DK172611B1 - DNA-sekvens kodende for erythropoietin, vektor inkluderende sekvensen, vært transformeret eller transficeret med sekvensen, - Google Patents

Description

i DK 172611 B1

Den foreliggende opfindelse angår en renset og isoleret DNA-sekvens, der koder for erythropoietin og derivater deraf med sartme biologiske virkning. Opfindelsen angår endvidere en biologisk funktionel cirkulær plasmid- eller viral DNA-vektor, prokaryotiske og 5 eukaryotiske værtsceller for DNA-sekvensen og vektoren, et polypep-tidprodukt eksprimeret af værtscellerne, en fremgangsmåde til fremstilling af polypeptidproduktet, et farmaceutisk præparat indeholdende polypeptidproduktet samt anvendelse af polypeptidproduktet til fremstilling af et lægemiddel til erythropoietin-terapi.

10 A. Manipulation af genetiske materialer.

Genetiske materialer kan bredt defineres som de kemiske stoffer, der programmerer for og styrer fremstillingen af konstituenter i celler og vira og dirigerer cellers og vira's respons. Et langkædet polymert stof 15 kendt som deoxyribonucleinsyre (DNA) indeholder det genetiske materiale for alle levende celler og vira undtagen for visse vira, der grogrammeres af ribonucleinsyrer (RNA). De gentagne enheder i DNA-polymere er fire forskellige nucleotider, der hver består af enten en purin 20 (adenin eller guanin) eller en pyrimidin (thymin eller cytosin) bundet til et deoxyribosesukker, hvortil der er bundet en phosphatgruppe. Sammenbinding af nucleotider i lineær polymer form foregår ved fusion af 5'-phosphatet fra ét nucleotid til 3'-hydroxygruppen fra et andet.

25 Funktionelt DNA forekommer i form af stabile dobbeltstren-gede sammenføjninger af enkelte strenge af nucleotider (kendt som deoxyoligonucleotider), hvilke sammenføjninger sker ved hjælp af hydrogenbinding mellem purin- og py-rimidin-baser fdvs. "komplementære" sammenføjninger eksi-30 sterende enten mellem adenin (A) og thymin (T) eller guanin (G) og cytosin (C)]. Ifølge konvention betegnes nucleotider ved navnene på deres indgående purin- eller py-rimidin-baser, og de komplementære sammenføjninger af nucleotider i dobbeltstrenget DNA (dvs. A-T og G-C) omta-35 les som "base-par"). Ribonucleinsyre er et polynucleotid indeholdende adenin, guanin, cytosin og uracil (U), i stedet for thymin, bundet til ribose og en phosphatgruppe.

Kort udtrykt udøves den programmerende funktion af DNA generelt ved en proces, hvor specifikke DNA-nu- ψ 2 DK 172611 B1 cleotidsekvenser (gener) "transkriberes" til relativt u-stabile messenger RNA(mRNA)-polymere. mRNA tjener på sin side som en "template" for dannelsen af strukturelle, regulatoriske og katalytiske proteiner ud fra aminosy-5 rer. Denne RNA-"translations"-proces indebærer operationer af små RNA-strenge (tRNA), der transporterer individuelle aminosyrer og anbringer dem på linie langs mRNA-strengen for at. tillade dannelse af polypeptider i de rette aminosyresekvenser. Det mRNA-"message", der stam-10 mer fra DNA og danner basis for tRNA-leveringen og -orienteringen af enhver given aminosyre blandt de tyve aminosyrer til polypeptid-"ekspression", er i form af tri-plet-"codon'er" — sekventielle grupperinger af tre nu-cleotidbaser. På en måde er dannelsen af et protein den 15 endelige "ekspressions"-form for det programmerede genetiske message tilvejebragt af nucleotidsekvensen i et gen.

"Promotor"-DNA-sekvenser ligger sædvanligvis "forud" for et gen i en DNA-polymer og tilvejebringer et 20 sted for initiering af transkriptionen til mRNA. "Regulator "-DNA-sekvenser, også sædvanligvis "opstrøms" for (dvs. forud for) et gen i en given DNA-polymer, binder proteiner, der bestemmer frekvensen (eller hastigheden) af transkriptions-initiering.

25 Disse kollektivt som "promotor/regulator"- eller "kontrol"-DNA-sekvens betegnede sekvenser, der ligger foran et valgt gen (eller række af gener) i en funktionel DNA-polymer, samarbejder for at bestemme, om transkriptionen (og eventuel ekspression) af et gen skal finde 30 sted. DNA-sekvenser, der "følger efter" et gen i en DNA-polymer og tilvejebringer et signal for afslutning af transkriptionen til mRNA, omtales som transkriptions-"terminator"-sekvenser.

Mikrobiologiske fremgangsmåder har i det sidste 35 årti navnlig været rettet mod forsøget på at fremstille industrielt og farmaceutisk signifikante stoffer under anvendelse af organismer, der enten ikke oprindeligt har genetisk kodet information vedrørende det ønskede pro- 3 DK 172611 B1 dukt inkluderet i deres DNA, eller (i tilfælde af pat-’ tedyrceller i kultur) ikke sædvanligvis eksprimerer et kromosomalt gen i væsentlig grad. Simpelt udtrykt bliver et gen, der specificerer strukturen af et ønsket poly-5 peptidprodukt, enten isoleret fra en "donor"-organisme eller bliver syntetiseret kemisk og derefter på stabil måde indført i en anden organisme, der fortrinsvis er en selv-replikerende unicellulær organisme, såsom bakterie-, gær- eller pattedyrceller i kultur. Når dette er gjort, 10 vil det eksisterende maskineri til gen-ekspression i de "transformerede" eller "transficerede" mikrobielle værtceller operere til opbygning af det ønskede produkt under anvendelse af exogent DNA som en template for tran-skription af mRNA, der derefter translateres til en kon-15 tinuert sekvens af aminosyrerester.

Dette tekniske område er rigt på patent- og litteratur-publikationer vedrørende "rekombinant-DNA"-metodiker til isolering, rensning og forøgelse af genetiske materialer til anvendelse ved transformationen af ud-20 valgte værtorganismer. For eksempel angår US patentskrift nr. 4.237.224, Cohen, et al., transformation af unicellulære værtorganismer med "hybridt" viralt eller cirkulært plasmid DNA, der inkluderer exogene DNA-sekven-ser. Processerne ifølge Cohen, et al.-patentet indebærer 25 først fremstilling af en transformationsvektor ved enzymatisk kløvning af viralt eller cirkulært plasmid DNA for at danne lineære DNA-strenge. Udvalgte fremmede ("exogene" eller "heterologe") DNA-strenge sædvanligvis inkluderende sekvenser, der koder for ønsket produkt, 30 fremstilles i lineær form ved anvendelse af lignende enzymer. Det lineære virale eller plasmid DNA inkuberes med det fremmede DNA i nærværelse af ligerende enzymer, der er i stand til at tilvejebringe en restaureringsproces, og der dannes "hybrid"-vektorer, der inkluderer det 35 udvalgte exogene DNA-segment "splejset" ind i det virale eller cirkulære DNA-plasmid.

Transformation af kompatible unicellulære værtorganismer med hybrid-vektoren resulterer i dannelse af 4 DK 172611 B1 multiple kopier af det exogene DNA i værtcelle-popula-tionen. I nogle tilfælde er det ønskede resultat simpelthen forøgelsen af det fremmede DNA, og det indhøstede "produkt" er DNA. Hyppigere er formålet med transforma-5 tionen værtcellernes ekspression af det exogene DNA i form af syntese i stor milestok af isolerbare mængder af kommercielt signifikant protein eller polypeptid-frag-menter, som det fremmede DNA har kodet for. Se også f. eks. US patentskrifterne nr. 4.264.731 (Shine), nr.

10 4.273.875 (Manis), nr. 4.293.652 (Cohen) og europæisk patentansøgning nr. 093.619, publiceret 9. november 1983.

Udviklingen af specifikke DNA-sekvenser til splejsning ind i DNA-vektorer foregår ved forskellige former for teknik, der i høj grad afhænger af graden af '^οποί 5 rens" "fremmedhed" i forhold til den projekterede vært og størrelsen af det polypeptid, der skal eksprimeres i værten. Med risiko for oversimplificering kan det siges, at der kan anvendes tre alternative principielle metoder: (1) "isolering" af dobbeltstrenget DNA-sekvens fra 20 donorens genomiske DNA, (2) kemisk fremstilling af en DNA-sekvens, der tilvejebringer en kode for et polypeptid af interesse, og (3) in vitro-syntese af en dobbeltstrenget DNA-sekvens ved enzymatisk "omvendt transkrip-tion" af mRNA isoleret fra donor-celler. De sidstnævnte 25 metoder, der indebærer dannelse af et DNA-"komplement" af mRNA, omtales generelt som "cDNA"-metoder.

Fremstilling af DNA-sekvenser er ofte den udvalgte metode, når hele sekvensen af aminosyrerester for det ønskede polypeptidprodukt kendes. DNA-fremstillingsmeto-r 30 der ifølge US patentansøgning Serial nr. 483.451, Alton, et al., (indleveret 15. april 1983, og svarende til PCT US83/00605, publiceret 24. november 1983 som W083/ 04053) tilvejebringer for eksempel et bedre middel til opnåelse af sådanne stærkt ønskede resultater som: opnå-35 else af tilstedeværelse af vekslende codon’er, der er almindeligt foreliggende i gener, som i høj grad eksprimeres i den værtorganisme, der er valgt til ekspression (f.eks. tilvejebringelse af gær- eller E. coli-"præfe- 5 DK 172611 B1 rence”-codon1 er); undgåelse af tilstedeværelse af ikke-translaterede "intron"-sekvenser (sædvanligvis til ste-de i pattedyr-genom-DNA-sekvenser og mRNA-transkriptio-ner deraf), der ikke let forarbejdes af prokaryotiske 5 værtceller; undgåelse af ekspression af uønskede "fører"-polypeptid-sekvenser, der sædvanligvis kodes for af ge-nomiske DNA og cDNA-sekvenser, men som ofte ikke let kløves fra det ønskede polypeptid af bakterie- eller gær-værtceller; tilvejebringelse af let indføjelse af 10 DNA'et i passende ekspressions-vektorer i kombination med ønskede promotor/regulator- og terminator-sekvenser; og tilvejebringelse af let konstruktion af gener, der koder for polypeptidfragmenter og analoge af de ønskede polypeptider.

15 Når den totale sekvens af aminosyrerester i det ønskede polypeptid ikke er kendt, er den direkte fremstilling af DNA-sekvenser ikke mulig, og isolering af DNA-sekvenser, der koder for polypeptidet, ved en cDNA-metode bliver den udvalgte metode til trods for de po-20 tentielle ulemper i henseende til let samling af ekspressionsvektorer, der kan tilvejebringe høje niveauer af mikrobiel ekspression som ovenfor omtalt. Blandt standardmetoderne til isolering af cDNA-sekvenser af interesse er fremstillingen af plasmid-bårne cDNA-"biblio-25 teker" stammende fra omvendt transkription af mRNA, der foreligger rigeligt i donor-celler, som er valgt som ansvarlige for højniveau-ekspression af gener (f.eks. biblioteker af cDNA stammende fra hypofyseceller, der eks-prlmerer relativt store mængder af væksthormonprodukter).

30 Når væsentlige dele af polypeptidets aminosyresekvens er kendt, kan mærkede, enkeltstrengede DNA-probesekvenser, der er genpart af en sekvens, som formentlig foreligger i ,,mål,,-cDNA,et, anvendes ved DNA/DNA-hybridiserings-processer gennemført på klonede kopier af cDNA'et, der 35 er blevet denatureret til enkeltstrenget form. iSe generelt omtale og diskusion af denne teknik indeholdt i US patentskrift nr. 4.394.443, Weissman, et al., og nylige demonstrationer af anvendelsen af lange oligonuclé-' 6 DK 172611 B1 otid-hybridiseringsprober rapporteret i Wallace, et al.,

Nuc.Acids Res., 6, side 3543-3557, (1979), og Reyes, et al., P.N.A.S. (U.S.A.), 79, side 3270-3274 (1982), og Jaye, et al., Nuc. Acids Res., 11, side 2325-2335 (1983).

5 Se også US patentskrift nr. 4.358.535, Falkow, et al., vedrørende DNA/DNA-hybridiseringsmetoder ved gennemførelse af diagnoser, de publicerede europæiske patentansøgninger nr. 0070685 og 0070687 vedrørende lys-emitte-rende mærker på enkeltstrengede polynucleotid-prober; 10 Davis, et al., "A Manual for Genetic Engineering, Advanced Bacterial Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1980) , side 55-58 og 174-176, vedrørende koloni- og plaque-hybridiseringsteknik, og New England Nuclear (Boston, Mass.)-brochurer for 15 "Gene Screen" Hybridization Transfer Membrane-materialer, hvilke brochurer giver instruktion om overføring og hy-bridisering af DNA og RNA, Katalog nr. NEF-972].

Blandt de mere signifikante, nyere fremskridt inden for hybridiseringsmetoder til screening af rekombi-20 nant-kloner er anvendelsen af mærkede blandede syntetiske oligonucleotid-prober, der hver potentielt er det fulde komplement af en specifik DNA-sekvens i hybridi-seringsprøven omfattende en heterogen blanding af enkeltstrengede DNA1 er eller RNA'er. Disse metoder betragtes 25 som særligt anvendelige til påvisning af cDNA-kloner stammende fra kilder, der tilvejebringer ekstremt lave mængder af mENA-sekvenser for det ønskede polypeptid.

Kort udtrykt kan anvendelse af strenge hybridiseringsbe-tingelser rettet mod at undgå ikke-specifik binding mu-30. liggøre for eksempel autoradiografisk visualisering af en specifik cDNA-klon efter indtrådt hybridisering af mål-DNA'et til den enkelte probe i blandingen, der er dens fuldstændige komplement. Se generelt Wallace, et al.,

Nuc. Acids Res., 9, side 879-897 (1981); Suggs, et al., 35 P.N.A.S. (U.S.A.), 78, side 6613-6617 (1981); Choo, et al., Nature, 299, side 178-180 (1982); Kurachi, et al., P.N.A.S. (U.S.A.), T9, side 6461-6464 (1982), Ohkubo, et al.., P.N.A.S. (U.S.A.), 80, side 2156-22C0 (1983), og 7 DK 172611 B1

Kornblihtt, et al., P.N.A.S.(U.S.A.), 80, side 3218-3222 (1983). Generelt er de blandede probe-metoder ifølge Wallace, et al., (1981), supra, videreudviklet af forskellige forskere til det punkt, hvor pålidelige resul-5 tater er rapporteret opnået ved en cDNA-klonisolering under anvendelse af en blandet "pool" på 32 16-base-lan-ge (16-mere) oligonucleotid-prober med ensarter varierende DNA-sekvenser sammen med en enkelt 11-mer til opnåelse af en for to steder "positiv" bekræftelse på 10 tilstedeværelsen af cDNA af interesse. Se Singer-Sam, et al., P.N.A.S. (U.S.A.), 80, side 802-806 (1983).

Anvendelsen af genomiske DNA-isolater er den mindst almene af de tre ovennævnte metoder til udvikling af specifikke DNA-sekvenser til anvendelse vedrekombi-15 nant-metoder. Dette gælder navnlig på området for rekom-binant-metoder rettet mod sikring af mikrobiel ekspres-· sion af pattedyr-polypeptider og skyldes hovedsageligt kompleksiteten afganomisk pattedyr-DNA. Mens der således findes pålidelige metoder til udvikling af phag-bårne 20 biblioteker af genomisk DNA stammende fra mennesker eller andre pattedyrearter (se f.eks. Lawn, et al.. Cell, 15, side 1157-1174 (1978) vedrørende metoder til frembringelse af et humant genomisk bibliotek alment omtalt som the "Maniatis Library", Karn, et al., P.N.A.S.

25 (U.S.A.), 21' side 5172-5176 (1980) vedrørende et humant genomisk bibliotek baseret på alternativ restriktions-endonuclease-fragmentationsmetode, og Blattner, et al.,

Science, 196, side 161-169 (1977), der beskriver konstruktion af et okse-genom-bibliotek], har der været re-30 lativt få heldige forsøg på anvendelse af hybridise- ringsmetoder til isolering af genomisk DNA ved fravær af betydeligt forkendskab til aminosyre- eller DNA-sekven-ser. Som ét eksempel rapporterer Fiddes, et al., J. Mol. and App.Genetics, side 3-18 (1981) heldig isolering 35 af et gen, der koder for α-subenheden af de humane hypo-fyse-glycoproteinhormoner ud fra the Maniatis Library ved anvendelse af en "fuld-længde"-probe inkluderende et fuldstændigt 621 base-par-fragment af en forud isoleret ’ 8 DK 172611 B1 cDNA-sekvens for α-subenheden. Som et andet eksempel rapporterer Das, et al., P.N.A.S. (U.S.A.), 80, side 1531-1535 (1983) isolering af humane genomiske kloner for humant HLA-DR under anvendelse af et 175 base-par, synte-5 tisk oligonucleotid. Endelig rapporterer Anderson, et al., P.N.A.S. (U.S.A.), 80, side 6838-6842 (1983) isolering af genomisk klon for oksepancreastrypsininhibitor (BPTI) under anvendelse af en enkelt probe 86 base-par lang og konstrueret ifølge den kendte aminosyresekvens for BPTI.

10 Forfatterne giver udtryk for ringe udsigter til isolering af mRNA egnet til syntese af et cDNA-bibliotek som følge af tilsyneladende lave niveauer af mRNA i oprindeligt tilsigtede ørespytkirtel- og lungevævkilder og giver derefter udtryk for mulig succes ved probning af et ge-15 nomisk bibliotek under anvendelse af en blanding af mærkede prober, idet det anføres: "More generally, mixed-sequence oligodeoxynucleotide probes have been used to isolate protein genes og unknown sequence from cDNA libraries. Such probes are typically mixtures of 8-32 20 oligonucleotides, 14-17 nucleotides in length, representing every possible codon combination for a small stretch (5-6 residues) of amino acid-sequence. Under stringent hybridization conditions that discriminate against incorrectly base-paired probes, these mixtures 25 are capable of locating specific gene sequences in clone libraries of low-to-moderate complexity. Nevertheless, because of their short length and heterogeneity, mixed probes often lack the specificity required for probing sequences as complex as a mammalian genome. This makes 30 such a method impractical for the isolation of mammalian protein genes when the corresponding mRNAs are unavailable." (Citeringer udeladt).

Der er således fortsat et behov for forbedrede metoder til gennemførelse af· hurtig og effektiv isole-35 ring af cDNA-kloner i tilfælde, hvor der kun vides lidt om aminosyre-sekvensen af det polypeptid, der kodes for, og hvor "berigede" vævkilder for mRNA ikke er let tilgængelige til anvendelse ved konstruktionen af cDNA-bib’- 9 DK 172611 B1 lioteker. Sådanne forbedrede metoder ville være særligt nyttige, hvis de kunne anvendes til at isolere genomiske pattedyr-kloner, hvor der foreligger sparsom information vedrørende aminosyresekvenser for det polypeptid, som det 5 eftersøgte gen koder for.

B. Erythropoietin som polypeptid af interesse.

Erythropoiesis, fremstillingen af røde blodceller, foregår kontinuerligt under hele menneskets livstid for at opveje celledestruktion. Erythropoiesis er en meget 10 præcist styret fysiologisk mekanisme, der gør det muligt at have det rette antal røde blodceller til rådighed i blodet for den rette vævoxygenering, men ikke så mange, at cellerne vil genere cirkulation. Dannelsen af røde blodceller foregår i benmarven og styres af hormonet 15 erythropoietin.

Erythropoietin, et surt glycoprotein med en molekylvægt på ca. 34.000 dalton, kan forekomme i tre former: σ, 0 og asialo. Formerne o og 0 afviger lidt med hensyn til carbohydrat-komponenter, men har samme styrke, biolo-20 giske aktivitet og molekylvægt. Asialo-formen er en a-eller Ø-form med det terminale carbohydrat (sialinsyre) fjernet. Erythropoietin er til stede i meget lave koncentrationer i plasma, når legemet er i en sund tilstand, hvor væv modtager tilstrækkelig oxygenering fra det 25 eksisterende antal erythrocyter. Denne normale lave koncentration er tilstrækkelig til at stimulere erstatning af røde blodceller, der normalt går tabt ved ældning.

Mængden af erythropoietin i kredsløbet forøges under tilstande med hypoxi, hvor oxygentransport ved 30 hjælp af blodceller i kredsløbet nedsættes. Hypoxi kan forårsages af tab af store mængder blod som følge af hæ-moragi, destruktion af røde blodceller ved overbestråling, reduktion af oxygenindtagning som følge af store højder eller langvarig bevidstløshed, eller forskellige 35 former for anæmi. Som svar på væv, der udsættes for hy-poxisk stress, vil erythropoietin forøge produktionen af røde blodceller ved at stimulere omdannelsen af primitive precursorceller i benmarven til pro-erythrobla- 10 DK 172611 B1 ster, der derefter modnes, syntetiserer hæmoglobin og frigøres til kredsløbet som røde blodceller. Når antallet af røde blodceller i kredsløb er større, end det behøves for normale vævoxygenkrav, nedsættes erythropoietin i 5 kredsløb.

Se generelt Testa, et al., Exp. Hematol., 8(Supp.

8K 144-152 (1980); Tong, et al., J. Biol. Chem. 256(24), 12666-12672 (1981); Goldwasser, J. Cell. Physiol., 110 (Supp. 1). 133-135 (1982); Finch, Blood, 60(6) . 1241-10 1246 (1982); Sytowski, et al., Expt. Hematol-, 8(Supp 8), 52-64 (1980: Naughton, Ann. Clin. Lab. Sci., 13(5), 432-438 (1983); Weiss, et al., Am. J. Vet. Res., 44(10), 1832-1835 (1983); Lappin, et al., Exp. Hematol., 11(7), 661-666 (1983); Baciu, et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 414, 15 66-72 (1983); Murphy, et al., Acta. Haematologica Japo-nica, 46(7), 1380-1396 (1983); Dessypris, et al., Brit.

J. Haemotol., 56, 295-306 (1984); og Emmanouel, et al..

Am. J. Physiol..247 (1 Pt. 2), F168-76 (1984).

Da erythropoietin er essentielt for dannelsen af 20 røde blodceller, har hormonet potentiel nyttig anvendelse både ved diagnose og behandling af blodsygdomme, der er karakteriseret ved lav eller defekt produktion af røde blodceller. Se generelt Pennathur-Das, et al., Blood, 63 (5) , 1168-1171 (1984) og Haddy, Am. Jour. Ped. Hema-25 tol./Oncol., £. 191-196 (1982), vedrørende erythropoietin ved mulige terapier for seglcellesygdom, og Esch-bach, et al., J. Clin. Invest., 74(2), side 434-441 (1984), der beskriver et terapeutisk program for uræmiske får baseret på in vivo-respons på erythropoietin-rige 30 plasmainfusioner og foreslår en dosis på 10E EPO/kg pr. dag i 15-40 dage som korrektiv for anæmi af den type, der står i forbindelse med kronisk nyresvigt. Se også Krane, Henry Ford Hosp. Med. J., 31(3), 177-181 (1983).

Det er nyligt vurderet, at erythropoietin tilgæn-35 geligt i stor mængde ville tillade behandling hvert år af anæmier hos 1.600.000 personer i alene U.S.A.. Se f.eks. Morrison, "Bioprocessing in Space----an Overview", side 557-571 i The World Biotech Report 1984, bind 2.: 11 DK 172611 B1 USA, (Online Publications, New York, N.Y. 19841. Nylige undersøgelser har givet basis for skøn over erythropoie-^ tin-terapiens effektivitet ved forskellige sygdomstilstande, forstyrrelser og tilstande ved hæmatologisk ure-5 gelmæssighed: Vedovato, et al., Acta. Haematol, 71» 211-213 (1984) (beta-^thalassemi ); Vichinsky, et al., J. Pe-diatr., 105 (1) , 15-r21 (1984) (cystisk fibrose); Cotes, et al., Brit. J. Obstet. Gyneacol., 90(4), 304-311 (1983) (graviditet, menstruelle forstyrrelser); Haga, et al., 10 Acta. Pediatr. Scand., 72.» 827-831 (1983) (tidlig anæmi ved tidlig modenhed); Claus-Walker, et al.,Arch. Phys.

Med. Rehabil., ^5, 370-374 (1984) (rygmarvsskade); Dunn, et al., Eur. J. Appl. Phsiol., ^2, 178-182 (1984) (rumflyvning); Miller, et al., Brit. J. Haematol., 52^, 545-15 590 (1982) (akut blodtab); Udupa, et al., J. Lab. Clin.

Med., 103(4), 574-580 og 581-588 (1984); og Lipschitz, et al., Blood, 63(3) 502-^509 (1983) (ældning); og Daini-ak, et al., Cancer, 51(6), 1101-1106 (1983) og Schwartz, et al., Otolaryngol., 109, 269-272 (1983) (forskellige 20 neoplastiske sygdomstilstande ledsaget af abnorm erythro-poiesis).

Tidligere forsøg på at vinde erythropoietin i godt udbytte ud fra plasma eller urin har vist relativ mangel på succes. Kompliceret og forfinet laboratorie-25 teknik er nødvendig og resulterer i almindelighed i indsamling af meget små mængder urene og ustabile ekstrakter indeholdende erythropoietin, US patentskrift nr. 3.033.753 beskriver en fremgangsmåde til partiel rensning af erythropoietin ud fra 30 fåre-blodplasma, hvilken fremgangsmåde giver lave udbytter af en r& fast ekstrakt indeholdende erythropoietin.

Indledende forsøg på at isolere erythropoietin fra urin gav ustabile, biologisk inaktive præparater af hormonet. US patentskrift nr. 3.865.801 beskriver en 35 12 DK 172611 B1 fremgangsmåde til stabilisering af den biologiske aktivitet af et råstof indeholdende erythropoietin udvundet fra urin. Det resulterende rå prsparat indeholdende erythropoietin skulle tilbageholde 90% af erythropoietin-5 aktivitet og vare stabilt.

En anden fremgangsmåde til rensning af humant erythropoietin fra urin fra patienter med aplastisk anæmi er beskrevet i Miyake, et al., J. Biol., Chem., bind 252, nr. 15 (10. august 1977), side 5558-5564. Denne 10 syv-trins proces indebærer ionbytnings-chromatografi og giver et rent erythropoietin-præparat med en styrke på 70.400 enheder/mg af protein i 21% udbytte.

US patentskrift nr. 4.397.840, Takezawa, et al., beskriver fremgangsmåder til fremstilling af "et erythro-15 poietinprodukt" fra urinprøver fra raske mennesker ved hjælp af svagt basiske ionbyttere og angiver, at de vundne lavmolekylære produkter "er uden hæmmende virkninger over for erythropoietin".

UK patentansøgning nr. 2.085.887, Sugimoto, et al., 2Q publiceret 6. maj 1982, beskriver en fremgangsmåde til fremstilling af hybride humane lymfoblastoide celler og rapporterer produktionsniveauer liggende fra 3 til 420 enheder erythropoietin pr. ml suspension af celler (fordelt i kulturerne efter pattedyrvært-formering indehol-25 dende op til 10^ celler pr. ml. Ved de højeste produktionsniveauer, der er rapporteret opnået, kunne hastigheden for erythropoietin-produktion beregnes til fra 40 til 4.000 enheder/106 celler/48 timer i in vitro-kultur efter overføring af celler fra in vivo -formeringssyste-30 mer. (Se også det tilsvarende US patentskrift nr.

4.377.513). Der er fremsat mangfoldige forslag til isolering af erythropoietin fra vævkilder inklusive neoplasti-ske celler, men udbytterne har været temmeligt lave. Se f.eks. Jelkman, et al., Expt.- Hematol., 11(7) , 581-588 35 (1983); Iambourin, et al., P.N.A.S. (U.S.A.), 80, 6269-6273 (1983); Katsuoka, et al., Gann, J74, 534-541 (1983);

Hagiwara, et al., Blood, 63 (4) , 828-835 (1984); og Chop-pin, et al., Blood, 64 (2) . 341-347 (1984).

13 DK 172611 B1

Andre former for isolationsteknik anvendt til udvinding af renset erythropoietin indebærer immunologiske processer. Et polyklonalt, serumafledt antistof rettet mod erythropoietin er udviklet ved at injicere et dyr, 5 fortrinsvis en rotte eller kanin, med humant erythropoietin. Det injicerede humane erythropoietin opfattes som et fremmed antigenstof af dyrets immunsystem og fremkalder produktion af antistoffer mod antigenet. Forskellige celler, der reagerer på stimulation fra antigenstoffet, 10 producerer og frigør til kredsløbet antistoffer, der afviger lidt fra dem, der produceres af andre reagerende celler. Antistof-aktiviteten forbliver i dyrets serum, når dets blod ekstraheres. Selv om urenset serum eller antistof-præparater, der er renset som en serum-immuno-15 globulin G-fraktion, derefter kan anvendes ved prøver til påvisning af og kompleksdannelse med humant erythropoietin, lider materialerne af en væsentlig ulempe. Dette serum-antistof, sammensat af alle de forskellige antistoffer produceret af individuelle celler, er af natur 20 polyklonalt og vil kompleksdanne med andre komponenter i rå ekstrakter end alene erythropoietin.

Af Interesse for baggrunden for den foreliggende opfindelse er nylige fremskridt på området med udvikling af kontinuerte kulturer af celler, der kan producere en 25 enkelt art af antistof, der er specifikt immunologisk reaktiv med en enkelt antigenisk determinant fra et udvalgt antigen. Se generelt Chrisholm, High Technology, bind 3, nr. 1,57-63 (1983). Der har været gjort forsøg på at anvende cellefusions- og hybridiseringsteknik til 30 udvikling af "monoklonale" antistoffer mod erythropoietin og at anvende disse antistoffer ved isolering og kvantitativ bestemmelse af humant erythropoietin. Som et eksempel findes i resuméform en rapport vedrørende heldig udvikling af mus-mus hybridoma-cellelinier, der 35 udskiller monoklonale antistoffer mod humant erythropoietin, Lee-Huang, Abstract nr. 1463 fra Fed. Proc., 41, 520 (1982). Et andet eksempel er en detaljeret beskrivelse af fremstilling og anvendelse af et monoklo- 14 DK 172611 B1 nalt, anti-erythropoietin-antistof i Weiss, et al., P.N.A.S. (U.S.A.), 79/ 5465-5469 (1982). Se også Sasaki,

Biomed. Biochim. Acta., 42 (11/12), S202-S206 (1983); Ya-nagawa, et al., Blood, 64(2), 357-364 (1984); Yanagawa, 5 et al., J. Biol. Chem., 259 (5), 2707-2710 (1984); og US patentskrift nr. 4.465.624.

Ligeledes af interesse for baggrunden for den foreliggende opfindelse er rapporter vedrørende den immunologiske aktivitet af syntetiske peptider, der i det væ-10 sentlige duplikerer den aminosyresekvens, der eksisterer i naturligt foreliggende proteiner, glycoproteiner og nucleoproteiner. Mere specifikt er det påvist, at relativt lavmolekylære polypeptider deltager i immun-reak-tioner, der med hensyn til varighed og udstrækning sva-15 rer til inununreaktionerne af fysiologisk signifikante proteiner, såsom virale antigener, polypeptid-hormoner og lignende. Omfattet af iiranun-reaktionerne af sådanne polypeptider er fremkaldelsen af dannelsen af specifikke antistoffer i immunologisk aktive dyr. Se f.eks.

20 Lerner, et al.. Cell, 2^, 309-310 (1981); Ross, et al.,

Nature, 294, 654-656 (1981); Walter et al., P.N.A.S.

(U.S.A.), 77, 5197-5200 (1980); Lerner, et al., P.N.A.S.

(U.S.A.), 78, 3403-3407 (1981); Walter, et al., P.N.A.S.

(U.S.A.), 78, 4882-4886 (1981); Wong, et al., P.N.A.S.

25 (U.S.A.), 78, 7412-7416 (1981); Green, et al. Cell, 28./ 477-487 (1982); Nigg, et al., P.N.A.S. (U.S.A.), 79, 5322-5326 (1982); Baron, et al., Cell, £8, 395-404 (1982); Dreesman, et al.,Nature, 295, 158-160 (1982); og Lerner, Scientific American, 248, Nr. 2, 66-74 (1983).

30 Se også Kaiser, et al.. Science, 223, side 249-255 (1984) vedrørende biologiske og immunologiske aktiviteter af syntetiske peptider, der omtrentlig deler sekundære strukturer med peptid-hormoner, men måske ikke har deres primære strukturelle udformning. De ovennævnte undersø-35 gelser angår naturligvis aminosyresekvenser hos proteiner forskellige fra erythropietin, et stof for hvilket der ikke findes publiceret nogen væsentlig aminosyrese-kvens-imformation. I US patentansøgning Serial nr.

15 DK 172611 B1 463.724, Indleveret 4. februar 1983, J. Egrie, publiceret 22. august 1984 som europæisk patentansøgning nr.

0.116.446, er beskrevet en mus-mus hybridoma-cellelinie (A.T.C.C. nr. HB8209), der producerer ét meget specifikt 5 monoklonalt, anti-erythropoietin-antistof, der også er specifikt immunoreaktivt med et polypeptid indeholdende følgende aminosyresekvens: NI^-Ala-Pro-Pro-Arg-Leu-Ile-Cys-Asp-Ser-Arg-Val-Leu-Glu-Arg-Tyr-Leu-Leu-Glu-Ala-Lys-COOH.

10 Polypeptid-sekvensen er en sekvens, der tilskrives de første tyve aminosyrerester i modent humant erythropoietin isoleret ved metoden ifølge Miyake, et al., J. Biol.

Chem., 252, 5558-5564 (1977), og på hvilket der blev foretaget aminosyreanalyse med gasfase-sekvensbestemmer 15 (Applied Biosystems, Inc.) ved metoden ifølge Hewick, M., et al., J. Biol. Chem., 256, 7990-7997 (1981). Se også Sue, et al., Proc. Kat. Acad. Sci. (USA), 80, side 3651-3655 (1983) vedrørende udvikling af polyklonale antistoffer mod en syntetisk 26-mer baseret på en anden ami-20 nosyresekvens, og Sytowski, et al., J. Immunol. Methods, 69, side 181-186 (1984) .

Selv om polyklonale og monoklonale antistoffer som ovenfor beskrevet tilvejebringer meget nyttige materialer til anvendelse ved immunoprøver til påvisning og 25 kvantitativ bestemmelse af erythropoietin og kan være nyttige ved affinitets-rensning af erythropoietin, synes det usandsynligt, at disse materialer let skulle kunne tilvejebringe isolering i stor målestok af sådanne erythropoietin-mængder fra pattedyrkilder, der ville være 30 tilstrækkelige for analyse, klinisk testning og potentiel vidtrækkende terapeutisk anvendelse af stoffet ved behandling af f.eks. kronisk nyresygdom, hvor sygt væv ikke er i stand til at opretholde produktion af erythropoietin.

Dét er derfor vurderet, at de bedste udsigter til fuld-35 stændig karakterisering af pattedyr-erythropoietin og tilvejebringelse af store mængder deraf til potentiel diagnostisk og klinisk anvendelse indebærer heldig anvendelse af r.ekombinant-metoder til opnåelse af mikrobiel syntese ' 16 DK 172611 B1 af forbindelsen i stor målestok.

Selv om der er gjort store anstrengelser for at isolere DNA-sekvenser, der koder for erythropoietin fra mennesker eller andre pattedyrarter, har ingen forsøg 5 været heldige. Dette skyldes hovedsageligt knapheden på vævskilder, navnlig humane vævskilder, beriget på mRNA, således at det ville blive muligt at konstruere et cDNA-bibliotek, ud fra hvilket der ved konventionel teknik kunne isoleres en DNA-sekvens, der koder for erythropoie-10 tin. Endvidere vides så lidt om den kontinuerte sekvens af aminosyrerester i erythropoietin, at det ikke er murligt f.eks. at konstruere lange polynucleotid-prober, der let og pålideligt kunne anvendes ved DNA/DNA-hybri-diserings-screening af cDNA, og navnlig genomiske DNA-15 biblioteker. Til illustration kan nævnes, at den tyve-aminosyrers sekvens, der er anvendt til at udvikle det ovennævnte monoklonale antistof produceret af A.T.T.C. nr. HB8209, ikke tillader konstruktion af en utvetydig, 60 basers oligonucleotid-probe på den af Anderson , et 20 al., supra, beskrevne måde. Det er vurderet, at det humane gen for erythropoietin kan foreligge som et ”en-kelkopi-gen" i det human genom, og under alle omstændigheder må det genomiske materiale, der koder for humant erythropoietin, forventes at udgøre mindre end 0,00005% 25 af totalt genomisk DNA, der ville være til stede i et genomisk bibliotek.

Hidtil har de mest succesrige blandt de kendte rapporterede forsøg på rekombinant^relaterede metoder til tilvejebringelse af DNA-sekvenser egnede til anven-30 delse ved mikrobiel ekspression af isolerbare mængder af pattedyr-erythropoietin langt fra nået målet. Som et eksempel rapporterer Farber, et al., Exp. Hematol., 11,

Supp. 14, Abstract 101 (19831 ekstraktion af mRNA fra nyrevæv fra phenylhydrazin-behandlede bavianer og in-· 35 jektion af mRNA'et i Xenopus laevis-oocyter med det temmeligt flygtige resultat bestående i in vitro-produk-tion af en blanding af "translationsprodukter" omfattende blahdt andre sådanne med biologiske egenskaber af erythro- 17 DK 172611 B1 poietin. Af nyere dato har Farber, et al., Blood, 6_2, nr. 5, Supp. nr. 1, Abstract 392, side 122a (1983) rapporteret fn vitro-translation af humant nyre-mRNA ved hjælp af frø-oocyter, Den resulterende translationspro-5 duktblanding blev vurderet som indeholdende en størrelsesorden på 220 mE af et translationsprodukt med aktivitet som erythropoietin pr. mikrogram af injiceret rnRNA.

Selv om sådanne niveauer af in vitro-translation af exo-gent rnRNA, der koder for erythropoietin, blev erkendt 10 som værende temmeligt lave (sammenlignet selv med de tidligere rapporterede niveauer af bavian-mRNA-transla-tion til det eftersøgte produkt) blev det vurderet, 'at resultaterne bekræfter den humane nyre som et sted med erythropoietin-ekspression, der tillader konstruktion 15 af et beriget humant nyre-cDNA-bibliotek, ud fra hvilket det ønskede gen muligvis kunne isbleres [Se også Farber,

Clin. Res., 31 (4) , 769A (1983)J.

Siden indleveringen af US patentansøgningerne Serial nr. 561.024 og 582.185 er der fremkommet en enkelt 20 rapport vedrørende kloning og ekspression af, hvad der anføres at have været humant erythropoietin-cDNA i E. coli. Kort forklaret blev et antal cDNA-kloner indført i E. coli-plasmider, og 3-lactamase-fusionsprodukter blev observeret som værende immunoreaktive med et mono-25 klonalt antistof for uspecificeret "epitop" af humant erythropoietin. Se Lee-Huang, Proc. Nat. Acid. Sci.

(USA), 81, side 2708-2712 (1984).

Kort Resumé

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer, for 30 første gang, hidtil ukendte, rensede og isolerede poly-peptidprodukter, der har en del af eller hele den primære strukturelle udformning [dvs. kontinuert sekvens af aminosyrerester) og som har samme biologiske virkninger (f.eks. immuhplogiske egenskaber og in vivo 35 og in vitro biologiske aktivitet) som.naturligt forekommende erythropoietin, inklusive alleliske varianter deraf. Disse polypeptider er også entydigt karakteriseret ved' at være produktet fra prokaryotisk eller eukaryotisk 18 DK 172611 B1 vært-ekspression (f.eks. ved hjælp af bakterie-, gær- og pattedyr-celler i kultur) af exogene DNA-sekvenser vundet ved genomisk eller cDNA-kloning eller ved gen-syntese.

Produkter fra mikrobiel ekspression i hvirveldyrceller 5 {f.eks. fra pattedyr og fulge) er yderligere fordelagtige ved frihed for forening med humane proteiner eller andre forureninger, der kan være forenet med erythropoietin i dets naturlige omgivelser i pattedyrceller eller i ekstracellulære væsker, såsom plasma eller urin. Produk-10 terne fra typiske gær- (f.eks. Saccharomyces cerevisiae-) eller prokaryot- (f.eks. E. coli-) værtceller er fri for forening med enhver form for pattedyrproteiner. Alt efter den anvendte vært kan polypeptiderne ifølge opfindelsen være glycosyleredp med pattedyr-carbohydrater eller 15 andre eukaryotiske carbohydrater, eller de kan være ikke-glycolerede. Polypeptider ifølge opfindelsen kan også inkludere en indlevende methionin-aminosyrerest (ved 1-stilling).

Hidtil ukendte glycoproteinprodukter ifølge op-20 findelsen inkluderer dem med en primær strukturel udformning, der i tilstrækkelig grad er dublet af den strukturelle udformning af et naturligt forekommende (f.eks. humant) erythropoietin til at tillade besiddelse af én eller flere af dettes biologiske egenskaber, og med en 25 gennemsnitlig carbohydrat-komposition, der afviger fra kompositionen af naturligt forekommende (f.eks. humant) erythropoietin.

Hvirveldyrværtsceller (f.eks. COS-1 og CHO) ifølge den foreliggende opfindelse omfatter de første celler 30 nogensinde, der kan formeres kontinuerligt i_n vitro, og som efter vækst i kultur er i stand til i deres vækstmedium at producere mere end 100 E (fortrinsvis mere end 500 E og navnlig mere end 1.000 til 5.000 E) af erythropoietin pr. 10® celler i løbet af 48 timer, bestemt ved 35 radioimmunoprøve.

Illustrerende for den foreliggende opfindelse er klonede DNA-sekvenser stammende fra abe- og humane arter, og polypeptid-sekvenser passende deduceret derfra, som 19 DK 172611 B1 repræsenterer den primære strukturelle udformning af erythropoietiner stammende fra henholdsvis abe- og humane arter.

Opfindelsen tilvejebringer endvidere hidtil ukendte bio-5 logisk funktionelle virale og cirkulære plasmid DNA-vek-torer, der inkorporerer DNA-sekvenser ifølge opfindelsen, og mikrobielle værtorganismer (f.eks. bakterie-, gær-og pattedyrceller), der er stabilt transformeret eller transficeret med sådanne vektorer. Tilsvarende tilveje-10 bringer opfindelsen hidtil ukendte fremgangsmåder til fremstilling af nyttige polypeptider, hvilke fremgangsmåder omfatter dyrket vækst af sådanne transformerede eller transficerede mikrobielle værter under betingelser, der letter ekspression i stor målestok af de exo-15 gene, vektor-bårne DNA-sekvenser og isolering af de ønskede polypeptider fra vækstmediet, cellulære lysater eller cellulære membranfraktioner.

Isolering og rensning af mikrobielt eksprimerede polypeptider tilvejebragt ved hjælp af opfindelsen kan 20 foregå med konventionelle midler omfattende f.eks. præparative chromatografiske separationer og immunologiske separationer involverende monoklonale og/eller polyklo-nale antistofpræparater.

' Efter klarlæggelse her af sekvensen af erythro-25 poietins aminosyrerester tilvejebringer den foreliggende opfindelse den totale og/eller partielle fremstilling af DNA-sekvenser, der koder for erythropoietin og inkluderer sådanne fordelagtige karakteristika som inkorporering af codon'er "foretrukket" til ekspression ved hjælp 30 udvalgte ikke-pattedyrværter, tilvejebringelse af steder til kløvning ved hjælp af restriktionsendonuclease-en-zymer og tilvejebringelse af yderligere, indledende, terminale eller intermediære DNA-sekvenser, der letter konstruktion af let eksprimerede vektorer. Tilsvarende 35 tilvejebringer den foreliggende opfindelse fremstilling (og udvikling ved positionsspecifik mutagenese af cDNA og genomisk DNA) af DNA-sekvenser, der koder for mikrobiel ekspression af polypeptid-analoge eller -deriva- 20 DK 172611 B1 ter af erythropoietin, der afviger fra naturligt forekommende former i henseende til identiteten eller beliggenheden af én eller flere aminosyrerester (dvs. deleti-onsanaloge indeholdende mindre end alle de rester, der 5 er specificeret for EPO, og/eller substitutions-analoge, hvori én eller flere specificerede rester er erstattet med andre rester, og/eller additions-analoge, hvori én eller flere aminosyrerester er adderet til en terminal eller medial del af polypeptidet), og som har samme bio-10 logisk virkning som naturligt forekommende former.

Det har nu overraskende vist sig, at de ovenfor omtalte rekombinant fremstillede polypeptidprodukter ifølge opfindelsen med samme biologiske virkning som 15 humant erythropoietin in vivo har en aktivitet, der er omtrent 1,5 gange så høj som aktiviteten af erythropoietin fremstillet ved kendt teknik ud fra menneskeurin.

I overenstemmelse hermed er den rensede og isolerede DNA-sekvens ifølge opfindelsen, hvilken sekvens koder for 20 erythropoientin og derivater deraf med samme biologiske virkning, ejendommelig ved, at nævnte DNA-sekvens er valgt blandt: (a) DNA-sekvenser anført i de nedenfor anførte tabeller V og VI eller deres komplementære strenge, 25 (b) DNA-sekvenser, der under stringente betingelser hybridiserer til DNA-sekvenser defineret under (a) eller fragmenter deraf, og (c) DNA-sekvenser, der, hvis det ikke var for degenerationen af den genetiske kode, ville hybridisere 30 til DNA-sekvenserne defineret under (a) og (b).

Endvidere er den biologisk funktionelle cirkulære plasmid- eller virale DNA-vektor ifølge opfindelsen ejendommelig ved det i krav 17 's kendetegnede del angivne, ejendommeligheden for de prokaryotiske og eukaryo-35 tiske værtsceller ifølge opfindelsen vises i de kendetegnende dele af kravene 6, 7 og 18 , polypeptidprodukter ifølge opfindelsen er ejendommelige ved det i de kendetegnende dele af kravene 15,16 og 19 angivne, og frem- 21 DK 172611 B1 gangsmåden til fremstilling af de omhandlede polypeptidprodukter er ejendommelig ved det i krav 20 's kendetegnede del angivne.

Endelig er de farmaceutiske præparater/kompositioner 5 ifølge opfindelsen ejendommelige ved det i krav 23's kendetegnende del angivne. Disse praparater/kompositioner muliggør tilvejebringelse af erythropoientin-terapi, navnlig ved behandling af af anæmiske sygdomstilstander og især i forbindelse med nyresvigt, hvorfor anvendelsen 10 ifølge opfindelsen af de omhandlede polypeptider er ejendommelig ved det i krav 24 angivne.

Man bør endvidere vare opmærksom på den klasse af polypeptider, som der kodes for af dele af det DNA, der er komplement til den i Tabel VI viste top-15 strengsekvens for humant genomisk DNA, dvs. "complementary inverted proteins", som beskrevet af Tramentano, et al., Nucleic Acids Research, 12^, side 5049-5059 (1984).

Som beskrevet nedenfor er det blevet muligt at 20 identificere cDNA-kloner, der koder for erythropoietin staiimende fra abe-arter, inden for et bibliotek fremstillet ud fra nyrecelle-mRNA fra anæmis’k abe. Nærmere angivet blev en blanding af 128 ensartet varierende 20-mere prober baseret på aminosyresekvens-information stammende fra sekvens-25 bestemmelse af fraktioner af humant erythropoietin, anvendt ved kolonihybridiseringsprocesser til at identificere syv "positive" erythropoietin-cDNA-kloner inden for ialt 200.000 kolonier. Endnu mere bemærkelsesværdigt er det blevet muligt hurtigt at isolere tre positive kloner 30 inden for en screening af 1.500.000 phag- plaque’er, der udgjorde et humant genomisk bibliotek. Dette foregik ved anvendelse af en blanding af 128 20-mere prober sammen med et andet sæt af 128 17-mere prober baseret på aminosyreanalyse af en anden kontinuert sekvens af 35 humant erythropoietin.

Sådanne processer udgør det første kendte tilfælde med anvendelse af multiple bian- 22 DK 172611 B1 dede oligonucleotid-prober i DNA/DNA-hybridiseringspro-cesser rettet mod isolering af genomiske pattedyr-kloner og det første tilfælde af anvendelse af en blanding af mere end 32 oligonucleotid-prober ved isolering af cDNA-5 kloner.

I forbindelse med opfindelsen er DNA-sekven-ser, der indkoder en del af eller hele polypeptid-sekven-sen af erythropoietin fra humane og abe-arter i i det følgende undertiden "EPO"), blevet isoleret og karakteriseret.

10 Endvidere er DNA'et stammende fra aber og mennesker gjort til genstand for eukaryotisk og prokaryotisk ekspression under tilvejebringelse af isolerbare mængder af polypeptider, der udviser biologiske (f.eks. immunologiske) egenskaber af naturligt forekommende EPO samt både 15 in vivo og in vitro biologiske aktiviteter af EPO.

DNA'et stammende fra abearter blev isoleret fra et cDNA-bibliotek konstrueret med mRNA stammende fra nyrevæv fra en abe i en kemisk induceret anæmisk tilstand, og hvis serum ifølge immunologisk bestemmelse indeholdt høje 20 niveauer af EPO sammenlignet med normalt abeserum. Isoleringen af de ønskede cDNA-kloner indeholdende EPO-ind-kodende DNA foregik ved brug af DNA/DNA koloni-hybridise-ring under anvendelse af en pool af 128 blandede, radiomærkede, 20-mere oligonucleotid-prober og indebar hurtig 25 screening af 200.000 kolonier. Opbygning af oligonucleo-tid-proberne var baseret på aminosyresekvens-informati-on tilvejebragt ved enzymatisk fragmentation og sekvensbestemmelse af en lille prøve af humant EPO.

DNA'et stammende fra humane arter blev isoleret 30 fra et humant genomisk DNA-bibliotek. Isoleringen af kloner indeholdende EPO-indkodende DNA foregik ved DNA/DNA plaque-hybridisering under anvendelse af den ovennævnte pool af 128 blandede 20-mere oligonucleotid-prober og en anden pool af 128 radiomærkede 17-mere prober, hvis se-35 kvenser var baseret på aminosyresekvens-information opnået fra et andet enzymatisk humant EPO-fragment.

Positive kolonier og plaoue'er blev verificeret ved ’dideoxy-sekvensbestemmelse af klonalt DNA under an- 23 DK 172611 B1 vendelse af et subsæt af 16 sekvenser inden for poolen af 20-mere prober, og udvalgte kloner blev underkastet nucleotid-sekvensanalyse resulterende i deduktion af primær strukturel udformning af de dermed indkodede EPO-5 polypeptider. De deducerede polypeptidsekvenser udviste en høj grad af homologi i forhold til hinanden og i forhold til en partiel sekvens udviklet ved aminosyreanalyse af humane EPO-fragmenter.

En udvalgt positiv abe-cDNA-klon og en udvalgt 10 positiv human genomisk klon blev hver indført i en "shuttle"-DNA-vektor, der blev forøget i E. coli og anvendt til at transficere pattedyrceller i kultur. Dyrket vækst af transficerede værtceller resulterede i dyrk-ningsmedium-supernatantpræparater vurderet til at inde-15 holde så meget som 3000 mE af EPO pr. ml dyrkningsvæske.

De følgende eksempler illustrerer opfindelsen og er specifikt rettet på fremgangsmåder gennemført forud for identifikation af EPO-indkodende abe-cDNA-kloner og humane genomiske kloner, og på fremgangsmåder, der re-20 suiterer i sådan identifikation, samt på sekvensbestemmelse, udvikling af ekspressionssystemer og immunologisk verificering af EPO-ekspression i sådanne systemer.

Nærmere angivet er Eksempel 1 rettet på amino-se-kvensbestemmelse af humane EPO-fragmenter og opbygning 25 af blandinger af radiomærkede prober baseret på de ved denne sekvensbestemmelse opnåede resultater. Eksempel 2 er generelt rettet på fremgangsmåder involveret i identificeringen af positive abe-cDNA-kloner og tilvejebringer således information vedrørende dyrebehandling og 30 præliminær radioimmunoprøve-analyse (RIA-analyse) af animalske sera. Eksempel 3 er rettet på fremstilling af cDNA-biblioteket, kolonihybridiserings-screening og verificering af positive kloner, DNA-sekvensbestemmelse af en positiv cDNA-klon og frembringelse af information vedrø-35 rende primær strukturel udformning af abe-EPO-polypeptid (aminosyresekvens). Eksempel 4 er rettet på fremgangsmåder involveret i identificering af positive humane ge-nomi'ske kloner og tilvejebringer således information 24 DK 172611 B1 vedrørende kilden for det genomiske bibliotek, pladehybri-diserings-processer og verificering af positive kloner.

Eksempel 5 er rettet på DNA-sekvensbestemmelse af en positiv genomisk klon og frembringelse af aminosyrese-5 kvens-information vedrørende humant EPO-polypeptid, inkluderende en sammenligning deraf med sekvens-informationen vedrørende abe-EPO. Eksempel 6 er rettet på fremgangsmåder til konstruktion af en vektor inkorporerende EPO-indkodende DNA stammende fra en posi-10 tiv abe-cDNA-klon, anvendelse af vektoren til transfek-tion af COS-1 celler og dyrket vækst af de transficerede celler. Eksempel 7 er rettet på fremgangsmåder til konstruktion af en vektor inkorporerende EPO-indkodende DNA stammende fra en positiv human genomisk klon, anvendelse 15 af vektoren til transfektion af COS-1 celler og dyrket vækst af de transficerede celler. Eksempel 8 er rettet på immunoprøve-processer gennemført på medium-supernatanter vundet fra den dyrkede vækst af transficerede celler ifølge Eksempel 6 og 7. Eksempel 9 er rettet på ^n vitro og 20 in vivo biologisk aktivitet af mikrobielt eksprimeret EPO fra Eksempel 6 og 7.

Eksempel 10 er rettet på udvikling af pattedyr-vært-ekspressionssystemer for abe-EPO-cDNA og humant genomisk DNA involverende ovarieceller fra kinesisk ham-25 ster ("CHO"-celler), og på de immunologiske og biologiske aktiviteter af produkter fra disse ekspressionssystemer samt karakterisering af sådanne produkter. Eksempel 11 er rettet på fremstilling af fabrikerede gener, der indkoder EPO og EPO-analoge fra humane arter, hvilke gener 30 inkluderer en række preference-codon'er for ekspression i E. coli og gær-værtceller, og ekspressionssystemer baseret derpå. Eksempel 12 angår de immunologiske og biologiske aktivitetsprofiler for ekspressionsprodukter fra systemerne i Eksempel 11.

35 Endelig angår Eksempel 13 en sammenligning mellem in vivo aktiviteter for højoprenset humant erythropoietin fremstillet ud fra menneskeurin og-rekombinant humant erythropoietin fremstillet ifølge 25 DK 172611 B1 opfindelsen.

På tegningerne viser: fig. 1 en grafisk sammenligning mellem radioimmunassayda-ta for rekombinant humant og abe EPO, 5 fig. 2 plasmidet pDSVL-MkE, fig. 3 vektoren pSVgHuEPO, og fig. 4 plasmidet pSVLgHuEPO.

Eksempel 1 10 Ά. Amlnosyresekvensbestemmelse af humant EPO-fragment

Humant EPO blev isoleret fra urin og underkastet tryptisk digerering resulterende i udvikling og isolering af 17 separate fragmenter i mængder på omtrent 100-150 picomol.

15 Fragmenter blev nummereret vilkårligt og blev ana lyseret for aminosyresekvens ved mikrosekvens-analyse under anvendelse af en gasfase-sekvensbestemmer (Applied Biosystems), hvorved der blev tilvejebragt den i Tabel I anførte sekvens-information, i hvilken enkeltbogstav-20 koder er anvendt og "X" angiver en rest, der ikke blev bestemt entydigt.

Tabel 1 26 DK 172611 B1

Fragment nr. Sekvensanalyse-resultat

T4a A-P-P-R

T4b G-K-L-K

T9 A-L-G-A-g-K

5 T13 V-L-E-R

Tlé A-V-S-G-L-a T13 L-F-a

T 21 <-L-r-R

725 Y-L-i--c-A-< 10 T2€& l -:-2-0-5-=.

"2fo L-v-T-G-z-A-C-a T 2 7 7-2-7-A-G-T-”-.= T2S £-A - I-S-i’-P-O-A-A-M-A-A-F-.-a T30 £-A.a-x-:-:_--3-X-A-c---X-5-w- i5 ν-ξ-χ-:-'-/-ρ T 31 y-y-S-N-F-L-a T33 5-L-T-T-L-L-a

135 V-N-r-Y-A-W-K

T 33 G-Q-A-L-1-V-X-5-5-Q-P-W-

20 Ξ-P-L-Q-L-H-V-D-X

B. Skitsering og konstruktion af oligonucleotid-probe-blandlnqer

De i Tabel I viste aminosyre-sekvenser blev inspiceret i sammenhæng med degenerationen af den geneti-25 ske kode med det formål at fastslå, om processer med blandet probe kunne anvendes til DNA/DNA hybridiserings-processer på cDNA- og/eller genardsk DKA-biblioteker. Denne analyse viste, at der i Fragment nr. T35 eksisterede en række på 7 aminosyrerester (Val-Asn-Phe-Tyr-Ala-Trp-30 Lys), der kunne karakteriseres unikt som indkodet for af én af 128 mulige DNA-sekvenser omspændende 20 basepar. Et første sæt af 128 20-mere oligonucleotider blev derfor syntetiseret ved standard-phosphoamidit-metoder (se f.

27 DK 172611 B1 eks. Beaucage, et al., Tetrahedron Letters, £2. side 1859-1862 (1982)) på en fast bærer ifølge det i nedenstående Tabel II anførte sekvens-sæt.

Tabel II

5 Rest - val Asn rhe T»r Al3 Tra Lys 3’ CAA TTS AAG dTG CGA OCC TT - 5’

T A A A · T

G G

C C

Yderligere analyse viste, at der inden i fragment 1° nr. T38 eksisterede en række på 6 aminosyrerester (Gln-Pro-Trp-Glu-Pro-Leu), på basis af hvilken der kunne fremstilles en pool af 128 blandede 17-mere oligonucleo-tid-prober, som vist i nedenstående Tabel III.

Tabel III

15 Rest ; - Gin Pro Tro Glu k££ 3’ GTT GGA ACC CTT GGA GA - 5'

C T C T. A

G G

C C

Oligonucleotid-prober blev mærket ved 5?-enden 3 2 20 med gamma- P-Atp, 7500-3000 Ci/mmol (ICN) under anvendelse af T4 polynucleotid-kinase (NEN) .

Eksempel 2 A. Abe-behandlingsmetoder og RlA-analyse *

Cynomolgus-hunaber Macaca fascicularias (2,5 kg, 25 1,5-2 år gamle) blev behandlet subeutant med en pH 7,0 opløsning af phenylhydrazin-hydrochlorid ved et dosis-niveau på 12,5 kg/kg på dag 1, 3 og 5. Hæmatocrit'en blev overvåget forud for hver injektion. På dag 7, eller når som helst hænatocrit-niveauet faldt under 25% af det 5° indledende niveau, blev serum og nyrer indhøstet efter 28 DK 172611 B1 indgift af 25 mg/kg-doser af ketamin-hydrochlorid. Indhøstede materialer blev straks frosset i flydende nitrogen og lagret ved -70°C.

B. RIA for EPO

5 Radioimmunoprøveprocesser anvendt til kvantitativ bestemmelse af EPO i prøver gennemførtes på følgende måde:

En erythropoietin-standard eller ukendt prøve blev inkuberet sammen med antiserum i to timer ved 37°C. Efter to timers inkubation blev prøverørene afkølet på is, 125 10 der blev tilsat I-mærket erythropoietin, og rørene blev derefter inkuberet ved 0°C i mindst yderligere 15 timer. Hvert prøverør indeholdt 500 yl inkubationsblanding bestående af 50 yl fortyndede immum-sera, 10,000 125 cpm af I-erythropoietin, 5 yl trasylol og 0-250 yl af 15 enten EPO-standard eller ukendt prøve, hvorhos PBS indeholdende 0,1% BSA udfyldte det resterende volumen. Det anvendte antiserum var den anden test-blodudtagning fra en kanin, der vår inmuniseret med et- 1% rent præparat af humant urinært erythropoietin. Den endelige antiserum-for- 20 tynding ved prøven blev indstillet således, at det an- 125 tistof-bundne I-EPO ikke oversteg 10-20% af de totale input-tællinger. I almindelighed svarede dette til en endelig antiserum-fortynding på fra 1:50.000 til 1:100.000.

125 25 Det antistof-bundne I-erythropoietin blev udfæl det ved tilsætning af 150 yl Staph A. Efter 40 minutters inkubation blev prøverne centrifugeret, og de vundne pellets blev vasket to gange med 0,75 ml 10 mM Tris-HCl pH 8,2 indeholdende 0,15M NaCl, 2mM EDTA og 0,05% Triton 30 X-100. De vaskede pellets blev talt i en gamma-tæller 125 for at bestemme procenten af bundet I-erythropoietin.

Tællinger bundet med præ-immune sera blev subtraheret fra alle slutværdier for at korrigere for ikke-specifik fældning. Erythropoietin-indholdet i de ukendte prøver 35 blev bestemt ved sammenligning med standardkurven.

Denovennævnte metode blev anvendt til abe-serum vundet i Del A ovenfor, samt til det ubehandlede abeserum. Normale serum-niveauer fandtes at indeholde ca.

29 DK 172611 B1 36 mE/ml, mens behandlet abe-serum indeholdt fra 1000 til 1700 mE/ml.

Eksempel 3 5 A. Konstruktion af abe-cPNA-bibliotek.

Messenger KNA blev isoleret fra nyrer fra normale og anæmiske aber ved guanidiniumthiocyanat-metoden ifølge Chirgvin, et al., Biochemistry, 1J3, side 5294 (1979), og poly (A; mRNA blev renset ved to passager 10 med oligo (dT)-cellulose-søjlechromatografi som beskrevet på side 197-198 i Maniatis, et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual" (Cold Springs Harbor Laboratory, Cold Springs Harbor, N.Y., 1982). cDNA-biblioteket blev konstrueret ifølge en modifikation af 15 de generelle processer ifølge Okayama, et al., Mol.· and Cell.Biol., 2, side 161-170 (198¾). De centrale træk ved de for nærværende foretrukne processer var følgende: (1) pUC8 anvendtes som eneste vektor, kløvet med PstI og derefer "tailed" med oligo dT på 60-80 baser i længde, 20 (2) HincII-digerering anvendtes til at fjerne oligo dT- halen fra den ene ende af vektoren, (3) første strengsyntese og oligo dG-"tailing" gennemførtes ifølge den publicerede metode, (4) BamHI-digerering anvendtes til at fjerne oligo dG-halen fra den ene ende af vektoren, og 25 (5) udskiftning af RNA-strengen med DNA foregik i nær værelse af to lænkere (GATCTAAAGACCGTCCCCCCCCC og ACGGTCTTTA) i et tre-fold molært overskud i forhold til den oligo dG-"tailed" vektor.

B. Koloni-hybrldlseringsmetoder til screening af abe-30 cDNA-bibllotek.

Transformerede E.coli blev spredt ud, i en tæthed på 9000 kolonier pr. 10 x 10 cm plade, på næringsplader indeholdende 50 mikrogram/ml Ampicillin. Gene-Screen-filtre (New England Nuclear Catalog nr. NEF-972) 35 blev for-fugtede på en BHI-CAM-plade (Bacto hjerne- hjerte-infusion 37 g/liter, Casamino-syrer 2 g/liter og agar 15 g/liter, indeholdende 500 mikrogram/ml af chloramphenicol) O'; sj-jvendtes til at lofte kolonierne vask fra pladen.

30 DK 172611 B1

Kolonierne blev dyrket i det same medium i 12 timer eller lancere for at forøge plasmidkopiantallet. De forøgede kolonier (koloniside op) blev behandlet ved i rækkefølge at anbringe filtrene over 2 stykker Whatman 3 MM-5 papir mættet med hver af følgende opløsninger: (1) 50mM glucose - 25 n\M Tris-HCl (pH 8,0) -lOmM EDTA (pH 8,0) i fem minutter, (2) 0,5M NaOH i ti minutter, og (3) 1,OM Tris-HCl (pH 7,0) i tre minutter.

10 Filtrene blev derefter lufttørret i en vakuum ovn ved 80°C i to timer.

Filtrene blev derefter underkastet Proteinase K-digerering ved behandling med en opløsning indeholdende 30 mikrogram/ml af proteaseenzymet i Puffer K [0,1M 15 Tris-HCl (pH 8,0) - 0,15M NaCl - lOmM EDTA (pH 8,2) - 0,2% SDS]. Der blev tilsat 5 ml af opløsningen til hvert filter, og digerering blev fortsat ved 55°C i 30 minutter, hvorefter opløsningen blev fjernet.

Filtrene blev derefter behandlet med 4 ml af en 20 pradiydridiseringspuffer (5 x SSPE - 0,5% SDS - 100 mikrogram/ml af SS E.coli DNA - 5 x BFP). Præhybridi-seringsbehandlingen gennemførtes ved 55°C, i almindelighed i 4 timer eller længere, hvorefter præhybridi-seringspufferen blev fjernet.

25 Hybridiseringsprocessen gennemførtes på følgende måde. Til hvert filter blev der sat 3 ml hybridiserings-puffer ( 5 x SSPE - 0,5% SDS - 100 mikrogram/ml af gær-tRNA) indeholdende 0,025 picomol af hver af de 128 probe-sekvenser fra Tabel II (idet den totale blanding 30 blev betegner EPV-blandingen), og filtrene holdtes ved 48°C i 20 timer. Denne temperatur var 2°C lavere end den laveste af de beregnede dissociationstemperaturer (Td) bestemt for nogen af proberne.

Efter hybridisering blev filtrene vasket tre 35 gange I ti minutter på en ryster med 6 x SSC - 0,1% SDS ved stuetemperatur og vasket to til tre gange med 6 x SSC - 1% SDS ved hybridiseringstemperaturen (4$°C) .

31 DK 172611 B1

Autoradiografi af filtrene viste syv positive kloner blandt 200.000 screenede kolonier.

Indledende sekvens-analyse af én af de formodede abe-cDNA-kloner (betegnet klon 83) blev til verifi-5 ceringsformål gennemført ved en modifikation af metoden ifølge Wallace, et al., Gene, 1£, side 21-26 (1981).

Kort angivet blev plasmid DNA fra abe-cDNA-klon 83 lineariseret ved digerering med EcoRI og denatureret ved opvarmning i kogende vandbad. Nucleotid-sekvensen 10 blev bestemt ved dldeoxy-metoden ifølge Sanger, et al., P.N.A.S. (U.S.A.), 74, side 5463-5467 (1977). Et subsæt af EPV-blandingen af prober bestående af 16 sekvenser anvendt som en primer til sekvensbestemmelse-reaktionerne.

C. Abe-EPO-cDNA-sekvensbestemmelse.

15 Nucleotid-sekvensanalyse af klon 83 foregik ved processer ifølge Messing, Methods in Enzymology, 101, side 20-78 (1983). I tabel IV er angivet en præliminær restriktionskort-analyse af det omtrent 1600 basepar lange klonede BcoRI/Hindlll fragment af klon 83. Om-20 trentlige beliggenheder af restriktionsendonuclease- enzym-genkendelsessteder er tilvejebragt i form af antal af baser 3' til EcoRI-stedet ved 5'-enden af fragmentet. Nucleotid-sekvensbestemmelse gennemførtes ved sekvens-bestemmelse af individuelle restriktionsfragmenter med 25 den hensigt af matche overlappende fragmenter, eksempelvis en overlapning af sekvens-information tilvejebragt ved analyse af nucleotider i et restriktionsfragment betegnet C113 (Sau3Aved 111/SmaI ved ^ 324) og sekvensbestemmelse i den modsatte orden af et frag-30 ment betegnet C73 (Alul ved ~424/BstEII ved^ 203).

32 DK 172611 B1

Tabel IV

Restriktionsenzym- Omtrentlig(e) be- genkendelsessted liggenhed(er)-

EcoRI 1

Sau3A m

Sma I -SO

3stE11 203'

Snva I 524

Kpnl 371

Rsal 372

Alul *24 f 3 V i *· —

Alui -3G

~1CS I -C i

Alui 5-= s S c I - G -

PvuII £04

Alui *05 A1 'JI 7c2

Alui 788

Rsal 792 ? S11 807

Alui 3*1

Alui 927

NcoI 94 6

Sau3A 101A

Alui 1072

Alui 1115

Alui 1223

PstI 1301

Rsal 13*3

Alui 1384

Hindu I 1**9

Alui 1A 50

Hindi11 1535 33 DK 172611 B1

Sekvensbestemmelse af omtrent 1342 basepar (Inden for regionen omspændende Sau3A-stedet 3' til EcoRI-stedet og Hlndlll-stedet) og analyse af alle mulige læserammer har muliggjort udvikling af DNA- og minosyresekvens-5 information som vist i Tabel V. I tabellen er den formentlige indledende aminosyrerest af aminoterminalen af modent EPO (som verificeret ved korrelation til den ovenfor omtalte sekvensanalyse af tyve terminale aminorester) betegnet ved tallet +1. Tilstedeværelsen af 10 en methionin-specificerende ATG-codon (betegner -27) "opstrøms" for den indledende amino-terminale alaninrest som den første rest udpeget for aminosyresekvensen af det modne protein, er tegn på, at EPO sandsynligvis oprindeligt er eksprimeret i cytoplasmaet i en precursor-15 form inkluderende en 27 aminosyre lang fører-region, der fjernes, før modent EPO indgår i kredsløb. Potentielle glycosylerings-steder inden for polypetidet er angivet ved stjerner. Molekylvægten af den translaterede region blev vurderet til 21.117 dalton, og molekylvægten af de 20 165 rester af det polypeptid, der udgør modent abe- EPO, blev bestemt til 18.236 dalton.

34 DK 172611 B1 o « 3 o -o o O c π i l. o <u — a !- «-o y cj o. cj ju 3ε «t cl o CJ >— 0.0

I_ cj t- CJ 3 O -'O L. O -* CJ

rjCJ )— v— il 5— (3 5— £ (J O h—

UU -J O > O t- =f > O

CJ ►- O O CJ

L3 CJ CN —4 O V«{J O Cl eC r-* CJ O *h O

rj CJ I < O —1 CJ —<UCJ 3 i— ^ — CJ

ir 5 CJ CJ cf CJ > CJ i-<= r J h— O r— O CJ u u JO L, CJ c t— a cj S CJ CL O O 5- ω CJ * ΙΛ ez —I >- y y _j cj m tf tf tf - tf ej cj -O *— _ t- o >·O O l·- 0.0 3 CJ Ctrl n CJ >— u (J m tf —“tf * ^ tf y y CL CJ C CJ O CJ tf et ί$ CJ CJ c cC _ jz y y —i < jo (Λ *— coo j cj 0 CJ < CJ CJ O r- J-O * O -«<=

υ o o —i o o *— tf CJ CJ CJ

1 ^ — «Λ O

O rj CJ —i tf o L C3 U O 3 CJ - 1—

ri CJCJ — CJ —I O CJ — — tf cneC

w __ ~ |V)H -c: o CJ tf tf > “ O - O ¥ —* CJ 3 O O « O 3 0 . -9 _ O > O 3 - a- jsiO-tf »- 3 O CJ >'j -U -·« -J-

O u-i — O >* O

SS 53 5^ £3 |jj SS

•S 3 tf Na- = < =2 -»-J

« ad 3 * - ^ a cj -

W 5 5 5 3 CJ o« 30 ^ O

c 5 o u — - o o— ao ro cj tf o _jo cl o -Jt— cn <

Li O O O _ _ -

fH i—O O 3 CJ —><3 0 Jo -r=C

r \ ri ri flJ^--r-HO -} h— —> tf yy y _jo <o jo o o y y 5 j t- -i >-o t- o o ii o

(J1_ CJ Oh· I—(O >. tf K"! O O

CJ >_ o JU OCJ h- I— c/>h- y y y oo o o oo

CJ tf O C* O L| O Li O >> O

ej CJ CJ O h-h- Ql O tf tf O'-

tf JO —I O 30 >iCJ

O tf O O OL- 0 5— —I tf —i CJ

£ O O O -CO >o OO OO

35 DK 172611 B1 >,0 3 «3 oh- av- nu uo uo _ b —i < u o . ω t— ήο —· ►- *- o O O O 3.0 -JO «3 0 ^ *t 3- ·“ -U «- « CO >O 3< £ O C £ >0 O U O U OCJ h-< «C€l

τ<*ι u< μ o &-* V-~ C O O ^ ^ O

.? g jf au a au ^ =£ * n o ® u jj q j ζ__> ςΠ >— '·0 <1 OO ^ ^ U (/>l·—

•n O 30 HH- uo BU jp <£ ^>U

x«£ _JO 00 V— Ή < <3 0 -JO V— >—

CIO C3 O CO BO >-« 0*3 ^ U

(_ o —“O ♦ ΙΛ <3 * 1 O —«O 0*0 B J— «:< <0 3 g: <0 00 0.0 > o IO 3 0 DO <Λ< DO B V— i« 5- -o «·- -ju i«

4J _j c; _’ O <0 —J < —‘ O sCJ --O

V) — O >»0 3 0 =·£ BO jE ^ M -O —>0 U— JJ«C O O — o --- 00 -η- < — =:-3 — w —

^ 3D O CO O — O H 'J OOO '— o = = O

> <0 00 >0 -s. 3 — < — ^ ~ — ‘-J

hH __ i o BO to O 3 — BO ? S

o >. se - o — o — < - — Z ri jq -- -- <c o — o — u =3 _· _j«c fd

H y O - O =U 3 O C O 3 O £ O

- d B— — = a — a— — o >- '- Ξ - >0 O O -r O O O «= U - - ~o 3 < >. O a o - — — *— a o ·, ri ,_er — o —1 c _c o to < — <x< bo OO OO H- «3 <30 0L>- —1_ c: 00 30 t- o o«: tH>- D _ d >— u o UH- -CO ‘H O — o >0 >0 «30 —10 »— < 0.0 t— «ί to «C O B H- 30 000 a o 0 3 0 0.0 >><c ohu o ·— o\ t u -1 *- ^ ^ Γτ Hl 5; _I<S «30 JO Q. O *-* <. —'-JO «30 UO CO —i O 30 '-> O Η O B H- £0 -> <3 B t- Ή «3 UO UO o 00 5- O OO 'J0«3 ΙΛΗ «30 o. o co «i— a o 00 uo h h- in c —(<3 —< O -C t- o —< ^ p o «30 OU <0 3. H- «30 HH«3 >-« 36 DK 172611 B1 5 cd υο>— cd>— >—ldo ner rf < eX CD CJ !— h- t— et :i S' o « « =c<ooy<ua CT « u>-

O CJ

ns f n rf (J ^ U i ^ 'Τ J

So o ct oo«>-cDOH- h-

crcC >— cj «X CJ < ·— h- =£ CJ J

r_) ^ cjCD<x=rcJcD=tcj •3 Bin u CJ CJ CD O cr O C t- o 3 £o o - οοοο«χοο< -ifjS ί-CJ 0<05J«XI-C3s£

u CJ o CDO<£OCJCjCDO

o CJ CJ CD CDh-CJ<CDe£eX«X

.—i CJ «£ O cct— CDCDCDOCDCD

rf u CJ CD CJCJ*—CD>— cXOh-

Cj CC h· <X ^ H- CD CD CD

DU <r cd υα<>-αΗΚ ίΐ «

. —^ CJCJ >— CJCJh— cXh-CDCD

CD CD Oi- =CCJ<CJ>-CJUU »- ~ ^ cC CJCDOC3'-O=rc3t-- >,CD < CJ c: o c£ o o u o H- CJ- -~· .— o CJCJ CD o o =c < cj o c; _. ·_ 4J CD CD «X CJ ^C<CJ=CCJ·— o-; — Π3 CJCJ 5COCJ<CDCD-a<= in l-'d cdct i o cd O «C < O o

*> - rC o C CJ CJ c: CD CJ CD - — CJ

>H Z i CD CD '_D — CJ CJ c: CD CJ — O _CJ s: CD CD CJ — <C CD CJ c.

^ u / > CJ CJ CJ — < c: CJ CJ < < CD

>- eC CD CJ CJ < CJ *- < Jj CJ — . >-w cT — U 'J " s C J C w P* CJCJ — CDCJCD — *- CD — ^ s S Ξ 5 5 S s z § '6 § d d ra 5 5 Ξ 'r Ξ s § 3 Ξ i il

- ^ -3 CJ C p CJ < u CJ 5 c: H

CD CJ CJ C O CJ J — sC — —' 2 CD X CJ C CD < CD CD CJ =C CJ —

□ Z cd — CJ — <£ < c: '-D CJ

I cj CJCJ CDCJCDCJCJCJCDCD^

-1 U O s-h-Co-CDOOCJ

m CD cX CJ C U CD S 'i o < < u >.< 2_CDC CJ<<CJCJOCJJw

3 - CJ CJ < CD CJ u u o o CD

<χ o Λ D< ϋ *- cX CJ U CJ CJ 5¾¾

|Λ Η ϋ ^ ϋ u 13 O»— CJ CJV- J O O

m C3U —« cX c£ O V— C3 Η- H- CJ CJ w CD C3

v- CJ^'SCJdCJvJCDCD

CDtD C. CJ CD u S H S

t- U Λ «5 !- C3«CCDCJCJO=£'-CD

<£CJ <X CD CJ eXCJ«1— <<iCD>; O CJ CJ «£ CJ >— <ϊ CJ <

2 CJ >*o CD CJ >- CD O - O CD O CD

Uh —i CD h- CDCDO<h-V- h-h-CD

_ICJ CD CD CJ cjh-«CDi— Oh-Oti 37 DK 172611 B1 i i

Polypeptid-sekvensen i Tabel V kan let underkastet analyse for tilstedeværelse af meget hydrofile regioner og/eller sekundære udformningsmæssige karakteristika/ der er tegn på potentielt meget immunogene 5 regioner, ved f.eks. metoderne ifølge Hopp, et al., P.N.A.S. (U.S.A.), 78, side 3824-3828 (1981), og Kyte, et al., J.Mol.Biol., 157, side 105-132 (1982), og/eller Chou, et al., Biochem., 13, side 222-245 (1974) og Advances in Enzymology, £7, side 45-47 (1978). Computer-10 hjulpet analyse ifølge Hopp, et al.-metoden er tilgængelig ved hjælp af et program betegnet PEP Reference Section 6.7 stillet til rådighed af Intelligenetics,

Inc., 124 University Avenue, Palo Alto, Californien.

15 Eksempel A

A. Humant genomisk bibliotek.

Der blev opnået et genomisk bibliotek for Ch4A phag-båren human føetal lever ved processerne ifølge Lawn, et al., Cell. 18, side 533-543 (1979), og dette 20 blev bevaret til brug ved en plaque-hybridiserings-prøve.

B. Plaque-hybridiserlnqsprocesser til screening af humant genomisk bibliotek.

Phag-partikler blev underkastet lysis, og DNA'-25 erne blev fikseret p& filtre (50.000 plaque'er pr. filter) ved processerne ifølge Woo, Methods in Enzymology, 68, side 389-395 (1979), med undtagelse af anvendelsen af GeneScreen Plus-filtre (New England Nuclear Catalog nr. NEF-976) og NZYAM-plader (NaCl, 30 5 g* MgCl2~6H20, 2 g; NA-Amin, A, 10 g; gærekstrakt, 5 g; casaminosyrer, 2 g? maltose, 2 g; og agar, 15 g pr. liter).

De lufttørrede filtre blev opvarmet ved 80°C i 1 time og derefter digereret med Proteinase K som be-35 skrevet i Eksempel 3, Del B. Præ-hybridisering foregik med en puffer 1M NaCl - 1% SDS ved 55°C i 4 timer eller mere, hvorefter pufferen blev fjernet. Hybridi-sering og post-hybridiserings-vaske foregik som be- 38 DK 172611 B1 skrevet i Eksempel 3, Del B. Både blandingen af 128 20-mere prober betegnet EPV og blandingen af 128 17-mere prober fra Tabel III (betegnet EPQ-blanding) anvendtes. Hybridisering foregik ved 48°C under anvendelse af EPV-5 probeblandingen. EPQ-probeblandings-hybridisering foregik ved 46°C — 4 grader under den laveste beregnede Td for komponenter i blandingen. Fjernelse af den hy-bridiserede probe til genhybridisering foregik ved kogning med 1 x SSC - 0,1% SDS i to minutter. Auto-10 radiografi af filtrene viste tre positive kloner (reaktive med begge probe-blandinger) blandt 1.500.000 screenede phag-plaque'er. Verificering af de positive kloner som værende EPO-indkodende foregik ved DNA-se-kvensbestemmelse og elektronmikrografisk visualisering 15 af heteroduplex-dannelse med abe-cDNA'et fra Eksempel 3. Denne metode poviste også multiple introner i sekvensen af det genomiske DNA.

Eksempel 5 20 Nucleotid-sekvensanalyse af én af de positive kloner (betegner AhEl) blev foretaget og de til dato opnåede resultater er vist i Tabel VI.

39 DK 172611 B1 eoooooo* ° H S o o = o d u <r«u o d - = o 5 o o o 7'^ g g doougoog'-oo «-»Hgddoo-'-Oo >-ΗΗΗοο = ο>οο gasgsySo ».<» g

S-j5oo“oS SS S

2 O o 1- o o U U !- ΓΤ Γί U M O o — f-

Sf ^ O g £5 O c-' — CM -J — - 0 5 o d u O o U I X < < _ /"cjcjcjcj — ri = 5 g o < o o g u b i S 5 £ r, d o '3 < :- 1 S s § - 5 u « å h r;^S5oo<co '— o - = = = -000 d - « Η Η d H 5 d S d - tj=OOOJf£ — — LJ ^ <5 1 —•οοο'ί^**-5;^ H d ajdooooooo og j3£_tjc_>o = o = — — o Π>ν_ΟΟΟΟθΟΟ <so ooooooo o o f5 i— >— o o = o o ΓΤΗ = ooo = ouo dd G5SS-^S§S dd dd^dddd - o o

HbSddddS § d gd-dddog dd «ooooooo o 'r.

r Λ t 3 /5 Π O < Η· H U

O000>—000 O o

Hooooo-o dd

l-OUOOOOO OJ

dd<oooao o o ddoOÆOOO Hif 0 = 0 = -^^-5¾ y J- — ooooou = Sd ooooo << o i£ ~ j_ oooo — o o o o £do-o = uo Hg

0 = 00000 — O O

c£ O = O — e£0 — O — 5 = = = oouo o o 40 DK 172611 B1 o < o *- o o vik- o o ^ o o 5 r—. c o « *- >>o ^ o o · o t- -jo o»- - < ^ ^ £t g P 8 < - o iu o c - o c 00- o o oo -- H ^ 0<I—i o *- ΙΛ — —< ^ < o < O - o < O = o 3 0 30 o o O 1) H~ o >— *—(< CJ < <ouo o OO JO OO - <

O O O O CJ 3 O o O Λ O < C

o o t- c o o - t- o — o c o O O O O O o o CO <o o - o o c o o _ - ,, g j— cj <j cj o<^ -2 *2 ^ «X CJ ^ - r% f η i · f \ c_l o U '-3 H- — CJ 3- U vJwr ij wj ^5 <r *— cj o r: K g 5 2 = 25 sig S b o c o c o -- ---3 r: - ϊ 3 t r; ” ~o — π fj s c; o o O O- - c J - - - O - O fj « 5, 5 ~ Ξ < i’o’T — O — c o c _ d 8 < o o I- - O o o o o - JJ Γί r ' tf < < -1 <0^ 0 0 0 0 =30 = o r ^ - = W u_ _ _ — 0^ — 0 O — - — - % t3 0-00 -ICO -JO -· - o c

Vh ^ * Λ ^ ^ W

O / « l. * \ tf C_j c CJ » CJ ^ w ** £ £ d o O -o * »*- <2 i£ - oo-o 1- a. o > O -JO C - μι CJ C CJ ^ CJ , . i ^ m JT1 r i c *5 μ- rj )— -1 l— O < *-» (J ^ ^ o o I— o o >-0 — O >>C O c M < o o o o o— a-O I-1- O o _Q o o O o 5 ΓΛ 3 C 30 =0 — — g I t S g S ‘TS* 55 S3 5 § if S - S ^ -o -g § « o o o C £ oo8G3 < -

O O 5 C O - 30 30 O O

s g a s a t 35 3D at o O C C — O ot- — O — o 1- o (JO o — i-o O g o t- o c o o a.o >o o o 8 g c a o c 3oc=c a a < 5 o a 5 o -JO CO o o

5 t 3 a 5 oo-o -o o C

8 a i: a a o 7££ s s P 8 o a O a O O c. O vo - O c 75at t c «Η- ^ C cvru o < o o t- o O -JO CO t-C o 41 DK 172611 B1

g=gt:S S g g g g S

o o n^- o u *— *5» £5 5 5 0 K> ^ CJ -C >- CJ O < 2 ΓΪ if

g *=a £ £ d ί= £ S

CJ _ Sfi^trocj “ “ o «< ggo<oo uu-<«£ g g d tf d o S ^o o- - o I i g 5 B § I t: g §

E ^ d o o £ 5 S

y "o E d 2 S § S

_ j— ’j rj tf tf tf CJ O

f= _ ^ u tf o tf O i-

s c d tf tf CJ CJ CJ

1 n^siuo g d <ϋ - . S S s § 5 S c: o< - 2i£ddo 7? d < ίο ίΐ % <z « u <

5 >- CJ '-J CJ CJ CJ

Vnrt d -3— _ CJ O CJ tf ►- ° 03 03 > CJ *- '-J d g g d <r >- >- '-3 -> -j ri f-.

“ 5 -j = - - - '-J g - d h >1 s '=* s S I S i a s H g =S - g H 5 Ξ 3 2 Ξ H =: I S g - S s I 3 cc _" ‘é Ξ g g ^ - - tf g 3 S g Ό O Z *— —> CJ — < ΓΖ , .

^ π ·.> < Z3 — < r-> — J ;-2 « ^<<xc:3oy3| y S 32 ?8 = S § I £

;; Γΐ "j— se >— si ej «c CJ

5 ^ -1 i- 3 CJ o tf

5 »~ ucj >-tf CJ CJ CJ J- J

s S 5 S 5 S g 3 8 SL8 d3 S S - g o d g «- -- g d 5 S g CJ tf W U O C3 U CJ O < CJ ►- CJ o -i tf ^HO CJ CJ CJ I- j- d O ~ CJ tf O 1- CJ CJ o >- 42 DK 172611 B1 rj 3 >— 3 o 31— «S »— nt-

u o —i o «i- u«- O u Γί O

y if CX S -JO JU O O «S O

f « 1_ L3 O H

if £ « 3« oou 30 o o ro ίο o y- -I <s <M-u OJW. «s u r: o 2 ί_ tj o o cl o -ίο «s 55 < o

, \ (Λ μ» (J CJ

il o O I- O 30 ^ < o ^ « o V- O o O -I es j=o er o 3 0 et 1- O <Λ·γ- OO h «£ ^ ir o 0 0 3 0 a o - o 1- O «o 1_ et et Γ" U H l*o Γ o o >— "T ri

< o O -JO HH- >- <S £ O «O

if u if 30 OO 30 i- o rtO

I— O O tlH (-tO 3 H- O o o

et μ- et _J O CL O JO O O <J

w V— CD O *“ . μ« ^ Q M C O C# CJ O CD CL >— et o O —I O —1 =£ 30 t- >- Wf5 5 (_ u et o OO ΙΛ et H O <0

μ— O CJ O

r_ ir ir 3 o u o oo o h o« t— u 3 >- 30 <-1 O *- I- t-o

□ u S JO </lt- CO O O CL O

ίΐ cr rj >>o >-i >— 3 — >— O O >—

4J«3- i— μ- —< O 30 31— O >- J-O

(0 5 et u O O (ΛΗ -JO < >- Q- O

Mej "3 ^ CO CO >»0 «S U O t. U

O if if o * S« -hO O >-<^3 0 M-let i— i— OO <t <S OO o h —· cn — ~ 5 S O ao -< o o - o 30

Hif _ ' - --o 3 — 0 3 0 «S O —· — >,, _ -- >0 -ΙΛί O O — c o — «= O o H · a '" —i O 30 —< O < ~ 30

3 ^ 3 — 3 — 3 — — O — O

>0 -JH >o O SCO

3 73 Γ: _ et O

E"1 iT < O 3 et 0 3 0 SO O C 3et st c o -SCS53- -o r ?5 “ΓΪ

St O O o O —' O et O O O --

et — O —> =C 3 0 Λ < Ά C O « « O

5 -t c 3- —o >-«s--=s o - ^5 3 2 3 > O CO _J Ct — O O <-_ie= 1 ~ o oso co ar- 3 0 o

et ς Oho —i < «1 eC ^ O «C

< o o «so OO «so «so o ^ v— o o o

Ct -r- < CO >-0 —O >>< < «s

er et O —< et -h O 3— —< O «S O

§ O o oo o o > o oo ►- o et i— o O o

Γη ►_ O CO oo VI H 3 0 O H

< et O — «S U O “H « 31- H —

< O «s oo «SO “O -JO H O

< h— CD —> cr r- }- >*CD 3CJ 3 'J rø )— »-* *-

/j ff η CD 1) η V »— ^ CJ CD CJ

< 5 O CD CD -J U JU cCU O ^ ff H> w "*

et CJ O vO —I O —I O CO O OO <S H

et <S O u"\ 3 t— 3 i— —(st—'L'O «C H

5 u O >0 >0 OOH«SO o o 43 DK 172611 B1 t— ·_> >-u = aaaaaa< a u - awgfiboa 00 5Z_«;i-a<C>-

Η i 5 § ϊ s s 5 i S

:u =8 s g s I s 5 S s > a «= < H g S 3 « § 5 “ ®« SLg “u"a-a3< « «2 gsJSS^Ssg

Sif SJ2y 5g«3gl“« =-- -«^ :- d -> < « '-> *- a s= ijj ggils^B^ = ·' < ’fi rii ri h ~ ~ C 5 — aa = g I 1 Ξ = I r

Jj J; 5 5 a — a * S Z — « <=a =5 = = ij - - >- u 2 - - S z ” b a I =; :: llllllll

> Is ri 8 S Ϊ Ϊ S I S I

r-i _. _,. rif- ZcS-i <u j! z - - - Z « a - a - -Q < Ξ Z a 5 a a a a « — * a a a a a - — a p-ι ___ n a a a a |~ a —

=¾ rs ξ ί E B i 5 S S

ϋ“-5 Ξ-aa-tfoo -« U'J 5 ¾ « a a a 5 a w c o cur c'-ao c^au <a 0 5 ·- a a a ^ a ?g Sif a.g 3 5 - B ξ g g δ « « a ο β - a a a a g {3 .3 < a 3 a 0 a ό =><= a « < a Z H x < ^ -j — - _ vc 1- a a a a < — a ~ 5 __-a 1- -<« if S 3 5 = 5 f. a a <s c*- =.a ar-aaa>-a< -a * « ai <c a a a j “ a J a o. a <c <c c a O'i^^ai-cc 44 DK 172611 B1 I Tabel VI angiver den indledende kontinuerte DNA-sekvens en topstreng af 620 baser, i hvad der øjensynligt er en ikke-translateret sekvens umiddelbart forud for en translateret del af det humane EPO-gen.

5 Nærmere angivet viser sekvensen sig at omfatte 5'-enden af det gen, der fører op til en translateret DNA-region, som koder for de første fire aminosyrer (-27 til -24) af en førersekvens ("præsekvens"). Fire basepar 1 sekvensen forud for den, der indkoder begyndelsen af 10 føreren, er endnu ikke entydigt bestemt og er derfor betegnet ved et "X". Derefter følger en intron på ca.

639 basepar (hvoraf 439 basepar er sekvensbestemt, og de resterende 200 basepar er betegnet "I.S.") og umiddelbart forud for en codon for glutamin, der er 15 betegnet som rest -23 af det translaterede polypeptid. Exon-sekvensen, der følger umiddelbart efter, ses at kode for aminosyrerester gennom en alaninrest (betegnet som +l-resten af aminosyresekvensen af moden humant EPO) til den threonin-specificerende codon ved 20 position +26, hvorefter der følger en anden intron bestående af 256 baser, som specifikt angivet. Efter denne intron er en exon-sekvens for aminosyrerester 27 til 55 og derefter begynder en tredie intron omfattende 612 basepar. Den efterfølgende exon koder for rester 25 56 til 115 af humant EPO, og derefter begynder en fjerde intron på 134 baser, som specificeret. Efter den fjerde intron er en exon, der koder for rester nr. 116 til 166, og en "stop"-codon (TGA). Endelig identificerer Tabel VI en sekvens på 568 basepar, i 30 hvad der øjensynligt er en ikke-translateret 3'-region af det humane EPO-gen, og hvoraf to basepar ("X") endnu ikke er entydigt sekvensbestemt.

Tabel VI tjener således til at identificere den primære strukturelle udformning (aminosyresekvens) 35 af modent humant EPO som omfattende 166 specificerede aminosyrerester (vurderet mol.vægt = 18.399). Ligeledes vist i tabellen er den DNA-sekvens, der koder for- en førersekvens på 27 rester sammen med 5'- og 3'- 45 DK 172611 B1 DNA-sekvenser, der kan være signifikante for promotor/-operator-funktioner af det humane gen-operon. Steder for potentiel glycosylering af det modne humane EPO-polypeptid er i tabellen betegnet ved stjerner. Det 5 er værd at notere/ at den specifikke aminosyresekvens i Tabel VI sandsynligvis udgør sekvensen af en naturligt forekommende allelisk form af humant erythropoietin.

Basis for denne opfattelse findes i de resultater, der stammer fra fortsatte anstrengelser på at sekvensbe-10 stemme urinære isolater af humant erythropoietin, hvilke resultater har vist, at et signifikant antal erythropoietin-molekyler deri har en methionin ved rest 236 beliggende over for en serin, som vist i tabellen.

Nedenstående Tabel VII illustrerer graden af 15 polypeptidsekvenshomologi mellem humant EPO og abe-EPO.

I den øvre kontinuerte linie i tabellen er enkeltbogstaver anvendt til at repræsentere de deducerede translaterede polypeptid-sekvenser af humant EPO begyndende ved rest -27, og den nedre kontinuerte linie 20 viser den deducerede polypeptid-sekvens af abe-EPO begyndende ved den som nummer -27 betegnede rest.

Stjerner er anvendt til at fremhæve sekvens-homologier.

Det skal bemærkes, at de deducerede sekvenser for humant EPO og abe-EPO afslører en "yderligere" lysin-25 rest (K) ved (human) position 116. Kryds-reference til Tabel VI viser, at denne rest ligger ved marginen af et formentligt nRNA-splejsningsforbindelsessted i den genomiske sekvens. Tilstedeværelse af lysinresten i den humane polypeptid-sekvens blev yderligere verifi-30 ceret ved sekvensbestemmelse af en human cDNA-sekvens-klon fremstillet ud fra mRNA Isoleret fra COS-1 celler transformeret med det humane genomiske dna I Eksempel 7 nedenfor.

46 DK 172611 B1

2 * 2 UJ * IU

r- * >- 2 I

o + o ar * ar 2 + 2 < * < > ♦ > 0*0

C r * u _l * _J

2 i—i ♦ >—i «C ♦ «X

z ♦ z 02*2 UJ * 'JLl ·—< —i ♦ —» z ♦ Z -H _J * _1 _J * _) >- * >- lo * lo η- * ίο * o _j *-> X yo cn + to il/ * lu 2*2

c < o _J * -J

rn o + O 0*0

0*0 o l/> * LO

)- 2 O > ·—'

V— * l·- -H < *· C

-i > 2*2

z * Z O ♦ G

_U * ui >2 2 * < X + Z ~ + ~

_U * LU _' * —' G * Q

- v + ^ O' + O 0*0 I Csi 2 * 2 _J + —1 1—2 C) LU ♦ lu O 2 * 2 2*2 n Ξ * _J <>>_)+ tU 0*0

TO 3: 2 C < * C

>. * >- 2*2 -C LU * LU

& 2*2 O * C7 -0*0 Π i * LU LO * LO — ♦ ~ _ LO ♦ LO >*?- c >*> 2*2 -· * - TO =2*2 > c; 2*2 g — .0 * O -J * — — * — 3 G*G =_!> 2*2 HÆ 0*0 C«; * < 0*0 H C?*» 02*2 > u-ι μ * _j o*o jo _ * _· TOO) 2*2 2*2 — 2 + 2 '

r—( Ό ' * -i _J*_I Z * Z

®<J-H ”*> > + > O * LO

.QG-U — 2+sC 2*2 >-·*>- -0+0 LU + LU >*> IH £ ϊ χ n+LO 2+2 £ >*> O _l ♦ _! 2+2

3j>r 2*2 -J+.J

en “'*_J 2+< 02+2

Sa 0+0 -J + -I -C20 S r _j+_i o*o -+2+2 1 Λ 2*2 ar * ar *- * »- ig _3 * _j c * o LO H C I/O ♦ l/l >+> *5+2 [ _r ♦ J >+> +++-1 00 + LO 2 * «X I— *·— i * _J O 0*0 2*2 i*i o a + a o _j * _i _J*_J 0*0 IO 1 * 1.

ϊ * Ϊ >*> —i < + 2

• * i IU+LU 2*<X

5*3: Z + Z 00 + to C < * < 2+2 5*5 C* 2 + 2 2+2 5*5

10+0 5*3t C+O

UJ* !U O «X * 2 2+2 Z * X ιΛ>-+>- 2 —) >*> 2+2 O 00 * 00 0+0 Z*Z {Si·—*«-*

Z*Z >*> - < * G

u >> >>

C Cl) CO

TO TO 2 TO 2

S ® se s C

3 0 3 0 3 0

X 3 X Z X Z

DK 172611 B1

Al

Eksempel 6

Det ekspressionssystem, der blev valgt til indledende forsøg på mikrobiel syntese af isolerbare mængder af EPO-polypeptidmateriale kodet for ved hjælp af abe-5 cDNA tilvejebragt ved processerne i Eksempel 3, var et system involverende pattedyr-værtceller (dvs. COS-1 celler, A.T.C.C nr. CRL-1650). Cellerne blev transfi-ceret med en "shuttle"-vektor, der var i stand til autonom replikation i E.coli-vært {som følge af tilstede-10 værelse af pBR322-afledt DNA) og pattedyr-værterne (som følge af tilstedeværelse af SV40 virus-afledt DNA).

Nærmere angivet blev der konstrueret en ekspressionsvektor ved følgende processer. Plasmid-klonen 83 tilvejebragt i Eksempel 3 blev forøget i E.coli, og 15 det abe-EPO-indkodende DNA på omtrent 1,4 kb blev isoleret ved EcoRI- og Hindlll-digerering. Separat blev der isoleret et ca. 4.0 kb HindIII/SalI-fragment fra pBR322. Et omtrent 30 bp EcoRI/SalI-"lænker*'-fragment vandtes ud fra Ml3mpl0 RF DNA ( P and L Laboratories). Denne 20 lænker inkluderede, i rækkefølge, en kohæsiv EcoRi-ende efterfulgt af SstI-, Smal-, BamHI- og Xbal-genkendelsessteder og en kohæsiv Sall-ende. De ovennævnte tre fragmenter blev ligeret til tilvejebringelse af et omtrent 5,4 kb intermediært plasmid 25 ("pERS"), hvori EPO-DNA'et var flankeret på den ene side af en "bank" af nyttige restriktionsendonuclease-genkendelsessteder. pERS blev derefter digereret med Hindlll og Sall til opnåelse af EPO-DNA'et og EcoRI-til-Sall-lænkeren (Ml3mpl0-lænker). Fragmentet på 1,4 kb 30 blev ligeret med et ca. 4,0 kb BamHI/Sall fra pBR322 og en anden Ml3mpl0 Hindlll/BamHI RF-fragmentlænker ligeledes på ca. 30 bp. M13-lænkerfragmentet var karakteriseret ved en kohæsiv Hindlll-ende efterfulgt af PstI-, Sall-, Xbal-genkendelsessteder og en kohæsiv 35 BamHI-ende. Ligeringsproduktet var også her et nyttigt intermediært plasmid ("pBR-EPO") inkluderende EPO-DNA'et flankeret på begge sider af banke af restriktionssteder.

Den til ekspression af EPO-DNA'et i COS-1 celler’ 48 DK 172611 B1 ("pDSVLl") valgte vektor var forud konstrueret med henblik på at tillade udvælgelse og autonom replikation i E.coli. Disse karakteristika tilvejebringes ved tilkomsten af replikations- og ampicillinresistens-gen-5 DNA-sekvenser til stede i den region, der omspænder nucleotider 2448 til 4362 af pBR322. Denne sekvens blev strukturelt modificeret ved addition af en lænker, der tilvejebringer en HindiIl-genkendelse umiddelbart nabostillet til nucleotid 2448, forud for inkorporering 10 i vektoren. Blandt den udvalgte vektors andre nyttige egenskaber var evnen til autonomt at replikere i COS-1 celler og tilstedeværelsen af en viral promotor-sekvens, der kan fungere i pattedyrceller. Disse karakteristika tilvejebringes ved tilkomsten af replikations-DNA-15 sekvens og "sent gen" viral promotor-DNA-sekvens til stede i 342 bp sekvensen, der omspænder nucleotid-numrene 5171 til 270 af SV40-genomet. Et unikt restriktionssted (BamHI) blev tilvejebragt i vektoren og umiddelbart nabostillet til den virale promotor-20 sekvens, ved anvendelse af en kommercielt tilgængelig lænker-sekvens (Collaborative Research). Endvidere blev der i vektoren inkorporeret en. 237 basepar-sekvens (afledt som nucleotid-numre 2553 til 2770 fra SV40) indeholdende det "sent gen" virale mPNA polyadenylerings-25 signal (almindeligt omtalt som transkriptions-terminator).

Dette fragment blev anbragt i vektoren med den rette orientering vis-a-vis den "sent gen" virale promotor via det unike BamHI-sted. Ligeledes tilstede I vektoren var et andet pattedyr-gen ved en position, der ikke var 30 væsentlig for potentiel transkription af et gen indført ved det unike BamHI-sted, mellem de virale promotor- og terminator-sekvenser. [Pattedyr-genet omfattende et omtrent 2.500 bp muse-dihydrofolatreduktase-(DHFR)-minigen isoleret fra plasmid pMG-1 som i Gasser, 35 et al., P.N.A.S. (U.S.A.), 79 side 6522-6526 (1982)].

Også her omfatter de operative.hovedkomponenter af plasmid pDSVLl nucleotider 2448 til 4362 af p?R322 sammen med 49 DK 172611 B1 nucleotider 5171 til 270 (342bp) og 2553 til 2770 (237 bp) af SV40 DNA.

Ved at følge processerne beskrevet for eksempel i Maniatis, et al., supra, blev det EPO-indkodende DNA 5 isoleret fra plasmid pBR-EPO som et BamHI-fragment og ligeret ind i plasmid pDSVLl kløvet med BAMHI. Restriktionsenzym-analyse anvendtes til at bekræfte indføring af EPO-genet i den rette orientering i to af de resulterende klonede vektorer (dublet-vektorer H og L).

10 Se Fig. 2, der illustrerer plasmid pDSVL-MkE. Vektorer med EPO-gener i den forkerte orientering blev bevaret til anvendelse som negativ kontrol i transfektions-forsøg beregnet til at bestemme EPO-ekspressions-niveauer hos værter transformeret med vektorer med 15 EPO-DNA i den korrekte orientering.

Vektorer H, L, F, X og G kombineret med bærer-DNA (muse-lever- og -milt-DNA) blev anvendt til at transficere 60 nun's dublet-plader ved calciumphosphat-mikrofældningsmetoder. 60 Iran's Dublet-plader blev også 20 transficeret med bærer-DNA som en negativ "imitation"-transformationskontrol. Efter fem dage blev alle kulturmedier testet for tilstedeværelse af polypetider besiddende de immunologiske egenskaber af naturligt forekommende EPO.

25

Eksempel 7 A. Indledende EPO-ekspresslonssystem involverende COS-1 celler.

Det system, der valgtes til indledende forsøg på 30 mikrobiel syntese af isolerbare mængder af humant EPO-polypetidmateriale kodet for med den humane genomiske DNA-EPO-klorv involverede også ekspression i pattedyr-værtceller (dvs. COS-1 celler, A.T.C.C. nr. CRL-1650).

Det humane EPO-gen blev først sub-klonet ind i en 35 "shuttle"-vektor, der er i stand til autonom replika- tion i både E.coli-værter {som følge af tilstedeværelsen af pBR322-afledt DNA) og i pattedyr-cellelinien COS-1 (som følge af tilstedeværelsen af SV40 virus-afledt DNA).

50 DK 172611 B1 "Shuttle"-vektoren, indeholdende EPO-genet, blev derefter transficeret ind i COS-1 celler. EPO-polypetid-materiale blev fremstillet i de transficerede celler og udskilt i cellekulturmedierne.

5 Nærmere angivet blev en ekspressionsvektor kon strueret ved følgende processer. DNA isoleret fra lambda-klon IhEl, indeholdende det humane genomiske EPO-gen, blev digereret med BamHI- og HlndIII-re-striktionsendonucleaser, og et 5,6 Kb DNA-fragment 10 kendt som indeholdende hele EPO-genet blev isoleret.

Dette fragment blev blandet og ligeret med det bakterielle plasmid pUC8 {Bethesda Research Laboratories, Inc.), der var blevet tilsvarende digereret, hvorved skabtes det intermediære plasmid "pUC8-HuE", der tilvejebringer 15 en passende kilde for dette restriktionsfragment.

Den vektor, der valgtes til ekspression af EPO-DNA'et i COS-1 celler (pSV4SEt), var forud kon-, strueret. Plasmid pSV4SEt indeholdt DNA-sekvenser, der tillod udvælgelse og autonom replikation i E.coli.

20 Disse karakteristika er tilvejebragt ved tilkomsten af replikations- og Ampicillinresistens-gen-DNA-sekvenser tilstede i den region, der omspænder nucleotider 2448 til 4362 af det bakterielle plasmid pBR322. Denne sekvens blev strukturelt modificeret ved addition af en 25 lænker, der tilvejebragte et Hindlll-genkendelsessted umiddelbart nabostillet til nucleotid 2448. Plasmid pSC4SEt var også i stand til autonom replikation i COS-1 celler. Dette karakteristikum blev tilvejebragt med et 342 bp fragment indeholdende den fra SV40 virus stammende 30 replikation (nucleotid-numre 5171 til 270) . Dette frament var blevet modificeret ved addition af en lænker til-vejebringende et EcoRl-genkendelsessted nabostillet til nucleotid 270 og en lænker tilvejebringende et Sall-genkendelsessted nabostillet til nucleotid 5171. Et 35 1061 bp fragment af SV40 var også tilstede i denne vektor (nucleotid-numre 1711 til 2772 plus en lænker tilvejebringende et Sall-genkendelsessted ved siden af nucleotid nummer 2772). Inden for dette fragment var eii DK 172611 Bl 51 unik BamHI-genkendelsessekvens. Sammenfattende indeholdt plasrdd pSV4SEt unike BamHl- og Hindlll-genkendelsessteder, der tillader indsætning af det humane EPO-gen, sekvenser, der tillader replikation og udvælgelse i E.coli, og se-5 kvenser, der tillader replikation i COS-1 celler.

For at indføre EPO-genet i pSV4Et blev plasmid pUC8-HuE digereret med BamHl- og Hindlll-restriktionsen-donucleaser, og det 5,6 kb EPO-inkodende DNA-fragment blev isoleret. pSV4£t blev også digereret med BamHl og Hindlll, 10 og 2513 bp hovedfragmentet blev isoleret (bevarende alle nødvendige funktioner). Disse fragmenter blev blandet og ligeret, hvorved skabtes den endelige vektor "pSVgHuEPO".

(Se Fig.3). Denne vektor blev formeret i E.coli, og vek-tor-DNA blev isoleret. Restriktionsenzym-analyse anvend-15 tes til at bekræfte indføring af EPO-genet.

Plasmid pSVgKuEPO-DNA anvendtes til at eksprimere humant EPO-polypeptidmateriale i COS-1 celler. Nærmere angivet blev pSVgHuEPO-DNA kombineret med bærer-DNA og transficeret ind i 60 mm*s triplet-plader af COS-1 cel-20 ler. Som kontrol blev bærer-DNA alene også transficeret ind i COS-1 celler. Cellekulturmedier blev prøvet fem og syv dage senere og testet for tilstedeværelse af polypep-tider besiddende de immunologiske egenskaber af naturligt forekommende humant EPO.

25 B. Andet EPO-ekspressionssystem Involverende COS-1 celler Endnu et system blev konstrueret for at tilvejebringe forbedret produktion af humant EPO-polypetidmateri-ale kodet med den humane genomiske DNA-EPO-klon i COS-1 celler (A.T.C.C. nr.CRL-1650).

30 I det umiddelbart foregående system blev EPO eks- primeret i COS-1 celler under anvendelse af dets egen promotor, der ligger inden for 5,6 Kb BamHl-tll-Hlndlll-restriktions-fragmentet. I den følgende konstruktion ændres EPO-genet således, at der eksprimeres under anvendelse af den sene 35 SV4O-promotor.

Nærmere betegnet blev det klonede 5,6 Kb genomiske 52 DK 172611 B1 humane BamHl-til-Hindlll EPO-restriktionsfragment modificeret ved følgende processer. Plasmid pUC8-HuE, som beskrevet ovenfor, blev kløvet med BamHI- og med BstEII-re-striktlonsendonucleaser.BstEII kløver inden for 5,6 Kb EPO-5 genet ved en position, der er 44 basepar 5' til den initierende ATG-kodning for præ-peptidet og omtrent 680 basepar 3' til Hlndlll-restriktionsstedet. Det omtrent 4900 basepar-fragment blev isoleret.Et syntetisk lænker-DNA-fragment, indeholdende kohæsive Sall- og BstEII-ender og et internt BamHI-genkendelsessted blev syntetiseret 10 og renset. De to fragmenter blev blandet og ligeret med plasmid pBR322, der var udskåret med Sall og BamHI, hvorved vandtes det intermediare plasmid pBRgHE. Den genomi-ske humane EPO-gen kan isoleres derfra som et 4900 basepar BamHI-digereringsfragment bærende det komplette struktu-15 relle gen med et enkelt ATG 44 basepar 3' til BamHI-stedet nabostillet til den amino-terminale kodningsregion.

Dette fragment blev isoleret og indført som et BamHI-fragment i BamHI-kløvet ekspressionsvektorplasmid pDSVLl (beskrevet i Eksempel 6). Det resulterende plasmid, 20 pSVLgHuEPO, som illustreret i Fig.4, anvendtes til at eks-primere EPO-polypoptidmateriale fra COS-1 celler, som beskrevet i Eksemplerne 6 og 7A.

Eksempel 8 25 Kulturmedier til vækst af de seks transficerede COS-1 kulturer fra Eksempel 6 blev analyseret ved radio-immunoprøve ved processerne anført i Eksempel 2, Del B.

Hvert prøveeksemplar blev prøvet ved ali guot-niveauer på 250, 125, 50 og 25 mikroliter. Supernatanter fra vækst af 30 celler, der var imitations-transficeret eller transficeret med vektorer med ukorrekt EPO-gen-orientering, var entydigt negative for EPO-immunoreaktivitet. For hvert prøvemateriale af de to supernatanter stammende fra vækst af COS-1 celler transficeret med vektorer (H og L) med EPO-DNA'et i den korrekte orientering, lå den procentuelle 35 hæmning af I-EPO-binding til antistof inden for områ- ‘ det fra 72 til 88%, hvilket placerer alle værdier ved top- 53 DK 172611 B1 pen af standardkurven. Den nøjagtige koncentration af EPO i kultur-supernatanten kunne ikke vurderes pålideligt. Der blev imidlertid foretaget en temmelig en temmeligt lav regnet vurdering på 300 mE/ml ud fra værdiberegningen af den største aliquot-størrelse (250 mikroliter).

5 En repræsentativ kulturvæske ifølge Eksempel 6 og fem og syv dages kulturvæsker vundet ifølge Eksempel 7A blev testet i RIA for at sammenligne aktivitet af rekom-binante abe- og humane EPO-materialer med en standard for naturligt forekommende humant EPO, og resultaterne er vist 10 i grafisk form i Fig.l. Kort anført viste resultaterne som forventeligt, at det rekombinante abe-EPO konkurrerede signifikant for anti-humant EPO-antistof, selv om det ikke var i stand til fuldstændigt at hæmme binding under testbetingelserne. De maksimale hæmningsprocentværdier 15 for rekcrribinant humant EPO lå imidlertid meget nær værdierne for den humane EPO-standard. Den parallelle karakter af dosis/ respons-kurverne lader formode immunologisk identitet af de fælles sekvenser (epitoper). Tidligere vurderinger af abe-EPO i kulturvæsker blev genvurderet ved disse høje 20 fortyndingsniveauer og fandtes at ligge i området fra 2,91 til 3,12 E/ml. Anslåede produktionsniveauer for humant EPO blev tilsvarende sat til 392 mE/ml for den fem dage gamle vækstprøve og 567 mE/ml for den syv dage gamle vækstprøve. Anslåede produktionsniveauer for abe-EPO i 25 ekspressionssystemet fra Eksempel 7B var af samme størrelsesorden eller bedre.

Eksempel 9

Kulturvæsker fremstillet ifølge Eksemplerne 6 og 30 7 blev underkastet en in vitro-prøve for EPO-aktivitet ved metoden ifølge Goldwasser, et al., Endocrinology, 9T_, 2, side 315-323 (1975). Anslåede abe-EPO-værdier for testede kulturvæsker lå i området fra 3,2 til 4,3 E/ml. Humane EPO-kulturvæsker var også aktive ved denne in vitro-prøve, og 35 endvidere kunne denne aktivitet neutraliseres af anti-EPO-antistof. De rekombinante abe-EPO-kulturvæsker ifølge Ek- 54 DK 172611 B1 sempel6 blev også underkastet en prøve for biologisk in vivo-aktivitet ved de generelle processer ifølge Cotes, et al.. Nature, 191, side 1065-1067 (1961), og Hammond, et al., Ann. N.Y. Acad.Sci., 149, side 516-527 (1968), og 5 aktivitetsniveauer lå i området fra 0,94 til 1,24 E/ml.

Eksempel 10 I de foregående eksempler blev rekombinant abeeller humant EPO-materiale fremstillet ud fra vektorer, 10 der blev anvendt til at transficere COS-1 celler. Disse vektorer replikerer i COS-1 celler som følge af tilstedeværelse af SV4 0 T-antigen i cellen og et SV4 0 replikations-begyndelsespunkt på vektorerne. Selvom disse vektorer producerer nyttige mængder af EPOiCOS-1 celler, er ekspres-15 sion kun forbigående (7 til 14 dage) som følge af tabet efterhånden af vektoren. Yderligere blev kun en lille procentdel af COS-1 transficeret produktivt med vektorerne.

Det foreliggende eksempel beskriver ekspressionssystemer, der gør brug af kinesisk hamster-ovarie(CHO)-DHFR~-celler 20 og den valgbare markør, DHFR. (Vedrørende diskussion af beslægtede ekspressionssystemer, se US patentskrift nr.

4.399.216 og europæiskepatentansøgninger 117058, 117059 og 117060, alle publiceret 29. august 1984).

CHO-DHFR--celler (DuX-Bll) CHO-Kl-celler, Urlaub, 25 et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (U.5.A.), bind 77, 4461 (1980), mangler enzymet dihydrofolat-reduktase (DHFR), bind 77, 4461 (1980), mangler enzymet dihydrofolat-reduktase (DHFR)som følge af mutationer i de strukturelle gener og kræver derfor tilstedeværelse af 30 glycin, hypoxanthin og thymidin i dyrkningsmedierne.

Plasmider pDSVL-MkE (Eksempel 6) eller pDSVL-gHuEPO (Eksempel 7B) blev sammen med bærer-DNA transficeret ind i CHO-DHFR -celler, der voksede i medier indeholdende hypoxanthin, thymidin og glycin i 60 mm's kulturplader.

35 Plasmid pSVgHuEPO (Eksempel 7A) blev blandetmed plasmidet pMG2 indeholdende et muse-dihydrofolat-reduktase-gen klonet ind i den bakterielle plasmidvektor pBR322 (ifølge Gasser, et al., supra). Plasmidblandingen og 55 DK 172611 B1 bærer-DNA blev transficeret ind i CHO-DHFR -celler.

(Celler, der erhverver ét plasmid, vil i almindelighed også erhverve et andet plasmid). Efter tre dage blev cellerne ved trypsinering dispergeret ind i adskillige 5 100 Tnm's kulturplader i medier manglende hypoxanthin og thymidin. Kun de celler, der er blevet stabilt transformeret med DHFR-genet, og dermed EPO-genet, overlever i dette medium. Efter 7-21 dage blev kolonier af overlevende celler synlige. Disse transformant-kolonier kan 10 efter dispergering ved trypsinering formeres kontinuert i medier manglende hypoxanthin og thymidin under tilvejebringelse af hidtil ukendte cellestammer (f.eks.

CHO pDSVL-MkEPO, CHO pSVgHuEPO, CHO pDSVL-gHuEPO).

Kulturvæsker fra de ovennævnte cellestammer blev 15 testet i RIA for tilstedeværelse af rekombinant abeeller humant EPO. Medier for stamme CHO pDSVL-MkEPO indeholdt EPO med immunologiske egenskaber som det, der blev opnået fra COS-1 celler transficeret med plasmid pDSVL-MkEPO. En repræsentativ 65 timers kultur-20 væske indeholdt abe-EPO i en mængde på 0,60 E/ml.

Kulturvæsker fra CHO pSVgHuEPO og CHO pDSVL-gHuEPO indeholdt rekombinant humant EPO med immunologiske egenskaber som det, der blev opnået med COS-1 celler transficeret med plasmid pSVgHuEPO eller pDSVL-gHuEPO.

25 En repræsentativ 3 dages kulturvæske fra CHO pSVgHuEPO indeholdt 2,9 9 E/ml af humant EPO, og en 5,5 dages prøve fra CHO pDSVL-gHuEPO havde 18,2 E/ml af humant EPO målt ved RIA.

Mængden af EPO produceret af de ovenfor beskrevne 30 cellestammer kan forhøjes ved gen-forøgelse under tilvejebringelse af hidtil ukendte cellestammer med større produktivitet. Enzymet dihydrofolat-reduktase (DHFR), der er produktet kodet for af DHFR-genet, kan hæmmes af lægemidlet methotrexat (MTX). Nærmere angivet bliver 35 celler, der er formeret i medier manglende hypoxanthin og thymidin, hæmmet eller dræbt af MTX. Under de rette betingelser (f.eks. minimale koncentrationer af MTX) kan der vindes celler, der er resistente over for og 56 DK 172611 B1 i stand til at vokse i MTX. Disse celler har vist sig at være resistente over for MTX som følge af en forøgelse af antallet af deres DHFR-gener, hvilket resulterer i forøget produktion af DHFR-enzym. De overlevende celler kan derefter behandles med stigende koncentrationer af 5 MTX, hvilket resulterer i cellestammer indeholdende større antal DHFR-gener. "Passager-gener" (f.eks.

EPO) båret på ekspressionsvektoren sammen med DHFR-genet eller transformeret med DHFR-genet har også ofte vist sig at blive forøget med hensyn til deres gen-10 kopiantal.

Som eksempler på praktisering af dette forøgelsessystem blev cellestamme CHO pDSVL-MkE udsat for stigende MTX-koncentrationer (0 nM, 30 nM og 100 nM). Repræsentative 65 timers kulturmedieprøver fra hvert forøgelses-15 trin blev prøvet ved RIA og bestemt til at indeholde henholdsvis 0,60, 2,45 og 6,10 E/ml. Cellestamme CHO-pDSVL-gHuEPO blev underkastet en række stigende MTX-koncentrationer på 30 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM,

1 pH og 5 pM MTX. En repræsentativ 3 dages kultur-20 medieprøve fra 100 nM MTX-trinnet indeholdt humant EPO

i en mængde på 3089+ 129 E/ml bedømt ved RIA. Repræsentative 48 timers kulturmediumprøver fra 100 hM og 1 pM MTX-trinnene indeholdt humant EPO i en mængde på henholdsvis 466 og 1352 E/ml vurderet ved RIA (gennemsnit 25 af tredobbelte prøver). Ved disse processer blev 1 x 10^ celler udpladet i 5 ml medium i 60 mm's kulturskåle.

24 Timer senere blev mediet fjernet og erstattet med 5 ml seriumfrit medium (højglucose-DMEM suppleret med 0,1 mM ikke-essentielle aminosyrer og L-glutamin).

30 EPO fik lov at akkumulere i 48 timer i det seriumfrie medium. Mediet blev indsamlet til RIA-bestemmelse, og cellerne blev trypsineret og talt. De gennemsnitlige RIA-værdier på 467 E/ml og 1352 E/ml for celler dyrket ved henholdsvis 100 nM og 1 yM MTX viste faktiske ud-35 bytter på 2335 E/plade og 6750 E/plade. Det gennemsnitlige celleantal pr. plade var henholdsvis 1,94 x C £ 10® og 3,12 x 10 celler. De effektive produktions- 57 DK 172611 B1 hastigheder for disse dyrkningsbetingelser var således 1264 og 2167 E/106 celler/48 timer.

Cellerne i de umiddelbart ovenfor beskrevne kulturer er en genetisk heterogen population. Standard-5 screeningsmetoder anvendtes i et forsøg på at isolere genetisk homogene kloner med den højeste produktionskapacitet. Se sektion A, Del 2 af "Points to Consider in the Characterization of Cell Lines Used to Produce Biologies", 1. Juni 1984, Office of Biologies Research 10 Review, Center for Drugs and Biologies, U.S. Food and Drug Administration.

Produktiviteten af de EPO-producerede CHO-celle-linier beskrevet ovenfor kan forbedres ved passende former for celledyrkningsteknik. Formeringen af patte-15 dyrceller i kultur kræver i almindelighed tilstedeværelse af serum i vækstmediet. En fremgangsmåde til fremstilling af erythropoietin ud fra CHO-celler i medium, der ikke indholder serum, letter i høj grad rensningen af erythropoietin fra dyrkningsmediet.

20 Den nedenfor beskrevne fremgangsmåde er i stand til at producere erythropoietin i serumfrie medier økonomisk og i store mængder, der er tilstrækkelige til produktion.

Stamme CHO pDSVL-gHuEPO-celler, dyrket under 25 standard-cellekulturbetingelser, anvendtes til at pode cellekultur-rotationskolber. Cellerne blev formeret som en suspensions-cellelinie i cellekultur- rotationskolberne i medium bestående af en 50/50-blanding af højglucose-DMEM og Ham's F12 suppleret med 5% foetalt 30 kalveserum, L-glutamin, penicillin og streptomycin, 0,05 mM ikke-essentielle aminosyrer og den passende koncentration af methotrexat. Suspensions-cellekultur tillader de EPO-producerende CHO-celler let at blive ekspanderet til store voluminer. CHO-celler, dyrket i 35 suspension, anvendes til at pode rulleflasker ved en

Indledende podningstæthed på 1,5 x 10^ levedygtige 2 celler pr. 850 cm rulleflaske i 200 ml medium. Cellerne får lov til at vokse til sammenløb som en vedhæftende 58 DK 172611 B1 cellelinie over en periode på 3 dage. Det til denne vækstfase anvendte medium er det samme som det, der anvendes til vækst i suspension. Ved afslutningen af den tre dages vækstperiode fjernes det serumholdige medium 5 og erstattes med 100 ml serumfrit medium, 50/50- blanding af højglucose-DMEM og Ham’s F12 suppleret med 0,05 mM ikke-essentielle aminosyrer og L-glutamin.

Rulleflaskerne returneres til rulleflaskeinkubatoren for en periode på 1-3 timer, og mediet fjernes igen og 10 erstattes med 100 ml frisk serumfrit medium. Den 1-3 timers inkubation af det serumfrie medium reducerer koncentrationen af forurenende serumproteiner. Rulleflaskerne returneres til inkubatoren for en periode på syv dage, hvorunder erythropoietin akkumulerer i 15 det serumfrie kulturmedium. Ved afslutningen af den 7 dages produktionsfase fjernes det konditionerede medium og ersatttes med frisk serumfrit medium til en anden produktionscyclus. Som et eksempel på praktiseringen af dette produktionssystem indeholdt en repræsentativ 20 syv-dages serumfri mediumprøve humant erythropoietin i en mængde på 3892+409 E/ml vurderet ved RIA. Baseret på en anslået celletæthed på 0,9 til 1,8 x 10^ celler/-cm2 indeholdt hver 850 cm2,s rulleflaske fra 0,75 til

O

1,5 x 10 celler, og produktionshastigheden for EPO 25 i 7-dages, 100 ml's kulturen var således 750 til 1470 E/106 celler/48 timer.

Dyrkningsvæsker fra cellestamme CHO pDSVL-MkEPO holdt i 10 nM MTX blev underkastet in vitro og in vivo EPO-aktivitetsprøver ved RIA. Den konditionerede 30 mediumprøve indeholdt 41,2+1,4 E/ml af MkEPO målt ved RIA, 41,2+0,064 E/ml målt ved biologisk aktivitetsprøve In vitro og 42,5+5 E/ml målt ved biologisk aktivitetsprøve i_n vivo. Aminosyre-sekvensbestemmelse af polypeptidprodukter viste tilstedeværelse af EPO-35 produkter, idet en hoved-art havde 3 rester af "fører"-sekvensen nabostillet til den formentlige amino-terminale alanin. Om dette er resultatet af ukorrekt membranforarbejdning af polypeptidet i CHO-celler eller af- 59 DK 172611 B1 spejler en forskel i struktur af amino-terminalen af abe-EPO vis-a-vis humant EPO er endnu ukendt.

Dyrkningsvæsker fra cellestamme CHO pDSVL-gHuEPO blev underkastet de tre prøver. Et 5,5 dages prøve-5 materiale indeholdt rekombinant humant EPO i mediet i en mængde på 18,2 E/ml i følge RIA-prøve, 15,8+4,6 E/ml ved in vitro-prøve og 16,8+3,0 E/ml ved in vivo-prøve.

Dyrkningsvæske fra CHO pDSVL-gHuEPO-celler fremstillet med trinvis stigning til 100 nM MTX blev under-10 kastet de tre prøver. Et 3,0 dages prøvemateriale indeholdt rekombinant humant EPO i en mængde på 3089+ 129 E/ml ved RIA, 2589+71,5 E/ml ved in vitro-prøve og 2040+160 E/ml ved jln vlvo-prøve. Aminosyre-sekvensbestemmelse af dette produkt viste en amino-terminal 15 svarende til den i Tabel VI viste.

Celle-konditionerede medier fra CHO-celler trans-ficeret med plasmid pDSVL-MkE i 10 nM MTX blev samlet, og MTX blev dialyseret ud i løbet af flere dage, hvilket resulterede i medium med en EPO-aktivitet på 221+5,1 20 E/ml (EPO-CCM). For at bestemme in vivo-effekten af EPO-CCM på haenatocrit-niveauer i normale Balb/C mus blev der gennemført følgende forsøg. Celle-konditionerede medier fra ikke-transficerede CHO-celler (CCM) og EPO-CCM blev indstillet med PBS. CCM anvendtes til kontrol-25 gruppen (3 mus), og to dosisniveauer af EPO-CCM — 4 enheder pr. injektion og 44 enheder pr. injektion — anvendtes til forsøgsgrupperne (2 mus/gruppe). I løbet af 5 uger blev de syv mus injiceret intraperitonealt , 3 gange pr. uge. Efter den ottende injektion blev 30 middel-haematocritværdierne for kontrolgruppen bestemt til 50,4%, for 4E-gruppen til 55,1% og for 44E-gruppen til 67,9%.

Pattedyrcelle-ekspressionsprodukter kan let udvindes i hovedsageligt renset form fra dyrkningsmedier 35 ved HPLC (C^) under anvendelse af ethanolgradient, fortrinsvis ved pH 7.

Et indledende forsøg gennemførtes for at karakterisere rekombinant-glycoproteinprodukter fra 60 DK 172611 B1 konditioneret medium med C0S-1- og CHO-celleekspression af det humane EPO-gen sammenlignet med humane urinære EPO-isolater under anvendelse af både "Western blot"-analyse og SDS-PAGE. Disse undersøgelser viste, at det 5 CHO-producerede EPO-materiale havde en noget højere molekylvægt end COS-l-ekspressionsproduktet, der på sin side var lidt større end det pool’ede humane urinære isolat.

Alle produkter var noget heterogene. Neuraminidase-enzymbehandling for at fjerne sialinsyre resulterede i 10 COS-1- og CHO-rekombinantprodukter af omtrent samme molekylvægt, og som begge var større end den resulterende humane urinære asialo-ekstrakt. Endoglycosidase F-enzym (EC 3.2.1)-behandling af det rekombinante CHO-produkt og det urinære ekstraktprodukt (for totalt af fjerne 15 carboh'ydrat fra begge) resulterede i hovedsageligt homogene produkter med i det væsentlige indtiske molekylvægt-karakteristika.

Renset humant urinært EPO og et rekombinant, CHO-celle-produceret EPO ifølge opfindelsen blev under-20 kastet carbohydrat-analyse ved metoden ifølge Ledeen, et al., Methods in Enzymology, 83 (Del D), 139-191 (1982), modificeret ved anvendelse af hydrolyseprocesserne ifølge Nesser, et al., Anal.Biochem., 142, 58-67 (1984). Eksperimentelt bestemte carbo-25 hydrat-konstitutionsværdier (udtrykt som molære carbo-hydratforhold i produktet) for det urinære isolat var følgende: hexoser, 1,73; N-acetylglucosamin, 1; N-acetylneuraminsyre, 0,93; fucose, 0 og N-acetylgalactos-amin, O. Tilsvarende værdier for rekombinantproduktet 30 (stammende fra 3 dage gammelt CHO pDSVL-gHuEPO-kulturmedium ved 100 nM MTX) var følgende’; hexoser. 15,09; N-acetylglucosamin, 1; N-acetylneuraminsyre, 0,998, fucose, O og N-acetylgalactosamin o. Disse fund stemmer overens med "Western blot”- og SDS-PAGE-35 analyserne beskrevet ovenfor.

Glycoproteinprodukter tilvejebragt ifølge den foreliggende opfindelse omfatter således produkter med en‘primær strukturel udformning, der er tilstrækkeligt 61 DK 172611 B1 dublet af den primære strukturelle udformning af et naturlig forekommende erythropoietin til at tillade besiddelse af én eller flere af dettes biologiske egenskaber, og med en gennemsnitlig carbohydrat-5 komposition, der afviger fra kompositionen af naturligt forekommende erythropoietin.

Eksempel 11

Dette eksempel angår den totale fremstilling ved 10 samling af nucleotidbaser, af to strukturelle gener, der indkoder den i Tabel VI viste sekvens for EPO fra humane arter, og som inkorporerer "foretrukne" codon'er for ekspression i henholdsvis E.coli og gær-celler (S.cerevisiae). Endvidere er beskrevet konstruktionen 15 af gener, der indkoder analoge af humant EPO. Kort anført var den anvendte protokol generelt som anført i den ovenfor nævnte forskrift ifølge Alton, et al.

(WO 83/04053). Generne blev konstrueret til indledende samling af indgående oligonucleotider til 20 multiple duplexer, der igen blev samlet til tre separate sektioner. Disse sektioner blev konstrueret ti til let forøgelse og kunne, efter fjernelse fra forøgelsessystemet, samles sekventielt eller ved en flerfragment-ligering i en passende ekspressionsvektor.

25 Tabeller VIII til XIV nedenfor illustrerer konstruktionen og samlingen af et fabrikeret gen, der indkoder et humant EPO-translationsprodukt, som mangler enhver fører eller præsekvens, men inkluderer en indledende methioninrest ved position -1. Endvidere 30 inkorporerede genet i betydelig grad E.coli-preference-codon'er, og konstruktionen blev derfor betegnet som "ECEPO"-genet.

62

Tabel VIII

ECEPO-Sektion l-01igonucleotider DK 172611 B1

1. AATTCTAGAAACCATGAGGGT AATAAAAT A

5 2. CCATTATTTTATTACCCTCATGGTTTCTAG

3. ATGGCTCCGCCGCGTCTGATCTGCGAC

4. CTCGAGTCGCAGATCAGACGCGGCGGAG

5. tcgagagttctggaacgttacctgctg

10 6. CTTCCAGCAGGTAACGTTCCAGAACT

7. gaagctaaagaagctgaaaacatc

3. 3TGG7GATG77TTCAGC7TCT7TAG

15 9. ACCAC7Gu77G7GC7GAACAC7G77C

10. CAAAGAACAGTG77CAGCACAACCA

11. T77GAACGAAAACAT7ACGGTACCG

12. GATCCGG74CCGTAATG7T7TCG7T

20

Tabel IX ECEPO-Sektion 1

Xtial 25 &coRI 1, I 3

AATTCTAG AAACCATGAG GGTAATAAAA T.fljATGGC7CC GfCGCGTCTG GATC T77GG7AC7C CCAT7ATT7T ATTA£c|GAGG CGGCGCAGAC

2 4

A7CTGCGAclr CGAGAG77C7 GGAACGTTAC C7GCTg1;AAG CTAAAGAAGC 30 TAGACGCTGA GCTCjTCAAGA CCT7GCAATG GACGACCTTC] GA7TTCTTCG

I . 9 ,11

7GAAAACA7C WCCACTGG77 G7GC7GAACA C7G77Ch-TTG AACGAAAACA

ACTT7TGTAG TGGTGACCAA CACGAC77G7 GACAAGAAAC] 7TGC7777GT

8 10 1 1

Κρπ I BsnHI

TTACGGTACC G AA7GCCATGG CCTAG 12 63

Tabel X

ECEPO-Sektion 2-Oligonucleotider DK 172611 B1

5 1. AATTCGGTACCAGACACCAAGGT

2. GTTAACCTTGGTGTCTGGTACCG

3. TAACTTCTACGCTTGGAAACGTAT

å. TTCCATACGTTTCCAAGCGTAGAA

10 5. GGAAGTTGGTCAACAAGCAGTTGAAGT

6. CCAAACTTCAACTGCTTGTTGACCAAC

7. 7TGGCAGGGTCTGGCACTGCTGAGCG

“ . 'jUm · Lyu ! wnbL/*lj i iju-MunLLu i 'j 15 ** · Λ Λ T — 7 · : J : "L · '<JU J I ^ ΤΛ — 4 p s* <·% Λ *· T Ϊ p· « —i . I ULo ! uukv^Ljunu I nLn

!. C7GCTGG7AAAC7CC7C7CAGCCGT

20 12. 7TCCCAC3GCTGAGAGGAG7TTACCA

13. GGGAACCGCTGCAGC7GCATG7TGAC

1A. GCTTTG7CAACATGCAGCTGCAGCGG

15. AAAGCAGTA7CTGGCCTGAGATCTG 25 16. GATCCAGATCTCAGGCCAGATACT 30 1 64 DK 172611 B1 !i C-- i μ. « c lu _sj>- Ϊ".

f'r : ^3u U!U U

Te U u UUo - u u < i_ o o —«c — «s Ξ ^ u o t^'u u uS - b b u ruser — O U U O ^3 u er — — S U U ~ — 5 ΰ o u — <s — ^ 3 ri «- =i uu uu ^ U r- i— eT U u r-, i(_ c <r I O O UU U U 'ij • » »2 o U U U --ΊΟ U ’ 1 3 u >— c < i — i·— <

O U U U U o CM U

<m c — — « ,5 r -I

O U -«S'- «~ *z.

c i— «C >-|0 U — !«= 5— ►- < O CJ U _ ....

H-H >- <S U U »-«= — y x -p <s i— u u .* U O U U. U U u o 1-1 v < i- u u ’“iSr— QJ LO er i— o o o o < I— Λ I - g· t- C ulu « *” H3 O L_ er er t—!< _31il—

Η Λ U U f—' < «—' lU U O

W UU < I- <*-

CJ ou <t— UU UU

— cT 1— er I- <s >- UU >-5 ou uu uu r-<r ou I— <r er >— uu —i \<s >— i— <£. uu >—5

OUCM| UU UU eS

ec i_ <th u u C ou

O O uu uu—l UU

<X I— U O CM*— < >— «s «s: i— u u u u o U <S u- o u u u I-H U U , /-jrf t_ uu UU «X'f— -9·

£P 5 «U ►-« ioiuu^I

i]U U ιΛΐ<£ i— U U -HU u μ UU cT ’— >— c OU >-«£ U u _ £ ou uu uu c: v- uo >— <· ou

Cl«X I- et ulu U U_ O >- <C Ulu o ler U U ulo «sil- 5 65 DK 172611 B1

Tabel XII ECEPO-Sektion 3

1. GATCCAGATCTCTGACTACTCTGC

2. acgcagcagagtagtcagagatctg

3. TGCGTGCTCTGGGTGCACAGAAAGAGG

10 A. GATAGCC7CTT7CTGTGCACCCAGAGC

5. CTATCTCTCCGCCGGATGCTGCATCT

S. CAGCAGATGCAGCATCCGGCGGAGA

/ » UU Jl, I -C J I I vnl, i d J* 3 3 . Hi w U · n i oc i nL o u nlju L:o i 'j 9 « l 11;A i AC wT j uCssL AAAu iGTTTC’o

10. ATACACGAAACAG77TGCGGAAGGT

20 11. t G i ATACi C:AACT i CCiGCG i Go i A

12. CAGTTTACCACGCAGGAAGTTAGAG7

13. AACTGAAAC7GTATACTGGCGAAGC

1A . GGCATGC7TCGCCAGTATACAG7TT

25 15. ATGCCG7ACTGGTGACCGCTAATAG

lé. TCGACTATTAGCGGTCACCAGTAC

30 1 66

Tabel XIII

ECEPO-Sektion 3 DK 172611 B1

BamHI Bgl11 GA TCCAGATCTCTG GTCTAGAGAC

il — L — , Λ ACTACTCTGC ITGCGTGCTCT GGGTGCACAG AAAGAGGpTA TCTCTCCGCC 111 TGATGAGACG ACSCACGAGA CCCACGTGTC TTTCTCCGAT AGlAGAGGCGG 2 A ” , I ,9

GGATGCTGCA TC'uCTGCAC CGCTGCGTAC CATCACTGC7 GATACCTTCC

cctacgacgt agacgaTgtg gcgacgcatg gt agtga^a“ct1tggaagg 6 v 3 1 15 ii , 13 GCAAACTG7T TCGjTGTATAC TC7AACTTCC TGCSTGGTa|a ACTGAAACT3 CGTTTGACAA AGCACATaJtG AGATTGAAGG ACGCACCATi fåACtTTTGAC i0 12 ' , il- Sall

20 TATACTGGCG AAGCATGCCG TACTGGTGAC CGCTAATAG

atatgaccgc ttcgtacTSc atgaccactg gcgattatc agct i£ ' 16 25 30 1 67

Tabel XIV

ECEPO-Gen DK 172611 B1 -1 1

Xbal MetAla 5 cTag aaaccatgag ggtaataaaa taatggctcc gccgcgtctg

TTTGGTACTC CCATTATTTT ATTACCGAGG CGGCGCAGAC

ATCTGCGACT CGAGAGTTCT GGAACGTTAC CTGCTGGAAG CTAAAGAAGC

TAGACGCTGA GCTCTCAAGA CCTTGCAA7G GACGACCT7C GAT77C77CG

10 7GAAAACA7C ACCAC7GG7T G7GC7GAACA CTG77C7T7G AACGAAAACA

AC7777G7AG 7GG7GACCAA CACGAC77G7 GACAAGAAAC 77GC77T7G7 77ACGGTACC 3GACACCAAG G77AAC77C7 ACGCT75GAA AC37A7GGA-

A.A7GCCA7GG 7C7G7GGT7C CAAT7GAAGA TGCGAACCT7 7GCA7ACC7T

15 G i iG5iCAAC AAGCAGTiGA AGiT<GGCAG GG < C i u GC A C 7GC7GAGGGA

• AnLvni) i >u ! IwG'CAAl· jlAAACwji'w \»i»AbACi_GiQ ACGAC i CGC

GGC7G7AC7G CG7GGCCAGG CAC7GCTGG7 AAACTCCTC7 CAGCCG7GGG

CCGACA7GAC GCACCGG7CC G7GACGACCA 777GAGGAGA G7CGGCACCC

20 AACCGC7GCA GC7GCATG77 GACAAAGCAG 7A7C7GGCCT GAGATCTC'G

77GGCGACG7 CGACG7ACAA CTG777CG7C ATAGACCGGA CTCTAGAGAC

AC7AC7C7GC 'GCG7GCTC7 GGG7GCACAG AAAGAGGC7A 7C7C7CCGCC

7GA7GAGACG ACGCACGAGA CCCACGTQTC 777C7CCGA7 AGAGAGGCGG

25 GGA7GC7GCA 7C7GC7GCAC CGC7GCGTAC CA7CACTGCT GA7ACC77CC

CC7ACGACG7 AGACGACG7G GCGACGCA7G GTAG7GACGA CTA7GGAAGG

GCAAAC7G7T 7CG7G7A7AC 7C7AAC77CC 7GCG7GG7AA ACTGAAAC7G

CG777GACAA AGCACATA7G AGA7TGAAGG ACGCACCA7T TGAC77TGAC

Sall

30 7A7AC7GGCG AAGCA7GCCG 7AC7GG7GAC CGC7AA7AG

A7A7GACCGC 77CGTACGGC A7GACCAC7G GCGA7TA7CA GCT 1 68 DK 172611 B1 Nærmere angivet illustrerer Tabel VIII oligo-nucleotider anvendt til at udvikle Sektion 1 af ECEPO-genet, der inkoder amino-terminale rester af poly-petidet af human art. Oligonucleotider blev samlet til 5 duplexer (JL og 2, 3 og 4^ osv.) , og duplexerne blev derefter ligeret til tilvejebringelse af ECEPO-Sektion 1 som i tabel IX. Det bemærkes, at den samlede sektion inkluderer respektive terminale kohæsive EcoRl- og BamHI-ender, at der "nedstrøms" for den kohæsive EcoRI-10 ende er et Xbal-restriktionsenzym-genkendelsessted, samt at der "opstrøms" for den kohæsive BamHI-ende er et Kpnl-genkendelsessted. Sektion 1 kunne let forøges under anvendelse af den til verificering af sektionens sekvens anvendte M13 phag-vektor. Der forekom nogle vanskelig-15 heder ved isolering af sektionen som et Xbal/Kpnl- fragment fra RF DNA udviklet i E.coli, formodentlig på grund af methylering af KpnI-genkendelsessted-baserne inden i værten. Enkelt-strenget phag-DNA blev derfor isoleret og gjort til dobbelt-strenget form in vitro 20 ved primer-ekstension, og det ønskede dobbelt-strengede fragment blev derefter let isoleret.

ECEPO-gen-sektioner 2 og 3 (Tabel XI og XIII) blev konstrueret på tilsvarende måde ud fra oligo-nucleotiderne i henholdsvis Tabel X og XII. Hver 25 sektion blev forøget i den til sekvens-verificering anvendte Ml3-vektor og blev isoleret fra phag-DNA.

Som det fremgår af Tabel XI, blev ECEPO-sektion 2 konstrueret med kohæsive EcoRl- og BamHI-ender og kunne isoleres som et Kpnl/Bglll-fragment. Tilsvarende blev 30 ECEPO-sektion 3 fremstillet med kohæsive BamHI- og Sall-ender og kunne isoleres fra phag RF DNA som et Bglll/Sall-fragment. De tre således fremstillede sektioner kan let samles til en kontinuert DNA-sekvens (Tabel XIV), der indkoder hele EPO-polypeptidet af human 35 art med en amino-terminal methionin-codon (ATG) for E.coli-translations-initiering. Det bemærkes også, at der "opstrøms" for det indledende ATG er en række basepar, der i det væsentlige duplikerer ribosom-bindings- 69 DK 172611 B1 sted-sekvensen af det højt eksprimerede OMP-f-gen fra E.coli.

Enhver egnet ekspressions-vektor kan anvendes til at bære ECEPO. Den vektor, der vælges til ekspression 5 af ECEPO-genet, er det "temperatur-sensibile" plasmid PCFM536 — et derivat af plasmid pCFM414 (A.T.C.C.40076) — som beskrevet i US patentansøgning Serial nr.

636.727, indleveret 6. august 1984, Charles F.Morris.

Nærmere angivet blev pCFM536 digereret med Xbal og 10 Hindlll, det store fragment blev isoleret og anvendt i en totrins-ligering med ECEPO-genet. Sektioner 1 (Xbal/Kpnl), 2 (KpnI/BgIII) og 3 (Bglll/Sall) var forud blevet samlet i den korrekte rækkefølge i M13, og EPO-genet blev isoleret derfra som et enkelt 15 Xbal/HindlII-fragment. Dette fragment inkluderede en del af polylænkeren fra M13 mp9-phag omspændende Sall-til Hindlll-stederne deri. Styring af ekspression i det resulterende ekspressions-plasmid, p536, foregik ved hjælp af en lambda-P. -promotor, der i sig selv li 20 kan være under kontrol fra Cjg^repressorgenet (som tilvejebragt i E.coli-stamme Kl2AHtrp).

Det ovennævnte fabrikerede ECEPO-gen kan modificeres på forskellig måde for at inkode erythropoietin-analoge, såsom [Asn2, des-Pro2 til Ile6]hEPO og [His7)-25 hEPO, som beskrevet nedenfor.

A. [Asn2, des-Pro2 til lle6]hEPO.

Plasmid 536 bærende det fremstillede ECEPO-gen fra Tabel XIV som en Xbal-tll-Hindlll-lndsætninq blev digereret med Hindlll og xhol. Sidsnævnte endonuclease 30 afskærer ECEPO-genet ved et unikt, 6 basepar genkendelsessted omspændende den sidste base af den codon, der 8 in inkoder Asp , til den anden base af Arg -codon'en. En Xbal/Xhol "lænker"-sekvens blev fremstillet mad følgende sekvens: 35 70 DK 172611 B1

Xbal *1 2 7 8 9

Mat Ala Asn Cys Asp , Xnjol 5*-CTAG ATG GCT AAT TGC GAC-3 3’-TAC CGA TTA ACG CTG AGCT-5 5

Xbal/Xhol-lænkeren og Xhol/Hindlll ECEPO-gen-sekvensfragmentet blev indført i det store fragment stammende fra Xbal- og HindIIl-digerering af plasmid PCFM526 — et derivat af plasmid *3*414 (A.T.C.C. 40076) 10 — som beskrevet i US patentansøgning Serial nr.

636.727, indleveret 6. august 1984, Charles F. Morris, for at udvikle en plasmid-båren DNA-sekvens, der indkoder E.coli -ekspression af Met~^-formen af den ønskede analoge.

15 B. [His71hEPO.

Plasmid 536 blev digereret med Hindlll og Xhol som i del A ovenfor. En Xbal/Xhol-lænker blev fremstillet med følgende sekvens: 20 Xbal *123456789

Mat Ala Pro Pro Arg Leu Ile His Asp 5’-CTAG ATG GCT CCG CCA CGT CTG ATC CAT GAC-3 3’-TAC CGA GGC GGT GCA GAC TAG GTA CTG AGCT-5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Lænkeren og Xhol/Hindlll ECEPO-sekvensfragmentet 2 blev derefter indført i pCFM526 for at udvikle en 3 pi asmld-båren DNA-sekvens, der indkoder E.coli- 4 ekspression af Met'^-formen af den ønskede analoge.

5

Konstruktion af et fabrikeret gen ("SCEPO") in- 6 korporerende gær-præferencecodon'er er som beskrevet i 7 følgende tabeller XV til XXI. Ligesom det var til 8 fælde med ECEPO-genet, involverede den totale konstruktion 9 dannelse af tre sæt af oligonucleotider (tabeller XV, 10 XVII og XIX), der blev tildannet til duplexer og samlet 11 til sektioner (tabeller XVI, XVIII og XX). Det bemærkes, at syntese blev lettet delvis ved anvendelse af nogle sub-optimale condon'er i både SCEPO- og ECEPO-konstruktionen, dvs. oligonucleotider 7-12 fra Sektion 1 af begge gener var identiske, ligesom også oligo-_40 nucleotider 1-6 fra Sektion 2 i hvert gen.

Tabel XV

SCEPO-Sektion l-01igonucleotider 71 DK 172611 B1

5 1. AATTCAAGCTTGGATAAAAGAGCT

2. GTGGAGCTCTTTTATCCAAGCTTG

3. CCACCAAGATTGATCTGTGACTC

a. TCTCGAGTCACAGA7CAATCTTG

10 5. GAGAGTTT7GGAAAGATACTTGTTG

é. C7TCCAACAAG7A7C777CCAAAAC

, v cnrtlju i nnnOr ·*ίΙ;υ i i ’w jL5 Zt» · G i ’cG i :*A i G i i ! wAGu . > uT f i Au

5 · C A C · G ! i b ί 1 IjrACrC . 'c i i U

10. C A A A G A A C A G 7 G 7 7 C A G C A c A A. C C A

11. TT7GAACGAAAACA7TACGG7ACCG

20 12. GA7CCGG7ACCG7AATG77TTCGTT

Tabel XVI SCEPO-Sektion 1 25 EcoRI Hindi 11 1 AA77CA AGCTTGGATa G7 TCGAACCT.A7 2

AAAGAGClbc ACCAAGAT7C A7C7GTGACT cllAGAGTTTT 30 TTTCTCGAGG TGpT7C7AAC TAGACACTGA GCTC^CAAAA

£ 5 7 GGAAAGATAC TTGTTCPAAG CTAAAGAAGC 7GAAAACATC fcCCACTGGTT CCTT7CTATG AACAACCTTC] GATTTCTTCG ACTTTTGTAG ΤΠΠΤΞΑαΟΑΑ i 1 a Λ 35 9 ,11 KonI 3cHHl

G7GCTGAACA C7G77C}TT7G AACGAAAACA TTACGG7ACC G CACGACTTGT GACAAGAAAC] TTGCTTTTGT AATGCCA7GG CCTAG

! 12 72

Tabel XVII

SCEPO-Sektion 2-Oligonucleotider DK 172611 B1

5 1. AATTCGGTACCAGACACCAAGGT

2. GTTAACCTTGGTGTCTGGTACCG

3. TAACTTCTACGCTTGGAAACGTAT

4. TTCCATACGTTTCCAAGCGTAGAA

10 5. GGAAGTTGGiCAACAAGCAGTTGAAGT

5. CCAAACT7CAACTGC77GTTGACCAAC

7 . i i jGC AA'jG > i i G Gu C i · s? 7 i A i C i

5. GG”7CAG A 7.ACAAGGCCA A AC C T7G

15 ?· A AuC u · i i iuAGAGuilAAGi-CI

IC . AACAAGGC7 7GACC 7C7CAAAACA

11. 7G77GG77AAC7C77C7CAA.CCA7GGG

12. 7GG77CCCA7GG77GAGAAGAG7TAACC

20 13. AACCA77GCAA77GCACGTCGAT

1A. CT7TA7CGACG7GCAA77GCAA

15. AAAGCCG7C7C7GG777GAGA7C7G

16. GA7CCAGATC7CAAACCAGAGACGG 25 30 1

Tabel XVIII

5CEP0-Sektion 2 73 DK 172611 B1

KonI

EcoRI 1 OTTCGGTiCC AGACACCAAG GCCATGG TCTGTGGT7C 2 , I 2

i n GTJTAACTTCT ACGC77GGAA ACG7ATPGAA GTTGGTCAAC AAGCTGTTGA CAATTGpAGA 7GCGAACC 7T 7GCA7ACC7T| CAACCAG77G TTCGACAACT

— Z f £

AGliTTGGCAA GG777GGCG7 7G77A7CTGP. AGG7G7777G AGAGG7CAAG

7CAAACGE77 CCAAACGGGA A C A A 7 A G A C ? μΤΞΡ C A A A A C 7C7CCAGT7C

3 ' -0 15 - — * · t ^ ^ „ 1 ^

GG T(7GT 7GG7 7AACTC'7G7 CAACCA7GGG fcACGA7TGCA A77GCACG7C

joAnCj· ^JG GA At iGAGmAGA Gi > uo i ACml i i u · |A A Co· t A A C G *C G

11 li

1_5 Bell I 3am rtI

20 GA7hAAGCCG 7C7C7GG777 GAGA7C7G

C7AiTTTpGC AGAGACCAAA C7C7AGACC7A G 16 DK 172611 B1 74

Tabel XIX

SCEPO-Sektion 3-Oligonucleotider

5 1. GATCCAGATCTTTGACTACTTTGTT

2. TCTCAACAAAGTAGTCAAAGATCTG

3. GAGAGCTTTGGGTGCTCAAAAGGAAG

4. ATGGCTTCCTTTTGAGCACCCAAAGC

10 5. CCATTTCCCCACCAGACGCTGCTT

5. GCAGAAGCAGi-G i lTuG i uuGGAA

?. CTGCC3CTCCATT5AGAACCA7C

CAuTGA i Uu i iv*T'_AAioGAGCj 15 c. AC7GC7GA7ACC7TCAGAAAG77

10. GA.474AC77TCTGAAGG7ATCAG

11. ATTCAGAG77TAC7CCAACTTCT

12- CTCAAGAAGTTGGAGTAAACTCT

20 13. TGAGAGGTAAATTGAAGTTGTACAC

14. ACCCGTGTACAACTTCAATTTACCT

15. CGGTGAAGCCTGTAGAACTGG7

25 16. CTGTCACCAG7TCTACAGGCTTC

17. GACAGA7AAGCCCGACTGATAA

13. GTTGTTATCAGTCGGGCTTAT

19. CAACAGTG7AGA7GTAACAAAG

30 20. TCGACTTTGTTACATCTACACT 1

Tabel XX

SCEPO-Sektion 3 75 DK 172611 B1 5 BamHl 6olII 1 GA7C CAGA7CTTTG ACTACTTTGT TGAGAGCTTT GTCTAGAAAC TGATGAAACA ACTCT^GAAA 2 3 5

GGGTGCTCAA AAGGAAGtCA TTTCCCCACC AGACGCTGCT 7CTGCCGCTC 10 CCCACGAG7T TTCCTTCGGT'Å^AGGGGTGG TC7GCGACGA aSACITGCGAG

£ å 7 9 n CA7TGAGAAC CA7C£C7GC7 GA7ACCT7CA GAAAGT7fr77 CAGAG77T.-C G 7 AAC . C i 7G '.j i A G » G A C C A CiAioGAAGi C7 i »A A i A A G IT C i C A A A i u a 1 10 12 15 ~ ~ ~

11 11 7CCAAC77C7 |7 G A G A G G 7 A A A77GAAG77G TACACCGG7 G AAGCC7G7 AG AGG77GAAGA Au7Cf7CCA77 TAACT7CAAC A7G7GGC:.-C 77CGGACA7C

’ 1A ‘ Il il il

20 AAC7GG7fcAC AGA7AAGCCC GAC7GA7AA]: A.ACAGTG7AG TTGACCAC7G 7CfTA77CGGG C7GACTA77G 7T37CACA7C

il

Sall ATG7AACAAA G TACA7TG7TT CAGCT 25 20 DK 172611 B1 76

Tabel XXI SCEPO-Gen -1 +i

Hindlll ArgAla 5 Sgcttggata aaagagctcc accaagattg atctgtgact cgagagtttt

ACCTAT TTTCTCGAGG TGGTTCTAAC TAGACACTGA GCTCTCAAAA

GGAAAGATAC TTGTTGGAAG CTAAAGAAGC TGAAAACATC ACCACTGGTT

CCTTTCTATG AACAACCTTC GATTTCTTCG ACTTTTGTAG TGGTGACCAA

10 GTGCTGAACA CTGT7CTT7G AACGAAAACA 77ACGG7ACC AGACACGAAG

CACGAC77G7 GACAAGAAAC 77GC7777G7 AA7GCGA7GG 7C7G7GG7TC

; i AAC : i C7 AC3C . GGAA Av-3i"i7GuAA Gi ί G G C A A u A A G C c i CAA77GAAGA T3CGAACG77 7GCA7ACC77 CAACCAG77G 77CGACAAC7

15 AG7T7GGCAA GG777GGCC7 7G77A7C7GA AGC7G7777G AGAGG7CA.AG

7CAAACCG77 CCAAACCGGA ACAA7AGAC7 7CGACAA.AAC 7C7CCAGT7C

CC77G77GG7 7AAC7CT7C7 CAACCA7GGG AACCA77GCA A77GCACG7C

GGAACAACCA A77GAGAAGA G77GG7ACCC 77GG7AACG7 7AACG7GCAG

20 GATAAAGCCG 7C7C7GG777 GAGA7C777G AC7AC777G7 7GAGAGC777

C7A77TCGGC AGAGACCAAA C7C7AGAAAC 7GA7GAAACA ACTC7CGAAA

GGG7GC7CAA AAGGAAGCCA 777CCCCACC AGACGC7GC7 7C7GCCGCTC

CCCACGAG77 77CC77CGGT AAAGGGGTGG 7C7GCGACGA AGACGGCGAG

25 CAT7GAGAAC CA7CAC7GC7 GA7ACC77CA GAAAG7TA77 CAGAG777AC

G7AAC7C77G G7AG7GACGA C7A7GGAAG7 C777CAA7AA G7C7CAAA7G

7CCAAC77C7 7GAGAGG7AA A77GAAG77G 7ACACCGG7G AAGCC7Q7AG

AGG77GAAGA AC7C7CCA77 7AAC77CAAC A7G7GGCCAC 77CGGACA7C

30 AAC7GG7GAC AGA7AAGCCC GAC7GA7AAC AACAG7G7AG

77GACCAC7G 7C7A77CGGG C7GAC7A77G 77G7CACA7C

Sall A7G7AACAAA G TACA7TG77T CAGC7 1 77 DK 172611 B1

De samlede SCEPO-sektloner blev sekvens-bestemt i M13, og sektioner 1, 2 og 3 var isolerbare fra phagerne som Hindlll/Kpnl, KpnI/BgIII og BglII/SaII-fragmenter.

Det for nærværende foretrukne ekspressionssytem 5 for SCEPO-genprodukter er et sekretionssystem baseret på S.cerevisiae α-faktor-sekretion, som beskrevet i US patentansøgning Serial nr. 487.753, indleveret 22. april 1983, Grant A.Bitter, publiceret 31. oktober 1984 som europæisk patentansøgning 0.123.294. Kort 10 angivet, involverer systemet konstruktioner, hvori DNA, der indkoder førersekvensen af gær-a-faktor-gen-produktet, er beliggende umiddelbart 5' til kodningsregionen for det exogene gen, der skal eksprimeres.

Som et resultat inkluderer det translaterede genprodukt 15 en fører- eller signal-sekvens, der "forarbejdes væk" af et endogent gær-enzym under sekretionsforløbet for resten af produktet. Da konstruktionen gør brug af a-faktor-translationsinitierings (ATG) -codon'en, var der intet behov for at tilvejebringe en sådan codon ved 20 positionen -1 af SCEPO-genet. Som det vil bemærkes af Tabel XXI, ligger der forud for den alanin(+l)-indkodende sekvens en lænkersekvens, der tillader direkte indføring i et plasmid inkluderende DNA'et for de første 80 rester af α-faktor-føreren, der efter-25 følger α-faktor-promotoren. Den specifikt foretrukne konstruktion for SCEPO-gen-ekspression involverede en fireparts-ligering inkluderende de ovennævnte SCEPO-sektionfragmenter og det store fragment fra Hindlll/-Sall-dlgererlng af plasmid paC3. Fra det resulterende 30 plasmid paC^/SCEPO blev a-faktor-promotor- og -fører-sekvensen og SCEPO-genet isoleret ved digerering med BamHI og ligeret ind i BamHI-digereret plasmid pYE til dannelse af ekspressionsplasmid pYE/SCEPO. 1

Eksempel 12

Dette eksempel angår ekspression af rekombinant-produkter af de fabrikerede ECEPO- og SCEPO-gener inden i ekspressionssystemerne fra Eksempel 11.

78 DK 172611 B1

Ved anvendelse af ekspressionssystemet konstrueret til brug af E.coli-værtceller blev plasmid p536 fra Eksempel 11 transformeret til AM7 E.coli-celler, der.forud var transformeret med et passende plasmid,

5 pMWl, der huser et CIg57-gen. Cellekulturer i LB

kulturvæske (ampicillin 50 ug/ml og kanamycin 5 ug/ml, fortrinsvis med 10 mM MgSO^) holdtes ved 28°C, og efter vækst af celler i kultur til O.D.ggg ** 0,1, blev EPO-ekspression induceret ved at hæve kultur-10 temperaturen til 42°C. Celler dyrket til ca. 40 O.D. tilvejebragte EPO-produktion (vurderet med gel) på ca. 5 mg/OD.liter.

Celler blev indhøstet, underkastet lysis, brudt med French Press (10.000 psi) og behandlet med lysozym 15 og NP-40 detergens. Den resulterende pellet fra 24.000 xg centrifugering blev opløseliggjort med guanidin-HC1 og underkastet yderligere rensning i et enkelt trin ved hjælp af (Vydac) Reverse Phase HPLC (EtOH, 0-80%, 50 mM NH^Ac, pH 4,5). Protein-sekvens-20 bestemmelse viste produktet som mere end 95% rent, og de vundne produkter viste to forskellige amino- terminaler, A-P-P-R___ og P-P-R___ i et relativt mængdeforhold på ca. 3 til 1. Sidstnævnte observation af hEPO- og [des Ala^JhEPO-produkter viser, at amino-25 terminal-"forarbejdning" inden i værtcellerne tjener til at fjerne det terminale methionin og i nogle tilfælde det indledende alanin. Radioimmunoprøve-aktivitet for isolaterne lå ved et niveau på 150.000 til 160.000 E/mg, iji vitro-prøve-aktivitet lå ved et niveau på 30 30.000 til 62.000 E/mg, og JLn vivo-prøve-aktivitet lå i området fra ca. 120 til 720 E/mg. (Jfr. human urinær isolat-standard på 70.000 E/mg i hver prøve). Dosis/-resporjs-kurven for rekombinant-produktet ved irj vlvo-prøven afveg markant fra kurven for den humane urinære 35 EPO-standard.

EPO-analog-plasmiderne dannet i delene A og B af Eksempel 11 blev hver transformeret ind i pMWl-trans-formerede AM7 E.coli-celler, og cellerne blev dyrket 79 DK 172611 B1 som ovenfor. Rensede isolater blev testet ved både RIA- og in vitro-prøver. RIA- og in vitro-prøveværdier for 2 2 β " [Asn , des-Pro til Ile ]hEPO-ekspressionsprodukter var henholdsvis ca. 11.000 E/mg og 6.000 E/mg protein, 5 mens prøveværdierne for [His7]hEPO var henholdsvis ca.

41.000 E/mg og 14.000 E/mg protein, hvilket viser, at de analoge produkter var fra en fjerdedel til en tiendedel så "aktive" som "stam"-ekspressionsproduktet ved prøverne.

10 I ekspressionssystemet konstrueret til anvendelse af S.cerevisiae-værtceller blev plasmid pYE/SCEPO transformeret Ind i to forskellige stammer, YSDP4 (genotype pep4-3 trpl· og RK81 (genotype αα pep4-3 trpl). Transformerede YSDP4-værter blev dyrket i SD medium (Methods in Yeast Genetics,

Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., side 62 (1983)) suppleret med casaminosyrer ved 0,5%, pH 6,5 ved 30°C.

Medium indhøstet, efter at cellerne var dyrket til 36 O.D., indeholdt EPO-produkter ved niveauer på ca. 244 E/ml (97 yg/OD.liter ved RIA). Transformerede RK81-celler dyrket 20 til enten 6,5 O.D. eller 60 O.D. tilvejebragte medier med EPO-koncentrationer på ca. 80-90 E/ml (34 yg/OD.liter ved RIA). Præliminære analyser viste signifikant heterogenitet I produkter produceret af ekspressionssystemet, og som formentlig skyldes variationer i glycosylering af 25 eksprimerede proteiner, og relativt højt mannose-indhold hos det forbundne carbohydrat.

Plasmider P<*C3 og pYE i HB101 E.coli-celler blev ifølge U.S. Patent Office Rules of Practice deponeret den 27. september 1984 I the American Type Culture Collec-30 tion, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, under deponeringsnumrene henholdsvis A.T.C.C. 39881 og A.T.C.C.

39882. Plasmider pCFM526 i AM7-celler, pCFM536 i JM103-celler og pMWl i JMl03-celler blev ligeledes deponeret 21 november 1984 som henholdsvis A.T.C.C.33932, 33934 og 33933. Saccharomyces cerevisiae- stammer YSPD4 og RK81 blev deponeret 21 november 1984 som henholdsvis A.T.C.C.

80 DK 172611 B1 20734 og 20733.

Eksempel 13

Ved en sammenlignende undersøgelse foretaget af en 5 uafhængig trediemand (Cbugai Pharmaceutical Co., Ltd.) bestemtes in vivo aktiviteten både for høj oprenset humant erythropoietin fremstillet udfra urin (uEPO) og for re-kombinant humant erythropoietin ifølge opfindelsen (rEPO), idet man ved undersøgelsen benyttede polycytæmi-10 ske mus og fo2retog fire fortyndinger i området 100-1000 mE/ml. Vægten af de to proteiner blev vurderet ud fra en kvantitativ aminosyreanalyse - uden glycosylering - og man fandt en aktivitet på 132 000 E/mg for uEPO og over 200 000 E/mg for rEPO, dvs en over 1,5 gange forøget 15 aktivitet. Litteraturværdier for aktiviteten af uEPO ligger i området 70 400 - 81 600 E/mg {vægt angivet for det glycosylerede protein),· under samme forhold kan aktiviteten for rEPO anslås til omkring 140 000 E/mg.

Aktiviteterne in vitro for uEPO og rEPO var sammen-20 lignelige.

Det vil være indlysende på baggrund af de ovennævnte eksempler, at adskillige exceptionelt værdifulde produkter og fremgangsmåder er tilvejebragt gennem den foreliggende opfindelse i dens mange aspekter.

25 Polypetider tilvejebragt gennem opfindelsen er ty deligt nyttige materialer, uanset om de er mikrobielt eksprimerede produkter eller syntetiske produkter, hvis primære, sekundære eller tertiære strukturelle opbygning for første gang er gjort kendt gennem den foreliggende 30 opfindelse.

Som ovenfor anført deler rekombinant-producerede og syntetiske produkter ifølge opfindelsen i det væsentlige den biologiske in vitro-aktivitet af EPO-isolater fra naturlige kilder og er derfor planlagt til at have 35 anvendelighed som substituter for EPO-isolater i kulturmedier anvendt til dyrkning af erythropoietiske celler i kultur. Tilsvarende er polypeptidprodukter ifølge opfindelsen med i det væsentlige s arme in vivo—aktivitet scm naturlige EPO-isolater tydeligt egnede til anvendel- 81 DK 172611 B1 se i erythropoietin-terapiprocesser praktiseret på pattedyr, inklusive mennesker, med henblik på at udvikle en hvilken som helst af eller alle de effekter, der hertil er tillagt EPO in vivo, f. eks. stimulation af retuculo-5 cyt-respons, udvikling af ferrokinetiske effekter (såsom plasmajern-omorganiseringseffekter og marvtransittidseffekter} , erythrocytmasseændringer, stimulation af hæ-maglobin C-syntese (se Eschbach, et al., supra) og, som anført i Eksempel 10, stigende haematocrit -niveauer hos 10 pattedyr. Inkluderet i klassen af mennesker, der kan behandles med produkter ifølge opfindelsen, er patienter, der generelt kræver blodtransfusioner og inkluderer traum-ofre, kirurgiske patienter, nyresygdomspatienter inklusive dialysepatienter, og patienter med forskellige blod-15 kompositionspåvirkende sygdomme, såsom haanofili, segl-cellesygdom, fysiologiske anæmier og lignende. Minimering af behovet for transfusionsterapi gennem anvendelse af EPO-terapi kan forventes at resultere i transmission af inficerende· midler. Produkter ifølge opfindelsen kan, som 20 fdige af deres fremstilling ved rekombinantmetoder, forventes at være frie for pyrogener, naturlige inhibitori-ske stoffer, og lignende, og de vil derfor formodentlig tilvejebringe forbedret total effektivitet ved terapeutiske processer vis-a-vis produkter af naturlig oprin-25 delse. Erythropoietin-terapi med produkter ifølge opfindelsen forventes også at være nyttig ved fremme af oxygenbærende kapacitet hos individer, der udsættes for hy-poxiske miljøbetingelser, og muligvis i henseende til at tilvejebringe gunstige cardiovasculare effekter.

30 En foretrukket fremgangsmåde til anvendelse af po- lypeptidsprodukter ifølge opfindelsen er ad parenteral ( f.eks. i.v., i.m., s.c. eller i.p.) vej, og de anvendte kompositioner Vil ± almindelighed inkludere terapeutisk effektive produktmængder i kombination med accep-35 table fortyndingsmidler, bærere og/eller hjælpestoffer. Præliminære farmakokinetiske undersøgelser indicerer en længere halveringstid in vivo for abe-EPO-produkter, når de indgives i.m. i stedet for i.v. Effektive doser 82 DK 172611 B1 forventes at variere betydeligt alt efter den behandlede tilstand, men terapeutiske doser forventes for nærværende at ligge i området fra 0,1 (~7E) til 100 (~7000 E) yg/ kg legemsvægt af det aktive materiale. Standard-fortyn-5 dingsmidler, såsom humant serumalbumin, kommer i betragtning til farmaceutiske kompositioner ifølge opfindelsen ligesom standardbærere, såsom saltopløsning.

Hjælpematerialer til evt. anvendelse sammen med præparater ifølge opfindelsen inkluderer forbindelser, der uaf-10 hængigt er bemærket for erythropoietiske stimulatoriske effekter, såsom testosteroner, progenitorcellestimulato-rer, insulin-lignende vækstfaktor, prostaglandiner, se-totonin, cyclisk AMP, prolactin og triiodtheronin, samt midler, der er almindeligt anvendt ved behandling af 15 aplastisk anæni, såsom methenolen stanazolol og nandro-lon [se f.eks. Resegotti, et al., Panminerva Medica,23, 243-248 (1981), McGonigle, et al., Kidney Int., 25 (2), 437-444 (1984), Pavlovic-Kantera, et al., Expt. Hematol., 8(Supp. 8), 283-291 (1980) og Kurtz, FEBS Letters, 14a 20 (1) .105-108 (1982)] . Som hjælpemidler kommer ognå sådan ne stoffer i betragtning, der er rapporteret at fremme effekterne af eller synergisere erythropoietin eller asi-alo-EPO, såsom adrenergiske agonister, thyroide hormoner, androgener og BPA [se Dunn, "Current Concepts in Ery-25 thropoiesis", John Wiley and Sons (Chichester, England, 1983) , Weiland, et al., Blut, 44 (3), 173-175 (1982),

Kalmanti, Kidney Int., 22, 383-391 (1981); Shahidi, New Eng. J.Med., 289, 72-80 (1973), Fisher, et al., Steroids, 30(6), 833-845 (1977), Urabe, et al., J.Exp.Med., 149, 30 1314-1325 (1979), og Billat, et al., Expt.Hematol., 10(1), 133-140 (1982)] samt de forbindelsesklasser, der betegnes "hepatiske erythropoietiske faktorer" [se Naughton, et al., Acta.Haemat. , 69_, 171-179 (1983)] og "erythrotropiner" [som heskrevet af Congote, et al., 35 i Abstract 364, Proceedings 7th International Congress of Endocrinology (Quebec City, Quebec, 1.-7. juli, 1984) , Congote, Blochem.Biophys.Res.Comm., 115(2), 447-483 (1983), og Congote, Anal.Biochem., 140, 428-433 83 DK 172611 B1 (1984)], og "erythrogeniner" [som beskrevet i Rothman, et al., J.Surg.Oncol., 2j), 105-108 (1982)]. Præliminære screeninger beregnet til at måle erythropoietiske responser hos ex-hypoxiske polycythemiske mus forbe-5 handlet med enten 5-a-dihydrotestosteron eller nandrolon og derefter givet erythropoietin ifølge opfindelsen har vist tvetydige resultater.

Diagnostiske anvendelser af polypeptider ifølge opfindelsen er tilsvarende ekstensive og omfatter an-10 vendelse i mærkede og ikke-mærkede former ved forskellig immunoprøveteknik inkluderende RlA'er, ELISA'er og lignende, samt forskellige in vitro- og in vivo-aktlvitetsprøver. Se f.eks. Dunn, et al.,

Expt.Hematol., 11(7), 590-600 (1983), Gibson, et al., 15 Pathology, 16, 155-156 (1984), Krystal, Expt.Hematol., 11 (7), 649-660 (1983), Saito, et al.. Jap.J.Med., 23(1), 16-21 (1984), Nathan, et al., New Eng.J.Med., 308(9), 520-522 (1983), og forskellige referencer vedrørende prøvemetoder omtalt deri.

20 Selvom de deducerede aminosyrerest-sekvenser af pattedyr-EPO tilvejebragt gennem de illustrerende eksempler hovedsageligt definerer den primære strukturelle udformning af modent EPO, vil det forstås, at den specifikke sekvens af 165 aminosyrerester fra abeart-25 EPO i Tabel V og de 166 rester fra humant EPO i Tabel VI ikke er da eneste nyttige polypeptider tilvejebragt gennem opfindelsen. Omfattet af opfindelsen er de forskellige naturligt forekommende alleliske former af EPO, som tidligere forskning vedrørende 30 biologisk aktive pattedyr-polypeptider, såsom humant α-interferon, viser formodentlig eksisterer. (Jfr. f.eks. de humane immune Interferonarter, der 1 den publicerede europæiske ansøgning 0.077.670 er rapporteret at have en arginin-rest ved position nr. 140, og de arter, 35 der i Gray, et al., Nature, 295, side 503-508 (1982), er rapporteret at have glutamin ved position nr. 140.

Begge arter er karakteriseret som udgørende "modne" humane Ύ-interferon-sekvenser). Alleliske former af 84 DK 172611 B1 modne EPO-polypeptider Jean variere indbyrdes og fra sekvenserne i tabellerne V og VI med hensyn til sekvenslængde og/eller med hensyn til udeladelser, substitutioner, indføjelser eller additioner af amino-5 syrer i sekvensen med deraf følgende potentielle . variationer i evnen til glycosylering. Som ovenfor bemærket, menes én mulig allelisk form af EPO af human art at inkludere en methionin-rest ved position 126.

Der vil også kunne forventes at findes naturligt fore-10 kommende alleliske former af EPO-indkodende geometriske DNA- og cDNA-sekvenser, der koder for de ovennævnte typer af alleliske polypeptider eller simpelthen benytter forskellige condon'er til konstruktion af de samme, specificerede polypeptider.

15 Foruden naturligt forekommende alleliske former af modent EPO omfatter den foreliggende opfindelse også andre "EPO-produkter", såsom polypeptid-analoge af EPO og fragmenter af "modent" EPO. Ved at følge processerne fra den ovennævnte publicerede ansøgning fra Alton, 20 et al. (WO/83/04053) kan let konstrueres og fabrikeres gener, der koder for mikrobiel ekspression af polypeptider med primære udformninger, der afviger fra den heri for modent EPO specificerede i henseende til identiteten eller beliggenheden af én eller flere rester 25 (f.eks. substitutioner, terminale og intermediære additioner og udeladelser). Alternativt kan modifikationer af cDNA- og genomiske EPO-gener let udføres ved velkendte former for positions-rettet mutagenese-teknik og anvendes til at udvikle analoge og derivater 30 af EPO. Sådanne omhandlede EPO-produkter vil i det væsentlige have samme’biologisk virkning som EPO.

Som eksempler omfatter projekterede EPO-produkter ifølge opfindelsen produkter, der er for- 2 2 kortet ved f.eks. udeladelser [Asn , des-Pro til 35 Ile6]hEP0, [des-Thr163 til Arg166]hEPO og "å27-55hEPO", hvor sidstnævnte mangler resterne kodet for ved hjælp af en total exon; eller produkter, som er mere stabile over for hydrolyse (og derfor kan have mere tydelige 85 DK 172611 B1 eller længere varende effekter end naturligt forekommende EPO); eller produkter som er ændret for at udelade ét eller flere potentielle steder for glyco-sylering (hvilket kan resultere i højere aktiviteter 5 for gær-producerede produkter)* eller produkter, hvori én eller flere cystein-rester er udeladt eller erstattet med f.eks. histidin- eller serin-rester (såsom den 7 analoge iHis JhEPO), og som potentielt lettere isoleres i aktiv form fra mikrobielle systemer* eller 10 produkter, som har én eller flere tyrosin-rester erstattet med phenylalanin (såsom de analoge [Phe1^~]hEPO, [Phe49 JhEPO og [Phe145 JhEPO), og som kan binde mere eller mindre let til EPO-receptorer på målcellerne.

Ligeledes omfattet er polypeptid-fragmenter, der kun 15 duplikerer en del af den kontinuerte aminosyre-sekvens eller af de sekundære udformninger i det indre af modent EPO, hvilke fragmenter kan have én af EPO’s aktiviteter (f.eks. receptorbinding) og ikke andre (f.eks. ery-thropoietisk aktivitet). Særligt signifikante i denne 20 henseende er de potentielle fragmenter af EPO, der vil kunne udledes på basis af den i Tabel VI viste humane genomiske DNA-sekvens, dvs. "fragmenter" af den totale kontinuerte EPO-sekvens, der er aftegnet af intron-sekvenser, og som kan udgøre særskilte"domæner" for 25 biologisk aktivitet. Det er bemærkelsesværdigt, at fravær af in vivo-aktivitet hos ét eller flere af "EPO-produkterne" ifølge opfindelsen ikke helt udelukker terapeutisk anvendelighed (se Weiland, et al., supra) eller anvendelighed i andre sammenhænge, såsom ved EPO-30 prøver eller EPO-antagonisme. Antagonister for erythropoietin kan være ganske nyttige ved behandling af polycythemier eller tilfælde med overproduktion af EPO [se f.eks. Adamson, Hosp.Practice, 18(12), 49-57 (1983), og Hellmann, et al., Clin.Lab.Haemat., 5, 35 335-342 (1983)J.

De her bekrevne klonede DNA-sekvenser, der indkoder humane og abe-EPO-polypeptider, er tydeligt værdi- 86 DK 172611 B1 fulde for den information, som de tilvejebringer vedrørende aminosyre-sekvensen af priSiat -erythropoietin, som hidtil ikke har været tilgængelig trods årtiers analytisk forarbejdning af isolater af naturligt fore-5 kommende produkter. DNA-sekvenserne er også tydeligt værdifulde som produkter, der er anvendelige til gennemførelse af mikrobiel syntese i stor målestok af erythropoietin ved forskellige former for rekombinant-teknik. Sagt på en anden måde er DNA-sekvenser, der er 10 tilvejebragt gennem den foreliggende opfindelse, anvendelige ved udvikling af hidtil ukendte og nyttige virale og cirkulære plasmid DNA-vektorer, hidtil ukendte og nyttige transformerede og transficerede mikrobielle prokaryotiske og eukaryotiske værtceller (inkluderende 15 bakterie- og gærceller og pattedyrceller dyrket i kultur), og hidtil ukendte og nyttige fremgangsmåder til kulturdyrkning af sådanne mikrobielle værtceller, der er i stand til at eksprimere EPO og EPO-produkter. DNA-sekvenser ifølge opfindelsen er også tydeligt egnede 20 materialer til anvendelse som mærkede prober ved isolering af EPO- og beslægtede protein-indkodende cDNA- og genomiske DNA-sekvenser fra pattedyrarter forskellige fra heri særligt illustrerede humane arter og abe-arter. Den grad, hvori DNA-sekvenser ifølge opfindelsen 25 vil finde anvendelse ved forskellige alternative fremgangsmåder til proteinsyntese (f.eks. i insektceller) eller inden for genetisk terapi til mennesker og andre pattedyr kan ikke endnu beregnes. DNA-sekvenser ifølge opfindelsen forventes at blive anvendelige ved ud-30 vikling af transgeniske pattedyrarter, der kan tjene som eukaryotiske "værter" for produktion af erythropoietin og erythropoietin-produkter i stor mængde. Se generelt Palmiter, et al., Science, 222(4625), 809-814 (1983).

Det kan til slut nævnes, at blandet probe-teknik som heri illustreret generelt udgør en række forbedringer ved hybridiseringsprocesser, hvorved der muliggøres hurtigere og mere pålidelige polynu- 87 DK 172611 B1 cleotid-isoleringer. Disse mange individuelle procesforbedringer omfatter: forbedret koloni-overførings- og -bevaringsprocesser, anvendelse af nylon-baserede filtre, sisom GeneScreen og GeneScreen Plus, som tillader re-5 probning med samme filtre og gentagen anvendelse af filteret; anvendelse af hidtil ukendte protease-behandlinger [sammenlignet med f.eks. Taub, et al.,

Anal.Biochem., 126, side 222-230 (1982)]; anvendelse af meget lave individuelle koncentrationer (af stør-10 relsesorden 0,025 picomol) af et stort antal blandede prober (f.eks. antal på over 32); og gennemførelse af hybridiserings- og post-hybridiseringstrin under strenge temperaturer, der ligger nær (dvs. inden for 4°C og fortrinsvis inden for 2°C) fra den laveste beregnede dissocieringstemperatur for enhver af de anvendte blandede prober. Disse forbedringer fører kombineret til resultater, der ikke kunne forventes at ledsage deres anvendelse. Dette er rigeligt illustreret ved den kendsgerning, at metoder med blandede prober in-20 volverende 4 gange det antal prober, der nogensinde tidligere er rapporteret anvendt med held ved lige cDNA-screeninger på messenger RNA-arter af relativt lav rigelighed, med held er anvendt til isolering af et gen med unik sekvens ved en genomisk bibliotek-25 screening af 1.500.000 phag-plaque'er. Denne bedrift blev gennemført i det væsentlige samtidigt med publiceringen af den opfattelse ifølge Anderson, et al., supra , at screeningsmetoder med blandede prober var ".......impractical for isolation of mammalian protein 30 genes when corresponding RNA's are unavailable".

Claims (24)

1. 88 DK 172611 B1
2. 1. Renset og isoleret DNA-sekvens, der koder for erythropoietin og derivater deraf med samme biologiske virkning, kendetegnet ved, at nævnte DNA-sekvens er valgt blandt: (a) DNA-sekvenser anført i tabellerne V og VI eller deres komplementære strenge, (b) DNA-sekvenser, der under stringente betingelser hybridiserer til DNA-sekvenser defineret under (a) eller fragmenter deraf, og (c) DNA-sekvenser, der, hvis det ikke var for degenerationen af den genetiske kode, ville hybridisere til DNA-sekvenserne defineret under (a) og (b).
3. 2. Renset og isoleret DNA-sekvens ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den koder for humant erythropoietin. 3. cDNA-sekvens ifølge krav 2.
4. 4. Genomisk DNA-sekvens ifølge krav 2.
5. 5. DNA-sekvens ifølge krav 2, kendetegnet ved, at den koder for [Phe13]hEPO, [Phe49]hEPO, [Phe145JhEPO, [His7]hEPO, [Asn2 des-Pro2 til Ile6]hEPO, [des-Thr163 til Arg166]hEPO eller [Δ 27-55]hEPO.
6. 6. Prokaryotisk værtscelle, kendetegnet ved, at den er transformeret eller transficeret med en DNA-sekvens ifølge krav 1 eller 2 på en måde, der tillader værtscellen at eksprimere erythropoietin. 89 DK 172611 B1
7. 7. Eukaryotisk værtscelle, kendetegnet ved, at a) den er transformeret eller transficeret med en DNA-sekvens ifølge krav 1 eller 2 på en måde, der tillader værtscellen at eksprimere erythropoietin, og/eller b) den er en hvirveldyrscelle omfattende promotor DNA, der afviger fra human erythropoietin promotor DNA, operativt forbundet med DNA kodende for den i tabel VI anførte aminosyresekvens for modent humant EPO, eller c) den er en hvirveldyrscelle omfattende amplifikeret DNA kodende for den i tabel VI anførte aminosyresekvens for modent humant EPO.
8. 8. Værtscelle ifølge krav 7b), kendetegnet ved, at nævnte promotor DNA er viral promotor DNA.
9. 9. Værtscelle ifølge krav 7c), kendetegnet ved, at hvirveldyrscellerne yderligere omfatter amplifikeret markørgen DNA.
10. 10. Værtscelle ifølge krav 9, kendetegnet ved, at det amplifikerede markørgen DNA er di-hydrofolatreduktase (DHFR) gen DNA.
11. 11. Værtscelle ifølge krav 7, kendetegnet ved, at den eksprimerer glycosyleret erythropoietin.
12. 12. Pattedyrsceller ifølge krav 11.
13. 13. Transformeret eller transficeret COS-celle ifølge krav 12.
14. 14. Transformeret eller transficeret CHO-celle ifølge krav 12.
15. 15. Polypeptidprodukt, kendetegnet ved, at det stammer fra ekspression af en DNA-sekvens i en prokaryotisk vært ifølge krav 6.
16. 16. Polypeptidprodukt, kendetegnet ved, at det stammer fra ekspression af en DNA-sekvens i en eukaryotisk vært ifølge krav 7. 90 DK 172611 B1
17. 17. Biologisk funktionel cirkulær plasmid- eller viral DNA-vektor, kendetegnet ved, at den inkluderer en DNA-sekvens ifølge krav 1 eller 2.
18. 18. Prokaryotisk eller eukaryotisk værtscelle, kendetegnet ved, at den er stabilt transformeret eller transficeret med en DNA-vektor ifølge krav 17.
19. 19. Polypeptidprodukt, kendetegnet ved, at det stammer fra ekspression i en prokaryotisk eller eukaryotisk værtscelle af en DNA-vektor ifølge krav 17.
20. 20. Fremgangsmåde til fremstilling af et polypep-tidprodukt, kendetegnet ved, at prokaryoti-ske eller eukaryotiske værtsceller, der er transformeret eller transficeret med en DNA-sekvens ifølge krav 1 eller 2, dyrkes under egnede næringsbetingelser, og at ønskede polypeptidprodukter fra ekspressionen af nævnte DNA-sekvenser isoleres.
21. 21. Polypeptidprodukt, kendetegnet ved, at det er produktet af en fremgangsmåde, hvorved proka-ryotiske eller eukaryotiske værtsceller, der er transformeret eller transficeret med en DNA-sekvens ifølge krav 1 eller 2, dyrkes under egnede næringsbetingelser, og at ønskede polypeptidprodukter fra ekspressionen af nævnte DNA-sekvenser isoleres.
22. 22. Glycoproteinprodukt ifølge krav 21, kendetegnet ved, at det har en gennemsnitlig carbohy- dratsammensætning, der afviger fra den gennemsnitlige carbohydratsammensætning af naturligt forekommende erythropoietin.
23. 23. Farmaceutisk præparat, kendetegnet ved, at det indeholder en effektiv mængde af et poly-peptid ifølge krav 15, 16, 19, 21 og 22 og et farmaceutisk acceptablet fortyndingsmiddel, hjælpestof eller bærestof. 91 DK 172611 B1
24. 24. Anvendelse af et polypeptid ifølge krav 15, 16, 19, 21 og 22 til fremstilling af et lægemiddel til erythropoietin-terapi.