PL239062B1 - Sposób wytwarzania insuliny i jej pochodnych - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania insuliny i jej pochodnych.

Cukrzyca (diabetes mellitus), choroba metaboliczna (grupa chorób metabolicznych) o wieloczynnikowej etiologii, jest jedną z najgroźniejszych chorób społecznych i cywilizacyjnych, nazywana jest też czasem epidemią XXI wieku. Wiążąc się z poważnymi powikłaniami, nieleczona cukrzyca może prowadzić do śmierci pacjenta. Jeżeli przewlekła hiperglikemia wynika z niedostatecznego wydzielania insuliny przez organizm - cukrzyca typu 1 - leczenie wymaga stałego stosowania insuliny i/lub jej analogów. Liczba chorych na cukrzycę wynosi 5-6% populacji, a roczny wzrost liczby diabetyków wynosi ok. 4-6% zależności od regionu świata. Zachorowalność na tę chorobę wciąż wzrasta: jest uznana za chorobę cywilizacyjną - do rozwoju cukrzycy w dużym stopniu przyczynia się obecny styl życia - z tego też powodu do tej pory nie udaje się zahamować rozwoju tej choroby. Również mimo postępu medycyny, insulina oraz jej analogi szybko działające i długo działające stanowią podstawę leczenia cukrzycy typu 1 (10% całkowitej liczby przypadków choroby). Stosowana w leczeniu cukrzycy w dużych ilościach insulina i jej rozmaite pochodne są wytwarzane w dużej skali przemysłowej i z tej przyczyny metody jej wytwarzania są stale ulepszane w celu podwyższenia wydajności procesu i obniżenia kosztów produkcji. Ekonomika procesu produkcji jest również istotna dla zwiększającej się liczby wytwórców biopodobnych insulin [m. in.: S. Gough, Practical Diabetes 2013, 30 (4), 146-147a, G. Dranitsaris, E. Amir, K. Dorwart, Drugs 2011, 71 (12)1527-1536].

W pierwszym okresie po odkryciu insuliny, jako lek dla ludzi stosowana była insulina zwierzęca, wydzielana z trzustek wołowych lub wieprzowych. Humanizowanie tych insulin przez wymianę różnicujących ich aminokwasów metodą syntetyczną nie znalazło zastosowania w skali przemysłowej. Dopiero metody biosyntetyczne rozwiązały problem dostępu chorych do insuliny ludzkiej, a pierwszym procesem było biotechnologiczne oddzielne wytworzenie rekombinowanych łańcuchów A i B insuliny ludzkiej, a następnie ich połączenie w hormon taki, jaki jest wytwarzany endogennie w ludzkiej trzustce (D. V. Goeddel et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 76: 106-110, 1979). Od końca ubiegłego stulecia, biosyntetyczna insulina ludzka i jej analogi, wytwarzane przez transformacje jednołańcuchowego białka fuzyjnego, stanowią podstawowe źródło tego hormonu jako egzogennego leku. Jest on wytwarzany w rekombinowanych systemach bakteryjnych, przede wszystkim w komórkach Eschericha coli (patent polski nr PL 127 843) lub drożdży (L. Thim et al. , Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 83: 6766-6770, 1986). Metoda wytwarzania tych leków jest ogólnie opisana w licznych opisach patentowych oraz publikacjach naukowych i polega na nadekspresji genu kodującego preproinsulinę, czyli polipeptyd hybrydowy, składający się z białka liderowego oraz proinsuliny, tj. łańcucha B insuliny (lub jej pochodnej), peptydu łącznikowego i łańcucha A insuliny (lub jej pochodnej). Po wyizolowaniu białka fuzyjnego, kolejnym etapem wytwarzania jest odcięcie białka liderowego i peptydu łącznikowego, po czym wydziela się czysty hormon. Jednym z przykładów takiego procesu jest sposób wytwarzania insuliny ludzkiej opisany w patencie polskim nr PL 180 818, a metody te są stale udoskonalane (np. polskie opisy patentowe: PL167 810, PL168 114, PL177 002, PL178 466, pLi80 968, PL183 284, PL191 901, PL196,626, PL198 190, PL203 195, PL203 2546,

PL210 437 i zgłoszenia patentowe P.309 882, P.310 007, P.320 644, P.356 005, P.374 949, P.385 586 i P.391 975).

Biosyntetyczna insulina ludzka i jej analogi są podstawowymi lekami w terapii cukrzycy typu 1 oraz mają istotne znaczenie w leczeniu typu 2 z problemami innej kontroli poziomu glukozy. Choć leczenie insuliną ludzką od 30 lat przynosi w większości przypadków zadawalające wyniki, powstały liczne jej analogi pozwalające na lepszą metaboliczną kontrolę cukrzycy dzięki ich szybszemu lub przedłużonemu działaniu. Od kilku już lat sprzedaż analogów insuliny przekracza połowę światowego rynku insulin, jednocześnie ochrona patentowa tych leków zaczyna wygasać. Ta sytuacja pozwala na wejście na rynki medyczne nowych producentów tych insulin jako leków biopodobnych, zgodnie z regulacjami Unii Europejskiej i USA. Z tych powodów istotne stają się wydajne metody ich biosyntezy, zapewniające wysoką ekspresję pożądanych białek.

W patencie polskim nr PL180 818 opisano wydajny sposób wytwarzania rekombinowanej insuliny ludzkiej przy użyciu szczepu bakterii E. coli pozbawionego represora cytR (opisanego w europejskim zgłoszeniu patentowym nr EP.0303972) transformowanego plazmidem z operonem deo, zawierającym region kodujący białko hybrydowe (prekursor) obejmujące peptyd liderowy, o długości 62 aminokwasów pochodzący z N-końca modyfikowanej ludzkiej dysmutazy nadtlenkowej (CuZnSOD) poprzedzony od końca N aminokwasem Met i zakończony od końca C resztą Arg łączącą go z łańcuchem B insuliny. Łańcuch B insuliny połączony jest z łańcuchem A krótkim peptydem łącznikowym składającym się ze

PL 239 062 B1 znanych łączników Lys-Arg (europejski opis patentowy nr EP195 691) lub Arg (europejski opis patentowy nr EP347 781).

Celem wynalazku było uzyskanie wydajnego sposobu otrzymywania insuliny i jej analogów o kilkanaście procent przewyższającego wydajność procesu z zastosowaniem peptydu C jako białka łącznikowego, a także białek hybrydowych znajdujących zastosowanie w tym sposobie.

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania insuliny ludzkiej obejmujący mikrobiologiczną ekspresję rekombinowanego białka zawierającego insulinę, charakteryzujący się tym, że obejmuje:

(a) otrzymywanie polipeptydu hybrydowego zawierającego proinsulinę poprzez ekspresję tego polipeptydu hybrydowego w komórce szczepu bakterii Escherichia coli pozbawionej represorów deo i/lub genu deo (cytR) zawierającej DNA kodujący polipeptyd hybrydowy, przy czym ten DNA jest obecny w wektorze pod kontrolą promotora deo P1P2 natomiast polipeptyd hybrydowy zawiera łańcuch B insuliny kowalencyjnie związany z łańcuchem A dipeptydem ArgArg, (b) odzyskiwanie polipeptydu hybrydowego, (c) ufałdowywanie i tworzenie wiązań dwusiarczkowych w polipeptydzie hybrydowym otrzymanym w (b), unikając uprzedniego poddawania polipeptydu hybrydowego siarczynolizie, (d) poddawanie uzyskanego w (c) ufałdowanego, z utworzonymi wiązaniami dwusiarczkowymi polipeptydu hybrydowego trawieniu enzymatycznemu w celu otrzymania insuliny, (e) oczyszczania tak wytworzonej insuliny.

Korzystnie, peptydem hybrydowym jest peptyd posiadający sekwencję aminokwasową o wzorze ogólnym:

Xn-B-Arg-Arg-A gdzie :

A oznacza polipeptyd łańcucha A insuliny lub jej analogu, korzystnie o sekwencji wybranej spośród Sekw. Nr Id.: 1-4,

B oznacza polipeptyd łańcucha B insuliny lub jej analogu, korzystnie o sekwencji wybranej spośród Sekw. Nr Id.: 5-6, n oznacza 0 lub 1,

X oznacza polipeptyd białka liderowego, korzystnie o sekwencji wybranej spośród SOD o Sekw. Nr Id.: 12 lub UBI o Sekw. Nr Id.: 13.

Korzystnie, peptyd hybrydowy ma sekwencję aminokwasową wybraną spośród: Sekw. Nr Id.: 8-26.

Korzystnie, w etapie (a) ekspresję prowadzi się w szczepie E. coli o genotypie: F^- ara Δ (pro lac) rpsL thi cyt R rec A λ ^-, pozbawionym aktywnego białka represora cyt R.

Korzystnie, w etapie (a) jako wektor stosuje się plazmid pIBA o sekwencji Sekw Nr Id: 27.

Korzystnie, etap (a) obejmuje fermentację w obecności glukozy, glicerolu lub galaktozy.

Korzystnie, etap (b) obejmuje:

(i) niszczenie ściany komórkowej komórki bakteryjnej lub jej fragmentów w celu utworzenia lizatu, korzystnie poprzez działanie lizozymu i Tritonu X100 a następnie sonifikację lub dezintegrację;

(ii) izolowanie wewnątrzkomórkowego precypitatu ciałek inkluzyjnych z lizatu przez wirowanie; i (iii) rozpuszczanie precypitatu ciałek inkluzyjnych.

Korzystnie, etap (c) obejmuje inkubację polipeptydu hybrydowego, korzystnie w obecności kwasu askorbinowego, zwłaszcza w stężeniu około 2 moli na mol grup SH obecnych w mieszaninie, w temperaturze od 4 do 37°C przez około od 1 do 30 godzin, korzystnie około 5 godzin, w pH od 8,5 do 12, korzystnie w pH od 11,0 do 11,25.

Korzystnie, etap (d) obejmuje ponadto:

(i) doprowadzanie pH do około 8,8-9,0; i (ii) trawienie polipeptydu hybrydowego trypsyną i następnie ewentualnie karboksypeptydazą B w temperaturze 16-37°C w ciągu 30 minut do 16 godzin.

Korzystnie, etap (e) obejmuje ponadto oczyszczanie roztworu przez niskociśnieniową chromatografią cieczową na Sefarozie Q przed trawieniem trypsyną.

Korzystnie, etap (e) obejmuje ponadto oczyszczanie roztworu niskociśnieniową chromatografią na DEAE-Sepharose przed trawieniem karboksypeptydazą B.

Korzystnie, etap (e) obejmuje ponadto oczyszczanie uzyskanej insuliny wysokosprawną chromatografią cieczową, korzystnie do czystości co najmniej 98%, a następnie krystalizację, filtrację i suszenie.

PL 239 062 B1

Korzystnie, w etapie (e) oczyszczaną insuliną jest białko wybrane z grupy do której należy: insulina ludzka, insulina ludzka Ala^A22Lys³³Arg^B31, insulina ludzka Ser^A22Lys^B3Arg^B31 insulina ludzka Ser^A22Lys^B3Arg^B31, insulina ludzka Lys^B28Pro^B29 oraz insulina ludzka Asp³²⁸ .

Szczegółowy opis wynalazku

W ramach poszukiwań wysokosprawnych systemów ekspresji insulin, zaplanowano badania nad wpływem rodzaju peptydu łącznikowego łączącego łańcuchy A i B (proinsuliny) na wydajność insuliny i jej analogów w systemie genowym opisanym w patencie polskim nr PL 180 818.

Zgodnie z wynalazkiem jako rekombinowaną preproinsulinę przyjmuje się połączenie proinsuliny z dodatkowym polipeptydem liderowym, np. ubikwityną albo dysmutazą ponadtlenkową (SOD), albo ich fragmentami. W świetle uznanej terminologii, przez rekombinowaną proinsulinę rozumie się łańcuch polipeptydowy, w którym łańcuchy A i B insuliny ludzkiej lub jej analogu są połączone dowolnym (poli)peptydem (łącznikowym) umożliwiającym ich ufałdowanie poprzez utworzenie 2 połączeń disiarczkowych między łańcuchami A i B oraz trzeciego - w obrębie łańcucha A. Zgodnie z wynalazkiem, przez insulinę rozumie się rekombinowaną insulinę ludzką lub jej rekombinowany analog o działaniu hipoglikemizującym.

Zgodnie z wynikami przeprowadzonych badań, według wynalazku specjalnie wydajny sposób wytwarzania insuliny i jej analogów obejmujący mikrobiologiczną nadekspresję genu kodującego rekombinowany polipeptyd hybrydowy, zawierający proinsulinę, w komórkach szczepów bakterii Escherichia coli pozbawionych represora cytR transformowanego odpowiednim wektorem z wstawionym właściwym genem pod kontrolą promotora deoP1P2, polega na tym, że wytwarzana proinsulina składa się z łańcucha B insuliny kowalencyjnie związanego z łańcuchem A dipeptydem Arg-Arg jako peptydem łącznikowym. W celu przeprowadzenia badań, na podstawie opisu patentu nr PL 180 818 wytworzono plazmid pIBA, zawierający region kodujący promotor deoP1P2 oraz fragment genu ludzkiej dysmutazy ponadtlenkowej (SOD, 62 aa) lub ubikwityny (UBI) opisany w patentach US 8158382 oraz US 8956848 oraz przez A. Wojtowicz i in., Microbial Cell Fact. 2005, 4: 17 i Microb Cell Fact. 2014; 13(1): 113. W tej samej ramce odczytu znajduje się następnie fragment kodujący odpowiednią proinsulinę - ewentualnie modyfikowany łańcuch B, peptyd łącznikowy i ewentualnie modyfikowany łańcuch A. Elementy regulacyjne plazmidu pochodzą z wektora pBR322 (ATCC 31344). Promotor deoP1P2 pochodzi z bakteryjnego operonu deo złożonego z czterech ściśle powiązanych genów regulujących katabolizm nukleotydów i dezoksynukleotydów w bakteriach Escherichia coli; jego sekwencję zamplifikowano z chromosomalnego DNA szczepu E. coli K12 w oparciu o sekwencję nukleotydową z bazy danych genów [GenBank: AP009048]. W oparciu o szczep bakterii E. coli CSH50 (ATCC:39111; Cheng i wsp., Gene; 14 Suppl. 1-2: 121-130, 1981), otrzymano szczep E. coli IBA, o genotypie : F^- ara Δ (pro lac) rpsL thi cyt R rec A λ -, pozbawiony aktywnego białka represora cyt R poprzez wprowadzenie mutacji do jego genu, stosując metodę opisaną w europejskim zgłoszeniu patentowym nr PL 0303972. Po transformacji szczepu gospodarza E. coli IBA plazmidem pIBA uzyskano opisany w patencie polskim 180 818 system ekspresji kodowanego białka fuzyjnego w wektorze pIBAINS pod kontrolą promotora deoP1P2, który jest ujemnie kontrolowany przez białko chromosomalnego represora, produktu genu cytR (K. Hammer-Jesperson i inni, Molec. Genet. 1975; 137:327-335). W konstrukcji plazmidów zastosowano elementy-fragmenty DNA kodujące różne białka liderowe i różne pochodne insuliny, przy czym łańcuch A (pro)insuliny był połączony z łańcuchem B insuliny różnymi peptydami łącznikowymi - których przykłady podano poniżej.

Wydajność wytwarzania insuliny i jej analogów w tym systemie ekspresji i z różnymi peptydami łącznikowymi porównano z ekspresją tych hormonów z użyciem innych szczepów E. coli i wektora będącego pochodną plazmidu pIGAL (Bank genów AY 424310), badając przede wszystkim zależność wydajności od rodzaju peptydu łącznikowego.

Zastosowanymi peptydami łącznikowymi były sekwencje:

1. Lys-Arg

2. Arg

3. Arg-Arg

4. Peptyd C

Według wynalazku przebadaną insuliną i jej pochodnymi- analogami były: rekombinowaną insulina ludzka (opis patentu polskiego nr PL128 599), insulina ludzka Lys^B28Pro^B29 (insulina lispro, opis patentu polskiego nr PL180 968), insulina ludzka Gly^A22Arg^B31; (opis patentu polskiego nr PL219335 lub US 08618048, insulina GR), insulina ludzka Ser^A22Arg^B31 (opis polskiego zgłoszenia patentowego nr P.219335, insulina SR),

PL 239 062 B1 insulina ludzka Ser^A22Lys^B3Arg^B31 (opis polskiego zgłoszenia patentowego nr P.399287, insulina SK3R) oraz preproinsulina (prekursor) G: białko liderowe - łańcuch B - łącznik - łańcuch A: dezAsnA21GlyA21.

Jako szczep gospodarza E. coli do badań wydajności wykorzystano E. coli IBA; istotą jego właściwości jest nieaktywny gen białka represywnego cytR, co ujawniono i opisano w literaturze fachowej (m. in. Miller J H. Experiments in molecular genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. 1972), czy w opisie patentu USA 4 480 038 lub patentu polskiego 180 818 dla szczepów E. coli zdeponowanych pod numerami dostępu ATCC 69361 i 69363. Dla celów porównawczych stosowano również inne, szeroko stosowane w badaniach szczepy - E. coli DH5, E. coli DH5alfa i E. coli HB101.

Jako plazmidy do ekspresji białek do badań wydajności wykorzystano wektor plBA - promotor deoP1P2, oporność: tetracyklina, terminator transkrypcji terA Trp, ale dla celów porównawczych stosowano również inne wektory - pochodną pIGAL1 (Bank genów AY 424310) - promotor pm s, oporność: ampicylina, terminator transkrypcji ST1; pochodną pIGAL1 - promotor pms, oporność: tetracyklina, terminator transkrypcji terA Trp i pochodną pIGAL1 - promotor deoP1P2, oporność: tetracyklina, terminator transkrypcji ST1. Jako białko liderowe do badań wydajności stosowano przede wszystkim modyfikowany fragment SOD, jak w opisie patentu polskiego nr PL 180 818 oraz modyfikowaną ubikwitynę (UBI), opisaną w opisie patentowym US 8158382 oraz US 8956848. W dalszej części niniejszego opisu terminy SOD i UBI oznaczają związki opisane odpowiednio w tych opisach patentowych. Sposób wytwarzania każdej insuliny, będącej przedmiotem niniejszego zgłoszenia, realizuje się klasyczną metodą inżynierii genetycznej i biotechnologii. Polega ona na tym, że konstruuje się odpowiedni szczep, który w procesie biosyntezy (fermentacji) wytwarza żądany polipeptyd hybrydowy (odpowiednią preproinsulinę), którą następnie transformuje się w żądany produkt, oczyszcza się i izoluje. System ten jest uniwersalny dla wytworzenia rekombinowanej insuliny ludzkiej i jej badanych - niewiele różniących się analogów. Dla tego celu skonstruowane zostały modyfikacje genu rekombinowanej preproinsuliny ludzkiej przy wykorzystaniu technik genetycznych takich jak np. reakcja miejscowo - specyficznej mutagenezy. Reakcję mutagenezy punktowej przeprowadzono przy użyciu zestawu firmy Stratagene (nr kat. 200518-5); jako matrycę wykorzystano DNA plazmidowe plazmidu plBA oraz pIGAL. Jako matrycę można również wykorzystywać dowolny inny DNA zawierający odpowiednią sekwencję kodującą rekombinowaną ludzką proinsulinę lub preproinsulinę.

Dla każdej insuliny wytworzono konstrukty plazmidowe - wektory - kodujące badaną (pre)proinsulinę z (poli)peptydem łącznikowym, przy czym w konstrukcji plazmidów zastosowano elementyfragmenty DNA kodujące różne proinsuliny - składające się z różnych peptydów łącznikowych i różnych pochodnych insuliny.

Wektorami tymi transformowano komórki kompetentne odpowiedniego szczepu Escherichia coli', jak np. IBA, DH5a, DH5, czy HB101, przy czym możliwe jest wykorzystanie komórek innych szczepów E. coli lub komórek innych mikroorganizmów albo innych znanych linii komórkowych nadających się do ekspresji białek rekombinowanych. Plazmid zawierający określoną modyfikację genu rekombinowanej preproinsuliny ludzkiej izolowano i sekwencjonowano w celu sprawdzenia poprawności transformacji i sekwencji nukleotydowej. Pojedyncze klony transformowanych szczepów hodowano standardowo na odpowiednim podłożu z dodatkiem antybiotyku selekcyjnego, przygotowując materiał bakteryjny do badawczego banku szczepów, a próby w stosunku 1:1 hodowli bakteryjnej i 40% glicerolu zdeponowano w temp. -70°C. Wszystkie otrzymane szczepy banków badawczych poddano wyczerpującym badaniom mikrobiologicznym, biochemicznym i fizykochemicznym, które potwierdziły ich stabilność i zgodność ich właściwości z wymaganiami właściwymi dla banków przemysłowych. Przebieg dalszej biosyntezy oparto na opisie patentu polskiego nr PL 180 818. Po biosyntezie, wytwarzane w szczepach E. coli warianty rekombinowanej preproinsuliny izolowano po rozbiciu komórek w postaci ciałek inkluzyjnych, które oddzielano. Z ciałek inkluzyjnych izolowano polipeptyd hybrydowy z insuliną lub jej analogiem (odpowiednią preproinsulinę), a następnie poddawano go ufałdowaniu (foldingowi, renaturacji). Uzyskany roztwór ufałdowanego białka hybrydowego poddawano kontrolowanemu działaniu trypsyny, analogicznie jak w przypadku szeregu metod znanych uprzednio i opisanych (np. przez Kemmlera i wsp. w J. Biol. Chem. , Vol. 246, str. 6786-6791 (1971) lub w patentach US 6686177, lub US 6100376), albo proteazy deubikwitynującej, jak opisano w patentach US 8158382 oraz US 8956848 oraz przez A. Wojtowicz i in., Microbial Cell Fact. 2005, 4: 17 i Microb Cell Fact. 2014; 13(1): 113, albo obu tych enzymów.

PL 239 062 B1

W części przypadków (insulina ludzka, insulina Lispro) działaniem karboksypeptydazy B usuwano dodatkowe aminokwasy peptydu łącznikowego; w pozostałych przypadkach etap ten pomijano. Otrzymaną insulinę i jej analogi poddawano procesowi oczyszczania przy zastosowaniu znanych metod, przede wszystkim chromatografii niskociśnieniowej, ultrafiltracji i HPLC. Z oczyszczonego w dostatecznym stopniu - do wymagań farmakopealnych - roztworu insuliny lub jej analogu, produkt krystalizowano i suszono.

W celu porównania wydajności ekspresji dla każdego gospodarza i wariantu systemu opracowano i zoptymalizowano biosyntezę, izolację i oczyszczanie produktu każdego ze szczepów. Biosyntezę szczepów Escherichia coli pozbawionych represora cytR transformowanego odpowiednim wektorem z wstawionym właściwym genem pod kontrolą promotora deoP1P2 prowadzono zgodnie z opisem polskiego patentu nr PL 180 818, w fermentorach o pojemności 7,5 dm³, stosując ok. 3-5% materiału szczepiennego i minimalną, przemysłową pożywkę do inokulum i hodowli produkcyjnej oraz regulując indukcję żądanego produktu za pomocą glukozy, zgodnie z przykładem 2 polskiego patentu nr PL 180 818. Biosyntezę innych szczepów E. coli prowadzono zgodnie z ogólnymi sposobami ich hodowli. Hodowlę inokulum prowadzono przez ok. 10 godzin, do czasu zakończenia logarytmicznej fazy wzrostu bakterii, a hodowlę produkcyjną przez ok. 16 godzin. Dalszy proces wydzielania, transformacji i oczyszczania produktu prowadzono również zgodnie z opisem polskiego patentu nr PL 180 818 - zoptymalizowanym przykładem 2 i 3. W szczególności, po zakończonej biosyntezie produkcyjnej wytworzoną brzeczkę chłodzono do ok. 10°C, odwirowywano komórki E. coli, poddawano je działaniu lizozymu i Tritonu X100, a następnie w temperaturze 5-10°C poddawano sonifikacji ultradźwiękami lub dezintegracji ciśnieniowej. Ciała inkluzyjne ponownie odwirowywano, przemywano, po czym poddawano renaturacji, jak ogólnie opisano w przykładzie 3A patentu PL 180 818. Za wyjątkiem białka otrzymywanego według Przykładu 6, dalszy zoptymalizowany proces polegał na poddaniu roztworu niskociśnieniowej chromatografii cieczowej z użyciem DEAE Sepharozy po cytrakonylacji i trawieniu trypsyną lub proteazą deubikwitynującą i trypsyną. Po decytrakonylacji i strąceniu oraz rozpuszczeniu białka, roztwór poddawano kolejnej niskociśnieniowej chromatografii cieczowej z zastosowaniem złoża Sepharozy Q, po której następowało ewentualne trawienie peptydu łącznikowego karboksypeptydazą B. Po końcowej wysokosprawnej chromatografii cieczowej na złożu Kromasil C8-18, oczyszczony do czystości minimum 98% produkt poddawano krystalizacji, filtracji i suszeniu. Szczegółowy opis całego procesu, całkowicie porównywalnego dla określonych insulin, podano w przykładach. Proces prowadzono w skali pilotowej, stosując metody i aparaturę wykorzystywane w przemyśle. Po zoptymalizowaniu procesu, dla celów badania wydajności procesu przeprowadzono trzy kolejne szarże każdej insuliny, a przedstawione wyniki są średnią z każdej z nich.

Do porównania wydajności ekspresji, przy ustalonym procesie produkcyjnym, z ujednoliconej kontroli procesowej wybrano badania analityczne pięciu operacji:

(1) Gęstości optycznej (OD600) zakończonej hodowli produkcyjnej;

(2) Masy hodowli (wyizolowanych bakterii) - wyrażanej w g w przeliczeniu na 1 dm³ hodowli produkcyjnej (wilgotnej i/lub suchej);

(3) Masy wyizolowanych ciał inkluzyjnych, wyrażanej w g na 1 dm³ hodowli produkcyjnej (wilgotnej i/lub suchej albo jako suchej masy zawiesiny w buforze);

(4) Białka całkowitego (po foldingu prekursora), oznaczanego metodą spektrofotometryczną i wyrażanego w AU/dm³ lub HPLC i wyrażanego w % ufałdowanego prekursora w białku całkowitym;

(5) Masę oczyszczonego końcowego produktu wyrażaną w mg na 1 dm3 hodowli produkcyjnej.

W przypadku insuliny lispro podano wyniki badań analitycznych większości etapów - białka całkowitego oznaczanego metodą spektrofotometryczną i wyrażanego w AU/dm³ i metodą Bradforda i wyrażanego w g na 1 dm³ hodowli produkcyjnej.

Ogó lny schemat blokowy wytwarzania insuliny i jej pochodnych przedstawiono na schemacie 1.

Wynalazek ujawnia, że wydajność końcowa biosyntetycznej insuliny ludzkiej i jej analogów, przy zoptymalizowanym procesie technologicznym biosyntezy, wydzielania, transformacji i oczyszczania, zależąca od stopnia nadekspresji genu kodującego preproinsulinę w komórkach modyfikowanych bakterii Escherichia coli (z nieaktywnymi represorami cytR negatywnie regulującymi operon deo) transformowanych określonym plazmidem (z promotorem deoPIP2), nieoczekiwanie zależy przede wszystkim od zastosowanego łącznika peptydowego, łączącego łańcuch A i B insuliny.

Zgodnie z wynalazkiem nieoczekiwanie ustalono, iż największą wydajność w tym systemie uzyskuje się w przypadku, gdy rolę łącznika peptydowego pełni dipeptyd Arg-Arg.

PL 239 062 B1

Dzięki wynalazkowi podano specyficzne warunki dla wytwarzania insuliny ludzkiej oraz jej analogów metodą inżynierii genetycznej, przy zastosowaniu mikrobiologicznej nadekspresji odpowiedniej preproinsuliny w komórkach szczepów bakterii Escherichia coli pozbawionych represorów deo i/lub genu deo, zawierających plazmid DNA kodujący odpowiedni polipeptyd hybrydowy w wektorze pod kontrolą promotora deoP1P2 z optymalną wydajnością - znacząco podwyższoną w porównaniu z opublikowanymi danymi.

W opisanych poniżej przykładach realizacji wynalazku strukturę, wydajność i czystość wszystkich produktów wyznaczano rutynowo znanymi metodami HPLC i spektrofotometrii UV; do pełnego scharakteryzowania wytworzonych insulin zastosowano również liczne nowoczesne metody i techniki analityczne, między innymi MS, CIEF, LC-MS/MS, GC, mapowanie peptydowe, NMR, krystalografię i proszkową dyfrakcję rentgenowską, CD, FTIR, ELISA czy PCR oraz sekwencjonowanie aminokwasów i nukleotydów.

Dla lepszego wyjaśnienia istoty wynalazku niniejszy opis został uzupełniony o szczegółowe omówienie jego przykładowych realizacji, obejmujące również rysunki, przedstawiające ogólną strukturę (Fig. 1) i sekwencję (Fig. 2) plazmidu pIBA zarówno gotowego do insercji genu białka hybrydowego jak i przykładowej realizacji w postaci plazmidu zawierającego gen kodujący białko hybrydowe insuliny (Fig. 3 i Fig. 4).

W przykładach nie podano szczegółowych opisów konwencjonalnych metod bioinżynierii zastosowanych do konstrukcji określonych genów, plazmidów, wektorów ze wstawionymi genami kodującymi badane preproinsuliny czy też sposobów transformacji szczepów bakteryjnych tymi wektorami, jak również metod badania stabilności tych szczepów. Metody te są powszechnie znane specjalistom w tej dziedzinie i stosowane w laboratoriach biotechnologicznych oraz opisane w licznych publikacjach, z których kluczowe podano w niniejszym opisie. Produkty końcowe wytwarzane metodą według wynalazku są znanymi insulinami, większość szczegółowych bioinżynieryjnych metod konstrukcji tych rekombinowanych szczepów bakteryjnych opisano w polskim opisie patentowym nr PL 180 968, P. 385 586 i P. 399 287.

Nie opisano również szczegółowo standardowych metod analitycznych stosowanych do określania zawartości i stężenia białek i insulin na poszczególnych etapach wytwarzania, gdyż metody te są również dobrze znane odpowiednim specjalistom i rutynowo stosowane w oznaczaniu białek.

Podane przykłady, nie ograniczając zakresu wynalazku, opisują szczegółowo zastosowaną metodykę badawczą, pozwalającą w pełni kontrolowanym sposobem na dokonanie porównania uzyskanych reprezentatywnych wyników badań zależności wydajności procesu od struktury peptydu łącznikowego.

P r z y k ł a d y

I. Ogólna procedura prowadzenia procesu

Etap 1. Bank badawczy - hodowla podstawowa

Hodowle podstawowe szczepu E. coli IBA, DH5 DH5alfa i HB101 zawierające jako plazmidy do ekspresji białek wektor pIBA i pochodną pIGAL1 (Bank genów AY 424310) prowadzono zgodnie z wymaganiami (ICH Topic Q 5 D: Quality of Biotechnological Products: Derivation and Characterisation of Cell Substrates Used for Production of Biotechnological/Biological Products oraz ICH Topic Q 5 B: Quality of Biotechnological Products:

Analysis of the Expression Construct in Cell Lines Used for Production of r-DNA Derived Protein Products) na podłożu podstawowym :

Podłoże podstawowe:

- Hydrolizat kazeiny20 g

- Ekstrakt drożdżowy10 g

- NaCl5,0 g

- Woda do objętości1 dm

- Antybiotyk (tetracyklina lub ampicylina) do końcowego stężenia 12,5 μg/cm³ TET lub 100 μg/cm³ Amp

Kolbę z podłożem podstawowym z antybiotykiem szczepiono pojedynczą kolonią bakteryjną uzyskaną po transformacji i wytrząsano (220 obr./min.) w 37°C do gęstości optycznej ODsoo ok. 1.

Otrzymaną hodowlę mieszano z podłożem do zamrażania (1:1) i zamrażano w temperaturze -70°C w porcjach po 1 ml.

PL 239 062 B1

Podłoże do zamrażania:

- K2HPO4 6,3g

- KH2PO4 1,8g

- Cytrynian sodu mx 2H2O 0,57 g

- MgSO4 x 7H2O 0,09 g

- (NH4)2SO4 0,9g

- Glicerol 44,0g

- Woda do objętości 450 cm³

Dla uzyskanej hodowli bakteryjnej wykonywano następujące badania:

• pomiar gęstości optycznej hodowli OD przy długości fali 600 nm;

• sprawdzenie jednorodności hodowli bakteryjnej wykonując preparat przyżyciowy. Oceniano czystość hodowli bakteryjnej, cechy morfologiczne - wygląd, kształt komórek. Obserwacja preparatu w mikroskopie Olympus CX 40;

• wyznaczano najbardziej prawdopodobną liczbę jednostek tworzących kolonie na podłożu TSA i TSA z konkretnym antybiotykiem - cfu/ml;

• sprawdzano czystość mikrobiologiczną hodowli na podłożach Sabouraud (do identyfikacji zanieczyszczeń grzybami) i TSA (do identyfikacji zanieczyszczeń innymi bakteriami).

Etap 2. Inokulum

Inokulum przygotowuje się w kolbach o pojemności 250-300 ml i wypełnieniu 50 ml pożywki do inokulum. Do każdej z kolb dodawane są sterylnie roztwory:

• Antybiotyk (tetracyklina lub ampicylina, 12,5 mg/ml) • Glukoza 50%

Do hodowli szczepów E. coli IBA dodaje się dodatkowo:

• Prolina (100 mg/ml) • Tiamina (50 mg/ml) pl

500 pl

300 pl

2-5 pl.

Po zaszczepieniu kolb hodowlą podstawową (bank roboczy), inokulum inkubuje się w temperaturze 30-37°C przez 16-18 godzin do osiągnięcia OD600 ok. 0,7-1,0 na wytrząsarce przy 180-200 rpm. Pożywka do inokulum (skład na 1 dm³)

-	K2HPO4	9 g
-	KH2PO4	1 g
-	NaCl	5 g
-	NH4Cl	1 g
-	MgSO4-7H2O	0,4 g
-	Cytrynian żelazowo-amonowy	0,01 g
-	Ekstrakt drożdżowy	0,2 g
-	Roztwór pierwiastków śladowych	1 ml
	MnSO4 x H2O	1 g/dm3
	ZnSO4 x 7 H2O	2,78
	CoCI2 x 7 H2O	2 g/dm3
	Na2MoO4 x 2 H2O	2 g/dm3
	CaCl2x 2 H2O	3 g/dm3
	CuSO4x 5 H2O	1,85 g/dm3
	H3BO4	0,5 g/dm3
	HCl (32%)	100 ml/dm3
Etap	3. Hodowla produkcyjna (Fermentor	BioFlo 310 firmy NewBrunswick 7,5 dm3

(objętość startowa 4 dm³)

Parametry wyjściowe hodowli:

• Temperatura:

• pH:

• DO:

• Obroty:

• Przepływ powietrza:

37°C

7,1±0,01

30-35%

250 rpm dm³/min.

PL 239 062 B1

Do sterylnego fermentora z 4 dm³ pożywki produkcyjnej i antypieniaczem Antifoam 204 (0,5-1 ml, SIGMA) dodaje się sterylnie roztwory:

• 6 g MgSO4 x 7H2O w 80 cm³ wody • 0,2 g CaCl2 x 2H2O w 60 cm³ wody • glukoza 50%, 4 cm³

Do hodowli szczepów E. coli IBA dodaje się dodatkowo:

• Prolina (100 mg/ml) 24 cm³ • Tiamina (50 mg/ml) 200-500 μl.

Pożywka produkcyjna:

o	K2HPO4	8 g/dm3
o	KH2PO4	2 g/dm3
o	NH4Cl	3 g/dm3
o	Cytrynian żelazowo-amonowy	0,15 g/dm3
o	K2SO4	0,9 g/dm3
o	Cytrynian sodu	3,0 g/dm3
o	Roztwór pierwiastków śladowych	3 cm3
	MnSO4 x H2O	1 g/dm3
	ZnSO4 x 7 H2O	2,78 g/dm3
	CoCI2 x 7 H2O	2 g/dm3
	Na2MoO4 x 2 H2O	2 g/dm3
	CaCl2X 2 H2O	3 g/dm3
	CuSO4X 5 H2O	1,85 g/dm3
	H3BO4	0,5 g/dm3
	HCl (32%)	100 ml/dm3

Pożywkę w fermentorze zaszczepia się inokulum i hoduje w odpowiednich warunkach. Jako źródło węgla i energii do wytwarzania biomasy stosuje się stałe dozowanie do fermentora roztworu 40% glukozy (w przypadku szczepów E. coli IBA z dodatkiem proliny 10-30 mg/ml) tak, aby jej stężenie wynosiło 70-180 mg/dm³.

pH (7,1+/-0,1) kontroluje się przy pomocy 16% amoniaku przez kaskadę. Poziom tlenu w pożywce utrzymuje się na poziomie nie niższym niż 30-35%. Parametr ten kontrolowany jest w zależności od odczytu z elektrody DO przez zwiększenie obrotów mieszadła z 250 do 1000 rpm i przepływu powietrza z 5 do 10 dm³/min. Po osiągnięciu maksymalnych obrotów mieszadła oraz maksymalnego przepływu powietrza (po ok. 7-10 godz.) zatrzymuje się dodawanie glukozy; wartość ODsoo wynosi (w przypadku szczepów E. coli IBA/pIBA) ok. 25-35.

Po spadku stężenia glukozy, jej dodawanie utrzymywane jest tak, aby stężenie wynosiło ok. 35-50 mg/dm³, a pHbyło utrzymywane na poziomie 7,1 +/- 0,1. Ta faza biosyntezy prowadzona jest do momentu osiągnięcia przez komórki stacjonarnej fazy wzrostu (nie obserwuje się już wzrostu gęstości optycznej hodowli) i trwa ok. 7-8 godzin. Na koniec fazy produkcji rekombinowanego białka ODsoo wynosi 50-60 w przypadku szczepów E. coli IBA/pIBA. Następnie hodowla schładzana jest do temperatury poniżej 20°C, korzystnie ok. 10°C.

Etap 4. Wirowanie

Biomasę odwirowuje się na wirówce stacjonarnej przy 6 000-8 000 rpm w czasie 15 min. i w temperaturze +4°C. Brzeczkę pofermentacyjną można odwirować na wirówce przepływowej.

Etap 5. Izolacja ciałek inkluzyjnych

Biomasę zawiesza się w 1 dm3 buforu 50 mM TRIS, 0.5 M NaCl i 5 mM beta-merkaptoetanolu, o pH 7,5, dodaje się lizozym do stężenia 0,43 mg/cm³ i 0,2M EDTA do stężenia 0,5%, po czym inkubuje się przez 30 minut w temperaturze pokojowej i poddaje dezintegracji przez sonikację lub ciśnienie.

Etap 6 - wariant 1: Sonikacja

Materiał chłodzi się do ok. 10°C, dzieli się na 4 części, dodaje Triton do 1% i każdą porcję sonikuje się przez 30 minut przy amplitudzie 33%. Po sonikacji próbę odwirowuje się przy 8000 rpm przez 15 min w temperaturze pokojowej. Następnie osad zawiesza się w 1 dm³ buforu 50 mM TRIS, 0,5 M NaCl i 5 mM betamerkaptoetanolu, o pH 7,5 i ponownie sonikuje przez 10 min. Ciała inkluzyjne odwirowuje się przy 8000 rpm przez 15 min w temperaturze pokojowej.

PL 239 062 B1

Etap 6 - wariant 2: Dezintegracja ciśnieniowa

Materiał chłodzi się do ok. 10°C, poddaje się dezintegracji ciśnieniowej (Panda+1000 firmy GEA Niro Soavi) przy ciśnieniu 800 bar z szybkością zapewniającą całkowite rozbicie komórek (kontrola mikroskopowa) i chłodząc zawiesinę tak, aby temperatura nie przekroczyła ok. 10°C.

Etap 7. Rozpuszczanie ciał inkluzyjnych

Ciała inkluzyjne rozpuszcza się w odpowiedniej ilości 12 mM buforu wodorowęglanowego i 0,2 mM EDTA do uzyskania wartości absorbancji poniżej 9 przy długości fali 280 nm. Roztwór doprowadza się do pH do wartości 11,5 ± 0,5 za pomocą 2 M NaOH i miesza przez 30 min. w temp pokojowej. Następnie koryguje się pH do 10,8 ± 0,4 za pomocą 2 M HCl. Roztwór klaruje się przez wirowanie przy 12 500 rpm przez 15 min w temp. 4°C.

Etap 8. Renaturacja

Po rozpuszczeniu ciał inkluzyjnych białko renaturuje się przez napowietrzanie - silne mieszanieprzez ok. 16-18 h w temperaturze pokojowej. Następnie koryguje się pH do wartości 9,0 za pomocą 2 M HCl.

Etap 9. Cytrakonylacja

Do roztworu białka dodaje się porcjami bezwodnika cytrokonylowego w ilości obliczonejwedług wzoru: objętość bezwodnika (cm³) = 0,15 x objętość roztworu [dm³] x A280 oraz 2 M NaOH do utrzymania pH o wartości w przedziale 8,7-9,3. Po dodaniu całej ilości bezwodnika roztwór miesza się przez 1 godzinę, po czym dodaje się roztwór 2 M etanolaminy w trzykrotnej objętości bezwodnika i miesza przez 30 min.

Etap 10. Trypsynowanie

Po cytrakonylacji pH roztworu koryguje się do wartości 8,8 za pomocą 2 M HCl i rozcieńcza wodą tak, aby przewodnictwo wyniosło poniżej 5 mS. Następnie dodaje się 1% roztwór trypsyny w ilości obliczonej według wzoru: objętość roztworu trypsyny = A280 x objętość roztworu [dm³] / 95) i miesza przez 16-18 godzin w temperaturze pokojowej. Reakcję hamuje się roztworem aprotyniny o stężeniu 1 mg/ml, dodawanego w ilości dwudziestojednokrotnie mniejszej od objętości trypsyny.

Etap 11. Odcięcie białka liderowego - ubikwityny

Do roztworu białka o temperaturze 10°C dodaje się 20 mM kwas fosforowy do uzyskania pH o wartości 7,5, po czym w temperaturze 37°C dodaje się 19,2 cm³ roztworu proteazy UBP1AC lub UBP1AC2 o stężeniu 1 mg/cm³, i miesza się przez 1 godzinę. Po ochłodzeniu do 4°C roztwór klaruje się przez wirowanie przy 12 000 rpm przez 15 minut.

Etap 12. Chromatografia niskociśnieniowa na złożu DEAE Sepharosa

Na kolumnę wypełnioną złożem DEAE (200 cm³) i zrównoważoną 0,5 M TRIS o pH 8,6 ± 0,2, a następnie 20 mM TRIS o pH 8,6 ± 0,2 nanosi się roztwór o pH 8,6 + 0,2. Po naniesieniu kolumnę płucze się buforami o pH 8,6 ± 0,2: 20 mM TRIS z NaCl do przewodności 5mS ±1 mS, a następnie 20 mM TRIS z NaCl do przewodności 2 mS ± 1 mS i 20% ± 5% izopropanolu. Białko insuliny eluuje się buforem o pH 8,6 ± 0,2, składającym się z 20 mM TRIS z NaCl do przewodności 5 ± 1 mS i z dodatkiem 25% ± 5% izopropanolu.

Etap 13. Decytrakonylacja

Frakcję główną wyeluowaną z kolumny rozcieńcza się 2 razy, ochładza do 4°C i zakwasza 0,1 M HCl do pH o wartości 2,9 ± 0,2, po czym miesza się 10 godzin.

Etap 14. Strącanie insuliny chlorkiem cynku

Do rozcieńczonej frakcji głównej dodaje się taką objętość 1 M chlorku cynku, która odpowiada 1/50 objętości frakcji głównej, koryguje się pH do wartości 5,5 ± 0,5 i miesza przez 1 godzinę. Następnie zawiesinę odwirowuje się przy 9000 rpm przez 15 min w 4°C. Otrzymany osad zawiesza się w wodzie.

Etap 15. Chromatografia niskociśnieniowa na złożu Q Sepharosa

Zawiesinę insuliny uzupełnia się wodą do objętości wyliczonej z wzoru: objętość końcowa = całkowita ilość białka otrzymanego po DEAE [AU A28o]/7, dodaje TRIS o pH 8,6 do stężenia 30 mM i 0,2 M roztwór EDTA w ilości wyliczonej z wzoru: objętość [cm³] = całkowita ilość białka otrzymanego po DEAE [AU A280] / 190, po czym doprowadza się pH do wartości 8,6. Na kolumnę wypełniona złożem Q (80 cm³) i zrównoważoną 0,5 M TRIS o pH 8,66, a następnie 20 mM TRIS o pH 8,6, nanosi się roztwór rozpuszczonej soli cynkowej insuliny o pH 8,6. Po naniesieniu kolumnę płucze się buforem 20 mM TRIS z 20% ± 5% izopropanolu o pH 8,6, a następnie eluuje się białko insuliny buforem o pH 8,6, składającym się 20 mM TRIS z NaCl do przewodności 3 mS ±2 mS i 25% ± 5% izopropanolu.

PL 239 062 B1

Etap 16. Reakcja z karboksypeptydazą B

Frakcję główną wyeluowaną z kolumny rozcieńcza się 2 razy i dodaje roztwór karboksypeptydazy B o stężeniu 2,5 mg/cm³ w ilości obliczonej z wzoru: objętość [μm³] = całkowita ilość białka otrzymanego po Q [AU A280] / 15. pH roztworu doprowadza się do wartości 8,8, po czym roztwór miesza się przez 16-18 godzin w temperaturze pokojowej. Następnie pH doprowadza się do 3 i roztwór poddaje się oczyszczaniu przez chromatografię wysokociśnieniową.

Etap 17. Chromatografia wysokociśnieniowa RP-HPLC.

Rozdział prowadzi się na kolumnie Kromasil C8 lub C18 z zastosowaniem gradientu acetonitrylu:

Faza A Faza B

95% 5%

75% 25%

Faza ruchoma A: 2000 cm³ 0,2 M roztworu siarczanu sodu z 440 cm³ acetonitrylu, o pH 2,3 i o temperaturze 25-30°C;

Faza ruchoma B: 1250 cm³ 0,2 M roztworu siarczanu sodu z 1250 cm³ acetonitrylu, o pH 2,3 i o temperaturze 25-30°C;

Roztwór po reakcji z karboksypeptydazą B lub frakcję główną po oczyszczaniu na złożu Q Sepharosa po dwukrotnym rozcieńczeniu i doprowadzeniu pH do wartości 3, oczyszcza się porcjami, nanosząc na kolumnę jednorazowo objętość roztworu o zawartości białka całkowitego 200 AU, po czym zbiera frakcję główną tak, aby czystość produktu (HPLC) wynosiła co najmniej 98%.

Etap 18. Strącanie insuliny chlorkiem cynku

Połączone frakcje główne po chromatografii wysokociśnieniowej rozcieńcza się 2 razy i dodaje 1 M ZnCl2 w proporcji 3 cm³ chlorku cynku na 150 cm³ próbki, po czym pH doprowadza się do wartości 6 ± 1 i miesza przez 1 godzinę. Następnie zawiesinę wiruje się przy 9000 rpm przez 15 min w 4°C, a osad zawiesza się w 10-15 cm³ wody.

Etap 19. Chromatografia na złożu Sephadeks G-25 i liofilizacja

Zawiesinę osadu doprowadza się do pH 3, filtruje przez filtr 0,22 μm i nanosi na kolumnę wypełnioną nośnikiem Sephadex G 25 (120 cm³). Przed naniesieniem kolumnę równoważy się 5 mM octanem amonu o pH 4, a białko wymywa się 5 mM octanem amonu o pH 4. Tak otrzymaną substancję poddaje się liofilizacji.

II. Przykłady szczegółowe

P r z y k ł a d 1. Insulina ludzka LysB28ProB29 (insulina lispro)

Zgodnie z powyżej podaną ogólną procedurą prowadzenia procesu (punkt I), przeprowadzono wytwarzanie biosyntetycznej insuliny lispro, stosując etapy 1-6, 6b, 7-10 i 12-19 oraz dla systemu ekspresji 1.2. i 1.5. dodatkowo etap II (Tabela 1. Insulina lispro). Proces badano w 20 wariantach 8 systemów ekspresji białka. Z otrzymanych danych wynika, że sprawdzające się w warunkach laboratoryjnych szczepy bakterii Escherichia coli DH5a, DH5 i HB101 z plazmidami z promotorami deoP1P2 i pms nie są odpowiednie dla hodowli produkcyjnej z pożywką minimalną (system 1.3., 1.4., 1.5., 1.6. i 1.7.). Szczepy te charakteryzują się niskim wzrostem na minimalnej pożywce technologicznej, wykazując znacznie niższą wartość gęstości optycznej w fermentorach produkcyjnych. Podobnie małą przydatność produkcyjną wykazuje system szczepu IBA z uszkodzonym represorem cytR i z plazmidem pIGAL (system 1.8.), charakteryzujący się stosunkowo lepszym wzrostem, lecz niską zawartością ciał inkluzyjnych (obserwacje mikroskopowe).

Najlepszą wydajnością ekspresji charakteryzuje się system szczepu IBA/plBA, opisany w patencie polskim nr PL 180 818, który zbadano w 4 wariantach peptydu łącznikowego i 2 wariantach białka liderowego (system 1.1. i 1.2.). Wszystkie charakteryzują się dobrymi, porównywalnymi parametrami wzrostu w pożywce minimalnej, lecz różnią się masą ciał inkluzyjnych i względną wydajnością renaturacji peptydu fuzyjnego oraz - w związku z tym - końcową wydajnością produktu.

Najwyższą wydajność insuliny lispro uzyskano wykorzystując system ekspresji E. coli IBA/pIBA wytwarzający łańcuch A połączony z łańcuchem B insuliny lispro dipeptydem ArgArg (Tabela 1, L.p przykładu 1.1.1. i 1.2.1.), przewyższający wydajność pozostałych systemów co najmniej o 13-15%.

P r z y k ł a d 2. Insulina GlyA22ArgB31 (insulina GR)

Zgodnie z powyżej podaną ogólną procedurą prowadzenia procesu (punkt I), przeprowadzono wytwarzanie biosyntetycznej insuliny GR, stosując etapy 1-6, 6b, 7-10, 12--15 i 17-19 oraz dla systemu ekspresji 2.2. dodatkowo etap 11 (Tabela 2. Insulina GR). Proces badano w 12 wariantach 5 systemów ekspresji białka (nie stosowano wariantu z łącznikiem LysArg, jako nieprowadzącego do

PL 239 062 B1 insuliny GR). Otrzymane dane potwierdzają wnioski z przykładu 1, dotyczące wyższości systemu ekspresji opisanego w patencie polskim nr PL 180 818 nad innymi badanymi oraz wykazują podobne różnice w wydajności procesu w zależności od rodzaju peptydu łącznikowego łączącego łańcuch A i B tego analogu insuliny. W szczególności najwyższą wydajność insuliny GR uzyskano wykorzystując system ekspresji E. coli IBA/pIBA, wytwarzający łańcuch A połączony z łańcuchem B insuliny GR dipeptydem ArgArg (Tabela 2, L.p przykładu 2.1.1. i 2.2.1.) i przewyższający wydajność pozostałych systemów co najmniej o 16%-22%. Z przedstawionych rezultatów wynika przewaga technologiczna łącznika ArgArg bez względu na rodzaj białka liderowego.

P r z y k ł a d 3. Insulina ludzka.

Zgodnie z powyżej podaną ogólną procedurą prowadzenia procesu, przeprowadzono wytwarzanie biosyntetycznej insuliny ludzkiej w 8 wariantach 2 systemów ekspresji białka. W badaniach prowadzono etapy 1-6, 6b, 7-10 i 12-19 oraz dla systemu ekspresji 1.2. i 1.5. dodatkowo etap 11. Z otrzymanych danych wynika (Tabela 3. Insulina ludzka), że najlepszą wydajnością ekspresji charakteryzuje się system szczepów IBA/pIBA, wykazujących się dobrymi, porównywalnymi parametrami wzrostu w przemysłowej pożywce minimalnej i różniących się masą wytworzonych ciał inkluzyjnych oraz względną wydajnością renaturacji. Ponownie najwyższą wydajność insuliny ludzkiej uzyskano wykorzystując system ekspresji E. coli IBA/pIBA wytwarzający łańcuch A połączony z łańcuchem B insuliny ludzkiej dipeptydem ArgArg (Tabela 3, L.p przykładu 3.1.1. i 3.2.1. Badania analityczne, prowadzone w poszczególnych etapach procesu wykazują, że wyższą wydajność w tym wariantach systemu ekspresji - o 14%-16% - osiąga się po etapie wytwarzania ciał inkluzyjnych i renaturacji, przy czym utrzymuje się ona przez wszystkie pozostałe etapy procesu.

P r z y k ł a d 4. Insulina ludzka SerA22ArgB31 (insulina SR).

Badania wydajności procesu wytwarzania insuliny SR przeprowadzono zgodnie z powyżej podana ogólną procedurą (punkt I), realizując etapy 1-6, 6b, 7-10, 12-15 i 17-19 oraz dla systemu ekspresji 4.2. dodatkowo etap 11 (Tabela 2. Insulina GR). Proces badano w 12 wariantach 5 systemów ekspresji białka (nie stosowano wariantu z łącznikiem LysArg, jako nieprowadzącego do insuliny SR). Otrzymane dane potwierdzają poprzednie wyniki, stale wykazując wyższą wydajność systemu ekspresji E. coli IBA/pIBA, wytwarzającego łańcuch A połączony z łańcuchem B insuliny SR dipeptydem ArgArg (Tabela 4, L.p przykładu 4.1.1. i 4.2.1.) w porównaniu z innym peptydami łącznikowymi tego systemu co najmniej o 15% .

P r z y k ł a d 5. Insulina SerA22LizB3ArgB31 (insulina SK3R)

Zgodnie z powyżej podaną ogólną procedurą prowadzenia procesu, przeprowadzono wytwarzanie biosyntetycznej insuliny SK3R w 6 wariantach 2 systemów ekspresji białka. W badaniach prowadzono etapy 1-6, 6b, 7-10, 12-15 i 17-19 oraz dla systemu ekspresji 5.2. dodatkowo etap 11. Z otrzymanych danych wynika (Tabela 5. Insulina SK3R), że najlepszą wydajnością ekspresji charakteryzuje się system szczepów IBA/pIBA, wykazujących się dobrymi, porównywalnymi parametrami wzrostu w przemysłowej pożywce minimalnej i różniących się masą wytworzonych ciał inkluzyjnych oraz względną wydajnością renaturacji. Ponownie najwyższą wydajność insuliny ludzkiej uzyskano wykorzystując system ekspresji E. coli IBA/pIBA wytwarzający łańcuch A połączony z łańcuchem B insuliny ludzkiej dipeptydem ArgArg (Tabela 5, L.p przykładu 5.1.1. i 5.2.1. Wyczerpujące badania analityczne, prowadzone w poszczególnych etapach procesu wykazują, że wyższa wydajność w tych wariantach systemu ekspresji utrzymuje się przez wszystkie etapy procesu po etapie wytwarzania ciał inkluzyjnych i renaturacji, wydajność ta jest wyższa od uzyskanej z innych wariantów systemu ekspresji przynajmniej o 14%-16%.

P r z y k ł a d 6. Preproinsulina (prekursor) G: białko liderowe - łańcuch B - łącznik - łańcuch

A:dezAsnA21GIyA21.

Uniwersalność przewagi łącznika ArgArg nad innymi w ekspresji preproinuliny wykazano również badając wydajność wytwarzania białka składającego się z białka liderowego poprzedzającego łańcuch B, który był połączony badanymi łącznikami z modyfikowanym łańcuchem A insuliny (A:dezAsnA21GlyA21). Badania zrealizowano przeprowadzając krytyczne etapy 1-8 ogólnej procedury prowadzenia procesu w 8 wariantach 2 systemów ekspresji. Wyniki badań, przedstawione w Tabeli 6. Preproinsulina (prekursor) G: białko liderowe - łańcuch B - łącznik - łańcuch A:dezAsnA21GlyA21 wykazują, że w przypadku łącznika ArgArg wydajność procesu jest wyższa o 10%, niż w pozostałych przypadkach.

Na podstawie końcowej wydajności produktu, potwierdzonej zawartością białka przed oczyszczeniem, nieoczekiwanie okazało się, że najlepsze wyniki w wytwarzaniu rekombinowanej insuliny ludzkiej i jej analogów osiąga się w systemie ekspresji składającym się z plazmidu ekspresyjnego z promotorem

PL 239 062 B1 deoP1P2 w szczepach bakterii Escherichia coli pozbawionych genu represora cytR (patent polski nr PL 180 818), jeżeli w plazmidzie kodującym białko fuzyjne łańcuch A insuliny jest połączony z łańcuchem B za pomocą dipeptydu ArgArg. Co więcej, różnica w wydajności między wariantem systemu z dipeptydem ArgArg a LysArg wynosi 13%-22% i jest porównywalna z opisanym w patencie polskim nr PL 180 818 postępem w wydajności systemu z dipeptydem LysArg i Arg w porównaniu z systemem z peptydem C, wynoszącym odpowiednio 23% i 17%.

Konstrukcja genetyczna plazmidu pIBA i pIBA/INS [pIBA/lNSLys(31B)Arg(32B)]

Plazmid plBA/IMS o wielkości 4354 par zasad jest zbudowany z następujących sekwencji regulatorowych oraz genów:

- od 7 pz do 942 pz zlokalizowany jest region regulatorowy z promotorami deoP1P2

- od 946 pz do 1137 pz znajduje się sekwencja kodująca fragment ludzkiego genu SOD,

- od 1138 pz do 1299 pz zawarta jest sekwencja kodująca łańcuchy A, B oraz łańcuch C (w postaci łącznika Lys-Arg) rekombinowanej ludzkiej insuliny INS, sekwencja nukleotydowa insuliny została zmieniona zgodnie z częstością występowania kodonów. w E. coli',

- od 1312 pz do 1338 pz do zlokalizowany jest region kodujący terminator transkrypcji Ter trpA,

- od 1508 pz do 2698 pz znajduje się gen oporności na tetracyklinę Tet,

Strukturę plazmidu pIBA przedstawiono schematycznie na Fig. 1, a jego sekwencję nukleotydową i aminokwasowa; na Fig. 2. Strukturę plazmidu plBA/INS zawierającego przykładowy gen kodujący białko rekombinowanej insuliny ludzkiej, w której łańcuch A jest połączony z łańcuchem B dipeptydem LysArg przedstawiono schematycznie na Fig. 3, a jego sekwencję nukleotydową i aminokwasową na Fig. 4.

PL 239 062 Β1

SEQUENCE LISTING < 110> Instytut Biotechnologii i Antybiotyków < 120> Sposób wytwarzania insuliny i jej pochodnych oraz peptyd hybrydowy stosowany w tym sposobie < 130> PK/3515/RW < 160>29 < 170> Patentln version 3.5 < 210>1 < 211>21 < 212> PRT < 213> artificial <220>

< 223> łańcuch A <400>1

Gly Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu

1015

Glu Asn Tyr Cys Asn 20 <210>2 <211> 22 <212> PRT <213> artificial <220>

<223>

łańcuch a <400>2

Gly Ile Val 1

Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu

1015

Glu Asn Tyr Cys Asn Gly <210>3 <211> 22 <212> PRT <213> artificial

PL 239 062 Β1 <220>

<223> łańcuch a <400> 3

Gly Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser

5

Ile Cys Ser Leu Tyr Gin

15

Leu

Glu Asn Tyr Cys Asn Ser <210> 4 <211> 21 <212> PRT <213> artificial <220>

<223> łańcuch A <400> 4

Gly Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin 15 10 15

Leu

Glu Asn Tyr Cys Gly <210> 5 <211> 30 <212> PRT <213> artificial <220>

<223> łańcuch B <400> 5

Phe Val Asn Gin His Leu Cys 1 5

Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu 10 15

Tyr

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr

25 30 <210> 6 <211> 30 <212> PRT <213> artificial

PL 239 062 Β1 <220>

<223> łańcuch B <400> 6

Phe Val Lys Gin His Leu Cys Gly

5

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 20 <210> 7 <211> 30 < 212> PRT < 213> artificial <220>

< 223> łańcuch B < 400> 7

Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly 1 5

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 20 <210> 8 <211> 64 <212> PRT <213> artificial <220>

<223> SOD <400> 9

Met Ala Thr Lys Ala Val Ser Val 1 5

Gly Ile Ile Asn Phe Glu Gin Lys 20

His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 10 15

Tyr Thr Pro Lys Thr

His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 10 15

Tyr Thr Lys Pro Thr

Lys Gly Asp Gly Pro Val Gin 10 15

Ser Asn Gly Pro Val Lys Val 30

Trp Gly Ser Ile Lys Gly Leu Thr

40

Gly Leu His Gly Phe His Val 45

His Glu Phe Gly Asp Asn Thr Ala

55

Ser Thr Ser Ala Gly Pro Arg 60

PL 239 062 Β1 <210> 9 <211> 76 <212> PRT <213> artificial <220>

<223> ubi <400> 9

Met Gin Ile Phe Val Lys Thr

5

Val Glu Ser Ser Asp Thr Ile

Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp 35

Gin Leu Glu Asp Gly Arg Thr

5055

Ser Thr Leu His Leu Val Leu

6570 <210>10 <211>117 <212> PRT <213> artificial <220>

<223> X-B-R-R-A (SOD) <400> 10

Met 1	Ala	Thr	Lys	Ala 5	Val	Ser
Gly	Ile	Ile	Asn 20	Phe	Glu	Gin
Trp	Gly	Ser 35	Ile	Lys	Gly	Leu

Thr	Gly 10	Lys	Thr	Ile	Thr	Leu 15	Glu
Asn 25	Val	Lys	Ser	Lys	Ile 30	Gin	Asp
Gin	Arg	Leu	Ile	Phe 45	Ala	Gly	Lys
Ser	Asp	Tyr	Asn 60	Ile	Gin	Lys	Glu
Leu	Arg	Gly 75	Gly
Leu	Lys 10	Gly	Asp	Gly	Pro	Val 15	Gin
Glu 25	Ser	Asn	Gly	Pro	Val 30	Lys	Val
Glu	Gly	Leu	His	Gly 45	Phe	His	Val

PL 239 062 Β1

His	Glu 50	Phe	Gly	Asp	Asn
Phe 65	Val	Asn	Gin	His	Leu 70

Thr Ala Gly Ser Thr Ser Ala Gly Pro Arg 55 60

Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr

80

Leu Val Cys

Gly Glu Arg Gly Phe 85

Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg

95

Gly Ile Val

Glu Gin Cys Cys Thr 100

Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu

105 110

Glu Asn Tyr Cys Asn

115 <210> 11 <211> 117 <212> PRT <213> artificial <220>

<223> X-B-R-R-A (SOD) 2 <400> 11

Met Ala Thr Lys Ala Val

5

Ser Val Leu Lys Gly Asp Gly Pro Val Gin

15

Gly Ile Ile Asn Phe Glu Gin Lys 20

Glu Ser Asn Gly Pro Val Lys Val

30

Trp	Gly	Ser 35	Ile	Lys	Gly	Leu	Thr 40
His	Glu	Phe	Gly	Asp	Asn	Thr	Ala
	50					55
Phe	Val	Asn	Gin	His	Leu	Cys	Gly
65					70

Glu	Gly	Leu	His	Gly 45	Phe	His	Val
Gly	Ser	Thr	Ser 60	Ala	Gly	Pro	Arg
Ser	His	Leu 75	Val	Glu	Ala	Leu	Tyr 80

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe

Phe Tyr Thr Lys 90

Pro Thr

Arg Arg 95

PL 239 062 Β1

Gly Ile Val Glu Gin Cys 100

Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu 105 110

Glu Asn Tyr Cys Asn 115 <210> 12 <211> 118 <212> PRT <213> artificial <220>

<223> X-B-R-R-A (SOD) <400> 12

Met 1

Ala

Thr

Lys

Ala 5

Val

Ser

Val

Leu

Lys 10

Gly

Asp

Gly

Pro

Val 15

Gin

Gly

Ile

Ile

Asn 20

Phe

Glu

Gin

Lys

Glu 25

Ser

Asn

Gly

Pro

Val 30

Lys

Val

Trp

Gly

Ser 35

Ile

Lys

Gly

Leu

Thr 40

Glu

Gly

Leu

His

Gly 45

Phe

His

Val

His

Glu 50

Phe

Gly

Asp

Asn

Thr 55

Ala

Gly

Ser

Thr

Ser 60

Ala

Gly

Pro

Arg

Phe 65

Val

Asn

Gin

His

Leu 70

Cys

Gly

Ser

His

Leu 75

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr 80

Leu

Val

Cys

Gly

Glu 85

Arg

Gly

Phe

Phe

Tyr 90

Thr

Pro

Lys

Thr

Arg 95

Arg

Gly

Ile

Val

Glu 100

Gin

Cys

Cys

Thr

Ser 105

Ile

Cys

Ser

Leu

Tyr 110

Gin

Leu

Glu Asn Tyr Cys Asn Gly

115 <210> 13 <211> 118 <212> PRT

PL 239 062 Β1 <213> artificial <220>

<223> X-B-R-R-A (SOD) <400> 13

Met Ala Thr Lys Ala Val Ser Val

5

Lys Gly Asp Gly Pro Val Gin

15

Gly Tle Tle Asn Phe Glu Gin Lys 20

Ser Asn Gly Pro Val Lys Val

Trp Gly Ser Ile Lys GLy Leu Thr

40

Gly Leu His Gly Phe His Val 45

His Glu Phe Gly Asp Asn Thr Ala

55

Ser Thr Ser Ala Gly Pro Arg

Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly 65 70

His Leu Val Glu Ala Leu Tyr

80

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 85

Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg

95

Gly Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr

100

Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu

110

Glu Asn Tyr Cys Asn Ser 115 <210> 14 <211> 118 <212> PRT <213> artificial <220>

<223> X-B-R-R-A (SOD) <400> 14

Met Ala Thr Lys ALa Val Ser Val

5

Gly Ile Ile Asn Phe Glu Gin Lys

Lys Gly Asp Gly Pro Val Gin

15

Ser Asn Gly Pro Val Lys Val

PL 239 062 Β1

Trp

Gly

Ser 35

Ile

Lys

Gly

Leu

Thr 40

Glu

Gly

Leu

His

Gly 45

Phe

His

Val

His

Glu 50

Phe

Gly

Asp

Asn

Thr 55

Ala

Gly

Ser

Thr

Ser 60

Ala

Gly

Pro

Arg

Phe 65

Val

Lys

Gin

His

Leu 70

Cys

Gly

Ser

His

Leu 75

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr 80

Leu

Val

Cys

Gly

Glu 85

Arg

Gly

Phe

Phe

Tyr 90

Thr

Pro

Lys

Thr

Arg 95

Arg

Gly

Ile

Val

Glu 100

Gin

Cys

Cys

Thr

Ser 105

Ile

Cys

Ser

Leu

Tyr 110

Gin

Leu

Glu

Asn

Tyr 115

Cys

Asn

Ser

<210 15 <211> 117 <212> PRT <213> artificial <220 <223> Χ-Β-R-R-A (SOD) <400>15

Met Ala Thr Lys Ala Val Ser Val Leu Lys Gly Asp Gly Pro Val Gin

1015

Gly Ile Ile Asn Phe Glu Gin Lys Glu Ser Asn Gly Pro Val Lys Val 20 2530

Trp Gly Ser Ile Lys Gly Leu Thr Glu Gly Leu His Gly Phe His Val 35 4045

His Glu Phe Gly Asp Asn Thr Ala Gly Ser Thr Ser Ala Gly Pro Arg 50 5560

Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr

70 7580

PL 239 062 Β1

Leu	Val	Cys	Gly	Glu 85	Arg	Gly	Phe
Gly	Ile	Val	Glu 100	Gin	Cys	Cys	Thr
Glu	Asn	Tyr 115	Cys	Gly

Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg 90 95

Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu

110 <210> 16 <211> 129 < 212> PRT < 213> artificial <220>

< 223> Χ-Β-R-R-A (UBI) <400> 16

Met Gin Ile Phe Val Lys Thr Leu

5

Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu

15

Val Glu Ser Ser Asp Thr Ile Asp 20

Val Lys Ser Lys Ile Gin Asp 30

Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gin

40

Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys 45

Gin Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu

55

Asp Tyr Asn Ile Gin Lys Glu 60

Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg 65 70

Arg Gly Gly Phe Val Asn Gin

80

His Leu Cys Gly Ser His Leu Val 85

Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly

95

Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro

100

Thr Arg Arg Gly Ile Val Glu

110

Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser

115 120

Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys

125

PL 239 062 Β1

Asn <210> 17 <211> 129 <212> PRT <213> artificial <220>

<223> X-B-R-R-A (UBI) <400> 17

Met Gin Ile Phe Val Lys Thr

5

Vai Glu Ser Ser Asp Thr Ile

Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp 35

Gin Leu Glu Asp Gly Arg Thr

55

Ser Thr Leu His Leu Val Leu

70

His Leu Cys Gly Ser His Leu 85

Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr

100

Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys 115

Thr	Gly 10	Lys	Thr	Ile	Thr	Leu 15	Glu
Asn 25	Val	Lys	Ser	Lys	Ile 30	Gin	Asp
Gin	Arg	Leu	Ile	Phe 45	Ala	Gly	Lys
Ser	Asp	Tyr	Asn 60	Ile	Gin	Lys	Glu
Leu	Arg	Gly 75	Gly	Phe	Val	Asn	Gin 80
Glu	Ala 90	Leu	Tyr	Leu	Val	Cys 95	Gly
Pro 105	Thr	Arg	Arg	Gly	Ile 110	Val	Glu
Leu	Tyr	Gin	Leu	Glu 125	Asn	Tyr	Cys

Asn <210> 18

PL 239 062 Β1 <211> 130 <212> PRT <213> artificial <220>

<223> X-B-R-R-A (UBI) <400> 18

Met Gin Ile Phe Val Lys Thr Leu 1 5

Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu

15

Val· Glu Ser Ser Asp Thr Ile Asp 20

Asn Val Lys Ser Lys Ile Gin Asp 25 30

Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gin

40

Gin Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys

Gin Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu

55

Ser Asp Tyr Asn Ile Gin Lys Glu 60

Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg 65 70

Leu Arg Gly Gly Phe Val Asn Gin

80

His Leu Cys Gly Ser His Leu Val 85

Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly

95

Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro

100

Lys Thr Arg Arg Gly Ile Val Glu

105 110

Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser

115 120

Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys

125

Asn Gly

130 <210> 19 <211> 130 <212> PRT <213> artificial <220>

<223> X-B-R-R-A (UBI) <400> 19

PL 239 062 Β1

Met Gin Ile Phe Val Lys Thr 1 5

Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu 10 15

Val Glu Ser Ser Asp Thr Ile 20

Asn Val Lys Ser Lys Ile Gin Asp 25 30

Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp 35

Gin Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys 45

Gin Leu Glu Asp Gly Arg Thr

55

Ser Asp Tyr Asn Ile Gin Lys Glu

Ser Thr Leu His Leu Val Leu

70

Leu Arg Gly Gly Phe Val Asn Gin

80

His Leu Cys Gly Ser His Leu 85

Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly

95

Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr 100

Lys Thr Arg Arg Gly Ile Val Glu

105 110

Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys 115

Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys

125

Asn Ser

130 <210> 20 <211> 130 <212> PRT <213> artificial <220>

<223> X-B-R-R-A (UBI) <400> 20

Met Gin Ile Phe Val Lys Thr

5

Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu

15

Val Glu Ser Ser Asp Thr Ile 20

Asn Val Lys Ser Lys Ile Gin Asp

30

PL 239 062 Β1

Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gin

40

Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys

Gin Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu

55

Asp Tyr Asn Tle Gin Lys Glu 60

Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg

70

Arg Gly Gly Phe Val Lys Gin

80

His Leu Cys Gly Ser His Leu Val 85

Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly

95

Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro

100

Thr Arg Arg Gly Ile Val Glu

110

Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser

115 120

Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys

125

Asn Ser

130 <210> 21 <211> 129 <212> PRT <213> artificial <220>

<223> X-B-R-R-A (UBI) <400> 21

Met Gin Ile Phe Val Lys Thr Leu

5

Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu

15

Val Glu Ser Ser Asp Thr Ile Asp 20

Val Lys Ser Lys Ile Gin Asp

Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gin

40

Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys 45

Gin Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu

55

Asp Tyr Asn Ile Gin Lys Glu

PL 239 062 Β1

Ser Thr Leu His Leu Val Leu

70

Leu Arg Gly Gly Phe Yal Asn Gin

80

His Leu Cys Gly Ser His Leu 85

Glu Ala Leu Tyr Leu Yal Cys Gly

95

Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr

100

Lys Thr Arg Arg Gly Ile Yal Glu

105 110

Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys 115

Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys

125

Gly <210> 22 <211> 53 < 212> PRT < 213> artificial <220>

< 223> B-R-R-A < 400> 22

Phe Val Asn Gin His Leu Cys

5

Ser His Leu Yal Glu Ala Leu Tyr

15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly 20

Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg

30

Gly Ile Yal Glu Gin Cys Cys 35

Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu 45

Glu Asn Tyr Cys Asn 50 <210> 23 <211> 53 <212> PRT <213> artificial <220>

<223> B-R-R-A

PL 239 062 Β1 <400> 23

Phe Val Asn

Gin His Leu Cys Gly Ser His

10

Leu Val Cys

Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr

25

Leu Val Glu Ala Leu Tyr 15

Thr Lys Pro Thr Arg Arg 30

Gly Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu 35 4045

Glu Asn Tyr Cys Asn <210>24 <211>54 <212> PRT <213> artificial <220>

<223> B-R-R-A 3 <400>24

Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His 1510

Leu Val Glu Ala Leu Tyr 15

Leu Val Cys

Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20	25	30

Gly Ile Val

Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys	Ser Leu Tyr Gin Leu
40	45

Glu Asn Tyr Cys Asn Gly 50 <210>25 <211> 54 <212> PRT <213> artificial <220>

<223> B-R-R-A <400> 25

PL 239 062 Β1

Phe 1

Val

Asn

Gin

His 5

Leu

Cys

Gly

Ser

His 10

Leu

Val

Glu

Ala

Leu 15

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly 20

Glu

Arg

Gly

Phe

Phe 25

Tyr

Thr

Pro

Lys

Thr 30

Arg

Arg

Gly

Ile

Val 35

Glu

Gin

Cys

Cys

Thr 40

Ser

Ile

Cys

Ser

Leu 45

Tyr

Gin

Leu

Glu

Asn 50

Tyr

Cys

Asn

Ser

<210> 26 <211> 54 <212> PRT <213> artificial <220>

<223> B-R-R-A <400> 26

Phe 1

Val

Lys

Gin

His 5

Leu

Cys

Gly

Ser

His 10

Leu

Vai

Glu

Ala

Leu 15

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly 20

Glu

Arg

Gly

Phe

Phe 25

Tyr

Thr

Pro

Lys

Thr 30

Arg

Arg

Gly

Ile

VaL 35

Glu

Gin

Cys

Cys

Thr 40

Ser

Ile

Cys

Ser

Leu 45

Tyr

Gin

Leu

Glu

Asn 50

Tyr

Cys

Asn

Ser

<210> 27 <211> 53 <212> PRT <213> artificial <220>

<223> B-R-R-A <400> 27

Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr

10 15

PL 239 062 Β1

Leu Val Cys

Gly Glu Arg 20

Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg

2530

Gly Ile Val

Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu 4045

Glu Asn Tyr Cys Gly 50 <210>28 < 211> 4003 < 212> DNA < 213> artificial <220>

< 223> pIBA < 400> 28 gaattcggac cgttggcgat gtgcggtttg ctacattcac agatgttctt cgccacttcc 60 agcagcaggt catcaggggt gatttcagga tcgtagataa aggtcaggtt cggtgaaacc 120 tgcttcaact ctgcatctgc acgtaagatc gcgcgggtaa tgggcgaatc agacgggccg 180 atattggcgt gcataaaggc gtctggcagg gttctgtcga gguaacgcca gaaacgtttt 240 attcgaacat cgatctcgtc ttgtgttaga attaattcta acatacggtt gcaacaacgc 300 atccagttgc cccaggtaga ccggcatcga tgtgaccgac ggcacgtggt ggtaaagaat 360 ggtcagcaga gagagtgcgt catcaagatc tttcgcgcct tccagctcca gccattcgga 420 accgttcgcc agaaaacggg cgtaatcggg taagacatag cgcggtttgt acggcgcatg 480 accttcaaac atatcgcaga ttacaccttc atccagcgcg cggcgggctt cggcaggaag 540 ctgtgggtaa ggcagattgt tttctgcttc cagtgccaga aaatggcgct tctgctccgg 600

PL 239 062 Β1

gctaagcact 660	gggctggtga	caatttgctg	gcaacgttgt	tgcagtgcat	tttcatgaga
agtgggcatc 720	ttcttttcct	tttatgccga	aggtgatgcg	ccattgtaag	aagtttcgtg
atgttcactt 780	tgatcctgat	gcgtttgcca	ccactgacgc	at~catttga	aagtgaatta
tttgaaccag 840	atcgcattac	agtgatgcaa	acttgtaagt	agatttcctt	aattgtgatg
tgtatcgaag 900	tgtgttgcgg	agtagatgtt	agaatactaa	caaactcgca	aggtgaattt
tattggcgac 960	aagcctaggt	ttgtttaact	ttaaggagaa	atcatatgtc	tagaatcgat
gcccgcttaa 1020	tgagcgggct	tttttttctc	gaggacgtct	aagaaaccat	tattatcatg
acattaacct 1080	ataaaaatag	gcgtatcacg	aggccctttc	gtcttcaaga	cctctcatgt
ttgacagctt 1140	atcatcgata	agctttaatg	cggtagttta	tcacagttaa	attgctaacg
cagtcaggca 1200	ccgtgtatga	aatctaacaa	tgcgctcatc	gtcatcctcg	gcaccgtcac
cctggatgct 1260	gtaggcatag	gcttggttat	gccggtactg	ccgggcctct	tgcgggatat
cgtccattcc 1320	gacagcatcg	ccagtcacta	tggcgtgctg	ctagcgctat	atgcgttgat
gcaatttcta 1380	tgcgcacccg	ttctcggagc	actgtccgac	cgctttggcc	gccgcccagt
cctgctcgct 1440	tcgctacttg	gagccactat	cgactacgcg	atcatggcga	ccacacccgt
cctgtggatc 1500	ctctacgccg	gacgcatcgt	ggccggcatc	accggcgcca	caggtgcggt
tgctggcgcc 1560	tatatcgccg	acatcaccga	tggggaagat	cgggctcgcc	acttcgggct
catgagcgct 1620	tgtttcggcg	tgggtatggt	ggcaggcccc	gtggccgggg	gactgttggg
cgccatctcc	ttgcatgcac	cattccttgc	ggcggcggtg	ctcaacggcc	tcaacctact

1680

PL 239 062 Β1 actgggctgc ttcctaatgc aggagtcgca taagggagag cgtcgaccga tgcccttgag 1740 agccttcaac ccagtcagct ccttccggtg ggcgcggggc atgactatcg tcgccgcact 1800 tatgactgtc ttctttatca tgcaactcgt aggacaggtg ccggcagcgc tctgggccat 1860 tttcggcgag gaccgctttc gctggagcgc gacgatgatc ggcctgtcgc ttgcggtatt 1920 cggaatcttg cacgccctcg ctcaagcctt cgtcactggt cccgccacca aacgtttcgg 1980 cgagaagcag gccattatcg ccggcatggc ggccgacgcg ctgggctacg tcttgctggc 2040 gttcgcgacg cgaggctgga tggccttccc cattatgatt ct^ctcgctt ccggcggcat 2100 cgggatgccc gcgttgcagg ccatgctgtc caggcaggta ga~gacgacc atcagggaca 2160 gcttcaagga tcgctcgcgg ctcttaccag cctaacttcg atcattggac cgctgatcgt 2220 cacggcgatt tatgccgcct cggcgagcac atggaacggg ttggcatgga ttgtaggcgc 2280 cgccctatac cttgtctgcc tccccgcgtt gcgtcgcggt gcatggagcc gggccacctc 2340 gacctgaatg gaagccggcg gcacctcgct aacggattca ccactccaag aattggagcc 2400 aatcaattct tgcggagaac tgtgaatgcg caaaccaacc cttggcagaa catatccatc 2460 gcgtccgcca tctccagcag ccgcacgcgg cgcatctcgg gcagcgttgg gtcctggccc 2520 gggactcacc agtcacagaa aagcatctta cggatggcat gacagtaaga gaattatgca 2580 gtgctgccat aaccatgagt gataacactg cggccaactt acitctgaca acgatcggag 2640 gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca acatggggga tcatgtaact cgccttgatc 2700 gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg 2760

PL 239 062 Β1 cagcaatggc aacaacgttg cgcaaactat taactggcga actacttact ctagcttccc 2820 ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg 2880 cccttccggc tggctggttt attgctgata aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg 2940 gtatcattgc agcactgggg ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt atctacacga 3000 cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata ggtgcctcac 3060 tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag attgatttaa 3120 aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca 3180 aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag 3240 gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac 3300 cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa 3360 ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgtccttct agtgtagccg tagttaggcc 3420 accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag 3480 tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac 3540 cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc 3600 gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc 3660 ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca 3720 cgagggagct. tccaggggga aacgcc.tggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc 3780 tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg 3840

PL 239 062 Β1 ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg 3900 ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata 3960 ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca 4003 ccttttgctg gccttttgct cacatgttct accgtattac cgcctttgag tgagctgata gcgagtcagt gag <210> 29 <211> 4354 <212> DNA <213> artificial <220>

<223> pIBA/INSLys(31B)Arg(32B) <400> 29 gaattcggac cgttggcgat gtgcggtttg ctacattcac agatgttctt cgccacttcc 60 agcagcaggt catcaggggt gatttcagga tcgtagataa aggtcaggtt cggtgaaacc 120 tgcttcaact ctgcatctgc acgtaagatc gcgcgggtaa tgggcgaatc agacgggccg 180 atattggcgt gcataaaggc gtctggcagg gttctgtcga ggtaacgcca gaaacgtttt 240 attcgaacat cgatctcgtc ttgtgttaga attaattcta acatacggtt gcaacaacgc 300 atccagttgc cccaggtaga ccggcatcga tgtgaccgac ggtacgtggt ggtaaagaat 360 ggtcagcaga gagagtgcgt catcaagatc tttcgcgcct tccagctcca gccattcgga 420 accgttcgcc agaaaacggg cgtaatcggg taagacatag cgcggtttgt acggcgcatg 480 accttcaaac atatcgcaga ttacaccttc atccagcgcg cggcgggctt cggcaggaag 540 ctgtgggtaa ggcagattgt tttctgcttc cagtgccaga aaatggcgct tctgctccgg 600 gctaagcact gggctggtga caatttgctg gcaacgttgt tgcagtgcat tttcatgaga 660 agtgggcatc ttcttttcct tttatąccga agqtqatgcq ccattqtaaq aaqtttcqtq 720

PL 239 062 Β1 atgttcactt tgatcctgat gcgtttgcca ccactgacgc attcatttga aagtgaatta 780 tttgaaccag atcgcattac agtgatgcaa acttgtaagt agatttcctt aattgtgatg 840 tgtatcgaag tgtgttgcgg agtagatgtt agaatactaa caaactcgca aggtgaattt 900 tattggcgac aagcctaggt ttgtttaact ttaaggagaa atcatatggc tactaaagct 960 gtttctgttt taaaaggtga tggtccagtt caaggaatta ttaattttga acaaaaagaa 1020 agtaatggac cagttaaagt atggggaagt attaaaggac ttactgaagg cctgcatgga 1080 ttccatgttc atgagtttgg agataataca gcaggcagta ctagtgcagg tcctcgtttt 1140 gtcaaccagc acctgtgtgg ttctcacctg gttgaagcac tgtacctggt atgtggcgaa 1200 cgtggtttct tctacactcc taaaacaaag cgcggcatcg ttgaacagtg ctgtacctct 1260 atctgttccc tgtaccaact ggagaactac tgcaattaat ctagaatcga tgcccgctta 1320 atgagcgggc ttttttttct cgaggacgtc taagaaacca ttattatcat gacattaacc 1380 tataaaaata ggcgtatcac gaggcccttt cgtcttcaag acctctcatg tttgacagct 1440 tatcatcgat aagctttaat gcggtagttt atcacagtta aattgctaac gcagtcaggc 1500 accgtgtatg aaatctaaca atgcgctcat cgtcatcctc ggcaccgtca ccctggatgc 1560 tgtaggcata ggcttggtta tgccggtact gccgggcctc ttgcgggata tcgtccattc 1620 cgacagcatc gccagtcact atggcgtgct gctagcgcta taugcgttga tgcaatttct 1680 atgcgcaccc gttctcggag cactgtccga ccgctttggc cgccgcccag tcctgctcgc 1740 ttcąctactt gąagccacta tcgactacgc ąatcatggcg accacacccg tcctgtgąat 1800

PL 239 062 Β1 cctctacgcc ggacgcatcg tggccggcat caccggcgcc acaggtgcgg ttgctggcgc 1860 ctatatcgcc gacatcaccg atggggaaga tcgggctcgc cacttcgggc tcatgagcgc 1920 ttgtttcggc gtgggtatgg tggcaggccc cgtggccggg ggactgttgg gcgccatctc 1980 cttgcatgca ccattccttg cggcggcggt gctcaacggc ctcaacctac tactgggctg 2040 cttcctaatg caggagtcgc ataagggaga gcgtcgaccg atgcccttga gagccttcaa 2100 cccagtcagc tccttccggt gggcgcgggg catgactatc gtcgccgcac ttatgactgt 2160 cttctttatc atgcaactcg taggacaggt gccggcagcg ctctgggcca ttttcggcga 2220 ggaccgcttt cgctggagcg cgacgatgat cggcctgtcg cttgcggtat tcggaatctt 2280 gcacgccctc gctcaagcct tcgtcactgg tcccgccacc aaacgtttcg gcgagaagca 2340 ggccattatc gccggcatgg cggccgacgc gctgggctac gtcttgctgg cgttcgcgac 2400 gcgaggctgg atggccttcc ccattatgat tcttctcgct tccggcggca tcgggatgcc 2460 cgcgttgcag gccatgctgt ccaggcaggt agatgacgac catcagggac agcttcaagg 2520 atcgctcgcg gctcttacca gcctaacttc gatcattgga ccgctgatcg tcacggcgat 2580 ttatgccgcc tcggcgagca catggaacgg gttggcatgg atcgtaggcg ccgccctata 2640 ccttgtctgc ctccccgcgt tgcgtcgcgg tgcatggagc cgggccacct cgacctgaat 2700 ggaagccggc ggcacctcgc taacggattc accactccaa gaattggagc caatcaattc 2760 ttgcggagaa ctgtgaatgc gcaaaccaac ccttggcaga acatatccat cgcgtccgcc 2820 atctccagca gccgcacgcg gcgcatctcg ggcagcgttg gg~cctggcc cgggactcac 2880

PL 239 062 Β1 cagtcacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag agaattatgc agtgctgcca 2940 taaccatgag tgataacact gcggccaact tacttctgac aacgatcgga ggaccgaagg 3000 agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac tcgccttgat cgttgggaac 3060 cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct gcagcaatgg 3120 caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac tctagcttcc cggcaacaat 3180 taatagactg gatggaggcg gataaagttg caggaccact tctgcgctcg gcccttccgg 3240 ctggctggtt tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg tgggtctcgc ggtatcattg 3300 cagcactggg gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg acggggagtc 3360 aggcaactat ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca ctgattaagc 3420 attggtaact gtcagaccaa gtttactcat atatacttta gattgattta aaacttcatt 3480 tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt 3540 aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt 3600 gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag 3660 cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta actggcttca 3720 gcagagcgca gataccaaat actgtccttc tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca 3780 agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg 3840 ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg 3900 cgcagcggtc qqqctqaacq qqqqgttcgt ącacacaącc caqcttgqaą cgaacgacct 3960

PL 239 062 Β1

acaccgaact 4020	gagataccta	cagcgtgagc	tatgagaaag	cgccacgctt	cccgaaggga
gaaaggcgga 4080	caggtatccg	gtaagcggca	gggtcggaac	aggagagcgc	acgagggagc
ttccaggggg 4140	aaacgcctgg	tatctttata	gtcctgtcgg	gtttcgccac	ctctgacttg
agcgtcgatt 4200	tttgtgatgc	tcgtcagggg	ggcggagcct	atggaaaaac	gccagcaacg
cggccttttt 4260	acggttcctg	gccttttgct	ggccttttgc	tcacatgttc	tttcctgcgt
tatcccctga 4320	ttctgtggat	aaccgtatta	ccgcctttga	gtgagctgat	accgctcgcc
gcagccgaac 4354	gaccgagcgc	agcgagtcag	tgag

Zastrzeżenia patentowe

Claims (13)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania insuliny ludzkiej obejmujący mikrobiologiczną ekspresję rekombinowanego białka zawierającego insulinę, znamienny tym, że obejmuje:

   (a) otrzymywanie polipeptydu hybrydowego zawierającego proinsulinę poprzez ekspresję tego polipeptydu hybrydowego w komórce szczepu bakterii Escherichia coli pozbawionej represorów deo i/lub genu deo (cytR) zawierającej DNA kodujący polipeptyd hybrydowy, przy czym ten DNA jest obecny w wektorze pod kontrolą promotora deoPiPz natomiast polipeptyd hybrydowy zawiera łańcuch B insuliny kowalencyjnie związany z łańcuchem A dipeptydem Arg-Arg, (b) odzyskiwanie polipeptydu hybrydowego, (c) ufałdowanie i tworzenie wiązań dwusiarczkowych w polipeptydzie hybrydowym otrzymanym w (b), unikając uprzedniego poddawania polipeptydu hybrydowego siarczynolizie, (d) poddawanie uzyskanego w (c) ufałdowanego, z utworzonymi wiązaniami dwusiarczkowymi polipeptydu hybrydowego trawieniu enzymatycznemu w celu otrzymania insuliny, (e) oczyszczania tak wytworzonej insuliny.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że peptydem hybrydowym jest peptyd posiadający sekwencję aminokwasową o wzorze ogólnym:

   Xn-B-Arg-Arg-A gdzie :

   A oznacza polipeptyd łańcucha A insuliny lub jej analogu, korzystnie o sekwencji wybranej spośród Sekw. Nr Id.: 1-4,

   B oznacza polipeptyd łańcucha B insuliny lub jej analogu, korzystnie o sekwencji wybranej spośród Sekw. Nr Id.: 5-6, n oznacza 0 lub 1,

   X oznacza polipeptyd białka liderowego, korzystnie o sekwencji wybranej spośród SOD o Sekw. Nr ld.:12 lub UBI o Sekw. Nr Id.: 13.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że peptyd hybrydowy ma sekwencję aminokwasową wybraną spośród: Sekw. Nr Id.: 8-26.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie (a) ekspresję prowadzi się w szczepie E. coli o genotypie:

   F~ ara A (pro lac) rpsL thi cyt R rec A λ pozbawionym aktywnego receptora cyt R.

   PL 239 062 B1
5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie (a) jako wektor stosuje się plazmid pIBA o sekwencji Sekw Nr Id: 27.
6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że etap (a) obejmuje fermentację w obecności glukozy, glicerolu lub galaktozy.
7. 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że etap (b) obejmuje:

   (i) niszczenie ściany komórkowej komórki bakteryjnej lub jej fragmentów w celu utworzenia lizatu, korzystnie poprzez działanie lizozymu i Tritonu X100 a następnie sonifikację lub dezintegrację;

   (ii) izolowanie wewnątrzkomórkowego precypitatu ciałek inkluzyjnych z lizatu przez wirowanie; i (iii) rozpuszczanie precypitatu ciałek inkluzyjnych.
8. 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że etap (c) obejmuje inkubację polipeptydu hybrydowego, korzystnie w obecności kwasu askorbinowego, zwłaszcza w stężeniu około 2 moli na mol grup SH obecnych w mieszaninie, w temperaturze od 4 do 37°C przez około od 1 do 30 godzin, korzystnie około 5 godzin, w pH od 8,5 do 12, korzystnie w pH od 11,0 do 11,25.
9. 9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że etap (d) obejmuje ponadto:

   (i) doprowadzanie pH do około 8,8-9,0; i (ii) trawienie polipeptydu hybrydowego trypsyną i następnie ewentualnie karboksypeptydazą B w temperaturze 16-37°C w ciągu 30 minut do 16 godzin.
10. 10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że etap (e) obejmuje ponadto oczyszczanie roztworu przez niskociśnieniową chromatografią cieczową na Sefarozie Q przed trawieniem trypsyną.
11. 11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że etap (e) obejmuje ponadto oczyszczanie roztworu niskociśnieniową chromatografią na DEAE-Sepharose przed trawieniem karboksypeptydazą B.
12. 12. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że etap (e) obejmuje ponadto oczyszczanie uzyskanej insuliny wysokosprawną chromatografią cieczową, korzystnie do czystości co najmniej 98%, a następnie krystalizację, filtrację i suszenie.
13. 13. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie (e) oczyszczaną insuliną jest białko wybrane z grupy do której należy: insulina ludzka, insulina ludzka Ala^A22Lys^B3Arg^B31, insulina ludzka Ser^A22Lys^B3Arg^B31 insulina ludzka Ser^A22Lys^B3Arg^B31, insulina ludzka Lys^B28Pro^B29 oraz insulina ludzka Asp^B28.

    PL 239 062 Β1

    Schemat 1

    (1| Kontrola gęstości optycznej 03«« (Optical Deisit/j (2j Masa hodowli (bakterii) po odwirowaniu [lub pc odwirowaniu i wysuszę ii u) (B.i Masa czystych ciał n Aluzyjnych po cdwirowaniu (lub po odwirowaniu i wysuszaniu) (4| Białko całkowite (po fold ng u, metoda spektrobtometryczna lub ΗPLC) (5| Wydajność końcowa oroduktu w przypadku prowadzenia operacji