent
dokumente sind aufgrund der Bezugnahme und für alle Zwecke
als Bestandteil der Beschreibung anzusehen und zwar in dem
gleichen Ausmaß als wenn jede einzelne Veröffentlichung oder
jedes einzelne Patentdokument individuell bezeichnet worden
wäre.
Claims (122)
1. Menschliches Telomerase-Reverse-Transkriptase (hTRT)-Pro
tein oder eine Variante oder ein Fragment davon.
2. Menschliches hTRT-Protein, wobei das Protein durch eine
Aminosäuresequenz gekennzeichnet ist mit mindestens 75%
Sequenzidentität zu dem hTRT-Protein SEQ. ID. Nr. 2
(Fig. 17) oder eine Variante oder ein Fragment davon.
3. hTRT-Protein nach Anspruch 1 mit der Sequenz SEQ. ID.
Nr. 2 oder ein Fragment davon.
4. hTRT-Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei
das Protein oder die Variante oder das Fragment davon
katalytische Aktivität von Telomerase haben.
5. hTRT-Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei
das Protein oder die Variante oder das Fragment davon
keine katalytische Aktivität von Telomerase haben.
6. hTRT-Protein nach einem der Ansprüche 2 bis 5, das min
destens 6 Aminosäurereste enthält.
7. Zusammensetzung, umfassend ein hTRT-Protein nach einem
der Ansprüche 1 bis 6 und eine RNA.
8. Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei die RNA eine Te
lomerase-RNA ist.
9. Zusammensetzung nach Anspruch 8, wobei die RNA eine
menschliche Telomerase-RNA ist.
10. Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei das hTRT-Protein
und die menschliche Telomerase-RNA einen Ribonucleopro
teinkomplex mit einer Telomerase-Aktivität bilden.
11. Zusammensetzung nach Anspruch 9 oder 10, wobei das
hTRT-Protein die Sequenz von SEQ. ID. Nr. 2 hat.
12. Menschliche Telomerase, umfassend das hTRT-Protein nach
einem der Ansprüche 1 bis 6 und menschliche Telomerase-
RNA (hTR).
13. Menschliche Telomerase nach Anspruch 12, die mindestens
etwa 95% rein ist.
14. Menschliche Telomerase nach Anspruch 12 oder 13, die
aus einer Zelle isoliert wurde.
15. Nucleinsäuresequenz, die ein hTRT-Protein oder ein
Fragment davon codiert.
16. Nucleinsäuresequenz, die ein hTRT-Protein codiert, wo
bei das hTRT-Protein eine wie in SEQ. ID. Nr. 2 angege
bene Aminosäuresequenz hat, oder eine Sequenz, die
einen oder mehrere konservative Substitutionen in der
Aminosäuresequenz umfaßt.
17. Nucleinsäuresequenz nach Anspruch 15 oder 16, wobei das
hTRT-Protein die in SEQ. ID. Nr. 2 dargestellte Amino
säuresequenz hat.
18. Nucleinsäuresequenz nach Anspruch 17 mit der in Fig.
16 gezeigten Sequenz.
19. Nucleinsäuresequenz, die ein hTRT-Protein codiert oder
ein Fragment oder eine Variante davon, wobei die
Nucleinsäuresequenz eine kleinste Wahrscheinlichheit
der Summe von weniger als etwa 0,5 hat im Vergleich zu
einer in SEQ. ID. Nr. 1 angegebenen Nucleinsäurese
quenz, wobei ein BLAST-Algorythmus mit Voreinstellungs
parametern verwendet wird.
20. Nucleinsäuresequenz nach Anspruch 15, die unter strin
genten Bedingungen mit einer Nucleinsäuresequenz von
SEQ. ID. Nr. 1 hybridisiert.
21. Polynucleotid, umfassend eine Nucleinsäuresequenz nach
einem der Ansprüche 15 bis 20.
22. Polynucleotid nach Anspruch 21, umfassend eine mit der
hTRT-Protein codierenden Nucleinsäuresequenz funktio
nell verknüpfte Promotorsequenz.
23. Polynucleotid nach Anspruch 22, wobei der Promotor kein
natürlich vorkommender hTRT-Promotor ist.
24. Ein im wesentlichen reines Polynucleotid, das eine
Länge von mindestens 10 Nucleotiden hat und eine auf
einanderfolgende Sequenz von mindestens 10 Nucleotiden
umfaßt, die zu einer aufeinanderfolgenden Sequenz in
einem natürlich vorkommenden hTRT-Gen oder einer hTRT-mRNA
identisch oder genau komplementär ist.
25. Nucleinsäuresequenz oder Polynucleotid nach einem der
Ansprüche 15 bis 24, die/das eine DNA oder RNA ist.
26. Nucleinsäuresequenz oder Polynucleotid nach einem der
Ansprüche 15 bis 25, umfassend ein oder mehrere nicht
natürlich vorkommende(s) synthethische(s) Nucleotid(e).
27. Nucleinsäuresequenz oder Polynucleotid nach einem der
Ansprüche 15 bis 25, die/das zu der zusammenhängenden
Sequenz in einem natürlich vorkommenden hTRT-Gen oder
einer hTRT-mRNA identisch ist.
28. Nucleinsäuresequenz oder Polynucleotid nach einem der
Ansprüche 15 bis 25, die/das zu der zusammenhängenden
Sequenz in einem natürlich vorkommenden hTRT-Gen oder
einer hTRT-mRNA genau komplementär ist.
29. Nucleinsäuresequenz, die eine "antisense"-Nucleinsäure
sequenz einer Nucleinsäuresequenz bzw. eines Poly
nucleotids nach einem der Ansprüche 15 bis 27 ist.
30. "Antisense"-Polynucleotid nach Anspruch 29, umfassend
mindestens etwa 20 Nucleotide.
31. Expressionsvektor, der eine Nucleinsäuresequenz oder
ein Polynucleotid nach einem der Ansprüche 15 bis 30
umfaßt.
32. Zelle, die eine Nucleinsäuresequenz oder ein Poly
nucleotid nach einem der Ansprüche 15 bis 31 enthält.
33. Zelle nach Anspruch 32, die eine menschliche Zelle ist.
34. Zelle nach einem der Ansprüche 32 oder 33, die eine er
höhte Proliferationskapazität hat im Vergleich zu einer
Zelle, die zwar ansonsten identisch ist, jedoch die
Nucleinsäuresequenz oder das Polynucleotid nicht ent
hält.
35. Zelle nach einem der Ansprüche 32 oder 33, die einen
erhöhten Spiegel an Telomerase-Aktivität hat im Ver
gleich zu einer Zelle, die zwar ansonsten identisch
ist, jedoch das rekombinante Polynucleotid nicht ent
hält.
36. Zelle nach einem der Ansprüche 32 bis 35, die unsterb
lich ist.
37. Nicht-menschlicher Organismus, umfassend eine Nuclein
säuresequenz oder ein Polynucleotid nach einem der An
sprüche 15 bis 30 oder den Expressionsvektor nach An
spruch 31.
38. Organismus nach Anspruch 37, wobei der Organismus eine
Maus, Hefe oder ein Bakterium ist.
39. Antikörper oder Fragment davon, die an ein hTRT-Protein
nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder 12 bis 14 spezi
fisch binden.
40. Antikörper oder Fragment nach Anspruch 39, wobei der
Antikörper oder das Fragment mit einer Affinität von
mindestens etwa 108M⁻1 binden.
41. Zelle, die den Antikörer nach Anspruch 39 oder 40 se
zernieren kann.
42. Zelle nach Anspruch 41, die ein Hybridom ist.
43. Zusammensetzung, umfassend einen Antikörper nach An
spruch 39 oder 40.
44. Zusammensetzung nach Anspruch 43, wobei der Antikörper
ein monoclonaler Antikörper ist.
45. Verfahren zur Untersuchung, ob eine Verbindung oder Be
handlung ein Modulator einer Telomerase-Reverse-Tran
skriptase-Aktivität oder eine hTRT-Expression ist, um
fassend im Anschluß an die Verabreichung der Verbindung
oder Behandlung den Nachweis einer Veränderung in der
Aktivität oder Expression in einer Zelle, einem Tier
oder einer Zusammensetzung, umfassend ein hTRT-Protein
oder Polynucleotid.
46. Verfahren zur Untersuchung, ob eine Testverbindung ein
Modulator einer Telomerase-reverse-Transkriptase-Akti
vität ist, wobei das Verfahren folgende Schritte um
faßt:
- a) Bereitstellung eines Proteins nach einem der An sprüche 1 bis 6 oder 12 bis 14;
- b) Inkontaktbringen des Proteins mit der Testverbin dung; und
- c) Messung der Aktivität des hTRT-Proteins, wobei eine Veränderung in der Telomerase-reverse Tran skriptase-Aktivität, die in Gegenwart der Testver bindung gemessen wurde, im Vergleich zu der Aktivi tät in Abwesenheit der Testverbindung einen Nach weis dafür liefert, daß die Testverbindung die te lomerase-reverse-Transkriptase-Aktivität moduliert.
47. Verfahren nach Anspruch 46, wobei die Zusammensetzung
eine Zelle ist, ein rekombinantes, hTRT-Polypeptid co
dierendes Polynucleotid enthaltend.
48. Verfahren nach Anspruch 46, wobei die Zusammensetzung
ein nicht-menschlicher Organismus ist, ein hTRT-Poly
peptid codierendes Polynucleotid enthaltend.
49. Verfahren nach Anspruch 46 oder 47, wobei die menschli
che Telomerase-reverse Transkriptase ein Produkt einer
in vitro-Expression ist.
50. Verfahren nach einem der Ansprüche 46 bis 49, wobei die
telomerase-reverse Transkriptase-Aktivität durch Über
wachung des Einbaus einer Nucleotidmarkierung in ein
Substrat für Telomerase gemessen wird.
51. Verfahren nach einem der Ansprüche 46 bis 49, wobei te
lomerase-reverse Transkriptase-Aktivität durch Überwa
chung der Hybridisierung einer Sonde mit einem verlän
gerten Telomerasesubstrat gemessen wird.
52. Verfahren nach einem der Ansprüche 46 bis 49, wobei die
telomerase-reverse-Transkriptase-Aktivität durch Über
wachung der Amplifikation eines verlängerten Telome
rasesubstrats gemessen wird.
53. Verfahren nach einem der Ansprüche 46 bis 49, wobei die
telomerase-reverse Transkriptase-Aktivität durch Über
wachung der Telomerlänge einer gegen die Testverbindung
exponierten Zelle gemessen wird.
54. Verfahren nach einem der Ansprüche 46 bis 49, wobei die
telomerase-reverse Transkriptase-Aktivität durch Über
wachung des Verlusts der Fähigkeit der Telomerase an
ein Chromoson zu binden, gemessen wird.
55. Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die
hTRT-Aktivität moduliert, wobei das Verfahren die fol
genden Schritte umfaßt: Inkontaktbringen von hTRT mit
der Verbindung und Messung einer Veränderung einer Ei
genschaft oder Aktivität von hTRT, wobei eine stati
stisch signifikante Veränderung die Verbindung als ein
Modulator von hTRT-Aktivität identifiziert.
56. Verfahren zur Herstellung rekombinanter Telomerase nach
einem der Ansprüche 1 bis 6, das die Züchtung einer
Zelle nach Anspruch 32 oder 33 und die Isolierung des
Proteins aus der Kultur umfaßt.
57. Verfahren nach Anspruch 56, das ferner das Inkontakt
bringen des rekombinanten hTRT-Proteins mit einem Telo
merase-RNA-Bestandteil umfaßt, unter solchen Bedingun
gen, daß das rekombinante Protein und der Telomerase-
RNA-Bestandteil zur Bildung eines Telomerase-Enzyms as
soziieren, das die Anfügung von Nucleotiden an ein Te
lomerasesubstrat katalysieren kann.
58. Verfahren nach Anspruch 56 oder 57, wobei das hTRT-Pro
tein in einem in vitro-Expressionssystem hergestellt
wird.
59. Verfahren nach Anspruch 58, wobei eine Telomerase-RNA
in dem in vitro-Expressionssystem coexprimiert wird.
60. Verfahren nach einem der Ansprüche 56 bis 59, wobei die
Telomerase-RNA menschliche Telomerase-RNA ist.
61. Verfahren nach einem der Ansprüche 56 bis 60, wobei
eine Telomerase-RNA mit dem hTRT vermischt ist.
62. Verfahren nach einem der Ansprüche 56 bis 61, wobei das
Inkontaktbringen in einer Zelle geschieht.
63. Verfahren nach einem der Ansprüche 56 bis 62, wobei die
Telomerase-RNA von der Zelle natürlich exprimiert wird.
64. Verfahren nach Anspruch 63, wobei vor dem Inkontakt
bringen die Zelle eine Telomerase-Aktivität exprimiert.
65. Verfahren nach Anspruch 64, wobei nach der Inkontakt
bringung die Zelle Telomerase-Aktivität exprimiert.
66. Verfahren nach einem der Ansprüche 56 bis 65, wobei die
Zelle eine menschliche Zelle ist.
67. Verfahren zum Nachweis eines hTRT-Genprodukts in einer
Probe, umfassend:
- a) Inkontaktbringen der Probe mit einer Sonde, die das Genprodukt spezifisch bindet, wobei die Sonde und das Genprodukt einen Komplex bilden und Nachweis des Komplexes; oder
- b) spezifische Amplifikation des Genprodukts in der biologischen Probe, wobei das Genprodukt eine Nucleinsäure ist, und Nachweis des Amplifikations produkts,
68. Verfahren nach Anspruch 67, wobei das Genprodukt eine
RNA ist.
69. Verfahren nach Anspruch 67 oder 68, wobei die Sonde
eine Nucleinsäure ist.
70. Verfahren nach Anspruch 67 oder 68, wobei das Genpro
dukt ein Polypeptid ist.
71. Verfahren nach Anspruch 67 oder 70, wobei die Sonde ein
Antikörper ist.
72. Verfahren nach einem der Ansprüche 67 bis 71, wobei die
Probe von einem Menschen stammt.
73. Verfahren nach einem der Ansprüche 67 bis 72, wobei die
Probe mindestens eine Zelle enthält.
74. Verfahren nach einem der Ansprüche 67 bis 73, wobei das
Inkontaktbringen oder die Amplifikation in einer intak
ten Zelle geschehen.
75. Verfahren nach einem der Ansprüche 67 bis 73, wobei das
Inkontaktbringen oder die Amplifikation in einem Zell
extrakt geschehen.
76. Verfahren nach einem der Ansprüche 73 bis 75, wobei die
Zelle eine menschliche Zelle ist.
77. Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins von minde
stens einer telomerase-positiven menschlichen Zelle in
einer, menschliche Zellen enthaltenden biologischen
Probe, wobei das Verfahren die folgenden Schritte um
faßt:
- a) Bestimmung der Menge an hTRT-Genprodukt in der Probe,
- b) Vergleich der gemessenen Menge mit einer Kontrolle, die mit einer, keine telomerase-positiven Zellen enthaltenden Probe korreliert,
78. Verfahren nach Anspruch 77, wobei die telomerase-posi
tiven Zellen Krebszellen sind.
79. Verfahren nach Anspruch 77, wobei die telomerase-posi
tiven Zellen unsterbliche Zellen sind.
80. Verfahren nach Anspruch 77, wobei die telomerase-posi
tiven Zellen fötale Zellen sind.
81. Verfahren zur Diagnose eines mit Telomerase in Zusam
menhang stehenden Zustands in einem Patienten, umfas
send:
- a) Gewinnung einer Zellprobe oder Gewebeprobe von dem Patienten;
- b) Bestimmung der Menge an hTRT-Genprodukt in der Zelle oder dem Gewebe; und
- c) Vergleich der Menge an hTRT-Genprodukt in der Zelle oder dem Gewebe mit der Menge in einer gesunden Zelle oder einem gesunden Gewebe des gleichen Typs;
82. Verfahren nach Anspruch 81, wobei die Menge in der
Probe höher ist im Vergleich zur Menge in gesunden Zel
len oder gesundem Gewebe und wobei der mit Telomerase
in Zusammenhang stehende Zustand Krebs ist.
83. Verfahren zur Krebsdiagnose, wobei das Verfahren um
faßt:
- a) Gewinnung einer biologischen Probe von einem Pati enten; und
- b) Nachweis eines hTRT-Genprodukts in der Patienten probe;
84. Verfahren zur Krebsdiagnose, wobei das Verfahren um
faßt:
- a) Gewinnung einer Patientenprobe;
- b) Bestimmung der Menge an hTRT-Genprodukt in der Pa tientenprobe; und
- c) Vergleich der Menge an hTRT-Genprodukt mit einem Normalwert,
85. Verfahren zur Krebsdiagnose, wobei das Verfahren um
faßt:
- a) Gewinnung einer mindestens eine Zelle enthaltenden Patientenprobe;
- b) Bestimmung der Menge eines hTRT-Genprodukts in ei ner Zelle in der Probe; und
- c) Vergleich der Menge an hTRT-Genprodukt in der Zelle mit einem für die Zelle normalen Wert,
86. Verfahren nach Anspruch 85, wobei die Probe mindestens
eine maligne Zelle enthält.
87. Verfahren zur Bereitstellung einer Prognose für einen
Krebspatienten, wobei das Verfahren umfaßt:
- a) Bestimmung der Menge an hTRT-Genprodukt in einer von dem Patienten entnommenen Krebszelle; und
- b) Vergleich der Menge an hTRT in der Krebszelle mit einem prognostischen Wert für hTRT pro Krebszelle der konsistent mit einer Prognose für Krebs ist;
88. Verfahren zur Überwachung der Wirksamkeit Fähigkeit ei
ner Antikrebsbehandlung hinsichtlich der Erniedrigung
die Proliferationskapazität von Krebszellen in einem
Patienten, wobei das Verfahren umfaßt:
- a) Durchführung einer ersten Messung der Menge eines hTRT-Genprodukts in mindestens einer Krebszelle des Patienten;
- b) Durchführung einer zweiten Messung des Spiegels des hTRT-Genprodukts in mindestens einer Krebszelle des Patienten, wobei die Antikrebsbehandlung dem Pati enten vor der zweiten Messung verabreicht wird oder zur gleichen Zeit; und
- c) Vergleich der ersten mit der zweiten Messung, wobei ein niedrigerer Spiegel des hTRT-Genprodukts bei der zweiten Messung mit der Wirksamkeit einer An tikrebsbehandlung hinsichtlich der Erniedrigung der Proliferationskapazität von Krebszellen in dem Pa tienten korreliert ist.
89. Kit zum Nachweis eines hTRT-Gens oder -genprodukts, wo
bei der Kit ein Molekül enthält, ausgewählt aus einer
Nucleinsäuresequenz oder einem Polynucleotid nach einem
der Ansprüche 15 bis 30 oder einem Teil davon, einem
wie in einem der Ansprüche 1 bis 14 definierten hTRT-Poly
peptid oder einer Teilsequenz davon und dem Anti
körper von Anspruch 39 oder 40.
90. Kit zum Nachweis eines hTRT-Gens oder -genprodukts,
enthaltend ein Primerpaar, das zur Amplifikation eines
Teils eines hTRT-Gens oder einer hTRT-mRNA verwendet
werden kann.
91. Kit nach Anspruch 89 oder 90, umfassend eine Oligo
nucleotidsonde, die mit hTRT-mRNA spezifisch hybridi
sieren kann.
92. Verfahren zur Steigerung der Proliferationskapazität
einer Vertebratenzelle, dadurch gekennzeichnet, daß die
Expression von hTRT in der Zelle gesteigert wird.
93. Verfahren zur Steigerung der Proliferationskapazität
einer Vertebratezellen durch Einführung eines rekom
binanten Polynucleotids in die Zelle, wobei das Poly
nucleotid eine, ein hTRT-Polypeptid codierende Sequenz
umfaßt und wobei die Sequenz mit einem Promotor funk
tionell verknüpft ist.
94. Verfahren nach Anspruch 93, wobei das hTRT-Polypeptid
eine katalytische Aktivität von Telomerase hat.
95. Verfahren nach Anspruch 93 oder 94, wobei das hTRT-Po
lypeptid eine Sequenz von SEQ. ID. Nr. 2 hat.
96. Verfahren nach einem der Ansprüche 93 bis 95, wobei die
Zelle eine Säugerzelle ist.
97. Verfahren nach Anspruch 96, wobei die Zelle eine men
schliche Zelle ist.
98. Verfahren nach Anspruch 97, wobei die Zelle von einem
menschlichen Patienten stammt.
99. Verfahren nach einem der Ansprüche 93 bis 98, wobei die
Zelle in vitro kultiviert wird.
100. Verfahren nach einem der Ansprüche 93 bis 99, außerdem
die Einführung eines Polynucleotids in eine Zelle um
fassend, das eine mit einem Promotor funktionell ver
knüpfte, menschliche Telomerase-RNA codierende Sequenz
umfaßt.
101. Verfahren zur Steigerung der Proliferationskapazität
einer Vertebratenzelle, wobei das Verfahren die Einfüh
rung einer wirksamen Menge des hTRT-Polypeptids in die
Zelle umfaßt.
102. Verfahren nach einem der Ansprüche 92 bis 101, wobei
das hTRT-Polypeptid katalytische Aktivität von Telome
rase hat.
103. Arzneimittel, umfassend ein Molekül ausgewählt aus ei
nem hTRT-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 14,
einer ein hTRT-Polypeptid codierenden Nucleinsäure oder
einem Polynucleotid nach einem der Ansprüche 15 bis 30
und dem Antikörper oder Fragment davon nach einem der
Ansprüche 39 oder 40, gegebenenfalls in Kombination mit
einem pharmazeutisch verträglichen Träger.
104. Arzneimittel, umfassend einen Inhibitor der Telomerase-
Aktivität, gegebenenfalls in Kombination mit einem
pharmazeutisch verträglichen Träger.
105. Arzneimittel nach Anspruch 104, wobei der Inhibitor ein
hTRT-Polypeptid, ein hTRT-Antikörper oder ein hTRT-Po
lynucleotid ist.
106. Arzneimittel nach Anspruch 104 oder 105, wobei der In
hibitor eine Sequenz von SEQ. ID. Nr. 2 oder Unterse
quenz oder Variante davon enthaltendes Polypeptid ist.
107. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 104 bis 106, wo
bei das Polypeptid Nicht-Standardreste oder derivati
sierte Reste enthält.
108. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 104 bis 107, wo
bei das Polypeptid die Bindung von endogener hTRT an
hTR hemmt.
109. Impfstoff, enthaltend ein hTRT-Polypeptid und ein Adju
vans.
110. Fusionsprotein codierendes Polynucleotid, wobei das Fu
sionsprotein eine Sequenz eines hTRT-Proteins, wie in
einem der Ansprüche 1 bis 6 definiert, enthält oder
eine Teilsequenz davon.
111. Rekombinantes Polynucleotid, eine hTRT-Promotorsequenz
umfassend.
112. Polynucleotid nach Anspruch 111, wobei die hTRT-Promo
torsequenz mit einer Protein-codierenden Sequenz funk
tionell verknüpft ist.
113. Polynucleotid nach Anspruch 112, wobei die Protein-co
dierende Sequenz nicht hTRT codiert.
114. Verfahren zur Isolierung einer ausgewählten Nuclein
säure mit unbekannter Sequenz, die in einer längeren
Nucleinsäure enthalten ist, wobei das Verfahren umfaßt:
- a) Inkontaktbringen der Nucleinsäure mit einem Oligo nucleotidprimerpaar zur Bildung eines Reaktionsge misches, wobei das Primerpaar mindestens einen Pri mer umfaßt, der ein Primergemisch mit unterschied lichen Sequenzen ist, und wobei mindestens einer der Primer mit einer bindenden Einheit unter sol chen Bedingungen markiert ist, daß die Primer mit komplementären Sequenzen in der Nucleinsäure hybri disieren können und durch Anfügung von Nucleotiden an das 3'-Ende des Primers verlängert werden, zur Bildung von verlängerten, mit der Nucleinsäure hy bridisierten Primern;
- b) Erhitzen oder eine andere Behandlung des in Schritt a) gebildeten Reaktionsgemisches zur Denaturierung verlängerter, mit der Nucleinsäure hybridisierter Primer, und danach Wiederholung des Schritts des Inkontaktbringens a);
- c) Wiederholung von Schritt (b) mindestens ein bis 10 Mal,
- d) Inkontaktbringen des Reaktionsgemisches mit einem, an einen festen Träger immobilisierten Agens, wobei das Agens die bindende Einheit spezifisch bindet und die verlängerten, die bindende Einheit umfas senden Primer unter solchen Bedingungen so bindet, daß doppelsträngige Nucleinsäuren während des Schritts des Inkontaktbringens nicht denaturiert werden;
- e) Entfernung unspezifisch gebundener Substanzen von dem festen Träger zur Herstellung eines trägerge bundenen Gemisches von Nucleinsäuren;
- f) Erhitzen oder anderweitige Behandlung des trägerge bundenen Gemisches von Nucleinsäuren unter solchen Bedingungen, daß das Agens an die bindende Einheit gebunden bleibt und doppelsträngige Nucleinsäuren zur Bildung einzelsträngiger Nucleinsäuren denatu rieren; und
- (g) Isolierung jeder einzelsträngigen Nucleinsäure, die nach dem Erhitzungsschritt (e) an den Träger gebun den ist.
115. Verfahren nach Anspruch 114, wobei das Verfahren außer
dem die Durchführung einer zweiten Amplifikationsreak
tion mittels der in Schritt (g) isolierten einzelsträn
gigen Nucleinsäure umfaßt.
116. Verfahren nach Anspruch 114 oder 115, wobei die bin
dende Einheit Biotin ist und das Agens Avidin oder ein
avidinyliertes Molekül.
117. Die Verwendung eines die Expression von hTRT erhöhenden
Agens zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung
eines Zustands, der durch Steigerung der Proliferati
ons-Kapazität einer Vertebratenzelle behandelt werden
kann.
118. Verwendung nach Anspruch 117, wobei das Medikament zur
Hemmung einer Auswirkung der Alterung ist.
119. Die Verwendung eines Inhibitors von Telomerase-Aktivi
tät zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung
eines Zustands, der mit einem erhöhten Spiegel an Telo
merase-Aktivität innerhalb einer menschlichen Zelle as
soziiert ist.
120. Die Verwendung einer Nucleinsäuresequenz oder eines Po
lynucleotids nach einem der Ansprüche 15 bis 30 zur Un
tersuchung oder dem Screenen (nach) einer hTRT-Gense
quenz oder einer hTRT-mRNA.
121. Die Verwendung einer Nucleinsäuresequenz oder eines Po
lynucleotids nach einem der Ansprüche 15 bis 30 zur
Herstellung rekombinanter Wirtszellen.
122. Die Verwendung des Proteins nach einem der Ansprüche 1
bis 6, der Telomerase nach einem der Ansprüche 12 bis
14, des Polynucleotids nach einem der Ansprüche 15 bis
30 oder des Antikörpers oder Fragments nach Anspruch 39
oder 40 zur Herstellung eines Medikaments zur Hemmung
einer Auswirkung der Alterung oder von Krebs ist.
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