WO2017050157A1 - 艾塞那肽修饰物及其用途 - Google Patents

艾塞那肽修饰物及其用途 Download PDF

Info

Publication number
WO2017050157A1
WO2017050157A1 PCT/CN2016/098844 CN2016098844W WO2017050157A1 WO 2017050157 A1 WO2017050157 A1 WO 2017050157A1 CN 2016098844 W CN2016098844 W CN 2016098844W WO 2017050157 A1 WO2017050157 A1 WO 2017050157A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
fmoc
compound
preparation
reaction
added
Prior art date
Application number
PCT/CN2016/098844
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
袁建栋
黄仰青
宋云松
袁芳
Original Assignee
博瑞生物医药（苏州）股份有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to LTEP16848039.0T priority Critical patent/LT3321279T/lt
Priority to RS20200228A priority patent/RS60053B1/sr
Priority to JP2018506893A priority patent/JP6647387B2/ja
Priority to AU2016328015A priority patent/AU2016328015B9/en
Application filed by 博瑞生物医药（苏州）股份有限公司 filed Critical 博瑞生物医药（苏州）股份有限公司
Priority to CA2995613A priority patent/CA2995613C/en
Priority to DK16848039.0T priority patent/DK3321279T3/da
Priority to KR1020187005100A priority patent/KR102005294B1/ko
Priority to EP16848039.0A priority patent/EP3321279B1/en
Priority to US15/752,838 priority patent/US11179467B2/en
Priority to SI201630653T priority patent/SI3321279T1/sl
Priority to ES16848039T priority patent/ES2775185T3/es
Priority to PL16848039T priority patent/PL3321279T3/pl
Publication of WO2017050157A1 publication Critical patent/WO2017050157A1/zh
Priority to HRP20200332TT priority patent/HRP20200332T1/hr
Priority to CY20201100184T priority patent/CY1122760T1/el

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/14—Esters of carboxylic acids, e.g. fatty acid monoglycerides, medium-chain triglycerides, parabens or PEG fatty acid esters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/2278—Vasoactive intestinal peptide [VIP]; Related peptides (e.g. Exendin)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/26—Glucagons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/605—Glucagons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

一种通过亲水性连接臂将艾塞那肽和末端带羧基的脂肪链连接起来的艾塞那肽修饰物，及其在制备作为GLP-1受体激动剂的药物中的用途；在制备用于预防和/或治疗与GLP-1受体活性低下相关的疾病和/或症状的药物中的用途；在制备用于糖代谢相关的疾病和/或症状的药物中的用途；在制备用于糖尿病的药物中的用途；在制备用于脂肪肝的药物中的用途；在制备用于减肥的药物中的用途。

Description

艾塞那肽修饰物及其用途 技术领域
本发明涉及治疗性肽领域，具体涉及艾塞那肽修饰物、制备方法，含它们的药物组合物，及其修饰物和组合物在治疗糖代谢相关疾病中的用途。
背景技术
艾塞那肽(又称依西纳肽或依克那肽，Exenatide，或Exendin‐4，商品名Byetta)是由39个氨基酸组成的多肽，其分子量为4186.6，分子式为C184H282N50O60S，氨基酸序列为：His‐Gly‐Glu‐Gly‐Thr‐Phe‐Thr‐Ser‐Asp‐Leu‐Ser‐Lys‐Gln‐Met‐Glu‐Glu‐Glu‐Ala‐Val‐Arg‐Leu‐Phe‐Ile‐Glu‐Trp‐Leu‐Lys‐Asn‐Gly‐Gly‐Pro‐Ser‐Ser‐Gly‐Ala‐Pro‐Pro‐Pro‐Ser‐NH2；由Amylin Pharmaceuticals和Eli Lilly公司(Eli Lillyand Company)生产并销售。艾塞那肽已于2005年4月由FDA批准上市，属于药皮下注射制剂，具有促进葡萄糖依赖的胰岛素分泌、恢复第一时相胰岛素分泌、抑制胰高血糖素的分泌、减慢胃内容物的排空，改善胰腺β细胞的功能等作用，非常适用于II型糖尿病的治疗，例如，用于改善和控制二甲双胍和磺酰脲类药物治疗不理想的II型糖尿病患者的血糖。
艾塞那肽是生长在美国西南部几个州的蜥蜴希拉毒蜥(Gilamonster)唾液中激素exendin‐4的合成形式(J.Biol.Chem.1990,265,20259‐20262；J.Biol.Chem.1992,267,7402‐7405)，是一种人胰高血糖素样肽‐1(GLP‐1)的类似物，其氨基酸序列与GLP‐1的氨基酸序列部分重合，是比较有效的GLP‐1受体激动剂，由于艾塞那肽模拟GLP‐1的葡萄糖调节作用，故又被称为肠促胰岛素激动剂。与磺酰脲和美格列奈类(meglitinides)不同，艾塞那肽仅在葡萄糖存在下提高胰岛素的合成和分泌，降低了低血糖的风险。一些医师还将Byetta用于治疗胰岛素抵抗。
尽管如此，由于蛋白质/多肽类药物普遍存在体内半衰期较短，物理、化学稳定性较差，易被体内各种蛋白酶降解等特性，使得这些药物通常需要在一天之内多次注射，这给病人带来了许多痛苦和诸多不便。上个世纪70年代出现的聚乙二醇化技术被证明是当前蛋白质/多肽类给药领域一项较适用的技术。但是，单纯使用PEG修饰后药物的活性会普遍下降。
一系列不同方法已经用于修饰GLP‐1类似物的结构以便提供体内更长久的 作用持续时间。CN1384755公开了新型exendin激动剂制剂及其给药方法，其中公开了艾塞那肽的化合物结构和其制备方法。CN102532303公开了使用甲氧基聚乙二醇残基与艾塞那肽分子中赖氨酸残基的氨基或N末端组氨酸残基的氨基缀合，合成聚乙二醇缀合的艾塞那肽的方法；CN101980725公开了脂肪酸‐PEG‐艾塞那肽的结构，并且PEG的修饰位点在N端His上；WO2005028516和WO2012035139也公开了脂肪酸‐PEG‐艾塞那肽的结构。中国专利CN101215324公开了一种对艾塞那肽进行结构改造后得到的艾塞那肽短肽模拟肽。中国专利CN101125207报道了对Exendin‐4进行PEG修饰。WO99/43708公开了具有连接至C‐端氨基酸残基的亲脂性取代物的GLP‐1(7‐35)和GLP‐1(7‐36)衍生物。WO2013059323A1公开了PEG缀合的艾塞那肽及制备方法。
CN102397558公开了将Exendin‐4中某些氨基酸用半胱氨酸取代后，用PEG或末端被甲基取代的PEG修饰。CN102421796公开了一个或多个聚乙二醇聚合到Exendin变体的半胱氨酸上，公开艾塞那肽其中一个氨基酸用半胱氨酸取代，然后在半胱氨酸上用聚乙二醇修饰。CN102827270公开了Exendin‐4‐Cys‐PEG衍生物，具体在艾塞那肽分子的非活性区C端引入1个半胱氨酸，并偶联马来酰胺基聚乙二醇，其中聚乙二醇末端用甲基封闭。
虽然做了这些多方面的努力，但是，现在已有的Exendin‐4或其变体以及各种修饰形式仍有一些缺点，包括在体内使用时给药频率较高，给患者身体、心理和经济带来较大的负担，限制了患者用药依从性，无法广泛应用。糖尿病群体对长效的活性GLP‐1类似物仍具有巨大的需求，需开发新的艾塞那肽衍生物，使其在体内作用时间长，稳定性好，降糖效果好，同时保持低毒性和较好的活性。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服目前所公开的艾塞那肽修饰物GLP‐1受体结合力低和低血糖持续时间短，以致临床使用效果差或注射频繁的缺点。
本领域技术人员已知，在缀合了聚合物基团的生物活性分子中，随着缀合基团分子量的增加，缀合生物分子的生物活性将呈指数性逐渐降低。本领域技术人员还已知，随着所述聚合物基团分子量的增加，该缀合物分子的生物半衰期和/或血浆半衰期和系统性药物暴露逐渐延长或增加。
本发明技术人员出乎意料的发现，经过本发明技术人员对艾塞那肽进行修饰， 不仅改善了药代动力学性质，使得低血糖持续时间增加。而且与艾塞那肽相比，本发明分子仍然保留了大部分GLP‐1受体激动剂活性，这意味着，本发明分子不仅GLP‐1受体激动剂活性较高，且低血糖持续时间长，有可能在未来的临床中成为体内作用时间长，稳定性好，降糖效果好的药物。
本发明一方面提供了这样一种艾塞那肽修饰物或其可药用盐，如式(Ⅰ)所示：
(Ex‐4)‐L‐Y  (Ⅰ)
其中，Ex‐4为Exendin‐4；L为亲水性的连接臂，连接Ex‐4与Y；Y为末端带羧基的脂肪链。
进一步说，本发明提供了这样一种艾塞那肽修饰物：
Figure PCTCN2016098844-appb-000001
其中L’为亲水性的连接臂，优选含醚基的亲水链。
更进一步说，本发明的艾塞那肽修饰物(Ex‐4)‐L‐Y中，亲水性的连接臂L选自：
Figure PCTCN2016098844-appb-000002
Figure PCTCN2016098844-appb-000003
其中，m为2‐20之间的任一整数；n为2‐20之间的任一整数；r为1‐6之间的任一整数。
更进一步说，本发明提供了这样一种艾塞那肽修饰物：
Figure PCTCN2016098844-appb-000004
其中L’为含醚基的亲水链，k为6‐20之间的任一整数。具体结构如下：
Figure PCTCN2016098844-appb-000005
本发明优选这样的艾塞那肽修饰物：
Figure PCTCN2016098844-appb-000006
Figure PCTCN2016098844-appb-000007
其中，m为2-20之间的任一整数；n为2-20之间的任一整数；r为1-6之间的任一整数；k为6-20之间的任一整数。
更具体的说，本发明提供如下艾塞那肽修饰物：
系列1：参见实施例1‐5
Figure PCTCN2016098844-appb-000008
化合物 化合物1 化合物2 化合物3 化合物4 化合物5
m 5 2 20 14 10
k 16 20 6 10 14
系列2：参见实施例6‐10
Figure PCTCN2016098844-appb-000009
化合物 化合物6 化合物7 化合物8 化合物9 化合物10
m 5 2 20 10 11
n 3 7 2 20 15
k 16 20 12 6 10
系列3：参见实施例11‐15
Figure PCTCN2016098844-appb-000010
化合物 化合物11 化合物12 化合物13 化合物14 化合物15
m 3 2 20 10 11
n 5 9 2 20 15
k 16 20 12 6 10
系列4：参见实施例16‐20
Figure PCTCN2016098844-appb-000011
化合物 化合物16 化合物17 化合物18 化合物19 化合物20
r 2 3 3 3 6
m 6 2 15 10 20
k 16 18 10 20 6
系列5：参见实施例21‐25
Figure PCTCN2016098844-appb-000012
化合物 化合物21 化合物22 化合物23 化合物24 化合物25
r 1 2 3 3 6
m 5 2 15 10 20
k 16 18 10 20 6
系列6：参见实施例26‐30
Figure PCTCN2016098844-appb-000013
化合物 化合物26 化合物27 化合物28 化合物29 化合物30
r 2 2 3 3 6
m 5 2 15 10 20
k 16 14 10 20 6
系列7：参见实施例31‐35
Figure PCTCN2016098844-appb-000014
化合物 化合物31 化合物32 化合物33 化合物34 化合物35
r 2 2 3 3 6
m 6 2 15 10 20
n 3 20 5 10 2
k 16 14 10 20 6
系列8：参见实施例36‐40
Figure PCTCN2016098844-appb-000015
化合物 化合物36 化合物37 化合物38 化合物39 化合物40
r 2 2 3 3 6
m 5 2 15 10 20
n 6 20 5 10 2
k 16 14 10 20 6
系列9：参见实施例41‐45
Figure PCTCN2016098844-appb-000016
化合物 化合物41 化合物42 化合物43 化合物44 化合物45
m 6 2 20 10 15
k 16 14 10 20 6
系列10：参见实施例46‐50
Figure PCTCN2016098844-appb-000017
化合物 化合物46 化合物47 化合物48 化合物49 化合物50
m 6 2 20 10 15
k 16 14 10 20 6
系列11：参见实施例51‐55
Figure PCTCN2016098844-appb-000018
化合物 化合物51 化合物52 化合物53 化合物54 化合物55
m 6 2 20 10 15
n 3 9 16 2 20
k 16 14 10 20 6
系列12：参见实施例56‐60
Figure PCTCN2016098844-appb-000019
化合物 化合物56 化合物57 化合物58 化合物59 化合物60
m 6 2 20 10 15
n 3 9 16 2 20
k 16 14 10 20 6
系列13：参见实施例61‐66
Figure PCTCN2016098844-appb-000020
化合物 化合物61 化合物62 化合物63 化合物64 化合物65 化合物66
m 2 4 5 7 9 10
k 20 10 16 8 16 6
系列14：参见实施例67
Figure PCTCN2016098844-appb-000021
m＝6；n＝3；k＝16
本发明另一方面提供了所述艾塞那肽修饰物或其可药用盐在制备作为GLP‐1受体激动剂的药物中的用途；在制备用于预防和/或治疗与GLP‐1受体活性低下相关的疾病和/或症状的药物中的用途；在制备用于糖代谢相关的疾病和/或症状的药物中的用途；在制备用于糖尿病的用途；在制备用于脂肪肝的用途；在制备用于减肥的用途。
本发明第三方面提供了包括所述艾塞那肽修饰物或其可药用盐以及任选的药学可接受的载体组成的组合物。
本发明第四方面提供了上述组合物在制备作为GLP‐1受体激动剂的药物中的用途；在制备用于预防和/或治疗与GLP‐1受体活性低下相关的疾病和/或症状的药物中的用途；在制备用于糖代谢相关的疾病和/或症状的药物中的用途；在制备用于糖尿病的用途；在制备用于脂肪肝的用途；在制备用于减肥的用途。
本发明提供的艾塞那肽修饰物不仅GLP‐1受体激动活性较高，且低血糖持续时间长。以下通过药理试验进行说明：
分别将各试验样品溶于双蒸水，终浓度为1.0×10‐2mol/L，4℃保存。PC12细胞培养于25cm2培养瓶中,置于CO2培养箱(37℃，95％空气，5％CO2)，培养基选用DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium，pH＝7.4，高糖)，加入5％胎牛血清及10％马血清。将生长状态良好的PC12细胞用0.25％胰酶消化下来，调整细胞浓度为1.0×105个/ml接种于24孔板，待细胞长至60－70％密度时，用PBS(Phosphate Buffer Saline)洗涤两次，加入含1％BSA(Bovine Serum Albumin)的PBS各1ml，分别将试验药物各分5个梯度浓度(10‐10、10‐9、10‐8、10‐7、10‐6mol/L)与IBMX(3-isobutyl-1-methylxanthine，100μmol/L)共孵育30min，每个浓度的样品进行3个复孔操作。药物干预时间结束，立即收集细胞，用冷的PBS悬浮细胞，调整细胞浓度为1.0×107个/ml，立即加入1体积的IN HCl至9体积的细胞悬液中，室温孵育10min，超声仪超声15s。4℃，1000rpm离心10min去除 细胞碎片，上清液加入与1N HCl等体积的1N NaOH进行中和(其中1N表示一当量)，得到的溶液即为含cAMP的样品溶液，保存于‐20℃待检测。采用非干扰型蛋白质浓度测定试剂盒，检测样品中总蛋白的浓度。使用ELISA试剂盒检测细胞裂解液中cAMP的含量，按照试剂盒说明书进行操作，用BIO‐RAD 680酶标仪在450nm测定OD(Optical Density)值。根据标准品的OD值采用CurveExpert 1.3软件拟和曲线并计算出标准曲线公式，计算各样本的浓度。使用计算机程序Microsoft Excel和GraphPad Prism 5软件进行数据处理和制图，并计算出各试验药物的EC50(半数有效浓度，Concentration for 50％of Maximal Effect)。
表1化合物对细胞内cAMP活性的影响
Figure PCTCN2016098844-appb-000022
Figure PCTCN2016098844-appb-000023
GLP‐1与GLP‐1受体(β受体家族的G偶联蛋白)结合后，激活细胞膜内环苷腺氨酸(cAMP)和丝裂原激活蛋白(MAPK)通路。胰岛成熟β细胞的GLP‐1受体偶联Gs，活化腺苷酰环化酶，产生cAMP，后者与葡萄糖协同刺激胰岛素合成和分泌，刺激胰岛素基因转录和胰岛素原生物合成，降低胰高血糖素浓度并一直胰高血糖素分泌，增强细胞对胰岛素的敏感性，刺激胰岛素依赖性糖原合成，降低餐后血糖浓度。EC50越小，其表明药物GLP‐1受体激动活性越高。
表1结果表明，本发明化合物与艾塞那肽活性相比，相当或只有轻微下降，这说明本发明对艾塞那肽的修饰没有影响其GLP‐1受体激动活性。
对自发性2型糖尿病db/db小鼠降糖作用
5～6周龄C57BL/6db/db9小鼠(雄性)购自南京大学模式动物研究所，实验动物饲养在SPF动物房内。动物房通风良好，装备空调，温度保持在20～25℃，湿度保持在40％～70％，换气次数10～15次/h，明暗照明各12小时，实验动物自由进食和饮水，每只小鼠均用耳标标记。每周将小鼠用于一次实验，小鼠使用不超过三周。在一周适应期后，使用茂晶血糖仪测定小鼠尾尖毛细血管血糖。选取血糖水平大于16.7mmol/L的小鼠340只，按血糖水平随机分成68组，模型对照组皮下注射给予5mL/kg的PBS(pH＝7.4)，阳性对照组1皮下注射艾塞那肽(10μg/kg，5mL/kg)，给药组分别皮下注射化合物1‐15(10μg/kg，5mL/kg)，给药后使用血糖仪测定0、1、2、4、8、12、18、24、30、36、42、48、72h的血糖，将所有数据输入Graphpad Prism中计算平均血糖。计算最大降糖作用(与模型组比最大下降率)，最大降糖时间(与模型组比，血糖显著降低的最后一个时间点)和曲线下面积。
表2对自发性2型糖尿病db/db小鼠降糖作用(h)
Figure PCTCN2016098844-appb-000024
Figure PCTCN2016098844-appb-000025
表2结果表明，本发明化合物与艾塞那肽相比，在维持低血糖时间方面有很大优势，将最大降糖时间4h延长至30h‐48h。
综合以上两个试验结果，本发明优选化合物为化合物41、42、43、46、47、48、51‐63、65、67。
综上，本发明艾塞那肽修饰物与艾塞那肽相比，活性相当或只有轻微下降，保留了大部分的GLP‐1受体激动剂活性，对艾塞那肽的修饰没有影响其GLP‐1受体 激动活性。与此同时，本发明艾塞那肽修饰物在维持低血糖时间方面有很大优势，将最大降糖时间4h延长至30h‐48h。本发明分子不仅GLP‐1受体激动剂活性较高，且低血糖持续时间长，有可能在未来的临床中成为体内作用时间长，稳定性好，降糖效果好的药物。
具体实施例
氨基酸及缩写和英文简称如下表所示：
Figure PCTCN2016098844-appb-000026
实施例1 化合物1的制备
Figure PCTCN2016098844-appb-000027
BP103n01的制备
向50mL三口瓶中加入1.0g化合物BP103n00(1.0eq，其中eq表示当量，下同)，10ml二氯甲烷，10ml叔丁醇，0.40g DIC(1.0eq)，0.39g DMAP(1.0eq，4‐二甲氨基吡啶)，室温搅拌过夜，TLC(薄层色谱)监控反应完毕，用乙醚稀释后水洗3次，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，柱层析得泡沫状粉末BP103n010.4g。
BP103n02的制备
向100mL三口瓶中加入0.95g N‐羟基琥珀酰亚胺(HOSU)，2.0g化合物19和15ml二氯甲烷，加入1.58g EDC·HCl，室温反应2h，TLC监控反应完毕，用二氯甲烷稀释后用pH＝6.0的50mmol/L的磷酸二氢钾水溶液洗涤2次，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩得白色固体2.6g化合物BP103n02。
Figure PCTCN2016098844-appb-000028
BP103m01的制备
氮气保护下，向500ml三口瓶中加入200mL吡啶，50g BP103g00(1.0eq)，搅拌降温至0℃，分批加入70.7g TsCl(2.1eq)，搅拌1h，然后缓慢升温至室温，继续搅拌3‐4h。反应结束后，将反应液倒入冰的稀盐酸溶液，加乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层用稀盐酸洗一次，饱和碳酸氢钠洗涤，饱和食盐水洗，无水Na2SO4 干燥，减压蒸除溶剂，硅胶柱层析得BP103m01纯品52g。
BP103m02的制备
向500mL三口瓶中加入50g BP103m01(1.0eq)和150mL DMSO(二甲亚砜)，搅拌均匀，然后加入NaN3 22.0g(4.0eq)，加热至50℃反应3小时，降温至室温，将反应液倒入水中，用乙酸乙酯萃取多次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，浓缩得无色液体BP103m02 25.3g。
BP103m03的制备
向1L氢化反应釜中加入BP103m03 25g，甲醇200mL，钯碳6.0g，搅拌，氮气置换，通入氢气反应3‐4h，TLC监控反应完毕后，过滤反应液，将滤液浓缩得到BP103m03的油状物20.4g。
BP103m04的制备
向500mL三口瓶中加入化合物BP103m03 20.0g(1.0eq)，二氯甲烷200ml，Fmoc‐HOSU 24.0g(1.0eq)，搅拌降温至0℃，滴加9.2g DIEA(1.0eq，N,N‐二异丙基乙胺)，搅拌过夜，TLC监控反应完毕后，水洗涤、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后柱层析得油状物BP103m04的27.3g。
BP103m05的制备
向200mL烧瓶加入5.0g BP103m04(1.0eq)，50ml水，1.7g NaHCO3(2.0eq)，搅拌，滴加4.7g化合物BP103n02(1.0eq)溶于50ml DME(乙二醇二甲醚)的溶液，补加50ml THF(四氢呋喃)，搅拌过夜，TLC监控反应完毕，蒸去有机溶剂，用醋酸调节pH＝4，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩，得6.4g类白色固体化合物BP103m05。
BP103m06的制备
向100mL烧瓶加入6.0g化合物BP103m05，30ml二氯甲烷，30ml TFA(三氟醋酸)，20℃搅拌，TLC监控反应完毕，蒸去有机溶剂，石油醚打浆，抽滤，干燥得5.1g类白色固体BP103m06。
Figure PCTCN2016098844-appb-000029
目标化合物的合成
20ml反应柱中，加入1.0g 2Cl‐Trt树脂，240mg BP103m06，5ml二氯甲烷， 300ul DIEA，氮气鼓泡40min，加入5ml二氯甲烷，1ml甲醇，1mlDIEA，反应20min后DMF(N,N‐二甲基甲酰胺)洗涤，制得BP103m06树脂。偶联试剂采用HOBT/DIC(即：1‐羟基苯并三唑/N,N‐二异丙基碳二亚胺)，DMF为反应溶剂，反应监控采用茚三酮检测法，依次将下列保护氨基酸连接到树脂上：
Fmoc‐Ser(tBu)‐OH、Fmoc‐Pro‐OH、Fmoc‐Pro‐OH、Fmoc‐Pro‐OH、Fmoc‐Ala‐OH、Fmoc‐Gly‐OH、Fmoc‐Ser(tBu)‐OH、Fmoc‐Ser(tBu)‐OH、Fmoc‐Pro‐OH、Fmoc‐Gly‐OH、Fmoc‐Gly‐OH、Fmoc‐Asn(Trt)‐OH、Fmoc‐Lys(Boc)‐OH、Fmoc‐Leu‐OH、Fmoc‐Trp(Boc)‐OH、Fmoc‐Glu(OtBu)‐OH、Fmoc‐Ile‐OH、Fmoc‐Phe‐OH、Fmoc‐Leu‐OH、Fmoc‐Arg(Pbf)‐OH、Fmoc‐Val‐OH、Fmoc‐Ala‐OH、Fmoc‐Glu(OtBu)‐OH、Fmoc‐Glu(OtBu)‐OH、Fmoc‐Glu(OtBu)‐OH、Fmoc‐Met‐OH、Fmoc‐Gln(Trt)‐OH、Fmoc‐Lys(Boc)‐OH、Fmoc‐Ser(tBu)‐OH、Fmoc‐Leu‐OH、Fmoc‐Asp(OtBu)OH、Fmoc‐Ser(tBu)‐OH、Fmoc‐Thr(tBu)‐OH、Fmoc‐Phe‐OH、Fmoc‐Thr(tBu)‐OH、Fmoc‐Gly‐OH、Fmoc‐Glu(OtBu)‐OH、Fmoc‐Gly‐OH、Fmoc‐His(Trt)‐OH、最后脱除Fmoc保护，树脂的裂解采用82.5％TFA/5％苯酚/5％水/2.5％EDT/5％苯甲硫醚，冰的MTBE(甲基叔丁基醚)沉淀、洗涤，粗品经反相HPLC纯化，得目标肽纯品32mg。
MS(ESI+,m/e)：4743.53[M+H]+
实施例2 化合物2的制备
参考实施例1的方法制备化合物2：
Figure PCTCN2016098844-appb-000030
Figure PCTCN2016098844-appb-000031
最终得到目标肽纯品31.2mg。
MS(ESI+,m/e)：4667.52[M+H]+
实施例3 化合物3的制备
参考实施例1的方法制备化合物3：
Figure PCTCN2016098844-appb-000032
最终得到目标肽纯品32.3mg。
MS(ESI+,m/e)：5263.78[M+H]+
实施例4 化合物4的制备
参考实施例1的方法制备化合物4：
Figure PCTCN2016098844-appb-000033
Figure PCTCN2016098844-appb-000034
最终得到目标肽纯品31.8mg。
MS(ESI+,m/e)：5055.68[M+H]+
实施例5 化合物5的制备
参考实施例1的方法制备化合物5：
Figure PCTCN2016098844-appb-000035
最终得到目标肽纯品31.0mg。
MS(ESI+,m/e)：4935.64[M+H]+
实施例6 化合物6的制备
Figure PCTCN2016098844-appb-000036
BP103a01的制备
氮气保护下，向1000ml三口瓶中加入200mL吡啶，120g BP103a00(1.0eq)，搅拌降温至0℃，分批加入151.8g TsCl(1.0eq)，搅拌1h，然后缓慢升至室温，继续搅拌3-4h。反应结束后，将反应液倒入冰的稀盐酸溶液，加乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层用稀盐酸洗一次，饱和碳酸氢钠洗涤，饱和食盐水洗，无水Na2SO4干燥，减压蒸除溶剂，硅胶柱层析得BP103a01纯品55g。
BP103a02的制备
向1000mL三口瓶中加入55g BP103a01(1.0eq)和160mL DMSO，搅拌均匀，然后加入NaN3 23.52g(2.0eq)，加热至50℃反应3小时，降温至室温，将反应液倒入水中，用乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，浓缩得BP103a02无色液体29.2g。
BP103a03的制备
向1L氢化反应釜中加入29g BP103a02，甲醇360mL，钯碳5.0g，搅拌，氮气置换，通入氢气反应3-4h，TLC监控反应完毕后，过滤反应液，将滤液浓缩得到BP103a03的油状物23.5g。
BP103a04的制备
向1L三口瓶中加入23.5g化合物BP103a03(1.0eq)，68.6g(Boc)2O(2.0eq)，甲醇：三乙胺(9：1)的混合溶液500ml，搅拌升温至回流，反应1h，TLC监控反应完毕后，蒸去甲醇三乙胺，加水溶解，二氯甲烷萃取3次，合并有机层水洗一次，无水硫酸钠干燥，蒸除溶剂，干燥，得到固体BP103a04的34.8g。
BP103a05的制备
向1000mL三口瓶中加入34.8g化合物BP103a04(1.0eq)，甲苯和THF各 150ml，溴乙酸58.2g(3eq)，搅拌，加热至45～50℃，再加入氢氧化钠33.5g(6eq)，反应过夜，TLC监控反应完毕后，蒸除反应液，加水和乙酸乙酯萃取，水相调节pH为3，水相用二氯甲烷萃取，合并二氯甲烷层，无水硫酸钠干燥后浓缩得BP103a05油状物化合物18g。
Figure PCTCN2016098844-appb-000037
BP103m07的制备
向100mL三口瓶中加入化合物BP103m04 5.0g(1.05eq)，2.9g BP103a05(1.0eq)，二氯甲烷50ml，DIEA3.8g(3.0eq)，DEPC 2.4g(1.5eq，氰代磷酸二乙酯)，TLC监控反应完毕后，0.1mol/L的HCl/水洗涤、碳酸氢钠洗涤，水洗涤，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后柱层析得油状物BP103m07的6.3g。
BP103m08的制备
向100mL烧瓶加入6.3g化合物BP103m07，30ml乙酸乙酯，降至0℃加入7.0molHCl/乙酸乙酯，TLC监控反应完毕后蒸去有机溶剂，石油醚打浆，抽滤，干燥得5.3g类白色固体BP103m08。
BP103m09的制备
向200mL烧瓶加入5.0g BP103m08(1.0eq)，50ml水，1.2g NaHCO3(2.0eq)，搅拌，滴加3.2g化合物BP103n02(1.0eq)溶于50ml DME(乙二醇二甲醚)的溶液，补加50ml THF,搅拌过夜，TLC监控反应完毕，蒸去有机溶剂，用醋酸调节pH＝4，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩，得6.1g类白色固体化合物BP103m09。
BP103m10的制备
向100mL烧瓶加入6.0g化合物BP103m09，30ml二氯甲烷，30mlTFA，20℃搅拌，TLC监控反应完毕，蒸去有机溶剂，石油醚打浆，抽滤，干燥得4.8g类白色固体BP103m10。
目标肽的制备
Figure PCTCN2016098844-appb-000038
20ml反应柱中，加入1.0g 2Cl-Trt树脂，296mg BP103m10，5ml二氯甲烷，300ul DIEA，氮气鼓泡40min，加入5ml二氯甲烷，1ml甲醇，1ml DIEA，反应20min后DMF洗涤，制的BP103m06树脂。Fmoc的脱除采用20％的哌啶/DMF，反应20分钟，偶联试剂采用HOBT/DIC，DMF为反应溶剂，反应监控采用茚三酮检测法，依次将下列保护氨基酸连接到树脂上：Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、最后脱除Fmoc保护，树脂的裂解采用82.5％TFA/5％苯酚/5％水/2.5％EDT/5％苯甲硫醚，冰的MTBE沉淀、洗涤，粗品经反相HPLC纯化， 得目标肽纯品39mg。
MS(ESI+,m/e)：4932.65[M+H]+
实施例7 化合物7的制备
参考实施例6的方法制备化合物7
Figure PCTCN2016098844-appb-000039
最终得到目标肽纯品39.6mg。
MS(ESI+,m/e)：5032.76[M+H]+
实施例8 化合物8的制备
参考实施例6的方法制备化合物8
Figure PCTCN2016098844-appb-000040
最终得到目标肽纯品40.2mg。
MS(ESI+,m/e)：5492.99[M+H]+
实施例9 化合物9的制备
参考实施例6的方法制备化合物9
Figure PCTCN2016098844-appb-000041
最终得到目标肽纯品40.7mg。
MS(ESI+,m/e)：5761.11[M+H]+
实施例10 化合物10的制备
参考实施例6的方法制备化合物10
Figure PCTCN2016098844-appb-000042
最终得到目标肽纯品40.7mg。
MS(ESI+,m/e)：5641.07[M+H]+
实施例11 化合物11的制备
Figure PCTCN2016098844-appb-000043
BP103a的制备
向250mL三口瓶中加入18g化合物BP103a05，100ml乙酸乙酯，搅拌溶解后降温至0℃，加入150ml乙酸乙酯/HCl(3.5M)，保温0℃，TLC监控反应完毕，过滤，滤饼用TBME洗涤得白色固体BP103a 10.4g。
BP103a06的制备
向200mL烧瓶加入5.0g BP103a(1.0eq)，50ml水，3.5g NaHCO3(2.0eq)，搅拌，滴加7.3gFmoc-HOSU(1.0eq)溶于50ml DME(乙二醇二甲醚)的溶液，补加50ml THF，搅拌过夜，TLC监控反应完毕，蒸去有机溶剂，用稀盐酸调节pH＝2，乙酸乙酯萃取，水洗，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，得7.6g类白色固体化合物BP103a06。
Figure PCTCN2016098844-appb-000044
BP103m20的制备
向500mL三口瓶中加入化合物BP103m03 10.0g(1.0eq)，二氯甲烷100ml,(Boc)2O 7.8g(1.0eq)，搅拌降温至0℃，滴加4.6g DIEA(1.0eq)搅拌过夜，TLC监控反应完毕后，水洗涤、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后柱层析得油状物BP103m20的6.2g。
BP103m21的制备
向100mL三口瓶中加入化合物BP103m20 6.2g(1.05eq)，6.7g BP103a06(1.0eq)二氯甲烷50ml，DIEA6.3g(3.0eq)，DEPC 4.0g(1.5eq)，TLC监控反应完毕后，0.1mol/L的HCl/水洗涤、碳酸氢钠洗涤，水洗涤，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后柱层析得油状物BP103m21的9.5g。
BP103m22的制备
向100mL烧瓶加入9.5g化合物BP103m21，50ml乙酸乙酯，搅拌降温至0℃，加入50ml 7.0mol/L的HCl/乙酸乙酯，TLC监控反应完毕，蒸去有机溶剂，石油醚打浆，抽滤，干燥得8.3g类白色固体BP103m22。
BP103m23的制备
向200mL烧瓶加入5.0g BP103m22(1.0eq)，50ml水，1.2g NaHCO3(2.0eq)，搅拌，滴加3.2g化合物BP103n02(1.0eq)溶于50ml DME(乙二醇二甲醚)的溶液，补加50ml THF,搅拌过夜，TLC监控反应完毕，蒸去有机溶剂，用醋酸调节pH＝4，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩，得5.6g类白色固体化合物BP103m23。
BP103m24的制备
向100mL烧瓶加入5.6g化合物BP103m23，30ml二氯甲烷，30mlTFA，20℃搅拌，TLC监控反应完毕，蒸去有机溶剂，石油醚打浆，抽滤，干燥得4.4g类白色固体BP103m24。
目标肽的制备
Figure PCTCN2016098844-appb-000045
20ml反应柱中，加入1.0g 2Cl‐Trt树脂，296mg BP103m24，5ml二氯甲烷，300ul DIEA，氮气鼓泡40min，加入5ml二氯甲烷，1ml甲醇，1ml DIEA，反应20min后DMF洗涤，制的BP103m06树脂。Fmoc的脱除采用20％的哌啶/DMF，反应20分钟，偶联试剂采用HOBT/DIC，DMF为反应溶剂，反应监控采用茚三酮检测法，依次将下列保护氨基酸连接到树脂上：Fmoc‐Ser(tBu)‐OH、Fmoc‐Pro‐OH、Fmoc‐Pro‐OH、Fmoc‐Pro‐OH、Fmoc‐Ala‐OH、Fmoc‐Gly‐OH、Fmoc‐Ser(tBu)‐OH、Fmoc‐Ser(tBu)‐OH、Fmoc‐Pro‐OH、Fmoc‐Gly‐OH、Fmoc‐Gly‐OH、Fmoc‐Asn(Trt)‐OH、Fmoc‐Lys(Boc)‐OH、Fmoc‐Leu‐OH、Fmoc‐Trp(Boc)‐OH、Fmoc‐Glu(OtBu)‐OH、Fmoc‐Ile‐OH、Fmoc‐Phe‐OH、Fmoc‐Leu‐OH、Fmoc‐Arg(Pbf)‐OH、Fmoc‐Val‐OH、Fmoc‐Ala‐OH、Fmoc‐Glu(OtBu)‐OH、Fmoc‐Glu(OtBu)‐OH、Fmoc‐Glu(OtBu)‐OH、Fmoc‐Met‐OH、Fmoc‐Gln(Trt)‐OH、Fmoc‐Lys(Boc)‐OH、Fmoc‐Ser(tBu)‐OH、Fmoc‐Leu‐OH、Fmoc‐Asp(OtBu)OH、Fmoc‐Ser(tBu)‐OH、Fmoc‐Thr(tBu)‐OH、Fmoc‐Phe‐OH、Fmoc‐Thr(tBu)‐OH、Fmoc‐Gly‐OH、Fmoc‐Glu(OtBu)‐OH、 Fmoc‐Gly‐OH、Fmoc‐His(Trt)‐OH、最后脱除Fmoc保护，树脂的裂解采用82.5％TFA/5％苯酚/5％水/2.5％EDT/5％苯甲硫醚，冰的MTBE沉淀、洗涤，粗品经反相HPLC纯化，得目标肽纯品29mg。
MS(ESI+,m/e)：4932.65[M+H]+
实施例12 化合物12的制备
参考实施例11的方法制备化合物12。
Figure PCTCN2016098844-appb-000046
最终得到目标肽纯品29.1mg。
MS(ESI+,m/e)：5032.76[M+H]+
实施例13 化合物13的制备
参考实施例11的方法制备化合物13。
Figure PCTCN2016098844-appb-000047
最终得到目标肽纯品30mg。
MS(ESI+,m/e)：5492.99[M+H]+
实施例14 化合物14的制备
参考实施例11的方法制备化合物14。
Figure PCTCN2016098844-appb-000048
最终得到目标肽纯品30.2mg。
MS(ESI+,m/e)：5761.11[M+H]+
实施例15 化合物15的制备
参考实施例11的方法制备化合物15。
Figure PCTCN2016098844-appb-000049
最终得到目标肽纯品30.4mg。
MS(ESI+,m/e)：5641.07[M+H]+
实施例16 化合物16的制备
Figure PCTCN2016098844-appb-000050
化合物BP103g01的制备
氮气保护下，向500ml三口瓶中加入200mL吡啶，50g BP103g00(1.0eq)，搅拌降温至0℃，分批加入35.5g TsCl(1.0eq)，搅拌1h，然后缓慢升温至室温，继续搅拌3-4h。反应结束后，将反应液倒入冰的稀盐酸溶液，加乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层用稀盐酸洗一次，饱和碳酸氢钠洗涤，饱和食盐水洗，无水Na2SO4干燥，减压蒸除溶剂，硅胶柱层析得BP103g01纯品38g。
化合物BP103g02的制备
向500mL三口瓶中加入38g BP103g01(1.0eq)和190mL DMSO，搅拌均匀，然后加入NaN3 11.5g(2.0eq)，加热至50℃反应3小时，降温至室温，将反应液倒入水中，用乙酸乙酯萃取多次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，浓缩得无色液体BP103g02 40g。
化合物BP103g03的制备
向1L氢化反应釜中加入BP103g02 70g，甲醇500mL，钯碳8.0g，搅拌，氮气置换，通入氢气反应3-4h，TLC监控反应完毕后，过滤反应液，将滤液浓缩得到BP103g03的油状物52g。
化合物BP103g04的制备
向250mL三口瓶中加入化合物BP103g03 10.0g(1.0eq)，(Boc)2O 15.5g(2.0eq)，甲醇：三乙胺(9：1)的混合溶液200ml，搅拌升温至回流，反应1h，TLC 监控反应完毕后，蒸去甲醇三乙胺，加水溶解，二氯甲烷萃取3次，合并有机层水洗一次，无水硫酸钠干燥，浓缩得油状物BP103g04的9.0g。
化合物BP103g05的制备
向250mL三口瓶中加入BP103g04化合物7.0g(1.0eq)，甲苯和THF各40ml，溴乙酸7.6g(3.0eq)，搅拌，加热至45～50℃，再加入氢氧化钠4.4g，反应过夜，TLC监控反应完毕后，蒸除反应液，加水和乙酸乙酯萃取杂质，水相调节pH＝3，水相用二氯甲烷萃取，合并二氯甲烷层，无水硫酸钠干燥后浓缩得BP103g05油状物化合物4.2g。
Figure PCTCN2016098844-appb-000051
BP103m30的制备
向100mL三口瓶中加入化合物BP103g05 4.2g(1.05eq)，2.9g Fmoc-乙二胺盐酸盐(1.0eq)二氯甲烷50ml，DIEA3.7g(3.0eq)，DEPC 2.3g(1.5eq)TLC监控反应完毕后，0.1mol/L的HCl/水洗涤、碳酸氢钠洗涤，水洗涤，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后柱层析得油状物BP103m21的5.6g。
BP103m31的制备
向100mL烧瓶加入5.6g化合物BP103m30，30ml乙酸乙酯，搅拌降温至0℃， 加入30ml 7.0mol/L的HCl/乙酸乙酯，TLC监控反应完毕，蒸去有机溶剂，石油醚打浆，抽滤，干燥得4.8g类白色固体BP103m31。
BP103m32的制备
向200mL烧瓶加入4.6g BP103m31(1.0eq)，45ml水，1.2g NaHCO3(2.0eq)，搅拌，滴加3.4g化合物BP103n02(1.0eq)溶于45ml DME(乙二醇二甲醚)的溶液，补加45ml THF，搅拌过夜，TLC监控反应完毕，蒸去有机溶剂，用醋酸调节pH＝4，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩，得4.9g类白色固体化合物BP103m32。
BP103m33的制备
向100mL烧瓶加入4.5g化合物BP103m32，25ml二氯甲烷，25mlTFA，20℃搅拌，TLC监控反应完毕，蒸去有机溶剂，石油醚打浆，抽滤，干燥得3.8g类白色固体BP103m33。
Figure PCTCN2016098844-appb-000052
20ml反应柱中，加入1.0g 2Cl-Trt树脂，270mg BP103m33，5ml二氯甲烷，300ul DIEA，氮气鼓泡40min，加入5ml二氯甲烷，1ml甲醇，1mlDIEA，反应20min后DMF洗涤，制得BP103m06树脂。Fmoc的脱除采用20％的哌啶/DMF，反应20分钟，偶联试剂采用HOBT/DIC，DMF为反应溶剂，反应监控采用茚三酮检测法，依次将下列保护氨基酸连接到树脂上：Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、最后脱除Fmoc保护，树脂的裂解采用82.5％TFA/5％苯酚/5％ 水/2.5％EDT/5％苯甲硫醚，冰的MTBE沉淀、洗涤，粗品经反相HPLC纯化，得目标肽纯品33mg。
MS(ESI+,m/e)：4844.6[M+H]+
实施例17 化合物17的制备
参考实施例16的方法制备化合物17。
Figure PCTCN2016098844-appb-000053
最终得到目标肽纯品32mg。
MS(ESI+,m/e)：4710.54[M+H]+
实施例18 化合物18的制备
参考实施例16的方法制备化合物18。
Figure PCTCN2016098844-appb-000054
最终得到目标肽纯品33.5mg。
MS(ESI+,m/e)：5170.77[M+H]+
实施例19 化合物19的制备
参考实施例16的方法制备化合物19。
Figure PCTCN2016098844-appb-000055
最终得到目标肽纯品33.1mg。
MS(ESI+,m/e)：5090.82[M+H]+
实施例20 化合物20的制备
参考实施例16的方法制备化合物20。
Figure PCTCN2016098844-appb-000056
最终得到目标肽纯品33.1mg。
MS(ESI+,m/e)：5090.82[M+H]+
实施例21 化合物21的制备
Figure PCTCN2016098844-appb-000057
BP103m06的制备方法见实施例6。
Figure PCTCN2016098844-appb-000058
20ml反应柱中，加入1.0g 2Cl-Trt树脂，240mg BP103m06，5ml二氯甲烷，300ul DIEA，氮气鼓泡40min，加入5ml二氯甲烷，1ml甲醇，1mlDIEA，反应20min后DMF洗涤，制得BP103m06树脂。Fmoc的脱除采用20％的哌啶/DMF，反应20分钟，偶联试剂采用HOBT/DIC，DMF为反应溶剂，反应监控采用茚三酮检测法，依次将下列保护氨基酸连接到树脂上：Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、最后脱除Fmoc保护，树脂的裂解采用82.5％TFA/5％苯酚/5％ 水/2.5％EDT/5％苯甲硫醚，冰的MTBE沉淀、洗涤，粗品经反相HPLC纯化，得目标肽纯品42mg。
MS(ESI+,m/e)：4800.56[M+H]+
实施例22 化合物22的制备
参考实施例21的方法制备化合物22。
Figure PCTCN2016098844-appb-000059
最终得到目标肽纯品41.7mg。
MS(ESI+,m/e)：4710.53[M+H]+
实施例23 化合物23的制备
参考实施例21的方法制备化合物23。
Figure PCTCN2016098844-appb-000060
最终得到目标肽纯品42.5mg。
MS(ESI+,m/e)：5184.78[M+H]+
实施例24 化合物24的制备
参考实施例21的方法制备化合物24。
Figure PCTCN2016098844-appb-000061
最终得到目标肽纯品42.1mg。
MS(ESI+,m/e)：5104.83[M+H]+
实施例25 化合物25的制备
参考实施例21的方法制备化合物25。
Figure PCTCN2016098844-appb-000062
最终得到目标肽纯品43mg。
MS(ESI+,m/e)：5390.91[M+H]+
实施例26
Figure PCTCN2016098844-appb-000063
BP103m40的制备
向500mL三口瓶中加入化合物BP103g01 25.0g(1.0eq)，乙腈250ml，Fmoc-乙二胺盐酸盐18.3g(1.0eq)，搅拌降温至0℃，加入7.9g碳酸钾(1.0eq)，TLC监控反应完毕后，稀盐酸洗涤、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后柱层析得油状物BP103m40的25.3g。
BP103m41的制备
向500mL三口瓶中加入化合物BP103m40 25.0g(1.0eq)，二氯甲烷250ml,(Boc)2O 19.9g(2.0eq)，滴加17.7g DIEA(3.0eq)，TLC监控反应完毕后，稀盐酸洗涤、碳酸氢钠水溶液洗涤后饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，柱层析得油状物BP103m41的23.8g。
BP103m42的制备
氮气保护下，向1000ml三口瓶中加入100mL吡啶，23.5g BP103m41(1.0eq)，搅拌降温至0℃，分批加入8.3g TsCl(1.2eq)，搅拌1h，然后缓慢升至室温，继续搅拌3-4h。反应结束后，蒸去大部分吡啶，乙酸乙酯溶解，稀盐酸洗一次，饱和碳酸氢钠洗涤，饱和食盐水洗，无水Na2SO4干燥，硅胶柱层析得BP103m42纯品25.3g。
BP103m43的制备
向1000mL三口瓶中加入25.0g BP103m42(1.0eq)和100mL DMSO，搅拌均匀，然后加入NaN3 4.1g(2.0eq)，加热至50℃反应3小时，降温至室温，将反应液倒入水中，用乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，浓缩得BP103m43无色液体22.7g。
BP103m44的制备
向1L氢化反应釜中加入22.7g化合物BP103m43，甲醇250mL，钯碳5.0g，搅拌，氮气置换，通入氢气反应3-4h，TLC监控反应完毕后，过滤反应液，将滤液浓缩得到BP103m44的油状物19.6g。
BP103m45的制备
向500mL烧瓶加入10.0g BP103m44(1.0eq)，100ml水，2.6g NaHCO3(2.0eq)，搅拌，滴加7.2g化合物BP103n02(1.0eq)溶于100ml DME(乙二醇二甲醚)的溶液，补加100ml THF,搅拌过夜，TLC监控反应完毕，蒸去有机溶剂，用醋酸调节pH＝4，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩，得13.2g类白色固体化合物BP103m45。
BP103m46的制备
向100mL烧瓶加入13.2g化合物BP103m45，15ml二氯甲烷，15mlTFA，20℃搅拌，TLC监控反应完毕，蒸去有机溶剂，石油醚打浆，抽滤，干燥得10.5g 类白色固体BP103m46。
BP103m47的制备
向250ml三口瓶中加入10.5g化合物BP103m36(1.0eq)，110ml二氯甲烷，5.4g(Boc)2O(2.0eq)，滴加4.8g DIEA(3.0eq)，TLC监控反应完毕后，稀盐酸洗涤、碳酸氢钠水溶液洗涤后饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，柱层析得类白色固体的BP103m47 7.9g。
Figure PCTCN2016098844-appb-000064
20ml反应柱中，加入1.0g 2Cl-Trt树脂，283mg BP103m47，5ml二氯甲烷，300ul DIEA，氮气鼓泡40min，加入5ml二氯甲烷，1ml甲醇，1mlDIEA，反应20min后DMF洗涤，制得BP103m06树脂。Fmoc的脱除采用20％的哌啶/DMF，反应20分钟，偶联试剂采用HOBT/DIC，DMF为反应溶剂，反应监控采用茚三酮检测法，依次将下列保护氨基酸连接到树脂上：Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、最后脱除Fmoc保护，树脂的裂解采用82.5％TFA/5％苯酚/5％水/2.5％EDT/5％苯甲硫醚，冰的MTBE沉淀、洗涤，粗品经反相HPLC纯化，得目标肽纯品41mg。
MS(ESI+,m/e)：4771.57[M+H]+
实施例27 化合物27的制备
参考实施例26的方法制备化合物27。
Figure PCTCN2016098844-appb-000065
最终得到目标肽纯品40.5mg。
MS(ESI+,m/e)：4611.44[M+H]+
实施例28 化合物28的制备
参考实施例26的方法制备化合物28。
Figure PCTCN2016098844-appb-000066
最终得到目标肽纯品41.6mg。
MS(ESI+,m/e)：5141.77[M+H]+
实施例29 化合物29的制备
参考实施例26的方法制备化合物29。
Figure PCTCN2016098844-appb-000067
最终得到目标肽纯品41.2mg。
MS(ESI+,m/e)：5061.82[M+H]+
实施例30 化合物30的制备
参考实施例26的方法制备化合物30。
Figure PCTCN2016098844-appb-000068
最终得到目标肽纯品42.3mg。
MS(ESI+,m/e)：5347.9[M+H]+
实施例31 化合物31的制备
Figure PCTCN2016098844-appb-000069
BP103m50的制备
向100mL三口瓶中加入286mg N-羟基琥珀酰亚胺(HOSU)，0.50g BP103a05和5ml二氯甲烷，加入477mg EDC·HCl，室温反应2h，TLC监控反应完毕，用二氯甲烷稀释后用pH＝6.0的50mmol/L的磷酸二氢钾水溶液洗涤2次，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩得油状物0.72g化合物BP103m50。
BP103m51的制备
向100mL烧瓶加入0.62g化合物BP103g06(1.0eq)，10ml水，0.27g NaHCO3(2.0eq)，搅拌，滴加0.66g化合物BP103m50溶于10ml DME(乙二醇二甲醚)的溶液，补加5ml THF，搅拌过夜，TLC监控反应完毕，蒸去有机溶剂，用稀盐酸调节pH＝4，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩，得油状物0.71g化合物BP103m51。
BP103m52的制备
向100mL烧瓶加入0.71g化合物BP103m51，5ml乙酸乙酯溶解后降至0℃，加入5ml HCl/乙酸乙酯(7mol/L)，保温0℃，TLC监控反应完毕后浓缩，得油状物BP103m52的0.71g。
BP103m53的制备
向100mL烧瓶加入640mg化合物BP103m52(1.0eq)，15ml水，190mg  NaHCO3(2.0eq)，搅拌，滴加528mg化合物BP103n02溶于15ml DME(乙二醇二甲醚)的溶液，补加15mlTHF,搅拌过夜，TLC监控反应完毕，蒸去有机溶剂，用醋酸调节pH＝6，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩，得油状物0.65g化合BP103m53。
Figure PCTCN2016098844-appb-000070
BP103m54的制备
向100mL三口瓶中加入化合物BP103m53 3.0g(1.0eq)，1.1gFmoc-乙二胺盐酸盐(1.05eq)二氯甲烷30ml，DIEA1.3g(3.0eq)，DEPC 0.8g(1.5eq)TLC监控反应完毕后，0.1mol/L的HCl/水洗涤、碳酸氢钠洗涤，水洗涤，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后柱层析得油状物BP103m54的2.9g。
BP103m55的制备
向100mL烧瓶加入2.9g化合物BP103m54，15ml二氯甲烷，15mlTFA，20℃搅拌，TLC监控反应完毕，蒸去有机溶剂，石油醚打浆，抽滤，干燥得2.5g类白色固体BP103m55。
Figure PCTCN2016098844-appb-000071
20ml反应柱中，加入1.0g 2Cl-Trt树脂，344mg BP103m55，5ml二氯甲烷，300ul DIEA，氮气鼓泡40min，加入5ml二氯甲烷，1ml甲醇，1ml DIEA，反应20min后DMF洗涤，制得BP103m06树脂。Fmoc的脱除采用20％的哌啶 /DMF，反应20分钟，偶联试剂采用HOBT/DIC，DMF为反应溶剂，反应监控采用茚三酮检测法，依次将下列保护氨基酸连接到树脂上：Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、最后脱除Fmoc保护，树脂的裂解采用82.5％TFA/5％苯酚/5％水/2.5％EDT/5％苯甲硫醚，冰的MTBE沉淀、洗涤，粗品经反相HPLC纯化，得目标肽纯品46mg。
MS(ESI+,m/e)：5033.72[M+H]+
实施例32 化合物32的制备
参考实施例31的方法制备化合物32。
Figure PCTCN2016098844-appb-000072
最终得到目标肽纯品46.8mg。
MS(ESI+,m/e)：5578.07[M+H]+
实施例33 化合物33的制备
参考实施例31的方法制备化合物33。
Figure PCTCN2016098844-appb-000073
最终得到目标肽纯品46.4mg。
MS(ESI+,m/e)：5447.95[M+H]+
实施例34 化合物34的制备
参考实施例31的方法制备化合物34。
Figure PCTCN2016098844-appb-000074
最终得到目标肽纯品46.5mg。
MS(ESI+,m/e)：5588.15[M+H]+
实施例35 化合物35的制备
参考实施例31的方法制备化合物35。
Figure PCTCN2016098844-appb-000075
最终得到目标肽纯品46mg。
MS(ESI+,m/e)：5521.99[M+H]+
实施例36 化合物36的制备
Figure PCTCN2016098844-appb-000076
BP103m60的制备
向500mL烧瓶加入10.0g BP103g06(1.0eq)，100ml水，4.5g NaHCO3(2.0eq)，搅拌，滴加12.4g化合物BP103n02(1.0eq)溶于100ml DME(乙二醇二甲醚)的溶液，补加100ml THF，搅拌过夜，TLC监控反应完毕，蒸去有机溶剂，用醋酸调节pH＝4，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩，得15.2g类白色固体化合物BP103m60。
Figure PCTCN2016098844-appb-000077
BP103m61的制备
向100mL三口瓶中加入化合物BP103m44 3.0g(1.05eq)，3.1g(1.0eq)BP103m60，二氯甲烷30ml，DIEA1.7g(3.0eq)，DEPC 1.1g(1.5eq)，TLC监控反应完毕后，0.1mol/L的HCl/水洗涤、碳酸氢钠洗涤，水洗涤，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后柱层析得油状物BP103m61的4.1g。
BP103m62的制备
向100mL烧瓶加入4.1g化合物BP103m61，20ml二氯甲烷，20mlTFA，20℃搅拌，TLC监控反应完毕，蒸去有机溶剂，石油醚打浆，抽滤，干燥得3.5g类白色固体BP103m62。
BP103m63的制备
向250ml三口瓶中加入3.5g化合物BP103m62(1.0eq)，50ml二氯甲烷， 1.2g(Boc)2O(2.0eq)，滴加1.1g DIEA(3.0eq)TLC监控反应完毕后，稀盐酸洗涤、碳酸氢钠水溶液洗涤后饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，柱层析得类白色固体的BP103m63 2.6g。
Figure PCTCN2016098844-appb-000078
20ml反应柱中，加入1.0g 2Cl-Trt树脂，408mg BP103m63，5ml二氯甲烷，300ul DIEA，氮气鼓泡40min，加入5ml二氯甲烷，1ml甲醇，1mlDIEA，反应20min后DMF洗涤，制的BP103m06树脂。Fmoc的脱除采用20％的哌啶/DMF，反应20分钟，偶联试剂采用HOBT/DIC，DMF为反应溶剂，反应监控采用茚三酮检测法，依次将下列保护氨基酸连接到树脂上：Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、最后脱除Fmoc保护，树脂的裂解采用82.5％TFA/5％苯酚/5％水/2.5％EDT/5％苯甲硫醚，冰的MTBE沉淀、洗涤，粗品经反相HPLC纯化，得目标肽纯品55mg。
MS(ESI+,m/e)：5107.81[M+H]+
实施例37 化合物37的制备
参考实施例36的方法制备化合物37。
Figure PCTCN2016098844-appb-000079
最终得到目标肽纯品55.7mg。
MS(ESI+,m/e)：5564.1[M+H]+
实施例38 化合物38的制备
参考实施例36的方法制备化合物38。
Figure PCTCN2016098844-appb-000080
最终得到目标肽纯品55mg。
MS(ESI+,m/e)：5433.98[M+H]+
实施例39 化合物39的制备
参考实施例36的方法制备化合物39。
Figure PCTCN2016098844-appb-000081
最终得到目标肽纯品55.2mg。
MS(ESI+,m/e)：5574.18[M+H]+
实施例40 化合物40的制备
参考实施例36的方法制备化合物40。
Figure PCTCN2016098844-appb-000082
最终得到目标肽纯品55.3mg。
MS(ESI+,m/e)：5508.02[M+H]+
实施例41 化合物41的制备
Exendin‐4(1‐39)‐Lys40(Alloc)‐NH2的制备
目标肽的固相肽合成采用Fmoc法固相合成、利用Fmoc‐Rink MBHA Amide树脂、采用20％的哌啶/DMF脱除Fmoc，偶联试剂采用HOBT/DIC，DMF为反应溶剂，反应监控采用茚三酮检测法，依次将下列保护氨基酸连接到Rink MBHA Amide树脂上：Fmoc‐Lys(Alloc)‐OH、Fmoc‐Ser(tBu)‐OH、Fmoc‐Pro‐OH、Fmoc‐Pro‐OH、Fmoc‐Pro‐OH、Fmoc‐Ala‐OH、Fmoc‐Gly‐OH、Fmoc‐Ser(tBu)‐OH、Fmoc‐Ser(tBu)‐OH、Fmoc‐Pro‐OH、Fmoc‐Gly‐OH、Fmoc‐Gly‐OH、Fmoc‐Asn(Trt)‐OH、Fmoc‐Lys(Boc)‐OH、Fmoc‐Leu‐OH、Fmoc‐Trp(Boc)‐OH、Fmoc‐Glu(OtBu)‐OH、Fmoc‐Ile‐OH、Fmoc‐Phe‐OH、Fmoc‐Leu‐OH、Fmoc‐Arg(Pbf)‐OH、Fmoc‐Val‐OH、Fmoc‐Ala‐OH、Fmoc‐Glu(OtBu)‐OH、Fmoc‐Glu(OtBu)‐OH、Fmoc‐Glu(OtBu)‐OH、Fmoc‐Met‐OH、Fmoc‐Gln(Trt)‐OH、 Fmoc‐Lys(Boc)‐OH、Fmoc‐Ser(tBu)‐OH、Fmoc‐Leu‐OH、Fmoc‐Asp(OtBu)OH、Fmoc‐Ser(tBu)‐OH、Fmoc‐Thr(tBu)‐OH、Fmoc‐Phe‐OH、Fmoc‐Thr(tBu)‐OH、Fmoc‐Gly‐OH、Fmoc‐Glu(OtBu)‐OH、Fmoc‐Gly‐OH、Fmoc‐His(Trt)‐OH、(BOC)2O(采用DIEA，二氯甲烷)。DMF洗涤、甲醇洗涤、二氯甲烷洗涤后干燥得12.1g Exendin‐4(1‐39)‐Lys40(Alloc)‐NH2树脂。
Figure PCTCN2016098844-appb-000083
化合物a02的制备
氮气保护下，向500ml三口瓶中加入200mL吡啶，50g a01(1.0eq)，搅拌降温至0℃，分批加入35.5g TsCl(1.0eq)，搅拌1h，然后缓慢升温至室温，继续搅拌3‐4h。反应结束后，将反应液倒入冰的稀盐酸溶液，有固体产生，加乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层用稀盐酸洗一次，饱和碳酸氢钠洗涤，饱和食盐水洗，无水Na2SO4干燥，减压蒸除溶剂，硅胶柱层析得a02纯品38g。
化合物a03的制备
向500mL三口瓶中加入38g a(1.0eq)和190mL DMSO，搅拌均匀，然后加入NaN3 11.5g(2.0eq)，加热至50℃反应3小时，降温至室温，将反应液倒入水中，用乙酸乙酯萃取多次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，浓缩得无色液体a03 40g。
化合物a04的制备
向1L氢化反应釜中加入a03 70g，甲醇500mL，钯碳8.0g，搅拌，氮气置换，通入氢气反应3‐4h，TLC监控反应完毕后，过滤反应液，将滤液浓缩得到a04的油状物52g。
化合物a05的制备
向250mL三口瓶中加入化合物a04 10.0g(1.0eq)，(Boc)2O 15.5g(2.0eq)，甲醇：三乙胺(9：1)的混合溶液200ml，搅拌升温至回流，反应1h，TLC监控反应完毕后，蒸去甲醇三乙胺，加水溶解，二氯甲烷萃取3次，合并有机层水洗一次，无水硫酸钠干燥，浓缩得油状物a05的9.0g。
化合物a06的制备
向250mL三口瓶中加入a05化合物7.0g(1.0eq)，甲苯和THF各40ml，溴乙酸7.6g(3.0eq)，搅拌，加热至45～50℃，再加入氢氧化钠4.4g，反应过夜，TLC监控反应完毕后，蒸除反应液，加水和乙酸乙酯萃取杂质，水相调节pH＝3，水相用二氯甲烷萃取，合并二氯甲烷层，无水硫酸钠干燥后浓缩得a06油状物化合物4.2g。
化合物a07的制备
向250mL单口瓶中加化合物a06 4.0g，20ml乙酸乙酯溶解后降至0℃，加入20ml HCl/乙酸乙酯(7mol/L)，TLC监控反应完毕后浓缩，得油状物a07 4.2g。化合物a09的制备
向50mL三口瓶中加入1.0g化合物a08(1.0eq)，10ml二氯甲烷，10ml叔丁醇，0.40g DIC(1.0eq)，0.39g DMAP(1.0eq)，室温搅拌过夜，TLC监控反应完毕，用乙醚稀释后水洗3次，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，柱层析得泡沫状粉末a09 0.4g。
化合物a10的制备
向100mL三口瓶中加入0.95g N‐羟基琥珀酰亚胺(HOSU)，2.0g化合物a09和15ml二氯甲烷，加入1.58g EDCHCl，室温反应2h，TLC监控反应完毕，用二氯甲烷稀释后用pH＝6.0的50mmol/L的磷酸二氢钾水溶液洗涤2次，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩得油状物2.6g化合物a10。
化合物a11的制备
向100mL烧瓶加入1.28g化合物a07(1.0eq)，20ml水，1.16g NaHCO3(4.0eq)，搅拌，滴加1.75g化合物a10溶于20ml DME(乙二醇二甲醚)的溶液，补加20mlTHF,搅拌过夜，TLC监控反应完毕，蒸去有机溶剂，用醋酸调节pH＝6，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩，得类白色固体,柱层析后得0.95g化合物a11。
Figure PCTCN2016098844-appb-000084
取1.5g Exendin‐4(1‐39)‐Lys40‐NH2树脂，DMF溶胀后加入3eq的Pd(PPh3)4的CHCl3:AcOH:NMM(18:1:0.5)的溶液，反应2h，随后用氯仿洗涤(6次，每次20ml氯仿)，20％HOAc的二氯甲烷溶液洗涤(6次，每次20ml 20％HOAc的二氯甲烷溶液)、二氯甲烷洗涤(6次，每次20ml二氯甲烷)和DMF洗涤(6次，每次20ml DMF)，茚三酮监测阳性，加入5mlDMF,415mg化合物a11，150mg HOAT，150ul DIC,反应4h，茚三酮检测阴性，表明侧链a11已经连接到Exendin‐4(1‐39)‐Lys40‐NH2树脂上，树脂的裂解采用82.5％TFA/5％苯酚/5％水/2.5％EDT/5％苯甲硫醚进行，随后用冰的甲基叔丁基醚(MTBE)沉淀、洗涤。产物粗品用HPLC纯化，得到目标化合物43mg。
MS(ESI+,m/e)：4932.56[M+H]+
实施例42 化合物42的制备
参考实施例41的方法制备化合物42。
Figure PCTCN2016098844-appb-000085
最终得到目标肽纯品41mg。
MS(ESI+,m/e)：4725.38[M+H]+
实施例43 化合物43的制备
参考实施例41的方法制备化合物43。
Figure PCTCN2016098844-appb-000086
最终得到目标肽纯品41.5mg。
MS(ESI+,m/e)：5461.93[M+H]+
实施例44 化合物44的制备
参考实施例41的方法制备化合物44。
Figure PCTCN2016098844-appb-000087
最终得到目标肽纯品43mg。
MS(ESI+,m/e)：5161.83[M+H]+
实施例45 化合物45的制备
参考实施例41的方法制备化合物45。
Figure PCTCN2016098844-appb-000088
最终得到目标肽纯品42mg。
MS(ESI+,m/e)：5185.7[M+H]+
实施例46 化合物46的制备
Exendin‐4(1‐39)‐Orn40(Alloc)‐NH2树脂的制备
取5g Fmoc‐Rink MBHA Amide树脂，采用20％的哌啶/DMF脱除Fmoc，偶联试剂采用HOBT/DIC，DMF为反应溶剂，反应监控采用茚三酮检测法，依次将下列保护氨基酸连接到Rink MBHA Amide树脂上：Fmoc‐Orn(Alloc)‐OH、Fmoc‐Ser(tBu)‐OH、Fmoc‐Pro‐OH、Fmoc‐Pro‐OH、Fmoc‐Pro‐OH、Fmoc‐Ala‐OH、Fmoc‐Gly‐OH、Fmoc‐Ser(tBu)‐OH、Fmoc‐Ser(tBu)‐OH、Fmoc‐Pro‐OH、Fmoc‐Gly‐OH、Fmoc‐Gly‐OH、Fmoc‐Asn(Trt)‐OH、Fmoc‐Lys(Boc)‐OH、Fmoc‐Leu‐OH、Fmoc‐Trp(Boc)‐OH、Fmoc‐Glu(OtBu)‐OH、Fmoc‐Ile‐OH、Fmoc‐Phe‐OH、Fmoc‐Leu‐OH、 Fmoc‐Arg(Pbf)‐OH、Fmoc‐Val‐OH、Fmoc‐Ala‐OH、Fmoc‐Glu(OtBu)‐OH、Fmoc‐Glu(OtBu)‐OH、Fmoc‐Glu(OtBu)‐OH、Fmoc‐Met‐OH、Fmoc‐Gln(Trt)‐OH、Fmoc‐Lys(Boc)‐OH、Fmoc‐Ser(tBu)‐OH、Fmoc‐Leu‐OH、Fmoc‐Asp(OtBu)OH、Fmoc‐Ser(tBu)‐OH、Fmoc‐Thr(tBu)‐OH、Fmoc‐Phe‐OH、Fmoc‐Thr(tBu)‐OH、Fmoc‐Gly‐OH、Fmoc‐Glu(OtBu)‐OH、Fmoc‐Gly‐OH、Fmoc‐His(Trt)‐OH、(Boc)2O(采用DIEA，二氯甲烷)。DMF洗涤、甲醇洗涤、二氯甲烷洗涤后干燥得7.8g Exendin‐4(1‐39)‐Orn40(Alloc)‐NH2树脂。
Figure PCTCN2016098844-appb-000089
取1.5g Exendin-4(1-39)-Orn40(Alloc)-NH2树脂，DMF溶胀后加入3eq的Pd(PPh3)4的CHCl3:AcOH:NMM(18:1:0.5)的溶液，反应2h，随后用氯仿洗涤(6次，每次20ml氯仿)，20％HOAc的二氯甲烷溶液洗涤(6次，每次20ml 20％HOAc的二氯甲烷溶液)、二氯甲烷洗涤(6次，每次20ml二氯甲烷)和DMF洗涤(6次，每次20mlDMF)，茚三酮监测阳性，加入5mlDMF,415mg化合物BP103m60，150mg HOAT，150ul DIC,反应4h，茚三酮检测阴性，表明侧链BP103m60已经连接到Exendin-4(1-39)-Orn40-NH2树脂上，树脂的裂解采用82.5％TFA/5％苯酚/5％水/2.5％EDT/5％苯甲硫醚进行，随后用冰的甲基叔丁基醚(MTBE)沉淀、洗涤。产物粗品用HPLC纯化，得到目标化合物41mg。
MS(ESI+,m/e)：4915.61[M+H]+
实施例47 化合物47的制备
参考实施例46的方法制备化合物47。
Figure PCTCN2016098844-appb-000090
最终得到目标肽纯品42mg。
MS(ESI+,m/e)：4711.45[M+H]+
实施例48 化合物48的制备
参考实施例46的方法制备化合物48。
Figure PCTCN2016098844-appb-000091
最终得到目标肽纯品43.4mg。
MS(ESI+,m/e)：5447.91[M+H]+
实施例49 化合物49的制备
参考实施例46的方法制备化合物49。
Figure PCTCN2016098844-appb-000092
最终得到目标肽纯品43mg。
MS(ESI+,m/e)：5147.81[M+H]+
实施例50 化合物50的制备
参考实施例46的方法制备化合物50。
Figure PCTCN2016098844-appb-000093
最终得到目标肽纯品42.8mg。
MS(ESI+,m/e)：5171.68[M+H]+
实施例51 化合物51的制备
Figure PCTCN2016098844-appb-000094
化合物a13的制备
氮气保护下，向1000ml三口瓶中加入200mL吡啶，120g a12(1.0eq)，搅拌降温至0℃，分批加入151.8g TsCl(1.0eq)，搅拌1h，然后缓慢升至室温，继续搅拌3‐4h。反应结束后，将反应液倒入冰的稀盐酸溶液，有固体产生，加乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层用稀盐酸洗一次，饱和碳酸氢钠洗涤，饱和食盐水洗，无水Na2SO4干燥，减压蒸除溶剂，得119g粗品，硅胶柱层析得a13纯品55g。
化合物a14的制备
向1000mL三口瓶中加入55g a13(1.0eq)和160mL DMSO，搅拌均匀，然后加入NaN3 23.52g(2.0eq)，加热至50℃反应3小时，降温至室温，将反应液倒入1.2L水中，用乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，浓缩得a14无色液体29.2g。
化合物a15的制备
向1L氢化反应釜中加入29g化合物a14，甲醇360mL，钯碳5.0g，搅拌，氮气置换，通入氢气反应3‐4h，TLC监控反应完毕后，过滤反应液，将滤液浓缩得到a15的油状物23.5g。
化合物a16的制备
向1L三口瓶中加入23.5g化合物a15(1.0eq)，68.6g(Boc)2O(2.0eq)，甲醇：三乙胺(9：1)的混合溶液500ml，搅拌升温至回流，反应1h，TLC监控反应完毕后，蒸去甲醇三乙胺，加水溶解，二氯甲烷萃取3次，合并有机层水洗一次，无水硫酸钠干燥，蒸除溶剂，干燥，得到固体a16 34.8g。
化合物a17的制备
向1000mL三口瓶中加入34.8g化合物a16(1.0eq)，甲苯和THF各150ml，溴乙酸58.2g(3eq)，搅拌，加热至45～50℃，再加入氢氧化钠33.5g(6eq)，反应过夜，TLC监控反应完毕后，蒸除反应液，加水和乙酸乙酯萃取，水相调节pH为3，水相用二氯甲烷萃取，合并二氯甲烷层，无水硫酸钠干燥后浓缩得a17油状物化合物18g。
化合物a18的制备
向100mL三口瓶中加入286mg N‐羟基琥珀酰亚胺(HOSU)，0.50g a17和5ml二氯甲烷，加入477mg EDC·HCl，室温反应2h，TLC监控反应完毕，用二氯甲烷稀释后用pH＝6.0的50mmol/L的磷酸二氢钾水溶液洗涤2次，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩得油状物0.72g化合物a18。
化合物a19的制备
向100mL烧瓶加入0.62g化合物a07(1.0eq)，10ml水，0.27g NaHCO3(2.0eq)，搅拌，滴加0.66g化合物a18溶于10ml DME(乙二醇二甲醚)的溶液，补加5ml THF，搅拌过夜，TLC监控反应完毕，蒸去有机溶剂，用稀盐酸调节pH＝4，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩，得油状物0.71g化合物a19。
化合物a20的制备
向100mL烧瓶加入0.71g化合物a19，5ml乙酸乙酯溶解后降至0℃，加入5ml HCl/乙酸乙酯(7mol/L)，保温0℃，TLC监控反应完毕后浓缩，得油状物a20 0.71g。
化合物a21的制备
向100mL烧瓶加入640mg化合物a20(1.0eq)，15ml水，190mg NaHCO3(2.0eq)，搅拌，滴加528mg化合物a10溶于15ml DME(乙二醇二甲醚)的溶液，补加15mlTHF，搅拌过夜，TLC监控反应完毕，蒸去有机溶剂，用醋酸调节pH＝6，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩，得油状物a21 0.65g。
Figure PCTCN2016098844-appb-000095
取1.5g Exendin‐4(1‐39)‐Lys40(Alloc)‐NH2树脂，DMF溶胀后加入3eq的Pd(PPh3)4的CHCl3:AcOH:NMM(18:1:0.5)的溶液，反应2h，随后用氯仿洗涤(6次，每次20ml氯仿)，20％HOAc的二氯甲烷溶液洗涤(6次，每次20ml 20％HOAc的二氯甲烷溶液)、二氯甲烷洗涤(6次，每次20ml二氯甲烷)和DMF洗涤(6次，每次20ml DMF)，茚三酮监测阳性，加入5mlDMF,528mg化合物a21，150mg HOAT(1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑)，150ul DIC,反应4h，茚三酮检测阴性，表明侧链a21已经连接到Exendin‐4(1‐39)‐Lys40‐NH2树脂上，树脂的裂解采用82.5％TFA/5％苯酚/5％水/2.5％EDT/5％苯甲硫醚进行，随后用冰的甲基叔丁基醚(MTBE)沉淀、洗涤。产物粗品用HPLC纯化，得到目标化合物48mg。
MS(ESI+,m/e)：5123.50[M+H]+
实施例52 化合物52的制备
参考实施例51的方法制备化合物52
Figure PCTCN2016098844-appb-000096
最终得到目标肽纯品47.5mg。
MS(ESI+,m/e)：5178.76[M+H]+
实施例53 化合物53的制备
参考实施例51的方法制备化合物53
Figure PCTCN2016098844-appb-000097
最终得到目标肽纯品53mg。
MS(ESI+,m/e)：6223.43[M+H]+
实施例54 化合物54的制备
参考实施例51的方法制备化合物54
Figure PCTCN2016098844-appb-000098
最终得到目标肽纯品48.3mg。
MS(ESI+,m/e)：5306.91[M+H]+
实施例55 化合物55的制备
参考实施例51的方法制备化合物55
Figure PCTCN2016098844-appb-000099
最终得到目标肽纯品52.8mg。
MS(ESI+,m/e)：6123.32[M+H]+
实施例56 化合物56的制备
Figure PCTCN2016098844-appb-000100
取1.5g Exendin-4(1-39)-Orn40(Alloc)-NH2树脂，DMF溶胀后加入3eq的Pd(PPh3)4的CHCl3:AcOH:NMM(18:1:0.5)的溶液，反应2h，随后用氯仿洗涤(6次，每次20ml氯仿)，20％HOAc的二氯甲烷溶液洗涤(6次，每次20ml 20％HOAc的二氯甲烷溶液)、二氯甲烷洗涤(6次，每次20ml二氯甲烷)和DMF洗涤(6次，每次20ml DMF)，茚三酮监测阳性，加入5mlDMF,528mg化合物BP103m53，150mg HOAT，150ul DIC,反应4h，茚三酮检测阴性，表明侧链BP103m53已经连接到Exendin-4(1-39)-Orn40-NH2树脂上，树脂的裂解采用82.5％TFA/5％苯酚/5％水/2.5％EDT/5％苯甲硫醚进行，随后用冰的甲基叔丁基醚(MTBE)沉淀、洗涤。产物粗品用HPLC纯化，得到目标化合物47mg。
MS(ESI+,m/e)：5104.72[M+H]+
实施例57 化合物57的制备
参考实施例56的方法制备化合物57。
Figure PCTCN2016098844-appb-000101
最终得到目标肽纯品48mg。
MS(ESI+,m/e)：5164.74[M+H]+
实施例58 化合物58的制备
参考实施例56的方法制备化合物58
Figure PCTCN2016098844-appb-000102
最终得到目标肽纯品51mg。
MS(ESI+,m/e)：6209.41[M+H]+
实施例59 化合物59的制备
参考实施例56的方法制备化合物59。
Figure PCTCN2016098844-appb-000103
最终得到目标肽纯品47.6mg。
MS(ESI+,m/e)：5292.89[M+H]+
实施例60 化合物60的制备
参考实施例56的方法制备化合物60
Figure PCTCN2016098844-appb-000104
最终得到目标肽纯品49.7mg。
MS(ESI+,m/e)：6109.3[M+H]+
实施例61 化合物61的制备
Exendin-4(1-39)-Cys(40)–NH2的制备
目标肽的固相肽合成采用Fmoc法固相合成、利用Fmoc-Rink MBHAAmide 树脂、采用20％的哌啶/DMF脱除Fmoc，偶联试剂采用HOBT/DIC，DMF为反应溶剂，反应监控采用茚三酮检测法，依次将下列保护氨基酸连接到Rink MBHA Amide树脂上：Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、最后脱除Fmoc保护，DMF洗涤、二氯甲烷洗涤、MeOH洗涤后干燥，得到含有全保护的树脂，树脂的裂解采用82.5％TFA/5％苯酚/5％水/2.5％EDT/5％苯甲硫醚，冰的MTBE沉淀、洗涤，粗品经反相HPLC纯化，得Exendin-4(1-39)-Cys(40)–NH2纯品。
Figure PCTCN2016098844-appb-000105
BG02的制备
氮气保护下，向500ml三口瓶中加入200mL吡啶，18.8g BG01(1.0eq)，搅拌降温至0℃，分批加入35.5g TsCl(1.0eq)，搅拌1h，然后缓慢升温至室温，继续搅拌3-4h。反应结束后，将反应液倒入冰的稀盐酸溶液，有固体产生，加乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层用稀盐酸洗一次，饱和碳酸氢钠洗涤，饱和食盐水洗，无水Na2SO4干燥，减压蒸除溶剂，硅胶柱层析得BG02纯品22.7g。
BG03的制备
向500mL三口瓶中加入22.7g BG02(1.0eq)和190mL DMSO，搅拌均匀，然后加入NaN3 11.5g(2.0eq)，加热至50℃反应3小时，降温至室温，将反应液倒入水中，用乙酸乙酯萃取多次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，浓缩得无色液体BG03 17.1g。
BG04的制备
向1L氢化反应釜中加入BG03 30g，甲醇500mL，钯碳8.0g，搅拌，氮气置换，通入氢气反应3-4h，TLC监控反应完毕后，过滤反应液，将滤液浓缩得到BG04的油状物19.4g。
BG05的制备
向500mL三口瓶中加入化合物BG04 3.7g(1.0eq)，(Boc)2O 15.5g(2.0eq)，甲醇：三乙胺(9：1)的混合溶液200ml，搅拌升温至回流，反应1h，TLC监控反应完毕后，蒸去甲醇三乙胺，加水溶解，二氯甲烷萃取3次，合并有机层水洗一次，无水硫酸钠干燥，浓缩得油状物BG05 4.8g。
BG06的制备
向250mL三口瓶中加入BG05化合物3.7g(1.0eq)，甲苯和THF各40ml，溴乙酸7.6g(3.0eq)，搅拌，加热至45～50℃，再加入氢氧化钠4.4g，反应过夜，TLC监控反应完毕后，蒸除反应液，加水和乙酸乙酯萃取杂质，水相调节pH＝3，水相用二氯甲烷萃取，合并二氯甲烷层，无水硫酸钠干燥后浓缩得BG06油状物化合物2.5g。
BG07的制备
向100mL单口瓶中加化合物BG06 2.4g，20ml乙酸乙酯溶解后降至0℃，加入20ml HCl/乙酸乙酯(7mol/L)，TLC监控反应完毕后浓缩，得油状物BG07 2.3g。
BG08的制备
向200mL三口瓶中加入3.5g化合物BG07(1.0eq)，1.7g马来酸酐(1.0eq)70ml醋酸，加热至回流过夜，TLC监控反应完毕，蒸去醋酸，加入乙酸乙酯溶解后用水洗涤3次，饱和氯化钠洗涤3次，无水硫酸钠干燥，柱层析得类白色固体BG08 1.8g。
BG09的制备
向100mL三口瓶中加入1.30g(1.53eq)N-羟基琥珀酰亚胺(HOSU)，3.1g化合物BG08 1.8g和15ml二氯甲烷，加入2.16g EDC·HCl(1.53eq)，室温反应2h，TLC监控反应完毕，用二氯甲烷稀释后用pH＝6.0的50mmol/L的磷酸二氢钾水溶液洗涤2次，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩得类白色2.2g化合物BG09。
BG11的制备
向50mL三口瓶中加入2.17g化合物BG10(1.0eq)，10ml二氯甲烷，10ml叔丁醇，0.40g DIC(1.0eq)，0.39g DMAP(1.0eq)，室温搅拌过夜，TLC监控反应完毕，用乙醚稀释后水洗3次，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，柱层析得泡沫状粉末BG11 0.6g。
BG12的制备
向100mL三口瓶中加入0.95g N-羟基琥珀酰亚胺(HOSU)，3.1g化合物BG11和15ml二氯甲烷，加入1.58gEDC·HCl，室温反应2h，TLC监控反应完毕，用二氯甲烷稀释后用pH＝6.0的50mmol/L的磷酸二氢钾水溶液洗涤2次，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩得白色固体3.3g化合物BG12。
BG14的制备
向200mL烧瓶加入2.8g化合物BG13(1.05eq)，50ml水，1.8g NaHCO3(2.0eq)，搅拌，滴加6.4g化合物BG12(1.0eq)溶于50ml DME(乙二醇二甲醚)的溶液，补加50ml THF，搅拌过夜，TLC监控反应完毕，蒸去有机溶剂，用醋酸调节pH＝4，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩，得6.9g类白色固体化合物BG14。
BG15的制备
向100mL烧瓶加入6.9g化合物BG14，30ml二氯甲烷，30mlTFA，20℃搅拌，TLC监控反应完毕，蒸去有机溶剂，石油醚打浆，抽滤，干燥得5.35g类白色固体BG15。
BG16的制备
向100mL烧瓶加入1.27g化合物BG15(1.0eq)，10ml水，0.36g NaHCO3(2.0eq)，搅拌，滴加0.72g化合物BG09(1.0eq)溶于10ml DME(乙二醇二甲醚)的溶液，补加10ml THF，搅拌过夜，TLC监控反应完毕，蒸去有机溶剂， 用醋酸调节pH＝6，乙酸乙酯萃取，有机相用水洗涤，饱和食盐水洗涤后无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析得0.9g类白色固体化合物BG16。
Figure PCTCN2016098844-appb-000106
取50.0mg Exendin-4(1-39)-Cys(40)–NH2溶解于10ml 20mM的磷酸钠盐缓冲液(pH 6.5)，加入16mg BG16，在20℃条件下搅拌1小时，HPLC监控反应完毕后，用过量的半胱氨酸溶液(0.5ml 0.5M半胱氨酸溶液)终止反应，HPLC制备后冻干，得偶联化合物30mg。
MS(ESI+,m/e)：4926.49[M+H]+。
实施例62 化合物62的制备
参考实施例61的方法制备化合物62
Figure PCTCN2016098844-appb-000107
产物粗品用HPLC纯化，得到目标化合物31mg。
MS(ESI+,m/e)：4918.41[M+H]+。
实施例63 化合物63的制备
参考实施例61的方法制备化合物63
Figure PCTCN2016098844-appb-000108
产物粗品用HPLC纯化，得到目标化合物31mg。
MS(ESI+,m/e)：5046.53[M+H]+。
实施例64 化合物64的制备
参考实施例61的方法制备化合物64
Figure PCTCN2016098844-appb-000109
产物粗品用HPLC纯化，得到目标化合物29mg。
MS(ESI+,m/e)：5022.46[M+H]+。
实施例65 化合物65的制备
参考实施例61的方法制备化合物65
Figure PCTCN2016098844-appb-000110
产物粗品用HPLC纯化，得到目标化合物34mg。
MS(ESI+,m/e)：5222.63[M+H]+。
实施例66 化合物66的制备
参考实施例61的方法制备化合物66
Figure PCTCN2016098844-appb-000111
产物粗品用HPLC纯化，得到目标化合物32mg。
MS(ESI+,m/e)：5126.5[M+H]+。
实施例67 化合物67的制备
Figure PCTCN2016098844-appb-000112
化合物BP103m50的制备
向100mL三口瓶中加入286mg N-羟基琥珀酰亚胺(HOSU)，0.50g BP103a05和5ml二氯甲烷，加入477mg EDC.HCl，室温反应2h，TLC监控反应完毕，用二氯甲烷稀释后用Ph＝6.0的50mmol/L的磷酸二氢钾水溶液洗涤2次，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩得油状物0.72g化合物BP103m50。
化合物BP103m51的制备
向100mL烧瓶加入0.62g化合物BP103g06(1.0eq)，10ml水，0.27g NaHCO3(2.0eq)，搅拌，滴加0.66g化合物BP103m50溶于10ml DME(乙二醇二甲醚)的溶液，补加5ml THF,搅拌过夜，TLC监控反应完毕，蒸去有机溶剂，用稀盐酸调节pH＝4，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩，得油状物0.71g化合物BP103m51。
化合物BP103m52的制备
向100mL烧瓶加入0.71g化合物BP103m51，5ml乙酸乙酯溶解后降至0℃，加入5ml HCl/乙酸乙酯(7mol/L)，保温0℃，TLC监控反应完毕后浓缩，得油状物BP103m52的0.71g。
Figure PCTCN2016098844-appb-000113
化合物BP103n01的制备
向50mL三口瓶中加入1.0g化合物BP103n00(1.0eq)，10ml二氯甲烷，10ml叔丁醇，0.40g DIC(1.0eq)，0.39g DMAP(1.0eq)，室温搅拌过夜，TLC监控反应完毕，用乙醚稀释后水洗3次，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，柱层析得泡沫状粉末BP103n01 0.4g。
化合物BP103n02的制备
向100mL三口瓶中加入0.95g N-羟基琥珀酰亚胺(HOSU)，2.0g化合物BP103n01和15ml二氯甲烷，加入1.58g EDC.HCl，室温反应2h，TLC监控反应完毕，用二氯甲烷稀释后用pH＝6.0的50mmol/L的磷酸二氢钾水溶液洗涤2次，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩得白色固体2.6g化合物BP103n02。化合物BP103m70的制备
向100mL烧瓶加入0.50g化合物H-Glu-OtBu.HCl(1.0eq)，10ml水，350mg NaHCO3(2.0eq)，搅拌，滴加0.96g化合物BP103n02(1.0eq)溶于10ml DME(乙二醇二甲醚)的溶液，补加10mlTHF,搅拌过夜，TLC监控反应完毕，蒸去有机溶剂，用醋酸调节pH＝6，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩，得油状物1.09g化合BP103m70。
化合物BP103m71的制备
向100mL三口瓶中加入1.0g化合物BP103m70,317mg N-羟基琥珀酰亚胺(HOSU)(1.53eq)，和10ml二氯甲烷，加入528mg EDC.HCl(1.53eq)，室温反应2h，TLC监控反应完毕，用二氯甲烷稀释后用pH＝6.0的50mmol/L的磷酸二氢钾水溶液洗涤2次，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩得白色固体1.07g化合物BP103m71。
化合物BP103m72的制备
向100mL烧瓶加入0.87g化合物BP103m52(1.0eq)，10ml水，300mg NaHCO3(2.0eq)，搅拌，滴加1.00g化合物BP103m71(1.0eq)溶于10ml DME(乙二醇二甲醚)的溶液，补加10mlTHF，搅拌过夜，TLC监控反应完毕，蒸去有机溶剂，用醋酸调节pH＝6，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩，得油状物1.22g化合BP103m72。
Figure PCTCN2016098844-appb-000114
目标肽的合成
取1.5g Exendin-4(1-39)-Lys40(Alloc)-NH2树脂，DMF溶胀后加入3eq的Pd(PPh3)4的CHCl3:AcOH:NMM(18:1:0.5)的溶液，反应2h，随后用氯仿洗涤(6次，每次20ml氯仿)，20％HOAc的DCM(二氯甲烷)溶液洗涤(6次，每次20ml 20％HOAc的DCM溶液)、DCM洗涤(6次，每次20ml DCM)和DMF洗涤(6次，每次20ml DMF)，茚三酮监测阳性，加入5mlDMF，640mg化合物BP103m72，150mg HOAT，150ul DIC,反应4h，茚三酮检测阴性，表明侧链BP103m72已经连接到Exendin-4(1-39)-Lys40-NH2树脂上，树脂的裂解采用82.5％TFA/5％苯酚/5％水/2.5％EDT/5％苯甲硫醚进行，随后用冰的甲基叔丁基醚(MTBE)沉淀、洗涤。产物粗品用经HPLC纯化、冻干，得目标化合物48mg。
MS(ESI+,m/e)：5252.54[M+H]+。

Claims (10)

  1. 一种艾塞那肽修饰物或其可药用盐，如式(Ⅰ)所示：
    (Ex‐4)‐L‐Y  (Ⅰ)
    其中，Ex‐4为Exendin‐4；L为亲水性的连接臂，连接Ex‐4与Y；Y为末端带羧基的脂肪链。
  2. 如权利要求1所述的艾塞那肽修饰物或其可药用盐，L为
    Figure PCTCN2016098844-appb-100001
    L’为亲水性的连接臂。
  3. 如权利要求2所述的艾塞那肽修饰物或其可药用盐，L’为含醚基的亲水链。
  4. 如权利要求3所述的艾塞那肽修饰物或其可药用盐，L选自：
    Figure PCTCN2016098844-appb-100002
    Figure PCTCN2016098844-appb-100003
    其中，m为2‐20之间的任一整数；n为2‐20之间的任一整数；r为1‐6之间的任一整数。
  5. 如权利要求2或3所述的艾塞那肽修饰物或其可药用盐，其为：
    Figure PCTCN2016098844-appb-100004
    k为6-20之间的任一整数。
  6. 如权利要求5所述的艾塞那肽修饰物或其可药用盐，其为：
    Figure PCTCN2016098844-appb-100005
    Figure PCTCN2016098844-appb-100006
    其中，m为2‐20之间的任一整数；n为2‐20之间的任一整数；r为1‐6之间的任一整数；k为6‐20之间的任一整数。
  7. 如权利要求6所述的艾塞那肽修饰物或其可药用盐，包含以下化合物：
    Figure PCTCN2016098844-appb-100007
    Figure PCTCN2016098844-appb-100008
  8. 如权利要求1‐4任一所述的艾塞那肽修饰物或其可药用盐的用途，其为：在制备作为GLP‐1受体激动剂的药物中的用途；在制备用于预防和/或治疗与GLP‐1受体活性低下相关的疾病和/或症状的药物中的用途；在制备用于糖代谢相关的疾病和/或症状的药物中的用途；在制备用于糖尿病的药物中的用途；在制备用于脂肪肝的药物中的用途；在制备用于减肥的药物中的用途。
  9. 一种药物组合物，其包括如权利要求1‐4任一所述的艾塞那肽修饰物或其可药用盐以及任选的药学可接受的载体。
  10. 如权利要求9所述的组合物的用途，其为：在制备作为GLP‐1受体激动剂的药物中的用途；在制备用于预防和/或治疗与GLP‐1受体活性低下相关的疾病和/或症状的药物中的用途；在制备用于糖代谢相关的疾病和/或症状的药物中的用途；在制备用于糖尿病的药物中的用途；在制备用于脂肪肝的药物中的用途；在制备用于减肥的药物中的用途。
PCT/CN2016/098844 2015-09-25 2016-09-13 艾塞那肽修饰物及其用途 WO2017050157A1 (zh)

Priority Applications (14)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DK16848039.0T DK3321279T3 (da) 2015-09-25 2016-09-13 Exenatidmodificeringsmiddel og anvendelse deraf
JP2018506893A JP6647387B2 (ja) 2015-09-25 2016-09-13 エキセナチド修飾物及びその用途
AU2016328015A AU2016328015B9 (en) 2015-09-25 2016-09-13 Exenatide modifier and use thereof
EP16848039.0A EP3321279B1 (en) 2015-09-25 2016-09-13 Exenatide modifier and use thereof
CA2995613A CA2995613C (en) 2015-09-25 2016-09-13 Exenatide modifier and use thereof
RS20200228A RS60053B1 (sr) 2015-09-25 2016-09-13 Modifikator eksenatida i njegova primena
KR1020187005100A KR102005294B1 (ko) 2015-09-25 2016-09-13 엑세나타이드 수식물 및 그 용도
LTEP16848039.0T LT3321279T (lt) 2015-09-25 2016-09-13 Eksenatido modifikatorius ir jo panaudojimas
US15/752,838 US11179467B2 (en) 2015-09-25 2016-09-13 Exenatide modifier and use thereof
SI201630653T SI3321279T1 (sl) 2015-09-25 2016-09-13 Modifikator eksenatida in njegova uporaba
ES16848039T ES2775185T3 (es) 2015-09-25 2016-09-13 Modificador de exenatida y uso del mismo
PL16848039T PL3321279T3 (pl) 2015-09-25 2016-09-13 Modyfikator eksenatydu i jego zastosowanie
HRP20200332TT HRP20200332T1 (hr) 2015-09-25 2020-02-27 Modifikator eksenatida i njegova primjena
CY20201100184T CY1122760T1 (el) 2015-09-25 2020-02-28 Τροποποιητης εξενατιδης και χρηση αυτου

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510619012.7 2015-09-25
CN201510619012.7A CN106554403B (zh) 2015-09-25 2015-09-25 艾塞那肽修饰物及其用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2017050157A1 true WO2017050157A1 (zh) 2017-03-30

Family

ID=58385848

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/CN2016/098844 WO2017050157A1 (zh) 2015-09-25 2016-09-13 艾塞那肽修饰物及其用途

Country Status (18)

Country Link
US (1) US11179467B2 (zh)
EP (1) EP3321279B1 (zh)
JP (1) JP6647387B2 (zh)
KR (1) KR102005294B1 (zh)
CN (1) CN106554403B (zh)
AU (1) AU2016328015B9 (zh)
CA (1) CA2995613C (zh)
CY (1) CY1122760T1 (zh)
DK (1) DK3321279T3 (zh)
ES (1) ES2775185T3 (zh)
HR (1) HRP20200332T1 (zh)
HU (1) HUE048411T2 (zh)
LT (1) LT3321279T (zh)
PL (1) PL3321279T3 (zh)
PT (1) PT3321279T (zh)
RS (1) RS60053B1 (zh)
SI (1) SI3321279T1 (zh)
WO (1) WO2017050157A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111333714A (zh) * 2020-03-05 2020-06-26 成都奥达生物科技有限公司 一种长效glp-1化合物
CN112939771A (zh) * 2021-01-28 2021-06-11 宁夏蓝博思化学技术有限公司 长链烷基二酸单叔丁酯的制备方法
AU2022245736A1 (en) * 2021-03-25 2023-10-12 Brightgene Bio-Medical Technology Co., Ltd. Gip and glp-1 dual receptor agonist, pharmaceutical composition, and use
WO2024061310A1 (zh) * 2022-09-23 2024-03-28 博瑞生物医药（苏州）股份有限公司 一种glp-1和gip双受体激动剂药物组合物及其用途

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100184641A1 (en) * 2003-09-19 2010-07-22 Novo Nordisk A/S Novel Plasma Protein Affinity Tags
CN101980725A (zh) * 2008-02-01 2011-02-23 阿森迪斯药物股份有限公司 包含可自裂解的连接体的前药
CN103237561A (zh) * 2010-09-17 2013-08-07 赛诺菲-安万特德国有限公司 包含毒蜥外泌肽连接物缀合物的前药

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1056775B1 (en) 1998-02-27 2010-04-28 Novo Nordisk A/S Glp-1 derivatives of glp-1 and exendin with protracted profile of action
DE122007000001I1 (de) 1999-01-14 2007-06-28 Amylin Pharmaceuticals Inc Neue exendin agonist Formulierungen und deren Verabreichung
WO2006097538A1 (en) * 2005-03-18 2006-09-21 Novo Nordisk A/S Extended glp-1 compounds
TWI372629B (en) * 2005-03-18 2012-09-21 Novo Nordisk As Acylated glp-1 compounds
CN101125207B (zh) 2006-11-14 2012-09-05 上海华谊生物技术有限公司 带有聚乙二醇基团的艾塞丁或其类似物及其制剂和用途
CN101215324B (zh) 2007-12-26 2010-11-24 吉林大学 艾塞那肽短肽模拟肽及其在制备糖尿病治疗药物中的应用
US20110171164A1 (en) * 2008-09-19 2011-07-14 Nektar Therapeutics Polymer conjugates of glp-2-like peptides
CN101870728A (zh) 2009-04-23 2010-10-27 派格生物医药(苏州)有限公司 新型Exendin变体及其缀合物
CN102397558B (zh) 2010-09-09 2013-08-14 中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所 Exendin-4类似物的定位聚乙二醇化修饰物及其用途
US20140256626A1 (en) 2011-10-18 2014-09-11 Prolynx Llc Peg conjugates of exenatide
CN102532303A (zh) 2011-12-22 2012-07-04 江苏弘和药物研发有限公司 聚乙二醇缀合的艾塞那肽的合成及应用
CN102827270A (zh) 2012-09-13 2012-12-19 无锡和邦生物科技有限公司 一种聚乙二醇化艾塞那肽衍生物及其用途
CN103405753B (zh) * 2013-08-13 2016-05-11 上海仁会生物制药股份有限公司 稳定的促胰岛素分泌肽水针药物组合物
KR101768446B1 (ko) * 2014-03-21 2017-08-17 애니젠 주식회사 신규한 엑세나타이드 유사체 및 그의 용도

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100184641A1 (en) * 2003-09-19 2010-07-22 Novo Nordisk A/S Novel Plasma Protein Affinity Tags
CN101980725A (zh) * 2008-02-01 2011-02-23 阿森迪斯药物股份有限公司 包含可自裂解的连接体的前药
CN103237561A (zh) * 2010-09-17 2013-08-07 赛诺菲-安万特德国有限公司 包含毒蜥外泌肽连接物缀合物的前药

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP3321279A4 *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2016328015B2 (en) 2018-10-25
AU2016328015A9 (en) 2018-11-01
CA2995613A1 (en) 2017-03-30
SI3321279T1 (sl) 2020-07-31
EP3321279A4 (en) 2018-05-16
PL3321279T3 (pl) 2020-10-19
CN106554403B (zh) 2021-08-31
ES2775185T3 (es) 2020-07-24
US11179467B2 (en) 2021-11-23
EP3321279A1 (en) 2018-05-16
JP2018531217A (ja) 2018-10-25
AU2016328015B9 (en) 2018-12-06
EP3321279B1 (en) 2020-02-12
LT3321279T (lt) 2020-04-10
KR20180031740A (ko) 2018-03-28
JP6647387B2 (ja) 2020-02-14
CA2995613C (en) 2021-07-20
RS60053B1 (sr) 2020-04-30
DK3321279T3 (da) 2020-03-09
US20200101162A1 (en) 2020-04-02
HRP20200332T1 (hr) 2020-06-12
KR102005294B1 (ko) 2019-07-30
CN106554403A (zh) 2017-04-05
HUE048411T2 (hu) 2020-07-28
PT3321279T (pt) 2020-03-05
AU2016328015A1 (en) 2018-03-01
CY1122760T1 (el) 2021-03-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2505207B1 (en) Modified exendins and uses thereof
RU2383553C2 (ru) Пептиды, обладающие агонистической активностью в отношении рецептора нейропептида-2-(y2r)
WO2022111370A1 (zh) 一类glp-1/胰高血糖素受体双重激动剂及其应用
US8268784B2 (en) Neuropeptide-2 receptor (Y-2R) agonists and uses thereof
TW200306202A (en) Extended glucagon-like peptide-1 analogs
US20230220033A1 (en) Glp-1 agonist polypeptide compound and salt thereof, synthesis method therefor and use thereof
WO2017050157A1 (zh) 艾塞那肽修饰物及其用途
CN116712530B (zh) 一类长效GLP-1/glucagon/GIP受体三重激动剂及其应用
KR100997835B1 (ko) 엑센딘 4 폴리펩타이드 단편
JP2018531217A6 (ja) エキセナチド修飾物及びその用途
CN106554404B (zh) 艾塞那肽修饰物及其用途
KR20230008846A (ko) 이중 수용체 아고니즘 작용을 갖는 폴리펩티드 유도체 및 그 용도
WO2015149627A1 (zh) 结构修饰的glp-1类似物及其制备方法
CN115785249B (zh) 一类glp-1类似物及其应用
KR20230106481A (ko) 지속형 지방산-펩타이드 유도체 및 이의 용도
CN117417431A (zh) 一类对glp-1、胰高血糖素和gip受体具有激动活性的多肽及其应用
CN117624333A (zh) 一类GLP-1受体、glucagon受体和GIP受体三激动多肽化合物及其应用
MX2008007186A (en) Neuropeptide-2 receptor-agonists

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 16848039

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2018506893

Country of ref document: JP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2995613

Country of ref document: CA

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20187005100

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2016328015

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20160913

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE