JP2018531217A6 - エキセナチド修飾物及びその用途 - Google Patents
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Abstract
【課題】
従来のエキセナチド修飾物GLP−1受容体の結合力が低く、低血糖時間が短いという欠点を克服すること。
【解決手段】
親水性のスペーサーアームによりエキセナチドと末端にカルボキシル基を有する脂肪鎖と接続したエキセナチド修飾物 (Ex−4)−L−Y (I)、及びそのGLP−1受容体アゴニストとしての薬物の製造における用途、GLP−1受容体活性低下に関連する疾患及び/又は症状の予防及び/又は治療に用いられる薬物の製造における用途、糖代謝に関連する疾患及び/又は症状に用いられる薬物の製造における用途、糖尿病用薬物の製造における用途、脂肪肝用薬物の製造における用途、及びダイエット用薬物の製造における用途で解決する。
従来のエキセナチド修飾物GLP−1受容体の結合力が低く、低血糖時間が短いという欠点を克服すること。
【解決手段】
親水性のスペーサーアームによりエキセナチドと末端にカルボキシル基を有する脂肪鎖と接続したエキセナチド修飾物 (Ex−4)−L−Y (I)、及びそのGLP−1受容体アゴニストとしての薬物の製造における用途、GLP−1受容体活性低下に関連する疾患及び/又は症状の予防及び/又は治療に用いられる薬物の製造における用途、糖代謝に関連する疾患及び/又は症状に用いられる薬物の製造における用途、糖尿病用薬物の製造における用途、脂肪肝用薬物の製造における用途、及びダイエット用薬物の製造における用途で解決する。
Description
本発明は、治療用ペプチドの分野に関し、具体的には、エキセナチド修飾物、製造方法、それらを含む薬物組成物、及びその修飾物と組成物の糖代謝関連疾患の治療における用途に関する。
エキセナチド(エキセンジン4、エクセナチド、Exenatide又はExendin−4とも呼ばれ、商品名がByettaである)は、39個のアミノ酸からなるペプチドであり、その分子量は4186.6で、分子式はC184H282N50O60Sで、アミノ酸配列はHis−Gly−Glu−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Leu−Ser−Lys−Gln−Met−Glu−Glu−Glu−Ala−Val−Arg−Leu−Phe−Ile−Glu−Trp−Leu−Lys−Asn−Gly−Gly−Pro−Ser−Ser−Gly−Ala−Pro−Pro−Pro−Ser−NH2であり、Amylin Pharmaceuticals社とEli Lilly社(Eli Lilly and Company)により製造販売される。エキセナチドは、2005年4月にFDAにより販売を承認され、皮下注射製剤に属し、グルコース依存的インスリン分泌を促進し、第1相インスリン分泌を回復させ、グルカゴンの分泌を抑制し、胃の内容物の排出速度を低下させ、膵臓β細胞の機能を改善するなどの役割を果たし、2型糖尿病の治療に好適に用いられ、例えば、メトホルミン及びスルホニルウレア系薬物での治療が望ましくない2型糖尿病患者の血糖の改善と抑制に用いられる。
エキセナチドは、米国南西部の数州に生息しているトカゲであるヒラモンスター(Gilamonster)の唾液中のホルモンexendin−4の合成形態(J.Biol.Chem.1990,265,20259−20262;J.Biol.Chem.1992,267,7402−7405)で、ヒトグルカゴン様ペプチド−1(GLP−1)の類似体であり、そのアミノ酸配列はGLP−1のアミノ酸配列と部分的に重なり、比較的に有効なGLP−1受容体アゴニストであり、エキセナチドがGLP−1のグルコース調節作用を模擬するため、インクレチンアゴニストとも呼ばれている。エキセナチドは、スルホニルウレア及びメグリチニド系(meglitinides)とは違って、グルコースの存在下でのみインスリンの合成と分泌を向上させ、低血糖のリスクを低減させる。Byettaをインスリン抵抗性の治療に用いる医者もいる。
それでも、タンパク質/ペプチド系薬物に、体内半減期が短く、物理的、化学的安定性が低く、体内の様々なプロテアーゼに分解されやすいなどの特性が一般的に存在しているため、これらの薬物は、通常、一日中数回の注射を必要とし、患者に多くの苦痛や不便をもたらす。1970年代に現れたポリエチレングリコール化技術は、現在のタンパク質/ペプチド系投与分野における好適な技術であると証明されている。しかし、単にPEGで修飾すると、薬物の活性が一般的に低減する。
体内でのより長い作用持続時間を提供するために、一連の異なる方法は、GLP−1類似体の構造の修飾に用いられている。CN1384755には、新規なexendinアゴニスト製剤及びその投与方法が開示され、その中にエキセナチドの化合物構造及びその製造方法が開示されている。CN102532303には、メトキシポリエチレングリコール残基をエキセナチド分子中のリシン残基のアミノ基又はN末端ヒスチジン残基のアミノ基と結合して、ポリエチレングリコールが結合されたエキセナチドを合成する方法が開示され、CN101980725には、脂肪酸−PEG−エキセナチドの構造が開示され、かつPEGの修飾部位がN末端Hisにあり、WO2005028516とWO2012035139にも、脂肪酸−PEG−エキセナチドの構造が開示されている。中国特許CN101215324には、エキセナチドの構造を変更して取得されたエキセナチドの短鎖ペプチド模倣体が開示されている。中国特許CN101125207には、Exendin−4に対するPEG修飾が報告されている。WO99/43708には、C末端アミノ酸残基に接続された親油性置換体を有するGLP−1(7−35)とGLP−1(7−36)誘導体が開示されている。WO2013059323A1には、PEGで結合されたエキセナチド及び製造方法が開示されている。
CN102397558には、Exendin−4の中の一部のアミノ酸をシステインで置換した後、PEG又は末端がメチル基で置換されたPEGで修飾することが開示されている。CN102421796には、1つ以上のポリエチレングリコールをExendin変異体のシステインに重合することが開示され、エキセナチド中の1つのアミノ酸をシステインで置換し、次にシステインにおいてポリエチレングリコールで修飾することが開示されている。CN102827270には、Exendin−4−Cys−PEG誘導体が開示され、具体的には、エキセナチド分子の非活性領域C末端に1つのシステインを導入し、マレイミド基ポリエチレングリコールをカップリングし、ポリエチレングリコール末端をメチル基で封鎖する。
これらの多方面で努力を重ねたが、従来のExendin−4又はその変異体及び各種の修飾形態には、まだ、体内使用の場合に投与頻度が高く、患者の体、心理及び経済に大きな負担をかけて、患者の投薬コンプライアンスを制限し、広く応用できないことを含むいくつかの欠点がある。糖尿病集団には、長時間作用型活性GLP−1類似体に対する巨大な需要があり、体内での作用時間が長く、安定性が高く、血糖降下効果が高いとともに、毒性が低く、活性を高くする新規なエキセナチド誘導体を開発する必要がある。
J.Biol.Chem.1990,265,20259−20262
J.Biol.Chem.1992,267,7402−7405
本発明の解決しようとする技術課題は、従来のエキセナチド修飾物GLP−1受容体の結合力が低く、低血糖持続時間が短いため、臨床使用効果が低いか又は注射が頻繁であるという欠点を克服することである。
当業者にとって、ポリマー基が結合された生物活性分子において、結合基の分子量の増加に従って、結合生物分子の生物活性が指数関数的に徐々に低下することは既知である。また、当業者にとって、前記ポリマー基の分子量の増加に従って、該結合体分子の生物学的半減期及び/又は血漿半減期と全身性薬物暴露が徐々に延長又は増加することも既知である。
本発明者は、エキセナチドを修飾することにより、薬物動態学的性質を改善して低血糖持続時間が増加しただけでなく、エキセナチドに比べて、本発明の分子が依然として大部分のGLP−1受容体アゴニスト活性を保持したことを意外に発見した。これは、本発明の分子はGLP−1受容体アゴニスト活性が高いだけでなく、低血糖持続時間が長く、将来の臨床において体内作用時間が長く、安定性が高く、血糖降下効果が高い薬物になる可能性があることを意味している。
本発明の第1の形態は、式(I)で示される、エキセナチド修飾物又はその薬学的に使用可能な塩を提供する。
(Ex−4)−L−Y (I)
(ここで、Ex−4は、Exendin−4であり、Lは、Ex−4とYを接続する親水性のスペーサーアームであり、Yは、末端にカルボキシル基を有する脂肪鎖である)
(Ex−4)−L−Y (I)
(ここで、Ex−4は、Exendin−4であり、Lは、Ex−4とYを接続する親水性のスペーサーアームであり、Yは、末端にカルボキシル基を有する脂肪鎖である)
さらに、本発明のエキセナチド修飾物(Ex−4)−L−Yにおいて、親水性のスペーサーアームLは、下記化合物から選択される。
(ここで、mは、2〜20の間の任意の整数であり、nは、2〜20の間の任意の整数であり、rは、1〜6の間の任意の整数である)
(ここで、mは、2〜20の間の任意の整数であり、nは、2〜20の間の任意の整数であり、rは、1〜6の間の任意の整数である)
本発明は、好ましくは、下記エキセナチド修飾物である。
(ここで、mは、2〜20の間の任意の整数であり、nは、2〜20の間の任意の整数であり、rは、1〜6の間の任意の整数であり、kは、6〜20の間の任意の整数である)
(ここで、mは、2〜20の間の任意の整数であり、nは、2〜20の間の任意の整数であり、rは、1〜6の間の任意の整数であり、kは、6〜20の間の任意の整数である)
本発明の第2の形態は、前記エキセナチド修飾物又はその薬学的に使用可能な塩の、GLP−1受容体アゴニストとしての薬物の製造における用途、GLP−1受容体活性低下に関連する疾患及び/又は症状の予防及び/又は治療に用いられる薬物の製造における用途、糖代謝に関連する疾患及び/又は症状に用いられる薬物の製造における用途、糖尿病用薬物の製造における用途、脂肪肝用薬物の製造における用途、及びダイエット用薬物の製造における用途を提供する。
本発明の第3の形態は、前記エキセナチド修飾物又はその薬学的に使用可能な塩と、任意の薬学的に許容可能な担体とを含む組成物を提供する。
本発明の第4の形態は、上記組成物の、GLP−1受容体アゴニストとしての薬物の製造における用途、GLP−1受容体活性低下に関連する疾患及び/又は症状の予防及び/又は治療に用いられる薬物の製造における用途、糖代謝に関連する疾患及び/又は症状に用いられる薬物の製造における用途、尿病用薬物の製造における用途、脂肪肝用薬物の製造における用途、及びダイエット用薬物の製造における用途を提供する。
本発明に係るエキセナチド修飾物は、GLP−1受容体アゴニスト活性が高いだけではなく、低血糖持続時間が長い。以下、薬理試験により説明する。
各試料をそれぞれ再蒸留水に溶解させ、最終濃度を1.0×10−2mol/Lとし、4℃で保存する。PC12細胞を25cm2の培養瓶に培養し、CO2培養器(37℃、95%空気、5%CO2)に置き、培養器は、DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium,pH=7.4、高グルコース)を用い、5%のウシ胎仔血清及び10%のウマ血清を添加する。成長状態が良好なPC12細胞を0.25%のトリプシンで消化し、細胞濃度を1.0×105個/mlに調整して24ウェルプレートに播種し、細胞が密度60−70%まで成長すると、PBS(Phosphate Buffer Saline)で2回洗浄し、1%のBSA( Bovine Serum Albumin)を含むPBSをそれぞれ1ml添加し、試験薬物をそれぞれ5段の濃度(10−10、10−9、10−8、10−7、10−6mol/L)に分けて、IBMX(3−isobutyl−1−methylxanthine,100μmol/L)と共に30minインキュベートし、各濃度のサンプルは3つの反複ウェルで操作する。薬物関与時間が終了すると、直ちに細胞を収集し、冷たいPBSで細胞を懸濁させ、細胞濃度を1.0×107個/mlに調整し、直ちに1体積部のIN HClを9体積部の細胞懸濁液に添加し、室温で10minインキュベートし、超音波装置で15s超音波処理する。4℃、1000rpmで10min遠心して細胞片を除去し、上清液を1N HClと同じ体積の1N NaOHに添加して中和(ここで1Nは1当量を表す)させ、取得した溶液がcAMPを含むサンプル溶液であり、−20℃下で保存して測定に備える。Non−Interfering Protein Assayキットを用いてサンプルの中の総タンパク量の濃度を測定する。ELISAキットを用いて細胞溶解液の中のcAMPの含量を測定し、キットの説明書に従って操作し、BIO−RAD 680マイクロプレートリーダーを用いて450nmでOD(Optical Density)値を測定する。標準試料のOD値に基づいてCurveExpert 1.3ソフトウェアを用いて曲線をフィッティングしかつ標準曲線公式を算出して、各サンプルの濃度を計算する。コンピュータプログラムMicrosoft ExcelとGraphPad Prism 5ソフトウェアを用いてデータ処理と作図を行って、各試験薬物のEC50(半数効果濃度,Concentration for 50% of Maximal Effect)を算出する。
GLP−1とGLP−1受容体(β受容体ファミリーのG結合タンパク質)が結合すると、細胞膜内の環状アデノシン一リン酸(cAMP)と分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ(MAPK)の経路を活性化する。膵臓の成熟β細胞のGLP−1受容体がGsとカップリングし、アデニリルシクラーゼを活性化し、cAMPを生成し、後者はグルコースと相乗的にインスリンの合成と分泌を刺激し、インスリン遺伝子転写とプロインスリンの生物合成を刺激し、グルカゴン濃度を低減させてグルカゴンの分泌を抑制し、細胞のインスリンに対する感度を増強し、インスリン依存性グリコーゲンの合成を刺激し、食後血糖濃度を低減させる。EC50が小さければ小さいほど、薬物GLP−1受容体アゴニスト活性が高いことを示す。表1の結果では、本発明の化合物がエキセナチドの活性に比べて、相当するか又はわずかに低減しており、これは、本発明のエキセナチドに対する修飾が、そのGLP−1受容体アゴニスト活性に影響しないことを示す。
自発性2型糖尿病db/dbマウスに対する血糖降下作用
5〜6週齢のC57BL/6db/db9マウス(雄)は、南京大学モデル動物研究所から購入され、試験動物はSPF動物室に飼養されていた。動物室は、風通しがよく、エアコンを備え、温度が20〜25℃に保持され、湿度が40%〜70%に保持され、換気回数が10〜15回/hで、明暗それぞれ12時間で照明され、試験動物は自由に飲食し、各マウスはいずれも耳標で標識されている。毎週、マウスを1回試験に用いるが、マウスの使用は三週間を超えない。一週間の適応期間の後、茂晶血糖測定装置でマウスの尾端の毛細血管の血糖を測定する。血糖レベルが16.7mmol/Lより高いマウスを340匹選択し、血糖レベルによりランダムに68群に分け、モデル対照群は、皮下注射で5mL/kgのPBS(pH=7.4)を投与し、陽性対照群1は、エキセナチド(10μg/kg,5mL/kg)を皮下注射し、投与群は、それぞれ化合物1−15(10μg/kg,5mL/kg)を皮下注射し、投与後、血糖測定装置で0、1、2、4、8、12、18、24、30、36、42、48、72hの血糖を測定し、全部のデータをGraphpad Prismに入力して平均血糖値を計算する。最大血糖降下作用(モデル群と比べた最大降下率)、最大血糖降下時間(モデル群と比べて、血糖が顕著に降下していた最終の時点)及び曲線下面積を計算する。
5〜6週齢のC57BL/6db/db9マウス(雄)は、南京大学モデル動物研究所から購入され、試験動物はSPF動物室に飼養されていた。動物室は、風通しがよく、エアコンを備え、温度が20〜25℃に保持され、湿度が40%〜70%に保持され、換気回数が10〜15回/hで、明暗それぞれ12時間で照明され、試験動物は自由に飲食し、各マウスはいずれも耳標で標識されている。毎週、マウスを1回試験に用いるが、マウスの使用は三週間を超えない。一週間の適応期間の後、茂晶血糖測定装置でマウスの尾端の毛細血管の血糖を測定する。血糖レベルが16.7mmol/Lより高いマウスを340匹選択し、血糖レベルによりランダムに68群に分け、モデル対照群は、皮下注射で5mL/kgのPBS(pH=7.4)を投与し、陽性対照群1は、エキセナチド(10μg/kg,5mL/kg)を皮下注射し、投与群は、それぞれ化合物1−15(10μg/kg,5mL/kg)を皮下注射し、投与後、血糖測定装置で0、1、2、4、8、12、18、24、30、36、42、48、72hの血糖を測定し、全部のデータをGraphpad Prismに入力して平均血糖値を計算する。最大血糖降下作用(モデル群と比べた最大降下率)、最大血糖降下時間(モデル群と比べて、血糖が顕著に降下していた最終の時点)及び曲線下面積を計算する。
表2の結果では、本発明の化合物がエキセナチドに比べて、低血糖時間の維持の面で大きな優位性を持ち、最大血糖降下時間を4hから30h〜48hに延長することを示す。以上2つの試験結果を総合すると、本発明の好ましい化合物は、化合物41、42、43、46、47、48、51〜63、65、67である。
以上をまとめると、本発明のエキセナチド修飾物は、エキセナチドに比べて、活性が同等か又はわずかに低減しており、大部分のGLP−1受容体アゴニスト活性を保ち、エキセナチドに対する修飾がそのGLP−1受容体アゴニスト活性に影響しない。それとともに、本発明のエキセナチド修飾物は、低血糖時間の維持の面で大きな優位性を持ち、最大血糖降下時間を4hから30h〜48hに延長する。本発明の分子は、GLP−1受容体アゴニスト活性が高いだけではなく、低血糖持続時間が長く、将来の臨床において、体内での作用時間が長く、安定性が高く、血糖降下効果が高い薬物になる可能性がある。
BP103n01の調製
50mLの三口フラスコに1.0gの化合物BP103n00(1.0eq,ここでeqは当量を表し、以下同様である)、10mlのジクロロメタン、10mlのtert−ブタノール、0.40gのDIC(1.0eq)、及び0.39gのDMAP(1.0eq,4−ジメチルアミノピリジン)を添加し、室温で一晩撹拌し、TLC(薄層クロマトグラフィー)で反応終了まで監視し、エーテルで希釈した後、水で3回洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させて、カラムクロマトグラフィーにより泡沫状のBP103n01粉末を0.4g取得する。
50mLの三口フラスコに1.0gの化合物BP103n00(1.0eq,ここでeqは当量を表し、以下同様である)、10mlのジクロロメタン、10mlのtert−ブタノール、0.40gのDIC(1.0eq)、及び0.39gのDMAP(1.0eq,4−ジメチルアミノピリジン)を添加し、室温で一晩撹拌し、TLC(薄層クロマトグラフィー)で反応終了まで監視し、エーテルで希釈した後、水で3回洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させて、カラムクロマトグラフィーにより泡沫状のBP103n01粉末を0.4g取得する。
BP103n02の調製
100mLの三口フラスコに0.95gのN−ヒドロキシこはく酸イミド(HOSU)、2.0gの化合物19及び15mlのジクロロメタンを添加し、1.58gのEDC・HClを添加し、室温で2h反応させ、TLCで反応終了まで監視し、ジクロロメタンで希釈した後、pH=6.0の50mmol/Lのりん酸二水素カリウム水溶液で2回洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して、白色固体の2.6gの化合物BP103n02を取得する。
100mLの三口フラスコに0.95gのN−ヒドロキシこはく酸イミド(HOSU)、2.0gの化合物19及び15mlのジクロロメタンを添加し、1.58gのEDC・HClを添加し、室温で2h反応させ、TLCで反応終了まで監視し、ジクロロメタンで希釈した後、pH=6.0の50mmol/Lのりん酸二水素カリウム水溶液で2回洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して、白色固体の2.6gの化合物BP103n02を取得する。
BP103m01の調製
窒素の保護下で、500mlの三口フラスコに200mLのピリジン、50gのBP103g00(1.0eq)を添加し、温度が0℃に降下するまで撹拌し、パッチ式で70.7gのTsCl(2.1eq)を添加し、1h撹拌し、次に、室温まで徐々に昇温させ、続いて3〜4h撹拌する。反応が終了した後、反応液を冷たい希塩酸溶液に入れ、酢酸エチルを添加して抽出し、酢酸エチル層を希塩酸で1回洗浄し、飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、溶媒を留去し、減圧して溶媒を留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによりBP103m01の精製品を52g取得する。
窒素の保護下で、500mlの三口フラスコに200mLのピリジン、50gのBP103g00(1.0eq)を添加し、温度が0℃に降下するまで撹拌し、パッチ式で70.7gのTsCl(2.1eq)を添加し、1h撹拌し、次に、室温まで徐々に昇温させ、続いて3〜4h撹拌する。反応が終了した後、反応液を冷たい希塩酸溶液に入れ、酢酸エチルを添加して抽出し、酢酸エチル層を希塩酸で1回洗浄し、飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、溶媒を留去し、減圧して溶媒を留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによりBP103m01の精製品を52g取得する。
BP103m02の調製
500mLの三口フラスコに50gのBP103m01(1.0eq)と150mLのDMSO(ジメチルスルホキシド)を添加し、均一に撹拌し、次にNaN3を22.0g(4.0eq)添加し、50℃まで加熱して3時間反応させ、室温まで温度を降下させ、反応液を水に入れ、酢酸エチルで数回抽出し、有機相を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して無色液体のBP103m02を25.3g取得する。
500mLの三口フラスコに50gのBP103m01(1.0eq)と150mLのDMSO(ジメチルスルホキシド)を添加し、均一に撹拌し、次にNaN3を22.0g(4.0eq)添加し、50℃まで加熱して3時間反応させ、室温まで温度を降下させ、反応液を水に入れ、酢酸エチルで数回抽出し、有機相を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して無色液体のBP103m02を25.3g取得する。
BP103m03の調製
1Lの水素化反応釜にBP103m03 25g、メタノール 200mL、及びパラジウム炭素 6.0gを添加し、撹拌し、窒素を置換し、水素を導入して3〜4h反応させ、TLCで反応終了まで監視した後、反応液を濾過し、濾液を濃縮してBP103m03の油状物を20.4g取得する。
1Lの水素化反応釜にBP103m03 25g、メタノール 200mL、及びパラジウム炭素 6.0gを添加し、撹拌し、窒素を置換し、水素を導入して3〜4h反応させ、TLCで反応終了まで監視した後、反応液を濾過し、濾液を濃縮してBP103m03の油状物を20.4g取得する。
BP103m04の調製
500mLの三口フラスコに20.0g(1.0eq)の化合物BP103m03、200mlのジクロロメタン、及び24.0g(1.0eq)のFmoc−HOSUを添加し、温度が0℃に降下するまで撹拌し、9.2gのDIEA(1.0eq,N,N−ジイソプロピルエチルアミン)を滴加し、一晩撹拌し、TLCで反応終了まで監視した後、水で洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、カラムクロマトグラフィーにより油状物のBP103m04を27.3g取得する。
500mLの三口フラスコに20.0g(1.0eq)の化合物BP103m03、200mlのジクロロメタン、及び24.0g(1.0eq)のFmoc−HOSUを添加し、温度が0℃に降下するまで撹拌し、9.2gのDIEA(1.0eq,N,N−ジイソプロピルエチルアミン)を滴加し、一晩撹拌し、TLCで反応終了まで監視した後、水で洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、カラムクロマトグラフィーにより油状物のBP103m04を27.3g取得する。
BP103m05の調製
200mLのフラスコに5.0gのBP103m04(1.0eq)、50mlの水、及び1.7gのNaHCO3(2.0eq)を添加し、撹拌し、4.7gの化合物BP103n02(1.0eq)を滴加して50mlのDME(1,2−ジメトキシエタン)の溶液に溶解させ、50mlのTHF(テトラヒドロフラン)を補充し、一晩撹拌し、TLCで反応終了まで監視し、有機溶媒を留去し、酢酸でpH=4に調節し、酢酸エチルで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して、6.4gのオフホワイト色の固体の化合物BP103m05を取得する。
200mLのフラスコに5.0gのBP103m04(1.0eq)、50mlの水、及び1.7gのNaHCO3(2.0eq)を添加し、撹拌し、4.7gの化合物BP103n02(1.0eq)を滴加して50mlのDME(1,2−ジメトキシエタン)の溶液に溶解させ、50mlのTHF(テトラヒドロフラン)を補充し、一晩撹拌し、TLCで反応終了まで監視し、有機溶媒を留去し、酢酸でpH=4に調節し、酢酸エチルで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して、6.4gのオフホワイト色の固体の化合物BP103m05を取得する。
BP103m06の調製
100mLのフラスコに6.0gの化合物BP103m05、30mlのジクロロメタン、及び30mlのTFA(トリフルオロ酢酸)を添加し、20℃で撹拌し、TLCで反応終了まで監視し、有機溶媒を留去し、石油エーテルでスラリー化し、吸引濾過し、乾燥させて5.1gのオフホワイト色の固体のBP103m06を取得する。
100mLのフラスコに6.0gの化合物BP103m05、30mlのジクロロメタン、及び30mlのTFA(トリフルオロ酢酸)を添加し、20℃で撹拌し、TLCで反応終了まで監視し、有機溶媒を留去し、石油エーテルでスラリー化し、吸引濾過し、乾燥させて5.1gのオフホワイト色の固体のBP103m06を取得する。
目的化合物の合成
20mlの反応カラムに、1.0gの2Cl−Trt樹脂、240mgのBP103m06、5mlのジクロロメタン、及び300ulのDIEAを添加し、窒素で40minバブリングし、5mlのジクロロメタン、1mlのメタノール、及び1mlのDIEAを添加し、20min反応させた後、DMF(N,N−ジメチルホルムアミド)で洗浄し、BP103m06樹脂を取得する。カップリング試薬はHOBT/DIC(即ち、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール/N,N’−ジイソプロピルカルボジイミド)を用い、DMFは反応溶解とし、反応の監視はニンヒドリン測定法を用い、順に、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Asn(Trt)−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Trp(Boc)−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Ile−OH、Fmoc−Phe−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Arg(Pbf)−OH、Fmoc−Val−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Met−OH、Fmoc−Gln(Trt)−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Asp(OtBu)OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Phe−OH、Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−His(Trt)−OHという保護アミノ酸を樹脂に接続し、最後にFmoc保護を脱保護し、樹脂の分解は82.5%のTFA/5%のフェノール/5%の水/2.5%のEDT/5%のチオアニソールを用い、冷たいMTBE(メチルtert−ブチルエーテル)で沈殿させ、洗浄し、粗製品を逆相HPLCにより精製して、目的ペプチドの精製品を32mg取得する。
MS(ESI+,m/e):4743.53[M+H]+
BP103a01の調製
窒素の保護下で、1000mlの三口フラスコに200mLのピリジン、120gのBP103a00(1.0eq)を添加し、温度が0℃に降下するまで撹拌し、パッチ式で151.8gのTsCl(1.0eq)を添加し、1h撹拌し、次に徐々に室温まで昇温させ、続いて3〜4h撹拌する。反応が終了した後、反応液を冷たい希塩酸溶液に入れ、酢酸エチルを添加して抽出し、酢酸エチル層を希塩酸で1回洗浄し、飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、溶媒を留去し、減圧して溶媒を留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによりBP103a01の精製品を55g取得する。
窒素の保護下で、1000mlの三口フラスコに200mLのピリジン、120gのBP103a00(1.0eq)を添加し、温度が0℃に降下するまで撹拌し、パッチ式で151.8gのTsCl(1.0eq)を添加し、1h撹拌し、次に徐々に室温まで昇温させ、続いて3〜4h撹拌する。反応が終了した後、反応液を冷たい希塩酸溶液に入れ、酢酸エチルを添加して抽出し、酢酸エチル層を希塩酸で1回洗浄し、飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、溶媒を留去し、減圧して溶媒を留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによりBP103a01の精製品を55g取得する。
BP103a02の調製
1000mLの三口フラスコに55gのBP103a01(1.0eq)と160mLのDMSOを添加し、均一に撹拌し、次にNaN3を23.52g(2.0eq)添加し、50℃まで加熱して3時間反応させ、室温まで温度を降下させ、反応液を水に入れ、酢酸エチルで抽出し、有機相を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮してBP103a02の無色液体を29.2g取得する。
1000mLの三口フラスコに55gのBP103a01(1.0eq)と160mLのDMSOを添加し、均一に撹拌し、次にNaN3を23.52g(2.0eq)添加し、50℃まで加熱して3時間反応させ、室温まで温度を降下させ、反応液を水に入れ、酢酸エチルで抽出し、有機相を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮してBP103a02の無色液体を29.2g取得する。
BP103a03の調製
1Lの水素化反応釜に29gのBP103a02、360mLのメタノール、及び5.0gのパラジウム炭素を添加し、撹拌し、窒素を置換し、水素を導入して3〜4h反応させ、TLCで反応終了まで監視した後、反応液を濾過し、濾液を濃縮してBP103a03の油状物を23.5g取得する。
1Lの水素化反応釜に29gのBP103a02、360mLのメタノール、及び5.0gのパラジウム炭素を添加し、撹拌し、窒素を置換し、水素を導入して3〜4h反応させ、TLCで反応終了まで監視した後、反応液を濾過し、濾液を濃縮してBP103a03の油状物を23.5g取得する。
BP103a04の調製
1Lの三口フラスコに23.5gの化合物BP103a03(1.0eq)、68.6gの(Boc)2O(2.0eq)、及び500mlのメタノール:トリエチルアミン(9:1)の混合溶液を添加し、撹拌して還流するまで昇温させ、1h反応させ、TLCで反応終了まで監視した後、メタノールとトリエチルアミンを留去し、水を加えて溶解させ、ジクロロメタンで3回抽出し、有機層を合わせて水で1回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を留去し、乾燥させて、固体のBP103a04の34.8gを取得する。
1Lの三口フラスコに23.5gの化合物BP103a03(1.0eq)、68.6gの(Boc)2O(2.0eq)、及び500mlのメタノール:トリエチルアミン(9:1)の混合溶液を添加し、撹拌して還流するまで昇温させ、1h反応させ、TLCで反応終了まで監視した後、メタノールとトリエチルアミンを留去し、水を加えて溶解させ、ジクロロメタンで3回抽出し、有機層を合わせて水で1回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を留去し、乾燥させて、固体のBP103a04の34.8gを取得する。
BP103a05の調製
1000mLの三口フラスコに34.8gの化合物BP103a04(1.0eq)、それぞれ150mlのトルエンとTHF、及び58.2g(3eq)のブロモ酢酸を添加し、撹拌し、45〜50℃まで加熱し、さらに水酸化ナトリウムを33.5g(6eq)添加し、一晩反応させ、TLCで反応終了まで監視した後、反応液を留去し、水と酢酸エチルを加えて抽出し、水相のpHを3に調節し、水相をジクロロメタンで抽出し、ジクロロメタン層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、濃縮してBP103a05の油状物の化合物を18g取得する。
1000mLの三口フラスコに34.8gの化合物BP103a04(1.0eq)、それぞれ150mlのトルエンとTHF、及び58.2g(3eq)のブロモ酢酸を添加し、撹拌し、45〜50℃まで加熱し、さらに水酸化ナトリウムを33.5g(6eq)添加し、一晩反応させ、TLCで反応終了まで監視した後、反応液を留去し、水と酢酸エチルを加えて抽出し、水相のpHを3に調節し、水相をジクロロメタンで抽出し、ジクロロメタン層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、濃縮してBP103a05の油状物の化合物を18g取得する。
BP103m07の調製
100mLの三口フラスコに化合物BP103m04 5.0g(1.05eq)、BP103a05 2.9g(1.0eq)、ジクロロメタン 50ml、DIEA 3.8g(3.0eq)、及びDEPC 2.4g(1.5eq,シアノホスホン酸ジエチル)を添加し、TLCで反応終了まで監視した後、0.1mol/LのHCl/水で洗浄し、炭酸水素ナトリウムで洗浄し、水で洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、カラムクロマトグラフィーにより油状物のBP103m07の6.3gを取得する。
100mLの三口フラスコに化合物BP103m04 5.0g(1.05eq)、BP103a05 2.9g(1.0eq)、ジクロロメタン 50ml、DIEA 3.8g(3.0eq)、及びDEPC 2.4g(1.5eq,シアノホスホン酸ジエチル)を添加し、TLCで反応終了まで監視した後、0.1mol/LのHCl/水で洗浄し、炭酸水素ナトリウムで洗浄し、水で洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、カラムクロマトグラフィーにより油状物のBP103m07の6.3gを取得する。
BP103m08の調製
100mLのフラスコに6.3gの化合物BP103m07、30mlの酢酸エチルを添加し、0℃まで降温させて7.0molのHCl/酢酸エチルを添加し、TLCで反応終了まで監視した後、有機溶媒を留去し、石油エーテルでスラリー化し、吸引濾過し、乾燥させて5.3gのオフホワイト色の固体のBP103m08を取得する。
100mLのフラスコに6.3gの化合物BP103m07、30mlの酢酸エチルを添加し、0℃まで降温させて7.0molのHCl/酢酸エチルを添加し、TLCで反応終了まで監視した後、有機溶媒を留去し、石油エーテルでスラリー化し、吸引濾過し、乾燥させて5.3gのオフホワイト色の固体のBP103m08を取得する。
BP103m09の調製
200mLのフラスコに5.0gのBP103m08(1.0eq)、50mlの水、及び1.2gのNaHCO3(2.0eq)を添加し、撹拌し、3.2gの化合物BP103n02(1.0eq)を滴加して50mlのDME(1,2−ジメトキシエタン)の溶液に溶解させ、50mlのTHFを補充し、一晩撹拌し、TLCで反応終了まで監視し、有機溶媒を留去し、酢酸でpH=4に調節し、酢酸エチルで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して、6.1gのオフホワイト色の固体の化合物BP103m09を取得する。
200mLのフラスコに5.0gのBP103m08(1.0eq)、50mlの水、及び1.2gのNaHCO3(2.0eq)を添加し、撹拌し、3.2gの化合物BP103n02(1.0eq)を滴加して50mlのDME(1,2−ジメトキシエタン)の溶液に溶解させ、50mlのTHFを補充し、一晩撹拌し、TLCで反応終了まで監視し、有機溶媒を留去し、酢酸でpH=4に調節し、酢酸エチルで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して、6.1gのオフホワイト色の固体の化合物BP103m09を取得する。
BP103m10の調製
100mLのフラスコに6.0gの化合物BP103m09、30mlのジクロロメタン、及び30mlのTFAを添加し、20℃で撹拌し、TLCで反応終了まで監視し、有機溶媒を留去し、石油エーテルでスラリー化し、吸引濾過し、乾燥させて4.8gのオフホワイト色の固体のBP103m10を取得する。
100mLのフラスコに6.0gの化合物BP103m09、30mlのジクロロメタン、及び30mlのTFAを添加し、20℃で撹拌し、TLCで反応終了まで監視し、有機溶媒を留去し、石油エーテルでスラリー化し、吸引濾過し、乾燥させて4.8gのオフホワイト色の固体のBP103m10を取得する。
目的ペプチドの調製
20mlの反応カラムに1.0gの2Cl−Trt樹脂、296mgのBP103m10、5mlのジクロロメタン、及び300ulのDIEAを添加し、窒素で40minバブリングし、5mlのジクロロメタン、1mlメタノール、及び1mlのDIEAを添加し、20min反応させた後、DMFで洗浄し、BP103m06樹脂を取得する。Fmocの除去は20%のピペリジン/DMFを用い、20分間反応させ、カップリング試薬はHOBT/DICを用い、DMFは反応溶解とし、反応の監視はニンヒドリン測定法を用い、順に、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Asn(Trt)−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Trp(Boc)−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Ile−OH、Fmoc−Phe−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Arg(Pbf)−OH、Fmoc−Val−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Met−OH、Fmoc−Gln(Trt)−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Asp(OtBu)OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Phe−OH、Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−His(Trt)−OHという保護アミノ酸を樹脂に接続し、最後にFmoc保護を脱保護し、樹脂の分解は82.5%のTFA/5%のフェノール/5%の水/2.5%のEDT/5%のチオアニソールを用い、冷たいMTBEで沈殿させ、洗浄し、粗製品を逆相HPLCにより精製して、目的ペプチドの精製品を39mg取得する。
MS(ESI+,m/e):4932.65[M+H]+
MS(ESI+,m/e):4932.65[M+H]+
BP103aの調製
250mLの三口フラスコに18gの化合物BP103a05、100mlの酢酸エチルを添加し、撹拌して溶解させた後、0℃まで温度を降下させ、150mlの酢酸エチル/HCl(3.5M)を添加し、0℃に保温し、TLCで反応終了まで監視し、濾過し、フィルターケーキをTBMEで洗浄して白色固体のBP103aを10.4g取得する。
250mLの三口フラスコに18gの化合物BP103a05、100mlの酢酸エチルを添加し、撹拌して溶解させた後、0℃まで温度を降下させ、150mlの酢酸エチル/HCl(3.5M)を添加し、0℃に保温し、TLCで反応終了まで監視し、濾過し、フィルターケーキをTBMEで洗浄して白色固体のBP103aを10.4g取得する。
BP103a06の調製
200mLのフラスコに5.0gのBP103a(1.0eq)、50mlの水、及び3.5gのNaHCO3(2.0eq)を添加し、撹拌し、7.3gのFmoc−HOSU(1.0eq)を滴加して50mlのDME(1,2−ジメトキシエタン)の溶液に溶解させ、50mlのTHFを補充し、一晩撹拌し、TLCで反応終了まで監視し、有機溶媒を留去し、希塩酸でpH=2に調節し、酢酸エチルで抽出し、水で洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して、7.6gのオフホワイト色の固体の化合物BP103a06を取得する。
200mLのフラスコに5.0gのBP103a(1.0eq)、50mlの水、及び3.5gのNaHCO3(2.0eq)を添加し、撹拌し、7.3gのFmoc−HOSU(1.0eq)を滴加して50mlのDME(1,2−ジメトキシエタン)の溶液に溶解させ、50mlのTHFを補充し、一晩撹拌し、TLCで反応終了まで監視し、有機溶媒を留去し、希塩酸でpH=2に調節し、酢酸エチルで抽出し、水で洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して、7.6gのオフホワイト色の固体の化合物BP103a06を取得する。
BP103m20の調製
500mLの三口フラスコに化合物BP103m03 10.0g(1.0eq)、ジクロロメタン 100ml、及び(Boc)2O 7.8g(1.0eq)を添加し、温度が0℃に降下するまで撹拌し、4.6gのDIEA(1.0eq)を滴加して一晩撹拌し、TLCで反応終了まで監視した後、水で洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、カラムクロマトグラフィーにより油状物のBP103m20の6.2gを取得する。
500mLの三口フラスコに化合物BP103m03 10.0g(1.0eq)、ジクロロメタン 100ml、及び(Boc)2O 7.8g(1.0eq)を添加し、温度が0℃に降下するまで撹拌し、4.6gのDIEA(1.0eq)を滴加して一晩撹拌し、TLCで反応終了まで監視した後、水で洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、カラムクロマトグラフィーにより油状物のBP103m20の6.2gを取得する。
BP103m21の調製
100mLの三口フラスコに化合物BP103m20 6.2g(1.05eq)、BP103a06(1.0eq)6.7g、ジクロロメタン 50ml、DIEA 6.3g(3.0eq)、及びDEPC 4.0g(1.5eq)を添加し、TLCで反応終了まで監視した後、0.1mol/LのHCl/水で洗浄し、炭酸水素ナトリウムで洗浄し、水で洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、カラムクロマトグラフィーにより油状物BP103m21の9.5gを取得する。
100mLの三口フラスコに化合物BP103m20 6.2g(1.05eq)、BP103a06(1.0eq)6.7g、ジクロロメタン 50ml、DIEA 6.3g(3.0eq)、及びDEPC 4.0g(1.5eq)を添加し、TLCで反応終了まで監視した後、0.1mol/LのHCl/水で洗浄し、炭酸水素ナトリウムで洗浄し、水で洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、カラムクロマトグラフィーにより油状物BP103m21の9.5gを取得する。
BP103m22の調製
100mLのフラスコに9.5gの化合物BP103m21、50mlの酢酸エチルを添加し、温度が0℃に降下するまで撹拌し、50mlの7.0mol/LのHCl/酢酸エチルを添加し、TLCで反応終了まで監視し、有機溶媒を留去し、石油エーテルでスラリー化し、吸引濾過し、乾燥させて8.3gのオフホワイト色の固体のBP103m22を取得する。
100mLのフラスコに9.5gの化合物BP103m21、50mlの酢酸エチルを添加し、温度が0℃に降下するまで撹拌し、50mlの7.0mol/LのHCl/酢酸エチルを添加し、TLCで反応終了まで監視し、有機溶媒を留去し、石油エーテルでスラリー化し、吸引濾過し、乾燥させて8.3gのオフホワイト色の固体のBP103m22を取得する。
BP103m23の調製
200mLのフラスコに5.0gのBP103m22(1.0eq)、50mlの水、及び1.2gのNaHCO3(2.0eq)を添加し、撹拌し、3.2gの化合物BP103n02(1.0eq)を滴加して50mlのDME(1,2−ジメトキシエタン)の溶液に溶解させ、50mlのTHFを補充し、一晩撹拌し、TLCで反応終了まで監視し、有機溶媒を留去し、酢酸でpH=4に調節し、酢酸エチルで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して、5.6gのオフホワイト色の固体の化合物BP103m23を取得する。
200mLのフラスコに5.0gのBP103m22(1.0eq)、50mlの水、及び1.2gのNaHCO3(2.0eq)を添加し、撹拌し、3.2gの化合物BP103n02(1.0eq)を滴加して50mlのDME(1,2−ジメトキシエタン)の溶液に溶解させ、50mlのTHFを補充し、一晩撹拌し、TLCで反応終了まで監視し、有機溶媒を留去し、酢酸でpH=4に調節し、酢酸エチルで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して、5.6gのオフホワイト色の固体の化合物BP103m23を取得する。
BP103m24の調製
100mLのフラスコに5.6gの化合物BP103m23、30mlのジクロロメタン、及び30mlのTFAを添加し、20℃で撹拌し、TLCで反応終了まで監視し、有機溶媒を留去し、石油エーテルでスラリー化し、吸引濾過し、乾燥させて4.4gのオフホワイト色の固体のBP103m24を取得する。
100mLのフラスコに5.6gの化合物BP103m23、30mlのジクロロメタン、及び30mlのTFAを添加し、20℃で撹拌し、TLCで反応終了まで監視し、有機溶媒を留去し、石油エーテルでスラリー化し、吸引濾過し、乾燥させて4.4gのオフホワイト色の固体のBP103m24を取得する。
目的ペプチドの調製
20mlの反応カラムに、1.0gの2Cl−Trt樹脂、296mgのBP103m24、5mlのジクロロメタン、及び300ulのDIEAを添加し、窒素で40minバブリングし、5mlのジクロロメタン、1mlのメタノール、及び1mlのDIEAを添加し、20min反応させた後、DMFで洗浄し、BP103m06樹脂を取得する。Fmocの除去は20%のピペリジン/DMFを用い、20分間反応させ、カップリング試薬はHOBT/DICを用い、DMFは反応溶解とし、反応の監視はニンヒドリン測定法を用い、順に、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Asn(Trt)−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Trp(Boc)−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Ile−OH、Fmoc−Phe−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Arg(Pbf)−OH、Fmoc−Val−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Met−OH、Fmoc−Gln(Trt)−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Asp(OtBu)OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Phe−OH、Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、 Fmoc−Gly−OH、Fmoc−His(Trt)−OHという保護アミノ酸を樹脂に接続し、最後にFmoc保護を脱保護し、樹脂の分解は82.5%のTFA/5%のフェノール/5%の水/2.5%のEDT/5%のチオアニソールを用い、冷たいMTBEで沈殿させ、洗浄し、粗製品を逆相HPLCにより精製して、目的ペプチドの精製品を29mg取得する。
MS(ESI+,m/e):4932.65[M+H]+
20mlの反応カラムに、1.0gの2Cl−Trt樹脂、296mgのBP103m24、5mlのジクロロメタン、及び300ulのDIEAを添加し、窒素で40minバブリングし、5mlのジクロロメタン、1mlのメタノール、及び1mlのDIEAを添加し、20min反応させた後、DMFで洗浄し、BP103m06樹脂を取得する。Fmocの除去は20%のピペリジン/DMFを用い、20分間反応させ、カップリング試薬はHOBT/DICを用い、DMFは反応溶解とし、反応の監視はニンヒドリン測定法を用い、順に、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Asn(Trt)−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Trp(Boc)−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Ile−OH、Fmoc−Phe−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Arg(Pbf)−OH、Fmoc−Val−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Met−OH、Fmoc−Gln(Trt)−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Asp(OtBu)OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Phe−OH、Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、 Fmoc−Gly−OH、Fmoc−His(Trt)−OHという保護アミノ酸を樹脂に接続し、最後にFmoc保護を脱保護し、樹脂の分解は82.5%のTFA/5%のフェノール/5%の水/2.5%のEDT/5%のチオアニソールを用い、冷たいMTBEで沈殿させ、洗浄し、粗製品を逆相HPLCにより精製して、目的ペプチドの精製品を29mg取得する。
MS(ESI+,m/e):4932.65[M+H]+
化合物BP103g01の調製
窒素の保護下で、500mlの三口フラスコに200mLのピリジン、50gのBP103g00(1.0eq)を添加し、温度が0℃に降下するまで撹拌し、パッチ式で35.5gのTsCl(1.0eq)を添加し、1h撹拌し、次に、室温まで徐々に昇温させ、続いて3〜4h撹拌する。反応が終了した後、反応液を冷たい希塩酸溶液に入れ、酢酸エチルを添加して抽出し、酢酸エチル層を希塩酸で1回洗浄し、飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、溶媒を留去し、減圧して溶媒を留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによりBP103g01の精製品を38g取得する。
窒素の保護下で、500mlの三口フラスコに200mLのピリジン、50gのBP103g00(1.0eq)を添加し、温度が0℃に降下するまで撹拌し、パッチ式で35.5gのTsCl(1.0eq)を添加し、1h撹拌し、次に、室温まで徐々に昇温させ、続いて3〜4h撹拌する。反応が終了した後、反応液を冷たい希塩酸溶液に入れ、酢酸エチルを添加して抽出し、酢酸エチル層を希塩酸で1回洗浄し、飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、溶媒を留去し、減圧して溶媒を留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによりBP103g01の精製品を38g取得する。
化合物BP103g02の調製
500mLの三口フラスコに38gのBP103g01(1.0eq)と190mLのDMSOを添加し、均一に撹拌し、次にNaN3 11.5g(2.0eq)を添加し、50℃まで加熱して3時間反応させ、室温まで温度を降下させ、反応液を水に入れ、酢酸エチルで数回抽出し、有機相を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して無色液体のBP103g02を40g取得する。
500mLの三口フラスコに38gのBP103g01(1.0eq)と190mLのDMSOを添加し、均一に撹拌し、次にNaN3 11.5g(2.0eq)を添加し、50℃まで加熱して3時間反応させ、室温まで温度を降下させ、反応液を水に入れ、酢酸エチルで数回抽出し、有機相を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して無色液体のBP103g02を40g取得する。
化合物BP103g03の調製
1Lの水素化反応釜にBP103g02 70g、メタノール 500mL、パラジウム炭素 8.0gを添加し、撹拌し、窒素を置換し、水素を導入して3〜4h反応させ、TLCで反応終了まで監視した後、反応液を濾過し、濾液を濃縮してBP103g03の油状物を52g取得する。
1Lの水素化反応釜にBP103g02 70g、メタノール 500mL、パラジウム炭素 8.0gを添加し、撹拌し、窒素を置換し、水素を導入して3〜4h反応させ、TLCで反応終了まで監視した後、反応液を濾過し、濾液を濃縮してBP103g03の油状物を52g取得する。
化合物BP103g04の調製
250mLに三口フラスコに化合物BP103g03 10.0g(1.0eq)、(Boc)2O 15.5g(2.0eq)、及びメタノール:トリエチルアミン(9:1)の混合溶液 200mlを添加し、撹拌して還流するまで昇温させ、1h反応させ、TLC で反応終了まで監視した後、メタノールとトリエチルアミンを留去し、水を加えて溶解させ、ジクロロメタンで3回抽出し、有機層を合わせて水で1回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して油状物BP103g04の9.0gを取得する。
250mLに三口フラスコに化合物BP103g03 10.0g(1.0eq)、(Boc)2O 15.5g(2.0eq)、及びメタノール:トリエチルアミン(9:1)の混合溶液 200mlを添加し、撹拌して還流するまで昇温させ、1h反応させ、TLC で反応終了まで監視した後、メタノールとトリエチルアミンを留去し、水を加えて溶解させ、ジクロロメタンで3回抽出し、有機層を合わせて水で1回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して油状物BP103g04の9.0gを取得する。
化合物BP103g05の調製
250mLの三口フラスコにBP103g04化合物 7.0g(1.0eq)、トルエン及びTHFそれぞれ40ml、ブロモ酢酸 7.6g(3.0eq)を添加し、撹拌し、45〜50℃まで加熱し、さらに水酸化ナトリウム 4.4gを添加し、一晩反応させ、TLCで反応終了まで監視した後、反応液を留去し、水と酢酸エチルを加えて不純物を抽出し、水相をpH=3に調節し、水相をジクロロメタンで抽出し、ジクロロメタン層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、濃縮してBP103g05の油状物化合物を4.2g取得する。
250mLの三口フラスコにBP103g04化合物 7.0g(1.0eq)、トルエン及びTHFそれぞれ40ml、ブロモ酢酸 7.6g(3.0eq)を添加し、撹拌し、45〜50℃まで加熱し、さらに水酸化ナトリウム 4.4gを添加し、一晩反応させ、TLCで反応終了まで監視した後、反応液を留去し、水と酢酸エチルを加えて不純物を抽出し、水相をpH=3に調節し、水相をジクロロメタンで抽出し、ジクロロメタン層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、濃縮してBP103g05の油状物化合物を4.2g取得する。
BP103m30の調製
100mLの三口フラスコに添加する化合物BP103g05 4.2g(1.05eq)、Fmoc−エチレンジアミン二塩酸塩 2.9g(1.0eq)ジクロロメタン 50ml、DIEA 3.7g(3.0eq)、及びDEPC 2.3g(1.5eq)を添加し、TLCで反応終了まで監視した後、0.1mol/L的HCl/水で洗浄し、炭酸水素ナトリウムで洗浄し、水で洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、カラムクロマトグラフィーにより油状物のBP103m21の5.6gを取得する。
100mLの三口フラスコに添加する化合物BP103g05 4.2g(1.05eq)、Fmoc−エチレンジアミン二塩酸塩 2.9g(1.0eq)ジクロロメタン 50ml、DIEA 3.7g(3.0eq)、及びDEPC 2.3g(1.5eq)を添加し、TLCで反応終了まで監視した後、0.1mol/L的HCl/水で洗浄し、炭酸水素ナトリウムで洗浄し、水で洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、カラムクロマトグラフィーにより油状物のBP103m21の5.6gを取得する。
BP103m31の調製
100mLのフラスコに5.6gの化合物BP103m30、30mlの酢酸エチルを添加し、温度が0℃に降下するまで撹拌し、30mlの7.0mol/LのHCl/酢酸エチルを添加し、TLCで反応終了まで監視し、有機溶媒を留去し、石油エーテルでスラリー化し、吸引濾過し、乾燥させて4.8gのオフホワイト色の固体のBP103m31を取得する。
100mLのフラスコに5.6gの化合物BP103m30、30mlの酢酸エチルを添加し、温度が0℃に降下するまで撹拌し、30mlの7.0mol/LのHCl/酢酸エチルを添加し、TLCで反応終了まで監視し、有機溶媒を留去し、石油エーテルでスラリー化し、吸引濾過し、乾燥させて4.8gのオフホワイト色の固体のBP103m31を取得する。
BP103m32の調製
200mLフラスコに4.6gのBP103m31(1.0eq)、45mlの水、及び1.2gのNaHCO3(2.0eq)を添加し、撹拌し、3.4gの化合物BP103n02(1.0eq)を滴加して45mlのDME(1,2−ジメトキシエタン)の溶液に溶解させ、45mlのTHFを補充し、一晩撹拌し、TLCで反応終了まで監視し、有機溶媒を留去し、酢酸でpH=4に調節し、酢酸エチルで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して、4.9gのオフホワイト色の固体の化合物BP103m32を取得する。
200mLフラスコに4.6gのBP103m31(1.0eq)、45mlの水、及び1.2gのNaHCO3(2.0eq)を添加し、撹拌し、3.4gの化合物BP103n02(1.0eq)を滴加して45mlのDME(1,2−ジメトキシエタン)の溶液に溶解させ、45mlのTHFを補充し、一晩撹拌し、TLCで反応終了まで監視し、有機溶媒を留去し、酢酸でpH=4に調節し、酢酸エチルで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して、4.9gのオフホワイト色の固体の化合物BP103m32を取得する。
BP103m33の調製
100mLのフラスコに4.5gの化合物BP103m32、25mlのジクロロメタン、及び25mlのTFAを添加し、20℃で撹拌し、TLCで反応終了まで監視し、有機溶媒を留去し、石油エーテルでスラリー化し、吸引濾過し、乾燥させて3.8gのオフホワイト色の固体のBP103m33を取得する。
100mLのフラスコに4.5gの化合物BP103m32、25mlのジクロロメタン、及び25mlのTFAを添加し、20℃で撹拌し、TLCで反応終了まで監視し、有機溶媒を留去し、石油エーテルでスラリー化し、吸引濾過し、乾燥させて3.8gのオフホワイト色の固体のBP103m33を取得する。
20mlの反応カラムに、1.0gの2Cl−Trt樹脂、270mgのBP103m33、5mlのジクロロメタン、及び300ulのDIEAを添加し、窒素で40minバブリングし、5mlのジクロロメタン、1mlのメタノール、及び1mlのDIEAを添加し、20min反応させた後、DMFで洗浄し、BP103m06樹脂を取得する。Fmocの除去は20%のピペリジン/DMFを用い、20分間反応させ、カップリング試薬はHOBT/DICを用い、DMFは反応溶解とし、反応の監視はニンヒドリン測定法を用い、順に、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Asn(Trt)−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Trp(Boc)−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Ile−OH、Fmoc−Phe−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Arg(Pbf)−OH、Fmoc−Val−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Met−OH、Fmoc−Gln(Trt)−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Asp(OtBu)OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Phe−OH、Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−His(Trt)−OHという保護アミノ酸を樹脂に接続し、最後にFmoc保護を脱保護し、樹脂の分解は82.5%のTFA/5%のフェノール/5%の水/2.5%のEDT/5%のチオアニソールを用い、冷たいMTBEで沈殿させ、洗浄し、粗製品を逆相HPLCにより精製して、目的ペプチドの精製品を33mg取得する。
MS(ESI+,m/e):4844.6[M+H]+
BP103m06の製造方法は、実施例6を参照する。
20mlの反応カラムに、1.0gの2Cl−Trt樹脂、240mgのBP103m06、5mlのジクロロメタン、及び300ulのDIEAを添加し、窒素で40minバブリングし、5mlのジクロロメタン、1mlのメタノール、及び1mlのDIEAを添加し、20min反応させた後、DMFで洗浄し、を取得するBP103m06樹脂。Fmocの除去は20%のピペリジン/DMFを用い、20分間反応させ、カップリング試薬はHOBT/DICを用い、DMFは反応溶解とし、反応の監視はニンヒドリン測定法を用い、順に、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Asn(Trt)−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Trp(Boc)−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Ile−OH、Fmoc−Phe−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Arg(Pbf)−OH、Fmoc−Val−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Met−OH、Fmoc−Gln(Trt)−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Asp(OtBu)OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Phe−OH、Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−His(Trt)−OHという保護アミノ酸を樹脂に接続し、最後にFmoc保護を脱保護し、樹脂の分解は82.5%のTFA/5%のフェノール/5%の水/2.5%のEDT/5%のチオアニソールを用い、冷たいMTBEで沈殿させ、洗浄し、粗製品を逆相HPLCにより精製して、目的ペプチドの精製品を42mg取得する。
MS(ESI+,m/e):4800.56[M+H]+
20mlの反応カラムに、1.0gの2Cl−Trt樹脂、240mgのBP103m06、5mlのジクロロメタン、及び300ulのDIEAを添加し、窒素で40minバブリングし、5mlのジクロロメタン、1mlのメタノール、及び1mlのDIEAを添加し、20min反応させた後、DMFで洗浄し、を取得するBP103m06樹脂。Fmocの除去は20%のピペリジン/DMFを用い、20分間反応させ、カップリング試薬はHOBT/DICを用い、DMFは反応溶解とし、反応の監視はニンヒドリン測定法を用い、順に、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Asn(Trt)−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Trp(Boc)−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Ile−OH、Fmoc−Phe−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Arg(Pbf)−OH、Fmoc−Val−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Met−OH、Fmoc−Gln(Trt)−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Asp(OtBu)OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Phe−OH、Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−His(Trt)−OHという保護アミノ酸を樹脂に接続し、最後にFmoc保護を脱保護し、樹脂の分解は82.5%のTFA/5%のフェノール/5%の水/2.5%のEDT/5%のチオアニソールを用い、冷たいMTBEで沈殿させ、洗浄し、粗製品を逆相HPLCにより精製して、目的ペプチドの精製品を42mg取得する。
MS(ESI+,m/e):4800.56[M+H]+
BP103m40の調製
500mLの三口フラスコに化合物BP103g01 25.0g(1.0eq)、アセトニトリル 250ml、及びFmoc−エチレンジアミン二塩酸塩 18.3g(1.0eq)を添加し、温度が0℃に降下するまで撹拌し、7.9gの炭酸カリウム(1.0eq)を添加し、TLCで反応終了まで監視した後、希塩酸で洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、カラムクロマトグラフィーにより油状物のBP103m40の25.3gを取得する。
500mLの三口フラスコに化合物BP103g01 25.0g(1.0eq)、アセトニトリル 250ml、及びFmoc−エチレンジアミン二塩酸塩 18.3g(1.0eq)を添加し、温度が0℃に降下するまで撹拌し、7.9gの炭酸カリウム(1.0eq)を添加し、TLCで反応終了まで監視した後、希塩酸で洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、カラムクロマトグラフィーにより油状物のBP103m40の25.3gを取得する。
BP103m41の調製
500mLの三口フラスコに化合物BP103m40を25.0g(1.0eq)、ジクロロメタンを250ml、(Boc)2Oを19.9g(2.0eq)添加し、17.7gのDIEA(3.0eq)を滴加し、TLCで反応終了まで監視した後、希塩酸で洗浄し、炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した後、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、カラムクロマトグラフィーにより油状物のBP103m41の23.8gを取得する。
500mLの三口フラスコに化合物BP103m40を25.0g(1.0eq)、ジクロロメタンを250ml、(Boc)2Oを19.9g(2.0eq)添加し、17.7gのDIEA(3.0eq)を滴加し、TLCで反応終了まで監視した後、希塩酸で洗浄し、炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した後、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、カラムクロマトグラフィーにより油状物のBP103m41の23.8gを取得する。
BP103m42の調製
窒素の保護下で、1000mlの三口フラスコに100mLのピリジン、23.5gのBP103m41(1.0eq)を添加し、温度が0℃に降下するまで撹拌し、パッチ式で8.3gのTsCl(1.2eq)を添加し、1h撹拌し、次に徐々に室温まで昇温させ、続いて3〜4h撹拌する。反応が終了した後、大部分のピリジンを留去し、酢酸エチルで溶解させ、希塩酸で1回洗浄し、飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによりBP103m42の精製品を25.3g取得する。
窒素の保護下で、1000mlの三口フラスコに100mLのピリジン、23.5gのBP103m41(1.0eq)を添加し、温度が0℃に降下するまで撹拌し、パッチ式で8.3gのTsCl(1.2eq)を添加し、1h撹拌し、次に徐々に室温まで昇温させ、続いて3〜4h撹拌する。反応が終了した後、大部分のピリジンを留去し、酢酸エチルで溶解させ、希塩酸で1回洗浄し、飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによりBP103m42の精製品を25.3g取得する。
BP103m43の調製
1000mLの三口フラスコに25.0gのBP103m42(1.0eq)と100mLのDMSOを添加し、均一に撹拌し、次にNaN3 4.1g(2.0eq)を添加し、50℃まで加熱して3時間反応させ、室温まで温度を降下させ、反応液を水に入れ、酢酸エチルで抽出し、有機相を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮してBP103m43の無色液体を22.7gを取得する。
1000mLの三口フラスコに25.0gのBP103m42(1.0eq)と100mLのDMSOを添加し、均一に撹拌し、次にNaN3 4.1g(2.0eq)を添加し、50℃まで加熱して3時間反応させ、室温まで温度を降下させ、反応液を水に入れ、酢酸エチルで抽出し、有機相を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮してBP103m43の無色液体を22.7gを取得する。
BP103m44の調製
1Lの水素化反応釜に化合物BP103m43 22.7g、メタノール 250mL、及びパラジウム炭素 5.0gを添加し、撹拌し、窒素を置換し、水素を導入して3〜4h反応させ、TLCで反応終了まで監視した後、反応液を濾過し、濾液を濃縮してBP103m44の油状物を19.6g取得する。
1Lの水素化反応釜に化合物BP103m43 22.7g、メタノール 250mL、及びパラジウム炭素 5.0gを添加し、撹拌し、窒素を置換し、水素を導入して3〜4h反応させ、TLCで反応終了まで監視した後、反応液を濾過し、濾液を濃縮してBP103m44の油状物を19.6g取得する。
BP103m45の調製
500mLのフラスコに10.0gのBP103m44(1.0eq)、100mlの水、及び2.6gのNaHCO3(2.0eq)を添加し、撹拌し、7.2gの化合物BP103n02(1.0eq)を滴加し、100mlのDME(1,2−ジメトキシエタン)の溶液に溶解させて、100mlのTHF、一晩撹拌し、TLCで反応終了まで監視し、有機溶媒を留去し、酢酸でpH=4に調節し、酢酸エチルで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮し、13.2gのオフホワイト色の固体の化合物BP103m45を取得する。
500mLのフラスコに10.0gのBP103m44(1.0eq)、100mlの水、及び2.6gのNaHCO3(2.0eq)を添加し、撹拌し、7.2gの化合物BP103n02(1.0eq)を滴加し、100mlのDME(1,2−ジメトキシエタン)の溶液に溶解させて、100mlのTHF、一晩撹拌し、TLCで反応終了まで監視し、有機溶媒を留去し、酢酸でpH=4に調節し、酢酸エチルで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮し、13.2gのオフホワイト色の固体の化合物BP103m45を取得する。
BP103m46の調製
100mLフラスコに13.2gの化合物BP103m45、15mlのジクロロメタン、及び15mlのTFAを添加し、20℃で撹拌し、TLCで反応終了まで監視し、有機溶媒を留去し、石油エーテルでスラリー化し、吸引濾過し、乾燥させて10.5gの オフホワイト色の固体のBP103m46を取得する。
100mLフラスコに13.2gの化合物BP103m45、15mlのジクロロメタン、及び15mlのTFAを添加し、20℃で撹拌し、TLCで反応終了まで監視し、有機溶媒を留去し、石油エーテルでスラリー化し、吸引濾過し、乾燥させて10.5gの オフホワイト色の固体のBP103m46を取得する。
BP103m47の調製
250ml三口フラスコに10.5gの化合物BP103m36(1.0eq)、110mlのジクロロメタン、及び5.4gの(Boc)2O(2.0eq)を添加し、4.8gのDIEA(3.0eq)を滴加し、TLCで反応終了まで監視した後、希塩酸で洗浄し、炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した後、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、カラムクロマトグラフィーによりオフホワイト色の固体のBP103m47を7.9g取得する。
250ml三口フラスコに10.5gの化合物BP103m36(1.0eq)、110mlのジクロロメタン、及び5.4gの(Boc)2O(2.0eq)を添加し、4.8gのDIEA(3.0eq)を滴加し、TLCで反応終了まで監視した後、希塩酸で洗浄し、炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した後、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、カラムクロマトグラフィーによりオフホワイト色の固体のBP103m47を7.9g取得する。
MS(ESI+,m/e):4771.57[M+H]+
BP103m50の調製
100mLの三口フラスコに286mgのN−ヒドロキシこはく酸イミド(HOSU)、0.50gのBP103a05及び5mlのジクロロメタンを添加し、477mgのEDC・HClを添加し、室温で2h反応させ、TLCで反応終了まで監視し、ジクロロメタンで希釈した後、pH=6.0の50mmol/Lのりん酸二水素カリウム水溶液で2回洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して油状物の0.72gの化合物BP103m50を取得する。
100mLの三口フラスコに286mgのN−ヒドロキシこはく酸イミド(HOSU)、0.50gのBP103a05及び5mlのジクロロメタンを添加し、477mgのEDC・HClを添加し、室温で2h反応させ、TLCで反応終了まで監視し、ジクロロメタンで希釈した後、pH=6.0の50mmol/Lのりん酸二水素カリウム水溶液で2回洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して油状物の0.72gの化合物BP103m50を取得する。
BP103m51の調製
100mLのフラスコに0.62gの化合物BP103g06(1.0eq)、10mlの水、及び0.27gのNaHCO3(2.0eq)を添加し、撹拌し、0.66gの化合物BP103m50を滴加して10mlのDME(1,2−ジメトキシエタン)の溶液に溶解させ、5mlのTHFを補充し、一晩撹拌し、TLCで反応終了まで監視し、有機溶媒を留去し、希塩酸でpH=4に調節し、ジクロロメタンで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して、油状物の0.71gの化合物BP103m51を取得する。
100mLのフラスコに0.62gの化合物BP103g06(1.0eq)、10mlの水、及び0.27gのNaHCO3(2.0eq)を添加し、撹拌し、0.66gの化合物BP103m50を滴加して10mlのDME(1,2−ジメトキシエタン)の溶液に溶解させ、5mlのTHFを補充し、一晩撹拌し、TLCで反応終了まで監視し、有機溶媒を留去し、希塩酸でpH=4に調節し、ジクロロメタンで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して、油状物の0.71gの化合物BP103m51を取得する。
BP103m52の調製
100mLのフラスコに0.71gの化合物BP103m51を添加し、5ml酢酸エチルで溶解させた後、0℃まで降温させ、5mlのHCl/酢酸エチル(7mol/L)を添加し、0℃に保温し、TLCで反応終了まで監視した後、濃縮して、油状物のBP103m52の0.71gを取得する。
100mLのフラスコに0.71gの化合物BP103m51を添加し、5ml酢酸エチルで溶解させた後、0℃まで降温させ、5mlのHCl/酢酸エチル(7mol/L)を添加し、0℃に保温し、TLCで反応終了まで監視した後、濃縮して、油状物のBP103m52の0.71gを取得する。
BP103m53の調製
100mLのフラスコに640mgの化合物BP103m52(1.0eq)、15mlの水、及び190mgのNaHCO3(2.0eq)を添加し、撹拌し、528mgの化合物BP103n02を滴加して15mlのDME(1,2−ジメトキシエタン)の溶液に溶解させ、15mlのTHFを補充し、一晩撹拌し、TLCで反応終了まで監視し、有機溶媒を留去し、酢酸でpH=6に調節し、ジクロロメタンで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して、油状物の0.65gの化合物BP103m53を取得する。
100mLのフラスコに640mgの化合物BP103m52(1.0eq)、15mlの水、及び190mgのNaHCO3(2.0eq)を添加し、撹拌し、528mgの化合物BP103n02を滴加して15mlのDME(1,2−ジメトキシエタン)の溶液に溶解させ、15mlのTHFを補充し、一晩撹拌し、TLCで反応終了まで監視し、有機溶媒を留去し、酢酸でpH=6に調節し、ジクロロメタンで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して、油状物の0.65gの化合物BP103m53を取得する。
BP103m54の調製
100mLの三口フラスコに化合物BP103m53 3.0g(1.0eq)、Fmoc−エチレンジアミン二塩酸塩 1.1g(1.05eq)、ジクロロメタン 30ml、DIEA 1.3g(3.0eq)、及びDEPC 0.8g(1.5eq)を添加し、TLCで反応終了まで監視した後、0.1mol/LのHCl/水で洗浄し、炭酸水素ナトリウムで洗浄し、水で洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、カラムクロマトグラフィーにより油状物のBP103m54の2.9gを取得する。
100mLの三口フラスコに化合物BP103m53 3.0g(1.0eq)、Fmoc−エチレンジアミン二塩酸塩 1.1g(1.05eq)、ジクロロメタン 30ml、DIEA 1.3g(3.0eq)、及びDEPC 0.8g(1.5eq)を添加し、TLCで反応終了まで監視した後、0.1mol/LのHCl/水で洗浄し、炭酸水素ナトリウムで洗浄し、水で洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、カラムクロマトグラフィーにより油状物のBP103m54の2.9gを取得する。
BP103m55の調製
100mLのフラスコに2.9gの化合物BP103m54、15mlのジクロロメタン、及び15mlのTFAを添加し、20℃で撹拌し、TLCで反応終了まで監視し、有機溶媒を留去し、石油エーテルでスラリー化し、吸引濾過し、乾燥させて2.5gのオフホワイト色の固体のBP103m55を取得する。
100mLのフラスコに2.9gの化合物BP103m54、15mlのジクロロメタン、及び15mlのTFAを添加し、20℃で撹拌し、TLCで反応終了まで監視し、有機溶媒を留去し、石油エーテルでスラリー化し、吸引濾過し、乾燥させて2.5gのオフホワイト色の固体のBP103m55を取得する。
20mlの反応カラムに1.0gの2Cl−Trt樹脂、344mgのBP103m55、5mlのジクロロメタン、及び300ulのDIEAを添加し、窒素で40minバブリングし、5mlのジクロロメタン、1mlのメタノール、及び1mlのDIEA添加し、20min反応させた後、DMFで洗浄し、BP103m06樹脂を取得する。Fmocの除去は20%のピペリジン/DMFを用い、20分間反応させ、カップリング試薬はHOBT/DICを用い、DMFは反応溶解とし、反応の監視はニンヒドリン測定法を用い、順に、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Asn(Trt)−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Trp(Boc)−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Ile−OH、Fmoc−Phe−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Arg(Pbf)−OH、Fmoc−Val−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Met−OH、Fmoc−Gln(Trt)−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Asp(OtBu)OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Phe−OH、Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−His(Trt)−OHという保護アミノ酸を樹脂に接続し、最後にFmoc保護を脱保護し、樹脂の分解は82.5%のTFA/5%のフェノール/5%の水/2.5%のEDT/5%のチオアニソールを用い、冷たいMTBEで沈殿させ、洗浄し、粗製品を逆相HPLCにより精製して、目的ペプチドの精製品を46mg取得する。
MS(ESI+,m/e):5033.72[M+H]+
BP103m60の調製
500mLのフラスコに10.0gのBP103g06(1.0eq)、100mlの水、及び4.5gのNaHCO3(2.0eq)を添加し、撹拌し、12.4gの化合物BP103n02(1.0eq)を滴加して100mlのDME(1,2−ジメトキシエタン)の溶液に溶解させ、100mlのTHFを補充し、一晩撹拌し、TLCで反応終了まで監視し、有機溶媒を留去し、酢酸でpH=4に調節し、酢酸エチルで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して、15.2gのオフホワイト色の固体の化合物BP103m60を取得する。
500mLのフラスコに10.0gのBP103g06(1.0eq)、100mlの水、及び4.5gのNaHCO3(2.0eq)を添加し、撹拌し、12.4gの化合物BP103n02(1.0eq)を滴加して100mlのDME(1,2−ジメトキシエタン)の溶液に溶解させ、100mlのTHFを補充し、一晩撹拌し、TLCで反応終了まで監視し、有機溶媒を留去し、酢酸でpH=4に調節し、酢酸エチルで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して、15.2gのオフホワイト色の固体の化合物BP103m60を取得する。
BP103m61の調製
100mLの三口フラスコに化合物BP103m44 3.0g(1.05eq)、(1.0eq)BP103m60 3.1g、ジクロロメタン 30ml、DIEA 1.7g(3.0eq)、及びDEPC 1.1g(1.5eq)を添加し、TLCで反応終了まで監視した後、0.1mol/LのHCl/水で洗浄し、炭酸水素ナトリウムで洗浄し、水で洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、カラムクロマトグラフィーにより油状物のBP103m61の4.1gを取得する。
100mLの三口フラスコに化合物BP103m44 3.0g(1.05eq)、(1.0eq)BP103m60 3.1g、ジクロロメタン 30ml、DIEA 1.7g(3.0eq)、及びDEPC 1.1g(1.5eq)を添加し、TLCで反応終了まで監視した後、0.1mol/LのHCl/水で洗浄し、炭酸水素ナトリウムで洗浄し、水で洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、カラムクロマトグラフィーにより油状物のBP103m61の4.1gを取得する。
BP103m62の調製
100mLのフラスコに4.1gの化合物BP103m61、20mlのジクロロメタン、及び20mlのTFAを添加し、20℃で撹拌し、TLCで反応終了まで監視し、有機溶媒を留去し、石油エーテルでスラリー化し、吸引濾過し、乾燥させて3.5gのオフホワイト色の固体のBP103m62を取得する。
100mLのフラスコに4.1gの化合物BP103m61、20mlのジクロロメタン、及び20mlのTFAを添加し、20℃で撹拌し、TLCで反応終了まで監視し、有機溶媒を留去し、石油エーテルでスラリー化し、吸引濾過し、乾燥させて3.5gのオフホワイト色の固体のBP103m62を取得する。
BP103m63の調製
250mlの三口フラスコに3.5gの化合物BP103m62(1.0eq)、50mlのジクロロメタン、及び1.2gの(Boc)2O(2.0eq)を添加し、1.1gのDIEA(3.0eq)を滴加し、TLCで反応終了まで監視した後、希塩酸で洗浄し、炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した後、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、カラムクロマトグラフィーによりオフホワイト色の固体のBP103m63を2.6g取得する。
250mlの三口フラスコに3.5gの化合物BP103m62(1.0eq)、50mlのジクロロメタン、及び1.2gの(Boc)2O(2.0eq)を添加し、1.1gのDIEA(3.0eq)を滴加し、TLCで反応終了まで監視した後、希塩酸で洗浄し、炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した後、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、カラムクロマトグラフィーによりオフホワイト色の固体のBP103m63を2.6g取得する。
20mlの反応カラムに1.0gの2Cl−Trt樹脂、408mgのBP103m63、5mlのジクロロメタン、300ulのDIEAを添加し、窒素で40minバブリングし、5mlのジクロロメタン、1mlのメタノール、及び1mlのDIEAを添加し、20min反応させた後、DMFで洗浄し、BP103m06樹脂を取得する。Fmocの除去は20%のピペリジン/DMFを用い、20分間反応させ、カップリング試薬はHOBT/DICを用い、DMFは反応溶解とし、反応の監視はニンヒドリン測定法を用い、順に、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Asn(Trt)−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Trp(Boc)−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Ile−OH、Fmoc−Phe−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Arg(Pbf)−OH、Fmoc−Val−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Met−OH、Fmoc−Gln(Trt)−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Asp(OtBu)OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Phe−OH、Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−His(Trt)−OHという保護アミノ酸を樹脂に接続し、最後にFmoc保護を脱保護し、樹脂の分解は82.5%のTFA/5%のフェノール/5%の水/2.5%のEDT/5%のチオアニソールを用い、冷たいMTBEで沈殿させ、洗浄し、粗製品を逆相HPLCにより精製して、目的ペプチドの精製品を55mg取得する。
MS(ESI+,m/e):5107.81[M+H]+
実施例41 化合物41の調製
Exendin−4(1−39)−Lys40(Alloc)−NH2の調製
目的ペプチドの固相合成は、Fmoc法で固相合成し、Fmoc−Rink MBHA Amide樹脂を利用して、20%のピペリジン/DMFを用いてFmocを除去し、カップリング試薬はHOBT/DICを用い、DMFは反応溶解とし、反応の監視はニンヒドリン測定法を用い、順に、Fmoc−Lys(Alloc)−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Asn(Trt)−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Trp(Boc)−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Ile−OH、Fmoc−Phe−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Arg(Pbf)−OH、Fmoc−Val−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Met−OH、Fmoc−Gln(Trt)−OH、 Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Asp(OtBu)OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Phe−OH、Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−His(Trt)−OH、(BOC)2Oというアミノ酸をRink MBHA Amide樹脂に接続する(DIEA、ジクロロメタンを用いる)。DMFで洗浄し、メタノールで洗浄し、ジクロロメタンで洗浄した後、乾燥させて12.1gのExendin−4(1−39)−Lys40(Alloc)−NH2樹脂を取得する。
Exendin−4(1−39)−Lys40(Alloc)−NH2の調製
目的ペプチドの固相合成は、Fmoc法で固相合成し、Fmoc−Rink MBHA Amide樹脂を利用して、20%のピペリジン/DMFを用いてFmocを除去し、カップリング試薬はHOBT/DICを用い、DMFは反応溶解とし、反応の監視はニンヒドリン測定法を用い、順に、Fmoc−Lys(Alloc)−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Asn(Trt)−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Trp(Boc)−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Ile−OH、Fmoc−Phe−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Arg(Pbf)−OH、Fmoc−Val−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Met−OH、Fmoc−Gln(Trt)−OH、 Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Asp(OtBu)OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Phe−OH、Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−His(Trt)−OH、(BOC)2Oというアミノ酸をRink MBHA Amide樹脂に接続する(DIEA、ジクロロメタンを用いる)。DMFで洗浄し、メタノールで洗浄し、ジクロロメタンで洗浄した後、乾燥させて12.1gのExendin−4(1−39)−Lys40(Alloc)−NH2樹脂を取得する。
化合物a02の調製
窒素の保護下で、500mlの三口フラスコに200mLのピリジン、50gのa01(1.0eq)を添加し、温度が0℃に降下するまで撹拌し、パッチ式で35.5gのTsCl(1.0eq)を添加し、1h撹拌し、次に、室温まで徐々に昇温させ、続いて3〜4h撹拌する。反応が終了した後、反応液を冷たい希塩酸溶液に入れ、固体が生成され、酢酸エチルを添加して抽出し、酢酸エチル層を希塩酸で1回洗浄し、飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、溶媒を留去し、減圧して溶媒を留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによりa02の精製品を38g取得する。
窒素の保護下で、500mlの三口フラスコに200mLのピリジン、50gのa01(1.0eq)を添加し、温度が0℃に降下するまで撹拌し、パッチ式で35.5gのTsCl(1.0eq)を添加し、1h撹拌し、次に、室温まで徐々に昇温させ、続いて3〜4h撹拌する。反応が終了した後、反応液を冷たい希塩酸溶液に入れ、固体が生成され、酢酸エチルを添加して抽出し、酢酸エチル層を希塩酸で1回洗浄し、飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、溶媒を留去し、減圧して溶媒を留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによりa02の精製品を38g取得する。
化合物a03の調製
500mlの三口フラスコに38gのa02(1.0eq)と190mLのDMSOを添加し、均一に撹拌し、次にNaN3 11.5g(2.0eq)を添加し、50℃まで加熱して3時間反応させ、室温まで温度を降下させ、反応液を水に入れ、酢酸エチルで数回抽出し、有機相を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して無色液体a03を40g取得する。
500mlの三口フラスコに38gのa02(1.0eq)と190mLのDMSOを添加し、均一に撹拌し、次にNaN3 11.5g(2.0eq)を添加し、50℃まで加熱して3時間反応させ、室温まで温度を降下させ、反応液を水に入れ、酢酸エチルで数回抽出し、有機相を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して無色液体a03を40g取得する。
化合物a04の調製
1Lの水素化反応釜にa03 70g、メタノール 500mL、パラジウム炭素 8.0gを添加し、撹拌し、窒素を置換し、水素を導入して3〜4h反応させ、TLCで反応終了まで監視した後、反応液を濾過し、濾液を濃縮してa04の油状物を52g取得する。
1Lの水素化反応釜にa03 70g、メタノール 500mL、パラジウム炭素 8.0gを添加し、撹拌し、窒素を置換し、水素を導入して3〜4h反応させ、TLCで反応終了まで監視した後、反応液を濾過し、濾液を濃縮してa04の油状物を52g取得する。
化合物a05の調製
250mlの三口フラスコに化合物a04 10.0g(1.0eq)、(Boc)2O 15.5g(2.0eq)、メタノール:トリエチルアミン(9:1)の混合溶液 200mlを添加し、撹拌して還流するまで昇温させ、1h反応させ、TLCで反応終了まで監視した後、メタノールとトリエチルアミンを留去し、水を加えて溶解させ、ジクロロメタンで3回抽出し、有機層を合わせて水で1回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して油状物a05の9.0gを取得する。
250mlの三口フラスコに化合物a04 10.0g(1.0eq)、(Boc)2O 15.5g(2.0eq)、メタノール:トリエチルアミン(9:1)の混合溶液 200mlを添加し、撹拌して還流するまで昇温させ、1h反応させ、TLCで反応終了まで監視した後、メタノールとトリエチルアミンを留去し、水を加えて溶解させ、ジクロロメタンで3回抽出し、有機層を合わせて水で1回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して油状物a05の9.0gを取得する。
化合物a06の調製
250mlの三口フラスコにa05化合物 7.0g(1.0eq)、トルエンとTHFそれぞれ40ml、ブロモ酢酸 7.6g(3.0eq)を添加し、撹拌し、45〜50℃まで加熱し、さらに水酸化ナトリウム 4.4gを添加し、一晩反応させ、TLCで反応終了まで監視した後、反応液を留去し、水と酢酸エチルを加えて不純物を抽出し、水相をpH=3に調節し、水相をジクロロメタンで抽出し、ジクロロメタン層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、濃縮してa06の油状物の化合物を4.2g取得する。
250mlの三口フラスコにa05化合物 7.0g(1.0eq)、トルエンとTHFそれぞれ40ml、ブロモ酢酸 7.6g(3.0eq)を添加し、撹拌し、45〜50℃まで加熱し、さらに水酸化ナトリウム 4.4gを添加し、一晩反応させ、TLCで反応終了まで監視した後、反応液を留去し、水と酢酸エチルを加えて不純物を抽出し、水相をpH=3に調節し、水相をジクロロメタンで抽出し、ジクロロメタン層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、濃縮してa06の油状物の化合物を4.2g取得する。
化合物a07の調製
250mLの一口フラスコに化合物a06 4.0gを添加し、20mlのエチルで溶解させ後、0℃まで降温させ、20mlのHCl/酢酸エチル(7mol/L)を添加し、TLCで反応終了まで監視した後、濃縮して、油状物のa07を4.2g取得する。
250mLの一口フラスコに化合物a06 4.0gを添加し、20mlのエチルで溶解させ後、0℃まで降温させ、20mlのHCl/酢酸エチル(7mol/L)を添加し、TLCで反応終了まで監視した後、濃縮して、油状物のa07を4.2g取得する。
化合物a09の調製
50mLの三口フラスコに1.0gの化合物a08(1.0eq)、10mlのジクロロメタン、10mlのtert−ブタノール、0.40gのDIC(1.0eq)、及び0.39gのDMAP(1.0eq)を添加し、室温で一晩撹拌し、TLCで反応終了まで監視し、エーテルで希釈した後、水で3回洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させて、カラムクロマトグラフィーにより泡沫状のa09粉末を0.4g取得する。
50mLの三口フラスコに1.0gの化合物a08(1.0eq)、10mlのジクロロメタン、10mlのtert−ブタノール、0.40gのDIC(1.0eq)、及び0.39gのDMAP(1.0eq)を添加し、室温で一晩撹拌し、TLCで反応終了まで監視し、エーテルで希釈した後、水で3回洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させて、カラムクロマトグラフィーにより泡沫状のa09粉末を0.4g取得する。
化合物a10の調製
100mLの三口フラスコに0.95gのN−ヒドロキシこはく酸イミド(HOSU)、2.0gの化合物a09及び15mlのジクロロメタンを添加し、1.58gのEDCHClを添加し、室温で2h反応させ、TLCで反応終了まで監視し、ジクロロメタンで希釈した後、pH=6.0の50mmol/Lのりん酸二水素カリウム水溶液で2回洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して油状物の2.6gの化合物a10を取得する。
100mLの三口フラスコに0.95gのN−ヒドロキシこはく酸イミド(HOSU)、2.0gの化合物a09及び15mlのジクロロメタンを添加し、1.58gのEDCHClを添加し、室温で2h反応させ、TLCで反応終了まで監視し、ジクロロメタンで希釈した後、pH=6.0の50mmol/Lのりん酸二水素カリウム水溶液で2回洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して油状物の2.6gの化合物a10を取得する。
化合物a11の調製
100mLのフラスコに1.28gの化合物a07(1.0eq)、20mlの水、及び1.16gのNaHCO3(4.0eq)を添加し、撹拌し、1.75gの化合物a10を滴加して20mlのDME(1,2−ジメトキシエタン)の溶液に溶解させ、20mlのTHFを補充し、一晩撹拌し、TLCで反応終了まで監視し、有機溶媒を留去し、酢酸でpH=6に調節し、酢酸エチルで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮し、オフホワイト色の固体を取得し、カラムクロマトグラフィーにより0.95gの化合物a11を取得する。
100mLのフラスコに1.28gの化合物a07(1.0eq)、20mlの水、及び1.16gのNaHCO3(4.0eq)を添加し、撹拌し、1.75gの化合物a10を滴加して20mlのDME(1,2−ジメトキシエタン)の溶液に溶解させ、20mlのTHFを補充し、一晩撹拌し、TLCで反応終了まで監視し、有機溶媒を留去し、酢酸でpH=6に調節し、酢酸エチルで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮し、オフホワイト色の固体を取得し、カラムクロマトグラフィーにより0.95gの化合物a11を取得する。
1.5gのExendin−4(1−39)−Lys40−NH2樹脂を、DMFが膨張した後、3eqのPd(PPh3)4の、CHCl3:AcOH:NMM(18:1:0.5)の溶液に添加し、2h反応させ、次にクロロホルムで洗浄(6回×20mlのクロロホルム/回)し、20%のHOAcのジクロロメタン溶液で洗浄(6回×20mlの20%のHOAcのジクロロメタン溶液/回)し、ジクロロメタンで洗浄(6回×20mlのジクロロメタン/回)し、DMFで洗浄(6回×20mlのDMF/回)し、ニンヒドリン検出が陽性であると、5mlのDMF、415mgの化合物a11、150mgのHOAT、及び150ulのDICを添加し、4h反応させ、ニンヒドリン検出が陰性であると、側鎖がExendin−4(1−39)−Lys40−NH2樹脂に接続されていることを示し、樹脂の分解を82.5%のTFA/5%のフェノール/5%の水/2.5%のEDT/5%のチオアニソールで行って、次に冷たいメチルtert−ブチルエーテル(MTBE)で沈殿させて、洗浄する。生成物の粗製品をHPLCで精製して、目的化合物を43mg取得する。
MS(ESI+,m/e):4932.56[M+H]+
実施例46 化合物46の調製
Exendin−4(1−39)−Orn40(Alloc)−NH2樹脂の調製
5gのFmoc−Rink MBHA Amide樹脂に対して、20%のピペリジン/DMFを用いてFmocを除去し、カップリング試薬はHOBT/DICを用い、DMFは反応溶解とし、反応の監視はニンヒドリン測定法を用い、順に、Fmoc−Orn(Alloc)−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Asn(Trt)−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Trp(Boc)−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Ile−OH、Fmoc−Phe−OH、Fmoc−Leu−OH、 Fmoc−Arg(Pbf)−OH、Fmoc−Val−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Met−OH、Fmoc−Gln(Trt)−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Asp(OtBu)OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Phe−OH、Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−His(Trt)−OH、(Boc)2Oという保護アミノ酸をRink MBHA Amide樹脂に接続し(DIEA、ジクロロメタンを用いる)。DMFで洗浄し、メタノールで洗浄し、ジクロロメタンで洗浄した後、乾燥させて7.8gのExendin−4(1−39)−Orn40(Alloc)−NH2樹脂を取得する。
Exendin−4(1−39)−Orn40(Alloc)−NH2樹脂の調製
5gのFmoc−Rink MBHA Amide樹脂に対して、20%のピペリジン/DMFを用いてFmocを除去し、カップリング試薬はHOBT/DICを用い、DMFは反応溶解とし、反応の監視はニンヒドリン測定法を用い、順に、Fmoc−Orn(Alloc)−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Asn(Trt)−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Trp(Boc)−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Ile−OH、Fmoc−Phe−OH、Fmoc−Leu−OH、 Fmoc−Arg(Pbf)−OH、Fmoc−Val−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Met−OH、Fmoc−Gln(Trt)−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Asp(OtBu)OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Phe−OH、Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−His(Trt)−OH、(Boc)2Oという保護アミノ酸をRink MBHA Amide樹脂に接続し(DIEA、ジクロロメタンを用いる)。DMFで洗浄し、メタノールで洗浄し、ジクロロメタンで洗浄した後、乾燥させて7.8gのExendin−4(1−39)−Orn40(Alloc)−NH2樹脂を取得する。
1.5gのExendin−4(1−39)−Orn40(Alloc)−NH2樹脂を、DMFが膨張した後、3eqのPd(PPh3)4の、CHCl3:AcOH:NMM(18:1:0.5)の溶液に添加し、2h反応させ、次にクロロホルムで洗浄(6回×20mlのクロロホルム/回)、20%のHOAcのジクロロメタン溶液で洗浄(6回×20mlの20%のHOAcのジクロロメタン溶液)、ジクロロメタンで洗浄(6回×20mlのジクロロメタン/回)し、DMFで洗浄(6回×20mlのDMF/回)、ニンヒドリン検出が陽性であると、5mlのDMF、415mgの化合物BP103m60、150mgのHOAT、及び150ulのDICを添加し、4h反応させ、ニンヒドリン検出が陰性であると、側鎖BP103m60がExendin−4(1−39)−Orn40−NH2樹脂に接続されていることを示し、樹脂の分解を82.5%のTFA/5%のフェノール/5%の水/2.5%のEDT/5%のチオアニソールで行って、次に冷たいメチルtert−ブチルエーテル(MTBE)で沈殿させて、洗浄する。生成物の粗製品をHPLCで精製して、目的化合物を41mg取得する。
MS(ESI+,m/e):4915.61[M+H]+
化合物a13の調製
窒素の保護下で、1000mlの三口フラスコに200mLのピリジン、120gのa12(1.0eq)を添加し、温度が0℃に降下するまで撹拌し、パッチ式で151.8gのTsCl(1.0eq)を添加し、1h撹拌し、次に徐々に室温まで昇温させ、続いて3〜4h撹拌する。反応が終了した後、反応液を冷たい希塩酸溶液に入れ、固体が生成され、酢酸エチルを添加して抽出し、酢酸エチル層を希塩酸で1回洗浄し、飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、溶媒を留去し、減圧して溶媒を留去し、119gの粗品を取得し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによりa13の精製品を55g取得する。
窒素の保護下で、1000mlの三口フラスコに200mLのピリジン、120gのa12(1.0eq)を添加し、温度が0℃に降下するまで撹拌し、パッチ式で151.8gのTsCl(1.0eq)を添加し、1h撹拌し、次に徐々に室温まで昇温させ、続いて3〜4h撹拌する。反応が終了した後、反応液を冷たい希塩酸溶液に入れ、固体が生成され、酢酸エチルを添加して抽出し、酢酸エチル層を希塩酸で1回洗浄し、飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、溶媒を留去し、減圧して溶媒を留去し、119gの粗品を取得し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによりa13の精製品を55g取得する。
化合物a14の調製
1000mlの三口フラスコに55gのa13(1.0eq)と160mLのDMSOを添加し、均一に撹拌し、次にNaN3 23.52g(2.0eq)を添加し、50℃まで加熱して3時間反応させ、室温まで温度を降下させ、反応液を1.2Lの水に入れて、酢酸エチルで抽出し、有機相を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮してa14の無色液体を29.2g取得する。
1000mlの三口フラスコに55gのa13(1.0eq)と160mLのDMSOを添加し、均一に撹拌し、次にNaN3 23.52g(2.0eq)を添加し、50℃まで加熱して3時間反応させ、室温まで温度を降下させ、反応液を1.2Lの水に入れて、酢酸エチルで抽出し、有機相を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮してa14の無色液体を29.2g取得する。
化合物a15の調製
1Lの水素化反応釜に化合物a14 29g、メタノール 360mL、パラジウム炭素 5.0gを添加し、撹拌し、窒素を置換し、水素を導入して3〜4h反応させ、TLCで反応終了まで監視した後、反応液を濾過し、濾液を濃縮してa15の油状物を23.5g取得する。
1Lの水素化反応釜に化合物a14 29g、メタノール 360mL、パラジウム炭素 5.0gを添加し、撹拌し、窒素を置換し、水素を導入して3〜4h反応させ、TLCで反応終了まで監視した後、反応液を濾過し、濾液を濃縮してa15の油状物を23.5g取得する。
化合物a16の調製
1Lの三口フラスコに23.5gの化合物a15(1.0eq)、68.6gの(Boc)2O(2.0eq)、及び500mlのメタノール:トリエチルアミン(9:1)の混合溶液を添加し、撹拌して還流するまで昇温させ、1h反応させ、TLCで反応終了まで監視した後、メタノールとトリエチルアミンを留去し、水を加えて溶解させ、ジクロロメタンで3回抽出し、有機層を合わせて水で1回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を留去し、乾燥させて、固体のa16を34.8g取得する。
1Lの三口フラスコに23.5gの化合物a15(1.0eq)、68.6gの(Boc)2O(2.0eq)、及び500mlのメタノール:トリエチルアミン(9:1)の混合溶液を添加し、撹拌して還流するまで昇温させ、1h反応させ、TLCで反応終了まで監視した後、メタノールとトリエチルアミンを留去し、水を加えて溶解させ、ジクロロメタンで3回抽出し、有機層を合わせて水で1回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を留去し、乾燥させて、固体のa16を34.8g取得する。
化合物a17の調製
1000mlの三口フラスコに34.8gの化合物a16(1.0eq)、それぞれ150mlのトルエンとTHF、及び58.2g(3eq)のブロモ酢酸を添加し、撹拌し、45〜50℃まで加熱し、さらに33.5g(6eq)の水酸化ナトリウムを添加し、一晩反応させ、TLCで反応終了まで監視した後、反応液を留去し、水と酢酸エチルを加えて抽出し、水相のpHを3に調節し、水相をジクロロメタンで抽出し、ジクロロメタン層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、濃縮して18gのa17の油状物化合物を取得する。
1000mlの三口フラスコに34.8gの化合物a16(1.0eq)、それぞれ150mlのトルエンとTHF、及び58.2g(3eq)のブロモ酢酸を添加し、撹拌し、45〜50℃まで加熱し、さらに33.5g(6eq)の水酸化ナトリウムを添加し、一晩反応させ、TLCで反応終了まで監視した後、反応液を留去し、水と酢酸エチルを加えて抽出し、水相のpHを3に調節し、水相をジクロロメタンで抽出し、ジクロロメタン層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、濃縮して18gのa17の油状物化合物を取得する。
化合物a18の調製
100mLの三口フラスコに286mgのN−ヒドロキシこはく酸イミド(HOSU)、0.50gのa17及び5mlのジクロロメタンを添加し、477mgのEDC・HClを添加し、室温で2h反応させ、TLCで反応終了まで監視し、ジクロロメタンで希釈した後、pH=6.0の50mmol/Lのりん酸二水素カリウム水溶液で2回洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して油状物の0.72gの化合物a18を取得する。
100mLの三口フラスコに286mgのN−ヒドロキシこはく酸イミド(HOSU)、0.50gのa17及び5mlのジクロロメタンを添加し、477mgのEDC・HClを添加し、室温で2h反応させ、TLCで反応終了まで監視し、ジクロロメタンで希釈した後、pH=6.0の50mmol/Lのりん酸二水素カリウム水溶液で2回洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して油状物の0.72gの化合物a18を取得する。
化合物a19の調製
100mLのフラスコに0.62gの化合物a07(1.0eq)、10mlの水、及び0.27gのNaHCO3(2.0eq)を添加し、撹拌し、0.66gの化合物a18を滴加して10mlのDME(1,2−ジメトキシエタン)の溶液に溶解させ、5mlのTHFを補充し、一晩撹拌し、TLCで反応終了まで監視し、有機溶媒を留去し、希塩酸でpH=4に調節し、ジクロロメタンで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して、油状物の0.71gの化合物a19を取得する。
100mLのフラスコに0.62gの化合物a07(1.0eq)、10mlの水、及び0.27gのNaHCO3(2.0eq)を添加し、撹拌し、0.66gの化合物a18を滴加して10mlのDME(1,2−ジメトキシエタン)の溶液に溶解させ、5mlのTHFを補充し、一晩撹拌し、TLCで反応終了まで監視し、有機溶媒を留去し、希塩酸でpH=4に調節し、ジクロロメタンで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して、油状物の0.71gの化合物a19を取得する。
化合物a20の調製
100mLのフラスコに0.71gの化合物a19を添加し、5mlのエチルで溶解させ後、0℃まで降温させ、5mlのHCl/酢酸エチル(7mol/L)を添加し、0℃に保温し、TLCで反応終了まで監視した後、濃縮して、0.71gの油状物a20を取得する。
100mLのフラスコに0.71gの化合物a19を添加し、5mlのエチルで溶解させ後、0℃まで降温させ、5mlのHCl/酢酸エチル(7mol/L)を添加し、0℃に保温し、TLCで反応終了まで監視した後、濃縮して、0.71gの油状物a20を取得する。
化合物a21の調製
100mLのフラスコに640mgの化合物a20(1.0eq)、15mlの水、及び190mgのNaHCO3(2.0eq)を添加し、撹拌し、528mgの化合物a10を滴加して15mlのDME(1,2−ジメトキシエタン)の溶液に溶解させ、15mlのTHFを補充し、一晩撹拌し、TLCで反応終了まで監視し、有機溶媒を留去し、酢酸でpH=6に調節し、ジクロロメタンで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して、0.65gの油状物a21を取得する。
100mLのフラスコに640mgの化合物a20(1.0eq)、15mlの水、及び190mgのNaHCO3(2.0eq)を添加し、撹拌し、528mgの化合物a10を滴加して15mlのDME(1,2−ジメトキシエタン)の溶液に溶解させ、15mlのTHFを補充し、一晩撹拌し、TLCで反応終了まで監視し、有機溶媒を留去し、酢酸でpH=6に調節し、ジクロロメタンで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して、0.65gの油状物a21を取得する。
1.5gのExendin−4(1−39)−Lys40(Alloc)−NH2樹脂をDMFが膨張した後、3eqのPd(PPh3)4の、CHCl3:AcOH:NMM(18:1:0.5)の溶液に添加し、2h反応させ、次にクロロホルムで洗浄(6回×20mlのクロロホルム/回)し、20%のHOAcのジクロロメタン溶液で洗浄(6回×20%のHOAcのジクロロメタン溶液/回)し、ジクロロメタンで洗浄(6回×20mlのジクロロメタン/回)し、DMFで洗浄(6回×20mlのDMF/回)し、ニンヒドリンによる監視で陽性であると、5mlのDMF、528mgの化合物a21、150mgのHOAT(1−ヒドロキシ−7−アザベンゾトリアゾール)、及び150ulのDICを添加し、4h反応させ、ニンヒドリン検出が陰性であると、側鎖a21がExendin−4(1−39)−Lys40−NH2樹脂に接続されていることを示し、樹脂の分解を82.5%のTFA/5%のフェノール/5%の水/2.5%のEDT/5%のチオアニソールで行って、次に冷たいメチルtert−ブチルエーテル(MTBE)で沈殿させて、洗浄する。生成物の粗製品をHPLCで精製して、48mgの目的化合物を取得する。
MS(ESI+,m/e):5123.50[M+H]+
実施例56 化合物56の調製
1.5gのExendin−4(1−39)−Orn40(Alloc)−NH2樹脂を、DMFが膨張した後、3eqのPd(PPh3)4の、CHCl3:AcOH:NMM(18:1:0.5)の溶液に添加し、2h反応させ、次にクロロホルムで洗浄(6回×20mlのクロロホルム/回)し、20%のHOAcのジクロロメタン溶液で洗浄(6回×20%のHOAcのジクロロメタン溶液/回)し、ジクロロメタンで洗浄(6回×20mlのジクロロメタン/回)し、DMFで洗浄(6回×20mlのDMF/回)し、ニンヒドリンによる監視で陽性であると、5mlのDMF、528mgの化合物BP103m53、150mgのHOAT、及び150ulのDICを添加し、4h反応させ、ニンヒドリン検出が陰性であると、側鎖BP103m53がExendin−4(1−39)−Orn40−NH2樹脂に接続されていることを示し、樹脂の分解を82.5%のTFA/5%のフェノール/5%の水/2.5%のEDT/5%のチオアニソールで行って、次に冷たいメチルtert−ブチルエーテル(MTBE)で沈殿させて、洗浄する。生成物の粗製品をHPLCで精製して、目的化合物を47mg取得する。
MS(ESI+,m/e):5104.72[M+H]+
1.5gのExendin−4(1−39)−Orn40(Alloc)−NH2樹脂を、DMFが膨張した後、3eqのPd(PPh3)4の、CHCl3:AcOH:NMM(18:1:0.5)の溶液に添加し、2h反応させ、次にクロロホルムで洗浄(6回×20mlのクロロホルム/回)し、20%のHOAcのジクロロメタン溶液で洗浄(6回×20%のHOAcのジクロロメタン溶液/回)し、ジクロロメタンで洗浄(6回×20mlのジクロロメタン/回)し、DMFで洗浄(6回×20mlのDMF/回)し、ニンヒドリンによる監視で陽性であると、5mlのDMF、528mgの化合物BP103m53、150mgのHOAT、及び150ulのDICを添加し、4h反応させ、ニンヒドリン検出が陰性であると、側鎖BP103m53がExendin−4(1−39)−Orn40−NH2樹脂に接続されていることを示し、樹脂の分解を82.5%のTFA/5%のフェノール/5%の水/2.5%のEDT/5%のチオアニソールで行って、次に冷たいメチルtert−ブチルエーテル(MTBE)で沈殿させて、洗浄する。生成物の粗製品をHPLCで精製して、目的化合物を47mg取得する。
MS(ESI+,m/e):5104.72[M+H]+
実施例61 化合物61の調製
Exendin−4(1−39)−Cys(40)-NH2の調製
目的ペプチドの固相合成は、Fmoc法で固相合成し、Fmoc−Rink MBHAAmide樹脂を利用し、20%のピペリジン/DMFでFmocを除去し、カップリング試薬はHOBT/DICを用い、DMFは反応溶解とし、反応の監視はニンヒドリン測定法を用い、順に、Fmoc−Cys(Trt)−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Asn(Trt)−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Trp(Boc)−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Ile−OH、Fmoc−Phe−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Arg(Pbf)−OH、Fmoc−Val−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Met−OH、Fmoc−Gln(Trt)−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Asp(OtBu)OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Phe−OH、Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−His(Trt)−OHという保護アミノ酸をRink MBHA Amide樹脂に接続し、最後にFmoc保護を脱保護し、DMFで洗浄し、ジクロロメタンで洗浄し、MeOHで洗浄した後、乾燥させて、全保護を含む樹脂を取得し、樹脂の分解は82.5%のTFA/5%のフェノール/5%の水/2.5%のEDT/5%のチオアニソールを用い、冷たいMTBEで沈殿させ、洗浄し、粗製品を逆相HPLCにより精製して、Exendin−4(1−39)−Cys(40)-NH2の精製品を取得する。
Exendin−4(1−39)−Cys(40)-NH2の調製
目的ペプチドの固相合成は、Fmoc法で固相合成し、Fmoc−Rink MBHAAmide樹脂を利用し、20%のピペリジン/DMFでFmocを除去し、カップリング試薬はHOBT/DICを用い、DMFは反応溶解とし、反応の監視はニンヒドリン測定法を用い、順に、Fmoc−Cys(Trt)−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Asn(Trt)−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Trp(Boc)−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Ile−OH、Fmoc−Phe−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Arg(Pbf)−OH、Fmoc−Val−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Met−OH、Fmoc−Gln(Trt)−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Asp(OtBu)OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Phe−OH、Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−His(Trt)−OHという保護アミノ酸をRink MBHA Amide樹脂に接続し、最後にFmoc保護を脱保護し、DMFで洗浄し、ジクロロメタンで洗浄し、MeOHで洗浄した後、乾燥させて、全保護を含む樹脂を取得し、樹脂の分解は82.5%のTFA/5%のフェノール/5%の水/2.5%のEDT/5%のチオアニソールを用い、冷たいMTBEで沈殿させ、洗浄し、粗製品を逆相HPLCにより精製して、Exendin−4(1−39)−Cys(40)-NH2の精製品を取得する。
BG02の調製
窒素の保護下で、500mlの三口フラスコに200mLのピリジン、18.8gのBG01(1.0eq)を添加し、温度が0℃に降下するまで撹拌し、パッチ式で35.5gのTsCl(1.0eq)を添加し、1h撹拌し、次に、室温まで徐々に昇温させ、続いて3〜4h撹拌する。反応が終了した後、反応液を冷たい希塩酸溶液に入れ、固体が生成され、酢酸エチルを添加して抽出し、酢酸エチル層を希塩酸で1回洗浄し、飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、溶媒を留去し、減圧して溶媒を留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより22.7gのBG02の精製品を取得する。
窒素の保護下で、500mlの三口フラスコに200mLのピリジン、18.8gのBG01(1.0eq)を添加し、温度が0℃に降下するまで撹拌し、パッチ式で35.5gのTsCl(1.0eq)を添加し、1h撹拌し、次に、室温まで徐々に昇温させ、続いて3〜4h撹拌する。反応が終了した後、反応液を冷たい希塩酸溶液に入れ、固体が生成され、酢酸エチルを添加して抽出し、酢酸エチル層を希塩酸で1回洗浄し、飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、溶媒を留去し、減圧して溶媒を留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより22.7gのBG02の精製品を取得する。
BG03の調製
500mlの三口フラスコに22.7gのBG02(1.0eq)と190mLのDMSOを添加し、均一に撹拌し、次に11.5g(2.0eq)のNaN3を添加し、50℃まで加熱して3時間反応させ、室温まで温度を降下させ、反応液を水に入れ、酢酸エチルで数回抽出し、有機相を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して無色液体BG03を17.1g取得する。
500mlの三口フラスコに22.7gのBG02(1.0eq)と190mLのDMSOを添加し、均一に撹拌し、次に11.5g(2.0eq)のNaN3を添加し、50℃まで加熱して3時間反応させ、室温まで温度を降下させ、反応液を水に入れ、酢酸エチルで数回抽出し、有機相を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して無色液体BG03を17.1g取得する。
BG04の調製
1Lの水素化反応釜にBG03 30g、メタノール 500mL、及びパラジウム炭素 8.0gを添加し、撹拌し、窒素を置換し、水素を導入して3〜4h反応させ、TLCで反応終了まで監視した後、反応液を濾過し、濾液を濃縮してBG04の油状物を19.4g取得する。
1Lの水素化反応釜にBG03 30g、メタノール 500mL、及びパラジウム炭素 8.0gを添加し、撹拌し、窒素を置換し、水素を導入して3〜4h反応させ、TLCで反応終了まで監視した後、反応液を濾過し、濾液を濃縮してBG04の油状物を19.4g取得する。
BG05の調製
500mlの三口フラスコに化合物BG04 3.7g(1.0eq)、(Boc)2O 15.5g(2.0eq)、及びメタノール:トリエチルアミン(9:1)の混合溶液 200mlを添加し、撹拌して還流するまで昇温させ、1h反応させ、TLCで反応終了まで監視した後、メタノールとトリエチルアミンを留去し、水を加えて溶解させ、ジクロロメタンで3回抽出し、有機層を合わせて水で1回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して油状物BG05を4.8g取得する。
500mlの三口フラスコに化合物BG04 3.7g(1.0eq)、(Boc)2O 15.5g(2.0eq)、及びメタノール:トリエチルアミン(9:1)の混合溶液 200mlを添加し、撹拌して還流するまで昇温させ、1h反応させ、TLCで反応終了まで監視した後、メタノールとトリエチルアミンを留去し、水を加えて溶解させ、ジクロロメタンで3回抽出し、有機層を合わせて水で1回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して油状物BG05を4.8g取得する。
BG06の調製
250mlの三口フラスコに3.7gの(1.0eq)のBG05化合物、それぞれ40mlのトルエンとTHF、及び7.6g(3.0eq)のブロモ酢酸を添加し、撹拌し、45〜50℃まで加熱し、さらに4.4gの水酸化ナトリウムを添加し、一晩反応させ、TLCで反応終了まで監視した後、反応液を留去し、水と酢酸エチルを加えて不純物を抽出し、水相をpH=3に調節し、水相をジクロロメタンで抽出し、ジクロロメタン層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、濃縮してBG06油状物化合物を2.5g取得する。
250mlの三口フラスコに3.7gの(1.0eq)のBG05化合物、それぞれ40mlのトルエンとTHF、及び7.6g(3.0eq)のブロモ酢酸を添加し、撹拌し、45〜50℃まで加熱し、さらに4.4gの水酸化ナトリウムを添加し、一晩反応させ、TLCで反応終了まで監視した後、反応液を留去し、水と酢酸エチルを加えて不純物を抽出し、水相をpH=3に調節し、水相をジクロロメタンで抽出し、ジクロロメタン層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、濃縮してBG06油状物化合物を2.5g取得する。
BG07の調製
100mLの一口フラスコに化合物BG06 2.4gを添加し、20mlエチルで溶解させ後、0℃まで降温させ、20mlのHCl/酢酸エチル(7mol/L)を添加し、TLCで反応終了まで監視した後、濃縮して、油状物のBG07を2.3g取得する。
100mLの一口フラスコに化合物BG06 2.4gを添加し、20mlエチルで溶解させ後、0℃まで降温させ、20mlのHCl/酢酸エチル(7mol/L)を添加し、TLCで反応終了まで監視した後、濃縮して、油状物のBG07を2.3g取得する。
BG08の調製
200mLの三口フラスコに3.5gの化合物BG07(1.0eq)、1.7gの無水マレイン酸(1.0eq)、及び70mlの酢酸を添加し、一晩加熱して還流させ、TLCで反応終了まで監視し、酢酸を留去し、酢酸エチルを添加して溶解させ後、水で3回洗浄し、飽和塩化ナトリウムで3回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、カラムクロマトグラフィーによりオフホワイト色の固体のBG08を1.8g取得する。
200mLの三口フラスコに3.5gの化合物BG07(1.0eq)、1.7gの無水マレイン酸(1.0eq)、及び70mlの酢酸を添加し、一晩加熱して還流させ、TLCで反応終了まで監視し、酢酸を留去し、酢酸エチルを添加して溶解させ後、水で3回洗浄し、飽和塩化ナトリウムで3回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、カラムクロマトグラフィーによりオフホワイト色の固体のBG08を1.8g取得する。
BG09の調製
100mLの三口フラスコに1.30g(1.53eq)のN−ヒドロキシこはく酸イミド(HOSU)、3.1gの化合物BG08、1.8gの15mlのジクロロメタンを添加し、2.16gのEDC・HCl(1.53eq)を添加し、室温で2h反応させ、TLCで反応終了まで監視し、ジクロロメタンで希釈した後、pH=6.0の50mmol/Lのりん酸二水素カリウム水溶液で2回洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して2.2gのオフホワイト色の化合物BG09を取得する。
100mLの三口フラスコに1.30g(1.53eq)のN−ヒドロキシこはく酸イミド(HOSU)、3.1gの化合物BG08、1.8gの15mlのジクロロメタンを添加し、2.16gのEDC・HCl(1.53eq)を添加し、室温で2h反応させ、TLCで反応終了まで監視し、ジクロロメタンで希釈した後、pH=6.0の50mmol/Lのりん酸二水素カリウム水溶液で2回洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して2.2gのオフホワイト色の化合物BG09を取得する。
BG11の調製
50mLの三口フラスコに2.17gの化合物BG10(1.0eq)、10mlのジクロロメタン、10mlのtert−ブタノール、0.40gのDIC(1.0eq)、及び0.39gのDMAP(1.0eq)を添加し、室温で一晩撹拌し、TLCで反応終了まで監視し、エーテルで希釈した後、水で3回洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させて、カラムクロマトグラフィーにより泡沫状のBG11粉末を0.6g取得する。
50mLの三口フラスコに2.17gの化合物BG10(1.0eq)、10mlのジクロロメタン、10mlのtert−ブタノール、0.40gのDIC(1.0eq)、及び0.39gのDMAP(1.0eq)を添加し、室温で一晩撹拌し、TLCで反応終了まで監視し、エーテルで希釈した後、水で3回洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させて、カラムクロマトグラフィーにより泡沫状のBG11粉末を0.6g取得する。
BG12の調製
100mLの三口フラスコに0.95gのN−ヒドロキシこはく酸イミド(HOSU)、3.1gの化合物BG11及び15mlのジクロロメタンを添加し、1.58gのEDC・HClを添加し、室温で2h反応させ、TLCで反応終了まで監視し、ジクロロメタンで希釈した後、pH=6.0の50mmol/Lのりん酸二水素カリウム水溶液で2回洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して白色固体の3.3gの化合物BG12を取得する。
100mLの三口フラスコに0.95gのN−ヒドロキシこはく酸イミド(HOSU)、3.1gの化合物BG11及び15mlのジクロロメタンを添加し、1.58gのEDC・HClを添加し、室温で2h反応させ、TLCで反応終了まで監視し、ジクロロメタンで希釈した後、pH=6.0の50mmol/Lのりん酸二水素カリウム水溶液で2回洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して白色固体の3.3gの化合物BG12を取得する。
BG14の調製
200mLのフラスコに2.8gの化合物BG13(1.05eq)、50mlの水、及び1.8gのNaHCO3(2.0eq)を添加し、撹拌し、6.4gの化合物BG12(1.0eq)を滴加して50mlのDME(1,2−ジメトキシエタン)の溶液に溶解させ、50mlのTHFを補充し、一晩撹拌し、TLCで反応終了まで監視し、有機溶媒を留去し、酢酸でpH=4に調節し、酢酸エチルで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して、6.9gのオフホワイト色の固体の化合物BG14を取得する。
200mLのフラスコに2.8gの化合物BG13(1.05eq)、50mlの水、及び1.8gのNaHCO3(2.0eq)を添加し、撹拌し、6.4gの化合物BG12(1.0eq)を滴加して50mlのDME(1,2−ジメトキシエタン)の溶液に溶解させ、50mlのTHFを補充し、一晩撹拌し、TLCで反応終了まで監視し、有機溶媒を留去し、酢酸でpH=4に調節し、酢酸エチルで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して、6.9gのオフホワイト色の固体の化合物BG14を取得する。
BG15の調製
100mLのフラスコに6.9gの化合物BG14、30mlのジクロロメタン、及び30mlのTFAを添加し、20℃で撹拌し、TLCで反応終了まで監視し、有機溶媒を留去し、石油エーテルでスラリー化し、吸引濾過し、乾燥させて5.35gのオフホワイト色の固体のBG15を取得する。
100mLのフラスコに6.9gの化合物BG14、30mlのジクロロメタン、及び30mlのTFAを添加し、20℃で撹拌し、TLCで反応終了まで監視し、有機溶媒を留去し、石油エーテルでスラリー化し、吸引濾過し、乾燥させて5.35gのオフホワイト色の固体のBG15を取得する。
BG16の調製
100mLのフラスコに1.27gの化合物BG15(1.0eq)、10mlの水、及び0.36gのNaHCO3(2.0eq)を添加し、撹拌し、0.72gの化合物BG09(1.0eq)を滴加して10mlのDME(1,2−ジメトキシエタン)の溶液に溶解させ、10mlのTHFを補充し、一晩撹拌し、TLCで反応終了まで監視し、有機溶媒を留去し、酢酸でpH=6に調節し、酢酸エチルで抽出し、有機相を水で洗浄し、飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮し、カラムクロマトグラフィーにより0.9gのオフホワイト色の固体の化合物BG16を取得する。
100mLのフラスコに1.27gの化合物BG15(1.0eq)、10mlの水、及び0.36gのNaHCO3(2.0eq)を添加し、撹拌し、0.72gの化合物BG09(1.0eq)を滴加して10mlのDME(1,2−ジメトキシエタン)の溶液に溶解させ、10mlのTHFを補充し、一晩撹拌し、TLCで反応終了まで監視し、有機溶媒を留去し、酢酸でpH=6に調節し、酢酸エチルで抽出し、有機相を水で洗浄し、飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮し、カラムクロマトグラフィーにより0.9gのオフホワイト色の固体の化合物BG16を取得する。
化合物BP103m50の調製
100mLの三口フラスコに286mgのN−ヒドロキシこはく酸イミド(HOSU)、0.50gのBP103a05及び5mlのジクロロメタンを添加し、477mgのEDC.HClを添加し、室温で2h反応させ、TLCで反応終了まで監視し、ジクロロメタンで希釈した後、pH=6.0の50mmol/Lのりん酸二水素カリウム水溶液で2回洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して油状物の0.72gの化合物BP103m50を取得する。
100mLの三口フラスコに286mgのN−ヒドロキシこはく酸イミド(HOSU)、0.50gのBP103a05及び5mlのジクロロメタンを添加し、477mgのEDC.HClを添加し、室温で2h反応させ、TLCで反応終了まで監視し、ジクロロメタンで希釈した後、pH=6.0の50mmol/Lのりん酸二水素カリウム水溶液で2回洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して油状物の0.72gの化合物BP103m50を取得する。
化合物BP103m51の調製
100mLのフラスコに0.62gの化合物BP103g06(1.0eq)、10mlの水、及び0.27gのNaHCO3(2.0eq)を添加し、撹拌し、0.66gの化合物BP103m50を滴加して10mlのDME(1,2−ジメトキシエタン)の溶液に溶解させ、5mlのTHFを補充し、一晩撹拌し、TLCで反応終了まで監視し、有機溶媒を留去し、希塩酸でpH=4に調節し、ジクロロメタンで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して、油状物の0.71gの化合物BP103m51を取得する。
100mLのフラスコに0.62gの化合物BP103g06(1.0eq)、10mlの水、及び0.27gのNaHCO3(2.0eq)を添加し、撹拌し、0.66gの化合物BP103m50を滴加して10mlのDME(1,2−ジメトキシエタン)の溶液に溶解させ、5mlのTHFを補充し、一晩撹拌し、TLCで反応終了まで監視し、有機溶媒を留去し、希塩酸でpH=4に調節し、ジクロロメタンで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して、油状物の0.71gの化合物BP103m51を取得する。
化合物BP103m52の調製
100mLのフラスコに0.71gの化合物BP103m51を添加し、5mlエチルで溶解させ後、0℃まで降温させ、5mlのHCl/酢酸エチル(7mol/L)を添加し、0℃に保温し、TLCで反応終了まで監視した後、濃縮して、油状物のBP103m52の0.71gを取得する。
100mLのフラスコに0.71gの化合物BP103m51を添加し、5mlエチルで溶解させ後、0℃まで降温させ、5mlのHCl/酢酸エチル(7mol/L)を添加し、0℃に保温し、TLCで反応終了まで監視した後、濃縮して、油状物のBP103m52の0.71gを取得する。
化合物BP103n01の調製
50mLの三口フラスコに1.0gの化合物BP103n00(1.0eq)、10mlのジクロロメタン、10mlのtert−ブタノール、0.40gのDIC(1.0eq)、及び0.39gのDMAP(1.0eq)を添加し、室温で一晩撹拌し、TLCで反応終了まで監視し、エーテルで希釈した後、水で3回洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、カラムクロマトグラフィーにより泡沫状のBP103n01粉末を0.4gを取得する。
50mLの三口フラスコに1.0gの化合物BP103n00(1.0eq)、10mlのジクロロメタン、10mlのtert−ブタノール、0.40gのDIC(1.0eq)、及び0.39gのDMAP(1.0eq)を添加し、室温で一晩撹拌し、TLCで反応終了まで監視し、エーテルで希釈した後、水で3回洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、カラムクロマトグラフィーにより泡沫状のBP103n01粉末を0.4gを取得する。
化合物BP103n02の調製
100mLの三口フラスコに0.95gのN−ヒドロキシこはく酸イミド(HOSU)、2.0gの化合物BP103n01及び15mlのジクロロメタンを添加し、1.58gのEDC.HCl添加し、室温で2h反応させ、TLCで反応終了まで監視し、ジクロロメタンで希釈した後、pH=6.0の50mmol/Lのりん酸二水素カリウム水溶液で2回洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して白色固体の2.6gの化合物BP103n02を取得する。
100mLの三口フラスコに0.95gのN−ヒドロキシこはく酸イミド(HOSU)、2.0gの化合物BP103n01及び15mlのジクロロメタンを添加し、1.58gのEDC.HCl添加し、室温で2h反応させ、TLCで反応終了まで監視し、ジクロロメタンで希釈した後、pH=6.0の50mmol/Lのりん酸二水素カリウム水溶液で2回洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して白色固体の2.6gの化合物BP103n02を取得する。
化合物BP103m70の調製
100mLのフラスコに0.50gの化合物H−Glu−OtBu.HCl(1.0eq)、10mlの水、及び350mgのNaHCO3(2.0eq)を添加し、撹拌し、0.96gの化合物BP103n02(1.0eq)を滴加して10mlのDME(1,2−ジメトキシエタン)の溶液に溶解させ、10mlのTHFを補充し、一晩撹拌し、TLCで反応終了まで監視し、有機溶媒を留去し、酢酸でpH=6に調節し、ジクロロメタンで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して、油状物の1.09gの化合物BP103m70を取得する。
100mLのフラスコに0.50gの化合物H−Glu−OtBu.HCl(1.0eq)、10mlの水、及び350mgのNaHCO3(2.0eq)を添加し、撹拌し、0.96gの化合物BP103n02(1.0eq)を滴加して10mlのDME(1,2−ジメトキシエタン)の溶液に溶解させ、10mlのTHFを補充し、一晩撹拌し、TLCで反応終了まで監視し、有機溶媒を留去し、酢酸でpH=6に調節し、ジクロロメタンで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して、油状物の1.09gの化合物BP103m70を取得する。
化合物BP103m71の調製
100mLの三口フラスコに1.0gの化合物BP103m70、317mgのN−ヒドロキシこはく酸イミド(HOSU)(1.53eq)、及び10mlのジクロロメタンを添加し、528mgのEDC.HCl(1.53eq)を添加し、室温で2h反応させ、TLCで反応終了まで監視し、ジクロロメタンで希釈した後、pH=6.0の50mmol/Lのりん酸二水素カリウム水溶液で2回洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して白色固体の1.07gの化合物BP103m71を取得する。
100mLの三口フラスコに1.0gの化合物BP103m70、317mgのN−ヒドロキシこはく酸イミド(HOSU)(1.53eq)、及び10mlのジクロロメタンを添加し、528mgのEDC.HCl(1.53eq)を添加し、室温で2h反応させ、TLCで反応終了まで監視し、ジクロロメタンで希釈した後、pH=6.0の50mmol/Lのりん酸二水素カリウム水溶液で2回洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して白色固体の1.07gの化合物BP103m71を取得する。
化合物BP103m72の調製
100mLのフラスコに0.87gの化合物BP103m52(1.0eq)、10mlの水、及び300mgのNaHCO3(2.0eq)を添加し、撹拌し、1.00gの化合物BP103m71(1.0eq)を滴加して10mlのDME(1,2−ジメトキシエタン)の溶液に溶解させ、10mlのTHFを補充し、一晩撹拌し、TLCで反応終了まで監視し、有機溶媒を留去し、酢酸でpH=6に調節し、ジクロロメタンで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して、油状物の1.22gの化合物BP103m72を取得する。
100mLのフラスコに0.87gの化合物BP103m52(1.0eq)、10mlの水、及び300mgのNaHCO3(2.0eq)を添加し、撹拌し、1.00gの化合物BP103m71(1.0eq)を滴加して10mlのDME(1,2−ジメトキシエタン)の溶液に溶解させ、10mlのTHFを補充し、一晩撹拌し、TLCで反応終了まで監視し、有機溶媒を留去し、酢酸でpH=6に調節し、ジクロロメタンで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して、油状物の1.22gの化合物BP103m72を取得する。
目的ペプチドの合成
1.5gのExendin−4(1−39)−Lys40(Alloc)−NH2樹脂を、DMFが膨張した後、3eqのPd(PPh3)4のCHCl3:AcOH:NMM(18:1:0.5)の溶液に添加し、2h反応させ、次にクロロホルムで洗浄(6回×20mlのクロロホルム/回)し、20%のHOAcのDCM(ジクロロメタン)溶液で洗浄(6回×20mlの20%のHOAcのDCM溶液/回)し、DCMで洗浄(6回×20mlのDCM/回)し、DMFで洗浄(6回×20mlのDMF/回)し、ニンヒドリンによる監視で陽性であると、5mlのDMF、640mgの化合物BP103m72、150mgのHOAT、及び150ulのDICを添加し、4h反応させ、ニンヒドリン検出が陰性であると、側鎖BP103m72がExendin−4(1−39)−Lys40−NH2樹脂に接続されていることを示し、樹脂の分解を82.5%のTFA/5%のフェノール/5%の水/2.5%のEDT/5%のチオアニソールで行って、次に冷たいメチルtert−ブチルエーテル(MTBE)で沈殿させて、洗浄する。生成物の粗製品をHPLCで精製し、凍結乾燥して、目的化合物を48mg取得する。
MS(ESI+,m/e):5252.54[M+H]+。
1.5gのExendin−4(1−39)−Lys40(Alloc)−NH2樹脂を、DMFが膨張した後、3eqのPd(PPh3)4のCHCl3:AcOH:NMM(18:1:0.5)の溶液に添加し、2h反応させ、次にクロロホルムで洗浄(6回×20mlのクロロホルム/回)し、20%のHOAcのDCM(ジクロロメタン)溶液で洗浄(6回×20mlの20%のHOAcのDCM溶液/回)し、DCMで洗浄(6回×20mlのDCM/回)し、DMFで洗浄(6回×20mlのDMF/回)し、ニンヒドリンによる監視で陽性であると、5mlのDMF、640mgの化合物BP103m72、150mgのHOAT、及び150ulのDICを添加し、4h反応させ、ニンヒドリン検出が陰性であると、側鎖BP103m72がExendin−4(1−39)−Lys40−NH2樹脂に接続されていることを示し、樹脂の分解を82.5%のTFA/5%のフェノール/5%の水/2.5%のEDT/5%のチオアニソールで行って、次に冷たいメチルtert−ブチルエーテル(MTBE)で沈殿させて、洗浄する。生成物の粗製品をHPLCで精製し、凍結乾燥して、目的化合物を48mg取得する。
MS(ESI+,m/e):5252.54[M+H]+。
Claims (10)
- 式(I)に示されるエキセナチド修飾物又はその薬学的に使用可能な塩。
(Ex−4)−L−Y (I)
(ここで、Ex−4は、Exendin−4であり、Lは、Ex−4とYを接続する親水性のスペーサーアームであり、Yは、末端にカルボキシル基を有する脂肪鎖である) - L’は、エーテル基含有の親水性鎖である、請求項2に記載のエキセナチド修飾物又はその薬学的に使用可能な塩。
- GLP−1受容体アゴニストとしての薬物の製造における用途、GLP−1受容体活性低下に関連する疾患及び/又は症状の予防及び/又は治療に用いられる薬物の製造における用途、糖代謝に関連する疾患及び/又は症状に用いられる薬物の製造における用途、糖尿病用薬物の製造における用途、脂肪肝用薬物の製造における用途、及びダイエット用薬物の製造における用途のいずれかの用途である、請求項1〜4のいずれか一項に記載のエキセナチド修飾物又はその薬学的に使用可能な塩の用途。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載のエキセナチド修飾物又はその薬学的に使用可能な塩と、任意の薬学的に許容可能な担体とを含む薬物組成物。
- GLP−1受容体アゴニストとしての薬物の製造における用途、GLP−1受容体活性低下に関連する疾患及び/又は症状の予防及び/又は治療に用いられる薬物の製造における用途、糖代謝に関連する疾患及び/又は症状に用いられる薬物の製造における用途、糖尿病用薬物の製造における用途、脂肪肝用薬物の製造における用途、又は、ダイエット用薬物の製造における用途のいずれかの用途である、請求項9に記載の組成物の用途。
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