KR101651703B1 - Ｆｇｆ21 돌연변이체 및 이의 용도 - Google Patents

Ｆｇｆ21 돌연변이체 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR101651703B1
KR101651703B1 KR1020117010559A KR20117010559A KR101651703B1 KR 101651703 B1 KR101651703 B1 KR 101651703B1 KR 1020117010559 A KR1020117010559 A KR 1020117010559A KR 20117010559 A KR20117010559 A KR 20117010559A KR 101651703 B1 KR101651703 B1 KR 101651703B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
fgf21
polypeptide
delete delete
residue
peg
Prior art date
Application number
KR1020117010559A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20110093790A (ko
Inventor
케네스 더블유. 워커
콜린 브이 주니어 제그
랜디 아이. 헥트
에드워드 제이. 벨로우스키
웨-성 리
마크 엘. 마이클스
징 쉬
뮤리엘 엠. 엘리슨
Original Assignee
암젠 인크
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 암젠 인크 filed Critical 암젠 인크
Publication of KR20110093790A publication Critical patent/KR20110093790A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101651703B1 publication Critical patent/KR101651703B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

본 발명은 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자, FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드, FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물, 및 이러한 핵산, 폴리펩타이드 또는 약제학적 조성물을 사용하는 대사성 장애 치료 방법을 제공한다.

Description

ＦＧＦ21 돌연변이체 및 이의 용도{FGF21 Mutants and Uses Thereof}
관련 출원의 교차 참조
본원은 2008년 10월 10일자로 출원된 미국 가출원 제61/195,761호를 우선권으로 주장한다.
본 발명은 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자, FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드, FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물, 및 이러한 핵산, 폴리펩타이드 또는 약제학적 조성물을 사용하는 대사성 장애 치료 방법에 관한 것이다.
FGF21은, FGF19, FGF21, 및 FGF23을 포함하는, 섬유아세포 성장 인자 (FGF)의 서브패밀리에 속하는 분비형 폴리펩타이드이다 (Itoh et al., 2004, Trend Genet. 20: 563-69). FGF21은 헤파린 독립적인 비전형 FGF이며, 글루코즈, 지질 및 에너지 대사의 조절 시 호르몬으로 작용한다.
FGF21은 간 분비 인자로서 간 cDNA 라이브러리로부터 분리되었다. 이는 간 및 췌장에서 고도로 분비되며, 간에서 주로 발현되는 FGF 패밀리의 유일한 구성원이다. FGF21을 과다발현하는 트랜스제닉 마우스는 느린 성장 속도, 낮은 혈장 글루코즈 및 트리글리세라이드 수준의 대사성 표현형, 및 노화 관련 제2형 당뇨병, 소도 과형성 및 비만의 부재를 나타낸다. 당뇨병 설치류 모델은 재조합 FGF21 단백질의 약리학적 투여로 정상화된 수준의 혈장 글루코즈, 감소된 트리글리세라이드 및 콜레스테롤 수준, 및 개선된 글루코즈 내성 및 인슐린 민감성을 갖는다. 또한, FGF21은 에너지 소모, 신체 활성 및 대사 속도를 증가시킴으로써 체중 및 체지방을 감소시킨다. 실험 조사는 인간에서 제2형 당뇨병, 비만, 이상지질혈증 및 기타 대사성 상태 또는 장애의 치료를 위한 FGF21의 약리학적 투여에 대한 지지를 제공한다.
인간 FGF21은 생체내에서 짧은 반감기를 갖는다. 마우스 및 시노몰구스 원숭이에서, 인간 FGF21의 유효 반감기는 1 내지 2시간이다. 제2형 당뇨병을 치료하기 위한 치료제로서의 이용을 위해 FGF21 단백질을 개발함에 있어서는, 반감기의 증가가 바람직할 것이다. 증가된 반감기를 갖는 FGF21 단백질은 환자에게 투여되는 단백질의 투여 횟수를 줄일 것이다.
발명의 요약
하나의 구체예에서, 본 발명은 하기의 아미노산 치환 중 하나 이상을 갖는 서열 번호 4의 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다: (a) 위치 36, 72, 77, 126 및 175 중 하나 이상에서의 리신 잔기; (b) 위치 37, 38, 46, 91, 69, 77, 79, 87, 91, 112, 113, 120, 121, 125, 126, 175, 170, 및 179 중 하나 이상에서의 시스테인 잔기; (c) 위치 56, 59, 69, 및 122 중 하나 이상에서의 아르기닌 잔기; (d) 위치 170에서의 글리신 잔기; (e) 위치 171에서의 글리신 잔기; 및 (a) 내지 (e)의 조합.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 하기의 아미노산 치환 중 하나 이상을 갖고, 폴리펩타이드를 서열 번호 4와 85％ 이상 동일하게 하는 첨가, 결실 또는 추가의 치환을 포함하나, 하기 (a) 내지 (e)의 아미노산 치환 중 하나 이상이 추가로 변형되지는 않는, 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 핵산을 제공한다: (a) 위치 36, 72, 77, 126 및 175 중 하나 이상에서의 리신 잔기; (b) 위치 37, 38, 46, 91, 69, 77, 79, 87, 91, 112, 113, 120, 121, 125, 126, 175, 170, 및 179 중 하나 이상에서의 시스테인 잔기; (c) 위치 56, 59, 69, 및 122 중 하나 이상에서의 아르기닌 잔기; (d) 위치 170에서의 글리신 잔기; (e) 위치 171에서의 글리신 잔기; 및 (a) 내지 (e)의 조합.
또한, 본 발명은 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 벡터 및 숙주 세포를 제공한다.
추가의 구체예에서, 본 발명은 하기의 아미노산 치환 중 하나 이상을 갖는 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩타이드를 제공한다: (a) 위치 36, 72, 77, 126 및 175 중 하나 이상에서의 리신 잔기; (b) 위치 37, 38, 46, 91, 69, 77, 79, 87, 91, 112, 113, 120, 121, 125, 126, 175, 170, 및 179 중 하나 이상에서의 시스테인 잔기; (c) 위치 56, 59, 69, 및 122 중 하나 이상에서의 아르기닌 잔기; (d) 위치 170에서의 글리신 잔기; (e) 위치 171에서의 글리신 잔기; 및 (a) 내지 (e)의 조합.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 하기의 아미노산 치환 중 하나 이상을 갖고, 폴리펩타이드를 서열 번호 4와 85％ 이상 동일하게 하는 첨가, 결실 또는 추가의 치환을 포함하나, 하기 (a) 내지 (e)의 아미노산 치환 중 하나 이상이 추가로 변형되지는 않는, 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 핵산을 제공한다: (a) 위치 36, 72, 77, 126 및 175 중 하나 이상에서의 리신 잔기; (b) 위치 37, 38, 46, 91, 69, 77, 79, 87, 91, 112, 113, 120, 121, 125, 126, 175, 170, 및 179 중 하나 이상에서의 시스테인 잔기; (c) 위치 56, 59, 69, 및 122 중 하나 이상에서의 아르기닌 잔기; (d) 위치 170에서의 글리신 잔기; (e) 위치 171에서의 글리신 잔기; 및 (a) 내지 (e)의 조합.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 하기의 아미노산 치환 중 하나 이상을 갖고, 폴리펩타이드를 서열 번호 4와 85％ 이상 동일하게 하는 첨가, 결실 또는 추가의 치환을 포함하나, 하기 (a) 내지 (e)의 아미노산 치환 중 하나 이상이 추가로 변형되지는 않는, 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩타이드를 제공한다: (a) 위치 36, 72, 77, 126 및 175 중 하나 이상에서의 리신 잔기; (b) 위치 37, 38, 46, 91, 69, 77, 79, 87, 91, 112, 113, 120, 121, 125, 126, 175, 170, 및 179 중 하나 이상에서의 시스테인 잔기; (c) 위치 56, 59, 69, 및 122 중 하나 이상에서의 아르기닌 잔기; (d) 위치 170에서의 글리신 잔기; (e) 위치 171에서의 글리신 잔기; 및 (a) 내지 (e)의 조합.
추가로, 본 발명은, 하기의 아미노산 치환 중 하나 이상을 임의로 갖는 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드, 및 이에 링커를 통해 연결된, 하기의 아미노산 치환 중 하나 이상을 임의로 갖는 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 제공한다: (a) 위치 36, 72, 77, 126 및 175 중 하나 이상에서의 리신 잔기; (b) 위치 37, 38, 46, 91, 69, 77, 79, 87, 91, 112, 113, 120, 121, 125, 126, 175, 170, 및 179 중 하나 이상에서의 시스테인 잔기; (c) 위치 56, 59, 69, 및 122 중 하나 이상에서의 아르기닌 잔기; (d) 위치 170에서의 글리신 잔기; (e) 위치 171에서의 글리신 잔기; 및 (a) 내지 (e)의 조합.
또한, 본 발명은 본 발명의 폴리펩타이드의 화학적으로 변형된 형태를 제공한다. 폴리펩타이드의 화학적으로 변형된 형태는 N-말단 및/또는 천연 또는 비-천연 발생 중합체 부착 부위에 부착된 중합체를 포함한다. 또한, 본 발명은 대사성 장애, 예를 들어 비만 및 당뇨병의 치료가 필요한 환자에게 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기한 장애의 치료를 위한 약제학적 조성물 및 방법을 제공한다.
본 발명의 특정 구체예는 일정한 구체예에 대한 하기의 보다 상세한 설명 및 특허청구범위로부터 분명해질 것이다.
도 1은 서열에 부착된 2개의 중합체 (예: PEG 분자)를 갖는 FGF21 분자를 도시하는 카툰 (cartoon)이다.
도 2는 PEG로 화학적으로 변형된 단일 조작된 중합체 부착 부위를 갖는 9개 FGF21 돌연변이체, 즉 E37C, R77C 및 H125C (상단 좌측), D38C, D46C 및 D79C (상단 우측), H87C, E91C, G113C (하단 좌측) 및 G120C, R126C, N121C (하단 우측)의 페길화 (PEGylation) 정도를 보이는 4개의 SDS-PAGE 겔을 포함한다.
도 3은 20kDa 메톡시 PEG 말레이미드 분자로 화학적으로 변형된 단일 조작된 중합체 부착 부위를 갖는 3개 FGF21 돌연변이체, 즉 K69C, R175C 및 Y179C의 페길화 정도를 보이는 SDS-PAGE 겔을 포함한다.
도 4는 20kDa 메톡시 PEG 말레이미드 분자의 부착에 의해 화학적으로 변형된 단일 조작된 중합체 부착 부위를 갖는 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드, 즉 E37C, R77C, E91C, 야생형 FGF21 및 N-말단 페길화된 FGF21 (상단 플롯) 및 G113C, N121C, D46C, 야생형 FGF21 및 N-말단 페길화된 FGF21 (하단 플롯)에 대해 수행된 ELK-루시페라제 검정 결과를 도시하는 2개의 플롯을 포함한다.
도 5는 20kDa 메톡시-PEG 말레이미드의 부착에 의해 화학적으로 변형된 단일 조작된 중합체 부착 부위를 갖는 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드, 즉 H125C, G120C, R126C, 야생형 FGF21 및 N-말단 페길화된 FGF21 (상단 플롯) 및 D79C, D38C, 야생형 FGF21 및 N-말단 페길화된 FGF21 (하단 플롯)에 대해 수행된 ELK-루시페라제 검정 결과를 도시하는 2개의 플롯을 포함한다.
도 6은 야생형 FGF21 및 20kDa 메톡시 PEG 말레이미드 분자의 부착에 의해 화학적으로 변형된 단일 조작된 중합체 부착 부위를 갖는 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드, 즉 K69C, D79C, 야생형 FGF21 및 N-말단 페길화된 FGF21 (상단 플롯), 및 R175C, Y179C, 야생형 FGF21 및 N-말단 페길화된 FGF21 (하단 플롯)에 대해 수행된 ELK-루시페라제 검정 결과를 도시하는 2개의 플롯을 포함한다.
도 7은 본 발명의 결박된 (Tethered) 분자를 도시하는 카툰이다.
도 8은 비히클 (PBS), 야생형 FGF21 또는 N-말단 페길화된 야생형 FGF21의 단일 주사 후 시간 0부터 마우스의 혈당 수준 변화율 (％)을 도시하는 플롯이다.
도 9는 비히클 (PBS), 또는 20, 30 또는 40 kDa 메톡시 PEG 말레이미드 분자로 N-말단 페길화된 야생형 FGF21의 단일 주사 후 시간 0부터 마우스의 혈당 수준 변화율 (％)을 도시하는 플롯이다.
도 10은 PBS 또는 돌연변이 R77C 또는 R126K를 포함하는 N-말단 페길화된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 (이는 도입된 중합체 부착 부위에서 20kDa 메톡시 PEG 말레이미드 분자에 의해 추가로 페길화된다) 및 Fc 분자와 G170E FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 포함하는 융합물 (상단 플롯); 또는 돌연변이 R77C (이는 도입된 중합체 부착 부위에서 20kDa 메톡시 PEG 말레이미드 분자로 추가로 페길화된다) 및 P171G를 포함하는 N-말단 페길화된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 (하단 플롯)의 단일 주사 후 시간 0부터 마우스의 혈당 수준 변화율 (％)을 도시하는 플롯이다.
도 11은 비히클 (10 mM 인산칼륨, 5％ 소르비톨, pH 8), 또는 도입된 중합체 부착 부위에서 20kDa 메톡시 PEG 말레이미드 분자로 이중 페길화된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드, 즉 E91C/H125C, E91C/R175C, E37C/G120C, E37C/H125C, 및 E37C/R175C의 단일 주사 후 시간 0부터 마우스의 혈당 수준 변화율 (％)을 도시하는 플롯이며; Fc 분자와 P171G FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 포함하는 융합물도 조사되었다.
도 12는 비히클 (10 mM 인산칼륨, 5％ 소르비톨, pH 8), 또는 도입된 중합체 부착 부위에서 20kDa 메톡시 PEG 말레이미드 분자로 이중 페길화된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드, 즉 E91C/H121C, G120C/H125C, 또는 E37C/R77C의 단일 주사 후 시간 0부터 마우스의 혈당 수준 변화율 (％)을 도시하는 플롯이며; Fc 분자와 G170E FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 포함하는 융합물도 조사되었다.
도 13은 비히클 (10 mM 인산칼륨, 5％ 소르비톨, pH 8), 또는 도입된 중합체 부착 부위에서 20kDa 메톡시 PEG 말레이미드 분자로 이중 페길화된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드, 즉 E37C/R77C, E91C/R175C, E37C/H125C, E37C/R77C/P171G, E91C/R77C/P171G 및 E37C/R125C/P171G의 단일 주사 후 시간 0부터 마우스의 혈당 수준 변화율 (％)을 도시하는 플롯이다.
도 14는 비히클 (10 mM 인산칼륨, 5％ 소르비톨, pH 8), 도입된 중합체 부착 부위에서 20kDa 메톡시 PEG 말레이미드 분자로 이중 페길화된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드, 즉 E37C/R77C/P171G 및 E91C/R125C/P171G, 또는 동일한 도입 돌연변이를 갖는 2개의 동일한 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 포함하는 결박된 분자, 즉 R77C/P171G (2x) 및 R78C/P172G (2x) (이는 20kDa 메톡시 PEG 말레이미드 분자를 통해 함께 연결된다)의 단일 주사 후 시간 0부터 마우스의 혈당 수준 변화율 (％)을 나타내는 플롯이다.
도 15는 비히클 (10 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, pH 8.5), 또는 도입된 중합체 부위에서 20kDa 메톡시 PEG 말레이미드 분자로 이중 페길화된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드, 즉 E37C/R77C/P171G의 단일 주사 후 시간 0부터 용량의 함수로서 마우스의 혈당 수준 변화율 (％)을 나타내는 플롯이며, 0.01 mg/kg, 0.03 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.3 mg/kg 또는 1 mg/kg의 용량으로 투여되었다.
도 16은 비히클 (10 mM 인산칼륨, 5％ 소르비톨, pH 8), 또는 도입된 중합체 부착 부위에서 20kDa 메톡시 PEG 말레이미드 분자로 이중 페길화된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드, 즉 E37C/R77C, E91C/R175C, E37/H125C, E37C/R77C/P171G, E91C/R77C/P171G 및 E37C/R125C/P171G의 단일 주사 후 시간 0부터 마우스의 체중 변화를 나타내는 플롯이다.
도 17은 비히클 (10 mM 인산칼륨, 5％ 소르비톨, pH 8), 도입된 중합체 부착 부위에서 20kDa 메톡시 PEG 말레이미드 분자로 이중 페길화된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드, 즉 E37C/R77C/P171G 및 E91C/R125C/P171G, 또는 동일한 도입 돌연변이를 갖는 2개의 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드, 즉 R37C/P171G (2x) 및 R77C/P171G (2x) (이는 20kDa 메톡시 PEG 말레이미드 분자를 통해 함께 연결된다)의 단일 주사 후 시간 0부터 마우스의 체중 변화를 나타내는 플롯이다.
도 18은 비히클 (10 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, pH 8.5), 또는 도입된 중합체 부착 부위에서 20kDa 메톡시 PEG 말레이미드 분자로 이중 페길화된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드, 즉 E37C/R77C/P171G의 단일 주사 후 시간 0부터 용량의 함수로서 마우스의 체중 변화를 나타내는 플롯이며, 5개의 상이한 용량이 투여되었다.
도 19a 내지 19f는 매주 1회씩 비히클 (■), 5 mg/kg (▲) 및 25 mg/kg (○) 페길화된 FGF21 분자를 투여하는 8주의 신장 공포 조사 동안 마우스의 체중 변화를 나타내는 일련의 6개 플롯이다. 이중 시스테인 표적된 PEG-FGF21가 투여된 마우스는 지연된 체중 손실을 보였으며, 결박된 분자가 투여된 마우스는 주로 일시적인 체중 감소를 보였다.
도 20은 비히클, 또는 도입된 중합체 부착 부위에서 20kDa 메톡시 PEG 말레이미드 분자로 이중 페길화된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드, 즉 E37C/R77C/P171G; E37/H125C/P171G; E91C/H125C/P171G; E37C/P171G; R77C/P171G; 및 R77C/P171G가 주사된 마우스에서 8주 신장 공포 조사의 결과를 나타내는 2개의 막대 그래프를 포함하며, 2개의 상이한 용량이 시험되었다.
증가된 반감기와 같은 향상 개선된 특성을 갖는 인간 FGF21이 본원에 기술된 방법 및 표준 분자 생물학 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 하나 이상의 수용성 중합체, 예를 들어 PEG 분자를 단백질에 결합함으로써 단백질의 반감기가 연장될 수 있다는 것은 알려져 있다. 따라서, 다양한 구체예에서, 천연 FGF21의 반감기는, 중합체가 FGF21 단백질에 부착될 수 있는 포인트를 형성하도록 단백질에 아미노산 치환을 도입함으로써 연장될 수 있다. 본원에서는 이러한 변형된 단백질이 FGF21 돌연변이체로 불리며, 본 발명의 구체예를 형성한다. 또한, 중합체는 비-천연 발생 중합체 부착 부위의 도입과 함께 FGF21 분자의 N-말단에 도입될 수 있다.
실시예를 포함하는, 본원에 이용된 재조합 핵산 방법은 일반적으로 문헌 (Sambrook et al ., Molecular Cloning : A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) or Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., Green Publishers Inc. and Wiley and Sons 1994), 이둘 모두 모든 목적을 위해 본원에 참조로 삽입된다)에 기술되어 있다.
1. 일반 정의
본원에서 사용되는 용어 "하나"는 달리 구체적으로 지시하지 않는 한 하나 이상을 의미한다.
용어 "분리된 핵산 분자"는, (1) 전체 핵산이 공급원 세포로부터 분리되는 경우, 단백질, 지질, 탄수화물 또는 기타 물질 (핵산 분자는 천연적으로 이들 물질과 함께 발견된다)로부터 약 50％ 이상 분리되거나, (2) "분리된 핵산 분자"가 자연적으로 연결되는 폴리뉴클레오타이드의 전부 또는 일부에 연결되지 않거나, (3) 자연적으로는 연결되지 않는 폴리뉴클레오타이드에 작동적으로 연결되거나, (4) 보다 큰 폴리뉴클레오타이드 서열의 일부로서 자연적으로는 발생하지 않는, 본 발명의 핵산 분자를 말한다. 바람직하게는, 본 발명의 분리된 핵산 분자는 임의의 다른 오염 핵산 분자 또는 폴리펩타이드 생산 또는 이의 치료, 진단, 예방 또는 연구 이용에서의 이의 이용을 방해하는 천연 환경에서 발견되는 다른 오염물을 실질적으로 함유하지 않는다.
용어 "분리된 폴리펩타이드"는, (1) 공급원 세포로부터 분리되는 경우, 폴리뉴클레오타이드, 지질, 탄수화물 또는 기타 물질 (폴리펩타이드는 천연적으로 이들 물질과 함께 발견된다)로부터 약 50％ 이상 분리되거나, (2) "분리된 폴리펩타이드"가 자연적으로 연결되는 폴리펩타이드의 전부 또는 일부에 (공유 또는 비공유 상호작용으로) 연결되지 않거나, (3) 자연적으로는 연결되지 않는 폴리펩타이드에 (공유 또는 비공유 상호작용으로) 작동적으로 연결되거나, (4) 자연적으로는 발생하지 않는, 본 발명의 폴리펩타이드를 말한다. 바람직하게는, 분리된 폴리펩타이드는 임의의 다른 오염 폴리펩타이드 또는 치료, 진단, 예방 또는 연구 이용을 방해하는 천연 환경에서 발견되는 다른 오염물을 실질적으로 함유하지 않는다.
용어 "벡터"는 숙주 세포에 암호화 정보를 전달하는데 사용되는 임의의 분자 (예: 핵산, 플라스미드 또는 바이러스)를 일컫는데 사용된다.
용어 "발현 벡터"는 숙주 세포를 형질전환하는데 적합하고 삽입된 이종 핵산 서열의 발현을 지시 및/또는 조절하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 말한다. 발현은, 이로 제한됨이 없이, 전사, 해독, 및 인트론이 존재하는 경우, RNA 스플라이싱과 같은 과정을 포함한다.
용어 "숙주 세포"는 형질전환된 세포, 또는 핵산 서열로 형질전환되어 선택된 목적 유전자를 발현할 수 있는 세포를 말한다. 이 용어는, 자손이 형태학적으로 또는 유전적 구조면에서 최초 모 세포와 동일하든 동일하지 않든, 선택된 유전자가 존재하는 한, 모 세포의 자손을 포함한다.
용어 "천연 발생"은, 핵산 분자, 폴리펩타이드, 숙주 세포 등과 같은 생물학적 물질과 연관지어 사용되는 경우, 자연에서 발견되고 인간에 의해 조작되지 않는 물질을 말한다. 마찬가지로, 본원에서 사용되는 "비-천연 발생"은 자연에서 발견되지 않거나 인간에 의해 구조적으로 변형되거나 합성된 물질을 말한다. 뉴클레오타이드와 연관지어 사용되는 경우, 용어 "천연 발생"은 아데닌 (A), 시토신 (C), 구아닌 (G), 티민 (T), 및 우라실 (U)을 말한다. 아미노산과 연관지어 사용되는 경우, 용어 "천연 발생"은 20개의 아미노산인 알라닌 (A), 시스테인 (C), 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E), 페닐알라닌 (F), 글리신 (G), 히스티딘 (H), 이소루이신 (I), 리신 (K), 루이신 (L), 메티오닌 (M), 아스파라긴 (N), 프롤린 (P), 글루타민 (Q), 아르기닌 (R), 세린 (S), 트레오닌 (T), 발린 (V), 트립토판 (W), 및 티로신 (Y)을 말한다.
용어 "FGF21 폴리펩타이드"는 인간에서 발현되는 천연 발생 야생형 폴리펩타이드를 말한다. 본원의 목적 상, 용어 "FGF21 폴리펩타이드"는 209개의 아미노산 잔기 (서열 번호 2)로 이루어지고 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 전장의 FGF21 폴리펩타이드; 및 181개 아미노산 잔기 (서열 번호 4)로 이루어지고 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되며 전장의 FGF21 폴리펩타이드의 아미노-말단에 있는 28개의 아미노산 잔기 (즉, 시그널 펩타이드를 구성)가 제거된 성숙한 형태의 폴리펩타이드를 일컫기 위해 상호교환적으로 사용될 수 있다. FGF21 폴리펩타이드는 N-말단 메티오닌 잔기의 존재 또는 부재 하에 발현될 수 있으며; 본원에서 주목되는 바와 같이, N-말단 메티오닌 잔기는 디자인에 의해 또는 세균 발현 시스템의 기능으로 첨가될 수 있다.
본원에서 기술되는 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 포함한 FGF21 폴리펩타이드에 적용되는 것으로서, 용어 "생물학적으로 활성인"은, 야생형 FGF21 폴리펩타이드의 천연 발생 활성, 예를 들어 혈액 글루코즈, 인슐린, 트리글리세라이드 또는 콜레스테롤을 낮추고; 체중을 감소시키며; 내당력, 에너지 소비 또는 인슐린 민감성을 개선하는 능력을 말한다. FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드에 적용 시, 이 용어는 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드로 도입된 변형의 유형 또는 수에 의존적이지 않다. 예를 들어, 일부 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드는 야생형 FGF21 폴리펩타이드와 비교하여 다소 감소된 수준의 FGF21 활성을 가지나 그럼에도 불구하고 생물학적 활성 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드로 간주된다. 특정 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드의 활성 차이가 생체내 검정과 시험관내 검정 사이에 관측될 수 있으며; 이러한 차이는 이용된 특정 검정에 관련된다. 그러나, 이러한 관측은 용어 "생물학적으로 활성인"의 의미에 영향을 끼치지 않으며, 야생형 FGF21 폴리펩타이드의 천연 발생 활성, 예를 들어 생체내 또는 시험관내 시 혈액 글루코즈, 인슐린, 트리글리세라이드 또는 콜레스테롤을 낮추고; 체중을 감소시키며; 내당력, 에너지 소모 또는 인슐린 민감성을 개선하는 능력을 나타내는 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드는 "생물학적으로 활성"이다.
용어 "유효량" 및 "치료학적 유효량"은 상호교환적으로 사용되며, 야생형 FGF21 폴리펩타이드의 하나 이상의 생물학적 활성, 예를 들어 혈액 글루코즈, 인슐린, 트리글리세라이드 또는 콜레스테롤을 낮추고; 체중을 감소시키며; 내당력, 에너지 소모 또는 인슐린 민감성을 개선하는 능력의 관측가능한 수준을 지지하기 위해 사용되는 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드의 양을 언급한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "약제학적으로 허용되는 담체" 또는 "생리학적으로 허용되는 담체"는 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드의 전달을 달성하거나 증진시키기에 적합한 하나 이상의 제형화 물질을 말한다. 이러한 물질의 예는 본원에 참조로 삽입된 문헌 (Remington, 참조)에서 찾을 수 있다.
용어 "결박된 분자 (Tethered Molecule)"는 링커 분자에 의해 서로 묶인 2개 이상의 FGF 분자를 포함하는 구조물을 말한다. 결박된 분자는 2개 이상의 FGF21 폴리펩타이드 (이중 하나 이상은 본원에서 기술되는 바와 같은 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드이다)를 포함하나, 링커에 의해 서로 연결된 3개, 4개 또는 그 이상의 FGF21 또는 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 따라서, 용어 결박된 분자는 단지 1개 또는 2개의 FGF21 또는 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드의 배합물을 포함하는 분자에 제한되지 않는다.
용어 "중합체 부착 부위 (polymer attachment site)"는 중합체 (예: 모든 분자량의 PEG 분자, 중합체성 만노오스, 글리칸 등)와 공유 결합으로 화학적으로 적응가능한 폴리펩타이드 (예: FGF 폴리펩타이드)의 1차 아미노산 서열의 영역을 말한다. 중합체 부착 부위는 단일 아미노산 (예: 시스테인, 리신, 아르기닌 또는 적합한 비-천연 발생 아미노산)을 의미하거나 서열적으로 또는 공간적으로 서로 인접한 2개 이상의 아미노산을 말할 수 있다.
용어 "화학적으로 변형된"은, 본원에 기술되는 바와 같은 FGF21 야생형 또는 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드와 관련하여 사용되는 경우, 하나 이상의 이종 분자의 공유 부착에 의해 천연 발생 상태로부터 변형된 FGF21 폴리펩타이드를 일컫는다. 이종 분자의 예는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜, 덱스트란, 셀룰로즈, 폴리-(N-비닐 피롤리돈) 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올, 하이드록실 에틸 전분 (HES), 및 폴리비닐 알콜을 포함한다. 화학적으로 변형된 FGF21 폴리펩타이드의 예는 페길화된 야생형 FGF21 및 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 포함한다.
2. FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드
다양한 측면에서, 본 발명은 시험관내 활성에 대한 영향은 최소화하면서 FGF 분자의 약동학적 특성을 증진시킬 수 있는 FGF21 및 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드의 부위-지시된 페길화를 위한 일련의 방법을 기술한다. 이러한 페길화된 FGF21 분자의 증진된 약동학적 프로필은 치료제에 대한 노출을 증가시킴으로써 분자의 생체내 효능에 영향을 미친다. 또한, 본원에 기술된 계획은 분자의 약동학적 특성을 더욱 증진시킬 수 있는 다수의 페길화 부위를 만드는 것과 양립될 수 있고, 공포 (vacuole)-형성 포텐셜을 낮춘다. 2개의 원칙적 계획이 본원에 기술되는 바와 같이 이를 달성하기 위해 이용되었다.
하나의 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 변형이 도입된 FGF21 서열에 관한 것이다. 따라서, 상호교환적으로 사용될 수 있는 용어 "FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드" 및 "FGF21 돌연변이체"는 야생형 FGF21 아미노산 서열 (예: 서열 번호 2 또는 4)이 변형된 FGF21 폴리펩타이드를 말한다. 이러한 변형은, 이로 제한됨이 없이, 비-천연 발생 아미노산 동족체로의 치환을 포함한 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 및 절단을 포함한다. 따라서, FGF21 폴리펩타이드 돌연변이체는, 이로 제한됨이 없이, 본원에 기술되는 바와 같이, 부위-지시된 FGF21 돌연변이체, 예를 들어 비-천연적으로 발생하는 중합체 부착 부위를 도입하는 것들, 또는 단백질분해에 대해 어느 정도 내성을 부여하는 것을 포함한다. 본 발명의 FGF21 돌연변이체의 구체적인 아미노산 치환을 확인하기 위한 목적상, 절단되거나 돌연변이되는 아미노산 잔기의 번호매김은 성숙한 181-잔기 FGF21 폴리펩타이드 (즉, 서열의 N 말단은 HPIPD로 개시하고, 이들 잔기는 각각 잔기 1, 2, 3, 및 5로 표시된다)의 번호매김에 상응한다. N-말단 메티오닌 잔기는 존재할 수는 있으나 존재할 필요가 없으며, 이러한 N-말단 메티오닌 잔기는 단백질의 번호매김 계획에 포함되지 않는다.
기술된 바와 같이, 비-천연 발생 아미노산을 포함하는 하나 이상의 치환 또는 삽입을 포함하는 FGF21의 절단된 형태를 포함한 FGF21 돌연변이체가 본 발명의 구체예를 형성한다. 이러한 삽입 또는 치환은 중합체 부착을 위한 부위로서의 작용을 포함한 다양한 특성을 부여할 수 있다. 이러한 경우, 비-천연 발생 아미노산은 본원에 기술된 다양한 돌연변이에 추가하여 FGF21 서열에 삽입될 수 있다. 따라서, FGF21 돌연변이체는 본원에 기술된 하나 이상의 돌연변이를 포함하고, 하나 이상의 비-천연 발생 아미노산을 추가로 포함할 수 있다. FGF21 서열로 삽입될 수 있거나 FGF21 서열의 야생형 잔기 대신 치환될 수 있는 비-천연 발생 아미노산의 비제한적 예는, β-아미노산, 호모아미노산, 사이클릭 아미노산 및 유도체화된 측쇄를 갖는 아미노산을 포함한다. 예는 하기를 포함한다 (L-형 또는 D-형; 괄호에 약어로 표시됨): 파라-아세틸-페닐알라닌, 파라-아지도-페닐알라닌, 파라-브로모-페닐알라닌, 파라-요오도-페닐알라닌 및 파라-에티닐-페닐알라닌, 시트룰린 (Cit), 호모시트룰린 (hCit), Nα-메틸시트룰린 (NMeCit), Nα-메틸호모시트룰린 (Nα-MeHoCit), 오르니틴 (Orn), Nα-메틸오르니틴 (Nα-MeOrn 또는 NMeOrn), 사르코신 (Sar), 호모리신 (hLys 또는 hK), 호모아르기닌 (hArg 또는 hR), 호모글루타민 (hQ), Nα-메틸아르기닌 (NMeR), Nα-메틸루이신 (Nα-MeL 또는 NMeL), N-메틸호모리신 (NMeHoK), Nα-메틸글루타민 (NMeQ), 노르루이신 (Nle), 노르발린 (Nva), 1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린 (Tic), 옥타하이드로인돌-2-카복실산 (Oic), 3-(1-나프틸)알라닌 (1-Nal), 3-(2-나프틸)알라닌 (2-Nal), 1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린 (Tic), 2-인다닐글리신 (IgI), 파라-요오도페닐알라닌 (pI-Phe), 파라-아미노페닐알라닌 (4AmP 또는 4-아미노-Phe), 4-구아니디노 페닐알라닌 (Guf), 글리실리신 ("K(Nε-glycyl)" 또는 "K(glycyl)" 또는 "K(gly)"로 약어표기됨), 니트로페닐알라닌 (nitrophe), 아미노페닐알라닌 (aminophe 또는 amino-Phe), 벤질페닐알라닌 (benzylphe), γ-카복시글루탐산 (γ-carboxyglu), 하이드록시프롤린 (hydroxypro), p-카복실-페닐알라닌 (Cpa), α-아미노아디프산 (Aad), Nα-메틸 발린 (NMeVal), Nα-메틸 루이신 (NMeLeu), Nα-메틸노르루이신 (NMeNle), 사이클로펜틸글리신 (Cpg), 사이클로헥실글리신 (Chg), 아세틸아르기닌 (acetylarg), α,β-디아미노프로피온산 (Dpr), α,γ-디아미노부티르산 (Dab), 디아미노프로피온산 (Dap), 사이클로헥실알라닌 (Cha), 4-메틸-페닐알라닌 (MePhe), β,β-디페닐-알라닌 (BiPhA), 아미노부티르산 (Abu), 4-페닐-페닐알라닌 (또는 비페닐알라닌; 4Bip), α-아미노-이소부티르산 (Aib), beta-알라닌, 베타-아미노프로피온산, 피페리딘산, 아미노카프리오산, 아미노헵타노산, 아미노피멜산, 데스모신, 디아미노피멜산, N-에틸글리신, N-에틸아스파르긴, 하이드록시리신, 알로-하이드록시리신, 이소데스모신, 알로-이소루이신, N-메틸글리신, N-메틸이소루이신, N-메틸발린, 4-하이드록시프롤린 (Hyp), γ-카복시글루타메이트, ε-N,N,N-트리메틸리신, ε-N-아세틸리신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-포밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-하이드록시리신, ω-메틸아르기닌, 4-아미노-O-프탈산 (4APA), 및 다른 유사한 아미노산, 및 구체적으로 열거된 것들의 유도체화된 형태.
본 발명의 다른 구체예에서, FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드는 야생형 FGF21 아미노산 서열 (예: 서열 번호 2 또는 4)과 약 85％ 이상 동일하나, FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 내의 비-천연 발생 중합체 부착 부위를 도입하는 특정 잔기는 추가로 변형되지 않는, 아미노산 서열을 포함한다. 달리, 비-천연 발생 중합체 부착 부위 또는 단백질분해에 대한 내성을 증가시키기 위한 돌연변이를 도입하기 위해 변형된 FGF21 돌연변이체 서열의 잔기는 예외로 하고, FGF21 돌연변이체 서열의 모든 다른 아미노산 잔기의 약 15％가 변형될 수 있다. 예를 들어, FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 G170C에서, 위치 170의 글리신 잔기 이외의 모든 아미노산 잔기의 15％ 이하가 변형될 수 있었다. 또 다른 구체예에서, FGF21 폴리펩타이드 돌연변이체는 야생형 FGF21 아미노산 서열 (예: 서열 번호 2, 4, 6 또는 8)과 적어도 약 90％, 또는 약 95, 96, 97, 98, 또는 99％ 동일한 아미노산 서열을 포함하나, 비-천연 발생 중합체 부착 부위를 도입하거나 단백질분해 내성을 증진시키기 위해 변형된 특정 잔기는 추가로 변형되지 않는다. 이러한 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드는 야생형 FGF21 폴리펩타이드의 하나 이상의 활성을 갖는다.
FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드는 FGF21 폴리펩타이드의 특정 위치에서, 사실상 보존적이거나 비-보존적인 아미노산 치환을 도입하고, 천연적으로 또는 비-천연적으로 발생하는 아미노산을 이용함으로써 생성될 수 있다. 이러한 치환은 FGF21 폴리펩타이드에 바람직한 특성을 부여하도록 디자인되거나 관측된 치환에 추가하여 수행될 수 있다. 예시로써, FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드는 목적하는 특성, 예를 들어 비-천연 발생 중합체 부착 부위를 도입하거나 단백질분해 내성을 증진시키는 특성을 달성하기 위해 디자인된 치환을 포함할 수 있고, 야생형 FGF21 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 유지할 수 있는, 그러나 유지할 필요는 없는, 하나 이상의 보존적 또는 비-보존적 치환을 추가로 포함할 수 있다.
FGF21 돌연변이는 보존적 또는 비-보존적일 수 있다. "보존적 아미노산 치환"은 천연 아미노산 잔기 (즉, 야생형 FGF21 폴리펩타이드 서열의 지정된 위치에서 발견되는 잔기)를 그 위치에서 아미노산 잔기의 극성 또는 전하에 영향이 적거나 없도록 비천연 잔기 (즉, 야생형 FGF21 폴리펩타이드 서열의 지정된 위치에서 발견되지 않는 잔기)로 치환하는 것을 포함할 수 있다. 또한, 보존적 아미노산 치환은, 통상적으로 생물학적 시스템에서의 합성에 의한 것보다 화학적 펩타이드 합성에 의해 삽입되는 비-천연 발생 아미노산 잔기를 포함한다. 이들은 펩타이드유사체 (peptidomimetics), 및 아미노산 잔기의 다른 뒤집힌 (reversed) 또는 전도된 (inverted) 형태를 포함한다.
천연 발생 잔기는 공통의 측쇄 특성에 기초하여 하기 부류로 구분될 수 있다:
(1) 소수성: 노르루이신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성의 친수성: Cys, Ser, Thr;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: Asn, Gln, His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 끼치는 잔기: Gly, Pro; 및
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
보존적 치환은 이들 부류 중 하나의 부류의 구성원을 동일한 부류의 또 다른 구성원으로 교환하는 것을 포함할 수 있다. 비-보존적 치환은 이들 부류 중 하나의 부류의 구성원을 또 다른 부류의 구성원으로 교환하는 것을 포함할 수 있다.
(보존적이든 비-보존적이든) 바람직한 아미노산 치환은, 치환이 필요한 시점에서 당업자에 의해 결정될 수 있다. 아미노산 치환에 대한 예시적 (단, 비제한적) 목록이 하기 표 1에 제시된다.
아미노산 치환
최초 잔기 예시적 치환
Ala Val, Leu, Ile
Arg Lys, Gln, Asn
Asn Gln
Asp Glu
Cys Ser, Ala
Gln Asn
Glu Asp
Gly Pro, Ala
His Asn, Gln, Lys, Arg
Ile Leu, Val, Met, Ala, Phe
Leu Ile, Val, Met, Ala, Phe
Lys Arg, Gln, Asn
Met Leu, Phe, Ile
Phe Leu, Val, Ile, Ala, Tyr
Pro Ala
Ser Thr, Ala, Cys
Thr Ser
Trp Tyr, Phe
Tyr Trp, Phe, Thr, Ser
Val Ile, Met, Leu, Phe, Ala
2.A. 단백질분해 내성 돌연변이를 포함하는 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드
성숙한 형태의 FGF21 (즉, 181개 잔기 형태)는 궁극적으로는 단백질분해 공격에 기인하는 것으로 확인된 생체내 분해를 겪는 것으로 확인되었다. 성숙 FGF21의 생체내 분해는 보다 짧은 유효 반감기를 이끌어 분자의 치료적 포텐셜에 불리하게 영향을 끼칠 수 있는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 단백질분해에 내성을 나타내는 FGF21 돌연변이체를 확인하기 위한 통제된 조사를 수행하였다. 이러한 조사 결과, 단백질분해에 특히 민감한 것으로 확인된 성숙 FGF21 폴리펩타이드의 부위는 위치 4-5, 20-21, 151-152, 및 171-172의 아미노산 잔기 사이의 펩타이드 결합을 포함한다.
단백질의 생물학적 활성에 비허용되는 정도로는 영향을 끼치지 않으면서 성숙한 FGF21에서 관측되는 단백질분해 효과를 제거하는, 본 발명에서 사용될 수 있는, 예시적 치환에 대한 비제한적 목록이 표 2에 제시되어 있다. 표 2는 단지 예시적인 것이며, 다른 단백질분해 내성 치환이 확인되어 본 발명에 사용될 수 있다. 이들 단백질분해 내성 치환이 하나 이상의 비-천연 발생 중합체 부착 부위를 도입하는 치환에 추가하여 이루어질 수 있으며, 이로써 각각의 유형의 돌연변이에 의해 부여되는 바람직한 특성을 나타내는 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드가 생성된다.
단백질분해 내성을 제공하는 대표적인 치환
아미노산 위치 천연 잔기 돌연변이
19 Arg Gln, Ile, Lys
20 Tyr His, Leu, Phe
21 Leu Ile, Phe, Tyr, Val
22 Tyr Ile, Phe, Val
150 Pro Ala, Arg
151 Gly Ala, Val
152 Ile His, Leu, Phe, Val
170 Gly Ala, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Pro, Ser
171 Pro Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly,
His, Lys, Ser, Thr, Trp, Tyr
172 Ser Leu, Thr
173 Gln Arg, Glu
바람직하게는, 단 반드시는 아니나, 단백질분해 내성 돌연변이를 포함하는 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드는 야생형 FGF21의 활성과 본질적으로 동일하거나 보다 높은 생물학적 활성을 갖는다. 따라서, 본 발명의 또 다른 구체예는 하나 이상의 비-천연 발생 중합체 부착 부위를 포함하고 단백질분해에 내성이며 야생형 FGF21과 동일하거나 보다 높은 생물학적 활성을 여전히 보유하는 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드에 관한 것이다. 비록 일부의 경우에서는 덜 바람직하지만, 하나 이상의 비-천연 발생 중합체 부착 부위를 포함하고 단백질분해에 내성이며 다소 감소된 생물학적 활성을 나타내는 FGF21 돌연변이체가 본 발명의 또 다른 구체예를 형성한다. 일부의 경우, 어느 정도의 단백질분해를 유지하는 것이 바람직할 수 있으며, 따라서 하나 이상의 비-천연 발생 중합체 부착 부위를 포함하고 단백질분해에 내성이며 어느 정도의 단백질분해가 여전히 발생하도록 하는 FGF21 돌연변이체가 본 발명의 또 다른 구체예를 형성한다.
본 발명의 모든 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드와 마찬가지로, 하나 이상의 비-천연 발생 중합체 부착 부위를 포함하는 단백질 내성 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드도 본원에 기술되는 바와 같이 제조될 수 있다. 당업자, 예를 들어 표준 분자 생물학 기술에 익숙한 당업자는, 본 발명의 하나 이상의 비-천연 발생 중합체 부착 부위를 포함하는 단백질분해 내성 FGF21 돌연변이체를 제조하고 사용하기 위해서, 본 기술과 함께 그러한 기술을 이용할 수 있다. 표준 기술이 재조합 DNA, 올리고뉴클레오타이드 합성, 조직 배양, 및 형질전환 (예: 전기천공, 리포펙션)에 대해 이용될 수 있다 (Sambrook et al ., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 모든 목적으로 본원에 참조로 삽입됨). 효소 반응 및 정제 기술이 당해 기술 분야에서 일반적으로 수행되는 바와 같이 또는 본원에 기술되는 바와 같이 제작자의 설명서에 따라 수행될 수 있다. 달리 특별히 정의되지 않는 한, 본원에 기술된 분석 화학, 합성 유기 화학 및 의학 및 약학 화학과 연관지어 이용된 명명법 및 이의 실험 절차 및 기술은 당해 기술 분야에 널리 공지되고 일반적으로 이용되는 것들이다. 표준 기술이 화학 합성; 화학 분석; 약제 제조, 제형화 및 전달; 및 환자 치료에 대해 이용될 수 있다.
단백질분해에 내성인 하나 이상의 비-천연 발생 중합체 부착 부위를 포함하는 단백질분해 내성 FGF21 돌연변이체는 당해 기술 분야에 공지되고 본원에 기술된 방법을 이용하여 화학적으로 변형될 수 있다. 하나 이상의 비-천연 발생 중합체 부착 부위를 포함하는 단백질분해 내성 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 화학적으로 변형 (예: 페길화)시키는 것은 단백질분해 내성 및 목적하는 약동학 및 약력학 특성을 모두 나타내는 분자를 생성할 수 있다.
2.B. 비-천연 발생 중합체 부착 부위를 포함하는 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드
본 발명의 다양한 측면에서, FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드가 기술된다. 또 다른 측면에서, 본 발명의 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드는 비-천연 발생 중합체 (예: 페길화) 결합 부위(들)이 도입된 FGF21 폴리펩타이드를 포함한다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 비-천연 발생 중합체 (예: PEG) 부착 부위(들)이 도입된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드의 절단된 형태가 기술된다. 비-천연 발생 중합체 부착 부위 및 하나 이상의 보존적 또는 비-보존적 치환을 포함하고 야생형 FGF21의 생물학적 활성을 유지할 수 있거나 유지할 필요가 없는 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드가 본 발명의 또 다른 측면을 형성한다. 본 발명의 다양한 FGF21 폴리펩타이드 돌연변이체가 본원 및 본원에 기술된 참조문에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다.
하나의 구체예에서, 본 발명의 FGF21 폴리펩타이드 돌연변이체는 비-천연 발생 중합체 부착 부위를 도입함으로써 변형된다. 실제로, 하나의 구체예에서 이는, 즉 반감기-연장 중합체가 목적하는 위치에서 FGF21 폴리펩타이드 돌연변이체에 부착될 수 있도록 하나 이상의 비-천연 발생 중합체 부착 부위의 도입은 은 본 발명의 FGF21 돌연변이체의 목표이다. 선택된 중합체는 통상적으로, 반드시는 아니나, 부착되는 단백질이 수성 환경 (예: 생리학적 환경)에서 침전하지 않도록 수용성이다. 적합한 범위에는 중합체의 혼합물이 포함된다. 바람직하게는, 최종-제품 제제의 치료적 이용을 위해, 중합체는 약학적으로 허용되는 중합체, 예를 들어 적합한 분자량의 PEG일 것이다. 비-수용성 중합체, 예를 들어 PEG 지방산 블록공중합체가 또한 본 발명의 FGF21 폴리펩타이드 돌연변이체에 컨쥬게이션될 수 있으며, 본 발명의 하나의 측면을 형성한다.
본 발명의 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드의 활성은 다양한 방식으로, 예를 들어 실시예 10에 기술되는 바와 같은 시험관내 ELK-루시페라제 검정으로 평가될 수 있다.
또한, 본 발명의 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드의 활성은 생체내 검정, 예를 들어 실시예 12에 나타난 바와 같은 ob/ob 마우스를 사용하여 평가될 수 있다. 일반적으로, 이들 폴리펩타이드 중 하나 이상의 폴리펩타이드의 생체내 활성을 평가하기 위해서, 폴리펩타이드는 시험 동물에 복강내로 투여될 수 있다. 하나 이상의 목적하는 시간 경과 후, 혈액 샘플을 채혈하고 혈당 수준을 평가할 수 있다.
본 발명의 모든 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드와 마찬가지로, 이들 폴리펩타이드는 직접적 돌연변이에 의해 또는 세균 발현 공정에 의해 도입될 수 있는 아미노-말단 메티오닌 잔기를 임의로 포함할 수 있다.
본 발명의 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드는 실시예 7에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 표준 분자 생물학 기술과 익숙한 당업자는 본 발명의 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 제조하고 이용하기 위해 본 기술과 함께 이러한 기술을 이용할 수 있다. 표준 기술이 재조합 DNA, 올리고뉴클레오타이드 합성, 조직 배양, 및 형질전환 (예: 전기천공, 리포펙션)에 대해 이용될 수 있다 (Sambrook et al ., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 모든 목적으로 본원에 참조로 삽입됨). 효소 반응 및 정제 기술이 당해 기술 분야에서 일반적으로 수행되는 바와 같이 또는 본원에 기술되는 바와 같이 제작자의 설명서에 따라 수행될 수 있다. 달리 특별히 정의되지 않는 한, 본원에 기술된 분석 화학, 합성 유기 화학 및 의학 및 약학 화학과 연관지어 이용된 명명법 및 이의 실험 절차 및 기술은 당해 기술 분야에 널리 공지되고 일반적으로 이용되는 것들이다. 표준 기술이 화학 합성; 화학 분석; 약제 제조, 제형화 및 전달; 및 환자 치료에 대해 이용될 수 있다.
FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 제조하기 위해서, 폴리펩타이드는 실시예 9에 기술된 바와 같이 중합체의 부착에 의해 화학적으로 변형될 수 있다.
3. 비-천연 발생 중합체 부착 부위를 포함하는 절단된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드
본 발명의 하나의 구체예는 하나 이상의 비-천연 발생 중합체 부착 부위를 포함하는 돌연변이체 FGF21 폴리펩타이드의 절단된 형태에 관한 것이다. 이러한 절단된 돌연변이체 폴리펩타이드는, 화학적으로 변형될 수 있거나 변형될 필요가 없다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "절단된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드"는 하나 이상의 아미노산 잔기가 FGF21 폴리펩타이드의 아미노-말단 (또는 N-말단) 끝으로부터 제거되거나, 하나 이상의 아미노산 잔기가 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드의 카복실-말단 (또는 C-말단)으로부터 제거되거나, 하나 이상의 아미노산 잔기가 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 또는 화학적으로 변형된 FGF21 폴리펩타이드의 N-말단 및 C-말단 모두로부터 제거된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 또는 화학적으로 변형된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 말한다.
N-말단 절단된 돌연변이체 FGF21, C-말단 절단된 돌연변이체 FGF21 및 분자의 N-말단 및 C-말단 끝 모두에서 절단된 돌연변이체 FGF21 분자, 및 이들 돌연변이체의 화학적으로 변형된 형태의 활성은 다양한 방법, 예를 들어 실시예 10에 기술된 바와 같은 시험관내 ELK-루시페라제 검정을 이용하여 평가될 수 있다.
본 발명의 절단된 돌연변이체 FGF21 폴리펩타이드 및 화학적으로 변형된 절단된 돌연변이체 FGF21 폴리펩타이드의 활성은 실시예 12에 나타난 바와 같이 예를 들어 ob/ob 마우스에서 생체내 검정으로 평가될 수 있다. 일반적으로, 이들 폴리펩타이드 중 하나 이상의 폴리펩타이드의 생체내 활성을 평가하기 위해서, 폴리펩타이드는 시험 동물에 복강내로 투여될 수 있다. 하나 이상의 목적하는 시간 경과 후, 혈액 샘플을 채혈하고 혈당 수준을 평가할 수 있다.
본 발명의 모든 FGF21 돌연변이체와 마찬가지로, 절단된 돌연변이체 FGF21 및 화학적으로 변형된 절단된 돌연변이체 FGF21 폴리펩타이드는 직접적 돌연변이에 의해 또는 세균 발현 공정에 의해 도입될 수 있는 아미노-말단 메티오닌 잔기를 임의로 포함할 수 있다.
본 발명의 절단된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드는 실시예 7에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 표준 분자 생물학 기술과 익숙한 당업자는 본 발명의 절단된 돌연변이체 FGF21을 제조하고 이용하기 위해 본 기술과 함께 이러한 기술을 이용할 수 있다. 표준 기술이 재조합 DNA, 올리고뉴클레오타이드 합성, 조직 배양, 및 형질전환 (예: 전기천공, 리포펙션)에 대해 이용될 수 있다 (Sambrook et al ., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 모든 목적으로 본원에 참조로 삽입됨). 효소 반응 및 정제 기술이 당해 기술 분야에서 일반적으로 수행되는 바와 같이 또는 본원에 기술되는 바와 같이 제작자의 설명서에 따라 수행될 수 있다. 달리 특별히 정의되지 않는 한, 본원에 기술된 분석 화학, 합성 유기 화학 및 의학 및 약학 화학과 연관지어 이용된 명명법 및 이의 실험 절차 및 기술은 당해 기술 분야에 널리 공지되고 일반적으로 이용되는 것들이다. 표준 기술이 화학 합성; 화학 분석; 약제 제조, 제형화 및 전달; 및 환자 치료에 대해 이용될 수 있다.
절단된 돌연변이체 FGF21 폴리펩타이드를 제조하기 위해서, 폴리펩타이드는 실시예 9에 기술된 바와 같이 중합체의 부착에 의해 화학적으로 변형될 수 있다.
4. 캡핑 및 C-말단 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드
또 다른 구체예에서, 본 발명은 폴리펩타이드의 C-말단에 또 다른 하나 이상의 잔기를 첨가하여 캡핑함으로써 아미노산 서열을 야생형 단백질의 서열 이상으로 연장하는 하나 이상의 비-천연 발생 중합체 부착 부위를 포함하는 돌연변이체 FGF21 폴리펩타이드에 관한 것이다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 하나 이상의 C-말단 돌연변이를 추가로 포함하는 하나 이상의 비-천연 발생 중합체 부착 부위를 포함하는 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드에 관한 것이다. 이러한 캡핑되고 C-말단 돌연변이된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드는 화학적으로 변형될 수 있으나 변형되지 않아도 된다.
본원에서 사용되는 용어 "캡핑된 (capped) FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드"는 하나 이상의 아미노산 잔기가 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 또는 화학적으로 변형된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드의 C-말단에 첨가된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 또는 화학적으로 변형된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 말한다. 하나 이상의 프롤린 및 하나 이상의 글리신 잔기를 포함한 모든 천연 또는 비-천연 발생 아미노산이 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 캡핑하는데 사용될 수 있다. 비록 야생형 FGF21 서열은 단지 181개 잔기 길이이지만, 캡핑된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드는 각각 첨가된 캡핑 잔기에 대해 하나의 잔기로 폴리펩타이드의 길이를 연장하며; 본 기술의 번호매김 설계와 일치하게, 캡 잔기는 182부터 시작하도록 번호 매겨진다. 따라서, 단일 프롤린 캡핑 잔기는 P182로 표시된다. 보다 긴 캡이 가능하며, 상응하게 번호 매김된다 (예: X182, Y183, Z184, 여기서 X, Y 및 Z는 임의의 천연 또는 비-천연 발생 아미노산이다). 캡핑 잔기는 임의의 통상의 방식을 이용하여, 예를 들어 화학적으로 돌연변이 FGF21 폴리펩타이드에 첨가될 수 있으며, 아미노산은 화학 반응에 의해 폴리펩타이드의 C-말단에 공유적으로 결합된다. 달리는, 캡핑 잔기를 암호화하는 코돈이 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 암호화 서열에 첨가될 수 있다. 본원에 기술된 어떠한 돌연변이체 FGF21 폴리펩타이드도 필요한 경우 하나 이상의 잔기로 캡핑될 수 있다.
C-말단 돌연변이는 본 발명의 또 다른 측면을 형성한다. 본원에서 사용되는 용어 "C-말단 돌연변이"는 돌연변이체 FGF21 폴리펩타이드의 잔기 91-181의 영역 (또는 폴리펩타이드가 캡핑된느 경우 보다 긴 영역)에서의 하나 이상의 변화를 말한다. FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 서열에 도입된 C-말단 돌연변이는 비-천연 발생 중합체 부착 부위를 도입하는 하나 이상의 돌연변이에 추가될 것이다. 비록 C-말단 돌연변이가 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 서열의 91-181 영역의 임의의 포인트에서 도입될 수 있지만, C-말단 돌연변이를 위한 예시적 포인트는 위치 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180 및 181을 포함한다. C-말단 돌연변이는 표준 분자 생물학 기술, 예를 들어 본원에 기술된 기술을 이용하여 도입될 수 있다. 본원에 기술된 어떠한 돌연변이체 FGF21 폴리펩타이드도 C-말단 돌연변이를 포함할 수 있다.
캡핑 및/또는 C-말단 돌연변이를 위한 위치 및 실체에 대한 예가 표 3에 나타나 있다:
캡핑 위치 및/또는 C-말단 돌연변이의 예
E37C, R77C, P171G, P182
P171G, S181P, P182
P171G, S181P
P171G, S181T
P171G, S181G
P171G, S181A
P171G, S181L
P171G, A180P
P171G, A180G
P171G, A180S
P171G, Y179P
P171G, Y179G
P171G, Y179S
P171G, Y179A
P171G, L182
P171G, G182
P171G, P182
P171G, G182, G183
P171G, G182, G183, G184, G185, G186
캡핑 및/또는 C-말단 돌연변이된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 및 이들 돌연변이체의 화학적으로 변형된 형태의 활성은 다양한 방식, 예를 들어 실시예 10에 기술된 바와 같은 시험관내 ELK-루시페라제 검정을 이용하여 평가될 수 있다.
또한, 본 발명의 캡핑 및/또는 C-말단 돌연변이된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 및 화학적으로 변형된 캡핑 및/또는 C-말단 돌연변이된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드의 활성은 실시예 12에 나타난 바와 같이 생체내 검정으로 예를 들어 ob/ob 마우스에서 평가될 수 있다. 일반적으로, 이들 폴리펩타이드 중 하나 이상의 폴리펩타이드의 생체내 활성을 평가하기 위해서, 폴리펩타이드는 시험 동물에 복강내로 투여될 수 있다. 하나 이상의 목적하는 시간 후, 혈액 샘플을 취할 수 있으며, 혈당 수준이 측정될 수 있다.
본 발명의 모든 FGF21 돌연변이체와 마찬가지로, 캡핑 및/또는 C-말단 돌연변이된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 및 화학적으로 변형된 캡핑 및/또는 C-말단 돌연변이된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드도 임의로 아미노-말단 메티오닌 잔기를 포함할 수 있으며, 이는 직접적 돌연변이에 의하거나 세균 발현 공정에 의해 도입될 수 있다.
본 발명의 캡핑 및/또는 C-말단 돌연변이된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드는 실시예 7에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 표준 분자 생물학 기술과 익숙한 당업자는 본 발명의 캡핑 및/또는 C-말단 돌연변이된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 제조하고 이용하기 위해 본 기술과 함께 이러한 기술을 이용할 수 있다. 표준 기술이 재조합 DNA, 올리고뉴클레오타이드 합성, 조직 배양, 및 형질전환 (예: 전기천공, 리포펙션)에 대해 이용될 수 있다 (Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 모든 목적으로 본원에 참조로 삽입됨). 효소 반응 및 정제 기술이 당해 기술 분야에서 일반적으로 수행되는 바와 같이 또는 본원에 기술되는 바와 같이 제작자의 설명서에 따라 수행될 수 있다. 달리 특별히 정의되지 않는 한, 본원에 기술된 분석 화학, 합성 유기 화학 및 의학 및 약학 화학과 연관지어 이용된 명명법 및 이의 실험 절차 및 기술은 당해 기술 분야에 널리 공지되고 일반적으로 이용되는 것들이다. 표준 기술이 화학 합성; 화학 분석; 약제 제조, 제형화 및 전달; 및 환자 치료에 대해 이용될 수 있다.
캡핑 및/또는 C-말단 돌연변이된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 제조하기 위해서, 폴리펩타이드는 실시예 9에 기술된 바와 같이 중합체의 부착에 의해 화학적으로 변형될 수 있다.
5. 비-천연 발생 시스테인 잔기를 포함하는 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드
본 발명의 추가의 구체예에서, 야생형 FGF21 폴리펩타이드 서열의 시스테인 잔기 둘 모두가 디설파이드 결합을 형성하지 않고 중합체 부착 부위로서 사용되지 않는 잔기, 예를 들어 알라닌 또는 세린으로 대체된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드가 제조될 수 있다. 그 결과로서, 티올-함유 잔기 (예: 시스테인 잔기 또는 티올 그룹을 갖는 비-천연 발생 아미노산) 또는 유리 아미노 그룹 (예: 리신 또는 아르기닌 잔기 또는 유리 아미노 그룹을 갖는 비-천연 발생 아미노산) 형태로 비-천연 발생 중합체 부착 부위를 도입하는 치환이 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 서열에 만들어질 수 있다. 이어서, 부착을 위한 티올 또는 유리 아미노 그룹에 의존하는 중합체, 예를 들어 PEG가 공지된 위치에서 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 서열에 도입된 시스테인, 리신 또는 아르기닌에 표적될 수 있다. 이러한 방법은 보다 효율적이고 조절된 중합체 배치를 조장할 수 있다.
하나의 접근법으로, 위치 75 및 93에 위치되는 야생형 FGF21 폴리펩타이드 내의 2개의 자연 발생 시스테인 잔기가 비-티올 함유 잔기로 치환될 수 있다. 그 결과, 시스테인 잔기가 공지된 위치에 도입될 수 있다. 또한, FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드는 다른 돌연변이를 포함할 수 있으며, 이는 보다 많은 중합체 부착 부위 (예: 시스테인 잔기)를 도입하거나 일부 다른 목적하는 특성을 갖도록 디자인될 수 있다. 이러한 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드의 예는 C75A/E91C/C93A/H125C/P171G 및 C75S/E91C/C93S/H125C/P171G를 포함한다. 이들 예에서, 위치 75 및 93에서의 천연 발생 시스테인은 알라닌 또는 세린 잔기로 돌연변이되었으며, 중합체 부착 부위는 위치 91 및 125에 도입되고 (이 경우 티올-반응성 중합체, 예를 들어 PEG에 대한 부위), 위치 171에 추가의 돌연변이, 즉 프롤린 171의 글리신 잔기로의 치환이 만들어졌다.
본원에 기술된 모든 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드와 마찬가지로, 야생형 FGF21 폴리펩타이드 서열에서 발견되는 시스테인은 포함하지 않으나 대신 도입된 중합체 부착 부위 및 임의로 하나 이상의 추가의 돌연변이를 포함하는 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 및 이들 돌연변이체의 화학적으로 변형된 형태의 활성도 다양한 방식으로, 예를 들어 실시예 10에 기술된 바와 같이 시험관내 ELK-루시페라제 검정을 이용하여 평가될 수 있다. 이들 폴리펩타이드의 생체내 활성은 실시예 12에 기술되는 바와 같이 생체내 검정으로, 예를 들어 ob/ob 마우스를 사용하여 평가될 수 있다.
본 발명의 모든 FGF21 돌연변이체와 마찬가지로, 야생형 FGF21 폴리펩타이드 서열에서 발견되는 시스테인은 포함하지 않으나 대신 도입된 중합체 부착 부위 및 임의로 하나 이상의 추가의 돌연변이를 포함하는 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 및 이들 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드의 화학적으로 변형된 형태도 임의로 아미노-말단 메티오닌 잔기를 포함할 수 있으며, 이는 직접적 돌연변이에 의하거나 세균 발현 공정에 의해 도입될 수 있다.
본 발명의 야생형 FGF21 폴리펩타이드 서열에서 발견되는 시스테인은 포함하지 않으나 대신 도입된 중합체 부착 부위 및 임의로 하나 이상의 추가의 돌연변이를 포함하는 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드는 실시예 7에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 표준 분자 생물학 기술과 익숙한 당업자는 이러한 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 제조하고 이용하기 위해 본 기술과 함께 이러한 기술을 이용할 수 있다. 표준 기술이 재조합 DNA, 올리고뉴클레오타이드 합성, 조직 배양, 및 형질전환 (예: 전기천공, 리포펙션)에 대해 이용될 수 있다 (Sambrook et al ., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 모든 목적으로 본원에 참조로 삽입됨). 효소 반응 및 정제 기술이 당해 기술 분야에서 일반적으로 수행되는 바와 같이 또는 본원에 기술되는 바와 같이 제작자의 설명서에 따라 수행될 수 있다. 달리 특별히 정의되지 않는 한, 본원에 기술된 분석 화학, 합성 유기 화학 및 의학 및 약학 화학과 연관지어 이용된 명명법 및 이의 실험 절차 및 기술은 당해 기술 분야에 널리 공지되고 일반적으로 이용되는 것들이다. 표준 기술이 화학 합성; 화학 분석; 약제 제조, 제형화 및 전달; 및 환자 치료에 대해 이용될 수 있다.
야생형 FGF21 폴리펩타이드 서열에서 발견되는 시스테인은 포함하지 않으나 대신 도입된 중합체 부착 부위 및 임의로 하나 이상의 추가의 돌연변이를 포함하는 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 제조하기 위해서, 폴리펩타이드는 실시예 9에 기술된 바와 같이 중합체의 부착에 의해 화학적으로 변형될 수 있다.
6. "결박된 분자"
본 발명의 또 다른 측면으로, 본원에서 기술되는 바와 같은 "결박된 분자"가 제조될 수 있다. "결박된 분자"는 링커 분자에 의해 함께 묶인 2개의 FGF21 폴리펩타이드를 포함하는 분자이다. 2개의 FGF21 폴리펩타이드를 함께 연결함으로써, 결박된 분자의 효과적인 반감기 및 효능이 단일 FGF21 폴리펩타이드의 반감기 및 효능을 초과하게 연장될 수 있다.
본 발명의 결박된 분자는 링커 및 2개의 FGF21 폴리펩타이드를 포함하며, 이들은 어떠한 돌연변이도 도입되지 않는 2개의 천연 발생 FGF21 폴리펩타이드, FGF21 폴리펩타이드로 도입된 링커 부착 부위를 갖는 2개의 FGF21 돌연변이체 포리펩타이드, 또는 하나의 천연 발생 FGF21 폴리펩타이드 및 하나의 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드의 배합물일 수 있다. 또한, 비-천연 발생 링커 부착 부위 및 하나 이상의 추가의 돌연변이를 갖는 하나 이상의 FGF21 폴리펩타이드를 포함하는 결박된 분자가 고려되며, 본 발명의 또 다른 측면을 형성한다. 따라서, 이러한 결박된 분자는 링커 분자의 부착을 위한 부위를 형성하는 돌연변이 및 결박된 분자에 또 다른 바람직한 특성을 부여하기 위한 또 다른 돌연변이를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 "링커 부착 부위"는 링커가 결합되는 작용 그룹을 갖는 천연 또는 비-천연 발생 아미노산을 의미한다. 하나의 예에서, 링커 부착 부위는 티올 그룹을 포함하는 잔기이며, 이는 PEG 분자와 결합될 수 있다.
6.A. 결박 분자의 FGF21 폴리펩타이드
결박된 분자가 2개의 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 포함하는 경우, FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드는 서열에 도입된 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있으나, 돌연변이가 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 각각에서 동일한 아미노산 위치이어야 하는 것은 아니다. 예시로서, 결박된 분자가 2개의 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 포함하는 경우, 하나의 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드는 링커 분자를 위한 부착 부위를 형성하는 H125C 돌연변이를 포함할 수 있다. 이와는 대조적으로, 다른 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드는 2개의 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 함께 묶는 링커를 위한 부착 부위로서 사용될 수 있는 H125 이외의 부위에서 돌연변이를 포함할 수 있다. 하나 또는 2개의 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드가 사용되더라도, 링커가 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드의 N-말단 끝에서 부착될 수 있으며; 도입된 부착 부위가 반드시 사용되어야 하는 것은 아니다.
결박된 분자가 하나 또는 2개의 천연-발생 FGF21 폴리펩타이드를 포함하는 경우, 링커는 부착 화학에서 다루기 쉬운 FGF21 폴리펩타이드 내의 포인트에서 부착될 수 있다. 예를 들어, 천연 발생 디설파이드 결합이 환원되어 시스테인 잔기가 링커, 예를 들어 PEG를 위한 부착 포인트로서 사용될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 링커는 N-말단에서 또는 리신 측쇄에서 FGF21 폴리펩타이드에 부착될 수 있다.
결박된 분자의 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두가 절단된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 본원에 기술되는 바와 같이, 절단된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드는 N-말단, C-말단 또는 N-말단 및 C-말단 모두에서 임의의 수의 잔기를 제거함으로써 제조될 수 있다.
또한, 결박된 분자는 링커 부착 부위로서는 바람직하지 않으나 결박된 분자에 다소의 다른 바람직한 특성을 부여할 수 있는 돌연변이는 폴리펩타이드 서열에 포함하는 하나 또는 2개의 FGF21 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 따라서, 결박된 분자에 바람직한 특성을 부여하는 돌연변이가 도입된 하나 이상의 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 포함하는 결박된 분자가 본 발명의 추가의 측면을 형성한다.
결박된 분자의 활성은 다양한 방식, 예를 들어 실시예 10에 기술된 바와 같은 시험관내 ELK-루시페라제 검정을 이용하여 평가될 수 있다.
또한, 본 발명의 결박된 분자의 활성은 실시예 12에 나타난 바와 같이 생체내 검정으로 예를 들어 ob/ob 마우스에서 평가될 수 있다. 일반적으로, 이들 폴리펩타이드 중 하나 이상의 폴리펩타이드의 생체내 활성을 평가하기 위해서, 폴리펩타이드는 시험 동물에 복강내로 투여될 수 있다. 하나 이상의 목적하는 시간 후, 혈액 샘플을 취할 수 있으며, 혈당 수준이 측정될 수 있다.
본 발명의 모든 FGF21 돌연변이체와 마찬가지로, FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드, 야생형 FGF21 폴리펩타이드 또는 이 둘의 배합물일 수 있는 결박된 분자를 포함하는 FGF21 폴리펩타이드도 임의로 아미노-말단 메티오닌 잔기를 포함할 수 있으며, 이는 직접적 돌연변이에 의하거나 세균 발현 공정에 의해 도입될 수 있다.
표준 분자 생물학 기술과 익숙한 당업자는 본 발명의 결박된 분자를 제조하고 이용하기 위해 본 기술과 함께 이러한 기술을 이용할 수 있다. 표준 기술이 재조합 DNA, 올리고뉴클레오타이드 합성, 조직 배양, 및 형질전환 (예: 전기천공, 리포펙션)에 대해 이용될 수 있다 (Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 모든 목적으로 본원에 참조로 삽입됨). 효소 반응 및 정제 기술이 당해 기술 분야에서 일반적으로 수행되는 바와 같이 또는 본원에 기술되는 바와 같이 제작자의 설명서에 따라 수행될 수 있다. 링커를 FGF21 폴리펩타이드와 결합시키기 위한 공정은 링커의 특성에 의존할 것이며, 당업자에게 공지되어 있다. 링커 부착 화학의 예시가 본원에 기술되어 있다. 본 발명의 결박된 분자를 형성하는 방법에 대한 교시가 본원, 예를 들어 실시예 9에 제공된다.
달리 특별히 정의되지 않는 한, 본원에 기술된 분석 화학, 합성 유기 화학 및 의학 및 약학 화학과 연관지어 이용된 명명법 및 이의 실험 절차 및 기술은 당해 기술 분야에 널리 공지되고 일반적으로 이용되는 것들이다. 표준 기술이 화학 합성; 화학 분석; 약제 제조, 제형화 및 전달; 및 환자 치료에 대해 이용될 수 있다.
6.B. 결박된 분자의 링커
어떠한 링커도 2개의 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 함께 묶기 위해 결박된 분자에 사용될 수 있다. 링커 분자는 분지되거나 비분지될 수 있으며, 다양한 공지된 화학, 예를 들어 본원에 기술된 화학을 이용하여 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드에 부착될 수 있다. 링커는 주로 스페이서를 사용되기 때문에 링커의 화학 구조는 중요하지 않다. 링커는 독립적으로 결박된 분자 (예: 3개 이상의 FGF21 돌연변이체 또는 야생형 돌연변이체를 포함하는 결박된 분자)에 존재할 수 있는 임의의 다른 링커 또는 링커들과 동일하거나 상이할 수 있다. 하나의 구체예에서, 링커는 펩타이드 결합에 의해 함께 연결된 아미노산으로 구성될 수 있다. 이들 아미노산의 일부는 당업자가 잘 알고 있는 바와 같이 글리코실화될 수 있다. 예를 들어, 실릴화 부위를 구성하는 유용한 링커 서열은 X1X2NX4X5G (서열 번호 5)이며, 여기서 X1, X2, X4 및 X5는 각각 독립적으로 임의의 아미노산 잔기이다. 또 다른 구체예에서, 링커 분자는 임의 크기, 예를 들어 20kDa, 30 kDa 또는 40 kDa의 PEG 분자일 수 있다.
펩티딜 링커 (즉, 펩타이드 결합에 의해 함께 연결되는 아미노산으로 제조된 링커)가 존재하는 구체예에서, 이의 길이는 바람직하게는 1 내지 약 40개의 아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 1 내지 약 20개 아미노산 잔기, 가장 바람직하게는 1 내지 약 10개의 아미노산 잔기이다. 하나의 구체예에서, 링커의 아미노산 잔기는 임의의 20개의 표준 아미노산 중에서 선택된다. 또 다른 구체예에서, 링커의 아미노산 잔기는 시스테인, 글리신, 알라닌, 프롤린, 아스파라긴, 글루타민 및/또는 세린 중에서 선택된다. 또 다른 구체예에서, 펩티딜 링커는, 펩타이드 결합에 의해 연결된, 입체적으로 차단되지 않은 다수의 아미노산, 예를 들어 글리신, 세린 및 알라닌으로 제조된다. 존재하는 경우, 생체내 순환시 신속한 단백질분해 교체를 피하는 펩티딜 링커를 선택하는 것이 종종 바람직하다. 따라서, 바람직한 펩티딜 링커는 폴리글리신, 특히 (Gly)4 (서열 번호 6); (Gly)5 (서열 번호 7); 폴리(Gly-Ala); 및 폴리알라닌을 포함한다. 다른 바람직한 펩티딜 링커는 GGGGS (서열 번호 8); GGGGSGGGGS (서열 번호 9); GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (서열 번호 10) 및 본원에 제공되는 실시예에서 사용되는 임의의 링커를 포함한다. 그러나, 본원에서 사용되는 링커는 예시적인 것이며, 본 발명의 범위에 속하는 링커는 더욱 길 수 있고 다른 잔기를 포함할 수 있다.
펩타이드 링커 잔기를 포함하는 결박된 분자의 구체예에서, 산성 잔기, 예를 들어 글루타메이트 또는 아스파테이트 잔기가 링커 잔기의 아미노산 서열에 위치된다. 하기의 펩타이드 링커 서열을 예시로 포함한다:
GGEGGG (서열 번호 11);
GGEEEGGG (서열 번호 12);
GEEEG (서열 번호 13);
GEEE (서열 번호 14);
GGDGGG (서열 번호 15);
GGDDDGG (서열 번호 16);
GDDDG (서열 번호 17);
GDDD (서열 번호 18);
GGGGSDDSDEGSDGEDGGGGS (서열 번호 19);
WEWEW (서열 번호 20);
FEFEF (서열 번호 21);
EEEWWW (서열 번호 22);
EEEFFF (서열 번호 23);
WWEEEWW (서열 번호 24); 또는
FFEEEFF (서열 번호 25).
다른 구체예에서, 펩티딜 링커, 예를 들어 X1X2YX3X4G (서열 번호 26) (여기서, X1, X2,X3 및 X4는 각각 독립적으로 임의의 아미노산 잔기이다); X1X2SX3X4G (서열 번호 27) (여기서, X1, X2,X3 및 X4는 각각 독립적으로 임의의 아미노산 잔기이다; 또는 X1X2TX3X4G (서열 번호 28) (여기서, X1, X2,X3 및 X4는 각각 독립적으로 임의의 아미노산 잔기이다)는 는 포스포릴화 부위를 구성한다.
또한, 비-펩타이드 링커가 결박된 분자에 사용될 수 있다. 예를 들어, 알릴 링커, 예를 들어 -NH-(CH2)s-C(O)- (여기서, s는 2 내지 20이다)가 사용될 수 있다. 이들 알릴 링커는 임의의 비-입체적으로 방해된 그룹, 예를 들어 저급 알킬 (예: C1-C6), 저급 아실, 할로겐 (예: Cl, Br), CN, NH2, 페닐 등으로 추가로 치환될 수 있다.
어떠한 적합한 링커도 결박된 분자를 형성하기 위해 본 발명에 사용될 수 있다. 하나의 예에서, 본원에 기술된 결박된 분자를 생성하기 위해 사용되는 링커는 하기 화학식을 갖는 호모이작용성 비스-말레이미드 PEG 분자이다:
X-(CH2CH2O)nCH2CH2-X
상기 식에서, X는 말레이미드 그룹이다. 다른 구체예에서, X는 오르토피리딜-디설파이드, 요오도아세트아미드, 비닐설폰 또는 티올 그룹에 특이적인 것으로 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 다른 반응성 잔기일 수 있다. 또 다른 구체예에서, X는 N-말단 또는 조작된 리실 그룹을 통해 2개의 돌연변이체 폴리펩타이드를 묶는데 사용되는 아미노 특이적 반응성 잔기일 수 있다 (Pasut and Veronese, 2006, "PEGylation of Proteinsas Tailored Chemistry for Optimized Bioconjugates," Adv. Polym . Sci . 192:95-134).
또 다른 구체예에서, 링커는 하기 화학식을 가질 수 있다:
X-(CH2CH2O)nCH2CH2-Y
상기 식에서, × 및 Y는 상기 그룹 중에서 선택되는 상이한 반응성 잔기이다. 이러한 링커는 결박된 헤테로이량체 또는 헤테로-올리고머를 생성하도록 상이한 돌연변이체 폴리펩타이드의 컨주게이션을 가능하게 한다.
추가의 구체예에서, 링커는 분자량이 1 내지 100 kDa, 바람직하게는 10 내지 50 kDa (예: 10, 20, 30 또는 40 kDa), 더욱 바람직하게는 20 kDa일 수 있는 PEG 분자일 수 있다. 펩타이드 링커는 상술된 바와 동일한 방식으로 유도체를 형성하도록 변형될 수 있다.
유용한 링커에 대한 다른 예는, 국제 공보 제WO 2006/042151호 (본원에 전부 참조로 삽입됨)에 개시된, 아미노에틸옥시에틸옥시-아세틸 링커를 포함한다.
본 발명의 결박된 분자를 형성 시, 야생형 또는 돌연변이체 FGF21 분자와 결합하기 위해 표준 화학이 이용될 수 있다. 결합의 정확한 방법은 부착 부위 (예: 아미노산 측쇄) 및 링커의 특성에 따를 것이다. 링커가 PEG 분자인 경우, 부착은 표준 화학 및 유리 설피드릴 또는 아민 그룹, 예를 들어 (돌연변이에 의해 FGF21 폴리펩타이드 서열에 도입될 수 있거나 자연 발생적일 수 있는) 시스테인 잔기 또는 (돌연변이에 의해 FGF21 폴리펩타이드 서열에 도입될 수 있거나 자연 발생적일 수 있는) 리신에서 발견되는 그룹 또는 N-말단 아미노 그룹을 이용하여 달성될 수 있다.
7. FGF21 돌연변이체의 화학적 변형
본 발명의 하나의 측면에서, FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드는 화학적으로 변형된다. 용어 "화학적으로 변형된"은 폴리펩타이드의 하나 이상의 부위에서 중합체의 첨가에 의해 변형된 폴리펩타이드 (예: FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드)를 말한다. FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드의 화학적으로 변형된 형태의 예는 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드의 페길화되고 글리코실화된 형태를 포함한다.
본 발명의 화학적으로 변형된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드는 수용성 중합체, 예를 들어 PEG를 포함하여 임의의 유형의 중합체를 포함할 수 있다. 각각의 예시적 중합체는 임의의 분자량일 수 있으며, 분지되거나 비분지될 수 있다. 각각의 중합체는 통상적으로 약 2 kDa 내지 약 100 kDa의 평균 분자량을 갖는다 (용어 "약"은 수용성 중합체의 제조시 일부 분자가 기술된 분자량보다 크거나 다소 작을 수 있다는 것을 나타낸다). 각각의 중합체의 평균 분자량은 약 5 kDa 내지 약 50 kDa, 더욱 바람직하게는 약 10 kDa 내지 약 40 kDa, 가장 바람직하게는 약 10 kDa 내지 약 20 kDa이다.
적합한 수용성 중합체 또는 이의 혼합물은, 이로 제한됨이 없이, 탄수화물, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) (단백질을 유도체화하기 위해 사용된 PEG의 형태를 포함, 모노-(C1-C10), 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜을 포함), 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜, 덱스트란 (예를 들어 약 6 kD의 저분자량 덱스트란), 셀룰로즈, 또는 다른 탄수화물 기본 중합체, 폴리-(N-비닐 피롤리돈) 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올 (예: 글리세롤), 및 폴리비닐 알콜을 포함한다. 또한, 본 발명에는 공유적으로 부착된 FGF21 폴리펩타이드 돌연변이체 다량체를 제조하기 위해 사용될 수 있는 이작용성 가교결합 분자가 포함된다. 또한, 본 발명에는 폴리실릴산에 공유적으로 결합된 FGF21 돌연변이체가 포함된다.
본 발명의 일부 구체예에서, FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드는 하나 이상의 중합체, 예를 들어, 이로 제한됨이 없이, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리옥시에틸렌 글리콜 또는 폴리프로필렌 글리콜을 포함하도록 공유적으로 변형된다 (U.S. 특허 제4,640,835호; 제4,496,689호; 제4,301,144호; 제4,670,417호; 제4,791,192호; 및 제4,179,337호). 본 발명의 일부 구체예에서, FGF21 돌연변이체는 하나 이상의 중합체, 예를 들어, 이로 제한됨이 없이, 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜, 덱스트란, 셀룰로즈, 또 다른 탄수화물 기본 중합체, 폴리-(N-비닐 피롤리돈)-폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올 (예: 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 또는 이러한 중합체의 혼합물을 포함한다.
본 발명의 다른 구체예에서, 펩타이드 또는 단백질은 FGF21에 유리한 특성(예: 효능, 안정성, 선택성)을 부여하기 위해서 상기 조작된 잔기를 통해 부위 지시된 방식으로 FGF21에 컨주게이션될 수 있다. 따라서, 본 발명은 도입된 중합체 부착 부위에 헤테로단백질 또는 헤테로펩타이드에 컨주게이션된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 포함한다. 적합한 단백질의 예는 FGF21에 결합하지 않는 HSA 및 항체를 포함한다.
7.A. 페길화된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드
본 발명의 일부 구체예에서, FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드는 PEG 서브유닛으로 공유적으로 변형된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 수용성 중합체는 FGF21 돌연변이체의 하나 이상의 특정 위치 (예: N-말단)에서 결합된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 수용성 중합체는 FGF21 돌연변이체의 하나 이상의 측쇄에 부착된다; 이들 측쇄는 천연 발생적일 수 있거나 조작된 중합체 부착 부위의 성분을 형성할 수 있다. 일부 구체예에서, PEG는 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드의 치료 능력을 개선하는데 사용된다. 특정한 이러한 방법은, 예를 들어 미국 특허 6,133,426 (모든 목적을 위해 참조로 본원에 삽입된다)에 기술되어 있다.
중합체가 PEG인 본 발명의 구체예에서, PEG 그룹은 임의의 적당한 분자량을 가질 수 있으며 선형이거나 분지될 수 있다. PEG 그룹의 평균 분자량은 바람직하게는 약 2 kD 내지 약 100 kDa, 더욱 바람직하게는 약 5 kDa 내지 약 50 kDa, 예를 들어 0, 20, 30, 40, 또는 50 kDa의 범위일 수 있다. PEG 그룹은 일반적으로 FGF21 돌연변이체 상의 반응성 그룹 (예: 아미노 또는 티올 그룹)에 PEG 잔기 상의 반응성 그룹 (예: 알데하이드, NHS, 또는 말레이미드, 비닐설폰, 알킬할라이드)을 통해 아실화 또는 환원적 알킬화로 FGF21 돌연변이체에 부착될 것이다.
FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드에 부착된 중합체(들)이 PEG인 경우, 본 발명의 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드의 페길화는 당해 기술 분야에 공지된 임의의 페길화 반응을 이용하여 특정적으로 수행될 수 있다. 이러한 반응은, 예를 들어 문헌 (Zalipsky, 1995, Functionalized Poly( ethylene glycol) for Preparation of Biologically Relevant Conjugates , Bioconjugate Chemistry 6:150-165; Francis et al ., 1992, Focus on Growth Factors 3: 4-10; 유럽 특허 제0 154 316호 및 제0 401 384호; 및 U.S. 특허 제4,179,337호)에 기술되어 있다. 예를 들어, 표적 잔기가 리신 (즉, 반응성 아민 그룹을 갖는 잔기)인 경우, 페길화는 본원에 기술되는 바와 같이 아미노-반응성 폴리에틸렌 글리콜 분자 (또는 유사한 반응성 수용성 중합체)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응을 통해 수행될 수 있다. 아실화 반응을 위해, 선택된 중합체는 단일 반응성 에스테르 그룹을 가질 수 있다. 환원적 알킬화를 위해, 선택된 중합체는 단이 반응성 알데하이드 그룹을 가질 수 있다. 반응성 알데하이드는, 예를 들어 수용성인 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데하이드, 또는 이의 모노 C1-C10 알콕시 또는 아릴옥시 유도체이다 (U.S. 특허 제5,252,714호 참조). 또한, 상이한 아미노 특이적 잔기로 활성화된 다양한 반응성 PEG 중합체가 당업자에게 공지되어 있으며, 또한 상황에 따라 사용될 수 있다.
또 다른 예시에서, 표적 잔기가 시스테인 잔기 (즉, 반응성 설피드릴 그룹을 갖는 잔기)인 경우, 페길화는 표준 말레이미드 화학을 통해 수행될 수 있다. 이러한 반응을 위해, 선택된 중합체는 하나 이상의 반응성 말레이미드 그룹 또는 다른 티올 반응성 잔기, 예를 들어 비닐설폰, 오르토피리딜-디설파이드 또는 요오도아세트아미드를 포함할 수 있다 (Pasut ＆ Veronese, 2006, "pEGylation of Proteins as Tailored Chemistry for Optimized Bioconjugates", Adv . Polym . Sci . 192:95-134; Zalipsky, 1995, "Functionalized Poly(ethylene glycol) for Preparation of Biologically Relevant Conjugates", Bioconjugate Chemistry 6:150-165, and Hermanson, Bioconjugate Techniques ", 2 nd Ed ., Academic Press , 2008, 이들 각각이 참조로 본원에 삽입됨).
본 발명의 일부 구체예에서, PEG 그룹의 FGF21 돌연변이체에의 부착을 위한 유용한 방법은 용액 상에서의 컨주게이트 결합 형성을 통해 F21 돌연변이체 및 PEG 잔기 (각각 서로 다른 것에 대해 반응성인 특정 작용기를 갖는다)를 조합하는 것을 포함하는 것이다. FGF21 돌연변이체는 특정 위치에서 적합한 작용기로 "예비활성화"된다. 전구체는 PEG 잔기와 반응 전에 정제 및 충분히 특징분석된다. FGF21 돌연변이체의 PEG와의 연결은 종종 수상에서 발생하며, SED-PAGE 또는 역상 분석 HPLC에 의해 쉽게 모니터링될 수 있다. 상세한 분석은 LC-MS 기초 펩타이드 맵핑에 의해 수행될 수 있다.
7.B. 폴리사카라이드 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드
폴리사카라이드 중합체는 단백질 변형을 위해 사용될 수 있는 또 다른 유형의 수용성 중합체이다. 따라서, 본 발명의 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드는 폴리사카라이드 중합체에 부착될 수 있으며 이는 본 발명의 구체예를 형성한다. 따라서, FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드에서 조작된 비-천연 발생 중합체 부착 부위는 폴리사카라이드가 부착된느 잔기를 포함할 수 있다. 덱스트란은 주로 알파 1-6 연결에 의해 연결된 글루코즈의 개별적 서브유닛으로 구성된 폴리사카라이드 중합체이다. 덱스트란 자체는 많은 분자량 범위에서 이용가능하며, 약 1 kD 내지 약 70 kD의 분자량이 이용가능하다. 덱스트란은 비이클 자체로서 또는 또 다른 비히클 (예: Fc)과 병용하여 사용하기 위한 적합한 수용성 중합체이다 (국제 공보 제WO 96/11953호 참조). 치료 또는 진단 면역글로불린에 컨주게이션된 덱스트란의 사용이 보고되었다 (유럽 특허 공보 0 315 456, 참조로 본원에 삽입됨). 또한, 본 발명은 약 1 kDa 내지 약 20 kDa의 덱스트란 사용을 포함한다.
7.C. FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드의 화학적 변형 방법
일반적으로, 화학적 변형 (예: 페길화 또는 글리코실화)는 단백질을 활성화된 중합체 분자와 반응시키기 위해 이용되는 임의의 적합한 조건 하에서 수행될 수 있다. 화학적으로 변형된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 제조하는 방법은 일반적으로 (a) 폴리펩타이드를 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드가 하나 이상의 중합체 분자에 부착되는 조건 하에서 활성화된 중합체 분자 (예: 중합체 분자의 반응성 에스테르, 말레이미드 또는 알데하이드 유도체)와 반응시키는 단계; 및 (b) 반응 생성물을 수득하는 단계를 포함한다. 최적 반응 조건은 공지된 변수 및 목적하는 결과에 기초하여 결정될 것이다. 예를 들어, 중합체 분자 대 단백질의 비율이 더욱 클수록, 부착된 중합체 분자의 비율이 더욱 크다. 본 발명의 하나의 구체예에서, 화학적으로 변형된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드는 아미노-말단에 단일 중합체 분자를 가질 수 있고, 다른 구체예에서 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드는 일차 서열과 결합된 2개 이상의 중합체, 예를 들어 폴리펩타이드의 N-말단에서 하나의 중합체 및 폴리펩타이드의 또 다른 잔기에서 제2의 중합체를 가질 수 있다. 달리, FGF21 돌연변이체는 일차 서열에서 (단, N-말단에서는 아님) 2개의 상이한 잔기에 결합된 2개 이상의 중합체를 가질 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 화학적으로 변형된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드의 투여에 의해 완화되거나 조절될 수 있는 상태는 천연 FGF21 폴리펩타이드에 대해 본원에 기술된 것들을 포함한다. 그러나, 본원에 기술된 화학적으로 변형된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드는 야생형 FGF21 및 FGF21 돌연변이체와 비교하여 추가의 활성, 예를 들어 증가된 반감기를 가질 수 있다.
8. FGF21 돌연변이체의 치료 조성물 및 이의 투여
FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 포함하는 치료 조성물이 본 발명의 범위에 속하며, 향상된 특성을 나타내는 결박된 분자, FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 및 화학적으로 변형된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드의 확인에 비추어 구체적으로 고려된다. 이러한 결박된 분자, FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 및 화학적으로 변형된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드는 치료학적 유효량의 결박된 분자, FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 및 화학적으로 변형된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 (이는 화학적으로 변형될 수 있다)를 투여 방식과의 적합성을 위해 선택된 약제학적으로나 생리학적으로 허용가능한 제형화제와의 혼합물로서 포함할 수 있다.
적합한 제형화 물질은 바람직하게는 사용되는 용량 및 농도에서 수령자에게 무독하다.
약제학적 조성물은, 예를 들어 조성물의 pH, 삼투성, 점도, 투명도, 색상, 등장성, 냄새, 멸균성, 안정성, 용해 또는 방출 속도, 흡수, 또는 투과를 변형, 유지 또는 보존하기 위한 제형화물질을 포함할 수 있다. 적합한 제형화 물질은, 이로 제한됨이 없이, 아미노산 (예: 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신), 항미생물제, 항산화제 (예: 아스코르브산, 황산나트륨 또는 아황산수소나트륨), 완충제 (예: 보레이트, 비카보네이트, Tris-HCl, 시트레이트, 포스페이트 또는 기타 유기산), 벌크화제 (예: 만니톨 또는 글리신), 킬레이트화제 (예: 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA)), 컴플렉스화제 (예: 카페인, 폴리비닐피롤리돈, 베타-사이클로덱스트린 또는 하이드록시프로필-베타-사이클로덱스트린), 충전제, 모노사카라이드, 디사카라이드 및 기타 탄수화물 (예: 글루코즈, 만노오스 또는 덱스트린), 단백질 (예: 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린), 착색제, 향미제, 희석제, 유화제, 친수성 중합체 (예: 폴리비닐피롤리돈), 저분자량 폴리펩타이드, 염-형성 카운터이온 (예: 나트륨), 보존제 (예: 벤즈알코늄 클로라이드, 벤조산, 살리실산, 티메로살, 펜에틸 알콜, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르헥시딘, 소르브산 또는 과산화수소), 용매 (예: 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜), 슈가 알콜 (예: 만니톨 또는 소르비톨), 현탁화제, 습윤제 (예: 플루로닉스; PEG; 소르비탄 에스테르; 폴리소르베이트, 예를 들어 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80; 트리톤; 트로메타민; 레시틴; 콜레스테롤 또는 틸록사팔), 안정성 증진제 (예: 슈크로즈 또는 소르비톨), 긴장성 증진제 (예: 알칼리 금속 할라이드 - 바람직하게는 염화칼슘 또는 염화칼륨 - 또는 만니톨 소르비톨), 전달 비히클, 희석제, 부형제 및/또는 약제학적 아주반트를 포함한다 (Remington's Pharmaceutical Sciences (18th Ed., A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company 1990), 및 이의 후속판, 모든 목적을 위해 본원에 참조로 삽입됨).
최적의 약제학적 조성물은 의도된 투여 경로, 전달 포맷 및 바람직한 용량에 따라 당업자에 의해 결정될 것이다 (Remington's Pharmaceutical Science 참조). 이러한 조성물은 결박된 분자, FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 (이는 절단되거나 캡핑되거나 C-말단 돌연변이될 수 있다) 또는 화학적으로 변형된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드의 물리적 상태, 안정성, 생체내 방출 속도 및 생체내 제거 속도에 영향을 끼칠 수 있다.
약제학적 조성물 중의 주요 비히클 또는 담체는 현실적으로 수성 또는 비-수성일 수 있다. 예를 들어, 주사에 적합한 비히클 또는 담체는, 가능하게는 비경구 투여를 위한 조성물에서 통상적인 다른 물질로 보충되는, 물, 생리 식염 용액 또는 인공 뇌척수액일 수 있다. 중성 완충 식염수 또는 혈청 알부민과 혼합된 식염수가 추가의 예시적 비히클이다. 다른 예시적 약제학적 조성물은 약 pH 7.0 내지 8.5의 Tris 완충액, 또는 약 pH 4.0 내지 5.5의 아세테이트 완충액 (이는 소르비톨 또는 적합한 대체물를 추가로 포함할 수 있다)을 포함한다. 본 발명의 하나의 구체예에서, 결박된 분자, FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 및 화학적으로 변형된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 조성물은 저장을 위해 목적하는 순도를 갖는 선택된 조성물을 임의의 제형화제 (Remington's Pharmaceutical Sciences 참조)와 함께 혼합하여 냉동건조된 케이크 또는 수용액의 형태로 제조될 수 있다. 또한, 결박된 분자, FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 및 화학적으로 변형된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 생성물은 적합한 부형제, 예를 들어 슈크로즈를 사용하여 냉동건조물로서 제형화될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 비경구 전달을 위해 선택될 수 있다. 달리, 조성물은 흡입을 위해 또는 소화관을 통한 전달, 예를 들어 경구 전달을 위해 선택될 수 있다. 이러한 약제학적으로 허용되는 조성물의 제제는 당해 기술 분야에 속한다.
제형 성분은 투여 부위에 허용되는 농도로 존재한다. 예를 들어, 완충제를 사용하여 조성물을 생리학적 pH 또는 약간 낮은 pH, 전형적으로 약 5 내지 약 8의 pH 범위를 유지하는데 사용한다.
비경구 투여가 의도되는 경우, 본 발명에서의 사용을 위한 치료 조성물은 약제학적으로 허용되는 비히클 중에 목적하는 결박된 분자, FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 또는 화학적으로 변형된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 포함하는 발열물-비함유의 비경구적으로 허용되는 수용액의 형태일 수 있다. 비경구 주입을 위한 특히 적합한 비히클은 결박된 분자, FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 또는 화학적으로 변형된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드가 적합하게 보존되는 멸균된 등장 용액으로 제형화되는 멸균 증류수이다. 또 다른 제제는 작용제를 갖는 목적하는 분자의 제형, 예를 들어 주사가능한 미소구, 생-분해성 입자, 중합체성 분자 (예: 폴리락트산 또는 폴리글리콜산), 비드 또는 리포좀을 포함하며, 이는 데포 (depot) 주사를 통해 전달될 수 있는 제품의 조절 또는 지연 방출을 제공한다. 또한, 히알우론산을 사용할 수 있으며, 이는 순환 동안 지연을 증진시키는 효과를 가질 수 있다. 목적하는 분자의 도입을 위한 기타 적합한 수단은 이식가능한 약물 전달 디바이스를 포함한다.
하나의 구체예에서, 약제학적 조성물은 흡입을 위해 제형화될 수 있다. 예를 들어 결박된 분자, FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 또는 화학적으로 변형된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드는 흡입을 위한 건조 분말로서 제형화될 수 있다. 또한, 이러한 흡입 용액은 에어로졸 전달을 위한 추진제와 함께 제형화될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 용액은 분무될 수있다. 폐 투여가 화학적으로 변형된 단백질의 폐 전달을 기술하는 국제 공보 제WO 94/20069호에 더욱 기술되어 있다.
또한, 특정 제형은 경구로 투여될 수 있는 것으로 고려된다. 본 발명의 하나의 구체예에서, 이러한 방식으로 투여되는 결박된 분자, FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 (이는 절단되거나 캡핑되거나 C-말단 돌연변이될 수 있다) 또는 화학적으로 변형된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드는 고체 투여 형태, 예를 들어 정제 및 캡슐을 제조하는데 통상적으로 사용되는 담체의 존재 또는 부재 하에 제형화될 수 있다. 예를 들어, 생물이용성이 최대화되고 예비-시스템적 분해를 최소화하는 경우, 캡슐은 위장관의 지점에서 제형의 활성부를 방출하도록 디자인될 수 있다. 추가의 작용제가 결박된 분자, FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 (이는 절단되거나 캡핑되거나 C-말단 돌연변이될 수 있다) 또는 화학적으로 변형된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드의 흡수를 촉진하기 위해 포함될 수 있다. 또한, 희석제, 향미제, 저융점 왁스, 식물성유, 윤활제, 현탁제, 정제 붕해제 및 결합제가 사용될 수 있다.
또 다른 약제학적 조성물은 정제 제조에 적합한 무독성 부형제와 혼합한 치료학적 유효량의 결박된 분자, FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 (이는 절단되거나 캡핑되거나 C-말단 돌연변이될 수 있다) 또는 화학적으로 변형된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 정제를 멸균수 또는 다른 적합한 비히클에 용해시킴으로써 용액은 단위-용량 형태로 제조될 수 있다. 적합한 부형제는, 이로 제한됨이 없이, 불활성 희석제, 예를 들어 탄산칼슘, 탄산 또는 중탄산나트륨, 락토즈 또는 인산칼슘; 또는 결합제, 예를 들어 전분, 젤라틴 또는 아카시아; 또는 윤활제, 예를 들어 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 또는 활석을 포함한다.
결박된 분자, FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 또는 화학적으로 변형된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 지연- 또는 조절-전달 제형으로 수반하는 제형을 포함한 추가의 결박된 분자, FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 또는 화학적으로 변형된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 약제학적 조성물이 당업자에게 자명할 것이다. 또한, 다양한 기타의 지연- 또는 조절-전달 수단, 예를 들어 리포좀 캐리어, 생-분해성 미세입자 또는 다공성 비드 및 데포 (depot) 주입물을 제형화하기 위한 기술이 당업자에게 알려져 있다 (예를 들어, 국제 공보 제WO 93/15722호는 약제학적 조성물의 전달을 위한 다공성의 중합체 미세입자의 조절 방출을 기술한다).
서방성 제제에 대한 추가의 예는 필름 또는 미세캡슐과 같은 성형 제품 형태의 반투과성 중합체 매트릭스를 포함한다. 지연 방출 매트릭스는 폴리에스테르, 하이드로겔, 폴리락티드 (U.S. 특허 제3,773,919호 및 유럽 특허 제0 058 481호), L-글루탐산 및 감마 에틸-L-글루타메이트의 공중합체 (Sidman et al., 1983, Biopolymers 22: 547-56), 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트) (Langer et al., 1981, J. Biomed . Mater . Res. 15: 167-277 and Langer, 1982, Chem . Tech. 12: 98-105), 에틸렌 비닐 아세테이트 (Langer et al ., 상기 참조) 또는 폴리-D(-)-3-하이드록시부티르산 (유럽 특허 제0 133 988호)를 포함할 수 있다. 또한, 서방성 조성물은 당해 기술 분야에 공지된 임의의 수개의 방법에 의해 제조될 수 있는 리포좀을 포함할 수 있다 (Epstein et al ., 1985, Proc . Natl . Acad. Sci. U.S.A. 82: 3688-92; 및 유럽 특허 제0 036 676호, 제0 088 046호, 및 제0 143 949호).
생체내 투여를 위해 사용될 결박된 분자, FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 또는 화학적으로 변형된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 약제학적 조성물은 전형적으로 멸균되어야 한다. 이는 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 달성될 수 있다. 조성물이 냉동건조되는 경우, 이러한 방법을 이용하는 멸균은 냉동건조 및 재구성 전 또는 후에 수행될 수 있다. 비경구 투여를 위한 조성물은 냉동건조 형태 또는 용액으로 저장될 수 있다. 추가로, 비경구 조성물은 일반적으로 멸균 진입 포트를 갖는 용기, 예를 들어 정맥내 용액 백 또는 피하 주사 바늘에 의해 찌를 수 있는 스토퍼를 갖는 바이알에 놓인다.
일단 약제학적 조성물이 제형화되면, 이는 용액, 현탁액, 겔, 에멀젼, 고체 또는 탈수 또는 냉동건조된 분말로서 멸균 바이알에 저장될 수 있다. 이러한 제형은 즉시 사용 형태 또는 투여 전 재구성을 요하는 형태 (예: 냉동건조물)로 저장될 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명은 단일-용량 투여 유닛을 생성하기 위한 키트에 관한 것이다. 키트는 건조 단백질을 갖는 제1 용기 및 수성 제형물을 갖는 제2 용기 모두를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 범위에는 단일 및 다수-챔버의 예비-충전된 주사기 (예: 액체 주사기 및 냉동건조주사기 (lyosyringe))를 포함하는 키트가 포함된다.
치료적으로 사용될 결박된 분자, FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 (이는 절단되거나, 캡핑되거나, C-말단 돌연변이될 수 있다) 또는 화학적으로 변형된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 약제학적 조성물의 치료학적 유효량은, 예를 들어 치료 내용 및 목적에 따를 것이다. 당업자는 치료에 적합한 용량이 부분적으로 전달되는 분자, 결박된 분자, FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 또는 화학적으로 변형된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드가 사용되는 증상, 투여 경로 및 환자의 크기 (체중, 체표면적 또는 기관 크기) 및 상태에 따를 것이다. 따라서, 임상의는 최적 치료 효과를 얻기 위해 용량을 적정하고 투여 경로를 조절할 수 있다. 전형적인 용량은 상술된 인자에 따라 약 0.1 mg/kg 내지 약 100 mg/kg 이상의 범위일 수 있다. 다른 구체예에서, 용량은 0.01 mg/kg 내지 약 10 mg/kg의 범위, 예를 들어 0.05 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.2 mg/kg, 0.3 mg/kg, 0.4 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.6 mg/kg, 0.7 mg/kg, 0.8 mg/kg, 0.9 mg/kg, 1.0 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg 또는 10 mg/kg일 수 있다.
투여 횟수는 제형물 중의 결박된 분자, FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 또는 화학적으로 변형된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드의 약동학적 변수에 의존할 것이다. 통상적으로, 임상의는 목적하는 효과가 달성되는 용량에 도달할 때까지 조성물을 투여할 것이다. 따라서, 조성물은 단일 용량으로, 시간에 걸쳐 2회 이상의 용량 (이는 동일량의 목적하는 분자를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다)으로, 또는 이식 디바이스 또는 카테터를 통한 연속 주입으로 투여될 수 있다. 적합한 용량의 추가의 정제는 당업자에 의해 통상적으로 이루어지며, 이들에 의해 통상적으로 수행되는 일의 범위에 속한다. 적합한 용량은 적합한 용량-반응 자료를 이용하여 확인될 수 있다.
약제학적 조성물의 투여 경로는 공지된 방법, 예를 들어 경구로; 정맥내, 복강내, 뇌내 (실질내), 뇌실내, 근육내, 안내, 동맥내, 문맥내 또는 병소내 경로를 통해; 지연된 방출 시스템에 의해; 또는 이식 디바이스에 의한다. 필요한 경우, 조성물은 볼루스 주사에 의하거나 연속적으로 주입에 의하거나 이식 디바이스에 의해 투여될 수 있다.
달리 또는 추가로, 조성무른 목적하는 분자가 흡수되거나 캡슐화된 막, 스폰지 또는 기타 적합한 물질의 이식을 통해 국소적으로 투여될 수 있다. 이식 디바이스가 사용되는 경우, 디바이스는 임의의 적합한 조직 또는 기관으로 이식될 수 있으며, 목적하는 분자의 전달은 확산, 시간-방출 볼루스 또는 연속 투여를 통할 수 있다.
10. FGF21 폴리펩타이드 돌연변이체의 치료적 이용
본 발명의 결박된 분자, FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 (이는 절단되거나 캡핑되거나 C-말단 돌연변이될 수 있다) 및 화학적으로 변형된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드는, 이로 제한됨이 없이, 대사성 장애를 포함하여 다수의 질환, 장애 또는 상태를 치료, 진단, 완화 또는 예방하는데 사용될 수 있다. 하나의 구체예에서, 치료될 대사성 장애는 당뇨병이다. 또 다른 구체예에서, 대사성 장애는 비만이다. 다른 구체예는 이상지질혈증; 고혈압; 간지방증, 예를 들어 비-알콜성 지방간염 (NASH); 심혈관 질환, 예를 들어 죽상동맥경화증; 및 노화와 같은 대사성 상태 또는 장애를 포함한다.
적용시, 당뇨병 또는 비만과 같은 장애 또는 상태는 이의 치료가 필요한 환자에게 본원에서 기술되는 바와 같은 결박된 분자, FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 또는 화학적으로 변형된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 치료학적 유효량으로 투여함으로써 치료될 수 있다. 투여는 본원에 기술된 바와 같이, 예를 들어 IV 주사, 복강내 주사, 근육내 주사, 또는 정제 또는 액체 형태로 경구로 수행될 수 있다. 대부분의 상황에서, 바람직한 용량은 본원에 기술되는 바와 같이 임상의에 의해 결정될 수 있으며, 치료학적 유효량의 결박된 분자, FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 또는 화학적으로 변형된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 나타낼 수 있다. 치료학적 유효량의 결박된 분자, FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 또는 화학적으로 변형된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드가, 특히 투여 스케쥴, 투여되는 항원의 단위 용량, 핵산 분자 또는 폴리펩타이드가 다른 치료제와 병용 투여되는지의 여부, 면역 상태 및 수령자의 건강에 따를 것이라는 것이 당업자에게 자명할 것이다. 본원에서 사용되는 용어 "치료학적 유효량"은, 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 경감을 포함하는, 연구자, 의사 또는 임상의에 의해 고려되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 결박된 분자, FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 또는 화학적으로 변형된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드의 양을 의미한다.
11. 항체
본 발명의 결박된 분자, FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 및 화학적으로 변형된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드에는 특이적으로 결합하나 야생형 FGF21 폴리펩타이드에는 특이적으로 결합하지 않는 항체 및 항체 단편이 고려되며 본 발명의 범위에 속한다. 항체는 일특이적 폴리클로날을 포함한 폴리클로날; 모노클로날 (Mab); 재조합; 키메릭; 인간화, 예를 들어 상보성-결정 영역 (CDR)-그래프트; 인간; 단쇄; 및/또는 이특이적 항체; 및 이들의 단편; 변이체; 또는 화학적 변형 분자일 수 있다. 항체 단편은 FGF21 돌연변이체 항체 상의 에프토프에 특이적으로 결합하는항체의 부분을 포함한다. 이러한 단편의 예는 전장 항체의 효소적 절단에 의해 생성된 Fab 및 F(ab') 단편을 포함한다. 다른 결합 단편은 재조합 DNA 기술, 예를 들어 항체 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 플라스미드의 발현에 의해 생성되는 것들을 포함한다.
결박된 분자, FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 또는 화학적으로 변형된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드에 대해 지시되는 폴리클로날 항체는 일반적으로 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 및 아주반트의 다수 피하 또는 복강내 주사에 의해 동물 (예: 래비트 또는 마우스)에서 생성된다. FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 면역화될 종에서 면역원인 캐리어 단백질, 예를 들어 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청, 알부민, 소 티로글로불린 또는 대두 트립신 억제제에 컨주게이션하는 것이 유용할 수 있다. 또한, 응집제, 예를 들어 백반을 사용하여 면역 반응을 증진시킨다. 면역화 후, 동물로부터 채혈하고, 혈청을 항-결박된 분자, FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 또는 화학적으로 변형된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 항체 역가에 대해 검정한다.
결박된 분자, FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 또는 화학적으로 변형된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드에 대해 지시된 모노클로날 항체는 세포주의 연속 배양에 의해 항체 분자를 생성하는 임의의 방법을 이용하여 생성될 수 있다. 모노클로날 항체를 제조하는 적합한 방법의 예는 하이브리도마 방법 (Kohler et al., 1975, Nature 256: 495-97) 및 인간 B-세포 하이브리도마 방법 (Kozbor, 1984, J. Immunol. 133: 3001; Brodeur et al ., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications 51-63 (Marcel Dekker, Inc., 1987))을 포함한다. 또한, 결박된 분자, FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 또는 화학적으로 변형된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드와 반응성인 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주가 본 발명에 의해 제공된다.
본 발명의 항-FGF21 돌연변이체 항체는 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드의 검출 및 정량화를 위해 임의의 공지된 검정 방법, 예를 들어 경쟁적 결합 검정, 직접적 및 간접적 샌드위치 검정 및 면역침전 검정에 이용될 수 있다 (Sola, Monoclonal Antibodies : A Manual of Techniques 147-158 (CRC Press, Inc., 1987), 전부 본원에 참조로 삽입됨). 항체는 이용된 검정 방법에 적합한 친화성으로 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 결합할 것이다.
특정 구체예에서, 진단 적용을 위해, 항-결박된 분자, FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 또는 화학적으로 변형된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 항체는 검출가능한 잔기로 표지될 수 있다. 검출가능한 잔기는 직접적으로나 간접적으로 검출가능한 시그널을 생성할 수 있는 임의의 잔기일 수 있다. 예를 들어, 검출가능한 잔기는 방사성 동위원소, 예를 들어 3H, 14C, 32P, 35S, 125I, 99Tc, 111In, 또는 67Ga; 형광 또는 발광 화합물, 예를 들어 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민 또는 루시페린; 또는 효소, 예를 들어 알칼리 포스파타제, β-갈락토시다제 또는 서양고추냉이 퍼옥시다제일 수 있다 (Bayer et al ., 1990, Meth . Enz . 184: 138-63).
경쟁적 결합 검정은, 분석물에 따라 한정량의 항-결박된 분자, FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 또는 화학적으로 변형된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 항체와 결합하기 위해 시험 샘플 분석물 (예: 결박된 분자, FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 또는 화학적으로 변형된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드)와 경쟁할 표지된 표준물 (예: FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 또는 이의 면역학적 반응부)의 능력에 의지된다. 시험 샘플 중의 결박된 분자, FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 또는 화학적으로 변형된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드의 양은 항체에 결합되는 표준물의 양과 반비례한다. 결합되는 표준물의 양을 측정하기 위해서, 항체는 전형적으로 경쟁 전 또는 후에 불용화되어 항체에 결합된 표준물 및 분석물은 결합되지 않은 표준물 및 분석물로부터 편리하게 분리될 수 있다.
샌드위치 검정은 전형적으로 각각 검출 및/또는 정량화될 단백질의 상이한 면역원 부분 또는 에피토프에 결합할 수 있는 2개의 항체 사용을 포함한다. 샌드위치 검정에서, 시험 샘플 분석물은 전형적으로 고체 지지체에 고정된 제1 항체에 결합되며, 이어서 제2 항체는 분석물에 결합함으로써, 불용성 3부 컴플렉스를 형성한다 (U.S. 특허 제4,376,110호). 제2 항체는 검출가능한 잔기로 그 자체가 표지될 수 있거나 (직접적 샌드위치 검정) 검출가능한 잔기로 표지된 항-면역글로불린 항체를 사용하여 측정될 수 있다 (간접적 샌드위치 검정). 예를 들어, 일 유형의 샌드위치 검정은 효소-결합된 면역흡착 검정 (ELISA)이며, 이 경우 검출가능한 잔기는 효소이다.
또한, 본 발명의 항-결박된 분자, FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 또는 화학적으로 변형된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 항체는 생체내 영상화에 유용하다. 검출가능한 잔기로 표지된 항체는 동물, 바람직하게는 혈류로 투여될 수 있고; 숙주에서 표지된 항체의 존재 및 위치가 검정된다. 항체는 동물에서 검출가능한 임의의 잔기로 표지되어 핵자기공명, 방사선학 또는 당해 기술 분야에 공지된 다른 검출 수단을 통해 검출될 수 있다.
또한, 본 발명은 결박된 분자, FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 또는 화학적으로 변형된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 항체 및 생물학적 샘플에서 결박된 분자, FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 또는 화학적으로 변형된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 수준을 검출하는데 유용한 다른 시약을 포함하는 키트에 관한 것이다. 이러한 시약은 검출가능한 라벨, 차단 혈청, 양성 및 음성 대조 샘플 및 검출 시약을 포함할 수 있다.
실시예
하기의 실시예는 본 발명의 특정 구체예 및 이의 다양한 이용을 설명한다. 이들은 단지 예시적인 것으로서 결코 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니다.
실시예 1
FGF21 폴리펩타이드 발현 구조물의 제조
성숙 FGF21 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 성숙 FGF21 서열의 5 및 3 말단에 상응하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 프라이머를 사용하여 폴리머라제 쇄 반응 (PCR) 증폭에 의해 수득되었다. 표 4는 성숙 FGF21 서열을 증폭하는데 사용되었던 프라이머를 열거한다.
FGF21 구조물을 제조하기 위한 PCR 프라이머
프라이머 서열 서열 번호
센스 5'-AGGAGGAATAACATATGCATCCAATTCCAGATTCTTCTCC-3' 33
안티센스 5'-TAGTGAGCTCGAATTCTTAGGAAGCGTAGCTGG-3' 34
FGF21 발현 구조물을 제조하기 위해 사용된 프라이머는 서열을 적합한 발현 벡터 (예: pET30 (Novagen/EMD Biosciences; San Diego, CA) 또는 pAMG33 (Amgen; Thousand Oaks, CA))로 방향적 클로닝하기 위한 제한 엔도뉴클레아제 부위를 삽입하였다. 발현 벡터 pAMG33은 낮은 카피 수의 R-100 복제 기원, 변형된 lac 프로모터 및 카나마이신 내성 유전자를 포함한다. 발현 벡터 pET30은 pBR322-유도된 복제 기원, 유도성 T7 프로모터 및 카나마이신 내성 유전자를 포함한다. pAMG33으로부터의 발현이 더욱 높은 것을 밝혀졌으며, pET30은 더욱 확실한 클로닝 벡터로 밝혀졌다. 따라서, 본원에 기술된 구조물 대다수는 먼저 pET30에서 생성된 후 효능에 대해 스크리닝되었다. 이어서, 선택된 서열은 더욱 증폭시키기 위해 pAMG33으로 전달되었다.
FGF21 서열을 40.65 μL dH2O, 5μL PfuUltra II 반응 완충액 (10x), 1.25 μL dNTP Mix (40 mM - 4 × 10 mM), 0.1 μL 템플레이트 (100 ng/mL), 1 μL 프라이머 1 (10 μM), 1 μL 프라이머 2 (10 μM), 및 1 μL PfuUltra II 융합 HS DNA 폴리머라제 (Stratagene; La Jolla, CA)을 포함하는 반응 혼합물에서 증폭시켰다. 증폭 반응은 95 ℃에서 2분 동안; 이어서 목적 생성물 킬로베이스 당 95 ℃에서 20초, 60 ℃에서 20초 (사이클 당 추가로 1 ℃씩 차감) 및 72 ℃에서 15초 동안 10회 사이클; 이어서 목적 생성물 킬로베이스 당 94 ℃에서 20초, 55 ℃에서 20초 및 72 ℃에서 15초 동안 20회 사이클; 이어서 72 ℃에서 3분 동안 가열함으로써 수행하였다. 증폭 생성물을 제한 엔도뉴클레아제 NdeI 및 EcoRI로 분해하고; 적합한 벡터에 연결한 후; 컴피턴트 세포로 형질전환하였다.
사용된 세균 발현 시스템에 의해, 발현된 성숙 FGF21 폴리펩타이드는 N-말단 메티오닌 잔기 또는 변이 메티오닌 잔기, 예를 들어 fMet 또는 글루코닐화 Met를 포함하였다.
실시예 2
세균으로부터 야생형 FGF21 폴리펩타이드의 정제
하기 실시예에서는, 야생형 FGF21 폴리펩타이드가 세균 발현 시스템에서 발현되었다. 하기 기술되는 바와 같은 발현 후, 야생형 FGF21 폴리펩타이드는 달리 지시되지 않는 한 본 실시예에 기술된 바와 같이 정제되었다.
세균 봉입체로부터 야생형 FGF21 폴리펩타이드를 정제하기 위해서, 이중 세척 봉입체 (DWIB)를 Tris 완충액 (pH 8.5) 중의 구아니딘 하이드로클로라이드 및 DTT를 포함하는 가용화 완충액에 용해시킨 후, 실온에서 1시간 동안 혼합하고, 가용화 혼합물을 우레아, 아르기닌, 시스테인 및 시스타민 하이드로클로라이드를 포함하는 리폴드 완충액 (pH 9.5)에 가한 후, 5 ℃에서 24시간 동안 혼합하였다 (Clarke, 1998, Curr . Opin . Biotechnol . 9: 157-63; Mannall et al ., 2007, Biotechnol. Bioeng . 97: 1523-34; Rudolph et al ., 1997, "Folding protein," in Protein Function : A Practical Approach (Creighton, ed., New York, IRL Press), pp 57-99; and Ishibashi et al., 2005, Protein Expr . Purif . 42: 1-6).
가용화 및 리폴딩 후, 혼합물을 0.45 마이크론 필터를 통해 여과시켰다. 이어서, 리폴드 풀을 20 psi의 트랜스막 압력 (TMP)에서 10 kD 분자량 컷-오프 Pall Omega 카세트로 약 10배 농축하고, 20 psi의 TMP에서 3 컬럼 용적의 20 mM Tris (pH 8.0)로 투석여과하였다.
이어서, 투명 샘플을 Q Sepharose HP 수지를 사용하는 음이온 교환 (AEX) 크로마토그래피하였다. 20 mM Tris 중 0 → 250 mM NaCl의 선형 염 구배를 5 ℃, pH 8.0에서 진행시켰다. 피크 분획을 SDS-PAGE로 분석하고 풀링하였다.
이어서, AEX 용출물 풀에 페닐 세파로즈 HP 수지를 사용하여 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)를 수행하였다. 단백질을 pH 8.0 및 실온에서 0.7 M → 0 M 황산암모늄의 감소하는 선형 구배로 용출하였다. 피크 분획을 SDS-PAGE로 분석하고 (Laemmli, 1970, Nature 227: 680-85), 풀링하였다.
HIC 풀을 20 psi의 TMP에서 10 kD 분자량 컷-오프 Pall Omega 0.2 m2 카세트로 7 mg/mL로 농축하였다. 농축물을 20 psi의 TMP에서 5 용적의 10 mM KPO4, 5％ 소르비톨 (pH 8.0)로 투석여과하고, 회수된 농축물을 5 mg/mL로 희석하였다. 마지막으로, 용액을 Pall mini-Kleenpac 0.2 μM Posidyne 막을 통해 여과시켰다.
실시예 3
FGF21 돌연변이체의 확인
야생형 FGF21은 비교적 짧은 반감기를 가지며, 일부의 경우에서는 치료제로서 야생형 FGF21을 사용하는 것이 바람직하지 않다. 추가로, 반감기를 연장시키는 종래의 방법, 예를 들어 폴리펩타이드의 페길화는 FGF21 서열 내의 적합한 페길화 부위의 수 및 위치로 인해 제한된다. 야생형 FGF21 폴리펩타이드 서열에는 7개의 천연 발생 페길화 부위, 즉 알파 아미노 그룹, 4개의 리신 잔기 및 2개의 시스테인 잔기가 있다. 이들 부위는, PEG 분자가 천연 구조를 취하는 FGF21의 능력에 불리하게 작용할 수 있거나 FGF21과 이의 수용체 또는 베타-클로토 (beta-klotho) 사이의 상화작용에 불리하게 작용할 수 있기 때문에 페길화에 이상적이지 않다. 또한, 알파 아미노 그룹을 제외하고는, 이들 반응성 잔기는 단일 표적된 위치에서 부위 특이적 페길화를 가능하게 하지 않는다. 따라서, 화학적 변형에 적합한 잔기로 돌연변이될 수 있는 야생형 FGF21 폴리펩타이드 내 잔기를 확인하기 위해 통제되고 집중된 조사를 수행하였다. 조사에서의 고려 사항에는 FGF21 서열 내의 잔기의 위치선정 및 단백질 표면 상에서의 이의 위치가 포함되었다.
본원에 기술된 화학적 변형에 유용한 잔기에 대한 돌연변이에 적합한, 야생형 폴리펩타이드 내의 개별 잔기를 확인하는데 2가지의 상이한 방법을 이용하였다.
실시예 3.A
상동성 모델을 사용하여 확인된 돌연변이 후보물
제1 방법으로, FGF21 활성을 방해하지 않으면서 페길화를 견딜 수 있음 직한 표면 노출된 측쇄를 가질 가능성이 높은 잔기를 확인하기 위해서 체계적인 합리적 단백질 조작 접근법에 상동성 모델을 사용하였다. 이러한 잔기를 확인하는데 사용될 수 있는 FGF21에 대한 공개된 X-선 또는 NMR 구조가 없었으므로, Protein Databank (PDB)으로부터 얻은 FGF19 (1PWA)의 고분해 (1.3 Å) X-선 결정 구조를 이용하여 MOE (Molecular Operating Environment; Chemical Computing Group; Montreal, Quebec, Canada) 모델링 소프트웨어로 FGF21의 3D 상동성 모델을 만들었다. PDB에 기탁된 단백질 중에서 FGF19가 아미노산 서열 상동성면에서 FGF21과 가장 밀접하게 관련된 단백질이므로, FGF19를 템플레이트로 선택하였다.
이어서, FGF21 상동성 모델을 확장하여 FGF 수용체에 결합된 FGF-21을 나타내었다. 이러한 모델을 이용하여, FGF21와 이의 수용체와의 상호작용을 방해할 수 있는 잔기는 피하면서 FGF21 분자의 표면에 노출되고 활성화된 중합체 (예: PEG) 잔기와의 반응에 이용가능할 것 같은 잔기를 확인하였다. 또한, 종간의 잔기의 서열 보존성 및 천연 측쇄의 생화학적 특성을 고려하였다. 이러한 스크린에 의한 우수한 후보로서 확인된 잔기는 최소한의 활성 파괴와 함께 이러한 부위의 성공적인 페길화에 대한 예상 가능성에 따라 등급을 매겼다. 그룹 A의 잔기는 최선의 후보물이며, 그룹 D의 잔기는 실행가능하나 덜 바람직한 후보물을 나타낸다. 그룹 A는 N121, H125, H112, R77, H87, E37 및 K69를 포함한다. 그룹 B는 R126, G113, D79, E91, D38, D46 및 G120을 포함한다. 그룹 C는 S71, D89, L86, T70, G39, T40, R36, P49, S48, S123, K122, A81, A111, E110 및 R96을 포함한다. 마지막으로, 그룹 D는 Q18, R19, A26, Q28, E34, A44, A45, E50, L52, Q54, L55, K59, G61, L66, V68, R72, P78, G80, Y83, S85, F88, P90, A92, S94, L98, E101, D102, Q108, L114, H117, P119, P124, D127, P128, A129, P130, R131, 및 P140을 포함한다.
또한, 분자의 아미노 및 카복시 말단 절편 내의 잠재적인 페길화 부위는, 분자의 이들 부분에 대해 이용가능한 3차원 구조 자료가 이용가능하지 않으므로, 서열 정렬 및 측쇄의 생화학적 특성에 기초하여 확인되었다. 돌연변이에 가장 적합할 것으로 믿어지는 잔기를 확인한 후, 잔기가 일 세트의 선택 기준에 적당한가에 따라 그룹을 지었다. FGF21 폴리펩타이드 서열의 N-말단에 대해, 잔기 1-13이 평가되었으며, D5가 돌연변이에 대해 최적인 후보로 결정되었으며, 잔기 H1, P2, I3, P4 및 S6도 또한 실용적인 것으로 결정되었다. FGF21 폴리펩타이드 서열의 C-말단에 대해, 잔기 141-181이 평가되었으며, 잔기 Y179 및 R175가 돌연변이에 최적인 후보물로 결정되었으며, 잔기 P143, P171, S172, Q173, G174, S176, P177, S178, A180, 및 S181이 또 다른 후보 그룹을 형성하였고, 잔기 P144, A145, P147, E148, P149, P150, I152, A154, Q156 및 G170은 돌연변이를 위한 제3의 후보 그룹을 형성하였다.
실시예 3.B
비목적 천연 발생 중합체 부착 부위를 제거함으로써 생성된 FGF21 돌연변이체
제2 방법은 PEG를 FGF21에 커플링시키기 위한 아미노 특이적 컨주게이션 화학을 이용하였다. 잠재적인 공포형성 (vacuologenic) 컨주게이트의 부위-선택적 이중-페길화는 이들의 공포형성 잠재력을 상당히 감소시킬 수 있다 (U.S. 특허 제6,420,339호). 따라서, 본 발명의 하나의 측면으로, 단지 2개의 일차 아미노 그룹만이 페길화를 위해 남도록 단백질을 돌연변이시킴으로써, 부위-선택적 이중-페길화를 수행한다.
FGF21 단백질은 야생형 FGF21 서열 (서열 번호 4)에서 굵은 글씨 (R 및 K 잔기) 및 밑줄 (K 잔기)로 강조된 4개의 리신 및 10개의 아르기닌을 포함한다. 2개의 천연 발생 시스테인 잔기는 볼드체 및 이택릭체로 강조된다:
HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQL K AL K PGVIQILGV K TSRFL C QRPDGALYGSLHFDPEA C SFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGN K SPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS 서열 번호 4
먼저 4개의 천연 발생 리신을 아르기닌으로 돌연변이시켜 N-말단에서 α-아미노 그룹으로서 단지 하나의 일차 아민 그룹을 포함하는 모 분자를 만들었다. 이를 시험관내 활성에 대해 시험하였으며, 완전히 활성인 것으로 밝혀졌다. 이어서, 선택된 아르기닌을 단계적으로 리신으로 대체하여 FGF21 분자 상의 다양한 위치에서 페길화를 위한 제2의 일차 아미노 그룹을 포함하는 10개 이하의 동족체를 만들었다. (실시예 3A에서 기술된 바와 같이) FGF21의 수용체에 결합된 FGF21의 상동성 모델 조사는, 추정된 수용체 경계면에 대한 근접성의 함수로서 제안된 컨주게이션 부위의 등급화를 가능하게 하였다.
다양한 위치가 하기와 같이 구분되고 특징지어졌다: (a) 용매 노출되고 수용체 경계면에서 먼 부위: R36, R77, K122 ＆ R126; (b) 용매 노출되고 수용체 경계면에 가까운 부위: K56, K59, K69, R72 ＆ R175; 및 (c) 묻힌 부위: R17, R19, R131 ＆ R135.
각각 단일 α-아미노 및 ε-아미노 그룹을 포함하는 최종 구조물이 정제되었으며, 실시예 9 (컨주게이션) 및 10 (시험관내 활성 검정)에서 기술되는 바와 같이 PEG와의 컨주게이션 전 및 후 모두에 활성을 시험하였다.
실시예 4
단일 돌연변이를 포함하는 FGF21 돌연변이체의 확인
실시예 3.A 및 3.B에서 상술된 합리적인 단백질 조작 접근법을 통해 만들어진 단일 돌연변이를 포함하는 FGF21 돌연변이체에 대한 요약이 표 3에 제공된다. 이들 단일 돌연변이체는 비-천연 발생 중합체 부착 부위, 특히 시스테인 또는 리신 잔기를 제공하고 삽입한다. 이들 잔기의 측쇄는 중합체, 예를 들어 PEG 분자의 부착에 의한 화학적 변형에 특히 적합하다. 도입된 비-천연 발생 중합체 부착 부위에 추가하여, 필요한 경우, 중합체가 단백질의 N-말단에 임의로 부착될 수 있는 것으로 인식되었다.
도입된 잔기는 FGF21 생물학적 활성을 야생형 수준으로 유지하도록 디자인되었으므로, 이들 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드는 FGF21 생물학적 활성을 유지하고 하나 이상의 비-천연 발생 중합체 부착 부위를 여전히 제공할 것으로 예상된다. 화학적 변형 (예: 페길화) 후, 이들 돌연변이체는 상당한 생체내 야생형 수준의 생물학적 활성을 유지하면서 야생형 FGF21 보다 긴 생체내 반감기를 가질 것으로 예상된다.
돌연변이유발에 표적되는 위치의 수는 표 5에 나타나 있으며, 181개 아미노산 잔기로 이루어진 성숙 FGF21 단백질의 잔기 위치에 상응한다. 하기 표 5에 열거된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 후술된 기술을 이용하여 제조되었다.
단일 돌연변이를 포함하는 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드
잔기 번호 야생형 돌연변이
36 R K R36K
37 E C E37C
38 D C D38C
46 D C D46C
56 K R K56R
60 K R K60R
91 E C E91C
69 K C K69C
69 K R K69R
72 R K R72K
77 R C R77C
77 R K R77K
79 D C D79C
86 H C H86C
91 E C E91C
112 H C H112C
113 G C G113C
120 G C G120C
121 N C N121C
122 K R K122R
125 H C H125C
126 R C R126C
126 R K R126K
171 P G P171G
175 R C R175C
175 R K R175K
170 G C G170C
179 Y C Y179C
실시예 5
2개의 돌연변이를 포함하는 FGF21 돌연변이체의 확인
2개의 비-천연 발생 중합체 부착 부위를 제공하는 돌연변이체의 조합을 확인하기 위해서 단일 시스테인 돌연변이체로부터 얻은 상동성 모델 및 자료에 대한 추가의 분석을 수행하였다. 화학적 변형 후, 이들 FGF21 돌연변이체는 목적하는 위치에서 폴리펩타이드에 부착된 2개의 중합체 (예: PEG 분자)를 갖는다. 본 발명의 모든 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드와 마찬가지로, 중합체는 또한 중합체 자체의 특성에 따라 폴리펩타이드의 N-말단에 부착될 수 있다. 이중으로 페길화된 FGF21 돌연변이체를 도시하는 카툰이 도 1에 그래픽으로 나타나 있다.
이러한 합리적인 단백질 조작 접근법을 통해 만들어진 2개의 돌연변이를 갖는 FGF21 돌연변이체에 대한 요약이 표 6에 제공된다. 이들 이중 돌연변이체는 비-천연 발생 중합체 부착 부위, 특히 시스테인을 삽입한다. 이들 잔기의 측쇄는 특히 중합체, 예를 들어 PEG 분자의 부착에 의한 화학적 변형에 적합하다. 도입된 비-천연 발생 중합체 부착 부위에 추가하여, 필요한 경우, 중합체가 단백질의 N-말단에 임의로 부착될 수 있는 것으로 인식되었다.
도입된 잔기는 FGF21 생물학적 활성을 유지하도록 디자인되었으므로, 이들 FGF21 돌연변이체는 FGF21 생물학적 활성을 유지하고, 하나 이상의 비-천연 발생 중합체 부착 부위를 여전히 제공할 것으로 예상된다. 화학적 변형 (예: 페길화) 후, 이들 돌연변이체는 실질적인 생체내 효능을 유지하면서 야생형 FGF21 보다 긴 반감기를 가질 것으로 예상된다.
표 6에 제공된 위치의 수는 181개 아미노산 잔기로 이루어진 성숙 FGF21 단백질의 잔기 위치에 상응한다. 표 6에 열거된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 후술된 기술을 이용하여 제조되었다.
2개의 돌연변이를 포함하는 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드
잔기 1 야생형 돌연변이 잔기 2 야생형 돌연변이
37 E C 77 R C E37C,R77C
120 G C 125 H C G120C, H125C
77 R C 91 E C R77C, E91C
77 R C 125 H C R77C, H125C
91 E C 125 H C E91C, H125C
77 R C 120 G C R77C, G120C
37 E C 91 E C E37C, E91C
91 E C 175 R C E91C, R175C
37 E C 175 R C E37C, R175C
91 E C 120 G C E91C, G120C
37 E C 120 G C E37C, G120C
77 R C 175 R C R77C, R175C
37 E C 125 H C E37C, H125C
37 E C 69 K C E37C, K69C
69 K C 91 E C K69C, E91C
120 G C 175 R C G120C, R175C
69 K C 120 G C K69C, G120C
69 K C 125 H C K69C, H125C
69 K C 77 R C K69C, R77C
125 H C 175 R C H125C, R175C
69 K C 175 R C K69C, R175C
37 E C 170 G C E37C, G170C
실시예 6
3개의 돌연변이를 포함하는 FGF21 돌연변이체의 확인
상술된 바와 같이, 비-천연 발생 중합체 부착 부위가 야생형 FGF21 폴리펩타이드 서열로 도입될 수 있다. 이는 폴리펩타이드의 목적하는 위치에서 부위-선택적 화학적 변형을 위한 기회를 제공한다. 또한, 야생형 FGF21 서열의 잔기 P171이 단백질분해에 민감한 것으로 이미 결정되었다. 따라서, 상기한 변형 및 P171 위치에서의 돌연변이의 조합을 도입함으로써 증진된 단백질분해 안정성 및 부위 특이적 중합체 부착 부위 모두를 갖는 FGF21 분자가 생성될 수 있다.
2개의 비-천연 발생 중합체 부착 부위를 제공할 돌연변이체의 조합을 확인하기 위해서 상동성 모델에 대한 추가의 분석을 수행하였다. 화학적 변형 후, 이들 돌연변이체는 목적하는 위치에서 폴리펩타이드에 부착된 2개의 중합체 (예: PEG 분자)를 가질 것이다. 본 발명의 모든 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드와 마찬가지로, 중합체는 또한 중합체 자체의 특성에 따라 폴리펩타이드의 N-말단에 부착될 수 있다. 분석은, FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드의 단백질분해 안정성을 증진시키기 위해 디자인되었던 2개의 도입된 중합체 부착 부위 이외에, P171 위치에서의 돌연변이에 대한 평가도 포함하였으며, 야생형 FGF21의 생체내 생물학적 활성을 유지 또는 증진시킴과 동시에 선택된 중합체 부착 부위 및 증진된 단백질분해 안정성을 제공한다.
대응 조사에서, 실시예 4에 제시된 표 5로부터의 단일 돌연변이에 대한 선택된 서브세트를 전술된 바와 같은 부위-선택적 혼합 화학을 이용하여 α-아미노 N-말단 둘 모두에서 선택적으로 페길화하기 위한 안정성 증진 P171 돌연변이 및 도입된 시스테인 돌연변이와 조합하였다 (U.S. 특허 제6,420,339호, 본원에 참조로 삽입됨). 이들 이중 돌연변이체는 R77C/P171G 및 H125C/P171G로 표시되며, 실시예 4의 표 5에 기술된 돌연변이를 이용하여 고려될 수 있는 임의의 다른 조합에 대한 예시이다.
이러한 합리적인 단백질 조작 접근법을 통해 만들어진, P171 부위에서의 돌연변이 이외에, 2개의 돌연변이를 포함하는 FGF21 돌연변이체에 대한 요약이 표 7에 제공된다. 이들 돌연변이체는 2개의 비-천연 발생 중합체 부착 부위, 특히 시스테인을 삽입한다. 이들 잔기의 측쇄는 특히 중합체, 예를 들어 PEG 분자의 부착에 의한 화학적 변형에 적합하다. 도입된 비-천연 발생 중합체 부착 부위에 추가하여, 필요한 경우, 중합체가 단백질의 N-말단에 임의로 부착될 수 있는 것으로 인식되었다. 기술된 3중 FGF21 돌연변이체는 상술된 바와 같은 도입된 중합체 부착 부위뿐만 아니라 위치 171에서의 단백질분해 안정성 도입 돌연변이를 포함한다. FGF21 3중 돌연변이체의 화학적 변형 후, 이러한 돌연변이의 조합은 2개의 중합체 (예: PEG)의 결합을 통해 FGF21 반감기를 증진시키는 기능 및 단백질분해 절단 부위의 제거를 통해 반감기를 증진시키는 기능을 돕는다.
도입된 잔기는 생체내에서 야생형 수준의 FGF21 생물학적 활성을 유지하도록 디자인되었으므로, 이들 FGF21 돌연변이체는 FGF21 생물학적 활성을 유지하고, 독특한 비-천연 발생 중합체 부착 부위를 여전히 제공할 것으로 예상된다. 화학적 변형 (예: 페길화) 후, 이들 돌연변이체는 상당한 생체내 야생형 수준의 생물학적 활성을 유지하면서 야생형 FGF21 보다 긴 반감기를 가질 것으로 예상된다.
표 7에 제시된 위치의 수는 181개 아미노산 잔기로 이루어진 성숙 FGF21 단백질에서의 잔기 위치에 상응한다. 표 7에 열거된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 본원에서 설명된 기술을 이용하여 제조되었다.
3개의 돌연변이를 포함하는 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드
잔기 1 야생형 돌연변이 잔기 2 야생형 돌연변이 잔기 3 야생형 돌연변이
37 E C 77 R C 171 P G E37C, R77C, P171G
91 E C 125 H C 171 P G E91C, H125C, P171G
77 R C 120 G C 171 P G R77C, G120C, P171G
37 E C 91 E C 171 P G E37C, E91C, P171G
91 E C 175 R C 171 P G E91C, R175C, P171G
37 E C 175 R C 171 P G E37C, R175C, P171G
91 E C 120 G C 171 P G E91C, G120C, P171G
37 E C 120 G C 171 P G E37C, G120C, P171G
77 R C 175 R C 171 P G R77C, R175C, P171G
37 E C 125 H C 171 P G E37C, H125C, P171G
실시예 7
FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드의 제조 및 발현
표 3 (단일 돌연변이), 표 4 (이중 돌연변이) 및 표 5 (3중 돌연변이, 즉 이중 돌연변이 + P171G)에 열거된 FGF21 돌연변이체 (본 실시예에서는 총체적으로 "FGF21 돌연변이체"라 함)를 암호화하는 구조물은 후술되는 바와 같이 야생형 FGF21 발현 벡터의 PCT 증폭에 의해 제조되었다 (야생형 FGF21 발현 벡터의 제작은 실시예 1에 기술되어 있다). 이러한 실험의 목표는 하나 이상의 비-천연 발생 중합체 부착 부위를 포함하고, 일부의 경우, 단백질분해에 내성인 FGF21 돌연변이체를 제조하는 것이었다. 이들 FGF21 돌연변이체의 화학적으로 변형된 형태는 보다 긴 반감기를 나타내고 일부의 경우 또한 단백질분해에 내성을 나타낼 것으로 예상되었다.
FGF21 돌연변이체 구조물은 돌연변이될 코돈 (또는 코돈들)의 상류 및 하류 영역에 대해 상동성인 서열을 갖는 프라이머를 사용하여 제조되었다. 이러한 증폭 반응에 사용된 프라이머는 또한 증폭된 생성물, 즉 목적하는 돌연변이체를 갖는 전체 벡터의 재순환을 가능하게 할 약 15개 뉴클레오타이드의 중복 서열을 제공하였다.
위치 170에서 천연 글리신 잔기 대신에 글루탐산 잔기를 갖는 FGF21 돌연변이체를 암호화하는 예시적 FGF21 돌연변이체 구조물 (즉, G170E FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드)을 표 8에 나타낸 프라이머를 사용하여 제조하였다.
예시적 FGF21 돌연변이체를 제조하기 위한 PCR 프라이머
프라이머 서열 서열 번호
센스 5'-ATGGTGGAACCTTCCCAGGGCCGAAGC-3' 29
CTCCTCGGACCCTCTGAGCATGGTG GGA CCTTCCCAGGGCCGAAGCCCCA 30
GAGGAGCCTGGGAGACTCGTACCAC CCT GGAAGGGTCCCGGCTTCGGGGT 31
안티센스 5'-GGAAGGTTCCACCATGCTCAGAGGGTCCGA-3' 32
표 6에 나타낸 프라이머는 하기와 같이 글리신 잔기를 글루탐산 잔기로 치환하는 것을 가능하게 하며, 여기서 상부 서열은 센스 프라이머 (서열 번호 29)이고, 제2 및 제3 서열 (서열 번호 30 및 31)은 FGG21 발현 구조물의 일부이며, 제4 서열은 안티센스 프라이머 (서열 번호 32)이다.
Figure 112011034117079-pct00001
FGF21 돌연변이체 구조물을 본질적으로 실시예 1에 기술된 PCR 조건을 이용하여 제조하였다. 증폭 생성물을 제한 엔도뉴클레아제 DpnI으로 분해한 후, 컴피턴트 세포로 형질전환하였다. 생성된 클론을 서열분석하여 폴리머라제-생성 실수가 없음을 확인하였다.
FGF21 돌연변이체는 컴피턴트 BL21 (DE3) 또는 BL21 Star (Invitrogen; Carlsbad, CA) 세포를 특정 돌연변이체를 암호화하는 구조물로 형질전환함으로써 발현되었다. 형질전환체는 40 μg/mL 카나마이신으로 보충된 TB 배지에서 제한된 통기와 함께 밤새 성장시키고, 다음날 아침까지 통기하고, 짧은 회수 기간 후, 0.4 mM IPTG에서 유도하였다. FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 유도한 지 18 내지 20시간 후 원심분리로 수거하였다.
이용된 세균 발현 시스템에 의해, FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드는 N-말단 메티오닌 잔기와 함께 발현되었다.
실시예 8
세균으로부터 FGF21 및 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드의 정제
하기 실시예에서, FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드는 세균 발현 시스템에서 발현되었다. 실시예 7에 기술된 발현 후, 달리 지시되지 않는 한, FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 이 실시예에 기술된 바와 같이 정제하였다.
세균 봉입체로부터 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 정제하기 위해서, 이중 세척 봉입체 (DWIB)를 Tris 완충액 (pH 8.5) 중의 구아니딘 하이드로클로라이드 및 DTT를 포함하는 가용화 완충액에 용해시킨 후, 실온에서 1시간 동안 혼합하고, 가용화 혼합물을 우레아, 아르기닌, 시스테인 및 시스타민 하이드로클로라이드를 포함하는 리폴드 완충액 (pH 9.5)에 가한 후, 5 ℃에서 24시간 동안 혼합하였다 (Clarke, 1998, Curr . Opin . Biotechnol . 9: 157-63; Mannall et al ., 2007, Biotechnol. Bioeng . 97: 1523-34; Rudolph et al ., 1997, "Folding protein," in Protein Function : A Practical Approach (Creighton, ed., New York, IRL Press), pp 57-99; and Ishibashi et al., 2005, Protein Expr . Purif . 42: 1-6).
가용화 및 리폴딩 후, 혼합물을 0.45 마이크론 필터를 통해 여과시켰다. 이어서, 리폴드 풀을 20 psi의 트랜스막 압력 (TMP)에서 5 kD 분자량 컷-오프 Pall Omega 카세트로 약 10배 농축하고, 20 psi의 TMP에서 3 컬럼 용적의 20 mM Tris (pH 8.0)로 투석여과하였다.
이어서, 투명 샘플을 Q Sepharose HP 수지를 사용하는 음이온 교환 (AEX) 크로마토그래피하였다. 20 mM Tris 중 0 → 250 mM NaCl의 선형 염 구배를 5 ℃, pH 8.0에서 진행시켰다. 피크 분획을 SDS-PAGE로 분석하고 풀링하였다.
이어서, AEX 용출물 풀에 페닐 세파로즈 HP 수지를 사용하여 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)를 수행하였다. 단백질을 pH 8.0 및 실온에서 0.6 M → 0 M 황산암모늄의 감소하는 선형 구배로 용출하였다. 피크 분획을 SDS-PAGE로 분석하고 (Laemmli, 1970, Nature 227: 680-85), 풀링하였다.
HIC 풀을 20 psi의 TMP에서 5 kD 분자량 컷-오프 Pall Omega 0.2 m2 카세트로 7 mg/mL로 농축하였다. 농축물을 20 psi의 TMP에서 5 용적의 20 mM TRIS (pH 8.0)로 투석여과하고, 회수된 농축물을 약 5 mg/mL로 희석하였다. 마지막으로, 용액을 0.22 ㎛ 셀룰로즈 아세테이트 필터를 통해 여과시켰다.
실시예 9
FGF21 돌연변이체의 화학적 변형
표 3 내지 5에 나타난 선택된 위치에서 치환된 시스테인을 갖는 FGF21의 변이체를 실시예 7에 기술된 바와 같이 생성한 후, 이 분자를 20 kDa 메톡시-PEG-말레이미드와 함께 페길화 반응시켰다. 달리 언급되지 않는 한, 본원에 기술된 모든 페길화된 FGF21 야생형 및 돌연변이체 폴리펩타이드는 하나 이상의 20kDa 메톡시 PEG 말레이미드 중합체를 포함한다.
이어서, 부분 정제된 FGF21 분자를 25 ℃에서 30분 동안 5 몰 당량의 TCEP를 사용하여 환원하였다. 이어서, 환원된 FGF21을 GE Healthcare Sephadex G25M 컬럼을 사용하여 10 mM 이미다졸 (pH 7.5)로 완충액 교환하였다. 이어서, 완충액 교환된 FGF21을 25 ℃에서 30분 동안 5 몰 당량의 20 kDa 메톡시-PEG-말레이미드와 반응시켰다. 이어서, 생성된 반응 혼합물을 이온-교환 크로마토그래피하여 다중-페길화 및 비-페길화 분자들로부터 모노-페길화 종을 분리하였다. 대부분의 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드는 메톡시-PEG-말레이미드와 잘 반응하였으며, 고수율로 주로 모노-페길화된 생성물을 생성하였다 (도 2 및 3).
결박된 분자를 생성하기 위해서, 부분 정제된 FGF21 분자를 25 ℃에서 30분 동안 5 몰 당량의 TCEP를 사용하여 환원시켰다. 이어서, 환원된 FGF21을 GE Healthcare Sephadex G25M 컬럼을 사용하여 10 mM 이미다졸 (pH 7.5)로 완충액 교환하였다. 이어서, 완충액 교환된 FGF21을 4 ℃에서 60분 동안 0.45 몰 당량의 20 kDa PEG 비스-말레이미드와 반응시켰다. 이어서, 생성된 반응 혼합물을 이온 교환 크로마토그래피하여 다른 바람직하지 않은 반응 산물로부터 결박된 분자를 분리하였다. 종종, 추가의 이온-교환 크로마토그래피 단계가 필요하였으며, 이는 제1 이온-교환 풀을 약 4 용적의 물에 희석시키고 이온-교환 컬럼에 재적용함으로써 달성되었다.
달리, N-말단에의 아민 특이적 커플링은 전술된 바와 같이 메톡시-PEG-프로피온알데하이드를 사용한 환원적 알킬화에 의해 달성하였다 (U.S. 특허 제5,824,784호 참조). 간단히, 약 2 mg/ml의 돌연변이체 FGF21을 4 ℃에서 밤새 아세테이트 완충액 (pH 5.5) 중의 20kD mPEG-프로피온알데하이드 5배 몰 과량 및 10 mM 나트륨 시아노보로하이드라이드와 반응시켰다. 본원에 기술된 FGF21 야생형 및 돌연변이체 분자 중 임의의 것의 N-말단 페길화는 이러한 방법으로 달성될 수 있다.
아민 특이적 이중 페길화가 N-말단 및 돌연변이체 리신 모두에서 필요한 경우, 메톡시PEG-NHS (N-하이드록시석신이미딜 에스테르)가 사용되었다. 간단히, 약 2 mg/ml의 돌연변이체 FGF21을 4 ℃에서 약 2시간 동안 비신 완충액 (pH 7.5) 중의 20kD mPEG-NHS의 5배 몰 과량 (PEG:아미노 그룹)과 반응시켰다.
N-말단 및 돌연변이체 Cys 위치 모두에서의 FGF21 돌연변이체의 이중 페길화를 위해 혼식 화학 접근법 (mixed chemistry approach)을 적용하는 경우, 메톡시-PEG-프로피온알데하이드 및 메톡시-PEG-말레이미드 모두를 전술한 바와 같이 연속해서 사용하였다 (U.S. 특허 제6,420,339호 참조). 간단히, 약 2 mg/ml의 돌연변이체 FGF21을 4 ℃에서 포스페이트 완충액 (pH 6.5) 중의 20kD mPEG-말레이미드 1.5배 몰 과량과 약 2시간 동안 반응시킨 후, pH를 약 pH 5로 조절하고, 20kD mPEG-프로피온알데하이드 5배 몰 과량을 10 mM 나트륨 시아노보로하이드라이드와 함께 첨가하였다. 최종 반응을 4 ℃에서 밤새 수행하였다.
모든 상이한 반응 혼합물의 정제는 전술된 바와 같이 Tris 완충액 중 pH 8에서 음이온 교환 크로마토그래피로 수행하였다.
실시예 10
FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 및 화학적으로 변형된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드의 시험관내 활성
이어서, 비-페길화된 형태의 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 및 N-말단 페길화된 FGF21과 비교한 페길화된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드의 활성을 평가하기 위해, 페길화된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 시험관내 검정하였다.
본 실험의 하나의 목표는 ELK-루시페라제 시험관내 검정에서 FGF21 활성을 보유하는 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 및 화학적으로 변형된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 확인하는 것이다. ELK-루시페라제 검정은 재조합 인간 293T 신장 세포계를 사용하여 수행하였으며, 이때 293T 세포는 베타-클로토 및 루시페라제 리포터 구조물을 과발현한다. 베타-클로토는 FGF 수용체 활성화를 위해 FGF21이 필요로 하는 공동-수용체이다. 이 검정에 사용되는 FGF 수용체는 293T 신장 세포에서 발현되는 내생 수준의 FGF 수용체이다. 루시페라제 리포터 구조물은 GAL4-ELK1를 암호화하는 서열 및 5개 탠덤 (tandem) 카피의 Gal4 결합 부위 (5xUAS-Luc)를 포함하는 프로모터에 의해 유도되는 루시페라제 리포터를 포함한다. 루시페라제 활성은 포스포릴화된 Erk/ELK1의 수준에 의해 조절되며, FGF21 활성을 간접적으로 모니터링하고 정량하는데 이용된다.
ELK-루시페라제 검정은 6시간 동안 상이한 농도의 야생형 FGF21 또는 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드의 존재 하에서 293T 세포를 배양하고, 루시페라제 활성에 대해 세포 용해물을 검정함으로써 수행되었다. 도 4 내지 6 및 표 3 내지 5는 1, 2 또는 3개의 돌연변이를 갖는 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 포함하여 수개의 예시적 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드에 대해 수득된 시험관내 결과를 요약한다.
실시예 10.A
1개의 돌연변이를 포함하는 페길화된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드에 대한 EC50 값
하기 표 9는 특정한 공지된 위치에 비-천연 발생 중합체 부착 부위를 도입하는 2개의 돌연변이를 포함하는 다양한 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드의 EC50 값을 요약한다.
다양한 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 생성하고 활성을 본원에 기술된 시험관내 ELK-루시페라제 검정으로 측정하였다. 표 9는 수득된 자료를 요약한다:
1개의 돌연변이를 포함하는 페길화된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드에 대한 EC50의 요약
돌연변이 EC50 (nM) WT EC50 (nM) N-PEG20 EC50 (nM)
H125C 4.5 2.8 36.7
R77C 4.9 3.9 43.3
K69C 5.3 2.8 36.7
G120C 6.0 2.8 36.7
E37C 6.9 3.9 43.3
R175C 7.9 0.9 21.5
E91C 8.3 3.9 43.3
N121C 9.2 3.9 43.3
R126C 10.0 2.8 36.7
G113C 12.0 3.9 43.3
D38C 13.1 2.8 36.7
D79C 20.4 3.4 40.0
D46C 27.8 3.9 43.3
Y179C 287.1 1.1 21.5
표 9는 본 발명의 다양한 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 중 일부의 시험관내 활성에 대한 페길화의 효과를 요약한다.
도 4, 5 및 6은 단일 포인트 돌연변이를 포함하는 수개의 페길화된 FGF21 돌연변이체에 대한 결과 및 EC50 값을 그래프로 도시한다. 도 4 및 5는 FGF21 돌연변이체 중 수개에 대한 자료를 포함하며, 이에 대한 자료는 표 9에 제시된다. 더욱 특히, 도 4의 상단 플롯은 페길화된 E37C, R77C, E91C 돌연변이체 및 N-말단 페길화된 야생형 FGF21뿐만 아니라 비-페길화된 FGF21에 대해 수행된 ERK-루시페라제 검정 결과를 나타낸다. 도 4의 하단 플롯에서, 자료는 페길화된 G113C, N121C, D46C 돌연변이체 및 N-말단 페길화된 야생형 FGF21뿐만 아니라 비-페길화된 야생형 FGF21에 대해 제시된다.
도 5의 상단 플롯 자료는 H125C, G120C, R126C 돌연변이체 및 N-말단 페길화된 야생형 FGF21뿐만 아니라 비-페길화된 야생형 FGF21에 대해 제시된다. 하단 플롯에서, 자료는 D79C, D38C 돌연변이체 및 N-말단 페길화된 야생형 FGF21뿐만 아니라 비-페길화된 야생형 FGF21에 대해 제시된다.
도 6의 상단 플롯에서 그래프 자료는 페길화된 K69C 및 D79C 돌연변이체 및 N-말단 페길화된 야생형 FGF21뿐만 아니라 비-페길화된 야생형 FGF21에 대해 제시된다. 도 6의 하단 플롯에서, 자료는 페길화된 R175C 및 Y179C 돌연변이체 및 N-말단 페길화된 야생형 FGF21뿐만 아니라 비-페길화된 야생형 FGF21에 대해 제시된다. 놀랍게도, 이들 분자 중 많은 분자가 비페길화된 분자의 시험관내 활성과 근접한 시험관내 활성을 갖는다.
실시예 10.B
선택된 Arg / Lys FGF21 돌연변이체에 대한 EC50 값
실시예 3에 기술된 바와 같이, 천연-발생 중합체 부착 부위 (예: 페길화 부위)가 돌연변이유발에 의해 제거된 일련의 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 생성하였다. 이들 FGF21 돌연변이체에서, 먼저 반응성 Lys 그룹을 아르기닌으로 돌연변이시켜 페길화에 이용가능한 N-말단 α-아미노 그룹만을 남겼다. 이어서, 천연 또는 돌연변이체인 선택된 아르기닌 잔기를 하나씩 리신으로 전환시켜 FGF21 표면 상의 정의된 위치에 이차적 페길화 부위를 도입하였다. 이러한 방법의 하나의 목표는 중합체 (예: PEG 분자)가 하나 이상의 특정한 공지된 위치에서 컨주게이션되는 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 생성하는 것이었다.
다양한 아르기닌/리신 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 생성하고, 본원에 기술된 시험관내 ELK-루시페라제 검정으로 활성을 측정하였다. 표 10은 수득된 자료를 요약한다:
리신/아르기닌 돌연변이를 포함하는 페길화된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드에 대한 EC50의 요약
구조물 PEG의 유형 시험관내 활성
EC50 (nM)
천연 FGF21 PEG 없음 3
천연 FGF21 (N-말단) 1 × 20k 43.3
천연 FGF21 (무작위) 2 × 20k 200
FGF21(모든 K를 모두 R로) 1 × 20k nd
FGF21(모든 K를 모두 R로, R36K) 2 × 20k 73
FGF21(모든 K를 모두 R로, R77K) 2 × 20k 175
FGF21(K56/59/69R) 2 × 20k 500
FGF21(K 모두 R, R126K) 2 × 20k 38
FGF21(K59R/K69R/K122R) 2 × 20k 499
FGF21(K56R/K69R/K122R) 2 × 20k 215
FGF21(K56R/K59R/K122R) 2 × 20k 531
FGF21(모든 K를 모두 R로, R72K) 2 × 20k >1000
FGF21(모든 K를 모두 R로, R175K) 2 × 20k >1000
실시예 10.C
2개의 돌연변이를 포함하는 선택된 페길화된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드에 대한 EC50 값
2개의 돌연변이를 포함하는 다수의 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드의 활성을 본원에 기술된 ERK-루시페라제 검정으로 조사하였다. 이들 돌연변이체는 야생형 FGF21 서열에 (시스테인 잔기의 형태의) 2개의 비-천연 발생 중합체 부착 부위 및 증진된 단백질분해 안정성을 제공하는 1개의 돌연변이 (P171G)를 도입하도록 조작되었다.
다양한 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 생성하고 본원에 기술된 시험관내 ELK-루시페라제 검정으로 활성을 측정하였다. 이들 실험으로부터의 EC50 값이 하기 표 11에 나타나 있다.
2개의 돌연변이를 포함하는 선택된 화학적 변형 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드에 대한 EC50 값
돌연변이 EC50
(nM)
천연 FGF21 3
N-말단 PEG20K 37
E37C, R77C 21
G120C, H125C 23
R77C, E91C 26
R77C, H125C 30
E91, H125C 32
R77C, G120C 34
E37C, E91C 36
E91C, R175C 46
E37C, R175C 50
E91C, G120C 54
E37C, G120C 55
R77C, R175C 62
E37C, H125C 64
E37C, K69C 67
K69C, E91C 69
G120C, R175C 118
K69C, G120C 119
K69C, H125C 164
K69C, R77C 180
H125C, R175C 200
K69C, R175C 318
E37C, G170C 163
동시에, 이중-페길화된 FGF21 돌연변이체를, 실시예 10A로부터 유도된 단일 시스테인 돌연변이체를 사용할 뿐 아니라, 안정성 증진 P171G 돌연변이를 도입하여 제조하였다. 이들 돌연변이체는 전술된 바와 같이 혼식 페길화 화학을 이용하여 N-말단 및 조작된 시스테인 모두에서 부위-선택적으로 페길화되었다 (U.S. 특허 제6,420,339호 참조). 혼식 페길화 화학은 N-말단과 시스테인 컨주게이션 부위를 구분하므로, 상이한 부위에 대한 상이한 중합체의 부위-선택적 커플링이 가능하다. 이러한 경우에 있어, 5kDa, 10kDa 및 20kDa 중합체 배합물이 N-말단에 커플링되고 20kDa 중합체가 시스테인 돌연변이체에 일관되게 커플링된 일련의 컨주게이트를 제조하였다. 이는 FGF21 시험관내 활성에 대한 N-말단 페길화의 영향 평가를 가능하게 하였다. 이들 컨주게이트는 본원에 기술된 시험관내 ELK-루시페라제 검정으로 모두 시험되었다. 결과가 표 12에 제시된다.
시스테인 돌연변이 및 P171G 돌연변이를 포함하는 선택된 화학적 변형 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드에 대한 EC50 값
돌연변이 PEG 유형 EC50 (nM)
R77C, P171G 2 × 20k 64
H125C, P171G 2 × 20k 152
H125C, P171G 1 × 10k, 1 × 20k 65
H125C, P171G 1 × 5k, 1 × 20k 30
실시예 10.D
3개의 돌연변이를 포함하는 선택된 화학적 변형 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드에 대한 EC50 값
3개의 돌연변이를 포함하는 다수의 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드의 활성을 본원에 기술된 ERK-루시페라제 검정으로 조사하였다. 이들 돌연변이체는 야생형 FGF21 서열에 (시스테인 잔기의 형태의) 2개의 비-천연 발생 중합체 부착 부위 및 증진된 단백질분해 안정성을 제공하는 1개의 돌연변이 (P171G)를 도입하도록 조작되었다.
다양한 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 생성하였으며, 본원에서 기술된 시험관내 ELK-루시페라제 검정으로 활성을 측정하였다. 표 13은 수득된 자료를 요약한다:
3개의 돌연변이를 포함하는 선택된 화학적 변형 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드에 대한 EC50 값
돌연변이 PEG 유형 EC50 (nM)
E37C, R77C, P171G 2X 20 kDa 27
E91, H125C , P171G 2X 20 kDa 37
R77C, G120C , P171G 2X 20 kDa 35
E37C, E91C , P171G 2X 20 kDa 30
E91C, R175C , P171G 2X 20 kDa 155
E37C, R175C , P171G 2X 20 kDa 162
E91C, G120C , P171G 2X 20 kDa 34
E37C, G120C , P171G 2X 20 kDa 35
R77C, R175C , P171G 2X 20 kDa ND
E37C, H125C , P171G 2X 20 kDa 37
놀랍게도, 자료는 이들 이중-페길화된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 중 다수가 N-말단 모노-페길화된 분자를 능가하는 활성을 갖는다는 것을 나타낸다.
실시예 11
선택된 FGF21 결박된 분자에 대한 EC50 값
본 발명의 결박된 분자는 링커 분자로 함께 묶인 2개의 FGF21 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 도 7은 결박된 분자의 일례를 그래프로 도시한다. 본원에 기술된 바와 같이, 이들 결박된 분자는 보다 긴 반감기를 제공하고, 여전히 바람직한 수준의 생물학적 활성을 보유하는 것으로 예상되었다.
다양한 결박된 분자를 생성하고, 본원에 기술된 시험관내 ELK-루시페라제 검정으로 활성을 측정하였다. 생성된 결박된 분자는 돌연변이가 링커 부착 부위를 도입하는 FGF21 돌연변이체를 포함한다. FGF21 돌연변이체 중 수개는 이중 돌연변이체였으며, 단백질분해 안정성을 증진시키기 위한 P171G 돌연변이를 포함한다. 이러한 시험관내 조사를 위한 조건 및 절차는 실시예 10에 기술된 것과 동일하다. 표 14는 수득된 자료를 요약한다:
선택된 FGF21 결박된 분자에 대한 EC50 값
돌연변이 링커 EC50 (nM)
H125C, P171G 20 kDa PEG 0.21
R77C, P171G 20 kDa PEG 0.25
G120C, P171G 20 kDa PEG 0.51
E37C, P171G 20 kDa PEG 0.36
R175C, P171G 20 kDa PEG 0.36
E91C, P171G 20 kDa PEG 0.20
G170C 20 kDa PEG 0.47
P171C 20 kDa PEG 0.21
표 14의 자료로부터 결박된 분자가 참고로 0.63으로 측정된 비페길화된 분자의 시험관내 활성과 동일하거나 능가하는 놀랍도록 높은 시험관내 활성을 갖는 것을 알 수 있다.
실시예 12
화학적-변형 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드의 생체내 활성
FGF21은 혈당, 인슐린, 트리글리세라이드 또는 콜레스테롤 수준을 낮추거나; 체중을 감소시키거나; 글루코즈 내성, 에너지 소모 또는 인슐린 민감성을 개선하는 능력을 비롯한 다수의 생물학적 활성을 보유한다. 페길화된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 실시예 10에 기술된 최초 시험관내 평가 후, 생체내 FGF21 활성에 대해 더욱 분석하였다. 페길화된 FGF21 폴리펩타이드를 인슐린 내성 ob/ob 마우스에 도입하고, 특정 페길화된 FGF21 폴리펩타이드의 혈당 저하능을 측정하였다. 생체내 작업에 대한 절차는 하기와 같다.
시험될 페길화된 FGF21 폴리펩타이드를 8주령의 ob/ob 마우스 (Jackson Laboratory)에 복강내 주사하고, 단일 주사 후 다양한 시점에서, 예를 들어 주사한 지 0, 6, 24, 72, 120, 및 168시간 후 혈액 샘플을 취하였다. 혈당 수준은 OneTouch Glucometer (LifeScan, Inc. Milpitas, CA)로 측정하고, 결과는 기선 수준의 혈당 (즉, 시간 0에서의 혈당)에 대해 상대적인 혈당 변화율 (％)로서 나타내었다.
FGF21 돌연변이체를 본원에 기술된 바와 같이 생성하였으며, 전형적으로 시스테인 잔기인 도입된 중합체 부착 부위 각각에 하나씩 2개의 20kDa 메톡시 PEG 말레이미드 분자를 첨가하여 화학적으로 변형시켰다. 2개의 PEG 분자에 대해 분리된 공지의 부착 포인트를 제공하도록 돌연변이를 선택하였다. FGF21 돌연변이체의 페길화는 본원에 기술된 방법을 이용하여 수행하였다.
실시예 12.A
N-말단 페길화된 야생형 FGF21 의 생체내 활성
폴리펩타이드의 N-말단에서 페길화에 의해 화학적으로 변형된 야생형 FGF21을 ob/ob 마우스 모델에서 조사하였다. 또한, 비-페길화된 야생형 FGF21을 동일한 실험으로 조사하고, PBS를 대조군으로 이용하였다. 단일 20kDa 메톡시 PEG 말레이미드 분자를 야생형 FGF21을 N-말단 페길화하는데 사용하였다. 도 8은 이러한 실험 결과를 나타낸다.
천연 및 N-말단 페길화된 야생형 FGF21 모두 단일 주사 후 혈당 수준을 30 내지 40％ 낮추었다. 그러나, 천연 야생형 FGF21을 주사한 지 24시간 후 혈당 수준은 기선으로 복귀하였다. 이와는 대조적으로 N-말단 페길화된 야생형 FGF21은 적어도 72시간 동안 지연된 혈당 저하 활성을 갖는다. 이러한 조사 결과는 야생형 FGF21의 페길화가 천연 분자의 약력학적 효과를 지속시킨다는 것을 나타낸다.
도 9와 관련하여, 20, 30 또는 40kDa PEG 분자로 N-말단에서 페길화된 야생형 FGF21을 사용하여 ob/ob 마우스 모델에서 용량 반응 조사를 수행하였다. 도 9는 30 및 40kDa PEG 분자가 20kDa PEG 분자와 비교하여 더욱 크고 더욱 긴 글루코즈 저하 효능을 갖는다는 것을 입증하며, 이는 PEG 크기가 생체내 약력학적 효과와 긍정적으로 관련된다는 것을 제시한다.
실시예 12.A.1
N-말단 및 도입된 중합체 부착 부위 둘다에 컨주게이션된 , 선택된 화학적 변형 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드의 생체내 활성
N-말단 및 제2의 조작된 부위 모두에서 부위-선택적으로 페길화된 FGF21에 대한 수개의 화학적으로 변형된 돌연변이체를 마우스 ob/ob 모델에서 조사하였다. 이들 이중-페길화된 FGF21 구조물은 N-말단 및 실시예 4에 기술된 바와 같이 조작된 리신 또는 실시예 6에 기술된 바와 같이 조작된 시스테인을 포함하는 제2 부위에서 모두 페길화되었다.
유사한 실험을 상이한 그룹의 페길화된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 사용하여 수행하였다. 도 10은 비히클 (PBS), 또는 중합체 부착 돌연변이를 포함하는 페길화된 형태의 FGF21 돌연변이체, 즉 FGF21 R77C (또한 N-말단 페길화됨), 및 FGF21 R126K (또한 N-말단 페길화됨) (상단 플롯), 및 N-말단 페길화된 F77/P171G (또한 도입된 중합체 부착 부위에서 페길화됨) (하단 플롯)이 주사된 마우스의 혈당 수준 변화율 (％)을 나타내는 2개의 플롯을 포함한다. 20kDa 메톡시 PEG 말레이미드 분자가 사용되었다. 이 실험 결과는 이중 페길화된 FGF21 돌연변이체가 적어도 120시간의 지연된 글루코즈-저하와 함께 야생형 FGF21과 비교하여 증진된 약력학을 나타낸다는 것을 재차 확증한다.
실시예 12.B
2개 또는 3개의 돌연변이를 포함하는 선택된 화학적 변형 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드의 생체내 활성
다수의 화학적으로 변형된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 마우스 ob/ob 모델에서 조사하였다. 이들 돌연변이체는 도입된 시스테인 잔기에 하나씩 2개의 20kDa 메톡시 PEG 말레이미드 분자를 첨가함으로써, 단일 돌연변이를 포함하는 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드의 경우에는 폴리펩타이드의 N 말단에서 화학적으로 변형되었다. 하나 이상의 PEG 분자에 대한 분리된 공지의 부착 포인트를 제공하도록 돌연변이를 선택하였다. 일부 FGF21 돌연변이체는 또한 단백질분해 내성을 증진시키기 위해 P171G 돌연변이를 포함하였다. 페길화된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 마우스에 주사하고, 9일의 조사 동안 간격을 두고 채혈하였다.
실시예 12.B.1
혈당에 대한 영향
또 다른 그룹의 페길화된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 사용하여 실험을 수행하였다. 도 11은 비히클 (PBS), 또는 돌연변이를 포함하는 FGF21 돌연변이체의 이중 페길화된 형태, 즉 E91/H125C, E91C/R175C, E37C/G120C, E37C/H125C, E37C/R175C로 주사된 마우스의 혈당 변화율 (％)을 나타내는 플롯이며; 비페길화된 Fc-G170E FGF21도 조사하였다. 20kDa 메톡시 PEG 말레이미드 분자가 사용되었다. 이 실험 결과는 이중 페길화된 FGF21 돌연변이체가 야생형 FGF21 단백질에 비해 증진된 약력학을 나타낸다는 것을 재차 확증한다.
유사한 실험을 또 다른 그룹의 페길화된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 사용하여 수행하였다. 도 12는 비히클 (PBS), 또는 돌연변이를 포함하는 FGF21 돌연변이체의 이중 페길화된 형태, 즉 N-말단 페길화된 R77C (또한 도입된 중합체화 부위에서 페길화됨), N-말단 페길화된 R126K (또한 도입된 중합체화 부위에서 페길화됨), E91/G120C, G120C/H125C, 및 E37C/R77C로 주사된 마우스의 혈당 수준 변화율 (％)을 나타내는 플롯이며; 비페길화된 Fc-G170E FGF21도 조사되었다. 20kDa 메톡시 PEG 말레이미드 분자가 사용되었다. 이 실험 결과는 이중 페길화된 FGF21 돌연변이체가 야생형 FGF21 단백질에 비해 증진된 약력학을 나타낸다는 것을 확증한다.
또 다른 실험에서, 도 13은 9일의 조사 기간 동안 마우스의 혈당 수준에 대한 페길화된 FGF21 돌연변이체의 영향을 나타낸다. 이 자료는 페길화된 분자가 천연 분자의 생체내 효능과 비교하여 증진된 생체내 효능을 갖는다는 것을 증명한다. 도 13에서, 결과는, 도입된 중합체 부착 부위에서 이중으로 페길화된, 페길화된 E37C/R77C, E91C/R175C, E37C/H125C, E37C/R77C/P171G, E91C/R175C/P171G, 및 E37C/H125C/P171G FGF21 돌연변이체에 대한 것이다. 본 조사에서 FGF21 돌연변이체는 2개의 20kDa 메톡시 PEG 말레이미드 분자로 변형되었으며, 사용된 비히클은 10 mM 인산칼륨, 5％ 소르비톨 (pH 8)이었다.
도 13에 나타난 바와 같이, 3개의 이중 돌연변이 이중 페길화된 분자 E37C/R77C; E91C/R175C; E37C/H125C는 혈당 수준을 감소시켰으며, 그 효과는 단일 주사 후 72시간 동안 유지되었다. 흥미롭게도, P171G 돌연변이 도입은 생체내 작용을 더욱 연장시켰으며, 최대 글루코즈-저하 활성이 총 120시간의 작용 지속과 함께 추가의 2일 동안 유지되었다.
또한, 3개의 돌연변이를 포함하는 수개의 FGF21 폴리펩타이드의 글루코즈 저하 능력을 수개의 결박된 분자를 사용하여 조사하였다. 사용된 3중 돌연변이체는 E37C/R77C/P171G 및 E91C/H125C/P171G이었으며; 결박된 분자는 2개의 돌연변이를 포함하는 2개의 동일한 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드, 즉 E37C/P171G 및 R77C/P171G를 포함하였다. FGF21의 이중 페길화된 형태 및 결박된 분자의 링커 분자에 대해 20kDa 메톡시 PEG 말레이미드 분자가 사용되었다. 본 실험 결과가 도 14에 나타나 있다. 결박된 FGF21 돌연변이체와 비교하여, 이중 페길화된 돌연변이체는 더욱 증직된 약력학을 가진다. 이중 페길화된 돌연변이체의 글루코즈 저하 활성은 결박된 FGF21 돌연변이체의 120시간과 비교하여 적어도 168시간 동안 유지되었다.
도 15는 9일의 기간 동안 비히클 (10 mM TRIS, 150 mM NaCl, pH 8.5) 또는 상이한 용량의 이중 페길화된 E37C/R77C/P171G FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드로 주사된 ob/ob 마우스에서 용량의 함수로서 혈당 변화율 (％)을 나타내는 플롯이다. 본 실험의 결과는 이중으로 페길화된 3중 돌연변이체 E37C/R77C/P171G가 용량-의존적 방식으로 ob/ob 마우스에서 혈당 수준을 감소시켰다는 것을 입증한다. 0.3 mg/kg의 용량 수준이 거의 최대의 글루코즈-저하 활성에 도달했으며, 효과는 적어도 5일 동안 유지되었다. 용량 수준을 1 mg/kg으로 증가시킬 때 더욱 증진된 생체내 효능 및 작용 지속이 관측되었다.
실시예 12.B.2
체중에 대한 영향
제2형 당뇨병은 종종 증가된 비만증 및 체중을 동반한다. 따라서, 치료학적 분자는 바람직하게는 체중 감소의 바람직한 효과 및 혈당 수준 저하의 바람직한 효과를 가질 것이다. 따라서, 본원에 기술된 많은 페길화된 FGF21 돌연변이체를 마우스 체중에 대한 영향에 대해 평가하였다.
체중에 대한 다양한 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드의 영향을 조사하기 위해서, 페길화된 야생형 및 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 8주령의 ob/ob 마우스 (Jackson Laboratory)에 복강내 주사하고, 단일 주사 후 다양한 시점에서, 예를 들어 주사한 지 0, 24, 72, 120, 및 168시간 후 체중을 모니터링하였다.
도 16은 조사 기간 동안 마우스의 체중에 대한 페길화된 FGF21 돌연변이체의 영향을 나타낸다. 이중으로 페길화된 E37C/R77C, E91C/R175C, E37C/H125C, E37C/R77C/P171G, E91C/R175C/P171G, 및 E37C/H125C/P171G FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 사용하여 결과를 얻었다. 본 조사에서 FGF21 돌연변이체는 20kDa 메톡시 PEG 말레이미드 분자로 변형되었다. 이들 FGF21 돌연변이체를 또한 글루코즈 수준의 변화에 대해 조사하였으며, 그 결과가 도 13에 나타나 있다. 종합하면, 이 자료는 페길화된 FGF21 돌연변이체를 수용한 마우스가 비히클 대조군에 비해 체중이 덜 늘고, 단백질분해 내성 돌연변이 P171G를 포함하는 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드가 P171 야생형 카운터파트보다 더욱 효과적이라는 것을 입증한다.
도 17은 비히클, 또는 돌연변이를 포함하는 FGF21 돌연변이체의 이중으로 페길화된 형태, 즉 E37C/R77C/P171G; E91C/H125C/P171G; R77C/P171G; 및 하나의 경우에서는 2개의 E37C/P171G FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 포함하고 다른 경우에서는 2개의 R77C/P171G FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 포함하는 결박된 분자로 주사된 마우스의 체중 변화를 나타내는 플롯이다. FGF21의 페길화된 형태에서는 20kDa 메톡시 PEG 말레이미드 분자가 사용되고, 결박된 분자에서는 20kDa PEG 비스-말레이미드가 사용되었다. 이들 FGF21 돌연변이체를 또한 혈당 수준 변화에 대해 조사하였으며, 그 결과가 도 14에 나타나 있다. 이를 종합하면, 이 자료는 페길화된 FGF21 돌연변이체를 수용한 마우스가 비히클 대조군에 비해 체중이 덜 늘고, 이중으로 페길화된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드가 조사된 결박된 분자보다 체중 감소에 더욱 효과적이라는 것을 입증한다.
또한, 체중에 대한 이중으로 페길화된 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드의 영향을 다수-용량 조사로 시험하였다. 도 18은 9일 동안 비히클 또는 상이한 용량의 이중으로 페길화된 E37C/R77C/P171G로 주사된 ob/ob 마우스에서 용량의 함수로서 체중 변화를 나타내는 플롯이다. 이러한 FGF21 돌연변이체를 또한 혈당 변화에 대해 조사하였드며, 그 결과가 도 15에 나타나 있다. 종합하면, 이 자료는 0.3 mg/kg의 용량 수준이 단일 주사 후 ob/ob 마우스에서 체중 증가를 저하시키는데 충분하다는 것을 입증한다.
실시예 13
뮤린 신장 공포 조사
치료학적 단백질의 반감기를 연장시키기 위해 PEG 및 다른 중합체를 사용하는 것에 대한 하나의 고려사항은 페길화된 분자가 신장 공포를 형성할 것이라는 가능성이다. PEG의 이러한 특성은 익히 공지되어 있으며 (Bendele, et al 1998, "Short Communication: Renal Tubular Vacuolation in Animals Treated with Polyethylene-glycol-conjugated Proteins", Toxicological Sciences, 42:152-157 and Conover et al., 1996, "Transitional Vacuole Formation Following a Bolus Infusion of PEG-hemoglobin in the Rat", Art . Cells , Blood Subs ., and Immob . Biotech. 24:599-611), 예측이 불가능할 수 있다. 전형적으로 신장 공포 형성을 유도하는 페길화된 분자는, 반드시는 아니나, 분자를 치료학적 단백질로서 덜 바람직하게 한다. 일부 환경에서, 신장 공포화는 덜 우려되며 묵인될 수 있다. 따라서, 마우스에서 장기간 신장 공포 조사가 수행되었다.
FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 본원에 기술된 바와 같이 생성하였다. 하나의 조사를 하기와 같이 디자인하고, 수행하였다. 다수의 페길화된 FGF21 분자를 C57BL/6 암컷 마우스 (3마리/그룹)에 10 mg/kg의 용량으로 피하 주사를 통해 연속된 7일 동안 1일 1회씩 투여하였다. 비히클 대조군 (10 mM KHPO4, 150 mM NaCl, pH 8) 및 2개의 양성 대조군도 동일한 방식으로 투여되었다. 상세한 임상 관측을 각각의 용량 투여 전 및 1, 3 및 6일에 투여 후 1 내지 2시간 후에 모든 동물에 대해 수행하였으며, 우리-측 (cage-side) 관측을 모든 다른 투여일에 투여한 지 1 내지 2시간 후 수집하였다. 각각의 용량 투여 전 및 부검시 체중을 수집하였다. 조직학적 평가를 위해 모든 동물로부터 신장 및 간을 수집하였다. 표 15는 조사 결과를 요약한다.
신장 공포 조사의 요약
분자 신장 간
비히클 0.0 0.0
양성 대조군 3.7 0.0
FGF21-1X-NT(PEG20K) 2.0 0.0
H126C 1X-PEG20K 2.3 0.0
R78C 1X-PEG20K 2.3 0.0
K70C 1X-PEG20K 2.0 0.0
G121C 1X-PEG20K 2.0 0.0
E38C 1X-PEG20K 2.0 0.0
R176C 1X-PEG20K 3.0 0.0
E92C 1X-PEG20K 2.7 0.0
N122C 1X-PEG20K 2.0 0.0
R127C 1X-PEG20K 3.0 0.0
G114C 1X-PEG20K 2.7 0.0
D80C 1X-PEG20K 2.0 0.0
D47C 1X-PEG20K 3.0 0.0
H112C 1X-PEG20K 2.6 0.0
K56R, K59R, K69R, K122R, R175K 2X-PEG20K 0.0 0.0
K56R, K59R, K69R, K122R, R77K 2X-PEG20K 0.0 0.0
K56R, K59R, K69R, K122R, R72K 2X-PEG20K 0.0 0.0
표 15는 비히클 (10 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8.5), N-말단 페길화된 형태의 FGF21, 및 돌연변이 H125C, R77C, K69C, G120C, E37C, R175, E91C, N121C, R126C, G113C, D79C, D46C 및 H112C를 포함하는 페길화된 형태의 FGF21 돌연변이체를 사용하여 수행된 7일의 뮤린 공포 조사 결과는 나타낸다. 표에 나타난 바와 같이 1개 또는 2개의 20kDa 메톡시 PEG 말레이미드 분자가 사용되었다. 공포 지수는 0 (대조군과 비교하여 공포 변화가 관측되지 않음) 내지 4 (심각한 공포 형성)의 범위이다. 표 15로부터 명백한 바와 같이, 모노-페길화된 FGF21 돌연변이체는 모두 신장 공포 형성을 유도하였다. 그러나, 이중-페길화된 FGF21 돌연변이체는 어떠한 것도 공포 형성을 유도하지 않았다. 또한, 마우스의 간에서는 어떠한 공포도 관측되지 않았다.
1주일 조사 후, 8주의 장기간 조사를 수행하였다. 이 조사에서, 다양한 페길화된 FGF21 분자가 5 또는 25 mg/kg의 용량으로 C57BL/6 암컷 마우스 (5마리/그룹)에 8주 동안 피하 주사를 통해 매주 1회씩 투여되었으며; 비히클 대조군 (10 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8.5)도 동일한 방식으로 투여되었다. 모든 동물들을 투여 전 1일 1회씩, 투여일에는 투여한 지 1 내지 2시간 후, 비투여일에는 1일 1회씩 임상 징후를 관측하였다. 체중을 1일째 각각의 용량 투여 개시 전 및 이어서 각각의 투여 후 제3일 및 부검시 수집하였다. 신장, 간 및 비장을 조직학적 평가를 위해 모든 동물 (빈사 희생 및 최종 안락사)로부터 수집하였다.
도 19a 내지 19f는 비히클 (■) 및 2개 용량의 이중 페길화된 FGF21 돌연변이체, 즉 5 mg/kg (▲) 및 25 mg/kg (○)을 사용하여 8주의 신장 공포 조사 동안 관측된 체중 변화 결과를 나타내는 일련의 플롯이다. 조사된 FGF21 돌연변이체는 R77C, P171G (도 19a); E37C, R77C, P171G (도 19b); E37C, H125C, P171G (도 19c); E91C, H125C, P171G (도 19d); E37C, P171G (도 19e) 및 R77C, P171G (도 19f)를 포함한다. 도 19a에서, FGF21 돌연변이체의 N-말단 페길화 및 도입된 중합체 부착 부위 (77에서 비-천연 발생 시스테인)에서 페길화를 유도하는 혼식 화학 접근법을 이용하였다. 도 19b 내지 19d에서는, 비-천연 발생 시스테인 잔기 (도 19b에서는 위치 37 및 77에 시스테인 잔기, 도 19c에서는 위치 37 및 125에 시스테인 잔기, 도 19d에서는 위치 91 및 125에 시스테인 잔기)인 도입된 중합체 도입 부위에서 페길화를 유도하는 단일 화학 접근법을 이용하였다. 마지막으로, 도 19d 및 19e에서는, 비-천연 발생 시스테인 잔기 (도 19e에서는 위치 37의 시스테인, 도 19f에서는 위치 77에서의 시스테인)에서 2개의 FGF21 돌연변이체를 함께 연결하는데 단일 비스 말레이미드 PEG를 사용하였다.
도 20은 2개 용량 (5 및 25 mg/kg)의 6개의 단일 또는 이중 페길화된 FGF21 돌연변이체에 대한 8주 신장 공포 조사 동안 관측된 신장 공포의 평균 스코어를 나타내는 2개의 막대 그래프를 포함한다. 스코어 0은 대조군 동물에서 나타나는 것 보다 많은 공포가 관측되지 않았음을 나타내고, 스코어 4는 대조군에 비해 심각한 공포 형성을 나타낸다. FGF21 돌연변이체는 도 19a 내지 19e에 기술된 것과 동일하였다. 따라서, 하나의 구조물에 대해 FGF21 돌연변이체의 N-말단 페길화 및 도입된 중합체 부착 부위 (77에서 비-천연 발생 시스테인)에서 페길화를 유도하는 혼식 화학 접근법을 이용하였다. 비-천연 발생 시스테인 잔기 (제1 구조물에서는 위치 37 및 77에 시스테인 잔기, 제2 구조물에서는 위치 37 및 125에 시스테인 잔기, 제3 구조물에서는 위치 91 및 125에 시스테인 잔기)인 도입된 중합체 도입 부위에서 페길화를 유도하는 단일 화학 접근법을 이용하였다. 마지막으로, 비-천연 발생 시스테인 잔기 (위치 37 또는 위치 77에서의 시스테인)에서 2개의 FGF21 돌연변이체를 함께 연결하는데 단일 비스 말레이미드 PEG를 사용하였다. P171G 돌연변이는 6개의 구조물 각각에 도입되었다.
본 발명을 다양한 구체예를 예시하여 기술하였으나, 당업자라면 변화 및 변경될 것이라는 것을 알 수 있다. 따라서, 첨부된 청구항은 본 발명의 범위에 속하는 모든 이러한 등가의 변형들을 포함한다. 또한, 본원에 사용된 표제는 단지 조직상의 것으로서, 기술된 주제를 제한하는 것이 아니다.
본원에 인용된 모든 참조문은 명백히 참조로 본원에 삽입된다.
SEQUENCE LISTING <110> WALKER, Kenneth W. GEGG, Jr. , Colin V. HECHT, Randy I. BELOUSKI, Edward J. LI, Yue-Sheng MICHAELS, Mark L. XU, Jing ELLISON, Murielle M. <120> FGF21 MUTANTS AND USES THEREOF <130> A-1451-US-PSP <140> 61/195761 <141> 2008-10-10 <160> 34 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 630 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atggactcgg acgagaccgg gttcgagcac tcaggactgt gggtttctgt gctggctggt 60 cttctgctgg gagcctgcca ggcacacccc atccctgact ccagtcctct cctgcaattc 120 gggggccaag tccggcagcg gtacctctac acagatgatg cccagcagac agaagcccac 180 ctggagatca gggaggatgg gacggtgggg ggcgctgctg accagagccc cgaaagtctc 240 ctgcagctga aagccttgaa gccgggagtt attcaaatct tgggagtcaa gacatccagg 300 ttcctgtgcc agcggccaga tggggccctg tatggatcgc tccactttga ccctgaggcc 360 tgcagcttcc gggagctgct tcttgaggac ggatacaatg tttaccagtc cgaagcccac 420 ggcctcccgc tgcacctgcc agggaacaag tccccacacc gggaccctgc accccgagga 480 ccagctcgct tcctgccact accaggcctg ccccccgcac ccccggagcc acccggaatc 540 ctggcccccc agccccccga tgtgggctcc tcggaccctc tgagcatggt gggaccttcc 600 cagggccgaa gccccagcta cgcttcctga 630 <210> 2 <211> 209 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Asp Ser Asp Glu Thr Gly Phe Glu His Ser Gly Leu Trp Val Ser 1 5 10 15 Val Leu Ala Gly Leu Leu Leu Gly Ala Cys Gln Ala His Pro Ile Pro 20 25 30 Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr 35 40 45 Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg 50 55 60 Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu 65 70 75 80 Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val 85 90 95 Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly 100 105 110 Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu 115 120 125 Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu 130 135 140 His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly 145 150 155 160 Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Pro Pro Glu 165 170 175 Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp 180 185 190 Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala 195 200 205 Ser <210> 3 <211> 546 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 caccccatcc ctgactccag tcctctcctg caattcgggg gccaagtccg gcagcggtac 60 ctctacacag atgatgccca gcagacagaa gcccacctgg agatcaggga ggatgggacg 120 gtggggggcg ctgctgacca gagccccgaa agtctcctgc agctgaaagc cttgaagccg 180 ggagttattc aaatcttggg agtcaagaca tccaggttcc tgtgccagcg gccagatggg 240 gccctgtatg gatcgctcca ctttgaccct gaggcctgca gcttccggga gctgcttctt 300 gaggacggat acaatgttta ccagtccgaa gcccacggcc tcccgctgca cctgccaggg 360 aacaagtccc cacaccggga ccctgcaccc cgaggaccag ctcgcttcct gccactacca 420 ggcctgcccc ccgcaccccc ggagccaccc ggaatcctgg ccccccagcc ccccgatgtg 480 ggctcctcgg accctctgag catggtggga ccttcccagg gccgaagccc cagctacgct 540 tcctga 546 <210> 4 <211> 181 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val 1 5 10 15 Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His 20 25 30 Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser 35 40 45 Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln 50 55 60 Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly 65 70 75 80 Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg 85 90 95 Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His 100 105 110 Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro 115 120 125 Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro 130 135 140 Ala Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val 145 150 155 160 Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser 165 170 175 Pro Ser Tyr Ala Ser 180 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Linker Sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(2) <223> X IS INDEPENDENTLY ANY AMINO ACID RESIDUE <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(5) <223> X IS INDEPENDENTLY ANY AMINO ACID RESIDUE <400> 5 Xaa Xaa Asn Xaa Xaa Gly 1 5 <210> 6 <211> 4 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Linker Sequence <400> 6 Gly Gly Gly Gly 1 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Linker Sequence <400> 7 Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 8 <211> 5 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Linker Sequence <400> 8 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Linker Sequence <400> 9 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 10 <211> 25 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Linker Sequence <400> 10 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 <210> 11 <211> 6 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Linker Sequence <400> 11 Gly Gly Glu Gly Gly Gly 1 5 <210> 12 <211> 8 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Linker Sequence <400> 12 Gly Gly Glu Glu Glu Gly Gly Gly 1 5 <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Linker Sequence <400> 13 Gly Glu Glu Glu Gly 1 5 <210> 14 <211> 4 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Linker Sequence <400> 14 Gly Glu Glu Glu 1 <210> 15 <211> 6 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Linker Sequence <400> 15 Gly Gly Asp Gly Gly Gly 1 5 <210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Linker Sequence <400> 16 Gly Gly Asp Asp Asp Gly Gly 1 5 <210> 17 <211> 5 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Linker Sequence <400> 17 Gly Asp Asp Asp Gly 1 5 <210> 18 <211> 4 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Linker Sequence <400> 18 Gly Asp Asp Asp 1 <210> 19 <211> 21 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Linker Sequence <400> 19 Gly Gly Gly Gly Ser Asp Asp Ser Asp Glu Gly Ser Asp Gly Glu Asp 1 5 10 15 Gly Gly Gly Gly Ser 20 <210> 20 <211> 5 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Linker Sequence <400> 20 Trp Glu Trp Glu Trp 1 5 <210> 21 <211> 5 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Linker Sequence <400> 21 Phe Glu Phe Glu Phe 1 5 <210> 22 <211> 6 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Linker Sequence <400> 22 Glu Glu Glu Trp Trp Trp 1 5 <210> 23 <211> 6 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Linker Sequence <400> 23 Glu Glu Glu Phe Phe Phe 1 5 <210> 24 <211> 7 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Linker Sequence <400> 24 Trp Trp Glu Glu Glu Trp Trp 1 5 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Linker Sequence <400> 25 Phe Phe Glu Glu Glu Phe Phe 1 5 <210> 26 <211> 6 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Linker Sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(2) <223> X IS INDEPENDENTLY ANY AMINO ACID RESIDUE <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(5) <223> X IS INDEPENDENTLY ANY AMINO ACID RESIDUE <400> 26 Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Gly 1 5 <210> 27 <211> 6 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Linker Sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(2) <223> X IS INDEPENDENTLY ANY AMINO ACID RESIDUE <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(5) <223> X IS INDEPENDENTLY ANY AMINO ACID RESIDUE <400> 27 Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Gly 1 5 <210> 28 <211> 6 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Linker Sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(2) <223> X IS INDEPENDENTLY ANY AMINO ACID RESIDUE <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(5) <223> X IS INDEPENDENTLY ANY AMINO ACID RESIDUE <400> 28 Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Gly 1 5 <210> 29 <211> 27 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Primer Sequence <400> 29 atggtggaac cttcccaggg ccgaagc 27 <210> 30 <211> 50 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Primer Sequence <400> 30 ctcctcggac cctctgagca tggtgggacc ttcccagggc cgaagcccca 50 <210> 31 <211> 50 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Primer Sequence <400> 31 gaggagcctg ggagactcgt accaccctgg aagggtcccg gcttcggggt 50 <210> 32 <211> 30 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Primer Sequence <400> 32 ggaaggttcc accatgctca gagggtccga 30 <210> 33 <211> 40 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Primer Sequence <400> 33 aggaggaata acatatgcat ccaattccag attcttctcc 40 <210> 34 <211> 33 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Primer Sequence <400> 34 tagtgagctc gaattcttag gaagcgtagc tgg 33

Claims (85)

  1. 위치 36의 아르기닌 잔기의 리신 잔기로의 치환, 및 위치 56, 59, 69 또는 122의 리신 잔기의 아르기닌 잔기로의 치환인 하나 이상의 치환을 갖는 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자.
  2. 제1항의 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 폴리펩타이드의 발현에 적합한 조건 하에서 배양하고, 임의로 폴리펩타이드를 분리하는 것을 포함하는, 제1항의 핵산 분자를 포함하는 벡터에 의해 암호화된 폴리펩타이드를 생성하는 방법.
  3. 제2항의 방법에 의해 생성된 폴리펩타이드.
  4. 제3항에 있어서, C-말단에 첨가된 프롤린 또는 글리신 잔기를 추가로 포함하는 폴리펩타이드.
  5. 위치 36의 아르기닌 잔기의 리신 잔기로의 치환, 및 위치 56, 59, 69 또는 122의 리신 잔기의 아르기닌 잔기로의 치환인 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩타이드.
  6. 제5항에 있어서, C-말단에 첨가된 프롤린 또는 글리신 잔기를 추가로 포함하는 분리된 폴리펩타이드.
  7. 제5항에 있어서, 하나 이상의 중합체에 공유적으로 연결된 분리된 폴리펩타이드.
  8. 제5항에 있어서, 하나의 수용성 중합체에 공유적으로 연결되고, 상기 수용성 중합체가 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜, 덱스트란, 셀룰로즈, 폴리-(N-비닐 피롤리돈) 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올, 또는 폴리비닐 알콜인, 분리된 폴리펩타이드.
  9. 제8항에 있어서, 수용성 중합체가 PEG인 분리된 폴리펩타이드.
  10. 제5항에 있어서, 아미노-말단에 공유적으로 연결된 PEG 잔기를 갖는 분리된 폴리펩타이드.
  11. 제5항에 있어서, 2개의 중합체에 공유적으로 연결되고, 상기 2개의 중합체 중 하나가 수용성 중합체이며, 상기 수용성 중합체가 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜, 덱스트란, 셀룰로즈, 폴리-(N-비닐 피롤리돈) 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올, 또는 폴리비닐 알콜인, 분리된 폴리펩타이드.
  12. 제11항에 있어서, 수용성 중합체가 PEG인 분리된 폴리펩타이드.
  13. 제5항에 있어서, 아미노-말단에 공유적으로 연결된 PEG 잔기를 갖는 분리된 폴리펩타이드.
  14. 제5항의 분리된 폴리펩타이드 및 약제학적으로 허용되는 제형화제를 포함하는, 당뇨병, 비만, 이상지질혈증, 고혈압, 간지방증, 또는 심혈관 질환을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 제형화제가 담체, 아주반트, 가용화제, 안정화제 또는 항산화제인 약제학적 조성물.
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 위치 36의 아르기닌 잔기의 리신 잔기로의 치환, 및 위치 56, 59, 69 또는 122의 리신 잔기의 아르기닌 잔기로의 치환인 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드를 포함하고, 상기 제1 폴리펩타이드는 위치 36의 아르기닌 잔기의 리신 잔기로의 치환, 및 위치 56, 59, 69 또는 122의 리신 잔기의 아르기닌 잔기로의 치환인 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드에 링커를 통해 연결된 것인, 당뇨병, 비만, 이상지질혈증, 고혈압, 간지방증, 또는 심혈관 질환을 치료하기 위한 조성물.
  34. 제33항에 있어서, 제1 폴리펩타이드, 제2 폴리펩타이드 또는 둘 모두가 C-말단에 첨가된 프롤린 또는 글리신 잔기를 추가로 포함하는 것인 조성물.
  35. 제33항에 있어서, 링커가 수용성 중합체이고, 상기 수용성 중합체가 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜, 덱스트란, 셀룰로즈, 폴리-(N-비닐 피롤리돈) 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올, 또는 폴리비닐 알콜인 조성물.
  36. 제33항에 있어서, 제1 폴리펩타이드, 제2 폴리펩타이드 또는 둘 모두가, 링커 이외에, 하나의 수용성 중합체에 추가로 공유적으로 연결되고, 상기 수용성 중합체가 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜, 덱스트란, 셀룰로즈, 폴리-(N-비닐 피롤리돈) 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올, 또는 폴리비닐 알콜인 조성물.
  37. 제36항에 있어서, 수용성 중합체가 PEG인 조성물.
  38. 제33항에 있어서, 제1 폴리펩타이드, 제2 폴리펩타이드 또는 둘 모두가 2개의 중합체에 공유적으로 연결되고, 상기 2개의 중합체 중 하나가 수용성 중합체이며, 상기 수용성 중합체가 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜, 덱스트란, 셀룰로즈, 폴리-(N-비닐 피롤리돈) 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올, 또는 폴리비닐 알콜인 조성물.
  39. 제33항에 있어서, 제1 폴리펩타이드, 제2 폴리펩타이드 또는 둘 모두가 2개의 수용성 중합체에 공유적으로 연결되고, 상기 수용성 중합체가 독립적으로 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜, 덱스트란, 셀룰로즈, 폴리-(N-비닐 피롤리돈) 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올, 또는 폴리비닐 알콜, 또는 이의 배합물인 조성물.
  40. 제33항의 조성물 및 약제학적으로 허용되는 제형화제를 포함하는, 당뇨병, 비만, 이상지질혈증, 고혈압, 간지방증, 또는 심혈관 질환을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  41. 제14항에 있어서, 간지방증이 비-알콜성 지방간염인 약제학적 조성물.
  42. 제14항에 있어서, 심혈관 질환이 죽상동맥경화증인 약제학적 조성물.
  43. 삭제
  44. 삭제
  45. 제33항에 있어서, 간지방증이 비-알콜성 지방간염인 조성물.
  46. 제33항에 있어서, 심혈관 질환이 죽상동맥경화증인 조성물.
  47. 제40항에 있어서, 간지방증이 비-알콜성 지방간염인 약제학적 조성물.
  48. 제40항에 있어서, 심혈관 질환이 죽상동맥경화증인 약제학적 조성물.
  49. 제5항의 분리된 폴리펩타이드 및 약제학적으로 허용되는 제형화제를 포함하는, 글루코즈, 트리글리세라이드 또는 콜레스테롤 수준을 낮추거나, 체중을 감소시키거나, 내당력 또는 인슐린 민감성을 개선하기 위한 약제학적 조성물.
  50. 삭제
  51. 위치 36의 아르기닌 잔기의 리신 잔기로의 치환, 및 위치 56, 59, 69 또는 122의 리신 잔기의 아르기닌 잔기로의 치환인 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드를 포함하고, 상기 제1 폴리펩타이드는 위치 36의 아르기닌 잔기의 리신 잔기로의 치환, 및 위치 56, 59, 69 또는 122의 리신 잔기의 아르기닌 잔기로의 치환인 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드에 링커를 통해 연결된 것인, 글루코즈, 트리글리세라이드 또는 콜레스테롤 수준을 낮추거나, 체중을 감소시키거나, 내당력 또는 인슐린 민감성을 개선하기 위한 조성물.
  52. 제33항의 조성물 및 약제학적으로 허용되는 제형화제를 포함하는, 글루코즈, 트리글리세라이드 또는 콜레스테롤 수준을 낮추거나, 체중을 감소시키거나, 내당력 또는 인슐린 민감성을 개선하기 위한 약제학적 조성물.
  53. 삭제
  54. 삭제
  55. 삭제
  56. 삭제
  57. 삭제
  58. 삭제
  59. 삭제
  60. 삭제
  61. 삭제
  62. 삭제
  63. 삭제
  64. 삭제
  65. 삭제
  66. 삭제
  67. 삭제
  68. 삭제
  69. 삭제
  70. 삭제
  71. 삭제
  72. 삭제
  73. 삭제
  74. 삭제
  75. 삭제
  76. 삭제
  77. 삭제
  78. 삭제
  79. 삭제
  80. 삭제
  81. 삭제
  82. 삭제
  83. 삭제
  84. 삭제
  85. 삭제
KR1020117010559A 2008-10-10 2009-10-08 Ｆｇｆ21 돌연변이체 및 이의 용도 KR101651703B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US19576108P 2008-10-10 2008-10-10
US61/195,761 2008-10-10

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20110093790A KR20110093790A (ko) 2011-08-18
KR101651703B1 true KR101651703B1 (ko) 2016-08-26

Family

ID=41571715

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020117010559A KR101651703B1 (ko) 2008-10-10 2009-10-08 Ｆｇｆ21 돌연변이체 및 이의 용도

Country Status (21)

Country Link
US (2) US9279013B2 (ko)
EP (1) EP2358749B1 (ko)
JP (2) JP5878757B2 (ko)
KR (1) KR101651703B1 (ko)
CN (1) CN102625811B (ko)
AU (1) AU2009302318A1 (ko)
CA (1) CA2739615C (ko)
CL (1) CL2011000792A1 (ko)
CO (1) CO6362020A2 (ko)
CR (1) CR20110245A (ko)
EA (2) EA201990619A1 (ko)
IL (1) IL212061A0 (ko)
MA (1) MA32771B1 (ko)
MX (1) MX341149B (ko)
NZ (1) NZ592009A (ko)
PE (1) PE20120021A1 (ko)
SG (1) SG195542A1 (ko)
TN (1) TN2011000161A1 (ko)
UA (1) UA105016C2 (ko)
WO (1) WO2010042747A2 (ko)
ZA (1) ZA201103356B (ko)

Families Citing this family (68)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8981061B2 (en) 2001-03-20 2015-03-17 Novo Nordisk A/S Receptor TREM (triggering receptor expressed on myeloid cells) and uses thereof
GB0426146D0 (en) 2004-11-29 2004-12-29 Bioxell Spa Therapeutic peptides and method
KR20140012199A (ko) 2007-03-30 2014-01-29 암브룩스, 인코포레이티드 변형된 ｆｇｆ-21 폴리펩티드 및 그 용도
US8420088B2 (en) 2008-01-28 2013-04-16 Novartis Ag Methods and compositions using FGF23 fusion polypeptides
TW200936156A (en) 2008-01-28 2009-09-01 Novartis Ag Methods and compositions using Klotho-FGF fusion polypeptides
JOP20190083A1 (ar) * 2008-06-04 2017-06-16 Amgen Inc بولي ببتيدات اندماجية طافرة لـfgf21 واستخداماتها
EP2358749B1 (en) * 2008-10-10 2018-07-18 Amgen, Inc Fgf21 mutants and uses thereof
MX2011007544A (es) 2009-01-23 2011-08-12 Novo Nordisk As Derivados de factor de crecimiento de fibroblastos 21 (fgf21) con ligante de albumina a-b-c-d-e- y su uso.
WO2011154349A2 (en) * 2010-06-08 2011-12-15 Novo Nordisk A/S Fgf21 analogues and derivatives
US20110195077A1 (en) * 2010-01-29 2011-08-11 Novartis Ag Methods and compositions using fgf23 fusion ppolypeptides
CN103124562A (zh) * 2010-06-08 2013-05-29 诺沃—诺迪斯克有限公司 Fgf21的类似物和衍生物
WO2012010553A1 (en) 2010-07-20 2012-01-26 Novo Nordisk A/S N-terminal modified fgf21 compounds
MX2013002208A (es) 2010-08-23 2013-05-30 Amgen Inc Derivados de sulfonilpiperazina que interactuan con la proteina reguladora de glucocinasa para el tratamiento de diabetes.
US9023791B2 (en) * 2010-11-19 2015-05-05 Novartis Ag Fibroblast growth factor 21 mutations
EP2694491A1 (en) 2011-04-05 2014-02-12 Amgen Inc. Benzodioxepine and benzodioxine compounds that interact with glucokinase regulatory protein for the treatment of diabetes
CN103596980B (zh) 2011-05-16 2017-08-08 霍夫曼-拉罗奇有限公司 Fgfr1激动剂及使用方法
KR102077721B1 (ko) 2011-07-01 2020-02-14 엔지엠 바이오파마슈티컬스, 아이엔씨. 대사성 장애 및 질환의 치료를 위한 조성물, 용도 및 방법
AU2012301769B2 (en) * 2011-08-31 2016-05-19 Amgen Inc. FGF21 for use in treating type 1 diabetes
TW201315742A (zh) 2011-09-26 2013-04-16 Novartis Ag 治療代謝病症之雙功能蛋白質
RS57827B1 (sr) 2012-02-15 2018-12-31 Novo Nordisk As Antitela koja vezuju protein 1 prepoznavanja peptidoglikana
LT2814844T (lt) 2012-02-15 2017-10-25 Novo Nordisk A/S Antikūnai, kurie jungiasi ir blokuoja ekspresuotą ant mieloidinių ląstelių inicijuojantį receptorių 1 (trem-1)
US9550830B2 (en) 2012-02-15 2017-01-24 Novo Nordisk A/S Antibodies that bind and block triggering receptor expressed on myeloid cells-1 (TREM-1)
WO2013123444A1 (en) 2012-02-17 2013-08-22 Amgen Inc. Sulfonyl compounds that interact with glucokinase regulatory protein
WO2013173382A1 (en) 2012-05-15 2013-11-21 Amgen Inc. Benzothiophene sulfonamides and other compounds that interact with glucokinase regulatory protein
AU2013274639A1 (en) 2012-06-11 2014-11-06 Eli Lilly And Company Fibroblast growth factor 21 variants
TWI513705B (zh) 2012-06-11 2015-12-21 Lilly Co Eli 纖維母細胞生長因子２１蛋白質
US9290557B2 (en) 2012-11-28 2016-03-22 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions comprising variants and fusions of FGF19 polypeptides
WO2014085365A2 (en) 2012-11-28 2014-06-05 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treatment of metabolic disorders and diseases
US9273107B2 (en) 2012-12-27 2016-03-01 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Uses and methods for modulating bile acid homeostasis and treatment of bile acid disorders and diseases
CN108888757A (zh) 2012-12-27 2018-11-27 恩格姆生物制药公司 用于调节胆汁酸体内稳态及治疗胆汁酸紊乱和疾病的方法
WO2014149699A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Eli Lilly And Company Bifunctional protein
WO2015065897A1 (en) 2013-10-28 2015-05-07 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Cancer models and associated methods
TWI728373B (zh) 2013-12-23 2021-05-21 美商建南德克公司 抗體及使用方法
WO2015103782A1 (en) * 2014-01-13 2015-07-16 Wenzhou Medical College Biological Pharmaceuticals And Nature Products Ltd., Co Fgf21 mutant and conjugate thereof
RU2701434C2 (ru) 2014-01-24 2019-09-26 Нгм Биофармасьютикалс, Инк. Связывающие белки и способы их применения
JP6712230B2 (ja) 2014-03-11 2020-06-17 ノバルティス アーゲー リポジストロフィーおよびインスリン産生の欠損またはインスリンシグナル伝達の欠損と関連する代謝性障害を処置する方法
US10398758B2 (en) 2014-05-28 2019-09-03 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions comprising variants of FGF19 polypeptides and uses thereof for the treatment of hyperglycemic conditions
WO2015195509A2 (en) 2014-06-16 2015-12-23 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Methods and uses for modulating bile acid homeostasis and treatment of bile acid disorders and diseases
MX2017000484A (es) 2014-07-17 2017-05-01 Novo Nordisk As Mutagenesis dirigida al sitio anticuerpos receptor desencadenante expresado en las celulas mieloides de tipo 1 (trem-1) para reducir la viscosidad.
EP3209681A4 (en) 2014-10-23 2018-10-31 NGM Biopharmaceuticals, Inc. Pharmaceutical compositions comprising peptide variants and methods of use thereof
KR20240024362A (ko) 2014-10-24 2024-02-23 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 변형된 fgf-21 폴리펩티드 및 그의 용도
WO2016073855A1 (en) 2014-11-07 2016-05-12 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Methods for treatment of bile acid-related disorders and prediction of clinical sensitivity to treatment of bile acid-related disorders
WO2016088059A1 (en) 2014-12-04 2016-06-09 Novartis Ag Methods and compositions using klotho variant polypeptides
PT3236991T (pt) * 2014-12-23 2019-09-06 Novo Nordisk As Derivados de fgf21 e usos dos mesmos
KR20160088656A (ko) 2015-01-16 2016-07-26 주식회사유한양행 지속형 fgf21 융합 단백질 및 이를 포함하는 약학적 조성물
WO2016179140A1 (en) * 2015-05-05 2016-11-10 The Regents Of The University Of California Fibroblast growth factor polymers, methods for making the same and applications thereof
WO2016187558A2 (en) 2015-05-20 2016-11-24 University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education Method to improve neurologic outcomes in temperature managed patients
WO2017019957A2 (en) 2015-07-29 2017-02-02 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Binding proteins and methods of use thereof
KR102668200B1 (ko) * 2015-10-28 2024-05-23 주식회사유한양행 지속형 fgf21 융합 단백질 및 이를 포함하는 약학적 조성물
US10744185B2 (en) 2015-11-09 2020-08-18 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Methods of using variants of FGF19 polypeptides for the treatment of pruritus
TW201731867A (zh) * 2015-12-02 2017-09-16 賽諾菲公司 Ｆｇｆ２１變異體
WO2017220706A1 (en) 2016-06-22 2017-12-28 Novo Nordisk A/S Pharmaceutical compositions of fgf21 derivatives and uses thereof
CN106279437B (zh) 2016-08-19 2017-10-31 安源医药科技（上海）有限公司 高糖基化人凝血因子viii融合蛋白及其制备方法与用途
EP3502143A4 (en) 2016-08-19 2020-07-15 Ampsource Biopharma Shanghai Inc. BINDING PEPTIDE FOR THE CONSTRUCTION OF A FUSION PROTEIN
CN106317226B (zh) * 2016-08-19 2017-09-05 安源医药科技（上海）有限公司 用于构建融合蛋白的连接肽
WO2018039557A1 (en) 2016-08-26 2018-03-01 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Methods of treating fibroblast growth factor 19-mediated cancers and tumors
RU2019122785A (ru) 2016-12-22 2021-01-22 Санофи Комбинации соединения на основе fgf21/агониста glp-1r с оптимизированным соотношением активности
MX2019012331A (es) 2017-04-21 2020-01-23 Yuhan Corp Metodo para producir proteinas de doble funcion y sus derivados.
CN107056925B (zh) 2017-04-28 2022-01-14 中国科学院合肥物质科学研究院 人fgf21突变体、其制备方法及用途
SG11202001379WA (en) 2017-09-08 2020-03-30 Bristol Myers Squibb Co Modified fibroblast growth factor 21 (fgf-21) for use in methods for treating nonalcoholic steatohepatitis (nash)
CN116098989A (zh) * 2018-02-08 2023-05-12 广东东阳光药业有限公司 Fgf21变体、融合蛋白及其应用
EA202092302A1 (ru) 2018-04-02 2021-02-02 Бристол-Майерс Сквибб Компани Антитела к trem-1 и их применения
CN114903978A (zh) 2018-07-03 2022-08-16 百时美施贵宝公司 Fgf-21配制品
TW202140074A (zh) 2020-01-08 2021-11-01 美商必治妥美雅史谷比公司 Fgf-21結合物調配物
US11028132B1 (en) 2020-04-07 2021-06-08 Yitzhak Rosen Half-life optimized linker composition
US11981718B2 (en) 2020-05-27 2024-05-14 Ampsource Biopharma Shanghai Inc. Dual-function protein for lipid and blood glucose regulation
WO2022032187A1 (en) 2020-08-07 2022-02-10 Bristol-Myers Squibb Company Fgf21 combined with ccr2/5 antagonists for the treatment of fibrosis
WO2022115597A1 (en) 2020-11-25 2022-06-02 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating liver diseases

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005091944A2 (en) 2004-03-17 2005-10-06 Eli Lilly And Company Glycol linked fgf-21 compounds
WO2006065582A3 (en) 2004-12-14 2006-09-14 Lilly Co Eli Muteins of fibroblast growth factor 21
WO2006050247A3 (en) 2004-10-29 2007-05-10 Neose Technologies Inc Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (fgf)
WO2008121563A2 (en) 2007-03-30 2008-10-09 Ambrx, Inc. Modified fgf-21 polypeptides and their uses

Family Cites Families (147)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4263428A (en) 1978-03-24 1981-04-21 The Regents Of The University Of California Bis-anthracycline nucleic acid function inhibitors and improved method for administering the same
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
EP0088046B1 (de) 1982-02-17 1987-12-09 Ciba-Geigy Ag Lipide in wässriger Phase
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
HUT35524A (en) 1983-08-02 1985-07-29 Hoechst Ag Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance
EP0143949B1 (en) 1983-11-01 1988-10-12 TERUMO KABUSHIKI KAISHA trading as TERUMO CORPORATION Pharmaceutical composition containing urokinase
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
EP0154316B1 (en) 1984-03-06 1989-09-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified lymphokine and production thereof
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
DE3675588D1 (de) 1985-06-19 1990-12-20 Ajinomoto Kk Haemoglobin, das an ein poly(alkenylenoxid) gebunden ist.
CA1310924C (en) 1986-04-24 1992-12-01 Francis P. Mccormick Infective drug delivery system
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
US4970154A (en) 1987-10-09 1990-11-13 Baylor College Of Medicine Method for inserting foreign genes into cells using pulsed radiofrequency
DE3889853D1 (de) 1987-11-05 1994-07-07 Hybritech Inc Polysaccharidmodifizierte Immunglobuline mit reduziertem immunogenem Potential oder verbesserter Pharmakokinetik.
US5106627A (en) 1987-11-17 1992-04-21 Brown University Research Foundation Neurological therapy devices
US4892538A (en) 1987-11-17 1990-01-09 Brown University Research Foundation In vivo delivery of neurotransmitters by implanted, encapsulated cells
US5158881A (en) 1987-11-17 1992-10-27 Brown University Research Foundation Method and system for encapsulating cells in a tubular extrudate in separate cell compartments
US5011472A (en) 1988-09-06 1991-04-30 Brown University Research Foundation Implantable delivery system for biological factors
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
ATE135370T1 (de) 1988-12-22 1996-03-15 Kirin Amgen Inc Chemisch modifizierte granulocytenkolonie erregender faktor
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5288855A (en) 1989-01-23 1994-02-22 Farmitalia Carlo Erba Extracellular form of the human fibroblast growth factor receptor
JP3039802B2 (ja) 1989-07-06 2000-05-08 ザ リージェンツ オブザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 繊維芽細胞成長因子のための受容体
US5676954A (en) 1989-11-03 1997-10-14 Vanderbilt University Method of in vivo delivery of functioning foreign genes
EP0779362B2 (en) 1989-12-22 2012-06-13 Laboratoires Serono SA DNA constructs for endogenous gene activation and expression modification
US5272071A (en) 1989-12-22 1993-12-21 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Method for the modification of the expression characteristics of an endogenous gene of a given cell line
WO1991010470A1 (en) 1990-01-08 1991-07-25 Brown University Research Foundation Devices and methods for enhanced delivery of active factors
AU633698B2 (en) 1990-01-12 1993-02-04 Amgen Fremont Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5672510A (en) 1990-01-19 1997-09-30 Genetic Therapy, Inc. Retroviral vectors
EP1403285A1 (en) 1990-07-06 2004-03-31 Gencell S.A. Fibroblast growth factor receptors
WO1992003918A1 (en) 1990-08-29 1992-03-19 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5217889A (en) 1990-10-19 1993-06-08 Roninson Igor B Methods and applications for efficient genetic suppressor elements
US5252714A (en) 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
US5229501A (en) 1991-01-11 1993-07-20 Chiron Corporation Expression and use of human fibroblast growth factor receptor
US6565841B1 (en) 1991-03-15 2003-05-20 Amgen, Inc. Pulmonary administration of granulocyte colony stimulating factor
IL100219A0 (en) 1991-12-02 1992-09-06 Yeda Res & Dev Variable region within fibroblast growth factor receptors that confers ligand specificity
WO1993015722A1 (en) 1992-02-07 1993-08-19 Syntex (Usa) Inc. Controlled delivery of pharmaceuticals from preformed porous microparticles
US5234784A (en) 1992-04-01 1993-08-10 Eastman Kodak Company Method of making a projection viewable transparency comprising an electrostatographic toner image
US5364791A (en) 1992-05-14 1994-11-15 Elisabetta Vegeto Progesterone receptor having C. terminal hormone binding domain truncations
CA2136439A1 (en) 1992-06-18 1994-01-06 Michael Philip Nova Process for detection of neoplastic disease
NZ255101A (en) 1992-07-24 1997-08-22 Cell Genesys Inc A yeast artificial chromosome (yac) vector containing an hprt minigene expressible in murine stem cells and genetically modified rodent therefor
US5474914A (en) 1992-07-29 1995-12-12 Chiron Corporation Method of producing secreted CMV glycoprotein H
US5489743A (en) 1993-01-19 1996-02-06 Amgen Inc. Transgenic animal models for thrombocytopenia
US5581476A (en) 1993-01-28 1996-12-03 Amgen Inc. Computer-based methods and articles of manufacture for preparing G-CSF analogs
WO1994026122A1 (en) 1993-05-07 1994-11-24 Sterling Winthrop Inc. Lactose-hydrolyzed milk and milk products with improved taste and suppressed sweetness
US6664107B1 (en) 1993-05-26 2003-12-16 Ontario Cancer Institute, University Health Network CD45 disrupted nucleic acid
DE705334T1 (de) 1993-06-14 1999-12-30 Basf Ag Strenge kontrolle der genexpression in eukaryotischen zellen durch auf tetrazyklin ansprechende promotoren
US5589362A (en) 1993-06-14 1996-12-31 Basf Aktiengesellschaft Tetracycline regulated transcriptional modulators with altered DNA binding specificities
US5654168A (en) 1994-07-01 1997-08-05 Basf Aktiengesellschaft Tetracycline-inducible transcriptional activator and tetracycline-regulated transcription units
EP1179350A3 (en) 1993-08-12 2003-01-02 Cytotherapeutics, Inc. Encapsulated cell system for implantation into the human CNS
US5658785A (en) 1994-06-06 1997-08-19 Children's Hospital, Inc. Adeno-associated virus materials and methods
US5484720A (en) 1994-09-08 1996-01-16 Genentech, Inc. Methods for calcium phosphate transfection
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
EP1978033A3 (en) 1995-04-27 2008-12-24 Amgen Fremont Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
JPH11506319A (ja) 1995-05-26 1999-06-08 ゼネカ・リミテッド エクジソンレセプターを含む遺伝子スイッチ
EP0832269A1 (en) 1995-06-07 1998-04-01 Baylor College Of Medicine Nucleic acid transporters for delivery of nucleic acids into a cell
WO1996041865A1 (en) 1995-06-07 1996-12-27 Ariad Gene Therapeutics, Inc. Rapamcycin-based regulation of biological events
ATE465149T1 (de) 1996-02-28 2010-05-15 Ariad Pharma Inc Synthetische rapamycinderivate als multimerisierende wirkstoffe für chimere proteine mit von immunophilin abgeleiteten domänen
US5679559A (en) 1996-07-03 1997-10-21 University Of Utah Research Foundation Cationic polymer and lipoprotein-containing system for gene delivery
US6214795B1 (en) 1996-11-12 2001-04-10 Praecis Pharmaceuticals, Inc. Peptide compounds useful for modulating FGF receptor activity
CN1167795C (zh) 1996-12-26 2004-09-22 协和发酵工业株式会社 肽、dna及抗体
US6133426A (en) 1997-02-21 2000-10-17 Genentech, Inc. Humanized anti-IL-8 monoclonal antibodies
US6342220B1 (en) 1997-08-25 2002-01-29 Genentech, Inc. Agonist antibodies
DE69839571D1 (de) 1997-11-25 2008-07-10 Genentech Inc Fibroblasten-wachstumsfaktor-19
US6150098A (en) 1998-02-20 2000-11-21 Amgen Inc. Methods for identifying novel secreted mammalian polypeptides
ZA200007412B (en) 1998-05-15 2002-03-12 Imclone Systems Inc Treatment of human tumors with radiation and inhibitors of growth factor receptor tyrosine kinases.
US6548634B1 (en) 1998-09-30 2003-04-15 Chiron Corporation Synthetic peptides having FGF receptor affinity
US6369109B1 (en) 1998-10-28 2002-04-09 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung Des Offentlichen Rechts Betulinic acid and derivatives thereof useful for the treatment of neuroectodermal tumor
WO2000027885A1 (fr) 1998-11-05 2000-05-18 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Nouveau popypeptide chimerique
US6656728B1 (en) 1999-02-08 2003-12-02 Chiron Corporation Fibroblast growth factor receptor-immunoglobulin fusion
JP2002539176A (ja) 1999-03-15 2002-11-19 カイロン コーポレイション 眼の疾患を処置または予防するための組換え遺伝子送達ベクターの使用
CA2311201A1 (en) 1999-08-05 2001-02-05 Genset S.A. Ests and encoded human proteins
US7459540B1 (en) 1999-09-07 2008-12-02 Amgen Inc. Fibroblast growth factor-like polypeptides
US7408047B1 (en) 1999-09-07 2008-08-05 Amgen Inc. Fibroblast growth factor-like polypeptides
AU7368100A (en) 1999-09-10 2001-04-10 Curagen Corporation Fibroblast growth factor polypeptide and nucleic acids encoding same
WO2001032678A1 (en) 1999-11-05 2001-05-10 Smithkline Beecham Corporation sbgFGF-19a
AU1922101A (en) 1999-11-18 2001-05-30 Chiron Corporation Human fgf-21 gene and gene expression products
US6716626B1 (en) 1999-11-18 2004-04-06 Chiron Corporation Human FGF-21 nucleic acids
AU1628101A (en) 1999-11-22 2001-06-04 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Jaffa, a novel fibroblast growth factor family member and uses therefor
US7108984B2 (en) 2000-01-12 2006-09-19 Mount Sinai School Of Medicine Methods of identifying modulators of the FGF receptor
WO2001049849A1 (en) 2000-01-05 2001-07-12 Zymogenetics, Inc. Novel fgf homolog zfgf11
US20020081663A1 (en) 2000-01-05 2002-06-27 Conklin Darrell C. Novel FGF homolog ZFGF11
US20020001825A1 (en) 2000-03-31 2002-01-03 Nobuyuki Itoh Fibroblast growth factor-like molecules and uses thereof
JP2002112772A (ja) 2000-07-10 2002-04-16 Takeda Chem Ind Ltd 新規ポリペプチドおよびそのｄｎａ
IL139380A0 (en) 2000-10-31 2001-11-25 Prochon Biotech Ltd Active variants of fibroblast growth factor
US20060223114A1 (en) 2001-04-26 2006-10-05 Avidia Research Institute Protein scaffolds and uses thereof
US20030157561A1 (en) 2001-11-19 2003-08-21 Kolkman Joost A. Combinatorial libraries of monomer domains
US20040018499A1 (en) 2001-06-06 2004-01-29 Lal Preeti G Extracellular messengers
JP2005500034A (ja) 2001-06-20 2005-01-06 プロション バイオテク リミテッド 受容体型タンパク質チロシンキナーゼ活性化を遮断する抗体、そのスクリーニング方法、及びその使用
MXPA04000231A (es) 2001-07-11 2004-05-04 Maxygen Holdings Ltd Conjugados del factor de estimulacion de colonias de granulocitos.
US20040259780A1 (en) 2001-07-30 2004-12-23 Glasebrook Andrew Lawrence Method for treating diabetes and obesity
US20050187150A1 (en) 2001-10-31 2005-08-25 New York University Structure-based design and synthesis of FGF inhibitors and FGF modulator compounds
AU2003201810A1 (en) 2002-01-15 2003-07-30 Eli Lilly And Company Method for reducing morbidity and mortality in critically ill patients
CN100531796C (zh) 2002-01-31 2009-08-26 马普科技促进协会 Fgfr激动剂
EP1332761A1 (en) 2002-01-31 2003-08-06 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Agonists of fibroblast growth factor receptors (FGFR)
IL149562A0 (en) 2002-05-09 2002-11-10 Prochon Ltd Fgf variants and methods for use thereof
JP2003334088A (ja) 2002-05-22 2003-11-25 Pharma Design Inc ヒト由来の新規Ｋｌｏｔｈｏ様タンパク質及びその遺伝子
AU2003265057A1 (en) 2002-09-04 2004-03-29 Abtech Anti-idiotypic antibodies as vegf or fgf agonists for bone therapy
JP2006515747A (ja) 2002-11-01 2006-06-08 ジェネンテック・インコーポレーテッド 免疫関連疾患の治療のための組成物と方法
JP2007524566A (ja) 2002-12-20 2007-08-30 エンカム ファーマシューティカルズ アクティーゼルスカブ レセプターとリガンドの間の相互作用の調節の方法
WO2004083381A2 (en) 2003-03-13 2004-09-30 Indiana University Advanced Research & Technology Institute Fibroblast growth factor receptor-1 polynucleotides, polypeptides, and mutants
JP2006240990A (ja) 2003-05-15 2006-09-14 Kirin Brewery Co Ltd ｋｌｏｔｈｏタンパク質および抗ｋｌｏｔｈｏタンパク質抗体ならびにそれらの用途
SI1641483T1 (sl) 2003-06-12 2008-08-31 Lilly Co Eli Fuzijski proteini
AU2004251145C1 (en) 2003-06-12 2011-04-14 Eli Lilly And Company GLP-1 analog fusion proteins
WO2005019258A2 (en) 2003-08-11 2005-03-03 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
PT1680140E (pt) 2003-10-16 2011-05-31 Imclone Llc Inibidores do receptor-1 do factor de crescimento de fibroblastos e m?todos de tratamento destes
JP4477013B2 (ja) 2003-12-10 2010-06-09 イーライ リリー アンド カンパニー 線維芽細胞成長因子２１の突然変異タンパク質
US20070248605A1 (en) 2003-12-19 2007-10-25 Five Prime Therapetutics, Inc. Fibroblast Growth Factor Receptors 1,2,3, and 4 as Targets for Therapeutic Intervention
WO2005072769A1 (en) 2004-01-26 2005-08-11 Eli Lilly And Company Use of fgf-21 and thiazolidinedione for treating type 2 diabetes
JP4505631B2 (ja) 2004-03-31 2010-07-21 独立行政法人産業技術総合研究所 ヘパラン硫酸糖鎖を付加したヘパリン結合性タンパク質、その製造方法及びそれを含有する医薬組成物
DE602005016917D1 (de) 2004-05-13 2009-11-12 Lilly Co Eli Fgf-21-fusionsproteine
PT1789442E (pt) 2004-09-02 2009-11-11 Lilly Co Eli Muteínas do factor de crescimento de fibroblasto 21
WO2006028714A1 (en) 2004-09-02 2006-03-16 Eli Lilly And Company Muteins of fibroblast growth factor 21
WO2006078463A2 (en) 2005-01-21 2006-07-27 Eli Lilly And Company Method for treating cardiovascular disease
JP2006246823A (ja) 2005-03-11 2006-09-21 Kyoto Univ 造血因子としてのＦｇｆ２１の使用
WO2006130527A2 (en) 2005-05-31 2006-12-07 Novartis Ag Mutations and polymorphisms of fibroblast growth factor receptor 1
NZ565511A (en) 2005-07-22 2011-03-31 Five Prime Therapeutics Inc Compositions and methods of treating disease with FGFR fusion proteins
ZA200800970B (en) 2005-08-15 2009-10-28 Genentech Inc Gene disruptions, compositions and methods relating thereto
US8043833B2 (en) 2005-10-31 2011-10-25 Novo Nordisk A/S Expression of soluble therapeutic proteins
EP1996216A2 (en) 2006-02-28 2008-12-03 Trustees Of Boston University Methods to identify factors associated with muscle growth and uses thereof
EP2046384A4 (en) 2006-06-15 2009-12-02 Fibron Ltd ANTIBODIES BLOCKING FIBROBLAST GROWTH FACTOR RECEPTOR ACTIVATION AND METHODS OF USING THE SAME
CN101516388B (zh) 2006-07-21 2012-10-31 诺和诺德公司 通过o-联糖基化序列的肽的糖基化
WO2008057683A2 (en) 2006-10-03 2008-05-15 Novo Nordisk A/S Methods for the purification of polypeptide conjugates
WO2008066498A1 (en) 2006-12-01 2008-06-05 Agency For Science, Technology And Research Cancer-related protein kinases
CA2682096A1 (en) 2007-04-02 2009-01-15 Genentech, Inc. Klotho beta
JP5187837B2 (ja) 2007-04-06 2013-04-24 独立行政法人産業技術総合研究所 補助因子による受容体の活性化方法並びにリガンド活性の利用方法
US7537903B2 (en) 2007-04-23 2009-05-26 Board Of Regents, The University Of Texas System FGF21 upregulates expression of GLUT-1 in a βklotho-dependent manner
WO2008135993A1 (en) 2007-05-08 2008-11-13 Tel Hashomer Medical Research Infrastructure And Services Ltd. Klotho protein and related compounds for the treatment and diagnosis of cancer
KR20100017169A (ko) 2007-05-22 2010-02-16 노파르티스 아게 Ｆｇｆ２１-관련 장애의 치료, 진단 및 검출 방법
WO2008149521A1 (ja) 2007-05-29 2008-12-11 Immuno-Biological Labolatories Co., Ltd 癌治療剤及び癌の治療方法
JP2010531135A (ja) 2007-06-04 2010-09-24 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼを使用したｏ結合型グリコシル化
EP2185178B1 (en) 2007-08-03 2017-08-23 Eli Lilly And Company Use of an fgf-21 compound and a glp-1 compound for the treatment of obesity
US8426396B2 (en) 2008-01-08 2013-04-23 Shriners Hospitals For Children Treatment for achondroplasia
TW200936156A (en) 2008-01-28 2009-09-01 Novartis Ag Methods and compositions using Klotho-FGF fusion polypeptides
US20110015345A1 (en) 2008-03-19 2011-01-20 Ambrx, Inc. Modified FGF-23 Polypeptides and Their Uses
JOP20190083A1 (ar) 2008-06-04 2017-06-16 Amgen Inc بولي ببتيدات اندماجية طافرة لـfgf21 واستخداماتها
WO2010006214A1 (en) 2008-07-09 2010-01-14 Ambrx, Inc. Fgf-21 neutralizing antibodies and their uses
CA2732449A1 (en) 2008-08-04 2010-02-11 Five Prime Therapeutics, Inc. Fgfr extracellular domain acidic region muteins
EP2358749B1 (en) * 2008-10-10 2018-07-18 Amgen, Inc Fgf21 mutants and uses thereof
AU2010246038A1 (en) 2009-05-05 2011-12-01 Amgen Inc. FGF21 mutants and uses thereof
DK3248610T3 (da) 2009-05-05 2024-01-15 Amgen Inc Fgf21-mutanter og anvendelser deraf

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005091944A2 (en) 2004-03-17 2005-10-06 Eli Lilly And Company Glycol linked fgf-21 compounds
WO2006050247A3 (en) 2004-10-29 2007-05-10 Neose Technologies Inc Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (fgf)
WO2006065582A3 (en) 2004-12-14 2006-09-14 Lilly Co Eli Muteins of fibroblast growth factor 21
WO2008121563A2 (en) 2007-03-30 2008-10-09 Ambrx, Inc. Modified fgf-21 polypeptides and their uses

Also Published As

Publication number Publication date
WO2010042747A2 (en) 2010-04-15
MA32771B1 (fr) 2011-11-01
US9279013B2 (en) 2016-03-08
JP5878757B2 (ja) 2016-03-08
AU2009302318A1 (en) 2010-04-15
SG195542A1 (en) 2013-12-30
EA201990619A1 (ru) 2019-07-31
CO6362020A2 (es) 2012-01-20
JP2015165801A (ja) 2015-09-24
MX341149B (es) 2016-08-09
MX2011003788A (es) 2011-08-03
JP2012504965A (ja) 2012-03-01
UA105016C2 (uk) 2014-04-10
EP2358749A2 (en) 2011-08-24
IL212061A0 (en) 2011-06-30
NZ592009A (en) 2012-11-30
EP2358749B1 (en) 2018-07-18
US20110195895A1 (en) 2011-08-11
PE20120021A1 (es) 2012-02-10
TN2011000161A1 (en) 2012-12-17
WO2010042747A3 (en) 2010-06-17
KR20110093790A (ko) 2011-08-18
CA2739615A1 (en) 2010-04-15
CL2011000792A1 (es) 2011-08-26
EA032727B1 (ru) 2019-07-31
CA2739615C (en) 2017-12-05
EA201100516A1 (ru) 2011-10-31
ZA201103356B (en) 2012-02-29
CR20110245A (es) 2011-08-29
US20160244497A1 (en) 2016-08-25
CN102625811A (zh) 2012-08-01
CN102625811B (zh) 2016-09-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101651703B1 (ko) Ｆｇｆ21 돌연변이체 및 이의 용도
US11840558B2 (en) Methods of treating non-alcoholic steatohepatitis using FGF21 mutants
AU2010246108B2 (en) FGF21 mutants and uses thereof
EP2427207A2 (en) Fgf21 mutants and uses thereof
AU2016203765B2 (en) FGF21 mutants and uses thereof
AU2013211503B2 (en) FGF21 mutants and uses thereof
EA041758B1 (ru) Fgf21 мутанты и их применение
AU2011253868A1 (en) FGF21 mutants and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
AMND Amendment
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190729

Year of fee payment: 4