DE68916537T2

DE68916537T2 - Herstellung eines insulinähnlichen, wachstümsfaktor bindenden proteins.

Info

Publication number: DE68916537T2
Application number: DE68916537T
Authority: DE
Inventors: Robert Baxter; William Wood
Original assignee: CENTRAL SYDNRY AREA HEALTH SER; Genentech Inc
Current assignee: CENTRAL SYDNRY AREA HEALTH SER; Genentech Inc
Priority date: 1988-03-22
Filing date: 1989-03-10
Publication date: 1995-01-19
Anticipated expiration: 2009-03-11
Also published as: JPH03505397A; EP0406272B1; DE68916537D1; EP0406272B2; AU3217889A; HK1007335A1; JP3577311B2; WO1989009268A1; JP2004256541A; ATE107958T1; DE68916537T3; US5328891A; CA1340703C; EP0406272A1; AU629820B2; US5258287A; NZ228350A; JP3985015B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein bindendes bzw. Bindungsprotein für insulinähnlichen Wachstumsfaktor und die Einrichtung und Verfahren für seine Herstellung in therapeutisch bedeutsamen Mengen.
Peptide der Familie des insulinähnlichen Wachstumsfaktors (IGF), deren rekombinante Herstellung beispielsweise in der am 19. Dezember 1984 veröffentlichten EP-128,733 an Lee et al. beschrieben werden, sind mit bindenden bzw. Bindungsproteinen assoziiert im Blutkreislauf, in anderen Körperfluids und in durch kultivierte Zellen konditionierten Medien zu finden. Es sind zwei IGF-bindende bzw. -Bindungsproteine identifiziert und charakterisiert worden, die in verschiedenen Fluids zu finden sind. Hintz R.L. (1984) "Clinics in Endo. and Metabol." 13: 31-42; Martin J.L. und Baxter, R.C. (1986) "J.Biol.Chem." 261:87S4-8760; Povoa et al. (1984) "Eur.J.Biochem." 144:199-204. Eines dominiert in Erwachsenenserum, wahrend das andere in amniotischem Fluid in den höchsten Konzentrationen festgestellt wird. Baxter et al. (1987) "J.Clin.Endo. and Metabol." 65: 423-431.
Es ist herausgefunden worden, daß die Spiegel des bindenden bzw. Bindungsproteins in Erwachsenenserum den Wachstumshormon(GH)-Status von Individuen widerspiegelt, die entweder an GH-Defizienz oder Akromegalie leiden. Somit korrelieren hohe Spiegel an bindendem bzw. Bindungsprotein mit hohen GH-Spiegeln. Martin und Baxter (1985) "J.Clin.Endo. and Metabol." 61:799-801. Daher ist dieses bindende bzw. Bindungsprotein als das GH-abhängige IGF-bindende bzw. -Bindungsprotein bezeichnet worden. Aus Gründen der Zweckmäßigkeit werden in der vorliegenden Beschreibung die Bezeichnungen BP53 für das GH-abhängige bindende bzw. Bindungsprotein von menschlichem Plasma und BP28 für das zuerst aus amniotischem Fluid isolierte bindende bzw. Bindungsprotein verwendet. Die Bezeichnungen geben die Größe der gereinigten Proteine bei nichtreduzierender Natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) an.
BP53 ist als ein säurestabiler Bestandteil eines in menschlichem Plasma enthaltenen Glykoproteinkomplexes mit 125-150 kD zu finden, der die meisten endogenen IGFs trägt und auch von GH reguliert wird. White et al. (1981) "J.Clin.Endo. and Metabol." 53:49ff; Hintz et al., "J.Clin.Endo. and Metabol." 53:100ff; und Daughaday et al. (1982) "J.Clin.Endo. and Metabol." 55:916ff. Der nach Ansäuerung gereinigte bindende bzw. Bindungsbestandteil dieses Komplexes weist bei SDS-PAGE ein Molekulargewicht von 43 kD (reduziert) und 53 kD (nicht reduziert) auf. Das gereinigte Protein weist eine hohe Affinität für IGF-I und IGF-II auf (Ka=20-4- nM&supmin;¹). Martin und Baxter, "J.Biol.Chem., op cit. Die Konzentration an BP53 in normalem Erwachsenenplasma beträgt 6,1 mg/l. Die BP53-Spiegel steigen bei akromegalischen Patienten auf 13,5 mg/l und sinken bei Patienten mit GH-Defizienz auf 2-3 mg/l. Baxter und Martin, "J.Clin.Invest." 78: 1504-1542 (1986). Zwar dominiert BP28 in amniotischem Fluid, aber auch BP53 wird in amniotischem Fluid mit etwa 4,6 mg/l festgestellt. Das Rattenhomolog von BP53 ist gereinigt worden, und es weist beträchtliche N-terminale Aminosäuresequenzhomologie mit dem menschlichen Protein auf. Baxter und Martin (1987) "Biochem.Biophys.Res.Comm." 147:408-415.
BP28 weist ein Molekulargewicht von 35-40 kD auf, wie durch Gelfiltrationschromatographie ermittelt (Drop et al. (1984) "J.Clin.Endo. and Metabol." 59:899ff), ähnlich dem bei SDS-PAGE festgestellten Molekulargewicht von 32 kD (reduziert) oder 28 kD (nicht reduziert). Das gereinigte Protein bindet sich sowohl an IGF-I als auch IGF-II, jedoch mit einer geringeren Affinität als BP53 (Ka = 3-7 nM&supmin;¹). Von Baxter et al., oben, sind für BP28 in amniotischem Fluid Konzentrationen von 37 bis 148 mg/l berichtet worden. Während BP53 in Erwachsenenserum dominiert, ist BP28 in Serum vorhanden, bei dem seine Konzentrationen im Bereich von 0,02 bis 0,35 mg/l liegen, wobei der Tageszyklus bei 06.00 bis 08.00 Uhr einen deutlichen Spitzenwert erreicht. Baxter und Cowell (1987) "J.Clin.Endo. and Metabol." 65:432-440. Bei BP53 sind keine solchen Tagesschwankungen festgestellt worden. Daten für N-terminale Aminosäuresequenz zeigen, daß zwei andere menschliche Proteine, von Placenta isoliertes PP12 (Koistinen et al. (1986) "Endocrin." 118: 1375ff) und ein vom Kulturmedium einer -- Hepatomazellinie (HEP-G2) isoliertes IGF-bindendes bzw. -Bindungsprotein (Povoa et al. (1985) "Biochem.Biophys.Res.Comm." 128:1071ff) BP28 gleichen oder eng damit verwandt sind. Ein IGF-bindendes bzw. -Bindungsprotein ist auch aus Kulturmedium der Rattenzellinie, BRL-3A, isoliert worden. Lyons und Smith (1986) "Mol.Cell. Endo." 45: 263-270; Mottola et al. (1986) "J.Biol.Chem." 261:11180-11188. Ausgehend von ähnlichen Größeneigenschaften, hohen Fötalserumkonzentrationen und gewisser Proteinsequenzähnlichkeit ist es wahrscheinlich, daß dieses IGF-bindende bzw. -Bindungsprotein das Rattenhomolog von BP28 ist.
Obwohl in der oben angeführten Literatur die Isolierung und Reinigung von BP53 beschrieben worden ist, behindern die relativ geringe Konzentration des Proteins in menschlichem Plasma und seine hohen Kosten, sowohl was Arbeits- als auch was finanziellen Aufwand betrifft, für die Gewinnung von gereinigtem Protein aus dem Plasma in kommerziell verwertbaren Mengen seine Verwendung in großangelegtem Maßstab, entweder alleine oder in Kombination mit IGF.
Demgemäß ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, für BP53 kodierende DNA zu isolieren und aus einer therapeutisch akzeptablen Quelle kommerziell nützliche Mengen des Proteins zu erzeugen.
Ein weiteres Ziel besteht darin, BP53 in einer mit Glykosylierung, die mit nativem BP53 verbunden ist, nicht begleiteten Form zu erhalten.
Ein weiteres Ziel besteht darin, Aminosäuresequenz- und andere Varianten von BP53 herzustellen, welche die biologische Wirkung des Proteins nicht wesentlich negativ beeinflussen.
Wieder ein anderes Ziel besteht darin, BP53 vollständig frei von anderen natürlich auftretenden (Quellen-) Proteinen herzustellen.
Diese und andere Ziele der Erfindung werden aus der Beschreibung als Ganzes klar hervorgehen.
Die Ziele der vorliegenden Erfindung werden durch die Expression von BP53 in rekombinanter Zellkultur erreicht, ein Verfahren, das im wesentlichen darin besteht, für BP53 kodierende Nukleinsäure bereitzustellen, Wirtszellen mit der für BP53 kodierenden Nukleinsäure zu transformieren und die Zellen zu kultivieren, um das Protein in der Wirtszellkultur zu exprimieren.
In einer spezifischen Ausführungsform umfaßt die vorliegende Erfindung eine isolierte DNA-Sequenz, die eine für BP53 kodierende Sequenz enthält, worin die genannte DNA-Sequenz aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus
(a) der in Fig. 3 dargelegten DNA-Sequenz, und
(b) den DNA-Sequenzen besteht, die unter strengen Bedingungen mit der in (a) definierten DNA-Sequenz hybridisieren.
Die DNA-Sequenz kann auch so charakterisiert werden, daß sie eine Sequenz umfaßt, die für ein Protein mit einer Aminosäuresequenz kodiert, die für jene von BP53 ausreichend duplizierend ist, damit sie die biologische Eigenschaft aufweisen kann, daß sie (1) IGF bindet, oder (2) immunologisch mit einem Antikörper über Kreuz reagiert, der gegen zumindest ein Epitop des entsprechenden nativen Proteins gezüchtet wurde.
In anderen Ausführungsformen betrifft die Erfindung (1) markierte DNA-Sequenzen zu Assayzwecken, (2) operabel mit einem Promotor verbundene DNA-Sequenzen, (3) Expressionsvektoren, welche die oben beschriebene DNA-Sequenz operabel mit Steuersequenzen verbunden umfaßt, die von einem vom Vektor transformierten Wirt erkannt werden, und (4) mit dem oben beschriebenen Expressionsvektor transformierte Wirtszellen. Hierin werden auch Expressionsvektoren betrachtet, die sowohl BP53 als auch IGF enthalten, um die Expression beider Proteine gemeinsam mit der Wirtszelle zu ermöglichen.
Weitere Aspekte der Erfindung betreffen neue Formen von BP53, einschließlich BP53, das von assoziierter nativer Glykosylierung unbegleitet ist, zumindest etwa 80%ige Homologie mit der in Fig.3 gezeigten Aminosäuresequenz von reifem Protein aufweist und eine oder beide der biologischen Eigenschaften aufweist, (a) IGF zu binden oder (b) immunologisch mit zumindest einem Epitop des entsprechenden nativen bindenden bzw. Bindungsproteins über Kreuz zu reagieren. Solches BP53 wird im allgemeinen als ein Produkt der Expression in heterologer rekombinanter Zellkultur erhalten. BP53 in jeglicher Form als ein Bestandteil einer rekombinanten Zellkultur ist neu.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die zur Bindung von IGF nützlich ist und eine therapeutisch wirksame Menge des erfindungsgemäßen BP53-Proteins in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger umfaßt.
Ebenso befaßt sich die Erfindung mit pharmazeutischen Zusammensetzungen, die zur Metabolismusregulierung bei Säugetieren nützlich sind und therapeutisch wirksame Mengen an IGF und dem BP53 gemäß vorliegender Erfindung in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger umfassen.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch eine zum Bestimmen der IGF-Spiegel in zirkulierendem menschlichem Plasma nützliche Diagnosezusammensetzung, die das erfindungsgemäße BP53 kovalent an eine nachweisbare Markierungsgruppe gebunden umfaßt.
Die vorliegende Erfindung macht es sowohl möglich, BP53 und/oder Derivate davon durch rekombinante Techniken herzustellen, als auch mit einer solchen Herstellung in Verbindung stehende Produkte und Verfahren bereitzustellen. Die Verfahren, die eingesetzt wurden, um BP53 rekombinant zu erhalten, waren nicht geradlinig, d.h. ohne Umweg, da die von Martin und Baxter, op.cit. gelieferte Information über die N-terminale Sequenz für die ersten 15 Aminosäuren nicht ausreichend war, um eine Sonde zum Screenen bzw. Prüfen einer Sammlung auf die korrekten Klone zu erhalten. Bisher war keine vollständige Aminosäuresequenz für BP53 bekannt. Eine längere interne Sequenz war notwendig, um die Hybridisierungssonden zu erhalten, die zur Identifizierung von Klonen mit für BP53 kodierenden Sequenzen erforderlich waren. Außerdem wurde die Identifizierung der korrekten Klone nur erreicht, wenn drei getrennte Pools aus vier Sonden gleichzeitig verwendet wurden, und die Flecken, welche die korrekten Klone darstellten, waren schwach.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht auch die Herstellung von BP53 in Verbindung mit einem Membrananker, um es zu ermöglichen, den IGF- besser wirksam zu einer Zielzelle zu liefern. Das kann erreicht werden, indem am C-Terminus des BP53-Proteins durch rekombinante Einrichtungen oder anders eine Aminosäuresequenz eingefügt wird, die die Transmembran- oder membranbindende bzw. -bindungsdomäne des normalen Rezeptors entweder für IGF-I oder IGF-II oder eine Phospholipidankerdomäne darstellt. In diesem Fall wird die BP53-Variante aus Wirtszellmembranpräparaten gewonnen. Alternativ dazu kann das BP53 in das extrazelluläre Medium der Wirtszelle ausgeschieden werden.
Die Nützlichkeit des BP53-Proteins und seiner Varianten besteht in der Bindung von in vitro und in vivo vorhandenen IGF-Spezien. So wird angenommen, daß BP53 verwendet werden kann, um die Halbwertszeit von IGF im Kreislauf zu verlängern. Ohne daß damit irgendeiner bestimmten Theorie gefolgt werden soll, wird angenommen, daß es zu dieser Zunahme aufgrund der Sequestrierung des IGF durch das BP53 kommt, was als Reservoir zur gesteuerten Freisetzung von IGF dienen kann.
Darüber hinaus kann BP53 als Diagnosemittel für die IGF-Spiegel Verwendung finden. Außerdem ist das BP53 gemäß vorliegender Erfindung immunologisch kreuzreaktiv mit einem Antikörperpräparat, das ein vom entsprechenden nativen BP53 erkanntes Epitop aufweist, wodurch das BP53 gemäß vorliegender Erfindung als Diagnosemittel für solche Antikörper nützlich wird.
Andere Verwendungen für BP53 werden für Fachleute klar sein.
Fig. 1 zeigt die Oligonukleotidsondensequenzen, die verwendet werden, um menschliche Lebersammlungen auf cDNA-Klone für BP53 sowie die Übereinstimmung für die erhaltene cDNA-Sequenz zu überprüfen.
Fig. 2 zeigt ein Diagramm für die BP53-cDNA und translatierte Aminosäuresequenz. Das offene Kästchen zeigt den Bereich an, der für das reife BP53 kodiert, und das volle Kästchen die vermutliche Signalsequenz. Das Hydropathieplot stammt vom Verfahren von Kyte und Doolittle, "J.Mol.Biol." 157:105-132 (1982) mit einem Fenster aus 10 Resten.
Fig. 3 zeigt die Nukleotidsequenz und vorhergesagte Aminosäuresequenz von menschlichem BP53 aus cDNA Klon ibp.118. Die vorhergesagten Aminosäuren des Proteins werden unter der DNA-Sequenz gezeigt und sind vom ersten Rest des N-Terminus der Proteinsequenz numeriert. Negative Aminosäurenummern beziehen sich auf die/das vermeintliche Leadersignalsequenz oder Präprotein, während positive Nummern sich auf das reife Protein beziehen. Die Anordnung der sequenzierten Peptide ist durch Unterstreichung angegeben. Reste, die bei der Aminosäuresequenzbestimmung ungewiß oder unidentifiziert waren, sind mit einem Punkt bezeichnet.
Fig. 4 zeigt die Konstruktion des Ausgangsexpressionsvektors pF8CIS, der verwendet wird, um den endgültigen Expressionsvektor zu konstruieren.
Fig. 5 zeigt die Konstruktion des Zwischenvektors pCIS2.8c24D für Faktor VIII, bei dem die ClaI-Stelle nicht durch dam-Methylierung beeinflußt ist. Ebenfalls gezeigt wird das Subklonieren von 408 und 416 bp-Fragmenten des Faktor VIII-Kodierungsbereichs zur Konstruktion eines Fusionsplasmids.
Fig. 6 zeigt die Konstruktion des Zwischenplasmids pUC.8d28, das den Fusionsbereich einer Faktor VIII-Variante in einem pUC-Vektor enthält.
Fig. 7 zeigt die Konstruktion des Zwischenexpressionsvektors, der für ein Faktor VIII-Variantenprotein pCIS2.8c28D kodiert.
Fig. 8 zeigt die Konstruktion des Expressionsvektors pRK5, in den die für BP53 kodierende DNA eingesetzt wurde.
Fig. 9 zeigt die Konstruktion des Expressionsvektors pRK5.ibp1.1, der zum Transformieren von Säugetierwirtszellen verwendet wird, um BP53 herzustellen.
Fig. 10 stellt Ergebnisse von Assays zur Expression von BP53 in Säugetierzellen dar. Fig. 10a ist eine graphische Darstellung des Radioimmunoassays für BP53, wobei die Kreise, Quadrate und Dreiecke für die Zugabe von gereinigtem BP53 in ng, die Zugabe von pRK5.ibpl.1-transfiziertem Kulturmedium in ul bzw. die Zugabe von steuerungstransfiziertem Kulturmedium in ul steht. Fig. 10b zeigt eine graphische Darstellung für das Binden von BP53 an markierten IGF-I (geschlossene Symbole) oder IGF-II (offene Symbole), wobei die Kreise, Quadrate und Dreiecke für die Zugabe von gereinigtem BP53 in ng, die Zugabe von pRK5.ibpl.1-transfiziertem Kulturmedium in ul bzw. die Zugabe von steuerungstransfiziertem Kulturmedium in ul stehen. Fig. 10c zeigt eine graphische Darstellung für das Konkurrenzassay mit unmarkiertem IGF-I des Bindens von markiertem IGF-I an pRK5.ibpl.1-transfiziertes Kulturmedium. Das Insert ist ein Scatchardplot der gleichen Daten. Fig. 10d zeigt das gleiche wie Fig. 10c, mit der Ausnahme, daß das Binden mit IGF-II und nicht mit IGF-I erfolgt.
Wie hierin verwendet, bezieht sich bindendes bzw. Bindungsprotein für insulinähnlichen Wachstumsfaktor" oder "BP53" auf ein bindendes bzw. Bindungsprotein eines Säugetiers für insulinähnlichen Wachstumsfaktor mit der Aminosäuresequenz von Fig. 3 zusammen mit Analogen und Varianten davon, die die biologische Wirkung von nativem BP53 aufweisen. Die biologische Aktivität von nativem BP53 wird von jedem Analog oder Variante davon erbracht, das/die fähig ist, IGF (normalerweise IGF-I oder IGF-II) spezifisch zu binden oder ein Immunepitop besitzt, das immunologisch mit einem gegen zumindest ein Epitop von nativem BP53 gezüchteten Antikörper kreuzreaktiv ist. Analoge oder Varianten werden als Moleküle definiert, bei denen die Aminosäuresequenz, Glykosylierung oder ein anderes Merkmal von nativem BP53 kovalent oder nicht-kovalent modifiziert worden ist. Somit können die Varianten ein Molekulargewicht von 53 kD (wie durch in der Abwesenheit eines Reduktionsmittels wie z.B β-Mercaptoäthanol oder Dithiothreitol durchgeführtes SDS-PAGE ermittelt) haben oder nicht. Beispielsweise hat unglykosyliertes BP53 mit der nativen reifen Sequenz bei nicht-reduzierendem SDS-PAGE ein Molekulargewicht von etwa 28,7 kD. Aminosäuresequenzvarianten umfassen nicht nur Allele der Sequenz von Fig. 3, sondern auch vorbestimmte Mutationen davon. Im allgemeinen haben Aminosäuresequenzvariable eine Aminosäuresequenz mit zumindest etwa 80%iger Homologie, und mehr typisch zumindest etwa 90%iger Homologie zu jener des nativen BP53 von Fig. 3. In der Folge sind, wenn nicht anderes zweckmäßig scheint, mit dem Begriff BP53 entweder die native Sequenz oder eine Variantenform gemeint.
In den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung fallen auch BP53, das nicht von nativer Glykosylierung begleitet wird und das die in Fig. 3 dargelegte Aminosäuresequenz aufweist, analoge BP53-Proteine von anderen Tierspezien wie z.B. Rind, Pferd, Schwein, Eiern, Hund, Maus, Katze und ähnlichen und biologisch aktive Aminosäuresequenzvarianten von unglykosyliertem BP53, einschließlich Allele und in vitro-erzeugten kovalenten Derivaten von BP53-Proteinen, die BP53-Wirkung zeigen.
Aminosäuresequenzvarianten von BP53 umfassen beispielsweise Löschungen oder Einfügungen oder Substitutionen von Resten innerhalb der in Fig. 3 gezeigten Aminosäure-BP53-Sequenz Es kann auch jede beliebige Kombination aus Löschung, Einfügung und Substitution durchgeführt werden, um zum Endkonstrukt zu gelangen, vorausgesetzt, daß das Endkonstrukt die gewünschte Wirkung aufweist. Klarerweise dürfen die Mutationen, die in der für die BP53-Variante kodierenden DNA durchgeführt werden, die Sequenz nicht aus dem Leseraster bringen und erzeugen vorzugsweise keine komplementären Bereiche, die sekundäre mRNA-Struktur erzeugen könnten (siehe EP-75,444A).
Diese Varianten werden üblicherweise durch stellengerichtete Mutagenese von Nukleotiden in der für das BP53 kodierenden DNA hergestellt, wodurch für die Variante kodierende DNA hergestellt wird und die DNA in rekombinanter Zellkultur exprimiert wird. Jedoch können Varianten-BP53-Fragmente mit bis zu etwa 100-150 Resten zweckmäßig durch in vitro-Synthese hergestellt werden. Die Varianten weisen typischerweise die gleiche qualitative biologische Wirkung auf wie das natürlich vorkommende Analog.
Die Stelle der Einfügung einer Aminosäuresequenzvariation ist zwar vorbestimmt, die Mutation an sich muß aber nicht vorbestimmt sein. Beispielsweise können, um die Leistung einer Mutation an einer bestimmten Stelle zu optimieren, Zufallsmutagenese am Zielkodon oder -bereich durchgeführt und die exprimierten BP53-Varianten hinsichtlich der optimalen Kombination der gewünschten Wirkung gescreent werden. Techniken zur Durchführung von Substitutionsmutationen an vorbestimmten Stellen bei DNA mit einer bekannten Sequenz sind wohlbekannt, wie beispielsweise M13-Primermutagenese.
Aminosäuresequenzlöschungen liegen im allgemeinen im Bereich von etwa 1 bis 30 Resten, mehr bevorzugt 1 bis 10 Resten, und sind typischerweise benachbart.
Aminosäuresequenzeinfügungen umfassen amino- und/oder carboxylterminale Fusionen mit von einem Rest zu Polypeptiden mit im wesentlichen uneingeschränkter Länge, sowie Intrasequenzeinfügungen mit einzelnen oder Mehrfachaminosäureresten. Intrasequenzeinfügungen (d.h. Einfügungen innerhalb der reifen BP53-Sequenz) können im allgemeinen im Bereich von etwa 1 bis 10, mehr bevorzugt 1 bis 5 Resten liegen. Ein Beispiel für eine einzelne terminale Einfügung ist reifes BP53 mit einem N-terminalen Methionylrest. Diese Variante ist ein Artifakt der direkten Expression von BP53 in rekombinanter Zellkultur, d.h. Expression ohne eine Signalsequenz, um die Ausscheidung oder Zellmembranassoziation von reifem BP53 zu lenken. Andere Beispiele für terminale Einfügungen umfassen: (1) Fusionen von sei es heterologen oder homologen Signalsequenzen mit dem N-Terminus von reifem BP53, um die Ausscheidung von reifem BP53 aus rekombinanten Wirten zu erleichtern, (2) Fusionen von immunogenen Polypeptiden (d.h. Polypeptiden mit ausreichender Größe, um der Zielsequenz Immunogenität zu verleihen), z.B. bakteriellen Polypeptiden wie z.B. beta-Laktamase, beta-Galaktosidase oder ein Enzym, für das die E.coli trp-Stelle kodiert, und (3) Fusionen mit zelloberflächenbindenden Substanzen wie z.B. Membrananker.
Fusionen mit zelloberflächenbindenden Substanzen müssen nicht nach rekombinanten Verfahren hergestellt werden, sondern können das Produkt kovalenter oder nichtkovalenter Assoziation mit BP53 sein. Beispielsweise kann eine Transmembrandomäne vom normalen Zelloberflächenrezeptor für IGF-I oder IGF-II oder die Phospholipidankerdomäne am C-Terminus von reifem Zerfallbeschleunigungsfaktor (mDAF), wie in der am 4. November 1987 veröffentlichten EPO-Veröffentlichung Nr. 244,267 beschrieben, kovalent an den C-Terminus von BP53 gebunden oder als eine Fusion damit in rekombinanter Zellkultur exprimiert werden. Somit kann das BP53 in rekombinanter Zellkultur als eine C-terminale Fusion des pre-BP53 mit mDAF exprimiert werden. Beispielsweise kann ein Fusionsprotein konstruiert werden, bei dem die letzten 37 Aminosäuren von Membran-DAF, die von gespleißter cDNA vorhergesagt wird, innerhalb des Rahmens mit dem C-Terminus von preBP53-Glykoprotein verschmolzen werden, der herkömmlicherweise konstitutiv ins Kulturmedium ausgeschieden wird. Statt ausgeschieden zu werden, wird dieses Fusionskonstrukt zur Zellmembran transportiert und dank des Phosphatidycholinankers dort angeordnet bleiben.
Die dritte Gruppe von Varianten sind jene, bei denen zumindest ein Aminosäurerest im BP53-Molekül, und vorzugsweise nur einer, entfernt worden ist und an seiner Stelle ein anderer Rest eingefiigt worden ist. Derartige Substitutionen werden im allgemeinen gemäß der folgenden Tabelle durchgeführt, wenn es gewünscht wird, die Eigenschaften von BP53 fein abzustimmen. Tabelle 1 Ursprünglicher Rest Beispiele für Substitutionen
Wesentliche Änderungen der Funktion oder immunologischen Identität werden durchgeführt, indem Substitutionen ausgewählt werden, die weniger konservativ sind als jene in Tabelle 1, d.h. Reste ausgewählt werden, die sich in ihrer Wirkung deutlicher unterscheiden, was die Beibehaltung (a) der Struktur des Polypeptidrückrats im Bereich der Substitution, beispielsweise als eine bahn- oder spiralförmige Konformation, (b) der Ladung oder Hydrophobizität des Moleküls an der Ziel stelle, oder (c) des Bulks der Seitenkette betrifft. Die Substitutionen, von denen im allgemeinen erwartet wird, daß sie die größten Veränderungen bei den BP53-Eigenschaften erzeugen, sind jene, bei denen (a) Glycin und/oder Prolin durch eine andere Aminosäure ersetzt ist oder gelöscht oder eingefügt ist; (b) ein hydrophiler Rest, z.B. Seryl oder Threonyl einen hydrophoben Rest, z.B. Leucyl, Isoleucyl, Phenylalanyl, Valyl oder Alanyl ersetzt (oder durch diesen ersetzt ist); (c) ein Cystein- oder Prolinrest irgendeinen anderen Rest ersetzt (oder durch ihn ersetzt ist); (d) ein Rest mit einer elektropositiven Seitenkette, z.B. Lysyl, Arginyl oder Histidyl einen elektronegativen Rest, z.B. Glutamyl oder Aspartyl ersetzt (oder durch ihn ersetzt ist); oder (e) ein Rest mit einer voluminösen Seitenkette, z.B. Phenylalanin, einen solchen ersetzt (oder durch einen ersetzt ist), der keine solche Seitenkette aufweist, z.B. Glycin.
Bei den meisten Löschungen und Einfügungen, insbesondere Substitutionen, wird nicht erwartet, daß sie radikale Änderungen in den Merkmalen des BP53-Moleküls erzeugen. Wenn es jedoch schwierig ist, die exakte Wirkung der Substitution, Löschung oder Einfügung im voraus vorherzusagen, beispielsweise wenn die IGF-bindende bzw. -Bindungsdomäne oder ein Immunepitop modifiziert wird, wird ein Fachmann anerkennen, daß die Wirkung durch Routine-Screeningassays bewertet wird. Beispielsweise wird eine Variante typischerweise durch die stellenspezifische Mutagenese von für natives BP53 kodierender Nukleinsäure, Expression der Variantennukleinsäure in rekombinanter Zellkultur und wahlweise Reinigung aus der Zellkultur, beispielsweise durch Immunaffinitätsabsorption auf einer Kaninchen-polyklonal-anti-BP53-Säule durchgeführt (um die Variante durch zumindest ein verbleibendes Immunepitop zu absorbieren). Die Wirksamkeit des Zelllysats oder der gereinigten BP53-Variante wird dann in einem geeigneten Screeningassay hinsichtlich des gewünschten Merkmals gescreent. Beispielsweise wird eine Änderung des immunologischen Charakters des BP53, wie z.B. Affinität für einen bestimmten Antikörper, durch ein Immunoassay vom kompetitiven Typ gemessen. Veränderungen der Immunomodulatorwirksamkeit werden mit dem geeigneten Assay gemessen. Modifikationen von solchen Proteineigenschaften wie Redox- oder Wärmestabilität, Hydrophobizität, Anfälligkeit für proteolytischen Abbau oder die Tendenz zur Anhäufung mit Trägern oder in Multimeren werden nach Verfahren einem Assay unterzogen, die dem durchschnittlich erfahrenen Fachmann bekannt sind.
Für BP53 kodierende DNA kann aus anderen Quellen als vom Menschen erhalten werden, indem (a) eine cDNA-Sammlung von Geweben erhalten wird, die BP53 mRNA des speziellen Säugetiers exprimieren, (b) Hybridisierungsanalysen mit markierter DNA durchgeführt werden, die für menschliches BP53 oder Fragmente davon kodiert (üblicherweise mit einer Länge von mehr als 100 Basenpaaren), um Klone in der cDNA-Sammlung zu ermitteln, die homologe Sequenzen enthalten, und (c) die Klone durch Restriktionsenzymanalyse und Nukleinsäuresequenzierung analysiert werden, um Klone mit voller Länge zu identifizieren. Wenn in der Sammlung keine Klonen mit voller Länge vorhanden sind, können geeignete Fragmente aus den verschiedenen Klonen gewonnen werden, indem die Nukleinsäuresequenzinformation verwendet wird, die hierin erstmals geoffenbart wird, und an Restriktionsstellen ligiert wird, die den Klonen gemeinsam sind, um einen für BP53 kodierenden Klon mit voller Länge zusammenzustellen. Alternativ dazu sorgen genomische Sammlungen für die gewünschte DNA.
BP53 kann nach jeder beliebigen Technik hergestellt werden, einschließlich sowohl synthetischer als auch rekombinanter Verfahren. Ebenso ist mit einer isolierten DNA hierin chemisch synthetisierte DNA, cDNA, chromosomale oder extrachromosomale DNA mit oder ohne die 3'- und/oder 5'-Flankierungsbereiche gemeint. Vorzugsweise wird das BP53 hierin durch Synthese in rekombinanter Zellkultur hergestellt. Für eine solche Synthese ist es zuerst notwendig, Nukleinsäure sicherzustellen, die für BP53 kodiert. Die Erfinder sind bei dem Versuch, irgendeine für BP53 kodierende Nukleinsäure aus einer menschlichen cDNA-Sammlung zu identifizieren, auf beträchtliche Schwierigkeiten gestoßen. Die Sequenz der für BP53 kodierenden menschlichen DNA, die schließlich ermittelt wurde, wird in Fig. 3 gezeigt. Wenn man dieses Verfahren nun wiederholen würde, entstünden diese Probleme nicht, weil aus der Sequenz in Fig. 3 perfekt komplementäre Sonden erhalten werden können. Sobald diese DNA identifiziert worden ist, wobei die Hybridisierung mehrerer synthetischer Sonden verwendet wird, wird die von der Sammlung isolierte DNA zur weiteren Klonierung oder zur Expression in einen replizierbaren Vektor ligiert.
Zur Sequenzbestimmung wird natives BP53 aus Säugetierplasma erhalten und im allgemeinen aus einer Cohn IV-Fraktion davon gereinigt. Das am häufigsten zum Isolieren und Reinigen des nativen BP53 verwendete Verfahren wird bei Martin und Baxter, "J.Biol.Chem." 261:8754-8760 (1986) beschrieben. Kurz zusammengefaßt wird die Cohn-Paste mit Essigsäure, NaCl-Lösung gemischt, und das resultierende Homogenat wird 50 Min. lang bei 4200 UpM zentrifugiert. Endogener IGF wird durch Rühren des Oberstandes mit SP-Sephadex C-25 entfernt, das mit auf pH 3,0 eingestelltem Homogenisierungspuffer äquilibriert wurde. Nach 72 Stunden wird das Rühren abgebrochen, man läßt das Gel sich absetzen und der Überstand wird sorgfältig dekantiert. Der überstand wird dann auf pH 4 eingestellt, was zu einem Niederschlag führt, der durch Zentrifugierung entfernt wird. Der resultierende überstand wird dann auf pH-6,5 eingestellt und die Mischung wieder zentrifugiert. Der resultierende Überstand wird auf eine sorgfältig vorbereitete Affinitätssäule aus Agarose-IGF-II gepumpt. Die Säule wird dann mit Natriumphosphatpuffer mit pH 6,5 gewaschen. Das Protein wird mit Essigsäure, pH 3,0 mit 1 ml/min eluiert. Aktive Fraktionen werden kombiniert und auf eine Umkehrphasenhochleistungsflüssigkeitschromatographiesäule aufgebracht, die mit 15% Acetonitril in 0,1% Trifluoressigsäure äquilibriert wurde. Ein linearer Gradient zu 60% Acetonitril wird sofort begonnen und 30 Minuten lang mit 1,5 ml/min. durchgeführt. Ein einzelner Peak wird für das Protein erhalten.
Bei einem Beispiel für ein rekombinantes Expressionssystem wird BP53 in Prokaryoten exprimiert, die reifes Protein nicht verarbeiten und ausscheiden, indem mit einem Expressionsvektor transformiert wird, der für BP53 kodierende DNA umfaßt. Es ist vorzuziehen, Wirtszellen zu transformieren, die fähig sind, eine solche Verarbeitung zu erreichen, um BP53 im Kulturmedium oder Periplasma der Wirtszelle zu erhalten. Typischerweise sind höher eukaryote Wirtszellen wie z.B. Säugetierzellen nach der Transformation mit für BP53 kodierender DNA fähig, BP53 zu verarbeiten und reifes BP53 auszuscheiden.
Ausgeschiedenes reifes BP53 kann erhalten werden, indem das 5'-Ende der für reifes BP53 kodierenden DNA an das 3'-Ende von DNA ligiert wird, die für eine Signalsequenz kodiert, die von der Wirtszelle erkannt wird. Ein Expressionsvektor, der die ligierten DNA-Sequenzen umfaßt, wird verwendet, um Wirtszellen umzuwandeln. Die Wirtszelle verarbeitet die exprimierte Fusion, indem sie die Peptidbindung zwischen der Signalsequenz und der ersten Aminosäure von BP53 proteolytisch spaltet und das reife BP53 je nach der fraglichen Wirtszelle in das Wirtszellenperiplasma oder in das Medium ausscheidet. Beispielsweise wird bei der Konstruktion eines prokaryotischen Expressionsvektors der BP53-Sekretionsleader, d.h. die Aminosäuren -27 bis -1, durch die bakterielle alkalische Phosphatase oder wärmestabile Enterotoxin II-Leader ersetzt, und bei Hefe wird der BP53-Leader durch die Hefeinvertase, α-Faktor oder saure Phosphataseleader ersetzt. Mit einer homologen Signal-BP53-Fusion transformierte gramnegative Organismen scheiden reifes BP53 ins Zellperiplasma aus, wohingegen Hefe oder Bacillus sp. reifes BP53 in das Kulturmedium ausscheiden.
Vektoren sind nützlich, um zwei Funktionen in Zusammenarbeit mit kompatiblen Wirtszellen durchzuführen (ein Wirt-Vektor-System). Eine Funktion besteht darin, das Klonieren der für BP53 kodierenden Nukleinsäure zu erleichtern, d.h. einsetzbare Mengen der Nukleinsäure herzustellen. Die andere Funktion besteht darin, die Expression von BP53 zu lenken. Eine oder beide dieser Funktionen werden vom Vektor-Wirt-System durchgeführt. Die Vektoren enthalten je nach der Funktion, die sie zu erfüllen haben, sowie der Wirtszelle, die zum Klonieren oder Exprimieren ausgewählt wird, unterschiedliche Bestandteile.
Jeder Vektor enthält Nukleinsäure, die für BP53 kodiert, wie oben beschrieben. Typischerweise handelt es sich dabei um DNA, die für das BP53 in seiner reifen Form kodiert und an ihrem Aminoterminus mit einem Sekretionssignal verbunden ist. Dieses Sekretionssignal ist vorzugsweise die BP53-Präsequenz, die normalerweise die Ausscheidung von BP53 aus menschlichen Zellen in vivo lenkt. Jedoch umfassen geeignete Sekretionssignale auch. Signale von BP53 anderer Tiere, virale Signale oder Signale von ausgeschiedenen Polypeptiden der gleichen oder einer verwandten Spezies.
Expressions- und Klonierungsvektoren enthalten eine Nukleinsäuresequenz, die es dem Vektor ermöglicht, sich in einer oder mehreren ausgewählten Wirtszellen zu replizieren. Im allgemeinen ist diese Sequenz bei Klonierungsvektoren eine, die es dem Vektor ermöglicht, sich unabhängig von den Wirtschromosomen zu replizieren, und umfaßt Replikationsursprünge oder sich autonom repliziernde Sequenzen. Solche Sequenzen sind bei einer Vielzahl von Bakterien, Hefe und Viren wohlbekannt. Der Replikationsursprung vom wohlbekannten Plasmid pBR322 (Bolivar et al., "Gene" 2:95-113 (1977)) ist für die meisten gram-negativen Bakterien geeignet; der 2u Plasmidursprung für Hefe und verschiedene virale Ursprünge (SV40, Polyoma, Adenovirus, VSV oder BPV) ist nützlich zum Klonen von Vektoren bei Säugetierzellen. Für Säugetierexpressionsvektoren sind keine Ursprünge erforderlich (der SV40-Ursprung wird in den Beispielen nur verwendet, weil er den frühen Promotor enthält). Die meisten Expressionsvektoren sind "Shuttle"-Vektoren, d.h. sie sind zur Replikation in zumindest einer Klasse von Organismen fähig, können aber zur Expression in einen anderen Organismus transfiziert werden. Beispielsweise wird ein Vektor in E.coli kloniert, und dann wird derselbe Vektor zur Expression in Hefe oder Säugetierzellen transfiziert, obwohl er nicht fähig ist, sich unabhängig vom Wirtszellenchromosom zu replizieren.
DNA kann auch durch Einsetzen in das Wirtsgenom geklont werden. Dieses Klonen kann mit Bacillusspezies erreicht werden, beispielsweise indem in einen Vektor eine DNA-Sequenz aufgenommen wird, die zu einer in genomischer Bacillus-DNA zu findenden Sequenz komplementär ist. Die Transfektion von Bacillus mit diesem Vektor führt zur homologen Rekombination mit dem Genom und Einfügung von BP53-DNA. Jedoch ist die Gewinnung von für BP53 kodierender genomischer DNA komplexer als jene eines exogen replizierten Vektors, da es erforderlich ist, daß die Restriktionsenzymdigestion die BP53-DNA exzidiert. Im allgemeinen wird DNA in ein Wirtsgenom eingefügt, um eine stabile Zellinie oder Mikrobe zur BP53-Expression herzustellen.
Expressions- und- Klonierungsvektoren sollten ein Selektionsgen enthaltend das auch als selektierbare Markierung bezeichnet wird. Dabei handelt es sich um ein Gen, das für ein Protein kodiert, das für das Überleben oder Wachstum einer mit dem Vektor transformierten Wirtszelle notwendig ist. Das Vorhandensein dieses Gens gewährleistet, daß jede beliebige Wirtszelle, die den Vektor löscht, beim Wachstum oder der Reproduktion gegenüber transformierten Wirten keinen Vorteil erzielt. Typische Selektionsgene kodieren für Proteine, die (a) Widerstandsfähigkeit gegenüber Antibiotika oder anderen Toxinen, z.B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat oder Tetracyclin, verleihen, (b) auxotrophe Defizienzen ausgleichen oder (c) entscheidende Nährstoffe zuführen, die aus komplexen Medien nicht verfügbar sind, z.B. das Gen, das für D-Alaninracemase für Bazillen kodiert.
Ein geeignetes Selektionsgen zur Verwendung bei Hefe ist das im Hefeplasmid YRp7 vorhandene trpl-Gen (Stinchcomb et al. (1979) "Nature", 282,39; Kingsman et al. (1979) "Gene" 7: 141; oder Tschemper et al. (1980) "Gene" 10: 157). Das trp1-Gen liefert eine Selektionsmarkierung für einen mutanten Hefestamm, dem die Fähigkeit zum Wachstum in Tryptophan fehlt beispielsweise ATCC Nr. 44 076 oder PEP4-1 (Jones (1977) "Genetics" 85:12). Das Vorhandensein der trp1-Läsion im Hefewirtszellengenom liefert dann eine wirksame Umgebung zum Feststellen der Transformation durch Wachstum in Abwesenheit von Tryptophan. Auf ähnliche Weise sind Hefestämme mit Leu2-Defizienz (ATCC 20 622 oder 38 626) durch bekannte Plasmide ergänzt, die das Leu2-Gen tragen.
Beispiele für geeignete selektierbare Markierungen für Säugetierzellen sind Dihydrofolatreduktase (DHFR) oder Thymidinkinase. Solche Markierungen ermöglichen die Identifizierung von Zellen, die zur Aufnahme der BP53-Nukleinsäure kompetent waren. Die Säugetierzellentransformanten werden Selektionsdruck ausgesetzt, sodaß nur die Transformanten als einzige überlebensfähig gemacht sind, weil sie die Markierung aufgenommen haben. Selektionsdruck wird auferlegt, indem die Transformanten unter Bedingungen kultiviert werden, unter denen die Konzentration des Selektionsmittels im Medium nacheinander geändert wird, was zu einer Verstärkung sowohl des Selektionsgens als auch der für BP53 kodierenden DNA führt. Verstärkung ist der Vorgang, durch den Gene, die für die Produktion eines für das Wachstum entscheidenden Proteins in stärkerem Maße benötigt werden, gemeinsam mit den Chromosomen aufeinanderfolgender Generationen rekombinanter Zellen reiteriert bzw. vermehrt werden. Aus der verstärkten DNA werden erhöhte BP53-Mengen synthetisiert.
Beispielsweise werden mit dem DHFR-Selektionsgen transformierte Zellen zuerst identifiziert, indem alle Transformanten in einem Kulturmedium kultiviert werden, dem Hypoxanthin, Glycin und Thymidin fehlt. Eine geeignete Wirtszelle in diesem Fall ist die Chinesische Hamster-Eierstock-(CHO)-Zellinie, der DHFR-Wirkung fehlt, hergestellt und vermehrt wie von Urlaub und Chasin (1980) "Proc.Nat'l.Acad.Sci." (USA) 77:4216 beschrieben. Eine besonders nützliche DHFR ist eine mutante DHFR, die in hohem Maße gegen MTX resistent ist (EP 117,060A). Dieses Selektionsmittel kann ungeachtet des Vorhandenseins von endogenem DHFR mit jedem beliebigen ansonsten geeigneten Wirt verwendet werden, beispielsweise ATCC Nr. CCL61 CHO-K1). Die für DHFR und BP53 kodierende DNA wird dann verstärkt, indem sie einem Mittel (Methotrexat oder MTX) ausgesetzt wird, das die DHFR inaktiviert. Es ist gewährleistet, daß die Zelle mehr DHFR erfordert (und folglich die gesamte exogene DNA verstärkt) indem nur nach Zellen selektiert wird, die in aufeinanderfolgenden Runden immer größerer MTX-Konzentration wachsen können.
Expressionsvektoren sollten, anders als Klonierungsvektoren, einen Promotor enthalten, der vom Wirtsorganismus erkannt wird und operabel mit der BP53-Nukleinsäure verbunden ist. Promotoren sind untranslatierte Sequenzen, die stromaufwärts vom Startkodon eines Strukturgens (im allgemeinen innerhalb von etwa 100 bis 100 bp) angeordnet sind, die die Transkription und Translation von Nukleinsäuresequenzen unter ihrer Kontrolle steuern. Sie fallen typischerweise in zwei Klassen, die induzierbaren und die konstitutiven. Induzierbare Promotoren sind Promotoren, die als Reaktion auf eine gewisse Anderung der Kulturbedingungen, z.B. die Gegenwart oder Abwesenheit eines Nährstoffs oder eine Temperaturänderung, erhöhte Transkriptionsausmaße von DNA unter ihrer Kontrolle auslösen. Konstitutive Promotoren werden durch Veränderungen der Kulturbedingungen nicht induziert. Gegenwärtig ist eine große Anzahl von Promotoren wohlbekannt, die von einer Vielfalt potentieller Wirtszellen erkannt werden. Diese Promotoren können operabel mit für BP53 kodierender DNA verbunden werden, indem sie durch Restriktionsenzymdigestion von ihrem Ursprungsgen entfernt werden und sie dann 5' vom Startkodon für BP53 eingefügt werden. Das bedeutet nicht, daß der genomische BP53-Promotor nicht einsetzbar ist. Jedoch führen für BP53 heterologe Promotoren im allgemeinen zu einer größeren Transkription und höheren Ausbeuten an exprimiertem BP53.
Zu Promotoren, die zur Verwendung bei prokaryotischen Wirten geeignet sind, gehören die β-Laktamase- und Laktosepromotorsysteme (Chang et al., "Nature" 275:615 (1978) und Goeddel et al.; "Nature" 281: 544 (1979)), alkalische Phosphatase, ein Tryptophan(trp)-Promotorsystem (Goeddel, "Nucleic Acids Res." 8: 4057 (1980) und EPO-Anmeldung Veröffentlichungsnr. 36776) und Hybridpromotoren wie z.B. der tac-Promotor (H.de Boer et al., "Proc.Nat'l.Acad.Sci." (USA) 80: 21-25 (1983)). Jedoch sind auch andere bekannte bakterielle Promotoren geeignet. Ihre Nukleotidsequenzen sind veröffentlicht worden, wodurch ein Fachmann in der Lage ist, sie operabel an für BP53 kodierende DNA zu ligieren (Siebenlist et al., "Cell" 20: 269 (1980)), wobei Linker oder Adapter verwendet werden, um alle erforderlichen Restriktionsstellen bereitzustellen (Siebenlist et al., "Cell" 20: 269 (1980)). Promotoren zur Verwendung in bakteriellen Systemen enthalten auch eine Shine-Dalgarno (SD)-Sequenz, die operabel mit der für BP53 kodierenden DNA verbunden ist.
Zu geeigneten Promotorsequenzen zur Verwendung bei Hefewirten gehören die Promotoren für 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., "J.Biol.Chem." 255: 2073 (1980)) oder andere glykolytische Enzyme (Hess et al., "J.Adv.Enzyme Reg." 7:149 (1968) und Holland, "Biochemistry" 17: 4900 (1978)), wie z.B. Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdekarboxylase, Phosphofruktokinase, Glukose-6-phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglukoseisomerase und Glukokinase.
Andere Hefepromotoren, die induzierbare Promotoren mit dem zusätzlichen Vorteil der durch Wachstumsbedingungen gesteuerten Transkription sind, sind die Promotorbereiche für Alkoholdehydrogenase 2, Isozytochrom C, saure Phosphatase, mit Stickstoffstoffwechsel assoziierte Abbauenzyme, Metallothionein, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase und Enzyme, die für Maltose- und Galaktoseeinsatz verantwortlich sind (Holland, op cit.). Geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung bei der Hefeexpression werden weiters bei R. Hitzeman et al., EP 73,657A beschrieben. Auch Hefeverstärker werden vorteilhaft bei Hefepromotoren verwendet.
Die BP53-Transkription von Vektoren in Säugetierwirtszellen wird von Promotoren gesteuert, die aus verschiedenen Quellen erhalten werden, beispielsweise den Genomen von Viren wie z.B. Polyoma, Affen Virus 40 (SV40), Adenovirus, Retroviren, Hepatitis-B-Virus, und, am meisten bevorzugt, Cytomegalovirus, oder aus heterologen Säugetierpromotoren, z.B. beta-Actinpromotor. Die frühen und späten Promotoren des SV40-Virus werden zweckmäßig als ein SV40-Restriktionsfragment erhalten, das auch den viralen SV40-Replikationsursprung enthält (Fiers et al., "Nature" 273: 113 (1978)). Der unmittelbare frühe Promotor des menschlichen Cytomegalovirus wird zweckmäßig als ein HindIII E-Restriktionsfragment erhalten (Greenaway, P.J. et al., "Gene", 18: 355-360 (1982)). Selbstverständlich sind gemäß vorliegender Erfindung auch Promotoren von der Wirtszelle oder verwandten Spezien nützlich.
Die Transkription von für BP53 kodierender DNA durch höhere Eukaryoten wird durch das Einsetzen einer Verstärkersequenz in den Vektor erhöht. Verstärker sind cis-wirkende DNA-Elemente, üblicherweise mit etwa 10 bis 300 bp, die auf einen Promotor einwirken, um seine Transkriptionsingangsetzungsfähigkeit zu erhöhen. Verstärker sind relativ ausrichtungs- und positionsunabhängig und sind 5' (Laimins, L. et al., "Proc.Natl.Acad.Sci." 78: 993 (1981)) und 3' (Lusky, M.L. et al., "Mol.Cell. Bio." 3: 1108 (1983)) zur Transkriptionseinheit innerhalb eines Introns (Banerji, J.L. et al., "Cell" 33: 729 (1983)) sowie innerhalb der Kodierungssequenz selbst (Osborne, T.F. et al., "Mol.Cell Bio." 4: 1293 (1984)) festgestellt worden. Gegenwärtig sind viele Verstärkersequenzen von Säugetiergenen bekannt (Globin, Elastase, Albumin, α-Fötoprotein und Insulin). Typischerweise wird jedoch ein Verstärker von einem eükaryoten Zellvirus verwendet. Beispiele umfassen den SV40-Verstärker auf der späten Seite des Replikationsursprungs (bp 100-270), der Cytomegalovirus-früher Promotor-Verstärker auf der späten Seite des Replikationsursprungs und Adenoviralverstärker. Die Verstärker können an der Position 5' oder 3' von der für BP53 kodierenden Sequenz in den Vektor gespleißt werden, sind aber vorzugsweise an der Stelle 5' vom Promotor angeordnet.
In eukaryoten Wirtszellen (Hefe-, Pilz-, Insekten-, Pflanzen-, Tier-, menschliche oder nukleierte Zellen) verwendete Expressionsvektoren können auch Sequenzen enthalten, die zur Bestimmung der Transkription notwendig sind, die die mRNA-Expression beeinflussen kann. Diese Bereiche werden als polyadenylierte Segmente im untranslatierten Abschnitt der für BP53 kodierenden mRNA transkribiert. Die 3' gelegenen untranslatierten Bereiche umfassen auch Transkriptionsterminationsstellen.
Andere Vektoren, die zur Anpassung an die Synthese von heterologen Proteinen in rekombinanter Wirbeltierzellkultur geeignet sind, werden in M.J. Gething et al., "Nature" 293: 620-625 (1981); N. Mantei et al., "Nature" 281: 40-46; und A. Levinson et al., EP-117,060A und 117,058A beschrieben. Ein besonders nützliches Ausgangsplasmid zur Säugetierzellkulturexpression von BP53 ist pUC118, beschrieben von Vieira und Messing, "Meth. Enzymol." 153: 3-11 (1987). Kurz zusammengefaßt ist pUC118 ein Plasmid mit 3,2 kb, das Ampicillinresistenz und M13 IG-Bereich aufweist, sowie eine Sequenz, die für das lacZ-Peptid kodiert, die einzigartige Restriktionsstellen zum Klonen enthält. pUC118 ist pUC18 (beschrieben von Norrander et al., "Gene" 26: 101 (1983)), bei dem der IG-Bereich von M13 von der HgiAI-Stelle (5465) zur DraI-Stelle (5941) an der einzigen NdeI-Stelle (2499) von pUC eingefügt ist. Die Ausrichtung des M13 IG-Bereichs ist eine solche, daß der Strang des lac-Bereichs, der als ssDNA bepackt ist, der gleiche wie bei den M13mp-Vektoren ist.
Geeignete Wirtszellen zum Klonen oder Exprimieren der Vektoren gemäß vorliegender Erfindung sind Prokaryote, Hefe oder höher eukaryote Zellen. Zu den Prokaryoten gehören Gram-negative oder Gram-positive Organismen, beispielsweise E.coli oder Bacilli. Ein bevorzugter Klonierungswirt ist E.coli 294 (ATCC Nr. 31,446), obwohl andere Gram-negative oder Gram-positive Prokaryoten wie z.B. E.coli B, E.coli X1776 (ATCC Nr. 31,537), E.coli W3110 (F&supmin;, λ&supmin;, prototroph, ATCC Nr. 27 325), Bazillen wie z.B. Bacillus subtilus, Salmonella typhimurium, Pseudomonas-Spezien oder Serratia Marcesans geeignet sind. Wenn eine prokaryote Zelle als Wirt zur Expression eingesetzt wird, enthält der Expressionsvektor vorzugsweise eine Signalsequenz zum Transport des Proteins in das Kulturmedium. Ansonsten wird das Protein, das 18 Zysteinreste enthält, in Form refraktiler Körper hergestellt, die spezielle Behandlung erfordern, um das Protein zurückzugewinnen, welche Behandlung die erneute Faltung des Proteins umfaßt.
Außer den Prokaryoten sind eukaryote Mikroben wie z.B. Fadenpilze oder Hefe geeignete Wirte für für BP53 kodierende Vektoren. Saccharomyces cerevisiae, oder gemeine Backhefe, ist der am häufigsten verwendete eukaryote Mikroorganismus, obwohl auch eine Anzahl anderer Stämme im allgemeinen verfügbar ist. Zur Expression in Saccharomyces wird üblicherweise das Plasmid YRp7 (Stinchcomb, et al., "Nature" 282: 39 (1979); Kingsman et al., "Gene" 7: 141 (1979); Tschemper et al., "Gene" 10: 157 (1980)) verwendet. Dieses Plasmid enthält bereits das trp1-Gen, das eine Selektionsmarkierung für einen mutanten Hefestamm bietet, dem die Fähigkeit zum Wachstum in Tryptophan fehlt, beispielsweise ATCC Nr. 44,076 oder PEP4-1 (Jones, "Genetics" 85: 12 (1977)). Das Vorhandensein der trp1-Läsion als ein Merkmal des Hefewirtszellengenoms bietet dann ein wirksames Mittel zur Selektion durch Wachstum in Abwesenheit von Tryptophan.
Die bevorzugten Wirtszellen zur Expression von BP53 sind Zellen, die von multizellulären Organismen abgeleitet sind. Wie oben beschrieben, weist die große Anzahl an Cysteinresten bei BP53 darauf hin, daß die Wirtszelle optimalerweise einer höheren phylogenen Ordnung angehört als die Prokaryoten, wenn erwartet werden soll, daß das rekombinante Protein optimale Konformationstreue gegenüber nativem BP53 aufweist. Es kann auch notwendig sein, die Glykosylierung von BP53 zu gewährleisten. Alle diese Funktionen können am besten durch höhere eukaryote Zellen durchgeführt werden. Im Prinzip ist jede beliebige höhere eukaryote Zellkultur einsetzbar, gleichgültig, ob aus Wirbeltier- oder Wirbellostier-Kultur, aber Zellen von Säugetieren wie z.B. Affen, Ratten, Hamstern und Menschen werden bevorzugt. Die Vermehrung solcher Zellen in Kultur ist an sich wohlbekannt. Siehe "Tissue Culture", Academic Press, Hrsg. Kruse und Patterson (1973). Beispiele für nützliche Säugetierwirtszellinien sind Affennieren-CV1-Linie, transformiert durch SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); menschliche Embryonieren-Zellinie 293 (Graham, F.L. et al., "J.Gen.Virol.", 36: 59 (1977)); Babyhamster-Nierenzellen (BHK, ATCC CCL 10); Chinesischer Hamster-Eierstock-Zellen-DHFR (CHO, Urlaub und Chasin, "Proc.Natl.Acad.Sci." (USA) 77: 4216 (1980)); Maussertolizellen (TM4, Mather, J.P., "Biol.Reprod." 23: 243-251 (1980)); Affennierenzellen (CV1, ATCC CCL 70); Nierenzellen von der Afrikanischen Grünen Meerkatze (VERO-76, ATCC CRL-1587); menschliche Zervixkarzinomzellen (HELA, ATCC CCL 2); Hunde-Nierenzellen (MDCK, ATCC CCL 34); Büffelrattenleberzellen (BRL 3A, ATCC CRL 1442); menschliche Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75); menschliche Leberzellen (Hep G2, HB 8065); Mausbrusttumor (MMT 060562, ATCC CC1 51) und TRI-Zellen (Mather, J.P. et al., "Annals N.Y. Acad.Sci." 383: 44-68 (1982)).
Zur Konstruktion von geeigneten Vektoren, die die gewünschten Kodierungs- und Steuersequenzen enthalten, werden Standardligationstechniken eingesetzt. Isolierte Plasmide oder DNA-Fragmente werden in der zur Bildung der erforderlichen Plasmide gewünschten Form gespalten, zugeschnitten und erneut ligiert.
Zur Analyse zwecks Bestätigung der korrekten Sequenzen in den konstruierten Plasmiden werden die Ligationsmischungen verwendet, um E.coli K12-Stamm 294 (ATCC 31.446) oder einen anderen geeigneten Wirt zu transformieren. Erfolgreiche Transformanten werden durch Ampicillin-, Tetracyclin- oder andere antibiotische Resistenz ausgewählt, oder wenn zweckmäßig unter Verwendung anderer Markierungen je nach der Art der Plasmidkonstruktion. Plasmide aus den Transformanten könen dann nach dem Verfahren von Clewell, D.B. et al., "Proc.Natl.Acad.Sci." (USA) 62: 1159 (1969) hergestellt werden, gegebenenfalls nach Chloramphenicolverstärkung (Clewell, D.B., "J.Bacteriol." 110: 667 (1972)). Die isolierte DNA wird durch Restriktion analysiert und/oder nach dem Didesoxyverfahren von Messing et al., "Nucleic Acids Res." 9: 309 (1981) oder nach dem Verfahren von Maxam et al., "Methods in Enzymology" 65: 499 (1980) sequenziert.
Wirtszellen können mit den Expressionsvektoren gemäß vorliegender Erfindung transformiert und in herkömmlichen Nährmedien kultiviert werden, die entsprechend modifiziert sind, um Promotoren zu induzieren, Transformanten auszuwählen oder Gene zu verstärken. Die Kulturbedingungen, wie z.B. Temperatur, pH-Wert und ähnliches, sind je nach Fall geeigneterweise die zuvor bei der zum Klonen und Exprimieren ausgewählten Wirtszelle eingesetzten, und werden dem Fachmann mit Durchschnittserfahrung klar sein.
BP53 wird vorzugsweise als ausgeschiedenes Protein aus dem Kulturmedium oder Periplasma gewonnen. Es kann auch aus Wirtszelllysaten gewonnen werden, wenn es direkt ohne ein Sekretionssignal exprimiert wird, wobei als ein erster Schritt das Kulturmedium oder Lysat zentrifugiert wird, um teilchenförmige Zellbruchstücke zu entfernen. BP53 kann auch von verunreinigenden löslichen Proteinen gereinigt werden, beispielsweise durch Adsorption auf einer Selektionssäule wie z.B. ConA und Eluierung davon, oder Adsorption auf einer antiBP53-Immunoaffinitätssäule und Eluierung davon. Alternativ dazu können andere Verfahren, wie z.B. Chromatographie auf Alkyl-Sepharose, Silika oder einem Anion- oder Kationaustauschharz, oder Gelelektrophorese eingesetzt werden, um das BP53 von Verunreinigungen abzutrennen. BP53-Varianten, bei denen ein Membrananker am BP53-Protein befestigt ist, können auf die gleiche Art wie BP53 wiedergewonnen werden.
Für Stabilisierungszwecke kann dem BP53, wenn notwendig, während der Reinigung eine kleinere Menge eines nichtionischen oberflächenaktiven Mittels, wie z.B. Tween oder Polyäthylenglykol, zugegeben werden. Ein Proteasehemmer wie z.B. PMSF kann ebenfalls nützlich sein, um den proteolytischen Abbau während der Reinigung zu hemmen, und es können Antibiotika enthalten sein, um das Wachstum fremder Verunreinigungen zu verhindern.
Ein Fachmann wird anerkennen, daß für natives BP53 geeignete Reinigungsverfahren Modifikation erfordern können, um Änderungen des Charakters von BP53 oder seiner Varianten bei Expression in rekombinanter Zellkultur Rechnung zu tragen. Beispielsweise wird ein in prokaryoter Zellkultur erzeugtes BP53-Polypeptid nicht an Con-A-Sepharose adsorbiert, weil es unglykosyliert ist. In diesem Fall sollten andere Verfahren, wie z.B. Gelelektrophorese, Ionenaustausch oder Immunoaffinitätsreinigung eingesetzt werden. Geeignete Reinigungsverfahren je nach den Charakteristiken des speziellen in Betracht stehenden rekombinanten BP53 werden dem durchschnittlich ausgebildeten Praktiker klar sein.
Zur Vereinfachung der Beispiele und Ansprüche wird auf bestimmte häufig vorkommende Begriffe und Verfahren mit Kurzbezeichnungen verwiesen.
Mit "Transfektion" ist die Aufnahme eines Expressionsvektors durch eine Wirtszelle gemeint, gleichgültig, ob tatsächlich irgendwelche Kodierungssequenzen exprimiert wurden oder nicht. Dem durchschnittlich ausgebildeten Fachmann sind zahlreiche Transfektionsverfahren bekannt, beispielsweise CaPO&sub4; und Elektroporation. Wenn prokaryote Zellen oder Zellen, die wesentliche Zellwandkonstruktionen enthalten, verwendet werden, ist das bevorzugte Transfektionsverfahren Kalziumbehandlung unter Verwendung von Kalziumchlorid, wie von Cohen, F.N. et al., "Proc.Natl.Acad.Sci." (USA) 69: 2110 (1972) beschrieben. Erfolgreiche Transfektion wird im allgemeinen anerkannt, wenn irgendein Anzeichen für die Arbeit dieses Vektors in der Wirtszelle auftritt.
"Transformation" bedeutet das Einbringen von DNA in einen Organismus, sodaß die DNA entweder als ein extrachromosomales Element oder durch chromosomale Integration replizierbar ist. Je nach der verwendeten Wirtszelle wird die Transformation unter Verwendung von Standardtechniken durchgeführt, die für solche Zellen angemessen sind. Die Kalziumbehandlung unter Einsatz von Kalziumchlorid, wie von Cohen, S.N. "Proc.Natl.Acad.Sci." (USA) 69: 2110 (1972) beschrieben, wird im allgemeinen für Prokaryoten oder andere Zellen verwendet, die beträchtliche Zellwandbarrieren enthalten. Bei Säugetierzellen ohne solche Zellwände wird das Kalziumphosphatausfällungsverfahren von Graham, F. und van der Eb, A., "Virology" 52: 456-457 (1978) vorgezogen. Allgemeine Aspekte von Säugetierzellwirtssystemtransformationen sind von Axel in der am 16. August 1983 ausgegebenen US-PS-4,399,216 beschrieben worden. Transformationen in Hefe werden typischerweise nach dem Verfahren von Van Solingen P., et al., "J.Bact." 130: 946 (1977) und Hsiao, C.L. et al., "Proc.Natl.Acad.Sci." (USA) 76: 3829 (1979) durchgeführt. Jedoch können auch andere Verfahren zum Einführen von DNA in Zellen, wie durch Kerninjektion oder durch Protoplastfusion, eingesetzt werden.
Wie hierin verwendet, bezieht sich die Formulierung "Hybridisieren unter strengen Bedingungen" zur Beschreibung bestimmter DNA-Sequenzen, die in den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung fallen, auf das Hybridisieren in 50% Formamid mit 5 x SSC bei einer Temperatur von 42ºC und das Waschen der Filter in 0,2 x SSC bei 60ºC (1 x SSC ist 0,15M NaCl, 0,015M Natriumzitrat). Diese Bedingungen sollen Sequenzen ausschließen, die mit der BP28-Sequenz hybridisieren.
"Stellengerichtete Mutagenese" ist eine Standardtechnik nach dem Stand der Technik und wird unter Einsatz eines synthetischen Oligonukleotidprimers durchgeführt, der abgesehen von begrenzter fehlender Übereinstimmung, die die gewünschte Mutation darstellt, zu einer einstrangigen Phagen-DNA komplementär ist, die mutiert werden soll. Kurz zusammengefaßt wird das synthetische Oligonukleotid als ein Primer verwendet, um die Synthese eines zum Phagen komplementären Stranges zu lenken, und die resultierende doppelstrangige DNA wird in ein phagentragendes Wirtsbakterium transformiert. Kulturen der transformierten Bakterien werden in Topagar plattiert, was die Plaquebildung aus einzelnen Zellen ermöglicht, die den Phagen beherbergen. Theoretisch enthalten 50% der neuen Plaques den Phagen, der als einen einzelnen Strang die mutierte Form aufweist; 50% haben die ursprüngliche Sequenz. Die Plaques werden mit Kinase behandeltem synthetischen Primer bei einer Temperatur hybridisiert, die die Hybridisierung einer exakten Entsprechung ermöglicht, bei der aber die fehlenden Übereinstimmungen mit dem ursprünglichen Strang ausreichen, um Hybridisierung zu verhindern. Plaques, die mit der Sonde hybridisieren, werden dann ausgewählt und kultiviert, und die DNA wird gewonnen.
"Operabel verbunden" bezieht sich auf die Juxtaposition, sodaß die normale Funktion der Bestandteile ausgeführt werden kann. Somit bezieht sich die Kodierungssequenz "operabel verbunden" mit Steuersequenzen auf eine Konfiguration, worin die Kodierungssequenz unter der Kontrolle dieser Sequenzen exprimiert werden kann und worin die miteinander verbundenen DNA-Sequenzen benachbart und, im Fall eines Sekretionsleaders, benachbart und in Lesephase vorliegen. Beispielsweise ist DNA für eine Präsequenz oder einen Sekretionsleader operabel mit DNA für ein Polypeptid verbunden, wenn sie als ein Präprotein exprimiert ist, die an der Ausscheidung des Polypeptids beteiligt ist; ein Promotor oder Verstärker ist operabel mit einer Kodierungssequenz verbunden, wenn er die Transkription der Sequenz beeinflußt; oder eine Ribosombindungsstelle ist operabel mit einer Kodierungssequenz verbunden, wenn sie so positioniert ist, daß sie die Translation erleichtert. Verbindung wird durch Ligation an zweckmäßigen Restriktionsstellen erreicht. Wenn keine solchen Stellen vorhanden sind, werden nach herkömmlicher Praxis synthetische Oligonukleotidadaptoren oder Linker verwendet.
"Steuersequenzen" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die zur Expression einer operabel verbundenen Kodierungssequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus notwendig sind. Zu diesen Steuersequenzen, die für Prokaryote geeignet sind, gehören beispielsweise ein Promotor, wahlweise eine Operatorsequenz, eine Ribosombindende bzw. -bindungsstelle und möglicherweise andere bisher wenig erforschte Sequenzen. Es ist bekannt, daß bei eukaryoten Zellen Promotoren, Polyadenylierungssignale und Verstärker verwendet werden.
"Expressionsystem" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die eine gewünschte Kodierungssequenz und Steuersequenzen in operabler Verbindung enthalten, sodaß mit diesen Sequenzen transformierten Wirte zur Produktion der kodierten Proteine fähig sind. Um Transformation zu bewirken, kann das Expressionssystem auf einem Vektor enthalten sein; die relevante DNA kann dann jedoch auch in das Wirtschromosom integriert sein.
Wie hierin verwendet, werden "Zelle", "Zellinie" und "Zellkultur" untereinander austauschbar verwendet, und alle diese Bezeichnungen umfassen die Nachkommenschaft. Somit beinhaltet "Transformanten" oder "transformierte Zellen" die primäre Subjektzelle und davon abgeleitete Kulturen ungeachtet der Anzahl an Transfers. Es versteht sich auch, daß aufgrund absichtlicher oder unbeabsichtigter Mutationen möglicherweise nicht die gesamte Nachkommenschaft vollkommen identisch ist, was den DNA-Gehalt betrifft. Mutante Nachkommenschaft, die die gleiche Funktionalität aufweist, bezüglich der in der ursprünglich transformierten Zelle gescreent wurde, ist enthalten. Wo bestimmte Bezeichnungen beabsichtigt sind, geht das aus dem Zusammenhang hervor.
"Plasmide" sind mit einem kleinen p gefolgt von einer alphanumerischen Bezeichnung, bezeichnet. Die Ausgangsplasmide gemäß vorliegender Erfindung sind im Handel erhältlich, sind uneingeschränkt für die Öffentlichkeit verfügbar oder können nach veröffentlichten Verfahren aus solchen verfügbaren Plasmiden konstruiert werden. Außerdem sind zu denk beschriebenen äquivalente Plasmide nach dem Stand der Technik bekannt und werden dem durchschnittlich ausgebildeten Fachmann klar sein.
"Digestion" von DNA bezieht sich auf die katalytische Spaltung der DNA mit einem Restriktionsenzym, das nur an bestimmten Sequenzen in der DNA wirkt. Die verschiedenen gemäß vorliegender Erfindung verwendeten Restriktionsenzyme sind im Handel erhältlich, und ihre Reaktionsbedingungen, Cofaktoren und andere Anforderungen wurden angewendet, wie das dem gewöhnlich ausgebildeten Fachmann bekannt wäre, beispielsweise n-ach den Richtlinien des Herstellers. Für analytische Zwecke werden typischerweise 1 ug Plasmid oder DNA-Fragment mit etwa 2 Einheiten Enzym in etwa 20 ul Pufferlösung verwendet. Zum Zweck der Isolierung von DNA-Fragmenten zur Plasmidkonstruktion werden typischerweise 5 bis 50 ug DNA mit 20 bis 250 Einheiten Enzym in einem größeren Volumen digeriert. Geeignete Puffer und Substratmengen für spezielle Restriktionsenzyme werden vom Hersteller angegeben. Üblicherweise werden Inkubationszeiten von etwa 1 Stunde bei 37ºC angewendet, aber sie können entsprechend den Anweisungen des Lieferanten variieren. Nach der Digestion wird die Reaktionsmischung direkt auf einem Polyacrylamidgel elektrophoresiert, um das gewünschte Fragment zu isolieren.
"Dephosphorylierung" bezieht sich auf das Entfernen der terminalen 5'-Phosphate durch Behandlung mit bakterieller alkalischer Phosphatase (BAP). Dieses Verfahren verhindert, daß die beiden gespaltenen Restriktionsenden eines DNA-Fragments "zirkularisieren" oder eine geschlossene Schleife bilden, die das Einfügen eines anderen DNA-Fragments an der Restriktionsstelle behindern würde. Die Dephosphorylierung erfolgt mit herkömmlichen Verfahren und Reagenzien (T. Maniatis et al., 1982, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (New York: Cold Spring Harbor Laboratories, 1982), S. 133-134). Reaktionen unter Verwendung von BAP können in 50 mM Tris bei 68ºC durchgeführt werden, um die Aktivität jeglicher Exonukleasen zu unterdrücken, die in den Enzympräparaten vorhanden sein können. Die Umsetzungen können 1 Stunde lang durchgeführt werden. Nach der Reaktion kann das DNA-Fragment gewonnen werden, indem das Präparat mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Äthanol ausgefällt wird. Alternativ zur Dephosphorylierung kann das erneute Ligieren in Vektoren verhindert werden, die durch zusätzliche Restriktionsenzymdigestion der unerwünschten Fragmente doppelt digestiert worden sind.
Mit "Gewinnung" oder "Isolation" eines bestimmten DNA-Fragments aus einem Restriktionsdigest ist die Trennung des Digests auf Polyacrylamid oder Agarosegel durch Elektrophorese, Identifizierung des interessierenden Fragments durch Vergleich seiner Mobilität mit jener von Markierungs-DNA-Fragmenten mit bekanntem Molekulargewicht, Entfernung des das gewünschte Fragment enthaltenden Gelabschnittes und Trennung des Gels von DNA gemeint. Dieses Verfahren ist allgemein bekannt. Siehe beispielsweise R. Lawn et al. (1981) "Nucleic Acids Res." 9:6103-6114 und D. Goeddel et al. (1980) "Nucleic Acids Res." 8:4057.
"Southern-Analyse" ist ein Verfahren, mit dem das Vorhandensein von DNA-Sequenzen in einem Digest oder einer DNA-hältigen Zusammensetzung durch Hybridisierung mit einem bekannten, markierten Oligonukleotid oder DNA-Fragment bestätigt wird. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist mit Southern-Analysis, wenn nicht anders vorgesehen, die Trennung von Digesten auf 1%-Agarose, Denaturierung und Übertragung auf Nitrozellulose nach dem Verfahren von E. Southern (1975) "J.Mol.Biol." 98: 503-517 und Hybridisierung wie von T. Maniatis et al. (1978) "Cell" 15: 687-701 beschrieben, gemeint.
"Ligation" bezieht sich auf das Verfahren zur Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen zwei doppelstrangigen Nukleinsäurefragmenten (T. Maniatis et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, op cit., S. 146). Wenn nicht anders vorgesehen, kann Ligation unter Einsatz bekannter Puffer und Bedingungen mit 10 Einheiten T4-DNA-Ligase ("Ligase") pro 0,5 ug etwa äquimolarer Mengen der zu ligierenden DNA-Fragmente erreicht werden. Die Ligation mit "klebrigen Enden" wird üblicherweise bei 0ºC durchgeführt, wohingegen die Ligation mit "stumpfen Enden" im allgemeinen bei 14ºC durchgeführt wird.
"Füllen" oder "Abstumpfen" bezieht sich auf die Verfahren, bei denen das einstrangige Ende im Kohäsivterminus einer mit Restriktionsenzym gespaltenen Nukleinsäure in einen Doppelstrang umgewandelt wird. Das eliminiert den Kohäsivterminus und bildet ein stumpfes Ende. Dieses Verfahren ist ein vielseitiges Werkzeug zum Umwandeln eines geschnittenen Restriktionsendes, das kohäsiv sein kann, wobei aus den Enden durch nur einen oder wenige andere Restriktionsenzyme ein Terminus geschaffen werden kann, der mit irgendeiner stumpfschneidenden Restriktionsendonuklease oder anderem gefüllten Kohäsivterminus kompatibel ist. Typischerweise wird Abstumpfung durch das Inkubieren von 2-15 ug der Ziel-DNA in 10 mM MgCl&sub2;, 1 mM Dithiothreitol, 50 mM NaCl, 10 mM Tris (pH 7,5)-Puffer bei etwa 37ºC in Gegenwart von 8 Einheiten des Klenowfragments von DNA-Polymerase I und 250 uM eines jeden der vier Desoxynukleosidtriphosphate erreicht. Die Inkubation wird im allgemeinen nach 30 Min. abgeschlossen, und die Reaktionsmischung wird Phenol- und Chloroform-Extraktion und Äthanol ausfällung unterworfen.
Mit "Herstellung" von DNA aus Transformanten ist das Isolieren von Plasmid-DNA aus mikrobieller Kultur gemeint. Wenn nicht anders vorgesehen, kann das alkalische/SDS-Verfahren von Maniatis et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" op cit. S. 90, eingesetzt werden.
"Oligonukleotide" sind kurze, ein- oder doppelstrangige Polydesoxynukleotide, die nach bekannten Verfahren chemisch synthetisiert und dann auf Polyacrylamidgels gereinigt werden.
Es folgt eine Zusammenfassung dessen, wie BP53 auf rekombinantem Weg erhalten wurde:
1. Gereinigter BP53 aus menschlichem Plasma wurde teilweise sequenziert.
2. Eine Reihe von Oligonukleotidsonden, die eine einzelne Kodonwahl für jede Aminosäure darstellen, die dem aminoterminalen Abschnitt von BP53 und einer Reihe der internen Sequenzen von BP53 entspricht, wurde chemisch synthetisiert und mit ³²P markiert.
3. Zwei Erwachsenenleber-cDNA-Sammlungen wurden in αλgt10-Vektor konstruiert, von denen eine eine oligo(dT)-geprimte Sammlung und eine eine zufällig geprimte Sammlung war.
4. Jede Sammlung wurde mit drei Sondenpools gescreent. Jeder Sondenpool ergab von 300 bis 1000 Flecken mit variierender Intensität bei jeder Sammlung. 38 der Flecke wurden mit zwei der drei Sondenpools dupliziert; zwei Flecken traten dreifach in Erscheinung, beide von der oligo(dT)-geprimten Sammlung. Zwei der identifizierten Klone hybridisierten mit drei Sondenpools und mit einer vierten synthetisierten Sonde. Einige der Zweifach- und Dreifachklone wurden subgeklont und gemappt.
5. Einer der beiden Subklone, der mit allen vier Sondenpools hybridisierte, wurde sequenziert und die komplette DNA-Sequenz von BP53 ermittelt.
6. Die für BP53 kodierende cDNA mit voller Länge wurde in einem Plasmid konstruiert und repliziert. Es sollte erkannt werden, daß die Kenntnis der kompletten DNA-Sequenz in Fig. 3 es ermöglicht, extrem lange Sonden mit perfekter Homologie mit BP53-cDNA herzustellen, wodurch die Sondierung von cDNA oder genomischer Sammlungen von anderen Spezien beträchtlich vereinfacht und ihre Effizienz erhöht wurde und es ermöglicht wurde, auf BP53-Reinigung, Sequenzierung und die Herstellung von Sondenpools zu verzichten.
7. Für BP53 kodierende cDNA wurde aus dem Klonierungsplasmid herausgeschnitten und in ein Expressionsvehikel ligiert, das verwendet wurde, um eine geeignete Wirtszelle zu transformieren, die dann in einer Kultur gezüchtet wurde, um das gewünschte BP53 herzustellen.
8. Nach dem obigen Verfahren hergestelltes biologisch wirksames, reifes BP53 weist 264 Aminosäurereste auf, von denen 18 Cysteine sind.
Die folgenden Beispiele sollen lediglich die nunmehr bekannte beste Art der praktischen Durchführung der Erfindung veranschaulichen, aber die Erfindung ist nicht als auf sie beschränkt zu betrachten.

BEISPIEL I

Identifizierung von cDNA-Klonen die für BP53 kodieren und Klonierung von menschlichem Serum BP53

Für BP53 kodierende DNA kann durch chemische Synthese erhalten werden, wenn die vollständige DNA-Sequenz bekannt ist, durch das Screenen von Umkehrtranskripten von mRNA aus menschlicher Leber, oder durch das Screenen genomischer Sammlungen aus einer beliebigen Zelle. Da zum Zeitpunkt, zu dem diese Erfindung gemacht wurde, weder die vollständige Aminosäure- noch die DNA-Sequenz von BP53-Protein bekannt war, war die chemische Synthese der vollständigen DNA-Sequenz, die für BP53 kodiert, zu diesem Zeitpunkt nicht möglich.
Menschliches serumbindendes Protein BP53 wurde aus der von Commonwealth Serum Laboratories, Melbourne, Australien, erhaltenen Cohn Fraktion IV-Paste von menschlichem Plasma, wie von Martin und Baxter, "J.Biol.Chem." op. cit. beschrieben, gereinigt. Der gereinigtes BP53 darstellende einzelne HPLC-Peak wurde isoliert, und die aus diesem Material erhaltenen Aminosäuresequenzen werden in Tabelle 2 gezeigt.
Die erhaltene N-terminale 60-Aminosäuren-Sequenz entsprach - abgesehen von Position 5, wo zuvor ein Alaninrest gefunden worden war - der zuvor von Baxter und Martin, "Biochem.Biophys.Res.Comm." 147: 408-415 (1987) berichteten 15-Aminosäuren-Sequenz. Die vorliegende Sequenz ergab annähernd gleiche Ausbeuten an Alanin und Glycin, was darauf hinweist, daß das vorliegend isolierte Protein eine Mischung mit beiden Resten an dieser Position ist. Nachdem die N-terminale Sequenz aus 60 Resten vollständig war, wurde das auf dem Sequencerfilter verbleibende Protein mit Cyanogenbromid gespalten, wie von Gross und Witkup, "J.Am.Chem.Soc." 83: 1510-1511 (1961) beschrieben. Eine klare innere Sequenz wurde dann festgestellt (siehe Tabelle 2, CNBr).
Proteolytische Spaltung des Proteins mit Trypsin und Lysin-C, gefolgt von Isolierung des Peptids durch Umkehrphasenchromatographie, ergab eine einzigartige Sequenz für weitere neun innere Peptide und drei Mischsequenzen. Zur Trypsindigestion wurden 8,4 ug gereinigtes BP53 mit 0,5 ug Trypsin in 100 ul 10 mM Ammoniumbikarbonat, 10 mM Kalziumchlorid 24 Stunden lang bei 37ºC inkubiert. Zur Lysin-C-Peptidasedigestion wurden 6 ug gereinigtes BP53 mit 0,3 ug Lysin-C-Peptidase in 100 ul 10 mM Ammoniumbikarbonat, 0,1% SDS, 10 mM Dithiothreitol (DTT) 24 Stunden lang bei 37ºC inkubiert. Diese Fragmente wurden durch direktes Aufbringen der Digeste auf eine Synchropak 300 A C4-HPLC-Säule (2x 100 mm), gefolgt von Eluierung mit einem linearen Gradienten von 1 bis 70% Acetonitril oder 1-Propanol in 0,1% Trifluoressigsäure, getrennt. Diese Digestions- und RP-HPLC-Reinigungstechnik wird ausführlicher in Aggarwal et al., "J.Biol.Chem." 260: 2334-2344 (1985) beschrieben. Segmente der BP53-Aminosäuresequenz wurden unter Verwendung eines 470A-Gasphasensequenzers von Applied Biosystems erhalten, der mit einem 120A PTH-Aminosäureanalysator und einem Nelson 300 Datensystem ausgerüstet war, wie bei Henzel et al., "Chromatography" 404: 41-52 (1987) beschrieben. Tabelle 2 Aminosäuresequenz von BP53-Peptiden ungefähre anfängliche Ausbeute (pmoles) Position in der cDNA-Sequenz N-terminal Trypsin-Peptide Lysin-C-Peptide
Für die Aminosäuren werden Einzelbuchstabencodes verwendet, wobei ein nach dem Stand der Technik bekanntes Codierungssystem eingesetzt wird. X bezeichnet Reste, die nicht identifiziert werden konnten. Runde Klammern geben unsichere Reste an. Eckige Klammern geben Asn-Reste an, die keine Sequenz ergaben und daher glykosyliert werden können. Die Mischungssequenzen für T2-10-8, T2-20 und KC-20 wurden mit Hilfe der cDNA-Sequenz wieder gelöst.
Zwei menschliche Erwachsenenleber-cDNA-Sammlungen in einem λgt10-Vektor wurden verwendet, um nach Klonen von BP53 zu screenen. Bei einer handelte es sich um eine zufällig geprimte Sammlung, die wie von Leung et al., "Nature" 330: 537-543 (1987) beschrieben hergestellt wurde. Die andere, eine oligo(dT)-geprimte Menschenleber-cDNA-Sammlung wurde im allgemeinen aus Leber-RNA unter Verwendung eines Oligo(dT)-Primers mit einer Länge von 12 bis 18 Nukleotiden und AMV-Umkehrtranskriptase hergestellt. Nach der Behandlung des resultierenden RNA-DNA-Komplexes mit DNase-freier RNase-A, wurden sowohl das Klenowfragment von DNA-Polymerase I und zusätzlicher AMV-Umkehrtranskriptase verwendet, um den zweiten DNA-Strang unter Einsatz von nach dem Stand der Technik wohlbekannten Techniken zu synthetisieren. Die so hergestellte doppelstrangige cDNA (ds-cDNA) wurde mit S1-Nuklease digeriert und-mit dem Klenowfragment von DNA-Polymerase I behandelt. Die nun stumpfendige ds-cDNA wurde an ein phosphoryliertes 16-Nukleotidoligomer sowie an ein nicht-phosphoryliertes 20-Nukleotidoligomer ligiert, das Restriktionsstellen für SalI, SstI und XhoI und ein überhängendes EcoRI-Ende enthielt. Diese Oligomeren hatten die Sequenzen:
20-mer: 5'-AATTCTCGAGCTCGTCGACC
phosphoryliertes 16-mer: 5'-GGTCGACGAGCTCGAG
Dieses Ligationsprodukt wurde in die EcoRI-Stelle von λgt 10 eingesetzt, wie auf einem Anleitungsblatt beschrieben, das in einer im Handel erhältlichen DNA-Setpackung (Stratagene; San Diego, CA, Katalognr. GT-10) enthalten war, wobei das Verfahren auch von Maniatis et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" op. cit. beschrieben wird.
Es wurden 4 Pools von Oligonukleotidsonden synthetisiert, die eine Einzelkodonwahl für jede aus der N-terminalen Aminosäuresequenz und einer Anzahl der inneren Sequenzen (die sowohl den C-terminalen als auch den N-terminalen Bereichen entsprechen) darstellen. Diese synthetischen Oligomeren basierten auf den oben in Tabelle 2 gezeigten Aminosäuresequenzdaten. Diese Sonden sind gemeinsam mit ihrer Entsprechung zu den korrekten cDNA-Klonen in Fig. 1 dargestellt.
In Fig. 1 ist die obere Sequenz für jeden Satz die aus gereinigtem BP53 ermittelte Aminosäuresequenz. Die obere Nukleotidsequenz ist jene für die Oligonukleotidsonden (oibp.6,7,8,9 und 2) synthetisiert in Übereinstimmung mit Lathe, R., "J.Mol.Biol." 183: 1-12 (1985) basierend auf den Aminosäuresequenzdaten. Die mit BP53 markierte Sequenz ist die DNA-Sequenz der geklonten cDNA, und die untere Aminosäuresequenz ist die translatierte Sequenz von BP53. Die Punkte zeigen DNA-Sequenzübereinstimmungen zwischen den Sonden- und cDNA-Sequenzen an.
Pool A ist ein Pool aus drei überlappenden Oligonukleotiden, oibp 6.1, 6.2 und 6.3, die eine Länge von 69, 69 bzw. 70 Nukleotiden aufweisen. Die Oligonukleotide basieren auf einer BP53-Sequenz mit 60 Aminosäuren, die aus mehreren überlappenden tryptischen, Lysin-C- und CNBr-Fragmenten besteht, wie in Tabelle 2 gezeigt. Die Anordnung dieser Fragmente wird über der oberen Aminosäuresequenz gezeigt. Die Überlappung aus zwei Aminosäuren (Y,K) des letzten der Fragmente, T3-14, erwies sich als unkorrekt, und dieses Peptid befindet sich tatsächlich anderswo im Protein. Daher wird eine zweite untere Sequenz unter den Aminosäuren 41-60 gezeigt.
Pool B ist ein Pool aus zwei Oligonukleotiden, oibp.7 und 8, die eine Länge von 45 bzw. 36 Nukleotiden aufweisen.
Pool C ist ein Pool aus drei überlappenden Oligonukleotiden, oibp.9.1, 9.2 und 9.3, die eine Länge von 63, 63 bzw. 64 Nukleotiden aufweisen.
Pool D besteht aus einem einzelnen Oligonukleotid, oibp.2, das eine Länge von 60 Nukleotiden aufweist.
Diese neu synthetisierten Oligomeren wurden mit ³²P markiert, und die drei Pools A, B und C wurden verwendet, um die oben beschriebenen cDNA-Sammlungen aus menschlicher Leber zu screenen.
600 000 Klone der oligo(dT)-geprimten Sammlung und 600 000 Klone der zufällig geprimten cDNA-Sammlung aus menschlicher Leber wurden mit den drei Pools der Oligonukleotidsonden dreifach gescreent. Dreifache Nitrozellulosefilter wurden mit den Pools von ³²P-endmarkierten Sonden hybridisiert. Die Hybridisierung erfolgte in einem Puffer, der 20% Formamid, 10% Dextransulfat, 5 x SSC, 50 mM Natriumphosphat (pH 6,5), 5 x Denhardt-Lösung, 2 mM Natriumpyrophosphat, 0,1% SDS und 0,04 mg/ml gekochte, beschallte Lachssperma-DNA enthielt. Die Filter wurden bei 42ºC über Nacht hybridisiert. Nach der Hybridisierung wurden die Filter bei 37ºC zweimal zwei Stunden lang in 1 x SSC gewaschen, wie von Maniatis et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" op.cit., beschrieben.
Jedes der Pools A, B und C ergab 300-1000 hybridisierte Positiva mit variierender Intensität bei jeder Sammlung. Bei zwei der drei Pools wurden 38 Hybridisierungsduplikatpositiva beobachtet. Bei der oligo(dT)-geprimten Sammlung wurden zwei Hybridisierungsdreifachpositiva beobachtet, die mit allen vier Pools hybridisierten. Eine Anzahl dieser Zweifach- und Dreifachklone wurde plaquegereinigt und in pUC118(Vieira und Messing, op.cit.)-Vektoren zur DNA-Sequenzierung durch Didesoxykettentermination subgeklont, wie von Messing et al., "Nucleic Acids Res." 9: 309-321 (1981) beschrieben. Einige der Klone wurden gemappt, und durch sowohl Restriktionsmapping als auch Sequenzanalyse wurde gezeigt, daß ein als ibp.118 bezeichneter Klon BP53 enthielt (Fig. 2). In diesem Klon enthalten waren die Kodierungs- und 3'-untranslatierten Bereiche von BP53, wie in Fig. 3 dargestellt.

BEISPIEL II

DNA-Sequenz von BP53-cDNA

Die vollständige Nukleotidsequenz des BP53-cDNA-Klons wird in Fig. 3 gezeigt. Der sequenzierte Klon enthält einen einzelnen langen offenen Leseraster mit 873 bp, der mit einem Methioninrest beginnt. Alle 18 der aminoterminalen und inneren Sequenzen, die aus dem gereinigten Protein ermittelt wurden, sind in diesem Leseraster vorhanden, und tatsächlich sind etwa 75% der Proteinsequenz in den in Tabelle 2 aufgeführten Peptiden repräsentiert. Die aus dem gereinigten Protein ermittelten Aminosäuresequenzen stimmen genau mit der abgeleiteten Aminosäuresequenz von BP53 basierend auf dem cDNA-Klon überein, mit Ausnahme einiger Reste, die unsicher waren oder nicht zugeordnet werden konnten (Tabelle 2). Der aminoterminalen Sequenz von BP53 geht eine Sequenz mit 27 Aminosäuren voran, die mit einem Methionin beginnt. Die Sequenz enthält einen hydrophoben Kern aus 14 Aminosäuren, die von geladenen Resten flankiert werden, die eine Ausscheidungssignalsequenz anzeigen, wie nach Perlman und Halvorson, "J.Mol.Biol." 167: 309 (1983). Das dritte Nukleotid 5' vom vermeintlichen Initiierungs-ATG ist ein Purin, wie aufgrund von Translationsinitationskonsenssequenzen erwartet (siehe Kozak, "Nucl.Acids Res." 12: 857-872 (1984)). Der offene Leseraster ist nahe dem 5'-Ende einer etwa 2500 bp umfassenden Messenger-RNA enthalten, die einen 3'-untranslatierten Bereich mit 1500 bp enthält. Drei der isolierten BP-53-Klone (einschließlich ibp.118) enthalten poly(A)-Sequenzen an ihren 3'-Enden, denen ein AAATAAA-poly(A)-Additionssignal vorangeht.
Die von den cDNA-Klonen abgeleitete reife BP53-Sequenz mit voller Länge umfaßt 264 Reste, von denen 18 Cysteine sind, was anzeigt, daß das Protein cysteinreich ist. Die Cysteinreste sind mit 12 nahe dem N-Terminus und nahe dem C-Terminus zusammengeballt (siehe Fig.2). Das translatierte Molekulargewicht der Sequenz beträgt 28,7 kD, wesentlich weniger als das durch reduziertes SDS-PAGE ermittelte Molekulargewicht von 43 kD. Vermutlich ist ein Großteil der oder die gesamte Molekulargewichtsdiskrepanz auf Glykosylierung zurückzuführen. Das native Protein bindet das Lectin Concanavalin A (Martin und Baxter, "J.Biol.Chem." op.cit.), und die Aminosäuresequenz enthält drei potentielle N-verbundene Glykosylierungsstellen (NXS oder T) sowie zwei Anhäufungen von Serin- und Threoninresten (Fig. 2), die auch für O-verbundene Glykosylierung verwendet werden könnten (wie bei Russell et al., "Cell", 37: 577-585 (1984) vorgeschlagen). Das Fehlen eines Asparaginsignals an den Aminosäuren 109 und 172 in den Aminosäuresequenzen der Peptide T15-3 und T3-14 (Tabelle 2) weist darauf hin, daß zumindest zwei der drei potentiellen N-verbundenen Glykosylierungsstellen verwendet werden.
Die Aminosäuresequenz von BP53 ist der veröffentlichten Sequenz für ein von Ratten-BRL-3A-Zellen produziertes IGF-bindendes bzw. -Bindungsprotein ähnlich (siehe Lyons und Smith, "Mol.Cell.Endo." 45: 263-270 (1986) und Mottola et al., "J.Biol.Chem." 261:11180-11188 (1986)). Der Vergleich erfolgt nachstehend, wobei die Sternchen anzeigen, wo Sequenzhomologie auftritt: BP53 Rat BRL-3A protein
Von den 34 für das rattenbindende bzw. -bindungsprotein sequenzierten Aminosäuren stimmen 21 mit der Sequenz von menschlichem BP53 überein. Es wird angenommen, daß das Rattenprotein das Homolog von BP28 ist, ein menschliches IGF-bindendes bzw. -Bindungsprotein, das sich antigenisch und metabolisch von BP53 unterscheidet (siehe Baxter et al., "J.Clin.Endo. and Metabol." op.cit., und Baxter und Martin, "Biochem.Biophys.Res.Comm." op.cit.). Computergestützte Überprüfungen mehrerer Proteinsequenz-Datenbasen (Protein Identification Resource, National Biomedical Research Foundation, Georgetown Univ. Med. Center, Washington D.C. 20007 und GenBank, Bolt, Beranek and Newman, Inc., Cambridge, MA 02231) zeigen keine klare Ähnlichkeit zu irgendwelchen anderen bekannten Proteinen. Insbesondere wird keine Ähnlichkeit mit den IGF-I- und IGF-II-rezeptorbindenden bzw. -Bindungsdomänen festgestellt. Das steht im Gegensatz zu neueren Arbeiten mit dem Wachstumshormonrezeptor, wo gezeigt worden ist, daß die extrazellulare hormonbindende bzw. -bindungsdomäne des Rezeptors mit einem zirkulierenden wachstumshormonbindenden bzw. -bindungsprotein identisch ist (Leung et al., "Nature", 330: 537-543 (1987)).

BEISPIEL III

Expression von menschlichem BP53

Der endgültige Expressionsvektor, pRK5.ibpl.1 wurde, wie in Fig. 9 gezeigt, aus pibp.118.1 und pRK5 konstruiert. Die Konstruktion eines jeden dieser Plasmide und des endgültigen Plasmids wird nachstehend im Detail beschrieben.

A. Konstruktion von pibp.118.1

Die menschliche BP53-Protein-cDNA in voller Länge ist im Klon λibp.118 enthalten. Diese cDNA-Einfügung wurde durch EcoRI-Digestion von λibp.118, Isolation durch Agarosegelelektrophorese des EcoRI-Fragments mit 2585 bp und Ligation unter Verwendung von T4-Ligase dieses Fragments in EcoRI-digeriertes pUC118 subgeklont, was Plasmid pibp.118.1 ergab (Fig. 9).

B. Konstruktion von pRK5

B.1. Konstruktion von pF8CIS

Die anfängliche dreiteilige Konstruktion des Ausgangsplasmids pF8CIS wird nachstehend beschrieben und in Fig. 4 gezeigt.
1) Der Ampicillinresistenzmarker und Replikationsursprung des endgültigen Vektors wurden vom Ausgangsplasmid pUC13pML, einer Variante des Plasmids pML abgeleitet (Lusky, M. und Botchen, M., "Nature" 293: 79 [1981]). pUC13pML wurde konstruiert, indem der Polylinker von pUC13 (Vieira, J. und Messing, J. "Gene" 19:259 (1982) zu den EcoRI- und HindIII-Stellen von pML übertragen wurde. Ein zweites Ausgangsplasmid pUC8-CMV war die Quelle der CMV-Verstärker-, Promotor- und Spleißdonorsequenz. pUC8-CMV wurde konstruiert, indem etwa 800 Nukleotide für die -CMV-Verstärker-, Promotor- und Spleißdonorsequenz in die abgestumpften PstI- und SphI-Stellen von pUC8 eingefügt wurden. Vieira, J. und Messing, J., op.cit. Synthetische BamHI-HindIII-Linker (von New England Biolabs im Handel erhältlich) wurden an das kohäsive BamHI-Ende ligiert, wodurch eine HindIII-Stelle erzeugt wurde. Nach dieser Ligation wurde ein HindIII-HincII-Digest durchgeführt. Dieses Digest ergab ein Fragment mit etwa 800 bp, das die CMV-Verstärker-, Promotor- und Spleißdonorstelle enthielt. Nach der Gelisolierung wurde dieses 800 bp-Fragment an ein pUC13pML-Stück mit 2900 bp ligiert. Das für die Konstruktion von pF8CIS erforderliche Fragment wurde durch Digestion des obigen Zwischenplasmids mit SalI und HindIII erhalten. Dieses Stück mit 3123 bp enthielt die Resistenzmarkierung für Ampicillin, den Replikationsursprung von pUC13pML und die Steuersequenzen für den CMV, einschließlich der Verstärker-, Promotor- und Spleißdonorstelle.
2) Der Ig-variable Intron- und Spleißakzeptorsequenzbereich wurde unter Verwendung eines synthetischen Oligomers konstruiert, wie im mittleren Abschnitt von Fig. 4 gezeigt. Ein 99-mer und ein 30-mer wurden chemisch synthetisiert, sodaß sie die folgende Sequenz für die IgG-Intron- und Spleißakzeptorstelle aufwiesen (Bothwell et al., "Nature" 290:65-67 [1981]):
DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) füllte das synthetische Stück aus und erzeugte ein doppelstrangiges Fragment. Wartell, R.M. und W.S. Reznikoff, "Gene" 9: 307 (1980). Dem folgte ein doppeltes Digest von PstI und HindIII. Dieser synthetische Linker wurde an den PstI- und HindIII-Stellen in pUC13 (Veira und Messing, op.cit.) geklont. Die das synthetische Oligonukleotid mit der Markierung pUCIg.10 enthaltenden Klone wurden mit PstI digeriert. Diesem Fragment wurde unter Verwendung eines PstI-ClaI-Linkers eine ClaI-Stelle hinzugefügt. Nach der Digestion mit HindIII wurde ein Stück mit 118 bp, das einen Teil des Ig-Introns und des Ig-variablen Spleißakzeptorbereichs enthielt, gelisoliert.
3) Im dritten Teil des Konstruktionsschemas wurde das Hepatitisoberflächenantigen-3'-ende mit der Polyadenylierungsstelle und der Transkriptionsterminationsstelle des frühen Bereichs von SV40 ersetzt. Ein Vektor, pUC.SV40, der die SV40-Sequenzen enthielt, wurde an der von Vieira und Messing, op.cit. beschriebenen BamHI-Stelle in pUC8 eingefügt. pUC.SV40 wurde dann mit EcoRI und HpaI digeriert. Ein Fragment mit 143 bp, das die SV40-Polyadenylierungssequenz enthielt, wurde von diesem Digest gelisoliert. Zwei zusätzliche Fragmente wurden nach der Digestion von pSVE.8c1D gelisoliert. (EP-Veröffentlichungsnr. 160,457). Das durch EcoRI- und Clal-Digestion erzeugte Fragment mit 4,8 kb enthält die SV40-DHFR-Transkriptionseinheit, den Replikationsursprung von pML und die Ampicillinresistenzmarkierung. Das nach Digestion mit ClaI und HpaI erzeugte Fragment mit 7,5 kb enthält die cDNA für Faktor VIII. Eine dreiteilige Ligation ergab pSVE.8c24D. Dieses Zwischenplasmid wurde durch ClaI und SalI digeriert, was ein Fragment mit 9611 bp ergab, das die cDNA für Faktor VIII mit einer SV40-Poly A-Stelle, gefolgt von der SV40 DHFR-Transkriptionseinheit, enthielt.
Bei der abschließenden dreiteiligen Ligation, um pF8CIS zu ergeben, wurden verwendet: a) das SalI-HindIII-Fragment mit 3123 bp, das den Replikationsursprung enthielt, die Ampicillinresistenzmarkierung und die CMV-Verstärker-, Promotor- und Spleißdonorstelle; b) das HindIII-ClaI-Fragment mit 118 bp, das das Ig-Intron und die Spleißakzeptorstelle enthielt; und c) ein ClaI-SalI-Fragment mit 9611 bp, das die cDNA für Faktor VIII, die SV40-Polyadenylierungsstelle und die SV40-DHFR-Transkriptionseinheit enthielt.

B.2. Konstruktion von pCIS2.8c28D

pCIS2.8c28D umfaßt eine Untereinheit mit 90 kd von Faktor VIII, die an eine Untereinheit mit 73 kd von Faktor VIII angefügt ist. Die Untereinheit mit 90 kd umfaßt die Aminosäuren 1 bis 740, und die Unterheit mit 73 kd die Aminosäuren 1690 bis 2332. Dieses Konstrukt wurde durch eine dreiteilige Ligation der folgenden Fragmente hergestellt: a) das ClaI-SstII-Fragment mit 12617-bp von pF8CIS (isoliert von einem dam-Stamm und mit BAP behandelt); b) das SstII-PstI-Fragment mit 216 bp von pF8CIS; und c) ein kurzes synthetisches PstI-ClaI-Oligonukleotidfragment, das mit Kinase behandelt wurde (siehe Fig. 5, worin ein Sternchen das geänderte Nukleotid anzeigt).
Fig. 5 zeigt auch das Subklonen des BamHI-HindIII Fragments mit 408 bp und des BamHI-PstI-Fragments mit 416 bp von pSVEFVIIII (EP-Veröffentlichung Nr. 160,457), die die 5'- und 3'-DNA-Bereiche von Faktor VIII enthielten, die zur Herstellung von pCIS2.8c28D verschmolzen-werden mußten.
Fig. 6 zeigt die dreiteilige Ligation, die verwendet wurde, um den Fusionsbereich von pCIS2.8c28D zu konstruieren. Zwei verschiedene Fragmente, A und B, wurden in denselben pUC118 4 BamHI-PstI-BAP-Vektor geklont. Das Fragment A war das BamHI-HindIII-Fragment mit 408 bp von pUC408BH und das Fragment B war ein HindIII-PstI-Oligonukleotid. Das doppelstrangige Oligonukleotid wird in Fig. 6 gezeigt. Zwar gibt Fig. 6 die vollständige DNA-Sequenz an den terminalen Restriktionsstellen an, aber das tatsächliche Oligonukleotid umfaßt nicht die Basen, die durch die Linien an den Restriktionsstellen skizziert werden. Dieses Oligonukleotid wurde ohne Kinasebehandlung verwendet, um seine Polymerisation während der Ligation zu verhindern.
Nach der Ligation der Fragmente A und B in den Vektor, wie in Fig. 6 gezeigt, wurden die erwarteten Verbindungssequenzen durch DNA-Sequenzierung der Bereiche bestätigt, die die Nukleotide umfassen.
Das resultierende Plasmid, pCIS2.8c28D, wurde wie in Fig. 7 gezeigt mit einer vierteiligen Ligation konstruiert. Das Fusionsplasmid aus Fig. 6 wurde mit BamHI und PstI geschnitten und das Fragment mit 443 bp isoliert. Die verbleibenden drei Fragmente der vierteiligen Ligation waren: 1) ClaI-BamHI mit 1944 bp von pSVEFVIII (EP-Veröffentlichung Nr. 160,457); 2) ein BamHI-XbaI-Fragment mit 2202 bp von pSVEFVIII, das weiter teilweise mit Pstl digeriert wurde, und das PstI-XbaI-Fragment mit 1786 bp wurde isoliert, und 3) das XbaI-ClaI-BAP-Fragment mit 5828 bp von pCIS2.8c24D von Fig. 6. Die translatierte DNA-Sequenz der resultierenden Variante im exakten Fusionsverbindungsbereich von pCIS2.8c28D wurde ermittelt und korreliert mit der in Fig.6 gezeigten Sequenz.

B.3. Konstruktion von pRK5

Die Konstruktion von pRK5 wird in Fig. 8 dargestellt. Das Ausgangsplasmid zur Konstruktion von pRK5 war pCIS2.8c28D. Diese Basenzahlen in den Absätzen 1 bis 6 beziehen sich auf pCIS2.8c28D, wobei die Base 1 des ersten T der EcoRI-Stelle dem CMV-Promotor vorangeht. Der frühe Cytomegalovirus-Promotor und das Intron und der SV40-Ursprung und das polyA-Signal wurden auf getrennten Plasmiden angeordnet.
1. Der frühe Cytomegalovirus-Promotor wurde als ein EcoRI-Fragment von pCIS2.8c28D (9999-1201) in die EcoRI-Stelle des oben beschriebenen pUC118 kloniert. 12 Kolonien wurden ausgewählt und bezüglich Orientierung gescreent, bei der aus pUC118 hergestellte einstrangige DNA die Sequenzierung von der EcoRI-Stelle bei 1201 zur EcoRI-Stelle bei 9999 zulassen würde. Dieser Klon wurde mit pCMVE/P bezeichnet.
2. Einstrangige DNA wurde aus pCMVE/P hergestellt, um einen SP6 (Green, MR et al., "Cell" 32: 681-694 [1983])-Promotor durch stellengerichtete Mutagenese einzusetzen. Ein synthetisches 110-mer, das die Sequenzen von -69 bis +5 des SP6-Promotors enthielt (siehe "Nucleic Acids Res." 12: 7041 [1984], Figur 1) wurde gemeinsam mit 18 bp Fragmenten an beiden Enden des Oligomers verwendet, das den CMVE/P-Sequenzen entsprach. Mutagenese wurde nach Standardtechniken durchgeführt und unter Verwendung eines markierten 110-mers mit hoher und geringer Strenge gescreent. 6 potentielle Klone wurden ausgewählt und sequenziert. Ein positiver Klon wurde identifiziert und als pCMVE/PSP6 bezeichnet.
3. Der SP6-Promotor wurde überprüft und als wirksam gezeigt, indem beispielsweise SP6-RNA-Polymerase zugegeben wurde und nach RNA der geeigneten Größe gesucht wurde.
4. Ein Cla-NotI-Sma-Adapter wurde synthetisiert, sodaß er den Bereich von der ClaI-Stelle (912) zur SmaI-Stelle von pUC118 in pCMVE/P (Schritt 1) und pCMVE/PSP6 (Schritt 2) umfaßte. Dieser Adapter wurde in die ClaI-SmaI-Stelle von pUC118 ligiert und hinsichtlich der korrekten Klone gescreent. Der Linker wurde in beide sequenziert, und die Klone wurden als pCMVE/PSP6-L und pCMVE/P-L markiert.
5. pCMVE/PSP6-L wurde mit 5mal (bei Linker/pUC118-Verbindung) und HindIII (in pUC118) geschnitten. Ein HpaI (5573)-bis-HindIII (6136)-Fragment aus pSVORAAΔRI 11, wie unten beschrieben, wurde in SmaI-HindIII von pCMVE/PSP6-L eingefügt. Diese Ligation wurde gescreent, und ein Klon wurde isoliert und als pCMVE/PSP6-L-SVORAAΔRI bezeichnet.
a) Der SV40-Ursprung und das polyA-Signal wurde als das XmnI (5475) - HindIII (6136)-Fragment von pCIS2.8c28D isoliert und in die HindIII- bis 5mal-Stellen von pUC119 (beschrieben bei Vieira und Messing, op.cit.) geklont. Dieser Klon wurde als pSVORAA bezeichnet.
b) Die EcoRI-Stelle bei 5716 wurde durch teilweise Digestion mit EcoRI entfernt und durch Klenow aufgefüllt. Die durch Eigenligation nach dem Ausfüllen erhaltenen Kolonien wurden gescreent, und der korrekte Klon wurde isoliert und als pSVORAAΔRI 11 bezeichnet. Die gelöschte EcoRI-Stelle wurde durch Sequenzieren überprüft und erwies sich als korrekt.
c) Das HpaI(5573)- bis HindIII (6136)-Fragment von pSVORAAΔRI 11 wurde isoliert und in pCMVE/PSP6-L eingesetzt (siehe 4 oben).
6. pCMVE/PSP6-L-SVOrAAΔRI (Schritt 5) wurde mit EcoRI bei 9999 geschnitten, abgestumpft und eigenligiert. Ein Klon ohne eine EcoRI-Stelle wurde identifiziert und pRK benannt.
7. pRK wurde mit SmaI und BamHI geschnitten. Dies wurde mit Klenow ausgefüllt und erneut ligiert. Die Kolonien wurden gescreent. Ein positiver Klon wurde identifiziert und pRKΔBam/Sma3 benannt.
8. Die HindIII-Stelle von pRKDBam/Sma3 wurde unter Verwendung eines Konverters in eine HpaI-Stelle umgewandelt. (Ein Konverter ist ein DNA-Stück, das verwendet wird, um eine Restriktionsstelle in eine andere zu ändern. In diesem Fall wäre ein Ende komolementär zu einem klebrigen HindIII-Ende und das andere hätte eine Erkennungsstelle für HpaI). Ein positiver Klon wurde identifiziert und pRKΔBam/Sma, HIII-HpaI 1 benannt.
9. pRKΔBam/Sma, HIII-HpaI 1 wurde mit PstI und NotI geschnitten, und ein EcoRI-HindIII-Linker und ein HindIII-EcoRI-Linker wurden einligiert. Es wurden Klone für jeden Linker festgestellt. Es wurde jedoch auch festgestellt, daß zu viele der HpaI-Konverter eingegangen waren (zwei oder mehr Konverter erzeugen eine PvuII-Stelle). Daher mußten diese Klone mit HpaI geschnitten und selbstligiert werden.
10. RI-HIII-Kion 3 und HIII-RI-Klon 5 wurden mit HpaI geschnitten, verdünnt und selbstligiert. Positiva wurden identifiziert. Der RI-HIII-Klon wurde pRK5 benannt.

C. Konstruktion von pRK5.ibpl.1

Fig. 9 zeigt die Konstruktion von pRK5.ibp1.1. Ein EcoRI/SmaI-Fragment von pRK5 mit 4710 bp wurde isoliert. Nach der Isolation des pRK5-Fragments wurde ein PflMI/PvuII-Fragment mit 934 bp, das beinahe den gesamten BP53-Kodierungsbereich enthielt, aus pibp.118.1 isoliert. Dieses Fragment wurde erzeugt, indem zuerst pibp.118.1 mit BamHI (um ein benachbartes Fragment zu entfernen) und PvuII gespalten wurde, gefolgt von 6igestion mit PflMI. Die PvuII- und PflMI-Stellen unmittelbar 3' vom Kodierungsbereich überlappen, und so verhindert die Spaltung mit PvuII zuerst die darauffolgende Spaltung mit PflMI, wodurch ein stumpfes Ende am isolierten Fragment mit 934 bp zurückbleibt. Da die PflMI-Spaltung am 5'-Ende des Kodierungsbereichs das Ingangsetzungskodon ATG entfernt, wurde der 5'-Terminus unter Verwendung eines Oligonukleotids oibp.11 rekonstruiert, dessen Sequenz nachstehend angeführt ist. EcoRI PflMI
Die dreiteilige Ligation dieser Fragmente ergab den Expressionsvektor pRK5.ibpl .1.

D. Expression von menschlichem BP53

Mit Adenovirus Ela dn Elb (293s) transformierte menschliche Embryonierenzellen sind von Graham et al., "J.Gen.Virol." 36: 59-73 (1977) beschrieben worden. Diese Zellen und Affennierenzellen (COS-Zellen) wurden nach dem Kalziumphosphatverfahren von Gorman, in "DNA Cloning", Hrsg. D.M. Glover (IRC Press, 0xford, 1985), Band 2, S. 143-190, mit dem oben beschriebenen Expressionsvektor pRK5.ibpl.1 transfiziert (oder einem Steuerplasmid, das eine ausgeschiedene Form des von Leung et al., op.cit. beschriebenen menschlichen Wachstumshormonrezeptors exprimiert). Nach 24 Stunden wurden die Zellen für weitere 48stündige Inkubation in ein serumfreies Medium gewechselt. Dieses serumfreie Medium wurde dann bezüglich BP53 untersucht (Fig. 10).

BEISPIEL IV

Assays bezüglich BP53

Radioimmunoassay bezüglich BP53 (Fig. 10a) wurde durchgeführt, wie von Baxter und Martin J.Clin.Invest.", op.cit. beschrieben mit Antiseren R-7 (zusätzliche Blutabnahme vom gleichen Kaninchen, von dem Antiserum R1-4 stammte [Martin und Baxter (1985), op.cit.]) mit einer Endverdünnung 1:10.000 durchgeführt. Jedem Assay zugesetzte Radioaktivität 7633 cpm; nichtspezifischer Hintergrund 343 cpm; 100% spezifische Bindung 1711 cpm. Die Bindungs- und Bindungskompetitionsassays (Fig. 10b-10d) wurden durchgeführt, wie von Martin und Baxter, "J.Biol.Chem." op. cit. beschrieben. Freier und gebundener Ligand wurden durch Immunausfällung mit Antiserum R-7 mit Endverdünnung 1:300 getrennt. Die hinzugefügte Radioaktivität betrug etwa 14.500 cpm ¹²&sup5;I-IGF-I (200 Ci/g) oder 6300 cpm ¹²&sup5;I-IGF-II (80 Ci/g). Scatchard-Analyse wurde mit dem Computerprogramm LIGAND durchgeführt, wie von Munson und Rodbard, "Anal.Biochem." 107: 220-239 (1980) beschrieben. Die Scatchard-Daten für den vorübergehend exprimierten BP53 sind den Fig. 10c und 10d zu entnehmen.

BEISPIEL V

Bindungsproteinassay von IGF

Nach der folgenden Vorschrift kann BP53 verwendet werden, um anzugeben, ob IGF-I oder IGF-II, die zur Bindung an BP53 fähig sind, in einer Probe vorhanden ist. Dieses Assay könnte auf mehrere Arten durchgeführt werden. Beispielsweise könnte das BP53 an eine 96-Napf-Mikrotiterplatte gekoppelt werden, und Aliquote der Proben, die IGF-I oder IGF-II enthalten, könnten mit dem gebundenen BP53 in Gegenwart einer fixen Menge an authentischem IGF-I oder IGF-II inkubiert werden, wobei Biotin daran gekoppelt ist. Nach 4-6stündiger Inkubation werden die Lösungen entfernt und die Platten gewaschen, um ungebundenen IGF-I oder IGF-II zü entfernen. Die Zugabe von an Meerrettichperoxidase gekoppeltem Avidin und das Inkubieren bildet einen Komplex mit dem IGF-Biotin-Konjugat. Wieder werden die Platten gewaschen und HRP-Substrat zugegeben. Farbe entwickelt sich hauptsächlich in Näpfchen, die Proben ohne IGF enthalten. Während die Probe weiter inkubiert wird, bindet sich das Biotin-IGF-Konjugat in abnehmendem Ausmaß; somit verringert sich die Farbentwicklung. Das ergibt eine dosisabhängige Reaktion, die unter Verwendung von authentischem IGF-I oder IGF-II (wie angemessen) mit bekannten Konzentrationen geeicht werden könnte.
Dieser Assaytyp hat die Vorteile eines Radiorezeptorassays, einschließlich der Spezifität für aktiven Liganden, der zur Bindung an den Rezeptor fähig ist, und der Empfindlichkeit und Einfachheit eines ELISA-Antikörperassays, ohne die Nachteile der beiden (d.h. radioaktiver Tracer, Nichtspezifität für aktives Protein).

Pharmazeutische Zusammensetzungen

BP53 und, wenn gewünscht, IGF können nach bekannten Verfahren formuliert werdeh, um pharmazeutisch nützliche Zusammensetzungen herzustellen, worin BP53 (und wahlweise IGF) in Mischung mit einem pharmazeutisch verträglichen Trägervehikel kombiniert wird. Geeignete Vehikel und ihre Formulierungen, einschließlich anderer menschlicher Proteine, wie z.B. Serumalbumin, werden beispielsweise in "Remington's Pharmaceutical Sciences" von E.W. Martin beschrieben. Im allgemeinen kann BP53 in phosphatgepufferter Salzlösung gelagert oder in Gegenwart eines Exzipienten lyophilisiert werden, einschließlich Zuckeralkoholen, z.B. Mannit oder Sorbit; Monosacchariden, z.B. Glukose, Mannose, Galaktose oder Fruktose; Oligosacchariden wie z.B. Maltose, Laktose oder Saccharose; und Proteinen wie z.B. menschliches Serumalbumin.
Die vorangehenden Exzipienten können auch zur Stabilität von BP53 zur Inaktivierung oder Ausfällung bei wässeriger Lagerung beitragen, und können gemeinsam mit anderen Stabilisatoren verwendet werden, die an sich herkömmlich sind. Zu solchen Stabilisatoren gehören Chelatbildner, z.B. EDTA; Oxidationshemmer wie z.B. Ascorbat oder Dithiothreitol; Aminosäuren; und nichtionische oberflächenaktive Mittel wie z.B. Polyäthylenglykol oder Blockcopolymere aus Polyäthylen und Polypropylenglykol.
BP53 wird an Menschen oder Tiere verabreicht, um es zum Binden an zirkulierenden oder membrangebundenen IGF zu verwenden, der in vivo vorhanden ist, und möglicherweise die Halbwertszeit von IGF in vivo verlängert, wie oben beschrieben. Außerdem kann BP53 gemeinsam mit IGF, vorzugsweise IGF-I und/oder IGF-II verabreicht werden, um das Blutkreislaufsystem bei Säugetieren metabolisch zu beeinflussen. BP53 kann auch verwendet werden, um IGF-I oder IGF-II wirksamer an Gewebe abzugeben.
Therapeutische BP53-Zusammensetzungen enthalten eine therapeutisch wirksame Dosis an BP53 in einem pharmazeutisch verträglichen Träger. Die/der gewählte Dosis, Träger und Verabreichungsweg und -plan hängen, neben anderen Faktoren, voneinander und von der zu behandelnden Störung oder Affektion, der Krankengeschichte des Patienten und der Aktivität der ausgewählten BP53-Variante ab. Diese Faktoren lassen sich vom behandelnden Arzt im Verlauf der Therapie leicht bestimmen und überwachen. Eine typische Dosis liegt bei der Therapie am Menschen, je nach den obigen Faktoren, im Bereich von etwa 50 bis etwa 200 ug/kg, vorzugsweise 80-150 ug/kg. Wenn BP53 und IGF gemeinsam zu verabreichen sind, werden sie typischerweise in äquimolaren Mengen verabreicht, sodaß die molare IGF-Dosis in etwa der verabreichten molaren BP53-Dosis entspricht.
Der Träger zur parenteralen Verabreichung von BP53 ist eine sterile isotonische wässerige Lösung, beispielsweise Salzlösung zur Injektion oder 5%ige Dextrose. Diese Präparate werden auf intranasalem, subkutanem, intravenösem, intraperitonealem oder anderem herkömmlichen Verabreichungsweg injiziert oder infudiert.
BP53 kann auch in einer Trägerformulierung zur verzögerten Freisetzung bereitgestellt werden. Geeignete Beispiele umfassen halbdurchlässige Polymermatrizen in Form geformter Gegenstände, z.B. Zäpfchen oder Mikrokapseln. Implantierbare oder mikrokapselförmige Matrizen zur verzögerten Freisetzung umfassen Polylactide (US-PS-3,773,919, EP-58,481), Copolymere von L-Glutaminsäure und gamma-Äthyl-L-glutamat (U.Sidman et al, "Biopolymers" 22 (1): 547-556 (1983)), Poly(2-hydroxyäthylmethacrylat) (R. Langer et al., "J.Biomed.Mater.Res." 15: 167-277 (1981) und R. Langer, "Chem.Tech." 12: 98-105 (1982)), Äthylenvinylacetat (R.Langer et al., Id.) oder poly-D-(-)-3-Hydroxybuttersäure (EP 133,988A). BP53-Zusammensetzungen zur verzögerten Freisetzung umfassen auch liposomal eingeschlossenes BP53. Liposome, die BP53 enthalten, werden nach an sich bekannten Verfahren hergestellt: DE 3,218 121A, Epstein et al, "Proc.Nat'l.Acad.Sci." (USA) 82: 3688-3692 (1985); Hwang et al., "Proc.Nat'l.Acad.Sci. (USA), 77: 4030-4034 (1980); EP-52,322A; EP 36,676A; EP-88,046A; EP-143,949A; EP-142,641A; Japanische Patentanmeldung 83-118,008; US-PS 4,485,045 und US-PS-4,544,545; und EP-102,324A.

Claims

1. Isolierte DNA-Sequenz, die eine Sequenz umfaßt, die für bindendes bzw. Bindungsprotein BP53 für insulinähnlichen Wachstumsfaktor kodiert, worin die genannte DNA-Sequenz aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus

(a) der in Fig. 3 dargelegten DNA-Sequenz; und

(b) DNA-Sequenzen besteht, die unter strengen Bedingungen mit den in (a) definierten DNA-Sequenzen hybridisieren.

2. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, die weiters eine für insulinähnlichen Wachstumsfaktor (IGF) kodierende DNA-Sequenz umfaßt.

3. DNA-Sequenz nach Anspruch 2, worin der IGF IGF-I oder IGF-II ist.

4. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, worin das Protein ein menschliches Protein ist.

5. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, die weiters einen operabel mit der genannten DNA-Sequenz verbundenen Promotor umfaßt.

6. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, die weiters einen in einem einzelligen Organismus arbeitenden Replikationsursprung umfaßt.

7. Expressionsvektor, der die DNA-Sequenz nach Anspruch 1 operabel mit Steuersequenzen verbunden umfaßt, die von einem durch den Vektor transformierten Wirt erkannt werden.

8. Wirtszelle, transformiert mit dem Expressionsvektor nach Anspruch 7.

9. Wirtszelle nach Anspruch 8, worin die Zelle prokaryotisch ist und die Steuersequenz eine Signalsequenz zur Ausscheidung des Proteins außerhalb der Zelle umfaßt.

10. Wirtszelle nach Anspruch 8, die eukaryotisch ist.

11. Wirtszelle nach Anspruch 10, die eine Säugetierzelle ist.

12. Wirtszelle nach Anspruch 11, die eine menschliche Embryonierenzelle oder -COS-Zelle ist.

13. Sequenz nach Anspruch 1, die weiters einen für Signalsequenz kodierenden Bereich stromaufwärts der für Protein kodierenden Sequenz umfaßt.

14. Sequenz nach Anspruch 13, worin die Signalsequenz von Säugetierwirtszellen erkannt wird.

15. Sequenz nach Anspruch 13, worin die Signalsequenz von prokaryotischen oder Hefe-Wirtszellen erkannt wird.

16. Sequenz nach Anspruch 1, die weiters einen Bereich angrenzend an die für Protein kodierende Sequenz umfaßt, welcher Bereich für ein zu einem mit der genannten Sequenz transformierten Wirt exogenes Protein kodiert.

17. Sequenz nach Anspruch 16, worin das genannte exogene Protein dem bindenden Protein Immunogenität verleiht.

18. Sequenz nach Anspruch 16, worin das genannte exogene Protein von dem bindenden Protein abspaltbar ist.

19. Vektor nach Anspruch 7, der weiters eine für insulinähnlichen Wachstumsfaktor kodierende DNA-Sequenz umfaßt.

20. Wirtszelle, transformiert mit dem Expressionsvektor nach Anspruch 19.

21. Wirtszelle, die mit dem Expressionsvektor nach Anspruch 7 und mit einem Expressionsvektor transformiert ist, der die für insulinähnlichen Wachstumsfaktor kodierende DNA-Sequenz umfaßt, die operabel mit den von der genannten Wirtszelle erkannten Steuersequenzen verbunden ist.

22. Verfahren zur Herstellung von bindendem Protein BP53 für insulinähnlichen Wachstumsfaktor, welches Verfahren das Kultivieren der Zellen nach Anspruch 8 zum Exprimieren des Proteins in der Wirtszellkultur umfaßt.

23. Verfahren zur Herstellung von bindendem Protein BP53 für insulinähnlichen Wachstumsfaktor und von insulinähnlichem Wachstumsfaktor, welches Verfahren das Kultivieren der Zellen nach Anspruch 20 zum Exprimieren der Proteine in der Wirtszellkultur umfaßt.

24. Verfahren zur Herstellung von bindendem Protein BP53 für insulinähnlichen Wachstumsfaktor und von insulinähnlichem Wachstumsfaktor, welches Verfahren das Kultivieren der Zellen nach Anspruch 21 zum Exprimieren der Proteine in der Wirtszellkultur umfaßt.

25. Verfahren nach Anspruch 22, das weiters den Schritt der Gewinnung des Proteins aus der Wirtszellkultur umfaßt.

26. Bindendes Protein BP53 für insulinähnlichen Wachstumsfaktor, das nicht von assoziierter nativer Glykosylierung begleitet ist, das zumindest etwa 80% Homologie mit der Aminosäuresequenz des in Fig. 3 gezeigten reifen Proteins aufweist und das eine oder beide der biologischen Eigenschaften (a) des Bindens von insulinähnlichem Wachstumsfaktor (IGF) oder (b) des immunologischen Überkreuzreagierens mit einem Antikörper, der gegen zumindest ein Epitop des entsprechenden nativen bindenden Proteins gezüchtet worden ist, zeigt.

27. Protein nach Anspruch 26, das die Aminosäuresequenz des in Fig. 3 gezeigten reifen Proteins aufweist.

28. Protein nach Anspruch 26, das ein menschliches Protein ist.

29. Protein nach Anspruch 26, worin ein vorbestimmter Aminosäurerest auf dem Protein substituiert, eingesetzt oder gelöscht ist.

30. Pharmazeutische Zusammensetzung, die zur Bindung von insulinähnlichem Wachstumsfaktor nützlich ist und die eine therapeutisch wirksame Menge des Proteins nach Anspruch 26 oder 27 in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger umfaßt.

31. Pharmazeutische Zusammensetzung, die zur Stoffwechselregulierung nützlich ist und die therapeutisch wirksame Mengen des insulinähnlichen Wachstumsfaktors, des Proteins nach Anspruch 26 oder 27 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfaßt.

32. Zusammensetzung nach Anspruch 31, worin der insulinähnliche Wachstumsfaktor IGF-I oder IGF-II ist.

33. Zusammensetzung nach Anspruch 30, die isotonisch ist.

34. Zusammensetzung nach Anspruch 30, die steril gefiltert ist.

35. Sterile pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 31, worin der insulinähnliche Wachstumsfaktor und das bindende Protein in einem etwa äquimolaren Verhältnis vorhanden sind.

36. Diagnosezusammensetzung, die zum Bestimmen der Spiegel an insulinähnlichem Wachstumsfaktor in zirkulierendem menschlichem Plasma nützlich ist und das Protein nach Anspruch 26 oder 27 kovalent an eine nachweisbare Markierungsgruppe gebunden enthält.

37. Verfahren zur Herstellung von bindendem Protein BP53 für insulinähnlichen Wachstumsfaktor, welches das Kultivieren von Zellen umfaßt, die mit einer DNA transformiert sind, die für ein Protein mit zumindest etwa 80%iger Homologie mit der Aminosäuresequenz von in Fig. 3 dargestelltem reifem IGF-BP kodiert, und die eine oder beide der biologischen Eigenschaften (a) insulinähnlichen Wachstumsfaktor (IGF) zu binden oder (b) immunologisch mit einem gegen zumindest ein Epitop des entsprechenden nativen bindenden Proteins gezüchteten Antikörpers über Kreuz zu reagieren, aufweisen.

38. Verfahren nach Anspruch 37, worin die genannte DNA für ein Protein mit der Aminosäuresequenz von in Fig. 3 gezeigtem reifem IGF-BP53 kodiert.