KR102005294B1 - 엑세나타이드 수식물 및 그 용도 - Google Patents

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Abstract

친수성 연결암을 통해 엑세나타이드와 말단에 카르복실기를 가지는 지방사슬을 연결한 엑세나타이드 수식물 및 GLP-1 수용체 작용제로서의 약물 제조 용도, GLP-1 수용체 활성 저하에 관련된 질병 및/또는 증상의 예방 및/또는 치료에 사용되는 약물 제조 용도, 당대사 관련 질병 및/또는 증상에 사용되는 약물 제조 용도, 당뇨병에 사용되는 약물 제조 용도, 지방간에 사용되는 약물 제조 용도, 및 다이어트에 사용되는 약물 제조 용도에 관한 것이다.

Description

엑세나타이드 수식물 및 그 용도
본 발명은 치료성 펩타이드 분야에 관한 것이고, 구체적으로 엑세나타이드 수식물, 제조 방법, 이를 함유한 약물 조성물, 및 그 수식물 및 조성물이 당대사 관련 질병의 치료에서의 용도에 관한 것이다.
엑세나타이드(Exenatide, 또는 Exendin-4, 상품명: Byetta)는 39개의 아미노산으로 조성된 폴리펩티드이고 그 분자량은 4186.6이며, 분자식은 C184H282N50O60S이고, 아미노산 서열은 : His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2이며, Amylin Pharmaceuticals와 Eli Lilly회사 (Eli Lillyand Company)에 의해 생산 판매되고 있다. 엑세나타이드는 2005년 4월에 FDA의 비준을 받아 출시되었고, 피하주사제제에 속하며, 포도당에 의존하는 인슐린 분비를 촉진하고, 제1 위상 인슐린 분비를 회복하고, 글루카곤의 분비를 억제하며, 위 내용물의 고갈을 늦추며, 췌장 β세포의 기능을 개선하는 등 작용을 가지며, II형 당뇨병 치료에 매우 적합하고 예를 들어, 메트포르민 및 술포닐 요소류 약물 치료에 이상적이지 못한 II형 당뇨병 환자의 혈당을 개선 조절하는데 사용된다.
엑세나타이드는 미국 서남부의 일부 주에서 성장하는 힐러몬스터 (Gilamonster) 타액 중의 호르몬exendin-4의 합성 형식 (J.Biol.Chem.1990,265,20259-20262;J.Biol.Chem.1992,267,7402-7405)이고, 글루카곤 유사 펩티드-1(GLP-1)의 유사물이며, 그 아미노산 서열과 GLP-1의 아미노산 서열은 부분적으로 겹치며, 비교적 효과적인 GLP-1 수용체 작용제이고, 엑세나타이드는 GLP-1의 포도당 조절 작용과 유사하기에 인크레틴 수용체 작용제로도 불리운다. 술포닐 요소 및 메글리티나이드계(meglitinides)와 달리, 엑세나타이드는 포도당의 존재 하에서만 인슐린의 합성 및 분비를 제고시키고, 저혈당의 위험을 감소시켰다. 일부 의사들는 Byetta를 인슐린 저항성의 치료에 사용한다.
그럼에도 불구하고, 단백질/폴리펩티드계 약물은 보편적으로 체내 반감기가 비교적 짧고, 물리적, 화학적 안정성이 떨어져 체내 각종 단백질 분해 효소에 의해 쉽게 분해되는 등 특성을 가지기에 이러한 약물은 보통 하루에 여러번 주사하여야 하기에 환자에게 많은 고통과 여러가지 불편함을 초래하였다. 1970년대에 출시된 페길화 기술은 현재 단백질/폴리펩티드계 약물 분야에 적용되는 기술으로 불리웠다. 그러나 단순 PEG 수식 후 약물을 사용할 경우 활성이 보편적으로 떨어진다.
일련의 다른 방법들은 이미 GLP-1 유사물 구조의 수식에 사용되어 체내에서의 더욱 긴 작용 유지 시간을 제공하도록 하였다. CN1384755에서는 신규 exendin수용체 작용제 제제 및 그 투여방법을 공개하였는데 그 중, 엑세나타이드의 화합물 구조 및 그 제조방법을 공개하였다. CN102532303에서는 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 잔기와 엑세나타이드 분자 중 리신 잔기의 아미노기 또는 N말단 히스티딘 잔기의 아미노기 접합을 사용하여 폴리에틸렌 글리콜 접합의 엑세나타이드를 합성하는 방법을 공개하였고, CN101980725에서는 지방산-PEG-엑세나타이드의 구조를 공개하였고, PEG의 수식 위치가 N단His상에 위치하며, WO2005028516와 WO2012035139에서도 지방산-PEG-엑세나타이드의 구조를 공개하였다. 중국 특허CN101215324에서는 엑세나타이드 구조 개질 후 얻은 엑세나타이드 짧은 펩티드 펩타이드 유사체를 공개하였다. 중국 특허CN101125207 에서는 Exendin-4에 대한 PEG 수식에 대해 보도하였다. WO99/43708 에서는 C-단 아미노산 잔기에 연결된 친유성 치환물을 구비한 GLP-1(7-35) 및 GLP-1(7-36) 유도체를 공개하였다. WO2013059323A1에서는 PEG 접합의 엑세나타이드 및 제조 방법을 공개하였다.
CN102397558에서는 Exendin-4중의 일부 아미노산을 시스테인으로 치환한 후 PEG 또는 말단이 메틸기에 치환된 PEG수식을 공개하였다. CN102421796에서는 하나 또는 복수의 폴리에틸렌 글리콜이 Exendin 변이체의 시스테인에 중합된 것을 공개하고, 엑세나타이드 중의 하나의 아미노산이 시스테인에 인해 치환되는 것을 공개하였다. 그 후 시스테인 상에서 폴리에틸렌 글리콜로 수식한다. CN102827270에서는 Exendin-4-Cys-PEG유도체를 공개하였는데 구체적으로는 엑세나타이드 분자의 비활성구역 C단에 하나의 시스테인을 유입하고, 말레이미드 폴리에틸렌 글리콜을 커플링하며, 그중 폴리에틸렌 글리콜 말단은 메틸기로 봉쇄한다.
이러한 여러 방면의 노력을 했음에도 불가하고, 현재기존 Exendin-4 또는 그 변이체 및 각종 수식 형식에는 여전히 일부 결함이 존재하고, 체내 사용시 약물 투여 빈도가 비교적 높고, 환자에게 신체적, 심리적 및 경제적 방면에서 비교적 큰 부담을 가져다주며, 환자의 약물 순응도를 제한하여 광범위하게 응용될 수 없다. 당뇨병 집단은 여전히 지속성 활성 GLP-1유사물에 대해 거대한 수요를 가지고 있으며, 새로운 엑세나타이드 유도체의 개발하여 체내에서의 작용시간이 길고, 안정성이 우수하며, 혈당강하 효과가 좋은 동시에 독성이 적고 비교적 탁월한 활성을 유지하도록 할 것을 필요로 한다.
본 발명이 해결하고자 하는 기술과제는 기존 공개된 엑세나타이드 수식물 GLP-1 수용체 결합력이 낮고 저혈당 유지 시간이 짧아 임상 사용효과가 떨어지고 빈번히 주사하여야 하는 결점을 극복하는데 있다.
본 기술분야의 당업자는 폴리머를 접합한 생물활성분자 중 접합기 분자량의 증가에 따라, 접합 생물분자의 생물활성은 지수적으로 점차 저하된는 것을 알고 있다. 본 기술분야의 당업자는 상기 폴리머의 분자량이 증가함에 따라 해당 접합물 분자의 생물 반감기 및/또는 혈장 반감기 및 기능적 약물의 노출이 점차 연장되거나 증가되는 것도 알고 있다.
본 발명 기술인원들은 뜻밖에 본 발명의 기술인원이 엑세나타이드에 대한 수직을 거쳐 약물 동력학 성질을 개선하였을 뿐만아니라 저혈당 유지 시간을 연장시킨다는 것을 발견하였다. 또한 엑세나타이드에 비해, 본 발명의 분자는 여전히 대부분이 GLP-1 수용체 작용제 활성을 유지하고 있었는데, 이는 본 발명의 분자는 GLP-1 수용체 작용제 활성이 비교적 높을 뿐만아니라, 저혈당 유지 시간이 길고, 미래의 임상에서 체내 작용시간이 길며, 안정성이 우수하고, 혈당 저하 효과도 우수할 수 있는 약물 임을 의미한다.
본 발명의 한 방면에 따르면, 엑세나타이드 수식물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에 있어서, 식(Ⅰ)로 나타내고,
(Ex-4)-L-Y (Ⅰ)
여기서, Ex-4는 Exendin-4이고, L은 친수성 연결암이며, Ex-4와 Y를 연결하며, Y는 말단에 카르복실기를 가지는 지방사슬인 엑세나타이드 수식물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공하였다.
또한, 본 발명은
Figure 112018018183958-pct00001
이고, 여기서, L’는 친수성 연결암이고 바람직하게는 에테르기를 함유한 친수성 사슬인 엑세나타이드 수식물을 제공하였다.
추가로, 본 발명의 엑세나타이드 수식물 (Ex-4)-L-Y중, 친수성 연결암 L은
Figure 112018018183958-pct00002
Figure 112018018183958-pct00003
에서 선택되며,
여기서, m은 2-20사이의 임이의 정수이고, n은 2-20사이의 임이의 정수이며, r은 1-6사이의 임이의 정수이다.
추가로, 본 발명은
Figure 112018018183958-pct00004
이고,
여기서, L’는 에테르기를 함유한 친수성 사슬이고, k는 6-20사이의 임이의 정수인 엑세나타이드 수식물을 제공하였다. 구체적 구조는 아래와 같다.
Figure 112018018183958-pct00005
본 발명은 이러한 엑세나타이드 수식물이 바람직하며,
Figure 112018018183958-pct00006
Figure 112018018183958-pct00007
여기서, m은 2-20사이의 임이의 정수이고, n은 2-20사이의 임이의 정수이며, r은 1-6사이의 임이의 정수이며, k는 6-20사이의 임이의 정수이다.
더욱 구체적으로 본 발명은 아래의 엑세나타이드 수식물을 제공한다.
시리즈1 : 실시예1-5를 참조
Figure 112018018183958-pct00008
화합물 화합물1 화합물2 화합물3 화합물4 화합물5
m 5 2 20 14 10
k 16 20 6 10 14
시리즈2 : 실시예6-10을 참조
Figure 112018018183958-pct00009
화합물 화합물6 화합물7 화합물8 화합물9 화합물10
m 5 2 20 10 11
n 3 7 2 20 15
k 16 20 12 6 10
시리즈3 : 실시예11-15를 참조
Figure 112018018183958-pct00010
화합물 화합물11 화합물12 화합물13 화합물14 화합물15
m 3 2 20 10 11
n 5 9 2 20 15
k 16 20 12 6 10
시리즈4 : 실시예16-20을 참조
Figure 112018018183958-pct00011
화합물 화합물16 화합물17 화합물18 화합물19 화합물20
r 2 3 3 3 6
m 6 2 15 10 20
k 16 18 10 20 6
시리즈5 : 실시예21-25를 참조
Figure 112018018183958-pct00012
화합물 화합물21 화합물22 화합물23 화합물24 화합물25
r 1 2 3 3 6
m 5 2 15 10 20
k 16 18 10 20 6
시리즈6 : 실시예26-30을 참조
Figure 112018018183958-pct00013
화합물 화합물26 화합물27 화합물28 화합물29 화합물30
r 2 2 3 3 6
m 5 2 15 10 20
k 16 14 10 20 6
시리즈7 : 실시예31-35를 참조
Figure 112018018183958-pct00014
화합물 화합물31 화합물32 화합물33 화합물34 화합물35
r 2 2 3 3 6
m 6 2 15 10 20
n 3 20 5 10 2
k 16 14 10 20 6
시리즈8 : 실시예36-40을 참조
Figure 112018018183958-pct00015
화합물 화합물36 화합물37 화합물38 화합물39 화합물40
r 2 2 3 3 6
m 5 2 15 10 20
n 6 20 5 10 2
k 16 14 10 20 6
시리즈9 : 실시예41-45를 참조
Figure 112018018183958-pct00016
화합물 화합물41 화합물42 화합물43 화합물44 화합물45
m 6 2 20 10 15
k 16 14 10 20 6
시리즈10 : 실시예46-50을 참조
Figure 112018018183958-pct00017
화합물 화합물46 화합물47 화합물48 화합물49 화합물50
m 6 2 20 10 15
k 16 14 10 20 6
시리즈11: 실시예51-55를 참조
Figure 112018018183958-pct00018
화합물 화합물51 화합물52 화합물53 화합물54 화합물55
m 6 2 20 10 15
n 3 9 16 2 20
k 16 14 10 20 6
시리즈12 : 실시예56-60을 참조
Figure 112018018183958-pct00019
화합물 화합물56 화합물57 화합물58 화합물59 화합물60
m 6 2 20 10 15
n 3 9 16 2 20
k 16 14 10 20 6
시리즈13 : 실시예61-66을 참조
Figure 112018018183958-pct00020
화합물 화합물61 화합물62 화합물63 화합물64 화합물65 화합물66
m 2 4 5 7 9 10
k 20 10 16 8 16 6
시리즈14 : 실시예67을 참조
Figure 112018018183958-pct00021
m＝6; n＝3; k＝16
본 발명의 다른 한 방면에 의하면, 상기 엑세나타이드 수식물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 GLP-1 수용체 작용제로서의 약물 제조 용도; GLP-1 수용체 활성 저하에 관련된 질병 및/또는 증상을 예방 및/또는 치료하는 약물 제조 용도; 당대사 관련 질병 및/또는 증상에 사용되는 약물 제조 용도; 당뇨병에 사용되는 약물 제조 용도; 지방간에 사용되는 약물 제조 용도; 다이어트에 사용되는 약물 제조 용도를 제공한다.
본 발명의 제3방면에 의하면 상기 엑세나타이드 수식물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 및 임의의 약학적으로 허용 가능한 담체 구성을 포함하는 조성물을 제공하였다.
본 발명 제4방면에 의하면, 상술한 조성물이 GLP-1 수용체 작용제로서의 약물 제조 용도; GLP-1 수용체 활성 저하에 관련된 질병 및/또는 증상을 예방 및/또는 치료하는 약물 제조 용도; 당대사 관련 질병 및/또는 증상에 사용되는 약물 제조 용도; 당뇨병에 사용되는 약물 제조 용도; 지방간에 사용되는 약물 제조 용도; 다이어트에 사용되는 약물 제조 용도를 제공하였다.
본 발명에서 제공한 엑세나타이드 수식물은 GLP-1 수용체 작용제 활성이 비교적 높고, 저혈당 유지 시간이 길다. 아래와 같은 약리 시험을 통해 설명한다.
각 시료 각각 재증류수에 용해시키고, 최종 농도가 1.0×10-2mol/L이고, 4℃에서 보관한다. PC12세포를 25cm2 배양용기에서 배양하고, CO2배양기(37℃, 95% 공기, 5% CO2)에 넣고, 배지는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, pH＝7.4, 고당)을 선택하며, 5% 소태아혈청 및 10% 말혈청을 추가한다. 성장 상태가 양효한 PC12세포를 0.25% 췌장 효소로 소화시키고, 세포농도를1.0×105 cells/ml로 조절하여, 24 웰 세포배양 플레이트에 접종하며, 세포가 60－70% 밀도로 성장했을 때, PBS(Phosphate Buffer Saline)로 두번 세척하고, 1% BSA(Bovine Serum Albumin)의 PBS 각각 1ml를 추가하여, 각각 시약을 5개의 농도 기울기(10-10, 10-9, 10-8, 10-7, 10-6mol/L)로 IBMX(3-isobutyl-1-methylxanthine, 100μmol/L)와30분간 함께 배양하고, 각 농도의 샘플을 3차례의 독립적인 실험이 중복되어 실행한다. 약물 개입이 종료되고 즉시 세포를 수집하여 찬 PBS로 세포를 현탁하여 세포 농도를 1.0×107개/ml로 조절하고 즉시 1체적의 IN HCl를 9체적의 세포 현탁액에 넣고, 실온에서 10분간 배양하고 초음파기로 15초간 초음파를 진행한다. 4℃에서 1000rpm 10분간 원심 분리를 진행하여 세포 파편을 제거하고, 상청액에 1N HCl과 동등 체적의 1N NaOH을 추가하여 중화하여(여기서, 1N은 일당량을 표시), 얻은 용액이 cAMP를 함유한 샘플 용액이고, -20℃에서 측정 대기한다. 비간섭 단백질 농도를 이용하여 시제 키트를 이용하여 샘플 중의 총단백질의 농도를 검측한다. ELISA시제 키트를 사용하여 세포 용해물 중의 cAMP의 함량을 검측하는데, 시제키트 설명서에 근거하여 조작하며, BIO-RAD 680마이크로 플레이트 리더로 450nm에서 OD(Optical Density)값을 측정한다. 표준품의 OD값에 근거하여 CurveExpert1.3 소프트웨어 피팅 커브를 사용하여 표준곡선공식을 계산하며, 각 샘플의 농도를 계산한다. 컴퓨터 프로그램Microsoft Excel 및GraphPad Prism 5 소프트웨어를 사용하여 데이터 처리와 매핑을 진행하고, 각 시약의 EC50(반수 유효농도, Concentration for 50% of Maximal Effect)를 계산한다.
표 1 화합물이 세포내 cAMP 활성에 대한 영향
Figure 112018018183958-pct00022
GLP-1와 GLP-1 수용체 (β수용체 가족의 G커플링 단백질)이 결합 후, 세포막 내 사이클릭 아데노신일인산 (cAMP) 및 유사 분열물질-활성화 단백질인산화효소(MAPK) 통로를 활성화한다. 췌도 성숙β 세포의 GLP-1 수용체 커플링 Gs, 아데닐산 고리화 효소를 활성화 하여, cAMP를 생성하며, 후자와 포도당은 협동하여 인슐린 합성과 분비를 자극하고, 인슐린 유전자 전사 및 인슐린 원생물 합성을 자극하여, 글루카곤 놀도를 낮추고 지속적으로 글루카곤을 분비하도록 하여, 인슐린에 대한 세포 민감성을 강화시키고, 인슐린 의존성 글리코겐의 합성을 자극하여 식사후 혈당 농도를 낮춘다. EC50가 작을수록 약물 GLP-1 수용체 작용제 활성이 더 높음을 보여준다.
표 1의 표로부터 알 수 있다시피, 본 발명의 화합물은 엑세나타이드 활성에 비해 서로 맞먹거나 약간 낮은데, 이는 본 발명은 엑세나타이드의 수식에 대해 GLP-1 수용체 작용제 활성에 영향을 미치지 않는 것을 설명한다.
자발성 II형 당뇨병 db/db 쥐에 대한 혈당 강하 작용
5～6주령의 C57BL/6db/db9 쥐 (수컷)는 남경대학교모식동물연구소(Model Animal Research Center of Nanjing University)에서 구입하고, SPF 동물사육실에서 실험동물을 사양한다. 동물사육실은 통풍이 잘되고, 에어컨이 설치되어 있으며 온도는20～25℃를 유지하고, 습도는40%～70%를 유지하며, 환기 주기는 10～15차/시간이며, 명암 조명을 각각 12시간 진행하며, 실험동물은 자유롭게 음식물과 물을 섭취하며, 쥐들은 모두 귀표로 표기한다. 쥐는 매주 한차례 실험에 사용되며 쥐의 사용은 3주를 초과하지 않는다. 1주의 적응기간을 거친 후, 혈당측정기를 사용하여 쥐의 꼬리 끝 모세혈관 혈당을 측정한다. 혈당 수준이 16.7 mmol/L보다 높은 340마리의 쥐를 선택하여 혈당수준에 따라 무작위로 68개 그룹으로 나누고, 모델대조그룹은 5mL/kg의 PBS(pH＝7.4)를 피하주사 투여하고, 양성대조그룹은 엑세나타이드(10μg/kg, 5mL/kg)를 피하주사하고, 약물투여 그룹은 각각 화합물1-15(10μg/kg, 5mL/kg)를 피하주하하고, 약물투여 후 혈당측정기를 사용하여 0, 1, 2, 4, 8, 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 72h의 혈당을 측정하고 모든 데이터를 Graphpad Prism에 입력하여 평균혈당을 계산한다. 최대 혈당강하작용(모델그룹과 비교하여 강하률이 제일 큼), 최대 혈당강하 시간(모델 그룹과 비교하여, 혈당이 현저히 강하한 마지막 시간점) 및 곡선하면적을 계산한다.
표 2 자발성 II형 당뇨병db/db쥐에 대한 혈당강하 작용(h)
Figure 112018018183958-pct00023
표 2의 결과로부터 알 수 있다시피, 본 발명의 화합물은 엑세나타이드에 비해, 저혈당 유지 시간 방면에서 아주 큰 우세를 가지고, 최대혈당 강하 시간을 4시간에서30시간-48시간으로 연장되었다.
이상의 두가지 시험결과로부터 본 발명의 바람직한 화합물은 화합물41, 42, 43, 46, 47, 48, 51-63, 65, 67이다.
상술한 바를 종합하면, 본 발명의 엑세나타이드 수식물은 엑세나타이드에 비해 활성이 상당하거나 또는 약간 낮으며, 대부분 GLP-1 수용체 작용제 활성을 보류하고, 엑세나타이드의 수식에 대해 GLP-1 수용체 작용제 활성에 영향을 미치지 않는다. 이와 동시에, 본 발명 엑세나타이드 수식물 저혈당 유지시간 방면에서 아주 큰 우세를 가지며 최대혈당강하시간을 4시간에서 30시간-48시간으로 연장하였다. 본 발명의 분자는 GLP-1 수용체 작용제 활성이 비교적 높을 뿐만아니라 저혈당 유지 시간이 길고, 미래의 임상에서 체내 작용시간이 길며, 안정성이 우수하고, 혈당 저하 효과도 우수할 수 있는 약물이다.
구제척인 실시예
아미노산, 약자 및 영어 약칭은 아래와 같이 표시한다.
Fomc법 고체상합성에 필요한 아미노산의 명칭 및 그 약자
명칭 보호 아미노산 세자모 약자 단자모 약자
알라닌 Fmoc-Ala-OH Ala A
아스파르트산 Fmoc-Asp(OtBu)-OH Asp D
글루탐산 Fmoc-Glu(OtBu)-OH Glu G
페닐알라닌 Fmoc-Phe-OH Phe F
글리신 Fmoc-Gly-OH Gly G
히스티딘 Fmoc-His(Trt)-OH His H
이소류신 Fmoc-lle-OH lle l
리신 Fmoc-Lys(Boc)-OH Lys K
류신 Fmoc-Leu-OH Leu L
메티오닌 Fmoc-Met-OH Met M
아스파라긴 Fmoc-Asn(Trt)-OH Asn N
프롤린 Fmoc-Pro-OH Pro P
글루타민 Fmoc-Gln(Trt)-OH Gln Q
아르기닌 Fmoc-Arg(Pbf)-OH Arg R
세린 Fmoc-Ser(tBu)-OH Ser S
트레오닌 Fmoc-Thr(tBu)-OH Thr T
발린 Fmoc-Val-OH Val V
트립토판 Fmoc-Trp(Boc)-OH Trp W
티로신 Fmoc-Tyr(tBu)-OH Tyr T
리신 Fmoc-Lys(Alloc)-OH Lys K
오르니틴 Fmoc-Orn(Alloc)-OH Orn
실시예1 화합물1의 제조
Figure 112018018183958-pct00024
BP103n01의 제조
50mL 3구 플라스크에 1.0g 화합물 BP103n00(1.0eq, 여기서, eq는당량을 표시하고, 아래도 이와 같음), 10ml 다이클로로메테인, 10ml t-부틸 알코올,0.40g DIC(1.0eq), 0.39g DMAP(1.0eq, 4-디메틸아미노피리딘)를 넣고, 실온에서 교반하여 하루밤을 지내고, TLC(박층크로마토그래피) 로 반응 모니터링 완료하고, 에테르로 희석한 후 3번 물세척을 진행하고, 포화식염수로 세척하며, 무수황산나트륨으로 건조하여 칼럼크로마토그래피로 거품상 분말 BP103n01 0.4g을 얻는다.
BP103n02의 제조
100mL 3구 플라스크에 0.95g N-하이드록시석신이미드(HOSU), 2.0g 화합물19 및 15ml 다이클로로메테인을 추가하고, 1.58g EDC·HCl을 추가하고 2시간 실온에서 반응하며, TLC로 반응 모니터링 완료하고, 다이클로로메테인로 희석한 후, pH＝6.0, 50mmol/L의 인상이수소칼륨 수용액으로 2번 세척하고, 포화식염수로 세척하며, 무수황산나트륨으로 건조하고 농축하여 백색 고체 화합물 BP103n02 2.6g을 얻는다.
Figure 112018018183958-pct00025
BP103m01의 제조
질소 가스 보호 하에, 500ml 3구 플라스크에 200mL 피리딘, BP103g00(1.0eq) 50g을 넣고 교반하여 0℃로 온도를 낮추고, 몇차례에 거쳐TsCl(2.1eq) 70.7g을 추가하고, 1시간 교반한 후 천천히 온도를 실온까지 올리고, 3-4 시간 계속 교반한다. 반응 완료한 후, 반응액을 차가운 희염산 용액에 부어넣고, 초산에틸을 추가하여 추출하며, 초산에틸층용 희염산으로 1번 세척하고, 포화 탄산수소나트륨으로 세척하며, 포화 식염수로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조하며, 강압하여 용제를 증발 제거하여, 실리카젤칼럼크로마토그래피로 BP103m01 순수물 52g을 얻는다.
BP103m02의 제조
500mL 3구 플라스크에BP103m01(1.0eq) 50g및 150mL DMSO(디메틸 술폭시드)를 넣고 균일하게 교반한 후, NaN3 22.0g(4.0eq)를 추가하고 50℃까지 가열하며 3시간 반응시키고, 실온으로 온도를 낮추며, 반응액을 물에 부어넣고, 초산에틸로 여러번 추출하며, 유기상을 합병하여 무수황산나트륨으로 건조하고 농축하여 무색 액체 BP103m02 25.3g을 얻는다.
BP103m03의 제조
1L 수소화 반응기에 BP103m03 25g, 메탄올 200mL, 팔라듐-탄소(Palladium on carbon) 6.0g을 넣어 교반하고, 질소가스로 치환하며, 질소가스를 불어넣어 3-4 시간 반응시키며, TLC로 반응 모니터링 완료한 후, 반응액을 여과하고, 여과액을 농축하여 BP103m03의 오일 물질 20.4g을 얻는다.
BP103m04의 제조
500mL 3구 플라스크에 화합물 BP103m03 20.0g(1.0eq), 다이클로로메테인 200ml, Fmoc-HOSU 24.0g(1.0eq)을 넣어 교반하고 0℃로 온도를 낮추며, 9.2g DIEA(1.0eq, N,N-디이소프로필에틸아민)를 첨가하여 교반하고 하루밤을 지나며, TLC로 반응 모니터링 완료한 후, 물 세척, 포화식염수로 세척하며, 무수 황산나트륨 건조 후, 칼럼크로마토그래피로 오일 물질 BP103m04 27.3g을 얻는다.
BP103m05의 제조
200mL 플라스크에 5.0g BP103m04(1.0eq), 50ml 물, 1.7g NaHCO3(2.0eq)을 넣어 교반하고, 4.7g 화합물 BP103n02(1.0eq)가 50ml DME(디메톡시에탄)에 용해된 용액을 첨가하며, 50ml THF(테트라히드로푸란)을 추가하여 교반하고 하루밤을 지내며, TLC로 반응 모니터링 완료하고, 유기 용제를 증발 제거시키며, pH가 4가 되도록 초산으로 조절하며, 초산에틸로 추출하고, 무수황산나트륨으로 건조하고 농축하여6.4g의 오프 화이트 고체 화합물 BP103m05를 얻는다.
BP103m06의 제조
100mL 플라스크에 6.0g 화합물 BP103m05, 30ml 다이클로로메테인, 30ml TFA(트리플루오로아세트산)를 추가하고, 20℃에서 교반하며 TLC로 반응 모니터링 완료하고, 유기 용제를 증발 제거시키며, 석유 에터르로 펄프 반죽, 침출하고 건조하여 5.1g 오프 화이트 고체 BP103m06을 얻는다.
Figure 112018018183958-pct00026
목표 화합물의 합성
20ml 반응 칼럼(Reaction column)에 1.0g 2Cl-Trt 수지, 240mg BP103m06, 5ml 다이클로로메테인, 300ul DIEA를 넣고, 40분간 질소 가스 주입(nitrogen-blowing)을 진행하고, 5ml 다이클로로메테인, 1ml 메탄올, 1ml DIEA를 추가하여, 20분간 반응한 후DMF(N,N-디메틸포름아미드)로 세척하여, BP103m06 수지를 얻는다. 커플링 시제는 HOBT/DIC(즉, 1-히드록시벤조트리아졸/N,N-디이소프로필 카보디아미드)를 사용하고, DMF는 반응 용제이며, 반응 모니터링은 닌히드린 검사법을 사용하고, 차례로 아래의 보호 아니노산을 수지에 연결한다.
Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asp(OtBu)OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, 마지막에 Fmoc 보호를 제거하고, 수지의 열분해는 82.5% TFA/5% 페놀/5% 물/2.5%EDT/5% 싸이오아니졸을 사용하며, 차가운 MTBE( t-부틸메틸에테르 )로 침전, 세탁하고, 조품은 역상HPLC를 거쳐 정화되며, 목표 펩티드 순수물 32mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 4743.53[M+H]+
실시예2 화합물2의 제조
실시예1의 방법을 참조하여 화합물2를 제조:
Figure 112018018183958-pct00027
Figure 112018018183958-pct00028
최종적으로 목표 펩티드 순수물 31.2mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 4667.52[M+H]+
실시예3 화합물3의 제조
실시예1의 방법을 참조하여 화합물3을 제조:
Figure 112018018183958-pct00029
최종적으로 목표 펩티드 순수물 32.3mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 5263.78[M+H]+
실시예4 화합물4의 제조
실시예1의 방법을 참조하여 화합물4를 제조:
Figure 112018018183958-pct00030
Figure 112018018183958-pct00031
최종적으로 목표 펩티드 순수물 31.8mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 5055.68[M+H]+
실시예5 화합물5의 제조
실시예1의 방법을 참조하여 화합물5를 제조:
Figure 112018018183958-pct00032
최종적으로 목표 펩티드 순수물 31.0mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 4935.64[M+H]+
실시예6 화합물6의 제조
Figure 112018018183958-pct00033
BP103a01의 제조
질소 가스 보호하에, 1000ml 3구 플라스크에 200mL 피리딘, 120g BP103a00(1.0eq)을 넣어 교반하고 0℃로 온도를 낮추며, 몇차례에 거쳐 151.8g TsCl(1.0eq)를 추가하고 1시간 교반한 후 온도를 천천히 실온으로 올리고, 3-4시간 계속 교반한다. 반응 완료한 후, 반응액을 차가운 희염산 용액에 부어넣고, 초산에틸을 추가하여 추출하며, 초산에틸층은 희염산으로 1번 세척하고, 포화 탄산수소나트륨으로 세척하며, 포화 식염수로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조하며, 강압하여 용제를 증발 제거하여, 실리카젤칼럼크로마토그래피로 BP103a01순수물 55g을 얻는다.
BP103a02의 제조
1000mL 3구 플라스크에 55g BP103a01(1.0eq) 및160mL DMSO을 넣어 균일하게 교반한 후, NaN3 23.52g(2.0eq)을 추가하여 50℃까지 가열하여 3시간 반응시키며, 실온으로 온도를 낮추고, 반응액을 물에 부어넣고, 초산에틸로 추출하며, 유기상을 합병하여, 무수황산나트륨으로 건조하고 농축하여 BP103a02 무색 액체 29.2g을얻는다.
BP103a03의 제조
1L 수소화 반응기에 29g BP103a02, 메탄올 360mL, 팔라듐-탄소(Palladium on carbon) 5.0g을 넣어 교반하고, 질소가스로 치환하며, 질소가스를 불어넣어 3-4시간 반응하고, TLC로 반응 모니터링 완료한 후, 반응액을 여과하며, 여과액을 농축하여 BP103a03의 오일 물질 23.5g을 얻는다.
BP103a04의 제조
1L 3구 플라스크에 23.5g 화합물 BP103a03(1.0eq), 68.6g(Boc)2O(2.0eq), 메탄올 : 트리에틸아민(9 : 1)의 혼합용액500ml를 넣어 교반하고 역류할 때까지 온도를 올려1시간 반응시키고, TLC로 반응 모니터링 완료한 후, 메탄올 트리에틸아민을 증발 제거시키고, 물을 추가하여 용해시키며, 다이클로로메테인으로 3번 추출하고, 유기층을 합병하여 1번 물 세척하고, 무수황산나트륨으로 건조하며, 용제를 증발 제거시키고 건조하여 고체 BP103a04 34.8g을 얻는다.
BP103a05의 제조
1000mL 3구 플라스크에 34.8g 화합물 BP103a04(1.0eq), 톨루엔 및THF 각각 150ml, 브로모아세트산 58.2g(3eq)을 넣어 교반하고 45～50℃로 가열하며, 수산화나트륨 33.5g(6eq)을 추가하고, 반응시켜 하루밤을 지내고 TLC로 반응 모니터링 완료한 후, 반응액을 증발 제거시키고, 물과 초산에틸을 추가하여 추출하며, pH가 3이 되도록 수상으로 조절하며, 수상은 다이클로로메테인을 사용하여 추출하고, 다이클로로메테인층을 합병하여, 무수 황산나트륨로 건조한 후 농축하여 BP103a05 오일 물질 화합물18g을 얻는다.
Figure 112018018183958-pct00034
BP103m07의 제조
100mL 3구 플라스크에 화합물 BP103m04 5.0g(1.05eq), 2.9g BP103a05(1.0eq), 다이클로로메테인50ml, DIEA3.8g(3.0eq), DEPC 2.4g(1.5eq, 다이에틸 시아노포스포네이트: Diethyl cyanophosphate)을 추가하여 TLC로 반응 모니터링 완료한 후, 0.1mol/L의HCl/물로 세척하고, 탄산 수소 나트륨으로 세척하며, 물로 세척하고, 포화식염수로 세척하며, 무수 황산나트륨로 건조한 후 칼럼크로마토그래피로 오일 물질 BP103m07 6.3g을 얻는다.
BP103m08의 제조
100mL 플라스크에 6.3g 화합물 BP103m07, 30ml 초산에틸을 넣어 0℃로 온도를 낮추고 7.0mol HCl/초산에틸을 추가하여TLC로 반응 모니터링을 완료한 후 유기 용제를 증발 제거하고, 석유 에터르로 펄프 반죽, 침출하고 건조하여 5.3g 오프 화이트 고체 BP103m08을 얻는다.
BP103m09의 제조
200mL 플라스크에 5.0g BP103m08(1.0eq), 50ml 물, 1.2g NaHCO3(2.0eq)을 넣어 교반하고, 3.2g 화합물 BP103n02(1.0eq)가 50ml DME(디메톡시에탄)에 용해된 용액을 첨가하며, 50ml THF를 더 추가하여 교반하고 하루밤을 지내고, TLC로 반응 모니터링 완료하며, 유기 용제를 증발 제거시키며, pH가 4가 되도록 초산으로 조절하고, 초산에틸로 추출하며, 무수황산나트륨으로 건조하고 농축하여 6.1g 오프 화이트 고체 화합물 BP103m09을 얻는다.
BP103m10의 제조
100mL 플라스크에 6.0g화합물 BP103m09, 30ml 다이클로로메테인, 30mlTFA를 넣어 20℃에서 교반하고 TLC로 반응 모니터링 완료하고, 유기 용제를 증발 제거시키며, 석유 에터르로 펄프 반죽, 침출하고 건조하여 4.8g 오프 화이트 고체 BP103m10을 얻는다.
목표 펩티드의 제조
Figure 112018018183958-pct00035
20ml 반응 칼럼에 1.0g 2Cl-Trt 수지, 296mg BP103m10, 5ml 다이클로로메테인, 300ul DIEA를 넣어 40분간 질소 가스 버블링을 진행하고 5ml 다이클로로메테인, 1ml메탄올, 1ml DIEA를 추가하여 20분간 반응시킨 후 DMF로 세척하여 BP103m06 수지를 얻는다. Fmoc의 제거는 20%의 피페리딘/DMF를 사용하여 20분간 반응시키고, 커플링 시제는 HOBT/DIC를 사용하고, DMF는 반응 용제이며, 반응 모니터링은 닌히드린 검사법을 이용하고 차례로 아래의 보호 아미노산을 수지에 연결한다. Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asp(OtBu)OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, 마지막에 Fmoc 보호를 제거하고, 수지의 열분해는 82.5% TFA/5% 페놀/5% 물/2.5% EDT/5% 싸이오아니졸을 사용하고 차가운 MTBE로 침전, 세탁하고, 조품은 역상HPLC를 거쳐 정화되어 목표 펩티드 순수물 39mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 4932.65[M+H]+
실시예7 화합물7의 제조
실시예 6의 방법을 참조하여 화합물7을 제조한다.
Figure 112018018183958-pct00036
최종적으로 목표 펩티드 순수물 39.6mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 5032.76[M+H]+
실시예8 화합물8의 제조
실시예 6의 방법을 참조하여 화합물8을 제조한다.
Figure 112018018183958-pct00037
최종적으로 목표 펩티드 순수물 40.2mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 5492.99[M+H]+
실시예9 화합물9의 제조
실시예 6의 방법을 참조하여 화합물9를 제조한다.
Figure 112018018183958-pct00038
최종적으로 목표 펩티드 순수물 40.7mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 5761.11[M+H]+
실시예10 화합물10의 제조
실시예 6의 방법을 참조하여 화합물10을 얻는다.
Figure 112018018183958-pct00039
최종적으로 목표 펩티드 순수물 40.7mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 5641.07[M+H]+
실시예11 화합물11의 제조
Figure 112018018183958-pct00040
BP103a의 제조
250mL 3구 플라스크에 18g 화합물 BP103a05, 100ml 초산에틸을 넣어 교반 용해시킨 후 0℃로 온도를 낮추고, 150ml 초산에틸/HCl(3.5M)를 추가하고 0℃를 유지하며, TLC로 반응 모니터링 완료하고, 여과하는데 필터 케이크는 TBME를 사용하고 세척하여 백색 고체 BP103a 10.4g을 얻는다.
BP103a06의 제조
200mL 플라스크에 5.0g BP103a(1.0eq), 50ml 물, 3.5g NaHCO3(2.0eq)을 넣어 교반하고, 7.3g Fmoc-HOSU(1.0eq)를 50ml DME(디메톡시에탄)에 용해시킨 용액을 첨가하고, 50ml THF 더 추가하고 교반하여 하루밤을 지내고, TLC로 반응 모니터링 완료하고, 유기 용제를 증발 제거시키며, pH가 2가 되도록 희염산으로 조절하고, 초산에틸로 추출하며, 물세척하고, 포화식염수로 세척하며, 무수황산나트륨으로 건조하고 농축하여 7.6g 오프 화이트 고체 화합물 BP103a06를 얻는다.
Figure 112018018183958-pct00041
BP103m20의 제조
500mL 3구 플라스크에 화합물 BP103m03 10.0g(1.0eq), 다이클로로메테인100ml, (Boc)2O 7.8g(1.0eq)을 넣어 교반하고 0℃로 온도를 낮추며, 4.6g DIEA(1.0eq)를 첨가하고 교반하여 하루밤을 지내고, TLC로 반응 모니터링 완료한 후, 물 세척하고, 포화식염수로 세척하며, 무수 황산나트륨로 건조한 후 칼럼크로마토그래피로 오일 물질 BP103m20 6.2g을 얻는다.
BP103m21의 제조
100mL 3구 플라스크에 화합물 BP103m20 6.2g(1.05eq), 6.7g BP103a06(1.0eq)다이클로로메테인50ml, DIEA 6.3g(3.0eq), DEPC 4.0g(1.5eq)을 넣어 TLC로 반응 모니터링 완료한 후, 0.1mol/L의 HCl/물로 세척하고, 탄산 수소 나트륨으로 세척하며, 물로 세척하고, 포화식염수로 세척하며, 무수 황산나트륨로 건조한 후 칼럼크로마토그래피로 오일 물질 BP103m21 9.5g을 얻는다.
BP103m22의 제조
100mL 플라스크에 9.5g 화합물 BP103m21, 50ml 초산에틸을 넣어 교반하고 0℃로 온도를 낮추며, 50ml 7.0mol/L의HCl/초산에틸을 추가하여 TLC로 반응 모니터링 완료하고, 유기 용제를 증발 제거시키며, 석유 에터르로 펄프 반죽, 침출하고 건조하여 8.3g 오프 화이트 고체 BP103m22를 얻는다.
BP103m23의 제조
200mL 플라스크에 5.0g BP103m22(1.0eq), 50ml 물, 1.2g NaHCO3(2.0eq)을 넣어 교반하고, 3.2g 화합물 BP103n02(1.0eq)를 50ml DME(디메톡시에탄)에 용해시킨 용액을 첨가하고, 50ml THF를 더 추가하고 교반하여 하루밤을 지내고, TLC로 반응 모니터링 완료하며, 유기 용제를 증발 제거시키고, pH가 4가 되도록 초산으로 조절하며, 초산에틸로 추출하고, 무수황산나트륨으로 건조하며 농축하여 5.6g오프 화이트 고체 화합물 BP103m23을 얻는다.
BP103m24의 제조
100mL 플라스크에 5.6g화합물 BP103m23, 30ml 다이클로로메테인, 30mlTFA를 넣어 20℃에서 교반하고, TLC로 반응 모니터링 완료하고, 유기 용제를 증발 제거시키며, 석유 에터르로 펄프 반죽, 침출하고 건조하여 4.4g 오프 화이트 고체 BP103m24를 얻는다.
목표 펩티드의 제조
Figure 112018018183958-pct00042
20ml 반응 칼럼에 1.0g 2Cl-Trt 수지, 296mg BP103m24, 5ml 다이클로로메테인, 300ul DIEA를 넣어 40분간 질소 가스 버블링을 진행하고, 5ml 다이클로로메테인, 1ml 메탄올, 1ml DIEA를 넣어 20분간 반응시킨 후 DMF로 세척하여 BP103m06 수지를 얻는다. Fmoc의 제거는 20%의 피페리딘/DMF를 사용하고 20분간 반응시키며, 커플링 시제는 HOBT/DIC를 사용하고 DMF는 반응 용제이며, 반응 모니터링은 닌히드린 검사법을 이용하고, 차례로 아래의 보호 아미노산을 수지에 연결한다. Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asp(OtBu)OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, 마지막에 Fmoc 보호를 제거하고, 수지의 열분해는 82.5% TFA/ 5% 페놀/5% 물/2.5% EDT/5% 싸이오아니졸을 사용하고, 차가운 MTBE로 침전, 세탁하고, 조품은 역상HPLC를 거쳐 정화되고, 목표 펩티드 순수물 29mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 4932.65[M+H]+
실시예12 화합물12의 제조
실시예11의 방법을 참조하여 화합물12를 제조한다.
Figure 112018018183958-pct00043
최종적으로 목표 펩티드 순수물 29.1mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 5032.76[M+H]+
실시예13 화합물13의 제조
실시예11의 방법을 참조하여 화합물13을 제조한다.
Figure 112018018183958-pct00044
최종적으로 목표 펩티드 순수물 30mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 5492.99[M+H]+
실시예14 화합물14의 제조
실시예11의 방법을 참조하여 화합물14를 제조한다.
Figure 112018018183958-pct00045
최종적으로 목표 펩티드 순수물 30.2mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 5761.11[M+H]+
실시예15 화합물15의 제조
실시예11의 방법을 참조하여 화합물15를 제조한다.
Figure 112018018183958-pct00046
최종적으로 목표 펩티드 순수물 30.4mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 5641.07[M+H]+
실시예16 화합물16의 제조
Figure 112018018183958-pct00047
화합물 BP103g01의 제조
질소 가스 보호하에, 500ml 3구 플라스크에 200mL피리딘, 50g BP103g00(1.0eq)을 넣어 교반하고 0℃로 온도를 낮추며, 몇차례에 거쳐 35.5g TsCl(1.0eq)를 추가하고 1시간 교반한 후 천천히 온도를 실온까지 올리고 3-4시간 계속 교반한다. 반응 완료한 후, 반응액을 차가운 희염산 용액에 부어넣고, 초산에틸을 추가하여 추출하며, 초산에틸층용 희염산으로 1번 세척하고, 포화 탄산수소나트륨으로 세척하며, 포화 식염수로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고 강압하여 용제를 증발 제거하여, 실리카젤칼럼크로마토그래피로 BP103g01순수물 38g을 얻는다.
화합물 BP103g02의 제조
500mL 3구 플라스크에 38g BP103g01(1.0eq) 및 190mL DMSO을 넣어 균일하게 교반한 후, NaN3 11.5g(2.0eq)을 넣어 50℃까지 가열하고 3시간 반응시키며, 실온으로 온도를 낮추고, 반응액을 물에 부어넣고, 초산에틸로 여러번 추출하며, 유기상을 합병하며, 무수황산나트륨으로 건조하고 농축하여 무색 액체 BP103g02 40g을 얻는다.
화합물 BP103g03의 제조
1L 수소화 반응기에 BP103g02 70g, 메탄올 500mL, 팔라듐-탄소(Palladium on carbon) 8.0g을 넣어 교반하고, 질소가스로 치환하며, 질소가스를 불어넣어 3-4시간 반응하고, TLC로 반응 모니터링 완료한 후, 반응액을 여과하며, 여과액을 농축하여 BP103g03의 오일 물질 52g을 얻는다.
화합물 BP103g04의 제조
250mL 3구 플라스크에 화합물 BP103g03 10.0g(1.0eq), (Boc)2O 15.5g(2.0eq), 메탄올 : 트리에틸아민(9 : 1)의 혼합용액200ml를 넣어 교반하고 역류할 때까지 온도를 올려1시간 반응시키고, TLC 로 반응 모니터링을 종료한 후, 메탄올 트리에틸아민을 증발 제거키시고, 물을 추가하여 용해시키며, 다이클로로메테인으로 3번 추출하고, 유기층을 합병하여 1번 물세척하며, 무수황산나트륨으로 건조하고 농축하여 오일 물질 BP103g04 9.0g을 얻는다.
화합물 BP103g05의 제조
250mL 3구 플라스크에 BP103g04 화합물7.0g(1.0eq), 톨루엔 및 THF 각각 40ml, 브로모아세트산 7.6g(3.0eq)을 넣어 교반하고, 45～50℃로 가열하며, 수산화나트륨 4.4g을 더 추가하여 반응시키고 하루밤을 지내며, TLC로 반응 모니터링 완료한 후, 반응액을 증발 제거시켜, 물과 초산에틸을 추가하여 이물질을 추출하고, pH가 3이 되도록 수상으로 조절하며, 수상은 다이클로로메테인으로 추출하고, 다이클로로메테인층을 합병하고, 무수 황산나트륨으로 건조한 후 농축하여 BP103g05오일 물질 화합물 4.2g을 얻는다.
Figure 112018018183958-pct00048
BP103m30의 제조
100mL 3구 플라스크에 화합물 BP103g05 4.2g(1.05eq), 2.9g Fmoc-에틸렌디아민염산염(1.0eq) 다이클로로메테인 50ml, DIEA 3.7g(3.0eq), DEPC 2.3g(1.5eq)을 넣어 TLC로 반응 모니터링 완료한 후, 0.1mol/L의 HCl/물 세척, 탄산 수소 나트륨으로 세척하고, 물로 세척하며, 포화식염수로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조한 후 칼럼크로마토그래피로 오일 물질 BP103m21 5.6g을 얻는다.
BP103m31의 제조
100mL 플라스크에 5.6g 화합물 BP103m30, 30ml 초산에틸을 넣어 교반하고 0℃로 온도를 낮추며, 30ml 7.0mol/L의 HCl/초산에틸을 추가하고 TLC로 반응 모니터링 완료하며, 유기 용제를 증발 제거시키고, 석유 에터르로 펄프 반죽, 침출하며 건조하여 4.8g 오프 화이트 고체 BP103m31을 얻는다.
BP103m32의 제조
200mL 플라스크에 4.6g BP103m31(1.0eq), 45ml 물, 1.2g NaHCO3(2.0eq)을 넣어 교반하고, 3.4g 화합물 BP103n02(1.0eq)를 45ml DME(디메톡시에탄)에 용해시킨 용액을 첨가하며, 45ml THF을 더 추가하고 교반하여 하루밤을 지내고, TLC로 반응 모니터링 완료하고, 유기 용제를 증발 제거시키며, pH가 4가 되도록 초산으로 조절하고, 초산에틸로 추출하며, 무수황산나트륨으로 건조하고 농축하여 4.9g 오프 화이트 고체 화합물 BP103m32를 얻는다.
BP103m33의 제조
100mL 플라스크에 4.5g 화합물 BP103m32, 25ml 다이클로로메테인, 25ml TFA를 넣어 20℃에서 교반하고, TLC로 반응 모니터링 완료하고, 유기 용제를 증발 제거시키며, 석유 에터르로 펄프 반죽, 침출하고 건조하여 3.8g 오프 화이트 고체 BP103m33을 얻는다.
Figure 112018018183958-pct00049
20ml 반응 칼럼에 1.0g 2Cl-Trt 수지, 270mg BP103m33, 5ml 다이클로로메테인, 300ul DIEA를 넣어 40분간 질소 가스 버블링을 진행하고, 5ml 다이클로로메테인, 1ml 메탄올, 1ml DIEA를 추가하여 20분간 반응시킨 후 DMF로 세척하여 BP103m06 수지를 얻는다. Fmoc의 제거는 20%의 피페리딘/DMF를 사용하고 20분간 반응시키며, 커플링 시제는 HOBT/DIC를 사용하고 DMF는 반응 용제이며, 반응 모니터링은 닌히드린 검사법을 이용하고, 차례로 아래의 보호 아미노산을 수지에 연결한다. Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asp(OtBu)OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, 마지막에 Fmoc 보호를 제거하고, 수지의 열분해는 82.5% TFA/5% 페놀/5% 룰/2.5% EDT/5% 싸이오아니졸을 사용하고 차가운 MTBE로 침전, 세탁하고, 조품은 역상 HPLC를 거쳐 정화되어 목표 펩티드 순수물 33mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 4844.6[M+H]+
실시예17 화합물17의 제조
실시예 16의 방법을 참조하여 화합물17을 제조한다.
Figure 112018018183958-pct00050
최종적으로 목표 펩티드 순수물 32mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 4710.54[M+H]+
실시예18 화합물18의 제조
실시예 16의 방법을 참조하여 화합물18을 얻는다.
Figure 112018018183958-pct00051
최종적으로 목표 펩티드 순수물 33.5mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 5170.77[M+H]+
실시예19 화합물19의 제조
실시예 16의 방법을 참조하여 화합물19를 제조한다.
Figure 112018018183958-pct00052
최종적으로 목표 펩티드 순수물 33.1mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 5090.82[M+H]+
실시예20 화합물20의 제조
실시예 16의 방법을 참조하여 화합물20을 제조한다.
Figure 112018018183958-pct00053
최종적으로 목표 펩티드 순수물 33.1mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 5090.82[M+H]+
실시예21 화합물21의 제조
Figure 112018018183958-pct00054
BP103m06의 제조방법은 실시예6을 참조한다.
Figure 112018018183958-pct00055
20ml 반응 칼럼에 1.0g 2Cl-Trt 수지, 240mg BP103m06, 5ml 다이클로로메테인, 300ul DIEA를 넣어 40분간 질소 가스 버블링을 진행하고, 5ml 다이클로로메테인, 1ml 메탄올, 1ml DIEAA를 추가하여 20분간 반응시킨 후 DMF로 세척하여 BP103m06 수지를 얻는다. Fmoc의 제거는 20%의 피페리딘/DMF을 사용하고 20분간 반응시키며, 커플링 시제는 HOBT/DIC를 사용하고 DMF는 반응 용제이며, 반응 모니터링은 닌히드린 검사법을 이용하고, 차례로 아래의 보호 아미노산을 수지에 연결한다. Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asp(OtBu)OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, 마지막에 Fmoc 보호를 제거하고, 수지의 열분해는 82.5% TFA/5% 페놀/5% 룰/2.5% EDT/5% 싸이오아니졸을 사용하고 차가운 MTBE로 침전, 세탁하고, 조품은 역상HPLC를 거쳐 정화되며, 목표 펩티드 순수물 42mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 4800.56[M+H]+
실시예22 화합물22의 제조
실시예 21의 방법을 참조하여 화합물22를 제조한다.
Figure 112018018183958-pct00056
최종적으로 목표 펩티드 순수물 41.7mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 4710.53[M+H]+
실시예23 화합물23의 제조
실시예 21의 방법을 참조하여 화합물23을 제조한다.
Figure 112018018183958-pct00057
최종적으로 목표 펩티드 순수물 42.5mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 5184.78[M+H]+
실시예24 화합물24의 제조
실시예 21의 방법을 참조하여 화합물24를 제조한다.
Figure 112018018183958-pct00058
최종적으로 목표 펩티드 순수물 42.1mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 5104.83[M+H]+
실시예25 화합물25의 제조
실시예 21의 방법을 참조하여 화합물25를 제조한다.
Figure 112018018183958-pct00059
최종적으로 목표 펩티드 순수물 43mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 5390.91[M+H]+
실시예26
Figure 112018018183958-pct00060
BP103m40의 제조
500mL 3구 플라스크에 화합물 BP103g01 25.0g(1.0eq), 아세토나이트릴 250ml, Fmoc-1,2-에테인다이아민18.3g(1.0eq)을 넣어 교반하고 0℃로 온도를 낮추며, 7.9g 탄산칼륨 (1.0eq)을 넣어 TLC로 반응 모니터링 완료한 후, 희염산으로 세척하고, 포화식염수로 세척하며, 무수 황산나트륨으로 건조한 후 칼럼크로마토그래피로 오일 물질 BP103m40 25.3g을 얻는다.
BP103m41의 제조
500mL 3구 플라스크에 화합물 BP103m40 25.0g(1.0eq), 다이클로로메테인250ml, (Boc)2O 19.9g(2.0eq)을 넣고 17.7g DIEA(3.0eq)을 첨가하여 TLC로 반응 모니터링 완료한 후, 희염산으로 세척하고, 탄산수소나트륨 수용액으로 세척한 후 포화식염수로 세척하며, 무수황산나트륨으로 건조하여 칼럼크로마토그래피로 오일 물질 BP103m41 23.8g을 얻는다.
BP103m42의 제조
질소 가스 보호하에, 1000ml 3구 플라스크에 100mL 피리딘, 23.5g BP103m41(1.0eq)을 넣어 교반하고 0℃로 온도를 낮추며, 몇차례에 거쳐 8.3g TsCl(1.2eq)를 추가하고 1시간 교반한 후 온도를 천천히 실온으로 올리고, 3-4시간 계속 교반한다. 반응 완료한 후, 대부분의 피리딘을 증발 제거시키고, 초산에틸로 용해시키며, 희염산으로 1번 세척하고, 포화 탄산수소나트륨으로 세척하며, 포화 식염수로 세척하고, 무수 Na2SO4으로 건조시켜 실리카젤칼럼크로마토그래피로 BP103m42 순수물 25.3g을 얻는다.
BP103m43의 제조
1000mL 3구 플라스크에 25.0g BP103m42(1.0eq) 및 100mL DMSO를 넣어 균일하게 교반한 후, NaN3 4.1g(2.0eq)을 추가하여 50℃까지 가열하고 3시간 반응시키며, 실온으로 온도를 낮추고, 반응액을 물에 부어넣으며, 초산에틸로 추출하고, 유기상을 합병하며, 무수황산나트륨으로 건조하고 농축하여 BP103m43무색 액체 22.7g을 얻는다.
BP103m44의 제조
1L 수소화 반응기에 22.7g 화합물 BP103m43, 메탄올 250mL, 팔라듐-탄소(Palladium on carbon) 5.0g을 넣어 교반하고, 질소가스로 치환하며, 질소가스를 불어넣어 3-4시간 반응하고, TLC로 반응 모니터링 완료한 후, 반응액을 여과하며, 여과액을 농축하여 BP103m44의 오일 물질 19.6g을 얻는다.
BP103m45의 제조
500mL 플라스크에 10.0g BP103m44(1.0eq), 100ml 물, 2.6g NaHCO3(2.0eq)을 넣어 교반하고, 7.2g 화합물 BP103n02(1.0eq)를 100ml DME(디메톡시에탄)에 용해시킨 용액을 첨가하며, 100ml THF를 더 추가하여 교반하고 하루밤을 지내며, TLC로 반응 모니터링 완료하고, 유기 용제를 증발 제거시키며, pH가 4가 되도록 초산으로 조절하고, 초산에틸로 추출하며, 무수황산나트륨으로 건조하고 농축하여 13.2g 오프 화이트 고체 화합물 BP103m45를 얻는다.
BP103m46의 제조
100mL 플라스크에 13.2g 화합물 BP103m45, 15ml 다이클로로메테인, 15mlTFA를 넣어 20℃에서 교반하고, TLC로 반응 모니터링 완료하며, 유기 용제를 증발 제거시키고, 석유 에터르로 펄프 반죽, 침출하고 건조하여 10.5g 오프 화이트 고체 BP103m46를 얻는다.
BP103m47의 제조
250ml 3구 플라스크에 10.5g 화합물 BP103m36(1.0eq), 110ml 다이클로로메테인, 5.4g (Boc)2O(2.0eq)을 넣고 4.8g DIEA(3.0eq)을 추가하여, TLC로 반응 모니터링 완료한 후, 희염산으로 세척하고, 탄산수소나트륨 수용액으로 세척한 후 포화식염수로 세척하며, 무수황산나트륨으로 건조하여 칼럼크로마토그래피로 오프 화이트 고체 BP103m47 7.9g을 얻는다.
Figure 112018018183958-pct00061
20ml 반응 칼럼에 1.0g 2Cl-Trt 수지, 283mg BP103m47, 5ml 다이클로로메테인, 300ul DIEA를 넣어 40분간 질소 가스 버블링을 진행하고, 5ml 다이클로로메테인, 1ml 메탄올, 1ml DIEAA를 넣어 20분간 반응시킨 후 DMF로 세척하여 BP103m06 수지를 얻는다. Fmoc의 제거는 20%의 피페리딘/DMF를 사용하고 20분간 반응시키며, 커플링 시제는 HOBT/DIC를 사용하고 DMF는 반응 용제이며, 반응 모니터링은 닌히드린 검사법을 이용하고 차례로 아래의 보호 아미노산을 수지에 연결한다. Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asp(OtBu)OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, 마지막에 Fmoc 보호를 제거하고, 수지의 열분해는 82.5% TFA/5% 페놀/5% 물/2.5% EDT/5% 싸이오아니졸을 사용하고 차가운 MTBE로 침전, 세탁하고, 조품은 역상HPLC를 거쳐 정화되며, 목표 펩티드 순수물 41mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 4771.57[M+H]+
실시예27 화합물27의 제조
실시예 26의 방법을 참조하여 화합물27을 제조한다.
Figure 112018018183958-pct00062
최종적으로 목표 펩티드 순수물 40.5mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 4611.44[M+H]+
실시예28 화합물28의 제조
실시예 26의 방법을 참조하여 화합물28을 제조한다.
Figure 112018018183958-pct00063
최종적으로 목표 펩티드 순수물 41.6mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 5141.77[M+H]+
실시예29 화합물29의 제조
실시예 26의 방법을 참조하여 화합물29를 제조한다.
Figure 112018018183958-pct00064
최종적으로 목표 펩티드 순수물 41.2mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 5061.82[M+H]+
실시예30 화합물30의 제조
실시예 26의 방법을 참조하여 화합물30을 제조한다.
Figure 112018018183958-pct00065
최종적으로 목표 펩티드 순수물 42.3mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 5347.9[M+H]+
실시예31 화합물31의 제조
Figure 112018018183958-pct00066
BP103m50의 제조
100mL 3구 플라스크에286mg N-하이드록시석신이미드(HOSU), 0.50g BP103a05및 5ml 다이클로로메테인을 넣고 477mg EDC·HCl을 추가하고 실온에서 2시간 반응시키며, TLC로 반응 모니터링 완료하고, 다이클로로메테인로 희석한 후 pH가 6.0인 50mmol/L의 인상이수소칼륨 수용액으로 2번 세척하고, 포화식염수로 세척하며, 무수황산나트륨으로 건조하고 농축하여 오일 물질0.72g 화합물 BP103m50을 얻는다.
BP103m51의 제조
100mL 플라스크에 0.62g 화합물 BP103g06(1.0eq), 10ml 물, 0.27g NaHCO3(2.0eq)을 넣어 교반하고, 0.66g 화합물 BP103m50을 10ml DME(디메톡시에탄)에 용해시킨 용액을 첨가하며, 5ml THF를 추가하여 교반하고 하루밤을 지내며, TLC로 반응 모니터링 완료하고, 유기 용제를 증발 제거시키며, pH가 4가 되도록 희염산으로 조절하고, 다이클로로메테인으로 추출하며, 무수황산나트륨으로 건조하고 농축하여 오일 물질 0.71g화합물 BP103m51을 얻는다.
BP103m52의 제조
100mL 플라스크에 0.71g 화합물 BP103m51, 5ml 초산에틸을 넣어 용해시켜 0℃로 온도를 낮추고, 5ml HCl/초산에틸(7mol/L)을 추가하며, 0℃를 유지하고, TLC로 반응 모니터링을 종료한 후 농축하여 오일 물질BP103m52 0.71g을 얻는다.
BP103m53의 제조
100mL 플라스크에 640mg 화합물 BP103m52(1.0eq), 15ml 물, 190mg NaHCO3(2.0eq)을 넣어 교반하고, 528mg화합물 BP103n02를 15ml DME(디메톡시에탄)에 용해시킨 용액을 첨가하며, 15ml THF를 추가하여 교반하고 하루밤을 지내며, TLC로 반응 모니터링 완료하고, 유기 용제를 증발 제거시키며, pH가 6이 되도록 초산으로 조절하고, 다이클로로메테인로 추출하며, 무수황산나트륨으로 건조하고 농축하여 오일 물질 0.65g 화합물 BP103m53을 얻는다.
Figure 112018018183958-pct00067
BP103m54의 제조
100mL 3구 플라스크에 화합물 BP103m53 3.0g(1.0eq), 1.1g Fmoc-1,2-에테인다이아민(1.05eq) 다이클로로메테인 30ml, DIEA 1.3g(3.0eq), DEPC 0.8g(1.5eq)를 넣어 TLC로 반응 모니터링 완료한 후, 0.1mol/L의 HCl/물로 세척하고, 탄산 수소 나트륨으로 세척하며, 물로 세척하고, 포화식염수로 세척하며, 무수 황산나트륨으로 건조한 후 칼럼크로마토그래피로 오일 물질 BP103m54 2.9g을 얻는다.
BP103m55의 제조
100mL 플라스크에 2.9g 화합물 BP103m54, 15ml 다이클로로메테인, 15mlTFA를 넣어 20℃에서 교반하고, TLC로 반응 모니터링 완료하며, 유기 용제를 증발 제거시키고, 석유 에터르로 펄프 반죽, 침출하며 건조하여 2.5g 오프 화이트 고체 BP103m55를 얻는다.
Figure 112018018183958-pct00068
20ml 반응 칼럼에 1.0g 2Cl-Trt 수지, 344mg BP103m55, 5ml 다이클로로메테인, 300ul DIEA를 넣어 40분간 질소 가스 버블링을 진행하고, 5ml 다이클로로메테인, 1ml 메탄올 , 1ml DIEA를 넣어 20분간 반응시킨 후 DMF로 세척하여 BP103m06 수지를 얻는다. Fmoc의 제거는 20%의 피페리딘/DMF를 사용하고 20분간 반응시키며, 커플링 시제는 HOBT/DIC를 사용하고, DMF는 반응 용제이며, 반응 모니터링은 닌히드린 검사법을 이용하고 차례로 아래의 보호 아미노산을 수지에 연결한다. Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asp(OtBu)OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, 마지막에 Fmoc 보호를 제거하고, 수지의 열분해는 82.5% TFA/5% 페놀/5% 물/2.5% EDT/5% 싸이오아니졸을 사용하고 차가운 MTBE로 침전, 세탁하고, 조품은 역상HPLC를 거쳐 정화되며, 목표 펩티드 순수물 46mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 5033.72[M+H]+
실시예32 화합물32의 제조
실시예 31의 방법을 참조하여 화합물32를 제조한다.
Figure 112018018183958-pct00069
최종적으로 목표 펩티드 순수물 46.8mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 5578.07[M+H]+
실시예33 화합물33의 제조
실시예 31의 방법을 참조하여 화합물33을 제조한다.
Figure 112018018183958-pct00070
최종적으로 목표 펩티드 순수물 46.4mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 5447.95[M+H]+
실시예34 화합물34의 제조
실시예 31의 방법을 참조하여 화합물34를 제조한다.
Figure 112018018183958-pct00071
최종적으로 목표 펩티드 순수물 46.5mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 5588.15[M+H]+
실시예35 화합물35의 제조
실시예 31의 방법을 참조하여 화합물35를 제조한다.
Figure 112018018183958-pct00072
최종적으로 목표 펩티드 순수물 46mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 5521.99[M+H]+
실시예36 화합물36의 제조
Figure 112018018183958-pct00073
BP103m60의 제조
500mL 플라스크에 10.0g BP103g06(1.0eq), 100ml 물, 4.5g NaHCO3(2.0eq)을 넣어 교반하고, 12.4g화합물 BP103n02(1.0eq)을 100ml DME(디메톡시에탄)에 용해시킨 용액을 첨가하며, 100ml THF더 추가하여 교반하고 하루밤을 지내며, TLC로 반응 모니터링 완료하고, 유기 용제를 증발 제거시키며, pH가 4가 되도록 초산으로 조절하고, 초산에틸로 추출하며, 무수황산나트륨으로 건조하고 농축하여 15.2g오프 화이트 고체 화합물 BP103m60을 얻는다.
Figure 112018018183958-pct00074
BP103m61의 제조
100mL 3구 플라스크에 화합물 BP103m44 3.0g(1.05eq), 3.1g (1.0eq)BP103m60, 다이클로로메테인 30ml, DIEA 1.7g(3.0eq), DEPC 1.1g(1.5eq)을 넣어 TLC로 반응 모니터링 완료한 후, 0.1mol/L의 HCl/물로 세척하고, 탄산 수소 나트륨으로 세척하며, 물로 세척하고, 포화식염수로 세척하며, 무수 황산나트륨으로 건조한 후 칼럼크로마토그래피로 오일 물질 BP103m61 4.1g을 얻는다.
BP103m62의 제조
100mL 플라스크에 4.1g 화합물 BP103m61, 20ml 다이클로로메테인, 20mlTFA를 넣어 20℃에서 교반하고, TLC로 반응 모니터링 완료하고, 유기 용제를 증발 제거시키며, 석유 에터르로 펄프 반죽, 침출하고 건조하여 3.5g 오프 화이트 고체 BP103m62를 얻는다.
BP103m63의 제조
250ml 3구 플라스크에 3.5g 화합물 BP103m62(1.0eq), 50ml 다이클로로메테인, 1.2g (Boc)2O(2.0eq)을 넣고1.1g DIEA(3.0eq)를 첨가하고 TLC로 반응 모니터링 완료한 후, 희염산으로 세척하고, 탄산수소나트륨 수용액으로 세척한 후 포화식염수로 세척하며, 무수황산나트륨으로 건조하여 칼럼크로마토그래피로 오프 화이트 고체의 BP103m63 2.6g을 얻는다.
Figure 112018018183958-pct00075
20ml 반응 칼럼에 1.0g 2Cl-Trt 수지, 408mg BP103m63, 5ml 다이클로로메테인, 300ul DIEA를 넣어 40분간 질소 가스 버블링을 진행하고, 5ml 다이클로로메테인, 1ml 메탄올, 1ml DIEA를 넣어 20분간 반응시킨 후 DMF로 세척하여 BP103m06 수지를 얻는다. Fmoc의 제거는 20%의 피페리딘/DMF를 사용하고 20분간 반응시키며, 커플링 시제는 HOBT/DIC를 사용하고, DMF는 반응 용제이며, 반응 모니터링은 닌히드린 검사법을 이용하고 차례로 아래의 보호 아미노산을 수지에 연결한다. Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asp(OtBu)OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, 마지막에 Fmoc 보호를 제거하고, 수지의 열분해는 82.5% TFA/5% 페놀/5% 물/2.5% EDT/5% 싸이오아니졸을 사용하고 차가운 MTBE로 침전, 세탁하고, 조품은 역상HPLC를 거쳐 정화되어 목표 펩티드 순수물 55mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 5107.81[M+H]+
실시예37 화합물37의 제조
실시예 36의 방법을 참조하여 화합물37을 제조한다.
Figure 112018018183958-pct00076
최종적으로 목표 펩티드 순수물 55.7mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 5564.1[M+H]+
실시예38 화합물38의 제조
실시예 36의 방법을 참조하여 화합물38을 제조한다.
Figure 112018018183958-pct00077
최종적으로 목표 펩티드 순수물 55mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 5433.98[M+H]+
실시예39 화합물39의 제조
실시예 36의 방법을 참조하여 화합물39를 얻는다.
Figure 112018018183958-pct00078
최종적으로 목표 펩티드 순수물 55.2mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 5574.18[M+H]+
실시예40 화합물40의 제조
실시예 36의 방법을 참조하여 화합물40을 제조한다.
Figure 112018018183958-pct00079
최종적으로 목표 펩티드 순수물 55.3mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 5508.02[M+H]+
실시예41 화합물41의 제조
Exendin-4(1-39)-Lys40(Alloc)-NH2의 제조
목표 펩티드의 고체상 펩티드는 Fmoc법을 이용하여 고체상으로 합성하고, Fmoc-Rink MBHA Amide 수지를 이용하고, 20%의 피페리딘/DMF를 사용하여 Fmoc를 제거하며, 커플링 시제는 HOBT/DIC를 사용하고, DMF는 반응 용제이며, 반응 모니터링은 닌히드린 검사법을 이용하고 차례로 아래의 보호 아미노산을 Rink MBHA Amide 수지에 연결한다. Fmoc-Lys(Alloc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asp(OtBu)OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, (BOC)2O(DIEA, 다이클로로메테인을 사용함). DMF로 세척하고 메탄올로 세척하며, 다이클로로메테인 세척 후 건조하여 12.1g Exendin-4(1-39)-Lys40(Alloc)-NH2 수지를 얻는다.
Figure 112018018183958-pct00080
화합물 a02의 제조
질소 가스 보호하에, 500ml 3구 플라스크에 200mL피리딘, 50g a01(1.0eq)을 넣어 교반하고 0℃로 온도를 낮추며, 몇차례에 거쳐 35.5g TsCl(1.0eq)를 추가하고 1시간 교반한 후 천천히 온도를 실온까지 올리며, 3-4 시간 계속 교반한다. 반응 완료한 후, 반응액을 차가운 희염산 용액에 부어넣고, 고체가 생성되며, 초산에틸을 추가하여 추출하며, 초산에틸층용 희염산으로 1번 세척하고, 포화 탄산수소나트륨으로 세척하며, 포화 식염수로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조하고, 강압하여 용제를 증발 제거하여, 실리카젤칼럼크로마토그래피로 a02순수물 38g을 얻는다.
화합물 a03의 제조
500mL 3구 플라스크에 38g a(1.0eq) 및 190mL DMSO를 넣어 균일하게 교반한 후, NaN3 11.5g(2.0eq)을 넣고, 50℃까지 가열하며 3시간 반응시키고 실온으로 온도를 낮추며, 반응액을 물에 부어넣고, 초산에틸로 여러번 추출하며, 유기상을 합병하여 무수황산나트륨으로 건조하고 농축하여 무색 액체 a03 40g을 얻는다.
화합물 a04의 제조
1L 수소화 반응기에 a03 70g, 메탄올 500mL, 팔라듐-탄소(Palladium on carbon) 8.0g을 넣어 교반하고, 질소가스로 치환하며, 질소가스를 불어넣어 3-4시간 반응시키고, TLC로 반응 모니터링 완료한 후, 반응액을 여과하며, 여과액을 농축하여 a04의 오일 물질 52g을 얻는다.
화합물 a05의 제조
250mL 3구 플라스크에 화합물 a04 10.0g(1.0eq), (Boc)2O 15.5g(2.0eq), 메탄올 : 트리에틸아민(9 : 1)의 혼합용액200ml를 넣어 교반하고 역류할 때까지 온도를 올려1시간 반응시키고, TLC로 반응 모니터링 완료한 후, 메탄올 트리에틸아민을 증발 제거시키고, 물을 추가하여 용해시키며, 다이클로로메테인으로 3번 추출하고, 유기층을 합병하고 1번 물세척하며, 무수황산나트륨으로 건조하고 농축하여 오일 물질 a05 9.0g을 얻는다.
화합물 a06의 제조
250mL 3구 플라스크에 a05 화합물7.0g(1.0eq), 톨루엔 및 THF 각각 40ml, 브로모아세트산 7.6g(3.0eq)을 넣어 교반하고, 45～50℃로 가열하며, 산화나트륨 4.4g을 더 추가하고, 반응시켜 하루밤 지내며, TLC로 반응 모니터링 완료한 후, 반응액을 증발 제거시켜, 물과 초산에틸을 추가하여 이물질을 추출하고, pH가 3이 되도록 수상으로 조절하며, 수상은 다이클로로메테인을 사용하여 추출하고, 다이클로로메테인층을 합병하며, 무수 황산나트륨으로 건조한 후 농축하여 a06오일 물질 화합물 4.2g을 얻는다.
화합물 a07의 제조
250mL에 1구 라운드 플라스크에 화합물 a06 4.0g, 20ml 초산에틸을 넣어 용해시켜 0℃로 온도를 낮추고, 20ml HCl/초산에틸(7mol/L)을 추가하여 TLC로 반응 모니터링을 종료한 후 농축하여 오일 물질 a07 4.2g을 얻는다.
화합물 a09의 제조
50mL 3구 플라스크에 1.0g 화합물 a08(1.0eq), 10ml 다이클로로메테인, 10ml t-부틸 알코올, 0.40g DIC(1.0eq), 0.39g DMAP(1.0eq)을 넣어 실온에서 교반하여 하루밤을 지내고, TLC로 반응 모니터링 완료하며, 에테르로 희석한 후 3번 물세척을 진행하고, 포화식염수로 세척하며, 무수황산나트륨으로 건조하여 칼럼크로마토그래피로 거품상 분말 a09 0.4g을 얻는다.
화합물 a10의 제조
100mL 3구 플라스크에 0.95g N-하이드록시석신이미드 (HOSU), 2.0g화합물 a09 및 15ml 다이클로로메테인을 넣고, 1.58g EDCHCl을 추가하고, 실온에서 2시간 반응시키며, TLC로 반응 모니터링 완료하고, 다이클로로메테인로 희석한 후 pH가 6.0인 50mmol/L의 인상이수소칼륨 수용액으로 2번 세척하고, 포화식염수로 세척하며, 무수황산나트륨으로 건조하고 농축하여 오일 물질2.6g화합물 a10을 얻는다.
화합물 a11의 제조
100mL 플라스크에 1.28g화합물 a07(1.0eq), 20ml 물, 1.16g NaHCO3(4.0eq)을 넣어 교반하고, 1.75g화합물 a10을 20ml DME(디메톡시에탄)에 용해시킨 용액을 첨가하며, 20ml THF을 추가하여 교반하고 하루밤을 지내며, TLC로 반응 모니터링 완료하고, 유기 용제를 증발 제거시키며, pH가 6이 되도록 초산으로 조절하고, 초산에틸로 추출하며, 무수황산나트륨으로 건조하고 농축하여 오프 화이트 고체를 얻고, 칼럼크로마토그래피로 0.95g 화합물 a11을 얻는다.
Figure 112018018183958-pct00081
1.5g Exendin-4(1-39)-Lys40-NH2수지, DMF팽윤 후 3eq의 Pd(PPh3)4의 CHCl3:AcOH:NMM(18:1:0.5)의 용액을 취하여 2시간 반응시킨 후 뒤이어 클로로포름으로 세척하고(6번, 매번 20ml 클로로포름), 20% HOAc의 다이클로로메테인 용액으로 세척하며(6번, 매번 20ml 20%HOAc의 다이클로로메테인 용액), 다이클로로메테인으로 세척하고(6번, 매번 20ml 다이클로로메테인),DMF으로 세척하며(6번, 매번 20ml DMF), 닌히드린 검사에서 양성을 나타내고, 5ml DMF, 415mg 화합물 a11, 150mg HOAT, 150ul DIC를 넣어 4시간 반응시키며, 닌히드린 검사에서 음성을 나타내고, 측쇄 a11이 이미 Exendin-4(1-39)-Lys40-NH2수지에 연결됨을 표시하고, 수지의 열분해는 82.5% TFA/5% 페놀/5% 물/2.5% EDT/5% 싸이오아니졸을 사용하여 진행하고, 뒤이어 차가운 t-부틸메틸에테르 (MTBE)로 침전, 세탁한다. 산물 조품은 HPLC로 순수화하여, 목표 화합물 43mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 4932.56[M+H]+
실시예42 화합물42의 제조
실시예41의 방법을 참조하여 화합물42를 제조한다.
Figure 112018018183958-pct00082
최종적으로 목표 펩티드 순수물 41mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 4725.38[M+H]+
실시예43 화합물43의 제조
실시예41의 방법을 참조하여 화합물43을 얻는다.
Figure 112018018183958-pct00083
최종적으로 목표 펩티드 순수물 41.5mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 5461.93[M+H]+
실시예44 화합물44의 제조
실시예41의 방법을 참조하여 화합물44를 얻는다.
Figure 112018018183958-pct00084
최종적으로 목표 펩티드 순수물 43mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 5161.83[M+H]+
실시예45 화합물45의 제조
실시예41의 방법을 참조하여 화합물45를 얻는다.
Figure 112018018183958-pct00085
최종적으로 목표 펩티드 순수물 42mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 5185.7[M+H]+
실시예46 화합물46의 제조
Exendin-4(1-39)-Orn40(Alloc)-NH2 수지의 제조
5g Fmoc-Rink MBHA Amide 수지를 취해 20%의 피페리딘/DMF를 사용하여 Fmoc를 제거하고, 커플링 시제는 HOBT/DIC을 사용하며, DMF는 반응 용제이고, 반응 모니터링은 닌히드린 검사법을 이용하며 차례로 아래의 보호 아미노산을 Rink MBHA Amide 수지에 연결한다. Fmoc-Orn(Alloc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asp(OtBu)OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, (Boc)2O(DIEA, 다이클로로메테인을 사용함). DMF로 세척하고 메탄올로 세척하며, 다이클로로메테인로 세척 후 건조하여 7.8g Exendin-4(1-39)-Orn40(Alloc)-NH2 수지를 얻는다.
Figure 112018018183958-pct00086
1.5g Exendin-4(1-39)-Orn40(Alloc)-NH2 수지를 취해, DMF팽윤 후 3eq의 Pd(PPh3)4의 CHCl3:AcOH:NMM(18:1:0.5) 용액을 추가하여, 2시간 반응시킨 후 뒤이어 클로로포름으로 세척하고(6번, 매번 20ml 클로로포름), 20% HOAc의 다이클로로메테인 용액으로 세척하며(6번, 매번 20ml 20%HOAc의 다이클로로메테인 용액), 다이클로로메테인으로 세척하고(6번, 매번 20ml 다이클로로메테인) DMF으로 세척하며(6번, 매번 20ml DMF), 닌히드린 검사에서 양성을 나타내고, 5ml DMF, 415mg 화합물 BP103m60, 150mg HOAT, 150ul DIC를 추가하여 4시간 반응시키며, 닌히드린 검사에서 음성을 나타내고, 측쇄BP103m60이 이미 Exendin-4(1-39)-Orn40-NH2수지에 연결되었음을 표시하며, 수지의 열분해는 82.5% TFA/5% 페놀/5% 물/2.5% EDT/5% 싸이오아니졸을 사용하여 진행하고, 뒤이어 차가운 t-부틸메틸에테르 (MTBE)로 침전, 세탁한다. 산물 조품은 HPLC로 순수화하여, 목표 화합물 41mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 4915.61[M+H]+
실시예47 화합물47의 제조
실시예 46의 방법을 참조하여 화합물47을 제조한다.
Figure 112018018183958-pct00087
최종적으로 목표 펩티드 순수물 42mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 4711.45[M+H]+
실시예48 화합물48의 제조
실시예 46의 방법을 참조하여 화합물48을 제조한다.
Figure 112018018183958-pct00088
최종적으로 목표 펩티드 순수물 43.4mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 5447.91[M+H]+
실시예49 화합물49의 제조
실시예 46의 방법을 참조하여 화합물49를 제조한다.
Figure 112018018183958-pct00089
최종적으로 목표 펩티드 순수물 43mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 5147.81[M+H]+
실시예50 화합물50의 제조
실시예 46의 방법을 참조하여 화합물50을 제조한다.
Figure 112018018183958-pct00090
최종적으로 목표 펩티드 순수물 42.8mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 5171.68[M+H]+
실시예51 화합물51의 제조
Figure 112018018183958-pct00091
화합물 a13의 제조
질소 가스 보호 하에, 1000ml 3구 플라스크에 200mL 피리딘, 120g a12(1.0eq)를 넣어 교반하고 0℃로 온도를 낮추며, 몇차례에 거쳐 151.8g TsCl(1.0eq)를 추가하고, 1시간 교반한 후 온도를 천천히 실온으로 올리며, 3-4 시간 계속 교반한다. 반응 완료한 후, 반응액을 차가운 희염산 용액에 부어넣고, 고체가 생성되며, 초산에틸을 추가하여 추출하며, 초산에틸층용 희염산으로 1번 세척하고, 포화 탄산수소나트륨으로 세척하며, 포화 식염수로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조하고, 강압하여 용제를 증발 제거하여119g 조품을 얻으며, 실리카젤칼럼크로마토그래피로 a13 순수물 55g을 얻는다.
화합물 a14의 제조
1000mL 3구 플라스크에 55g a13(1.0eq) 및160mL DMSO을 넣어 균일하게 교반한 후, NaN3 23.52g(2.0eq)을 추가하여 50℃까지 가열하고 3시간 반응시키며, 실온으로 온도를 낮추고, 반응액을 1.2L의 물에 부어넣고, 초산에틸로 추출하며, 유기상을 합병하여 무수황산나트륨으로 건조하고 농축하여 a14무색 액체 29.2g을 얻는다.
화합물 a15의 제조
1L 수소화 반응기에 29g 화합물 a14, 메탄올 360mL, 팔라듐-탄소(Palladium on carbon) 5.0g을 넣어 교반하고, 질소가스로 치환하며, 질소가스를 불어넣어 3-4시간 반응시키고, TLC로 반응 모니터링 완료한 후, 반응액을 여과하며, 여과액을 농축하여 a15의 오일 물질 23.5g을 얻는다.
화합물 a16의 제조
1L 3구 플라스크에 23.5g화합물 a15(1.0eq), 68.6g(Boc)2O(2.0eq), 메탄올 : 트리에틸아민(9 : 1)의 혼합용액500ml를 넣어 교반하고 역류할 때까지 온도를 올려1시간 반응시키고, TLC로 반응 모니터링 완료한 후, 메탄올 트리에틸아민을 증발 제거시키고, 물을 추가하여 용해시키며, 다이클로로메테인으로 3번 추출하고, 유기층을 합병하여 1번 물세척하고, 무수황산나트륨으로 건조하며, 용제를 증발 제거시키고 건조하여 고체 a16 34.8g을 얻는다.
화합물 a17의 제조
1000mL 3구 플라스크에 34.8g화합물 a16(1.0eq), 톨루엔 및 THF 각각 150ml, 브로모아세트산 58.2g(3eq)을 넣어 교반하고, 45～50℃로 가열하며, 수산화나트륨 33.5g(6eq)을 더 추가하고 반응시켜 하루밤 지내며, TLC로 반응 모니터링 완료한 후, 반응액을 증발 제거시켜, 물과 초산에틸을 추가하여 추출하고, pH가 3이 되도록 수상으로 조절하며, 수상은 다이클로로메테인을 사용하여 추출하고, 다이클로로메테인층을 합병하며, 무수 황산나트륨으로 건조한 후 농축하여 a17 오일 물질 화합물 18g을 얻는다.
화합물 a18의 제조
100mL 3구 플라스크에 286mg N-하이드록시석신이미드 (HOSU), 0.50g a17 및 5ml 다이클로로메테인 넣고, 477mg EDC·HCl을 추가하여, 실온에서 2시간 반응시키며, TLC로 반응 모니터링 완료하고, 다이클로로메테인로 희석한 후 pH가 6.0인 50mmol/L의 인상이수소칼륨 수용액으로 2번 세척하고, 포화식염수로 세척하며, 무수황산나트륨으로 건조하고 농축하여 오일 물질 0.72g 화합물 a18을 얻는다.
화합물 a19의 제조
100mL 플라스크에 0.62g화합물 a07(1.0eq), 10ml 물, 0.27g NaHCO3(2.0eq)을 넣어 교반하고, 0.66g화합물 a18을 10ml DME(디메톡시에탄)에 용해시킨 용액을 첨가하며, 5ml THF를 더 추가하고, 교반하여 하루밤을 지내며, TLC로 반응 모니터링 완료하고, 유기 용제를 증발 제거시키며, pH가 4가 되도록 희염산으로 조절하고, 다이클로로메테인으로 추출하며, 무수황산나트륨으로 건조하고 농축하여 오일 물질 0.71g 화합물 a19을 얻는다.
화합물 a20의 제조
100mL 플라스크에 0.71g화합물 a19, 5ml 초산에틸을 넣어 용해시켜 0℃로 온도를 낮추고, 5ml HCl/초산에틸(7mol/L)을 추가하여 0℃를 유지하고, TLC로 반응 모니터링을 종료한 후 농축하여 오일 물질 a20 0.71g을 얻는다.
화합물 a21의 제조
100mL 플라스크에 640mg화합물 a20(1.0eq), 15ml 물, 190mg NaHCO3(2.0eq)을 넣어 교반하고, 528mg화합물 a10을15ml DME(디메톡시에탄)에 용해시킨 용액을 첨가하며, 15ml THF을 더 추가하고 교반하여 하루밤을 지내며, TLC로 반응 모니터링 완료하고, 유기 용제를 증발 제거시키며, pH가 6이 되도록 초산으로 조절하고, 다이클로로메테인으로 추출하며, 무수황산나트륨으로 건조하고 농축하여 오일 물질 a21 0.65g을 얻는다.
Figure 112018018183958-pct00092
1.5g Exendin-4(1-39)-Lys40(Alloc)-NH2 수지를 취해 DMF팽윤 후 3eq의 Pd(PPh3)4의 CHCl3:AcOH:NMM(18:1:0.5)의 용액을 추가하여 2시간 반응시킨 후 뒤이어 클로로포름으로 세척하고(6번, 매번 20ml 클로로포름), 20% HOAc의 다이클로로메테인 용액으로 세척하며(6번, 매번 20ml 20%HOAc의 다이클로로메테인 용액), 다이클로로메테인으로 세척하고(6번, 매번 20ml 다이클로로메테인), DMF으로 세척하며(6번, 매번 20ml DMF), 닌히드린 검사에서 양성을 나타내고, 5ml DMF, 528mg 화합물 a21, 150mg HOAT(1-hydroxy-7-azobenzotriazole), 150ul DIC를 넣어 4시간 반응시키며, 닌히드린 검사에서 음성을 나타내고, 측쇄a21가 이미Exendin-4(1-39)-Lys40-NH2수지에 연결되었음을 표시하며, 수지의 열분해는 82.5% TFA/5% 페놀/5% 물/2.5% EDT/5% 싸이오아니졸을 사용하여 진행하고, 뒤이어 차가운 t-부틸메틸에테르 (MTBE)로 침전, 세탁한다. 산물 조품은 HPLC로 순수화하여, 목표 화합물 48mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 5123.50[M+H]+
실시예52 화합물52의 제조
실시예 51의 방법을 참조하여 화합물52를 제조한다.
Figure 112018018183958-pct00093
최종적으로 목표 펩티드 순수물 47.5mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 5178.76[M+H]+
실시예53 화합물53의 제조
실시예 51의 방법을 참조하여 화합물53을 제조한다.
Figure 112018018183958-pct00094
최종적으로 목표 펩티드 순수물 53mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 6223.43[M+H]+
실시예54 화합물54의 제조
실시예 51의 방법을 참조하여 화합물54를 제조한다.
Figure 112018018183958-pct00095
최종적으로 목표 펩티드 순수물 48.3mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 5306.91[M+H]+
실시예55 화합물55의 제조
실시예 51의 방법을 참조하여 화합물55를 제조한다.
Figure 112018018183958-pct00096
최종적으로 목표 펩티드 순수물 52.8mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 6123.32[M+H]+
실시예56 화합물56의 제조
Figure 112018018183958-pct00097
1.5g Exendin-4(1-39)-Orn40(Alloc)-NH2 수지를 취해 DMF팽윤 후 3eq의 Pd(PPh3)4의 CHCl3:AcOH:NMM(18:1:0.5)의 용액을 추가하여 2시간 반응시킨 후 뒤이어 클로로포름으로 세척하고(6번, 매번 20ml 클로로포름), 20% HOAc의 다이클로로메테인 용액으로 세척하며(6번, 매번 20ml 20%HOAc의 다이클로로메테인 용액), 다이클로로메테인으로 세척하고(6번, 매번 20ml 다이클로로메테인), DMF으로 세척하며(6번, 매번 20ml DMF), 닌히드린 검사에서 양성을 나타내고, 5mlDMF, 528mg 화합물 BP103m53, 150mg HOAT, 150ul DIC을 넣어 4시간 반응시키며, 닌히드린 검사에서 음성을 나타내고, 측쇄BP103m53이 이미 Exendin-4(1-39)-Orn40-NH2수지에 연결되었음을 표시하며, 수지의 열분해는 82.5% TFA/5% 페놀/5% 물/2.5% EDT/5% 싸이오아니졸을 사용하여 진행하고, 뒤이어 차가운 t-부틸메틸에테르 (MTBE)로 침전, 세탁한다. 산물 조품은 HPLC로 순수화하여, 목표 화합물47mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 5104.72[M+H]+
실시예57 화합물57의 제조
실시예 56의 방법을 참조하여 화합물57를 제조한다.
Figure 112018018183958-pct00098
최종적으로 목표 펩티드 순수물 48mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 5164.74[M+H]+
실시예58 화합물58의 제조
실시예 56의 방법을 참조하여 화합물58을 제조한다.
Figure 112018018183958-pct00099
최종적으로 목표 펩티드 순수물 51mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 6209.41[M+H]+
실시예59 화합물59의 제조
실시예 56의 방법을 참조하여 화합물59을 제조한다.
Figure 112018018183958-pct00100
최종적으로 목표 펩티드 순수물 47.6mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 5292.89[M+H]+
실시예60 화합물60의 제조
실시예 56의 방법을 참조하여 화합물60을 제조한다.
Figure 112018018183958-pct00101
최종적으로 목표 펩티드 순수물 49.7mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 6109.3[M+H]+
실시예61 화합물61의 제조
Exendin-4(1-39)-Cys(40)-NH2의 제조
목표 펩티드의 고체상 펩티드는 Fmoc법을 이용하여 고체상으로 합성하고, Fmoc-Rink MBHAAmide 수지를 이용하여, 20%의 피페리딘/DMF를 사용하여 Fmoc를 제고하고, 커플링 시제는 HOBT/DIC사용하고, DMF는 반응 용제이며, 반응 모니터링은 닌히드린 검사법을 이용하고 차례로 아래의 보호 아미노산을 Rink MBHA Amide 수지에 연결한다. Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asp(OtBu)OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, 마지막에 Fmoc 보호를 제거하고, DMF로 세척하여 다이클로로메테인으로 세척하고, MeOH 세척 후 건조하여 전보호를 함유한 수지을 얻으며 수지의 열분해는 82.5% TFA/5% 페놀/5% 물/2.5% EDT/5% 싸이오아니졸을 사용하고, 차가운 MTBE로 침전, 세탁하고, 조품은 역상HPLC를 거쳐 정화되며, Exendin-4(1-39)-Cys(40)-NH2 순수물을 얻는다.
Figure 112018018183958-pct00102
BG02의 제조
질소 가스 보호하에, 500ml 3구 플라스크에 200mL 피리딘, 18.8g BG01(1.0eq)을 넣어 교반하고 0℃로 온도를 낮추며, 몇차례에 거쳐 35.5g TsCl(1.0eq)을 추가하고 1시간 교반한 후 천천히 온도를 실온까지 올리며, 3-4시간 계속 교반한다. 반응 완료한 후, 반응액을 차가운 희염산 용액에 부어넣고, 고체가 생성되며, 초산에틸을 추가하여 추출하며, 초산에틸층용 희염산으로 1번 세척하고, 포화 탄산수소나트륨으로 세척하며, 포화 식염수로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조하고, 강압하여 용제를 증발 제거하여, 실리카젤칼럼크로마토그래피로 BG02 순수물 22.7g을 얻는다.
BG03의 제조
500mL 3구 플라스크에 22.7g BG02(1.0eq) 및 190mL DMSO를 넣어 균일하게 교반한 후, NaN3 11.5g(2.0eq)을 추가하여 50℃까지 가열하고 3시간 반응시키며, 실온으로 온도를 낮추고, 반응액을 물에 부어넣으며, 초산에틸로 여러번 추출하고, 유기상을 합병하여 무수황산나트륨으로 건조하고 농축하여 무색 액체 BG03 17.1g을 얻는다.
BG04의 제조
1L 수소화 반응기에 BG03 30g, 메탄올 500mL, 팔라듐-탄소(Palladium on carbon) 8.0g을 넣어 교반하고, 질소가스로 치환하며, 질소가스를 불어넣어 3-4시간 반응하고, TLC로 반응 모니터링 완료한 후, 반응액을 여과하며, 여과액을 농축하여 BG04의 오일 물질19.4g을 얻는다.
BG05의 제조
500mL 3구 플라스크에 화합물 BG04 3.7g(1.0eq), (Boc)2O 15.5g(2.0eq), 메탄올 : 트리에틸아민(9 : 1)의 혼합용액200ml를 넣어 교반하고 역류할 때까지 온도를 올려1시간 반응시키고, TLC로 반응 모니터링 완료한 후, 메탄올 트리에틸아민을 증발 제거시키고, 물을 추가하여 용해시키며, 다이클로로메테인으로 3번 추출하고, 유기층을 합병하여 1번 물 세척하며, 무수황산나트륨으로 건조하고 농축하여 오일 물질 BG05 4.8g을 얻는다.
BG06의 제조250mL 3구 플라스크에 BG05 화합물 3.7g(1.0eq), 톨루엔 및 THF 각각 40ml, 브로모아세트산 7.6g(3.0eq)을 넣어 교반하고, 45～50℃로 가열하며, 수산화나트륨 4.4g을 더 추가하여 반응시키고 하루밤 지내며, TLC로 반응 모니터링 완료한 후, 반응액을 증발 제거시켜, 물과 초산에틸을 추가하여 이물질을 추출하고, pH가 3이 되도록 수상으로 조절하며, 수상은 다이클로로메테인을 사용하여 추출하고, 다이클로로메테인층을 합병하며, 무수 황산나트륨으로 건조한 후 농축하여 BG06 오일 물질 화합물 2.5g을 얻는다.
BG07의 제조
100mL 1구 라운드 플라스크에 화합물 BG06 2.4g, 20ml 초산에틸을 넣어 용해시켜 0℃로 온도를 낮추고, 20ml HCl/초산에틸(7mol/L)을 추가하여 TLC로 반응 모니터링을 종료한 후 농축하여 오일 물질 BG07 2.3g을 얻는다.
BG08의 제조
200mL 3구 플라스크에 3.5g화합물 BG07(1.0eq), 1.7g 무수말레인산(1.0eq), 70ml 초산을 넣어 역류할 때까지 가열하고 하루밤을 지내고, TLC로 반응 모니터링 완료하며, 초산을 증발 제거시키고, 초산에틸을 추가하여 용해시킨 후 물로 3번 세척하며, 포화염화나트륨으로 3번 세척하고, 무수황산나트륨으로 건조하여 칼럼크로마토그래피로 오프 화이트 고체 BG08 1.8g을 얻는다.
BG09의 제조
100mL 3구 플라스크에 1.30g (1.53eq)N-하이드록시석신이미드(HOSU), 3.1g 화합물 BG08 1.8g 및 15ml 다이클로로메테인을 넣고, 2.16g EDC·HCl(1.53eq)을 추가하여 실온에서 2시간 반응시키며, TLC로 반응 모니터링 완료하고, 다이클로로메테인로 희석한 후 pH가 6.0인 50mmol/L의 인상이수소칼륨 수용액으로 2번 세척하고, 포화식염수로 세척하며, 무수황산나트륨으로 건조하고 농축하여 오프 화이트 2.2g 화합물 BG09을 얻는다.
BG11의 제조
50mL 3구 플라스크에 2.17g화합물 BG10(1.0eq), 10ml 다이클로로메테인, 10mlt-부틸 알코올, 0.40g DIC(1.0eq), 0.39g DMAP(1.0eq)를 넣어 실온에서 교반하여 하루밤을 지내고, TLC로 반응 모니터링 완료하고, 에테르로 희석한 후 3번 물세척을 진행하고, 포화식염수로 세척하며, 무수황산나트륨으로 건조하여 칼럼크로마토그래피로 거품상 분말 BG11 0.6g을 얻는다.
BG12의 제조
100mL 3구 플라스크에 0.95g N-하이드록시석신이미드(HOSU), 3.1g 화합물 BG11 및 15ml 다이클로로메테인을 넣고 1.58g EDC·HCl을 추가하여 실온에서 2시간 반응시키며, TLC로 반응 모니터링 완료하고, 다이클로로메테인로 희석한 후 pH가 6.0인 50mmol/L의 인상이수소칼륨 수용액으로 2번 세척하고, 포화식염수로 세척하며, 무수황산나트륨으로 건조하고 농축하여 백색 고체 3.3g화합물 BG12를 얻는다.
BG14의 제조
200mL 플라스크에 2.8g화합물 BG13(1.05eq), 50ml 물, 1.8g NaHCO3(2.0eq)을 넣어 교반하고, 6.4g화합물 BG12(1.0eq)를 50ml DME(디메톡시에탄)에 용해시킨 용액을 첨가하고, 50ml THF를 더 추가하여, 교반하고 하루밤을 지내며, TLC로 반응 모니터링 완료하고, 유기 용제를 증발 제거시키며, pH가 4가 되도록 초산으로 조절하고, 초산에틸로 추출하며, 무수황산나트륨으로 건조하고 농축하여 6.9g 오프 화이트 고체 화합물 BG14을 얻는다.
BG15의 제조
100mL 플라스크에 6.9g 화합물 BG14, 30ml 다이클로로메테인, 30ml TFA를 넣어 20℃에서 교반하고, TLC로 반응 모니터링 완료하고, 유기 용제를 증발 제거시키며, 석유 에터르로 펄프 반죽, 침출하고 건조하여 5.35g 오프 화이트 고체 BG15를 얻는다.
BG16의 제조
100mL 플라스크에 1.27g 화합물 BG15(1.0eq), 10ml 물, 0.36g NaHCO3(2.0eq)을 넣어 교반하고, 0.72g화합물 BG09(1.0eq)을 10ml DME(디메톡시에탄)에 용해시킨 용액을 첨가하며, 10ml THF를 추가하여 교반하고 하루밤을 지내며, TLC로 반응 모니터링 완료하고, 유기 용제를 증발 제거시키며, pH가 6이 되도록 초산으로 조절하고, 초산에틸로 추출하며, 유기상을 물로 세척하고, 포화식염수로 세척한 후 무수황산나트륨으로 건조하고 농축하여 칼럼크로마토그래피로 0.9g오프 화이트 고체 화합물 BG16을 얻는다.
Figure 112018018183958-pct00103
50.0mg Exendin-4(1-39)-Cys(40)-NH2를 10ml 20mM의 인산나트륨염에 용해시킨 완충용액(pH 6.5)을 취해 16mg BG16을 추가하여 20℃ 조건 하에서 1시간 교반하고, HPLC로 반응 모니터링 완료한 후, 과량의 시스테인 용액(0.5ml 0.5M시스테인용액)으로 반응을 정지시키고, HPLC 제조 후 동결 건조하여 커플링 화합물 30mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 4926.49[M+H]+.
실시예62 화합물62의 제조
실시예 61의 방법을 참조하여 화합물62를 제조한다.
Figure 112018018183958-pct00104
산물 조품은 HPLC로 순수화하여, 목표 화합물 31mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 4918.41[M+H]+.
실시예63 화합물63의 제조
실시예 61의 방법을 참조하여 화합물63을 제조한다.
Figure 112018018183958-pct00105
산물 조품은 HPLC로 순수화하여, 목표 화합물31mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 5046.53[M+H]+.
실시예64 화합물64의 제조
실시예 61의 방법을 참조하여 화합물64를 제조한다.
Figure 112018018183958-pct00106
산물 조품은 HPLC로 순수화하여, 목표 화합물 29mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 5022.46[M+H]+.
실시예65 화합물65의 제조
실시예 61의 방법을 참조하여 화합물65를 제조한다.
Figure 112018018183958-pct00107
산물 조품은 HPLC로 순수화하여, 목표 화합물 34mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 5222.63[M+H]+.
실시예66 화합물66의 제조
실시예 61의 방법을 참조하여 화합물66을 제조한다.
Figure 112018018183958-pct00108
산물 조품은 HPLC로 순수화하여, 목표 화합물 32mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 5126.5[M+H]+.
실시예67 화합물67의 제조
Figure 112018018183958-pct00109
화합물 BP103m50의 제조
100mL 3구 플라스크에 286mg N-하이드록시석신이미드(HOSU), 0.50g BP103a05 및 5ml 다이클로로메테인을 넣고, 477mg EDC.HCl를 추가하여 실온에서 2시간 반응시키며, TLC로 반응 모니터링 완료하고, 다이클로로메테인로 희석한 후 pH가 6.0인 50mmol/L의 인상이수소칼륨 수용액으로 2번 세척하고, 포화식염수로 세척하며, 무수황산나트륨으로 건조하고 농축하여 오일 물질 0.72g 화합물 BP103m50을 얻는다.
화합물 BP103m51의 제조
100mL 플라스크에 0.62g화합물 BP103g06(1.0eq), 10ml 물, 0.27g NaHCO3(2.0eq)을 넣어 교반하고, 0.66g화합물 BP103m50을 10ml DME(디메톡시에탄)에 용해시킨 용액을 첨가하며, 5ml THF를 더 추가하여 교반하고 하루밤을 지내며, TLC로 반응 모니터링 완료하고, 유기 용제를 증발 제거시키며, pH가 4가 되도록 희염산으로 조절하고, 다이클로로메테인으로 추출하며, 무수황산나트륨으로 건조하고 농축하여 오일 물질0.71g 화합물 BP103m51을 얻는다.
화합물 BP103m52의 제조
100mL 플라스크에 0.71g 화합물 BP103m51, 5ml 초산에틸을 넣어 용해시켜 0℃로 온도를 낮추고, 5ml HCl/초산에틸(7mol/L)을 추가하고 0℃를 유지하며, TLC로 반응 모니터링을 종료한 후 농축하여 오일 물질 BP103m52 0.71g을 얻는다.
Figure 112018018183958-pct00110
화합물 BP103n01의 제조
50mL 3구 플라스크에 1.0g 화합물 BP103n00(1.0eq), 10ml 다이클로로메테인, 10ml 삼차-부틸 알코올, 0.40g DIC(1.0eq), 0.39g DMAP(1.0eq)를 넣어 실온에서 교반하여 하루밤을 지내고, TLC로 반응 모니터링 완료하고, 에테르로 희석한 후 3번 물 세척을 진행하고, 포화식염수로 세척하며, 무수황산나트륨으로 건조하여 칼럼크로마토그래피로 거품상 분말 BP103n01 0.4g을 얻는다.
화합물 BP103n02의 제조
100mL 3구 플라스크에 0.95g N-하이드록시석신이미드(HOSU), 2.0g 화합물 BP103n01 및 15ml 다이클로로메테인을 넣고, 1.58g EDC.HCl를 추가하여 실온에서 2시간 반응시키며, TLC로 반응 모니터링 완료하고, 다이클로로메테인로 희석한 후 pH가 6.0인 50mmol/L의 인상이수소칼륨 수용액으로 2번 세척하고, 포화식염수로 세척하며, 무수황산나트륨으로 건조하고 농축하여 백색 고체 2.6g 화합물 BP103n02을 얻는다.
화합물 BP103m70의 제조
100mL 플라스크에 0.50g화합물H-Glu-OtBu.HCl(1.0eq), 10ml 물, 350mg NaHCO3(2.0eq)을 넣어 교반하고, 0.96g화합물 BP103n02(1.0eq)를 10ml DME(디메톡시에탄)에 용해시킨 용액을 추가하고, 10ml THF를 더 추가하여 교반하고 하루밤을 지내며, TLC로 반응 모니터링 완료하고, 유기 용제를 증발 제거시키며, pH가 6이 되도록 초산으로 조절하고, 다이클로로메테인으로 추출하며, 무수황산나트륨으로 건조하고 농축하여 오일 물질 1.09g 화합물 BP103m70을 얻는다.
화합물 BP103m71의 제조
100mL 3구 플라스크에 1.0g 화합물 BP103m70, 317mg N-하이드록시석신이미드(HOSU)(1.53eq), 및 10ml 다이클로로메테인을 넣고 528mg EDC.HCl(1.53eq)을 추가하여 실온에서 2시간 반응시키며, TLC로 반응 모니터링 완료하고, 다이클로로메테인로 희석한 후 pH가 6.0인 50mmol/L의 인상이수소칼륨 수용액으로 2번 세척하고, 포화식염수로 세척하며, 무수황산나트륨으로 건조하고 농축하여 백색 고체 1.07g 화합물 BP103m71을 얻는다.
화합물 BP103m72의 제조
100mL 플라스크에 0.87g 화합물 BP103m52(1.0eq), 10ml 물, 300mg NaHCO3(2.0eq)을 넣어 교반하고, 1.00g 화합물 BP103m71(1.0eq)을 10ml DME(디메톡시에탄)에 용해시킨 용액을 추가하며, 10ml THF를 더 추가하고, 교반하여 하루밤을 지내며 TLC로 반응 모니터링 완료하고, 유기 용제를 증발 제거시키며, pH가 6이 되도록 초산으로 조절하고, 다이클로로메테인으로 추출하며, 무수황산나트륨으로 건조하고 농축하여 오일 물질 1.22g 화합물 BP103m72를 얻는다.
Figure 112018018183958-pct00111
목표 펩티드의 합성
1.5g Exendin-4(1-39)-Lys40(Alloc)-NH2수지를 취해 DMF팽윤 후 3eq의 Pd(PPh3)4의 CHCl3:AcOH:NMM(18:1:0.5)의 용액에 추가하여 2시간 반응시킨 후 뒤이어 클로로포름으로 세척하고(6번, 매번 20ml 클로로포름), 20%HOAc의DCM(다이클로로메테인)용액으로 세퍽하며(6번, 매번 20ml 20%HOAc DCM용액), DCM으로 세척하고(6번, 매번 20ml DCM), DMF로 세척하며(6번, 매번 20ml DMF), 닌히드린 검사에서 양성을 나타내고, 加入5mlDMF, 640mg화합물 BP103m72, 150mg HOAT, 150ul DIC,4시간 반응시키며, 닌히드린 검사에서 음성을 나타내고, 측쇄BP103m72가 이미Exendin-4(1-39)-Lys40-NH2수지에 연결되었음을 표시하며, 수지의 열분해는 82.5% TFA/5% 페놀/5% 물/2.5% EDT/5% 싸이오아니졸을 사용하여 진행하고, 뒤이어 차가운 t-부틸메틸에테르 (MTBE)로 침전, 세탁한다. 산물 조품은 HPLC로 순수화하고, 동결 건조하여, 목표 화합물48mg을 얻는다.
MS(ESI+,m/e) : 5252.54[M+H]+.

Claims (10)

  1. 엑세나타이드 수식물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에 있어서, 식(Ⅰ)로 나타내고,
    (Ex-4)-L-Y (Ⅰ)
    여기서, Ex-4는 Exendin-4이고; L은
    Figure 112019064778905-pct00120
    이고 Ex-4와 Y를 연결하며; L'는 친수성 연결암이며; Y는 말단에 카르복실기를 가지는 지방사슬이고,
    여기서 상기 엑세나타이드 수식물은:
    Figure 112019064778905-pct00121
    이고,
    여기서, k는 6-20 사이의 임의의 정수이되,
    상기 L은
    Figure 112019064778905-pct00122

    Figure 112019064778905-pct00123

    에서 선택되고,
    여기서, m은 2-20사이의 임의의 정수이고, n은 2-20사이의 임의의 정수이며, r은 1-6사이의 임의의 정수인 것을 특징으로 하는 엑세나타이드 수식물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    L’는 에테르기를 함유한 친수성 사슬인 것을 특징으로 하는 엑세나타이드 수식물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서,
    Figure 112019027314506-pct00116

    Figure 112019027314506-pct00117
    이고,
    여기서, m은 2-20사이의 임의의 정수이고, n은 2-20사이의 임의의 정수이며, r은 1-6사이의 임의의 정수이고, k는 6-20사이의 임의의 정수인 것을 특징으로 하는 엑세나타이드 수식물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 엑세나타이드 수식물은 이하의 화합물
    Figure 112019027314506-pct00118


    Figure 112019027314506-pct00119
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상인 것을 특징으로 하는 엑세나타이드 수식물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  8. 당 대사 관련 질병 및/또는 증상, 당뇨병, 또는 지방간의 치료 또는 예방을 위한, 또는 체중 감량을 위한 제1항 또는 제3항에 따른 엑세나타이드 수식물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  9. 제1항 또는 제3항에 기재된 엑세나타이드 수식물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 및 임의의 약학적으로 허용 가능한 담체를 함유하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    당 대사 관련 질병 및/또는 증상, 당뇨병, 또는 지방간의 치료 또는 예방을 위한, 또는 체중 감량을 위한 약학적 조성물.
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