DE3855536T2

DE3855536T2 - Rezeptoren für wachstumshormone

Info

Publication number: DE3855536T2
Application number: DE3855536T
Authority: DE
Inventors: R Hammonds; David Leungh; Steven Spencer; William Wood
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1987-06-12
Filing date: 1988-06-10
Publication date: 1997-02-27
Anticipated expiration: 2008-06-11
Also published as: WO1988009818A3; ATE142645T1; HK1008021A1; EP0366710B1; NZ224961A; JPH03500122A; CA1341382C; US5057417A; AU616672B2; EP0366710A1; WO1988009818A2; AU1986588A; DE3855536D1; JP2879079B2

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf Wachstumshormonrezeptoren und ein neues, Wachstumshormon bindendes Protein. Die Erfindung bezieht sich weiter auf die Synthese des Wachstumhormonrezeptors und des Wachstumshormon-Bindeproteins durch Rekombinationsmethoden.
Menschliches Wachstumshormon ("human growth hormon", hGH) ist ein lineares Polypeptid mit 191 Aminosäuren und enthält zwei Disulfidbrücken innerhalb der Kette. Der hauptsächliche biologische Effekt des hGH ist, Wachstum zu fördern. Die betroffenen Organsysteme umfassen das Skelett, Bindegewebe, Muskeln, und innere Organe wie Leber, Darm und Nieren. Das Wachstumshormon erzielt seine Wirkung durch Wechselwirkung mit speziellen Rezeptoren auf der Zellmembran. Die spezifische Bindung des Wachstumshormons wurde mit metabolischen Wirkungen in primären Kulturen von Adipozyten (Clemmons, D.R. et al., J. Clin. Invest. 106, 361-367 [1981]; Gause, I. et al., Endocrinology 112, 1559-66 [1983]), mit Entwicklungswirkungen in einer Fibroblastenzellinie (Murphy, L.J. et al., Endocrinology 113, 750-57 [1983]; Nixon, T. und Green, H.J., Cell. Physiol. 115, 291-96 [1983]), und mit Wachstumswirkungen in primären Kulturen von Chondrozyten (Eden, S. et al., Endocrinology 112, 1127-29 [1983]; Madsen, K. et al., Nature 304, 545-47 [1983]) korreliert.
Mehrere Rezeptoren wurden kloniert, z.B. EGF, Insulin und IL-2. (Siehe z.B. EP-A- 0.192.392; EP-A-0.128.733; und EP-A-0.162.699). Es wurde gezeigt, daß der Wachstumshormonrezeptor (GH-Rezeptor) ein integrales Membranprotein ist. Lektinrezeptor-Wechselwirkungen lassen weiters vermuten, daß Wachstumshormonrezeptoren eine Kohlenhydratkomponente enthalten, die mit der extrazellulären Domäne des Rezeptors in Verbindung mit der Wachstumshormon- Bindungsstelle assoziiert ist (Tsushima, T. et al., Biochem. J. 187, 479-92 [1980]). Analyse des Wachstumshormonrezeptors mittels Gelfilration zeigte, daß der mit Triton solubilisierte Rezeptor mit einem Mr von 200.000-300.000 eluiert (Waters, M.J. und Friesen, H.G., J. Biol. Chem. 254, 6815-25 [1979]). Es wurde vermutet, daß nach diesem Verfahren wahrscheinlich ein zu hohes Mr des Rezeptors bestimmt wurde, weil es den Anteil an rezeptorgebundenem Triton nicht einrechnet (Hughes, J. P. et al., Polypeptide Hormone Receptors, Posner, B. I. [Hrsg.] [Dekker, M., N.Y.]). Laut neuen Studien liegt das Mr des GH-Rezeptors im Bereich von 130.000-200.000 (Ratten- Hepatozyten, Donner, D., J. Biol. Chem. 258, 2736-43 [1983]; Ratten-Adipozyten, Carter-Su, C. et al., J. Biol. Chem., 259, 1099-104 [1984]; und IM-9-Lymphozyten, Hughes, J.P. et al., Endocrinology 112, 1980-85 [1983]). Bei SDS-Gelelektrophorese unter reduzierenden Bedingungen lag das Mr im Bereich von 108.000 bis 112.000. In Abwesenheit von Reduktionsmitteln wanderte der Wachstumshormonrezeptor, der auf Rattenhepatozyten identifiziert worden war, gleich wie einer mit höherem Mr, was vermuten läßt, daß dieser GH-Rezeptor über Disulfidbrücken zwischen den Ketten mit anderen Rezeptoren oder Nichtrezeptorproteinen wechselwirkt (Donner, D., siehe oben).
Im Gegensatz zu dem relativ hohen Mr, das für menschliche und Ratten-GH-Rezeptoren in Quervernetzungs-Studien gefunden wurde, wurden für den Kaninchen-GH-Rezeptor in Mikrosom-Membranen Mr im Bereich von 50.000-67.000 erhalten (Tsushima, T. et al., FEBS Lett. 147, 49-53 [1982]). Weitere Daten lassen vermuten, daß der GH- Rezeptor in intrazellulären Membranen (Mikrosom-Membranen) aus nicht-kovalent gebundenen Untereinheiten zusammengesetzt ist, wogegen der Rezeptor an der Zelloberfläche (Plasmamembranen) vor allem aus disulfidverbundenen Untereinheiten aufgebaut ist.
Mehrere verschiedene Hinweise lassen das Vorhandensein von zwei Rezeptoren, die fähig sind, hGH zu binden, in Kaninchenlebermembranen vermuten. Ein Hinweis dafür sind Unterschiede in der Bindung, die zu beobachten sind, wenn zwei oder mehrere GH-Tracer von verschiedenen Spezies verwendet werden, um die GH-Rezeptoren im gleichen Kaninchenleberpräparat zu charakterisieren (Hughes, J. P. et al., Endocrinology 113, 1904-6 [1983]. Unterstützende Hinweise für das Vorhandensein mehrerer Typen von Rezeptoren wurden durch Studien erhalten, welche die Bindungscharakteristika/biologischen Wirkungen der gespaltenen Formen des Wachstumshormons untersuchten (Maciag, T. et al., J. Biol. Chem. 255, 6064-70, [1980]). Verdrängungsstudien unter Einsatz verschiedener Arten von Wachstumshormonen (von Ratten, Schweinen, Menschen, Rindern) und von Prolactin lassen das Vorhandensein von zwei Wachstumshormonrezeptoren vermuten. Beispielsweise bindet der somatogene Rezeptor aus der Leber markiertes GH, wobei dieser Marker durch nicht markiertes GH aber nicht durch Prolactin ersetzt werden kann. Es wurde auch beobachtet, daß Rinder- oder Eiprolactin rezeptorgebundenes hGH verdrängen kann (Waters, M. J. und Friesen, H.G., J. Biol. Chem. 254, 6815-25 [1979]). Auch andere Forscher beobachteten eine teilweise Verdrängung sowohl durch Eiprolactin als auch durch Rinderwachstumshormon, was das Vorhandensein von bestimmten somatogenen und lactogenen Rezeptoren vermuten läßt, die beide hGH binden. Die Leber dürfte zwei Arten von GH-Rezeptoren enthalten, eine davon mit hoher Affinität für Kaninchen-GH und relativ niedriger Affinität für hGH (Hughes, J. P. et al., Endocrinology 105, 414-20 [1974]). Andere lassen den Schluß zu, daß die Leber drei Rezeptoren für Hormone aus der Familie der Wachstumshormone/Prolactin enthält, einen für Wachstumshormon spezifischen, einen für Prolactin spezifischen und einen, der nicht zwischen den beiden unterscheidet (Wallis, M. et al., "Investigation of Membrane-Located Receptors", Reid, E. et al. [Hrsg.] [Plenum Press, N.Y., 1984]).
Vor kurzem sammelten sich Daten an, welche die Anwesenheit von Bindeprotein für Wachstumshormon (Wachstumshormon-Bindeprotein) im Serum sowohl von Menschen als auch von Kaninchen vermuten lassen (Ymer, S.I. & Herrington, A.C., Mol. Cell. Endocrinol. 41, 153-161, [1985]; Herrington, A.C. et al., Proc. Annu. Meet. Endocr. Soc. Australia 28th. Adelaide, abstr. 77 [1985]). Unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern gegen den vermuteten Wachstumshormonrezeptor in Ratten- und Kaninchenleber wurde eine enge antigene und mögliche ontogene Beziehung zwischen Membran"rezeptoren" und den Zytosol-Bindeproteinen, die in der Leber gefunden wurden, beobachtet (Barnard, R. & Waters, M.J., J. Receptor Res. [1986]). Weitere Arbeiten lassen vermuten, daß diese Zytosol-Bindeproteine neu synthetisierte Serumbindeproteine sein könnten (Barnard, R. & Waters, M.J., Biochem. J. 237, 885- 892 [1986]). Für das Wachstumshormon-Bindeprotein, das durch hGH- Affinitätschromatographie teilweise gereinigt wurde, wurde ein Molekulargewicht von 74.000-85.000 beobachtet, was einen Unterschied zum Hauptserumprotein Humanalbumin darstellte (Ymer, S.I. und Herrington, A.C., Mol. Cell. Endocr. 41, 153- 61, [1985]).
Viele Wachstumseffekte werden durch Induktion von Somatomedinen bewirkt, die in der Leber produziert werden. Wachstumshormon bindet sich an spezifische Rezeptoren auf der Zellmembran und stimuliert die Erzeugung von Somatomedin. Die grundlegenden metabolischen Effekte des "Wachstumshormons (und der Somatomedine) umfassen die Stimulation der Nukleinsäure und Proteinsynthese, die Induktion einer positiven Stickstoffbilanz, die Stimulation der Lipolyse und ein Absinken der Harnstoffausscheidung. Eine als Laron-Zwergwuchs bekannte Art des Zwergwuchses tritt bei Patienten auf, bei denen Wachstumshormon vorhanden ist, wo sich jedoch zeigt, daß der Rezeptor beschädigt oder nicht vorhanden ist, sodaß es zu keiner Somatomedinbildung kommt (Fishet et al., Isr. J. Med. Sci. 20, 8-11 [1984] und Golde et al., N. Engl. J. Med. 303, 1156-1159 [1980]).
Hughes et al., "Human Growth Hormon" (1986) (Raiti Salvatore, Hrsg.) 455-461, berichteten über frühere Versuche, Wachstumshormon zu reinigen.
Herington et al., Biochem. and Biophys. Res. Comm. 139(1), 150-155 (1986), beschrieben die Identifikation eines spezifischen Bindeproteins für hGH in menschlichem Serum, dieses wurde jedoch nicht isoliert oder charakterisiert.
Obwohl auf diesem Gebiet versucht wurde, die vermeintlichen Wachstumsrezeptoren und Bindeproteine zu reinigen, waren diese Präparate nicht genügend rein, um eine Bestimmung der Sequenzen des Wachstumshormonrezeptors und des Bindeproteins durchzuführen. Diese Erfindung bestimmte zum ersten Mal die genaue Identität des Wachstumshormonrezeptors und die Ontogenese und Identität des Wachstumshormon- Bindeproteins. Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, den Wachstumshormonrezeptor und das Bindeprotein sowie dafür kodierende DNA zu reinigen und brauchbare Mengen eines jeden durch rekombinante DNA-Techniken zu produzieren. Dieses und andere Ziele dieser Erfindung gehen aus der gesamten Beschreibung hervor.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Ziele dieser Erfindung wurden durch ein Verfahren erreicht, das folgendes umfaßt: das Identifizieren und Klonieren jenes Gens, das für den Säugetierwachstumshormonrezeptor oder das Bindeprotein kodiert; den Einbau dieses Gens in einen rekombinanten DNA-Vektor; das Transformieren eines geeigneten Wirts mit jenem Vektor, der dieses Gen enthält; das Exprimieren des Säugetierwachstumshormonrezeptors oder Bindeproteins in einem derartigen Wirt; und die Gewinnung des erzeugten Säugetierwachstumshormonrezeptors oder Bindeproteins. In ähnlicher Weise ermöglicht die vorliegende Erfindung die Produktion von menschlichem Wachstumshormonrezeptor oder Bindeprotein und/oder Derivaten davon durch rekombinante Techniken, sowie Produkte und Verfahren, die sich mit derartigen menschlichen Wachstumshormonrezeptoren und Bindeproteinen befassen, bereitzustellen.
Daher wird gemäß vorliegender Erfindung in einem ersten Aspekt Wachstumshormonrezeptor mit einer spezifischen Aktivität von mindestens etwa 1000 pMol/mg bis etwa 7000 pMol/mg bereitgestellt, bestehend aus einer Aminosäuresequenz, die einer der in Fig. 8a und 8b gezeigten Sequenzen entspricht, sowie weiters durch Substitution, Insertion oder Deletion erzeugte Varianten davon, im speziellen Varianten, welche die Fähigkeit besitzen, sich selektiv an Wachstumshormon zu binden.
In einem zweiten Aspekt wird gemäß vorliegender Erfindung Wachstumshormon- Bindeprotein mit einer spezifischen Aktivität von mindestens 10.000 pMol/mg bereitgestellt, umfassend eine Aminosäuresequenz, die einer in Fig. 8a oder 8b gezeigten Sequenz entspricht, wobei diese aus 190-250 Aminosäureresten beginnend am N-Terminus des Wachstumshormonrezeptors besteht, sowie weiters durch Substitution, Insertion oder Deletion erzeugte Varianten davon, im speziellen Varianten, welche die Fähigkeit besitzen, sich selektiv an Wachstumshormon zu binden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Produktion von Säugetierwachstumshormonrezeptoren und Bindeproteinen durch rekombinante DNA- Verfahren, umfassend: 1) die Isolation, Reinigung und Strukturidentifizierung des Wachstumshormonrezeptors und des Bindeproteins; 2) die Aufklärung und Identifizierung der gesamten DNA-Sequenz des Wachstumshormonrezeptors und dessen flankierender 5'- und 3'-Bereiche, sowie jener DNA, die für das Bindeprotein kodiert; 3) die Konstruktion von Klonier- und Expressionsvehikeln, welche diese DNA- Sequenz, die die Expression des Säugetierrezeptors oder Bindeproteins ermöglichen, umfassen, sowie Methionyl-, Fusions- oder N-terminale Konjugate davon; und 4) lebensfähige Zellkulturen, die durch ihre Eigenschaft, derartige Vehikel zu enthalten, und durch die Fähigkeit, Säugetierwachstumshormonrezeptor oder Bindeprotein zu produzieren, genetisch verändert sind. Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung sind neue Verbindungen, einschließlich von Desoxyribonukleotiden und Ribonukleotiden, die zur Hybridisierung mit DNA, die für den Wachstumshormonrezeptor oder das Bindeprotein kodiert, verwendet werden.
Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung ist Wachstumshormonrezeptor oder Bindeprotein, die wie hierin definiert im wesentlichen rein sind, über die spezifischen Aktivitäten, die vor dieser Erfindung erhalten wurden, hinausgehen und in einer ausreichenden Reinheit vorliegen, um eine N-terminale Sequenzbestimmung zu ermöglichen. Zusätzlich können der Wachstumshormonrezeptor und das Bindeprotein - in Abhängigkeit vom Herstellungsverfahren - assoziierte Kohlenhydratkomponenten in größerem oder geringerem Ausmaß enthalten als jenes Material, das aus seinem physiologischen in vivo-Milieu, im speziellen aus Blut und/oder Gewebe, stammt.
Der Wachstumshormonrezeptor und das Bindeprotein dieser Erfindung umfassen den reifen Wachstumshormonrezeptor und reifes Bindeprotein, Prä- Wachstumshormonrezeptor und -Bindeprotein, sowie Wachstumshormonrezeptor- und Bindeproteinderivate, einschließlich von a) Fusionsproteinen, in denen der Wachstumshormonrezeptor oder das Bindeprotein oder ein beliebiges Fragment davon mit anderen Proteinen oder Polypeptiden durch eine Peptidbindung an der amino- und/oder carboxylterminalen Aminosäure des Wachstumshormonrezeptors oder Bindeproteins verbunden sind; b) Wachstumshormonrezeptor- und Bindeproteinfragmenten, in denen jede Aminosäure der Signalsequenz die aminoterminale Aminosäure des Fragments darstellt; c) Varianten des Wachstumshormonrezeptors oder Bindeproteins oder Fragmenten davon, wobei eine oder mehrere Aminosäurereste durch Insertion, Deletion oder Substitution verändert sind; und/oder d) durch aminoterminale Addition von Methionyl- oder modifiziertem Methionyl (wie z.B. Formylmethionyl oder anderen blockierten Methionylarten) erzeugten Derivaten der obigen Proteine, Fragmente oder Varianten.
Rekombinanter Waachstumshormonrezeptor und Bindeprotein dafür werden gereinigt und dann für therapeutische Zwecke mit physiologisch unschädlichen Stabilisatoren und Exzipienten kombiniert, sterilfiltriert und in Dosierungsform gebracht, wie z.B. durch Lyophilisierung in Dosierungsphiolen oder Aufbewahrung in stabilisierten wäßrigen Präparationen.
Der Säugetierwachstumshormonrezeptor und das modifizierte Bindeprotein können zur Behandlung verschiedener pathologischer Störungen, wie z.B. Gigantismus und Acromegalie, die mit einem Wachstumshormonüberschuß verbunden sind, dienen, vorausgesetzt daß das modifizierte Bindeprotein eine höhere Affinität für Wachstumshormon hat. Daher werden Wachstumshormonrezeptor- und Bindeproteinpräparate in therapeutisch wirksamen Dosen an Tiere verabreicht, um übermäßige Mengen an Wachstumshormon im Kreislauf zu verringern. Die neue DNA dieser Erfindung oder damit hybridisierende DNA kann auch verwendet werden, um Kinder, die verzögertes Wachstum zeigen, auf Mangel an Wachstumshormonrezeptor, z.B. Laron-Zwergwuchs, zu untersuchen. Wachstumshormon-bindendes Protein und Derivate davon dienen zur Behandlung von pathologischen Störungen, die mit einem Mangel an Wachstumshormon verbunden sind. Wachstumshormon-Bindeprotein könnte die in vivo-Stabilität und -Wirksamkeit von Wachstumshormon erhöhen. Daher würden Wachstumshormon und Wachstumshormon-Bindeprotein in einem Präparat zur Wachstumsförderung an Patienten verabreicht werden, die einen Mangel an Wachstumshormon aufweisen. Geeignete Dosen ergeben sich für Ärzte aus dem therapeutischen Zusammenhang. Wachstumshormonrezeptor und Bindeprotein dienen zur Affinitätsreinigung von Wachstumshormon oder in Rezeptorbindungs-Assays. Diese Assays wären eine Verbesserung gegenüber derzeit erhältlichen Immunoassays.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1a: Silber-gefärbtes 9,5%-iges SDS-Polyacrylamidgel der Affinitätsreinigungsschritte für den Leber-GH-Rezeptor. Etwa 1 µg Gesamtprotein pro Bahn; die Proben sind, wenn nicht anders angegeben, reduziert. Der Pfeil zeigt das obere Ende des Trenngels an. Bahn 1 - Beladung der Affinitätssäule; Bahn 2 - Durchfluß; Bahn 3 - Waschflüssigkeit; Bahn 4 - Harnstoffeluat; Bahn 5 - MgCl&sub2;-Eluat; Bahn 6 - nicht reduziertes MgCl&sub2;-Eluat.
Fig. 1b: Immunoblot mit monoklonalem Antirezeptor-Antikörper Nr. 5 des reduzierten Leber-GH-Rezeptor-(MgCl&sub2;-)Eluats, das die vorwiegende Färbung der 130 kD- Bande und zweier schwächerer Banden um 100 kD zeigt. Bahn 1 - Beginn mit gefrorener Leber (man beachte den Abbau); Bahn 2 - Beginn mit frischer Leber.
Fig. 2a: Silber-gefärbtes 9,5%-iges SDS-Polyacrylamidgel (nicht reduziert) der Affinitätsreinigungsschritte und des S300-Pool für das Serumbindeprotein. Etwa 1 µg Gesamtprotein pro Bahn. Der Pfeil zeigt das obere Ende des Trenngels an. Bahn 1 - Beladung der Affinitätssäule; Bahn 2 - Durchfluß; Bahn 3 - Waschflüssigkeit; Bahn 4 - Harnstoffeluat; Bahn 5 - MgCl&sub2;-Eluat; Bahn 6 - S300- Pool.
Fig. 2b: Autoradiogramm eines 9,5%-igen SDS-Polyacrylamidgels von ¹²&sup5;I-hGH, mittels Disuccinimidsuberat mit dem Serumbindeprotein quervernetzt, in Anwesenheit (+) oder Abwesenheit (-) von 1 µg unmarkiertem hGH. Der Komplex bei 75 kD umfaßt das 51 kD Serumbindeprotein für hGH und hGH von 22 kD.
Fig. 3 (a-c): Bindungs/Verdrängungskurven und Scatchard-Plots (kleines Bild) für Leberwachstumshormonrezeptor-MgCl&sub2;-Eluat (a) und -Harnstoffeluat (b) der Affinitätssäule sowie MgCl&sub2;-Eluat des Serumbindeproteins (c). Jede Messung 3fach; 32.000 cpm ¹²&sup5;I-hGH pro Röhrchen. Einfache (-) und doppelte (- - -) Ausgleichsrechnung für die Daten werden für die Leberrezeptorfraktionen gezeigt.
Fig. 3 (d-f): Hormonbindungs/verdrängungskurven für Leberwachstumshormonrezeptor- MgCl&sub2;-Eluat (d) und -Harnstoffeluat (e) sowie Serumbindeprotein-MgCl&sub2;-Eluat (f). ¹²&sup5;I-hGH war der Tracer und hGH ( ), Rinder-CH ( ) und Eiprolactin ( ) die konkurrierenden Liganden. Jede Messung 3fach.
Fig. 4: Bindungsaktivitätsprofil für die Serumbindeproteinfraktionen aus der Sephacryl S300-Gelfiltrationssäule. Es wurde ein einzelner Aktivitätspeak bei etwa 96 kD erhalten.
Fig. 5: Reverse-Phase-HPLC-Trennung eines Trypsinaufschlusses des gereinigten 130 kD-Leberwachstumshormonrezeptors. Die Peaks T1-T6 wurden sequenziert (siehe Tabelle V und Text). Säule: Synchrom RP-P (C18) 4, 6x100mm; Flußrate: 0,5 ml/min.
Fig. 6: RP-HPLC-Trennung eines V8-Aufschlusses des gereinigten Leberwachstumshormonrezeptors. Die Peaks V1-V5 wurden sequenziert (siehe Tabelle V und Text). Säule: Brownlee BU-300 (C4) 2, 1x100 mm; Flußrate: 0,5 ml/min.
Fig. 7: Karten der klonierten cDNA's für den menschlichen und Kaninchenwachstumshormonrezeptor. Die offene Box ist der Kodierbereich der mRNA. Der volle Teil der Box ist die Signalsequenz; Der punktierte Teil ist die Transmembrandomäne. Die mit A-K bezeichneten Bereiche sind Sonden und Oligonukleotidprimer, die beim weiter unten beschriebenen cDNA-Klonieren verwendet werden. Die einzelnen cDNA-Klone werden ghr.25-465 genannt. Wie im Text beschrieben, divergieren die Klone 5' von der an den Klonen ghr.262, 265, 435 und 440 gezeigten Linie. Die 3'-Divergenz des Klons ghr.347 ist durch die punktierte Linie angedeutet.
Fig. 8a: DNA und translatierte Aminosäuresequenz des menschlichen Wachstumshormonrezeptor-cDNA-Klons. Ausgewählte Restriktionsstellen werden ebenfalls gezeigt.
Fig. 8b: DNA und translatierte Aminosäuresequenz des Kaninchenwachstumshormonrezeptor-cDNA-Klons. Ausgewählte Restriktionsstellen werden ebenfalls gezeigt.
Fig. 8c: Homologie der DNA und Aminosäuresequenzen von menschlichem und Kaninchenwachstumshormonrezeptor. Reihe 1: menschliche DNA-Sequenz; Reihe 2: Unterschiede zur Kaninchen-DNA-Sequenz; Reihe 3: die translatierte menschliche Aminosäuresequenz; und Reihe 4: Unterschiede zur Kaninchen- Aminosäuresequenz. Die DNA-Sequenzen sind beginnend mit 1 beim initiierenden ATG und die Proteinsequenz beginnend mit 1 beim reifen N- terminalen Phenylalanin numeriert. Die DNA-Sequenzanalyse erfolgte nach dem Didesoxykettenabbruchsverfahren unter Verwendung von Fragmenten, die in den Vektoren pUC 118/119 kloniert wurden.
Fig. 9: Blothybridisierung der Kaninchenwachstumshormonrezeptoren-mRNA. 5 µg Kaninchenleber-RNA wurden in einem 1%-igen Agarosegel, das 2, 2 M Formaldehyd enthielt, durch Elektrophorese aufgetrennt, auf Nitrozellulose übergeführt und an eine mit ³²P-markierte Sonde hybridisiert, die aus gleichen Anteilen eines 844 bp-XbaI-SspI- und eines 1297 bp-SspI-Fragments hergestellt wurde und den gesamten Kodierbereich jenes Kaninchenwachstumshormonrezeptors überspannte, der aus dem Kaninchenwachstumshormonrezeptor- Expressionsvektor pC1S2.RGHR1 erhalten wurde.
Fig. 10: Schematische Darstellung des menschlichen Wachstumshormonrezeptors. Der Hydropathie-Plot stammt vom Verfahren nach Kyte und Doolittle, J. Mol. Biol. 153, 105-132 (1982) mit einem Fenster von 10 Resten. Die potentiellen N- Glykosylierungsstellen sind Asn-X-(Ser Thr). Exakte Homologie zum Kaninchenrezeptor ist über ein Fenster von 10 Aminosäuren gegeben.
Fig. 11a: Konstruktion des Kaninchenwachstumshormonrezeptor-Expressionsplasmids pCIS2.RGHR1.
Fig. 11b: Karte des Kaninchenwachstumshormonrezeptor-Expressionsplasmids pCIS2.RGHR1.
Fig. 12 (a-c): Konstruktion eines Expressionvektors für lösliches menschliches Wachstumshormon-Bindeprotein.
Fig. 13 (a, b): Sich an Kaninchenrezeptor, der in Säugetierzellen exprimiert wurde, bindendes Wachstumshormon. COS-7 Affennierenzellen wurden mit pCIS2 transfiziert. RGHR1 nach dem Calciumphosphat-Fällungsverfahren. (a) Die Zellmembranen wurden präpariert und auf Bindungskonkurrenz zwischen ¹²&sup5;I-hGH und unmarkiertem hGH untersucht, Scatchard-Plot (kleines Bild) derselben Daten. Bindungs/Verdrängungskurven mit ¹²&sup5;I-hGH und unmarkiertem hGH ( ), Rinder- GH ( ) oder Eiprolactin ( ) als konkurrierende Liganden.
Fig. 14a: Wachstumshormon, das sich an lösliches menschliches Wachstumshormon- Bindeprotein bindet. Menschliche 293-Nierenzellen wurden nach dem Calciumphosphatverfahren mit pCIS2.sHGHR transfiziert. Das Kulturmedium der Zellen wurde auf Bindungskonkurrenz zwischen ¹²&sup5;I-hGH und unmarkiertem hGH untersucht; Scatchard-Ptot (kleines Bild) derselben Daten.
Fig. 14b: Bindungskonkurrenz zwischen ¹²&sup5;I-hGH und unmarkiertem hGH ( ), Rinder-GH ( ) oder Eiprolactin ( ).

Detailierte Beschreibung

Wie hierin verwendet, bezeichnen Wachstumshormonrezeptor, Wachstumshormon- Bindeprotein und Derivate davon Nicht-Immun-Polypeptide, die in der Lage sind, Wachstumshormon zu erkennen und selektiv damit in Wechselwirkung zu treten, also eine Bindung einzugehen. Eine derartige Bindung könnte z.B. durch Verdrängungsstudien wie hierin beschrieben, bestätigt werden.
GH-Rezeptor und GH-Bindeprotein, wie hierin verwendet, umfassen GH-Rezeptoren und Bindeproteine, die enthalten: native Glykosylierung; (für den Fall des Kaninchen- und des menschlichen GH-Rezeptors) die in den Figuren 8a und 8b dargelegten Aminosäuresequenzen; (für den Fall des GH-Bindeproteins) jene Aminosäuresequenz, die aus zumindest den ersten 190 Aminosäuren des Aminoterminus besteht und sich bis zu zumindest etwa 250 Aminosäuren erstreckt; analoge GH-Rezeptoren und Bindeproteine von anderen Tierarten, wie z.B. Rindern, Schweinen und dergleichen; deglykosylierte und unglykosylierte Derivate derartiger Wachstumshormonrezeptoren und Bindeproteine; Aminosäuresequenzvarianten von GH-Rezeptor und Bindeprotein sowie in vitro-entstandene kovalente Derivate von GH-Rezeptor und Bindeprotein. Normalerweise sind GH-Rezeptor- und Bindeproteinpolypeptide etwa zu 40-100%, vorzugsweise zu 75-90%, homolog zu den in den Figuren 8a und 8b dargestellten Sequenzen. All diese Formen des GH-Rezeptors und Bindeproteins binden Wachstumshormon.
Prä-Wachstumshormonrezeptor und -Bindeprotein ist eine Art von Rezeptor und Bindeprotein, die auch unter die obige Definition fällt. Sie ist durch die Gegenwart eines Signal-(oder Leader-)Polypeptids, das dazu dient, das Protein nach der Translation zu einer bestimmten Stelle inner- oder außerhalb der Zelle zu führen, im Molekül gekennzeichnet. Im allgemeinen wird das Signalpeptid (das selbst nicht Wachstumshormon binden kann) proteolytisch von einem Restprotein abgespalten, das als Teil jenes Sekretionsprozess, in dem das Protein in das Wirtszellenperiplasma oder - Kulturmedium transportiert wird, wachstumshormonbindende Aktivität aufweist. Das Signalpeptid kann von Mikroben oder Säugetieren (einschließlich der nativen Präsequenz aus 18 Aminosäuren) stammen, vorzugsweise jedoch aus Säugetieren.
Aminosäuresequenzvarianten von Wachstumshormonrezeptor oder Bindeprotein der Figuren 8a und 8b fallen in eine oder mehrere von drei Klassen: Substitutions-, Insertions- und Deletions-Varianten. Die Varianten werden normalerweise durch stellenspezifische Mutagenese der Nukleotide in der DNA, die für den Wachstumshormonrezeptor oder das Bindeprotein kodiert, wodurch für die Variante kodierende DNA erhalten wird, und durch anschließende Expression in rekombinanten Zellkulturen hergestellt. Fragmente von Wachstumshormonrezeptor- und Bindeproteinvarianten aus etwa 100-150 Resten können normalerweise durch in vitro- Synthese hergestellt werden. Aminosäuresequenzvarianten sind meist durch die vorbestimmte Natur der Variation gekennzeichnet, derartige Varianten inkludieren jedoch natürlich vorkommende Allel- oder Interspeziesvariationen der Wachstumshormonrezeptor- und Bindeproteinaminosäuresequenz. Die Varianten weisen typischerweise dieselbe qualitative biologische Aktivität auf wie die natürlich vorkommenden, obwohl auch Varianten danach gewählt werden, ob sie die Charakteristika des Wachstumshormonrezeptors und Bindeproteins modifizieren, wie weiter unten genauer beschrieben wird.
Während die Stelle zur Einbringung einer Aminosäuresequenzvariation vorbestimmt ist, braucht die Mutation als solche nicht vorbestimmt zu werden. Beispielsweise kann, um die Durchführung einer Mutation an einer gegebenen Stelle zu optimieren, eine Zufallsmutagenese an einem Zielcodon oder -bereich erfolgen und die exprimierten Wachstumshormonrezeptor- und Bindeproteinvarianten nach der optimalen Kombination der gewünschten Aktivitäten gescreent werden. Techniken, um Substitutionsmutationen an bestimmten Stellen von DNA mit bekannter Sequenz zu erhalten, sind bekannt, wie z.B. M13-Primer-Mutagenese.
Aminosäuresubstitutionen erfolgen typischerweise an einzelnen Resten; Insertionen liegen für gewöhnlich im Bereich von etwa 1-10 Aminosäurenresten; und Deletionen reichen von 1-30 Resten. Deletionen oder Insertionen werden vorzugsweise an benachbarten Paaren durchgeführt, d.h. eine Deletion von 2 Resten oder eine Insertion von 2 Resten. Substitutionen, Deletionen, Insertionen oder beliebige Kombinationen davon können kombiniert werden, um ein bestimmtes Konstrukt zu erreichen. Offensichtlich dürfen jene Mutationen, die in der für die Variante des GH-Rezeptors oder Bindeproteins kodierenden DNA durchgeführt werden, die Sequenz nicht aus dem Leserahmen entfernen und sollten keine Komplementärbereiche bilden, die eine sekundäre mRNA-Struktur bilden können (EP 75, 444A).
Substitutionsvarianten sind jene, in denen zumindest ein Rest aus der Sequenz aus Fig. 8a und 8b entfernt wurde und ein anderer Rest an dieser Stelle eingefügt wurde. Derartige Substitutionen werden im allgemeinen in Übereinstimmung mit der folgenden Tabelle 1 durchgeführt, wenn es notwendig ist, die Eigenschaften des GH-Rezeptors und des Bindeproteins geringfügig zu modulieren. Tabelle 1
Wesentliche Änderungen in Funktion und immunologischer Identität werden durch Selektion derartiger Substitutionen erhalten, die weniger konservativ sind als jene in Tabelle 1, d.h. durch die Auswahl von Resten, die sich in ihren Auswirkungen auf die Erhaltung (a) der Struktur des Polypeptidgerüsts im Bereich der Substitution, wie z.B als Faltblatt- oder Helix-Konformation, (b) des Ausmaßes der Hydrophobie des Moleküls an der Targetstelle oder (c) der Sperrigkeit der Seitenkette deutlicher unterscheiden. Die Substitutionen, von denen im allgemeinen erwartet wird, daß sie die stärksten Änderungen der Eigenschaften des GH-Rezeptors und des Bindeproteins verursachen, sind jene, in denen (a) ein hydrophiler Rest, z.B. Seryl oder Threonyl, durch einen hydrophoben Rest, z.B. Leucyl, Isoleucyl, Phenylalanyl, Valyl oder Alanyl, ersetzt wird; (b) ein Cystein oder Prolin durch irgendeinen anderen ersetzt oder anstelle dessen eingefügt wird; (c) ein Rest mit einer elektropositiven Seitenkette, z.B. Lysyl, Arginyl oder Histidyl, durch einen elektronegativen Rest, z.B. Glutamyl oder Asparagyl, ersetzt wird; oder (d) ein Rest mit einer sperrigen Seitenkette, z.B. Phenylalanin, durch einen ohne Seitenkette, z.B. Glycin, ersetzt wird.
Eine Hauptklasse der Substitutions- oder Deletionsvarianten sind jene, welche die Transmembrandomäne und/oder die Zytoplasmabereiche des Wachstumshormonrezeptors betreffen. Die Zytoplasmadomäne des Wachstumshormonrezeptors ist jene Sequenz von Aminosäurenresten, die etwa mit Aminosäure 271 in Fig. 8a, b beginnt und beinahe 350 zusätzliche Reste anhält. In der Kaninchen- und menschlichen Sequenz wird angenommen, daß die Lys-Gln-Gln-Arg-Ile-Lys-Domäne (etwa Reste 270- 276) als Transferstopsequenz dient; der elektropositive Charakter, der durch die basischen Reste gegeben ist, bewirkt zusammen mit dem weiter unten beschriebenen Transmembranbereich den Abbruch (Stop) des Transfers des Wachstumhormonrezeptors durch die Zellmembran.
Der Transmembranbereich des GH-Rezeptors befindet sich in der menschlichen Sequenz etwa bei den Resten 247-269 und bei der Kaninchensequenz an der analogen Stelle. Dieser Bereich ist eine sehr hydrophobe Domäne, welche die richtige Größe hat, um sich über die Lipiddoppelschicht der Zellmembran zu erstrecken (siehe Hydropathieprofil in Fig. 10). Es wird angenommen, daß sie zusammen mit der Zytoplasmadomäne bewirkt, daß der Erkennungs- und Bindungsabschnitt des GH- Rezeptors, d.h. das GH-bindende Protein, in der Zellmembran verankert wird.
Eine Deletion oder Substitution von Zytoplasma- und/oder Transmembrandomäne erleichtert die Gewinnung des rekombinanten GH-Bindeproteins aus dem GH-Rezeptor, indem es seine Zell- oder Membranlipidaffinität herabsetzt und seine Wasserlöslichkeit verbessert. Im Fall des GH-Rezeptors kann die Transmembran- oder die Zytoplasmadomäne deletiert werden, um die Gewinnung des rekombinanten Wachstumshormonrezeptors durch die Reduktion seiner Zell- und Membranlipidaffinität und Verbesserung seiner Wasserlöslichkeit zu erleichtern, damit keine Detergentien benötigt werden, um den Wachstumshormonrezeptor in wäßriger Lösung zu halten. Vorzugsweise werden sowohl Zytoplasma- als auch Transmembrandomäne deletiert.
Das GH-bindende Protein, bei dem die Zytoplasma- und/oder Transmembran-(C-T-)- Domänen deletiert oder substituiert sind, kann direkt in rekombinanten Zellkulturen oder als Fusion mit einer Signalsequenz, vorzugsweise mit einem zum Wirt homologen Signal, synthetisiert werden. Beispielsweise werden bei der Konstruktion eines prokaryotischen Expressionsvektors die C-T-Domänen deletiert, und die bakteriellen alkalische Phosphatase-, STII- oder hitzestabilen Enterotoxin II-Leader ersetzen das natürlich vorkommende Signal aus 18 Aminosäuren, während in Hefe Invertase-, Alphafaktor- oder saure Phosphatase-Leader verwendet werden können. Bei der Expression in Säugetierzellen kann ein viraler Sekretionsleader verwendet werden, z.B. das Herpes simplex-gD-Signal. Wenn der Sekretionsleader durch den Wirt "erkannt" wird, ist die Wirtssignalpeptidase in der Lage, eine Fusion des Leaderpolypeptids, das an seinem C- Terminus mit GH-Bindeprotein verbunden ist, d.h. C-T-deletierten GH-Rezeptor, zu spalten. Ein Vorteil des GH-Bindeproteins betsteht darin, daß es in das Kulturmedium sekretiert werden kann. Diese Variante ist wasserlöslich und hat keine nennenswerte Affinität zu Zellmembranlipiden, wodurch es die Gewinnung aus rekombinanten Zellkulturen deutlich vereinfacht.
Substitutions- oder Deletionsmutagenese wird durchgeführt, um N- oder O- Glykosylierungsstellen zu beseitigen. Alternativ dazu werden unglykosylierter GH- Rezeptor und Bindeprotein in rekombinanter Prokaryotenzellkultur hergestellt. Deletion von Cystein oder anderen labilen Resten kann auch erwünscht sein, z.B. um die Oxidationsstabilität des GH-Rezeptors und Bindeproteins zu erhöhen. Deletionen oder Substitutionen von potentiellen Proteolysestellen, d.h. Arg Arg, erfolgt durch Deletion eines der basischen Reste oder Substitution eines Rests durch Glutaminyl- oder Histidylreste.
Durch Insertion entstandene Aminosäuresequenzvarianten des GH-Rezeptors und Bindeproteins sind jene, in denen ein oder mehrere Aminosäurenreste an eine vorbestimmte Stelle in den Ziel-GH-Rezeptor und -Bindeprotein eingefügt wurden. Meistens sind Insertionsvarianten Fusionen von heterologen Proteinen oder Polypeptiden am Amino- oder Carboxylterminus von GH-Rezeptor und Bindeprotein. Immunogene GH-Rezeptor- und Bindeproteinderivate werden durch Fusion eines immunogenen Polypeptids mit der Zielsequenz durch Quervernetzung in vitro oder durch rekombinante Zellkulturen, die mit für die Fusion kodierender DNA transformiert wurden, hergestellt. Solche immunogenen Polypeptide sind vorzugsweise bakterielle Polypeptide wie z.B. trpLE, β-Galactosidase und dergleichen, zusammen mit deren immunogenen Fragmenten.
Für den GH-Rezeptor und das Bindeprotein kodierende DNA wird aus anderen Quellen als Kaninchen oder Menschen durch a) Erhalt einer cDNA-Bibliothek aus der Leber des betreffenden Tiers, b) Durchführung einer Hybridisierungsanalyse mit markierter DNA, die für den hGH-Rezeptor und das Bindeprotein und für Fragmente davon kodiert (üblicherweise größer als 100 bp), um Klone mit homologen Sequenzen in der cDNA- Bibliothek zu detektieren, und c) durch Analyse der Klone mittels Restriktionsenzymanalyse und Nukleinsäuresequenzierung, um die Klone voller Länge zu identifizieren, erhalten. Wenn keine Klone voller Länge in der Bibliothek vorliegen, können geeignete Fragmente aus den verschiedenen Klonen gewonnen und an gemeinsamen Restriktionsstellen der Klone ligiert werden, um einen Klon voller Länge zu bilden.
GH-Rezeptor und Bindeprotein umfassen Aminosäuresequenzmutanten, Glykosylierungsvarianten sowie kovalente oder Aggregations-Konjugate mit anderen chemischen Gruppen. GH-Rezeptor und Bindeprotein umfassen u.a. (wie bereits bekannt) kovalente Derivate, die durch Verbindung von Funktionalitäten mit Gruppen, die in den Seitenketten der Aminosäuren von GH-Rezeptor und Bindeprotein oder an den N- oder C-Termini zu finden sind. Diese Derivate können z.B. umfassen: aliphatische Ester oder Amide des Carboxylterminus oder Reste, die Carboxylseitenketten enthalten, O-Acylderivate von Hydroxylgruppen enthaltenden Resten und N-Acylderivate der aminoterminalen Aminosäure oder Aminogruppen enthaltende Reste, z.B. Lysin oder Arginin. Acylgruppen werden aus Alkylgruppen ausgewählt (einschließlich von normalen C3 bis C18-Alkylgruppen) und bilden somit Alkoyl-Aroyl-Arten.
Eine Hauptgruppe von Derivaten sind kovalente Konjugate von GH-Rezeptor und Bindeprotein sowie von deren Fragmenten mit anderen Proteinen oder Polypeptiden. Diese Derivate werden in rekombinanter Kultur als N- oder C-terminale Fusionen oder unter Verwendung von an sich bekannten difunktionellen Agentien zur Quervernetzung von Proteinen an unlösliche Matrizen mittels reaktiver Seitengruppen synthetisiert. Bevorzugte Derivatisierungsstellen mit Quervernetzern liegen bei GH-Rezeptor und Bindeprotein an Cystein- und Lysinresten. Bevorzugte Agentien sind N- Maleimidobenzoylsuccinimidester und N-Hydroxysuccinimid.
Kovalente oder Aggregations-Derivate dienen als Immunogene, als Reagentien in Immunoassays oder zur Affinitätsreinigung des Wachstumshormons und anderer bindender Liganden. Beispielsweise werden GH-Rezeptor und Bindeprotein zur Verwendung im Assay oder bei der Reinigung von Anti-Wachstumshormonrezeptor- und -Bindeprotein-Antikörper oder von Wachstumshormon durch kovalente Bindung an mit Bromcyan aktivierte Sepharose mittels an sich bekannter Verfahren unlöslich gemacht oder an Polyolefin-Oberflächen adsorbiert (mit oder ohne Quervernetzung mittels Glutaraldehyd). Wachstumshormonrezeptor und Bindeprotein werden zur Verwendung in diagnostischen Assays auch mit einer detektierbaren Gruppe markiert, z.B. nach dem Chloramin T-Verfahren radioiodiert, kovalent an Seltenerdchelate gebunden oder an andere fluoreszierende Gruppen konjugiert.
Zusammensetzungen, in denen GH-Rezeptor und Bindeprotein vorkommen, können auch folgende Substanzen umfassen: die nachstehend beschriebenen Stabilisatoren und Bindemittel, bestimmte Mengen an Proteinen aus der Zelle oder dem Organismus, die/der als Ursprung der für den GH-Rezeptor und das Bindeprotein kodierenden DNA diente, Proteine aus anderen Ursprungszellen oder -organismen als jenen für GH- Rezeptor und Bindeprotein, sowie synthetische Polypeptide, wie z.B. Poly-L-lysin. Rekombinanter GH-Rezeptor und rekombinantes Bindeprotein, die in allogenen Wirten exprimiert wurden, werden natürlich völlig frei von Genursprungsproteinen exprimiert. Die Expression des hGH-Rezeptors oder Bindeproteins in CHO oder anderen, nichtmenschlichen, höheren Säugetierzellen führt zu einer Zusammensetzung, worin der Rezeptor nicht nur frei von etwaigen vorhandenen biologischen Agentien ist, sondern auch frei von menschlichen Proteinen.
Für den Wachstumshormonrezeptor und das Bindeprotein kodierende DNA wird durch chemische Synthese, durch Screenen reverser Transkripte von mRNA aus Plazentazellen oder -zellinienkulturen, oder durch Screenen von Genombibliotheken beliebiger Zellen erhalten. Im Umfang der vorliegenden Erfindung liegen auch Nukleinsäuren, die nicht für den Rezeptor oder das Bindeprotein kodieren, die jedoch in der Lage sind, unter schonenden Bedingungen mit der für den Rezeptor oder das Bindeprotein kodierenden DNA zu hybridisieren.
Diese DNA wird nach an sich bekannten Verfahren kovalent mit einer nachweisbaren Substanz, wie z.B. einer fluoreszierenden Gruppe, einem radioaktiven Atom oder einer chemoluminiszierenden Gruppe markiert. Sie wird dann in konventionellen Hybridisierungsassays eingesetzt. Solche Assays werden zur Identifikation von GH- Rezeptor- und Bindeproteinvektoren sowie von Transformanten, wie in den nachstehenden Beispielen, oder zur in vitro-Diagnose eingesetzt, wie z.B. zum Nachweis von abnormer GH-Rezeptor- und Bindeprotein-DNA und -RNA in Gewebeproben.
Die vorliegende Erfindung stellt neue GH-Rezeptor und Bindeproteinpräparate bereit. In einer Ausführungsform ist der GH-Rezeptor oder das Bindeprotein "im wesentlichen rein", was bedeutet, daß der GH-Rezeptor oder das Bindeprotein, die gemäß der Erfindung produziert wurden, frei von etwaigen vorhandenen, biologischen Agentien sind, die normalerweise mit dem GH-Rezeptor oder dem Bindeprotein in deren physiologischen in vivo-Milieu vorkommen, z.B. wenn der GH-Rezeptor oder das Bindeprotein durch Extraktion und Reinigung aus Blut und/oder Gewebe gewonnen wird. Beispiele für derartige etwaige vorhandene, biologische Agentien sind Bakterien, Pilze, Mykoplasma, Proteine und Viren, z.B. ist neuerdings das AIDS-Virus von Bedeutung.
In einer weiteren Ausführungsform hat der nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung produzierte GH-Rezeptor eine spezifische Aktivität von mehr als 3.000 pMol/mg, während das GH-bindende Protein eine spezifische Aktivität von mindestens etwa 10.000 pMol/mg hat.
In einer weiteren Ausführungsform werden Präparate des GH-Rezeptors oder des Bindeproteins bereitgestellt, sodaß die Aminosäuresequenz des Rezeptors oder Bindeproteins ermittelt werden kann. Im speziellen sollte unter Anwendung von sequentiellem Edman-Abbau eine Sequenzierung von mindestens 16 Resten vom N- Terminus des Rezeptors weg, sowie für mindestens 35 Reste des Bindeproteins möglich sein.
Im allgemeinen werden bei der Konstruktion der in dieser Erfindung verwendbaren Vektoren Prokaryoten zur Klonierung von DNA-Sequenzen benützt. Beispielsweise ist E.coli K12-Stamm 294 (ATCC Nr. 31446) besonders geeignet. Andere einsetzbare Mikrobenstämme umfassen E.coli B und E.coli X1776 (ATCC Nr. 31537). Diese Beispiele dienen zur Veranschaulichung und nicht als Einschränkung.
Auch Prokaryoten werden zur Expression genützt. Dabei können die vorher erwähnten Stämme sowie E.coli W3110 (F&supmin;, λ&supmin;, prototroph, ATCC Nr. 27325), Bacillusstämme, wie z.B. Bacillus subtilis, und andere Enterobakterienfamilien, wie z.B. Salmonella typhimurium oder Serratia marcesens, und verschiedene Pseudomonasarten verwendet werden.
Im allgemeinen werden gemeinsam mit diesen Wirten Plasmidvektoren verwendet, die Promotoren und Kontrollsequenzen enthalten, die aus Spezies stammen, welche mit der Wirtszelle kompatibel sind. Der Vektor beinhaltet normalerweise eine Replikationsstelle sowie Markersequenzen, die zur phenotypischen Selektion in transformierten Zellen befähigt sind. Beispielsweise wird E.coli typischerweise unter Verwendung von pBR322, einem Plasmid aus einer E.coli-Spezies (Bolivar et al., Gene 2, 95 [1977]), transformiert. pBR322 enthält Gene für Ampicillin- und Tetracyclinresistenz und erleichtert somit die Identifikation transformierter Zellen. Das pBR322-Plasmid oder andere mikrobielle Plasmide müssen auch Promotoren und andere Kontrollelemente, die normalerweise bei der rekombinanten DNA-Konstruktion verwendet werden, enthalten oder werden entsprechend mofiziert.
Promotoren, die für den Einsatz mit prokaryotischen Wirten geeignet sind, umfassen u.a. die β-Lactamase und Lactose-Promotorsysteme (Chang et al., "Nature" 275, 615 [1978]; und Goeddel et al., "Nature" 281, 344 [1979]), alkalische Phosphatase, das Tryptophan-(trp-)Promotorsystem (Goeddel "Nucleic Acid Res." 8, 4057 [1980] und EP- A-36.776) und Hybridpromotoren sowie den tac-Promotor (H. de Boer et al., "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 80, 21-25 [1983]). Es sind jedoch auch andere funktionelle Bakterien-Promotoren geeignet. Deren Nukleotidsequenzen sind im allgemeiner bekannt, was einem Fachmann auf diesem Gebiet ermöglicht, diese mit für den GH- Rezeptor und das Bindeprotein kodierender DNA (Siebenlist et al., "Cell" 20, 269 [1980]) unter Verwendung von Linkern und Adaptoren zu ligieren, um erforderliche Restriktionsstellen bereitzustellen. Promotoren zur Verwendung in bakteriellen Systemen enthalten auch eine Shine-Dalgarno-(S.D.-)Sequenz, die mit der für den GH- Rezeptor und das Bindeprotein kodierenden DNA operabel verbunden ist.
Zusätzlich zu Prokaryoten können auch eukaryotische Mikroben, wie z.B. Hefekulturen, verwendet werden. Saccharomyces cerevisiae, oder normale Backhefe ist der im allgemeinen am häufigsten verwendete eukaryotische Mikroorganismus, obwohl auch eine Anzahl anderer Stämme allgemein erhältlich ist. Zur Expression in Saccharomyces wird normalerweise z.B. das Plasmid YRp7 (Stinchcomb, er al., Nature 282, 39 [1979]; Kingsman et al., Gene 7, 141 [1979]; Tschemper et al., Gene 10, 157 [1980]) benutzt. Dieses Plasmid enthält bereits das trp1-Gen, das einen Selektionsmarker für einen mutierten Hefestamm darstellt, dem die Fähigkeit zur Vermehrung in Tryptophan fehlt, wie z.B. ATCC Nr. 44076 oder PEP4-1 (Jones, Genetics 85, 12 [1977]).
Zum Einsatz mit Hefewirten geeignete Promotorsequenzen umfassen die Promotoren für 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., "J. Biol. Chem." 255, 2073 [1980]) oder andere glykolytische Enzyme (Hess et al. "J. Adv. Enzyme Reg." 7, 149 [1968]; und Holland, "Biochemistry" 17, 4900 [1978]), wie z.B. Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphat- Dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvat-Decarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6- phosphat-Isomerase, 3-Phosphoglycerat-Mutase, Pyruvat-Kinase, Triosephosphat- Isomerase, Phosphoglucose-Isomerase und Glucokinase.
Andere Hefepromotoren, die induzierbare Promotoren mit dem zusätzlichen Vorteil der Transkriptionskontrolle durch die Wachstumsbedingungen sind, sind die Promotorbereiche für Alkohol-Dehydrogenase 2, Isocytochrom C, saure Phosphatase, mit dem Stickstoffmetabolismus assoziierte Abbauenzyme, Metallothionein. Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase und Enzyme, die für die Maltose- und Galactoseverwertung verantwortlich sind. Weitere zum Einsatz bei der Hefeexpression geeignete Vektoren und Promotoren werden von Hitzeman et al., EP-A-73.657, beschrieben. Vorteilhafterweise werden gemeinsam mit Hefepromotoren auch Hefe- Enhancer verwendet.
"Kontrollbereich" bezieht sich auf spezifische Sequenzen am 5'- und 3'-Ende von eukaryotischen Genen, die in die Kontrolle von Transkription oder Translation eingebunden sein können. Faktisch haben alle eukaryotischen Gene einen AT-reichen Bereich, der sich etwa 25-30 Basen stromauf von jener Stelle befindet, an der die Transkription initiiert wird. Eine andere Sequenz, die 70-80 Basen stromauf vom Transkriptionsstart vieler Gene zu finden ist, ist ein CXCAAT-Bereich, wobei X ein beliebiges Nukleotid sein kann. Am 3'-Ende der meisten eukaryotischen Gene befindet sich eine AATAAA-Sequenz, die das Signal für die Addition eines Poly-A-Rests an das 3'-Ende der transkribierten mRNA sein kann.
Bevorzugte Promotoren, die die Transkription von Vektoren in Säugetierwirtszellen kontrollieren, können aus verschiedenen Quellen erhalten werden, z.B. aus den Genomen von Viren, wie z.B. Polyoma, Simian Virus 40 (SV40), Adenovirus, Retroviren, Hepatitis-B-Virus und am meisten bevorzugt Zytomegalievirus, oder aus heterologen Säugetierpromotoren, z.B. β-Aktin-Promotor. Die frühen und späten Promotoren des SV40-Virus werden normalerweise als SV40-Restriktionsfragment erhalten, welches auch den Replikationsursprung des SV40-Virus enthält (Fiers et al., Nature 273, 113 [1978]). Der erste der frühen Promotoren des menschlichen Zytomegalievirus wird normalerweise als HindIII-E-Restriktionsfragment erhalten (Greenaway, P.J. et al., Gene 18, 355-360 [1982]). Natürlich sind dabei auch Promotoren der Wirtszelle oder verwandter Arten einsetzbar.
Die Transkription einer DNA, die für den GH-Rezeptor und das Bindeprotein kodiert, durch höhere Eukaryoten kann durch Insertion einer Enhancer-Sequenz in den Vektor verstärkt werden. Enhancer sind cis-aktive DNA-Elemente mit normalerweise 10-300 bp, die auf den Promotor einwirken und seine Transkription verstärken. Enhancer sind relativ unabhängig von Ausrichtung und Position und wurden 5' (Laimins, L. et al., PNAS 78, 993 [1981]) und 3' (Lusky, M.L. et al., Mol. Cell Bio. 3, 1108 [1983]) zur Transkriptionsstelle, innerhalb eines Introns (Banerji, J.L. et al., Cell 33, 729 [1983]) sowie auch in der Kodiersequenz selbst (Osborne, T.F. et al., Mol. Cell Bio. 4, 1293 [1983]) gefunden. Viele Enhancersequenzen aus Säugetiergenen sind nun bekannt (Globin, Elastase, Albumin, α-Fetoprotein und Insulin). Typischerweise wird allerdings einen Enhancer aus einem eukaryotischen Zellvirus verwendet werden. Beispiele dafür umfassen den SV40-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsursprungs (bp 100- 270), den frühen Promotorenhancer des Zytomegalievirus, den Polyomaenhancer auf der späten Seite des Replikationsursprungs und Adenovirusenhancer.
Expressionsvektoren, die in eukaryotischen Wirtszellen (Hefe-, Pilz-, Insekten-, Pflanzen-, tierischen, menschlichen oder anderen Zellen mit Kern anderer mehrzelliger Organismen) verwendet werden, enthalten auch Sequenzen, die notwendig sind, um die Transkription zu beenden, was auch die mRNA-Expression beeinflussen kann. Diese Bereiche werden als polyadenylierte Segmente im untranslatierten Abschnitt der mRNA, die für den GH-Rezeptor und das Bindeprotein kodiert, transkribiert. Die untranslatierten 3'-Bereiche enthalten auch Transkriptionsterminationsstellen.
Exprssionvektoren können auch ein Selektionsgen, auch selektierbarer Marker genannt, enthalten. Beispiele für geeignete selektierbare Marker für Säugetierzellen sind Dihydrofolat-Reduktase (DHFR), Thymidin-Kinase oder Neomycin. Wenn derartige selektierbare Marker erfolgreich in eine Säugetierwirtszelle transferiert werden, kann die transformierte Wirtszelle überleben, wenn sie unter selektiven Druck gebracht wird. Es gibt zwei unterschiedliche weitverbreitete Kategorien von Selektionssystemen. Die erste Kategorie basiert auf dem Stoffwechsel einer Zelle und der Verwendung einer mutierten Zellinie, der die Fähigkeit fehlt, sich unabhängig von einem ergänzten Medium zu vermehren. Zwei Beispiele dafür sind: CHO-DHFR&supmin;-Zellen und Mäuse-LTK&supmin;-Zellen. Diesen Zellen fehlt die Fähigkeit, sich ohne Zusatz von Nährstoffen wie Thymidin oder Hypoxanthin zu vermehren. Da diesen Zellen bestimmte Gene fehlen, die für einen kompletten Nukleotidsyntheseweg erforderlich sind, können sie nicht überleben, solange die fehlenden Nukleotide nicht in einem ergänzten Medium zur Verfügung gestellt werden. Ein Alternative zur Ergänzung des Mediums ist die Einführung eines intakten DHFR- oder TK-Gens in die Zellen, denen diese Gene fehlen, um dadurch deren Wachstumsbedürfnisse zu verändern. Einzelne Zellen, die nicht mit dem DHFR- oder TK-Gen transformiert wurden, sind nicht in der Lage, in nicht ergänztem Medium zu überleben.
Die zweite Kategorie ist die dominante Selektion, die sich auf ein Selektionsschema bezieht, das für beliebige Zelltypen eingesetzt wird und nicht die Verwendung einer mutierten Zellinie erfordert. Nach diesen Schemata wird typischerweise ein Arzneimittelwirkstoff (im folgenden kurz Wirkstoff genannt) eingesetzt, um das Wachstum der Wirtszelle anzuhalten. Jene Zellen, die das neue Gen enthalten, würden ein Protein exprimieren, das ihnen Resistenz gegenüber diesem Wirkstoff verleiht, und würden die Selektion überleben. Zu den Beispielen für eine derartige dominante Selektion zählen die Verwendung von Neomycin (Southern P. und Berg, P., J. Molec. Appl. Genet. 1, 327 [1982]), Mycophenolsäure (Mulligan, R. C. und Berg, P., Science 209, 1422 [1980]) oder Hygromycin (Sugden, B. et al., Mol. Cell. Biol. 5, 410-413 [1985]). Diese drei oben erwähnten Beispiele benutzen bakterielle Gene unter eukaryotischer Kontrolle, um Resistenz gegen den jeweiligen Wirkstoff G418 oder Neomycin (Geneticin), xgpt (Mycophenolsäure) bzw. Hygromycin zu verleihen.
"Amplifikation" bezieht sich auf die Verstärkung der Replikation eines isolierten Bereichs innerhalb der chromosomalen DNA einer Zelle. Amplifikation wird unter Verwendung eines Selektionsmittels wie z.B. Methotrexat (MTX), das DHFR inaktiviert, erreicht. Die Amplifikation oder die erfolgreiche Herstellung von Kopien des DHFR- Gens führt zu größeren Mengen an DHFR, die in Anwesenheit von größeren Mengen an MTX produziert werden. Der Amplifikationsdruck wird, ungeachtet der Anwesenheit von endogenem DHFR, durch Zugabe von größeren Mengen an MTX angelegt. Die Amplifikation eines gewünschten Gens kann erreicht werden, indem eine Säugetierwirtszelle mit einem Plasmid cotransfiziert wird, welches DNA enthält, die für das gewünschte Protein und das DHFR- oder Amplifikationsgen kodiert, das Cointegration ermöglicht. Es wird sichergestellt, daß die Zelle mehr DHFR benötigt, welches Erfordernis durch Replikation des Selektionsgens erfüllt wird, wodurch ausschließlich nach Zellen selektiert wird, die sich in Gegenwart immer höherer MTX- Konzentrationen vermehren können. Falls das Gen, das für ein gewünschtes heterologes Protein kodiert, das Selektionsgen kointegriert hat, bewirkt die Replikation dieses Gens die Replikation des für das gewünschte Protein kodierenden Gens. Das Ergebnis ist, daß vermehrte Kopien des Gens, also des amplifizierten Gens, das für das gewünschte heterologe Protein kodiert, eine größere Menge des gewünschten heterologen Proteins exprimieren.
Bevorzugte geeignete Wirtszellen zur Expression der Vektoren dieser Erfindung, die für den GH-Rezeptor und das Bindeprotein in höheren Eukaryoten umfassen: die mit SV40 transformierte Affennieren-CV1-Linie (COS-7, ATCC CRL 1651); menschliche Embryonalnierenlinie (293, Graham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36, 59 [1977]); Babyhamsternierenzellen (BHK, ATCC CCL 10); von chinesischen Hamstern stammende Eierstockzellen-DHFR (CHO, Urlaub und Chasin, PNAS (USA) 77, 4216 [1980]); Mäuse- Sertolizellen (TM4, Mather, J.P., Biol. Reprod. 23, 243-251 [1980]); Affennierenzellen (CV1, ATCC CCL 70); Nierenzellen afrikanischer Grüner Meerkatzen (VERO-76, ATCC CRL-1587); menschliche Cervicalkarzinomzellen (HELA, ATCC CCL 2); Hundenierenzellen (MDCK, ATCC CCL 34); Büffelrattenleberzellen (BRL 3A, ATCC CRL 1442); menschliche Lungenzellen (WI38 ATCC CCL 75); menschliche Leberzeilen (Hep G2, HB 8065); Mäusebrusttumor (MMT 060562, ATCC CCL 51); und TRI-Zellen (Mather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383, 44-68 [1982]).
"Transformation" bedeutet die Einbringung von DNA in einen Organismus, sodaß diese DNA entweder als exrachomosomales Element oder durch chomosomale Integration replizierbar ist. Wenn nicht anders erwähnt, wird hierin zur Transformation der Wirtszellen das Verfahren von Graham, F. und van der Eb, A., Virology 52, 456-457 (1973), angewandt. Es können jedoch auch andere Verfahren zur Einbringung von DNA in Zellen, wie z.B. Kerninjektion oder Protoplastenfusion, eingesetzt werden. Falls prokaryotische Zellen oder Zellen mit substantiellen Zellwandkonstruktionen verwendet werden, ist das bevorzugte Transfektionsverfahren die Calciumbehandlung unter Verwendung von Calciumchlorid, wie von Cohen, F.N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 69, 2110 (1972), beschrieben.
Die Konstruktion von geeigneten Vektoren, welche die gewünschten Kodier- und Kontrollsequenzen enthalten, erfolgt unter Anwendung von Standardligationstechniken. Die isolierten Plasmide oder DNA-Fragmente werden gespalten, zurechtgeschnitten und in der zur Bildung der Plasmide gewünschten Form erneut ligiert.
Zur Analyse, um die korrekten Sequenzen in den konstruierten Plasmiden zu bestätigen, werden die Ligationsgemische verwendet, um E. coli K12-Stamm 294 (ATCC 31446) zu transformieren, und erfolgreiche Transformanten entweder nach Ampicillin- oder nach Tetracyclinresistenz selektiert, je nachdem, was sich besser eignet. Es werden Plasmide der Transformanten präpariert, durch Restriktion analysiert und/oder nach dem Verfahren von Messing et al., Nucleic Acids Res. 9, 309 (1981), oder nach dem Verfahren von Maxam et al., Methods in Enzymology 65, 499 (1980), sequenziert.
Die Wirtszellen können mit den Expressionsvektoren dieser Erfindung transformiert und in konventionellen Nährstoffmedien, die in geeigneter Weise zum Induzieren von Promotoren, zur Selektion von Transformanten oder zum Amplifizieren von Genen modifiziert wurden, kultiviert werden. Die Kulturbedingungen, wie z.B. Temperatur, pH und dergleichen, sind dieselben, die zuvor bei den zur Expression selektierten Wirtszellen verwendet wurden, und werden einem Fachmann auf diesem Gebiet klar sein.
"Transfektion" bezieht sich auf die Aufnahme eines Expressionsvektors durch eine Wirtszelle, unabhängig davon, ob tatsächlich irgendeine Kodiersequenz exprimiert wird oder nicht. Fachleuten auf diesem Gebiet sind zahlreiche Transfektionsverfahren bekannt, wie z.B. CaPO&sub4; und Elektroporation. Eine erfolgreiche Transfektion ist normalerweise daran zu erkennen, daß irgendein Anzeichen der Funktionsweise dieses Vektors innerhalb der Zelle auftritt.
Der Wachstumshormonrezeptor und das Bindeprotein oder der Anti-Wachstumshormonrezeptor-Antikörper wird zur Verabreichung vorbereitet, indem Wachstumshormonrezeptor und Bindeprotein oder Anti-Wachstumshormonrezeptor- Antikörper in der gewünschten Reinheit mit physiologisch annehmbaren Trägern vermischt werden. Solche Trägersubstanzen sind für die Empfänger in den angewandten Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch. Normalerweise beeinhaltet die Herstellung derartiger Präparate eine Kombination des jeweiligen Proteins mit Puffern, Antioxidantien, wie z.B. Ascorbinsäure, niedermolekularen Polypeptiden (weniger als etwa 10 Reste), Proteinen, Aminosäuren, Kohlenhydraten, einschließlich von Glucose oder Dextrinen, Chelatbildnern, wie z.B. EDTA, Glutathion und anderen Stabilisatoren und Exzipienten.
Zum besseren Verständnis der folgenden Beispiele werden bestimmte oft verwendete Verfahren und/oder Begriffe erklärt.
"Plasmide" werden durch ein kleines p nach und/oder vor Großbuchstaben und/oder Zahlen bezeichnet. Die hier benützten Ausgangsplasmide sind im Handel erhältlich, allgemein uneingeschränkt zugänglich oder können aus erhältlichen Plasmiden unter Verwendung veröffentlichter Vorgangsweisen hergestellt werden. Zusätzlich sind auf diesem Fachgebiet gleichwertige zu den beschriebenen bekannt und werden einem Fachmann auf diesem Gebiet klar sein.
"Digestion" bzw. "Spaltung" bezieht sich auf die katalytische Spaltung der DNA mit Restriktionsenzymen, die nur bei bestimmten Sequenzen innerhalb der DNA auftritt. Die verschiedenen Restriktionsenzyme, die hier verwendet werden, sind kommerziell erhältlich, und ihre Reaktionsbedingungen, Cofaktoren und anderen Erfordernisse wurden in einer einem durchschnittlich ausgebildeten Fachmann auf diesem Gebiet bekannten Weise eingesetzt. Für analytische Zwecke werden typischerweise 1 µg Plasmid oder DNA-Fragment gemeinsam mit 2 Units Enzym in etwa 20 µl Pufferlösung eingesetzt. Zur Isolierung von DNA-Fragmenten für die Plasmidkonstruktion werden typischerweise 5-50 µg DNA mit 20-250 Units Enzym in einem größeren Volumen gespalten. Geeignete Puffer und Substratmengen für spezielle Restriktionsenzyme werden vom Hersteller angegeben. Normalerweise werden Inkubationszeiten von etwa einer Stunde bei 37ºC verwendet, diese können jedoch nach der Beschreibung des Händlers variieren. Nach der Spaltung wird die Reaktionslösung direkt auf einem Polyacrylamidgel einer Elektrophorese unterzogen, um das gewünschte Fragment zu isolieren.
Die Auftrennung der Spaltfragmente nach der Größe erfolgt unter Einsatz von Gelelektrophorese, wie von Maniatis, T. et al., Molecular Cloning S. 133-134 (1982), beschrieben.
"Dephosphorylierung" bezieht sich auf die Entfernung der terminalen 5'-Phosphate durch Behandlung mit bakterieller alkalischer Phosphatase (BAP). Diese Vorgangsweise verhindert, daß die zwei durch Restriktionsspaltung entstandenen Enden eines DNA- Fragments einen "Ring" oder eine geschlossene Schleife bilden, was die Insertion eines anderen DNA-Fragments an der Restriktionsstelle verhindern würde. Die Verfahren und Reagentien der Dephosphorylierung sind konventionell. Maniatis, T. et al., Molecular Cloning S. 133-134 (1982). Reaktionen unter Einsatz von BAP werden bei 68ºC in 50 mM Tris ausgeführt, um die Aktivität jeglicher möglicherweise in den Enzympräparaten vorhandener Exonukleasen zu unterdrücken. Diese Reaktionen liefen 1 Stunde lang. Darauffolgend wurde das DNA-Fragment mittels eines Gels gereinigt.
"Oligonukleotide" bezieht sich entweder auf ein einstrangiges Polydesoxynukleotid oder auf zwei komplementäre Polydesoxynukleotid-Stränge, die chemisch synthetisiert sein können. Solche synthetischen Oligonukleotide haben kein 5'-Phosphat ligieren daher ohne Hinzufügung eines Phosphats mittels ATP in Anwesenheit einer Kinase nicht an andere Oligonukleotide. Ein synthetisches Oligonukleotid ligiert an ein Fragment, das nicht dephosphoryliert wurde.
"Ligation" bezieht sich auf den Vorgang der Ausbildung von Phosphodiesterbindungen zwischen zwei doppelstrangigen Nukleinsäurefragmenten (Maniatis, T. et al., ebenda, S. 146). Falls nicht anders erwähnt, erfolgt die Ligation unter Verwendung bekannter Puffer und Bedingungen von 10 Units T4-DNA-Ligase ("Ligase") pro 0,5 µg ungefähr äquimolarer Mengen der zu ligierenden DNA-Fragmente.
"Füllen" oder "Abstumpfen" bezieht sich auf jenen Vorgang, durch den das einstrangige Ende am kohesiven Terminus einer mit Restriktionsenzym gespaltenen Nukleinsäure in einen Doppelstrang übergeführt wird. Das beseitigt den kohesiven Terminus und ergibt ein "stumpfes" Ende. Dieser Vorgang ist ein geeignetes Instrument, um ein restriktionsgespaltenes Ende, das mittels entweder nur eines einzigen oder einiger anderer Restriktionsenzyme erzeugt wurde, in einen Terminus, der mit beliebigen "stumpf spaltenden" Restriktionsendonukleasen kompatibel ist, oder einen anderen abgestumpften, kohäsiven Terminus umzuwandeln. Typischerweise wird abgestumpft, indem 2-15 µg der Ziel-DNA in 10 mM MgCl&sub2;, 1 mM Dithiothreitol, 50 mM NaCl, 10 mM Tris-Puffer (pH 7, 5) bei etwa 37ºC in Anwesenheit von 8 Units des Klenow- Fragments von DNA-Polymerase I und jeweils 250 µM der 4 Desoxynukleosidtriphosphate inkubiert werden. Die Inkubation wird normalerweise nach 30 Minuten durch Extraktion mit Phenol- und Chloroform und Fällung mit Ethanol beendet.

BEISPIEL 1

Reinigung des Wachstumshormonrezeptors

a) Herstellung des hGH-Affinitätsgels

Das Affinitätsgel wurde größtenteils hergestellt wie von Roy, S.K. et al., J. Chromatog. 303, 225-228 (1984), beschrieben. 0,96 g Glycerylglas mit gesteuerter Porengröße wurden in 10 ml einer 0,1% Natrium-m-periodat in destilliertem Wasser suspendiert und 30 min lang bei Raumtemperatur gerührt, dann schnell mit 2x10 ml kaltem destilliertem Wasser gewaschen. 10 mg hGH in 9,3 ml phosphatgepufferter Salzlösung (pH 7, 4) wurden mit etwa 5 mg Natriumcyanoborhydrid dem aktivierten Gel zugegeben. Die Mischung wurde langsam über Nacht gerührt, woraufhin ein Proteinassay des Überstands 85% Bindung ergab. Die verbliebenen reaktiven Stellen wurden durch Zugabe von 5 ml 2 M Ethanolamin-HCl (pH 8) mit etwa 5 mg Natriumcyanoborhydrid und Rühren bei 4ºC über einen Zeitraum von 48 Stunden blockiert. Das Gel wurde dann auf einer Glassinternutsche mit drei Zyklen abwechselnder Zugabe von Natriumacetat mit 0,5 M NaCl (pH 4) und Tris-HCl mit 0,5 M NaCl (pH 8, 5), jeweils 50 ml für jeden Wachvorgang, gewaschen. Dann wurde mit 50 ml 50 mM Tris-HCl mit 0,1% Triton X-100 (Tris-Triton), 20 ml 6 M Harnstoff in Tris- Triton, 50 ml Tris-Triton, 20 ml 5 M MgCl&sub2; in Tris-Triton, 30 ml Tris-Triton, 13 ml 4,5 M Harnstoff in Tris-Triton (der Durchfluß wurde 30 min lang gestoppt) und zum Abschluß mit 200 ml Tris-Triton gewaschen. Das Gel enthielt etwa 3,5 mg hGH/ml Gel und wurde bei 4ºC in Tris-Triton mit 0,02% Natriumazid gelagert.

b) Leberrezeptorextraktion

Der GH-Rezeptor wurde durch Membransolubilisierung in Triton-X100 und GH- Affinitätschromatographie aus Kaninchenleber gereinigt. Die Reinigung wurde durch Assays auf die spezifische Bindung von hohe Affinität aufweisendem, ¹²&sup5;I-markiertem, menschlichem Wachstumshormon (hGH) überwacht. Insgesamt wurde der Rezeptor mit einer Ausbeute in der Größenordnung von 30% durch die Anwendung von Affinitätschromatographie auf das 59.000fache gereinigt. Das gereinigte Material zeigte bei der Elektrophorese auf reduziertem SDS-Gel eine Hauptbande bei 130 kD, die als der Rezeptor identifiziert wurde (siehe weiter unten). Auf dieser Stufe wurde der Rezeptor basierend auf der SDS-Gelanalyse und einer theoretisch maximalen spezifischen Bindung von 7.700 pMol/mg, unter der Voraussetzung, daß pro 130 kD Rezeptor 1 Mol Hormon gebunden wird, auf eine Reinheit von 40% geschätzt. Die hohe Affinitätsbindungskonstante für hGH an den gereinigten Rezeptor ist Ka = 30x10&sup9; M&supmin;¹ (siehe unten, Fig. 3).
Die Reinigung folgte dem Verfahren von Waters und Friesen (J. Biol. Chem. 254, 6815- 6825 [1979]) mit einigen wichtigen Verbesserungen und Modifikationen. Erstens wurde die Proteolyse des Rezeptors durch die Verwendung von frisch erhaltener Kaninchenleber und den extensiven Einsatz von Proteaseninhibitoren während der Reinigung verhindert. Die Reinigung aus gefrorener Kaninchenleber oder das Altern des gereinigten Rezeptors ergaben einen geringen Verlust an Bindungsaktivität, aber eine Analyse durch SDS-Gelelektrophorese ergab, daß das isolierte Material nur wenig von der 130 kD Bande dafür viel mehr von einer breiten Bande bei 50-60 kD enthielt. Diese Proteolyse ist wahrscheinlich die Erklärung für die Größe von 50-67 kD, die von anderen für den Kaninchenleberrezeptor angegeben wird. Basierend auf Quervernetzungsexperimenten für den GH-Rezeptor aus IM-9-Lymphozyten (Asaka, K. et al., Biochem. J. 238, 379-386 [1986]); Rattenadipozyten (Carter-Su, C. et al., J. Biol. Chem. 259, 1099-1104 [1986]); und Rattenhepatozyten (Donner, D., J. Biol. Chem. 258, 2736-2743 [1983]) wurden Molekulgewichte von etwa 110 kD beschrieben.
Die zweite größere Verbesserung war die Optimierung der GH-Affinitätssäule. Die Säule wurde kleiner gemacht, um nichtspezifische Bindungen zu minimieren, und ein noch stabilerer Träger, nämlich Glycerylglas mit gesteuerter Porengröße, in Kombination mit einem stabileren Bindungsverfahren verwendet (Roy, S.K., siehe oben). Dieser Träger ermöglichte den Einsatz von ausgiebigen Waschungen unter Miteinbeziehung von 4,5 M Harnstoff (in dem nur 11% der Aktivität eluierten, Tabelle 1). MgCl&sub2;-Elutionen der Affinitätssäule ergaben eine 12.500fache Reinigung.
Die 130 kD Bande auf SDS-Gel wurde durch Immunoblotten als Rezeptor identifiziert (Fig. 1b). Einige monoklonale Anti-Rezeptor-Antikörper wurden bereits früher beschrieben, aber nur einer, Mab5, band sich gut an den SDS-denaturierten und reduzierten Rezeptor. Dieser Antikörper markierte die 130 kD Bande sowie zwei scharfe Banden im Bereich von 100 kD (Fig. 1b) deutlich. Einige niedriger molekulare Banden, vermutlich Abbauprodukte, wurden bei längerer Entwicklungszeit sichtbar. Es wurde bereits gezeigt, daß Mab5 die Rezeptorbindeaktivität aus solubilisierten Membranen fällt (Barnard, R. et al., Endocrinology 115, 1805-1813 [1984]). Zwei andere monoklonale Antikörper, Mab7 und 263, die in der Nähe der Hormonbindestelle binden, binden ebenfalls spezifisch die 130 kD Bande; das Signal, das der reduzierte Rezeptor im Immunoblot ergab, war jedoch wesentlich schwächer. SDS-Gelelektrophorese des nicht-reduzierten Rezeptors ergab einen hochmolekularen Komplex, der kaum in das Gel eindrang (Fig. 1a) und der sich, selbst bei einem geringen Prozentsatz an Acrylamid, nicht in Banden auflöste. Vom reduzierten und SDS-denaturierten Material wurde keine nennenswerte Aktivität wiedergewonnen.
Junge (2 kg), weibliche, weiße Neuseelandkaninchen wurden anästhesiert, deren Leber entfernt und sofort in eiskalten Puffer mit 0,3 M Saccharose, 10 mM Tris-HCl und 1 mM EDTA (pH 7, 4) eingebracht. Die Verarbeitungszeiten wurden verringert, indem für jedes Präparat nur 3-4 Kaninchen verwendet wurden. Diese Lebern wurden gewogen, in kleine Stücke geschnitten (< 0,5 cm), und im 5fachen Volumen (v/w) frischen, eiskalten Saccharosepuffer, der 30.000 Kallikrein-Inhibitor-Units (KIU) pro Liter Aprotinin und 2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) enthält. Das PMSF wurde in 5 ml Isopropanol gelöst und unmittelbar vor der Verwendung zugegeben. Die Suspension wurde bei hoher Geschwindigkeit homogenisiert (Tekmar Modell SDT-1810 Homogenisierer mit SDT-182EN Sonde), bis sie einheitlich war (etwa 2 min lang), wobei die Temperatur unter 4ºC gehalten wurde. Benzamidin-hydrochlorid, gelöst in einer geringen Menge an 50 mM Tris-HCl (pH 7, 4), wurde auf 10 mM zugegeben und vermischt, dann wurde das homogenisierte Material 20 min lang bei 4ºC und 14.000 g zentrifugiert (Sorval GS3 Rotor, 9000 U/min). Der Überstand wurde durch ein Glasfasersieb filtriert, um die Fettschicht, die sich manchmal an der Oberfläche bildete, zu entfernen, und dann bei 142.000 g (Beckmann 45 Ti Rotor, 35.000 U/min) 60 min lang bei 4ºC zentrifugiert. Die oben befindliche Fettschicht und der klare Überstand wurden verworfen und das Pellet im 1,5fachen Volumen (basierend auf dem ursprünglichen Lebergewicht) an 50 mM Tris-HCl (pH 7, 4) mit 1% Triton X-100 (TX- 100), 50.000 KIU/l Aprotinin, jeweils 7 µg/ml Pepstatin und Leupeptin, 1 mM PMSF und 1mM α-Aminoacetonitril bei Raumtemperatur erneut suspendiert. Das Pellet wurde bei einem Viertel der Geschwindigkeit gut bis zur Einheitlichkeit homogenisiert (Tekmar, etwa 30 s lang), dann bei Raumtemperatur auf einen Magnetrührer gestellt. Benzamidin-hydrochlorid wurde auf 10 mM zugegeben und die Suspension bei mäßiger Geschwindigkeit 20 min lang gerührt. Der Extrakt wurde bei 235.000 x g (Beckmann Ti Rotor, 45.000 U/min) 90 min lang bei 4ºC zentrifugiert. Der resultierende, klare, rote Extrakt wurde vorsichtig mittels einer 50 ml Spritze entfernt, wobei darauf achtgegeben wurde, weder die dünne Fettschicht an der Oberfläche mitaufzuziehen noch das Pellet zu zerstören. Diesem Extrakt wurden PMSF auf 1 mM, NaCl auf 150 mM und MgCl&sub2; auf 12 mM zugegeben. Diese Lösung wurde auf die Affinitätssäule aufgegeben.

c) Affinitätschromatographie

Mit diesem eiskalten Lebermembranextrakt wurde eine 1 ml hGH-Affinitätssäule mit 18 ml/h beschickt. Die Säule wurde dann mit 10 ml eiskaltem 1% TX-100 in 50 mM Tris- HCl (pH 7, 4) mit 18 ml/h, dann mit 50 ml eiskaltem 1% TX-100 mit 0,5 M NaCl in 50 mM Tris-HCl (pH 7, 4) mit 150 ml/h und schließlich mit 10 ml eiskaltem Tris-Triton mit 150 ml/h gewaschen. Die Säule wurde auf Raumtemperatur erwärmt und mit 5 ml raumtemperiertem 4, 5 M Harnstoff in Tris-Triton eluiert, wobei zuerst 1 ml auf die Säule aufgegeben wurde und dann der Fluß für 10 min unterbrochen wurde. Dieser Vorgang wurde für die nächsten 3 ml wiederholt, wobei jedesmal 10 min gewartet wurde, erst der letzte ml wurde durchfließen gelassen, gefolgt von 2 ml Tris-Triton. Die Harnstoff-Fraktionen wurden allesamt in 5 ml eiskaltem Tris-Triton mit 10 mM Benzamidin-HCl gesammelt. Die Säule wurde anschließend mit 5 ml raumtemperiertem 4,5 M MgCl&sub2; in Tris-Triton (pH etwa 5), gefolgt von 2 ml Tris-Triton eluiert. Dieses Eluat wurde auch in 5 ml kaltem Tris-Triton mit 10 mM Benzamidin-HCl gesammelt. Das Harnstoff- und das MgCl&sub2;-Eluat wurden bei 4ºC gegen 2 x 1 l desselben Puffers dialysiert und dann bei -80ºC gelagert.
Einige Proben des MgCl&sub2;-Eluats wurden bei dieser Stufe durch Zugabe von festem Guanidin-HCl zur dialysierten Probe auf eine Endkonzentration von 5, 3 M acetyliert und der pH mit 1 M Natriumhydroxid auf 8,5 eingestellt. Dithiothreitol (DTT) wurde auf 10 mM zugegeben, dann wurde die Lösung unter Stickstoff in einem Röhrchen eingeschlossen und im Dunkeln über Nacht bei 4ºC gelagert. Unter gedämpftem Licht wurde Iodessigsäure, die in 1 M NaOH (etwa pH 7,5) gelöst war, der Probe auf 50 mM Endkonzentration zugegeben und der pH auf 8-8,5 eingestellt. Die Probe wurde mit Stickstoff gespült und im Dunkeln bei Raumtemperatur 25 min lang inkubiert. Anschließend wurde 2-Mercaptoethanol auf 1% (v/v) zugegeben und die Probe bei 4ºC im Dunkeln gegen 2 x 1 l Tris-Triton mit 10 mM Benzamidin-HCl dialysiert.

BEISPIEL 2

Reinigung des Wachstumshormonbindeproteins

Das GH-Serumbindeprotein wurde in einer Ausbeute von 14% nach einem zweistufigen Verfahren auf das 400.000fache gereinigt, beginnend mit gefrorenem Kaninchenserum. Gemäß diesem Verfahren wurde eine GH-Affinitätssäule eingesetzt wie jene, die für den Leberrezeptor verwendet wurde, gefolgt von einer Gelfiltrationssäule unter nichtreduzierenden Bedingungen, was eine Verunreinigung entfernte, die bei der Elektrophorese mit reduziertem SDS-Gel mit dem Serumbindeprotein mitwanderte. Das letzlich erhaltene material besaß, basierend auf der SDS-Gelanalyse und einer theoretisch maximalen Bindung von 20.000 pMol/mg, unter Annahme von 1 Mol GH- Bindung pro 51 kD, eine Reinheit von mehr als 70%.
Das Serumbindeprotein wurde in ähnlicher Weise wie der Leberrezeptor gereinigt. 500 ml gefrorenes Kaninchenserum wurden bei 4ºC aufgetaut, wobei Aprotinin auf 50.000 KIU/l und Benzamidin-HCl (gelöst in 10 ml 50 mM Tris-HCl pH 7,4) auf 10 mM zugegeben wurde. Sobald das Serum aufgetaut war, wurde PMSF auf 2 mM und MgCl&sub2; auf 12 mM zugegeben, anschließend das Serum bei 16.000 g (Sorval GSA Rotor, 10.000 U) 20 min lang bei 4ºC zentrifugiert. Der Überstand wurde durch Whatman 541-Filterpapier filtriert, um schwebende Fettpartikel zu entfernen, dann in ein Eisbad eingebracht und auf die oben beschriebene Affinitätssäule aufgegeben. Kreuzkontamination mit dem Leberrezeptor wurde durch die Verwendung einer eigenen Affinitätssäule verhindert. Die Säule wurde mit 15 ml eiskaltem 50 mM Tris- HCl (pH 7,4) mit 18 ml/h, 50 ml eiskaltem 50 mM Tris-Triton mit 0,5 M NaCl mit 150 ml/h und 10 ml eiskaltem 50 mM Tris-HCl (pH 7,4) mit 150 ml/h gewaschen. Die Elution wurde wie oben beschrieben durchgeführt, außer daß die Puffer kein TX-100 enthielten. Allerdings wurde TX-100 in der Verdünnung und in den Dialysepuffern belassen, um potentielle Verluste während der Dialyse zu verhindern. Die dialysierten Fraktionen wurden bei -80ºC gelagert.
Die Anwesenheit einer Verunreinigung, die auf SDS-Gelen unmittelbar vor der Bindeproteinbande läuft, macht es notwendig, vor der Elektroelution einen Gelfiltrationsschritt einzuschieben. Eine 1 x 47 cm Sephacryl S300 Säule wurde bei Raumtemperatur mit 50 mM Tris-HCl (pH 7, 4) mit 0,15 M NaCl und 0,02% NaN&sub3; äquilibriert. Das dialysierte MgCl&sub2;-Eluat aus der Affinitätssäule wurde bei 4ºC mit einem Centricon 30 Konzentrator (Amicon) auf etwa 0,5 ml konzentriert und auf die Gelfiltrationssäule aufgebracht. Das Bindeprotein wurde bei Raumtemperatur mit einer Flußrate von 6 ml/h eluiert. Es wurden Fraktionen von 0,5 ml abgenommen, auf Bindungsaktivität untersucht und dann basierend auf den Assayergebnissen und einem SDS-Gel der Fraktionen gepoolt.

BEISPIEL 3

Wachstumshormonbindeassays

a) Radiomarkierung des Proteins

hGH wurde nach dem Lactoperoxidase-Verfahren iodiert (Thorell, J.I. et al., Biochem. Biophys. Acta 251, 363-369 [1971]). 10 µl hGH (1 mg/ml in 3 mM Natriumphosphat, pH 7,4), 20 µl 0,3 M Natriumphosphat (pH 7,0), 5 µl Lactoperoxidase (35 µg/ml in 0,1 M Natriumphosphat, pH 7, 0) und 10 µl trägerfreies Na¹²&sup5;I (100 µCi/ml) wurden vereinigt und anschließend 25 µl 0,65 mM H&sub2;O&sub2; zugegeben, um die Reaktion zu starten. Nach 5 min wurde die Reaktion durch Zugabe von 0,5 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) pH 7,4 mit 0,1% BSA und 0,02% Natriumazid gestoppt. Monomeres ¹²&sup5;I-hGH wurde auf einer 1,5 x 45 cm Sephadex G-75 Säule, die mit demselben Puffer äquilibriert worden war, isoliert. Fraktionen von etwa 2,5 ml wurden in Röhrchen, die 0,5 ml PBS mit 3% (w/v) BSA und 0,02% (w/v) Natriumazid enthielten, gesammelt. Um Kontamination mit dem Dimer zu vermeiden, wurden nur der hGH-Peak und die danach anfallenden Fraktionen gepoolt und bei -20ºC gelagert. Die spezifische Aktivität, berechnet nach dem Verfahren von Greenwood et al. (Biochem. J. 89, 114- 123 [1963]), variierte zwischen 44-144 µCi/µg.
Zur Lodierung des gereinigten Rezeptors oder Bindeproteins wurde das Iodierverfahren angewandt (Fraker, P.J. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 80, 849-857 [1978]). Polypropylenröhrchen (12 x 75 mm) wurden mit 10 µl einer 1mg/ml Iod-Lösung in Chloroform beschichtet. Unmittelbar vor dem Einsatz wurden die Röhrchen mit destilliertem Wasser ausgespült, und 50-100 µl Proteinlösung in Tris-Triton wurden gemeinsam mit 5 µl (0,5 mCi) Na¹²&sup5;I zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde auf Eis 20 min lang inkubiert, dann in 1 ml eiskaltes Aceton übergeführt und auf Eis weitere 20 min lang inkubiert. Das ausgefällte Protein wurde bei 16.000 g 10 min lang zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Pellet wurde mit 1 ml eiskaltem Aceton gewaschen und wie zuvor zentrifugiert. Das Pellet wurde in Tris-Triton gelöst und bei -80ºC gelagert. Die spezifische Aktivität wurde nicht bestimmt, aber 0,2-0,5% der gesamten ¹²&sup5;I-Radioktivität waren mit Aceton fällbar.

b) hGH-Bindungsassays

Zur Routinebestimmung der Wiederfindungsraten, wurde ein Verdünnungsassay verwendet, der auf dem von Herrington & Veith (Endocrinology 101, 984-987 [1977]) beschriebenen Verfahren basiert. Dabei wurden aufeinanderfolgend zweifache Verdünnungen in Assaypuffer (50 mM Tris-HCl mit 10 mM MgCl&sub2; oder CaCl&sub2; und 0,1% BSA mit 0,02% Natriumazid, pH 7,4) für jede Probe in 12 x 75 mm Polypropylenröhrchen hergestellt. Etwa 30.000 cpm ¹²&sup5;I-hGH wurden pro Röhrchen zugegeben, entweder in An- oder Abwesenheit von 1 µg/ml (Endkonzentration) unmarkiertem hGH. Das Endvolumen pro Röhrchen betrug 0,5 ml. Die Proben wurden normalerweise je zweimal gemessen. Die Röhrchen wurden über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert, dann wurde der Assay durch Zugabe von 0,5 ml 0,1% Rinder-γ-globulin und 1 ml 30% (w/v) Polyethylenglykol 8000 (beide bei 4ºC in phosphatgepufferter Salzlösung mit 0,02% Natriumazid) gestoppt, gründlich vermischt und bei 4000 g (Sorval HS4 Rotor, 5000 U/min) 20 min bei 4ºC zentrifugiert. Die Überstände wurden verworfen, die Pellets getrocknet und umgedreht und dann die γ- Strahlung 1 min lang gemessen. Die spezifische Bindung wurde durch Subtraktion der Zählungen jener Proben, die unmarkiertes hGH im Überschuss enthielten, von den Zählungen der entsprechenden Proben ohne unmarkiertes hGH bestimmt. Die spezifische Bindung im 1-10% Bereich verhielt sich linear zur Rezeptorkonzentration, daher wurden die Wiederfindungsraten für verdünnte Proben in diesem Bereich folgendermaßen berechnet:
Relative Ausbeute = B&sub1; . V&sub1; . D&sub1; / B&sub2; . V&sub2; . D&sub2;
wobei B die Zählungen an spezifisch Gebundenem, V das Probenvolumen und D der Verdünnungsfaktor sind.
Für das Serumbindeprotein wurde der Assay wie oben beschrieben durchgeführt, außer daß der monoklonale Antikörper 263 (Barnard, R. et al., Biochem. J. 231, 459-468 [1985]) mit einer Endverdünnung von 1/2000 während der Inkubation zugegeben wurde, um den hGH-Bindeprotein-Komplex durch Polyethylenglykol fällbar zu machen.
Für die Scatchard-Analyse (Ann. N.Y. Acad. Sci. 51, 660-672 [1949]) wurden die Assays wie oben beschrieben durchgeführt, außer daß die Proben bei jeder Konzentration an unmarkiertem Hormon je dreimal gemessen wurden, daß die Inkubationszeit mindestens 18 Stunden betrug und unmarkierte Hormone den Assayproben in einem Bereich von 0 bis 10.000 ng/ml zugegeben wurden. Unter Anwendung des Scatchard- Verfahrens wurde die Konzentration der Bindungsstellen (pM) bestimmt. (Siehe z.B. Fig. 3a). Diese Verdrängungskurven wurden mit dem Programm LIGAND (Munson, P.J. und Rodbard, D., Anal. Biochem. 107, 220-239 [1980]) analysiert, das an einigen Stellen modifiziert worden war, um es auf einem VAX-Computer (Digital Equipment) laufen lassen zu können.

c) Protein Assays

Die Proteinkonzentrationen wurden nach dem Verfahren von Bradford, M., Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976), mit Rinderserumalbumin (BSA) als Standard gemessen. Für Proben, bei denen das Protein zu verdünnt war, um es im Bradford-Verfahren zu dedektieren, und bei denen Detergentien einen starken Hintergrund verursachten, wurden Proben und Standard(s) ausgiebig gegen 1 mM HCl mit 0,1% TX-100 bei 4ºC dialysiert, um Interferenz durch Tris zu entfernen, und dann nach dem Fluorescamin- Verfahren (Bohlen, R. et al., Arch. Biochem. Biophys. 155, 213-220 [1973]) unter Verwendung von BSA als Standard untersucht. Für sehr verdünnte Proben wurde das mdifizierte Fluorescamin-Verfahren von Stowell et al., Anal. Biochem. 85, 572-580 (1978) verwendet. Dies umfaßte eine Hydrolyse der Proben und Standard(s) in 2 N NaOH bei 100ºC für 24 Stunden, teilweise Neutralisation mit HCl und Bestimmung der freien Aminogruppen im Hydrolysat unter Anwendung des normalen Fluorescamin- Assayverfahrens. Um die Verdünnung, die durch die Zugabe von NaOH und HCl verursacht wird, zu verringern, wurden konzentrierte Reagentien anstelle der von Stowell et al. beschriebenen verwendet. Die Fluoreszenz wurde auf einem Perkin- Elmer-Spektralfluorimeter, Modell 650-105, unter Anregung bei 390 nm und Emission bei 480 nm gemessen. Die Hydrolyse erhöhte die Assayempfindlichkeit um etwa das 7fache gegenüber den nicht hydrolysierten Proben.

BEISPIEL 4

Proteinsequenzbestimmung

Elektroeluiertes Protein mit 130 kD wurde mit Trypsin gespalten, indem das Protein in 50 mM Tris-HCl (pH7,4) mit 0,1% (v/v) TX-100 gelöst und TPCK-Trypsin, das in 10 mM CaCl&sub2; (0,3 M Endkonzentration) gelöst war, auf 1% (w/w) des 130 kD-Proteins zugegeben wurde. Die Proben wurden über Nacht bei 37ºC inkubiert und anschließend ein zweites 1%-Aliquot (w/w) des TPCK-Trypsins zugegeben. Nach weiteren 6 Stunden bei 37ºC wurden die Proben eingefroren und bei -20ºC gelagert. Die Spaltung wurde durch SDS-PAGE bestätigt. Die mit Trypsin gespaltenen Peptide wurden mittels Reverse- Phase-HPLC unter Verwendung einer 4,6 x 100 mm Synchrom RP-P C18 Säule isoliert. Das Spaltungsgemisch wurde mit dem gleichen Volumen an 50 mM Tris-HCl (pH 7,6) mit 8 M Harnstoff und 25 mM DTT verdünnt, dann in die Säule injiziert, die vorher mit 1% 1-Propanol mit 0,1%-iger Trifluoressigsäure (TFA) äquilibriert worden war. Die Peptide wurden mit einem linearen 1-30% 1-Propanolgradienten im Bereich von zwischen 58 und 116 min eluiert. Die Flußrate betrug 0,5 ml/min. Die Peaks werden basierend auf der Absorption bei 214 und 280 nm (Fig. 5) gesammelt.
Die Spaltung mit S. aureus V8 Protease wurde durchgeführt, indem das elektroeluierte, reduzierte und carboxymethylierte 130 kD-Protein in 0,1 M Ammoniumbicarbonat (pH 8,0) mit 0,1% (v/v) TX-100 gelöst und 2% (w/w) Protease zugegeben wurde. Nach 3 Stunden bei 37ºC wurden weitere 2% (w/w) Protease zugegeben und die Probe über Nacht bei 37ºC gespalten. Die Spaltung wurde mittels SDS-PAGE bestätigt. Die Probe wurde dann im Vakuum getrocknet und in 20 mM Tris-HCl (pH 8,0) mit 7 M Guanidin- HCl und 20 mM DTT erneut gelöst. Diese Lösung wurde auf eine 2,1 x 100 mm Brownlee RP-300-C4-RP-HPLC-Säule, die zuvor mit 1% 1-Propanol mit 0,1% (TFA) äquilibriert worden war, aufgegeben und die Peptide mit einem linearen 1-30% 1- Propanolgradienten innerhalb von 58 min eluiert. Die Flußrate betrug 0,5 ml/min. Die Peaks wurden wie oben gesammelt (Fig. 6).
Proben für die Aminosäuresequenzierung wurden im Vakuum getrocknet und in 70% Ameisensäure erneut gelöst. Dann wurden sie auf einen Dampfphasensequenzer Modell 470A von Applied Biosystems, Inc. aufgegeben und durch sequentiellen Edman-Abbau analysiert.
Zur Bestimmung der Aminosäurezusammensetzung wurden die Proben in Pyrexröhrchen getrocknet, in 6 M HCL erneut gelöst und 24 Stunden lang bei 110ºC in evakuierten Röhrchen hydrolysiert. Die Proben wurden auf einem Beckman Aminosäureanalysegerät Modell 6300 analysiert.

a) Glykosidasespaltung

Die Neuramidasespaltung erfolgte mittels Acetonfällung (Zugabe von 5 Volumsteilen Aceton, Inkubation bei -20ºC für 30 min, Zentrifugation bei 16.000 g, Verwerfen des Überstands und Vakuumtrocknen des Pellets) eines Aliquots des ¹²&sup5;I-markierten 130 kD Rezeptors in Anwesenheit von 200 KIU Aprotinin und Wiederauflösen in Neuramidaselösung (1 U/ml in 50 mM Natriumacetat (pH 5, 5) mit 154 mM NaCl und 4 mM CaCl&sub2;). Dieses Gemisch wurde bei 37ºC über Nacht inkubiert, dann das Protein mit Aceton gefällt und in Laemmli-Probenpuffer mit 10 mM DTT erneut gelöst.
Die N-Glykanasespaltung erfolgte nach der Vorschrift, die zusammen mit dem Enzym geliefert wurde. Ein Aliquot des ¹²&sup5;I-130 kD Rezeptors wurde wie oben gefällt und in 10 µl 0,5% SDS mit 0,1 M 2-Mercaptoethanol erneut gelöst. Diese Lösung wurde 3 min lang auf 100ºC erhitzt, dann wurden 10,8 µl 0,55 M Tris-HCl (pH 8,6), 3 µl 100 mM Phenantrolin in Methanol (1:10) und 5 µl 7,5% NP-40-Detergens zugegeben und vermischt. 0,5 µl N-Glykanase (250 U/ml) wurden zugegeben und die Probe bei 37ºC über Nacht inkubiert. Das Protein wurde dann mit Aceton gefällt und in Laemmli- Probenpuffer mit 10 mM DTT erneut gelöst.

b) Affinitätsquervernetzung

Eine 0,5 ml Probe des affinitätsgereinigten Serumbindeproteins wurde bei 4ºC gegen 2 x 150 ml 25 mM HEPES-Puffer (pH 7,6) dialysiert. Zwei 100 µl Proben wurden mit 390 µl 25 mM HEPES (pH 7,5) mit 10 mM MgCl&sub2; und 0,05% BSA verdünnt, und 1 µl 1 mg/ml hGH zu einer Probe zugegeben. 10 µl ¹²&sup5;I-hGH (395.000 cpm) wurden jedem Röhrchen zugesetzt und die Proben für 4 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Proben wurden dann mit 0,4 ml desselben Puffers verdünnt, auf Eis gekühlt und 100 µl 11 mM Disuccinimidsuberat in Aceton zugegeben. Nach 30 min bei 0ºC wurden 10 µl 1 M Glycin in 25 mM HEPES (pH 7,2) zugesetzt, um die Reaktion zu stoppen. Aliquote von 12 µl (etwa 5000 cpm) wurden mit Aceton gefällt und (nicht reduziert) auf ein 9,5% SDS-Gel geladen. (Es wurden kleine Aliquote verwendet, um eine Überladung des Gels mit BSA zu verhindern). Das fertige Gel wurde mit Silber gefärbt, getrocknet und bei 80ºC mit einem Kodak X-Omat AR Film und einem Verstärkerschirm autoradiographiert.
Beträchtlicher Aufwand ging in die Optimierung des Affinitätsreinigungsschritts. Frühere Versuche mit Affigel-10 (Bio-Rad) als Affinitätsträger ergaben eine Reinigung von weniger als 1000fach und eine Rückgewinnung von nur 15-20% der Bindungsaktivität. Die auftretende niedrige Rückgewinnung konnte auf ein unerwünschtes Austreten von hGH aus der Säule während der Elution zurückgeführt werden. Da diese Bedingung nicht durch ausgiebiges Waschen korrigiert werden konnte, wurde ein alternativer Träger, Glycerylglas mit gesteuerter Porengröße (CPG), in Verbindung mit einer stabileren Kupplungschemie (Roy et al., siehe oben) verwendet. Tests, die mit an diesen Träger gebundenem ¹²&sup5;I-hGH durchgeführt wurden, zeigten, daß es nur mehr zu einem geringen Verlust der Liganden kam. Des weiteren zeigte der Rezeptor unter Verwendung dieses Trägers eine stärkere Bindung und erlaubte damit ausgiebiges Waschen mit Puffer und Elution der Verunreinigung mit 4,5 M Harnstoff vor der Elution des Rezeptors mit 4,5 M MgCl&sub2;. Bei der Affigel-Säule eluierten sowohl der Rezeptor als auch die Verunreinigungen mit Harnstoff. Die Verwendung des CPG-Trägers verdoppelte die Bindungswiederfindungen und erhöhte die Rezeptorreinheit um mindestens das 10fache.
Die Verringerung der Säulengröße erhöhte ebenfalls die Reinheit, da sich zeigte, daß sich nicht-spezifische Bindungen proportional zum Säulenvolumen verhalten. Eine 1 ml Säule war mehr als ausreichend, um die Gesamtmenge an Rezeptor aus 4 Kaninchenlebern oder 500 ml Kaninchenserum zu binden.

c) Reinigung des Leberrezeptors

Die Ergebnisse der Kaninchenleber-Wachstumshormonrezeptor-(GHR-)Reinigung sind in Tabelle 1 und einem SDS-Gel des Affinitätsreinigungsschritts, das in Fig. 1a gezeigt wird, zusammengefaßt. Der Affinitätsschritt ergab eine Reinigung auf das 12.500fache und einen Rezeptor mit etwa 40% Reinheit, bezogen auf das reduzierte Molekulargewicht von 130 kD für das Hauptprotein. Es zeigte sich, daß dieses Protein ziemlich empfindlich gegenüber Proteasen war und nur dadurch erhalten werden konnte, daß die Präparate so kalt wie möglich gehalten und ansehnliche Mengen an Proteaseninhibitoren - speziell zum TX-100 Extrakt - zugegeben wurden und daß schnell gearbeitet wurde. Diese Empfindlichkeit gegenüber Proteolyse könnte auch frühere geringere Angaben über das Molekulargewicht für diesen Rezeptor erklären.
Auf einem nicht reduzierten SDS-Gel verschwand die 130 kD Bande - gemeinsam mit den meisten der niedermolekularen Banden - und es war nur eine diffuse Bande am Kopf des Trenngels zu erkennen. Dies läßt vermuten, daß der extrahierte Rezeptor ein disulfidgebundener Komplex ist und daß viele der niedermolekularen Banden entweder über Disulfid an den Rezeptor gebunden oder Fragmente davon sind. Es erklärt auch, warum diese anderen Proteine von der Affinitätssäule zurückgehalten wurden. Wenn er auf einem Gel nicht-reduziert laufen gelassen wurde, produzierte dieser Komplex nur eine diffuse Proteinschmier ohne definiertes Molekulargewicht. Tabelle 1 Reinigung des Wachstumshormonrezeptors aus Kaninchenleber
* beginnend mit 220 g frischer Leber.

d) Reinigung des Wachstumshormonbindeproteins

Tabelle 2 faßt die Reinigung des Kaninchen-Wachstumshormonbindeproteins zusammen, und Fig. 2a zeigt ein SDS-Gel der Affinitätssäulenfraktionen und des abschließenden S300-Pools. Die Affinitätssäule reinigte das Wachstumshormonbindeprotein auf das 63.000fache und ergab Material, das etwa 16% Reinheit besaß, basierend auf einem Molekulargewicht von (nicht-reduziert) 51 kD. Als Hauptverunreinigungen zeigten sich Immunoglobuline und andere hochmolekulare Proteine, von denen viele durch die S300-Säule entfernt wurden. Die Bindungsaktivität entsprach genau der diffusen Bande um 51 kD.
Das Harnstoffeluat enthielt einen größeren Anteil der Bindungsaktivität, als im Leberpräparat zu erkennen war, und war im wesentlichen in der Gesamtbindung äquivalent zum MgCl&sub2;-Eluat. Da dieses jedoch deutlich weniger rein war als das MgCl&sub2;- Eluat, wurden die Harnstoffeluate für eine spätere wiederholte Reinigung auf der Affinitätssäule aufbewahrt. Tabelle 2 Reinigung des Wachstumshormonbindeproteins aus Kaninchenserum
* beginnend mit 500 ml Serum
** Die Ausbeute in diesem Schritt ist niedriger als im Normalfall. Es wurden daher für gewöhnlich in der MgCl&sub2;-Eluat-Stufe 2 Präparate vereinigt und gemeinsam verarbeitet, um fixe Verluste zu verringern.

e) Charakterisierung des Affinitätssäuleneluats-Leberrezeptor

Scatchard-Analyse der Bindungs/Verdrängungs-Versuche mit ¹²&sup5;I-hGH als Tracer und unmarkiertem hGH als konkurrierendem Ligand zeigte eine geringfügige, aber deutlich erkennbare Krümmung, wenn sowohl das Harnstoff- als auch das MgCl&sub2;-Eluat getestet wurden (Fig. 3a, b). Unter Verwendung eines zwei Stellen-Modells wurden Assoziationskonstanten für die Stellen mit hoher Affinität von KA = 9,8 x 10&sup9; M&supmin;¹ für das Harnstoffeluat und 28 x 10&sup9; M&supmin;¹ für das MgCl&sub2;-Eluat erhalten. Die Assoziationskonstanten für das Harnstoffeluat waren deutlich niedriger als für das MgCl&sub2;-Eluat. Für die Stellen mit niedriger Affinität galt in beiden Fällen KA = 10&sup8; M&supmin;¹. Da die Auswirkung dieser Stellen gering ist, wurden die Assoziationskonstanten nur ungenau bestimmt.
Verdrängungsversuche mit ¹²&sup5;I-hGH als Tracer und menschlichem Wachstumshormon (hGH), Rinderwachstumshormon (bGH) oder Eiprolactin (O-PRL) zeigten klare Unterschiede zwischen den Harnstoff- und den MgCl&sub2;-Eluaten. Beim Harnstoffeluat wurde ¹²&sup5;I-hGH um einiges schlechter von bGH verdrängt als von hGH und ganz schlecht von O-PRL. Das ist für den sogenannten somatogenen Rezeptor in Kaninchenleber charakteristisch.
Beim MgCl&sub2;-Eluat waren die Ergebnisse insofern überraschend als bGH etwa 20% des Tracers in niedriger Konzentration ersetzte, aber auch bei sehr hoher Konzentration (1 µg/ml) den Rest nicht verdrängen konnte. Das Ausmaß der Verdrängung von bGH lag im Bereich von 15-70%, abhängig von der Rezeptorkonzentration und der Assayinkubationszeit. O-PRL konnte den Tracer bei hohen Konzentrationen vollständig verdrängen, war aber etwa 40fach weniger effektiv als hgH. Der Verlauf der O-PRL- Verdrängungskurve läßt vermuten, daß mehr als eine einzige Klasse von Bindungsstellen beteiligt war. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß das MgCl&sub2;-Eluat mindestens zwei Klassen von hGH-Bindungsstellen enthält, wobei eine durch bGH ersetzbar bzw. verdrängbar ist und eine nicht. Da keine leicht durch O-PRL verdrängbar war, scheinen sie keine klassischen lactogenen Rezeptoren zu sein. Beide Eluate enthielten ein Hauptprotein bei 130 kD, sodaß dieses den wahrscheinlichsten Kandidaten für das Protein, das die hGH-Bindungsstelle enthält, darstellte.

f) Charakterisierung des Leberrezeptors

Das 130 kD Protein konnte nur durch Reduktion des gereinigten Rezeptors und Auftrennung auf einem denaturierenden Gelsystem erhalten werden. Da diese Behandlung die Bindungsaktivität zerstörte, war es notwendig, die Beziehung zwischen dem 130 kD Protein und der Bindungsaktivität durch indirekte Versuche zu bestimmen.
Es wurden einige monoklonale Anti-Rezeptor-Antikörper (Barnard, R. et al., Biochem. J. 231, 459-468 [1985]) gegen den denaturierten Rezeptor getestet, aber nur Mab 5 zeigte eine starke Reaktion. Fig. 1b zeigt einen Immunoblot des MgCl&sub2;-Eluats mit MAb 5. Frische Leber zeigt eine Bindung vor allem beim 130 kD Protein sowie bei zwei scharfen Banden bei etwa 100 kD. Längere Entwicklungszeiten ergaben auch schwache Bindungen an verschiedene niedermolekulare Banden. Ein monoklonaler Antikörper derselben Klasse, der sich an ein nicht verwandtes Protein (Gewebeplasminogenaktivator) bindet, zeigte keine Reaktion. Bahn 1 ist dieselbe wie Bahn 2, außer daß mit kommerziell erhaltener, gefrorener Leber begonnen wurde; in diesem Material ist deutlicher Abbau festzustellen.
Ein Immunoblot mit den inhibierenden Antikörpern 263 und 7 zeigte eine schwache Reaktion. Die Immunopräzipitation mit MAb 263 fällte das 130 kD Protein gemeinsam mit vielen kleineren Proteinen, was wiederum zeigt, daß diese Proteine assoziiert sind. In ähnlicher Weise ergab Affinitätsquervernetzung eine starke, radioaktive Bande am Kopf des Gels, ähnlich zu jener, die auf einem nicht-reduziertem Gel zu erkennen ist. Dies ist vielleicht der Quervernetzung der disulfid-gebundenen Proteine zuzuschreiben, die eine Reduktion uneffektiv macht, da sie diese dissoziiert.
In einem Hormonblot mit SDS-solubilisierten Kaninchenlebermembranen zeigten Haeuptle et al., J. Biol. Chem. 258, 305-314 (1983), eine spezifische Bindung von ¹²&sup5;I- hGH an eine Bande im 50-67 kD-Bereich und eine andere im 130-140 kD-Bereich. Die Ergebnisse der Anmelder waren sich, wenn affinitäts-gereinigtes Material verwendet wurde, dahingehend ähnlich, daß die Hauptbindungsaktivität bei etwa 50 kD zu erkennen war. Für rohe Membranextrakte war auch über 100 kD beträchtliche spezifische Bindung festzustellen, ein stark diffuser Hintergrund (durch hGH verdrängbar) machte es jedoch schwer, individuelle Banden zu unterscheiden. Der affinitäts-gereinigte Rezeptor zeigte die spezifische Bindung vor allem an der Spitze des Gels, wenn es nicht-reduziert gefahren wurde; diese Aktivität wurde durch Reduktion zerstört.

g) Glykosidasespaltung

Die Spaltung des ¹²&sup5;I-markierten 130 kD-Rezeptors mit N-Glykanase und Neuramidase zeigt das Vorhandensein von N-gebundenen Kohlenhydraten mit einigen endständigen Sialinsäuren. Neuramidase alleine reduzierte das 130 kD Protein auf reduzierten SDS- Gelen zu einer scharfen Bande bei etwa 116 kD, während N-Glykanase eine diffuse Bande zwischen 90 und 100 kD produzierte. Es wurde nicht versucht, das Vorhandensein von O-gebundenen Zuckern zu zeigen.

Charakterisierung der Affinitätssäuleneluate - Wachstumshormonbindeprotein

Scatchard-Analyse der Harnstoff- und der MgCl&sub2;-Eluate aus der Affinitätssäule (Fig. 3c) unter Verwendung von ¹²&sup5;I-hGH als Tracer und unmarkiertem hGH als konkurrierendem Liganden zeigte eine einzige Kasse von Bindungsstellen in beiden. Die Assoziationskonstanten lagen innerhalb des Versuchsfehlerbereichs (KA = 5,5 x 10&sup9; M&supmin;¹ für das Harnstoff- und 5,7 x 10&sup9; M&supmin;¹ für das MgCl&sub2;-Eluat), weshalb es möglich ist, daß der hohe Prozentsatz der Bindung, die mit Harnstoff eluiert (verglichen mit dem Membranrezeptor), auf die niedrigere Bindungsaffinität des Bindeproteins für hGH zurückzuführen ist und nicht auf Subpopulationen von Bindeproteinen mit unterschiedlichen Bindungsaffinitäten. Beim MgCl&sub2;-Eluat zeigt die Verdrängung von ¹²&sup5;I- hGH durch bGH und O-PRL die Charakteristika, die für einen somatogenen Rezeptor erwartet werden, was bedeutet, daß bGH ca. 6fach weniger effektiv als hGH und O-PRL etwa 170fach weniger effektiv als hGH war.

Charakterisierung des Wachstumshormonbindeproteins

Das mit der Sephacryl S300-Säule (Fig. 4) erhaltene Molekulargewicht ist 96 kD. Da das auf einem nicht-reduzierenden SDS-Gel auftretende Molekulargewicht bei ungefähr 51 kD liegt, könnte das Protein in jenen Konzentrationen, die auf einer S300-Säule verwendet werden, in ein nicht-kovalentes Dimer übergehen.
Die Affinitätsquervernetzung von ¹²&sup5;I-hGH an das Bindeprotein unter Verwendung von Disuccinimidsuberat ergab eine einzelne diffuse Bande mit einem Molekulargewicht von 75kD auf einem nichtreduzierenden SDS-Gel (Fig. 2b). Die Subtraktion von 22 kD bei hGH ergibt 53 kD für das Bindeprotein. Es wurde keine andere spezifische Bindung im Serum gefunden.
Die Ergebnisse von Quervernetzung und Gelfiltration deuten an, daß die diffuse Bande bei 51 kD auf nicht-reduzierenden SDS-Gelen das Serumbindeprotein ist. Dies wurde durch Elektroelution von SDS-Gelscheiben, welche diese Bande und den umgebenden Bereich enthielten, und Testen der Eluate auf Bindungsaktivität bestätigt. Beträchtliche Aktivität (zumindest der Beladung entsprechend) wurden nur von der 51 kD Bande wiedergefunden.
Die Spaltung mit N-Glykanase bestätigte die Anwesenheit von N-gebundenen Zuckern auf dem 51 kD Protein. Die Spaltung reduzierte das 51 kD Protein auf einige Banden im Bereich von 40-49 kD. Diese können unvollständige Deglykosylierungen oder teilweise abgebaute Formen des Bindeproteins darstellen.

g) Sequenz und Zusammensetzung - Membranrezeptor

Die Zusammensetzungsergebnisse für den elektroeluierten, reduzierten und carboxymethylierten 130 kD-Rezeptor werden in Tabelle 3 gezeigt. Die Anzahl jeder Aminosäure bei einem angenommenen Gesamt-Molekulargewicht von 72 kD wird in Tabelle 3 gezeigt. Eine Computerberechnung, wie gut die integralen Restwerte zu den Daten passen, ergab eine ungefähres Molekulargewicht von 72 kD, mit einem zweiten Minimum bei 116 kD. Die Glykosidasedaten zeigen, daß das Molekulargewicht unter 100 kD liegt, sodaß der niedriger angesetzte Wert der wahrscheinlichere ist. Tabelle 3

h) N-terminale Sequenz

Die N-terminale Sequenz für den 130 kD-Rezeptor wurde dreimal bestimmt, zweimal an dem elektroeluierten 130 kD-Rezeptor (carboxymethyliert und nicht- carboxymethyliert) und einmal an dem kompletten MgCl&sub2;-Eluat aus der Affinitätssäule. In allen 3 Fällen wurden 2 Sequenzen (Tabelle 4) erhalten - mit einer geringen Menge an anderen Resten in den weniger gereinigten Proben. Die kürzere Sequenz (Sequenz 2 in Tabelle 4) war Ubiquitin (Schlesinger, D. H. et al., Science 231, 923-928 [1986]; Yarden, Y. et al., Nature 323, 226-232 [1986]), dessen Funktion dort jedoch unbekannt ist. Die Menge an Ubiquitin war unterschiedlich; bei den Sequenzierungsergebnissen zeigte sich allerdings, daß es 20-50% des Anteils der Hauptsequenz ausmachte. Tabelle 4 Aminoterminale Sequenz für den Leberrezeptor
Die Hauptsequenz, die 16 Aminosäuren umfaßt, stimmte mit keinem bereits bekannten Protein überein. Rest 7 wurde anfangs nicht identifiziert, konnte aber später aus der cDNA-Sequenz mit Thr bestimmt werden. Ubiquitin hat auch ein Thr an der Stelle 7, aber die Rückgewinnung in diesem Zyklus erschien zu niedrig, um die Summe der beiden Proteine zu sein. Das könnte bedeuten, daß Thr-7 am Rezeptor modifiziert ist. Tabelle 5 Tryptische und V8-Peptide des 130 kD Leber-GH-Rezeptors
¹ Das Gemisch wurde schlußendlich aus der cDNA-Sequenz aufgelöst. Das Fehlen von Asn in Zyklus 3 könnte andeuten, daß in T2.2 an dieser Position Kohlenhydrat gebunden ist.
² Klammern zeigen Unsicherheiten in den Sequenzierungsdaten. Wenn zwei Reste gezeigt sind, ist der obere jener, der aus der cDNA-Sequenz erhalten wurde.
³ Eckige Klammern deuten nicht oder unkorrekt aufgeklärte Reste an. Der angezeigte Rest stammt aus der cDNA-Sequenz.

i) Tryptische Peptide

Das RP-HPLC-Chromatogramm (Fig. 5) ergab ungewöhnlich breite Peaks. Der Grund dafür ist unklar, da andere Proteine, die unter denselben Bedingungen gespalten werden, normal liefen. Kontaminationen im TX-100 ergaben störende Peaks im interessanten Bereich, diese konnten aber durch Vergleiche mit Blindversuchen ausgeschlossen werden.
Sechs Peptide (T2 - T6.2, Tabelle 5) wurden auf ihre Aminosäuresequenz analysiert. T1 zeigte keine brauchbare Sequenz und T2 und T6 waren Gemische. Wo die Proteinsequenz nicht eindeutig oder unkorrekt war, wird der korrekte Rest aus der cDNA angegeben.
T2 enthält zwei Hauptpeptide und geringfügige Verunreinigungen. T2.1 ist ungewöhnlich, weil es einen Lys-Rest enthält. Anscheinend waren die benachbarten Säuregruppen in der Lage, die Trypsin-Spaltung an dieser Stelle zu verhindern. T2.2 enthält eine potentielle N-Glykosylierungsstelle. Da Asn in Zyklus 3 trotz starker Signale der benachbarten Reste nicht zu sehen war, ist es wahrscheinlich, daß dieses Asn glykosyliert ist.

j) V8-Peptide

Das RP-HPLC-Chromatogramm für die V8-Spaltung wird in Fig. 6 gezeigt. Auch hier zeigten Kontaminationen im TX-100 störende Peaks. Die Aminosäuresequenzierung wurde an 5 Peptiden durchgeführt (V1-V5), von denen nur zwei brauchbare Sequenzen ergaben (Tabelle 5).
Die Bedingungen der Spaltung bevorzugten eine Spaltung nur bei Glu-Resten. Andere Faktoren beschränkten die Spaltung auf eine Untereinheit der möglichen Stellen, da sowohl V3 als auch V5.2 interne Glu-Reste enthielten.

k) N-terminale Sequenz, Wachstumshormonbindeprotein

Das aus dem Gel elektroeluierte 51 kD-Serumbindeprotein ergab bei der Aminosäurenanalyse eine Haupt- und zwei kleinere Sequenzen (Tabelle 6). Die Hauptsequenz stimmt genau mit der N-terminalen Sequenz des membrangebundenen Rezeptors überein. Bei Subtraktion dieser bekannten Sequenz und Vergleich der verbleibenden Reste mit der cDNA-Sequenz des Rezeptors entsprechen diese Sequenzen trypsin-ähnlichen Spaltungen bei Arg 13 und 20. Aus diesem Grund war es möglich, die Sequenzübereinstimmung zwischen den serum- und den membrangebundenen Formen von Rest 37, mit nur gelegentlichen Unterbrechungen, die durch den starken Hintergrund (speziell Glycin) in den frühen Zyklen verursacht wurden, zu bestätigen. Ubiquitin war in diesem Präparat nicht enthalten. Tabelle 6 Aminoterminale Sequenzen für den Leberrezeptor und das Serumbindeprotein
¹ Reste in [] wurden aus der cDNA bestimmt.
² X bezeichnet Reste, die nicht genau aufgeklärt werden konnten. Ein starker Glycin- Hintergrund verdeckte diese Reste in den ersten Zyklen.
³ () bezeichnet Reste, deren Vorhandensein unsicher war.
&sup4; Das Fehlen von Asn an dieser Stelle könnte auf N-gebundene Kohlenhydrate an dieser Stelle hindeuten.
Die zum N-terminalen Sequenzieren verwendeten Filter wurden entfernt, das Restprotein mit Bromcyan gespalten und anschließend erneut sequenziert. Ein Vergleich der Sequenz des Gemischs mit der cDNA-Sequenz bestätigte das Vorhandensein von Peptiden, die bei Met-117 und Met-189 beginnen. Jenes Peptid, das bei Met-236 beginnt, könnte auch vorhanden gewesen sein, war jedoch schwieriger zu detektieren. Es wurden keine anderen Bromcyanpeptide gefunden, was nahelegt, daß die Sequenz nicht weiter als bis zur Transmembrandomäne reicht. Zurzeit werden Anstrengungen unternommen, den C-terminalen Rest zu bestimmen. Da nur sehr geringe Mengen des Proteins zugänglich sind, sowie aufgrund der Tatsache, daß es keine geeigneten Verfahren gibt, um C-terminale Spaltungen im pMol-Bereich durchzuführen, ist dies kompliziert.

BEISPIEL 5

Isolierung von Wachstumshormonrezeptor-Klonen

Drei Versuche wurden unternomen, um Klone des Wachstumshormonrezeptors zu isolieren. Bevor gut gereinigtes Protein erhalten wurde, wurden monoklonale Antikörper (Barnard et al., siehe oben) gegen den Kaninchenleberrezeptor eingesetzt, um sowohl L- Zellen, die mit genomischer Kaninchen-DNA transfiziert worden waren, als auch Kaninchenleber-cDNA-Klone in einem λgt11-Vektor zu screenen. Nach keinem dieser beiden Versuche wurden Rezeptorklone isoliert.
Wachstumshormonrezeptor-Klone wurden durch Screenen einer Kaninchenleber-cDNA- Bibliothek mit einer auf Proteinsequenzdaten basierenden Oligonukleotid-Sonde isoliert. Eine Einzelsequenz-57-Mer-Sonde, basierend auf der Sequenz der 19 Aminosäurereste eines tryptischen Fragments des Rezeptors, wurde verwendet, um Kaninchenleber-cDNA-Klone in einem λgt10-Vektor zu screenen. Aus einem Screen von 1,0 x 10&sup5; Oligo-dT- und 1,0 x 10&sup5; statistisch geprimten Klonen wurden 2 bzw. 27 positive Klone identifiziert. Eine Reihe dieser Klone wurde kartiert und sequenziert (Fig. 7, ghr.25, ghr.27 und ghr.41). Die translatierte DNA-Sequenz stimmte exakt mit der Aminosäuresequenz des als Sonde eingesetzten tryptischen Fragments überein, und die Sonde enthielt ein mit der klonierten DNA-Sequenz übereinstimmendes Stück von zwei aus 14 Basen bestehenden Bereichen, die durch ein einzelnes nicht-übereinstimmendes Stück getrennt waren. Das tryptische Fragment befindet sich nahe dem C-terminalen Ende des Proteins und beginnt bei Aminosäure 538 (Fig. 8). Klone der gesamten kodierenden und der untranslatierten 3'-Bereiche wurden durch erneutes Screenen derselben Bibliothek mit Fragmentsonden ausgehend vom anfänglichen Satz an Klonen isoliert.
Menschliche Wachstumshormonrezeptor-Klone wurden durch Screenen einer menschlichen Leber-cDNA-Bibliothek mit einer Restriktionsfragmentsonde, die aus einem der ersten isolierten Kaninchenklone (ghr.27) stammte, isoliert. Überlappende Klone der gesamten menschlichen kodierenden und untranslatierten 3'-Bereiche wurden aus Oligo-dT-, statistisch und spezifisch geprimten Leber-cDNA-Bibliotheke isoliert. Fig. 7 zeigt die Karte einer ausgewählten Anzahl von sowohl Kaninchen- als auch menschlichen cDNA-Klonen. Die vollständige DNA- und die translatierte Proteinsequenz von beiden cDNA's wird in Fig. 8 gezeigt.
Die Hybridisierungen wurden in 20% Formamid, 5xSSC, 50 mM Natriumphosphat (pH 7), 40 µg/ml ultraschallbehandelter Lachsspermien-DNA, 5xDenhardt 20% Dextransulfat bei 42ºC über Nacht durchgeführt und in 1xSSC bei 42ºC gewaschen, wenn nachstehend nicht anders angegeben. Die Fragmentsonden wurden durch geprimte Synthese ³²P-markiert (Feinberg, A.P., Vogelstein, B., Analyt. Biochem. 132, 6-13 [1983]); die Oligonukleotidsonden wurden am Ende ³²P-markiert.
Poly-A&supmin;-Kaninchenleber-RNA wurde aus männlichen, weißen Neuseelandkaninchen nach dem LiCl-Präzipitationsverrfahren präpariert (Cathala, G. et al., DNA 2, 329-335 [1983], gefolgt von Oligo-dT-Zellulosechromatographie (Maniatis, T. et al., Molecular Cloning [1982]). 282 µg Poly-A&supmin;-RNA wurden aus 6 g Leber erhalten. Oligo-dT- und statistisch geprimte cDNA's wurden aus 2 µg der Poly-A&supmin;-Kaninchen-RNA mit Reagentien von Amersham Inc. hergestellt. Diese cDNA-Präparate wurden mit einem λgt10-Vektor (Huynh, T. V. et al., DNA Cloning, Bd. 1, Glover, D.M. (Hrsg.) Oxford, IRL Press [1985]) und mittels mit Hemikinase behandelter Linker wie beschrieben kloniert (Wood, W. et al., Nature 312, 330-337 [1984]). Aus 20 ng Oligo-dT- und 10 ng statistisch geprimter, vernetzter DNA, wurden 2 x 10&sup6; und 1 x 10&sup6; primäre Klone erhalten und amplifiziert.
Diese zwei Bibliotheken wurden mit der Sonde ghr.3,
einem synthetischen, aus 57 Basen bestehendem Oligonukleotid, das auf dem aus 19 Aminosäuren bestehenden tryptischen Fragment T4 des Rezeptors basiert, gescreent. Die Hybridisiernngen wurden wie oben mit 20% Formamid durchgeführt und in 1xSSC bei 42ºC gewaschen. Die Klone ghr.25, ghr.27 und ghr.41 wurden aus der statistisch geprimten Bibliothek isoliert.
Die Oligo-dT- (760.000 Klone) und die statistischen (800.000 Klone) Kaninchenbibliotheken wurden mit einem 5'-Restriktionsfragment aus ghr.25 (Sonde A) erneut gescreent. Es wurden 8 positive Oligo-dT- und 100-300 statistisch geprimte, positive Klone identifiziert. Klon ghr.321 aus der Oligo-dT-Bibliothek wurde vollständig sequenziert. Dasselbe Plating der Oligo-dT-geprimten Bibliothek wurde erneut mit einem 5'-Restriktionsfragment aus ghr.3321 (Sonde B) gescreent. Es wurden 7 positive Klone identifiziert, von denen ghr.347 gezeigt wird.
Um die Isolierung von langen Klonen einschließlich des 5'-Endes des Gens zu erleichtern und um Vorteile aus dem starken Vorkommen der positiven Klone in der statistisch geprimten Bibliothek zu ziehen, wurden die längeren Inserts aus dieser Bibliothek isoliert und erneut kloniert. Die Bibliothek wurde als Phagenpool vermehrt, die cDNA-Inserts mit Xho (eine Stelle des Klonierungslinkers) herausgeschnitten und die langen Inserts (größer als 1, 5 kbp) auf einem Acrylamidgel isoliert. Diese Fragmente wurden in λgt10 mit XhoI zu EcoRI-Linkern erneut kloniert. 2 x 10&sup6; primäre Klone wurden für diese Bibliothek erhalten. (Das Aussehen dieser Bibliothek ist schwer zugänglich, da das Wachstum dieser Bibliothek zum Erhalt von DNA als Pool erfolgte.) 1.100.000 Klone aus dieser Bibliothek wurden sowohl mit Sonde B (siehe oben) als auch mit einem 5'-Restriktionsfragment aus ghr.347 (Sonde C) gescreent. Es wurden jene Klone identifiziert, die bei beiden Sonden positiv waren; von diesen sind ghr.435 und ghr.440 dargestellt.
Um Klone des nicht-translatierten 3'-Bereichs von Kaninchen zu erhalten, wurden 200.000 Oligo-dT-geprimte Kaninchen-cDNA-Klone mit einem Restriktionsfragment aus ghr.321 (Sonde E) gescreent. Die Hybridisierung erfolgte in 50% Formamid, und die Filter wurden in 0,2xSSC bei 60ºC gewaschen. Es wurden 15 positive Klone erhalten. Die DNA von 7 davon wurde denaturiert, auf Nitrozellulose aufgetragen und mit einer dT&sub4;&sub0;-Oligonukleotidsonde hybridisiert, um Klone mit einer terminalen Poly-A-Sequenz zu isolieren. Die Hybridisierung wurde in 20% Formamid durchgeführt und die Blots in 3,0 M Tetramethylammoniumchlorid bei 65ºC gewaschen. 3 der 7 Klone waren positiv; zwei davon (ghr.46 und 465) werden gezeigt.
Die anfänglichen menschlichen Wachstumshormonrezeptor-Klone wurden aus einer Leber-cDNA-Bibiothek eines Erwachsenen isoliert. Diese Bibliothek enthielt Oligo-dT- geprimte Klone in einem λgt10-Vektor. 1.000.000 cDNA-Klone wurden mit einem Restriktionsfragment aus dem Kaninchenklon (ghr.27, Sonde D) gescreent. Die Hybridisierung erfolgte in 20% Formamid, und die Filter wurden in 1xSSC bei 42ºC gewaschen. 28 positive Klone wurden identifiziert, von denen Klon ghr.110 gezeigt wird. Das selbe Plating der Oligo-dT-geprimten Bibliothek wurde mit einem 5'- geprimten Restriktionsfragment aus ghr.110 (Sonde G) gescreent. Es wurden 12 weitere positive Klone identifiziert, von denen λghr.210 gezeigt wird.
Um Klone zu isolieren, die das 5'-Ende des menschlichen Rezeptors enthalten, wurden zwei zusätzliche cDNA-Bibliotheken aus menschlicher Leber-RNA eines Erwachsenen wie oben beschrieben konstruiert. Eine Bibliothek wurde statistisch, die andere spezifisch mit dem 15-Mer ghr.5 (5' ATTGCGTGGTGCTTC; Primer H) geprimt. 1.100.000 primäre Klone aus der statistischen Bibliothek und 360.000 primäre Klone aus der spezifisch geprimten Bibliothek wurden mit zwei Sonden gescreent. Eine Sonde, das 27-Mer ghr.6, 5'-CATTGCTAGTTAGCTTGATACAATAAG (Sonde I) wurden in 20% Formamid hybridisiert und in 3,0 M Tetramethylammoniumchlorid gewaschen (Wood, W.I. et al., PNAS [USA] 82, 1585-1588 [1985]). Die andere Sonde (Sonde C, siehe oben) wurde in 20% Formamid hybridisiert und in 1xSSC bei 42ºC gewaschen. 2 positive Klone wurden aus der statistischen Bibliothek und 9 aus der spezifisch geprimten Bibliothek gefunden. Die Klone ghr.262 (aus der statistischen Bibliothek) und ghr.265 (aus der spezifisch geprimten Bibliothek) werden gezeigt.
Um einen zweiten Klon für den menschliche cDNA-Bereich zwischen Klon ghr.110 und ghr.262 zu erhalten, wurden 1.000.000 Klone aus der statistisch geprimten menschlichen cDNA-Bibliothek mit einem Restriktionsfragment von ghr.210 (Sonde T) gescreent. Die Hybridisierung erfolgte in 50% Formamid, und die Filter wurden in 0,2xSSC bei 60ºC gewaschen. Es wurden 4 positive Klone erhalten, und einer davon (ghr.501) wurde durch Sequenzierung des DNA-Inserts charakterisiert.
Um Klone des menschlichen untranslatierten 3'-Bereichs zu erhalten, wurden 200.000 Klone der Oligo-dT-geprimten Bibliothek mit einem Restriktionsfragment von ghr.110 (Sonde K) gescreent. Die Hybridisierung erfolgte in 50% Formamid, und die Filter wurden in 0,2xSSC bei 60ºC gewaschen. Es wurden 11 positive Klone erhalten, und einer (ghr.501) von den drei getesteten war mit einer Oligo-dT-Sonde positiv (wie oben für die Kaninchen-3'-Endklone beschrieben).
Zwei unabhängige Klone, die den gesamten Kodierbereich und viel von den untranslatierten Bereichen sowohl der Kaninchen- als auch der menschlichen cDNA enthielten, wurden isoliert. Die DNA-Sequenzen dieses Klonpaars stimmen mit Ausnahme einiger einfacher Basenunterschiede und einiger beträchtlicher Unterschiede im untranslatierten 5'-Bereich (in der Tabelle 7 angeführt, siehe unten) überein. Nur zwei der Unterschiede betreffen eine Aminosäure. Im menschlichen Rezeptor ändert der Unterschied zwischen G und T in ghr.501 Serin 357 zu Isoleucin ab, und im Kaninchenrezeptor ändert der Unterschied zwischen A und G in ghr.440 Alanin (-8) zu einem Threonin ab. Beides sind konservative Substitutionen. Tabelle 7 Einzelne Basenpaarunterschiede in den Wachstumshormon-Rezeptor-cDNA-Klonen
Die DNA-Sequenzen jenseits von elf Basenpaaren 5' vom mutmaßlich initiierenden ATG unterscheiden sich in den meisten der isolierten Klone vollständig. Von den 6 menschlichen und den 3 Kaninchen-cDNA-Klonen, die diesen 5'-Bereich enthalten, sind nur zwei ähnlich. Die 2 menschlichen Klone, die in Fig. 7 gezeigt werden (ghr.262 und ghr.265), sind in diesem 5'-Bereich ident, und ein Kaninchenklon (ghr.435) und ein menschlicher Klon (ghr.244. nicht gezeigt) zeigen eine Homologie von etwa 80%. Die übrigen 5 Klone sind einzigartig. Wahrscheinlich entstehen diese Klone wegen der multiplen, unterschiedlich gespleißten RNA's am 5'-Ende dieser beiden Gene. Die Beobachtung, daß Klone zweier verschiedener Arten, die aus einer Anzahl verschiedener cDNA-Bibliotheken isoliert wurden, am selben Punkt divergieren, läßt vermuten, daß es sich hier nicht um irgendein unübliches Klonierartefakt handelt. Ob diese unterschiedlich gespleißten Klone biologisch bedeutsam sind, werden weitere Untersuchungen klären.
Zwei unabhängige Kaninchenklone unterscheiden sich von den anderen 3' von bp 877 (einer davon, ghr.347, wird in Fig. 7 gezeigt). Die divergenten Sequenzen dieser zwei Klone stimmen exakt überein. Die translatierte Aminosäuresequenz dieser zwei Klone divergiert von den anderen, beginnend 4 Reste C-terminal der mutmaßlichen Transmembrandomäne (siehe unten), gefolgt von 4 neuen Aminosäuren, bevor ein Stopcodon erscheint. Diese zwei Klone würden somit für ein Protein kodieren, das die extrazelluläre, wachstumshormon-bindende Domäne, die Transmembrandomäne und eine verkürzte Zytoplasmadomäne von nur 8 Resten enthält.
Zwei der Kaninchen-cDNA-Klone (ghr.461 und 465) und ein menschlicher cDNA-Klon (ghr.281) enthalten Poly-A&supmin;-Stränge am 3'-Ende. Davor stehen AATAAA (beim Menschen) und CATAAA (beim Kaninchen) als Poly-A&supmin;-Additionssignale. Die Blothybridisierung der Poly-A&supmin;-Kaninchenleber-RNA mit einer Kaninchensonde voller Länge zeigt eine Haupthybridisierungsbande von 4700 bp, was ungefähr der Größe der klonierten cDNA entspricht (Fig. 9).
Sowohl der Kaninchen- als auch der menschliche Rezeptor enthalten einen offenen Leserahmen von 638 Aminosäuren. Alle 10 N-terminalen, tryptischen und V8- Peptidsequenzen, die für den gereinigten Kaninchenrezeptor bestimmt worden waren, sind in dieser translatierten Sequenz vorhanden (siehe Tabelle 4 und 5). Vor der Aminosäuresequenz, die als N-Terminus des Kaninchenrezeptors gefunden wurde, stehen noch 18 Aminosäuren, beginnend mit einem Methionin. Jene DNA-Sequenz, die dieses ATG umgibt, welches für Methionin kodiert, stimmt mit der Konsenssequenz, die für eine Translationsinitiationsstelle erwartet wurde, überein. Die folgenden 18 Aminosäuren enthalten einen von geladenen Resten flankierten, hydrophoben Kernbereich, was auf eine Membransignalsequenz hinweist. Daher wäre für die reife Form des Rezeptors eine Anzahl von 620 Aminosäuren zu erwarten, mit einem translatierten Molekulargewicht von 70 kD. Das ist etwas kleiner als das Molekulargewicht von 130 kD, das durch SDS-Gelanalyse für den gereinigten Kaninchenleberrezeptor bestimmt wurde, selbst wenn kovalent gebundenes Ubiquitin einberechnet wird (-9 kD). Da eine Anzahl von cDNA-Klonen für sowohl den menschlichen als auch den Kaninchenrezeptor isoliert worden waren, entsteht die auffallende Diskrepanz im Molekulargewicht wahrscheinlich durch Glykosylierung oder ein SDS-Gel-Artefakt oder beides. Ein Hydropathieplot der menschlichen Sequenz (Fig. 10) zeigt nur einen einzigen, größeren, hydrophoben Bereich von etwa 24 Resten, der in der Mitte des Moleküls liegt. Es wird erwartet, daß dieser hydrophobe Bereich eine Transmembrandomäne ist, welche die extrazelluläre, N-terminale, wachstumshormonbindende Domäne von der intrazellulären, C-terminalen Signaldomäne trennt. Die potentiellen N-Glykosylierungsstellen (Asn-X-[Ser/Thr]) sowie die Stellung der Cysteinreste werden ebenfalls in Fig. 10 gezeigt. Es gibt keine offensichtlichen Bereiche mit einem hohen Serin- oder Threonin-Gehalt, der oft auf O-Glykosylierung hinweist.
Die Kaninchen- und die menschlichen Proteinsequenzen sind stark homolog, mit insgesamt 84% Übereinstimmung. (Fig. 8 und 10). Die zwei Sequenzen können ohne jegliche Insertionen oder Deletionen untereinandergeschrieben werden. Die Homologie zwischen den gesamten Molekülen umfaßt sogar die Transmembrandomäne. Eine computerunterstützte Suche nach Homologien zu anderen bekannten Proteinen in verschiedenen Datenbanken ergab keine klare Homolgie zu anderen Proteinen. Der Rezeptor enthält keine intern wiederholten Domänen und keine besonders cysteinreichen Bereiche in der Extrazellulärdomäne, wie dies bei einigen anderen Rezeptoren gefunden worden war (Fig. 10). Die 7 extrazellulären Cysteine sind bei den menschlichen und den Kaninchensequenzen konserviert. In der intrazellulären Domäne gibt es 7 konservierte und 3 nicht konservierte Cysteine.
Das lösliche, wachstumshormon-bindende Protein, das in Kaninchenserum gefunden wurde, hat dieselbe N-terminale Aminosäuresequenz wie der Rezeptor. Es gibt zwei potentielle Stellen für trypsinartige proteolytische Spaltung beim Kaninchenrezeptor, welche die extrazelluläre, wachstumshormon-bindende Domäne in löslicher Form freisetzen könnten. Eine Stelle ist jene neutrale Aminosäure-Sequenz mit alternierendem Arginin, die beginnend mit Arginin 211 gefunden wurde. Die andere ist bei Arginin 246, welches unmittelbar vor der Transmembrandomäne liegt. Obwohl der menschlichen Sequenz diese zweite Stelle fehlt, ist zu erwarten, daß irgendeine Art von proteolytischer Spaltung vor der Transmembrandomäne stattfindet, um die extrazelluläre Bindungsdomäne freizusetzen.

BEISPIEL 7

Expression des Wachstumshormonrezeptors

Eine cDNA voller Länge für den Kaninchenwachstumshormonrezeptor wurde in einem Säugetierexpressionsvektor zusammengestellt, der einen Zytomegalievirus-Promotor und andere Funktionen enthielt, die für Expression in Säugetierzellen in großen Mengen notwendig sind (EP-A-0.260.148 veröffentlicht am 16. März 1988). Fig. 11a zeigt die Konstruktion dieses Expressionsplasmids pCIS2.RGHR1. Zuerst wurden die 5'- und die 3'-Enden der cDNA von den λ-Kloniervektoren in pUC119 subkloniert. Das 1399 bp SstI-Fragment von λghr.435 wurde in die SstI-Stelle von pUC119 kloniert, um pghr.4345.1 zu erzeugen und das 2659 bp XhoI-Fragment λghr.321 wurde in die kompatible SalI-Stelle von pUC119 kloniert, um phgr.321.2 zu erzeugen. Die SstI- und die XhoI-Stelle in den λ-Klonen befanden sich in den Klonierlinkern. Das fertige Expressionsplasmid wurde durch Ligation von 4 Fragmenten konstruiert: 1) dem 5340 bp ClaI-HpaI-Fragment von pCIS.8c24D (EP-A-0.260.148, veröffentlicht am 16. März 1988), das den Vektor enthält; 2) einem kurzen, synthetischen ClaI/AvaII-Linker, der in Fig. 11a gezeigt wird; 3) dem 462 bp AvaII-PflMI-Fragment von pghr.435.1, welches das 5'-Ende der cDNA enthält; und 4) dem 1673 bp PflMI-DraI-Fragment von pghr.321.2, welches das 3'-Ende der cDNA enthält. Der fertige Vektor pCIS2.RGHR1 wird in Fig. 11b gezeigt.
Die Konstruktion eines Expressionsvektors für die lösliche Form des menschlichen Rezeptors wird in Fig. 12a-c gezeigt. Dieser Vektor wurde so konstruiert, daß Säugetierzellen die exrazelluläre, wachstumshormon-bindende Domäne des Rezeptors sekretieren. Dieses Protein ist in der Funktion äquivalent zum Wachstumshormon- Bindeprotein, das wie zuvor beschrieben aus Kaninchenserum gereinigt wurde.
Zuerst (Fig. 12a) wurden die Anfangs- und Endstücke der menschlichen Rezeptor-λ- cDNA-Klone unter Verwendung der SstI-Stellen in den Klonierlinkern in pUC119 subkloniert. Das 681 bp SstI-Fragment von λght.262 ergibt pghr.262.1, und das 2697 bp SstI-Fragment von λght.210 ergibt pghr.210.2. Zusätzlich wurde ein synthetisches Oligonukleotid mit SstI-Enden an den SstI-Stellen in pUC119 kloniert und somit pUC119D1.6 erzeugt.
Zweitens (Fig. 12b) wurde das 31 bp ClaI-HpaI-Fragment von pUC119D1.6 (aus dem synthetischen Oligonukleotid) an das 5340 bp ClaI-HpaI-Fragment von pCIS2.8c24d (US-A-06/907.185, siehe oben) ligiert, um den allgemeinen Vektor pCIS2.CXXNH zu erzeugen. Zusätzlich wurden 3 Fragmente ligiert, um das 5'-Ende des Gens zu erzeugen: 1) das 8828 bp ClaI-EcoRV-Fragment von pCIS.8c24d, das den Vektor enthält: 2) das 519 bp partielle AvaII-EcoRV-Fragment von pghr.262.1, das das 5'-Ende des Gens enthält; und 3) ein synthetisches ClaI-AvaII-Oligonukleotid, das in Fig. 12b gezeigt wird. Diese Ligation von drei Stücken ergibt das Plasmid pCIS2.AV.
Drittens (Fig. 12c) wurde eine verkürzte Version von pBR322 konstruiert, indem mit AvaI und NdeI gespalten, mit allen vier Nukleotiden gefüllt und erneut ligiert wurde. Der erhaltene Vektor pBR322XAN wurde zur Ligation von drei Fragmenten verwendet: 1) des 3188 bp BamHI-ClaI-Fragments von pBR322XAN; 2) des 2512 bp EcoRV-BamHI- Fragments von pghr.210.2, welches das 3'-Ende der cDNA enthielt; und 3) des 536 bp ClaI-EcoRV-Fragments von pCIS2.AV, welches das 5'-Ende des Gens enthält. Diese Ligation aus drei Stücken ergibt das Plasmid pBRHGHR. Das fertige Expressionsplasmid in der löslichen Form wurde durch die Ligation von drei Fragmenten konstruiert: 1) des 5348 bp NotI-Cla1-Fragments von pCIS2.LXXNH das den Expressionsvektor enthält; 2) des 746 bp ClaI-partiell-HgiAI-Fragments von pBRHGHR, das die erforderlicnen Abschnitt der cDNA enthält; und 3) eines synthetischen HgiAI-NotI-Oligonukleotids, das unmittelbar nach der extrazellulären, wachstumshormon-bindenden Domäne der Rezeptor-cDNA ein Stopcodon anfügt. Diese Ligation der drei Stücke ergibt das Expressionsplasmid pCIS2.sHGHR.
Vorübergehende Transfektion des Plasmids pCIS2.RGHR1 in COS-7-Affennierenzellen führte zur Expression des Rezeptors in Zellmembranen (Fig. 13a). Bindungsexperimente mit ¹²&sup5;I-markiertem Wachstumshormon zeigen, daß der exprimierte Rezeptor eine Affinität von 10 x 10&sup9; M&supmin;¹ hat, also eine mit jener des gereinigten Kaninchenrezeptors (28 x 10&sup9; M&supmin;¹ vergleichbare. Etwa 200.000 Kopien des Rezeptors werden pro Zelle exprimiert. Kleine Anteile von Bindungsaktivität mit hoher Affinität werden auch im Kulturmedium derartiger Zellen gefunden. Es zeigte sich, daß diese lösliche Bindungsaktivität dieselbe proteolytisch gespaltene, extrazelluläre Domäne des Rezeptors darstellt, die in Kaninchenserum gefunden wurde.
Fig. 13b zeigt die Verdrängung von ¹²&sup5;I-hGH vom exprimierten Kaninchenrezeptor durch Rinderwachstumshormon und Eiprolactin. Wie für den somatogenen Kaninchenrezeptor erwartet, verdrängten alle drei "kalten" Hormone ¹²&sup5;I-hGH vollständig; für eine Verdrängung von 50% werden jedoch 3- bis 5fach höhere Konzentrationen an Rinderwachstumshormon und etwa 100fach höhere Konzentrationen an Eiprolactin benötigt.
Eine ähnliche vorübergehende Transfektion, aber in 293-Zellen wurde mit dem Plasmid pCIS2.sHGHR durchgeführt, um die lösliche Form des menschlichen Rezeptors auszuscheiden. Fig. 14a zeigt den Assay der spezifischen Wachstumshormonbindeaktivität im Überstand dieser transfizierten Zellen. Wie erwartet wird mit diesem Expressionsvektor die Bindungsaktivität in einer löslichen Form ausgeschieden. Die Bindungskonstante ist 2,2 x 10&sup9; M&supmin;¹ und damit nur wenig geringer als jene für das natürliche Kaninchen-Wachstumshormon-Bindeprotein (KA = 6 x 10&sup9; M&supmin;¹). Fig. 14b zeigt die Verdrängung von ¹²&sup5;I-hGH von diesem exprimierten Material durch Rinderwachstumshormon und Eiprolactin. Wie für den menschlichen Rezeptor erwartet (Lesniak, J. Biol. Chem. 249, 1661-1667 [1974]), verdrängen die beiden Hormone das ¹²&sup5;I-hGH selbst in hohen Konzentrationen nicht.

BEISPIEL 8

Serumbindeprotein zur Verwendung bei Wachstumshormonmangel

Serumbindeprotein kann verwendet werden, um die in vivo-Stabilität und -Effizienz des Wachstumshormons (GH) zu erhöhen. Therapeutische Verabreichung von Wachstumshormon und Bindeprotein würde die Effekte bei einem gegebenen Dosierschema erhöhen und den Zeitraum zwischen den erforderlichen Injektionen verlängern.
Es wurde gezeigt (Bauman, G. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 64, 657-660 [1987]), daß die Injektion von menschlichem Wachstumshormon (hGH), das mit teilweise gereinigtem menschlichem Serumbindeprotein komplexiert ist, in vivo eine wesentlich längere Halbwertszeit ergibt, als wenn hGH selbst injiziiert wird, und daß die Abbaurate niedriger ist. Es wurde auch gezeigt, daß hGH, wenn es mit bestimmten Antikörpern komplexiert ist, eine viel größere in vivo-Wirkung hat als freies hGH.
Keiner dieser Komplexe wäre aufgrund der möglichen Abwehrreaktionen gegen die Verunreinigungen im Bindeprotein-Präparat oder gegen die Antikörper, die verwendet werden, um den Komplex zu bilden, als Pharmazeutikum geeignet. Das im wesentlichen reine Wachstumshormon-Bindeprotein dieser Erfindung ist, wenn es in einer Zusammensetzung mit Wachstumshormon verabreicht wird, nicht immunogen und zeigt dieselben Vorteile wie die vorher beschriebenen Präparate, ohne mögliche Abwehrreaktionen aufgrund der Einführung von Fremdproteinen.
Die Dosis des Serumbindeproteins, das in Kombination mit dem hGH verabreicht werden soll, läge im Bereich der 1- bis 10fachen molaren Menge des verabreichten hGH. Es kann angenommen werden, daß die Dosis des für die Effizienz benötigten hGH in dieser Kombinationstherapie um vielleicht die Hälfte oder ein Fünftel des zur Zeit verwendeten Bereichs reduziert werden kann, und daß die Anzahl der Verabreichungen pro Woche ebenfalls reduziert werden kann.

BEISPIEL 9

Serumbindeprotein als Diagnostikum

Das Serumbindeprotein kann auch verwendet werden, um ein Diagnostikum für Kinder mit normalen Mengen an GH, aber anormalen Wachstumsraten, zu entwickeln. Bei einer derartigen Gruppe - Laronzwergwuchs - konnte kürzlich gezeigt werden, daß ein funktionelles Serumbindeprotein fehlt (Bauman, G. et al., Clinical Research 35, 582A [1987]; und Daughaday, W.H. et al., Clinical Research 35, 646A [1987]). Da gezeigt wurde, daß das Wachstumshormonbindeprotein ein Teil des Leberrezeptors ist, der an der Stimulation des Waachstums beteiligt ist, ist es unwahrscheinlich, daß diese Kinder auf Standard-Waachstumshormontherapien reagieren. Ein derartiger Mangel kann diagnostiziert werden, indem das Bindeprotein verwendet wird, um den Status der Leberrezeptoren des Patienten zu bestimmen. An einem gewissen Punkt könnte es auch möglich sein, Patienten mit mangelnden oder nicht vorhandenen Rezeptoren zu behandeln, und so wäre es wünschenswert, Screenassays verfügbar zu haben, um die Art des Mangels bestimmen zu können, da dies die angewandte Therapie ändern könnte. Obwohl der GH-Bindungsassay in gewissem Maße nützlich ist, kann er nicht zwischen dem Nichtvorhandensein von Bindeprotein und der Produktion eines mangelhaften Bindeproteins, das nicht in der Lage ist, GH zu binden, unterscheiden. Auch normale Bindung allein könnte nicht ausreichend sein, da andere Teile des Rezeptors mangelhaft sein können.
Dazu könnte ein mehrstufiges Screenverfahren angewandt werden. Es würden Antikörper gegen das Bindeprotein erhalten werden. Tiere werden gegen das Bindeprotein oder ausgewählte Fragmente davon in konjugierter Form mit derartigen Proteinen wie Schlüssellochnapfschnecken-Hämoganin (KLH), Rinderserumalbumin (BSA), Sojabohnentrypsininhibitor (STI) oder Rinderthyroglobulin (BT) immunisiert, indem 1 mg oder 1 µg des Bindeproteins oder Konjugats (für Kaninchen bzw. Mäuse) mit 3 Volumsteilen an Freund'schem vollständigem Adjuvans vereinigt werden und die Lösung an verschiedenen Stellen intradermal injiziert wird. Auffrischungsimpfungen mit einem Fünftel bis einem Zehntel der ursprünglichen Menge an Konjugat in Freund'schem vollständigem Adjuvans werden ein Monat nach der anfänglichen Immunisierung durch subkutane Injektion an verschiedenen Stellen verabreicht. Den Tieren wird ein bis zwei Wochen nach der Auffrischungsimpfung Blut abgenommen und das Serum auf Anti-Wachstumshormonrezeptorwirkung untersucht. Die Tiere werden wiedergeimpft, bis das Titerniveau erreicht ist. Monoklonale Antikörper werden durch Entnahme von Milzzellen aus den immunisierten Tieren und "Immortalisieren" der Zellen auf konventionellem Weg, d.h. durch Fusion mit Myelomzellen oder durch EB-Virustransformation, und durch Screenen auf Klone, die den gewünschten Antikörper exprimieren, hergestellt. Ein derartiger Antikörper könnte in einem Standard- Immunoassay (ELISA, RIA, usw.) eingesetzt werden, um die Konzentration des Bindeproteins im Serum zu bestimmen. In seiner einfachsten Form würde dieser Assay anzeigen, ob normale Mengen an Leberrezeptoren vorhanden sind, aber er könnte durch kluge Selektion von monoklonalen Antikörper weiter verbessert werden, um normale von mangelhaften Arten des Bindeproteins zu unterscheiden. Wenn sich das Bindeprotein als normal erweist, dann könnte ein weiterer Screen, der dazu dient, durch Standard-Restriktionskartierungstechniken die korrekten Gensequenzen mit der DNA des Patienten zu vergleichen, verwendet werden, um Mängel in anderen Abschnitten des Rezeptors zu identitizieren.

BEISPIEL 10

DNA als Diagnostikum

Die cDNA für den menschlichen Wachstumshormonrezeptor kann verwendet werden, um Patienten auf genetische Mängel im Gen selbst zu untersuchen. Eine mögliche mangelhafte Rezeptorpopulation - Laronzwergwuchs - wurde bereits beschrieben. Dieses Screenen kann auf mindestens zwei Arten durchgeführt werden. Erstens kann Restriktionsfragment-Längenpolymorphie (RFLP) in den Genen identifiziert werden. Dies kann anschließend genützt werden, um einem mangelhaften Gen in betroffenen Familien zu folgen. Verfahren zur Durchführung derartiger Genanalysen und RFLP's wurden für andere Gene bereits beschrieben (Gitschier et al., Nature 312, 326-330 [1984] und Gitschier et al., Nature 314, 738-740 [1985]). Zweitens kann die genaue Art bestimmter Mängel im Wachstumshormonrezeptor-Gen durch Klonierung und Sequenzierung der Rezeptor-DNA von betroffenen Individuen identifiziert werden. Nach der Identifikation können diese spezifischen Genmängel leicht durch Genomblothybridisierung der DNA von betroffenen Individuen (wie z.B. in jenem seines Kinds) mittels direkter Oligonukleotidhybridisierung unter schonenden Bedingungen identifiziert werden. Verfahren für diese Techniken wurden bereits im Detail beschrieben (Gitschier et al., Nature 315, 427-430 [1985]; Gitschier et al., Science 232, 1415-1416 [1986]).

BEISPIEL 11

Wachstumshormonrezeptor- und Bindeprotein-Assay auf Wachstumshormon

Sowohl das Serumbindeprotein als auch der intakte Rezeptor können verwendet werden, um GH zu bestimmen. Zur Zeit gibt es zwei Typen von Assays. Um GH- Mengen zu messen, wird im allgemeinen ein Antikörperassay verwendet. Dies ist einfach, hat jedoch den Nachteil, daß ein Antikörper GH, das mit anderen Proteinen komplexiert ist, nicht erkennen kann und daß er aktives von inaktivem GH nicht unterscheiden kann. Letzteres erfordert einen Bioassay, der beinhaltet, daß die Hypophyse von Ratten entfernt wird, diesen das GH-Präparat injiziert wird und Gewichtszunahme und Gewebewachstum gemessen werden. Obwohl dies einen Hinweis auf die Aktivität des GH liefert, ist es langsam, beschwerlich und erfordert große Mengen des GH-Präparats. Zusätzlich kann es sein, daß die Wirkung in Ratten nicht immer ein guter Maßstab für die Wirkung auf Hormone anderer Spezies ist.
Daher wird vorgeschlagen, zwei neue Typen von GH-Assays zu entwickeln, wobei gereinigtes, rekombinantes Serumbindeprotein für den einen und membrangebundenes, in Säugetierzellen rekonstituiertes für den zweiten verwendet wird.
Der Assay unter Verwendung von Serumbindeprotein würde anzeigen, ob GH vorhanden ist, das fähig ist, sich an den GH-Rezeptor zu binden. Dies könnte auf einige Arten durchgeführt werden. Beispielsweise könnte das Serumbindeprotein an eine Mikrotiterplatte mit 96 Näpfen gebunden werden und Deletionen der GH-enthaltenden Proben, die mit dem gebundenen Rezeptor in Gegenwart einer bestimmten Menge an autentischem GH mit daran gebundenem Biotin, inkubiert werden. Nach 4-6 Stunden Inkubation würden die Lösungen entfernt und die Platten gewaschen werden, um ungebundenes GH zu entfernen. Die Zugabe von an Meerrettich-Peroxidase (HRP) gebundenem Avidin und Inkubation würde einen Komplex mit dem GH-Biotin ergeben. Die Platte würde erneut gewaschen und HRP-Substrat zugegeben werden. Die Farbe würde sich am stärksten in den Näpfen ohne GH entwickeln. Wenn die Probe inkubierende Mengen an GH enthielte, würde sich das Biotin-GH in abnehmendem Maße binden, und die Farbentwicklung wäre schwächer. Dies ergäbe eine dosisabhängige Reaktion, die unter Verwendung von autentischem GH in bekannten Konzentrationen geeicht werden könnte. Dieser Typ von Assav hätte die Vorteile eines Radiorezeptorassays, Spezifität für aktive Liganden, die in der Lage sind, sich an der Rezeptor zu binden, die Empfindlichkeit und Einfachheit eines ELISA-Antikörpertests ohne dessen Nachteile (d.h. radioaktive Tracer, nicht spezifisch für aktives Protein).
Ein Assay für die GH-Bioaktivität könnte auch unter Verwendung des intakter (membrangebundenen) Rezeptors entwickelt werden. In diesem Fall würde der Rezeptor voller Länge in eine Säugetierzellinie inkorporiert werden, die bei Stimulation des GH-Rezeptors in der Lage ist, eine deutliche biologische Reaktion (z.B. die Freisetzung von IGF-1) zu produzieren. Diese Zellen würden dann mit dem GH Präparat inkubiert und die freigesetzte Menge an IGF-1 durch ELISA gemessen werden Dies wäre ein Assay auf bioaktives GH (im Gegensatz zu denaturiertem oder inhibierendem), der viel schneller wäre als der Hypophysektomie-Assay (2-3 Tage gegenüber 2-3 Wochen) und der die Messung der Aktivität am Rezeptor der Spezies von Interesse erlauben würde.

Claims

1. Wachstumshormon-Rezeptor mit einer spezifischen Aktivität im Bereich von zumindest etwa 1.000 pMol/mg bis etwa 7.000 pMol/mg, umfassend eine Aminosäuresequenz, die aus den in Fig. 8a und Fig. 8b dargestellten sowie aus Substitutions-, Einfügungs- und Löschungsvarianten davon ausgewählt ist, wobei die Varianten die Fähigkeit besitzen, sich selektiv an ein Wachstumshormon zu binden.

2. Wachstumshormon-Rezeptor nach Anspruch 1 mit einer spezifischen Aktivität von zumindest etwa 3.000 pMol/mg.

3. Wachstumshormon-Rezeptor in einer Reinheit, die das Sequenzieren von zumindest etwa 16 Resten mittels aufeinanderfolgenden Edman-Abbaus am N-Terminus ermöglicht, umfassend eine Aminosäuresequenz, die aus den in Fig. 8a und Fig. 8b dargestellten sowie aus Substitutions-, Einfügungs- und Löschungsvarianten davon ausgewählt ist, wobei die Varianten die Fähigkeit besitzen, sich selektiv an ein Wachstumshormon zu binden.

4. Wachstumshormon-Rezeptor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die C-terminale Zytoplasma-Domäne (nämlich jene Sequenz der Aminosäurereste beginnend bei etwa Aminosäure 271 in den Figuren 8a und 8b, die sich über etwa 350 weitere Reste fortsetzt) gelöscht ist.

5. Wachstumshormon-Rezeptor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Transmembran-Domäne (nämlich jene Sequenz der Aminosäurereste, die in der menschlichen Sequenz von Fig. 8a etwa die Reste 247-269 umfaßt und in der Hasensequenz von Fig. 8b an analoger Stelle liegt) gelöscht ist.

6. Bindeprotein für Wachstumshormone mit einer spezifischen Aktivität von zumindest etwa 10.000 pMol/mg, umfassend eine Aminosäuresequenz, die aus der am N- terminalen Ende der Wachstumshormon-Rezeptorsequenz beginnenden Sequenz aus 190 bis 250 Aminosäureresten von Fig. 8a oder 8b oder aus Substitutions-, Einfügungs- und Löschungsvarianten davon ausgewählt ist, wobei die Varianten die Fähigkeit besitzen, sich selektiv an ein Wachstumshormon zu binden.

7. Bindeprotein für Wachstumshormone in einer Reinheit, die ausreicht, um ein Sequenzieren des N-Terminus aus zumindest etwa 35 Resten mittels aufeinanderfolgenden Edman-Abbaus zu ermöglichen, umfassend eine Aminosäuresequenz, die aus der am N-terminalen Ende der Wachstumshormon Rezeptorsequenz beginnenden Sequenz aus 190 bis 250 Aminosäureresten von Fig. 8a oder 8b oder aus Substitutions-, Einfügungs- und Löschungsvarianten davon ausgewählt ist, wobei die Varianten die Fähigkeit besitzen, sich selektiv an ein Wachstumshormon zu binden.

8. Wachstumshormon-Rezeptor nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder Bindeprotein nach Anspruch 6 oder 7, der bzw. das nicht von der damit in Verbindung stehenden nativen Glykosylierung begleitet ist.

9. Wachstumshormon-Rezeptor nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder Bindeprotein nach einem der Ansprüche 6 bis 8, der bzw. das eine der Varianten ist, die zu zumindest 40% homolog mit der Sequenz aus Fig. 8a oder 8b ist.

10. Wachstumshormon-Rezeptor nach einem der Ansprüche 1 bis 5, 8 oder 9 oder Bindeprotein nach einem der Ansprüche 6 bis 9, der bzw. das nicht-immunogen ist.

11. DNA-Isolat, das für den Wachstumshormon-Rezeptor nach Anspruch 1 kodiert.

12. DNA-Isolat nach Anspruch 11, das für den Rezeptor nach Anspruch 4 oder 5 kodiert.

13. DNA-Isolat, das für das Wachstumshormon-Bindeprotein nach Anspruch 6 kodiert.

14. Isolat nach Anspruch 11 oder 12, das frei von Wachstumshormon-Rezeptor-Introns ist.

15. Isolat nach Anspruch 13, das frei von Wachstumshormon-Bindeprotein-Introns ist.

16. Rekombinanter Expressionsvektor, umfassend die DNA nach einem der Ansprüche 11 bis 15.

17. Zusammensetzung, umfassend eine mit dem rekombinanten Expressionsvektor nach Anspruch 16 transformierte Zelle.

18. Zusammensetzung nach Anspruch 17, worin die Zelle eine Säugetierzelle ist.

19. Verfahren zur Herstellung von Wachstumshormon-Rezeptor nach Anspruch 1, umfassend das Konstruieren eines Vektors, der für den Wachstumshormon-Rezeptor kodierende DNA enthält, das Transformieren einer Wirtszelle mit dem Vektor, das Kultivieren der transformierten Zelle und das Gewinnen des Rezeptors aus der Kultur.

20. Verfahren zur Herstellung von Wachstumshormon-Bindeprotein nach Anspruch 6, umfassend das Konstruieren eines Vektors, der für das Wächstumshormon-Bindepotein kodierende DNA enthält, das Transformieren einer Wirtszelle mit dem Vektor, das Kultivieren der transformierten Zelle und das Gewinnen des Proteins aus der Kultur.

21. Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, worin die Wirtszelle eine eukaryotische Zelle ist.

22. Verfahren nach Anspruch 21, worin die eukaryotische Zelle eine menschliche Embryo-Nieren-Zellinie ist.

23. Verfahren nach Anspruch 21, worin die eukaryotische Zelle eine chinesische Hamster-Eierstock-Zellinie ist.

24. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Wachstumshormon- Bindeprotein nach einem der Ansprüche 6 bis 9 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.

25. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 24, die zusätzlich ein Wachstumshormon enthält.

26. Zusammensetzung nach Anspruch 25, worin das Bindeprotein menschlichen Ursprungs ist.

27. Verwendung eines Wachstumshormon-Bindeproteins nach einem der Ansprüche 6 bis 9 zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung einer Wachstumshormon-Störung.