RS60053B1 - Modifikator eksenatida i njegova primena - Google Patents

Modifikator eksenatida i njegova primena

Info

Publication number
RS60053B1
RS60053B1 RS20200228A RSP20200228A RS60053B1 RS 60053 B1 RS60053 B1 RS 60053B1 RS 20200228 A RS20200228 A RS 20200228A RS P20200228 A RSP20200228 A RS P20200228A RS 60053 B1 RS60053 B1 RS 60053B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
fmoc
compound
preparation
added
washed
Prior art date
Application number
RS20200228A
Other languages
English (en)
Inventor
Jiandong Yuan
Yangqing Huang
Yunsong Song
Fang Yuan
Original Assignee
Brightgene Bio Medical Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Brightgene Bio Medical Technology Co Ltd filed Critical Brightgene Bio Medical Technology Co Ltd
Publication of RS60053B1 publication Critical patent/RS60053B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/14—Esters of carboxylic acids, e.g. fatty acid monoglycerides, medium-chain triglycerides, parabens or PEG fatty acid esters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/2278—Vasoactive intestinal peptide [VIP]; Related peptides (e.g. Exendin)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/26—Glucagons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/605—Glucagons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Description

OBLAST
Predmetni pronalazak se odnosi na oblast terapeutskih peptida, naročito na modifikatore eksenatida, farmaceutski sastav koji ih sadrži i upotrebu modifikatora i sastava u tretmanu bolesti povezanih sa glikometabolizmom.
STANJE TEHNIKE
Eksenatid (ili eksendin-4, robna marka Byetta) je polipeptid od 39 aminokiselina sa molekularnom težinom od 4186,6, čija je molekulska formula C184H282N50O60S, i aminokiselinska sekvenca je: His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2; i proizvode ga i prodaju Amylin Pharmaceuticals i kompanija Eli Lilly (Eli Lillyand Company). Eksenatid je odobren od strane FDA u aprilu 2005. godine, i spada u preparate sa potkožne injekcije, sa efektima promovisanja lučenja insulina zavisnog od glukoze, oporavljanja lučenja insulina prve faze, inhibicije lučenja glukagona, usporavanja pražnjenja sadržaja želuca, poboljšanja funkcija β ćelija pankreasa i slično, što je veoma korisno u tretmanu dijabetesa tipa II, na primer, za poboljšanje i kontrolu glukoze u krvi pacijenata sa dijabetesom tipa II koji nisu idealni kada se tretiraju metforminom i sulfonilureom.
Eksenatid je sintetički oblik hormona, eksendin-4, u pljuvačci guštera, Heloderma supectum (Gilamonster), koji se uzgaja u nekoliko država na jugozapadu Sjedinjenih Država (J.Biol.Chem.1990, 265, 20259-20262; J.Biol.Chem.1992, 267, 7402-7405), i analogan je ljudskom peptidu-1 nalik glukagonu (GLP-1), čija je aminokiselinska sekvenca delimično preklopljena aminokiselinskom sekvencom GLP-1, i moćan je agonist GLP-1 receptora, i takođe je poznat kao agonist inkretina jer taj eksenatid simulira efekat regulisanja glukoze od GLP-1. Za razliku od sulfoniluree i meglitinida, eksenatid povećava sintezu i lučenje insulina samo u prisustvu glukoze, smanjujući rizik od hipoglikemije. Neki lekari će takođe koristiti Byetta u tretmanu otpornosti na insulin.
Ipak, svojstva kao što su kratki in vivo polu-život, loša fizička i hemijska stabilnost, podložnost degradaciji različitim proteazama in vivo, uobičajena su kod proteina/polipeptidnih lekova, tako da ovim lekovima često treba više injekcija dnevno, što pacijentima donosi puno bola i neprijatnosti. PEGilacija nastala 1970-ih dokazana je tehnologija pogodna za oblast trenutne primene proteina/polipeptida. Međutim, nakon što se prosto modifikuje koristeći PEG, aktivnost lekova će generalno opadati.
Za modifikovanje struktura analoga GLP-1 korišćen je niz različitih postupaka, kako bi se omogućilo duže trajanje aktivnosti in vivo. CN1384755 obelodanjuje nove preparate agonista eksendina i njihove postupke doziranja, I obelodanjuje sastav jedinjenja eksenatida i njegovu pripremu. CN102532303 obelodanjuje postupak sinteze eksenatida konjugovanog polietilen glikolom, konjugacijom ostatka metoksi polietilen glikola sa amino lizinskim ostatkom u molekulu eksenatida ili amino ostatka histidina na N terminalu; CN101980725 obelodanjuje strukturu PEG-eksenatida masne kiseline, sa mestom modifikacije PEG-a na N-terminalu od His; WO2005028516 i WO2012035139 takođe obelodanjuju strukturu PEG-eksenatida masne kiseline. Kineski patent CN101215324 obelodanjuje mimetički peptid kratkog peptida eksenatida koji je dobijen restruktuiranjem eksenatida. Kineski patent CN101125207 opisuje PEG modifikaciju na Eksendinu-4. WO99/43708 obelodanjuje derivate GLP-1 (7-35) i GLP-1 (7-36) sa lipofilnim supstituentima povezanim na aminokiselinskim ostacima na C terminalu. WO2013059323A1 obelodanjuje PEG-konjugovani eksenatid i njegovu pripremu.
CN102397558 obelodanjuje upotrebu PEG ili PEG modifikacije sa metilnom supstitucijom na terminalu, nakon zamene nekih aminokiselina u eksendinu-4 za cistein. CN102421796 obelodanjuje da jedan ili više polietilen glikola polimerizuju do cisteina od varijanti eksendina, i obelodanjuje eksenatid u kom je jedna aminokiselina supstituisana cisteinom, i zatim modifikovana polietilen glikolom na cisteinu. CN102827270 obelodanjuje derivat eksendin-4-Cys-PEG, posebno uvodeći jedan cistein na C-terminal neaktivnog područja molekule eksenatida, i povezujući se sa maleimido polietilen glikolom, gde se on završava sa metilom na terminalu polietilen glikola.
Bez obzira na ove napore u toliko mnogo aspekata, trenutno postojeći eksendin-4 ili njegove varijante i različite modifikacije i dalje imaju neke nedostatke, uključujući i visoku učestalost doziranja kada se koristi in vivo, što pacijentima predstavlja velika opterećenja za njihova tela, mentalitet i poslovnu sposobnost, ograničavaju usklađenost pacijenata, i stoga nisu u mogućnosti da se široko primenjuju. Ostaje velika potreba za aktivnim analozima GLP-1 dugog delovanja za dijabetičku populaciju, pa je potrebno razviti nove derivate eksenatida, tako da imaju dugotrajno delovanje, dobru stabilnost, dobre hipoglikemijske efekte, uz održavanje niske toksičnosti i dobre aktivnosti.
SAŽETAK
Predmetni pronalazak je namenjen da prevaziđe nedostatke predmetno obelodanjenih GLP-1 receptora modifikatora eksenatida, sa malom snagom vezivanja i kratkim trajanjem hipoglikemije, izazivajući tako slabe efekte ili česte injekcije u kliničkoj upotrebi.
Stručnjacima je poznato da će se u bioaktivnom molekulu sa konjugovanom polimernom grupom biološka aktivnost konjugovanog biološkog molekula postepeno eksponencijalno smanjivati kako se povećava molekulska masa konjugovane grupe. Stručnjacima je takođe poznato da kako se molekularna težina polimerne grupe povećava, biološki polu-život i/ili poluživot u plazmi i sistematsko izlaganje lekovima konjugovanog biološkog molekula će se postepeno produžavati ili povećavati.
Predmetni pronalazači su neočekivano otkrili da su, modifikacijom eksenatida farmakokinetička svojstva poboljšana, povećavajući tako trajanje hipoglikemije. U poređenju sa eksenatidom, molekuli predmetnog pronalaska još uvek zadržavaju većinu aktivnosti agonista GLP-1 receptora, što znači da molekuli predmetnog pronalaska imaju visoku aktivnost agonista GLP-1 receptora, i da imaju dugačko trajanje hipoglikemije, sa mogućnošću da budu lekovi sa dugim trajanjem delovanja, dobrom stabilnošću i dobrim hipoglikemijskim efektima u budućim kliničkim primenama.
Sa jedne strane, predmetni pronalazak pruža takav modifikator eksenatida ili njegove farmaceutski prihvatljive soli koje imaju aktivnost agonista GLP-1 receptora, kao što je prikazano u formuli (I):
(Ex-4)-L-Y (I)
gde, Ex-4 je Eksendin-4; L je za povezivanje Ex-4 sa Y; L’ je hidrofilni lanac koji sadrži etarsku grupu; Y je alifatički lanac sa terminalnom karboksilnom grupom, gde je modifikator eksenatida:
k je bilo koji ceo broj između 6-20.
Dalje, u modifikatoru eksenatida (Ex-4)-L-Y predmetnog pronalaska, hidrofilni vezivni krak L može biti izabran od:
gde je m bilo koji ceo broj između 2-20; n je bilo koji ceo broj između 2-20; r je bilo koji ceo broj između 1-6.
Specifična struktura je kako sledi:
Predmetni pronalazak poželjno pruža naredne modifikatore eksenatida:
gde m je bilo koji ceo broj između 2-20; n je bilo koji ceo broj između 2-20; r je bilo koji ceo broj između 1-6; k je bilo koji ceo broj između 6-20.
Specifičnije, predmetni pronalazak pruža naredne modifikatore eksenatida:
Serija 1: pogledati Primere 1-5
Serija 4: pogledati Primere 16-20
Serija 5: pogledati Primere 21-25
Serija 8: pogledati Primere 36-40
Serija 9: pogledati Primere 41-45
1
Serija 11: pogledati Primere 51-55
Serija 12: pogledati Primere 56-60
Serija 13: pogledati Primere 61-66
m＝6; n＝3; k＝16
Ovde se takođe govori o upotrebi modifikatora eksenatida ili njegovih farmaceutski prihvatljivih soli u pripremi lekova koji služe kao agonist GLP-1 receptora, i upotrebi u pripremi lekova za sprečavanje i/ili tretman bolesti i/ili simptoma povezanih sa niskom aktivnost GLP-1 receptora. Predmetni pronalazak takođe pruža gore opisane modifikatore eksenatida za upotrebu u tretmanu bolesti i/ili simptoma povezanih sa glikometabolizmom, za upotrebu u tretmanu dijabetesa, za upotrebu u tretmanu masne jetre i za upotrebu u postupku za gubitak težine.
U trećem aspektu, predmetni pronalazak pruža sastav koji sadrži modifikator eksenatida ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, i opciono farmaceutski prihvatljive nosače.
Ovde je takođe opisana upotreba gore opisanog sastava u pripremi lekova koji služi kao agonist GLP-1 receptora, i upotreba u pripremi lekova za prevenciju i/ili tretman bolesti i/ili simptoma povezanih sa niskom aktivnošću GLP-1 receptora. Predmetni pronalazak takođe pruža gore opisan sastav za upotrebu u tretmanu bolesti i/ili simptoma povezanih sa glikometabolizmom, za upotrebu u tretmanu dijabetesa, za upotrebu u tretmanu masne jetre i za upotrebu u postupku za gubitak težine.
Modifikatori eksenatida pruženi u predmetnom pronalasku ne samo da imaju višu agonističku aktivnost GLP-1 receptora, već takođe imaju i dugo trajanje hipoglikemije. To je ilustrovano narednim farmakološkim testovima.
Svaki test uzorak je respektivno rastvoren u dvostruko destilovanoj vodi do krajnje koncentracije od 1,0×10<-2>mol/L, i čuvan na 4°C. PC12 ćelije su kultivisane u 25 cm<2>boci za kulturu smeštenoj u CO2inkubatoru (37°C, 95% vazduha, 5% CO2), sa medijumom za kulturu DMEM (Dulbecc-ov modifikovan Eagle-ov medijum, pH = 7,4, visoka glukoza), u koji je dodato 5% fetalnog goveđeg seruma i 10% konjskog seruma. Dobro uzgajane PC12 ćelije su digestirane sa 0,25% pankreatina je koncentracija ćelija je prilagođena 1,0×10<5>ćelija/ml, zasejano na 24-komoričnu ploču. Kada su ćelije porasle do gustine od 60-70%, isprane su dva puta sa PBS-om (fosfatni pufer), uz dodatak PBS-a koji sadrži 1% BSA (goveđi serumski albumin) po 1 ml, i ispitivani lekovi su podeljeni u 5 gradijenata koncentracije (10<-10>, 10<-9>, 10<-8>, 10<-7>, 10<-6>mol/L) i ko-inkubirani su se sa IBMX (3-izobutil-1-metilksantin, 100 μmol/L) tokom 30 minuta, 3 operacije višestrukih rupa su odrađene za svaku koncentraciju uzoraka. Jednom kada se intervenciono vreme lekova završi, ćelije su odmah sakupljene, suspendovane hladnim PBS-om i koncentracija ćelija je podešena na 1,0×10<7>/ml. Jedna zapremina IN HCl je odmah dodata u 9 zapremina ćelijske suspenzije, inkubirana je 10 minuta na sobnoj temperaturi, ultraozvučena 15 minuta pomoću ultrazvučnog aparata. Na 4°C je centrifugirano 10 min pri 1000omin kako bi se uklonili ostaci ćelije. Supernatant je dodat u 1N NaOH jednake zapremine sa 1N HCl do neutralizacije (gde 1N predstavlja jedan ekvivalent), gde je dobijeni rastvor rastvor uzorka koji sadrži cAMP, I čuvan je na -20°C spreman za detekciju. Non-Interference Protein Assay Kit korišćen je za detektovanje ukupne koncentracije proteina u uzorku. cAMP sadržaj u ćelijskom lizatu detektovan je korišćenjem ELISA kompleta prateći uputstva proizvođača, i vrednost OD (optička gustina) je određena na 450 nm pomoću BIO-RAD 680 čitača mikroploča. Na osnovu OD vrednosti standarda, CurveExpert 1.3 softver je korišćen za postavljanje krivih i izračunavanje standardne formule krive i izračunavanje koncentracije svakog uzorka. Kompjuterski programi Microsoft Excel i GraphPad Prism 5 softver su korišćeni za obradu podataka i grafikona za izračunavanje EC50(polu-efektivna koncentracija, koncentracija za 50% maksimalnog efekta ) svakog testiranog leka.
Tabela 1 Efekti jedinjenja na cAMP aktivnost u ćelijama
Posle vezivanja, GLP-1 i GLP-1 receptori (G-vezujući proteini porodice β receptora) aktiviraju ciklični adenozin-monofosfat (cAMP) i mitogen-aktiviranu protein kinazu (MAPK). GLP-1 receptori zrelih pankreasnih β ćelija, u kombinaciji sa G, aktiviraju adenilat ciklazu i proizvode cAMP, koji je koordinisan sa glukozom, stimulišu sintezu i lučenje insulina,
1
stimulišu transkripciju gena insulina i biosintezu proinsulina, smanjuju koncentraciju glukagona i inhibiraju lučenje glukagona, pojačavaju osetljivost ćelija na insulin, stimulišu sintezu glikogena zavisnu od insulina, smanjuju post-prandijalnu koncentraciju šećera u krvi. Nizak EC50je ukazao na više agonističke aktivnosti leka GLP-1 receptora.
Iz rezultata u Tabeli 1 se vidi, da su jedinjenja predmetnog pronalaska uporediva sa eksenatidom u aktivnosti ili su samo neznatno smanjena, što ukazuje da modifikacije eksenatida u predmetnom pronalasku nemaju uticaja na agonističke aktivnosti GLP-1 receptora.
Hipoglikemijski efekti na miševe db/db sa spontanim dijabetesom tipa 2
C57BL/6db/db9 miševi (mužjaci) uzrasta od 5 do 6 nedelja nabavljeni su od Model Animal Research Center of Nanjing University, i eksperimentalne životinje su se hranjene u SPF kućama za životinje. Kuće za životinje bile su dobro ventilirane, opremljene klima uređajima, održavajući temperaturu na 20 ~ 25°C i vlažnost vazduha od 40% do 70%, sa brzinom ventilacije od 10 do 15 puta/sat, i ciklusima svetla i tamne od 12 sati. Eksperimentalne životinje imale su slobodan pristup hrani i vodi, i svaki je miš bio obeležen ušnom etiketom. Miševi su korišćeni u eksperimentu jednom nedeljno, sa periodom ne dužim od tri nedelje. Posle nedeljne aklimatizacije, kalorijske glukoze u krvi na vrhu repa miševa određene su MAJOR meračem glukoze. Odabrano je 340 miševa sa nivoom glukoze u krvi većim od 16,7 mmol/L i nasumično su podeljeni u 68 grupa u skladu sa nivoom glukoze u krvi. Model kontrolnoj grupi je primenjeno 5 ml/kg PBS (pH=7,4) subkutanom injekcijom, pozitivnoj kontrolnoj grupi 1 je primenjeno Eksenatid (10 µg/kg, 5 mL/kg) subkutanom injekcijom, dozirajućim grupama su respektivno injektirana jedinjenja 1-15 (10 µg/kg, 5 mL/kg) subkutano. Nakon primene, glukoza u krvi pri 0, 1, 2, 4, 8, 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 72 sata određena je meračem glukoze, i svi podaci uneti su u Graphpad Prism za izračunavanje srednje vrednosti glukoze u krvi. Izračunati su maksimalni hipoglikemijski efekat (maksimalna stopa smanjenja u poređenju sa model grupom), maksimalno vremena hipoglikemije (poslednja tačka u kojoj je glukoza u krvi značajno opala u poređenju sa model grupom) i površina ispod krive.
Tabela 2 Hiipoglikemijski efekti na miševe db/db sa spontanim dijabetesom tipa 2 (sati)
Iz rezultata u Tabeli 2 se vidi da u poređenju sa Eksenatidom, jedinjenja predmetnog pronalaska imaju veliku prednost u pogledu održavanja vremena hipoglikemije, produžavajući maksimalno vreme hipoglikemije sa 4 sata na 30-48 sati.
Na osnovu rezultata prethodna dva ispitivanja, poželjna jedinjenja predmetnog pronalaska su jedinjenja 41, 42, 43, 46, 47, 48, 51-63, 65, 67.
Ukratko, modifikatori eksenatida predmetnog pronalaska bili su uporedivi sa aktivnošću eksenatida ili su samo neznatno smanjeni, zadržali su većinu agonističkih aktivnosti GLP-1 receptora, i modifikacije eksenatida nisu uticale na agonističke aktivnosti GLP-1 receptora. U međuvremenu, modifikatori eksenatida predmetnog pronalaska imaju veliku prednost u pogledu održavanja vremena hipoglikemije, produžavajući maksimalno vremena hipoglikemije sa 4 sata na 30-48 sati. Molekuli predmetnog pronalaska imaju ne samo visoke agonističke aktivnosti GLP-1 receptora, već i dugo trajanje hipoglikemije, sa mogućnošću da postanu lekovi dugog delovanja in vivo, dobre stabilnosti i dobrog hipoglikemijskog efekta u budućim kliničkim primenama.
Specifični primeri
Aminokiseline i njihove skraćenice i kratki nazivi prikazani su u narednoj tabeli:
1
Primer 1 Priprema jedinjenja 1
Priprema BP103n01
U 50mL bocu sa tri grla su dodati 1,0g jedinjenja BP103n00 (1,0ekv., gde ekv. predstavlja ekvivalent, isto u nastavku), 10ml dihlorometana, 10ml terc-butanola, 0,40g DIC(1,0ekv.), i 0,39g DMAP (1,0ekv., 4-dimetilaminopiridin). Mešano je preko noći na sobnoj temperaturi, praćeno sa TLC (tankoslojna hromatografija) do završetka reakcije, razređeno sa etrom, i zatim oprano sa vodom 3 puta, oprano sa zasićenim fiziološkim rastvorom, osušeno preko nevodenog natrijum sulfata, i hromatografirano na koloni kako bi se dobilo 10,4g BP103n0 kao penasti prašak.
Priprema BP103n02
U 100mL bocu sa tri grla su dodati 0,95 g N-hidroksi sukcinimida (HOSU), 2,0g jedinjenja 19 i 15 ml dihlorometana, u šta je 1,58g EDC•HCl dodato i reagovano je tokom 2 sata na sobnoj
1
temperaturi. Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, razređeno je sa dihlorometanom, i zatim oprano sa 50mmol/L vodenog rastvora kalijum dihidrogen fosfata pri pH=6,0 2 puta, oprano sa zasićenim fiziološkim rastvorom, osušeno preko nevodenog natrijum sulfata, i koncentrovano kako bi se dobilo 2,6g jedinjenja BP103n02 kao bela čvrsta supstanca.
Priprema BP103m01
Pod zaštitom azota, u 500ml bocu sa tri grla su dodati 200 mL piridina, 50 g BP103g00 (1,0ekv.), mešano je i ohlađeno do 0°C. 70,7g TsCl (2,1ekv.) je dodato iz serija, mešano tokom 1 sata, i zatim polako zagrejano do sobne temperature, uz nastavak mešanja tokom 3-4 sata. Nakon završetka reakcije, reakciona tečnost je sipana u ledeno hladni rastvor razređene hlorovodonične kiseline, ekstrahovano sa etil acetatom. Sloj etil acetata je opran jednom sa razređenom hlorovodoničnom kiselinom, oprano sa zasićenim natrijum bikarbonatom i zasićenim fiziološkim rastvorom, i osušeno preko nevodenog Na2SO4. Rastvarači su ispareni pod redukovanim pritiskom, i hromatografirani na silika gel koloni kako bi se dobilo 52g čistog BP103m01.
Priprema BP103m02
U 500 mL bocu sa tri grla su dodati 50g BP103m01 (1,0ekv.) i 150mL DMSO (dimetil sulfoksid), i ravnomerno mešani, u šta je je zatim dodato NaN322,0 g (4,0 ekv.), zagrejano do 50°C i reagovano je tokom 3 sata, ohlađeno do sobne temperature. Reakciona tečnost je sipana u vodu, ekstrahovano sa etil acetatom više puta. Organske faze su kombinovane, osušene preko nevodenog natrijum sulfata, i koncentrovane kako bi se dobilo 25,3g BP103m02 kao bezbojna tečnost.
Priprema BP103m03
U 1L reaktor hidrogenizacije su dodati BP103m0325g, metanol 200 mL, paladijum na ugljeniku 6,0g, mešano, zamenjeno sa azotom uvođenjem vodonika da reaguje tokom 3-4 sata.
1
Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, reakciona tečnost je filtrirana, i filtrat je koncentrovan kako bi se dobilo 20,4g BP103m03 kao ulje.
Priprema BP103m04
U 500mL bocu sa tri grla su dodati jedinjenje BP103m0320,0g (1,0ekv.), dihlorometan 200ml, i Fmoc-HOSU 24,0g (1,0 ekv.), mešano je i ohlađeno do 0°C.9,2g DIEA (1,0ekv., N,N-diizopropil etilamin) je dodato kapanjem, i mešano preko noći. Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, oprano je sa vodom i zasićenim fiziološkim rastvorom, osušeno preko nevodenog natrijum sulfata, i zatim hromatografirano na koloni kako bi se dobilo 27,3g BP103m04 kao ulje.
Priprema BP103m05
U 200mL bocu su dodati 5,0g BP103m04 (1,0ekv.), 50 ml vode, 1,7 g NaHCO3(2,0ekv.), i mešano je. Rastvor 4,7g jedinjenja BP103n02(1,0ekv.) u 50ml DME (etilen glikol dimetil etar) je dodat kapanjem, obnovljeno je sa 50ml THF (tetrahidrofuran), i mešan preko noći. Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, organski rastvarači su ispareni, prilagođeni do pH=4 sa sirćetnom kiselinom, ekstrahovani sa etil acetatom, osušeni preko nevodenog natrijum sulfata, i koncentrovani kako bi se dobilo 6,4g jedinjenja BP103m05 kao beličasta čvrsta supstanca.
Priprema BP103m06
U 100mL bocu su dodati 6,0 g jedinjenja BP103m05, 30 ml dihlorometana, 30ml TFA (trifluorosirćetna kiselina), i mešano je pri 20°C. Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, organski rastvarači su ispareni, suspendovani u petrolej etru, sukcijski filtrirani, i osušeni kako bi se dobilo 5,1g BP103m06 kao beličasta čvrsta supstanca.
Sinteza ciljanog Jedinjenja
U 20ml reakcionu kolonu su dodati 1,0g 2Cl-Trt smole, 240mg BP103m06, 5ml dihlorometana, i 300ul DIEA, u čemu se azot penuša tokom 40 minuta. 5ml dihlorometana, 1ml metanola, i 1ml DIEA su dodati i reagovano je tokom 20 minuta, nakon čega je oprano sa DMF (N,N-dimetilformamid), dajući kao proizvod BP103m06 smolu. HOBT/DIC (i.e, 1-hidroksi benzotriazol/N,N-diizopropilkarbodiimid) je korišćen kao reagens za spajanje, sa DMF kao reaktivnim rastvaračem. Reakcija je praćena uz korišćenje postupka detektovanja ninhidrina, sukcesivno vezujući naredne zaštićene aminokiseline na smolu: Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-
1
Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg (Pbf)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asp(OtBu)OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, uz konačno uklonjenu Fmoc zaštitu. Piroliza smole je postignuta korišćenjem 82,5% TFA/5% fenola/5% vode/2,5% EDT/5% tioanizola, i zatim je taloženo sa ledeno hladnim metil terc-butil etrom (MTBE), i oprano, i sirovi proizvodi su prečišćeni obrnutom HPLC kako bi se dobilo 32mg čistog ciljanog peptida.
MS(ESI<+>, m/e):4743,53[M+H]<+>
Primer 2 Priprema jedinjenja 2
Jedinjenje 2 je pripremljeno uz pozivanje na postupak Primera 1:
31,2mg čistog ciljanog peptida je dobijeno na kraju.
MS(ESI<+>, m/e): 4667,52[M+H]<+>
Primer 3 Priprema jedinjenja 3
Jedinjenje 3 je pripremljeno uz pozivanje na postupak Primera 1:
1
32,3mg čistog ciljanog peptida je dobijeno na kraju.
MS(ESI<+>, m/e): 5263,78[M+H]<+>
Primer 4 Priprema jedinjenja 4
Jedinjenje 4 je pripremljeno uz pozivanje na postupak Primera 1:
31,8mg čistog ciljanog peptida je dobijeno na kraju.
MS(ESI<+>, m/e): 5055,68[M+H]<+>
Primer 5 Priprema jedinjenja 5
Jedinjenje 5 je pripremljeno uz pozivanje na postupak Primera 1:
2
31,0mg čistog ciljanog peptida je dobijeno na kraju.
MS(ESI<+>, m/e): 4935,64[M+H]<+>
Primer 6 Priprema jedinjenja 6
Priprema BP103a01
Pod zaštitom azota, u 1000mL bocu sa tri grla su dodati 200 mL piridina, 120 g BP103a00(1,0ekv.), mešano je i ohlađeno do 0°C. 151,8g TsCl (1,0ekv.) je dodato iz serija, mešano tokom 1 sata, zatim polako zagrejano do sobne temperature, i mešanje je nastavljeno tokom 3-4 sata. Nakon završetka reakcije, reakciona tečnost je sipana u ledeno hladni razređen rastvor hlorovodonične kiseline, ekstrahovano je sa etil acetatom. Sloj etil acetata je opran jednom sa razređenom hlorovodoničnom kiselinom, oprano sa zasićenim natrijum bikarbonatom, oprano sa zasićenim fiziološkim rastvorom, i osušeno preko nevodenog Na2SO4.
Rastvarači su ispareni pod redukovanim pritiskom, i hromatografirani na silika gel koloni kako bi se dobilo 55g čistog BP103a01.
Priprema BP103a02
U 1000 mL bocu sa tri grla su dodati 55 g BP103a01 (1,0ekv.) i 160mL DMSO, ravnomerno mešani, u šta je zatim dodato NaN323,52 g (2,0 ekv.), zagrejano do 50°C i reagovano je tokom 3 sata, i ohlađeno do sobne temperature. Reakciona tečnost je sipana u vodu, ekstrahovano sa etil acetatom. Organske faze su kombinovane, osušene preko nevodenog natrijum sulfata, i koncentrovane kako bi se dobilo 29,2g BP103a02 kao bezbojna tečnost. Priprema BP103a03
U 1L reaktor hidrogenizacije su dodati 29g BP103a02, metanol 360 mL, paladijum na ugljeniku 5,0g, i mešano je. Azot je zamenjen, i vodonik je uveden kako bi reagovao tokom 3-4 sata. Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, reakciona tečnost je filtrirana, i filtrat je koncentrovan kako bi se dobilo 23,5g BP103a03 kao ulje.
Priprema BP103a04
U 1 L bocu sa tri grla su dodati 23,5 g jedinjenja BP103a03 (1.0ekv.), 68,6g (Boc)2O (2,0 ekv.), mešani rastvor metanola:trietilamina (9:1) 500ml, mešano je i zagrejano do refluksa, i reagovano je tokom 1 sata. Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, metanol trietilamin je isparen, i rastvoren sa vodom. Dihlorometan je ekstrahovan 3 puta. Organski slojevi su kombinovani i oprani jednom sa vodom, osušeni preko nevodenog natrijum sulfata. Rastvarači su ispareni, i osušeni kako bi se dobilo 34,8g BP103a04 kao čvrsta supstanca. Priprema BP103a05
U 1000mL bocu sa tri grla su dodati 34,8 g jedinjenja BP103a04 (1,0ekv.), toluen i THF 150ml svakog, bromosirćetna kiselina 58,2 g (3ekv.), mešano je, zagrejano do 45~50°C, zatim je dodat natrijum hidroksid 33,5g (6ekv.), i reagovano je preko noći. Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, reakciona tečnost je isparena, ekstrahovana sa vodom i etil acetatom, i vodena faza je prilagođena do pH 3. Vodena faza je ekstrahovana sa dihlorometanom, i slojevi dihlorometana su kombinovani, osušeni preko nevodenog natrijum sulfata, i zatim koncentrovani kako bi se dobilo 18g BP103a05 jedinjenje kao ulje.
Priprema BP103m07
U 100mL bocu sa tri grla su dodati jedinjenje BP103m045,0g (1,05ekv.), 2,9g BP103a05 (1,0ekv.), dihlorometan 50ml, DIEA 3,8g (3,0 ekv.), DEPC 2,4g (1,5 ekv., dietil cijanofosfonat). Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, reakcija je oprana sa 0,1mol/L HCl/vodom, natrijum bikarbonatom, vodom, i zasićenim fiziološkim rastvorom, i osušena preko nevodenog natrijum sulfata, i zatim hromatografirana na koloni kako bi se dobilo 6,3 g BP103m07 kao ulje. Priprema BP103m08
U 100mL bocu su dodati 6,3g jedinjenja BP103m07, 30 ml etil acetata, ohlađeno je do 0°C i dodato 7,0mol HCl/etil acetata. Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, organski rastvarači su ispareni, suspendovani sa petrolej etrom, sukcijski filtrirani, i osušeni kako bi se dobilo 5,3g BP103m08 kao beličasta čvrsta supstanca.
Priprema BP103m09
U 200mL bocu su dodati 5,0g BP103m08(1,0ekv.), 50 ml vode, 1,2 g NaHCO3(2,0ekv.), i mešano je. Rastvor 3,2g jedinjenja BP103n02(1,0ekv.) u 50ml DME (etilen glikol dimetil etar) je dodat kapanjem, obnovljeno je sa 50ml THF, i mešan preko noći. Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, organski rastvarači su ispareni, prilagođeni do pH=4 sa sirćetnom kiselinom, ekstrahovano je sa etil acetatom, osušeno preko nevodenog natrijum sulfata, i koncentrovano kako bi se dobilo 6,1g jedinjenja BP103m09 kao beličasta čvrsta supstanca.
2
Priprema BP103m10
U 100mL bocu su dodati 6,0 g jedinjenja BP103m09, 30 ml dihlorometana, 30ml TFA, i mešano je pri 20°C. Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, organski rastvarači su ispareni, suspendovani sa petrolej etrom, sukcijski filtrirani, i osušeni kako bi se dobilo 4,8g BP103m10 kao beličasta čvrsta supstanca.
Priprema ciljanog peptida
U 20ml reakcionu kolonu su dodati 1,0g 2Cl-Trt smole, 296mg BP103m10, 5ml dihlorometana, i 300ul DIEA, u čemu se azot penuša tokom 40 minuta. 5ml dihlorometana, 1ml metanola, i 1ml DIEA su dodati i reagovano je tokom 20 minuta, nakon čega je oprano sa DMF, dajući kao proizvod BP103m06 smolu. 20% piperidin/DMF je korišćen za uklanjanje Fmoc, reakcija je održavana tokom 20 minuta, HOBT/DIC je korišćen kao reagens za spajanje, i reaktivni rastvarač je DMF. Reakcija je praćena uz korišćenje postupka detektovanja ninhidrina, sukcesivno vezujući naredne zaštićene aminokiseline na smolu: Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg (Pbf)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asp(OtBu)OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, uz konačno uklonjenu Fmoc zaštitu. Piroliza smole je postignuta korišćenjem 82,5% TFA/5% fenola/5% vode/2,5% EDT/5% tioanizola, i zatim je taloženo sa ledeno hladnim metil terc-butil etrom (MTBE), i oprano i sirovi proizvodi su prečišćeni obrnutom HPLC kako bi se dobilo 39mg čistog ciljanog peptida.
MS(ESI<+>, m/e): 4932,65[M+H]<+>
Primer 7 Priprema jedinjenja 7
Jedinjenje 7 je pripremljeno uz pozivanje na postupak Primera 6:
39,6mg čistog ciljanog peptida je dobijeno na kraju. MS(ESI<+>, m/e): 5032,76[M+H]<+>
Primer 8 Priprema jedinjenja 8
Jedinjenje 8 je pripremljeno uz pozivanje na postupak Primera 6:
40,2mg čistog ciljanog peptida je dobijeno na kraju.
MS(ESI<+>, m/e): 5492,99[M+H]<+>
Primer 9 Priprema jedinjenja 9
Jedinjenje 9 je pripremljeno uz pozivanje na postupak Primera 6:
40,7mg čistog ciljanog peptida je dobijeno na kraju.
MS(ESI<+>, m/e): 5761,11[M+H]<+>
Primer 10 Priprema jedinjenja 10
Jedinjenje 10 je pripremljeno uz pozivanje na postupak Primera 6:
40,7mg čistog ciljanog peptida je dobijeno na kraju.
MS(ESI<+>, m/e): 5641,07[M+H]<+>
Primer 11 Priprema jedinjenja 11
2
Priprema BP103a
U 250mL bocu sa tri grla su dodati 18g jedinjenja BP103a05, 100ml etil acetata, mešano do rastvaranja i zatim ohlađeno do 0°C, uz dodavanje 150 ml etil acetata/HCl (3,5M), održavajući temperaturu pri 0°C. Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, filtrirana je, i filter kolač je opran sa TBME kako bi se dobilo 10,4g BP103a kao bela čvrsta supstanca. Priprema BP103a06
U 200mL bocu su dodati 5,0g BP103a (1,0ekv.), 50 ml vode, 3,5 g NaHCO3(2,0ekv.), i mešano je. Rastvor 7,3 gFmoc-HOSU (1,0ekv.) u 50ml DME (etilen glikol dimetil etar) je dodat kapanjem, obnovljeno je sa 50ml THF, i mešano preko noći. Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, organski rastvarači su ispareni, prilagođeni do pH=2 sa razređenom hlorovodoničnom kiselinom, ekstrahovano je sa etil acetatom, oprano sa vodom i zasićenim fiziološkim rastvorom, osušeno preko nevodenog natrijum sulfata, i koncentrovano kako bi se dobilo 7,6g jedinjenja BP103a06 kao beličasta čvrsta supstanca.
2
Priprema BP103m20
U 500mL bocu sa tri grla su dodati jedinjenje BP103m0310,0g (1,0ekv.), dihlorometan 100ml, (Boc)2O 7,8g (1,0 ekv.), mešano je i ohlađeno do 0°C. 4,6g DIEA (1,0ekv.) je dodat kapanjem, i mešano je preko noći. Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, oprano je sa vodom i zasićenim fiziološkim rastvorom, osušeno preko nevodenog natrijum sulfata, i zatim hromatografirano na koloni kako bi se dobilo 6,2g BP103m20 kao ulje.
Priprema BP103m21
U 100mL bocu sa tri grla su dodati jedinjenje BP103m206,2g (1,05ekv.), 6,7g BP103a06 (1,0ekv.), dihlorometan 50ml, DIEA 6,3g (3,0 ekv.), DEPC 4,0g (1,5 ekv.). Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, oprano je sa 0,1mol/L HCl/vodom, natrijum bikarbonatom, vodom, i zasićenim fiziološkim rastvorom, osušeno preko nevodenog natrijum sulfata, i zatim hromatografirano na koloni kako bi se dobilo 9,5 g BP103m21 kao ulje.
Priprema BP103m22
U 100mL bocu su dodati 9,5 g jedinjenja BP103m21, 50 ml etil acetata, mešano je i ohlađeno do 0°C, uz dodavanje 50ml 7,0mol/L HCl/etil acetata. Nakon završetka reakcije pod
2
TLC posmatranjem, organski rastvarači su ispareni, suspendovani sa petrolej etrom, sukcijski filtrirani, i osušeni kako bi se dobilo 8,3g BP103m22 kao beličasta čvrsta supstanca.
Priprema BP103m23
U 200mL bocu su dodati 5,0g BP103m22(1,0ekv.), 50 ml vode, 1,2 g NaHCO3(2,0ekv.), mešano je. Rastvor 3,2g jedinjenja BP103n02 (1,0ekv.) u 50ml DME (etilen glikol dimetil etar) je dodat kapanjem, obnovljeno je sa 50ml THF, i mešan preko noći. Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, organski rastvarači su ispareni, prilagođeni do pH=4 sa sirćetnom kiselinom, ekstrahovano je sa etil acetatom, osušeno preko nevodenog natrijum sulfata, i koncentrovano kako bi se dobilo 5,6g jedinjenja BP103m23 kao beličasta čvrsta supstanca. Priprema BP103m24
U 100mL bocu su dodati 5,6 g jedinjenja BP103m23, 30 ml dihlorometana, 30mlTFA, i mešano je pri 20°C. Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, organski rastvarači su ispareni, suspendovani sa petrolej etrom, sukcijski filtrirani, i osušeni kako bi se dobilo 4,4g BP103m24 kao beličasta čvrsta supstanca.
Priprema ciljanog peptida
U 20ml reakcionu kolonu su dodati 1,0g 2Cl-Trt smole, 296mg BP103m24, 5ml dihlorometana, i 300ul DIEA, u se azot penuša tokom 40 minuta. 5ml dihlorometana, 1ml metanola, 1ml DIEA su dodati i reagovano je tokom 20 minuta, nakon čega je oprano sa DMF, dajući kao proizvod BP103m06 smolu. 20% piperidin/DMF je korišćen za uklanjanje Fmoc, reakcija je održavana tokom 20 minuta, HOBT/DIC je korišćen kao reagens za spajanje, i reaktivni rastvarač je DMF. Reakcija je praćena uz korišćenje postupka detektovanja ninhidrina, sukcesivno vezujući naredne zaštićene aminokiseline na smolu: Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asp(OtBu)OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, uz konačno uklonjenu Fmoc zaštitu.
2
Piroliza smole je postignuta korišćenjem 82,5% TFA/5% fenola/5% vode/2,5% EDT/5% tioanizola, i zatim je taloženo sa ledeno hladnim metil terc-butil etrom (MTBE), i oprano je, i sirovi proizvodi su prečišćeni obrnutom HPLC kako bi se dobilo 29mg čistog ciljanog peptida.
MS(ESI<+>, m/e): 4932,65[M+H]<+>
Primer 12 Priprema jedinjenja 12
Jedinjenje 12 je pripremljeno uz pozivanje na postupak Primera 11.
29,1mg čistog ciljanog peptida je dobijeno na kraju.
MS(ESI<+>, m/e): 5032,76[M+H]<+>
Primer 13 Priprema jedinjenja 13
Jedinjenje 13 je pripremljeno uz pozivanje na postupak Primera 11:
30mg čistog ciljanog peptida je dobijeno na kraju.
MS(ESI<+>, m/e): 5492,99[M+H]<+>
Primer 14 Priprema jedinjenja 14
Jedinjenje 14 je pripremljeno uz pozivanje na postupak Primera 11:
30,2mg čistog ciljanog peptida je dobijeno na kraju.
MS(ESI<+>, m/e): 5761,11[M+H]<+>
Primer 15 Priprema jedinjenja 15
Jedinjenje 15 je pripremljeno uz pozivanje na postupak Primera 11:
30,4mg čistog ciljanog peptida je dobijeno na kraju.
2
MS(ESI<+>, m/e): 5641,07[M+H]<+>
Primer 16 Priprema jedinjenja 16
Priprema jedinjenja BP103g01
Pod zaštitom azota, u 500ml bocu sa tri grla su dodati 200 mL piridina, 50 g BP103g00 (1,0ekv.), mešano je i ohlađeno do 0°C. 35,5g TsCl (1,0ekv.) je dodato iz serija, mešano tokom 1 sata, i zatim polako zagrejano do sobne temperature, uz nastavak mešanja tokom 3-4 sata. Nakon završetka reakcije, reakciona tečnost je sipana u ledeno hladni rastvor razređen hlorovodoničnom kiselinom, ekstrahovano je sa etil acetatom. Sloj etil acetata je opran jednom sa razređenom hlorovodoničnom kiselinom, opran je sa zasićenim natrijum bikarbonatom i zasićenim fiziološkim rastvorom, i osušen preko nevodenog Na2SO4. Rastvarači su ispareni pod redukovanim pritiskom, i hromatografirani na silika gel koloni kako bi se dobilo 38g čistog BP103g01.
Priprema jedinjenja BP103g02
U 500 mL bocu sa tri grla su dodati 38g BP103g01 (1,0ekv.) i 190mL DMSO, ravnomerno mešani, zatim je dodat NaN311,5 g (2,0 ekv.), zagrejano je do 50°C i reagovano je tokom 3 sata, ohlađeno do sobne temperature. Reakciona tečnost je sipana u vodu, ekstrahovano je sa etil acetatom više puta. Organske faze su kombinovane, osušene preko nevodenog natrijum sulfata, i koncentrovane kako bi se dobilo 40g BP103g02 kao bezbojna tečnost.
Priprema jedinjenja BP103g03
U 1L reaktor hidrogenizacije su dodati BP103g02 70g, metanol 500 mL, paladijum na ugljeniku 8,0g, mešano je, zamenjeno sa azotom uvođenjem vodonika da reaguje tokom 3-4 sata. Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, reakciona tečnost je filtrirana, i filtrat je koncentrovan kako bi se dobilo 52g BP103g03 kao ulje.
Priprema jedinjenja BP103g04
U 250mL bocu sa tri grla su dodati jedinjenje BP103g0310,0g (1.0ekv.), (Boc)2O 15,5g (2,0 ekv.), mešani rastvor metanola:trietilamina (9:1) 200ml, mešano i zagrejano do refluksa, i reagovano je tokom 1 sata. Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, metanol trietilamin je isparen, i rastvoren sa vodom. Dihlorometan je ekstrahovan 3 puta. Organski slojevi su kombinovani i oprani jednom sa vodom, osušeni preko nevodenog natrijum sulfata, i koncentrovani kako bi se dobilo 9,0g BP103g04 kao ulje.
Priprema jedinjenja BP103g05
U 250mL bocu sa tri grla su dodati BP103g04 jedinjenje 7,0 g (1,0ekv.), toluen i THF 40ml svakog, bromosirćetna kiselina 7,6 g (3,0ekv.), mešano je, zagrejano do 45~50°C, zatim je dodat natrijum hidroksid 4,4g, i reagovano je preko noći. Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, reakciona tečnost je isparena. Nečistoće su ekstrahovane sa vodom i etil acetatom, i vodena faza je prilagođena do pH=3. Vodena faza je ekstrahovana sa dihlorometanom, i slojevi dihlorometana su kombinovani, osušeni preko nevodenog natrijum sulfata, i zatim koncentrovani kako bi se dobilo 4,2g BP103g05 jedinjenja kao ulje.
Priprema BP103m30
U 100mL bocu sa tri grla su dodati jedinjenje BP103g05 4,2g (1. 05ekv.), 2,9g Fmocetilendiamin hlorovodonik (1. 0ekv.), dihlorometan 50ml, DIEA 3,7g (3,0 ekv.), DEPC 2,3g (1,5 ekv.). Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, oprano je sa 0,1mol/L HCl/vodom, natrijum bikarbonatom, vodom, i zasićenim fiziološkim rastvorom, osušeno preko nevodenog
1
natrijum sulfata, i zatim hromatografirano na koloni kako bi se dobilo 5,6 g BP103m21 kao ulje.
Priprema BP103m31
U 100mL bocu su dodati 5,6g jedinjenja BP103m30, 30 ml etil acetata, mešano je i ohlađeno do 0°C, uz dodavanje 30ml 7,0mol/L HCl/etil acetata. Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, organski rastvarači su ispareni, suspendovani sa petrolej etrom, sukcijski filtrirani, i osušeni kako bi se dobilo 4,8g BP103m31 kao beličasta čvrsta supstanca.
Priprema BP103m32
U 200mL bocu su dodati 4,6g BP103m31 (1,0ekv.), 45 ml vode, 1,2 g NaHCO3(2,0ekv.), i mešano je. Rastvor 3,4g jedinjenja BP103n02 (1,0ekv.) u 45ml DME (etilen glikol dimetil etar) je dodat kapanjem, obnovljeno je sa 45ml THF, i mešano je preko noći. Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, organski rastvarači su ispareni, prilagođeni do pH=4 sa sirćetnom kiselinom, ekstrahovano je sa etil acetatom, osušeno preko nevodenog natrijum sulfata, i koncentrovano kako bi se dobilo 4,9g jedinjenja BP103m32 kao beličasta čvrsta supstanca.
Priprema BP103m33
U 100mL bocu su dodati 4,5g jedinjenja BP103m32, 25 ml dihlorometana, 25ml TFA, i mešano je pri 20°C. Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, organski rastvarači su ispareni, suspendovani sa petrolej etrom, sukcijski filtrirani, i osušeni kako bi se dobilo 3,8g BP103m33 kao beličasta čvrsta supstanca.
U 20ml reakcionu kolonu su dodati 1,0g 2Cl-Trt smole, 270mg BP103m33, 5ml dihlorometana, 300ul DIEA, u čemu se azot penuša tokom 40 minuta.5ml dihlorometana, 1ml metanola, 1ml DIEA su dodati i reagovano je tokom 20 minuta, nakon čega je oprano sa DMF, dajući kao proizvod BP103m06 smola. 20% piperidin/DMF je korišćen za uklanjanje Fmoc, reakcija je održavana tokom 20 minuta, HOBT/DIC je korišćen kao reagens za spajanje, i reaktivni rastvarač je DMF. Reakcija je praćena uz korišćenje postupka detektovanja ninhidrina, sukcesivno vezujući naredne zaštićene aminokiseline na smolu: Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Ile-
2
OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg (Pbf)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asp(OtBu)OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, uz konačno uklonjenu Fmoc zaštitu. Piroliza smole je postignuta korišćenjem 82,5% TFA/5% fenola/5% vode/2,5% EDT/5% tioanizola, i zatim je taloženo sa ledeno hladnim metil terc-butil etrom (MTBE), i oprano, i sirovi proizvodi su prečišćeni obrnutom HPLC kako bi se dobilo 33mg čistog ciljanog peptida.
MS(ESI<+>, m/e): 4844,6[M+H]<+>
Primer 17 Priprema jedinjenja 17
Jedinjenje 17 je pripremljeno uz pozivanje na postupak Primera 16.
32mg čistog ciljanog peptida je dobijeno na kraju.
MS(ESI<+>, m/e): 4710,54[M+H]<+>
Primer 18 Priprema jedinjenja 18
Jedinjenje 18 je pripremljeno uz pozivanje na postupak Primera 16.
33,5mg čistog ciljanog peptida je dobijeno na kraju.
MS(ESI<+>, m/e): 5170,77[M+H]<+>
Primer 19 Priprema jedinjenja 19
Jedinjenje 19 je pripremljeno uz pozivanje na postupak Primera 16.
33,1mg čistog ciljanog peptida je dobijeno na kraju.
MS(ESI<+>, m/e): 5090,82 [M+H]<+>
Primer 20 Priprema jedinjenja 20
Jedinjenje 20 je pripremljeno uz pozivanje na postupak Primera 16.
33,1mg čistog ciljanog peptida je dobijeno na kraju.
MS(ESI<+>, m/e): 5090,82 [M+H]<+>
Primer 21 Priprema jedinjenja 21
Postupak pripreme BP103m06 se nalazi u Primeru 6.
U 20ml reakcionu kolonu su dodati 1,0g 2Cl-Trt smole, 240mg BP103m06, 5ml dihlorometana, 300ul DIEA, u čemu se azot penuša tokom 40 minuta.5ml dihlorometana, 1ml metanola, 1ml DIEA su dodati i reagovano je tokom 20 minuta, nakon čega je oprano sa DMF, dajući kao proizvod BP103m06 smola. 20% piperidin/DMF je korišćen za uklanjanje Fmoc, reakcija je održavana tokom 20 minuta, HOBT/DIC je korišćen kao reagens za spajanje, i reaktivni rastvarač je DMF. Reakcija je praćena uz korišćenje postupka detektovanja ninhidrina, sukcesivno vezujući naredne zaštićene aminokiseline na smolu: Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH,
4
Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg (Pbf)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asp(OtBu)OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, uz konačno uklonjenu Fmoc zaštitu. Piroliza smole je postignuta korišćenjem 82,5% TFA/5% fenola/5% vode/2,5% EDT/5% tioanizola, i zatim je taloženo sa ledeno hladnim metil terc-butil etrom (MTBE), i oprano, i sirovi proizvodi su prečišćeni obrnutom HPLC kako bi se dobilo 42mg čistog ciljanog peptida.
MS(ESI<+>, m/e): 4800,56 [M+H]<+>
Primer 22 Priprema jedinjenja 22
Jedinjenje 22 je pripremljeno uz pozivanje na postupak Primera 21.
41,7mg čistog ciljanog peptida je dobijeno na kraju.
MS(ESI<+>, m/e): 4710,53 [M+H]<+>
Primer 23 Priprema jedinjenja 23
Jedinjenje 23 je pripremljeno uz pozivanje na postupak Primera 21.
42,5mg čistog ciljanog peptida je dobijeno na kraju.
MS(ESI<+>, m/e): 5184,78[M+H]<+>
Primer 24 Priprema jedinjenja 24
Jedinjenje 24 je pripremljeno uz pozivanje na postupak Primera 21.
42,1mg čistog ciljanog peptida je dobijeno na kraju.
MS(ESI<+>, m/e): 5104,83[M+H]<+>
Primer 25 Priprema jedinjenja 25
Jedinjenje 25 je pripremljeno uz pozivanje na postupak Primera 21.
43mg čistog ciljanog peptida je dobijeno na kraju.
MS(ESI<+>, m/e): 5390,91[M+H]<+>
Primer 26
Priprema BP103m40
U 500mL bocu sa tri grla su dodati jedinjenje BP103g0125,0g (1.0ekv.), acetonitril 250ml, Fmoc-etilendiamin hlorovodonik 18,3g (1,0 ekv.), mešano je i ohlađeno do 0°C, uz dodavanje 7,9g kalijum karbonata (1,0ekv.). Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, oprano je sa razređenom hlorovodoničnom kiselinom i zasićenim fiziološkim rastvorom, osušeno preko nevodenog natrijum sulfata, i zatim hromatografirano na koloni kako bi se dobilo 25,3g BP103m40 kao ulje.
Priprema BP103m41
U 500mL bocu sa tri grla su dodati jedinjenje BP103m4025,0g (1.0ekv.), dihlorometan 250ml, (Boc)2O 19,9g (2,0 ekv.), u šta je 17,7g DIEA (3,0ekv.) dodato kapanjem. Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, oprano je sa razređenom hlorovodoničnom kiselinom, vodenim rastvorom natrijum bikarbonata i zatim zasićenim fiziološkim rastvorom, osušeno preko nevodenog natrijum sulfata, i zatim hromatografirano na koloni kako bi se dobilo 23,8g BP103m41 kao ulje.
Priprema BP103m42
Pod zaštitom azota, u 1000mL bocu sa tri grla su dodati 100 mL piridina, 23,5 g BP103m41 (1,0ekv.), mešano je i ohlađeno do 0°C.8,3g TsCl (1,2ekv.) je dodato iz serija, mešano tokom 1 sata, i zatim polako zagrejano do sobne temperature, uz nastavak mešanja tokom 3-4 sata. Nakon završetka reakcije, veći deo piridina je isparen, rastvoren u etil acetatu, oprano je jednom sa razređenom hlorovodoničnom kiselinom, oprano je sa zasićenim natrijum bikarbonatom i zasićenim fiziološkim rastvorom, osušeno preko nevodenog Na2SO4, i hromatografirano na silika gel koloni kako bi se dobilo 25,3g čistog BP103m42.
Priprema BP103m43
U 1000 mL bocu sa tri grla su dodati 25,0 g BP103m42 (1,0ekv.) i 100mL DMSO, ravnomerno mešani, zatim je dodat NaN34,1 g (2,0 ekv.), zagrejano je do 50°C i reagovano je tokom 3 sata, ohlađeno do sobne temperature. Reakciona tečnost je sipana u vodu, ekstrahovano je sa etil acetatom, organske faze su kombinovane, osušeno je preko nevodenog natrijum sulfata, i koncentrovano kako bi se dobilo 22,7g BP103m43 kao bezbojna tečnost.
Priprema BP103m44
U 1L reaktor hidrogenizacije su dodati 22,7g jedinjenja BP103m43, metanol 250 mL, paladijum na ugljeniku 5,0g, mešano, zamenjeno je sa azotom uvođenjem vodonika da reaguje tokom 3-4 sata. Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, reakciona tečnost je filtrirana, i filtrat je koncentrovan kako bi se dobilo 19,6g BP103m44 kao ulje.
Priprema BP103m45
U 500mL bocu su dodati 10,0g BP103m44 (1,0ekv.), 100 ml vode, 2,6g NaHCO3(2,0ekv.), i mešano je. Rastvor 7,2g jedinjenja BP103n02 (1,0ekv.) u 100ml DME (etilen glikol dimetil etar) je dodato kapanjem, obnovljeno je sa 100ml THF, i mešano je preko noći. Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, organski rastvarači su ispareni, prilagođeni do pH=4 sa sirćetnom kiselinom, ekstrahovano je sa etil acetatom, osušeno preko nevodenog natrijum sulfata, i koncentrovano kako bi se dobilo 13,2g jedinjenja BP103m45 kao beličasta čvrsta supstanca.
Priprema BP103m46
U 100mL bocu su dodati 13,2 g jedinjenja BP103m45, 15 ml dihlorometana, 15ml TFA, i mešano je pri 20°C. Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, organski rastvarači su ispareni, suspendovani sa petrolej etrom, sukcijski filtrirani, i osušeni kako bi se dobilo 10,5g BP103m46 kao beličasta čvrsta supstanca.
Priprema BP103m47
U 250mL bocu sa tri grla su dodati 10,5 g jedinjenja BP103m36 (1. 0ekv.), 110ml dihlorometana, 5,4g (Boc)2O (2,0 ekv.), u šta je 4,8g DIEA (3,0ekv.) je dodato kapanjem. Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, oprano je sa razređenom hlorovodoničnom kiselinom, vodenim rastvorom natrijum bikarbonata, i zatim zasićenim fiziološkim rastvorom, osušeno preko nevodenog natrijum sulfata, i hromatografirano na koloni kako bi se dobilo 7,9g BP103m47 kao beličasta čvrsta supstanca.
U 20ml reakcionu kolonu su dodati 1,0g 2Cl-Trt smole, 283mg BP103m47, 5ml dihlorometana, i 300ul DIEA, u čemu se azot penuša tokom 40 minuta. 5ml dihlorometana, 1ml metanola, i 1ml DIEA su dodati i reagovano je tokom 20 minuta, nakon čega je oprano sa DMF, dajući kao proizvod BP103m06 smola. 20% piperidin/DMF je korišćen za uklanjanje Fmoc, reakcija je održavana tokom 20 minuta, HOBT/DIC je korišćen kao reagens za spajanje, i reaktivni rastvarač je DMF. Reakcija je praćena uz korišćenje postupka detektovanja ninhidrina, sukcesivno vezujući naredne zaštićene aminokiseline na smolu: Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg (Pbf)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Met-OH, FmocGln(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asp(OtBu)OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, uz konačno uklonjenu Fmoc zaštitu. Piroliza smole je postignuta korišćenjem 82,5% TFA/5% fenola/5% vode/2,5% EDT/5% tioanizola, i zatim je taloženo sa ledeno hladnim metil terc-butil etrom (MTBE), i oprano, i sirovi proizvodi su prečišćeni obrnutom HPLC kako bi se dobilo 41mg čistog ciljanog peptida.
MS(ESI<+>, m/e): 4771,57[M+H]<+>
Primer 27 Priprema jedinjenja 27
Jedinjenje 27 je pripremljeno uz pozivanje na postupak Primera 26.
40,5mg čistog ciljanog peptida je dobijeno na kraju.
MS(ESI<+>, m/e): 4611,44[M+H]<+>
Primer 28 Priprema jedinjenja 28
Jedinjenje 28 je pripremljeno uz pozivanje na postupak Primera 26.
41,6mg čistog ciljanog peptida je dobijeno na kraju.
MS(ESI<+>, m/e): 5141,77[M+H]<+>
Primer 29 Priprema jedinjenja 29
Jedinjenje 29 je pripremljeno uz pozivanje na postupak Primera 26.
41,2mg čistog ciljanog peptida je dobijeno na kraju.
MS(ESI<+>, m/e): 5061,82[M+H]<+>
Primer 30 Priprema jedinjenja 30
Jedinjenje 30 je pripremljeno uz pozivanje na postupak Primera 26.
42,3mg čistog ciljanog peptida je dobijeno na kraju.
MS(ESI<+>, m/e): 5347,9[M+H]<+>
Primer 31 Priprema jedinjenja 31
Priprema BP103m50
U 100mL bocu sa tri grla su dodati 286mg N-hidroksi sukcinimida (HOSU), 0,50g BP103a05 i 5 ml dihlorometana, u šta je 477mg EDC•HCl je dodato i reagovano na sobnoj temperaturi tokom 2 sata. Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, razređeno je sa dihlorometanom, i zatim oprano sa 50mmol/L vodenog rastvora kalijum dihidrogen fosfata pri pH=6,0 2 puta, oprano sa zasićenim fiziološkim rastvorom, osušeno preko nevodenog natrijum sulfata, i koncentrovano kako bi se dobilo 0,72g jedinjenja BP103m50 kao ulje.
Priprema BP103m51
U 100mL bocu su dodati 0,62g jedinjenja BP103g06(1,0ekv.), 10 ml vode, 0,27 g NaHCO3(2,0ekv.), i mešano je. Rastvor 0,66 g jedinjenja BP103m50 u 10ml DME (etilen glikol dimetil etar) je dodat kapanjem, obnovljeno je sa 5ml THF, i mešano je preko noći. Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, organski rastvarači su ispareni, prilagođeni do pH=4 sa razređenom hlorovodoničnom kiselinom, ekstrahovano je sa dihlorometanom, osušeno preko nevodenog natrijum sulfata, i koncentrovano kako bi se dobilo 0,71g jedinjenja BP103m51 kao
4
ulje.
Priprema BP103m52
U 100mL bocu su dodati 0,71g jedinjenja BP103m51 i 5ml etil acetata, nakon što su rastvoreni, ohlađeni su do 0°C, u šta je 5 ml HCl/etil acetata(7mol/L) dodato, održavajući temperaturu pri 0°C. Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, koncentrovani su kako bi se dobilo 0,71g BP103m52 kao ulje.
Priprema BP103m53
U 100mL bocu su dodati 640mg jedinjenja BP103m52(1,0ekv.), 15 ml vode, 190mg NaHCO3(2,0ekv.), i mešano je. Rastvor 528mg jedinjenja BP103n02 u 15ml DME (etilen glikol dimetil etar) je dodat kapanjem, obnovljeno je sa 15mlTHF, i mešano je preko noći. Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, organski rastvarači su ispareni, prilagođeni do pH=6 sa sirćetnom kiselinom, ekstrahovano je sa dihlorometanom, osušeno preko nevodenog natrijum sulfata, i koncentrovano kako bi se dobilo 0,65g jedinjenja BP103m53 kao ulje.
Priprema BP103m54
U 100mL bocu sa tri grla su dodati jedinjenje BP103m53 3,0g (1. 0ekv.), 1,1g Fmocetilendiamin hlorovodonik (1,05ekv.), dihlorometan 30ml, DIEA 1,3g (3,0 ekv.), i DEPC 0,8g (1,5 ekv.). Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, oprano je sa 0,1mol/L HCl/vodom, natrijum bikarbonatom, vodom, i zasićenim fiziološkim rastvorom, osušeno preko nevodenog natrijum sulfata, i zatim hromatografirano na koloni kako bi se dobilo 2,9g BP103m54 kao ulje.
Priprema BP103m55
U 100mL bocu su dodati 2,9g jedinjenja BP103m54, 15 ml dihlorometana, 15ml TFA, i mešano je pri 20°C. Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, organski rastvarači su ispareni, suspendovani sa petrolej etrom, sukcijski filtrirani, i osušeni kako bi se dobilo 2,5g BP103m55 kao beličasta čvrsta supstanca.
U 20ml reakcionu kolonu su dodati 1,0g 2Cl-Trt smole, 344mg BP103m55, 5ml dihlorometana, i 300ul DIEA, u čemu se azot penuša tokom 40 minuta. 5ml dihlorometana, 1ml metanola, i 1ml DIEA su dodati i reagovano je tokom 20 minuta, nakon čega je oprano sa DMF, dajući kao proizvod BP103m06 smola. 20% piperidin/DMF je korišćen za uklanjanje Fmoc, reakcija je održavana tokom 20 minuta, HOBT/DIC je korišćen kao reagens za spajanje, i reaktivni rastvarač je DMF. Reakcija je praćena uz korišćenje postupka detektovanja ninhidrina, sukcesivno vezujući naredne zaštićene aminokiseline na smolu: Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg (Pbf)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asp(OtBu)OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, uz konačno uklonjenu Fmoc zaštitu. Piroliza smole je postignuta korišćenjem 82,5% TFA/5% fenola/5% vode/2,5% EDT/5% tioanizola, i zatim je taloženo sa ledeno hladnim metil terc-butil etrom (MTBE), i oprano, i sirovi proizvodi su prečišćeni obrnutom HPLC kako bi se dobilo 46mg čistog ciljanog peptida.
MS(ESI<+>, m/e): 5033,72[M+H]<+>
Primer 32 Priprema jedinjenja 32
Jedinjenje 32 je pripremljeno uz pozivanje na postupak Primera 31.
46,8mg čistog ciljanog peptida je dobijeno na kraju.
MS(ESI<+>, m/e): 5578,07[M+H]<+>
Primer 33 Priprema jedinjenja 33
Jedinjenje 33 je pripremljeno uz pozivanje na postupak Primera 31.
46,4mg čistog ciljanog peptida je dobijeno na kraju.
MS(ESI<+>, m/e): 5447,95[M+H]<+>
Primer 34 Priprema jedinjenja 34
Jedinjenje 34 je pripremljeno uz pozivanje na postupak Primera 31.
46,5mg čistog ciljanog peptida je dobijeno na kraju.
MS(ESI<+>, m/e): 5588,15 [M+H]<+>
Primer 35 Priprema jedinjenja 35
Jedinjenje 35 je pripremljeno uz pozivanje na postupak Primera 31.
46mg čistog ciljanog peptida je dobijeno na kraju.
MS(ESI<+>, m/e): 5521,99 [M+H]<+>
Primer 36 Priprema jedinjenja 36
Priprema BP103m60
U 500mL bocu su dodati 10,0g BP103g06(1,0ekv.), 100 ml vode, 4,5g NaHCO3(2,0ekv.),
4
i mešano je. Rastvor 12,4g jedinjenja BP103n02(1,0ekv.) u 100ml DME (etilen glikol dimetil etar) je dodat kapanjem, obnovljeno je sa 100ml THF, i mešano je preko noći. Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, organski rastvarači su ispareni, prilagođeni do pH=4 sa sirćetnom kiselinom, ekstrahovano je sa etil acetatom, osušeno preko nevodenog natrijum sulfata, i koncentrovano kako bi se dobilo 15,2g jedinjenja BP103m60 kao beličasta čvrsta supstanca.
Priprema BP103m61
U 100mL bocu sa tri grla su dodati jedinjenje BP103m443,0g (1,05ekv.), 3,1g (1,0ekv.) BP103m60, dihlorometan 30ml, DIEA 1,7g (3,0 ekv.), DEPC 1,1g (1,5 ekv.). Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, oprano je sa 0,1mol/L HCl/vodom, natrijum bikarbonatom, vodom, i zasićenim fiziološkim rastvorom, osušeno preko nevodenog natrijum sulfata, i zatim hromatografirano na koloni kako bi se dobilo 4,1g BP103m61 kao ulje.
Priprema BP103m62
U 100mL bocu su dodati 4,1g jedinjenja BP103m61, 20 ml dihlorometana, 20ml TFA, i mešano je pri 20°C. Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, organski rastvarači su ispareni, suspendovani sa petrolej etrom, sukcijski filtrirani, i osušeni kako bi se dobilo 3,5g BP103m62 kao beličasta čvrsta supstanca.
Priprema BP103m63
U 250mL bocu sa tri grla su dodati 3,5 g jedinjenja BP103m62 (1,0ekv.), 50ml dihlorometana, i 1,2g (Boc)2O (2,0 ekv.), u šta je 1,1g DIEA (3,0ekv.) je dodato kapanjem. Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, oprano je sa razređenom hlorovodoničnom kiselinom, vodenim rastvorom natrijum bikarbonata, i zatim zasićenim fiziološkim rastvorom, osušeno preko nevodenog natrijum sulfata, i hromatografirano na koloni kako bi se dobilo 2,6g BP103m63 kao beličasta čvrsta supstanca.
U 20ml reakcionu kolonu su dodati 1,0g 2Cl-Trt smole, 408mg BP103m63, 5ml dihlorometana, 300ul DIEA, u čemu se azot penuša tokom 40 minuta.5ml dihlorometana, 1ml metanola, i 1ml DIEA su dodati i reagovano je tokom 20 minuta, nakon čega je oprano sa DMF, dajući kao proizvod BP103m06 smola. 20% piperidin/DMF je korišćen za uklanjanje Fmoc, reakcija je održavana tokom 20 minuta, HOBT/DIC je korišćen kao reagens za spajanje, i reaktivni rastvarač je DMF. Reakcija je praćena uz korišćenje postupka detektovanja ninhidrina, sukcesivno vezujući naredne zaštićene aminokiseline na smolu: Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg (Pbf)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asp(OtBu)OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, uz konačno uklonjenu Fmoc zaštitu. Piroliza smole je postignuta korišćenjem 82,5% TFA/5% fenola/5% vode/2,5% EDT/5% tioanizola, i zatim je taloženo sa ledeno hladnim metil terc-butil etrom (MTBE), i oprano, i sirovi proizvodi su prečišćeni obrnutom HPLC kako bi se dobilo 55mg čistog ciljanog peptida.
MS(ESI<+>, m/e): 5107,81[M+H]<+>
4
Primer 37 Priprema jedinjenja 37
Jedinjenje 37 je pripremljeno uz pozivanje na postupak Primera 36.
55,7mg čistog ciljanog peptida je dobijeno na kraju.
MS(ESI<+>, m/e): 5564,1 [M+H]<+>
Primer 38 Priprema jedinjenja 38
Jedinjenje 38 je pripremljeno uz pozivanje na postupak Primera 36.
55mg čistog ciljanog peptida je dobijeno na kraju.
MS(ESI<+>, m/e): 5433,98 [M+H]<+>
Primer 39 Priprema jedinjenja 39
Jedinjenje 39 je pripremljeno uz pozivanje na postupak Primera 36.
55,2mg čistog ciljanog peptida je dobijeno na kraju.
MS(ESI<+>, m/e): 5574,18 [M+H]<+>
Primer 40 Priprema jedinjenja 40
Jedinjenje 40 je pripremljeno uz pozivanje na postupak Primera 36.
55,3mg čistog ciljanog peptida je dobijeno na kraju.
MS(ESI<+>, m/e): 5508,02[M+H]<+>
Primer 41 Priprema jedinjenja 41
Priprema Eksendin-4(1-39)-Lys40(Alloc)-NH2
Peptidi čvrste faze ciljanih peptida su sintetisani koristeći sintezu čvrste faze Fmoc procesa, koristeći Fmoc-Rink MBHA amid smolu, gde je 20% piperidin/DMF korišćen za uklanjanje Fmoc, HOBT/DIC je korišćen kao reagens za spajanje, i reaktivni rastvarač je DMF. Reakcija
4
je praćena uz korišćenje postupka detektovanja ninhidrina, sukcesivno vezujući naredne zaštićene aminokiseline na Rink MBHA amid smolu: Fmoc-Lys(Alloc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg (Pbf)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asp(OtBu)OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, (BOC)2O (koristeći DIEA, dihlorometan). Oprano je sa DMF, metanolom, i dihlorometanom, i zatim osušeno kako bi se dobilo 12,1g Eksendin-4(1-39)-Lys40(Alloc)-NH2smole.
4
Priprema jedinjenja a02
Pod zaštitom azota, u 500ml bocu sa tri grla su dodati 200 mL piridina, 50 g a01 (1,0ekv.), mešano je i ohlađeno do 0°C, u šta je 35,5g TsCl(1,0ekv.) je dodato iz serija, mešano tokom 1 sata, i zatim je polako zagrejano do sobne temperature, uz nastavak mešanja tokom 3-4 sata. Nakon završetka reakcije, reakciona tečnost je sipana u ledeno hladni rastvor razređen hlorovodoničnom kiselinom, uz generisanje čvrste supstance, koja je ekstrahovana sa etil acetatom. Sloj etil acetata je opran jednom sa razređenom hlorovodoničnom kiselinom, oprano je sa zasićenim natrijum bikarbonatom i zasićenim fiziološkim rastvorom, i osušeno preko nevodenog Na2SO4. Rastvarači su ispareni pod redukovanim pritiskom, i hromatografirani na silika gel koloni kako bi se dobilo 38g čistog a02.
Priprema jedinjenja a03
U 500 mL bocu sa tri grla su dodati 38g (1,0ekv.) i 190mL DMSO, ravnomerno mešani, zatim je dodato NaN311,5 g (2,0 ekv.), zagrejano je do 50°C i reagovano je tokom 3 sata, i ohlađeno do sobne temperature. Reakciona tečnost je sipana u vodu, ekstrahovano je sa etil acetatom više puta. Organske faze su kombinovane, osušeno je preko nevodenog natrijum sulfata, i koncentrovano kako bi se dobilo 40g a03 kao bezbojna tečnost.
Priprema jedinjenja a04
U 1L reaktor hidrogenizacije su dodati a0370g, metanol 500 mL, paladijum na ugljeniku 8,0g, i mešano je, zamenjeno sa azotom uvođenjem vodonika da reaguje tokom 3-4 sata. Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, reakciona tečnost je filtrirana, i filtrat je koncentrovan kako bi se dobilo 52g a04 kao ulje.
Priprema jedinjenja a05
U 250mL bocu sa tri grla su dodati jedinjenje a0410,0g (1,0ekv.), (Boc)2O 15,5g (2,0 ekv.), mešani rastvor metanola:trietilaminaa (9:1) 200ml, mešano je, zagrejano do refluksa, i reagovano je tokom 1 sata. Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, metanol trietilamin je isparen, i rastvoreno je u vodi, i ekstrahovano sa dihlorometanom 3 puta. Organski slojevi su kombinovani i oprano jednom sa vodom, osušeno preko nevodenog natrijum sulfata, i koncentrovano kako bi se dobilo 9,0g a05 kao ulje.
Priprema jedinjenja a06
U 250mL bocu sa tri grla su dodati a05 jedinjenje 7,0 g (1,0ekv.), toluen i THF 40ml svakog, bromosirćetna kiselina 7,6 g (3,0ekv.), mešano je, i zagrejano do 45~50°C, u šta je 4,4g natrijum hidroksida zatim dodato, i reagovano je preko noći. Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, reakciona tečnost je isparena, nečistoće su ekstrahovano sa vodom i etil acetatom, i vodena faza je prilagođena do pH=3. Vodena faza je ekstrahovana sa
4
dihlorometanom, i slojevi dihlorometana su kombinovani, osušeni preko nevodenog natrijum sulfata, i zatim koncentrovani kako bi se dobilo 4,2g a06 jedinjenje kao ulje.
Priprema jedinjenja a07
U 250mL bocu sa jednim grlom su dodati jedinjenje a064,0g i 20ml etil acetata, nakon što su rastvoreni, ohlađeni su do 0°C, u šta je je dodato 20 ml HCl/etil acetata (7mol/L). Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, koncentrovani su kako bi se dobilo 4,2g a07 kao ulje.
Priprema jedinjenja a09
U 50mL bocu sa tri grla su dodati 1,0g jedinjenja a08(1,0ekv.), 10ml dihlorometana, 10ml terc-butanola, 0,40g DIC(1,0ekv.), 0,39g DMAP(1,0ekv.), i mešano je preko noći na sobnoj temperaturi. Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, razređeno je sa etrom, zatim oprano sa vodom 3 puta i oprano sa zasićenim fiziološkim rastvorom, osušeno preko nevodenog natrijum sulfata, i hromatografirano na koloni kako bi se dobilo 0,4g a09 kao penasti prašak. Priprema jedinjenja a10
U 100mL bocu sa tri grla su dodati 0,95 g N-hidroksi sukcinimida (HOSU), 2,0g jedinjenja a09 i 15 ml dihlorometana, u šta je 1,58g EDC∙HCl dodato i reagovano je tokom 2 sata na sobnoj temperaturi. Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, razređeno je sa dihlorometanom, zatim oprano sa 50mmol/L vodenog rastvora kalijum dihidrogen fosfata pri pH=6,0 2 puta, i oprano sa zasićenim fiziološkim rastvorom, osušeno preko nevodenog natrijum sulfata, i koncentrovano kako bi se dobilo 2,6g jedinjenja a10 kao ulje.
Priprema jedinjenja a11
U 100mL bocu su dodati 1,28g jedinjenja a07(1,0ekv.), 20 ml vode, 1,16g NaHCO3(4,0ekv.), i mešano je. Rastvor 1,75g jedinjenja a10 u 20ml DME(etilen glikol dimetil etar) je dodat kapanjem, obnovljeno je sa 20ml THF, i mešano preko noći. Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, organski rastvarači su ispareni, prilagođeno je do pH=6 sa sirćetnom kiselinom, ekstrahovano je sa etil acetatom, osušeno preko nevodenog natrijum sulfata, i koncentrovano kako bi se dobila beličasta čvrsta supstanca, koja je hromatografirana na koloni kako bi se dobilo 0,95g jedinjenja a11.
1,5g Eksendin-4(1-39)-Lys40-NH2smola je nabubrena u DMF, u šta je je zatim dodato 3ekv. rastvora Pd(PPh3)4u CHCl3:AcOH:NMM (18:1:0,5). Ovo je reagovano tokom 2 sata,
4
zatim oprano sa hloroformom (6 puta, 20ml hloroforma svaki put), oprano sa 20% rastvorom HOAc u dihlorometanu (6 puta, 20ml 20% rastvorom HOAc u dihlorometanu svaki put), oprano sa dihlorometanom (6 puta, 20ml dihlorometana svaki put) i oprano sa DMF (6 puta, 20ml DMF svaki put). Kada je ninhidrin pozitivno detektovan, 5ml DMF, 415mg jedinjenja a11, 150mg HOAT, i 150ul DIC su dodati i reagovano je tokom 4 sata; i kada je ninhidrin negativno detektovan, to je ukazalo da je bočni lanac a11 povezan za Eksendin-4(1-39)-Lys40-NH2smolu. Piroliza smole je sprovedena korišćenjem 82,5% TFA/5% fenola/5% vode/2,5% EDT/5% tioanizola, i zatim je taloženo sa ledeno hladnim metil terc-butil etrom (MTBE), i oprano. Sirovi proizvodi su prečišćeni sa HPLC kako bi se dobilo 43mg ciljanog jedinjenja.
MS(ESI<+>, m/e): 4932,56 [M+H]<+>
Primer 42 Priprema jedinjenja 42
Jedinjenje 42 je pripremljeno uz pozivanje na postupak Primera 41.
41mg čistog ciljanog peptida je dobijeno na kraju.
MS(ESI<+>, m/e): 4725,38[M+H]<+>
Primer 43 Priprema jedinjenja 43
Jedinjenje 43 je pripremljeno uz pozivanje na postupak Primera 41.
41,5mg čistog ciljanog peptida je dobijeno na kraju.
MS(ESI<+>, m/e): 5461,93[M+H]<+>
Primer 44 Priprema jedinjenja 44
Jedinjenje 44 je pripremljeno uz pozivanje na postupak Primera 41.
43mg čistog ciljanog peptida je dobijeno na kraju.
MS(ESI<+>, m/e): 5161,83[M+H]<+>
Primer 45 Priprema jedinjenja 45
Jedinjenje 45 je pripremljeno uz pozivanje na postupak Primera 41.
42mg čistog ciljanog peptida je dobijeno na kraju.
MS(ESI<+>, m/e): 5185,7[M+H]<+>
Primer 46 Priprema jedinjenja 46
Priprema Eksendin-4(1-39)-Orn40(Alloc)-NH2smole
Uzimajući 5g Fmoc-Rink MBHA amid smole, 20% piperidin/DMF je korišćen za uklanjanje Fmoc, HOBT/DIC je korišćen kao reagens za spajanje, i reaktivni rastvarač je DMF. Reakcija je praćena uz korišćenje postupka detektovanja ninhidrina, sukcesivno vezujući naredne zaštićene aminokiseline na Rink MBHA amid smolu: Fmoc-Orn(Alloc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg (Pbf)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asp(OtBu)OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, (Boc)2O (koristeći DIEA, dihlorometan). Oprano je sa DMF, oprano sa metanol, oprano sa dihlorometanom, i zatim osušeno kako bi se dobilo 7,8g Eksendin-4(1-39)-Orn40(Alloc)-NH2smole.
1,5g Eksendin-4(1-39)-Orn40(Alloc)-NH2smola je nabubrena u DMF, u šta je je zatim dodato 3ekv. rastvora Pd(PPh3)4u CHCl3:AcOH:NMM (18:1:0,5). Ovo je reagovano tokom 2 sata, zatim oprano sa hloroformom (6 puta, 20ml hloroforma svaki put), oprano sa 20% rastvorom HOAc u dihlorometanu (6 puta, 20ml 20% rastvorom HOAc u dihlorometanu svaki put), oprano sa dihlorometanom (6 puta, 20ml dihlorometana svaki put) i oprano sa DMF (6
1
puta, 20ml DMF svaki put). Kada je ninhidrin pozitivno detektovan, 5ml DMF, 415mg jedinjenja BP103m60, 150mg HOAT, i 150ul DIC su dodati i reagovano je tokom 4 sata; i kada je ninhidrin negativno detektovan, to je ukazalo da je bočni lanac BP103m60 povezan za Eksendin-4(1-39)-Orn40-NH2smolom. Piroliza smole je sprovedena korišćenjem 82,5% TFA/5% fenola/5% vode/2,5% EDT/5% tioanizola, i zatim je taloženo sa ledeno hladnim metil terc-butil etrom (MTBE), i oprano. Sirovi proizvodi su prečišćeni sa HPLC kako bi se dobilo 41mg ciljanog jedinjenja.
MS(ESI<+>, m/e): 4915,61[M+H]<+>
Primer 47 Priprema jedinjenja 47
Jedinjenje 47 je pripremljeno uz pozivanje na postupak Primera 46.
42mg čistog ciljanog peptida je dobijeno na kraju.
MS(ESI<+>, m/e): 4711,45[M+H]<+>
Primer 48 Priprema jedinjenja 48
Jedinjenje 48 je pripremljeno uz pozivanje na postupak Primera 46.
43,4mg čistog ciljanog peptida je dobijeno na kraju.
MS(ESI<+>, m/e): 5447,91[M+H]<+>
Primer 49 Priprema jedinjenja 49
Jedinjenje 49 je pripremljeno uz pozivanje na postupak Primera 46.
43mg čistog ciljanog peptida je dobijeno na kraju.
MS(ESI<+>, m/e): 5147,81[M+H]<+>
Primer 50 Priprema jedinjenja 50
Jedinjenje 50 je pripremljeno uz pozivanje na postupak Primera 46.
2
42,8mg čistog ciljanog peptida je dobijeno na kraju.
MS(ESI<+>, m/e): 5171,68[M+H]<+>
Primer 51 Priprema jedinjenja 51
Priprema jedinjenja a13
Pod zaštitom azota, u 1000mL bocu sa tri grla su dodati 200 mL piridina, 120 g a12(1,0ekv.), mešano je i ohlađeno do 0°C.151,8g TsCl (1,0ekv.) je dodat iz serija, mešano je tokom 1 sata, i zatim polako zagrejano do sobne temperature, uz nastavak mešanja tokom 3-4 sata. Nakon završetka reakcije, reakciona tečnost je sipana u ledeno hladni rastvor razređen hlorovodoničnom kiselinom, uz generisanje čvrste supstance, koja je ekstrahovana sa etil acetatom. Sloj etil acetata je opran jednom sa razređenom hlorovodoničnom kiselinom, oprano je sa zasićenim natrijum bikarbonatom i zasićenim fiziološkim rastvorom, i osušeno preko nevodenog Na2SO4. Rastvarači su ispareni pod redukovanim pritiskom kako bi se dobilo 119g sirovog proizvoda, koji je hromatografiran na silika gel koloni kako bi se dobilo 55g čistog a13. Priprema jedinjenja a14
U 1000 mL bocu sa tri grla su dodati 55 g a13(1,0ekv.) i 160mL DMSO, ravnomerno mešani, zatim je dodato NaN323,52 g (2,0 ekv.), zagrejano je do 50°C i reagovano je tokom 3 sata, ohlađeno do sobne temperature. Reakciona tečnost je sipana u 1,2L vode, ekstrahovano je sa etil acetatom. Organske faze su kombinovane, osušeno je preko nevodenog natrijum sulfata, i koncentrovano kako bi se dobilo 29,2g a14 kao bezbojna tečnost.
Priprema jedinjenja a15
U 1L reaktor hidrogenizacije su dodati 29g jedinjenja a14, metanol 360mL, paladijum na ugljeniku 5,0g, mešano je, zamenjeno sa azotom uvođenjem vodonika da reaguje tokom 3-4 sata. Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, reakciona tečnost je filtrirana, i filtrat je koncentrovan kako bi se dobilo 23,5g a15 kao ulje.
Priprema jedinjenja a16
U 1 L bocu sa tri grla su dodati 23,5 g jedinjenja a15 (1,0ekv.), 68,6g (Boc)2O (2,0 ekv.), mešani rastvor metanola:trietilamina (9:1) 500ml, mešano je i zagrejano do refluksa, i reagovano je tokom 1 sata. Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, metanol trietilamin je isparen, i rastvoren u vodi. Dihlorometan je ekstrahovan 3 puta. Organski slojevi su kombinovani i oprani jednom sa vodom, osušeno je preko nevodenog natrijum sulfata, rastvarači su ispareni, i osušeni kako bi se dobilo 34,8g a16 kao čvrsta supstanca.
Priprema jedinjenja a17
U 1000mL bocu sa tri grla su dodati 34,8 g jedinjenja a16 (1,0ekv.), toluen i THF 150ml svakog, bromosirćetna kiselina 58,2 g (3ekv.), mešano je, zagrejano do 45~50°C, zatim je dodat natrijum hidroksid 33,5g (6ekv.), i reagovano je preko noći. Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, reakciona tečnost je isparena, ekstrahovano je sa vodom i etil acetatom, i vodena faza je prilagođena do pH 3. Vodena faza je ekstrahovana sa dihlorometanom, i slojevi dihlorometana su kombinovani, osušeni preko nevodenog natrijum sulfata, i zatim koncentrovani kako bi se dobilo 18g a17 uljano jedinjenje.
Priprema jedinjenja a18
U 100mL bocu sa tri grla su dodati 286mg N-hidroksi sukcinimida (HOSU), 0,50g a17 i 5 ml dihlorometana, u šta je je dodato 477mg EDC•HCl, i reagovano je tokom 2 sata na sobnoj temperaturi. Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, razređeno je sa dihlorometanom, i zatim oprano sa 50mmol/L vodenog rastvora kalijum dihidrogen fosfata pri pH=6,0 2 puta,
4
oprano sa zasićenim fiziološkim rastvorom, osušeno preko nevodenog natrijum sulfata, i koncentrovano kako bi se dobilo 0,72g jedinjenja a18 kao ulje.
Priprema jedinjenja a19
U 100mL bocu su dodati 0,62g jedinjenja a07 (1,0ekv.), 10 ml vode, 0,27 g NaHCO3(2,0ekv.), i mešano je. Rastvor 0,66 g jedinjenja a18 u 10ml DME (etilen glikol dimetil etar) je dodat kapanjem, obnovljeno je sa 5ml THF, i mešano preko noći. Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, organski rastvarači su ispareni, prilagođeni do pH=4 sa razređenom hlorovodoničnom kiselinom, ekstrahovano je sa dihlorometanom, osušeno preko nevodenog natrijum sulfata, i koncentrovano kako bi se dobilo 0,71g jedinjenja a19 kao ulje.
Priprema jedinjenja a20
U 100mL bocu je dodato 0,71g jedinjenja a19, koje je rastvoreno sa 5ml etil acetata i zatim ohlađeno do 0°C, uz dodavanje 5 ml HCl/etil acetataa (7mol/L), održavajući temperaturu pri 0°C. Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, koncentrovano je kako bi se dobilo 0,71g a20 kao ulje.
Priprema jedinjenja a21
U 100mL bocu su dodati 640mg jedinjenja a20 (1,0ekv.), 15 ml vode, 190mg NaHCO3(2,0ekv.), i mešano je. Rastvor 528mg jedinjenja a10 u 15ml DME (etilen glikol dimetil etar) je dodato kapanjem, obnovljeno je sa 15ml THF, i mešano preko noći. Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, organski rastvarači su ispareni, prilagođeni do pH=6 sa sirćetnom kiselinom, ekstrahovano je sa dihlorometanom, osušeno preko nevodenog natrijum sulfata, i koncentrovano kako bi se dobilo 0,65g a21 kao ulje.
1,5g Eksendin-4(1-39)-Lys40(Alloc)-NH2smola je nabubrena u DMF, u šta je je zatim dodato 3ekv. rastvora Pd(PPh3)4u CHCl3:AcOH:NMM (18:1:0,5). Ovo je reagovano tokom 2 sata, zatim oprano sa hloroformom (6 puta, 20ml hloroforma svaki put), oprano je sa 20% rastvorom HOAc u dihlorometanu (6 puta, 20ml 20% rastvorom HOAc u dihlorometanu svaki put), oprano je sa dihlorometanom (6 puta, 20ml dihlorometana svaki put) i oprano sa DMF (6 puta, 20ml DMF svaki put). Kada je ninhidrin pozitivno detektovan, 5ml DMF, 528mg jedinjenja a21, 150mg HOAT (1-hidroksi-7-azobenzotriazol), i 150ul DIC su dodati i reagovano je tokom 4 sata; i kada je ninhidrin negativno detektovan, to je ukazalo da je bočni lanac a21 povezan za Eksendin-4(1-39)-Lys40-NH2smolom. Piroliza smole je sprovedena korišćenjem 82,5% TFA/5% fenola/5% vode/2,5% EDT/5% tioanizola, i zatim je taloženo sa ledeno hladnim metil terc-butil etrom (MTBE), i oprano. Sirovi proizvodi su prečišćeni sa HPLC kako bi se dobilo 48mg ciljanog jedinjenja.
MS(ESI<+>, m/e): 5123,50[M+H]<+>
Primer 52 Priprema jedinjenja 52
Jedinjenje 52 je pripremljeno uz pozivanje na postupak Primera 51.
47,5mg čistog ciljanog peptida je dobijeno na kraju.
MS(ESI<+>, m/e): 5178,76[M+H]<+>
Primer 53 Priprema jedinjenja 53
Jedinjenje 53 je pripremljeno uz pozivanje na postupak Primera 51.
53mg čistog ciljanog peptida je dobijeno na kraju.
MS(ESI<+>, m/e): 6223,43[M+H]<+>
Primer 54 Priprema jedinjenja 54
Jedinjenje 54 je pripremljeno uz pozivanje na postupak Primera 51.
48,3mg čistog ciljanog peptida je dobijeno na kraju.
MS(ESI<+>, m/e): 5306,91[M+H]<+>
Primer 55 Priprema jedinjenja 55
Jedinjenje 55 je pripremljeno uz pozivanje na postupak Primera 51.
52,8mg čistog ciljanog peptida je dobijeno na kraju.
MS(ESI<+>, m/e): 6123,32[M+H]<+>
Primer 56 Priprema jedinjenja 56
1,5g Eksendin-4(1-39)-Orn40(Alloc)-NH2smola je nabubrena u DMF, u šta je je zatim dodato 3ekv. rastvora Pd (PPh3)4u CHCl3:AcOH:NMM (18:1:0,5). Ovo je reagovano tokom 2 sata, zatim oprano sa hloroformom (6 puta, 20ml hloroforma svaki put), 20% rastvorom HOAc u dihlorometanu (6 puta, 20ml 20% rastvorom HOAc u dihlorometanu svaki put), oprano sa dihlorometanom (6 puta, 20ml dihlorometana svaki put) i oprano sa DMF (6 puta, 20ml DMF svaki put). Kada je ninhidrin pozitivno detektovan, 5ml DMF, 528mg jedinjenja BP103m53, 150mg HOAT, 150ul DIC su reagovano tokom 4 sata; i kada je ninhidrin negativno detektovan, to je ukazalo da je bočni lanac BP103m53 povezan za Eksendin-4(1-39)-Orn40-NH2smolu. Piroliza smole je sprovedena korišćenjem 82,5% TFA/5% fenola/5% vode/2,5% EDT/5% tioanizola, i zatim je taloženo sa ledeno hladnim metil terc-butil etrom (MTBE), i oprano. Sirovi proizvodi su prečišćeni sa HPLC kako bi se dobilo 47mg ciljanog jedinjenja.
MS(ESI<+>, m/e): 5104,72[M+H]<+>
Primer 57 Priprema jedinjenja 57
Jedinjenje 57 je pripremljeno uz pozivanje na postupak Primera 56.
48mg čistog ciljanog peptida je dobijeno na kraju.
MS(ESI<+>, m/e): 5164,74[M+H]<+>
Primer 58 Priprema jedinjenja 58
Jedinjenje 58 je pripremljeno uz pozivanje na postupak Primera 56.
51mg čistog ciljanog peptida je dobijeno na kraju.
MS(ESI<+>, m/e): 6209,41[M+H]<+>
Primer 59 Priprema jedinjenja 59
Jedinjenje 59 je pripremljeno uz pozivanje na postupak Primera 56.
47,6mg čistog ciljanog peptida je dobijeno na kraju.
MS(ESI+, m/e): 5292,89[M+H]<+>
Primer 60 Priprema jedinjenja 60
Jedinjenje 60 je pripremljeno uz pozivanje na postupak Primera 56.
49,7mg čistog ciljanog peptida je dobijeno na kraju.
MS(ESI<+>, m/e): 6109,3[M+H]<+>
Primer 61 Priprema jedinjenja 61
Priprema Eksendin-4(1-39)-Cys(40)-NH2
Peptidi čvrste faze ciljanih peptida su sintetisani koristeći sintezu čvrste faze Fmoc procesa, koristeći Fmoc-Rink MBHA amid smolu, gde je 20% piperidin/DMF korišćen za uklanjanje Fmoc, HOBT/DIC je korišćen kao reagens za spajanje, i reaktivni rastvarač je DMF. Reakcija je praćena uz korišćenje postupka detektovanja ninhidrina, sukcesivno vezujući naredne zaštićene aminokiseline na Rink MBHA amid smolu: Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg (Pbf)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asp(OtBu)OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, uz konačno uklonjenu Fmoc zaštitu. Oprano je sa DMF, dihlorometanom, i MeOH, i zatim osušeno kako bi se dobila smola sa punom zaštitom. Piroliza smole je postignuta korišćenjem 82,5% TFA/5% fenola/5% vode/2,5% EDT/5% tioanizola, i zatim je taloženo sa ledeno hladnim metil terc-butil etrom (MTBE), i oprano, i sirovi proizvodi su prečišćeni obrnutom HPLC kako bi se dobio čist Eksendin-4(1-39)-Cys(40)–NH2.
Priprema BG02
Pod zaštitom azota, u 500ml bocu sa tri grla su dodati 200 mL piridina, 18,8 g BG01 (1,0ekv.), mešano je i ohlađeno do 0°C. 35,5g TsCl (1,0ekv.) je dodato iz serija, mešano tokom 1 sata, i zatim polako zagrejano do sobne temperature, uz nastavak mešanja tokom 3-4 sata. Nakon završetka reakcije, reakciona tečnost je sipana u ledeno hladni rastvor razređen hlorovodoničnom kiselinom, uz generisanje čvrste supstance, koja je ekstrahovana sa etil acetatom. Sloj etil acetata je opran jednom sa razređenom hlorovodoničnom kiselinom, oprano sa zasićenim natrijum bikarbonatom i zasićenim fiziološkim rastvorom, i osušeno preko nevodenog Na2SO4. Rastvarači su ispareni pod redukovanim pritiskom, i hromatografirani na silika gel koloni kako bi se dobilo 22,7g čistog BG02.
Priprema BG03
U 500 mL bocu sa tri grla su dodati 22,7g BG02(1,0ekv.) i 190mL DMSO, ravnomerno mešani, zatim je dodato NaN311,5 g (2,0 ekv.), zagrejano do 50°C i reagovano je tokom 3 sata, ohlađeno do sobne temperature. Reakciona tečnost je sipana u vodu, i ekstrahovano je sa etil acetatom više puta. Organske faze su kombinovane, osušeno je preko nevodenog natrijum sulfata, i koncentrovano kako bi se dobilo 17,1g BG03 kao bezbojna tečnost.
Priprema BG04
U 1L reaktor hidrogenizacije su dodati BG03 30g, metanol 500 mL, paladijum na ugljeniku 8,0g, mešano je, zamenjeno sa azotom uvođenjem vodonika da reaguje tokom 3-4 sata. Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, reakciona tečnost je filtrirana, i filtrat je koncentrovan kako bi se dobilo 19,4g BG04 kao ulje.
Priprema BG05
U 500mL bocu sa tri grla su dodati jedinjenje BG043,7g (1,0ekv.), (Boc)2O 15,5g (2,0 ekv.), mešani rastvor metanola:trietilamina (9:1) 200ml, mešano je i zagrejano do refluksa, i reagovano je tokom 1 sata. Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, metanol trietilamin je isparen, i rastvoren u vodi. Dihlorometan je ekstrahovan 3 puta. Organski slojevi su kombinovani i oprani jednom sa vodom, osušeni preko nevodenog natrijum sulfata, i koncentrovani kako bi se dobilo 4,8g BG05 kao ulje.
Priprema BG06
U 250mL bocu sa tri grla su dodati BG05 jedinjenje 3,7g (1,0ekv.), toluen i THF 40ml svakog, bromosirćetna kiselina 7,6 g (3,0ekv.), mešano je, zagrejano do 45~50°C, zatim je dodat natrijum hidroksid 4,4g, i reagovano je preko noći. Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, reakciona tečnost je isparena, nečistoće su ekstrahovane sa vodom i etil acetatom, i vodena faza je prilagođena do pH=3. Vodena faza je ekstrahovana sa dihlorometanom, i slojevi dihlorometana su kombinovani, osušeni preko nevodenog natrijum sulfata, i zatim koncentrovani kako bi se dobilo 2,5g BG06 uljano jedinjenje.
Priprema BG07
U 100mL bocu sa jednim grlom su dodati 2,4g jedinjenja BG06 i 20ml etil acetata, nakon što su rastvoreni, ohlađeni su do 0°C, u šta je je dodato 20 ml HCl/etil acetata (7mol/L). Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, koncentrovano je kako bi se dobilo 2,3g BG07 kao ulje.
Priprema BG08
U 200mL bocu sa tri grla su dodati 3,5g jedinjenja BG07(1,0ekv.), 1,7g maleinskig anhidrida (1,0ekv.), 70ml sirćetne kiseline, i zagrejano je do refluksa preko noći. Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, sirćetna kiselina je isparena, u šta je je dodat etil acetat kako bi se rastvorilo, i zatim je oprano sa vodom 3 puta, oprano sa zasićenim natrijum hloridom 3 puta, osušeno preko nevodenog natrijum sulfata, i hromatografirano na koloni kako bi se dobilo 1,8g BG08 kao beličasta čvrsta supstanca.
Priprema BG09
U 100mL bocu sa tri grla su dodati 1,30 g (1,53ekv.) N-hidroksi sukcinimida (HOSU), 3,1g jedinjenja, BG081,8g i 15 ml dihlorometana, u šta je je dodato 2,16g EDC·HCl (1,53ekv.) i reagovano je tokom 2 sata na sobnoj temperaturi. Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, razređeno je sa dihlorometanom, i zatim oprano sa 50mmol/L vodenog rastvora kalijum dihidrogen fosfata pri pH=6,0 2 puta, oprano sa zasićenim fiziološkim rastvorom, osušeno preko nevodenog natrijum sulfata, i koncentrovano kako bi se dobilo 2,2g beličastog jedinjenja BG09.
Priprema BG11
U 50mL bocu sa tri grla su dodati 2,17g jedinjenja BG10 (1,0ekv.), 10ml dihlorometana, 10ml terc-butanola, 0,40g DIC (1,0ekv.), i 0,39g DMAP (1,0ekv.), i mešano je na sobnoj temperaturi preko noći. Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, razređeno je sa etrom, i zatim oprano sa vodom 3 puta, oprano sa zasićenim fiziološkim rastvorom, osušeno preko nevodenog natrijum sulfata, i hromatografirano na koloni kako bi se dobilo 0,6g penastog praška BG11.
Priprema BG12
U 100mL bocu sa tri grla su dodati 0,95 g N-hidroksi sukcinimida (HOSU), 3,1g jedinjenja BG11 i 15 ml dihlorometana, u šta je je dodato 1,58g EDC·HCl, i reagovano je tokom 2 sata na sobnoj temperaturi. Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, razređeno je sa dihlorometanom, i zatim oprano sa 50mmol/L vodenog rastvora kalijum dihidrogen fosfata pri pH=6,0 2 puta, oprano je sa zasićenim fiziološkim rastvorom, osušeno preko nevodenog natrijum sulfata, i koncentrovano kako bi se dobilo 3,3g jedinjenja BG12 kao bela čvrsta supstanca.
Priprema BG14
U 200mL bocu su dodati 2,8g jedinjenja BG13 (1,05ekv.), 50 ml vode, 1,8 g NaHCO3(2,0ekv.), i mešano je. Rastvor 6,4g jedinjenja BG12 (1,0ekv.) u 50ml DME (etilen glikol dimetil etar) je dodat kapanjem, obnovljeno je sa 50ml THF, i mešano preko noći. Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, organski rastvarači su ispareni, prilagođeni do pH=4 sa sirćetnom kiselinom, ekstrahovano je sa etil acetatom, osušeno preko nevodenog natrijum sulfata, i koncentrovano kako bi se dobilo 6,9g jedinjenja BG14 kao beličasta čvrsta supstanca.
1
Priprema BG15
U 100mL bocu su dodati 6,9g jedinjenja BG14, 30 ml dihlorometana, 30ml TFA, i mešano je pri 20°C. Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, organski rastvarači su ispareni, suspendovani sa petrolej etrom, sukcijski filtrirani, i osušeni kako bi se dobilo 5,35g BG15 kao beličasta čvrsta supstanca.
Priprema BG16
U 100mL bocu su dodati 1,27g jedinjenja BG15 (1,0ekv.), 10 ml vode, 0,36 g NaHCO3(2,0ekv.), i mešano je. Rastvor 0,72g jedinjenja BG09 (1,0ekv.) u 10ml DME (etilen glikol dimetil etar) je dodato kapanjem, obnovljeno je sa 10ml THF, i mešano preko noći. Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, organski rastvarači su ispareni, prilagođeni do pH=6 sa sirćetnom kiselinom, i ekstrahovano sa etil acetatom. Organske faze su oprane sa vodom i zasićenim fiziološkim rastvorom, i zatim je osušeno preko nevodenog natrijum sulfata, koncentrovano, i hromatografirano na koloni kako bi se dobilo 0,9g jedinjenja BG16 kao beličasta čvrsta supstanca.
50,0mg Eksendin-4(1-39)-Cys(40)–NH2je rastvoren u 10ml pufera natrijum fosfata (pH 6,5) pri 20mM, u šta je je dodato 16mg BG16 i mešano tokom 1 sata pri uslovima od 20°C. Nakon završetka reakcije pod HPLC posmatranjem, reakcija je zaustavljena sa viškom rastvora cisteina (0,5ml 0,5M rastvor cisteina), pripremljena sa HPLC i zatim liofilizovana kako bi se dobilo 30mg jedinjenja za spajanje.
MS(ESI<+>, m/e): 4926,49[M+H]<+>.
Primer 62 Priprema jedinjenja 62
Jedinjenje 62 je pripremljeno uz pozivanje na postupak Primera 61.
Sirovi proizvodi su prečišćeni sa HPLC kako bi se dobilo 31mg ciljanog jedinjenja. MS(ESI<+>, m/e):4918,41[M+H]<+>.
Primer 63 Priprema jedinjenja 63
Jedinjenje 63 je pripremljeno uz pozivanje na postupak Primera 61.
2
Sirovi proizvodi su prečišćeni sa HPLC kako bi se dobilo 31mg ciljanog jedinjenja. MS(ESI<+>, m/e): 5046,53[M+H]<+>.
Primer 64 Priprema jedinjenja 64
Jedinjenje 64 je pripremljeno uz pozivanje na postupak Primera 61.
Sirovi proizvodi su prečišćeni sa HPLC kako bi se dobilo 29mg ciljanog jedinjenja. MS(ESI<+>, m/e): 5022,46[M+H]<+>.
Primer 65 Priprema jedinjenja 65
Jedinjenje 65 je pripremljeno uz pozivanje na postupak Primera 61.
Sirovi proizvodi su prečišćeni sa HPLC kako bi se dobilo 34mg ciljanog jedinjenja. MS(ESI<+>, m/e): 5222,63[M+H]<+>.
Primer 66 Priprema jedinjenja 66
Jedinjenje 66 je pripremljeno uz pozivanje na postupak Primera 61.
Sirovi proizvodi su prečišćeni sa HPLC kako bi se dobilo 32mg ciljanog jedinjenja. MS(ESI<+>, m/e): 5126,5[M+H]<+>.
Primer 67 Priprema jedinjenja 67
Priprema jedinjenja BP103m50
U 100mL bocu sa tri grla su dodati 286mg N-hidroksi sukcinimida (HOSU), 0,50g BP103a05 i 5 ml dihlorometana, u šta je je dodato 477mg EDC.HCl i reagovano je tokom 2 sata na sobnoj temperaturi. Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, razređeno je sa dihlorometanom, i zatim oprano sa 50mmol/L vodenog rastvora kalijum dihidrogen fosfata pri Ph=6,0 2 puta, oprano sa zasićenim fiziološkim rastvorom, osušeno preko nevodenog natrijum sulfata, i koncentrovano kako bi se dobilo 0,72g jedinjenja BP103m50 kao ulje.
Priprema jedinjenja BP103m51
U 100mL bocu su dodati 0,62g jedinjenja BP103g06 (1,0ekv.), 10 ml vode, 0,27 g NaHCO3(2,0ekv.), i mešano je. Rastvor 0,66 g jedinjenja BP103m50 u 10ml DME (etilen glikol dimetil etar) je dodat kapanjem, obnovljeno je sa 5ml THF, i mešano preko noći. Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, organski rastvarači su ispareni, prilagođeni do pH=4 sa razređenom hlorovodoničnom kiselinom, ekstrahovano je sa dihlorometanom, osušeno preko nevodenog natrijum sulfata, i koncentrovano kako bi se dobilo 0,71g jedinjenja BP103m51 kao ulje.
Priprema jedinjenja BP103m52
U 100mL bocu su dodati 0,71g jedinjenja BP103m51 i 5ml etil acetata, nakon što su rastvoreni, ohlađeni su do 0°C, u šta je je dodato 5 ml HCl/etil acetata (7mol/L), održavajući temperaturu pri 0°C. Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, koncentrovani su kako bi se dobilo 0,71g BP103m52 kao ulje.
4
Priprema jedinjenja BP103n01
U 50mL bocu sa tri grla su dodati 1,0g jedinjenja BP103n00 (1,0ekv.), 10ml dihlorometana, 10ml terc-butanola, 0,40g DIC (1,0ekv.), i 0,39g DMAP (1,0ekv.), i mešano preko noći na sobnoj temperaturi. Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, razređeno je sa etrom, i oprano sa vodom 3 puta, oprano sa zasićenim fiziološkim rastvorom, osušeno preko nevodenog natrijum sulfata, i hromatografirano na koloni kako bi se dobilo 0,4g BP103n01 kao penasti prašak.
Priprema jedinjenja BP103n02
U 100mL bocu sa tri grla su dodati 0,95 g N-hidroksi sukcinimida (HOSU), 2,0g jedinjenja BP103n01 i 15 ml dihlorometana, u šta je je dodato 1,58g EDC.HCl i reagovano je tokom 2 sata na sobnoj temperaturi. Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, razređeno je sa dihlorometanom, i zatim oprano sa 50mmol/L vodenog rastvora kalijum dihidrogen fosfata pri pH=6,0 2 puta, oprano sa zasićenim fiziološkim rastvorom, osušeno preko nevodenog natrijum sulfata, i koncentrovano kako bi se dobilo 2,6g jedinjenja BP103n02 kao bela čvrsta supstanca. Priprema jedinjenja BP103m70
U 100mL bocu su dodati 0,50 g jedinjenja H-Glu-OtBu.HCl (1,0ekv.), 10 ml vode, 350mg NaHCO3(2,0ekv.), i mešano je. Rastvor 0,96 g jedinjenja BP103n02 (1,0ekv.) u 10ml DME (etilen glikol dimetil etar) je dodat kapanjem, obnovljeno je sa 10ml THF, i mešano preko noći. Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, organski rastvarači su ispareni, prilagođeni do pH=6 sa sirćetnom kiselinom, ekstrahovano je sa dihlorometanom, osušeno preko nevodenog natrijum sulfata, i koncentrovano kako bi se dobilo 1,09g jedinjenja BP103m70 kao ulje.
Priprema jedinjenja BP103m71
U 100mL bocu sa tri grla su dodati 1,0g jedinjenja BP103m70, 317mg N-hidroksi sukcinimida (HOSU) (1,53ekv.), i 10 ml dihlorometana, u šta je je dodato 528mg EDC.HCl (1,53ekv.) i reagovano je tokom 2 sata na sobnoj temperaturi. Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, razređeno je sa dihlorometanom, i zatim oprano sa 50mmol/L vodenog rastvora kalijum dihidrogen fosfata pri pH=6,0 2 puta, oprano sa zasićenim fiziološkim rastvorom, osušeno preko nevodenog natrijum sulfata, i koncentrovano kako bi se dobilo 1,07g jedinjenja BP103m71 kao bela čvrsta supstanca.
Priprema jedinjenja BP103m72
U 100mL bocu su dodati 0,87 g jedinjenja BP103m52 (1,0ekv.), 10 ml vode, 300mg NaHCO3(2,0ekv.), i mešano je. Rastvor 1,00 g jedinjenja BP103m71 (1,0ekv.) u 10ml DME (etilen glikol dimetil etar) je dodato kapanjem, obnovljeno je sa 10ml THF, i mešano preko noći. Nakon završetka reakcije pod TLC posmatranjem, organski rastvarači su ispareni, prilagođeni do pH=6 sa sirćetnom kiselinom, ekstrahovano je sa dihlorometanom, osušeno preko nevodenog natrijum sulfata, i koncentrovano kako bi se dobilo 1,22g jedinjenja BP103m72 kao ulje.
Sinteza ciljanog peptida
1,5g Eksendin-4(1-39)-Lys40(Alloc)-NH2smola je nabubrena u DMF, u šta je je zatim dodato 3ekv. rastvora Pd (PPh3)4u CHCl3:AcOH:NMM (18:1:0,5). Ovo je reagovano tokom 2 sata, zatim oprano sa hloroformom (6 puta, 20ml hloroforma svaki put), oprano sa 20% rastvorom HOAc u DCM (dihlorometan) (6 puta, 20ml 20% rastvorom HOAc u DCM svaki put), oprano sa DCM (6 puta, 20ml DCM svaki put) i oprano sa DMF (6 puta, 20ml DMF svaki put). Kada je ninhidrin pozitivno detektovan, 5ml DMF, 640mg jedinjenja BP103m72, 150mg HOAT, i 150ul DIC su dodati i reagovano je tokom 4 sata; i kada je ninhidrin negativno detektovan, to je ukazalo da je bočni lanac BP103m72 povezan za Eksendin-4(1-39)-Lys40-NH2smolu. Piroliza smole je sprovedena korišćenjem 82,5% TFA/5% fenola/5% vode/2,5% EDT/5% tioanizola, i zatim je ovo taloženo sa ledeno hladnim metil terc-butil etrom (MTBE), i oprano. Sirovi proizvodi su prečišćeni sa HPLC kako bi se dobilo 48mg ciljanog jedinjenja. MS(ESI<+>, m/e): 5252,54[M+H]<+>.

Claims (7)

  1. PATENTNI ZAHTEVI 1. Modifikator eksenatida ili njegovih farmaceutski prihvatljivih soli, koji imaju agonističku aktivnost GLP-1 receptora, kako je prikazano u formuli (I): (Ex-4)-L-Y (I)
    gde, Ex-4 je Eksendin-4; L je za povezivanje Ex-4 sa Y; L’ je hidrofilni lanac koji sadrži etarsku grupu; Y je alifatički lanac sa terminalnom karboksilnom grupom, gde je modifikator eksenatida:
    k je bilo koji ceo broj između 6-20.
  2. 2. Modifikator eksenatida ili njegovih farmaceutski prihvatljivih soli prema patentnom zahtevu 1, gde L je izabran od:
    gde, m je bilo koji ceo broj između 2-20; n je bilo koji ceo broj između 2-20; r je bilo koji ceo broj između 1-6.
  3. 3. Modifikator eksenatida ili njegovih farmaceutski prihvatljivih soli prema patentnom zahtevu 1, gde je modifikator eksenatida:
    gde m je bilo koji ceo broj između 2-20; n je bilo koji ceo broj između 2-20; r je bilo koji ceo broj između 1-6; k je bilo koji ceo broj između 6-20.
  4. 4. Modifikator eksenatida ili njegovih farmaceutski prihvatljivih soli prema patentnom zahtevu 3, koji obuhvata naredna jedinjenja: 1
    �
  5. 5. Modifikator eksenatida ili njegovih farmaceutski prihvatljivih soli prema patentnom zahtevu 1 ili 2 za primenu u tretmanu bolesti i/ili simptoma povezanih sa glikometabolizmom, ili za primenu u tretmanu dijabetesa, ili za primenu u tretmanu masne jetre, ili za primenu u postupku gubitka težine.
  6. 6. Farmaceutski sastav koji obuhvata modifikator eksenatida ili njegovih farmaceutski prihvatljivih soli prema patentnom zahtevu 1 ili 2, i opciono farmaceutski prihvatljive nosače.
  7. 7. Sastav patentnog zahteva 6 za primenu u tretmanu bolesti i/ili simptoma povezanih sa glikometabolizmom, ili za primenu u tretmanu dijabetesa, ili za primenu u tretmanu masne jetre, ili za primenu u postupku gubitka težine. Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5 4
RS20200228A 2015-09-25 2016-09-13 Modifikator eksenatida i njegova primena RS60053B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510619012.7A CN106554403B (zh) 2015-09-25 2015-09-25 艾塞那肽修饰物及其用途
PCT/CN2016/098844 WO2017050157A1 (zh) 2015-09-25 2016-09-13 艾塞那肽修饰物及其用途
EP16848039.0A EP3321279B1 (en) 2015-09-25 2016-09-13 Exenatide modifier and use thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS60053B1 true RS60053B1 (sr) 2020-04-30

Family

ID=58385848

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20200228A RS60053B1 (sr) 2015-09-25 2016-09-13 Modifikator eksenatida i njegova primena

Country Status (19)

Country Link
US (1) US11179467B2 (sr)
EP (1) EP3321279B1 (sr)
JP (1) JP6647387B2 (sr)
KR (1) KR102005294B1 (sr)
CN (1) CN106554403B (sr)
AU (1) AU2016328015B9 (sr)
CA (1) CA2995613C (sr)
CY (1) CY1122760T1 (sr)
DK (1) DK3321279T3 (sr)
ES (1) ES2775185T3 (sr)
HR (1) HRP20200332T1 (sr)
HU (1) HUE048411T2 (sr)
LT (1) LT3321279T (sr)
PL (1) PL3321279T3 (sr)
PT (1) PT3321279T (sr)
RS (1) RS60053B1 (sr)
SI (1) SI3321279T1 (sr)
SM (1) SMT202000117T1 (sr)
WO (1) WO2017050157A1 (sr)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111333714A (zh) * 2020-03-05 2020-06-26 成都奥达生物科技有限公司 一种长效glp-1化合物
WO2021205388A2 (en) 2020-04-10 2021-10-14 Fresenius Kabi Oncology Limited An improved process for the preparation of semaglutide side chain
CN112939771A (zh) * 2021-01-28 2021-06-11 宁夏蓝博思化学技术有限公司 长链烷基二酸单叔丁酯的制备方法
US12215133B2 (en) 2021-03-25 2025-02-04 Brightgene Bio-Medical Technology Co., Ltd. GIP and GLP-1 dual receptor agonist, pharmaceutical composition, and use
EP4317179B1 (en) * 2021-03-25 2025-10-29 BrightGene Bio-Medical Technology Co., Ltd. Gip and glp-1 dual receptor agonist, pharmaceutical composition, and use
KR20250073361A (ko) * 2022-09-23 2025-05-27 브라이트제네 피티이. 엘티디. Glp-1 및 gip 이중 수용체 작용제 약학적 조성물 및 그 용도
CN119930756A (zh) * 2023-11-02 2025-05-06 博瑞生物医药（苏州）股份有限公司 一种gip和glp-1的双受体激动剂的制备方法
CN117736118B (zh) * 2023-12-15 2024-10-18 四川普康药业有限公司 Fmoc-AEEA的合成方法
CN117820136A (zh) * 2023-12-25 2024-04-05 康羽生命科学技术(苏州)有限公司 2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙酸的合成方法

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU3247799A (en) 1998-02-27 1999-09-15 Novo Nordisk A/S Glp-1 derivatives of glp-1 and exendin with protracted profile of action
EP1140145B2 (en) 1999-01-14 2019-05-15 Amylin Pharmaceuticals, LLC Novel exendin agonist formulations and methods of administration thereof
JP2007537981A (ja) 2003-09-19 2007-12-27 ノボ　ノルディスク　アクティーゼルスカブ 新規の血漿タンパク質親和性タグ
TWI372629B (en) * 2005-03-18 2012-09-21 Novo Nordisk As Acylated glp-1 compounds
BRPI0608516A2 (pt) * 2005-03-18 2010-11-16 Novo Nordisk As análogo de glp-1, método para aumentar o tempo de ação em um paciente de um análogo de glp-1, composição farmacêutica, e, uso de um composto
CN101125207B (zh) 2006-11-14 2012-09-05 上海华谊生物技术有限公司 带有聚乙二醇基团的艾塞丁或其类似物及其制剂和用途
CN101215324B (zh) 2007-12-26 2010-11-24 吉林大学 艾塞那肽短肽模拟肽及其在制备糖尿病治疗药物中的应用
CN101980725B (zh) * 2008-02-01 2013-06-12 阿森迪斯药物股份有限公司 包含可自裂解的连接体的前药
WO2010042145A1 (en) * 2008-09-19 2010-04-15 Nektar Therapeutics Polymer conjugates of glp-2-like peptides
CN101870728A (zh) 2009-04-23 2010-10-27 派格生物医药(苏州)有限公司 新型Exendin变体及其缀合物
CN102397558B (zh) 2010-09-09 2013-08-14 中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所 Exendin-4类似物的定位聚乙二醇化修饰物及其用途
EP2438930A1 (en) * 2010-09-17 2012-04-11 Sanofi-Aventis Deutschland GmbH Prodrugs comprising an exendin linker conjugate
WO2013059323A1 (en) 2011-10-18 2013-04-25 Prolynx Llc Peg conjugates of exenatide
CN102532303A (zh) 2011-12-22 2012-07-04 江苏弘和药物研发有限公司 聚乙二醇缀合的艾塞那肽的合成及应用
CN102827270A (zh) 2012-09-13 2012-12-19 无锡和邦生物科技有限公司 一种聚乙二醇化艾塞那肽衍生物及其用途
CN103405753B (zh) * 2013-08-13 2016-05-11 上海仁会生物制药股份有限公司 稳定的促胰岛素分泌肽水针药物组合物
KR101768446B1 (ko) * 2014-03-21 2017-08-17 애니젠 주식회사 신규한 엑세나타이드 유사체 및 그의 용도

Also Published As

Publication number Publication date
CN106554403A (zh) 2017-04-05
CA2995613A1 (en) 2017-03-30
DK3321279T3 (da) 2020-03-09
AU2016328015B9 (en) 2018-12-06
WO2017050157A1 (zh) 2017-03-30
SMT202000117T1 (it) 2020-03-13
CA2995613C (en) 2021-07-20
AU2016328015A1 (en) 2018-03-01
KR20180031740A (ko) 2018-03-28
PL3321279T3 (pl) 2020-10-19
AU2016328015B2 (en) 2018-10-25
AU2016328015A9 (en) 2018-11-01
KR102005294B1 (ko) 2019-07-30
EP3321279B1 (en) 2020-02-12
JP2018531217A (ja) 2018-10-25
ES2775185T3 (es) 2020-07-24
CN106554403B (zh) 2021-08-31
EP3321279A4 (en) 2018-05-16
PT3321279T (pt) 2020-03-05
HUE048411T2 (hu) 2020-07-28
HRP20200332T1 (hr) 2020-06-12
EP3321279A1 (en) 2018-05-16
JP6647387B2 (ja) 2020-02-14
US11179467B2 (en) 2021-11-23
LT3321279T (lt) 2020-04-10
CY1122760T1 (el) 2021-03-12
SI3321279T1 (sl) 2020-07-31
US20200101162A1 (en) 2020-04-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RS60053B1 (sr) Modifikator eksenatida i njegova primena
JP7634531B2 (ja) ｇＩＰおよびＧＬＰ－１デュアルアゴニストポリペプチド化合物、薬学的に許容できる塩、および使用
AU2018201623B2 (en) Pegylated OXM variants
JP6297969B2 (ja) 部位特異的モノｐｅｇ化エキセンジン類似体およびその調製方法
CN102397558B (zh) Exendin-4类似物的定位聚乙二醇化修饰物及其用途
JP2018531217A6 (ja) エキセナチド修飾物及びその用途
WO2015149627A1 (zh) 结构修饰的glp-1类似物及其制备方法
JP2025525218A (ja) インクレチンアナログおよびその使用
CN106554404B (zh) 艾塞那肽修饰物及其用途
AU2016273045A1 (en) Pegylated oxyntomodulin variants
WO2024215876A2 (en) Compounds containing one or more diboronates and related insulin analogs
WO2024245233A1 (zh) 一种口服递送的多肽衍生物