CN102802657A

CN102802657A - 用于治疗2型糖尿病的glp-1和fgf21组合

Info

Publication number: CN102802657A
Application number: CN201080026383XA
Authority: CN
Inventors: B·安德森; A·M·K·汉森; B·C·罗林
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 2009-06-11
Filing date: 2010-06-08
Publication date: 2012-11-28
Also published as: EP2440235A1; JP2012529463A; WO2010142665A1; US20120172298A1; US20130252884A1

Abstract

本发明涉及成纤维细胞生长因子21(FGF21)化合物和胰高血糖素样肽-1(GLP-1)化合物组合用于制备用于治疗糖尿病、更特别是2型糖尿病的药物中的用途，以及包含某些FGF21化合物和GLP-1化合物组合以及药学上可接受的载体的药物组合物。所述组合对2型糖尿病相关参数(即在游离脂肪酸存在下的离体β细胞的生存力、离体β细胞的胱天蛋白酶活性(细胞凋亡的衡量))具有显著的作用，并且在体内对db/db小鼠具有降血糖作用。

Description

用于治疗2型糖尿病的GLP-1和FGF21组合

发明领域

本发明涉及成纤维细胞生长因子21(FGF21)化合物和胰高血糖素样肽1(GLP-1)化合物组合用于制备用于治疗糖尿病、更特别是2型糖尿病的药物中的用途。

本发明还涉及包含某些FGF21化合物和GLP-1化合物组合以及药学上可接受的载体的药物组合物。

发明背景

成纤维细胞生长因子为表达于正在发育的组织和成熟组织中的多肽。其涉及几种生理机制，包括例如代谢调控和细胞分化。整个家族(FGF家族)存在超过二十种成纤维细胞生长因子。包括FGF19、FGF21和FGF23在内的FGF家族的三个成员形成起参与代谢调控的内分泌因子作用的亚族。

FGF21优先表达于肝脏中并且已显示出发挥激素样代谢作用。成熟的人FGF21多肽具有SEQ ID NO：1的第1-181个氨基酸的序列。

FGF21已被证明在小鼠的脂肪细胞中激活葡萄糖摄取，并且当给予糖尿病啮齿类动物时降低血糖和甘油三酯的水平(Kharitonenkov等，J.Clin.Invest.(2005)，115：1627-1635)。FGF21对血糖和甘油三酯的降低作用已在糖尿病猴中显示。基于这些结果，已将FGF21提议作为具有治疗尤其是糖尿病的潜能的药理作用剂。

GLP-1是在摄入食物后由肠的内分泌细胞产生的肠促胰岛素激素。GLP-1是葡萄糖代谢和胰脏中胰岛的β细胞分泌胰岛素的调节物。GLP-1还导致糖尿病状态中的胰岛素分泌。然而GLP-1本身的体内半衰期非常短，因此备受关注延长GLP-1在体内的半衰期的方法。

WO 98/08871公开了具有延长的半衰期的基于人GLP-1(7-37)(SEQ ID NO：3的第1-31个氨基酸)的延长GLP-1类似物和衍生物，包括利拉糖肽，其为由Novo Nordisk A/S开发的用于每日一次给药的GLP-1衍生物并且有望很快上市用于治疗2型糖尿病。

艾塞那肽(Exenatide)是由Amylin Pharmaceuticals和Eli Lilly &Co生产和销售的用于2型糖尿病的治疗的市售肠促胰岛素模拟物。艾塞那肽基于毒蜥外泌肽-4(7-45)(SEQ ID NO：4的第1-39个氨基酸)，存在于吉拉毒蜥(Gila monster)唾液中的激素。其展示出与人GLP-1类似的生物学性质。US 5,424,286尤其涉及通过给予毒蜥外泌肽-4(7-45)(该美国专利中的SEQ ID NO：1)在哺乳动物中刺激胰岛素释放的方法。

WO 2009/020802涉及FGF21化合物和GLP-1化合物基于所谓的协同效应在生产用于减少体重和用于治疗肥胖症的药物中的用途。此外，所述组合被指出(但仅一次而且非常简略地，仅仅附带地在第7页中)还导致“在降低提高的血糖水平方面的协同效应，并且因此在治疗糖尿病方面有潜在应用”。然而，后来的宣称完全未被支持。

本发明提供关于通过使用FGF21化合物和GLP-1化合物的组合治疗2型糖尿病的显著作用的实现和证据。

发明简述

本发明涉及FGF21化合物和GLP-1化合物组合用于制备用于治疗2型糖尿病的药物中的用途。

本申请提供了尤其由以下研究支持的该组合的意外的和未预料的显著作用的展示：在游离脂肪酸存在下的离体β细胞的生存力的相关研究；在游离脂肪酸存在下的离体β细胞的胱天蛋白酶活性(细胞凋亡的衡量)的相关研究；和/或在体内对db/db小鼠显示出降血糖作用的研究。

与FGF21联合检测的化合物之一为新型化合物N-ε-37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(15-羧基十五酰氨基)丁酰氨基]-乙氧基}乙氧基)-乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][Aib8，22，35，Lys37]GLP-1-(7-37)，在下文中为“化合物G4”。

本发明还涉及：

用于治疗2型糖尿病的FGF21化合物和GLP-1化合物的组合；

包含FGF21化合物和GLP-1化合物以及药学上可接受的载体的组合物，其中

所述GLP-1化合物：

i)包含以下中的至少一种：脱氨基His7、Aib8、Aib22、Arg26、Aib35和/或Lys37；

ii)为包含白蛋白结合部分的GLP-1衍生物，所述结合部分包含至少一个、优选至少两个、更优选两个游离的羧酸基团；或者其药学上可接受的盐；

iii)为包含白蛋白结合部分的GLP-1衍生物，所述结合部分包含二羧酸的酰基，其优选包含总计12-24个碳原子，例如C12、C14、C16、C18、C20、C22或C24，最优选C16、C18或C20；其中优选a)所述酰基与GLP-1肽的赖氨酸残基的ε氨基经由接头连接；b)所述接头包含至少一个OEG基团和/或至少一个Trx基团，并且任选还包含至少一个Glu；和/或

iv)选自除化合物G1外的权利要求28的化合物；和/或所述FGF21化合物：

a)包含-1M、S71C、K56R、K59R、K69R和/或K122R中的至少一种；

b)为经由半胱氨酸残基优选内部半胱氨酸残基例如71C的巯基修饰的FGF21衍生物；

c)为包含白蛋白结合部分的FGF21衍生物；

d)并非聚乙二醇化的FGF21衍生物；

e)为包含白蛋白结合部分的FGF21衍生物，所述结合部分包含至少一个、优选至少两个、更优选两个游离的羧酸基团或者其药学上可接受的盐；

f)为包含白蛋白结合部分的FGF21衍生物，所述结合部分包含酰基，例如脂肪酸或二羧酸的酰基，所述酰基优选包含总计12-24个碳原子，例如C12、C14、C16、C18、C20、C22或C24，最优选C18或C20；或者其药学上可接受的盐；其中优选i)所述酰基与FGF21肽的N端氨基酸残基的氨基例如与-1M的氨基或与FGF21肽的内部半胱氨酸残基的巯基例如与71C的巯基经由接头连接；并且优选b)所述接头包含至少一个OEG基团和/或至少一个Glu基团；和/或

g)选自除具有SEQ ID NO：1的多肽之外的权利要求51的化合物；以及

治疗2型糖尿病、增强β细胞的生存力、减少β细胞的凋亡和降低血糖的方法，所有方法包括给予患者有效量的FGF21化合物和GLP-1化合物组合。

在另一个方面，本发明涉及包含FGF21化合物和GLP-1化合物以及药学上可接受的载体的组合物，其中

所述GLP-1化合物：

a)与SEQ ID NO：1相比包含以下修饰中的至少一种：-1G、-1C、-1A、-1S、Q27E、Q28R、A31E、K56R、K59R、K69R、S71C、D102E、D102N、D102T、N121Q、des121N、N121D、K122R、D159E、L166F、S167G、M168L、V169aT、G170T、P171L、S172E、Q173A、G174A、G174V、Y179F、A180E、S181K和/或S181R；独立地任选带有N端的M(例如-1M)；和/或

b)与SEQ ID NO：1相比包含最多25个氨基酸残基、优选最多20个氨基酸残基、更优选最多15个氨基酸残基、甚至更优选最多10个氨基酸残基或者最优选最多6个氨基酸残基的N端延伸，其中至少50％、优选至少60％、更优选至少70％、甚至更优选至少80％或者最优选至少90％的N端延伸的氨基酸残基为G或S，前提条件是所述FGF21类似物包含不超过210个氨基酸残基、优选不超过209个氨基酸残基、更优选不超过206个氨基酸残基，并且另外的前提条件是若N端延伸仅由单一氨基酸组成，则所述氨基酸不为Met，这样的FGF21化合物的特定实例为[-1A，71C，121Q，166F，167G，168L，171L，172E，173A，174V，179F，180E，des181]FGF21。

定义

本文所用术语“FGF21化合物”是指天然的人FGF21以及保持FGF21活性的其类似物、融合肽及衍生物。

天然的人FGF21蛋白的序列可来自UNIPROT数据库，登录号Q9NSA1。209个氨基酸前体蛋白包含信号肽(氨基酸1-28)和成熟蛋白(氨基酸29-209)。将成熟蛋白作为SEQ ID NO：1(氨基酸1-181)包括在本文中，以及将信号肽作为SEQ ID NO：2(氨基酸1-28)包括在本文中。在成熟蛋白的本文SEQ ID NO：1第146位用Pro代替Leu的天然人FGF21的同种型或等位基因形式，自尤其是US 2001012628A1(已公开的美国申请中SEQ ID NO：2的第174位残基)获知。天然的人FGF21的具体实例是成熟的部分，即SEQ ID NO：1及其L146P同种型。

FGF21活性可使用本领域已知的任何方法确定，例如本文实施例8的测定法(3T3-L1脂肪细胞中的葡萄糖摄取)。

本文所用术语“GLP-1化合物”是指人GLP-1(7-37)(SEQ ID NO：3的第1-31个氨基酸)、毒蜥外泌肽-4(7-45)(SEQ ID NO：4的第1-39个氨基酸)以及保持GLP-1活性的其类拟物、融合肽及衍生物。

至于GLP-1化合物的位置编号：对于本目的，将任何氨基酸取代、缺失和/或添加相对于SEQ ID NO：3和/或SEQ ID NO：4的序列指出。然而，序列表的氨基酸残基的编号始终从第1号开始，而对于我们想要的本目的，按照本领域的已建立的实践，以氨基酸残基编号7起始并给其分配编号7。因此，一般而言，本文对GLP-1(7-37)或毒蜥外泌肽-4序列的位置编号的任何参考都是指在两种情况下以第7位的His起始并分别以第37位Gly或者第45位Ser终止的序列。

GLP-1活性可使用本领域已知的任何方法确定，例如本文实施例7的测定法(表达人GLP-1受体的细胞系中对cAMP形成的刺激)。

在FGF21和GLP-1的情况下本文所用术语“类似物”是指以下多肽，其通过修饰其氨基酸序列或可通过修饰其氨基酸序列分别推导或衍生自SEQ ID NOs：1、3和4的各自的FGF21、GLP-1和毒蜥外泌肽-4序列。这样的修饰可包括一个或多个氨基酸的取代、缺失和/或添加。例如，氨基酸可在氨基酸序列的C端、N端或内部添加和/或缺失。优选氨基酸在C端和/或N端，更优选在N端添加和/或缺失。带有C端或N端缺失的氨基酸的氨基酸序列也可称为截短序列，如本领域所已知。类似地，序列内部添加的氨基酸可被称作插入。本文在此和接下来使用术语“变体”或“突变蛋白质”替代术语“类似物”。

本文具体的实施方案部分、实验部分以及权利要求中公开FGF21类似物和GLP-1类似物的实例。

在FGF21修饰和GLP-1修饰的情况下本文所指术语“氨基酸”或“氨基酸残基”包括被细胞用于蛋白生物合成中并由遗传密码规定的二十种标准的α-氨基酸，即丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。所述术语还包括非标准氨基酸，例如硒代半胱氨酸和吡咯赖氨酸，其也由遗传密码编码但罕见于蛋白中。存在于蛋白中的其它非标准氨基酸可通过翻译后修饰形成，例如γ-羧基谷氨酸盐/酯和羟脯氨酸。并非由遗传密码编码的非标准或非天然的氨基酸的另外的实例为鸟氨酸和磷酸丝氨酸。非标准氨基酸的另外的实例还为合成的氨基酸，包括通过化学合成生产的氨基酸，例如由遗传密码编码的氨基酸的D-异构体，例如D-丙氨酸、D-谷氨酰胺、D-组氨酸和D-亮氨酸、Aib(α-氨基异丁酸)、Abu(α-氨基丁酸)、Tle(叔丁基甘氨酸)、β-丙氨酸、3-氨甲基苯甲酸、邻氨基苯甲酸、脱氨基组氨酸(缩写为脱氨基His(或DesaH)，备选名咪唑基丙酸，缩写为Impr)，氨基酸的β类似物例如β-丙氨酸、2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸、Nα-乙酰基-组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α-甲基-组氨酸、α，α-二甲基-谷氨酸、m-CF₃-苯丙氨酸(缩写为m-CF₃-Phe)、α，β-二氨基丙酸(缩写为DAP)、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸或4-吡啶基丙氨酸、(1-氨基环丙基)甲酸、(1-氨基环丁基)甲酸、(1-氨基环戊基)甲酸、(1-氨基环己基)甲酸、(1-氨基环庚基)甲酸和(1-氨基环辛基)甲酸。

对于本目标而言，标准氨基酸的两种公认密码(单字母和三字母)可互换使用，或者在此和接下来将氨基酸名称完全拼出。显然这些术语被认为是完全相等的(例如C＝Cys＝半胱氨酸)。

在FGF21和GLP-1的情况下本文所用术语“衍生物”是指已被共价修饰的多肽。所述术语并不限于所述而是描述性的，因为其旨在标出如所述对组成性多肽化合物作出的变化(“类似物”)和侧链与多肽的共价结合(籍此其变成“衍生化的”)的区别。若需要的话，术语衍生物可被其它的普通化学术语例如化合物取代。衍生物的实例包括酰化和聚乙二醇化的多肽，如本领域所已知。衍生物的另外的实例公开于本文具体的实施方案部分、实验部分和权利要求中。

术语“白蛋白结合剂(albumin binder)”也不意指限制于所述。此外，其相反地是描述性的，因为其反映了侧链的总体目标或目的，即所得化合物(衍生物)能够结合人血清白蛋白，其提供或至少有利于本发明衍生物常常针对的延长作用。若需要的话，该术语还可用其它的普通化学术语例如化合物取代。白蛋白结合剂的实例公开于具体的实施方案部分、实验部分以及权利要求中。

命名：本文可互换地使用多肽命名、有机化学命名和化学式或其混合来命名类似物和衍生物，无论哪一种都被认为最适合使讨论中的技术问题易于理解。

变体命名：本文可互换地使用多肽命名、有机化学命名、化学式、氨基酸序列或其混合来命名FGF21、GLP-1和毒蜥外泌肽-4的变体，无论哪一种都被认为最适合使讨论中的技术问题易于理解。

例如，变体的取代可表示为：“原始的氨基酸-位置-取代的氨基酸”。可使用三字母码或单字母码。因此，以FGF21为例，符号“K122C”或“Lys122Cys”意指，讨论中的FGF21变体包括在FGF21(SEQ IDNO：1)中第122位氨基酸对应的变体氨基酸位置用半胱氨酸取代赖氨酸。但取代可仅仅表示为位置和所得的氨基酸残基，如122C被认为等同于K122C，因为其指的是相同的所得分子。若需要的话，可如下进一步所述(“比对”)通过比对变体和FGF21证实位置。

多个取代可通过逗号分隔，如果需要的话用括号包围以明晰它们属于同一变体。再次以FGF21为例，用于制备化合物F3(实施例2)的FGF21类似物可例如命名为“K56R，K59R，K69R，K122R Met-FGF21”，或其可被称为“带有K56R，K59R，K69R，K122R和N端M的SEQ ID NO：1”。或者，“+”可用于分隔，如在SEQ ID NO：1的(-1M+56R+59R+69R+122R)变体中。另一实例为SEQ ID NO：3的GLP-1变体(8V+22E)，其中第8位的Ala(序列表中的第2位)被Val取代，并且在第22位的Gly(序列表中的第16位)被Glu取代。

可如下描述延伸：通过添加位置编号(C端为继续的正编号，而在N端为负编号)参考真实的SEQ ID NO来描述，或者更简单地，通过利用其正确序列对讨论中的化合物添加讨论中的延伸的氨基酸，如例如在Met-FGF21(-1M-FGF21)中。

对于本发明的目标，两个相关氨基酸序列的比对，例如FGF21与其类似物的比对，可使用EMBOSS软件包的Needle程序(http://emboss.org)进行。优选版本为2.8.0。Needle程序实现了Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.(1970)J.MoI.Biol.48，443-453中所述的总体比对算法。所用取代矩阵为BLOSUM62，空位开放罚分为10，空位延伸罚分为0.5。

或者，可使用程序“比对”，其为Needleman-Wunsch比对(即总体比对)。序列通过该程序利用缺省打分矩阵BLOSUM50比对。对于空位的第一个残基的罚分为12，对于空位的另外的残基的罚分为2。Needleman-Wunsch算法描述于：Needleman，S.B.和Wunsch，CD.，(1970)，Journal of Molecular Biology，48：443-453，比对程序由Myers和W.Miller在Optimal Alignments in Linear Space″CABIOS(computerapplications in the biosciences(生物科学中的计算机运用))(1988)4：11-17描述。“比对”为FASTA软件包版本v20u6的一部分(参见W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988)，″Improved Tools for BiologicalSequence Analysis″，PNAS 85：2444-2448和W.R.Pearson(1990)″Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA，″Methods in Enzymology 183：63-98)。

包含本发明的FGF21化合物和GLP-1化合物的药物组合物可进一步包含药学上可接受的载体。对于注射，所述载体可为水，若需要的话，补充有其它物质，例如盐水，例如生理盐水。还可使用其它药学上可接受的物质例如稀释剂和适当的缓冲液。若需要的话，还可使用其它药学上可接受的物质，例如乳化剂、助悬剂、溶剂、填充剂、膨胀剂、佐剂、防腐剂、抗氧化剂、着色剂和/或调味剂。所述FGF21化合物和GLP-1化合物可以纯化的多肽的形式使用，或者利用合适的药学上可接受的赋形剂配制，如本领域所已知。所述药物组合物可以本领域已知的任何方式给予，例如注射，例如静脉(i.v.)或皮下(s.c)注射。

所述FGF21化合物和GLP-1化合物可以以治疗有效量或预防有效量包含于药物组合物中。所述量根据治疗目的或预防目的而定，例如需要治疗的患者的状况、所需的给药途径等。如在本领域常规的，熟练的医师可能不得不根据这些因素调整剂量和修改给药。示例性和非限制性的剂量在本实施例中公开。

根据本发明使用的很多FGF21化合物和GLP-1化合物为已知化合物。根据本发明使用的那些非已知化合物的FGF21化合物和GLP-1化合物可与相似化合物的制备类似地制备。

具体实施方案

以下为本发明的具体实施方案：

1.FGF21化合物和GLP-1化合物组合用于制备用于治疗2型糖尿病的药物中的用途。

2.实施方案1的用途，其中所述GLP-1化合物包含SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4的氨基酸序列，或者为具有最多15个氨基酸取代、缺失和/或添加的SEQ ID NO：3或4的类似物。

3.实施方案2的用途，其中所述GLP-1化合物包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列，或者为其具有最多15个氨基酸取代、缺失和/或添加的类似物。

4.实施方案2的用途，其中所述GLP-1化合物包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列，或者为其具有最多15个氨基酸取代、缺失和/或添加的类似物；例如艾塞那肽。

5.实施方案1-4中任一项的用途，其中所述GLP-1化合物具有GLP-1活性。

6.实施方案5的用途，其中所述GLP-1化合物与N-ε26-((S)-4-羧基-4-十六酰氨基丁酰)[Arg34]GLP-1-(7-37)(化合物G1)相比具有一样的活性、活性更高、或者为其活性的最少1/10，优选最少1/8、1/6、1/5、1/4、1/3或1/2，其中所述活性优选按照在含人GLP-1受体的培养基中刺激cAMP形成的能力来检测，例如如实施例7中所述。

7.实施方案5-6中任一项的用途，其中所述GLP-1化合物的EC₅₀值基于测量在含人GLP-1受体的培养基中刺激cAMP形成的能力的测定法来测定，所述EC₅₀值优选不超过1000pM、更优选不超过800、600、500、400、300或200pM，其中所述测定优选如实施例7中所述进行。

8.实施方案2-7中任一项的用途，其中氨基酸取代、缺失和/或添加的最大数目为14、优选13、更优选12、甚至更优选11或者最优选10。

9.实施方案2-8中任一项的用途，其中氨基酸取代、缺失和/或添加的最大数目为9、优选8、更优选7、甚至更优选6或者最优选5。

10.实施方案2-9中任一项的用途，其中氨基酸取代、缺失和/或添加的最大数目为4、优选3、更优选2或者最优选1。

11.实施方案2-3和5-10中任一项的用途，其中所述GLP-1化合物包含以下中的至少一种：脱氨基His7、Aib8、Aib22、Arg26、Aib35和/或Lys37。

12.实施方案2-3和5-10中任一项的用途，其中所述GLP-1化合物包含以下中的至少一种：Glu22和/或Arg34。

13.实施方案2-3和5-12中任一项的用途，其中所述GLP-1化合物包含以下组合：(34R)、(8Aib+22Aib+35Aib+37K)、(8Aib+34R)或(7DesaH+22E+26R+34R+37K)。

14.实施方案2和4-10的用途，其中所述GLP-1化合物包含以下中的至少一种：8V、G；22E；33I；36G；37P；38S；39S；40G；41A；42P；43P；44P；45S；46C；46C-酰胺；优选包含以下组合：(8V+22E)、(8G+22E+36G)或(8V+22E+33I+36G+37P+38S+39S+40G+41A+42P+43P+44P+45S)。

15.实施方案1-14中任一项的用途，其中所述GLP-1化合物为任选经由接头的带有第二多肽的融合肽。

16.实施方案15的用途，其中所述第二多肽选自免疫球蛋白的Fc部分、人白蛋白及其类似物和片段。

17.实施方案1-14中任一项的用途，其中所述GLP-1化合物为GLP-1衍生物。

18.实施方案17的用途，其中所述GLP-1衍生物在C端氨基酸残基或者内部氨基酸残基处修饰。

19.实施方案18的用途，其中所述GLP-1衍生物经由赖氨酸残基例如26K或37K的ε氨基修饰。

20.实施方案17-19中任一项的用途，其中所述GLP-1衍生物包含白蛋白结合部分。

21.实施方案20的用途，其中所述白蛋白结合部分包含至少一个、优选至少两个、更优选两个游离的羧酸基团或者其药学上可接受的盐。

22.实施方案17-21中任一项的用途，其中所述白蛋白结合部分包含酰基，例如脂肪酸或二羧酸的酰基，例如十六酰-和15-羧基十五酰-，所述酰基优选包含总计12-24个碳原子，例如C12、C14、C16、C18、C20、C22或C24，最优选C16、C18或C20；或者其药学上可接受的盐。

23.实施方案22的用途，其中所述酰基与GLP-1肽的赖氨酸残基的ε氨基经由接头连接。

24.实施方案23的用途，其中所述接头包含至少一个OEG基团(OEG为8-氨基-3，6-二氧杂辛酸)、至少一个Trx基团(Trx为氨甲环酸，或者反式-4-(氨甲基)环己烷甲酸)：

和/或至少一个Glu(谷氨酰胺)基团。

25.实施方案24的用途，其中所述接头包含二-OEG基团，其中两个OEG基团已经由酰胺键结合。

26.实施方案25的用途，其中所述接头还包含Glu基团，其中优选Glu的氨基与所述酰基形成酰胺键，并且更优选地，Glu的γ-酰基与二-OEG基团的氨基形成酰胺键，所述二-OEG基团的羧基最优选与GLP-1肽的Lys残基的ε-氨基形成酰胺键。

27.实施方案24-25中任一项的用途，其中所述接头还包含Trx基团，其中优选Trx的氨基与所述酰基形成酰胺键，并且更优选地，Trx的酰基与Glu的氨基形成酰胺键，所述Glu的γ-酰基甚至更优选与二-OEG基团的氨基形成酰胺键，所述二-OEG基团的羧基最优选与GLP-1肽的Lys残基的ε-氨基形成酰胺键。

28.实施方案1-27中任一项的用途，其中所述GLP-1化合物选自以下化合物及其药学上可接受的盐、酰胺、链烃基化合物(alkyls)或酯：

N-ε26-((S)-4-羧基-4-十六酰氨基丁酰)[Arg34]GLP-1-(7-37)：

(化合物G1)；

N-ε37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-({反式-4-[(19-羧基十九酰氨基)-甲基]环己烷羰基}氨基)丁酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基]-[脱氨基His7，Glu22，Arg26，Arg34，Lys37]GLP-1-(7-37)：

(化合物G2)；

N-ε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰氨基)丁酰氨基]-乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][Aib8，Arg34]GLP-1-(7-37)：

(化合物G3)；

N-ε37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(15-羧基十五酰氨基)丁酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][Aib8，22，35，Lys37]GLP-1-(7-37)：

(化合物G4)。

29.实施方案1-28中任一项的用途，其中所述FGF21化合物包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列，或者为其具有最多30个氨基酸取代、缺失和/或添加的类似物。

30.实施方案29的用途，其中所述FGF21化合物具有FGF21活性。

31.实施方案30的用途，其中所述FGF21化合物具有Met-FGF21(带有添加的N端Met的SEQ ID NO：1；化合物F1)的效价的至少1％、优选至少5％、更优选至少10％、甚至更优选至少20％、或者最优选至少30％的效价，其中所述效价通过测量3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖摄取来确定。

32.实施方案31的用途，其中所述效价为相对于Met-FGF21(带有添加的N端Met的SEQ ID NO：1；化合物F1)的效价的至少40％、优选至少50％、更优选至少60％、甚至更优选至少70％。

33.实施方案32的用途，其中所述效价为相对于Met-FGF21(带有添加的N端Met的SEQ ID NO：1；化合物F1)的效价的至少80％、优选至少90％、更优选至少100％、甚至更优选至少110％、或者最优选至少120％。

34.实施方案31-33中任一项的用途，其中所述效价按照相对于Met-FGF21(带有添加的N端Met的SEQ ID NO：1；化合物F1)的EC₅₀的衍生物EC₅₀计算。

35.实施方案31-34中任一项的用途，其中所述3T3-L1脂肪细胞来源于小鼠的3T3-L1成纤维细胞，优选ATCC CL-173，并且测定法优选如实施例8中所述进行。

36.实施方案29-35中任一项的用途，其中氨基酸取代、缺失和/或添加的最大数目为25、优选20、更优选15、甚至更优选10和最优选9。

37.实施方案29-36中任一项的用途，其中氨基酸取代、缺失和/或添加的最大数目为8、优选7、更优选6、甚至更优选5和最优选4。

38.实施方案29-37中任一项的用途，其中氨基酸取代、缺失和/或添加的最大数目为3、更优选2或者最优选1。

39.实施方案29-38中任一项的用途，其中所述FGF21化合物包含以下中的至少一种：-1M、S71C、K56R、K59R、K69R和/或K122R。

40.实施方案29-38中任一项的用途，其中所述FGF21化合物包含以下中的至少一种：(118C+134C)、167A、(21C+33C)、(26C+122C)、121A。

41.实施方案1-40中任一项的用途，其中所述FGF21化合物为FGF21衍生物。

42.实施方案41的用途，其中所述FGF21衍生物在N端氨基酸残基或内部氨基酸残基处修饰。

43.实施方案42的用途，其中所述FGF21衍生物经由N端氨基酸残基的氨基或者经由半胱氨酸残基、优选内部半胱氨酸残基例如71C的巯基修饰。

44.实施方案41-43中任一项的用途，其中所述FGF21衍生物包含白蛋白结合部分。

45.实施方案44的用途，其中所述白蛋白结合部分包含至少一个、优选至少两个、更优选两个游离的羧酸基团或者其药学上可接受的盐。

46.实施方案41-45中任一项的用途，其中所述白蛋白结合部分包含酰基，例如脂肪酸或二羧酸的酰基，例如17-羧基十七酰-和19-羧基十九酰-，所述酰基优选包含总计12-24个碳原子，例如C12、C14、C16、C18、C20、C22或C24，最优选C18或C20；或者其药学上可接受的盐。

47.实施方案46的用途，其中所述酰基与FGF21肽的N端氨基酸残基的氨基例如与-1M的氨基或与FGF21肽的内部半胱氨酸残基的巯基例如与71C的巯基经由接头连接。

48.实施方案47的用途，其中所述接头包含至少一个OEG基团(OEG为8-氨基-3，6-二氧杂辛酸)和/或至少一个Glu(谷氨酰胺)基团。

49.实施方案48的用途，其中所述接头包含二-OEG基团，其中两个OEG基团已经由酰胺键结合。

50.实施方案49的用途，其中所述接头还包含Glu基团，其中优选Glu的氨基与所述酰基形成酰胺键，并且更优选地，Glu的γ-酰基与二-OEG基团的氨基形成酰胺键，所述二-OEG基团的羧基最优选与FGF21肽的N端氨基形成酰胺键，或作为备选，与FGF21肽的半胱氨酸残基的巯基任选经由接头例如-N-(CH₂)₂-N-C(＝O)-CH₂-连接。

51.实施方案1-50中任一项的用途，其中所述FGF21化合物选自以下化合物及其药学上可接受的盐、酰胺、链烃基化合物或酯：

具有SEQ ID NO：1的多肽(人FGF21)；

具有SEQ ID NO：1和添加的N端Met的多肽((Met-FGF21_人，化合物F1)；

S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(19-羧基十九酰氨基)丁酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙基氨甲酰基}甲基)[Cys71]Met-FGF21(化合物F2)；和

N-α1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰氨基)丁酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][Arg56，Arg59，Arg69，Arg122]-Met-FGF21(化合物F3)。

52.实施方案1-51中任一项的用途，其中所述GLP-1化合物选自实施方案28的化合物，并且所述FGF21化合物选自实施方案51的化合物。

53.实施方案52的用途，其中所述FGF21和GLP-1化合物为以下化合物或其药学上可接受的盐、酰胺、链烃基化合物或酯：

具有SEQ ID NO：1(人FGF21)、优选带有添加的N端Met(化合物F1)的多肽以及N-ε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰氨基)丁酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][Aib8，Arg34]GLP-1-(7-37)(化合物G3)；

具有SEQ ID NO：1(人FGF21)、优选带有添加的N端Met(化合物F1)的多肽以及N-ε26-((S)-4-羧基-4-十六酰氨基丁酰)[Arg34]GLP-1-(7-37)(化合物G1)；或

具有SEQ ID NO：1(人FGF21)、优选带有添加的N端Met(化合物F1)的多肽以及N-ε37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(15-羧基十五酰氨基)丁酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][Aib8，22，35，Lys37]GLP-1-(7-37)(化合物G4)。

54.实施方案1-53中任一项的用途，其中所述化合物同时和/或序贯给予。

55.实施方案1-54中任一项的用途，其中对于用GLP-1化合物和FGF21化合物组合预处理的细胞，在存在0.35mM游离脂肪酸下β细胞(INS-1)的生存力，为相同条件下用各种化合物单独预处理的细胞的生存力的至少1.2倍(1.2x)、优选1.4倍、更优选1.6倍、甚至更优选1.8倍和最优选至少2.0倍，将所述生存力在MTT测定法中测定为吸光度。

56.实施方案55的用途，其中i)所述游离脂肪酸如实施例4中所述制备；ii)将所述FGF21化合物和/或GLP-1化合物在暴露于所述游离脂肪酸前一小时加入细胞中；iii)在确定生存力前将细胞温育48小时；iv)将细胞的生存力测量为550nm处的吸光度；和/或v)条件通常如实施例4中所概述，例如通过使用Promega CellTiter96试剂盒。

57.实施方案1-56中任一项的用途，其中对于用GLP-1化合物和FGF21化合物组合预处理的细胞，在存在0.35mM游离脂肪酸下β细胞(INS-1)的胱天蛋白酶活性，低于相同条件下用各种化合物单独预处理的细胞的胱天蛋白酶活性的90％、优选低于80％、更优选低于70％、甚至更优选低于65％，将所述胱天蛋白酶活性测量为胱天蛋白酶-3/7测定法中的荧光。

58.实施方案57的用途，其中i)所述游离脂肪酸如实施例4中所述制备；ii)在暴露于游离脂肪酸前一小时将FGF21化合物和/或GLP-1化合物加入细胞中；iii)在确定胱天蛋白酶活性前将细胞温育48小时；和/或iv)条件通常如实施例4中所概述，例如通过利用Promega Apo-One同源胱天蛋白酶-3/7测定法。

59.实施方案1-58中任一项的用途，其中，在db/db小鼠的急性研究中，序贯给予FGF21化合物和GLP-1化合物后的血糖(曲线下面积，AUC)低于相同条件下单独给予各种所述化合物后的血糖(AUC)的60％、优选低于50％、甚至更优选低于40％、或者最优选低于30％。

60.实施方案59的用途，其中对于序贯给予FGF21化合物和GLP-1化合物的AUC低于所述化合物的预期叠加作用的90％、优选低于80％、更优选低于70％和最优选低于60％。

61.实施方案59-60中任一项的用途，其中i)小鼠每日用FGF21化合物给予一次，持续3天；ii)FGF21化合物的最后剂量后一小时给予GLP-1化合物；iii)采血样并分析给予GLP-1化合物后0-48小时的血糖(mmol/l)；iv)结果以基于所有测量(0-48小时)的葡萄糖曲线下面积(AUC)给出；和/或v)条件通常如实施例5中所概述。

62.实施方案60-61中任一项的用途，其中所述预期叠加作用利用下式计算：AUC_溶媒-((AUC_溶媒-AUC_FGF21)+(AUC_溶媒-AUC_GLP-1))。

63.实施方案1-62中任一项的用途，其中在db/db小鼠的亚慢性研究中，在同时给予FGF21化合物和GLP-1化合物后的血糖(mmol/l)低于相同条件下单独给予各种化合物后的血糖的70％、优选低于60％、甚至更优选低于50％、或者最优选低于40％。

64.实施方案63的用途，其中i)每日给予化合物两次，持续21天；ii)采血样并分析第0、7、14和21天时的血糖(mmol/l)；和/或v)条件通常如实施例6中所概述。

65.一种用于治疗2型糖尿病的FGF21化合物和GLP-1化合物的组合。

66.实施方案65的组合，在加以必要的变更下将实施方案2-64的每一个条件独立施用于所述组合。

67.一种包含FGF21化合物和GLP-1化合物以及药学上可接受的载体的组合物，其中

所述GLP-1化合物：

iv)选自除化合物G1外的实施方案28的化合物；和/或所述FGF21化合物：

a)包含-1M、S71C、K56R、K59R、K69R和/或K122R中的至少一种；

b)为经由半胱氨酸残基、优选内部半胱氨酸残基例如71C的巯基修饰的FGF21衍生物；

c)为包含白蛋白结合部分的FGF21衍生物；

d)并非聚乙二醇化的FGF21衍生物；

g)选自除具有SEQ ID NO：1的多肽之外的实施方案51的化合物，。

68.一种包含FGF21化合物和GLP-1化合物以及药学上可接受的载体的组合物，其中

所述GLP-1化合物：

a)与SEQ ID NO：1相比包含以下修饰中的至少一种：-1G、-1C、-1A、-1S、Q27E、Q28R、A31E、K56R、K59R、K69R、S71C、D102E、D102N、D102T、N121Q、des121N、N121D、K122R、D159E、L166F、S167G、M168L、V169aT、G170T、P171L、S172E、Q173A、G174A、G174V、Y179F、A180E、S181K和/或S181R；独立任选带有N端M(例如-1M)；和/或

b)与SEQ ID NO：1相比包含最多25个氨基酸残基、优选最多20个氨基酸残基、更优选最多15个氨基酸残基、甚至更优选最多10个氨基酸残基、或者最优选最多6个氨基酸残基的N端延伸，其中至少50％、优选至少60％、更优选至少70％、甚至更优选至少80％、或者最优选至少90％的N端延伸的氨基酸残基为G或S，前提条件为所述FGF21类似物包含不超过210个氨基酸残基、优选不超过209个氨基酸残基、更优选不超过206个氨基酸残基并且另外的前提条件为若N端延伸仅由单一氨基酸组成，则所述氨基酸不为Met。

69.实施方案67和68的组合物，在加以必要的变更下将实施方案2-66的每一个条件独立施用于所述组合物。

70.实施方案67-69中任一项的组合物，其为治疗2型糖尿病的药物制剂。

71.实施方案67-70中任一项的组合物，其中所述GLP-1化合物和FGF21化合物以有效量存在。

72.实施方案67-71中任一项的组合物，在尽可能的范围内，其中所述GLP-1化合物如所述实施方案中所定义并且所述FGF21化合物为[-1A，71C，121Q，166F，167G，168L，171L，172E，173A，174V，179F，180E，des181]FGF21的衍生物，例如S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰氨基)丁酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙基氨甲酰基}甲基)[71C，121Q，166F，167G，168L，171L，172E，173A，174V，179F，180E，des181]Ala-FGF21。

73.一种治疗2型糖尿病的方法，所述方法包括给予患者有效量的FGF21化合物和GLP-1化合物的组合。

74.一种增强β细胞生存力的方法，所述方法包括给予有效量的FGF21化合物和GLP-1化合物的组合。

75.一种减少β细胞凋亡的方法，所述方法包括给予有效量的FGF21化合物和GLP-1化合物的组合。

76.一种降血糖的方法，所述方法包括给予有效量的FGF21化合物和GLP-1化合物的组合。

77.实施方案73-76中任一项的方法，在加以必要的变更下将实施方案2-66的每一个条件独立施用于所述方法。

78.化合物N-ε37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(15-羧基十五酰氨基)丁酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][Aib8，22，35，Lys37]GLP-1-(7-37)：

或其药学上可接受的盐、酰胺、链烃基化合物或酯。

79.实施方案77的化合物，其具有GLP-1活性，优选如实施方案6-7各自所述。

80.包含实施方案78-79中任一项的化合物以及药学上可接受的载体的组合物，优选用于治疗2型糖尿病的药物组合物，并且其中更优选所述化合物以有效量存在。

81.用作药物的实施方案78-79中任一项的化合物。

82.用于治疗2型糖尿病的实施方案78-79中任一项的化合物。

83.一种治疗2型糖尿病的方法，所述方法包括给予患者实施方案78-79中任一项的化合物。

84.一种降血糖的方法，所述方法包括给予实施方案78的化合物。

85.本文所述的任何新特征或特征的组合。

将各种参考引用于本文中，其公开内容通过引用以其整体掺入。

实施例

以下实施例用来阐述本发明。

缩写

本文使用以下缩写：DCM为二氯甲烷，DIC为二异丙基碳二亚胺，DIPEA为二异丙基乙胺，DPBS为Dulbecco氏磷酸缓冲盐水，DVB为二乙烯基苯，EDAC为(3-二甲氨基丙基)乙基碳二亚胺盐酸盐，fmoc为9H-芴-9-基-甲氧羰基，h为小时，HEPES为4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸，HOAt为1-羟基-7-氮杂苯并三唑，HOBt为1-羟基苯并三唑，HPLC为高效液相色谱，IBMX为3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，Inp为六氢异烟酸，IPTG为异丙基β-D-1-硫代半乳吡喃糖苷对照(check)，LCMS为液相色谱质谱，MALDI-TOF MS为基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱，MeOH为甲醇，min为分钟，NanoES-MS为纳米-电喷雾串联质谱，NMP为1-甲基吡咯烷-2-酮，OEG为8-氨基-3，6-二氧杂辛酸，OtBu为叔丁酯，PBS为磷酸缓冲盐水，RT为室温，TFA为三氟乙酸，THF为四氢呋喃，TIPS为三异丙基硅烷，Tris为三(羟甲基)氨基甲烷或2-氨基-2-羟甲基丙烷-1，3-二醇，Trx为氨甲环酸，TSTU为O-(N-琥珀酰亚胺基)-N，N，N′，N′-四甲基脲

四氟硼酸盐，UPLC是超高效液相色谱。

一般方法

LCMS方法1(LCMS1)

将Agilent Technologies LC/MSD TOF(G1969A)质谱仪用于鉴定样品从Agilent 1200系列HPLC系统洗脱后的质量。蛋白质谱的退卷积用Agilent的蛋白确认软件计算。

洗脱剂：

A：含0.1％三氟乙酸的水

B：含0.1％三氟乙酸的乙腈

柱：Zorbax 5u，300SB-C3，4.8x50mm

梯度：在15分钟内的25％-95％乙腈

LCMS方法2(LCMS2)

在从Perkin Elmer Series 200 HPLC系统洗脱后利用Perkin ElmerSciex API 3000质谱仪鉴定样品的质量。

洗脱剂：

A：含0.05％三氟乙酸的水

B：含0.05％三氟乙酸的乙腈

柱：Waters Xterra MS C-18 X 3mm id 5μm

梯度：以1.5ml/min的在7.5分钟内的5％-90％乙腈

LCMS方法3(LCMS3)

在从Waters Alliance HT HPLC系统洗脱后利用Waters MicromassZQ质谱仪鉴定样品的质量。

洗脱剂：

A：含0.1％三氟乙酸的水

B：含0.1％三氟乙酸的乙腈

柱：Phenomenex，Jupiter C4 50 X 4.60mm id 5μm

梯度：以1.0ml/min的在7.5分钟内的10％-90％B

实施例1：GLP-1衍生物的制备

制备以下GLP-1化合物(均为GLP-1(7-37)(SEQ ID NO：3)的类似物的衍生物)：

化合物G1：

N-ε26-((S)-4-羧基-4-十六酰氨基丁酰)[Arg34]GLP-1-(7-37)，其还可被命名为Arg³⁴Lys²⁶(Nε-(γ-谷氨酰基(Nα-十六酰基)))-GLP-1(7-37)-OH

化合物G2：

N-ε37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-({反式-4-[(19-羧基十九酰氨基)-甲基]环己烷羰基}氨基)丁酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][脱氨基His7，Glu22，Arg26，Arg34，Lys37]GLP-1-(7-37)：

化合物G3：

N-ε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰氨基)丁酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][Aib8，Arg34]GLP-1-(7-37)：

化合物G4：

N-ε37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(15-羧基十五酰氨基)丁酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][Aib8，22，35，Lys37]GLP-1-(7-37)

化合物G1如WO 98/08871的实施例37中所述制备。化合物G2如WO 09030771的实施例26中所述制备。化合物G3如WO2006/097537的实施例4中所述制备。

新型化合物G4以WO 09/030771中所述方法的相似方式，利用CEM Liberty肽合成仪制备。

LCMS：m/z＝1046(M/4)

计算值(M)＝4184.8

LCMS在由来自Micromass的Waters Acquity UPLC系统和LCTPremier XE质谱仪组成的装置上进行。HPLC泵连接两个洗脱液储罐，其含有：

A：含0.1％甲酸的水

B：含0.1％甲酸的乙腈。

在室温(RT)下通过注射合适体积的样品(优选2-10μL)至柱上并将柱用A和B的梯度洗脱来进行分析。所用的HPLC的条件、检测器的设置和质谱仪的设置在下表给出：

柱：Waters Acquity UPLC BEH，C-18，1.7μm，2.1mm x 50mm

梯度：在4.0min期间以0.4ml/min的5％-95％乙腈线性梯度

检测：214nm(来自DAD(二极管阵列检测器)的模拟输出)

MS电离模式：API-ES(大气压电离电喷雾)，扫描100-2000amu(原子质量单位)，步长0.1amu

实施例2：FGF21化合物的制备

制备以下FGF21化合物：

化合物F1：

天然的人FGF21(SEQ ID NO：1)，但由于在大肠杆菌中表达而带有N端Met，即Met-FGF21_人。

化合物F2：

将化合物F1的S71C类似物用以下试剂在第71位修饰：

得到化合物S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(19-羧基十九酰氨基)丁酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙基氨甲酰基}甲基)[Cys71]Met-FGF21。

化合物F3：

将化合物F1的K56R，K59R，K69R，K122R类似物用以下试剂在N端的Met残基处修饰：

得到化合物N-α1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰氨基)丁酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][Arg56，Arg59，Arg69，Arg122]-Met-FGF21。

化合物F1、F2和F3如PCT/EP2010/-(参见具体实施例1、3、4、6和7)所述制备，其要求2009年1约23日的EP09151227.7和2009年2月5日的EP 09152144.3的优先权。后者的EP优先权申请的相关实施例正文在以下插入。

人FGF21的DNA序列和氨基酸序列已由例如Nishimura等在Biochim.Biophys.Acta 1492(1)：203-206(2000)公开。所述序列还可来自公开数据库，登录号分别为EMBL：AB021975和UNIPROT：Q9NSA1。

合成具有28个氨基酸的信号肽的天然多肽用于分泌：

1

HP IPDSSPLLQF GGQVRQRYLY

51 TDDAQQTEAH LEIREDGTVG GAADQSPESL LQLKALKPGV IQILGVKTSR

101 FLCQRPDGAL YGSLHFDPEA CSFRELLLED GYNVYQSEAH GLPLHLPGNK

151 SPHRDPAPRG PARFLPLPGL PPALPEPPGI LAPQPPDVGS SDPLSMVGPS

201 QGRSPSYAS

由以上以斜体字示出的信号肽，作为SEQ ID NO：2包含在随附序列表中。由剩余的181个氨基酸组成的成熟FGF21多肽作为SEQID NO：1色含在序列表中。

将成熟的FGF21多肽克隆并作为胞内蛋白表达于大肠杆菌中，其不含信号肽，但带有添加的N-端甲硫氨酸。更具体地，将在3′端包含Met的ATG密码子以及分别在3′端和5′端的Nde1和BamH1限制性酶切位点的550bp编码区，插入至噬菌体T7启动子控制下的表达载体pET 11c的Nde1-BamH1中，并转化至大肠杆菌B BL21(DE3)中。细胞在含100ug/ml amp的LB生长至OD₄₅₀0.5，并用0.3mM的IPTG在37℃下诱导表达4小时。粗细胞提取物通过超声得到用于FGF21表达的分析。

考马斯染色的SDS-PAGE凝胶显示出FGF21的成功表达，其主要鉴定于可溶上清液部分，极少在不溶的沉淀中。尽管由此表达的FGF21(Met-FGF21)(化合物A)的计算MW是19.5kD，但其在凝胶上迁移为25kD的蛋白，这可能是由于高脯氨酸含量，延缓了蛋白质的移动。

将FGF21多肽及其类似物进一步如下纯化：

将含大肠杆菌的pH7.5 10mM磷酸钾缓冲液的浆液(20％重量/体积)超声(冰上3秒开/关间隔持续5分钟)。将多肽通过离心(10000 x g，30分钟)沉淀，并通过在50mM pH 8.0的Tris中超声重新溶解，通过离心(10000 x g，30分钟)移除碎片。所得上清中的多肽通过阴离子交换色谱(50mM Tris pH 8.0，50-250mM NaCl)利用Q Sepharose FastFlow树脂(GE Healthcare)纯化，如Protein Purification.Principles andPractice Series：Springer Advanced Texts in Chemistry Scopes，Robert K.第3次编辑，1994中一般所述。在某些情况下，通过使用用50mM TrispH 8.0和200mM NaCl运行的HiLoad 26/60 Superdex pg 75柱(GEHealthcare)的体积排阻色谱进行进一步的纯化。为了储存，将多肽转移至pH7.9的50mM的碳酸氢铵中，冻干，并保存于-80℃。

含马来酰亚胺的白蛋白结合剂可如下所述来合成，并且包含游离半胱氨酸的FGF21及其类似物可用这类白蛋白结合剂来衍生化，其亦如下所述。

17-((S)-1-羧基-3-{2-[2-({2-[2-({2-[3-(2，5-二氧代-2，5-二氢吡咯-1-基)丙酰基氨基]乙基氨甲酰基}甲氧基)乙氧基]乙基氨甲酰基}甲氧基)乙氧基]乙基氨甲酰基}丙基氨甲酰基)十七烷酸的制备：

步骤1：fmoc-乙二胺2-氯三苯甲基树脂

将5.8g(7.5mmol)2-氯三苯甲基氯树脂(100-200目，1％DVB，上样1.3mmol/g)在DCM(80ml)中溶胀大约1小时，然后将其排干。将Fmoc-乙二胺盐酸盐悬浮于NMP(30ml)和DCM(30ml)和DIPEA(5当量，6.42ml)中。将该悬浮物加入树脂中并振荡3小时。将该树脂排干并用17∶2∶1的DCM∶MeOH∶DIPEA、DCM、NMP和DCM(3×80ml)洗涤。将其在干燥器中在KOH/NaoH上干燥。

步骤2：fmoc-OEG-乙二胺2-氯三苯甲基树脂

将3mmol fmoc-OEG-乙二胺2-氯三苯甲基树脂利用CEMLiberty微波肽合成仪和基于fmoc的固相肽方法修饰。将树脂在NMP(60mL)中溶胀并排干。

将树脂用含5％哌啶的NMP(60ml)FMOC去保护，加热30秒，排干，用NMP(60ml)洗涤，然后另外用含5％哌啶的NMP(60ml)洗涤，在70-75℃下加热3分钟，随后用NMP(60ml)洗涤四次。将含0.3MFmoc-8-氨基-3，6-二氧杂辛酸+0.3M HOAT的NMP(45ml)溶液加入树脂并随后加入含0.75M DIC的NMP(18ml)溶液。将反应加热至70-75℃持续10分钟，之后用NMP(60ml)洗涤四次。

步骤3：fmoc-OEG-OEG-乙二胺2-氯三苯甲基树脂

步骤4：fmoc-γ-Glu-OEG-OEG-乙二胺2-氯三苯甲基树脂

将树脂用含5％哌啶的NMP(60ml)FMOC去保护，加热30秒，排干，用NMP(60ml)洗涤，然后另外用含5％哌啶的NMP(60ml)洗涤，在70-75℃下加热3分钟，随后用NMP(60ml)洗涤四次。将含0.3MFmoc-Glu-OtBu+0.3M HOAT的NMP(45ml)溶液加入树脂并随后加入含0.75M DIC的NMP(18ml)溶液。将反应加热至70-75℃持续10分钟，之后用NMP(60ml)洗涤四次。

步骤5：C18-二酸-γ-Glu-OEG-OEG-乙二胺2-氯三苯甲基树脂

将树脂用含5％哌啶的NMP(60ml)FMOC去保护，加热30秒，排干，用NMP(60ml)洗涤，然后另外用含5％哌啶的NMP(60ml)洗涤，在70-75℃下加热3分钟，随后用NMP(60ml)洗涤四次。将含0.3M十八烷二酸单叔丁酯+0.3M HOAT的NMP(45ml)溶液加入树脂并随后加入含0.75M DIC的NMP(18ml)溶液。将反应加热至70-75℃持续10分钟，之后用NMP(60ml)洗涤四次。

步骤6：17-[(S)-3-(2-{2-[(2-{2-[(2-氨基乙基氨甲酰基)甲氧基]乙氧基}乙基氨甲酰基)甲氧基]乙氧基}乙基氨甲酰基)-1-羧基丙基氨甲酰基]十七烷酸

将树脂用TFA/TIPS/水以95∶2.5∶2.5处理1小时。滤去树脂并将滤液在真空下浓缩。加入乙腈并重新浓缩样品。将粗产物通过HPLC(10-50％乙腈，0.1％TFA，60mL/min，C18，50mmx200mm，)纯化。LCMS2m/z：777(M+1)。

步骤7：17-((S)-1-羧基-3-{2-[2-({2-[2-({2-[3-(2，5-二氧代-2，5-二氢吡咯-1-基)丙酰基氨基]乙基氨甲酰基}甲氧基)乙氧基]乙基氨甲酰基}甲氧基)乙氧基]乙基氨甲酰基}丙基氨甲酰基)十七烷酸

将N-马来酰基-β-丙氨酸(0.65mmol，110mg)溶解在NMP中。加入EDAC(0.65mmol，125mg)和HOBt(0.65mmol，88mg)，将混合物在室温下搅拌1小时。加入含17-[(S)-3-(2-{2-[(2-{2-[(2-氨基乙基氨甲酰基)甲氧基]乙氧基}乙基氨甲酰基)甲氧基]乙氧基}乙基氨甲酰基)-1-羧基丙基氨甲酰基]十七烷酸(0.65mmol，504mg)的NMP(5ml)溶液，将混合物在室温下搅拌16小时。将粗产物通过HPLC(25-65％乙腈，0.1％TFA，60mL/min，C18，50mmx200mm，

)纯化以得到200mg的标题化合物。LCMS2 m/z：927.8(M+1)。

K122C Met-FGF21衍生物S-122-[1-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰氨基)丁酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙基氨甲酰基}乙基)-2，5-二氧代吡咯烷-3-基][Cys122]-Met-FGF21的制备：

将如上所述制备的K122C Met-FGF21类似物(带有K122C和N端M的SEQ ID NO：1)中第122位的Cys残基，用如上所述制备的以下试剂在巯基处修饰：

将[Cys122]-Met-FGF21(冻干的)溶解于20mM pH7.5的Tris缓冲液中并与20mM的Tris缓冲液用PD-10柱(GE Healthcare 170851-01)进行缓冲液交换。向7ml(1.48μmol)的该溶液(4.1mg/ml)中，加入1.5ml含17-((S)-1-羧基-3-{2-[2-({2-[2-({2-[3-(2，5-二氧-2，5-二氢吡咯-1-基)-丙酰基氨基]乙基氨甲酰基}甲氧基)乙氧基]乙基氨甲酰基}甲氧基)乙氧基]乙基氨甲酰基}丙基氨甲酰基)十七烷酸的乙腈/Tris缓冲液(1.3∶1)(2.96μmol)的溶液。允许反应在室温下反应1小时。将反应混合物滤过0.22μm的滤器，并用体积排阻色谱(GE Healthcare，Superdex200，26/60)用20mM pH7.5的Tris缓冲液洗脱，接着用离子交换色谱(Mono-Q 5/50，在60个柱体积内含0-0.5M NaCl的pH7.520mM Tris的梯度)来纯化。通过LCMS和SDS-PAGE分析后，将相关流分合并，并与50mM的NH₄HCO₃进行缓冲液交换并冻干。LCMS1：理论质量＝20442.2，实测值20442.3。

S71C Met-FGF21衍生物S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(19-羧基十九酰氨基)丁酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙基氨甲酰基}甲基)[Cys71]Met-FGF21如下制备：

19-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-碘乙酰氨基)乙基氨甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙基氨甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙基氨甲酰基]丙基氨甲酰基}十九烷酸的制备：

步骤1：19-[(S)-3-(2-{2-[(2-{2-[(2-氨基乙基氨甲酰基)甲氧基}乙氧基}乙基氨甲酰基)甲氧基}乙氧基}乙基氨甲酰基)-1-叔丁氧羰基丙基氨甲酰基]十九烷酸叔丁酯

向含19-{(S)-1-叔丁氧羰基-3-[2-(2-{[2-(2-羧基甲氧基乙氧基)乙基氨甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙基氨甲酰基]丙基氨甲酰基]十九烷酸叔丁酯(500mg)的乙腈(15ml)溶液中加入TSTU(224mg)和DIPEA(0.13ml)。室温搅拌2小时后将该混合物倒入含乙二胺(0.50ml)的乙腈(5ml)溶液中。搅拌2小时后将混合物在真空下浓缩。将残留物在1N NaOH(100ml)和乙酸乙酯(400ml)中搅拌。分离各层。将有机层用硫酸镁干燥并在真空下浓缩得到白色固体。将该固体在乙醇中搅拌接着过滤。浓缩滤液得到浆液。收率：250mg(48％)。LCMS3：理论质量：916.26，实测值：926.7。

步骤2：19-[(S)-1-叔-丁氧基羰基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-碘乙酰氨基)乙基氨甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙基氨甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙基氨甲酰基]丙基氨甲酰基]十九烷酸叔丁酯

向含碘乙酸(60mg)的DCM(8ml)溶液中加入TSTU(90mg)和DIPEA(0.05ml)。室温搅拌60分钟后，加入含19-[(S)-3-(2-{2-[(2-{2-[(2-氨基乙基氨甲酰基)甲氧基}乙氧基}乙基氨甲酰基)甲氧基}乙氧基}乙基氨甲酰基)-1-叔丁氧羰基丙基氨甲酰基]十九烷酸叔丁酯(0.25g)的DCM(8ml)和DIPEA(0.05ml)溶液。搅拌120分钟后，用DCM(100ml)稀释混合物和加入1N HCl(50ml)。分离各层。将有机层用硫酸镁干燥并在真空下浓缩。将残留物与乙醇共浓缩以得到固体化合物。收率：250mg(76％)。LCMS3：理论质量：1084.2，实测值：1084.8

步骤3：19-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-碘乙酰氨基)乙基氨甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙基氨甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙基氨甲酰基]丙基氨甲酰基}十九烷酸

将19-[(S)-1-叔-丁氧基羰基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-碘乙酰氨基)乙基氨甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙基氨甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙基氨甲酰基]丙基氨甲酰基]十九烷酸叔丁酯(225mg)用TFA(10ml)处理90分钟。将混合物在真空下浓缩并与甲苯共浓缩两次。将残留物通过HPLC纯化，HPLC使用A缓冲液：含0.1％TFA的水和B缓冲液：含0.1％TFA的乙腈。梯度：在45分钟内的10-80％B。流速：20ml/min，C18柱30mmx250mm，

收率：45mg(22％)。LCMS3：理论质量：971.98，实测值：972.6。

将一般如上所述制备的S71C Met-FGF21类似物(带有S71C和N端M的SEQ ID NO：1)中第71位的Cys残基，，用以下试剂在巯基处修饰：

将从NH₄HCO₃冷冻干燥的[Cys71]Met-FGF21(7.53mg，385nmol)溶解于3 x350ul 0.02M pH 7.8的Tris中，并通过PD 10柱与0.02M pH7.8的Tris进行缓冲液交换。收集约3.5ml。将如上所述制备的19-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-碘乙酰氨基)乙基氨甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙基氨甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙基氨甲酰基]丙基氨甲酰基}十九烷酸(1.5mg)，溶解于0.02M pH7.8的Tris缓冲液/乙腈1∶1(0.75ml)中。向[Cys71]Met-FGF21的溶液中加入碘乙酰胺(0.561ml，3当量)。乙腈浓度为7％。将混合物在室温下静置70小时。将混合物在Amicon Ultra-4离心装置MWCO 10000中在4000g下超滤10分钟。用约4ml的A缓冲液重复再超滤4次以移除试剂。将样品通过阴离子交换纯化，所述阴离子交换在monoQ 5/50GL柱上，用A缓冲液：pH 7.8的20mM TRIS；B缓冲液：pH7.8的20mM TRIS、50ml NaCl，流动0.5ml和在60CV内的0-100％B的梯度来进行。合并含产物的已分离的流分并在Amicon Ultra-4离心装置MWCO10000以6000rpm超速离心2×10分钟来浓缩。

用PD 10(GE 179851-01)柱进行与50mM NH₄HCO₃的缓冲液交换。收集约4.0ml洗脱液。将其通过Millex GV无菌0.22um滤器过滤并冷冻干燥。收率：2.18mg。LCMS1：理论质量：20400.2，实测值：20400.13。

如下制备K56R，K59R，K69R，K122R Met-FGF21衍生物N-α1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰氨基)丁酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][Arg56，Arg59，Arg69，Arg122]-Met-FGF21：

将通常如上所述制备的K56R，K59R，K69R，K122R Met-FGF21类似物(带有K56R，K59R，K69R，K122R和N端M的SEQ ID NO：1)中的N端Met残基，用以下试剂在α氨基处修饰：

将[Arg56，Arg59，Arg69，Arg122]-Met-FGF21(冻干的)溶解于DPBS缓冲液中并用PD-10柱(GE Healthcare 170851-01)与DPBS缓冲液进行缓冲液交换，得到3.5ml(4.3mg/ml，0.77μmol)。将样品用DPBS缓冲液(10.5ml)稀释，加入含通常如上所述制备的17-((S)-1-羧基-3-{2-[2-({2-[2-(2，5-二氧代吡咯烷-1-基氧基羰基甲氧基)乙氧基]乙基氨甲酰基}甲氧基)乙氧基]乙基氨甲酰基}丙基氨甲酰基)十七烷酸(6.2μmol)的乙腈溶液(7.5ml)。室温下达1小时后，将混合物冷却至0℃并加入冷的0.2M NaOH(21ml)。在0℃下达30分钟后将混合物用盐酸中和。将混合物用Amicon Centriprep ultracel YM10离心式滤器(10000MWCO)浓缩，接着用5ml 20mM Tris缓冲液，pH 7.5稀释并再次浓缩两次(终体积约为5ml)。将溶液混合物滤过0.22μm的滤器并用离子交换色谱纯化并如上所述冻干。LCMS1：理论质量＝20368.1，实测值20367.2。

实施例3：葡萄糖刺激的胰岛素释放的离体修复

本离体实施例调查了糖尿病db/db小鼠的胰岛因响应用FGF21和GLP-1化合物的处理而恢复因响应葡萄糖刺激而释放胰岛素的能力的能力。

依照以下程序分离25只15周龄的db/db小鼠(Charles River)的胰岛：

将动物通过颈脱位法处死并用针固定在聚苯乙烯泡沫塑料板上。移出胰腺并转移至含5ml胶原酶(Life Science，II级，目录号100502)(300单位/ml(一个胰腺/小瓶))的Packard小瓶中，将该小瓶置于冰上直至所有胰腺移除。然后将胰腺在37℃下在Grant/EdmundS25恒温振荡器(thermoshaker)中以200冲程/分振荡5分钟。将组织转移至含5ml 150单位/ml胶原酶(上清已弃)的新鲜小瓶中并在恒温振荡器中再次振荡5分钟。将组织在恒温振荡器上再振荡3-5分，之后所有的振荡每次通过手摇晃5-10秒完成。重复这些步骤直至所有组织被消化。在立体显微镜下持续跟踪该过程，一旦消化则合并组织并收集于逐渐减少的管中。将所有上清在HBSS+0.5％NCS(将来自Gibco目录号14060的HBSS(10x)在使用前用水稀释10x；新生牛血清(NCS)，来自Gibco目录号26010-066)中洗涤三次，允许沉淀5分钟。在每次洗涤之间于冰上静置，之后胰岛已对挑选准备好。如下纯化胰岛：通过转移少许上清至培养皿中，用HBSS+NCS充满随后用压缩移液管转移(通过口移液)至新培养皿中。自此再次挑选胰岛直至纯的，接着在37℃下，在RPMI 1640培养基(Gibco，目录号61870-010)+10％NCS中温育。

分离后的当天，将所有动物的胰岛混合并分为三部分并分别与50nM FGF21化合物(化合物F1)、100nM GLP-1化合物(化合物G3)和缓冲液(对照)温育48小时。温育后，将胰岛用Krebs Ringer缓冲液(115mM NaCl，4.7mM KCl，2.6mM CaCl₂，1.2mM KH₂PO₄，1.2mMMgSO₄，10mM HEPES，0.2％BSA，2mM谷氨酰胺，5mM NaHCO₃，pH 7.4)洗涤，随后用于胰岛灌流(perifusion)实验(来自Brandel的Suprafusion 2500)。对于三种预温育条件的每一种，使用各自有60个胰岛的四个灌流柱。将胰岛置于柱中的Bio-gel P2(Bio-Rad.目录号150-4114)的中，其中凝胶上下带有尼龙网。将胰岛开始用含3mM葡萄糖的Krebs Ringer溶液灌流40分钟以得到胰岛素释放的稳定基线。40分钟后将缓冲液换成15mM葡萄糖持续30分钟(时间为40-70分钟)。接着将缓冲液换成含10μM毛喉素(Tocris 1099，批次3A/86008)的15mM葡萄糖持续40分钟(时间70-110分针)。最后将缓冲液换成低葡萄糖(3mM)持续30分钟(时间110-140分钟)。将缓冲液设置为以0.3ml/分钟的速率流过灌流系统。在30-140分钟的时间内每隔5分钟采集样品。将样品储存于-20℃，随后基本如Poulsen等.载于Journal ofBiomolecular Screening 12(X)；第1-8页，2007(LOCI(LuminescentOxygen Channelling Immunoassay)夹心免疫测定法)所述分析胰岛素。

结果(ng/ml胰岛素)于下表1中显示为平均值+/-平均值的标准差(SEM)。对照和FGF21化合物的数据基于三次重复(由于这两次试验中四个柱之一有问题)，而GLP-1化合物的数据基于四次重复。

表1

还计算了相应的曲线下面积(命名为AUC)数据，对于统计则使用斯氏T-检验。对于时间＝35-75分钟(对葡萄糖增加的应答)和时间＝75-140分钟(毛喉素应答)的时间间隔的AUC结果分别在表2和表3中示出。

表2：对于时间35-75分钟的AUC(葡萄糖应答)

FGF21的AUC结果显著高于对照(p＝0.0057，对应于两个星号(**))，并且这也是与对照相比的GLP-1 AUC结果的情况(p＝0.0010，也对应于两个星号(**))。

表3：对于时间75-140分钟的AUC(毛喉素应答)

这意指FGF21的AUC结果可高于对照(p＝0.067表明趋势，但无显著性)。这并不出现在GLP-1 AUC结果(p＝0.28)的情况中。但是，FGF21的AUC结果显著高于GLP-1的AUC结果(p＝0.02)，对应于表3中所用的一个星号(*)。

总而言之，FGF21化合物和GLP-1化合物能够离体恢复db/db小鼠胰岛的葡萄糖刺激的胰岛素释放(表2的结果)。这是首次表明这些化合物在治疗2型糖尿病中的潜在用处和对胰岛的直接积极作用。

接着转向毛喉素的结果，毛喉素为腺苷酸环化酶激活剂，其用于升高环状AMP(cAMP)的水平。cAMP是细胞对激素和其他胞外信号的合适生物学应答所必需的重要信号载体。它对于下丘脑/脑垂体腺轴的细胞联系和激素的反馈控制所必需。它通过激活蛋白激酶A来发挥作用。

此外，熟知的是肠促胰岛素样GLP-1的作用之一实际上是产生cAMP。

表3的结果(显示与FGF-21温育的胰岛对毛喉素的应答明显好于与GLP-1温育的胰岛)，因此可被采用作为FGF-21和GLP-1组合的潜在协同效应的指示(与GLP-1提供的cAMP形成作用相比，FGF-21对胰岛素的释放提供了额外的作用)。

实施例4：离体保护β细胞免受凋亡

本离体实施例调查了FGF21和GLP-1化合物对大鼠胰岛素瘤β细胞(INS-1)的FFA(游离脂肪酸)诱导性凋亡的影响。

化合物F1(Prospec，目录号CYT-474)用作FGF21化合物，化合物G1用作GLP-1化合物。

将INS-1细胞接种于96孔板(50000个细胞/孔)中并于细胞培养基(RPMI 1640培养基(Gibco，目录号61870-010))中温育过夜，该培养基补充有10％FCS(Gibco，目录号10085-140)、1％Pen/Strep(Gibco，目录号15140-114)和0.5ml β-巯基乙醇(Gibco，目录号31350-010(50mM))。将FGF21化合物(50nM)和GLP-1化合物(50nM)在将细胞暴露于FFA前1小时加入细胞中。FFA如下制备：将含1M棕榈酸(Sigma P5585)和1M油酸(Sigma O1383)的DMSO储存溶液以1∶2混合并加热至60摄氏度。接着将FFA混合物用0.1M NaOH稀释10倍。然后将该混合物于细胞培养基中进一步稀释以得到1mM的FFA浓度。接着将FFA以终浓度为0.35mM加入细胞中。将细胞温育48小时并接着进行以下三个测定：1)利用来自Promega的CellTiter 96

Non-radioactive Cell Proliferation Assay(MTT)依照生产商说明书进行评价细胞的生存力(550nm处的吸光度，A550)；2)利用来自Promega的Apo-ONE

Homogeneous Caspase-3/7 Assay依照生产商说明书进行评价凋亡情况(荧光)；和3)分析与FFA温育48小时期间培养基中累积的胰岛素(如实施例3所述；ng/ml胰岛素)。

1)、2)和3)的结果分别在下面的表4、表5和表6中示出，所有数据为平均值+/-平均值的标准差(SEM)。所有实验设置四次重复，但一些由于实验错误仅进行三次就结束(即对于生存力，0.35mMFFA：GLP-1；对于凋亡，0.35mM FFA：对照和FGF21，0.00mM FFA：GLP-1；和对于累积的胰岛素，0.35mM FFA：对照、FGF21和GLP-1，0.00mM FFA：对照)。

表4：细胞生存力(MTT测定，A550)

表4显示出在不存在游离的脂肪酸下细胞的生存力在四种处理之间并无显著差别(FFA＝0.00mM)。另一方面，与对照相比，细胞的生存力在存在游离的脂肪酸(FFA＝0.35mM)下被每一种单独的GLP-1和FGF21以及其组合显著增强(分别地，p＝0.0014、0.0031和0.0057，各自对应于两个星号的显著水平(**，斯氏t-检验))。

另外，有趣的是，与每一种单独的GLP-1和FGF21相比，在组合实验中的细胞生存力显著提高(分别地，p＝0.042和0.016，各自对应于一个星号的显著水平(*，斯氏t-检验))。因此，FGF21和GLP-1化合物的组合在保护β细胞(INS-1)免受游离脂肪酸诱导的凋亡(测定为MTT测定中的细胞生存力)，方面好于每一种单独的化合物。

表5：凋亡(胱天蛋白酶3/7测定，荧光)

胱天蛋白酶或半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶家族，其在凋亡(程序性细胞死亡)中发挥关键作用。因此胱天蛋白酶活性的升高指示凋亡增加。

表5的结果显示出在不存在游离的脂肪酸(FFA＝0.00mM)下，在四个处理组的每一个之中胱天蛋白酶水平是相同的。另一方面存在游离的脂肪酸(FFA＝0.35mM)导致全部四组中胱天蛋白酶活性的增加。然而，FGF21组中的胱天蛋白酶活性显著低于对照组(p＝0.002，对应于两个星号的显著水平(**，斯氏t-检验)，并且与GLP-1组相比也显著较低(p＝0.049，对应于一个星号的显著水平(*，斯氏t-检验))。

此外，接受组合处理的组中的胱天蛋白酶活性显著低于GLP-1组(p＝0.0059，对应于两个星号的显著水平(**，斯氏t-检验))。此外，与对照相比，组合差异显著(两个星号，**，p＝0.002，斯氏t-检验)。最后，尽管在组合处理对比单独的FGF21(p＝0.09，斯氏t-检验)方面，这些结果并不允许有效结论，但在此也可有降低的趋势。

因此，GLP-1和FGF21化合物的组合好于单独的GLP-1化合物和对照，降低少胱天蛋白酶3/7活性，因此也减少凋亡。

表6：胰岛素(ng/ml)

表6显示出在不存在游离的脂肪酸(FFA＝0.00mM)下，与对照相比，单独的GLP-1化合物及组合相导致胰岛素分泌的显著增加(分别地，p＝0.009，对应于两个星号(**)；p＝0.0009，对应于三个星号(***))。对单独的FGF21观察到的数值增加并不显著(p＝0.08，并不显著(ns))。

仍然在不存在游离的脂肪酸下，接受组合的组中的胰岛素水平显著高于单独的FGF21(p＝0.002，对应于两个星号(**))，但仅在数值上高于单独的GLP-1(p＝0.08，ns)。

在存在游离的脂肪酸(FFA＝0.35mM)下，与对照相比，GLP-1化合物、FGF21化合物及其组合导致胰岛素分泌的显著增加(分别地，p＝0.0005，对应于三个星号(***)；p＝0.007，对应于两个星号(**)；和p＝0.0016，对应于两个星号(**))。

仍然在存在游离的脂肪酸(FFA＝0.35mM)下，接受组合处理的组中的胰岛素水平显著高于单独的FGF21(p＝0.0046，对应于两个星号(**))，但仅在数值上高于单独的GLP-1(p＝0.30，ns)。

这些结果反映了在48小时内累积的胰岛素。不希望受任何理论所限制，为何在存在游离的脂肪酸下累积的胰岛素更多的原因可能是1)由于存在化合物(FGF21和GLP-1)更多的细胞存活并因此能够释放胰岛素；和/或2)化合物可刺激单独的细胞释放更多的胰岛素。对于GLP-1，理由1)和理由2)有助于该作用。对于FGF21，至少理由1)有助于该作用，参见表4和表5的MTT结果和胱天蛋白酶结果。在不存在游离的脂肪酸下的FGF21结果确认了该化合物并不刺激胰岛素的释放。然而这样的作用在存在游离的脂肪酸下可见，这可能是由于FGF21增强细胞生存力的能力，即理由1)，同样不希望受该理论所限制。

总而言之，这些结果确认了由于存在FGF21化合物和GLP-1化合物，在存在游离脂肪酸下存活的细胞是有功能的。

实施例5：在db/db小鼠的体内急性研究中对血糖的作用

本急性体内研究调查了FGF21化合物和GLP-1化合物对db/db小鼠的血糖水平的作用。

db/db小鼠是2型糖尿病的高血糖、高胰岛素、摄食过度和肥胖的模型。

利用以下的研究设计：

23只db/db小鼠(雄性，C57BLKS db/db，来自Taconic，Denmark，15-16周龄)。

每日皮下给予1×0.125mg/kg人FGF21(n＝11)(化合物F1)或溶媒(n＝12)，持续3天。溶媒为无菌的PBS缓冲液(DPBS，Gibco，目录号14190)。

接着，将两组动物以1nmol/kg给予溶媒或GLP-1化合物G4(n＝5-6)。所述G4化合物为GLP-1类似物，其由于用白蛋白结合剂衍生化而具有延长的半衰期。在最后的FGF21或溶媒剂量后一小时皮下给予GLP-1或溶媒剂量。

从尾尖采集10μl血样，用于测量GLP-1化合物给药后0-48小时的血糖。

利用溶媒组、GLP-1组、FGF21组和组合组的葡萄糖下面积(AUC)分析结果。

下表7显示了4个不同组的AUC_0-48小时。

表7：降葡萄糖能力(AUC)

**)p＝0.0022(斯氏t-检验，对比“预期的”)

检测相互作用的双向ANOVA：p＝0.40

右列显示了若存在两种化合物的叠加效应时的预期AUC。使用下式计算预期AUC：

AUC_溶媒-((AUC_溶媒-AUC_FGF21)+(AUC_溶媒-AUC_GLP-1))。

由于该预期AUC显著高于对组合观察到的作用，所以推断两种化合物之间存在协同效应。然而，利用双向ANOVA检测相互作用未得到显著结果。该可能由于相对小的样本大小。

因此，在降血糖方面，用FGF21化合物每日处理一次，持续三天，随后GLP-1化合物的一个剂量导致意料之外的额外作用。

实施例6：在db/db小鼠的体内亚慢性研究中对血糖的作用

本亚慢性体内给药研究调查了GLP-1化合物和FGF21化合物对血糖的作用。该研究在db/db小鼠中进行(如实施例5中所述)。

研究的设计为：

48只db/db小鼠，雄性，研究开始时11-12周龄。

每日皮下给予以下之一2×：(i)0.5mg/kg的人FGF21(化合物F1；n＝12)；(ii)30nmol/kg的GLP-1化合物G1(n＝12)；(iii)0.5mg/kg的化合物F1和30nmol/kg的化合物G1的组合(n＝12)；或(iv)溶媒(无菌的PBS缓冲液，n＝12)。

所有组给药21天。

每周从尾尖采集10μl血样一次用于血糖的测量。

下表8显示了在第0、7、14和21天测量的亚慢性给药研究期间的血糖值(mmol/l)。

表8：葡萄糖(mmol/l)

第7、14和21天检测FGF21化合物和GLP-1化合物的作用之间的相互作用的双向ANOVA，显示无显著的相互作用。

检测FGF21化合物、GLP-1化合物及组合分别对比溶媒的作用的单向ANOVA，显示两种化合物在除仅FGF21化合物的第7天之外的所有时间点有显著的作用。

对比单独FGF21化合物和含GLP-1化合物的其组合的单向ANOVA，在第7、14和21天显示该组合有显著更好的作用(p＝0.0001，所有天数)。对比单独GLP-1化合物和含FGF21化合物的其组合也在第7天(p＝0.01)、第14天(p＝0.001)和第21天(p＝0.0001)显示该组合有显著更好的作用。

因此，用FGF21化合物和GLP-1化合物的组合处理与用每一种化合物单独处理相比在血糖方面提供统计学上显著的改进。

实施例7：GLP-1活性测定-表达克隆的人GLP-1受体的细胞系中cAMP形成的刺激

以下测定可用于确定GLP-1化合物的活性(效价)。简而言之，检测GLP-1化合物在含人GLP-1受体的培养基中刺激环状AMP(cAMP)形成的能力。

大体上，将从表达人GLP-1受体的稳定转染的细胞系BHK467-12A(tk-ts13)中纯化的质膜用讨论中的GLP-1化合物刺激，cAMP产生的效价用来自Perkin Elmer Life Sciences的AlphaScreen^TM cAMP测定试剂盒检测。

使细胞于5％CO₂下生长于含5％FCS、1％Pen/Strep(青霉素/链霉素)和0.5mg/ml的选择标记G418的DMEM中。

将约80％汇合的细胞用PBS(磷酸缓冲盐水)洗涤两次并用Versene(乙二胺四乙酸的四钠盐水溶液)收获，在1000rpm下离心5分钟并去除上清。其他步骤均在冰上进行。将细胞沉淀通过Ultrathurax匀浆，在10ml缓冲液1(20mM Na-HEPES、10mMEDTA、pH＝7.4)中混合20-30秒，以20000rpm离心15分钟并在10ml缓冲液2(20mM Na-HEPES、0.1mM EDTA、pH＝7.4)中重新悬浮。将悬浮液匀浆20-30秒并以20000rpm离心15分钟。重复进行在缓冲液2中的悬浮、匀浆和离心一次，将膜重新悬浮于缓冲液2中准备用于进一步分析或储存于-80℃。

功能性受体测定通过用AlphaScreen技术测量肽诱导的cAMP产生来进行。AlphaScreen技术的基本原理是内源cAMP和外源添加的生物素-cAMP之间的竞争。cAMP的捕获通过使用与受体珠粒缀合的特异性抗体来实现。在AlphaFusion Microplate Analyzer上计算并测量形成的cAMP。例如使用Graph-Pad Prism软件(第5版)计算EC₅₀值。

EC₅₀值可相对于例如化合物G1的EC₅₀表示。化合物G2和G3的EC₅₀值分别为化合物G1的EC₅₀值的约5倍和3倍，而SEQ ID NO4的化合物的EC₅₀值为化合物G1的约0.3倍。

实施例8：FGF21活性测定-3T3-L1脂肪细胞中的葡萄糖摄取

以下测定可用于确定FGF21化合物的生物活性或效价。

将小鼠3T3-L1成纤维细胞(例如可来自ATCC，目录号CL-173)保持在含10％胎牛血清(FBS)和青霉素/链霉素)的基础培养基(DMEM(4500mg/l葡萄糖)中。该细胞不允许达到汇合并且应该在达到约60％汇合(通过视觉观察)前传代(转移至新的小管中)。

对于葡萄糖摄取测定，将细胞在24孔板中以80000个细胞/孔铺板，或者在96孔板中以20000细胞/孔铺板，并且当其达到汇合(高密度，观察到具有分化的脂肪细胞形成)时，将培养基从基础培养基换成含曲格列酮、IBMX、地塞米松(市购自例如Sigma)和人胰岛素(市购自例如Novo Nordisk A/S)的基础培养基。

在分化开始后7-14天、优选7-10天使用细胞。将细胞用渐增浓度(0-300nM)的FGF21化合物在基础培养基中刺激20小时。在加入3H-脱氧葡萄糖(在以下：示踪剂)前，将细胞在温暖(约37℃)的测定缓冲液(含1mM MgCl₂和2mM CaCl₂的PBS)、HEPES和0.1％的人血清白蛋白)中洗涤，然后将细胞与示踪剂温育1小时。该温育通过在冰冷的测定缓冲液中洗涤两次终止。将细胞用Triton X-100裂解并将裂解液转移至96孔板中，加入microscint-40(市购自例如PerkinElmer)并在TOP-counter(例如Perkin Elmer的Packard top-counter)中计算示踪剂的量。

计算讨论中的FGF21化合物的EC₅₀，并且可相对于例如化合物F1的EC₅₀表示。化合物F2和F3的EC₅₀相对于化合物F1的EC₅₀分别为11％和30％。

Claims

2.权利要求1的用途，其中所述GLP-1化合物包含SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4的氨基酸序列，或者为具有最多15个氨基酸取代、缺失和/或添加的SEQ ID NO：3或4的类似物。

3.权利要求1-2中任一项的用途，其中所述GLP-1化合物为包含白蛋白结合部分的GLP-1衍生物。

4.权利要求3的用途，其中所述白蛋白结合部分包含至少一个、优选至少两个、更优选两个游离的羧酸基团或者其药学上可接受的盐。

5.权利要求3-4中任一项的用途，其中所述白蛋白结合部分包含酰基，例如脂肪酸或二羧酸的酰基，例如十六酰-和15-羧基-十五酰-，所述酰基优选包含总计12-24个碳原子，例如C12、C14、C16、C18、C20、C22或C24，最优选C16、C18或C20；或者其药学上可接受的盐。

6.权利要求5的用途，其中所述酰基与GLP-1肽的赖氨酸残基的ε氨基经由接头连接，其中所述接头优选包含至少一个OEG基团(OEG为8-氨基-3，6-二氧杂辛酸)、至少一个Trx基团(Trx为氨甲环酸，或者反式-4-(氨甲基)环己烷甲酸)：

和/或至少一个Glu(谷氨酰胺)基团。

7.权利要求1-6中任一项的用途，其中所述GLP-1化合物选自以下化合物及其药学上可接受的盐、酰胺、链烃基化合物或酯：

N-ε26-((S)-4-羧基-4-十六酰氨基丁酰)[Arg34]GLP-1-(7-37)：

(化合物G1)；

(化合物G2)；

(化合物G3)；

(化合物G4)。

8.权利要求1-7中任一项的用途，其中所述FGF21化合物包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列，或者为其具有最多30个氨基酸取代、缺失和/或添加的类似物。

9.权利要求1-40中任一项的用途，其中所述FGF21化合物为包含白蛋白结合部分的FGF21衍生物。

10.权利要求9的用途，其中所述白蛋白结合部分包含至少一个、优选至少两个、更优选两个游离的羧酸基团或者其药学上可接受的盐。

11.权利要求9-10中任一项的用途，其中所述白蛋白结合部分包含酰基，例如脂肪酸或二羧酸的酰基，例如17-羧基-十七酰-和19-羧基十九酰-，所述酰基优选包含总计12-24个碳原子，例如C12、C14、C16、C18、C20、C22或C24，最优选C18或C20；或者其药学上可接受的盐。

12.权利要求11的用途，其中所述酰基与FGF21肽的N端氨基酸残基的氨基例如与-1M的氨基经由接头连接，或与FGF21肽的内部半胱氨酸残基的巯基例如与71C的巯基经由接头连接，其中所述接头优选包含至少一个OEG基团(OEG为8-氨基-3，6-二氧杂辛酸)和/或至少一个Glu(谷氨酰胺)基团。

13.权利要求1-12中任一项的用途，其中所述FGF21化合物选自以下化合物及其药学上可接受的盐、酰胺、链烃基化合物或酯：

具有SEQ ID NO：1的多肽(人FGF21)；

S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(19-羧基十九酰氨基)丁酰氨基]-乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙基氨甲酰基}甲基)[Cys71]Met-FGF21(化合物F2)；和

N-α1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰氨基)丁酰氨基]-乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][Arg56，Arg59，Arg69，Arg122]-Met-FGF21(化合物F3)。

14.权利要求1-13中任一项的用途，其中所述化合物同时和/或序贯给予。

15.一种用于治疗2型糖尿病的FGF21化合物和GLP-1化合物的组合。