JP2000503205A - 真核生物発現システムの発現増大配列エレメント（ｅａｓｅ） - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 発現ベクター内にある場合に、安定な細胞プール内での組換えタンパク質の発現を２から８倍改良することのできるヌクレオチド配列を開示している。

Description

【発明の詳細な説明】 真核生物発現システムの発現増大配列エレメント（ＥＡＳＥ） 発明の技術分野 本発明は、真核細胞内で組換えタンパク質の発現を増大させるＤＮＡ配列エレ メントに関する。発明の背景 組換えタンパク質を生産する発現システムの開発は、研究用または医療用用途 に供されるタンパク質源の開発に重要である。発現システムは、大腸菌のような 原核細胞、ならびに、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａおよび Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種）および哺乳動物細胞の両方を含む真核細胞、の 両方で開発されている。しかし、時として、哺乳動物細胞での発現は、医療用タ ンパク質の製造に好ましい。なぜなら、そのような発現システムでの翻訳後修飾 は、微生物（原核生物）発現システムで起こる翻訳後修飾の型より、哺乳動物に 見られる翻訳後修飾の型に、より似ていると考えられるためである。 真核生物遺伝子の転写は、様々なシス−およびトランス−作用調節エレメント によって調節されている（ＤｉｌｌｏｎおよびＧｒｏｓｖｅｌｄ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ.，９，１３４，１９９３）。最も良く特徴付けられた２つのシスエ レメントは、プロモーターとエンハンサーである。プロモーターは、遺伝子のコ ード配列の５’側すぐのＤＮＡ配列であり、トランス−作用転写因子のための複 数の結合部位を包含し、基礎的転写装置を形成する。エンハンサーもまた、トラ ンス−作用転写因子のための複数の結合部位から構成されるが、コード配列の上 流あるいは下流から遠くに見出されるか、またはイントロン内に見出すこともで きる。また、これらのエレメントは、方向非依存性様式で作用することができる 。プロモーターおよびエンハンサーの活性は、一過性の発現システム内で検出す ることができ、組織特異的であるかまたは組織特異的でないエレメントを含む； それらは、安定細胞系またはトランスジェニッタ動物内で研究する場合、位置の 影 響を受けやすい。 シス−調節エレメントのもう一つのカテゴリーは、座制御領域(locus control regions)（ＬＣＲ）(Ｇｒｏｓｖｅｌｄ Ｆ．ら、Ｃｅｌｌ，５１，９７５，１ ９８７)、マトリックス付着領域(matrix attachment regions)（ＭＡＲ）(Ｐｈ ｉ−Ｖａｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ.，１０，２３０２，１９８０)、骨 格付着領域(Scaffold attachment regions)（ＳＡＲ）(ＧａｓｓｅｒおよびＬａ ｅｍｍｌｉ、Ｔｒｅｎｄｓ．Ｇｅｎｅｔ.，３，１６，１９８７)、および絶縁エ レメント(insulator element)（ＫｅｌｌｕｍおよびＳｃｈｅｄｌ、Ｃｅ１１， ６４，９４１，１９９１）を含む、クロマチン構造を調節すると信じられている エレメントである。これらのエレメントは、離れていても作用できると言う点で エンハンサーと同様であり、それらの効果は安定な形質転換細胞系またはトラン スジェニック動物内でのみ検出できると言う点でユニークなものである。また、 ＬＣＲも、それらが位置および方向依存性であり、組織特異的様式で活性である という点で、エンハンサーとに類似していない。さらに、ＬＣＲおよびＳＡＲ配 列は、Ａボックス、ＴボックスおよびトポイソメラーゼII部位を特徴とし、それ らは、エンハンサーまたはプロモーター配列内には典型的には認められない（Ｇ ａｓｓｅｒおよびＬａｅｍｍｌｉ、上記；Ｋｌｅｈｒ，Ｄ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ ｉｓｔｒｙ，３０，１２６４，１９９１）。 内在性リボソームエントリー部位（internal ribosome entry sites）は、い くつかのウイルスおよび細胞内ＲＮＡ内に認めることのできるもう一つの型の調 節エレメントである(ＭｃＢｒａｔｎｅｙら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ．５．９６１、１９９３に概説)。ＩＲＥＳ は、バイシストロニック（bicistronic）真核生物発現カセット中の第二の遺伝 子生成物の翻訳を強化するために有用である(Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．ら、Ｎ ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ.，１９，４４８５，１９９１)。 哺乳動物宿主内で発現させるためのいくつかのベクターであって、そのそれぞ れが、最少の時間枠内に組換えタンパク質を高レベルにするための、シス−およ びある場合にはトランス−の調節エレメントを様々な組み合わせで含む、ベクタ ーは入手可能である。しかしながら、そのようなベクターは数多く入手可能であ るにもかかわらず、哺乳動物システム内で達成される組換えタンパク質の発現レ ベルが、微生物発現システムで得られるそれより低いこともしばしばある。さら に、望ましいタンパク質を高レベルで発現する形質転換された細胞系の開発は、 時間を浪費するクローニングおよび増幅を時として必要とすることもある。従っ て、哺乳動物細胞内での発現を改善し改良するための、および組み換えタンパタ 質の発現を増大させ、組換えタンパク質生産への哺乳動物細胞の使用を容易にす るエレメントを同定するための、技術が必要とされる。発明の概要 短期間の内に哺乳動物宿主細胞内での組換えタンパク質の高い発現を容易にす る、新規の転写調節配列である、発現増大配列エレメント(expression augmenti ng sequence element)（ＥＡＳＥ）を開示する。本発明の一つの実施態様は、短 期間の内に哺乳動物宿主細胞内での組換えタンパク質の高い発現を容易にする発 現増大配列エレメント（ＥＡＳＥ）であって、一過性の発現システム内では活性 でなく、タンパク質をコードするＤＮＡの特徴を示さず、ＬＣＲ、ＭＡＲまたは ＳＡＲに認められるヌクレオチド配列特性を示さない、発現増大配列エレメント である。本発明の望まし実施態様は、チャイニーズハムスター卵巣(Chinese ham ster ovary)（ＣＨＯ）細胞のゲノムＤＮＡの、哺乳動物の組換えタンパク質の 唯一の組込み部位の近傍から得られるＥＡＳＥである。 本発明の最も好ましい実施態様では、ＥＡＳＥは、配列番号：１のヌクレオチ ド１から１４５０７、ヌクレオチド５９８０から１４５０７、ヌクレオチド８６ ７１から１４５０７、ヌクレオチド８６７１から１０５１５、ヌクレオチド９２ ７７ら１０５１５、ヌクレオチド８６７２から１２２７３、ヌクレオチド１０１ ００から１４９２３を含むＤＮＡ、発現増大活性を持つ前述のＤＮＡのフラグメ ント、前述のＤＮＡに相補性をもつＤＮＡ、発現増大活性を持つ前述のＤＮＡに 対してヌクレオチド配列で少なくとも約８０％同一であるＤＮＡ、ならびに、発 現増大活性を持つ前述のＤＮＡの組み合わせからなる群より選択される。一つの 実施態様では、ＥＡＳＥ ＤＮＡを、配列番号：１のヌクレオチド１４２９０か ら１４５０７を含むＤＮＡと連結する；代わりの方法では、ＥＡＳＥ ＤＮＡ を、配列番号：１のヌクレオチド１２５９２から１４５０７を含むＤＮＡと連結 する。 新規のＥＡＳＥを含む発現ベクターは、組換えタンパク質を高発現させるよう にＣＨＯ細胞を形質転換することができる。このように、本発明のもう一つの実 施態様は、ＥＡＳＥを含む発現ベクターである。望ましい実施態様では、発現ベ タターは、さらに、興味あるタンパク質を発現させる真核生物プロモーター／エ ンハンサーを含む。最も好ましい実施態様では、発現ベクターは、第一のエクソ ンが興味ある遺伝子をコードし、そして第二のエキソンが増幅可能な優性選択可 能マーカー（amplifyable dominant selectable marker）をコードする、バイシ ストロニックプラスミドからなる。好ましいマーカーはジヒドロホレートレダク ターゼ（dihydrofolate reductase）（ＤＨＦＲ）であり、その他の増幅可能マ ーカーもまた、本発明の発現ベクター内での使用に適当である。さらに、発現ベ クターは、二つのエキソン間にＩＲＥＳ配列を含む。 哺乳動物宿主細胞は、本発明の発現ベクターで形質転換することができ、短期 間内に高レベルの組換えタンパク質を生産するであろう。従って、本発明のもう 一つの実施態様では、本発明の発現ベクターで形質転換した哺乳動物宿主細胞が 提供される。最も好ましい実施態様では、宿主細胞はＣＨＯ細胞である。 また、本発明は、組換えタンパク質を得るための方法であって、本発明の発現 ベクターで宿主細胞を形質転換し、形質転換された宿主細胞をタンパク質の発現 を促進する条件下で培養し、そしてタンパク質を回収することを含む、前記の方 法を提供する。本発明の好ましい適用では、形質転換された宿主細胞系は、二段 階の選択段階；優性増幅可能マーカーを発現する細胞を選択するための第一の選 択段階、および、マーカー遺伝子ならびに興味ある遺伝子の高レベル発現および ／または増幅のための第二段階；で選択される。最も好ましい実施態様では、選 択または増幅剤は、メトトレキセート、内因性ＤＨＦＲ遺伝子およびトランスフ ェクトされたＤＨＦＲ配列の増幅を生じることが示されたＤＨＦＲのインヒビタ ーである。 さらに、本発明は、さらなる発現増大配列エレメントを、例えば他の形質転換 細胞系から同定する方法も提供する。そのような細胞系は、遺伝子の高コピー数 に依存しない高レベルの発現を示すであろう。本発明の技術は、そのようなＥＡ ＳＥ、ならびに、非形質転換細胞内に存在するＥＡＳＥの同定および単離（例え ば、ハイブリダイゼーション研究または配列分析によって）に有用であろう。図面の簡単な説明 図１は、２Ａ５−３ ＣＨＯゲノムＤＮＡから誘導された様々な長さの挿入物 を示す。図１Ａは、実施例１に記載した、クローニングベクターλＦｉｘII内に クローン化されたＴＮＦｒＦｃ組込み部位の制限地図である；サブクローニング に用いられた制限部位も示している。挿入物は、配列番号：１のヌクレオチド１ から１４５０７に相当する。図１Ｂは、図１Ａに示したファージクローンから実 施例７に記載したように誘導され、ｐＧＥＭ１内にクローン化された挿入物につ いて示している。太い黒線はＣＭＶプロモーターであり、ドット打ちした箱はア デノウイルスの３文節系リーダー配列であり、左向きのハッチングを引いた箱は ＴＮＦｒＦｃコード領域であり、そしてより間隔の狭いハッチングを引いた箱は ＤＨＦＲ−コード配列である。配列番号：１に対応させると、ＰＧ８．５中の挿 入物はヌクレオチド５９８０から１４５０７に相当し、ＰＧ５．７中の挿入物は ヌクレオチド８６７１から１４５０７に相当し、ＰＧ５．７ΔＳ中の挿入物は、 ヌクレオチド１２５９２から１４５０７に連結させたヌクレオチド８６７１から １０５１５に相当し、ＰＧ．２ＳＥ１．８中の挿入物はヌクレオチド１４２９０ から１４５０７に連結させたヌクレオチド８６７１から１０５１５に相当し、Ｐ Ｇ．２ＳＨ１．２中の挿入物はヌクレオチド１４２９１から１４５０７に連結さ せたヌクレオチド９２７７から１０５１５に相当し、ＰＧ．２．２中の挿入物は ヌクレオチド１２２６９から１４５０７に相当し、そしてＰＧ．２中の挿入物は ヌクレオチド１４２９０から１４５０７に相当する。発明の詳細な説明 発現ベクター内に挿入した場合に、安定な細胞プール内でレポータータンパク 質の発現を２から８倍に改良することのできる新規の配列エレメントを単離同定 した。そのような配列エレメントの一つは、組換え二量体である腫瘍壊死因子レ セプター／イムノグロブリンＦｃ融合タンパク質(Tumor Necrosis Factor recep tor/immunogloburin Fc fusion protein)（ＴＮＦｒＦｃ）をコードする唯一の 発現カセットの組み込み部位を、このタンパク質を高レベルで発現する細胞系の ゲノムＤＮＡからクローニングすることによって、同定された。本発明の配列エ レメントは、以前から特徴付けられているプロモーター、エンハンサー、座調節 領域、骨格付着領域またはマトリックス付着領域のようなシス−作用エレメント とは、その発現増強活性の動向が類似していないため、新規の機能をコードする と考えられる。さらに、この配列エレメントはいかなるオープンリーディングフ レーム(open reading frame)（ＯＲＦ）も含まず、それらが新規のトランス−活 性化タンパク質をコードするとは考えられない。我々は、これらの新規の配列エ レメントを「発現増大配列エレメント」（ＥＡＳＥ）と名付ける。ＥＡＳＥの物理的機能的特徴 ＥＡＳＥ活性は、このタンパク質を高レベルで発現する細胞系のゲノムから、 ＣＨＯゲノムＤＮＡのＴＮＦｒＦｃコード配列の唯一の組込み部位の５’側の１ ４．５ｋｂ内に同定された。(２Ａ５−３と名付けられた)。この単離された１４ ．５ｋｂ領域およびそのより短いフラグメントを含む発現ベクターは、ＤＸＢ１ １ ＣＨＯ細胞を、組換えタンパク質の発現を頻度＞５０％の高レベルに形質転 換することができた。マッピングの研究から、＞５０％の活性は、１．８ｋｂの ＤＮＡ領域内（配列番号：１のヌクレオチド８６７１からヌクレオチド１０５１ ５まで）に位置することが分かった。さらに、配列番号：１のヌクレオチド８６ ７１からヌクレオチド９２７６の配列（ＥｃｏＲ１からＨｐａ１までの６０４ｂ ｐフラグメント）は、もしこの領域がベクター内に存在しない場合には発現増強 が著しく減少すると言う理由から、活性に必須であると考えられる。本発明のＥ ＡＳＥは、それを連結させるプロモーター／エンハンサー領域によって操縦(ｄ ｒｉｖｅ)される組換えタンパク質の発現を改良することができる。 さらに、本明細書中に記載の方法に従って、ＥＡＳＥ活性を示す１４．５ｋｂ のＣＨＯゲノムＤＮＡのさらなるフラグメントを同定することもでき、あるいは その他の細胞系または形質転換された細胞内のその他の組込み部位から類似のＥ ＡＳＥモチーフを同定することもできる。さらに、この技術分野では、制限酵素 消化によって調製されたＤＮＡフラグメントをさらに処理することによって、フ ラグメント末端からいくつかのヌクレオチドをさらに除去できることも知られて いる。したがって、本明細書中に記載されたおよび請求の範囲に記載されたＤＮ Ａフラグメントは、列挙したヌクレオチドの５塩基対内で終わるフラグメントを も含む。 本明細書中に記載のフラグメントのその他の組み合わせ（例えば、本明細書中 に開示されたＥＡＳＥの複数のコピーを含む配列、または開示されたＥＡＳＥを その他のヌクレオチド配列と組み合わせることによって誘導された配列）を開発 し、調節エレメントの最適な組み合わせを達成することができる。そのような組 み合わせを隣接して連結または配置すると、（即ち、エレメント間に「スペーサ ー」ヌクレオチドを導入することによって）ＥＡＳＥフラグメントに最適な間隔 を提供することができる。また、調節エレメントを配置することで、他の調節領 域からの最適な間隔をＥＡＳＥに提供することができる。同様に、ベクター内の ＥＡＳＥの方向を最適化すると、高レベルのタンパク質発現を提供することがで きる。 本明細書中に記載のＥＡＳＥは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞 から単離された。相同の発現増大エレメントが、他の哺乳動物種からの細胞内、 ならびにその他の組織型から誘導された細胞系内にも存在すると予想され、この 技術分野で周知の技術、例えば、種間ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲに基 づいた技術によって単離することができる。さらに、この技術分野で周知の部位 特異的またはランダム突然変異誘発技術によって、配列番号：１に示したヌクレ オチド配列に変更を加えることもできる。次いで、そうして得られたＥＡＳＥ変 異体を、本明細書中に記載の方法に従って、ＥＡＳＥ活性について試験すること ができる。配列番号：１のヌクレオチド配列またはＥＡＳＥ活性を持つそのフラ グメントと少なくとも約８０％同一、より好ましくは少なくとも約９０％同一で あるＤＮＡは、日常的に行われている実験によって単離可能であり、ＥＡＳＥ活 性を持つと予想される。ＥＡＳＥのフラグメントについて、同一性の％とは、Ｅ ＡＳＥフラグメント内に認められる天然配列と関連する部分の％をさす。従って 、 ＥＡＳＥの同族体およびＥＡＳＥの変異体もまた、本発明に包含される。 組換えタンパク質の発現は、適当な真核生物のプロモーター／エンハンサーお よび本発明のＥＡＳＥによって操縦される。例えば、選択培地中にメトトレキセ ート(ＭＴＸ)、ＤＨＦＲインヒビターを用いることによって、優性の選択可能マ ーカーについて低いストリンジェンシーの下で選択されたプラスミドを、細胞に トランスフェクトし、次いで、より高いストリンジェンシーで再度選択する。最 初の選択で、陽性の形質転換株（即ち、メトトレキセート選択の場合にはＤＨＦ Ｒ⁺形質転換株）が得られ、そして、第二の選択で、興味ある遺伝子を高レベル で発現する形質転換株が得られる。 ＥＡＳＥを含むベクター内にＩＲＥＳ配列を挿入することは、いくつかのタン パク質の発現を強化するために有益であろう。ＩＲＥＳ配列は、高選択圧下での 興味ある遺伝子の発現を安定化すると考えられる(Ｋａｕｆｍａｎら、１９９１ 、上記)。細胞によって十分にプロセスされるタンパク質については、高発現レ ベルを達成するために、ＩＲＥＳ配列は必要ではない。 組換えタンパク質を高レベルで発現する細胞集団は、本明細書中に記載の二段 階の選択プロトコールを用いて、５から７週間で開発することができる。高発現 の絶対的レベルは、具体的なタンパク質に応じて変化し、細胞によってタンパク 質がどれだけ充分にプロセスされるかに依存する。我々は、様々なサイトカイン およびサイトカインレセプターを用いて、少なくとも約０．２μｇ／１０⁶細胞 ／日で、多くの場合には、約１２μｇ／１０⁶細胞／日で発現する安定な細胞の プールを得た。このレベルのタンパク質発現を達成するために必要な時間は、Ｅ ＡＳＥを含まないベクターを用いて行った同様の形質転換株で認められる時間の ほぼ半分である。さらに、ＥＡＳＥで開発された細胞のプールは、期間中ずっと 安定であり、ほとんどすべての目的のための細胞系として扱うことができる。通 例の組換えタンパク質に比べると、開発プロセスのより後期まで、クローニング の段階を遅らせることもできる。さらなるクローニング段階を踏むことによって 、約２４μｇ／１０⁶／日より大きく発現する細胞系を開発することも可能であ る。 トランスフェクション実験から、これらのＤＮＡ配列内に認められるＥＡＳＥ は、従来報告されているシス−作用エレメントのある種の特徴を有しているが、 従来の報告の定義内に入るものではないことが判明した。ＬＣＲ、ＭＡＲおよび ＳＡＲ配列と同様に、ＥＡＳＥ活性は、一過性のアッセイでは検出されない。し かしながら、これらの配列とは異なり、ＥＡＳＥは、これらのエレメント内で典 型的に認められるＡボックス、Ｔボックスまたはトポイソメラーゼ２部位（Ｋｌ ｅｈｒら、上記）を持たない。一過性のアッセイではＥＡＳＥ活性が検出されな いので、それらはまた、これらの方法で検出されるプロモーターおよびエンハン サーエレメントとも異なると考えられる。組換えタンパク質の発現 組換え発現ベクターは、哺乳動物、ウイルスまたは昆虫の遺伝子より誘導され た適当な転写または翻訳調節エレメントに機能可能なように連結された、タンパ ク質をコードする合成またはｃＤＮＡ−誘導のＤＮＡフラグメントを含む。その ような調節エレメントは、転写プロモーター、適当なｍＲＮＡリボソーム結合部 位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終結を調節する配列を含む(詳 細を以下に記載する)。また、哺乳動物発現ベクターは、発現される遺伝子に連 結された複製開始点、適当なプロモーターおよびエンハンサーのような非転写エ レメント、その他の転写されない５’または３’フランキング配列、必須のリボ ソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部 位のような翻訳されない５’または３’配列、ならびに転写終止配列を含み得る 。また、宿主内で複製する能力を授ける複製開始点および形質転換株の認識を容 易にする選択可能遺伝子を取り入れることもできる。 ＤＮＡ領域は、それらが互いに機能的に関連する場合には、機能できるように 連結される。例えば、もしポリペプチドがその分泌に関与する前駆体として発現 される場合には、シグナルペプチド（分泌リーダー）のＤＮＡをポリペプチドの ＤＮＡに機能できるように連結する；プロモーターが配列の転写を調節する場合 には、プロモーターをコード配列に機能できるように連結する；または、翻訳を 可能にするようにリボソーム結合部位を配置する場合には、それをコード配列に 機能するように連結する。一般的には、「機能できるように連結された」とは、 隣接を意味し、分泌リーダーの場合には隣接しおよび読み枠内であることを意味 する。 脊椎動物細胞の形質転換に用いられる発現ベクター内の転写および翻訳調節配 列は、ウイルス起源から提供できる。例えば、共通に用いられるプロモーターお よびエンハンサーは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サルのウイルス４０（Ｓ Ｖ４０）およびヒトのサイトメガロウイルスから誘導される。ウイルスゲノムプ ロモーター、調節および／またはシグナル配列は、そのような調節配列が選ばれ た宿主細胞と適合するならば、発現を操縦するために利用することができる。模 範的ベクターは、ＯｋａｙａｍａおよびＢｅｒｇ（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ .，３，２８０，１９８３）に開示の方法に従って、構築することができる。組 換えタンパク質を発現させる細胞型によっては、非ウイルス細胞プロモーター( 即ち、β−グロビンおよびＥＦ−１αプロモーター)もまた、用いることができ る。 異種ＤＮＡ配列の発現に必要なその他の遺伝子エレメントを提供するために、 ＳＶ４０ウイルスゲノムより誘導されたＤＮＡ配列（例えば、ＳＶ４０開始点、 早期および後期プロモーター、エンハンサー、スプライス、およびポリアデニル 化部位）を用いることができる。早期および後期プロモーターは、両方ともＳＶ ４０ウイルス複製開始点をも含むフラグメントとしてウイルスから容易に得られ るため、特に有用である(Ｆｉｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，２７３，１１３，１９７ ８)。ウイルスの複製開始点内に位置するＨｉｎｄIII部位からＢｇｌＩ部位方向 に伸びるおおよそ２５０ｂｐの配列を含む限りにおいて、より小さいまたはより 大きいＳＶ４０フラグメントを用いることもできる。 複数の転写物を発現させるために用いられるバイシストロニックな発現ベクタ ーについては、すでに記載されている(Ｋｉｍ，Ｓ．Ｋ．およびＷｏｌｄ，Ｂ.Ｊ .，Ｃｅｌｌ，４２，１２９，１９８５；Ｋａｕｆｍａｎら、１９９１、上記)。 ｐＣＡＶＤＨＦＲは、マウスのＤＨＦＲのコード配列（Ｓｕｂｒａｍａｎｉら、 Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ.，１，８５４，１９８１）を含むｐＣＤ３０２(Ｍ ｏｓｌｅｙら、Ｃｅｌｌ、１９８９）の誘導体である。ｐＣＤＥベクターは、ア デノウイルスの３文節系リーダー配列とＤＨＦＲ ｃＤＮＡコード配列との間に クローン化されたマウスの脳心筋炎ウイルスの内在性リボソームエントリー部位 （ヌクレオチド２６０から８２４；ＪａｎｇおよびＷｉｍｍｅｒ，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖ.，４，１５６０，１９９０）を含むｐＣＡＶＤＨＦＲの誘導体 である。例えば、来国特許第４，６３４，６６５号（Ａｘｅｌら）および第４， ６５６，１３４号（Ｒｉｎｇｏｌｄら）に記載されているようなその他の型の発 現ベクターもまた、本発明のＥＡＳＥと組み合わせると有用である。宿主細胞 形質転換された宿主細胞とは、組換えＤＮＡ技術を用いて構築された発現ベク ターで形質転換またはトランスフェクトされた細胞であって、組換えタンパク質 をコードする配列を含む細胞である。発現したタンパク質は、選択されたＤＮＡ によっては、培養液上清内に分泌されるのが好ましいであろうが、細胞膜内に蓄 積することもできる。組換えタンパク質を発現させるために、様々な哺乳動物細 胞培養システムを用いることができる。適当な哺乳動物宿主細胞系の例としては 、サルの腎臓細胞ＣＯＳ−７系(Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｃｅｌｌ，１７５，１９８１ に記載)、ならびに、例えば、ＣＶ−１／ＥＢＮＡ(ＡＴＣＣ ＣＲＬ１０４７８ )、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チャイニーズハムスターの卵巣(ＣＨＯ)、Ｈｅ ＬａおよびＢＨＫ細胞系を含む適当なベクターを発現する能力を持つその他の細 胞系が含まれる。 共通に用いられる細胞系は、グリシン、チミジンおよびヒポキサンチンに対す る栄養素要求性を持つＤＨＦＲ ＣＨＯ細胞であり、増幅可能な優性マーカーと してＤＨＦＲ ｃＤＮＡを用いてＤＨＦＲ⁺表現型に形質転換することができる 。そのようなＤＨＦＲ^- ＣＨＯ細胞系の一つであるＤＸＢ１１は、Ｕｒｌａｕ ｂおよびＣｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７ ，４２１６，１９８０に記載されている。選択または増大スキームのために開発 されたその他の特定の細胞系もまた、本発明のＥＡＳＥと共に有用であろう。形質転換された哺乳動物細胞の調製 この技術分野では、いくつかの形質転換のプロトコールが知られており、Ｋａ ｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ.，Ｍeｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８５，５３７，１ ９８８に論評されている。形質転換プロトコールの選択は、宿主細胞系および興 味ある遺伝子の性質に依存するであろうし、日常的に行われる実験を基本に選択 することができる。任意のそのようなプロトコールに基本的に必要とされること は、第一に適当な宿主細胞内に興味あるタンパタ質をコードするＤＮＡを導入す ることであり、次に、安定で発現可能な様式で異種のＤＮＡを取り入れる宿主細 胞を同定および単離することである。 異種ＤＮＡの導入に共通して用いられる方法の一つは、例えば、Ｗｉｇｌｅｒ ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，３５６７，１９８ ０に記載されているような、リン酸カルシウム沈殿である。この方法によって宿 主細胞内に導入されるＤＮＡは、しばしば再配列を受け、その結果、この方法は 、独立した遺伝子のコトランスフェクション（cotransfection）に有用である。 哺乳動物細胞と細菌プロトプラストのポリエチレン−誘導融合（Ｓｃｈａｆｆ ｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，２１６３、 １９８０）は、異種ＤＮＡを導入するためのもう一つの有用な方法である。プロ トプラスト融合プロトコールからは、時として、哺乳動物宿主細胞ゲノム内に組 込まれたプラスミドＤＮＡの複数コピーが得られる；しかしながら、この技術は 、興味ある遺伝子と同一のプラスミド上に選択および増幅マーカーが存在するこ とを必要とする。 また、例えば、Ｐｏｔｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ ＳＡ，８１，７１６１，１９８８、または、ＳｈｉｇｅｋａｗａおよびＤｏｗｅ ｒ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６，７４２，１９８８に記載のように、エレ クトロポレーションを用いて、ＤＮＡを宿主細胞の細胞質内に直接導入すること もできる。プロトプラスト融合とは異なって、エレクトロポレーションは選択マ ーカーと興味ある遺伝子が同一のプラスミド上に存在することを要求しない。 より最近には、哺乳動物細胞内への異種ＤＮＡの導入に有用ないくつかの試薬 について、記載されている。これらには、リポフェクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉ ｎ^R）試薬およびリポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ^TM）試薬（Ｇ ｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）が含まれる。これらの試 薬は両方とも、培養細胞に適用する場合には、細胞内への核酸の取り込みを容易 にする、脂質−核酸複合体（またはリポソーム）を形成するために用いられてい る試薬として市販されている。 興味ある遺伝子を増幅させる方法もまた、組換えタンパタ質の発現に望ましく 、典型的には、選択マーカー（Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ.、上記）の使用を含む 。細胞毒性薬剤に対する耐性は、選択マーカーとして最も頻繁に用いられる特性 であり、優性な特質（即ち、宿主細胞系のいかんにかかわらず用いることができ る）か、または劣性の特質（即ち、選択される活性が欠損している特別な宿主細 胞系に有用である）のいずれかの結果であることができる。いくつかの増幅可能 マーカーが本発明の発現ベクター内での使用に適当である(例えば、Ｍａｎｉａ ｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ ａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， ＮＹ，１９８９，１６．９−１６．１４に記載されている)。 薬剤耐性哺乳動物細胞内での遺伝子増幅に有用な選択可能マーカーは、Ｋａｕ ｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．（上記）の表１に示されており、ＤＨＦＲ−ＭＴＸ耐性、Ｐ −糖タンパク質および複数の薬剤耐性（Multiple drug resistance）（ＭＤＲ） −様々な親油性細胞毒性薬剤（即ち、アドリアマイシン、コルヒチン、ビンクリ スチン）、およびアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）−Ｘｙｌ−Ａまたはアデノ シンおよび２’−デオキシコホルマイシンが含まれる。 その他の優性選択可能マーカーには、微生物誘導抗生物質耐性遺伝子、例えば 、ネオマイシン、カナマイシンまたはヒグロマイシン耐性が含まれる。しかしな がら、これらの選択マーカーが、増幅可能であることは示されていない(Ｋａｕ ｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ.、上記)。哺乳動物宿主のために、いくつかの適当な選択シス テムがある(Ｍａｎｉａｔｉｓ、上記、１６．９−１６．１５)。２つの優性選択 可能マーカーを用いる共移入(コトランスフェクション)プロトコールもまた、Ｏ ｋａｙａｍａおよびＢｅｒｇ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ.，５，１１３６， １９８５、に記載されている。 特に有用な選択および増幅スキームは、ＤＨＦＲ−ＭＴＸ耐性を用いている。 ＭＴＸは、内因性のＤＨＦＲ遺伝子（Ａｌｔ，Ｆ．Ｗ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏ ｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２５３，１３５７，１９７８ ） および移入（トランスフェクト）されたＤＨＦＲ配列（Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．ら、 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，３５６７，１９８０) の増幅を起こすことが判明しているＤＨＦＲのインヒビターである。一つの発現 カッセト内の興味ある遺伝子を含むＤＮＡを、第二の発現カッセト内のＤＨＦＲ 遺伝予に連結させるかまたはこれとは連結させずして、細胞を形質転換する。ま た、２つの遺伝子は、一つのバイシストロニック発現ユニット内に存在すること もできる(Ｋａｕｆｍａｎら、１９９１、上記、およびＫａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ ．ら、ＥＭＢＯ Ｊ.，６，１８７，１９８７)。形質転換された細胞を、連続的 に増加する量のＭＴＸを含む培地内で増殖させ、結果として、ＤＨＦＲ遺伝子な らびに興味ある遺伝子をより多く発現させる。 また、前記の有用な調節エレメントを、哺乳動物細胞を形質転換するために用 いられるプラスミド内に含ませることもできる。選ばれた形質転換プロトコール およびそこに用いるために選択されたエレメントは、用いられる宿主細胞の型に 依存するであろう。当業者らは、数多くの異なるプロトコールおよび宿主細胞を 知っており、それらの細胞培養システムの要求に基づいて、所望のタンパク質の 発現に適当なシステムを選択することができる。 本明細書中に引用されたすべての参考文献に関連した開示は、特に参照として 援用される。以下の実施例は、本発明の実施態様を詳細に説明するつもりのもの であって、本発明の範囲を制限するものではない。 実施例 実施例１：ゲノムライブラリーのスクリーニングおよびサブクローニング 腫瘍壊死因子の８０Ｋｄレセプターの細胞外ドメインを含むイムノグロブリン Ｆｃ融合タンパク質（ＴＮＦｒＦｃ；Ｍｏｈｌｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ.， １５１，１５４８，１９９３；米国特許第５，３９５，７６０号、１９９５年３ 月７日発行；これらの開示は両方共参照として援用する）を高レベルで発現する ように形質転換されたＣＨＯ細胞系（２Ａ５−３細胞系と名付ける）は、サザン ブロット分析から、この細胞系に認められるＴＮＦｒＦｃ発現がＴＮＦｒＦｃを コードする発現カセットの単一組込みによって高く発現することが示されたため 、ゲノムライブラリーの調製用として選ばれた。ＤＮＡをこれらの細胞から単離 し、特にＭｂｏＩで部分消化し、そしてｌａｍｂｄａ ＦＩＸ IIクローニング ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ｃｕｓｔｏｍ ｇｅｎｏｍｉｃ ｌｉｂｒａ ｒｙ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）内にクローン化し、ラ イブラリーを作成した。ｐ８０ ＴＮＦレセプターコード配列は、１４，４ｋｂ の細胞内フランキング配列と共に、以下に記載した方法に従って、ライブラリー からクローン化した。 ライブラリーをスクリーニングするために、２５０ｃｍのプレート当たり、お およそ２ｘ１０⁴ プラーク形成ユニット（plaque forming units）（ｐｆｕ）に 形成させた。プラークをニトロセルロース膜（ＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒおよびＳｃ ｈｕｅｌｌ，Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）に移し、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅによって供給さ れた標準プロトコールを用いて溶解した。ｐ８０ ＴＮＦレセプターの細胞外ド メインの細胞表面部分（Ｍｏｈｌｅｒら、上記）をコードするランダムプライム したＮｏｔｌ−ＰｖｕIIＤＮＡフラグメントで、フィルターをプローブ処理した 。ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーションバッファー［１０ｘ Ｄ ｅｎｈａｒｔｓ溶液(Ｍａｎｉａｔｉｓ、上記、９．４９)、０．０５Ｍ Ｔｒｉ ｓ ｐＨ７．５、１Ｍ ＮａＣｌ、０．１％のピロリン酸ナトリウム、１％ Ｓ ＤＳ、４μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ］中、６３゜Ｃで行った。フィルターを以下 の方法に従って洗浄した；最初に０．１％ ＳＤＳ、０．１％ ＳＳＣ（Ｍａｎ ｉａｔｉｓ、上記、Ｂ．１３）中、４２゜Ｃで３０分間洗浄し、次に、同溶液、 ６３゜Ｃ、６０分間で、さらに二回洗浄した。最後に、０．１％ ＳＤＳおよび ０．０１％ ＳＳＣを用いて、６３゜Ｃで６０分間、二度洗浄した。約４ｘ１０⁵ 組換え体をスクリーニングした後、一つの陽性組換えクローンを同定した。こ のクローンは、２Ａ５−３λと名付けられ、以下の分析のすべてに用いられた。 このクローンからのＣＨＯゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号：１に示 す。２Ａ５−３λは、１９９６年１月４日にブダペスト条約の条件下でＡｍｅｒ ｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌ ｌｅ ＭＤに奇託した(寄託番号９７４１１)。実施例２：サザンブロッティング サザンブロット技術を用いて、遺伝子のコピー数をモニターした。適当な細胞 系からの全細胞ＤＮＡは、前記の方法（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｐ．Ｊ．ら、Ｍｏｌ ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ.，６，４２５，１９８６）を用いて調製された。供給者 （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡまたはＢｏ ｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）が 記載している条件下、適当な酵素でＤＮＡを消化した後、例えば、Ｍａｎｉａｔ ｉｓ、上記、ｐｇ．６．２０に記載の方法に従って、１％のＴＡＥ（Ｔｒｉｓ− 酢酸バッファー化）アガロースゲル上で、ＤＮＡを泳動した。電気泳動後、ＤＮ ＡをＺｅｔａｐｒｏｂｅフィルターに移し、供給者（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）の推奨する条件下でハイブリダイ ズした。フィルターを０．１％ ＳＤＳおよび０．１ｘＳＳＣで３回、各々３０ 分間洗浄した。最初の洗浄は、３７゜Ｃで行い、それに続く２回の洗浄は、６３ ゜Ｃで行った。ランダムプライミングキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎ ｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いて、プローブを調製した。 ブロットについて、ライブラリースクリーンに記載したのと同じプローブを用い て、ＴＮＦｒ配列を検出した。同様に、興味あるその他の任意のタンパク質（ま たはそのフラグメント）をコードするＤＮＡ領域から誘導されたプローブは、遺 伝子のコピー数をモニターするサザンブロット技術に有用であろう。実施例３：組織培養 ジヒドロホレートレダクターゼ（dihydrofolate reductase）（ＤＨＦＲ）欠 損チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞ＤＸＢ１１（Ｃｈａｓｉｎおよび Ｕｒｌａｕｂ、上記）細胞を、Ｄｕｌｂｅｃｃｏの最少必須培地、ならびに７． ５％のウシ胎児血清(ＦＢＳ；Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ；またはＳｉ ｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ)、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、９０μＭのチミ ジン(Ｔ)、９０μＭのヒポキサンチン（Ｈ）および１２０μＭのグリシン（Ｇ） を補充したＦ１２（ＤＭＥＭ：Ｆ１２）中に維持した。ＤＨＦＲ選択研究および メトトレキセート選択を行うため、細胞を、ＤＭＥＭ：Ｆ１２欠損ＧＨＴ中で培 養し、７．５％の透析ＦＢＳ、６ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび１ｍＭ アスパラ ギンを補充した。メトトレキセート選択を行うため、メトトレキセート（ＭＴＸ ；Ｌｅｄｅｒｌｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐｅａｒｌ Ｒｉｖｅｒ，ＮＹ ）を適当な濃度で選択培地に加えた。ネオマイシン選択を用いる場合には、４０ ０μｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を培 地に加えた。供給者（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ） の薦めに従って、リン酸カルシウムトランスフェクション(Ｗｉｇｌｅｒら、上 記)、またはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ^TMトランスフェクションを用いて、細 胞にトランスフェクトした。実施例４：酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ） 組換えタンパク質の生成は、結合アッセイ、阻害アッセイおよび生物学的アッ セイを含む、所望のタンパク質の検出に適した任意のアッセイによって、モニタ ーすることができる。特に有用なアッセイは、当業者に周知の（例えば、Ｅｎｇ ｖａｌｌら、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ.，８，８７１，１９７１および米国特許第 ４，７０３，００４号に開示された技術を応用した）抗体サンドイッチ酵素結合 イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）である。このアッセイでは、興味ある タンパク質に特異的な第一抗体（通常はモノクローナル抗体）を、支持体上（最 も頻繁には、９６−穴のミクロタイタープレート）に固定化し、次いで、タンパ ク質を含むサンプルを加え、インキュベートした。また、既知濃度のタンパタ質 の一連の希釈物を加え、インキュベートし、標準曲線を得た。非結合タンパク質 およびその他の物質を除去する洗浄段階の後、タンパク質に対する第二抗体を加 えた。第二抗体は、タンパク質の異なるエピトープに対して作られ、モノクロー ナル抗体であっても、またはポリクローナル抗体であっても良い。 西洋わさびのペルオキシダーゼ（horse radish peroxidase）（ＨＲＰ）のよ うな酵素と複合させた第二抗体と結合する抗体を含む複合試薬を、非結合タンパ ク質を除去する第二の洗浄段階の後か、または第二抗体を加えるのと同時に加え る。適当なインキュベーション期間の後、非結合複合試薬を洗浄によって除去し 、酵素複合体の基質を含む発色溶液をプレートに加えて、発色させる。適正な波 長での光学濃度の読みによって、それぞれの穴の数値が分かる。サンプルの値を 標準曲線の値と比較すると、所望のタンパク質のレベルが定量できる。 三量体のＣＤ４０リガンドを定量するために、２つのモノクローナル抗体（Ｍ Ａｂ）を用いるＣＤ４０Ｌ ＥＬＩＳＡを開発した。一つの抗体は、三量体のタ ンパク質内に存在するオリゴマー化ジッパードメインに対応し、第二の抗体は、 分子のヒトＣＤ４０リガンド部分に対応した。第一のＭＡｂをプレート上に一晩 吸収させ、そして第二の抗体と複合させたペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を、洗浄 段階の後に加えた。数回行った実験では、０．７８と５０ｎｇ／ｍｌの間の量の ＣＤ４０Ｌが検出された。 同様のＥＬＩＳＡを用いて、組換えヒト腫瘍壊死因子レセプター融合タンパク 質（ＴＮＦｒＦｃ）を定量した。このＥＬＩＳＡでは、ＴＮＦｒＦｃの異なるエ ピトープに対する２つのモノクローナル抗体を用いた。この場合も、第一のＭＡ ｂをプレート上に一晩吸収させ、第二の抗体と複合させたペルオキシダーゼ（Ｈ ＲＰ）を洗浄段階の後に加えた。数回の実験では、０．７８と５０ｎｇ／ｍｌの 間の量のＴＮＦｒＦｃが検出された。 組換えＦｌｔ−３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）を検出するために、モノクローナ ル抗体およびウサギのポリクローナル抗血清を用いる、やや異なるＥＬＩＳＡを 行った。前記のように、ＭＡｂをプレート上に一晩吸収させた。ポリクローナル 抗−Ｆｌｔ−３Ｌおよびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−複合第二抗体（ロバ抗− ウサギイムノグロブリン）の両方を含む溶液を、第一の洗浄段階の後に加えて、 非結合タンパタ質を除去した。数回の実験では、１．５６と１００ｎｇ／ｍｌの 間の量のＦｌｔ−３Ｌが検出された。実施例５：シークエンシングおよびデータベース調査 文献に報告されているショットガンシークエンシング（Ｂａｎｋｉｅｒ，Ｍｅ ｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ.，２３，４７，１９９３）またはＡＢＩ Ｔａｑ Ｄ ｙｅ Ｄｅｏｘｙ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ キットを用いたプライマーウォーキング（primer walking）を用いて、自動ＤＮ Ａシークエンサー（ｍｏｄｅｌ ３７３ａ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ ｍｓ．Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）でＤＮＡを配列決定した。いくつかの異 なる型のコンピューター分析を行うことによって、２Ａ５−３λ ＤＮＡの特徴 を調べた。 （ａ） 組成分析 ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ ＧｒｏｕｐからのＷｉｓｃｏ ｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ（Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８，１９９４年９月、 Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ ５３７１１）で市 販されている、ＳＩＭＰＬＩＦＹ、ＷＩＮＤＯＷおよびＳＴＡＴＰＬＯＴと呼ば れる３つのコンピュータープログラムを組み合わせて用い、Ａ＋Ｔの高含有領域 について、２Ａ５−３λ配列を詳しく調べた。Ａ＋Ｔ高含有領域を調べるために 、５０塩基対のスライディングウインドウを、１塩基対づつ増加させながら、２ Ａ５−３λ配列にわたってスライドさせ、そのウインドウ内のＡ＋Ｔの％をプロ ットした。興味ある領域は、Ａ＋Ｔの平均含有量が一貫して７０％より多い領域 である。＞７０％のＡ＋Ｔを持つ＞２００塩基対の一つの領域が、２つのＳｗａ ｌに挟まれた部位（配列番号：１のヌクレオチド１０５１７から１２５９１）に 認められた。この領域は、ＥＡＳＥ活性に重要であるとは考えられない(実施例 ７および８を参照のこと)。 （ｂ）転写増強モチーフ ＧＣＧプログラムモチーフを用いた３つの転写増強モチーフ：”Ｔｏｐｏ−Ｉ Ｉ”［ＧＴＮＷＡＹＡＴＴＮＡＴＮＮＲ］、”Ｔ−ｂｏｘ”［ＡＴＡＴＴＴ／Ａ ＡＴＡＴＴ］、および”Ａ−ｂｏｘ”［ＡＡＴＡＡＡＹＡＡＡ］(Ｋｌｅｈｒら 、上記)について、調査を行った。このプログラムは、インプットされたおのお の特定のモチーフとの正確な対合を、線状様式（linear fashion）で探すことに より、求める配列をスキャンする。それぞれのモチーフについて、Ｉｎｔｅｒｎ ａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ＩＵＢ）の命 名規定 を用いて、縮重をシンボルで示す。”ｔｏｐｏ−II ｂｏｘ”は、２Ａ５−３λ ＤＮＡ内の１４．５ｋｂのＣＨＯ ＤＮＡ内には見出されなかった。２つの” Ａ−ｂｏｘ”および２６の”Ｔ−ｂｏｘ”が、ＣＨＯ ＤＮＡのこの領域を通し て分散していることが分かった。これらのモチーフは、ＥＡＳＥ活性に必要とさ れる６０４ｂｐのＥｃｏＲ１からＨｐａ１フラグメント内には見出されなかった 。 （ｃ）類似性についての配列データベース調査 Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ.，２１５，４０３，１９９０の ＢＬＡＳＴ アルゴリズムを用いて、ＧｅｎＢａｎｋ ＤＮＡ配列データベース およびＳｗｉｓｓＰｒｏｔおよびＰＩＲタンパク質配列のデータベースのデータ ベース調査を行った。このアルゴリズムは、アライメント内にギャップを挿入す ることなく位置類似性セグメントを見つけ出すために、最適化されている。２Ａ ５−３λ ＤＮＡ配列およびすべての６リーディングフレーム内の動的タンパク 質翻訳の両方についてのＢＬＡＳＴ調査は、いかなる既知の転写活性化配列とも 有意の対合を作り出さなかった。 （ｄ）コード配列分析 コンピュータープログラムＧＲＡＩＬ(Ｕｂｅｒｂａｃｈｅｒ，Ｅ．Ｃ．およ びＭｕｒａｌ，Ｒ．Ｊ.，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８ ８，１１２６１，１９９１)、神経ネットワークに基づいた遺伝子−認識システ ムを用いて、コード領域の可能性について２Ａ５−３λ配列を詳細に調べた。Ｇ ＲＡＩＬ調査は、スライドする１００ｂｐウインドウ内でＤＮＡ配列のコード可 能性を評価する。偏りを避けるために、コード領域可能性についての調査は、さ らなるゲノムの特性（例えば、スプライス接合点および翻訳開始点）に関してお よび関せずに行われた。ＧＲＡＩＬ調査の結果、２Ａ５−３λ配列内にはタンパ ク質をコードする可能性の高い領域は認められなかった。実施例６：クローン化配列を用いたタンパク質の発現 この実験の目的は、ＣＨＬ細胞系２Ａ５−３内のＴＮＦｒＦｃ組み込み部位の 周辺配列が、ＤＸＢ１１細胞内にランダムに組み込まれた場合に、このタンパク 質の高発現を授与することができるかどうかについて決定することである。実施 例１記載の方法に従って、この組み込み部位をクローン化し、リン酸カルシウム 形質転換法を用いて、ＤＸＢ１１ ＣＨＯ細胞に５μｇの２Ａ５−３λＤＮＡま たは５μｇの対照プラスミドのいずれか、および１μｇのｐＳＶ３ＮＥＯ（この 発現ベクターは、ＳＶ４０プロモーターによって操縦されるＧ４１８耐性マーカ ー遺伝子を含む）ＤＮＡを、コトランスフェクトした。対照細胞は、第一のイン トロンがＴＮＦｒＦｃをコードする配列であり第二のイントロンがマウスのＤＨ ＦＲをコードするバイシストロニックメッセージの発現を操縦するＣＭＶプロモ ーター／エンハンサーからなるｐＣＡＶＤＨＦＲｐ８０と呼ばれるＴＮＦｒＦｃ の発現ベクターで形質転換された。ｐＣＡＶＤＨＦＲｐ８０は、２Ａ５−３細胞 系を構築するために用いられたプラスミドである。４８時間の回収期間の後、細 胞を、４００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含む培地内、１０ｃｍの皿内に、１：３ま たは１：２にスプリットした。Ｇ４１８−含有培地内で７から９日間選択した後 、耐性コロニーを検出し、１から３コロニーからなる２４のプールを選択し、２ ４穴プレート内に種付けした。 細胞が集密に達したならば、培地をＧＨＴ欠乏培地に変換し、ＤＨＦＲ⁺細胞 を選択した。二重に選択した８つのプールは、実施例５記載のようなＥＬＩＳＡ によって、ＴＮＦｒＦｃの比生産性についてアッセイしたところ、プールの４０ ％が親細胞系のそれより７５％大きい又はそれ以上の発現レベルであることが分 かった(以下の表１参照)。表１ ：２Ａ５−３λＤＮＡで形質転換された細胞によるＴＮＦｒＦｃの比生産量 ^* １： 親細胞系（正の対照)； ２−９： ２Ａ５−３λで形質転換した細胞プール； １０−１２：ＣＡＶＤＨＦＲＴＮＦｒｐ８０で形質転換された細胞プール （負の対照）^** ＢＲ；範囲以下 これらのプールの内３つは、１０継代以上モニターされ、以下の表２に示すよ うに、親細胞系の発現より大きいまたはそれと等しい発現を維持していることが 分かった。表２：２Ａ５−３λＤＮＡをトランスフェクトした細胞（複数継代）による ＴＮＦｒＦｃの比生産性 第二のコトランスフェクションを行うことによって、この実験を繰り返し、同 様の結果を得た。両方のコトランスフェクション実験に於いて、プール継代時に 比生産量の減少が認められ、このことは、おそらく、混ざった細胞集団のプール の内、より少量の組換えタンパク質しか生産しないより増殖のはやい細胞が、生 産性は高いが増殖の遅い細胞より多くなると言う事実によるものと考えられる。 具体的生産性が減少するにもかかわらず、すべての細胞プールは、親細胞系の生 産レベルより多いまたは等しい生産レベルを維持していた。結果から、２Ａ５− ３λＤＮＡ挿入物は、ＤＸＢ１１ ＣＨＯ細胞ＤＮＡ内にランダムに組み込まれ た場合に、高頻度（≧４０％）で親細胞系に近い指標タンパタ質の発現を授与で きることが示された。実施例７：ＥＡＳＥ活性を持つフラグメントの同定 コトランスフェクション実験の第二のシリーズでは、２Ａ５−３λＤＮＡのよ り短いセグメントは組換えタンパク質の高発現を授与できるが、その頻度は２Ａ ５−３λより低いことが分かった。シークエンシングおよび制限酵素地図のため に、制限酵素切断および連結反応の標準技術を用いて、ファージ挿入物の様々な 部分をｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔII(Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃ Ａ)、またはｐＧＥＭ−１１Ｚｆ（−）(Ｐｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ) 内にサブクローン化した(図１を参照のこと)。タンパク質の発現について研究す るために、様々な挿入物を図１Ａに示すファージクローンから誘導し、ｐＧＥＭ １（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）内にサブクローン化した。サブク ローン化に用いた制限部位を図１Ａに示す制限地図内に示している。 ＤＸＢ１１ ＣＨＯ細胞に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ^TM試薬（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて、それぞれのＴＮＦｒＦ ｃ発現プラスミドの配列をコードする０．２μｇのＴＮＦｒＦｃおよび０．１μ ｇのｐＳＶ３ｎｅｏをトランスフェクトした。４８時間の後、Ｇ４１８選択培地 内で、細胞を１：４または１：４０にスプリットした。培地を−Ｈまたは−ＧＨ Ｔ ＤＨＦＲ選択培地に変換した時点で、７−１０日の期間、コロニーを可視化 した。ＤＨＦＲ選択培地中で１０−１３日間選別の後、１−３コロニーのプール を取り上げ、２４穴の容器に蒔いた。集密時に培養物をサンプリングし、高発現 の頻度について評価した（表３参照）。高発現は、最少でＣＭＶプロモーターか ら３．９ｋｂのＥｃｏＲ１からＳｗａ１までの２．８ｋｂおよびＣＭＶプロモー ターのすぐ５’側の１．９ｋｂ配列（ＰＧ５．７ΔＳ）を含むベクターで達成で きることが分かった。より多量の挿入物を含むプラスミド（ＰＧ８．５およびＰ Ｇ５．７）もまた、発現の増強に有効であった。表３：＞０．５μｇ／ｍｌの組換えタンパク質を発現するプールの％ １：アッセイせず Ｆｌｔ−３リガンド（Ｌｙｍａｎら、Ｂｌｏｏｄ，８３，２７９５，１９９４ およびＵＳＳＮ０８／２４２，５４５、１９９４年５月１１日出願）の細胞外部 分をコードするＤＮＡを含む発現プラスミドの同様のセットを調製し、上記の方 法に従って試験した。ＴＮＦｒＦｃで認められるように、高レベルの発現は、Ｐ Ｇ５．７ΔＳベクターで達成できたが、ＰＧ２．２ベクターまたはＰＧ．２ベク ターでは達成できなかった。これらの実験の結果から、高頻度の組換えタンパク 質高発現は、タンパク質に特異的なものではなく、１．８ｋｂのＥｃｏＲ１から Ｓｗａ１のバンドがこの活性に重要であることが示された。 さらなるフラグメントを調製し、発現増大活性について試験した。構築物ＰＧ ３．６は、配列番号：１のヌクレオチド８６７２から１２２７３によって表され るＥｃｏＲ１フラグメントを含んでおり、ＰＧ．２ＳＥ１．８およびＰＧ．２Ｓ Ｈ１．２の構築物と同様の様式で、ヌクレオチド１４２９０から１４５０７に連 結させた。また、配列番号：１のヌクレオチド１０１００から１４２９３で表さ れるＢｂｓ１フラグメントから、同様の構築物を調製した。これらの構築物は両 方共、構築物ＰＧ５．７の発現増大活性に匹敵する、発現増大活性を示した。Ｐ Ｇ３．８と呼ばれる構築物は、配列番号：１のヌクレオチド１４２９０から１４ ５０７に連結したＢａｍＨ１フラグメント（ヌクレオチド２２２１−５９８４） からなるが、活性を示さなかった。 これらの実験の結果から、発現増大活性を示す２Ａ５−３λＤＮＡの領域は、 ヌクレオチド５９８０（図１のＢａｍＨ１サイト）と１４２９０（図１のＢｂｓ Ｉサイト）の間に主に存在することが示された。ＳＶ４０プロモーター／エンハ ンサーを用いたさらなる実験から、発現増大活性はプロモーター依存性でないこ とが分かった。さらに、ＥＡＳＥ−含有構築物もまた、エレクトロポレーション によって成功裡に細胞内に導入され、発現増大活性を示した。しかしながら、発 現増大活性は、ＥＡＳＥ−含有構築物をサル細胞系（Ｖｅｒｏ）内にトランスフ ェクトした場合には認められず、このことは、配列番号：１のＥＡＳＥが種特異 性または細胞型特異性のいずかである可能性を示している。実施例８：比生産性（specific Productivity）の比較 長さのより短い組み込み部位ＤＮＡを含むプラスミドをトランスフェクトした クローンからの発現をより正確に定量し、そしてファージＤＮＡのトランスフェ クションから誘導したクローンとそれを比較するために、ＰＧ５．７ΔＳＴＮＦ ｒＦｃ構築物で形質転換された最も高発現の３つのプールおよびファージＤＮＡ で形質転換された最も高発現の３つのプールの比生産性を比較した(表４)。この 実験では、標準Ｔ検定（ｐ＝０．１４）を用いて比較した場合、６プールすべて の発現レベルに有意な差は認められないことが分かった。表４：ファージＤＮＡまたはＰＧ５．７ｄＳを用いて発現させた 組換えタンパク質の発現の比較 １：ｎ＝２ これらの結果は、表３に示す頻度のデータと共に、ＰＧ５．７ΔＳベクターが 高レベル発現に必要な配列情報をすべて含んでいることを示している。実施例９：ＥＡＳＥの特徴 ２Ａ５−３ λ−誘導発現ベクター内で認められる発現増強活性をさらに特徴 付けるために、コロニー形成アッセイを行った。ここでは、プラスミドＰＧ８． ５、ＰＧ５．７ΔＳ、ＰＧ．２ＳＥ１．８、ＰＧ．２ＳＨ１．２およびＰＧ．２ からのＤＨＦＲコード配列０．１６μｇを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ^TMを用 いて、ＤＸＢ１１細胞内にトランスフェクトした。４８時間の発現期間の後、様 々な濃度のＭＴＸを含む−ＧＨＴ培地内に、細胞を１ｘ１０⁴細胞／プレートで 蒔Ｅ。９−１１日後にプレートをメタノールで固定化し、そしてコロニー形成を メチレンブルーで染色した。コロニーの形成は、０ｎＭおよび１０ｎＭ ＭＴＸ で実験を行った場合、プラスミドＰＧ．２ＳＨ１．２およびＰＧ．２プラスミド と比べて、プラスミドＰＧ８．５、ＰＧ５．７ΔＳおよびＰＧ．２ＳＥ１．８で より多く検出された（表５参照）。表５：ｐｇｅｍベクターを用いたコロニー形成 これらのデータは、ＰＧ．２Ｅ１．８に含まれる１．８ｋｂのＥｃｏＲ１から Ｓｗａ１フラグメントがＥＡＳＥ機能に重要であることを示している。さらに、 この領域に含まれる０．６ｋｂのＨｐａ１からＥｃｏＲ１フラグメントは、ＥＡ ＳＥ活性に必須である(ＰＧ．２ＳＨ１．２およびＰＧ．２の結果を比較せよ)。 長さのより長いＣＨＯゲノムＤＮＡを持つプラスミド、即ち、ＰＧ８．５および ＰＧ５．７ΔＳ、は、プラスミドＰＧ．２ＳＥ１．８と比較した場合、選択圧力 を増加（２５ｎＭおよび５０ｎＭのＭＴＸ）させた場合に、より多くコロニーを 形成した。より高い選択圧でのこのコロニー形成の差から、プラスミド内のより 長く伸びるＣＨＯゲノムＤＮＡの存在は、より短いＣＨＯゲノムＤＮＡよりも、 より高頻度高発現を授与することが示唆される。実施例１０：一過性発現アッセイ 発現増大活性が、非染色体ＤＮＡ内での一過性発現の発現を増加させることの できる古典的なエンハンサーまたはプロモーターの様に作用するか否かを決定す るために、一過性発現アッセイを行った。プラスミドＰＧ８．５およびプラスミ ドＰＧ２．２（前者はＥＡＳＥ活性を持つことが示されたが、後者は（実施例７ に示すように）活性を持たなかった）を、前記のようなＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉ ｎｅ^TM技術を用いて、ＣＨ０細胞内に一過性でトランスフェクトした。４８時間 後、上清を集め、前記のようにＥＬＩＳＡを用いてＴＮＦｒＦｃ発現について試 験した。実施例７の安定な発現実験とは対照的に、これらの２つのプラスミドは 、一過性の発現アッセイで、組換えＴＮＦｒＦｃと同レベルの発現を示した（表 ６を参照のこと）。表６：ＴＮＦｒＦｃの一過性の発現 １：ｎ＝４ これらのデータは、ＥＡＳＥ機能が、既知のエンハンサーおよび／またはプロ モーターとは違って、染色体組み込みを必要としていることを示している。実施例１１：タンパク質生産に必要な時間の短縮 Ｆｌｔ−３Ｌを、３つの異なる発現ベクター、ｐＣＤＥ(「組換えタンパク質 の発現」を参照のこと)、ＰＧ５．７およびＰＧ５．７１を用いて、ＣＨＯ細胞 内で発現させた。ベクターＰＧ５．７１は、ＰＧ５．７のアデノウイルス三分節 （triPartite）リーダーとＤＨＦＲ ｃＤＮＡの間にクローン化されたマウスの 脳心筋炎ウイルスＩＲＥＳを含むＰＧ５．７の誘導体である。Ｌｉｐｏｆｅｃｔ ａｍｉｎｅ^TM法を用いて、ＤＸＢ１１ ＣＨＯ細胞に上記三つのＦｌｔ−３Ｌ発 現プラスミドをトランスフェクトし、−ＧＨＴ培地中でＤＨＦＲ発現について選 択した。次に、ＤＨＦＲ⁺ クローンをプールし、０ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭお よび１００ｎＭ ＭＴＸと共に蒔き、集密まで増殖させ、その時点で、それぞれ の構築物をトランスフェクトしたプールの比生産性を定量した。それぞれの構築 物からの発現は、それぞれのＭＴＸレベルで類似していたが、分析を完了させる のに必要な時間は、ｐＣＤＥおよびＰＧ５．７ベクターでは７から８週間を要す るのと比べて、ＰＧ５．７１ベクターから作られた細胞のプールでは、たった４ から５週間であった。 ＥＡＳＥが存在する場合により短い時間で同様の発現レベルが得られるという この傾向は、多くの異なるタンパク質、少なくともｐＣＤＥベクター内で発現し た少なくとも３つのタンパク質およびＰＧ５．７１ベクター内で発現した６つよ り多くのタンパク質、で認められた。一般的に、ＩＲＥＳ配列のみを含む類似の 発現ベクターと比較して、ＥＡＳＥおよびＩＲＥＳ配列を含む発現ベクターを用 いると、組換えタンパク質の生成に要する時間が２から５週間少なくて済む。さ らに、ＥＡＳＥから得られた細胞プールは、長時間安定で、多くの目的のために 細胞系として扱うことができた。開発プロセスのかなり後までクローニング段階 を遅らせることが可能であり、短期間に大量の組換えタンパク質を得るために、 有意の利益を提供した。実施例１２：生産規模での発現におけるＥＡＳＥの使用 ＰＧ５．７１ベクターを用いた製造を行うため、組換えＨｕＣＤ４０ＬをＣＨ Ｏ細胞内で発現させた。ここでは、三量体型のｈｕＣＤ４０ＬをコードするＤＮ ＡをＰＧ５．７１ベクター内にクローン化し、その結果得られたＣＤ４０Ｌ発現 プラスミドから得られたＤＮＡをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ^TMを用いて、ＣＨ Ｏ細胞内にトランスフェクトした。最初に、細胞をＤＨＦＲ⁺表現型で選択し、 次いで、プールし、そして５０ｎＭ ＭＴＸ中で選択した。５０ｎＭ ＭＴＸ内 で増殖した細胞を、軟寒天クローニング法を用いてクローン化した(Ｇｉｂｓｏ ｎら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１５：５９４，１９９３)。１８コロニー を取り上げ、ｈｕＣＤ４０Ｌの比生産性についてスクリーニングし、懸濁液適応 性および流加バイオリアクター走行内での生産走行について、２つの細胞系を選 択した。細胞系の一つ（５０−Ｂ４細胞系）を用いてそれぞれ１０日間および８ 日間の２つの生産走行の間、細胞は、それぞれ、おおよそ２４および２５μｇ／ １０⁶細胞／日の平均比生産性を維持した。ＥＬＩＳＡによる最終力価は、それ ぞれ１０日間走行および８日間走行で、１．０２および１．０９ｇ／Ｌであった 。この実施例では、組換えタンパタ質の高レベル発現が最少のスクリーニング（ １８細胞系がスクリーニングされた）および選択段階（二段階）で測定可能フォ ーマットに達したので、製造開発にこのベクターを用いると、この技術分野の改 良 が起こることを、示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 トーマス，ジェイムズ・エヌ アメリカ合衆国ワシントン州98052，レッ ドモンド，フォーティセカンド・コート, ノース・イースト 16123

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 配列番号：１のヌクレオチド１から１４５０７、ヌクレオチド５９８ ０から１４５０７、ヌクレオチド８６７１から１４５０７、ヌクレオチド８６７ １から１０５１５、ヌクレオチド９２７７から１０５１５、ヌクレオチド８６７ ２から１２２７３、ヌクレオチド１０１００から１４９２３を含むＤＮＡ、発現 増大活性を持つ前述のＤＮＡのフラグメント、前述のＤＮＡと相補性を持つＤＮ Ａ、前述のＤＮＡとヌクレオチド配列で少なくとも約８０％同一であり発現増大 活性を持つＤＮＡ、および発現増大活性を持つ前述のＤＮＡの組み合わせ、から なる群より選択された、単離された発現増大配列エレメント（ＥＡＳＥ）。 ２． 本質的に、配列番号：１のヌクレオチド１から１４５０７、ヌクレオ チド５９８０から１４５０７、ヌクレオチド８６７１から１４５０７、ヌクレオ チド８６７１から１０５１５、ヌクレオチド９２７７から１０５１５、ヌクレオ チド８６７２から１２２７３、およびヌクレオチド１０１００から１４９２３か らなるＤＮＡからなる群より選択された、請求項１記載のＥＡＳＥ。 ３． 配列番号：１のヌクレオチド１４２９０から１４５０７を含むＤＮＡ と連結される、請求項２記載のＥＡＳＥ。 ４． 請求項１記載のＥＡＳＥを含む発現ベクター。 ５． 請求項２記載のＥＡＳＥを含む発現ベクター。 ６． 請求項３記載のＥＡＳＥを含む発現ベクター。 ７． 第一のエキソンが興味あるタンパタ質をコードし、第二のエキソンが 増幅可能な優性選択可能マーカーをコードする、バイシストロニックプラスミド である、請求項６記載の発現ベクター。 ８． 増幅可能優性選択可能マーカーがジヒドロホレートレダクターゼ（Ｄ ＨＦＲ）である、請求項７記載の発現ベクター。 ９． ２つのエキソン間にさらにＩＲＥＳ配列を含む、請求項８記載の発現 ベクター。 １０． 請求項７記載の発現ベクターで形質転換されたＣＨＯ細胞 １１． 請求項８記載の発現ベクターで形質転換されたＣＨＯ細胞 １２． 請求項９記載の発現ベクターで形質転換されたＣＨＯ細胞 １３． タンパク質の発現を促進する条件下で請求項１０記載の形質転換され た宿主細胞を培養し、タンパク質を回収することを含む、組換えタンパク質を得 る方法。 １４． タンパク質の発現を促進する条件下で請求項１１記載の形質転換され た宿主細胞を培養し、タンパク質を回収することを含む、組換えタンパク質を得 る方法。 １５． タンパク質の発現を促進する条件下で請求項１２記載の形質転換され た宿主細胞を培養し、タンパタ質を回収することを含む、組換えタンパク質を得 る方法。 １６． 請求項７、８または９のいずれか１項に記載の発現ベクターで形質転 換されたＣＨＯ細胞の安定なプール。 １７． タンパク質の発現を促進する条件下で請求項１６記載のＣＨＯ細胞の 安定なプールを培養し、タンパク質を回収することを含む、組換えタンパク質を 得る方法。