KR100997835B1

KR100997835B1 - 엑센딘 4 폴리펩타이드 단편

Info

Publication number: KR100997835B1
Application number: KR1020060053009A
Authority: KR
Inventors: 시아오펭 마; 빙 왕; 샤오퀴 자이
Original assignee: 창조우 파마슈티컬 팩토리; 샤오퀴 자이; 빙 왕; 시아오펭 마
Priority date: 2005-06-29
Filing date: 2006-06-13
Publication date: 2010-12-01
Also published as: CN1724563A; US20070037747A1; EP1908778A4; CN100429227C; JP2008546816A; WO2007000118A1; US7608587B2; EP1908778A1; KR20070001798A; AU2006264162A1; CA2613903A1; BRPI0613849A2

Abstract

본 발명은 혈당강하 활성을 가지며 II형 당뇨병의 치료에 사용될 수 있는 엑센딘(Exendin) 4 폴리펩타이드 단편에 관한 것이다. 본원에 기술된 폴리펩타이드 서열은 하기 화학식 1로 표시된다:

HGEGTX₁TSDLSKQX₂EEEAVX₃LFIEWLKNGX₄PX₅

상기 식에서, X₁은 Phe 또는 Tyr을 나타내고, X₂는 Met, Ile 또는 Leu를 나타내고, X₃은 Lys를 나타내고, X₄는 Gly 또는 결실을 나타내고, X₅는 Arg 또는 결실을 나타낸다. 부가적으로, 본 발명은 엑센딘 4 폴리펩타이드 단편의 제조방법에 관한 것이다.

엑센딘 4 폴리펩타이드, II형 당뇨병

Description

엑센딘 4 폴리펩타이드 단편{EXENDIN 4 POLYPEPTIDE FRAGMENT}

도 1은 유전공학방법을 사용하는 엑센딘 4 폴리펩타이드 단편의 제조방법을 보여주는 흐름도이다.

도 2는 엑센딘 4 폴리펩타이드 단편과 엑센딘 4에 대하여 지속되는 혈당강하 활성을 비교한 도면이다.

도 3은 db/db II형 당뇨병 쥐에 대한 엑센딘 4 폴리펩타이드 단편의 혈당강하 활성을 보여주는 도면이다.

도 4는 고토-고키자키(Goto-Kokizaki) II형 당뇨병 생쥐에 대한 엑센딘 4 폴리펩타이드 단편의 식후 혈당강하 활성을 보여주는 도면이다. 곡선 1은 대조군을 나타낸다. 곡선 2는 투여군을 나타낸다.

도 5는 알록산(alloxan)-유도 당뇨병 쥐에 대한 엑센딘 4 폴리펩타이드 단편의 혈당강하 활성을 보여주는 도면이다.

도 6은 엑센딘 4 폴리펩타이드 단편에 의해 자극된 인슐린 분비량을 보여주는 도면이다. 곡선 1은 투여군을 나타낸다. 곡선 2는 블랭크 대조군을 나타낸다.

본 발명은 혈당강하 활성을 가지며 II형 당뇨병의 치료에 사용될 수 있는 절단된(truncated) 엑센딘 4 폴리펩타이드 단편에 관한 것이다.

현대적 음식 섭취 구조 및 삶의 형태로 인해, 당뇨병 환자 수는 매년 전 세계적으로 증가하고 있다. 현재, 중국에는 5천만명의 환자, 인도에는 6천만명의 환자, 미국에는 180만명의 환자 및 일본에는 6백만명의 환자가 각각 존재한다.

당뇨병은 인슐린 의존형 당뇨병(I형 당뇨병) 및 인슐린 비-의존성 당뇨병(II형 당뇨병)으로 크게 2가지 유형으로 분류된다. II형 당뇨병을 앓는 환자들은 상기 질병을 앓는 환자들의 90% 이상을 차지한다. II형 당뇨병을 앓는 환자들은 식후 불충분한 인슐린 분비, 인슐린 분비 시간의 지연, 높은 혈당량 등과 같은 다양한 증상을 나타낸다. 비만의 II형 당뇨병 환자의 말초 인슐린 수용체에서는 인슐린에 대한 민감도의 감소가 나타나며, 이로 인해 높은 혈중 인슐린 수준 및 8% 이상의 높은 헤모글로빈(HbA1c) 수준(비당뇨인의 인슐린 범위는 4 내지 6%임)과 함께 혈당량이 증가한다. 그 결과, 심장질환, 신부전증 등과 같은 당뇨합병증이 나타난다. 그러므로, II형 당뇨병을 효과적으로 치료하기 위한 해결책은 혈당량을 감소시키는 것이다.

오늘날, 당뇨병을 치료하기 위해 사용되는 약제는 6개의 큰 범주로 분류되는데, 이들 범주로는 설포닐우레아류 및 메글리티나이드류(Meglitinides)와 같은 인슐린 분비촉진제(secretagogue); 및 인슐린, α-글루코시다제 억제제, 바이구아니드류(biguanides) 및 티아졸린디온류(thiazolinediones)와 같은 인슐린 비-분비촉 진제를 들 수 있다. 그러나, UK Prospective Diabetes Study(UKPDS)에 의한 6년 동안 수 천명의 II형 당뇨병 환자에 대한 추적 연구보고서에 나타나 있는 바와 같이, 상술한 6개 부류의 약제 중 어떠한 것도 II형 당뇨병 환자에 대해 효과적이지 않았다. 이들 약제는 췌장 β-세포가 계속해서 퇴화되는 것을 억제하지 못했으며, 또한 HbA1c 수준을 증가시키지도, 심장 질환 및 신부전증과 같은 당뇨합병증을 예방하지도 못했다. 따라서, II형 당뇨병 치료를 위한 신규한 약제의 개발이 필수적이다.

1995년에는 엑센딘 4에 대한 미국 특허(제 5424286 호)가 허여되었다. 엑센딘 4는 미국 남서부 지역에서 자생하는 길러몬스터(Gila monster, 학명 Helode suspectum)의 타액으로부터 분리되었다. 39개 아미노산으로 된 이러한 폴리펩타이드는 아미노산 서열 수준에서 글루카곤-유사 펩타이드 1(GLP-1)과 40%의 상동성을 나타낸다.

GLP-1과 유사체인 엑센딘 4는 GLP-1 수용체와 결합하는 것으로 보고되어 있다. 엑센딘 4는 프로인슐린(proinsulin)의 합성 및 인슐린의 분비를 자극하여, 혈당량을 감소시킨다. 엑센딘 4는 혈당이 정상 수준으로 되돌아갈 때까지 계속해서 작용한다. 엑센딘 4는 저혈당증으로 인한 마비 및 쇼크를 피할 수 있기 때문에 안전하고 효과적이다. 상기 엑센딘 4는 HbA1c 수준을 감소시키고 β-세포의 양을 증가시키며, II형 당뇨병을 앓는 환자들에서 인슐린 수용체의 민감도를 향상시키고, 글루카곤 등의 분비를 억제한다. 바이에타(Byetta)로 지칭되는 상업적으로 이용가능한 엑센딘 4은 2005년 4월에 FDA에 의해 판매가 허용되었다(문헌[Diabetes (1997) 46 433-439]; 문헌[Ibid (1995) 44 1249-1258]; 문헌[Ibid (2002) 51 2796-2803]; 문헌[Ibid (1994) 53 2397-2403]; 문헌[Diabetes Care (2002) 25 330-336]; 문헌[Ibid (2000) 23 64-69]; 문헌[Ibid (2004) 2 2623-2635]; 문헌[JAMA (2002) 287 373-379]; 문헌[N. Engl. J. Med. (2002) 346 393-436]; 문헌[Lanced (1998) 352 837-853]; 문헌[Diabetes Endocrinology (2005) 146 (4) 2069-2070]; 및 문헌[J. Clin. Endocrinology Metab (2004) 89 3469-3473] 참조)

더욱 효과적이며 제조하기 용이하고, 엑센딘 4 대체물을 더 많이 제공하여주는 엑센딘 4 변형체를 더 얻기 위하여 많은 연구자들이 상기 엑센딘 4 폴리펩타이드를 변형하려는 노력을 기울였다. 중국 특허출원 제 CN1227567A 호에는 절단된 엑센딘 4 폴리펩타이드가 공지되어 있으며, 여기서 상기 폴리펩타이드는 C-말단에 Arg 또는 Tyr를 갖는 30개의 아미노산 잔기로 이루어져 있다. 미국 소재의 릴리(Lilly)사는 장기간 동안 당뇨병을 안전하게 치료할 수 있는 일련의 GLP-1 유사체를 개발하였다 (국제 공개공보 제 WO 02/047716 A 호 참조). 그러나, 상기 유사체들은 시험관내에서 GLP-1 수용체와 결합하는 능력, 섬 세포 종양(islet cell tumor)의 인슐린 분비량 및 고리형 AMP(cAMP)의 생산량 측면에서만 측정되었기 때문에 상술한 이러한 예들은 매우 제한적이다(문헌[J. Biol. Chem (1997) 272 21201-21206]; 문헌[Regulatory Peptides (2003) 114 153-158]; [Trend in Pharmacological Sci. (2003) 24 377-383]; 및 국제 공개공보 제 WO 03/011892 A 호 참조).

현존하는 기법의 단점을 극복하기 위해, 본 발명자들은 C-말단에 프롤린을 갖는 신규한 C-말단 절단형 엑센딘 4 폴리펩타이드 단편을 얻기 위해 노력하였다. 이러한 구조를 갖는 상기 폴리펩타이드는 펩타이드 사슬이 약 1/4 정도 더 짧고, 생산이 촉진되면서도 당뇨병 치료에 대한 새로운 대안점을 제공하는 것으로 주목할만 하다. 또한, 상기 절단형 엑센딘 4는 카르복시펩티다제(carboxypeptidase)에 대하여 효과적으로 버틸 수 있으며, 보다 오랫동안 혈당강하 활성을 유지할 수 있다.

일 양태에서, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 서열을 갖는 엑센딘 4 폴리펩타이드 단편, 및 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 에스테르를 제공한다:

<화학식 1>

HGEGTX₁TSDLSKQX₂EEEAVX₃LFIEWLKNGX₄PX₅

상기 식에서,

X₁은 Phe 또는 Tyr을 나타내고,

X₂는 Met, Ile 또는 Leu를 나타내고,

X₃은 Lys를 나타내고,

X₄는 Gly을 나타내고,

X₅는 Arg 또는 결실을 나타낸다.

상기 화학식 1에서, 상기 엑센딘 4 폴리펩타이드 단편의 6번째 부위에서의 아미노산 잔기(X₁)는 Tyr인 것이 바람직하다. 약물동력학 연구에 있어서, 분자중의 Phe는 Tyr에 의해 치환되어 ¹²⁵I 표지화를 용이하게 한다.

상기 화학식 1에서, 상기 엑센딘 4 폴리펩타이드 단편의 14번째 부위에서의 아미노산 잔기(X₂)는 Met, Ile 또는 Leu와 치환되며, Met가 바람직하다.

상기 화학식 1에서, 상기 엑센딘 4 폴리펩타이드 단편의 30번째 부위에서의 아미노산 잔기(X₄)는 결실이 바람직하다.

상기 폴리펩타이드 단편은 X₁이 Tyr이고, X₂가 Met이고, X₃이 Lys이며, X₄가 결실이고, X₅가 Arg 또는 결실인 것이 바람직하다.

본 발명에서, "제공된 엑센딘 4 폴리펩타이드 단편"이란 용어는 그 서열이 화학식 1에 나타나 있는 상기 절단형 엑센딘 4 폴리펩타이드를 지칭한다. 본 발명에서, 이러한 폴리펩타이드는 간단하게 "E₄(f)", "폴리펩타이드 단편" 또는 "제공된 폴리펩타이드"로 명명된다.

화학식 1로 표시되는 상기 폴리펩타이드 단편에서, 상기 N-말단 아미노기, 상기 C-말단 카르복실기 및 상기 아미노산 측쇄기는 변형되지 않거나, 상기 "약학적으로 허용가능한 에스테르"를 형성하는 것과 같은 본 발명의 폴리펩타이드의 활성에 근본적으로 영향을 미치지 않는 범위에서 변형된다. 상기 아미노산 측쇄기의 변형으로는 리신의 ε-아미노기의 아실화, 및 아르기닌, 히스티딘 또는 리신의 N-알킬의 탈아실화를 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 상기 N-말단 아미노기의 변형으로는 N-단쇄 알킬, N-단쇄 디알킬 및 N-아실의 탈아민화 및 변형을 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 상기 C-말단 카르복실기의 변형으로는 아미드, 단쇄 알킬아미드, 디알킬아미드 및 단쇄 알킬에스테르를 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는, 상기 말단기들은 아세틸, 트리플루오로아세틸, N-(9-플루오레닐)메톡시카보닐(Fmoc), t-부톡시카보닐(Boc), 알릴옥시카보닐(Alloc), C_1-6 알킬, C_2-8 알케닐, C_7-9 아르알킬 등과 같은 당해 기술분야의 숙련자에게 공지된 보호기에 의해 보호된다. 바람직하게는, 본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 폴리펩타이드 단편에서, 상기 N-말단 아미노기, 상기 C-말단 카르복실기 및 상기 아미노산 측쇄기는 변형되지 않는데, 즉 N-말단기는 N-말단에서 여전히 His의 α-아미노기(-NH₂)이고, C-말단기는 C-말단에서 여전히 Pro의 카르복실기(-COOH)이다. 또한, 바람직하게는 상기 Pro의 C-말단 카르복실기는 아미드화, 즉 -CO NH₂로 된다.

본 발명에서, 상기 폴리펩타이드, 아미노산들 및 화학기들의 명명법은 당해 기술분야에서 널리 인지된다. 상기 아미노산의 약어들은 하기 표 1에 나열되어 있다. 본 발명에서, 상기 아미노산들은 일반적으로 특별히 한정하지 않는다면 L-아미노산을 지칭한다.

아미노산 및 이의 약어
아미노산	3-문자 코드	1-문자 코드	아미노산	3-문자 코드	1-문자 코드
알라닌	Ala	A	류신	Leu	L
아르기닌	Arg	R	리신	Lys	K
아스파라긴	Asn	N	메티오닌	Met	M
아스파르트산	Asp	D	페닐알라닌	Phe	F
시스테인	Cys	C	프롤린	Pro	P
글루타민	Gln	Q	세린	Ser	S
글루탐산	Glu	E	트레오닌	Thr	T
글리신	Gly	G	트립토판	Trp	W
히스티딘	His	H	티로신	Tyr	Y
이소류신	Ile	I	발린	Val	V

"약학적으로 허용가능한 염"이란 용어는 폴리펩타이드와 결합하는 저분자의 산성 또는 염기성 화합물의 염을 지칭한다. 상기 형성된 염은 일반적으로 폴리펩타이드의 용해성을 향상시키지만 폴리펩타이드의 활성에는 근본적으로 영향을 미치지 않는다. 예를 들어, 상기 산은 염산, 인산, 황산, 아세트산, 숙신산, 말산, 시트르산 등을 포함하며, 이들은 본 발명에서 일반적으로 상기 폴리펩타이드와 염을 형성할 수 있다. 상기 염기는 알칼리금속 또는 알칼리토금속의 수산화물, 암모니아, 탄산염을 포함하며, 이들은 본 발명에서 일반적으로 폴리펩타이드와 염을 형성할 수 있다.

본 발명에서 폴리펩타이드의 혈당강하수준의 효과는 세포생물학의 실험, 동물 실험 등과 같은 당해 기술분야의 통상적인 방법으로 증명된다. 본 발명의 실시예에서, 시험관내에서의 상기 실험들의 한계점을 극복하기 위해서 혈당강하 수준의 효과를 측정하기 위한 당뇨병 동물 모델, 예를 들어 db/db II형 당뇨병 쥐, 고토-고키자키 II형 생쥐, 당뇨병 KK 쥐, 알록산(alloxan)-유도 당뇨병 쥐를 이용하는 것이 바람직하다. 이들 동물 실험 결과, 본 발명의 화학식 1로 표시되는 상기 엑센딘 4 폴리펩타이드 단편은 생체내에서 혈당강하 활성을 계속적으로 유지하는 효과를 가지며, 당뇨병 치료에 사용될 수 있는 것으로 나타났다.

그러므로, 다른 양태에서 본 발명은 당뇨병 치료, 특히 II형 당뇨병 치료에 사용될 수 있는 화학식 1로 표시되는 상기 엑센딘 4 폴리펩타이드 단편의 약학 조성물을 제공한다. 상기 약학 조성물은 본 발명의 하나 또는 여러 종류의 엑센딘 4 폴리펩타이드 단편들, 바람직하게는 오직 하나의 엑센딘 4 폴리펩타이드 단편을 포함한다. 이러한 약학 조성물은 하나 또는 여러 종류의 약학적으로 허용가능한 희석제, 부형제 또는 담체를 포함한다. 바람직하게는, 이러한 약학 조성물은 정제, 박피(pellicle), 환제, 캡슐제(서방형을 포함함), 분말제, 과립제, 팅크제(tincture), 시럽, 유제, 멸균 주사용액 또는 현탁제, 에어로졸 또는 액체 스프레이, 점적약(drops), 주사액, 자동 주사장치들 및 좌제와 같은 약학적 단위 투여형태로 제공된다. 일 실시예에서, 정제 또는 캡슐제로서 경구 투여되는 상술한 활성 성분은 에탄올, 글리세롤 또는 물과 같은 약학적으로 허용가능하고 비-독성인 불활성 담체 한 물질과 함께 또는 이들의 조합과 함께 투여될 수 있다. 국제공개공보 제 WO 2004/035754 A 호 및 제 WO 2004/036186 A 호의 이전 특허들은 엑센딘 4 폴리펩타이드 단편의 조절 방출 형태(controlled release dosage form)에 적용할 수 있는 투여 형태를 각각 개시하고 있는데, 바람직하게는 본 발명에서 화학식 1로 표시되는 활성 폴리펩타이드에 대해 이러한 투여 형태가 권장된다(상기 공개공보 제 WO 2004/035754 A 호 및 제 WO 2004/036186 A 호 둘 모두의 개시내용은 본원에서 전체가 참고로 인용됨).

본 발명은 또한 당뇨병 치료용 약제의 제조, 바람직하게는 II형 당뇨병 치료에 사용되는 상기 약제의 제조에 있어서 상술한 화합물들 및 약학 조성물들의 용도를 제공한다. 본 발명의 약학 조성물들은 경구 투여, 직장 투여, 설하선(sublingual) 투여, 폐 약제 투여, 경피 약제 투여, 이온영동법(iontophoresis), 질내 투여 및 비강내 투여와 같은 당해 기술분야의 숙련자들에게 널리 공지된 약제 투여 방식에 의해 투여된다. 바람직하게는, 본 발명의 상기 약학 조성물은 피하 투여, 근육내 투여 및 정맥내 투여와 같은 비경구 주사에 의해 투여된다. 본 발명의 상기 약제는 인슐린을 정상 수준으로 조정할 수 있어, 결과적으로 혈당을 정상 수준으로 지속적으로 유지할 수 있다. 상기 투여량은 투여형태, 예상되는 효과기간 및 치료 대상에 의해 변경될 수 있다. 상기 임상 투여량은 편의상 실제 상황(예를 들어, 환자의 질병상태, 체중 등)에 따라 주치의에 의해 결정될 수 있다. 정상 성인에 있어서, 1일 투여량의 범위는 0.1 내지 100㎍, 바람직하게는 1 내지 20㎍, 또는 바람직하게는 5 내지 10㎍이다. 상기 투여량은 상업적으로 이용가능한 엑센딘 4 폴리펩타이드 약제의 상기 투여량을 참고하여 결정될 수도 있다.

또한, 본 발명은 폴리펩타이드의 화학 합성법을 제공한다. 상기 폴리펩타이드의 화학 합성법은 당해 기술분야의 숙련자에게 자명한 것이다. 문헌[Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Ed by J.M. Steward and J.D. Young, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois (1984)] 및 [Hormonal Proteins and Peptides by J. Meienhofer, Volume II, Academic Press, New York (1973)]을 참고하여 상기 폴리펩타이드의 고상 합성방법과 같은 상기 참고문헌의 방법에 따라 상세한 반응식을 수행할 수 있다. 문헌[The Peptides by E. Schroder 및 K. Lubke, Volume I, Academic Press, New York (1965)]을 참고하여 상기 펩타이드의 액상 합성방법을 수행할 수 있다. 상기 참고문헌 모두의 개시내용은 본원에서 전체가 참고로 인용된다. 일 실시예에서, 본 발명은 바람직하게는 폴리펩타이드의 고상 합성방법을 이용한다.

다른 양태에서, 본 발명은 하기 화학식 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 제공한다:

HGEGTX₁TSDLSKQX₂EEEAVX₃LFIEWLKNGPX₄

상기 식에서,

X₁은 Phe 또는 Tyr을 나타내고,

X₂는 Met, Ile 또는 Leu를 나타내고,

X₃은 Lys를 나타내고,

X₄는 Arg 또는 결실을 나타낸다.

E₄(f) 폴리펩타이드 단편을 암호화하는 상기 유전자는 E. coli에서의 코돈 사용법(codon usage bias)에 따라 설계된다. 예를 들어, 본 발명의 상기 폴리펩타이드의 핵산 서열이 E. coli에서 발현되는 경우, 발현 생성물은 바람직하게는 E. coli에서의 코돈 사용법에 의해 최적화된다.

또한, 본 발명은 상술한 폴리펩타이드를 생산하는 유전공학방법을 제공한다. 이러한 방법으로는 a) 본 발명의 상기 폴리펩타이드를 발현하는 숙주세포의 발효, 및 b) 상기 발현 생성물의 추출 및 정제를 들 수 있다. 이러한 방법은 상기 발현 생성물의 절단(cleavage) 과정을 추가로 포함한다. 중간 크기의 분자량(20 내지 60개의 아미노산 잔기)을 갖는 폴리펩타이드의 발현량은 일반적으로 낮으며 분해되기 쉽다. 그래서, 하나의 접근법은 상기 표적 폴리펩타이드 유전자를 담체 단백질 유전자에 결합시키는 것인데, 상기 표적 단백질은 융합 단백질로서 발현된다. 상기 과정 이후에, 상기 표적 단백질은 화학법 또는 효소법 중 하나를 이용하여 융합 단백질을 절단하고, 추출하고 정제함으로써 얻을 수 있다. 이러한 방법의 단점은, 단백질 수율이 낮고, 공정이 복잡하다는 것이다. 다른 접근법은 폴리펩타이드의 아미노산 서열에 기초한다. 상기 표적 유전자를 여러 카피(copy) 직렬로 연결하고, 적절한 프로모터로 구동한다. 상기 직렬로 연결된 표적 단백질은 절단(cleavage)에 의하여 제조될 수 있다. 이러한 접근법은 인간 인슐린(문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984 81 4627-4631]), 칼시토닌(calcitonin, 일본 특허 제 62-226998 호), GLP-1(국제공개공보 제 WO 95/17510호)과 같이 많은 폴리펩타이드 제조의 사례에서 성공적이다. 이러한 접근법의 이점은, 발현 단백질의 수율이 매우 높다는 것이다. 바람직하게는, 본 발명의 상기 폴리펩타이드는 상술한 바와 같이 다중 직렬 결합 유전자법을 이용하여 발현된다. 상기 결합된 폴리펩타이드는 당해 기술분야의 통상적인 방법을 이용하여 절단된다. 예를 들어, 시트라콘산(citraconic) 무수물로 상기 리신 잔기를 보호한 후에 이 다중체성(multimeric) 폴리펩타이드는 트립신에 의해 아르기닌 자리에서 분해된 후, 산 처리에 의해 시트라콘산기가 제거된다(문헌[J. D. Baxter. et al., Nature 1980 285 456-461]; 및 일본 특허 제 JP62-226998 호 참조). 바람직한 일 실시예에서, 도 1에 도시된 바와 같이 상술한 방법은 하기 단계를 포함한다: a) 본 발명의 상기 폴리펩타이드를 발현하는 세균 세포의 발효; b) 세균 세포의 수확; c) 세포의 용균; d) 다중체성 폴리펩타이드의 추출; e) 제조된 폴리펩타이드들의 재접힘; f) 절단 g) 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용한 최종 폴리펩타이드들의 정제.

유전 공학기법에 의해 발현된 상기 표적 폴리펩타이드(20 내지 60개의 아미노산 잔기를 가짐)는 담체 단백질과 결합하는 경우에만 수득될 수 있다. 상기 융합 단백질 분자는 융합 단백질의 약 10%를 차지하는 하나의 표적 폴리펩타이드 분자만을 포함하기 때문에 상기 표적 단백질의 수율은 매우 낮다. 또한, 기타 많은 비-표적 단백질들이 융합 단백질 분해 이후에 또한 수득되며, 이는 상기 표적 폴리펩타이드의 정제를 어렵게 한다. 본 발명에서, 다중 폴리펩타이드 유전자들은 직렬로 연결되어 있고, 발현된 융합 단백질들은 표적 폴리펩타이드로만 이루어져 있다. 상기 분해된 폴리펩타이드는 오직 단일 형태이고, 수율은 이전의 방법보다 10배 더 높은데, 이는 상기 정제공정을 더욱 용이하게 한다. 본 발명에서, 상기 X₃ 부위는 Lyr로서 존재하고, 상기 융합 단백질은 E₄(f)의 완전성을 확보하도록 분자간 부위(Arg 부위)에서만 분해된다.

상기 E₄(f)의 C-말단에서의 상기 Pro 잔기들은 카르복시펩티다제 A 및 B에 대해 내성을 나타내며, 이는 분자의 안정성을 향상시킬 것이다.

실제, E₄(f)의 중간체로서 E₄(f)Arg 중의 Arg 잔기는 혈중에서 카르복시펩티 다제 A에 의해 신속하게 제거되고, E₄(f)Arg는 가수분해되어 E₄(f)를 형성하며, E₄(f) 및 E₄(f)Arg 둘 모두가 효능을 갖는다.

하기 실시예들은 본 발명을 예시하기 위해 제공되지만, 본 발명의 범주를 한정하는 것으로 이해되어서는 안 된다. 또한, 모든 참고문헌의 개시내용은 본원에서 전체가 참고로 인용된다. 본 발명은 첨부된 도면과 함께 하기 실시예를 참고함으로써 더욱 명백하게 이해될 것이다. 따라서, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하기 위해 제공되는 것으로 이해되어야 하지만, 본 발명의 범주를 한정하기 위해 인용되지 않는 것으로 간주되어서는 안 된다. 본원에 기술된 것 이외에, 본 발명에 따른 본 발명의 다양한 변형은 당해 기술분야의 숙련자에게 자명할 것이다. 또한, 상기 참고문헌의 모든 개시내용은 본원에서 전체가 참고로 인용된다.

실시예

실시예 1: 엑센딘 4 폴리펩타이드 변형체의 고상 합성 방법

완전 자동의 다중 SyRo II 펩타이드 합성기를 이용하는 고상 펩타이드 합성 방법에 의해 폴리펩타이드를 합성한다. N-(9-플루오레닐)메톡시카보닐(Fmoc)을 이용하여 아미노산의 α-아미노기를 보호한다. 또한, 다른 보호기를 이용할 수도 있다. 예를 들어 Asp, Glu, Ser 및 Thr을 위해 t-부틸기, Asn, Gln 및 His을 위해 트리틸(Trt)기, Lys 및 Trp을 위해 t-부톡시카보닐(Boc)로 보호하고, Arg을 위해 2,2,5,7,8,-5-펜타메틸-크로만-6-설포닐(Pmc)기로 보호한다. 활성화제로서 N,N'-디이소프로필카보디이미드/1-하이드록시벤조트리아졸을 사용함으로써, 상기 보호된 아미노산들은 각각의 접합 반응에서 40분씩 차례로 접합된다. 15% 에탄디티올/디메틸설파이드/아니솔(1:1:1v/v/v)의 존재하에 상기 폴리펩타이드는 85% 트리플루오로아세트산과 실온에서 120분 동안 반응한 후, 수지로부터 분해되는 동시에 탈보호된다. 무수 에테르에 의한 침전 이후, 메르캅탄을 완전히 제거하기 위해 침전물을 무수 에테르로 수회 세척한다. 이어, 상기 폴리펩타이드를 물/t-부틸 알코올(1:1)로 침전시키고, 조질의 폴리펩타이드로 냉동건조시킨다. 상기 조질의 폴리펩타이드는 37 내지 42% 아세토니트릴/0.9% 트리플루오로아세트산(TFA)의 농도구배에서 30분 이내에 역상 HPLC에 의해 정제된다. 용출된 용액을 농축시키고 냉동건조시킨다. 백색의 최종 고체 생성물의 순도는 97% 이상이었다.

실시예 2: 생체공학에 의한 엑센딘 4 폴리펩타이드 변이체의 제조과정

1) 4개의 유전자 단편의 화학 합성(Shanghai Biocolor Bioscience & Technology Company, 중국)

(1) 5' AAT TCC AGA TCT ATG CGT CAC GGC GAA GGC ACC TAC ACC AGC CAT CTG AGC AAA CAG;

(2) 5' ATG GAA GAA GAA GCG GTT AAA CTG TTC ATC GAA TGG CTG AAA AAC GGC GGC CCG CGT GGA TCC TAG;

(3) 5' TCG CTA GGA TCC ACG CGG GCC GCC GTT TTT CAG CCA TTC GAT GAA CAG TTT AAC CGC TTC TTC T;

(4) 5' TC CAT CTG TTT GCT CAG ATC GCT GGT GAT GGT GCC TTC GCC GTG ACG CAT AGA TCT GG.

2) 유전자 단편의 연결:

50㎕의 물을 단편 (1), (2), (3) 및 (4)로 표시된 4개의 합성된 유전자(A_260nm=2)에 각각 첨가하고, 2㎕의 단편 (1) 및 (4)를 하나의 마이크로튜브로 옮겨서 혼합한 후, 2㎕의 단편 (2) 및 (3)을 다른 마이크로튜브로 옮겨서 혼합한다. 1㎕의 10×T4 폴리뉴클레오타이드 키나제 완충액, 1㎕의 ATP(0.1mol/L) 및 1㎕의 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제를 상기 마이크로튜브 둘 모두에 첨가하고, 37℃에서 30분 동안 방치한 후, 95℃ 수욕에서 5분 동안 방치하여 실온까지 냉각시키고, 2개의 마이크로튜브에서 상기 성분들을 혼합한 후에 2㎕의 10×리가제(ligase) 완충액, 1㎕의 ATP(0.1mol/L) 및 2㎕ T4 리가제를 첨가하고, 상기 마이크로튜브를 16℃에서 2시간 동안 방치한다. 이어, 연결된 단편들은 EcoRI 및 SalI로 절단한 후에 DNA 단편 키트(Shanghai Biocolor Bioscience & Technology Company, 중국; Promega, 미국)를 이용하여 정제하고, 이어 상기 단편을 전기영동으로 분석한다.

3) 클로닝:

1㎕의 pUC18 플라스미드(Shanghai Biocolor Bioscience & Technology Company, 중국)를 클린 튜브(clean tube)에 첨가한다. 1㎕의 10×제한효소 완충액을 첨가한다. 1㎕의 EcoRI 및 SalI 효소를 각각 첨가한다. 37℃에서 30분 동안 배양한다. 페놀:클로로포름으로 추출한다. 상기 마이크로튜브를 원심분리하여 상(phase)들을 분리한다. 상층액을 클린 튜브로 옮긴다. 클로로포름으로 다시 추출한다. 원심분리에 의해 상기 클로로포름을 제거한다. 상기 DNA를 60% 이소프로판올 로 침전시킨다. 상기 튜브를 원심분리하여 상기 DNA를 수집한 후, 펠릿(pellet)을 건조시키고, 사용할 때가지 상기 DNA를 저장한다. 단계 2에서 제조된 EcoRI 및 SalI 절단 DNA 단편을 상기 동일한 효소로 절단된 상기 플라스미드와 혼합한다. 1㎕의 연결 완충액, 1㎕의 ATP 및 2㎕의 T4 리가제를 첨가한다. 16℃에서 12시간 동안 배양한다. E. coli 균주 JM 109 컴피턴트 세포(competent cell)를 통상적인 방법을 이용하여 침전시킨다. 상기에서 기술된 연결-반응 혼합물은 형질전환용으로 사용된다. 형질전환체의 양성 콜로니를 선별한 후, 플라스미드를 추출하였다.

4) 결합:

상기 단계 3으로부터의 상기 변이 폴리펩타이드 유전자를 포함하는 벡터를 Bgl II 및 Sal I로 이중 절단한 후, 이러한 변이 폴리펩타이드-함유 DNA 단편들을 추출한다. 또한, 상기 단계 3으로부터의 벡터를 Bam HI 및 Sal I로 이중 절단하고, 상기 2개의 절단된 변이 폴리펩타이드-함유 DNA 단편을 연결함으로써 상기 2개의 변이 폴리펩타이드 유전자를 포함하는 벡터를 얻는다. 이렇게 얻어진 벡터를 Bgl HI 및 Sal I로 추가로 절단하고, 2개의 유전자를 포함하는 단편을 얻는다. Bam HI 및 Sal I로 앞서 절단된 2개의 유전자를 함유하는 벡터에 이러한 단편을 연결하여, 4개의 유전자를 함유하는 벡터를 형성한다. 또한, 8개, 16개, 32개의 유전자를 함유하는 벡터를 이러한 방법으로 얻을 수 있다.

5) 형질전환:

변이 폴리펩타이드를 포함하는 상기 플라스미드를 JM 109 E. coli의 컴피턴트 세포와 혼합한다. 물기가 있는 얼음에서 30분 동안 방치한다. 상기 세포에 정확 히 42℃의 수욕에서 2분 동안 열충격을 가한다. 물기가 있는 얼음으로 옮긴다. 1% 아가로즈 및 50㎍/㎖의 암피실린을 포함하는 LB 플레이트 상에 형질전환용 배양액을 도말한다. 상기 플레이트를 37℃에서 하룻밤 동안 배양한다. 50㎍/㎖의 암피실린을 포함하는 LB 배양배지가 들어 있는 플라스크에 단일 콜로니의 형질전환체를 선별하여 넣는다. 상기 배양액들을 격렬하게 교반하면서 37℃에서 하룻밤 동안 성장시킨다. 하룻밤 동안 배양한 0.7㎖의 배양액에 0.3㎖의 50% 글리세롤을 첨가하고, 완전히 혼합하고, 사용할 때까지 -85℃에 저장한다.

6) 발효법에 의한 변이 폴리펩타이드의 제조과정(도 1에 도시된 흐름도)

먼저, 1,000㎖의 LB 배양배지(10g의 박토-트립톤, 5g의 박토-효모 추출물 및 5g의 NaCl)를 준비하고, 120℃에서 30분 동안 오토클레이브(autoclave)한다. 암피실린(최종 농도: 100㎕/㎖)을 첨가하기 전에 실온까지 냉각시킨다. 단계 5에서 준비된 글리세롤-함유 저장액 튜브(stock tube)로부터 1㎖의 세포 배양액을 접종한다. 상기 배양액들을 격렬하게 교반하면서 37℃에서 하룻밤 동안 성장시킨다. 5,000 rpm으로 원심분리하여 상기 세포 배양액을 수확한다. -35℃에 냉동시킨 후, 세포 배양액을 해동시키고, 6M 구아니딘 염산을 첨가한다. 샘플을 균질화하고, 결합된 폴리펩타이드를 추출하고, 18,000rmp에서 원심분리하여 상층액을 수집한다. 새로운 튜브에 상기 상층액을 옮기고, 투석 완충액(10mM 인산 완충액, pH 7.2; 0.1% 메르캅토에탄올)을 첨가하여 상기 폴리펩타이드를 다시 접히게 하였다. 원심분리하여 결합된 폴리펩타이드를 분리한다. 이어, 백스터(J. D. Baxter) 등(문헌[Nature 1980, 285, 456-461])에 의해 개시된 방법에 따라 상기 결합된 폴리펩타 이드를 분해한다. 물에 상기 결합된 폴리펩타이드를 용해시키고, pH 8.5가 될 때까지 Na₂CO₃을 첨가한다. 시트라콘산 무수물을 첨가하여 pH 8.5에서 봉입체(inclusion body)를 완전히 용해시킨다. 상기 튜브를 볼텍싱(vertexing)한 후에 실온에서 2시간 동안 배양한다. 트립신 및 카르복시펩티다제 B를 첨가한다. 37℃에서 2시간 동안 배양한 후, 상기 결합된 폴리펩타이드를 수득한다. 3N 염산을 첨가하여 pH값을 3으로 조정하고, 4시간 동안 볼텍싱하고, 시트르콘산의 보호기를 탈보호하여 본 발명의 최종 정제된 엑센딘 4 폴리펩타이드를 얻는다.

실시예 3: 엑센딘 4 폴리펩타이드 단편의 유지된 혈당강하 활성 분석

체중이 50g인 KK 2형 당뇨병 쥐(중국 과학원(Chinese Academy of Sciences) 산하 상하이실험동물센터(Shanghai Laboratory Animal Center, 중국)로부터 구입함)를 2시간 동안 단식시킨 후, 4개의 군으로 나누었다. 2개의 군은 엑센딘 4로 주사하고, 다른 2개의 군은 본 발명에서 제공되는 2㎍의 엑센딘 4 폴리펩타이드 단편으로 주사한다. 시험 물질을 투여한 후 0, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5 및 6시간의 시점에 단식중인 동물로부터 20㎕의 혈액 샘플을 각각 얻는다. 혈당 분석 키트(상하이생물제품연구소(Shanghai Institute of Biological Products, 중국)로부터 구입함)를 이용하여 상기 유지된 혈당강하 활성을 분석한다. 그 결과는 도 2에 도시되어 있다.

실시예 4: db/db II형 당뇨병 쥐에 대한 엑센딘 4 폴리펩타이드 단편의 혈당강하 활성 분석

체중이 50g인 db/db II형 당뇨병 쥐(중국 과학원 산하 상하이실험동물센터 및 양주대학(Yangzhou University, 중국)으로부터 구입함)를 2시간 동안 단식시키고, 상기 시험 동물들에 엑센딘 4 폴리펩타이드 단편의 피하 주사액을 2㎍의 양으로 투여하였다. 시험 물질을 투여한 후 0, 0.5, 1 및 2시간의 시점에 단식중인 동물로부터 20㎕의 혈액 샘플을 각각 얻었다. 혈당 분석 키트(상하이생물제품연구소(중국)로부터 구입함)를 이용하여 상기 유지된 혈당강하 활성을 분석한다. 그 결과는 도 3에 도시되어 있다.

실시예 5: 고토-고키자키 II형 당뇨병 생쥐에 대한 엑센딘 4 폴리펩타이드 단편의 식후 혈당강하 활성

5개월령(체중: 470g)의 고토-고키자키 당뇨병 생쥐(중국 과학원 산하 상하이실험동물센터(중국)로부터 구입함)를 수술과정을 위해 포획하였다. 2시간 동안 단식시킨 후, 시험 동물들에 20% 글루코즈의 복강내 주사액을 1㎖의 양으로 투여하고, 엑센딘 4 폴리펩타이드 단편의 피하 주사액을 5㎍의 양으로 투여하였다. 대조군에는 글루코즈만 투여하였다. 시험 물질을 투여한 후 0, 0.5, 1 및 2시간의 시점에 단식중인 동물로부터 20㎕의 혈액 샘플을 각각 얻었다. 혈당 분석 키트(상하이생물제품연구소(중국)로부터 구입함)를 이용하여 상기 유지된 혈당강하 활성을 측정한다. 그 결과는 도 4에 도시되어 있다. 곡선 1은 대조군을 나타낸다. 곡선 2는 투여군을 나타낸다.

실시예 6: 알록산-유도 당뇨병 쥐에 대한 엑센딘 4 폴리펩타이드 단편의 혈당강하 활성

8주령(체중: 20g)의 쥐를 수술과정을 위해 포획하였다. 0.1㎖의 알록산(16㎎/㎖)을 꼬리 정맥에 주사함으로써 이에 의해 생쥐에서 실험용 당뇨병이 유도되었다. 동물들을 5개의 군으로 나눈다. 48시간 후, 2㎍의 엑센딘 4 폴리펩타이드 단편을 주사하였다. 시험 물질을 투여한 후 0, 0.5, 1 및 2시간의 시점에 단식중인 동물로부터 20㎕의 혈액 샘플을 각각 얻었다. 혈당 분석 키트(상하이생물제품연구소(중국)로부터 구입함)를 이용하여 상기 유지된 혈당강하 활성을 측정한다. 유의한 혈당강하 활성이 당뇨병 쥐의 5개 군 모두에서 관측되었다. 그 결과는 도 5에 도시되어 있다.

실시예 7: 엑센딘 4 폴리펩타이드 단편에 의한 인슐린 분비의 자극

6개월령(체중: 470g)의 고토-고키자키 당뇨병 생쥐를 수술과정을 위해 포획하였다. 시험 동물들에 엑센딘 4 폴리펩타이드 단편의 피하 주사액을 5㎍의 양으로 투여하고, 대조군 동물들에는 생리식염수만을 투여하였다. 시험 물질을 투여한 후 0, 3, 5, 10, 15, 30 및 45분의 시점에 단식중인 동물로부터 20㎕의 혈액 샘플을 각각 얻었다. 엑센딘 4 폴리펩타이드 단편에 의해 자극되는 인슐린 분비량은 ELISA 키트(Dianostic Systemlab Inc., 미국)를 이용하여 측정된다. 그 결과는 도 6에 도시되어 있다. 시험군의 동물들은 엑센딘 4 폴리펩타이드의 피하 주사액으로 투여되는 제 1 상 인슐린 분비량을 회복하였다.

상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 엑센딘 4 폴리펩타이드 단편은 펩타이드 쇄가 보다 짧고 이의 생산이 촉진될 뿐만 아니라, 카르복시펩티다 제(carboxypeptidase)들을 효과적으로 억제하면서 혈당강하 활성을 보다 오랫동안 유지할 수 있어, II형 당뇨병의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

<110> Changzhou Pharmaceutical Factory <120> EXENDIN 4 POLYPEPTIDE FRAGMENT <150> CN200510040823.8 <151> 2005-06-29 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exendin 4 polypeptide fragment <400> 1 His Gly Glu Gly Thr Xaa Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Xaa Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Xaa Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Xaa Pro Xaa 20 25 30 <210> 2 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exendin 4 polypeptide fragment <400> 2 His Gly Glu Gly Thr Xaa Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Xaa Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Xaa Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Pro Xaa 20 25 30 <210> 3 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized primer 1 <400> 3 aattccagat ctatgcgtca cggcgaaggc acctacacca gccatctgag caaacag 57 <210> 4 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized primer 2 <400> 4 atggaagaag aagcggttaa actgttcatc gaatggctga aaaacggcgg cccgcgtgga 60 tcctag 66 <210> 5 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized primer 3 <400> 5 tcgctaggat ccacgcgggc cgccgttttt cagccattcg atgaacagtt taaccgcttc 60 ttct 64 <210> 6 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized primer 4 <400> 6 tccatctgtt tgctcagatc gctggtgatg gtgccttcgc cgtgacgcat agatctgg 58

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 에스테르:

<화학식 1>

HGEGTX₁TSDLSKQX₂EEEAVX₃LFIEWLKNGX₄PX₅

상기 식에서,

X₁은 Phe 또는 Tyr을 나타내고,

X₂는 Met, Ile 또는 Leu를 나타내고,

X₃은 Lys를 나타내고,

X₄는 결실을 나타내고,

X₅는 Arg 또는 결실을 나타낸다.
제 1 항에 있어서, X₁은 Tyr인 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드 및 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 에스테르.
제 1 항에 있어서, X₂는 Met인 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드 및 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 에스테르.
삭제
제 1 항에 있어서, X₁은 Tyr이고, X₂는 Met이고, X₃은 Lys이고, X₄는 결실이고, X₅는 Arg 또는 결실인 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드 및 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 에스테르.
제 1 항 내지 제 3 항 및 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 하나 또는 여러 종류의 폴리펩타이드, 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 에스테르를 포함하는 약학 조성물.
제 6 항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 희석제, 부형제 또는 담체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 7 항에 있어서, 상기 담체는 에탄올, 글리세롤 및 물로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 물질인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 6 항에 있어서, 상기 약학 조성물은 당뇨병을 치료하기 위한 것임을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 9 항에 있어서, 상기 당뇨병은 II형 당뇨병인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.