PL239062B1 - Sposób wytwarzania insuliny i jej pochodnych - Google Patents
Sposób wytwarzania insuliny i jej pochodnych Download PDFInfo
- Publication number
- PL239062B1 PL239062B1 PL415888A PL41588816A PL239062B1 PL 239062 B1 PL239062 B1 PL 239062B1 PL 415888 A PL415888 A PL 415888A PL 41588816 A PL41588816 A PL 41588816A PL 239062 B1 PL239062 B1 PL 239062B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- insulin
- gly
- leu
- arg
- lys
- Prior art date
Links
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 125
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 86
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 title claims description 81
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 title claims description 81
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 title claims description 60
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 58
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 38
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 55
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 claims description 44
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 39
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 claims description 39
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 38
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 32
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 30
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 30
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 27
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 26
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 claims description 23
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 23
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 claims description 19
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 17
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 17
- 101800000120 Host translation inhibitor nsp1 Proteins 0.000 claims description 13
- 101800000517 Leader protein Proteins 0.000 claims description 13
- 101800000512 Non-structural protein 1 Proteins 0.000 claims description 13
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 claims description 11
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 10
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 10
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 10
- 101150109777 cytR gene Proteins 0.000 claims description 10
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 10
- 102000003670 Carboxypeptidase B Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000087 Carboxypeptidase B Proteins 0.000 claims description 9
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 9
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 9
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 9
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 8
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims description 6
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 5
- 238000000527 sonication Methods 0.000 claims description 5
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 claims description 4
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 claims description 4
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 claims description 4
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 claims description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 4
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 4
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 4
- 239000012467 final product Substances 0.000 claims description 4
- 238000003819 low-pressure liquid chromatography Methods 0.000 claims description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 4
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 claims description 4
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 3
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 claims description 3
- 102000001218 Rec A Recombinases Human genes 0.000 claims description 3
- 108010055016 Rec A Recombinases Proteins 0.000 claims description 3
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 claims description 3
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 claims description 3
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 claims description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 3
- 101150098466 rpsL gene Proteins 0.000 claims description 3
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 claims description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 claims description 2
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 claims description 2
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 claims description 2
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 claims description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 2
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 claims description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 claims description 2
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 claims description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-UHTZMRCNSA-N Vidarabine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-UHTZMRCNSA-N 0.000 claims 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 claims 1
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 51
- 108010016616 cysteinylglycine Proteins 0.000 description 35
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 31
- KOHBWQDSVCARMI-BWBBJGPYSA-N Cys-Cys-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O KOHBWQDSVCARMI-BWBBJGPYSA-N 0.000 description 20
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 20
- JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N H-Gly-Phe-OH Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- LJUIEESLIAZSFR-SRVKXCTJSA-N His-Leu-Cys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)N LJUIEESLIAZSFR-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 16
- 108010081551 glycylphenylalanine Proteins 0.000 description 16
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 15
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 description 15
- 102400000757 Ubiquitin Human genes 0.000 description 14
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Inorganic materials [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- ZJICFHQSPWFBKP-AVGNSLFASA-N Glu-Asn-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O ZJICFHQSPWFBKP-AVGNSLFASA-N 0.000 description 13
- 108010025306 histidylleucine Proteins 0.000 description 13
- 108010066381 preproinsulin Proteins 0.000 description 13
- DLPXTCTVNDTYGJ-JBDRJPRFSA-N Ser-Ile-Cys Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O DLPXTCTVNDTYGJ-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 12
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 12
- 108010012058 leucyltyrosine Proteins 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 238000011160 research Methods 0.000 description 12
- MKIAPEZXQDILRR-YUMQZZPRSA-N Gly-Ser-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN MKIAPEZXQDILRR-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 11
- LHSGPCFBGJHPCY-UHFFFAOYSA-N L-leucine-L-tyrosine Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 LHSGPCFBGJHPCY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- TUIOUEWKFFVNLH-DCAQKATOSA-N Leu-Val-Cys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O TUIOUEWKFFVNLH-DCAQKATOSA-N 0.000 description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 11
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- GOUWCZRDTWTODO-YDHLFZDLSA-N Phe-Val-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O GOUWCZRDTWTODO-YDHLFZDLSA-N 0.000 description 9
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 9
- NLKVNZUFDPWPNL-YUMQZZPRSA-N Glu-Arg-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O NLKVNZUFDPWPNL-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 8
- DHDOADIPGZTAHT-YUMQZZPRSA-N Gly-Glu-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N DHDOADIPGZTAHT-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 8
- COVXELOAORHTND-LSJOCFKGSA-N Gly-Ile-Val Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O COVXELOAORHTND-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 8
- 108010065920 Insulin Lispro Proteins 0.000 description 8
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- YVKSMSDXKMSIRX-GUBZILKMSA-N Leu-Glu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O YVKSMSDXKMSIRX-GUBZILKMSA-N 0.000 description 8
- UPJONISHZRADBH-XPUUQOCRSA-N Val-Glu Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O UPJONISHZRADBH-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 8
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 8
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- 108010073969 valyllysine Proteins 0.000 description 8
- MQIGTEQXYCRLGK-BQBZGAKWSA-N Ala-Gly-Pro Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O MQIGTEQXYCRLGK-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 7
- NJLLRXWFPQQPHV-SRVKXCTJSA-N Asp-Tyr-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O NJLLRXWFPQQPHV-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 7
- DTPOVRRYXPJJAZ-FJXKBIBVSA-N Gly-Arg-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCN=C(N)N DTPOVRRYXPJJAZ-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 7
- FQYQMFCIJNWDQZ-CYDGBPFRSA-N Ile-Pro-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)CCC1 FQYQMFCIJNWDQZ-CYDGBPFRSA-N 0.000 description 7
- HFBCHNRFRYLZNV-GUBZILKMSA-N Leu-Glu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O HFBCHNRFRYLZNV-GUBZILKMSA-N 0.000 description 7
- UGTZHPSKYRIGRJ-YUMQZZPRSA-N Lys-Glu Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O UGTZHPSKYRIGRJ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 7
- GCMWRRQAKQXDED-IUCAKERBSA-N Lys-Glu-Gly Chemical compound [NH3+]CCCC[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CCC([O-])=O)C(=O)NCC([O-])=O GCMWRRQAKQXDED-IUCAKERBSA-N 0.000 description 7
- XIULAFZYEKSGAJ-IXOXFDKPSA-N Thr-Leu-His Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 XIULAFZYEKSGAJ-IXOXFDKPSA-N 0.000 description 7
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 7
- 108010042598 glutamyl-aspartyl-glycine Proteins 0.000 description 7
- JYPCXBJRLBHWME-UHFFFAOYSA-N glycyl-L-prolyl-L-arginine Natural products NCC(=O)N1CCCC1C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(O)=O JYPCXBJRLBHWME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108010036413 histidylglycine Proteins 0.000 description 7
- 239000004026 insulin derivative Substances 0.000 description 7
- 108010031424 isoleucyl-prolyl-proline Proteins 0.000 description 7
- 108010009298 lysylglutamic acid Proteins 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- GJFYPBDMUGGLFR-NKWVEPMBSA-N Asn-Gly-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)CNC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)C(=O)O GJFYPBDMUGGLFR-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 6
- BMWFDYIYBAFROD-WPRPVWTQSA-N Gly-Pro-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)CN BMWFDYIYBAFROD-WPRPVWTQSA-N 0.000 description 6
- MMFKFJORZBJVNF-UWVGGRQHSA-N His-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 MMFKFJORZBJVNF-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 6
- DSXPMZMSJHOKKK-HJOGWXRNSA-N Phe-Phe-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O DSXPMZMSJHOKKK-HJOGWXRNSA-N 0.000 description 6
- BTPAWKABYQMKKN-LKXGYXEUSA-N Ser-Asp-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O BTPAWKABYQMKKN-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 6
- XYEXCEPTALHNEV-RCWTZXSCSA-N Thr-Arg-Arg Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O XYEXCEPTALHNEV-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 6
- JKHXYJKMNSSFFL-IUCAKERBSA-N Val-Lys Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN JKHXYJKMNSSFFL-IUCAKERBSA-N 0.000 description 6
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 6
- WNRQPCUGRUFHED-DETKDSODSA-N humalog Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1.C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 WNRQPCUGRUFHED-DETKDSODSA-N 0.000 description 6
- 229960002068 insulin lispro Drugs 0.000 description 6
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 6
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 6
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 6
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 6
- 108010038745 tryptophylglycine Proteins 0.000 description 6
- RAUPFUCUDBQYHE-AVGNSLFASA-N Asn-Phe-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O RAUPFUCUDBQYHE-AVGNSLFASA-N 0.000 description 5
- ITYRYNUZHPNCIK-GUBZILKMSA-N Glu-Ala-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O ITYRYNUZHPNCIK-GUBZILKMSA-N 0.000 description 5
- NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N Lys-Arg Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N 0.000 description 5
- FMIIKPHLJKUXGE-GUBZILKMSA-N Lys-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN FMIIKPHLJKUXGE-GUBZILKMSA-N 0.000 description 5
- TVHCDSBMFQYPNA-RHYQMDGZSA-N Lys-Thr-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O TVHCDSBMFQYPNA-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 5
- JWOBLHJRDADHLN-KKUMJFAQSA-N Ser-Leu-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O JWOBLHJRDADHLN-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 5
- UYKREHOKELZSPB-JTQLQIEISA-N Trp-Gly Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O)=CNC2=C1 UYKREHOKELZSPB-JTQLQIEISA-N 0.000 description 5
- AOIZTZRWMSPPAY-KAOXEZKKSA-N Tyr-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)N)O AOIZTZRWMSPPAY-KAOXEZKKSA-N 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 5
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 description 5
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XQHSBNVACKQWAV-WHFBIAKZSA-N Gly-Asp-Asn Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O XQHSBNVACKQWAV-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 4
- AAHSHTLISQUZJL-QSFUFRPTSA-N Gly-Ile-Ile Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O AAHSHTLISQUZJL-QSFUFRPTSA-N 0.000 description 4
- LIXWIUAORXJNBH-QWRGUYRKSA-N Gly-Leu-His Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)CN LIXWIUAORXJNBH-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 4
- WEIYKCOEVBUJQC-JYJNAYRXSA-N His-Glu-Phe Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)N WEIYKCOEVBUJQC-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 4
- DURWCDDDAWVPOP-JBDRJPRFSA-N Ile-Cys-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N DURWCDDDAWVPOP-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 4
- ZUKPVRWZDMRIEO-VKHMYHEASA-N L-cysteinylglycine Chemical compound SC[C@H]([NH3+])C(=O)NCC([O-])=O ZUKPVRWZDMRIEO-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- AIMGJYMCTAABEN-GVXVVHGQSA-N Leu-Val-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O AIMGJYMCTAABEN-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 4
- GQFDWEDHOQRNLC-QWRGUYRKSA-N Lys-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN GQFDWEDHOQRNLC-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 4
- SPXWRYVHOZVYBU-ULQDDVLXSA-N Phe-His-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)NC(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)N SPXWRYVHOZVYBU-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 4
- SNXUIBACCONSOH-BWBBJGPYSA-N Ser-Thr-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SNXUIBACCONSOH-BWBBJGPYSA-N 0.000 description 4
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- CDKZJGMPZHPAJC-ULQDDVLXSA-N Tyr-Leu-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 CDKZJGMPZHPAJC-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 4
- VPGCVZRRBYOGCD-AVGNSLFASA-N Val-Lys-Val Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O VPGCVZRRBYOGCD-AVGNSLFASA-N 0.000 description 4
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 4
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 4
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- FAAHJOLJYDXKKU-ZHDGNLTBSA-N (2s)-6-amino-2-[[(2s)-1-[(2s,3r)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[(2-aminoacetyl)amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]hexanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)CN)C1=CC=C(O)C=C1 FAAHJOLJYDXKKU-ZHDGNLTBSA-N 0.000 description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RFXXUWGNVRJTNQ-QXEWZRGKSA-N Arg-Gly-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N RFXXUWGNVRJTNQ-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 3
- HAVKMRGWNXMCDR-STQMWFEESA-N Arg-Gly-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O HAVKMRGWNXMCDR-STQMWFEESA-N 0.000 description 3
- DNUKXVMPARLPFN-XUXIUFHCSA-N Arg-Leu-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O DNUKXVMPARLPFN-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 3
- LMIWYCWRJVMAIQ-NHCYSSNCSA-N Asn-Val-Lys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N LMIWYCWRJVMAIQ-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 3
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- OIMUAKUQOUEPCZ-WHFBIAKZSA-N Cys-Asn-Gly Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O OIMUAKUQOUEPCZ-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LRPXYSGPOBVBEH-IUCAKERBSA-N Glu-Gly-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O LRPXYSGPOBVBEH-IUCAKERBSA-N 0.000 description 3
- DHNXGWVNLFPOMQ-KBPBESRZSA-N Gly-Phe-His Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)NC(=O)CN DHNXGWVNLFPOMQ-KBPBESRZSA-N 0.000 description 3
- PARSHQDZROHERM-NHCYSSNCSA-N Ile-Lys-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)O)N PARSHQDZROHERM-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 3
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- LHSGPCFBGJHPCY-STQMWFEESA-N Leu-Tyr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 LHSGPCFBGJHPCY-STQMWFEESA-N 0.000 description 3
- GPJGFSFYBJGYRX-YUMQZZPRSA-N Lys-Gly-Asp Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O GPJGFSFYBJGYRX-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 3
- FPTXMUIBLMGTQH-ONGXEEELSA-N Phe-Ala-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 FPTXMUIBLMGTQH-ONGXEEELSA-N 0.000 description 3
- JEBWZLWTRPZQRX-QWRGUYRKSA-N Phe-Gly-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O JEBWZLWTRPZQRX-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 3
- MHNBYYFXWDUGBW-RPTUDFQQSA-N Phe-Tyr-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)N)O MHNBYYFXWDUGBW-RPTUDFQQSA-N 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010034634 Repressor Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000009661 Repressor Proteins Human genes 0.000 description 3
- MPUMPERGHHJGRP-WEDXCCLWSA-N Thr-Gly-Lys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N)O MPUMPERGHHJGRP-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 3
- GXUWHVZYDAHFSV-FLBSBUHZSA-N Thr-Ile-Thr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O GXUWHVZYDAHFSV-FLBSBUHZSA-N 0.000 description 3
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 3
- WITCOKQIPFWQQD-FSPLSTOPSA-N Val-Asn Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O WITCOKQIPFWQQD-FSPLSTOPSA-N 0.000 description 3
- XGJLNBNZNMVJRS-NRPADANISA-N Val-Glu-Ala Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O XGJLNBNZNMVJRS-NRPADANISA-N 0.000 description 3
- OTJMMKPMLUNTQT-AVGNSLFASA-N Val-Leu-Arg Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N OTJMMKPMLUNTQT-AVGNSLFASA-N 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 3
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 3
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 3
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 3
- 108010072405 glycyl-aspartyl-glycine Proteins 0.000 description 3
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L magnesium sulphate Substances [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 3
- 238000011017 operating method Methods 0.000 description 3
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 3
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 3
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 33017-11-7 Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)CCC1 VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 0.000 description 2
- CXISPYVYMQWFLE-VKHMYHEASA-N Ala-Gly Chemical compound C[C@H]([NH3+])C(=O)NCC([O-])=O CXISPYVYMQWFLE-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- BLIMFWGRQKRCGT-YUMQZZPRSA-N Ala-Gly-Lys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN BLIMFWGRQKRCGT-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- RGQCNKIDEQJEBT-CQDKDKBSSA-N Ala-Leu-Tyr Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 RGQCNKIDEQJEBT-CQDKDKBSSA-N 0.000 description 2
- SAHQGRZIQVEJPF-JXUBOQSCSA-N Ala-Thr-Lys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN SAHQGRZIQVEJPF-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 2
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 2
- OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N Arg-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- IASNWHAGGYTEKX-IUCAKERBSA-N Arg-Arg-Gly Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NCC(O)=O IASNWHAGGYTEKX-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- CYXCAHZVPFREJD-LURJTMIESA-N Arg-Gly-Gly Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O CYXCAHZVPFREJD-LURJTMIESA-N 0.000 description 2
- SONUFGRSSMFHFN-IMJSIDKUSA-N Asn-Ser Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SONUFGRSSMFHFN-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 description 2
- 229910021580 Cobalt(II) chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- CPTUXCUWQIBZIF-ZLUOBGJFSA-N Cys-Asn-Ser Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O CPTUXCUWQIBZIF-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 2
- 101710083939 Deubiquitinase SseL Proteins 0.000 description 2
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 2
- TUTIHHSZKFBMHM-WHFBIAKZSA-N Glu-Asn Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O TUTIHHSZKFBMHM-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- FXGRXIATVXUAHO-WEDXCCLWSA-N Gly-Lys-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCCN FXGRXIATVXUAHO-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 2
- KBDIBHQICWDGDL-PPCPHDFISA-N Ile-Thr-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O)N KBDIBHQICWDGDL-PPCPHDFISA-N 0.000 description 2
- 102100023915 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 241000880493 Leptailurus serval Species 0.000 description 2
- IASQBRJGRVXNJI-YUMQZZPRSA-N Leu-Cys-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O IASQBRJGRVXNJI-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- IRNSXVOWSXSULE-DCAQKATOSA-N Lys-Ala-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN IRNSXVOWSXSULE-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- DCRWPTBMWMGADO-AVGNSLFASA-N Lys-Glu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O DCRWPTBMWMGADO-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- ZOKVLMBYDSIDKG-CSMHCCOUSA-N Lys-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN ZOKVLMBYDSIDKG-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 2
- -1 Met amino acid Chemical class 0.000 description 2
- HUKLXYYPZWPXCC-KZVJFYERSA-N Met-Ala-Thr Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O HUKLXYYPZWPXCC-KZVJFYERSA-N 0.000 description 2
- 229910004619 Na2MoO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- JXWLMUIXUXLIJR-QWRGUYRKSA-N Phe-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 JXWLMUIXUXLIJR-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- RGMLUHANLDVMPB-ULQDDVLXSA-N Phe-Val-Lys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)N RGMLUHANLDVMPB-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WFIVLLFYUZZWOD-RHYQMDGZSA-N Pro-Lys-Thr Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O WFIVLLFYUZZWOD-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 2
- 101710111400 Protease ElaD Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TYVAWPFQYFPSBR-BFHQHQDPSA-N Thr-Ala-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O TYVAWPFQYFPSBR-BFHQHQDPSA-N 0.000 description 2
- BIYXEUAFGLTAEM-WUJLRWPWSA-N Thr-Gly Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O BIYXEUAFGLTAEM-WUJLRWPWSA-N 0.000 description 2
- BQBCIBCLXBKYHW-CSMHCCOUSA-N Thr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]([NH3+])[C@@H](C)O BQBCIBCLXBKYHW-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 2
- GFRIEEKFXOVPIR-RHYQMDGZSA-N Thr-Pro-Lys Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O GFRIEEKFXOVPIR-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 2
- XBWKCYFGRXKWGO-SRVKXCTJSA-N Tyr-Cys-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O XBWKCYFGRXKWGO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- AEMPCGRFEZTWIF-IHRRRGAJSA-N Val-Leu-Lys Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O AEMPCGRFEZTWIF-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- 108010024078 alanyl-glycyl-serine Proteins 0.000 description 2
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 2
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 2
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 238000012443 analytical study Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 239000012595 freezing medium Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 108010025376 glycyl-glutamyl-arginyl-glycyl-phenylalanyl-phenylalanyl-tyrosine Proteins 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N heavy water Substances [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 2
- 239000004313 iron ammonium citrate Substances 0.000 description 2
- 235000000011 iron ammonium citrate Nutrition 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000357 manganese(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 2
- 108010012581 phenylalanylglutamate Proteins 0.000 description 2
- 229920002552 poly(isobornyl acrylate) polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- 239000011684 sodium molybdate Substances 0.000 description 2
- 235000015393 sodium molybdate Nutrition 0.000 description 2
- TVXXNOYZHKPKGW-UHFFFAOYSA-N sodium molybdate (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Mo]([O-])(=O)=O TVXXNOYZHKPKGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 2
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 2
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 2
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 2
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 108010071097 threonyl-lysyl-proline Proteins 0.000 description 2
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 2
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011686 zinc sulphate Substances 0.000 description 2
- 235000009529 zinc sulphate Nutrition 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- XUUXCWCKKCZEAW-YFKPBYRVSA-N Arg-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N XUUXCWCKKCZEAW-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KLKHFFMNGWULBN-VKHMYHEASA-N Asn-Gly Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O KLKHFFMNGWULBN-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- POTCZYQVVNXUIG-BQBZGAKWSA-N Asp-Gly-Pro Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O POTCZYQVVNXUIG-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- KBJVTFWQWXCYCQ-IUKAMOBKSA-N Asp-Thr-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O KBJVTFWQWXCYCQ-IUKAMOBKSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- AYKQJQVWUYEZNU-IMJSIDKUSA-N Cys-Asn Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O AYKQJQVWUYEZNU-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- OABOXRPGTFRBFZ-IMJSIDKUSA-N Cys-Cys Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O OABOXRPGTFRBFZ-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- WTXCNOPZMQRTNN-BWBBJGPYSA-N Cys-Thr-Ser Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N)O WTXCNOPZMQRTNN-BWBBJGPYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 238000005033 Fourier transform infrared spectroscopy Methods 0.000 description 1
- JZDHUJAFXGNDSB-WHFBIAKZSA-N Glu-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O JZDHUJAFXGNDSB-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ALMBZBOCGSVSAI-ACZMJKKPSA-N Glu-Ser-Asn Chemical compound C(CC(=O)O)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N ALMBZBOCGSVSAI-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- VNCNWQPIQYAMAK-ACZMJKKPSA-N Glu-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O VNCNWQPIQYAMAK-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- KGVHCTWYMPWEGN-FSPLSTOPSA-N Gly-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN KGVHCTWYMPWEGN-FSPLSTOPSA-N 0.000 description 1
- LLZXNUUIBOALNY-QWRGUYRKSA-N Gly-Leu-Lys Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN LLZXNUUIBOALNY-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- VDCRBJACQKOSMS-JSGCOSHPSA-N Gly-Phe-Val Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O VDCRBJACQKOSMS-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 1
- VHOLZZKNEBBHTH-YUMQZZPRSA-N His-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CNC=N1 VHOLZZKNEBBHTH-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101500025354 Homo sapiens Insulin B chain Proteins 0.000 description 1
- XQLGNKLSPYCRMZ-HJWJTTGWSA-N Ile-Phe-Val Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)N XQLGNKLSPYCRMZ-HJWJTTGWSA-N 0.000 description 1
- KSZCCRIGNVSHFH-UWVGGRQHSA-N Leu-Arg-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O KSZCCRIGNVSHFH-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- NFNVDJGXRFEYTK-YUMQZZPRSA-N Leu-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O NFNVDJGXRFEYTK-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- LFSQWRSVPNKJGP-WDCWCFNPSA-N Leu-Thr-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O LFSQWRSVPNKJGP-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- JGKHAFUAPZCCDU-BZSNNMDCSA-N Leu-Tyr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C([O-])=O)CC1=CC=C(O)C=C1 JGKHAFUAPZCCDU-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- 101500021084 Locusta migratoria 5 kDa peptide Proteins 0.000 description 1
- RPWTZTBIFGENIA-VOAKCMCISA-N Lys-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O RPWTZTBIFGENIA-VOAKCMCISA-N 0.000 description 1
- UGCIQUYEJIEHKX-GVXVVHGQSA-N Lys-Val-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O UGCIQUYEJIEHKX-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- XBAJINCXDBTJRH-WDSOQIARSA-N Lys-Val-Trp Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N XBAJINCXDBTJRH-WDSOQIARSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 229910017621 MgSO4-7H2O Inorganic materials 0.000 description 1
- KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-proline Natural products NCC(=O)N1CCCC1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 101100342977 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) leu-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 208000025174 PANDAS Diseases 0.000 description 1
- 208000021155 Paediatric autoimmune neuropsychiatric disorders associated with streptococcal infection Diseases 0.000 description 1
- 240000000220 Panda oleosa Species 0.000 description 1
- 235000016496 Panda oleosa Nutrition 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- GVUVRRPYYDHHGK-VQVTYTSYSA-N Pro-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 GVUVRRPYYDHHGK-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- CICQXRWZNVXFCU-SRVKXCTJSA-N Ser-His-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O CICQXRWZNVXFCU-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- WFAUDCSNCWJJAA-KXNHARMFSA-N Thr-Lys-Pro Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(O)=O WFAUDCSNCWJJAA-KXNHARMFSA-N 0.000 description 1
- NXQAOORHSYJRGH-AAEUAGOBSA-N Trp-Gly-Ser Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)=CNC2=C1 NXQAOORHSYJRGH-AAEUAGOBSA-N 0.000 description 1
- WJKJJGXZRHDNTN-UWVGGRQHSA-N Tyr-Cys Chemical compound SC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 WJKJJGXZRHDNTN-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- CLEGSEJVGBYZBJ-MEYUZBJRSA-N Tyr-Thr-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@H](O)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 CLEGSEJVGBYZBJ-MEYUZBJRSA-N 0.000 description 1
- ROLGIBMFNMZANA-GVXVVHGQSA-N Val-Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N ROLGIBMFNMZANA-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GLMQHZPGHAPYIO-UHFFFAOYSA-L azanium;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylate;iron(2+) Chemical compound [NH4+].[Fe+2].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O GLMQHZPGHAPYIO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229940126698 biosimilar insulin Drugs 0.000 description 1
- 229960000106 biosimilars Drugs 0.000 description 1
- 238000013452 biotechnological production Methods 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- LEMUFSYUPGXXCM-JNEQYSBXSA-N caninsulin Chemical class [Zn].C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC3N=CN=C3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1C=NC=N1 LEMUFSYUPGXXCM-JNEQYSBXSA-N 0.000 description 1
- 238000000533 capillary isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000366 copper(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010004073 cysteinylcysteine Proteins 0.000 description 1
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000002050 diffraction method Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000016097 disease of metabolism Diseases 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000002389 essential drug Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000008570 general process Effects 0.000 description 1
- KZNQNBZMBZJQJO-YFKPBYRVSA-N glyclproline Chemical compound NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 108010077435 glycyl-phenylalanyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010077515 glycylproline Proteins 0.000 description 1
- 201000001421 hyperglycemia Diseases 0.000 description 1
- 230000002218 hypoglycaemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229950004152 insulin human Drugs 0.000 description 1
- 230000003914 insulin secretion Effects 0.000 description 1
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 238000013386 optimize process Methods 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 238000012510 peptide mapping method Methods 0.000 description 1
- 238000011020 pilot scale process Methods 0.000 description 1
- 108010005636 polypeptide C Proteins 0.000 description 1
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- OTYBMLCTZGSZBG-UHFFFAOYSA-L potassium sulfate Chemical compound [K+].[K+].[O-]S([O-])(=O)=O OTYBMLCTZGSZBG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910052939 potassium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000634 powder X-ray diffraction Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000004886 process control Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 108010053725 prolylvaline Proteins 0.000 description 1
- 230000000754 repressing effect Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 101150017120 sod gene Proteins 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 101150019416 trpA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania insuliny i jej pochodnych.
Cukrzyca (diabetes mellitus), choroba metaboliczna (grupa chorób metabolicznych) o wieloczynnikowej etiologii, jest jedną z najgroźniejszych chorób społecznych i cywilizacyjnych, nazywana jest też czasem epidemią XXI wieku. Wiążąc się z poważnymi powikłaniami, nieleczona cukrzyca może prowadzić do śmierci pacjenta. Jeżeli przewlekła hiperglikemia wynika z niedostatecznego wydzielania insuliny przez organizm - cukrzyca typu 1 - leczenie wymaga stałego stosowania insuliny i/lub jej analogów. Liczba chorych na cukrzycę wynosi 5-6% populacji, a roczny wzrost liczby diabetyków wynosi ok. 4-6% zależności od regionu świata. Zachorowalność na tę chorobę wciąż wzrasta: jest uznana za chorobę cywilizacyjną - do rozwoju cukrzycy w dużym stopniu przyczynia się obecny styl życia - z tego też powodu do tej pory nie udaje się zahamować rozwoju tej choroby. Również mimo postępu medycyny, insulina oraz jej analogi szybko działające i długo działające stanowią podstawę leczenia cukrzycy typu 1 (10% całkowitej liczby przypadków choroby). Stosowana w leczeniu cukrzycy w dużych ilościach insulina i jej rozmaite pochodne są wytwarzane w dużej skali przemysłowej i z tej przyczyny metody jej wytwarzania są stale ulepszane w celu podwyższenia wydajności procesu i obniżenia kosztów produkcji. Ekonomika procesu produkcji jest również istotna dla zwiększającej się liczby wytwórców biopodobnych insulin [m. in.: S. Gough, Practical Diabetes 2013, 30 (4), 146-147a, G. Dranitsaris, E. Amir, K. Dorwart, Drugs 2011, 71 (12)1527-1536].
W pierwszym okresie po odkryciu insuliny, jako lek dla ludzi stosowana była insulina zwierzęca, wydzielana z trzustek wołowych lub wieprzowych. Humanizowanie tych insulin przez wymianę różnicujących ich aminokwasów metodą syntetyczną nie znalazło zastosowania w skali przemysłowej. Dopiero metody biosyntetyczne rozwiązały problem dostępu chorych do insuliny ludzkiej, a pierwszym procesem było biotechnologiczne oddzielne wytworzenie rekombinowanych łańcuchów A i B insuliny ludzkiej, a następnie ich połączenie w hormon taki, jaki jest wytwarzany endogennie w ludzkiej trzustce (D. V. Goeddel et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 76: 106-110, 1979). Od końca ubiegłego stulecia, biosyntetyczna insulina ludzka i jej analogi, wytwarzane przez transformacje jednołańcuchowego białka fuzyjnego, stanowią podstawowe źródło tego hormonu jako egzogennego leku. Jest on wytwarzany w rekombinowanych systemach bakteryjnych, przede wszystkim w komórkach Eschericha coli (patent polski nr PL 127 843) lub drożdży (L. Thim et al. , Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 83: 6766-6770, 1986). Metoda wytwarzania tych leków jest ogólnie opisana w licznych opisach patentowych oraz publikacjach naukowych i polega na nadekspresji genu kodującego preproinsulinę, czyli polipeptyd hybrydowy, składający się z białka liderowego oraz proinsuliny, tj. łańcucha B insuliny (lub jej pochodnej), peptydu łącznikowego i łańcucha A insuliny (lub jej pochodnej). Po wyizolowaniu białka fuzyjnego, kolejnym etapem wytwarzania jest odcięcie białka liderowego i peptydu łącznikowego, po czym wydziela się czysty hormon. Jednym z przykładów takiego procesu jest sposób wytwarzania insuliny ludzkiej opisany w patencie polskim nr PL 180 818, a metody te są stale udoskonalane (np. polskie opisy patentowe: PL167 810, PL168 114, PL177 002, PL178 466, pLi80 968, PL183 284, PL191 901, PL196,626, PL198 190, PL203 195, PL203 2546,
PL210 437 i zgłoszenia patentowe P.309 882, P.310 007, P.320 644, P.356 005, P.374 949, P.385 586 i P.391 975).
Biosyntetyczna insulina ludzka i jej analogi są podstawowymi lekami w terapii cukrzycy typu 1 oraz mają istotne znaczenie w leczeniu typu 2 z problemami innej kontroli poziomu glukozy. Choć leczenie insuliną ludzką od 30 lat przynosi w większości przypadków zadawalające wyniki, powstały liczne jej analogi pozwalające na lepszą metaboliczną kontrolę cukrzycy dzięki ich szybszemu lub przedłużonemu działaniu. Od kilku już lat sprzedaż analogów insuliny przekracza połowę światowego rynku insulin, jednocześnie ochrona patentowa tych leków zaczyna wygasać. Ta sytuacja pozwala na wejście na rynki medyczne nowych producentów tych insulin jako leków biopodobnych, zgodnie z regulacjami Unii Europejskiej i USA. Z tych powodów istotne stają się wydajne metody ich biosyntezy, zapewniające wysoką ekspresję pożądanych białek.
W patencie polskim nr PL180 818 opisano wydajny sposób wytwarzania rekombinowanej insuliny ludzkiej przy użyciu szczepu bakterii E. coli pozbawionego represora cytR (opisanego w europejskim zgłoszeniu patentowym nr EP.0303972) transformowanego plazmidem z operonem deo, zawierającym region kodujący białko hybrydowe (prekursor) obejmujące peptyd liderowy, o długości 62 aminokwasów pochodzący z N-końca modyfikowanej ludzkiej dysmutazy nadtlenkowej (CuZnSOD) poprzedzony od końca N aminokwasem Met i zakończony od końca C resztą Arg łączącą go z łańcuchem B insuliny. Łańcuch B insuliny połączony jest z łańcuchem A krótkim peptydem łącznikowym składającym się ze
PL 239 062 B1 znanych łączników Lys-Arg (europejski opis patentowy nr EP195 691) lub Arg (europejski opis patentowy nr EP347 781).
Celem wynalazku było uzyskanie wydajnego sposobu otrzymywania insuliny i jej analogów o kilkanaście procent przewyższającego wydajność procesu z zastosowaniem peptydu C jako białka łącznikowego, a także białek hybrydowych znajdujących zastosowanie w tym sposobie.
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania insuliny ludzkiej obejmujący mikrobiologiczną ekspresję rekombinowanego białka zawierającego insulinę, charakteryzujący się tym, że obejmuje:
(a) otrzymywanie polipeptydu hybrydowego zawierającego proinsulinę poprzez ekspresję tego polipeptydu hybrydowego w komórce szczepu bakterii Escherichia coli pozbawionej represorów deo i/lub genu deo (cytR) zawierającej DNA kodujący polipeptyd hybrydowy, przy czym ten DNA jest obecny w wektorze pod kontrolą promotora deo P1P2 natomiast polipeptyd hybrydowy zawiera łańcuch B insuliny kowalencyjnie związany z łańcuchem A dipeptydem ArgArg, (b) odzyskiwanie polipeptydu hybrydowego, (c) ufałdowywanie i tworzenie wiązań dwusiarczkowych w polipeptydzie hybrydowym otrzymanym w (b), unikając uprzedniego poddawania polipeptydu hybrydowego siarczynolizie, (d) poddawanie uzyskanego w (c) ufałdowanego, z utworzonymi wiązaniami dwusiarczkowymi polipeptydu hybrydowego trawieniu enzymatycznemu w celu otrzymania insuliny, (e) oczyszczania tak wytworzonej insuliny.
Korzystnie, peptydem hybrydowym jest peptyd posiadający sekwencję aminokwasową o wzorze ogólnym:
Xn-B-Arg-Arg-A gdzie :
A oznacza polipeptyd łańcucha A insuliny lub jej analogu, korzystnie o sekwencji wybranej spośród Sekw. Nr Id.: 1-4,
B oznacza polipeptyd łańcucha B insuliny lub jej analogu, korzystnie o sekwencji wybranej spośród Sekw. Nr Id.: 5-6, n oznacza 0 lub 1,
X oznacza polipeptyd białka liderowego, korzystnie o sekwencji wybranej spośród SOD o Sekw. Nr Id.: 12 lub UBI o Sekw. Nr Id.: 13.
Korzystnie, peptyd hybrydowy ma sekwencję aminokwasową wybraną spośród: Sekw. Nr Id.: 8-26.
Korzystnie, w etapie (a) ekspresję prowadzi się w szczepie E. coli o genotypie: F- ara Δ (pro lac) rpsL thi cyt R rec A λ -, pozbawionym aktywnego białka represora cyt R.
Korzystnie, w etapie (a) jako wektor stosuje się plazmid pIBA o sekwencji Sekw Nr Id: 27.
Korzystnie, etap (a) obejmuje fermentację w obecności glukozy, glicerolu lub galaktozy.
Korzystnie, etap (b) obejmuje:
(i) niszczenie ściany komórkowej komórki bakteryjnej lub jej fragmentów w celu utworzenia lizatu, korzystnie poprzez działanie lizozymu i Tritonu X100 a następnie sonifikację lub dezintegrację;
(ii) izolowanie wewnątrzkomórkowego precypitatu ciałek inkluzyjnych z lizatu przez wirowanie; i (iii) rozpuszczanie precypitatu ciałek inkluzyjnych.
Korzystnie, etap (c) obejmuje inkubację polipeptydu hybrydowego, korzystnie w obecności kwasu askorbinowego, zwłaszcza w stężeniu około 2 moli na mol grup SH obecnych w mieszaninie, w temperaturze od 4 do 37°C przez około od 1 do 30 godzin, korzystnie około 5 godzin, w pH od 8,5 do 12, korzystnie w pH od 11,0 do 11,25.
Korzystnie, etap (d) obejmuje ponadto:
(i) doprowadzanie pH do około 8,8-9,0; i (ii) trawienie polipeptydu hybrydowego trypsyną i następnie ewentualnie karboksypeptydazą B w temperaturze 16-37°C w ciągu 30 minut do 16 godzin.
Korzystnie, etap (e) obejmuje ponadto oczyszczanie roztworu przez niskociśnieniową chromatografią cieczową na Sefarozie Q przed trawieniem trypsyną.
Korzystnie, etap (e) obejmuje ponadto oczyszczanie roztworu niskociśnieniową chromatografią na DEAE-Sepharose przed trawieniem karboksypeptydazą B.
Korzystnie, etap (e) obejmuje ponadto oczyszczanie uzyskanej insuliny wysokosprawną chromatografią cieczową, korzystnie do czystości co najmniej 98%, a następnie krystalizację, filtrację i suszenie.
PL 239 062 B1
Korzystnie, w etapie (e) oczyszczaną insuliną jest białko wybrane z grupy do której należy: insulina ludzka, insulina ludzka AlaA22Lys33ArgB31, insulina ludzka SerA22LysB3ArgB31 insulina ludzka SerA22LysB3ArgB31, insulina ludzka LysB28ProB29 oraz insulina ludzka Asp328 .
Szczegółowy opis wynalazku
W ramach poszukiwań wysokosprawnych systemów ekspresji insulin, zaplanowano badania nad wpływem rodzaju peptydu łącznikowego łączącego łańcuchy A i B (proinsuliny) na wydajność insuliny i jej analogów w systemie genowym opisanym w patencie polskim nr PL 180 818.
Zgodnie z wynalazkiem jako rekombinowaną preproinsulinę przyjmuje się połączenie proinsuliny z dodatkowym polipeptydem liderowym, np. ubikwityną albo dysmutazą ponadtlenkową (SOD), albo ich fragmentami. W świetle uznanej terminologii, przez rekombinowaną proinsulinę rozumie się łańcuch polipeptydowy, w którym łańcuchy A i B insuliny ludzkiej lub jej analogu są połączone dowolnym (poli)peptydem (łącznikowym) umożliwiającym ich ufałdowanie poprzez utworzenie 2 połączeń disiarczkowych między łańcuchami A i B oraz trzeciego - w obrębie łańcucha A. Zgodnie z wynalazkiem, przez insulinę rozumie się rekombinowaną insulinę ludzką lub jej rekombinowany analog o działaniu hipoglikemizującym.
Zgodnie z wynikami przeprowadzonych badań, według wynalazku specjalnie wydajny sposób wytwarzania insuliny i jej analogów obejmujący mikrobiologiczną nadekspresję genu kodującego rekombinowany polipeptyd hybrydowy, zawierający proinsulinę, w komórkach szczepów bakterii Escherichia coli pozbawionych represora cytR transformowanego odpowiednim wektorem z wstawionym właściwym genem pod kontrolą promotora deoP1P2, polega na tym, że wytwarzana proinsulina składa się z łańcucha B insuliny kowalencyjnie związanego z łańcuchem A dipeptydem Arg-Arg jako peptydem łącznikowym. W celu przeprowadzenia badań, na podstawie opisu patentu nr PL 180 818 wytworzono plazmid pIBA, zawierający region kodujący promotor deoP1P2 oraz fragment genu ludzkiej dysmutazy ponadtlenkowej (SOD, 62 aa) lub ubikwityny (UBI) opisany w patentach US 8158382 oraz US 8956848 oraz przez A. Wojtowicz i in., Microbial Cell Fact. 2005, 4: 17 i Microb Cell Fact. 2014; 13(1): 113. W tej samej ramce odczytu znajduje się następnie fragment kodujący odpowiednią proinsulinę - ewentualnie modyfikowany łańcuch B, peptyd łącznikowy i ewentualnie modyfikowany łańcuch A. Elementy regulacyjne plazmidu pochodzą z wektora pBR322 (ATCC 31344). Promotor deoP1P2 pochodzi z bakteryjnego operonu deo złożonego z czterech ściśle powiązanych genów regulujących katabolizm nukleotydów i dezoksynukleotydów w bakteriach Escherichia coli; jego sekwencję zamplifikowano z chromosomalnego DNA szczepu E. coli K12 w oparciu o sekwencję nukleotydową z bazy danych genów [GenBank: AP009048]. W oparciu o szczep bakterii E. coli CSH50 (ATCC:39111; Cheng i wsp., Gene; 14 Suppl. 1-2: 121-130, 1981), otrzymano szczep E. coli IBA, o genotypie : F- ara Δ (pro lac) rpsL thi cyt R rec A λ -, pozbawiony aktywnego białka represora cyt R poprzez wprowadzenie mutacji do jego genu, stosując metodę opisaną w europejskim zgłoszeniu patentowym nr PL 0303972. Po transformacji szczepu gospodarza E. coli IBA plazmidem pIBA uzyskano opisany w patencie polskim 180 818 system ekspresji kodowanego białka fuzyjnego w wektorze pIBAINS pod kontrolą promotora deoP1P2, który jest ujemnie kontrolowany przez białko chromosomalnego represora, produktu genu cytR (K. Hammer-Jesperson i inni, Molec. Genet. 1975; 137:327-335). W konstrukcji plazmidów zastosowano elementy-fragmenty DNA kodujące różne białka liderowe i różne pochodne insuliny, przy czym łańcuch A (pro)insuliny był połączony z łańcuchem B insuliny różnymi peptydami łącznikowymi - których przykłady podano poniżej.
Wydajność wytwarzania insuliny i jej analogów w tym systemie ekspresji i z różnymi peptydami łącznikowymi porównano z ekspresją tych hormonów z użyciem innych szczepów E. coli i wektora będącego pochodną plazmidu pIGAL (Bank genów AY 424310), badając przede wszystkim zależność wydajności od rodzaju peptydu łącznikowego.
Zastosowanymi peptydami łącznikowymi były sekwencje:
1. Lys-Arg
2. Arg
3. Arg-Arg
4. Peptyd C
Według wynalazku przebadaną insuliną i jej pochodnymi- analogami były: rekombinowaną insulina ludzka (opis patentu polskiego nr PL128 599), insulina ludzka LysB28ProB29 (insulina lispro, opis patentu polskiego nr PL180 968), insulina ludzka GlyA22ArgB31; (opis patentu polskiego nr PL219335 lub US 08618048, insulina GR), insulina ludzka SerA22ArgB31 (opis polskiego zgłoszenia patentowego nr P.219335, insulina SR),
PL 239 062 B1 insulina ludzka SerA22LysB3ArgB31 (opis polskiego zgłoszenia patentowego nr P.399287, insulina SK3R) oraz preproinsulina (prekursor) G: białko liderowe - łańcuch B - łącznik - łańcuch A: dezAsnA21GlyA21.
Jako szczep gospodarza E. coli do badań wydajności wykorzystano E. coli IBA; istotą jego właściwości jest nieaktywny gen białka represywnego cytR, co ujawniono i opisano w literaturze fachowej (m. in. Miller J H. Experiments in molecular genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. 1972), czy w opisie patentu USA 4 480 038 lub patentu polskiego 180 818 dla szczepów E. coli zdeponowanych pod numerami dostępu ATCC 69361 i 69363. Dla celów porównawczych stosowano również inne, szeroko stosowane w badaniach szczepy - E. coli DH5, E. coli DH5alfa i E. coli HB101.
Jako plazmidy do ekspresji białek do badań wydajności wykorzystano wektor plBA - promotor deoP1P2, oporność: tetracyklina, terminator transkrypcji terA Trp, ale dla celów porównawczych stosowano również inne wektory - pochodną pIGAL1 (Bank genów AY 424310) - promotor pm s, oporność: ampicylina, terminator transkrypcji ST1; pochodną pIGAL1 - promotor pms, oporność: tetracyklina, terminator transkrypcji terA Trp i pochodną pIGAL1 - promotor deoP1P2, oporność: tetracyklina, terminator transkrypcji ST1. Jako białko liderowe do badań wydajności stosowano przede wszystkim modyfikowany fragment SOD, jak w opisie patentu polskiego nr PL 180 818 oraz modyfikowaną ubikwitynę (UBI), opisaną w opisie patentowym US 8158382 oraz US 8956848. W dalszej części niniejszego opisu terminy SOD i UBI oznaczają związki opisane odpowiednio w tych opisach patentowych. Sposób wytwarzania każdej insuliny, będącej przedmiotem niniejszego zgłoszenia, realizuje się klasyczną metodą inżynierii genetycznej i biotechnologii. Polega ona na tym, że konstruuje się odpowiedni szczep, który w procesie biosyntezy (fermentacji) wytwarza żądany polipeptyd hybrydowy (odpowiednią preproinsulinę), którą następnie transformuje się w żądany produkt, oczyszcza się i izoluje. System ten jest uniwersalny dla wytworzenia rekombinowanej insuliny ludzkiej i jej badanych - niewiele różniących się analogów. Dla tego celu skonstruowane zostały modyfikacje genu rekombinowanej preproinsuliny ludzkiej przy wykorzystaniu technik genetycznych takich jak np. reakcja miejscowo - specyficznej mutagenezy. Reakcję mutagenezy punktowej przeprowadzono przy użyciu zestawu firmy Stratagene (nr kat. 200518-5); jako matrycę wykorzystano DNA plazmidowe plazmidu plBA oraz pIGAL. Jako matrycę można również wykorzystywać dowolny inny DNA zawierający odpowiednią sekwencję kodującą rekombinowaną ludzką proinsulinę lub preproinsulinę.
Dla każdej insuliny wytworzono konstrukty plazmidowe - wektory - kodujące badaną (pre)proinsulinę z (poli)peptydem łącznikowym, przy czym w konstrukcji plazmidów zastosowano elementyfragmenty DNA kodujące różne proinsuliny - składające się z różnych peptydów łącznikowych i różnych pochodnych insuliny.
Wektorami tymi transformowano komórki kompetentne odpowiedniego szczepu Escherichia coli', jak np. IBA, DH5a, DH5, czy HB101, przy czym możliwe jest wykorzystanie komórek innych szczepów E. coli lub komórek innych mikroorganizmów albo innych znanych linii komórkowych nadających się do ekspresji białek rekombinowanych. Plazmid zawierający określoną modyfikację genu rekombinowanej preproinsuliny ludzkiej izolowano i sekwencjonowano w celu sprawdzenia poprawności transformacji i sekwencji nukleotydowej. Pojedyncze klony transformowanych szczepów hodowano standardowo na odpowiednim podłożu z dodatkiem antybiotyku selekcyjnego, przygotowując materiał bakteryjny do badawczego banku szczepów, a próby w stosunku 1:1 hodowli bakteryjnej i 40% glicerolu zdeponowano w temp. -70°C. Wszystkie otrzymane szczepy banków badawczych poddano wyczerpującym badaniom mikrobiologicznym, biochemicznym i fizykochemicznym, które potwierdziły ich stabilność i zgodność ich właściwości z wymaganiami właściwymi dla banków przemysłowych. Przebieg dalszej biosyntezy oparto na opisie patentu polskiego nr PL 180 818. Po biosyntezie, wytwarzane w szczepach E. coli warianty rekombinowanej preproinsuliny izolowano po rozbiciu komórek w postaci ciałek inkluzyjnych, które oddzielano. Z ciałek inkluzyjnych izolowano polipeptyd hybrydowy z insuliną lub jej analogiem (odpowiednią preproinsulinę), a następnie poddawano go ufałdowaniu (foldingowi, renaturacji). Uzyskany roztwór ufałdowanego białka hybrydowego poddawano kontrolowanemu działaniu trypsyny, analogicznie jak w przypadku szeregu metod znanych uprzednio i opisanych (np. przez Kemmlera i wsp. w J. Biol. Chem. , Vol. 246, str. 6786-6791 (1971) lub w patentach US 6686177, lub US 6100376), albo proteazy deubikwitynującej, jak opisano w patentach US 8158382 oraz US 8956848 oraz przez A. Wojtowicz i in., Microbial Cell Fact. 2005, 4: 17 i Microb Cell Fact. 2014; 13(1): 113, albo obu tych enzymów.
PL 239 062 B1
W części przypadków (insulina ludzka, insulina Lispro) działaniem karboksypeptydazy B usuwano dodatkowe aminokwasy peptydu łącznikowego; w pozostałych przypadkach etap ten pomijano. Otrzymaną insulinę i jej analogi poddawano procesowi oczyszczania przy zastosowaniu znanych metod, przede wszystkim chromatografii niskociśnieniowej, ultrafiltracji i HPLC. Z oczyszczonego w dostatecznym stopniu - do wymagań farmakopealnych - roztworu insuliny lub jej analogu, produkt krystalizowano i suszono.
W celu porównania wydajności ekspresji dla każdego gospodarza i wariantu systemu opracowano i zoptymalizowano biosyntezę, izolację i oczyszczanie produktu każdego ze szczepów. Biosyntezę szczepów Escherichia coli pozbawionych represora cytR transformowanego odpowiednim wektorem z wstawionym właściwym genem pod kontrolą promotora deoP1P2 prowadzono zgodnie z opisem polskiego patentu nr PL 180 818, w fermentorach o pojemności 7,5 dm3, stosując ok. 3-5% materiału szczepiennego i minimalną, przemysłową pożywkę do inokulum i hodowli produkcyjnej oraz regulując indukcję żądanego produktu za pomocą glukozy, zgodnie z przykładem 2 polskiego patentu nr PL 180 818. Biosyntezę innych szczepów E. coli prowadzono zgodnie z ogólnymi sposobami ich hodowli. Hodowlę inokulum prowadzono przez ok. 10 godzin, do czasu zakończenia logarytmicznej fazy wzrostu bakterii, a hodowlę produkcyjną przez ok. 16 godzin. Dalszy proces wydzielania, transformacji i oczyszczania produktu prowadzono również zgodnie z opisem polskiego patentu nr PL 180 818 - zoptymalizowanym przykładem 2 i 3. W szczególności, po zakończonej biosyntezie produkcyjnej wytworzoną brzeczkę chłodzono do ok. 10°C, odwirowywano komórki E. coli, poddawano je działaniu lizozymu i Tritonu X100, a następnie w temperaturze 5-10°C poddawano sonifikacji ultradźwiękami lub dezintegracji ciśnieniowej. Ciała inkluzyjne ponownie odwirowywano, przemywano, po czym poddawano renaturacji, jak ogólnie opisano w przykładzie 3A patentu PL 180 818. Za wyjątkiem białka otrzymywanego według Przykładu 6, dalszy zoptymalizowany proces polegał na poddaniu roztworu niskociśnieniowej chromatografii cieczowej z użyciem DEAE Sepharozy po cytrakonylacji i trawieniu trypsyną lub proteazą deubikwitynującą i trypsyną. Po decytrakonylacji i strąceniu oraz rozpuszczeniu białka, roztwór poddawano kolejnej niskociśnieniowej chromatografii cieczowej z zastosowaniem złoża Sepharozy Q, po której następowało ewentualne trawienie peptydu łącznikowego karboksypeptydazą B. Po końcowej wysokosprawnej chromatografii cieczowej na złożu Kromasil C8-18, oczyszczony do czystości minimum 98% produkt poddawano krystalizacji, filtracji i suszeniu. Szczegółowy opis całego procesu, całkowicie porównywalnego dla określonych insulin, podano w przykładach. Proces prowadzono w skali pilotowej, stosując metody i aparaturę wykorzystywane w przemyśle. Po zoptymalizowaniu procesu, dla celów badania wydajności procesu przeprowadzono trzy kolejne szarże każdej insuliny, a przedstawione wyniki są średnią z każdej z nich.
Do porównania wydajności ekspresji, przy ustalonym procesie produkcyjnym, z ujednoliconej kontroli procesowej wybrano badania analityczne pięciu operacji:
(1) Gęstości optycznej (OD600) zakończonej hodowli produkcyjnej;
(2) Masy hodowli (wyizolowanych bakterii) - wyrażanej w g w przeliczeniu na 1 dm3 hodowli produkcyjnej (wilgotnej i/lub suchej);
(3) Masy wyizolowanych ciał inkluzyjnych, wyrażanej w g na 1 dm3 hodowli produkcyjnej (wilgotnej i/lub suchej albo jako suchej masy zawiesiny w buforze);
(4) Białka całkowitego (po foldingu prekursora), oznaczanego metodą spektrofotometryczną i wyrażanego w AU/dm3 lub HPLC i wyrażanego w % ufałdowanego prekursora w białku całkowitym;
(5) Masę oczyszczonego końcowego produktu wyrażaną w mg na 1 dm3 hodowli produkcyjnej.
W przypadku insuliny lispro podano wyniki badań analitycznych większości etapów - białka całkowitego oznaczanego metodą spektrofotometryczną i wyrażanego w AU/dm3 i metodą Bradforda i wyrażanego w g na 1 dm3 hodowli produkcyjnej.
Ogó lny schemat blokowy wytwarzania insuliny i jej pochodnych przedstawiono na schemacie 1.
Wynalazek ujawnia, że wydajność końcowa biosyntetycznej insuliny ludzkiej i jej analogów, przy zoptymalizowanym procesie technologicznym biosyntezy, wydzielania, transformacji i oczyszczania, zależąca od stopnia nadekspresji genu kodującego preproinsulinę w komórkach modyfikowanych bakterii Escherichia coli (z nieaktywnymi represorami cytR negatywnie regulującymi operon deo) transformowanych określonym plazmidem (z promotorem deoPIP2), nieoczekiwanie zależy przede wszystkim od zastosowanego łącznika peptydowego, łączącego łańcuch A i B insuliny.
Zgodnie z wynalazkiem nieoczekiwanie ustalono, iż największą wydajność w tym systemie uzyskuje się w przypadku, gdy rolę łącznika peptydowego pełni dipeptyd Arg-Arg.
PL 239 062 B1
Dzięki wynalazkowi podano specyficzne warunki dla wytwarzania insuliny ludzkiej oraz jej analogów metodą inżynierii genetycznej, przy zastosowaniu mikrobiologicznej nadekspresji odpowiedniej preproinsuliny w komórkach szczepów bakterii Escherichia coli pozbawionych represorów deo i/lub genu deo, zawierających plazmid DNA kodujący odpowiedni polipeptyd hybrydowy w wektorze pod kontrolą promotora deoP1P2 z optymalną wydajnością - znacząco podwyższoną w porównaniu z opublikowanymi danymi.
W opisanych poniżej przykładach realizacji wynalazku strukturę, wydajność i czystość wszystkich produktów wyznaczano rutynowo znanymi metodami HPLC i spektrofotometrii UV; do pełnego scharakteryzowania wytworzonych insulin zastosowano również liczne nowoczesne metody i techniki analityczne, między innymi MS, CIEF, LC-MS/MS, GC, mapowanie peptydowe, NMR, krystalografię i proszkową dyfrakcję rentgenowską, CD, FTIR, ELISA czy PCR oraz sekwencjonowanie aminokwasów i nukleotydów.
Dla lepszego wyjaśnienia istoty wynalazku niniejszy opis został uzupełniony o szczegółowe omówienie jego przykładowych realizacji, obejmujące również rysunki, przedstawiające ogólną strukturę (Fig. 1) i sekwencję (Fig. 2) plazmidu pIBA zarówno gotowego do insercji genu białka hybrydowego jak i przykładowej realizacji w postaci plazmidu zawierającego gen kodujący białko hybrydowe insuliny (Fig. 3 i Fig. 4).
W przykładach nie podano szczegółowych opisów konwencjonalnych metod bioinżynierii zastosowanych do konstrukcji określonych genów, plazmidów, wektorów ze wstawionymi genami kodującymi badane preproinsuliny czy też sposobów transformacji szczepów bakteryjnych tymi wektorami, jak również metod badania stabilności tych szczepów. Metody te są powszechnie znane specjalistom w tej dziedzinie i stosowane w laboratoriach biotechnologicznych oraz opisane w licznych publikacjach, z których kluczowe podano w niniejszym opisie. Produkty końcowe wytwarzane metodą według wynalazku są znanymi insulinami, większość szczegółowych bioinżynieryjnych metod konstrukcji tych rekombinowanych szczepów bakteryjnych opisano w polskim opisie patentowym nr PL 180 968, P. 385 586 i P. 399 287.
Nie opisano również szczegółowo standardowych metod analitycznych stosowanych do określania zawartości i stężenia białek i insulin na poszczególnych etapach wytwarzania, gdyż metody te są również dobrze znane odpowiednim specjalistom i rutynowo stosowane w oznaczaniu białek.
Podane przykłady, nie ograniczając zakresu wynalazku, opisują szczegółowo zastosowaną metodykę badawczą, pozwalającą w pełni kontrolowanym sposobem na dokonanie porównania uzyskanych reprezentatywnych wyników badań zależności wydajności procesu od struktury peptydu łącznikowego.
P r z y k ł a d y
I. Ogólna procedura prowadzenia procesu
Etap 1. Bank badawczy - hodowla podstawowa
Hodowle podstawowe szczepu E. coli IBA, DH5 DH5alfa i HB101 zawierające jako plazmidy do ekspresji białek wektor pIBA i pochodną pIGAL1 (Bank genów AY 424310) prowadzono zgodnie z wymaganiami (ICH Topic Q 5 D: Quality of Biotechnological Products: Derivation and Characterisation of Cell Substrates Used for Production of Biotechnological/Biological Products oraz ICH Topic Q 5 B: Quality of Biotechnological Products:
Analysis of the Expression Construct in Cell Lines Used for Production of r-DNA Derived Protein Products) na podłożu podstawowym :
Podłoże podstawowe:
- Hydrolizat kazeiny20 g
- Ekstrakt drożdżowy10 g
- NaCl5,0 g
- Woda do objętości1 dm
- Antybiotyk (tetracyklina lub ampicylina) do końcowego stężenia 12,5 μg/cm3 TET lub 100 μg/cm3 Amp
Kolbę z podłożem podstawowym z antybiotykiem szczepiono pojedynczą kolonią bakteryjną uzyskaną po transformacji i wytrząsano (220 obr./min.) w 37°C do gęstości optycznej ODsoo ok. 1.
Otrzymaną hodowlę mieszano z podłożem do zamrażania (1:1) i zamrażano w temperaturze -70°C w porcjach po 1 ml.
PL 239 062 B1
Podłoże do zamrażania:
- K2HPO4 6,3g
- KH2PO4 1,8g
- Cytrynian sodu mx 2H2O 0,57 g
- MgSO4 x 7H2O 0,09 g
- (NH4)2SO4 0,9g
- Glicerol 44,0g
- Woda do objętości 450 cm3
Dla uzyskanej hodowli bakteryjnej wykonywano następujące badania:
• pomiar gęstości optycznej hodowli OD przy długości fali 600 nm;
• sprawdzenie jednorodności hodowli bakteryjnej wykonując preparat przyżyciowy. Oceniano czystość hodowli bakteryjnej, cechy morfologiczne - wygląd, kształt komórek. Obserwacja preparatu w mikroskopie Olympus CX 40;
• wyznaczano najbardziej prawdopodobną liczbę jednostek tworzących kolonie na podłożu TSA i TSA z konkretnym antybiotykiem - cfu/ml;
• sprawdzano czystość mikrobiologiczną hodowli na podłożach Sabouraud (do identyfikacji zanieczyszczeń grzybami) i TSA (do identyfikacji zanieczyszczeń innymi bakteriami).
Etap 2. Inokulum
Inokulum przygotowuje się w kolbach o pojemności 250-300 ml i wypełnieniu 50 ml pożywki do inokulum. Do każdej z kolb dodawane są sterylnie roztwory:
• Antybiotyk (tetracyklina lub ampicylina, 12,5 mg/ml) • Glukoza 50%
Do hodowli szczepów E. coli IBA dodaje się dodatkowo:
• Prolina (100 mg/ml) • Tiamina (50 mg/ml) pl
500 pl
300 pl
2-5 pl.
Po zaszczepieniu kolb hodowlą podstawową (bank roboczy), inokulum inkubuje się w temperaturze 30-37°C przez 16-18 godzin do osiągnięcia OD600 ok. 0,7-1,0 na wytrząsarce przy 180-200 rpm. Pożywka do inokulum (skład na 1 dm3)
| - | K2HPO4 | 9 g |
| - | KH2PO4 | 1 g |
| - | NaCl | 5 g |
| - | NH4Cl | 1 g |
| - | MgSO4-7H2O | 0,4 g |
| - | Cytrynian żelazowo-amonowy | 0,01 g |
| - | Ekstrakt drożdżowy | 0,2 g |
| - | Roztwór pierwiastków śladowych | 1 ml |
| MnSO4 x H2O | 1 g/dm3 | |
| ZnSO4 x 7 H2O | 2,78 | |
| CoCI2 x 7 H2O | 2 g/dm3 | |
| Na2MoO4 x 2 H2O | 2 g/dm3 | |
| CaCl2x 2 H2O | 3 g/dm3 | |
| CuSO4x 5 H2O | 1,85 g/dm3 | |
| H3BO4 | 0,5 g/dm3 | |
| HCl (32%) | 100 ml/dm3 | |
| Etap | 3. Hodowla produkcyjna (Fermentor | BioFlo 310 firmy NewBrunswick 7,5 dm3 |
(objętość startowa 4 dm3)
Parametry wyjściowe hodowli:
• Temperatura:
• pH:
• DO:
• Obroty:
• Przepływ powietrza:
37°C
7,1±0,01
30-35%
250 rpm dm3/min.
PL 239 062 B1
Do sterylnego fermentora z 4 dm3 pożywki produkcyjnej i antypieniaczem Antifoam 204 (0,5-1 ml, SIGMA) dodaje się sterylnie roztwory:
• 6 g MgSO4 x 7H2O w 80 cm3 wody • 0,2 g CaCl2 x 2H2O w 60 cm3 wody • glukoza 50%, 4 cm3
Do hodowli szczepów E. coli IBA dodaje się dodatkowo:
• Prolina (100 mg/ml) 24 cm3 • Tiamina (50 mg/ml) 200-500 μl.
Pożywka produkcyjna:
| o | K2HPO4 | 8 g/dm3 |
| o | KH2PO4 | 2 g/dm3 |
| o | NH4Cl | 3 g/dm3 |
| o | Cytrynian żelazowo-amonowy | 0,15 g/dm3 |
| o | K2SO4 | 0,9 g/dm3 |
| o | Cytrynian sodu | 3,0 g/dm3 |
| o | Roztwór pierwiastków śladowych | 3 cm3 |
| MnSO4 x H2O | 1 g/dm3 | |
| ZnSO4 x 7 H2O | 2,78 g/dm3 | |
| CoCI2 x 7 H2O | 2 g/dm3 | |
| Na2MoO4 x 2 H2O | 2 g/dm3 | |
| CaCl2X 2 H2O | 3 g/dm3 | |
| CuSO4X 5 H2O | 1,85 g/dm3 | |
| H3BO4 | 0,5 g/dm3 | |
| HCl (32%) | 100 ml/dm3 |
Pożywkę w fermentorze zaszczepia się inokulum i hoduje w odpowiednich warunkach. Jako źródło węgla i energii do wytwarzania biomasy stosuje się stałe dozowanie do fermentora roztworu 40% glukozy (w przypadku szczepów E. coli IBA z dodatkiem proliny 10-30 mg/ml) tak, aby jej stężenie wynosiło 70-180 mg/dm3.
pH (7,1+/-0,1) kontroluje się przy pomocy 16% amoniaku przez kaskadę. Poziom tlenu w pożywce utrzymuje się na poziomie nie niższym niż 30-35%. Parametr ten kontrolowany jest w zależności od odczytu z elektrody DO przez zwiększenie obrotów mieszadła z 250 do 1000 rpm i przepływu powietrza z 5 do 10 dm3/min. Po osiągnięciu maksymalnych obrotów mieszadła oraz maksymalnego przepływu powietrza (po ok. 7-10 godz.) zatrzymuje się dodawanie glukozy; wartość ODsoo wynosi (w przypadku szczepów E. coli IBA/pIBA) ok. 25-35.
Po spadku stężenia glukozy, jej dodawanie utrzymywane jest tak, aby stężenie wynosiło ok. 35-50 mg/dm3, a pHbyło utrzymywane na poziomie 7,1 +/- 0,1. Ta faza biosyntezy prowadzona jest do momentu osiągnięcia przez komórki stacjonarnej fazy wzrostu (nie obserwuje się już wzrostu gęstości optycznej hodowli) i trwa ok. 7-8 godzin. Na koniec fazy produkcji rekombinowanego białka ODsoo wynosi 50-60 w przypadku szczepów E. coli IBA/pIBA. Następnie hodowla schładzana jest do temperatury poniżej 20°C, korzystnie ok. 10°C.
Etap 4. Wirowanie
Biomasę odwirowuje się na wirówce stacjonarnej przy 6 000-8 000 rpm w czasie 15 min. i w temperaturze +4°C. Brzeczkę pofermentacyjną można odwirować na wirówce przepływowej.
Etap 5. Izolacja ciałek inkluzyjnych
Biomasę zawiesza się w 1 dm3 buforu 50 mM TRIS, 0.5 M NaCl i 5 mM beta-merkaptoetanolu, o pH 7,5, dodaje się lizozym do stężenia 0,43 mg/cm3 i 0,2M EDTA do stężenia 0,5%, po czym inkubuje się przez 30 minut w temperaturze pokojowej i poddaje dezintegracji przez sonikację lub ciśnienie.
Etap 6 - wariant 1: Sonikacja
Materiał chłodzi się do ok. 10°C, dzieli się na 4 części, dodaje Triton do 1% i każdą porcję sonikuje się przez 30 minut przy amplitudzie 33%. Po sonikacji próbę odwirowuje się przy 8000 rpm przez 15 min w temperaturze pokojowej. Następnie osad zawiesza się w 1 dm3 buforu 50 mM TRIS, 0,5 M NaCl i 5 mM betamerkaptoetanolu, o pH 7,5 i ponownie sonikuje przez 10 min. Ciała inkluzyjne odwirowuje się przy 8000 rpm przez 15 min w temperaturze pokojowej.
PL 239 062 B1
Etap 6 - wariant 2: Dezintegracja ciśnieniowa
Materiał chłodzi się do ok. 10°C, poddaje się dezintegracji ciśnieniowej (Panda+1000 firmy GEA Niro Soavi) przy ciśnieniu 800 bar z szybkością zapewniającą całkowite rozbicie komórek (kontrola mikroskopowa) i chłodząc zawiesinę tak, aby temperatura nie przekroczyła ok. 10°C.
Etap 7. Rozpuszczanie ciał inkluzyjnych
Ciała inkluzyjne rozpuszcza się w odpowiedniej ilości 12 mM buforu wodorowęglanowego i 0,2 mM EDTA do uzyskania wartości absorbancji poniżej 9 przy długości fali 280 nm. Roztwór doprowadza się do pH do wartości 11,5 ± 0,5 za pomocą 2 M NaOH i miesza przez 30 min. w temp pokojowej. Następnie koryguje się pH do 10,8 ± 0,4 za pomocą 2 M HCl. Roztwór klaruje się przez wirowanie przy 12 500 rpm przez 15 min w temp. 4°C.
Etap 8. Renaturacja
Po rozpuszczeniu ciał inkluzyjnych białko renaturuje się przez napowietrzanie - silne mieszanieprzez ok. 16-18 h w temperaturze pokojowej. Następnie koryguje się pH do wartości 9,0 za pomocą 2 M HCl.
Etap 9. Cytrakonylacja
Do roztworu białka dodaje się porcjami bezwodnika cytrokonylowego w ilości obliczonejwedług wzoru: objętość bezwodnika (cm3) = 0,15 x objętość roztworu [dm3] x A280 oraz 2 M NaOH do utrzymania pH o wartości w przedziale 8,7-9,3. Po dodaniu całej ilości bezwodnika roztwór miesza się przez 1 godzinę, po czym dodaje się roztwór 2 M etanolaminy w trzykrotnej objętości bezwodnika i miesza przez 30 min.
Etap 10. Trypsynowanie
Po cytrakonylacji pH roztworu koryguje się do wartości 8,8 za pomocą 2 M HCl i rozcieńcza wodą tak, aby przewodnictwo wyniosło poniżej 5 mS. Następnie dodaje się 1% roztwór trypsyny w ilości obliczonej według wzoru: objętość roztworu trypsyny = A280 x objętość roztworu [dm3] / 95) i miesza przez 16-18 godzin w temperaturze pokojowej. Reakcję hamuje się roztworem aprotyniny o stężeniu 1 mg/ml, dodawanego w ilości dwudziestojednokrotnie mniejszej od objętości trypsyny.
Etap 11. Odcięcie białka liderowego - ubikwityny
Do roztworu białka o temperaturze 10°C dodaje się 20 mM kwas fosforowy do uzyskania pH o wartości 7,5, po czym w temperaturze 37°C dodaje się 19,2 cm3 roztworu proteazy UBP1AC lub UBP1AC2 o stężeniu 1 mg/cm3, i miesza się przez 1 godzinę. Po ochłodzeniu do 4°C roztwór klaruje się przez wirowanie przy 12 000 rpm przez 15 minut.
Etap 12. Chromatografia niskociśnieniowa na złożu DEAE Sepharosa
Na kolumnę wypełnioną złożem DEAE (200 cm3) i zrównoważoną 0,5 M TRIS o pH 8,6 ± 0,2, a następnie 20 mM TRIS o pH 8,6 ± 0,2 nanosi się roztwór o pH 8,6 + 0,2. Po naniesieniu kolumnę płucze się buforami o pH 8,6 ± 0,2: 20 mM TRIS z NaCl do przewodności 5mS ±1 mS, a następnie 20 mM TRIS z NaCl do przewodności 2 mS ± 1 mS i 20% ± 5% izopropanolu. Białko insuliny eluuje się buforem o pH 8,6 ± 0,2, składającym się z 20 mM TRIS z NaCl do przewodności 5 ± 1 mS i z dodatkiem 25% ± 5% izopropanolu.
Etap 13. Decytrakonylacja
Frakcję główną wyeluowaną z kolumny rozcieńcza się 2 razy, ochładza do 4°C i zakwasza 0,1 M HCl do pH o wartości 2,9 ± 0,2, po czym miesza się 10 godzin.
Etap 14. Strącanie insuliny chlorkiem cynku
Do rozcieńczonej frakcji głównej dodaje się taką objętość 1 M chlorku cynku, która odpowiada 1/50 objętości frakcji głównej, koryguje się pH do wartości 5,5 ± 0,5 i miesza przez 1 godzinę. Następnie zawiesinę odwirowuje się przy 9000 rpm przez 15 min w 4°C. Otrzymany osad zawiesza się w wodzie.
Etap 15. Chromatografia niskociśnieniowa na złożu Q Sepharosa
Zawiesinę insuliny uzupełnia się wodą do objętości wyliczonej z wzoru: objętość końcowa = całkowita ilość białka otrzymanego po DEAE [AU A28o]/7, dodaje TRIS o pH 8,6 do stężenia 30 mM i 0,2 M roztwór EDTA w ilości wyliczonej z wzoru: objętość [cm3] = całkowita ilość białka otrzymanego po DEAE [AU A280] / 190, po czym doprowadza się pH do wartości 8,6. Na kolumnę wypełniona złożem Q (80 cm3) i zrównoważoną 0,5 M TRIS o pH 8,66, a następnie 20 mM TRIS o pH 8,6, nanosi się roztwór rozpuszczonej soli cynkowej insuliny o pH 8,6. Po naniesieniu kolumnę płucze się buforem 20 mM TRIS z 20% ± 5% izopropanolu o pH 8,6, a następnie eluuje się białko insuliny buforem o pH 8,6, składającym się 20 mM TRIS z NaCl do przewodności 3 mS ±2 mS i 25% ± 5% izopropanolu.
PL 239 062 B1
Etap 16. Reakcja z karboksypeptydazą B
Frakcję główną wyeluowaną z kolumny rozcieńcza się 2 razy i dodaje roztwór karboksypeptydazy B o stężeniu 2,5 mg/cm3 w ilości obliczonej z wzoru: objętość [μm3] = całkowita ilość białka otrzymanego po Q [AU A280] / 15. pH roztworu doprowadza się do wartości 8,8, po czym roztwór miesza się przez 16-18 godzin w temperaturze pokojowej. Następnie pH doprowadza się do 3 i roztwór poddaje się oczyszczaniu przez chromatografię wysokociśnieniową.
Etap 17. Chromatografia wysokociśnieniowa RP-HPLC.
Rozdział prowadzi się na kolumnie Kromasil C8 lub C18 z zastosowaniem gradientu acetonitrylu:
Faza A Faza B
95% 5%
75% 25%
Faza ruchoma A: 2000 cm3 0,2 M roztworu siarczanu sodu z 440 cm3 acetonitrylu, o pH 2,3 i o temperaturze 25-30°C;
Faza ruchoma B: 1250 cm3 0,2 M roztworu siarczanu sodu z 1250 cm3 acetonitrylu, o pH 2,3 i o temperaturze 25-30°C;
Roztwór po reakcji z karboksypeptydazą B lub frakcję główną po oczyszczaniu na złożu Q Sepharosa po dwukrotnym rozcieńczeniu i doprowadzeniu pH do wartości 3, oczyszcza się porcjami, nanosząc na kolumnę jednorazowo objętość roztworu o zawartości białka całkowitego 200 AU, po czym zbiera frakcję główną tak, aby czystość produktu (HPLC) wynosiła co najmniej 98%.
Etap 18. Strącanie insuliny chlorkiem cynku
Połączone frakcje główne po chromatografii wysokociśnieniowej rozcieńcza się 2 razy i dodaje 1 M ZnCl2 w proporcji 3 cm3 chlorku cynku na 150 cm3 próbki, po czym pH doprowadza się do wartości 6 ± 1 i miesza przez 1 godzinę. Następnie zawiesinę wiruje się przy 9000 rpm przez 15 min w 4°C, a osad zawiesza się w 10-15 cm3 wody.
Etap 19. Chromatografia na złożu Sephadeks G-25 i liofilizacja
Zawiesinę osadu doprowadza się do pH 3, filtruje przez filtr 0,22 μm i nanosi na kolumnę wypełnioną nośnikiem Sephadex G 25 (120 cm3). Przed naniesieniem kolumnę równoważy się 5 mM octanem amonu o pH 4, a białko wymywa się 5 mM octanem amonu o pH 4. Tak otrzymaną substancję poddaje się liofilizacji.
II. Przykłady szczegółowe
P r z y k ł a d 1. Insulina ludzka LysB28ProB29 (insulina lispro)
Zgodnie z powyżej podaną ogólną procedurą prowadzenia procesu (punkt I), przeprowadzono wytwarzanie biosyntetycznej insuliny lispro, stosując etapy 1-6, 6b, 7-10 i 12-19 oraz dla systemu ekspresji 1.2. i 1.5. dodatkowo etap II (Tabela 1. Insulina lispro). Proces badano w 20 wariantach 8 systemów ekspresji białka. Z otrzymanych danych wynika, że sprawdzające się w warunkach laboratoryjnych szczepy bakterii Escherichia coli DH5a, DH5 i HB101 z plazmidami z promotorami deoP1P2 i pms nie są odpowiednie dla hodowli produkcyjnej z pożywką minimalną (system 1.3., 1.4., 1.5., 1.6. i 1.7.). Szczepy te charakteryzują się niskim wzrostem na minimalnej pożywce technologicznej, wykazując znacznie niższą wartość gęstości optycznej w fermentorach produkcyjnych. Podobnie małą przydatność produkcyjną wykazuje system szczepu IBA z uszkodzonym represorem cytR i z plazmidem pIGAL (system 1.8.), charakteryzujący się stosunkowo lepszym wzrostem, lecz niską zawartością ciał inkluzyjnych (obserwacje mikroskopowe).
Najlepszą wydajnością ekspresji charakteryzuje się system szczepu IBA/plBA, opisany w patencie polskim nr PL 180 818, który zbadano w 4 wariantach peptydu łącznikowego i 2 wariantach białka liderowego (system 1.1. i 1.2.). Wszystkie charakteryzują się dobrymi, porównywalnymi parametrami wzrostu w pożywce minimalnej, lecz różnią się masą ciał inkluzyjnych i względną wydajnością renaturacji peptydu fuzyjnego oraz - w związku z tym - końcową wydajnością produktu.
Najwyższą wydajność insuliny lispro uzyskano wykorzystując system ekspresji E. coli IBA/pIBA wytwarzający łańcuch A połączony z łańcuchem B insuliny lispro dipeptydem ArgArg (Tabela 1, L.p przykładu 1.1.1. i 1.2.1.), przewyższający wydajność pozostałych systemów co najmniej o 13-15%.
P r z y k ł a d 2. Insulina GlyA22ArgB31 (insulina GR)
Zgodnie z powyżej podaną ogólną procedurą prowadzenia procesu (punkt I), przeprowadzono wytwarzanie biosyntetycznej insuliny GR, stosując etapy 1-6, 6b, 7-10, 12--15 i 17-19 oraz dla systemu ekspresji 2.2. dodatkowo etap 11 (Tabela 2. Insulina GR). Proces badano w 12 wariantach 5 systemów ekspresji białka (nie stosowano wariantu z łącznikiem LysArg, jako nieprowadzącego do
PL 239 062 B1 insuliny GR). Otrzymane dane potwierdzają wnioski z przykładu 1, dotyczące wyższości systemu ekspresji opisanego w patencie polskim nr PL 180 818 nad innymi badanymi oraz wykazują podobne różnice w wydajności procesu w zależności od rodzaju peptydu łącznikowego łączącego łańcuch A i B tego analogu insuliny. W szczególności najwyższą wydajność insuliny GR uzyskano wykorzystując system ekspresji E. coli IBA/pIBA, wytwarzający łańcuch A połączony z łańcuchem B insuliny GR dipeptydem ArgArg (Tabela 2, L.p przykładu 2.1.1. i 2.2.1.) i przewyższający wydajność pozostałych systemów co najmniej o 16%-22%. Z przedstawionych rezultatów wynika przewaga technologiczna łącznika ArgArg bez względu na rodzaj białka liderowego.
P r z y k ł a d 3. Insulina ludzka.
Zgodnie z powyżej podaną ogólną procedurą prowadzenia procesu, przeprowadzono wytwarzanie biosyntetycznej insuliny ludzkiej w 8 wariantach 2 systemów ekspresji białka. W badaniach prowadzono etapy 1-6, 6b, 7-10 i 12-19 oraz dla systemu ekspresji 1.2. i 1.5. dodatkowo etap 11. Z otrzymanych danych wynika (Tabela 3. Insulina ludzka), że najlepszą wydajnością ekspresji charakteryzuje się system szczepów IBA/pIBA, wykazujących się dobrymi, porównywalnymi parametrami wzrostu w przemysłowej pożywce minimalnej i różniących się masą wytworzonych ciał inkluzyjnych oraz względną wydajnością renaturacji. Ponownie najwyższą wydajność insuliny ludzkiej uzyskano wykorzystując system ekspresji E. coli IBA/pIBA wytwarzający łańcuch A połączony z łańcuchem B insuliny ludzkiej dipeptydem ArgArg (Tabela 3, L.p przykładu 3.1.1. i 3.2.1. Badania analityczne, prowadzone w poszczególnych etapach procesu wykazują, że wyższą wydajność w tym wariantach systemu ekspresji - o 14%-16% - osiąga się po etapie wytwarzania ciał inkluzyjnych i renaturacji, przy czym utrzymuje się ona przez wszystkie pozostałe etapy procesu.
P r z y k ł a d 4. Insulina ludzka SerA22ArgB31 (insulina SR).
Badania wydajności procesu wytwarzania insuliny SR przeprowadzono zgodnie z powyżej podana ogólną procedurą (punkt I), realizując etapy 1-6, 6b, 7-10, 12-15 i 17-19 oraz dla systemu ekspresji 4.2. dodatkowo etap 11 (Tabela 2. Insulina GR). Proces badano w 12 wariantach 5 systemów ekspresji białka (nie stosowano wariantu z łącznikiem LysArg, jako nieprowadzącego do insuliny SR). Otrzymane dane potwierdzają poprzednie wyniki, stale wykazując wyższą wydajność systemu ekspresji E. coli IBA/pIBA, wytwarzającego łańcuch A połączony z łańcuchem B insuliny SR dipeptydem ArgArg (Tabela 4, L.p przykładu 4.1.1. i 4.2.1.) w porównaniu z innym peptydami łącznikowymi tego systemu co najmniej o 15% .
P r z y k ł a d 5. Insulina SerA22LizB3ArgB31 (insulina SK3R)
Zgodnie z powyżej podaną ogólną procedurą prowadzenia procesu, przeprowadzono wytwarzanie biosyntetycznej insuliny SK3R w 6 wariantach 2 systemów ekspresji białka. W badaniach prowadzono etapy 1-6, 6b, 7-10, 12-15 i 17-19 oraz dla systemu ekspresji 5.2. dodatkowo etap 11. Z otrzymanych danych wynika (Tabela 5. Insulina SK3R), że najlepszą wydajnością ekspresji charakteryzuje się system szczepów IBA/pIBA, wykazujących się dobrymi, porównywalnymi parametrami wzrostu w przemysłowej pożywce minimalnej i różniących się masą wytworzonych ciał inkluzyjnych oraz względną wydajnością renaturacji. Ponownie najwyższą wydajność insuliny ludzkiej uzyskano wykorzystując system ekspresji E. coli IBA/pIBA wytwarzający łańcuch A połączony z łańcuchem B insuliny ludzkiej dipeptydem ArgArg (Tabela 5, L.p przykładu 5.1.1. i 5.2.1. Wyczerpujące badania analityczne, prowadzone w poszczególnych etapach procesu wykazują, że wyższa wydajność w tych wariantach systemu ekspresji utrzymuje się przez wszystkie etapy procesu po etapie wytwarzania ciał inkluzyjnych i renaturacji, wydajność ta jest wyższa od uzyskanej z innych wariantów systemu ekspresji przynajmniej o 14%-16%.
P r z y k ł a d 6. Preproinsulina (prekursor) G: białko liderowe - łańcuch B - łącznik - łańcuch
A:dezAsnA21GIyA21.
Uniwersalność przewagi łącznika ArgArg nad innymi w ekspresji preproinuliny wykazano również badając wydajność wytwarzania białka składającego się z białka liderowego poprzedzającego łańcuch B, który był połączony badanymi łącznikami z modyfikowanym łańcuchem A insuliny (A:dezAsnA21GlyA21). Badania zrealizowano przeprowadzając krytyczne etapy 1-8 ogólnej procedury prowadzenia procesu w 8 wariantach 2 systemów ekspresji. Wyniki badań, przedstawione w Tabeli 6. Preproinsulina (prekursor) G: białko liderowe - łańcuch B - łącznik - łańcuch A:dezAsnA21GlyA21 wykazują, że w przypadku łącznika ArgArg wydajność procesu jest wyższa o 10%, niż w pozostałych przypadkach.
Na podstawie końcowej wydajności produktu, potwierdzonej zawartością białka przed oczyszczeniem, nieoczekiwanie okazało się, że najlepsze wyniki w wytwarzaniu rekombinowanej insuliny ludzkiej i jej analogów osiąga się w systemie ekspresji składającym się z plazmidu ekspresyjnego z promotorem
PL 239 062 B1 deoP1P2 w szczepach bakterii Escherichia coli pozbawionych genu represora cytR (patent polski nr PL 180 818), jeżeli w plazmidzie kodującym białko fuzyjne łańcuch A insuliny jest połączony z łańcuchem B za pomocą dipeptydu ArgArg. Co więcej, różnica w wydajności między wariantem systemu z dipeptydem ArgArg a LysArg wynosi 13%-22% i jest porównywalna z opisanym w patencie polskim nr PL 180 818 postępem w wydajności systemu z dipeptydem LysArg i Arg w porównaniu z systemem z peptydem C, wynoszącym odpowiednio 23% i 17%.
Konstrukcja genetyczna plazmidu pIBA i pIBA/INS [pIBA/lNSLys(31B)Arg(32B)]
Plazmid plBA/IMS o wielkości 4354 par zasad jest zbudowany z następujących sekwencji regulatorowych oraz genów:
- od 7 pz do 942 pz zlokalizowany jest region regulatorowy z promotorami deoP1P2
- od 946 pz do 1137 pz znajduje się sekwencja kodująca fragment ludzkiego genu SOD,
- od 1138 pz do 1299 pz zawarta jest sekwencja kodująca łańcuchy A, B oraz łańcuch C (w postaci łącznika Lys-Arg) rekombinowanej ludzkiej insuliny INS, sekwencja nukleotydowa insuliny została zmieniona zgodnie z częstością występowania kodonów. w E. coli',
- od 1312 pz do 1338 pz do zlokalizowany jest region kodujący terminator transkrypcji Ter trpA,
- od 1508 pz do 2698 pz znajduje się gen oporności na tetracyklinę Tet,
Strukturę plazmidu pIBA przedstawiono schematycznie na Fig. 1, a jego sekwencję nukleotydową i aminokwasowa; na Fig. 2. Strukturę plazmidu plBA/INS zawierającego przykładowy gen kodujący białko rekombinowanej insuliny ludzkiej, w której łańcuch A jest połączony z łańcuchem B dipeptydem LysArg przedstawiono schematycznie na Fig. 3, a jego sekwencję nukleotydową i aminokwasową na Fig. 4.
PL 239 062 Β1
SEQUENCE LISTING < 110> Instytut Biotechnologii i Antybiotyków < 120> Sposób wytwarzania insuliny i jej pochodnych oraz peptyd hybrydowy stosowany w tym sposobie < 130> PK/3515/RW < 160>29 < 170> Patentln version 3.5 < 210>1 < 211>21 < 212> PRT < 213> artificial <220>
< 223> łańcuch A <400>1
Gly Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu
1015
Glu Asn Tyr Cys Asn 20 <210>2 <211> 22 <212> PRT <213> artificial <220>
<223>
łańcuch a <400>2
Gly Ile Val 1
Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu
1015
Glu Asn Tyr Cys Asn Gly <210>3 <211> 22 <212> PRT <213> artificial
PL 239 062 Β1 <220>
<223> łańcuch a <400> 3
Gly Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser
5
Ile Cys Ser Leu Tyr Gin
15
Leu
Glu Asn Tyr Cys Asn Ser <210> 4 <211> 21 <212> PRT <213> artificial <220>
<223> łańcuch A <400> 4
Gly Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin 15 10 15
Leu
Glu Asn Tyr Cys Gly <210> 5 <211> 30 <212> PRT <213> artificial <220>
<223> łańcuch B <400> 5
Phe Val Asn Gin His Leu Cys 1 5
Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu 10 15
Tyr
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
25 30 <210> 6 <211> 30 <212> PRT <213> artificial
PL 239 062 Β1 <220>
<223> łańcuch B <400> 6
Phe Val Lys Gin His Leu Cys Gly
5
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 20 <210> 7 <211> 30 < 212> PRT < 213> artificial <220>
< 223> łańcuch B < 400> 7
Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly 1 5
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 20 <210> 8 <211> 64 <212> PRT <213> artificial <220>
<223> SOD <400> 9
Met Ala Thr Lys Ala Val Ser Val 1 5
Gly Ile Ile Asn Phe Glu Gin Lys 20
His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 10 15
Tyr Thr Pro Lys Thr
His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 10 15
Tyr Thr Lys Pro Thr
Lys Gly Asp Gly Pro Val Gin 10 15
Ser Asn Gly Pro Val Lys Val 30
Trp Gly Ser Ile Lys Gly Leu Thr
40
Gly Leu His Gly Phe His Val 45
His Glu Phe Gly Asp Asn Thr Ala
55
Ser Thr Ser Ala Gly Pro Arg 60
PL 239 062 Β1 <210> 9 <211> 76 <212> PRT <213> artificial <220>
<223> ubi <400> 9
Met Gin Ile Phe Val Lys Thr
5
Val Glu Ser Ser Asp Thr Ile
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp 35
Gin Leu Glu Asp Gly Arg Thr
5055
Ser Thr Leu His Leu Val Leu
6570 <210>10 <211>117 <212> PRT <213> artificial <220>
<223> X-B-R-R-A (SOD) <400> 10
| Met 1 | Ala | Thr | Lys | Ala 5 | Val | Ser |
| Gly | Ile | Ile | Asn 20 | Phe | Glu | Gin |
| Trp | Gly | Ser 35 | Ile | Lys | Gly | Leu |
| Thr | Gly 10 | Lys | Thr | Ile | Thr | Leu 15 | Glu |
| Asn 25 | Val | Lys | Ser | Lys | Ile 30 | Gin | Asp |
| Gin | Arg | Leu | Ile | Phe 45 | Ala | Gly | Lys |
| Ser | Asp | Tyr | Asn 60 | Ile | Gin | Lys | Glu |
| Leu | Arg | Gly 75 | Gly | ||||
| Leu | Lys 10 | Gly | Asp | Gly | Pro | Val 15 | Gin |
| Glu 25 | Ser | Asn | Gly | Pro | Val 30 | Lys | Val |
| Glu | Gly | Leu | His | Gly 45 | Phe | His | Val |
PL 239 062 Β1
| His | Glu 50 | Phe | Gly | Asp | Asn |
| Phe 65 | Val | Asn | Gin | His | Leu 70 |
Thr Ala Gly Ser Thr Ser Ala Gly Pro Arg 55 60
Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
80
Leu Val Cys
Gly Glu Arg Gly Phe 85
Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
95
Gly Ile Val
Glu Gin Cys Cys Thr 100
Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu
105 110
Glu Asn Tyr Cys Asn
115 <210> 11 <211> 117 <212> PRT <213> artificial <220>
<223> X-B-R-R-A (SOD) 2 <400> 11
Met Ala Thr Lys Ala Val
5
Ser Val Leu Lys Gly Asp Gly Pro Val Gin
15
Gly Ile Ile Asn Phe Glu Gin Lys 20
Glu Ser Asn Gly Pro Val Lys Val
30
| Trp | Gly | Ser 35 | Ile | Lys | Gly | Leu | Thr 40 |
| His | Glu | Phe | Gly | Asp | Asn | Thr | Ala |
| 50 | 55 | ||||||
| Phe | Val | Asn | Gin | His | Leu | Cys | Gly |
| 65 | 70 |
| Glu | Gly | Leu | His | Gly 45 | Phe | His | Val |
| Gly | Ser | Thr | Ser 60 | Ala | Gly | Pro | Arg |
| Ser | His | Leu 75 | Val | Glu | Ala | Leu | Tyr 80 |
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe
Phe Tyr Thr Lys 90
Pro Thr
Arg Arg 95
PL 239 062 Β1
Gly Ile Val Glu Gin Cys 100
Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu 105 110
Glu Asn Tyr Cys Asn 115 <210> 12 <211> 118 <212> PRT <213> artificial <220>
<223> X-B-R-R-A (SOD) <400> 12
| Met 1 | Ala | Thr | Lys | Ala 5 | Val | Ser | Val | Leu | Lys 10 | Gly | Asp | Gly | Pro | Val 15 | Gin |
| Gly | Ile | Ile | Asn 20 | Phe | Glu | Gin | Lys | Glu 25 | Ser | Asn | Gly | Pro | Val 30 | Lys | Val |
| Trp | Gly | Ser 35 | Ile | Lys | Gly | Leu | Thr 40 | Glu | Gly | Leu | His | Gly 45 | Phe | His | Val |
| His | Glu 50 | Phe | Gly | Asp | Asn | Thr 55 | Ala | Gly | Ser | Thr | Ser 60 | Ala | Gly | Pro | Arg |
| Phe 65 | Val | Asn | Gin | His | Leu 70 | Cys | Gly | Ser | His | Leu 75 | Val | Glu | Ala | Leu | Tyr 80 |
| Leu | Val | Cys | Gly | Glu 85 | Arg | Gly | Phe | Phe | Tyr 90 | Thr | Pro | Lys | Thr | Arg 95 | Arg |
| Gly | Ile | Val | Glu 100 | Gin | Cys | Cys | Thr | Ser 105 | Ile | Cys | Ser | Leu | Tyr 110 | Gin | Leu |
Glu Asn Tyr Cys Asn Gly
115 <210> 13 <211> 118 <212> PRT
PL 239 062 Β1 <213> artificial <220>
<223> X-B-R-R-A (SOD) <400> 13
Met Ala Thr Lys Ala Val Ser Val
5
Lys Gly Asp Gly Pro Val Gin
15
Gly Tle Tle Asn Phe Glu Gin Lys 20
Ser Asn Gly Pro Val Lys Val
Trp Gly Ser Ile Lys GLy Leu Thr
40
Gly Leu His Gly Phe His Val 45
His Glu Phe Gly Asp Asn Thr Ala
55
Ser Thr Ser Ala Gly Pro Arg
Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly 65 70
His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
80
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 85
Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
95
Gly Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr
100
Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu
110
Glu Asn Tyr Cys Asn Ser 115 <210> 14 <211> 118 <212> PRT <213> artificial <220>
<223> X-B-R-R-A (SOD) <400> 14
Met Ala Thr Lys ALa Val Ser Val
5
Gly Ile Ile Asn Phe Glu Gin Lys
Lys Gly Asp Gly Pro Val Gin
15
Ser Asn Gly Pro Val Lys Val
PL 239 062 Β1
| Trp | Gly | Ser 35 | Ile | Lys | Gly | Leu | Thr 40 | Glu | Gly | Leu | His | Gly 45 | Phe | His | Val |
| His | Glu 50 | Phe | Gly | Asp | Asn | Thr 55 | Ala | Gly | Ser | Thr | Ser 60 | Ala | Gly | Pro | Arg |
| Phe 65 | Val | Lys | Gin | His | Leu 70 | Cys | Gly | Ser | His | Leu 75 | Val | Glu | Ala | Leu | Tyr 80 |
| Leu | Val | Cys | Gly | Glu 85 | Arg | Gly | Phe | Phe | Tyr 90 | Thr | Pro | Lys | Thr | Arg 95 | Arg |
| Gly | Ile | Val | Glu 100 | Gin | Cys | Cys | Thr | Ser 105 | Ile | Cys | Ser | Leu | Tyr 110 | Gin | Leu |
| Glu | Asn | Tyr 115 | Cys | Asn | Ser |
<210 15 <211> 117 <212> PRT <213> artificial <220 <223> Χ-Β-R-R-A (SOD) <400>15
Met Ala Thr Lys Ala Val Ser Val Leu Lys Gly Asp Gly Pro Val Gin
1015
Gly Ile Ile Asn Phe Glu Gin Lys Glu Ser Asn Gly Pro Val Lys Val 20 2530
Trp Gly Ser Ile Lys Gly Leu Thr Glu Gly Leu His Gly Phe His Val 35 4045
His Glu Phe Gly Asp Asn Thr Ala Gly Ser Thr Ser Ala Gly Pro Arg 50 5560
Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
70 7580
PL 239 062 Β1
| Leu | Val | Cys | Gly | Glu 85 | Arg | Gly | Phe |
| Gly | Ile | Val | Glu 100 | Gin | Cys | Cys | Thr |
| Glu | Asn | Tyr 115 | Cys | Gly |
Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg 90 95
Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu
110 <210> 16 <211> 129 < 212> PRT < 213> artificial <220>
< 223> Χ-Β-R-R-A (UBI) <400> 16
Met Gin Ile Phe Val Lys Thr Leu
5
Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu
15
Val Glu Ser Ser Asp Thr Ile Asp 20
Val Lys Ser Lys Ile Gin Asp 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gin
40
Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys 45
Gin Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu
55
Asp Tyr Asn Ile Gin Lys Glu 60
Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg 65 70
Arg Gly Gly Phe Val Asn Gin
80
His Leu Cys Gly Ser His Leu Val 85
Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly
95
Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro
100
Thr Arg Arg Gly Ile Val Glu
110
Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser
115 120
Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys
125
PL 239 062 Β1
Asn <210> 17 <211> 129 <212> PRT <213> artificial <220>
<223> X-B-R-R-A (UBI) <400> 17
Met Gin Ile Phe Val Lys Thr
5
Vai Glu Ser Ser Asp Thr Ile
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp 35
Gin Leu Glu Asp Gly Arg Thr
55
Ser Thr Leu His Leu Val Leu
70
His Leu Cys Gly Ser His Leu 85
Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr
100
Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys 115
| Thr | Gly 10 | Lys | Thr | Ile | Thr | Leu 15 | Glu |
| Asn 25 | Val | Lys | Ser | Lys | Ile 30 | Gin | Asp |
| Gin | Arg | Leu | Ile | Phe 45 | Ala | Gly | Lys |
| Ser | Asp | Tyr | Asn 60 | Ile | Gin | Lys | Glu |
| Leu | Arg | Gly 75 | Gly | Phe | Val | Asn | Gin 80 |
| Glu | Ala 90 | Leu | Tyr | Leu | Val | Cys 95 | Gly |
| Pro 105 | Thr | Arg | Arg | Gly | Ile 110 | Val | Glu |
| Leu | Tyr | Gin | Leu | Glu 125 | Asn | Tyr | Cys |
Asn <210> 18
PL 239 062 Β1 <211> 130 <212> PRT <213> artificial <220>
<223> X-B-R-R-A (UBI) <400> 18
Met Gin Ile Phe Val Lys Thr Leu 1 5
Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu
15
Val· Glu Ser Ser Asp Thr Ile Asp 20
Asn Val Lys Ser Lys Ile Gin Asp 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gin
40
Gin Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys
Gin Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu
55
Ser Asp Tyr Asn Ile Gin Lys Glu 60
Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg 65 70
Leu Arg Gly Gly Phe Val Asn Gin
80
His Leu Cys Gly Ser His Leu Val 85
Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly
95
Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro
100
Lys Thr Arg Arg Gly Ile Val Glu
105 110
Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser
115 120
Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys
125
Asn Gly
130 <210> 19 <211> 130 <212> PRT <213> artificial <220>
<223> X-B-R-R-A (UBI) <400> 19
PL 239 062 Β1
Met Gin Ile Phe Val Lys Thr 1 5
Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu 10 15
Val Glu Ser Ser Asp Thr Ile 20
Asn Val Lys Ser Lys Ile Gin Asp 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp 35
Gin Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys 45
Gin Leu Glu Asp Gly Arg Thr
55
Ser Asp Tyr Asn Ile Gin Lys Glu
Ser Thr Leu His Leu Val Leu
70
Leu Arg Gly Gly Phe Val Asn Gin
80
His Leu Cys Gly Ser His Leu 85
Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly
95
Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr 100
Lys Thr Arg Arg Gly Ile Val Glu
105 110
Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys 115
Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys
125
Asn Ser
130 <210> 20 <211> 130 <212> PRT <213> artificial <220>
<223> X-B-R-R-A (UBI) <400> 20
Met Gin Ile Phe Val Lys Thr
5
Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu
15
Val Glu Ser Ser Asp Thr Ile 20
Asn Val Lys Ser Lys Ile Gin Asp
30
PL 239 062 Β1
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gin
40
Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys
Gin Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu
55
Asp Tyr Asn Tle Gin Lys Glu 60
Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg
70
Arg Gly Gly Phe Val Lys Gin
80
His Leu Cys Gly Ser His Leu Val 85
Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly
95
Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro
100
Thr Arg Arg Gly Ile Val Glu
110
Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser
115 120
Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys
125
Asn Ser
130 <210> 21 <211> 129 <212> PRT <213> artificial <220>
<223> X-B-R-R-A (UBI) <400> 21
Met Gin Ile Phe Val Lys Thr Leu
5
Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu
15
Val Glu Ser Ser Asp Thr Ile Asp 20
Val Lys Ser Lys Ile Gin Asp
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gin
40
Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys 45
Gin Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu
55
Asp Tyr Asn Ile Gin Lys Glu
PL 239 062 Β1
Ser Thr Leu His Leu Val Leu
70
Leu Arg Gly Gly Phe Yal Asn Gin
80
His Leu Cys Gly Ser His Leu 85
Glu Ala Leu Tyr Leu Yal Cys Gly
95
Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr
100
Lys Thr Arg Arg Gly Ile Yal Glu
105 110
Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys 115
Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys
125
Gly <210> 22 <211> 53 < 212> PRT < 213> artificial <220>
< 223> B-R-R-A < 400> 22
Phe Val Asn Gin His Leu Cys
5
Ser His Leu Yal Glu Ala Leu Tyr
15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly 20
Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
30
Gly Ile Yal Glu Gin Cys Cys 35
Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu 45
Glu Asn Tyr Cys Asn 50 <210> 23 <211> 53 <212> PRT <213> artificial <220>
<223> B-R-R-A
PL 239 062 Β1 <400> 23
Phe Val Asn
Gin His Leu Cys Gly Ser His
10
Leu Val Cys
Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr
25
Leu Val Glu Ala Leu Tyr 15
Thr Lys Pro Thr Arg Arg 30
Gly Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu 35 4045
Glu Asn Tyr Cys Asn <210>24 <211>54 <212> PRT <213> artificial <220>
<223> B-R-R-A 3 <400>24
Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His 1510
Leu Val Glu Ala Leu Tyr 15
Leu Val Cys
| Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg | ||
| 20 | 25 | 30 |
Gly Ile Val
| Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys | Ser Leu Tyr Gin Leu |
| 40 | 45 |
Glu Asn Tyr Cys Asn Gly 50 <210>25 <211> 54 <212> PRT <213> artificial <220>
<223> B-R-R-A <400> 25
PL 239 062 Β1
| Phe 1 | Val | Asn | Gin | His 5 | Leu | Cys | Gly | Ser | His 10 | Leu | Val | Glu | Ala | Leu 15 | Tyr |
| Leu | Val | Cys | Gly 20 | Glu | Arg | Gly | Phe | Phe 25 | Tyr | Thr | Pro | Lys | Thr 30 | Arg | Arg |
| Gly | Ile | Val 35 | Glu | Gin | Cys | Cys | Thr 40 | Ser | Ile | Cys | Ser | Leu 45 | Tyr | Gin | Leu |
| Glu | Asn 50 | Tyr | Cys | Asn | Ser |
<210> 26 <211> 54 <212> PRT <213> artificial <220>
<223> B-R-R-A <400> 26
| Phe 1 | Val | Lys | Gin | His 5 | Leu | Cys | Gly | Ser | His 10 | Leu | Vai | Glu | Ala | Leu 15 | Tyr |
| Leu | Val | Cys | Gly 20 | Glu | Arg | Gly | Phe | Phe 25 | Tyr | Thr | Pro | Lys | Thr 30 | Arg | Arg |
| Gly | Ile | VaL 35 | Glu | Gin | Cys | Cys | Thr 40 | Ser | Ile | Cys | Ser | Leu 45 | Tyr | Gin | Leu |
| Glu | Asn 50 | Tyr | Cys | Asn | Ser |
<210> 27 <211> 53 <212> PRT <213> artificial <220>
<223> B-R-R-A <400> 27
Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
10 15
PL 239 062 Β1
Leu Val Cys
Gly Glu Arg 20
Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
2530
Gly Ile Val
Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu 4045
Glu Asn Tyr Cys Gly 50 <210>28 < 211> 4003 < 212> DNA < 213> artificial <220>
< 223> pIBA < 400> 28 gaattcggac cgttggcgat gtgcggtttg ctacattcac agatgttctt cgccacttcc 60 agcagcaggt catcaggggt gatttcagga tcgtagataa aggtcaggtt cggtgaaacc 120 tgcttcaact ctgcatctgc acgtaagatc gcgcgggtaa tgggcgaatc agacgggccg 180 atattggcgt gcataaaggc gtctggcagg gttctgtcga gguaacgcca gaaacgtttt 240 attcgaacat cgatctcgtc ttgtgttaga attaattcta acatacggtt gcaacaacgc 300 atccagttgc cccaggtaga ccggcatcga tgtgaccgac ggcacgtggt ggtaaagaat 360 ggtcagcaga gagagtgcgt catcaagatc tttcgcgcct tccagctcca gccattcgga 420 accgttcgcc agaaaacggg cgtaatcggg taagacatag cgcggtttgt acggcgcatg 480 accttcaaac atatcgcaga ttacaccttc atccagcgcg cggcgggctt cggcaggaag 540 ctgtgggtaa ggcagattgt tttctgcttc cagtgccaga aaatggcgct tctgctccgg 600
PL 239 062 Β1
| gctaagcact 660 | gggctggtga | caatttgctg | gcaacgttgt | tgcagtgcat | tttcatgaga |
| agtgggcatc 720 | ttcttttcct | tttatgccga | aggtgatgcg | ccattgtaag | aagtttcgtg |
| atgttcactt 780 | tgatcctgat | gcgtttgcca | ccactgacgc | at~catttga | aagtgaatta |
| tttgaaccag 840 | atcgcattac | agtgatgcaa | acttgtaagt | agatttcctt | aattgtgatg |
| tgtatcgaag 900 | tgtgttgcgg | agtagatgtt | agaatactaa | caaactcgca | aggtgaattt |
| tattggcgac 960 | aagcctaggt | ttgtttaact | ttaaggagaa | atcatatgtc | tagaatcgat |
| gcccgcttaa 1020 | tgagcgggct | tttttttctc | gaggacgtct | aagaaaccat | tattatcatg |
| acattaacct 1080 | ataaaaatag | gcgtatcacg | aggccctttc | gtcttcaaga | cctctcatgt |
| ttgacagctt 1140 | atcatcgata | agctttaatg | cggtagttta | tcacagttaa | attgctaacg |
| cagtcaggca 1200 | ccgtgtatga | aatctaacaa | tgcgctcatc | gtcatcctcg | gcaccgtcac |
| cctggatgct 1260 | gtaggcatag | gcttggttat | gccggtactg | ccgggcctct | tgcgggatat |
| cgtccattcc 1320 | gacagcatcg | ccagtcacta | tggcgtgctg | ctagcgctat | atgcgttgat |
| gcaatttcta 1380 | tgcgcacccg | ttctcggagc | actgtccgac | cgctttggcc | gccgcccagt |
| cctgctcgct 1440 | tcgctacttg | gagccactat | cgactacgcg | atcatggcga | ccacacccgt |
| cctgtggatc 1500 | ctctacgccg | gacgcatcgt | ggccggcatc | accggcgcca | caggtgcggt |
| tgctggcgcc 1560 | tatatcgccg | acatcaccga | tggggaagat | cgggctcgcc | acttcgggct |
| catgagcgct 1620 | tgtttcggcg | tgggtatggt | ggcaggcccc | gtggccgggg | gactgttggg |
| cgccatctcc | ttgcatgcac | cattccttgc | ggcggcggtg | ctcaacggcc | tcaacctact |
1680
PL 239 062 Β1 actgggctgc ttcctaatgc aggagtcgca taagggagag cgtcgaccga tgcccttgag 1740 agccttcaac ccagtcagct ccttccggtg ggcgcggggc atgactatcg tcgccgcact 1800 tatgactgtc ttctttatca tgcaactcgt aggacaggtg ccggcagcgc tctgggccat 1860 tttcggcgag gaccgctttc gctggagcgc gacgatgatc ggcctgtcgc ttgcggtatt 1920 cggaatcttg cacgccctcg ctcaagcctt cgtcactggt cccgccacca aacgtttcgg 1980 cgagaagcag gccattatcg ccggcatggc ggccgacgcg ctgggctacg tcttgctggc 2040 gttcgcgacg cgaggctgga tggccttccc cattatgatt ct^ctcgctt ccggcggcat 2100 cgggatgccc gcgttgcagg ccatgctgtc caggcaggta ga~gacgacc atcagggaca 2160 gcttcaagga tcgctcgcgg ctcttaccag cctaacttcg atcattggac cgctgatcgt 2220 cacggcgatt tatgccgcct cggcgagcac atggaacggg ttggcatgga ttgtaggcgc 2280 cgccctatac cttgtctgcc tccccgcgtt gcgtcgcggt gcatggagcc gggccacctc 2340 gacctgaatg gaagccggcg gcacctcgct aacggattca ccactccaag aattggagcc 2400 aatcaattct tgcggagaac tgtgaatgcg caaaccaacc cttggcagaa catatccatc 2460 gcgtccgcca tctccagcag ccgcacgcgg cgcatctcgg gcagcgttgg gtcctggccc 2520 gggactcacc agtcacagaa aagcatctta cggatggcat gacagtaaga gaattatgca 2580 gtgctgccat aaccatgagt gataacactg cggccaactt acitctgaca acgatcggag 2640 gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca acatggggga tcatgtaact cgccttgatc 2700 gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg 2760
PL 239 062 Β1 cagcaatggc aacaacgttg cgcaaactat taactggcga actacttact ctagcttccc 2820 ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg 2880 cccttccggc tggctggttt attgctgata aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg 2940 gtatcattgc agcactgggg ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt atctacacga 3000 cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata ggtgcctcac 3060 tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag attgatttaa 3120 aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca 3180 aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag 3240 gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac 3300 cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa 3360 ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgtccttct agtgtagccg tagttaggcc 3420 accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag 3480 tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac 3540 cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc 3600 gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc 3660 ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca 3720 cgagggagct. tccaggggga aacgcc.tggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc 3780 tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg 3840
PL 239 062 Β1 ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg 3900 ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata 3960 ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca 4003 ccttttgctg gccttttgct cacatgttct accgtattac cgcctttgag tgagctgata gcgagtcagt gag <210> 29 <211> 4354 <212> DNA <213> artificial <220>
<223> pIBA/INSLys(31B)Arg(32B) <400> 29 gaattcggac cgttggcgat gtgcggtttg ctacattcac agatgttctt cgccacttcc 60 agcagcaggt catcaggggt gatttcagga tcgtagataa aggtcaggtt cggtgaaacc 120 tgcttcaact ctgcatctgc acgtaagatc gcgcgggtaa tgggcgaatc agacgggccg 180 atattggcgt gcataaaggc gtctggcagg gttctgtcga ggtaacgcca gaaacgtttt 240 attcgaacat cgatctcgtc ttgtgttaga attaattcta acatacggtt gcaacaacgc 300 atccagttgc cccaggtaga ccggcatcga tgtgaccgac ggtacgtggt ggtaaagaat 360 ggtcagcaga gagagtgcgt catcaagatc tttcgcgcct tccagctcca gccattcgga 420 accgttcgcc agaaaacggg cgtaatcggg taagacatag cgcggtttgt acggcgcatg 480 accttcaaac atatcgcaga ttacaccttc atccagcgcg cggcgggctt cggcaggaag 540 ctgtgggtaa ggcagattgt tttctgcttc cagtgccaga aaatggcgct tctgctccgg 600 gctaagcact gggctggtga caatttgctg gcaacgttgt tgcagtgcat tttcatgaga 660 agtgggcatc ttcttttcct tttatąccga agqtqatgcq ccattqtaaq aaqtttcqtq 720
PL 239 062 Β1 atgttcactt tgatcctgat gcgtttgcca ccactgacgc attcatttga aagtgaatta 780 tttgaaccag atcgcattac agtgatgcaa acttgtaagt agatttcctt aattgtgatg 840 tgtatcgaag tgtgttgcgg agtagatgtt agaatactaa caaactcgca aggtgaattt 900 tattggcgac aagcctaggt ttgtttaact ttaaggagaa atcatatggc tactaaagct 960 gtttctgttt taaaaggtga tggtccagtt caaggaatta ttaattttga acaaaaagaa 1020 agtaatggac cagttaaagt atggggaagt attaaaggac ttactgaagg cctgcatgga 1080 ttccatgttc atgagtttgg agataataca gcaggcagta ctagtgcagg tcctcgtttt 1140 gtcaaccagc acctgtgtgg ttctcacctg gttgaagcac tgtacctggt atgtggcgaa 1200 cgtggtttct tctacactcc taaaacaaag cgcggcatcg ttgaacagtg ctgtacctct 1260 atctgttccc tgtaccaact ggagaactac tgcaattaat ctagaatcga tgcccgctta 1320 atgagcgggc ttttttttct cgaggacgtc taagaaacca ttattatcat gacattaacc 1380 tataaaaata ggcgtatcac gaggcccttt cgtcttcaag acctctcatg tttgacagct 1440 tatcatcgat aagctttaat gcggtagttt atcacagtta aattgctaac gcagtcaggc 1500 accgtgtatg aaatctaaca atgcgctcat cgtcatcctc ggcaccgtca ccctggatgc 1560 tgtaggcata ggcttggtta tgccggtact gccgggcctc ttgcgggata tcgtccattc 1620 cgacagcatc gccagtcact atggcgtgct gctagcgcta taugcgttga tgcaatttct 1680 atgcgcaccc gttctcggag cactgtccga ccgctttggc cgccgcccag tcctgctcgc 1740 ttcąctactt gąagccacta tcgactacgc ąatcatggcg accacacccg tcctgtgąat 1800
PL 239 062 Β1 cctctacgcc ggacgcatcg tggccggcat caccggcgcc acaggtgcgg ttgctggcgc 1860 ctatatcgcc gacatcaccg atggggaaga tcgggctcgc cacttcgggc tcatgagcgc 1920 ttgtttcggc gtgggtatgg tggcaggccc cgtggccggg ggactgttgg gcgccatctc 1980 cttgcatgca ccattccttg cggcggcggt gctcaacggc ctcaacctac tactgggctg 2040 cttcctaatg caggagtcgc ataagggaga gcgtcgaccg atgcccttga gagccttcaa 2100 cccagtcagc tccttccggt gggcgcgggg catgactatc gtcgccgcac ttatgactgt 2160 cttctttatc atgcaactcg taggacaggt gccggcagcg ctctgggcca ttttcggcga 2220 ggaccgcttt cgctggagcg cgacgatgat cggcctgtcg cttgcggtat tcggaatctt 2280 gcacgccctc gctcaagcct tcgtcactgg tcccgccacc aaacgtttcg gcgagaagca 2340 ggccattatc gccggcatgg cggccgacgc gctgggctac gtcttgctgg cgttcgcgac 2400 gcgaggctgg atggccttcc ccattatgat tcttctcgct tccggcggca tcgggatgcc 2460 cgcgttgcag gccatgctgt ccaggcaggt agatgacgac catcagggac agcttcaagg 2520 atcgctcgcg gctcttacca gcctaacttc gatcattgga ccgctgatcg tcacggcgat 2580 ttatgccgcc tcggcgagca catggaacgg gttggcatgg atcgtaggcg ccgccctata 2640 ccttgtctgc ctccccgcgt tgcgtcgcgg tgcatggagc cgggccacct cgacctgaat 2700 ggaagccggc ggcacctcgc taacggattc accactccaa gaattggagc caatcaattc 2760 ttgcggagaa ctgtgaatgc gcaaaccaac ccttggcaga acatatccat cgcgtccgcc 2820 atctccagca gccgcacgcg gcgcatctcg ggcagcgttg gg~cctggcc cgggactcac 2880
PL 239 062 Β1 cagtcacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag agaattatgc agtgctgcca 2940 taaccatgag tgataacact gcggccaact tacttctgac aacgatcgga ggaccgaagg 3000 agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac tcgccttgat cgttgggaac 3060 cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct gcagcaatgg 3120 caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac tctagcttcc cggcaacaat 3180 taatagactg gatggaggcg gataaagttg caggaccact tctgcgctcg gcccttccgg 3240 ctggctggtt tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg tgggtctcgc ggtatcattg 3300 cagcactggg gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg acggggagtc 3360 aggcaactat ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca ctgattaagc 3420 attggtaact gtcagaccaa gtttactcat atatacttta gattgattta aaacttcatt 3480 tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt 3540 aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt 3600 gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag 3660 cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta actggcttca 3720 gcagagcgca gataccaaat actgtccttc tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca 3780 agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg 3840 ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg 3900 cgcagcggtc qqqctqaacq qqqqgttcgt ącacacaącc caqcttgqaą cgaacgacct 3960
PL 239 062 Β1
| acaccgaact 4020 | gagataccta | cagcgtgagc | tatgagaaag | cgccacgctt | cccgaaggga |
| gaaaggcgga 4080 | caggtatccg | gtaagcggca | gggtcggaac | aggagagcgc | acgagggagc |
| ttccaggggg 4140 | aaacgcctgg | tatctttata | gtcctgtcgg | gtttcgccac | ctctgacttg |
| agcgtcgatt 4200 | tttgtgatgc | tcgtcagggg | ggcggagcct | atggaaaaac | gccagcaacg |
| cggccttttt 4260 | acggttcctg | gccttttgct | ggccttttgc | tcacatgttc | tttcctgcgt |
| tatcccctga 4320 | ttctgtggat | aaccgtatta | ccgcctttga | gtgagctgat | accgctcgcc |
| gcagccgaac 4354 | gaccgagcgc | agcgagtcag | tgag |
Zastrzeżenia patentowe
Claims (13)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób wytwarzania insuliny ludzkiej obejmujący mikrobiologiczną ekspresję rekombinowanego białka zawierającego insulinę, znamienny tym, że obejmuje:(a) otrzymywanie polipeptydu hybrydowego zawierającego proinsulinę poprzez ekspresję tego polipeptydu hybrydowego w komórce szczepu bakterii Escherichia coli pozbawionej represorów deo i/lub genu deo (cytR) zawierającej DNA kodujący polipeptyd hybrydowy, przy czym ten DNA jest obecny w wektorze pod kontrolą promotora deoPiPz natomiast polipeptyd hybrydowy zawiera łańcuch B insuliny kowalencyjnie związany z łańcuchem A dipeptydem Arg-Arg, (b) odzyskiwanie polipeptydu hybrydowego, (c) ufałdowanie i tworzenie wiązań dwusiarczkowych w polipeptydzie hybrydowym otrzymanym w (b), unikając uprzedniego poddawania polipeptydu hybrydowego siarczynolizie, (d) poddawanie uzyskanego w (c) ufałdowanego, z utworzonymi wiązaniami dwusiarczkowymi polipeptydu hybrydowego trawieniu enzymatycznemu w celu otrzymania insuliny, (e) oczyszczania tak wytworzonej insuliny.
- 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że peptydem hybrydowym jest peptyd posiadający sekwencję aminokwasową o wzorze ogólnym:Xn-B-Arg-Arg-A gdzie :A oznacza polipeptyd łańcucha A insuliny lub jej analogu, korzystnie o sekwencji wybranej spośród Sekw. Nr Id.: 1-4,B oznacza polipeptyd łańcucha B insuliny lub jej analogu, korzystnie o sekwencji wybranej spośród Sekw. Nr Id.: 5-6, n oznacza 0 lub 1,X oznacza polipeptyd białka liderowego, korzystnie o sekwencji wybranej spośród SOD o Sekw. Nr ld.:12 lub UBI o Sekw. Nr Id.: 13.
- 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że peptyd hybrydowy ma sekwencję aminokwasową wybraną spośród: Sekw. Nr Id.: 8-26.
- 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie (a) ekspresję prowadzi się w szczepie E. coli o genotypie:F~ ara A (pro lac) rpsL thi cyt R rec A λ pozbawionym aktywnego receptora cyt R.PL 239 062 B1
- 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie (a) jako wektor stosuje się plazmid pIBA o sekwencji Sekw Nr Id: 27.
- 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że etap (a) obejmuje fermentację w obecności glukozy, glicerolu lub galaktozy.
- 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że etap (b) obejmuje:(i) niszczenie ściany komórkowej komórki bakteryjnej lub jej fragmentów w celu utworzenia lizatu, korzystnie poprzez działanie lizozymu i Tritonu X100 a następnie sonifikację lub dezintegrację;(ii) izolowanie wewnątrzkomórkowego precypitatu ciałek inkluzyjnych z lizatu przez wirowanie; i (iii) rozpuszczanie precypitatu ciałek inkluzyjnych.
- 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że etap (c) obejmuje inkubację polipeptydu hybrydowego, korzystnie w obecności kwasu askorbinowego, zwłaszcza w stężeniu około 2 moli na mol grup SH obecnych w mieszaninie, w temperaturze od 4 do 37°C przez około od 1 do 30 godzin, korzystnie około 5 godzin, w pH od 8,5 do 12, korzystnie w pH od 11,0 do 11,25.
- 9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że etap (d) obejmuje ponadto:(i) doprowadzanie pH do około 8,8-9,0; i (ii) trawienie polipeptydu hybrydowego trypsyną i następnie ewentualnie karboksypeptydazą B w temperaturze 16-37°C w ciągu 30 minut do 16 godzin.
- 10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że etap (e) obejmuje ponadto oczyszczanie roztworu przez niskociśnieniową chromatografią cieczową na Sefarozie Q przed trawieniem trypsyną.
- 11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że etap (e) obejmuje ponadto oczyszczanie roztworu niskociśnieniową chromatografią na DEAE-Sepharose przed trawieniem karboksypeptydazą B.
- 12. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że etap (e) obejmuje ponadto oczyszczanie uzyskanej insuliny wysokosprawną chromatografią cieczową, korzystnie do czystości co najmniej 98%, a następnie krystalizację, filtrację i suszenie.
- 13. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie (e) oczyszczaną insuliną jest białko wybrane z grupy do której należy: insulina ludzka, insulina ludzka AlaA22LysB3ArgB31, insulina ludzka SerA22LysB3ArgB31 insulina ludzka SerA22LysB3ArgB31, insulina ludzka LysB28ProB29 oraz insulina ludzka AspB28.PL 239 062 Β1Schemat 1(1| Kontrola gęstości optycznej 03«« (Optical Deisit/j (2j Masa hodowli (bakterii) po odwirowaniu [lub pc odwirowaniu i wysuszę ii u) (B.i Masa czystych ciał n Aluzyjnych po cdwirowaniu (lub po odwirowaniu i wysuszaniu) (4| Białko całkowite (po fold ng u, metoda spektrobtometryczna lub ΗPLC) (5| Wydajność końcowa oroduktu w przypadku prowadzenia operacji
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL415888A PL239062B1 (pl) | 2016-01-22 | 2016-01-22 | Sposób wytwarzania insuliny i jej pochodnych |
| EP17741726.8A EP3405484A4 (en) | 2016-01-22 | 2017-01-22 | METHOD FOR PRODUCING INSULIN AND INSULIN DERIVATIVES AND HYBRID PEPTIDE USED IN THIS PROCESS |
| PCT/PL2017/050003 WO2017126984A1 (en) | 2016-01-22 | 2017-01-22 | A method for producing insulin and insulin derivatives, and hybrid peptide used in this method |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL415888A PL239062B1 (pl) | 2016-01-22 | 2016-01-22 | Sposób wytwarzania insuliny i jej pochodnych |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL415888A1 PL415888A1 (pl) | 2017-07-31 |
| PL239062B1 true PL239062B1 (pl) | 2021-11-02 |
Family
ID=59361950
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL415888A PL239062B1 (pl) | 2016-01-22 | 2016-01-22 | Sposób wytwarzania insuliny i jej pochodnych |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP3405484A4 (pl) |
| PL (1) | PL239062B1 (pl) |
| WO (1) | WO2017126984A1 (pl) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3807306A4 (en) * | 2018-06-18 | 2022-04-06 | Unichem Laboratories Limited | LEADER SEQUENCE FOR HIGHER EXPRESSION OF RECOMBINANT PROTEINS |
| MX2021006970A (es) | 2018-12-11 | 2021-07-15 | Sanofi Sa | Analogos de insulina que tienen una afinidad de union disminuida al receptor de insulina. |
| US10799564B1 (en) | 2019-05-06 | 2020-10-13 | Baxter International Inc. | Insulin premix formulation and product, methods of preparing same, and methods of using same |
| AU2020399194A1 (en) * | 2019-12-10 | 2022-07-28 | Sanofi | A method of forming a conjugate of a sulfonamide and a polypeptide |
| CN113527506A (zh) * | 2020-04-15 | 2021-10-22 | 博锐生物科技有限公司 | 融合蛋白及其应用 |
| CN113527505A (zh) * | 2020-04-15 | 2021-10-22 | 博锐生物科技有限公司 | 一种多肽和包含该多肽的药物组合物以及它们的应用 |
| CN113801236A (zh) * | 2020-06-11 | 2021-12-17 | 宁波鲲鹏生物科技有限公司 | 一种赖脯胰岛素的制备方法 |
| CN113105536B (zh) * | 2020-09-11 | 2023-07-18 | 美药星（南京）制药有限公司 | 一种新甘精胰岛素原及其制备甘精胰岛素的方法 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK129385A (da) * | 1985-03-22 | 1986-09-23 | Novo Industri As | Peptider og fremstilling deraf |
| DK0622376T3 (da) * | 1993-04-27 | 2001-11-12 | Hoechst Ag | Amorfe monosfæriske former af insulinderivater |
| US6001604A (en) * | 1993-12-29 | 1999-12-14 | Bio-Technology General Corp. | Refolding of proinsulins without addition of reducing agents |
| PL180818B1 (pl) * | 1994-12-29 | 2001-04-30 | Bio Technology General Corp | Sposób wytwarzania insuliny ludzkiej, oraz polipeptyd hybrydowy |
| EP2242767A4 (en) * | 2008-02-19 | 2011-04-06 | Biocon Ltd | PROCESS FOR OBTAINING PURIFIED HETEROLOGOUS INSULINS EXPRESSED IN YEASTS |
| PL219335B1 (pl) * | 2008-07-04 | 2015-04-30 | Inst Biotechnologii I Antybiotyków | Pochodna insuliny lub jej farmaceutycznie dopuszczalna sól, jej zastosowanie oraz zawierająca ją kompozycja farmaceutyczna |
| WO2014122653A1 (en) * | 2013-02-07 | 2014-08-14 | Valin Technologies Ltd. | Process for preparing insulin |
-
2016
- 2016-01-22 PL PL415888A patent/PL239062B1/pl unknown
-
2017
- 2017-01-22 WO PCT/PL2017/050003 patent/WO2017126984A1/en not_active Ceased
- 2017-01-22 EP EP17741726.8A patent/EP3405484A4/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP3405484A4 (en) | 2019-11-06 |
| PL415888A1 (pl) | 2017-07-31 |
| EP3405484A1 (en) | 2018-11-28 |
| WO2017126984A1 (en) | 2017-07-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL239062B1 (pl) | Sposób wytwarzania insuliny i jej pochodnych | |
| RU2495131C2 (ru) | Способ получения рекомбинантного инсулина гларгина | |
| CA2729938C (en) | New insulin analogues of prolonged activity | |
| JP5909478B2 (ja) | インスリン化合物の調製方法 | |
| CN113683679B (zh) | 一种重组i型人源化胶原蛋白c1l6t及其制备方法和用途 | |
| CN113683680A (zh) | 一种重组ⅰ型人源化胶原蛋白c1l1t及其制备方法和用途 | |
| CN113637068A (zh) | 一种重组i型人源化胶原蛋白c1l5t及其制备方法和用途 | |
| CN113105536A (zh) | 一种新甘精胰岛素原及其制备甘精胰岛素的方法 | |
| JP5047978B2 (ja) | インスリン複合体の調製のための方法 | |
| HUE032520T2 (en) | A pharmaceutical composition containing PCMV-VEGF165 to stimulate angiogenesis | |
| CN112851791B (zh) | 一种新型抗代谢紊乱的fgf类似物及其应用 | |
| CN113788891A (zh) | 一种重组i型人源化胶原蛋白c1l4t及其制备方法和用途 | |
| CN119841961A (zh) | 一种胶原蛋白融合多肽及其用途与制备方法 | |
| CN110627889B (zh) | 重组蜘蛛丝蛋白及其制备方法和产业化应用 | |
| KR101946789B1 (ko) | 이황화결합 이성질화효소 신호 펩타이드를 포함하는 재조합 벡터 및 이의 용도 | |
| CN113683681B (zh) | 一种重组i型人源化胶原蛋白c1l3t及其制备方法和用途 | |
| CN113773392B (zh) | 一种甘精胰岛素的制备方法 | |
| CN113773399B (zh) | 一种甘精胰岛素衍生物及其应用 | |
| CN113166230A (zh) | 重组血红蛋白及其制备和使用方法 | |
| KR101841646B1 (ko) | 암 억제 표적 단백질인 ａｉｍｐ－ｄｘ2의 제조방법 | |
| CN106699898A (zh) | 一种可以增大电子传递的融合蛋白及其应用 | |
| CN121378505A (zh) | 一种唇部护理的人源纤连-胶原重组融合蛋白及其应用 | |
| KR100726717B1 (ko) | 재조합 인체 혈소판 유래 성장인자(ｐｄｇｆ-ｂｂ)를고효율로 생산·분비하는 균주 및 분비인자 ｇｓｔ | |
| Coman | Optimization strategies and scale-up the production of a recombinant protein in a methylotropic yeast Pichia pastoris from eggshells. | |
| JP3184182B2 (ja) | 泥鰌成長ホルモン発現ベクター |