KR20010096991A - 텔로머레이즈의 프로모터에 특정하게 결합하는더블유티이1 절편, 그 유전자, 발현벡터 및 그것을 이용한세포성장 억제 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 텔로머레이즈의 프로모터에 특정하게 결합하는 WT1과 상기 절편을 코딩하는 유전자 절편을 발현 플라즈미드에 서브클로닝하고, 서브클로닝된 플라즈미드를 텔로머레이즈 양성 세포에 트랜스펙션하는 단계를 포함하는 텔로머레이즈를 생산하는 종양세포의 성장을 억제하는 방법을 제공한다.

Description

텔로머레이즈의 프로모터에 특정하게 결합하는 더블유티이1 절편, 그 유전자, 발현벡터 및 그것을 이용한 세포성장 억제 방법{WT1 fragment specifically binding telomerase promoter, the gene, the expression vector and method for inhibiting cell growth by the fragment}
본 발명은 특정 유전자를 발현하는 세포의 성장을 억제하는 WT1 절편과 그 억제 방법에 대한 발명으로서, 더욱 상세하게는 인간 텔로머레이즈 역전사효소(human telomerase reverse transcriptase)를 만드는 세포의 성장을 억제하는 WT1 절편과 그 절편을 이용하여 텔로머레이즈 역전사 효소를 만드는 세포를 억제하는 방법에 관한 것이다.
텔로머레이즈는 염색체 말단에서 반복되는 서열을 합성하는 리보 핵단백질이다. 복제 노쇠의 텔로미어 가설에 있어서, 정상적인 체세포에서는 텔로머레이즈가 없어서 매 세포분열마다 텔로미어가 줄어들어서, 치사조절 지점인 M1에 도달하면, 세포가 분열을 멈춘다. 이 제한은 p53, Rb와 같은 종양억제유전자의 불활성화에 의해 극복될 수 있고, 세포가 다시 복제하여 두 번째 치사조절 지점인 M2에 도달할 때까지 그들의 텔로미어가 더 감소된다. 이 지점에서 많은 유전자 불안정화가 있고, 대부분의 세포는 죽으나, 극히 일부세포에서 텔로머레이즈의 활성이 염색체를 안정시키고, 세포분열을 재개한다. 따라서 텔로머레이즈의 활성화에 의한 텔로미어 길이의 유지는 종종 세포불멸과 관련이 있고, 인간 암의 발생에 주된 단계를 구성할 것이다.
인간 텔로머레이즈의 촉매단위체를 코딩하는 유전자의 클로닝이 텔로미어 가설의 직접실험을 가능케 했다. 인간 텔로머레이즈의 발현은 정상 인체세포에서 텔로머레이즈 활성을 재구성하였고, 일부 정상 체세포의 불멸을 가능케 하였다. 또한 인간 텔로머레이즈 mRNA는 텔로머레이즈 양성 종양세포에서 검출되지만, 그 활성이 없는 것으로 알려진 정상 체세포에서는 검출되지 않았다. 게다가 그것은 세포 불멸화 과정 동안 텔로머레이즈 활성을 유도하고, 유도된 분화 동안 텔로머레이즈 활성과 관련하여 다운 레귤레이트된다. 이들 모든 자료는 인간 텔로머레이즈 mRNA 발현이 텔로머레이즈 활성의 속도결정 단계이다라는 것을 암시하므로, 인간 텔로머레이즈 유전자의 억제와 탈억제는 종양세포에서 텔로머레이즈의 활성화에 직접 관련되어 있을 것이다.
최근, Myc 발암유전자 산물이 인간 텔로머레이즈 유전자 활성화에 관련이 있다는 것이 밝혀졌다. 그러나 인간 텔로머레이즈 유전자를 억제하거나, 활성을 감소하는 인자에 대해서는 거의 알려져 있지 않았다. 따라서 텔로머레이즈 유전자의 발현을 억제하는 인자를 밝혀낼 필요성이 있었다.
본 발명은 상기한 필요성에 의해 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 텔로머레이즈를 생산하는 세포의 성장을 억제하는 절편과 그 절편을 이용한 세포의 성장을 억제하는 방법을 제공하는 것이다.
도 1은 293 및 WI38 세포에서의 인간 텔로머레이즈 역전사 효소 프로모터의 활성의 차이에 대한 그림이고,
도 2는 cDNA 발현 클로닝 분석에 대한 그림이고,
도 3은 인간 텔로머레이즈 역전사 효소 프로모터와 WT1의 직접 작용하는 것을 보여주는 그림이다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 텔로머레이즈의 프로모터에 특정하게 결합하는 WT1 절편을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 WT1 절편을 코딩하는 유전자 및 그 유전자를 발현하기 위한 발현벡터를 제공한다.
상기 발현벡터는 pET25 발현 플라즈미드인 것이 적당하다.
또한 본 발명은 상기 WT1 절편을 코딩하는 유전자 절편을 발현 플라즈미드에 서브클로닝하고, 서브클로닝된 플라즈미드를 텔로머레이즈 양성 세포에 트랜스펙션하는 단계를 포함하는 텔로머레이즈를 생산하는 세포의 성장을 억제하는 방법을 제공한다.
WT1 단백질은 C 말단에 4개의 인접한 징크 핑거와 N 말단에 글루타민과 프로린이 풍부한 지역을 갖는 429 아미노산으로 구성된 단백질이다. WT1의 징크 핑거부분은 초기 성장 반응(Egr-1)DNA의 특정 부분이나 PDGF-A 체인 프로모터의 특정 부분과 상호작용을 한다. WT1은 일부 세포의 핵에서 발현되고, DNA 결합 전사 인자의 구조적 특성을 갖는다. WT1을 코딩하는 wt1유전자는 염색체 11p13에 존재하고, 이것이 돌연변이가 일어나면 Wilms 종양으로 발전된다.
본 발명은 Sambrook 등의 Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2 판에 기재된 통상적인 방법에 의해 클로닝 등을 수행하였다.
이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로서 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
A. 인간 텔로머레이즈 프로모터-리포터 컨스트럭트의 제조
인간 정자 지노믹 DNA의 BAC 라이브러리를 인간 텔로머레이즈 유전자의 5′말단에 해당하는 PCR에 의해 생성된 0.2 kb DNA 절편으로 스크린하였다. 3396 bp의 인간 텔로머레이즈 프로모터 부분의 일련의 결실을 PCR과 제한효소 처리로 만들어서 아래에서 기술한 표지유전자 분석을 위해서 반딧불이 루시퍼레이즈 표지 플라즈미드인 pGL3-Basic에 서브클로닝하였다. 얻어진 인간 텔로머레이즈 프로모터 부분내의 WT1 결합서열은 사이트-디렉티드 돌연변이에 의해서 CCCGCGCGG에서 CAAGCGTTG로 변하였다. 서열변화는 DNA 서열분석으로 확인하였다.
B. 발현 cDNA 라이브러리의 제조
이중 나선 cDNA를 SuperScript Plasmid System(Gibco BRL)에 의해서 다음과같은 방법으로 제조하였다. 인간 정상 신장조직에서 5 ug의 폴리(A+)RNA에서 합성된 NotI-올리고(dT)프라임된 cDNA를 젤 여과에 의해서 분리하여 BamHI 어뎁터에 연결하였다. 이 cDNA를 CMV 프로모터와 SV 40 오리진을 갖는 Invitrogen의 pcDNA1.1/Amp 플라즈미드에 클로닝하였다. 라이게이션 혼합물의 일부를 적합한 Gibco BRL 사의 대장균 MAX Efficiency DH10B 세포에 형질전환하여서 106이상의 재조합체를 갖는 지향성(directional) cDNA 라이브러리를 만들었다. 이 라이브러리를 풀(pool) 당 약 100 cDNA의 풀로 나누었다. 플라즈미드 풀을 LB 배지에서 밤새 배양하고 플라즈미드 DNA를 정제하였다. 풀들을 293T 세포에 트랜스펙트하였고, SV40 T 항원을 발현하였고, 아래와 같은 방법으로 분석하였다. 양성 풀에서 온 DNA를 대장균 DH5α세포에 형질전환하여 이후 트랜스펙트할 분류된 서브풀을 만들었다.
C. 트랜스펙트와 표지유전자 분석
293(T)과 HeLa 세포를 Boehringer Mannheim사의 Fugene 또는 Gibco BRL사의 Lipofectamine과 같은 리포좀 시약을 사용하여 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션 효율을 표준화하기 위해서, 비조절된 CMV 프로모터의 조절하에서 renilla 루시퍼레이즈 유전자를 발현하는 프로메가(Promega)사의 pRL-CMV를 코트랜스펙션시켰다. pGL3-hTERT : pRL-CMV 프로모터 플라즈미드의 코트랜스펙션에는 100:1의 비가 사용되었다. Promega사의 Dual-Luciferase Reporter Assay System을 사용하여 트랜스펙션 후 24-48 시간사이에 루시퍼레이즈 표지유전자 발현을 분석하였다. 표준화된 루시퍼레이즈 활성은 반딧불이 루시퍼레이즈의 상대적 광 단위 대 renilla 루시퍼레이즈의 상대적 광 단위로 정하였다.
D. 텔로머레이즈 효소, RNase 방어, 전기영동적 모빌리티 이동 분석
세포 추출액을 제조하여 텔로머레이즈 활성을 TRAP사의 PCR에 의한 텔로머레이즈 반복 증폭 방법을 사용하여 20 ng의 단백질로 측정하였다. 총 RNA는 Gibco BRL사의 Trizol 시약으로 제조하였고, 아래에 기재된 바와 같은 인간 텔로머레이즈 mRNA 수준은 결정하기 위하여 RNase 방어 실험을 사용하였다. RNA 양을 표준화하기 위하여 액틴을 사용하였다. 전기영동적 모빌리티 이동분석은 야생과 돌연변이 WT1결합자리서열을 갖는 두 줄의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 분석하였다. WT1 단백질의 DNA 결합 도메인을 코딩하는 DNA 절편을 Novagen사의 pET25 발현플라즈미드에 서브클로닝하였다. 재조합 히스티딘 부착된 WT1 단백질을 니켈 친화 크로마토그래피를 사용하여 대장균 BL21(DE3)LysS로부터 정제하였다.
실험예
A. 모털(mortal)과 임모털(immortal)세포내의 다른 인간 텔로머레이즈 활성 실험
인간 텔로머레이즈 유전자 조절을 이해하기 위하여, 인간 BAC 라이브러리에서 인간 텔로머레이즈 유전자의 3369 bp의 프로모터 절편을 얻었다. 인간 텔로머레이즈 프로모터 활성을 분석하기 위해서, 인간 텔로머레이즈 프로모터를 반딧불이 루시퍼레이즈 표지유전자에 융합하였고, 그것을 293과 WI38 세포에 트랜스펙션하였다. 도 1은 293 및 WI38 세포에서의 인간 텔로머레이즈 역전사 효소 프로모터의활성의 차이에 대한 그림으로서, 인간 텔로머레이즈 역전사 효소의 3396 bp의 프로모터 절편을 반딧불의 루시퍼레이즈 표지 유전자에 융합하여, 활성을 텔로머레이즈 양성인 293세포와 음성인 WI38세포에서 분석하였다. 293 세포는 탐지될 수 있는 텔로머레이즈 유전자 발현을 갖는 텔로머레이즈 양성 임모털 세포주인 반면에 WI38은 탐지될 수 있는 텔로머레이즈 유전자 발현이 없는 텔로머레이즈 음성 모털 세포주이다. 샘플의 표준화를 위해, 코트랜스펙션된 pRL-CMV 프라즈미드에서 온 Renilla 루시퍼레이즈 활성을 사용하였다. pGL3-hTERT 프로포터 프라즈미드의 양을 레인 2와 6은 0.5 ug, 레인 3과 7은 1 ug, 레인 4와 8은 2 ug으로 증가시켜서 세포속으로 트랜스펙션하였다. 레인 1과 5는 인간 텔로머레이즈 역전사 효소 프로모터가 없는 pGL3-기본 표지 프라즈미드 1 ug을 갖는다. 3369 bp의 텔로머레이즈 프로모터 절편은 도 1의 레인 2-4에서 보는 바와 같이 WI38 세포에서 표지유전자를 유도하지 못하였다. 반면에 도 1의 레인 6-8에서 보는 바와 같이 293세포에서는 표지유전자 발현이 높은 수준으로 관찰되었다. 이러한 프로모터 활성의 차이는 다른 텔로머레이즈 양성 임모털(HeLa, BHK 및 Hep G2)과 텔로머레이즈 음성 모털(IMR90 및 foreskin)세포에서도 관찰되었다.
B. 발현 클로닝 실험에서 텔로머레이즈 프로모터의 억제제로서 WT1
텔로머레이즈 유전자의 억제 메카니즘을 이해하기 위해서 3369 bp의 텔로머레이즈 프로모터를 사용한 발현 클로닝 방법을 개발하였다. 텔로머레이즈 유전자 발현이 억제된 정상 인간신장 조직으로부터 cDNA를 제조하였다. 이 라이브러리를 풀 당 약 100 cDNA의 풀로 나누어서 3369 bp 텔로머레이즈 프로모터의 조절하에 반딧불이 루시퍼레이즈 표지유전자와 293T 신장세포에 코트랜스펙션하였다. 도 2는 cDNA 발현 클로닝 분석에 대한 그림이다. 풀, 서브풀 및 단일 콜로니의 약 0.4 ug의 cDNA 프라즈미드를 1 ug의 pGL3-hTERT 프로모터 및 10 ng의 pRL-CMV 프라즈미드와 함께 293T 세포에 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션된 세포의 파쇄액을 제조하여 루시퍼레이즈 활성을 분석하였다. 상대적 프로모터 활성은 pRL-CMV 프라즈미드에서 온 Renilla 루시퍼레이즈 활성으로 pGL3-hTERT 프로모터에서 온 반딧불이 루시퍼레이즈를 표준화한 것을 의미한다. (A)는 #376 풀을 포함하는 각각 약 100 cDNA을 갖는 1,200 개의 풀; (B)는 #376 풀에서 온 약 10 cDNA의 30개의 서브풀; (C)는 #12 서브 풀에서 온 150개의 단일 콜로니이다. 1200풀 중에서 세 풀(376 번, 727 번 및 1012 번)에서 반딧불이 대 renilla 루시퍼레이즈 활성의 비가 크게 감소하였다. 도 2A는 376번이 포함된 트랜스펙션 실험을 보여준다. 376 번을 각각 약 10개의 콜로니를 갖는 30개의 서브풀로 나누고, 도 2B에서 보는 바와 같이 12 번과 20 번의 두 양성 서브풀을 얻었다. 그 중 12번을 골라 도 2C에서 보는 바와 같이 더 나누어서 세 개의 순수한 cDNA 클론을 얻었다. 서열분석을 해보니 그들은 모두 대체 스플라이싱이 없는 WT1(-KTS) 단백질을 코딩하는 것이 밝혀졌다.
WT1은 신장세포와 같은 특정세포의 성장과 분화에 관여하는 조절유전자이고, 그것의 종양억제인자 유전자로서 불활성화는 종양형성에 기여한다는 것이 밝혀졌다. WT1 mRNA는 두 자리에서 선택적인 스플라이싱을 하는 것으로 알려졌다. WT1(+KTS)는 서브뉴클레어 크로스터와 스플라이싱 인자들과 결합되어 있고, 그 기능은 확실하지 않은 반면에 WT1(-KTS)변이체는 핵에 존재하고 전사조절에 중요한역할을 한다는 것이 알려졌다.
C. 텔로머레이즈 프로모터와 WT1의 직접 상호작용
텔로머레이즈 프로모터내의 특정 서열에 WT1이 직접 붙을 수 있는지 여부를 테스트하였다. 박테리아에서 WT1(-KTS)의 DNA 결합 도메인을 발현하고, 세균용해액으로부터 재조합 단백질을 정제하였다. 도 3은 인간 텔로머레이즈 역전사 효소 프로모터와 WT1의 직접 작용하는 것을 보여주는 그림이다. 추정적인 결합 서열과 정제된 재조합 WT1 단백질과의 상호작용을 고 농도의 초과적인 경쟁제의 유무하에서 전기영동 모빌리티 이동법을 통하여 분석하였다. 경쟁제는 야생(wt;AGCGCCCGCGCGGGCGGG)과 돌연변이(mt; AGCGCAAGCGTTGGCGGG) WT1 결합자리의 올리고뉴크레오티드 이중 나선이다. 도 3의 레인 2의 모빌리티 이동 분석에서 보는 바와 같이 정제된 WT1 단백질은 텔로머레이즈 프로모터의 WT1 조절서열과 효율적으로 상호작용을 하였다. 이 WT1-DNA 상호작용은 도 3의 레인 3 및 4에서 보는 바와 같이 돌연변이된 WT1결합서열이 아니라 야생의 결합서열을 갖는 경쟁적 올리고뉴클레오티드에 의해서 특정하게 저해된다. 도 3의 레인 7에서 보는 바와 같이 이 WT1-DNA 혼합체의 형성은 WT1 사이트 돌연변이에 의해서 없어졌고, 따라서 WT1은 텔로머레이즈 프로모터와 특정하게 작용할 수 있고, WT1 결합서열은 텔로머레이즈 유전자의 최대 전사 억제를 위해 필요한 것이다.
본 발명의 실험예 등에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 WT 1은 텔로머레이즈 프로모터와 특정하게 작용하여 텔로머레이즈를 발현하는 세포, 즉 대부분의 암세포인 임모털 세포을 선택적으로 저해할 수 있다.

Claims (5)

  1. 텔로머레이즈 프로모터를 특정하게 저해하는 활성을 갖는 서열 정보 1에 기재된 WT1의 330에서 449부분의 절편.
  2. 상기 제 1항의 WT1 절편을 코딩하는 서열정보 2의 유전자.
  3. 상기 제 2항의 상기 유전자를 발현하는 pET25 발현 플라즈미드.
  4. a) 상기 제 2 항의 상기 유전자 절편을 발현 플라즈미드에 서브클로닝하는 단계 ; 및
    b) 상기 서브클로닝된 플라즈미드를 텔로머레이즈 양성 세포에 트랜스펙션하는 단계를 포함하는 텔로머레이즈를 생산하는 세포 성장 억제 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 텔로머레이즈 양성 세포는 신장 또는 생식선세포인 텔로머레이즈를 생산하는 세포 성장 억제 방법.
KR1020000020704A 2000-04-19 2000-04-19 텔로머레이즈의 프로모터에 특정하게 결합하는더블유티이1 절편, 그 유전자, 발현벡터 및 그것을 이용한세포성장 억제 방법 KR20010096991A (ko)

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