CN113527506A - 融合蛋白及其应用 - Google Patents

融合蛋白及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113527506A
CN113527506A CN202010294231.3A CN202010294231A CN113527506A CN 113527506 A CN113527506 A CN 113527506A CN 202010294231 A CN202010294231 A CN 202010294231A CN 113527506 A CN113527506 A CN 113527506A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gly
seq
ser
val
amino acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010294231.3A
Other languages
English (en)
Inventor
龚珉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Borui Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Borui Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Borui Biotechnology Co ltd filed Critical Borui Biotechnology Co ltd
Priority to CN202010294231.3A priority Critical patent/CN113527506A/zh
Publication of CN113527506A publication Critical patent/CN113527506A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/605—Glucagons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本申请提供了一种融合蛋白，其包含活性蛋白、连接子和多肽；其中，所述多肽包含S1和S2，其中沿N端至C端方向上S1和S2以肽键串联连接；所述S1为如SEQ ID No:1所示的氨基酸序列或其功能性变体；所述S2为如SEQ ID No:7所示的氨基酸序列或其功能性变体。

Description

融合蛋白及其应用
技术领域
本申请涉及药物制备领域，更具体地，本申请涉及融合蛋白和包含该融合蛋白的药物组合物及其用途。
背景技术
生物类药物(尤其是核酸类或蛋白类药物)广泛用于治疗众多疾病，例如癌症、自身免疫性疾病以及艾滋病等。然而生物类药物也存在一些突出的问题，例如给药系统不完善、药物稳定性差、体内半衰期短和生物利用率低等问题。本领域技术人员有时会通过修饰来优化生物类药物的代谢动力学特性，以达到延长半衰期的目的，然而并非所有药物均可以被修饰，有些药物会在修饰过程中丧失部分或全部活性。因此，本领域迫切需要寻找新的药物融合蛋白。
发明概述
第一方面，本申请提供了一种融合蛋白，其包含活性蛋白、连接子和多肽，其中所述多肽包含S1和S2，其中
沿N端至C端方向上S1和S2以肽键串联连接；
所述S1为如SEQ ID No:1所示的氨基酸序列或其功能性变体；
所述S2为如SEQ ID No:7所示的氨基酸序列或其功能性变体。
在一些实施方案中，所述多肽是SEQ ID No:2所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述多肽包含S1、S2和S3，其中
沿N端至C端方向上S1、S2和S3彼此之间以肽键串联连接；
所述S1为如SEQ ID No:1所示的氨基酸序列或其功能性变体；
所述S2为如SEQ ID No:7所示的氨基酸序列或其功能性变体；
所述S3为如SEQ ID No:8所示的氨基酸序列或其功能性变体。
在一些实施方案中，所述多肽是SEQ ID No:3或SEQ ID No:4所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述多肽包含S1、X1和S2，其中
沿N端至C端方向上S1、S2、X1彼此之间以肽键串联连接；
所述S1为如SEQ ID No:1所示的氨基酸序列或其功能性变体；
所述S2为如SEQ ID No:7所示的氨基酸序列或其功能性变体；
所述X1为任意的氨基酸。
在一些实施方案中，所述X1为赖氨酸或精氨酸。
在一些实施方案中，所述X1为精氨酸。
在一些实施方案中，所述多肽除X1和S2之外包含两个S1。
在一些实施方案中，所述多肽是SEQ ID No:5或SEQ ID No:6所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述多肽还包括其药学上可接受的盐、酯、醚、酰胺或它们的混合物。
在一些实施方案中，所述活性蛋白、连接子和多肽的顺序为沿N端至C端方向上依次为活性蛋白、连接子和多肽。
在一些实施方案中，所述活性蛋白、连接子和多肽的顺序为沿N端至C端方向上依次为多肽、连接子和活性蛋白。
在一些实施方案中，所述活性蛋白为蛋白类药物。
在一些实施方案中，所述活性蛋白选自以下中的一种或多种：GLP-1、EPO、Erylysin A、Exendin-4、PKA竞争型多肽抑制剂、胰岛素、单克隆抗体药物或它们的片段。
在一些实施方案中，所述连接子包含如GGGS或TP的重复序列。
在一些实施方案中，所述连接子为如SEQ ID No:13-16中任一项所示的氨基酸序列或其功能性变体。
在一些实施方案中，所述融合蛋白为如SEQ ID No:9所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述融合蛋白为如SEQ ID No:10所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述融合蛋白为如SEQ ID No:11所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述融合蛋白为如SEQ ID No:12所示的氨基酸序列。
第二方面，本申请提供了一种药物组合物，其包括第一方面所述的融合蛋白以及一种或多种药学上可接受的辅料。
在一些实施方案中，所述药学上可接受的辅料为选自以下的一种或多种：可溶性填充剂、pH调节剂、稳定剂、非离子表面活性剂和渗透压调节剂。
第三方面，本申请提供了第一方面所述的融合蛋白在制备用于治疗疾病的药物中的用途。
在一些实施方案中，所述疾病为糖尿病、肥胖症、贫血或非酒精性脂肪性肝病。
第四方面，本申请提供了一种核酸，其编码第一方面所述的融合蛋白。
第五方面，本申请提供了一种表达系统，其中：
所述表达系统是表达载体或表达盒，
所述表达载体或表达盒包含第四方面所述的核酸。
第六方面，本申请提供了一种细胞，所述细胞包含第一方面所述的融合蛋白和/或第四方面所述的核酸和/或包含第四方面所述的核酸的表达载体或表达盒。
附图说明
现结合说明书附图来详细说明本申请的实施方案。
图1示出了如SEQ ID No:9所示的融合蛋白的稳定性。
图2示出了如SEQ ID No:10所示的融合蛋白的长效降血糖功能。
图3示出了SEQ ID No:1-4所示的多肽的溶解度比较。
序列说明
SEQ ID No:1为本申请的S1氨基酸序列的一个实例，其序列为：
QQCTTGQLQCCESTSTANDPATSXLLGLIGVVISDVDALVGLTCSPISVIGVGSGSACTANPVCCDSSPIGGLVSIGCVPVNV
其中X为Glu(E)或Lys(K)。
SEQ ID No:2为包含S1和S2的多肽的一个实例，其由SEQ ID No:1以及在SEQ IDNo:1的N端的SEQ ID No:7组成。具体地，SEQ ID No:2的序列为：
GLTEGLHGFHVHEFGDNTAGSTSAGPRQQCTTGQLQCCESTSTANDPATSXLLGLIGVVISDVDALVGLTCSPISVIGVGSGSACTANPVCCDSSPIGGLVSIGCVPVNV
其中X为Glu(E)或Lys(K)。
SEQ ID No:3为包含S1、S2和S3的多肽的一个实例，其由SEQ ID No:2以及在SEQ IDNo:2的N端的SEQ ID No:8组成且SEQ ID No:2中的X为E。具体地，SEQ ID No:3的序列为：
SSMATKAVSVLKGDGPVQGIINFEQKESNGPVKVWGSIKGLTEGLHGFHVHEFGDNTAGSTSAGPRQQCTTGQLQCCESTSTANDPATSELLGLIGVVISDVDALVGLTCSPISVIGVGSGSACTANPVCCDSSPIGGLVSIGCVPVNV
SEQ ID No:4为包含S1、S2和S3的多肽的一个实例，其由SEQ ID No:2以及在SEQ IDNo:2的N端的SEQ ID No:8组成且SEQ ID No:2中的X为K。具体地，SEQ ID No:4的序列为：
SSMATKAVSVLKGDGPVQGIINFEQKESNGPVKVWGSIKGLTEGLHGFHVHEFGDNTAGSTSAGPRQQCTTGQLQCCESTSTANDPATSKLLGLIGVVISDVDALVGLTCSPISVIGVGSGSACTANPVCCDSSPIGGLVSIGCVPVNV
SEQ ID No:5为包含2个S1、X1和S2的多肽的一个实例，其由SEQ ID No:2以及在SEQID No:2的C端的氨基酸R(Arg，精氨酸)和SEQ ID No:1组成且SEQ ID No:1中的X为E且SEQID No:2中的X为E。具体地，SEQ ID No:5的序列为：
GLTEGLHGFHVHEFGDNTAGSTSAGPRQQCTTGQLQCCESTSTANDPATSELLGLIGVVISDVDALVGLTCSPISVIGVGSGSACTANPVCCDSSPIGGLVSIGCVPVNVRQQCTTGQLQCCESTSTANDPATSELLGLIGVVISDVDALVGLTCSPISVIGVGSGSACTANPVCCDSSPIGGLVSIGCVPVNV
SEQ ID No:6为包含2个S1、X1和S2的多肽的一个实例，其由SEQ ID No:2以及在SEQID No:2的C端的氨基酸R(Arg，精氨酸)和SEQ ID No:1组成且SEQ ID No:1中的X为K且SEQID No:2中的X为E。具体地，SEQ ID No:6的序列为：
GLTEGLHGFHVHEFGDNTAGSTSAGPRQQCTTGQLQCCESTSTANDPATSELLGLIGVVISDVDALVGLTCSPISVIGVGSGSACTANPVCCDSSPIGGLVSIGCVPVNVRQQCTTGQLQCCESTSTANDPATSKLLGLIGVVISDVDALVGLTCSPISVIGVGSGSACTANPVCCDSSPIGGLVSIGCVPVNV
SEQ ID No:7为如下所示序列的多肽：
GLTEGLHGFHVHEFGDNTAGSTSAGPR
SEQ ID No:8为如下所示序列的多肽：
SSMATKAVSVLKGDGPVQGIINFEQKESNGPVKVWGSIK
SEQ ID No:9为本申请的融合蛋白的一个实例，其中所述活性蛋白为GLP-1，所述连接子为如SEQ ID No:13所示的氨基酸，所述多肽为如SEQ ID No:3所示的氨基酸序列。具体地，SEQ ID No:9的序列为：
HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGGGGSGGGSGGGSASSMATKAVSVLKGDGPVQGIINFEQKESNGPVKVWGSIKGLTEGLHGFHVHEFGDNTAGSTSAGPRQQCTTGQLQCCESTSTANDPATSELLGLIGVVISDVDALVGLTCSPISVIGVGSGSACTANPVCCDSSPIGGLVSIGCVPVNV
SEQ ID No:10为本申请的融合蛋白的一个实例，其中所述活性蛋白为胰岛素，所述连接子为如SEQ ID No:14所示的氨基酸，所述多肽为如SEQ ID No:5所示的氨基酸序列。具体地，SEQ ID No:10的序列为：
MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAAFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCNSGTPTPTPTPTGEFGLTEGLHGFHVHEFGDNTAGSTSAGPRQQCTTGQLQCCESTSTANDPATSELLGLIGVVISDVDALVGLTCSPISVIGVGSGSACTANPVCCDSSPIGGLVSIGCVPVNVRQQCTTGQLQCCESTSTANDPATSELLGLIGVVISDVDALVGLTCSPISVIGVGSGSACTANPVCCDSSPIGGLVSIGCVPVNV
SEQ ID No:11为本申请的融合蛋白的一个实例，其中所述活性蛋白为ErylysinA，所述连接子为如SEQ ID No:15所示的氨基酸，所述多肽为如SEQ ID No:3所示的氨基酸序列。具体地，SEQ ID No:11的序列为：
AYAQWVIILIHNVGQQNVKIKNLNASWGKLYADGDKDTEVPASKYEGMVIAPDDQVQINACGREDAAEGTTGTFDLVDPNDSDKQVRHFAWDCPWGTKANSWVVGGSNSKWMIEYTGQNLDSGALGTITVNTLRIGNGGGSGGGSGGGSSSMATKAVSVLKGDGPVQGIINFEQKESNGPVKVWGSIKGLTEGLHGFHVHEFGDNTAGSTSAGPRQQCTTGQLQCCESTSTANDPATSELLGLIGVVISDVDALVGLTCSPISVIGVGSGSACTANPVCCDSSPIGGLVSIGCVPVNV
SEQ ID No:12为本申请的融合蛋白的一个实例，其中所述活性蛋白为EPO，所述连接子为如SEQ ID No:16所示的氨基酸，所述多肽为如SEQ ID No:3所示的氨基酸序列。具体地，SEQ ID No:12的序列为：
APPPNLPDPKFESKAALLAARGPEELLCFTERLEDLVCFWEEAASAGVGPGNYSFSYQLEDEPWKLCRLHQAPTARGAVRFWCSLPTADTSSFVPLELRVTAASGAPRYHRVIHINEVVLLDAPVGLVARLADESGHVVLRWLPPPETPMTSHIRYEVDVSAGNGAGSVQRVEILEGRTECVLSNLRGRTRYTFAVRARMAEPSFGGFWSAWSEPVSLLTPSDLDPGGGSGGGSGGGSSSMATKAVSVLKGDGPVQGIINFEQKESNGPVKVWGSIKGLTEGLHGFHVHEFGDNTAGSTSAGPRQQCTTGQLQCCESTSTANDPATSELLGLIGVVISDVDALVGLTCSPISVIGVGSGSACTANPVCCDSSPIGGLVSIGCVPVNV
SEQ ID No:13为本申请的连接子的一个实例，其为如下所示序列的多肽：GGGSGGGSGGGSA
SEQ ID No:14为本申请的连接子的一个实例，其为如下所示序列的多肽：SGTPTPTPTPTGEF
SEQ ID No:15为本申请的连接子的一个实例，其为如下所示序列的多肽：GGGSGGGSGGGS
SEQ ID No:16为本申请的连接子的一个实例，其为如下所示序列的多肽：PGGGSGGGSGGGS
发明详细描述
虽然本申请含有许多细节，但这些不应被解释为对发明或要求保护的任何范围的限制，而应被解释为可对特定发明的特定实施方案具有特异性的特征的描述。在本申请的单独实施方案中描述的某些特征也可以在单个实施方案中组合实现。相反地，在单个实施方案中描述的各种特征也可以在多个实施方案中单独地或以任何合适的子组合来实现。此外，尽管特征可以在上文中被描述为以某些组合起作用并且甚至最初如此被要求保护，但是来自所要求保护的组合的一个或多个特征可以在一些情况下从组合中删除，并且所要求保护的组合可以涉及子组合或子组合的变型。
除非另外说明，本文中的术语的含义与本领域技术人员通常理解的含义相同，例如，涉及原料和产物、操作步骤、工艺参数、使用设备和工具以及数值单位中的术语。
定义
在本文中，词语“包括”和“包含”表示开放式，也可以是封闭式。例如，所述“包括”或“包含”可以表示还可以包括或包含没有列出的其他组分或步骤或其他要素，也可以仅包括或包含列出的组分或步骤或其他要素。
在本文中，术语“约”(例如，在组分含量和反应参数中)以本领域技术人员通常能够理解的含义来解释。一般情况下，术语“约”可以理解为给定数值的正负5％范围内的任意数值，例如，约X可以代表95％X至105％X的范围中的任意数值。
在本文中，两个或多个要素在某方面“基本”相同以本领域技术人员在具体实践中的技术要求和技术经验来解释。一般情况下，术语“基本”可以理解为两个或多个要素在某方面相差不超过5％。
还应当理解，本文中给出的具体数值(例如，在比例、温度和持续时间中)不仅可作为单独的数值理解，还应当认为提供了某一范围的端点值，并且可以相互组合提供其他范围。此外，本文给出的具体数值还可以理解为在所有情况下被术语“约”修饰。因此，除非有相反规定，本申请所记载的数值是可以根据要求改变的近似值。
除非另外指明，本申请中所用的术语具有本领域技术人员通常理解的含义。
本申请中，氨基酸可以通过其公知的三字母符号或IUPAC-IUB生化命名委员会(Biochemical Nomenclature Commission)推荐的单字母符号来表示。
在本申请中，S1、S2和S3代表肽段序列，其中使用单字母缩写来表示氨基酸残基。例如GLTEGLHGFHVHEFGDNTAGSTSAGPR(SEQ ID No:7)应当理解为代表由氨基酸残基单字母缩写组成的肽段。
在本申请中，术语“串联连接”是指一段肽链的C端与另一段肽链的N端连接。任选地，相互连接的肽链的先后顺序可以互换。例如，可以是一段肽链的C端与另一段肽链的N端连接，也可以是一段肽链的N端与另一段肽链的C端连接。
在本申请中，X1代表单个的任意氨基酸残基。
缩写“GLP-1”是指胰高血糖素样肽-1。
缩写“EPO”是指促红细胞生成素。
缩写“PKA”是指蛋白激酶A。
缩写“EGFR”是指表皮生长因子受体。
缩写“NASH”是指非酒精性脂肪性肝炎。
对于出现于本申请的肽序列中的氨基酸残基，除非另外指明，应当理解为L型残基，即，天然状态的存在形式。
术语“功能性变体”是指与母体具有相同或相近的生物学功能和性质的变体。作为非限制性的实例，“功能性变体”可以通过在母体中进行一处或多处取代(例如，保守型取代或D型氨基酸残基取代)获得。
本领域技术人员将认识到，对于改变、添加或缺失序列中的单个或数个氨基酸残基而言，如果这些改变不影响其原先的功能，则认为是一种功能性变体。例如某一氨基酸残基可以被化学上相似的其它氨基酸残基取代，这种取代是本领域公知的。例如，以下各组中的氨基酸之间的相互取代通常可以认为是保守型取代：
1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、缬氨酸(V)；
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；
7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；以及
8)半胱氨酸(C)、蛋氨酸(M)。
在一些实施方案中，某一序列的功能性变体是该序列中的1个氨基酸被其它氨基酸保守型取代的变体。
在一些实施方案中，某一序列的功能性变体是该序列中的2个氨基酸被其它氨基酸保守型取代的变体。
在一些实施方案中，某一序列的功能性变体是该序列中的3个氨基酸被其它氨基酸保守型取代的变体。
在一些实施方案中，某一序列的功能性变体是该序列中的多个氨基酸被其它氨基酸保守型取代的变体。
在一些实施方案中，某一序列的功能性变体是该序列中的1个氨基酸被其它氨基酸取代的变体。
在一些实施方案中，某一序列的功能性变体是该序列中的2个氨基酸被其它氨基酸取代的变体。
在一些实施方案中，某一序列的功能性变体是该序列中的3个氨基酸被其它氨基酸取代的变体。
在一些实施方案中，某一序列的功能性变体是该序列中的多个氨基酸被其它氨基酸取代的变体。
在一些实施方案中，某一序列的功能性变体是该序列中的1个氨基酸被取代为相应的D型氨基酸的变体。
在一些实施方案中，某一序列的功能性变体是该序列中的2个氨基酸被取代为相应的D型氨基酸的变体。
在一些实施方案中，某一序列的功能性变体是该序列中的3个氨基酸被取代为相应的D型氨基酸的变体。
在一些实施方案中，某一序列的功能性变体是该序列中的多个氨基酸被取代为相应的D型氨基酸的变体。
第一方面，本申请提供了一种融合蛋白，其包含活性蛋白、连接子和多肽，其中所述多肽包含S1和S2，其中
沿N端至C端方向上S1和S2以肽键串联连接；
所述S1为如SEQ ID No:1所示的氨基酸序列或其功能性变体；
所述S2为如SEQ ID No:7所示的氨基酸序列或其功能性变体。
在一些实施方案中，所述多肽包含以下结构：
S2-S1或S1-S2
在一些实施方案中，所述结构是以从N端到C端的顺序示出。
在一些实施方案中，所述多肽是SEQ ID No:2所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，多肽为人工发酵制备的多肽，可以由大肠杆菌或Picha酵母发酵获得，发酵的方法为本领域所公知的方法。可以使用HPLC对多肽进行纯化。
在一些实施方案中，融合蛋白为人工发酵制备的多肽，可以由大肠杆菌或Picha酵母发酵获得，发酵的方法为本领域所公知的方法。可以使用HPLC对融合蛋白进行纯化。
在一些实施方案中，具有S2-S1结构的多肽的自组装能力高于具有S1-S2结构的多肽。
在一些实施方案中，具有S2-S1结构的多肽的自组装能力为具有S1-S2结构的多肽的自组装能力的约2倍。
在一些实施方案中，所述多肽包含S1、S2和S3，其中
沿N端至C端方向上S1、S2和S3彼此之间以肽键串联连接；
所述S1为如SEQ ID No:1所示的氨基酸序列或其功能性变体；
所述S2为如SEQ ID No:7所示的氨基酸序列或其功能性变体；
所述S3为如SEQ ID No:8所示的氨基酸序列或其功能性变体。
在一些实施方案中，所述多肽包含以下结构：
S3-S2-S1或S3-S1-S2或S1-S2-S3或S1-S3-S2或S2-S1-S3或S2-S3-S1
在一些实施方案中，所述结构是以从N端到C端的顺序示出。
在一些实施方案中，所述多肽是SEQ ID No:3或SEQ ID No:4所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述多肽包含S1、X1和S2，其中
沿N端至C端方向上S1、S2、X1彼此之间以肽键串联连接；
所述S1为如SEQ ID No:1所示的氨基酸序列或其功能性变体；
所述S2为如SEQ ID No:7所示的氨基酸序列或其功能性变体；
所述X1为任意的氨基酸。
在一些实施方案中，所述X1为赖氨酸或精氨酸。
在一些实施方案中，所述X1为精氨酸。
在一些实施方案中，所述多肽包含以下结构：
S2-X1-S1或S1-X1-S2
在一些实施方案中，所述结构是以从N端到C端的顺序示出。
在一些实施方案中，所述多肽除X1和S2之外包含两个S1。
在一些实施方案中，所述多肽包含2个S1、X1和S2。
在一些实施方案中，所述多肽包含以下结构：
S2-S1-X1-S1或S1-X1-S1-S2或S1-S2-X1-S1或S1-X1-S2-S1或X1-S1-S2-S1或S1-S2-S1-X1
在一些实施方案中，所述结构是以从N端到C端的顺序示出。
在一些实施方案中，所述多肽是SEQ ID No:5或SEQ ID No:6所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述多肽还包括其药学上可接受的盐、酯、醚、酰胺或它们的混合物。
在一些实施方案中，所述活性蛋白、连接子和多肽的顺序为沿N端至C端方向上依次为活性蛋白、连接子和多肽。
在一些实施方案中，所述活性蛋白、连接子和多肽的顺序为沿N端至C端方向上依次为多肽、连接子和活性蛋白。
在一些实施方案中，所述活性蛋白为蛋白类药物。
在一些实施方案中，所述活性蛋白选自以下中的一种或多种：GLP-1、EPO、Erylysin A、Exendin-4、PKA竞争型多肽抑制剂、胰岛素、单克隆抗体药物或它们的片段。
在一些实施方案中，所述活性蛋白为GLP-1、EPO、Erylysin A或胰岛素。
在一些实施方案中，所述活性蛋白为GLP-1或其部分的多肽片段。
在一些实施方案中，所述活性蛋白为EPO或其部分的多肽片段。
在一些实施方案中，所述活性蛋白为Erylysin A或其部分的多肽片段。
在一些实施方案中，所述活性蛋白为胰岛素或其部分的多肽片段。
在一些实施方案中，连接子是用于分隔或连接多肽和活性蛋白的一段多肽。合适的连接子可基于以下因素进行选择：(1)它们呈现柔性延伸构象的能力；(2)它们不能呈现能与多肽或活性蛋白上的功能表位相互作用的二级结构；和(3)缺乏可与多肽功能表位发生反应的疏水或带电荷残基。
在一些实施方案中，连接子为约1-5个氨基酸、5-10个氨基酸、5-25个氨基酸、5-50个氨基酸、10-25个氨基酸、10-50个氨基酸、10-100个氨基酸或任何介于中间范围的氨基酸。
在一些实施方案中，连接子的长度包含约1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50个或更多个氨基酸。具体的连接子可以具有约1-200个氨基酸、1-150个氨基酸、1-100个氨基酸、1-90个氨基酸、1-80个氨基酸、1-70个氨基酸、1-60个氨基酸、1-50个氨基酸、1-40个氨基酸、1-30个氨基酸、1-20个氨基酸、1-10个氨基酸、1-5个氨基酸、1-4个氨基酸、1-3个氨基酸、或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90、100个或更多个氨基酸的总氨基酸长度。
连接子可用如本文其他部分所述的和本领域中已知的任意一种或多种天然存在的氨基酸，非天然存在的氨基酸，氨基酸类似物，和/或氨基酸模拟物。可用作连接子的某些氨基酸序列包含Gly和/或Ser残基。若需要，其他接近中性的氨基酸，诸如Thr和Pro也可用在连接子中。
某些示例性连接子包括包含G(Gly)和/或S(Ser)的连接子，例如：[G]x、[S]x、[GS]x、[GGS]x、[GSS]x、[GSGS]x、[GGSG]x、[GGGS]x、[GGGGS]x，其中x为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20或更多。这些和有关的氨基酸的其他组合对本领域中技术人员是明显的。
在一些实施方案中，连接子序列包含T(Thr)和/或P(Pro)，例如：[TP]x，其中x为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20或更多。这些和有关的氨基酸的其他组合对本领域中技术人员是明显的。
在一些实施方案中，所述连接子包含如GGGS或TP的重复序列。
在一些实施方案中，所述连接子为如SEQ ID No:13所示的连接子。
在一些实施方案中，所述连接子为如SEQ ID No:14所示的连接子。
在一些实施方案中，所述连接子为如SEQ ID No:15所示的连接子。
在一些实施方案中，所述连接子为如SEQ ID No:16所示的连接子。
在一些实施方案中，所述融合蛋白为如SEQ ID No:9所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述融合蛋白为如SEQ ID No:10所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述融合蛋白为如SEQ ID No:11所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述融合蛋白为如SEQ ID No:12所示的氨基酸序列。
第二方面，本申请提供了一种药物组合物，其包括第一方面所述的融合蛋白以及一种或多种药学上可接受的辅料。
在一些实施方案中，所述药学上可接受的辅料为选自以下的一种或多种：可溶性填充剂、pH调节剂、稳定剂、非离子表面活性剂和渗透压调节剂。
在一些实施方案中，所述水溶性填充剂为选自以下的一种或多种：甘露醇、低分子右旋糖苷、山梨醇、聚乙二醇、葡萄糖、乳糖和半乳糖。
在一些实施方案中，所述pH调节剂为选自以下的一种或多种：非挥发性的酸、生理可接受的有机酸、生理可接受的无机酸、生理可接受的碱和它们的盐。
在一些实施方案中，所述pH调节剂为选自以下的一种或多种：橼酸、磷酸、乳酸、酒石酸、盐酸、氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铵、碳酸氢钠、碳酸氢钾和碳酸氢铵。
在一些实施方案中，所述稳定剂为选自以下的一种或多种：EDTA-2Na、硫代硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、磷酸氢二钾、碳酸氢钠、碳酸钠、精氨酸、谷氨酸、聚乙二醇6000、聚乙二醇4000、十二烷基硫酸钠和三羟甲基氨基甲烷。
在一些实施方案中，所述稳定剂为选自以下的一种或多种：焦亚硫酸钠、磷酸氢二钾、精氨酸、聚乙二醇6000和三羟甲基氨基甲烷。
在一些实施方案中，所述非离子表面活性剂为泊洛沙姆。
在一些实施方案中，所述渗透压调节剂为选自以下的一种或多种：氯化钠和氯化钾。
第三方面，本申请提供了第一方面所述的融合蛋白在制备用于治疗疾病的药物中的用途。
在一些实施方案中，所述疾病为糖尿病、肥胖症、贫血或非酒精性脂肪性肝病。
在一些实施方案中，所述非酒精性脂肪性肝病是非酒精性脂肪性肝炎。
第四方面，本申请提供了一种核酸，其编码第一方面所述的融合蛋白。
第五方面，本申请提供了一种表达系统，其中：
所述表达系统是表达载体或表达盒，
所述表达载体或表达盒包含第四方面所述的核酸。
在一些实施方案中，本申请提供了一种包含第四方面所述的核酸的表达载体。
在一些实施方案中，本申请提供了一种包含第四方面所述的核酸的表达盒。
第六方面，本申请提供了一种细胞，所述细胞包含第一方面所述的融合蛋白和/或第四方面所述的核酸和/或包含第四方面所述的核酸的表达载体或表达盒。
在一些实施方案中，本申请提供了一种包含第一方面所述的融合蛋白的细胞。
在一些实施方案中，本申请提供了一种包含第四方面所述的核酸的细胞。
在一些实施方案中，本申请提供了一种含有包含第四方面所述的核酸的表达载体的细胞。
在一些实施方案中，本申请提供了一种含有包含第四方面所述的核酸的表达盒的细胞。
实施例
下面结合具体实施例，进一步阐述本申请。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造商建议的条件。除非另外说明，否则百分比按质量计算，组分之间的比例按摩尔比计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业术语或科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本申请中。本文中所述的较佳的实施方法与材料仅作示范之用。
实验材料：
患糖尿病的大鼠购自于上海SLAC动物中心；
GLP-1EIA试剂盒购自于Phoenix Pharmaceuticals,INC；
HFD+CCL4模型动物购自于美迪西生物医药有限公司；
昆明种小鼠购自于中科院上海实验动物中心。
实施例1：SEQ ID No:9-12所示的融合蛋白的制备
本申请所涉及的融合蛋白(例如SEQ ID No:9-12)可以采用大肠杆菌作为宿主细胞进行发酵制备。将编码融合蛋白的cDNA序列经酶切处理连接到pET15b质粒中，随后转染大肠杆菌。将所获得的阳性克隆进行初级发酵，随后将初级发酵液移至二级发酵罐(500L)，在培养至OD值为2-5时进行IPTG诱导。在蛋白表达后，收集菌丝体并进行菌体破碎。将菌丝体破碎液收集重悬后，采用C 8液相柱进行纯化并冻干备用。
实施例2：如SEQ ID No:9所示的融合蛋白的稳定性
将患糖尿病的大鼠分别注射GLP-1(对照组)或如SEQ ID No:9所示的融合蛋白(给药剂量均为0.1M/kg bw)，注射后在不同时间点进行眼丛静脉取血约0.2mL，制备血清备用。
采用酶联免疫吸附方法(ELISA)检测大鼠血清中GLP-1的血药浓度，操作如下：于4℃离心分离，13,000rpm/min离心20分钟获得血清。将血清与100mM的醋酸铵于室温孵育10分钟，用GLP-1EIA试剂盒对GLP-1的浓度进行测定。试验方法参照试剂盒的说明书并根据结果评价GLP-1稳定性。结果如图1所示。
结果表明，融合蛋白延长了GLP-1分子的稳定性，降低了GLP-1分子被DPP-IV蛋白酶水解的速度。
实施例3：如SEQ ID No:10所示的融合蛋白的长效降血糖功能
将患有糖尿病的大鼠每10只一组进行分组，分别进行2g/kg体重的口服葡萄糖刺激，随后口服施用胰岛素或如SEQ ID No:10所示的融合蛋白(实验剂量均为0.5mM胰岛素/kg bw或0.1mM融合蛋白/kg bw)。检测动物血糖值变化，结果参见图2。结果表明：胰岛素口服给药途径使得胰岛素在肠胃中迅速降解失活而没有药效。然而，本申请的融合蛋白能够保护胰岛素不受酸性环境的破坏或肠道内蛋白酶降解，并且融合蛋白的尺寸大小符合肠道吸收的要求(60-120nm)。
实施例4：如SEQ ID No:11所示的融合蛋白具有治疗NASH的功能
向HFD+CCL4模型动物口服施用如SEQ ID No:11所示的融合蛋白，给药频率为1次/每天，给药剂量为3mg/kg bw、15mg/kg bw或30mg/kg bw。在给药4周后，对实验动物进行生化指标分析，其中包括甘油三酯、总胆固醇以及肝糖原水平测定，结果参见表1。结果表明如SEQ ID No:11所示的融合蛋白能够治疗NASH。
表1：如SEQ ID No:11所示的融合蛋白对HFD+CCL4模型动物的疗效(单位：umol/g肝组织)
Figure BDA0002451577780000181
实施例5：如SEQ ID No:12所示的融合蛋白能够长效刺激小鼠网织红细胞的生成
向昆明小鼠分别皮下注射EPO(每天一次，注射剂量为0.1mM/kg bw)及如SEQ IDNo:12所示的融合蛋白(每五天一次，剂量为0.5mM/kg bw)，42天后处死小鼠，取全血进行外周血网织红细胞计数，血细胞计数用全自动血球计数仪计数。
结果发现如SEQ ID No:12所示的融合蛋白能刺激小鼠外周血网织红细胞计数的升高，说明其刺激了红细胞生成功能(参见表2)。
表2：如SEQ ID No:12所示的融合蛋白能够长效刺激小鼠网织红细胞的生成
名称 网织红细胞数目
空白对照组 113.68±3.82
单独的EPO组 805.75±4.67
融合蛋白组 789.76±3.89
实施例6：SEQ ID No:1-4所示的多肽的溶解度比较
将四种蛋白(即SEQ ID No:1所示的多肽、SEQ ID No:2所示的多肽、SEQ ID No:3所示的多肽和SEQ ID No:4所示的多肽，每种均为10mg)分别溶于1mL的生理盐水中，肉眼观测，可以观察到相比于SEQ ID No:1，其它三种蛋白(即，SEQ ID No:2所示的多肽、SEQ IDNo:3所示的多肽和SEQ ID No:4所示的多肽)具有更好的溶解性，观察结果如图3所示。
最后，应理解的是，虽然本说明书的各个方面描述了具体实施方案，但本领域技术人员容易理解，这些公开的实施方案仅是本文公开的主题的原理的说明。因此，应该理解的是，除非明确说明，所公开的主题不限于本文所述的具体组合物、方法和/或配方等。此外，本领域普通技术人员将认识到，在不脱离本说明书的精神的情况下，根据本文的教导可以做出某些改变、修改、置换、变更、增加、减少和亚组合。因此，本申请所附的权利要求旨在被解释为包括在其真实精神和范围内的所有这些改变、修改、置换、变更、增加、减少和亚组合。
序列表
<110> 博锐生物科技有限公司
<120> 融合蛋白及其应用
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 83
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> SITE
<222> (24)..(24)
<223> Xaa为Glu或Lys
<400> 1
Gln Gln Cys Thr Thr Gly Gln Leu Gln Cys Cys Glu Ser Thr Ser Thr
1 5 10 15
Ala Asn Asp Pro Ala Thr Ser Xaa Leu Leu Gly Leu Ile Gly Val Val
20 25 30
Ile Ser Asp Val Asp Ala Leu Val Gly Leu Thr Cys Ser Pro Ile Ser
35 40 45
Val Ile Gly Val Gly Ser Gly Ser Ala Cys Thr Ala Asn Pro Val Cys
50 55 60
Cys Asp Ser Ser Pro Ile Gly Gly Leu Val Ser Ile Gly Cys Val Pro
65 70 75 80
Val Asn Val
<210> 2
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> SITE
<222> (51)..(51)
<223> Xaa为Glu或Lys
<400> 2
Gly Leu Thr Glu Gly Leu His Gly Phe His Val His Glu Phe Gly Asp
1 5 10 15
Asn Thr Ala Gly Ser Thr Ser Ala Gly Pro Arg Gln Gln Cys Thr Thr
20 25 30
Gly Gln Leu Gln Cys Cys Glu Ser Thr Ser Thr Ala Asn Asp Pro Ala
35 40 45
Thr Ser Xaa Leu Leu Gly Leu Ile Gly Val Val Ile Ser Asp Val Asp
50 55 60
Ala Leu Val Gly Leu Thr Cys Ser Pro Ile Ser Val Ile Gly Val Gly
65 70 75 80
Ser Gly Ser Ala Cys Thr Ala Asn Pro Val Cys Cys Asp Ser Ser Pro
85 90 95
Ile Gly Gly Leu Val Ser Ile Gly Cys Val Pro Val Asn Val
100 105 110
<210> 3
<211> 149
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ser Ser Met Ala Thr Lys Ala Val Ser Val Leu Lys Gly Asp Gly Pro
1 5 10 15
Val Gln Gly Ile Ile Asn Phe Glu Gln Lys Glu Ser Asn Gly Pro Val
20 25 30
Lys Val Trp Gly Ser Ile Lys Gly Leu Thr Glu Gly Leu His Gly Phe
35 40 45
His Val His Glu Phe Gly Asp Asn Thr Ala Gly Ser Thr Ser Ala Gly
50 55 60
Pro Arg Gln Gln Cys Thr Thr Gly Gln Leu Gln Cys Cys Glu Ser Thr
65 70 75 80
Ser Thr Ala Asn Asp Pro Ala Thr Ser Glu Leu Leu Gly Leu Ile Gly
85 90 95
Val Val Ile Ser Asp Val Asp Ala Leu Val Gly Leu Thr Cys Ser Pro
100 105 110
Ile Ser Val Ile Gly Val Gly Ser Gly Ser Ala Cys Thr Ala Asn Pro
115 120 125
Val Cys Cys Asp Ser Ser Pro Ile Gly Gly Leu Val Ser Ile Gly Cys
130 135 140
Val Pro Val Asn Val
145
<210> 4
<211> 149
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Ser Ser Met Ala Thr Lys Ala Val Ser Val Leu Lys Gly Asp Gly Pro
1 5 10 15
Val Gln Gly Ile Ile Asn Phe Glu Gln Lys Glu Ser Asn Gly Pro Val
20 25 30
Lys Val Trp Gly Ser Ile Lys Gly Leu Thr Glu Gly Leu His Gly Phe
35 40 45
His Val His Glu Phe Gly Asp Asn Thr Ala Gly Ser Thr Ser Ala Gly
50 55 60
Pro Arg Gln Gln Cys Thr Thr Gly Gln Leu Gln Cys Cys Glu Ser Thr
65 70 75 80
Ser Thr Ala Asn Asp Pro Ala Thr Ser Lys Leu Leu Gly Leu Ile Gly
85 90 95
Val Val Ile Ser Asp Val Asp Ala Leu Val Gly Leu Thr Cys Ser Pro
100 105 110
Ile Ser Val Ile Gly Val Gly Ser Gly Ser Ala Cys Thr Ala Asn Pro
115 120 125
Val Cys Cys Asp Ser Ser Pro Ile Gly Gly Leu Val Ser Ile Gly Cys
130 135 140
Val Pro Val Asn Val
145
<210> 5
<211> 194
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gly Leu Thr Glu Gly Leu His Gly Phe His Val His Glu Phe Gly Asp
1 5 10 15
Asn Thr Ala Gly Ser Thr Ser Ala Gly Pro Arg Gln Gln Cys Thr Thr
20 25 30
Gly Gln Leu Gln Cys Cys Glu Ser Thr Ser Thr Ala Asn Asp Pro Ala
35 40 45
Thr Ser Glu Leu Leu Gly Leu Ile Gly Val Val Ile Ser Asp Val Asp
50 55 60
Ala Leu Val Gly Leu Thr Cys Ser Pro Ile Ser Val Ile Gly Val Gly
65 70 75 80
Ser Gly Ser Ala Cys Thr Ala Asn Pro Val Cys Cys Asp Ser Ser Pro
85 90 95
Ile Gly Gly Leu Val Ser Ile Gly Cys Val Pro Val Asn Val Arg Gln
100 105 110
Gln Cys Thr Thr Gly Gln Leu Gln Cys Cys Glu Ser Thr Ser Thr Ala
115 120 125
Asn Asp Pro Ala Thr Ser Glu Leu Leu Gly Leu Ile Gly Val Val Ile
130 135 140
Ser Asp Val Asp Ala Leu Val Gly Leu Thr Cys Ser Pro Ile Ser Val
145 150 155 160
Ile Gly Val Gly Ser Gly Ser Ala Cys Thr Ala Asn Pro Val Cys Cys
165 170 175
Asp Ser Ser Pro Ile Gly Gly Leu Val Ser Ile Gly Cys Val Pro Val
180 185 190
Asn Val
<210> 6
<211> 194
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gly Leu Thr Glu Gly Leu His Gly Phe His Val His Glu Phe Gly Asp
1 5 10 15
Asn Thr Ala Gly Ser Thr Ser Ala Gly Pro Arg Gln Gln Cys Thr Thr
20 25 30
Gly Gln Leu Gln Cys Cys Glu Ser Thr Ser Thr Ala Asn Asp Pro Ala
35 40 45
Thr Ser Glu Leu Leu Gly Leu Ile Gly Val Val Ile Ser Asp Val Asp
50 55 60
Ala Leu Val Gly Leu Thr Cys Ser Pro Ile Ser Val Ile Gly Val Gly
65 70 75 80
Ser Gly Ser Ala Cys Thr Ala Asn Pro Val Cys Cys Asp Ser Ser Pro
85 90 95
Ile Gly Gly Leu Val Ser Ile Gly Cys Val Pro Val Asn Val Arg Gln
100 105 110
Gln Cys Thr Thr Gly Gln Leu Gln Cys Cys Glu Ser Thr Ser Thr Ala
115 120 125
Asn Asp Pro Ala Thr Ser Lys Leu Leu Gly Leu Ile Gly Val Val Ile
130 135 140
Ser Asp Val Asp Ala Leu Val Gly Leu Thr Cys Ser Pro Ile Ser Val
145 150 155 160
Ile Gly Val Gly Ser Gly Ser Ala Cys Thr Ala Asn Pro Val Cys Cys
165 170 175
Asp Ser Ser Pro Ile Gly Gly Leu Val Ser Ile Gly Cys Val Pro Val
180 185 190
Asn Val
<210> 7
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Gly Leu Thr Glu Gly Leu His Gly Phe His Val His Glu Phe Gly Asp
1 5 10 15
Asn Thr Ala Gly Ser Thr Ser Ala Gly Pro Arg
20 25
<210> 8
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Ser Ser Met Ala Thr Lys Ala Val Ser Val Leu Lys Gly Asp Gly Pro
1 5 10 15
Val Gln Gly Ile Ile Asn Phe Glu Gln Lys Glu Ser Asn Gly Pro Val
20 25 30
Lys Val Trp Gly Ser Ile Lys
35
<210> 9
<211> 193
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Ser Ser Met Ala
35 40 45
Thr Lys Ala Val Ser Val Leu Lys Gly Asp Gly Pro Val Gln Gly Ile
50 55 60
Ile Asn Phe Glu Gln Lys Glu Ser Asn Gly Pro Val Lys Val Trp Gly
65 70 75 80
Ser Ile Lys Gly Leu Thr Glu Gly Leu His Gly Phe His Val His Glu
85 90 95
Phe Gly Asp Asn Thr Ala Gly Ser Thr Ser Ala Gly Pro Arg Gln Gln
100 105 110
Cys Thr Thr Gly Gln Leu Gln Cys Cys Glu Ser Thr Ser Thr Ala Asn
115 120 125
Asp Pro Ala Thr Ser Glu Leu Leu Gly Leu Ile Gly Val Val Ile Ser
130 135 140
Asp Val Asp Ala Leu Val Gly Leu Thr Cys Ser Pro Ile Ser Val Ile
145 150 155 160
Gly Val Gly Ser Gly Ser Ala Cys Thr Ala Asn Pro Val Cys Cys Asp
165 170 175
Ser Ser Pro Ile Gly Gly Leu Val Ser Ile Gly Cys Val Pro Val Asn
180 185 190
Val
<210> 10
<211> 318
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Met Ala Leu Trp Met Arg Leu Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu
1 5 10 15
Trp Gly Pro Asp Pro Ala Ala Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly
20 25 30
Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe
35 40 45
Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly
50 55 60
Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu
65 70 75 80
Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys
85 90 95
Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn Ser Gly
100 105 110
Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Glu Phe Gly Leu Thr Glu
115 120 125
Gly Leu His Gly Phe His Val His Glu Phe Gly Asp Asn Thr Ala Gly
130 135 140
Ser Thr Ser Ala Gly Pro Arg Gln Gln Cys Thr Thr Gly Gln Leu Gln
145 150 155 160
Cys Cys Glu Ser Thr Ser Thr Ala Asn Asp Pro Ala Thr Ser Glu Leu
165 170 175
Leu Gly Leu Ile Gly Val Val Ile Ser Asp Val Asp Ala Leu Val Gly
180 185 190
Leu Thr Cys Ser Pro Ile Ser Val Ile Gly Val Gly Ser Gly Ser Ala
195 200 205
Cys Thr Ala Asn Pro Val Cys Cys Asp Ser Ser Pro Ile Gly Gly Leu
210 215 220
Val Ser Ile Gly Cys Val Pro Val Asn Val Arg Gln Gln Cys Thr Thr
225 230 235 240
Gly Gln Leu Gln Cys Cys Glu Ser Thr Ser Thr Ala Asn Asp Pro Ala
245 250 255
Thr Ser Glu Leu Leu Gly Leu Ile Gly Val Val Ile Ser Asp Val Asp
260 265 270
Ala Leu Val Gly Leu Thr Cys Ser Pro Ile Ser Val Ile Gly Val Gly
275 280 285
Ser Gly Ser Ala Cys Thr Ala Asn Pro Val Cys Cys Asp Ser Ser Pro
290 295 300
Ile Gly Gly Leu Val Ser Ile Gly Cys Val Pro Val Asn Val
305 310 315
<210> 11
<211> 298
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Ala Tyr Ala Gln Trp Val Ile Ile Leu Ile His Asn Val Gly Gln Gln
1 5 10 15
Asn Val Lys Ile Lys Asn Leu Asn Ala Ser Trp Gly Lys Leu Tyr Ala
20 25 30
Asp Gly Asp Lys Asp Thr Glu Val Pro Ala Ser Lys Tyr Glu Gly Met
35 40 45
Val Ile Ala Pro Asp Asp Gln Val Gln Ile Asn Ala Cys Gly Arg Glu
50 55 60
Asp Ala Ala Glu Gly Thr Thr Gly Thr Phe Asp Leu Val Asp Pro Asn
65 70 75 80
Asp Ser Asp Lys Gln Val Arg His Phe Ala Trp Asp Cys Pro Trp Gly
85 90 95
Thr Lys Ala Asn Ser Trp Val Val Gly Gly Ser Asn Ser Lys Trp Met
100 105 110
Ile Glu Tyr Thr Gly Gln Asn Leu Asp Ser Gly Ala Leu Gly Thr Ile
115 120 125
Thr Val Asn Thr Leu Arg Ile Gly Asn Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Ser Ser Ser Met Ala Thr Lys Ala Val Ser Val Leu
145 150 155 160
Lys Gly Asp Gly Pro Val Gln Gly Ile Ile Asn Phe Glu Gln Lys Glu
165 170 175
Ser Asn Gly Pro Val Lys Val Trp Gly Ser Ile Lys Gly Leu Thr Glu
180 185 190
Gly Leu His Gly Phe His Val His Glu Phe Gly Asp Asn Thr Ala Gly
195 200 205
Ser Thr Ser Ala Gly Pro Arg Gln Gln Cys Thr Thr Gly Gln Leu Gln
210 215 220
Cys Cys Glu Ser Thr Ser Thr Ala Asn Asp Pro Ala Thr Ser Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Leu Ile Gly Val Val Ile Ser Asp Val Asp Ala Leu Val Gly
245 250 255
Leu Thr Cys Ser Pro Ile Ser Val Ile Gly Val Gly Ser Gly Ser Ala
260 265 270
Cys Thr Ala Asn Pro Val Cys Cys Asp Ser Ser Pro Ile Gly Gly Leu
275 280 285
Val Ser Ile Gly Cys Val Pro Val Asn Val
290 295
<210> 12
<211> 387
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Ala Pro Pro Pro Asn Leu Pro Asp Pro Lys Phe Glu Ser Lys Ala Ala
1 5 10 15
Leu Leu Ala Ala Arg Gly Pro Glu Glu Leu Leu Cys Phe Thr Glu Arg
20 25 30
Leu Glu Asp Leu Val Cys Phe Trp Glu Glu Ala Ala Ser Ala Gly Val
35 40 45
Gly Pro Gly Asn Tyr Ser Phe Ser Tyr Gln Leu Glu Asp Glu Pro Trp
50 55 60
Lys Leu Cys Arg Leu His Gln Ala Pro Thr Ala Arg Gly Ala Val Arg
65 70 75 80
Phe Trp Cys Ser Leu Pro Thr Ala Asp Thr Ser Ser Phe Val Pro Leu
85 90 95
Glu Leu Arg Val Thr Ala Ala Ser Gly Ala Pro Arg Tyr His Arg Val
100 105 110
Ile His Ile Asn Glu Val Val Leu Leu Asp Ala Pro Val Gly Leu Val
115 120 125
Ala Arg Leu Ala Asp Glu Ser Gly His Val Val Leu Arg Trp Leu Pro
130 135 140
Pro Pro Glu Thr Pro Met Thr Ser His Ile Arg Tyr Glu Val Asp Val
145 150 155 160
Ser Ala Gly Asn Gly Ala Gly Ser Val Gln Arg Val Glu Ile Leu Glu
165 170 175
Gly Arg Thr Glu Cys Val Leu Ser Asn Leu Arg Gly Arg Thr Arg Tyr
180 185 190
Thr Phe Ala Val Arg Ala Arg Met Ala Glu Pro Ser Phe Gly Gly Phe
195 200 205
Trp Ser Ala Trp Ser Glu Pro Val Ser Leu Leu Thr Pro Ser Asp Leu
210 215 220
Asp Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ser Ser
225 230 235 240
Met Ala Thr Lys Ala Val Ser Val Leu Lys Gly Asp Gly Pro Val Gln
245 250 255
Gly Ile Ile Asn Phe Glu Gln Lys Glu Ser Asn Gly Pro Val Lys Val
260 265 270
Trp Gly Ser Ile Lys Gly Leu Thr Glu Gly Leu His Gly Phe His Val
275 280 285
His Glu Phe Gly Asp Asn Thr Ala Gly Ser Thr Ser Ala Gly Pro Arg
290 295 300
Gln Gln Cys Thr Thr Gly Gln Leu Gln Cys Cys Glu Ser Thr Ser Thr
305 310 315 320
Ala Asn Asp Pro Ala Thr Ser Glu Leu Leu Gly Leu Ile Gly Val Val
325 330 335
Ile Ser Asp Val Asp Ala Leu Val Gly Leu Thr Cys Ser Pro Ile Ser
340 345 350
Val Ile Gly Val Gly Ser Gly Ser Ala Cys Thr Ala Asn Pro Val Cys
355 360 365
Cys Asp Ser Ser Pro Ile Gly Gly Leu Val Ser Ile Gly Cys Val Pro
370 375 380
Val Asn Val
385
<210> 13
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala
1 5 10
<210> 14
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Ser Gly Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Glu Phe
1 5 10
<210> 15
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 16
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10

Claims (10)

1.融合蛋白，其包含活性蛋白、连接子和多肽；其中，
所述多肽包含S1和S2，其中
沿N端至C端方向上S1和S2以肽键串联连接；
所述S1为如SEQ ID No:1所示的氨基酸序列或其功能性变体；
所述S2为如SEQ ID No:7所示的氨基酸序列或其功能性变体；
优选地，所述多肽是SEQ ID No:2所示的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其中所述多肽包含S1、S2和S3，其中
沿N端至C端方向上S1、S2和S3彼此之间以肽键串联连接；
所述S1为如SEQ ID No:1所示的氨基酸序列或其功能性变体；
所述S2为如SEQ ID No:7所示的氨基酸序列或其功能性变体；
所述S3为如SEQ ID No:8所示的氨基酸序列或其功能性变体；
优选地，所述多肽是SEQ ID No:3或SEQ ID No:4所示的氨基酸序列。
3.如权利要求1所述的融合蛋白，其中所述多肽包含S1、X1和S2，其中
沿N端至C端方向上S1、S2、X1彼此之间以肽键串联连接；
所述S1为如SEQ ID No:1所示的氨基酸序列或其功能性变体；
所述S2为如SEQ ID No:7所示的氨基酸序列或其功能性变体；
所述X1为任意的氨基酸，优选为赖氨酸或精氨酸，更优选为精氨酸；
任选地，所述多肽除X1和S2之外包含两个S1，优选地，所述多肽是SEQ ID No:5或SEQ IDNo:6所示的氨基酸序列。
4.如权利要求1所述的融合蛋白，其中
所述活性蛋白、连接子和多肽的顺序为沿N端至C端方向上依次为活性蛋白、连接子和多肽；或者所述活性蛋白、连接子和多肽的顺序为沿N端至C端方向上依次为多肽、连接子和活性蛋白；和/或
所述活性蛋白为蛋白类药物；优选地，所述活性蛋白选自以下中的一种或多种：GLP-1、EPO、Erylysin A、Exendin-4、PKA竞争型多肽抑制剂、胰岛素、单克隆抗体药物或它们的片段；和/或
所述连接子包含如GGGS或TP的重复序列；优选地，所述连接子为如SEQ ID No:13-16中任一项所示的氨基酸序列或其功能性变体。
5.如权利要求1所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白为如SEQ ID No:9-12中任一项所示的氨基酸序列。
6.药物组合物，其包括权利要求1-5中任一项所述的融合蛋白以及一种或多种药学上可接受的辅料；
优选地，所述药学上可接受的辅料为选自以下的一种或多种：可溶性填充剂、pH调节剂、稳定剂、非离子表面活性剂和渗透压调节剂。
7.如权利要求1-5中任一项所述的融合蛋白在制备用于治疗疾病的药物中的用途；
优选地，所述疾病为糖尿病、肥胖症、贫血或非酒精性脂肪性肝病。
8.核酸，其编码如权利要求1-5中任一项所述的融合蛋白。
9.表达系统，其中所述表达系统是表达载体或表达盒，所述表达载体或表达盒包含权利要求8所述的核酸。
10.细胞，所述细胞包含权利要求1-5中任一项所述的融合蛋白和/或权利要求8所述的核酸和/或包含权利要求8所述的核酸的表达载体或表达盒。
CN202010294231.3A 2020-04-15 2020-04-15 融合蛋白及其应用 Pending CN113527506A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010294231.3A CN113527506A (zh) 2020-04-15 2020-04-15 融合蛋白及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010294231.3A CN113527506A (zh) 2020-04-15 2020-04-15 融合蛋白及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113527506A true CN113527506A (zh) 2021-10-22

Family

ID=78088260

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010294231.3A Pending CN113527506A (zh) 2020-04-15 2020-04-15 融合蛋白及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113527506A (zh)

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1177928A (zh) * 1994-12-29 1998-04-01 生物技术通用公司 生产人胰岛素
CN103980353A (zh) * 2014-05-21 2014-08-13 乔明强 一种疏水蛋白及其组成的药物制剂
CN103981242A (zh) * 2013-02-07 2014-08-13 华凌科技有限公司 胰岛素的制备方法
WO2017126984A1 (en) * 2016-01-22 2017-07-27 Instytut Biotechnologii i Antybiotyków A method for producing insulin and insulin derivatives, and hybrid peptide used in this method
CN107033247A (zh) * 2017-04-18 2017-08-11 天津世传生物科技有限公司 复合物、蛋白质及二者的制备方法
CN108004254A (zh) * 2017-12-13 2018-05-08 天津大学 疏水蛋白mHGFI基因及表达的蛋白及应用
CN108187060A (zh) * 2018-01-11 2018-06-22 王�琦 药物载体、药物制剂及制备方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1177928A (zh) * 1994-12-29 1998-04-01 生物技术通用公司 生产人胰岛素
CN103981242A (zh) * 2013-02-07 2014-08-13 华凌科技有限公司 胰岛素的制备方法
CN103980353A (zh) * 2014-05-21 2014-08-13 乔明强 一种疏水蛋白及其组成的药物制剂
WO2017126984A1 (en) * 2016-01-22 2017-07-27 Instytut Biotechnologii i Antybiotyków A method for producing insulin and insulin derivatives, and hybrid peptide used in this method
CN107033247A (zh) * 2017-04-18 2017-08-11 天津世传生物科技有限公司 复合物、蛋白质及二者的制备方法
CN108004254A (zh) * 2017-12-13 2018-05-08 天津大学 疏水蛋白mHGFI基因及表达的蛋白及应用
CN108187060A (zh) * 2018-01-11 2018-06-22 王�琦 药物载体、药物制剂及制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
牛宝龙: "真菌疏水蛋白HGFI、HFBI的表达及其结构、性质和功能研究", 《中国博士学位论文全文数据库 基础科学辑》, pages 006 - 36 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4809352B2 (ja) 線維芽細胞成長因子２１の突然変異タンパク質
KR101651703B1 (ko) Ｆｇｆ21 돌연변이체 및 이의 용도
JP5695909B2 (ja) 極度に遅延した時間作用プロファイルを有する新規なインスリン誘導体
US11911443B2 (en) Fusion proteins with extended serum half life
US7566691B2 (en) Vasoactive intestinal polypeptide pharmaceuticals
US7595294B2 (en) Vasoactive intestinal polypeptide pharmaceuticals
WO2015197446A1 (en) Mic-1 fusion proteins and uses thereof
CN101993485A (zh) 促胰岛素分泌肽类似物同源二聚体及其用途
EP0748817A2 (en) Parathyroid hormone derivatives and their use
EP2987804A1 (en) Solid phase synthesis of h[gly2]glp-2
CN103649126B (zh) 用于调节铁稳态的组合物及其使用方法
US5622932A (en) IGF-1 superagonists
WO2016106229A1 (en) Methods of improving yield in recombinant protein production
CN110536899B (zh) 对胰岛素受体具有降低的亲和力的胰岛素类似物复合物及其用途
WO2016102580A1 (en) Alpha-1-antitrypsin (a1at) fusion proteins and uses thereof
CN108794634A (zh) 重组的长效人生长激素融合蛋白及其制备和用途
CN113527506A (zh) 融合蛋白及其应用
EP3888667A1 (en) Glucagon analogs and methods of use thereof
US20230012823A1 (en) GhR-BINDING PEPTIDE AND COMPOSITION COMPRISING SAME
CN113527505A (zh) 一种多肽和包含该多肽的药物组合物以及它们的应用
CN115960246A (zh) 一种重组环状人生长激素-Fc融合蛋白及其应用
EA041758B1 (ru) Fgf21 мутанты и их применение
JPH05202095A (ja) 安定化生理活性ポリペプチド及びその用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination