DE3750379T3

DE3750379T3 - Varianten des abbaubeschleunigenden Faktors (DAF), hergestellt durch rekombinante DNS-Technologie.

Info

Publication number: DE3750379T3
Application number: DE3750379T
Authority: DE
Inventors: Ingrid Wendy San Francisco Caras; Victor New York Nussenzweig; Michael A. Riverdale Davitz; David W. Jr. San Francisco Martin
Original assignee: Genentech Inc; New York University NYU
Current assignee: Genentech Inc; New York University NYU
Priority date: 1986-05-02
Filing date: 1987-05-01
Publication date: 2005-07-28
Anticipated expiration: 2007-05-02
Also published as: IL82390A0; JP2713875B2; EP0244267A2; DE3750379T2; EP0244267B1; AU7242687A; AU612572B2; EP0244267B2; JPH08242882A; EP0244267A3; CA1341118C; DE3750379D1; JPS63102699A; JP2686257B2

Description

Die vorliegende Anmeldung betrifft die Herstellung des abbaubeschleunigenden Faktors (nachstehend als DAF abgekürzt) in rekombinanter Zellkultur. Insbesondere betrifft sie die Herstellung von DAF, der zur pharmazeutischen oder diagnostischen Verwendung geeignet ist, im großen Maßstab.
Antigene Zellen, die das Ziel humoraler Immunreaktion sind, werden durch ein Verfahren namens Komplementaktivierung lysiert. Dieses Verfahren besteht aus einer Reihe oder Kaskade proteolytischer Aktivitäten, die durch das Binden des Antikörpers mit seinem Antigen initiiert werden. Die an der Komplementaktivierung beteiligten Komponenten sind zahlreich und komplex, doch für die Zwecke der vorliegenden Anmeldung sind die wichtigsten C4b und C3b. In einem Schlüssel-Schritt der Komplementaktivierung werden diese zwei Proteine mit der Zielzelloberfläche kovalent assoziiert und dienen dann als Anker für den Zusammenbau der C3 und C5 Konvertasen, den verstärkenden Enzymen der Kaskade.
Die Komplementaktivierung muß sich nur auf das Ziel konzentrieren und darf nicht auf den Wirtszellen auftreten. Im Laufe der Komplementaktivierung wird jedoch eine große Menge entstehender C4b- und C3b-Fragmente in die Fluidphase freigesetzt. Die meisten reagieren mit Wasser, doch einige können sich zufällig an nahe Wirtszellen binden und zu ihrer Beschädigung führen. Aus diesem und möglicherweise anderen Gründen werden die Aktivitäten gebundener sowie freier C3b- und C4b-Fragmente durch ein komplexes System von Serum- und Membranproteinen genau gesteuert.
Beweise aus der jüngsten Zeit (Medof et al., 1982, „J.Exp.Med." 156: 1739; Medof et. al., 1984. „J.Exp.Med." 159:1669) legen nahe, daß die Regulierung der Aktivitäten von substratgebundenen C4b und C3b von der Steuerung der Fluidphasenenfragmente zu unterscheiden ist. Die Funktionen der ersteren werden hauptsächlich durch zwei Membranproteine gesteuert: den C3b/C4b-Rezeptor (CR1) und DAF. CR1 dissoziiert C2 und Faktor B von C4b und C36 in C3 und C5 Konvertasekomplexe und fördert die Spaltung von C3b (Medof, et al., 1982. „J.Exp.Med." 156: 1739; Fearon, D.T. 1979 „Proc.Natl.Acad.Sci. USA" 76: 5867; Medicus, et al., 1983. „Eur.J.Immunol." 13: 465; und Ross, et al., 1982 „J.Immunol." 129:2051) und C4b (Medof, et al. 1984. „J.Exp.Med." 159:1669; lida et al. 1981. „J.Exp.Med." 153: 1138) durch den Serumenzym C3b/C4b Inaktivator (I). Es wurde gezeigt, daß DAF die Zerfalldissoziation von C2 und Faktor B aus C3 Konvertasen verbessert (Nicholson-Weller, et al. 1982, „J.Immunol." 129: 205 und Pangburn, M.K. et al. 1983 „J.Exp.Med" 157: 1971). Der Grund für die offenkundige Redundanz in regulierenden Aktivitäten der zwei Membranfaktoren und ihre jeweiligen Rollen bei der Konvertase-Steuerung blieb unklar. Abnormalitäten von CR1 wurden im systemischen Lupuserythematosus (SLE) festgestellt (Miyakawa, Y. et al. 1981 „Lancet" 2: 493; lida, K. et al. 1982 „J.Exp.Med." 155: 1427; Wilson, J.G. et al. 1982 „N.Engl.J.Med." 307: 981; Taylor, R.P. et al: 1983 „Arthritis Rheum." 26:736), einer mit mangelhafter Immunkomplexhandhabung in Zusammenhang stehender Erkrankung; Abnormalitäten von DAF wurden in paroxysmaler nächtlicher Hämoglobinurie (PNH) festgestellt (Pangburn, M.K. et al. 1983 „J.Exp.Med." 157:1971; Pangburn, M.K. et al. 1983 „Proc.Natl.Acad.Sci." 80: 5430; Nicholson-Weller, A. et al. 1983 „Proc.Natl.Acad.Sci." 80: 5066) , einer mit erhöhter Lyse-Anfälligkeit von Blutkörperchen in Zusammenhang stehender Erkrankung.
Es wurde berichtet, daß DAF zu einem einzigen 70 Kd-Band an silbergefärbtem SDS-PAGE von einem vereinigten Extrakt menschlichen Erythrozytenstromas gereinigt wurde (Medof et al., 1984, „J.Exp.Med." 160: 1558). Das Molekül war hydrophob und neigte dazu, Multimere von ≥ 150 Kd zu bilden, wie dies durch Molekularsiebchromatographie festgestellt wurde. Gereinigter DAF konnte mit roten Blutkörperchen erneut assoziieren. Nur eine kleine Anzahl von DAF-Molekülen (< 100) hatte auf die hämolytische Wirkung des aktivierten Komplements einen bedeutsamen Einfluß. Medof et al. schloß, daß DAF nur innerhalb der Zellmembran wirken könnte und erinnerte, daß er die Möglichkeit des in vitro-Korrigierens des Fehlers in den Membranen von Zellen aus Patienten mit PNH bot.
Bestehende Verfahren zum Gewinnen von DAF sind für seine kommerzielle Herstellung unbefriedigend. Rote Blutkörperchen enthalten äußerst geringe Mengen an DAF. Außerdem enthält Blut Viren und andere biologisch aktive Komponenten, die ein Risiko nachteiliger Reaktionen in Empfängern oder Benutzern darstellen.
DAF roter Blutkörperchen ist auf die gebundene Nativmembranform beschränkt, einschließlich allenfalls vorhandener, natürlich vorkommender Allele. Verfahren zum Synthetisieren von Aminosäure- und Glykosylierungsvarianten sind erforderlich, die als DAF-Agonisten oder Antagonisten wirken oder die andere wünschenswerte Eigenschaften wie z.B. die Abwesenheit von C-terminalem Lipid, Proteasen-Resistenz oder die Fähigkeit, DAF zu den Membranen von Zielzellen zu befördern, aufweisen.
Demgemäß besteht ein Ziel der vorliegenden Erfindung darin, DAF in kommerzieller Menge aus einer therapeutisch akzeptablen Quelle herzustellen.
Ein weiteres Ziel besteht darin, menschlichen DAF aus einer Quelle zu gewinnen, die durch andere menschliche Proteine völlig unverschmutzt ist.
Ein zusätzliches Ziel besteht darin, Aminosäuresequenz- und Glykosylierungsvarianten von DAF herzustellen.
Andere Ziele der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der Beschreibung als Ganzes.
Zusammenfassung
Die Ziele der vorliegenden Erfindung können durch das Exprimieren von DAF in rekombinanter Zellkultur erreicht werden, ein Verfahren, das im Grunde genommen das Vorsehen von für DAF kodierender Nukleinsäure, das Transformieren einer Wirtszelle mit der für DAF-kodierenden Nukleinsäure und das Kultivieren der Zelle zur Expression von DAF in der Wirtszellenkultur umfaßt.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Herstellung neuartiger Formen von DAF, einschließlich von Aminosäuresequenzvarianten und Glykosylierungsvarianten. Aminosäuresequenzvarianten bestehen aus Löschungen, Substitutionen und Einfügungen von einem oder mehreren DAF-Aminosäureresten. DAF wird auch in einer Form exprimiert, die nicht durch die mit nativem DAF assoziierte Glykosylierung begleitet wird (einschließlich Formen, die durch keine Glykosylierung begleitet werden), die als Expressionsprodukt von DAF in einer heterologen rekombinanten Zellkultur gewonnen wird.
Unerwarteterweise entdeckten die Autoren während der Untersuchung des Zellverarbeitens von DAF mRNA, daß die membrangebundene Form von DAF (mDAF) nicht die einzige Form ist, in der er in vivo exprimiert ist. Es gibt nämlich eine weitere Form von DAF namens sDAF. Diese Form wird durch eine mRNA-Spezies kodiert, aus der das letzte 3' Intron nicht gespleißt wurde, was zu einem Aminosäuresequenz C-Terminal bis Rest 327 führt, der sich von jenem von mDAF gänzlich unterscheidet. Man glaubt, daß der neuartige C-Terminus von sDAF in vivo zur Sekretierung des Proteins in den Blutstrom führt, wo er biologisch aktiv ist, da das Vorhandensein des Introns den Leserahmen des letzten Exons ändert, sodaß der Bereich eliminiert wird, an den Phosphatidylinosit (der Membrananker für mDAF) gebunden ist. Diese neuartige Form von DAF war unbekannt, bis die hierin beschriebenen bahnbrechenden Arbeiten durchgeführt wurden; sie unterscheidet sich insofern von mDAF, als sie einen antigenisch unterschiedlichen C-Terminus enthält. sDAF eignet sich zur Diagnose von PNH, da es nun möglich ist, zu bestimmen, ob die Erkrankung eines Patienten aus einem Unvermögen, jegliches DAF-Gen zu exprimieren, oder einem Versagen der posttranslationalen Verarbeitung herrührt, den Phosphatidylinositanker zu befestigen.
Neuartige Nukleinsäuren sind auch vorgesehen, einschließlich (1) zellfreie Nukleinsäure, die als kodierender DAF identifiziert wird, einschließlich genomische DNA, cDNA oder RNA, (2) für DAF kodierende DNA, frei von einer untranslatierten intervenierenden Sequenz (Introne) oder flankierende genomische DNA, und (3) für DAF kodierende Nukleinsäure, frei von Nukleinsäure, die irgendein anderes Protein kodiert, das zur Quelle der für DAF kodierenden Nukleinsäure homolog ist. In den erfindungsgemäßen Schutzbereich fällt auch eine Nukleinsäure, die nicht für DAF kodiert, doch fähig ist, mit für DAF kodierender Nukleinsäure zu hybridisieren.
Für DAF kodierende Nukleinsäure eignet sich zur Expression von DAF in rekombinanter Zellkultur oder zum Prüfen von Testproben hinsichtlich der Gegenwart von für DAF kodierender Nukleinsäure. Markierte für DAF kodierende oder hybridisierende Nukleinsäure wird zur Verwendung in solchen Assays bereitgestellt.
Rekombinanter DAF wird zu therapeutisch verträglichen Vehikeln formuliert und zur Behandlung von PNH oder Entzündungs- oder zellytischen Autoimmunerkrankungen verabreicht. DAF-Konjugate oder Fusionen werden hergestellt, die DAF zu Zielzellen befördern, um die Komplementaktivierung an den Oberflächen solcher Zellen zu hemmen. Die Konjugate oder Fusionen eignen sich zum Verbessern der Allograftabstoßung oder von Autoimmunerkrankungen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1a – 1f zeigen die cDNA-Sequenz für Klone λ33 (zur Hind III-Stelle an Rest 1) und λ47 (Hind III bis zum 3' Ende). Der Punkt, an dem das Intron entfernt wird, ist durch einen Stern gekennzeichnet. Die mutmaßliche Phosphatidylinosit-Derivatisierungsstelle ist Cys ₃₃₀, und der vermeintliche Transmembranbereich erstreckt sich von Rest 331–347. Aminosäurereste werden vom reifen Aminoterminus bei Asp¹ an numeriert. 2a – 2g zeigen die cDNA-Sequenz der Klone λ33 bis zur Hind III- Stelle an Rest +1) und λ41 (Hind III bis zum 3'-Ende), die für menschlichen sDAF kodiert. Das nicht gespleißte Intron in der für sDAF kodierenden cDNA ist eingeklammert. Restriktionsenzymstellen sind unter Verwendung herkömmlicher Abkürzungen angezeigt. Die zugeschriebene Aminosäuresequenz für jede DAF-Spezies ist gemeinsam mit dem Sekretionsleader und dem reifen N-Terminus eines jeden (durch Pfeile gekennzeichnet) dargestellt.
Ausführliche Beschreibung
DAF ist gemäß Definition jegliches Molekül, das die in 1 oder 2 dargestellte prä- oder reife Aminosäuresequenz ebenso wie ihre Aminosäuresequenz- oder Glykosylierungsvarianten aufweist (einschließlich natürlicher Allele), die fähig sind, eine biologische Aktivität aufzuweisen, die dem nativen DAF der 1 oder 2 gemeinsam ist. Der Ausdruck DAF steht nunmehr für eine oder beide Formen, soferne nicht anders passend. Nativer DAF ist DAF aus Serum, Blutkörperchen oder anderen tierischen Fluids oder Geweben. DAF-biologische Aktivität ist als irgendeine beliebige (1) immunologische Kreuzreaktivität mit zumindest einem Epitop von nativem DAF oder (2) als Besitz zumindest einer hormonalen, regulierenden oder Effektorfunktion definiert, die qualitativ nativem DAF gemeinsam ist. Da die Aminosäuresequenzvariationen von DAF mit antagonistischer oder agonistischer Aktivität eingeschlossen sind, muß eine Aminosäuresequenzvariante keine DAF-immunomodulatorische Aktivität aufweisen, um in der Definition von DAF enthalten zu sein. Eine Variante kann z.B. als ein Antagonist wirken und nativen DAF vollständig hemmen, aber keine immunomodulatorische Aktivität an sich aufweisen. Alternativ dazu kann die Variante weder ein Antagonist sein noch eine immunomodulatorische Aktivität aufweisen, jedoch trotzdem in der Definition enthalten sein, wenn sie die Fähigkeit des Kreuzreagierens mit einem gegen nativen DAF gezüchteten Antikörper bewahrt. Ein Beispiel einer derzeit bekannten DAF-immunomodulatorischen Aktivität ist die Hemmung der C4b2a funktionalen Aktivität (Medof et al., 1984. ebda).
Aminosäuresequenzvarianten von DAF enthalten Löschungen aus, oder Einfügungen oder Substitutionen von Resten innerhalb der in 1 oder 2 dargestellten prä- oder reifen DAF-Sequenz. Aminosäuresequenzlöschungen reichen im allgemeinen von etwa 1 bis 10 Resten und sind typischerweise angrenzend. Angrenzende Löschungen erfolgen üblicherweise in geradzahligen Resten, doch auch einfache oder ungerade Zahlen von Löschungen fallen in den erfindungsgemäßen Schutzbereich. Repräsentative Löschungen sind (des Cys₃₃₀ ) reifer mDAF, (des Cys₃₃₀ – Thr₃₄₇ ) reifer mDAF, (des Thr₂ – Gly₃₂₇ ) reifer sDAF. Eine besonders interessante Löschung ist die von Cys₃₃₀ – Thr₃₄₇ aus mDAF. Diese beseitigt die Membranankerstelle und den Transmembranbereich, wodurch ein Molekül entsteht, das wie sDAF sekretiert wird, das jedoch keine der einzigartigen.antigenen Determinanten von sDAF aufweist.
Einfügungen werden auch vorzugsweise in geradzahligen Resten vorgenommen, wenn die Variation in die reife DAF-Sequenz fällt, obwohl Einfügungen im allgemeinen von etwa 1 bis 5 Resten reichen können. Einfügungen enthalten jedoch auch Fusionen auf die Amino- oder Carboxyltermini von DAF von 1 Rest bis zu Polypeptiden mit im wesentlichen uneingeschränkter Länge. Ein Beispiel einer einfachen terminalen Einfügung ist reifer DAF mit einem N-terminalen Methionyl. Diese Variante ist ein Artefakt der direkten Expression von DAF in rekombinanter Zellkultur, d.h. einer Expression ohne eine Signalsequenz, um die Sekretierung oder Zellmembranassoziierung von reifem DAF zu lenken. Andere Beispiele terminaler Einfügungen umfassen (1) Fusionen heterologer Signalsequenzen bis zum N-Terminus von reifem DAF, um die Sekretierung von reifem DAF aus rekombinanten Wirten zu erleichtern, (2) Fusionen immunogener Polypeptide, z.B. bakterieller Polypeptide, wie z.B. Beta-Lactamase oder ein durch die E.coli trp Stelle kodiertes Enzym und (3) Fusionen mit Zelloberflächenbindungssubstanzen, einschließlich Hormone, Wachstumsfaktoren oder Antikörper. Fusionen mit Zelloberflächenbindungssubstanzen müssen nicht durch rekombinante Verfahren erzeugt werden, können aber das Produkt kovalenter oder nichtkovalenter Assoziierung mit DAF einschließlich seiner Phosphatidylinositgruppe sein. Beispielsweise ist ein Antikörper oder Fragment davon, das den variablen Bereich trägt, an den C-Terminus von DAF kovalent gebunden oder in in einer rekombinanten Zellkultur als Fusion mit dem C-Terminus von DAF exprimiert. Zur Verbesserung der Allograftabstoßung ist der DAF an Antikörper gebunden, die für die HLA-Antigene des Allografts spezifisch sind. Der Antikörper und DAF sind kovalent gebunden, z.B. durch das Verfahren von EP 170.697A , obwohl auch andere Verfahren zum Verbinden von Proteinen mit Antikörpern herkömmlich und dem Fachmann bekannt sind. Immunogene Fusionen eignen sich zum Herstellen von immunogenen DAFs, die als Impfstoffe für die Herstellung von anti-DAF Antikörpern geeignet sind. Diese sind nützlich für die Herstellung von diagnostischen Reagenzien. Repräsentative Einfügungen sind (Thr ₃₂₉ LeuLeu Cys₃₃₀) reifer DAF, (Arg ₁₀₀ His Arg ₁₀₀) reifer DAF, (Lys ₁₂₅ GlnLys ₁₂₆ GlnLys ₁₂₇) reifer DAF, (Pro ₁₉₃LeuLeu Ala ₁₉₄) reifer DAF, (Pro ₂₄₇ AspAspGlu ₂₄₈) reifer DAF, ((Thr ₂₈₂SerSer Thr ₂₈₃) reifer DAF und (Gly ₃₁₆ ThrThrThr ₃₁₇) reifer DAF.
Die dritte Variantengruppe ist jene, worin zumindest ein Rest im DAF-Molekül entfernt wurde und ein unterschiedlicher Rest an seiner Stelle eingefügt wurde. Solche Substitutionen werden im allgemeinen gemäß der folgenden Tabelle vorgenommen. Tabelle 1

Ursprünglicher Rest Beispielhafte Substitutionen

Ala gly;ser

Arg lys

Asn gln;his

Asp glu

Cys ser

Gln asn

Glu asp

Gly ala

His asn;gln

Ile leu;val

Leu ile;val

Lys arg; gln; glu

Met leu; ile

Phe met; leu; tyr

Ser thr

Thr ser

Trp tyr

Tyr trp; phe

Val ile; leu
Wesentliche Veränderungen der Funktion oder immunologischen Identität erfolgen durch das Auswählen von Substitutionen, die weniger konservativ sind als die von Tabelle 1, d.h. durch Auswählen von Resten, die sich in ihrem Einfluß auf die Aufrechterhaltung (a) der Struktur des Polypeptidrückgrats im Substitutionsbereich, z.B. als Blatt- oder Spiralförmige Konformation, (b) der Ladung oder Hydrophobie des Moleküls an der Zielstelle oder (c) des Großteils der Seitenkette bedeutsam unterscheiden. Die Substitionen, von denen man erwarten kann, daß sie im allgemeinen die größten Veränderungen der DAF-Eigenschaften hervorrufen, sind jene, worin (a) ein hydrophiler Rest, z.B. Seryl oder Threonyl, für (oder durch) einen hydrophoben Rest substituiert ist, z.B. Leucyl, Isoleucyl, Phenylalanyl, Valyl oder Alanyl; (b) ein Cystein oder Prolin für (oder durch) einen weiteren Rest substituiert ist; (c) ein Rest mit einer elektropositiven Seitenkette, z.B. Lysyl, Arginyl oder Histidyl, für (oder durch) einen elektronegativen Rest substituiert ist, z.B. Glutamyl oder Aspartyl; oder (d) ein Rest mit einer voluminösen Seitenkette, z.B. Phenylalanin, für (oder durch) einen Rest substituiert ist, der eine solche Seitenkette nicht aufweist, z.B. Glycin.
Repräsentative substituierte DAFs sind (Cys₃₃₀ -> Met) reifer mDAF, (Cys₃₃₀ -> Ser) reifer mDAF, (Cys₂ -> Ser) reifer DAF, (Lys ₁₂₅ Lys ₁₂₆) -> Gln) reifer DAF, (Gly ₁₄₄ -> Pro) reifer DAF, (Ile ₁₄₆ -> Met) reifer DAF, (Phe ₁₆₉ -> Tyr) reifer DAF, (Pro ₁₉₂ -> Gly) reifer DAF, (Ile ₂₀₁ -> Leu) reifer DAF, (Asn ₂₃₆ Asn ₂₃₇ -> Asp Asp ) reifer DAF, (Glu ₂₃₉ -> Asp) reifer DAF, (Ser ₂₅₆ -> Tyr) reifer DAF, (Val ₂₆₈ -> Phe) reifer DAF, (Lys ₂₈₅ -> Gln) reifer DAF, (Thr ₂₉₄ -> Ser) reifer DAF und (Leu ₃₂₄ -> Ser) reifer DAF.
Die oben beschriebenen Varianten werden entweder in sDAF oder mDAF gebildet. Die folgenden Varianten werden im einzigen sDAF C-Terminal gebildet:
(Lys ₃₅₂ -> Gln) reifer sDAF, (Cys ₃₃₉ -> Ser) reifer sDAF, (Arg ₃₉₄ -> His) reifer sDAF und reifer sDAF (Leu ₄₀₃ Phe ₄₀₄ Leu ₄₀₅ -> SerTyrSer) reifer sDAF.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung sind alle natürlich vorkommenden Allele nicht im Schutzumfang der DAF-Varianten enthalten, da die hierin beschriebenen Varianten vorbestimmte DAF-Varianten sind.
Die C-terminate Domäne von mDAF enthält eine Stelle, an die im Laufe des posttranslationalen Verarbeitens ein Lipid angebracht wird. Diese Domäne oder jedes beliebige sie enthaltende Fragment von mDAF wird als Fusion mit irgendeinem anderen Polypeptid exprimiert, für das wünschenswerterweise eine membrangebundene Form geschaffen werden soll. Beispielsweise wird ein in üblicher Weise sekretiertes Hormon in einer rekombinanten Zellkultur als eine C-terminate Fusion des Präproteins mit der C-terminalen Domäne von mDAF exprimiert. Diese Fusion wird nicht sekretiert, sondern. zur Zellmembran transportiert und dort durch den Phosphatidycholinanker bleibend aufgenommen. Solche rekombinante Zellen eignen sich als Immunogene oder Impfstoffe für das Hormon oder ein anderes ausgewähltes Polypeptid. Das Sequestrieren des Polypeptids in der Membran schützt es vor der Verdünnung in das Kulturmedium. Schließlich eignen sich Fusionspolypeptide mit C-terminalen Lipiden in diagnostischen Assays hinsichtlich der Polypeptide oder ihrer Antikörper, da das terminale Lipid eine geeignete Stelle zur Adsorption auf immobilisierende Matrizen wie z.B. Alkyl-Sepharose, Polyolefin-Mikrotiter oder Reagenzglasoberflächen u.ä. bietet.
Die meisten Löschungen und Einfügungen, und insbesondere die Substitutionen, bewirken keine radikalen Veränderungen der Eigenschaften des DAF-Moleküls. Wenn es jedoch schwierig ist, die genaue Auswirkung der Substitution, Löschung oder Einfügung vor der Durchführung derselben vorherzusagen, z.B. wenn die DAF-Rezeptorbindungsdomäne oder ein immunes Epitop modifiziert wird, ist es für einen Fachmann auf dem Gebiet offenkundig, daß die Auswirkung durch Routine-Screenassays ermittelt werden kann. Eine Variante wird z.B. typischerweise durch stellenspezifische Mutagenese der für nativen DAF kodierenden Nukleinsäure, Expression der Varianten-Nukleinsäure in rekombinanter Zellkultur und wahlweise durch Reinigung aus der Zellkultur, z.B. durch Immunoaffinitätsadsorption auf einer Kaninchen-polyklonale anti-DAF-Säule hergestellt (um die Variante durch zumindest ein verbleibendes Immunepitop zu adsorbieren). Die Aktivität des Zellysats oder der gereinigten DAF-Variante wird dann in einem geeigneten Screenassay hinsichtlich der erwünschten Eigenschaft geprüft. Beispielsweise wird eine Veränderung der immunologischen Eigenschaft des DAF, wie z.B. Affinität für einen bestimmten Antikörper, durch einen Immunassay der kompetitiven Art gemessen. Veränderungen der Immunmodulatoraktivität werden durch den C4b2a-Assay gemessen, obwohl mit einem größeren Wissen über die in vivo Funktionen von sDAF und mDAF andere Assays für ein solches Screenen nützlich sein werden. Modifizierungen solcher Proteineigenschaften wie der Redox- oder Wärmestabilität, Hydrophobie, Anfälligkeit gegenüber proteolytischem Abbau oder der Neigung, sich mit Trägern oder in Multimere zu aggregieren, werden durch Verfahren geprüft, die dem Fachmann auf dem Gebiet wohl vertraut sind.
DAF wird vorzugsweise durch die Synthese in rekombinanter Zellkultur hergestellt. Dafür ist es zunächst erforderlich, Nukleinsäure sicherzustellen, die für DAF kodiert. Die Autoren der vorliegenden Erfindung stießen beim Versuch, irgendeine für DAF kodierende Nukleinsäure zu identifizieren, auf beträchtliche Schwierigkeiten. Die Sequenz der für DAF kodierenden menschlichen mDNA, die schließlich ermittelt wurde, ist in 1 ersichtlich. Wie bereits erwähnt, führte die Untersuchung von cDNAs aus Hela-Zellen zur Identifizierung der für sDAF kodierenden cDNA (dargestellt in 2). Sobald diese DNA identifiziert wurde, stellte es für Fachleute auf dem Gebiet keine Schwierigkeit dar, sie durch Nukleinsäurehybridisierung zu genomischen Sammlungen menschlicher DNA zu gewinnen oder, falls dies gewünscht wird, DNA zu erhalten, die für den DAF einer anderen Tierspezies kodiert, in diesem Falle durch Hybridisierung von DNA-Sammlungen aus Zellen dieser Spezies. Die Hybridisierungsanalyse ist nun vereinfacht, da 1 und 2 die Herstellung von sehr langen synthetischen Sonden ermöglichen, die perfekte oder nahezu perfekte Anpassungen für die Ziel-DNA sind.
Es ist möglich, daß die cDNA oder genomische Sammlung, die als Quelle für die DAF-Nukleinsäure ausgewählt wurde, kein einzelnes Klon enthält, das für DAF voller Länge kodiert, sondern nur Teilklone enthält. Diese Teilklone und Fragmente werden durch Spalten der Teilklone an ausgewählten Restriktionsstellen in überlappenden Abschnitten, durch Gewinnen jedes der erwünschten Fragmente und durch deren Ligieren in der richtigen Reihenfolge und Ausrichtung ohne Schwierigkeiten zusammengesetzt. Im Bedarfsfall werden Oligonukleotide hergestellt, um jegliche fehlende Sequenzen bereitzustellen.
Die für DAF kodierende Nukleinsäure wird dann zum weiteren Klonen oder zum Exprimieren in einen replizierbaren Vektor ligiert. Vektoren eignen sich zum Ausführen von zwei Funktionen in Zusammenwirken mit kompatiblen Wirtszellen (ein Wirtsvektorsystem). Eine Funktion besteht darin, das Klonieren der für den DAF kodierenden Nukleinsäure zu erleichtern, d.h. brauchbare Mengen der Nukleinsäure zu erzeugen. Die andere Funktion ist die Lenkung der Expression von DAF. Eine oder beide dieser Funktionen erfolgen durch das Vektorwirtssystem. Die Vektoren enthalten je nach Funktion, die sie erfüllen sollen unterschiedliche Komponenten sowie die Wirtszelle, die zum Klonieren oder Exprimieren ausgewählt wird.
Jeder Vektor enthält Nukleinsäure, die wie oben beschrieben für DAF kodiert. Typischerweise ist dies DNA; die für den DAF in seiner an seinem Aminoterminus mit einem Sekretionssignal verbundenen reifen Form kodiert. Dieses Sekretionssignal ist vorzugsweise die DAF-Präsequenz, die normalerweise die Sekretion von DAF aus menschlichen Zellen in vivo lenkt. Geeignete Sekretionssignale enthalten jedoch auch Signale aus anderen Tier-DAFs, Virensignalen oder Signalen aus sekretierten Polypeptiden derselben oder verwandten Spezies.
Expressions- und Klonierungsvektoren enthalten eine Nukleinsäuresequenz, die es dem Vektor ermöglicht, in einer oder mehreren ausgewählten Wirtszellen zu replizieren. Im allgemeinen ermöglicht es diese Sequenz in Klonierungsvektoren dem Vektor, sich unabhängig von den Wirtschromosomen zu replizieren und enthält Replikationsursprünge oder autonom replizierende Sequenzen. Solche Sequenzen sind für eine Vielfalt von Bakterien, Hefe und Viren bekannt. Der Replikationsursprung aus dem wohlbekannten Plasmid pBR322 eignet sich für die meisten gramnegativen Bakterien, dem 2μ Plasmidursprung für Hefe und verschiedene virale Ursprünge (SV40, Polyoma, Adenovirus, VSV oder BPV) für Klonierungsvektoren in Säugetierzellen. Ursprünge sind für Säugetier-Expressionsvektoren nicht erforderlich (der SV40-Ursprung wird in den Beispielen nur deswegen verwendet, weil er den frühen Promotor enthält). Die meisten Expressionsvektoren sind „Shuttle"-Vektoren, d.h. sie sind in zumindest einer Organismenklasse zur Replikation fähig, können aber zur Expression in einen anderen Organismus transfiziert werden. Beispielsweise wird ein Vektor in E.coli geklont und dann wird derselbe Vektor zur Expression in Hefe oder Säugetierzellen transfiziert, obwohl er nicht fähig ist, sich unabhängig vom Wirtszellenchromosom zu replizieren.
DNA wird auch durch das Einsetzen in das Wirtsgenom geklont. Dies wird ohne Schwierigkeiten durch Bazillenspezies erreicht, z.B. durch Einschließen einer DNA-Sequenz in den Vektor, die zur einer Sequenz in der genomischen DNA des Bazillus komplementär ist. Die Transfektion des Bazillus mit diesem Vektor führt zur homologen Rekombination mit dem Genom und zum Einfügen von DAF-DNA. Die Gewinnung von für DAF kodierender genomischer DNA ist jedoch komplexer als jene eines exogen replizierten Vektors, da zum Ausschneiden von DAF-DNA eine Restriktionsenzymdigestion erforderlich ist.
Im allgemeinen wird DNA zum Zwecke der Herstellung einer stabilen Zellinie oder Mikrobe für die DAF-Expression in ein Wirtsgenom eingesetzt.
Expressions- und Klonierungsvektoren sollten ein Auswahlgen enthalten, das auch als auswählbarer Marker bezeichnet wird. Dies ist ein Gen, das für ein Protein kodiert, das für das Überleben oder Wachstum einer mit dem Vektor transformierten Wirtszelle notwendig ist. Die Anwesenheit dieses Gens stellt sicher, daß keine Wirtszelle, die den Vektor löscht, einen Vorteil hinsichtlich des Wachstums oder der Reproduktion im Vergleich zu transformierten Wirten aufweist. Typische Auswahlgene kodieren für Proteine, die (a) Resistenz gegenüber Antibiotika oder anderen Toxinen, z.B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat oder Tetracyclin verleihen, (b) auxotrophische Mängel wettmachen oder (c) entscheidende Nährstoffe bereitstellen, die aus komplexen Medien nicht erhältlich sind, z.B. das Gen, das für D-Alaninracemase für Bazillen kodiert.
Ein geeignetes Auswahlgen zur Verwendung in Hefe ist das trp1-Gen, das im Hefeplasmid YRp7 vorhanden ist (Stinchcomb et al., 1979, „Nature", 282: 39; Kingsman et al., 1979, „Gene", 7: 141; oder Tschemper et al., 1980, „Gene", 10: 157). Das trp1-Gen bietet einen Auswahlmarker für einen Mutanten-Hefestamm, dem es an der Fähigkeit mangelt, in Tryptophan zu wachsen, z.B. ATCC Nr. 44076 oder PEP4-1 (Jones, 1977, „Genetics", 85: 12). Das Vorhandensein der trp1-Läsion im Hefewirtszellengenom bietet dann eine wirkungsvolle Umgebung zum Nachweisen von Transformation durch Wachstum in Abwesenheit von Tryptophan. In ähnlicher Weise werden Leu2-lose Hefestämme (ATCC 20.622 oder 38.626) durch bekannte, das Leu2-Gen aufweisende Plasmide ergänzt.
Beispiele geeigneter auswählbarer Marker für Säugetierzellen sind Dihydrofolatreductase (DHFR) oder Thymidinkinase. Solche Marker ermöglichen die Identifizierung von Zellen, die kompetent waren, die DAF-Nukleinsäure aufzunehmen. Die Säugetierzelltransformanten werden unter Auswahldruck gesetzt, den nur die Transformanten in einzigartiger Weise eingestellt sind zu überleben, da sie den Marker aufgenommen haben. Der Selektionsdruck wird durch Kultivieren der Transformanten unter Bedingungen auferlegt, worin die Konzentration des Auswahlmittels im Medium hintereinander geändert wird, was zu einer Verstärkung sowohl des Auswahlgens als auch der für DAF kodierenden DNA führt. Die Verstärkung ist ein Vorgang, durch den Gene, für die zur Herstellung eines für das Wachstum entscheidenden Proteins ein größerer Bedarf besteht, im Tandem innerhalb der Chromosomen nachfolgender Generationen rekombinanter Zellen (ständig) wiederholt werden. Gesteigerte DAF-Mengen werden aus der verstärkten DNA synthetisiert.
Beispielsweise werden die mit dem DHFR-Auswahlgen transformierten Zellen zunächst durch Kultivieren aller Transformanten in einem Kulturmedium identifiziert, das einen Mangel an Hypoxanthin, Glycin und Thymidin aufweist. Eine geeignete Wirtszelle ist in diesem Fall die chinesische Hamstereierstock- (CHO Zellinie, die einen Mangel an DHFR-Aktivität aufweist und nach Urlaub und Chasin, 1980, „Proc.Nat'I.Acad.Sci. USA" 77: 4216 hergestellt und vermehrt wird. Eine besonders geeignete DHFR ist eine Mutanten-DHFR, die gegenüber MTX ( EP 117.060A ) äußerst resistent ist. Dieses Auswahlmittel kann mit jedem beliebigen sonst geeigneten Wirt verwendet werden, z.B. ATCC Nr. CCL61 CHO-K1), trotz des Vorhandenseins endogener DHFR. Die für DHFR und DAF kodierende DNA wird dann verstärkt, indem sie einem Mittel (Methotrexat oder MTX) ausgesetzt wird, das die DHFR inaktiviert. Man stellt sicher, daß die Zelle mehr DHFR erfordert (und folglich die gesamte exogene DNA amplifiziert), indem man nur jene Zellen auswählt, die in aufeinanderfolgenden Runden immer größerer MTX-Konzentration wachsen können.
Andere Verfahren, Vektoren und Wirtszellen, die sich zur Anpassung an die Synthese des Hybridrezeptors in rekombinanter Wirbeltierzellkultur eignen, sind bei M.J. Gething et al., „Nature" 293: 620–625 (1981); N.Mantei et al., „Nature" 281: 40–46; und A.Levinson et al., EP 117.060A und 117.058A beschrieben. Ein besonders geeignetes Ausgangsplasmid für Säugetierzellkulturexpression von DAF ist pE342.HBV E400.D22 (auch als pE348HBVE400D22, EP 117.058A bezeichnet).
Expressionsvektoren sollten im Gegensatz zu Klonierungsvektoren einen Promotor enthalten, der durch den Wirtsorganismus erkannt und operabel mit der DAF-Nukleinsäure verbunden wird. Promotoren sind untranslatierte Sequenzen, die stromaufwärts vom Startcodon eines Strukturgens (im allgemeinen innerhalb von etwa 100 bis 1000 bp) angeordnet sind und welche die Transkription und Translation von Nukleinsäure unter ihrer Kontrolle steuern. Sie lassen sich typischerweise in zwei Klassen einteilen, in induzierbare und konstitutive. Induzierbare Promotoren sind Promotoren, die als Reaktion auf gewisse Veränderung in den Kulturbedingungen, z.B. durch das Vorhandensein oder das Fehlen eines Nährstoffes oder durch eine Temperaturänderung, gesteigerte Transkriptionswerte aus DNA unter ihrer Kontrolle initiieren. Derzeit ist eine große Anzahl an Promotoren wohlbekannt, die durch viele verschiedene potentielle Wirtszellen erkannt werden. Diese Promotoren werden durch Entfernen aus ihrem Ursprungsgen durch Restriktionsenzymdigestion und anschließender Einfügung 5' zum Startcodon für DAF operabel an für DAF kodierende DNA gebunden. Dies bedeutet nicht, daß der genomische DAF-Promotor ungeeignet ist. Heterologe Promotoren jedoch führen im allgemeinen zu einer größeren Transkription und höheren Ausbeuten an exprimiertem DAF.
Die Nukleinsäure wird operabel verbunden, wenn sie mit einer anderen Nukleinsäuresequenz in eine funktionale Beziehung gesetzt wird. Beispielsweise wird DNA für eine Präsequenz oder einen sekretorischen Leader operabel mit DNA für ein Polypeptid verbunden, wenn sie als Präprotein exprimiert wird, das an der Sekretion des Polypeptids beteiligt ist; ein Promotor oder Verstärker wird operabel mit einer Kodierungssequenz verbunden, wenn er die Transkription der Sequenz beeinflußt; oder eine Ribosomenbindende Stelle wird operabel mit einer Kodierungssequenz verbunden, wenn sie so positioniert ist, daß sie die Translation erleichtert. Im allgemeinen bedeutet operabel verbunden, daß die verbundenen DNA-Sequenzen angrenzend und im Fall eines Sekretionsleaders angrenzend und in einer Lesephase sind. Das Verbinden erfolgt durch Ligieren an geeigneten Restriktionsstellen. Wenn solche Stellen nicht vorhanden sind, werden synthetische Oligonukleotidadaptoren oder Linker gemäß herkömmlicher Verfahren verwendet.
Zur Verwendung mit prokaryotischen Wirten geeignete Promotoren sind u.a. die β-Lactamase- und Lactose-Promotorsysteme (Chang et al., 1978, „Nature", 275: 615; und Goeddel et al., 1979, „Nature", 281: 544), alkalische Phosphatase, ein Tryptophan- (trp) Promotorsystem (Goeddel 1980, „Nucleic Acids Res." 8: 4057 und EPO Anmeldungsveröffentl.Nr. 36.776) und Hybridpromotoren wie z.B. der tac-Promotor (H.de Boer et al., 1983, „Proc.Nat'I.Acad.Sci. USA" 80: 21–25). Es eignen sich jedoch auch andere bakterielle Promotoren. Ihre Nukleotidsequenzen wurden veröffentlicht, wodurch ein Fachmann auf dem Gebiet in der Lage ist, sie an für DAF kodierende DNA (Siebenlist et al., 1980, „Cell" 20: 269) unter Verwendung von Linkern oder Adaptoren zu ligieren, um beliebige erforderliche Restriktionsstellen bereitzustellen. Promotoren zur Verwendung in Bakteriensystemen enthalten auch eine Shine-Dalgarno (S.D.) Sequenz, die operabel mit der für DAF kodierenden DNA verbunden ist.
Geeignete Promotorsequenzen zur Verwendung mit Hefewirten sind u.a. die Promotoren für 3-Phosphoglyzeratkinase (Hitzeman et al., 1980, „J.Biol.Chem." 255: 2073) oder andere glykolytische Enzyme (Hess et al., 1968, „J. Adv. Enzyme Reg." 7: 149; und Holland, 1978, „Biochemistry", 17: 4900), wie z.B. Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glukose-6-phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglukoseisomerase und Glucokinase.
Andere Hefepromotoren, die induzierbare Promotoren mit dem zusätzlichen Vorteil der durch Wachstumsbedingungen gesteuerten Transkription sind, sind die Promotorbereiche für Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, saure Phosphatase, Abbauenzyme, die mit dem Stickstoffmetabolismus, Metallothionein, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase assoziiert sind und Enzyme, die für Maltose und Galactose-Verwendung verantwortlich sind. Geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung bei der Hefeexpression sind in R.Hitzeman et al., EP 73.657A beschrieben. Hefeverstärker werden auch in vorteilhafter Weise mit Hefepromotoren verwendet.
Die DAF-Transkription aus Vektoren in Säugetierwirtszellen wird durch Promotoren gesteuert, die aus Genomen von Viren wie z.B. Polyoma, Cytomegalovirus, Adenovirus, Retrovirus, Hepatitis-B Virus und am bevorzugtesten vom Affenvirus 40 (SV40) oder aus heterologen Säugetierpromotoren, z.B. dem Actinpromotor, gewonnen werden. Die frühen und späten Promotoren des SV40 Virus werden in geeigneter Weise als ein SV40-Restriktionsfragment gewonnen, das auch den SV40 Virenreplikationsursprung enthält (Fiers et al., 1978, „Nature", 273: 113). Natürlich sind auch Promotoren aus der Wirtszelle oder verwandten Spezien in der vorliegenden Erfindung geeignet.
Die Transkription von für DAF kodierender DNA durch höhere Eukaryoten wird durch Einfügen einer Verstärkersequenz in den Vektor gesteigert. Ein Verstärker ist eine Nukleotidsequenz, üblicherweise von etwa 10–300 bp, die auf einen Promotor wirkt, um seine Transkription zu erhöhen; dies geschieht in einer relativ ausrichtungs- und positionsunabhängigen Weise. Es sind nun viele Verstärkersequenzen aus Säugetiergenen bekannt (Globin, Elastase, Albumin, α-Fetoprotein und Insulin). Typischerweise verwendet man jedoch einen Verstärker aus einem eukaryotischen Zellvirus. Zu Beispielen gehören der SV40-Verstärker auf der späten Seite des Replikationsursprungs (bp 100–270), der Cytomegalovirus-frühe Promotorverstärker, der Polyomaverstärker auf der späten Seite des Replikationsursprungs und adenovirale Verstärker. Der Verstärker kann bei einer Position 5' oder 3' zur für DAF kodierenden Sequenz in den Vektor gespleißt werden, doch er befindet sich vorzugsweise an einer Stelle 5' vom Promotor.
Die in eukaryotischen Wirtszellen (Hefe-, Pilze-, Insekten-, Pflanzen-, Tier-, Menschen- oder kernhältige Zellen aus anderen multizellularen Organismen) verwendeten Expressionsvektoren enthalten auch Sequenzen, die für die Beendigung der Transkription und zum Stabilisieren der mRNA erforderlich sind. Solche Sequenzen sind üblicherweise von den 5' und gelegentlich auch von den 3' untranslatierten Bereichen eukaryotischer oder viraler DNAs oder cDNAs verfügbar. Diese Bereiche enthalten Bereiche, die im untranslatierten Abschnitt der für DAF kodierenden mRNA als polyadenylierte Segmente transkribiert sind. Die 3' untranslatierten Bereiche enthalten auch Transkriptionsterminationsstellen.
Geeignete Wirtszellen zum Klonieren oder Exprimieren der Vektoren sind in der vorliegenden Erfindung Prokaryoten, Hefe oder höhere eukaryotische Zellen. Zu Prokaryoten gehören gramnegative oder grampositive Organismen, z.B. E.coli oder Bazillen. Ein bevorzugter Klonierungswirt ist E.coli 294 (ATCC 31.446), obwohl auch andere gramnegative oder grampositive Prokaryoten wie z.B. E.coli B, E.coli X1776 (ATCC 31.537), E.coli W3110 (ATCC 27.325), Pseudomonas-Spezies oder Serratia Marcesans geeignet sind.
Zusätzlich zu Prokaryoten, sind eukaryotische Mikroben wie z.B. Fadenpilze oder Hefe geeignete Wirte für Vektoren, die für DAF kodieren. Saccharomyces cerevisiae, oder herkömmliche Backhefe, ist der am häufigsten verwendete niedere eukaryotische Wirtsmikroorganismus. Es sind jedoch auch mehrere andere Gattungen, Spezien und Stämme üblicherweise verfügbar und für die vorliegende Erfindung geeignet.
Die bevorzugten Wirtszellen zur Expression von DAF sind aus multizellularen Organismen gewonnene Zellen. Die große Größe von DAF sowie seine intramolekularen Disulfidbindung(en) und, im Falle von mDAF, seine einzigartige posttranslationale Verarbeitung legt nahe, daß die Wirtszelle optimalerweise eine höhere phylogenetische Ordnung als die Mikroben aufweist, wenn man vom rekombinanten Protein erwartet, daß es eine optimale Treue zu nativem DAF zeigt. Zusätzlich kann es wünschenswert sein, DAF zu glykosylieren. All diese Funktionen können am besten durch höhere eukaryotische Zellen erfüllt werden. Im Prinzip ist jede beliebige höhere eukaryotische Zellkultur brauchbar, ob aus einer Wirbeltier- oder einer wirbellostier Kultur, obwohl Zellen aus Säugetieren wie z.B. Menschen bevorzugt sind. Die Vermehrung solcher Zellen in Kultur ist an sich wohlbekannt. Siehe "Tissue Culture", Academic Press, Kruse und Patterson, Hrsg. (1973). Beispiele geeigneter Säugetierzellinien sind VERO und HeLa-Zellen, chinesische Hamstereierstock-Zellinien, die WI38, BHK, COS-7, MDCK-Zellinien und die menschliche Embryonennieren-Zellinie 293.
Wirtszellen werden mit den oben beschriebenen Expressions- oder Klonierungsvektoren transformiert und in herkömmlichen Nährmedien kultiviert, die in geeigneter Weise zum Induzieren von Promotoren oder Auswählen von Transformanten, die verstärkte Gene enthalten, modifiziert werden. Die Kulturbedingungen, wie z.B. Temperatur, pH-Wert u.ä., sind geeigneterweise jene, die zuvor bei der Wirtszelle herrschten, die entweder zum Klonieren oder zum Exprimieren ausgewählt wurde, wie dies für einen Fachmann auf dem Gebiet offenkundig ist.
sDAF wird vorzugsweise als ein sekretiertes Protein aus dem Kulturmedium gewonnen, obwohl er bei direkter Expression ohne ein sekretorisches Signal auch aus Wirtszellenlysaten gewonnen werden kann. In einem ersten Schritt wird das Kulturmedium oder Lysat zentrifugiert, um teilchenförmige Zellbruchstücke zu entfernen. DAF wird auch aus verschmutzenden löslichen Proteinen gereinigt, z.B. durch Adsorption auf einer Abschnittssäule, z.B. ConA, Elektion, Adsorption auf einer anti-sDAF oder anti-mDAF-Immunaffinitätssäule und Eluierung daraus. Alternativ dazu wendet man andere Verfahren wie z.B. Chromatographie auf Alkyl-Sepharose, Silika oder einem Anionen- oder Kationenaustauschharz oder Gelelektrophorese an, um den sDAF von Verunreinigungen zu trennen. mDAF wird mittels des Verfahrens von Medof et al. (1984, ebda.) aus Transformanten-Zellmembranen gewonnen. mDAF-Varianten, worin der hydrophobe Transmembranbereich und/oder der mDAF-Phosphatidylinosit-Bindungsrest gelöscht oder substituiert sind, werden in gleicher Weise wie sDAF gewonnen, obwohl Varianten, in denen der Transmembranbereich intakt bleibt, auch aus Transformanten-Zellmembranen gewonnen werden.
Da nativer DAF die Tendenz hat, sich unter bestimmten Bedingungen zu aggregieren, kann es nützlich sein, den aggregierten Zustand der Multimeren zu stabilisieren, indem in den Abtrennungen eine geringe Menge eines nichtionischen oberflächenaktiven Stoffes bzw. Tensids wie z.B. Tween oder Palyäthylenglykol vorgesehen ist. Ein Proteasehemmer wie z.B. PMSF kann auch nützlich sein, um den proteolytischen Abbau während der Reinigung zu hemmen, und es können Antibiotika enthalten sein, um das Wachstum zufällig hinzugekommener Verunreinigungen zu verhindern.
Ein Fachmann auf dem Gebiet ist sich bewußt, daß die für nativen DAF geeigneten Reinigungsverfahren möglicherweise eine Modifizierung erfordern, um die Veränderungen im Wesen von DAF oder seiner Varianten bei der Expression in rekombinanter Zellkultur zu berücksichtigen. Beispielsweise adsorbiert ein in prokaryotischer Zellkultur hergestelltes DAF-Polypeptid nicht an Con-A Sepharose, da es unglykosyliert ist. In diesem Fall sollte man andere Verfahren wie z.B. Gelelektrophorese, Ionenaustausch oder Immunaffinitätsreinigung anwenden. In ähnlicher Weise adsorbieren sDAF lipidfreie C-terminale mDAF-Varianten nicht so leicht an hydrophoben Adsorptionsmitteln wie mDAF. Ein Fachmann auf dem Gebiet kennt geeignete Reinigungsverfahren, wobei sie von den Eigenschaften des jeweiligen rekombinanten DAF abhängen.
DAF wird mit solchen Ionen wie Natrium, Kalium, Phosphat, Chlorid u.ä. als nichttoxisches Salz hergestellt. Im allgemeinen wird DAF in phosphatgepufferter Salzlösung gelagert oder kann in Gegenwart eines Exzipienten, wie beispielsweise in Gegenwart von Zuckeralkoholen, z.B. Mannit oder Sorbit; Monosacchariden, z.B. Glukose, Mannose, Galactose oder Fructose; Oligosacchariden wie z.B. Maltose, Lactose oder Saccharose und Proteinen wie z.B. menschlichem Serumalbumin lyophilisiert werden.
Obige Exzipienten können zur Stabilität von DAF gegenüber Inaktivierung oder Ausfällung bei wässeriger Lagerung beitragen und können gemeinsam mit anderen Stabilisatoren verwendet werden, die an sich herkömmliche sind. Zu solchen Stabilisatoren gehören Chelatbildner, z.B. EDTA; Antioxidantien wie z.B. Ascorbat oder Dithiothreitol; Aminosäuren; und nichtionische oberflächenaktive Stoffe bzw. Tenside wie z.B. Polyäthylenglykol oder Blockcopolymere von Polyäthylen- und Polypropylenglykol.
DAF wird Menschen oder Tieren verabreicht, um verschiedene Störungen aufgrund von Immundysfunktion oder -fehlausrichtungen, insbesondere Fehler der humoralen Immunreaktion zu verbessern. Beispiele umfassen PNH, entzündliche Erkrankungen wie z.B. entzündliche Darmerkrankung (Kolitits), rheumatoide Arthritis, Allograft-Abstoßung u.ä. Die Behandlung mit DAF sollte im Frühstadium solcher Störungen einsetzen.
Therapeutische DAF-Zusammensetzungen enthalten eine therapeutisch wirkungsvolle Dosis DAF in einem pharmakologisch verträglichen Träger. Die Dosis, der Träger und die Verabreichungsart hängen neben anderen Faktoren von der zu behandelnden Störung oder Erkrankung, dem Zustand des Patienten, der gewünschten Verabreichungsart und der Aktivität der ausgewählten DAF-Variante ab. Dies kann während der Therapie durch den Arzt leicht ermittelt und überwacht werden.
Der Träger zur Infusion oder Injektion von DAF ist eine sterile isotonische wässerige Lösung, z.B. Salzlösung zur Injektion oder 5%ige Dextrose. Diese Präparate werden durch intranasale, subkutane, intravenöse, intraperitoneale oder andere herkömmliche Verabreichtungswege injiziert oder infundiert. Die Präparate werden auch in das Synonialfluid der arthritischen Gelenke injiziert.
DAF wird auch in einem Träger mit Langzeitwirkung bereitgestellt. Geeignete Beispiele umfassen halbdurchlässige Polymermatrizen in Form geformter Gegenstände, z.B. Zäpfchen oder Mikrokapseln. Implantierbare oder Mikrokapsel-Matrizen mit Langzeitwirkung umfassen u.a. Polylactide (US PS 3.773.919, EP 58.481 ) Copolymere von L-Glutaminsäure und : Gammaäthyl-L-Glutamat (U.Sidman et al., 1983, „Biopolymers" 22 (1 ): 547–556), Poly (2-Hydroxyäthylmethacrylat) (R.Langer et al., 1981, „J.Biomed.Mater.Res." 15: 167–277 und R.Langer, 1982, "Chem.Tech." 12: 98-105), Äthylenvinylacetat (R. Langer et al, ebda.) oder Poly-D-(-)-3-Hydroxybuttersäure ( EP 133.988A ). DAF-Zusammensetzungen mit Langzeitwirkung enthalten auch liposomal eingeschlossenen DAF. DAF-hältige Liposome werden durch an sich bekannte Verfahren hergestellt: DE 3.218.121A ; Epstein et al., 1985, „Proc.Natl.Acad.Sci. USA" 82: 3688–3692; Hwang et al., 1980, „Proc.Natl.Acad.Sci. USA" 77: 4030–4034; EP 52322A; EP 36676A; EP 88046A; EP 143949A; EP 142641A; japanische Patentanmeldung 83-118008; US Psen 4.485.045 und 4.544.545; und EP 102.324A . Üblicherweise sind die Liposomen vom kleinen (etwa 200–800 Angström) und unilamellaren Typ, worin der Lipidgehalt größer als etwa 30 Mol-% Cholesterin ist, wobei der ausgewählte Abschnitt zur optimalen Rate des DAF-Austretens eingestellt ist.
DAF-Präparate mit Langzeitwirkung werden in der Nähe der entzündeten Stelle oder Therapie, z.B. angrenzend zu arthritischen Gelenken oder entzündetem Darmgewebe implantiert oder injiziert.
Polyklonale Kaninchen- oder Mäuse-Antiseren, die gegen DAF gebildet werden, sind durch Medof et al (1984, ebda) beschrieben. Antiseren werden zur Immunaffinitätsreinigung von DAF und in einem ELISA-Assay für DAF verwendet. Der Antikörper, der für den einzigen C-Terminus von sDAF spezifisch ist, wird durch Immunisieren eines Tieres gegen ein immunogenes sDAF-Konjugat, z.B. eine immunogene Fusion in rekombinanter Zellkultur, wie dies hierin anderswo beschrieben ist, und durch anschließendes Screenen hinsichtlich der Gegenwart von anti-sDAF-Titer hergestellt, indem das Antiserum durch eine Säule von immobilisiertem mDAF geschickt wird, um gegen mDAF-Epitope gerichtete Antikörper zu adsorbieren, indem das nicht adsorbierte Antiserum in Gegenwart von ¹²⁵ I-sDAF (hergestellt im wesentlichen in gleicher Weise wie ¹²⁵ I-mDAF, Medof et al., 1984, ebda.) inkubiert wird, um es den einzigen sDAF-Epitopen zu ermöglichen, sich an die anti-sDAF-Antikörper im nicht adsorbierten Antiserum zu binden, und indem die Menge von nicht gebundenem ¹²⁵ I-sDAF, z.B. durch Adsorption auf Protein-A Sepharose bestimmt wird.
Die sDAF-spezifischen Antikörper in solchen Antiseren werden durch Adsorption als immobilisierter mDAF, Gewinnung der nicht adsorbierten Fraktion, Adsorption auf immobilisiertem sDAF und Eluierung mit einem Puffer (pH-Wert 4-6) hergestellt, um die sDAF-spezifischen Antikörper zu gewinnen, die im wesentlichen frei von mDAF-Antikörpern sind. Alternativ dazu werden Milzzellen aus immunisierten Tieren gewonnen, die einen anti-sDAF-Neutralisierungstiter aufweisen und mit Myelomazellen verschmolzen, oder sie werden in bekannter Weise mit EB-Virus transformiert, um monoklonale sDAF-spezifische Antikörper herzustellen.
Neutralisierende Antikörper gegen DAF eignen sich als Immunogene zum Bilden von anti-idiotypischen Antikörpern mit DAF-Aktivität, wenn sie an immunogene Polypeptide konjugiert sind. Solche anti-idiotypischen Antikörper eignen sich für die gleichen diagnostischen und therapeutischen Zwecke wie DAF.
Zur Vereinfachung der Beispiele werden einige häufig wiederkehrende Verfahren durch Abkürzungen bezeichnet.
„Plasmide" werden durch ein kleingeschriebenes p gekennzeichnet, vor und/oder nach dem Großbuchstaben und/oder Zahlen stehen. Die hierin angeführten Ausgangsplasmide sind im Handel erhältlich, in uneingeschränktem Umfang öffentlich erhältlich, oder sie können aus solchen erhältlichen Plasmiden gemäß veröffentlichter Verfahrensweisen konstruiert werden. Weiters sind auch andere äquivalente Plasmide auf dem Gebiet bekannt, was für einen Fachmann auf dem Gebiet offenkundig ist.
„Digestion" von DNA bezieht sich auf das katalytische Spalten der DNA mit einem Enzym, das nur an bestimmten Stellen in der DNA wirkt. Solche Enzyme bezeichnet man als Restriktionsenzyme und die Stellen, für die sie spezifisch sind, Restriktionsstellen. Die verschiedenen hierin verwendeten Restriktionsenzyme sind im Handel erhältlich, und man hielt sich hinsichtlich ihrer Reaktionsbedingungen, Cofaktoren und anderer Erfordernisse an die Vorgaben der Enzym-Lieferfirmen. Restriktionsenzyme werden üblicherweise durch Abkürzungen bezeichnet, die aus einem Großbuchstaben und nachfolgenden anderen Buchstaben, die den Mikroorganismus darstellen, aus dem jedes Restriktionsenzym ursprünglich gewonnen wurde, sowie einer das jeweilige Enzym bezeichnenden Zahl bestehen. Im allgemeinen wird etwa 1 μg Plasmid oder DNA-Fragment mit etwa 2 Enzymeinheiten in etwa 20 μl Pufferlösung verwendet. Geeignete Puffer und Substratmengen für bestimmte Restriktionsenzyme sind durch den Hersteller angegeben. Die Inkubationszeiten betragen üblicherweise etwa 1 Stunde bei 37°C, sie können aber je nach Anweisungen der Lieferfirmen variieren. Nach der Inkubation wird Protein durch Extraktion mit Phenol und Chloroform entfernt, und die digerierte Nukleinsäure wird durch Ausfällen mit Äthanol aus der wässerigen Fraktion gewonnen. An die Digestion mit einem Restriktionsenzym schließt sich in seltenen Fällen die Hydrolyse mit bakterieller alkalischer Phosphatase der terminalen 5'-Phosphate an, um ein „Ringschließen" oder ein Bilden einer geschlossenen Schleife der zwei restriktionsgespaltenen Enden eines DNA-Fragments zu verhindern, wobei dies das Einsetzen eines weiteren DNA-Fragments an der Restriktionsstelle erschweren würde. Soferne nicht anders angegeben schließt sich an die Digestion von Plasmiden keine 5'-terminale Dephosphorylierung an. Die Verfahrensweisen und Reagenzien zur Dephosphorylierung sind herkömmlich (T.Maniatis et al., 1982, "Molecular Cloning", S.133–134).
„Einfüllen" oder „Abstumpfen" bezieht sich auf das Verfahren, durch welchen das einstrangige Ende im kohäsiven Terminus einer Restriktionsenzym-gespaltenen Nukleinsäure in einen Doppelstrang umgewandelt wird. Dieses Verfahren eliminiert den kohäsiven Terminus und bildet ein stumpfes Ende. Dieses Verfahren ist ein vielseitiges Instrument zum Umwandeln eines restriktionsgeschnittenen Endes, das mit den Enden kohäsiv sein kann, die nur durch ein oder wenige andere Restriktionsenzyme gebildet werden, in einen Terminus, der mit jeder beliebigen stumpfschneidenden Restriktionsendonuklease oder einem anderen eingefüllten kohäsiven Terminus kompatibel ist. Typischerweise erfolgt das Abstumpfen durch Inkubieren von 2–15 μg der Ziel-DNA in 10 mM Mg Cl₂, 1 mM Dithiothreitol, 50 mM NaCl, 10 mM Tris Puffer (pH-Wert 7,5) bei etwa 37°C in Gegenwart von 8 Einheiten des Klenow-Fragments von DNA-Polymerase I und 250 μM jedes der vier Desoxynukleosidtriphosphate. Die Inkubation wird im allgemeinen nach 30 Minuten durch Phenol- und Chloroformextraktion und Äthanolausfällung beendet.
„Gewinnung" oder „Isolierung" eines bestimmten DNA-Fragments aus einem Restriktionsdigest bedeutet das Trennen des Digests auf Polyacrylamid oder Agarosegel durch Elektrophorese, Identifizierung des interessierenden Fragments durch Vergleich seiner Mobilität im Verhältnis zu jener der Marker-DNA-Fragmente mit bekanntem Molekulargewicht, Entfernung des Gelabschnitts, der das erwünschte Fragment enthält und Abtrennen des Gels von DNA. Diese Verfahrensweise ist allgemein bekannt. Siehe z.B. R.Lawn et al., 1981, „Nucleic Acids Res." 9: 6103-6114, und D.Goeddel et al., 1980, „Nucleic Acids Res.: 8: 4057.
„Northern"-Blotting ist ein Verfahren, mittels dessen die Gegenwart einer zellularen mRNA durch Hybridisierung mit einem bekannten, markierten Oligonukleotid oder DNA-Fragment bestätigt wird. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung bedeutet die Northern-Analyse, soferne nicht anders angegeben, die elektrophoretische Trennung der mRNA auf 1 %iger Agarose in Gegenwart eines Denaturierungsmittels (Formaldehyd 7%), die Übertragung zur Nitrozellulose-Hybridisierung zum markierten Fragment, wie dies durch T.Maniatis et al., ebda., 5.202, beschrieben ist.
„Transformation" bezieht sich auf das Einführen von DNA in einen Organismus, sodaß die DNA replizierbar ist, entweder als extrachromosomales Element oder chromosomaler Integrant. Soferne nicht anders angegeben ist das hierin beschriebene Verfahren zur Transformation von E.coli das CaCl₂-Verfahren nach Mandel et al., 1970, „J.Mol.Biol." 53: 154.
„Ligierung" bezieht sich auf das Verfahren zum Bilden von Phosphodiesterbindungen zwischen zwei doppelstrangigen Nukleinsäurefragmenten (T.Maniatis et al., ebda., S.146). Soferne nicht anders angegeben, kann die Ligierung durch Verwendung bekannter Puffer und Bedingungen mit 10 Einheiten T4 DNA Ligase („Ligase") pro 0,5 μg von etwa äquimolaren Mengen der zu ligierenden DNA-Fragmente erfolgen.
„Herstellung" von DNA aus Transformanten bedeutet das Isolieren von Plasmid-DNA aus mikrobieller Kultur. Soferne nicht anders angegeben, kann das alkalische/SDS-Verfahren nach Maniatis et al., ebda., 5.90, verwendet werden.
„Oligonukleotide" sind einstrangige oder doppelstrangige Polydesoxynukleotide kurzer Länge, die durch bekannte Verfahren chemisch synthetisiert und dann auf Polyacrylamidgels gereinigt werden.
Die folgenden Beispiele dienen lediglich der Veranschaulichung des besten derzeit bekannten Modus zur Durchführung der Erfindung; diese ist jedoch nicht als darauf beschränkt anzusehen.
Alle Literaturzitate sind hierin ausdrücklich durch Verweis eingeschlossen.
Beispiel 1
Identifizierung von cDNA-Klonen, die für DAF kodieren
Klonieren von menschlichem DAF
Menschlicher DAF wurde bis zur Homogenität gereinigt, und es wurden 23 Aminosäuren der N-terminalen Sequenz bestimmt. Fünf davon waren nicht eindeutig.
Eine 69mer Oligonukleotidsonde auf der Grundlage dieser Aminosäuresequenz wurde in vitro synthetisiert. Die mit ³²P markierte (einer Kinase unterzogene) Sonde wies die folgende Nukleotidsequenz auf:
Eine Hela-Zelle λ cDNA-Sammlung (etwa 1 × 10⁶ Rekombinanten) wurde unter wenig strengen Bedingungen mit diesem 69mer gescreent. Nur ein DAF-Klon (λ21) wurde gemeinsam mit 6 falschen positiven identifiziert (durch Sequenzieren stellte sich heraus, daß diese eine beschränkte Nukleinsäurehomologie mit der Sonde, doch eine gänzlich unterschiedliche Aminosäuresequenz aufwiesen). λ21 enthielt eine Einfügung, die für die Sequenz: Asp.Cys.Gly.Leu.Pro.Pro.Asp.Val.Pro.Asn.Ala.Gln.Pro.Ala.Leu.Glu.Gly.Arg.Thr.Ser.Ple.P ro.Gly. kodierte, worin sich die unterstrichenen Reste von jenen unterschieden, die durch Aminoterminalsequenzieren idenitifiziert wurden.
Das anfängliche DAF-Klon (Klon λ21) war 1395 bp in der Länge und enthielt einen poly A-Schwanz, jedoch kein Initiatormethionin.
Zur Bestimmung der Größe von DAF-MRNA wurde ein Northern Blot, der Hela-Zellen Poly A+ RNA enthielt, ³²P-markiert mit DAF λ21 gescreent. Diese Sonde hybridisierte mit zwei Botschaften, deren Größen etwa 1500 bp und 2000 bp betrugen. Sie wiesen eine etwa gleiche Intensität auf.
Zur Identifizierung von längeren DAF-Klonen mit Extensionen an einem der beiden 5' und 3'-Enden isolierten die Autoren der vorliegenden Anmeldung zwei kleine Restriktionsfragmente aus den 5' und 3' Enden von λ21 wie folgt:
Diese Sonden wurden mit ³²P markiert und verwendet, um die Hela cDNA-Sammlung hinsichtlich zusätzlicher für DAF kodierender Klone erneut zu screenen. 2 weitere Klone wurden identifiziert, DAF λ41 und DAF λ47. Diese hybridisierten mit beiden Sonden und waren mit etwa 2000 bp bzw. 2200 bp länger als die DAF λ21-Einfügung.
Beide Klonen enthielten etwa 780 bp zusätzlicher 3' untranslatierter Sequenz vor dem poly A Schwanz. Die 3'-untranslatierte Sequenz des DAF-Gens enthält eine Anzahl an Polyadenylierungssignalen (AATAAA), und es scheint, daß entweder ein stromaufwärtiges oder stromabwärtiges Signal verwendet werden kann, um MRNAS von etwa 1500 bp oder etwa 2000 bp zu erzeugen.
Am 5' Ende war Klon DAF λ41 55 bp länger als DAF λ21 und enthielt ein ATG zur Translationseinleitung. Klon DAF λ47 war 93 bp kürzer als DAF λ21 am 5' Ende.
Klon DAF 33 wurde auch identifiziert, doch es hybridisierte nur mit der 5' Sonde. Dieses Klon war 71 bp länger als DAF λ21 am 5' Ende und stellte somit die längste Extension in der 5' Richtung dar.
DAF λ21 und DAF λ41 überlappten einander im Kodierungsbereich des Proteins vollständig und kodierten für ein Protein von 440 Aminosäuren. DAF λ47 und DAF λ33 enthielten eine offensichtliche „Löschung" von 118 bp des Kodierungsbereiches im Verhältnis zu DAF λ21 und DAF λ41. Bei näherer Beobachtung schien es, daß DAF λ21 und DAF λ41 ein nicht gespleißtes (nicht entferntes) Intron von 118 bp enthielten. Anschließend wurden zwei weitere Klonen identifiziert, DAF λ35 und DAF λ37, von denen eines das gleiche Intron enthält und eines dieses nicht enthält.
Die Häufigkeit, mit der die nicht gespleißte Form in der Sammlung vorhanden ist (3 von 6 Klonen) legt nahe, daß es unwahrscheinlich ist, daß die nicht gespleißten Klone eine unrichtig gespleißte Botschaft enthalten. Es scheint hingegen zwei Formen des DAF-Proteins zu geben. Diese zwei Formen sind an Aminosäurepositionen 1-327 identisch, weisen aber unterschiedliche C-terminale Sequenzen auf. Die nicht gespleißte Form enthält zusätzliche 79 Aminosäuren, die gespleißte Form enthält zusätzliche 20 Aminosäuren. Da das Spleißen eine Veränderung des Leserahmens bewirkt, gibt es zwischen den zwei Proteinen an den C-Termini keine Homologie.
Anhand der Hydropathie-Plots der zwei DAF-Proteine und des Vergleichs mit dem gut charakterisierten Thy-1 membrangebundenen Glykoprotein schließt man, daß die gespleißte DAF-cDNA die Synthese von membrangebundenem DAF lenkt, während die nicht gespleißte Version für eine lösliche Form kodiert.
Beispiel 2
Expression von DAF in rekombinanter Zellkultur.
Klone DAF λ33; λ41 und λ47 aus Beispiel 1 wurden jeweils in pUC19, einen leicht erhältlichen Klonierungsvektor für E.coli, durch Digerieren jedes der λ-Klone mit EcoRI, Gewinnen der DAF-Einfügung aus jedem Klon, Digerieren von pUC19 mit EcoRI, Ligieren der Einfügungen in geöffnetes pUC19 und Transformieren von E.coli 294 mit Jeder Ligierungsmischung subgeklont. pUC1933, pUC1941 und pUC1947 wurden aus Ampicillin-resistenten Kolonien gewonnen.
pUC1933, pUC1941 und pUC1947 wurden jeweils mit EcoRI und HindIII digeriert, und es wurden die Fragmente gewonnen (I, II bzw. III), die jeweils das 5' Ende des DAF-Gens und die 3' Enden der sDAF- und mDAF-Gene enthielten. Mit EcoRI digeriertes pUC19 wurde in einer Dreiwegligierung an Fragmente I und II ligiert, und pUC19sDAF wurde aus einer Ampicillin-resistenten E.coli-Kolonie gewonnen. Dies war das Subklon des vollständigen, in 2a – 2g dargestellten sDAF.
pUC19mDAF wurde in gleicher Weise wie pUC19sDAF konstruiert, mit der Ausnahme, daß das Fragment III anstelle von Fragment II verwendet wurde. Dieses Subklon enthielt das vollständige mDAF-Gen von 1a – 1f.
pE348HBVE400D22 (auch pE342HBVE400D22, EP 117.058A ) wird mit Hind III digeriert, sodaß das DHFR-hältige Fragment gewonnen wird. Die Hind III köhäsiven Termini werden eingefüllt, das Fragment mit Clal digeriert und das folgende Fragment isoliert
pE348 MBV E400D22 wird auch mit Clal und SocII digeriert, sodaß das Fragment mit 990 bp, welches den SV40-Ursprung und die HBsAg poly A Sequenz enthält, gewonnen wird (Fragment b).
pUCsDAF und pUCmDAF wurden mit EcoRI digeriert und jedes für DAF kodierende Fragment isoliert (Fragmente CII und CIII).
Fragmente CII, a und b werden in einer Dreiwegligierung ligiert und in E.coli 294 transfiziert. pE348sDAF wird aus einer Ampicillin-resistenten Kolonie gewonnen. Es enthält das sDAF-Gen in der richtigen Ausrichtung 3' zum SV40 sDAF frühen Promotor. Das sDAF-Gen wird durch den SV40 frühen Promotor in einem Expressionsvektor gesteuert, der sich zur Transformation in eine Säugetierwirtszelle und zur Methotrexat-Auswahl und Verstärkung in derselben eignet.
pE348mDAF wird in gleicher Weise konstruiert, mit der Ausnahme, daß Fragment CIII verwendet wird.
Ein alternativer Expressionsvektor wird durch Digerieren von p342E (Crowley et al., 1983, „Mol.Cell.Biol." 3: 44–55) mit EcoRI und HpaI konstruiert und das Vektorfragment gewonnen. Beide von pUC19mDAF oder pUC19sDAF werden mit AccI (für mDAF) oder stumpfem XhoII (für sDAF) digeriert, eingefüllt, mit EcoRI digeriert; dann werden die für DAF kodierenden Fragmente gewonnen. Die DAF-Fragmente werden in das Vektorfragment ligiert und Expressionsvektoren gewonnen. Dieser Vektor enthält kein DHFR-Gen, obwohl die Cotransformation mit pFD11 (Simonsen et al., 1983, „P.N.A.S.-USA" 80: 2495-99) zufriedenstellende Ergebnisse liefert.
pE348mDAF oder pE348sDAF werden unter Verwendung herkömmlicher Verfahren in DHFR^– CHO Zellen cotransfiziert, in HAT Medium geimpft und Transformanten nach der Kultur in Medien ausgewählt, die serielle Zunahmen der Methotrexat-Konzentration enthalten, um die DHFR- und DAF-Gene zu verstärken. Ein Transformantenklon wird gewonnen, der DAF stabil exprimiert und ihn in das Kulturmedium sekretiert. Der sDAF wird durch Adsorption an einer Immunaffinitätssäule, die Protein-A Sepharose – immobilisierten -Kaninchen-polyklonalen Antikörper zu sDAF enthält, und durch Eluierung mit einem Glycinpuffer (pH-Wert 5) aus dem Medium gewonnen.
pE348mDAF wird in gleicher Weise in verstärkte DHFR^– CHO-Zellen transformiert. mDAF wird durch Isolation aus Detergenslysaten von Wirtszellmembranen im wesentlichen in gleicher Weise gewonnen, wie mDAF davor aus Stroma roter Blutkörperchen gewonnen wurde.

Claims

Nucleinsäure, die für den in 1 dargestellten mDAF, den in 2 dargestellten sDAF oder eine Aminosäuresequenzvariante davon kodiert, worin ein vorbestimmter(s) Aminosäurerest oder Polypeptid in die native reife oder Prä-DAF-Aminosäuresequenz des in 1 dargestellten mDAF oder in 2 dargestellten sDAF eingeführt ist, daraus deletiert ist oder einen Aminosäurerest oder ein Polypeptid davon substituiert, wobei die Variante fähig ist, eine biologische Aktivität aufzuweisen, die sie mit dem mDAF oder sDAF gemeinsam hat; wobei die Nucleinsäure (a) DNA, die frei von Introns ist, oder (b) DNA, die frei von flankierender genomischer DNA ist, oder (c) zellfrei oder (d) frei von Nucleinsäure ist, die für ein beliebiges anderes Protein kodiert, das homolog zur Quelle der für den DAF kodierenden Nucleinsäure ist.
Für eine Variante kodierende Nucleinsäure nach Anspruch 1, worin der vorbestimmte Rest oder das vorbestimmte Polypeptid in die reife DAF-Aminosäuresequenz eingeführt ist.
Für eine Variante kodierende Nucleinsäure nach Anspruch 2, worin reifer DAF an seinem Aminoterminus mit dem Carboxyterminus einer zum DAF heterologen Sekretionssignalsequenz fusioniert ist.
Für eine Variante kodierende Nucleinsäure nach Anspruch 3, worin die Signalsequenz die Signalsequenz eines viralen Polypeptids ist.
Für eine Variante kodierende Nucleinsäure nach Anspruch 4, worin das virale Polypeptid die Signalsequenz für das Herpes-simplex-gD-Protein ist.
Für eine Variante kodierende Nucleinsäure nach Anspruch 2, worin die Variante met-reifer DAF ist.
Für eine Variante kodierende Nucleinsäure nach Anspruch 2, worin der reife DAF an seinem Amino- oder Carboxyterminus mit einem immunogenen Polypeptid fusioniert ist.
Für eine Variante kodierende Nucleinsäure nach Anspruch 7, worin das immunogene Polypeptid ein mikrobielles Polypeptid ist.
Für eine Variante kodierende Nucleinsäure nach Anspruch 2, worin der reife DAF an seinem Carboxyterminus mit einem Polypeptid fusioniert ist, das an ein Zelloberflächenprotein binden kann.
Für eine Variante kodierende Nucleinsäure nach Anspruch 9, worin das Polypeptid ein Antikörper oder proteinbindendes Fragment davon ist.
Für eine Variante kodierende Nucleinsäure nach Anspruch 10, worin der Antikörper gegen ein HLA-Antigen gerichtet ist.
Für eine Variante kodierende Nucleinsäure nach Anspruch 1, worin ein vorbestimmter(s) Aminosäurerest oder Polypeptid aus der reifen DAF-Aminosäuresequenz deletiert ist.
Für eine Variante kodierende Nucleinsäure nach Anspruch 12, worin sich der vorbestimmte Aminosäurerest oder das vorbestimmte Polypeptid am C-Terminus vom mDAF befindet.
Für eine Variante kodierende Nucleinsäure nach Anspruch 1, worin ein Lysinyl- oder Arginylrest deletiert oder substituiert ist.
Für eine Variante kodierende Nucleinsäure nach Anspruch 1, worin ein vorbestimmter(s) Aminosäurerest oder Polypeptid einen Aminosäurerest oder ein Polypeptid in der reifen DAF-Aminosäuresequenz substituiert.
Für eine Variante kodierende Nucleinsäure nach Anspruch 15, worin ein einziger Rest einen Aminosäurerest in der reifen DAF-Aminosäuresequenz substituiert.
Für eine Variante kodierende Nucleinsäure nach Anspruch 16, worin der in DAF substituierte Rest eine hydrophobe Seitenkette enthält.
Für eine Variante kodierende Nucleinsäure nach Anspruch 17, worin der Rest Valyl, Isoleucyl, Leucyl, Phenylalanyl oder Alanyl ist.
Für eine Variante kodierende Nucleinsäure nach Anspruch 16, worin der in DAF substituierte Rest eine elektronegative Seitenkette enthält.
Für eine Variante kodierende Nucleinsäure nach Anspruch 19, worin der Rest Glutamyl oder Aspartyl ist.
Für eine Variante kodierende Nucleinsäure nach Anspruch 16, worin der in DAF substituierte Rest eine elektropositive Seitenkette enthält.
Für eine Variante kodierende Nucleinsäure nach Anspruch 21, worin der Rest Lysyl, Arginyl oder Histidyl ist.
Für eine Variante kodierende Nucleinsäure nach Anspruch 16, worin der Rest Tryptophanyl, Prolyl, Tyrosyl, Methionyl, Seryl oder Threonyl ist.
Für eine Variante kodierende Nucleinsäure nach Anspruch 16, worin der Rest Prolyl, Cysteinyl oder Glycidyl ist.
Für eine Variante kodierende Nucleinsäure nach Anspruch 1, worin ein Lysyl- oder Arginylrest innerhalb eines Lysyl- oder Arginylreste enthaltenden zweibasigen DAF-Dipeptids durch einen Glutamyl- oder Histidylrest substituiert ist.
Für eine Variante kodierende Nucleinsäure nach Anspruch 1, worin die Variante eine Fusion einer DAF-Sequenz mit einem immunogenen Polypeptid, Hormon oder Antikörper ist.
Für eine Variante kodierende Nucleinsäure nach Anspruch 1, worin der DAF mDAF ist.
Für eine Variante kodierende Nucleinsäure nach Anspruch 1, worin der DAF sDAF ist.
sDAF mit der reifen oder Prä-Sequenz von 2, frei von homologen Zellen und frei von zumindest einer homologen Plasmakomponente.
Nucleinsäure, mit Ausnahme von nativer mRNA oder genomischer DNA, die für DAF kodiert, die fähig ist, mit Nucleinsäure zu hybridisieren, die für den in 1 dargestellten mDAF, den in 2 dargestellten sDAF oder eine Variante nach einem der Ansprüche 1 bis 27 kodiert.
Nucleinsäure, die für den in 1 dargestellten mDAF kodiert, aus dem eine Cys₃₃₀ – Thr₃₄₇ umfassende Sequenz deletiert ist.
Replizierbarer Vektor, der die Nucleinsäure umfasst, die für den in 1 dargestellten mDAF, den in 2 dargestellten sDAF oder eine Variante nach einem der Ansprüche 1 bis 27 kodiert.
Vektor nach Anspruch 32, umfassend die für sDAF kodierende Nucleinsäure.
Zusammensetzung, umfassend eine mit dem Vektor nach Anspruch 32 oder 33 transformierte Wirtszelle.
Zusammensetzung nach Anspruch 34, worin die Zelle eine Säugetierzelle ist.
Verfahren zur Herstellung des in 1 dargestellten mDAF, des in 2 dargestellten sDAF oder einer Variante nach einem der Ansprüche 1 bis 27, umfassend das Kultivieren einer Wirtszelle, die mit einem Vektor transformiert ist, der die Nucleinsäure enthält, die für den mDAF, den sDAF oder eine operabel an einen Promotor gebundene Variante kodiert, unter Bedingungen zum Exprimieren von mDAF, sDAF oder einer Variante.
Verfahren nach Anspruch 36, worin die Wirtszelle eine Säugetierzelle ist.
Verfahren nach Anspruch 37, worin der mDAF, sDAF oder die Variante aus dem Kulturmedium der Wirtszelle gewonnen wird.
Verfahren nach Anspruch 38, worin sDAF gewonnen wird.
DAF, der die reife oder Prä-Aminosäuresequenz von in 1 dargestelltem mDAF oder von in 2 dargestelltem sDAF aufweist und von keiner nativen Glykosylierung begleitet ist.
DAF nach Anspruch 40, der unglykosyliert ist.
Von keiner nativen Glykosylierung begleiteter DAF, hergestellt durch das Verfahren nach Anspruch 36.
Pharmazeutische Zusammensetzung zum Hemmen einer Antikörpervermittelten Abstoßung von Allotransplantaten oder zum Verbessern von Autoimmunreaktionen gegen Zielgewebe, die ein immunomodulatorisches Konjugat von DAF umfasst, das die reife oder die Prä-Sequenz von in 1 dargestelltem mDAF oder von in 2 dargestelltem sDAF aufweist, gebunden an eine Substanz, die fähig ist, das Allotransplantat oder das Zielgewebe spezifisch zu binden, mit einem physiologisch harmlosen Exzipienten.
Zusammensetzung nach Anspruch 43, worin der DAF mDAF ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 43, worin die Substanz ein Antikörper oder Fragment davon ist, der/das fähig ist, ein im Allotransplantat vorhandenes HLA-Antigen zu binden, das durch den Transplantatrezipienten nicht exprimiert wird.
Zusammensetzung nach Anspruch 45, worin der Antikörper oder das Fragment davon durch eine kovalente Bindung gebunden ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 45, worin der Antikörper oder das Fragment davon mit dem C-Terminus von sDAF fusioniert ist, erhalten durch Expression in einem rekombinanten Wirtsvektorsystem.
Zusammensetzung, umfassend einen Antikörper, der fähig ist, das reife oder Prä-sDAF-Polypeptid von 2 zu binden, wobei die Zusammensetzung im Wesentlichen frei von Antikörpern ist, die fähig sind, das reife oder Prä-mDAF-Polypeptid von 1 zu binden.
Zusammensetzung nach Anspruch 48, worin der Anti-sDAF-Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Polypeptid, umfassend eine Phospholipid-Ankerdomäne von mDAF, einschließlich einer C-terminalen Domäne von mDAF der in 1 vorhandenen Aminosäuresequenz, die mit einem anderen Polypeptid als DAF fusioniert ist.
Polypeptid, das eine Fusion der (a) C-terminalen Domäne von in 1 dargestelltem mDAF, der Cys und die Reste 331 – 347 umfasst, und (b) eines anderen Polypeptids als DAF ist.
Polypeptid nach Anspruch 50 oder 51, worin das andere Polypeptid als DAF ein Präprotein ist.
Polypeptid nach Anspruch 50 oder 51, worin das andere Polypeptid als DAF ein Hormon ist.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 50 bis 53, worin sich die Fusion am C-Terminus des anderen Polypeptids als DAF befindet.