JP4477013B2 - 線維芽細胞成長因子２１の突然変異タンパク質 - Google Patents

Description

本発明は、改善された薬剤的特質を有する線維芽細胞成長因子２１の新たな突然変異タンパク質の同定に関する。

線維芽細胞成長因子は、発生中の、および成人の組織（Ｂａｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ，３：２３９−２４３， １９９１）において広範に発現される大きなポリペプチドであり、血管形成、有糸分裂誘発、パターン形成、細胞分化、代謝調節、および組織傷害の修復を含む複数の生理機能において重要な役割を果たす（ＭｃＫｅｅｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５９：１３５−１７６，１９９８）。発表された文献によれば、ＦＧＦファミリーは、現在、ＦＧＦ−１〜ＦＧＦ−２３の少なくとも２３メンバーからなる（Ｒｅｕｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ．３１３：１３９−１５７（２００３）。

線維芽細胞成長因子２１（ＦＧＦ−２１）は、肝臓に優先して発現されることが報告されており（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、１４９２：２０３−２０６，（２０００）；ＷＯ０１／３６６４０；およびＷＯ０１／１８１７２）、虚血性血管疾患、創傷治癒、並びに肺、気管支、または肺胞細胞機能の喪失および多くのその他の障害に関連した疾患の治療として記載されている。より最近では、ＦＧＦ−２１は、インスリンの有無においてマウス３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞のグルコース摂取を刺激すること、およびｏｂ／ｏｂおよびｄＢ／ｄＢマウスにおける摂食並びに空腹時血糖、トリグリセリド、およびグルカゴンレベルを減少することが示され、したがって、８週齢のＺＤＦラットを用量依存滴様式で糖尿病および肥満症を治療するための療法として、ＦＧＦ−２１の使用についての基礎を提供する（ＷＯ０／０１１２１３）。加えて、ＦＧＦ−２１は、非常に重篤な患者の死亡率および罹患率を減少させるのに有効なことが示された（ＷＯ０３／０５９２７０）。

ＦＧＦ−２１などのタンパク質医薬の開発における有意な挑戦は、これらの物理的および化学的不安定性に対処することである。タンパク質の組成上の多様性および特徴は、折りたたみ、高次構造上の安定性、およびアンフォールディング／変性などの具体的挙動を定義する。このような特徴により、水性タンパク質溶液を利用して薬剤的処方条件を開発するときには、タンパク質を安定化するように処理されなければならない（Ｗａｎｇ，Ｗ．，Ｉｎｔ．Ｊ．ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，１８，（１９９９））。

特に、薬剤的タンパク質開発、フェノール、ｍ−クレゾール、メチルパラベン、レゾルシノール、およびベンジルアルコールなどの抗菌性保存剤は、無菌の多目的製剤であることが企図される非経口的製剤において必要とされる。残念なことに、これらの化合物は、タンパク質産物の安定性に悪影響を与えることが多く、特に会合および凝集をトリガーしてしまう（Ｍａａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ １４０：１５５−１６８（１９９６）；Ｌａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１４（６）：７２５−７２９（１９９７））。

ＦＧＦ−２１は、多目的の、無菌の製剤として利用される可能性が高い。しかし、保存剤（すなわち、ｍ−クレゾール）が、これらの条件下でその安定性に対して有害な影響を有することが決定された。明らかであるが、治療的タンパク質ＦＧＦ−２１のための安定な水性タンパク質製剤を開発する必要がある。本発明は、製剤条件下で野生型ＦＧＦ−２１よりも安定なＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質の本発明によって、物理的不安定性に関する有意なハードルを克服する。従って、本発明のＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質は、２型糖尿病、肥満症、代謝症候群の治療のために、並びに非常に重篤な患者の死亡率および罹患率を減少させるのに有用である安定な薬理学的タンパク質製剤を提供する。

第１の局面において、本発明は、以下の１つまたは複数に対する、荷電した、および／または極性であるが、無電荷のアミノ酸の置換を含む、ヒト線維芽細胞成長因子２１の突然変異タンパク質、またはこれらの生物活性ペプチド：グリシン４２、グルタミン５４、アルギニン７７、アラニン８１、ロイシン８６、フェニルアラニン８８、リジン１２２、ヒスチジン１２５、アルギニン１２６、プロリン１３０、アルギニン１３１、ロイシン１３９、アラニン１４５、ロイシン１４６、イソロイシン１５２、アラニン１５４、グルタミン１５６、グリシン１６１、セリン１６３、グリシン１７０、またはセリン１７２（式中、アミノ酸の番号付けは、配列番号：１に基づく）を提供する。

本発明の第２の局面は、以下の２つ以上に対するシステインの置換を含むヒト線維芽細胞成長因子２１の突然変異タンパク質、またはこれらの生物活性ペプチド：アルギニン１９、チロシン２０、ロイシン２１、チロシン２２、スレオニン２３、アスパラギン酸２４、アスパラギン酸２５、アラニン２６、グルタミン２７、グルタミン２８、アラニン３１、ロイシン３３、イソロイシン３５、ロイシン３７、バリン４１、グリシン４２、グリシン４３、グルタミン酸５０、グルタミン５４、ロイシン５８、バリン６２、ロイシン６６、グリシン６７、リジン６９、アルギニン７２、フェニルアラニン７３、グルタミン７６、アルギニン７７、アスパラギン酸７９、グリシン８０、アラニン８１、ロイシン８２、グリシン８４、セリン８５、プロリン９０、アラニン９２、セリン９４、フェニルアラニン９５、ロイシン１００、アスパラギン酸１０２、チロシン１０４、チロシン１０７、セリン１０９、グルタミン酸１１０、プロリン１１５、ヒスチジン１１７、ロイシン１１８、プロリン１１９、アスパラギン１２１、リジン１２２、セリン１２３、プロリン１２４、ヒスチジン１２５、アルギニン１２６、アスパラギン酸１２７、アラニン１２９、プロリン１３０、グリシン１３２、アラニン１３４、アルギニン１３５、ロイシン１３７、プロリン１３８、またはロイシン１３９（式中、アミノ酸の番号付けは、配列番号：１に基づく）を提供する。

本発明の第３の局面は、本発明の第１の態様に示したアミノ酸位置のいずれかにおける荷電した、および／または極性であるが、無電荷のアミノ酸の置換を、本発明の第２の態様に示した２つ以上のアミノ酸位置におけるシステインの置換と組み合わせて含む、ヒトＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質またはこれらの生物活性ペプチド（式中、アミノ酸の番号付けは、配列番号：１に基づく）を提供する。

その他の態様は、第１の、第２の、および第３の態様の突然変異タンパク質をコードするポリヌクレオチド、上記ポリヌクレオチドを含むベクター、および上記ベクターを有する宿主細胞を導く。もう一つの態様は、ポリペプチドを産生するための、上記ポリペプチドを産生することができる細胞を産生するための、および上記ポリペプチドをコードするベクターを含むＤＮＡを産生するための方法を導く。

さらにもう一つの態様は、肥満症、２型糖尿病、インスリン耐性、高インスリン血症、グルコース不耐性、高血糖、または代謝症候群からなる群からの徴候の１つまたは複数を示す患者を治療するための方法であって、このような治療の必要がある患者に対して、第１の、第２の、または第３の態様のヒトＦＧＦ−２１突然変異タンパク質またはこれらの薬剤的組成物の治療上有効な量を投与することを含む方法を導く。

本明細書において開示され、請求したような本発明の目的のために、以下の用語は、下記のとおりに定義される。

ＦＧＦ−２１は、２７アミノ酸リーダー配列を含む２０８アミノ酸のポリペプチドである。ヒトＦＧＦ−２１は、マウスＦＧＦ−２１と〜７９％アミノ酸同一性を、およびラットＦＧＦ−２１と〜８０％アミノ酸同一性を有する。ヒトＦＧＦ−２１は、本発明の突然変異タンパク質のための好ましいポリペプチド鋳型であるが、当然のことながら当業者であれば、代わりの哺乳類ＦＧＦ−２１のポリペプチド配列に基づいて突然変異タンパク質を容易に作製することができることが認識されるであろう。

本発明の突然変異タンパク質のアミノ酸位置は、以下（配列番号：１）：

に示すように成熟ヒト１８１アミノ酸ＦＧＦ−２１のポリペプチドから決定される。

成熟ヒト１８１アミノ酸ＦＧＦ−２１のポリペプチドをコードする対応するＤＮＡ配列は、（配列番号：２）：

である。

タンパク質の分野の当業者であれば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）での発現のために、メチオニンまたはメチオニン−アルギニン配列を成熟配列（配列番号：１）のＮ末端に導入することができることを認識し、本発明の状況の範囲内において考慮されるであろう。

アミノ酸は、３文字コードを使用して確定され、またあるいは、標準的な１文字コードを使用して示すことができる。突然変異は、元のアミノ酸のための３文字コード、続いてアミノ酸番号、続いて置換アミノ酸のための３文字コードによって示される。それぞれの突然変異タンパク質の数値指定は、成熟野生型ヒトＦＧＦ−２１の１８１アミノ酸配列に基づく。たとえば、負に荷電したアミノ酸、グルタミン酸（Ｇｌｕ）での位置１３９のロイシン（すなわち、Ｌｅｕ１３９）に対する置換は、Ｌｅｕ１３９ＧｌｕまたはＬ１３９Ｅのように示される。同様に、負に荷電したアミノ酸、グルタミン酸（Ｇｌｕ）での位置１５２のイソロイシンおよび位置１６３のセリンに対する二重置換（Ｉｌｅ１５２、Ｓｅｒ１６３）は、Ｉｌｅ１５２Ｇｌｕ／Ｓｅｒ１６３Ｇｌｕ、Ｉ１５２Ｅ／Ｓ１６３Ｅ、またはＩ１５２Ｅ−Ｓ１６３Ｅのように示される。

ヒトＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質は、野生型成熟タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されたヒトＦＧＦ−２１からなるものとして定義される。一般的に言って、突然変異タンパク質は、野生型タンパク質のいくらか修飾された構造的または機能的特質を有する。たとえば、突然変異タンパク質は、濃縮溶液中での物理安定度（たとえば、あまり疎水性でないもので媒介された凝集）を増強または改善し、その一方で、有利な生理活性プロフィールを維持する可能性がある。突然変異タンパク質は、薬剤的防腐剤（たとえば、ｍ−クレゾール、フェノール、ベンジルアルコール）との適合性が増大されることがあり、したがって、貯蔵の間にタンパク質の物理化学的特質および生物活性を維持する保存される製剤の調製が可能になる。従って、薬剤的安定性が増強された突然変異タンパク質は、野生型ＦＧＦ−２１と比較したときに、生理学的および保存される製剤条件下で、濃縮溶液中での物理安定度が改善される一方で、生物学的能力を維持している。本明細書に使用されるこれらの用語は、限定を意味するものではなく、所与の突然変異タンパク質が野生型タンパク質の１つまたは複数の修飾された特質を有することは全く可能である。

「生物活性ペプチド」は、突然変異タンパク質の修飾された特質および生物学的能力を維持する本発明の突然変異タンパク質のペプチドとして定義される。

「治療上有効な量」は、治療の利益を患者に与えるために必要な活性薬剤の最小量である。たとえば、２型糖尿病、肥満症、もしくは代謝的症候群を示すか、罹患しているか、または罹患する傾向がある患者に、または患者が罹患することを予防するために「治療上有効な量」は、病理学的徴候、疾患進行、前述の障害に関連した生理学的症状、もしくは前述の障害に屈しないような耐性の改善を誘導し、寛解し、またはさもなければ生じさせるような量である。本発明の目的に関して、「被検者」または「患者」は、好ましくはヒトであるが、また動物、より具体的には、コンパニオンアニマル（たとえば、イヌ、ネコなど）、家畜（たとえば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマなど）、および実験動物（たとえば、ラット、マウス、モルモットなど））であることができる。

「２型糖尿病」は、インスリンの利用能にもかかわらず、過剰なグルコース産生によって特徴づけられ、不適当なグルコースクリアランスの結果として、循環グルコースレベルが、過度に高いままである。

「グルコース不耐性」は、グルコースに対する例外的感受性として定義することができる。

「高血糖」は、血液中の過剰な糖（グルコース）として定義される。

「低血糖症」（低血糖とも呼ばれる）は、あなたの血糖値が、あなたの体の活性のために十分なエネルギーを提供するには低すぎるほど低下するときに生じる。

「高インスリン血症」は、正常よりも高い血液中のインスリンのレベルとして定義される。

「インスリン耐性」は、正常な量のインスリンにより、亜正常の生物学的な反応を生じる状態として定義される。

「肥満症」は、ヒト被験者に関して、所与の集団に対する理想体重よりも２０パーセント以上越えた体重として定義することができる（Ｒ．Ｈ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１９７４，ｐ．９０４−９１６）。

「代謝症候群」は、以下の徴候うちの少なくとも３つのクラスターとして定義することができる。腹部脂肪−大部分の男性においてウエスト４０インチ以上、高血糖−絶食後に１デシリットルあたり少なくとも１１０ミリグラム（ｍｇ／ｄｌ）、高トリグリセリド−血流中に少なくとも１５０ｍｇ／ｄＬ、低ＨＤＬ−４０ｍｇ／ｄｌ未満、および１３０／８５以上の血圧。

本発明によって包含される非常に重篤な患者は、一般に不安定な異化亢進状態を経験する。この不安定な代謝状態は、基質代謝の変化によるものであり、これにより、いくつかの栄養素の相対的な欠損を生じる可能性がある。一般に、脂肪および筋肉の両方において酸化が増大される。

さらに、非常に重篤な患者は、好ましくは全身性炎症反応症候群または呼吸困難を経験する患者である。罹患率の減少は、非常に重篤な患者が、さらなる疾病、症状、もしくは徴候を発症するという可能性を減少させるか、またはさらなる疾病、症状、もしくは徴候の重症度を減少させることを意味する。たとえば、罹患率の減少は、多臓器不全と関連する菌血症または敗血症または合併症の発病率の減少に対応し得る。

本明細書に使用される「全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）」は、多数の臨床条件と関連する炎症性プロセスを記載し、以下の臨床症状のうちの１つ以上を含むが、これらに限定されるわけではない。（１）３８℃より高いか、または３６℃未満の体温、（２）１分あたり９０の拍動よりも高い心拍数、（３）１分あたり２０の呼吸よりも高い呼吸数によって明示される頻呼吸症または３２ｍｍ Ｈｇ未満のＰａＣＯ_２によって示される過換気、および（４）１２，０００／ｃｕ ｍｍよりも高いカウントか、４，０００／ｃｕ ｍｍ未満のカウントか、または１０％以上の未成熟の好中球の存在などの白血球数の変化。これらの生理的変化は、化学療法、好中球減少の誘導、および白血球減少症などの、このような異常のその他の公知の原因の非存在下においてベースラインからの急性的変化を表すはずである。

本明細書に使用される「敗血症」は、感染により生じるＳＩＲＳとして定義される。ＳＩＲＳの非伝染性病原性の原因は、膵炎、虚血、複数の外傷、および組織傷害、すなわち圧壊傷害または重篤なやけど、出血性ショック、免疫を媒介した器官傷害、並びに腫瘍壊死因子およびその他のサイトカインなどの炎症性プロセスの推定上のメディエーターの外因的投与を含んでもよい。

感染性ショックおよび多臓器機能障害は、ＩＣＵ状況における罹患率および死亡率の主要な誘因である。敗血症は、サイトカインネットワーク、白血球、および補体カスケードを含む多くの宿主防御機構、並びに内皮を含む凝固／線維素溶解系の活性と関連し、およびこれらによって媒介される。播種性血管内血液凝固（ＤＩＣ）およびその他の程度の種々の器官の微小血管系内の線維素沈着と関連した消費性凝固障害は、敗血症／感染性ショックの徴候である。標的器官に対する宿主防御反応における下流の効果は、多臓器機能障害（ＭＯＤＳ）の発症における重要なメディエーターであり、敗血症、重篤な敗血症、およびショックによって併発した敗血症である患者の予後不良に寄与する。

本明細書に使用される「呼吸困難」は、患者がいくつかのタイプの肺機能障害のために呼吸困難である症状を意味する。これらの患者は、様々の程度の低酸素血症を示すことが多く、補充酸素での治療に不応性であっても、または不応性でなくてもよい。

呼吸困難は、直接の肺傷害により肺機能が障害された患者に生じてもよく、または全身性プロセスの状況において間接的な肺傷害などにより生じてもよい。加えて、複数の素因が存在すると、実質的に障害のリスクを増大し、慢性アルコール乱用、慢性肺疾患、および低血清ｐＨなどの二次因子の存在も同様である。

いくつかの直接の肺傷害の原因には、肺炎、胃内容物の吸引、肺挫傷、脂肪の塞栓、溺水寸前、吸入傷害、高い高度、および肺移植または肺動脈塞栓摘出術後の再灌流肺水腫を含む。いくつかの間接的肺傷害の原因には、敗血症、ショックおよび多量の輸液での重篤な外傷、人工心肺、薬剤過剰投与、急性膵炎、および血液製剤の輸血を含む。

呼吸困難を生じさせる肺障害の１つの分類は、肺性心として公知の症候群と関連する。これらの障害は、肺性高血圧と呼ばれる肺循環内の圧力の上昇を生じる慢性低酸素血症と関連する。引き続いて起こる肺性高血圧は、右心室の作業負荷を増大し、したがって、その拡大または肥大に至る。肺性心は、一般に右室圧の持続的増大によって定義される右心不全および右心への静脈還流量が減少される臨床的証拠を示す。

また、肺気腫および慢性気管支炎を含む「慢性閉塞性肺疾患」（ＣＯＰＤ）も、呼吸困難を生じさせ、気流の妨害によって特徴づけられる。ＣＯＰＤは、４番目の主な死因であり、毎年１００，０００人以上の生命を奪う。

「急性呼吸不全症候群」（ＡＲＤＳ）は、一般に進行性であり、種々の段階によって特徴づけられる。本症候群は、一般に本症状の危険因子をもつ患者において呼吸不全が迅速に発症することによって明らかにされる。補充酸素での治療に不応性である動脈の低酸素血症が特長である。これらは、肺ゾーンに依存的に生じている肺胞の充填、硬化、および無気肺であってもよいが、依存のない領域が、実質的に炎症を有していてもよい。本症候群は、線維化性肺胞隔炎、肺胞死腔が増大されること、および肺コンプライアンスのさらなる減少を伴った持続的低酸素血症に進行する可能性もある。肺毛細管床に対する損傷により生じる肺性高血圧を発症するかもしれない。

本発明の第１の好ましい局面は、置換が以下の少なくとも１つにおける荷電した、および／または極性であるが、無電荷のアミノ酸のいずれかを意味する、ヒトＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質またはこれらの生物活性ペプチドを含む。グリシン４２、グルタミン５４、アルギニン７７、アラニン８１、ロイシン８６、フェニルアラニン８８、リジン１２２、ヒスチジン１２５、アルギニン１２６、プロリン１３０、アルギニン１３１、ロイシン１３９、アラニン１４５、ロイシン１４６、イソロイシン１５２、アラニン１５４、グルタミン１５６、グリシン１６１、セリン１６３、グリシン１７０、またはセリン１７２（式中、アミノ酸の番号付けは、配列番号：１に基づく）。荷電したアミノ酸は、正または負に荷電したアミノ酸と定義される。正に荷電したアミノ酸は、ヒスチジン（ｈｉｓｔａｄｉｎｅ）、リジン、アルギニン、およびこれらの天然には存在しない類似体（たとえば、γアミノ酪酸、オルニチン、その他）を含むと定義される。負に荷電したアミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸、およびこれらの天然には存在しない類似体（たとえば、アミノアジピン酸）含むものと定義される。極性であるが、無電荷のアミノ酸は、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、およびこれらの天然には存在しない類似体を含むものと定義される。第１の態様で最も好ましい突然変異タンパク質は、Ｇｌｎ５４Ｇｌｕ、Ｌｅｕ１３９Ｇｌｕ、Ａｌａ１４５Ｇｌｕ、Ｌｅｕ１４６Ｇｌｕ、Ｉｌｅ１５２Ｇｌｕ、Ｇｌｎ１５６Ｇｌｕ、Ｓｅｒ１６３Ｇｌｕ、およびＩｌｅ１５２Ｇｌｕ−Ｓｅｒ１６３Ｇｌｕである。

本発明の第２の態様は、以下の２つ以上のためにシステインの置換を含むヒトＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質またはこれらの生物活性ペプチドを提供する。アルギニン１９、チロシン２０、ロイシン２１、チロシン２２、スレオニン２３、アスパラギン酸２４、アスパラギン酸２５、アラニン２６、グルタミン２７、グルタミン２８、アラニン３１、ロイシン３３、イソロイシン３５、ロイシン３７、バリン４１、グリシン４２、グリシン４３、グルタミン酸５０、グルタミン５４、ロイシン５８、バリン６２、ロイシン６６、グリシン６７、リジン６９、アルギニン７２、フェニルアラニン７３、グルタミン７６、アルギニン７７、アスパラギン酸７９、グリシン８０、アラニン８１、ロイシン８２、グリシン８４、セリン８５、プロリン９０、アラニン９２、セリン９４、フェニルアラニン９５、ロイシン１００、アスパラギン酸１０２、チロシン１０４、チロシン１０７、セリン１０９、グルタミン酸１１０、プロリン１１５、ヒスチジン１１７、ロイシン１１８、プロリン１１９、アスパラギン１２１、リジン１２２、セリン１２３、プロリン１２４、ヒスチジン１２５、アルギニン１２６、アスパラギン酸１２７、アラニン１２９、プロリン１３０、グリシン１３２、アラニン１３４、アルギニン１３５、ロイシン１３７、プロリン１３８、またはロイシン１３９（式中、アミノ酸の番号付けは、配列番号：１に基づく）。

また、当業者であれば、天然のシステイン、システイン７５、およびシステイン９３も、改善された特質を与える可能性のある新規ジスルフィド結合を導入する座位として利用することができることを認識するであろう。セリン８５またはフェニルアラニン７３におけるシステイン置換の導入を、それぞれシステイン９３またはシステイン７５のいずれかの同時変化と組み合わせることが、具体的に想定され、この場合、後者の部位は、他の任意のアミノ酸でも置換される。

システイン残基によって提供される天然に存在するジスルフィド結合は、一般にタンパク質の熱力学的安定性を増大する。融解温度の増大において測定される熱力学的安定性の増大の良好な例は、酵素Ｔ４リゾチーム（Ｍａｔｓｕｍｕｒａ， ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ８６：６５６２−６５６６（１９８９））およびバーンアーゼ（ｂａｒｎａｓｅ）（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６８：１９８−２０８（１９９７））の複数のジスルフィド結合の変異体である。本発明のある局面は、ジスルフィド結合によってＦＧＦ−２１の１１８〜１３４のアミノ酸ループの柔軟性を拘束すると、おそらくタンパク質の疎水性コアに対する保存剤のアクセスを制限することよって、保存剤の存在下におけるＦＧＦ−２１の物理安定度を増強することを前提とする。

ジスルフィド結合が操作されたＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質は、Ｃｙｓ７５〜Ｃｙｓ９３に天然に存在するものに加えて、以下のとおりである。Ｇｌｎ７６Ｃｙｓ−Ｓｅｒ１０９Ｃｙｓ、Ｃｙｓ７５−Ｓｅｒ８５Ｃｙｓ、Ｃｙｓ７５−Ａｌａ９２Ｃｙｓ、Ｐｈｅ７３Ｃｙｓ−Ｃｙｓ９３、Ｓｅｒ１２３Ｃｙｓ−Ｈｉｓ１２５−Ｃｙｓ、Ａｓｐ１０２Ｃｙｓ−Ｔｙｒ１０４Ｃｙｓ、Ａｓｐ１２７Ｃｙｓ−Ｇｌｙ１３２Ｃｙｓ、Ｓｅｒ９４Ｃｙｓ−Ｇｌｕ１１０Ｃｙｓ、Ｐｒｏ１１５Ｃｙｓ−Ｈｉｓ１１７Ｃｙｓ、Ａｓｎ１２１Ｃｙｓ−Ａｓｐ１２７Ｃｙｓ、Ｌｅｕ１００Ｃｙｓ−Ａｓｐ１０２Ｃｙｓ、Ｐｈｅ９５Ｃｙｓ−Ｔｙｒ１０７Ｃｙｓ、Ａｒｇ１９Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１３８Ｃｙｓ、Ｔｙｒ２０Ｃｙｓ−Ｌｅｕ１３９Ｃｙｓ、Ｔｙｒ２２Ｃｙｓ−Ｌｅｕ１３７Ｃｙｓ、Ａｒｇ７７Ｃｙｓ−Ａｓｐ７９Ｃｙｓ、Ｐｒｏ９０Ｃｙｓ−Ａｌａ９２Ｃｙｓ、Ｇｌｕ５０Ｃｙｓ−Ｌｙｓ６９Ｃｙｓ、Ｔｈｒ２３Ｃｙｓ−Ａｓｐ２５Ｃｙｓ、Ａｌａ３１Ｃｙｓ−Ｇｌｙ４３Ｃｙｓ、Ｇｌｎ２８Ｃｙｓ−Ｇｌｙ４３Ｃｙｓ、Ｔｈｒ２３Ｃｙｓ−Ｇｌｎ２８Ｃｙｓ、Ｖａｌ４１Ｃｙｓ−Ｌｅｕ８２Ｃｙｓ、Ｌｅｕ５８Ｃｙｓ−Ｖａｌ６２Ｃｙｓ、Ｇｌｎ５４Ｃｙｓ−Ｌｅｕ６６Ｃｙｓ、Ｉｌｅ３５Ｃｙｓ−Ｇｌｙ６７Ｃｙｓ、Ｇｌｙ６７Ｃｙｓ−Ａｒｇ７２Ｃｙｓ、Ｉｌｅ３５Ｃｙｓ−Ｇｌｙ８４Ｃｙｓ、Ａｒｇ７２Ｃｙｓ−Ｇｌｙ８４Ｃｙｓ、またはＡｒｇ７７Ｃｙｓ−Ａｌａ８１Ｃｙｓ（式中、アミノ酸の番号付けは、配列番号：１に基づく）。ジスルフィド結合が操作された好ましい突然変異タンパク質は、Ｔｙｒ２２Ｃｙｓ−Ｌｅｕ１３９Ｃｙｓ、Ａｓｐ２４Ｃｙｓ−Ａｒｇ１３５Ｃｙｓ、Ｌｅｕ１１８Ｃｙｓ−Ｇｌｙ１３２Ｃｙｓ、Ｈｉｓ１１７Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１３０Ｃｙｓ、Ｈｉｓ１１７Ｃｙｓ−Ａｌａ１２９Ｃｙｓ、Ｌｅｕ８２Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１１９Ｃｙｓ、Ｇｌｙ８０Ｃｙｓ−Ａｌａ１２９Ｃｙｓ、Ｇｌｙ４３Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１２４Ｃｙｓ、Ｇｌｙ４２Ｃｙｓ−Ａｒｇ１２６Ｃｙｓ、Ｇｌｙ４２Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１２４Ｃｙｓ、Ｇｌｎ２８Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１２４Ｃｙｓ、Ｇｌｎ２７Ｃｙｓ−Ｓｅｒ１２３Ｃｙｓ、Ａｌａ２６Ｃｙｓ−Ｌｙｓ１２２Ｃｙｓ、またはＡｓｐ２５Ｃｙｓ−Ｌｙｓ１２２Ｃｙｓである。ジスルフィド結合が操作された最も好ましい突然変異タンパク質は、Ｌｅｕ１１８Ｃｙｓ−Ａｌａ１３４Ｃｙｓ、Ｌｅｕ２１Ｃｙｓ−Ｌｅｕ３３Ｃｙｓ、Ａｌａ２６Ｃｙｓ−Ｌｙｓ１２２Ｃｙｓ、Ｌｅｕ２１Ｃｙｓ−Ｌｅｕ３３Ｃｙｓ／Ｌｅｕ１１８Ｃｙｓ−Ａｌａ１３４Ｃｙｓである。

本発明の第３の局面は、本発明の第１の態様に示したアミノ酸位置のいずれかにおける荷電した、および／または極性であるが、無電荷のアミノ酸の置換を、本発明の第２の態様に示す２つ以上におけるシステインの置換と組み合わせて含む、ヒトＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質またはこれらの生物活性ペプチドを提供する。

タンパク質医薬の開発における有意なチャレンジは、タンパク質の物理的および化学的不安定性に対処ことであることは当技術分野において周知である。これは、タンパク質製剤が、有利な生理活性プロフィールを維持すると共に、安定な、濃縮された、および保存された溶液を必要とする多目的の注射用の製剤であることが企図されるときに、さらに明白である。野生型ＦＧＦ−２１の詳細な生物物理学的な特性付けにより、濃縮されたタンパク質溶液（＞５ｍｇ／ｍｌ）が、高温または低ｐＨなどのストレス条件に曝露されたときに、会合および凝集の促進（すなわち、乏しい物理安定度および生物薬剤特質）を生じることが確立された。また、薬剤的防腐剤（たとえば、ｍ−クレゾール）に対するＦＧＦ−２１の濃縮されたタンパク質溶液の曝露は、物理安定度に対してネガティブな影響を有した。

従って、本発明のある態様は、濃縮溶液の物理的安定度を増強し、その一方で、生理学的および保存された製剤条件下で、化学的安定性および生物学的能力を維持することである。所与のタンパク質において、濃度、温度、およびイオン強度は、物理安定度に対してかなりの影響を有するので、会合および凝集は、疎水的相互作用によって生じる可能性があると考えられる。ほとんどの場合、保存されていない、表面に曝露されていると推定されるアミノ酸残基が標的とされた。これらの残基の局部的な環境を解析して、構造的に重要であるとは考えられなかったものを突然変異誘発のために選択した。特異的な変化を惹起するための１つの方法は、グルタミン酸残基を導入することによって、さらにタンパク質のｐＩを減少させることである（「グルタミン酸スキャン」）。荷電された置換物の導入により、電荷−電荷相反を経た疎水性媒介凝集を阻害し、潜在的に保存剤適合性を改善することが仮定される。加えて、当業者であれば、十分な程度の突然変異誘発により、負電荷を同時に減少し、またはすることなく正電荷を導入することによって、ｐＩを塩基性ｐＨ範囲に移して、したがって電荷−電荷相反させることができることを認識するであろう。

本発明の本態様は、生理学的および保存された製剤条件下での物理的および化学的安定性に関するが、野生型ＦＧＦ−２１と比較して、突然変異タンパク質の生物学的能力を維持することも、同様に考慮の重要な因子である。従って、本発明の突然変異タンパク質の生物学的能力は、インビトロでの３Ｔ３−Ｌ１細胞アッセイ法（実施例４）において測定される、突然変異タンパク質がグルコース摂取に影響を及ぼす能力、および／またはｏｂ／ｏｂマウス・アッセイ法（実施例５）においてインビボで測定される、血漿グルコースレベルの低下、並びに血漿トリグリセリドによって定義される。

本発明に従って投与されるＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質は、当技術分野において公知の任意の手段によって作製され、および／または単離されてもよい。突然変異タンパク質を産生するための最も好ましい方法は、組換えＤＮＡ技法を介するものであり、当業者に周知である。このような方法は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）に記載されており、これは参照として本明細書に組み入れられる。

加えて、好ましい態様は、本明細書に記載されている突然変異タンパク質に由来する生物活性ペプチドを含む。このようなペプチドは、記載されている置換のうちの少なくとも１つを含み、かつ突然変異タンパク質は生物活性を有する。ペプチドは、当業者に公知のいずれの、および全ての手段によって産生してもよく、これらの例は、酵素消化、化学合成、または組換えＤＮＡ技法を含むが、これらに限定されるわけではない。

一定の線維芽細胞成長因子のペプチド断片が生物学的に活性であることは、当技術分野において確立されている。たとえば、Ｂａｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ（ＵＳＡ）８５：２３２４−２３２８（１９８８）、およびＪ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓ．Ｓｕｐｐｌ．５：１０１−１０６（１９８７）を参照されたい。従って、突然変異タンパク質の断片またはペプチドの選択は、当技術分野において公知の基準に基づく。たとえば、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）は、神経ペプチド、内分泌ペプチド、およびサイトカインの不活性化に関与するセリン型プロテアーゼであることが公知である（Ｄａｍｍｅ ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７２：４２−５６，（１９９９））。ＦＧＦ−２１のＮ末端は、潜在的にＤＰＰ−ＩＶに対する基質であり得る２つのジペプチドを含み、Ｎ末端で４アミノ酸が切断された断片を生じる。予想外に、野生型ＦＧＦ−２１のこの断片は、生物活性を保持することが証明されており（表１）、したがって、Ｎ末端にて４アミノ酸までが切断された本発明の突然変異タンパク質も、本発明の態様である。

また、本発明は、上記突然変異タンパク質をコードするポリヌクレオチドを包含し、これらは、ＲＮＡの形態でも、またはＤＮＡの形態であってもよく、ＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡを含む。ＤＮＡは、二本鎖でも、または一本鎖であってもよい。本発明の突然変異タンパク質をコードするコード配列は、遺伝暗号の重複性または縮重の結果として異なっていてもよい。

本発明の突然変異タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、以下を含んでもよい。突然変異タンパク質のコード配列だけ、突然変異タンパク質のコード配列と機能的ポリペプチドなどのさらなるコード配列、またはリーダー配列もしくは分泌配列もしくはプロタンパク質配列、突然変異タンパク質のコード配列と突然変異タンパク質のコード配列のイントロンまたは非コード配列５’および／または３’などの非コード配列。したがって、「突然変異タンパク質をコードするポリヌクレオチド」という用語は、突然変異タンパク質のコード配列だけでなく、さらなるコード配列および／または非コード配列を含むポリヌクレオチドも含んでもよいポリヌクレオチドを包含する。

本発明は、さらに、示した置換を含むポリペプチドの断片、類似体、および誘導体をコードする記載されたポリヌクレオチドの変異体にも関する。ポリヌクレオチドの変異体は、上記のとおりのヒトＦＧＦ−２１の配列、天然には存在しない変異体、または切断された変異体の天然に存在する対立遺伝子変異体であってもよい。従って、本発明は、また、上記した突然変異タンパク質をコードするポリヌクレオチド、並びにこのようなポリヌクレオチドの変異体を含み、これらの変異体は、開示された突然変異タンパク質の断片、誘導体、または類似体をコードする。このようなヌクレオチド変異体は、第１または第２の態様の示されたアミノ酸置換のうちの少なくとも１つが存在する限り、欠失体、置換変異体、切断変異体、および付加または挿入変異体を含む。

本発明のポリヌクレオチドは、配列が発現制御配列に作動可能に連結された（すなわち、機能を保証するように配置された）後、宿主に発現される。これらの発現ベクターは、典型的には、エピソームとして、または宿主染色体のＤＮＡの必須部分のいずれかとして、宿主生物において複製可能である。一般に、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列で形質転換されたこれらの細胞の検出ができるように、選択マーカー、たとえばテトラサイクリン、ネオマイシン、およびジヒドロ葉酸還元酵素を含む。ＦＧＦ−２１突然変異タンパク質は、哺乳動物細胞、昆虫、酵母、細菌、またはその他の細胞において、適切なプロモーターの制御下で発現することができる。また、本発明のＤＮＡ構築物に由来するＲＮＡを使用してこのようなタンパク質を産生するために、無細胞翻訳系を使用することができる。

大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、特に本発明のポリヌクレオチドをクローニングするために有用な原核生物宿主である。使用のために適したその他の微生物の宿主は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｕｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、並びにセラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、およびブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）の種々の種を含むが、その他を選択物として使用してもよい。また、これらの原核生物の宿主において、典型的には宿主細胞（たとえば、複製開始点）と適合する発現制御配列を含む発現ベクターを作製することができる。加えて、ラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、β−ラクタマーゼプロモーター系、またはファージラムダもしくはＴ７由来プロモーター系などの任意の多くの周知のプロモーターであってもよい。プロモーターは、典型的には、任意にオペレーター配列と共に発現を制御し、転写および翻訳を開始および完了するためのリボソーム結合部位配列等を有する。

タンパク質の発現の分野の当業者であれば、大腸菌での発現ために、メチオニンまたはメチオニン−アルギニン配列を成熟配列（配列番号：１）のＮ末端に導入することができることを認識し、本発明の状況の範囲内において想定されるであろう。従って、他に断らない限り、大腸菌に発現される本発明の突然変異タンパク質は、Ｎ末端に導入されたメチオニン配列を有する。

また、酵母または真菌などのその他の微生物を発現のために使用してもよい。ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロマイセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、およびピチア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ ａｎｇｕｓｔａ）は、好ましい酵母宿主の例であり、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたはその他の糖分解酵素、複製起点、終結配列などを含む、望まれるプロモーターなどの発現制御配列を有する適切なベクターである。クロカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、トリコデルマ・レッセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、およびシゾフィリウム・コミューヌ（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ ｃｏｍｍｕｎｅ）は、真菌宿主の例であるが、選択物としてその他を使用してもよい。

また、本発明のポリペプチドを発現し、産生するために、哺乳類組織細胞培養を使用してもよい。無処置の突然変異タンパク質を分泌することができる多くの適切な宿主株化細胞が、当技術分野において開発されており（ＣＨＯ株化細胞、種々のＣＯＳ株化細胞、ＮＳ０細胞、シリアハムスター卵巣株化細胞、ＨｅＬａ細胞、またはヒト胚腎臓株化細胞（すなわちＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ）を含む）、真核細胞が実際には好ましい。

これらの細胞のための発現ベクターは、複製開始点、プロモーター、エンハンサーなどの発現制御配列、並びにリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写ターミネータ配列などの必要なプロセシング情報部位を含むことができる。好ましい発現制御配列は、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウィルス、サイトメガロウイルス、ラウス肉腫ウイルス等に由来するプロモーターである。好ましいポリアデニル化部位は、ＳＶ４０およびウシ成長ホルモンに由来する配列を含む。

関心対象のポリヌクレオチド配列（たとえば、ＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質および発現制御配列）を含むベクターを、周知の方法によって宿主細胞に移すことができ、これは細胞の宿主のタイプに応じて変化する。たとえば、塩化カルシウムトランスフェクション法は、原核細胞に対して一般に利用されるが、一方で、その他の細胞の宿主のためにリン酸カルシウム処置法または電気穿孔法を使用してもよい。

種々のタンパク質精製法を使用してもよく、このような方法は、当技術分野において公知であり、たとえばＤｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８２：８３−９（１９９０）およびＳｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ（１９８２）に記載されている。選択される精製工程は、たとえばＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質に使用される生産プロセスの性質に依存する。

ＦＧＦ−２１突然変異タンパク質を含む組成物は、患者の臨床症状、ＦＧＦ−２１突然変異タンパク質組成物のデリバリー部位、投与方法、投与スケジューリング、および開業医に公知のその他の因子を考慮して、優れた医療と一致した様式で処方され、および投薬されるべきである。したがって、本明細書における目的のためのＦＧＦ−２１突然変異タンパク質の「治療上有効な量」は、このような考慮によって決定される。

ＦＧＦ−２１突然変異タンパク質および本発明の薬剤的組成物は、２型糖尿病、肥満症、代謝的症候群、または非常に重篤な患者を治療するための、一般に企図される目的を達成するいずれの手段によって投与してもよい。本明細書に使用される「非経口的」という用語は、経静脈、筋肉内、腹腔内、ステム内、皮下、並びに関節内の注射および注入を含む投与様式をいう。投与される用量は、レシピエントの年齢、健康、および重量に、もしあれば、並列治療の種類、治療の頻度、および要求される効果の性質に依存する。本発明の範囲内の組成物は、ＦＧＦ−２１突然変異タンパク質が、２型糖尿病、肥満症、または代謝的症候群を治療するための所望の医学的効果を達成するために有効な量で存在する全ての組成物を含む。個々の必要は、患者間で変化し得るが、本成分の全ての有効な量の最適範囲の決定は、通常の技術の臨床家の能力の範囲内である。

本発明のＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質は、薬剤的に有用な組成物を調製するために、公知の方法に従って処方することができる。所望の製剤は、任意の薬剤的に許容される担体、防腐剤、賦形剤、または安定剤と共に、適切な希釈剤または高純度の水溶液で再構成された安定な凍結乾燥された産物であるものである［Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８０）］。本発明の突然変異タンパク質は、薬剤的に許容される緩衝液、および許容される安定性を提供するように調整されたｐＨ、および投与のために許容されるｐＨと組み合わせてもよい。

非経口投与のためには、一つの態様において、ＦＧＦ−２１突然変異タンパク質を、一般にこれらの１つまたは複数を、所望の程度の純度で、単位用量注射剤形態（溶液、懸濁液、またはエマルジョン）において、薬剤的に許容される担体、すなわち使用される用量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、かつ製剤のその他の成分と適合性であるものと共に混合することによって処方される。好ましくは、１つまたは複数の薬剤的に許容される抗菌性薬剤を添加してもよい。フェノール、ｍ−クレゾール、およびベンジルアルコールは、好ましい薬剤的に許容される抗菌性薬剤である。

任意に、イオン強度または張力を調整するために、１つまたは複数の薬剤的に許容される塩を添加してもよい。製剤の等張性を調整するために、１つまたは複数賦形剤をさらに添加してもよい。グリセリン、塩化ナトリウム、およびマンニトールは、等張性を調整する賦形剤の例である。

当業者であれば、優れた医療および個々の患者の臨床症状によって定めて、ＦＧＦ−２１突然変異タンパク質を含む治療的な組成物のための薬剤的に有効な用量および投与処方計画を容易に最適化することができるであろう。本発明のＦＧＦ−２１突然変異タンパク質のための典型的な用量範囲は、成人に対して約０．０１ｍｇ／日〜約１０００ｍｇ／日の範囲である。好ましくは、用量は、約０．１ｍｇ／日〜約１００ｍｇ／日、より好ましくは、約１．０ｍｇ／日〜約１０ｍｇ／日の範囲である。最も好ましくは、用量は、約１−５ｍｇ／日である。投与されるＦＧＦ−２１突然変異タンパク質の適切な用量は、血糖値を低下させ、より迅速、かつより効率的なグルコース利用によってエネルギー消費を増大させると考えられ、したがって、２型糖尿病、肥満症、および代謝的症候群を治療するために有用である。

加えて、高血糖およびインスリン耐性は、栄養補助が与えられる非常に重篤な患者において一般的であるので、一部のＩＣＵでは、与えた非常に重篤な患者における過剰な高血糖を治療するためにインスリンを投与する。実際に、最近の研究では、外科集中治療室の非常に重篤な患者の死亡率および罹患率が、彼らが糖尿病病歴を有するかどうかにかかわらず減少される１デシリットルあたり１１０ｍｇ未満のレベルに血糖を維持するために、外因性インスリンの使用を実証する（Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇｈｅ， ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．，３４５（１９）：１３５９，（２００１））。従って、本発明のＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質は、唯一、代謝的に不安定な非常に重篤な患者の代謝安定性を回復するのを補助するために適している。ＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質は、これらがグルコース摂取を刺激し、かつインスリン感受性を増強するが、低血糖を誘導しないという点で独特である。

本発明のもう一つの局面において、２型糖尿病、肥満症、代謝的症候群、または非常に重篤な患者の治療のために医薬として使用するための、ＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質が想定される。

今回詳細に本発明を記載したものは、以下の実施例を参照することでより明確に理解され、これらは、説明のみの目的で本明細書に含まれ、本発明を限定することは企図されない。

本明細書で言及した特許および刊行物の全てが、明白に参照として組み入れられる。

実施例１
大腸菌におけるＦＧＦ−２１突然変異タンパク質の発現および精製
本実施例における細菌発現のためには、細菌発現ベクターｐＥＴ３０ａが使用される（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）。ｐＥＴ３０ａは、カナマイシン抗生物質耐性遺伝子をコードし、多くの独特の制限エンドヌクレアーゼ切断部位と共に、細菌複製開始点（「ｏｒｉ」）、強力なＴ７ファージ−ＩＰＴＧ誘導性プロモーター、リボソーム結合部位（「ＲＢＳ」）、および適切なＭＣＳを含む。精製目的のために都合よくは、ベクターは、Ｎ末端のペプチド融合のためのＨｉｓおよびＳタグ、並びにＣ末端のＨｉｓタグ融合をコードすることができる。しかし、本発明の目的を達成するためには、ＦＧＦ−２１変異体をコードするｃＤＮＡが、それぞれ制限部位ＮｄｅＩとＢａｍＨＩとの間に挿入されており、生じる構築物は、記載したタグのいずれも利用しない。

リーダー配列を欠いているが、メチオニン残基で置換されたＦＧＦ−２１突然変異タンパク質をコードする核酸配列は、オープンリーディングフレームの５’および３’末端にアニールするＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ｃＤＮＡクローンから増幅される。制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩのための認識部位を含むさらなるヌクレオチドが、それぞれ５’および３’配列に付加されている。

クローニングのためには、５’フォワードおよび３’リバースＰＣＲプライマーは、当技術分野において公知の方法に従って、ＦＧＦ−２１突然変異タンパク質をコードする核酸の一部のコード配列に対応するか、または相補的なヌクレオチドを有する。当技術分野の当業者であれば、プライマーが始まるポリヌクレオチド配列の位置を変更することができることを認識するであろう。

増幅された核酸断片およびベクターｐＥＴ３０ａをＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素で消化し、次いで精製した消化されたＤＮＡ断片を共に結合させる。制限されたｐＥＴ３０ａベクターへのＦＧＦ−２１突然変異タンパク質をコードするＤＮＡの挿入により、その付随する終止コドンをインフレームの開始ＡＴＧコドンと共に含むＦＧＦ−２１突然変異タンパク質ポリペプチドコード領域をＩＰＴＧ−誘導性プロモーターの下流に配置する。付随する終止コドン（ＴＡＧ）は、挿入位置の下流の６ヒスチジンコドンの翻訳を防げる。

ライゲーション混合物を、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）に記載されているものなどの標準的方法を使用して形質転換受容性大腸菌細胞に形質転換する。

形質転換反応をＬＢ／カナマイシンプレートにまき、一晩の後、増殖形質転換体をプラスミド調製のために拾うか、またはＰＣＲによるスクリーニングのためにインサイチューで溶解する。所望のＦＧＦ−２１変異体挿入物を含む陽性の組換えプラスミドを、切断解析、続くＤＮＡ配列解析によって同定する。その後、これらのプラスミドを、発現株を形質転換して、タンパク質を産生するために使用する。

大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）ＳＴＡＲ、またはＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＰをＦＧＦ−２１突然変異タンパク質を発現させるために使用する。ＦＧＦ−２１突然変異タンパク質を発現するために適した多くのうちのわずか一部であるこれらの株は、それぞれＮｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、およびＳｔｒａｔａｇｅｎから市販されている。形質転換体は、これらがカナマイシンの存在下においてＬＢプレート上で成長する能力によって同定される。

所望の構築物を含むクローンを、カナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）を補ったＬＢ培地中での液体培養において一晩（ｏ／ｎ）培養する。ｏ／ｎ培養を使用して、大規模培養に約１：２５〜１：２５０の希釈で播種する。細胞を６００ｎｍにて０．６（「ＯＤ６００」）の光学濃度に培養する。次いで、イソプロピル−ｂ−Ｄ−チオ・ガラクトピラノシド（「ＩＰＴＧ」）を１ｍＭの終濃度に添加して、ｌａｃＩリプレッサーを不活性化することによってｌａｃレプレッサー感受性のプロモーターからの転写を誘導する。その後、細胞を３〜１２時間さらにインキュベートする。次いで、細胞を遠心分離によって収集し、ペレットを５０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ８．０で洗浄して、精製まで−２０℃に貯蔵する。ＦＧＦ−２１突然変異タンパク質は、大腸菌の不溶性画分、すなわち封入体（または顆粒）に発現される。発現レベルは、変異体間で変化する可能性があり、典型的には、野生型（ＷＴ）ＦＧＦ−２１のタンパク質について観察されたレベルは、５０ｍｇ／Ｌである。その後の精製プロセスは、顆粒剤の可溶化および変異体の再折りたたみ、続いて４回のクロマトグラフィー工程で開始する。

大腸菌からＦＧＦ−２１突然変異タンパク質を精製するために、顆粒を５０ｍＭトリス、ｐＨ９．０、７Ｍ尿素、および１ｍＭ ＤＴＴに、ｐＨ１１．０にｐＨランプを介して、室温にて攪拌しながら１時間溶解する。次いで、上記したのと同じ緩衝液を使用してＱ−セファロースカラムにタンパク質を捕獲し、０〜４００ｍＭ ＮａＣｌの直線濃度勾配で溶出した。次いで、全てのジスルフィド結合を還元させるために、Ｑ−セファロースプールをＲＴにて２時間、１０ｍＭ ＤＴＴで処置する。次いで、緩衝液濃度が以下のとおりであるために、プールを１０倍希釈する。約２５０〜５００μｌ／ｍｌのタンパク質濃度で、５０ｍＭトリス、ｐＨ９．０、７Ｍ尿素、１０ｍＭシステイン１ｍＭ ＤＴＴ。遊離のジスルフィド形態のタンパク質を得るために、還元条件下においてＲＴでさらに２時間インキュベーション後、次いで正確なジスルフィド結合を形成することができるように、プールを２０ｍＭグリシン、ｐＨ９．０に約４８時間透析する。

逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーを、Ｖｙｄａｃ Ｃ１８カラムおよび移動相として０．１％ＴＦＡ／０〜５０％ＣＨ_３ＣＮでの最初の精製工程として使用する。このカラムは、ＦＧＦ−２１またはＦＧＦ−２１突然変異タンパク質を濃縮し、混入する内毒素を除去するために使用される。

以下の精製工程は、１×ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中で行われるＳｕｐｅｒｄｅｘ３５／６００カラムでのサイズ排除クロマトグラフィーである。この工程では、ＦＧＦ−２１突然変異タンパク質は、〜９５％純粋である。最終工程では、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０でのＭｏｎｏＱクロマトグラフィーおよび０〜３００ｍＭ ＮａＣｌの直線濃度勾配での溶出を含み、これにより、通常＞９７％純粋なタンパク質を得る。

上記した４回のカラム工程精製スキームを全てのＦＧＦ−２１突然変異タンパク質のために使用し、安定な標品を産生した。

実施例２
ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞におけるＦＧＦ−２１突然変異タンパク質の発現および精製
あるいは、ＦＧＦ−２１突然変異タンパク質は、ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞（ＥｄｇｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｇａｉｅｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）などの、哺乳類細胞発現系において産生することができる。ＦＧＦ−２１突然変異タンパク質は、市販のｐＥＡＫ１０の制限部位の修飾を示す専売の発現ベクターに、ＭＣＳ内のＮｈｅＩとＸｂａＩとの間にサブクローニングする。組織培地における所望の産物の分泌を増強するために、成熟ＦＧＦ−２１をコードするｃＤＮＡ配列をＩｇκリーダー配列とフレームに融合させる。発現は、強力なウイルスＣＭＶプロモーターによって駆動される。ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞には、Ｆｕｇｅｎｅ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）などの標準的なトランスフェクション試薬および組換えプラスミドの適切な量を使用して、単層または懸濁培養としてのいずれかとして、十分な細胞密度にて一過性にトランスフェクトする。細胞を無血清培地において、３７℃および５％のＣＯ_２にてインキュベートし、５日間毎日、収集を行う。典型的には、ＨＥＫ２３９ＥＢＮＡ懸濁培養中の発現レベルは、〜３０ｍｇ／Ｌである。哺乳動物細胞におけるヒトＦＧＦ−２１の発現により、ＨＰＩＰの天然のＮ末端配列、すなわちＮ末端のメチオニン残基なしを得る。ＤＰＰ−ＩＶ（ブタの腎臓、ＳＩＧＭＡ Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ）での、ＨＥＫ２３９ＥＢＮＡ細胞からのＦＧＦ−２１の酵素処置により、４アミノ酸までのＮ末端の切断を生じることが発見された。マウス３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞アッセイ法（実施例４を参照されたい）においてアッセイしたときに、この切断されたＦＧＦ−２１の変異体は、野生型ＦＧＦ−２１のものに相当するレベルでグルコース摂取を刺激する（表１）。

実施例３
酵母におけるＦＧＦ−２１突然変異タンパク質の発現および精製
ＦＧＦ−２１突然変異タンパク質の産生のためのさらにもう一つの発現系は、ピチア・パストリス、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、またはサッカロマイセス・セレビジエなどの酵母である。ピチア・パストリスにおける産生のためには、市販の系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）により、組換えタンパク質の高レベル発現を駆動するための強力なＡＯＸ１（アルコールオキシダーゼ）プロモーターをもつベクターを使用する。あるいは、ＧＡＰ遺伝子（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）由来プロモーターを使用するベクターも、高レベルの構成的発現のために利用できる。多コピーのピチア発現ベクターにより、ゲノムに組み込まれた関心対象の遺伝子の複数のコピーをもつ株を得ることができる。組換えピチア株における関心対象の遺伝子のコピーの数を増大することにより、タンパク質発現レベルを増大することができる。さらにもう一つの酵母発現系は、サッカロマイセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。発現ベクターは、ＧＡＬ１遺伝子由来のプロモーターおよびエンハンサー配列を含む。ＧＡＬ１プロモーターは、ガラクトースで誘導する際のその強力な転写活性のため、最も広く使用されている酵母プロモーターのうちの１つである。

解析特性付け（質量スペクトル解析）では、ピチア・パストリスにおいて発現されるＦＧＦ−２１が切断されていることを示す（Ｎ末端の４アミノ酸除去［ＨｉｓＰｒｏＩｌｅＰｒｏ］まで、以下ｄｅ−ＨＰＩＰと命名する）。マウス３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞アッセイ法（実施例４を参照されたい）においてアッセイしたときに、この切断されたＦＧＦ−２１の変異体は、野生型ＦＧＦ−２１と同じレベルでグルコース摂取を刺激する（表１）。

実施例４
マウス３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるグルコース摂取
３Ｔ３−Ｌ１細胞は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手される。細胞をダルベッコ修飾イーグル培地中に１０％の鉄を補充したウシ胎児血清を含む増殖培地（ＧＭ）中で培養する。標準的な脂肪細胞分化については、細胞が周密状態に達した２日後に（０日という）、細胞を１０％のウシ胎児血清、１０μｇ／ｍｌインスリン、１μＭデキサメサゾン、および０．５μＭイソブチルメチルキサンチンを含む分化培地（ＤＭ）に４８時間曝露する。次いで、細胞を１０％のウシ胎児血清、および１０μｇ／ｍｌインスリンを含む分化後培地中で維持する。

グルコース輸送アッセイ法−０．１ｍＭ ２−デオキシ−Ｄ−［^１４Ｃ］グルコースの蓄積によってアッセイされるヘキソース摂取は、以下のとおりに測定される。１２ウェル・プレート内の３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を、３７℃に温め、かつ０．２％のＢＳＡを含むＫＲＰ緩衝液（１３６ｍＭ ＮａＣｌ、４．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＮａＰＯ_４、０．９ｍＭ ＣａＣｌ_２、０．９ｍＭ ＭｇＳＯ_４、ｐＨ７．４）で２回洗浄して、０．２％のＢＳＡを含むリーボビッツＬ−１５培地中で大気中において３７℃で２時間インキュベートして、０．２％のＢＳＡ緩衝液を含むＫＲＰで再び２回洗浄し、ＫＲＰ、０．２％のＢＳＡ緩衝液中で、ワートマニンの非存在下（Ｍｅ_２ＳＯのみ）または存在下において大気中で３７℃にて３０分間インキュベートする。次いで、インスリンを１００ｎＭの終濃度に１５分間添加し、２−デオキシ−Ｄ−［^１４Ｃ］グルコースの摂取を最後の４分間測定する。非特異的摂取（１０μＭサイトカラシンＢの存在下において測定した）を全ての値から減算する。タンパク質濃度は、Ｐｉｅｒｃｅビシンコニン酸アッセイ法で決定する。摂取は、それぞれの実験について３回または４回、ルーチン的に測定する。

インビトロでの能力は、野生型ＦＧＦ−２１のインビトロでの活性に対して規準化し、これを１．０に指定して、陽性対照として使用する。本発明のＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質のインビトロでの能力を表１の野生型ＦＧＦ−２１と比較する。表１に示したように、本発明の突然変異タンパク質は、野生型ＦＧＦ−２１と比較して種々の程度で生物学的能力を維持した。

実施例５
Ｏｂ／ｏｂマウスモデル
媒体およびインスリン対照群と比較して、ＦＧＦ−２１で処置後の血漿グルコースレベルおよびトリグリセリドレベルを監視するために、雄ｏｂ／ｏｂマウスを使用する肥満症モデルにおける研究を行った。雄ｏｂ／ｏｂマウス（７週間目）の試験群には、媒体（０．９％のＮａＣｌ）単独、またはＦＧＦ−２１突然変異タンパク質（０．１２５ｍｇ／ｋｇ）（０．１ｍＬ、毎日一回）を皮下に７日間注射した。７日目の最後の化合物注射の１時間後に、血液を尾部クリップ出血によって収集し、標準的プロトコルを使用して血漿グルコースレベルを測定した。媒体対照と比較して、ＦＧＦ−２１突然変異タンパク質が、より血漿グルコースレベルを低下する能力を表２に示してある。表２のデータは、本発明の突然変異タンパク質が、媒体対照と比較して血漿グルコースレベルを低下させたことを示す。媒体対照と比較して、ＦＧＦ−２１突然変異タンパク質が、トリグリセリドレベルを低下にする能力は、表３に示してある。

実施例６
ＦＧＦ−２１突然変異タンパク質の薬剤的安定性
本発明のＦＧＦ−２１突然変異タンパク質の安定性を、シミュレートされた生理学的および製剤条件下で解析した。生理学的条件をシミュレートするために、突然変異タンパク質を、１０ｍｇ／ｍｌ（ｐＨ７．４）の標的タンパク質濃度における室温（ＲＴ）でのＰＢＳ中の安定性について解析した。ＰＢＳ中での突然変異タンパク質の溶解度／物理安定度は、サイズ排除および／または逆相クロマトグラフィーによって測定される調製後のタンパク質の回収により、ＲＴにおいて＞９０％の回収を生じる場合に満足なものであるとみなす。表４および５に示した本発明の突然変異タンパク質は、この基準を満たす。

本発明の突然変異タンパク質の製剤は、保存された多目的製剤である可能性が高いことが予期され、したがって一般的保存剤との適合性を解析した。製剤適合性について試験するために、保存剤、ｍ−クレゾール（３ｍｇ／ｍＬの終濃度、通常、中性のｐＨ条件下での保存剤有効性についての欧州薬局方Ｂ基準を満たすのに十分な濃度）を、室温において、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に約１０ｍｇ／ｍｌで突然変異タンパク質を含む溶液に添加した。最初に、ＲＴにて逆相およびサイズ排除クロマトグラフィーの後に、主なクロマトグラフピークにおけるタンパク質回収を決定することによって、保存剤の存在下における物理安定度をアクセスした。さらにまた、３７℃でのＤＬＳ（動的光散乱）によって測定される凝集の範囲は、野生型ＦＧＦ−２１と比較して、２時間後のｍ−クレゾールの存在下における粒子の平均直径として示してある。より大きな平均直径は、タンパク質会合および／または凝集が増大された程度に対応する。野生型ＦＧＦ−２１と比較した本発明の第１および第２の態様の突然変異タンパク質の保存剤適合性（粒子の平均直径の関数として）を表４に示してある。全ての突然変異タンパク質は、大腸菌において発現された。

ＰＢＳ中で安定で、かつ保存剤適合性の本発明の突然変異タンパク質は、野生型ＦＧＦ−２１と比較して、増強されたか、または改善された薬剤的特質を有することを示す。表４に示したとおり、野生型ＦＧＦ−２１と比較して増強された薬剤的特質を有する本発明の好ましい突然変異タンパク質は、Ｌ１３９Ｅ、Ａ１４５Ｅ、Ｌ１４６Ｅ、Ｉ１５２Ｅ、Ｑ１５６Ｅ、［Ｉ１５２Ｅ、Ｓ１６３Ｅ］、Ｓ１６３Ｅ、Ｑ５４Ｅ、［Ｌ２１Ｃ−Ｌ３３Ｃ、Ｌ１１８Ｃ−Ａ１３４Ｃ］、Ｌ２１Ｃ−Ｌ３３Ｃ、Ａ２６Ｃ−Ｋ１２２Ｃ、およびＬ１１８Ｃ−Ａ１３４Ｃである。

Claims (9)

1. 突然変異タンパク質が、Ｌｅｕ１３９Ｇｌｕ、Ａｌａ１４５Ｇｌｕ、Ｌｅｕ１４６Ｇｌｕ、Ｉｌｅ１５２Ｇｌｕ、Ｇｌｎ１５６Ｇｌｕ、Ｓｅｒ１６３Ｇｌｕ、［Ｉｌｅ１５２Ｇｌｕ，Ｓｅｒ１６３Ｇｌｕ］、およびＧｌｎ５４Ｇｌｕ（式中、アミノ酸の番号付けは、配列番号：１に基づく）からなる群より選択される、ヒト線維芽細胞成長因子２１（ＦＧＦ−２１）の突然変異タンパク質。
2. 前記突然変異タンパク質が、Ｎ末端で最大４アミノ酸が切断されている、請求項１記載の突然変異タンパク質。
3. 以下の２つ以上のアミノ酸：ロイシン２１、アラニン２６、ロイシン３３、ロイシン１１８、リジン１２２またはアラニン１３４（式中、アミノ酸の番号付けは、配列番号：１に基づく）の、システインでの置換を含む、Ｌｅｕ２１Ｃｙｓ−Ｌｅｕ３３Ｃｙｓ／Ｌｅｕ１１８Ｃｙｓ−Ａｌａ１３４Ｃｙｓ、Ｌｅｕ２１Ｃｙｓ／Ｌｅｕ３３Ｃｙｓ、Ｌｅｕ１１８Ｃｙｓ／Ａｌａ１３４Ｃｙｓ、およびＡｌａ２６Ｃｙｓ／Ｌｙｓ１２２Ｃｙｓからなる群より選択される、ヒトＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質。
4. 前記突然変異タンパク質が、Ｎ末端で最大４アミノ酸が切断されている、請求項３記載の突然変異タンパク質。
5. 前記突然変異タンパク質が、ｄｅｓ−（Ｈｉｓ１Ｐｒｏ２Ｉｌｅ３Ｐｒｏ４）−Ｌｅｕ１１８Ｃｙｓ／Ａｌａ１３４ＣｙｓヒトＦＧＦ−２１である、請求項４記載の突然変異タンパク質。
6. 請求項１〜５のいずれか１項記載のＦＧＦ−２１突然変異タンパク質の治療上有効な量と、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
7. 医薬用の請求項１〜５のいずれか１項記載の突然変異タンパク質。
8. 肥満症、２型糖尿病、インスリン耐性、高インスリン血症、グルコース不耐性、高血糖、または代謝症候群の治療用の、請求項１〜５のいずれか１項記載のＦＧＦ−２１突然変異タンパク質。
9. ２型糖尿病の治療用の、請求項８記載の突然変異タンパク質。