DE69333726T2

DE69333726T2 - Glucagonrezeptoren

Info

Publication number: DE69333726T2
Application number: DE69333726T
Authority: DE
Inventors: R. Wayne KINDSVOGLE; J. Laura JELINEK; O. Paul SHEPPARD; J. Francis GRANT; L. Joseph KUIJPER; C. Donald FOSTER; Si Lok; J. Patrick O'HARA
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1992-08-28
Filing date: 1993-08-30
Publication date: 2006-02-23
Also published as: EP0658200B1; NZ255922A; PL307746A1; PL178685B1; HU219674B; EP0658200A1; AU5097493A; CA2142819A1; RU2184779C2; DE69333726T8; AU689078B2; DE69333726D1; HU9500596D0; US5919635A; CA2142819C; JPH08500737A; ATE285472T1; HUT74352A; WO1994005789A1; US5770445A

Description

Technischer Bereich
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Zelloberflächenrezeptoren, und genauer Glucagonrezeptoren.
Hintergrund der Erfindung
Glucagon ist ein 29 Aminosäure-Hormon, das durch die Alpha-Zellen von pankreatischen Inseln produziert wird. Glucagon ist für die Aufrechterhaltung von normalen Spiegeln von Glucose in vielen Tieren, einschließlich Menschen, durch seine Wirkung als ein Insulin-gegensteuerndes Hormon verantwortlich. Insbesondere während Insulin dafür bekannt ist, schnell Blutglucosespiegel abnehmen zu lassen, balanciert Glucagon diese Effekte durch Beitragen zur Erhöhung von Blutglucosespiegeln aus.
Die Interaktionen von Glucagon und Insulin sind für die Aufrechterhaltung von Glucosespiegeln innerhalb des Körpers sehr wichtig. Von einer Imbalance von Glucagon oder Insulin wird geglaubt, daß sie eine Rolle in verschiedenen Erkrankungen spielt, wie zum Beispiel Diabetes Mellitus und Diabetes Ketoacidosis. Nach einer Theorie kann der hyperglycämische Zustand von Diabetes Mellitus nicht nur durch Glucose Minderverwendung (aufgrund verringertem Insulin) hervorgebracht werden, sondern auch durch die Überproduktion von Glucose aufgrund von erhöhten Konzentrationen von Glucagon (siehe Unger, "Diabetes and the alpha cell", Diabetes 25: 136–151, 1976; Unger and Orci, "The essential role of glucagon in the pathogenesis of diabetes mellitus". Lancet 1: 14–16, 1975).
Ein wichtiger Faktor in der Untersuchung von Glucagon und der Rolle von Glucagon bei Erkrankungen, wie zum Beispiel Diabetes Mellitus ist der Glucagonrezeptor, der bei Bindung mit Glucagon ein Signal an die Zelle weiterleitet, wodurch die Glycogenolyse (Glycogenhydrolyse) und Gluconeogenese (Glucosesynthese) ausgelöst wird.
Es wird im Augenblick geglaubt, daß die Effekte des Glucagons teilweise durch die Erhöhung der intrazellulären Spiegel von zyklischem Adenosinmonophosphat (cAMP) vermittelt werden. Insbesondere aktiviert die Bindung von Glucagon an seinen zellulären Rezeptor die Adenylatcyclase, um so cAMP zu produzieren, was dadurch die Spiegel von intrazellulärem cAMP anhebt. Von dieser Erhöhung von intrazellulären Spiegeln von cAMP wird geglaubt, daß sie zu Glycogenolyse und Gluconeogenese führen, mit dem sich ergebenden Anstieg in der Glucoseproduktion durch die Leber (siehe, Biological Activities of des-His¹ [Glu⁹]Glucagon Amide, a Glucagon Antagonist, "Peptides 10: 1171–1177, 1989).
Es wurden jedoch auch zusätzliche Signalwege für die Stimulation von Glycogenolyse und Gluconeogenese vorgeschlagen. Insbesondere wurde berichtet, daß Glucagon an Rezeptoren in der Hepatozytenmembran bindet, die über ein G-Protein mit Phospholipase C gekoppelt sind. Nach der Stimulierung verursacht dieses Protein den Abbau von Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat, um die Second-Messengers Inositoltriphosphat und 1,2-Diacylglycerin zu produzieren (siehe, Wakelam et al., "Activation of two signal-transduction systems in hepatocytes by glucagon "Nature 323: 68–71, 1986: Unson et al., Peprides 10: 1171–1177, 1989; and Pittner and Fain. Biochem. J. 277: 371–378, 1991). Die Stimulation von Inositolphospholipid-Stoffwechsel durch Glucagon kann ein zusätzlicher Signalweg sein, durch den Glucagon die Glycogenolyse und Gluconeogenese stimuliert.
Die Isolierung des Rezeptors für Glucagon hat sich als schwierig erwiesen. Herberg et al. (J. Biol. Chem. 259: 9285–94 (1984)) berichteten, daß, während Glucagon charakterisiert wurde, relativ wenig über seinen Rezeptor bekannt war (siehe auch, Iyengar et al., Pharmac. Ther. 37: 151–65 (1988)). Iwanij and Vincent (J. Biol. Chem. 265: 21302–06 (1990)) berichteten über die Isolierung eines Proteins, von dem gedacht wurde, daß es der Ratten-Glucagonrezeptor sei. Es wurde jedoch anschließend gezeigt, daß ein Antikörper gegen dieses Protein an e in neues Leber-Transporterprotein bindet und nicht an den Ratten-Glucagonrezeptor (siehe Simonsen et al., J. Cell Sci. 107: 1065–72 (1994).
Die vorliegende Erfindung beschreibt Glucagonrezeptor(en) und stellt weiterhin andere damit zusammenhängende Vorteile zur Verfügung.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein isoliertes DNA-Molekül zur Verfügung gestellt, das für einen Glucagonrezeptor oder ein Glucagonrezeptorpeptid kodiert, wobei das Molekül eine Nukleotidsequenz umfaßt, ausgewählt aus:

a) der Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 14 von Nukleotid 145 bis zum Nukleotid 1599;
b) der Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 14 von Nukleotid 226 bis zum Nukleotid 570;
c) der Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 24 von Nukleotid 53 bis zum Nukleotid 1486.
d) der Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 17, oder
e) einer Nukleotidsequenz, die unter hoher Stringenz mit einer komplementären Nukleotidsequenz von a), b), c) oder d) hybridisiert.

Bevorzugterweise umfaßt der Glucagonrezeptor oder das Glucagonrezeptorpeptid eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus

a) der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 15 vom Met, Aminosäure Nummer 1, bis zum Thr, Aminosäure Nummer 485;
b) der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 15 vom Gln, Aminosäure N 28, bis zum Tyr, Aminosäure Nummer 142;
c) der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 25 vom Met, Aminosäure Nummer 1, bis zum Phe, Aminosäure Nummer 477,
d) der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 18 oder
e) einem Peptidfragment von a), b), c) oder d) von mindestens 10 Aminosäuren Länge.

Gemäß dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein DNA-Konstrukt zur Verfügung gestellt, umfassend ein erstes DNA-Segment, das ein DNA-Molekül gemäß dem ersten Aspekt dieser Erfindung ist, kodierend für einen Glucagonrezeptor oder ein Glucagonrezeptorpeptid, operativ an ein weiteres DNA-Segment gebunden, das für die Expression des ersten DNA-Segments notwendig ist, und ein Verfahren zur Herstellung eines Glucagonrezeptors oder Glucagonrezeptorpeptids.
Gemäß dem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein isolierter Glucagonrezeptor oder Glucagonrezeptorpeptid zur Verfügung gestellt, umfassend:

a) die Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 24 vom Nukleotid 53 bis zum Nukleotid 1486;
b) die Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 17; oder
c) eine Nukleotidsequenz, die unter hoher Stringenz mit einer komplementären Nukleotidsequenz von a) oder b) hybridisiert.

Gemäß dem vierten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Sonde von mindestens 12 Nukleotiden zur Verfügung gestellt, wobei die Sonde in der Lage ist, unter Bedingungen hoher Stringenz mit einem DNA-Molekül nach Anspruch 1 a), b), c) oder d) zu hybridisieren.
Gemäß dem fünften Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit von Glucagonantagonisten zur Verfügung gestellt, umfassend die Schritte von:

a) Aussetzen einer Verbindung unter Anwesenheit eines Glucagon-Agonisten gegenüber einem Glucagonrezeptor oder Glucagonrezeptorpeptid gemäß dem dritten Aspekt der Erfindung, gekoppelt an einen Antwortsignalweg unter Bedingungen und für eine Zeit, die ausreichend sind, um das Binden der Verbindung an den Rezeptor und eine damit einhergehende Antwort durch den Signalweg zu ermöglichen; und
b) Nachweisen einer Verringerung der Stimulation des Antwortwegs, resultierend aus dem Binden der Verbindung an den Glucagonrezeptor, relativ zur Stimulation des Antwortsignalwegs durch den Glucagon-Agonisten allein und, dadurch, Bestimmen des Vorhandenseins eines Glucagon-Antagonisten.

Der Ausdruck "isoliertes DNA-Molekül", wie hier verwendet, betrifft DNA-Moleküle oder Sequenzen, die abgetrennt sind, beabstandet sind und allein oder von anderen Komponenten abgetrennt sind. Zum Beispiel ist ein DNA-Molekül isoliert, wenn es von anderen DNA-Molekülen abgetrennt ist, einschließlich anderen chromosomalen Sequenzen, mit denen es natürlicherweise in Genom assoziiert ist und, insbesondere, frei von anderen Strukturenen.
Ein isoliertes DNA-Molekül kann 5' und 3' nicht-translatierte Sequenzen einschließen, mit denen es natürlicherweise assoziiert ist.
Innerhalb eines Aspekts der Erfindung werden isolierte Antikörper zur Verfügung gestellt, die spezifisch an Glucagonrezeptoren binden. Innerhalb einer Ausführungsform ist der Antikörper ein monoklonaler Antikörper. Innerhalb einer weiteren Ausführungsform wird ein monoklonaler Antikörper zur Verfügung gestellt, der in der Lage ist, die Bindung von Glucagon an einen Glucagonrezeptor zu blockieren. Auch zur Verfügung gestellt sind Hybridome, die die oben beschriebenen monoklonalen Antikörper produzieren.
Innerhalb verschiedener Ausführungsformen der Erfindung ist der Antwort-Signalweg ein Membran-gebundener Adenylatcyclase-Antwort-Signalweg und der Schritt von achweisen umfaßt Messen einer Verringerung in der cyclischen AMP-Produktion durch den Membran-gebundenen Adenylatcyclase-Antwort-Signalweg. Innerhalb einer anderen Ausführungsform der Erfindung schließt der Antwort-Signalweg ein Luciferase-Reportersystem ein.
Diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden nach Bezug auf die folgende genaue Beschreibung und die beigefügten Zeichnungen ersichtlich werden. Zusätzlich sind verschiedene Referenzen unten angegeben, die genauer bestimmte Verfahren oder Zusammensetzungen (z.B. Plasmide, usw.) beschreiben und daher in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme aufgenommen sind.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 verdeutlicht die Struktur eines repräsentativen Glucagonrezeptors. Die verwendeten Symbole sind EATD (extrazelluläre Amino-terminale Domäne) die durch die gepunktete Linie eingekreist ist; CM (zelluläre Membran); ED (Effektordomäne) die durch die gestrichelte Linie eingekreist ist; 1ID, die erste intrazelluläre Schleifendomäne; 2ID, die zweite intrazelluläre Schleifendomäne; 3ID, die dritte intrazelluläre Schleifendomäne; C-ID, die Carboxy-terminale intrazelluläre Domäne; 1ELD, die erste extrazelluläre Schleifendomäne; 2ELD, die zweite extrazelluläre Schleifendomäne; 3ELD, die dritte extrazelluläre Schleifendomäne; TMD1, die erste Transmembran-Domäne; TMD2, die zweite Transmembran-Domäne; TMD3, die dritte Transmembran-Domäne; TMD4, die vierte Transmembran-Domäne; TMDS, die fünfte Transmembran-Domäne; TMD6, die sechste Transmembran-Domäne und TMD7, die siebte Transmembran-Domäne.
2 stellt graphisch die Hydrophobizität eines Ratten-Glucagonrezeptors dar.
3 stellt graphisch die Bindung von ¹²⁵J-Glucagon an Glucagonrezeptoren dar.
4 ist eine Scatchard-Analyse des ersichtlichen Kd für Glucagonrezeptoren.
5 ist die Aminosäuresequenz eines Ratten-Glucagonrezeptors, wobei die Transmembran-Domänen überstrichen sind.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Wie oben angegeben stellt die vorliegende Erfindung isolierte DNA-Moleküle zur Verfügung, die Glucagonrezeptoren kodieren. In ihrer nativen Konfiguration wird von Glucagonrezeptoren geglaubt, daß sie als Membran-gebundene Proteine existieren, die aus einer extrazellulären Amino-terminalen Domäne sowie mehreren kleineren externen und internen Domänen bestehen (siehe 1). Innerhalb des Kontexts der vorliegenden Erfindung betrifft "Glucagonrezeptor" solche Proteine und im wesentlichen ähnliche Derivate. Derivate schließen allelische Varianten und gentechnisch veränderte Varianten ein, die konservative Aminosäuresubstitutionen und/oder kleinere Additionen, Substitutionen oder Deletionen von Aminosäuren enthalten. Glucagonrezeptoren der vorliegenden Erfindung sind in der Lage, Glucagon zu binden und das durch Glucagon zur Verfügung gestellte Signal an eine Zelle zu transduzieren. Bevorzugterweise sind die Glucagonrezeptoren der vorliegenden Erfindung in der Lage, Glucagon mit einem Kd von 100 nM oder weniger, weiter bevorzugt 50 nM oder weniger und am meisten bevorzugt 33 nM oder weniger zu binden. Repräsentative Tests, die verwendet werden können, um die Glucagonbindung durch einen Glucagonrezeptor zu bestimmen, sind genauer unten in den Beispielen 3 und 6 beschrieben.
Eine Signaltransduktion tritt typischerweise auf, wenn ein Antwort-Signalweg durch einen externen Stimulus aktiviert wird, der im allgemeinen, jedoch nicht immer, direkt an einen Membran-gebundenen Rezeptor gekoppelt wird. Antwort-Signalwege induzieren im allgemeinen zelluläre Antworten, wie zum Beispiel extrazelluläre Matrix-Sekretion von responsiven Zellinien, Hormonsekretion, Chemotaxis, Differenzierung oder die Initiierung oder Inhibierung von Zellteilung von responsiven Zellen. Wie hier verwendet, betrifft das Koppeln von Rezeptoren an Antwort-Signalwege die direkte Aktivierung eines Antwort-Signalwegs oder die Transduktion eines Signals über einen Second-Messenger, wie zum Beispiel ein G-Protein, um einen zellulären Antwort-Signalweg zu aktivieren.
Eine Auswahl von zellulären Antwort-Signalwegen kann durch Glucagonrezeptoren verwendet werden, um ein Glucagonbindesignal zu der Zelle zu transduzieren, einschließlich, zum Beispiel, dem Adenylatcyclase-Antwort-Signalweg und einem intrazellulären Calcium-Anwort-Signalweg. Tests, um Adenylatcyclaseaktivität zu bestimmen, sind im Stand der Technik gut bekannt und schließen zum Beispiel diejenigen, beschrieben durch Lin et al. (Biochemistry 14: 1559–1563, 1975), ein. Die vorliegende Erfindung schließt auch die Messung von biologischer Aktivität eines Glucagonrezeptors, basierend auf intrazellulären Calciumkonzentrationen, ein (siehe, Grynkiewicz et al., J. Biol. Chem. 260: 3440–2450, 1985), sowie durch die Verwendung eines Luciferase-Reportersystems, das weiter unten genauer beschrieben ist. Zusätzlich können biologische Antworten, die über Inositoltriphosphat-Signalweg auftreten, durch Messen von Inositolphosphat-Stoffwechsel ermittelt werden, wie im allgemeinen in Subers and Nathanson (J. Mol. Cell. Cardiol. 20: 131–140, 1988) oder Pittner and Fain (Biochem. J. 277: 371–378, 1991) beschrieben wird. Es sollte bemerkt werden, daß innerhalb des Kontexts der vorliegenden Erfindung nicht alle Antwort-Signalwege erforderlicherweise vorhanden sein müssen, damit der Glucagonrezeptor ein Signal an eine Zelle transduziert. Zum Beispiel können bestimmte zelluläre Antworten, wie zum Beispiel einen Zunahme in intrazellulären Calciumspiegeln auch durch die Bindung von Glucagon an seinen Rezeptor in der Abwesenheit von cAMP oder Inositolphosphat-Signalen ausgelöst werden.
Isolierung von Glucagonrezeptor cDNA-Klonen
Wie oben angegeben stellt die vorliegende Erfindung isolierte DNA-Moleküle zur Verfügung, die Glucagonrezeptoren kodieren. Kurz, können genomische cDNA-Moleküle, die Glucagonrezeptoren kodieren aus Bibliotheken erhalten werden, die aus Zellen und Geweben gemäß Verfahren, sowie denjenigen, unten beschrieben und in den Beispielen, präpariert wurden. Zellen und Gewebe, die innerhalb der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, können aus einer Vielzahl von Säugern erhalten werden, zum Beispiel, Menschen, Makaken, Rindern, Schweinen, Pferden, Hunden, Ratten und Mäusen. Bevorzugte Zellen und Gewebe, die verwendet werden können, schließen adipöse, Nieren-, Pankreas-, Herz- und Leberzellen ein.
Innerhalb eines Aspekts der Erfindung kann ein Ratten-Glucagonrezeptor werden unter der Verwendung von hier beschriebenen Verfahren isoliert und kloniert. Kurz, wurde Poly(A)⁺ RNA aus Sprague Dawley Ratten isoliert und als ein Templat für die cDNA-Synthese im wesentlichen wie beschrieben durch Houamed et al. (Science 252: 1318–1321, 1991) verwendet, um Vollängen-cDNAs zu erzeugen. Eine Bibliothek, die ungefähr 1 × 10⁶ Klone enthielt, wurde dann in einem Säugerzell-Expressionsplasmid durch die direktionale Klonierung von cDNAs von größer als 800 bp konstruiert. Plasmid-DNAs, die aus Pools präpariert wurden, die jeweils 5000 Klone enthielten, wurden dann in COS-7-Zellen transfiziert, selektiert und auf Mikroskop-Objektträgern angezogen. Die transfizierten Zellen wurden nach 72 Stunden durch Bindung mit ¹²⁵J-Glucagon, gefolgt von Emulsions-Radiographie (McMahan et al., EMBO J. 10: 2821–2832, 1991) analysiert. Positive Pools wurden nacheinander heruntergebrochen, bis ein einzelner Klon isoliert wurde. Das aus diesem Klon erhaltene Plasmid, bezeichnet als pLJ4, enthält ein ungefähr 2,0 Kilobasen-Insert, das für ein 458 Aminosäure-Protein mit einem vorhergesagten Molekulargewicht von 54962 Dalton kodiert (siehe SEQ ID NO: 15).
Innerhalb anderer Aspekte der vorliegenden Erfindung werden Verfahren zur Isolierung und Klonierung eines menschlichen Glucagonrezeptors zur Verfügung gestellt. Eine Auswahl von Techniken kann unter der Berücksichtigung der hier zur Verfügung gestellten Beschreibung verwendet werden, einschließlich, zum Beispiel, die Verwendung von Polymerase-Kettenreaktion ("PCR"), um Sequenzen zu amplifizieren, die für einen Glucagonrezeptor kodieren (Beispiel 4), die dann bei der Identifizierung von Bibliotheken verwendet werden können, die Sequenzen enthalten, die einen menschlichen Glucagonrezeptor kodieren, gefolgt von der Klonierung des Rezeptors (Beispiel 5). Besonders bevorzugte Strategien zu Klonierung des menschlichen Glucagonrezeptors sind unten in Beispielen 4 und 5 angegeben. Alternativ kann eine Expressionsbibliothek, die menschliche cDNAs enthält, aus geeigneten RNA-Quellen im wesentlichen wie in Beispiel 1 beschrieben präpariert werden und wie in Beispiel 3 auf Klone gescreent werden, die funktionelle menschliche Glucagonrezeptoren exprimieren.
Herstellung von rekombinanten Glucagonrezeptoren
Die vorliegende Erfindung stellt die Produktion von rekombinanten Glucagonrezeptoren durch Kultivieren von Wirtszellen, die ein DNA-Konstrukt enthalten, das ein erstes DNA-Segment enthält, das für einen Glucagonrezeptor kodiert, operativ verbunden mit weiteren DNA-Segmenten, die für die Expression des ersten DNA-Segments erforderlichen sind, zur Verfügung. Wie oben bemerkt, werden innerhalb des Kontexts der vorliegenden Erfindung "Glucagonrezeptoren" als Derivate davon einschließend verstanden, die im wesentlichen ähnlich sind. Darüber hinaus können Glucagonrezeptoren durch DNA-Sequenzen kodiert werden, die im wesentlichen ähnlich zu den hier offenbarten DNA-Sequenzen sind. Wie hier verwendet, wird eine DNA-Sequenz als "im wesentlichen ähnlich" betrachtet, wenn: (a) die DNA-Sequenz abgeleitet ist aus der kodierenden Region eines nativen Glucagonrezeptorgens (einschließlich, zum Beispiel, allelischen Variationen der unten offenbarten Sequenzen); (b) die DNA-Sequenz in der Lage ist, an DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung unter hoher oder geringer Stringenz (siehe, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1989) zu hybridisieren; oder (c) DNA-Sequenzen, die als ein Ergebnis des genetischen Codes zu den in den (a) oder (b) definierten Sequenzen degeneriert sind.
Mutationen in Nukleotidsequenzen, die für die Expression von Varianten-Glucagonrezeptoren konstruiert wurden, werden den Leserahmen der kodierenden Sequenzen beibehalten. Weiterhin werden die Mutationen bevorzugterweise keine komplementäre Regionen erzeugen, die hybridisieren könnten, um sekundäre mRNA-Strukturen zu erzeugen, wie zum Beispiel Schleifen oder Haarnadeln, die die Translation der Rezeptor-mRNA negativ beeinträchtigen würden. Obwohl eine Mutationsstelle vorbestimmt sein kann, ist es nicht erforderlich, daß die Natur der Mutation als solches vorherbestimmt sein muß. Zum Beispiel kann, um auf optimale Charakteristika von Mutanten an einer bestimmten Stelle zu selektieren, eine zufällige Mutagenese an dem Zielcodon durchgeführt werden, und die exprimierten Glucagonrezeptor-Mutanten auf biologische Aktivität gescreent werden.
Mutationen können an bestimmten Stellen durch synthetisieren von Oligonukleotiden eingeführt werden, die eine Mutantensequenz enthalten, flankiert von Restriktionsstellen, die die Ligation an Fragmente der nativen Sequenz ermöglichen. Im Anschluß an die Ligation codiert die sich ergebende rekonstruierte Sequenz für ein Derivat, das die gewünschte Aminosäureinsertion, -substitution oder -deletion aufweist.
Alternativ können Oligonukleotid-gerichtete Stellen-spezifische Mutageneseverfahren verwendet werden, um ein verändertes Gen zur Verfügung zu stellen, das besondere veränderte Codons aufweist, gemäß der erforderlichen Substitution, Deletion oder Insertion. Beispielhafte Verfahren von Einführen der Änderungen wie oben angegeben werden durch Walder et al. (Gene 42: 133, 1986); Bauer et al. (Gene 37: 73, 1985); Craik (Bio Techniques, January 1985, 12–19); Smith et al. (Generic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981); and Sambrook et al. (supra) offenbart.
Die primäre Aminosäurestruktur eines Glucagonrezeptors kann auch durch Bilden von kovalenten oder aggregativen Konjugaten mit anderen chemischen Gruppen modifiziert werden, wie zum Beispiel Glycosylgruppen, Lipiden, Phosphat, Acetylgruppen oder mit anderen Proteinen oder Polypeptiden. Innerhalb einer weiteren Ausführungsform können Glucagonrezeptoren mit anderen Peptiden fusioniert werden, die die Reinigung oder Identifizierung von Glucagonrezeptoren erleichtern. Zum Beispiel kann ein Glucagonrezeptor als ein Fusionsprotein mit der FLAG Polypeptid-Sequenz präpariert werden (siehe U.S. Patent Nr. 4,851,341; siehe auch, Hopp et al., Bio/Technology 6: 1204, 1988). Die FLAG Polypeptid-Sequenz ist hoch antigen und stellt ein Epitop zur Bindung durch einen spezifischen monoklonalen Antikörper zur Verfügung, was eine schnelle Reinigung des exprimierten rekombinanten Proteins ermöglicht. Diese Sequenz wird auch spezifisch durch Rindermucosa Enterokinase an den Rest unmittelbar im Anschluß an das Asp-Lys Paar gespalten.
Zahlreiche DNA-Konstrukte, einschließlich des gesamten oder eines Teils von Nukleotidsequenzen eines nativen oder Varianten-Glucagonrezeptors wie oben diskutiert können bequem präpariert werden. Innerhalb des Kontexts der vorliegenden Erfindung wird ein DNA-Konstrukt als ein DNA-Molekül betreffend verstanden oder einen Klon eines solchen Moleküls (entweder einzel- oder doppelsträngig), der durch menschlichen Eingriff modifiziert wurde, um Segmente von DNA auf eine Weise kombiniert und aneinandergrenzend zu enthalten, die ansonsten insgesamt in der Natur nicht vorkommen würde. DNA-Konstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen ein erstes DNA-Segment, das für einen Glucagonrezeptor kodiert, operativ verbunden an weitere DNA-Segmente, die für die Expression des ersten DNA-Segments erforderlich sind. Innerhalb des Kontexts der vorliegenden Erfindung werden zusätzliche DNA-Segmente im allgemeinen Promotoren und Transkriptions-Terminatoren einschließen, und können weiter Enhancer und andere Elemente einschließen.
DNA-Konstrukte, auch als Expressionsvektoren bekannt, können auch DNA-Segmente enthalten, die erforderlich sind, um die Sekretion eines Polypeptids von Interesse zu steuern. Solche DNA-Segmente können mindestens eine sekretorische Signalsequenz einschließen. Bevorzugte sekretorische Signalsequenzen schließen das Glucagon-sekretorische Signal (prä-pro Sequenz), die Alpha-Signalsequenz (prä-pro Sequenz); Kurjan and Herskowitz, Cell 30: 933–943, 1982; Kurjan et al., U.S. Patent Nr. 4,546,082; Brake, EP 116,201 ) die PHO5 Signalsequenz (Beck et al., WO 86/00637), die BAR1 sekretorische Signalsequenz (MacKay et al., U.S. Patent Nr. 4,613,572; McKay, WO 87/002670), die SUC2 Signalsequenz (Carlson et al., Mol. Cell. Biol. 3: 439–447, 1983), die α-1-Antitrypsin Signalsequenz (Kurachi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 6826–6830, 1981), die α-2 Plasmin-inhibitorische Signalsequenz (Tone et al., J. Biochem. (Tokyo) 102: 1033–1042, 1987), die Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Signalsequenz (Pennica et al., Nature 301: 214–221, 1983), die E. coli PhoA Signalsequenz (Yuan et al., J. Biol. Chem. 265: 13528–13552, 1990) oder irgendeine der bakteriellen Signalsequenzen ein, die zum Beispiel durch Oliver (Ann. Rev. Microbiol. 39: 615–649, 1985) zusammenfassend beschrieben sind. Alternativ kann eine sekretorische Signalsequenz gemäß den durch zum Beispiel von Heinje (Eur. J. Biochem. 133: 17–21, 1983; J. Mol. Biol. 184: 99–105, 1985; Nuc. Acids Res. 14: 683–4690, 1986) etablierten Regeln synthetisiert werden.
Sekretorische Signalsequenzen können einzeln verwendet werden oder können kombiniert werden. Zum Beispiel kann eine erste sekretorische Signalsequenz in Kombination mit einer Sequenz verwendet werden, die für die dritte Domäne von Barrier kodiert (beschrieben in U.S. Patent Nr. 5,037,243, das hier durch Bezug in seiner Gesamtheit aufgenommen ist). Eine Sequenz, die für die dritte Domäne von Barrier kodiert, kann in einem geeigneten Leserahmen 3' der DNA-Sequenz von Interesse oder 5' zu dem DNA-Segment und in einem geeigneten Leserahmen mit sowohl der sekretorischen Signalsequenz und dem DNA-Segment von Interesse positioniert werden.
Für die Expression wird ein DNA-Molekül, das für einen Glucagonrezeptor kodiert, in ein geeignetes DNA-Konstrukt inseriert, das umgekehrt dazu verwendet wird, um geeignete Wirtszellen zur Expression zu transformieren oder transfizieren. Wirtszellen zur Verwendung bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung schließen Säuger-, Vogel-, Pflanzen-, Insekten-, bakterielle und Pilzzellen ein. Bevorzugte eukaryontische Zellen schließen kultivierte Säugerzellinien (z.B. Nager- oder menschliche Zellinien) und Pilzzellen ein, einschließlich Spezies von Hefe (z.B. Saccharomyces spp., insbesondere S. cerevisiae, Schizosaccharomyces spp., oder Kluvveromyces spp.) oder filamentöse Pilze (z.B. Aspergillus spp., Neurospora spp.) ein. Stämme der Hefe Saccharomyces cerevisiae sind besonders bevorzugt. Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Proteinen in einer Vielzahl von prokaryontischen und eukaryontischen Wirtszellen sind im allgemeinen im Stand der Technik bekannt (siehe, "Gene Expression Technology", Methods in Enzymology, Vol. 185, Goeddel (ed.), Academic Press, San Diego, Calif., 1990; siehe auch, "Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology", Methods in Enzymology, Guthrie and Fink (eds.) Academic Press, San Diago, Calif., 1991). Im allgemeinen wird eine Wirtszelle auf der Basis seiner Fähigkeit ausgesucht, das Protein von Interesse in einem hohen Spiegel zu produzieren oder seine Fähigkeit, mindestens einige der für die biologische Aktivität des Proteins erforderlichen Prozessierungsschritte durchzuführen. Auf diese Weise kann die Zahl von klonierten DNA-Sequenzen minimiert werden, die in die Wirtszelle transfiziert werden müssen, und die Gesamtausbeute von biologisch aktiven Protein kann maximiert werden.
Geeignete Hefevektoren zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung schließen YRp7 (Struhl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 1035–1039, 1978), YEp13 (Broach et al., Gene 8: 121–133, 1979), POT-Vektoren (Kawasaki et al., U.S. Patent Nr. 4,931,373 das hier durch Bezugnahme aufgenommen ist), pJDB249 und pJDB219 (Beggs, Nature 275: 104–108, 1978) und Derivate davon. Solche Vektoren werden im allgemeinen einen selektierbaren Marker einschließen, der einer von jeder Zahl von Genen sein kann, die einen dominanten Phänotyp zeigen, für den ein phänotyischer Test existiert, um einen Selektion von Transformanten zu ermöglichen. Bevorzugte selektierbare Marker sind diejenigen, die Wirtszell-Auxothrophie komplementieren, eine Antibiotikum-Resistenz zur Verfügung stellen oder es einer Zelle ermöglichen, spezifische Kohlenstoffquellen zu verwenden und schließen LEU2 (Broach et al., ibid.), URA3 (Botstein et al., Gene 8: 17, 1979), HIS3 (Struhl et al., ibid.) oder POTI (Kawasaki et al., ibid.). ein. Ein anderer geeigneter selektierbarer Marker ist das CAT-Gen, das Chloramphenicol-Resistenz auf Hefezellen überträgt.
Bevorzugte Promotoren zur Verwendung in Hefe schließen Promotoren von Hefe-glycolytischen Genen (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255: 12073–12080, 1980; Alber and Kawasaki, J. Mol. Appl. Gene. 1: 419–434, 1982; Kawasaki, U.S. Patent Nr. 4,599,311) oder Alkohol-Dehydrogenasegene (Young et al., in Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals, Hollaender et al. (eds.), p. 355, Plenum, New York, 1982; Ammerer, Meth. Enzymol. 101: 192–201, 1983) ein. In dieser Hinsicht sind besonders bevorzugte Promotoren der TPI1-Promotor (Kawasaki, U.S. Patent Nr. 4,599,311, 1986) und der ADH2-4^C-Promotor (Russell et al., Nature 304: 652–654, 1983; Irani and Kilgore, U.S. Patentanmeldung Nr. 07/784,653, die hier durch Bezugnahme aufgenommen ist). Die Expressionseinheiten können auch einen transkriptionellen Terminator einschließen. Ein bevorzugter Terminator ist der TPII-Terminator (Alber and Kawasaki, ibid.)
Zusätzlich zur Hefe können Proteine in der vorliegenden Erfindung in filamentösen Pilzen, zum Beispiel Stämmen des Pilzes Aspergillus (McKnight et al., U.S. Patent Nr. 4,935,349, das hier durch Bezugnahme aufgenommen ist) exprimiert werden. Beispiele von brauchbaren Promotoren schließen diejenigen, abgeleitet von Aspergillus nidulans glycolytischen Genen, wie zum Beispiel den ADH3 Promotor (McKnight et al., EMBO J. 4: 2093–2099, 1985) und den tpiA-Promotor ein. Ein Beispiel eines geeigneten Terminators ist der ADH3-Terminator (McKnight et al., ibid., 1985). Die Expressioneinheiten, die solche Komponenten verwenden, werden in Vektoren kloniert, die in der Lage sind, in die chromosomale DNA von Aspergillus zu inserieren.
Techniken zur Transformation von Pilzen sind in der Literatur gut bekannt und wurden zum Beispiel durch Beggs (ibid.), Hinnen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929–1933, 1978), Yelton et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1740–1747, 1984) und Russell (Nature 301: 167–169, 1983) beschrieben. Der Genotyp der Wirtszelle wird im allgemeinen einen genetischen Defekt enthalten, der durch den selektierbaren Marker, der auf dem Expressionsvektor vorhanden ist, komplementiert wird. Die Auswahl eines bestimmten Wirts und selektierbaren Markers liegt gut innerhalb des Niveaus des Durchschnittsfachmanns. Um die Produktion der heterologen Proteine in Hefe zu optimieren, ist es zum Beispiel bevorzugt, daß der Wirtsstamm eine Mutation, wie zum Beispiel die Hefe pep4-Mutation (Jones, Generics 85: 23–33, 1977) trägt, was zu einer verringerten proteolytischen Aktivität führt.
Zusätzlich zu Pilzzellen können kultivierte Säugerzellen als Wirtszellen innerhalb der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Bevorzugte kultivierte Säugerzellen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung schließen die COS-1-(ATCC Nr. CRL 1650), COS-7-(ATCC Nr. CRL 1651, BHK-(ATCC Nr. CRL 1632) und 293-(ATCC Nr. CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36: 59–72, 1977) Zellinien ein. Eine bevorzugte BHK-Zellinie ist die BHL 570-Zellinie (hinterlegt bei der American Type Culture Collection unter Zugangsnummer CRL 10314). Zusätzlich kann eine Zahl von anderen Säugerzellinien innerhalb der vorliegenden Erfindung verwendet werden, einschließlich Ratten Hep I- (ATCC Nr. CRL 1600), Ratten Hep II-(ATCC Nr. CRL 1548), TCMK (ATCC Nr. CCL 139), menschliche Lungen- (ATCC Nr. CCL 75,1), menschliche Hepatoma-(ATCC Nr. HTB-52), Hep G2 (ATCC Nr. HB 8065), Mausleber- (ATCC Nr. CCL 29,1), NCTC 1469 (ATCC Nr. CCL 9,1), SP2/0-Ag14- (ATCC Nr. 1581), HIT-T15 (ATCC Nr. CRL 1777) und RINm-5AHT₂B- (Orskov and Nielson, FEBS 229(1): 175–178, 1988).
Säugetier-Expressionsvektoren zur Verwendung bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung werden einen Promotor einschließen, der in der Lage ist, die Transkription eines klonierten Gens oder einer cDNA zu dirigieren. Bevorzugte Promotoren schließen virale Promotoren und zelluläre Promotoren ein. Virale Promotoren schließen den unmittelbaren frühen Cytomegalovirus-Promotor (Boshart et al., Cell 41: 521–530, 1985) and den SV40-Promotor (Subramani et al., Mol. Cell. Biol. 1: 854–864, 1981) ein. Zelluläre Promotoren schließen den Maus-Metallothionein-1-Promotor (Palmiter et al., U.S. Patent Nr. 4,579,821), einen Maus V_κ Promotor (Bergman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 7041–7045, 1983; Grant et al., Nuc. Acids Res. 15: 5496, 1987) und einen Maus V_H-Promotor (Loh et al., Cell 33: 85–93, 1983) ein. Ein besonders bevorzugter Promotor ist der Haupt-späte-Promotor aus Adenovirus 2 (Kaufman and Sharp, Mol. Cell. Biol. 2: 1304–13199, 1982). Solche Expressionsvektoren können auch ein Set von RNA-Splice-Stellen enthalten, die stromabwärts von dem Promotor lokalisiert sind und stromaufwärts von der DNA-Sequenz, die für das Peptid oder Protein von Interesse kodiert. Bevorzugte RNA-Splice-Stellen können aus Adenovirus und/oder Immunglobulinen erhalten werden. Auch in den Expressionsvektoren enthalten ist ein Polyadenylierungssignal, lokalisiert stromabwärts von der kodierenden Sequenz von Interesse. Geeignete Polyadenylierungssignale schließen die frühen oder späten Polyadenylierungssignale aus SV40 (Kaufman and Sharp, ibid.), das Polyadenylierungssignal aus der Adenovirus 5 E1B-Region und dem menschlichen Wachstumsfaktorgen-Terminator (DeNoto et al., Nuc. Acids Res. 9: 3719–3730, 1981) ein. Die Expressionsvektoren können eine nicht-kodierende virale Vorläufersequenz, wie zum Beispiel die Adenovirus 2-Tripartit-Vorläufersequenz, lokalisiert zwischen dem Promotor und den RNA-Splice-Stellen einschließen. Bevorzugte Vektoren können auch Enhancer-Sequenzen, wie zum Beispiel den SV40-Enhancer und dem Maus-μ-Enhancer (Gillies, Cell 33: 717–728, 1983) einschließen. Expressionsvektoren können auch Sequenzen einschließen, die für die Adenovirus VA RNAs kodieren. Geeignete Vektoren können aus kommerziellen Quellen erhalten werden (z.B. Stratagene, La Jolla, CA).
Klonierte DNA-Sequenzen können in kultivierte Säugerzellen durch, zum Beispiel, Calciumphosphat-vermittelte Transfektion (Wigler et al., Cell 14: 725, 1978; Corsaro and Pearson, Somaric Cell Genetics 7: 603, 1981; Graham and Van der Eb, Virology 52: 456, 1973), Elektroporation (Neumann et al., EMBO J. 1: 841–845, 1982) oder DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion (Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987) eingeführt werden, die hier durch Bezugnahme aufgenommen sind. Um Zellen zu identifizieren, die die klonierte DNA stabil integriert haben, wird allgemein ein selektierbarer Marker in die Zellen gemeinsam mit dem Gen oder der cDNA von Interesse eingeführt. Bevorzugte selektierbare Marker zur Verwendung in kultivierten Säugerzellen schließen Gene ein, die eine Resistenz gegenüber Wirkstoffen wie zum Beispiel Neomycin, Hygromycin und Methotrexat vermitteln. Der selektierbare Marker kann ein amplifizierbarer selektierbarer Marker sein. Bevorzugte amplifizierbare selektierbare Marker sind das DHFR-Gen und das Neomycin-Resistenzgen. Selektierbare Marker werden durch Thilly (Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, MA, die hier durch Bezugnahme aufgenommen ist) zusammenfassend beschrieben. Die Auswahl von selektierbaren Marker liegt gut innerhalb des Niveaus des Durchschnittsfachmanns.
Selektierbare Marker können in die Zelle auf einem separaten Vektor zur selben Zeit wie die Glucagonrezeptor-Sequenz eingeführt werden oder sie können auf demselben Vektor eingeführt werden. Falls auf demselben Vektor, können der selektierbare Marker und die Glucagonrezeptor-Sequenz unter der Kontrolle von verschiedenen oder dem selben Promotor vorliegen, wobei die letzte Anordnung einen dicistronischen Boten produziert. Konstrukte dieses Typs sind im Stand der Technik bekannt (zum Beispiel, Levison and Simonsen, U.S. Patent Nr. 4,713,339). Es kann auch vorteilhaft sein, zusätzliche DNA, bekannt als "Träger-DNA", zu dem Gemisch hinzuzufügen, das in die Zellen eingeführt wird.
Den transfizierten Säugerzellen wird es erlaubt, für eine Zeitdauer zu wachsen, typischerweise 1–2 Tage, um damit zu beginnen, die DNA-Sequenzen) von Interesse zu exprimieren. Eine Wirkstoffselektion wird dann angewendet, um auf das Wachstum von Zellen zu selektieren, die den selektierbaren Marker auf eine stabile Weise exprimieren. Für Zellen, die mit einem amplifizierbaren selektierbaren Marker transfiziert wurden, kann die Wirkstoffkonzentration auf eine schrittweise Art angehoben werden, um auf eine erhöhte Kopienzahl der klonierten Sequenzen zu selektieren, wodurch die Expressionsspiegel gesteigert werden. Die Zellen, die die eingeführten Sequenzen exprimieren, werden selektiert und auf die Produktion des Proteins von Interesse in der gewünschten Form oder in den gewünschten Spiegel gescreent. Zellen, die diese Kriterien erfüllen, können dann kloniert werden und für die Produktion vermehrt werden.
Bevorzugte prokaryontische Wirtszellen zur Verwendung in der Durchführung der vorliegenden Erfindung sind Stämme des Bakteriums Escherichia coli, obwohl Bacillus andere Genera brauchbar sind. Techniken zur Transformation dieser Wirte und der Expression von fremden DNA-Sequenzen, die darin kloniert sind, sind gut im Stand der Technik bekannt (siehe, z.B. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, das hier durch Bezugnahme aufgenommen ist; oder Sambrook et al., supra). Zur Expression von klonierten DNA-Sequenzen in bakteriellen Wirten verwendete Vektoren werden allgemein einen selektierbaren Marker, wie zum Beispiel ein Gen für Antibiotikum-Resistenz enthalten, und einen Promotor, der in der Wirtszelle funktioniert. Geeignete Promotoren schließen das trp (Nichols and Yanofsky, Meth. Enzymol. 101: 155–164, 1983), lac (Casadaban et al., J. Bacteriol. 143: 971–980, 1980) und Phage λ (Queen. J. Mol. Appl. Genet. 2: 1–10, 1983) Promotorsystem ein. Zur Transformation von Bakterien brauchbare Plasmide schließen pBR322 (Bolivar et al., Gene 2: 95–113, 1977), die pUC-Plasmide (Messing, Meth. Enzymol. 101: 20–78, 1983; Vieira and Messing, Gene 19: 259–268, 1982), pCQV2 (Queen, ibid.) und Derivate davon ein. Plasmide können sowohl virale als auch bakterielle Elemente enthalten.
In Anbetracht der hier zur Verfügung gestellten Lehren wären Promotoren, Terminatoren und Verfahren zur Einführung von Expressionsvektoren, die für Glucagonrezeptoren kodieren, der vorliegenden Erfindung in Pflanzen-, Vogel- und Insektenzellen dem Fachmann ersichtlich. Die Verwendung von zum Beispiel Baculoviren, als Vektoren zur Expression von heterologen DNA-Sequenzen in Insektenzellen, wurde durch Atkinson et al. (Pesric. Sci. 28: 215–224, 1990) zusammenfassend beschrieben. Zusätzlich wurde die Verwendung von Agrobacterium rhizogenes als Vektor zur Expression von Genen in Pflanzenzellen durch Sinkar et al. (J. Biosci. (Bangalore) 11: 47–58, 1987) zusammenfassend beschrieben.
Wirtszellen, die DNA-Konstrukte der vorliegenden Erfindung enthalten, werden dann kultiviert, um ein DNA-Segment zu exprimieren, das für einen Glycagonrezeptor kodiert. Die Zellen werden gemäß Standardverfahren in einem Kulturmedium kultiviert, das Nährstoffe enthält, die zum Wachstum der ausgewählten Wirtszellen erforderlich sind. Eine Vielzahl von geeigneten Medien sind im Stand der Technik bekannt und schließen im allgemeinen eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, essentielle Aminosäuren, Vitamine und Mineralien ein, sowie andere Komponenten, z.B. Wachstumfaktoren oder Serum, die durch die besonderen Wirtszellen erforderlich sein können. Das Wachstumsmedium wird im allgemeinen auf Zellen selektieren, die die DNA-Konstrukte) enthalten, durch, zum Beispiel, Wirkstoffselektion oder Defizienz in einem essentiellen Nährstoff, der durch den selektierbaren Marker auf dem DNA-Konstrukt komplementiert wird oder der mit dem DNA-Konstrukt co-transfiziert wird.
Geeignete Wachstumsbedingungen für Hefezellen schließen zum Beispiel kultivieren in einem chemisch definierten Medium umfassend eine Stickstoffquelle ein, die eine nicht-Aminosäure-Stickstoffquelle oder ein Hefeextrakt sein kann, anorganische Salze, Vitamine und essentielle Aminosäure-Ergänzungsstoffe, bei einer Temperatur zwischen 4°C und 37°C, wobei 30°C bevorzugt sind. Der pH des Mediums wird bevorzugterweise bei einem pH von größer als 2 und weniger als 8, weiter bevorzugt pH 5–6 gehalten. Verfahren zur Aufrechterhaltung eines stabilen pHs schließen Puffer und konstante pH-Kontrolle ein. Bevorzugte Mittel zur pH-Kontrolle schließen Natriumhydroxid ein. Bevorzugte Puffermittel schließen Succininsäure und Bis-Tris (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) ein. Aufgrund der Tendenz von Hefe-Wirtszellen, heterologe Proteine zu hyperglycosylieren, kann es bevorzugt sein, die Glucagonrezeptoren der vorliegenden Erfindung in Hefezellen zu exprimieren, die einen Defekt in einem Gen aufweisen, das für die Asparagin-verbundene Glycosylierung erforderlich ist. Solche Zellen werden bevorzugterweise in einem Medium angezogen, das einen osmotischen Stabilisator enthält. Ein bevorzugter osmotischer Stabilisator ist Sorbitol, ergänzt in das Medium bei einer Konzentration von zwischen 0,1 M und 1,5 M, bevorzugterweise bei 0,5 M oder 1,0 M. Kultivierte Säugerzellen werden im allgemeinen in käuflich erhältlichen Serum-enthaltenden oder Serum-freien Medien kultiviert. Die Selektion eines Mediums und geeignete Wachstumsbedingungen für die bestimmte verwendete Zellinie liegen innerhalb des Niveaus des Durchschnittsfachmanns.
Glucagonrezeptoren können auch in nicht-menschlichen transgenen Tieren, insbesondere transgenen warmblütigen Tieren exprimiert werden. Verfahren zur Herstellung von transgenen Tieren, einschließlich Mäusen, Ratten, Kaninchen, Schafen und Schweinen, sind im Stand der Technik bekannt und zum Beispiel durch Hammer et al. (Nature 315: 680–683, 1985), Palmiter et al. (Science 222: 809–814, 1983), Brinster et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4438–4442, 1985), Palmiter und Brinster (Cell 41: 343–345, 1985) und U.S. Patent Nr. 4,736,866 beschrieben, die alle hier durch Bezugnahme aufgenommen sind. Kurz, wird eine Expressionseinheit, die eine DNA-Sequenz einschließt, die zusammen mit geeignet positionierten Expressions-Kontrollsequenzen exprimiert werden soll in Pronuclei von befruchteten Eizellen eingeführt. Die Einführung von DNA wird im allgemeinen durch Mikroinjektion durchgeführt. Die Integration der injizierten DNA wird durch Blot-Analyse von DNA aus Gewebeproben, typischerweise Proben von Schwanzgewebe, nachgewiesen. Es ist allgemein bevorzugt, daß die eingeführte DNA in die Keimbahn des Tieres eingeführt wird, so daß sie an die Nachkommen des Tieres weitergegeben wird.
Innerhalb einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein transgenes Tier, wie zum Beispiel eine Maus, durch Abzielen einer Mutation entwickelt, um eine Glucagonrezeptor-Sequenz zu unterbrechen (siehe, Mansour et al., "Disruption of the protooncogene int-2 in mouse embryo-derived stem cells: a general strategy for targeting mutations to non-selectable genes", Nature 336: 348–352, 1988). Solche Tiere können leicht als ein Modell verwendet werden, um die Rolle des Glucagonrezeptors im Stoffwechsel zu untersuchen.
Glucagonrezeptor-Peptide
Wie oben angegeben, stellt die vorliegende Erfindung auch Glucagonrezeptor-Peptide zur Verfügung. Innerhalb des Kontexts der vorliegenden Erfindung werden Glucagonrezeptor-Peptide als Teile eines Glucagonrezeptors oder Derivate davon, wie oben diskutiert, einschließend verstanden, die keine Transmembran-Domänen enthalten und mindestens 10 Aminosäuren lang sind. Kurz, kann die Struktur des Glucagonrezeptors sowie putativer Transmembran-Domänen aus den primären Translationsprodukten unter der Verwendung der Hydrophobizitäts-Blot-Funktion von zum Beispiel P/C Gen oder Intelligenetics Suite (Intelligenetics, Mt. View, CA) oder gemäß den von Kyte and Doolittle (J. Mol. Biol. 157: 105–132, 1982) beschriebenen Verfahren vorhergesagt werden. Der Hydrophobizitäts-Blot des Ratten-Glucagonrezeptors ist graphisch in 2 dargestellt. Obwohl man nicht durch eine graphische Darstellung basierend auf dieser Hydrophobizitäts-Analyse gebunden werden will, wird von Glucagonrezeptoren geglaubt, daß sie die in 1 gezeigte allgemeine Struktur aufweisen. Insbesondere wird von diesen Rezeptoren geglaubt, daß sie einen extrazelluläre Amino-terminale Domäne, drei extrazelluläre Schleifendomänen und vier intrazelluläre Schleifendomänen, jede durch eine Transmembran-Domäne beabstandet, umfassen.
Innerhalb eines Aspekts dieser Erfindung wird ein isoliertes Glucagonrezeptor-Peptid zur Verfügung gestellt, umfassend die extrazelluläre Amino-terminale Domäne eines Glucagonrezeptors. Innerhalb einer bevorzugten Ausführungsform wird ein isoliertes Glucagonrezeptor-Peptid zur Verfügung gestellt, umfassend die Sequenz der Aminosäuren von SEQ ID NO: 15, von Glutamin, Aminosäure-Nummer 28, bis Tyrosin, Aminosäure-Nummer 142. Auch zur Verfügung gestellt werden andere isolierte Glucagonrezeptor-Peptide, die aus den extrazellulären und intrazellulären Schleifendomänen des Glucagonrezeptors ausgewählt sein können (siehe 1 und 5). Innerhalb einer Ausführungsform werden Glucagonrezeptor-Peptide, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 1ID (SEQ ID NO: 15 von Lysin, Aminosäure-Nummer 169 bis Histidin, Aminosäure-Nummer 178), 1ELD (SEQ ID NO: 15 von Tyrosin, Aminosäure-Nummer 203 bis Isoleucin, Aminosäure-Nummber 231), 2ID (SEQ ID NO: 15, von Phenylalanin, Aminosäure-Nummer 259 bis Serin, Aminosäure-Nummer 266), 2ELD (SEQ II) NO: 15, von Valin, Aminosäure-Nummer 293 bis Isoleucin, Aminosäure-Nummer 307), 3ID (SEQ ID NO: 15, von Leucin, Aminosäure-Nummer 334 bis Lysin, Aminosäure-Nummer 345), und 3ELD (SEQ ID NO: 15, von Asparaginsäure, Aminosäure-Nummer 371 bis Serin, Aminosäure-Nummer 380).
Glucagonrezeptor-Peptide der vorliegenden Erfindung können unter der Verwendung von rekombinanten Techniken, wie oben diskutiert, hergestellt werden, oder durch synthetische Verfahren und können wie unten beschrieben zusätzlich gereinigt werden.
Reinigung von Glucagonrezeptor-Peptiden
Isolierte Glucagonrezeptor-Peptide können durch, neben anderen Methoden, Kultivieren von geeigneten Wirts-/Vektorsystemen präpariert werden, um die rekombinanten Translationsprodukte der vorliegenden Erfindung herzustellen. Überstände von solchen Zellinien können dann durch eine Vielzahl von Reinigungsverfahren behandelt werden, um das Glucagonrezeptor-Peptid zu isolieren. Zum Beispiel kann der Überstand zuerst unter der Verwendung von käuflich erhältlichen Protein-Konzentrationsfiltern, wie zum Beispiel einer Amicon- oder Millipore Pellicon-Ultrafiltrationseinheit konzentriert werden. Im Anschluß an die Konzentrierung kann das Konzentrat auf eine geeignete Reinigungsmatrix, wie zum Beispiel Glucagon, oder einen anti-Glucagonrezeptor-Antikörper, gebunden an einen geeigneten Träger, aufgetragen werden. Alternativ können anionische oder kationische Austauschharze verwendet werden, um den Rezeptor oder das Peptid zu reinigen. Zuletzt können einer oder mehrere Umkehrphase-High-Performance-Flüssigkeitschromatographie (RP-HPLC)-Schritte verwendet werden, um das Glucagonrezeptor-Peptid weiter zu reinigen.
Ein Glucagonrezeptor-Peptid wird als "isoliert" oder gereinigt innerhalb des Kontexts der vorliegenden Erfindung betrachtet, wenn nur eine einzelne Bande, im Anschluß an SDS-Polyacrylamid-Gelanalyse, gefolgt von Färbung mit Coomassie Brilliant Blau, nachgewiesen wird.
Antikörper gegen Glucagonrezeptoren
Innerhalb eines Aspekts der vorliegenden Erfindung können Glucagonrezeptoren, einschließlich Derivate davon sowie Teile oder Fragmente dieser Proteine, wie zum Beispiel die oben diskutierten Glucagonrezeptor-Peptide, dazu verwendet werden, um Antikörper herzustellen, die spezifisch an Glucagonrezeptoren binden. Innerhalb des Kontexts der vorliegenden Erfindung schließt der "Antikörper" polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper, Fragmente davon, wie zum Beispiel F(ab')₂ und Fab-Fragmente, sowie rekombinant produzierte Bindepartner ein. Diese Bindepartner inkorporieren die variablen Regionen aus einem Gen, das für einen spezifisch bindenden monoklonalen Antikörper kodiert. Antikörper werden als spezifisch bindet definiert, wenn sie an den Glucagonrezeptor mit einem K_a von mehr als oder gleich zu 10⁷ M^–1 binden. Die Affinität eines monoklonalen Antikörpers oder Bindepartners kann leicht durch den Durchschnittsfachmann bestimmt werden (siehe, Scatchard, Ann. N.Y. Acad. Sci. 51: 660–672, 1949).
Polyklonale Antikörper können leicht durch einen Durchschnittsfachmann aus einer Vielzahl von warmblütigen Tieren, wie zum Beispiel Pferden, Kühen, Ziegen, Schafen, Hunden, Hühnern, Kaninchen, Mäusen oder Ratten erzeugt werden. Kurz, wird der Glucagonrezeptor verwendet, um das Tier durch intraperitoneale, intramuskuläre, intraokulare oder subkutane Injektionen zu immunisieren. Die Immunogenizität eines Glucagonrezeptors oder Glucagonrezeptor-Peptids kann durch die Verwendung eines Adjuvans, wie zum Beispiel Freund's vollständigem oder unvollständigem Adjuvans erhöht werden. Im Anschluß an mehrere Booster-Immunisierungen werden kleine Proben von Serum gesammelt und auf die Reaktivität mit dem Glucagonrezeptor getestet. Eine Vielzahl von Tests kann verwendet werden, um Antikörper nachzuweisen, die spezifisch an einen Glucagonrezeptor binden. Beispielhafte Tests sind genau in Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds)., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988 beschrieben. Repräsentative Beispiele von solchen Tests schließen ein: Gegenstrom-Immunelektrophorese (CIEP), Radioimmuntests, Radioimmunpräzipitationen, Enzym-gekoppelte Immuno-Sorbent-Tests (ELISA), Dot-Blot-Tests, Inhibitions- oder Kompetitionstests und Sandwich-Tests (siehe U.S. Patent Nrn. 4,376,110 und 4,486,530; siehe auch Antibodies: A Laboratory Manual, supra). Besonders bevorzugte polyklonale Antiseren werden ein Signal ergeben, das mindestens dreifach höher ist, als der Hintergrund. Sobald der Titer des Tieres im Hinblick auf seine Reaktivität mit dem Glucagonrezeptor ein Plateau erreicht hat, können größere Mengen von polyklonalen Antiseren leicht entweder durch wöchentliches Blutabnehmen oder durch Ausbluten des Tieres erhalten werden.
Monoklonale Antikörper können auch leicht unter der Verwendung von gut bekannten Techniken erzeugt werden (siehe U.S. Patent Nrn. RE 32,011, 4,902,614, 4,543,439 und 4,411,993; siehe auch Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett, McKearn and Bechtol (eds.), 1980 and Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988). Kurz, innerhalb einer Ausführungsform, wird ein Subjekt-Tier, wie zum Beispiel eine Ratte oder Maus, mit einer Form von Glucagonrezeptor injiziert, die zur Erzeugung einer Immunantwort gegen den Glucagonrezeptor geeignet ist. Geeignete Beispiele von geeigneten Formen schließen unter anderem Zellen ein, die den Glucagonrezeptor exprimieren oder Peptide, die auf der Glucagonrezeptor-Sequenz basieren. Zusätzlich sind viele Techniken im Stand der Technik bekannt, um die sich ergebende Immunantwort zu erhöhen, zum Beispiel durch Koppeln des Rezeptors oder der Rezeptorpeptide an ein anderes Protein, wie zum Beispiel Ovalbumin oder "Keyhole-Limpet"-Hämocyanin (KLH) oder durch die Verwendung von Adjuvans, wie zum Beispiel Freund's vollständigem oder unvollständigem Adjuvans. Die anfängliche Imnunisierung kann durch intraperitoneale, intramuskuläre, intraokulare oder subkutante Routen sein.
Zwischen einer und drei Wochen nach der anfänglichen Immunisierung kann das Tier mit einer weiteren Booster-Immunisierung re-immunisiert werden. Das Tier kann dann Testausgeblutet werden und das Serum auf die Bindung an den Glucagonrezeptor unter der Verwendung von Tests wie oben beschrieben getestet werden. Weitere Immunisierungen können auch durchgeführt werden, bis das Tier in seiner Reaktivität auf den Glucagonrezeptor ein Plateau erreicht hat. Dem Tier kann dann ein finaler Boost von Glucagonrezeptor oder Glucagonrezeptor-Peptid gegeben werden, und drei bis vier Tage später wird es getötet. Zu dieser Zeit können die Milz und die Lymphknoten geerntet werden und in Einzel-Zellsuspensionen durch Passieren der Organe durch ein Siebnetz oder durch Aufbrechen der Milz- oder Lymphknoten-Membranen, die die Zellen einkapseln, aufgebrochen werden. Innerhalb einer Ausführungsform werden die roten Zellen anschließend durch die Hinzufügung einer hypotonischen Lösung lysiert, gefolgt von unmittelbarer Rückkehr zur Isotonizität.
Innerhalb einer anderen Ausführungsform werden geeignete Zellen zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern durch die Verwendung von in vitro-Immunisierungstechniken erhalten. Kurz, wird ein Tier getötet und die Milz- und Lymphknotenzellen werden wie oben beschrieben entfernt. Eine Einzelzellsuspension wird hergestellt und die Zellen werden in eine Kultur platziert, die eine Form des Glucagonrezeptors enthält, die zur Erzeugung einer Immunantwort wie oben beschrieben geeignet ist. Anschließend werden die Lymphozyten geerntet und, wie unten beschrieben, fusioniert.
Zellen, die durch die Verwendung einer in vitro-Immunisierung oder von einem immunisierten Tier wie oben beschrieben erhalten wurden, können durch Transfektion mit einem Virus, wie zum Beispiel dem Epstein-Barr-Virus (EBV) (siehe Glasky and Reading, Hybridoma 8(4): 377–389, 1989) immortalisiert werden. Alternativ werden innerhalb einer bevorzugten Ausführungsform die geernteten Milz- und/oder Lymphknotenzellen-Zellsuspensionen mit einer geeigneten Myelomzelle fusioniert, um ein "Hybridom" zu erzeugen, das monoklonale Antikörper sekretiert. Geeignete Myelomlinien sind bevorzugterweise in der Konstruktion oder Expression von Antikörpern defekt und sind weiterhin syngeneisch mit den Zellen aus dem immunisierten Tier. Viele solcher Myelomzellinien sind im Stand der Technik gut bekannt und können von Quellen, wie zum Beispiel der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland (siehe Catalogue of Cell Lines & Hybridomas, 6^th ed., ATCC, 1988) erhalten werden. Repräsentative Myelomzellinien schließen ein: für Menschen UC 729-6 (ATCC No. CRL 8061), MC/CAR-Z2 (ATCC No. CRL 8147) und SKO-007 (ATCC No. CRL 8033); für Mäuse, SP2/0-Ag14 (ATCC No. CRL 1581) und P3X63Ag8 (ATCC No. TIB 9) und für Ratte Y3-Ag1,2,3 (ATCC No. CRL 1631) und Y B2/0 (ATCC No. CRL 1662). Besonders bevorzugte Fusionslinien schließen NS-1 (ATCC No. TIB 18) und P3X63-Ag 8,653 (ATCC No. CRL 1580) ein, die für Fusionen mit entweder Maus-, Ratten- oder menschlichen Zellinien verwendet werden können. Die Fusion zwischen der Myelomzellinie und den Zellen aus dem immunisierten Tier kann durch eine Vielzahl von Verfahren erreicht werden, einschließlich der Verwendung von Polyethylenglycol (PEG) (siehe Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (Hrsg.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988) oder Elektrofusion (siehe Zimmermann and Vienken, J. Membrane Biol. 67: 165–182, 1982).
Im Anschluß an die Fusion werden die Zellen in Kulturplatten platziert, die ein geeignetes Medium enthalten, wie zum Beispiel RPMI 1640 oder DMEM (Dulbecco's Modified Eagles Medium) (JRH Biosciences, Lenexa, Kan.). Das Medium kann auch weitere Inhaltsstoffe, wie zum Beispiel fötales Rinderserum (FBS, d.h., von Hyclone, Logan, Utah oder JRH Biosciences), Thymozyten, die von einem Babytier derselben Spezies geerntet wurden, die für die Immunisierung verwendet wurde oder Agar, um das Medium zu verfestigen, enthalten. Zusätzlich sollte das Medium ein Reagenz enthalten, das selektiv das Wachstum von fusionierten Milz- und Myelomzellen ermöglicht. Besonders bevorzugt ist die Verwendung von HAT (Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin) (Sigma Chemical Co., St. Louis,. Missouri). Nach ungefähr sieben Tagen können die fusionierten Zellen oder Hybridome gescreent werden, um die Anwesenheit von Antikörpern zu bestimmen, die den Glucagonrezeptor erkennen. Im Anschluß an mehrere klonale Verdünnungen und Rücktests kann ein Hybridom, das Antikörper produziert, die an Glucagonrezeptor binden, isoliert werden.
Andere Techniken können auch verwendet werden, um monoklonale Antikörper zu konstruieren (siehe William D. Huse et al., "Generation of a Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda", Science 246: 1275–1281, Dezember 1989; siehe auch L. Sastry et al., "Cloning of the Immunological Repertoire in Escherichia coli for Generation of Monoclonal Catalytic Antibodies: Construction of a Heavy Chain Variable Region-specific cDNA Library", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5728–5732, August 1989) siehe auch Michelle Alting-Mees et al., "Monoclonal Antibodies Expression Libraries: A Rapid Alternative to Hybridomas", Strategies in Molecular Biology 3: 1–9, Januar 1990, diese Referenzen beschreiben von Stratacyte, La Jolla, California, kommerziell erhältliche Systeme, welche die Produktion von Antikörper durch rekombinante Techniken ermöglichen. Kurz gesagt wird mRNA aus einer B-Zellpopulation isoliert und dazu verwendet, um schwere und leichte Kette Immunglobulin cDNA-Expressionsbibliotheken in den λIMMUNOZAP(H)- und λIMMUNOZAP(L)-Vektoren zu erzeugen. Diese Vektoren können einzeln gescreent werden oder co-exprimiert werden, um Fragmente oder Antikörper zu bilden (siehe Huse et al., supra; siehe auch Sastry et al., supra). Positive Plaques können anschließend in ein nicht-lytisches Plasmid überführt werden, das die Expression von monoklonalen Antikörperfragmenten aus E. coli ermöglicht.
Ähnlich können auch Bindepartner unter der Verwendung von rekombinanten DNA-Techniken konstruiert werden, um die variablen Regionen eines Gens einzuschließen, das für einen spezifisch bindenden Antikörper kodiert. Die Konstruktion dieser Proteine kann leicht durch einen Durchschnittsfachmann (siehe, James W. Larrick et al., "Polymerase Chain Reaction Using Mixed Primers: Cloning of Human Monoclonal Antibody Variable Region Genes From Single Hybridoma Cells", Biotechnology 7: 934–938, September 1989; Riechman et al., "Reshaping Human Antibodies for Therpay", Nature 332: 323–327, 1988; Roberts et al., "Generation of an Antibody with Enhanced Affinity and Specificity for its Antigen by Protein Engineering", Nature 328: 731–734, 1987; Verhoeven et al., "Reshaping Human Antibodies: Grafting an Antilysozyme Activity", Science 239: 1534, 1536, 1988; Chaudhary er al., "A Recombinant Immunotoxin Consisting of Two Antibodies Variable Domains Fused to Pseudomonas Exotoxin", Nature 339: 394–397, 1989, siehe auch, U.S. Patent Nr. 5,132,405 beschrieben als "Biosynthetic Antibody Binding Sites"), unter Berücksichtigung der hier zur Verfügung gestellten Offenbarung erreicht werden. Kurz, werden innerhalb einer Ausführungsform DNA-Segmente, die für Glucagonrezeptor spezifische Antigen-bindende Domänen codieren, aus Hybridomen amplifiziert, die einen spezifisch bindenden monoklonalen Antikörper herstellen und direkt in das Genom einer Zelle inseriert, das menschliche Antikörper produziert (siehe Verhoeven et al., supra; siehe auch Reichmann et al., supra). Diese Technik ermöglicht es der Antigen-bindenden Stelle eines spezifisch bindenden Maus oder Ratten monoklonalen Antikörpers, in einen menschlichen Antikörper transferiert zu werden. Solche Antikörper sind für die therapeutische Verwendung im Menschen bevorzugt, da sie nicht so antigen wie Ratten- oder Maus-Antikörper sind.
Alternativ können die Antigen-bindenden Stellen (variable Region) entweder gekoppelt an oder inseriert in ein anderes vollständig verschiedenes Protein vorliegen (siehe Chaudhary et al., supra), was zu einem neuen Protein mit Antigen-bindenden Stellen des Antikörpers und der funktionellen Aktivität des vollständig verschiedenen Proteins führt. Wie der Fachmann erkennen wird, können die Antigen-bindenden Stellen oder die Glucagonrezeptor-bindende Domäne des Antikörpers in der variablen Region des Antikörpers gefunden werden. Weiterhin können innerhalb des Kontexts der vorliegenden Erfindung DNA-Sequenzen, die für kleinere Teile des Antikörpers oder variable Regionen kodieren, die spezifisch an Säuger-Glucagonrezeptor binden auch verwendet werden. Diese Teile können leicht auf Bindungsspezifität an den Glucagonrezeptor unter der Verwendung von unten beschriebenen Tests getestet werden.
Innerhalb einer bevorzugten Ausführungsform werden Gene, die für die variable Region kodieren, aus einem Hybridom amplifiziert, das einen monoklonalen Antikörper von Interesse produziert unter der Verwendung von Oligonukleotid-Primern für die variable Region. Diese Primer können durch einen Fachmann synthetisiert werden oder von käuflich erhältlichen Quellen erworben werden. Stratacyte (La Jolla, Calif.) verkauft Primer für Maus und menschliche variable Regionen, einschließlich, unter anderem, Primer für V_Ha, V_Hb, C_Hc, V_Hd C_H1, V_L und C_L Regionen. Diese Primer können dazu verwendet werden, um schwere oder leichte Kette variable Regionen zu amplifizieren, die dann in Vektoren, wie zum Beispiel IMMUNOZAP*(H) oder IMMUNOZAP*(L) (Stratacyte), jeweils inseriert werden können. Diese Vektoren können dann in für Expression E. coli eingeführt werden. Unter der Verwendung dieser Techniken können große Mengen eines Einzel-Kettenproteins, das eine Fusion der V_H- und V_L-Domänen enthält, hergestellt werden (siehe Bird et al., Science 242: 423–426, 1988).
Innerhalb anderer Ausführungsformen wird der Bindepartner innerhalb des Expressionsvektors an ein anderes Protein, wie zum Beispiel ein Toxin, fusioniert. Zellen, die durch den Bindepartner gebunden werden, werden daher durch Inkorporation des Toxins abgetötet (siehe Chaudhary et al., supra).
Sobald geeignete Antikörper oder Bindepartner erhalten wurden, können sie durch den Fachmann im Stand der Technik gut bekannte zahlreiche Techniken isoliert oder gereinigt werden (siehe Antibodies: A Laboratory Manual, supra). Geeignete Techniken schließen Peptid- oder Proteinaffinitätssäulen, HPLC oder RP-HPLC, die Reinigung auf Protein A- oder Protein G-Säulen oder jede Kombination von diesen Techniken ein. Innerhalb des Kontexts der vorliegenden Erfindung bedeutet der Ausdruck "isoliert" wenn dazu verwendet, um Antikörper oder Bindepartner zu definieren "im wesentlichen frei von anderen Blutkomponenten".
Antikörper und Bindepartner der vorliegenden Erfindung weisen viele Verwendungen auf. Zum Beispiel können Antikörper in der Flußzytometrie verwendet werden, um Glucagonrezeptor-tragende Zellen zu sortieren oder um histochemisch Glucagonrezeptor-tragende Gewebe zu färben. Kurz, um Glucagonrezeptor auf Zellen nachzuweisen, werden die Zellen mit einem markierten monoklonalen Antikörper inkubiert, der spezifisch an Glucagonrezeptoren bindet, gefolgt vom Nachweis der Anwesenheit von gebundenem Antikörper. Diese Schritte können auch mit zusätzlichen Schritten erreicht werden, wie zum Beispiel Waschungen, um nicht-gebundenen Antikörper zu entfernen. Zur Verwendung innerhalb der vorliegenden Erfindung brauchbare Markierungen sind im Stand der Technik gut bekannt, unter anderem, Fluoreszin-Isothiocyanat (FITC), Phycoerythrin (PE). Meerrettichperoxidase (HRP) und kolloidales Gold. Insbesondere bevorzugt zur Verwendung in Flußzytometrie ist FITC, das an gereinigten Antikörper gemäß dem Verfahren von Keltkamp in "Conjugation of Fluorescein Isothiocyanate to Antibodies. I. Experiments on the Conditions of Conjugation", Immunology 18: 865–873, 1970. (Siehe auch Keltkamp,. "Conjugation of Fluorescein Isothiocyanate to Antibodies. II. A Reproducible Method", Immunology 18: 875–881, 1970; and Goding, "Conjugation of Antibodies with Fluorochromes: Modification to the Standard Methods", J. Immunol. Methods 13: 215–226, 1970) konjugiert werden kann. Für die histochemische Färbung kann HRP, die bevorzugt ist, an den gereinigten Antikörper gemäß dem Verfahren von Nakane and Kawaoi ("Peroxidase-Labeled Antibody: A New Method of Conjugation", J. Histochem. Cytochem. 22: 1084–1091, 1974; siehe auch Tijssen and Kurstak. "Highly Efficient and Simple Methods for Preparation of Peroxidase and Active Peroxidase Antibody Conjugates for Enzyme Immunoassays", Anal. Biochem. 136: 451–457, 1984) konjugiert werden.
Zusätzlich können auch gereinigte Antikörper oder Bindepartner therapeutisch verwendet werden, um die Bindung von Glucagon an den Glucagonrezeptor in vitro oder in vivo zu blockieren. Kurz, sind blockierende Antikörper diejenigen Antikörper, die an Glucagonrezeptor-Epitope auf solche Weise binden, um eine Bindung von Glucagon an den Rezeptor zu verhindern oder um zu verhindern, daß Glucagon eine Signaltransduktion bewirkt. Wie oben angegeben, kann eine Vielzahl von Tests verwendet werden, um Antikörper nachzuweisen, die die Bindung von Glucagon an den Glucagonrezeptor blockieren oder inhibieren, einschließlich, unter anderem, inhibierende und kompetitive Tests wie oben angegeben. Innerhalb einer Ausführungsform werden monoklonale Antikörper (wie oben beschrieben präpariert) auf die Bindung an den Glucagonrezeptor in Abwesenheit von Glucagon, sowie in der Anwesenheit von verschiedenen Konzentrationen von Glucagon getestet. Blockierende Antikörper oder Bindepartner werden als diejenigen identifiziert, die zum Beispiel an Glucagonrezeptoren binden und in der Anwesenheit von Glucagon die Bindung von Glucagon an den Glucagonrezeptor blockieren oder inhibieren.
Antikörper oder Bindepartner, die therapeutisch verwendet werden sollen, werden bevorzugterweise in einer therapeutischen Zusammensetzung zur Verfügung gestellt, die den Antikörper oder Bindepartner und einen physiologisch akzeptablen Träger oder Verdünnungsmittel umfaßt. Geeignete Träger oder Verdünnungsmittel schließen unter anderem neutrale gepufferte Kochsalzlösung oder Kochsalzlösung ein und können auch weitere Hilfsstoffe oder Stabilisatoren wie zum Beispiel Puffer, Zucker, wie zum Beispiel Glucose, Saccharose oder Dextrose, Chelat-bildende Mittel, wie zum Beispiel EDTA und verschiedene Konservierungsmittel enthalten.
Glucagon-Antagonisten
Wie oben angegeben, stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zum Nachweis von Glucagon-Antagonisten zur Verfügung. Innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung wird ein Antagonist als sich auf ein Molekül beziehend verstanden, das in der Lage ist, an einen Rezeptor zu binden, das jedoch nicht einen Antwortsignalweg innerhalb einer Zelle stimuliert, oder die Stimulierung davon verringert. Insbesondere werden Glucagon- Antagonisten im allgemeinen durch ihre Fähigkeit identifiziert, an den Glucagonrezeptor zu binden und dadurch die Stimulierung eines Antwortsignalwegs innerhalb einer Zelle zu verringern.
Innerhalb eines Aspekts der vorliegenden Erfindung werden Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit von Glucagon-Antagonisten zur Verfügung gestellt, umfassend die Schritte von (a) Aussetzen einer Verbindung in Anwesenheit eines Glucagon-Agonisten zu einem rekombinanten Glucagonrezeptor, gekoppelt an einen Antwortsignalweg unter Bedingungen und für eine Zeitdauer, die ausreichend ist, um eine Bindung der Verbindung an den Rezeptor und eine assoziierte Antwort durch den Signalweg zu ermöglichen, und (b) Nachweisen einer Verringerung in der Stimulierung des Antwortsignalwegs, der sich aus der Bindung der Verbindung an den Glucagonrezeptor ergibt, relativ zu der Stimulierung des Antwortsignalwegs durch den Glucagon-Agonisten allein, und daraus bestimmen der Anwesenheit eines Glucagon-Antagonisten. Innerhalb des Kontexts der vorliegenden Erfindung schließen Glucagon-Agonisten Moleküle ein (einschließlich Glucagon selber), die in der Lage sind, an einen Glucagonrezeptor zu binden und die einen Antwortsignalweg innerhalb einer Zelle stimulieren.
Eine Vielzahl von Verbindungen kann unter der Verwendung solcher Verfahren gescreent werden. Repräsentative Beispiele schließen blockierende Antikörper wie oben diskutiert, Glucagonrezeptor-Peptide und Glucagon-Analogy (einschließlich sowohl Peptid- und nicht-Peptid-Liganden) ein. U.S. Serial Nr. 07/741,931 stellt zum Beispiel Verfahren zur Herstellung von großen Zahlen von Glucagon-Analoga unter der Verwendung von Pools von DNA-Sequenzen, die für solche Analogy kodieren, zur Verfügung. Solche Pools von DNA-Sequenzen, die für Glucagon-Analogy kodieren, können durch Sättigungs-Mutagenese von DNA-Sequenzen erzeugt werden, die für Glucagon kodieren (z.B., Little, Gene 88: 113–115, 1990; Hembers et al., Gene 88: 143–151, 1989), durch Segment-gerichtete Mutagenese (z.B., Shortle et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 5375–5379, 1980), durch erzwungene Nukleotid-Fehlinkorporation (z.B. Liao and Wise Gene 88: 107–111, 1990) oder durch die Verwendung von zufällig mutagenisierten Oligonukleotiden (Hutchison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 710–714, 1986). Einzelne Transformanten, die ein Glucagon-Analogon exprimieren, können dann wie oben diskutiert kloniert werden oder vereinigt werden.
Die Verbindungen werden einem rekombinanten Glucagonrezeptor in der Anwesenheit eines Glucagon-Agonisten ausgesetzt, unter Bedingungen und für eine Zeitdauer, die ausreichend ist, um die Bindung der Verbindung einen Rezeptor und eine damit zusammenhängende Antwort durch den Signalweg zu ermöglichen. Wie in der vorliegenden Erfindung verwendet, werden die Bedingungen und Zeitdauern, die für die Bindung des Glucagon-Antagonisten an den Rezeptor ausreichend sind mit der Quelle des Rezeptors variieren, jedoch treten für die Bindung geeignete Bedingungen im allgemeinen zwischen 4°C und 50°C in einer Pufferlösung zwischen 0 und 2 M NaCl, bevorzugt zwischen 0 und 0,9 M NaCl auf, wobei 0,1 M NaCl besonders bevorzugt ist, und innerhalb eines pH-Bereichs von zwischen 5 und 9, bevorzugterweise zwischen 6,8 und B. Eine ausreichende Zeit für die Bindung und Antwort wird im allgemeinen zwischen 5 und 15 Minuten nach Aussetzen sein.
Sobald die Verbindung einem rekombinanten Glucagonrezeptor in der Anwesenheit eines Glucagon-Agonisten ausgesetzt wurde, unter Bedingungen und für eine Zeitdauer, die ausreichend ist um die Bindung der Verbindung an Rezeptor zu ermöglichen, kann eine Verringerung in der Stimulierung des Antwortsignalwegs nachgewiesen werden, falls die Verbindung mit dem Glucagon-Agonisten für den rekombinanten Glucagonrezeptor kompetitiv ist. Innerhalb einer Ausführungsform der Erfindung ist der Antwortsignalweg ein Membran-gebundener Adenylatcyclase-Antwortsignalweg und der Schritt von Nachweisen umfaßt ein Messen einer Verringerung in der cAMP-Produktion durch den Membran-gebundenen Adenylatcyclase-Antwortsignalweg, relativ zu der zyklischen AMP-Produktion in der Anwesenheit des Glucagon-Agonisten allein. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, daß die Verringerung in der Stimulierung des Antwortsignalwegs gleich oder größer ist, als die mit des-His¹-Glucagon-assoziierte Verringerung. Adenylatcyclase-Aktivitätstests können, zum Beispiel unter der Verwendung von Verfahren, beschrieben durch Lin et al. (Biochem. 14: 1559–1563, 1975) und in den Beispielen durchgeführt werden. Diese Verfahren messen den Spiegel von Stimulierung von cAMP relativ zu nativem Glucagon und schließen im allgemeinen ein Aussetzen einer Präparation von Zellen, die einen biologisch aktiven rekombinanten Glucagonrezeptor exprimieren, gegenüber einem Gemisch von Glucagon und der Testverbindung in Anwesenheit von radiomarkiertem ATP ein.
Alternativ kann die cAMP-Produktion auch leicht unter der Verwendung von Verfahren gemessen werden, die gut im Stand der Technik bekannt sind, einschließlich, zum Beispiel, Verfahren beschrieben durch Salomon et al. (Anal. Biochem. 58: 541–548, 1976) oder Krishna et al. (J. Pharmacol. Exp. Ther. 163: 379, 1968) oder, bevorzugterweise, unter der Verwendung von käuflich erhältlichen Kits, wie zum Beispiel dem Szintillation-Proximitäts-Testkit von Amersham Corporation. Der Szintillations-Proximitäts-Testkit mißt die Produktion von cAMP durch Kompetition von jodiniertem-cAMP mit anti-cAMP-Antikörpern. Besonders bevorzugt weisen Glucagonrezeptoren eine biologische Aktivität in solchen Tests mit einer ED₅₀ (effektive Dosis für eine 50%ige Antwort) von weniger als 1 nM, weiter bevorzugt einer ED₅₀ von weniger als 0,7 nM und am meisten bevorzugt einer ED₅₀ von weniger als 0,25 nM auf.
Innerhalb einer weiteren Ausführungsform der Erfindung schließt der Antwortsignalweg ein Luciferase-Reportersystem ein. Kurz ist die Luciferase ein Enzym, das die Freisetzung von Photonen durch Luciferin katalysiert und daher leicht nach Expression in der Anwesenheit von Luciferin nachgewiesen werden kann (Alam and Cook, Anal. Biochem. 188: 245–254, 1990). Wie unten genauer beschrieben wird, wird innerhalb einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ein DNA-Konstrukt zur Verfügung gestellt, umfassend ein cyclisches AMP-Antwortelement, wie zum Beispiel ein Proencephalin-cyclisches cAMP-Antwortelement, das operativ mit einer Luciferase-DNA verbunden ist. Das DNA-Konstrukt, umfassend die Luciferase-cDNA wird stabil in eine Wirtszelle transfiziert. Die Wirtszelle wird dann mit einem zweiten DNA-Konstrukt transfiziert, das ein erstes DNA-Segment enthält, das für den Glucagonrezeptor kodiert, operativ verbunden an weitere DNA-Segmente, die für die Expression des Vektors erforderlich sind. Nach Bindung eines Glucagonrezeptor-Agonisten induzieren die erhöhten cAMP-Spiegel die Expression von Luciferase. Die Luciferase wird Luciferin ausgesetzt, und die freigesetzten Photonen während der Oxidation von Luciferin durch die Luciferase werden gemessen.
Innerhalb anderer Ausführungsformen der Erfindung führt die Aktivierung eines Antwortsignalwegs zu einer Zunahme der interzellulären Konzentration von freiem Kalzium. Eine Auswahl von Tests können durchgeführt werden, um die Konzentration von freien intrazellulären Kalzium nachzuweisen, einschließlich, zum Beispiel, dem Kalziumfluor QuinZ-Verfahren, beschrieben durch Charest et al. (J. Biol. Chem. 259: 8769–8773, 1983) oder dem Aequorin-Photoproteinverfahren, beschrieben von Nakajima-Shimada (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 6878–6882, 1991). Ein besonders bevorzugtes Verfahren ist das intrazelluläre Kalzium-Photo-bildgebende Verfahren, das genauer unten in Beispiel 6 beschrieben ist. Kurz werden innerhalb einer Ausführungsform Zellen mit einem Glucagonrezeptor exprimierenden Plasmid transformiert und für 3 Tage unter normalen Kulturbedingungen angezogen. Das Wachstumsmedium wird dann entfernt und durch eine Lösung ersetzt, die 10 μM Fura-2AM enthält (siehe Grynkiewicz et al., J. Biol. Chem. 260: 3440–3450, 1985). Die Zellen werden dann für 30 Minuten im Dunklen inkubiert, gefolgt durch Spülen und einer weiteren Inkubation für 30 bis 120 Minuten. Die Photobildgebung kann mit einem Nikon Diaphor Umkehr-Fluoreszenz-Mikroskop, ausgerüstet mit einer Quecksilber-Bogenlampe durchgeführt werden. Die Zellen können zuerst für mindestens 60 Sekunden verfolgt werden, um eine Basislinie zu etablieren, gefolgt durch Stimulierung mit einem Puffer, der Glucagon enthält. Die Bilder werden typischerweise für mindestens 3 Minuten nach der Stimulierung aufgenommen. Software, wie zum Beispiel Inovision (Research Triangle Park, N. C.), kann verwendet werden, um die Bilder zu bearbeiten und zu quantifizieren.
Glucagon-Antagonisten, die, wie oben diskutiert, nachgewiesen wurden, können durch Ionenaustausch und Partitions-Chromatographie, wie zum Beispiel durch Coy et al. (Peptides Structure and Function, Pierce Chemical Company, Rockford IL, pp. 369–372, 1983) durch Umkehrphase-Chromatographie (Andreu and Merrifield, Eur. J. Biochem. 164: 585–590, 1987) oder durch HPLC (z.B., Koford et al., Int. J. Peptide Protein Res. 32: 436–440, 1988) gereinigt werden. Eine weitere Reinigung kann durch herkömmliche chemische Reinigungsmittel, wie zum Beispiel unter anderem Flüssigkeits-Chromatographie, Gradienten-Zentrifugation und Gelelektrophorese erreicht werden. Verfahren zur Proteinreinigung sind im Stand der Technik bekannt (siehe allgemein, Scopes, R, Protein Purification, Springer-Verlag, NY, 1982) und können für die Reinigung der hier beschriebenen rekombinanten Glucagon-Antagonisten angewandt werden. Alternativ können Glucagon-Antagonisten durch das Festphaseverfahren von Barany und Merrifield (in The Peptides, Vol. 2A, Gross and Meienhofer, Hrsg., Academic Press, NY, pp. 1–284, 1979) oder durch die Verwendung eines automatisierten Peptidsynthesizers synthetisiert werden.
Im wesentlichen gereinigte rekombinante Glucagon-Antagonisten von mindestens ungefähr 50% Homogenität sind bevorzugt, mindestens ungefähr 70% bis 80% Homogenität, weiter bevorzugt sind 95–99% oder mehr Homogenität am meisten bevorzugt, insbesondere für pharmazeutische Verwendungen. Sobald gereinigt oder in Homogenität, wie gewünscht, können die Glucagon-Antagonisten therapeutisch verwendet werden. Im allgemeinen können die Antagonisten parenteral oder durch Infusion verabreicht werden. Typischerweise sind die Antagonisten als freie Basen oder als Säuresalze vorhanden. Geeignete Salze sollten pharmazeutisch akzeptabel sein. Repräsentative Beispiele schließen Metallsalze, Alkali- und alkalische Erdmetallsalze, wie zum Beispiel Kalium- oder Natriumsalze ein. Andere pharmazeutisch akzeptable Salze schließen Zitronen-, Succini-, Milch-, Hydrochlor- und Hydrobromsäuren ein. Parenterale Zusammensetzungen können in wäßrigen isotonischen Lösungen von zwischen pH 5,6 und 7,4 formuliert werden. Geeignete isotonische Lösungen können Natriumchlorid, Dextrose, Borsäure und Natriumtartrat und Propylenglycollösungen einschließen. Therapeutische Dosierungen von Antagonisten können gleichzeitig mit Insulin entweder in derselben Zusammensetzung oder in getrennten Zusammensetzungen verabreicht werden.
Diagnostische Verwendung von Glucagonrezeptor-Sonden
Innerhalb eines anderen Aspekts der vorliegenden Erfindung werden Sonden und Primer zum Nachweis von Glucagonrezeptoren zur Verfügung gestellt. Innerhalb einer Ausführungsform der Erfindung werden Sonden zur Verfügung gestellt, die in der Lage sind, an Glucagonrezeptor DNA oder RNA zu hybridisieren. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung sind Sonden "in der Lage" an eine Glucagonrezeptor DNA „zu hybridisieren", wenn sie unter Bedingungen von entweder hoher oder niedriger Stringenz hybridisieren (siehe Sambrook et al., supra). Bevorzugterweise kann die Sonde verwendet werden, um an geeignete Nukleotidsequenzen in der Anwesenheit von 6× SSC, 1× Denhardt's (Sambrook et al., supra) 0,1% SDS bei 65°C und mindestens einer Waschung, in der Anwesenheit von 2× SSC, 1× Denhardt's, 0,1% SDS bei 65°C zu hybridisieren, um überschüssige Sonde zu entfernen. Sondensequenzen sind bevorzugterweise so aufgebaut, um eine Hybridisierung an Glucagonrezeptor-Sequenzen zu ermöglichen, jedoch nicht an Secretin-, Calcitonin- oder Parathyroidhormon-Rezeptorsequenzen.
Sonden der vorliegenden Erfindung können aus entweder Desoxyribonukleinsäure (DNA) oder Ribonukleinsäuren (RNA) zusammengesetzt sein und können so wenig wie ungefähr 12 Nukleotide in der Länge betragen, gewöhnlicherweise ungefähr 14 bis 18 Nukleotide in der Länge und möglicherweise so groß wie die gesamte Sequenz des Glucagonrezeptors. Die Auswahl der Sondengröße hängt ein wenig von der Verwendung der Sonde ab. Zum Beispiel, um die Anwesenheit von verschiedenen polymorphen Formen des Glucagonrezeptors innerhalb eines Individuums zu bestimmen, ist eine Sonde bevorzugt, die im wesentlichen die gesamte Länge der Glucagonrezeptor kodierenden Sequenz umfaßt. Glucagonrezeptor-Sonden können verwendet werden, um Polymorphismen zu identifizieren, die mit dem Glucagonrezeptorgen gekoppelt sind (siehe zum Beispiel Weber, Genomics 7: 524–530, 1990; and Weber and May, Amer. J. Hum. Gen. 44: 388–396, 1989). Solche Polymorphismen können mit vererbten Erkrankungen, wie zum Beispiel Diabetes, assoziiert sein.
Sonden können unter der Verwendung von Techniken konstruiert und markiert werden, die im Stand der Technik gut bekannt sind. Kürzere Sonden von zum Beispiel 12 Basen können synthetisch erzeugt werden. Längere Sonden von ungefähr 75 Basen bis weniger als 1,5 kb werden im allgemeinen durch, zum Beispiel, PCR-Amplifikation in der Anwesenheit von markierten Vorläufern, wie, zum Beispiel, ³²-P-dCTP, Digoxigenin-dUTP oder Biotin-dATP erzeugt. Sonden von mehr als 1,5 kb werden im allgemeinen am leichtesten durch Transfizieren einer Zelle mit einem Plasmid, das die relevante Sonde enthält, Anziehen der transfizierten Zelle in größeren Mengen und Reinigen der relevanten Sequenz aus den transfizierten Zellen amplifiziert (siehe, Sambrook et al., supra).
Die Sonden könne mit einer Vielzahl von Markern, einschließlich, zum Beispiel, radioaktiven Markern, fluoreszenten Markern, enzymatischen Markern und chromogenen Markern markiert sein. Die Verwendung von ³²P ist zur Markierung oder einem Labelling einer bestimmten Sonde besonders bevorzugt.
Sonden der vorliegenden Erfindung können auch dazu verwendet werden, um die Anwesenheit einer Glucagonrezeptor mRNA oder DNA innerhalb einer Probe nachzuweisen. Jedoch, wenn Glucagonrezeptoren nur in einer begrenzten Zahl vorhanden sind oder wenn es gewünscht ist, eine ausgewählte Mutantensequenz nachzuweisen, die nur in einer begrenzten Zahl vorhanden ist oder wenn es gewünscht ist, einen Glucagonrezeptor aus einem ausgewählten warmblütigen Tier zu klonieren, kann es vorteilhaft sein, die relevante Sequenz zu amplifizieren, so daß sie leichter nachgewiesen oder erhalten werden kann.
Eine Vielzahl von Verfahren können verwendet werden, um eine ausgewählte Sequenz zu amplifizieren, einschließlich zum Beispiel RNA-Amplifikation (siehe Lizardi et al., Bio/Technology 6: 1197–1202, 1988; Kramer et al., Nature 339: 401–402, 1989; Lomeli et al., Clinical Chem. 35(9): 1826–1831, 1989; U.S. Patent Nr. 4,786,600) und DNA-Amplifikation unter der Verwendung von Polymerase-Kettenreaktion ("PCR") (siehe, U.S. Patent Nrn. 4,683,195, 4,683,202 und 4,800,159) (siehe auch, U.S. Patent Nrn. 4,876,187 und 5,011,769, die ein alternatives Nachweis-/Amplifikationssystem unter der Verwendung von schneidbaren Verbindungen beschreiben) ein.
Innerhalb einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die PCR-Amplifikation verwendet, um eine Glucagonrezeptor-DNA nachzuweisen oder zu erhalten. Kurz, wie unten genauer beschrieben, wird eine DNA-Probe bei 95°C denaturiert, um einzelsträngige DNA zu erzeugen. Spezifische Primer, wie unten diskutiert, werden dann bei 37°C bis 70°C in Abhängigkeit von den Anteilen von AT/GC in den Primern anhybridisiert. Die Primer werden bei 72°C mit Taq-Polymerase verlängert, um den Gegenstrang des Templats zu erzeugen. Diese Schritte stellen einen Zyklus dar, der wiederholt werden kann, um die ausgewählte Sequenz zu amplifizieren.
Primer für die Amplifikation einer ausgewählten Sequenz sollte aus Sequenzen ausgewählt sein, die hoch spezifisch sind und stabile Duplices mit der Zielsequenz bilden. Die Primer sollten auch nicht komplementär sein, insbesondere am 3'-Ende, sollten keine Dimere mit sich selber oder anderen Primern bilden und sollten keine Sekundärstrukturen oder Duplices mit anderen Regionen von DNA bilden. Im allgemeinen sind Primer von ungefähr 18 bis 20 Nukleotiden bevorzugt und können leicht unter der Verwendung von gut bekannten Verfahren im Stand der Technik synthetisiert werden. Insbesondere bevorzugte Primer sind unten in Tabelle 1 angegeben und schließen die degenerierten Oligonukleotide ZC4715 und ZC4701 (jeweils SEQ ID NOS: 9 und 8) sowie die Oligonukleotide ZC4785 und ZC4778 (jeweils SEQ ID NOS: 10 und 11) ein.
Weitere Verwendungen von Glucagonrezeptor-Nukleotidsequenzen
Innerhalb noch eines anderen Aspekts der vorliegenden Erfindung werden virale Vektoren zur Verfügung gestellt, die dazu verwendet werden können, um Erkrankungen zu behandeln, wobei entweder der Glucagonrezeptor (oder ein Mutanten-Glucagonrezeptor) überexprimiert ist oder wobei kein Glucagonrezeptor exprimiert wird. Kurz, werden innerhalb einer Ausführungsform der Erfindung virale Vektoren zur Verfügung gestellt, die die Produktion von Antisense-Glucagonrezeptor RNA steuern, um die Überexpression von Glucagonrezeptoren oder die Expression von Mutanten-Glucagonrezeptoren zu verhindern.
Innerhalb einer anderen Ausführungsform werden virale Vektoren zur Verfügung gestellt, die die Expression von Glucagonrezeptor cDNA steuern. Zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignete virale Vektoren schließen unter anderem rekombinanten Vaccina-Vektoren (U.S. Patent Nrn. 4,603,112 und 4,769,330), rekombinante Pockenvirus-Vektoren (PCT Veröffentlichung Nr. WO 89/01973) und bevorzugterweise rekombinante retrovirale Vektoren ("Recombinant Retroviruses with Amphotropic and Ecoptropic Host Ranges", PCT Veröffentlichung Nr. WO 90/02806; "Retroviral Packaging Cell Lines and Processes of Using Same", PCT Veröffentlichung Nr. WO 89/07150; und "Antisense RNA for Treatment of Retroviral Disease States", PCT Veröffentlichung Nr. WO/03451) ein.
Wie oben angegeben, können virale Vektoren der vorliegenden Erfindung bei der Behandlung von Erkrankungszuständen verwendet werden, wobei entweder der Glucagonrezeptor überexprimiert ist, ein Mutanten-Glucagonrezeptor exprimiert wird oder wobei kein Glucagonrezeptor exprimiert wird.
Die folgenden Beispiele werden als Verdeutlichung angeboten und nicht als Einschränkung.
Beispiele
Beispiel 1
SYNTHESE VON CDNA UND PRÄPARATION VON CDNA-BIBLIOTHEKEN
A. Rattenleber-cDNA-Synthese
Lebern a us 30 g weiblichen Sprague-Dawley Ratten (Simonsen Labs, Gilroy, CA) wurden entfernt und unmittelbar in flüssigen Stickstoff platziert. Gesamt-RNA wurde aus dem Lebergewebe unter der Verwendung von Guanidin-Isothiocyanat (Chirgwin et al., Biochemistry 18: 52–94, 1979) und CsCl-Zentrifugation präpariert. Die Poly(A)⁺ RNA wurde unter der Verwendung von Oligo d(T)-Cellulose-Chromatographie isoliert (Aviv and Leder, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 1408–1412, 1972).
Die Erst-Strang-CDNA wurde aus zweifach Poly-d(T)-selektierter Leber Poly(A)⁺ RNA synthetisiert. 10 μl einer Lösung, enthaltend 10 μg an Leber Poly(A)⁺ RNA wurden mit 2 μl von 20 pmol/μl Erst-Strangprimer ZC3747 (SEQ ID NO:7) und 4 μl von Diethylpyrocarbonat-behandeltem Wasser gemischt. Das Gemisch wurde für 4 Minuten auf 65°C erhitzt und durch Kühlen auf Eis abgekühlt.
Die Erst-Strang-cDNA-Synthese wurde durch die Hinzufügung von 8 μl von 5× SUPERSCRIPT-Puffer (GIBCO BRL, Gaithersburg, Md.), 4 μl 100 mM Dithiothreitol und 2,0 μl einer Desoxynukleotid-Triphosphatlösung, enthaltend 10 mM jedes von dATP, dGTP, dTTP und 5-Methyl-dCTP (Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscataway, N.J.) zu den RNA-Primergemisch gestartet. Das Reaktionsgemisch wurde bei 42°C für 3 Minuten inkubiert. Nach Inkubation wurden 6,0 μl von 200 U/μl SUPERSCRIPT reverse Transkriptase (GIBCO BRL) hinzugefügt. Die Effizienz der ersten Strangsynthese wurde in einer parallelen Reaktion durch das Hinzufügen von 10 μCi von ³²P-αdCTP zu einem 10 μl Aliquot des Reaktionsgemischs, um die Reaktionsprodukte zu markieren, analysiert. Die Erst-Strangsynthese-Reaktionsgemische wurden bei 45°C für 45 Minuten inkubiert, gefolgt von einer 15 minütigen Inkubation bei 50°C. Die Reaktionen wurden durch das Hinzufügen von Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 100 μl, gefolgt von zwei Phenol/Chloroform (1:1)-Extraktionen und einer Chloroform/Isoamylalkohol (24:1)-Extraktion beendet. Nicht-inkorporierte Nukleotide wurden aus jeder Reaktion durch zweimal Ausfällen der cDNA in Anwesenheit von 6 μg Glycogenträger, 2,5 M Ammoniumacetat und 2,5 Volumen Ethanol entfernt. Die nicht-markierte cDNA wurde in 50 μl Wasser resuspendiert und für die Zweitstrangsynthese verwendet. Die Längen der Erststrang-cDNA wurde durch Resuspendieren der markierten cDNA in 20,0 μl Wasser und Bestimmen der cDNA-Größe durch Agarose-Gelelektrophorese bestimmt.
Die Zweitstrangsynthese wurde an dem RNA-DNA-Hybrid aus der Erststrangsynthesereaktion unter Bedingungen durchgeführt, die ein Priming des ersten Strangs über die Zweitstrangsynthese förderte, was zu DNA-Schleifenbildung führte. Ein Reaktionsgemisch wurde präpariert, das 20,0 μl 5× Polymerase-I-Puffer (100 mM Tris, pH 7,4, 500 mM KCl, 25 mM MgCl₂, 50 mM (NH₄)₂SO₄), 4,0 μl 100 mM Dithiothreitol, 1,0 μl einer Lösung enthaltend 10 mM von jedem als Desoxynukleotid-Triphosphat, 3,0 μl von β-NAD, 15,0 μl 3 U/μl E. coli-DNA-Ligase (NBL Enzymes Ltd., (Cramlington, Northumbria, England), 5,0 μl 10 U/μl E. coli-DNA-Polymerase I (GIBCO BRL) und 50,0 μl der nicht-markierten Erststrang-DNA enthielt. Eine parallele Reaktion, worin ein 10 μl Aliquot der Zweitstrangsynthese durch die Hinzufügung von 10 μCi von ³²P-adCTP markiert wurde, wurde verwendet, um die Effizienz der Zweitstrangsynthese zu überwachen. Die Reaktionsgemische wurden bei Raumtemperatur für 4 Minuten inkubiert, gefolgt durch die Hinzugabe von 1,5 μl von 2 U/μl RNase H (GIBCO BRL) zu jedem Reaktionsgemisch. Die Reaktionen wurden bei 15°C für 2 Stunden inkubiert, gefolgt von einer 15minütigen Inkubation bei Raumtemperatur. Die Reaktionen wurden dann jeweils durch das Hinzufügen von 4 μl von 500 mM EDTA, gefolgt nacheinander von einer Phenol/Chloroform- und einer Chloroform/Isoamylalkohol-Extraktion, wie oben beschrieben, beendet. Die DNA aus jeder Reaktion wurde in Anwesenheit von Ethanol und 3,5 M Ammoniumacetat gefällt. Die DNA aus der nicht markierten Reaktion wurde mit 15 μl Wasser resuspendiert. Die markierte DNA wurde resuspendiert und elektrophoriert, wie oben beschrieben.
Die einzelsträngige cDNA in der Schleifenstruktur wurde unter der Verwendung von Mungobohnen-Nuklase gespalten. Das Reaktionsgemisch enthielt 10 μl 10× Mungobohnen Nuklease-Puffer (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, Calif.), 4 μl 200 mM Dithiothreitol, 34 μl Wasser, 50 μl der Zweitstrang-cDNA und 2 μl einer 1:10-Verdünnung von Mungobohnen-Nuklease (Promega Corp., Madison, Wis.) in Stratagene-Verdünnungspuffer (Stratagene Cloning System). Die Reaktion wurde bei 37°C für 15 Minuten inkubiert, und die Reaktion wurde durch die Hinzufügung von 20 μl von Tris-HCl, pH 8,0 gefolgt von aufeinanderfolgenden Phenol/Chloroform- und Chloroform/Isoamylalkohol-Extraktionen, wie oben beschrieben, beendet. Im Anschluß an die Extraktionen wurde die DNA in Ethanol gefällt und in Wasser resuspendiert.
Die resuspendierte cDNA wurde mit T4 DNA-Polymerase mit stumpfen Enden versehen. Die cDNA, die in einem Volumen von 192 μl Wasser resuspendiert wurde, wurde mit 50 μl 5× T4 DNA-Polymerasepuffer (250 mM Tris HCl, pH 8,0, 250 mM KCl, 25 mM MgCl₂, 3 μl Dithiothreitol, 3 μl einer Lösung, enthaltend 10 mM von jedem Desoxynukleotid-Triphosphat und 2 μl von 6,7 U/μl T4 DNA-Polymerase (Pharmacia LKB Biotechnology Inc.) gemischt. Nach einer Inkubation bei 15°C für 30 Minuten wurde die Reaktion durch die Hinzufügung von 2 μl 500 mM EDTA, gefolgt von seriellen Phenol/Chloroform- und Chloroform/Isoamylalkohol-Extraktionen, wie oben beschrieben, beendet. Die DNA wurde Ethanol-gefällt und in 30 μl Wasser resuspendiert. Basierend auf der Inkorporation von ³²P-dCTP wurde die Ausbeute an cDNA als 4 μg von einem Ausgangs-mRNA-Templat von 10 μg abgeschätzt.
B. Präparation einer Rattenleber-cDNA-Bibliothek
Eco RI-Adaptoren (Invitrogen, San Diego, Calif.) wurden zu der oben präparierten cDNA hinzufügt, um die Klonierung der cDNA in einen Säugerexpressionsvektor zu erleichtern. Ein 10 μl-Aliquot der cDNA und 800 pMol des Adaptors (12 μl) wurden mit 4,0 μl 10× Ligasepuffer (Stratagene Cloning Systems), 4 μl 10 mM ATP, 6,0 μl Wasser und 16 Einheiten T₄ DNA-Ligase (4,0 μl; Stratagene Cloning Systems) gemischt. Die Reaktion wurde für 16 Stunden bei einem Temperaturgradienten von 4°C bis 15°C inkubiert. Die Reaktion wurde durch die Hinzugabe von 185 μl Wasser, 25 μl REACT 2-Puffer (GIBCO BRL), gefolgt von einer Inkubation bei 65°C für zwischen 30 und 60 Minuten beendet. Nach Inkubation wurde die Reaktion Phenol/Chloroform-extrahiert, gefolgt von einer Chloroform/Isoamylalkohol-Extraktion und Ethanol-Fällung, wie oben beschrieben. Im Anschluß an die Zentrifugation wurde das DNA-Pellet mit 70% Ethanol gewaschen und wurde luftgetrocknet. Das Pellet wurde in 180 μl Wasser resuspendiert.
Um die gerichtete Einführung der cDNA in einen Säugerexpressionsvektor zu erleichtern wurde die cDNA mit Xho I verdaut, was zu einer cDNA führte, die ein 5' Eco RI adhäsives Ende und ein 3' Xho I adhäsives Ende aufwies. Die Xho I-Restrtktionsstelle an dem 3'-Ende der cDNA wurde durch den ZC3747-Primer (SEQ ID NO: 7) eingeführt. Der Restriktionsverdau wurde durch serielle Phenol/Chloroform- und Chloroform/Isoamylalkohol-Extraktionen beendet. Die cDNA wurde Ethanol-gefällt und das sich ergebende Pellet wurde mit 70% Ethanol gewaschen und luftgetrocknet. Das Pellet wurde in 1× Ladepuffer (10 mM Phosphat-Puffer, pH 8,8, 5% Glyzerin, 0,125% Bromphenolblau) resuspendiert.
Die resuspendierte cDNA wurde für 10 Minuten auf 65°C erhitzt, auf Eis abgekühlt und auf einem 0,9% niedrig schmelzenden Agarosegel (Seaplaque GTG Low Melt Agarose, FMC Corpo., Rockland, Me.) unter der Verwendung der BRL 1 kb-Leiter (GIBCO BRL) und der Pharmacia 100 bp-Leiter (Pharmacia LKB Biotechnology Inc.) als Größenmarker elektrophoriert. Die kontaminierenden Adaptoren und Nebenproduktfragmente unterhalb von 800 bp in Größe wurden aus dem Gel ausgeschnitten. Die Elektroden wurden umgekehrt und die cDNA wurde elektrophoriert, bis nahe dem Ausgangspunkt der Spur konzentriert. Der Bereich des Gels, der die konzentrierte DNA enthielt wurde ausgeschnitten, in ein Mikrofugenröhrchen plaziert, und das ungefähre Volumen der Gelscheibe wurde bestimmt. Ein Aliquot von TE äquivalent zu der Hälfte des Volumens der Gelscheibe wurde zu dem Röhrchen hinzugefügt und die Agarose wurde durch Erhitzen auf 65°C für 15 Minuten geschmolzen. Im Anschluß an die Äquilibrierung der Probe auf 42°C wurden ungefähr 5 Einheiten β-Agarase I (New England Biolabs, Beverly, Mass.) hinzugefügt. Die Probe wurde für 90 Minuten inkubiert, um die Agarose zu verdauen. Nach Inkubation wurde ein 0,1× Volumen von 3 M Natriumacetat zu der Probe hinzugefügt, und das Gemisch wurde auf Eis für 15 Minuten inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Probe bei 14.000 × g für 15 Minuten bei 4°C zentrifugiert, um die nicht-verdaute Agarose zu entfernen. Die cDNA in dem Überstand wurde Ethanol-gefällt. Das cDNA-Pellet wurde mit 70% Ethanol gewaschen, luftgetrocknet und in 10 μl Wasser resuspendiert.
Die sich ergebende cDNA wurde in den E. coli-Vektor pZCEP kloniert, einem Derivat von pCDNA1 (Invitrogen), worin der M13 Replikationsursprung und der SupF selektierbare Marker durch die Beta-Lactamase-Kassette von pUC18 ersetzt waren. Plasmid pZCEP, das durch Verdau mit Eco RI und Xho I linearisiert wurde, wurde mit der Eco RI-Xho I-cDNA ligiert. Die sich ergebenden Plasmide wurden in E. coli-Stamm DH10B ELECTROMAX-Zellen (GIBCO BRL) elektroporiert.
C. Synthese von menschlicher Inselzell-cDNA
Inselzellen wurden aus menschlichen Bauchspeicheldrüsen isoliert, die von Organtransplantatspendern erhalten wurden, für die ein passender Empfänger nicht erhältlich war. Nach der in situ-Perfusion mit kalter UW-Lösung (Du Pont, Boston, Mass.) wurde jede Bauchspeicheldrüse sorgfältig ausgeschnitten, der pankreatische Ductus kannüliert und 4 mg/ml Collagenase-Lösung (Typ V, Sigma, St. Louis, Mo.) bei einer konstanten Rate infundiert, zuerst bei 4°C und dann 39°C. Die Drüse wurde dann auseinandergezogen und freigesetzte Fragmente wurde durch Zentrifugation gewaschen, durch Nadeln von abnehmender Dicke trituriert und durch diskontinuierliche Ficoll-Dichte-Zentrifugation (Warnock, Diabetes 35 (Suppl. 1): 136, 139, 1989) gereinigt. Aus den oberen Grenzschichten geerntetes Material wurde vereinigt und nach einer Bestimmung der Inselreinheit durch Dithiazon-Färbung gezählt. Bei der Bibliotheksherstellung verwendete Inseln waren mehr als 65% rein, während die in den Northern Blots verwendeten Inseln mehr als 40% rein waren. Der durchschnittliche Inseldurchmesser war 175 μm. Zusätzlich zeigten die isolierten Inseln sowohl erste als auch zweite Phase Insulin-sekretorische Funktion nach der Perfusion mit entweder hoher Glucose oder mit Isobutylmethylxanthin (IBMX).
Poly(A)⁺ RNA wurde unter der Verwendung des FASTTRACK mRNA Isolierungskits (Invitrogen) gemäß den Angaben des Herstellers isoliert. Kurz, wurden 30.000 gereinigte Inseln schnell in Lysepuffer lysiert unter der Verwendung von Nadeln abnehmender Dicke homogenisiert und in der Anwesenheit von Proteinase K und RNasin verdaut, dann wurde die Poly(A)⁺ RNA durch Oligo-d(T)-Cellulose-Chromatographie selektiert. Die Konzentration und Reinheit der eluierten Fraktionen wurden bei OD_260/280 bestimmt.
Ungefähr 2,5 μg Poly(A)⁺ RNA aus den menschlichen Inseln wurde für die cDNA-Bibliothekskonstruktion unter der Verwendung eines LIBRARIAN R II cDNA-Bibliothekskonstruktionssystems (Invitrogen) und DH10B ELECTROMAX E. coli-Zellen (GIBCO BRL) gemäß den Angaben des Herstellers verwendet. Kurz gesagt, wurden ungefähr 2,5 μg Poly(A)⁺ RNA aus den menschlichen Inseln isoliert, in doppelsträngige cDNA überführt, gefolgt von der Hinzugabe von BstX I nicht-palindromischen Linkem (Invitrogen). Die cDNA wurde Größen-fraktioniert und nicht reagierte Linker wurden durch Agarose-Gelektrophorese unter Elektroelution entfernt. Komplementäre DNA-Stränge von länger als 600 bp wurden ausgewählt.
Beispiel 2
ISOLIERUNG EINER RATTEN-GLUCAGONREZEPTOR-CDNA DURCH POLYMERASE-KETTENREAKTIONSAMPLIFIKATION
Rattenleber-CDNA wurde als ein Templat für die Amplifikation von Glucagonrezeptor-Sequenzen unter der Verwendung von degenerierten Oligonukleotiden (ZC4715 und ZC4701; jeweils SEQ ID NOS: 9 und 8) verwendet, die Regionen von hoher Konservierung unter den Mitgliedern der Secretin-Genfamilie entsprachen. Eine 50 μl Reaktion wurde zusammengestellt, die 5 ng der Templat-cDNA (Beispiel 1A); 100 pMol jedes der Oligonukleotide ZC4715 (SED ID NO: 9) und ZC4701 (SEQ ID NO: 8), 0,25 mMol jedes Desoxynukleotid-Triphosphats (Cetus, Emeryville, CA); 1× Promega 10× Puffer (Promega Corp.); und 1,25 Einheiten Taq Polymerase (Promega) enthielt. Die PCR-Reaktion wurde für 40 Zyklen durchgeführt (1 Minute bei 95°C, 1 Minute bei 40°C und 2 Minuten bei 72°C), gefolgt von einer 7minütigen Inkubation bei 72°C.
Das 650 pb PCR-Produkt wurde durch Gelektrophorese isoliert und mit pCR1000 (Stratagene Cloning Systems) ligiert. Das sich ergebende Plasmid wurde dazu verwendet, um E. coli XL-1 Zellen zu transformieren. Die Plasmid-DNA wurde von einer ausgewählten Transformante, bezeichnet als G13/pCR1000, präpariert und sequenziert (SEQ ID NO: 14). Die Sequenzanalyse des Klons zeigte, daß das Insert ein Polypeptid kodierte, das mit dem Secretin-Rezeptor verwandt war.
Beispiel 3
KLONIERUNG EINER VOLLÄNGEN-RATTEN-GLUCAGONREZEPTOR-CDNA
Eine Vollängen-Ratten-Glucagonrezeptor-cDNA wurde durch Screenen der Bibliothek, wie beschrieben in Beispiel 1B in einem Glucagon-Bindungstest erhalten. Die Bibliothek wurde ausplattiert, um eine Million unabhängige Klone zu erhalten. Die Transformanten-Kolonien aus jeder Platte wurden in 10 ml LB-Amp (Sambrook et al., supra) abgeschabt. Die Zellen wurden abzentrifugiert, und das Medium wurde abgegossen. Die Zellpellets wurden in 4 ml LB-Amp, 15% Glyzerin resuspendiert, und vier 1 ml Aliquots wurden bei –80°C gelagert. Der erste Glyzerin-Stamm wurde titriert und 100 Pools von 5000 Kolonien pro Platte wurden plattiert. Nachdem die Kolonien angewachsen waren, wurde jede Platte in 10 ml LB-Amp abgeschabt. Ein Aliquot der Zellen aus jedem Pool wurde zur Verwendung bei der Präparation von Plasmid-DNA entfernt. Die verbliebenen Zellgemische wurden auf eine finale Konzentration von 15% Glyzerin gebracht, aliquotiert und bei –80°C eingefroren. Plasmid-DNA wurde von jedem Pool an Zellen präpariert, und die DNA wurde mit RNase (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.) gemäß den Anweisungen des Herstellers verdaut. Die RNase-Reaktion wurde durch eine Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (24:24:1)-Extraktion beendet und die DNA wurde Ethanol-gefällt.
Die Plasmid-DNA aus jedem Pool wurde in COS-7-Zellen (ATCC CRL 1651) transfiziert und die Transfektanten wurden auf die Anwesenheit von Glucagonrezeptoren durch einen ¹²⁵J-Glucagon-Bindungstest gescreent. Kurz, wurden einen Tag vor der Transfektion ungefähr 2 × 10⁵ COS-7-Zellen auf sterilen einzelnen Kammer-Objektträgern (Nunc AS, Roskilde, Dänemark) plattiert, die mit 10 μg/ml menschlichem Fibronectin (Tabelle 1) für 30 Minuten bei Raumtemperatur beschichtet waren und mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) gewaschen. 2 μg an Plasmid-DNA von jedem Pool wurde dazu verwendet, um die Zellen zu transfizieren, die auf den einzelnen Kammer- Trägern unter der Verwendung des Verfahrens, im wesentlichen wie beschrieben durch McMahan et al. (EMBO J. 10: 2821–2832, 1991; die hier durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen ist) gewachsen waren. Nach der Transfektion wurden die Zellen für 72 Stunden bei 37°C in 5% CO₂ angezogen. Tabelle 1 Menschliches Fibronectin

4 g menschliches Plasma Fibronectin-lyophilisiertes Pulver (Alpha Therapeutics Corp., Los Angeles, Calfi.)

50 ml 1 mM NaPO₄, pH 7,4 (Gemisch von mono- und di-Na), 300 mM NaCl
Das lyophilisierte Puffer wird in der Pufferlösung gelöst. Das Ammoniumsulfat wird dann bis zu einer Konzentration von 25% hinzugefügt und der Lösung wird es erlaubt, für zwei Stunden bei 4°C auszufallen. Das Fibronectin wird durch Zentrifugation bei 1.000 U/min in einer Labortischezentrifuge (Beckman Instruments, Inc., Irvine, Califonien) für 15 Minuten pelletiert. Der Überstand wird abgegossen, und das Pellet wird in 10 ml der NaPO₄ Pufferlösung (oben) gelöst.
Das Fibronectin wird in einem finalen Volumen von 16,9 ml über Nacht gegen einen Liter einer NaPO₄ Pufferlösung (oben beschrieben) dialysiert. Das dialysierte Material wird dreifach mit 1 mM NaPO₄, pH 7,4 verdünnt, um eine Lösung von 1 mM NaPO₄, pH 7,4, 100 mM NaCl herzustellen. Das Fibronectin wird dann zweifach mit destilliertem Wasser verdünnt. Das fasrige, unlösliche Präzipitat wird mit einem Glasstab entfernt.
Das Fibronectin wird über eine 50 ml DEAE FF Sepharose-Säule (Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscataway, N.J.) FPLC unterzogen, die mit drei Volumen von 10 mM Tris, pH 8,1, 50 mM NaCl, äquilibriert wurde. Nachdem die Säule mit 10 mM Tris, pH 8,1, 50 mM NaCl gewaschen wurde bis eine Basislinienprobe erzeugt wurde, wird das Fibronectin mit einem Salzgradienten von 10 mM Tris, pH 8,1, 300 mM NaCl eluiert. Die Fraktionen werden gesammelt, Aliquots der Fraktionen werden auf Acrylamidgelen elektrophogiert und die Gele werden durch Coomasie-Blau Färbung und Westernanalyse analysiert. Laie Peak-Fraktionen werden vereinigt und gegen 10 mM CAPS (3-(Cyclohexyamin)-1- propansulfonsäure, Sigma), pH 11,0, 10 mM CaCl₂, 150 mM NaCl dialysiert. Die Lösung wird bei –80°C gelagert.
Um die Transfektanten für den ¹²⁵J-Glucagon Bindungstest zu präparieren, wurde das verbrauchte Medium aus den Zellen ausgeblasen, und die Zellen wurden dreimal mit kaltem (4°C) PBS gewaschen. Nach dem finalen Waschen wurden die Zellen mit Bindemedium (Tabelle 2) bedeckt und für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Das Medium wurde durch 0,5 ml von Bindungsmedium, enthaltend 0,5 nM ¹²⁵J-Glucagon (Amersham Rezeptorgrad, spezifische Aktivität 2000 Ci/mM; Amersham) ersetzt. Die Zellen wurden dann bei 30°C für eine Stunde geschüttelt. Das Medium wurde aus den Zellen ausgeblasen, kaltes (4°C) Bindemedium ohne Glucagon wurde hinzugefügt, und die Zellen wurden für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Medien wurden von den Zellen ausgeblasen und die Zellen wurden dreimal mit kalter (4°C) PBS gewaschen. Nach dem finalen Waschen wurden die Zellen mit 1 ml 2,5% Glutaraldehyd in PBS bei Raumtemperatur für 20 Minuten fixiert. Das Glutaraldehyd wurde entfernt, und die Zellen wurden dreimal mit PBS gespült. Die Objektträger wurden für eine Stunde bei Raumtemperatur luftgetrocknet, in flüssige photographische Emulsion (Eastman Kodak Co., Rochester, N.Y.) gemäß den Anweisungen des Herstellers eingetaucht und bei Raumtemperatur im Dunklen für mindestens 30 Minuten getrocknet. Die Objektträger wurden dann in einer lichtdichten Box für 72 Stunden bei 4°C plattiert. Zellen, die in der Lage waren Glucagon zu bilden wurden bei 2,5× Vergrößerung unter Hellfeldbeleuchtung nachgewiesen. Ein Pool, # 57, wurde als Zellen enthaltend identifiziert, die in der Lage waren, Glucagon zu bilden.
Tabelle 2
Bindemedium

RPMI 1640 (Sigma), enthaltend:
20 μg/ml Bacitracin (Sigma)
25 mM HEPES Puffer, pH 7,4
1% Penicillin/Streptomycin (Sigma)
2 mM Glutamin
50 U/ml Aprotinin (Sigma)
1% Rinderserum Albumin, Fraktion V (Sigma)

1 M Natriumbicarbonat

8,4 g festes NaCO₃

Das Natriumbicarbonat wird in einen 100 ml gestopften graduierten Kolben gegossen, und 80 ml destilliertes Wasser werden hinzugefügt. Die Lösung wird gemischt, bis der Feststoff gelöst ist. Destilliertes Wasser wird bis zu 100 ml hinzugefügt. Die Lösung wird nochmals gemischt und bei 4°C in einer zugestopften Flasche gelagert.
Medium
Ein Milliliter 1 M Natriumbicarbonat wird pro Liter von destilliertem Wasser hinzugefügt. Vier Liter werden entweder im voraus präpariert und mit der Lösung über Nacht gekühlt oder mit kaltem destilliertem Wasser hergestellt.
69% Saccharoselösung

69 g Saccharose

Saccharose wird in 31 ml destilliertem Wasser unter Hitze gelöst.
Die Konzentration der Lösung wird mit einem Refraktometer gemessen. Feste Saccharose oder Wasser wird wie erforderlich hinzugefügt, um die Konzentration auf 69 +/– 0,5 einzustellen.
42,3% Saccharose

42 g Saccharose

Saccharose wird in 57 ml destilliertem Wasser unter erhitzen gelöst. Die Konzentration der Lösung wird mit einem Refraktometer gemessen. 69% Saccharoselösung oder Wasser wird wie erforderlich hinzugefügt, um die Konzentration auf 42,3 +/– 1% einzustellen.
2× Bindepuffer

100 mM HEPES, pH 7,3
300 mM NaCl
2 mM EDTA
2% Rinderserum Albumin
1,6 mg/ml Bacitracin

Imaging Puffer

140 mM NaCl
10 mM HEPES
5,6 mM Glukose
5 mM KCl
1 mM MgSO₄
1 mM CaCl₂

Fura-2 AM Lösung

50 mg Fura-2 AM (Molecular Probes)
50 ml DMSO
5 ml Imaging Puffer

50 mg von Fura-2 AM werden in 50 ml DMSO gelöst. Nachdem sich der Feststoff gelöst hat, wird die Lösung mit 5 ml Imaging Puffer gemischt.
Ein Aliquot der Plasmid-DNA aus dem #57 Pool wurde einer PCR Amplifikation unter der Verwendung von Oligonukleotiden ZC4701 und ZC4715 (jeweils SEQ ID NOs: 8 und 9) unterzogen. Ein 50 μl Reaktionsgemisch wurde hergestellt, das zwischen 200 ng und 400 ng Plasmid DNA aus dem # 57 Pool enthielt, 100 pM jedes der Oligonukleotide ZC4701 und ZC4715 (SEQ ID NOs: 8 und 9); 50 mM KCl; 10 mM Tris-HCl, pH 9,0 (bei 20°C); 1,5 mM MgCl₂; 0,01% Gelatine; 0,1% Triton X-100; 0,2 mM jedes der Desoxynukleotidtriphosphate (Pharmacia LKB Biotechnology Inc) und 1 Einheit Taq Polymerase (Promega). Die PCR Reaktion wurde für 30 Zyklen durchgeführt (2 Minuten bei 95°C, 2 Minuten bei 45°C und 2 Minuten bei 72°C), gefolgt von einer 7-minütigen Inkubation bei 72°C. Das Reaktionsgemisch wurde bei 4°C gelagert. Die Analyse des PCR Produkts durch Gel-Elektrophorese zeigte die Anwesenheit einer 700 bp Bande, die ungefähr dieselbe Größe aufwies, wie das in Beispiel 2 beschriebene Produkt.
Der Glyzerinstock aus Pool #57 wurde tritiert und 20 Platten von 500 Kolonien wurden plattiert. Die Kolonien wurden vereinigt und Glyzerinstock und Plasmid DNA wurden wie oben beschrieben präpariert. Die Plasmid DNA wurde in COS-7 Zellen transfiziert und Transfektanten wurden unter der Verwendung des oben beschriebenen Glucagon Bindetests gescreent. Ein Pool #57-18 wurde als Zellen enthaltend identifiziert, die in der Lage waren, Glucagon zu binden.
Ein Aliquot von Plasmid DNA aus Pool #57-18 wurde einer PCR Amplifikation unter d er Verwendung der Oligonukleotide ZC4701 und ZC4715 (jeweils SEQ ID NOs: 8 und 9) wie oben beschrieben unterzogen. Die Analyse des PCR Produkts durch Gelelektrophorese zeigte die Anwesenheit einer 700 pb Bande, die die Anwesenheit von Glucagonrezeptor-DNA Sequenzen bestätigte.
Der Glyzerinstock aus Pool # 57-18 wurde tritriert, und 6 Platten von 50 Kolonien und 47 Platten von 20 Kolonien wurden plattiert. Die Kolonien wurden vereinigt und Glyzerinstocks und Plasmid DNA wurden wie oben beschrieben präpariert. Ein Aliquot aus jedem Pool von Plasmid DNA wurde in COS-7 Zellen transfiziert und Transfektanten wurden unter der Verwendung des Glucagon Bindungstests wie oben beschrieben gescreent. Zusätzlich wurden ein Aliquot von jedem, Pool und Plasmid DNA einer PCR Amplifikation unter der Verwendung von Oligonukleotiden ZC4701 und ZC4715 (jeweils SEQ ID NOs: 8 und 9) wie früher beschrieben unterzogen. Vier positive Pools (#57-18-16, #57-18-18, #57-18-36 und #57-18-48) wurden als Zellen enthaltend identifiziert, die in der Lage waren, Glucagon zu binden und wurden durch Amplifikation als die bestätigende 700 bp Base enthaltend gezeigt.
Um die cDNA zu isolieren, wurden zwei 150 mm Platten jeweils mit 2.500 Kolonien des #57-18 Pools plattiert. Filterabzüge wurde unter der Verwendung des Verfahrens im wesentlichen durch Hanahan und Meselson (Gene 10: 63, 1980) und Sambrook et al. (ibid.), die hier durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen sind, präpariert. Die Hybridisierungs-Sonde wurde durch PCR Amplifikation von Plasmid DNA aus dem #57 Pool unter der Verwendung der oben beschriebenen Oligonukleotide und Verfahren erhalten. Das PCR Produkt wurde aus einem niedrig-schmelzenden Agarosegel Gel-gereinigt und wurde unter der Verwendung des MEGAPRIME Kits (Amersham, Arlington Heights, Illinois) gemäß den Anweisungen des Herstellers zufällig geprimed. Die Filter wurden in einer Lösung hybridisiert, die 6× SSC, 5× Denhardt's, 5% SDS, 200 μg/ml beschallte Lachssperma DNA und 2 × 10⁵ cpm/ml von ³² P-markiertem PCR Fragment enthielt. Die Filter wurden über Nacht bei 65° C hybridisiert. Der überschüssige Marker wurde durch drei Waschungen mit 2× SSC, 1% SDS bei 65°C entfernt. Die Filter wurden einem Film mit zwei Schirmen für 4 Stunden bei –80°C ausgesetzt. Ein positiver Klon, der das Plasmid pLJ4 enthielt, wurde identifiziert und sequenziert. Plasmid pLJ4 wurde bei der American Type Culture Collection (12301 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852) als eine E. coli Transformante unter der Zugangsnummer 69056 am 21. August 1992 hinterlegt. Restriktions-Endonuclease-Analyse und Sequenzanalyse zeigten, daß pLJ4 ein ungefähr 2 kb großes Insert enthielt, das für ein 485-Aminosäureprotein mit einem vorhergesagten Molekulargewicht von 54.962 Dalton kodierte. Die Nukleinsäuresequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz sind in SEQ ID NO 14 und 15 gezeigt. Die Hydropathie-Analyse unter der Verwendung des Verfahrens von Kyte und Doolittle (J. Mol. Biol. 157: 105–132, 1982; die hier durch Bezugnahme aufgenommen ist) zeigte 8 Cluster von hydrophoben Aminosäuren, die einer Amino-terminalen Signalsequenz entsprechen und 7 Transmembrandomänen (2). Zusätzlich zeigte die Analyse der abgeleiteten Aminosäuresequenzen die Anwesenheit von 4 potentiellen N-verbundenen Glykosylierungsstellen, die in einer verlängerten hydrophilen Sequenz angeordnet sind, und die Anwesenheit von 6 Cysteinen in derselben Region.
Beispiel 4
ISOLIERUNG EINER MENSCHLICHEN GLUCAGONREZEPTOR CDNA DURCH POLIMERASE KETTENREAKTIONS-AMPLIFIKATION
Menschliche Insel-Zell cDNA (Beispiel 1C) wurde als ein Templat für die Amplifikation von menschlichen Glucagonrezeptorsequenzen unter der Verwendung der degenerierten Oligonukleotide ZC4715 und ZC4701 (jeweils SEQ ID NOs: 9 und 8) verwendet. Eine 50 μl Reaktion wurde angesetzt, die 5 ng der Templat cDNA (Beispiel 1C), 100 pM jedes der Oglionukleotide ZC4715 (SEQ ID NO: 9) und ZC4701 (SEQ ID NO: 8)m 0,25 mM jedes Desoxynukleotidtriphosphats (Cetus, Emeryville, Californien), 1× Promega 10× Puffer (Promega) und 1,25 Einheiten Taq Polymerase (Promega) enthielt. Die PCR Reaktion wurde für 40 Zyklen durchgeführt (1 Minute bei 95°C, 1 Minute bei 45°C und 2 Minuten bei 72°C), gefolgt von einer 7-minütigen Inkubation bei 72°C.
Ein ungefähr 750 bp-PCR Produkt wurde durch Gelelektrophorese isoliert. Ein Zehntel des isolierten PCR Produkts wurde als ein Templat für eine weitere PCR Reaktion unter der Verwendung der Oligonukleotide ZC4758 und ZC4778 (SEQ ID NOs: 10 und 11) verwendet, die so aufgebaut wurden, um eine Bam HI Restriktionsstelle am 3' Ende und eine Eco RI Restriktionsstelle am 5' Ende des PCR Produkts für die Klonierung einzuführen. Ein 50 μl Reaktionsgemisch wurde wie oben beschrieben angesetzt. Die PCR Reaktion wurde für 40 Zyklen durchgeführt (1 Minute bei 95°C, 1 Minute bei 50°C und eine halbe Minute bei 72°C), gefolgt von einer 7-minütigen Inkubation bei 72°C.
Um Transformanten auf eine menschliche Glucagonrezeptorsequenz zu screenen, wurde die Insert DNA, die in jeder Transformante vorhanden war unter der Verwendung der Oligonukleotide ZC447 und ZC976 (jeweils SEQ II) NOs: 1 und 2) amplifiziert, die als universelle pUC Sequenzierungsprimer aufgebaut waren und an pUC Sequenzen, die das PCR Produktinsert flankierten, anhybridisierten. 48 der Transformanten wurden jeweils in 25 μl Reaktionsgemisch enthaltend 20 pM jedes Oligonukleotids, 0,125 mM jedes Desoxynukleotidtriphosphats (Cetus, Emeryville, Kalifornien), 1× Promega 10× Puffer (Promega) und 1,25 Einheiten Taq Polymerase (Promega) enthielt, gepickt. Die PCR Reaktion wurde für 30 Zyklen durchgeführt (1 Minute bei 92°C, 1 Minute bei 45°C und 1 und eine halbe Minute bei 72°C), gefolgt von einer 7-minütigen Inkubation bei 72°C.
Die PCR Produkte wurden anschließend durch Southern-Hybridisierung (Southern, J. Mol. Biol. 89: 503, 1975; und Sambrook et al., ibid.; die hier durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen sind) unter der Verwendung des 1,9 kb Eco RI-Xho I Fragments von pLJ4, das durch zufälliges Primen und Verwendung des Amersham MEGAPRIME Kit (Amersham) als eine Sonde markiert wurde, analysiert. Ein Klon, G30, wurde als mit der Volllängen Raten cDNA Sonde hybridisierend gezeigt. Die Nukleotidsequenz von G30 ist in SEQ ID NO: 16 gezeigt.
Beispiel 5
KLONIERUNG EINER VOLLÄNGEN-MENSCHLICHEN GLUCAGON CDNA

Um eine Bibliothek zu identifizieren, die Sequenzen enthielt, die für einen menschlichen Glucagonrezeptor kodieren, wurde eine Reihe von Bibliotheken durch PCR gescreent, unter der Verwendung der Oligonukleotidprimer ZC5433 und ZC5432 (jeweils SEQ ID NOs: 13) und 12, die so aufgebaut waren, um Sequenzen aus dem oben diskutierten Klon G30 zu enthalten. Gekaufte und präparierte menschliche genomische und cDNA Bibliotheken aus menschlicher Leber, Inselzellen, HepG2 Zellen, Hirn und Plazenta wurden gescreent (Tabelle 3). Einzelne 50 μl PCR Reaktionen wurden unter der Verwendung der DNA aus jeder Bibliothek bei den in Tabelle 4 aufgelisteten Volumina, 20 pM/μl jedes von ZC5433 und ZC5432 (jeweils SEQ ID NO: 13 und 12), 0,25 mM jedes Desoxyribonukleinsäuretriphosphats, 5 μl 10× Taq I Puffer (Promega), 15 mM MgCl₂, 19,5 μl destilliertem Wasser und 0,5 μl 5 U/μl Taq I Polymerase (Promega) angesetzt. Zusätzlich wurden Reaktionen angesetzt, die pLJ4 als eine positive Kontrolle und keine DNA als eine negative Kontrolle enthielten. Tabelle 2 Bibliotheks- und DNA-Quellen

Bibliothek/DNA	Quelle
NIH menschliche Leber cDNA	R. Bertolloti (NIH, Bethesda, Md.)
menschliche genomische #946203	Stratagene
menschliche genomische #944201	Stratagene
menschliche Inselzell cDNA	Beispiel 1C
λgt11 HEPG2	präpariert wie von Hagen et al. (U.S. Patent 4,784,950, das hier durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit aufgenommen ist) beschrieben
menschliches Hirn 1. Strang cDNA	Clontech
menschliche Plazenta 1. Strang cDNA	Clontech
menschliche Leber 1. Strang cDNA	Clontech

Tabelle 4 Volumen

Bibliothek/DNA	Volumen (verdünnt mit Wasser auf 15 μl)
NIH menschliche Leber cDNA	1 μl einer 400 ng/μl Vorratslösung
menschliche genomische #9462003	15 μl von Phagenvorrat
menschliche genomische #944201	15 μl von Phagenvorrat
menschliche Inselzell cDNA	1 μl einer 1,2 μg/μl Vorratslösung, verdünnt 1:3
λgt11 HEPG2	15 μl von Phagenvorrat
menschliches Hirn 1. Strang cDNA	1 μl eins 10 ng/μl Vorrats
menschliche Plazenta 1. Strang cDNA	1 μl eins 10 ng/μl Vorrats

menschliche Leber 1. Strang cDNA

1 μl eins 10 ng/μl Vorrats

Die PCR Reaktionen wurden für 30 Zyklen durchgeführt (1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 50°C und eine und eine halbe Minute bei 72°C), gefolgt von einer 10-minütigen Inkubation bei 72°C. Die PCR Produkte wurden anschließend durch Agarosegel-Elektrophorese analysiert. Nur die NIH Leber-Bibliothek erzeugte eine 320–410 bp Bande von gleicher Größe zu der, die mit der pLJ4 positiven Kontrolle gesehen wurde.
Die in Plasmid pcD2 (Chen und Okayama, Mol. Cell. Biol. 7: 2 745–2752, 1987) erhaltene menschliche Leber-Bibliothek, die von Dr. Roger Bertolloti erhalten wurde (National Institutes of Health, Bethesda, Md.), wurde verwendet, um einen Volllängen cDNA Klon zu erhalten, der für den menschlichen Glucagonrezeptor kodierte. Die Bibliothek wurde plattiert, um eine Million unabhängige Klone zu erhalten. Die Transformanten-Kolonien aus jeder Platte wurden in 10 ml LB-Amp (Sambrook et al., ibid.) abgeschabt. Die Zellen wurden abzentrifugiert und die Medien verworfen. Die Zellpellets wurden in 4 ml L B-Amp, 15% Glyzerin resuspendiert und 4 1 ml Aliquots wurden bei –80° C gelagert. Der erste Glyzerinvorrat wurde titriert und 100 Pools von 5.000 Kolonien pro Platte wurden plattiert. Nachdem die Kolonien angewachsen waren, wurde jede Platte in 10 ml LB-Amp abgeschabt. Ein Aliquot der Zellen aus jedem Pool wurde zur Verwendung bei der Präparation von Plasmid DNA entfernt. Die verbliebenen Zellgemische wurden auf eine finale Kombination von 15% Glyzerin gebracht, aliquotiert und bei –80°C eingefroren. Die Plasmid DNA wurde aus jedem Pool an Zellen präpariert und die DNA wurde mit RNAse (Boehringer Mannheim, Indianapolis, In.) gemäß den Anweisungen des Hersteller verdaut. Die RNAse Reaktion wurde durch eine Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (24:24:1) Extraktion beendet, die DNA wurde Ethanol-gefällt.
Aliquots der resuspendierten Plasmid DNA aus jedem Pool wurden in Gruppen von 10 (d.h. 1–10, 11–20, 21–30, 31–40, usw.) kombiniert. Die Plasmid-DNA wurde 1:20 verdünnt und 1 μl der DNA aus jedem Pool wurde in einem PCR Reaktionsgemisch verwendet, das mit dem oben beschriebenen Reaktionsgemisch identisch war. Das Reaktionsgemisch wurde einer Amplifikation unter den wie oben angegebenen Bedingungen unterzogen. Die Analyse der PCR Produkt-Agarosegelelektrophorese zeigte, daß der Pool 31–40 eine 320–410 bp Band der selben Größe wie die positive Kontrolle enthielt.
Die Plasmid-DNA, die aus den originalen Pools 31 bis 40 präpariert wurde, wurde 1:20 verdünnt und 1 μl jedes Pools wurde in einem Reaktionsgemisch identisch zu dem oben beschriebenen verwendet. Die PCR Amplifikation des Reaktionsgemisches unter der Verwendung der oben beschriebenen Bedingungen wurde durchgeführt. Die Analyse der PCR Produkte durch Agarosegelelektrophorese zeigte, daß Pool #40 eine Bandengröße von ungefähr 310–420 bp ergab.
Die Konzentration von Plasmid-DNA wurde ungefähr als 70 ng/μl durch Agarosegelelektrophorese von 1 μl von Pool #40, der 1:10 verdünnt wurde, quantifiziert. 70 ng von #40 Plasmid DNA wurden in E. coli Stamm DH10B-Zellen bei 2,3 kV, 400 Ω, 25 μF elektroporierten und in 1 ml SOC (Sambrook et al., ibid.) resuspendiert. Drei Verbindungen der Zellen bei 10^–2, 10^–3 und 10^–4 wurden präpariert. 100 μl jeder Verdünnung wurden auf 4 Platten ausplattiert. Die Koloniezahlen wurden als ungefähr 10.000 Kolonien pro Platte für die 4 Platten enthaltend Zellen von der 10^–2 Verdünnung und ungefähr 1.000 Kolonien pro Platte für die 4 Platten enthaltend Zellen aus der 10^–3 Verdünnung abgeschätzt. Doppelte Filterabzüge wurden von jeder der 4 10^–3 Platten und 1 der 10^–2 Platten präpariert, die als Pool #1 bis Pool #5 bezeichnet wurden. Ein Filter von jedem doppelten Ansatz wurde auf Festmedium ausgelegt und es ihm ermöglicht zu wachsen, bis sich Kolonien bildeten. Die Kolonien wurden dann abgeschabt und dazu verwendet, Plasmid DNA für die PCR-Amplifikation zu präparieren. Zusätzlich wurden die drei verbleibenden Platten der 10^–2 Platten abgeschabt und Plasmid DNA wurde aus den Zellen präpariert.
Die verbleibenden Filter wurden mit 3 × SSC + 0,5% SDS bei 65°C unter Schütteln für 12 Stunden vorgewaschen, um bakterielle Zellrückstände zu entfernen. Die Filter wurden dann in Ullrich's Puffer (Ullrich, EMBO J. 3: 361–364, 1984) + 50% Formamid, 1% SDS über Nacht bei 37°C prähybridisiert. Klon G30-DNA, die der Verwendung des Amersham MEGAPRIME Kit (Amersham) gemäß den durch den Hersteller vorgeschlagenen Bedingungen markiert wurde, wurde gekocht und zu der Hybridisierungslösung (Ullrich's Puffer + 50% Formamid) auf eine finale Konzentration von 6 × 10⁵ cpm/ml hinzugefügt. Die Filter wurden dann über Nacht bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Nach der Inkubation über Nacht wurde die Probenlösung entfernt, und die Filter wurden für 5 Minuten bei 65°C in 2 × SSC + 0,1% SDS gewaschen. Im Anschluß an die erste Waschung wurden die Filter in derselben Lösung für 15 Minuten bei 65°C gewaschen, gefolgt von 5 Minuten unter Schütteln bei Raumtemperatur. Das letzte Waschprotokoll wurde zwei weitere Male wiederholt. Die Filter wurden über Nacht bei Raumtemperatur gegenüber Film ausgesetzt. Eine einzelne Kolonie auf Patte #2, die Pool #2 entspricht, war durch Hybridisierung an G30 positiv. Diese Kolonie wurde gepickt und wurde ausgestrichen, um unabhängige Kolonien zu erhalten. Plasmid DNAs, die aus mehreren unabhängigen Kolonien präpariert wurden, wurden einer DNA Sequenzanalyse unterzogen. Ein Klon, 40-2-2, wurde einer weiteren Sequenzanalyse unterzogen und wurde bei der American Type Culture Collection (12301 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852) als eine E. coli Transformante unter der Zugangsnummer 69055 am 21. August 1992 hinterlegt. Eine teilweise DNA Sequenz von Klon 40-2-2 und seine abgeleitete Aminosäuresequenz sind als SEQ ID NOs: 17 und 18 gezeigt.
Um die Anwesenheit von Glucagonrezeptorsequenzen in der Filterhybridisierung zu bestätigen, wurden PCR Amplifikationsreaktionen mit jeder Plasmid DNA Präparation (Plasmid DNA wurde von jedem Duplikatfilter präpariert und Plasmid DNA wurde von jedem der 3 10^–2 Platten präpariert) durchgeführt. Die vereinigten Plasmid DNAs wurden jeweils 1:20 mit Wasser verdünnt und 1 μl jeder DNA wurde als ein Templat in einer PCR Reaktion verwendet, die wie oben beschrieben angesetzt und durchgeführt wurde. Die Agarosegelelektrophorese der sich ergebenden PCR Produkte zeigte, daß Pool #2 und drei der vier Pools von 10.000 PCR-erzeugte Banden zwischen 310 und 420 bp enthielten. Die Anwesenheit der PCR-erzeugten Bande in Pool #2, die der Platte #2 entspricht, bestätigte die Anwesenheit von Glucagonrezeptor DNA Sequenzen.
F. Strategie zur Klonierung der 5' Sequenz eines menschlichen Glucagonrezeptors
Die Analyse der partiellen cDNA Sequenz von Klon 40-2-2 und der Vollängen-Ratten-Glucagonrezeptor cDNA Sequenz zeigte, daß dem 40-2-2 Klon die Amino-terminale Sequenz fehlte, die ungefähr 25 Aminosäuren entsprach. Die 5' menschliche Glucagonrezeptor cDNA Sequenz wurde unter der Verwendung einer Adaptation des von Frohman et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8998–9002, 1988) beschriebenen Verfahrens erhalten. Kurz wurde ein Oligonukleotidprimer so aufgebaut, daß die Sequenz zu einer Sequenz nahe dem 5'-Ende der 40-2-2 kodierenden Sequenz hybridisierte. Der Primer wurde dann an ein G-Schwanz menschliches Leber Erst-Strang cDNA Templat hybridisiert, und Primer wurde in Richtung des 5' Terminus unter der Verwendung von Taq I DNA Polymerase verlängert. Ein zweiter Poly d(C) Primer wurde an das G-Schwanz cDNA Templat anhybridisiert, um eine Polymerasekettenreaktions-Amplifikation und anschließende Klonierung, Sequenzierung und Splicing der in Klon 40-2-2 vorhandenen kodierenden Sequenz zu ermöglichen.
Drei cDNA Template wurden präpariert. Ein erstes Templat war eine käuflich erhältliche menschliche Leber Erst-Strang cDNA. Ein zweites und ein drittes cDNA Templat wurden durch Synthetisieren von Erst-Strang cDNA aus käuflich erhältlicher menschlicher Leber mRNA (Clontech) unter der Verwendung von jeweils entweder einem Oligonukleotid, das für den menschlichen Glucagonrezeptor spezifische Sequenzen enthielt oder unter der Verwendung von herkömmlichem Oligo d(T) Primen präpariert.
Das zweite cDNA Templat wurde durch Synthese aus menschlicher Leber mRNA unter der Verwendung von Oligonukleotid ZC5433 (SEQ ID NO: 13), das für die menschliche Glucagonrezeptor kodierende Sequenz spezifisch ist, präpariert. Ein Reaktionsgemisch, enthaltend 2 μl von 1 μg/μl menschlicher Leber mRNA, 8 μl 20 pM/μl ZC5433 (SEQ ID NO: 13) und 0,5 μl 10 mM Tris, pH 7,4, 0,1 mM EDTA wird für 7 Minuten bei 68°C inkubiert, gefolgt von 2 Minuten auf Eis. Nach der Inkubation erhielt das Reaktionsgemisch 4 μl von 5× SUPERSCRIPT Puffer (GIBCO-BRL), 1 μl 200 mM Dithiotreitol, 1 μl einer Lösung enthaltend 10 mM von jedem dNTP, 1 μl 0,25 μCi/μl α³²P-dCTP und 5 μl SUPERSCRIPT Reverse Transkriptase. Die Reaktion wurde für 1 Stunde bei 45°C inkubiert. Im Anschluß an die Inkubation wurde die Reaktion bei 50°C für 10 Minuten inkubiert. Die Reaktion wurde durch die Hinzufügung von 80 μl TE beendet. Die RNA wurde durch die Hinzufügung von 1 μl 0,5 M EDTA und 1 μl KOH hydrolysiert. Die Hydrolysierungsreaktion wurde bei 65°C für 5 Minuten inkubiert. Nach Inkubation wurde die Probe auf 1 ml mit 50 mM KOH 0,1 mM EDTA verdünnt, und die Probe wurde über einen CENTRICON 100 Konzentrator (Amicon, Danvers, Mass.) passiert. Die Säule wurde mit 1 ml 50 mM KOH 0,1 mM EDTA gewaschen. Die konzentrierte cDNA wurde gesammelt und mit einem halben Volumen von 100 mM HCl neutralisiert. Die neutralisierte cDNA Probe wurde Ethanol-gefällt, und das Präzipitat wurde in 26 μl destilliertem Wasser resuspendiert.
Das dritte cDNA Templat wurde durch Synthese aus menschlicher Leber mRNA unter der Verwendung eines gekauften Oligo d(T) Primers präpariert. Ein Reaktionsgemisch wurde hergestellt, enthaltend 2 μl von 1 μg/μl menschlicher Leber mRNA, 1 μl von 1 μg/μl Oligo d(T)18 (New England Biolabs, Beverly, Mass.) und 5 μl 10 mM Tris, pH 7,4, 0,1 mM EDTA.
Die cDNA der Synthese wurde unter der Verwendung der für die oben beschriebene Synthese angegebenen Bedingungen durchgeführt.
Die Erst-Strang cDNAs wurden dann mit einem G-Schwanz versehen. Die Reaktionsröhrchen wurden enthaltend 4 μl menschliche Leber Erst-Strang cDNA (QUICK CLONE; Clontech, Palo Alto, Califonien), 4 μl menschliche Leber Erst-Strang cDNA von dem ZC5433 (SEQ ID NO: 13) Primer oder 4 μl menschlicher Leber erst Strang cDNA von dem Oligo d(T) Primer. Jedes Reaktionsgemisch erhielt 22 μl Wasser, 8 μl 5× Puffer (Promega), 4 μl 10 mM dGTP und 2 μl von 15 U/μl terminale Transferase angesetzt, und die Reaktionen wurden für 30 Minuten bei 37°C inkubiert, gefolgt von einer 10-minütigen Inkubation bei 65°C. Die Reaktionen wurden dann auf 90 μl mit 10 mM Tris, pH 7,4, 1 mM EDTA verdünnt und Ethanol-gefällt.
Die Zweit-Strang Synthese aller G-Schwanz-cDNA's wurde identisch durchgeführt. Jede cDNA wurde zuerst in 50 μl destilliertem Wasser suspendiert. Jede cDNA erhielt dann 100 pM ZC4814 (SEQ ID NO: 20) in 5 μl. Die cDNA's wurden an die Primer durch Erhitzen des Gemisches auf 68°C für 5 Minuten gestartet, gefolgt von einer 2-miütigen Inkubation auf Eis. Nachdem der Primer an die cDNA anhybridisiert war, erhielt jedes Gemisch 20 μl 5× Polymerase I Puffer (Beispiel 1), 1 μl 100 mM Dithiotreitol, 2 μl einer Lösung enthaltend 10 mM dNTP, 2 μl 0,5 μCi/μl α³²P-dCTP, 1 μl von 3 U/μl E. coli DNA Ligase (New England Biolabs), 5 μl 7 U/μl E. coli DNA Polymerase I (Amersham). Die Reaktion wurde für 5 Minuten bei 22°C inkubiert, gefolgt von der Zugabe von 1,5 μl 2 U/μl RNase H (GIBCO-BRL), wonach die Inkubation bei 16°C für 2 Stunden fortgeführt wurde. Die Reaktion wurde durch die Hinzufügen von 200 μl 10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, gefolgt von 150 μl Wasser-gesättigtem Phenol und 150 μl Chloroform beendet. Das Gemisch wurde gevortext und dann für 3 Minuten bei 22°C zentrifugiert, um die Phasen zu trennen. Die wäßrige Phase wurde entfernt und mit Phenol und Chloroform, wie oben beschrieben, re-extrahiert. Nach der zweiten Phenol-Chloroform-Extraktion wurde die wäßrige Lage mit Chloroform extrahiert. Die cDNA in der wäßrigen Lage wurde durch die Hinzufügung von 5 μg Muschelglycogen, 100 μl 8 M Ammoniumacetat und 300 μl Isopropanol gefällt, um selektiv größere Nukleinsäuren auszufällen, was die nicht inkorporierten Oligonukleotidprimer im Überstand zurückließ. Die cDNA wurde durch Zentrifugation pelletiert und das Pellet wurde mit 70% Ethanol gewaschen, gefolgt von Lufttrocknung. Das cDNA Pellet wurde in 15 μl doppelt-destilliertem Wasser resuspendiert.
Die doppelstängigen cDNA's wurden in 5 parallelen Reaktionen unter der Verwendung eines Oligonukleotidprimers, der zum 5' Ende von ZC4814 (SEQ ID NO: 20) homolog ist und Restriktionsedonukleasestellen enthält, um die Subklonierung zu erleichtern, und einem Oligonukleotidprimer, der für das letzte 5' Ende der kodierenden Sequenz, die in dem 40-2-2 Klon vorhanden ist, spezifisch ist, amplifiziert. Jedes Reaktionsgemisch enthielt 5 μl 10× Taq I Puffer, 3 μl 25 mM MgCl₂, 5 μl einer Lösung enthaltend 2,5 mM jedes dNTPs, 1 μl doppelsträngiger cDNA und 0,5 μl Taq I Polymerase (Promega). Destilliertes Wasser wurde bis zu einem Gesamtvolumen von 50 μl hinzugefügt. Die Reaktion wurde für 5 Minuten bei 98°C denaturiert, vor der Hinzufügung von 1 μl jedes von den 10 pM/μl ZC5624 (SEQ ID NO: 21) und 20 pM/μl ZC4812 (SEQ ID NO: 19). Jede Probe wurde mit 70 μl Mineralöl überschichtet, das bei 90°C gehalten wurde. Die Reaktionen wurden für 30 Zyklen amplifiziert (95°C für 60 Sekunden, 57°C für 40 Sekunden, 72°C für 60 Sekunden) gefolgt von einer 7-minütigen Verlängerung bei 72°C.
Jedes PCR-Produkt wurde Agarosegelelektrophorese unterzogen, und die amplifizierten Fragmente wurden jedes ausgeschnitten und in pCR1000 unter der Verwendung des TA Cloning Kits (Invitrogen) subkloniert. 3 Klone von jeder Ligation wurden ausgewählt und auf die Anwesenheit von Insert durch die Verwendung der Oligonukleotidprimer ZC5624 (SEQ ID NO: 21) und ZC4812 (SEQ ID NO: 19) in unabhängigen PCR Reaktionsgemischen, die jedes ein Inokulum aus einem Klon als die Quelle an Templat-DNA einschlossen, analysiert. Die PCR Reaktion wurde wie oben beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, daß nur 30 Zyklen an Amplifikation durchgeführt wurden. Ein einzelner Insert-positiver Klon aus jeder original PCR Reaktion wurde einer DANN-Sequenzanalyse unterzogen. Von den zwei Klonen, die als die fehlerfreie 5' menschliche Glucagonrezeptor kodierende Sequenz enthaltend gezeigt wurden, wurde ein Klon ausgewählt, um die 5' menschliche Glucagonrezeptor kodierende Sequenz zur Verfügung zu stellen. Klon 9A wurde mit Eco RI und Kpn I verdaut, um ein 551 bp Fragment zu erhalten, das die 5' kodierende Sequenz des Glucagonrezeptors enthielt. Die 3' Glucagonrezeptor kodierende Sequenz wurde als ein 561 bp Kpn I-Bam HI Fragment aus 40-2-2 erhalten. Das Eco RI-Kpn I Fragment und das 561 bp Kpn I-Bam HI Fragment wurden in Anwesenheit von Eco RI und Bam HI ligiert, um eine Konkatemerisierung zu verhindern. Das Produkt der Ligation, ein 1112 bp Fragment, wurde Gel-gereinigt und als 9A1 bezeichnet. Zur Bequemlichkeit wurde Fragment 9A1 in Eco RI-Bam HI verdauten pUC18 ligiert. Das Ligationsgemisch wurde in E. coli Stamm DH10b Zellen transformiert, und ausgewählte Klone wurden auf die Anwesenheit von Insert analysiert. Ein Klon, 9A11, enthielt das Insert.
Die Glucagonrezeptor kodierende Sequenz wurde in einen Säugerexpressionsvektor unter der Verwendung von Plasmiden p9A11 und Klon 40-2-2 konstruiert, um die vollständige Glucagonrezeptor kodierende Sequenz zu erhalten. Plasmid p9A11 wurde mit Pvu II und Bam HI verdaut, um das 967 pb Fragment zu isolieren. Klon 40-2-2 wurde mit Bam HI und Sac I verdaut, um das 828 bp Fragment zu isolieren, das die 3' menschliche Glucagonrezeptor kodierende Sequenz enthielt. Der Säugerexpressionsvektor pHZ1 wurde durch Verdau mit Eco RI linearisiert und die Enden wurden unter der Verwendung von T4 DNA Polymerase stumpf gemacht. Der stumpft-endige linearisierte Vektor wurde dann mit Sac I verdaut. Das 967 bp Pvu II-Bam HI Fragment und das 828 bp Bam HI-Sac I Fragment wurden mit dem stumpf-Sac I verdauten pHZ1 Vektor ligiert.
Plasmid pHZ1 ist ein Expressionsvektor, der dazu verwendet werden kann, um Protein in Säurezellen oder in einem Frosch-Oozyten-Translationssystem aus mRNAs zu exprimieren, die in vitro transkribiert wurden. Die pHZ1 Expressionseinheit umfaßt den Maus-Metallothionein-1 Promotor, den Bakteriophagen T7 Promotor, flankiert durch mehrfache Klonierungsbänke und enthaltend einmalige Restriktionsstellen für die Insertion von kodierenden Sequenzen, den menschlichen Wachstumshormon Terminator und den Bakteriophagen T7 Terminator. Zusätzlich enthält pHZ1 einen E. coli Replikationsursprung; ein bakterielles Beta Lactamasegen; eine Säuger-selektierbare Markerexpressionseinheit, umfassend den SV40 Promotor und einen Ursprung, ein Neomycinresistenzgen und den SV40 Transkriptionsterminator.
Das pHZ1 Plasmid, das die Glucagonrezeptor cDNA Sequenz in der korrekten Orientierung relativ zum Promotor enthielt, wurde als pLJ6' bezeichnet. Die Insert- und Vektorgrenzen wurden sequenziert, um die Anwesenheit der korrekten Sequenz zu bestätigen. Plasmid pLJ6' wurde bei der American Type Culture Collection (123301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852) unter der Zugangsnummer 69183 am 15. Januar 1993 hinterlegt. Die DNA Sequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz der in pLJ6' vorhandenen Glucagonrezeptor cDNA ist in SEQ ID NO: 24 und SEQ ID NO: 25 gezeigt.
Beispiel 6
KLONIERUNG EINER GLUCAGONREZEPTOR CDNA AUS MENSCHLICHEN INSELZELLEN
Zusätzlich zur Klonierung eines Glucagonrezeptors aus menschlichen Leberzellen wurde eine Glucagonrezeptor cDNA aus einer menschlichen Inselzell-Bibliothek erhalten. Ein Aliquot der menschlichen Inselzell cDNA Bibliothek (Beispiel 1C) wurde einer PCR Amplifikation unter der Verwendung des Oligonukleotids ZC5763 (SEQ ID NO: 22) unterzogen, das e in Sinnstrang-Oligonukleotid ist, das eine Eco RI Stelle enthält, flankiert von Sequenzen aus der 5' nicht-translatierten Sequenz der menschlichen Glucagonrezeptor cDNA und Oligonukleotid ZC5849 (SEQ ID NO: 23), das ein Gegenstrang-Oligonukleotid ist, daß eine Xho I Stelle enthält, flankiert von Sequenzen aus der 3' nicht-translatierten Sequenz der menschlichen Glucagonrezeptor cDNA. Der Einschluß von Restriktionsstellen in den Oligonukleotidprimern erleichterte die gerichtete Klonierung der sich ergebenden PCR-Produkte in einem geeigneten Plasmidvektor. Ein PCR Reaktionsgemisch wurde angesetzt, enthaltend 4 μl der Inselzell-cDNA Bibliothek (Beispiel 1C), 8 μl 10× Promega PCR Puffer (Promega), 20 pM ZC5763 (SEQ ID NO: 22), 20 pM ZC5849 (SEQ ID NO: 23), 1 μl einer Lösung enthaltend 20 mM jedes Desoxyribonukleotids und 46,5 μl Wasser. Das Gemisch wurde für 3 Minuten auf 95°C erhitzt, die Hitze wurde dann für 3 Minuten auf 80°C verringert. Das Gemisch wurde bei 80°C gehalten, bis zur Verwendung bereit. Um die Reaktion zu beginnen, wurden 20 μl eines Enzymgemischs, umfassend 2 μl 10× Promega PCR Puffer (Promega), 2 μl 5 U/μl Taq I Polymerase (Cetus) und 16 μl Wasser zu dem Reaktionsgemisch hinzugefügt. Die Reaktion wurde mit 50 μl Mineralöl (Sigma) überschichtet, und die Reaktion wurde 30 Zyklen unterzogen (95°C für 1 Minute, 55°C für 1 Minute, 72°C für 2 Minuten und 15 Sekunden, wobei die 72°C Inkubation in jedem Zyklus um 3 Sekunden verlängert wurde), gefolgt von einer 10-minütigen Inkubation bei 72°C. Nach der finalen 72°C Inkubation wurde die Reaktion bei 4°C gehalten. Die Agarosegelelektrophorese eines 10 μl Aliquots des PCR Produkts zeigte die Anwesenheit eines ungefähr 1,8 bis 1,9 kb Fragments. Basierend auf der menschlichen Glucagonrezeptor cDNA, wie in pLJ6' vorhanden, wurde ein Fragment von ungefähr 1846 bp erwartet.
Die PCR Reaktion wurde mit Chloroform extrahiert, gefolgt von 2 Phenol:Chloroform Extraktionen und einer finalen Chloroform Extraktion. Nach der finalen Extraktion wurden 5 μl 4 μg/μl Glycogenträger (Boerhinger Mannheim Corporation) hinzugefügt, und das Gemisch wurde in der Anwesenheit von Ammoniuacetat und Ethanol gefällt. Die DNA wurde durch Zentrifugation pelletiert, und das Pellet wurde mit 70% Ethanol gewaschen. Das DNA Pellet wurde in Wasser rekonstituiert und mit Xho I und Eco RI verdaut. Die DNA wurde Gel-gereinigt und in Plasmid pBLUESCRIPT SK⁺ (Stratagene Cloning Systems) subkloniert, das mit Xho I und Eco RI linearisiert wurde. Das Ligtionsgemisch wurde in E. coli Stamm DH10B Zellen (GIBCO-BRL) transformiert. Die Plasmid DNA wurde aus ausgewählten Transformanten präpariert und die DNA wurde einer Restriktionsenzym- und Southern Blot Analyse unterzogen. Die Klone wurden mit dem menschlichen Glucagonrezeptor DNA Insert, das in pRJ6' vorhanden war, verglichen. Auf der Basis von diagnostischem Restriktionsenzymverdau wurden ausgewählte Klone einer Sequenzanalyse unterzogen. D ie Sequenzanalyse davon zeigte, daß ein Klon, pSLIGR-1, Glucagonrezeptor kodierende Sequenzen enthielt. Die kodierende Region von pSLIGR-1 enthielt drei Nukleotidaustausche in der Glucagonrezeptor kodierenden Region, verglichen zu Leber cDNA, vorhanden in pLJ6'. Einer der Nukleotidaustausche war eine stumme Mutation, die verbliebenen zwei führten zu konservativen Aminosäureaustauschen, wie in Tabelle 5 gezeigt. Die Analyse der Veränderungen läßt vermuten, daß sie das Ergebnis von polymorphen Unterschieden sind und allelische Variationen darstellen.
Tabelle 5
Beispiel 7
KLONIERUNG EINES MENSCHLICHEN GLUCAGONREZEPTOR GENS
Um einen menschlichen Glucagonrezeptor genomischen Klon zu erhalten, wurden zwei Bibliotheken von genomischer DNA unter der Verwendung der menschlichen Glucagonrezeptor cDNA als einer Sonde gescreent. Eine amplifizierte menschliche λFIX II kaukasische männliche Plazenta genomische Bibliothek und eine amplifizierte menschliche Lungen λFIX II genomische Bibliothek (beide Bibliotheken wurden von Stratagene Cloning Systems, jeweils Katalognummern 946203 und 944201 erhalten) wurden auf das menschliche Glucagonrezeptor Gen hin gescreent.
Die amplifizierte menschliche Lungen genomische Bibliothek wurde titriert und ungefähr 4 × 10⁴ Plaque-bildende Einheiten (pfu) wurden mit E. coli Stamm LE392 Zellen (Stratagene Cloning Systems) auf jeder von 30 150 mm Durchmesser-Platten plattiert. Weitere 10 Platten wurden mit E. coli Stamm LE3092 Zellen und ungefähr 6 × 10⁴ pfu pro Platte plattiert. Den Platten wurde erlaubt, über Nacht bei 37°C zu inkubieren, und 30 Platten wurden für das Screening ausgewählt.
Duplikatfilter wurden für jede der 30 Platten präpariert. Jeder Filter wurde durch Auflegen einer Platte mit einer HYBOND Nylonmembran (Amersham) gemäß den durch den Hersteller empfohlenen Verfahren präpariert. Die Filter wurden von den Platten abgehoben, und die Zellen wurden in 1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH für 5 Minuten bei Raumtemperatur lysiert. Die Filter wurden für 5 Minuten in 1 M Tris-HCl (pH 7,5), 1,5 M NaCl neutralisiert, und die Filter wurden mit 1200 μJoule UV Energie in einem STRATALINKER (Stratagene Cloning Systems) fixiert. Nachdem die Filter fixiert waren, wurden die Filter dreimal in 0,25× SSC, 0,25% SDS, 1 mM EDTA bei 65° C vorgewaschen. Nach Vorwaschen wurden die Filter in 6 Chargen von 10 Filtern aufgeteilt, die in einer Prähybridisierungslösung (5× SSC, 5× Denhardt's Lösung, 0,2% SDS, 1 mM EDTA) prähybridisiert wurden, die durch einen 0,45 μm Filter filtriert wurde und zu der eine finale Konzentration von 100 μg/μl hitzedenaturierter Lachssperma DNA unmittelbar vor der Verwendung hinzugefügt wurde. Die Filter wurden bei 65°C über Nacht prähybridisiert.
Die menschliche Glucagonrezeptor cDNA von p40-2-2 wurde unter der Verwendung des Amersham MEGAPRIME Kits (Amersham) unter der Verwendung des durch den Hersteller empfohlenen Verfahrens zufällig geprimed. Die Prähybridisierungslösung jeder Charge an Filtern wurde durch frische Prähybridisierungslösung ersetzt, die 28,5 × 10⁶ cpm an Sonde enthielt. Die Filter wurden dann für 20 Stunden bei 65°C hybridisiert. Nach der Hybridisierung wurde die Hybridisierungslösung entfernt, und die Filter wurden vier- oder fünfmal jeweils in einer Waschlösung enthaltend 0,25× SSC, 0,2% SDS, 1 mM EDTA bei Raumtemperatur gespült. Nach dem Spülen wurden die Filter in 8 aufeinander folgenden Waschungen bei 65°C in der Waschlösung gewaschen, gefolgt von einem finalen Waschschritt bei 70°C. Nach der 70°C-Waschung wurden die Filter gegenüber Autoradiographiefilm (XAR-5; Eastman Kodak Co.; Rochester, NY) für 4 Tage bei –70°C mit einem Verstärkungsschirm ausgesetzt.
Die Untersuchung der Autoradiographien ergab die Anwesenheit von 4 Regionen an Hybridisierung mit der radiomarkierten Probe. Ein Agarstöpsel aus jeder der 4 Regionen wurde für die Reinigung ausgestochen. Jeder Agarstöpsel wurde über Nacht in SM (Maniatis et al., eds,, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, 1982; die hier in ihrer Gesamtheit aufgenommen ist), 1% Chloroform eingeweicht. Nach der Inkubation über Nacht wurde der Phage aus jedem Stöpsel 1:1000 SM verdünnt. Aliquots von 5,25 und 50 μl wurden mit E. coli Stamm LE392 Zellen plattiert. Die Platten wurden inkubiert und einzelne Abzüge wurden von den Platten der 5 und 25 μl Plattierungen präpariert. Die Filter wurden präpariert, prähybridisiert und hybridisiert und gewaschen wie oben beschrieben. Die Filter wurden gegenüber Autoradiographiefilm ausgesetzt.
Die Untersuchung der Autoradiographien ergab positiv markierte Regionen von jedem der 4 Klone. Eine Gesamtzahl von 10 Agarstöpseln wurde aus den positiven Bereichen ausgestochen, wobei diese mindestens 2 positive Bereiche für jeden des Ausgangsklons darstellten. Die Agarstöpsel wurden wie oben beschrieben behandelt. Der Phage aus jedem Agarstöpsel wurde 1:10.000 in SM verdünnt. Aliqouts von 2,5 und 10 μl wurden mit E. coli Stamm LE392 Zellen plattiert. Die Platten wurden inkubiert, und einzelne Abzüge wurden von den Platten präpariert, die geeignet beabstandete Plaques aufwiesen. Die Filter wurden präpariert und hybridisiert wie oben beschrieben. Photoradiographien der Filter ergaben Bereiche von Aussetzen, die einzelnen Plaques entsprachen. 12 positive Plaques wurden ausgestochen, die mindestens einem Klon von jedem der vier original Positiven entsprachen. Ein Plaque von jeder Platte wurde für die weitere Analyse ausgewählt.
Agarstöpsel aus den Phagenklonen 2-2-1, 3-1-1, 14-2-1 und 11-2-1 wurden wie oben beschrieben behandelt. Der Phage wurde 1:1000 in SM verdünnt und in eine Kultur von E. coli Stamm LE932 Zellen geimpft. Doppelstränige DNA wurde im wesentlichen wie beschrieben durch Grossberger (Nucl. Acids Res. 15: 6737, 1987; die hier durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen ist) präpariert. Die doppelsträngige DNA wurde mit Xba I verdaut, um das genomische Insert freizusetzen. Agarosegelelektroporese zeigte, daß die Klone 2-2-1 und 11-2-1 ein 9 kb Xba I Insert enthielten, Klon 14-2-1 enthielt ein 15 kb Insert und 3-3-1 enthielt ein 13 kb Insert. Southern Blot Analyse von Xba I verdaute und Xba I-Bam HI verdauten Klonen zeigte, daß die menschliche Glucagonrezeptor cDNA an die in Tabelle 6 gezeigten Fragmente hybridisierte.
Tabelle 6
Klone 11-2-1 und 14-2-1 wurden für die weitere Analyse ausgewählt. Klon 2-2-1 schien zu Klon 11-2-1 identisch zu sein und wurde keiner weiteren Analyse unterzogen. Zur Bequemlichkeit wurden die Namen der Klone wie in Tabelle 6 widergespiegelt geändert. Doppelsträngige DNA wurde aus jedem Phagenklon zur Subklonierung in einem Plasmidvektor unter der Verwendung des im wesentlichen durch Maniatis beschriebenen Verfahrens präpariert. Die DNA wurde mit Xba I verdaut, Gel-gereinigt und in Plasmid pBLUESCRIPT SK⁺ (Stratagene Cloning Systems) subkloniert, das durch Verdau mit Xba I linearisiert wurde und mit Kälber-alkalischer Phosphatase behandelt wurde, um eine Rezirkularisierung zu verhindern. Die Ligationsgemische wurden in ELECTROMAX DH10B Zellen (GIBCO-BRL) in einem BioRad GENEPULSER (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) bei 400 Ohm, 25 μFarad und 2,3 kVolt elektroporiert. Plasmid DNA wurde von ausgewählten Transformanten präpariert. Die Klone, die genomische Inserts von Klonen 6 und 2 enthielten, wurden jeweils als pSLHGR6 und pSLHGR2 benannt. Die Klone pSLHGR6 und pSLHGR2 wurden sequenziert. Die Sequenzanalyse und der Vergleich mit der kodierenden Region der menschlichen Glucagonrezeptor cDNA ergab die Anwesenheit von 12 Exons, enthaltend die kodierende Region. Chromosomale Positionsanalyse wurde an Methaphase-Chromosomenausbreitungen, die im wesentlichen durch Durnam et al. beschrieben präpariert wurden (Mol. Cell. Biol. 8: 1863–1867, 1988; die hier durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen ist) unter der Verwendung einer biotinylierten menschlichen Glucagonrezeptor-Gensonde und einer Chromosom 17-spezifischen Centromersonde durchgeführt. Die Denaturierung von Chromosomen, Hybridisierung und Einzelfarbnachweis wurden im wesentlichen wie durch Pinkel et al. (Proc. Natl. Acad. Sci USA 83: 2934–2938, 1986; die hier durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen ist) durchgeführt und modifiziert durch Kievits et al. (Cytogenet. Cell Genet. 53: 134–136, 1990, die durch Bezugnahme hier in ihrer Gesamtheit aufgenommen ist), mit der Ausnahme, daß die Hybridisierung in 65% (Vol/Vol) Formamid/10% Dextransulfat/ 2× SSC durchgeführt wurde und die Post-Hybridisierungswaschungen mit 65 Formamid/ 2× SSC bei 42°C und dann 0,1× SSC bei 55°C wie beschrieben von Palmiter et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6333–6337, 1992, die hier in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme aufgenommen ist) durchgeführt wurden. Die q²⁵ Position wurde durch DAPI Färbung von einigen hybridisierten Metaphaseausbreitungen, wie beschrieben von Testa et al. (Cytogenet. Cell Genet. 60: 247–249, 1992; die hier durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen ist), bestätigt. Die DAPI Färbung produzierte eine Q-Band-ähnliches Muster.
Die amplifizierte menschliche Platzenta-genomische Bibliothek (Stratagene) wurde ohne Erfolg auf ein Glucagonrezeptorgen unter der Verwendung des Verfahrens im wesentlichen wie oben beschrieben hin gescreent. Kurz, wurde die Bibliothek titriert und E. coli Stamm LE392 Zellen und ungefähr 5 × 10⁴ pfu wurden auf jeder von 30 150-mm Platten plattiert. Zusätzlich wurden 11 150-mm Platten jede mit ungefähr 10⁵ pfu und E. coli Stamm LE392 Zellen plattiert. Den Platten wurde es ermöglicht, über Nacht bei 37°C zu inkubieren, und 38 Platten wurden für das Screening ausgewählt.
Nylonfilterabzüge wurden präpariert, gewaschen und prähybridisiert, wie oben beschrieben. Das menschliche Insel-Glucagonrezeptor cDNA Fragement G30 (Beispiel 4) wurde unter der Verwendung des Amersham MEGAPRIME Kits (Amersham) unter der Verwendung des durch den Hersteller empfohlenen Verfahrens zufällig geprimed. Die Prähybridisierungslösung aus jeder Charge an Filtern wurde durch frische Prähybridisierungslösung, enthaltend 1,1 × 10⁶ cpm Sonde ersetzt. Die Filter wurden bei 75°C über Nacht hybridisiert. Nach der Hybridisierung wurde die Hybridisierungslösung entfernt, und die Filter wurden vier- oder fünfmal jeweils in einer Waschlösung, enthaltend 0,25× SSC, 0,25% SDS, 1 mM EDTA bei Raumtemperatur gespült. Nach dem Spülen wurden die Filter in 8 aufeinander folgenden Waschungen bei 65°C in der Waschlösung gewaschen. Nach der 70°C-Waschung wurden die Filter gegenüber Autoradiographiefilmen (XAR-5; Eastman Kodak Co.) für 4 Tage bei –70°C mit einem Verstärkungsschirm exponiert.
Die Untersuchung der Autoradiographien ergab keine überzeugenden positiven Signale, jedoch wurden sieben Bereiche, die schwach markierten Regionen entsprachen, zur weiteren Analyse ausgestochen. Die Klone wurden einem zweiten Screen wie oben beschrieben unterzogen, jedoch zeigten die Autoradiographien des zweiten Screenings keine markierten Bereiche. Diese Klone wurden nicht weiter verfolgt.
Beispiel 8
EXPRESSION EINER GLUCAGONREZEPTOR CDNA IN SÄUGERZELLEN
A. Expression eines Ratten-Glucagonrezptors in BHK570 Zellen
Plasmid pLJ4 wurde mit Plasmid pLJI in BHK570 Zellen co-transfiziert (hinterlegt bei der American Type Culture Collection unter Zugangsnummer 10314), unter der Verwendung des Kalziumphosphat-Verfahrens, im wesentlichen wie durch Graham und Van der Eb (Virology 52: 456, 1973; die durch Bezugnahme hier in ihrer Gesamtheit aufgenommen ist), beschrieben. Plasmid pLJI wurde von Plasmid p416 abgeleitet, das den Adenovirus 5 Ori, SV40 Enhancer, Adenovirus 2 Haupt-späten Promotor, Adenovirus 2 Tripartit-Vorläufer, 5' und 3' Splice-Stellen, die DHFR^T cDNA, das SV40 Polyadenylierungssignal und pML-1 Vektorsequenzen umfaßt (Lusky and Botchan, Nature 293: 79–81, 1981). Die Eco RI-Xba I DHFR Expressionseinheit aus p416 wurde in pUC18 ligiert, der durch Verdau mit Eco RI und Xba I linearisiert wurde, um so Plasmid pLJI zu konstruieren. Die transfizierten Zellen wurden in Wachstumsmedium angezogen (Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium (DMEM) enthaltend 10% fötales Kälberserum, 1× PSN Antibiotikumgemisch (GIBCO BRL 600–5640) und 2,0 mM L-Glutamin). Nach ein paar Tagen nicht-selektivem Wachstumsmedium wurde das Wachstumsmedium durch Selektionsmedium ersetzt (Wachstumsmedium, enthaltend 250 mM Methotrexat (MTX)). Die Zellen wurden aufgeteilt und 1:20 und 1:50 in dem Selektionsmedium in 10 cm Platten verdünnt. Nach 7–10 Tagen an Selektion in 250 mM MTX wurden die Kolonien unter der Verwendung von Klonierungszylindern in Wells von 24-Wellplatten ausgestochen. Die sich ergebenden Klone wurden wie oben beschrieben (Beispiel 3) auf die Fähigkeit hin getestet, Glucagon zu binden. Die Glucagonbindung wurde auch an Gesamtzellen durch Plattieren von 2 × 10⁵ Zellen jedes Klons in die Wells einer 24-Wellplatte durchgeführt. Die Platten wurden für 72 Stunden bei 37°C in 5% CO₂ inkubiert. Die Glucagonbindung wurde wie in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, daß nach der finalen PBS Waschung Zellen aus den Wells durch Trypsinisierung in Röhrchen entfernt wurden. Die Röhrchen wurden in einem Gamma-Zähler gezählt. Diejenigen Zellen, die die Höchstzahl von Zählungen aufwiesen und daher in der Lage waren, das meiste Glucagon zu binden, wurden für die weitere Charakterisierung ausgewählt. Die ausgewählten Transformanten wurden auch auf die Glucagon-vermittelten cAMP Antwort, wie beschrieben in Beispiel 8D, und die Glucagon-vermittelte intrazelluläre Kalziumantwort, wie beschrieben in Beispiel 8E, getestet. Glucagonbindungstests wurden auch an Membranpräparationen von den Transfektanten wie im folgenden beschrieben durchgeführt.
B. Glucagonbindung unter der Verwendung von Membranpräparationen
Membranen aus den pLJ4 BHK Transfektanten wurden mit Rattenleber-Membranpräparationen auf die Fähigkeit hin verglichen, ¹²⁵J-Glucagon zu binden. Die Membranen wurden im wesentlichen wie durch Rodbell et al. (J. Biol. Chem. 246: 1861–1871, 1971, die hier durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen ist) präpariert präpariert. Zwei Chargen von Lebermembranen wurden jeweils aus ungefähr 80 g Leber und 12–16 enthaupteten jungen weiblichen Ratten präpariert. Die Lebern wurden schnell entfernt und in einem Gefäß auf Eis platziert. Die Lebern wurden in 10 g Portionen aufgeteilt. Die Portionen wurden mit Scheren zerhackt und das Bindegewebe wurde während des Hack-Verfahrens entfernt. Die Teile wurden getrennt in einem Dounce Homogenisator homogenisiert. Zu jedem Teil wurden 25 ml Medium (Tabelle 2) zu dem gehackten Gewebe in dem Homogenisator hinzugefügt, und das Gewebe wurde in einem Eiskorb mit 8 kräftigen Stößen des losen Stempels homogenisiert. Nach Homogenisierung wurden die Homogenate in 450 ml kaltem Medium (Tabelle 2) vereinigt. Die vereinigten Homogenate wurden für 3 Minuten gerührt und durch 2 Lagen von Käsetuch filtriert, gefolgt von Filtrieren durch 4 Lagen von Käsetuch. Die Homogenate wurden dann für 30 Minuten bei 1500 × g bei 4°C zentrifugiert. Die Überstände wurden abgegossen und die Pellets wurden in einem sauberen Dounce Homogenisator vereinigt. Die Pellets wurden mit 3 sanften Stößen des losen Stempels resuspendiert. Die resuspendierten Pellets wurden in ein 250 ml graduiertes Gefäß, enthaltend 62 ml 69% Saccharoselösung (Tabelle 2), abgegossen. Destilliertes Wasser wurde bis auf ein Gesamtvolumen von 110 ml hinzugefügt, und das Gemisch wurde kräftig gemischt und kühl gehalten. Die Konzentration der Lösung wurde auf 44,0% +/– 0,1% unter der Verwendung von 69% Sacharose oder Wasser eingestellt, wie durch ein Refraktometer (Bausch & Lomb, Rchester, NY) gemessen. Die Saccharose-Suspension wurde gleich in 25 × 89 mm Ultrazentrifugenröhrchen aufgeteilt. Jede Suspension wurde sorgfältig mit 20 ml 42,3% Saccharoselösung (Tabelle 2) überschichtet und die Suspensionen wurden für 150 Minuten bei 24000 U/min SW28 Rotor (Sorvall, Dupont Company, Wilmington, Del.) bei 4°C zentrifugiert.
Nach der Zentrifugation wurde das fließende Material von jedem Röhrchen durch Aspiration in eine 10 ml Spritze durch eine 18-Gauge Nadel entfernt. Das Material aus jedem Röhrchen wurde in ungefähr 10 ml Medium (Tabelle 2) durch Aufziehen und Ausstoßen des Gemisches durch die Nadel in ein Zentrifugenröhrchen vereinigt und resuspendiert. Das Röhrchen wurde mit Medium gefüllt (Tabelle 2) und für 15 Minuten bei 15000 U/min in einem SS-34 Rotor (Sorvall) zentrifugiert.
Der Überstand wurde sorgfältig abgegossen und verworfen. Das Pellet wurde in Medium (Tabelle 2) resuspendiert und wurde 1:1000 mit destilliertem Wasser verdünnt. Die Absorption wurde in 1 cm Küvetten abgelesen, um die Proteinkonzentration zu bestimmen. Die Proteinkonzentration wurde unter der Verwendung der Formel:
bestimmt. Die Membranpräparation wurde aliquotiert, in einem Trockeneis/Ethanol-Bad schnell gefroren und bei –80°C gelagert.
Membranen wurde aus BHK Transfektanten präpariert, die bis auf Konfluenz in 150-mm Platten in Selektionsmedium angewachsen waren. 2 Platten von konfluenten Transfektanten wurden zweimal mit kalter Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS: Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) gespült, und 10 ml PBS, enthaltend 1 mM PMSF, wurde zu jeder Platte hinzugefügt. Die Zellen aus jeder Platte wurden in die PBS Lösung abgeschabt, und die Zellen aus jeder Platte wurden dann in frische Röhrchen transferiert. Jede Platte wurde mit 5 ml PBS enthaltend 1 mM PMSF gespült, und die Spülungen wurden mit ihren jeweiligen Zellen vereinigt. Die Zellen wurden bei 2000 U/min in einer Tischzentrifuge bei 4°C zentrifugiert. Die Überstände wurden verworfen und die Zellen wurden in 30 ml 5 mM Hepes, 1 mM PMSF, pH 7,5 resuspendiert. Die Zellen wurden auf Eis für 15 Minuten inkubiert, gefolgt von Zentrifugation bei 47800 × g bei 4°C. Jedes Pellet wurde in einer Lösung von PBS enthaltend 1 M PMSF resuspendiert, aliquotiert und bei –80°C eingefroren.
Die Kompetitionsanalyse unter der Verwendung von Glucagonbindungstests wurde mit den Rattenleber- und BHK-Transfomanten Membranpräparationen durchgeführt. Kurz wurden Reaktionsgefäße, die 20 μl Glucagon von 10^–11 M bis 10^–6 M verdünnt enthielten in 10 mM HOAc oder 20 μl von BSA angesetzt. Zu jedem Röhrchen wurden 100 μl von 2 × Bindepuffer, 20 μl ¹²⁵J-Glucagon (Amersham), 20 μl 12 mM NaHCO₃, 20 μl 10 mM HOAc, 0,5% BSA (Novo Nordisk N/A, Bagsvaerd, Dänemark) und 40 μl destilliertes Wasser hinzugefügt. Die Bindungsreaktion wurde durch die Hinzufügung von 20 μl einer Membranpräparation zu den Reaktionsröhrchen gestartet. Die Reaktionen wurden ungefähr 30 Minuten bei 30°C inkubiert. Die Membranen wurden durch Zentrifugation in einer Mikrofuge bei hoher Geschwindigkeit für 10 Minuten bei 4°C pelletiert. Die Überstände jeder Probe wurden ausgeblasen und die Pellets wurden gezählt. Die Kompetition mit nichtmarkiertem Glucagon ergab nahezu identische Sigmoidalekurven für die Glucagonbindung (3). Durch Scatchard-Analyse (Scatchard, Ann. N. Y. Acad. Sci. 51: 660–672, 1949, die hier durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen ist) ist der ersichtliche Kd 50 nM für den klonierten Rezeptor und 49 nM für Rattenlebermembran (4).

Die Spezifität des durch pLJ4 kodierten Rezeptors wurde auf die Fähigkeit von verwandten Peptidhormonen hin getestet, um die ¹²⁵J-Glucagonbindung kompetitiv zu sein. Mikromolare Mengen von Glucagon und verwandten Peptiden (Tabelle 7) wurden jeweils mit ¹²⁵J-Glucagon zu Membranpräparationen der pLJ4 Transfektanten in den oben beschriebenen Bindungstests hinzugefügt. Nur natives Glucagon und der Antagonist des-His¹[Glu⁹]Glucagonamid waren in der Lage, mit dem ¹²⁵J-Glucagon um die Bindung an die Membranen kompetitiv zu sein. Tabelle 7

1 μM	menschliches Glucagon (Sigma)
1 μM	des-His¹ [Glu⁹]Glucagonamid (synthetisiert auf einem Applied Biosystems 431A Peptidsynthesizer unter der Verwendung von RINK AMIDE MBHA Harz (Bachem Bioscience Inc., Philadelphia, Penn.))

200 nM	menschliches Glucagon-ähnliches Peptid (GLP) (Sigma)
20 nM	Schweine vasoaktives intestinales Peptid (VIP) (Sigma)
1 μM	Lachs Calcitonin (Sigma)
1 μM	Schweinesekretin (Sigma)
1 μM	Rinder Parathyroidhormon (PTH) (Sigma)

C. Expression eines Rattenglucagognrezeptors in COS-7-Zellen
Die Fähigkeit von COS-7 Zellen, die mit pLJ4 transfiziert waren durch Glucagon stimuliert zu werden, um die cAMP Spiegel zu erhöhen wurde unter der Verwendung eines Amersham SPA Kit (Amersham) wie unten beschrieben (Beispiel 8D) ermittelt. Der Test zeigte, daß die Glucagon-stimulierten pLJ4 Transfektanten ungefähr fünfmal mehr cAMP akkumulieren, als nur mit Kontrollvektor transfizierte COS-7-Zellen. Die verwandten Peptide Sekretin, VIP, PTH, GLP und Calcitonin wurden jeweils zu Transfektanten bei Konzentrationen von 100 nM bis 1000 nM hinzugefügt und auf ihre Fähigkeit hin getestet, cAMP Spiegel zu induzieren.
Die Ergebnisse dieser Tests zeigten, daß keines der verwandten Peptide in der Lage war, signifikante Erhöhungen in cAMP Spiegeln zu induzieren.
D. Luciferase und Adenylatcyclase Aktivitätstests mit gesamten Zellen
Die Rattenglucagonrezeptor cDNA wurde in einer BHAK570 Zelllinie exprimiert, die stabil mit ZK6 transfiziert war, einer Expressionseinheit umfassend einen Promotor enthaltend mindestens ein zyklisches AMP Antwortelement, die Luciferase cDNA und den hGH Terminator. Diese Zellinie ermöglicht die Messung von Luciferaseaktivität, Adenylatcyclaseaktivität und intrazelluläre Kalziumkonzentrationen in Antwort auf Glucagonbindung an seinen Rezeptor.
Das Proencephalin zyklisches AMP Antwortelement (CRE) in Plasmid ZK6 wurde aus Zem233 erhalten. Zem233 war von den Plasmiden Zem67 und Zem106 abgeleitet. Plasmid Zem106 wurde aus dem Vorläufer Zem93 konstruiert. Um Zem93 zu konstruieren, wurde ein Kpn I-Bam HI Fragment, umfassend den MT-1 Promotor aus MThGH111 (Palmiter et al., Science 222: 809–814, 1983) isoliert und in pUC18 inseriert. Plasmid Zem93 wurde dann mit Sst I verdaut und religiert, um Plasmid Zem106 zu erzeugen, worin ungefähr 600 bp der Sequenz 5' zu dem MT-1 Promotor entfernt waren.
Ein Proencephalin CRE wurde in das 5' Ende des SV40 Promotors in Zem106 durch zuerst verdauen von Zem106 mit Eco RI und Sst I, um das Vektor-enthaltende Fragment zu isolieren, insertiert. Die Oligonukleotide ZC982 und ZC983 (jeweils SEQ ID NOs: 3 und 4) wurden so aufgebaut, um, wenn anhybridisiert, ein Proencephalin CRE von Nukleotiden –71 bis –133 (Com et al., Nature 323: 353–356, 1986), flankiert von einer 5' Eco RI Stelle und einer 3' Sst I Stelle zu kodieren. Die Oligonukleotide ZC982 und ZC983 (jeweils SEQ ID NOs: 3 und 4) wurden Kinase-behandelt, anhybridisiert und mit dem linearisierten Zem106 ligiert, um Plasmid Zem224 zu erhalten.
Plasmid Zem67 wurde durch zuerst verdauen von pIC19R (Marsh et al., Gene 32: 481–486, 1984) mit Sma I und Hind III erhalten. Die Ori-Region von SV40 von Kartenposition 270 (Pvu II) bis Position 5171 (Hind III) wurde dann in das linearisierte pIC19R ligiert, um Plasmid Zem67 herzustellen. Das Hin III-Bam HI Neomycin Resistenz Gen-SV40 Terminatorfragment aus Plasmid pSV2-neo (American Type Culture Collection, Zugangsnummer 37149) wurde in Hind III-Bgl II verdautes Zem67 inseriert, um Zem220 zu erhalten.
Die SV40 Promotor-Neomycin Resistenzgen-SV40 Terminator-Expressionseinheit aus Plasmid Zem220 wurde als ein Eco RI Fragment isoliert. Plasmid Zem220 wurde mit Eco RI verdaut und mit Kälber alkalischer Phosphatase behandelt, um einen Rezirkularisierung zu verhindern. Die Neomycin Expressionseinheit und linearisiertes Zem224 wurden ligiert. Ein Plasmid, enthaltend den SV40 Promotor proximal zum CRE wurde als Zem233 bezeichnet.
Plasmid Zem233 wurde modifiziert, um eine weitere CRE Sequenz, eine TATA Box und ein Teil der lacZ kodierenden und Poly(A) Sequenzen unmittelbar 3' zu der Proencephalin CRE Sequenz zu inserieren, so daß die sich ergebende Expressionseinheit in der entgegenliegenden Orientierung relativ zu der Neomycin Resistenzexpressionseinheit, die in Zem233 vorhanden ist, vorhanden war. Plasmid Zem233 wurde durch Verdau mit Sst I und Bam HI linearisiert. Die Oligonukleotide ZC3509 und ZC3510 (jeweils SEQ ID NOs: 5 und 6) wurden so aufgebaut, daß, wenn anhybridisiert, die sich ergebende Duplex die α-Glycoprotein CRE (Delegeane et al., Mol. Cell. Biol. 7: 3994–4002, 1987) mit einem 5' Sst I adhäsiven Ende und einem 3' Eco RI adhäsiven Ende kodiert. Die Oligonukleotide wurden gemäß Standardverfahren anhybridisiert. Die Thymidinkinase TATA Box wurde als ein Eco RI-Pst I Fragment, überbrückend Nukleotide –79 bis +18 des Thymidinkinasegens (McKnight, Cell 31: 3 55–366, 1982) erhalten. Die 3' Sequenz des lacZ Gens und seine assoziierte Poly(A) Sequenz wurden als ein Pst I- Bam HI aus Plasmid pLacF (erhalten von Jaques Peschon, Immunex Corp., Seattle, Wash.) erhalten, das die lacZ kodierende Region und die Maus-Protaminterminator Sequenz, kloniert in den pUC18 Vektor, enthielt. Das Sst I-Bam HI linearisierte Zem233, der Sst I-Eco RI ZC3509/ZC3510 Adaptor, das Eco RI-Pst I TATA Box Fragment und die Pst I-Bam HI lacZ Sequenz wurden ligiert. Ein Plasmid, das die Expressionseinheit in der richtigen Orientierung relativ zu der Neomycin Resistenzgen Expressionseinheit von Zem233 enthielt, wurde als KZ5 bezeichnet.
Die Luciferasegen und menschliches Wachstumshormon (hGH) Terminatorsequenzen wurden verwendet, um die lacZ kodierenden und Poly(A) Sequenzen, die in KZ5 vorhanden waren, zu ersetzten. Das Luciferasegen wurde ursprünglich aus Plasmid α-168luc (Delegeane et al., Mol. Cell. Biol. 7: 3994–4002, 1987; und de Wet e al., Mol. Cell. Biol. 7: 725–737, 1987) als ein 1,7 kb Xho I-Xba I Fragment erhalten. Der hGH Terminator wurde als ein Xba I-Sal I Fragment aus Zem219b (hinterlegt als eine E. coli Transformante bei der American Type Culture Colletion (Rockville, Md.) unter Zugangsnummer ATCC 68979) erhalten. Die Luciferasegen und hGH Terminatorsequenzen wurden zur Bequemlichkeit in Xho I-Sal I linearisierten pIC 19H (Marsh et al., ibid.) subkloniert. Das sich ergebende Plasmid KZ8 wurde mit Xho I und Sal I verdaut, um die Luciferase-hGH Terminatorsequenzen zu isolieren. Plasmid KZ5 wurde mit Sal I verdaut, um das im Vektor enthaltene Fragment zu isolieren und wurde Kälber-alkalische Phosphatase behandelt, um eine Rezirkularisierung zu verhindern. Das Xho I-Sal I Luciferase-hGH Terminatorfragment wurde mit dem Sal I-verdauten KZ5 ligiert. Ein Plasmid, enthaltend den Luciferase-gGH Terminator in der richtigen Orientierung relativ zu dem Promotor wurde als KZ6 bezeichnet.
Plasmid KZ6 wurde in BHK570 Zellen (hinterlegt bei der American Type Culture Collection unter Zugangsnummer 10314) unter der Verwendung des Kalziumphosphatfällungsverfahrens, im wesentlichen wie beschrieben von Graham und Van der Eb (Virology 52: 456, 1973, die hier durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen worden ist) transfiziert. Die transfizierten Zellen wurden in Wachstumsmedium (Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium (DMEM), enthaltend 10% fötales Kälberserum, 1× PSN Antibiotikum-Mix (GIBCO-BRL) und 2,0 m M L-Glutamin) angezogen. Nach ein paar Tagen in nicht-selektivem Wachstumsmedium wurde das Wachstumsmedium durch G418 Selektionsmedium ersetzt (Wachstumsmedium enthaltend 500 μg/ml G418). Den Zellen wurde es dann ermöglicht, bis zur Konfluenz zu wachsen, wonach sie trypsinisiert wurden und bei begrenzenden Verdünnungen in die Wells von 96-Wellplatten plattiert wurden. Die Zellen wurden für 1 bis 2 Wochen in G418 Selektionsmedium angezogen. Klone aus Wells, die Einzelkolonien enthielten, wurden auf ihre Fähigkeit hin getestet, auf Forskolin in dem oben beschriebenen Luciferasetest zu antworten. Forskolin erhöht den zellulären cAMP Spiegel und daher die damit zusammenhängenden cAMP-abhängigen biologischen Antwortsignalwege auf eine Rezeptorunabhängige Weise. Ein Klon, der in der Lage war, auf Forskolin zu antworten, wurde als BHK/KZ6-19-46 bezeichnet.
BHK/KZ6-19-46 Zellen wurden mit pLJ4 und pLJI oder mit pZCEP und pLJI (pZCEP Transfektanten wurden als negative Kontrollen verwendet) wie oben beschrieben unter der Verwendung von Kalziumphosphat-vermittelter Transfektion co-transfiziert. Die Transfektanten wurden in 250 nM Methotrexat wie vorher beschrieben selektiert.
Die Transfektanten wurden in dreifachen Ansätzen auf eine Induktion der CRE-Luciferaseantwort durch ausgewählte Agoisten getestet. 6 zufällige pLJ4 Transfektanten wurden getestet und zufällige pZCEP Transfektanten wurden getestet (negative Kontrollen). Mikrotitertestplatten wurden angesetzt, so daß jeder Well 2 × 10⁴ Zellen in 100 μl Selektionsmedium enthielt, und die Zellen wurden über Nacht angezogen. Die Agonisten wurden in Selektionsmedium bei der angeführten 2× finalen Testkonzentration präpariert:
1 μM Glucagon
200 nM Glucagon-ähnliches Peptid (GLP)
20 nM vasoaktives intestinales Peptid (VIP)
100 nM Calcitonin (CT)
20 μM Forskolin (CalBiochem, San Diego, California)
Die Induktion wurde durch die Hinzugabe von 100 μl für jede 2× Lösung in dreifachen Probenwells gestartet. Nicht induzierte Spiegel wurden in dreifachen Wells bestimmt, zu denen 100 μl DMEM, enthaltend 10% fötales Kälberserum hinzugefügt wurden. Die Platten wurden für 4 Stunden bei 37°C, 5% CO₂ inkubiert, um eine Induktion der Luciferaseproduktion zu ermöglichen.
Im Anschluß an die Induktion wurde das Medium entfernt und die Wells wurden einmal in 200 μl/Well PBS gewaschen. Nach der Waschung wurden 25 μl 1× Zellkultur Lyse-Reagenz (Luciferase Testsystem, Promega Corp., Madison, Wis.) zu jedem Well hinzugefügt, und die Platten wurden für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden dann in ein Labsystems Luminoskan Mikrotiterluminometer (Labsystems Inc., Morton Grove, Ill.) transferiert, das 40 μl Luciferase Testsubstrat (Luziferase Testsystem, Promega) hinzufügte, die Reaktion für 3 Sekunden mischte und das Luciferasesignal für 2 Stunden pro Well integrierte. Die Stärke der Induktion von Luciferase von jeden Agonisten wurde wie folgt berechnet:
Ein pLJ4 Transfektantenklon, KZ6/rGR-DHFR-2, zeigte ein 6–10 fache Induktion von Luciferase durch Glucagon, wurde jedoch nicht durch GLB, VIP oder CT induziert.
Die cAMP Antwort des Transfektantenklons KZ6/rGR-DHFR-2 auf Glucagon und Forskolin wurde auch durch Radioimmuntest unter der Verwendung des cAMP [¹²⁵J] Szintillations-Proximitätstestsystems (Amersham) unter der Verwendung der Anweisungen des Herstellers getestet. Kurz, wurden 100 μl 2 × 10⁵ Zellen pro ml KZ6/rGR-DHFR-2 Zellen in die Wells einer Multi-Well Kulturschale plattiert und über Nacht in Selektionsmedien angezogen. Glucagon und Forskolin wurden in DMEM, 10% fötalem Kälberserum, 10 μM IBMX bei jeweils 0,0001–1000 nM und 25 μM präpariert.
Die Wachstumsmedien wurden durch 50 μl/Well von Agonist (entweder Glucagon oder Forskolin) ersetzt. Die Zellen wurden im Agonisten für 10 Minuten bei 37°C, 5% CO₂ inkubiert. Im Anschluß an die Inkubation wurden die Zellen durch die Hinzufügung von 200 μl kochendem Wasser zu jedem Well lysiert. Nach 15 Minuten wurden die Überstände gesammelt und 1:5 oder 1:40 in Acetatpuffer (cAMP [¹²⁵J] Szintillations-Proximitätstestsystem (Amersham)) verdünnt. Die Proben wurden unter der Verwendung von Triethylamin und Essigsäureanhydrid gemäß dem durch den Hersteller zur Verfügung gestellten Protokoll acetyliert.
Ein 100 μl Aliquot von jeder acetierten Probe wurde mit 75 μl eines ¹²⁵J-cAMP, 75 μl snti-Succinyl cAMP Antiserum und 75 μl Esel-Anti-Kaninchen IgG-gekoppelten SPA Perlen (alle Testlösungen wurden in dem cAMP [¹²⁵J] Szintillations-Proximitätstestsystem (Amersham) zur Verfügung gestellt) in einem Well eines LKB 7-Tabletts kombiniert. Die Tabletts wurden versiegelt und über Nacht unter kontinuierlichem Schütteln auf einem Rotationsplattformschüttler bei 200 U/min inkubiert. Die Proben wurden in einem 1205 BETAPLATE Flüssigszintillationszähler (Pharmacia LKB Instruments Inc., Gaithersburg, Md.) gezählt. Eine Standardkuve von 2-128 fmol acetyliertem cAMP wurde auch durchgeführt. Gesamtes gebundenes ¹²⁵J-cAMP und nicht-spezifische Verbindungen wurden ebenfalls bestimmt. KZ6/rGR-DHR-2 zeigte eine 140-fache Induktion der cAMP Spiegel bei Sättigung mit Glucagon (10–100 nM) und eine ED₅₀ von 0,25 nM.
E. Intrazelluläre Kalziumkonzentrations Bestimmung
Die intrazellulären Kalziumantworten von pLJ4 Transfektanten auf Glucagon wurden unter der Verwendung des Verfahrens im wesentlichen beschrieben durch Grynkiewicz et al. (J. Biol. Chem. 260: 3440–3450, 1985, die hier durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen ist) getestet. Plasmid pLJ4 BHK-Transfektanten wurden bei 5 × 10⁴ Zellen pro Kammer in 2 Well Deckglaskammern (NUNC) ausgesät. Die Zellen wurde für zwischen 1 und 3 Tagen unter normalen Kulturbedingungen in Methotrexat-Selektionsmedium angezogen. Das Medium wurde durch Ausblasen entfernt und die Kammern wurden zweimal mit 1 ml Imaging Puffer (Tabelle 3) gespült. Die Zellen wurden für 30 Minuten im Dunklen bei Raumtemperatur mit 0,5 ml Fura-2 AM Lösung (Tabelle 3) inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Fura-2 AM Lösung entfernt, und die Zellen wurden dreimal mit 1 ml Imaging Puffer gespült. Nach der finalen Spülung wurden 0,5 ml des Puffers in jeder Kammer zurückgelassen. Die Zellen wurden bei Raumtemperatur von 30 bis 120 Minuten im Dunkeln gehalten.
Die Bildgebung wurde auf einem Nikon Diaphot Umkehr-Fluoreszenzmikroskop, ausgerüstet mit einer Quecksilberbogenlampe, und 10× und 40× Nikon Fluor Trockenobjektivlinsen durchgeführt. Die Experimente wurden unter der Verwendung einer Sun SPARC II Arbeitsstation und Inovision (Research Triangle Park, N. C.) RATIOTOOL Software kontrolliert und analysiert. Alternierende Exzitationswellenlängen wurden durch diese Software durch ein automatisiertes Filterrad, das 340 nm und 380 nm Band passierende Filter enthielt, kontrolliert. Die Emissionsbilder wurden durch einen dichroischen Spiegel (380 nm Ausschluß) zu einer Dage-MIT 72 CCD Kamera gerichtet, die mit einem Genesis II Bildverstärker ausgerüstet war und digital durch die Software aufgezeichnet.
Die intrazelluläre Calciumkonzentration wurde durch berechnen eines Verhältnisses von Emissionsintensitäten bei jeder der 2 Excitationswellenlängen (340/380) für jeden Pixel des digitalen Mikroskopbildfelds (512 × 480 Pixel) verfolgt. Grynkiewicz et al. (ibid.) haben gezeigt, daß dieses Verhältnis mit der Kalziumkonzentration zusammenhängt, die durch den Fura-2 Farbstoff innerhalb der Zellen gesehen wird, die das Acetoxymethylderivat (Fura-2 AM) aufgenommen und deesterifiziert haben, das dazu verwendet wurde, um die Zellen zu beladen. Die RATIOTOOL Software stellt diese Information als ein Falschfarbenbild dar, das auf die Calciumkonzentration kalibriert werden kann. Die Bilder wurden aufgenommen und diese Berechnung wurde in 5-sekündigen Intervallen während jedes Experiments durchgeführt.
Die Zellen wurden für mindestens 60 Sekunden (12 Bilder) verfolgt, um Basislinienbedingungen vor der Stimulation zu etablieren. Die Stimulation wurde durch Hinzufügen von 0,5 ml Imaging Puffer, enthaltend 200 nM Glucagon, zu 0,5 ml Imaging Puffer in der Deckglas-Kammer durchgeführt, was zu einer 100 nM finalen Konzentration führte. Die Zellen wurden verfolgt und die Bilder wurden für mindestens 3 Minuten nach der Stimulation aufgezeichnet.
Die Verhältnisbilder, die einer Zahl von Zellen in jedem Feld entsprachen wurden als sich dramatisch verändernd beobachtet, kurz nach der Hinzufügung von Glucagon. Dies wurde unter der Verwendung der RATIOTOOL Software quantifiziert, um so einen Mittelwert für spezifische Regionen der Verhältnisbilder zu berechnen, der jedem der antwortenden Zellen entsprach. Zellen mit einem durchschnittlichen Ruheverhältnis von ungefähr 1,4 stiegen schnell auf einen Wert von 3–4 an. Sie verblieben für 40 bis 50 Sekunden bei diesem hohen Wert und nahmen dann allmählich zurück zur Ausgangslinie ab. Unabhängige Kalibrierungsexperimente zeigten, daß dies Veränderungen in der intrazellulären Calciumkonzentration von einem Ruhewert von ungefähr 150 nM zu einem Peak von ungefähr 400 nM widerspiegelt.
F. Inositolphosphat-Bestimmung
BHK-570 Zellen, die den Glucagonrezeptor aus pLJ4 exprimierten oder schein-transfizierte BHK 570 Zellen wurden in 24-Well Gewebekulturschalen bei ungefähr 200.000 Zellen pro Well plattiert. Nach 24 Stunden wurden die Zellen in jedem Well durch Inkubation in 0,5 ml MTX Sektionsmedien, enthaltend 2,0 μCi myo-(2-³H)-Inositol (spezifische Aktivität –20 Ci/mmol, Amersham) markiert. Am Ende einer 24-ständigen Inkubation wurden die Zellen mit 1 ml vorgewärmtem DMEM (Dulbecco's modifizierte Eagles Medium, JRH Biosciences, Lenexa, Kan.) gewaschen, das mit 20 mM Hepes, pH 7,0 Puffer (Sigma Chemical Co.) enthaltend 10 mM LiCl gepuffert wurde. Die Waschmedien wurden durch Ausblasen entfernt und durch 9 00 μl frische gepufferte Medien ersetzt. Die Zellen wurden für 5 Minuten bei 37°C inkubiert. Nach Inkubation wurde jeder Agonist oder Antagonist zu dreifachen Wells hinzugefügt und gemäß dem Volumen und den Bedingungen, wie in Tabelle 8 angegeben, inkubiert.
Tabelle 8
Die Reaktion wurde durch Platzieren der Glucagonzellen auf Eis beendet. Im Anschluß an die Aspiration der Medien wurden die Zellen durch die Hinzugabe von 1 ml kaltem DMEM und 1 ml eiskalter 10% Perchlorsäure lysiert. Nach 10 Minuten wurden die Zelllysate in Röhrchen auf Eis transferiert, von denen jedes 500 μl 10 mM EDTA, pH 7,0 enthielt. Die Proben wurden durch die Hinzufügung von 900 μl von 1,5 M KOH in 60 mM Hepes Puffer und tropfenweiser Hinzufügung der KOH-HEPES Lösung, bis ein pH zwischen 7 und 7,5 erreicht wurde, neutralisiert. Die neutralisierten Proben wurden bei –20°C über Nacht gefroren. Die gefrorenen Proben wurden aufgetaut und dem Präzipitat wurde es ermöglicht, sich von den Proben abzusetzen. Die Überstände wurden auf AMPREP Minisäulen (Amicon) aufgetragen, die nacheinander mit 5 ml jedem von Methanol und 1 M KHCO₃, gefolgt von einer Waschung mit 15 ml Wasser, gewaschen wurden. Nachdem die Proben aufgetragen wurden, wurde der Durchfluß gesammelt. Die Säulen wurden viermal mit 1 ml Wasser gewaschen und 1 ml Stichproben wurden nach jedem Waschen gesammelt. Die Inositolphosphate wurden aus der Säule durch aufeinander folgende 1 ml-Anwendungen von 0,25 M KHCO₃ eluiert, wobei 1 ml Stichproben nach jeder Anwendung gesammelt wurden. 10 ml von OPTIFLUOR (Packard Instruments Co., Menden, Conn.) wurden zu jeder Probe hinzugefügt, und die Proben wurden gezählt. Die Stimulierung des Inositolphosphat-Signalwegs wurde durch eine Zunahme in dem markierten Inositolphosphatspiegeln angezeigt. Es wurde keine Stimulierung der Inositolphosphatproduktion in irgendeiner Probe beobachtet.
G. Expression eines menschlichen Glucagonrezeptors in COS-7-Zellen
Plasmid pLJ6' wurde in COS-7-Zellen unter der Verwendung eines DEAE-Dextranverfahrens wie oben beschrieben transfiziert. Zellen wurden auf Glaskammerträgern (wie beschrieben im Beispiel 3) für 72 Stunden nach der Transfektion angezogen. Ein in situ Glucagon Bindungstest unter der Verwendung von ¹²⁵J-Glucagon, gefolgt von Emulsionsautoradiographie wurde wie im Bespiel 3 beschrieben durchgeführt. Mehr als 50% der Zellen, die mit pLJ6' transfiziert waren, banden Glucagon auf eine spezifische Weise.
H. Expression eines menschlichen Gluca og nrezeptors in BHK570 Zellen
BHK570 (hinterlegt bei American Type Culture Collection unter Zugangsnummer 10314) wurde mit Plasmid pLJ6' unter der Verwendung des Calciumphosphat Transfekionsverfahrens (Beispiel 8) transfiziert. Die transfizierten Zellen wurden in der Anwesenheit von G418 selektiert, bis einzelne Kolonien sichtbar waren. Einzelne Kolonien wurden unter der Verwendung von Klonierungszylindern geklont. Von den Klonen wurde gezeigt, daß sie Glucagon binden, wobei die in situ Bindung an jodiniertes Glucagon verwendet wurde, die wie oben beschrieben durchgeführt wurde.
Die pLJ6'-transfizierten Zellen wurden auf cAMP Akkumulation im wesentlichen wie in Beispiel 8C beschrieben hin getestet. Die Transfektanten wurden nach Stimulation mit Glucagon, Sekretin, VIO oder GLP-I getestet. Die Tests zeigten, daß die pLJ6'-transfizierten Zellen ansteigende Konzentrationen von cAMP im Anschluß auf Glucagon Stimulation akkumulierten, im Gegensatz zu Kontrollzellen. Die Stimulation der Transfektanten mit Sekretin, VIP oder GLP-I zeigte keine erhöhte cAMP Akkumulation. Die intrazelluläre Kalziumantwort wurde im wesentlichen wie in Beispiel 8E beschrieben bestimmt. Glucagon-stimmulierte pLJ6'-transfizierte Zellen zeigten eine Zunahme in den intrazellulären Kalziumspiegeln, wie durch einen schnellen Anstieg in der Fluoreszenz des Calciumindikators Fura-2 gezeigt. Diese Ergebnisse zeigen, daß pLJ6' für einen funktionellen menschlichen Glucagonrezeptor kodiert, der in der Lage ist, Glucagon zu binden und die Signaltransduktion erleichtert.
Aus dem Voranstehenden wird es ersichtlich sein, daß, obwohl spezifische Ausführungsformen der Erfindung hier für die Zwecke der Verdeutlichung beschrieben wurden, verschiedene Modifikationen gemacht werden können, ohne sich vom Geist und Bereich der Erfindung zu entfernen. Demzufolge ist die Erfindung nicht begrenzt, außer durch die beigefügten Ansprüche.

Claims

Isoliertes DNA-Molekül, das für einen Glucagonrezeptor oder für ein Glucagonrezeptorpeptid kodiert, wobei das Molekül eine Nukleotidsequenz umfaßt, ausgewählt aus: a) der Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 14 vom Nukleotid 145 bis zum Nukleotid 1599; b) der Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 14 vom Nukleotid 226 bis zum Nukleotid 570; c) der Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 24 vom Nukleotid 53 bis zum Nukleotid 1486. d) der Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 17, oder e) einer Nukleotidsequenz, die unter hoher Stringenz mit einer komplementären Nukleotidsequenz von a), b), c) oder d) hybridisiert.
DNA-Molekül nach Anspruch 1, wobei der Glucagonrezeptor oder das Glucagonrezeptorpeptid eine Aminosäuresequenz umfaßt, ausgewählt aus a) der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 15 vom Met, Aminosäure Nummer 1, bis zum Thr, Aminosäure Nummer 485; b) der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 15 vom Gln, Aminosäure Nummer 28, bis zum Tyr, Aminosäure Nummer 142; c) der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:25 vom Met, Aminosäure Nummer 1, bis zum Phe, Aminosäure Nummer 477, d) der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 18 oder e) einem Peptidfragment von a), b), c) oder d) von mindestens 10 Aminosäuren Länge.
DNA-Konstrukt, das ein erstes DNA-Segment umfaßt, das ein DNA-Molekül nach Anspruch 1 oder 2 ist, kodierend für einen Glucagonrezeptor oder ein Glucagonezeptorpeptid, funktionsfähig an ein weiteres DNA-Segment gebunden, das für die Expression des ersten DNA-Segments notwendig ist.
Verfahren zur Herstellung eines Glucagonrezeptors oder eines Glucagonrezeptorpeptids, umfassend das Kultivieren einer mit einem DNA-Konstrukt nach Anspruch 3 transformierten oder transfizierten Wirtszelle unter Bedingungen, die die Expression des ersten DNA-Segments fördern.
Isolierter Glucagonrezeptor oder Glucagonrezeptorpeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, die durch ein DNA-Molekül kodiert ist, das eine Nukleotidsequenz umfaßt, die ausgewählt ist aus: a) der Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 24 vom Nukleotid 53 bis zum Nukleotid 1486; b) der Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 17; oder c) einer Nukleotidsequenz, die unter hoher Stringenz mit einer komplimentären Nukleotidsequenz von a) oder b) hybridisiert.
Isolierter Antikörper, der spezifisch an einen Glucagonrezeptor nach Anspruch 5 bindet, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist, und wobei der Antikörper die Bindung von Glucagon an einen Glucagonrezeptor blockiert.
Sonde von mindestens 12 Nukleotiden zum Detektieren der Nukleinsäuren des Glucagonrezeptors, wobei die Sonde in der Lage ist, unter Bedingungen hoher Stringenz mit einem DNA-Molekül nach Anspruch 1 a), b), c) oder d) zu hybridisieren.
Verfahren zum Detektieren des Vorhandenenseins eines Glucagon-Antagonisten, das die Schritte umfaßt: a) Exponieren einer Verbindung bei Anwesenheit eines Glucagon-Agonisten gegenüber einem Glucagonrezeptor oder Glucagonrezeptorpeptid nach Anspruch 5, gekoppelt an einen Antwortweg unter Bedingungen und für eine Zeit, ausreichend, um das Binden der Verbindung an den Rezeptor und eine damit einhergehende Antwort bis einschließlich zum Antwortweg zu ermöglichen; und b) Detektieren einer Verringerung der Stimulation des Antwortwegs, resultierend aus dem Binden der Verbindung an den Glucagonrezeptor, relativ zur Stimulation des Antwortwegs durch den Glucagon-Agonisten allein und dadurch Bestimmen des Vorhandenseins eines Glucagon-Antagonisten.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Antwortweg ein Membran-gebundener, Adenylatcyclase-Antwortweg ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Antwortweg ein Luziferase-Nachweissystem beinhaltet.