JP5781308B2 - 異種タンパク質を得る方法およびインスリン類似体 - Google Patents
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Description
インスリン、インスリン類似体及び/又は派生物の組み換え型は様々な微生物発現系を生み出している。現在、大腸菌(E.coli)、サッカロマイセス・セレヴィシエ(S.cerevisiae)のような生命体は、組み換え型ヒトインスリン及びその派生物の商業生産に用いられている。低発現量、下流精製における困難性などのようなこれらの系のいくつかの不利点のため、メチロトローフ酵母であるピキア・パストリスの使用はタンパク質発現系として主流になっている。この発現系は、高い発現性、簡単な処理、低生産コスト、高濃度培養等のいくつかの利点をもたらす(米国特許第6800606号明細書)。
本発明の主目的は、精製された、酵母発現系において組み換え発現した生物活性異種タンパク質を得る方法を開発することであり、精製タンパク質は、グリコシル化副産物を有していない、又は、実質的に極少量のグリコシル化副産物を含むことを特徴とする。
本発明の他の目的は、宿主細胞において組み換え発現した、精製された、生物活性異種タンパク質を得るプロセスを開発することである。
また、本発明の他の目的は、精製された、生物活性異種タンパク質を生成するプロセスを開発することである。
さらに、本発明の他の目的は、少なくとも96%の純度の精製された、生物活性異種タンパク質生成物を得ることである。
さらに、本発明の他の目的は、97−100%の範囲の純度の精製された、生物活性異種タンパク質生成物を得ることである。
さらに、本発明の他の目的は、少なくとも96%の純度の精製インスリングラルギンを得ることである。
さらに、本発明の他の目的は、1%以下のグリコシル化不純物を含む精製インスリングラルギンを得ることである。
さらに、本発明の他の目的は、グリコシル化不純物を有していない精製インスリングラルギンを得ることである。
さらに、本発明の他の目的は、グリコシル化不純物を有していない精製インスリングラルギンを得ることであり、タンパク質のグリコシル化型は、モノグリコシル化、トリグリコシル化、ポリグリコシル化でもよい。
X−B−Y−A
ここで、
Xは、少なくとも1つのアミノ酸を含むリーダーペプチド配列である。
Bは、インスリン分子、その派生物又は類似体のB鎖のアミノ酸配列である。
Yは、少なくとも2つのアミノ酸を含むリンカーペプチドである。
Aは、インスリン分子、その派生物又は類似体のA鎖のアミノ酸配列であり、アミノ酸置換、欠損及び/又は付加によって、A、B鎖は変更できる。
a)タンパク質の発現に適した条件のもとで、異種タンパク質をコード化する式Iによって定義されたDNA配列を含むベクターによって変形された宿主細胞を培養する。
b)回収されるタンパク質製剤を生産するため、宿主細胞から前記タンパク質を分離する工程を含む、発現したタンパク質の回収。
c)ステップ(b)で回収されたタンパク質を結晶化のステップに適用する。
d)トリプシン又はトリプシン様の酵素の存在下において、酵素的変換ステップを実行する。
e)クロマトグラフィックマトリックスとともに前記タンパク質混合物を含む少なくとも1つの関連不純物を含む前記タンパク質を精製する。精製は、有機酸緩衝液を含む水相において、極性有機緩衝溶媒を適用して実行される。
f)溶出タンパク質を沈殿させる。
X−B−Y−A
ここで、
Xは、少なくとも1つのアミノ酸を含むリーダーペプチド配列である。
Bは、インスリン分子、その派生物又は類似体のB鎖のアミノ酸配列である。
Yは、少なくとも2つのアミノ酸を含むリンカーペプチドである。
Aは、インスリン分子、その派生物又は類似体のA鎖のアミノ酸配列であり、アミノ酸置換、欠損及び/又は付加によって、A鎖、B鎖は変更できる。
また、本発明の他の実施の形態において、宿主菌株はGS115である。
a)前記タンパクを発現させる発現ベクターを含む形質転換体酵母菌株を含水発酵培地に接種する。
b)前記タンパク質の発現に有効な条件下において、発酵培地で転換された菌株を成育する。
本発明の他の実施の形態において、有機酸緩衝液は、クエン酸、酢酸、ホウ酸、ギ酸、塩酸、リン酸を含むグループから選択される。
さらに、本発明の他の実施の形態において、精製されたインスリングラルギンは、1%以下のグリコシル化不純物を含む。
さらに、本発明の他の実施の形態において、精製されたインスリングラルギンにおけるタンパク質のグリコシル化形は、モノグリコシル化、トリグリコシル化、ポリグリコシル化であってもよい。
以下の実施例は、発明の理解を助けるために示されるものであり、決してそのスコープを限定することを目的とするものでなく、限定するものと解釈されるべきではない。実施例は、ベクターの構築、そのようなベクターにポリペプチドをコード化する遺伝子の挿入又は結果として生じるプラスミドの宿主への導入において用いられている従来の方法の詳細な説明を含まない。実施例はまた、そのような宿主ベクター系によって生産されたポリペプチドを検査するのに用いられる従来の方法の詳細な説明を含まない。そのような方法は当業者によく知られており、例として含む多数の刊行物において説明されている。
a)タンパク質の発現に適した条件のもとで、異種タンパク質をコード化するSEQ ID 1又は2によって定義されたDNA配列を含むベクターによって変形された宿主細胞を培養する。
b)回収されるタンパク質製剤を生産するため、宿主細胞から前記タンパク質を分離する工程を含む、発現したタンパク質の回収。
c)ステップ(b)で回収されたタンパク質を結晶化のステップに適用する。
d)トリプシン又はトリプシン様の酵素の存在下において、酵素的変換ステップを実行する。
e)前記タンパク質混合物をクロマトグラフィーマトリックスと接触することによって、少なくとも1つの関連不純物を含む前記タンパク質を精製する。精製は、有機酸緩衝液を含む水相において、極性有機緩衝溶媒を適用して実行される。
f)溶出タンパク質を沈殿させる。
「細胞」、「細胞培養」、「組み換え宿主細胞」又は「宿主細胞」は、文脈から明確であるように、しばしば互換性を持って使用される。これらの用語は、本発明の所望のタンパク質を発現する直接の対象細胞、及び、もちろんそれらの子孫も含んでいる。すべての産物がまさに親細胞と同じであるというわけではないということが、環境の変異又は違いによって理解される。しかしながら、そのような変化した産物は、その産物がもともと変形した細胞に与えられたものに関する特性を保持する限り、これらの用語に含まれる。
X−B−Y−A
ここで、
Xは、少なくとも1つのアミノ酸を含むリーダーペプチド配列である。
Bは、インスリン分子、その派生物又は類似体のB鎖のアミノ酸配列である。
Yは、少なくとも2つのアミノ酸を含むリンカーペプチドである。
Aは、インスリン分子、その派生物又は類似体のA鎖のアミノ酸配列であり、アミノ酸置換、欠損及び/又は付加によって、A鎖、B鎖は変更できる。
を示し、カラム充填に用いられる粒子(固定相)は小さく(3〜50μmの間)、選択されたサイズからほとんど違いがなく一定である。このようなクロマトグラフィーは、典型的に相対的に高い(約500〜3500psi)入口圧力を採用する。
実施例1:
GIP−Aは、式X-[グラルギン−B鎖(B1-B30)]- Y- [グラルギン−A鎖(A1-A21)]のグラルギン前駆体で表わされる。Xはリーダーペプチド配列、B鎖はB1−B30のグラルギンB鎖配列、YはB鎖とA鎖との間のリンカーペプチド配列、A鎖はグラルギンのA鎖である。配列は、リーダー又は他のリーダーペプチドが欠けていてもよい。リンカーペプチドYは、例のRR、RRDADDRからのいずれでもよい。GIP−A前駆体は、大腸菌(Escherichia coli)、ピキア・パストリス、サッカロマイセス・セレビシエ、CHO細胞(CHO cells)などの適切な発現系によって生産されうる。
インスリングラルギン前駆体遺伝子を運ぶ組換え型のベクターの構造:
GIP−A前駆体は、ピキア・パストリス発現ベクターpPIC9Kにおいて、mat α−シグナルペプチドを用いる機構でクローン化される。組み換えプラスミドは、ピキア・パストリス宿主菌株GS115を形質転換させるのに用いられ、分泌されたGIP−Aは、最終生成物を作る下流の精製プロセスで処理されるインスリングラルギン前駆体である。
組み換えプラスミドDNAを含むpPIC9K/IGP-Aクローンは、Bgl IIで消化され、ピキア・パストリスGS115(his4)宿主のエレクトロコンピテント細胞を形質転換させるのに用いられる。インビトロジェンマニュアルは形質転換法の詳細なプロトコルを提供する。
約2000形質転換細胞は、適切な制御とともに、384ウェルミクロタイタープレート中のYPD培養液に植菌された。プレートは、30℃で24時間培養され、0.5mg/mLのGeniticin(G418)を含むYPD寒天プレートにスタンプされる。選別の第2ラウンドのため、49個のクローンが選択され、さらに1、2、3mg/mLのG418のプレートにスタンプされた。最後に、1−3mgl/mlのG418に耐性を示す7個のクローンが選択され発現研究に用いられた。
選択された組み換えPichiaクローンからのゲノムのDNAは、ゲノムにおけるGIP−Aの統合を確認するために、遺伝子特異的プライマを用いてPCRに適用された。
ピキア・パストリスでの小規模な発現の研究は、インビトロジェンマニュアルにより与えられるプロトコルにより実行された。簡潔に、クローンは、30℃でBMGY中において、その後、24℃でBMMY中にメタノールを導入して成長された。メタノールの導入は、トータル3日実行された。
発酵方法:
組み換えインスリングラルギンの発酵プロセスは、実験室規模で最適化された。以下に示される例は、このプロセスの簡単な説明である。
種培地は、以下の要素を含む:酵母窒素塩基、硫酸アンモニウム、グリセロール、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム及びD−ビオチン。
発酵プロセスは、2つの段階を有する。それは、成長段階(バイオマスを増加させる)と、これに続く誘導段階である。生成物は、メタノールが供給されたバッチ段階の間に形成され、分泌される。
関連する変換と精製法:
ピキア・パストリスの発酵において生産されたインスリングラルギン前駆体は、以下の精製プロセスを含む精製ステップを受ける。
陽イオン交換クロマトグラフィーステップで発酵培養液から得られたグラルギン前駆体は、色度除去及び保存の目的で結晶化される。前駆体濃度が結晶化の初めに約2から20g/L、好ましくは8から14g/Lで、結晶化が行われた。結晶化は、ZnCl2及びフェノールを加えることにより実行され、3.0から8.0、好ましくは、3.5から5.5の間のpHに調整された。フェノールは、CIEX溶出液堆積の0.1から0.5%加えることができる。4%のZnCl2は、CIEX溶出液堆積の3から15%加えることができる。pHは、いずれかのアルカリ、好ましくはNaOH又はTRISを用いることによって調整することができる。結晶化プロセスは2から30℃の間で実行することができ、懸濁液は、結晶が完全に形成されるように、しばらく保存される。前駆体結晶は、遠心分離又はデカンテーションで上澄みから分離することができる。
463mlの溶出液(前駆体濃度13.8g/L)が選択され、適切な解凍の後に、2.315mlのフェノール(0.5%のEP volume)が加えられた。その後、57.875mlの4%ZnCl2溶液(12.5%のEP volume)が加えられた。この段階のpHは、4.08であり、これは420mlの2.5NのNaOHを加えることによって調整された。母液は、15分間ゆっくり撹拌される状態に保たれ、その後冷たい場所(2から8℃)に移動され、一晩放置された。そして、すべての混合物は、Beckman Coulter Avanti J-26 XP遠心分離機を用いて、20分間5000rpmで遠心分離された。上澄みの損失は、1.55%であった。
500mlの溶出液(前駆体濃度2.9g/L)が選択され、適切な解凍の後に、0.625mlのフェノール(0.125%のEP volume)が加えられた。その後、15.625mlの4%ZnCl2溶液(3.125%のEP volume)が加えられた。この段階のpHは、4.08であり、これは315mlの2.5NのNaOHを加えることによって4.8まで調整された。母液は、15分間ゆっくり撹拌される状態に保たれ、その後冷たい場所(2から8℃)に移動され、5時間放置された。そして、上澄みが遠心分離により分離された。上澄みの損失は、4%であった。
トリプシン処理
グラルギンは、グラルギン前駆体から酵素的変換を経て調整される。変化は、トリプシン又は植物、動物又は微生物期限のトリプシン様の酵素の存在によって行われた。反応は、好ましくはDMSO、DMF、エタノール、アセトン、アセトニトリル、エチルアセテートなど、特にDMF、DMSOの水混和性有機溶剤の存在下において実行された。有機溶剤の好ましい比は、反応混合物の約0−65%であり、特に40−60%である。
1gのグラルギン前駆体は、1.5mlの1MのTRIS溶液に溶解された。1mlのそれぞれのこの溶液は、試料A、試料Bと表示された2つのチューブに入れられた。試料Aには、3mlの水及び166.6mgのTRISが加えられた。試料Bには、2mlのDMF、1mlの水及び166.6mgのTRISが加えられた。それぞれの試料は4つに分割され、pHを調整して異なる4つのpHになった。50μg/mlの濃度で牛トリプシンを加えて、すべての試料において反応が実行された。試験された条件は、以下に示される。
1.6gのグラルギン前駆体は、2mlの1MのTRIS溶液に溶解された。1mlのそれぞれのこの溶液は、試料A、試料B、試料Cと表示された3つのチューブに入れられた。試料Aには、1.8mlの水及び1.2mlのDMF及び161mgのTRISが加えられた。試料Bには、0.6mlの水、2.4mlのDMF及び161mgのTRISが加えられた。試料Cには、1mlの水、2.0mlのDMF及び161mgのTRISが加えられた。試料A、Bは4つに分割され、試料Cは2つに分割され、異なるpHに調整された。50μg/mlの濃度で牛トリプシンを加えて、すべての試料において反応が実行された。試験された条件は、以下に示される。
1.5gのグラルギン前駆体は、2mlの1MのTRIS溶液に溶解された。0.75mlのそれぞれのこの溶液は、試料A、試料B、試料Cと表示された3つのチューブに入れられた。試料Aには、0.75mlの水及び1.5mlのエタノール及び106mgのTRISが加えられた。試料Bには、0.75mlの水、1.5mlのDMF及び106mgのTRISが加えられた。試料Cには、0.75mlの水、1.5mlのDMF及び106mgのTRISが加えられた。試料A、Bは2つに分割され、2つの異なるpHに調整された。試料Cは、pH9.0に調整された。50μg/mlの濃度で牛トリプシンを加えて、すべての試料において反応が実行された。試験された条件は、以下に示される。
1.5gのグラルギン前駆体は、2mlの1MのTRIS溶液に溶解された。0.75mlのこの溶液に、0.75mlの水、1.5mlのエタノール及び106mgのTRISが加えられた。そして、pHが9.0に調整された。その後、この溶液は試料A、試料Bの2つに分割された。試料Aには室温(20から25℃)で反応が実行され、一方、試料Bには2から8℃で反応が実行された。50μg/mlの濃度で牛トリプシンを加えることにより、反応が始まった。
1gのグラルギン前駆体は、1mlの1MのTRIS溶液に溶解された。0.75mlのそれぞれのこの溶液は、試料A、試料Bと表示された2つのチューブに入れられた。試料Aには、0.75mlの水及び1.5mlのDMF及び130mgのTRISが加えられた。試料Bには、0.75mlの水、1.5mlのDMSO及び130mgのTRISが加えられた。試料A、Bは、pHが8.7に調整された後に2つに分割された。50μg/mlの濃度で牛トリプシンを加えて、4つのすべての試料において反応が実行された。試料A、Bからの一定分量での反応は2−8℃で行われた。試験された条件は、以下に示される。
2gのグラルギン前駆体は、0.5gのTRIS、2mlの水、2mlのDMFを含む溶液に溶解された。この溶液から、それぞれ50%のDMF及び0.5MのTRISを含む、pH8.7である3.08mlの6つの試料が作られた。前駆体濃度はこれらの試料間で10g/Lから60g/Lまで変化している。前駆体のグラム当たり5mgのトリプシンを加えて、それぞれの試料で反応が始まった。すべての試料は、反応の間2−8℃であった。試験された条件は、以下に示される。
実施例5g:
湿式前駆体結晶は、−20℃の冷凍庫に保存され、溶解の前に取り出された。これらの結晶は、撹拌条件下で、TRIS溶液(前駆体結晶の50%w/wのTRIS及び前駆体結晶のkg当たり2Lの水)に加えることにより溶解された。例えば、500グラムのTRISを含む2LのTRIS溶液に1kgの前駆体結晶が加えられる。これに続いて、DMF(前駆体のkg当たり2L)が添加された。すべての混合物は完全に溶解し、この溶液は試験液として扱われた。結果として得られる試験液は、C18対称分析RP−HPLC法を用いて生成物の分析がなされた。
実施例6a:
ピキア・パストリスの発酵によって生成されたインスリングラルギン前駆体は精製される。このプロセスに関与するステップは以下を含む。
RP−HPLC樹脂(細孔径120ÅのC8 Daisogel、10μm粒子サイズ)により充填されたカラムは、250mMの酢酸(バッファA)において、10%のアセトニトリル(バッファB)で平衡状態が保たれた。水を用いて1:5に希釈されたトリプシン処理端の充填が行われた。バッファBの直線勾配は、10g/L未満の充填で、収率75%、純度94.5%で精製されたグラルギンを溶出するために用いられた。
RP−HPLC樹脂(細孔径120ÅのC8 Daisogel、10μm粒子サイズ)により充填されたカラムは、200mM、pH5.0の酢酸ナトリウム(バッファA)において、10%のアセトニトリル(バッファB)で平衡状態が保たれた。10%のアセトニトリルが含まれるように希釈された、前のステップからのRP溶出液の充填が行われた。バッファBの直線勾配は、収率80%、純度98.5%で精製されたグラルギン及び0.29%のグリコシル化された不純物を溶出するために用いられた。
RP−HPLC樹脂(細孔径120ÅのC8 Daisogel、10μm粒子サイズ)により充填されたカラムは、50mMの酢酸(バッファA)において、6%のエタノール(バッファB)で平衡状態が保たれた。水を用いて1:3に希釈された、前のステップからのRP溶出液の充填が行われた。バッファBの直線勾配は、35g/Lの充填で、収率85%、純度99.4%で精製されたグラルギンを溶出するために用いられた。
RP−HPLC樹脂(細孔径120ÅのC8 Daisogel、10μm粒子サイズ)により充填されたカラムは、250mMの酢酸(バッファA)において、10%のアセトニトリル(バッファB)で平衡状態が保たれた。水を用いて1:5に希釈されたトリプシン処理端の充填が行われた。バッファBの直線勾配は、10g/L未満の充填で、収率75%、純度94.5%で精製されたグラルギンを溶出するために用いられた。
RP−HPLC樹脂(細孔径120ÅのC8 Daisogel、10μm粒子サイズ)により充填されたカラムは、200mM、pH5.0の酢酸ナトリウム(バッファA)において、10%のアセトニトリル(バッファB)で平衡状態が保たれた。10%のアセトニトリルが含まれるように希釈された、前のステップからのRP溶出液の充填が行われた。バッファBの直線勾配は、収率80%、純度98.5%で精製されたグラルギン及び0.29%のグリコシル化された不純物を溶出するために用いられた。
RP−HPLC樹脂(細孔径120ÅのC8 Daisogel、10μm粒子サイズ)により充填されたカラムは、10mMのクエン酸(バッファA)において、6%のエタノール(バッファB)で平衡状態が保たれた。水を用いて1:3に希釈された、前のステップからのRP溶出液の充填が行われた。バッファBの直線勾配は、35g/Lの充填で、収率79.2%、純度98.5%で精製されたグラルギンを溶出するために用いられた。
RP−HPLC樹脂(細孔径120ÅのC8 Daisogel、10μm粒子サイズ)により充填されたカラムは、250mMの酢酸(バッファA)において、10%のアセトニトリル(バッファB)で平衡状態が保たれた。水を用いて1:5に希釈されたトリプシン処理端の充填が行われた。バッファBの直線勾配は、10g/L未満の充填で、収率75%、純度94.5%で精製されたグラルギンを溶出するために用いられた。
RP−HPLC樹脂(細孔径120ÅのC8 Daisogel、10μm粒子サイズ)により充填されたカラムは、pH8.5で100mMのTris+20mMのCaC12(バッファA)において、10%のアセトニトリル(バッファB)で平衡状態が保たれた。10%のアセトニトリルが含まれるように希釈された、前のステップからのRP溶出液の充填が行われた。バッファBの直線勾配は、収率71%、純度97.4%で精製されたグラルギン及び0.22%のグリコシル化された不純物を溶出するために用いられた。
RP−HPLC樹脂(細孔径120ÅのC8 Daisogel、10μm粒子サイズ)により充填されたカラムは、10mMのクエン酸(バッファA)において、6%のエタノール(バッファB)で平衡状態が保たれた。水を用いて1:3に希釈された、前のステップからのRP溶出液の充填が行われた。バッファBの直線勾配は、35g/Lの充填で、収率75.0%、純度98.0%で精製されたグラルギンを溶出するために用いられた。
RP−HPLC樹脂(細孔径120ÅのC8 Daisogel、10μm粒子サイズ)により充填されたカラムは、250mMの酢酸(バッファA)において、10%のアセトニトリル(バッファB)で平衡状態が保たれた。水を用いて1:5に希釈されたトリプシン処理終了の充填が行われた。バッファBの直線勾配は、10g/L未満の充填で、収率75%、純度94.5%で精製されたグラルギンを溶出するために用いられた。
RP−HPLC樹脂(細孔径120ÅのC8 Daisogel、10μm粒子サイズ)により充填されたカラムは、100mM、pH5.0の酢酸アンモニウム(バッファA)において、10%のアセトニトリル(バッファB)で平衡状態が保たれた。10%のアセトニトリルが含まれるように希釈された、前のステップからのRP溶出液の充填が行われた。バッファBの直線勾配は、収率60.7%、純度98.0%で精製されたグラルギン及び0.91%のグリコシル化された不純物を溶出するために用いられた。
RP−HPLC樹脂(細孔径120ÅのC8 Daisogel、10μm粒子サイズ)により充填されたカラムは、10mMのクエン酸(バッファA)において、6%のエタノール(バッファB)で平衡状態が保たれた。水を用いて1:3に希釈された、前のステップからのRP溶出液の充填が行われた。バッファBの直線勾配は、35g/Lの充填で、収率75.0%、純度98.0%で精製されたグラルギンを溶出するために用いられた。
RP−HPLC樹脂(細孔径120ÅのC8 Daisogel、10μm粒子サイズ)により充填されたカラムは、250mMの酢酸(バッファA)において、10%のアセトニトリル(バッファB)で平衡状態が保たれた。水を用いて1:5に希釈されたトリプシン処理終了の充填が行われた。バッファBの直線勾配は、10g/L未満の充填で、収率75%、純度94.5%で精製されたグラルギンを溶出するために用いられた。
RP−HPLC樹脂(細孔径120ÅのC8 Daisogel、10μm粒子サイズ)により充填されたカラムは、pH3.0、20mMの過塩素酸(バッファA)において、10%のアセトニトリル(バッファB)で平衡状態が保たれた。10%のアセトニトリルが含まれるように希釈された、前のステップからのRP溶出液の充填が行われた。バッファBの直線勾配は、収率37.4%、純度96.2%で精製されたグラルギン及び0.28%のグリコシル化された不純物を溶出するために用いられた。
RP−HPLC樹脂(細孔径120ÅのC8 Daisogel、10μm粒子サイズ)により充填されたカラムは、10mMのクエン酸(バッファA)において、6%のエタノール(バッファB)で平衡状態が保たれた。水を用いて1:3に希釈された、前のステップからのRP溶出液の充填が行われた。バッファBの直線勾配は、35g/Lの充填で、収率70.0%、純度97.0%で精製されたグラルギンを溶出するために用いられた。
RP−HPLC樹脂(細孔径120ÅのC8 Daisogel、10μm粒子サイズ)により充填されたカラムは、250mMの酢酸(バッファA)において、10%のアセトニトリル(バッファB)で平衡状態が保たれた。水を用いて1:5に希釈されたトリプシン処理終了の充填が行われた。バッファBの直線勾配は、10g/L未満の充填で、収率75%、純度94.5%で精製されたグラルギンを溶出するために用いられた。
RP−HPLC樹脂(細孔径120ÅのC8 Daisogel、10μm粒子サイズ)により充填されたカラムは、pH8.5、100mMのホウ酸塩緩衝剤(バッファA)において、10%のアセトニトリル(バッファB)で平衡状態が保たれた。10%のアセトニトリルが含まれるように希釈された、前のステップからのRP溶出液の充填が行われた。バッファBの直線勾配は、収率79.4%、純度98.3%で精製されたグラルギン及び0.11%のグリコシル化された不純物を溶出するために用いられた。
RP−HPLC樹脂(細孔径120ÅのC8 Daisogel、10μm粒子サイズ)により充填されたカラムは、10mMのクエン酸(バッファA)において、6%のエタノール(バッファB)で平衡状態が保たれた。水を用いて1:3に希釈された、前のステップからのRP溶出液の充填が行われた。バッファBの直線勾配は、35g/Lの充填で、収率75.0%、純度98.8%で精製されたグラルギンを溶出するために用いられた。
最終沈殿:
異なる逆相クロマトグラフィーステップを経て精製されたグラルギンは、クエン酸緩衝液及びZnCl2溶液を加え、pHを調整することにより沈殿された(クエン酸緩衝液は、15.4g/Lのクエン酸(無水)、90g/Lのオルトリン酸塩2ナトリウム緩衝液(無水)を含み、pHは6.3±0.1に調整され、O−リン酸を有する)。沈殿は、pHが4.0から10.0の範囲、好ましくは、6.0から8.0で行われる。生成物濃度は、好ましくは、2から20g/Lである。沈殿後、たまった沈殿物を分散させずに、遠心分離又は上澄みを移すことにより、澄んだ上澄みから生成物が分離された。このようにして得られた沈殿は、冷水で洗浄され、存在する非結合イオンが除去された。
最終懸濁剤は沈殿後に移され、懸濁液は無菌で凍結乾燥トレイに移される。その後、保存され、調合されうるインスリングラルギンの乾燥粉末を得るために、懸濁液は冷凍され凍結乾燥される。また、本組成物を調合するために、(例えば、米国特許第4,925,673号に報告されているプロテイノイド小球体のような)リポソーム封入又はプロテイノイド封入を使用することが可能である。
グリコシル化された不純物の分離と特性評価:
内部の医薬品有効成分からのグラルギンのグリコシル化形の分離:
不純物のグリコシル化形の特性を示すために、mGIG(モノグリコシル化インスリングラルギン)及びtGIG(トリグリコシル化インスリングラルギン)を半予備的逆相クロマトグラフィーによって分離した。プロセス不純物の識別は、Prochrome C18(250×8.0mm)カラムを用いて、Agilent 1100クロマトグラフィーシステム(CA、USA)で行われた。移動相溶液は、含水0.1%TFA(A)及びアセトニトリル0.1%TFA(B)であった。グラルギンの不純物は、直線勾配プログラムを用いて溶出された。直線勾配プログラムは、1.5mL/minの一定流量で、0分25%B、0−10分27%B、10−15分29%B、15−21分30%B、21−27分33%B、27−35分25%Bであった。注入量は、20μlに保たれ、カラム温度は40℃に保たれた。溶離液は、214nmにモニターされた。グリコシル化不純物に対応するクロマトグラフィーピークは、Agilent 1100 series LCMSD SLイオントラップ質量分析計(Agilent Technologies, USA)によって、オンラインで分析された。質量分析計は、ESIモードで動作させた。噴霧ガスは、60psiに保たれ、乾燥ガスは12.0L/min、乾燥温度は、350度に保たれた。正イオン電気スプレイ質量スペクトルは、質量範囲600−2200m/zにおいてMSモードで記録された。
実施例9b:
最終生成物のRP−HPLC及びSEC−HPLCプロファイル
得られた最終タンパク質生成物のRP−HPLCプロファイル及びSEC−HPCLプロファイルは、図5、6に示される。
グラルギン、モノグリコシル化インスリングラルギン(mGIG)、トリグリコシル化インスリングラルギン(tGIG)の電気スプレイイオン化質量スペクトルは、それぞれ図7、8、9に示されている。
表6:電気スプレイ及びマトリックス支援レーザー脱離イオン化技術によって測定された分子量の比較
ペプチドマッピング:
グリコシル化が起こったアミノ酸位置を識別するために、グラルギンの糖型は酵素消化される。0.65mgの天然グラルギンは、200μl、1MのTRIS(pH=9.0)に溶解された。これに新たに準備した50μlの1mg/mLのV8プロテアーゼ(Glu−C)が加えられ、37℃で2時間培養された。IGのトリプシン消化物、mGIG、tGIGは、流量0.8mL/minで、C18 250×4.6mm、5μ、300°(水;対称性)で分離された。カラム温度は、40度に維持された。次の勾配が用いられた:0−60分5−80%B、60−65分80−5%B。溶媒A=0.1%含水TFA、溶媒B=アセトニトリルである。20μlの試料が注入され、溶出されたピークが220nmでモニターされた。試料は、GLU-Cのフラグメント分析のためのAgilent 1100 LCMSによって、オンラインで分析された。比較研究は、リテンションタイム及び分子量を調べるために、IG、mGIG、tGIGについてなされた。
本発明は、成熟インスリングラルギンの免疫学的及び生物的な活性を示すポリペプチドをコード化する組み換えタンパク質の生産及び精製方法を提供することを目的とする。前記精製タンパク質は、成熟インスリングラルギンと類似のすべての生理学的、免疫学的、生化学的な特徴を有していることが見出される。
(a)宿主微生物を、インスリングラルギン活性を有するタンパク質を生産する方向に向かわせることが可能なDNA配列の準備
(b)宿主微生物に移動し、内部で複製することが可能なベクターへ前記DNA配列をクローン化する。このようなベクターは、DNA配列の操作可能な要素を含む。
(c)DNA配列及び操作可能な要素を含むベクターを、インスリングラルギンタンパク質を発現可能な宿主微生物に移動させる。
(d)ベクターの増幅とタンパク質の発現に適切な条件下で微生物を培養する。
(e)タンパク質を収穫する。
Claims (8)
- ピキア・パストリス発現系において、精製されており生物活性を有する組換えインスリングラルギンであって、少なくとも純度96%であり、かつ含有グリコシル化不純物が1%未満のインスリングラルギンを得る方法であって、
a)式X−B−Y−Aによって定義される前記インスリングラルギンの前駆体をコードしているDNA配列を含むベクターによって形質転換されたピキア・パストリスを、前記インスリングラルギンの前駆体の発現に適している状態で培養し、
ここで、
前記Xは、少なくとも1つのアミノ酸で構成されるリーダーペプチド配列であり、
前記Bは、前記インスリングラルギンのB鎖の1−30アミノ酸を有する、アミノ酸配列であり、
前記Yは、最初の2つのアミノ酸が"RR"で表される2以上のアミノ酸で構成されたリンカーペプチドであり、
前記Aは、前記インスリングラルギンのA鎖のアミノ酸配列であり、
b)インスリングラルギンの前駆体を回収した調製物を得るために陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて、前記ピキア・パストリスから前記インスリングラルギンの前駆体を分離して、前記発現されたインスリングラルギンの前駆体を回収し、
c)インスリングラルギンの前駆体の結晶を得るために工程b)で回収した調製物を結晶化工程に供し、
d)工程c)で得られた前記インスリングラルギンの前駆体の結晶を、トリプシン又はトリプシン様酵素の存在下で活性なインスリングラルギンに酵素変換し、
e)グリコシル化された不純物を含む前記インスリングラルギンを精製することで精製されたインスリングラルギンを得るために、インスリングラルギンをRP-HPLCクロマトグラフィックマトリックスに接触させる上で以下を含む複数の精製工程を実行し、
i.濃度250mMの酢酸の下で濃度10%のアセトニトリルで前記マトリックスを平衡化し;該アセトニトリルで前記インスリングラルギンを溶出する第一工程;
ii.濃度20mMから200mMの水性緩衝液Aの下で濃度10%のアセトニトリルで前記マトリックスを再度平衡化し;該アセトニトリルで前記インスリングラルギンを再度溶出する第二工程;
iii.濃度10mMから50mMの水性緩衝液Aの下で濃度6%のエタノールで前記マトリックスを再度平衡化し;該エタノールで前記インスリングラルギンを再度溶出する第三工程;
f)クエン酸緩衝液及び塩化亜鉛を添加して工程e)で前記精製されたインスリングラルギンを沈殿させ、少なくとも純度96%であり、かつ含有グリコシル化不純物が1%未満の前記インスリングラルギンを得る、
各工程を備える、インスリングラルギンを得る方法。 - 前記インスリングラルギンの前駆体は、SEQ ID: 1又はSEQ ID: 2.によって定義されることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記ピキア・パストリスはGS115株であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記工程c)において、塩化亜鉛及びフェノールを添加することにより、前記インスリングラルギンの前駆体を結晶化させることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記工程d)において、前記酵素変換は、水混和性有機溶媒においてトリプシンの存在下で行うことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記水混和性有機溶媒は、DMSO、DMF、エタノール、アセトン、アセトニトリル、酢酸エチル及びこれらの混合物のグループから選択されることを特徴とする請求項5に記載の方法。
- 前記工程e)における前記水性緩衝液Aは、クエン酸、酢酸、ホウ酸、ギ酸、塩酸、酢酸ナトリウム、Tris−CaCl2、酢酸アンモニウム、過塩素酸及びリン酸からなるグループから選択されることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記インスリングラルギンのグリコシル化不純物は、モノグリコシル化、トリグリコシル化又はポリグリコシル化のいずれかであることを特徴とする請求項1に記載の方法。
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