DD251786A5 - Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids - Google Patents

Abstract

Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids mit einem Teil oder der ganzen primaeren strukturellen Gestaltung und einer oder mehreren biologischen Funktionen des natuerlich vorkommenden Erythropoietins, gekennzeichnet durch (a) das Zuechten - unter geeigneten Bedingungen - von procaryotischen oder eucaryotischen Wirtszellen, umgestaltet oder uebertragen mit einem biologisch aktiven, kreisfoermigen Plasmid oder einem Virus-DNS-Vektor, einschliesslich einer gereinigten und isolierten DNS-Sequenzkodierung fuer den procaryotischen oder eucaryotischen Wirtsausdruck eines Polypeptids mit einem Teil oder der ganzen primaeren strukturellen Gestaltung und einer oder mehreren biologischen Eigenschaften vom Erythropoietin und durch (b) die Isolierung der gewuenschten Polypeptidprodukte des Ausdruckes der DNS-Sequenzen im genannten Vektor.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids. Allgemein bezieht sich die Erfindung auf die Manipulation genetischer Materialien, insbesondere auf rekombinante Verfahren, die die Herstellung von Polypeptiden ermöglichen, die teilweise oder insgesamt die primäre strukturelle Anordnung aufweisen und/oder eine oder mehrere der biologischen Eigenschaften natürlich vorkommenden Erythropoietins.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

A. Manipulation von genetischen Materialien

Genetische Materialien können weitgehend als jene chemischen Substanzen definiert werden, die für die Herstellung von Zellbestandteilen und Viren programmieren und diese Vorgänge lenken und die Reaktion von Zellen und Viren ausrichten. Eine langkettige polymere Substanz, die als Desoxyribonucleinsäure (DNA) bekannt ist, enthält das genetische Material aller lebenden Zellen und Viren, mit Ausnahme bestimmter Viren, die durch die Ribonucleinsäuren (RNA) programmiert werden; Die wiederkehrenden Einheiten in DNA-Polymeren sind vier unterschiedliche Nucleotide, wobei jenes von ihnen entweder aus einem Purin (Adenin oder Guanin) oder einem Pyrimidin (Thymin oder Cytosin) besteht, gefunden an einen Desoxyribosezucker, an den eine Phosphatgruppe angefügt ist. Die Anfügung von Nucleotiden in linearer Form erfolgt über die Fusion 5'-Phosphates eines Nucleotids an die 3'-Hydroxy-Gruppe eines anderen. Funktionelle DNA tritt in Form stabiler doppelsträngiger Zusammenlagerungen einzelsträngiger Nucleotide auf (bekannt als Desoxyoligonucleotide), wobei sich diese Zusammenlagerungen durch Wasserstoffbindung zwischen Purin- und Pyrimidinbasen ergeben (z. B. „komplementäre" Zusammenlagerungen, die entweder zwischen Adenin [A] und Thymin [T] oder Guanin [G] und Cytosin [C] bestehen). Durch Übereinkommen werden die Nucleotide durch die Namen ihrer konstitutionellen Purin- oder Pyrimidinbasen bezeichnet, und die komplementären Zusammenlagerungen der Nucleotide in derdoppelsträngigen DNA (z.B. — A-Tund G-C) werden als „Basenpaare" bezeichnet. Ribonucleinsäure ist ein Polynucleotid, bestehend aus Adenin, Guanin, Cytosin und Uracil (U) anstelle von Thymin, gebunden an Ribose und eine Phosphatgruppe.

Zusammengefaßt wird die programmierende Funktion der DNA im allgemeinen durch einen Prozeß bewirkt, bei dem spezifische DNA-Nucelotidsequenzen (Gene) in relativ instabile Boten-RNA (mRNA)-Polymere „transscribiert" werden. Die mRNA dient umgekehrt als eine Schablone für die Bildung struktureller, regulierender und katalytischer Proteine aus Aminosäuren. Zu diesem mRNA-„Translations"prozeß gehören die Operationen kleiner RNA-Stränge (tRNA), die einzelne Aminosäuren am mRNA-Strang entlang transportieren und ausrichten, um die Bildung von Polypeptiden in einwandfreier Aminosäurefolge zu ermöglichen. Die mRNA-„Botschaft", abgeleitet aus der DNA und die Basis für die tRNA-Unterstützung bildend und die Orientierung jeder gegebenen der zwanzig Aminosäuren für die Polypeptid-„Expression", liegt in Form von Dreifach-,,Lodons" vor — aufeinanderfolgende Gruppierungen der drei Nucleotidbasen. In diesem Sinne ist die Bildung eines Proteins die letzte Form der „Expression" der programmierten genetischen Botschaft, die in der Nucleotidsequenz eines Gens vorliegt. „Promotor"-DNA-Sequenzen gehen überlicherweise einem Gen in einem DNA-Polymeren, „voraus" und sehen eine Stelle für die Initiierung derTransskription in mRNA vor. „Regulator"-DNA-Sequenzen, auch üblicherweise oberhalb (upstream) des (z. B. vorausgehenden) Gens in ein einem gegebenen DNA-Polymeren, binden Proteine, die die Frequenz (oder Rate) der Transskriptionsinitiierung bestimmen.

Gemeinsam als „Promotor/Regulator"- oder „Steuerungs"-DNA-Sequenz bezeichnet, arbeiten diese Sequenzen, die einen ausgewählten Gen (oder einer Reihe von Genen) in einem funktionellen DNA-Polymeren vorausgehen, zusammen, um zu bestimmen, ob die Transskription (und eventuell Expression) eines Gens stattfindet. DNA-Sequenzen, die einem Gen in einem DNA-Polymeren „folgen" und ein Signal für die Beendigung der Transskription in mRNA vorsehen, werden als Transskriptions„terminator"-Sequenzen bezeichnet.

Brennpunkt mikrobiologischer Verfahren war im letzten Jahrzehnt der Versuch zur Herstellung industriell und pharmazeutisch bedeutsamer Substanzen unter Verwendung von Organismen, die entweder anfänglich keine genetisch codierte Information hinsichtlichdes gewünschten Produktes in ihrer DNA enthielten oder (im Falle menschlicher Zellen in Kultur) gewöhnlich kein chromosomales Gen mit entsprechenden Gehalten exprimieren. Vereinfacht dargestellt, wird ein Gen, das die Struktur eines gewünschten Polypeptidproduktes spezifiziert, entweder aus einem „Spender" („Donor")-organismus isoliert oder chemisch synthetisiert und dann stabil in einen anderen Organismus eingeführt, der vorzugsweise ein selbstreplizierender, vielzelliger Organismus wie Bakterien-, Hefe- oder Säugetierzellen in Kultur ist.

Wenn dies einmal erfolgt ist, wird der vorhandene Mechanismus für die Genexpresskon in den „transformierten" oder „transferierten" mikrowellen Wirtszellen dazu benutzt, das gewünschte Produkt zu konstruieren, unter Verwendung der exogenen DNA als eine Schablone für die Transskription von mRNA, die dann in eine kontinuierliche Sequenz von Aminosäureresten translatiert wird.

Aus dem Stand derTechnikgibt eine zahlreiche Patent-und Literaturpublikation zu „rekombinanter DNA"-Technik hinsichtlich Isolierung, Synthese, Reinigung und Amplifizierung genetischer Materialien zur Verwendung bei der Transformation ausgewählter Wirtsorganismen. So betrifft beispielsweise die US-PS 4237 224 (Cohen et-al.) die Transformation einzelliger Wirtsorganismen mit „Hybrid"-viraler oder ringförmiger Plasmid-DNA, wozu ausgewählte exogene DNA-Sequenzen gehören. Zu den Verfahrensweisen des Cohen-Patents gehört die Herstellung eines Transformationsvektors durch enzymatisches Schneiden viraler oder ringförmiger Plasmid-DNA, um lineare DNA-Stränge zu bilden. Ausgewählte fremde („exogene" oder „heterologe") DNA-Stränge, zu denen üblicherweise Sequenzen, die für das gewünschte Produkt codieren, gehören, werden in linearer Form durch die Verwendung ähnlicher Enzyme hergestellt. Die lineare virale oder Plasmid-DNA wird mit derfremden DNA in Anwesenheit ligierender Enzyme inkubiert, die in der Lage sind, einen Wiederherstellungsprozeß zu bewirken, und es werden „Hybrid"-Vektoren gebildet, zu denen das ausgewählte exogene DNA-Segment gehört, „gespleißt" in das virale oder kreisförmige DNA-Plasmid.

Die Transformation von kompatiblen einzelligen Wirtsorganismen mit dem Hybridvektor führt zur Bildung von verfielfachten Kopien der exogenen DNA in der Wirtszellenpopulation. In vielen Fällen ist das erwünschte Ergebnis einfach die Amplifizierung der Fremd-DNA, und das gewonnene „Produkt" ist die DNA. Kürzlich wurde darüber berichtet, daß das Endziel der Transformation die Expression durch die Wirtszellen der exogenen DNA in Form einer Synthese im Großmaßstab von isolierbaren Mengen kommerziell bedeutender, dafür codierender Protein- oder Polypeptidfragmente durch die Fremd-DNA ist, siehe auch z. B. US-PS 4264731 (Shine), 4273875 (Manis), 4293652 (Cohen) und EP-OS 093619, veröffentlicht am 9. November 1983.

Die Entwicklung spezifischer DNA-Sequenzen für das Spleißen in DNA-Vektoren erreicht man über eine Vielzahl von Techniken, abhängig im großen Maße vom Grad der „Fremdheit" des „Donors" zum vorgesehenen Wirt und der Größe des im Wirt zu exprimierenden Polypeptids. Zur Gefahr der Über-Vereinfachung kann festgestellt werden, daß drei alternative prinzipielle Methoden eingesetzt werden können: (1) die „Isolierung" der doppelsträngigen DNA-Sequenz aus der genomischen DNA des Donors; (2) die chemische Herstellung einer DNA-Sequenz, die einen Code für ein Polypeptid von Interesse aufweist; und (3) die in vitro-Synthese einer doppelsträngigen DNA-Sequenz durch enzymatische „reverse Transskription" von mRNA, die aus Dono.rzellen isoliert worden ist. Die letztgenannten Methoden, zu denen die Bildung eines DNA-„Komplements" von mRNA gehört, werden allgemein als „cDNA"-Methoden bezeichnet.

Die Herstellung von DNA-Sequenzen wurde kürzlich als Methode der Wahl bezeichnet, wenn die gesamte Sequenz der Aminosäurereste des gewünschten Polypeptidproduktes bekannt ist. DNA-Herstellungsverfahren von der ebenfalls zugeeigneten, anhängigen US-Patentanmeldung Nr.483451 von Alton et al. (eingereicht am 15. April 1983 und korrespondierend zu PCT US 83/00605, veröffentlicht am 24. November 1983 als-WO 83/04053 sehen, beispielsweise weiterführende Mittel vor zur Erreichung solcher höchst wünschenswerter Ergebnisse wie: Vorsehen von alternierenden Codons, die kürzlich in Genen gefunden wurden, die in hohem Maße in den für die Expression ausgewählten Wirtsorganismen exprimiert werden (z. B. Vorsehen von Hefe- oder Eccoli-„Vorzugs"codons) Vermeiden der Anwesenheit untranslatierter „Intron"-Sequenzen (üblicherweise in menschlichen genomischen DNA-Sequenzen und mRNA-Transksripten davon), die nicht leicht durch procaryotische Wirtszellen verarbeitet werden; Vermeiden der Expression unerwünschter „leade^'-Polypeptidsequenzen, die üblicherweise dafür codieren, durch genomische DNA-und cDNA-Sequenzen, jedoch letztens nicht leicht von dem interessierenden Polypeptid durch bakterielle oder Hefe-Wirtszellen abgespalten werden; Vorsehen einer leichten Insertion der DNA in geeignete Expressionsvektoren in Zusammenlagerung mit gewünschten Promotor/Regulator- und Terminator-Sequenzen; und Vorsehen einer leichten Konstruktion von Genen, die für Polypeptidfragmente codieren und Analoge der gewünschten Polypeptide.

Wenn die gesamte Sequenz der Aminosäurereste der gewünschten Polypeptide nicht bekannt ist, ist die direkte Herstellung der DNA-Sequenzen nicht möglich, und die Isolierung von DNA-Sequenzen, die für das Polypeptid codieren, durch eine cDNA-Methode wird die Methode der Wahl, ungeachtet der potentiellen Rückgänge im Spielraum der Gruppe von Expressionsvektoren, die in der Lage sind, einen hohen Grad der mikrowellen Expression, über die oben berichtet wurde, zu verwirklichen. Zu den Standardverfahren zur Isolierung von interessierenden cDNA-Sequenzen gehört die Bereitung von Plasmid-geborenen cDNA-„Bibliotheken", abgeleitet von reverser Transskription von mRNA, reich an Donorzellen, ausgewählt als verantwortlich für einen hohen Grad an Expression von Genen (z. B. Bibliotheken von cDNA, abgeleitet von Hypophysenzellen, die relativ große Mengen an Wachstumshormonprodukten exprimieren.

Wo wesentliche Mengen der Aminosäuresequenzen des Polypeptids bekannt sind, können markierte, einzelsträngige DNA-Sondierungssequenzen eingesetzt werden, die eine vermutlich in der „Target"-cDNA vorhandene Sequenz duplizieren, in DNA/DNA-Hybridisierungsverfahren eingesetzt werden , die auf klonierten Köpfen der cDNA durchgeführt werden, die in eine einzelsträngige Form abgebaut worden waren (siehe allgemein die Offenbarung und die Diskussion des Standes der Technik in der US-PS 4394443 von Weissman et al. und die kürzlich erfolgte Demonstration der Verwendung von langen Oligonucleotidhybridisierungssonden, die von Wallace et al. in Nuc. Acids Res. 6, S. 3543-3557 [1979] und Reyes et al. in P.N.A.S. [USA], 79, S. 3270-3274 (1982) und Jaye et al in Nuc. Acids Res. 11, S. 2325-2335 [1983] berichtet wurden. Siehe auch US-PA 4358535 [Falkowetal.],die sich auf die DNA/DNA-Hybridisierungsverfahren zur Bewirkung der Diagnose bezieht; veröffentlichte Europäische Patentanmeldungen Nr,0070685 und 0070687, die die leicht-emittierenden Markierungen an einzelsträngigen Polynucleotidsonden betreffen; Davis et al. „A Manual for Genetic Engineering, Advanced Bacterial Genetics" [Handbuch der Gentechnik, Fortschritte bakterieller genetischer Methoden], Cold Sspring Harbor Laboratory, Cold Spring

Harbor, N.Y. [1980], Seiten 55-58 und 174-176, betreffend die Kolonie- und Plaque-Hybridisierungstechniken; sowie New England Nuclear (Boston, Mass.) Broschüren für „Gene Screen" Hybridisierungs-Transfermembranmaterialien mit Anweisungen für den Transfer und die Hybridisierung von DNA und RNA, Katalog Nr. NEF-972].

Zu den bedeutendsten Fortschritten der letzten Zeit bei Hybridisierungsverfahren für das Screening rekombinanter Klone gehört die Verwendung markierter gemischter synthetischer Oligonucleotidsonden, von denen jede potentiell das vollständige Gegenstück einer spezifischen DNA-Sequenz in der Hybridisierungsprobe einschließlich eines heterogenen Gemisches einzeisträngiger DNA's oder RNA's ist. Diese Verfahrensweisen wurden als besonders nützlich bei der Feststeilung von cDNA-Klonen bestätigt, die aus solchen Quellen stammten, die extrem niedrige Mengen an mRNA-Sequenzenfürdie interessierenden Polypeptide zulassen. Zusammengefaßt, die Verwendung von scharfen Hybridisierungsbedingungen, die auf das Vermeiden nichtspezifischer Bindungen gerichtet ist, kann z. B. für die autoradiografische Sichtbarmachung eines spezifischen cDNA-Klons für den Fall der Hybridisierung der Target-DNA zu dieser einzelnen Sonde innerhalb des Gemisches, das deren vollständiges Gegenstück ist, gestatten. Siehe dazu allgemein Wallace et al., Nucl. Acids Res. 9 S. 879-897 (1981); Suggs et al., P.N.A.S. (USA), 78 S.6613-6617 (1981); Choo et al., Nature, 299, S. 178-180 (1982); Kurachi et al., P.N.A.S. (USA), 79, S. 6461-6464 (1982); Ohkubo et al., P.N.A.S. (USA) 80, S.2196-2200 (1983); und Kornblihtt et al., P.N.A.S. (USA) 80, S.3218-3222 (1983). Allgemein wurden die gemischten Sondenverfahren von Wallace et al. (1981), s. o. von verschiedenen Forschern erweitert bis zu dem Punkt, wo zuverlässige Ergebnisse vermutlich erhalten wurden in einer cDNA-Klonisolierung unter Einsatz eines 32teiligen gemischten „Pools" von 16-Basen-langen (16-mer) Oligonucleotidsonden von gleichmäßigen, verschiedenen DNA-Sequenzen zusammen mit einem einzelnen 11-mer, um eine Zwei-Stellen-„positive"-Bestätigung der Anwesenheit von interessierender cDN A zu bewirken. Siehe dazu Singer-Sam et al., P.N.A.S. (USA), 80, S.802-806 (1983).

Die Verwendung von genomischen DNA-Isolaten ist die letzte übliche der drei oben genannten Methoden zur Entwicklung spezieller DNA-Sequenzen für den Einsatz in rekombinanten Verfahren. Dies ist insbesondere richtig auf dem Gebiet der rekombinanten Verfahren, die auf die Sicherung der mikrowellen Expression von Säugetierpolypeptiden gerichtet ist und wird prinzipiell der Komplexizität Säugetier-genomischer DNA gerecht. Während somit zuverlässige Verfahrensweisen für die Entwicklung phag engeborener Bibliotheken genomischer DNA des Menschen und anderer Säugetierspezies entstehen (siehe z. B. Lawn et al., Cell 15, S. 1157-1174 (1978) hinsichtlich von Verfahren zur Erzeugung einer Human-Genbibliothek, bezeichnet als „Maniatis-Bibliothek"; Kam et al., P.N.A.S. [USA] 77, S. 5172-5176 (1980) hinsichtlich einer Human-Genbibliothek, basierend auf alternativem Restriktionsendonuclease-Fragmentierungsverfahren; und Blattneretal. Science, 196, S. 161-169 [1977], wo die Konstruktion einer Rinder-Genbibliothek beschrieben wird), gibt es relativ wenig erfolgreiche Versuche, bei der Verwendung von Hybridisierungsverfahren zur Isolierung genomischer DNA beim Fehlen umfassender Vorkenntnisse zu Aminosäure- oder DNA-Sequenzen.

Als ein Beispiel berichten Fiddes et al., J. Mol. and Appl. Genetics, 1, S.3-18 (1981) über die erfolgreiche Isolierung eines Gens, das für die aipha-Untereinheit des menschlichen Hypophysenglycopröteinhormons aus der Maniatis-Bibliothek codiert, durch Verwendung einer Sonde mit „voller Länge", eines vollständigen 621-Basenpaar-Fragments einer vorher isolierten cDNA-Sequenz für die alpha-Untereinheit.

Als ein weiteres Beispiel berichten Das et al., P.N.A.S. (USA), 80, S. 1531-1535 (1983) über die Isolierung von menschlichen genomischen Klonen für Human-HLA-DR unter Verwendung eines synthetischen Oligonucleotids mit 175 Basenpaaren. Schließlich berichten Anderson et al., P.N.A.S. (USA), 80, S. 6838-6842 (1983) über die Isolierung eines genomischen Klonsfür einen Rinderpankreatischen Trypsininhibitor (BPTI) unter Verwendung einer Einzelsonde mit 86 Basenpaaren in der Länge und konstruiert entsprechend der bekannten Aminosäuresequenz des BPTI. Die Autoren beobachten eine Determinierung geringer Aussichten für die Isolierung von mRNA, die geeignet ist für die Synthese einer cDNA-Bibliothek, wegen scheinbar geringer Gehalte an mRNA in anfänglich „targetiertem" Ohrspeicheldrüsen- und Lungengewebsmaterial und lenken dann die Erfolgsaussichten auf die Sondierung einer Gen-Bibliothek unter Verwendung eines Gemisches markierter Sonden mit der Feststellung:

— „Allgemeiner, es wurden Mischsequenz-Oligodesoxynucleotidsonden verwendet, um Proteingene unbekannter Sequenz auscDNA-Bibliotheken zu isolieren. Derartige Sonden sind normalerweise Gemische von 8-32 Oligonucleotiden, 14-17 Nucleotiden in der Länge, die jede mögliche Codonkombination für eine geringe Streckung (5-6 Reste) der Aminosäuresequenz repräsentieren. Unter strengen Hybridisierungsbedingungen, die nichtkorrekte Basenpaarsonden benachteiligen, sind diese Sonden in der Lage, den Platz spezifischer Gensequenzen in Klonbibliotheken nieder- bis mittelmäßiger Komplexität festzustellen. Dessen ungeachtet weisen Mischsonden wegen ihrer kurzen Länge und Heterogenität oft nicht die Spezifität auf, die für sondierende Sequenzen als Komplex als ein Säugetier-Genom erforderlich ist. Dies macht ein derartiges Verfahren ungeeignet zur Isolierung von Säugetier-Proteingenen, wenn die entsprechenden mRNA's nicht erhältlich sind." (Ende des Zeitats).

Somit besteht weiterhin ein Bedürfnis, für verbesserte Methoden, die eine schnelle und wirksame Isolierung von cDNA-Klonen in Fällen bewirken, wo nur wenig von der Aminosäuresequenz des dafür codierenden Polypeptide bekannt ist und wo „angereichertes" Gewebematerial von mRNA nicht leicht für den Einsatz bei der Konstruktion von cDNA-Bibliotheken erhältlich ist. Derartige verbesserte Methoden würden insbesondere dann nützlich sein, wenn sie zur Isolierung von Säugetiergenomischen Klonen einsetzbar wären, wo nur zerstreute Informationen erhältlich sind hinsichtlich der Aminosäuresequenzen der dafür codierenden Polypeptide durch die gesuchten Gene

B. Erythropoietin als ein Polypeptid von Interesse

Erythropoese, die Produktion roter Blutzellen, läuft kontinuierlich während des menschlichen Lebens ab, um den Zellabbau auszugleichen. Die Erythrozytenbildung ist ein sehr genau gesteuerter physiologischer Mechanismus, die es ermöglicht, daß eine ausreichende Anzahl roter Blutzellen im Blut zur Versorgung des Gewebes mit Sauerstoff verfüg bar ist, jedoch nicht so viele, daß die Zellen die Zirkulation behindern würden. Die Bildung von roten Blutzellen erfolgt im Rückenmark und wird von dem Hormon Erythropoietin gesteuert.

Erythropoietin, ein saures Glycoprotein von ungefähr 34000 Dalton Molekülmasse, kann in drei Formen auftreten: α, β und asialo. Die'α- und /3-Formen unterscheiden sich geringfügig in den Carbohydratkomponenten, haben aber die gleiche Wirksamkeit, biologische Aktivität und Molekülmasse. Die asialo-Form ist eine a- oder /3-Form bei der das terminale Carbohydrat (Sialsäure) entfernt ist. Erythropoietin ist in sehr geringen Konzentrationen im Plasma vorhanden, wenn sich der Körper in einem gesunden Zustand befindet, wobei das Gewebe ausreichend Sauerstoff über die vorhandene Anzahl Erythrozyten erhält. Diese normale geringe Konzentration reicht aus, den Ersatz der roten Blutzellen zu stimulieren, die normalerweise durch Alterung gusfallen.

Die Menge an Erythropoietin im Kreislauf steigt unter den Bedingungen von Gewebesauerstoffmangel (Hypoxie), wenn der Sauerstofftransport durch die Blutzellen im Blutkreislauf verringert ist. Hypoxie kann hervorgerufen werden durch Verlust großer Mengen an Blut infolge Hämorrhagie, Zerstörung roter Blutzellen durch Überdosis an Strahlung, Verminderung der Sauerstoffaufnahme in großen Höhen oder durch längere Bewußtlosigkeit oder durch verschiedene Formen der Anämie. Als Erwiderung auf den das Gewebe erleidenden hypoxischen Stress erhöht das Erythropoietin die Produktion roter Blutzellen durch Stimulierung der Umwandlung einfacher Precursor-Zellen im Rückenmark in Proerythroblasten, die später reifen, Hämoglobin synthetisieren und in den Blutkreislauf als rote Blutzellen freigesetzt werden. Wenn die Anzahl der roten Blutzellen im Kreislauf höher als für die normalen Sauerstofferfordernisse des Gewebes benötigt ist, wird das Erythropoietin im Kreislauf verringert. Siehe dazu allgemein, Testa et al., Exp. Hematol., 8 (Suppl.8), 144-152 (1980); Tong et al., J. biol. ehem., 256 (24), 12666-12672 (1981); Goldwasser, J. Cell. Physiol., 110(Supp.1), 133-135(1982); Finch, Blood, 60 (6), 1241-1246(1982); Sytowski et al., Expt. Hematol., 8 (Supp.8), 52-64 (1980); Naughton, Ann. Clin. Lab. Sei., 13 (5), 432^138 (1983); Weiss et al., Am. J. vet. Res., 44 (10), 1832-1835 (1983); Lappin et al., Esp. Hematol. 11 (7), 661-666 (1983); Bacin et al., Ann. N.Y.Acad. Sei.,414,66-72 (1983); Murphy et al., Acta Haematologica Japonica, 46 (7), 1380-1396 (1983); Dessypris et al., Brit. J. Haematol., 56, 295-306 (1984); und Emmanoul et al., Am. J. Physiol., 247 (1 pt 2), F 168-76 (1984).

Da Erythropoietin im Prozeß der roten Blutzellenbildung wesentlich ist, weist das Hormon eine potentiell nützliche Applikation sowohl bei der Diagnose als auch der Behandlung von Blutkrankheiten auf, die durch eine niedrige oder gestörte rote Blutzellenproduktion gekennzeichnet sind. Siehe dazu allgemein Pennathur-Das et al., Blood 63 (5), 1168-1171 (1984) und Haddy, am. Jour. Ped. Hematol./Oncol, 4,191-196 (1982), die sich auf Erythroproietin für mögliche Therapien der Sichelzellen, anämie beziehen, und Eschbach etal., J. Clin. Invest., 74(2), S. 434-441 (1984), die ein therapeutisches Regime für urämische Schafe beschreiben, basierend auf invivo-Reaktionen auf Erythropoietinreiche Plasmainfusionen, und einer vorgeschlagenen Dosis von 10 Einheiten EPO/kg pro Tag für 15 bis 40 Tage als Korrektiv einer Anämie des mit chronischem Nierenversagen verbundenen Typs. Sie auch Krane, Henry Ford Hosp., Med.,31 (3) 177-181 (1983).

Kürzlich wurde eingeschätzt, daß die Erhältlichkeit von Erythropoietin in Mengen die Anämiebehandlung von 1 600000 Menschen allein in den Vereinigten Staaten erlauben würde. Siehe z. B. Morrison „Bioprocessing in Space-— an Overview" Seite 557-571 in The World Biotech Report 1984, Bd. 2: USA (Online Publications, New York, N.Y. 1984). Kürzliche Studien haben eine Basis für die Planung der Wirksamkeit der Erythropoietintherapie in einer Vielzahl von Krankheitszuständen, Krankheiten und Zuständen hämatologischer Unregelmäßigkeit erbracht:

Vedovato, et al., Acta. Haematol. 71, 211-213 (1984) (beta-Thalassämie); Vichinsky, et al., J. Pediatr., 105 (1), 15-21 (1984) (zystische Fibröse); Cotes, et al., Brit. J. Obstet. Gyneacol., 90(4), 304-311 (1983) (Schwangerschaft, Menstruationsbeschwerden); Hage, et al., Acta. Pediatr. Scand., 72, 827-831 (1983) (frühe Anämie der Frühreife); Claus-Walker, et al., Arch. Phys. Med. Rehabil., 65,370-374 (1984) (Rückenmarkverletzung) Dunn, et al., Eur. J. Appl. Physiol., 52,178-182 (1984) (Raumflug); Miller, et al., Brit. J. Haematol., 52,545-590 (akuter Blutverlust); Udupa, et al., J. Lab. Clin. Med., 103 (4L 574-580 und 581-588 (1984); und Lipschitz, et al., Blood, 63 (3), 502-509 (1983) (Alterung); und Dainiak, et al., Cancer, 51 (6), 1101-1106(1983) und Schwartz, etal., Otolaryngol., 109,269-272 (1983) (verschiedene neoplastische Krankheitsstadien begleitet durch abnorme Erythropoiesie).

Frühere Versuche zur Gewinnung von Erythropoietin in guter Ausbeute aus Plasma oder Urin verliefen relativ erfolglos. Es sind komplizierte und umständliche Laborverfahren erforderlich, die im allgemeinen zur Gewinnung nur sehr geringer Mengen unreiner und instabiler Erythropoietin enthaltender Extrakte führten.

Anfängliche Versuche zur Isolierung von Erythropoietin aus Urin erbrachten instabile, biologisch inaktive Zubereitungen des Hormons. Die US 3865801 beschreibt ein Verfahren zur Stabilisierung der biologischen Aktivität einer Rohsubstanz, die aus Urin gewonnenes Erythropoietin enthält. Das resultierende Rohpräparat, das Erythropoietin enthält, erhält scheinbar 90% der Erythropoietinaktivität zurück und ist stabil.

Ein anderes Reinigungsverfahren von Human-Erythropoietin aus Urin von Patienten mit aplastischer Anämie wird von Miyakeet al., in J. Biol. Chem., Bd.252, Nr. 15 (10. August 1977) S. 5558-5564 beschrieben. Zu dem siebenstufigen Verfahren gehört lonenaustauschchromatografie, Ethanolfällung, Gelfiltration und Adsorptionschrömatografie, wobei als Ausbeuten ein reines Erythropoietinpräparat mit einer Potenz von 70400 Einheiten/mg Protein mit 21 % Ausbeute erhalten wird. Die US-PS 4397840 (Takezawa etal.) beschreibt Verfahren zur Herstellung „eines Erythropoietinproduktes" aus Urinproben gesunder Menschen mit schwachbasischen Ionenaustauschern und sagt aus, daß das erhaltene Produkt niederer Molekülmasse „keine inhibitorischen Effekte gegen Erythropoietin aufweist".

Die GB-PS 2 085887 (Sugitomo et al.), veröffentlicht am 6. Mai 1982, beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Hybrid-Humanlymphoblastoiden Zellen und berichtet über Produktionsmengen im Bereich von 3 bis 420 Einheiten Erythropoietin pro ml Zellsuspension (verteilt in den Kulturen nach der Säugetierwirtsvermehrung, die bis zu 10⁷ Zellen pro ml enthielt(en). Bei den besten Ergebnissen, von denen behauptet wurde, daß man sie erreichte, konnte die Herstellungsrate von Erythropoietin auf 40 bis 4000 Einheiten/10⁶ Zellen/48 Stunden in in vitro-Kultur, die dem Zelltransfer aus in vivo-Vermehrungssystemen folgten, berechnet werden. (Siehe auch die analoge US-PS 4377 513). Es wurden zahlreiche Vorschläge unterbreitet zur Isolierung von Erythropoietin aus Gewebe, einschließlich neoplastischen Zellen, die Ausbeuten waren jedoch sehr gering. Siehe z. B. Jelkman, et al., Expt. Hematol., 11 (7), 581-588 (1983); Tambourin, et al., P.N.A.S. (USA), 80, 6269-6273 (1983); Katsucka, et al., Gann, 74, 534-541 (1983); Hagiwara, et al., Blood, 63 (4), 828-835 (1984); und Choppin, et al., Blood 64 (2), 341-347 (1984). Zu anderen eingesetzten Isolierungsverfahren, um gereinigtes Erythropoietin zu erhalten, gehören immunologische Verfahrensweisen. Ein gegen Erythropoietin gerichteter polykionaler, aus Serum herrührender Antikörper wurde durch Injizieren eines Tieres, vorzugsweise einer Ratte oder eines Kaninchens, mit Human-Erythropoietin entwickelt. Das injizierte Human-Erythropoietin wird durch das Immunsystem des Tieres als fremde.Antigensubstanz erkannt und löst die Produktion von Antikörpern gegen das Antigen aus. Unterschiedliche Zellen, die auf die Stimulierung durch die Antigensubstanz reagieren, produzieren und setzen Antikörper in den Kreislauf frei, die sich von denen anderer reagierender Zellen geringfügig unterscheiden. Die Antikörperaktivität bleibt im Serum des Tieres erhalten, wenn das Blut extrahiert wird. Während ungereinigte Semm-oder Antikörperzubereitungen, gereinigt als eine Semm-lmmunoglobuIin G-Fraktion, dann in Assays verwendet werden können, um Human-Erythropoietin zu bestimmen und mit ihm einen Komplex bilden zu können, weisen die Materialien einen wesentlichen Nachteil auf. Dieser Serum-Antikörper, zusammengesetzt aus all den unterschiedlichen, durch einzelne Zellen produzierten Antikörpern, ist von Natur aus polyklonal und wird mit Komponenten in Rohextrakten Komplexe bilden, anders als Erythropoietin allein. Für den Hintergrund der vorliegenden Erfindung von Interesse sind auch kürzlich bekannt gewordene

Fortschritte auf dem Gebiet hinsichtlich der Entwicklung kontinuierlicher Zellkulturen, die in der Lage sind, eine einzige Art von Antikörpern zu bilden, die spezifisch immunologisch reaktiv mit einer einzigen antigenen Bestimmungsgröße eines ausgewählten Antigens ist. Siehe allgemein Chisholm, High Technology, Bd.3, Nr. 1, 57-63 (1983).

Es wurden Versuche unternommen, Zellfusions- und Hybridisierungstechniken anzuwenden, um „monoklonale" Antikörper bei der Isolierung und quantitativen Bestimmung von Human-Erythropoietin einzusetzen. Als ein Beispiel erschien ein Bericht über die erfolgreiche Entwicklung der Maus-Maus-Hybridomazellinien, die monoklonale Antikörper für Human-Erythropoietin absonderten, in Kurzform durch Lee-Huang, Abstract No. 1463, Fed. Proa, 41, 520 (1982). Als ein weiteres Beispiel erschien eine detaillierte Beschreibung der Herstellung und Verwendung monoklonaler Anti-Erythropoietin-Antikörper durch Weiss et al., P.N.A.S. (USA) 79,5465-5469 (1982). Siehe auch Sasaki, Biomed. Biochim. Acta., 42(11/12), 5202-5206 (1983); Yanagawa, et al., Blood 64 (2), 357-364 (1984), Yanagawa, et al., J. Biol. Chem., 259 (5), 2707-2710 (1984); und US-PSk 4465624. Für den Hintergrund der Erfindung sind ebenso von Interesse Berichte über die immunologische Aktivität synthetischer Peptide die die in natürlich vorkommenden Proteinen, Glycoproteinen und Nucleoproteinen vorhandenen Aminosäuresequenzen im wesentlichen verdoppeln. Insbesondere Polypeptide mit relativ geringer Molekülmasse haben gezeigt, daß sie an Immunreaktionen teilnehmen, die in Dauer und Umfang den Immunreaktionen physiologisch bedeutender Proteine, wie virale Antikörper, Polypeptidhormone und ähnliche ähneln. Zu den Immunreaktionen derartiger Polypeptide gehört auch die Provozierung der Bildung spezifischer Antikörper in immunologisch aktiven Tieren. Siehe z.B. Lerner et al. Cell, 23, 309-310 (1981); Ross, et al., Nature, 294, 654-656 (1981); Walter, et al., P.N.A.S. (USA), 77,5197-5200 (1980); Lerner, et al., P.N.A.S. (USA), 78, 3403-3407 (1981); Walter, et al., P.N.A.S. (US), 78, 4882^886 (1981); Wong, et al., P.N.A.S. (USA), 78, 7412-7416 (1981 ); Green, et al., Cell, 28, 477-487 (1982); Nigg, et al., P.N.A.S. (USA), 79, 5322-5326 (1982); Baron, et al., Cell, 28, 395-404 (1982); Dreesman, et al.. Nature, 295,158-160 (1982); und Lerner, Scientific American, 248, No. 2,66-74 (1983). Siehe auch Kaiser, et al., Science, 223, pp. 249-255 (1984) bezüglich biologischer und immunologischer Aktivitäten synthetischer Peptide, die die sekundären Strukturen der Peptidhormone annähernd teilen, nicht jedoch deren primäre strukturelle Anordnung. Die oben genannten Studien beziehen sich natürlich auf Aminosäuresequenzen von Proteinen, die sich von Erythropoietin unterscheiden, einer Substanz, für die keine wesentliche Aminosäuresequenz bisher beschrieben worden ist. In der anhängigen US-Patentanmeldung Nr.463724, an der Miteigentum besteht, eingereicht am 4. Februar 1983 durch J. Egrie, veröffentlicht am 22. August 1984 als EP-OS 0116446 wird eine Maus-Maus-Hybridoma-Zellinie (ATCC HB 8209) beschrieben, die einen hoch spezifischen, monoklonalen, Anti-Erythropoietin-Antikörper produziert, der auch spezifisch immunoreaktiv mit einem Polypeptid ist, das aus der folgenden Sequenz von Aminosäuren besteht: NH^AIa-Pro-Pro-Arg-Leu-lle-Cys-Asp-Ser-Arg-Val-Leu-Glu-Arg-Tyr-Leu-Leu-Glu-Ala-Lys-COOH.

Die Polypeptidsequenz ist eine, die den ersten zwanzig Aminosäureresten reifen Human-Erythropoietins zuzuschreiben ist, die nach dem Verfahren von Miyake et al., J. Biol. chem. 252, 5558-5564 (1977) isoliert wurden, und für die eine Aminosäureanalyse mittels Gasphasensequenzer (Applied Biosystems, Inc.) durchgeführt wurde nach der Verfahrensweise von Hewick, M. et al., J. Biol. Chem., 256, 6990-7997 (1981). Siehe auch Sue et al., Proc. Nat. Acad. Sei. (USA), 80, S. 3651-3655 (1983) betreffend die Entwicklung polyklonaler Antikörper gegen ein synthetisches 26-mer, basierend auf einer unterschiedlichen Aminosäuresequenz und Sytowski et al., J. Immunol. Methods, 69, S. 181-186 (1984).

Während polygonale und monoklonale Antikörper, wie oben beschrieben, zu sehr nützlichen Produkten für den Einsatz in Immunoassays zur Bestimmung und mengenmäßigen Erfassung von Erythropoietin führen und bei der Affinitätsreinigung von Erythropoietin verwendet ist, erscheint es unwahrscheinlich, daß diese Materialien leicht zur großtechnischen Isolierung größerer Mengen Erythropoietin aus Säugetiermaterial eingesetzt werden können, die ausreichend sind für weitere Analysen, klinische Untersuchungen und eine potentiell weitreichende therapeutische Verwendung der Substanz bei der Behandlung von beispielsweise chronischen Nierenerkrankungen, wobei krankes Gewebe nicht in der Lage ist, die Produktion von Erythropoietin aufrechtzuerhalten. Es besteht daher in der Wissenschaft die Auffassung, daß die besten Aussichten zur vollständigen Kennzeichnung von Säugetier-Erythropoietin und Bereitstellung großer Mengen davon zur potentiellen diagnostischen und klinischen Verwendung darin bestehen, erfolgreich die rekombinanten Verfahren einzusetzen, um eine großtechnische mikrobielle Synthese der Verbindung zu ermöglichen.

Während es so erscheint, daß bei der versuchten Isolierung von DNA-Sequenzen, die für Human- und andere Säugetierarten-Erythropoietin kodieren, wesentliche Fortschritte gemacht wurden, scheint dies doch nicht so erfolgreich gewesen zu sein. Dies liegt prinzipiell an dem Mangel an Gewebematerial, insbesondere menschlichem Gewebematerial, das mRNA-angereichert ist, und das gestatten würde, eine cDNA-Bibliothek aufzubauen, aus der eine für Erythropoietin codierende DNA-Sequenz durch Standardverfahren isoliert werden könnte. Darüber hinaus ist über die fortlaufende Sequenz der Aminosäurereste des Erythropoietins so wenig bekannt, daß es nicht möglich ist, beispielsweise lange Polynucleotidsonden zu konstruieren, die in der Lage sind, zuverlässig bei dem DNA/DNA-Hybridisierungsscreening von cDNA und insbesondere genomischen DNA-Bibliotheken eingesetzt zu werden.

Als Erläuterung dafür sei genannt, daß die 20-Aminosäuresequenz, die zur Erzeugung des oben genannten monoklonalen Antikörpers verwendet wurde, produziert durch ATCC Nr. HB8209, keine Konstruktion einer zweifelsfreien 60-Basenpaar-Oligonucleotidsonde in der von Anderson et al., ebenda, beschriebenen Weise. Es wird eingeschätzt, daß das Humangen für Erythropoietin als ein „Einzelkopie-Gen" (aingle copy gen) innerhalb des menschlichen Genoms erscheint und in jedem Fall das für Human-Erythropoietin codierte genetische Material wahrscheinlich aus weniger als 0,00005% der gesamten menschlichen genomischen DNA besteht, die in einer Gen-Bibliothek vorhanden sein würde.

Bis heute sind die erfolgreichsten der in der Literatur bekannt gewordenen Versuche mit Rekombinanten verwandten Verfahren zur Bereitstellung von DNA-Sequenzen für die Verwendung bei der mikrowellen Expression isolierbarer ³Mengen von Säugetier-Erythropoietin weit vor dem Ziel stehengeblieben. Als Beispiel berichtet Farber et al., Exp. Hematol. 11, Supp. 1.4, Abstract 101 (1983) über die Extraktion von mRNAaus Nierengewebe von Phenylhydrazin-behandelten Pavianen und die Injizierung von mRNA in Xenopus-Iaevis-Eizellen mit dem eher flüchtigen Ergebnis der in vitro Produktion eines Gemisches von „Translationsprodukten", das unter anderem biologische Eigenschaften von Erythropoietin entfaltete. In der jüngsten Zeit berichteten Farberet al., Blood, 62, Nr. 5, Suppl. Nr. 1, Abstract 392 auf Seite 122 a (1983) über die in vitro-Translation von Humannieren-mRNA durch Frosch-Eizellen. Es wurde geschätzt, daß das resultierende Translationsproduktgemisch in der Größenordnung von 220 (Millieinheiten) (mU) eines Translationsproduktes mit der Aktivität von Erythropoietin pro Mikrogramm injizierte mRNA enthielt. Während sich solche Gehalte bei der in vitro-Translation exogener mRNA als ziemlich niedrig bestätigten (verglichen mit den schon früher bekannt gewordenen Gehalten der Pavian-mRNA-

Translation in das gesuchte Produkt), wurde geglaubt, daß die Ergebnisse die menschliche Niere als Ort der Erythropoietinexpression bestätigen und die Konstruktion einer angereicherten Humannieren-cDNA-Bibliothek gestatten würden, aus der das gewünschte Gen isoliert werden könnte, (siehe auch Farber, Clin. Res., 31[4], 769A [1983]). Seit Einreichen der US-Patentanmeldungen Nr.561024und 582185 ist ein einziger Bericht zur Klonierung und Expression erschienen, in dem behauptet wird, Human-Erythropoietin-cDNA in E. coli erhalten zu haben. Dabei wurden eine Anzahl von cDNA-Klonen in E. coli-Plasmide insertiert, und es wurden ß-Lactamase-Fusionsprodukte festgestellt, die sich immunreaktiv mit einem monoklonalen Antikörper zu einem unspezifizierten „Epitop" von Human-Erythropoietin verhielten. Siehe Lee-Huang, Proc.Nat.Acad.Sci. (USA), 81, Ss.2708-2712 (1984).-

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines neuen gereinigten und isolierten Polypeptids mit einem Teil oder der gesamten primären strukturellen Anordnung und einer oder mehrerer biologischer Eigenschaften von natürlich auftretendem Erythropoietin.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Peptide mit den gewünschten Eigenschaften und Verfahren zu ihrer Herstellu ng aufzufinden für die Manipulation genetischer Materialien.

Erfindungsgemäß werden in erster Linie neue gereinigte und isolierte Polypeptidprodukte zur Verfügung gestellt, die einen Teil oder die gesamte primäre Strukturanordnung (d.i. die fortlaufende Sequenz der Aminosäurereste) sowie eine oder mehrere biologische Eigenschaften (z. B. immunologische Eigenschaften und in vivo- und in vitro-biologische Aktivität) von natürlich vorkommendem Erythropoietin aufweisen, einschließlich Allel-Varianten davon. Diese Polypeptide sind auch allein dadurch gekennzeichnet, daß sie das Produkt einer procaroytischen oder eurcaroytischen Wirtsexpression \z. B. durch Bakterien-, Hefe- und Säugetierzellen in Kultur) exogener DNA-Sequenzen darstellen, die durch genomisches oder cDNA-Klonieren oder durch Gensynthese erhalten werden. Produkte mikrobieller Expression in Wirbeltier- (z. B. Säugetier- und Vogel-)zellen können weiterhin dadurch gekennzeichnet sein, daß sie frei von einer Assoziation mit Humanproteinen oder anderen kontaminierenden Stoffen sind, die in ihrer natürlichen Säugetierzellenumgebung oder in extrazellulären Flüssigkeiten wie Plasma oder Urin mit Erythropoietin assoziiert sein können. Die Produkte typischer Hefe- (ζ. B. Saccaromyces cerevisiae) oder Procaryoten (z. B. E. coli) Wirtszellen sind frei von einer Assoziation mit irgendwelchen Säugetierproteinen. Abhängig vom verwendeten Wirt, können die erfindungsgemäßen Polypeptide mit Säugetier- oder anderen eucaryotischen Carbohydraten glykosyliert werden oder unglykosyliert bleiben. Die erfindungsgemäßen Polypeptide können auch einen am Anfang stehenden Methionin-Aminosäurereste-(an Position-1) aufweisen.

Zu den neuen Glycoproteinprodukten der Erfindung gehören solche, die eine primäre strukturelle Anordnung mit ausreichender Duplizierbarkeit von dereines natürlich vorkommenden (z.B. Human-)Erythropoietins aufweisen, um damit zu einer oder mehreren der biologischen Eigenschaften dieser Verbindung zu gelangen und eine durchschnittliche Carbohydratzusammensetzung haben, die von der natürlich auftretenden (z. B. Human-) Erythropoietins abweicht. Die durch die vorliegende Erfindung vorgesehenen Wirbeltier- (z.B. COS-1 und CHO)zellen gehören zu den ersten immer erhältlichen Zellen, die in vitro kontinuierlich vermehrt werden können und die durch Setzen auf Kultur in der Lage sind, in ihrem Wachstumsmedium im Überschuß von 100E (vorzugsweise im Überschuß von 500E und am bevorzugtesten im Überschuß von 1000 bis 5000E) Erythropoietin pro 10⁶ Zellen in 48 Stunden zu produzieren, wie durch Radioimmunoassay bestimmt wurde. Weiterhin erbringt die vorliegende Erfindung synthetische Polypeptide, ganz oder teilweise duplikativ, fortlaufender Sequenzen von Erythropoietin-Aminosäureresten, die hier zum ersten Mal beschrieben werden. Diese Sequenzen können infolge Beteiligung primärer, sekundärer oder teriärer Struktur- oder Anordnungscharakteristika mit natürlich vorkommenden Erythropoietin biologische Aktivität und/oder immunologische Eigenschaften besitzen genau wie das natürlich auftretende Produkt, so daß sie als biologisch aktive oder immunologische Ersatzstoffe für Erythropoietin in therapeutischen und immunologischen Verfahren eingesetzt werden können. Dementsprechend vorgesehen sind durch Standardverfahren erzeugte monoklonale oder polyklonale Antikörper, die mit derartigen Polypeptiden immunoreaktiv sind, vorzugsweise auch immunoreaktiv mit natürlich auftretendem Erythropoietin.

Die vorliegende Erfindung erläutern klonierte DNA-Sequenzen vom Affen oder Menschen und auf geeignete Weise daraus abgeleitete Polypeptidsequenzen, die die primäre Strukturanordnung von Erythropoietinen mit ihrem entsprechenden Ursprung vom Affen oder Menschen darstellen.

Die Erfindung betrifft auch neue biologisch funktionell, virale und ringförmige Plasmid-DNA-Vektoren, die die DNA-Sequenzen der Erfindung enthalten sowie mikrobielle (z. B. bakterielle, Hefe- und Säugetierzellen-)Wirtsorganismen, die durch Eingriff derartiger Vektoren transformiert oder transferiert werden. Dementsprechend betrifft die Erfindung neue Verfahren zur Herstellung nützlicher Polypeptide durch Kulturwachstum derartig transformierter oder transferierter mikrobieller Wirte unter die Expression exogener, Vektor-geborener DNA-Sequenzen im großen Maßstab fördernden Bedingungen und die Isolierung der gewünschten Polypeptide aus dem Wachstumsmedium, den Zellysaten oder Zellmembranfraktionen. Isolierung und Reinigung mikrobiell exprimierter, erfindungsgemäßer Polypeptide kann durch gebräuchliche Verfahren erfolgen, einschließlich praparativer chromatografischer Trennungen und immunologischer Trennungen unter Einsatz monoklonaler und/oder polyklonaler Antikörperpräparationen.

Unter Darstellung der Sequenz der Aminosäurereste von Erythropoietin sieht die vorliegende Erfindung die totale und/oder partielle Herstellung von DNA-Sequenzen vor, die für Erythropoietin codieren und die solch vorteilhafte Charakteristika wie Einbeziehung von für die Expression „bevorzugten" Codons durch Nicht-Säugetierwirte, mit der Maßgabe, daß Stellen für das Schneiden durch Restriktionsendonuclease-Enzyme vorgesehen sind und der weiteren Maßgabe von zusätzlichen Anfangs-, End- oder Zwischen-DNA-Sequenzen, die die Konstruktion leicht exprimierbarer Vektoren erleichtern. Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung die Herstellung (und Entwicklung durch Stellen-spezifische Mutagenese von cDNA und genomischer

DNA) von DNA-Sequenzen, die für die mikrobielle Expression von Polypeptidanalogen oder Derivaten von Erythropoietin codieren, die sich von natürlich vorkommenden Formen durch Identität oder Ort der Anordnung eines oder mehrerer Aminosäurereste unterscheiden (d. i. Deletierungsanaloga, die weniger als alle der für EPO spezifizierenden Reste enthalten und/oder Substitutionsanaloge, worin eine oder mehrere der spezifizierten Reste durch andere Reste ersetzt ist und/oder Additionsanaloga, worin einer oder mehrere Aminosäurereste an einenterminalen oder mediaIen Teil des Polypeptids angefügt ist); und die an einigen oder allen Eigenschaften natürlich vorkommender Formen teilhaben.

Die neuen DNA-Sequenzen der Erfindung enthalten alle für eine sichere Expression in procaryotischen oder eucaryotischen Wirtszellen von Polypeptidprodukten erforderlichen Sequenzen, die zumindest einen Teil der primären Strukturanordnung aufweisen sowie eine oder mehrere der biologischen Eigenschaften von Erythropoietin, von denen umfaßt werden:

(a) die in den Tabellen V und Vl aufgeführten DNA-Sequenzen oder deren Komplementärstränge; (b) DNA-Sequenzen, die (unter Hybridisierungsbedingungen, wie sie hier erläutert werden oder strengeren Bedingungen) zu DNA-Sequenzen, wie sie unter (a) definiert sind, hybridisieren, oder zu Fragmenten davon; und (c) DNA-Sequenzen, die allerdings'unter Degenerierung des genetischen Codes — zu unter (a) und (b) definierten DNA-Sequenzen hybridisieren würden. Speziell vom Teil (b) umfaßt sind genomische DNA-Sequenzen, die allelische Variantenformen von Affen- oder Human-Erythropoietin verschlüsseln und/oder andere Säugetierarten von Erythropoietin decodieren. Speziell vom Teil (c) umfaßt sind hergestellte DNA-Sequenzen, die EPO, EPO-Fragmente und EPO-Analoge verschlüsseln, deren DNA-Sequenzen Condons enthalten können, die die Translation von Boten-RNA in Nicht-Wirbeltierwirten erleichtern.

Weiterhin der vorliegenden Erfindung zuzuordnen ist die Klasse von Polypeptiden, die für Teile des DNA-Komplements zum oberen Strang der Human-genomischen DNA-Sequenz von Tabelle Vl codieren, d.i. „komplementär umgekehrte Proteine", wie sie von Tramontano et al.. Nucleic Acids Research, 12, S. 5049-5049 — (1984) Ebenfalls von der Erfindung umfaßt sind pharmazeutische Zusammensetzungen, die wirksame Mengen an erfindungsgemäßen Polypeptidprodukten enthalten, zusammen mit geeigneten Verdünnungsmitteln, Zusätzen und/oderTrägerstoffen, die eine Erythropoietintherapie gestatten, insbesondere zur Behandlung anämischer Krankheitszustände und vorzugsweise solcher anämischer Zustände, wie sie bei chronischem Nierenversagen auftreten.

Die erfindungsgemäßen Polypeptidprodukte können „markiert" werden durch kovalente Bindung an eine bestimmbare Markersubstanz (z. B. radiomarkiert mit ¹²⁵I), um zu Reagentien zu gelangen, die bei der Ermittlung und mengenmäßigen Bestimmung von Erythropoietin in festem Gewebe und flüssigen Proben wie Blut oder Urin von Nutzen sind. Die erfindungsgemäßen DNA-Produkte können auch mit bestimmbaren Markern (wie Radiomarkern und Nicht-Isotopenmarkern wie Biotin) markiet und bei DNA-Hybridisierungsverfahren eingesetzt werden, um die Erythropoietin-Genposition und/oder die Genposition irgendeiner verwandten Genfamilie aus der Human-, Affen- und anderen Säugetierspezies-Chromosomenkarte zu orten. Sie können auch zum Herausfinden von Erythropoietin-Genunstimmigkeiten an Hand des DNA-Gehalts verwendet werden und als Genmarker zur Identifizierung benachbarter Gene und deren Unstimmigkeiten.

Wie hieranschließend im Detail beschrieben wird, bringt die vorliegende Erfindung signifikante Verbesserungen bei den Bestimmungsverfahren eines speziellen einzelsträngigen Polynucleotids unbekannter Sequenz in einer heterogenen zellulären oder viralen Probe mit sich, die multipler einzelsträngiger Polynucleotide enthält, wobei

(a) ein Gemisch markierter, einzelsträngiger Nucleotidsonden mit gleichmäßig variierenden Basensequenzen hergestellt wird, wobei jede dieser Sonden potentiell spezifisch komplementär zu einer Sequenz von Basen ist, die in dem zu bestimmenden Polynucleotid vermutlich nur einmal existierend ist,

(b) die Probe auf einem festen Substrat fixiert ist,

(c) das Substrat mit der darauf fixierenden Probe behandelt wird, um die weitere Bindung von Polynucleotiden daran zu verhindern, ausgenommen mittels Hybridisierung an Polynucleotide in der Probe,

(d) das behandelte Substrat mit der darauf fixierten Probe flüchtig mit dem genannten Gemisch markierter Sonden unter solchen Bedingungen in Kontakt gebracht wird, die die Hybridisierung nur zwischen vollständig komplementären Polynucleotiden erleichtern, und

(c) das spezifische Polynucleotid durch Beobachten des Abiaufens einer Hybridisierungsreaktion zwischen diesem und einer vollständig komplementären Sonde innerhalb des Gemisches markierter Sonden bestimmt wird, was durch Vorhandensein einer höheren Dichte von markiertem Material auf dem Substrat am Ort des spezifischen Polynucleotids bewiesen wird, im Vergleich zu einer Hintergrund-Dichte am markierten Material, die sich aus der nichtspezifischen Bindung markierter Sonden an das Substrat ergibt.

Die Verfahren sind insbesondere effektiv bei Situationen, die die Verwendung von 64,128,256,512,1 024 oder mehr gemischten Polynucleotidsonden mit einer Länge von 17 bis 20 Basen bei DNA/DNA- oder RNA/RNA- oder DNA/RNA-Hybridisierungen erfordern.

Wie weiter unten ausgeführt wird, haben die oben genannten verbesserten Verfahren die Erkennung von cDNA-Klonen gestattet, die für Erythropoietin mit Ursprung von Affenspezies codieren, innerhalb einer Bibliothek, die aus anämischer AffennierenzellmRNA hergestellt wurde. Insbesondere wurde ein Gemisch von 128 gleichmäßig variierten 20-mer-Sonden basierend auf einer Aminosäuresequenzinformation, die von sequenzierenden Fraktionen von Human-Erythropoietin abgeleitet wurde, in Koloniehybridisierungsverfahren eingesetzt, um sieben „positive" Erythropoietin-cDNA-Klone innerhalb einer Gesamtmenge von 200000 Kolonien zu identifizieren. Noch bemerkenswerter ist, daß der praktische Einsatz der verbesserten erfindungsgemäßen Verfahren die schnelle Isolierung von drei positiven Klonen gestattet, und zwar über ein Screening von 1 500000 Phagenplaques, die eine Human-Genbibliothek darstellen. Dies wurde erreicht durch Verwendung des oben genannten Gemisches von 128 20-mer-Sonden zusammen mit einem zweiten Satz von 128 17-mer-Sonde'n, basierend auf einer Aminosäureanalyse einer unterschiedlichen fortlaufenden Sequenz von Human-Erythropoietin.

Die oben genannten erläuternden Verfahren bilden den ersten bekannten Fall der Verwendung multipler gemischten Oligonucleotidsonden bei DNA/DNA-Hybridisierungsverfahren, die auf die Isolierung von Säugetiergenomklonen gerichtet sind, und den ersten bekannten Fall der Verwendung eines Gemisches von mehr als 32 Oligonucleotidsonden bei der Isolierung von cDNA-Klonen.

Für den Fachmann ergeben sich zahlreiche Aspekte und Vorteile der Erfindung durch die folgende detaillierte Beschreibung, in der auch praktische Seiten der Erfindung in ihren gegenwärtig bevorzugten Ausführungsformen erläutert werden. Erfindungsgemäß wurden DNA-Sequenzen isoliert und bestimmt, die einen Teil oder die gesamte Polypeptid-Sequenz von Human- und Affenspezies-Erythropoietin (anschließend teilweise als „EPO" bezeichnet) verschlüsseln. Weiterhin wurde die vom Affen oder Menschen stammende DNA zum Subjekt eucaryotischer und procaryotischer Expression gemacht, wobei isolierbare Mengen an Polypeptiden entstehen, die biologische (z. B. immunologische) Eigenschaften von natürlich vorkommenden EPO zeigen sowie sowohl in vivo- als auch in vitro-biologische Aktivitäten von EPO. Die DNA aus Affenspezies wurde aus einer cDNA-Bibliothek isoliert, die mit einer mRNA konstruiert worden war, die aus Affennierengewebe in einem auf chemischem Wege ausgelösten anämischen Zustand gewonnen wurde, und deren Serum nach immunologischer Bestimmung hohe Anteile EPO enthielt, verglichen mit normalem Affenserum. Die Isolierung der gewünschten cDNA-Klone, die DNA verschlüsselnde EPO enthielten, erreichte man unter Einsatz von DNA/DNA-Koloniehybridisierung durch Verwendung eines Pools von 128 gemischten, radiomarkierten 20-mer-Oligonucleotidsonden unter Einbeziehung des Schnellscreenings von 200000 Kolonien. Das Muster der Oligonucleotidsonden wurde auf Aminosäuresequenzinformation stationiert, die durch enzymatische Fragmentierungen und Sequenzieren einer kleinen Human-EPO-Probe gewonnen wurden.

Die DNA von Menschen wurde aus einer humangenomischen DNA-Bibliothek isoliert. Die Isolierung von Klonen, die EPO-verschlüsselnde DNA enthielten, wurde durch DNA/DNA-Plaquehybridisierung erreicht unter Verwendung des oben angeführten Pools von 128 gemischten 20-mer-Oligonucleotidsonden und einem zweiten Pool von 128 radiomarkierten 17-mer-Soiiden, deren Sequenzen auf Aminosäuresequenzinformationen stationiert sind, die man aus einem unterschiedlichen enzymatischen Human-EPO-Fragment erhielt.

•Positive Kolonien und Plaques wurden mittels Didesoxy-Sequenzieren klonaler DNA unter Verwendung eines Teilsatzes von 16 Sequenzen innerhalb des Pools von 20-mer-Sonden auf Richtigkeit nachgeprüft, und ausgewählte Klone wurden einer Nucleotid-Sequenzanalyse unterworfen, die die Herleitung primärer Strukturübereinstimmung der damit verschlüsselten EPO-Polypeptide zuließ. Die hergeleiteten Polypeptidsequenzen zeigten einen hohen Grad an Homologie zueinander und zu einer durch Aminosäureanalyse von Human-EPO-Fragmenten erzeugten Partialsequenz.

Ein selektierter positiver Affen-cDNA-Klon und ein selektierter positiver Human-Genklon wurden jeweils in einen „Zubringer"-(„Shuttle")DNA-Vektor insertiert, der in E.coli amplifiziert und dazu verwendet wurde, Säugetierzellen in Kultur zu transfektieren. Kultiviertes Wachstum transfektiertre Wirtszellen führte zu Präparationen des Überstehenden des Kulturmediums, die mehr als 300OmE EPO pro ml Kulturflüssigkeit enthielten.

Ausführungsbeispiel

Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung und sind speziell auf Verfahren gerichtet, die vorher zur Erkennung von EPO verschlüsselnden Affen-cDNA-Klonen und humangenomischen Klonen durchgeführt wurden, auf Verfahren, die in zu einer solchen Erkennung führen und auf das Sequenzieren, die Entwicklung von Expressionssystemen und immunologische Überprüfung der EPO-Expression in derartigen Systemen.

Insbesondere Beispiel 1 ist auf das Aminosäuresequenzieren von Human-EPO-Fragmenten gerichtet und auf die Konstruktion von Gemischen radiomarkierter Sonden, die auf den Ergebnissen dieses Sequenzierens basieren. Beispiel 2 ist allgemein auf Verfahren gerichtet, zu denen die Erkennung von positiven Affen-cDNA-Klonen gehört und erbringt eine Information zur Behandlung des Tieres und zur vorläufigen Radioimmunoassay-(RIA)-analyse tierischer Seren. Beispiel 3 ist gerichtet auf die Herstellung der cDNA-Bibliothek, das Kolonie-Hybridisierungsscreening und die Überprüfung der positiven Klone auf Richtigkeit, das DNA-Sequenzieren eines positiven cDNA-Klons und die Erzeugung einer primären Strukturübereinstimmungs(Aminosäuresequenz)-lnformation desAffen-EPO-Polypeptids. Beispiel 4 ist auf Verfahren gerichtet, die die Erkennung positiver humangenomischer Klone'betreffen und zu einer Information über die Herkunft der Gen-Bibliothek, über Plaquehybridisierungsverfahren und die Überprüfung auf Richtigkeit positiver Klone führen. Beispiel 5 ist auf das DNA-Sequenzieren eines positiven genomischen Klons und die Erzeugung einer Aminosäuresequenzinformation des Human-EPO-Polypeptids gerichtet, einschließlich eines Vergleichs dieser mit der Affen-EPO-Sequenzinformation. Beispiel 6 ist auf Verfahren zur Konstruktion einer Vektor-enthaltenden, EPO-verschlüsselnden DNA gerichtet, abgeleitet aus einem positiven Affen-cDNA-Klon, die Verwendung des Vektors für dieTransfektion von COS-1-Zellen und kultiviertes Wachstum der transferierten Zellen. Beispiel 7 ist auf Verfa-hren zur Konstruktion einer Vektor-enthaltenden, EPO-verschlüsselnden DNA gerichtet, die aus einem positiven humangenomischen Klon abgeleitet ist, die Verwendung des Vektors zurTransfektion von COS-1-Zellen und das kultivierte Wachstum der transferierten Zellen. Beispiel 8 ist auf Immunoassay-Verfahren gerichtet, die auf den Medienüberstehenden durchgeführt wurden, die man durch Kulturwachstum gemäß Beispiel 6 und 7 transferierter Zellen erhalten hatte. Beispiel 9 ist auf die in vitro- und in vivo-biologische Aktivität mikrobiell exprimierter EPO der Beispiele 6 und 7 gerichtet.

Beispiel 10 ist auf eine Entwicklung von Säugetierwirtsexpressionssystemen für EPO-cDNA von Affenspezies und genomischer DNA von Menschen gerichtet unter Einbeziehung von Ei-(„CHO")-zellen des chinesischen Hamsters sowie auf die immunologischen und biologischen Aktivitäten der Produkte dieses Expressionssystems ebenso wie auf die Kennzeichnung derartiger Produkte. Beispiel 11 ist auf die Präparation hergestellter Gene gerichtet, die menschliche EPO und EPO-Analoge verschlüsseln, wobei zu diesen Genen eine Anzahl Präferenzcodonsfür die Expression in E.coli — und Hefewirtszellen gehört, und auf die darauf basierenden Expressionssysteme. Beispiel 12 betrifft die immunologischen und biologischen Aktivitätsprofile der Expressionsprodukte des Systems von Beispiel 11.

Beispiel 1 A. Human-EPO-Fragment-Aminosäuresequenzieren

Human-EPO wurde aus Urin isoliert und einem tryptischen Abbau unterworfen, was zur Entwicklung und Isolierung von 17 getrennten Fragmenten in Mengen von annähernd 100 bis 150 Picomolen führte.

Den Fragmenten wurden willkürlich Nummern zugeordnet, und sie wurden auf Aminosäuresequenzen durch Mikrosequenzanalyse unter Verwendung eines Gasphasensequenzers (Applied Biosystems) analysiert, wobei man die in Tabelle I dargestellte Sequenzinformation erhielt. Es wurden darin Einzelbuchstabencodes verwendet, und „X" bezeichnet einen Rest, der nicht genauer weiter bestimmt wurde.

TABLEI

Fragment No. Sequence Analysis Result

T4a A-P-P-R

T4b G-K-L-K

T 9 A-L-G-A-Q-K

T13 V-L-E-R

T16 A-V-S-G-L-R

T18 · ' L-F-R

T21 K-L-F-R

T 25 Y-L-L-E-A-K

T 26 a L-I-C-D-S-R

T26d L-Y-T-G-E-A-C-R

T 27 T-I-T-A-D-T-F-R

T 28 E-A-I-S-P-P-D-A-A-M-A-A-P-L-R

T 30 E-A-E-X-I-T-T-G-X-A-E-H-X-S-L-N-E-X-I-T-V-P

T31 V-Y-S-N-F-L-R

T 33 S-L-T-T-L-L-R

T35 V-N-F-Y-A-W-K

T 38 G-Q-A-L-L-V-X-S-S-Q-P-W-E-P-L-Q-L-H-V-D-K

B. Muster und Konstruktion von Oligonucleotidsondengemischen

Die in Tabelle I aufgeführten Aminosäuresequenzen wurden im Zusammenhang mit der Degenerierung des genetischen Codes dahingehend nochmals überprüft, ob die Mischsondenverfahren auf DNA/DNA-Hybridisierungsverfahren in cDNA- und/oder genomischen DNA-Bibliotheken angewandt werden können. Diese Analyse zeigte, daß innerhalb des Fragmentes Nr.T35 eine Serie von 7 Aminosäureresten (Val-Asn-Phe-Tyr-Ala-Trp-Lys) existierte, die einzig und allein dadurch gekennzeichnet werden kann, daß sie durch eine von 128 möglichen DNA-Sequenzen, die 20 Basen paare überspannt, verschlüsselt wird. Ein erster Satz von 128 20-mer-Oligonucleotiden wurde somit durch Standard-Phosphoamiditverfahren (siehe z.B. Beaucage et al., Tetrahedron Letters, 22, S. 1859-1862 [1981 lauf festen Träger entsprechend der in Tabelle Il aufgeführten Sequenz synthetisiert.

Tabelle Il	-VaI	-Asn	Phe	Tyr	AIa	Trp	Lys
Rest	CAA	TTG	AAG	ATG	CGA	ACC	TT -5'
3'	T	A	A	A	T
	G				G
	C				C

Die weitere Analyse zeigte, daß innerhalb des Fragments T38 eine Serie von 6 Aminosäureresten (Gln-Pro-Trp-Glu-Pro-Leu) auf der Basis existierte, von der aus man einen Pool von 128 Misch-Oligonucleotid-^-mer-Sonden herstellen konnte, wie unten in Tabelle IM aufgeführt sind.

Tabelle III	GIn	Pro	Trp	GIu	Pro	Leu
Rest	GTT	GGA	ACC	CTT	GGA	GA -5'
3'.	C	T		C	T	A
		G			G
		C			C

Die Oligonucleotidsonden wurden am 5'-Ende mit Gamma -³²P-ATP, 7500-8000ci/mmol (ICN) unter Verwendung von T₄-Polynucleotidkinase (NEN) markiert.

Beispiel 2 A. Affenbehandlungsverfahren und RIA-Analyse

Weibliche Cynomolgus-Affen Macacafascicularias (2,5-3 kg, eineinhalb bis zwei Jahre alt) wurden subkutan mit einer pH 7-Lösung von Phenylhydrazinhydrochlorid bei einer Dosis von 12,5 mg/kg am ersten, dritten und fünften Tag behandelt. Vor jeder Injektion wurde der Hämatok'ritwert beobachtet. Am siebenten Tag oder zu dem Zeitpunkt, wo der Hämatokritspiegel unter 25% des Anfangswertes fiel, wurden Serum und Nieren nach Verabreichung von 25 mg/kg Dosen Ketaminhydrochlorid entnommen. Die entnommenen Materialien wurden unmittelbar danach in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei —70⁰C gelagert.

B. RIA für EPO

Es wurden Radioimmunoassays zur quantitativen Bestimmung von EPO in Proben nach den folgenden Verfahrensweisen durchgeführt: Ein Erythropoietin-Standard oder eine unbekannte Probe wurde zusammen mit Antiserum für 2 Stunden bei 37⁰C inkubiert. .

Nach der zweistündigen Inkubierung wurden die Proberöhrchen in Eis gekühlt, ¹²⁵l-markiertes Erythropoietin hinzugegeben und die Röhrchen bei O⁰C für wenigstens 15 weitere Stunden inkubiert. Jedes Assayröhrchen enthielt 500μΙ Inkubationsgemisch, bestehend aus 50μΙ verdünnten Immunseren, lOOOOcpm ¹²⁵l-Erythropoietin, δμ,Ι Trasylol und 0 bis 250μΙ entweder des EPO-Standards oder der unbekannten Probe, wobei man 0,1 % BSA enthaltendem PBS das restliche Volumen erbracht wurde. Das verwendete Antiserum war das zweite Testblut eines mit 1%igem Reinpräparat von Humanurin-Erythropoietin immunisierten Kaninchens. Die Endverdünnung des Antiserums bei der Assay wurde so eingestellt, daß das Antikörper-gebundene ¹²⁵I-EPO 10-20% der Eingangs-Gesamtcounts überschritt. Allgemein entsprach dies einer Endverdünnung des Antiserums von 1:50000 bis 1:100000.

Das Antikörper-gebundene ¹²⁵l-Erythropoietin wurde durch Zusatz von 150μΙ Staph A gefällt. Nacheiner40minütigen Inkubation wurden die Proben zentrifugiert und die Pellets zweimal mit 0,75ml 10mMTris-HCI von pH8,2, die 0,15M NaCI, 2mM EDTA und 0,05% Triton x-100 enthielt, gewaschen. Die gewaschenen Pellets wurden in einem Gammazähler gezählt, um den Prozentsatz der ¹²⁵l-Erythropoietinbindung zu bestimmen. Die durch Prä-Immunseren gebundenen Counts wurden von allen Gesamtwerten abgezogen zwecks Korrektur der nicht-spezifischen Fällung. Der Erythropoietingehalt der unbekannten Proben wurde durch Vergleich mit der Standardkurve ermittelt.

Das oben genannte Verfahren wurde auf im Teil A (s.o.) erhaltenes Affenserum angewandt und ebenso auf das unbehandelte Affenserum. Normale Serumspiegel wurden geprüft und zeigten annähernd 36mE/ml, während behandeltes Affenserum von 1 000 bis 1 700mE/ml enthielt.

Beispiel 3 A. Konstruktion der Affen-cDNA-Bibliothek

Aus normalen und anämischen Affennieren wurde Boten-RNA isoliert mit Hilfe des Guanidin-Thiocyanatverfahrens von Chirgwin et al., Biochemistry, 18, S. 5294 (1979), und die Poly (A)⁺mRNA wurde durch zwei Durchläufe der Oligo(dT)-Zellulose-Säulenchromatografie gereinigt, beschrieben bei „Maniatis et al., „Molecular Cloning, A Laboratory Manual", S. 197-198, Cold Springs Harbor Laboratory, Cold Springs, Harbor, N. Y., 1982). Die cDNA-Bibliothek wurde gemäß einer Modifikation der allgemeinen Verfahrensweisen von Okayama et al;, Mol. and Cell. Biol., 2, S. 161-170 (1982) konstruiert. Die Schlüsselmerkmale der gegenwärtig bevorzugten Verfahren sind die folgenden:

(1) pUC 8 wurde a Is a I leiniger Vektor verwendet, geschnitten mit Pst I und dann mit einem Schwanzstück von OligodTvon60 bis 80 Basen in der Länge versehen; (2) Hinc Il-Verdauung wurde eingesetzt, um das Oligo dT-Schwanzstück vom einen Ende des Vektors zu entfernen; (3) die erste Strangsynthese und das Versehen von Oligo dG mit einem Schwanzstück erfolgte nach dem veröffentlichten Verfahren; (4).es wurde mit einer Barn HI-Verdauung gearbeitet, um den Oligo dG-Schwanz von einem Ende des Vektors zu entfernen; und (5) Ersatz des RNA-Stranges durch DNA in Anwesenheit von zwei Linkern (GATCTAAAGACCGTCCCCCCCC und ACGGTCTTTA) in einem dreifachen molaren Überschuß über den mit dem Oligo dG-Schwanzstück versehenen Vektor.

B. Koloniehybridisierungsverfahren für das Screenen der Affen-cDNA-Bibliothek

Transformierte E. coli wurde bei einer Dichte von 9000 Kolonien pro 10 χ 10 cm Platte auf Nährmediumplatten ausgebracht, die 50 Mikrogramm/ml Ampicillin enthielten. GeneScreen-Filter (New England Nuclear Catalog Nr. NEF-972) wurden auf einer BHI-CAM-Platte vorbenetzt (Bacto Hirn-Herz-Infusion 37g/l, Casaminosäuren 2g/l und Agar 15g/l, mit 500 Mikrogramm/ml Chloramphenicol) und dazu verwendet, die Kolonien von der Platte abzuheben. Die Kolonien wurden im gleichen Medium 12 Stunden wachsen gelassen, um die Plasmidkopienzahl zu amplifizieren. Die amplifizierten Kolonien (Kolonieseite oben) wurden durch reihenweises Auflegen der Filter über 2 Stücke Whatman 3 MM-Papier behandelt, gesättigt mit jeweils den folgenden Lösungen:

(1) 5OmM Glucose —25mMTris-HCI(pH8,0)-1OmM EDTA (pH 8,0) für fünf Minuten;

(2) 0,5M NaOH für zehn Minuten; und

(3) 1,0MTris-HCI (pH 7,5) für drei Minuten

Die Filter wurden anschließend im Vakuum bei 80'C für zwei Stunden luftgetrocknet.

Durch Behandlung mit einer Lösung, die 50 Mikrogramm/ml des Proteaseenzyms in Puffer K [0,1 M Tris-HCI (pH 8,O)-0,15 NaCI-IOmM EDTA (pH 8,2)—0,2% SDS] wurden die Filter danach dem Protease K-Abbau unterworfen. Jedem Filter wurden speziell 5ml der Lösung hinzugesetzt, und man ließ den Abbau bei 55°C über 30 Minuten vorsieh gehen. Danach wurde die Lösung entfernt.

Die Filter wurden dann mit 4 ml eines Prä-Hybridisierungspuffers (5 x SSPE — 0,5% SDS —100 Mikrogramm/ml SS E. coli-DNA — 5 x BFP) behandelt. Die Prä-Hybridisierungsbehandiung erfolgte bei 55°C, im allgemeinen über4 Stunden oder langer.

Danach wurde der Prähybridisierungspuffer entfernt.

DasHybridisierungsverfahren wurde auf goldene Weise durchgeführt. Zu jedem Filter wurden 3 ml Hybridisierungspuffer (5 x SSPE — 0,5% SDS —100 Mikrogramm/ml Hefe-tRNA), der 0,025 Picomole jeder der 128 Sondensequenzen von Tabelle Il enthielt (das Gesamtgemisch wurde als EPV-Gemisch bezeichnet), gegeben, und die Filter wurden 20 Stunden bei 48°C gehalten.

Diese Temperatur lag um 2⁰C niedriger als die niedrigste der berechneten Dissoziationstemperaturen (Td), die für eine beliebige der Sonden berechnet worden war.

Nach der Hybridisierung wurden die Filter dreimal für zehn Minuten auf einem Schüttler mit 6 x SSC-0,1 % SDS bei Zimmertemperatur gewaschen sowie zwei- bis dreimal mit 6 x SSC— 1%SDS bei derHybridisierungstemperatur (48⁰C) gewaschen. Die Autoradiografie der Filter zeigte sieben positive Klone unter 200000 gescreenten Kolonien.

Die Initialsequenzanalyse eines der vermeintlichen Affen-cDNA-Klone (als Klon 83 bezeichnet) erfolgte aus Gründen der Überprüfung auf Richtigkeit durch eine Modifikation der Verfahrensweise von Wallace et. al., Gene, 16, S. 21-26 (1981). Dabei wurde die Plasmid-DNA des Affen-cDNA-Klons 83 linearisiert durch Abbau mit Eco Rl und durch Erhitzen im siedenden Wasserbad denaturiert. Die Nucleotidsequenz wurde mittels des Didesoxy-Verfahrens von Sanger et al., P.N.A.S. (USA), 74, S.5463-5467 (1997) bestimmt. Ein Teilsatz des EPV-Gemisches der Sonden, bestehend aus 16 Sequenzen, wurde als Primerfür die Sequenzierungsxreaktionen verwendet. .

C. Sequenzieren von Affen-EPO-cDNA

Die Nucleotid-Sequenzanalysedes Klons 83 wurde mittels des Verfahrens von Messing, Methods in Enzymology, 101, 3.20^7S

(1983) durchgeführt. Aus Tabelle IV ist eine vorläufige Restriktionsmappenanalyse des annähernd 1 600 Basenpaar-Eco Rl/Hind lll-klonierten Fragments des Klons 83 zu entnehmen. Die annähernden Ortungen der Restriktionsendonuclease-enzym-Erkennungsstellen erfolgten mit Hilfe der Anzahl von Basen 3' zur EcoRI-Stelle am 5'-Ende des Fragments. Das Nucleotidsequenzieren erfolgte durch Sequenzen der individuellen Restriktionsfragmente mit der Absicht, überlappende Fragmente anzupassen, beispielsweise bestimmte die Analyse der Nucleotide in einem Restriktionsfragment die Überlappung der Sequenzinformation C113 (Sau 3A bei — 111 /Sma I bei ~ 324), und das reverse Ordersequenzieren eines Fragments C73 (AIu I bei ~ 424/BstE Il bei -203.

Approximate Location(s)

TABLE IV	Appr
Restriction Enzyme
Recognition Site	1
EcoRI	111
Sau3A	180
Smal	203
BstEII	324
Smal	371
Kpnl	372
Rsal	424
AIuI	426
Pstl	430
AIuI	466
Hpal	546
AIuI	601
Pstl	604
Pvull	605
AIuI	782
AIuI	788
AIuI	792
Rsal	8'07
Pstl	841
AIuI	927
AIuI	946
Ncol	1014
Sau3A	1072
AIuI	1 115
AIuI	1223
AIuI

TABLE IV (Fortsetzung) Approximate Location(s)

Restriction Enzyme	Appr
Recognition Site
Pstl	1301
Rsal	1343
AIuI	1384
Hindlll	1449
AIuI	1450
Hindlll	1585

Das Sequenzieren von annähernd 1 342 Basenpaaren (innerhalb der von der Sau 3A-Stelle 3' bis zur Eco R I-Stelle und der Hind Mi-steile überspannten Region) und die Analyse der Ableseraster gestattete die Aufstellung der DNA-und Arriihosäuresequenzinformationen,die in der Tabelle V enthalten sind. In der Tabelle wurde der vermutliche Anfangsaminosäurerest des Aminoterminals der reifen EPO (auf Richtigkeit überprüft durch Korrelation der vorher genannten Sequenzanalyse von zwanzig Aminoterminalresten) mit der Ziffer +1 bezeichnet. Die Anwesenheit eines Methioninspezifizierenden ATG-Codons (bezeichnet als —27) „oberhalb" (upstream) des anfänglichen Aminoterminal-Alaninrestes als des ersten Restes, der für die Aminosäuresequenz des reifen Proteins bezeichnet ist, zeigt die Wahrscheinlichkeit an, daß EPO anfänglich im Cytoplasma in einer Precursorform exprimiert wurde mit einer 27 Aminosäuren-„leader"-Region, die vor dem Eintritt des reifen EPO in den Kreislauf herausgeschnitten wird. Potentielle Glykosylierungsstellen innerhalb des Polypeptids sind durch Sternchen gekennzeichnet. Die geschätzte Molekülmasse dertranslatierten Region betrug 21117 Daltons und die Molekülmasse der 165 Reste des Polypeptids, das reifes Affen-EPO bildete, wurde mit 18236 Daltons bestimmt.

TABLE V

Translation of Monkey EPO cDNA

gatcccgcgccccctggacagccgccctctcctccaggcccgtggggctggccctgccc cgctgaacttcccgggatgaggactcccggtgtggtcaccgcgcgcctaggtcgctgag

Trp

Leu

Leu

Leu

-27

GIy

VaI

His

GIu

Cys

Pro

-20

Trp

Pro

Arg

TGG

CTT

CTC

CTG

Met

GGG

GTG

CAC

GAA

TGT

CCT

AIa

TGG

CCA

AGA

-1

+ 1

ATG

-10

GCC

Pro

GIy

AIa

Pro

Leu

VaI

Ser .

Leu

Pro

Leu

Leu

Leu

CCG

GGC

GCC

CCA

Ser

CTC

GTG

TCG

CTC

CCT

CTG

GIy

CTC

CTG

TCT

GGC

Arg

Tyr

Leu

Leu

Arg

Leu

Me

Cys

Asp

Ser

10

VaI

Met

AGG

TAC

CTC

TTG

Pro '

CGC

CTC

ATC

TGT

GAC

AGC

Arg

GTC

ATG

30

CCA

20

*

CGA

Cys

Ser

GIu

Ser

AIa

Lys

GIu

AIa

GIu

Asn

Thr

Pro

GGACCCCGGCCAGGCGCGGAG

TGT

TCC

GAA

AGC

GIu

GCC

AAG

GAG

GCC

GAG

AAT

VaI

ACG

CCA

Thr

Lys

VaI

Asn

GAG

*

GTC

GIy

Leu

ACC

AAA

GTT

AAC

Ser

Leu

Asn

GIu

Asn

He

40

VaI

GGG

CTG

60

Cys

AGC

TTG crt

AAT

GAG

AAT

ATC

Thr

GTC

Gin

AIa

VaI

GIu

TGC

Tyr

OU AIa

Trp

Lys

Arg

Met

ACC

VaI

GIu

VaI

CAG

GCT

GTA

GAA

Phe

TAT

GCC

TGG

AAG

AGG

ATG

GIu

GTC

GAA

GTC

TTC

GAG

VaI

Leu

Arg

GIy

Trp

Gin

GIy

Leu

AIa

Leu

70

Ser

Pro

GIu

GTC

CTG

CGG

GGC

VaI

TGG

CAG

GGC

CTG

GCC

CTG

Leu

TCA

CCT

GAG

90

GTC

80

#

CTC

GIu

Pro

Leu

GIn

AIa

VaI

Leu

AIa

Asn

Ser

GIn

Leu

GIy

GAG

CCC

CTG

CAG

GIn

GCC

GTG

TTG

GCC

AAC

TCT

Ser

CAG

CTT

GGC

CAG

TCC

Asp

Ser

ile

Thr

Thr

His

Met

Asp

Lys

AIa

Me

100

GIy

AIa

GAC

AGC

ATC

ACC

ACT

Leu

CAC

• ATG

GAT

AAA

GCC

ATC

Ser

GGC

GCC

120

CTG

110

AGT

Gin

Ser

Leu

Pro

Asp

Leu

Arg

AIa

Leu

GIy

AIa

GIu

He

CAG

TCC

CTC

CCA

GAT

Leu

CTT

CGG

GCG

CTG

GGA

GCC .

GIn .

GAA

ATC

CTG

CAG

Ala

AIa

Asp

Thr

Phe

AIa

Ser

AIa

AIa

Pro

Leu

130

Thr

Phe

GCT

GCT

GAC

ACT

TTC

AIa

GCC

TCG

GCT

GCT

CCA '

CTC

Arg

ACC

TTC

150

GCG

140

CGA

t

Phe

Arg

GIy

Lys

Leu

Lys

Leu

Phe

Arg

VaI

Tyr

Asn

TTC

CGG

GGA

AAG

CTG

Cys

AAA

CTC

TTC

CGA

GTC

TAC

Ser

AAT

TGC

TCC

Arg

Leu

Tyr

Thr

GIy

GIu

AIa

160

Arg

CGC

Lys

CTG

TAC

ACG

GGG

GAG

GCC

Cys

AGG

AAG

TGC

He

ATC

Th r

ACT

Leu

CTC

TABLE V (continued)

165 GIy Asp Arg OP

ggg gac aga tga ccaggtgcgtccagctgggcacatccaccacctccctcaccaaca ctgcctgtgccacaccctccctcaccatcccgaaccccatcgaggggctctcagctaag cgccagcctgtcccatggacactccagtgccagcaatgacatctcaggggccagaggaac tgtccagagcacaactctgagatctaaggatgtcgcagggccaacttgagggcccagagc aggaagcattcagagagcagctttaaactcaggagcagagacaatgcagggaaaacacct gagctcactcggccacctgcaaaatttgatgcaggacacgctttggaggcaatttacctg tttttgcacctaccatcagggacaggatgactggagaacttaggtggcaagctgtcactt ctcaaggcctcacgggcactcccttggtggcaagagcccccttgacactgagagaatatt ttgcaatctgcagcaggaaaaattacggacaggttttggaggttggagggtacttgacag gtgtgtggggaagcagggcggtaggggtggagctgggatgcgagtgagaaccgtgaagac ag g atg g g g g ctg g cctctg gttctcgtg g g gtccaag ctt

Hindi!]

Die Polypeptidsequenz von Tabelle V kann auf analytischem Wege leicht auf das Vorhandensein hydrophiler Bereiche und/oder sekundärer übereinstimmender Charakteristika überprüft werden, die potentiell hoch immunogene Bereiche anzeigen, z. B. durch die Methoden von Hopp et al., P.N. A. S. (USA), 78, S. 3824-3828 (1981) und Kyte et al., J.Mol. Biol. 157, S. 105-132 (1982) und/oder Chou et al. Biochem., 13, S. 222-245 (1974) und Advances in Enzymology, 47, S. 45-47 (1978). Die computergestützte Analyse nach der Methode von Hopp et al. ist über ein Programm möglich, das als PEP Reference Section 6.7 bezeichnet wird und über Intelligenetics, Inc. 124 University Avenue, PaIo Alto, Californien, erhältlich ist.

Beispiel 4 A. Human-Genbibliothek

Eine Ch4APhagen-geborene menschliche fötale Leber-Genbibliothek, hergestellt nach den Verfahren von Lawn et al., Cell, 18, S. 533-543 (1979), wurde erhalten und zur Verwendung in einer Plaque-Hybridisierungsassay bereitgestellt.

B. Plaque-Hybridisierungsverfahren zum Screening einer HuMan-Genbibliothek

Phagenteilchen wurden lysiert und die DNA's auf Filtern fixiert (50000 Plaques pro Filter) nach den Verfahrensweisen von Woo, Methods in Enzymology, 68, S. 389-395 (1979), ausgenommen für die Verwendung von GeneScreene Plus-Filter (New England Nuclear Catalog Nr.NEF-976) und NZYAM-Platten (NaCI, 5g; MgCI₂-6H₂O, 2g; NZ-Amin A, 10g; Hefeextrakt, 5g; Casaminosäuren, 2g; Maltose, 2g; und Agar, 15g/l).

Die luftgetrockneten Filter wurden für eine Stunde bei 8O⁰C wärmebehandelt und im Anschluß daran mit Proteinase K wie in Beispiel 3, Teil B, abgebaut. Die Prä-Hybridisierung wurde mit 1 M NaCI — 1 % SDS-Puffer bei 55°C über 4 Stunden oder mehr durchgefüh rt, wonach der Puffer entfernt wurde. Hybridisierungs-und Nachhybridisierungswaschungen wurden wie in Beispiel 3, Teil B beschrieben, durchgeführt. Sowohl das Gemisch von als EPV bezeichneten 128 20-mer-Sonden als auch das Gemisch von 128 17-mer-Sonden aus Tabelle III (bezeichnet als EPQ-Gemisch) wurde eingesetzt. Die Hybridisierung wurde bei 48⁰C unter Verwendung des EPV-Sondengemisches durchgeführt. Die EPQ-Sondengemisch-Hybridisierung wurde bei 46°C durchgeführt — 4 Grad unterhalb der niedrigsten berechneten Td für Bestandteile des Gemisches. Die Entfernung der Hybridisierungssonde für die Rehybridisierung erfolgte durch Kochen mit 1 χ SSC — 0,1 % SDS für zwei Minuten. Die Autoradiografie der Filter zeigte drei positive Klone (mit beiden Sondengemischen reaktionsfähig) von 1 500000 gescreenten Phagenplaques. Die Überprüfung auf Richtigkeit der positiven Klone als EPO-verschlüsselnd erhielt man über DNA-Sequenzieren und elektronenmikrografische Sichtbarmachung derHeteroduplex-Bildung mit der Affen-cd N A von Beispiel 3. Dieses Verfahren gab auch über multiple I ntrons in der genomischen DNA-Sequenz Aufschluß.

Beispiel 5

Es wurde eine Nucleotid-Sequenzanalyse eines der positiven Klone (bezeichnet als XhEI) durchgeführt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle Vl aufgeführt.

TABLEVI

aagcttctgggcttccagacccagctactttgcggaactcagcaacccaggcatctctgagtctccgccca agaccgggatgccccccaggggaggtgtccgggagcccagcctttcccagatagcacgctccgccagtccc aagggtgcgcaaccggctgcactcccctcccgcgacccagggcccgggagcagcccccatgacccacacgc acgtctgcagcagccccgctcacgccccggcgagcctcaacccaggcgtcctgcccctgctctgaccccgg gtggcccctacccctggcgacccctcacgcacacagcctctcccccacccccacccgcgcacgcacacatg cagataacagccccgacccccggccagagccgxagagtccctgggccaccccggccgctcgcctgccgctg cgccgcaccgcgctgtcctcccggagccggaccggggccaccgcgcccxgctctgctccgacaccgcgccc cttggacagccgccctctcctctaggcccgtggggctggccctgcaccgccgagcttcccgggatgaggxx

-27 -24

Met GIy VaI His

CCCGGTGACCGGCGCGCCCCAAGTCGCTGAGGGACCCCGGCCAAGCGCGGAG ATG GGG GTG CAC G

GTGAGTACTCGCGGGCTGGGCGCTCCCGGCGGCCGGGTTCCTGTTTGAGCGGGGATTTAGCGCCCCGGCT

TABLE Vl (cont'd.)

ATTGGCCAAGAGGTGGCTGGGTTCAAGGACCGGCGACTTGTCAAGGACCCCGGAAGGGGGAGGGGGGTGGG GCAGCCTCCACGTGCCGCGGGGACTTGGGGGAGTTCTTGGGGATGGCAAAAACCTGGCCTGTTGAGGGGCA CAGTTTGGGGTTGGGGAGGAGGTTTGGGGTTCTGCTGTGCAGTTGTGTCGTTGTCAGTGTCTCGIl.S.] TTGCACACGCACAGATCAATAAGCCAGAGGCAGCACCTGAGTGCTTGCATGGTTGGGACAGGAAGGACGAG CTGGGGCAGAGACGTGGGGATGAAGGAAGCTGTCCTTCCACAGCCACCCTTCTCCCCCCCCGCCTGACTCT

-23 -20

GIu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu CAGCCTGGCTATCTGTTCTAG AA TGT CCT GCC TGG CTG TGG CTT CTC CTG TCC CTG

-10 -1 +1

Leu .Ser Leu Pro Leu GIy Leu Pro VaI Leu GIy AIa Pro Pro Arg Leu He Cys CTG TCG CTC CCT CTG GGC CTC CCA GTC CTG GGC GCC CCA CCA CGC CTC ATC TGT

' 10 20 . *

Asp Ser Arg VaI Leu GIu Arg Tyr Leu Leu GIu AIa Lys GIu Ala GIu Asn He GAC AGC CGA GTC CTG GAG AGG TAC CTC TTG GAG GCC AAG GAG GCC GAG AAT ATC 26 Thr

ACG GTGAGACCCCTTCCCCAGCACATTCCACAGAACTCACGCTCAGGGCTTCAGGGAACTCCTCCCAGAT CCAG G AACCTG G CACTTG GTTTGG G GTG GAGTTG G G AAGCTAG ACACTG CCCCCCTACATAAG AATAAGTC TG GTG GCCCCAAACCATACCTG AAACTAG G CAAG G AG CAAAG CCAG CAG ATCCTACG CCTGTG GGCCAGGG

27 30

Thr GIy Cys Ala GIu CCAGAGCCTTCAGGGACCCTTGACTCCCCGGGCTGTGTGCATTTCAG ACG GGC TGT GCT GAA

* 40

His Cys Ser Leu Asn GIu Asn Ne Thr VaI Pro Asp Thr Lys VaI Asn Phe Tyr CAC TGC AGC TTG AAT GAG AAT ATC ACT GTC CCA GAC ACC AAA GTT AAT TTC TAT 50 55

AIa Trp Lys Arg Met GIu

gcc tgg aag agg atg gag gtgagttcci i i i i i i il i i i i i icctttcttttggagaatctcatt tgcgagcctgattttggatgaaagggagaatgatcgggggaaaggtaaaatggagcagcagagatgaggct gcctgggcgcagaggctcacgtctataatcccaggctgagatggccgagatgggagaattgcttgagccct ggagtttcagaccaacctaggcagcatagtgagatcccccatctctacaaacatttaaaaaaattagtcag gtgaagtggtgcatggtggtagtcccagatatttggaaggctgaggcgggaggatcgcttgagcccaggaa tttgaggctgcagtgagctgtgatcacaccactgcactccagcctcagtgacagagtgaggccctgtctca aaaaagaaaagaaaaaagaaaaataatgagggctgtatggaatacattcattattcattcactcactcact CACTCATTCATTCATTCATTCATTCAACAAGTCTTATTG CATACCTTCTGTTTG CTCAG CTTG GTG CTTG G ggctgctgaggggcaggagggagagggtgacatgggtcagctcgactcccagagtccactccctgtag

56 60 70

VaI GIy Gin Gin Ala VaI GIu VaI Trp Gin GIy Leu AIa Leu Leu Ser GIu AIa GTC GGG CAG CAG GCC GTA GAA GTC TGG CAG GGC CTG GCC CTG CTG TCG GAA GCT

80 * 90

VaI Leu Arg GIy Gin AIa Leu Leu VaI Asn Ser Ser GIn Pro Trp GIu Pro Leu GTC CTG CGG GGC CAG GCC CTG TTG GTC AAC TCT TCC CAG CCG TGG GAG CCC CTG

100

GIn Leu His VaI Asp Lys Ala VaI Ser GIy Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu CAG CTG CAT GTG GAT AAA GCC GTC AGT GGC CTT CGC AGC CTC ACC ACT CTG CTT 110 115

Arg AIa Leu GIy Ala GIn

CGG GCT CTG GGA GCC CAG GTGAGTAGGAGCGGACACTTCTGCTTGCCCTTTCTGTAAGAAGGGGA GAAGGGTCTTGCTAAGGAGTACAGGAACTGTCCGTATTCCTTCCCTTTCTGTGGCACTGCAGCGACCTCCT

116 120

Lys GIu Ala He Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala AIa GTTTTCTCCTTGGCAG AAG GAA GCC ATC TCC CCT CCA GAT GCG GCC TCA GCT GCT

130 140

Pro Leu Arg Thr He Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg VaI Tyr Ser CCA CTC CGA ACA ATC ACT GCT GAC ACT TTC CGC AAA CTC TTC CGA GTC TAC TCC

150 160

Asn Phe Leu Arg GIy Lys Leu Lys Leu Tyr Thr GIy GIu AIa Cys Arg Thr GIy AAT TTC CTC CGG GGA AAG CTG AAG CTG TAC ACA GGG GAG GCC TGC AGG ACA GGG

Asp Arg OP GAC AGA TGA CCAGGTGTGTCCACCTGGGCATATCCACCACCTCCCTCACCAACATTGCTTGTGTGCCACA

TABLE Vl (cont'd.)

CCCTCCCCCGCCACTCCTGAACCCCGTCGAGGGGCTCTCAGCTCAGCGCCAGCCTGTCCCATGGACACTCC

AGGGCCAACTTGAAGGGCCCAGAGCAGGAAGCATTCAGAGAGCAGCTTTAAACTCAGGGACAGAGCCATGC TGGGAAGACGCCTGAGCTCACTCGGCACCCTGCAAAATTTGATGCCAGGACACGCTTTGGAGGCGATTTAC CTGTTTTCGCACCTACCATCAGGGACAGGATGACCTGGAGAACTTAGGTGGCAAGCTGTGACTTCTCCAGG TCTCACGGGCATGGGCACTCCCTTGGTGGCAAGAGCCCCCTTGACACCGGGGTGGTGGGAACCATGAAGAC AXGATXGGGGCTGGCCTCTGGCTCTCATGGGGTCCAAGTTTTGTGTATTCTCAACCTATTGACAGACTGAA ACACAATATGAC

In Tabelle Vl bezeichnet die anfängliche fortlaufende DNA-Sequenz einen Kopfstrang von 620 Basen, in dem offensichtlich eine untranslatierte Sequenz unmittelbar einem translatierten Teil des Human-EPO-Gens vorausgeht. Insbesondere erscheint es so, daß die Sequenz das 5'Ende des Gens umfaßt, das zu einer translatierten DNA-Region überleitet, die für die ersten vier Aminosäuren (—27 bis —24) einer Führungssequenz („Pre-Sequenz") codiert. Vier Basenpaare in der Sequenz vor der die den Anfang der Führungssequenz verschlüsselt, wurden nicht genau bestimmt und sind daher als „X" bezeichnet worden. Es folgt dann ein Intron von etwa 639 Basenpaaren (439 Basenpaare davon wurden sequenziert und die restlichen 200 Basenpaare davon wurden als „I.S." bezeichnet) und unmittelbar davor ein Codon für Glutamin, das als Rest —23 des translatierten Polypeptids bezeichnet wurde. Die unmittelbar folgende Exonsequenz wird als codierend für Aminosäurereste durch einen Alanin rest angesehen (bezeichnet als der +1-Rest der Aminosäuresequenz von reifem ³Human-EPO) zu dem Codon, das Threonin an Position +26 spezifiziert, wonach ein zweites Intron folgt, das aus 256 Basen besteht, wie sie spezifisch bezeichnet sind. Diesem Intron folgt eine Exonsequenz für die Aminosäurereste 27 bis 55 und danach beginnt ein 612 Basen paare enthaltendes drittes Intron.

Das anschließende Exon codiert für die Reste 56 bis 115 das Hu man-EPO und dann beginnt ein viertes Intron von 134 Basen, wie aufgeführt. Dem vierten jntron folgt ein Exon, das für die Reste Nr. 116 bis 166 codiert und ein Stopcodon (TGA). Schließlich wird in Tabelle IV eine Sequenz von 568 Basenpaaren identifiziert, worin eine untranslatierte 3'-Region des Human-EPO-Gens erscheint, zwei Basenpaare, von denen („X") bisher noch nicht genau sequentiell worden ist.

Tabelle Vl dient somit zur Ermittlung der Strukturübereinstimmung (Aminosäuresequenz) von reifem Human-EPO, das 166 spezifische Aminosäurereste enthält (geschätzte Molmasse = 18399). Außerdem erscheint in der Tabelle die DNA-Sequenz, die für eine Führungssequenz mit 27 Resten zusammen mit 5'- und 3'-DNA-Sequenzen codiert, die für Promoter/Operatorfunktionen des Humangen-Operons signifikant sein können.

Stellen für die potentielle Glycosylierung des reifen Human-EPO-Polypeptids sind in der Tabelle durch Sternchen bezeichnet. Es sollte beachtet werden, daß die spezifische Aminosäuresequenz von Tabelle Vl wahrscheinlich jene einer natürlich auftretenden allelischen Form von Human-Erythropoietin bildet. Diese Position wird durch die Ergebnisse der fortlaufenden Bemühungen beim Sequenzieren von Urinisolaten von Human-Erythoropoietin gestützt, das dazu führte, daß man eine bedeutende Anzahl von Erythropoietinmolekülen darin herausfand, die ein Methionin am Rest 126 gegenüber einem Serin aufwiesen, wie in der Tabelle gezeigt.

Die folgende Tabelle VII erläutert den Grad der Polypeptidsequenz-Homologie zwischen Human- und Affen-EPO. In der oberen fortlaufenden Reihe der Tabelle wurden Einzelbuchstabenbezeichnungen verwendet, um die hergeleiteten, translatierten Polypeptidsequenzen von Human-EPO darzustellen, beginnend mit dem Rest -27, und die untere fortlaufende Reihe zeigt die . hergeleitete Polypeptidsequenz von Affen-EPO, beginnend mit dem als Nummer —27 bezeichneten Rest. Sternchen zeigen die Sequenzhomologien an. Es sollte festgehalten werden, daß die hergeleiteten Human- und Affen-EPO-Sequenzen einen „zusätzlichen" Lysiη(K)-ReSt an der (Human-) Position 116 aufweisen. Ein Vergleich mit Tabelle Vl zeigt, daß dieser Rest am Rande einer vermutlichen mRNA-Spleißverbindu ng in der genomischen Sequenz auftritt. Das Vorhandensein des Lysinrestes in der Human-Polypeptidsequenz wurde darüber hinaus durch Sequenzieren eines cDNA-Humansequenzklons überprüft, hergestellt aus mRNA, die aus COS-1 Zellen isoliert worden waren, die mit der humangenomischen DNA von Beispiel 7 (siehe unten) transformiert wurden.

TABLE VII

Comparison of Human and Monkey EPO Polypeptides

-20 -10 .+ 1 10 20 30 40 Human MGVHECPAWLWLLLSLLSLPLGLPVLGAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCSLNENITVPDTK

Monkey MGVHECPAWLWLLLSLVSLPLGLPVPGAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENVTMGCSESCSLNENITVPDTK

50 60 70 80 90 100 110 Human VNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKE

Monkey VNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQAVLANSSQPFEPLQLHMDKAISGLRSITTLLRALGAQ-E

120 130 140 150 160

Human AISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTGDR

Monkey AISLPDAASAAPLRT ITADTFCKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRRGDR

Beispiel 6

Das Expressionssystem, ausgewählt für anfängliche Versuche bei der mikrowellen Synthese von isolierbaren Mengen des durch Affen-cDNA dafür codierten EPO-Polypeptidmaterials, die durch die Verfahrensweisen von Beispiel 3 erhalten wurde, war ein solches, zu dem Säugetierwirtszellen (d. i. COS-1 Zellen, ATTC Nr. CRL-1650) gehören. Die Zellen wurden mit einem „Zubringer"-Vektor transfektiert, der zur selbständigen Replikation in dem E. coli-Wirt (infolge der Anwesenheit von pBR322-abgeleiteter DNA) und den Säugetierwirten (infolge der Anwesenheit von SV40 virusabgeleiteter DN A) in der Lage ist.

Speziell wurde ein Expressionsvektor nach den folgenden Verfahren konstruiert. Der in Beispiel 3 erhaltene Plasmidklon 83 wurde in E. coli amplifiziert und die annähernd 1, 4kb Affen-ΕPO verschlüsselnde DNA wurde durch EcoRI- und Hindlll-Abbau isoliert. Getrennt isoliert wurde ein ungefähr 4,0 kb, Hind Ill/Sal1-Fragment aus pBR322. Ein ungefähr 3ObP₁ECoRIZSaM-„linker"-Fragment erhielt man ausM13mp10RFDNA(PundL Laboratories). Dieser Linker enthielt — in Reihe — ein einzelsträngiges EcoRI-ende, gefolgt von Sst1-, Smal-, BamHl-und Xbal-Erkennungsstellen und einem einzelsträngigen Sa11-Ende.

Die oben genannten drei Fragmente wurden ligiert, wobei man ein ungefähr 54kb Zwischenplasmid („pERS") erhielt, worin die EPO-DNA auf einer Seite von einer „bank" nützlicher Restriktionsendonuclease-Erkennungsstellen flankiert war. Dann wurde pERS mit Hind III und SaIII abgebaut, und man erhielt die EPO-DNa und die EcoRI- bis SaII-(M 13 mp 10)-Linker. Das1,4kb-Fragment wurde in einem ungefähr 4,0kb BamH I/Sall— von pBR322 und einem anderen M 13 mp10 Hind HI/BamH 1-RF-Fragmentlinker ligiert, der auch etwa 30 bp aufwies. Das M13-Linkerfragment war gekennzeichnet durch ein einzelsträngiges Hindlll-Ende, gefolgt von Pst I-, Sail — und Xba1-Erkennungsstellen und einem einzelsträngigen BamH1-Ende. Das Ligierungsprodukt war wiederum ein nützliches Zwischenplasmid („pBR-EPO"), das die von beiden Seiten durch Bänke von Erkennungsstellen flankierte DNA enthielt.

Der für die Expression der EPO-DNA in Cos-1 Zellen gewählte Vektor („pDSVL 1") wurde vorher konstruiert, um die Selektion und selbständige Replikation in E. coli zu ermöglichen. Diese Kennzeichen ergeben sich durch die Herkunft der Replikation und die Ampicillinresistenten Gen-DNa-Sequenzen, die in der von den Nucleotiden 2448 bis 4362 des pBR322 überspannten Region vorhanden sind. Diese Sequenz wurde strukturell durch Zugabe eines Linkers modifiziert, der eine Hindlll-Erkennung unmittelbar neben dem Nucleotid 2448 vor dem Einbau in den Vektor vorsah. Zu den anderen nützlichen Eigenschaften des ausgewählten Vektors gehörte die Kapazität selbständig in COS-1 Zellen zu replizieren und das Vorhandensein eines viralen Promotorsequenzfunktionals in Säugetierzellen. Diese Kennzeichen ergeben sich durch die Herkunft der replikations-DNA-Sequenzund die virale Promoter-DNA-Sequenz am „spaten Gen" („late gen"), die in der 342bp-Sequenz vorhanden ist, die die Nucleotide Nr. 5171 bis 270 des SV40-Genoms überspannt.

Im Vektor wurde eine einzelne Restriktionsstelle (BamH I) vorgesehen und unmittelbar benachbart die virale Promotersequenz durch Einsatz einer handelsüblichen Linkersequenz (Collaborative Research). Ebenfalls eingebaut in den Vektor war eine 237-Basenpaarsequenz (abgeleitet als Nucleotide Nr. 2553 bis 2770 von SV40), die das virale mRNA-Polyadenylierungssignal des „späten Gens" (üblicherweise als ein Transskriptionsterminator bezeichnet) enthielt. Dieses Fragment wurde im Vektor in der richtigen Orientierung vis-a-vis dem viralen Promoter des „spaten Gens" über die einzelne BamHI-Stelle angeordnet. Ebenso war im Vektor ein anderes Säugetiergen an einem Standort anwesend, wo kein Material zur potentiellen Transskription eines an der einzelnen BamH !-Stelle inserierten Gens war, zwischen den viralen Promoter- und Terminatorsequenzen.

Das Säugetiergen umfaßte ein ungefähr 2 500 bp Mäusedihydrofolatreduktase (DHFR)-Minigen, isoliert aus dem Plasmid pMG-1, wie in Gasser et al., P. N-A. S. (USA), 79, S.6522 bis 6526 (1982) beschrieben.

Wiederum enthielten die hauptoperativen Komponenten des Plasmids pDSVLI die Nucleotide 5171 bis 270 (342 bp) und 2553 bis 2770(237bp)derSV40-DNA.

Nach den folgenden z. B. von Maniatis et al. (siehe oben) beschriebenen Verfahrensweisen wurde die EPO-verschlüsselnde DNA aus dem Plasmid pBR-EPO als ein BamH I-Fragment isoliert und in das mit BamH I geschnittene Plasmid pDSVL 1 ligiert. Die Restriktionsenzymanalyse wurde für die Bestätigung der Insertion des EPO-Gens in der korrekten Orientierung in zwei der erhaltenen geklonten Vektoren eingesetzt (Doppelvektoren H und L) — siehe Fig. 2, die das Plasmid pDSVL-MKE erläutert.

Vektoren mit EPO-Genen in falscher Orientierung wurden zur Verwendung als negative Kontrollelemente in Transfektionsexperimenten aufgehoben, um EPO-Expressionsgehalte in Wirten zu bestimmen, die mit EPO-DNA in der korrekten Orientierung aufweisenden Vektoren transformiert worden waren.

Die Vektoren H, L, F, X und G wurden mit Träger-DNA (Mäuseleber- und Milz-DNA) kombiniert und dazu eingesetzt, Doppel-60-mm-Platten durch Kalziumphosphat-Mikrofällungsmethoden zu transfektieren. Die Doppel-60-mm-Platten wurden auch mit Träger-DNA als eine „mock"-Transformationsnegativkontrolle transferiert.

Nach 5 Tagen wurden alle Kulturmedien auf Vorhandensein von Polypeptiden getestet, die immunologische Eigenschaften von natürlich auftretender EPO besitzen.

Beispiel 7 A. Initial-EPO-Expressionssystem unter Einbeziehung von COS-1 Zellen

In das für die anfänglichen Versuche bei der mikrowellen Synthese isolierbarer Mengen von Human-EPO-Polypeptidmaterial,für das der humangenomische DNA-EPO-Klon codiert, ausgewählte System war auch die Expression in Säugetierwirtszellen (d. i. COS-1 Zellen, ATTC Nr. CRL-1650) mit einbezogen. Das Human-EPO-Gen wurde zuerst subkloniert in einen „Zubringer"-Vektor, der zur selbständigen Replikation sowohl in E. coli-Wirten (infolge der von pBR322 abgeleiteten Anwesenheit von DNA) als auch in der Säugetierzellinie COS-1 (infolge der von SV40-Virus abgeleiteten Anwesenheit von DNA) in der Lage war. Der Zubringervektor, der das EPO-Gen enthielt, wurde dann in COS-1 Zellen transferiert. In den transferierten Zellen wurde EPO-Polypeptidmaterial produziert und in die Zellkulturmedien ausgeschieden.

Speziell wurde der Expressionsvektor nach den folgenden Verfahren konstruiert. Aus dem Lambda-Klon \hE1, der das humangenomische EPO-oen enthielt, wurde DNA isoliert und mitBamHI- und Hindlll-Restriktionsendonukleasen abgebaut, wobei man ein 5,6kb DNA-Fragment isolierte, von dem bekannt war, daß es das gesamte EPO-Gen enthielt. Dieses Fragment wurde gemischt und ligiert mit dem bakteriellen Plasmid pUC8 (Bethesda Research Laboratories, ine.) das auf ähnliche Weise abgebaut wurde, wobei man zu dem Zwischenplasmid „PUC8-HUE" gelangte, wodurch ein geeigneter Ausgangsstoff dieses Restriktionsfragmentes erschlossen war.

Derfür die Expression der EPO-DNA in COS-1 Zellen (pSV4SEt) gewählte Vektor wurde vorher konstruiert. Das Plasmid pSV4SEt enthielt DNA-Sequenzen, die eine Selektion und selbständige Replikation in E. coli gestattete. Diese Kennzeichen ergaben sich durch den Ursprung der Replikation und die Ampicillinresistenz-Gen-DNA-Sequenzen, die in der Region vorhanden waren, die die Nucleotide 2448 bis 4362 des bakteriellen Plasmids pBR322 überspannte. Diese Sequenz war strukturell modifiziert durch die Zugabe eines Linkers, der eine Hindlll-Erkennungsstelle unmittelbar neben dem Nucleotid 2448 vorsah. Das Plasmid pSV4SEt war ebenso zur selbständigen Replikation in COS-1 Zellen in der Lage. Dieses Kennzeichen ergab sich durch ein 342 bp-Fragment, das den SV40-Virusursprung der Replikation (Nucleotide Nr. 5171 bis 270) enthielt. Dieses Fragment wurde durch den Zusatz eines Linkers modifiziert, der eine EcoRIU-Erkennungsstelle neben dem Nucleotid 270 vorsah, und eines Linkers, der eine Sall-Erkennungsstelle neben dem Nucleotid 5171 vorsah.

Ein 1061bp-Fragmentvon SV40 war auch in diesem Vektor vorhanden (Nucleotidnr. 1711 bis 2772 plus Linker, der eine Sal I-Erkennungsstelleals nächstes neben dem Nucleotid Nr.2772 vorsah). Innerhalb dieses Fragments gab es eine einzelne BamHI-Erkennungssequenz. Zusammengefaßt erlaubte somit das Plasmid pSV4SEt, das eine einzelne BamHI und Hind IiI-Erkennungsstelle enthielt, die Insertion des Human-EPO-Gens, die Sequenzen gestatteten die Replikation und Selektion in E. coli und die Sequenzen gestatteten die Replikation in COS-1 Zellen.

Um das -EPO-Gen in pSV4SEt zu insertieren, wurde das Plasmid pUC8-HuE mit BamHI- und HindIll-Restriktionsendonucleasen abgebaut und das 5,6 kb EPO-verschlüsselnde DNA-Fragmet isoliert. pSV4SEt wurde ebenfalls mit BamH I und Hind III abgebaut und das größere 2513bp-Fragment isoliert (bewahrt alle notwendigen Funktionen). Diese Fragmente wurden gemischt und ligiert, wodurch der endgültige Vektor „pSVgHuEPO" entstand (siehe Fig. 3). Dieser Vektor wurde in E. coli reproduziert und die Vektor-DNa isoliert. Unter Einsatz der Restriktionsenzymanalyse wurde die Insertion des EPO-Gens bestätigt. Die Plasmid pSVgHuEPO-DNA wurde verwendet, Human-EPO-Polypeptidmaterial in COS-1 Zellen zu exprimieren. Genauer . gesagt, pSVgHuePO-DNA wurde mit Träger-DNA kombiniert und in dreifache 60-mm-Platten von COS-1 Zellen transferiert. Als Kontrolle wurde Träger-DNA allein ebenfalls in COS'-Zellen transferiert. Von den Zellkulturmedien wurden fünf und sieben Tage später Proben genommen und auf Vorhandensein von Polypeptiden getestet, die die immunologischen Eigenschaften von natürlich vorkommendem Human-EPO besitzen.

B. Zweites EPO-Expressionssystem unter Einbeziehung von COS-1 Zellen

Ein weiteres System war dazu bestimmt, eine verbesserte Produktion von EPO-Polypeptidmaterial zu ermöglichen, das durch den humangenomischen DNA-EPO-Klon in COS-i Zellen (ATCCNr. CRL-1650) codiert wird.

In dem unmittelbar vorausgehenden System war EPO in COS-1 Zellen experimentiert worden unter Verwendung von dessen eigenem Promoter, der innerhalb des 5,6 kb BamHI- bis Hindlll-Restriktionsfragmentes liegt. In der folgenden Konstruktion wurde das EPO-Gen umgeändert, so daß es unter Einsatz von SV40-„späten"-Promotorsexprimiert wurde. Speziell wurde das klonierte 5,6kb Bam Hl — bis Hind lll-genomische Human-EPO-Restriktionsfragmentauf folgende Weise modifiziert. Das oben beschriebene Plasmid pUC8-HuE wurde mit Bam Hl- und mit BstE Il-Restriktionsendonucleasen geschnitten. BstE Il schneidet innerhalb des 5,6kb EPO-Gens an einer Position, die 44 Basenpaare 5' nach dem einleitenden ATG liegt, das für das Pre-Peptid codiert, und ungefähr 680 Basenpaare 3' nach der Hind Ill-Restriktionsstelle. Das annähernd 4900 Basenpaarfragment wurde isoliert. Ein synthetisches Linker-DNA-Fragment, das einzelsträngige Sail- und.BstE ll-enden und eine innere Barn Hl-Erkennungsstelle enthielt, wurde synthetisiert und gereinigt. Die beiden Fragmente wurden gemischt und ligiert mit dem Plasmid pBR322, das mit Sal I und Bam Hl geschnitten worden war, um das Zwischenplasmid pBRgHE zu produzieren. Das genomische Human-EPO-Gen konnte daraus als ein 4900 Basenpaar-Bam HI-Abbaufragment isoliert werden, das das vollständige strukturelle Gen mit einem einzelnen ATG 44 Basenpaare 3' bis zur Barn HI-Stelle, die an die Aminoterminal codierende Region angrenzt, trägt.

Dieses Fragment wurde isoliert und als ein Barn HI-Fragment in das Barn HI-geschnittene Expressionsvektorplasmid pDSVLI (geschrieben in Beispiel 6) insertiert. Das erhaltene Plasmid pDSVLgHuEPO, wie in Fig.4 erläutert, wurde dazu verwendet, EPO-Polyeptidmaterial aus COS-1 Zellen-zu exprimieren, beschrieben in den Beispielen 6 und 7A.

Beispiel 8

Kulturmedien aus dem Wachstum der sechs transferierten COS-1 Kulturen des Beispiels 6 wurden durch Radioimmunoassay entsprechend den Verfahrensweisen nach Beispiel 2, Teil B, analysiert. Jedes Beispiel wurde bei 250,125, 50 und 25 Mikroliter aliquoten Gehalten untersucht. Überstehendes aus dem Wachstum von Zellen, scheintransfektiert oder transferiert mit Veroren, die die nichtkorrekte Genorientierung aufwiesen, waren unzweifelhaft negativ für die EPO-lmmunoreaktivität. Für jede Probe der beiden Überstehenden, die sich aus dem Wachstum von COS-1 Zellen ergaben, die mit Vektoren (H und L). transferiert waren, deren EPO-DNA sich in korrekter Orientierung befand, reichte die prozentuale Inhibierung der ¹²⁵I-EPO-Bindung an Antikörper von 72 bis 88%, wodurch alle Werte an die Spitze der Standardkurve getreten, aus. Die genaue Konzentration des EPO im Kulturüberstehenden konnte nicht zuverlässig eingeschätzt werden. Es erfolgte eine völlig konservative Einschätzung von 300mU/ml, allerdings aus der Wertberechnung der größten aliquoten Größe (250 Mikroliter).—

Eine repräsentative Kulturflüssigkeit gemäß Beispiel 6 sowie fünf und sieben Tage alte Kulturflüssigkeiten, die man nach Beispiel 7 A erhalten hatte, wurden über eine RIA getestet, um die Aktivität der rekombinanten Affen-und Human-EPO-Materialien gegen einen Standard einer natürlich auftretenden Human-EPO zu vergleichen, wobei die Ergebnisse in grafischer Form in Fig. 1 aufgeführt sind. Kurz zusammengefaßt offenbarten die Ergebnisse erwartetermaßen, daß das rekombinante Affen-EPO signifikant mit Anti-Human-EPO-Antikörper konkurrierte, obgleich es nicht in der Lage war, die Bindung unter den Testbedingungen vollständig zu inhibieren. Der höchste Inhibierungsprozentsatz für rekombinante Human-EPO lag allerdings nahe etwa bei dem desHuman-EPO-Standards. Die parallele Lage der Dosisreaktionskurven deutet auf immunologische Identität der gemeinsamen Sequenzen (Epitope) hin. Vorherige Einschätzungen der Affen-ePO in Kulturflüssigkeiten wurden bei diesen höheren Verdünnungsgraden zurückgerechnet und im Bereich von 2,91 bis 3,12E/ml gefunden. Eingeschätzte Human-EPO-Produktionshöhen wurden dementsprechend bei 392mE/ml für die Fünf-Tage-Wachstumsprobe und bei 567mE/ml für die Sieben-Tage-Wachstumsprobe angesetzt. Eingeschätzte Affen-EPO-Produktionshöhen im Expressionssystem des Beispiels 78 lagen im selben Bereich oder höher.

Beispiel 9

Nach den Beispielen 6 und 7 hergestellte Kulturflüssigkeiten wurden einer in vitro-Assay auf EPO-Aktivität unterworfen gemäß der Verfahrensweise von Goldwasser et al., Endocrinology, 97,2, S. 315-323 (1975). Eingeschätzte Affen-EPO-Werte für getestete Kulturflüssigkeiten lagen im Bereich von 3,2 bis 4,3 E/ml. Human-EPO-Kulturflüssigkeiten waren in dieser in vitro-Assay ebenfalls aktiv und darüber hinaus konnte diese Aktivität durch Anti-EPO-Antikörper aufgehoben werden. Die rekombinanten Affen-EPO-Kulturflüssigkeiten gemäß Beispiel 6 wurden ebenfalls einer Assay auf in vivo-biologische Aktivität unterworfen, gemäß den allgemeinen Verfahrensweisen von Cotes et al., Nature, 191, S. 1065-1067 (1981) und Hammond et al., Ann. N. Y. Acad. Sei., 149, S.516-527 (1986), und Aktivitätsspiegel lagen im Bereich von 0,94 bis 1,24E/ml.

Beispiel 10

In den vorangegangenen Beispielen wurde rekombinantes Affen- oder Human-EPO-Material aus Vektoren produziert, die zur Transfektion vonCOS-1 Zellen verwendet wurden. Diese Vektoren replizieren in COS-1 Zellen wegen der Anwesenheit von SV 40 Antigen in der ZeIIe und einesSV40-Replikationsursprungesauf den Vektoren. So produzieren diese Vektoren nützliche Mengen an EPO in COS-1 Zellen, die Expression ist nur vorübergehend (7 bis 14 Tage) infolge des eventuellen Verlustes des Vektors. Zusätzlich würde nur ein geringer Prozentsatz von COS-1 produktiv mit den Vektoren transferiert.

Das vorliegende Beispiel beschreibt Expressionssysteme, die mit Ovar-(CHO)DHFR~-Zellen des chinesischen Hamsters und dem ausgewählten Marker DHFR arbeitete [zur Diskussion verwandter Expressionssysteme siehe US-PS 4399216 und europäische Patentanmeldungen 117058,117059 und 117060, alle am 29. August 1984 veröffentlicht.] CHO DHFR"-Zellen (DuX-B 11), CHO K1-Zellen, Urlaub et al., Proc. Nat. Acad. Sei. (USA), Bd.77,4461 (1980) fehlt das Enzym Dihydrofolatreduktase (DHFR), das bei Mutationen in strukturellen Genen vorhanden sein muß, und somit ist das Vorhandensein von Glycin, Hypoxanthin und Thymidin im Kulturmedium erforderlich. Die Plasmide pDSVL-Mke (Beispiel 6) oder pDSVL-gHuEPO (Beispiel 7b) wurden längs mitTräger-dNA in CHO DHFR~-Zellen transferiert, die in einem Medium wuchsen, das Hypoxanthin, Thymidin und Glycin enthielt, in 60mm Kulturplatten. Das Plasmid psVgHuEPO (Beispiel 7A) wurde mit dem Plasmid pMG 2 gemischt, das MäuseDihydrofolatreduktasegen enthielt, geklont in den bakteriellen Plasmidvektor PBR 322 (nach Grasseretal.,s.o.).DasPlasmidgemisch und die Träger-DNa wurden in CHO DHFR~-Zellen transferiert (Zellen, die ein Plasmid aufnehmen, nehmen im allgemeinen auch ein zweites Plasmid auf.)

Nach drei Tagen wurden die Zellen durch Trysinisierung in verschiedene 100mm-Kulturplatten in Medien dispergiert, denen Hypoxanthin und Thymidin fehlte. Nur jene Zellen, die mit dem DHFR-Gen und dadurch mit dem EPO-Gen stabil transformiert worden waren, überleben in diesem Medium. Nach 7 bis 21 Tagen wurden die Kolonien der überlebenden Zellen sichtbar. Diese Transformatenkolonien können nach Dispergierung durch Trypsinisierung kontinuierlich in Medien reproduziert werden, in denen Hypoxanthin und Thymidin fehlt, wobei neue Zellstämme entstehen (z. B. CHO pDSVL-MkEPO, kcHO pSVgHuEPO, CHO-pDSVL-gHuEPO.

Kulturflüssigkeiten aus den obigen Zellstämmen wurde in einer RIA auf das Vorhandensein von rekombinanten Affen- oder Human-EPO getestet. Medien für die Stämme CHO pDSVL-MkEPO enthielten EPO mit immunologischen Eigenschaften wie denen, die aus COS-1 Zellen, transferiert mit dem Plasmid pDSVL-MkEPO, erhalten worden waren. Eine repräsentative 65-Stunden-Kulturflüssigkeit enthielt Affe-EPO mit 0,60E/ml.

Kulturflüssigkeiten aus CHO pSVgHuEPO und CHO pDSVL-gHuEPO enthielten rekombinantes Human-EPO mit immunologischen Eigenschaften wie jenes, das mit COS-1 Zellen, transferiert mit dem Plasmid pSVgHuEPO oder pDSVL-gHuEPO; erhalten worden war. Eine repräsentative 3-Tage-Kulturflüssigkeit aus CHO pSVgHuEPO enthielt 2,99E/ml Human-EPO, und eine 5,5-Tage-Probe von CHO pDSVL-gHuEPO enthielt E/ml Human-EPO nach Messung durch RIA. Die Menge der durch die oben beschriebenen Zellstämme produzierten EPO kann durch Gen-Amplifizierung erhöht werden, wodurch neue Zellstämme größerer Produktivität entstehen. Das Enzym Dihydrofolatreduktase (DHFR), das das durch das DHFR-Gen dafür codierende Produkt ist, kann durch das Arzneimittel Methotrexat(MTX) inhibiert werden. Insbesondere werden die in den Medien, denen Hypoxanthin und Thymidin fehlte, vermehrten Zellen durch MTX inhibiert oder abgetötet. Unter den entsprechenden Bedingungen (z. B. Minimalkonzenträtion von MTX) können Zellen erhalten werden, die gegen MTX resistent sind und in der Lage, darin zu wachsen. Es wurde gefunden, daß diese Zellen gegen MTX resistent sind infolge einer Amplifizierung der Anzahl ihrer DHFR-Gene, was zu einer Steigerung der Produktion von DHFR-Enzym führt. Die überlebenden Zellen können der Reihe nach mit erhöhten MTX-Konzentrationen behandelt werden, was zu Zellstämmen führt, die eine größere Anzahl von DHFR-Genen enthalten. „Passagiergene" (z. B. EPO), die vom Expressionsvektor mit dem DHFR-Gen getragen werden oder mit dem DHFR-Gen transformiert werden, sind nach kürzlichen Berichten ebenso als anwachsend hinsichtlich ihrer Anzahl von Genkopien zu betrachten.

Als praktische Beispiele dieses Amplifizierungssystems wurde der ZeI!stamm CHO pDSVL-MkE steigenden Konzentrationen am MTX (OnM, 3OnM und 10OnM) ausgesetzt. Repräsentative 65-Stunden-Kulturmedienproben aus jeder Amplifizierungsstufe wurden durch RIA überprüft, und es wurde bestimmt, daß sie entsprechend 0,60,2,45 und 6,10 E/mI enthielten. Der Zellstamm CHO pDSVL-gHuEPO wurde einer Reihe von ansteigenden MTX-Konzentrationen von 3OnM, 5OnM, 10OnM, 20OnM, 1μΜ und 5μΜ MTX ausgesetzt. Eine repräsentative 3-Tage-Kulturmedienprobe aus der 10OnM MTX-Stufe enthielt Human-EPO mit 3089 ± 129E/ml, wie durch RIA festgestellt wurde.

Repräsentative 48 Stunden-Kulturmediumproben aus den 10OnM-und 1 μΜ-MTX-Stufen enthielten entsprechend Human-EPO mit 466 und 1 352E/ml, wie durch RIA festgestellt (Durchschnitt von dreifachen Assays). Bei diesen Verfahren wurden 1 χ 10⁶ Zellen plattiert mit 5ml des Mediums in 60 mm Kulturschälchen. Vierundzwanzig Stunden später wurden die Medien entfernt und durch 5 ml serumfreie Medien ersetzt (DMEM mit hohem Glukosegehalt) ergänzt mit O₁ImM nicht-essentiellen Aminosäuren und L-Glutamin). Den EPO-Gehalt ließ man für 48 Stunden in den serumfreien Medien anwachsen. Die Medien wurden für eine RIA gesammelt und die Zellen strypsiniert und gezählt. Die durchschnittlichen RIA-Werte von 467 E/ml und 1 352 E/ml für Zellen, die bei 10OnM und 1μΜ MTXgewachsen waren, führten zu Ausbeuten von 2 335 E/Platte und 6750 E/Platte, Die durchschnittliche Anzahl der Zellen pro Platte betrug entsprechend 1,94 χ 10⁶ und 3,12 χ 10⁶ Zellen. Die effektiven Produktionsraten für diese Kulturbedingungen lagen somit entsprechend bei 1 264 und 2167 E/10^s Zellen / 48 Stunden.

Die Zellen in den unmittelbar zuvor beschriebenen Kulturen stellen eine genetisch heterogene Population dar. Es wurden Standard-Screeningverfahren bei dem Versuch eingesetzt, genetisch homogene Klone mit der höchsten Produktionskapazität zu isolieren. Siehe dazu Abschnitt A, Teil 2 von „Points to Consider in the Characterization of Cell Lines Used to Produce Biologies", I.Juni 1984, Office of Biologies Research Review, Centerfor Drugs and Biologies, US Food and Drug Administration. Die Produktivität der oben beschriebenen EPO produzierenden CHO-Zellinien kann durch entsprechende Zellkulturteehniken verbessert werden. Die Vermehrung von Säugetierzellen in Kultur erfordert allgemein des Vorhandensein von Serum in den Wachstumsmedien. Ein Herstellungsverfahren von Erythropoietin aus CHO-Zellen in Medien, die kein Serum enthalten, erleichtert im großen Maße die Reinigung von Erythropoietin vom Kulturmedium. Die weiter unten beschriebene Methode zeigt einen ökonomischen Weg der Herstellung von Erythropoietin in serumfreien Medien in für die Produktion ausreichenden großen Mengen.

Zellen des Stammes CHO pDSVL-gHuEPO,.die unter Standardzellkulturbedingungen gewachsen waren, wurden dazu eingesetzt, Spinner-Zellkulturkolben anzuimpfen. Die Zellen wurden als eine Suspensionszellinie in den Spinner-Zellkulturkolben in

Medien vermehrt, die aus einem 50-50-Gemisch von DMEIVl mit hohem Glukosegehalt und Ham's M12, ergänzt mit 5% fötalem Kalbsserum, L-Glutamin, Penicillin und Streptomycin, 0,05mM nicht-essentiellen Aminosäuren und der entsprechenden Konzentration von Methotrexat bestanden. Die Suspensionskellkultur gestattet, die EPO-produzierenden CHO-Zelien leicht zu großem Volumina zu erweitern.

In Suspension gewachsene CHO-Zellen wurden dazu eingesetzt, Rollflaschen bei einer anfänglichen Impfdichte von 1,5 χ 10⁷ lebensfähigen Zellen pro 850cm² Rollflaschen in 200ml Medien zu beimpfen. Man ließ die Zellen bis zum Zusammenfließen zu einer zusammenhängenden Zellinie über einen Zeitraum von 3 Tagen wachsen. Die für diese Wachstumsphase verwendeten Medien sind die gleichen wie für das Wachstum in Suspension. Am Ende der dreitägigen Wachstumsperiode wurde das serumhaltige Medium entfernt und durch 100ml serumfreies Medium ersetzt:

50:50-Gemisch von DMEM mit hohem Glukosegehalt und Ham's F12, ergänzt mit 0,05mM nicht-essentiellen Aminosäuren und L-Glutamin, die Rollflaschen wurden für 1 bis 3 Stunden wieder in den Rollflascheninkubator eingebracht, das Medium wiederum entfernt und durch 100ml frisches, serumfreies Medium ersetzt. Die 1- bis 3stündige Inkubierung des serumfreien Mediums reduziert die Konzentration der kontaminierenden Serumproteine.

Die Rollflaschen wurden für sieben Tage nochmals in den Inkubator gebracht, während dieser Zeit sammelte sich Erythropoietin in dem serumfreien Kulturmedium. Am Ende der siebentägigen Produktionsphase wurde das daraus bedingte Medium entfernt und durch frisches serumfreies Medium für einen zweiten Produktionszyklus ersetzt. Als ein Beispiel für das praktische Ergebnis dieses Produktionssystems enthielt eine repräsentative, sieben Tage alte, serumfreie Probe Human-Erythropoietin mit 3892 ± 409E/ml, wie durch RIA festgestellt wurde. Basierend auf einer geschätzten Zelldichte von 0,9 bis 1,8 χ 10⁵ Zellen/cm² enthielt jede 850cm³-Rollflasche 0,75 bis 1,5 χ 10⁸ Zellen, wodurch sich eine Produktionsrate von EPO in der siebentägigen lOOml-Kultur von 750 bis 1 470e/10⁶Zellen / 48 Stunden ergab.

Kulturflüssigkeiten des Zellstammes CHO pDSVL-MkEPO in 10 nM MTX wurden RIA und in vitro- und in vivo-EPO-Aktivitätsassays unterzogen. Eine Probe des daraus hervorgehenden Mediums enthielt 41,2 ± 1,4E/ml MkEPO, gemessen durch RIA, 41,2 ± 0,064E/ml, gemessen durch in vitro Assay der biologischen Aktivität und 42,5 ± 5E/ml, gemessen durch in vivo Assay der biologischen Aktivität. Das Aminosäuresequenzieren der Polypeptidprodukte zeigte die Anwesenheit von EPO-Produkten, eines prinzipiellen Spezies mit 3 Resten der „Führungs"sequenz, benachbart zum vermeintlichen Aminoterminal-Alanin. Ob dies das Ergebnis einer ungenügenden Membranfunktion des Polypeptids in CHO-Zellen ist oder eine Differenz in der Struktur des Aminoterminus des Affen-EPO gegenüber dem Human-EPO widerspiegelt, ist zur Zeit nicht bekannt. Kulturflüssigkeiten des Zellstammes CHO pDSVL-gHuEPO wurden drei Assays unterzogen. Eine fünfeinhalb Tage Probe enthielt im Medium rekombinantes Human-EPO in Höhe von 18,2 E/ml gemäß Rl A-Assay, 15,8 ± E/ml gemäß in vitro-Assay und 16,8 ± 3,0E/ml in vivo-Assay.

Kulturflüssigkeit von CHO pDSVL-gHuEPO-Zellen, amplifiziert durch stufenweises 10OnM MTX, wurden drei Assays unterzogen. Eine 3,0 Tage Probe enthielt rekombinantes Human-EPO in einer Höhe von 3089 ± 129E/ml gemäß RIA, 2589 ± 71,5E/ml gemäß in vitro-Assay und 2040 ± 160 E/ml gemäß in vivo-Assay. Das Aminosäuresequenzieren dieses Produktes zeigte ein Aminoterminal, das dem von Tabelle Vl entsprach.

Zellbedingtes Medium von CHO-Zellen, die mit dem Plasmid pDSVL-Mke in 1OnM MTX transferiert worden waren, wurde gesammelt und das MTX über mehrere Tage durch Dialyse entfernt, wobei man ein Medium mit einer EPO-Aktivität von 221 ± 5,1 E/ml (EPO-CCM) erhielt. Um die in vivo-Wirkung des EPO-CCM auf die Hämatokritspiegel in normalen BalB/C-Mäusen zu bestimmen, wurde der folgende Versuch durchgeführt.

Zellbedingtes Medium von untransfektierten CHO-Zellen (CCM) und EPO-CCM wurde mit PBS eingestellt. CCM wurde für die Kontrollgruppe (3 Mäuse) verwendet, und es wurden zwei EPO-CCM-Dosismengen (4 Einheiten pro Injektion und 44 Einheiten pro Injektion) für die Versuchsgruppe (2 Mäuse pro Gruppe) eingesetzt. Über einen Zeitraum von 3 Wochen wurden die sieben Mäuse intraperitoneal dreimal wöchentlich injiziert. Nach der achten Injektion wurden die durchschnittlichen Hämatokritwerke für die Kontrollgruppe mit 50,4%, für die 4E-Gruppe mit 55,1 % und für die 44E-Gruppe mit 67,9% bestimmt. Expressionsprodukte von Säugetierzellen können leicht in im wesentlichen gereinigter Form aus Kulturmedien gewonnen werden, wenn HPLC (C₄) eingesetzt wird unter Verwendung eines Ethanolgradienten, vorzugsweise bei pH 7. Es wurde ein Vor-Versuch unternommen, die rekombinanten Glycoprodeinprodukte aus dem entsprechenden Medium der COS-1 und CHO Zellexpression des Human-EPO-Gens zu charakterisieren, im Vergleich zu Humanurin-EPO-lsolaten unter Einsatz sowohl der Western-Blot-Analyse als auch von SDS-PAGE. Diese Untersuchungen zeigten, daß das CHO-produzierte EPO-Material eine etwas höhere Molekularmasse als das COS-1 Expressionsprodukt hatte, das demgegenüber etwas größer war als das aus dem gesammelten menschlichen Urinextrakt. Alle Produkte waren ziemlich heterogen. Die Enzymbehandlung mit Neuraminidase zur Entfernung von Sialsäure führte zu COS-1 und CHO-rekombinanten Produkten von annähernd gleicher Molekularmasse, die beide nichtsdestoweniger größer als der erhaltene asioalo-Humanurinextrakt waren. Die Behandlung des rekombinanten CHO-Produktes sowie des Urinextraktproduktes (zur vollständigen Entfernung des Carbohydrates aus beiden) mit Endoglycosidase F-Enzym (EC 3.2.1.) führte zu im wesentlichen homogenen Produkten mit hauptsächlich identischen Molekularmassencharakteristika.

Gereinigte Humanurin-EPO und eine erfindungsgemäße rekombinante CHO-Zellen-produzierte EPO wurden einer Carbohydratanalyse unterzogen nach der Verfahrensweise von Ledeen et al., Methods in Enzymology, 83 (Teil D), 139-191 (1982), modifiziert durch die Verwendung der Hydrolyseverfahren von Nesser et al., Anal. Biochem., 142, 58-67 (1984). Experimentell bestimmte Carbohydratbildungswerte (ausgedrückt als molare Verhältnisse des Carbohydrats im Produkt) waren für das Urinisolat folgende: Hexosen, 1,73; N-Acetylglucosamin, 1; N-Acetylneuraminsäure, 0,93; Fucose, 0; und N-Acetylgalactosamin, 0. Entsprechende Werte für das rekombinante Produkt (abgeleitet aus einem dreitägigen CHO pDSVL-gHuEPO-Kulturmedium mit 10OnM MTX) waren folgende: Hexosen, 15,09; N-Acetylglucosamin, 1; N-Acetylneuraminsäure, 0,998; Fucose, 0; und N-Acetylgalactosamin, 0. Diese gefundenen Werte stimmen mit der oben genannten Western-Blot-Analyse und der SDS-PAGE-Analyse überein.

Durch die vorliegende Erfindung hergestellte Glycoproteinprodukte umfassen somit Produkte mit einer primären strukturellen Übereinstimmung ausreichender Doppelung wie jener von natürlich auftretenden Erythropoiethin, um eine oder mehrere der biologischen Eigenschaften diese aufzuweisen und eine durchschnittliche Carbohydratzusammensetzung zu haben, die von der natürlich auftretenden Erythropietins abweicht.

Beispiel 11

Das vorliegende Beispiel betrifft die gesamte Herstellung durch Zusammenstellung der Nucleotidbasen von zwei strukturellen Genen, die die Human-EPO-sequenz von Tabelle Vl verschlüsseln und schließt entsprechend „bevorzugte" Codons für die Expression in E. coli- und Hefe (s. cerevisiaej-zellen ein. Beschrieben wird auch die Konstruktion von Genen, die Analoge von Human-EPO verschlüsseln. Kurz zusammengefaßt entsprach der Ablauf dem in der bereits vorher genannten Literaturstelle von Alton et al., (WO 83/04053). Die Gene wurden für eine anfängliche Zusammenstellung der Komponenten-Oligonucleotide in mehrfachen Verdoppelungen gestaltet, die der Reihe nach in drei getrennte Abschnitte (section) vereinigt wurden. Diese Sectionen wurden für eine fertige Amplifizierung gestaltet, und nach Entfernung aus dem Amplifizierungssystem konnten sie sequentiell oder durch eine mehrfache Fragmentligation in einem geeigneten Expressionsvektor vereinigt werden. Die folgenden Tabelle VIII bis XIV erläutern die Gestaltung und Vereinigung eines hergestellten Gens, dasein Human-EPO-Translationsprodukt verschlüsselt, dem eine beliebige Führungs- oder Presequenz fehlt, zu dem jedoch ein anfänglicher Methioninrest an Position -1 gehört. Darüber hinaus gehören zu dem Gen in seinem wesentlichen Teil E.coli-Präfenzcodons, und die Konstruktion wurde daher als das „ECEPO"-Gen bezeichnet.

TABLE VIII

ECEPO SECTION 1 OUGONUCLEOTIDES

1. AATTCTAG AAACCATG AG G GTAAT AAAATA

2. CCATTATTTTATTACCCTCATGGTTTCTAG

3. ATGGCTCCGCCGCGTCTGATCTGCGAC

4. CTCGAGTCGCAGATCAGACGCGGCGGAG

5. TCGAGAGTTCTGGAACGTTACCTGCTG

6. CTTCCAGCAGGTAACGTTCCAGAACT

7. GAAGCTAAAGAAGCTGAAAACATC

8. GTGGTGATGTTTTCAGCTTCTTTAG

9. ACCACTGGTTGTGCTGAACACTGTTC

10. CAAAGAACAGTGTTCAGCACAACCA

11. TTTGAACGAAAACATTACGGTACCG

12. GATCCGGTACCGTAATGTTTTCGTT

TABLE IX ECEPO SECTION 1

Xbal

EcoRI I₁ , 3.

AATTCTAG AAACCATGAG GGTAATAAAA TfljATGGCTCC GCCGCGTCTG GATC TTTGGTACTC CCATTATTTT ATTaCC]GAGG CGGCGCAGAC

ATCTGCGAc|r CGAGAGTtCT GGAACGTTAC CTGCTGbAAG CTAAAGAAGC TAGACGCTGA GCTCJTCAAGA CCTTGCAATG GACGACCTTc] GATTTCTTCG

TGAAAACATC ACTTTTGTAG 8

CCACTGGTT GTGCTGAACA CTGTTC

11. TTTG AACGAAAACA

GGTGRCCAA CACGACTTGT GACAAGAAACI TTGCTTTTGT 10

Kpnl BamHI TTACGGTACC G AATGCCATGG CCTAG 12

TABLE X

ECEPO SECTION 2 OUGONUCLEOTIDES

1. AATTCGGTACCAGACACCAAGGT

2. GTTAACCTTGGTGTCTGGTACCG

3. TAACTTCTACGCTTGGAAACGTAT 4... TTCCATACGTTTCCAAGCGTAGAA

5. GGAAGTTGGTCAACAAGCAGTTGAAGT

6. CCAAACTTCAACTGCTTGTTGACCAAC

7. TTGGCAGGGTCTGGCACTGCTGAGCG

8. GCCTCGCTCAGCAGTGCCAGACCCTG

9. AGGCTGTACTGCGTGGCCAGGCA

10. GCAGTGCCTGGCCACGCAGTACA

11. CTGCTGGTAAACTCCTCTCAGCCGT

12. TTCCCACGGCTGAGAGGAGTTTACCA

13. GGGAACCGCTGCAGCTGCATGTTGAC

14. GCTTTGTCAACATGCAGCTGCAGCGG

15. AAAGCAGTATCTGGCCTGAGATCTG

16. GATCCAGATCTCAGGCCAGATACT TABLE Xl

ECEPO SECTION 2 .

EcoRI Kpnl 1_ .

A ATTCGGTACC AGACACCAAG GTTAACTTCT ACGCTTGGAA ACGTATPGAA

GCCATGG TCTGTGGTTC caaTtgIaaga tgcgaacctt tgcataccTt]

1 A

5 ,7

GTTGGTCAAC AAGCAGTTGA AGTjTTGGCAG GGTCTGGCAC TGCTGAGCGfi

CAACCAGTTG TTCGTCAACT TCAAÄCCJGTC CCAGACCGTG ACGACTCGCT

6. ^Γ

2. 1 il

GGCTGTACTG CGTGGCCAGG CApTGCTGGT AAACTCCTCT CAGCCGTGGG

CCGJACATGAC GCACCGGTCC GTGÄCGhcCA TTTGAGGAGA GTCGGCACcT

1P_

λΐ ι 15 BgIII BamHI

AACCGCTGCA gctgcatgtt gacbaagcag tatctggcct GAGaTC^-TG —

TTfcGCGACGT CGACGTACAA ctgtttcgJtc atagaccgga ctctagacctac

IA '

TABLE XII ECEPO SECTION 3

1. GATCCAGATCTCTGACTACTCTGC

2. ACGCAGCAGAGTAGTCAGAGATCTG

3. TGCGTGCTCTGGGTGCACAGAAAGAGG

4. GATAGCCTCTTTCTGTGCACCCAGAGC

5. CTATCTCTCCGCCGGATGCTGCATCT

6. CAGCAGATGCAGCATCCGGCGGAGA

7. GCTGCACCGCTGCGTACCATCACTG .

8. ATCAGCAGTGATGGTACGCAGCGGTG

9. CTGATACCTTCCGCAAACTGTTTCG

10. ' ATACACGAAACAGTTTGCGGAAGGT

11. TGTATACTCTAACTTCCTGCGTGGTA

12. CAGTTTACCACGCAGGAAGTTAGAGT

13. AACTGAAACTGTATACTGGCGAAGC

14. GGCATGCTTCGCCAGTATACAGTTT.

15. ATGCCGTACTGGTGACCGCTAATAG

16. TCGACTATTAGCGGTCACCAGTAC

TABLE XIII ECEPO SECTION 3

BamHI BgIII GA TCCAGATCTCTG GTCTAGAGAC

¹ ACTACTCTGC

TGATGAGACG 2

GCGTGCTCT GGGTGCACAG AAAGAGGFTA TCTCTCCGCC CGCAtGAGA CCCACGTGTC TTTCTCCGAT AGjAGAGGCGG

GGATGCTGCA TCT CCTACGACGT AGA

- L-

3CTGCAC CGCTGCGTAC CATCACTGCT GATACCTTCC

;tg gcgacgcatg gtagtgacga ct^jtggaagg

:GAC!

GCAAACTGTT TCGtTGTATAC TCTAACTTCC TGCGTGGTA CGTTTGACAA AGCACATA(TG AGATTGAAGG ACGCACCAT 10 12

ACTGAAACTG

TGAqTTTGAC

11 Sail

TATACTGGCG AAGChTGCCG TACTGGTGAC CGCTAATAG ATATGACCGC TTCGTACGOC ATGACCACTG GCGATTATC AGCT 14 16

TABLE XIV ECEPO GENE 3

-11

Xbal - ' MetAla CTAG AAACCATGAG GGTAATAAAA TAATGGCTCC GCCGCGTCTG TTTGGTACTC CCATTATTTT ATTACCGAGG CGGCGCAGAC

ATCTGCGACT CGAGAGTTCT GGAACGTTAC CTGCTGGAAG CTAAAGAAGC TAGACGCTGA GCTCTCAAGA CCTTGCAATG GACGACCTTC GATTTCTTCG

TGAAAACATC ACCACTGGTT GTGCTGAACA CTGTTCTTTG AACGAAAACA ACTTTTGTAG TGGTGACCAA CACGACTTGT GACAAGAAAC TTGCTTTTGT

TTACGGTACC AGACACCAAG GTTAACTTCT ACGCTTGGAA ACGTATGGAA AATGCCATGG TCTGTGGTTC CAATTGAAGA TGCGAACCTT TGCATACCTT

GTTGGTCAAC AAGCAGTTGA AGTTTGGCAG GGTCTGGCAC TGCTGAGCGA CAACCAGTTG TTCGTCAACT TCAAACCGTC CCAGACCGTG ACGACTCGCT

GGCTGTACTG CGTGGCCAGG CACTGCTGGT AAACTCCTCT.CAGCCGTGGG CCGACATGAC GCACCGGTCC GTGACGACCA TTTGAGGAGA GTCGGCACCC

AACCGCTGCA GCTGCATGTT GACAAAGCAG TATCTGGCCT GAGATCTCTG TTGGCGACGT CGACGTACAA CTGTfTCGTC ATAGACCGGA CTCTAGAGAC

ACTACTCTGC TGCGTGCTCT GGGTGCACAG AAAGAGGCTA TCTCTCCGCC TGATGAGACG ACGCACGAGA CCCACGTGTC TTTCTCCGAT AGAGAGGCGG

GGATGCTGCA TCTGCTGCAC CGCTGCGTAC CATCACTGCT GATACCTTCC CCTACGACGT AGACGACGTG GCGACGCATG GTAGTGACGA CTATGGAAGG

GCAAACTGTT TCGTGTATAC TCTAACTTCC TGCGTGGTAA ACTGAAACTG CGTTTGACAA AGCACATATG AGATTGAAGG ACGCACCATT TGACTTTGAC

Sail

TATACTGGCG AAGCATGCCG TACTGGTGAC CGCTAATAG ATATGACCGC TTCGTACGGC ATGACCACTG GCGATTATCA GCT

Im Detail sind aus Tabelle VIII Oligonucleotide zu entnehmen, die dazu eingesetzt wurden, die Section 1 des ECEPO-Gens zu erzeugen, das die Aminoterminaireste menschlichen Poiypeptids verschlüsselt. Oligonucleotide wurden zu Dopplungen vereinigt (1 und 2,3 und 4 usw.), und die Dopplungen wurden dann ligiert, um zu der ECEPO Section 1 wie in Tabelle IX zu gelangen. Bemerkt werden muß, daß zu der vereinigten Section terminale einzeisträngige EcoRI- und BamHI-Enden gehören, daß „stromabwärts" des einzelsträngigen EcoRI-Endes eine Xbal-Restriktionsenzym-Erkennungsstelle ist; und daß „stromaufwärts" von einzelsträngigen BamHI-Ende eine Kpml-Erkennungsstelle ist. Section 1 konnte leicht unter Verwendung des M 13 Phagenvektors amplifiziert werden, der zur Überprüfung der Sequenz der Section eingesetzt wurde. Einige Schwierigkeiten traten auf beim Isolieren der Section als Xbal/Kpnl-Fragment aus RF DNA, in E. coli erzeugt, wahrscheinlich wegen der Methylierung der Kpnl-Erkennungsstellenbasen innerhalb des Wirte.s. Es wurde daher einzeisträngige Phagen-DNA isoliert und in die doppelsträngige Form in vitro übersetzt mittels Primerverlängerung (extension), und das gewünschte doppelsträngige Fragment wurde danach leicht isoliert.

DieECEPO-Gensectionen 2und3(TabellenXl undXIII) wurden in ähnlicherWeiseausdem Oiigonucleotiden derTabellenXund XII· konstruiert. Jede Section wurde in dem M 13 Vektor amplifiziert, der für die Sequenzüberprüfung auf Richtigkeit eingesetzt wurde, und wurde aus Phagen DNA isoliert.

Wie aus Tabelle Xl ersichtlich, wurde die ECEPO-Section 2 miteinzelsträngigen EcoRI-und BamHI-Enden konstruiert und konnte als ein Kpnl/Bglll-Fragment isoliert werden. In ähnlicher Weise wurde die ECEPO-Section 3 mit einzelsträngigen BamHI-und SaI I-Enden hergestellt und konnte aus Phagen RFDNAaIs ei η BgI Il/Sal I-Frag ment isoliert werden. Die auf diese Weise hergestellten drei Sectionen konnten leicht zu einer fortlaufenden DNA-Sequenz vereinigt werden (Tabelle XlV), die das gesamte menschliche EPO-Polypeptid mit einem Aminoterminal-Methionincodon (ATG) für den E. coli-Translationsbeginn verschlüsselt. Weiterhin ist zu bemerken, daß sich „stromaufwärts" vom anfänglichen ATG eine Serie von Basenpaaren befindet, die die Ribosomenbindungsstellensequenz des hoch exprimierten OMP-f-Gens von E. coli dupliziert.

Um das ECEPO zu tragen, kann ein beliebiger geeigneter Expressionsvektor eingesetzt werden. Der besondere Vektor, der für die Expression des ECEPO-Gens als das „temperaturempfindliche" Plasmid pCFM536 — ein Derivat des Plasmids pCFM414 (ATCC40076) —gewählt wurde, ist in der noch anhängigen US-Patentanmeldung Nr. 636727 eingereicht am 6. August 1984 von Charles F.Morris beschrieben.

Insbesondere wurde pCFM 536 mit Xbal und Hindlll abgebaut; das große Fragment wurde isoliert und in einer zweiteiligen Ligierung mit dem ECEPO-Gen eingesetzt. Sectionen 1 (Xbal/Kpnl), 2 (Kpml/Bgl II) und 3 (BgI Il/Sal I) wurden vorher inkorrekter · Weise in M13 vereinigt, und das EPO-Gen wurde daraus isoliert als ein einzelnes Xba I/Hind Ill-Fragment. Zu diesem Fragment gehörte ein Teil des Polylinkers aus dem M13 und mp9 Phagen, der die Sal I bis Hind I Il-Stellen darin überspannte. Die Steuerung der Expression im erhaltenen Expressionsplasmid p536 erfolgte mittels eines Lambda-PL-Promotors, der selbst von dem Cii8S7--Repressor-Gen (wie vom E. coli Stamm K12 Δ Htrp vorgesehen) gesteuert wurde.

Das hergestellte obige ECEPO-Gen konnte auf verschiedene Weise modifiziert werden, um Erythropoietin-Analoge zu verschlüsseln, wie [Asn², desPro² bis He⁶JhEPO und [HiS⁷JhEPO, wie unten beschrieben.

A. [Asn², des-Pro² bis lle^e]hEPO

Das Plasmid 53 b, das das ECEPO-hergestellte Gen von Tabelle XIV als ein XbaL- bis Hind Ill-Insert trug, wurde mit Hind III und Xho I abgebaut. Letztere Endonuclease schneidet das ECEPO-Gen an einer einzigen 6-Basenpaare-Erkennungsstelle, die die letzte Base des Asp⁸ verschlüsselnden Codons bis zur zweiten Base des Arg^1c-Codons überspannt.

Eine Xba l/Xhol-„Linker"sequenz wurde hergestellt, die die folgenden Sequenzen enthielt:

Xbal +1.2 7 8 9

Met AIa · Asn Cys Asp Xho I

5'-CTAG ATG GCT AAT TGC GAC-3'

3' -TAC CGA TTA ACG CTG AGCT-5'

Der Xba I/Xho I-Linker und das Xho I/Hind Ill-ECEPO-Gensequenzfragment wurde in das große Fragment insertiert, das man aus dem Xbal- und Hind Ill-Abbau des Plasmids pCFM 526 — einem Derivat des Plasmids pCFM414 (ARCC40076) — erhielt, wie in der noch anhängigen US-Patentanmeldung Nr.636727, eingereicht am 6.August 1984 von Charles F.Morris beschrieben, um eine Plasmid-geborene DNA-Sequenz zu erzeugen, die die E. coli-Expression der Met^-Form des gewünschten Analogen verschlüsselt

B.[His⁷²]hEPO

Das Plasmid 536 wurde mit Hind III und Xho 1 wie im Teil A oben abgebaut. Ein Xba I / Xho I-Linker wurde hergestellt, der die folgende Sequenz hatte: Xbal +123456789 Xho I

Met AIa

5'-CTAG ATG GCT

3' -TAC CGA

Der Linker und das Xhol/Hind lll-ECEPO-Sequenzfragment wurde dann in pCFM 526 insertiert, um eine Plasmid-geborene DNA-Sequenz zu erzeugen, die die E. coli-Expression der Met~¹-Form des gewünschten Analoges verschlüsselt. Die Konstruktion eines hergestellten Gens („SCEPO") einschließlich der Hefepräferenzcodons ist in den folgenden Tabellen XV bis XXI beschrieben. Wie beim ECEPO-Gen gehört zu der gesamten Konstruktion die Bildung von drei Sätzen Oligonucleotide (Tabellen XV, XVII und XIX) die in Doppelungen formiert wurden und zu Sectionen vereinigt wurden (Tabellen XVI, XVIII und XX). Es ist festzuhalten, daß die Synthese teilweise erleichtert wurde durch Verwendung von einigen sub-optimalen Codons, sowohl bei der SCEPO- als auch ECEPO-Konstruktion, d. h. die Oligonucleotide 7—12 der Section I beider Gene waren identisch, ebenso die Oligonucleotide 1-6 der Section 2 in jedem Gen.

TABLE XV

SCEPO SECTION 1 OLIGOIMUCLEOTIDES

1.· AATTCAAGCTTGGATAAAAGAGCT

2. GTGGAGCTCTTTTATCCAAGCTTG

3. CCACCAAGATTGATCTGTGACTC

4. TCTCGAGTCACAGATCAATCTTG

5. GAGAGTTTTGGAAAGATACTTGTTG

6. CTTCCAACAAGTATCTTTCCAAAAC

7. GAAGCTAAAGAAGCTGAAAACATC

8. GTGGTGATGTTTTCAGCTTCTTTAG

9. ACCACTGGTTGTGCTGAACACTGTTC

10. CAAAGAACAGTGTTCAGCACAACCA

11. TTTGAACGAAAACATTACGGTACCG

12. GATCCGGTACCGTAATGTTTTCGTT

2	3	4	5	6	7	8	9
Pro	Pro	Arg	Leu	He	His	Asp
CCG	CCA	CGT	CTG	ATC	CAT	CAC-3'
GGC	GGT	GCA	GAD	TAG	GTA	CTG	AGCT-5'

TABLE XVI SCEPO SECTION 1

EcoRI HiodIII _1 AATTCA AGCTTGGATA GT TCGAACCTAT 2

AAAGAGCTZCACCAAGATTG ATCTGTGACT CGAGAGTTTT

'TTTCTCGAGG TGIGTTCTAAC TAGACACTGA GCTCTJCAAAA

GGAAAGATAC TTGTTGPAAG CTAAAGAAGC TGAAAACATC hCCACTGGTT CCTTTCTATG AACAACCTTC] GATTTCTTCG ACTTTTGTAG TGGTG&CCAA 6 I

1 ii HEU¹ BamHI

GTGCTGAACA ctgttc|tttg aacgaaaaca ttacggtacc g

CACGACTTGT GACAAGAÄÄC] TTGCTTTTGT AATGCCATGG CCTAG

TABLEXVII

SCEPO SECTION 2 OLIGONUCLEOTIDES

1. AATTCGGTACCAGACACCAAGGT

2. GTTAACCTTGGTGTCTGGTACCG

3. TAACTTCTACGCTTGGAAACGTAT , 4. TTCCATACGTTTCCAAGCGTAGAA

5. GGAAGTTGGTCAACAAGCAGTTGAAGT

6. CCAAACTTCAACTGCTTGTTGACCAAC

7. TTGGCAAGGTTTGGCCTTGTTATCTG

8. GCTTCAGATAACAAGGCCAAACCTTG

9. AAGCTGTTTTGAGAGGTCAAGCCT

10. AACAAGGCTTGACCTCTCAAAACA

11. TGTTG GTTAACTCTTCTCAACCATG G G

12. TGGTTCCCATGGTTGAGAAGAGTTAACC

13. AACCATTGCAATTGCACGTCGAT

14. CTTTATCGACGTGCAATTGCAA

15. AAAGCCGTCTCTGGTTTGAGATCTG

16. GATCCAGATCTCAAACCAGAGACGG

Kpnl

EcoRI 1

Α~~~ÄTTCGGTACC AGACACCAAG GCCATGG TCTGTGGTTC 2

TAACTTCT ACGCTTGGAA ACGTATPGAA GTTGGTCAAC AAGCTGTTGA

CAACCAGTTG TTCGACAACT 6

iTTCnAGA TGCGAACCTT TGCATACCT

AGT|TTGGCAA GGTTTGGCCT TGTTATCTGp AGCTGTTTTG AGAGGTCAAG

TCAÄÄCfJ3TT CCAAACCGGA ACAATAGACTTCGhCAAAAC TCTCCAGTTC

8 ' 10

CCTfrGTTGGT TAACTCTTCT CAACCATGGG f\ACCATTGCA ATTGCACGTC GGAAC~ÄÄtCA ATTGAGAAGA GTTGGTACCC TTGGTt\ACGT TAACGTGCAG

12 ' 14

11 ML·äi£L

GAThAAGCCG TCTCTGGTTT GAGATCTG CTATTTCbGC AGAGACCAAA CTCTAnAPHTA Π

TABLE XVIII SCEPO SECTION 2

TABLE XIX

SCEPO SECTION 3 OLIGONUCLEOTIDES

1. GATCCAGATCTTTGACTACTTTGTT

2. TCTCAACAAAGTAGTCAAAGATCTG

3. GAGAGCTTTGGGTGCTCAAAAGGAAG

4. ATGGCTTCCTTTTGAGCACCCAAAGC

5. CCATTTCCCCACCAGACGCTGCTT

6. GCAGAAGCAGCGTCTGGTGGGGAA

7. CTGCCGCTCCATTGAGAACCATC

8. CAGTGATGGTTCTCAATGGAGCG

9. ACTGCTGATACCTTCAGAAAGTT

10. GAATAACTTTCTGAAGGTATCAG

11. ATTCAGAGTTTACTCCAACTTCT

12. CTCAAGAAGTTGGAGTAAACTCT

13. TGAGAGGTAAATTGAAGTTGTACAC

14. ACCGGTGTACAACTTCAATTTACCT

15. CGGTGAAGCCTGTAGAACTGGT

16. CTGTCACCAGTTCTACAGGCTTC

17. GACAGATAAGCCCGACTGATAA

18. GTTGTTATCAGTCGGGCTTAT

19. CAACAGTGTAGATGTAACAAAG

20. TCGACTTTGTTACATCTACACT

TABLE XX SCEPO SECTION 3

BamHI BgIII 1

GATC CAGATCTTTG ACTACTTTGT T^AGAGCTTT GTCTAGAAAC TGATGAAACA ACTCTbGAAA 2

3

GGGTGCTCAA AAGGAAGfcCA TTTCCCCACC AGACGCTGCT TCTGCCGCTC CCCACGAGTT TTCCTTCGGT A)AAGGGGTGG TCTGCGACGA AGÄCGGCGAG

2 . 9

CATTGAGAAC CATCPCTGCT GATACCTTCA GAAAGTTJ^TT CAGAGTtTAC

GTAACTCTTG GTAGTGÄCfcA CTATGGAAGT CTTTCAATAA GItCTCAAATG

8 10 I!

„ ' 12

TCCAACTTCT [TGAGAGGTAA ATTGAAGTTG TACAC^GGTG AAGCCTGTAG

AGGTTGAAGA ACTCfTCCATT TAACTTCAAC ATGTGÜCTÄJC TTCGGACATC

¹ 14 ^

AACTGGTGAC AGATAAGCCC GACTGATAAbAACAGTGTAG TTGACCACTG TCjTATTCGGG CTGACTATTG TTGfTCACATC

Sail

ATGTAACAAA G TACATTGTTT CAGCT 20

TABLE XXI SCEPOGENE

HlndIII AGCTTGGATA ACCTAT

-1 +1 ArgAla AAAGAGCTCC TTTCTCGAGG

ACCAAGATTG TGGTTCTAAC

ATCTGTGACT TAGACACTGA

CGAGAGTTTT GCTCTCAAAA

GGAAAGATAC TTGTTGGAAG CTAAAGAAGC TGAAAACATC ACCACTGGTT CCTTTCTATG AACAACCTTC GATTTCTTCG ACTTTTGTAG TGGTGACCAA

GTGCTGAACA CTGTTCTTTG AACGAAAACA TTACGGTACC AGACACCAAG CACGACTTGT GACAAGAAAC TTGCTTTTGT AATGCCATGG TCTGTGGTTC

GTTAACTTCT ACGCTTGGAA ACGTATGGAA GTTGGTCAAC AAGCTGTTGA CAATTGAAGA TGCGAACCTT TGCATACCTT CAACCAGTTG TTCGACAACT

AGTTTGGCAA GGTTTGGCCT TGTTATCTGA AGCTGTTTTG AGAGGTCAAG TCAAACCGTT CCAAACCGGA ACAATAGACT TCGACAAAAC TCTCCAGTTC

CCTTGTTGGT TAACTCTTCT CAACCATGGG AACCATTGCA ATTGCACGTC GGAACAACCA ATTGAGAAGA GTTGGTACCC TTGGTAACGT TAACGTGCAG

GATAAAGCCG TCTCTGGTTT GAGATCTTTG ACTACTTTGT TGAGAGCTTT CTATTTCGGC AGAGACCAAA CTCTAGAAAC TGATGAAACA ACTCTCGAAA

GGGTGCTCAA AAGGAAGCCA TTTCCCCACC AGACGCTGCT TCTGCCGCTC CCCACGAGTT TTCCTTCGGT AAAGGGGTGG TCTGCGACGA AGACGGCGAG

CATTGAGAAC CATCACTGCT GATACCTTCA GAAAGTTATT CAGAGTTTAC GTAACTCTTG GTAGTGACGA CTATGGAAGT CTTTCAATAA GTCTCAAATG

tccaacttct tgagaggtaa attgaagttg tacaccggtg aagcctgtag aggttgaaga actctccatt taacttcaac atgtggccac ttcggacatc

AACTGGTGAC AGATAAGCCC GACTGATAAC AACAGTGTAG TTGACCACTG TCTATTCGGG CTGACTATTG TTGTCACATC

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ATGTAACAAA G TACATTGTTT CAGCT

Die vereinigten SCEPO-Sectionen wurden in M 13 sequenziert, und die Sectionen 1,2 und 3 waren aus dem Phagen als Hindlll/Kpnl-, Kpnl/Bglll- und BgI Il/Sall-Fragmente isolierbar.

Das gegenwärtig bevorzugteste Expressionssytem für SCEPO-Genprodukte ist ein Skretionssystem, basierend auf einer S. cerevisiae-a-Faktor-Sekretion, wie in der anhängigen US-Patentanmeldung Nr. 487753, eingereicht am 22. April 1983 von Grant A. Bitter, veröffentlicht am 31.Oktober 1984 als Europäische Patentanmeldung 0123294, beschrieben. Kurz zusammengefaßt gehören zu dem System Konstruktionen, worin DNA, die die Führungssequenz des Hefe-a-Faktor-Genproduktes verschlüsselt, unmittelbar 5' zur codierenden Region des zu exprimierenden exogenen Gens angeordnet ist. Als ein Ergebnis enthält das translatierte Genprodukt eine Führungs- oder Signalsequenz, die „wegbehandelt" (processed off) wird durch ein endogenes Hefeenzym im Verlauf der Sekretion des verbliebenen Produktes. Da bei der Konstruktion mit dem a-Faktor-Translationsbeginn (ATG)-codon gearbeitet wurde, war es nicht erforderlich, ein solches Codon an der-1-Position des SCEPO-Gens einzubauen.

Wie aus Tabelle XXl entnommen werden kann, geht der Alanin ( + 1) verschlüsselnden Sequenz eine Linkersequenz voraus, die eine direkte Insertion in ein Plasm id gestattet, enthaltend die DNA für die ersten 80 Reste der a-Faktorführungssequenz, die dem a-Faktor-Promoter folgt. Zu der speziell bevorzugten Konstruktion für die SCEPO-Genexpression gehört eine vierteilige Ligierung unter Einschluß des oben genannten SCEPO-Sectionfragmentes und des großen Fragmentes des Hind III/SaI I-Abbaus des Plasmids p«C3. Aus dem erhaltenen paC3/SCEPO wurden dera-Faktorpromoter und die Führungssequenz und das SCEPO-Gen isoliert durch Abbau mit Bam Hl und ligiert in das Barn Hl-abgebaute Plasmid pYE, um zu dem Expressionsplasmid pYE/ SCEPO zu gelangen.

Beispiel 12

Das vorliegende Beispiel betrifft die Expression von rekombinanten Produkten der hergestellten ECEPO- und SCEPO-Gene innerhalb des Expressionssystems von Beispiel 11.

Unter Verwendung des Expressionssystems, das für die Verwendung von E. coli Wirtszellen bestimmt war, wurde das Plasmid ρ536 in AM 7 E. coli-Zellen transformiert, die vorher mit einem geeigneten Plasmid, pMW1, transformiert worden war, worauf man ein C|₈57-Gen erhielt. Zellkulturen in LB-Brühe (Ampicillin 50/xg/ml und Kanamycin ö/zg/ml), vorzugsweise mit 1OnM mg SO₄) wurden bei 28⁰C und bis zum Wachstum der Zellen in KuItUr bis 0. D._6Oo = 0,1 gehalten. Die EPO-Expression wurde durch Erhöhen der Kulturtemperatur auf 42°C hervorgerufen. Die Zellen wuchsen bis etwa 40 O. D. und führten zu einer EPO-Produktion (geschätzt durch Gel) von etwa 5mg/0.D. Liter.

Die Zellen wurden geerntet, lysiert, mit der Französischen Presse (10000 psi) aufgebrochen und mit Lysozan und NP-40 Detergent behandelt. Das erhaltene Pellet nach 24000xg-Zentrifugierung wurde mit Guanidin-HCI gelöst und einer weiteren einstufigen Reinigung mittels C₄(Vydac)-Reverse Phase—HPLC (EtDHm 0-80%, 5OmM NH₄Ac, pH 4,5) unterzogen.Das Proteinsequenzieren ergab ein Produkt mit einer Reinheit von größer als 95%, und die erhaltenen Produkte zeigten zwei unterschiedliche Aminoterminals,- A-P-P-R ... und P-P-R ... in einem relativen quantitativen Verhältnis von etwa 3 zu 1. Diese letztere Beobachtung von hEPO- und [des Ala^lhEPO-Produktion zeigte, daß Aminoterminal „arbeiten" innerhalb der Wirtszellen dazu dient, das terminale Methionin zu entfernen und in manchen Fällen das anfängliche Alanin.

Die Radioimmunoassay-Aktivitätfür die Isolate lag in einer Höhe von 150 000 bis 160 000 E/mg; die in vitro-Assay-Aktivitätlagin einer Höhe von 30000 bis 62000E/mg; und die in vivo-Assay-Aktivität lag bei etwa 120 bis 720 U/mg. (Cf., Humanurin-Isolatstandard von 70000 U/mg in jeder Assay). Die Dosiswirksamkeitskurve für das rekombinante Produkt in der in vivo-Assay wich merklich von der des Humanurin-EPO-Standard ab.

Die EPO-Analogplasmide, die in den Teilen A und B des Beispiels 11 gebildet worden waren, wurden jeweils in pMW1-transformierte AM 7 E. coli Zellen transformiert und die Zellen wie oben kultiviert. Gereinigte Isolate wurden sowohl über RIAaIs auch über in vitro-Assays getestet. Die RIA- und in vitro-Assay-Werte für [Asn², des-Pro² bis He⁶]hEPO-Expressionsprodukte waren annähernd 11 000 E/mg und 6000 E/mg Protein, während die Assaywertefür [His⁷-]hEPO etwa 4100 E/mg und 14000E/mg Protein betrugen. Das wies darauf hin, daß die Analogprodukte ein Viertel bis ein Zehntel so aktiv waren wie die „Eltem"expressionsprodukte in den Assays.

In das für die Verwendung von S. cerevisiae-Wirtszellen gestaltete Expressionsprodukt wurde das Plasmid pYE/SCEPO transformiert in zwei unterschiedlichen Stämmen, YSDP4 (Genotyp α pep4-3 trpl) und RK81 (Genotyp α α pep4-3 trpl).

Transformierte YSDP4-Wirte ließ man in SD-Medium wachsen (Methods in Yeast Genetics, Cold Spr. Harb. Lab., Cold Spring Harbor, N. Y., S. 62 [1983]) ergänzt durch Casaminosäuren 5%, pH 6,5 bei 30⁰C. Das Medium wurde geerntet als die Zellen auf

360. D. gewachsen waren, und man erhielt EPO-Produkte in Höhe von etwa 244E/ml (97/u.g/O.D. Liter gemäß RIA).

Transformierte RK81-Zellen wuchsen bis entweder 6,5 O. D. oder 60 O. D., wobei man Medien mit EPO-Konzentrationen von etwa 80-90 E/ml (34/j,g/O.D. Liter gemäß RIA) erhielt. Vorläufige Analysen zeigten signifikante Heterogenität in den vom Expressionssystem produzierten Produkten, wahrscheinlich wegen Variation bei derGlycosylierung von exprimierten Proteinen und wegen des relativ hohen Mannose-Gehaltes des assoziierten Carbohydrate.

Die Plasmide PaC3 und pYE in HB101 E. coli Zellen wurden gemäß Ausführungsverordnung des US-Patentamtes am

27. September 1984 bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland unter den Hinterlegungsnummern ATCC 39881 und ATCC 39882 hinterlegt. Die Plasmide pCFM526 in AM7 Zellen, pCFM536 in JM 103 Zellen und pMW1 in JM 103 Zellen wurden in gleicher Weise am 21. November 1984 als ATCC 33932,33934 und 33933 hinterlegt.

Die Saccharomycescerevisiase Stämme YSPD4 und RK81 wurden am 21. November 1984 als ATCC 20734 und 20733 hinterlegt.

Es sollte bei Betrachtung der Beispiele deutlich geworden sein, daß zahlreiche, außerordentlich wertvolle Produkte und Verfahrensweisen durch die vorliegende Erfindung in ihren vielen Aspekten hervorgebracht wurden.

Die durch die Erfindung vorgesehenen Polypeptide sind bemerkenswert nützliche Materialien, ob sie als mikrobiell exprimierte Produkte oder synthetische Produkte vorliegen, und deren primäre, sekundäre und tertiäre strukturelle Anordnung wurde zu erst durch die vorliegende Erfindung bekannt.

Wie bereits vorher darauf hingewiesen, teilen die auf rekombinantem Wege produzierten und die synthetischen erfindungsgemäßen Produkte, in verschiedenen Graden, die in vitro-biologische Aktivität von EPO-lsolaten aus natürlichem Aufkommen, und sie können dementsprechend als Ersatzstoffe für EPO-lsolate in Kulturmedien, die für das Wachstum von Erythropoietin-Zellen in Kultur eingesetzt werden, dienen. In dem Umfang, wie die erfindungsgemäßen Polypeptidprodukte in ähnlicher Weise die in vivo Aktivität natürlicher EPO-lsolate teilen, sind sie bemerkenswert geeignet für den Einsatz bei der Erythropoietintherapie, wie sie bei Säugetieren, einschließlich Menschen, praktiziert wird, um einige oder alle Wirkungen zu entwickeln, wie sie in vivo dem EPO zugeschrieben werden, z. B. Stimulierung der Retikulozytenreaktion, Entwicklung ferrokinetischer Effekte (wie Plasmaeisen-Umkehreffekte und Knochenmark-Übergangszeiteffekte), Erythrozytenmassenänderungen, Stimulierung der Hämoglobin C-Synthese (siehe Eschbach et al., oben) und wie in Beispiel darauf hingewiesen, Erhöhung der Hämatokritspiegel in Säugetieren.

Zu der Gruppe von Menschen, die mit den erfindungsgemäßen Produkten zu behandeln sind, gehören Patienten, die allgemein Bluttransfusionen benötigen einschließlich traumatisch Geschädigte, chirurgische Patienten, Patienten mit Nierenkrankheiten einschließlich Dialysepatienten und Patienten mit einer Normabweichung in Form von die Blutzusammensetzung beeinflussenden Krankheiten wie Hämophilie, Sichelzellenkrankheit, physiologischen Anämien und ähnlichem. Die Einschränkung der Notwendigkeit einer Transfusionstherapie auf ein Minimum durch Einsatz der EPO-Therapie kann dazu führen, daß die Übertragung infektiöser Bestandteile reduziert wird. Von den erfindungsgemäßen Produkten kann

erwartet werden, daß sie wegen der Herstellung durch rekombinante Verfahren frei von Pyrogenen, natürlichen Inhibierungssubstanzen und ähnlichem sind und sie somit wahrscheinlich eine erhöhte Gesamtwirkung in therapeutischen Verfahrensabläufen gegenüber natürlich abgeleiteten Produkten aufweisen. Die Erythropoietintherapie mit erfindungsgemäßen Produkten kann somit auch nützlich sein bei der Steigerung der Sauerstoffträgerkapazität von Lebewesen, die unter hypoxischen Umweltbedingungen leiden sowie möglicherweise bei der Herbeiführung kardiovasculärer Wirkungen.

Ein bevorzugtes Verfahren für die Verabreichung von erfindungsgemäßen Polypeptidprodukten ist auf parenteralen Wegen (z.B. i.v., i.m., s.c. oder i. p.), und zu den verabreichten Zusammensetzungen gehören normalerweise therapeutisch wirksame Mengen des Produktes in Kombination mit annehmbaren Trägern und/oder Begleitstoffen. Vorläufige pharmakokinetischen Untersuchungen zeigen eine längere Halbwertszeit in vivo für Affen-EPO-Produkte, wenn sie i. m. verabreicht werden, besser als bei i.v.-Verabreichung. Es ist zu erwarten, daß die wirksame Dosierung im wesentlichen von den zu behandelnden Bedingungen abhängt. Therapeutische Dosen werden jedoch gegenwärtig im Bereich von 0,1 (~ 7 E) bis 100 (~ 7000E) ju.g/kg Körpermasse an aktivem Material eingeschätzt. Für erfindungsgemäßen pharmazeutische Zusammensetzungen ist mit Standardverdünnungsmitteln wie Humanserumalbumin ebenso zu rechnen wie mit Standardträgerstoffen wie Salzlösung. Zu Begleitstoffen, die für den Einsatz in erfindungsgemäßen Zusammensetzungen geeignet sind, gehören Verbindungen, die unabhängig festgestellte, Erythropoietin-stimulierende Wirkungen aufweisen, wie Testosterone, Progenitar-Zellstimulantien, Insulin-ähnliche Wachstumsfaktoren, Prostaglandine, Serotonin, zyklisches AMP, Prolactin und Trijodthyronin, ebenso wie Mittel, die allgemein bei der Behandlung aplastischer Anämien eingesetzt werden, wie Methenolen, Stanozolol und Nandrolen (siehe z. B. Resegotte, et al., Panminerva Medica, 23 243-248 [1981]; McGonigle, et al., Kidney Int., 25 [2], 437-444 [1984]; Pavlovic-Kantera, et al., Expt. Hematol., 8 [Supp. 8], 283-291 [1980]; und Kurtt, FEBS Letters, 14a [1], 105-108 [1962]). Ebenso als Adjuvans sind Substanzen geeignet, von denen berichtet wird, daß sie die Wirkungen von Erythropoietin oder asialo-EPO erhöhen oder synergistisch steigern, wie adrenergische Agonisten, thyroide Hormone, Androgene und BPA (siehe Dunn, „Current Concepts in Erythropoieses", John Wiley and Sons [Chichester, England, 1983]; Weiland, et al., Blut, 44 [3], 173-175 [1982]; Kalmanti, Kidney Int., 22, 383-391 [1982]; Shahidi, New. Eng. J. Med., 289, 72-80 [1973]; Fisher, et al., Steroids, 30[6],833-845[1977];Urabe,etal.,J.Exp. Med., 149,1314-1325 [1979]; und Billat, et al., Expt. Hematol., 10 [1], 133-140 [1980]), desgleichen Verbindungsklassen, die als „hepatische erythropoietische Faktoren" bezeichnet werden (siehe Naughton et al., Acta. Haemat., 69 171-179 [1983] und „Erythrotropine" [beschrieben von Congote, et al., in Abstract 364, Proceedings 7th International Congress of Endocrinology Quebec, July 1-7,1984]; Congote, Biochem. Biophys. Res. Comm., 115 [2], 447-483 [1983] und Congote, Anal. Biochem. 140,428-433 [1984] und „Erythrogenine", beschrieben in Rothman, et al., J. Surg. Oncol., 20 105-108 [1982]).

Vorläufige' Screenings zur Messung erythropoietischer Reaktionen von ex-hypoxischen polyzythämischen Mäusen, die entweder mit 5-a-Dihydrotestosteron oder Nadrolen vorbehandelt und dann mit Erythropoietin der vorliegenden Erfindung behandelt wurden, führten zu zweifelhaften Ergebnissen.

Die diagnostische Verwendung von erfindungsgemäßen Polypeptiden ist ähnlich extensiv und kann eine Verwendung in markierten und unmarkierten Formen in einer Vielzahl von Immunoassaytechniken einschließen, wie RIA's, ELlSA's und ähnlichen, sowie eine Vielzahl von in vitro- und in vivo-Assays. (siehe z.B. Dunn, et al., Expt. Hematol*, 11 [7], 590-600 [1983]; Gibson et al.. Pathology, 16,155-156 [1984]; Krystal, Expt. Hematol., 11 [7], 649-660 [1983]; Saito, et al., Jap. J. Med., 223 [1], 16-21 [1984]; Natahn, et al., New Eng. J. Med., 308 [9], 520-522 [1983]) und zahlreiche Literaturstellen, die sich auf Assays beziehen, über die dort berichtet wird.

Die erfindungsgemäßen Polypeptide einschließlich der synthetischen Peptide enthalten Sequenzen von EPO-Resten, über die hier erstmals berichtet wird, führen auch zu sehr nützlichen reinen Materialien für die Erzeugung polyklonaler Antikörper und „Bänke" monoklonaler Antikörper, die spezifisch für die Differenzierung fortlaufender und diskontinuierlicher Epitope von EPO sind. Als ein Beispiel zeigte die vorläufige Analyse der Aminosäuresequenzen von Tabelle Vl im Kontext der Hydropathizität nach Hoppetal., P.N.A.S. (USA), 78 S. 3824-3828 (1981) und von sekundären Strukturen nach Chou et al., Ann. Rev. Biochem. 47, S. 251 (1978), daß die synthetischen Peptide mit verdoppelten fortlaufenden Sequenzen der Reste, die die Positionen 41 bis einschließlich 57,116 bis einschließlich 118 und 144 bis einschließlich 166 überspannen, wahrscheinlich zu einer hoch antigenen Reaktion führen und nützliche monoklonale und polyklonale Antikörper erzeugen, die sowohl mit dem synthetischen Peptid als auch dem gesamten Protein immunoreaktiv sind. Es ist zu erwarten, daß derartige Antikörper beim Nachweis und der Affinitätsreinigung von EPO und EPO-verwandten Produkten nützlich sind

Zur Erläuterung wurden die drei folgenden synthetischen Peptide hergestellt:

(DhEPO 41-57, V-P-D-T-K-V-N-F-Y-A-W-K-R-M-E-V-G;

(2) hEPO 116-128, K-E-A-I-S-P-P-D-A-A-S-A-A;

(3) hEPO 144-166, V-Y-S-N-F-L-R-G-K-L-K-L-Y-T-G-E-A-C-R-T-G-D-R.

Vorläufige Immunisierungsuntersuchungen unter Verwendung der oben genannten Polypeptide haben eine relativ schwache positive Reaktion auf hEPO41-57, eine merkliche Reaktion auf hEP0116-128 und eine stark positive Reaktion auf hEP0144-166 gezeigt, gemessen an der Kapazität von Kaninchenserum-Antikörper gegenüber immungefällen ¹²⁵l-markierten Humanurin-EPO-lsolaten. Vorläufige in vivo-Aktivitätsuntersuchungen bei diesen drei Peptiden zeigten keine signifikante Aktivität, weder allein noch in Kombination.

Während die hergeleiteten Sequenzen von Aminosäureresten von Säuretier-EPO entsprechend den erläuternden Beispielen im wesentlichen die primäre strukturelle Anordnung des reifen EPO definieren, wird richtig angenommen, daß die spezifische Sequenz von 165 Aminosäureresten des EPO von Affenarten in Tabelle V und die 166 Reste von Human-EPO in Tabelle Vl den Schutzumfang der nützlichen, durch dei Erfindung bereitgestellten Polypeptide, nicht einschränken. Umfaßt von der vorliegenden Erfindung sind jene zahlreichen natürlich auftretenden allelischen Formen von EPO, die die Forschung in der Vergangenheit als in biologisch aktiven Säugetierpolypeptiden wie Human-y-lnterferon wahrscheinlich existierend vermutete (Vergleiche z. B. die Humaninterferonarten, die mit einem Argininrest in Position 140 beschrieben wurden gemäß EP-Anmeldung 0077670 und die Art mit einem Glutaminrest in Position 140 gemäß Gray et al., Nature, 295, S.503-508 [1982]. Beide Arten wurden gekennzeichnet als „reife" Human-y-lnterferonsequenzen bildend). Allelische Formen reifer EPO-Polypeptide können voneinander abweichen und von den Sequenzen der Tabellen V und Vl hinsichtlich der Länge der Sequenz und/oder hinsichtlich Deletierungen, Substitutionen, Insertionen oder Additionen von Aminosäuren in der Sequenz bei folgerichtigen Potentialvariationen in der Kapazität für die Glycosylierung

Wie bereits vorher festgestellt wurde, wird vermutet, daß eine vermeintlich allelische Form von Human-EPO einen Methioninrest

an Position 126 enthält. Erwartungsgemäß treten natürliche allelische Formen von EPO-verschlüsselnder DNA genomischer und cDNA-Sequenzen wahrscheinlich ebenso auf, die für die oben genannten Typren allelischer Polypeptide codieren, oder einfach voneinander abweichende Codonszur Gestaltung dergleichen Polypeptide, wie ausgeführt, benutzen. Zusätzlich zu natürlich auftretenden allelischen Formen von reifer EPO erfaßt die vorliegende Erfindung auch andere „EPO-Produkte", wie Polypeptidanaloge von EPO und Fragmente des „reifen" EPO. Unter Benutzung der Verfahrenswege der oben genannten veröffentlichten Anmeldung von Alton et al.

(WO/83/04053) kann man leicht Gene gestalten und herstellen, die für die mikrobielle Expression von Polypeptiden mit primären Anordnungen codieren, die sich von jenen hierfür reifer EPO beschriebenen in Hinblick auf Identität oder Ort einer oder mehrerer Reste (z. B. Substitutionen, terminale und Zwischenadditionen und Deletionen) unterscheiden.

Nacheinander können Modifikationen und cDNA und genomischen EPO-Genen leicht durch bekannte Stellengerichtete Mutagenesetechniken erzielt und dazu eingesetzt werden, Analoge und Derivate von EPO zu erzeugen. Derartige EPO-Produkte würden zumindest eine der biologischen Eigenschaften von EPO aufweisen, sich in anderen jedoch unterscheiden können. Als Beispiele können zu geplanten EPO-Produkten der Erfindung jene gehören, die verkürzt werden durch z. B. Deletionen [Asn², des-Pro² bis He⁶JhEPO, [des-Thr¹⁶⁴ bis Arg¹⁶⁶]hEPO und „A27-55hEPO", letzteres weist Reste auf, die für ein deletiertes vollständiges Exon codieren; oder die stabiler gegen Hydrolyse sind (und daher ausgeprägtere oder längere Dauereffekte als natürlich auftretendes EPO aufweisen); oder die geändert worden sind, eine oder mehrere potentieller Stellen für die Glykosylierung zu deletieren (was zu höheren Aktivitäten für Hefe-produzierte Produkte führen kann); oder die einen oder mehrere Cystein-Reste aufweisen, die deletiert oder durch z.B. Histidin-oder Serinreste ersetzt sind (wie bei dem analogen [HiS⁷IhEPO) und potentiell leichter in aktiver Form aus mikrobiellen Systemen zu isolieren sind; oder die einen oder mehrere Tyrosinreste aufweisen, die durch Phenylalanin ersetzt wird wie bei den Analogen [Phe¹⁵]hEPO, [Phe⁴⁹]hEPO und [Phe¹⁴⁵]hEPO und mehr oder weniger leicht EPO-Rezeptoren an Targetzellen binden können.

Ebenso erfaßt sind Polypeptidfragmente, die nur einen Teil der fortlaufenden Aminosäuresequenz verdoppeln oder sekundäre Anordnungen innerhalb des reifen EPO, deren Fragmenteeine EPO-Aktivität aufweisen können (z. B. Rezeptorbinden) und keine weiteren (z. B. erythropoietische Aktivität). Insbesondere bedeutsam in diesem Zusammenhang sind jene potentiellen Fragmente des EPO, die unter Einbeziehung der humangenomischen DNA-Sequenz von Tabelle Vl (strukturell) aufgeklärt wurden, z. B. „Fragmente" der gesamten fortlaufenden EPO-Sequenz, die durch Intronsequenzen dargestellt wurden und die hervorgehobene „Gebiete" („domains") biologischer Aktivität bilden können. Es ist bemerkenswert, daß das Fehlen der in vivo-Aktivität für ein beliebiges oder mehrere der „EPO-Produkte" der Erfindung nicht völlig deren therapeutische Verwendbarkeit ausschließt (siehe Weiland et al., weiter oben) oder die Verwendbarkeit in anderen Zusammenhängen, wie bei EPO-Assays oder EPO-Antagonismus.

Antagonisten von Erythropoietin können sehr nützlich bei der Behandlung von Polycythemien oder Fällen der EPO-Überproduktion sein (siehe Adamson, Hosp. Practice, 18 [12], 49-57 [1983] und Hellmann et al., Clin, Lab. Hacmat, 5, 335-342. [1983]).

Nach einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung sind die hier beschriebenen klonierten DNA-Sequenzen, die Human- und Affen-EPO-Polypeptide verschlüsseln, bemerkenswert wertvoll für die darin enthaltenen Informationen hinsichtlich der Aminosäuresequenz von Säugetiererythropoietin, die bis heute nicht zu erhalten waren, abgesehen von Teilen aus analytischen Verfahren von Isolaten natürlich auftretender Produkte. Die DNA-Sequenzen sind auch bemerkenswert wertvoll als Produkte, die dazu eingesetzt werden können, die mikrobielle Synthese von Erythropoietin im großen Maße zu beschreiben mittels einer Vielzahl rekombinanter Techniken. Andererseits sind die durch die vorliegende Erfindung vorgesehenen DNA-Sequenzen nützlich für die Erzeugung neuer und nutzbringender viraler und ringförmiger Plasmid-DNA-Vektoren, neuer und nutzbringender transformierter und transferierte mikrobieller procaryotischer und eucaryotischer Wirtszellen (einschließlich bakterieller und Hefezellen sowie in Kultur gewachsener Säugetierzellen), sowie neuer und nutzbringender Verfahren des kultivierten Wachstums solcher mikrobieller Wirtszellen, die zur Expression von EPO- und EPO-Produkten in der Lage sind. Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen sind auch bemerkenswert geeignete Materialien für den Einsatz als markierte Sonden bei der Isolierung von EPO und verwandter Protein-verschlüsselnder cDNA- und genomischer DNA-Sequenzen von anderen Säugetieren als den hier speziell erläuterten Menschen und Affenarten. Der Gehalt, bis zu dem die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen bei dem unterschiedlichen alternativen Verfahren zur Prokinsynthese eingesetzt werden (z. B. in Insektenzellen) oder bei der genetischen Therapie von Menschen oder anderen Säugetieren kann noch nicht berechnet werden. Es ist zu erwarten, daß die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen bei der Entwicklung transgenischer Säugetierarten nutzbringend sein können, die alseucaryotische „Wirte" zur Herstellung von Erythropoietin und Erythropoietinprodukten in Mengen dienen können. Sieheallgemein Polmiter et al., Science, 222 (4625), 809-814 (1983).

Unter diesem Gesichtspunkt ist klar nicht beabsichtigt, daß die erläuternden Beispiele den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung einschränken, und für den Fachmann sind zahlreiche Modifikationen und Variationen denkbar. Als ein Beispiel: Während zu den DNA-Sequenzen, die durch die erläuternden Beispiele gehören, da diese Anmeldung Aminosäuresequenzinformationen vorsieht, die zur Herstellung der DNA-Sequenz wesentlich sind, umfaßt die Erfindung auch solche hergestellten DNA-Sequenzen, wie sie infolge des Wissens um die EPO-Aminosäuresequenzen konstruiert werden können. Diese können für EPO codieren (wie im Beispiel 12), ebenso wie für EPO-Fragmente und kEPO-Polypeptidanaloge (d.i. „EPO-Produkte"), die eine oder mehrere der biologischen Eigenschaften von natürlich auftretendem EPO aufweisen, andere jedoch nicht (oder die andere in unterschiedlichem Grad besitzen).

Die durch die vorliegende Erfindung offengelegten DNA-Sequenzen umfassen somit alle DNA-Sequenzen, die für eine sichere Expression eines Polypeptidproduktes in einer procaryotischen oder eucaryotischen Wirtszelle geeignet sind, wobei dieses Produkt wenigstens einen Teil der primären strukturellen Anordnung und eine oder mehrere der biologischen Eigenschaften von Erythropoietin aufweist und unter folgenden ausgewählt ist:

(a) den in den Tabellen V und Vl aufgeführten DNA-Sequenzen;

(b) DNA-Sequenzen, die zu den unter (a) aufgeführten oder deren Fragmenten hybridisieren; und (c) DNA-Sequenzen, die — allerdings unter Degenerierung des genetischen Codes — zu den unter (a) und (b) definierten DNA-Sequenzen hybridisieren. In diesem Zusammenhang ist es zum Beispiel bemerkenswert, daß zu erwarten ist, daß existierende allelische Affen- und Human-EPO-Gensequenzen und die Gensequenzen anderer Säugetierarten zu Sequenzen der Tabellen V und Vl oder zu Fragmenten davon hybridisieren. Darüber hinaus würden auch — allerdings unter Degenerierung des genetischen Codes — die SCEPO — und ECEPO-Gene und die hergestellten oder mutierten cDNA- oder genomischen DNA-Sequenzen, die verschiedene EPO-

Fragmente und -analoge verschlüsseln, ebenfalls zu den oben genannten DNA-Sequenzen hybridisieren. Derartige Hybridisierungen könnten leicht unter den hier beschriebenen Hybridisierungsbedingungen durchgeführt werden im Hinblick auf die anfängliche Isolierung der Affen-und Human-EPO verschlüsselnden DNA oder schärferen Bedingungen um die Hintergrundhybridisierung gewünschtenfalls zu verringern.

In ähnlicher Weise liegt eine Vielzahl von Expressionssystemen innerhalb dessen, was die Erfindung erfaßt, während die obigen Beispiele die Erfindung einer mikrobiellen Expression von EPO-Produkte im Zusammenhang mit einer Säugetierzellexpression von DNA erläutert, die in einen Hybridvektor bakteriell plasmidischen und viral genomischen Ursprungs insertiert ist. Besonders umfaßt sind Expressionssysteme, zu denen Vektoren homogener Herkunft gehören, die auf eine Vielzahl von bakteriellen, Hefe- und Säugetierzellen in Kultur angewandt werden, ebenso auf Expressionssysteme, die keine Vektoren enthalten (wie z. B. die Kalziumphosphattransfektion von Zellen). In dieser Hinsicht ist die Angelegenheit so zu verstehen, daß die Expression von z. B. DNA von Affen in Affenwirtszellen in Kultur und Humanwirtszellen in Kulturtatsächlich Fälle „exogener'VDNA-Expression bildet in der Weise, wie in EPO-DNA, deren hoher Expressionsspiegel gesucht ist, nicht ihren Ursprung im Genom des Wirtes haben würde. Darüber hinaus berücksichtigen die erfindungsgemäßen Expressionssysteme diese Gewohnheiten, die zur cytoplasmischen Bildung von EPO-Produkten und zur Ansammlung von glycosylierten und nicht-glycosylierten EPO-Produkten im Wirtszellencytoplasma oder in Membranen führt (z. B. Aufspeicherung in bakteriellen periplasmischen Räumen) oder im überstehenden von Kulturmedien, wie oben erläutert, oder in mehr unüblichen Systemen, wie P. aeruginosa-Expressionssytemen (beschrieben von Gray et al., in Biotechnology, 2, S. 161-165 [1984]) Erfindungsgemäße verbesserte Hybridisierungsmethodologien, die erläuternd auf die obigen DNA/dNA-Hybridisierungsscreenings angewandt wurden, sind gleichfalls auf RNA/RNA- und RNA/DNA-Screening anwendbar. Mischsondentechniken, wie sie hier erläutert wurden, bestehen allgemein aus einer Anzahl von Verbesserungen bei Hybridisierungsmethoden, die schnellere und zuverlässigere Polynucleotidisolierungen gestatten. Zu diesen vielen einzelnen Verfahrensverbesserungen gehören: verbesserte Kolonieübertragungsverfahren und -erhaltungsverfahren; Verwendung von Filtern auf Nylinbasis wie GeneScreen und GeneScreenPlus, um mit demselben Film ein Re-Sondieren zu gestatten und die Filter wiederholt verwenden zu können, Anwendung neuer Proteasebehandlungen (z.B. Taub et al., Anal. Biochem., 126, S. 222-230 [1982]); Verwendung von sehr geringen Einzelkonzentrationen (im Bereich von 0,025 picomol) einer größeren Anzahl von Mischsonden (z. B. die über 32 liegenden Zahlen); und Durchführung von Hybridisierungs- und Nachhybridisierungsschritten unter strengen Temperaturen, die in der Nähe (d. i. innerhalb 4°C und vorzugsweise innerhalb 2⁰C entfernt von) der niedrigsten berechneten Dissoziationstemperatur einer beliebigen der eingesetzten Mischsonden liegt. Die Verbesserungen führen gemeinsam zu Ergebnissen, die von vornherein nicht zu erwarten gewesen sind. Verstärkt wird dies durch die Tatsache unterstrichen, daß Mischsondenverfahren mit der vierfachen Zahl der Sonden, über die je bisher als erfolgreich eingesetzt in gleichen cDNA-Screens von Boten-RNA-spezies relativ geringer Menge berichtet wurde, erfolgreich für die Isolierung eines einzelnen Gens in einer Genbibliothek unter Screenen von 1 500000 Phagenpiaques angewandt wurden. Dies wurde erreicht im wesentlichen entgegen der von Anderson et al., siehe oben, publizierten Auffassung, daß Mischsondensreeningverfahren „. .-.für die Isolierung von Säugetierproteingenen untunlich sind, wenn die entsprechenden RNA's nicht erhältlich sind. Die in der vorangegangenen Beschreibung, in den folgenden Patentansprüchen und/oder in den dazugehörigen Zeichnungen offenbarten Merkmale können sowohl getrennt voneinander als auch in Kombination Grundlage für die Realisierung der Erfindung in ihren diversen Formen sein.

Claims (1)

1. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids mit einem Teil oder der ganzen primären strukturellen Gestaltung und einer oder mehreren biologischen Funktionen des natürlich vorkommenden Erythropoietins, gekennzeichnet durch (a) das Züchten — unter geeigneten Bedingungen — von procaryotischen oder eucaryotischen Wirtszellen, umgestaltet oder übertragen mit einem biologisch aktiven, kreisförmigen Plasmid oder einem Virus-DNS-Vektor, einschließlich einer gereinigten und isolierten DNS-Sequenzkodierung für den procaryotischen oder eucaryotischen Wirtsausdruck eines Polypeptids mit einem Teil oder der ganzen primären strukturellen Gestaltung und einer oder mehreren biologischen Eigenschaften vom Erythropoietin und durch (b) die Isolierung der gewünschten Polypeptidprodukte des Ausdruckes der DNS-Sequenzen im genannten Vektor.

   Hierzu 4 Seiten Zeichnungen