KR19990077015A - 진핵 세포 발현 시스템을 위한 발현 증강 서열 요소 (ease) - Google Patents

진핵 세포 발현 시스템을 위한 발현 증강 서열 요소 (ease) Download PDF

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크리스토퍼 엘. 와이트, 스코트 지. 홀퀴스트, 스티븐 엘. 말라스카
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Abstract

본 발명에서는 발현 벡터 내에 존재할 경우 안정한 세포 풀에서 재조합 단백질의 발현을 2배 내지 8배 증가시킬 수 있는 뉴클레오티드 서열을 공개한다.

Description

진핵 세포 발현 시스템을 위한 발현 증강 서열 요소 (ＥＡＳＥ)
재조합 단백질 제조를 위한 발현 시스템을 개발하는 것은 주어진 단백질을 연구용 또는 치료용 원료로 개발하는 데 중요하다. 이. 콜라이 (E. coli)와 같은 원핵 세포 및 효모 (예를 들어 사카로마이세스 (Saccharomyces), 피키아 (Pichia) 및 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 종)와 포유류 세포 모두를 포함하는 진핵 세포 모두를 위한 발현 시스템이 개발되어 왔다. 종종 포유류 세포 내에서의 발현이 치료 단백질을 제조하는 데 더 선호되는데, 이는 상기와 같은 발현 시스템에서의 번역후 변형 (post-translational modification)이 미생물 (원핵 세포) 발현 시스템에서 일어나는 번역후 변형의 형태보다 포유류에서 발견되는 것과 더 유사할 것 같기 때문이다.
진핵 세포 유전자의 전사는 다양한 시스 작용 및 트랜스 작용 조절 요소에 의해 조절된다 (딜론 (Dillon) 및 그로스벨드 (Grosveld)의 문헌 [Trends Genet. 9: 134; 1993]에 개설(開設)되어 있음). 가장 잘 특성화된 두 가지 시스 요소들은 프로모터와 인핸서이다. 프로모터는 유전자의 코딩 서열의 5'에 인접한 DNA 서열로서 기본적인 전사 장치를 형성하는 트랜스 작용 전사 인자의 다중 결합 부위를 포함한다. 인핸서도 또한 트랜스 작용 전사 인자를 위한 다중 결합 부위로 구성되어 있으나 코딩 서열로부터 먼 상향 또는 하향 또는 심지어 인트론 내에서 발견될 수 있다. 상기 요소는 또한 배향과 독립적인 방식으로 작용할 수도 있다. 프로모터 및 인핸서의 활성은 일시 발현 시스템 내에서 검출될 수 있고 조직 특이적이거나 조직 특이적이 아닐 수 있는 요소들을 포함하며 안정한 세포주 또는 형질전환 동물에서 연구될 경우 위치 효과 (position effect)에 대한 취약성이 있다.
다른 범주의 시스 조절 요소로는 장소 조절 영역 (locus control region, LCR, 그로스벨드 에프. (Grosveld F.,) 등의 문헌 [Cell 51: 975, 1987] 참조), 매트릭스 부착 영역 (matrix attachment region, MAR, 피-반 (Phi-Van) 등의 문헌 [Mol Cell Biol 10: 2302; 1980] 참조), 스캐폴드 부착 영역 (scaffold attachment region, SAR; 개서 (Gasser) 및 라에믈리 (Laemmli)의 문헌 [Trends Genet 3: 16, 1987] 참조), 및 인슐레이터 요소 (insulator element, 켈룸 (Kellum) 및 쉐들 (Schedl)의 문헌 [Cell 64: 941, 1991] 참조)를 포함하는, 크로마틴 구조를 조절하는 것으로 여겨지는 것들이 있다. 상기 요소들은 장거리에 걸쳐 작용할 수 있다는 점에서 인핸서와 유사하지만, 그들의 효과가 단지 안정하게 형질전환된 세포주 또는 형질전환 동물에서만 검출될 수 있다는 점에서 유일무이하다. LCR은 또한 위치 및 배향에 의존적이고 조직 특이적인 방식으로 활성을 갖는다는 점에서 인핸서와 유사하지 않다. 또한 LCR 및 SAR 서열은 인핸서 또는 프로모터 서열에서는 일반적으로 발견되지 않는 A 박스, T 박스 및 토포이소머라제 II 부위로 특징지워진다 (개서 및 라에믈리의 상기 문헌; 클레어 디. (Klehr D.) 등의 문헌 [Biochemistry 30: 1264, 1991] 참조).
리보좀 내부 유입 부위 (internal ribosome entry site, IRES)는 여러 바이러스 및 세포질 RNA에서 발견될 수 있는 다른 형태의 조절 요소이다 (맥브라트니 (McBratney) 등의 문헌 [Current Opinion in Cell Biology 5: 961, 1993]에 개설되어 있음). IRES는 2 시스트론성 진핵 세포 발현 카세트에서 제2 유전자 생성물의 번역을 증가시키는 데 유용하다 (카우프만 알.제이.(Kaufman R.J.) 등의 문헌 [Nucleic Acids Res 19: 4485, 1991] 참조).
최소 시간 틀 내에 고수준의 재조합 단백질을 획득하기 위하여 각각 다양한 조합의 시스 조절 요소와 몇몇 경우 트랜스 조절 요소의 다양한 결합물을 포함하는 여러 벡터들이 포유류 숙주에서의 발현용으로 입수가능하다. 하지만 상기와 같은 다수의 벡터가 입수가능함에도 불구하고 포유류 시스템에서 획득되는 재조합 단백질의 발현 수준은 미생물 발현 시스템에서 수득되는 것보다 종종 더 낮다. 또한 원하는 단백질을 고수준으로 발현하는 형질전환 세포주를 개발하는 데에는 종종 장시간의 클로닝 및 증폭이 요구된다. 따라서 당 업계에서는 포유류 세포에서의 발현을 개량 및 향상시키고, 재조합 단백질의 발현을 증가시키고 재조합 단백질의 생산에 있어서의 포유류 세포의 사용을 촉진할 수 있는 요소들이 동정될 필요가 있다.
발명의 요약
본 발명은 단시간 내에 포유류 숙주 세포에서 재조합 단백질의 고발현을 촉진하는 신규한 전사 조절 서열인 발현 증강 서열 요소 (EASE)를 공개한다. 본 발명의 한 실시 형태는 단시간 내에 포유류 숙주 세포에서 재조합 단백질의 고발현을 촉진시키고, 일시 발현 시스템에서는 활성이 없으며, 단백질을 코딩하는 DNA의 특성은 나타내지 않고, LCR, MAR 또는 SAR에서 발견되는 뉴클레오티드 서열의 특성을 나타내지 않는 발현 증강 서열 요소 (EASE)이다. 본 발명의 바람직한 실시 형태는 중국 햄스터 난소 (Chinese hamster ovary, CHO) 세포 게놈 DNA로부터 수득된, 유일무이한 통합 부위 (integration site)에 인접한, 포유류 재조합 단백질을 위한 EASE이다.
본 발명의 가장 바람직한 실시 형태에 있어서, EASE는 서열 번호 1의 뉴클레오티드 1 내지 14507, 뉴클레오티드 5980 내지 14507, 뉴클레오티드 8671 내지 14507, 뉴클레오티드 8671 내지 10515, 뉴클레오티드 9277 내지 10515, 뉴클레오티드 8672 내지 12273, 뉴클레오티드 10100 내지 14923을 포함하는 DNA, 발현 증강 활성을 갖는 상기 DNA의 프래그먼트, 상기 DNA에 상보적인 DNA, 뉴클레오티드 서열이 상기 DNA에 대하여 약 80% 이상 동일하고 발현 증강 활성을 갖는 DNA와, 발현 증강 활성을 갖는 상기 DNA들의 결합물로 구성된 군으로부터 선택된다. 한 실시 형태에 있어서, EASE DNA는 서열 번호 1의 뉴클레오티드 14290 내지 14507을 포함하는 DNA에 라이게이션되거나, 별법으로 EASE DNA는 서열 번호 1의 뉴클레오티드 12592 내지 14507을 포함하는 DNA에 라이게이션된다.
신규 EASE를 포함하는 발현 벡터는 CHO 세포를 형질전환시켜 재조합 단백질의 고발현을 가능하게 한다. 따라서 본 발명의 다른 실시 형태는 EASE를 포함하는 발현 벡터이다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 발현 벡터는 원하는 단백질을 발현되게 하는 진핵 세포 프로모터/인핸서를 더 포함한다. 가장 바람직한 실시 형태에 있어서, 발현 벡터는 제1 엑손이 원하는 유전자를 코딩하고 제2 엑손이 증폭가능하고 선별가능한 우성 마커를 코딩하는 2 시스트론성 플라스미드로 구성된다. 바람직한 마커는 디히드로폴레이트 환원효소 (DHFR)이며 다른 증폭가능한 마커도 또한 본 발명의 발현 벡터에 사용하기에 적당하다. 발현 벡터는 두 개의 엑손 사이에 IRES 서열을 더 포함할 수 있다.
포유류 숙주 세포는 본 발명의 발현 벡터로 형질전환시킬 수 있으며 단시간 내에 재조합 단백질을 고수준으로 생산할 것이다. 따라서 본 발명의 다른 실시 형태는 본 발명의 발현 벡터로 형질전환된 포유류 숙주 세포를 제공한다. 가장 바람직한 실시 형태에 있어서, 숙주 세포는 CHO 세포이다.
본 발명은 또한 숙주 세포를 본 발명의 발현 벡터로 형질전환시키고, 단백질의 발현을 촉진하는 조건 하에서 형질전환된 숙주 세포를 배양시키며, 이 단백질을 회수하는 것을 포함하는 재조합 단백질의 수득 방법을 제공한다. 본 발명의 바람직한 실시 형태에 있어서, 형질전환된 숙주 세포주는 2 단계의 선별 단계로 선별하는데, 제1 단계에서는 증폭가능한 우성 마커를 발현하는 세포를 선별하는 것이고 제2 단계에서는 마커 유전자 및 원하는 유전자의 고발현 수준 및(또는) 높은 증폭 수준에 대해 선별하는 것이다. 가장 바람직한 실시 형태에 있어서, 선별 또는 증폭 약제는 내생 DHFR 유전자 및 트랜스펙션된 DHFR 서열을 증폭시키는 것으로 나타난 DHFR의 억제제인 메토트렉세이트이다.
또한 본 발명은 예를 들어 다른 형질전환 세포주로부터 추가의 발현 증강 서열 요소를 동정하는 방법을 제공한다. 상기와 같은 세포주는 큰 유전자 카피수에 기인하지 않는 높은 발현 수준을 나타낼 것이다. 본 발명의 기술은 상기와 같은 EASE 및 형질전환되지 않은 세포에 존재하는 EASE를 동정 및 단리시키는 데 유용하다 (예를 들어 혼성화 연구 또는 서열 분석법).
본 발명은 진핵 세포에서 재조합 단백질의 발현을 증가시키는 DNA 서열 요소 (element)에 관한 것이다.
도 1은 2A5-3 CHO 게놈 DNA로부터 유래된 다양한 길이의 인서트를 나타낸다. 도 1A는 실시예 1에 기술된 바와 같이 클로닝 벡터인 λFixII에 클로닝된 TNFrFc 통합 부위의 제한효소 지도이고, 서브클로닝에 사용된 제한효소 부위가 표시되어 있다. 인서트는 서열 번호 1의 뉴클레오티드 1 내지 14507에 해당한다. 도 1B는 실시예 7에 기술된 바와 같이 도 1A에 나타낸 파지 클론으로부터 유래된, pGEM1에 클로닝된 인서트들이 요약되어 있다. 검고 두꺼운 선은 CMV 프로모터이고 점선 박스는 세 부분으로 이루어진 아데노바이러스 리더 서열이며 좌측의 평행선 박스는 TNFrFc 코딩 영역이고 더 작은 평행선은 DHFR 코딩 서열이다. 서열 번호 1에 대하여 PG8.5의 인서트는 뉴클레오티드 5980 내지 14507에 해당하고, PG5.7의 인서트는 뉴클레오티드 8671 내지 14507에 해당하며, PG5.7△S의 인서트는 뉴클레오티드 12592 내지 14507에 라이게이션된 뉴클레오티드 8671 내지 10515에 해당하고, PG.2SE1.8의 인서트는 뉴클레오티드 14290 내지 14507에 라이게이션된 뉴클레오티드 8671 내지 10515에 해당하며, PG.2SH1.2의 인서트는 뉴클레오티드 14291 내지 14507에 라이게이션된 뉴클레오티드 9277 내지 10515에 해당하고, PG.2.의 인서트는 뉴클레오티드 12269 내지 14507에 해당하며, PG.2의 인서트는 뉴클레오티드 14290 내지 14507에 해당한다.
발명의 상세한 설명
본 발명자들은 발현 벡터에 삽입될 경우 안정한 세포 풀에서 리포터 단백질의 발현을 2배 내지 8배 증가시킬 수 있는 신규한 서열 요소를 단리 및 동정하였다. 상기와 같은 서열 요소 중 하나는 재조합 종양 회저 인자 수용체 (Tumor Necrosis factor receptor)/면역 글로불린 Fc 융합 단백질 (TNFrFc) 이량체를 고수준으로 발현하는 세포주의 게놈 DNA로부터 상기 융합 단백질을 코딩하는 유일무이한 발현 카세트의 통합 부위를 클로닝함으로써 동정되었다. 본 발명의 서열 요소는 신규한 기능을 코딩하는 것으로 여겨지는데, 이는 발현 증강 활성이 이전에 특성화된 프로모터, 인핸서, 좌위 조절 영역, 스캐폴드 부착 영역 또는 매트릭스 부착 영역과 같은 시스 작용 요소들처럼 작용하지 않기 때문이다. 또한 본 발명의 서열 요소는 개방 판독 프레임 (open reading frame, ORF)을 전혀 포함하지 않아 상기 요소가 신규한 트랜스 활성체 단백질을 코딩하는 것 같지 않다. 본 발명자들은 상기 신규한 서열 요소를 "발현 증강 서열 요소" (EASE)로 나타낸다.
EASE의 물리학적 특성화 및 기능적 특성화
TNFrFc 단백질을 고수준으로 발현하는 세포주 (2A5-3으로 칭함)의 게놈으로부터 상기 단백질을 코딩하는 서열의 유일무이한 통합 부위로부터의 5' 방향에 존재하는 14.5 kb의 CHO 게놈 DNA에서 EASE 활성이 동정되었다. 단리된 상기 14.5 kb 영역 및 그의 더 짧은 프래그먼트를 포함하는 발현 벡터는 DXB11 CHO 세포를 형질전환시켜 >50% 빈도로 고수준의 재조합 단백질 발현을 가능하게 하였다. >50%의 활성이 서열 번호 1의 뉴클레오티드 8671 내지 뉴클레오티드 10515인 이 DNA의 1.8 kb 영역에 위치한다는 것이 지도 제작 연구에서 나타났다. 또한 서열 번호 1의 뉴클레오티드 8671 내지 뉴클레오티드 9276 서열 (604 bp의 EcoR1 내지 Hpa1 프래그먼트)이 활성에 필수적인 것으로 나타났는데, 이는 상기 영역이 벡터에 존재하지 않을 경우 발현 증강이 현저하게 감소되기 때문이다. 본 발명의 EASE는 프로모터/인핸서 영역에 결합하여 상기 영역에 의해 작동되는 재조합 단백질의 발현을 증가시킬 수 있다.
또한 본 명세서에서 기술된 바와 같이 다른 형태의 세포 또는 형질전환된 세포에서 다른 통합 부위로부터의 EASE 유사 모티프일 수 있는, EASE 활성을 나타내는 14.5 kb의 CHO 게놈 DNA의 추가의 프래그먼트가 동정될 수 있다. 또한 제한 효소 절단에 의해 제조되는 DNA의 프래그먼트를 그 이후에 프로세싱하여 이 프래그먼트의 말단으로부터 추가의 뉴클레오티드를 제거할 수 있다는 것이 당 업계에 공지되어 있다. 따라서 본 명세서에서 기술되고 청구되는 DNA 프래그먼트는 그의 말단이 본 명세서에 실린 뉴클레오티드의 5 bp 이내에서 존재하는 프래그먼트들을 또한 포함한다.
본 명세서에서 기술된 프래그먼트들의 다른 결합물, 예를 들어 본 명세서에 공개된 EASE의 다중 카피를 포함하는 서열 또는 조절 요소들의 최적의 결합물을 획득하기 위하여 공개된 EASE와 다른 뉴클레오티드 서열이 결합되어 유래되는 서열도 또한 개발될 수 있다. 상기와 같은 결합물은 EASE 프래그먼트들의 최적의 간격을 제공하기 위하여 인접하여 결합되거나 또는 배열될 수 있다 (즉, 요소들 사이에 '스페이서 (spacer)' 뉴클레오티드를 도입함). 조절 요소들은 또한 다른 조절 영역으로부터의 EASE의 최적의 간격을 제공하기 위하여 배열될 수 있다. 유사하게는, 벡터 내의 EASE의 배향이 고수준의 단백질 발현을 제공하기 위하여 최적화될 수 있다.
본 명세서에서 공개된 EASE는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포로부터 단리되었다. 다른 포유류 종의 세포 및 다른 조직 형태로부터 유래된 세포주에 동종성의 발현 증강 요소가 존재할 것으로 기대되며, 당 업계에 잘 알려진 기술, 예를 들어 종 교차 (cross-species) 혼성화 또는 PCR에 기초한 기술로 단리시킬 수 있다. 또한 당 업계에 공지된 사이트 디렉티드 (site-directed) 돌연변이 유발 기술 또는 무작위 (random) 돌연변이 유발 기술로 서열 1에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 변화시킬 수 있다. 생성된 EASE 변형체는 그 후 본 명세서에 기술된 바와 같이 EASE 활성에 대하여 시험될 수 있다. 서열 번호 1 또는 EASE 활성을 갖는 그의 프래그먼트에 대하여 뉴클레오티드 서열 상 약 80% 이상 동일한 DNA, 더 바람직하게는 약 90% 이상 동일한 DNA는 통상의 실험으로 단리가능하며 EASE 활성을 가질 것으로 예상된다. EASE의 프래그먼트에 있어서 % 상동성은 이 EASE 프래그먼트에서 발견되는 천연 서열에 관련한 그의 부분을 의미한다. 따라서 EASE의 동종체 및 EASE의 변형체도 또한 본 발명에 포함된다.
재조합 단백질은 적당한 진핵 세포 프로모터/인핸서 및 본 발명의 EASE에 의해 발현이 작동된다. 세포는 낮은 엄격성 하에서 선별가능한 우성 마커로 선별되는 플라스미드로 형질감염시키며 이어서 예를 들어 선별 배지에 DHFR의 억제제인 메토트렉세이트 (MTX)를 사용하여 더 높은 엄격성 하에서 다시 선별한다. 제1 선별에서 양성 형질전환체 (즉 메토트렉세이트 선별의 경우 DHFR＋형질전환체)가 수득되고 제2 선별에서 원하는 유전자를 고수준으로 발현하는 형질전환체가 수득된다.
EASE를 포함하는 벡터 내로 IRES 서열을 포함시키면 몇몇 단백질의 발현을 증가시키는 데 유익할 수 있다. IRES 서열은 높은 선별 압력 하에서 원하는 유전자의 발현을 안정화시키는 것으로 나타난다 (카우프만 (Kaufman) 등의 상기 문헌 (1991) 참조). 세포에 의해 우수하게 프로세싱되는 단백질에 있어서, IRES 서열은 고발현 수준을 획득하는 데 불필요하다.
고수준의 재조합 단백질을 발현하는 세포 집단은 본 명세서에서 기술된 바와 같이 2단계 선별 프로토콜을 사용하여 5주 내지 7주만에 개발될 수 있다. 절대적인 고발현 수준은 세포에 의해 단백질이 얼마나 우수하게 프로세싱되는가에 따라 특정 단백질에 따라 다르다. 본 발명자들은 106세포 당 일일 약 0.2 μg 이상, 다수의 경우 106세포 당 일일 약 12 μg을 초과하여 발현하는 안정한 세포 풀을 다양한 시토카인 및 시토카인 수용체를 사용하여 관찰하였다. 상기 수준의 단백질 발현을 획득하는 데 요구되는 시간은 EASE가 없는 벡터를 사용하여 수행된 유사한 형질전환에서 관찰되는 시간의 거의 절반이었다. 또한 EASE를 포함하도록 개발된 세포 풀은 시간이 흘러도 안정하며 대부분의 목적에 있어서 세포주로서 처리될 수 있다. 클로닝 단계는 재조합 단백질을 위한 통상적인 개발 과정보다 더 늦게 지체될 수 있다. 추가의 클로닝 단계를 사용하여 106세포 당 일일 약 24 μg을 초과하여 발현하는 세포주를 개발할 수 있다.
상기 DNA 서열에서 발견되는 EASE는 이전에 기술된 시스 작용 요소들의 몇몇 특성을 가지지만 이전에 기술된 정의에 포함되지는 않는다는 것이 형질감염 실험으로 증명된다. EASE 활성은 LCR, MAR 및 SAR 서열과 유사하게 일시 분석법에서는 검출되지 않는다. 하지만 상기 서열들과는 달리 EASE는 상기 요소들에서 전형적으로 발견되는 A 박스, T 박스 또는 토포이소머라제 2 부위를 갖지 않는다 (클레어 등의 상기 문헌 참조). 또한 EASE 활성이 일시 분석법으로 검출되지 않기 때문에, 상기 EASE는 상기 방법으로 검출되는 프로모터 및 인핸서 요소도 또한 다른 것으로 나타났다.
재조합 단백질의 발현
재조합 발현 벡터는 포유류, 바이러스 또는 곤충류 유전자로부터 유래된 적당한 전사 또는 번역 조절 요소에 작동가능하게 결합된, 단백질을 코딩하는 합성 또는 cDNA 유래 DNA 프래그먼트를 포함한다. 상기와 같은 조절 요소는 하기에 상세하게 기술되는 바와 같이 전사 프로모터, 적당한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열과, 전사 및 번역의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 포유류 발현 벡터는 또한 복제 원점 (origin of replication), 발현시킬 유전자에 결합된 적당한 프로모터 및 인핸서, 다른 5' 또는 3' 플랭킹 (flaking) 비전사 서열, 5' 또는 3' 비번역 서열, 예를 들어 필요한 리보좀 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 (splice) 제공자 및 수용자 부위, 및 전사 종결 서열과 같은 5' 또는 3' 비전사 요소를 포함할 수 있다. 숙주에서의 복제능을 부여하는 복제 원점, 및 형질전환체의 인지를 도와주는 선별가능한 유전자도 또한 삽입될 수 있다.
DNA 영역들은 그들이 서로 기능적으로 연관되어 있을 경우 작동가능하게 결합시킨다. 예를 들어 폴리펩티드가 전구체로서 발현될 경우 폴리펩티드의 분비에 관여하는 신호 펩티드 (분비 리더)에 대한 DNA를 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동가능하게 결합시키거나, 프로모터가 이 서열의 전사를 조절할 경우 코딩 서열에 이 프로모터를 작동가능하게 결합시키거나, 또는 리보좀 결합 부위가 번역이 가능하도록 배향되어 있는 경우 이 부위를 코딩 서열에 작동가능하게 결합시킨다. 일반적으로 "작동가능하게 결합시키는"의 의미는 인접한다는 의미이며, 분비 리더의 경우 판독 프레임 내에 존재하고 인접한다는 것을 의미한다.
척추 동물 세포를 형질전환시키는 데에 사용되는 발현 벡터 내의 전사 및 번역 조절 서열은 바이러스 원천으로부터 제공될 수 있다. 예를 들어 일반적으로 사용되는 프로모터 및 인핸서는 폴리오마 (Polyoma), 아데노바이러스 (Adenovirus) 2, 시미안 바이러스 40 (Simian Virus 40, SV40), 및 사람 세포확대 바이러스로부터 유래된다. 바이러스 게놈 프로모터, 조절 및(또는) 신호 서열은 이들 조절 서열들이 선택된 숙주 세포와 양립가능하다면 발현을 작동시키기 위하여 사용될 수 있다. 전형적인 벡터는 오까야마 (Okayama) 및 베르그 (Berg)의 문헌 [Mol. Cell. Biol. 3: 280, 1983]에 기술된 바와 같이 작제될 수 있다. 재조합 단백질을 발현시키는 세포 형태에 따라 비바이러스성 세포 프로모터 (즉, β-글로빈 및 EF-1α 프로모터)도 또한 사용될 수 있다.
SV40 바이러스 게놈으로부터 유래된 DNA 서열, 예를 들어 SV40 복제원점, 초기 및 후기 프로모터, 인핸서, 스플라이스, 및 폴리아데닐화 부위를 사용하여 이종성 DNA 서열의 발현에 필요한 다른 유전 요소들을 제공할 수 있다. 초기 및 후기 프로모터는 특히 유용한데 이는 이들 모두가 SV40 바이러스의 복제 원점을 또한 포함하는 프래그먼트로서 이 바이러스로부터 용이하게 수득되기 때문이다 (피어스 (Fiers) 등의 문헌 [Nature 273: 113, 1978] 참조). SV40 바이러스의 복제 원점 내에 존재하는 HindIII 부위로부터 BglI 부위 방향으로 연장된 대략 250 bp의 서열이 포함된다면 더 작은 또는 더 큰 SV40 프래그먼트도 또한 사용할 수 있다.
다중 전사체의 발현에 사용되는 2 시스트론성 발현 벡터가 이미 기술되어 있다 (김 (Kim S.K.) 및 월드 (Wold B.J.)의 문헌 [Cell 42: 129, 1985]; 카우프만 등의 1991년도 문헌 참조). pCAVDHFR은 생쥐 DHFR의 코딩 서열 (수브라마니 (Subramani) 등의 문헌 [Mol. Cell. Biol. 1: 854, 1981] 참조)을 포함하는 pCD302의 유도체이다 (모슬리 (Mosley) 등의 문헌 [Cell, 1989] 참조). pCDE 벡터는 아데노바이러스의 세 부분으로 이루어진 리더와 DHFR cDNA 코딩 서열 사이에 클로닝된 쥐과 뇌심근염 바이러스의 리보좀 내부 유입 부위 (뉴클레오티드 260 내지 824; 장 (Jang) 및 위머 (Wimmer)의 문헌 [Genes and Dev. 4: 1560, 1990] 참조)를 포함하는 pCAVDHFR의 유도체이다. 본 발명의 EASE와 결합시킴에 있어서, 예를 들어 악셀 (Axel) 등의 미국 특허 제4,634,665호 및 링올드 (Ringold) 등의 미국 특허 제4,656,134호에 기술되어 있는 다른 유형의 발현 벡터도 또한 유용하다.
숙주 세포
형질전환 숙주 세포는 DNA 재조합 기술을 사용하여 작제되고 재조합 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 세포이다. 발현 단백질은 바람직하게는 선별된 DNA에 따라 배양 상청액 내로 분비되지만, 세포 막 내에 퇴적될 수 있다. 다양한 포유류 세포 배양 시스템을 사용하여 재조합 단백질을 발현시킬 수 있다. 적당한 포유류 숙주 세포주의 예로는 글루즈만 (Gluzman)의 문헌 [Cell 23: 175, 1981]에 기술되어 있는 원숭이 신장 세포의 COS-7 주, 및 적당한 벡터를 발현시킬 수 있는, 예를 들어 CV-1/EBNA (ATCC CRL 10478), L 세포, C127, 3T3, 중국 햄스터 난소 (CHO), HeLa 및 BHK 세포주를 포함하는 다른 세포주가 있다.
일반적으로 사용되는 세포주는 글리신, 티미딘 및 하이포크산틴에 대하여 영양요구성인 DHFR-CHO 세포이며 증폭가능한 우성 마커로서 DHFR cDNA를 사용하여 DHFR＋표현형으로 형질전환시킬 수 있다. 상기와 같은 DHFR- CHO 세포주 중 하나인 DXB11이 울라우브 (Urlaub) 및 차신 (Chasin)의 문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216, 1980]에 기술되어 있다. 특정 선별 방법 또는 증폭 방법을 위하여 개발된 본 발명의 EASE를 포함하는 다른 세포주도 또한 유용하다.
형질전환 포유류 세포의 제조
여러 형질전환 프로토콜이 당 업계에 공지되어 있으며 카우프만 (Kaufman, R.J.)의 문헌 [Meth. Enzymology 185: 537 (1988)]에 개설되어 있다. 선택되는 형질전환 프로토콜은 숙주 세포의 형태 및 원하는 유전자의 성질에 의존적이며 통상의 실험을 기초로 하여 선택할 수 있다. 상기와 같은 임의의 프로토콜의 기본적인 요건은 첫 번째로 원하는 단백질을 코딩하는 DNA를 적당한 숙주 세포 내로 도입시키고, 이어서 이종성 DNA가 안정하고 발현가능한 방식으로 삽입된 숙주 세포를 동정 및 단리시키는 것이다.
이종성 DNA를 도입시키는 데 일반적으로 사용되는 방법 중 하나는 예를 들어 위글러 (Wigler) 등의 문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567, 1980]에 기술되어 있는 바와 같이 인산 칼슘 침전법이다. 상기 방법으로 숙주 세포 내로 도입된 DNA는 종종 재배열되기 때문에 이 방법은 독립적인 유전자들을 동시 형질감염시키는 데 유용하다.
박테리아 원형질체와 포유류 세포와의 폴리에틸렌 유도 융합법은 이종성 DNA를 도입시키는 또다른 유용한 방법이다 (샤프너 (Schaffner) 등의 문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 2163, 1980] 참조). 원형질체 융합 프로토콜은 종종 포유류 숙주 세포 게놈 내로 통합되는 플라스미드 DNA의 다중 카피를 초래하지만, 이 기술에서는 원하는 유전자로서 동일한 플라스미드 상에 선별 및 증폭 마커가 존재할 것이 요구된다.
또한 예를 들어 포터 (Potter) 등의 문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 7161, 1988] 또는 시게까와 (Shigekawa) 및 다우어 (Dower)의 문헌 [BioTechniques 6: 742, 1988]에 기술되어 있는 바와 같이 전기천공법 (electroporation)을 사용하여 숙주 세포의 세포질 내로 DNA를 직접적으로 도입시킬 수도 있다. 원형질 융합법과는 달리 전기천공법은 선별 마커 및 원하는 유전자가 동일 플라스미드 상에 존재하지 않아도 된다.
더 최근에는 이종성 DNA를 포유류 세포 내로 도입하는 데 유용한 여러 시약들이 기술되었다. 상기 시약들로는 미국 매릴랜드주 게이터스부르그 소재의 깁코 비알엘 (Gibco BRL)사의 리포펙틴 (등록상표, Lipofectin) 시약 및 리포펙타민 (상표명, Lipofectamine) 시약이 있다. 상기 시약들 모두는 배양 세포에 사용될 경우 세포 내로의 핵산의 흡수를 촉진하는 지질-핵산 복합체 (또는 리포좀)을 형성시키는 데 사용되는 구매가능한 시약들이다.
원하는 유전자의 증폭 방법도 또한 재조합 단백질의 발현을 위하여 바람직하며 일반적으로 선별 마커의 사용을 포함한다 (카우프만, 알.제이.의 상기 문헌에 개설되어 있음). 세포 독성 약품에 대한 내성은 선별 마커로서 가장 빈번하게 사용되는 특성이며 우성 특성 (즉, 숙주 세포 형과는 독립적으로 사용될 수 있음) 또는 열성 특성 (즉 선별하려는 모든 활성에 대하여 결함있는 숙주 세포 형에 특히 유용함) 중 어느 하나의 결과일 수 있다. 증폭가능한 여러 마커가 본 발명의 발현 벡터에서의 사용에 적당하다 (예를 들어 마니아티스 (Maniatis)의 문헌 [Molecular Biology: A Laboratory Manual, 16.9 내지 16.14 페이지, 1989; 미국 뉴욕 소재의 콜드 스프링 하버 래버러토리 (Cold Spring Habor Laboratory)사]에 기술되어 있음).
약품에 내성을 갖는 포유류 세포에서의 유전자 증폭을 위한 선별가능한 유용한 마커는 카우프만, 알.제이.의 상기 문헌의 표 1에 나타나 있으며, DHFR-MTX 내성, P-당단백질 및 다중 약품 내성 (multiple drug resistance, MDR)-다양한 친지성 세포독성 약제 (즉, 아드리아마이신, 콜히친, 빈크리스틴), 및 아데노신 데아미나제 (ADA)-Xyl-A 또는 아데노신 및 2'-데옥시코포르마이신을 포함한다.
선별가능한 다른 우성 마커로는 미생물로부터 유래된 항생제 내성 유전자, 예를 들어 네오마이신, 카나마이신 또는 히그로마이신 내성 유전자를 포함한다. 하지만 상기 선별 마커들은 증폭가능하지 않은 것으로 나타났다 (카우프만, 알.제이.의 상기 문헌 참조). 포유류 숙주를 위한 적당한 여러 선별 시스템이 존재한다 (마니아티스의 상기 문헌 중 16.9 내지 16.15 페이지 참조). 2개의 선별가능한 우성 마커를 사용하는 동시 형질감염 프로토콜이 또한 기술되어 있다 (오까야마 및 베르그의 문헌 [Mol. Cell Biol 5: 1136, 1985] 참조).
특히 유용한 선별 및 증폭 방법에서는 DHFR-MTX 내성을 사용한다. MTX는 내생 DHFR 유전자 (알트 (Alt F.W.) 등의 문헌 [Journal of Biological Chemistry 253: 1357, 1978] 참조) 및 형질감염 DHFR 서열 (위글러 엠. (Wigler M.) 등의 문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567, 1980] 참조)의 증폭을 야기하는 것으로 나타난 DHFR의 억제제이다. 제2 발현 카세트 내의 DHFR 유전자에 결합되어 있거나 결합되어 있지 않은, 제1 발현 카세트 내의 원하는 유전자를 포함하는 DNA로 세포를 형질전환시킨다. 두 유전자는 또한 하나의 2 시스트론성 발현 단위 내에 존재할 수도 있다 (카우프만 등의 상기 문헌 (1991년) 및 카우프만 알.제이. 등의 문헌 [EMBO J 6: 187, 1987] 참조). 형질전환된 세포는 연속적으로 더 많은 양의 MTX를 포함하는 배지에서 배양시킴으로써 DHFR 유전자 및 원하는 유전자를 더 많이 발현시킨다.
이전에 기술된 유용한 조절 요소들도 포유류 세포를 형질전환시키는 데 사용되는 플라스미드 내에 또한 포함시킬 수 있다. 선택되는 형질전환 프로토콜 및 여기에 사용하기 위하여 선별되는 요소들은 사용되는 숙주 세포의 형에 의존적이다. 당 업게의 숙련자들은 다수의 상이한 프로토콜 및 숙주 세포를 알고 있고 세포 배양 시스템의 요건을 기초로 하여 원하는 단백질의 발현을 위한 적당한 시스템을 선택할 수 있다.
본 명세서에서 인용된 모든 참조 문헌들의 관련 공보는 참조 문헌으로써 구체적으로 인용되어 있다. 하기 실시예는 본 발명의 특정 실시 형태를 예시하기 위함이지 본 발명의 범위를 한정시키려는 것은 아니다.
실시예 1: 게놈 라이브러리 스크리닝 (screening) 및 서브클로닝
종양 회저 인자에 대한 80 Kd의 수용체의 세포외 도메인을 포함하는 면역 글로불린 Fc 융합 단백질 (TNFrFc; 뮐러 (Mohler) 등의 문헌 [J. Immunol. 151: 1548, 1993], 1995년 3월 7일에 출원된 미국 특허 제5,395,760호; 상기 문헌 모두는 참조 문헌으로 인용되어 있음)을 고수준으로 발현하는 형질전환 CHO 세포주 (2A5-3 세포주라 나타냄)가 게놈 라이브러리의 제조를 위하여 선발되었는데 이는 상기 세포주에서 관찰된 높은 발현율의 TNFrFc 발현이 TNFrFc를 코딩하는 발현 카세트의 단일 통합에 의해 작동된다는 것이 서턴 블롯 분석에서 나타났기 때문이다. DNA를 상기 세포로부터 단리시키고, Mbo1로 부분 절단시키며 람다 FIX II 클로닝 벡터 (스트라타진 (Stratagene) 주문 게놈 라이브러리; 미국 캘리포니아주 라 졸라 소재의 스트라타진 사) 내에 클로닝시켜 라이브러리를 제조하였다. 14.4 kb의 세포질 플랭킹 서열과 함께 존재하는 p80 TNF 수용체 코딩 서열은 하기에 기술된 바와 같이 이 라이브러리로부터 클로닝하였다.
라이브러리를 스크리닝하기 위하여 250 cm 플레이트 당 대략 2 x 104플라크 형성 단위 (pfu)가 형성되게 하였다. 플라크를 니트로셀룰로스 막 (미국 뉴 햄프셔주 킨 소재의 Schleicher and Schuell사)으로 옮겼고 스트라타진에 의해 제공되는 표준 프로토콜을 사용하여 세포를 용해 (lysis)시켰다. p80 TNF 수용체 세포외 도메인의 세포 표면 부분을 코딩하는 랜덤하게 프라이밍(priming)된 NotI pVUII DNA 프래그먼트로 필터를 프로빙 (probing)하였다 (뮐러 등의 상기 문헌 참조). 혼성화 완충제 (10배의 덴하르트 (Denhart's) 용액 (마니아티스의 상기 문헌 9.49 페이지 참조), pH가 7.5인 0.05 M 트리스 (Tris), 1 M NaCl, 0.1% 피로인산나트륨, 1% SDS, 4 μg/ml의 연어 정자 DNA) 중에서 63℃에서 혼성화를 수행하였다. 필터는 초기 세척은 0.1% SDS, 0.1% SSC 중에서 42℃에서 30분 동안 수행하고 (마니아티스의 상기 문헌, B.13), 이어서 동일 용액에서 63℃에서 60분 동안 추가로 2회 세척시켰다. 최종 2회의 세척은 0.1% SDS 및 0.01% SSC를 사용하여 63℃에서 60분 동안 수행하였다. 약 4 x 105개의 재조합체를 스크리닝한 후 한 개의 양성 재조합체 클론을 동정하였다. 2A5-3 λ라고 명명된 상기 클론을 그 이후의 모든 분석에서 사용하였다. 상기 클론의 CHO 게놈 DNA의 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 1에 나타낸다. 2A5-3 λ는 1996년 1월 4일자의 부다페스트 조약의 협약 하에 미국 매릴랜드주 록크빌 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection)에 기탁되었으며 수탁번호 97411을 부여받았다.
실시예 2: 서턴 블로팅
유전자 카피수는 서턴 블롯 기술을 사용하여 모니터링하였다. 적당한 세포주의 전체 세포 DNA를 미첼 (Mitchell P.J.) 등의 문헌 [Mol Cell Biol 6: 425, 1986]에 이전에 기술되어 있는 방법을 사용하여 제조하였다. 공급자 (미국 매사추세츠주 비벌리 소재의 뉴 잉글랜드 바이오랩스 (New England Biolabs)사 또는 미국 인디애나주 인디애나폴리스 소재의 뵈링거 만하임 (Boehringer Mannheim)사)에 의해 기술된 조건 하에서 적당한 효소로 DNA를 절단시킨 후 DNA는 예를 들어 마니아티스의 상기 문헌 (6.20 페이지)에 기술된 바와 같이 1% TAE (트리스-아세테이트로 완충됨) 아가로스 겔 상에서 움직이게 한다. DNA는 전기영동 후 공급자 (미국 캘리포니아주 리치몬드 소재의 바이오 라드 래버러토리즈 (Bio-Rad Laboratories)가 권유하는 조건 하에서 제타프로브 (Zetaprobe) 필터로 옮겨 혼성화하였다. 필터는 0.1% SDS 및 0.1배 SSC로 각각 30분 동안 3회 세척시켰다. 첫 번째 세척은 37℃에서 수행하였으며 그 이후의 2회의 세척은 63℃에서 수행하였다. 프로브는 랜덤 프라이밍 키트 (미국 인디애나주 인디애나폴리스 소재의 뵈링거 만하임사)를 사용하여 제조하였다. 라이브러리 스크리닝에 있어서 기술된 바와 같이 블롯에 대하여 동일한 프로브를 사용하여 TNFr 서열을 검출하였다. 유사하게는, 원하는 임의의 다른 단백질을 코딩하는 DNA 영역 (또는 그의 프래그먼트)으로부터 유래된 프로브가 유전자 카피수를 모니터링하기 위한 서턴 블롯 기술에서 유용할 것이다.
실시예 3: 조직 배양
7.5%의 소과 태아 혈청 (FBS; 미국 유타주 로간 소재의 하이클론 (Hyclone)사; 또는 미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마 (Sigma)사), 2 mM의 L-글루타민, 90 μM의 티미딘 (T), 90 μM의 하이포크산틴 (H) 및 120 μM의 글리신 (G)이 보충된 둘비코 최소 필수요소 배지 (Dulbecco's minimal essential medium) 및 F12 (DMEM:F12)에 디히드로폴레이트 환원효소 (DHFR)에 결함이 있는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포인 DXB11 세포 (차신 및 울라우브의 상기 문헌 참조)를 유지시켰다. DHFR 선별 연구 및 메토트렉세이트 선발을 위하여 GHT가 없고 7.5%의 투석 FBS, 6 mM의 L-글루타민 및 1 mM의 아스파라긴이 보충된 DMEM:F12에서 세포를 배양하였다. 메토트렉세이트 선별을 위하여 메토트렉세이트 (MTX; 미국 뉴욕주 펄 리버 소재의 레들리 래브러토리즈 (Lederle Laboratories)사)를 적당한 농도로 선별 배지에 첨가하였다. 네오마이신 선별법을 사용할 경우 400 μg/ml의 G418 (미국 뉴욕주 그랜드 아일런드 소재의 깁코 (Gibco)사)을 배지에 첨가하였다. 세포는 인산 칼슘 형질감염 방법 (위글러 등의 상기 문헌 참조)을 사용하거나 또는 공급자 (미국 매릴랜드주 게이터스부르그 소재의 깁코 BRL사)가 추천하는 바와 같이 리포펙타민 (상표명) 트랜스팩션 방법을 사용하여 형질감염시켰다.
실시예 4: 효소 결합 면역흡착 분석법 (Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA)
재조합 단백질의 생산은 결합 분석법, 억제 분석법, 및 생물학적 분석법을 포함하여 원하는 단백질을 검출하는 데 적당한 임의의 분석법으로 모니터링할 수 있다. 특히 유용한 분석법은 당 업계에 잘 공지되어 있는 항체 샌드위치 효소 결합 면역흡착 분석법 (ELISA)이다 (예를 들어 엥그볼 (Engvall)등의 문헌 [Immunochem. 8: 871, 1971] 및 미국 특허 제4,703,004호에 공개되어 있는 기술을 변형시킨 것). 상기 분석법에서 원하는 단백질에 특이적인 제1 항체 (일반적으로 단일클론 항체)를 기재 (가장 흔히는 96웰 마이크로타이터 플레이트) 상에 고정시키고 이어서 단백질을 함유하는 시료를 첨가하여 인큐베이션시킨다. 이미 알고있는 농도의 단백질의 일련의 희석물을 또한 첨가하고 인큐베이션시켜 표준 곡선을 수득한다. 결합되지 않은 단백질 및 다른 물질들을 제거하기 위한 세척 단계 후 단백질에 대한 제2 항체를 첨가한다. 제2 항체는 단백질의 다른 에피토프 (epitope)에 대한 것이고 단일클론 항체 또는 폴리클론 항체 중의 어느 하나일 수 있다.
결합되지 않은 단백질을 제거하기 위한 제2 세척 단계 후 또는 제2 항체를 첨가하는 시점과 동일한 시점 중 어느 한 시기에 말 라디쉬 페록시다제 (horse radish peroxidase, HRP)과 같은 효소에 콘주게이션 (conjugation)되어 있는 제2 항체에 콘주게이트 항체를 포함하는 결합 시약을 첨가한다. 적당한 인큐베이션 시간 후 결합되지 않은 콘주게이트 시약을 세척으로 제거하고 효소 콘주게이트에 대한 기질을 함유하는 발색 용액을 플레이트에 첨가하여 발색되게 하였다. 적당한 파장에서 광학적 농도를 판독하여 각 웰의 수치를 수득하였다. 시료에 대한 수치를 표준 곡선 수치와 비교하여 원하는 단백질의 수준을 정량화하였다.
삼량체 CD40 리간드를 정량화하기 위하여 2종의 단일 클론 항체 (MAb)를 사용하는 CD40L ELISA를 개발하였다. 제1 항체는 삼량체 단백질에 존재하는 올리고머화 지퍼 도메인에 대한 것이었고 제2 항체는 이 분자의 사람 CD40 리간드 부분에 대한 것이었다. 제1 MAb를 플레이트 상에 철야 흡착시켰고 페록시다제 (HRP)가 콘주게이션된 제2 항체는 세척 단계 후에 첨가하였다. 여러 실험에서 CD40L의 양이 0.78 내지 50 ng/ml 사이에서 검출되었다.
유사한 ELISA를 사용하여 재조합 사람 종양 회저 인자 수용체 융합 단백질 (TNFrFc)를 정량화하였다. 상기 ELASA에서 상이한 TNFrFc의 에피토프에 대한 2가지의 단일클론 항체를 사용하였다. 다시 제1 MAb를 플레이트 상에 철야 흡착시켰고 페록시다제 (HRP)가 콘주게이션된 제2 항체를 세척 단계 후에 첨가하였다. 여러 실험에서 TNFrFc의 양이 0.78 내지 50 ng/ml 사이에서 검출되었다.
재조합 Flt-3 리간드 (Flt-3L)를 검출하기 위하여 단일클론 항체 및 토끼 폴리클론 항혈청을 사용하는 약간 다른 ELISA를 사용하였다. 상기에 기술된 바와 같이 MAb는 플레이트 상에 철야 흡착시켰다. 폴리클론 항Flt-3L 및 페록시다제 (HRP)가 콘주게이션된 제2 항체 (당나귀 항토끼 면역글로불린) 모두를 함유하는 용액은 결합되지 않은 단백질을 제거하는 제1 세척 단계 후에 첨가하였다. 여러 실험에서 Flt-3L의 양이 1.56 내지 100 ng/ml 사이에서 검출되었다.
실시예 5: 서열분석 및 데이터 베이스 검색
자동화된 DNA 서열분석기 (미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 어플라이드 바이오시스템스 (Applied Biosystems)사, 모델 373a) 상에서 ABI Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing kit를 사용하여 이전에 뱅키어 (Bankier)의 문헌 [Meth Mol Biol 23: 47, 1993]에 기술된 바와 같이 숏건 (shotgun) 서열분석법을 사용하거나 또는 프라이머 워킹 (walking) 방법을 사용하여 DNA를 서열분석하였다. 2A5-3λ DNA는 여러 다른 형태의 컴퓨터 분석을 수행하여 특성화하였다.
(a) 구성 분석
2A5-3 λ 서열은 제네틱스 컴퓨터 그룹 (Genetics Computer Group)의 위스콘신 패키지 (Wisconsin Package)로부터 입수가능한 세 가지 컴퓨터 프로그램 (위스콘신 패키지를 위한 프로그램 입문서, 버전 8, 1994년 9월, 미국 53711 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575 소재의 제네틱스 컴퓨터 그룹), 즉 심플리파이 (SIMPLIFY), 윈도우 (WINDOW), 및 스타트플롯 (STATPLOT)을 조합하여 사용하여 A+T 함량이 높은 영역에 대하여 스캐닝하였다. A+T 함량이 높은 영역을 검색하기 위하여 1 bp씩 증가시키면서 2A5-3 λ 서열을 가로질러 50 bp의 슬라이딩 윈도우를 슬라이딩시켰으며 상기 윈도우 내의 A+T 퍼센트를 플로팅 (plotting)하였다. 원하는 영역은 A+T의 평균 함량이 항상 70퍼센트를 초과하는 영역이었다. A+T 함량이 >70%인 >200 bp의 한 영역을 2개의 Swa1 부위 사이 (서열 번호 1의 뉴클레오티드 10517 내지 12591)에서 찾아내었다. 이 영역은 EASE 활성에는 중요하지 않은 것으로 나타났다 (실시예 7 및 8 참조).
(b) 전사 증강 모티프
GCG 프로그램인 모티프스 (MOTIFS)를 사용하여 공지된 3가지의 전사 증강 모티프인 "토포-II" (GTNWAYATTNATNNR), "T-박스" (ATATTT/AATATT), 및 "A-박스" (AATAAAYAAA)에 대하여 검색하였다 (클레어 등의 상기 문헌 참조). 상기 프로그램은 각각의 특정 입력 모티프에 정확하게 매칭 (matching)되는 것을 찾기 위하여 선형 방식의 의문시되는 서열을 스캐닝한다. 각각의 모티프에 있어서 퇴화성 (degeneracy)은 국제 생화학 연맹 (International Union of Biochemistry, IUB)의 명명 협약을 사용하여 기호로 나타내었다. 2A5-3 λ DNA 중 14.5 kb의 CHO DNA 내에서는 "토포-II 박스"가 발견되지 않았다. CHO DNA의 상기 영역에 걸쳐 2개의 "A-박스" 및 26개의 "T-박스"가 분산되어 있음이 발견되었다. 상기 모티프 중 어느 것도 EASE 활성에 요구되는 604 bp의 EcoR1 내지 Hpa1 프래그먼트 내에서는 발견되지 않았다.
(c) 유사성에 대한 서열 데이터베이스 검색
젠뱅크 (GenBank) DNA 서열 데이터베이스 및 스위스프롯 앤드 피아이알 (SwissProt and PIR) 단백질 서열 데이터베이스의 데이터베이스 검색은 블라스트 (BLAST) 알고리즘을 사용하여 수행하였다 (알트슐 (Altschul) 등의 문헌 [J. Mol. Biol. 215: 403, 1990] 참조). 상기 알고리즘은 정렬 내에 갭을 삽입시키지 않고 국부적으로 유사성을 갖는 단편을 찾아내는 데 최적화되어 있다. 2A5-3 λ DNA 서열 및 모든 6개의 판독 프레임 내의 동적 단백질 번역 모두에 대하여 블라스트 검색을 해 본 결과 공지된 임의의 전사 활성화 서열과 현저하게 매치되는 것이 없었다.
(d) 코딩 서열 분석
신경망 조직에 기초를 둔 유전자 인식 시스템인, 컴퓨터 프로그램인 그레일 (GRAIL) (우베르바허 (Uberbacher, E.C.) 및 무랄 (Mural, R. J.)의 문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 11261, 1991] 참조)을 사용하여 가능한 코딩 영역에 대하여 2A5-3 λ 서열을 스캐닝하였다. 그레일 검색은 100 bp의 슬라이딩 윈도우 내에서 DNA 서열의 코딩 가능성을 평가한다. 편향을 피하기 위하여 추가의 게놈 특성 (예를 들어 스플라이스 접합부 및 번역 출발부)과 관련하여 그리고 상기 특성과 관련없이 가능한 코딩 영역에 대한 검색을 수행하였다. 그레일 검색의 결과 2A5-3 λ 서열 내에 가능성이 높은 단백질 코딩 영역이 전혀 나타나지 않았다.
실시예 6: 클로닝된 서열을 사용한 단백질의 발현
본 실험의 목적은 CHO 세포주인 2A5-3 내에서 TNFrFc 통합 부위를 둘러싸는 서열이 DXB11 세포 내로 랜덤하게 통합될 경우 상기 단백질의 높은 발현성을 부여할 수 있는지를 측정하는 것이었다. 상기 통합 부위는 실시예 1에 기술된 바와 같이 클로닝하였으며, 인산 칼슘 형질전환법을 사용하여 5 μg의 2A5-3 λ DNA 또는 5 μg의 대조 플라스미드 중 어느 하나와, 1 μg의 pSV3NEO (상기 발현 벡터는 SV40 프로모터에 의해 작동되는 G418 내성 마커 유전자를 포함함) DNA를 DXB11 CHO 세포에 동시 형질감염시킨다. 대조 세포는 제1 인트론이 TNFrFc를 코딩하는 서열이고 제2 인트론이 쥐과 DHFR을 코딩하는 2 시스트론성 메시지의 발현을 작동시키는 CMV 프로모터/인핸서로 구성된, pCAVDHFRp80이라 불리는 TNFrFc의 발현 벡터로 형질전환시켰다. pCAVDHFRp80은 2A5-3 세포주를 작제하는 데 사용된 플라스미드이다. 세포는 48시간의 회복 기간 후 400 μg/ml의 G418을 함유하는 배지로 10 cm 디쉬 내로 1:3 내지 1:2로 나뉘어졌다. 내성 콜로니는 G418 함유 배지 중에서 7일 내지 9일 동안 선별한 후 검출되었으며 1개 내지 3개의 콜로니로 구성된 24개의 풀을 선별하였고 24웰 플레이트에 접종하였다.
세포가 조밀하게 되었을 때 이 배지를 GHT가 없는 배지로 바꾸어 DHFR＋세포를 선별하였다. 이중으로 선별한 8개의 풀에 대하여 실시예 5에 기술된 바와 같이 ELISA로 TNFrFc의 비생산성을 분석하였으며 풀의 40%가 부모 세포주의 발현 수준보다 75% 이상 더 큰 발현 수준을 가짐이 밝혀졌다 (하기의 표 1 참조).
2A5-3 λ DNA로 형질전환된 세포에 의한 TNFrFc의 비생성량
세포주 또는 풀* μg/106세포/일
1. 2A5-3 2.88
2. 2A5-3.3 3.40
3. 2A5-3.6 1.45
4. 2A5-3.8 1.17
5. 2A5-3.10 0.04
6. 2A5-3.11 1.16
7. 2A5-3.13 1.99
8. 2A5-3.15 2.40
9. 2A5-3.24 4.00
10. p80.8 BR**
11. p80.9 0.01
12. p80.20 0.02
*1: 부모 세포주 (양성 대조군); 2 내지 9: 2A5-3 λ로 형질전환된 세포 풀; 10 내지 12: CAVDHFRTNFrp80으로 형질전환된 세포 풀 (음성 대조군)
**BR: 범위 미만
3개의 상기 풀을 10회의 계대에 걸쳐 모니터링하였으며 하기 표 2에 예시된 바와 같이 발현량이 부모 세포주의 발현량 이상 남아있음이 밝혀졌다.
2A5-3 λ DNA로 형질전환된 다중 계대 세포에 의한 TNFrFc의 비생성량
세포 계대수 μg/106세포/일
2A5-3 부모 세포주 75 1.59
83 1.30
2A5-3.8 풀 3 2.75
11 1.46
2A5-3.13 풀 3 2.55
11 1.91
2A5-3.15 풀 3 4.17
11 2.65
상기 실험은 제2 동시 형질감염을 반복하였으며 유사한 결과를 획득하였다. 동시 형질감염 실험 모두에 있어서, 풀을 계대함에 따라 비생성량이 감소하는 것을 관찰하였으며 이는 가장 그럴듯하게는 풀의 혼합 세포 집단에 있어서, 더 적은 양의 재조합 단백질을 생산하는 더 빠르게 성장하는 세포가 더 천천히 성장하는 더 많은 양의 재조합 단백질을 생산하는 세포보다 더 빨리 자라기 때문인 것 같다. 심지어 비생성량이 감소된 모든 세포 풀도 부모 세포주 이상의 생성량 수준을 유지하였다. 이 결과는 2A5-3 λ DNA 인서트가 DXB11 CHO 세포 DNA 내로 랜덤하게 통합될 경우 높은 빈도로 (≥40%) 부모 세포주의 표지 단백질 발현량과 근접한 발현량의 지시 단백질을 발현시킬 수 있음을 나타낸다.
실시예 7: EASE 활성을 갖는 프래그먼트의 동정
두 번째의 일련의 동시 형질감염 실험에 있어서, 2A5-3 λ DNA의 더 짧은 단편이 2A5-3 λ보다는 낮은 빈도로 재조합 단백질을 고발현 수준으로 발현시킬 수 있는지를 측정하였다. 제한 효소 절단 및 라이게이션의 표준 기술을 사용하여 서열 분석 및 제한 효소 지도 작성을 위하여 다양한 부분의 파지 인서트를 블루스크립트II (bluescriptII, 미국 캘리포니아주 라 졸라 소재의 스트라타진 제조) 또는 pGEM-11Zf(-) (미국 위스콘신주 매디슨 소재의 프로메가 (Promega)사) 내로 서브클로닝하였다 (도 1 참조). 다양한 인서트는 단백질 발현 연구를 위하여 도 1A에 예시되어 있는 파지 클론으로부터 유래되었고 pGEM1 (미국 위스콘신주 매디슨 소재의 프로메가) 내로 서브클로닝되었다. 서브클로닝에 사용되는 제한효소 부위가 도 1A에 예시된 제한효소 지도에 나타나 있다.
리포펙타민 (상표명) 시약 (미국 매릴랜드주 게이터스부르그 소재의 깁코 비알엘)을 사용하여 각각 TNFrFc 발현 플라스미드인 0.2 μg의 TNFrFc 코딩 서열 및 0.1 μg의 pSV3neo로 DXB11CHO 세포를 형질감염시켰다. 48시간 후 이 세포는 G418 선별 배지 내로 1:4 또는 1:40으로 나뉘어졌다. 배지를 -H 또는 -GHT DHFR 선별 배지로 교환할 시점인 7일 내지 10일 후에 콜로니를 육안으로 관찰할 수 있었다. DHFR 선별 배지에서 10일 내지 13일 동안 선별한 후 1 내지 3개 콜로니의 풀을 골라 24웰 용기에 도말하였다. 배양물은 조밀하게 되었을 때 샘플링되었으며 고발현율의 빈도를 기록하였다 (표 3 참조). 고발현율은 CMV 프로모터로부터의 3.9 kb 프래그먼트로부터의, 최소한 EcoR1 내지 Swa1의 2.8 kb 프래그먼트 및 CMV 프로모터의 5'에 인접한 1.9 kb 서열을 포함하는 벡터 (PG5.7△S)로 성취될 수 있음이 밝혀졌다. 더 많은 양의 인서트를 포함하는 플라스미드 (PG8.5 및 PG5.7)도 또한 발현을 증강시키는 데 효과적이었다.
>0.5 μg/ml의 재조합 단백질을 발현하는 풀의 퍼센트
작제물 재조합 단백질
HuTNRrFc HuFlt-3L
실험 1 실험 2 실험 1 실험 2
2A5-3 λ 100 (n=8) 100 (n=6) na na
PG8.5 70 (n=19) 100 (n=11) na na
PG5.7 40 (n=14) 100 (n=13) 100 (n=12) 80 (n=12)
PG5.7△S 100 (n=12) 50 (n=10) na 50 (n=6)
PG.2SE1.8 na1 100 (n=12) na na
PG.2SH1.2 na 0.0 (n=12) na na
PG2.2 0 (n=12) 0.0 (n=12) na 0.0 (n=12)
PG.2 na 0.0 (n=12) na na
1: 분석되지 않음.
상기에 기술된 바와 같이 Flt-3 리간드의 세포외 부분을 코딩하는 DNA를 포함하는 유사한 세트의 발현 플라스미드를 제조 및 시험하였다 (리만 (Lyman) 등의 문헌 [Blood 83: 2795, 1994] 및 1994년 5월 11일에 출원된 미국 특허 제08/242,545호 참조). TNFrFc에서 관찰된 바와 같이 PG5.7△S 벡터에서는 고발현 수준이 성취될 수 있었지만 PG2.2 벡터 또는 PG.2 벡터에서는 성취되지 않았다. 상기 실험 결과는 재조합 단백질의 높은 발현율이 큰 빈도로 일어나는 것은 단백질에 특이적인 것이 아니고 1.8 kb의 EcoR1 내지 Swa1 밴드가 상기 활성에 필수적임을 나타낸다.
추가의 프래그먼트를 제조하여 발현 증강 활성에 대하여 실험하였다. EcoR1 프래그먼트를 포함하고 서열 번호 1의 뉴클레오티드 8672 내지 12273으로 대표되는 작제물인 PG3.6은 PG.2SE1.8 작제물 및 PG.2SH1.2 작제물과 유사한 방식으로 뉴클레오티드 14290 내지 14507에 라이게이션시켰다. 서열 번호 1의 뉴클레오티드 10100 내지 14293으로 대표되는 BbsI 프래그먼트로부터 유사한 작제물을 또한 제조하였다. 상기 작제물 모두는 PG5.7 작제물에 필적하는 발현 증강 활성을 나타내었다. 서열 번호 1의 뉴클레오티드 14290 내지 14507에 라이게이션된 BamHI 프래그먼트 (뉴클레오티드 2221 내지 5984)로 이루어진, PG3.8로 명명된 작제물은 활성을 나타내지 않았다.
상기 실험 결과는 발현 증강 활성을 나타내는 2A5-3 λ DNA의 영역이 주로 뉴클레오티드 5980 (도 1에서 BamHI 부위)과 14290 (도 1에서 BbsI 부위) 사이에 위치한다는 것을 나타낸다. SV40 프로모터/인핸서를 사용한 다른 실험에서 발현 증강 활성이 프로모터에 의존적이 아님이 증명되었다. 또한 EASE 포함 작제물은 전기천공법으로 세포 내로 성공적으로 또한 도입되었으며 발현 증강 활성을 나타내었다. 하지만 EASE 포함 작제물을 원숭이 세포주 (Vero) 내로 형질감염시킬 경우 발현 증강 활성이 관찰되지 않았는데, 이는 서열 번호 1의 EASE에 대한 종 특이성 또는 세포형 특이성의 가능성을 나타내는 것이다.
실시예 8: 비생성량의 비교
더 짧은 길이의 통합 부위 DNA를 포함하는 플라스미드로 형질감염시킨 클론의 발현량을 더 정확하게 정량화하고 파지 DNA로 형질감염시킴으로써 유래된 클론과 상기 클론을 더 정확하게 비교하기 위하여 PG5.7△STNFrFc 작제물로 형질감염된, 가장 높은 발현량을 나타내는 3개의 풀의 비생성량과, 파지 DNA로 형질감염된, 가장 높은 발현량을 나타내는 3개의 풀의 비생성량을 비교하였다 (표 4). 상기 실험으로부터 모든 6개의 풀은 표준 T 시험법을 사용하여 비교할 경우 발현 수준이 현저하게 다르지 않음이 밝혀졌다 (p=0.14).
파지 DNA 또는 PG5.7dS를 사용하여 발현시킨 재조합 단백질의 상대적 발현량
세포 풀 평균 μg/106세포/일1
2a5.3.3 3.06 ± 0.60
2a5.3.7 2.67 ± 0.28
2a5.3.11 3.37 ± 0.54
PG5.7△S.1 2.25 ± 0.35
PG5.7△S.4 2.79 ± 0.89
PG5.7△S.6 2.65 ± 0.34
1: n=2
표 3에 나타낸 빈도 데이터와 함께 상기 결과를 고려해 보면 PG5.7△S 벡터는 고수준의 발현에 필요한 모든 서열 정보를 포함하고 있음을 알 수 있다.
실시예 9: EASE의 특성화
2A5-3 λ 유래 발현 벡터에서 발견되는 발현 증강 활성을 더 특성화하기 위하여 콜로니 형성 분석을 수행하였다. 여기에서, 플라스미드 PG8.5, PG5.7△S, PG.2SE1.8, PG.2SH1.2 및 PG.2로부터의 DHFR 코딩 서열 0.16 μg을 DXB11 세포 내로 리포펙타민 (상표명)을 사용하여 형질감염시켰다. 48시간의 발현 시간 후 다양한 농도의 MTX를 함유하는 -GHT 배지에 플레이트 당 1 x 104세포를 도말하였다. 9일 내지 11일 후 플레이트를 메탄올로 고정시켰고 콜로니 형성에 대하여 메틸렌 블루로 염색시켰다. 0 nM 및 10 nM의 MTX에서 플라스미드 PG.2SH1.2 및 PG.2 플라스미드와 비교하여 플라스미드 PG8.5, PG5.7△S, 및 PG.2SE1.8에서 더 큰 콜로니 형성수가 검출되었다 (표 5 참조).
pgem 벡터를 사용한 경우의 콜로니 형성
플라스미드 콜로니/메토트렉세이트 (단위: nM)
0 nM 10 nM 25 nM 50 nM
PG8.5 206 65 8 3
PG5.7△S 224 57 6 3
PG.2SE1.8 168 28 0 2
PG.2SH1.2 51 2 0 1
PG.2 85 22 1 0
상기 데이터는 PG.2E1.8에 포함된 1.8 kb의 EcoR1 내지 Swa1 프래그먼트가 EASE 기능에 필수적임을 나타낸다. 또한 상기 영역에 포함된 0.6 kb의 Hpa1 내지 EcoR1 프래그먼트는 EASE 활성에 중요하다 (PG.2SH1.2 및 PG.2의 결과와 비교하기 바람). 길이가 더 긴 CHO 게놈 DNA를 포함하는 플라스미드, 즉 PG8.5 및 PG5.7△S는 플라스미드 PG.2SE1.8과 비교했을 때 증가된 선별 압력 (25 nM 및 50 nM의 MTX)에서 더 큰 콜로니 형성수를 나타내었다. 더 큰 선별 압력에서의 상기와 같은 특이한 콜로니 형성은 플라스미드 내에 더 긴 CHO 게놈 DNA의 스트레치가 존재할 경우 더 짧은 CHO 게놈 DNA 스트레치보다 더 큰 빈도수로 높은 발현이 일어날 수 있음을 나타낸다.
실시예 10: 일시 발현 분석
일시 발현 분석은 일시 발현 비염색체 DNA에서 발현을 증가시킬 수 있는 고전적인 인핸서 또는 프로모터와 유사하게 발현 증강 활성이 작용하는지를 측정하기 위하여 행하였다. 상기에 기술된 바와 같이 리포펙타민 (상표명) 기술을 사용하여 플라스미드 PG8.5 및 플라스미드 PG2.2 (실시예 7에서 증명된 바와 같이 전자는 EASE 활성을 갖는 것으로 나타난 반면 후자는 그렇지 않음)로 CHO 세포를 일시적으로 형질감염시켰다. 48시간 후에 상청액을 수집하였으며 상기에 기술된 바와 같이 ELISA를 사용하여 TNFrFc 발현에 대하여 시험하였다. 실시예 7의 안정한 발현에 대한 실험과는 반대로 상기 2개의 플라스미드는 일시 발현 분석에서 재조합 TNFrFc의 발현 수준이 동일하였다 (표 6 참조).
TNFrFc의 일시 발현량
플라스미드 평균 TNFrFc (ng/ml1)
PG2.2 95.75 ± 41.97
PG8.5 105.5 ± 26.02
1: n=4
상기 데이터는 이전에 공지된 인핸서 및(또는) 프로모터와는 달리 EASE 기능에 염색체 통합이 필요하다는 것을 나타낸다.
실시예 11: 단백질 생산에 요구되는 시간의 단축
3개의 상이한 발현 벡터인 pCDE ("재조합 단백질의 발현" 참조), PG5.7 및 PG5.7I를 사용하여 Flt-3L을 CHO 세포에서 발현시켰다. PG5.7I 벡터는 아데노바이러스의 세 부분으로 이루어진 리더와 PG5.7의 DHFR cDNA 사이에 클로닝된 쥐과 뇌심근염 바이러스 IRES를 포함하는 PG5.7의 유도체이다. 리포펙타민 (상표명) 방법을 사용하여 상기에 기술된 3개의 Flt-3L 발현 플라스미드로 DXB11 CHO 세포를 형질감염시키고 -GHT 배지에서 DHFR 발현에 대하여 선별하였다. 이어서 DHFR＋콜로니를 풀로 모았으며 0 nM, 25 nM, 50 nM 및 100 nM의 MTX에 도말하여 조밀해질 때까지 배양하였고 이 때 각 작제물로 형질감염된 풀의 비생산성을 측정하였다. 각 작제물로부터의 발현량은 각 MTX 수준에서 동일하였지만, 분석을 완료하는 데 요구되는 시간은 pCED 및 PG5.7의 벡터에 있어서 요구되는 7주 내지 8주와 비교하여 PG5.7I 벡터로 만들어진 세포 풀의 경우 단지 4주 내지 5주였다.
상기 경향 (EASE가 존재할 경우 더 짧은 시간에 유사한 발현 수준을 획득함)은 다수의 상이한 단백질, 즉 pCED 벡터에서 발현되는 3종 이상의 단백질 및 PG5.7I 벡터로 발현되는 6종 이상의 단백질에서 관찰되었다. 일반적으로 EASE 및 IRES 서열을 포함하는 발현 벡터를 사용할 경우 IRES 서열만을 단독으로 포함하는 유사한 발현 벡터와 비교했을 때 재조합 단백질을 생산하는 시간이 2주 내지 5주 더 단축된다. 또한 EASE를 포함하도록 개발된 세포 풀은 시간이 흘러도 안정하였으며 대부분의 목적에 있어서 세포주로서 처리될 수 있었다. 개발 과정에서 클로닝 단계가 훨씬 늦게까지 지연될 가능성도 있는데, 이는 단시간에 다량의 재조합 단백질을 수득하는 데 현저한 잇점을 제공하였다.
실시예 12: 생산 규모 발현에서의 EASE의 용도
PG5.7I 벡터를 사용하여 재조합 HuCD40L을 제조용으로 CHO 세포에서 발현시켰다. 여기에서 huCD40L의 삼량체 형태를 코딩하는 DNA는 PG5.7I 벡터 내로 클로닝시켰고 생성된 CD40L 발현 플라스미드의 DNA는 리포펙타민 (상표명)을 사용하여 CHO 세포 내로 형질감염시켰다. 세포는 첫 번째로 DHFR＋표현형에 대하여 선별하였고 이어서 풀로 모아 50 nM의 MTX에서 선별하였다. 50 nM의 MTX에서 성장하는 세포는 소프트 아가 클로닝 방법을 사용하여 클로닝하였다 (깁슨 (Gibson) 등의 문헌 [BioTechniques 15: 594, 1993] 참조). 18개의 콜로니를 골라 huCD40L의 비생산성에 대하여 스크리닝하였으며 현탁 적응에 대하여 2종의 세포주를 선별하였고 생산은 공급 배치식 (fed-batch) 생물반응기에서 수행하였다. 각각 세포주 중 하나 (50-B4 주)를 사용하는 10일 및 8일의 2가지의 생산 작업 동안 세포는 각각 평균 비생산성이 106세포 당 일일 약 24 μg 및 25 μg으로 유지시켰다. 최종 역가는 ELISA에 의하면 10일 및 8일의 작업에 있어서 각각 1.02 및 1.09 g/L이었다. 상기 실시예는 제조 개발에서 상기 벡터를 사용하면 이 기술이 개선된다는 것을 입증하는데 이는 고수준의 재조합 단백질 발현이 최소 스크리닝 (18종의 세포주가 스크리닝됨) 및 선별 단계 (2 단계)로 도달가능한 형식으로 성취되었기 때문이다.
〈서열표〉
(1) 일반적 정보 :
(i) 출원인: 모리스, 아비아 이., 리, 지창, 토마스, 제임스 엔.
(ii) 발명의 명칭: 발현 증강 서열 요소
(iii) 서열수: 1
(iv) 통신 주소:
(A) 수신인: 임뮤넥스 코포레이션
(B) 거리: 유니버시티 스트리트 51
(C) 도시: 시애틀
(D) 주: 워싱톤주
(E) 국가: 미국
(F) 우편번호: 98101
(v) 컴퓨터 판독 형태
(A) 매체 유형: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: 애플 파워 매킨토시
(C) 작동 시스템: 애플 작동 시스템 소프트웨어 7.5.5
(D) 소프트웨어: 파워 매킨토시용의 마이크로소프트 워드, 버전 6.0.1
(vi) 본 출원 데이터
(A) 출원 번호:
(B) 출원일: 97년 1월 10일
(C) 분류:
(vii) 우선권 데이터
(A) 출원 번호: USSN 08/586,509
(B) 출원일: 96년 1월 11일
(C) 분류:
(viii) 대리인/대행인 정보
(A) 성명: 퍼킨스, 패트리샤 앤
(B) 등록 번호: 34,693
(C) 참조/일람 번호: 2841-WO
(ix) 통신 정보:
(A) 전화: (206)587-0430
(B) 텔레팩스: (206)233-0644
(2) 서열 1에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 14507 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 상관없음
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(iii) 가설: 없음
(iv) 안티 센스: 없음
(vi) 원천
(A) 유기체: 중국 햄스터
(vii) 직접적인 원천:
(B) 클론: 2A5-3 람다 CHO 서열
(xi) 서열 설명: 서열 번호 1

Claims (17)

  1. 서열 번호 1의 뉴클레오티드 1 내지 14507, 뉴클레오티드 5980 내지 14507, 뉴클레오티드 8671 내지 14507, 뉴클레오티드 8671 내지 10515, 뉴클레오티드 9277 내지 10515, 뉴클레오티드 8672 내지 12273, 뉴클레오티드 10100 내지 14923을 포함하는 DNA, 발현 증강 활성을 갖는 상기 DNA의 프래그먼트, 상기 DNA에 상보적인 DNA, 뉴클레오티드 서열이 상기 DNA에 대하여 약 80% 이상 동일하고 발현 증강 활성을 갖는 DNA와, 발현 증가 활성을 갖는 상기 DNA들의 결합물로 구성된 군으로부터 선택된, 단리된 발현 증강 서열 요소 (expression augmenting sequence element, EASE).
  2. 제1항에 있어서, 서열 번호 1의 뉴클레오티드 1 내지 14507, 뉴클레오티드 5980 내지 14507, 뉴클레오티드 8671 내지 14507, 뉴클레오티드 8671 내지 10515, 뉴클레오티드 9277 내지 10515, 뉴클레오티드 8672 내지 12273, 및 뉴클레오티드 10100 내지 14923으로 주로 구성된 DNA들로 구성된 군으로부터 선택되는 EASE.
  3. 제2항에 있어서, 서열 번호 1의 뉴클레오티드 14290 내지 14507을 포함하는 DNA에 라이게이션된 EASE.
  4. 제1항의 EASE를 포함하는 발현 벡터.
  5. 제2항의 EASE를 포함하는 발현 벡터.
  6. 제3항의 EASE를 포함하는 발현 벡터.
  7. 제6항에 있어서, 제1 엑손이 원하는 단백질을 코딩하고 제2 엑손이 증폭가능하고 선별가능한 우성 마커를 코딩하는 2 시스트론성 플라스미드인 발현 벡터.
  8. 제7항에 있어서, 증폭가능하고 선별가능한 우성 마커가 디히드로폴레이트 환원 효소 (DHFR)인 발현 벡터.
  9. 제8항에 있어서, 2개의 엑손 사이에 IRES 서열을 더 포함하는 발현 벡터.
  10. 제7항에 따른 발현 벡터로 형질전환된 CHO 세포.
  11. 제8항에 따른 발현 벡터로 형질전환된 CHO 세포.
  12. 제9항에 따른 발현 벡터로 형질전환된 CHO 세포.
  13. 재조합 단백질의 발현을 촉진하는 조건 하에서 제10항에 따른 형질전환 숙주 세포를 배양하고 이 단백질을 회수하는 것을 포함하는 재조합 단백질의 수득 방법.
  14. 재조합 단백질의 발현을 촉진하는 조건 하에서 제11항에 따른 형질전환 숙주 세포를 배양하고 이 단백질을 회수하는 것을 포함하는 재조합 단백질의 수득 방법.
  15. 재조합 단백질의 발현을 촉진하는 조건 하에서 제12항에 따른 형질전환 숙주 세포를 배양하고 이 단백질을 회수하는 것을 포함하는 재조합 단백질의 수득 방법.
  16. 제7항 내지 9항 중 어느 한 항에 따른 발현 벡터로 형질전환된 CHO 세포의 안정한 풀.
  17. 재조합 단백질의 발현을 촉진하는 조건 하에서 제16항에 따른 CHO 세포의 안정한 풀을 배양하고 이 단백질을 회수하는 것을 포함하는 재조합 단백질의 수득 방법.
KR1019980705146A 1996-01-11 1997-01-10 진핵 세포 발현 시스템을 위한 발현 증강 서열 요소 (ease) KR19990077015A (ko)

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