CN115819619A - 一类glp-1/y2受体双重激动剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一类GLP‑1/Y₂受体双重激动剂及其应用，所述的双重激动剂对人GLP‑1和Y₂受体具有双重激动活性。本发明的GLP‑1/Y₂受体双重激动剂在更为有效的降低血糖的同时具有显著的减重作用。本发明提供的GLP‑1/Y₂受体双重激动剂化学性质稳定，具有可在人身上一天一次或一周一次皮下注射给药的药代动力学特征，实现长效给药，适合作为治疗代谢性疾病，如糖尿病、肥胖症、血脂障碍等疾病药物的活性成分。

Description

一类GLP-1/Y2受体双重激动剂及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一类GLP-1/Y₂受体双重激动剂及其应用。

背景技术

肥胖及其相关代谢综合征已成为全球性的公众健康问题，许多代谢综合征如2型糖尿病(T2DM)、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、血脂代谢异常的发病率与病程发展都与肥胖密切相关。GLP-1是由小肠L细胞所分泌的一种葡萄糖依赖性降血糖多肽激素，其最主要的功能就是促进胰岛素的分泌。胰高血糖素糖肽-1(GLP-1)可以抑制食欲、延缓胃排空实现降低体重的作用。虽然GLP-1具有优异的降糖作用和一定的减重效果，但是如果需要实现较好的体重减轻作用，一般需要加大给药剂量，而大剂量给予GLP-1类药物容易产生胃肠道副作用、耐受性差而导致治疗窗较窄。因此，仍然需要更为安全耐受的、可有效减轻体重和控制血糖的治疗剂。

神经肽Y(NPY)是一种36个氨基酸肽的神经递质，是已经显示存在于外周和中枢神经系统两者中的神经递质/神经激素的胰腺多肽类别的成员。NPY是已知的最有效的开胃剂之一，并且NPY显示在调节人和动物的食物摄取上具有重要作用。NPY受体共有4种亚型，Y₁、Y₂、Y₄和Y₅，其中神经肽-2(Y₂)受体广泛分布在啮齿动物和人的中枢神经系统中。在下丘脑中，Y₂mRNA定位在弓状核、视前核和背内侧核中。在人脑中，Y₂受体是主要的NPY受体亚型。在弓状核中，超过80％的NPY神经元共表达Y₂受体mRNA。选择激动Y₂受体可以抑制摄食，具有减重的效果。

肽YY_3-36(PYY_3-36)是34个氨基酸的线性肽，其具有Y₂受体的激动活性，在动物和人体内联合注射GLP-1和PYY_3-36，具有很好的降糖和减重作用，说明同时激动GLP-1和Y₂受体，能够在保持GLP-1降糖作用的前提下，进一步利用激动Y₂受体所带来的食欲抑制效果产生更好的减重作用。Novo Nordisk在2021年报道了一类具有GLP-1和Y₂受体双重激动活性的GLP-1和短链PYY_3-36类似物的杂合肽。但是，该类化合物没有经过长效化修饰，其体内稳定性较为有限，无法实现长效给药(Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,2021,6；60(15):8268-8275)。Brandon等揭示了一类exendin-4与短链PYY_3-36类似物的杂合肽，具有较好的GLP-1和Y₂受体双重激动活性，与Novo Nordisk所报道的化合物类似，该类化合物也没有经过任何长效化修饰，稳定性较差(J.Med.Chem.,202,28；64(2):1127-1138)。

发明内容

本发明目的在于提供一类GLP-1/Y₂受体双重激动剂及其应用，该激动剂可对人GLP-1受体和Y₂受体具有双重激动活性且稳定性高，具有可在人身上一天一次或一周一次皮下注射给药的药代动力学特征，实现长效给药；将其应用于制备治疗代谢综合征，诸如糖尿病、肥胖症、血脂障碍等疾病药物方面具有更大的潜力。

为实现上述发明目的，本发明的技术方案具体如下：

一类GLP-1/Y₂受体双重激动剂，所述GLP-1/Y₂受体双重激动剂的氨基酸序列通式为：His-Xaa₁-Glu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Asn-Asp-Val-Thr-Glu-Tyr-Leu-Glu-Glu-Xaa₂-Ala-Ala-Xaa₃-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ile-Lys-Gly-Lys-Xaa₄-Xaa₅-Lys-Pro-Glu-Ala-Pro-Gly-Xaa₆-Asp-Ala-Ser-Pro-Glu-Glu-Xaa₇-Asn-Arg-Tyr-Tyr-Ala-Xaa₈-Leu-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Xaa₉-Xaa₁₀-Thr-Arg-Gln-Xaa₁₁-Tyr-NH₂，

其中：

Xaa₁选自Ala、Gly或Aib；

Xaa₂选自Glu、Lys或侧链被修饰的Lys；

Xaa₃选自Lys或侧链被修饰的Lys；

Xaa₄选自Cys或侧链被修饰的Cys-R1或Cys-R2或Cys-R3；

Xaa₅选自Ile或Pro；

Xaa₆选自Glu或Lys；

Xaa₇选自Leu或Trp；

Xaa₈选自Ser或Asp；

Xaa₉选自Leu或Trp；

Xaa₁₀选自Leu或Val；

Xaa₁₁选自Arg或

其中，侧链被修饰的Lys选自

其中，n为自然数，且12≤n≤20。

优选的，所述n是14、16、18或20。

优选的，所述Cys-R1的化学结构如下：

所述Cys-R2的化学结构如下：

所述Cys-R3的化学结构如下：

优选的，所述GLP-1/Y₂受体双重激动剂的氨基酸序列结构为：

(1)SEQ ID NO:1

(2)SEQ ID NO:2

(3)SEQ ID NO:3

(4)SEQ ID NO:4

(5)SEQ ID NO:5

(6)SEQ ID NO:6

(7)SEQ ID NO:7

(8)SEQ ID NO:8

(9)SEQ ID NO:9

(10)SEQ ID NO:10

(11)SEQ ID NO:11

(12)SEQ ID NO:12

(13)SEQ ID NO:13

(14)SEQ ID NO:14

本发明还提供了一类GLP-1/Y₂受体双重激动剂药学上可接受的盐。

优选的，所述盐为GLP-1/Y₂受体双重激动剂与下述化合物中的一种所形成的盐：乙酸、水杨酸、月桂酸、肉桂酸、柠檬酸草酸、乳酸、琥珀酸。

本发明还提供了一类GLP-1/Y₂受体双重激动剂所制备的药剂，所述的药剂是任何一种药剂学上所说的片剂、胶囊、吸入剂、喷雾剂、注射剂、膜剂、贴剂、乳剂、栓剂或者复方制剂，药剂由一类GLP-1/Y₂受体双重激动剂和药学上可接受的药用辅料、载体或稀释剂组成。

本发明还提供了含有一类GLP-1/Y₂受体双重激动剂的药物组合物，该药物组合物以上述任一GLP-1/Y₂受体双重激动剂为有效原料，或者其药学上可接受的盐为有效原料，再加上药学上可接受的载体或稀释剂组成。

本发明还提供了本发明所述的GLP-1/Y₂受体双重激动剂或其药学上可接受的盐、或其药物组合物或其药剂在制备用于治疗代谢性疾病或病症的药物中的用途。在特定方面，代谢性疾病或病症为糖尿病、肥胖症、血脂障碍。在特定方面，糖尿病为T1DM、T2DM或妊娠糖尿病。在特定方面，所述药物用于治疗超过一种代谢疾病或病症，例如，糖尿病和肥胖；糖尿病和血脂障碍；糖尿病、血脂障碍和肥胖。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明提供一种基于GLP-1类似物序列设计的变体，保留GLP-1类似物对糖尿病的治疗作用同时具有PYY_3-36对食欲抑制的有益作用，对人GLP-1受体和Y₂受体具有双重激动活性对糖、脂、能量代谢产生协同影响，具有更强的降低血糖和减轻体重的疗效，对糖尿病、肥胖等代谢综合征的治疗具有显著优势。另外，本发明的GLP-1/Y₂受体双重激动剂具有极高的稳定性，具有支持在人身上一天一次或一周一次皮下注射给药的药代动力学特征，实现长效给药；将其应用于制备治疗代谢综合征，诸如糖尿病、肥胖症、血脂障碍等疾病药物方面具有更大的潜力。

附图说明

图1显示的是各受试物单次给药在C57BL/6J小鼠上的摄食抑制作用；

图2显示的是各受试物在DIO小鼠长期给药21天的体重变化百分比。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。

除非本文另有定义，否则本申请书中所使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。通常，本文所述的与化学、生物学、药理学关联使用的术语和方法是本领域中公知和常用的。

另外，本发明涉及的氨基酸根据IUPAC-IUB的命名规则缩写如下：

丙氨酸(Ala，A)；精氨酸(Arg，R)；天冬酰胺(Asn，N)；天冬氨酸(Asp，D)；半胱氨酸(Cys，C)；谷氨酸(Glu，E)；谷氨酰胺(Gln，Q)；甘氨酸(Gly，G)；组氨酸(His，H)；异亮氨酸(Ile，I)；亮氨酸(Leu，L)；赖氨酸(Lys，K)；甲硫氨酸(Met，M)；苯丙氨酸(Phe，F)；脯氨酸(Pro，P)；丝氨酸(Ser，S)；苏氨酸(Thr，T)；色氨酸(Trp，W)；酪氨酸(Tyr，Y)；缬氨酸(Val，V)。

另外，除非明确标明，本发明的多肽化合物中的所有氨基酸残基优选为L构型。

另外，所述序列的C端上的“-NH₂”部分表明C端上的酰胺基(-CONH₂)。

另外，本发明序列中除了天然氨基酸以外，还使用了非天然氨基酸α-氨基异丁酸(Aib)。

实施例1

SEQ ID NO:1多肽化合物的合成

(1)树脂的溶胀

称取担载量为0.36mmol/g的Rink Amide MBHA树脂0.278g(0.1mmol当量)，放入25mL的反应器中，用7mL的DCM和甲醇交替清洗树脂1次，7mL的DCM清洗树脂2次，然后用7mL的DCM溶胀树脂1h，最后用7mL DMF清洗树脂3次。

(2)树脂Fmoc保护基的脱除

将溶胀后的树脂转入PSI-200多肽合成仪，加入7mL 20％哌啶/DMF(v/v)室温反应5min，滤去脱保护溶液，7mL DMF清洗树脂一次，再加入7mL 20％哌啶/DMF(v/v)脱保护溶剂与树脂反应15min，最后7mL DMF清洗树脂4次，每次2min，得到脱除Fmoc保护基的Rink树脂。

(3)Fmoc-Tyr-Rink amide-MBHA Resin的合成

称Fmoc-Tyr(tBu)-OH(0.4mmol)，用2mL DMF溶解，加入3mL DIC/HOBt(0.4mmol/0.44mmol)缩合剂，加入反应器中，室温震荡反应2h，滤去反应液后用7mL DMF清洗树脂4次，使用Kaiser试剂检测反应耦合是否完全，如不完全则2次耦合。

(4)PYY部分肽链的延长

按照PYY部分肽链的序列(IKPEA PGEDA SPEEL NRYYA SLRHY LNLVT RQRY-NH₂)，重复上述脱保护和耦合的步骤依次连接上相应的氨基酸，直至肽链合成完毕。

(5)连接臂的合成

在PYY部分肽链合成完毕后，继续合成连接臂部分，加入0.4mmol的Fmoc-AEEA-OH、0.4mmol的DIC及0.44mmol的HOBt，震荡缩合反应2h。脱除Fmoc保护基后，再次加入0.4mmol的Fmoc-AEEA-OH、0.4mmol的DIC及0.44mmol的HOBt，震荡缩合反应2h。脱除Fmoc保护基后，加入0.4mmol的3-马来酰亚胺基丙酸、0.4mmol的DIC及0.44mmol的HOBt，震荡缩合反应2h。

(6)包含连接臂的PYY部分的裂解

将上述得到的连有多肽的树脂转移至圆底瓶中，使用切割剂Reagent R(TFA/苯甲硫醚/苯酚/EDT，90:5:3:2，V/V)5mL切割树脂，在油浴中恒温30℃反应2h，切割液倾入40mL冰乙醚中，冷冻离心后粗品用15mL冰乙醚洗涤3次，最后用氮气吹干，得到包含连接臂的PYY部分的粗肽。

(7)GLP-1部分序列的合成

称取担载量为0.36mmol/g的Rink Amide MBHA树脂0.278g(0.1mmol当量)，放入25mL的反应器中，用10mL的DCM和甲醇交替清洗树脂1次，10mL的DCM清洗树脂2次，然后用10mL的DCM溶胀树脂1h，最后用10mL DMF清洗树脂3次。将溶胀后的树脂转入PSI-200多肽合成仪，加入10mL 20％哌啶/DMF(v/v)室温反应5min，滤去脱保护溶液，10mL DMF清洗树脂一次，再加入10mL 20％哌啶/DMF(v/v)脱保护溶剂与树脂反应15min，最后10mL DMF清洗树脂4次，每次1.5min，得到脱除Fmoc保护基的Rink树脂。称Fmoc-Cys(Trt)-OH(0.4mmol)，用2mL10％DMF/DMSO(v/v)溶解，加入3mL DIC/HOBt(0.4mmol/0.44mmol)缩合剂，加入反应器中，室温震荡反应2h，滤去反应液后用10mL DMF清洗树脂4次，使用Kaiser试剂检测反应耦合是否完全，如不完全则2次耦合。

(8)GLP-1部分肽链的延长

按照肽链的序列，重复上述脱保护和耦合的步骤依次连接上相应的氨基酸，直至肽链合成完毕。其中侧链修饰位点的Lys采用Fmoc-Lys(Dde)-OH保护策略，同时N末端的His使用的是Boc-His(Boc)-OH。

(9)GLP-1部分Lys侧链的修饰

肽链合成完毕后，加入7mL 2％水合肼/DMF(v/v)选择性脱除Lys的Dde保护基，Dde保护基脱除后加入0.4mmol的Fmoc-Glu-OtBu、0.4mmol的DIC及0.44mmol的HOBt，震荡反应2h。脱除Fmoc保护基后，再次加入0.4mmol的Fmoc-Glu-OtBu、0.4mmol的DIC及0.44mmol的HOBt，震荡缩合反应2h。脱除Fmoc保护基后，加入0.4mmol的棕榈酸，0.4mmol的DIC及0.44mmol的HOBt缩合反应2h，反应完全后用7mL DMF清洗树脂4次。

(10)GLP-1部分的裂解

将上述得到的连有多肽的树脂转移至圆底瓶中，使用切割剂Reagent R(TFA/苯甲硫醚/苯酚/EDT，90:5:3:2，V/V)5mL切割树脂，在油浴中恒温30℃反应2h，切割液倾入40mL冰乙醚中，冷冻离心后粗品用15mL冰乙醚洗涤3次，最后用氮气吹干，得到GLP-1部分的粗肽。

(11)目标多肽的合成

将0.05mmol的包含连接臂的PYY部分的粗肽与0.05mmol的GLP-1部分的粗肽溶解于2mL的NMP中，加入0.005mmol的DIPEA催化，反应20分钟后，加入5mL 50％的甲醇/水(0.1％TFA)停止反应，反应液用0.25μm微孔滤膜过滤后进岛津制备型反相HPLC系统纯化。色谱条件为C18反相制备柱(250mm×20mm，12μm)；流动相A：0.1％TFA/水(V/V)，流动相B：甲醇(V/V)；流速为8mL/min；检测波长为214nm。采用线性梯度(20％B～90％B/30min)洗脱，收集目标峰，除去甲醇后冻干得纯品0.01g，纯度大于98％，通过MS确认目标多肽的分子量。理论相对分子质量为8490.6。ESI-MS m/z:计算值[M+7H]⁷⁺1213.9,[M+8H]⁸⁺1062.3；观察值[M+7H]⁷⁺1213.5,[M+8H]⁸⁺1062.0。

实施例2

SEQ ID NO:2多肽化合物的合成

合成方法同实施例1，收集目标峰冻干得纯品0.011g，纯度大于98％，通过MS确认目标多肽的分子量。理论相对分子质量为8780.9。ESI-MS m/z:计算值[M+7H]⁷⁺1255.4,[M+8H]⁸⁺1098.6；观察值[M+7H]⁷⁺1255.1,[M+8H]⁸⁺1098.3。

实施例3

SEQ ID NO:3多肽化合物的合成

合成方法同实施例1，收集目标峰冻干得纯品0.013g，纯度大于98％，通过MS确认目标多肽的分子量。理论相对分子质量为9361.5。ESI-MS m/z:计算值[M+9H]⁹⁺1041.2,[M+10H]¹⁰⁺937.2；观察值[M+9H]⁹⁺1040.9,[M+10H]¹⁰⁺936.9。

实施例4

SEQ ID NO:4多肽化合物的合成

合成方法同实施例1，收集目标峰冻干得纯品0.009g，纯度大于98％，通过MS确认目标多肽的分子量。理论相对分子质量为8491.9。ESI-MS m/z:计算值[M+7H]⁷⁺1214.1,[M+8H]⁸⁺1062.5；观察值[M+7H]⁷⁺1213.8,[M+8H]⁸⁺1062.2。

实施例5

SEQ ID NO:5多肽化合物的合成

合成方法同实施例1，收集目标峰冻干得纯品0.011g，纯度大于98％，通过MS确认目标多肽的分子量。理论相对分子质量为8781.8。ESI-MS m/z:计算值[M+7H]⁷⁺1255.6,[M+8H]⁸⁺1098.7；观察值[M+7H]⁷⁺1255.2,[M+8H]⁸⁺1098.4。

实施例6

SEQ ID NO:6多肽化合物的合成

合成方法同实施例1，收集目标峰冻干得纯品0.012g，纯度大于98％，通过MS确认目标多肽的分子量。理论相对分子质量为9362.5。ESI-MS m/z:计算值[M+9H]⁹⁺1041.3,[M+10H]¹⁰⁺937.3；观察值[M+9H]⁹⁺1041.1,[M+10H]¹⁰⁺937.0。

实施例7

SEQ ID NO:7多肽化合物的合成

合成方法同实施例1，仅步骤(9)中的Lys侧链的修饰部分不同，在GLP-1部分肽链合成完毕后，加入7mL 2％水合肼/DMF(v/v)选择性脱除Lys的Dde保护基，Dde保护基脱除后加入0.4mmol的Fmoc-AEEA-OH、0.4mmol的DIC及0.44mmol的HOBt，震荡缩合反应2h。脱除Fmoc保护基后，再次加入0.4mmol的Fmoc-AEEA-OH、0.4mmol的DIC及0.44mmol的HOBt，震荡缩合反应2h。脱除Fmoc保护基后，加入0.4mmol的Fmoc-Glu-OtBu、0.4mmol的DIC及0.44mmol的HOBt，震荡缩合反应2h。脱除Fmoc保护基后，加入0.4mmol的十八烷二酸单叔丁酯、0.4mmol的DIC及0.44mmol的HOBt缩合反应2h，反应完全后用7mLDMF清洗树脂4次。其他合成方法同实施例1，收集目标峰冻干得纯品0.013g，纯度大于98％，通过MS确认目标多肽的分子量。理论相对分子质量为9129.3。ESI-MS m/z:计算值[M+9H]⁹⁺1015.4,[M+10H]¹⁰⁺913.9；观察值[M+9H]⁹⁺1015.2,[M+10H]¹⁰⁺913.7。

实施例8

SEQ ID NO:8多肽化合物的合成

合成方法同实施例7，收集目标峰冻干得纯品0.011g，纯度大于98％，通过MS确认目标多肽的分子量。理论相对分子质量为9709.9。ESI-MS m/z:计算值[M+9H]⁹⁺1079.9,[M+10H]¹⁰⁺972.0；观察值[M+9H]⁹⁺1079.6,[M+10H]¹⁰⁺971.8。

实施例9

SEQ ID NO:9多肽化合物的合成

合成方法同实施例7，收集目标峰冻干得纯品0.012g，纯度大于98％，通过MS确认目标多肽的分子量。理论相对分子质量为9130.2。ESI-MS m/z:计算值[M+9H]⁹⁺1015.5,[M+10H]¹⁰⁺914.0；观察值[M+9H]⁹⁺1015.2,[M+10H]¹⁰⁺913.8。

实施例10

SEQ ID NO:10多肽化合物的合成

合成方法同实施例7，收集目标峰冻干得纯品0.011g，纯度大于98％，通过MS确认目标多肽的分子量。理论相对分子质量为9710.8。ESI-MS m/z:计算值[M+9H]⁹⁺1080.0,[M+10H]¹⁰⁺972.1；观察值[M+9H]⁹⁺1079.8,[M+10H]¹⁰⁺971.9。

实施例11

SEQ ID NO:11多肽化合物的合成

合成方法同实施例1，收集目标峰冻干得纯品0.014g，纯度大于98％，通过MS确认目标多肽的分子量。理论相对分子质量为8952.1。ESI-MS m/z:计算值[M+8H]⁸⁺1120.0,[M+9H]⁹⁺995.7；观察值[M+8H]⁸⁺1119.7,[M+9H]⁹⁺995.5。

实施例12

SEQ ID NO:12多肽化合物的合成

合成方法同实施例1，收集目标峰冻干得纯品0.013g，纯度大于98％，通过MS确认目标多肽的分子量。理论相对分子质量为9532.6。ESI-MS m/z:计算值[M+8H]⁸⁺1192.6,[M+9H]⁹⁺1060.2；观察值[M+8H]⁸⁺1192.2,[M+9H]⁹⁺1059.5。

实施例13

SEQ ID NO:13多肽化合物的合成

合成方法同实施例1，收集目标峰冻干得纯品0.011g，纯度大于98％，通过MS确认目标多肽的分子量。理论相对分子质量为8867.9。ESI-MS m/z:计算值[M+8H]⁸⁺1109.5,[M+9H]⁹⁺986.3；观察值[M+8H]⁸⁺1109.4,[M+9H]⁹⁺985.8。

实施例14

SEQ ID NO:14多肽化合物的合成

合成方法同实施例1，收集目标峰冻干得纯品0.011g，纯度大于98％，通过MS确认目标多肽的分子量。理论相对分子质量为9448.6。ESI-MS m/z:计算值[M+10H]¹⁰⁺945.9,[M+11H]¹¹⁺860.0；观察值[M+10H]¹⁰⁺945.5,[M+11H]¹¹⁺859.8。

实施例15

多肽化合物对人GLP-1受体和Y₂受体的激动活性测定

通过功能测定法来确定多肽化合物对受体的激动作用，GLP-1受体激动活性通过测量稳定表达人GLP-1受体的HEK-293细胞系的cAMP响应。将稳定表达GLP-1受体的细胞分入T175培养瓶并在培养基(DMEM/10％FBS)中过夜生长至接近汇合状态，然后除去培养基，并用无钙和镁的PBS洗涤细胞，然后用Accutase酶进行蛋白酶处理。洗涤脱离的细胞并将其重悬于测定缓冲液(20mM HEPES,0.1％BSA,2mM IBMX,1×HBSS)中，并确定细胞密度，并将25μL的等分试样分装至96孔板的孔中。为了测量，将25μL的测试多肽化合物在测定缓冲液中的溶液添加到孔中，然后室温温育30分钟。用Cisbio的试剂盒，基于均相时间分辨荧光(HTRF)来确定细胞的cAMP含量。添加稀释于裂解缓冲液(试剂盒组分)中的HTRF试剂后，将平板温育30分钟，然后测量665/620nm处的荧光比。通过检测引起最大响应的50％激活的浓度(EC₅₀)来对激动剂的体外效力进行量化。

使用稳定表达人Y₂受体和cAMP敏感的钙离子通道的HEK-293细胞测定化合物对Y₂受体的激动作用。首先，将细胞培养在培养基中(DMEM、10％FBS、遗传霉、遗传霉素、青霉/链霉素)，然后将每孔20μL的细胞悬液添加到384孔板中(20000个细胞/孔)。然后用钙敏感染料在37℃、5％CO₂条件下预处理细胞50分钟，接着在25℃下预处理10分钟。将待测化合物按4倍量连续稀释10次，并将750nL的测试化合物转移到384孔板。然后从培养箱中取出384孔板并将其放入FLIPR Tetra System，测量荧光信号，测量荧光信号(激发494nm/发射516nm)，通过检测引起最大响应的50％激活的浓度(EC₅₀)来对激动剂的体外效力进行量化。

将本专利申请实施例中的检测数据(nM)显示于下表1中，虽然用一定数量的有效数字来陈述检测数据，但不应该认为表示数据已确定精确为有效数字的数。

表1 多肽化合物对人GLP-1受体及Y₂受体的激动活性

如表1所示，所有多肽化合物都显示出了对GLP-1受体和Y₂受体的双重激动活性，说明这些多肽化合物均具有双重激动剂的特点。同时，部分多肽化合物显示出了与GLP-1和PYY_3-36接近或者更好的GLP-1受体和Y₂受体的激动活性。

实施例16

多肽化合物在大鼠体内的药代动力学性质

大鼠给予50nmol/kg的皮下(s.c.)注射给药，在给药后0.25h、0.5h、1h、2h、4h、8h、16h和24h收集血样。使用乙腈沉淀蛋白质后，用LC-MS分析血浆样品。用WinonLin5.2.1(非房室模型)计算药代参数和半衰期。

表2 多肽化合物在大鼠体内的药代动力学概貌

样品	T<sub>1/2</sub>(h)	C<sub>max</sub>(ng/mL)
			Liraglutide	3.3	462
SEQ ID NO:11	4.4	459

如表2结果显示，本发明的多肽化合物的体内半衰期显著延长，具有支持每天一次给药或每周一次给药的药代动力学特征。

实施例17

多肽化合物对C57BL/6J小鼠进食的影响

雄性C57BL/6J小鼠，随机分为3组，每组6只。实验前小鼠禁食12h，空白组皮下注射给予生理盐水(10mg/kg)，给药组分为2组，小鼠非空腹状态下分别皮下单次注射25nmol/kg的liraglutide和SEQ ID NO:11。然后立即给予小鼠预先称重的鼠饲料，并在1h、2h、3h、4h、5h、6h、8h、10h、12h和24h再次称饲料重量，计算小鼠在不同时间点的摄食量。

如图1结果所示，在C57BL/6J小鼠体内的摄食实验结果表明，在24h，liraglutide只能降低小鼠30.2％的进食量，而SEQ ID NO:11多肽化合物可以降低小鼠72.6％进食量，明显优于liraglutide，说明本专利的多肽化合物具有优异的抑制进食效果。

实施例18

多肽化合物对饮食诱导肥胖(DIO)小鼠血糖和体重的影响

雄性C57BL/6J小鼠，体重22g左右，模型组共18只，用Research Diets公司的D12492高脂饲料饲养18周造DIO小鼠模型。在给药开始前，各组DIO小鼠按照体重随机分组，共分为3组，每组6只，分别为生理盐水组(空白对照组)、阳性对照组(liraglutide)和受试样品组(SEQ ID NO:11)。各组小鼠每天两次皮下注射生理盐水(10mg/kg)，liraglutide(25nmol/kg)，SEQ ID NO:11(25nmol/kg)，给药周期21天。每天记录小鼠体重变化。在实验结束后，各组小鼠处死，取血制血清，并测量血清甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)含量。

如图2结果显示，本发明的多肽化合物SEQ ID NO:11在DIO小鼠体内连续给药3周，可以降低32.6％的小鼠体重，而liraglutide只能降低16.5％的小鼠体重，说明SEQ ID NO:11的减重作用显著强于阳性对照药liraglutide。

表3 DIO小鼠治疗3周后的血清甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)含量

样品(剂量)	总胆固醇(mmol/L)	甘油三酯(mmol/L)
			空白对照(生理盐水组)	7.14±0.33	1.61±0.12
Liraglutide(25nmol/kg)	5.97±0.31<sup>***</sup>	1.18±0.08<sup>***</sup>
			SEQ ID NO:11(10nmol/kg)	4.15±0.15<sup>***,###</sup>	0.96±0.10<sup>***,##</sup>

^***：与空白对照组相比P<0.001；^##：与liraglutide组比P<0.01；^###：与liraglutide组比P<0.001(One-Way ANOVA,Tukey post hoc test)，结果表示为每组6只小鼠平均值±SD。

如表3结果显示，本发明的多肽化合物SEQ ID NO:11的在DIO小鼠体内连续给药3周，可以显著降低小鼠的血清甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)含量，并且本发明的多肽化合物的降低血脂的作用显著强于阳性对照药liraglutide。

Claims (10)

1.一类GLP-1/Y₂受体双重激动剂，其特征在于，所述GLP-1/Y₂受体双重激动剂的氨基酸序列通式为：

His-Xaa₁-Glu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Asn-Asp-Val-Thr-Glu-Tyr-Leu-Glu-Glu-Xaa₂-Ala-Ala-Xaa₃-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ile-Lys-Gly-Lys-Xaa₄-Xaa₅-Lys-Pro-Glu-Ala-Pro-Gly-Xaa₆-Asp-Ala-Ser-Pro-Glu-Glu-Xaa₇-Asn-Arg-Tyr-Tyr-Ala-Xaa₈-Leu-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Xaa₉-Xaa₁₀-Thr-Arg-Gln-Xaa₁₁-Tyr-NH₂，

其中：

Xaa₁选自Ala、Gly或Aib；

Xaa₂选自Glu、Lys或侧链被修饰的Lys；

Xaa₃选自Lys或侧链被修饰的Lys；

Xaa₄选自Cys或侧链被修饰的Cys-R1或Cys-R2或Cys-R3；

Xaa₅选自Ile或Pro；

Xaa₆选自Glu或Lys；

Xaa₇选自Leu或Trp；

Xaa₈选自Ser或Asp；

Xaa₉选自Leu或Trp；

Xaa₁₀选自Leu或Val；

Xaa₁₁选自Arg或

其中，侧链被修饰的Lys选自

其中，n为自然数，且12≤n≤20。

2.根据权利要求1所述的一类GLP-1/Y₂受体双重激动剂，其特征在于，所述n是14、16、18或20。

3.根据权利要求1所述的一类GLP-1/Y₂受体双重激动剂，其特征在于，所述Cys-R1的化学结构如下：

所述Cys-R2的化学结构如下：

所述Cys-R3的化学结构如下：

4.根据权利要求1所述的一类GLP-1/Y₂受体双重激动剂，其特征在于，所述GLP-1/Y₂受体双重激动剂的氨基酸序列结构为：

(1)SEQ ID NO:1

(2)SEQ ID NO:2

(3)SEQ ID NO:3

(4)SEQ ID NO:4

(5)SEQ ID NO:5

(6)SEQ ID NO:6

(7)SEQ ID NO:7

(8)SEQ ID NO:8

(9)SEQ ID NO:9

(10)SEQ ID NO:10

(11)SEQ ID NO:11

(12)SEQ ID NO:12

(13)SEQ ID NO:13

(14)SEQ ID NO:14

5.一类GLP-1/Y₂受体双重激动剂药学上可接受的盐，其特征在于：所述的GLP-1/Y₂受体双重激动剂为权利要求1-4任意一项所述的化合物。

6.根据权利要求5所述的一类GLP-1/Y₂受体双重激动剂药学上可接受的盐，其特在于，所述盐为GLP-1/Y₂受体双重激动剂与下述化合物中的一种所形成的盐：盐酸、乙酸、水杨酸、月桂酸、肉桂酸、柠檬酸草酸、乳酸、琥珀酸。

7.权利要求1-4项中任意一项所述的一类GLP-1/Y₂受体双重激动剂所制备的药剂，其特征在于，所述药剂是任何一种药剂学上所说的片剂、胶囊、吸入剂、喷雾剂、注射剂、膜剂、贴剂、乳剂、栓剂或者复方制剂，药剂由一类GLP-1/Y₂受体双重激动剂和药学上可接受的药用辅料、载体或稀释剂组成。

8.含有一类GLP-1/Y₂受体双重激动剂的药物组合物，其特征在于，该药物组合物以权利要求1-4项中任意一项所述的GLP-1/Y₂受体双重激动剂为有效原料，或者以权利要求5或6所述的GLP-1/Y₂受体双重激动剂药学上可接受的盐为有效原料，再加上药学上可接受的载体或稀释剂组成。

9.权利要求1-8项中任意一项所述的一类GLP-1/Y₂受体双重激动剂或其药学上可接受的盐、或其药物组合物或其药剂在制备用于治疗代谢性疾病或病症的药物中的用途。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述代谢性疾病或病症为糖尿病、肥胖症或血脂障碍。

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