KR20160088656A - 지속형 fgf21 융합 단백질 및 이를 포함하는 약학적 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인간 FGF21의 변이체 단백질과 인간 면역글로불린의 Fc 영역을 포함하는 융합단백질에 관한 것이다. 본 발명에 따른 융합 단백질은 개선된 약리학적 효능, 체내 지속성 및 단백질의 안정성을 나타내며, 상기 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 당뇨, 비만 질환 및 지질대사 개선을 위한 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

지속형 FGF21 융합 단백질 및 이를 포함하는 약학적 조성물{LONG-ACTING FGF21 FUSION PROTEINS AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING THE SAME}
본 발명은 약리 활성 및 생체내 안정성이 증가된 지속형 FGF21 변이체 단백질을 포함한 융합 단백질 및 이를 포함한 약학적 조성물에 대한 것이다.
FGF21(fibroblast growth factor 21)은 간에서 합성되며 글루코스 및 지질 항상성에 있어서 중요한 역할을 한다고 알려진 호르몬이다. FGF21은 FGF21 특이적 수용체인 FGF 수용체와 베타-클로토(β-klotho) 복합체가 같이 발현되는 간, 지방, 췌장의 베타 세포, 뇌의 시상 하부 및 근육에서 그 약리 작용을 나타낸다. 현재까지 다양한 당뇨 및 비만 질환 마우스와 원숭이에서 FGF21은 인슐린 비의존적으로 혈중 글루코스 농도를 저하시키고, 체중 감소 및 혈중 트리글리세리드, 저비중리포단백질(Low-density lipoprotein, LDL)의 농도를 감소시켰다. 또한 인슐린 감수성 개선 효과 또한 가지고 있어 새로운 항 당뇨·비만 치료제 타깃으로 잠재성을 갖고 있다(WO2003/011213, WO2003/0529270, WO2005/072769, 및 WO2013/033452).
이에 따라 FGF21을 타깃으로 하는 새로운 항 당뇨 약제 개발을 위해, 야생형 FGF21을 기반으로 하여, 일부 아미노산을 치환, 도입, 제거하여, FGF21 돌연변이를 제작하여 생물학적 활성 및 생체 내 안정성을 개선한 시도가 있었다(WO2005/061712, WO2006/029714, WO2006/065582, WO2010/065439, WO2011/154349, WO2013/052311, WO2013/131091, WO2013/188182, 및 WO2014/085365). 그러나, FGF21을 생물치료제로서 직접 사용하는 것과 연관된 문제점은 그의 반감기가 매우 짧다는 것이다(문헌 [Kharitonenkov, A. et al. (2005) Journal of Clinical Investigation 115:1627-1635]). FGF21의 생체 내 반감기는 마우스에서 1~2시간, 원숭이에서 2.5~3시간으로 짧기 때문에 FGF21을 당뇨병 치료제로 개발한다면 매일 투여를 해야 하는 단점이 있다.
현재까지 FGF21 재조합 단백질의 생체 내 반감기를 증가시키기 위하여 다양한 기술들이 보고되었다. 먼저 FGF21에 고분자 물질인 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG)을 연결하여 분자량을 증가시켜, 신장 배설을 억제함으로써 체네 잔류 시간을 증가시킨 예가 있다(WO2005/091944, WO2006/050247, WO2008/121563, WO2012/066075). FGF21 분자에 인간 알부민에 결합하는 지방산을 융합시켜 반감기를 향상시키는 예도(WO2010/084169 및 WO2012/010553) 있다.
또한 인간 FGF 수용체 단독 또는 베타-클로토와의 복합체에 특이적으로 결합하는 아고니스트 항체를 만들어 FGF21의 작용기전과 동일한 약리학적 활성을 나타내면서 반감기를 증가시킨 예도 있다(WO2011/071783, WO2011/130417, WO2012/158704, WO2012/170438). 또한, FGF21 분자에 면역글로불린 IgG의 Fc를 연결한 지속형 융합 단백질을 만들어 반감기를 향상시킬 수도 있다(WO2004/110472, WO2005/113606, WO2009/149171, WO2010/042747, WO2010/129503, WO2010/129600, WO2013/049247, 및 WO2013/188181).
여러 지속형 기술 중 Fc 융합 기술은 체내 반감기가 증가하면서 독성이나 면역반응 유발과 같은 부작용 우려가 적다는 점에서 가장 많이 활용되고 있다. Fc 융합 FGF21 단백질을 지속형 치료용 약물로 개발하기 위해서는 다음과 같은 여러 조건을 충족해야 한다. 첫째, 융합에 의한 시험관 내 활성 감소가 적어야 한다. FGF21의 N 말단과 C 말단은 모두 FGF21 활성에 관여한다. 이에 따라 융합 위치에 따라 FGF21 융합 단백질의 활성이 크게 달라진다고 알려져 있다. 따라서 FGF21에 돌연변이가 도입된 Fc 융합 FGF21 단백질의 활성은 융합 여부 또는 위치에 따라 달라질 수 있다. 둘째, 융합에 의해 체내 반감기가 증가하여, 인간에서 주1회 간격으로 투여할 수 있는 약물동태 프로필을 나타내야 한다. 셋째, 대부분의 바이오의약품의 경우 환자에서 면역원성이 발생할 수 있다는 점을 감안하면, 융합 링커 또는 돌연변이에 의한 면역원성 위험성이 적어야 한다. 넷째, 융합 위치나 돌연변이 도입에 의한 안정성 문제가 없어야 한다. 다섯째, 융합한 면역글로불린의 종류(isotype)에 따라 원치 않는 면역 반응을 야기할 수 있기 때문에 이에 대한 대안이 필요하다.
FGF21 분자에 면역글로불린 IgG의 Fc를 연결하여 지속형 융합 단백질로 개발하려는 시도는 이미 보고된 바 있다(WO2009/149171, WO2010/042747, WO2010/129503, WO2010/129600, WO2013/049247, 및 WO2013/188181). 야생형 FGF21의 N 말단에 Fc가 융합된 Fc-FGF21 구조의 경우, 시험관 내 활성은 야생형 FGF21 대비 큰 차이가 나지 않지만, 생체 내 단백질 분해작용에 의해 반감기가 매우 짧은 것으로 알려져 있다. 이를 개선하기 위해 FGF21의 특정 위치에 단백질 분해작용에 저항성이 있는 여러 개의 돌연변이를 도입해 생체 내 반감기를 개선시킨 사례가 있지만, 다수의 돌연변이 도입으로 인해 면역원성 위험성이 증가할 수 있다. 반면 FGF21 분자의 C 말단에 Fc가 융합된 형태인 FGF21-Fc 구조의 경우, Fc-FGF21 구조에 비해 융합에 의한 활성 감소가 큰 것으로 알려져 있다. 현재까지 FGF21-Fc 구조에서 활성을 개선하거나, 약물동태 프로필을 개선하려는 시도는 없었다.
본 발명자들은 FGF21의 생리학적 활성 및 안정성을 개선시키기 위해 노력하던 중, FGF21의 특정 위치에 돌연변이를 도입하고, 면역글로불린 Fc 영역을 결합시킬 경우, FGF21의 활성이 향상되고, 생체내 반감기가 증가되는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 약리학적 효능, 체내 지속성 및 단백질의 안정성이 개선된 FGF21 변이체 단백질을 포함하는 융합 단백질을 제공하는 것이다.
또 다른 목적은 상기 융합 단백질을 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 것이며, 이를 이용하여 당뇨병, 비만, 이상지질혈증 또는 대사 증후군을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여, 서열번호: 1로 표시되는 아미노산 서열의 19번째 아미노산인 아르기닌이 다른 아미노산으로 치환된 FGF21 변이체 단백질과 면역글로불린의 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 융합 단백질을 포함한 FGF21 관련 질환 치료용 약학적 조성물 및 FGF21 관련 질환의 예방 및 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 지속형 FGF21 융합 단백질은 FGF21의 변이체에 인간 면역글로불린 IgG의 Fc가 결합되어 약리학적 효능, 체내 지속성 및 단백질의 안정성이 개선된 융합단백질과 상기 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 당뇨, 비만 질환 및 지질대사 개선을 위한 치료제로서 응용할 수 있다. 특히, 본 발명의 약학적 조성물은 종래의 FGF21 단백질을 포함한 약학적 조성물에 비하여, 생체내 안정성이 증가되어 투약 주기가 긴 장점이 있다.
도 1a은 인간 베타-클로토가 과발현된 HEK293 세포주를 이용하여 FGF21-Fc의 19번 내지 22번 위치의 알라닌 점 돌연변이의 시험관내 활성을 측정한 그래프이다. 19번 위치의 점 돌연변이의 활성 감소가 가장 적음을 알 수 있다.
도 1b는 FGF21-Fc 단백질의 알라닌 점 돌연변이와 FGF21의 19번 위치 아미노산에 대한 점 돌연변이의 시험관내 활성을 측정하여 상대적 수치로 표기하였다.
도 2는 인간 베타-클로토가 과발현된 HEK293 세포주를 사용하여 N00와 N12의 시험관내 활성을 측정한 그래프이다. N12가 인간 베타-클로토 과발현 세포주에서 N00 대비 활성이 증가하였음을 나타낸다.
도 3은 마우스에 N00와 N12를 2 mg/kg 용량으로 피하 투여 후 192시간 동안의 시간에 따른 혈중 약물 농도 그래프이다. 데이터는 평균값들과 표준편차(standard deviation)로 표기되었다.
도 4는 N12가 ob/ob 당뇨병 마우스 모델에서 N00 대비 개선된 효능을 갖는 것을 나타낸다. 도 4a는 N00와 N12를 각각의 투여 용량을 피하 주사한 ob/ob 마우스에서 측정된 비절식 혈당 수치를 도시한 그래프이다. 데이터는 평균값들과 평균의 표준오차(standard error of the mean, S.E.M.)로 표기되었다.
도 4b는 N00와 N12를 용량별 피하 투여 후 0일부터 7일차까지의 비절식 혈당에 대한 곡선하 면적 값을 보여주는 막대 그래프이다.
도 4c는 N00와 N12를 각각의 투여 용량을 피하 주사한 ob/ob 마우스에서 투여 시점부터 7일차까지 측정된 체중 변화 퍼센트를 보여주는 플롯이다. 데이터는 평균값들과 평균의 표준오차로 표기되었다.
도 4d는 N00 및 N12 투여 후 기준점(0일) 대비 4일차에서의 체중 변화 퍼센트를 보여주는 막대 그래프이다. 데이터는 평균값들과 평균의 표준오차로 표기하였으며, 각 실험군간 유의성 검정은 일원 아노바(one-way ANOVA)의 Dunnett's test를 이용하여 ob/ob 마우스의 vehicle 처리 군 대비 통계 처리한 후, 신뢰 구간(p value)이 0.05 보다 작은 경우 통계학적인 의의가 있는 것으로 판정하였다.
도 5는 인간 베타-클로토 과발현 HEK293 세포주에서 H05, H09, H11과 HyC의 시험관내 활성을 측정한 결과이다. 데이터는 EC50 값으로 표기되었다.
도 6은 마우스에 H05, H09, H11와 HyC를 2 mg/kg 용량으로 피하 투여 후 192시간 동안의 시간에 따른 혈중 약물 농도 그래프이다. 데이터는 평균값들과 표준편차로 표기되었다.
도 7은 다양한 FGF21과 하이브리드 Fc를 연결하는 힌지 종류에 따른 ob/ob 당뇨병 마우스 모델에서 효력 시험결과를 나타낸다. 도 7a는 H05, H09와 H11을 각각의 투여 용량을 주사한 ob/ob 마우스에서 측정된 비절식 혈당 수치(투여 후부터 7일차)에 대한 곡선하 면적 값을 보여주는 막대 그래프이다.
도 7b는 H05, H09와 H11 투여 후 기준점(0일) 대비 3일차에서의 체중 변화 퍼센트를 보여주는 막대 그래프이다. 데이터는 평균값들과 평균의 표준오차로 표기하였으며, 각 실험군간 유의성 검정은 one-way ANOVA의 Dunnett's test를 이용하여 ob/ob 마우스의 vehicle 처리 군 대비 통계 처리한 후, 신뢰 구간(p value)이 0.05 보다 작은 경우 통계학적인 의의가 있는 것으로 판정하였다.
도 8은 인간 베타-클로토 과발현 HEK293 세포주에서 H05와 M09의 시험관내 활성을 측정한 결과이다. 데이터는 EC50 값으로 표기되었다.
도 9는 M09가 ob/ob 당뇨병 마우스 모델에서 H05 대비 개선된 효능을 갖는 것을 나타낸다. 도 9a는 H05와 M09를 각각의 투여 용량을 피하 주사한 ob/ob 마우스에서 측정된 비절식 혈당 수치를 도시한 그래프이다. 데이터는 평균값들과 평균의 표준오차로 표기되었다.
도 9b는 H05와 M09를 용량별 피하 투여 후 0일부터 7일차까지의 비절식 혈당에 대한 곡선하 면적 값을 보여주는 막대 그래프이다.
도 9c는 H05와 M09를 각각의 투여 용량을 피하 주사한 ob/ob 마우스에서 투여 시점부터 7일차까지 측정된 체중 변화 퍼센트를 보여주는 플롯이다. 데이터는 평균값들과 평균의 표준오차로 표기되었다.
도 9d는 H05 및 M09 투여 후 기준점(0일) 대비 4일차에서의 체중 변화 퍼센트를 보여주는 막대 그래프이다. 데이터는 평균값들과 평균의 표준오차로 표기하였으며, 각 실험군간 유의성 검정은 일원 아노바(one-way ANOVA)의 Dunnett's test를 이용하여 ob/ob 마우스의 vehicle 처리 군 대비 통계 처리한 후, 신뢰 구간(p value)이 0.05 보다 작은 경우 통계학적인 의의가 있는 것으로 판정하였다.
도 10은 인간 베타-클로토 과발현 HEK293 세포주에서 H05와 H40의 시험관내 활성을 측정한 결과이다. 데이터는 EC50 값으로 표기되었다.
도 11은 마우스에 H05와 H40을 2 mg/kg 용량으로 피하 투여 후 192시간 동안의 시간에 따른 혈중 약물 농도 그래프이다. 데이터는 평균값들과 표준편차로 표기되었다.
도 12는 H40이 ob/ob 당뇨병 마우스 모델에서 H05 대비 개선된 효능을 갖는 것을 나타낸다. 도 12a는 H05와 H40을 피하 주사한 ob/ob 당뇨병 마우스 모델에서 비절식 혈당의 용량 반응성을 보여주는 플롯이다. 데이터는 평균값들과 평균의 표준오차로 표기되었다.
도 12b는 H05, H40을 피하 주사 후 0일부터 7일차까지의 비절식 혈당에 대한 곡선하 면적 값을 보여주는 막대 그래프이다.
도 12c는 H05와 H40을 피하 주사한 ob/ob 당뇨병 마우스 모델에서 투여 시점부터 7일차까지 체중 변화 퍼센트를 나타내는 그래프이다. 데이터는 평균값들과 평균의 표준오차로 표기되었다.
도 12d는 다양한 용량의 H05와 H40을 피하 투여 후 기준점(0일) 대비 7일차에서의 체중 변화 퍼센트를 보여주는 막대 그래프이다. 데이터는 평균값들과 평균의 표준오차로 표기하였으며, 각 실험군간 유의성 검정은 one-way ANOVA의 Dunnett's test를 이용하여 ob/ob 마우스의 vehicle 처리 군 대비 통계 처리한 후, 신뢰 구간(p value)이 0.05 보다 작은 경우 통계학적인 의의가 있는 것으로 판정하였다.
도 13은 인간 베타-클로토 과발현 HEK293 세포주에서 M09와 F09의 시험관내 활성을 측정한 결과이다. 데이터는 EC50 값으로 표기되었다.
도 14a는 마우스에 M09와 F09를 2 mg/kg 용량으로 피하 투여 후 192시간 동안의 시간에 따른 혈중 약물 농도 그래프이다. 데이터는 평균값들과 표준편차로 표기되었다.
도 14b는 래트(rat)에 M09와 F09를 1 mg/kg 용량으로 피하 투여 후 192시간 동안의 시간에 따른 혈중 약물 농도 그래프이다. 데이터는 평균값들과 표준편차로 표기되었다.
도 15는 지속형 FGF21 돌연변이체인 F09가 ob/ob 당뇨병 마우스 모델에서 M09 대비 개선된 효능을 갖는 것을 나타낸다. 도 15a는 M09와 F09를 주사한 ob/ob 당뇨병 마우스 모델에서 비절식 혈당의 용량 반응성을 보여주는 플롯이다. 데이터는 평균값들과 평균의 표준오차로 표기되었다.
도 15b는 M09, F09를 단회 주사 후 0일부터 7일차까지의 비절식 혈당에 대한 곡선하 면적 값을 보여주는 막대 그래프이다.
도 16은 지속형 FGF21 돌연변이체인 F09가 식이 유도 비만 마우스 모델에서 M09 대비 개선된 항 비만효과를 갖는 것을 나타낸다. 도 16a는 M09와 F09를 2주 동안 단회 또는 주 1회 간격으로 피하 주사한 식이 유도 비만 마우스 모델에서 체중 변화의 용량 반응성을 보여주는 플롯이다. 데이터는 평균값들과 평균의 표준오차로 표기되었다.
도 16b는 M09와 F09를 2주 동안 단회 또는 주 1회 간격으로 피하 주사한 식이 유도 비만 마우스 모델에서 투여 시점(0일) 대비 7일차와 14일차에서의 체중 변화를 나타내는 막대 그래프이다. 데이터는 평균값들과 평균의 표준오차로 표기되었다.
도 17은 지속형 FGF21 돌연변이체인 F09의 db/db 당뇨병 마우스 모델에서 투여 용량 및 주사 횟수에 따른 효력 시험 결과를 나타낸다. 도 17a는 단회 또는 주2회(0, 4일) 피하 주사 후 db/db 마우스에서 F09의 용량 반응성을 보여주는 비절식 혈당 수치를 나타내는 플롯이다. 데이터는 평균값들과 평균의 표준오차로 표기되었다.
도 17b는 db/db 마우스에 단회 또는 주 2회 F09 투여 후 0일부터 7일차까지의 비절식 혈당에 대한 곡선하 면적 값을 보여주는 막대 그래프이다.
도 17c는 F09를 단회 또는 주2회 투여한 db/db 마우스에서 투여 시점부터 7일차까지의 체중 변화를 나타내는 그래프이다. 데이터는 평균값들과 평균의 표준오차로 표기되었다.
도 17d는 F09를 단회 또는 주2회 투여 후 투여 시점(0일) 대비 7일차에서 db/db 마우스의 체중 변화를 보여주는 막대 그래프이다. 데이터는 평균값들과 평균의 표준오차로 표기하였으며, 각 실험군간 유의성 검정은 one-way ANOVA의 Dunnett's test를 이용하여 ob/ob 마우스의 vehicle처리 군 대비 통계 처리한 후, 신뢰 구간(p value)이 0.05 보다 작은 경우 통계학적인 의의가 있는 것으로 판정하였다.
이하, 본 발명은 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 일 측면으로, 서열번호: 1로 표시되는 아미노산 서열의 19번째 아미노산인 아르기닌이 다른 아미노산으로 치환된 FGF21 변이체 단백질과 면역글로불린의 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
상기 FGF21은 섬유모세포 성장인자로서 글루코스 및 지질 항상성에 있어서 중요한 역할을 한다고 알려진 호르몬이다. 상기 FGF21은 인간, 마우스, 돼지, 원숭이 등의 포유류에서 유래된 것일 수 있으며, 바람직하게는 인간 유래의 FGF21일 수 있다. 더욱, 바람직하게는 상기 FGF21은 서열번호: 1로 표시되는 아미노산 서열일 수 있다. 일 구체예로는 상기 FGF21 변이체 단백질은 서열번호: 1의 19번째 아미노산인 아르기닌이 티로신으로 치환된 것일 수 있다. 또한, 상기 FGF21 변이체 단백질은 서열번호: 1의 19번째 아미노산이 티로신인 것을 포함하고, 야생형 FGF21에 비해 N 말단 또는 C 말단의 1 내지 10개의 아미노산이 결실된 형태일 수 있다.
또한, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 항체를 구성하는 Fc 영역 전체 또는 이의 단편, 또는 Fc 영역 변이체일 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "Fc 영역", "Fc 단편" 또는 "Fc"란 면역글로불린의 중쇄 불변 영역 1(CH1), 중쇄 불변 영역 2(CH2) 및 중쇄 불변 영역 3(CH3)을 포함하며, 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 및 경쇄 불변 영역 1(CL1)은 포함하지 않는 단백질을 말한다. 또한, 상기 Fc 영역은 단량체 또는 다량체 형태의 분자를 포함한다. 또한, 상기 Fc 영역은 중쇄 불변 영역의 힌지 영역을 더 포함할 수 있다.
또한, 본원에서 사용된 용어 "Fc 영역 변이체"는 Fc 영역 중 일부 아미노산이 치환되거나, 서로 다른 종류의 Fc 영역을 조합하여 제조된 것을 의미한다. 상기 Fc 영역 변이체는 힌지 부위에서 절단되는 것을 예방하기 위해 변형될 수 있다.
일 구체예로, 상기 면역글로불린의 Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 및 IgD의 영역의 어느 하나 또는 이들의 조합인 하이브리드 Fc일 수 있다. 또한, 상기 하이브리드 Fc는 IgG4 영역 및 IgD의 영역을 포함할 수 있다. 또한, 상기 하이브리드 Fc 영역은 IgG4 Fc의 힌지 서열 일부, CH2 및 CH3 서열을 포함할 수 있다. 또한, IgG4 Fc의 힌지 서열은 항체 의존 세포 매개 세포독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)이나 보체 의존 세포독성(complemant-dependent cytotoxicity, CDC)을 줄이기 위해 아미노산 서열 일부가 치환될 수 있다. 또한 IgG4 Fc 힌지 서열은 Fab 영역의 재배열을 억제하기 위해 아미노산 서열 일부가 치환될 수 있다. IgG4 Fc C-말단의 라이신(K)은 제거될 수 있다.
또한, 본 발명의 Fc 단편은 야생형 당쇄, 야생형에 비해 증가된 당쇄, 야생형에 비해 감소한 당쇄, 또는 당쇄가 제거된 형태일 수 있다. 화학적 방법, 효소적 방법 및 미생물을 사용한 유전공학적 엔지니어링 방법 등과 같은 당업계에 알려진 통상적인 방법으로 면역글로불린 Fc 당쇄의 증가, 감소 또는 제거가 수행될 수 있다.
또한, 상기 융합 단백질의 일 구체예로서 상기 면역글로불린의 Fc 영역은 서열번호: 4 또는 서열번호: 5의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
또한, 상기 융합 단백질은 링커를 더 포함할 수 있다. 상기 융합 단백질은 FGF21 변이체 단백질이 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단 또는 C-말단에 직접 연결된 형태일 수 있으나, 링커를 통하여 결합된 형태일 수 있다.
이때, 링커는 Fc 단편의 N-말단, C-말단 또는 유리기(free radical)에 연결될 수 있고, 또한, FGF21 변이체 단백질의 N-말단, C-말단 또는 유리기에 연결될 수 있다. 링커가 펩타이드 링커인 경우, 연결은 임의의 연결 부위에서 일어날 수 있다. 링커 및 Fc가 별개로 발현된 후에 서로 결합될 때, 링커는 당업계에 알려진 가교제일 수 있다.
이러한 가교제의 예는 1,1-비스(다이아조아세틸)-2-페닐에테인(1,1-bis (diazoacetyl)-2-phenylethane), 글루타르알데하이드(glutaraldehyde), 4-아지도살리실릭산(4-azidosalicylic acid)과 같은 N-하이드로옥시석신이미드 에스테르(N-hydroxysuccinimide ester), 3,3'-디사이오비스(석신이미딜프로피오네이트)(3,3'-dithiobis(succinimidylpropionate))와 같은 다이석신이미딜에스테르(disuccinimidyl esters)를 포함하는 이미도에스테르(imidoesters), 및 비스-N-말레이미도-1,8-옥테인과 같은 이중 기능적 말레이미드(bifunctional maleimides)를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 링커는 펩타이드일 수 있다. 이때, 상기 링커는 글리신 및 세린 잔기로 이루어지고, 10 내지 20개의 아미노산 잔기로 구성된 펩타이드일 수 있다. 또한, 상기 링커의 양 말단에는 알라닌이 추가적으로 결합될 수 있다. 상기 합성 링커는 바람직하게 서열번호: 2 또는 서열번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드일 수 있다.
또한, 상기 융합 단백질은 하나 이상의 FGF21 변이체 단백질이 결합한 형태인 이량체 또는 다량체 FGF21 변이체 단백질이 면역글로불린 Fc 영역에 결합한 형태일 수 있다. 또한, FGF21 변이체 단백질이 결합된 면역글로불린 Fc 영역이 두개 이상이 결합된 이량체 또는 다량체 형태일 수 있다.
또한, 상기 FGF21 변이체 단백질을 포함한 융합 단백질은 바람직하게 서열번호: 18, 서열번호: 39 또는 서열번호: 40의 서열로 표시되는 아미노산을 포함하는 펩타이드일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면으로, 본 발명은 상기 융합 단백질을 포함하는 FGF21-연관 장애 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본원에서 사용된 용어 "FGF21-연관 장애"는 비만, 제1형 및 제2형 당뇨병, 췌장염, 이상지혈증, 비알콜성 지방간 질환(NAFLD), 비알콜성 지방간염(NASH), 인슐린 저항성, 고인슐린혈증, 글루코스 불내성, 고혈당증, 대사 증후군, 급성 심근경색, 고혈압, 심혈관 질환, 아테롬성동맥경화증, 말초 동맥 질환, 졸중, 심부전, 관상동맥 심장 질환, 신장 질환, 당뇨병성 합병증, 신경병증, 위마비, 인슐린 수용체에서의 중증 불활성화 돌연변이와 연관된 장애, 및 다른 대사 장애를 포함한다. 바람직하게는, FGF21-연관 장애는 당뇨병, 비만, 이상지질혈증 또는 대사증후군 일 수 있다.
또한, 상기 약학적 조성물은 약학적 담체를 더 포함할 수 있다. 약학적 담체는 환자에게 항체를 전달하기에 적절한 비-독성 물질이면 어떠한 담체라도 가능하다. 증류수, 알코올, 지방, 왁스 및 비활성 고체가 담체로 포함될 수 있다. 약학적으로 허용되는 애쥬번트(완충제, 분산제) 또한 약학적 조성물에 포함될 수 있다. 이러한 제형에 있어서 융합 단백질의 농도는 매우 다양할 수 있는데, 예를 들면 무게에 따라 약 0.5% 이하일 수 있고, 일반적으로 또는 적어도 약 1% 내지 15% 또는 20%까지 일 수 있고 선택된 특정 투여 방법에 따라 체액 부피, 점성도(viscosities) 등에 우선적으로 기초하여 선택될 수 있다.
구체적으로, 상기 약학적 조성물은, 조성물의 pH, 오스몰 농도, 점도, 투명도, 색상, 등장성, 냄새, 무균성, 안정성, 용해 또는 방출 속도, 흡착, 또는 투과를 변형하거나, 유지하거나 또는 보존하기 위한 제제화 물질을 함유할 수 있다. 적합한 제제화 물질은 아미노산(예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신), 항미생물제, 항산화제(예컨대 아스코르브산, 아황산나트륨 또는 아황산수소나트륨), 완충제(예컨대 보레이트, 비카르보네이트, 트리스-HCl, 시트레이트, 포스페이트 또는 다른 유기산), 벌킹제(예컨대 만니톨 또는 글리신), 킬레이트화제(예컨대 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA)), 착화제(예컨대 카페인, 폴리비닐피롤리돈, 베타-시클로덱스트린 또는 히드록시프로필-베타-시클로덱스트린), 충전제, 모노사카라이드, 디사카라이드 및 다른 탄수화물(예컨대 글루코스, 만노스 또는 덱스트린), 단백질(예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 이뮤노글로불린), 착색제, 향미제 및 희석제, 유화제, 친수성 중합체(예컨대 폴리비닐피롤리돈), 저분자량 폴리펩타이드, 염-형성 반대이온(예컨대 나트륨), 보존제(예컨대 벤즈알코늄 클로라이드, 벤조산, 살리실산, 티메로살, 페네틸 알콜, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르헥시딘, 소르브산 또는 과산화수소), 용매(예컨대 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜), 당 알콜(예컨대 만니톨 또는 소르비톨), 현탁화제, 계면활성제 또는 습윤제(예컨대 플루로닉스; PEG; 소르비탄 에스테르; 폴리소르베이트, 예컨대 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80; 트리톤; 트로메타민; 레시틴; 콜레스테롤 또는 틸록사팔), 안정성 증진제(예컨대 수크로스 또는 소르비톨), 장성 증진제(예컨대 알칼리 금속 할라이드; 바람직하게는 염화나트륨 또는 염화칼륨; 또는 만니톨 소르비톨), 전달 비히클, 희석제, 부형제 및/또는 제약 아주반트를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 또 다른 측면으로, 본 발명은 상기 융합 단백질을 치료가 필요한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, FGF21-연관 장애를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 특히, FGF21-연관 장애인 당뇨병, 비만, 이상지질혈증 또는 대사증후군의 증상을 가진 포유류에게 본 발명의 FGF21 융합 단백질의 유효량을 투여하는 것을 포함한다.
본원의 약학적 조성물은 어떠한 경로로도 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 직접적으로(예, 조직 부위에 주입, 이식 또는 국부적으로 투여함으로써, 국소적으로) 또는 시스템적으로(예, 비경구 또는 경구로) 임의의 적절한 수단에 의하여 동물에게 제공될 수 있다. 본 발명의 조성물이 정맥내, 피하, 눈(ophthalmic), 복강 내, 근육 내, 구강, 직장, 안와 내(intraorbital), 뇌 내(intracerebral), 두개 내(intracranial), 척추 내(intraspinal), 뇌실 내(intraventricular), 수막강 내(intrathecal), 조내(intracistenal), 캡슐 내(intracapsular), 비 내(intranasal) 또는 에어로졸 투여와 같이 비경구적으로 제공되는 경우, 조성물은 바람직하게는 수성(aqueous) 이거나 생리학적으로 적용가능한 체액 현탁액 또는 용액의 부분을 포함하는 것이 바람직하다. 이에 따라, 담체 또는 운반체(vehicle)가 생리학적으로 허용가능하므로 조성물에 첨가하여 환자에게 전달될 수 있다. 따라서, 제제를 위한 체액과 같은 담체로 일반적으로 생리식염수를 포함할 수 있다.
또한, 투여 빈도는 사용되는 제제 내의 FGF21 변이체 단백질의 약동학적 파라미터에 따라 달라질 것이다. 전형적으로, 임상의는 목적 효과를 달성하는 투여량에 도달할 때까지 조성물을 투여할 것이다. 따라서, 조성물은 단일 용량으로서, 시간 간격을 둔 2회 이상의 용량(동일한 양의 목적 분자를 함유하거나 함유하지 않을 수 있음)으로서, 또는 이식 장치 또는 카테터를 통한 연속 주입으로서 투여될 수 있다. 적절한 투여량의 추가의 정밀화는 당업자에 의해 일상적으로 이루어지고, 그들에 의해 일상적으로 수행되는 업무 영역 내에 해당한다.
또한, 융합 단백질의 바람직한 단위 투여량은 인간에 있어서 0.1 ㎍/kg-100 mg/kg이며, 더욱 바람직하게는, 0.01 mg/kg-10 mg/kg이다. 이것이 최적량이긴 하나, 치료대상 질환 및 부작용의 유무에 따라 달라질 수 있다. 그러나, 최적의 투여량은 통상적인 실험을 이용하여 결정될 수 있다. 융합 단백질의 투여는 주기적인 급속 주입(periodic bolus injections)에 의하거나, 외측 공급원(external reservoir) (예, 정맥주사 보유주머니(intravenous bag)) 또는 내측 (예, 생체부식성 임플란트(bioerodable implant))으로부터의 지속적인 정맥 내, 피하, 또는 복막 내 투여에 의할 수 있다.
또한, 본 발명의 융합 단백질은 다른 생물학적 활성 분자와 함께 대상 수용체에 투여될 수 있다. 그러나 융합 단백질 및 다른 분자의 최적의 조합, 투여 형태, 정량은 당업계에서 잘 알려진 통상적인 실험을 통하여 결정될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면으로, 본 발명은 상기 융합 단백질을 코딩하는 단리된 핵산분자를 제공한다.
본원에서 사용된 용어 "단리된 핵산 분자"는 전체 핵산이 공급원 세포로부터 단리될 때 그와 함께 자연에서 발견되는 단백질, 지질, 탄수화물, 또는 다른 물질의 약 50% 이상으로부터 분리되었거나, 자연에서는 연결되지 않는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되거나, 또는, 보다 큰 폴리뉴클레오티드 서열의 일부로서 자연에서 발생하지 않는 본 발명의 핵산 분자를 의미한다. 바람직하게는, 본 발명의 단리된 핵산 분자에는 임의의 다른 오염 핵산 분자, 또는 폴리펩타이드 생산 또는 그의 치료, 진단, 예방 또는 연구 용도에서 그의 사용을 저해하는 그의 천연 환경에서 발견되는 다른 오염물이 실질적으로 존재하지 않는다.
이때, 상기 융합 단백질을 코딩하는 단리된 핵산 분자는 코돈의 중복(redundancy)으로 인해 서로 상이한 서열을 가질 수 있다. 또한, 상기 단리된 핵산은 상기 융합 단백질을 생산할 수 있는 한 목적에 따라 적절히 변형되거나, N 말단 또는 C 말단에 뉴클레오티드가 첨가될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면으로, 본 발명은 FGF21 융합 단백질과 면역글로불린의 Fc 영역으로 이루어진 융합 단백질을 코딩하는 단리된 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
용어 "발현 벡터"는 숙주 세포의 형질전환에 적합하고 삽입된 이종 핵산 서열의 발현을 지시하거나 제어하는 핵산 서열을 함유하는 벡터를 의미한다. 상기 벡터는 선형(linear) 핵산, 플라스미드, 파지미드(phagemids), 코스미드(cosmids), RNA 벡터, 바이러스 벡터 및 이의 유사체들을 포함한다. 바이러스 벡터의 예로는 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 및 아데노-관련 바이러스(adeno-associated virus)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본원에서 사용된 용어, 목적 단백질의 "이종 핵산 서열의 발현" 또는 "발현"은, 삽입된 DNA 서열의 전사, mRNA 전사체의 번역, 및 Fc 융합 단백질 생산물 또는 항체 또는 항체 단편의 생산을 의미한다.
유용한 발현 벡터는 RcCMV(Invitrogen, Carlsbad) 또는 이의 변이체일 수 있다. 유용한 발현 벡터는 포유류 세포에서 목적 유전자의 연속적인 전사를 촉진하기 위한 인간 CMV(cytomegalovirus) 프로모터, 및 전사 후 RNA의 안정상태 수준을 높이기 위한 우태 성장 인자(bovine growth hormone) 폴리아데닐레이션 신호 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구체예로 발현 벡터는 RcCMV의 변형 벡터인 pAD15이다.
본 발명의 또 다른 측면으로, 본 발명은 상기 발현벡터를 포함하는 숙주세포를 제공한다.
본원에서 사용된 용어 "숙주 세포"는 재조합 발현 벡터가 도입될 수 있는 원핵 및 진핵 세포를 나타낸다. 본원에서 사용된 용어, "형질전환된" 및 "형질감염된"은 당업계에 공지된 많은 기술에 의한 세포 내로의 핵산(예를 들어, 벡터)을 도입하는 것을 의미한다.
적절한 숙주 세포는 본 발명의 DNA 서열로 형질 전환되거나 형질 감염시킬 수 있으며, 목적 단백질의 발현 및/또는 분비에 이용될 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 현재 바람직한 숙주 세포는 불사의 하이브리도마 세포(immortal hybridoma cells), NS/0 골수종 세포(NS/0 myeloma cells), 293 세포, 중국 햄스터 난소 세포(CHO cell), HeLa 세포, CAP 세포 (인간 양수 유래 세포), 및 COS 세포를 포함한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다.
제조예 1. FGF21 변이체를 포함한 융합 단백질의 제조 및 스크리닝
제조예 1-1. FGF21 변이체 단백질의 발현을 위한 발현벡터의 제조
FGF21-Fc 구조에서 FGF21의 생물학적 활성을 증가시키기 위해 FGF21에 대한 돌연변이 연구를 수행하였다. 먼저, FGF21 단백질의 3차원 구조 분석을 통해 단백질 활성에 영향이 클 것으로 예측되는 19번, 20번, 21번, 22번 위치 각 아미노산을 알라닌으로 치환하고, IgG4 Fc 변이체를 결합시킨 융합 단백질을 아래 표 1과 같이 제조하였다.
FGF21 변이체 단백질을 포함한 융합 단백질
물질
코드 		FGF21
서열변화 		융합 캐리어 링커 서열 서열번호
N00 없음 IgG4Fc 변이체 (서열번호: 5) GS3A (서열번호: 3) 서열번호: 6
N01 R19A IgG4Fc 변이체 (서열번호: 5) GS3A (서열번호: 3) 서열번호: 7
N02 Y20A IgG4Fc 변이체 (서열번호: 5) GS3A (서열번호: 3) 서열번호: 8
N03 L21A IgG4Fc 변이체 (서열번호: 5) GS3A (서열번호: 3) 서열번호: 9
N04 Y22A IgG4Fc 변이체 (서열번호: 5) GS3A (서열번호: 3) 서열번호: 10
구체적으로, 각 FGF21 변이체 단백질의 아미노산 서열을 기초로 이를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 ㈜바이오니아사에 의뢰하여 합성하였다. 각 FGF21 변이체 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 5' 말단과 3' 말단에 각각 NheI 과 NotI 제한효소 서열을 첨가하였고, 5' 말단의 제한효소 서열 뒤에 단백질 번역을 위한 시작 코돈과 발현된 단백질을 세포 밖으로 분비하게 하는 유도서열을 삽입하였다. 각 FGF21 단백질 변이체 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 뒤에는 종결코돈을 삽입하였다. NheI과 NotI 두 제한효소 서열을 이용하여 각 FGF21 변이체 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 pTrans-empty 발현벡터에 클로닝하였다. pTrans-empty 발현벡터는 독일의 CEVEC사에서 입수 하였으며, CMV 프로모터, pUC 유래 복제기원, SV40 유래 복제기원, 암피실린 내성 유전자를 가지는 간단한 구조의 발현벡터이다.
제조예 1-2. FGF21 변이체 단백질의 발현을 위한 플라스미드 DNA 의 제작
상기 제조예 1-1에서 제작한 각 발현벡터를 대장균에 형질전환하여 발현에 쓰일 다량의 플라스미드 DNA를 얻었다. 각 발현벡터는 세포벽이 약화된 대장균내에 열쇼크를 통해 형질도입하였으며, LB 플레이트에 도말하여 콜로니를 확보하였다. 확보된 콜로니를 LB배지에 접종한 후 16시간 배양하여 각 발현벡터를 세포내에 가지는 대장균을 각 100 ml씩 확보하였다. 확보된 대장균은 원심분리를 통해 배양배지를 제거한 후 P1, P3, P3 용액(QIAGEN사, cat no.:12963)을 첨가하여 세포벽을 깨고 단백질과 DNA를 분리한 DNA 혼탁액을 확보하였다. Qiagen DNA 정제 칼럼을 이용해 확보한 용액으로부터 플라스미드 DNA를 정제하였다. 용출된 DNA는 아가로즈 젤 전기영동을 통해 확인하였으며, 나노드롭 기기(Thermo scientific사, Nanodrop Lite)를 이용하여 농도와 순도를 측정한 후 발현에 사용하였다.
제조예 1-3. CAP -T 세포에서 FGF21 변이체 단백질의 발현
상기 제조예 1-2에서 분리한 각 플라스미드 DNA로 인간세포주를 형질전환하였다. PEM 배지(Life technologies)에서 배양 중인 CAP-T 세포(CEVEC사)에 PEI 용액(Polyplus사, cat. no.:101-10N)을 이용하여 각 플라스미드 DNA를 형질도입하였다. DNA와 PEI 용액의 혼합액을 인비트로젠사의 Freestyle293 발현 배지를 이용하여 현탁한 세포에 섞고 5시간 배양 후 PEM 배지를 첨가하였다. 7일간 배양 후 원심분리를 통해 세포를 제거하여 FGF21 변이체 단백질이 포함된 상등액을 확보하였다.
제조예 1-4. FGF21 변이체 단백질과 Fc 영역이 융합된 융합 단백질의 정제
Protein A 친화크로마토그래피 칼럼을 20 mM 인산나트륨(pH 7.0) 완충액으로 평형화하였다. 각 FGF21 변이체 단백질을 포함하는 배양 상등액을 0.2 μm 필터로 여과한 후, Protein A 친화크로마토그래피(GE Healthcare) 칼럼에 로딩하였다. 20 mM 인산나트륨 완충액으로 칼럼을 세척한 후 100 mM 글리신(pH 3.0) 완충액으로 FGF21 변이체 단백질을 용출하였다. 친화크로마토그래피를 통해 얻은 단백질은 하이드록시아파타이트(CHT hydroxyapatite Type I 40 μm, Bio-Rad) 칼럼을 이용해 정제하였다. 하이드록시아파타이트 칼럼을 5 mM 인산나트륨(pH 6.8) 완충액으로 평형화한 후, 친화크로마토그래피에서 용출한 단백질을 로딩하였다.
5 mM 인산나트륨(pH 6.8) 완충액으로 칼럼을 세척한 후, 500 mM 인산나트륨(pH 6.8) 완충액을 농도 구배로 흘려준 후 용출된 분획을 분석하였다. SDS-PAGE 환원 조건에서 각 분획을 분석하여 고순도의 FGF21 변이체 단백질이 존재하는 부분을 모은 다음 최종 완충액 1X PBS, 1 mM EDTA, pH 7.4로 4℃에서 밤새 투석하였다. 투석이 끝난 후 30,000 MW 컷오프 원심분리 필터를 사용하여, 3000 rpm, 4℃에서 농축하였다. FGF21 변이체 단백질의 농도는 BCA 정량분석으로 측정하였다.
실험예 1. FGF21 변이체 단백질을 포함한 융합 단백질 스크리닝
위 제조예 1에서 제조된 융합 단백질인, N01, N02, N03 및 N04의 시험관내 활성을 측정하였다. 구체적으로, 융합 단백질의 시험관내 활성을 평가하기 위해 FGF21의 보조수용체인 베타-클로토가 과발현하도록 제작된 HEK293 세포주를 이용하였다. 활성 평가를 위해 야생형 FGF21을 200 nM 농도에서 3배 계열희석 하였고, 융합 단백질이 포함된 샘플을 30 μM 농도에서 3배 계열 희석하여 5시간의 혈청 결핍상태로 배양한 인간 베타-클로토 과발현 HEK293 세포주에 20분간 처리한 후 세포를 용해시켰다. 용해된 세포액은 ERK와 인산화된 ERK를 검출 할 수 있는 항체와 섞은 후 2시간 상온에서 반응시킨 후 형광검출반응을 탐지하였다. 야생형 FGF21 단백질에 IgG4 Fc를 결합시켜 제조한 융합 단백질인 N00 대비 상기 융합 단백질이 포함된 샘플의 FGF21 활성을 측정하였다.
그 결과, 야생형 FGF21 단백질에 IgG4 Fc를 결합시켜 제조한 융합 단백질인 N00 대비 상기 4개의 융합 단백질의 FGF21 활성을 측정한 결과, 야생형 FGF21의 19번 위치 아르기닌(R)을 알라닌(A)으로 치환시켰을 때의 활성 감소 정도가 가장 적었다. 따라서, 야생형 FGF21의 19번 위치가 가장 중요함을 확인하였다.
제조예 2. 야생형 FGF21 의 19번째 위치의 변이를 포함한 FGF21 변이체 단백질을 포함한 융합 단백질의 제조 및 스크리닝
상기 제조예 1-1 내지 1-4의 방법에 따라 야생형 FGF21의 19번째 위치의 아르기닌을 알라닌을 제외한 아래 표 2에 기재된 18개의 아미노산으로 각각 치환한 FGF21 변이체 단백질을 포함한 융합 단백질(N05~N22)을 제조하였다.
야생형 FGF21 의 19번째 위치의 변이를 포함한 FGF21 변이체 단백질을 포함한 융합 단백질
물질
코드 		FGF21
서열변화 		융합 캐리어 링커 서열 서열번호
N05 R19E IgG4Fc 변이체 (서열번호: 5) GS3A (서열번호: 3) 서열번호: 11
N06 R19H IgG4Fc 변이체 (서열번호: 5) GS3A (서열번호: 3) 서열번호: 12
N07 R19N IgG4Fc 변이체 (서열번호: 5) GS3A (서열번호: 3) 서열번호: 13
N08 R19M IgG4Fc 변이체 (서열번호: 5) GS3A (서열번호: 3) 서열번호: 14
N09 R19S IgG4Fc 변이체 (서열번호: 5) GS3A (서열번호: 3) 서열번호: 15
N10 R19T IgG4Fc 변이체 (서열번호: 5) GS3A (서열번호: 3) 서열번호: 16
N11 R19P IgG4Fc 변이체 (서열번호: 5) GS3A (서열번호: 3) 서열번호: 17
N12 R19Y IgG4Fc 변이체 (서열번호: 5) GS3A (서열번호: 3) 서열번호: 18
N13 R19F IgG4Fc 변이체 (서열번호: 5) GS3A (서열번호: 3) 서열번호: 19
N14 R19L IgG4Fc 변이체 (서열번호: 5) GS3A (서열번호: 3) 서열번호: 20
N15 R19I IgG4Fc 변이체 (서열번호: 5) GS3A (서열번호: 3) 서열번호: 21
N16 R19V IgG4Fc 변이체 (서열번호: 5) GS3A (서열번호: 3) 서열번호: 22
N17 R19Q IgG4Fc 변이체 (서열번호: 5) GS3A (서열번호: 3) 서열번호: 23
N18 R19K IgG4Fc 변이체 (서열번호: 5) GS3A (서열번호: 3) 서열번호: 24
N19 R19D IgG4Fc 변이체 (서열번호: 5) GS3A (서열번호: 3) 서열번호: 25
N20 R19C IgG4Fc 변이체 (서열번호: 5) GS3A (서열번호: 3) 서열번호: 26
N21 R19W IgG4Fc 변이체 (서열번호: 5) GS3A (서열번호: 3) 서열번호: 27
N22 R19G IgG4Fc 변이체 (서열번호: 5) GS3A (서열번호: 3) 서열번호: 28
이와 같이 수득한 융합 단백질에 대하여, 상기 실험예 1과 같은 방법으로 시험관내 활성을 측정하였다. N00 대비 N05 내지 N22의 시험관내 활성을 평가한 결과, N12를 제외한 모든 돌연변이 물질에서 활성이 감소하였다. N12는 N00 대비 약 6배 정도 활성이 증가하였다.
제조예 3. 하이브리드 Fc 를 포함한 FGF21 융합 단백질의 제조 및 스크리닝
상기 제조예 1-1 내지 1-4의 방법에 따라 야생형 FGF21 및 야생형 19번째 위치의 아르기닌을 티로신으로 치환된 FGF21 변이체 단백질과 하이브리드 Fc가 결합된 융합 단백질을 하기 표 3과 같이 제조하였다.
하이브리드 Fc 를 포함한 FGF21 융합 단백질
물질
코드 		FGF21
서열변화 		융합 캐리어 링커 서열 서열번호
H05 없음 hyFc5 (서열번호: 29) - 서열번호: 34
H09 없음 hyFc9 (서열번호: 30) - 서열번호: 35
H11 없음 hyFc11 (서열번호: 31) - 서열번호: 36
HyC - hyFc-C (서열번호: 32) - 서열번호: 37
H40 없음 hyFc40 (서열번호: 33) - 서열번호: 38
M09 R19Y hyFc5 (서열번호: 29) - 서열번호: 39
F09 R19Y hyFc40 (서열번호: 33) - 서열번호: 40
상기 실험예 1의 실험 방법과 같은 방법으로 시험관내 활성을 평가하였다. 각 융합 단백질들의 EC50 값을 측정한 결과, H05 링커 구조의 시험관내 활성이 가장 우수하였고, HyC 물질의 경우 EC50 값의 측정을 통한 활성은 우수한 경향을 보였으나 Emax 값이 다소 낮은 경향을 보였다.
실험예 2. 융합 단백질의 시험관내 활성 측정 결과
실험예 2-1. N00 및 N12 의 실험 결과
FGF21의 19번째 아미노산의 변이에 따른 FGF21을 포함한 융합 단백질의 활성을 평가하기 위하여, N00 및 N12를 실험한 결과, N12는 N00 대비 시험관내 활성이 약 6배 정도 증가한 경향을 확인하였다. 따라서, 야생형 FGF21에 비하여 19번째 아미노산이 티로신으로 치환된 FGF21 변이체 단백질을 포함한 융합 단백질의 활성이 증가함을 확인하였다.
실험예 2-2. H05 , H09 , H11 및 HyC 의 실험 결과
FGF21 변이체 단백질 및 각 링커 구조의 시험관내 활성을 평가하기 위하여, H05, H09, H11 및 HyC 단백질에 대하여 상기 실험 방법에 따라 시험관내 활성을 측정한 결과, H05 링커 구조의 시험관내 활성이 가장 우수하였고, HyC 물질의 경우 EC50 값의 측정을 통한 활성은 우수한 경향을 보였으나 Emax 값이 다소 낮은 경향을 보였다.
실험예 2-3. H05 및 H40 의 실험 결과
하이브리드 Fc의 종류에 따른 야생형 FGF21 단백질을 포함한 융합 단백질의 활성을 평가하기 위하여, H05 및 H40의 활성을 측정한 결과, 두 물질의 경우 시험관내 활성은 큰 차이가 없음을 확인하였다.
실험예 2-4. H05 및 M09 의 실험 결과
FGF21의 변이 유무에 따른 융합 단백질의 활성을 측정하기 위하여, H05 및 M09의 시험관내 활성을 평가한 결과, M09 물질의 경우 H05 대비 시험관내 활성이 증가되었음을 확인하였다. 즉, FGF21의 변이체 단백질을 포함한 융합 단백질이 야생형의 FGF21 단백질을 포함한 융합 단백질에 비하여 활성이 우수함을 확인하였다.
실험예 2-5. M09 및 F09의 실험 결과
야생형 FGF21의 19번째 아미노산이 티로신으로 치환된 변이체의 경우 하이브리드 Fc에 따른 시험관내 활성을 측정하기 위하여 M09 및 F09의 시험관내 활성을 측정하였다. 두 물질의 경우 시험관내 활성은 큰 차이가 없음을 확인하였다. 따라서, FGF21의 변이체의 활성은 Fc의 종류가 아닌 FGF21의 변이체의 위치에 크게 영향을 받음을 확인하였다.
실험예 3. 융합 단백질의 약동역학 측정
실험예 3-1. 약동역학 측정 실험 방법
㈜오리엔트 바이오(Orient BIO, Korea)에서 구입한 6주령의 수컷 ICR 마우스를 약물 처리일 전날에 체중의 평균값이 유사하도록 군분리(채혈 시간당 n=3)한 후, 샘플을 각각 2 mg/kg 용량을 단회 피하 투여하였으며, 혈액 샘플은 1, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96, 144 및 192 시간차에 수집하였다. 온전한(intact) 전체 길이 FGF21의 혈중 농도를 측정하기 위해, 본 시험에서는 N-말단 및 C-말단 FGF21에 대해 면역 반응성을 갖는 Intact human FGF21 ELISA Kit(F1231-K01, Eagle Biosciences, USA) 를 사용하였다. 마우스에 피하 주사 후 192시간 까지의 샘플의 혈중 농도를 측정하였다.
실험예 3-2. 약동역학 활성 측정 결과
3-2-1. N00 및 N12 의 실험 결과
FGF21의 19번째 아미노산의 변이에 따른 FGF21을 포함한 융합 단백질의 약동 역학을 평가하기 위하여, N00 및 N12를 이용하여 실험하였다. 마우스에 피하 주사 후 192시간 까지의 N00 및 N12의 혈중 농도를 도3에 나타내었다. N00는 N12 대비 시간에 따른 높은 혈중 농도 값과 N00 대비 약 2.4배 증가된 혈중 농도 곡선하 면적(Area under the curve, AUC)수치를 나타내었으며, 두 물질의 반감기는 N00는 20.9시간, N12는 18.8시간으로 유사하였다.
3-2-2. H05 , H09 , H11 및 HyC 의 실험 결과
FGF21 변이체 단백질 및 각 링커 구조의 약동역학을 평가하기 위하여, H05, H09, H11 및 HyC 단백질에 대하여 상기 실험 방법에 따라 약동역학을 측정하였다. 마우스에서 피하 주사 후 시간에 따른 H05, H09, H11 및 HyC 혈중 농도는 도6에 나타내었다. 약물의 노출 정도를 나타내는 혈중 농도 곡선하면적은 H05와 H11이 유사하였으며, H09는 H05 대비 약 40% 정도 감소한 수치를 나타내었고, HyC 경우 빠른 약물 소실로 인하여 가장 낮은 혈중 농도 곡선하 면적 값을 보였다. 또한 각 물질의 반감기는 H05 18.3시간, H09 19.0시간, H11 20.9 시간 그리고 HyC 5.7시간으로 HyC를 제외하고는 유사한 반감기를 보였다.
3-2-3. H05 및 H40 의 실험 결과
하이브리드 Fc의 종류에 따른 야생형 FGF21 단백질을 포함한 융합 단백질의 약동역학을 평가하기 위하여, H05 및 H40의 약동역학을 측정하였다. 마우스에서 피하 주사 후 시간에 따른 H05 및 H40의 혈중 농도는 도 11에 나타내었다. H40은 H05 대비 약 1.6배 증가된 혈중 농도 곡선하 면적 범위를 나타내었으며, 두 물질의 반감기는 H05 18.3시간, H40 18.7시간으로 유사하게 산출되었다.
3-2-4. H05 및 M09 의 실험 결과
FGF21의 변이 유무에 따른 융합 단백질의 약동역학을 측정하기 위하여, H05 및 M09의 약동역학을 평가하였다. 약물 처리일(0일차)부터 7일차까지의 혈중 글루코스 곡선하 면적 값을 보면 H05 10 mg/kg 와 M09 3 mg/kg투여 용량에서 비슷한 혈당 강하 효과를 보이는 것으로 보아 대략 3배정도 M09가 H05 대비 우수한 효과를 가진다고 할 수 있다. 체중 증가 억제 효과 또한 M09 투여 그룹에서 H05 그룹 대비 10 mg/kg 용량에서 우수한 효과를 보였으며, 투여 후 4일차에서 효과 비교 시 M09는 10 mg/kg 투여 용량에서 강한 체중 증가 억제 효과를 나타내었다. 따라서 M09는 H05 대비 우수한 항 당뇨 효과 및 체중 증가 억제 효과를 보이는 지속형 FGF21 단백질임을 확인하였다.
3-2-5. M09 및 F09의 실험 결과
야생형 FGF21의 19번째 아미노산이 티로신으로 치환된 변이체의 경우 하이브리드 Fc에 따른 약동역학을 측정하기 위하여 M09 및 F09의 약동역학을 측정하였다. 마우스에서 피하 주사 후 시간에 따른 M09 및 F09의 혈중 농도는 도 14a에 나타내었다. F09는 M09 대비 약 1.6배 증가된 혈중 농도 곡선하 면적 범위를 나타내었으며, 두 물질의 반감기는 M09는 15.6시간, F09는 20.9시간으로 산출되었다.
실험예 4. ob / ob 마우스에서 융합 단백질의 활성 평가
실험예 4-1. ob / ob 마우스에서 활성 평가 실험 방법
ob/ob 마우스는 유전적으로 랩틴(leptin)이 결핍되어 고혈당증, 인슐린 저항, 과식증, 지방간 및 비만을 특징으로 하는 마우스로서, 주로 2형 당뇨병에 대한 연구에 있어 널리 사용되고 있다. 수컷 ob/ob 마우스(Harlan, USA)와 연령을 매칭한 마른(lean) 대조군 마우스는 라온바이오(Korea)에서 구입하였으며, 도착 시 5 내지 6주령이었고, 3주 동안 순응하여 약물 처리 시에 8 내지 9주령이었다. 약물 처리일(0일) 전날에 체중 및 꼬리 혈당의 평균값이 유사하도록 군분리(군당 n=8)한 후, 각각의 용량에 따라 샘플을 단회 피하 투여 하였다. 이 때 비히클 처리는 둘베코스 포스페이트 완충 식염수(Dulbecco's phosphate buffered saline, DPBS, Gibco, USA)를 투여하였으며, 혈액 내 글루코스 농도는 글루코닥터 혈당측정기(올메디쿠스, Korea)를 사용하여 측정하였다. 투여 후 7일차까지의 비절식 혈당을 측정하였다. 또한, 약물 처리일(0일)부터 7일차까지의 혈중 글루코스 곡선하 면적값을 확인하였다.
실험예 4-2. ob / ob 마우스에서 활성 평가 결과
4-2-1. N00 및 N12 의 실험 결과
FGF21의 19번째 아미노산의 변이에 따른 FGF21을 포함한 융합 단백질의 in vivo 효과를 확인하기 위하여, N00 및 N12를 이용하여 실험하였다. 투여 후 7일차까지의 비절식 혈당 그래프(도 4a)를 보면 N00(서열번호: 06) 의 경우 3 mg/kg 용량 이상에서 우수한 혈당 강하 효과를 보이는 반면, 시험관내 활성이 증가된 N12(서열번호: 18)의 경우 1 mg/kg 용량에서도 우수한 혈당 조절 작용을 나타낼 뿐만 아니라 정상 대조군에 필적하는 수준으로 혈당 수치를 감소시켰다. 약물 처리일(0일)부터 7일차까지의 혈중 글루코스 곡선하 면적값(도 4b)을 보면 N12 1 mg/kg 와 N00 3 mg/kg투여 용량에서 비슷한 혈당 강하 효과를 보이는 것으로 보아 대략 3배 정도 N12가 N00 대비 우수한 효과를 가진다고 할 수 있다. 체중 증가 억제 효과 또한 N12 투여 그룹에서 N00 그룹 대비 동일 용량 대비 우수한 효과를 보였으며, 투여 후 4일차에서 효과 비교 시 N12 1 mg/kg 와 N00 3 mg/kg에서 비슷한 체중 증가 억제 효과를 나타내었다. 따라서 N12는 N00 대비 강력한 항 당뇨 효과를 보이는 돌연변이체임을 확인하였다.
즉, 돌연변이체인 N12는 N00 대비 시험관내 평가에 있어서 우수한 활성을 보일 뿐만 아니라 마우스 모델에서도 항 당뇨 및 체중 증가 억제 효과에 있어서 N00 대비 동일 용량에서 더 큰 효력이 나타남을 입증하였다.
4-2-2. H05 , H09 , H11 및 HyC 의 실험 결과
FGF21 변이체 단백질 및 각 링커 구조의 in vivo 효과를 확인하기 위하여, H05, H09, H11 및 HyC 단백질에 대하여 상기 실험 방법에 따라 실험하였다. 투여 일(0일)부터 7일차까지의 혈중 글루코스 곡선하 면적 값(도 7a)을 보면 H09를 제외한 H05, H11 투여 그룹에서 용량 의존적인 혈당 감소 효과를 보였다. 체중 증가 억제 효과에서는 H05 및 H11 투여 그룹에서는 10 mg/kg 용량에서 우수한 억제 효과를 나타냈다(도 7b).
4-2-3. H05 및 H40 의 실험 결과
하이브리드 Fc의 종류에 따른 야생형 FGF21 단백질을 포함한 융합 단백질의 in vivo 효과를 확인하기 위하여, H05 및 H40을 실험하였다. 각각의 용량에 따라 H05(서열번호: 34) 와 H40(서열번호: 38) 을 단회 피하 투여 하였다. 투여 후 7일차까지의 비절식 혈당 그래프(도 12a)를 보면 H05의 경우 10 mg/kg 용량 이상에서 우수한 혈당 강하 효과를 보이는데 비해, 약물 동태시험에서 H05 대비 향상된 체내 노출 수치를 보인 H40의 경우 3 mg/kg 용량에서도 우수한 혈당 조절 작용을 보였다.
약물 처리일(0일차)부터 7일차까지의 혈중 글루코스 곡선하 면적 값(도 12b)을 보면 H05 10 mg/kg과 H40 3 mg/kg 투여 용량에서 비슷한 혈당 강하 효과를 보이는 것으로 보아 대략 3배 정도 H40이 H05 대비 우수한 효과를 가진다고 할 수 있다. 체중 증가 억제 효과 또한 H40 투여 그룹에서 H05 그룹 대비 10 mg/kg 용량에서 우수한 효과를 보였으며, 투여 후 4일 차에서 효과 비교 시 H40 3 mg/kg 투여 그룹은 H05 10 mg/kg 투여 그룹 대비 더 큰 체중 증가 억제 효과를 나타내었다(도 12c, d). 따라서 H40은 H05 대비 우수한 항 당뇨 효과 및 체중 증가 억제 효과를 보이는 지속형 FGF21 단백질이다.
즉, FGF21과 하이브리드 Fc를 연결하는 링커의 다른 형태인 H05와 H40의 평가에 있어서 두 물질은 시험관내 평가에 있어서 유사한 활성을 보였다. 그러나 마우스에서의 약물동역학 결과에서 보듯이 H40이 H05 대비 대략 1.6배 향상된 혈중 농도 곡선하 면적 수치를 보였고, 당뇨 모델 마우스인 ob/ob에서도 혈당 저하 작용 및 체중 증가 억제에 있어서 H05 대비 동일 용량 대비 우수한 활성을 보임을 관찰하였다.
4-2-4. M09 및 F09의 실험 결과
야생형 FGF21의 19번째 아미노산이 티로신으로 치환된 변이체의 경우 하이브리드 Fc에 따른 in vivo 효과를 확인하기 위하여, M09 및 F09를 실험하였다. 각각의 용량에 따라 M09(서열번호: 39)와 F09(서열번호: 40)를 단회 피하 투여 하였다. 투여 후 7일차까지의 비절식 혈당 그래프(도 15a)를 보면 두 물질 모두 3, 10 mg/kg에서 우수한 혈당 강하 효과를 보이며, 특히 10 mg/kg 용량에서는 정상 대조군에 필적하는 수준으로 혈당 수치를 나타내었다. F09의 경우, 낮은 용량 구간인 0.3 mg/kg 투여 군에서도 양호한 혈당 강하 효과를 보이는데 이는 M09 3 mg/kg투여 군과 유사한 혈당 프로파일을 나타내었다. 약물 처리일(0일차)부터 7일차까지의 혈중 글루코스 곡선하 면적 값(도 15b)을 보면 F09 0.3 mg/kg 와 M09 3 mg/kg 투여 용량에서 비슷한 혈당 강하 효과를 보이는 것으로 보아 F09는 M09 대비 저 용량에서도 우수한 항 당뇨 약효를 입증하였다.
실험예 5. db / db 마우스에서 융합 단백질의 활성 평가
실험예 5-1. db / db 마우스에서 활성 평가 실험 방법
융합 단백질을 포함한 샘플의 항 당뇨 효과 및 체중 증가 억제 효과를 또 다른 당뇨 모델 마우스인 db/db 마우스에서 평가하였다. db/db 마우스는 유전적으로 랩틴(leptin)수용체가 결핍되어 고혈당증, 인슐린 저항, 과식증, 지방간 및 비만을 특징으로 하는 마우스로서 주로 2형 당뇨병에 대한 연구에 있어 ob/ob 마우스와 함께 널리 사용되고 있다. 6주령의 수컷 db/db 마우스(SLC, Japan)와 연령을 매칭한 마른 대조군 마우스는 ㈜중앙실험동물에서 구입하였으며, 3주 동안 순응하여 약물 투여 시에 9주령 이었다. 약물 처리일(0일) 전날에 체중 및 꼬리 혈당의 평균값이 유사하도록 군분리(군당 n=8)한 후, 각각의 용량에 따라 샘플을 단회 또는 2회(0, 4일) 피하 투여 하였다. 투여 후 7일차까지의 비절식 혈당 그래프와 글루코스 곡선하 면적 값을 확인하였다.
실험예 5-2. db / db 마우스에서 활성 평가 결과
F09의 db/db 마우스에서 활성을 측정하기 위하여 상기의 실험 방법에 따라, F09의 활성을 측정하였다. 투여 후 7일차까지의 비절식 혈당 그래프(도 17a)와 글루코스 곡선하 면적 값(도 17b)을 보면 F09 용량에 따른 혈당 강하 효과가 나타나며, 단회 투여 보다 주 2회 투여 군에서 4일차 이후로 정상 마우스의 혈당 수치에 근접하는 우수한 혈당 감소 효력을 보였다. 체중 증가 억제 또한 용량 의존적은 아니나 F09투여에 의해 억제 효과가 관찰되었으며 주2회 투여 그룹에서 가장 큰 억제 효과를 보였다(도 17c 및 17d). 본 시험은 F09의 항 당뇨 및 체중 증가 억제 효과를 다른 당뇨 모델 마우스인 db/db 마우스에서도 나타남을 입증하였다.
실험예 6. 래트에서의 융합 단백질에 대한 약동역학 측정
야생형 FGF21의 19번째 아미노산이 티로신으로 치환된 변이체가 포함된 융합 단백질의 활성을 확인하기 위하여, 래트에서 활성을 확인하였다. 투여 전날에 체중의 평균값으로 군분리(약물당 n=3) 한 수컷 래트(Orient BIO, Korea)에 M09(서열번호: 39) 및 F09(서열번호: 40) 각각 1 mg/kg 용량을 단회 피하 투여하였으며, 혈액 샘플은 1, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96, 144 및 192 시간차에 수집하였다. 도 14b는 래트에서 피하 주사 후 시간에 따른 M09 및 F09의 혈중 농도를 나타낸 것이다. 마우스에서와 약동역학 결과와 유사한 경향으로 F09는 M09 대비 약 1.4배 증가된 혈중 농도 곡선하 면적 범위를 나타내었으며, 두 물질의 반감기는 M09는 15.0시간, F09는 17.8시간으로 산출되었다.
실험예 7. 식이 유도 비만 마우스에서 융합 단백질의 활성 평가
FGF21 변이체 단백질을 포함한 M09와 F09의 체중 감소 효과를 식이 유도 비만 마우스에서 평가하였다. 식이 유도된 비만을 위하여 C57BL/6J 마우스들을 ㈜중앙실험동물로부터 구입하여 60 kcal % 지방을 함유하는 고지방 식이(Research diet)상에서 8~12주 정도 사육하여 비만 마우스 모델을 제작하였다. 약물 처리일(0일) 전날에 체중의 평균값이 유사하도록 군분리(군당 n=8)한 후, 각각의 용량에 따라 시험 물질을 2주 동안 단회 또는 주1회 간격으로 피하 투여하였다.
투여 후 7일차 및 14일차에서의 체중 감소 효과를 보면 두 물질 모두 용량 의존적으로 체중을 감소시켰으며 단회 투여 시 F09는 10, 30 mg/kg투여 용량에서 동일 용량의 M09 투여 그룹 대비 우수한 체중 감소 효과를 보였다. 또한 주 1회 간격으로 10 mg/kg 용량을 2회 반복 투여한 F09 투여 그룹에서 동일 용량의 M09 반복 투여 그룹뿐만 아니라 모든 투여 그룹 대비 가장 큰 체중 감소 효과를 나타내었다(도 16a 및 16b). 따라서 F09는 M09 대비 우수한 항 비만 효과를 보이는 지속형 FGF21 돌연변이체이다.
즉, 돌연변이체인 FGF21과 하이브리드 Fc를 연결하는 링커의 다른 형태인 M09와 F09의 평가에 있어서 두 물질은 시험관내 평가에 있어서 유사한 활성을 보였다. 그러나 마우스와 래트에서의 약물동태 시험에서 F09가 M09 대비 향상된 혈중 농도 곡선하 면적 수치를 보였고, 당뇨 모델인 ob/ob 마우스와 식이 유도 비만 마우스에서의 효력 비교 평가 시 F09가 M09 대비 혈당 저하 작용 및 체중 감소 효과에 있어서 우수한 활성을 보임을 입증하였다.
실험예 8. 융합 단백질의 안정성 평가
실험예 8-1. 안정성 평가 실험 방법
샘플의 초기 상태에서의 단백질 응집체의 양을 측정하기 위하여, 크기 배제 크로마토그래피(SEC-HPLC) 방법을 이용하여, %고분자량 응집체(%HMW)를 측정하였다. SEC-HPLC 방법은 토소하스(TosoHaas) 모델 TSK-GEL G3000SWXL 칼럼을 사용하였다. 완충액 1X PBS, 1 mM EDTA, pH 7.4를 칼럼에 1 ml/min의 유속으로 흘려주어 평형화시켰다. M09와 F09 단백질 원액을 30,000 MW 컷오프 원심분리 필터를 사용하여, 3000 rpm, 4℃에서 20 mg/ml 이상의 표적 농도로 농축하였다.
BCA 정량분석으로 각 샘플의 농도를 측정한 후, 완충액 1X PBS, 1 mM EDTA, pH 7.4로 희석하여 최종 20 mg/ml이 되도록 하였다. M09와 F09의 초기 %HMW를 측정하기 위해, 20 mg/ml의 시료를 1X PBS, 1 mM EDTA, pH 7.4로 희석하여 0.5 mg/ml이 되도록 한 후, SEC-HPLC 칼럼에 100 μl를 주입하여 분석하였다. 각 샘플의 안정성을 평가하기 위해 4℃와 25℃에서 4주 동안 보관하면서 1주, 2주, 4주차에 SEC-HPLC 방법을 이용하여, %HMW를 측정하였다. 샘플의 제로 시간 샘플(초기)과 1주, 2주, 4주 동안 보관하면서 분석하였다.
실험예 8-2. N09 및 F09의 안정성 평가
M09 및 F09에 대하여 상기 실험 방법과 같이 안정성을 측정한 결과, M09와 F09의 제로 시간 샘플(초기)과 1주, 2주, 4주 동안 보관하면서 분석한 결과를 표 4에 요약하였다. 제로 시간에서의 %HMW 양은 M09의 경우 2.27%, F09의 경우 관찰되지 않았다. 4주 경과 시점에서 %HMW 양은 M09의 경우 3.70%, F09의 경우 1.31%로 나타났다. F09는 M09 대비 초기 시점 및 4주 경과 시점에서 HMW 비율이 낮은 것으로 확인됐다.
20 mg / ml 농도에서 M09 와 F09의 4주간 안정성 (% HMW )
week 초기 1주 2주 4주
온도 4℃ 25℃ 4℃ 25℃ 4℃ 25℃
M09 2.27 2.19 2.32 2.53 2.50 3.70 3.90
F09 0.00 1.07 1.27 1.40 1.45 1.31 1.45
<110> YUHAN CORPORATION <120> LONG-ACTING FGF21 FUSION PROTEINS AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING THE SAME <130> FPD_201412-0016_c <160> 40 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 181 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human wtFGF21 <400> 1 His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val 1 5 10 15 Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His 20 25 30 Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser 35 40 45 Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln 50 55 60 Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly 65 70 75 80 Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg 85 90 95 Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His 100 105 110 Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro 115 120 125 Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro 130 135 140 Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val 145 150 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Val Ser Val 260 265 270 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 275 280 285 Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser 290 295 300 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 305 310 315 320 Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 325 330 335 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 340 345 350 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 355 360 365 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 370 375 380 Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 385 390 395 400 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 405 410

Claims (15)

  1. 서열번호: 1로 표시되는 아미노산 서열의 19번째 아미노산인 아르기닌이 다른 아미노산으로 치환된 FGF21 변이체 단백질과 면역글로불린의 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 FGF21 변이체 단백질이 서열번호: 1로 표시되는 아미노산 서열의 19번째 아미노산인 아르기닌이 티로신으로 치환된 것인, 융합 단백질.
  3. 제1항에 있어서, 상기 FGF21 변이체 단백질이 링커를 통해 상기 면역글로불린의 Fc 영역에 연결되는 것인, 융합 단백질.
  4. 제3항에 있어서, 상기 링커는 글리신 및 세린 잔기를 포함하고, 10 내지 20개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩타이드인, 융합 단백질.
  5. 제4항에 있어서, 상기 링커는 GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호: 2) 또는 GGGGSGGGGSGGGGSA(서열번호: 3)인 것인, 융합 단백질.
  6. 제1항에 있어서, 상기 면역글로불린의 Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 및 IgD의 영역 중 어느 하나 또는 이들의 조합인 하이브리드 Fc인 것인, 융합 단백질.
  7. 제6항에 있어서, 상기 하이브리드 Fc는 IgG4 영역 및 IgD의 영역을 포함하는 것인, 융합 단백질.
  8. 제1항에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열번호: 18로 표시되는 아미노산 서열인 것인, 융합 단백질.
  9. 제1항에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열번호: 39로 표시되는 아미노산 서열인 것인, 융합 단백질.
  10. 제1항에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열번호: 40으로 표시되는 아미노산 서열인 것인, 융합 단백질.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 포함하는, 당뇨병, 비만, 이상지질혈증 또는 대사증후군 치료용 약학적 조성물.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 치료가 필요한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 당뇨병, 비만, 이상지질혈증 또는 대사증후군을 치료 또는 예방하는 방법.
  13. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 코딩하는 단리된 핵산분자.
  14. 제13항의 핵산분자를 포함하는 발현벡터.
  15. 제14항의 발현벡터를 포함하는 숙주세포.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220052202A (ko) * 2020-10-20 2022-04-27 전남대학교산학협력단 플라젤린 융합 단백질을 포함하는 비알코올성 지방간질환 또는 대사증후군 예방 또는 치료용 조성물

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107759694B (zh) 2016-08-19 2023-01-13 安源医药科技（上海）有限公司 双特异性抗体及其制备方法与用途
CN106279437B (zh) 2016-08-19 2017-10-31 安源医药科技（上海）有限公司 高糖基化人凝血因子viii融合蛋白及其制备方法与用途
US11123438B2 (en) 2016-08-19 2021-09-21 Ampsource Biopharma Shanghai Inc. Linker peptide for constructing fusion protein
CA3042512A1 (en) * 2016-11-10 2018-05-17 Yuhan Corporation Pharmaceutical composition for preventing or treating hepatitis, hepatic fibrosis, and hepatic cirrhosis comprising fusion proteins
JP7475276B2 (ja) * 2018-02-08 2024-04-26 サンシャイン・レイク・ファーマ・カンパニー・リミテッド Ｆｇｆ２１バリアント、融合タンパク質及びそれらの適用
JP2021528422A (ja) 2018-06-21 2021-10-21 サノフイＳａｎｏｆｉ 最適化された活性比を有するｆｇｆ２１化合物／ｇｌｐ−１ｒアゴニストの組合せ
WO2020177712A1 (en) * 2019-03-05 2020-09-10 Dongguan Hec Biopharmaceutical R&D Co., Ltd. A polypeptide molecule and application thereof
CN114853908A (zh) 2019-05-16 2022-08-05 浙江道尔生物科技有限公司 一种治疗代谢疾病的融合蛋白
AU2020204470B1 (en) * 2020-07-03 2021-05-27 Ampsource Biopharma Shanghai Inc. Dual-function protein for lipid and blood glucose regulation
WO2023280144A1 (zh) * 2021-07-05 2023-01-12 上海翰森生物医药科技有限公司 一种融合蛋白及其医药用途

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005091944A2 (en) 2004-03-17 2005-10-06 Eli Lilly And Company Glycol linked fgf-21 compounds
WO2006050247A2 (en) 2004-10-29 2006-05-11 Neose Technologies, Inc. Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (fgf)
WO2008121563A2 (en) 2007-03-30 2008-10-09 Ambrx, Inc. Modified fgf-21 polypeptides and their uses
WO2009149171A2 (en) 2008-06-04 2009-12-10 Amgen Inc. Fgf21 mutants and uses thereof
WO2010042747A2 (en) 2008-10-10 2010-04-15 Amgen Inc. Fgf21 mutants and uses thereof
WO2010129600A2 (en) 2009-05-05 2010-11-11 Amgen Inc. Fgf21 mutants and uses thereof
WO2010129503A1 (en) 2009-05-05 2010-11-11 Amgen Inc. Fgf21 mutants and uses thereof
WO2012066075A1 (en) 2010-11-19 2012-05-24 Novartis Ag Methods of treating fgf21-associated disorders
WO2013049247A1 (en) 2011-09-26 2013-04-04 Novartis Ag Fusion proteins for treating metabolic disorders
WO2013188181A1 (en) 2012-06-11 2013-12-19 Eli Lilly And Company Fibroblast growth factor 21 proteins

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK1751184T3 (da) * 2004-05-13 2009-11-23 Lilly Co Eli FGF-21 fusionsproteiner
MX2014002260A (es) * 2011-08-31 2014-08-18 Amgen Inc Factor de crecimiento de fibroblasto 21 para usar en el tratamiento de diabetes tipo 1.

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005091944A2 (en) 2004-03-17 2005-10-06 Eli Lilly And Company Glycol linked fgf-21 compounds
WO2006050247A2 (en) 2004-10-29 2006-05-11 Neose Technologies, Inc. Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (fgf)
WO2008121563A2 (en) 2007-03-30 2008-10-09 Ambrx, Inc. Modified fgf-21 polypeptides and their uses
WO2009149171A2 (en) 2008-06-04 2009-12-10 Amgen Inc. Fgf21 mutants and uses thereof
WO2010042747A2 (en) 2008-10-10 2010-04-15 Amgen Inc. Fgf21 mutants and uses thereof
WO2010129600A2 (en) 2009-05-05 2010-11-11 Amgen Inc. Fgf21 mutants and uses thereof
WO2010129503A1 (en) 2009-05-05 2010-11-11 Amgen Inc. Fgf21 mutants and uses thereof
WO2012066075A1 (en) 2010-11-19 2012-05-24 Novartis Ag Methods of treating fgf21-associated disorders
WO2013049247A1 (en) 2011-09-26 2013-04-04 Novartis Ag Fusion proteins for treating metabolic disorders
WO2013188181A1 (en) 2012-06-11 2013-12-19 Eli Lilly And Company Fibroblast growth factor 21 proteins

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220052202A (ko) * 2020-10-20 2022-04-27 전남대학교산학협력단 플라젤린 융합 단백질을 포함하는 비알코올성 지방간질환 또는 대사증후군 예방 또는 치료용 조성물
WO2022085900A1 (ko) * 2020-10-20 2022-04-28 주식회사 메디스팬 플라젤린 융합 단백질을 포함하는 비알코올성 지방간질환 또는 대사증후군 예방 또는 치료용 조성물

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