KR100807312B1

KR100807312B1 - 재조합 인간 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질-3의 생산정제 방법

Info

Publication number: KR100807312B1
Application number: KR1020050099932A
Authority: KR
Inventors: 이영익; 조진숙; 이은원
Original assignee: (주)리즈바이오텍
Priority date: 2005-10-22
Filing date: 2005-10-22
Publication date: 2008-02-28
Also published as: KR20070043901A

Abstract

본 발명은 재조합 인간 유사 성장 인자 결합 단백질-3(recombinant human insulin like growth factor binding protein-3)의 생산 정제 방법에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 재조합 IGFBP-3 유전자 카피수가 높은 CHO 세포주를 제공하며, 높은 수율의 재조합 IGFBP-3의 생산 및 정제 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에 의하여 생산된 재조합 IGFBP-3은 저혈당증 치료제 및 간기능 보호제로 유용하게 사용될 수 있다.

재조합 인슐린 유사 성장인자 결합 단백질-3

Description

재조합 인간 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질-3의 생산 정제 방법{Production and purification of recombinant human insulin like growth factor binding protein-3}

도 1은 pIRES-DHFR/IGFBP-3 벡터 지도이고,

도 2는 pIRES-DHFR/IGFBP-3 벡터를 CHO(dhfr-) 세포주에 형질전환된 재조합 동물 세포(CHO-YSBP3)의 분자 생물학적 특성을 나타낸 그림으로, A는 재조합 동물 세포주 CHO-YSBP3의 지노믹 DNA를 주형으로 PCR을 수행한 그림이고, B는 CHO-YSBP3의 RNA를 주형으로 RT-PCR을 수행한 그림이고, C는 CHO-YSBP3 배양액으로 웨스턴 블롯을 수행한 그림이고,

도 3은 CHO-YSBP3 세포주를 α-MEM 및 CHO-S-SFM-Ⅱ 배양배지로 배양하고 A는 ELISA 방법을 수행한 그림이고, B는 웨스턴 블롯을 수행한 그림이고,

도 4는 배양액으로 분비한 재조합 IGFBP-3의 IGF-I 친화성 크로마토그래피를 통해 정제한 그림이고,

도 5는 정제된 제조합 IGFBP-3의 생물학적 특성 분석을 나타낸 그림으로, A는 IGF-I/IGFBP-3의 결합 어세이를 수행한 그림이고, B는 IGF-I/IGFBP-3의 결합 경쟁적 어세이를 수행한 그림이고,

도 6은 정제된 재조합 IGFBP-3의 성장 저해 어세이를 수행한 그림이다.

본 발명은 재조합 인슐린 유사 성장인자 결합 단백질-3(recombinant insulin like growth factor binding protein-3: 이하 "재조합 IGFBP-3"라 칭함)의 생산 정제 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 재조합 IGFBP-3를 포함하는 발현벡터를 동물 세포 CHO 세포주에 형질전환 후 배양하여 재조합 IGFBP-3를 생산하고 정제하는 방법에 관한 것이다.

성장 인자들은 특정 세포군의 광범위한 생물학적 반응, 즉 DNA 합성, 세포분열, 특이한 유전체의 발현 등을 일으키는 폴리펩티드이다. 다수의 상이한 성장 인자군은 전이 성장 인자 베타군(TGF-β), 상피 성장 인자군(EGF), 전이 성장 인자 알파군(TGF-α), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 섬유원 세포 성장 인자군(FGF) 그리고 인슐린 유사 성장인자-Ⅰ(IGF-Ⅰ)과 인슐린 유사 성장인자-Ⅱ(IGF-Ⅱ)를 포함하는 인슐린 유사 성장 인자군(IGF)으로 정의된다.

IGF-Ⅰ과 IGF-Ⅱ는 여러 세포의 성장을 촉진하는 펩티드로 자가분비(autocrine) 및 방분비(paracrine) 방법으로 작용을 나타내는데 이러한 분열촉진 효과(mitogenic effect)는 세포 표면에 있는 IGF-Ⅰ 수용체와 결합하여 타이로신 카이네이즈(tyrosine kinase)를 활성화시킴으로 나타난다(Japes et al ., Experimental Cell Research, 116:336-340 1988; King et al ., J Clin Invest, 66:130-140 1980). IGF-Ⅰ과 IGF-Ⅱ는 아미노산 서열과 구조에서 서로 관련이 있으며, 각각의 폴리펩티드는 대략 7.5kDa의 분자량을 가지고 있다. IGF-Ⅰ은 성장 호르몬의 주요 효과에 개입하며, 출생 후 성장에 관여하는 중요 물질이다. 또한 다양한 다른 성장 인자들을 세포에 처리할 때 IGF-Ⅰ생성이 증가되는 것으로 보아 다양한 성장 인자들의 작용에 관여하는 것으로 보인다. 대조적으로 IGF-Ⅱ는 태아 성장의 주된 역할을 한다. IGF-Ⅰ과 IGF-Ⅱ는 모두 인슐린 유사 활성을 가지고 있으며, 신경 조직, 근육, 재생 조직, 골격 조직 및 다양한 다른 조직의 세포들의 세포 분열을 촉진한다. 대부분의 성장 인자들과는 달리, IGF는 순환계에 실질적인 양이 존재하며, 미량의 IGF만이 순환계에서 또는 다른 체액에서 자유롭게 유리되어 있다. 순환하는 대부분의 IGF는 IGFBP-3와 결합되어 있다. IGFBP-3는 IGF와 높은 친화력을 가지고 결합하여 IGF를 운반하고 반감기를 증가시키며 IGF 수용체에 유리 IGF가 결합하는데 조절 역할을 한다(Rajaram et al ., Endocr Rev, 18:801-831 1997). 따라서 IGFBP-3는 대부분 세포증식에 대한 IGF-Ⅰ의 자극 효과를 억제하나 반대로 IGF 작용을 항진시키는 경우도 있다. IGF-Ⅰ은 비정상적인 성장 관련 질환들, 예를 들면 하수체거대증, 선단비대증, 소인증 및 다양한 성장 호르몬 결핍증을 진단하기 위하여 혈청 내에서 측정된다. IGF-Ⅰ이 많은 조직에서 생성되지만, 순환하는 대부분의 IGF-Ⅰ은 간에서 합성된다. 거의 모든 IGF-Ⅰ 또는 IGF-Ⅱ는 IGFBP-3과 산 가변성 하위단위체(acid labile subunit:이하 "ALS" 라 칭함)로 불리 는 보다 큰 단백질 하위단위체와 비공유결합된 3원 복합체 형태로 순환한다. ALS는 직접적으로 IGF-결합 활성을 가지고 있지 않으며, IGF-Ⅰ/IGFBP-3 2원 복합체에만 결합한다. IGF-Ⅰ/GFBP-3/ALS의 3원 복합체는 대략 150kDa의 분자량을 가진다. 상기 3원 복합체는 순환계에서 유리 IGF 농도의 급격한 변화를 방지하는 IGF-Ⅰ 및 IGF-Ⅱ에 대한 저장소 및 완충제로서 작용한다(Blum et al ., In Modern Concepts of Insulin-like Growth Factors, p. 381-393, E.M.Spencers, ed., Elseviver, New York, 1991).

대부분 순환하는 IGF-Ⅰ, IGF-Ⅱ 및 IGFBP-3은 복합체의 형태이며, 따라서 검출 가능한 유리 IGF는 거의 없다. 더욱이, 혈액 내 유리 IGF가 높은 농도로 존재하면 IGF의 인슐린 유사 활성으로 인해 심각한 저혈당증을 유발한다. IGF 및 IGFBP-3와는 대조적으로, 순환계에 들어가는 모든 IGF-Ⅰ/IGFBP-3 복합체가 즉시 3원 복합체를 형성하기 위해 유리 ALS 풀이 혈장 내에 있다.

IGFBP-3이 순환계 내의 가장 흔한 IGF 결합 단백질인 반면, 최소한 여섯 개의 구별되는 IGF 결합 단백질들이 다양한 조직 및 체액에서 확인되었다. 상기 단백질들이 IGF와 결합하기는 하나, 각각 별도의 유전자로부터 기원하여 구별되는 아미노산 서열을 포함하고 있으므로 결합 단백질들은 단순한 공통 전구체의 유사체 또는 유도체가 아니다.

IGF-I 및 IGFBP-3은 천연 공급원으로부터 정제되거나 또는 재조합 방법에 의하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 사람 혈청으로부터 IGF-I을 정제하는 방법이 있다(Rinderknecht et al , PNAS , 73:2365-2369 1976). 재조합 방법에 의해 IGF-I을 제조하는 방법은 1984년 12월 공고된 유럽 특허 제 0,128,733호에 공지되어 있다. IGFBP-2는 Baxter 등의 방법을 사용하여 천연 공급원으로부터 정제될 수 있다( Baxter et al ., Biochem Biophys Res Comm, 139:1256-1261, 1986). 사람 혈청으로부터 얻어지는 성장 호르몬 의존성 인슐린 유사 성장인자(IGF) 결합 단백질은 사람 유래의 다른 IGF 결합 단백질들과 구별된다(Baxter et al ., Biochem Biophys Res Comm, 139:1256-1261, 1986). IGFBP-3은 Tressel 등이 논의한 바와 같이 재조합 유기체에 의해 합성될 수 있다(Tressel et al ., Biochem Biophys Res Comm , 178(2):625-633, 1991). 최근에는 LCR/Mel 발현 시스템을 이용하여 MEL-C88 세포주에서 1리터당 0.24mg IGFBP-3를 정제한 사례가 보고되었다(Bagnall et al ., Prot. Express . Purific ., 27:1-11, 2003)

현재 미생물, 식물, 효모, 곤충세포, 동물 세포 등의 다양한 발현 시스템을 이용하여 목적 단백질을 대량으로 발현, 수득하여 치료 등의 목적으로 사용하고 있다. 가장 쉽게 사용되는 발현 시스템은 미생물 발현 시스템이며 다양한 미생물 발현 시스템이 개발되어 상용화되어 있다. 하지만 미생물 발현 시스템은 몇 가지 제한 요인을 가지고 있다. 가장 큰 제한 요인으로 작용하는 것은 미생물의 단백질 발현 및 단백질 변형 기작(당쇄화, 인산화, 아마이드화)으로, 동물 세포와 달리 동일한 유전자를 미생물 시스템에서 발현시키더라도 발현되는 단백질의 구조나 특성이 동물 세포에서 발현시킨 단백질과 완전히 동일하지 않다. 이로 인해 미생물 발현 시스템을 이용한 재조합 단백질은 단백질 변형이 거의 일어나지 않거나 단백질 의 변형, 구조가 차이가 나더라도 기능상 차이가 없는 단백질들로 제한되어 있는 실정이다. 또한, 미생물 발현 시스템을 이용한 재조합 단백질을 이용함에 있어, 미생물의 오염, 미생물의 내독소 오염 등으로 인하여 부차적인 오염물 제거과정을 수반하여야 한다는 번거로움이 따른다.

그에 비해 동물 세포 발현 시스템은 동물 단백질을 발현시키기에 가장 적합한 시스템임에도 불구하고 미생물 발현시스템에 비해 재조합 단백질의 발현효율이 낮고, 생산단가가 높으며, 동물 세포를 조작하는데 까다로워 쉽게 산업화되지 못하고 있다. 현재 사용되는 산업용 동물 세포는 CHO(Chinese Hamster Ovary), BHK(Baby Hamster Kidney), 골수종(Myeloma)등이 있으며, 미생물 발현 시스템과 동일하게 발현벡터를 상기 세포주에 도입하여 목적하는 외래 단백질을 발현시킨다. 이들 세포주 중 dhfr이 결핍된 CHO 세포주는 동물 세포를 이용하여 목적 단백질을 산업적으로 대량 생산하기 위하여 가장 널리 사용되고 있는 동물 세포주이다. dhfr이 결핍된 CHO 세포주는 첫째로 단백질의 번역 후 변형 과정(posttranslational modification), 즉 당쇄화 및 인산화 과정이 인간과 비슷하고, 둘째로 부착 배양 뿐 아니라 부유 배양이 가능하며, 셋째로 무혈청 배지에서 다른 세포에 비해 상대적으로 고농도 배양이 가능하고, 넷째로 미생물에 비하여 현저히 낮은 목적 단백질 생산성을 디하이드로폴레이트 환원효소(dihydrofolate reductase, DHFR) 및 MTX(methotrexate) 유전자 증폭시스템을 이용하여 증가시킬 수 있고, 다섯째로 안정성이 점증되어 FDA와 같은 감독기관으로부터 허가를 쉽게 받을 수 있다는 장점을 가지고 있다. 이를 이용한 동물 단백질의 수정 과정을 재 조합 동물 발현 시스템에서 해결함으로 발현 단백질의 복잡한 재접힘 과정을 생략할 수 있어 시간적 손실을 막을 수 있다.

이에 본 발명자들은 IGFBP-3를 코딩하는 유전자와 DHFR 유전자가 IRDS로 연결된 유전자로 구성된 발현 벡터를 CHO 세포주에 형질전환한 후 MTX를 처리하여 유전자 카피수를 증가시킨 세포주를 선별하고, 배양하여 재조합 IGFBP-3를 높은 수율로 정제함으로 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 재조합 IGFBP-3 유전자로 형질전환된 CHO 세포주, 그의 제조 방법 및 상기 형질전환된 CHO 세포주를 이용한 재조합 IGFBP-3의 생산 및 정제 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 재조합 IGFBP-3 유전자로 형질전환된 dhfr 유전자가 결핍된 CHO 세포주를 제공한다.

또한, 상기 형질전환 CHO 세포주의 제조 방법을 제공한다.

또한, 상기 형질전환 CHO 세포주의 배양 방법을 제공한다.

또한, 재조합 IGFBP-3의 정제 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 재조합 IGFBP-3 유전자로 형질전환된 dhfr 유전자가 결핍된 CHO 세포주 및 그의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 재조합 IGFBP-3 유전자로 형질전환되고 dhfr 유전자가 결핍된 CHO세포주의 제조 방법은 1) 재조합 IGFBP-3 발현벡터를 CHO 세포주에 형질전환하는 단계; 2) 형질전환된 CHO 세포주를 혈청 함유 배지에서 배양하는 단계; 3) 형질전환된 CHO 세포주에 MTX를 가하여 유전자 카피수를 증가시키는 단계; 및 4) 유전자 카피수가 증가된 형질전환 CHO 세포주를 선별하는 단계로 구성된다.

본 발명에서 사용한 dhfr 유전자가 결핍된 CHO 세포주는 세포 내 필수성분인 하이폭산틴(hypoxanthine) 및 티미딘(thymidine)의 합성 작용에 관여하는 DHFR 단백질을 발현하지 않는 세포주로서 상업적으로 구입할 수 있는 세포주이며(ATCC:CRL 9096) 당업자에게 알려진 통상적인 형질전환 방법을 사용하여 직접 제조할 수도 있다.

본 발명자들은 재조합 IGFBP-3 유전자로 형질전환된 dhfr이 결핍된 CHO 세포주를 제조하기 위하여, 재조합 IGFBP-3 발현 벡터를 제작하였다. 종래의 2개의 유전자를 발현시키기 위한 벡터계로서는 복수의 프로모터를 삽입한 형태와 하나의 프로모터와 IRES 계열(Internal Ribosomal Entry Site)을 조합한 형태가 있다. 복수의 프로모터를 가지는 벡터는 프로모터 간의 간섭에 의해, 어느 한쪽의 프로모터부터의 발현의 효율만 높게 되는 문제점이 발생한다. IRES 벡터 시스템은 하나의 발 현벡터에서 2개의 유전자가 발현되는 시스템으로, 프로모터에서의 5' 부위에 있는 단백질은 3' 부위에 있는 단백질보다 5-10배 정도 발현율이 높은 것으로 알려져 있다. 본 특허에서 사용한 동물 세포 발현벡터는 내부 라이보좀 유입 위치를 가지는 pIRES(Clontech. Inc, USA)이다. 세포 내 같은 유전자 카피수에서 재조합 IGFBP-3의 유전자 카피수를 증가시키기 위해 3' 쪽에는 dhfr 유전자를 삽입하고, 5' 쪽에는 재조합 IGFBP-3 유전자를 삽입하여 재조합 발현벡터(pIRES-DHFR/IGFBP-3)를 제조하였다(도 1 참조). 상기와 같이 제조한 발현벡터 pIRES-DHFR/IGFBP-3를 CHO 세포 내로 형질전환시키고, 재조합 벡터 내의 선택마커인 G418을 이용하여 1차적으로 선별하였고, 배양액 내의 일부 아미노산들을 제한하여 특정 유전자(dhfr)가 있는 세포들만 2차적으로 선별하였다. 세포 내 dhfr 유전자의 세포 내 카피수를 높이기 위하여 점차적으로 MTX(methotrexate)의 농도를 증가시키고 지노믹 DNA PCR, RT-PCR, 웨스턴 블롯 등의 기법을 통해 배양액 내로 분비하는 재조합 IGFBP-3의 양을 측정한 후 재조합 단백질을 가장 많이 분비하는 세포주를 선별하여 재조합 세포주 CHO-YSBP3라 명명하였으며 2005년 10월 10일자로 대한민국 대전광역시 유성구 어은동 52번지 소재 한국생명공학연구원 생명자원센터에 수탁번호 KCTC10860BP로 기탁하였다(도 2 참조).

상기에서 확보한 재조합 세포주 CHO-YSBP3을 무혈청 배지 상태에서 배양하였고 α-MEM 배지 또는 CHO 세포주 무혈청 배양배지 CHO-S-SFM-Ⅱ에서 24, 48 및 72시간 배양하여 ELISA 및 웨스턴 블롯을 수행하여 확인하였고 배양조건을 무혈청 배양배지 CHO-S-SFM-Ⅱ에서 48시간으로 확립하였다(도 3 참조). 세포배양액은 여 과를 통하여 세포찌꺼기 등과 분리하였다. 이후 발현된 재조합 단백질을 수득한 후, 인슐린 유사 성장 인자Ⅰ(IGF-Ⅰ) 친화성 크로마토그래피 방법으로 정제하였다(도 4 참조). 재조합 단백질은 무혈청 배양액에서 배양한 48시간 내지 72시간이 경과했을 때, 최대 발현량을 나타냈다. 시간이 지나면, 경우에 따라 재조합 단백질의 분해 산물이 생성되므로, 배양시간은 72시간을 넘지 않는 것이 바람직하다. 정제 결과 240㎖ 무혈청 배양 배지에서 0.825㎎의 재조합 IGFBP-3을 4.476%의 높은 회수율로 얻었다(표 1 참조). 이는 MEL 세포주에서 1리터당 0.24mg의 IGFBP-3을 정제한 종래 기술보다 높은 수치이다. 상기 정제한 재조합 IGFBP-3 및 양성대조군 IGHBP-3와 IGF-1의 결합 어세이를 통해 생활성도를 측정한 결과 양성대조군과 대등하게 생활성을 가지고 있음을 확인하였다(도 5 참조). 또한 상기 정제한 재조합 IGFBP-3 및 양성대조군 IGFBP-3와 IGF-1을 MCF-7 세포주에 처리한 결과 양성 대조군과 대등하게 IGF-1과 결합하여 세포 성장을 저해함을 확인하였다(도 6 참조).

이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 이해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> IGFBP -3 발현 벡터 제작

IGFBP-3 발현 벡터를 제작하기 위하여 human IGFBP-3 cDNA(Gene Bank accession No. NM000598)를 주형으로 하여 Xba Ⅰ 및 Sal Ⅰ 절단 부위를 삽입하도록 서열번호 1 또는 2로 기재되는 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction: 이하 "PCR"이라 칭함)을 수행하여 증폭하였다. PCR은 초기 변성과정으로 94℃에서 5분 처리한 후, 94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초 총 25회 수행하였다. 이후 PCR 생성물을 1% 아가로스 젤을 사용하여 전기영동하고, QIAquick kit(Qiagen, USA)를 사용하여 젤에서 정제하였다. 정제된 생성물을 XbaⅠ 및 SalⅠ으로 절단하였다. 상기 생성물을 NheⅠ 및 SalⅠ 절단 자리를 삽입하도록 서열번호 3 및 4로 기재되는 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 증폭하였다. 이후 PCR 생성물을 1% 아가로스 젤을 사용하여 전기영동하고, QIAquick kit(Qiagen, USA)를 사용하여 젤에서 정제하였다. 정제된 생성물을 37℃에서 NheⅠ 및 SalⅠ으로 절단하였다. 상기 생성물을 pIRES(Clontech. Inc, USA) 벡터의 XbaⅠ-SalⅠ 절단 부위에 삽입하고, 또한 상기 벡터에 dhfr 유전자를 삽입하였다. Human dhfr cDNA(Gene bank accession No. NM000791)를 주형으로 하여 서열번호 7 또는 8로 기재되는 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR은 초기 변성과정으로 94℃에서 5분 처리한 후, 94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초 총 25회 수행하였다. 이 과정을 통하여 제조된 벡터를 pIRES-DHFR/IGFBP-3라고 명명하였다(도 1 참조).

< 실시예 2> 동물 세포 주(CHO, dhfr -)에 형질전환

동물 세포주 CHO(dhfr-, Chinese Hamster Ovary)(ATCC:CRL9096)에 실시예 1에서 제조된 동물 세포 발현 벡터 pIRES-DHFR/IGFBP-3을 형질전환하였다. CHO 세 포를 100mm² 배양 플레이트에 세포수가 1×10⁶ 세포/플레이트에 맞추어서 8㎖ DMEM/F12 배양액(10㎎/ℓhypoxanthine, 10㎎/ℓ thymidine, 10% Fetal bovine serum)(Gibco-BRL, USA)에 혼합하여 37℃, 5% CO₂, 95% 공기 및 100% 습도의 혼합배양기에서 18시간 동안 배양하였다. 이 후 재조합 동물 세포 발현벡터인 pIRES-DHFR/IGFBP-3 5㎍을 무혈청 DMEM/F12 배양액(10㎎/ℓhypoxanthine, 10㎎/ℓ thymidine)(Gibco-BRL,USA) 700㎕에 희석하고 Lipofectamine^TM(Gibco-BRL, USA) 20㎕를 무혈청 DMEM/F12 배양액(10㎎/ℓhypoxanthine, 10㎎/ℓ thymidine)(Gibco-BRL, USA) 700㎕에 희석하여 상기 벡터 희석액 20㎕를 Lipofectamine 희석액 20㎕와 혼합한 후 상온에서 15분간 방치하여 결합시켰다. 배양한 CHO 세포 배양 플레이트를 PBS 버퍼로 2회 세척하고 상기 lipofectamine 혼합물을 무혈청 DMEM/F12 배양액(10㎎/ℓhypoxanthine, 10㎎/ℓ thymidine)(Gibco-BRL, USA) 5㎖와 혼합하여 CHO 세포 배양 플레이트에 첨가하고 37℃, 5% CO₂, 95% 공기 및 100% 습도의 혼합배양기에서 5시간 동안 배양하였다. 이후 배양액을 DMEM/F12 배양액(10㎎/ℓhypoxanthine, 10㎎/ℓ thymidine, 10% FBS)(Gibco-BRL, USA) 10㎖로 교체하고 37℃, 5% CO₂, 95% 공기 및 100% 습도의 혼합배양기에서 48시간 동안 배양하였다. 48시간 후 트립신(trypsin)-EDTA 용액을 사용하여 플레이트에서 CHO 세포를 분리하고, 100mm² 배양 플레이트에 세포수가 1×10⁵세포/플레이트가 되도록 선택마커 G418 용액이 첨가된 DMEM/F12 배양액(10㎎/ℓhypoxanthine, 10㎎/ℓ thymidine, 10% FBS, 550㎍/㎖ G418)(Gibco-BRL, USA)에 희석하고 배양하여 선택 마커가 없는 세포의 사멸을 유도하였다. 1차적으로 선택된 세포들을 96-웰 플레이트에 세포수가 1×10⁴세포/플레이트가 되도록 DMEM/F12 배양액(10㎎/ℓhypoxanthine, 10㎎/ℓ thymidine, 10% FBS, 200㎍/㎖ G418)(Gibco-BRL, USA)에 희석하여 각 웰 당 200㎕씩 분주하고 37℃, 5% CO₂, 95% 공기 및 100% 습도의 혼합배양기에서 배양하였고, 하나의 클론이 가득 메워지면 이를 트립신-EDTA 용액으로 처리하여 세포를 회수한 후 다시 24-웰 플레이트의 각 웰에 분주하여 30개의 클론을 확보하였다. 선택된 30개의 클론의 배양액을 저장하고, IGFBP-3을 분비하는 Hep3B(ATCC:HB-8064)의 배양액을 양성 대조군으로 사용하여 항-hIGFBP-3 항체(Santa Cruz Biotechnology. Inc, USA)를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행하여 발현 정도를 확인하였다. 웨스턴 블롯은 Hep3B에서 회수한 상층액을 SDS-PAGE 젤에 로딩하여 니트로셀루로오스 막에 전이하고, 1차 항체인 항-IGFBP-3(goat polyclonal IgG)(Santa Cluz Biotechnology, Inc., USA)으로 결합시킨 후 항-염소 IgG-HRP(anti-goat IgG-HRP)(Santa Cluz Biotechnology, Inc., USA)를 결합시켜 IGFBP-3의 발현을 확인하였다.

<실시예 3> 형질전환 세포주 CHO 클론 선별

실시예 2에서 선택된 클론들 중 발현율이 높은 클론을 선별하여 MTX(methotrexate)로 유전자 카피를 증폭시켰다. 형질전환이 확인된 클론을 α- MEM 배양액(10% FBS, 200㎍/㎖ G418)(Gibco-BRL, USA)에 MTX를 0.008, 0.02, 0.04, 0.08, 0.32, 0.64, 1μM의 순서로 순차적으로 농도를 높여가면서 각각의 농도로 1주일씩 배양하여 세포 내 재조합 유전자의 카피수를 증가시켰다. 배양 조건은 실시예 2의 조건과 동일하다. 각 MTX 농도별로 단백질이 분비된 배양액을 취하여 상기 실시예 2에서 사용한 방법과 동일하게 항-hIGFBP-3 항체를 이용한 웨스턴 블롯 방법으로 단백질 발현 정도를 측정하였다. 또한 지노믹 DNA와 전체 RNA를 Menitas 등의 방법으로(Menitas et al., Molecular Cloning, 3rd Ed, Cold Spring Harber Laboratory Press, 2001) 분리하여 PCR 방법과 RT-PCR 방법을 통해 세포 내 지노믹 DNA에 외부유전자 삽입 및 전사 정도를 확인하였다. 분리한 지노믹 DNA를 주형으로 하여 서열번호 5 및 6으로 기재되는 프라이머를 사용하여 PCR 방법으로 증폭하였다. PCR은 초기 변성과정으로 94℃에서 5분 처리한 후, 94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초 과정으로 총 25회 수행하였다. 25회 반복 후 반응물은 72℃에서 5분 동안 길이연장반응을 수행하였다. 이후 PCR 생성물을 1.5% 아가로스 젤을 사용하여 전기영동하였다.

그 결과 각각의 지노믹 DNA 내에 IGFBP-3 유전자가 삽입된 것을 확인할 수 있었으며, 그 카피수는 클론마다 차이가 있음을 확인하였다(도 2A 참조). 또한, RT-PCR 결과 RNA 발현이 정상적으로 일어나는 것을 확인하였다(도 2B 참조). 항-IGFBP-3 항체를 사용한 웨스턴 블롯을 통해 MTX 농도에서 클론 #3의 발현 정도가 가장 높은 것을 확인하고 클론 #3을 확보하였다. 이렇게 확보된 클론 #3을 CHO-YSBP3로 명명하고 2005년 10월 10일부로 대한민국 대전광역시 유성구 어은동 52번 지 소재 한국생명공학연구원 생명자원센터에 기탁하였다(수탁번호: KCTC10860BP).

< 실시예4 > 선택된 클론( CHO - YSBP3 )의 배양조건 확립

배양액으로 분비되는 재조합 단백질을 정제하기 위해 선택 배양액Ⅰ(α-MEM, 10% FBS, 200㎍/㎖ G418, 0.08μM MTX)(Gibco-BRL, USA)에 존재하는 단백질의 양을 최소화하는 배양액을 사용하였다. 재조합 동물 세포주 CHO-YSBP3을 2×10⁵세포/플레이트로 6-웰 플레이트에 분주하여 기존의 선택 배양액Ⅰ에서 37℃, 5% CO₂, 95% 공기 및 100% 습도의 혼합배양기에서 24시간 배양한 후 세포를 PBS로 세척하고, 선택 배양액Ⅱ(α-MEM, 200㎍/㎖ G418, 0.08μM MTX)(Gibco-BRL, USA)에서 37℃, 5% CO₂, 95% 공기 및 100% 습도의 혼합배양기에서 24, 48 및 72시간 배양하고, 배양액을 회수하였다. 또한 배양액에 FBS를 10, 5, 2.5, 1 및 0.1% 농도의 차이를 주어 배양하였다. 선택배양액Ⅰ에서 24시간 후 PBS로 세척하고, CHO 세포주를 배양하는 무혈청배지 CHO-S-SFM-Ⅱ 배양액(0.08μM MTX)(Gibco-BRL, USA)에서 37℃, 5% CO₂, 95% 공기 및 100% 습도의 혼합배양기에서 24, 48 및 72시간 배양하고, 배양액을 회수하였다. 또한 배양액에 FBS를 10, 5, 2.5, 1 및 0.1% 농도의 차이를 주어 배양하였다. 회수한 배양액을 시료로 사용하여 항-IGFBP-3 항체가 코팅되어 있는 ELISA 플레이트에서 ELISA 기법으로 정량하였고 Chang 등의 방법으로(Chang S et al ., Cancer Epidermiol Biomarkers Prev., Aug; 11(8):758-766, 2002) 상기 실시예 2에서 수행한 방법과 동일하게 웨스턴 블롯을 수행하여 IGFBP-3의 발현을 확인 하였다.

그 결과 CHO-S-SFM-Ⅱ 배양액에서 48시간 배양시 24시간 배양할 때 보다 세포주는 적으나, 세포수에 비하여 IGFBP-3의 생산이 뛰어남을 확인함으로 48시간대로 배양 시간을 결정하였다(도 3 참조).

< 실시예 5> CHO - YSBP3 에서 배양된 배양액 시료에서의 재조합 IGFBP -3의 분리 및 정제

<5-1> 재조합 IGF -1 친화성 컬럼 ( CNBr 4B IGF -1 affinity column ) 제작

IGF-1 친화성 컬럼(affinity column) 제작을 위해 CNBr-activated Sepharose 4B powder(Amersham Pharmacia Biotech, USA)를 1mM HCl에 녹여 젤을 만들고 중화시켰다. 실시예 4에서 확립한 배양조건에서 발현시켜 정제한 rhIGF-1 단백질을 결합 용액(0.1M NaHCO₃, 0.5mM NaCl, pH8.3)에 녹여 리간드(ligand)로 사용하여 상기 CNBr-4B 젤에 4℃에서 16시간 동안 결합시킨 후 5배 용량의 결합 용액으로 컬럼을 세척하고, 남아 있는 활성 그룹을 제거하기 위해 0.1M Tris-HCl 용액(pH 8.0)을 첨가하여 4℃에서 2시간 방치하였다. 그 후 0.1M Tris-HCl 용액(pH 8.0), 0.1M ㅇ아아세트산(acetic acid)(pH 4.0)이 포함된 0.5M NaCl 및 0.1M Tris-HCl 용액(pH 8.0) 순으로 컬럼을 세척하여 준비하였다.

<5-2> 재조합 IGF -1 친화성 컬럼을 이용한 재조합 IGFBP -3의 분리 및 정제

실시예 4에서 확립된 배양조건으로 150mm² 배양 플레이트에 재조합 세포주 CHO-YSBP3을 1×10⁷ 세포/플레이트가 되도록 분주하여 선택 배양액Ⅰ에 희석하여 37℃, 5% CO₂, 95% 공기 및 100% 습도의 혼합배양기에서 24시간 배양하고, PBS로 2회 세척한 후, CHO-S-SFM-Ⅱ 배양액(0.08μM MTX)으로 교체하여 48시간을 배양하여 배양액을 회수하였다. 회수한 배양액을 0.22㎛ 한외여과필터를 통해 세포 부유물 찌꺼기를 제거하고 실시예 5-1에서 제작한 CNBr-4B-IGF-1 친화성 컬럼을 1㎖/min로 투입하고 0.5M 아세트산(acetic acid)(pH 3.0)을 1㎖/min로 투입하여 10㎖씩 분획하였다. 분획 중 2번째 분획을 PBS(pH 7.4)에서 투석을를 통해 아세트산(acetic acid)을 PBS로 치환하고 Viva-spin 10kDa 단백질 농축기(25㎖, Satorius)를 이용하여 농축하고 SDS-PAGE 법으로 확인하였다(도 4 참조). 그 결과는 하기 표와 같다.

단계	전체 부피 (㎖)	농도 (㎎/㎖)	전체 단백질 (㎎)	회수율 (%)
IGF-1 친화 크로마토그래피	240	0.07679	18.43	100
용출	10	0.087	0.87	4.612
투석	10	0.085	0.85	4.72
단백질 농축	10	0.825	0.825	4.476

실시예 결과 본 발명에서 재조합 IGFHB-3은 240㎖ 배양 배지에서 재조합 세포주 CHO-YSBP3을 배양하여 세포 18.43㎎을 얻었고, 그 중 0.825㎎으로 4.476%의 높은 회수율로 정제되었다.

<실시예 6> 정제된 재조합 IGFBP -3을 이용한 결합 어세이 ( binding assay ) 및 성장 저해 어세이(growth inhibition assay )

<6-1> 결합 어세이( binding assay )

정제된 재조합 IGFBP-3을 100ng/㎖, 200ng/㎖로 각각 코팅 완충액(15mM Na₂CO₃, 35mM NaHCO₃, 3.1mM NaN₃, pH 9.6)에 희석하고, 96-웰 ELISA 플레이트에 100㎕씩 분주하여 4℃에서 16시간 이상 코팅하고 PBST(1X PBS, 0.5% Tween 20)로 3번 세척하고 PBS에 1% BSA(bovine serum albumin)를 첨가한 용액을 100㎕씩 각 웰이 분주하여 상온에서 2시간 동안 교반하면서 비특이적인 결합 부위를 제거하였다. Pierce사의 실험 방법에 따라 EX-link sulfo-NHS-Biotinylation kit(Pierce Biotechnology, Inc, USA)를 이용하여 IGF-1을 바이오틴화(biotinylation)시키고 이를 1% BSA가 포함된 PBS 용액에 각각 0, 0.24, 0.98, 15.6, 62.5, 250 및 1000ng/㎖ 농도로 희석하여 4개씩 짝을 이루어 각 웰에 분주하고 교반하여 2시간 동안 상온에서 반응하였다. 반응 후 PBST로 3회 세척하고, streptavidine-peroxidase(Sigma Aldrich, USA)를 1% BSA가 포함된 PBS에 1㎍/㎖로 희석하여 각 웰에 100㎕씩 분주하고 상온에서 30분간 반응하고, PBST로 4회 세척한 후 각 웰에 100㎕의 tetramethylbenzidine(TMB)을 넣고 암실에서 색깔반응이 일어나면 100㎕의 0.5N 황산(sulfuric acid)을 첨가하여 반응을 중지하고 흡광도 450nm에서 값을 읽어 통계를 냈다.

그 결과 양성 대조군인 IGFBP-3과 같이 정제된 재조합 IGFBP-3 단백질이 활성을 나타냄을 확인하였다(도 5A 참조).

<6-2> IGF -1/ IGFBP -3의 결합 경쟁 어세이( binding competition assay )

실시예 6-1에서 시행한 경쟁 어세이 결과를 확인하기 위해 결합 경쟁 어세이를 수행하였다. 정제된 재조합 IGFBP-3 100ng/㎖을 코팅 완충액(15mM Na₂CO₃, 35mM NaHCO₃, 3.1mM NaN₃, pH 9.6)에 희석하고 96-웰 플레이트에 100㎕씩 분주하고 4℃에서 16시간 이상 방치하여 코팅하고, PBST로 3회 세척하고 1% BSA가 포함된 PBS를 100씩 각 웰에 분주하고 상온에서 2시간 동안 교반하면서 비특이적인 결합 부위를 제거하였다. Pierce사의 실험 방법에 따라 EZ-lnk sulfo-NHS-Biotinylation kit(Pierce사)를 이용하여 IGF-1을 바이오틴화시키고 이를 1% BSA가 포함된 PBS에 0, 25, 50, 100 및 200ng/㎖ 농도로 희석하여 각각의 농도에 바이오틴화 시키지 않은 재조합 IGF-1을 각각 0, 1.28, 6.4, 32, 160, 800ng/㎖ 농도로 희석하여 4개씩 짝을 이루어 각 웰에 분주하고 교반하여 2시간 동안 상온에서 반응하였다. 반응 후 PBST로 4회 세척하고, streptavidine-peroxidase(Sigma Aldrich, USA)를 1% BSA가 포함된 PBS로 1㎍/㎖로 희석하여 각 웰에 100㎕씩 분주하고 상온에서 30분간 반응시키고 PBST로 4번 세척 후 각 웰에 100㎕ tetrathylbenzidine(TMB)을 첨가한 후 암실에서 색깔반응이 일어나면 100㎕의 0.5N 황산(sulfuric acid)을 넣어 반응을 중지시키고 흡광도 450nm에서 값을 읽어 통계를 내었다(도 6B 참조).

<6-3> IGFBP -3의 세포 성장 저해 어세이( cell growth inhibition assay )

MCF-7 세포를 RPMI 배양액(10% FBS, insulin)에 4×10⁵ 세포/플레이트로 분주하여 37℃, 5% CO₂, 95% 공기 및 100% 습도의 혼합배양기에서 24시간 동안 배양하여 PBS로 세척한 후 Phenol-red free RPMI로 배양액을 교체하여 48시간 동안 무혈청(serum starvation) 상태에서 배양하였다. 이후 PBS로 세척 후, IGF-1과 IGFMP-3을 농도별로 혼합하여(IGF-1은 0과 10nM, IGFBP-3은 0, 1, 5, 10 및 100nM) 37℃, 5% CO₂, 95% 공기 및 100% 습도의 혼합배양기에서 24시간 동안 배양하여, MTT를 4시간 반응시킨 후 반응을 정지하여 596nm에서 측정하였다(도 6 참조). MTT는 Yang 등의 방법으로 수행하였다(Yang et al., Anticancer Res., 22:2753-2756, 2002).

본 실시예 결과 재조합 IGFBP-3가 양성대조군인 IGFBP-3와 같이 IGF-1과 결합하여 세포 성장을 저해하는 것을 확인하였다(도 6 참조).

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 재조합 인간 인슐린 유사 성장인자 결합 단백질 유전자가 형질전환된 CHO-YSBP3 세포주를 제공하고, 배양 배지 조건을 확립하고, CHO-YSBP3의 배양하여 높은 수율의 재조합 IGFBP-3 정제방법을 제공하는 것으로 보아, 상기 세포주 및 IGFBP-3 정제 방법은 저혈당증 치료제 및 간기능 보호제를 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

재조합 인슐린 유사 성장인자 결합 단백질-3(Insulinlike Growth Factor Binding Protein-3, IGFBP-3)를 코딩하는 유전자의 3` 말단에 내부 리보좀 도입 부위(Internal Ribosome Entry Site, IRES) 및 디하이드로폴레이트 환원효소(Dihydrofolate Reductase, DHFR)를 코딩하는 유전자가 작동하도록 연결되며, 도 1의 개열지도로 표시되는 pIRES-DHFR/IGFBP-3인 것을 특징으로 하는 동물 세포 발현벡터.
삭제
제 1항의 발현벡터로 형질전환된 CHO 세포주.
제 3항에 있어서, 수탁번호 KCTC10860BP로 기탁된 CHO-YSBP3인 것을 특징으로 하는 CHO 세포주.
ⅰ) 제 1항의 발현벡터를 CHO 세포주에 형질전환시키는 단계;

ⅱ) 형질전환된 CHO 세포주를 혈청 함유 배지에서 배양하는 단계;

ⅲ) 형질전환된 CHO 세포주에 메쏘트렉세이트(methotrexate, MTX)를 농도별로 가하여 유전자 카피수를 증가시키는 단계; 및

ⅳ) 유전자 카피수를 증가시킨 형질전환 CHO 세포주를 선별하는 단계인 것을 특징으로 하는 재조합 인슐린 유사 성장인자 결합 단백질-3(Insulinlike Growth Factor Binding Protein-3, IGFBP-3)를 생산하는 CHO 세포주를 제조하는 방법.
ⅰ) 제 1항의 발현벡터를 CHO 세포주에 형질전환시키는 단계;

ⅱ) 단계 ⅰ) 에서 형질전환된 CHO 세포주를 혈청 함유 배지에서 배양하는 단계;

ⅲ) 상기 단계 ⅱ)에서 배양된 형질전환된 CHO 세포주에 메쏘트렉세이트(methotrexate, MTX)를 농도별로 가하여 유전자 카피수를 증가시키는 단계;

ⅳ) 상기 단계 ⅲ)에서 유전자 카피수를 증가시킨 형질전환된 CHO 세포주를 선별하는 단계;

ⅴ) 시아노겐 브로마이드-세파로즈-4B(Cyanogen bromide-Sepharose-4B, CNBr-4B) 아가로스로 재조합 인슐린 유사 성장인자-1(Insulinlike growth factor-1, IGF-1) 친화성 컬럼을 제작하는 단계;

ⅵ) 무혈청 배지에서 상기 단계 ⅳ)에서 선별된 형질전환된 CHO 세포주를 배양하는 단계;

ⅶ) 상기 단계 ⅵ)의 형질전환된 CHO 세포주의 배양액을 수거하는 단계;

ⅷ) 상기 단계 ⅶ)의 수거액을 상기 단계 ⅴ)에서 제작한 친화성 컬럼에 주입하여 친화성 크로마토그래피을 수행하는 단계; 및

ⅸ)상기 단계 ⅷ)의 수득물을 투석하는 단계인 것을 특징으로 하는 재조합 인슐린 유사 성장인자 결합 단백질-3(Insulinlike Growth Factor Binding Protein-3, IGFBP-3)의 분리 및 정제 방법.