CN105936647A

CN105936647A - 长效化艾塞那肽(Exendin-4)类似物及其应用

Info

Publication number: CN105936647A
Application number: CN201610283641.1A
Authority: CN
Inventors: 黄文龙; 钱海; 孙李丹; 蔡星光; 韩京; 褚莹莹; 周洁
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2016-04-27
Filing date: 2016-04-27
Publication date: 2016-09-14

Abstract

本发明涉及一类长效化艾塞那肽(Exendin‑4)类似物及其合成方法。通过对Exendin‑4进行改造得到具有更长药理作用时间的Exendin‑4类似物，目标多肽的合成是通过微波促进固相合成方法快速实现，粗品经纯化，冻干得到Exendin‑4类似物。

Description

长效化艾塞那肽(Exendin-4)类似物及其应用

技术领域

本发明涉及糖尿病治疗领域的长效化艾塞那肽(Exendin-4)类似物及其应用。

背景技术

糖尿病是继肿瘤、心血管疾病之后第三大严重威胁人类健康的慢性非传染性疾病。目前，全球约有3亿糖尿病患者，预计到2025年将增加至5亿。临床上采用胰岛素强化治疗的方法来延缓糖尿病进程，胰岛素治疗在降低血糖的同时可以一定程度上逆转胰岛β-细胞功能损害。但是使用胰岛素会出现低血糖的危险。受到剂量大小、注射部位、注射途径、个体差异或注射后未进食等因素的影响，如果使用胰岛素稍有不慎，就会出现严重的低血糖副作用。

胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是一种葡萄糖依赖性肠降血糖多肽激素，GLP-1刺激胰岛素分泌而不出现低血糖，这种葡萄糖依赖性的促胰岛素分泌特性，避免了糖尿病治疗中常存在的产生低血糖症的危险，这些生理功能使开发GLP-1作为一种2型糖尿病治疗药物具有广阔的前景。

GLP-1主要由末端空肠、回肠和结肠的L细胞所分泌的葡萄糖依赖性肠降血糖多肽激素，通过作用于胰岛β-细胞膜上的受体GLP-1受体(GLP-1R)，促进胰岛素的分泌。此外，cAMP水平升高，又激活cAMP依赖的蛋白激酶A和磷酸化酶，进而刺激β-细胞胰岛素基因的转录和翻译，刺激β-细胞的增值和分化。

GLP-1具有多种生物学效应。如下：

1、具有血糖依赖性的肠促胰岛素分泌作用；

2、阻止胰腺β-细胞退化，刺激β-细胞的增值和分化；

3、诱导前胰岛素基因的转录，促进前胰岛素的生物合成；

4、增加胰岛素的敏感性；

5、增加生长抑素分泌，抑制胰高血糖素的产生(此作用也是血糖依赖性)；

6、抑制胃酸分泌，延迟胃排空；

7、通过作用于丘脑下部的中枢抑制食欲，降低食物摄取量等作用。

虽然天然GLP-1在治疗糖尿病上有以上诸多优点，但它在体内易被二肽基肽酶IV(DPP-IV)快速降解。DPP-IV可特异性识别GLP-1的N末端第二位丙氨酸(Ala)残基，从肽链N末端第2位丙氨酸(Ala)处切除二肽，使其转变为无活性的形式，其体内半衰期仅5分钟左右。GLP-1分子N端是与GLP-1受体的结合部位，其组氨酸残基丧失，导致GLP-1完全失去生物活性。目前普遍使用的延长GLP-1体内半衰期的修饰策略包括对8位修饰使得GLP-1、能抵抗DPP-IV酶的降解，将GLP-1肽链N端8位和9位的氨基酸互换可以达到此目的。短效GLP-1受体激动剂Exendin-4和lixisenatide就是利用此方法进行修饰的典型代表。然而，由于多肽还会在肾脏中快速滤过消除，抗DPP-IV酶的降解只能一定程度的延长GLP-1的半衰期。这里，我们在短效GLP-1受体激动剂Exendin-4的基础上，设计了一类Exendin-4类似物。该类类似物首次将其进行多肽非活性位点的半胱氨酸替换，通过半胱氨酸的巯基与马来酰亚胺发生点击化学反应来方便高效地引入小分子基团，可避免早期长效化GLP-1受体激动剂的研发过程中，采用赖氨酸作为小分子基团连接壁的选择性差，反应不方便等问题。此外，小分子基团具有较强的血清白蛋白结合率，可增加缀合物与血清白蛋白的结合，延长肽链的作用时间，可避免GLP-1的肾脏快速滤过和代谢失活，因而该类化合物的半衰期及体内降糖作用时间显著延长。

发明内容

本发明涉及一类艾塞那肽(Exendin-4)类似物，其序列为：

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Xaal-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Xaa2-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Xaa3

其中：

Xaa1：化学修饰的Cys或Lys；

Xaa2：化学修饰的Cys或Trp；

Xaa3：化学修饰的Cys或-NH₂；

化学修饰的Cys结构为

这里：n选自6～14。

其中，优选的脂肪链修饰Cys结构为

在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的Exendin-4类似物：

本发明还提供了一种药物组合物，包括治疗有效量的至少一种上述化合物和其药学上可接受的盐，或药学上可接受的载体或稀释剂。

本发明进一步提供了上述化合物和其药学上可接受的盐，或药学上可接受的载体或稀释剂在制备用于糖尿病的药物中的运用。

本发明提供的上述化合物化学性质稳定，部分化合物血浆半衰期达到了30h以上，较原型Exendin-4(半衰期2.4h)有显著的提高。另外，本发明提供的上述化合物或化合物作为有效成分制备的药物组合物用于降低体内血糖浓度时，既有很长的血浆半衰期，高于目前已经上市的化学修饰长效化多肽利拉鲁肽，又具有显著的降糖效果，而且可避免药剂学手段长效化产品易产生的注射部位出现局部瘙痒等不良反应。

本发明还提供了上述化合物的制备方法，本发明采用微波促进Fmoc/tBu正交保护固相合成策略高效快速地合成得到上述目标化合物。

以下是本发明中涉及的Exendin-4类似物的体外和体内降糖药理实验方法以及结果：

(1)Exendin-4及Exendin-4类似物体外血浆稳定性实验

大鼠在取血浆前禁食12h(不禁水)，乙醚麻醉，眼球采血于盛有肝素钠(30mg)的磨口三角瓶中，采血过程中轻轻振摇三角瓶，使肝素钠均匀溶于血中。收集全血，3000rpm.min-1离心15min，移取上清液，即得血浆。纯化后的Exendin-4和Exendin-4衍生物用Tris缓冲液配成1000ng/ml的初始母液，100μL的化合物溶液与等体积大鼠血浆涡旋混匀，pH＝7.4，37℃温孵。所有化合物都温孵24h以上，于0、0.5、1、2、4、6、8、12、24、36、48和72h时间点取10μL温孵样品，加入20μL含有0.1％TFA的乙腈沉淀，涡旋3min，14000rpm.min-1离心15分钟，上清液直接进LC-MS分析，记录不同时间点的质谱峰面积数值，做出降解曲线，计算化合物的体外半衰期。如图1所示，没有经过改造的原型Exendin-4半衰期只有约2.5h，而Exendin-4类似物的半衰期均得到延长，其中，最长的半衰期达到35.6个小时。

(2)Exendin-4及Exendin-4类似物的隔日降血糖实验

正常昆明小鼠，分为8组，每组6只，小鼠饲养在标准化动物房中。实验开始时，提前24h给予Exendin-4及Exendin-4类似物，对照组注射生理盐水。正常饮食饮水12h，接着禁食12h，在化合物注射24h后，进行小鼠单次腹腔葡萄糖耐量实验。各组按照小鼠体重每千克腹腔注射18mmol的葡萄糖溶液(浓度20％)，注射葡萄糖时定为0min，在0，15，30，45，60，120min用血糖仪测定血糖水平。

表1 Exendin-4及Exendin-4类似物隔日降血糖的效应

n＝6，**P＜0.01，***P＜0.001vs Exendin-4with saline ascontrol

如表1所示，由于修饰后的Exendin-4类似物的生物半衰期都达到了30h以上，所以在体内代谢24h后，降血糖实验显示其促胰岛素分泌作用仍然维持，而未经改造的天然Exendin-4早已失去活性，说明我们的Exendin-4类似物体内降糖作用时间显著的延长。

(3)Exendin-4及Exendin-4类似物的隔日多次口服葡萄糖耐量实验

选取8周龄db/db糖尿病小鼠，随机分组，每组6只，适应性饲养7天后，在实验开始前12小时禁食，只给予饮水。每组小鼠在给予Exendin-4及Exendin-4类似物之前，测初始血糖值，定为-30min，然后腹腔给予Exendin-4类似物，30min后腹腔注射葡萄糖(每千克18mmol)，定为0min，对照组注射相同体积的生理盐水和Exendin-4。0min，15min，30min，60min，90min，120min分别尾部取血，测定血液葡萄糖浓度。并且于360min和720min再次注射葡萄糖，继续测定血糖值，一共重复给予3次葡萄糖，检测化合物的长效化降糖活性。

表2 Exendin-4及Exendin-4类似物多次腹腔葡萄糖耐量效应

n＝6，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001vs saline as control

如表2所示，Exendin-4在第三次腹腔糖耐量实验时已经失去活性，而所有的Exendin-4类似物在三次给予葡萄糖过程中，仍然维持了较好的降糖活性，说明化合物经过改造后，其长效化降糖作用显著。

本发明的优点在于：

1.提出的一种长效化Exendin-4类似物可以在保留降糖活性的基础上，具有抗肾脏滤过消除和抗DPP-IV酶解作用，生物半衰期较Exendin-4原型显著延长，部分达到了30小时以上，提高了稳定性，极大的延长了降糖作用时间。

2.微波促进固相合成的Exendin-4类似物大大的提高了偶合反应速率，常规固相合成方法充分偶合一个氨基酸到树脂上去，往往需要2小时到20小时不等，甚至更长。而微波促进则平均只需要10分钟左右；常规固相合成方法脱Fmoc保护基，往往需要30分钟到1小时不等，而微波促进则平均只需要5分钟左右，这极大的提高了多肽合成的效率，缩短了合成周期。此外，合成Exendin-4类似物的粗品纯度大于80％，较常规固相合成方法大大提高，这方便了后续的纯化工作。微波促进固相合成Exendin-4类似物的方法易于实现自动化、大规模化，这使其更适合工业化生产。

因此用本发明提供的微波促进固相合成技术制备的Exendin-4类似物，收率高、合成周期短、粗品纯化容易，生产成本低、易于工业自动化生产。制备得到的Exendin-4类似物，结构全新，比天然Exendin-4更加稳定，降血糖作用时间长，适合作为治疗糖尿病药物的活性成分。

附图说明

上文对本发明做了一般性描述，下面附图用于说明本发明的具体实施方案。其中：

图1显示的是原型Exendin-4和本发明的Exendin-4类似物的血浆温孵半衰期柱形图；

具体实施方式

在本说明书全文中采用以下缩写：

Et₃N：三乙胺；NMM：N-甲基吗啉；DIEA：N，N′-二异丙基乙胺；DMF：二甲基甲酰胺；DMSO：二甲亚砜；DCM：二氯甲烷；Fmoc：N-9-芴甲氧羰基；DIC：N，N’-二异丙基碳二亚胺；CDI：N，N’-羰基二咪唑；DMAP：4-二甲氨基吡啶；HOSU：N-羟基琥珀酰亚胺；EDC.HCl：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐；HATU：2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯；HBTU：苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯；HCTU：6-氯苯并三氮唑-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯；HOAT：1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑；HOBT：1-羟基-苯并三氮唑；PyBOP：六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷；HPLC：高效液相色谱；ESI-MS：电喷雾质谱；Gly：甘氨酸；Ser：丝氨酸；Ala：丙氨酸；Thr：苏氨酸；Val：缬氨酸；Ile：异亮氨酸；Leu：亮氨酸；Tyr：酪氨酸；Phe：苯丙氨酸；His：组氨酸；Pro：脯氨酸；Asp：天门冬氨酸；Met：蛋氨酸；Glu：谷氨酸；Trp：色氨酸；Lys：赖氨酸；Arg：精氨酸。Asn：天冬酰胺；Gln：谷氨酰胺。

本发明是通过下列实施例来进行说明的，但这些实施例不做任何限制本发明的解释。

实施例1

的微波促进固相合成

(1)侧链改构的半胱氨酸合成

称取Fmoc-Cys-OH 0.21g，溶于DCM中，加入0.12g N-正辛基马来酰亚胺，3ul DIEA作为催化剂，室温下搅拌反应4小时，薄层板监测反应完毕后，反应液减压浓缩，柱层析分离得产物0.27g，收率79％。

MS(70eV)m/z：575.6([M+Na]⁺)。

(2)树脂的溶胀

称取Fmoc-Rink amide-MBHA Resin 50mg(取代量0.4mmol/g)，经7mL DCM溶胀30min，抽滤去DCM，再用10mLNMP溶胀30min，最后分别用NMP，DCM，NMP 7mL冲洗干净。

(3)微波促进Fmoc保护基的脱除

将溶胀好的树脂放入反应器中，加入7mL含0.1M HOBT的25％哌啶/NMP(V/V)溶液，在微波反应器中反应1min，微波功率为15W，反应温度控制在50℃以内，使用空气压缩机压缩空气冷却，反应结束后滤去溶液；再加入7mL含0.1M HOBT的25％哌啶/NMP(V/V)溶液在微波反应器中再反应4min，微波功率为25W，反应温度控制在50℃，使用空气压缩机压缩空气冷却。反应结束后滤去溶液，用NMP洗涤干净。得到脱去初始连接的Fmoc保护基的树脂。

(4)微波促进Fmoc-Ser-Rink amide-MBHA Resin的合成

将Fmoc-Ser-OH(0.04mmol)，HBTU(0.04mmol)，HOBT(0.04mmol)和DIPEA(0.08mmol)溶于10mLNMP中，再将此溶液加入上面的树脂中，在微波反应器中反应7min，微波功率为25W，反应温度控制在50℃，使用空气压缩机压缩空气冷却。反应结束后滤除反应液，用DCM和NMP各7mL洗涤树脂3次。

(5)偶合效率的检测

用茚三酮法或者溴酚兰法定性检测树脂的偶合效率，显色反应为阴性即可进入下一个偶合循环。

茚三酮法：取少量树脂颗粒用乙醇洗涤，放入透明小瓶中加入5％茚三酮乙醇、KCN吡啶溶液(2ml 0.001M KCN稀释于98ml吡啶中)、80％苯酚乙醇溶液各2滴，于100℃加热5分钟，如果树脂显蓝色即为阳性。

溴酚兰法：取少量树脂颗粒用二甲酰乙酰胺洗涤，放入透明小瓶中加入3滴1％的溴酚蓝二甲基乙酰胺溶液，常温下振摇3分钟，如果树脂显蓝色即为阳性。

(6)肽链的延长

按照肽链的序列，重复上述脱保护和偶合的步骤依次连接上相应的氨基酸，合成到肽链17位时，加入侧链改构的半胱氨酸，偶合45min，然后继续重复脱保护和偶合的步骤依次连接上相应的氨基酸直至肽链合成完毕，得到连有化合物的树脂。

(7)树脂上多肽的裂解

将上述得到的连有化合物的树脂放入反应瓶中，各加入裂解剂Reagent K(TFA/苯甲硫醚/水/苯酚/EDT，82.5∶5∶5∶5∶2.5，V/V)10mL，先在0℃下振摇30min，再在常温下反应3h。反应结束后抽滤，加少量TFA和DCM洗涤三次，合并滤液。将滤液加入大量的冰乙醚中析出白色絮状沉淀，冷冻离心得到目标多肽的粗品。最终得到化合物的粗品63.2mg，收率为94.3％。

(7)多肽的纯化

将粗品多肽溶于50％的乙腈/水中，使用制备液相色谱纯化，色谱条件为：C18反相柱(320mm×28mm，5μm)；流动相A：0.1％TFA/水(V/V)，流动相B：0.1％TFA/乙腈(V/V)；流动相梯度：流动相B 40％～90％，20min；流速为6mL/min检测波长为214nm。收集的溶液冻干得纯品30mg。理论相对分子质量为4370.7。ESI-MS m/z：found[M+3H]³⁺1457.9，[M+4H]⁴⁺1093.7；calu[M+3H]³⁺1457.7，[M+4H]⁴⁺1093.2。

实施例2～9

根据实施例1所述的方法，根据相应的序列合成得到实施例2～9的Exendin-4类似物，通过电喷雾质谱(ESI-MS)确证各自的分子量。

实施例2

理论相对分子质量为4426.8。ESI-MS m/z：found[M+3H]³⁺1476.6，[M+4H]⁴⁺1107.7；calu[M+3H]³⁺1476.8，[M+4H]⁴⁺1107.9。

实施例3

理论相对分子质量为4483.6。ESI-MS m/z：found[M+3H]³⁺1495.5，[M+4H]⁴⁺1121.9；calu[M+3H]³⁺1495.2，[M+4H]⁴⁺1121.9。

实施例4

理论相对分子质量为4313.6。ESI-MS m/z：found[M+3H]³⁺1438.9，[M+4H]⁴⁺1079.4；calu[M+3H]³⁺1439.1，[M+4H]⁴⁺1079.7。

实施例5

理论相对分子质量为4369.7。ESI-MS m/z：found[M+3H]³⁺1457.6，[M+4H]⁴⁺1093.1；calu[M+3H]³⁺1457.9，[M+4H]⁴⁺1093.2。

实施例6

理论相对分子质量为4426.5。ESI-MS m/z：found[M+3H]³⁺1476.5，[M+4H]⁴⁺1107.6；calu[M+3H]³⁺1476.6，[M+4H]⁴⁺1107.6。

实施例7

理论相对分子质量为4498.8。ESI-MS m/z：found[M+3H]³⁺1500.6，[M+4H]⁴⁺1125.7；calu[M+3H]³⁺1500.6，[M+4H]⁴⁺1025.4。

实施例8

理论相对分子质量为4554.9。ESI-MS m/z：found[M+3H]³⁺1519.3，[M+4H]⁴⁺1139.7；calu[M+3H]³⁺1519.8，[M+4H]⁴⁺1139.5。

实施例9

理论相对分子质量为4611.7。ESI-MSm/z：found[M+3H]³⁺1538.6，[M+4H]⁴⁺1153.9；calu[M+3H]³⁺1538.7，[M+4H]⁴⁺1153.3。

Claims

1.一种艾塞纳肽(Exendin-4)类似物，其序列为：

其中：

Xaa1：化学修饰的Cys或Lys；

Xaa2：化学修饰的Cys或Trp；

Xaa3：化学修饰的Cys或-NH₂；

化学修饰的Cys结构为

这里：n选自6～14。

2.根据权利要求1所述的艾塞纳肽(Exendin-4)类似物，优选的序列为：

。

3.一种药物组合物，包括治疗有效量的至少一种权利要求1中所述的艾塞纳肽(Exendin-4)类似物和其药学上可接受的盐。

4.一种药物组合物，包括治疗有效量的至少一种权利要求1中所述的艾塞纳肽(Exendin-4)类似物和药学上可接受的载体或稀释剂。

5.权利要求1中所述的艾塞纳肽(Exendin-4)类似物和其药学上可接受的盐在制备用于糖尿病的药物中的运用。

6.权利要求1中所述的艾塞纳肽(Exendin-4)类似物和药学上可接受的载体或稀释剂在制备用于糖尿病的药物中的运用。

7.权利要求1中所述的艾塞纳肽(Exendin-4)类似物的制备方法，包括生物表达、液相合成和固相合成制备方法。